JP3342749B2 - 糖化蛋白の測定方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は糖化蛋白の測定方法に関
する。更に詳しくは、例えば糖尿病の診断マーカーとし
て有用な糖化蛋白を測定する方法に関するものであり、
臨床検査分野等で利用される測定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術・発明が解決しようとする課題】血液中の
蛋白成分であるアルブミンや赤血球中のヘモグロビンは
グルコースと非酵素的に反応して糖化され、糖化蛋白と
なることが知られている。この糖化を受ける蛋白の量
は、その蛋白が生体中に存在していた期間の体内のグル
コース量に比例しているため、体内の蛋白中の糖化蛋白
量を測定することは、糖尿病の診断等の臨床検査分野に
おいて有用である。

【０００３】このような糖化蛋白量を測定するマーカー
としては、例えば、ヘモグロビンＡｌｃ（ＨｂＡｌ
ｃ）、フルクトサミン等が挙げられる。ＨｂＡｌｃは、
ヘモグロビンのβサブユニットのＮ末端アミノ酸にグル
コースが結合したもので、臨床検査において用いられる
マーカーの一つである。ＨｂＡｌｃを用いる糖化蛋白量
の測定は、充填剤としてイオン交換樹脂を使用した専用
の高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）によりおこなわ
れる（例えば、特開昭６３−２９８０６３号公報）。こ
の測定法によるＨｂＡｌｃ値は総ヘモグロビン量に対す
るＨｂＡｌｃ量の相対パーセントで示されるため、測定
値が被検試料中に含まれるヘモグロビン量の影響を受け
ないという特徴があるものの、異常ヘモグロビン（例え
ばＨｂＳ）の影響を受けることがあるという問題があ
る。

【０００４】また、フルクトサミンをマーカーとして用
いる測定法は、糖化蛋白の還元性を利用した比色法であ
り、生化学検査用の自動測定機を用いて血漿又は血清中
に含まれている糖化蛋白量を測定する方法である。この
測定法によると、糖化蛋白量の絶対量としてフルクトサ
ミンの測定値が示されるので、測定量が試料中に含まれ
ている蛋白量の影響を受けるという問題がある。

【０００５】また、他の測定法として、ボロン酸アフィ
ニティー法を利用するＨＰＬＣを用いた糖化蛋白の測定
法が知られている。ボロン酸アフィニティー法は、ボロ
ン酸が弱アルカリ条件下でシス・ジオール基を持つ物質
と可逆的な結合体を作ることを利用した方法であり、例
えば、クロマトグラフィー用の充填剤としてアミノフェ
ニルボロン酸をセルロースやポリアクリルアミド樹脂に
結合させた例が報告されている。ボロン酸は弱アルカリ
の条件下でボロン酸陰イオンとなり、シス・ジオール基
を持つ物質と安定な結合体を形成する。この結合体は可
逆的でｐＨを酸性側にすることにより解離する。この性
質を利用して充填剤としてボロン酸を使用することによ
って、シス・ジオール基を持つ物質の充填剤への吸着、
脱着をｐＨの変化だけでコントロールすることができ
る。

【０００６】ボロン酸アフィニティー法を利用するＨＰ
ＬＣを用いる糖化アルブミンの測定について、その専用
測定機は未だ普及していないものの、特開平２−９６６
５７号公報によると、この測定法による糖化アルブミン
値は、血漿又は血清試料中に含まれているアルブミンの
うち、糖化されたアルブミン量の総アルブミン量に対す
る相対パーセントで示される旨が記載されている。従っ
て、フルクトサミンをマーカーとする測定法等で問題に
なっている試料中の蛋白量変動による測定値への影響が
ないことから、糖尿病の診断等の臨床検査分野において
非常に有用であると考えられる。

【０００７】即ち、ボロン酸アフィニティー法を利用し
た、上記のＨＰＬＣによる糖化アルブミンの測定法とし
て同公報には、第１カラムで試料中のアルブミンと他の
蛋白を分離した後、アルブミンのみを第２カラム（ボロ
ン酸アフィニティーカラム）に導き糖化アルブミンと非
糖化アルブミンに分離する方法が記載されている。ま
た、その他のＨＰＬＣによる糖化アルブミンの測定法と
して、臨床化学、第２０巻補冊２号（１９９１年）中の
３４ｂ頁及び３５ｂ頁では試料をボロン酸アフィニティ
ーカラムにより糖化成分と非糖化成分に分離した後、ア
ルブミンのみと特異的に結合する色素（ブロムクレゾー
ルパープル）を用いて、ポストカラム法によりアルブミ
ンを検出する方法が記載されている。

【０００８】また、他の測定法として、糖化蛋白に対す
る特異的抗体を用いて糖化蛋白を検出して測定に用いる
方法が開発されており、ＥＬＩＳＡ法による糖化アルブ
ミンの測定キットがアメリカのＥＸＯＣＥＬＬ，ＩＮ
Ｃ．社からＧＹＬＣＡＢＥＮの商品名で販売されてい
る。ここでいうＥＬＩＳＡ法とは、固相化抗ヒト糖化ア
ルブミンモノクローナル抗体と酵素標識抗ヒトアルブミ
ンポリクローナル抗体とのサンドイッチ法である。この
キットでは、試料中の糖化アルブミン量をＥＬＩＳＡ法
で、総アルブミン量をＢＣＧ（ブロムクレゾールグリー
ン）法で別々に測定し、測定値を総アルブミン量に対す
る糖化アルブミン量の比（パーセント）で表すようにな
っている。

【０００９】しかしながら、前記ＨＰＬＣ法による測定
は１検体当たりの測定時間が長いため、同時に多数検体
の測定ができないという問題がある。また、前記ＥＬＩ
ＳＡ法による測定キットを用いた測定では、総アルブミ
ン量に対する糖化アルブミン量の存在比を測定するため
には、糖化アルブミン量と総アルブミン量を別々に測定
する必要があるので、非常に手間のかかるものである。
また、前記ＥＬＩＳＡ法による測定キットを用いた測定
では、固相化抗ヒト糖化アルブミン抗体としてアルブミ
ンの糖化部位を認識するモノクローナル抗体を使用して
いるが、ヒトアルブミンは４カ所の糖化を受ける部位が
あるため、１種のモノクローナル抗体だけでは糖化アル
ブミン量を正確に測定することはできないという欠点を
有している。このように糖化アルブミンに対するモノク
ローナル抗体を利用した糖化アルブミンの測定は、抗原
−抗体反応を利用するので特異性に優れているものの、
全ての糖化アルブミンを認識できる抗体を作成すること
は困難であるという問題がある。

【００１０】また、別の免疫学的な測定法として、特開
昭６２−１００６６０号公報には、糖化蛋白を特異的に
吸着するフェニルボロン酸などの基質特異性／親和性の
吸着体を結合させた固相とある特定の蛋白にのみ特異的
親和性を有する標識化抗体を用いる方法により、ある特
定糖化蛋白のみを特異的に測定する方法が記載されてい
る。この方法は、ある特定糖化蛋白の存在量を特異的に
測定できる点で優れた方法であるが、フェニルボロン酸
に結合するのは種々の糖化蛋白であるため、臨床的に意
義のある特定蛋白の糖化割合を測定するためには特定蛋
白の総量を別に測定することが必須であるという問題が
ある。

【００１１】また、別の免疫学的な測定法として、特開
平４−１３０２７４号公報には、糖蛋白の糖類と特異的
に結合するレクチンをプラスチック製の固相の表面に不
溶化し、それに生体試料を反応させた後、同じ糖類と特
異的に結合する標識化したレクチンを加えて糖蛋白分子
をレクチン−レクチンサンドイッチとし、基質を加えて
その呈色度により判定する方法が記載されている。レク
チン−レクチンの組合わせでは糖に対しては補足するこ
とができるが、特定蛋白を測定する方法には好適ではな
いという問題がある。

【００１２】また、別の免疫学的な測定法として、特開
平５−８７８０９号公報には、ヒト血清アルブミンを含
む試料に、抗ヒト血清アルブミン抗体を固定化した担体
を加え、該担体を分離し、該分離した担体にペルオキシ
ダーゼ標識化フェニルボロン酸誘導体溶液を接触させる
技術が記載されているが、この方法は抗アルブミン抗体
とＯＰＤで標識化したボロン酸誘導体を用いたＥＩＡ法
であり、ＥＩＡ法は操作が煩雑であり、個人による手技
が測定系に与える影響が大きい。

【００１３】また、ボロン酸を用いた測定系では、ボロ
ン酸誘導体と反応をさせる際にｐＨをアルカリにする必
要があるので、測定対象物質によってはアルカリ側のｐ
Ｈにした際に失活等を起こす可能性があるという問題が
ある。

【００１４】また、別の免疫学的な測定法として、特開
昭６４−１６９６４号公報には、特定蛋白に対する抗体
を担体上に固定化した固相化抗体と被検液とを反応させ
た後、固相上の遊離の糖を除去し、還元剤を用いて糖化
蛋白の糖化部分を還元型に還元し、該還元反応時又は還
元反応後、標識化抗還元型糖化蛋白抗体を反応させ、固
相と液相を分離し、いずれかの相の標識量を測定し、そ
の測定値から特定糖化蛋白含量を測定する方法が記載さ
れている。この方法は、被検液として固相上に固定化し
た既定量の抗体のすべてに特定蛋白が結合しうる濃度以
上で特定蛋白を含有しうるものを用いることにより、同
一の固相化抗体に結合する特定蛋白量は常に一定となる
ため、特定蛋白の総量を測定する手間を省くことができ
るという点で優れた方法であるが、還元工程が必要であ
るので操作が複雑化すること、抗還元型糖化蛋白抗体が
必要であるがロット間差のない抗体の作成が容易でない
ことなどの問題がある。

【００１５】従って、本発明の目的は糖化蛋白の測定方
法であって、糖化蛋白の存在比を簡易に測定することの
できる方法を提供することにある。

【００１６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記課題
を解決するために鋭意検討した結果、本発明に到達し
た。即ち、本発明の要旨は、測定対象となる糖化蛋白の
蛋白部分に対して特異的結合能を有する固相化抗体及び
標識化合物を用いたサンドイッチ法により特定の糖化蛋
白を測定する方法であって、前記標識化合物が酵素標識
レクチンであるところにある。その具体的な態様として
は、次のような態様がある。

【００１７】（１）以下の工程を有する糖化蛋白の測定
方法、 測定対象となる糖化蛋白の蛋白部分に対して特異的
結合能を有する固相化抗体と試料中の糖化蛋白を反応さ
せて、固相化抗体−糖化蛋白複合物を形成させる工程、 酵素標識レクチンと前記固相化抗体−糖化蛋白複合
物を反応させて、固相上に前記固相化抗体−糖化蛋白を
介して前記酵素標識レクチンを結合させる工程、及び 洗浄後、固相上の酵素活性を測定する工程、 （２）前記（１）記載の工程と工程の間に洗浄工程
をさらに有する糖化蛋白の測定方法、 （３）以下の工程を有する糖化蛋白の測定方法、 酵素標識レクチンと試料中の糖化蛋白を反応させ
て、酵素標識レクチン−糖化蛋白複合物を形成させる工
程、 測定対象となる糖化蛋白の蛋白部分に対して特異的
結合能を有する固相化抗体と前記酵素標識レクチン−糖
化蛋白複合物を反応させて、固相上に前記固相化抗体−
糖化蛋白を介して前記酵素標識レクチンを結合させる工
程、及び 洗浄後、固相上の酵素活性を測定する工程、 （４）測定対象となる糖化蛋白の蛋白部分に対して特異
的結合能を有する固相化抗体、試料中の糖蛋白及び酵素
標識レクチンを実質的に同時に反応させて、固相化抗体
−糖化蛋白−酵素標識レクチンの複合物を形成させ、次
いで洗浄後、固相上の酵素活性を測定することを特徴と
する糖化蛋白の測定方法。

【００１８】本発明の測定方法は、前記のように測定対
象となる糖化蛋白の蛋白部分に対して特異的結合能を有
する固相化抗体及び標識化合物を用いたサンドイッチ法
により特定の糖化蛋白を測定する方法に関するものであ
るが、本発明でいうサンドイッチ法とは、測定対象とな
る糖化蛋白の蛋白部分に対して特異的結合能を有する蛋
白を固相化抗体と標識化合物の間にサンドイッチ状に挟
んで結合させ、固相化抗体−測定対象となる蛋白−標識
化合物の複合体を形成せしめ、該標識化合物の標識を利
用して測定対象となる蛋白の存在量を測定する方法をい
う。

【００１９】以下に本発明の糖化蛋白の測定方法につい
て、測定対象となる蛋白が糖化アルブミンである場合に
ついて例示し、更に詳しく説明するが、本発明の測定方
法の対象となる糖化蛋白は特にこれに限定されるもので
はなく、例えば糖化ヘモグロビン等も同様に本発明の測
定方法の対象となる。また測定対象となる糖化蛋白を有
する試料は、前記のような糖化蛋白を含有する生体由来
のものであればよく、例えば尿、血液、各種臓器抽出物
等があげられる。

【００２０】本発明による測定の原理を以下に述べる。 （１）糖化アルブミンの蛋白部分に対して特異的結合能
を有する抗体をプレート等に固相化させた固相化抗体と
試料を反応させることにより、試料中のアルブミン及び
糖化アルブミンの蛋白部分が該固相化抗体と結合した固
相化抗体−アルブミン複合物及び固相化抗体−糖化アル
ブミン複合物が形成される。 （２）固相化抗体に結合しなかった試料中の成分を吸引
除去し、固相を洗浄する。 （３）結合した糖化アルブミンに対して過剰量の酵素標
識レクチンを、（２）の洗浄工程により得られた固相に
添加して、固相化抗体−糖化アルブミン複合物を反応さ
せる。 （４）反応に関与しなかった遊離の酵素標識レクチンを
吸引除去し、固相を洗浄した後、基質液を添加して発色
させて酵素活性を測定する。 （５）標準試料の測定により得られる糖化アルブミン量
と発色量の関係から検量線を作成し、これを用いて測定
試料中の糖化アルブミン量を計算する。

【００２１】上記の本発明の測定方法の各工程について
以下に更に詳しくのべる。（１）の工程における固相化
抗体に用いる抗体としては、糖化アルブミンの蛋白部分
に特異的結合能を有するものである。従って、糖化され
ていないアルブミン自体に対しても特異的結合能を有す
るが、その結合能が糖化アルブミンと非糖化アルブミン
で差がなければ、モノクローナル抗体であってもポリク
ローナル抗体であってもよい。中でも測定結果のより高
い再現性を確保する点からモノクローナル抗体が好まし
く、またその場合アルブミンに対してグルコースが結合
するリジン残基から立体的に離れた位置に抗原決定基を
持つモノクローナル抗体であることが、糖化アルブミン
と非糖化アルブミンで特異的結合能に差のない抗体を得
る上でより好ましい。

【００２２】このような抗体を固定化する固相として
は、本測定法における各工程が行なえればよく、その材
質としては主に無機物質粉末、合成高分子を含む有機物
質が挙げられる。無機物質粉末としては、ガラス、シリ
カ若しくはアルミナ又は金、チタン、鉄若しくはニッケ
ル等の金属片が挙げられる。また、その形状としては、
フレーク状、ビーズ状、管状、又は樹脂を成形して得た
プレート状のもののいずれもが使用できる。測定におけ
る各工程を自動化する観点からはマイクロプレートが特
に好ましい。固相に抗体を結合させるには、蛋白を固相
に結合させる公知の方法を適宜使用することができ、物
理的吸着、化学的結合のいずれも使用することができ
る。なお、用いる抗体は糖鎖を有するため、あらかじめ
グリコペプチダーゼ（アーモンド由来）又はＮ−グリカ
ナーゼ等による酵素処理により糖鎖をＦｃフラグメント
から除去するか、又はペプシン処理によりＦ（ａｂ’）
₂ の形にし、糖類部分を有するＦｃフラグメントを除く
等の公知の方法により、抗体に由来する糖鎖の影響を除
去してから固相に抗体を結合させてもよい。

【００２３】本発明の方法において、糖化アルブミンと
非糖化アルブミンの存在比を算出する場合には、固相に
固定化する抗体量を一定にしておくことが必要となる。
即ち、固相化抗体に結合するアルブミン及び糖化アルブ
ミンの総和を一定にしておくことにより、後述の（５）
の工程における検量線による糖化アルブミンの計算値
を、総アルブミン量に対する糖化アルブミン量の相対比
とすることができる。このような点から固相に所定量の
抗体を固定化した後に、過剰の抗体が固相化されないた
めにブロッキング剤を使用するのが好ましい。このよう
なブロッキング剤としては、ウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）、カゼイン及び界面活性剤等が挙げられる。該ブロ
ッキング剤がシス・ジオール基を有している場合、バッ
クグランドが大きくなるため、あらかじめ、ボロン酸ア
フィニティーカラムクロマトグラフィー法、酵素による
糖鎖除去法等の公知の手法により、これらのブロッキン
グ剤の成分から糖化成分を除去しておくことが測定感度
を向上させる上で望ましい。しかしながら、該ブロッキ
ング剤が仮にシス・ジオール基を有していたとしても、
各ロット（測定バッチ）内においてブロッキング剤の成
分中のシス・ジオール基量さえ一定であれば、糖化アル
ブミン量の測定は可能である。

【００２４】前記（１）の工程では、固定化された抗体
量を一定にしておき、かつ固相化抗体の全抗体と反応す
るのに十分な量のアルブミン及び糖化アルブミンを含む
試料を固相化抗体と反応させることにより、結合するア
ルブミン及び糖化アルブミンの総量を各測定バッチ内で
同量とすることができる。さらに固相化抗体として、前
記のように糖化アルブミンに対しての特異性と非糖化ア
ルブミンに対しての特異性とにおいて差のないものを用
いることにより、試料との反応後の固相化抗体−アルブ
ミン複合物と固相化抗体−糖化アルブミン複合物の存在
比をもって試料中の糖化アルブミンと非糖化アルブミン
の存在比とみることができる。

【００２５】（２）の洗浄工程に用いる洗浄液として
は、生理食塩水、リン酸又はトリス−塩酸等の緩衝液が
好ましい。また、これらの緩衝液等に界面活性剤等を含
有させてもよい。なお、この工程は（４）の洗浄工程で
代用することができるので、省略することが可能であ
る。

【００２６】（３）の工程で用いる酵素標識レクチンと
しては、通常の方法により動植物から見いだされるレク
チンの酵素標識物が挙げられ、このようなレクチンとし
ては、例えば、ミヤコグサ、ウナギ血清等中に存在する
Ｌ−フクース結合性レクチン、ピーナッツ、ダイズ、ヒ
マ、モクワンジュ、インゲンマメ等中に存在するＤ−ガ
ラクトース、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン結合レ
クチン、タチナタマメ（コンカナバリンＡ）、レンズマ
メ、エンドウマメ、ソラマメ等中に存在するＤ−マンノ
ース結合レクチン、小麦胚（小麦胚芽凝集素）、アメリ
カヤマゴボウ（ＰＷＭレクチン）、ジャガイモ、ヨウシ
ュチョウセンアサガオ（ＤＳＡレクチン）等中に存在す
るジ−Ｎ−アセチルキトビオース結合レクチン、及び、
カブトガニ中に存在するシアル酸結合レクチン等が挙げ
られる。レクチンを酵素標識するには、２段階グルタル
アルデヒド法、マレイミド法及びピリジル・ジスルフィ
ド法等の公知の標識法（石川榮治ら、酵素免疫測定法第
３版、医学書院（１９８７年）等に記載されている）を
用いて、レクチン中のアミノ基と酵素中の官能基（例え
ばアミノ基やチオール基等）の架橋反応により容易に酵
素標識レクチンを得ることができるが、高収率及び高再
現性を得るためにはマレイミド法を選択することが好ま
しい。

【００２７】なお、レクチンに対する標識酵素として
は、シス・ジオール基を含有せず、前記レクチンとの結
合反応に用いるアミノ基又はチオール基等の官能基をも
ち、酵素−基質反応により発色性を示すものであれば、
特に限定されるものではない。糖化アルブミン中のシス
・ジオール基と酵素標識レクチンは、ｐＨ７．５〜９．
５程度の弱アルカリ下で結合するので、反応試薬の種類
を減らして工程を簡略化する目的から、シス・ジオール
基を含有せず、かつｐＨ７．５〜９．５程度の弱アルカ
リ下で酵素反応が進む酵素を選択することが望ましい。
例えば、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスフ
ァターゼ等が挙げられ、特に酵素の至適ｐＨの点からβ
−Ｄ−ガラクトシダーゼが好ましい。また、弱アルカリ
下以外のｐＨ条件で酵素反応が進む酵素を用いるとき
は、糖化アルブミンと酵素標識レクチンを弱アルカリ下
で結合させ、（４）の工程で過剰の遊離の酵素標識レク
チンを吸引除去し、固相を洗浄した後、使用する酵素の
酵素−基質反応に好適なｐＨ条件となるように調節すれ
ばよい。酵素標識レクチンと固相化抗体−糖化アルブミ
ン複合物の反応は、ｐＨ７．５〜９．５下にて反応温度
２０〜４０℃、反応時間は３０分から２時間で行われ
る。これにより固相上に前記固相化抗体−糖蛋白を介し
て酵素標識レクチンを結合させることができる。

【００２８】（４）の工程で用いる基質液とは、（３）
の工程で用いた酵素標識レクチンの標識酵素に対する基
質を含有する溶液である。この洗浄工程に用いる洗浄液
としては、前記（２）の工程と同様にトリス−塩酸緩衝
液等が好ましい。

【００２９】（５）の工程において、標準試料の測定に
より得られる糖化アルブミン量と発色量（吸光度）の関
係から得られる検量線を基礎にした計算により得られる
糖化アルブミン量は絶対量であるが、固相化抗体の量を
あらかじめ一定にしておいて過剰の試料と接触させれ
ば、抗体に反応する試料（標準試料又は測定試料）中の
アルブミン量も一定となるので、検量線から計算する過
程で絶対量である糖化アルブミン量（横軸）を総アルブ
ミン量に対する糖化アルブミン量の相対比（パーセン
ト、横軸）で置き換えて糖化アルブミン値（パーセン
ト）とすることができる。即ち、総アルブミン量に対す
る糖化アルブミン量の比を一度に測定することが可能に
なる。

【００３０】なお、本発明の測定方法において、前記
（１）の工程（固相化抗体−アルブミン複合物、固相化
抗体−糖化アルブミン複合物を形成する工程）と、前記
（３）の工程（糖化アルブミンと酵素標識レクチンを結
合させる工程）の工程の順序を逆にしてもよい。即ち、
まず先に（ａ）試料中の糖化アルブミンと酵素標識レク
チンを反応させて結合させ、酵素標識レクチン−糖化蛋
白複合物を形成させる。この場合、糖化されていない非
糖化アルブミンは、酵素標識レクチンとは反応すること
なくそのままの状態で混在する。なお、この（ａ）工程
において、糖化アルブミンと酵素標識レクチンを結合さ
せる反応は、前記（３）の工程の場合と同一の反応条件
で行うことができる。次に、（ｂ）測定対象となる糖化
蛋白の蛋白部分に対して特異的結合能を有する固相化抗
体と前記酵素標識レクチン−糖化蛋白複合物を反応させ
て、固相上に前記固相化抗体−糖化蛋白を介して前記酵
素標識レクチンを結合させる。ここで用いる固相化抗体
は、前記のように糖化アルブミンに対しての特異性と非
糖化アルブミンに対しての特異性とにおいて差のないも
のを使用するので、糖化アルブミンの存在比に応じた量
が固相化抗体と結合する。これにより固相上に固相化抗
体−糖化蛋白を介して酵素標識レクチンを結合させるこ
とができる。次に（ｃ）固相に結合していない遊離の酵
素標識レクチンや酵素標識レクチン−糖化蛋白複合物等
を除去して固相を洗浄し、（ｄ）前記の方法と同様にし
て固相上の酵素活性を測定する。この方法に寄れば、糖
化アルブミンと酵素標識レクチンを結合させる（ａ）工
程と固相化抗体−アルブミン複合物、固相化抗体−糖化
アルブミン複合物を形成する（ｂ）工程の間には洗浄工
程は不要である点で簡易な方法といえる。

【００３１】また、本発明においては、前記（１）の工
程及び（３）の工程を実質的に同時に行い、工程
（４）、工程（５）に入ることも可能である。即ち、測
定対象となる糖化蛋白の蛋白部分に対して特異的結合能
を有する固相化抗体、試料中の糖化蛋白及び酵素標識レ
クチンを実質的に同時に反応させて、固相化抗体−糖化
蛋白−酵素標識レクチンの複合物を形成させ、次いで洗
浄後、固相上の酵素活性を測定する。この場合、固相化
抗体、糖化アルブミン及び酵素標識レクチンを結合させ
る反応は、ｐＨ７．５〜９．５下にて反応温度２０〜４
０℃、反応時間は３０分〜２時間で行われる。

【００３２】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳しく説
明するが、本発明はこれらの実施例等によりなんら限定
されるものではない。なお、本実施例においては、以下
の試薬及び試料を用いた。

【００３３】ＰＢＳ（リン酸緩衝液）の調整 リン酸一ナトリウム（２水和物）、リン酸二ナトリウム
（２水和物）及び塩化ナトリウムをリン酸及び塩化ナト
リウムの終濃度がそれぞれ０．０２Ｍ、０．１５Ｍとな
るように、また、ｐＨが７．２となるように精製水を加
えて調整した。 １％カゼインナトリウム−ＰＢＳの調整 前記ＰＢＳにカゼインナトリウム（和光純薬社製、化学
用）を１％（Ｗ／Ｖ）となるように溶解した。測定試料の調整 ４名の健常者及び４名の糖尿病患者より採取した血液を
室温で６０分間放置した後、３０００ｒｐｍで１０分間
遠心し、上清（血清）を測定試料とした。表１〜表４中
の１〜４は健常者、５〜８は糖尿病患者より得られた試
料を示した。標準試料の調整 イン・ビトロでヒト血清アルブミン（ＨＳＡ、シグマ社
製）とグルコースを、蒸留水１Ｌ中にＨＳＡが４０ｇ、
グルコースが１８ｇ含まれるように加え、イキンキュベ
ート（３７℃、７日間）した。そして、これをボロン酸
アフィニティーカラムクロマトグラフィー（アイソラブ
社製）を用いて、糖化アルブミンと非糖化アルブミンを
分離・分取し、糖化割合が０．０、１０．０、２０．
０、４０．０％となるようにそれぞれを混合後、生理食
塩水を用いて総アルブミン濃度が４ｇ／ｄｌになるよう
に調整し、標準試料とした。

【００３４】抗ヒトアルブミン抗体（ポリクローナル抗
体）マイクロタイタープレートへの固定化 固定化は物理的吸着により行った。抗ヒトアルブミン抗
体ＩｇＧ分画（ヤギ由来、コスモバイオ社製）を１ｍｇ
／ｍｌとなるようにＰＢＳに分散させ、この溶液１００
μｌを９６穴マイクロタイタープレート（ファルコン社
製）２枚の各ウェルに加え４℃で一晩放置した。各ウェ
ルの吸着量を調べるため、一晩放置後１枚のウェルの上
清５０μｌを取り蛋白定量キット（ピアス社製）にて上
清中の蛋白（ＩｇＧ）量を測定した。吸着ＩｇＧ量（添
加ＩｇＧ量−上清ＩｇＧ量）は平均８２μｇ（ｎ＝９６
Ｃ．Ｖ．＝４．１％）であり、各ウェルにほぼ均一に吸
着しているものと考えられた。もう一枚のプレートは、
ＩｇＧ溶液をアスピレーターで除去後、生理食塩水で３
回洗浄した。その後１％カゼインナトリウム−ＰＢＳを
各ウェルに２００μｌ加え３７℃で２時間ブロッキング
した。その後、生理食塩水で３回洗浄し、抗ヒトアルブ
ミン抗体固定化マイクロタイタープレートを作成した。

【００３５】抗ヒトアルブミン抗体（モノクローナル抗
体）マイクロタイタープレートへの固定化 固定化は物理的吸着により行った。抗ヒトアルブミンモ
ノクローナル抗体ＩｇＧ分画（マウス由来、サブクラス
ＩｇＧ１、コスモバイオ社製）を１ｍｇ／ｍｌとなるよ
うにＰＢＳに分散させ、この溶液１００μｌを９６穴マ
イクロタイタープレート２枚の各ウェルに加え４℃で一
晩放置した。各ウェルの吸着量を調べるため、一晩放置
後１枚のウェルの上清５０μｌを取り蛋白定量キットに
て上清中の蛋白（ＩｇＧ）量を測定した。吸着ＩｇＧ量
（添加ＩｇＧ量−上清ＩｇＧ量）は平均６８μｇ（ｎ＝
９６Ｃ．Ｖ．＝３．６％）であり、各ウェルにほぼ均一
に吸着しているものと考えられた。もう一枚のプレート
はＩｇＧ溶液をアスピレーターで除去後生理食塩水で３
回洗浄した。その後１％カゼインナトリウム−ＰＢＳを
各ウェルに２００μｌ加え３７℃で２時間ブロッキング
した。その後、生理食塩水で３回洗浄し、抗ヒトアルブ
ミンモノクローナル抗体固定化マイクロタイタープレー
トを作成した。

【００３６】コンカナバリンＡ、ピーナツレクチンのβ
−ガラクトシダーゼへの結合 コンカナバリンＡ７１４ｍｇ（７０μｍｏｌ）、又はピ
ーナツレクチン４５５ｍｇ（７０μｍｏｌ）に対しマレ
イミド基導入試薬として、Ｎ−スクシンイミジンル ６
−マレイミドヘキサノエート２１ｍｇ（７０μｍｏｌ）
を、ｐＨ７．０に調整したリン酸緩衝液０．１ｍｏｌ／
ｌ １００ｍｌ中で３０℃１時間インキュベートを行っ
た。その後、遠心により沈殿物を除去し、ゲル濾過によ
りマレイミド基が導入された生成物を得た。この生成物
１．０ｍｇ（３μｍｏｌ）にβ−ガラクトシダーゼ６０
０ｍｇ（１１００（ｎｍｏｌ）を添加し、ｐＨ６．０に
調整したリン酸緩衝液０．１ｍｏｌ／ｌ ２０ｍｌ中で
３０℃１時間インキュベートを行った。その後、ゲル濾
過によりマレイミド基が導入された生成物を得た。コン
カナバリンＡ、ピーナツレクチンのβ−ガラクトシダー
ゼ重合体等の副反応生成物を除去した。さらに、充填剤
としてデキストランゲルを用いたボロン酸アフィニティ
ーカラムクロマトグラフィーにより反応のカゼインを除
去することにより、コンカナバリンＡ結合β−ガラクト
シダーゼが５ｍｇ／ｍｌ含まれる０．１ｍｏｌ／ｌのト
リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を１０ｍｌ、ピーナツ
レクチン結合β−ガラクトシダーゼが１０ｍｇ／ｍｌ含
まれる０．１ｍｏｌ／ｌのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
８．０）を１０ｍｌを得た。

【００３７】実施例１抗ヒトアルブミン抗体（ポリクローナル抗体）とコンカ
ナバリンＡ結合β−ガラクトシダーゼを用いるヒト血清
中の糖化アルブミン値の測定 抗ヒトアルブミン抗体結合マイクロタイタープレートの
各ウェルに標準試料及び測定試料各々５０μｌを計り入
れ、室温で３０分以上インキュベートした。反応液を各
ウェルから除去した後、１００ｍＭ塩化ナトリウム含有
１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）３００μ
ｌで各ウェルを３回洗浄し、未反応のアルブミンを除去
した。その後、コンカナバリンＡ結合β−ガラクトシダ
ーゼ溶液２００μｌを計り入れ、更に室温で６０分以上
インキュベートした。反応液を各ウェルから除去した
後、１００ｍＭ塩化ナトリウム含有１００ｍＭトリス−
塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）３００μｌで各ウェルを３回
洗浄し、洗浄液を各ウェルから除去した後β−ガラクト
シダーゼ活性測定のため１００ｍＭ塩化ナトリウム、１
ｍＭ塩化マグネシウム、２ｍＭ ｏ−ニトロフェニル−
β−Ｄ−ガラクトシド含有１００ｍＭトリス−塩酸緩衝
液（ｐＨ８．０）５０μｌを計り入れ、室温で６０分イ
ンキュベートした。反応を停止するために１Ｎ水酸化ナ
トリウム溶液２００μｌを混合し、３０分以内に波長４
２０ｎｍで吸光度を測定した。標準試料と測定試料の吸
光度から試料中の糖化アルブミン値を求めた。結果を表
１に示した。

【００３８】

【表１】

【００３９】実施例２抗ヒトアルブミン抗体（モノクローナル抗体）とコンカ
ナバリンＡ結合β−ガラクトシダーゼを用いるヒト血清
中の糖化アルブミン値の測定 抗ヒトアルブミン抗体結合マイクロタイタープレートの
各ウェルに標準試料及び測定試料各々５０μｌを計り入
れ、室温で３０分以上インキュベートした。反応液を各
ウェルから除去した後、１００ｍＭ塩化ナトリウム含有
１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）３００μ
ｌで各ウェルを３回洗浄し、未反応のアルブミンを除去
した。その後、コンカナバリンＡ結合β−ガラクトシダ
ーゼ溶液２００μｌを計り入れ、更に室温で６０分以上
インキュベートした。反応液を各ウェルから除去した
後、１００ｍＭ塩化ナトリウム含有１００ｍＭトリス−
塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）３００μｌで各ウェルを３回
洗浄し、洗浄液を各ウェルから除去した後β−ガラクト
シダーゼ活性測定のため１００ｍＭ塩化ナトリウム、１
ｍＭ塩化マグネシウム、２ｍＭ ｏ−ニトロフェニル−
β−Ｄ−ガラクトシド含有１００ｍＭトリス−塩酸緩衝
液（ｐＨ８．０）５０μｌを計り入れ、室温で６０分イ
ンキュベートした。反応を停止するために１Ｎ水酸化ナ
トリウム溶液２００μｌを混合し、３０分以内に波長４
２０ｎｍで吸光度を測定した。標準試料と測定試料の吸
光度から試料中の糖化アルブミン値を求めた。結果を表
２に示した。

【００４０】

【表２】

【００４１】実施例３抗ヒトアルブミン抗体（ポリクローナル抗体）とピーナ
ツレクチン結合β−ガラクトシダーゼを用いるヒト血清
中の糖化アルブミン値の測定 抗ヒトアルブミン抗体結合マイクロタイタープレートの
各ウェルに標準試料及び測定試料各々５０μｌを計り入
れ、室温で３０分以上インキュベートした。反応液を各
ウェルから除去した後、１００ｍＭ塩化ナトリウム含有
１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）３００μ
ｌで各ウェルを３回洗浄し、未反応のアルブミンを除去
した。その後、ピーナツレクチン結合β−ガラクトシダ
ーゼ溶液２００μｌを計り入れ、更に室温で６０分以上
インキュベートした。反応液を各ウェルから除去した
後、１００ｍＭ塩化ナトリウム含有１００ｍＭトリス−
塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）３００μｌで各ウェルを３回
洗浄し、洗浄液を各ウェルから除去した後β−ガラクト
シダーゼ活性測定のため１００ｍＭ塩化ナトリウム、１
ｍＭ塩化マグネシウム、２ｍＭｏ−ニトロフェニル−β
−Ｄ−ガラクトシド含有１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ８．０）５０μｌを計り入れ、室温で６０分イン
キュベートした。反応を停止するために１Ｎ水酸化ナト
リウム溶液２００μｌを混合し、３０分以内に波長４２
０ｎｍで吸光度を測定した。標準試料と測定試料の吸光
度から試料中の糖化アルブミン値を求めた。結果を表３
に示した。

【００４２】

【表３】

【００４３】実施例４抗ヒトアルブミン抗体（モノクローナル抗体）とピーナ
ツレクチン結合β−ガラクトシターゼを用いるヒト血清
中の糖化アルブミン値の測定 抗ヒトアルブミン抗体結合マイクロタイタープレートの
各ウェルに標準試料及び測定試料各々５０μｌを計り入
れ、室温で３０分以上インキュベートした。反応液を各
ウェルから除去した後、１００ｍＭ塩化ナトリウム含有
１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）３００μ
ｌで各ウェルを３回洗浄し、未反応のアルブミンを除去
した。その後、ピーナツレクチン結合β−ガラクトシダ
ーゼ溶液２００μｌを計り入れ、更に室温で６０分以上
インキュベートした。反応液を各ウェルから除去した
後、１００ｍＭ塩化ナトリウム含有１００ｍＭトリス−
塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）３００μｌで各ウェルを３回
洗浄し、洗浄液を各ウェルから除去した後β−ガラクト
シダーゼ活性測定のため１００ｍＭ塩化ナトリウム、１
ｍＭ塩化マグネシウム、２ｍＭｏ−ニトロフェニル−β
−Ｄ−ガラクトシド含有１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ８．０）５０μｌを計り入れ、室温で６０分イン
キュベートした。反応を停止するために１Ｎ水酸化ナト
リウム溶液２００μｌを混合し、３０分以内に波長４２
０ｎｍで吸光度を測定した。標準試料と測定試料の吸光
度から試料中の糖化アルブミン値を求めた。結果を表４
に示した。

【００４４】

【表４】

【００４５】

【発明の効果】本発明によれば、例えば、糖尿病等の診
断マーカーとして有用な糖化蛋白を正確かつ確実に測定
することができるので、臨床検査が極めて容易に行うこ
とができる。

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 測定対象となる糖化蛋白及び非糖化蛋白
   の蛋白部分に対して特異的結合能を有し、糖鎖が除去さ
   れた固相化抗体及び標識化合物を用いたサンドイッチ法
   により、特定の糖化蛋白及び非糖化蛋白の存在比を測定
   する方法であって、前記標識化合物が酵素標識レクチン
   であり、固相に固定化する抗体量が一定とされているこ
   とを特徴とする糖化蛋白及び非糖化蛋白の存在比の測定
   方法。