JP2935642B2 - 生体成分のアフィニティ分析法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、生体成分をそれらが有
する相互作用を利用して分析する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】生体試料中の微量成分を特異的かつ高感
度に測定する方法として、測定対象成分に対する抗体を
用いたイムノアッセイや受容体を用いたレセプターアッ
セイなどがある。

【０００３】高感度イムノアッセイの場合の測定原理を
以下に示すと、これは、まず測定対象成分（抗原）に対
する抗体をチューブ、ビーズ、プレートなどの担体に固
定化（固相化）させておき、これに試料を添加して抗原
を固相化抗体に捕捉させる。試料中の共存物質を除去し
た後、抗原に対して固相化抗体とは認識部位の異なる抗
体の標識抗体（抗体に標識物を結合させた抗体）を過剰
に添加し、固相上に捕捉された抗原に結合させる。前記
標識抗体の標識物としては、放射性同位元素、酵素、蛍
光物質、発光物質などが用いられる。結合した標識抗体
は抗原量に比例するため、未反応の標識抗体を洗浄除去
した後、固相上の標識物を定量することにより抗原量を
求める。

【０００４】しかし前記の測定原理においては、標識抗
体を過剰に添加するため、固相表面に非特異的に吸着し
た標識抗体が完全に洗浄除去されずに残り、測定系のバ
ックグランドを上げる原因となって高感度化が達成され
ないという問題がある。

【０００５】すなわち、前述の如き従来方法では、固相
の担体を含む反応液に過剰の標識抗体を添加し、洗浄し
た後、抗原−抗体反応によって固相上に形成されている
複合体の標識物を該固相と分離することなく直接検出す
るものであるため、固相表面に非特異的に吸着している
標識抗体も同時に検出される結果となり、これがバック
グランド上昇を招く結果となっていた。

【０００６】そこで、固相上に形成させた免疫複合体を
固相から切断した後、標識物を定量する試みがなされた
例があり、例えば、免疫複合体をジスルフィド結合を介
してゲルに捕捉させた後、還元剤を用いて結合を切断
し、免疫複合体を溶出させ標識物を定量する方法が報告
されている（臨床検査，２８，９０９〜９１６，１９８
４）。しかしこの方法では、固相からの切断に用いる還
元剤が抗体分子を変性させ、非特異吸着している標識抗
体が脱離したり標識物が乖離したりして、測定対象とな
る免疫複合体を選択的に切断させることができなかっ
た。

【０００７】また免疫複合体を核酸を介して固相に捕捉
させた後、制限酵素を用いて該核酸を切断し、標識物を
定量する方法が報告されている（今井他、特開平４−２
０４３７９号）。しかしこの方法では、酵素反応を利用
した切り出し法であるため、その工程に長時間を要し、
全体の測定時間の短縮化、低ランニングコスト化を図る
上において不利である。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、測定
対象物質と標識を含む免疫複合体を、固相より迅速、か
つ選択的に乖離させることができ、これにより、固相に
対して非特異的に吸着する画分由来のバックグランド上
昇の影響を低減可能とした高感度分析法を提供すること
にある。

【０００９】また本発明の別の目的は、固相から測定対
象物を選択的に乖離させる方法として、制御が容易な方
法を提供するところにある。

【００１０】

【課題を解決するための手段】すなわち前記した請求項
１の発明は、生体試料中の測定対象物を固相上に選択的
に捕捉して該試料中の共存物質と分離した後に測定する
分析法であって、測定対象物に対して親和性を有する物
質に第１の核酸を結合させた核酸結合体と、第１の核酸
と相補的に結合し得る第２の核酸を固相に結合させた核
酸固定固相とを用い、これら第１の核酸と第２の核酸が
相補結合する条件下で前記核酸結合体に含まれる測定対
象物に対して親和性を有する物質と前記試料中の測定対
象物とを反応させて、少なくとも測定対象物質と第１の
核酸を含んだ複合体を前記核酸の相補結合を介して固相
上に不動化させ、固相を試料と分離した後、第１の核酸
と第２の核酸の相補結合を解離する条件下で測定対象物
を含む複合体を固相から遊離させて固相を除いた測定液
を得ることを特徴とする生体成分のアフィニティ分析法
を提供するものである。

【００１１】また前記請求項２の発明の特徴は、生体試
料中の測定対象物を固相上に選択的に捕捉して該試料中
の共存物質と分離した後に測定する方法であって、測定
対象物質に対して親和性を有する物質に第１の核酸を結
合させた核酸複合体と、第１の核酸と相補的に結合し得
る第２の核酸を固相に結合させた核酸固定固相とを用
い、前記核酸結合体と前記試料中の測定対象物とを反応
させて少なくとも測定対象物と第１の核酸を含んだ複合
体を形成させ、該複合体中の第１の核酸を前記第２の核
酸と相補結合させて少なくとも測定対象物質と第１の核
酸を含んだ複合体を前記核酸の相補結合を介して固相上
に不動化させ、固相を試料と分離した後、第１の核酸と
第２の核酸の相補結合が解離する条件下で測定対象物を
含む複合体を固相から乖離させて固相を除いた測定液を
得ることを特徴とする生体成分のアフィニティ分析法を
提供するものである。

【００１２】また前記請求項３の発明の特徴は、前記の
第１の核酸と第２の核酸の相補結合を解く解離を、該相
補結合の安定性に関与する因子である塩濃度、温度の少
なくともいずれかを制御することにより与えるようにし
たところにある。

【００１３】固相から乖離した（離れた）複合体に含ま
れる測定対象物質の定量測定は従来既知の方法を用いて
行なうことができる。例えば、測定対象物に対して親和
性を有する物質として抗体を用い、第一抗体に第１の核
酸を結合させた核酸結合体に酵素（あるいはこれに代え
て放射性同位元素、蛍光物質、発光物質などであっても
よい）を標識物として含ませておく、あるいは酵素等の
標識物質を結合した第二抗体と前記核酸結合体の第一抗
体とをそれぞれ測定対象物質と免疫反応させ、結合して
形成された複合体中に含まれる標識酵素の反応により基
質に現われる蛍光強度の変化を測定するなどの方法を例
示することができる。

【００１４】

【作用】以下本発明を詳細に説明する。

【００１５】本発明に使用される測定対象物と親和性を
有する物質とは、抗原−抗体反応における抗原と抗体、
リガンド・レセプター反応におけるホルモンあるいはサ
イトカインなどとそれに対応するレセプター、酵素反応
における酵素と基質あるいは補酵素などのある特異的な
相互作用でもって互いに結合することのできる個々の分
子を意味する。生体外での複合体形成法にあたっては、
関与する成分が生体内に通常存在する場合にこれらの成
分同士の結合が実際行われる生理的条件下にできる限り
近づけて行うのが好ましいが、本発明の実施に先立って
予備的に実験を行い、複合体の形成を確認しておけば問
題はない。

【００１６】本発明に使用される核酸は、互いに相補的
な配列からなる２種類の１本鎖の核酸であれば使用可能
であり、特に限定されるものではないが長さとして５〜
５０塩基程度の範囲より適宜選定することができる。

【００１７】前記の核酸結合体は、例えば核酸の５’末
端にアミノ基を導入し、これを被結合体に存在するアミ
ノ基やチオール基など、あるいは被結合体に導入された
アミノ基やチオール基などに架橋剤を用いて結合させる
といった方法で調製することができる。架橋剤として
は、Ｎ−サクシニミジル−４−マレイミドブチレート、
Ｎ−サクシニミジル−６−マレイミドヘキサノエート、
Ｎ−サクシニミジル−３−（２′−ピリジルジチオ）プ
ロピオネートなどが例示できる。

【００１８】本発明において用いられる固相としては、
例えば、スチレン、エチレングリコール、アクリル酸、
メタクリル酸などのポリマー系またはコポリマー系の材
料を用いて形成した固相、またはこれらにトシル基、ト
レシル基、エポキシ基などの反応性官能基を導入した固
相、デンプン、デキストラン、セルロース、アガロース
などの多糖類のハロゲン化シアン活性化物あるいはメタ
過ヨウ素酸ナトリウム活性化物などの固相等を挙げるこ
とができる。固相の形状としては、プレート状、ビーズ
状、ゲル状、チューブ状などが例示される。

【００１９】第２の核酸としては未修飾の核酸または第
１の核酸と同様に例えば５′末端にアミノ基などを導入
したものが使用できる。そして第２の核酸の固相への結
合方法としては、物理的に吸着させる方法や固相表面に
導入された反応性官能基と核酸の末端に導入されたアミ
ノ基などの官能基とを共有結合させる方法などがある。

【００２０】測定対象物と核酸結合体とを含む複合体
を、固相に結合された核酸との相補結合によって固相に
不動化した状態に形成させる方法としては、 （１）核酸結合体を固相に結合された核酸との相補結合
によってまず不動化し、次ぎに測定対象物を含む成分
を、該核酸結合体に含まれる物質（例えば抗体）との親
和性によって複合体を形成させて固相に不動化させる方
法 （２）測定対象物と核酸結合体に含まれる物質（例えば
抗体）とを液相反応させることにより複合体を形成さ
せ、次ぎに該複合体を固相に結合された核酸との相補結
合によって不動化させる方法 などが挙げられる。

【００２１】相補結合した核酸を介して固相に不動化さ
れた測定対象物を含む複合体を、該固相から選択的に乖
離させる方法としては、核酸の相補結合の安定性に関与
する因子、例えば塩濃度、温度、変性剤などを調節する
方法を挙げることができる。その中でも塩濃度を調節す
る方法、具体的には該相補結合に至適な塩濃度とされて
いる溶液を、この相補結合を解離して核酸が１本鎖にな
る塩濃度に低下させる調節方法によって、容易に達成で
きる。塩の種類としては、リチウム塩、ナトリウム塩、
カリウム塩などが例示される。後述する実施例に示すよ
うに生体成分の反応温度に通常よく用いられる２５〜３
７℃程度において核酸を相補結合させる場合には塩濃度
を１Ｍ程度以上、１本鎖に解離させる場合には塩濃度を
該塩濃度より低下させ、最も好ましくは０Ｍ程度とする
ことにより容易に目的が達成できる。生理的塩濃度にお
いて核酸を相補結合させる場合には温度を４〜２０℃程
度、一本鎖に解離させる場合には温度を４０〜６０℃程
度のそれぞれの範囲より適宜選択することにより容易に
目的が達成できる。本発明の方法は、上述のように相補
結合および解離反応を塩濃度あるいは温度のいずれか一
方を調節することによって行なっても目的は達成できる
が、両者を同時に調節することによって行なう方が、効
率よく反応させることができるという面において好まし
い。相補結合反応および解離反応における塩濃度条件や
温度条件は、用いる核酸塩基の数、組成により異なる
が、分析するに当たっては予備的に実験し、最適条件を
求めておくのが好ましい場合が多い。

【００２２】

【発明の効果】本発明の核酸の相補結合を利用した生体
成分のアフィニティ分析法によれば以下の効果が得られ
る。

【００２３】（１）固相から測定対象物を含む成分を選
択的に乖離させることにより、固相に非特異的に吸着し
た標識物と分離して測定対象物を測定できるため、バッ
クグランドが低減でき、その結果、高感度に生体成分を
分析することができる。

【００２４】（２）固相から測定対象物を含む成分を選
択的に乖離させる方法として、塩濃度を変化させること
により行なえば迅速な測定が達成でき、測定時間の短縮
化が図れる。

【００２５】

【実施例】以下さらに実施例により本発明を説明する。

【００２６】実施例１ Tresyl-NPRゲル（２．５μｍ；東ソー製）に５’末端ア
ミノ化オリゴｄＴ３５ｍｅｒを結合させ、オリゴｄＴ３
５ｍｅｒ固定化ゲルを得た。また、抗ヒトインスリンモ
ノクローナル第一抗体をＦａｂ’化し、そのヒンジ部分
に５’末端アミノ化オリゴｄＡ１５ｍｅｒをＮ−サクシ
ニミジル−４−マレイミドブチレートを介して結合さ
せ、オリゴｄＡｌ５ｍｅｒ核酸結合体を得た。

【００２７】この第一抗体を含む核酸結合体を１Ｍ Ｎ
ａＣｌ存在下、該オリゴｄＴ３５ｍｅｒ固定化ゲルとハ
イブリダイズさせて抗体固定化ゲルを調製した。該抗体
固定化ゲルに０．５Ｍ ＮａＣｌ存在下、アルカリフォ
スファターゼ標識抗ヒトインスリンモノクローナル第二
抗体、次ぎにヒトインスリンを添加し、室温にて３０分
間反応させた。０．５Ｍ ＮａＣｌを含む洗浄液を用い
て２回洗浄を行った後、免疫複合体形成ゲルに０．０２
％牛血清アルブミンを含むリン酸緩衝液（０ＭＮａＣ
ｌ）を添加して４８℃，１０分間、固相からの乖離反応
を行った。

【００２８】得られた免疫複合体画分に４−メチルウン
ベリフェリルリン酸を添加し、３７℃、２０秒間反応さ
せたときの活性レートを蛍光測定した。得られた検量線
を第１図に示した。

【００２９】実施例２ Tresyl-NPRゲル（２．５μｍ；東ソー製）に５’末端ア
ミノ化オリゴｄＴ３５ｍｅｒを結合させ、オリゴｄＴ３
５ｍｅｒ固定化ゲルを得た。また、抗ヒトインスリンモ
ノクローナル第一抗体をＦａｂ’化し、そのヒンジ部分
に５’末端アミノ化オリゴｄＡ１５ｍｅｒをＮ−（ε−
マレイミドカプロリロキシ）サクシイミドを介して結合
させ、オリゴｄＡ１５ｍｅｒ結合第一抗体として核酸結
合体を得た。

【００３０】この第一抗体を含む核酸結合体を１Ｍ Ｎ
ａＣｌ共存下、該オリゴｄＴ３５ｍｅｒ固定化ゲルとハ
イブリダイズさせて抗体固定化ゲルを調製した。該抗体
固定化ゲルに０．５Ｍ ＮａＣｌ共存下、アルカリフォ
スファターゼ標識抗ヒトインスリンモノクローナル第二
抗体、次にヒトインスリンを添加し、室温にて１０分間
反応させた。０．５Ｍ ＮａＣｌを含む洗浄液を用いて
４回洗浄を行った後、免疫複合体形成ゲルに５３℃に予
備加熱した０．０２％牛血清アルブミンを含むトリス塩
酸緩衝液（０Ｍ ＮａＣｌ）を添加して５秒間ミキサー
で撹拌し、固相からの乖離反応を行った。

【００３１】得られた免疫複合体画分に４−メチルウン
ベリフェリルリン酸を添加し、３７℃、１００秒間反応
させたときの活性レートを蛍光測定した。得られた検量
線を図３に示した。

【００３２】また２ＳＤ法による検出下限界値を求めた
ところ、測定試料として２５μｌを用いた場合、５ｐｇ
／ｍｌ（１２５ｆｇ＝２０ａｍｏｌ／ａｓｓａｙ）であ
った。得られた結果を図４に示した。なおこの図４のｍ
ｅａｎ＋２ＳＤ（ｎ＝１０）とあるのは、０濃度の試料
を１０回測定した平均値（プロットしている箇所）＋２
ＳＤ（ＳＤ：標準偏差）のことをいい、エラーバーの上
限値から検量線に向かって水平線を引き、交差した点よ
りインスリンの濃度を読み取るという２ＳＤ法により検
出下限値を求めたことを示している。

【００３３】以上の実施例のように、本発明によれば、
固相に固定化した核酸と核酸結合体の核酸との相補結合
を利用して、測定対象物であるヒトインスリン及び測定
用標識である酵素を含む免疫複合体を固相に不動化し、
その後、核酸の相補結合を解いて該免疫複合体を回収し
て高密度の測定を行うことができる。なお本発明は前記
実施例に限定されるものではなく、本発明の要旨を変更
しない範囲で種々異なった態様で行うことができる。

【００３４】例えば、前記調製のオリゴｄＡ１５ｍｅｒ
標識抗ヒトインスリンモノクローナル第一抗体にアルカ
リフォスファターゼ標識抗ヒトインスリンモノクローナ
ル第二抗体およびヒトインスリンを添加して液相にて抗
原抗体反応を行い、生成した免疫複合体をオリゴｄＴ３
５ｍｅｒ固定化ゲルに捕捉させ、ゲルを洗浄したのち固
相からの乖離反応を行って、活性レートを測定する方法
によっても、良好な結果を得ることができた。

【００３５】前記実施例は塩濃度と温度の両方の因子ま
たは温度因子を調節することによって目的を達成した例
であるが、以下の実験結果によると一定温度下において
塩濃度を変化させる方法あるいは一定塩濃度下において
温度を変化させる方法によっても目的を達成できること
は明らかである。

【００３６】すなわち、実施例１の方法にて調製したオ
リゴｄＴ３５ｍｅｒ固定化ゲルおよびオリゴｄＡ１５ｍ
ｅｒ結合第一抗体を用い、２Ｍ ＮａＣｌ存在下におい
てハイブリダイズさせ、抗体固定化ゲルを調製した。つ
ぎにこの第一抗体の固相からの乖離反応を２５，３７，
４８℃のそれぞれにおいてＮａＣｌ濃度を２．０から０
Ｍまで段階的に減少させた条件にて行い、遠心分離後、
乖離して上清中に存在する第一抗体量をＨＰＬＣにて定
量した。得られた第一抗体の固相からの乖離割合（％）
とＮａＣｌ濃度（Ｍ）の関係を図２に示した。４８℃に
おいて１Ｍ ＮａＣｌ存在下で相補結合させ、次に０Ｍ
ＮａＣｌにすれば１００％の乖離が認められた。また
０．２５Ｍ ＮａＣｌにおいて２５℃で相補結合させ、
次に４８℃にすれば約７０％の乖離が認められた。実施
例２にも示したが、以上のように相補結合反応および解
離反応を濃度あるいは温度のいずれか一方のみを調節す
ることによっても目的は容易に達成できる。

【００３７】なお、実施例２において、インスリン陰性
血清および健常人の空腹時血清を用いて、同時再現性の
評価を実施した結果、平均濃度４２．６ｐｇ／ｍｌ（約
１μＵ／ｍｌ）の健常人空腹時血清が変動係数８．４％
と良好に測定できた。得られた結果を図５に示した。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１により得られた検量線を示した図。

【図２】実施例１ににおける、オリゴｄＡ１５ｍｅｒ結
合第一抗体の２５℃，３７℃，４８℃での乖離割合
（％）とＮａＣｌ濃度（Ｍ）の関係を示した図。

【図３】実施例２により得られた検量線を示した図。

【図４】実施例２における検出限界値を示した図。

【図５】実施例２における、インスリン陰性血清および
健常人の空腹時血清を用いて、同時再現性を評価した結
果を示す図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 北山 隆一 神奈川県綾瀬市早川2743−１ 東ソー株 式会社東京研究センター 科学計測事業 部内 (72)発明者 橋本 佳巳 神奈川県綾瀬市早川2743−１ 東ソー株 式会社東京研究センター 科学計測事業 部内 (56)参考文献 特開 平４−204379（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−167474（ＪＰ，Ａ) 特開 平６−27109（ＪＰ，Ａ) 特開 平６−186232（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) G01N 33/543 G01N 33/547

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 生体試料中の測定対象物を固相上に選択
   的に捕捉して該試料中の共存物質と分離した後に測定す
   る分析法であって、 測定対象物に対して親和性を有する物質に第１の核酸を
   結合させた核酸結合体と、第１の核酸と相補的に結合し
   得る第２の核酸を固相に結合させた核酸固定固相とを用
   い、これら第１の核酸と第２の核酸が相補結合する条件
   下で前記核酸結合体に含まれる測定対象物に対して親和
   性を有する物質と前記試料中の測定対象物とを反応させ
   て、少なくとも測定対象物質と第１の核酸を含んだ複合
   体を前記核酸の相補結合を介して固相上に不動化させ、 固相を試料と分離した後、第１の核酸と第２の核酸の相
   補結合が解離する条件下で測定対象物を含む複合体を固
   相から遊離させて固相を除いた測定液を得ることを特徴
   とする生体成分のアフィニティ分析法。
2. 【請求項２】 生体試料中の測定対象物を固相上に選択
   的に捕捉して該試料中の共存物質と分離した後に測定す
   る方法であって、 測定対象物に対して親和性を有する物質に第１の核酸を
   結合させた核酸結合体と、第１の核酸と相補的に結合し
   得る第２の核酸を固相に結合させた核酸固定固相とを用
   い、前記核酸結合体と前記試料中の測定対象物とを反応
   させて少なくとも測定対象物と第１の核酸を含んだ複合
   体を形成させ、該複合体中の第１の核酸を前記第２の核
   酸と相補結合させて少なくとも測定対象物と第１の核酸
   を含んだ複合体を前記核酸の相補結合を介して固相上に
   不動化させ、 固相を試料と分離した後、第１の核酸と第２の核酸の相
   補結合が解離する条件下で測定対象物を含む複合体を固
   相から乖離させて固相を除いた測定液を得ることを特徴
   とする生体成分のアフィニティ分析法。
3. 【請求項３】 第１の核酸と第２の核酸の相補結合を解
   離する条件を、該相補結合の安定性に関与する因子であ
   る塩濃度又は温度の少なくともいずれかの制御により与
   えることを特徴とする請求項１又は２に記載のアフィニ
   ティ分析法。
4. 【請求項４】 請求項１ないし３のいずれかにおいて、
   測定対象物質と第１の核酸を含む複合体は、測定用の標
   識物質を有していることを特徴とする生体成分のアフィ
   ニティ分析法。