CN111902720A - 基于非抗体高亲和力的样品制备、吸附剂、装置和方法 - Google Patents

基于非抗体高亲和力的样品制备、吸附剂、装置和方法 Download PDF

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Abstract

在各个方面,本公开涉及用于从液体样品中分离至少一种靶蛋白的吸附剂,该吸附剂包含固体载体,该固体载体包含对至少一种靶蛋白具有亲和力的附接的至少一种附接的高亲和力试剂。本公开的其他方面包括含有此类吸附剂的试剂盒以及使用该试剂盒处理样品的方法。

Description

基于非抗体高亲和力的样品制备、吸附剂、装置和方法
相关申请
本申请要求2018年3月21日提交的美国临时申请号62/646,277的权益,该申请的全部公开内容以引用方式并入。
技术领域
本公开涉及高亲和力吸附剂、装置及其使用方法,例如结合用于蛋白质耗尽和/或用于具有增强的回收率的低丰度蛋白质富集的过程。
背景技术
从血浆、血清或全血样品中识别和定量低丰度蛋白质(LAP)对研究者提出了挑战。这主要是由于存在高丰度蛋白质(HAP)。就这一点而言,10-12个HAP占血浆或血清的总蛋白质质量的约95%,其中人血清白蛋白是最普遍的HAP,通常占血浆或血清的总蛋白质质量的一半以上。其余的蛋白质构成LAP,并且许多生物标志物属于该类别。HAP的存在增加了噪声水平,这继而在执行分析时降低了信噪比。
识别和定量LAP的两种关键方法涉及基于亲和力的LAP富集和/或基于亲和力的HAP耗尽。市场上现有的产品的缺点包括(a)不能去除结合到载体蛋白诸如人血清白蛋白(已知其充当LAP的载体蛋白)的LAP,(b)不能特异性捕获低丰度蛋白质,以及(c)在耗尽HAP后需要蛋白沉淀和重构,这是导致LAP损失的步骤。
发明内容
在各个方面,本公开涉及样品处理的方法,该方法包括:(a)将包含样品的样品流体添加到吸附剂,该样品包含或可能包含至少一种靶蛋白,该吸附剂包含具有至少一种附接的高亲和力试剂的固体载体,该高亲和力试剂对靶蛋白具有特定高亲和力,从而得到具有结合的靶蛋白的吸附剂;以及(b)将包含表面活性剂和盐的洗涤溶液添加到吸附剂,从而移除至少一种高亲和力试剂对其不具有特定亲和力的物质(包括通过附接到至少一种靶蛋白而间接结合到吸附剂的所述物质)。
在各种实施方案中,靶蛋白为感兴趣的蛋白质,并且感兴趣的蛋白质在吸附剂上分离以用于进一步处理。
在各种实施方案中,靶蛋白不是感兴趣的蛋白质(例如,其中蛋白质是高丰度蛋白质等),并且可收集洗涤溶液以用于感兴趣的蛋白质的进一步下游处理。
在可结合前述方面和实施方案中的任一者使用的各种实施方案中,样品可选自全血样品、血浆样品和血清样品。
在可结合前述方面和实施方案中的任一者使用的各种实施方案中,可通过将样品与破坏蛋白质结合的预处理溶液组合来制备样品流体。例如,预处理溶液可包含酸性或碱性水溶液,例如,预处理溶液可选自H3PO4水溶液、NH4OH水溶液、乙二胺四乙酸(EDTA)水溶液、甲酸水溶液、乙酸水溶液、三氯乙酸(TCA)水溶液和三氟乙酸(TFA)水溶液。
在可结合前述方面和实施方案中的任一者使用的各种实施方案中,洗涤溶液可为高严格性洗涤溶液。
在可结合前述方面和实施方案中的任一者使用的各种实施方案中,盐可为离液盐。
在可结合前述方面和实施方案中的任一者使用的各种实施方案中,盐可选自LiCl、KCl、NaCl、CsCl、LiI、KI、NaI、ScI、LiSCN、KSCN、NaSCN、CsSCN、Na2CO3、NaHCO3、NH4HCO3、Na2NO3、NaClO4、四甲基氯化铵、四乙基氯化铵和三甲基氯化铵。
在可结合前述方面和实施方案中的任一者使用的各种实施方案中,表面活性剂可为酸不稳定性表面活性剂。酸不稳定性表面活性剂的示例包括3-[(2-甲基-2-十一烷基-1,3-二氧戊环-4-基)甲氧基]-1-丙烷磺酸钠、3-(4-(1,1-双(己氧基)乙基)吡啶鎓-1-基)丙烷-1-磺酸钠和3-((1-(呋喃-2-基)十一烷氧基)羰基氨基)丙烷-1-磺酸钠等等。
在可结合前述方面和实施方案中的任一者使用的各种实施方案中,表面活性剂可为离子表面活性剂。例如,离子表面活性剂可选自十二烷基硫酸钠(SDS)、脱氧胆酸钠、胆酸钠和月桂酰肌氨酸钠等等。
在可结合前述方面和实施方案中的任一者使用的各种实施方案中,表面活性剂可为非离子表面活性剂。例如,非离子表面活性剂可选自聚山梨醇酯表面活性剂(包括聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯(Tween20)和聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯(Tween80))、洋地黄皂苷、麦芽糖苷(包括正十二烷基-β-D-麦芽糖苷(DDM)、正辛基-β-D-麦芽糖苷(DDM))、葡糖苷(包括辛基葡糖苷和癸基葡糖苷)、3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸内盐(CHAPS)、3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸内盐水合物(CHAPSO)和聚乙二醇对-(1,1,3,3-四甲基丁基)-苯基醚(Triton X-100)。
在可结合前述方面和实施方案中的任一者使用的各种实施方案中,靶蛋白可为高丰度蛋白质或者靶蛋白可为低丰度蛋白质。
高丰度蛋白质的示例包括白蛋白、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白D(IgD)、免疫球蛋白D(IgE)、α-1-抗胰蛋白酶、转铁蛋白、结合珠蛋白、纤维蛋白原、结合球蛋白、α-2-巨球蛋白、补体C3、载脂蛋白A-I、载脂蛋白A-II、载脂蛋白B、α-1-酸性糖蛋白、血浆铜蓝蛋白、补体C4、补体C1q、前白蛋白、纤溶酶原、转甲状腺素蛋白、以及它们的组合等等。
低丰度蛋白质的示例包括血浆铜蓝蛋白、补体因子C4、C9、C8和C5、IgD、C1抑制剂、RBP、iC3b、甲状腺素结合球蛋白、补体蛋白、血栓前体蛋白、C反应蛋白、Bb片段、铁蛋白、randes、SC5b-9复合物、肌红蛋白、甲状腺球蛋白、TPA(组织纤溶酶原激活物)、神经元特异性烯醇酶、C-肽、甲胎蛋白、TNF-结合蛋白、PSA(前列腺特异性抗原)、前列腺酸性磷酸酶、CEA(癌胚抗原)、髓鞘碱性蛋白、肌钙蛋白I、白介素、MIP_1α、组织因子、GCSF(粒细胞集落刺激因子)、干扰素、以及它们的组合等等。
在例如其中蛋白质为低丰度蛋白质的方面和实施方案中,该方法还可包括将洗脱溶液添加到吸附剂,从而从吸附剂移除低丰度蛋白质。
在例如其中蛋白质为低丰度蛋白质的方面和实施方案中,低丰度蛋白质可在结合到吸附剂时消化成片段,并且可洗脱片段。例如,(a)可通过将包含蛋白水解酶的溶液添加到吸附剂来消化靶蛋白,或(b)吸附剂可包含附接的蛋白水解酶,并且可通过活化蛋白水解酶来将低丰度蛋白质消化成片段(例如,低丰度蛋白质可通过包括化学裂解和释放蛋白水解酶的方法消化成片段)。
在例如其中蛋白质为低丰度蛋白质的方面和实施方案中,该方法还可包括将洗脱溶液添加到吸附剂,这导致结合到低丰度蛋白质的高亲和力试剂的复合物从吸附剂中释放。例如,高亲和力试剂可通过可酶促裂解的键连接到载体,并且洗脱溶液可包含裂解可酶促裂解的键的酶。
在例如其中蛋白质为低丰度蛋白质的方面和实施方案中,(a)高亲和力试剂可通过可在暴露于亲核和/或碱性条件时,在暴露于亲电子和/或酸性条件时,或在暴露于还原条件时裂解的键连接到载体,并且(b)吸附剂可暴露于建立此类条件的洗脱溶液,从而裂解高亲和力试剂与结合的靶蛋白的复合物。
在各个方面,本公开涉及用于从液体样品中分离至少一种靶蛋白的吸附剂,该吸附剂包含固体载体,该固体载体包含对至少一种靶蛋白具有亲和力的附接的至少一种附接的高亲和力试剂。
在各种实施方案中,可针对至少一种高亲和力试剂对低丰度蛋白质的高亲和力、对高丰度蛋白质的高亲和力或两者来选择至少一种高亲和力试剂。高丰度蛋白质的示例包括白蛋白、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白D(IgD)、免疫球蛋白D(IgE)、α-1-抗胰蛋白酶、转铁蛋白、结合珠蛋白、纤维蛋白原、结合球蛋白、α-2-巨球蛋白、补体C3、载脂蛋白A-I、载脂蛋白A-II、载脂蛋白B、α-1-酸性糖蛋白、血浆铜蓝蛋白、补体C4、补体C1q、前白蛋白、纤溶酶原、转甲状腺素蛋白、以及它们的组合等等。低丰度蛋白质的示例包括血浆铜蓝蛋白、补体因子C4、C9、C8和C5、IgD、C1抑制剂、RBP、iC3b、甲状腺素结合球蛋白、补体蛋白、血栓前体蛋白、C反应蛋白、Bb片段、铁蛋白、randes、SC5b-9复合物、肌红蛋白、甲状腺球蛋白、TPA(组织纤溶酶原激活物)、神经元特异性烯醇酶、C-肽、甲胎蛋白、TNF-结合蛋白、PSA(前列腺特异性抗原)、前列腺酸性磷酸酶、CEA(癌胚抗原)、髓鞘碱性蛋白、肌钙蛋白I、白介素、MIP_1α、组织因子、GCSF(粒细胞集落刺激因子)、干扰素、以及它们的组合等等。
在可结合前述方面和实施方案中的任一者使用的各种实施方案中,固体载体可包含无机材料、有机材料或杂化有机-无机材料。
在可结合前述方面和实施方案中的任一者使用的各种实施方案中,固体载体可包含聚合物材料。例如,聚合物材料可包含共聚物,该共聚物包含疏水单体(例如,二乙烯基苯、苯乙烯等)和亲水单体(例如,乙烯基吡咯烷酮、N-乙烯基己内酰胺等)。
在可结合前述方面和实施方案中的任一者使用的各种实施方案中,吸附剂可选自强阳离子交换吸附剂、强阴离子交换吸附剂、弱阳离子交换吸附剂和弱阴离子交换吸附剂。
在可结合前述方面和实施方案中的任一者使用的各种实施方案中,至少一种高亲和力试剂可通过可化学裂解的键连接到固体载体。例如,至少一种高亲和力试剂可通过可在暴露于亲核和/或碱性条件时,在暴露于亲电子和/或酸性条件时,或在暴露于还原条件时裂解的键连接到固体载体。
在可结合前述方面和实施方案中的任一者使用的各种实施方案中,至少一种高亲和力试剂可通过可酶促裂解的键(例如,可通过蛋白水解酶裂解的键)连接到固体载体。在这些实施方案中的某些实施方案中,固体载体可包含附接的酶(例如,通过可化学裂解的键连接到载体的酶),该酶适于从固体载体酶促裂解至少一种高亲和力试剂,从而允许该至少一种高亲和力试剂和靶蛋白的复合物从固体载体释放以用于进一步处理。
在可结合前述方面和实施方案中的任一者使用的各种实施方案中,固体载体包含附接的酶,该附接的酶可适于在附接的酶活化后消化靶蛋白。
在可结合前述方面和实施方案中的任一者使用的各种实施方案中,固体载体包含附接的蛋白水解酶。例如,蛋白水解酶可选自胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、Glu-C、Lys-C、Arg-C、Asp-N、BNPS或NCS/脲、梭菌蛋白酶、CNBr、CNBr(甲基-Cys)、CNBr(具有酸)、甲酸、羟胺、亚碘酰苯甲酸、Lys-N、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、NBS、NTCB、胰弹性蛋白酶、胃蛋白酶A、脯氨酰内肽酶、蛋白酶K、葡萄球菌肽酶I、嗜热菌蛋白酶以及它们的组合等等。
在可结合前述方面和实施方案中的任一者使用的各种实施方案中,固体载体包含附接的蛋白水解酶,该附接的蛋白水解酶通过柔性连接基附接到固体载体。
在可与前述方面和实施方案中任一者结合使用的各种实施方案中,固体载体包含附接的蛋白水解酶,该附接的蛋白水解酶通过可裂解连接基附接到固体载体。例如,蛋白水解酶可通过可酶促裂解的连接基附接到固体载体。作为另一个示例,蛋白水解酶可通过可化学裂解的连接基附接到吸附剂。例如,可化学裂解的连接基可选自在暴露于亲核和/或碱性条件时裂解的化学连接基,在暴露于亲电子和/或酸性条件时裂解的化学连接基,在暴露于还原条件时裂解的化学连接基,在暴露于氧化条件时裂解的化学连接基,羟胺可裂解连接基,含有双-琥珀酰亚胺酯的化学连接基,含有双酰基叠氮的化学连接基以及含有双马来酰亚胺的化学连接基。
在可结合前述方面和实施方案中的任一者使用的各种实施方案中,蛋白水解酶可通过pH的变化而被化学活化,或者蛋白水解酶可通过加热或冷却而被热活化。
在可结合前述方面和实施方案中的任一者使用的各种实施方案中,吸附剂可设置在多孔条带、多孔板、柱、一次性料筒或ELISA板中。
在另外的方面,本公开涉及试剂盒,该试剂盒包含根据前述方面和实施方案中的任一者的吸附剂,以及选自以下各项的一种或多种试剂盒组分:(a)包含表面活性剂和盐的洗涤溶液、(b)预处理溶液、(c)一种或多种洗脱溶液、(d)一种或多种蛋白水解酶溶液、(e)收集板、(f)帽垫、(g)校准和参考标准物、以及(h)使用说明。
在可结合前述方面和实施方案中的任一者使用的各种实施方案中,高亲和力试剂可为适体或亲和体。
附图说明
图1是适体序列、功能性三维形式的适体序列、以及结合到靶标的适体的示意图。
图2A是根据本公开的实施方案的高亲和力试剂的示意图,该高亲和力试剂靶向样品中的附接到固体吸附剂颗粒的至少单一蛋白质。
图2B是附接到吸附剂颗粒的高亲和力试剂的示意图,该吸附剂颗粒下拉其靶蛋白以及通过弱化学相互作用附接到靶蛋白的非靶蛋白。
具体实施方式
本公开涉及基于亲和力的方法,并且涉及有益于执行基于亲和力的方法的吸附剂、装置和试剂盒。
就这一点而言,在一些方面,本公开涉及可用于从液体样品中分离至少一种靶蛋白的吸附剂,该吸附剂包含其上附接有亲和力试剂诸如适体或亲和体的固体载体材料,该亲和力试剂对至少一种靶蛋白具有高亲和力。
如本文所用,“适体”是选择性地结合到非核酸靶分子的核酸(例如,DNA、RNA等)。在一些实施方案中,本文所用的适体的长度可在15-80个核苷酸碱基的范围内。
图1是适体序列110s、活化的功能性三维形式的适体序列110f、以及结合靶120的功能性三维形式的适体序列110f的示意图,该靶在所示的特定实施方案中是生物标志物。适体在使用前可例如通过加热(例如,加热至85℃-90℃)来活化。
作为具体示例,标识为23G03(Oligo#372)的人血清白蛋白适体购自美国德克萨斯州休斯顿的Base Pair Technologies公司(Base Pair Technologies,Houston,Texas,USA),其含有39个碱基(没有3′-6T)或45个碱基(具有3′-6T),具有14,237.4g/mol的报告分子量(包括3′-6T和生物素)和29.1nM的Kd。除了生物素之外,3’位置也可用胺基团和硫醇基团修饰。5’端可用胺、硫醇、异硫氰酸荧光素(FITC)或花菁5(Cy5)修饰。可用的其他适体包括例如免疫球蛋白G(IgG)Fc适体、纤维蛋白原适体和人免疫球蛋白M(IgM)mu链适体等等。
如本文所用,“亲和体”是显示肽环并且选择性地结合到特定靶分子的稳定蛋白质分子。通常,亲和体包含具有2个可变环的固定核心结构,该可变环为特定靶蛋白提供高亲和力结合表面。在某些实施方案中,亲和体可以是衍生自胱抑素的半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族的低分子量(例如,12-14kDa)的蛋白质。
可用于本公开的吸附剂的固体载体材料包括亲和力试剂(例如,适体和/或亲和体)可附接至其的任何合适的固体载体材料。固体载体材料的示例包括有机材料、无机材料和有机-无机杂化材料。
无机材料的示例包括例如基于二氧化硅的材料、基于氧化铝的材料、基于二氧化钛的材料、基于氧化锆的材料和基于碳的材料。
在某些有益的实施方案中,固体载体包含通过水解缩合一种或多种有机硅烷化合物而形成的基于二氧化硅的材料,该有机硅烷化合物可例如包含一种或多种烷氧基硅烷化合物。烷氧基硅烷化合物的示例包括例如四烷氧基硅烷(例如,四甲氧基硅烷(TMOS)、四乙氧基硅烷(TEOS)等)、烷基烷氧基硅烷诸如烷基三烷氧基硅烷(例如,甲基三甲氧基硅烷、甲基三乙氧基硅烷(MTOS)、乙基三乙氧基硅烷等)和双(三烷氧基甲硅烷基)烷烃(例如,双(三甲氧基甲硅烷基)甲烷、双(三甲氧基甲硅烷基)乙烷、双(三乙氧基甲硅烷基)甲烷、双(三乙氧基甲硅烷基)乙烷(BTE)等),以及前述的组合。
在某些实施方案中,基于二氧化硅的材料可由两种单体制备:四烷氧基硅烷,诸如TMOS或TEOS,和烷基烷氧基硅烷诸如MTOS,或双(三烷氧基甲硅烷基)烷烃,诸如BTEE。当BTEE用作单体时,所得材料有时被称为乙烯桥联杂化(BEH)材料,并且提供优于常规基于二氧化硅的材料的各种优点,包括控制表面硅烷醇活性的能力、化学稳定性和机械稳定性。
在某些有益的实施方案中,固体载体包含聚合物形式的有机材料或有机-无机杂化材料。在特定实施方案中,聚合物可为包含亲水单体(例如,N-乙烯基吡咯烷酮、N-乙烯基己内酰胺等)和疏水单体(例如,二乙烯基苯、苯乙烯等)的共聚物。
在某些实施方案中,吸附剂可为离子交换吸附剂,例如,强阳离子交换吸附剂(例如,含有聚合物,该聚合物包含具有一个或多个强阴离子基团诸如磺酸根基团的单体,例如具有一个或多个磺酸根基团的二乙烯基苯)、强阴离子交换吸附剂(例如,含有聚合物,该聚合物包含具有一个或多个强阳离子基团诸如季铵基团的单体,例如具有一个或多个季铵基团的二乙烯基苯)、弱阳离子交换吸附剂(例如,含有聚合物,该聚合物包含具有一个或多个弱阴离子基团诸如羧基基团的单体,例如具有一个或多个羧基基团的二乙烯基苯)或弱阴离子交换吸附剂(例如,含有聚合物,该聚合物包含具有一个或多个弱阳离子基团诸如伯胺、仲胺或叔胺基团的单体,例如具有一个或多个伯胺、仲胺或叔胺基团(例如,一个或多个哌嗪基团)的二乙烯基苯)。
在各个方面,所采用的吸附剂是包含固体载体材料的颗粒的颗粒吸附剂,该固体载体材料诸如为上文所述的具有附接到其上的亲和力试剂的那些固体载体材料。
在其他方面,吸附剂可为在具有附接到其上的亲和力试剂的薄片上的整料、气凝胶、膜、水凝胶、纤维材料或的微通道。
结合本公开使用的吸附剂颗粒的尺寸可广泛变化,并且除其他颗粒尺寸外,直径可在例如约1um至约100um的范围内。
结合本公开使用的吸附剂颗粒可为无孔的、表面多孔的或完全多孔的,包括具有孔的颗粒,除其他值外,该孔的直径在约8nm至约2500nm范围内。
结合本公开使用的吸附剂颗粒可为多孔或无孔磁性颗粒。
亲和力试剂(例如适体和/或亲和体)可使用任何合适的结合方案(包括共价和非共价附接)附接到固体载体材料。
例如,参考图2A,示出了根据本公开的实施方案的具有附接的高亲和力试剂200的吸附剂颗粒的示意图,该高亲和力试剂能够靶向样品中的至少单一蛋白质。在所示的实施方案中,具有附接的生物素分子212的适体210(即,生物素酰化适体)附接到具有附接的链霉抗生物素蛋白分子214(比如以下实施例中所述)的吸附剂颗粒(例如,BEH颗粒216)。数字218表示酪蛋白。
根据本公开的装置通常在填充的吸附剂床中包括如本文所述的高亲和力吸附剂。
根据本公开的装置通常包括具有用于接纳和保持高亲和力吸附剂的室的壳体。在各种实施方案中,壳体可设置有入口和出口。
用于壳体的构造材料包括无机材料,例如,金属诸如不锈钢和陶瓷诸如玻璃,以及合成聚合物材料诸如聚乙烯、聚丙烯和聚醚醚酮(PEEK)和聚碳酸酯。
在某些实施方案中,装置可包括用于将吸附剂保持在壳体中的一个或多个过滤器。示例性过滤器可为例如膜、筛网、玻璃料或球形多孔过滤器的形式。
在某些实施方案中,接收在壳体中的溶液可自发地(例如,通过毛细管作用)流入高亲和力吸附剂中。作为另外一种选择,可通过外力(诸如重力或离心)或者通过向壳体的出口施加真空或者向壳体的入口施加正压力来产生穿过吸附剂的流。
用于本公开的壳体的具体示例包括例如注射器,注射筒,柱(例如,微孔柱、毛细管柱或纳米柱),多孔装置诸如4孔至8孔支架、4孔至8孔条带、48孔至96孔板、96孔至384孔微洗脱板,微洗脱尖端装置(包括4至8尖端微洗脱条带、96至384微洗脱尖端阵列、单个微洗脱移液管尖端)、薄层板,微量滴定板,旋转管或旋转容器。
多孔形式通常与机器人流体分配系统一起使用。典型的多孔形式包括48孔、96孔和384孔标准板形式,但其他形式显然也是可能的。
在各个方面,本公开涉及进行样品富集的方法,该方法包括使包含具有至少一种靶蛋白的样品的样品流体与根据本公开的吸附剂接触。
样品流体可以是含有或可能含感兴趣的靶蛋白的任何流体。在一些实施方案中,样品流体可为例如水性溶液或水混溶性有机溶液的形式。
在一些实施方案中,样品流体是或来源于生物样品。示例性生物样品包括生物流体、生物组织、生物基质、包埋的组织样品、包含体、细胞(例如,一种或多种类型的细胞)和细胞培养上清液。生物样品的特定示例可包括全血、血浆、血清、尿液、脑脊液、滑液、痰、精液、唾液、泪液、胃液和其他生物流体,包括组织(诸如肝组织、肌肉组织、脑组织、心脏组织等)的提取物。
在一些实施方案中,样品流体是或来源于反应混合物、制备性HPLC、色谱洗脱液或级分、或环境样品。
在一些实施方案中,可通过包括添加破坏蛋白质结合的预处理溶液的方法来制备样品流体。例如,在一些情况下,样品流体可包含与破坏蛋白质结合的预处理溶液结合的生物样品。破坏蛋白质结合的预处理溶液的示例包括酸性水溶液和碱性水溶液。在某些特定实施方案中,可采用预处理水溶液,其包含乙二胺四乙酸(EDTA)、甲酸、乙酸、三氯乙酸(TCA)、三氟乙酸(TFA)、磷酸、NH4OH以及它们的组合等等。
在一些实施方案中,靶蛋白可包含例如一种或多种高丰度蛋白质。
高丰度蛋白质的示例包括白蛋白、高丰度免疫球蛋白诸如免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白D(IgD)和免疫球蛋白E(IgE)、α-1-抗胰蛋白酶、转铁蛋白、结合珠蛋白、纤维蛋白原、结合球蛋白、α-2-巨球蛋白、补体C3、载脂蛋白A-I、载脂蛋白A-II、载脂蛋白B、α-1-酸性糖蛋白、血浆铜蓝蛋白、补体C4、补体C1q、前白蛋白、纤溶酶原、转甲状腺素蛋白、以及它们的组合。
在一些实施方案中,靶蛋白可包含例如一种或多种低丰度蛋白质。
低丰度蛋白质的示例包括血浆铜蓝蛋白、补体因子诸如C4、C9、C8、C5、IgD、C1抑制剂、RBP、iC3b、甲状腺素结合球蛋白、补体蛋白、血栓前体蛋白、C反应蛋白、Bb片段、铁蛋白、randes、SC5b-9复合物、肌红蛋白、甲状腺球蛋白、TPA(组织纤溶酶原激活物)、神经元特异性烯醇酶、C-肽、甲胎蛋白、TNF-结合蛋白、PSA(前列腺特异性抗原)、前列腺酸性磷酸酶、CEA(癌胚抗原)、髓鞘碱性蛋白、肌钙蛋白I、白介素、MIP_1α、组织因子、GCSF(粒细胞集落刺激因子)、干扰素、以及它们的组合。
在涉及LAP的某些实施方案中,亲和力试剂可通过可裂解连接基附接到固体载体材料,使得亲和力试剂连同任何结合的蛋白质可从载体释放。可裂解连接基包括化学不稳定性连接基和可酶促裂解的连接基。
可酶促裂解的连接基包括具有特定序列的基于肽的连接基,该基于肽的连接基在暴露于合适的酶(例如,蛋白酶)时裂解,尤其是对特定肽序列具有特异性的酶,例如半胱天冬酶-1、半胱天冬酶-2、半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-4、半胱天冬酶-5、半胱天冬酶-6、半胱天冬酶-7、半胱天冬酶-8、半胱天冬酶-9、半胱天冬酶-10、组织蛋白酶B、肠激酶、因子Xa、颗粒酶B、HRV3C蛋白酶、基质金属蛋白酶-2、TEV蛋白酶、凝血酶等。
化学不稳定性连接基包括在暴露于亲核和/或碱性条件时裂解的连接基(例如,基于可裂解基团,诸如二烷基二烷氧基硅烷、氰乙基、砜、乙二醇基二琥珀酸酯2-N-酰基硝基苯磺酰胺、α-噻吩酯、不饱和乙烯基硫醚、活化后的磺酰胺、丙二醛(MDA)-吲哚衍生物、乙酰丙酸酯、肼、酰腙和烷基硫酯、以及其他可裂解基团)。化学不稳定性连接基还包括在暴露于亲电子和/或酸性条件时裂解的连接基(例如,基于可裂解基团的连接基,诸如对甲氧基苄基衍生物、氨基甲酸叔丁酯类似物、二烷基或二芳基二烷氧基硅烷、原酸酯、缩醛、乌头酰基、腙、β-硫代丙酸酯、氨基磷酸酯、亚胺、三苯甲基、乙烯基醚、聚缩酮、2-(二苯基膦基)苯甲酸烷基酯衍生物和4-(4′-乙酰基苯氧基)丁酸,以及其他可裂解基团)。化学不稳定性连接基还包括在暴露于还原条件时裂解的连接基(例如,连接基诸如二硫键、重氮连接基等),可在暴露于氧化条件时裂解的连接基诸如包含二醇的那些连接基,以及羟胺可裂解连接基诸如包含酯的那些连接基。化学不稳定性同官能连接基,诸如含有可裂解的双琥珀酰亚胺酯、双酰基叠氮和双马来酰亚胺的那些连接基。
在各种实施方案中,本文所述的方法可首先包括使包含一种或多种靶蛋白的样品流体与吸附剂接触,该吸附剂包含具有附接的亲和力试剂(例如,适体或亲和体)的固体载体,该附接的亲和力试剂对一种或多种靶蛋白具有特定亲和力(此类吸附剂在上文更详细地描述),从而导致吸附剂结合到一种或多种靶蛋白。就这一点而言,可将不同的亲和力试剂附接到吸附剂以允许同时捕获多种靶蛋白。吸附剂可有益地包含相对于样品流体中的一种或多种靶蛋白摩尔过量的附接亲和力试剂。
该方法经常被称为“装载”方法,并且通常涉及使样品流体通过包含吸附剂的装置(此类装置在上文更详细地描述)。在装载期间,一种或多种靶蛋白连同各种非预期非靶物质(包括非靶蛋白)被吸附到吸附剂上。例如,具有如图2A所示的附接的高亲和力试剂200的吸附剂颗粒可用于结合到靶蛋白310以及通过弱化学相互作用附接到靶蛋白310的各种非靶蛋白312,如图2B中示意性所示。
加载期间的接触时间和/或流速可针对适当的扩散动力学和一种或多种靶蛋白与吸附剂的结合进行优化。如果需要,样品流体可多次通过装置。
在某些实施方案中,例如,在吸附剂不易被水润湿的情况下,可在样品装载之前进行调理和平衡步骤。例如,在示例性实施方案中,除了其他可能性之外,可使用甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、水以及它们的混合物来进行调理。例如,在示例性实施方案中,平衡溶液可与样品溶液具有类似或相同的离子强度,以在装载样品溶液时在吸附剂中提供平衡的分配环境。示例性平衡溶液/溶剂可以是但不限于水、水性溶液诸如缓冲溶液(例如,磷酸盐缓冲溶液)、水混溶性有机溶剂溶液等。
在某些实施方案中,例如,在吸附剂为充分水可润湿的情况下,可在样品装载之前省略调理和平衡。
一旦将样品装载到吸附剂上,就可使一种或多种洗涤溶液与吸附剂接触以从靶蛋白分离非靶物质(例如,亲和力试剂对其不具有特定亲和力的物质),从而导致非靶物质的洗脱,同时允许靶蛋白仍保留在吸附剂上。
在各种实施方案中,一种或多种洗涤溶液可包括低严格性洗涤溶液、高严格性洗涤溶液或两者。
如本文所用,“高严格性”洗涤溶液是能够破坏靶蛋白(P)和配体(L)之间的高亲和力相互作用(具体地讲,靶蛋白(P)和配体(L)之间的10-8M Kd或更高的相互作用,其中Kd是平衡解离常数)的洗涤溶液。在配体-蛋白质复合物的形成的情况下,LP可以通过双态方法
Figure BDA0002692280680000131
来描述,对应的平衡解离常数为
Figure BDA0002692280680000132
其中[L]、[P]和[LP]分别表示蛋白质(P)、配体(L)和配体-蛋白质复合物(LP)的摩尔浓度。如本文所用,“低严格性”洗涤溶液是能够破坏低亲和力相互作用(具体地讲,靶蛋白(P)和配体(L)之间的10-8M Kd或更高的相互作用)的洗涤溶液。
在本公开中,对靶蛋白具有特定高亲和力的高亲和力试剂通常为其中靶蛋白(P)和配体(L)(在这种情况下为高亲和力试剂)之间的相互作用为10-8M Kd或更高的试剂。
在各种实施方案中,一种或多种洗涤溶液可包含一种或多种表面活性剂和一种或多种离液盐。
除了其他之外,离液盐的示例可包括以下各项:LiCl、KCl、NaCl、CsCl、LiI、KI、NaI、ScI、LiSCN、KSCN、NaSCN、CsSCN、Na2CO3、NaHCO3、NH4HCO3、Na2NO3、NaClO4、四甲基氯化铵、四乙基氯化铵和三甲基氯化铵等等。
在各种实施方案中,一种或多种表面活性剂可包括离子表面活性剂或非离子表面活性剂。除了其他之外,离子表面活性剂的示例可包括以下各项:十二烷基硫酸钠(SDS)、脱氧胆酸钠、胆酸钠和月桂酰肌氨酸钠(肌氨酰)。除了其他之外,非离子表面活性剂的示例可包括以下各项:聚山梨醇酯表面活性剂(包括聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯(Tween20)和聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯(Tween80))、洋地黄皂苷、麦芽糖苷(包括正十二烷基-β-D-麦芽糖苷(DDM)、正辛基-β-D-麦芽糖苷(DDM))、葡糖苷(包括辛基葡糖苷和癸基葡糖苷)、3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸内盐(CHAPS)、3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸内盐水合物(CHAPSO)和聚乙二醇对-(1,1,3,3-四甲基丁基)-苯基醚(Triton X-100)。
在各种实施方案中,一种或多种表面活性剂可包括一种或多种酸不稳定性表面活性剂。除了其他之外,酸不稳定性表面活性剂的示例可包括以下各项:3-[(2-甲基-2-十一烷基-1,3-二氧戊环-4-基)甲氧基]-1-丙烷磺酸钠(以RapiGestTMSF表面活性剂购自美国马萨诸塞州米尔福德的沃特世公司(Waters Corporation,Milford,MA,USA))、3-(4-(1,1-双(己氧基)乙基)吡啶鎓-1-基)丙烷-1-磺酸钠(以PPS SilentTM表面活性剂购自英国剑桥郡的Expedeon公司(Expedeon Ltd.,Over Cambridgeshire,United Kingdom))和3-((1-(呋喃-2-基)十一烷氧基)羰基氨基)丙烷-1-磺酸钠(以ProteaseMAXTM购自美国威斯康星州菲奇堡的普洛麦格公司(Promega Corporation,Fitchburg,WI,USA))。
HAP。在一些实施方案中,靶蛋白可以是一个或多个HAP,并且本文所述的方法可用于从样品流体中耗尽一个或多个HAP,从而改善随后识别、定量或以其他方式处理样品流体中的各种非靶物质(包括一个或多个LAP)的能力。在一些实施方案中,可使用含有对于捕获LAP具有特异性的高亲和力吸附剂的第二装置来捕获和富集来自样品的LAP。
一种或多种洗涤溶液可包括低严格性洗涤、高严格性洗涤或两者。
例如,低严格性洗涤可使用含有低强度表面活性剂和中等盐浓度的溶液进行,以破坏一种或多种靶蛋白(例如,HAP)和其他血浆蛋白(例如,LAP)之间的低Kd蛋白质-蛋白质相互作用。作为另外一种选择或除此之外,高严格性洗涤可用含有强力表面活性剂诸如SDS和离液盐的溶液进行,以破坏吸附剂和一种或多种靶蛋白之间除高亲和力相互作用之外的基本上任何相互作用。如果对一种或多种靶蛋白的亲和力捕获是有益的话,强力表面活性剂可用于将蛋白质维持在半变性至完全变性状态。
在这些实施方案中,除了其他可能性(取决于适体-靶分子复合物的类型)以外,具有附接的一种或多种靶蛋白(例如,HAP)的吸附剂可在使用后通过用1M NaOH洗涤,然后在装载方法中使用的溶剂中平衡吸附剂来丢弃或再生。
在这些实施方案中,在一种或多种洗涤溶液与吸附剂接触以将非靶物质与结合到吸附剂的一种或多种靶蛋白分离之后,收集一种或多种洗涤溶液以用于进一步处理,这可包括例如识别、定量或以其他方式处理一种或多种洗涤溶液中的各种LAP。在这样做之前,可能期望的是从一种或多种洗涤溶液中移除一种或多种表面活性剂和一种或多种离液盐。这可例如使用合适的固相提取方法来进行,诸如采用
Figure BDA0002692280680000151
HLB吸附剂、
Figure BDA0002692280680000152
PRIMEHLB、
Figure BDA0002692280680000153
MCX或
Figure BDA0002692280680000154
MAX(沃特世公司(Waters Corp.))等等的那些方法。
值得注意的是,识别和定量来自生物样品诸如血浆、血清或全血样品的LAP对研究者提出了挑战,这主要是由于存在HAP,其中一个HAP(白蛋白)占血浆/血清的总蛋白质质量的一半以上,并且少量HAP(白蛋白、IgG、转铁蛋白、纤维蛋白原、IgA、结合珠蛋白、α-1-抗胰蛋白酶、α-2-巨球蛋白、IgM、载脂蛋白A-I、α-1-酸性糖蛋白、补体C3、载脂蛋白A-II、转甲状腺素蛋白)占血浆/血清的总蛋白质质量的约95%。耗尽这些HAP中的一个或多个HAP将改善研究者识别、定量或以其他方式处理SAP的能力。通过利用高亲和力吸附剂(其中高亲和力试剂诸如适体或亲和体结合到固体载体),可采用一种或多种洗涤溶液来从结合到吸附剂的HAP去除非靶物质(例如,LAP),该洗涤溶液包括本来将具有非常高的严格性以使得HAP将与非靶物质一起从吸附剂中移除的洗涤溶液。以这种方式,可在无需沉淀和重构步骤的情况下从LAP移除HAP,该沉淀和重构步骤通常用于本领域中并且导致LAP损失。因此,在各种实施方案中,本文所述的方法用于制备样品(例如,在耗尽过程期间移除HAP之后获得的样品)以用于进一步分析和/或处理。
LAP。在一些实施方案中,靶蛋白可为已被识别用于富集的一种或多种蛋白质(例如,一种或多种LAP)。在这些实施方案中,本文所述的方法可用于从样品流体中富集那些蛋白质。
就这一点而言,一种或多种洗涤溶液可包括高严格性洗涤。通过利用高亲和力吸附剂(其中高亲和力试剂诸如适体或亲和体结合到固体载体),可采用一种或多种高严格性洗涤溶液来从吸附剂去除非靶物质(包括HAP),这否则可能导致一种或多种富集的蛋白质(例如,一种或多种LAP)与非靶物质一起无意地从吸附剂移除。
例如,高严格性洗涤可用含有强力表面活性剂诸如SDS等等的溶液进行,以破坏吸附剂结合的亲和力试剂和一种或多种靶蛋白之间除高亲和力相互作用(例如,小于10-8M Kd的那些相互作用)之外的基本上任何相互作用。如果对一种或多种靶蛋白的亲和力捕获是有益的话,强力表面活性剂也可用于将蛋白质维持在半变性至完全变性状态。
在其中靶蛋白可为已被识别用于富集的一种或多种蛋白质(例如,一种或多种LAP)的这些实施方案中,在一种或多种洗涤溶液与吸附剂接触以将非靶物质与结合到吸附剂的一种或多种靶蛋白分离之后,吸附剂上的一种或多种靶蛋白可经受进一步处理。另一方面,可丢弃一种或多种洗涤溶液。
在此类实施方案中,结合到吸附剂的靶蛋白的进一步处理可包括例如定量或以其他方式处理附接到吸附剂的各种LAP。
例如,在一些实施方案中,一种或多种靶蛋白可在保留在吸附剂上的同时经受消化。例如,结合的靶蛋白可被一种或多种蛋白水解酶消化,例如一种或多种内切蛋白酶诸如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、Glu-C或Lys-C,该酶以水解方式断裂靶蛋白中的肽键,从而将靶蛋白分段成肽。可用于断裂肽键的附加蛋白水解物质/条件包括Arg-C、Asp-N、BNPS或NCS/脲、梭菌蛋白酶、CNBr、CNBr(甲基-Cys)、CNBr(具有酸)、甲酸、Glu-C、羟胺、亚碘酰苯甲酸、Lys-N、弱酸水解、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、NBS、NTCB、胰弹性蛋白酶、胃蛋白酶A、脯氨酰内肽酶、蛋白酶K、葡萄球菌肽酶I和嗜热菌蛋白酶等等。
蛋白水解酶可例如被添加到吸附剂床。作为另外一种选择,蛋白水解酶可化学连接到吸附剂,在这种情况下,可采用连接基来帮助酶接触和消化结合的靶蛋白。酶也可使用可裂解连接基结合在载体上,其中裂解以化学方式触发,从而允许释放酶以进行消化。附接到吸附剂的蛋白水解酶可例如通过升温或通过建立特定pH来活化。
如果使用添加的酶或裂解的酶,则在分析靶蛋白之前,可采用样品制备步骤来移除酶以及在一些情况下移除自溶产物。在消化附接的LAP之后,亲和力吸附剂可再生或丢弃。
在一些实施方案中,在消化之前,可使一种或多种结合的靶蛋白经受还原和烷基化。例如,可使用合适的还原剂诸如三(2-羧乙基)膦(TCEP)或二硫苏糖醇(DTT)使一种或多种结合的靶蛋白经受二硫化物还原,并且半胱氨酸残基上的游离巯基基团可用烷基化试剂诸如碘乙酰胺或碘乙酸烷基化以不可逆地防止游离巯基重新形成二硫键。
在消化后,可任选地将所得的肽混合物与缓冲液(例如,具有中和性质的缓冲液)混合。然后可将肽混合物在下游用于蛋白质定量。
在一些实施方案中,例如,在亲和力试剂经由可裂解键附接到吸附剂的情况下,具有附接的靶蛋白的亲和力试剂可从载体释放以供进一步处理。
例如,亲和力试剂可经由键附接到吸附剂,该键在暴露于亲核和/或碱性条件时、在暴露于亲电子和/或酸性条件时或在暴露于如上所讨论的还原条件时裂解,在这种情况下,吸附剂可暴露于建立此类条件的洗脱溶液。亲和力试剂可经由可酶促裂解的键附接到吸附剂,例如,键可包括具有特定序列的基于肽的连接基,该基于肽的连接基在暴露于合适的酶(例如,蛋白酶)时裂解,尤其是对特定肽序列(诸如先前所讨论的那些肽序列)具有特异性的酶。此类酶可被添加到吸附剂,或者作为另外一种选择,此类酶可化学连接到吸附剂,在这种情况下,可采用连接基来帮助酶接触可裂解键,亲和力试剂通过该可裂解键结合到吸附剂。在一些情况下,酶可通过可裂解连接基附接到颗粒,在这种情况下,连接基可被裂解以释放酶,该酶随后用于裂解亲和力试剂。附接到吸附剂的酶可例如通过升温或通过建立特定pH或溶剂体系来活化。
如上所指出,在各种实施方案中,本文所述的方法还可包括使用分析仪器和/或技术(例如,液相色谱(LC)(包括高效液相色谱(HPLC)和超高效液相色谱(UHPLC))、质谱(MS)(包括串联质谱(MS/MS)、电喷雾电离质谱(ESI-MS)、基质辅助激光解吸/电离质谱(MALDI-MS)、飞行时间质谱(TOFMS))、核磁共振、红外分析、紫外分析或它们的组合)来分析样品(例如,在耗尽过程期间移除HAP之后获得的样品,在富集过程中移除或消化由吸附剂捕获的LAP之后获得的样品等)。例如,在一些实施方案中,可使用液相色谱诸如HPLC或UHPLC结合质谱诸如MALDI-MS或ESI-MS来分析经处理的样品,其示例包括液相色谱-质谱(LC-MS)技术和液相色谱-质谱/质谱(LC-MS/MS)技术。在某些情况下,可将分析样品蒸发至干燥,然后在注入液相色谱系统中之前在另一种溶液中重构。
还可提供试剂盒,该试剂盒包含如本文在别处所述的高亲和力吸附剂和以下各项中的任一者的一项或多项:(a)包含如本文在别处所述的表面活性剂和盐的洗涤溶液、(b)如本文在别处所述的预处理溶液、(c)如本文在别处所述的一种或多种洗脱溶液、(d)收集板或收集圆筒、(e)帽垫、(f)校准和参考标准物、以及(g)使用说明。吸附剂可设置在壳体中,例如设置在柱、一次性料筒、多孔条带、多孔板或如本文在别处所述的其他壳体中。
本公开的另外方面在以下枚举的段落中阐述:
方面A1.一种样品处理的方法,所述方法包括:将包含样品的样品流体添加到吸附剂,所述样品包含或可能包含至少一种靶蛋白,所述吸附剂包含具有至少一种附接的高亲和力试剂的固体载体,所述高亲和力试剂对所述靶蛋白具有特定高亲和力,从而得到具有结合的靶蛋白的吸附剂;以及将包含表面活性剂和盐的洗涤溶液添加到所述吸附剂,从而移除所述至少一种高亲和力试剂对其不具有特定亲和力的物质,包括通过附接到所述靶蛋白而间接结合到所述吸附剂的所述物质。
方面A2.根据方面A1所述的方法,其中(a)当所述靶蛋白是感兴趣的蛋白质时,在所述吸附剂上分离所述感兴趣的蛋白质以用于进一步处理,或(b)当所述靶蛋白不是感兴趣的蛋白质时,收集所述洗涤溶液以用于所述感兴趣的蛋白质的进一步下游处理。
方面A3.根据方面A1-A2中任一项所述的方法,其中所述样品选自全血样品、血浆样品和血清样品。
方面A4.根据方面A1-A3中任一项所述的方法,其中通过将所述样品与破坏蛋白质结合的预处理溶液混合来制备所述样品流体。
方面A5.根据方面A4所述的方法,其中所述预处理溶液包括酸性或碱性水溶液。
方面A6.根据方面A4所述的方法,其中所述预处理溶液选自H3PO4水溶液、NH4OH水溶液、乙二胺四乙酸(EDTA)水溶液、甲酸水溶液、乙酸水溶液、三氯乙酸(TCA)水溶液和三氟乙酸(TFA)水溶液。
方面A7.根据方面A1-A6中任一项所述的方法,其中所述洗涤溶液为高严格性洗涤溶液。
方面A8.根据方面A1-A7中任一项所述的方法,其中所述盐为离液盐。
方面A9.根据方面A1-A7中任一项所述的方法,其中所述盐选自LiCl、KCl、NaCl、CsCl、LiI、KI、NaI、ScI、LiSCN、KSCN、NaSCN、CsSCN、Na2CO3、NaHCO3、NH4HCO3、Na2NO3、NaClO4、四甲基氯化铵、四乙基氯化铵和三甲基氯化铵。
方面A10.根据方面A1-A9中任一项所述的方法,其中所述表面活性剂为酸不稳定性表面活性剂。
方面A11.根据方面A10所述的方法,其中所述酸不稳定性表面活性剂选自3-[(2-甲基-2-十一烷基-1,3-二氧戊环-4-基)甲氧基]-1-丙烷磺酸钠、3-(4-(1,1-双(己氧基)乙基)吡啶鎓-1-基)丙烷-1-磺酸钠和3-((1-(呋喃-2-基)十一烷氧基)羰基氨基)丙烷-1-磺酸钠。
方面A12.根据方面A1-A9中任一项所述的方法,其中所述表面活性剂为离子表面活性剂。
方面A13.根据方面A12所述的方法,其中所述离子表面活性剂选自十二烷基硫酸钠(SDS)、脱氧胆酸钠、胆酸钠和月桂酰肌氨酸钠。
方面A14.根据方面A1-A9中任一项所述的方法,其中所述表面活性剂为非离子表面活性剂。
方面A15.根据方面A14所述的方法,其中所述非离子表面活性剂选自聚山梨醇酯表面活性剂(包括聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯(Tween20)和聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯(Tween80))、洋地黄皂苷、麦芽糖苷(包括正十二烷基-β-D-麦芽糖苷(DDM)、正辛基-β-D-麦芽糖苷(DDM))、葡糖苷(包括辛基葡糖苷和癸基葡糖苷)、3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸内盐(CHAPS)、3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸内盐水合物(CHAPSO)和聚乙二醇对-(1,1,3,3-四甲基丁基)-苯基醚(Triton X-100)。
方面A16.根据方面A1-A15中任一项所述的方法,其中所述靶蛋白为高丰度蛋白质。
方面A17.根据方面A16所述的方法,其中所述高丰度蛋白质选自白蛋白、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白D(IgD)、免疫球蛋白D(IgE)、α-1-抗胰蛋白酶、转铁蛋白、结合珠蛋白、纤维蛋白原、结合球蛋白、α-2-巨球蛋白、补体C3、载脂蛋白A-I、载脂蛋白A-II、载脂蛋白B、α-1-酸性糖蛋白、血浆铜蓝蛋白、补体C4、补体C1q、前白蛋白、纤溶酶原、转甲状腺素蛋白、以及它们的组合。
方面A18.根据方面A1-A15中任一项所述的方法,其中所述靶蛋白为低丰度蛋白质。
方面A19.根据方面A18所述的方法,其中所述低丰度蛋白质选自血浆铜蓝蛋白、补体因子C4、C9、C8和C5、IgD、C1抑制剂、RBP、iC3b、甲状腺素结合球蛋白、补体蛋白、血栓前体蛋白、C反应蛋白、Bb片段、铁蛋白、randes、SC5b-9复合物、肌红蛋白、甲状腺球蛋白、TPA(组织纤溶酶原激活物)、神经元特异性烯醇酶、C-肽、甲胎蛋白、TNF-结合蛋白、PSA(前列腺特异性抗原)、前列腺酸性磷酸酶、CEA(癌胚抗原)、髓鞘碱性蛋白、肌钙蛋白I、白介素、MIP_1α、组织因子、GCSF(粒细胞集落刺激因子)、干扰素、以及它们的组合。
方面A20.根据方面A18-A19中任一项所述的方法,还包括向所述吸附剂添加洗脱溶液,从而从所述吸附剂中移除所述低丰度蛋白质。
方面A21.根据方面A18-A19中任一项所述的方法,其中所述低丰度蛋白质在结合到所述吸附剂时消化成片段,并且洗脱所述片段。
方面A22.根据方面A21所述的方法,其中通过将包含蛋白水解酶的溶液添加到所述吸附剂来消化所述靶蛋白。
方面A23.根据方面A21所述的方法,其中所述吸附剂包含附接的蛋白水解酶,并且其中通过活化所述蛋白水解酶来将所述低丰度蛋白质消化成片段。
方面A24.根据方面A21所述的方法,其中所述吸附剂包含附接的可裂解酶,并且其中所述低丰度蛋白质通过包括化学裂解和释放所述蛋白水解酶的方法消化成片段。
方面A25.根据方面A18-A19中任一项所述的方法,其中所述高亲和力试剂通过可酶促裂解的键连接到所述载体,并且其中所述洗脱溶液包含裂解所述可酶促裂解的键的酶。
方面A26.根据方面A18-A19所述的方法,其中所述高亲和力试剂通过在暴露于亲核和/或碱性条件时,在暴露于亲电子和/或酸性条件时,或在暴露于还原条件时裂解的键连接到所述载体,其中所述吸附剂可暴露于建立此类条件的洗脱溶液,从而裂解所述高亲和力试剂与结合的靶蛋白的复合物。
方面A27.根据方面A1-A26中任一项所述的方法,其中所述高亲和力试剂为适体或亲和体。
方面B1.一种用于从液体样品中分离至少一种靶蛋白的吸附剂,所述吸附剂包含固体载体,所述固体载体包含对所述至少一种靶蛋白具有亲和力的附接的适体或亲和体。
方面B2.根据方面B1所述的吸附剂,其中所述固体载体包含二氧化硅。
方面B3.根据方面B1所述的吸附剂,其中所述固体载体包含杂化材料。
方面B4.根据方面B1-B3中任一项所述的吸附剂,其中所述固体载体包含聚合物材料。
方面B5.根据方面B4所述的吸附剂,其中所述聚合物材料包括共聚物,所述共聚物包含疏水单体和亲水单体。
方面B6.根据方面B5所述的吸附剂,其中所述亲水单体选自乙烯基吡咯烷酮和N-乙烯基己内酰胺。
方面B7.根据方面B5-B6中任一项所述的吸附剂,其中所述疏水单体选自二乙烯基苯和苯乙烯。
方面B8.根据方面B5-B7中任一项所述的吸附剂,其中所述吸附剂选自强阳离子交换吸附剂、强阴离子交换吸附剂、弱阳离子交换吸附剂和弱阴离子交换吸附剂。
方面B9.根据方面B1-B8中任一项所述的吸附剂,其中所述适体或亲和体通过可化学裂解的键连接到所述固体载体。
方面B10.根据方面B1-B8中任一项所述的吸附剂,其中所述适体或亲和体通过可酶促裂解的键连接到所述固体载体。
方面B11.根据方面B10所述的吸附剂,其中所述固体载体包含附接的酶,所述附接的酶适于从所述固体载体酶促裂解所述适体或亲和体,从而允许所述适体或亲和体和所述靶蛋白的复合物从所述固体载体释放以用于进一步处理。
方面B12.根据方面B1-B11中任一项所述的吸附剂,其中所述适体或亲和体针对其对低丰度蛋白质的高亲和力、对高丰度蛋白质的高亲和力或两者来选择。
方面B13.根据方面B1-B12中任一项所述的吸附剂,其中所述固体载体包含附接的酶,所述附接的酶适于在所述附接的酶活化后消化所述靶蛋白。
方面B14.根据方面B1-B13中任一项所述的吸附剂,其中所述固体载体包含附接的蛋白水解酶。
方面B15.根据方面B14所述的吸附剂,其中所述蛋白水解酶选自胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、Glu-C、Lys-C、Arg-C、Asp-N、BNPS或NCS/脲、梭菌蛋白酶、CNBr、CNBr(甲基-Cys)、CNBr(具有酸)、甲酸、羟胺、亚碘酰苯甲酸、Lys-N、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、NBS、NTCB、胰弹性蛋白酶、胃蛋白酶A、脯氨酰内肽酶、蛋白酶K、葡萄球菌肽酶I、嗜热菌蛋白酶以及它们的组合。
方面B16.根据方面B14-B15中任一项所述的吸附剂,其中所述蛋白水解酶通过柔性连接基附接到所述固体载体。
方面B17.根据方面B14-B15中任一项所述的吸附剂,其中所述蛋白水解酶通过可裂解连接基附接到所述固体载体。
方面B18.根据方面B14-B15中任一项所述的吸附剂,其中所述蛋白水解酶通过可酶促裂解的连接基附接到所述固体载体。
方面B19.根据方面B14-B15中任一项所述的吸附剂,其中所述蛋白水解酶通过可化学裂解的连接基附接到所述吸附剂。
方面B20.根据方面B19所述的吸附剂,其中所述可化学裂解的连接基选自在暴露于亲核和/或碱性条件时裂解的化学连接基,在暴露于亲电子和/或酸性条件时裂解的化学连接基,在暴露于还原条件时裂解的化学连接基,可在暴露于氧化条件时裂解的化学连接基,羟胺可裂解连接基,含有双-琥珀酰亚胺酯的化学连接基,含有双酰基叠氮的化学连接基以及含有双马来酰亚胺的化学连接基。
方面B21.根据方面B14-B20中任一项所述的吸附剂,其中所述蛋白水解酶随着pH的变化而被化学活化。
方面B22.根据方面B14-B20中任一项所述的吸附剂,其中所述蛋白水解酶通过加热或冷却来热活化。
方面B23.根据方面B1-B22中任一项所述的吸附剂,其中所述吸附剂设置在多孔条带、多孔板、柱、一次性料筒或ELISA板中。
方面B24.一种试剂盒,包含根据方面B1-B23中任一项所述的吸附剂,以及选自以下各项的一种或多种试剂盒组分:(a)包含表面活性剂和盐的洗涤溶液、(b)预处理溶液、(c)一种或多种洗脱溶液、(d)一种或多种蛋白水解酶溶液、(e)收集板、(f)帽垫、(g)校准和参考标准物、以及(h)使用说明。
实施例
实施例1.使用还原胺化固定适体
实施例1A.用醛硅烷进行颗粒活化
无机-有机5μm BEH300颗粒按照Wyndham等人在WO 2008/103423中报道的过程制备。通过将1.0g的5μm BEH300(美国马萨诸塞州米尔福德的沃特世公司(WatersCorporation,Milford MA,USA),比表面积(SSA)80m2/g,总孔容积(TPV)0.8cc/g,平均孔径(APD)
Figure BDA0002692280680000231
)添加到配备有磁力搅拌棒的50mL圆底烧瓶中来制备浆液,该磁力搅拌棒与大约5mL的50mM碳酸氢铵(美国密苏里州圣路易斯的西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich,St.Louis,MO,USA),pH 9.0缓冲液混合。向该悬浮液中添加220μL预先溶解于5mL乙醇中的三乙氧基甲硅烷基丁醛(美国宾夕法尼亚州莫里斯维尔的Gelest公司(Gelest,Morrisville,PA,USA),将它们添加到烧瓶中并且使混合物在室温下搅拌(300rpm)2小时。然后将混合物转移到50mL离心管中。经由离心(4500rpm)将颗粒洗涤三次(10mg/mL缓冲液)以移除未反应的硅烷,并且用乙醇洗涤两次,并且在使用前在4℃下储存。该方法适于制备醛结合覆盖率介于1.4毫摩尔/m2-至3毫摩尔/m2之间的材料。通过在反应中添加的硅烷的量容易地调节覆盖率。碳含量可通过燃烧分析测定,并且颗粒形态可通过SEM测定。
实施例1B.适体在醛改性的颗粒上的固定
使用还原胺化进行适体在醛活化颗粒上的固定。通过将0.6g得自实施例1A的材料添加在配备有磁力棒的50mL烧瓶中来制备悬浮液,并且用5mL 50mM碳酸氢铵pH 9缓冲液来浆化该悬浮液。向该悬浮液中添加预先溶解于13mL,50mM碳酸氢铵pH 9缓冲液中的16mg适体,然后添加2mL偶联溶液(包含50mM碳酸氢铵pH 9缓冲液中的1M NaCNBH3(西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich))。使混合物在室温下静置2小时,同时以300rpm持续搅拌。通过添加缓冲液中的2mL 1M乙醇胺(西格玛奥德里奇公司)并且在室温下再搅拌30分钟来淬灭反应。用50mM碳酸氢铵pH 9缓冲液洗涤颗粒四次,摇动10分钟以移除过量的适体和乙醇胺(美国新泽西州莫里斯平原的Acros Organics公司(Acros Organics,Morris Plains,NewJersey,USA))。将颗粒用pH 4三氟乙酸(西格玛奥德里奇公司)洗涤一次,并且在使用前在4℃下储存于该溶剂中。
实施例1C.固定适体和胰蛋白酶的混合物
使用醛活化颗粒的还原胺化进行适体和胰蛋白酶的固定。将0.6g得自实施例1A的醛活化BEH颗粒添加到配备有磁力棒的50mL烧瓶中,并且用5mL的50mM碳酸氢铵pH 9缓冲液来将其浆化。将(使用酸稳定性胰蛋白酶)与预先溶解于13mL的50mM碳酸氢铵pH 9缓冲液中的苄脒混合的8mg适体和8mg胰蛋白酶的混合物添加到颗粒溶液中,然后添加2mL偶联溶液(包含1M NaCNBH3 50mM碳酸氢铵pH 9缓冲液)。将反应混合物在室温下搅拌2小时。通过添加缓冲液中的2mL 1M乙醇胺(Acros Organics公司(Acros Organics))并且在室温下搅拌30分钟来淬灭反应。用50mM碳酸氢铵pH 9缓冲液通过离心洗涤颗粒四次,摇动10分钟以移除过量的适体、胰蛋白酶和乙醇胺。
实施例1D.适体和胰蛋白酶的顺序固定
使用如实施例1B所述的还原胺化进行适体在醛活化颗粒上的固定,其中较少的适体允许胰蛋白酶固定在相同的固体载体上。通过将0.6g得自实施例1A的材料添加在配备有磁力棒的50mL烧瓶中来制备悬浮液,并且用5mL 50mM碳酸氢铵pH 9缓冲液来浆化该悬浮液。向该悬浮液中添加预先溶解于13mL,50mM碳酸氢铵pH 9缓冲液中的8mg适体,然后添加2mL偶联溶液(包含50mM碳酸氢铵pH 9缓冲液中的1M NaCNBH3(西格玛奥德里奇公司))。使混合物在室温下静置2小时,同时以300rpm持续搅拌。用50mM碳酸氢铵pH 9缓冲液洗涤颗粒四次,摇动10分钟以移除过量的适体。将颗粒再分散于5ml 50mM碳酸氢铵pH 9缓冲液中,并转移到配备有用于胰蛋白酶固定的磁力棒的50mL烧瓶中。将40mg胰蛋白酶与预先溶解于13mL的50mM碳酸氢铵pH 9缓冲液中的适量苄脒(3g苄脒对应1mg胰蛋白酶)添加到悬浮液中,然后添加2mL偶联溶液(包含1M NaCNBH3 50mM碳酸氢铵pH 9缓冲液)。使反应在室温下搅拌2小时。通过添加缓冲液中的2mL 1M乙醇胺(Acros Organics公司)并且在室温下搅拌30分钟来淬灭反应。将颗粒转移到50mL离心管中。用50mM碳酸氢铵pH 9缓冲液通过离心洗涤颗粒四次,摇动10分钟以移除过量的胰蛋白酶和乙醇胺。在使用前,将颗粒在pH 4的水中在4℃下作为浆液储存。
实施例2.使用链霉抗生物素蛋白/生物素活化载体进行固定
实施例2A.用链霉抗生物素蛋白活化醛载体
通过还原胺化,将链霉抗生物素蛋白结合到实施例1A的醛颗粒,其中使用1.0g的3.5μm BEH600(马萨诸塞州米尔福德的沃特世公司),比表面积(SSA)40m2/g,总孔容积(TPV)0.6cc/g,平均孔径(APD)
Figure BDA0002692280680000251
)来替代BEH300。通过将0.6g醛活化颗粒添加到配备有磁力棒的100mL烧瓶中来制备悬浮液,并且用50mM碳酸氢铵pH 9缓冲液来浆化该悬浮液。在单独的烧瓶中,通过将8mg链霉抗生物素蛋白以10mg/mL的浓度溶解于50mM碳酸氢铵(pH 9)中来制备链霉抗生物素蛋白的溶液。将链霉抗生物素蛋白溶液添加到颗粒悬浮液中,然后添加2mL偶联溶液(包含1M NaCNBH3 50mM碳酸氢铵pH 9缓冲液),并且将样品在室温下混合2小时。通过添加缓冲液中的2mL 1M乙醇胺(Acros Organics公司)并且在室温下搅拌30分钟来淬灭反应。将链霉抗生物素蛋白活化颗粒用缓冲液洗涤4次并离心以移除未反应的链霉抗生物素蛋白。
可使用链霉抗生物素蛋白-生物素方案将任何生物素酰化的连接基或蛋白质结合到这些链霉抗生物素蛋白活化颗粒,该方案涉及将活化颗粒与生物素酰化试剂在缓冲液(诸如50mM碳酸氢铵(pH 9))中在室温下混合一小时。然后用缓冲液将颗粒洗涤若干次。生物素酰化连接基可包括具有可裂解连接基或生物素酰化适体的那些。
实施例2B.将混合的酶和链霉抗生物素蛋白固定到活化载体上
使用还原胺化进行酸稳定性胰蛋白酶在醛活化颗粒上的固定。通过将0.6g得自实施例1A的材料添加在配备有磁力棒的50mL烧瓶中来制备悬浮液,并且用10mL 50mM碳酸氢铵pH 9缓冲液来浆化该悬浮液。将8mg胰蛋白酶与预先溶解于13mL的50mM碳酸氢铵pH 9缓冲液中的适量苄脒(3g苄脒对应1mg胰蛋白酶)添加到该悬浮液中,然后添加2mL偶联溶液(包含1M NaCNBH3 50mM碳酸氢铵pH 9缓冲液)。将反应混合物在室温下搅拌2小时。将颗粒转移到50mL离心管中。用50mM碳酸氢铵pH 9缓冲液通过离心洗涤颗粒四次,摇动10分钟以移除过量的胰蛋白酶。获取样品以分析固定化胰蛋白酶的量。将样品的其余部分再分散于适当的缓冲液中,并使用实施例2A中所述的方案将链霉抗生物素蛋白固定。所得材料可用于结合任何生物素酰化试剂,包括遵循实施例2A中所述的方案的生物素酰化适体。
实施例2C.使用链霉抗生物素蛋白-生物素体系用可裂解连接基固定适体
使用链霉抗生物素蛋白-生物素复合物用可裂解连接基固定适体如下进行。遵循实施例2A所述的使链霉抗生物素蛋白活化颗粒与生物素反应的方案,使来自实施例2A的链霉抗生物素蛋白活化颗粒与可商购获得的NHS-SS-生物素蛋白(赛默科技公司(Thermoscientific))反应。在100mL烧瓶中用50mL的100mM磷酸钠缓冲液(pH 9)中的O.6g链霉抗生物素蛋白-生物素-SS-NHS酯活化颗粒制备悬浮液。在单独的烧瓶中,通过将8mg适体溶解于10mL的100mM磷酸钠缓冲液(pH 9)中来制备适体溶液。将适体溶液添加到颗粒悬浮液中,并且使其反应1h。生物素的NHS酯端基与适体或亲和体或任何蛋白质上的任何伯胺反应。用缓冲液洗涤颗粒四次,在洗涤之间间隔10分钟,然后离心以移除未反应的适体。然后用TFA(pH4)水冲洗颗粒并冷藏。
实施例2D.适体和可裂解酶
现在将描述适体和链霉抗生物素蛋白的混合物在醛改性的颗粒上的固定。使用醛活化颗粒的还原胺化进行适体和链霉抗生物素蛋白的固定。将0.6g的实施例1A的醛活化BEH颗粒添加到配备有磁力棒的100mL烧瓶中,并且用50mL的50mM碳酸氢铵pH 9缓冲液来将其浆化。将预先溶解于13mL的50mM碳酸氢铵pH 9缓冲液中的8mg适体和8mg链霉抗生物素蛋白的混合物添加到颗粒溶液中,然后添加2mL偶联溶液(包含1M NaCNBH3 50mM碳酸氢铵pH9缓冲液)。使反应在室温下搅拌2小时,并且通过添加缓冲液中的2mL 1M乙醇胺并且然后在室温下搅拌30分钟来淬灭反应。用50mM碳酸氢铵pH 9缓冲液洗涤颗粒四次,摇动10分钟以移除过量的适体、链霉抗生物素蛋白和乙醇胺。使用实施例2C中所述的过程,向这些颗粒添加磺基NHS-SS生物素酰化试剂并附接到链霉抗生物素蛋白。可使用生物素上的可裂解NHS酯将蛋白酶(诸如胰蛋白酶)结合到该载体。使用0.6g具有混合适体和磺基NHS-SS-生物素酰化链霉抗生物素蛋白的颗粒与100mL 50mM磷酸钠缓冲液(pH 9)来制备悬浮液。向该颗粒悬浮液中添加预先溶解于10mL 100mM磷酸钠缓冲液(pH 9)中的8mg胰蛋白酶与适当量的苄脒,并使其在室温下反应1小时。然后将颗粒转移到50mL离心管中,用缓冲液洗涤4次并离心以移除未反应的酶。然后用TFA(pH 4)水冲洗颗粒并冷藏。
实施例3A.适体在胺改性的颗粒上的固定
现在将描述用氨基硅烷进行颗粒活化。通过将颗粒添加到250mL圆底烧瓶中并将颗粒分散在甲苯(150mL,新罕布什尔州汉普顿的飞世尔科技公司(Fisher Scientific,Hampton,NH))中来制备10.0g的BEH颗粒(马萨诸塞州米尔福德的沃特世尔公司)的悬浮液,将混合物用dean stark分水器在氮气气氛下于110℃下干燥2小时。然后将混合物冷却至40℃,随后添加1mL纯氨基丙基三甲氧基硅烷(Gelest公司(Gelest))。将反应混合物混合10分钟,然后在70℃下加热2小时,之后将反应冷却下来。将胺化颗粒在0.5μm Tyvek上洗涤,并且用水中的50%乙醇洗涤两次,并且用乙醇(飞世尔科技公司(Fisher Scientific))洗涤两次。将胺改性的颗粒在真空下于80℃下干燥16小时。针对覆盖率计算的CHN和颗粒形态的SEM来分析颗粒。
实施例3B.通过可裂解连接基附接适体
可裂解连接基诸如双[2-(琥珀酰亚胺基氧基羰基氧基)乙基]砜(BSOCOES)为NHS酯生物官能化连接基,其可用于将适体结合到胺活化颗粒。通过将BSOCOES溶解于DMF中以用于活化胺颗粒来制备原液。用50mL 100mM磷酸钠缓冲液(pH 8)中的0.6g胺改性颗粒来制备悬浮液。向预先溶解于DMF中的该悬浮液中添加BSOCOES并使其反应1小时,然后向悬浮液中添加100mM磷酸钠缓冲液中的8mg预先溶解的适体(10mg/ml),并使其在室温下反应1小时。然后将颗粒用缓冲液洗涤4次并离心。洗涤后,用pH 4TFA水冲洗颗粒,并留在冰箱中。
实施例4.高丰度人血清白蛋白(HSA)的耗尽
用破坏蛋白质-蛋白质相互作用的试剂(诸如乙二胺四乙酸二钠、甲酸、TCA、乙酸、TFA、磷酸或NH4OH)处理血浆样品。
将所得的经处理的血浆样品(中和或不中和)添加到吸附剂床,该吸附剂床包含固体载体颗粒(例如,BEH颗粒),该颗粒具有摩尔过量的化学连接的HSA亲和力试剂,诸如靶向HSA的适体或亲和体。确立了足以实现适当的扩散动力学和HSA与亲和力试剂的结合的接触时间和流速。
然后可组合或单独使用以下步骤:(a)低严格性洗涤用低强度表面活性剂和中等盐浓度进行以破坏HSA和血浆蛋白之间的任何低Kd蛋白质-蛋白质相互作用,和/或(b)高严格性洗涤用包含强力表面活性剂和离液盐的溶液进行,以破坏任何非特异性结合,从而破坏具有高于亲和力试剂和靶HSA之间nM Kd相互作用的Kd的相互作用。
收集来自低严格性洗涤和/或高严格性洗涤的洗脱液。然后移除表面活性剂和盐,并且通过使洗脱物通过适当的固相提取(SPE)装置来浓缩洗脱物,该固相提取装置诸如购自美国马萨诸塞州米尔福德的沃特世公司的
Figure BDA0002692280680000281
HLB、
Figure BDA0002692280680000282
PRIME HLB、
Figure BDA0002692280680000283
MCX或
Figure BDA0002692280680000284
MAX吸附剂装置。所得的干净的浓缩洗脱液可在下游用于蛋白质定量。
实施例5.从血浆中富集低丰度甲状腺球蛋白
将血浆样品直接添加到亲和力吸附剂床,该亲和力吸附剂床包含固体载体颗粒,该颗粒具有摩尔过量的化学连接的甲状腺球蛋白亲和力试剂,诸如靶向甲状腺球蛋白的适体或亲和体。可将多种亲和力试剂附接到吸附剂以同时富集多个靶标。
用包含强力表面活性剂和离液盐的溶液进行高严格性洗涤,以破坏任何非特异性结合,从而破坏具有高于亲和试剂和靶甲状腺球蛋白之间的10-8M Kd相互作用的Kd的相互作用。丢弃洗涤液。
然后用蛋白水解酶(诸如胰蛋白酶或Lys-C)消化结合的甲状腺球蛋白,该蛋白水解酶可化学连接到吸附剂或作为消化试剂混合物的一部分添加到吸附剂床。在蛋白水解酶化学连接的情况下,可采用合适长度的连接基来增强酶到达和消化结合蛋白质的能力。蛋白水解酶可例如通过升温或通过建立特定pH来活化。
然后用合适的洗脱溶液(诸如缓冲液)来洗脱消化的蛋白质混合物,该洗脱溶液可具有中和性质,然后可将洗脱物用于下游蛋白质定量。

Claims (20)

1.一种样品处理的方法,所述方法包括:
将包含样品的样品流体添加到吸附剂,所述样品包含或可能包含至少一种靶蛋白,所述吸附剂包含具有至少一种附接的高亲和力试剂的固体载体,所述高亲和力试剂对所述靶蛋白具有特定高亲和力,从而得到具有结合的靶蛋白的吸附剂;以及
将包含表面活性剂和盐的洗涤溶液添加到所述吸附剂,从而移除所述至少一种高亲和力试剂对其不具有特定亲和力的物质,包括通过附接到所述靶蛋白而间接结合到所述吸附剂的所述物质。
2.根据权利要求1所述的方法,其中(a)当所述靶蛋白是感兴趣的蛋白质时,在所述吸附剂上分离所述感兴趣的蛋白质以用于进一步处理,或(b)当所述靶蛋白不是感兴趣的蛋白质时,收集所述洗涤溶液以用于所述感兴趣的蛋白质的进一步下游处理。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的方法,其中通过将所述样品与破坏蛋白质结合的预处理溶液混合来制备所述样品流体。
4.根据权利要求3所述的方法,其中所述预处理溶液包含酸性或碱性水溶液。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法,其中所述洗涤溶液是高严格性洗涤溶液。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法,其中所述靶蛋白为高丰度蛋白质。
7.根据权利要求1-5中任一项所述的方法,其中所述靶蛋白为低丰度蛋白质。
8.根据权利要求7所述的方法,还包括向所述吸附剂添加洗脱溶液,从而从所述吸附剂中移除所述低丰度蛋白质。
9.根据权利要求7所述的方法,其中所述低丰度蛋白质在结合到所述吸附剂时消化成片段,并且洗脱所述片段。
10.根据权利要求9所述的方法,(a)其中通过将包含蛋白水解酶的溶液添加到所述吸附剂来消化所述靶蛋白,(b)其中所述吸附剂包含附接的蛋白水解酶,并且其中通过活化所述蛋白水解酶来将所述低丰度蛋白质消化成片段,或者(c)其中所述吸附剂包含附接的可裂解酶,并且其中所述低丰度蛋白质通过包括化学裂解和释放所述蛋白水解酶的方法消化成片段。
11.根据权利要求8所述的方法,(a)其中所述高亲和力试剂通过可酶促裂解的键连接到所述载体,并且其中所述洗脱溶液包含裂解所述可酶促裂解的键的酶,或者(b)其中所述高亲和力试剂通过在暴露于亲核和/或碱性条件时,在暴露于亲电子和/或酸性条件时,或在暴露于还原条件时裂解的键连接到所述载体,并且其中所述吸附剂暴露于建立此类条件的洗脱溶液,从而裂解所述高亲和力试剂与结合的靶蛋白的复合物。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法,其中所述高亲和力试剂为适体或亲和体。
13.一种用于从液体样品中分离至少一种靶蛋白的吸附剂,所述吸附剂包含固体载体,所述固体载体包含对所述至少一种靶蛋白具有亲和力的附接的适体或亲和体。
14.根据权利要求13所述的吸附剂,其中所述适体或亲和体通过可化学裂解的键连接到所述固体载体,或者其中所述适体或亲和体通过可酶促裂解的键连接到所述固体载体。
15.根据权利要求14所述的吸附剂,其中所述固体载体包含附接的酶,所述附接的酶适于从所述固体载体酶促裂解所述适体或亲和体,从而允许所述适体或亲和体和所述靶蛋白的复合物从所述固体载体释放以用于进一步处理。
16.根据权利要求13-15中任一项所述的吸附剂,其中所述固体载体包含附接的酶,所述附接的酶适于在所述附接的酶活化后消化所述靶蛋白。
17.根据权利要求16所述的吸附剂,其中所述酶通过柔性连接基附接到所述固体载体,或者其中所述酶通过可裂解连接基附接到所述固体载体。
18.根据权利要求16所述的吸附剂,其中所述酶通过可酶促裂解的连接基附接到所述固体载体,或者其中所述酶通过可化学裂解的连接基附接到所述吸附剂。
19.根据权利要求13-18中任一项所述的吸附剂,其中所述吸附剂设置在多孔条带、多孔板、柱、一次性料筒或ELISA板中。
20.一种试剂盒,所述试剂盒包含根据权利要求13-19中任一项所述的吸附剂,以及选自以下各项的一种或多种试剂盒组分:(a)包含表面活性剂和盐的洗涤溶液、(b)预处理溶液、(c)一种或多种洗脱溶液、(d)一种或多种蛋白水解酶溶液、(e)收集板、(f)帽垫、(g)校准和参考标准物、以及(h)使用说明。
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