KR20140137353A - 단일 분석에서의 다중 분석물을 위한 선별제 기반 인식 및 정량 시스템 및 방법 - Google Patents

Abstract

측정될 분석물을 함유하는 샘플 용액에 샘플 용액 내의 분석물 중 하나 이상에 대한 친화력이 있는 친화력 선별제를 첨가하는 단계; 친화력 선별제와 분석물 사이에 면역 복합체가 형성되게 하는 단계; 형성된 면역 복합체를 제1 차원의 분리에서 선별적 흡착 기술을 사용하여 샘플 용액 내의 비-분석물 물질로부터 부분적으로 또는 완전히 분할하는 단계; 분할된 면역 복합체를 해리시키는 단계; 해리된 면역 복합체의 분석물 및 친화력 선별제를 제2 차원의 분리에서 선별적 흡착 기술을 사용하여 서로로부터 분리하는 단계; 및 분석물을 이의 질량-대-전하 비에 따라 분할하는 단계를 포함하는 다차원 방법이 샘플 용액 내의 다중 분석물을 동시에 분석하기 위해 제공된다.

Description

단일 분석에서의 다중 분석물을 위한 선별제 기반 인식 및 정량 시스템 및 방법{SELECTOR BASED RECOGNITION AND QUANTIFICATION SYSTEM AND METHOD FOR MULTIPLE ANALYTES IN A SINGLE ANALYSIS}

관련 출원에 관한 상호 참조

본 출원은 2012년 2월 2일에 출원된 미국 특허 가출원 일련 번호 61/594,193 (대리인 사건 번호 PERF-P0006-US)을 우선권으로 주장하고, 2010년 3월 10일에 출원된 미국 특허 출원 일련 번호 12/721,173 (대리인 사건 번호 PERF-P0004-US) 및 마찬가지로 2010년 3월 10일에 출원된 국제 특허 출원 번호 PCT/US2010/026819 (대리인 사건 번호 PERF-P0001-WO)의 일부 계속 출원이며, 이들의 개시내용은 이에 의해 명백하게 전문이 본원에 참고로 포함된다.

개시내용의 분야

본 개시내용은 일반적으로 항원을 분석하기 위한 다차원 분석 전략 및 시스템에 관한 것이고, 특히 단일 분석에서 다중 분석물을 분석하기 위한 친화력 선별제 기반 인식 및 정량 시스템 및 방법에 관한 것이다.

개시내용의 배경

~100,000개의 다른 성분들의 혼합물에서 단일 분석물을 측정하는 것은 어려운 과업이다. 60년도 이전에, 분석가들은 항체의 구조 선택성이 생물학적 추출물 또는 혈액으로부터의 항원 및 합텝에 이의 화학적 구조를 기초로 결합하여 이를 정제하는데 사용될 수 있다는 것을 인지하기 시작하였다. 이러한 기술은 매우 중요해져서 로잘린 얄로(Rosalyn Yalow)에게 1960년의 방사선-면역 검정법 (RIA: radio-immunological assay)으로 노벨상이 수여되었다. 효소 결합 면역흡착 검정법 (ELISA: enzyme linked immunosorbent assay)과 함께, 이러한 2가지 기술은 pg/㎖ 수준에 이르기까지 항원을 측정하는 간단한 방법을 세상에 제공하였다.

RIA 및 ELISA 양쪽 모두의 기본적인 구성요소는 검정법의 제1 단계에서 샘플로부터 항원 선별을 달성하기 위해 고정된 항체를 사용하는 것이다. 이러한 접근법들의 개시 이래로, 분석 면역학자들은 항체를 표면에 결합시키는 것이 유의한 동역학적 제약을 도입한다는 것을 이해하였다. 예를 들어, 표면에 도달하기 위해 항원이 분자 차원의 관점에서 실질적인 거리를 이동하여야 하고, 이에 의해 시험관 또는 미량역가 웰에서 항원 결합이 일어나는데 필요한 시간의 양을 증가시킨다. 또한, 검정법에서 사용된 모든 항체가 검정법 웰의 표면에서 또는 입자 상에서 뭉쳐지는 한편, 항원은 용액 전반에 걸쳐 균일하게 분포된다. ELISA가 미량역가 웰에서 수행되는 경우, 항체가 결합되어 있는 웰의 벽으로 항원이 확산되는 시간을 허용하도록 전형적으로 1일 이상의 인큐베이션 시간이 사용된다. RIA 경우의 확산 문제를 최소화하기 위한 노력은 항체가 고정된 다수의 초소형 무기 입자를 사용하는 것을 수반하였다. 지난 수년에 걸쳐, 많은 유형의 혼합, 유동, 가열, 및 심지어 초음파처리 절차가 상기 언급된 확산 문제를 최소화하는데 사용되었다. 이러한 노력들에도 불구하고, 확산 문제가 여전히 존재한다.

분석 화학이 발전함에 따라, 다중 분석물이 동시에 측정된다면 샘플에 관련된 여러 의문점에 대해 더욱 양호하고 더욱 완전한 해답이 얻어질 수 있다는 것이 인식되었다. 차례로 이는 다수의 분석물이 단일 분석 과정 동안 샘플에서 분석되는 "분석 다중화"에 대한 관심 증가로 이어졌다. 이는 종종 면역학적 어레이(array)를 통해 행해진다.

면역학적 검정법에 대한 관심은 미세-전자-기계-시스템 (MEMS: micro-electro-mechanical-system)의 유행 및 성공에서 기인한다. 여러 유형의 항체 어레이가 고-처리량 및 병렬 프로세싱 기술이 포함되는 대규모 다중화에 사용된 한편, 다른 접근법은 검정마다 총 분석 시간 및 비용을 최소화하는 것에 관심이 있는 임상 실험에서 필요할 바와 같이 더 적은 수의 샘플을 사용하는 대규모 다중화에 집중되었다. 어떠한 접근법이 사용되었든지, 면역학적 어레이 시스템은 항체 고정 및 동역학에 관한 난점에 여전히 직면한다. 항체가 고정 후 완전한 활성을 유지할지, 특히 표면에서 부적절하게 배향된 경우에 그러할지 여부에 관한 사안도 있다. 입체구조 사안 또한 고려되어야 하고, 특히 표면에 대한 항체의 배향의 관점에서 그러하며, 뿐만 아니라 이의 패킹(packing) 밀도도 고려되어야 한다. 마지막으로, 재생성 또한 하나의 요인인데, 이는 특히 표면에 침착된 피코리터 부피의 용액으로부터 고정된 항체를 재생시키는 것이 어렵기 때문이다. 증발, 뿐만 아니라 무수한 기타 현상들도 역가 플레이트 수준의 고정에서 경험한 것으로부터 재생성을 감소시킨다.

항원이 표면에 도달하기 위해 확산되어야 하는 거리가 미량역가 웰에서보다 면역학적 어레이에서 더 작지만, 동역학 사안이 여전히 면역학적 어레이의 심각한 제약이다. 이는 낮은 항원 농도에서 특히 그러하다. 상당한 시간이 항원이 용액 내의 모든 지점으로부터 어레이 요소 중 하나로 확산되는데 요구된다. 항원:항체 복합체 형성에서의 분자 도킹(docking)이 정확한 공간 배향을 요구하기 때문에, 올바른 포획 배향을 확립하기 전에 일반적으로 항원이 여러 번 표면을 타격한다. 예를 들어, 128-요소 어레이에서 표면과 충돌한 후에 항원이 포획되지 않으면, 두 번째로 표면을 타격하기 전에 탐사할 다수의 공간이 있다.

상기 언급된 바와 같이, 입자-기반 검정법은 RIA 및 얄로 접근법으로 시작하였다. 현재, 얄로 접근법은 2가지 유형의 검정법 시스템으로 발전하였다: 1) 개별적인 입자의 형광을 시험하는 유동 세포측정 검정법에서 사용되는 입자 접근법 (예를 들어, 루미넥스(Luminex) 시스템); 및 2) 항체가 자기 입자 상에 놓이고, 여기에서 면역 복합체가 형성된 후, 입자가 용액 밖으로 인출되고, 추가적인 측정에서 항원이 방출되는 접근법 (예를 들어, 리 앤더슨(Leigh Anderson)의 SISCAPA 시스템). 다중화는 측정될 각각의 항원에 대한 상이한 면역흡착 비드(bead) 세트의 제조를 필요로 한다. 이는 항체를 보유하는 비드의 20-50가지의 상이한 세트가 샘플 용액에 첨가될 필요가 있을 것이고, 이에 의해 적합한 항체 입자를 찾는 관점에서 항원의 더 큰 동역학 제약을 야기한다는 것을 의미한다. 또한, 용액이 다수의 입자로 혼잡해져서, 항원이 이의 항체를 보유하지 않는 입자 주변으로 확산되어야 한다. 이러한 제약들을 다루는 한가지 제안된 해법은 단일 입자 상에 다중 항체를 고정시키는 것이다. 그러나, 이러한 해법은 확산 및 화학양론적 제어의 문제를 완전히 해결하지 않는다. 또한, 입자 표면 상의 항체 농도의 희석은 항원이 이의 항체와 접촉하지 않으면서 입자 표면을 타격할 수 있다는 것을 의미한다. 게다가, 총 표면적, 및 따라서 필요한 입자의 총 개수가 여전히 높을 것이다.

유동 세포측정법 전략 (예컨대 루미넥스 시스템)과 관련하여, 유동 세포측정법에 의해 분석될 수 있기 전에 면역 복합체(complex)가 입자 표면 상에 형성되어야 한다. 이러한 시스템이 상기와 매우 유사한 한편, 각각의 비드는 단일 항원을 표적화하는 단일 항체를 보유한다. 또 다시, 항원 포획에서 확산 문제가 있다.

포유동물 면역계의 기능이 수천 개의 항원을 이들 모두를 동시는 아닐지라도 다루는 것이라는 것이 흥미롭다. 외래 물질에 대한 면역이 개별 포유동물에서 발달됨에 따라, 수천 개의 면역원에 대한 항체가 생산된다. 이러한 항체들은 혈액을 순환하는 면역글로불린 내에 함유되고, 혈액에서는 언제라도 수백 개의 항원이 항원:항체 복합체가 형성됨에 따라서 격리된다. 포유동물 면역계의 분석 시, 항체가 면역 복합체를 형성할 때 용액에서 기능하도록 진화된 것으로 결론지을 수 있다. 용액에서 기능하는 것에 더하여, 이들은 또한 다수의 항원을 동시에 격리하고, 고정된 항체 검정법 시스템에서 나타나는 제약들이 거의 없다.

포유동물 면역계의 상기 언급된 관찰은, 특히 용액에서의 면역 복합체의 형성이 천연적으로 효율적인 반면에 고정된 표면 상에서의 복합체의 형성은 그렇지 않다는 것을 명확하게 시사하기 때문에, 매우 중요하다. 또한, 여러 면역 복합체가 용액 (예컨대 혈액)에서 동시에 형성될 수 있다는 것이 명확하고, 이는 분석적 다중화 프로세스를 수행할 때 달성하기 위한 필수 요소이다. 마지막으로, 면역학적 검정법에 통상적으로 영향을 미치는 문제들 중 대부분 (예를 들어, 고정 동안의 활성 상실, 정확한 항체 배향, 확산 동역학 및 충분한 표면적이 있는 것)이 이러한 천연 용액 기반 시스템에서는 일반적이지 않다.

천연적으로 형성된 면역 복합체의 상기 기술된 장점에도 불구하고, 이같은 면역학적 검정법은 항체를 샘플에 첨가하는 것을 여전히 필요로 하고, 이는 걱정스러울 수 있다. 예를 들어, 다수의 항체를 혈장 샘플에 첨가하는 것은 분석물 확산이 방해되는 수준으로 단백질 농도를 증가시킬 수 있다. 이러한 문제는 표면에서는 걱정스럽게 보일 수 있지만, 더 들여다보면, 이러한 문제는 중요하지 않을 것 같다고 결론지을 수 있다. 더욱 특히, 혈장 내의 혈청 알부민의 평균 농도는 약 50 내지 약 100 mg/㎖ 범위로 존재하는 한편, 면역글로불린은 약 4 mg/㎖의 양으로 존재하고, 임의의 특정 항체의 양은 아마도 약 1 내지 약 100 ug/㎖의 범위일 것이다. 분석 측정을 수행하는데 필요한 항체의 농도가 10 ug/㎖인 것으로 가정된다면, 그리고 100개의 항체가 혈장 샘플에 첨가되어야 할 때, 단백질 농도의 총 증가는 약 1 mg/㎖일 것이다. 유사하게, 혈장 샘플 내의 단백질 농도가 75 mg/㎖이었으면, 단백질 농도의 증가는 약 1.3％일 것이다. 따라서, 100배 다중화 분석을 수행하기 위해 항체 100개를 혈장에 첨가하는 것이 단백질 농도, 용액 점도, 및 궁극적으로는 분석물 확산에 대한 효과가 거의 없을 것으로 결론지을 수 있다. 또한, 1000개의 항체를 첨가하는 것은 단지 10 mg/㎖의 양 또는 단백질 농도에서의 14％ 변화를 부가할 것이고, 이는 마찬가지로 분석에 영향을 미치는데 충분하지 않을 것이다.

1960년 이전에, 면역학적 검정법은 일반적으로 개별적인 항원을 표적으로 하였고, '침강소(precipitin) 반응'으로 칭해지는 프로세스를 통해 용액에서 수행되었다. 면역 복합체 형성에 이어서, 검정법에서 사용되는 폴리클로날 항체 혼합물이 침전물을 형성하였거나, 또는 탄수화물 또는 에틸렌 글리콜 중합체의 첨가에 의해 침전물을 형성하도록 유도되었다. 광 산란에 의해 항원 농도가 결정되었다; 그러나, 이러한 접근법과 관련된 감도 및 직선성의 결여, 뿐만 아니라 침강소 검정법은 한번에 1개의 항원만 검정되는 사실은 이러한 방법의 소멸에 이르렀고, 궁극적으로는 훨씬 더 민감성인 RIA 및 ELISA 방법으로 변천되었다. 침강소 반응 방법의 실패에도 불구하고, 선별도 및 검출 감도가 크게 개선되었다면 용액 기반 면역 복합체 형성 접근법이 면역학적 검정법에 유용할 수 있었을 것으로 여전히 추론될 수 있다.

원래의 침강소 및 RIA 접근법은 항원 측정의 실행에서 단일 선별 방법 (즉, 1개의 항체)에 의존적이었지만, 현재 단독 항체가 항원과 샘플 내의 모든 다른 화학적 실체를 구별하는데 충분히 선별적이지 않는 것으로 인정된다. 현행 면역학적 검정법은 다중 차원의 선별 및/또는 구별을 기반으로 하고, 이러한 차원 각각의 선별도가 직교성인 경우에 특히 이상적이다.

개요

본 개시내용은 상기 논의된 종래 기술의 단점들 중 하나 이상을 극복 또는 개선하거나, 또는 항원을 분석하기 위한 신규한 다차원 분석 전략 및 시스템을 제공하는 것에 의해 이에 대한 유용한 별법을 제공한다

이의 한가지 형태에서, 항원 분석을 위한 다차원 분석 전략이 제공된다. 본 개시내용의 이러한 측면에 따르면, 샘플 용액 내의 항원이 제1 차원의 분석 동안 가용성 면역 복합체에서 항체에 의해 격리된다. 분석 프로세스의 초반에 용액에 첨가되는 항체는 다차원 프로세스의 후속 단계에서의 정성적 및 정량적 분석을 위해 항원에 결합하는 특정 목적을 위한 것이다. 교차-반응 항원, 비-특이적으로 결합된 물질, 및 항원과 2차적으로 회합하는 종이 제1 차원에서 면역 복합체에 또한 흡착될 수 있고, 이후 차원의 분석에서 제거된다. 그 후, 제1 차원에서 형성된 면역 복합체의 독특한 특색을 제2 차원의 분석에서 활용하여, 분자 사이징(sizing) 시스템 또는 격리 항체의 특정 특색을 표적으로 하는 흡수제 매질을 사용하여 이들의 유체역학적 부피를 기초로 이들을 샘플 내의 다른 성분으로부터 분할한다. 이러한 2가지 특색 중 하나를 기초로 하는 분획화는 에피토프:파라토프 인식에 대해 직교성이고, 분석물 특이적 화학 변형 (예컨대 유도체화 또는 단백질분해) 및 흡착 및 표면 (예컨대 역상 또는 이온 교환 매질 상의 표면)으로부터의 차별적 용출에 따른 크기 구별, 또는 사이징 배제 및 소수성 흡착 (제한 접근 매질과 같음)의 조합의 범위에 이르는 방식들의 조합으로 제3 및 제4 차원에서의 구별이 달성된다. 선택된 특정한 구별 메커니즘, 및 이들이 커플링된 순서는 표적화되는 분석물의 화학적 성질 및 처음 2개의 차원에서 사용된 분획화 메커니즘에 좌우된다. 제5 차원 이상에서의 분석 차원은 질량 분광법에서 형광 및 전기화학 검출기까지에 이르는 검출 시스템 내에서 일어난다. 질량 분광법 검출 시스템을 이용하는 특정 실시양태에 따르면, 분석물은 제5 차원에서 이들의 질량에 따라, 제6 차원에서 분석물의 충돌-유도 해리에 따라, 제7 차원에서 생성된 단편 이온의 질량 분석에 따라 분할될 수 있다.

본 개시내용의 또 다른 형태에 따르면, 샘플 용액 내의 다중 분석물을 동시에 분석하기 위한 다차원 방법이 제공된다. 개시 내용의 이러한 측면에 따르면, 이러한 방법은 친화력 선별제를 샘플 용액에 첨가하여 친화력 선별제와 분석물 사이에 면역 복합체를 형성시키는 단계; 형성된 면역 복합체를 샘플 용액 내의 비-분석물 물질로부터 부분적으로 또는 완전히 분할하도록 제1 분리 수단을 제공하는 단계; 분석물을 샘플 용액 내의 서로로부터 부분적으로 또는 완전히 분할하도록 제2 분리 수단을 제공하는 단계; 및 분석물을 이의 질량-대-전하 비에 따라 분할하는 단계를 포함한다.

본 개시내용의 또 다른 형태에 따르면, 샘플 용액 내의 다중 분석물을 동시에 분석하기 위한 다차원 방법이 제공된다. 개시 내용의 이러한 측면에 따르면, 이러한 방법은 측정될 분석물을 함유하는 샘플 용액에 샘플 용액 내의 분석물 중 하나 이상에 대한 친화력이 있는 친화력 선별제를 첨가하는 단계; 친화력 선별제와 분석물 사이에 면역 복합체가 형성되게 하는 단계; 형성된 면역 복합체를 샘플 용액 내의 비-분석물 물질로부터 부분적으로 또는 완전히 분할하는 단계; 분할된 면역 복합체를 해리시키는 단계; 분석물을 표면 흡착 프로세스를 통해 포획하는 것에 의해, 해리된 면역 복합체의 분석물 및 친화력 선별제를 서로로부터 분리하는 단계; 포획된 분석물을 검출 수단으로 전송하는 단계; 및 분석물을 이의 질량-대-전하 비에 따라 검출 수단으로 분할하는 단계를 포함한다.

본 개시내용의 특정 측면에서, 분석물 또는 형성된 면역 복합체를 이들의 유체역학적 부피에 따라 분리하는 것, 친화력 선별제 또는 분석물의 독특한 구조적 특색을 표적화하여 분석물 또는 형성된 면역 복합체의 항체를 포획하는 것, 올리고뉴클레오티드를 혼성화시키는 것, 또는 비오틴화 친화력 선별제를 고정된 아비딘으로 흡착하고 포획하는 것에 의해, 형성된 면역 복합체가 전체적으로 또는 부분적으로 분할된다.

본 개시내용의 또 다른 측면에서, 분석물 또는 형성된 면역 복합체를 이들의 유체역학적 부피에 따라 분리하는 것, 분석물을 소수성 표면에 흡착시키고 이로부터 차별적으로 방출시키는 것, 친화력 선별제 또는 분석물의 독특한 구조적 특색을 표적화하여 분석물 또는 형성된 면역 복합체의 항체를 포획하는 것, 올리고뉴클레오티드를 혼성화시키는 것, 비오틴화 친화력 선별제를 고정된 아비딘으로 포획하는 것, 하전된 표면에 흡착시키고 이로부터 차별적으로 방출시키는 것, 고정된 금속 친화력 킬레이터에 흡착시키고 이로부터 차별적으로 방출시키는 것, 또는 보론산 강화 표면에 흡착시키고 이로부터 차별적으로 방출시키는 것에 의해 샘플 용액 내의 분석물 및 친화력 선별제가 서로로부터 분리된다.

본 교시내용에 따라 분석되는 분석물은 분석물 단편, 분석물 유도체 및 분석물 동위원소 이성질체 중 하나 이상을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다. 또한, 본 교시내용의 친화력 선별제는 항체, 항체 단편, 앱타머, 렉틴, 파지 디스플레이 단백질 수용체, 박테리아 단백질 및 올리고뉴클레오티드 중 하나 이상을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다. 특정 실시양태에 따르면, 박테리아 단백질은 G 단백질, A 단백질, 및 또 다른 생물로부터의 단백질을 표적화하는 생물에 의해 생산된 단백질 중 하나 이상을 포함할 수 있는 한편, 올리고뉴클레오티드는 RNA, DNA 및 PNA 중 하나 이상을 포함할 수 있다.

본 개시내용의 특정 실시양태에 따르면, 친화력 선별제의 독특한 구조적 특색을 고정된 항체로 표적화하는 것에 의해 분석물 및 친화력 선별제가 서로로부터 분리된다. 이러한 구체적인 실시양태에 따르면, 표적화되는 독특한 구조적 특색은 친화력 선별제의 특유한 천연 구조 특색, 친화력 선별제에 접합된 합텐, 및 친화력 선별제에 접합된 면역원 중 하나 이상을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다.

본 개시내용의 일부 측면에 따르면, 분석되는 분석물은 질량-대-전하 비에 따라 분리된 분석물의 모 이온(parent ion)을 특이적으로 검출하는 질량 분광법을 사용하여 검출가능한 이온화 분석물을 포함한다.

본 개시내용의 특정 측면에 따르면, (a) 질량-대-전하 비에 따라 분리된 분석물을 이온화시키는 단계; (b) 기체 상 단편화 프로세스를 이용함으로써 단계 (a)로부터의 모 이온의 단편 이온을 생성시키는 단계; (c) 단계 (b)로부터의 생성된 단편 이온을 이의 질량-대-전하 비에 따라 분리하는 단계; 및 (d) 단계 (c)로부터의 생성된 단편 이온이 검출기 표면과 충돌할 때, 발생된 상대적인 이온 전류를 기록하는 단계의 통합 단계를 수행하도록 구성된 검출 수단을 사용함으로써 분석물이 분할된다. 분석물을 분할하도록 사용된 검출 수단의 관점에서, 특정 실시양태에 따르면, 하기 기술 중 하나 이상에 의해 분석물이 검출된다: 질량 분광법, 흡광도, 형광 및 전기화학 분석.

본 개시내용의 추가적인 실시양태에 따르면, 동위원소에 의해 코딩되는 내부 표준물질이 분석 중인 분석물의 상대적 또는 절대적인 정량을 달성하는데 사용될 수 있다. 또한, 순차적 첨가, 경쟁적 결합 검정법이 분석물의 상대적 또는 절대적인 정량을 달성하는데 또한 사용될 수 있다.

본 개시내용의 또 다른 측면에 따르면, 샘플 용액으로부터 분취량의 분석물을 수집하도록 항체 농도가 또한 고려될 수 있다. 본 개시내용의 이러한 측면에 따르면, 수집된 분취량은 분석물을 분할하는데 사용되고 있는 장치의 최적 검출 범위를 맞추도록 구성된다.

본 개시내용의 또 다른 형태에 따르면, 다수의 직교성 분리 차원을 사용하여 샘플 용액 내의 다중 분석물을 분석하기 위한 방법이 제공된다. 개시내용의 이러한 측면에 따르면, 이러한 방법은 친화력 선별제를 샘플 용액에 첨가하여, 친화력 선별제와 분석물 사이에 면역 복합체를 형성시키고, 샘플 용액 내의 하나 이상의 항원 및 방해 물질을 독립적으로 격리시키는 단계; 선별적 흡착 기술을 사용하여, 격리된 하나 이상의 항원 및 방해 물질을 제1 또는 제2 직교 분리 차원 (순서와 관계없음)에서 제거하는 단계; 형성된 면역 복합체를 샘플 용액 내의 다른 비-분석물 물질로부터 부분적으로 또는 완전히 분할하도록 제1 분리 수단을 제공하는 단계; 분석물들을 샘플 용액 내의 서로로부터 부분적으로 또는 완전히 분할하도록 제2 분리 수단을 제공하는 단계; 및 분석물을 이의 질량-대-전하 비에 따라 분할하는 단계를 포함한다.

본 개시내용의 또 다른 측면에 따르면, 친화력 선별제를 샘플 용액에 첨가하여 친화력 선별제와 분석물 사이에 면역 복합체를 형성시키는 단계; 제1 크로마토그래피 칼럼을 제공함으로써, 형성된 복합체를 샘플 용액 내의 복합체를 형성하지 않은 다른 물질로부터 분리하는 단계; 형성된 복합체를 해리시키는 단계; 제2 크로마토그래피 칼럼의 표면 흡착을 통해 분석물을 포획함으로써, 분석물을 친화력 선별제로부터 분리하는 단계; 포획된 분석물을 제2 크로마토그래피 칼럼에 커플링된 제3 크로마토그래피 칼럼으로 전송하는 단계; 및 포획된 항원 또는 이의 단편을 이들이 제3 크로마토그래피 칼럼으로부터 용출될 때 분석하는 단계를 포함하는, 샘플 용액 내의 분석물들을 동시에 분석하기 위한 방법이 제공된다.

본 발명의 특정 측면에 따르면, 복합체를 형성하지 않은 물질은 첨가된 친화력 선별제가 표적화하는 에피토프가 없는 물질을 포함한다.

본 개시내용의 또 다른 측면에 따르면, 형성된 복합체를 샘플 용액 내의 복합체를 형성하지 않은 다른 물질로부터 분리하는데 사용된 크로마토그래피 칼럼은 크기 배제 크로마토그래피 칼럼, 흡수제가 패킹된 제한 접근 매질 칼럼, 일반적인 클래스의 첨가된 친화력 선별제를 표적화하도록 구성된 항체 칼럼, 모든 첨가된 친화력 선별제를 표적화하도록 구성된 단백질 A 또는 G 칼럼, 첨가된 친화력 선별제 중 하나 이상에 부착된 올리고뉴클레오티드에 대해 상보적인 DNA가 고정되어 있는 DNA 올리고뉴클레오티드 칼럼, 첨가된 친화력 선별제 중 하나 이상에 부착된 비오틴을 표적화하도록 구성된 아비딘 칼럼, 및 첨가된 친화력 선별제의 천연 발생 특색 또는 합성에 의해 생성된 특색을 선별하도록 구성된 크로마토그래피 칼럼 중 하나 이상으로부터 선택된다.

본 개시내용의 또 다른 측면에 따르면, 표면 흡착을 통해 분석물을 포획함으로써 분석물을 친화력 선별제로부터 분리하는데 사용된 크로마토그래피 칼럼은 역상 크로마토그래피 칼럼, 제한 접근 매질 칼럼, 면역흡착제, 고정된 금속-이온 친화력 크로마토그래피 칼럼, 이온 교환 칼럼 및 크로마토그래피 체류 메커니즘 중 하나 이상으로부터 선택된다.

본 개시내용의 특정 측면에 따르면, 친화력 선별제는 앱타머, 단백질 A, 단백질 G, 파지 디스플레이 단백질, 천연 수용체, 렉틴, DNA, RNA, 합성 친화력 시약, 또는 친화력 포획제와 분석물 사이에 다수의 분자간 복합체를 형성하도록 분석물에 대한 친화력을 나타내는 일부 기타 종을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.

본 개시내용의 또 다른 측면에 따르면, 샘플 용액 내의 다중 분석물을 동시에 분석하기 위한 다차원 방법은 측정될 분석물을 함유하는 샘플 용액에 샘플 용액 내의 분석물 중 하나 이상에 대한 친화력이 있는 친화력 선별제를 첨가하는 단계; 친화력 선별제와 분석물 사이에 면역 복합체가 형성되게 하는 단계; 형성된 면역 복합체를 제1 차원의 분리에서 선별적 흡착 기술을 사용하여 샘플 용액 내의 비-분석물 물질로부터 부분적으로 또는 완전히 분할하는 단계; 분할된 면역 복합체를 해리시키는 단계; 해리된 면역 복합체의 분석물 및 친화력 선별제를 제2 차원의 분리에서 선별적 흡착 기술을 사용하여 서로로부터 분리하는 단계; 및 분석물을 이의 질량-대-전하 비에 따라 분할하는 단계를 포함한다.

도면의 간단한 설명
첨부된 도면과 함께 기재된 개시내용의 실시양태들의 하기 설명을 참조로 본 개시내용의 상기 언급된 장점 및 기타 장점 및 이들을 수득하는 방식이 더욱 명백해질 것이고 개시내용 자체가 더 잘 이해될 것이다.
도 1은 본 개시내용의 교시에 따른 복합체를 형성하도록 분석물과 복합체를 이루는 친화력 선별제를 기초로 하는 다중 분석물의 동시 분석을 나타내는 다차원 체계이다;
도 2는 본 개시내용의 교시에 따른 제한 접근 매질 (RAM) 입자이다;
도 3은 본 개시내용의 교시에 따른 반투과성 표면 (SPS) 지지체의 도해이다;
도 4는 본 개시내용의 교시에 따른, 친화력 선별제에 의해 복합 샘플 매트릭스로부터 포획된 단백질의 직접적 질량 분광법 (MS) 분석의 분석 프로토콜이다;
도 5는 본 개시내용의 교시에 따른, 내부가 친수성 겔이고 외부가 고정된 트립신으로 코팅된 제한 접근 칼럼의 도해이다;
도 6은 본 개시내용의 교시에 따른, 트립신-RAM 칼럼에서 수반되는 코팅의 합성을 도시한다;
도 7은 본 개시내용의 교시에 따른, 친화력 선별제에 의해 복합 샘플 매트릭스로부터 포획된 후 추가적인 분석 전에 단백질분해 소화에 적용된 단백질의 직접적 질량 분광법 (MS) 분석의 분석 프로토콜이다;
도 8은 본 개시내용의 교시에 따른, 유동 정지 모드의 분석에서 고정된 효소 칼럼에 고압이 적용되게 하는 예시적인 밸빙(valving) 시스템이다;
도 9는 본 개시내용의 교시에 따른, 폴리클로날 항체 친화력 선별제에 의해 포획된 합텐 및 펩티드의 분석에서 사용된 프로토콜의 도해이다;
도 10은 본 개시내용의 교시에 따른, 비오틴화 친화력 선별제에 의해 포획된 합텐 및 펩티드의 분석에서 사용된 프로토콜의 도해이다;
도 11은 본 개시내용의 교시에 따른, DNA, RNA, 또는 PNA 친화력 선별제에 의해 포획된 합텐 및 펩티드의 분석에서 사용된 프로토콜의 도해이다;
도 12는 본 개시내용의 교시에 따른, 분자 크기를 기초로 하는 면역 복합체의 분획화에 사용된 프로토콜의 도해이다;
도 13은 본 개시내용의 교시에 따른, 다중 분석물을 동시에 분석하기 위한 친화력 선별제 기반 프로세스의 고해상도 분석을 수행할 수 있는 기구 플랫폼의 액체 크로마토그래피 성분이다.

도면의 상세한 설명

하기 기술된 본 개시내용의 실시양태들은 포괄적인 것으로 또는 개시내용을 하기의 상세한 설명에 개시된 정확한 형태로 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 그보다는, 이러한 실시양태들은 당업자가 본 개시내용의 원리 및 실행을 인식하고 이해할 수 있도록 선택 및 기술된다.

상기 언급된 바와 같이, 일반적으로 본 개시내용은 항원을 분석하기 위한 다차원 분석 전략 및 시스템에 관한 것이다. 하기에서 더욱 상세하게 설명될 바와 같이, 본 교시내용의 한 두드러진 특색은 제1 차원에서 샘플 용액 내의 분석물과 다수의 분자간 복합체를 형성하는 능력이고, 여기에 제2 차원에서의 일부 유형의 분자간 복합체 분리가 이어지며, 이는 제3 차원에서의 추가적인 분획화 또는 화학 반응을 위한 분획을 생성시킬 것이며, 제3 차원에서의 매우 특이적인 유형의 분리 또는 화학 반응이 이어진다. 본 교시내용의 특정 측면에서, 그 후 더 높은 차원의 분석이 제3 차원 후에 이용될 수 있고, 특히 다차원 분석 프로세스의 말기에, 1) 시험되는 각각의 물질 (분석물)이 개별적으로 확인 및 정량될 수 있거나, 또는 2) 분석물들의 밀접하게 관련된 패밀리가 함께 결정될 수 있는 경우에 그러할 것이다.

이제 도 1로 이동하면, 본 개시내용에 따른, 복합체 (S*:A)를 형성하도록 제1 차원의 분석에서 분석물 (A)와 복합체를 이루는 친화력 선별제 (S*) (예컨대 항체, 앱타머, 렉틴, 단백질 G, 단백질 A, 파지 디스플레이 단백질, 또는 결합 단백질)를 기초로 하는 다중 분석물의 동시 분석을 위한 체계가 제시된다. 본 개시내용의 특정 측면에 따르면 특이적인 친화력 선별제가 각각의 분석물에 대해 일반적으로 사용될 것인 한편, 다른 측면에서는 다수의 당단백질에 커플링되는 루이스(Lewis) x 항원을 표적화하는 항체의 경우에 나타날 바와 같이, 다중 분석물과 복합체를 형성하는 친화력 선별제가 있을 수도 있다.

제1 차원 (또는 "친화력 선별 차원")과 관련하여, 이러한 차원에서의 프로세스는 친화력 선별제 (S*)와 분석물의 복합체화를 기초로 한다. S 상의 기호 (*)는 더 높은 차원에서 추후에 이를 선별하는 것에서 활용될 수 있는 복합체 또는 친화력 선별제 상의 독특한 구조적 특색을 가리킨다.

이러한 제1 차원에서의 분석물 분석은 하기 식 1에서 기술된 바와 같은 용액 내에서의 개별적인 복합체들의 형성으로 시작된다:

<식 1>

[식 중, S*는 친화력 선별제 예컨대 IgG 또는 IgM 항체, 렉틴, 결합 단백질, DNA 종, RNA 종, 또는 분석물 (A)에 대한 결합 친화력이 있는 임의 유형의 종이고; S*:A는 친화력 선별제 (S*) 및 특정 분석물 (A)의 회합에 의해 형성된 비-공유결합 복합체이다]. 특정 친화력 선별제 S*는 친화력 선별제의 선별도에 따라 단일 분석물과 또는 다중 분석물과 복합체를 형성할 수 있다. 분석물은 S*에 대한 친화력이 있는, 항원, 합텐 또는 측정되는 임의의 분석물일 수 있다. S*:A 복합체가 각각의 분석물에 대해 형성될 것이다. S* 또는 A를 각괄호 안에 놓는 것은 몰/ℓ 단위의 이들의 농도를 가리킨다.

일반적으로 하기와 같을 것이다:

(1)

[식 중, K_b1은 특정 분석물 (A₁)에 대한 특정 친화력 선별제의 결합 상수이다]. 결합 상수는 복합체 형성 속도를 해리 속도로 나눈 것과 등가이다. 용액에서 형성된 각각의 유형의 복합체가 이같은 결합 상수가 있을 것이고, 하기의 일반식으로 표시될 수 있다:

(2)

[식 중, A_n은 임의의 특정 분석물이다].

본원에서 요구되지는 않지만, 특정 실시양태에서, 분석물에 대한 높은 친화력 및 큰 결합 상수 (예를 들어,약 10⁶ 초과)의 친화력 선별제가 있는 것이 이롭다. 또한, 특정 실시양태에서, 특정 차원 동안 인큐베이션 조건을 변화시킴으로써 복합체를 해리시키는 것이 의도되지 않는 한, 후속 차원의 분석 동안 복합체 S*:A가 해리되지 않도록 오프(off)-속도가 낮은 것이 이롭다. 게다가, 복합체가 다른 것으로부터의 분리 동안 무손상으로 유지되면, 샘플 내의 비-항원 성분이 중요한 고려 요소이다. 낮은 결합 친화력의 복합체가 제2 차원에서 분석될 수 있지만, 신속하게, 그리고 복합체가 해리될 시간이 있기 전에 분리가 달성된다면 유용하다는 것을 또한 주지하여야 한다.

본 개시내용의 특정 실시양태에 따르면, 친화력 선별제 (S*), 예컨대 항체와 분석물 (A) 사이에 형성된 복합체가 침전되지 않는 것이 바람직하다. 이같은 침전을 방해하기 위해, 높은 수준의 가교 또는 가능하게는 어떠한 가교도 촉진하지 않는 친화력 시약이 이러한 실시양태들에 따라 사용될 수 있다. 분석물의 분자량이 낮은 경우, 이는 일반적으로 문제가 되지 않을 것인데, 특히 친화력 선별제의 원자가는 전형적으로 고분자량 분석물의 경우에 사안이 되는 것으로 결정되었기 때문이다. 항체의 경우, 가교 침전물을 훨씬 덜 형성할 것이기 때문에 저분자량 분석물을 표적화할 때 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 사용하는 것이 가능할 것이다. 단백질 또는 기타 거대분자 분석물의 경우에는, 모노클로날 항체가 침전물을 형성할 가능성이 더 적다. 항체의 Fab 단편이 1가라는 사실은 이를 본 개시내용의 교시에 따른 친화력 선별제 작용제에 대한 양호한 후보물로 만든다. 또한, 이온 강도, pH, 및 첨가제도 복합체를 용액에서 유지시키는데 역할을 할 것이다.

본 개시내용의 또 다른 측면에 따르면, 분석되는 샘플이 면역복합체 형성 전에 또는 고체 상 흡수제 상에서의 면역 복합체의 친화력 포획 전에 분획화된다. 이러한 임의적인 단계의 기능은 교차-반응 종을 제거하는 것, 항원이 복합체의 성분인 천연 복합체들을 구별하는 것, 항원의 이성질체들을 구별하는 것, 또는 항원의 단편을 제거하는 것이다. S*:A 복합체 (식 1에서 제시됨)의 친화력 포획 전에 교차-반응 종을 제거하는 것은 분석물 분석을 매우 용이하게 하고, 2가지 방식으로 달성될 수 있다. 먼저, 교차-반응 종에 일부 특유한 특색 (예를 들어, 독특한 에피토프, 전하 성질, 또는 소수성)이 있으면, S*:A 복합체 형성 전에 또는 S*:A 복합체 형성 후에, 그러나 친화력 흡수제 상에서 복합체를 포획하기 전에 이들을 샘플로부터 선별할 수 있다. S*와 교차-반응 (CR) 종 사이의 복합체의 형성을 방해하는 것이 한가지 경우일 수 있는 한편, 또 다른 경우에는 S*:A 복합체를 포획하기 전에 S*:CR 복합체 복합체가 제거된다.

또 다른 실시양태에서, 인터액톰(interactome)에서 또는 항원이 자가-항체와 부분적으로 또는 완전하게 복합체를 이루었을 때 통상적인 바와 같이, 항원이 S*:A:P₁, S*:A:P₂, S*:A:P₃, 및 S*:A:P₄와 같은 여러 상이한 복합체 내에 있고, P는 1개의 추가적인 비-분석물 단백질이다. 때때로 이는 혈장 내의 티로글로불린의 경우이다. 또한, 이러한 형태들 중 하나는 질환과 연관된 항원 형태의 분석을 방해할 수 있다. 이러한 복합체들 간의 구별은 S*:A 복합체 형성 전에 또는 S*:A 복합체가 포획되기 전에 이러한 복합체의 하나 이상의 형태를 제거하는 면역흡착제로 복합체 내의 비-분석물을 표적화함으로써 달성된다. 방해 복합체의 제거는 복합체 내의 비-분석물을 표적화하는 면역흡착제 또는 일부 다른 유형의 흡착제 예컨대 이온 교환제, 고정된 금속 친화력 크로마토그래피 흡수제, 소수성 상호작용 칼럼, 또는 방해성 비-분석물과 분석물을 구별하는 크기 배제 크로마토그래피 칼럼으로 달성된다. 이러한 단계의 또 다른 용도는 천연 형태의 항원과 분자량이 더 낮은 단편을 구별하는 것이다. 이는 단편 또는 천연 형태의 항원이 검출에 표적화되는 바람직한 분석물인 경우일 수 있다. 또 다시, 면역흡착제 또는 크기 배제 칼럼으로 구별이 달성될 수 있고, 항원은 번역 후의 변형된 아이소형(isoform)으로 존재할 수 있다는 것을 본원에서 이해하여야 한다. 따라서, 이러한 임의적인 단계가 방해성 아이소형을 제거하는데 사용될 수 있다.

이제 도 1로 이동하여, 복합체 형성 후에, 모든 S*:A 복합체가 제2 차원의 분석에서 비-분석물로부터 분리된다. 이러한 분리 단계는 친화력 선별제 (S*) 상의 태그 (*)를 표적화하는 고도로 특이적인 선별 프로세스에서 정전기 또는 소수성 흡착, 전기영동 또는 심지어 크기 기반 분리까지의 범위에 이르는 다수의 방식 (이들 모두는 하기에 기술될 것이다)으로 수행될 수 있다. 이러한 분석 차원의 본질적인 특색은 복합체가 나머지 용액으로부터 일부 방식으로 부분적으로 또는 완전히 분할되어야 한다는 것이다. 흡착에 의해 이러한 단계를 달성하는 것이 하기 식 2에서 도해되고, 이때 S*:A 복합체가 통과할 때 매트릭스 (M) 표면이 이를 흡착한다.

<식 2>

이러한 단계는 다수의 방식으로 달성될 수 있다. 이상적으로는, 매트릭스의 비표면적 (면적/단위 부피)이 높고, 용액 내의 임의의 지점에서 표면까지의 거리는 10 um 이하이다. 매트릭스의 표면은 친화력 선별제 상의 태그 (*)를 표적화하는 일부 유형의 결합제와 같은 시약의 공유결합 부착을 허용하도록 유도체화제와 쉽게 반응하는 관능기가 또한 풍부하여야 한다. 이러한 결합제의 성질이 하기에서 기술된다. 매트릭스의 예는 정지 상을 지지하는 크로마토그래피 칼럼 및 모놀리스(monolithic) 크로마토그래피 칼럼에서 사용된 실리카 및 유기 수지 입자이다. 바람직한 성질의 크로마토그래피 입자는 크기가 <20 um일 것이고, 약 100 내지 약 500 nm 크기의 포어가 있을 것이며, 표면적은 약 40 ㎡/㎖를 초과할 것이다. 모노리스 내의 물질은 <10 um의 관통 포어 및 약 100 내지 약 500 nm의 제2 포어 세트가 있는 실리카 또는 유기 수지일 것이다.

S* 상의 기호 (*)는 이를 흡수제 매트릭스에 결합시키는 것에서 활용될 수 있는 복합체 또는 친화력 선별제 상의 독특한 구조적 특색을 가리킨다. 이러한 특색은 S* 내의 구조적 요소, 또는 S*:A 복합체 형성의 결과로서 생성된 새로운 특색일 수 있다. 이러한 독특한 구조적 특색은 S에서 천연적으로 발생할 수 있거나, 또는 태그로서 S에 화학적으로 접합될 수 있다. 천연 특색의 예는 인간 면역글로불린에서 발견되는 것과 독특하게 상이한 마우스, 래트, 토끼, 소, 돼지 또는 말 항체 내의 아미노산 서열일 것이다. 매트릭스 M에 부착된 항-마우스 IgG 면역흡착제를 사용하는 것은 마우스 항체가 복합체를 형성한 항원으로 인간 혈장으로부터 마우스 항체를 선별하는 것을 가능하게 할 것이다.

특정 실시양태에서, 반-천연 태그가 유전자 조작을 통해 부가될 수 있고, 이는 폴리펩티드 친화력 선별제의 발현 동안 아미노산 서열 태그의 생성을 허용할 것이다. 개시내용의 이러한 측면에 따른 한 이같은 예는 펩티드 꼬리가 부가된 단일쇄 항체이다.

본 개시내용의 다른 측면에 따르면, 비오틴, 합텐, 고도로 하전된 기, 또는 올리고뉴클레오티드 태그를 선별제 (S*)에 공유결합으로 부착시키는 것에 의해 친화력 선별제가 단독으로 또는 자신이 복합체를 이룬 분석물과 함께 샘플로부터 추출될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 태그의 관점에서, 원한다면 다수의 상이한 친화력 선별제를 개별적으로 태그화하는 것이 가능하다는 것을 본원에서 이해 및 인지하여야 한다.

본 개시내용의 추가적인 측면에서, 하기의 비-제한적인 기술 중 하나 이상에 의해 친화력 선별제가 분석물로부터 분리될 수 있다: 분석물 또는 형성된 면역 복합체를 이들의 유체역학적 부피에 따라 분리하는 것, 분석물을 소수성 표면에 흡착시키고 이로부터 차별적으로 방출시키는 것, 친화력 선별제 또는 분석물의 독특한 구조적 특색을 표적화하여 분석물 또는 형성된 면역 복합체의 항체를 포획하는 것, 올리고뉴클레오티드를 혼성화시키는 것, 비오틴화 친화력 선별제를 고정된 아비딘으로 포획하는 것, 분석물을 하전된 표면에 흡착시키고 이로부터 차별적으로 방출시키는 것, 분석물을 고정된 금속 친화력 킬레이터에 흡착시키고 이로부터 차별적으로 방출시키는 것, 또는 분석물을 보론산 강화 표면에 흡착시키고 이로부터 차별적으로 방출시키는 것.

본 개시내용의 교시에 따른 또 다른 비-제한적인 예에서, 항-항체 면역흡착제 매질이 인간 혈장 샘플에 첨가된 마우스 또는 토끼 항체를 포획하는데 사용된다. 이러한 항체들을 샘플로부터 재포획하는 과정 동안, 이들이 함께 복합체를 형성한 임의의 물질이 또한 마찬가지로 포획될 것이다. S*A 복합체를 포획한 후, 표면에 결합된 복합체의 과도한 세정이 모든 다른 약하게 결합된 성분들을 샘플로부터 제거하는데 사용된다. 이러한 기술은 더욱 일반적으로 항-친화력 선별제 접근법으로 지칭될 수 있다. 이러한 예시적인 실시양태에 따르면, 임의 유형의 친화력 선별제를 표적화하는 항체가 복합체를 샘플로부터 끌어당기는데 사용될 수 있다는 것을 이해하여야 한다.

다량의 면역글로불린, 단백질 A, 단백질 G 및/또는 일부 다른 고정물을 함유하지 않는 샘플의 경우, 항체 표적화 단백질이 S*:A 복합체 [식 중, S*는 면역글로불린이다]를 단리하는데 사용될 수 있다. 이러한 방법은 상기 논의된 항-항체 전략과 매우 유사하다.

본 개시내용의 또 다른 비-제한적인 예에 따르면, 아비딘 흡수제가 비오틴 태그가 부착된 친화력 선별제 및 이들의 복합체를 샘플로부터 선별하는데 사용된다. 또 다시, 과도한 세정이 낮은 친화력으로 결합하는 물질을 샘플로부터 제거하는데 사용된다.

항체가 이를 위해 제조된 합텐으로 친화력 선별제에 태그를 부착할 수도 있는 것으로 생각된다. 이러한 합텐 표적화 항체가 고정되는 경우, 제2 차원 포획 매트릭스가 S*:A 복합체의 단리에서 사용된다. 또한, 친화력 선별제가 앱타머인 경우, 제2 차원 매트릭스 (M)에 고정된 올리고뉴클레오티드 서열의 사용을 통해 이를 샘플로부터 선별할 수 있다. 고정된 서열이 표적화하는 앱타머 상의 서열은 복합체 형성에서 사용되지 않고, 흡수제 표면 상의 상보적인 서열과 자유롭게 혼성화하여야 한다.

DNA, RNA, 또는 펩티드 핵산 (PNA) 올리고머로 태그가 부착된 친화력 선별제는 염기쌍 혼성화를 통해 매트릭스 M 상의 상보적인 DNA, RNA, 또는 PNA 서열에 결합할 수 있을 것이다. 각각의 친화력 선별제 (예컨대 항체)는 독립적으로 또는 그룹으로 염기 8-12개의 독특한 DNA 서열로 태그가 부착된다 (코딩된다). 더욱이, 상보적인 올리고뉴클레오티드 서열이 부착되어 있는 M과 접촉하는 각각의 코딩된 친화력 선별제는 혼성화에 의해 결합할 것인 한편, 흡수제 상에 고정된 상보적인 DNA 서열은 이들이 용출될 방식에 따라 균질하게 분포될 수 있거나 또는 공간적으로 그룹화될 수 있다. 복합체를 변성시키는 것, 상보적인 하이브리드를 해리시키는 것, 또는 양쪽 모두에 의해 순차적으로 용출될 때 상보적인 올리고뉴클레오티드들은 칼럼 내의 상이한 위치에 놓인다. 이들이 함께 그룹화될 때, 써모사이클링(thermocycling)을 수반하는 더욱 정교한 순차적인 방출 절차가 사용되어야 한다.

크기의 관점에서, 매트릭스는 S*:A 복합체를 흡착하는 대신 이에 대한 차별적인 투과성을 나타낸다. 소형 분석물이 거대분자성 친화력 선별제와 복합체를 이룬 후, 이는 거대분자처럼 거동하여, 이를 크기 구별 분리기 예컨대 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 매트릭스, 제한 접근 매질 (RAM), 또는 반투과성 표면 (SPS) 매질, 장 유동 분획화 (FFF), 유체역학적 크로마토그래피 (HDC), 또는 막 여과 시스템에 의해 용액 내의 다른 소형 분자로부터 분리되게 한다. 거대분자성 S*:A 복합체는 샘플 내의 저분자량 성분들보다 분자량이 훨씬 더 높을 것이고, 제한 접근 매질 (RAM) 및 반투과성 표면 (SPS) 칼럼이 포함되는 크기 분리 시스템에 의해 쉽게 구별될 것이다. 이러한 매질의 포어 또는 반투과성 표면에 진입하는 저분자량의 소수성 물질은 차별적으로 흡착될 것이다. 이는 RAM 및 SPS 칼럼이 크기 및 소수성 상호작용 메커니즘 양쪽 모두에 의해 분자들을 분리하고 있다는 것을 의미한다.

이제 도 2로 이동하면, 제한 접근 매질 (RAM) 입자의 도해가 제시된다. 이러한 도해에 따르면, 일반적으로 RAM 지지체는 지지체의 내부 표면은 공유결합으로 스테아르산으로 유도체화되고 지지체의 외부 표면은 --OCH₂--CH(OH)--CH₂OH 구조의 글리세롤 에테르로 유도체화되어 있는, 마이크로미터 이하의 실리카 입자들의 응집체이다. 마이크로미터 이하의 입자들 간의 평균 포어 직경은 평균적으로 약 6 nm이고, 이는 분자량이 약 20 내지 약 40 kD을 초과하는 대부분의 단백질의 진입을 방해한다. 대조적으로, 약 3 kD 미만의 펩티드 및 합텐은 RAM 지지체의 내부에 쉽게 진입하고, 여기에서 물로부터 흡착된다.

전기영동 이동성 또는 등전점에서의 차이에 의해 복합체의 전기영동 분리가 달성될 수 있다. 특정한 예시적인 실시양태에 따르면, 친화력 선별제의 전기영동 성질이 용액 내의 다른 종의 것과 크게 상이한 것이 바람직하다. 이는 용액 내의 단백질과 비교하여 DNA 또는 RNA 기반 선별제의 경우에 일반적으로 해당될 것인 한편, DNA 또는 RNA와의 복합체 내의 펩티드 및 단백질도 마찬가지로 용액 내의 다른 펩티드 및 단백질로부터 쉽게 분리될 수 있다.

장 유동 분획화 (FFF)는 크기가 상이한 분자들을 이들의 확산 계수에서의 크기-관련 차이를 활용하는 메커니즘에 의해 분리한다. HDC는 용출 성질에서의 크기 관련 차이를 마찬가지로 일으키는 약간 상이한 메커니즘에 의해 거대분자들을 분리한다.

도 3에서, 반투과성 표면 (SPS) 지지체의 도해가 제공된다. 이러한 흡수제는 300 돌턴 폴리옥시에틸렌 (POE) 올리고머를 실리카 지지체의 표면에 부착된 15개의 옥틸 (C₈) 실란 기마다 평균 1개로 부착시킴으로써 제조된다. POE 올리고머는 흡수제 표면 상의 C₈ 잔기와 약하게 회합하여, 단백질과의 접촉을 차단한다. 대조적으로 합텐 및 펩티드는 이러한 코팅을 투과할 수 있고, 소수성 상호작용 메커니즘을 통해 C₈ 기에 결합한다.

제2 차원 분리 프로세스의 최종 성분은 S*:A 복합체 또는 분석물 단독이 제2 차원에서의 흡수제로부터 방출되고/되거나 추가적인 분석을 위해 제3 차원으로 전송되는 것을 요구한다. SEC, RAM, SPS, 또는 FFF 분리의 크기 선별의 경우에, 분석물이 제3 차원으로 직접적으로 전송될 수 있거나, 또는 분석물이 제3 차원으로 전송되기 전에 복합체가 해리될 수 있다. 분자 사이징 분리 경우의 해리는 분자 사이징 칼럼으로부터의 출구에서 상대적으로 산성 (pH 2.5) 또는 염기성 (pH 12)인 이동 상으로 pH를 조정함으로써 달성될 수 있다. 또한, 상대적으로 산성 (pH 2.5) 또는 염기성 (pH 12)인 조건에 의해 면역흡착제로부터의 면역 복합체의 해리가 달성된다. Ab:Ab 복합체를 해리시키는 것에 더하여, Ab:Ag 복합체가 또한 해리된다.

비오틴화 친화력 선별제:분석물 복합체가 여러 방식으로 모노-아비딘 친화력 칼럼으로부터 방출될 수 있다. 한가지는 비오틴을 포획제 위로 용액에 또는 크로마토그래피 칼럼의 경우 이동 상에 첨가하는 것에 의한 것이다. 이는 비오틴화 S*A 복합체를 방출시킬 것이다. 이러한 방식으로 방출될 때 모노-아비딘 칼럼이 다수의 사이클에 대해 사용될 수 있다. 별법적인 용출 전략은 pH가 약 2.5인 산성 용액을 적용하는 것이다. 이는 가역적으로 모노-아비딘을 변성시킬 것이고, 친화력 선별제 및 가능하게는 친화력 선별제로부터의 분석물 양쪽 모두를 방출시킬 것이다. 또한, 단백질인 기타 유형의 S*:A 친화력 선별제가 거의 같은 방식으로 (즉, pH 2 내지 2.5 범위의 산성 용액으로) S* 포획 선별제로부터 해리될 수 있고, 일반적으로 분석물이 동시에 방출될 것이다.

본 개시내용의 특정 실시양태에 따르면, 친화력 선별제는 폴리뉴클레오티드일 수 있거나 또는 올리고뉴클레오티드가 공유결합으로 부착되어 있을 수 있다. 본 개시내용의 이러한 측면에 따르면, 일부 유형의 흡수제 매트릭스 상의 상보적인 올리고뉴클레오티드 서열 (상기 식에서의 M_DNA 또는 M_RNA)이 S*:A 복합체를 샘플로부터 흡착하는데 사용된다. M_DNA로부터의 복합체 또는 복합체의 성분의 해리 및/또는 방출은 i) 이온 강도가 낮거나, ii) 매우 염기성이거나, 또는 iii) 변성제를 함유하는 용리제로 달성된다. 온도를 상승시켜 DNA:DNA, RNA:RNA, DNA:RNA, PNA:DNA, 또는 PNA:PNA 하이브리드를 용융시키는 것에 의해 해리 및 방출이 또한 달성될 수 있다. 또 다른 방식은 친화력 선별제 상의 태그와 동일한 DNA (또는 RNA) 서열을 함유하는 용액을 해리 단계에서 첨가한 후 M의 표면을 가로지르는 시약의 유동을 정지시키는 것일 것이다. 유동이 중지된 후, DNA:DNA, RNA:RNA, 또는 DNA:RNA 하이브리드가 용융되는 지점으로 용액의 온도를 상승시킨다. 그 후, 재혼성화가 일어날 수 있도록 온도를 실온으로 돌아가게 한다. 첨가된 상보적 올리고뉴클레오티드의 농도가 높은 경우, 이는 S*:A 복합체 상의 올리고뉴클레오티드 태그를 앞섬으로써 이를 용액 내에 남길 것이다. 그러면, 방출된 복합체를 추가적인 분석을 위한 제2 차원으로 전송할 수 있다.

본 개시내용의 교시에 따른 제3 차원에서의 분석은 분석 프로세스의 말기에 사용될 궁극적인 검출 방법, 뿐만 아니라 분석물이 i) 소형 분자 예컨대 합텐 또는 펩티드인지, ii) 단백질, 당단백질, 지질단백질, 다당류, 폴리뉴클레오티드인지, 또는 iii) 일부 기타 거대분자 종인지 여부에 좌우된다. 소형 분자 (즉, 합텐 및 펩티드)의 관점에서, 분석물이 전기분무 이온화 질량 분광법 (ESI-MS) 또는 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 질량 분광법 (MALDI-MS)에 의해 확인 및 정량되는 경우에, 분석물의 분자량이 약 2 kD 미만이면 검출이 더욱 쉽게 달성된다. 반면에, 더 큰 분자는 도 4에 제시된 바와 같이 검출될 수 있다; 그러나, 더 작은 분자의 경우에 이온화 효율이 종종 더 높다는 것을 주지하여야 한다.

도 4는 용액 내의 분석물의 친화력 선별제 결합으로 시작되는 단백질 분석을 위한 다차원 "분석 옵션 나무" (AOT: analysis option tree)이다. 친화력 복합체 형성으로부터 진행할 때, 본 개시내용의 특정 실시양태에 따르면, 분석 옵션의 숫자가 제5 차원의 분석에 의해 8, 또는 심지어 이보다 큰 값으로 증가할 수 있다. AOT는 일반적으로 제1 차원에서의 친화력 선별로 시작하고, 중간 차원의 분석에서의 일련의 크로마토그래피 및/또는 화학 변형 단계를 통해 진행되며, 질량 분광법, 형광, 또는 전기화학 수단에 의한 검출로 종결된다. 검출되는 분석물의 유형, 감도 요건, 및 이용가능한 기구 조작이 분석용으로 취해진 나무의 분지를 결정한다.

일부 유형의 친화력 선별제, 일반적으로는 항체, 항체의 Fab 단편, 단일쇄 항체 또는 파지 디스플레이 단백질에 의해 복합체 샘플 매트릭스로부터 격리된 단백질의 직접적인 MS 분석을 위한 AOT가 도 4에서 제시된다. 분자간 친화력 선별제:분석물 복합체가 친화력 선별제를 표적화하는 흡수제에 의해 제2 차원에서 용액으로부터 포획된 후, 항-선별제:선별제:분석물 복합체가 해리되고, 성분들이 차원 3 및 4에서 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 또는 역상 크로마토그래피 (RPC)에 의해 추가로 분획화된 후, 무손상 단백질의 직접적인 분석을 위해 ESI-MS/MS 또는 MALDI-MS/MS로 보내진다. 이를 위해, 단백질, 당단백질 및 지질단백질을 펩티드들의 혼합물로 전환시켜 이들을 질량분광법에 의해 확인 및 정량하는 것이 유용할 수 있다는 것을 본원에서 이해 및 인지하여야 한다. 이러한 접근법은 이하에 기재될 것이다.

도 4에서의 단백질의 직접적인 분석을 위한 AOT의 바깥쪽 분지는 최종 선택이 전기분무 이온화 (ESI) 또는 매트릭스 보조 레이터 탈착 이온화 (MALDI) 질량 분광법 (MS)에 의한 검출이라는 것을 나타낸다. 이러한 2가지 사이의 선택은 이용가능한 기구 조작 및 샘플의 복합도에 크게 좌우된다. 복합적인 혼합물의 경우, MALDI-MS가 특히 유용한 옵션일 수 있는데, 이는 특히 MALDI-MS가 일반적으로 단백질 또는 펩티드의 단일 전하 상태를 제공함으로써 5-20개의 폴리펩티드 (또는 심지여 수백 개의 종)를 한번에 시험하는 것을 가능하게 하기 때문이다. 반면에, ESI-MS는 더욱 빈번하게 폴리펩티드의 다중 전하 상태를 일으키고, 이는 단백질의 분자량을 인식하기 위해 디콘볼루션(deconvolution) 알고리즘을 요구한다. 혼합물 내의 단백질들의 분자량이 상이할 수 있음에도 불구하고, 단백질의 다중 전하 상태들이 MS 스펙트럼의 동일한 질량-대-전하 비에 속한다. 이러한 알고리즘은 일반적으로 2가지를 초과하는 단백질을 동시에 취급할 수 없다. 단백질의 ESI-MS 검출의 또 다른 문제점은 다중 전하 상태에 걸친 단백질의 분포가 검출 감도를 감소시킨다는 것이다. ESI-MS로 검출할 수 있지만, 종종 MALDI-MS로 검출이 최상으로 행해진다는 것을 주지하여야 한다.

AOT의 또 다른 요소는 MS로 보내지기 전에 친화력 선별제 (Ab)가 차원 3에서 샘플로부터 제거될 것인지 또는 샘플 내에 남을 것인지 여부이다. 여전히 도 4를 참조로, 분석 경로 A, B, C, 및 D에서는 항체가 제거되는 한편, 경로 E, F, G, 및 H에서는 샘플 내에 남는다. 본원에서 이해 및 인지되어야 하는 바와 같이, 분석 전에 항체가 샘플로부터 제거되는지 여부는 여러 사안에 좌우된다. 예를 들어, 항체의 크기가 전형적으로 약 160 kD 이상이기 때문에, 분석물의 분자량이 <100 kD이면, MALDI-MS 분석은 2가지를 구별하는데 문제가 없을 것이다. MALDI-MS/MS의 비-제한적인 장점은 주로 분자성 이온만 확인한다는 것과 다중 단백질 종들을 이들의 상이한 분자량을 기초로 동시에 구별할 수 있다는 것이다. 이는 항체의 농도가 항원 농도보다 10배 이하로 클 경우에 소수의 항원을 시험할 때 특히 유용하다. 다수의 항원의 경우, 총 항체 농도가 항원 농도보다 100배 더 클 수 있다. 또한, 다량의 항체가 풍부도가 낮은 항원의 이온화를 잠재적으로 억제할 수 있다. 샘플 내의 항체의 존재는 다중 하전이 항체로부터의 이온을 항원으로부터의 이온과 중첩되게 할 ESI-MS 방식의 검출에서 더욱 문제가 될 것이다. 간단한 샘플의 경우, 이러한 검출 모드가 물론 가능하다; 그러나, 샘플 복합도가 증가되면, ESI-MS는 검출 옵션으로서 덜 유용해진다.

분자량이 160 kD 이상인 항체의 경우, 포어 직경이 100-150 옹스트롬인 칼럼 상에서의 SEC로 도 4의 경로 A, B, C, 및 D의 제3 차원에서 80 kD 이하의 항원이 항체로부터 쉽게 분리된다. 항체는 배제 부피에서 또는 이 근방에서 용출되고, 폐기물로 보내진다. 항원은 소수성 표면이 있는 크로마토그래피 칼럼으로 직접적으로 전송되고, 여기에서 포획 및 재농축된다. 항체가 항원과 함께 MS로 보내지는 것으로 결정된 경우, 2가지 종이 경로 E, F, G, 및 H의 제3 및 제4 차원에서 소수성 크로마토그래피 매트릭스에 의해 공동-포획 및 분획화된다. 제4 차원에서의 옵션은 경로 E 및 F에서와 같이 고해상도의 구배 용출 분석 칼럼이 요구되는지 여부 또는 경로 G 및 H에서와 같이 짧은 저해상도 컬럼이 충분할 것인지 여부이다. 다수의 분석물이 분획화되는 경우, 경로 E 및 F가 선택될 것이다. 소수의 분석물의 경우에는, 경로 G 및 H가 사용될 것이다.

프로테오믹스(proteomics))에서의 최근의 성공은 단백질분해성 효소, 가장 대중적으로는 트립신으로의 절단에 의해 단백질이 더욱 쉽게 확인가능한 단편으로 축소된다는 사실을 기초로 한다 (하기의 식 3 참조). 트립신 소화는 단백질 혼합물을 50:1 질량비의 단백질:트립신과 함께 24시간 기간 동안 인큐베이션하는 것에 의해 가장 널리 달성된다. 단백질 분해 말기에, 생성된 펩티드들이 펩티드 성분으로 시작하는 샘플과 유사하거나 동일한 방식으로 분석될 것이다. 단백질 질량 당 더 많은 트립신이 사용되면, 트립신이 자가소화를 시작함으로써 샘플을 트립신 단편으로 오염시킨다.

<식 3>

상기 기술된 유형의 표면적이 높은 크로마토그래피 입자 또는 모노리스 매질 상에 고정된 트립신을 사용함으로써 단백질분해가 크게 가속된다는 것을 본원에서 이해 및 인지하여야 한다. 또한, 분석물이 크로마토그래피되는 방식으로 고정된 트립신 베드에 단백질 샘플이 종종 밀어넣어진다. 이러한 특정한 경우에, 단백질보다 더 많은 트립신을 사용하는 것이 가능한데, 특히 트립신이 고정됨으로써 자가소화될 수 없기 때문이다.

도 5에 제시된 바와 같이, 고정된 트립신이 크로마토그래피 칼럼에서 또한 사용될 수 있지만, 이전에 기술된 것과 상이한 방식이다. 개시내용의 특정 측면에 따르면, 트립신의 pH 최적값은 약 7 내지 약 9의 pH 범위이다. 또한, 대부분의 단백질의 촉매 효율은 약 2 내지 약 3 범위의 pH가 될 때 백만 배 감소한다. 또한, 단백질이 약 2.5의 이동 상 pH로 제2 차원 포획 칼럼으로부터 용출되어 트립신 칼럼으로 직접적으로 보내질 때, 트립신이 기능하기에는 너무 산성인 용액 내에 단백질이 존재할 것이다. 따라서, 트립신 소화가 일어나기 전에 일부 유형의 완충제 교환에 의해 pH가 약 8로 조정되어야 한다. 이는 입자의 외부 표면이 공유결합으로 고정된 트립신으로 코팅되어 있고, 20 kD을 초과하는 분자는 투과할 수 없지만 완충제는 입자의 포어 매트릭스에 자유롭게 진입하도록 포어가 작은 크로마토그래피 매트릭스를 통해 단백질 및 산성 용출 완충제의 혼합물을 운반함으로써 달성된다. 이러한 크기 배제 칼럼에 트립신 소화 완충제가 충전된다. 단백질 샘플이 칼럼을 통해 운반됨에 따라, 단백질이 산성 용출 완충제보다 앞서서 트립신 소화 완충제 내로 쉽게 이동하고, 여기에서 단백질분해가 일어나기 시작한다. 단백질분해로, 제한 접근 칼럼의 포어에 진입할 수 있는 펩티드들이 형성되지만, 이들 및 이들의 단백질 모체는 산성 용출 완충제 너머로 이동되어 있다.

도 5는 내부가 친수성 겔이고 외부가 고정된 트립신으로 코팅된 제한 접근 칼럼의 도해이다. 이러한 입자들의 포어 직경은 6 nm 이하의 범위이다. 이러한 칼럼은 동일한 공정에서 완충제 교환 및 단백질분해를 달성하는 기능을 한다. 산성 완충제 내의 샘플이 이러한 입자가 패킹된 칼럼 내로 도입되면, 샘플 내의 단백질은 포어에 진입하는 것이 방해되고, 입자의 포어에 진입하는 완충제에 앞서서 이동한다. 단백질분해에 적절한 완충제가 충전된 칼럼 내의 영역으로 단백질이 이동한다. 이러한 지점에서, 입자에 공유결합으로 커플링된 트립신에 의해 단백질분해가 촉매된다.

트립신이 6 내지 30 nm 범위의 다공성 입자 매질 상에 고정된 경우에, 칼럼이 크기 배제 칼럼으로서 또한 기능한다. 포어의 크기는 고정된 효소 매트릭스를 투과하는 것으로부터 다수의 단백질을 부분적으로 배제시킬 크기이다. 6 nm 포어 직경의 실리카 입자로 시작하여, 이러한 입자들은 감마-글리시독스프로필 트리메톡시실란으로 코팅되고, 부착된 옥시란이 가수분해되어 디올이 산출된다. 아크롤레인이 Ce⁺⁴ 촉매작용을 통해 디올 매트릭스 상으로 중합되어, 도 6, 단계 1에 제시된 폴리(알데히드) 매트릭스가 산출될 것이다. 그 후, 폴리(알데히드)가 실리카 지지체 매트릭스의 포어를 부분적으로 충전하고, 트립신이 입자와 접촉되며, 여기에서 소듐 시아노보로히드리드의 존재 하에 쉬프(Schiff) 염기 형성을 통해 효소 상의 라이신 잔기가 실리카 매트릭스에 공유결합으로 부착될 것이다 (도 6에서의 단계 2). 반응 혼합물에 첨가된 NaCNBH₄는 쉬프 염기가 형성될 때 이를 환원시키지만 알데히드는 환원시키지 않는다. 트립신이 오직 입자 외부 상에서 알데히드 기에 접근할 수 있도록 지지체 매트릭스의 포어가 작다. 달리 말하면, 입자의 포어 내에는 트립신이 없을 것이다. 트립신 고정 후, 입자 상의 알데히드 잔기 (--C=O)가 NaBH₄로 환원될 것이고 (도 6의 단계 3), 이에 의해 고정된 효소 매트릭스의 합성이 완료된다.

트립신이 입자의 외부에 있는 것에 더하여, 단백질 (그리고, 크게는 펩티드)가 입자의 포어로부터 배제되는 것은 양쪽 모두 본 발명의 매트릭스의 독특한 특색이다. 이는 고정된 효소 칼럼이 pH가 약 8인 완충제로 예비-충전되고, 예를 들어 선택된 Ab:Ag 복합체 (Ag는 단백질이다)가 있는 항-마우스 Ab 칼럼 또는 선택된 비오틴화 Ab:Ag 복합체 (Ag는 단백질이다)가 있는 아비딘 칼럼에 연속적으로 연결되며, pH 2.5 용리제의 펄스(pulse) 용출되는 경우에, 1) 산성 이동 상은 고정된 효소 칼럼의 포어에 진입할 것인 한편, 2) 모든 단백질은 배제될 것이고, 이러한 산에 앞서서 이동될 것이며, 3) 배제 프로세스의 일부로서, pH 8 완충제 내로 이동할 것임을 의미한다. 고정된 효소 칼럼에서의 단백질의 체류 시간은 칼럼을 통과하는 유속에 의해 또는 고정된 효소 칼럼에 단백질이 진입한 후 이를 나가기 전에 일부 지점에서 칼럼을 통과하는 유동을 방해하는 것에 의해 제어된다. 일반적으로 이러한 칼럼은 도 7에서 제시된 바와 같이 제3 차원의 분석에서 사용될 것이다.

전체 단백질 수준에서의 단백질의 선별 및 분석을 나타낸 도 4와 대조적으로, 도 7은 혼합물로부터의 무손상 단백질의 포획 및 단리를 나타내고, 그 후 이들은 질량 분광법에 의한 확인 및 정량을 위해 펩티드들로 전환된다. 또 다시 면역 복합체가 샘플로부터 단리되고, 항원 표적화 항체에 독특한 에피토프를 표적화하는 면역흡착제 상에서 또는 포획 항체 상의 태그를 표적화하는 친화력 흡수제 상에서 강화된다. 낮은 친화력으로 복합체에 결합된 물질들을 제거하기 위해 세정한 후, 비-공유결합 복합체가 산성 (~pH 2.5) 이동 상으로 해리되고, 항원이 포획 항체와 함께 고정된 트립신 칼럼으로 운반된다. 단백질 및 산성 완충제가 이러한 칼럼을 통과할 때, 단백질이 트립신 소화 완충제 내로 이동함에 따라 이들이 분할된다. 이러한 프로세스 동안, 단백질이 제3 차원의 분석에서 펩티드 절단 단편으로 전환된다. 이러한 단편들이 제4 차원에서 재농축되고, 일부 유형의 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 추가로 분할된 후, 최종적으로 ESI-MS/MS 또는 MALDI-MS/MS에 의해 확인 및 정량된다. 일반적으로 단백질로 30개 내지 수백 개의 펩티드 단편이 산출되고, 이들 중 임의의 것이 단백질 모체를 확인 및 정량하는데 사용될 수 있다. 확인 및 정량용으로 선택된 펩티드는 일반적으로 이온화 효율이 높고, 모체 단백질에 대해 독특한 서열을 제공하며, 역상 크로마토그래피 칼럼에 의해 잘 유지되는 것이다.

사용할 질량 분광법의 유형에 대한 근거는 펩티드의 경우에 도 4에서의 단백질의 경우와 상이하다. 이러한 경우에는, 충돌 유도 해리 (CID), 전자 전달 해리 (ETD), 또는 제1 차원의 MS 분석으로부터의 기체 상 이온을 단편화하는 일부 기타 방법에 의해 제1 차원의 질량 분석으로부터의 펩티드를 단편화하는 것이 가능하다. 그 후, 제2 차원의 질량 분석에서 CID 및/또는 ETD 단편 이온이 분할 및 기록된다. 이러한 3차원 프로세스는 각각의 펩티드에 대해 독특한 서열 보유 서명을 제공한다. 이러한 접근법의 매우 매력적인 특색은 MS 데이터가 DNA 데이터베이스 내의 서열에 직접적으로 연결될 수 있어서, 펩티드가 유래된 유전자 및 모 단백질의 확인을 허용한다는 것이다. 이러한 경우에 ESI-MS/MS 및 MALDI-MS/MS는 성능 면에서 더욱 유사하다. 어느 한쪽 접근법으로, 수백 개의 펩티드를 단일 분석에서 확인하는 것이 가능하다. MALDI-MS 및 ESI-MS에서 상이한 메커니즘에 의해 이온화 억제가 발생하기 때문에, 일부 펩티드는 다른 것보다 일부 유형의 MS로 더 양호하게 검출된다.

고정된 효소 칼럼에서의 단백질분해 속도가 온도를 상승시키는 것, 초음파처리, 또는 칼럼 내부의 압력을 ~10,000 psi로 증가시키는 것에 의해 가속될 수 있다는 것을 본원에서 이해 및 인지하여야 한다. 이와 관련하여 압력을 증가시키기 위한 예시적인 설정이 도 8에서 도해되고, 이는 유동 정지 양식의 분석에서 고정된 효소 칼럼에 고압이 적용되게 하는 밸빙 시스템을 구체적으로 나타낸다. 이러한 도해에 따르면, 고압이 단백질의 부분적인 변성에 의해 단백질분해를 용이하게 하는 것으로 생각된다. 면역흡착제, 트립신 칼럼, 및 RPC 농축기가 연속적으로 연결되게 하는 위치로 밸브를 스위칭(switching)함으로써 샘플의 단백질분해가 시작된다. 이러한 위치에서, 단백질이 Ab 칼럼으로부터 탈착되고, 트립신 칼럼 내로 전송되며, 여기에서 탈착 완충제 및 단백질이 크기 배제 메커니즘에 의해 분리된다. 이러한 지점에서, 칼럼을 통한 이동 상의 유동을 정지시키는 위치로 밸브가 스위칭됨으로써, 트립신 칼럼을 고압 인큐베이션 모드에 이르게 한다. 단백질 분해 후, 트립신 칼럼이 다시 로딩 위치로 스위칭되고, 소화된 단백질 혼합물이 RPC 농축기로 운반된다.

도 8의 고정된 효소 칼럼은 도 7의 제3 차원에 존재한다. 도 7의 제2 차원에서 친화력 칼럼으로부터 방출된 항원 및 항체가 도 8의 고정된 트립신 칼럼 내로 직접적으로 운반되고, 여기에서 단백질이 트립신 소화 완충제 내로 이동할 때 산성 용출 완충제 및 단백질이 분리된다. 제2 및 제3 차원에서의 칼럼의 부피를 기초로, 이러한 분리를 야기하도록 시스템에 펌프되어야 하는 용매의 양이 계산된다. 단백질이 트립신 칼럼의 절반을 이동했을 때, 밸브가 도 7에 지시된 위치로 스위칭된다. 이러한 밸브 위치에서, 공압 펌프로부터의 매우 높은 압력이 유속 0에서 트립신 칼럼에 적용될 수 있다. 이러한 밸브 위치에서 면역흡착제 칼럼으로부터의 직접적인 RPC 농축기로의 유동이 계속된다. 트립신 칼럼에서의 약 1 내지 약 10분의 유동 정지 후, 친화력 포획 칼럼, 고정된 트립신 칼럼 및 RPC 농축기를 연속적으로 연결하는 위치로 밸브가 다시 회전된다. 그 후, 트립신 칼럼으로부터의 단백질분해성 소화가 RPC 농축기로 전송된다.

단백질분해 후, 질량 분광법에 의해 확인 및 검출될 단백질들로부터의 펩티드들이 도 7에 기술된 절차들 중 하나에 의해 시험된다. 이를 위해, 차원 4 내지 6 (도 7에 제시된 바와 같음)은 펩티드 분석에 대한 차원 3 내지 5와 동일한데, 이유는 양쪽 모두의 경우에 펩티드들이 시험되고 있다는 것이다.

본 개시내용의 특정 측면에 따르면, 분석 프로세스에서 생성된 후에 및/또는 제2 차원에서 비-분석물로부터 분리된 후에 합텐 및 펩티드가 재농축된다. 이러한 프로세스는, 크로마토그래피 칼럼에서 수행되는 경우에, 분석물이 칼럼 주입구에서 밀집 구역(tight zone) 내에 흡착되기 때문에 종종 리포커싱(refocusing)으로 지칭된다. 분석물의 재농축 및 추가적인 분리는 일부 형태의 친화력 선별 메커니즘에서 이온 교환 또는 친수성 상호작용 메커니즘까지의 범위에 이르는 다중 방식으로 달성될 수 있지만, 가장 보편적인 흡착 방법이기 때문에 소수성 상호작용 메커니즘이 특히 유용하고, 이러한 단계에서, 대부분의 분석물은 물 내에 있을 것이다. 또한, 물이 소수성 상호작용 메커니즘으로의 흡착을 위한 가장 바람직한 용매이다. 소수성 상호작용 (역상 크로마토그래피 및 RAM)에 의한 분리가 제3 및 제4 차원에서 나타난다.

도 9, 10 및 11의 주요 차이는 차원 1 및 2에서 복합체 형성에서 사용된 항체가 태그화 및 선별되는 방식에 관련된다는 것을 본원에서 이해 및 인지하여야 한다. 처음 2개의 차원이 끝날 때, 분석물이 단일 그룹 또는 소수의 그룹으로 선별제(들)로부터 방출된다. 10개 내지 100개를 초과하는 분석물이 그룹 내에 있을 수 있고, 이들은 개별적으로 구별 및 검출될 수 있기 전에 추가적인 분리를 받아야 한다. 이러한 분리의 적어도 일부는 역상 크로마토그래피로 달성된다.

2가지 친화력 선별제 유형 중 하나에서 친화력 선별제로부터 방출된 분석물의 재농축이 달성되었다. 1가지는 RAM (또는 SPS) 칼럼이었다 (도 2). 이러한 칼럼의 장점은 친화력 선별제 (일반적으로 항체)를 합텐 및 펩티드로부터 분리한다는 것이다. 펩티드 및 합텝은 RAM 칼럼의 포어 내로 또는 SPS 칼럼의 외부 코팅을 통과하여 투과되고, 여기에서 소수성으로 흡착된다. 항체는 대형이기 때문에, 포어 또는 코팅을 투과할 수 없고, 도 8-10에서 지시된 바와 같이 폐기물로 운반된다. 별법적인 농축기는 ~1 cm 길이의 짧은 역상 크로마토그래피 칼럼이다. 선별제 항체에 더하여, 합텐, 펩티드, 및 단백질이 모두 칼럼 상에서 포획된다. 샘플이 칼럼 입구에서 리포커싱되기 때문에, 샘플의 날카롭고 불연속적인 소형 주입이 필요하지 않다. 게다가, 대형 샘플 부피를 연속적으로 로딩할 수 있다.

도 9는 본 개시내용의 교시에 따른, 폴리클로날 항체 친화력 선별제에 의해 포획된 합텐 및 펩티드의 분석에서 사용된 프로토콜의 도해이다. 개시내용의 이러한 측면에 따르면, 합텐 및 펩티드가 제2 차원에서 면역 복합체를 포획하는 친화력 선별제로부터 방출되고 나서, 리포커싱되고, ESI-MS/MS 또는 MALDI-MS/MS 전에 RAM 또는 RPC 칼럼에 의해 추가로 분할된다. 리포커싱 및 역상 분리는 제3 및 제4 차원의 분석에서 발생한다. 제2 차원에서 제4 차원으로 직접 가는 것이 가능하지만, RAM 또는 RPC 농축기가 분석 칼럼을 보존한다. 다수의 경우에, 제1 차원에서 사용된 Ab를 제3 차원에서 분석물로부터 분리하는 것이 또한 가능하다.

제2 차원에서의 친화력 선별제로부터의 방출은 일반적으로 산성 수성 이동 상으로 달성된다. 이러한 이동 상은 제3 차원에서의 하류 RAM 또는 RPC 칼럼의 흡착에 이상적이다. RAM 또는 RPC 칼럼에서 분석물이 리포커싱되기 때문에, 분할 또는 제4 차원에서의 RAM 또는 RPC 칼럼에 불리하게 영향을 미치지 않으면서 대형 샘플 부피가 사용될 수 있다. 차원 2, 3, 및 4에서의 동일한 논리 및 용출 프로토콜이 도 10에 적용된다.

도 9에서 제시된 분석 옵션 나무에서의 결정 중 하나는 RAM 칼럼 또는 RPC 농축기를 사용하는지 여부이다. RPC 농축기가 RAM 칼럼보다 더 간단하고, 결합 능력이 더 크며, 덜 고가이지만, RPC 칼럼은 펩티드, 합텐 및 항체를 불리하게 포획한다. 게다가, 모든 항체 종이 구배 용출 동안 크로마토그램에서 후기에 RPC 칼럼으로부터 함께 용출된다. 이는 분석물 피크에 비해 항체 피크가 클 것임을 의미한다. 펩티드 및 합텐이 항체 이전에 길게 용출되기 때문에 이는 대부분의 경우에 문제가 되지 않는다. 이러할 때 대형 항체 피크는 분석물 피크를 차폐하지 않을 것이다. 샘플이 대략적으로 동일한 시간에 또는 항체 이후에 용출되는 분석물들을 함유할 때는, RPC 칼럼을 사용할 수 없다. 이러한 경우에는, RAM 칼럼을 사용하여야 한다. 항체는 RAM 흡수제의 포어를 투과하기에 너무 크고, 흡착 없이 칼럼을 통과하는 한편, 대조적으로 펩티드 및 합텐은 RAM 흡수제의 포어에 진입하고, 입자의 소수성 내부 내에 포획된다.

합텐 또는 펩티드 혼합물이 비교적 간단할 때, RAM 또는 RPC 농축기가 ESI-MS 내로 또는 MALDI-MS 분석 플레이트 상으로 직접적으로 구배 용출될 수 있다. 이러한 짧은 칼럼의 피크 능력은 종종 성분 50개 이하이다. 더 높은 해상도의 분리 칼럼 예컨대 "분석적 RPC" 칼럼이 필요하지 않다. 이는 도 9-10에서의 제4 차원에서 발생하는 바와 같이 제시되지만, 제3 차원에서 샘플이 로딩되는 칼럼과 동일한 칼럼이다. 대조적으로, 복합적인 분석물 혼합물은 훨씬 더 길고 해상도가 더 높은 RPC 칼럼을 필요로 할 것이다. 이러한 분석 칼럼은 길이가 10-50이고, 옥타데실 실란 (C18) 코팅이 있는 직경이 약 1.5 내지 약 5 um 범위인 입자로 패킹된다. 느리게 구배 용출되고 이동 상 확산 속도를 강화하도록 가열되는 경우 분석 칼럼은 피크 능력이 성분 600개까지일 수 있다. RPC 칼럼으로부터 질량 분광계 내로 물질들이 용출되기 때문에, 공동-용출 피크들이 제1 또는 제2 차원의 질량 분광법에서 구별될 수 있다.

제5 차원 및 이보다 높은 차원에서 사용된 질량 분광법의 유형은 초기 샘플 매트릭스의 복합도, 분석되는 분석물의 숫자, 및 분석물 농도에 좌우된다. 샘플 매트릭스가 단순하고 10개 미만의 분석물이 시험되는 경우, MALDI 또는 ESI 모드에서의 분자량 단독의 단일 차원 질량 분석이 충분할 것이다. CID에 이어지는 제6 및 제7 차원에서의 단편 이온의 추가적인 질량 분석은 확인에서 더 높은 신뢰 수준을 허용하지만, 아마도 필수적이지 않을 것이다. 간단한 샘플의 경우의 질량 분광계의 유형은 샘플 농도가 ug/㎖ 내지 mg/㎖ 범위일 때 어떤 것이 이용가능한지를 기초로 주로 결정된다. 선택된 이온 모니터링 모드에서 삼중-사중극자 (QQQ) 또는 사중극자-이온 트랩 (Q-트랩) 기구와 같은 질량 분광계를 사용하는 것에 의해 ESI 모드에서 더욱 더 높은 감도가 수득될 것이다. 더 긴 기간 동안 특정 이온을 질량 분석하고 특정 분석물에 대해 더 많은 수의 이온 카운트를 축적하는, 이들과 같은 기구는 급속 스캐닝 기구보다 감도가 100배 이상 더 클 수 있다.

매우 복합적인 샘플의 경우, ESI-MS/MS 기구가 도 9의 프로토콜에 특히 유용한데, 이들이 높은 수준의 구별을 제공하기 때문이다. 마찬가지로, 최고의 감도가 필요한 경우, QQQ 또는 Q-트랩 유형 기구가 최상의 해법을 제공한다.

도 9와 도 10의 주요 차이는 선별 항체 상에 놓인 태그의 유형 및 면역 복합체가 포획되는 방식에 있다. 도 10의 항체 태그는 비오틴 또는 일부 합텐이다. 도 10은 비오틴화되거나 합텐 태그가 부착된 친화력 선별제에 의해 포획된 합텐 및 펩티드의 분석에서 사용된 프로토콜의 도해를 나타낸다. 이러한 도해에 따르면, 모노-아비딘이 제2 차원 친화력 선별제에서 사용되는데, 덜 엄격한 조건이 비오틴화 종을 방출시키는데 요구되기 때문이다. 생물특이적 전치(displacement) 또는 친화력 선별제 변성에 의해 제2 차원에서 합텐 및 펩티드가 방출될 수 있다. 비오틴 전치제의 경우가 가장 온건하다. 이러한 접근법의 단점은 탈착 동역학이 느려서, 용출 단계 동안 느린 유속을 요구한다는 것이다. 대조적으로, 도 9에 기술된 바와 같은, 산성 이동 상으로의 부분적인 변성은 훨씬 더 빠르다. 분석 옵션 나무를 따라 있는 추가적인 단계들은 도 9에서 기술된 것들과 동일하다.

반면에, 도 11은 DNA, RNA, 또는 PNA로 태그가 부착된 항체를 사용하여 포획된 합텐 및 펩티드의 분석에서 사용된 프로토콜의 도해이다. 상기 논의된 다른 예들에서와 같이, 제2 차원에서 샘플 내의 다른 물질로부터의 면역 복합체의 분리가 일어난다. 포획된 항체가 제2 차원으로부터 용출되는 것은 칼럼 온도를 올리고뉴클레오티드 하이브리드의 융점보다 높게 상승시킴으로써 일어난다. 유동 하에 써모사이클링이 일어나는 경우, 모든 해리된 종들이 칼럼으로부터 소제된다. 경쟁 올리고뉴클레오티드의 존재 하에 유동 정지 하에 써모사이클링하는 것은 특정 항체의 차별적인 전치를 허용한다. 제2 차원에서의 용출 조건은 면역 복합체가 제3 차원 내로 통과되어 포획될 때 여전히 무손상일 수 있도록 충분히 경도이다. 이러할 때, 아세토니트릴을 함유하는 산성 이동 상으로 RPC 또는 RAM 칼럼이 용출됨에 따라 제3 차원에서 면역 복합체가 해리될 것이다. 면역 복합체가 무손상인지 또는 해리되는지 여부는 분석의 순 결과에 영향을 미치지 않을 것이다. 나머지 작업 흐름은 도 9에 기술된 바와 같다.

도 9와 관련하여, 친화력 선별제 예컨대 항체와의 복합체화에 의해 제1 차원에서 분석물이 선별된다. 이러한 경우에 사용된 친화력 선별제의 독특한 특색은 이들에 올리고뉴클레오티드 (RNA, DNA, 또는 PNA의 규칙적인 염기 서열로 구성된 ONT_t) 태그가 부착된다는 것이다. 모든 항체의 올리고뉴클레오티드 서열이 동일할 수 있거나 또는 각각의 항체 종에 상이한 올리고뉴클레오티드 서열로 태그가 부착될 수 있다. 용액에서의 복합체 형성에 후속하여, 분취량의 용액을 친화력 선별제 상의 것에 상보적인 서열을 지니는 고정된 올리고뉴클레오티드 선별제 (ONT_s)를 함유하는 고체 지지체의 표면을 가로질러 통과시키거나 또는 입자에 통과시킴으로써 가용성 복합체가 샘플로부터 포획된다. 항체 상의 각각의 뉴클레오티드 태그에 대해 고체 상 표면 상에 1개의 상보적인 올리고뉴클레오티드 서열이 있을 것이다. 분취량의 용액을 올리고뉴클레오티드 (ONT_s)를 보유하는 표면을 가로질러 통과시키는 과정 동안, 분석물:선별제-ONT_t 복합체가 혼성화에 의해 포획되어, --ONT_t:ONT_s:선별제 분석물 복합체를 형성할 것이다. 올리고뉴클레오티드들 (고체 표면 상에 고정된 ONTO)은 뒤섞일 수 있거나, 또는 각각 공간적으로 상이한 부위에 위치할 수 있다. 특정한 구체적인 실시양태에 따르면, ONT_s를 고정하기 위한 지지체 매트릭스가 유기 수지, 예컨대 HPLC에서 사용되는 압력-안정적 스티렌-디비닐벤젠 수지인 것이 특히 유용하다. 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)로부터의 POROS 지지체 매트릭스가 이같은 수지의 이상적인 예이다. 유리하게는, 이러한 수지들은 약 80-90℃의 온도, 뿐만 아니라 하기 기술된 바와 같이 분석물 용출에서 사용될 수 있는 광범위한 pH 극값들을 견딘다.

제2 차원에서의 분석물:선별제 복합체의 포획 후, 이들은 방출되어 제3 차원 내로 용출되어야 한다. 본원에서의 교시에 따라 여러 상이한 방식으로 용출 단계가 달성될 수 있다. 한 예시적인 방법은 이동 상이 표면을 가로질러 통과되고 제3 차원으로 운반되는 동안에 --ONT_t:ONT_s:선별제 분석물 복합체를 보유하는 고체 상 흡착제의 온도를 --ONT_t:ONT_s 하이브리드의 융점보다 높게 상승시킴으로써 하이브리드를 해리시키는 것이다. --ONT_t:ONT_s 하이브리드가 해리될 것이고, ONT_s:선별제:분석물 복합체가 제3 차원으로 운반될 것이다. 대부분의 경우에, ONT_s:선별제 분석물 복합체가 무손상으로 유지될 것이지만, 일부 경우에는 부분적으로 또는 완전히 해리될 것이다. 어느 쪽이든, 이러한 경우는 제4 차원 내에 수용될 것이다.

제2의 예시적인 용출 방법은 극값의 pH 또는 이온 강도를 사용하여 하이브리드를 해리시키는 것이다. 고체 상 흡착제가 증류수로 용출될 때, 일반적으로 --ONT_t:ONT_s 하이브리드가 해리된다. 낮은 이온 강도에서 pH 10 완충제를 사용하는 것으로 동일하게 달성된다.

분자 사이즈에 따라 면역 복합체가 또한 분획화될 수 있다 (도 12 참조). 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 이러한 작업 흐름에서 제2 차원에서 면역 복합체가 분획화된다. SEC 칼럼의 포어 직경은 약 100 내지 약 150 옹스트롬 범위인 한편, 배제 매트릭스의 입자 크기는 약 3 내지 약 5 um이어야 한다. 포어 직경이 100 옹스트롬인 패킹 물질의 경우에 칼럼의 배제 부피 인근에서 면역 복합체가 용출될 것이고, 직접적으로 RPC 또는 RAM 농축으로 또는 직접적으로 분석적 RPC 칼럼으로 운반된다. 이러한 운반의 종료 시에, SEC 칼럼으로부터 용출되는 분자량이 더 낮은 종이 폐기물로 방향이 전환된다. 0.1％ 트리플루오로아세트산 또는 1％ 포름산에서 동일한 농도의 70％ 아세토니트릴을 함유하는 산까지의 범위에 이르는 이동 상으로 선형 구배로 RPC 칼럼이 용출된다. 이러한 이동 상은 RPC 칼럼의 주입구에서 포획된 면역 복합체를 해리시키는데 충분하게 산성이다. 어떤 유형의 질량 분광법을 사용할지에 대한 논거는 다른 경우들에서와 동일하다.

상기 언급된 바와 같이, 단백질은 합텐 및 펩티드의 분석에서 요구되는 것을 넘어서는 단백질분해 차원의 부가를 필요로 한다. 이는 일반적으로 제3 차원에서 달성된다. 도 13은 다중 분석물의 고처리량 동시 분석에 필요한 친화력 선별제의 자동화된 고해상도 분리를 제공할 수 있는 기구 플랫폼의 액체 크로마토그래피 성분을 나타낸다. 분석 전에 샘플의 미생물 성장을 최소화하는 냉장 챔버 내에 수용된 오토-샘플러에서 샘플 제조가 개시된다. 샘플을 보유하는 오토-샘플러 바이알은 샘플 부피를 최소화하도록 바닥 유형이 원뿔형이다. 다중 샘플에 더하여, 오토-샘플러는 분석에 필요한 고정된 농도의 항체 용액을 또한 보유한다. 환원, 알킬화, 유도체화, 단백질분해, 내부 표준물질 첨가, 및 희석제에 필요한 추가적인 시약이 오토-샘플러에 또한 로딩될 수 있고, 이들 중 임의의 것이 임의의 순서로 샘플 바이알 내로 분취될 수 있다. 로봇 주사기가 분취량의 항체, 항체들 또는 시약을 시약 바이알로부터 제거하여 이들을 샘플에 첨가할 때 오토-샘플러에서 분석이 시작된다. 분석 전에 샘플의 환원, 알킬화 및 단백질분해에서 필요할 수 있는 바와 같이 다중 시약이 샘플 바이알이 순차적으로 첨가될 수 있다. 단일 항체 시약 바이알이 1개의 항체 또는 특정한 다중 분석물 분석에 필요한 모든 항체를 함유할 수 있다. 시약 또는 항체를 샘플 내로 분배한 후, 시약이 없는 완충제를 함유하는 오토-샘플러 내의 바이알로 주사기가 이동하고, 주사기에 완충제를 여러 번 완전히 로딩하고 완충제를 폐기물 바이알로 분배하는 것에 의해 청소된다.

유도체 및/또는 면역 복합체(들)에 대해 적절한 인큐베이션 시간 후, 오토-샘플러가 샘플 바이알로부터 분취량의 용액을 인출하고, 고정된 부피의 샘플 루프(loop)를 샘플 로딩 위치에서 고압 밸브 상에 로딩한다. 그 후, 샘플 루프를 이를 하류 칼럼에 연결하는 이동 상 유동 경로 내로 도입하도록 밸브를 회전시킨다. 제1 하류 칼럼 (제2 차원의 분석에서의 칼럼)은 일반적으로 친화력 칼럼 또는 크기 배제 칼럼이고, 이는 면역 복합체(들)를 샘플 내의 다른 성분으로부터 부분적으로 또는 완전히 분할할 것이다. 면역 복합체(들)이 친화력 칼럼에 의해 포획될 때, 면역 복합체 또는 칼럼에 낮은 친화력으로 결합된 물질을 제거하도록 20 이상의 칼럼 부피의 이동 상이 칼럼을 통해 펌프되는 것이 바람직하다. 높은 결합 친화력의 항체가 분석에서 사용되는 경우, 모든 다른 결합된 종은 비-분석물일 것이다. 따라서 이러한 세정 단계는 비-분석물을 제거하고, 분리 프로세스의 일부이다.

제2 차원의 분석에서 사용되는 칼럼은 도 13에 도해된 바와 같이 실온에서 외부에 또는 냉장 챔버의 내부에 수용될 수 있다. 제2 차원에서 포획 칼럼 내의 고-친화력 항체 또는 SEC 칼럼을 사용할 때는, 칼럼이 실온에서 작동된다. 포획제의 친화력이 낮고 더 낮은 온도로 이동하는 것에 의해 포획제의 결합 상수가 증가될 때는 더 낮은 온도에서의 공정이 친화력 칼럼과 함께 사용된다. 5℃에서, 결합 상수가 실온에서의 것의 2배일 수 있다.

도 13에서의 도해는 제3 및 제4 차원에서의 분석이 오븐에서 수행될 수 있다는 것을 나타낸다. 이러한 도해는 분석물을 제2 차원에서 도 9, 10, 및 11에서의 제4 차원의 분석적 고해상도 RPC 칼럼으로 직접적으로 전송하는 것을 나타낸다. 일부 실시양태에 따르면, 제3 차원 칼럼이 밸브 B 이전에 부가될 수 있다. 이러한 실시양태에 따른 가열 칼럼의 기능은 액체 크로마토그래피 문헌에서 이동 상 및 정체 이동상 제약으로 공지된 제약을 감소시키는 것이다. 이동상 점도를 감소시키고 분석물 확산 속도를 증가시킴으로써, RPC에서 분할이 증가된다. 이는 RPC 칼럼의 분할 및 분할될 수 있는 분석물의 수를 증가시킨다.

도 13의 시스템에서의 제1 펌프 (P1)는 처음 2개 차원의 분리를 위한 용매를 제공한다. 펌프의 저압 측면 상에서 용매 스위칭이 행해지고, 이는 이러한 펌프로 생성된 구배가 단계 구배 유형의 것임을 의미한다. 2개의 크로마토그래피 시스템 사이의 펌프 P5는 SEC 칼럼이 제2 차원에서 사용되고 RAM 칼럼이 제3 차원에서 사용될 때 필요할 바와 같이 면역 복합체의 해리를 위한 이동 상을 도입하기 위해 사용된다. SEC 칼럼을 떠나는 용리제 스트림(stream)이 P5가 제공하는 산성 용액과 합쳐질 것이고, 이는 복합체가 밸브 B 상의 RAM 칼럼에 도달하기 전에 복합체를 해리시킬 것이다.

밸브 C는 크로마토그래피 칼럼을 검출기로부터 푸는데, 그리고 바람직하지 않은 시약 또는 분석물이 검출기로 운반되는 것을 방해하는데 사용된다. 예를 들어, 다량의 항체가 RPC 칼럼 내로의 샘플에 동반될 것이고 모든 분석물 이후에 이동 상의 끝부분에서 용출될 것임이 상기에서 언급되었다. 이러한 특정한 예시적인 각본에 따르면, 크로마토그래피 시스템이 MS로부터 풀어지고 RPC 칼럼으로부터 용출되는 항체가 폐기물로 방향이 전환되는 지점으로 밸브 C가 스위칭될 수 있다. UV 흡광도 모니터가 도해에 나타나지만, 이것이 요구되지 않고 특정 실시양태에서는 제거될 수 있다는 것을 본원에서 이해 및 인지하여야 한다. 또한, 다중 방식으로 분석물을 정량하여 정량 정확도를 확인하기 위해 여분의 측정 장치 또한 때때로 사용될 수 있다.

이러한 지점까지의 분석 옵션 나무는 질량 분광법에 의한 검출을 강조하였다. 순수하게 또는 분석물이 특정한 발색단 또는 전기화학적으로 활성인 관능기를 보유하는 용리제 스트림 내의 유일한 종이도록 분석물이 처음 4개의 분리 차원을 떠날 때, 하기에서 비-MS 검출 모드로 지칭되는 다른 방식으로 분석물을 검출하는 것이 가능하다. 이같은 비-MS 검출 모드의 예는 흡광도, 형광, 또는 전기화학적 수단을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.

친화력 선별제 기반 프로세스와 관련하여, 여러 차원의 직교 분석을 통해 분석물과 매우 많은 개수의 비-분석물을 구별하기 위한 다중 분석물의 동시 결정이 중요하다. 항체가 부여하는 매우 높은 수준의 선별도를 기초로, 제1 차원의 구별은 일반적으로 용액에서의 친화력 선별제:분석물 복합체 형성일 것이다. 가장 일반적으로, 친화력 선별제는 항체일 것이다; 그러나, 다양한 기타 선별제가 또한 사용될 수 있다는 것을 본원에서 이해 및 인지하여야 한다. 게다가, 복합체 형성이 용액에서 실행되는데, 이는 다수의 선별제를 고정할 필요 및 이와 연관된 고유 문제를 우회하기 때문이다.

상기 논의된 제2, 제3 및 종종 제4 차원의 분석은 어떻게 여러 크로마토그래피 방법 및 종종 화학 반응이 커플링되어 여전히 더 높은 수준의 분석물 구별을 제공할 수 있는지를 나타냈다. 이러한 차원들의 분할능은 포획된 항원들이 수백 개 내지 수천 개의 개별적인 성분으로 분획화될 수 있도록 한다. 많은 경우, 이러한 분할 정도가 충분하고, 이러한 지점에서 모든 분석물이 매우 유사한 검출 특성을 생산하는 형광, 흡광도, 전기화학적 또는 일부 기타 수단에 의해 항원들이 검출될 수 있다. 이러한 검출 유형들은 감도가 매우 높을 수 있지만, 여전히 분석물들 사이를 구별할 수 없다. 따라서, 검출기에 도달할 때 분석물들이 부분적으로 또는 완전하게 분할되어야 한다.

전통적인 검출 방법과 달리, 질량 분광법은 이의 분석 모드 면에서 직교성인 꽤 상이한 또 다른 검출 방법을 제공한다. 많은 유형의 질량 분광계가 있고, 이들 중 몇몇은 다중 분석물의 친화력 선별제 기반 분석에서 사용될 수 있다. 상기 기술된 크기 배제 방법은 물질의 유체역학적 부피를 시험한다. 다중 분석물이 RAM 또는 분석적 RPC 칼럼으로부터 함께 용출될 수 있다. MALDI 또는 ESI 프로세스에 의한 이온화 후, 분석물(들)이 질량 분광계 내로 운반되고, 여기에서 질량 분석된다. 비행 시간 (TOF), 4중극자 (Q), 이온 트랩 (IT), 및 하이브리드 형태의 이러한 기구들이 분석물 이온의 질량 분석에서 사용된다. 명칭이 암시하듯이, 질량 분광법은 분자들을 이의 질량을 기초로 분획화하고, 종종 1 미만의 원자 질량 단위 차이로 분획화한다. 이렇게 분석된 (분획화된) 분석물은 전자 증배관으로 운반되고, 이는 분석물을 정량하는데 사용될 수 있는 이온 전류로 일반적으로 지칭되는 전자 신호를 생산한다.

동일한 질량 또는 거의 동일한 질량의 분석물 이온이 RAM, RPC, 또는 일부 기타 유형의 크로마토그래피 칼럼으로부터 MS 용출액에 앞서서 함께 용출되는 경우가 있을 수 있다. 이는 분석에서의 이러한 지점까지 성질 면에서 동일한 분석물들 사이를 구별하는 것을 불가능하게 만든다.

더 높은 차원의 분석으로서, 제1 차원으로부터의 이온이 단편화되게 하는 일부 유형의 기체 상 화학 반응을 수행하는 것이 가능하다. 충돌 유도 해리 (CID) 및 전자 전달 해리 (ETD)가 기체 상 단편화 전략의 2가지 유형이지만, 본 교시에 따라 또한 사용될 수 있는 다른 것들도 있다는 것을 본원에서 이해 및 인지하여야 한다. 이러한 기체 상 반응에서, 분자들이 이들의 구조에 대해 독특한 방식으로 단편화되는 경우가 종종 있다. 이렇게 생산된 단편 이온의 질량 또한 독특할 것이고, 이는 제2 차원의 질량 분광법에서 분석될 때 (이의 질량에 의해) 인식 및 정량될 수 있다. 단일 단편 이온 또는 분석물에 대해 독특한 모든 단편 이온의 합계로부터 분석물 정량이 달성될 수 있다.

제2 차원의 질량 분광법으로부터의 단편 이온을 제3 차원의 질량 분광법에서 선별하고 추가로 단편화하여 더욱 많은 특이성을 획득할 수 있지만, 원래의 것에 비교하여 수반되는 이온의 양이 작고, 따라서 감도가 불량하다.

감도 관점에서 선택된 질량 분광계는 크로마토그래피 피크의 용출 동안 연속적으로 이온이 생산되고 수집 및/또는 분석된 후 추가로 이온화되어 정량을 위해 제2 차원의 MS로 운반되는 것이다. QQQ 및 IT-TOF 기구가 예이다. 이러한 기구들의 큰 장점 중 하나는 분석을 위해 다수의 더 많은 이온을 수집한다는 것이다.

불행하게도, 질량 분광법 기반 검출은 효소 연결 면역흡착제 검정법 (ELISA) 방법만큼 민감하지 않다. 예를 들어, MS 분석 전에 내부 직경 100 um의 RPC 칼럼을 사용할 때에도, 전류 검출 한계는 100 pg/㎖ 범위이다. 반면에, 최신식 ELISA는 1000배 더 민감하다. 그러나, 제4, 제5, 및 제6 차원의 분석에서 질량 분광법을 사용하는 것의 수많은 장점은 특이성이다. 또한, MS 분석은 매우 신속하다. 실제로, 직렬식 질량 스펙트럼 분석이 대부분의 기구로 1초 이하 이내에 수행될 수 있다. 또 다른 장점은 크로마토그래피 체류 시간이 통합된다는 것이다.

분석물 혼합물이 간단하고/하거나 매우 높은 검출 감도가 요구되는 경우, 본 개시내용의 교시에 따라 고감도 액체 크로마토그래피 검출기로 가는 것이 또한 가능하다. 질량 분광계에 비해 정규 액체 크로마토그래피 (LC) 검출기를 사용하는 것의 장점은 이들이 훨씬 덜 비싸고, 특히 ~100 um ID 모세관과 함께 사용될 때, 감도가 더욱 더 높을 수 있다는 것이다. LC 검출기의 감도는 칼럼 직경의 제곱에 반비례한다. 일반적인 4.6 mm ID 칼럼에서 동일한 길이의 100 um ID 칼럼으로 가는 것은 검출 감도를 2000배 이상 증가시킨다. 100 um ID RPC 칼럼 및 레이저 유도 형광 검출기를 사용하면, 70 kD 단백질로의 검출 한계가 약 1 pg/㎖이다. 이는 ELISA의 범위 내이지만, 문제는 다중 항원을 정량하는 것이다.

본 개시내용의 교시에 따라 사용될 수 있는 또 다른 검출기는 레이저 유도 형광 (LIF), 전기화학적 검출 (EC), 및 흡광도 검출 (AB)을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 이러함 검출기들 중에서, 흡광도 검출기가 단연 가장 덜 민감하다. 반면에, LIF 및 EC 검출은 일반적으로 검출을 용이하게 사는 시약으로 분석물이 유도체화되는 것을 필요로 한다. LIF의 경우에, 이는 사용되는 검출기에서의 검출로 다룰 수 있는 여기 및 방출 파장을 나타내는 형광단일 것이다. 형광 태그 작용제가 또한 분석물과 쉽게 반응하여 유도체화 반응을 용이하게 하여야 한다.

공지된 농도의 내부 표준물질을 혼합물에 첨가하고 내부 표준물질 및 분석물에 대한 관찰된 기구 응답 비를 사용하여 분석물 농도를 결정하는 것이 50년 이상 동안 관례였다. 이러한 접근법의 큰 장점은 샘플 분석 동안 발생하는 무작위 오차를 최소화한다는 것이다. 면역학적 검정법과 함께, 이러한 측정은 일반적으로 경쟁적 결합 검정법으로 지칭된다. 내부 표준물질을 면역학적 검정법 내에 부가하는 것은 항원과 유사한 태그가 부착된 합성 분자 (Ag*)가 샘플에 첨가된 잘 확립된 RIA 관례에 관련된다. 샘플 내의 천연 항원 (Ag)은 검출될 수 없기 때문에, 태그 (*)의 기능은 검출을 가능하게 하는 것이었다. 2개의 항원 Ag_i 및 Ag_i*가 동시에 첨가되고 제한된 양의 항체로부터의 결합 부위에 대해 경쟁하게 되었을 때, 이는 경쟁적 결합 검정법으로 지칭되었고, 하기의 설명적인 식으로 표시될 수 있다:

(3)

[식 중, [Ag_i]는 샘플 항원의 초기 농도이고, [Ag_i*]는 공지된 농도로 초기에 샘플에 첨가된 태그 부착 항원의 농도이며, [Ag_e]는 평형화 후의 샘플 항원의 최종 농도이고, [Ag_e*]는 최종 평형 후의 태그 부착 항원의 농도이다].

여기에서, 일반적으로 본 개시내용은 100개 이상의 항원 (Ag)과 태그 부착 합성 분자 (Ag*)를 동시에 구별하는 것에 관한 것이다. 이는 모든 이러한 종들을 단일 분석에서 구별하는 액체 크로마토그래피-질량 분광법에 의해 가능해진다. 상기 언급된 바와 같이, 다수의 항원으로 검정법을 실행하는 것의 특히 유용한 모드는 순차적 첨가, 경쟁적 결합 검정법 + 항체 포화에 있다. 제1 단계는 샘플 내의 항원 [Ag_i]의 양을 초과하는 공지된 양의 항체 [Ab₁] (또는 항체들 + 다중 항원)를 샘플에 첨가하는 것이다. 이같은 단계는 하기 식으로 표현될 수 있다:

(4)

[식 중, [Ab₁]-[Ag_i]

[Ab₃]]. 상기에서 Ab₁, Ab₂, 및 Ab₃은 동일한 항체이지만, 검정법 내의 상이한 지점에 있고 상이한 조건 하에 있다는 것을 주지하는 것이 중요하다.

검정법의 제2 단계는 태그 부착 내부 표준물질 [Ag_i*]을 샘플에 공지된 양으로 첨가하는 것이다. 하기 식 5와 같도록, 두 항원의 양이 이들을 표적화하는 항체의 총량의 농도를 초과하여야 하고, 즉 [Ag_i]+[Ag_i*][Ab]이다:

(5)

Ag_e*로부터의 Ab₃:Ag*의 분리는 [Ab₃:Ag*]를 단독으로 정량하게 한다. 순차적 첨가 검정법에서의 [Ab₃:Ag*]의 농도는 농도 [Ag_i]에 반비례하고, 즉 Ab₃:Ag*는 Ag_i가 0에 접근할 때 최대이다. 반대로, Ag_i 값이 커짐에 따라 Ab₃:Ag*는 0에 접근한다. 순차적 첨가 검정법은 다른 형태의 경쟁적 결합 검정법과는 대조적으로 선형이다.

상기 기술된 검정법에서 결정되는 항원의 농도가 검정법을 수행하기 위해 첨가되어야 하는 항체 및 태그 부착 항원의 양을 크게 제어한다는 것을 주목할 만하다. 다른 실시양태, 예컨대 하기 기술되는 경쟁적 결합 Ab 포화 검정법에서, 이는 그렇지 않다. 따라서, 본 교시내용이 제한되는 것으로 의도되지 않는다는 것을 본원에서 이해하여야 한다. 2번째 주목할 만한 점은 식 3 및 5에서 기술된 반응이 끝날 때, Ab₂:Ag 및 Ab₃:Ag* 양쪽 모두가 용액 내에 공존한다는 것이다. 또한, 이는 Ag_e*가 검정법 용액으로부터 제거되는 분리 단계가 끝날 때 여전히 그러하다. 이는 Ab₃:Ag* 검출의 관점에서, 태그가 Ab₂:Ag와 Ab₃:Ag* 사이의 구별을 허용하는 것이 필요하다는 것을 의미한다. 마지막으로, 특히 결정되는 항원 각각에 대해 상이한 태그가 사용되어야 하기 때문에, 모든 항원으로부터의 모든 Ab₃:Ag* 복합체를 구별하는 것이 상기 기술된 다중화 프로세스에 중요하다는 것이 또한 주목할 만하다. 그러나, 흡광도, 형광 및 전기화학적 기반 검출에서는, 이는 항원 5개의 결정에 지나지 않을 것이다.

본 개시내용의 경쟁적 결합 검정법에 따르면, 검정법 용액에 첨가된 내부 표준물질 (예를 들어, 분석물의 상대적 또는 절대적 정량을 달성하기 위한 동위원소로 코딩된 내부 표준물질)을 포함하여 모든 분석물은 다중화된 검정법에 대해 검출되기 위해서 구조적으로 상이하여야 한다. 따라서, 검정법들은 크로마토그래피 체류 시간이 상이하거나, 분자량이 상이하거나, 또는 질량 분광계에서 독특한 방식으로 단편화할 것이다. 상기 기술된 항원에 따르면, Ag*는 ¹³C, ¹⁴N, ¹⁸O, 또는 ²H 표지 버젼의 항원이거나, 또는 표지되지 않은 천연 버전의 Ag와 독특하게 상이한 질량을 내부 표준물질 항원에 제공하는 이러한 동위원소들의 일부 조합을 보유할 것이다. 별법적인 코딩 전략은 항원의 항원성을 변경시키지 않지만, Ag와 독특하게 상이하고 용액 내의 임의의 다른 물질과 구조적으로 상이한 질량 스펙트럼 성질을 항원에게 제공하는 일부 모이어티(moiety)로 항원을 유도체화하는 것일 것이다. 유도체화 경우의 표지는 빈번하게 중 동위원소로 코딩될 것이고, 만능 코딩제일 수 있으며, 이러한 만능 코딩제는 한 동위원소 형태에서는 모든 항원 (Ag)을 코딩하는데 사용되고, 동위원소 면에서 상이한 버전에서는 용액에 첨가된 모든 내부 표준물질 항원, 즉 식 5의 Ag*을 전체적으로 코딩하는데 사용된다. 식 5에서 기술된 최종 검정법 혼합물이 RPC-MS/MS 분석에 적용되는 경우, 동일한 샘플 내의 수천 개의 항원을 구별하는 것이 가능할 것이다. 유리하게는, 본 개시내용의 교시는 단일 분석에서 수천 개의 항원을 확인 및 구별하는 것을 가능하게 함으로써, 특정 어레이 요소에서의 수백 개 내지 수천 개의 항체 또는 일부 기타 결합 단백질을 표면 상에 고정하지 않으면서 수천 개의 면역학적 검정법이 동시에 수행되게 한다.

상기 식 3에 초점을 맞추면, 본 교시는 Ag 및 내부 표준물질 항원 Ag*이 항체 상의 결합 부위에 대해 경쟁하는 경우를 기술한다. 이러한 일반 개념을 고려하면, 하기에 기술된 조건이 본 개시내용의 특정한 검정법 실시양태에 따라 또한 적용된다: 검정되는 모든 항원에 대해 [Ag_i]+[Ag_i*]>[Ab]이고, 용액에 첨가된 [Ag_i*]의 농도가 [Ag_i]의 5배 이내임. 또한, 첨가된 내부 표준물질 [Agi*]의 농도가 정확하게 알려지고, [Ab:Ag]/[Ab:Ag*] 비가 검정법이 끝날 때 측정된다. 이러한 실시양태에 따르면, 다수의 항원, 즉 Ag_a, Ag_b, Ag_c, ... Ag_n이 측정되고, 이러한 항원은 농도가 크게, 즉 수천 배 변할 수 있다. 일부 실시양태에서는 모든 항체에 대해 동일한 농도가 대략적으로 사용되는 한편, 다른 실시양태에서는 항체의 농도가 대략적으로, 그리고 정확하지 않게 알려질 수 있다. 마지막으로, Ag 대 Ag*의 비가 상기 기술된 방식으로 결정될 것이고, 일반적으로 차별적인 동위원소 표지 또는 전체적인 내부 표준물질 표지 방법에 의해서이다.

본 개시내용의 일부 교시에 따르면, 공지된 농도의 내부 표준물질 항원을 첨가하는 것이 검정법이 끝날 때 항원 대 내부 표준물질의 비를 결정하는 것을 가능하게 한다는 것을 본원에서 이해 및 인지하여야 한다. 이러한 실시양태에 따르면, 주지된 내부 표준물질 방법을 사용하여 항원 농도를 결정하는 것이 가능하다. 또한, 항체 농도가 검출 시스템의 최적 감도 범위에 들어맞는 경우, 항체를 샘플링 도구로 사용하는 것이 또한 가능하다. 이러한 샘플링 체계에 따르면, 항원 농도를 고려하지 않으면서 검출기의 감도에 들어맞는 샘플의 양이 선택될 수 있고, 뿐만 아니라 항원을 이의 초기 농도와 관계없이 10배 이하로 변하는 농도 범위에 이르게 하는데 사용될 수 있다. 이러한 실시양태에 따르면, 분석물 및 내부 표준물질 농도를 정량에 사용된 측정 장치의 검출 범위에 이르게 하는데 항체 농도가 사용된다. 모니터링 시스템의 최적 검출 범위와 관계없이, 분석물 농도를 질량 분광계가 포함되는 임의의 검출기의 최적 범위에 이르게 하는 것이 가능하다는 것을 본원에서 이해 및 인지하여야 한다. 궁극적으로, 이러한 기술된 실시양태들은 항체 농도를 샘플 분석물들에 사용할 수 있고, 이들 모두를 검출 시스템에 들어맞는 유사한 농도 범위에 이르게 하는 한편, 실제 농도는 분석물 대 내부 표준물질 비에 의해 결정된다.

질량 분광법에서 광학적, 전기화학적, 간섭법까지의 범위에 이르는 검출 시스템들이 상기에서 기술되었다. 질량 분광법 이외에, 본 개시내용의 검출 방법에 따른 정량 프로세스가 일반적으로 업계에 공지되어 있고, 따라서 본원에서 상세하게 논의되지 않을 것이다. 그러나, 질량 분광법의 관점에서, 이온화 방법에 따라 다중 방식으로 정량이 달성될 수 있다. 질량 분석 후의 이온의 검출로부터 발생하는 이온 전류가 질량 분광법에서의 검출에 광범위하게 사용되는 한편, 이같은 방법의 이온화 효율은 분석물마다 광범위하게 변한다. 실제로, 일부 경우에 농도 및 샘플 내의 미지의 다른 매트릭스 성분에 따라 이온화 효율이 변할 수도 있다. 질량 분광법에 의한 정량의 더욱 상세한 논의를 하기의 저널 논문에서 확인할 수 있고, 이의 개시내용은 전문이 본원에 참고로 포함된다: 문헌 ["Primary amine coding as a path to comparative proteomics". Regnier, Fred E;. Julka, Samir. Proteomics (2006), 6(14), 3968-3979].

다행히, 분석물의 동위원소 이성질체들은 질량 분광계에 함께 제시될 때 거의 동일한 방식으로 이온화한다. 이는 중질 형태 및 경질 형태의 분석물에 대해 나타나는 상대적인 이온 전류가 이들의 농도에서의 상대적인 차이를 정확하게 반영한다는 것을 의미한다. 동위원소 이성칠체들 중 하나가 공지된 농도로 첨가된 분석물의 내부 표준물질인 경우, 미지 농도의 분석물의 절대 농도를 계산할 수 있다. 이는 전기분무 이온화 (ESI) 및 매트릭스 보조 레이터 탈착 이온화 (MALDI)의 경우에 그러하다. 특히 동위원소 이성칠체들이 RPC에서 분리되는 것을 방지하기 위해, 분석물의 모든 동위원소 이성칠체들이 동일한 조건 하에 이온화되는 것이 중요하다. 이들이 정확하게 공동-용출될 때, 이들은 동일한 이온화의 매트릭스 억제제를 경험한다. 상대적인 표준 편차는 이러한 검출 방법으로 6-8％만큼 다를 것이다.

본 개시내용의 특정 측면에 따르면, RPC 칼럼으로부터 용출되는 동안 장기간 (수 초) 동안 이온을 방치할 수 있는, 동위원소 이성질체 비 정량을 위한 질량 분광계가 특히 유용한데, RPC로부터 출현하는 이온의 질량 범위를 신속하게 스캐닝하고 검출을 위해 다수의 이온을 축적하지 못하는 기구보다 더 많은 이온이 축적되게 하기 때문이다. 이같은 기구의 비-제한적인 예는 삼중 사중극자 및 사중극자 이온 트랩 기구를 포함한다.

이온 전류 측정에 의한 직접적인 정량이 본 교시내용의 교시에 따라, 특히 약 20％ 내지 약 30％ 범위의 더 큰 측정 오차가 허용될 수 있는 경우에, 또한 유용하다.

질량 분광법과 함께, 제1 차원의 질량 분석 전에 기체 상에서 단편 펩티드들이 분리되는 경우가 빈번하다. 이온 이동성이 기체 상 분리 전략의 한가지 유형이지만, 본 개시내용에 따라 또한 사용될 수 있는 다른 기체 상 분리 전략들이 있다는 것을 본원에서 이해 및 인지하여야 한다. 이온 이동성의 경우에, ESI 또는 MALDI에 의한 이온화에 이어서, 캐리어 완충체 기체에서의 이동성을 기초로 이온들이 분리된다. 이러한 분리의 출력물은 이온 이동성 분포의 특징을 나타낸다. 이러한 유형의 분리는 종종 밀리세컨드 내에 일어나고, 본원에 기술된 전략에 펩티드 단편들을 분할하는 수단으로서 적용될 수 있다.

모든 단백질의 40％가 활성이 다를 수 있는 복합체로서 존재하는 것으로 종종 주장된다. 단백질 복합체의 친화력 선별은 관심 단백질을 끌어내리는 것뿐만 아니라 비-특이적으로 결합된 물질의 포획을 또한 초래한다. 이러한 물질들이 하류 분석을 방해하는 경우가 빈번하다. 추가적으로, 복합체 형성을 초래하는 단백질:단백질 상호작용이 에피토프:파라토프 인식을 종종 억제한다. 따라서, 변성된 종을 초래하는 화학적 수단에 의해 이러한 복합체를 파괴하는 것이 종종 이롭다. 환원 및 알킬화가 이러한 복합체들을 떨어뜨리는 한가지 수단이다. 다른 변형 전략 예컨대 열 변성, 마이크로웨이브 변성 및 본 교시에 따라 또한 사용될 수 있는 기타 변성이 있다는 것을 본원에서 이해 및 인지하여야 한다. 단백질 복합체들을 변성된 종으로 분해한 후에 관심 분석물을 친화력 정제하는 것이 자주 이롭다는 것을 주지하는 것이 또한 중요하다.

본원에 기술된 분리 전략을 수행하는데 필요한 물질들이 패킹된 칼럼이 한가지 전략이지만, 본 교시에 따라 또한 사용될 수 있는 다른 하드웨어 포맷이 있다는 것을 이해 및 인지하여야 한다. 상기 기술된 분리 전략이 필요한 패킹 물질을 함유하는 카트리지, 피펫 팁, 플로-쓰루(flow-through) 플레이트 또는 자기 비드에 적용될 경우가 빈번하다. 카트리지는 장소에 채워질 수 있고, 관심 분석물에 따라 쉽게 교환될 수 있다. 패킹 물질을 함유하는 필터가 있는 피펫 팁으로서 성형된 마이크로-바이오리액터로서 피펫 팁을 사용하는 것은 이러한 용도를 위한 1회용 포맷을 가능하게 할 것이다. 필터가 장착된 플로-쓰루 플레이트의 사용은 병행 프로세싱을 가능하게 하고, 따라서 본원에 기술된 물질의 고처리량 용도를 가능하게 한다. 패킹 물질을 함유하는 필터가 있는 튜브로서 성형된 마이크로-바이오리액터로서 스핀 칼럼을 사용하는 것은 본원에 기술된 공정에 적용가능한 또 다른 1회용 포맷이다. 필터가 장착된 플로-쓰루 플레이트의 사용은 병행 프로세싱을 가능하게 하고, 따라서 본원에 기술된 물질의 고처리량 용도를 가능하게 한다. 필요한 패킹 물질을 함유하는 자기 비드의 사용은 이러한 물질을 샘플에 직접 적용하는 것을 가능하게 하여 전송할 필요를 없앤다. 단계 완료 후, 이러한 물질들은 자석 사용을 통해 제거된다. 본원에 기술된 다차원 전략의 적용은 다양한 물질의 계단식 첨가에 의해서이다.

분석물 특이적 화학 변형 (예컨대 유도체화 또는 단백질분해)에 걸쳐지는 방식들의 조합으로 분석물들의 구별이 달성된다.

트립신을 사용하는 분석물 특이적 화학 변형 (또는 단백질분해)의 적용이 한가지 전략이지만, 본 교시에 따라 또한 사용될 수 있는 다른 변형이 있다는 것을 이해 및 인지하여야 한다. 기타 가능한 효소 변형은 lys c, glu c, 펩신, 파파인, 프로나제(pronase), PNGase F, 글루쿠로니다제(glucuronidase) 또는 다수의 기타 효소의 사용을 포함한다. 단계들을 다양한 순서로 조합하여 사용하여 분석물들의 구별이 종종 달성된다는 것을 주지하는 것이 또한 중요하다.

친화력 기반 구별에 이어지는 화학 변형 (예컨대 유도체화 또는 단백질분해)이 한가지 전략이지만, 본 교시에 따라 또한 사용될 수 있는 다양한 순서가 있다는 것을 이해 및 인지하여야 한다. 효소 변형이 제1차원의 분리에 선행하는 방식으로 펩티드의 친화력 선별이 수행되는 경우가 빈번하다. 이는 친화력 선별 프로세스를 표준화하기 위해 합성 펩티드를 사용하는 것을 가능하게 한다. 다른 경우에, 제2 차원의 분리 전에 제1 차원의 분리에 효소 소화가 이어진다. 이는 에피토프의 외부에 존재하는 변형 또는 단백질 변이체의 검출을 가능하게 한다. 다른 경우에, 제3 차원의 분리 전에 제2 차원의 분리에 효소 소화가 이어진다. 본원에 기술된 물질의 한 용도에서, 이는 번역후 변형을 이해하는데 이롭다. 상응하는 펩티드로부터 번역후 변형을 효소로 제거하는 것은 이러한 변형과 일반적으로 연관되는 이질성을 감소시킴으로써 분석을 단순화한다. 일단 소정의 변형을 함유하는 펩티드가 확인되면, 번역후 변형이 제거되지 않은 후속 분석이 종종 적용된다.

다른 경우에, 2가지 효소 변형이 이들 사이의 분리 단계와 함께 사용된다. 예로서, 친화력 선별에 의해 단백질이 정제되고, 후속 단계에서, 이러한 친화력 기반 구별에 트립신을 사용하여 수행되는 단백질분해가 이어지며, 생성된 관심 펩티드가 친화력 선별에 의해 추가로 정제된다. 후속 단계에서, 이러한 친화력 기반 구별에 PNGase F를 사용하는 탈글리코실화가 이어진다.

본 개시내용의 원리를 포함하는 예시적인 실시양태들이 상기에서 개시되었지만, 본 개시내용은 개시된 실시양태에 한정되지 않는다. 그보다는, 본 출원은 개시내용의 일반적인 원리를 사용하는 개시내용의 임의의 변형, 용도, 또는 개조를 포함하도록 의도된다. 추가로, 본 출원은 본 개시내용이 속하는 업계의 공지된 또는 통상적인 관행 내에 있는 바와 같고 첨부된 청구항의 한계 내에 속하는 본 개시내용으로부터의 변경을 포함하도록 의도된다.

Claims (19)

1. 측정될 분석물을 함유하는 샘플 용액에 샘플 용액 내의 분석물 중 하나 이상에 대한 친화력이 있는 친화력 선별제를 첨가하는 단계;
   친화력 선별제와 분석물 사이에 면역 복합체가 형성되게 하는 단계;
   형성된 면역 복합체를 제1 차원의 분리에서 선별적 흡착 기술을 사용하여 샘플 용액 내의 비-분석물 물질로부터 부분적으로 또는 완전히 분할하는 단계;
   분할된 면역 복합체를 해리시키는 단계;
   해리된 면역 복합체의 분석물 및 친화력 선별제를 제2 차원의 분리에서 선별적 흡착 기술을 사용하여 서로로부터 분리하는 단계; 및
   분석물을 이의 질량-대-전하 비에 따라 분할하는 단계
   를 포함하는, 샘플 용액 내의 다중 분석물을 동시에 분석하기 위한 다차원 방법.
2. 제1항에 있어서, 제1 차원의 분리가 칼럼, 카트리지, 피펫 팁, 플레이트, 또는 비드 포맷으로 수행되는 방법.
3. 제1항에 있어서, 제1 차원의 분리가 변성된 종(species) 상에서 수행되는 방법.
4. 제3항에 있어서, 변성된 종이 환원 및 알킬화에 의해 형성된 방법.
5. 제1항에 있어서, 효소 변형이 제1 차원의 분리에 선행하는 방법.
6. 제1항에 있어서, 제2 차원의 분리 전에 제1 차원의 분리에 효소 소화가 이어지는 방법.
7. 제6항에 있어서, 효소 소화가 트립신, lys c, glu c, 펩신, 파파인, 프로나제(pronase), PNGase F, 글루쿠로니다제(glucuronidase) 또는 다수의 기타 효소를 사용하여 수행되는 방법.
8. 제1항에 있어서, 제3 차원의 분리 전에 제2 차원의 분리에 효소 소화가 이어지는 방법.
9. 제8항에 있어서, 효소 소화가 트립신, lys c, glu c, 펩신, 파파인, 프로나제, PNGase F, 글루쿠로니다제 또는 다수의 기타 효소를 사용하여 수행되는 방법.
10. 제1항에 있어서, 2가지 효소 변형이 이들 사이의 분리 단계와 함께 사용되는 방법.
11. 제1항에 있어서, 기체 상 내의 이온화된 분자들을 이들의 캐리어(carrier) 기체에서의 이동성을 기초로 분리하기 위한 이온 이동성 분리기의 사용을 추가로 포함하는 방법.
12. 제1항에 있어서, 제1 및 제2 차원의 분리가 유체역학적 부피에 따라 분리하는 것, 포획 항체로 독특한 구조적 특색을 표적화하는 것, 고정된 아비딘으로 비오틴화 특색을 표적화하는 것, 소수성 표면에 흡착시키고 이로부터 차별적으로 방출시키는 것, 하전된 표면에 흡착시키고 이로부터 차별적으로 방출시키는 것, 고정된 금속 친화력 킬레이터에 흡착시키고 이로부터 차별적으로 방출시키는 것, 및 보론산(boronic acid) 강화 표면에 흡착시키고 이로부터 차별적으로 방출시키는 것 중 하나 이상을 포함하는 방법.
13. 제12항에 있어서, 독특한 구조적 특색이 친화력 선별제의 특유한 천연 구조 특색, 친화력 선별제에 접합된 합텐, 및 친화력 선별제에 접합된 면역원 중 하나 이상을 포함하는 방법.
14. 제1항에 있어서, 분석물이 분석물 단편, 분석물 유도체 및 분석물 동위원소이성질체 중 하나 이상을 포함하는 방법.
15. 제1항에 있어서, 분석물이 이온화된 분석물을 포함하는 방법.
16. 제1항에 있어서, 친화력 선별제가 항체 및 항체 단편 중 하나 이상을 포함하는 방법.
17. 제1항에 있어서, 친화력 선별제가 앱타머, 렉틴, 파지 디스플레이 단백질 수용체, 박테리아 단백질, 및 올리고뉴클레오티드 중 하나 이상을 포함하는 방법.
18. 제17항에 있어서, 박테리아 단백질이 G 단백질, A 단백질, 및 한 생물에 의해 다른 생물로부터의 단백질을 표적화하기 위해 생산된 단백질 중 하나 이상을 포함하는 방법.
19. 제17항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 RNA, DNA, 및 PNA 중 하나 이상을 포함하는 방법.

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