JPS58501073A - ８−アニリノナフタレン−１−スルホン酸類縁体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ８−アニリノナフタレン−１−スルホン酸類縁体本発明は８−アニリノナフタレ ン−１−スルホン酸の新規類縁体、それらの製造および酵素イムノアッセイ技術 へのそれらの使用に関する。

既知有ｉ化合物８−アニリノナフタレン−１−スルホン酸（ＡＮＳ）は、操作に 使用される特異結合抗体への薬剤もしくはホルモンリガンド／リガンドトレーサ ーの特異的結合を妨害する血清タンパク成分がそのようなりガント／リガンドト レーサーへ結合することから発生する妨害を防止するために、ラジオイムノアッ セイとして知られる技術に使用される試薬への添加剤として広く使用されている 。そのような用途は１例えばＣｈｏｐｒａ　、■、　Ｊ、　”Ａ　ｒａａｉｏ− ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ｔ ｈｙｒｏｘｉｎｅ　ｉｎ　ｕｎｅｘｔｒａｃｔｅｄｓｅｒｕｍ”、　Ｊ、　Ｃ１ １ｎ、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、　３４　＋１９７２１　ｐ−９３８のように為 チロキシンのような甲状腺ホルモンのラジオイムノアッセイのような操作に、ま た例えば　５ｅｋａｄｄｅ　Ｃ，Ｂ、　ｅｔ　ａｌ、　”Ｒａｐｉｄ　Ｒａｄｉ ｏ−ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　ｏｆ　Ｔｒｉｉｏｄｏｔｈｙｒｏｎｉｎｅ”、　 Ｃ１１ｎ、　Ｃｈｅｍ、　１９（１９７３１ｐ、１０１６のように、トリ′ヨー ドチロニンの定量に例証される。このような場合に、ＡＮＳの使用は定量のスピ ードおよび定量の特異性に著しい改善分与えることにおいて定量に特別の利益を 与える。この、１の理由は、例えばプレアルブミンに対するＡＮＳの結合を研究 した　Ｃｈｅｎｇ　Ｓ−ｅｔ　ａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１６　（１ ９７７）　ｐ、３７０７および甲状腺結合グロブリンへのＡＮＳ結合全研究した Ｎｉ１ｓｓｏｎ　Ｓ、　Ｆ。

ａｎｄ　Ｐｅｔｅｒｓｏｎ　Ｐ、Ａ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２５０　（１ ９７５）　ｐ、８５４３のように、深く研究されている。

ＡＮＳの他のタンパクへ４７）結合も、例えば５ｔｒｙｅｒ　Ｌ、、　Ｊ、Ｍｏ ｌ。

ＢｉｏＬ　１３　（１９６５）　ｐ、４Ｂ２および５ｔｅｉｎｅｒ　Ｒ，Ｆ、　 ｅｔ　ａｌ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。

２４１　（１９６６＋　ｐ、５６０　のように、深く研究されており、そして甲 状腺ホルモンの定量におけるその用途のほかに、ＡＮＳは例えばアメリカ合衆国 イリノイ州ノースジカゴのアボット、ラボラトリーズ社の市販シソキシンラジオ イムノアッセイ「シソキシン１１８５ＩＭＵＳＡＹ　Ｊのように薬剤のラジオイ ムノアッセイにおける定量成分としても使用されている。アッセイにＡＮＳを含 めることにより、該アッセイの特異性に著しい改良が得られることが認められて いる。該改良は、さもなければシソキシンが血清アルブミンへ結合することを防 止する。ＡＮＳの血清アルブミンへの結合に起因するものと思われる。

もつと最近開発された均質もしくは不均質酵素イムノアッセイおよび螢光イムノ アッセイのようなイムノアッセイもＡＮＳの使用から利益を受けるように見える が、しがし光の存在においては不安定であり、３４０ないし４２０ｎｍ　の域に おいて強く光を吸収し、そしてタンパクと結合する時さらに強まる天然螢光を示 すＡＮＳの物理的性質によってこのようなアッセイにそれを使用することが阻ま れる。このため、例えばＡＮＳを甲状腺アッセイに使用する時できるだけ簡単な そして早い技術を使用する代りに、これら技術はそのようなアッセイが機能する ためもつと面倒な操作を使用する。

本発明は、類縁体がＡＮＳのタンパク結合特性を保有するが、しかしその非アイ ソトープイムノアッセイ技術への使用を阻止するＡＮ、Ｓの光吸収性または螢光 性、または光への不安定性を持っていない類縁体の形へＡＮＳの分子構造を化学 的に修飾することに関する。

ＡＮＳの構造は以下の式１に示すとおりであり、そして分子へ甲状腺結合グロブ リン、プレアルブミンへしっかりと結合される能力、そしてアルブミンへの結合 能力を与えるのは３個の芳香環の構造の独特な性質であると思われる。

式１ スルホン酸基は分子を水溶性とする。この構造の考察から、アニリノ窒素上に存 在する電子のローンベアは、３個の芳香環全部分通じ電子共役が発生することを 許容することが見える。そのような共役は３００　ｎｍ以上の波長への光吸収の シフトに関連するのが通常であシ、そしてこの共役はまた公知のＡＮＳの螢光特 性に関連するように見える。

本発明の目的は、孤立電子対を含み、そしてそのためアニリノ芳香環の共役をナ フタレン環系ヘブロックするようにアニリノ窒素上の化学的置換により、ＡＮＳ の類縁体を創製することであるみこのＡＮＳ類縁体の構造は式２に示す以下の式 を持つことができ式２ 式２において、Ｒ１はＨまたは１ないし８の炭素数のアルキル基、Ｒ２はＨまた はＣ（Ｙ）＝Ｘであり、その場合ＸはＯまたはＳ、ＹはＨまたは炭素数１ないし ８の脂肪族基、ｎは１または２７ｍは１または２．そしてＡは強酸の陰イオンで あることができる。

好ましくはＲ１は炭素数１ないし４の低級アルキルであわ、さらに好ましくはメ チルまたはエチルである。しかしながら最も好ましいＲ１はＨである。

好ましくはＹば炭素数１ないし４の低級アルキルであシ、もつと好ましくはメチ ルまたはエチルである。

本発明の好ましい化合物は、Ｒ□がＨ，Ｒ２がＣＯＣＨ３、Ａが硫酸塩すなわち Ｎ−アセチル−８−アユリニラム−ナフタレン−１−スルホン酸硫酸塩（以下Ｎ Ａ−ＡＮＳという）である。

Ａは強酸の陰イオンであり、そして塩酸または硝酸を含むことができるが、最も 好ましくは硫酸である。

Ｒ３がＨであり、Ｒ１がＨである式２の化合物はＡＮＳを適切な条件で強酸と反 応させることにより製造し得る。最も好ましい酸は硫酸であシ、そして反応は室 温でおこる。

Ｒ２がＨであり、Ｒ１がｃ（ｙ）−ｘである式２の化合物は、最も好ましくは無 水硫酸である強酸の存在下、室温においてＡＮＳと炭素数１ないし８のアシル化 剤（例えば無水酢酸、無水トリフルオル酢酸、塩化アセチル）、または炭素数１ ないし８のチオアシル化剤（例えば塩化スルフェニルまたはチオ無水物）とを反 応させることによって製造し得る。

Ｒ２がＣ１−Ｃ８アルキルであり、Ｒ１がｃ（ｙ）＝ｘである式２の化合物は、 硫酸のような強酸の存在下室温において、炭素数１ないし８の適当なアルキル剤 をＡＮＳに反応させることによって製造し得る。適当なアルキル剤はハロゲン化 アルキル（例えば塩化アルキル）である。

Ｒ１がＣ□−０８アルキルであシ、Ｒ２がｃ（ｙ）−ｘである式２の化合物は前 述の方法の生成物を最初塩基と反応させ、次いで前記のアシル化剤またはチオア シル化剤と反応させることによって製造し得る。

そのような類縁体Ｎ−アセチル−８−アユリニラム−ナフタレン−１−スルホン 酸硫酸塩（ＮＡ−ＡＮＳ）の合成を詳述し、そしてこの類縁体がＡＮＳのタンパ ク結合特性を保有するが、しかし前記したＡＮＳの光および螢光有害性質は著し く変えられていることが示されるであろう。このためＮＡ−ＡＮＳは非アイソト ープイムノアッセイにおいてＡＮＳ自体をラジオイムノアッセイにおいて使用す るのと類似の態様で具合よく使用することができ、そしてそのような使用が詳述 されるであろう。

ＮＡ−ＡＮＳの合成 ＡＮＳ（アンモニウム塩、シグマ　ケミカル社、実用級）６ｙと無水酢酸６０− の懸濁液へ、濃硫酸３０滴を渦巻きながら滴下した。緑から紫へ色が直ちに変化 した。１０分後混合物へ酢酸エチル３００ｒｎｌを加え、さらに３０分後ＮＡ− ＡＮＳ生成物を口過し、酢酸エチルで洗い、減圧上乾燥してｍｐ１７２−１７６ ℃（分解）の紫色の粉末５ｙを得た。

物理的性質 赤外スペクトル−ＫＢｒ　ディスク：３４５０，３１５０，１６１５．１５９５ ，１４９５，１２７０，１１７０，１１２０，１０５０．１０３０，８３０，７ ６５，７３５，６９８，６７５゜６２０．６１５，５８０，５４５，５１０ｃｍ 　−１マススペクトル：　ｍ／ｅ　２１６　（１００％）、２８１（２０％）２ ８２（４％） 紫外−可視スベクトル：１０ｍＭ！Ｊン酸緩衝食塩水中　ラムダｍａｘ　２９０ 　ｎｍ　、消衰係数７８００螢光スペクトル：１０ｍＭ　リン酸緩衝食塩水中励 起３５２　ｎｍ。

放出４４２　ｎｍ ＮＭＲスペクトル：観察したプロトンおよび１３ＣスペクトルはＮＡ−ＡＮＳ構 造と一致した。

構造の確認 Ｌｕｔｓ　、　Ｈ，Ａ、はＪ、　Ｏｒｇ、　Ｃｈｅｍ、３３（１９６８）ｐ、４ ５２８にピリジニウムＮ−アセチル−８−アニリノ−ナフタレン−１−スルボン 酸塩の合成を報告した。この物質が詳述した方法に従って合成され、そして前述 の無水酢酸と濃硫酸との処理によって、また溶媒として酢酸エチル中濃硫酸で処 理することによってＮＡ−ＡＮＳへ変えられた。ＮＡ−ＡＮＳもまた室温でピリ ジンで処理することにより、ピリジニウムＮ−アセチル−８−アニリノ−ナフタ レン−１−スルホン酸塩へ変えることができた。

非アイソトープイムノアッセイにおけるＮＡ−ＡＮＳの使用非アイソトープイム ノアッセイにおけるＮＡ−ＡＮＳの使用は、例示のため、チロキシン、トリヨー ドチロテン、ジゴキシンおよびテオフィリンの不均質酵素イムノアッセイにおけ るその使用によって示された。そのような使用および観察された利益はこ＼に記 載し、利用した特定の非アイソトープイムノアッセイ操作に限られるものではな く、他の酵素および非酵素非アイソトープイムノアッセイ操作にも等しく応用し 得ることは当業者にとって自明われわれの特許出願ＰＣＴ／ＡＵ８０１０００６ ５およびその中で引用する文献は、様々の不均質酵素イムノアッセイのシリーズ のための抗体および抗体誘導体の製造と、そして酵素−リガント誘導体の製造と を記載し、そしてそのような操作がこれらの実験に用いられた。β−ガラクトシ ダーゼ−チロキシンがチロキシンマレイミド誘導体を用い、石川らのＥｎｚｙｍ ｅ　Ｌａｂｅｌｌｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏ　−ａｓｓａｙ　ｏｆ　、Ｈｏｒｍｏｎｅ ｓ　ａｎｄ　Ｄｒｕｇｓ　：　Ｅｄ、　Ｐａｌ　Ｓ、　Ｂ、　Ｗａｌｔｅｒ　ｄ ｅＧｒｕｙｔｅｒ　Ｂｅｒｌｉｎ　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９７８）　ｐａｇｅ 　４３　に記載の方法の改良法を用いて合成された。

原理：β−ガラクトシダーゼ−チロキシン、血清チロキシンおよび抗チロキシン 抗体フラグメン）（Ｆａｂ）を３０分間室温で緩衝液中でインキユベートシ、固 相法デン生成抗体を添加し、そして混合物をさらに３０分間インキュベートした 。混合物は次にベンチ遠心機上で５分間２０００ｒｐｍで遠心し、上清を残存酵 素活性について定量する。

試薬： １、チロキシン２００　ｎＭおよびタンパク１３０　ｎＭを含有するβ−ガラク トシダーゼ−チロキシン溶液２、抗チロキシン抗体：　アッセイにおいてβ−ガ ラクトシダーゼ−チロキシンの６０％結合を与えるのに十分な抗チロキシンガン マグロブリンのＦａｂ誘導体 ３、固相法デン生成抗体：　アッセイにおいてＦａｂの１００％結合を与える緩 衝液に希釈したセファローズ抗Ｆａｂ抗体４、酵素基質溶液：０−ニトロフェニ ル−β−ガラクトシド１．２■／−リン酸緩衝食塩水 ５、緩衝液：　ウシ血清アルブミン４■／−、ウシガンマグロブリン４■／−、 ゼラチンフラグメント７．５■／ｄ、オレイン酸０、３１１１１ＭおよびＮＡ− ＡＮＳ　Ｏ，７９ｎｙ／ｍを含む０．０１Ｍリン醗０、１５　Ｍ　ＮａＣ１ｐＨ ７，４ ６、チロキシン標準液：チロキシン１０，４０，８０，１３０゜１８０．２４０ 部Ｍを含むヒト血清 方法： アッセイの操作は以下のとおシであり、そしてすべてのステップは室温で実施さ れる。すべてのサンプルについて繰す返しアッセイが実施された。

（ａ）酵素１部と緩衝液１３４部をとり、酵素チロキシンの希釈液を調製せよ。

０．２５ｄコニ力ル自動分析機カップに希釈した酵素チロキシン２００μｌ、サ ンプルまたは較正液２０μｌおよび希釈したＦａｂ抗体５０声ｌを順番にピペッ トせよ。また緩衝液中酵素リガンド２００　ｐｌ、較正液２０μｌおよび緩衝液 ５０ｐｌを用いて総酵素活性チューブを調製し、他の試験管と同様に処理せよ。

（ｂ）　３０分間インキュベートせよ。

（Ｃ）　セファローズ抗Ｆａｂ５０７／　を加え、試験管をキャップし、抗体を 懸濁液中に保持するためゆるやかに絶えず転倒しながらさらに３０分間インキュ ベートせよ。

（ｄ）　キャップをしたま＼１００ＯＧで５分間ベンチ遠心機で遠心せよ。

（ｅ）　サンプルカップから直接上清をサンプリングすることによって遠心分析 機上で酵素含量を定量せよ。４０５　ｎｍにおいて５分間にわたる吸収の増加を 追従せよ。

（ｆ）　未知検体の２木の酵素割合の平均を計算し、各標準液または未知サンプ ルについて、以下のようにパーセント結合を計算セよＯ ％結合−１００−（１００Ｘ観察した酵素割合／総酵素割合）（ｇ）較正液の濃 度に対して％結合をプロットすることによシ、結合曲線を誘導せよ。

（ｂ）　曲線からテストサンプルの濃度を読み取れ。

このアッセイから得られる典型的な曲線が第３図に示され、そして緩衝液からＮ Ａ−ＡＮＳを省略した唯一の変更を行なって上の方法を実施することにより得ら れる曲線も示しである。ＮＡ−ＡＮＳの不存在下では、実用的な総血清チロキシ ン定量が達成されないことを理解すべきである。しかしながら、ＮＡ−ＡＮＳの 不存在下に見られるもつと低下した結合曲線は較正曲線に相当することが明らか であり、そしてこの曲線はＮＡ−ＡＮＳの使用により得られる総チロキシン定量 ではなく、血清中の遊離チロキシンの測定であることが確かである。

Ｂ、総トリョードチロニシアッ七イ 使用した緩衝液が０．０５Ｍホウ酸ｐ　Ｈ８，６であり、そしてトリョードチロ ニンおよびβ−ガラクトシダーゼトリョードチロニン誘導体に対して向けられた 適当なＦａｂフラグメントの使用を除いて、上に記載の方法に類似の方法を使用 して、トリョードチロニンのアッセイが同様に確立された。上と類似の態様で、 ＮＡ−ＡＮＳの存在および不存在下同様な結合曲線が観察された。

Ｃ−ａ清ジゴキシンアッセイ 血清ジゴキシンのアッセイはわれわれの以前の特許出願ＰＣＴ／ＡＵ８０１００ ０６５　に報告されている。このアッセイにＮＡ　−ＡＮ　Ｓを含めるとＮＡ− ＡＮＳの不存在下で観察された結果に比較して、アッセイの正確性および精度に 改良が得られることが判明した。

同様な態様で、前記特許出願に報告されたシランチンのアッセイに類似の態様に 仕組まれたテオフィリンの酵素イムノアッセイは、緩衝液にＮＡ−ＡＮＳを含め ることによって正確性と精度に関し改良された。

上の結果から、本発明はアイソトープイムノアッセイにおいてＡＮＳについて観 察される利益に類似の利益を非アイソトープイムノアッセイへ提供し、そしてそ れをアッセイに含めることにより、改良された簡単なそして速やがなアッセイを 許容することが明らかである。そのようなアッセイに有害なＡＮＳの化学的およ び物理的性質によるそのようなアッセイの以前の制限は、ＡＮＳ分子の変更によ って観察される変更された性質によってゆるめられた。

そのため、本発明はその範囲内に、抗原、ハプテンおよび低分子物質よりなる群 から選ばれた結合し得る物質と、前記結合し得る物質を特異的に結合し得るい抗 体および特異的結合タンパクよりなる群から選ばれたタンパクとの間の反応の成 分の測定方法であって、前記反応は反応成分として式１に規定する化合物をさら に含むＡとを特徴とし、前記化合物は反応系に存在する血清タンパクに結合し、 それにより前記結合し得る物質が前記血清タンパクへ結合するのを阻止し、そし てそれにより前記成分の測定方法の特異性を改良する前記方法を含んでいる。前 述の方法は均質でも不均質でもよい酵素イムノアッセイのような、非アイソトー プイムノアッセイに一層適用し得る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （式中Ｒエ　はＨまたは炭素数１ないし８の脂肪族基Ｎ　Ｒ２はＨまたはｃ（ｙ ）＝ｘで、ＸはＯまたはＳ、ＹはＨまたは炭素数１ないし８の脂肪族基、ｎは１ または２．ｍは１または２．Ａは強酸の陰イオンである。）の化合物。 ２、Ｒ１が炭素数１ないし４の低級アルキルである請求の範囲第１項の化合物。 ３、Ｒ□　がメチルまたはエチルである請求の範囲第２項の化合物。 ４、Ｒ□　がＨである請求の範囲第１項の化合物。 ５、ＸがＯであり、Ｙが炭素数１ないし４の低級アルキルである請求の範囲第１ 項ないし第４項のいずれかの化合物。 ６、Ｙがメチルまたはエチルである請求の範囲第５項の化合物。 ７、Ｙが水素であり、Ｘが０である請求の範囲第１項の化合物。 ８、Ｙがメチルであり、Ｘが０であり、Ｒ１がＨである請求の範囲第１項の化合 物。 ９、Ａが硫酸陰イオンであり、ｎが２、特許請求の範囲第１項の化合物。 １０、Ｎ−アセチル−８−アユリニラム−ナフタレン−１−スルホン酸硫酸塩。 （式中ＲはＣ１−Ｃ８アルキル、Ａは強酸の陰イオン、ｎは１または２．ｍは１ または２である。）の化合物を製造するため、強酸の存在下、ＡＮＳとＣ１−Ｃ ８ハロゲン化アルキルのような炭素数１ないし８のアルキル化剤とを反応させる ことを特徴とする前記化合物を製造する方法。 （式中ｎは１または２．ｍは１または２．Ａは強酸の陰イオンである。）の化合 物を製造するため、ＡＮＳと強酸とを反応させることを特徴とする前記化合物を 製造する方法。 １３、式 （式中ＲはＣ□−Ｃ，アルキル、Ｒ３はｃ（Ｙ、）＝ｘにして、ＹはＨまたはＣ １−Ｃ，アルキル、Ｘは０またはＳｓｎは１または２．ｍは１または２．Ａは強 酸の陰イオンである。）の化合物を製造するため、請求の範囲第１１項の方法に よって製造した化合物を最初塩基と反応させた後、炭素数１１ないし８を有する アシル化剤またはチオアシル化剤と反応させることを特徴とする前記化合物を製 造する方法。 （式中Ｒ３、ｎ、　ｍおよびＡは請求の範囲第１２項の定義に同じ。）の化合物 を製造するため、強酸の存在下、ＡＮＳと炭素数１ないし８のアシル化剤または チオアシル化剤とを反応させることを特徴とする前記化合物を製造する方法。 １５、抗原、ハプテンおよび低分子物質よりなる群から選ばれた結合し得る物質 と、前記結合し得る物質を特異的に結合し得る、抗体および特異的結合タンパク よりなる群から選ばれたタンパクとの間の反応の成分の測定方法であって、前記 反応は反応成分として、請求の範囲第１項に規定する化合物をさらに含み、前記 化合物は反応系に存在する血清タンパクに結合し、それによシ前記結合し得る物 質が前記血清タンパクへ結合するのを阻止し、そしてそれにより前記成分の測定 方法の特異性を改良することを特徴とする前記方法。 １６、前記化合物は、請求の範囲第１０項に規定する化合物である請求の範囲第 １５項の方法。 １７、ラジオイムノアッセイに用いられる請求の範囲第１５項または第１６項の 方法。 １８、均質および不均質非アイソトープイムノアッセイに用いられる請求の範囲 第１５項または第１６項の方法。 １９、均質および不均質酵素イムノアッセイに用いられる請求の範囲第１５項ま たは第１６項の方法。