CN104160278A - 基于选择剂的识别和量化系统及用于在单次分析中识别和量化多种分析物的方法 - Google Patents

Abstract

本申请提供了一种用于同时分析样品溶液中的多种分析物的多维方法，所述方法包括：向包含待测量分析物的样品溶液中添加亲和选择剂，所述亲和选择剂对所述样品溶液中的所述分析物中的一种或更多种具有亲和力；允许所述亲和选择剂与所述分析物形成免疫复合物；在第一维分离中采用选择性吸附技术将所形成的免疫复合物与所述样品溶液中的非分析物物质部分或全部分离；使所分离的免疫复合物解离；在第二维分离中采用选择性吸附技术使解离的免疫复合物中的所述分析物与所述亲和选择剂彼此分离；并根据所述分析物的质荷比来解析所述分析物。

Description

基于选择剂的识别和量化系统及用于在单次分析中识别和量化多种分析物的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2012年2月2日提交的美国临时专利申请序列号No.61/594,193(代理人案号No.PERF-P0006-US)的优先权，并且是于2010年3月10日提交的美国专利申请序列号No.12/721,173(代理人案号No.PERF-P0004-US)以及同样于2010年3月10日提交的国际专利申请No.PCT/US2010/026819(代理人案号No.PERF-P0001-WO)的部分继续申请，其公开内容明确地通过引用以其整体并入本文。

技术领域

本公开内容总体上涉及用于分析抗原的多维分析策略和系统，并且特别地涉及用于在单次分析中分析多种分析物的基于亲和选择剂(affinityselector)的识别和定量系统以及方法。

背景技术

在与约100,000种其他组分的混合物中测定单一分析物是一项艰巨的任务。在六十多年前，分析人员开始认识到抗体的结构选择性可用于基于抗原和半抗原的化学结构从生物提取物或血液中结合和纯化所述抗原和半抗原。该技术变得如此重要以至于Rosalyn Yalow因放射免疫测定(radio-immunological assays，RIA)而获得1960年的诺贝尔奖。连同酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)，这两项技术为世界提供了测量低至pg/mL水平的抗原的简单方法。

RIA和ELISA二者的基本组成都是在测定的第一步中使用固定化抗体以实现从样品中选择抗原。自从这些方法出现以来，分析免疫学家已理解，在表面结合抗体引入了显著的动力学限制。例如，抗原必须依照分子大小而经过相当的距离以到达表面，从而增加了在试管或微量滴定孔中发生抗原结合所需的时间量。此外，测定中使用的所有抗体在测定孔表面或在颗粒上聚集在一起，而抗原则均匀地分布于整个溶液中。当在微量滴定孔中进行ELISA时，通常使用一天或更长的孵育时间，以允许抗原有时间扩散至结合有抗体的孔壁上。在RIA的情况下，使扩散问题最小化的努力涉及使用大量的非常小的固定有抗体的无机颗粒。在过去的几年期间，已经使用了许多类型的混合、流动、加热以及甚至超声的过程以使上述的扩散问题最小化。虽然做出了这些努力，但是扩散问题仍然存在。

随着分析化学的发展，已认识到可获得涉及要同时测定多种分析物之样品的多种问题的更好更完整的答案。这进而导致了对“分析复用(analyticalmultiplexing)”兴趣的增加，其中在单次分析期间对样品中的大量分析物进行分析。这常常通过免疫阵列而进行。

对免疫阵列的兴趣源自微电子机械系统(micro-electro-mechanical-system，MEMS)的普及和成功。当已将几种类型的抗体阵列用于大规模复用(包括高通量和并行处理技术)时，另一些方法集中于较少数目样品的大规模复用，这是例如关注使每次测定的总分析时间和成本最小化的临床实验室所需要的。无论使用哪种方法，免疫阵列系统都仍然面临抗体固定化和动力学的挑战。还存在抗体在固定化(尤其是如果它们被错误的定位于表面)之后是否仍将保留全部活性的问题。还必须考虑空间问题，尤其是抗体在表面的定位及其堆积密度方面。最后，再现性也是一个因素，尤其是由于很难使来自在表面上沉积的皮升(picoliter)体积溶液的固定化抗体再生。蒸发以及很多其他现象也使滴定板水平的固定化所经历的再现性降低。

虽然抗原在免疫阵列中必须扩散以到达表面的距离比在微量滴定孔中的要小，但是动力学问题仍然是免疫阵列的一个严重限制。在低的抗原浓度下尤其如此。抗原从溶液中的所有点扩散至阵列元件之一需要大量的时间。因为在抗原：抗体复合物形成中的分子对接需要精确的空间定位，所以抗原通常在建立正确的捕获定位之前多次撞击表面。例如，如果抗原在128元件阵列上与表面碰撞之后未被捕获，那么它在第二次撞击表面之前有大量空间要行进。

如上所述，基于颗粒的测定始于RIA和Yalow方法。目前Yalow法已发展成为两类测定系统：1)用于流式细胞术测定的颗粒方法(例如，Luminex系统)，其中检测单个颗粒的荧光；以及2)其中将抗体放置在磁性颗粒上的方法，免疫复合物在所述磁性颗粒上形成，然后将所述颗粒从溶液中取出，并释放抗原用于进一步测量(例如，Leigh Anderson的SISCAPA系统)。复用需要制备用于每种被测定抗原的不同组的免疫吸附珠。这意味着，需要将20至50组不同的携带珠的抗体添加到样品溶液中，从而导致在寻找合适的抗体颗粒方面甚至更大的抗原动力学限制。此外，所述溶液因具有如此大量的颗粒而变得拥挤，使得抗原必须在未携带其抗体的颗粒周围扩散。用于处理这些限制的一种推荐解决方案是将多个抗体固定在单个颗粒上。然而，该解决方案未完全解决扩散和化学计量控制的问题。而且，颗粒表面上抗体浓度的稀释意味着抗原可撞击颗粒表面而不接触到其抗体。此外，总表面积以及由此所需的颗粒总数仍然保持很高。

至于流式细胞术策略(例如Luminex系统)，在可通过流式细胞术分析免疫复合物之前，必须在颗粒表面上形成免疫复合物。而该系统与上述系统非常类似，每个珠携带靶向单一抗原的单一抗体。此外，在抗原捕获中还存在扩散问题。

有趣的是，哺乳动物免疫系统的功能是处理数以千计的抗原，尽管它们并不都是同时进行。随着在单个哺乳动物中产生对外来物质的免疫，产生了针对数以千计免疫原的抗体。这些抗体包含在血液中循环的免疫球蛋白中，在任何时候，随着抗原：抗体复合物的形成，数百种抗原被隔离。基于对哺乳动物免疫系统的分析，可得出这样的结论：因为抗体形成免疫复合物，所以它们已发展为在溶液中起作用。除了在溶液中起作用之外，它们还同时隔离大量抗原，并且几乎没有固定化抗体测定系统中所见到的限制。

哺乳动物免疫系统的上述发现极其重要，特别是因为它们清楚地表明，溶液中免疫复合物的形成是天然有效的，而在固定化表面上之复合物的形成则并非如此。此外，清楚的是，可以在溶液(例如，血液)中同时形成几种免疫复合物，这是在进行分析复用过程时要实现的一个必需因素。最后，通常影响免疫测定的大多数问题(例如，固定化期间的活性丧失、抗体的适当定位、扩散动力学以及具有足够的表面积)在这些基于天然溶液的系统内并不普遍。

虽然天然形成的免疫复合物具有上述优点，但是这样的免疫测定仍需要向样品中添加抗体，这可产生问题。例如，向血浆样品中添加大量抗体可导致蛋白质浓度升高至阻碍分析物扩散的水平。虽然这个问题在表面上看起来可能似乎有关系，但是进一步观察之后可推断出这个问题很可能并不合逻辑。更特别地，在血浆中存在的血清白蛋白的平均浓度为约50mg/mL至约100mg/mL，而存在的免疫球蛋白的量为约4mg/mL，并且任意特定抗体的量很可能在约1μg/mL至约100μg/mL的范围内。如果假定进行分析测量所需的抗体浓度为10μg/mL，并且当将100种抗体添加至血浆样品中时，蛋白质浓度将总计升高约1mg/mL。类似地，如果血浆样品中的蛋白质浓度为75mg/mL，则蛋白质浓度将升高约1.3％。因此，可推断出向血浆中添加100种抗体以进行100倍的复用分析将对蛋白质浓度、溶液粘度以及最终分析物的扩散几乎没有影响。而且，添加1000种抗体只使质量提高10mg/mL，或者使蛋白质浓度改变14％；这很可能也不足以对分析造成影响。

在1960年以前，免疫测定一般靶向单个抗原，并且通过所谓的“沉淀素反应(precipitin reaction)”的方法在溶液中进行。形成免疫复合物之后，用于测定的多克隆抗体混合物或者形成沉淀，或者通过添加碳水化合物或乙二醇聚合物而被诱导形成沉淀。抗原浓度通过光散射进行测定；然而，这种方法缺乏灵敏度和线性，并且沉淀素测定一次只允许测定一种抗原的事实导致了该方法告终，并最终转变为灵敏得多的RIA和ELISA方法。虽然沉淀素反应方法失败了，但是仍然可以推理出，如果选择性和检测灵敏度得以大幅改进，则基于溶液的免疫复合物形成方法可用于免疫测定。

虽然最初的沉淀素和RIA方法在进行抗原测量中取决于单一选择方法(即，一种抗原)，但是现今可接受的是，单一抗体的选择性不足以将样品中的抗原与所有其他化学实体区分开。当前的免疫测定建立在多维的选择和/或区分上，并且如果这些维度中的每一个都是正交选择时尤其理想。

发明内容

本公开内容通过提供用于分析抗原的新的多维分析策略和系统从而克服或改善了上述现有技术缺点中的至少一个，或者提供了有用的替代方案。

在其一种形式中，提供了用于抗原分析的多维分析策略。根据本公开内容的这个方面，在第一维分析期间，用可溶性免疫复合物中的抗体隔离样品溶液中的抗原。在分析过程开始时向溶液中添加抗体的具体目的是结合抗原以在所述多维方法的后续步骤中进行定性和定量分析。交叉反应的抗原、非特异性结合物质以及与抗原发生次级结合的物质也可在第一维中吸附至免疫复合物，并在之后维的分析中被清除。在第一维中形成的免疫复合物的独特性质之后在第二维分析中被利用，其使用分子大小分级系统(molecularsizing system)或靶向隔离抗体之具体性质的吸附介质，基于其流体力学体积将其与样品中的其他组分分离(resolve)。基于这两种性质之一的分级对于表位：互补位识别是正交的，并且第三维和第四维中的区分通过下述方式的组合来实现：分析物特异性化学修饰(例如，衍生化或蛋白水解)和大小区分以及从表面(例如，在反相基质或离子交换介质上)吸附和差异洗脱，或者通过以尺寸排阻和疏水吸附(正如使用限进介质一样)的组合。所选择的具体区分机制以及其中它们联用的顺序取决于所靶向分析物的化学性质以及在前两维中使用的分级机制。在第五维及更高维的分析发生在从质谱到荧光和电化学检测器的检测系统内。根据采用质谱检测系统的某些实施方案，可根据分析物在第五维中的质量、在第六维中碰撞诱导的分析物解离以及在第七维中所得碎片离子的质量分析来解析所述分析物。

根据本公开内容的另一形式，提供了同时分析样品溶液中的多种分析物的多维方法。根据本公开内容的这个方面，所述方法包括：向所述样品溶液添加亲和选择剂以形成所述亲和选择剂与所述分析物的免疫复合物；提供第一分离方式，以使所述样品溶液中的所形成的免疫复合物与其它非分析物物质部分或完全分离；提供第二分离方式，以使所述样品溶液中所述分析物彼此部分或全部分离；以及根据其质荷比来解析所述分析物。

根据本公开内容的另一些方面，提供了用于同时分析样品溶液中的多种分析物的多维方法。根据本公开内容的这个方面，所述方法包括：向包含待测量分析物的样品溶液中添加亲和选择剂，所述亲和选择剂对所述样品溶液中的所述分析物中的一种或更多种具有亲和力；允许所述亲和选择剂与所述分析物形成免疫复合物；将所形成的免疫复合物与所述样品溶液中的非分析物物质部分或全部分离；使所分离的免疫复合物解离；通过表面吸附过程捕获所述分析物从而使解离的免疫复合物中的分析物与亲和选择剂彼此分离；将捕获的分析物转移至检测装置；以及用所述检测装置根据其质荷比来解析所述分析物。

在本公开内容的某些方面中，通过以下将所形成的免疫复合物完全或部分分离：根据其流体力学体积分离分析物或所形成的免疫复合物，靶向亲和选择剂或分析物之独特的结构特征以捕获分析物或所形成的免疫复合物的抗体，进行寡核苷酸杂交或者利用固定化亲和素来吸附和捕获生物素化的亲和选择剂。

在本公开内容的另一些方面中，通过以下将样品溶液中的分析物与亲和选择剂彼此分离：根据其流体力学体积分离分析物或所形成的免疫复合物，从疏水表面吸附和差异洗脱分析物，靶向亲和选择剂或分析物之独特的结构特征以捕获分析物或所形成的免疫复合物的抗体，进行寡核苷酸杂交，利用固定化亲和素捕获生物素化的亲和选择剂，从带电表面吸附和差异洗脱分析物，从固定化的金属亲和螯合剂吸附和差异化洗脱分析物，或者从富含硼酸的表面吸附和差异洗脱分析物。

根据本发明教导的分析的分析物可包括但不限于分析物片段、分析物衍生物和分析物同素异构体(isotopomer)中的至少一种。而且，本发明教导的亲和选择剂可包括但不限于抗体、抗体片段、适配体(aptamer)、凝集素、噬菌体展示蛋白受体、细菌蛋白质和寡核苷酸中的至少一种。根据某些实施方案，所述细菌蛋白质可包括G蛋白、A蛋白以及由生物体产生的靶向来自另一生物体之蛋白质的蛋白质中的至少一种，而所述寡核苷酸可包括RNA、DNA和PNA中的至少一种。

根据本公开内容的某些实施方案，用固定化抗体靶向亲和选择剂之独特的结构特征使分析物与亲和选择剂彼此分离。根据这些具体实施方案，被靶向的独特的结构特征可包括但不限于亲和选择剂特有的天然结构特征、已与亲和选择剂缀合的半抗原以及与亲和选择剂缀合的免疫原中的至少一种。

根据本公开内容的一些方面，进行分析的分析物包括使用质谱分析可检测的离子化分析物，所述质谱分析特别检测根据其质荷比已经分离的分析物的母体离子。

在本公开内容的某些方面中，通过使用检测装置对分析物进行解析，所述检测装置被配置成进行以下的整合步骤：(a)将已根据其质荷比分离的分析物离子化；(b)利用气相碎裂过程(gas phase fragmentation process)产生来自步骤(a)之母体离子的碎片离子；(c)根据其质荷比分离步骤(b)中产生的碎片离子；以及(d)记录当步骤(c)所产生的碎片离子与检测器表面碰撞时所产生的相对离子流。在用于解析分析物的检测装置方面，根据某些实施方案，通过以下技术中的一种或更多种对分析物进行检测：质谱、吸光度、荧光和电化学分析。

根据本公开内容的另一些实施方案，可使用同位素标记的内标物(isotopically coded internal standard)来实现进行分析之分析物的相对或绝对量化。此外，连续添加、竞争性结合测定也可用来实现分析物的相对或绝对量化。

在本公开内容的另一些方面中，还可考虑利用抗体浓缩来从样品溶液中收集分析物的等量份。根据本公开内容的这些方面，将收集的等量份配置成与用于解析分析物之装置的最佳检测范围相适应。

根据本公开内容的另一形式，提供了利用多个正交分离维数来分析样品溶液中的多种分析物的方法。根据本公开内容的这个方面，所述方法包括：向所述样品溶液中添加亲和选择剂以形成所述亲和选择剂与所述分析物的免疫复合物，并独立地隔离所述样品溶液中的一种或更多种抗原和干扰物质；利用选择性吸附技术在第一或第二正交分离维数中除去所隔离的一种或更多种抗原和干扰物质，而不论其顺序如何；提供第一分离方式，以使所述样品溶液中的所形成的免疫复合物与其他非分析物物质部分或完全分离；提供第二分离方式，以使所述样品溶液中的所述分析物彼此部分或全部分离；以及根据其质荷比来解析所述分析物。

根据本公开内容的另一个方面，提供了用于同时分析样品溶液中的分析物的方法，所述方法包括：向所述样品溶液中添加亲和选择剂以形成所述亲和选择剂与所述分析物的免疫复合物；通过提供第一色谱柱来将所形成的复合物与所述样品溶液中的其他未复合物质分离；使所形成的复合物解离；通过第二色谱柱的表面吸附捕获所述分析物，以将所述分析物与所述亲和选择剂分离；将所捕获的分析物转移至与所述第二色谱柱相联的第三色谱柱；以及随着所捕获的抗原或其片段从所述第三色谱柱洗脱，对所述捕获的抗原或其片段进行分析。

根据本公开内容的某些方面，所述非复合物质包括不具有被所添加亲和选择剂靶向的表位的物质。

在本公开内容的另一些方面中，用于将样品溶液中形成的复合物与其他非复合物质分离的色谱柱选自以下的至少一种：尺寸排阻色谱柱、填充有吸附剂的限进介质柱、配置成靶向一般类别的所添加亲和选择剂的抗体柱、配置成靶向所有的所添加的亲和选择剂的蛋白质A柱或G柱、具有与附着于一种或更多种所添加亲和选择剂上寡核苷酸互补之固定DNA的DNA寡核苷酸柱、配置成靶向附着于一种或更多种所添加亲和选择剂上的生物素的亲和素柱、以及配置成选择所添加亲和选择剂的天然存在或合成产生之特征的色谱柱。

根据本公开内容的另一些方面，通过表面吸附捕获分析物的用于将分析物与亲和选择剂分离的色谱柱选自以下的至少一种：反相色谱柱、限进介质柱、免疫吸附、固定化的金属离子亲和色谱柱、离子交换柱以及色谱保留装置。

根据本公开内容的某些方面，亲和选择剂包括但不限于：适配体、蛋白A、蛋白G、噬菌体展示蛋白、天然受体、凝集素、DNA、RNA、合成亲和试剂或对分析物表现出亲和力以在亲和捕获剂与分析物之间形成多种分子间复合物的一些其他物质。

根据本公开内容的另一个方面，用于同时分析样品溶液中的多种分析物的多维方法包括：向包含待测量分析物的样品溶液中添加亲和选择剂，所述亲和选择剂对所述样品溶液中的所述分析物中的一种或更多种具有亲和力；允许所述亲和选择剂与所述分析物之间形成免疫复合物；在第一维分离中采用选择性吸附技术使所述样品溶液中的所形成的免疫复合物与其他非分析物物质部分或完全分离；使所分离的免疫复合物解离；在第二维分离中采用选择性吸附技术使解离的免疫复合物中的分析物与亲和选择剂彼此分离；以及根据其质荷比来解析所述分析物。

附图说明

通过结合附图参照下文对本公开内容之一些实施方案的描述，本公开内容的上述优点和其他优点以及得到这些优点的方式将变得显而易见，并且将更好地理解本公开内容本身，其中：

图1是示出根据本公开内容教导基于亲和选择剂与分析物复合而形成复合物从而同时分析多种分析物的多维方案；

图2是根据本公开内容教导的限进介质(restricted access media，RAM)颗粒；

图3是根据本公开内容教导的半渗透表面(semipermeable surface，SPS)支持物的图解；

图4是根据本公开内容教导用于对由亲和选择剂从复合物样品基质中捕获的蛋白质直接进行质谱(MS)分析的分析方案。

图5是根据本公开内容教导的限进柱的图解，其中柱内部是亲水凝胶并且外部用固定化胰蛋白酶包被；

图6描述了据本公开内容教导的胰蛋白酶-RAM柱中涂层的合成；

图7是根据本公开内容教导用于蛋白质质谱分析的分析方案，所述蛋白质通过亲和选择剂从复合物样品基质中捕获，并且随后在进一步分析之前进行蛋白水解消化。

图8是根据本公开内容教导的一种示例性阀系统，其允许向截流模式分析中的固定化酶柱施加高压；

图9是根据本公开内容教导用于对由多克隆抗体亲和选择剂捕获的半抗原和肽进行分析之方案的图解；

图10是根据本公开内容教导用于对由生物素化亲和选择剂捕获的半抗原和肽进行分析之方案的图解；

图11是根据本公开内容教导用于对由DNA、RNA或PNA亲和选择剂捕获的半抗原和肽进行分析之方案的图解；

图12是根据本公开内容教导基于分子大小用于对免疫复合物进行分级之方案的图解；以及

图13是根据本公开内容教导的仪器平台的液相色谱组件，其能够进行基于亲和选择剂方法的高分辨率分析，用于同时分析多种分析物。

发明详述

下文描述的本公开内容的实施方案并不旨在穷举或将本公开内容限制在下文详细描述所公开的精确形式。相反，对实施方案进行选择和描述使得本领域其他技术人员可领会和理解本公开内容的原理和实践。

如上所述，本公开内容总体上涉及用于分析抗原的多维分析策略和系统。如将在下文更详细解释的，本发明教导的一个区别特征是在第一维中与样品溶液中的分析物形成大量分子间复合物，之后在第二维中进行某一类型分子间复合物的分离，这将产生用于在第三维中进一步分级或化学反应的级分，之后在第三维中进行非常特异类型的分离或化学反应的能力。在本发明教导的某些方面中，在第三维后可使用更高维的分析，并且尤其使得在多维分析过程结束时，将有这样的情况：1)可将被检测的每种物质(分析物)单独地鉴定和量化，或者2)可一起测定密切相关家族的分析物。

现在转到图1，其示出了一种根据本公开内容的用于同时分析多种分析物的方案，该方案基于亲和选择剂(S＊)(例如抗体、适配体、凝集素、蛋白G、蛋白A、噬菌体展示蛋白或结合蛋白)与分析物(A)在第一维分析中复合，形成复合物(S＊：A)。虽然根据本公开内容的某些方面，一般将特异性亲和选择剂用于每种分析物，但是在另一些方面中，也可以有与多种分析物形成复合物的亲和选择剂，例如，可见靶向与许多糖蛋白偶联的Lewis×抗原的抗体。

关于第一维(或“亲和选择维”)，该维中的过程基于亲和选择剂(S＊)与分析物的复合作用。S上的符号(＊)指明亲和选择剂或复合物之独特的结构特征，所述独特的结构特征可在稍后较高维中用于对其进行选择。

在该第一维中的分析物分析始于溶液中单一复合物的形成，如在下面的式1中所述：

其中，S＊是亲和选择剂，例如IgG或IgM抗体、凝集素、结合蛋白、DNA物质、RNA物质或对分析物(A)具有结合亲和力的任何类型的物质；S＊：A是通过亲和选择剂(S＊)与特定分析物(A)缔合而形成的非共价复合物。根据亲和选择剂的选择性，特定亲和选择剂S＊可与单一分析物或与多种分析物形成复合物。分析物可为抗原、半抗原或经测量对S＊具有亲和力的任何分析物。对于每种分析物都会形成S＊：A复合物。将S＊或A置于方括号中以摩尔每升表示其浓度。

通常为这种情况：

$K_{b_1}=\frac{[S^{*}:A_1]}{\left[S^{*}\right]\left[A_1\right]}---\left(1\right)$

其中K_b1为特定亲和选择剂与特定分析物(A₁)的结合常数。所述结合常数等于复合物形成速率除以解离速率。溶液中形成的每种复合物都将具有这样的结合常数，并且可由以下通式表示：

$K_{b_n}=\frac{[S^{*}:A_n]}{\left[S^{*}\right]\left[A_n\right]}---\left(2\right)$

其中A_n是任意具体分析物。

虽然本文未做出要求，但在某些实施方案中，亲和选择剂与分析物具有高亲和力和高结合常数(例如，大于约10⁶)是有益的。此外，在某些实施方案中，当解离率(off-rate)低使得复合物S＊：A在后续维度的分析期间不解离，除非在特定维期间的目的是通过改变孵育条件来使复合物解离，这是有利的。此外，使复合物在与样品中的其他非抗原组分分离期间保持完整是需要考虑的一个重要因素。还应注意，虽然在第二维中可以对具有低结合亲和力的复合物进行分析，但是如果在复合物有时间解离之前快速实现分离是有帮助的。

根据本公开内容的某些方面，期望亲和选择剂(S＊)(例如抗体)与分析物(A)之间形成复合物，而不是沉淀。为了阻止这样的沉淀，根据这些实施方案可使用不促进高水平交联或者可能的任何交联的亲和试剂。这在分析物的分子量低时一般不是问题，尤其是因为已确定亲和选择剂的化合价通常成为较高分子量分析物的问题。在抗体的情况下，当靶向低分子量分析物时，将可能使用多克隆或单克隆抗体，因为它们更不太可能形成交联沉淀。单克隆抗体与蛋白质或其它大分子分析物不太可能形成沉淀。根据本公开内容教导，抗体的Fab片段是单价这一事实使得其成为亲和选择剂的良好候选物。此外，离子强度、pH和添加剂也将在溶液中之复合物的维持中起作用。

根据本公开内容的另一个方面，在免疫复合物形成之前或在将免疫复合物亲和捕获至固相吸附剂上之前，对进行分析的样品进行分级。该任选步骤的作用是除去交叉反应物质，区分抗原是其组分的天然复合物，区分抗原的同种型，或者识别抗原片段。在亲和捕获S＊：A复合物(如式1所示)之前进行物质的去除或交叉反应物质很大程度地有助于分析物的分析，并且可通过两种方式实现。首先，当交叉反应的物质具有某一区别特征(例如，独特的表位、电荷性质或疏水性)时，它们可以在S＊：A复合物形成之前或S＊：A复合物形成之后但是在复合物被捕获到亲和吸附剂上之前从样品中选择出来。阻止S＊和交叉反应(CR)物质之复合物的形成是一种情况，而在另一种情况中，在S＊：A复合物被捕获之前除去S＊：CR复合物。

在另一些实施方案中，抗原存在于若干种不同的复合物(例如，S＊：A：P₁、S＊：A：P₂、S＊：A：P₃和S＊：A：P₄)中，并且P是另一种非分析物的蛋白，这在相互作用组(interactome)中或者当抗原部分或完全地与自身抗体复合时是常见的。有时血浆中的甲状腺球蛋白是这种情况。此外，这些形式中的一种可能干扰与疾病有关的抗原形式的分析。在形成S＊：A复合物之前或在捕获S＊：A复合物之前，通过用除去一种或更多种复合物形式的免疫吸附剂靶向复合物中的非分析物来实现对这些复合物的区分。使用以下物质实现干扰性复合物的去除：靶向复合物中非分析物的免疫吸附剂或另一些类型的吸附剂，例如区分干扰性非分析物与分析物的离子交换剂、固定化金属亲和色谱吸附剂、疏水相互作用柱或尺寸排阻色谱柱。该步骤的另一用途是区分天然形式的抗原与具有较低分子量的片段。可以是这样的情况：片段或天然形式的抗原是用于检测的被靶向的期望分析物。在本文中还应理解，可使用免疫吸附剂或尺寸排阻柱来实现区分，并且抗原可以以翻译后修饰同种型存在。因此，该任选的步骤可用于除去干扰性同种型。

现在转到图1，在复合物形成之后，在第二维分析中将所有S＊：A复合物与非分析物分离。可通过多种方式实施该分离步骤，包括靶向亲和选择剂(S＊)上的标签(＊)的高特异性选择过程、静电或疏水吸附、电泳或甚至基于大小的分离；将在下文中对所有这些进行描述。该维分析的一个基本特征是必须以某一方式从剩余溶液中部分或全部地分离复合物。通过吸附实现该步骤示于下式2中，其中，S＊：A复合物在经过基质(M)表面时被其吸附。

M+S*：A₁→M：S*A₁      式2

该步骤可通过许多方式实现。理想地，基质具有高的比表面积(面积/单位体积)，并且溶液中的任意点与所述表面的距离为10μm或更小。所述基质表面还应当富含易于与衍生剂反应的官能团，以允许试剂的共价结合，所述试剂例如一些类型的靶向亲和选择剂上之标签(＊)的结合剂。下文描述了这些结合剂的性质。基质的实例是用于色谱柱以支持固定相和整个色谱柱的二氧化硅(silica)和有机树脂颗粒。具有期望特性的色谱颗粒大小＜20μm，具有大小为约100nm至约500nm的孔，并且表面积超过约40m²/mL。材料整体是二氧化硅或有机树脂，其具有＜10μm的通孔和约100nm至约500nm的第二组孔。

S＊中的标记(＊)指示可用于使其与吸附基质结合的亲和选择剂或复合物之独特的结构特征。所述特征可为S＊中独有的结构元件，或者由S＊：A复合物的形成所产生的新特征。该独特的结构特征可天然地存在于S中，或者其可作为标签与S化学缀合。天然特征的一个实例可以是小鼠、大鼠、兔、牛、猪或马抗体中的氨基酸顺序，其独特地不同于见于人免疫球蛋白中的那些。采用与基质M结合的抗小鼠IgG免疫吸附剂使得可能从人血浆中选择出小鼠抗体以及与其形成复合物的抗原。

在某些实施方案中，可通过遗传工程来添加半天然标签，其允许在多肽亲和选择剂的表达期间产生氨基酸顺序标签。根据本公开内容这个方面的一个此类实例是具有附加肽尾的单链抗体。

根据本公开内容的另一些方面，亲和选择剂可以单独地或者与它们通过使生物素、半抗原、高电荷基团或寡核苷酸标签与选择剂(S＊)共价地结合而复合的分析物一起从样品中提取。对于寡核苷酸标签，在本文中应理解和领会，如果期望的话可能对大量不同的亲和选择剂进行单独标记。

在本公开内容的另一些方面中，可以通过以下非限制性技术中的一种或更多种来将亲和选择剂与分析物分离：根据其流体力学体积来分离所述分析物或所形成的免疫复合物，从疏水表面上吸附和差异洗脱所述分析物，靶向所述亲和选择剂或所述分析物的独特的结构特征以捕获所述分析物或所形成的免疫复合物的抗体，进行寡核苷酸杂交，利用固定化亲和素捕获生物素化的亲和选择剂，从带电表面上吸附和差异洗脱所述分析物，从固定化的金属亲和螯合剂上吸附和差异洗脱所述分析物，以及从富含硼酸的表面上吸附和差异洗脱所述分析物。

在根据本公开内容教导的另一个非限制性实施例中，使用抗-抗体免疫吸附剂介质来捕获已经添加至人血浆样品的小鼠或兔抗体。在从所述样品中重捕获这些抗体的过程中，也将捕获与其形成复合物的任何物质。在捕获S＊A复合物后，采用广泛清洗表面结合复合物以从所述样品中除去所有其他弱结合的组分。可以将该技术更一般地称为抗亲和选择剂法。应理解，根据该示例性实施方案，可以使用靶向任何类型的亲和选择剂的抗体以从样品中获取复合物。

对于不含大量免疫球蛋白的样品，可以使用蛋白A、蛋白G和/或另一些固定化抗体靶向蛋白质来分离S＊：A复合物(其中S＊是免疫球蛋白)。该方法与上述抗-抗体策略非常相似。

根据本公开内容的另一个非限制性实例，使用亲和素吸附剂从样品中选择生物素标记的亲和选择剂及其复合物。还采用广泛洗涤来从样品中除去以低亲和力结合的物质。

预想还可以用半抗原(针对它的抗体已制得)标记亲和选择剂。当固定化该半抗原靶向抗体时，使用第二维捕获基质分离S＊：A复合物。此外，当所述亲和选择剂是适配体时，可以通过使用固定在第二维基质(M)上的寡核苷酸序列将其从样品中选择出来。被所述固定化序列所靶向的适配体上的序列未用于形成复合物，并且必须自由地与吸附剂表面上的互补序列杂交。

用DNA、RNA或肽核酸(peptide nucleic acid，PNA)寡聚物标记的亲和选择剂将能够通过碱基对杂交与基质M上的互补DNA、RNA或PNA序列结合。每种亲和选择剂(例如抗体)都单独地或成组地用8至12个碱基的特有DNA序列标记(编码)。此外，每种经编码的、与M(互补寡核苷酸顺序已与其结合)接触的亲和选择剂将通过杂交结合，而固定在吸附剂上的互补DNA序列可根据其将被洗脱的方式均匀分布或在空间上成组分布。当通过使复合物变性、使互补杂交体解离或二者进行顺序洗脱时，将互补寡核苷酸置于柱中的不同位置。当它们聚集在一起时，必须采用更为细致的顺序释放程序，其涉及热循环。

在大小方面，基质对S＊：A复合物表现出差异渗透性而非将其吸附。在小分析物已经被大分子亲和选择剂复合之后，其表现为大分子，允许通过大小差别分离器(size discriminating separator)将其与溶液中的其它小分子分离，所述大小差别分离器例如尺寸排阻色谱(size exclusion chromatography，SEC)基质、限进介质(RAM)或半渗透性表面(SPS)介质、场流分级(fieldflow fraction，FFF)、流体动力色谱(hydrodynamic chromatography，HDC)或膜过滤系统。在样品中，大分子S＊：A复合物的分子量比低分子量组分高得多，并且可容易地通过大小分离系统(包括限进介质(RAM)和半渗透性表面(SPS)柱)而区分。进入这些介质的孔或半渗透性表面的低分子量疏水物质将被差异吸附。这意味着，RAM和SPS柱通过大小和疏水相互作用这两种机制来分离分子。

现在转到图2，其示出限进介质(RAM)颗粒的图解。根据该图解，RAM支持物一般是亚微米二氧化硅颗粒聚集体，其中所述支持物的内表面由硬脂酸共价地衍生化，并且所述支持物的外表面由结构为-OCH₂-CH(OH)-CH₂OH的甘油醚衍生化。所述亚微米颗粒之间的平均孔径平均为约6nm，这阻止了分子量超过约20kD至约40kD的大多数蛋白质进入。相反，小于约3kD的肽和半抗原易于进入RAM支持物内部，在这里它们被从水中吸附。

复合物的电泳分离可通过电泳迁移率或等电点的差异来完成。根据某些示例性实施方案，所期望的亲和选择剂的电泳特性非常不同于溶液中其他物质的电泳特性。而相对于溶液中的蛋白质，对于基于DNA或RNA的选择剂而言这通常是适用的，具有DNA或RNA的复合物中的肽和蛋白质也可以容易地与溶液中的其他肽和蛋白质分离。

场流分级(FFF)通过利用与大小相关的分子扩散系数的差异的机制来分离大小不同的分子。HDC通过稍微不同的机制来分离大分子，其也在洗脱特性中产生与大小相关的差异。

在图3中，提供了半渗透性表面(SPS)支持物的图解。通过使300道尔顿的聚氧乙烯(polyoxyethylene，POE)寡聚物与平均每15个附着于二氧化硅支持物表面的辛基(C₈)硅烷基中的一个结合来制备吸附剂。POE寡聚物与吸附剂表面上的C₈残基弱缔合，阻断(blocking)与蛋白质的接触。相反，半抗原和肽可透过该涂层，并通过疏水相互作用机制与C₈基团结合。

第二维分离过程的最终组分需要S＊：A复合物或仅分析物在第二维中从吸附剂释放和/或转运至第三维中用于进一步分析。在SEC、RAM、SPS或FFF分离的大小选择情况下，可以将分析物直接转运至第三维中，或者将在分析物转运到第三维中之前解离复合物。可以通过用相对酸性(pH2.5)或碱性(pH12)的流动相调节分子大小分级柱之出口处的pH来实现分子大小分离情况中的解离。此外，通过相对酸性(pH2.5)或碱性(pH12)条件来实现从免疫吸附剂解离免疫复合物。除解离Ab：Ab复合物以外，还解离Ab：Ag复合物。

生物素化亲和选择剂：分析物复合物可以以多种方式从单亲和素亲和柱释放。一种是通过将生物素在捕获剂之前添加至溶液或者在色谱柱的情况下添加至流动相。这将释放生物素化S＊A复合物。当以该方式洗脱时，单亲和素柱可用于许多个循环。一个替代洗脱策略是使用pH为约2.5的酸性溶液。这将使单亲和素可逆地变性并释放亲和选择剂和可能来自所述亲和选择剂的分析物二者。此外，可以以大致相同的方式(即，使用pH为2至2.5的酸性溶液)从S＊捕获选择剂解离另一些类型的S＊：A亲和选择剂(其为蛋白质)，并且一般会同时释放分析物。

根据本公开内容的某些方面，亲和选择剂可为多核苷酸，或具有共价连接的寡核苷酸。根据本公开内容的这个方面，使用在一些类型的吸附剂基质上的互补寡核苷酸序列(上式中的M_DNA或M_RNA)来吸附来自样品的S＊：A复合物。采用i)具有低离子强度，ii)碱性非常强，或iii)包含变性剂的洗脱剂来实现将复合物或来自M_DNA的复合物组分解离和/或释放。解离和释放还可以通过将温度升高至DNA：DNA、RNA：RNA、DNA：RNA、PNA：DNA或PNA：PNA杂交体解链来实现。另一种方式是在解离步骤中添加包含与亲和选择剂上的标签相同的DNA(或RNA)序列的溶液，然后使流经M表面的试剂停止。在流动受阻之后，将溶液的温度升高至DNA：DNA、RNA：RNA或DNA：RNA杂交体的解链温度。然后，使温度回到室温以使得发生再杂交。当所添加的互补寡核苷酸的浓度高时，其将相比S＊：A复合物上的寡核苷酸标签处于竞争优势，从而使将其留在溶液中。然后可将释放的复合物转运至第二维中用于进一步分析。

根据本公开内容教导的第三维中的分析取决于待在分析过程结束时使用的最终检测方法，以及分析物是否为i)小分子例如半抗原或肽，ii)蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、多糖、多核苷酸，或者iii)另一些大分子物质。对于小分子(即，半抗原和肽)，当分析物通过电喷雾离子化质谱(ESI-MS)或基质辅助激光解吸离子化质谱(MALDI-MS)进行鉴定和量化时，如果分析物分子量小于约2kD，则检测更易于实现。另一方面，可以如图4所示检测较大分子；然而，应注意，较小分子的离子化效率通常较高。

图4是用于分析蛋白质的多维“分析选择树”(analysis option tree，AOT)，其始于溶液中与分析物结合的亲和选择剂。根据本公开内容的某些实施方案，形成亲和复合物后继续进行，分析选择数目可以从第五维分析提高至八个，或者甚至更多。AOT一般始于第一维中进行的亲和选择，然后进行中间维度分析中的一系列色谱和/或化学修饰步骤，且最后通过质谱、荧光或电化学方法进行检测。被检测的分析物类型、灵敏度要求以及可用的仪器表示为了进行分析的树的分支。

对通过某一些类型的亲和选择剂对从复合物样品基质隔离之蛋白质进行直接MS分析的AOT参见图4，所述亲和选择剂一般是抗体、抗体的Fab片段、单链抗体或噬菌体展示蛋白。在第二维中通过吸附剂靶向亲和选择剂从溶液中捕获分子间亲和选择剂：分析物复合物之后，将抗选择剂：选择剂：分析物复合物解离，并在组分被送至ESI-MS/MS或MALDI-MS/MS进行完整蛋白质直接分析前，在第三维和第四维中通过尺寸排阻色谱(SEC)或反相色谱(reversed phase chromatography，RPC)对所述组分进行进一步分级。为此，在本文中应理解和领会，将蛋白质、糖蛋白和脂蛋白转化成肽的混合物可有助于通过质谱法对它们进行鉴定和量化。下文中将对该方法进行描述。

图4中用于蛋白质直接分析的AOT的外部分支示出，最终选择是通过电喷雾离子化(ESI)或基质辅助激光解吸离子化(MALDI)质谱(MS)进行的检测。这两者之间的选择在很大程度上取决于可用的仪器和样品的复杂度。对于复合的混合物，MALDI-MS可为特别有用的选择，特别是因为MALDI-MS一般提供单电荷态的蛋白质或肽，从而使得可能同时检测5至20种多肽(或甚至数百种)。另一方面，ESI-MS更频繁地产生多电荷态的多肽，这需要去卷积算法(deconvolution algorithm)以识别蛋白质的分子量。虽然混合物中蛋白的分子量可能不同，但是多电荷态蛋白质落在MS谱的相同质荷比中。该算法一般不能同时处理多于两种蛋白质。ESI-MS检测蛋白质的另一个问题是蛋白质在多电荷态的分布使检测灵敏度下降。应注意，虽然可以用ESI-MS进行检测，但通常最好用MALDI-MS来完成。

AOT的另一个要素是在将亲和选择剂(Ab)送至MS或者留在样品中之前，是否在第三维中将其从样品中除去。仍参照图4，当在分析路径A、B、C和D中除去抗体时，它们留在路径E、F、G和H的样品中。在本文中应理解和领会，是否在分析前从样品中除去抗体取决于多个问题。例如，因为抗体大小通常为至少约160kD，所以当分析物的分子量＜100kD时，MALDI-MS分析将没有任何问题地将二者区分开。MALDI-MS/MS的一个非限制性优点是其仅主要鉴定分子离子，并且能够基于多种蛋白质种类不同的分子量来同时对其进行区分。当检测其中抗体的总浓度可能不超过抗原浓度的十倍的少量抗原时，这特别有用。对于大量抗原，抗体总浓度可大于抗原浓度的一百倍。此外，大量抗体可潜在地抑制低丰度抗原的离子化。在ESI-MS模式的检测中，样品中抗体的存在更成问题，其中，多电荷化将导致来自抗体的离子与来自抗原的离子相交叠。对于简单样品，这种检测模式当然是可能的；但是，随着样品复杂度的升高，ESI-MS作为检测选择变得就不那么有用了。

对于分子量为160kD或更大的抗体，100埃至150埃孔径柱上的SEC易于在图4的路径A、B、C和D的第三维中将80kD或更小的抗原与抗体分离。在排阻体积处或其附近洗脱抗体并送至废液。将抗原直接转移至具有疏水表面的色谱柱，抗原在此处被捕获并被再浓缩。当决定将抗体与抗原一起送至MS时，通过路径E、F、G和H的第三和第四维中疏水色谱基质对这两种物质进行共捕获和分级。无论在第四维中的选择是否是高分辨率的，在路径E和F中都需要梯度洗脱分析柱，或者无论第四维中的选择是否是短柱，在路径G和H中低分辨柱都足够。当对大量分析物进行分级时，选择路径E和F。对于少量分析物，很可能采用路径G和H。

蛋白质组学中最近的成就基于通过用蛋白水解酶进行切割将蛋白质减缩为更容易鉴定之片段这一事实，最常用的是胰蛋白酶(参见下式3)。胰蛋白酶消化最广泛地通过用质量比为50∶1的蛋白质：胰蛋白酶将蛋白质混合物孵育24小时来实现。在蛋白水解结束时，将通过与始于肽组分的样品类似或相同的方式分析所产生的肽。当单位质量蛋白质使用更多胰蛋白酶时，胰蛋白酶开始自消化，从而样品被胰蛋白酶片段污染。

在本文中应理解和领会，通过使用上述类型的固定在高表面积色谱颗粒上或整体介质上的胰蛋白酶很大程度地加速蛋白水解。此外，通常以使分析物进行色谱处理的方式驱使蛋白质样品通过固定化胰蛋白酶床。在这种特定情况下，可使用比蛋白质更多的胰蛋白酶，特别因为胰蛋白酶是固定的，从而不能进行自消化。

如图5所示，固定化胰蛋白酶还可用于色谱柱中，但是以与前述不同的方式使用。根据本公开内容的某些方面，胰蛋白酶的最佳pH范围为pH约7至约9。此外，当pH为约2至约3时，其对大多数蛋白质的催化效率降低一百万倍。此外，当用pH为约2.5的流动相将蛋白质从第二维捕获柱中洗脱并直接进入胰蛋白酶柱时，所述蛋白质将处于对于胰蛋白酶过酸而使其无法起作用的溶液中。因此，必须在胰蛋白酶消化发生前通过某种类型的缓冲液更换将pH调节至约为8。这通过转运蛋白质混合物和酸性洗脱缓冲液通过色谱基质而完成，其中颗粒的外表面包被有共价固定的胰蛋白酶，并且孔小至超过20kD的分子不能穿过，但缓冲液自由地进入颗粒的孔基质中。该尺寸排阻柱填充有胰蛋白酶消化缓冲液。当蛋白质样品通过柱转运时，蛋白质易于在酸性洗脱缓冲液前面移动到胰蛋白酶消化缓冲液中，其中开始发生蛋白水解。对于蛋白水解，形成可以进入限进柱之孔的肽，但是它们和它们的母体蛋白质在酸性洗脱缓冲液的前面移动。

图5示出限进柱的一个图解，其中内部是亲水凝胶，外部用固定化胰蛋白酶包被。这些颗粒的孔径为6nm或更小。该柱的功能是在同一操作中实现缓冲液更换和蛋白水解。当将酸性缓冲液中的样品引入填充有这些颗粒的柱中时，样品中的蛋白质被阻止进入孔中，并且在进入颗粒孔的缓冲液之前迁移。蛋白质迁移至柱中的区域，该柱填充适于进行蛋白水解的缓冲液。在这点上，蛋白水解由与所述颗粒共价偶联的胰蛋白酶催化。

当胰蛋白酶固定在6nm至30nm的多孔颗粒介质上时，该柱还充当尺寸排阻柱。孔大小部分地阻止许多蛋白质穿过固定化酶基质。以6nm孔径的二氧化硅颗粒开始，用γ-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷包被这些颗粒，并且所结合的环氧乙烷水解得到二醇。如图6的步骤1所示，通过Ce⁺⁴催化将丙烯醛聚合至二醇基质上，以得到聚(醛)基质。然后，所述聚(醛)部分地填充二氧化硅支持物基质的孔，并使胰蛋白酶与颗粒接触，其中在氰基硼氢化钠的存在下，酶上的赖氨酸残基通过形成席夫碱(Schiff base)而与二氧化硅基质共价连接(图6的步骤2)。当席夫碱形成时，添加至反应混合物的NaCNBH₄还原席夫碱，但不还原醛。支持物基质的孔小至胰蛋白酶仅可以到达颗粒外部的醛基。换言之，在颗粒的孔中将没有胰蛋白酶。在胰蛋白酶固定化之后，用NaBH₄还原颗粒上的醛残基(-C＝O)(图6的步骤3)，从而完成固定化酶基质的合成。

除了颗粒外部有胰蛋白酶以外，从颗粒的孔中排出蛋白质(并在很大程度上为肽)也是本发明基质的独特特征。这意味着，当固定化酶柱预填充有pH为约8的缓冲液并与例如抗小鼠Ab柱(其具有选定的Ab：Ag复合物，其中Ag是蛋白质)或亲和素柱(其具有选定的生物素化的Ab：Ag复合物，其中Ag是蛋白质并经pH 2.5的洗脱剂脉冲洗脱)串连时：1)酸性流动相将进入所述固定化酶柱的孔中，同时2)所有蛋白质将被排出，并远远在酸的前面移动，以及3)作为排阻过程的一部分移动进入pH为8的缓冲液中。在蛋白质进入固定化酶柱之后以及在其流出之前，蛋白质在所述固定化酶柱中的停留时间通过流经柱的流速或者通过在某一点对通过柱的流进行干扰来控制。如图7所示，该柱一般用于第三维分析。

与示出在整个蛋白水平选择和分析蛋白质的图4相反，图7示出了从混合物中捕获和分离完整蛋白质，然后将其转化为肽用于通过质谱进行鉴定和量化。再次从样品中分离免疫复合物，并将其富集在免疫吸附剂(其靶向于靶向抗体之抗原的特有表位)上，或者富集在靶向捕获抗体上的标签的亲和吸附剂上。在清洗以除去与复合物以低亲和力结合的物质后，用酸性(～pH2.5)流动相使非共价复合物解离，并将抗原与捕获抗体一起转运至固定化胰蛋白酶柱中。随着蛋白质和酸性缓冲液流经该柱，它们随着蛋白质迁移进入胰蛋白酶消化缓冲液而分离。在该过程期间，蛋白质在第三维分析中被转化为肽切割片段。在第四维中将这些片段重浓缩，进一步通过某类型的疏水相互作用色谱进行分离，然后最终通过ESI-MS/MS或MALDI-MS/MS进行鉴定和量化。蛋白质一般产生三十至数百个肽片段，其中任意一个均可用于对母体蛋白质进行鉴定和量化。所选择用于鉴定和量化的肽一般是具有高离子化效率、提供母体蛋白质特有的序列并且被反相色谱柱良好保留的那些。

对于待使用的该类型质谱的基本原理，图4中蛋白质的情况相比于肽不同。在这种情况下，可以通过碰撞诱导解离(collision induced dissociation，CID)、电子转移解离(electron transfer dissociation，ETD)或来自MS分析的第一维将气相离子片段化的另一些方法，将来自质量分析第一维中的肽片段化。然后在质量分析的第二维中分离CID和/或ETD片段离子并记录。该三维过程提供了每个肽特有的序列承载特征。该方法的一个极具吸引力的特征是可以将MS数据与DNA数据库中的序列直接联系在一起，使得能够鉴定基因和衍生出肽的母体蛋白质。在这种情况下，ESI-MS/MS和MALDI-MS/MS能力相当。使用任一种方法都可以在单次分析中鉴定出数百种肽。因为通过MALDI-MS与ESI-MS中不同的机制发生离子化抑制，所以用某些类型的MS比另一些类型的MS更好地检测某些肽。

在本文中应当理解和领会，可以通过提高温度、通过超声或者通过将柱内压力升高至约10,000psi来加快固定化酶柱中的蛋白水解速率。在图8中示出了在该方面用于升高压力的一种示例性设置，其具体地示出一种阀系统，其允许在分析的停流模式(stopped flow mode)中将高压施加于固定化酶柱。根据该图解，认为高压通过使蛋白质部分变性来促进蛋白水解。通过将阀切换到使得免疫吸附剂、胰蛋白酶柱和RPC浓缩器串联的位置来开始进行样品的蛋白水解。在该位置，蛋白质从Ab柱解吸并转入胰蛋白酶柱中，在那里解吸缓冲液和蛋白质通过尺寸排阻机制而分离。此时，将阀切换至阻止流动相流经柱的位置，从而使胰蛋白酶柱进入高压孵育模式。在蛋白水解后，将胰蛋白酶柱切换回加载位置，并将已消化的蛋白质混合物转运到RPC浓缩器中。

图8的固定化酶柱在图7的第三维分析中。将从图7第二维中的亲和柱释放的抗原和抗体直接转入图8中的固定化胰蛋白酶柱中，在那里酸性洗脱缓冲液和蛋白质随着蛋白质迁移入胰蛋白酶消化缓冲液而分离。基于第二和第三维中的柱体积，计算必须经系统被泵出以引起分离的溶剂量。在蛋白质已迁移通过胰蛋白酶柱的一半时，将阀切换至图7所示的位置。在该阀位置的情况下，可以将来自气动泵的非常高的压力以零流速施加于胰蛋白酶柱。从免疫吸附剂柱直接流向RPC浓缩器的流继续在该阀位置进行。在胰蛋白酶柱中停流约1至约10分钟后，将阀旋转回到亲和捕获柱、固定化胰蛋白酶柱和RPC浓缩器串联的位置。然后将来自胰蛋白酶柱的蛋白水解消化物转入RPC浓缩器中。

在蛋白水解后，通过图7中描述的程序中的一种检查待通过质谱鉴定和检测的来自蛋白质的肽。为此，第4至6维(如图7所示)与第3至5维一样用于肽分析，原因是在这两种情况下都检查肽。

根据本公开内容的某些方面，在分析过程中产生半抗原和肽后和/或其在第二维中与非分析物分离后，对这些半抗原和肽进行再浓缩。当在色谱柱中进行该过程时，通常将其称为再浓集(refocusing)，因为分析物被吸附在柱入口处的致密区。分析物的再浓缩和进一步分离可通过多种方式实现，包括某些形式的亲和选择机制、离子交换或亲水相互作用机制，但是疏水相互作用机制特别有用，因为它是最通用的吸附方法，并且在该阶段，大多数分析物在水中。此外，水是用于疏水相互作用机制吸附的最有利溶剂。通过疏水相互作用(反相色谱和RAM)进行的分离见于第三和第四维中。

在本文中应理解和领会，图9、10和11之间的主要区别涉及在第一和第二维中标记和选择在复合物形成中所使用抗体的方式。在前两维结束时，以单组或小数目组从选择剂释放分析物。在对分析物进行单独区分和检测之前，在一组中可以有10种至多于一千种分析物必须进行进一步分离。用反相色谱来实现该分离的至少一部分。

从亲和选择剂释放的分析物的再浓缩以两种类型的亲和选择剂之一完成。一种是RAM(或SPS)柱(图2)。该柱的优点是其将亲和选择剂(一般是抗体)与半抗原和肽分离。肽和半抗原穿入RAM柱的孔或者通过SPS柱的外部涂层，在那里它们被疏水吸附。因为抗体较大，所以其不能穿过孔或涂层，并且如图8至10所示被运走至废液。一种替代浓缩器是长度为约1cm的短反相色谱柱。除了选择剂抗体外，半抗原、肽和蛋白质也都被捕获在柱上。因为在柱入口处对样品进行再浓集，所以不需要急剧、小量、离散地注射样品。此外，还可以持续地加载大样品体积。

图9是对根据本公开内容教导的用于分析由多克隆抗体亲和选择剂捕获的半抗原和肽之方案的图解。根据本公开内容的这个方面，半抗原和肽在第二维中从捕获免疫复合物的亲和选择剂释放，然后再浓集，并在进行ESI-MS/MS或MALDI-MS/MS之前进一步通过RAM柱或RPC柱进行分离。再浓集和反相分离发生在第三和第四维分析中。虽然可以直接从第二维至第四维，但是RAM或RPC浓缩器保留分析柱。在许多情况下，还可将第一维中所使用的Ab与第三维中的分析物分离。

在第二维中通常使用酸性的水性流动相来实现从亲和选择剂中释放。该流动相对于在第三维中的下游RAM柱或RPC柱的吸附是理想的。在第四维中，因为分析物再浓集于RAM柱或RPC柱中，所以可使用大样品体积，而对分辨率或者RAM或RPC柱没有不利影响。在第二、三和四维中的同样的逻辑和洗脱方案适用于图10。

在图9示出的分析选择树中的一个决定是使用RAM柱还是使用RPC浓缩器。虽然RPC浓缩器与RAM柱相比更简单、具有更好的结合能力并且更廉价，但是RPC柱在捕获肽、半抗原和抗体方面是不利的。此外，在梯度洗脱期间，所有抗体种类都在色谱图的后期一起从RPC柱洗脱。这意味着抗体峰比分析物峰更大。在大多数情况下，这并不是问题，因为肽和半抗原在抗体之前很早就洗脱出来。当确实如此时，大抗体峰将不会掩盖分析物峰。当样品包含与抗体大致同时或在其后洗脱的分析物时，则不可以使用RPC柱。在这种情况下，应当使用RAM柱。抗体太大以至于无法渗透RAM吸附剂的孔，并且通过柱而不被吸附，而相反地，肽和半抗原则进入RAM吸附剂的孔中，并在颗粒的疏水性内部被捕获。

当半抗原或肽混合物相对简单时，RAM或RPC浓缩器可被直接梯度洗脱到ESI-MS中或到MALDI-MS分析板上。这些短柱的峰容量通常不多于50个组分。不需要更高分辨率的分离柱，例如“分析型RPC”柱。这如图9至10的第四维中所示，但这是第三维中加载有样品的同样的柱。与此相反，复杂的分析物混合物将需要长得多、分辨率高得多的RPC柱。这些分析型柱的长度为10cm至50cm，并填充有直径为约1.5μm至5μm的具有十八烷基硅烷(C18)涂层的颗粒。当缓慢地梯度洗脱并加热以加强流动相的扩散速率时，分析型柱可具有多至600个组分的峰容量。因为物质从RPC柱洗脱出来并进入质谱仪中，所以在质谱法的第一维或第二维中可区分出共洗脱峰。

用于第五维或更高维的质谱法的类型取决于初始样品基质的复杂度、被分析的分析物的数目及分析物浓度。当样品基质简单并且被检查的分析物少于10种时，单独以MALDI或ESI模式的单维分子量质量分析就足够了。在第六维和第七维中的对碎片离子进行进一步质量分析后进行CID使得鉴定有更高的置信水平，但是可能不是必需的。当样品浓度在μg/mL至mg/mL的范围时，对于简单样品的质谱仪类型主要基于可用性确定。通过使用选定的离子监测模式的质谱仪(例如，三重-四级杆(QQQ)仪器或四级离子阱(Q-Trap)仪器)，可以以ESI模式获得高得多的灵敏度。例如这些对特定分析物的特定离子进行长时间质量分析并积累更大数目离子计数的仪器可具有与快速扫描仪器相比一百倍或更高的灵敏度。

对于非常复杂的样品，ESI-MS/MS仪器对图9的方案特别有用，因为它们提供了高水平的区分。同样地，当需要最高灵敏度时，QQQ或Q-Trap型仪器提供了最好的解决方案。

图9和图10之间的主要不同之处在于置于选择抗体上的标签类型和捕获免疫复合物的方式。图10的抗体标签是生物素或某半抗原。图10示例了用于分析由生物素化或半抗原标记之亲和选择剂捕获的半抗原和肽的方案。根据该图解，在第2维亲和选择剂中使用单亲和素，这是因为释放生物素化的物质不需要那么严苛的条件。在第二维中可通过生物特异性置换或亲和选择剂变性来释放半抗原和肽。最温和的是用生物素置换剂。该方法的缺点是解吸动力学缓慢，在洗脱步骤期间需要缓慢的流速。相比之下，如图9所述，用酸性流动相部分变性就快得多。沿着分析选择树的另一些步骤与图9中描述的那些相同。

另一方面，图11示例了用于分析使用标记有DNA、RNA或PNA的抗体捕获之半抗原和肽的方案。如在上述另一些实例中，免疫复合物与样品中其他物质的分离发生在第二维中。通过将柱温度提高至高于寡核苷酸杂交体的解链温度将第二维所捕获的抗体洗脱。当在流动下发生热循环时，从柱上清除所有解离的物质。在竞争性寡核苷酸的存在下，在止流下的热循环允许特异性抗体的差异置换。在第二维中的洗脱条件足够温和，使得免疫复合物在进入第三维时仍可完整并被捕获。当情况确实如此时，当用包含乙腈的酸性流动相洗脱RPC柱或RAM柱时，免疫复合物将在第三维中解离。免疫复合物是完整还是解离不会影响分析的净结果。其余的工作流程如图9所述。

参照图9，通过与亲和选择剂(例如抗体)复合在第一维中选择分析物。在这种情况下，所使用的亲和选择剂的独特特征是，它们用由有序的RNA、DNA或PNA碱基序列构成的寡核苷酸(ONT_t)标记。所有抗体可具有相同的寡核苷酸序列，或每种抗体可用不同的寡核苷酸序列标记。在溶液中形成复合物之后，通过使等量份溶液通过颗粒或穿过固体支持物的表面而从样品中捕获可溶性复合物，所述支持物含有具有与所述亲和选择剂的序列互补之序列的固定化寡核苷酸选择剂(ONT_s)。对于抗体上的每个核苷酸标签，固相表面上具有一个互补寡核苷酸序列。在使等量份溶液穿过具有寡核苷酸(ONT_s)的表面的过程中，分析物：选择剂-ONT_t复合物将通过杂交而被捕获，从而形成--ONT_t：ONT_s：选择剂分析物复合物。固定于固体表面的寡核苷酸(ONTO)可为混杂的，或者每个可位于空间上不同的位置。根据某些特定实施方案，特别有用的是，固定ONT_s的支持基质是有机树脂，例如用于HPLC的压力稳定的苯乙烯-二乙烯基苯树脂。来自Applied Biosystems的POROS支持基质是此类树脂的理想实例。有利地，这些树脂耐受可用于分析物洗脱的约80℃至90℃的温度以及非常极端的pH，如下文所述。

在第二维中捕获分析物：选择剂复合物后，必须将其释放并洗脱进入第三维中。根据本文中的教导，洗脱步骤可通过多种不同方式实现。一种示例性方法是，通过将含有-ONT_t：ONT_s：选择剂分析物复合物的固相吸附剂的温度提高至高于-ONT_t：ONT_s杂交物的解链温度而使所述杂交体解离，同时流动相通过该表面，并被运送至第三维。-ONT_t：ONT_s杂交体将解离，并且ONT_s：选择剂：分析物复合物将被转运至第三维。在大多数情况下，ONT_s：选择剂：分析物复合物将保持完整，但是在一些情况下，其将部分或全部解离。无论是哪种情况都将被容纳在第四维中。

第二种示例性洗脱方法是使用极端pH或极端离子强度以使杂交体解离。当用蒸馏水洗脱固相吸附剂时，-ONT_t：ONT_s杂交体一般会解离。使用低离子强度的pH为10的缓冲液完成相同的事情。

免疫复合物还可根据分子大小而被分级(参见图12)。免疫复合物在该工作流程的第二维中使用尺寸排阻色谱来分级。SEC柱的孔径为约100埃至150埃，而排阻基质的粒径应为约3μm至约5μm。在100埃孔径填充材料的情况下，免疫复合物将在柱的排阻体积附近洗脱，并被直接转运至RPC浓缩器或RAM浓缩器，或直接转运至分析型RPC柱。当该转移结束时，将从SEC柱洗脱的较低分子量物质转移至废液中。用0.1％的三氟乙酸或1％的甲酸至包含70％乙腈的相同浓度之酸的流动相对RPC柱进行线性梯度洗脱。该流动相有足够的酸性以使所捕获的免疫复合物在RPC柱入口处解离。所用质谱法类型的原理与其他情况的相同。

如上所述，除了在半抗原和肽分析中所需要的之外，蛋白质还需要增加蛋白水解的维度。这一般在第三维中实现。图13示出了能够提供对亲和选择剂进行自动化、高分辨率分离之仪器平台的液相色谱法组件，所述亲和选择剂为高通量并且多种分析物的同时分析所需。样品制备物起始于置于冷藏室中的自动进样器，所述冷藏室在分析之前使样品的微生物生长最小化。容纳样品的自动进样器瓶是锥形底类型以使样品体积最小化。除了多个样品之外，自动进样器还容纳分析所必需的固定浓度的抗体溶液。自动进样器还可装载还原、烷基化、衍生化、蛋白水解、添加内标物和稀释剂所需的额外试剂，其中的任何试剂可以以任何顺序等分地装在样品瓶中。当机械注射器从试剂瓶中移出等量份抗体或者试剂，并将它们添加至样品时，分析在自动进样器中开始。可将多种试剂顺序地添加至样品瓶，在分析前样品在还原、烷基化和蛋白水解方面可能需要这些试剂。单个抗体试剂瓶可包含特定多种分析物分析必需的一种抗体或所有抗体。在将试剂或抗体分配至样品中后，注射器转到自动进样器中包含无试剂缓冲液的瓶中，并通过多次用缓冲液完全装满注射器来进行清洗，并将缓冲液分配至废液瓶中。

在适于形成衍生物和/或免疫复合物的孵育时间之后，自动进样器从样品瓶中取出等量份溶液，并加载至样品装载位置的高压阀上的固定体积样品环。然后旋转所述阀以将样品环引入连接至下游柱的流动相流路(flowpath)。第一下游柱(在分析的第二维中)一般是亲和柱或尺寸排阻柱，从而使免疫复合物与样品中的其他组分部分或全部分离。当免疫复合物被亲和柱捕获时，期望将20或更多柱体积的流动相泵送通过该柱以除去以低亲和力与免疫复合物或柱结合的物质。当在分析中使用了高结合亲和力抗体时，所有其他结合物质都将是非分析物。因此，此洗涤步骤除去非分析物，并且是分离过程的一部分。

如图13所示，在第二维分析中使用的柱可置于冷藏室内部或室温下置于外部。当在第二维中的捕获柱或SEC柱中使用高亲和力抗体时，在室温下操作所述柱。当捕获剂是低亲和力的，并且捕获剂的结合常数通过转到较低温度来提高时，采取较低温度操作亲和柱。在5℃时，结合常数可为室温时的两倍。

图13中的示例示出在第三维和第四维中的分析可在烘箱中实施。该示例示出了将分析物从第二维直接转移至图9、10和11的第四维中的高分辨率分析型RPC柱。根据一些实施方案，可在阀B之前添加第三维柱。根据这些实施方案，加热柱的功能是降低液相色谱文献中已知的限制，例如流动相和滞留(stagnant)流动相限制。通过降低流动相的粘度以及提高分析物的扩散速率，提高了RPC中的分辨率。这提高了RPC柱的分辨率，以及可分离之分析物的数目。

图13系统中的第一泵(P1)提供了用于前两维分离的溶剂。在泵的低压侧完成溶剂转换，这意味着，用该泵产生的梯度是台阶式梯度型。当在第2维中使用SEC柱并且在第3维中使用RAM柱时，两个色谱系统之间的泵P5用于引入用于使免疫复合物解离的流动相(如果需要的话)。将离开SEC柱的洗脱剂流与由P5提供的酸性溶液合并，从而在复合物到达阀B的RAM柱之前将其解离。

阀C用于将色谱柱与检测器分开，并且阻止不期望的试剂或分析物向检测器的转运。例如，如前所述，大量抗体将伴随着样品进入RPC柱并在流动相梯度结束时在所有分析物之后被洗脱。根据此特定的示例情形，阀C可被转到这样的位置，色谱系统在此位置与MS分开，并且将从RPC柱上洗脱的抗体转移至废液中。在所述示例中可见到UV吸光度监测器，然而，在本文中应理解和领会，这不是必需的，并且在某些实施方案中可取消。此外，多余的测量装置还可偶尔以多种方式量化分析物，从而验证量化的准确性。

在这一点上，分析优化树通过质谱法强化检测。当分析物离开前四个分离维时是纯的，使得分析物在携带特定发色团或电化学活性官能团的洗脱剂流中是唯一的物质，可以以其他方式检测分析物，下文称为非MS检测模式。这样的非MS检测模式的实例包括但不限于吸光度法、荧光法或电化学手段。

至于基于亲和选择剂的过程，重要的是通过几维的正交分析将分析物与大量非分析物区分开来同时确定多种分析物。基于由抗体提供的非常高水平的选择性，第一维区分一般是在溶液中形成亲和选择剂：分析物复合物。亲和选择剂最通常是抗体；然而，在本文中应理解和领会，也可使用多种其他选择剂。此外，在溶液中进行复合物形成，因为这避免了对固定化大量选择剂的需要以及与此相关的固有问题。

上文讨论的第二、三维以及通常的第四维分析已经示出如何将这几种色谱法以及通常的化学反应相联合，以提供更高水平的分析物区分。这些维的分离力使得被捕获的抗原可被分级成数百至数千种单独的组分。许多时候，这个程度的分辨率是足够的，在这个点上，可通过荧光、吸光度、电化学或另一些手段检测抗原，其中所有分析物产生了非常类似的检测特征。这些类型的检测可具有非常高的灵敏度，但是仍然不能区分分析物。因此，当它们到达检测器时，分析物必须部分或完全分离。

与传统的检测方法不同，质谱法提供了另一种特别不同的检测方法，所述方法在其分析模式中是正交的。有许多类型的质谱仪，其中的许多种可用于针对多种分析物的基于亲和选择剂的分析。上述的尺寸排阻法检查了物质的流体动力学体积。多种分析物可从RAM柱或分析型RPC柱一起洗脱出来。在通过MALDI法或ESI法进行离子化后，将分析物转运至对其进行质量分析的质谱仪中。这些仪器的飞行时间(TOF)、四级杆(Q)、离子阱(IT)和杂交物形式用于分析物离子的质量分析。顾名思义，质谱法基于分子的质量来对其进行分级，差异通常低于一个原子质量单位。由此分析(分级)的分析物被转运至产生电信号(一般称为离子流)的电子倍增器，其可用于量化分析物。

可能存在这样的情况，在MS之前，从RAM、RPC或另一些类型的色谱柱洗脱出来的质量相同或接近相同的分析物离子一起洗脱出来。这使得无法在分析物之间进行区分，在这点上它们的特性在分析中相同。

对于更高维的分析，可进行引起来自第一维的离子碎裂的某些类型的气相化学反应。碰撞诱导解离(CID)和电子转移解离(ETD)是两种类型的气相碎裂策略，但在本文中应理解和领会，根据现有技术教导还可使用其他策略。在这些气相反应中常常存在这样的情况，以对其结构而言独特的方式发生分子碎裂。由此产生的碎片离子也将具有独特的质量，当在质谱法的第二维中分析时，可对所述碎片离子进行识别(通过其质量)和量化。分析物量化可通过对分析物而言独特的单一碎片离子或全部碎片离子的总和来实现。

可选择来自质谱法第二维的碎片离子，并在质谱法的第三维中进一步碎裂以得到甚至更高的特异性，但是相对于来源，所涉及的离子的量很小，因此灵敏度差。

按照灵敏度选择的质谱仪是这样的质谱仪，其中在洗脱色谱峰期间持续地产生并收集和/或分析离子，然后进一步离子化并转运至MS的第二维中用于量化。QQQ仪和IT-TOF仪是实例。这些仪器的一个很大的优势是，它们收集更多的离子用于分析。

遗憾的是，基于质谱法的检测没有酶联免疫吸附测定(ELISA)法那么灵敏。例如，即使在MS分析之前使用100μm内径的RPC柱时，当前的检测限为100pg/mL。另一方面，现有技术的ELISA比它灵敏1000倍。然而，在分析的第四、五和六维中使用质谱法的巨大优势是特异性。此外，MS分析非常快速。事实上，对于大多数仪器，串联质谱分析一般可在一秒或更短的时间内实施。另一个优势是整合了色谱的保留时间。

当分析物混合物简单和/或需要非常高的检测灵敏度时，根据本公开内容的教导，转至高灵敏度的液相色谱检测器也是可行的。相对于质谱仪，使用常规液相色谱法(LC)检测器的优点是，它们远远地更廉价，并且可具有高得多的灵敏度，尤其是当使用100μm的ID毛细管时。LC检测器的灵敏度与柱直径的平方呈负相关。从相同长度的标准4.6mm ID柱到100μm ID柱，检测灵敏度升高了超过2000倍。使用100μm ID RPC柱和激光诱导的荧光检测器，70kD蛋白质的检测限为大约1pg/mL。这在ELISA的范围，但这是量化多种抗原。

根据本公开内容的教导可使用的另一些检测器包括但不限于，激光诱导的荧光(laser induced fluorescence，LIF)、电化学检测(electrochemicaldetection，EC)和吸光度检测(absorbance detection，AB)。在这些检测器中，目前为止吸光度检测器的灵敏性最低。另一方面，LIF和EC检测一般需要将分析物用促进检测的试剂进行衍生化。在LIF的情况下，该试剂将是荧光团，其表现出适于在所使用的检测器中检测的激发波长和发射波长。荧光标记试剂还必须容易与分析物发生反应以促进衍生化反应。

以已知浓度将内标物添加至混合物，并使用观察到的仪器响应于内标物与分析物的比值来确定分析物的浓度，这是已经超过50年的实践。该方法的主要优势在于，其使在样品分析期间出现的随机误差最小化。对于免疫学测定，这些测量一般被称为竞争性结合测定。在免疫学测定内添加内标物与公知的RIA实践相关，在RIA中，将与抗原类似的标记的合成分子(Ag＊)添加至样品。标记(＊)的功能是使得能够进行检测，因为无法检测样品中的天然抗原(Ag)。当同时添加两种抗原Ag_i和Ag_i＊并允许其竞争有限量的抗体结合位点时，这被称为竞争性结合测定，并且可表示为下列示例的反应式：

[Ag_i]+[Ag_i*]+[Ab]→[Ab：Ag]+[Ab：Ag*]+[Ag_e]+[Ag_e*]and[Ag_i]+[Ag_i*]≥[Ab]   (3)

其中[Ag_i]是样品抗原的初始浓度，[Ag_i＊]是添加至初始已知浓度样品中的标记抗原的浓度，[Ag_e]是平衡后样品抗原的终浓度，并且[Ag_e＊]是最终平衡后标记抗原的浓度。

此处，本公开内容总体涉及同时区分一百种或更多种抗原(Ag)与标记的合成分子(Ag＊)。通过液相色谱-质谱能够在单次分析中区分所有这些物质。如上所述，进行具有大量抗原之测定的特别有用的模式是以顺序添加、具有抗体饱和的竞争性结合测定。第一步是将已知量的抗体[Ab₁](或者针对多种抗原的多种抗体)添加至样品，所述量超过样品中抗原[Ag_i]的量。该步骤可表示为下式：

[Ag_i]+[Ab₁].→[Ab₂：Ag]+[Ab₃]      (4)

其中[Ab₁]-[Ag_i]≈[Ab₃]。上述中重要的是，Ab₁、Ab₂和Ab₃是相同的抗体，

但却是在测定中不同的点以及在不同条件下。

所述测定的第二步是将已知量的经标记的内标物[Ag_i＊]添加至样品。这两种抗原的总和必须高于靶向它们之抗体总量的浓度，即，[Ag_i]+[Ag_i＊][Ab]使得：

[Ag_i*]+[Ab₃]→[Ab₃：Ag*]+[Ag_e*]      (5)

Ab₃：Ag＊与Ag_e＊的分离允许单独量化[Ab₃：Ag＊]。在顺序添加测定中[Ab₃：Ag＊]的浓度与[Ag_i]浓度呈负相关，即，当Ag_i接近于零时，Ab₃：Ag＊最大。相反，当Ag_i达到较大值时，Ab₃：Ag＊接近于零。与其它形式的竞争性结合测定相反，顺序添加测定是线性的。

值得注意的是，在上述测定中所测定的抗原浓度在很大程度上控制了必须添加以进行测定的抗体和标记抗原的量。在另一些实施方案中，例如下述竞争性结合Ab饱和测定，情况并非如此。因此，在本文中应理解，本公开内容的教导并非旨在限制。第二个要注意的点是，在式3和5所述的反应结束时，Ab₂：Ag和Ab₃：Ag＊二者共存于溶液中。此外，在分离步骤结束时，Ag_e＊确实从测定溶液中被移除。这意味着，在检测Ab₃：Ag＊的情形下，必要的是标记允许区分Ab₂：Ag与Ab₃：Ag＊。最后，还值得注意的是，将所有的Ab₃：Ag＊复合物与所有的抗原区分开对上述复用过程而言是重要的，尤其是因为每个被测定的抗原必须使用不同的标记。然而，在基于吸光度、荧光和电化学的检测中，或许可对总计不多于五种抗原进行测定。

根据本公开内容的竞争性结合测定，所有的分析物应与待检测的复用测定在结构上不同，包括添加至测定溶液的内标物(例如，同位素标记内标物以实现对分析物的相对或绝对量化)。因此，测定将具有不同的色谱保留时间、不同的分子量，或在质谱仪中以独特的方式碎裂。根据上述抗原，Ag＊是¹³C、¹⁴N、¹⁸O或²H标记形式的抗原，或携带这些同位素的某组合，与未标记的、天然形式的Ag相比，所述同位素给出了内标物抗原独特的不同质量。一种替代的标记(code)策略是用一些不改变其抗原性但赋予它们与Ag不同的独特质谱特性并且在结构上不同于溶液中的任何其他物质的某部分来衍生化抗原。在衍生化情况下，标记常常用重同位素标记，并且可为通用标记剂，所述标记剂以一种同位素形式用于标记所有抗原(Ag)，以及以不同同位素的形式用于总体地标记添加至溶液的全部内标物抗原，即，式5中的Ag＊。当对式5描述的最终测定混合物进行RPC-MS/MS分析时，可区分在同一样品中数以千计的抗原。有利地，本公开内容的教导使得可在单次分析中鉴定并区分数以千计的抗原，从而允许在表面的特异性阵列元件上不用固定数百至数千的抗体或另一些结合蛋白的情况下同时实施数以千计的免疫测定。

针对上述式3，本公开内容的教导描述了这样的情况，其中Ag和内标物抗原Ag＊竞争抗体上的结合位点。考虑到这个一般概念，根据本公开内容的某些测定实施方案还可适用下述条件：对于所有被测定的抗原[Ag_i]+[Ag_i＊]＞[Ab]，并且添加至溶液的[Ag_i＊]浓度为[Ag_i]的5倍以内。此外，所添加的内标物[Ag_i＊]的浓度是精确知晓的，并且在测定结束时测量[Ab：Ag]/[Ab：Ag＊]的比值。根据该实施方案，测量大量的抗原，即，Ag_a、Ag_b、Ag_c......Ag_n，并且这些抗原能够很大程度地(即数千倍)改变浓度。在一些实施方案中，所有抗体基本使用相同的浓度，而在另一些实施方案中，大致知晓抗体的浓度，但不精确。最后，以上述方式来测定Ag与Ag＊的比值，并且一般通过差异化的同位素标记法或总体内标物标记法来进行。

在本文中应理解和领会，根据本公开内容的一些教导，添加已知浓度的内标物抗原使得可在测定结束时测定抗原与内标物的比值。根据这些实施方案，可使用公知的内标物方法来测定抗原浓度。此外，当抗体浓度与检测系统的最优灵敏度范围匹配时，也可使用抗体作为采样工具。根据这种采样方案，可在不考虑抗原浓度的情况下选择与检测器的灵敏度匹配的样品的量，并且无论它们的初始浓度是多少，也可用于使抗原在不大于10倍的浓度范围内变动。根据这些实施方案，利用抗体浓缩使分析物和内标物的浓度处于用于量化的测量仪器的检测范围内。无论监测系统的最佳检测范围是多少，在本文中应理解和领会，可使分析物浓度处于包括质谱仪在内的任何检测器的最优范围内。最后，所述的这些实施方案能够利用抗体浓缩对分析物采样，并使它们全部达到类似的匹配检测系统的浓度范围，而通过分析物与内标物的比来确定实际浓度。

上文已经描述了包括质谱、光学、电化学、干涉分析法以及表面等离子体共振在内的检测系统。除了质谱之外，根据本公开内容检测方法的量化过程一般是本领域已知的，因此本文不再进行详述。然而，对于质谱，量化可以以依赖于离子化方法的多种方式实现。虽然由在质量分析后的离子检测引起的离子流被广泛用于质谱中的检测，但是，此类方法的离子化效率因分析物不同而变化很大。事实上，在一些情况下，离子化效率甚至可随着浓度以及样品中其他未知的基质组分而改变。通过质谱法量化的更详细讨论可见于以下杂志文章：“Primary amine coding as a path to comparative proteomics.”Regnier，Fred E；.Julka，Samir.Proteomics(2006)，6(14)，3968-3979，其公开内容通过引用整体并入本文。

幸运地是，当一起呈递给质谱仪时，分析物的同素异构体以近似相同的方式离子化。这意味着，对于重形式和轻形式的分析物，所见到的相对离子流准确地反映了它们浓度的相对偏差。当同素异构体之一是以已知浓度添加的分析物内标物时，可计算出未知浓度分析物的绝对浓度。这对于电喷雾离子化(ESI)和基质辅助的激光解吸离子化(MALDI)来说确实如此。重要的是，在相同的条件下分析物的所有同素异构体都离子化，尤其避免在RPC中分离同素异构体。当它们恰好共洗脱时，它们将经受相同的离子化基质抑制剂。使用该检测方法的相对标准偏差将在6％至8％变动。

根据本公开内容的某些方面，当从RPC柱洗脱时，能够很长时间(数秒)作用于离子的用于量化同素异构体比的质谱仪特别有用，因为与快速扫描来自RPC之离子的质量范围但无法积累大量离子用于检测的仪器相比，它们允许积累更多的离子。这样的仪器的非限制性实例包括三重四级杆仪器和四级离子阱仪器。

根据本公开内容的教导，还通过离子流测量进行直接量化也是有用的，尤其是其中可接受范围为约20％至约30％的较大测量误差。

质谱法常常有这样的情况，在质量分析的第一维之前在气相中分离片段肽。离子迁移是一种气相分离策略，但是在本文中应理解和领会，根据本公开内容还存在可使用的其他气相分离策略。在离子迁移的情况下，通过ESI或MALDI进行离子化，接着基于它们在缓冲载气中的迁移率进行离子分离。该分离的输出是离子迁移率的分布特征。这种分离常常在毫秒内发生，并且可作为分离肽片段的手段应用于本文描述的策略。

经常声称所有蛋白质的40％以可改变活性的复合物形式存在。蛋白复合物的亲和选择不仅导致目的分析物的减少，而且还捕获非特异结合物质。常常存在这样的情况，这些物质干扰下游分析。此外，蛋白质：蛋白质相互作用导致的复合物形成常常抑制表位：互补位识别。因此，通过化学手段破坏这些复合物从而产生变性物质通常是有益的。还原和烷基化是分开这些复合物的手段之一。在本文中应理解和领会，根据本教导还存在其他可使用的修饰策略，例如加热变性、微波变性及其他。还重要的是注意在将蛋白复合物分解(breakdown)成变性物质后亲和纯化目的分析物通常是有益的。

用进行本文描述的分离策略所需的材料填充的柱子是一种策略，但是，应理解和领会，根据本教导还存在其他可使用的硬件形式。常常存在这样的情况，上述分离策略将应用于包含必要填充材料的筒(cartridge)、移液器吸头、穿流板(flow through plate)或磁珠。可根据目的分析物将筒卡合就位，并容易地更换。使用移液器吸头作为微型生物反应器，其形状为具有包含填充材料之滤器的移液器吸头，这使其能够用于该应用的单一使用形式。使用装备有滤器的穿流板使得能够进行并行处理，并且因此能够进行本文所述材料的高通量应用。使用吸附柱作为微型生物反应器，其形状为具有包含填充材料之滤器的管，这是应用于本文所述过程的另一种单一使用形式。使用装备有滤器的穿流板使得能够进行并行处理，并且因此能够进行本文所述材料的高通量应用。使用包含必要填充材料的磁珠使得这些材料能够直接用于样品而不需要转移。在步骤完成后，然后通过使用磁体除去这些材料。本文所述的多维策略的应用是通过逐步添加多种材料进行的。

通过分析物特异性化学修饰(例如衍生化或蛋白水解)的多种方式的组合来实现分析物的区分。

使用胰蛋白酶之分析物特异性化学修饰(或蛋白水解)的应用是一种策略，但是，应理解和领会，根据本教导还存在其他可使用的修饰。其他可能的酶促修饰包括使用lys c、glu c、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、链霉蛋白酶、PNG酶F、葡糖醛酸酶或多种其他酶。还很重要的是注意分析物的区分通常使用多种顺序的组合步骤来实现。

基于亲和力区分然后进行化学修饰(例如衍生化或蛋白水解)是一种策略，但是应理解和领会，根据本教导还存在其他可使用的多种顺序。通常存在这样的情况，以在第一维分离之前进行酶促修饰的方式来进行肽的亲和选择。这使得能够使用合成的肽来标准化亲和选择过程。在另一些情况下，在第一维分离之后第二维分离之前是酶促消化。这使得能够检测表位外存在的蛋白质变体或修饰。在另一些情况下，在第二维分离之后第三维分离之前是酶促消化。在本文描述之材料的一种应用中，理解翻译后修饰是有益的。从相应的肽酶促去除翻译后修饰通过减少通常与这些修饰相关的异质性来简化分析。一旦鉴定出包含指定修饰的肽后，通常应用其中不去除翻译后修饰的随后的分析。

在另一些情况下，串联使用两步酶促修饰，并在它们之间有分离步骤。例如，通过亲和选择的手段来纯化蛋白质，在随后步骤中，在该基于亲和力的区分之后进行使用胰蛋白酶的蛋白水解，通过亲和选择的手段对所形成的目的肽进行进一步纯化。在随后步骤中，在该基于亲和力的区分之后，使用PNG酶F进行去糖基化。

虽然上文中已公开了并入本公开内容原理的示例性实施方案，但是本公开内容不限于所公开的实施方案。相反，本申请旨在涵盖使用其一般原理对本公开内容进行的任何变化、用途或调整。此外，本申请旨在涵盖属于本公开内容所属领域中已知或习惯实践并且落入所附权利要求限制内的本公开内容的偏离。

Claims (19)

1.一种用于同时分析样品溶液中之多种分析物的多维方法，所述方法包括：

向包含待测量分析物的样品溶液中添加亲和选择剂，所述亲和选择剂对所述样品溶液中的所述分析物中的一种或更多种具有亲和力；

允许所述亲和选择剂与所述分析物形成免疫复合物；

在第一维分离中采用选择性吸附技术将所形成的免疫复合物与所述样品溶液中的非分析物物质部分或全部分离；

使所分离的免疫复合物解离；

在第二维分离中采用选择性吸附技术使所解离的免疫复合物中的所述分析物与所述亲和选择剂彼此分离；以及

根据所述分析物的质荷比来解析所述分析物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中在柱、筒、移液器吸头、板或珠形式中进行所述第一维分离。

3.根据权利要求1所述的方法，其中在变性的物质上进行所述第一维分离。

4.根据权利要求3所述的方法，其中通过还原和烷基化形成所述变性的物质。

5.根据权利要求1所述的方法，其中酶促修饰在所述第一维分离之前进行。

6.根据权利要求1所述的方法，其中在所述第一维分离之后所述第二维分离之前进行酶促消化。

7.根据权利要求6所述的方法，其中使用胰蛋白酶、lys c、glu c、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、链霉蛋白酶、PNG酶F、葡糖醛酸酶或多种其他酶进行所述酶促消化。

8.根据权利要求1所述的方法，其中在所述第二维分离之后第三维分离之前进行酶促消化。

9.根据权利要求8所述的方法，其中使用胰蛋白酶、lys c、glu c、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、链霉蛋白酶、PNG酶F、葡糖醛酸酶或多种其他酶进行所述酶促消化。

10.根据权利要求1所述的方法，其中串联使用两步酶促修饰，并在它们之间有分离步骤。

11.根据权利要求1所述的方法，其还包括基于离子化分子在载气中的迁移率使用离子迁移分离器来分离在气相中的离子化分子。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一和第二维分离包括以下的至少一种：根据流体力学体积分离，用捕获抗体靶向独特的结构特征，用固定化的亲和素靶向生物素化的特征，从疏水表面上吸附和差异洗脱，从带电表面上吸附和差异洗脱，从固定化的金属亲和螯合剂上吸附和差异洗脱，以及从富含硼酸的表面上吸附和差异洗脱。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述独特的结构特征包括以下的至少一种：所述亲和选择剂特有的天然结构特征、已与所述亲和选择剂缀合的半抗原和与所述亲和选择剂缀合的免疫原。

14.根据权利要求1所述的方法，其中所述分析物包括以下的至少一种：分析物片段、分析物衍生物和分析物同素异构体。

15.根据权利要求1所述的方法，其中所述分析物包括离子化的分析物。

16.根据权利要求1所述的方法，其中所述亲和选择剂包括抗体和抗体片段中的至少一种。

17.根据权利要求1所述的方法，其中所述亲和选择剂包括以下的至少一种：适配体、凝集素、噬菌体展示蛋白受体、细菌蛋白质和寡核苷酸。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述细菌蛋白质包括以下的至少一种：G蛋白、A蛋白以及由生物体产生的用于靶向来自另一生物体之蛋白质的蛋白质。

19.根据权利要求17所述的方法，其中所述寡核苷酸包括RNA、DNA和PNA中的至少一种。