JPS59176675A - 酵素免疫測定用試薬 - Google Patents
酵素免疫測定用試薬Info
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- JPS59176675A JPS59176675A JP5074083A JP5074083A JPS59176675A JP S59176675 A JPS59176675 A JP S59176675A JP 5074083 A JP5074083 A JP 5074083A JP 5074083 A JP5074083 A JP 5074083A JP S59176675 A JPS59176675 A JP S59176675A
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- antigen
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- enzyme
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/535—Production of labelled immunochemicals with enzyme label or co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or enzyme substrates
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は酵素免疫測定用試薬に関するものである。
酵素免疫測定法は、手技が簡単で信頼性および感度にも
優れるため、微量成分の測定にしばしば使用されている
。この方法は抗原または抗体に酵素等の標識剤を結合さ
せた標識複合体を使用するものであり、競合法と非競合
法に大別される。競合法にはさらに固相法、二抗体法そ
の他があり、非競合法にはさらに、サンドインチ法、エ
ンザイモメトリック法、酵素抗体法その他がある。これ
らのうち、代表例としてサンドイツチ法および固相法に
よる競合法を抗原の測定を例に説明すれば、次の通りで
ある。
優れるため、微量成分の測定にしばしば使用されている
。この方法は抗原または抗体に酵素等の標識剤を結合さ
せた標識複合体を使用するものであり、競合法と非競合
法に大別される。競合法にはさらに固相法、二抗体法そ
の他があり、非競合法にはさらに、サンドインチ法、エ
ンザイモメトリック法、酵素抗体法その他がある。これ
らのうち、代表例としてサンドイツチ法および固相法に
よる競合法を抗原の測定を例に説明すれば、次の通りで
ある。
サンドインチ法は、抗体を不活性な不溶性物質よりなる
固相に結合させて不溶化抗体とし、これに抗原を含む試
料を反応させて、試料中の濃度に応じて抗原を固相上の
抗体に結合せしめ、さらにこの抗原を挾むように酵素等
の標識剤で標識した抗・体を結合させて、結合した標識
聾［の搬から試料中の抗原量’ｋＡべろ方法である。
固相に結合させて不溶化抗体とし、これに抗原を含む試
料を反応させて、試料中の濃度に応じて抗原を固相上の
抗体に結合せしめ、さらにこの抗原を挾むように酵素等
の標識剤で標識した抗・体を結合させて、結合した標識
聾［の搬から試料中の抗原量’ｋＡべろ方法である。
固相法による競合法は、抗体を固相に結合させた不溶化
抗体に既知量の標線抗原と試料中の未知量の測定抗原と
を競合的に反応させ、不溶化抗体に結合した標識剤の量
を調べることによって、試料中の抗原量を調べる方法で
ある。
抗体に既知量の標線抗原と試料中の未知量の測定抗原と
を競合的に反応させ、不溶化抗体に結合した標識剤の量
を調べることによって、試料中の抗原量を調べる方法で
ある。
上言ピ競合法およびサンドインチ法において、抗原と抗
体を逆にすｆ′１．は抗体全測定することもできる。従
来このような測定に使用する。ために抗原量たは抗体と
酵素の結合物（以下、標識複合物という）全製造するに
は、ゲルタール、アルデヒド法あるいは過ヨウ素酸法（
Ｊ、 Ｈｉｓｔｏ−ｃｈｅｍ。
体を逆にすｆ′１．は抗体全測定することもできる。従
来このような測定に使用する。ために抗原量たは抗体と
酵素の結合物（以下、標識複合物という）全製造するに
は、ゲルタール、アルデヒド法あるいは過ヨウ素酸法（
Ｊ、 Ｈｉｓｔｏ−ｃｈｅｍ。
Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、、 ２２ 、１０８４−９１ （１
９７４））が行なわれている。しかしながら、これらの
方法を用いたときは、標識成分の酵素と非標識成分の抗
原又は抗体とが１＝１で結合した均一な標識複合物だけ
でなく、これらが不規則な組合せで結合した分子量の大
きい復金物も生じてしまう。そのため、貴重な酵素や抗
原、抗体当たりの標識複合物の収率が低下するはかりで
なく、得られた標識複合物は酵素免疫測定に使用した時
ブランク値（被測定物質が含まれない検体の測定値）を
高めて低濃度の物質の測定を不可能にするという問題が
あった。
９７４））が行なわれている。しかしながら、これらの
方法を用いたときは、標識成分の酵素と非標識成分の抗
原又は抗体とが１＝１で結合した均一な標識複合物だけ
でなく、これらが不規則な組合せで結合した分子量の大
きい復金物も生じてしまう。そのため、貴重な酵素や抗
原、抗体当たりの標識複合物の収率が低下するはかりで
なく、得られた標識複合物は酵素免疫測定に使用した時
ブランク値（被測定物質が含まれない検体の測定値）を
高めて低濃度の物質の測定を不可能にするという問題が
あった。
上記問題を解決するため、マレイミド系の化合物を用い
て抗原又は抗体に酵素を結合させる方法も試みられてい
る。例えば特公昭５５−６１９３号公報には、マレイミ
ド安息香酸スクシミドエステル（以下、ＭＢＳＥと略称
する）により、酵素と抗原とを結合させて製した酵素標
識抗原が開示されている。
て抗原又は抗体に酵素を結合させる方法も試みられてい
る。例えば特公昭５５−６１９３号公報には、マレイミ
ド安息香酸スクシミドエステル（以下、ＭＢＳＥと略称
する）により、酵素と抗原とを結合させて製した酵素標
識抗原が開示されている。
さらに特開昭５２−８５１６３号公報には、臨床検査薬
として有用なＮ−（４−カルボキシシクロヘキシルメチ
ル）マレイミドのヘーヒドロキシスクシミドエステル（
以下、ＨＣＨＭと略称する）が開示されている。
として有用なＮ−（４−カルボキシシクロヘキシルメチ
ル）マレイミドのヘーヒドロキシスクシミドエステル（
以下、ＨＣＨＭと略称する）が開示されている。
しかしながら、前者のＭＢＳＥは、蛋白質と反応し易い
中性付近での安定性に劣り、そのため酵素、抗原又は抗
体当たりの標ｖＪ１．複合物の収率を低下させる問題が
あり、後者のＨｅＨＭは安定性には優れるものの、溶解
性が悪く、溶媒に溶解したとき沈澱を生じ、そのためや
はり標識複合物の収率を低下させる問題があった。
中性付近での安定性に劣り、そのため酵素、抗原又は抗
体当たりの標ｖＪ１．複合物の収率を低下させる問題が
あり、後者のＨｅＨＭは安定性には優れるものの、溶解
性が悪く、溶媒に溶解したとき沈澱を生じ、そのためや
はり標識複合物の収率を低下させる問題があった。
本発明は、標識成分（酵素）と非標識成分（抗原又は抗
体）とを結合させるに当たり、従来と異なるマレイミド
化合物を用いることにより、従来より高収率で得られ、
高感度の測定を可能ならしめる酵素免疫測定用試薬を提
供するものである。
体）とを結合させるに当たり、従来と異なるマレイミド
化合物を用いることにより、従来より高収率で得られ、
高感度の測定を可能ならしめる酵素免疫測定用試薬を提
供するものである。
本発明の酵素免疫測定用試薬は、次式Ｉ：（式中ｎは３
ないし５の数ヲ表わす。）で表わされるＮ−（マレイミ
ドアルカノイルオキシ）スクシドに用いて抗原または抗
体に標識剤酵素を結合した標Ｒ複合体よりなることを特
徴とする。
ないし５の数ヲ表わす。）で表わされるＮ−（マレイミ
ドアルカノイルオキシ）スクシドに用いて抗原または抗
体に標識剤酵素を結合した標Ｒ複合体よりなることを特
徴とする。
式Ｉにおいてｎが３またＦｉ５の数を表わす化合物が好
ましい。ｎが３の数を表わすものは、Ｎ−（ε−マレイ
ミドヵグロイルオキシ）スクシミド（以下、ＭＣ８と略
称する）である。ｎが５の数を表わすものは、Ｎ−（γ
−マレイミドブチリルオキシ）スクシミド（以下、ＭＢ
ｕ８と略称する）である。
ましい。ｎが３の数を表わすものは、Ｎ−（ε−マレイ
ミドヵグロイルオキシ）スクシミド（以下、ＭＣ８と略
称する）である。ｎが５の数を表わすものは、Ｎ−（γ
−マレイミドブチリルオキシ）スクシミド（以下、ＭＢ
ｕ８と略称する）である。
式Ｉで表わされるマレイミド化合物を用いて酵素と抗体
全結合させるには、先ず第一工程で式Ｉで表わされるマ
レイミド化合物と酵素の−Ｎ）１２基を反応させて次式
： で表わされる結合物を得、次いで第二工程でこの結合物
＠−８Ｈ基を有する抗体と反応させて次式： で表わされる酵素標識抗体複合物を得る。以上の代わり
に第一工程で抗体＠−ＮＨ２基を介してマレイミド化合
物に結合させ、第二工程で一８Ｈ基を有する酵素を結合
させてもよい。また抗体の代わりに抗原を結合させれば
同様にして酵素標識抗原複合物が得られる。
全結合させるには、先ず第一工程で式Ｉで表わされるマ
レイミド化合物と酵素の−Ｎ）１２基を反応させて次式
： で表わされる結合物を得、次いで第二工程でこの結合物
＠−８Ｈ基を有する抗体と反応させて次式： で表わされる酵素標識抗体複合物を得る。以上の代わり
に第一工程で抗体＠−ＮＨ２基を介してマレイミド化合
物に結合させ、第二工程で一８Ｈ基を有する酵素を結合
させてもよい。また抗体の代わりに抗原を結合させれば
同様にして酵素標識抗原複合物が得られる。
このように本発明によれは、工程毎に異なる結合方式で
標識成分（酵素）と被標識成分（抗体又は抗原）をマレ
イミド化合物を介して結合させるので、好ましからぬ組
合せの複合物、例えは標識成分同士の複合物、被標識成
分同士の複合物あるいは両成分が不規則に結合した複合
物等が生ずることなく、抗体またに抗原と酵素が均一に
結合した測定感度の優れた試薬を得ることが可能である
。本発明の酵素免疫測定用試薬の感度は、従来の過ヨウ
素酸法で慴られる試薬に比べて数十倍優れている。
標識成分（酵素）と被標識成分（抗体又は抗原）をマレ
イミド化合物を介して結合させるので、好ましからぬ組
合せの複合物、例えは標識成分同士の複合物、被標識成
分同士の複合物あるいは両成分が不規則に結合した複合
物等が生ずることなく、抗体またに抗原と酵素が均一に
結合した測定感度の優れた試薬を得ることが可能である
。本発明の酵素免疫測定用試薬の感度は、従来の過ヨウ
素酸法で慴られる試薬に比べて数十倍優れている。
前記第二工程で、抗原、抗体又は酵素が有する一８Ｈ基
とは、これらの分子中に初めから存在する基でもよく、
後から導入した基でもよい。
とは、これらの分子中に初めから存在する基でもよく、
後から導入した基でもよい。
−８Ｈ基を導入するには、例えば分子中のＳ−８結合を
還元してもよく、あるいはＳ−アセチルメルカプトスク
シニックアンハイドライド、メチル−４−メルカプトブ
チリルイミデート等の試薬を反応させてもよい。
還元してもよく、あるいはＳ−アセチルメルカプトスク
シニックアンハイドライド、メチル−４−メルカプトブ
チリルイミデート等の試薬を反応させてもよい。
第一工程の反応は次のようにして行なう。標識成分およ
び非標識成分の一方１ｐ）１５〜９、好ましくはｐＨ６
〜８の適当な緩衝液に溶解し、この溶液にアセトン、ジ
メチルＩホルムアミド、ジオキサン等の有機溶媒に溶か
した結合剤（ＭＣ８まｆＣはＭＨｕＳ）を適量滴下する
。標識成分、非標ｌｉ＆成分、結合剤の使用濃度は実質
的に任意である。この混合液を反応成分が実質的に安定
、な温度、好ましくは１０℃〜３０’Ｃで１ｏ分〜２時
間反応させ、ゲル濾過その他の分離手段で結合剤との結
合成分を回収し、必要であれば濃縮する。
び非標識成分の一方１ｐ）１５〜９、好ましくはｐＨ６
〜８の適当な緩衝液に溶解し、この溶液にアセトン、ジ
メチルＩホルムアミド、ジオキサン等の有機溶媒に溶か
した結合剤（ＭＣ８まｆＣはＭＨｕＳ）を適量滴下する
。標識成分、非標ｌｉ＆成分、結合剤の使用濃度は実質
的に任意である。この混合液を反応成分が実質的に安定
、な温度、好ましくは１０℃〜３０’Ｃで１ｏ分〜２時
間反応させ、ゲル濾過その他の分離手段で結合剤との結
合成分を回収し、必要であれば濃縮する。
第二工程の反応は次のように行なう。第一工程で結合さ
せた残りの結合成分を前記同様の緩衝液に溶解し、この
液に第一工程で回収した結合成分を徐々に加える。この
混・合液を５〜３０℃好ましくは１０℃以下の温度で２
０時間反応させ、ゲル濾過その他の分離手段で標識複合
物を分離回収する。
せた残りの結合成分を前記同様の緩衝液に溶解し、この
液に第一工程で回収した結合成分を徐々に加える。この
混・合液を５〜３０℃好ましくは１０℃以下の温度で２
０時間反応させ、ゲル濾過その他の分離手段で標識複合
物を分離回収する。
次に試験例および実施例に基ついて本発明をさらに詳し
く説明する。
く説明する。
試験例１．安定性の比較
式Ｉで表わされる本発明に係るマレイミド化合物ＭＣ８
およびＭＢｕＳと、従来のマレイミド化合物ＭＨ８Ｅと
の中性ｐＨ付近での安定性を比較した。
およびＭＢｕＳと、従来のマレイミド化合物ＭＨ８Ｅと
の中性ｐＨ付近での安定性を比較した。
三種のマレイミドに０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，
０，７，０，８，０）中に溶解し、室温で１時間放置し
て分解の程度をマレイミド定量によって測定した。マレ
イミド定量は次のように行なった。
０，７，０，８，０）中に溶解し、室温で１時間放置し
て分解の程度をマレイミド定量によって測定した。マレ
イミド定量は次のように行なった。
試料中にβ−メルカプトエタノール溶液ｏ、２−（２０
０ｎＭ）ｆ：加、ｔＯ，０２ＭＥＤＴＡを含む０．２Ｍ
トリス−塩ｒＲ緩衝液（ｐＨ８，２）を加えて最終容量
を２．２−とする。十分量攪拌後、０．０１Ｍジチオビ
ス（２−ニトロ安息香酸）０．２ｄｔ加λて未 １反
応チオール基と反応させ、生成する物質の吸光度（４１
２ｎｍ ）を測定し、標準物質の吸光度と比較して定量
する。
０ｎＭ）ｆ：加、ｔＯ，０２ＭＥＤＴＡを含む０．２Ｍ
トリス−塩ｒＲ緩衝液（ｐＨ８，２）を加えて最終容量
を２．２−とする。十分量攪拌後、０．０１Ｍジチオビ
ス（２−ニトロ安息香酸）０．２ｄｔ加λて未 １反
応チオール基と反応させ、生成する物質の吸光度（４１
２ｎｍ ）を測定し、標準物質の吸光度と比較して定量
する。
結果を第１表に示す。
第１表
上記第１表から明らかな通り、本発明で使用するＭＣ８
およびＭＢｕＳはいずれも室温で１時間以上安定である
のに対し、従来使用されていたＭＢＳＥは安定性が低か
った。
およびＭＢｕＳはいずれも室温で１時間以上安定である
のに対し、従来使用されていたＭＢＳＥは安定性が低か
った。
・同様に温度を４℃、２５℃（室温）および３７℃にし
て安定性を比較したところ、ＭＣ８およびＭＢｕＳの安
定性はＭＢＳＥよりはるかに良好であった。
て安定性を比較したところ、ＭＣ８およびＭＢｕＳの安
定性はＭＢＳＥよりはるかに良好であった。
試験例２ 複合体収率の比較
三種のマレイミド化合物ＭＣ８（本発明）、ＭＢｕＳ（
本発明） およＵＨｃＨＭ（従来）を結合剤として、後
記実施例の方法に従いペルオキシダーゼを抗ＡＦＰ抗体
と結合させ、ウルトロゲル（ｕｌｔｒｏｇｅｌ ） Ａ
ｃＡ−４４でゲル濾過して回収したときの、ペルオキシ
ダーゼ−抗Ａｌｌ’Ｐ抗体複合物の回収率を比較した。
本発明） およＵＨｃＨＭ（従来）を結合剤として、後
記実施例の方法に従いペルオキシダーゼを抗ＡＦＰ抗体
と結合させ、ウルトロゲル（ｕｌｔｒｏｇｅｌ ） Ａ
ｃＡ−４４でゲル濾過して回収したときの、ペルオキシ
ダーゼ−抗Ａｌｌ’Ｐ抗体複合物の回収率を比較した。
同時に過ヨウ素醸法による複合物についても比較した。
反応Ｇで使用した蛋白質光たりの複合物の収率を第２表
に丞−「。
に丞−「。
第２表
第２表に示した通り、ＨＣＨＭでは複合物の収率が３５
チと著しく劣っていた。こｔは、）４ＣＪ（Ｍを少量の
有機溶媒に溶かしてからベルキシダーゼ溶液中に滴下す
ると、大量のマレイミド化合物が析出してしまい、利用
されないままインキュベニイト後に、遠心して取り除が
ねばならないためと思われる。なお、この問題はＭＢＳ
Ｅでも認められた。
チと著しく劣っていた。こｔは、）４ＣＪ（Ｍを少量の
有機溶媒に溶かしてからベルキシダーゼ溶液中に滴下す
ると、大量のマレイミド化合物が析出してしまい、利用
されないままインキュベニイト後に、遠心して取り除が
ねばならないためと思われる。なお、この問題はＭＢＳ
Ｅでも認められた。
これに対して、本発明に係るマレイミド化合物ＭＣ８，
ＭＢｕＳではこのような析出物が殆んどなく、従って複
合物の収率も７０係り上で良好であった。
ＭＢｕＳではこのような析出物が殆んどなく、従って複
合物の収率も７０係り上で良好であった。
次に、これら複合物のゲル濾過パターンを第１図ないし
第４図に示す。第１図は結合剤としテＨＣＨＭ １に％
第２図はＭＣ８２、第３図はＭＢｕＳを、そして第４図
は、過ヨウ素酸を使用した場合の複合物のゲル濾過パタ
ーンである。各図において、Ａは目的とするパーオキシ
ダーゼ−抗ＡＦＰ抗体の均−複合物のピークを表わし、
Ｂは未結合で残存するパーオキシダーゼ及び抗ＡＦＰ抗
体の混合物のピークを表わし、Ａはパーオキシダーゼと
抗ＡＦＰ抗体とが不規則に結合し次、重合度の大きい複
合物を表わす。第２（２）及び第３図の本発明のＭＣ８
およびＭＢｕＳによる複合物では均一複合物のピークＡ
が大きいのに対し、第１図の）１０）−ＩＭによる複合
物では未結合残存物質によるビ〜りＢが太きく、逆に均
−複合物の生成量（ピークＡ）が低いことが判る。さら
に第３図に示す過ヨウ素酸法による複合物では、重合度
の大きい複合物のピークＡのみが認められる。
第４図に示す。第１図は結合剤としテＨＣＨＭ １に％
第２図はＭＣ８２、第３図はＭＢｕＳを、そして第４図
は、過ヨウ素酸を使用した場合の複合物のゲル濾過パタ
ーンである。各図において、Ａは目的とするパーオキシ
ダーゼ−抗ＡＦＰ抗体の均−複合物のピークを表わし、
Ｂは未結合で残存するパーオキシダーゼ及び抗ＡＦＰ抗
体の混合物のピークを表わし、Ａはパーオキシダーゼと
抗ＡＦＰ抗体とが不規則に結合し次、重合度の大きい複
合物を表わす。第２（２）及び第３図の本発明のＭＣ８
およびＭＢｕＳによる複合物では均一複合物のピークＡ
が大きいのに対し、第１図の）１０）−ＩＭによる複合
物では未結合残存物質によるビ〜りＢが太きく、逆に均
−複合物の生成量（ピークＡ）が低いことが判る。さら
に第３図に示す過ヨウ素酸法による複合物では、重合度
の大きい複合物のピークＡのみが認められる。
本発明の試薬をサンドイツチ法に使用して、α−フェト
プロティン（ＡＦＰ）の測定全行なっ建。
プロティン（ＡＦＰ）の測定全行なっ建。
Ａ）酵素免疫測定用試薬の調製
西洋ワサビパーオキシダーゼ（東洋紡製）１．５００単
位ｋｏ、ＩＭす７１９緩衝液（ｐＨ７，０） １ｍ Ｋ
溶解し、この溶液に少量の有機溶媒に溶がしたＭＣ８又
はＭＢｕＳ適量を滴下した。室温で１時間インキュベニ
イトした後、セファデックス（５ｅｐｈａｄｅｘ ）
Ｇ −２５Ｔニゲル（濾過し、マレイミド化合物とペル
オキシダーゼの結合物のフラジ”３７を集めて濃縮し次
（ペルオキシダーゼ１．０００単位／−）。
位ｋｏ、ＩＭす７１９緩衝液（ｐＨ７，０） １ｍ Ｋ
溶解し、この溶液に少量の有機溶媒に溶がしたＭＣ８又
はＭＢｕＳ適量を滴下した。室温で１時間インキュベニ
イトした後、セファデックス（５ｅｐｈａｄｅｘ ）
Ｇ −２５Ｔニゲル（濾過し、マレイミド化合物とペル
オキシダーゼの結合物のフラジ”３７を集めて濃縮し次
（ペルオキシダーゼ１．０００単位／−）。
これとは別に、抗ＡＦＰ家兎抗体のＩｇＧ成分をペプシ
ンで３７℃にて１６時間消化した後、β−メルカプトエ
タノールで還元して得らｔｌ［Ｆａ ｂ’ ｔ７）溶液
（１０”ｊ’／ｄ ） ０．３−中’、Ｆｊｔｌ Ｈｅ
、 濃縮ペルオキシダーゼ結合物０．７ｄ−ｉ滴下した
。４℃で２０時間インキュベニイト後、反応液金つルト
ロゲルＡＣＡ４４により０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ６，
５でゲル濾過し、ペルオキシダーゼ標識・抗ＡＦＰ抗体
複合物（本発明の試薬）ｆ：得た。
ンで３７℃にて１６時間消化した後、β−メルカプトエ
タノールで還元して得らｔｌ［Ｆａ ｂ’ ｔ７）溶液
（１０”ｊ’／ｄ ） ０．３−中’、Ｆｊｔｌ Ｈｅ
、 濃縮ペルオキシダーゼ結合物０．７ｄ−ｉ滴下した
。４℃で２０時間インキュベニイト後、反応液金つルト
ロゲルＡＣＡ４４により０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ６，
５でゲル濾過し、ペルオキシダーゼ標識・抗ＡＦＰ抗体
複合物（本発明の試薬）ｆ：得た。
比較のため従来の過ヨウ素酸法（Ｊ、 Ｈｉ ｓ’ｔｏ
ｃｈｅｍ。
ｃｈｅｍ。
Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、、 ２２．１０８４−９１ （１９
７４）によるペルオキシダーゼ標識・抗ＡＦＰ抗体（従
来の試薬）も作製した。
７４）によるペルオキシダーゼ標識・抗ＡＦＰ抗体（従
来の試薬）も作製した。
Ｂ）サンドイツチ法にょるＡＦＰの測定１チＢＳＡ含有
０．ＯＩＭＩＪン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７，２）を０
．３−づつ試験管に分注し、これに標準ＡＦＰ抗原溶液
または試料溶液全２ｏμを加えた。次に、抗ＡＦＰ抗体
を感作したポリスチレンボールを加え、３７℃で１時間
撮とつしながらインキュベニイトし７ｔ。
０．ＯＩＭＩＪン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７，２）を０
．３−づつ試験管に分注し、これに標準ＡＦＰ抗原溶液
または試料溶液全２ｏμを加えた。次に、抗ＡＦＰ抗体
を感作したポリスチレンボールを加え、３７℃で１時間
撮とつしながらインキュベニイトし７ｔ。
インキュベニイト後、生理食塩水２ｒｎ１．うつでポリ
スチレンボールを３回洗浄し、洗浄液全吸引除去して、
前記Ａ）で作成した酵素免疫測定用試薬の溶液を０．３
ｒｎｌ、加ヌた。混合物を３７℃で１時間振とうしな
がらインキュベニイトした。
スチレンボールを３回洗浄し、洗浄液全吸引除去して、
前記Ａ）で作成した酵素免疫測定用試薬の溶液を０．３
ｒｎｌ、加ヌた。混合物を３７℃で１時間振とうしな
がらインキュベニイトした。
インキュベニイト後、生理食塩水２ ｍ７！づつでポリ
スチレンボールを３回洗浄し、洗浄液を吸引除去して、
予めペルオキシダーゼ発色基質溶液（Ｏ−フェニレンジ
アミン−過酸化水素）を０．５−分注しておいた別の試
験管にポリスチレンボールを移し変え、３７℃で３０分
間振とうしながらインキュベニイトした。その後停止剤
として１．５Ｎ硫酸３−を加えて反応を停止し次。
スチレンボールを３回洗浄し、洗浄液を吸引除去して、
予めペルオキシダーゼ発色基質溶液（Ｏ−フェニレンジ
アミン−過酸化水素）を０．５−分注しておいた別の試
験管にポリスチレンボールを移し変え、３７℃で３０分
間振とうしながらインキュベニイトした。その後停止剤
として１．５Ｎ硫酸３−を加えて反応を停止し次。
ＡＦＰ＝２含まない試薬ブランクを対照として４ｇ２ｎ
ｍ で吸光度を測定し７た。なお一連の操作は同一順序
、同一時間間隔で行なった。第３表に標＠ＡＦＰ抗原稀
釈液について得られた吸光度の測定結果を、本発明の試
薬を用いた場合と、従来の過ヨウ素酸法で得られた試薬
を用いた場合を比較して示す。−１ｆｃ、第５図に第３
表の標準曲線を示す。
ｍ で吸光度を測定し７た。なお一連の操作は同一順序
、同一時間間隔で行なった。第３表に標＠ＡＦＰ抗原稀
釈液について得られた吸光度の測定結果を、本発明の試
薬を用いた場合と、従来の過ヨウ素酸法で得られた試薬
を用いた場合を比較して示す。−１ｆｃ、第５図に第３
表の標準曲線を示す。
上記第３表および第５図から明らかな通り、ｉｖ ｅ
ｓ又はＭＨｕＳで得られた本発明の酵素免疫測定用試薬
は、非常に低いブランク値を与え、測定系において固相
（ポリスチレンボール）への非特異的吸着の少ない事が
判る。
ｓ又はＭＨｕＳで得られた本発明の酵素免疫測定用試薬
は、非常に低いブランク値を与え、測定系において固相
（ポリスチレンボール）への非特異的吸着の少ない事が
判る。
以上説明し次通り、式Ｉで表わされるマレイミド化合物
により得られた本発明の酵素免疫測定用試薬は、酵素免
疫測定に使用したとき固相への非特異的吸着が少なく、
そのため測定のブランク値を下げて測定感＃全向上せし
める優れた試薬である。
により得られた本発明の酵素免疫測定用試薬は、酵素免
疫測定に使用したとき固相への非特異的吸着が少なく、
そのため測定のブランク値を下げて測定感＃全向上せし
める優れた試薬である。
また、本発明の試薬は高収率で製造しうる利点も有する
。本発明の試薬は、酵素等の標識成分と抗体又は抗原等
の被標識成分とを、一方はアミノ基により、他方はチオ
ール基により式Ｉで表わされる非常に安定なマレイミド
化合物を介して選・択的に結合して製造するものである
から、均一性の良好な試薬が高収率で得られるのである
。
。本発明の試薬は、酵素等の標識成分と抗体又は抗原等
の被標識成分とを、一方はアミノ基により、他方はチオ
ール基により式Ｉで表わされる非常に安定なマレイミド
化合物を介して選・択的に結合して製造するものである
から、均一性の良好な試薬が高収率で得られるのである
。
なお、本発明で慣用する式Ｉで表わされるマレイミド化
合物は、ペルオキシダーゼ等の酵素だけでなく、一般の
蛋白質を含めてアミノ基を有する任意の物質とチオール
基を有する物質を選択的に結合するために使用しうろこ
とはいうまでもない。
合物は、ペルオキシダーゼ等の酵素だけでなく、一般の
蛋白質を含めてアミノ基を有する任意の物質とチオール
基を有する物質を選択的に結合するために使用しうろこ
とはいうまでもない。
第１図ないし第４図は夫々ＨＣＨＭ、ＭＣ８゜ＭＢｕＳ
および過ヨウ素酸全使用して得られた標識複合物のゲ
ル濾過パターンを表わすグラフであり、 第５図は実施例のＡ Ｆ Ｐ測定の標準的ｉを表わすグ
ラフである。 特許出願人 栄研化学株式会社 （ほか１名） 才１ 図 才３ 図 ワラ２シヨ゛ノ番号 才２図 フラクソ３ノ番号 フラク２ノ、ノ番号 ２゛発明０名相２酵素免疫測定用試薬 ３．補正する者 事イ′１との関係 特許出願人 ５ 補正１欲令のＨ付 ７、補正の内容 （１） 明細書第５頁下から２行の「３」を「５」と
補正する。 （２） 同第６頁第２行の「５」を「３」と補正する
。
および過ヨウ素酸全使用して得られた標識複合物のゲ
ル濾過パターンを表わすグラフであり、 第５図は実施例のＡ Ｆ Ｐ測定の標準的ｉを表わすグ
ラフである。 特許出願人 栄研化学株式会社 （ほか１名） 才１ 図 才３ 図 ワラ２シヨ゛ノ番号 才２図 フラクソ３ノ番号 フラク２ノ、ノ番号 ２゛発明０名相２酵素免疫測定用試薬 ３．補正する者 事イ′１との関係 特許出願人 ５ 補正１欲令のＨ付 ７、補正の内容 （１） 明細書第５頁下から２行の「３」を「５」と
補正する。 （２） 同第６頁第２行の「５」を「３」と補正する
。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 次式■： （式中ｎは３ないし５の数ケ表わす。）で表わされるＮ
−、（マレイミドアルカノイルオキシ）スクシミドを
用いて抗原または抗体に標識剤酵素を結合してなる酵素
免疫測定用試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5074083A JPS59176675A (ja) | 1983-03-26 | 1983-03-26 | 酵素免疫測定用試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5074083A JPS59176675A (ja) | 1983-03-26 | 1983-03-26 | 酵素免疫測定用試薬 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59176675A true JPS59176675A (ja) | 1984-10-06 |
Family
ID=12867232
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5074083A Pending JPS59176675A (ja) | 1983-03-26 | 1983-03-26 | 酵素免疫測定用試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59176675A (ja) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62132172A (ja) * | 1985-12-04 | 1987-06-15 | Shionogi & Co Ltd | 固相化抗体およびその製造方法 |
| JPS62211557A (ja) * | 1986-03-13 | 1987-09-17 | Res Dev Corp Of Japan | 病原細菌が産生する毒素の簡易迅速かつ高感度検査法 |
| JPS6345561A (ja) * | 1986-07-24 | 1988-02-26 | マイルス・インコーポレーテッド | ポリアルキレングリコール架橋基を有する酵素標識抗体試薬 |
| EP0314127A2 (en) * | 1987-10-30 | 1989-05-03 | Abbott Laboratories | Heterobifunctional coupling agents |
| JPH02183164A (ja) * | 1989-01-09 | 1990-07-17 | Teijin Ltd | 多標識抗体 |
| US11458222B2 (en) | 2016-09-30 | 2022-10-04 | Enviroscent, Inc. | Articles formed of pulp base materials with modulated scent release |
| US11498095B2 (en) | 2014-09-29 | 2022-11-15 | Enviroscent, Inc. | Coating providing modulated release of volatile compositions |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5990054A (ja) * | 1982-11-15 | 1984-05-24 | Takeda Chem Ind Ltd | ヒト絨毛性ゴナドトロピンの免疫化学的測定法および試薬 |
-
1983
- 1983-03-26 JP JP5074083A patent/JPS59176675A/ja active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5990054A (ja) * | 1982-11-15 | 1984-05-24 | Takeda Chem Ind Ltd | ヒト絨毛性ゴナドトロピンの免疫化学的測定法および試薬 |
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62132172A (ja) * | 1985-12-04 | 1987-06-15 | Shionogi & Co Ltd | 固相化抗体およびその製造方法 |
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| JPS6345561A (ja) * | 1986-07-24 | 1988-02-26 | マイルス・インコーポレーテッド | ポリアルキレングリコール架橋基を有する酵素標識抗体試薬 |
| JPH0535990B2 (ja) * | 1986-07-24 | 1993-05-27 | Miles Inc | |
| EP0314127A2 (en) * | 1987-10-30 | 1989-05-03 | Abbott Laboratories | Heterobifunctional coupling agents |
| EP0314127A3 (en) * | 1987-10-30 | 1990-10-31 | Abbott Laboratories | Heterobifunctional coupling agents |
| JPH02183164A (ja) * | 1989-01-09 | 1990-07-17 | Teijin Ltd | 多標識抗体 |
| US11498095B2 (en) | 2014-09-29 | 2022-11-15 | Enviroscent, Inc. | Coating providing modulated release of volatile compositions |
| US11458222B2 (en) | 2016-09-30 | 2022-10-04 | Enviroscent, Inc. | Articles formed of pulp base materials with modulated scent release |
| US11931487B2 (en) | 2016-09-30 | 2024-03-19 | Enviroscent, Inc. | Articles formed of pulp base materials with modulated scent release |
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