JP2902581B2 - 測定すべき物質の定性的または/および定量的検出法 - Google Patents

測定すべき物質の定性的または/および定量的検出法

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Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、イムノアッセイま
たは核酸ハイブリダイゼーションアッセイによって被験
試料中の測定すべき物質を定性的または/および定量的
に検出する方法、このようなアッセイに用いる不活化固
相、ならびに分析すべき被験試料中の非特異的結合成分
を捕捉することによりイムノアッセイまたは核酸ハイブ
リダイゼーションアッセイにおける妨害を除去するため
のかかる不活化固相の使用に関する。最後に本発明は、
イムノアッセイまたは核酸ハイブリダイゼーションアッ
セイの通常成分と、本発明の不活化固相とを含む試験キ
ットにも関する。
【0002】
【従来技術】今日では、イムノアッセイおよび核酸ハイ
ブリダイゼーションアッセイは診断などの分野において
物質の迅速かつ簡単な試験として用いられている。これ
らは生物学的試料中の内因性または外因性物質の存在を
迅速かつ信頼性高く検出するために用いられている。イ
ムノアッセイおよび核酸ハイブリダイゼーションアッセ
イは、検出すべきある物質が別の物質と特異的に結合
し、そしてもしもアッセイが適正に設計されているなら
ば、検出すべき物質の存在はこの別の物質の助けによっ
て測定できる、という原理に基づいている。したがっ
て、測定すべき物質が1またはいくつかの別の物質と特
異的に結合できることが検出に利用される。しかしなが
ら、この過程においては、望ましくない相互作用や非特
異的結合反応などの副反応も生じ得る。特に、特異的に
結合する物質を固定するか、あるいは固定しうる固相を
用いる場合には、この固相に結合する別の物質が試料中
にしばしば存在し、このために誤った正のシグナルを生
じる。これによりバックグランドシグナルが増大し、シ
グナルのバラツキが大きくなることにより各試験の感受
性および特異性が減少する。
【0003】非特異的因子との相互作用を避けるため
に、例えば欧州特許出願EP0163312は、最大平
均サイズが0.2μmで、非特異的反応を引き起こす物
質と結合してこれを捕捉することのできる超微粒子をイ
ムノアッセイ試薬に加えることを提案する。しかしなが
ら、このために超微粒子を特別に調製しなければなら
ず、またどのような非特異的因子が試料中に実際に存在
するのかということもわかっていなければならない。
【0004】
【発明が解決すべき課題】しかしながら、実際に存在す
る妨害物質を知らなくともイムノアッセイや核酸ハイブ
リダイゼーションアッセイにおける妨害を除去する一般
的かつ普遍的方法が提供されれば有利であろう。したが
って、本発明の目的は適当な方法を提供することにあ
る。
【0005】
【課題を解決するための手段】上記目的は本発明により
達成される。すなわち、本発明は、イムノアッセイまた
は核酸ハイブリダイゼーションアッセイによって被験試
料中の測定すべき物質を定性的または/および定量的に
検出する方法であって、該方法は以下の成分: a)2つの異なる結合部位という手段によって試料中の
測定すべき物質を、1)所望するならば追加の試験成分
とともに特異的に検出することを可能とする捕捉試薬で
あって、該試薬は2)活性固相に特異的結合ペアを介し
て結合されているかまたは結合することができ、該結合
ペアの第1パートナーは捕捉試薬に連結し、第2パート
ナーは活性固相にカップリングする該試薬、 b)活性固相、および c)活性固相と実質的に対応するが、捕捉試薬が結合で
きない不活性固相、を使用し、被験試料をまず不活性固
相とのみ接触させてその後活性固相と接触させるか、あ
るいは活性固相と不活性固相とに同時に接触させ、この
間捕捉試薬および所望するならば追加の試験成分は最初
から存在するか、あるいは後に添加し、そして測定すべ
き物質を検出する、ことからなる。
【0006】
【発明の実施の形態】本発明の捕捉試薬は2つの型の結
合部位をもつように設計される。捕捉試薬は1つの型の
結合部位によって特異的結合ペアの1つのパートナーと
カップリングしうる。結合ペアのいくつかのパートナー
とのカップリングも可能である。さらに本発明の捕捉試
薬は測定すべき物質の特異的検出を可能にする別の型の
結合部位をもつ。これらの結合部位は好ましくは測定す
べき物質または測定すべき物質の複合体と、および追加
の試験成分と特異的に結合できる。捕捉試薬はまたこの
種の結合部位をいくつかもつことができ、例えば抗体は
特異的結合部位をもつ2つのエピトープをもつ。
【0007】本発明の方法においては、物質は測定すべ
き物質と特異的に結合できる捕捉試薬として使用される
のが好ましい。測定すべき物質が抗体である場合には、
対応する抗原、ハプテンまたは測定すべき抗体に対する
第2抗体またはその断片であっても捕捉試薬として使用
できる。これとは対照的に測定すべき物質が抗原である
場合には、抗体または抗体断片を捕捉試薬として使用す
る。測定すべき物質が核酸である場合には、核酸オリゴ
マーまたは核酸ポリマーまたは核酸類似体を捕捉試薬と
して使用する。この場合には、ペプチド性核酸を核酸類
似体として使用することが好ましい。
【0008】この関連において、本発明の捕捉試薬は、
測定すべき物質の結合を妨害しない分子の部位を用いて
捕捉試薬を特異的結合ペアを介して固相と結合できるよ
うに設計するか、あるいは捕捉試薬を固相とすでに結合
したものとして存在するように設計される。この結合は
結合ペアを介して直接行うことができる。しかしなが
ら、互いに結合できる2以上の成分からなる結合系を用
いて、捕捉試薬を固相にカップリングすることもでき
る。特異的結合ペアの1つのパートナーは常に捕捉試薬
と連結しており、特異的結合ペアの第2のパートナーは
固相とカップリングする。このカップリングは当業者に
公知のあらゆる方法を用いて実施することができ、特異
的結合ペアを介する捕捉試薬の固相へのカップリングは
イムノアッセイを実施する前に行うことができ、あるい
はイムノアッセイの途中まで行わないこともでき、この
場合には単に捕捉試薬をイムノアッセイの他の成分に後
で加える。
【0009】本発明の好ましい態様では、互いに特異的
に結合しうるビオチン/アビジン、ビオチン/ストレプ
トアビジン、抗原/抗体、ハプテン/抗体ペアまたはそ
の断片を特異的結合ペアとして使用する。本発明の特に
好ましい態様では、ビオチン/アビジンまたはビオチン
/ストレプトアビジンを特異的結合ペアとして使用す
る。
【0010】本発明によると、捕捉試薬と一緒になって
測定すべき物質の特異的検出を可能にし、かつ間接また
は直接の標識をもつ検出試薬によって、測定すべき物質
は検出される。直接標識された検出試薬を用いると、検
出試薬が測定すべき物質と結合し、標識をもつ検出可能
なサンドイッチ複合体を形成するか、または検出試薬が
測定すべき物質と競合して捕捉試薬と結合し、標識をも
つ検出試薬−捕捉試薬複合体を形成する、これらのいず
れかにより検出が行われる。間接標識をもつ検出試薬は
いくつかの成分からなっており、これらの成分のうち測
定すべき物質または捕捉試薬と結合する成分は未標識で
あり、標識をもつ追加の成分と結合することができる。
【0011】適当な標識は当業者に公知である。放射性
標識、化学発光標識、蛍光標識または電子化学発光標
識、金属ゾル粒子などの染色粒子、あるいは染色または
非染色ラテックスを使用するのが好ましい。例えば、パ
ーオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼまたはアルカリ
ホスファターゼなどの酵素を用いる酵素標識の場合にも
標識により間接シグナルが生じる。本発明では標識は活
性固相上で、または/および試料上清中で測定すること
が好ましい。
【0012】本発明ではすべての公知の検出法を測定す
べき物質の検出に用いることができる。試験は例えばい
わゆる置換法(displacement metho
d)またはサンドイッチ法として実施することができ
る。本発明で好ましい置換法においては、測定すべき物
質と同じまたは類似の結合部位をもち、それ故測定すべ
き物質と競合する標識された検出試薬を使用する。例え
ば測定すべき物質が抗体ならば、捕捉試薬としての適当
な抗原と標識抗体とを加えて置換法でこの抗体を検出
し、この場合標識抗体は測定すべき抗体と同じまたは類
似の結合特異性を有する。抗原は固相と直接連結する
か、あるいは特異的結合ペアを介して固相と結合するこ
とができ、この特異的結合ペアの第1パートナーは抗原
に連結し、第2パートナーは活性固相にカップリングす
る。抗原を固相に結合するか、あるいは固相と結合でき
るかまたは固相と結合された第2抗体を介して抗原を固
相上に間接的に固定化できる。標識抗体と同様に、この
第2抗体も測定すべき抗体と同じまたは類似の特異性を
もつ。試料抗体は抗原との結合において標識抗体と競合
し、そして所望するならば第2抗体と競合する。
【0013】測定すべき物質が抗原である場合には、測
定すべき抗原の免疫学的競合類似体を置換法の検出に使
用するのが好ましい。これは例えば同じ抗原または/お
よび類似の結合特異性をもつ抗原である。測定すべき物
質が核酸である場合には、核酸オリゴマーまたは核酸ポ
リマーまたは核酸類似体、そして特にペプチド性核酸を
検出試薬として使用するのが好ましい。
【0014】本発明によると、測定すべき物質はサンド
イッチ法によって検出するのが特に好ましい。この場
合、検出試薬は測定すべき物質と特異性に結合しうる。
測定すべき物質が抗体である場合には、抗原、ハプテン
または第1抗体に対する第2抗体または抗体断片が検出
試薬として使用しうる。他方、測定すべき物質が抗原で
ある場合には、抗体または抗体断片を、捕捉試薬のエピ
トープとは異なる抗原エピトープと特異的に結合する検
出試薬として使用する。測定すべき物質が例えばオリゴ
ヌクレオチドまたはDNAやRNAの一部のような核酸
である場合には、測定すべき物質と相補的な配列領域を
もつ捕捉試薬として、核酸オリゴマーまたは核酸ポリマ
ーまたは類似の構造体を使用するのが便利である。
【0015】修飾核酸塩基、糖または/およびヌクレオ
チド間結合を核酸類似体として使用することができる。
ペプチド性核酸/PNAがヌクレオチド類似体として特
に適している。このようなイムノアッセイおよび核酸ハ
イブリダイゼーションアッセイ、特に「サンドイッチア
ッセイ」に適した捕捉試薬および検出試薬は一般に当業
者に公知であり、特に本明細書で明らかにする必要はな
い。
【0016】本発明で好ましいサンドイッチ検出法にお
いては、測定すべき物質、固相への結合を仲介する捕捉
試薬、および標識をもち測定すべき物質の存在の検出を
可能にする検出試薬によって複合体が形成される。個々
の試験成分を添加する順序は本試験法で重要ではない。
本発明の方法では、捕捉試薬に加えて、活性固相と、必
要ならば検出試薬とを使用する。この活性固相は捕捉試
薬を既に結合した形で含んでいるか、あるいは固相に捕
捉試薬を結合できるように設計されている。「活性」固
相という用語は、この固相が測定すべき物質の検出を捕
捉試薬によって実施できることを明らかにするものであ
る。非結合成分が分離されて測定すべき物質が検出でき
るような方法によって、捕捉試薬が検出試薬を活性固相
に結合しうることが好ましい。しかしながら、従来公知
のイムノアッセイや核酸ハイブリダイゼーションアッセ
イとは異なり、本発明の方法では、実質的には活性固相
に対応するが、捕捉試薬がこれに結合できないように修
飾された不活性固相をさらに使用する。しかしながら、
この不活性固相上では捕捉試薬または固相へのその特異
的結合によって仲介されない非特異的結合が生じ得る。
被験試料のみとプレインキュベーションできるが、ある
いは1または複数のまたは究極的にはイムノアッセイの
すべての他の成分と組み合わせて用い得るこの不活性固
相を用いると、非特異的結合を防止でき、その結果、活
性固相上で生じるあらゆる種類の非特異的結合による架
橋を防止し、検出試薬が活性固相と結合して誤った正の
シグナルを生じることを防止できる。
【0017】被験試料はまず不活性固相のみとインキュ
ベートするのが好ましい。この工程で固相と結合できる
すべての非特異的物質が反応し、その後試料を不活性固
相から分離し、次いで活性固相や捕捉試薬などのその他
の成分および所望するならば検出試薬および追加の試験
成分と任意の順序または組み合わせでインキュベート
し、測定すべき物質を標識シグナルを介して検出でき
る。
【0018】別の好ましい態様では、不活性固相と活性
固相を同時に試料と、そして所望するならばイムノアッ
セイまたは核酸ハイブリダイゼーションアッセイのその
他の成分と接触させ、非特異的物質も不活性固相と結合
することにより少なくともある程度バックグランドと妨
害シグナルを減少する。本発明においては、イムノアッ
セイに使用できるすべての固相を固相として使用でき
る。プラスチック管、ミクロタイタープレート、ガラス
またはプラスチックビーズまたはラテックス粒子を固相
として用いるのが好ましい。しかし、紙またはプラスチ
ック製の試験ストリップも使用できる。
【0019】固相は各種方法で不活性化できる。しかし
ながら、この工程で捕捉試薬の固相への特異的結合が起
こらないよう確認しなければならない。ビオチン/スト
レプトアビジンまたはビオチン/アビジンを特異的結合
ペアとして用い、またそのうちのアビジンまたはストレ
プトアビジンが固相と結合して存在する本発明の特に好
ましい態様では、不活性固相の製造においてアビジンま
たはストレプトアビジンをビオチンまたはビオチン誘導
体で飽和することにより不活性化する。さらに、固相と
結合しているか、あるいは固相と結合すべきアビジンま
たはストレプトアビジンは活性中心の共有結合修飾によ
り不活性化することが好ましい。このような共有結合修
飾は活性中心の少なくとも1個のアミノ酸を誘導体とす
るか、あるいは活性中心にビオチンを共有結合的にカッ
プリングすることにより行うことが好ましい。この場
合、共有結合的カップリングは、例えばビオチン−DA
DOO−ABなどの光活性化されうるビオチンをアビジ
ンまたはストレプトアビジンにカップリングすることに
より行うのが好ましい。
【0020】しかしながら、不活性化固相を得るために
遺伝子操作により製造したアビジンまたはストレプトア
ビジンを用いることも可能であり、また本発明において
は特に好ましいことである。該方法では1または複数の
アミノ酸を置換、欠失または挿入することによって遺伝
子操作により活性中心を修飾してビオチンの結合を妨害
する。
【0021】アビジンまたはストレプトアビジンの断片
は、これとカップリングした固相がなお十分な非特異的
結合を捕捉できることを条件に、使用できる。簡単な予
備試験でこれを確認できる。水性試料を被験試料として
一般に使用し、体液および特に血液、血漿、血清、唾
液、皮膚パッチなどを用いて皮膚から得た組織液などの
組織液、ある種の体液(liquor)または尿を診断
に用いる。したがって好ましい試料は体液である。
【0022】本発明の方法では、測定すべき物質が抗原
である場合、抗体または抗体断片を捕捉試薬および所望
するときは検出試薬として用いるのが好ましい。逆に、
測定すべき物質が抗体である場合には、抗原または/お
よびハプテンを捕捉または/および検出試薬として用
い、これらの試薬のうちの1つまたは両方が抗原または
/およびハプテンで、他方の試薬が測定すべき抗体に対
する第2抗体であることができる。測定すべき物質がオ
リゴヌクレオチドまたはDNAやRNAのセクションで
ある場合には、核酸オリゴマーまたは核酸ポリマーまた
は核酸類似体、そして特に好ましくはペプチド性核酸を
用いることが便利である。
【0023】本発明の方法は、固相を含むすべての成分
を最初に反応容器に導入して行うことができる。この場
合、固相として修飾ガラスまたはプラスチックビーズを
用いることが好ましい。しかしながら、反応容器を2つ
の固相のうちの一方とし、そしてガラスまたはプラスチ
ックビーズを2つの固相のうちの他方として用いるイム
ノアッセイも実施できる。試験ストリップの形での固相
も使用でき、この場合両方の固相を試験ストリップとし
て設計することもできるし、あるいは反応容器を2つの
固相のうちの一方とすることもできる。
【0024】本発明の特に好ましい態様においては、特
異的結合系の一方のパートナーとしてのストレプトアビ
ジンまたはアビジンを熱ウシ血清アルブミン(TBS
A)によって固相にカップリングさせる。本発明のさら
に好ましい態様においては、ミクロタイタープレートを
固相として各場合に使用する。この場合のプレートは例
えば8および16ウエルストリップのような他の形態で
あってもよい。この場合には、幾つかの異なるイムノア
ッセイまたは核酸ハイブリダイゼーションアッセイを同
時に行うことができる。このためには、まず被験試料を
不活性化固相として設計されたミクロタイタープレート
と、所望するならば検出または/および捕捉試薬の存在
下に、接触させ、試料をウエルに導入する。不活性化固
相との非特異的結合が起きるプレインキュベーションの
後に、各種の平行して実施する試料を遅滞無くピペッ
ト、好ましくはマルチチャンネルピペットによって、活
性固相として設計された別のミクロタイタープレートに
移す。
【0025】マルチチャンネルピペットでピペッティン
グすると、活性固相を含むウエルへのピペッティングが
同時にできるので、よりよい試験精度が得られ、同時に
全体としての試験時間を短縮できる。本発明はさらに、
イムノアッセイまたは核酸ハイブリダイゼーションアッ
セイで用いられる固相に対応するが、捕捉試薬への結合
が起こらないように修飾されたことを特徴とする、イム
ノアッセイまたは核酸ハイブリダイゼーションアッセイ
に使用するための不活性固相に関する。捕捉試薬はイム
ノアッセイまたは核酸ハイブリダイゼーションアッセイ
で検出すべき物質と特異的結合することのできる試薬と
して理解され、これは固相への結合能のために壁−結合
(wall−binding)を仲介することができ
る。
【0026】不活性固相は好ましくはプラスチック管、
ミクロタイタープレート、ガラスまたはプラスチックビ
ーズまたはラテックス粒子である。この不活性固相は、
パートナーとして互いにそれぞれ結合しうる結合ペアで
あるビオチン/ストレプトアビジン、ビオチン/アビジ
ン、抗原/抗体、ハプテン/抗ハプテン抗体または断片
をもつのが好ましい。これらの結合ペアのパートナーは
例えば吸着コーティングなどの公知の方法によって不活
性固相に連結される。この場合、アビジンまたはストレ
プトアビジンが結合ペアのパートナーとして固相に結合
することが特に好ましく、ここでカップリングを熱−B
SA(TBSA)によるコーティングによって行うのが
特に好ましい。本発明の不活性固相はアビジンまたはス
トレプトアビジンをビオチンまたはビオチン誘導体で飽
和することによって、アビジンまたはストレプトアビジ
ンの活性中心を共有結合的に修飾することによって(こ
こで活性中心の少なくとも1個のアミノ酸を誘導体とす
ることにより共有結合的に修飾することが特に好まし
い)、または活性中心にビオチンを共有結合的にカップ
リングすることにより不活性化することが好ましい。本
発明による不活性固相を不活性化するさらなる可能性と
しては、例えばビオチン−DADOO−ABなどの光活
性化されうるビオチンを用いて活性中心にビオチンを共
有結合的にカップリングさせて次いで光活性化すること
である。ビオチンが固相上でもはや特異的に結合できな
いアビジンまたはストレプトアビジンの断片を用いて不
活性化固相を製造することは本発明の範囲内にある。最
後に、1または複数のアミノ酸を置換、欠失または挿入
などの遺伝子操作によりアビジンまたはストレプトアビ
ジンの活性中心を不活性化することは本発明の範囲内で
特に好ましい。
【0027】さらに本発明は、分析すべき試料中の非特
異的結合成分を捕捉することによってイムノアッセイま
たは核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおける妨害
除去に本発明の不活性固相を用いることに関する。本発
明の方法、またはイムノアッセイまたは核酸ハイブリダ
イゼーションアッセイにおける本発明の不活性固相の使
用は、非特異的に結合する成分による妨害を簡単かつ費
用効率的に制御下におき、実施すべきイムノアッセイか
ら妨害を除去する。この方法では、それぞれの試験の感
受性と特異性を損なう試験結果の広範すぎるバラツキと
同様に誤った正の結果を回避できる。
【0028】さらに本発明は、被検試料中の物質を定性
的または/および定量的に検出するためのイムノアッセ
イまたは核酸ハイブリダイゼーションアッセイ用試験キ
ットに関し、ここで該試験キットはイムノアッセイまた
は核酸ハイブリダイゼーションアッセイのための通常の
成分、およびイムノアッセイまたは核酸ハイブリダイゼ
ーションアッセイで用いられる活性固相と実質的に対応
するが捕捉試薬がこれとは結合しない不活性固相を含
む。試験キットは好ましくは以下の成分を含む: a)2つの異なる結合部位という手段によって試料中の
測定すべき物質を、1)所望するならば追加の試験成分
とともに特異的に検出することを可能とする捕捉試薬で
あって、該試薬は2)活性固相に特異的結合ペアを介し
て結合されているかまたは結合することができ、該結合
ペアの第1パートナーは捕捉試薬に連結し、第2パート
ナーは活性固相にカップリングする該試薬、 b)検出試薬 c)活性固相、および d)本発明の不活性固相。
【0029】さらに本発明は、以下の成分を用いるイム
ノアッセイにおいて固相への非特異的結合による妨害を
防止する方法に関する: a)2つの異なる結合部位という手段によって試料中の
測定すべき物質を、1)所望するならば追加の試験成分
とともに特異的に検出することを可能とする捕捉試薬で
あって、該試薬は2)活性固相に特異的結合ペアを介し
て結合されているかまたは結合することができ、該結合
ペアの第1パートナーは捕捉試薬に連結し、第2パート
ナーは活性固相にカップリングする該試薬、 b)少なくとも2つの活性固相であって、ここで捕捉試
薬および所望するならば追加の試験成分を加える前に被
験試料を第1活性固相の存在下にインキュベートし、そ
の後被験試料をこの第1固相から分離し、捕捉試薬およ
び所望するならば追加の試験成分ならびに実質的に同じ
第2固相の存在下にインキュベーションを行い、測定す
べき物質を適当な方法で検出することを特徴とする。こ
の方法は被験試料中に存在する物質の固相への結合によ
って引き起こされる非特異的妨害とそれによる非特異的
シグナルの発生を回避できる。非特異的に結合する物質
はイムノアッセイで用いられる固相に対応する活性固相
とプレインキュベーションすることによってあらかじめ
捕捉され、この方法では固相が分離されて捕捉試薬、所
望するならば検出試薬および新しいコーティングされて
いない試験相などの成分とインキュベートするまでは実
際のイムノアッセイは行われない。捕捉試薬は第2イン
キュベーションの後に添加するので、プレインキュベー
ションの間に測定すべき物質は活性固相にまだ結合しな
い。この態様では、固相を不活性化することは必ずしも
必要ではない。以下の実施例で本発明をさらに詳しく説
明する。
【0030】
【実施例】
実施例1:ヒト血清中の抗−GAD抗体測定のためのイ
ムノアッセイにおける比較試験法 A)従来法による試験法 濃度約1μg/mlのビオチン化グルタミン酸デカルボ
キシラーゼ(biotinylated glutam
ate decarboxylase:GAD)を含む
溶液100μlを活性ストレプトアビジン−コーティン
グミクロタイタープレートの各ウエルに分注し、室温で
1時間インキュベートする。その後プレートを適当なバ
ッファーで3回洗浄する。ヒト血清をEnzymun−
Test(登録商標)抗−HIV1+2からのインキュ
ベーションバッファー中に1+25で希釈し、その10
0μlをミクロタイタープレートの各ウエルに加え、室
温で1時間インキュベートする。この工程の後試料を吸
引し、ウエルを3回洗浄する。ヒトIgGへの結合特異
性をもつヒツジ由来のPOD−結合検出抗体(ヒツジ−
(抗−)ヒトPOD)を約75mU/mlの濃度でEn
zymun−Test(登録商標)抗−HIV1+2か
らのコンジュゲートバッファー中に希釈し、この希釈溶
液100μlをミクロタイタープレートの各ウエルに加
え、室温で1時間インキュベートする。液体を再度吸引
し、プレートを上述のように3回洗浄する。染料ABT
S(登録商標)をEnzymun−Test(登録商
標)基質バッファー中に1mg/mlの濃度となるよう
に溶解し、100μlをミクロタイタープレートの各ウ
エルに加えてインキュベートする。約30分後にミクロ
タイタープレート光度計で吸光度を読み取る。測定波長
は405nmであり、参照波長は492nmである。基
質/染料溶液のみを含む未処理キュベットからブランク
を決定する。異なる8つの血清を用いたGAD測定の結
果を「プレインキュベーションなし」の欄に示す。
【0031】B)本発明の方法による試験法 1A)に記載したようにしてビオチン化GAD(約1μ
g/ml)および血清の溶液(1:26)を調製し、不
活性ストレプトアビジンでコーティングしたミクロタイ
タープレート中、1ウエル当たりこの溶液250μlの
量で1時間インキュベートする。各ウエルから100μ
lのアリコートを2つピペットで取り出し活性ストレプ
トアビジンでコーティングしたプレートの各ウエルに入
れて再び1時間インキュベートする。その後溶液をピペ
ットで除去し、バッファーで3回洗浄し、ヒツジ−(抗
−)ヒトPODとインキュベートし、1A)と同様の発
色反応を行う。本発明の方法により得られた値を表1の
「インキュベーションあり」の欄に示す。
【0032】これらのデータは本発明の方法において非
特異的結合が劇的に減少したことを明瞭に示す。 表1 妨害血清 インキュベーションあり プレインキュベーションなし 7378−262 15 260 −269 45 468 −272 30 1669 −289 69 2208 7480−203 97 1343 −210 72 136 7463−531 0 1613 7478−298 182 1517
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.6,DB名) G01N 33/53 G01N 33/543

Claims (24)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 イムノアッセイまたは核酸ハイブリダイ
    ゼーションアッセイによって被験試料中の測定すべき物
    質を定性的または/および定量的に検出する方法であっ
    て、該方法は少なくとも以下の成分: a)2つの異なる結合部位という手段によって試料中の
    測定すべき物質を特異的に検出することを可能とする捕
    捉試薬であって、該試薬は活性固相に特異的結合ペアを
    介して結合されているかまたは結合することができ、該
    結合ペアの第1パートナーは捕捉試薬に連結し、第2パ
    ートナーは活性固相にカップリングする該試薬、 b)活性固相、および c)活性固相と実質的に対応するが、捕捉試薬が結合で
    きない不活性固相、 を使用し、被験試料をまず不活性固相とのみ接触させて
    その後活性固相と接触させるか、あるいは活性固相と不
    活性固相とに同時に接触させ、この間捕捉試薬は最初か
    ら存在するか、あるいは後に添加し、そして測定すべき
    物質を検出する、ことからなる上記方法。
  2. 【請求項2】 追加の試験成分をさらに使用する請求項
    1記載の方法。
  3. 【請求項3】 追加の試験成分が、捕捉試薬と一緒にな
    って測定すべき物質の特異的検出を可能にし、かつ間接
    または直接の標識をもつ検出試薬であって、そして測定
    すべき物質を、活性固相上で、または/および試料上清
    中で標識を測定することにより検出する、請求項2記載
    の方法。
  4. 【請求項4】 プラスチック管、ミクロタイタープレー
    ト、ガラスまたはプラスチックビーズまたはラテックス
    粒子を固相として用いる、請求項1〜3のいずれかに記
    載の方法。
  5. 【請求項5】 被験試料をまず捕捉試薬および不活性固
    相とインキュベートし、次いで不活性固相を除去し、そ
    の後活性固相および検出試薬をインキュベートする、請
    求項1〜4のいずれかに記載の方法。
  6. 【請求項6】 互いに特異的に結合できるビオチン/ア
    ビジン、ビオチン/ストレプトアビジン、抗原/抗体、
    ハプテン/抗−ハプテン抗体ペアまたはその断片を特異
    的結合ペアとして用いる、請求項1〜5のいずれかに記
    載の方法。
  7. 【請求項7】 不活性固相を製造する間、アビジンまた
    はストレプトアビジンをビオチンまたはビオチン誘導体
    で飽和することにより不活性化する、請求項6記載の方
    法。
  8. 【請求項8】 アビジンまたはストレプトアビジンを活
    性中心の共有結合修飾により不活性化する、請求項6記
    載の方法。
  9. 【請求項9】 活性中心の少なくとも1個のアミノ酸を
    誘導体とするか、または共有結合修飾するために活性中
    心にビオチンを共有結合的にカップリングする、請求項
    8記載の方法。
  10. 【請求項10】 活性中心へのビオチンの共有結合的カ
    ップリングを光活性化されうるビオチンによって行う、
    請求項8または9記載の方法。
  11. 【請求項11】 不活性固相を製造する間、1または複
    数のアミノ酸残基の置換、欠失、または挿入による遺伝
    子操作によって活性中心を修飾することによってアビジ
    ンまたはストレプトアビジンを不活性化する、請求項6
    記載の方法。
  12. 【請求項12】 測定すべき物質と特異的に結合する検
    出試薬を用いる、請求項1〜11のいずれかに記載の方
    法。
  13. 【請求項13】 測定すべき物質と結合部位を競合する
    検出試薬を用いる、請求項1〜11のいずれかに記載の
    方法。
  14. 【請求項14】 イムノアッセイまたは核酸ハイブリダ
    イゼーションアッセイに使用する不活性固相であって、
    イムノアッセイまたは核酸ハイブリダイゼーションアッ
    セイで使用する固相に対応するが、2つの異なる結合部
    位という手段によって試料中の測定すべき物質を特異的
    に検出することを可能とする捕捉試薬であって、該試薬
    は活性固相に特異的結合ペアを介して結合されているか
    または結合することができ、該結合ペアの第1パートナ
    ーは捕捉試薬に連結し、第2パートナーは活性固相にカ
    ップリングする該試薬への結合が起こらないように修飾
    されており、かつ特異的結合ペアの不活性な結合パート
    ナーを含む、上記不活性固相。
  15. 【請求項15】 結合ペアのパートナーがアビジンまた
    はストレプトアビジンである、請求項14記載の不活性
    固相。
  16. 【請求項16】 アビジンまたはストレプトアビジンを
    ビオチンまたはビオチン誘導体で飽和することにより不
    活性化する、請求項15記載の不活性固相。
  17. 【請求項17】 アビジンまたはストレプトアビジンを
    活性中心の共有結合修飾により不活性化する、請求項1
    5記載の不活性固相。
  18. 【請求項18】 活性中心の少なくとも1個のアミノ酸
    を誘導体とするか、または共有結合修飾するために活性
    中心にビオチンを共有結合的にカップリングする、請求
    項17記載の不活性固相。
  19. 【請求項19】 活性中心へのビオチンの共有結合的カ
    ップリングを光活性化されうるビオチンによって行う、
    請求項18記載の不活性固相。
  20. 【請求項20】 1または複数のアミノ酸残基の置換、
    欠失、または挿入による遺伝子操作によってアビジンま
    たはストレプトアビジンの活性中心を修飾することによ
    って不活性化を行う、請求項15記載の不活性固相。
  21. 【請求項21】 イムノアッセイまたは核酸ハイブリダ
    イゼーションアッセイの成分ならびに請求項14〜20
    のいずれかに記載の不活性固相を含む、被検試料中の測
    定すべき物質を定性的または/および定量的に検出する
    ためのイムノアッセイまたは核酸ハイブリダイゼーショ
    ンアッセイのための試験キット。
  22. 【請求項22】 イムノアッセイまたは核酸ハイブリダ
    イゼーションアッセイにおいて固相への非特異的結合に
    よる妨害を回避する方法であって、該方法は少なくとも
    以下の成分: a)2つの異なる結合部位という手段によって試料中の
    測定すべき物質を特異的に検出することを可能とする捕
    捉試薬であって、該試薬は活性固相に特異的結合ペアを
    介して結合されているかまたは結合することができ、該
    結合ペアの第1パートナーは捕捉試薬に連結し、第2パ
    ートナーは活性固相にカップリングする該試薬、 b)少なくとも2つの活性固相、 を使用し、ここで捕捉試薬を加える前に被験試料を第1
    活性固相の存在下にインキュベートし、その後被験試料
    をこの第1固相から分離し、次いで捕捉試薬および第2
    の実質的に同じ固相の存在下にインキュベーションを行
    い、測定すべき物質を適当な方法で検出する、 ことからなる上記方法。
  23. 【請求項23】 追加の試験成分をさらに使用する請求
    項22記載の方法。
  24. 【請求項24】 追加の試験成分が、捕捉試薬と一緒に
    なって測定すべき物質の特異的検出を可能にし、かつ間
    接または直接の標識をもつ検出試薬であって、そして測
    定すべき物質を、活性固相上で、または/および試料上
    清中で標識を測定することにより検出する、請求項23
    記載の方法。
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