JP2005529335A - 開放チャンネルを使って生体分子を固体相として抽出するシステムと方法 - Google Patents

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Abstract

１以上のチューブ濃縮係数である分子のオープンチューブラー固体相抽出用のオープン毛細管デバイス。デバイスは、一つのチャンネル(2, 12, 18, 42, 68, 98, 128, 200)の末端に液体とガスをポンプで吸出入できるポンプ(44, 70, 100, 218)を設け、他の末端に蛋白質チップサンプル用のアプリケーター(32)、又は質量分析器のインターフェース(26)を接続する事ができる。チャンネルの内側表面(4)と抽出表面は、キレート化された金属、蛋白質、糖又は核酸のような親和性結合剤と結合する事ができる。この方法は、親和性抽出の表面にサンプル溶液からこのデバイスを使って検体分子を結合し、脱離液で抽出表面から抽出係数が1以上で検体を脱離する。

Description

この発明は溶液から検体を分離し、凝縮する装置とその方法に関するものである。検体は蛋白質チップ用やマススペクトル分析のため質量分析計を用いるため精製し、凝縮する必要がある壊れやすい生体分子と生体分子複合体である。
固体相抽出は、分析準備のために水やその他の液体から検体を抽出するために使われている。例えば、この手法は、水から有機物を抽出し、次に高圧液体クロマトグラフィーで分離し、質量分析（ＭＳ）によって汚染物の特定と濃度測定することに成功している。蛋白質や核酸は、対象分子を吸着する固体層を収容したパックカラムやカートリッジ内を通過させることによって分離することが多い。サンプルがカラムを通過して、サンプル分子が吸着された後、溶媒を使ってその分子を脱着し、凝縮された溶液を作る。このように凝縮された溶液の一部を高性能液クロマトグラフ(HPLC)、質量分析計や他の分析計を使って分析する。
本明細書では多くの文献を参照し、その記載をここに取り込む。参照した文献の表記のフォーマットは次のとおりである：著者、刊行物、巻、ページ、年、参照した文献の全ページを参照によってここに取り込む。
使用可能なもとのサンプルが微量なので、一般にはより小さなパックトカラムを使用することで抽出カラムのサイズをなるべく小さくする努力が払われている。毛細管カラムはカラムを最小化する一つの手法である。大部分の努力は毛細管パックカラムに関するものである。最近、開放チューブ毛細管を使った液クロマトグラフィー用のサンプル分子の抽出がRalf Eisert 他によるAnalytical Chemistry, 69:3140 (1997)およびHiroyuki Kataoka他によるAnalytical Chemistry, 71:4237 (1999)に発表された。このチューブはシリカ製でキャピラリー電気泳動やガスクロマトグラフィーから適用された物である。
Norberto Guzman, Journal of Liquid Chromatography, 18:3751 (1995) とJianyl Cai, et al., Journal of Liquid Chromatography, 16(9&10): 2007 (1993). 毛細管チュウブの内側の壁に塗布された抽出体はCE用毛細管全体の一部として組み立てられている。サンプルは毛細管を通してポンプか、電気浸透のフロー（ＥＯＤ）を使って押し出されている。電気浸透のフローは液体を大量に動かす動力として使われている。毛細管は緩衝液溶液で洗浄し、脱離緩衝液を最初流し込み、その後緩衝液を流し込む。電圧を流す事によって、検体を分離することができる。
この発明は毛細管のチャンネルを使って固体相の抽出体を集め、集めた検体を設定された容積の溶液の中へ入れる。この発明は生体分子を含めた検体有効で、分析技術が必要としているサンプル準備(特にバイオチップやマススペクトル分析用)に適合している。
特にこの発明は蛋白質工学の分野に有用である。蛋白質工学とは蛋白質とその機能の研究と定義づけられている。蛋白質は細胞の働きを司っている。一つの蛋白質は多種多様の形状を持っている。蛋白質の機能はその形状や相互作用や蛋白質の複合体に依存している。新薬の開発には蛋白質の生物的機能の深い理解が必要である。
蛋白質工学内でも、蛋白質のサンプル加工の工程は難しい問題を抱えている。蛋白質は単体でも、複合体(グループ)でも機能できるようになっている。蛋白質はDNAのようにポリマレーゼの連鎖反応(PCR)方法使って増幅できない。蛋白質は分析する前に、濃縮し、精製されなければならない。蛋白質の加工工程の方法とシステムは適応性に富んでいなければならない(百万以上の蛋白質の形状の発現可能である)。分析の為に、何千とある蛋白質の中から、必要としている蛋白質を分離し濃縮しなければならない。同時に蛋白質の分析を妨げる不必要な細胞物質(糖、炭水化物、脂質、DNA、RNA、塩)を取り除かなければならない。この工程中回復修正が必要で、蛋白質の機能を維持しなければならない。多種多様の蛋白質の形状の構造の相違はそのまま保存し、サンプルの精製の最終工程は色々な解析の手法(マススペクトル分析、蛋白質チップ、等)にうまく準拠できなければならない。
固体相抽出は、分析の前に蛋白質のサンプルを用意するための基本的なツウールである。この工程は蛋白質をマススペクトロ分析やその他の分析方法の為に、蛋白質の正体やクラスタイプや構造や機能に基づいて、精製する。
固体相抽出の工程はカラムかベッドの中の抽出相を使い、サンプルはカラムに注入するか、抽出用のガラス玉に溶液として足される。抽出相がサンプルを保有し、抽出相は不純物を取り除くため洗浄され、サンプルは抽出、又は回収溶液で回収される。
抽出カラムを使って蛋白質のサンプルを分析用に準備する。しばしば、サンプル内に微量の蛋白質しか搾り出すことができない為、サンプルの準備工程が蛋白質を分離し、回収するために分析の前に必要である。
核酸や蛋白質のような生体分子の固体相抽出は普通多種多様な抽出相が入ったカラムを使って行われる。
蛋白質の生体分子の抽出は最近頻繁に行われるようになった。色々な分析技術を駆使して蛋白質の機能を判別し、理解するためには、多量のサンプルを分析する必要がある。典型的なサンプルのヴォリュームは典型的なカラムベッドのヴォリューム１から５ｍLに対して0.5から５ｍLであり、典型的な脱離溶液のヴォリュームは5から10ｍLである。
固体相抽出を使って蛋白質、又はある蛋白クラスを精製する製品を開発している会社は幾つかある。これらの製品の目的は開発研究者の興味がある蛋白質のサンプルを供給することによって蛋白質分析の簡略化が目的である。これらの製品はほとんど一回だけ使われ、廃棄されるように梱包されている。パックカラムは比較的低圧化で操作できるため、簡単に、数多く一変に、オートマチックに処理できる。パックベッドのアプローチはその特性の為、信頼性の高い量の測定や(か)サンプルの濃縮化には限度がある。パックベッドのアプローチは信頼性を上げ、尚且つ、コストを安くするのは不可能に近い。この手法はナノスケールのレベルの工程には不向きである。
その他の欠点は、溶液回収が不完全なため、物質のロスが生じて、結果再生が不可能である事、溶液回収のお不完全さを補うために薄める溶液を多量に使用するため、物質が必要以上に薄められてしまう事、インプり方法に左右されますが、頻繁にフローの方向性が決められてしまうため、サンプル精製の工程の融合に制約ができてしまう事、マイクロからナノスケールでの量産が簡単に安くできない事、一般市場で入手できる材料は目が粗く、必要な物質が流れ出てしまう事。
更に、パックカラムはサンプルからサンプルへの繰越の弊害があるとともに、製造費が高く、マルチプレックス(サンプル抽出を平行に幾つも同時に行う)が難しい。蛋白質の抽出層での吸着の逆行不可能になるか、又は、カラムの内部のフリット部や「死角の場所」に入り込み、蛋白質の回収が不完全になる。
分子の固体相用の抽出カラムの改善をする余地がある。US特許5,833,927は親和力を利用した分離のデバイスと方法が表記され、固体相抽出の必要性が確認されている。
これらの手法は一般的にパックカラムを使っている。蛋白質はパックカラム層から溶液で薄められ、直接それが分析されるか、(典型的には)分析をする前に脱塩し(又は)、透析する。
このように、設定されたヴォリュームの検体分子やもっと具体的には、幾つものサンプルタイプから生体分子を凝縮し、洗浄し、回収できるデバイスとその方法の必要性がある。このデバイスと方法は或る分析プロセスや計器に制約されてはならないし、微量のスケールでも働き、サンプル内の不純物や気泡に耐性でき、必要であらば、廃棄可能で、又、必要であらば、マルチプレックスできなければならない。
術語「溶液区分」とはここではチャンネル内の液体のブロックとして定義され、両端部、液体か気体のブロックが境になっている。
術語「リーディングエッジ脱離」とは先行部分のチャンネルを溶液が通り、全部、又はほとんど全部生体分子をチャンネルの壁から脱離する事を意味する。この先行部分が液体区分となりその「尻尾」が溶液で境になっているが、それは先行部分の一部ではない。
術語「固体相抽出チュウブ濃縮係数」とはチャンネルのヴォリュームと液体区分内の脱離検体のヴォリュームの比率として定義される。
術語「固体相抽出濃縮係数」とはサンプルのヴォリュームと液体区分内の脱離検体のヴォリュームの比率として定義される。
術語「アジテートフロー」とはチャンネルの中を溶液が流れる際、チャンネルの壁にあたっている二次的フローのパターンと定義される。
術語「蛋白質チップ」とは蛋白質の生体分子の個々のぽちの配列として置かれた小さなプレートか表面の事と定義される。一般的に、個々の蛋白質の配列の載ったチップで生体分子でできたサンプルと接触するように設計されていて、サンプルはその表面上で個々のぽちと結合するか、しないかは、後日判明される。一般的なタイプと機能の記述は、Gavin MacBeath, Nature Genetics Supplement, 32:526 (2002), を参照して下さい。
術語「アジテーションアスペクト比」(AAR)とは非線形チャンネルの中心軸の有効曲線の直径と有効チューブの直径の比率と定義される。下記の方程式で算出される。
AAR= チューブの有効曲線の直径 / 有効チューブの直径
術語「OCCD」とは「Open Capillary Channel Device」(開放毛細チャンネルデバイス) の事で、フレキシブルか硬い物、ブロックかチューブかその他の導管のデバイスのような物、で構成されて、少なくとも一つの毛細管があり、更に、其の管は注入入り口と出口がある。その管は、毛細チューブかチューブの束か毛細管があるブロックのような単体で毛細管一つでできいるものから、硬いブロックで複数の毛細管からできているものから、それらの類似のものもある。その管は非線形の中心軸と線形の中心軸がある。
術語「チューブ濃縮係数」、又は、「TEF」は毛細チャンネルの全ヴォリュームをデバイスが作成する脱離溶液のヴォリュームで割った比率である。例えば、チューブの全ヴォリューム(Vt)が0.45mL (450nL)で検体の生体分子を5mLのサンプル溶液ををポンプ使って抽出する場合。チューブは溶液で洗浄され、空気で溶液を押し出す。生体分子は45ｎLの脱離溶液が脱離区分で脱離される。チューブ濃縮係数(TEF)は下記の式で算出され、TEFは10である。
TEF=Vt/Vd=450nL/45nL=10
この発明の目的は少量の決められた溶液で生体分子の物質を脱離できるチャンネル、又はチャンネル群、を作り上げることで、この少量の溶液の部分を必要としている所に引き渡すことである。
この発明のもう一つの目的は脱離された生体分子の入っている溶液の部分をターゲットの計器か蛋白質チップか後日使用のための薬ビンに引き渡すために適切なヴォリュームや濃度に設定する為のシステムとその方法を供給することである。生体分子の最終濃度はシステムのチューブ濃縮係数ともとのサンプルヴォリュームとチューブヴォリュームとその濃度によって設定される。濃縮係数はもとのサンプルヴォリュームをカラムヴォリュームで割、TEFを掛ける事によって得られる。これは抽出と脱離プロセスが100％有効である事を前提にしている。
この発明のデバイスの部品は開放チュ−ブラーチャンネルデバイス(OCCD)で、生体分子の開放チューブ固体相抽出ができ、チューブ濃縮係数(TEF)が少なくとも1である事である。このデバイスは少なくとも或る幅のチャンネルで構成されていて、ひとつめの端末に溶液や気体を押し込むことができるポンプが接続されていて、もうひとつめの端末はチャンネルの内側の表面が抽出できるようになっている。ポンプの方法はスポイトか圧力容器か遠心ポンプか電動ポンプか誘導ベースの溶液ポンプである。ふたつめの端末は蛋白質チップのサンプルアプリケーターや質量分析器へのインターフェースに接続できるようになっている。
この毛細管チャンネルの中の抽出する表面は抽出剤が載った、結合できる属性を持っている。この抽出剤は、選択された生体分子と結合する、化学親和力結合体である。例で示すと、化学親和力結合体はキレート環を有する金属で、選択された生体分子に親和力結合性がある。化学親和力結合体は蛋白質で選択された蛋白質に親和力結合性がある。化学親和力結合体は有機分子か分子群で選択された蛋白質に親和力結合性が或る。化学親和力結合体は糖で選択された蛋白質に親和力結合性が或る。化学親和力結合体は核酸で選択された蛋白質に親和力結合性がある。化学親和力結合体は核酸か核酸のシーケンスで選択された核酸か核酸のシーケンスに親和結合性がある。
抽出する表面は具体的に使われる抽出と濃度のプロセスに合った色々な表面をお選ぶことができる。例で示すと、非極性の表面、有機溶液混合物の移動相と相互に作用する非極性逆相表面、非極性移動相と相互作用する極性表面、イオン交換の属性、弱い疎水性、又は、親水性に中性な属性。
この開放チューブラー固体相分子抽出の発明の方法はサンプル分子用の親和力抽出の表面を持ち、開放毛細管チャンネルデバイスがあり、次のステップから構成されている。ステップ(a) サンプル溶液から容積を持った毛細管チャンネルの親和性抽出の表面へサンプル分子を結合させる。ステップ(b)サンプル分子の大部分を親和性抽出の表面から毛細管チャンネルへ脱離溶液を流し込むことによって脱離させる。脱離溶液のヴォリュームは毛細管全体のヴォリュームん10分の一以下である。この方法で少なくとも有効チューブ濃縮係数１を達成でき、有効濃縮係数の400まで達成可能である。
サンプル溶液を薄めることができ、サンプル分子を親和性抽出の表面に大部分結合させるために、チャンネル内を通す時間とスピードを調節できる。チャンネルを通すサンプル溶液の方向を少なくとも一回、サンプル溶液と親和性抽出の表面の接点を増やすため、変えることができる。チャンネルを通す脱離溶液の方向も少なくとも一回、脱離溶液と親和性抽出の表面の接点を増やすため、変えることができる。
洗浄液は上記のステップ(a)と(b)の間に毛細管チャンネルに流し込むことができる。洗浄液はステップ(b)の前にガスを毛細管チャンネル通すことによって押し出すことができる。化学親和力結合体はキレート環を有する金属で、選択された生体分子に親和力結合性がある。化学親和力結合体は蛋白質で選択された蛋白質に親和力結合性がある。化学親和力結合体は有機分子か分子群で選択された蛋白質に親和力結合性が或る。化学親和力結合体は糖で選択された蛋白質に親和力結合性が或る。化学親和力結合体は核酸で選択された蛋白質に親和力結合性がある。化学親和力結合体は核酸か核酸のシーケンスで選択された核酸か核酸のシーケンスに親和結合性がある。洗浄液はステップ(b)でガスを毛細管チャンネル通すことによって押し出すことができる。サンプル濃度は少なくとも千倍に上げることができる。ここでの分子は生体分子で、ステップ(b)でできた成果物は蛋白質チップや質量分析器で使うことができる。
上記で説明された今まで発案された方法の欠点は親和力やクロマトグラフィーを使って分離する場合、開放チューブカラムのフォーマットで克服できるようになった。
この発明は生体分子の固体相抽出を開放チューブラーカラム駆使する事に依存している。開放チューブカラムの壁は一般的に無孔性で、蛋白質の採取と放出をできるだけ完全に、予測できるようになっている。
一掃されないヴォリュームはほとんどなく、ロスを最小限にとどめるか、なくすことが可能である。一掃されないヴォリュームがないということは、もしガスを毛細管内へ通しても、必ずしもチューブの壁がかわいているということではない。抽出相は、毛細管チャンネルが熱せられるか毛細管チャンネル内に大量のガスを流し込まない限り、水分や溶液を保っている。しかしながら、一掃されないヴォリュームがないことは、必要としている検体は入った設定され溶液のヴォリュームを注入し、制御し、収集できることである。チューブ、又は、毛細管チャンネルは溶液を流し込んだり、取り出したりできなければならない。この観点から、チューブ内には粗い表面や突出した表面や、更に、玉や単体構造のような二次的構造物を、この二次的構造物が一掃するヴォリュームを妨げない限り、入れ込むことができる。参考文献(Ronald Majors,2002 Pittsburgh Conference, Part I, lC/GC Europe, April 2002, pp 2-15)に梱包された、単体化した構造の詳細が書かれている。
更に、抽出相デバイスは分離するメディアとトランスファーチューブの両方の役割をする事ができる。例えば、シリカチューブの沈殿用の端部は精製と(又は)、濃縮したサンプルを直接蛋白質チップやMALDIターゲットや電動スプレーのノズルへ入れることができる。こうすることによって、検体のロスを防ぐことができる。
両方サンプルと脱離溶液を抽出相に何度もさらすことができる(ただ単に、幾度も前後に流す)。サンプルの場合、抽出度が増える事は、回収率が上がることである。脱離溶液の場合、脱離溶液の量を著しく減らすことができる事は脱離したサンプルの効率を上げることである。脱離溶液を固定相に幾度も流し込むことによってサンプルの濃度を、開放チューブカラムからターゲットへ入れる前に、上げる事ができる。
生体分子は大きくかさばっていて、そのため、壁上の抽出相から運び出し入れは小さな(有機)分子に比べて時間がかかる。しかしながら、このおような大きな分子でも、この発明方法とデバイスを使用すれば、抽出と回収を効率的にする事が可能である。
開放チューブカラム内の性能は表面への運び出し入れの性能を上げることで上げられる。これは毛細管カラム内の流れをアジテートさせる事によってできる(例えば、荒立った、又は、静かな曲がりくねった流れ)。
マイクロリッター、又は、ナノリッターの量を用意し、直接ターゲットに点をつけることができる。最近の分析のアプローチは微量のサンプルを扱うことが余儀なくされている。
開放毛細管(~0.1mm ID)は親和性グループで塗布されている。大量(数ｍLまで) のサンプルをプロセスできるようになってり、必要な蛋白質を選択できるようになっている。検体をナノスケールの量に、高い濃縮係数と異例な純粋度で、薄める事ができる。
この方法とデバイスは高い適応性があり、チャンネルの壁に適切な化学薬品を塗布することで、色々な応用化学に使うことができる。デバイスは頑強にできており、製造コストは低く、このオペレーションを複数化するのに適合している。
開放チューブラーデバイスは多種多様の一般的なシステムといっしょに使用して、この発明の方法使うことができる。このシステムは毛細管チャンネルとガスとサンプルや洗浄液や脱離液のような液体用ポンプの組み合わせでできている。ポンプはスポイト(圧力か真空)か圧力容器(バイアル)か遠心デバイスでよい。毛細管の壁を蛋白質や生体分子の抽出のために改善可能である。システムは毛細管チャンネルの端部をデポジションターゲットの上か、中か、真上に位置付ける方法が含まれている。これは調整液やサンプルや洗浄液が注入される毛細管の同じ端末か逆の端末である。ターゲットは注入装置か蛋白質チップか質量分析器かその他の解析デバイスかその他のサンプルを保留する(薬ビンかチューブのような)物である。これらの機能は抽出チャンネル一本でできることである。
チャンネルはチューブ一本でも、複数のチューブが入ったブロックでも、マルチチャンネルブック（マルチ毛細管のフォーマット）でも良い。
システム構造によって、この手法は毛細管チャンネルに双方向からサンプルを注入でき、又、双方向から毛細管を洗浄でき、又、脱離溶液をどちらからの端末からでも入れられ、脱離した蛋白質や生体分子はターゲットに置かれるか、沈積される。ターゲットは蛋白質チップのスポットかもしれない。
第1−4図はこの発明の開放チューブ抽出チャンネルを操作する際の見取り図を示している。第1図はチューブラーチャンネル2が示され、内側の壁には抽出剤４が塗られている。
第2図は第1図のチューブラーチャンネルが示されていて、サンプル6が毛細管に注入され、特別な抽出剤4がサンプル6と反応して、サンプルから必要とている蛋白質8を抽出し、求めている蛋白質か生体分子8を毛細管の壁に、化学薬品群と吸着させる。サンプルの無関係な蛋白質や汚染物は新鮮な水で洗浄される(表示されていない)。
第3図は、毛細管2を空気のようなガスで溶液を押し出した後の、第2図のチューブラーチャンネルを表示している。
第4図は、脱離溶液10がチューブ２を通って、蛋白質か生体分子8を抽出し、回収した、第3図のチューブラーチャンネルが示されている。
第4図で示された工程とは別の手法として、脱離溶液が毛細管チャンネルにポンプで或る方向から注入され、境界の前部分の溶液が生体分子8を脱離し、回収し、それが壁4に吸着している。壁から蛋白質か生体分子8がすばやく脱離し、蛋白質や生体分子8は脱離溶液の境界の前部分に入って、溶液がチューブの下へと流れる。
生体分子物は溶液層10内に集められ、それはターゲット(例えば、薬ビンかチューブか表面か機器)に沈積される。
第5図はこの発明の毛細管チャンネルチューブのループ形状を示している。コイル状の毛細管チャンネル12、チューブの形状で上側の端14と下側の端16が表示され、が八型のコイル形状にになっている。この形状は、選択された外付けの容器ヴォリューム用に、チューブを増長できるし、コイル形状は曲線がフローをコントロールされた形でアジテートさせることができる。開放チューブの内側の表面は結合作用物で塗布され、選択された分子を選択された親和性の相かその他の固定相を介して抽出できるように適応している。
第6図は第5図の毛細管チャンネルチューブを複数化した見取り図である。第5図で表示されているように、開放チューブ毛細管チャンネルのコイル形状はケース内に複数化でき、フローのアジテート状態を維持し、小さくできる。コイル18はくい20を使って形付け、位置を保ち、上側の端14の配列と下側の端16の配列を作る。固定された、平行のくいの配列を使って、やわらかい毛細管チューブのたけを巻きつけ、コイル群を作り上げる。コイル形状は開放毛細管システムを複合化するために適しており、この極端に小さな形状を使って、パラレルプロセスできる。
第7図は第6図で示された複合化した毛細管チャンネルチューブがケース22の中に入った形の見取り図である。これは、各チャンネル内のサンプルプロセスに指数をつけることができ、各チャンネルチューブから抽出し、濃縮した検体をターゲットに沈積したことを指数化できる。ケース22に毛細管チューブの開放チューブコイルを15個入れることができ、各チューブの上側の端14(第17図)はケース22の上側２６の配列24に設置される。各チューブの下側の端16はケース22の下の表面の配列(表示されていない)に設置されている。
沈積検査用のケース28には先端32の付いた沈積検査針が入っており、沈積検査用ケースを動かすことによって選択したターゲット34に合わせる事ができる。ターゲットはMALDIターゲット、表面プラズモン共鳴(SPR)チップのような蛋白質チップ、等。コイル形状は蛋白質チップのアレー、MALDIターゲットｎスポット、ナノ集合群(例えば、インジェクターアレー)を統合した形状に設計できる。
毛細管チャンネルとそれを使う方法は「開放チューブラー生体分子個体相抽出」(BOTSPE)の中枢の見地である。
毛細管チャンネルの重要な点は、散布距離、チャンネルアスペクト比(CAR)、チャンネル形状、抽出表面のタイプ、物理的、化学的特徴である。
散布距離は分子が抽出表面と作用するために動かないといけない距離である。一般的に最大散布距離はチャンネルの半径に依存する。
チャンネルアスペクト比はチャンネルの長さとチャンネル内の平均直径の比率である。この発明の毛細管チャンネルのチャンネルアスペクト比は10から40,000である。最適なオペレションの為には10から200、000にできる。
抽出プロセスはチャンネルの表面に散布するか動く分子に依存する。分子がチャンネルの抽出表面に散布する時間が足らない場合は、チャンネルの長さを伸ばすか、サンプルをチャンネルに流す回数を増やすか、サンプルをチャンネル内に流している最中にアジテートできる。
毛細管チャンネルの断面の形状は重要な点ではない。例えば、円か楕円か長方形かその他の多角形の形状か開放チューブの形状の組み合わせでもよい。
毛細管チャンネルは単体かチューブの束かブロックかチップの中の一つか複数のチャンネルでできている。チャンネルはまっすぐにできる。チャンネルはチャンネル内でアジテートのフローを促進させるため非線形のコイル形状かその他の曲線形にできる。チャンネルは壁がまっすぐか波を打っているか編まれているか円形か節があるかコイル状かコイルと逆コイルのコンビネーションかチューブの表面に動かせる事を促進させるための玉を入れることができる。コイル状のチューブは具体的なアプリ用に切り、他に汚染を防ぐため一回だけ使用するようにできる。
毛細管チャンネルは色々な異なった材料で作ることができる。これらの材料は熔融シリカ、ポリプロピリン、アクリル樹脂、ニッケル毛細管チューブ、カーボンナノチューブである。重合体のチューブ(Paradigm Optics, Inc., Pullman, WA) はまっすぐか穴のあいた物がある。毛細管チューブの表面上に固体相抽出のため機能グループが必要であるかもしれない。ポリマーに化学作用グループを付着させる方法が、次の有機合成のテキストに記述され、ここに参考文献を記述する。Jerry March, ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY, 3rd ed., Wiley Interscience: New York (1985); Herbert House, MODERN SYNTHETIC REACTIONS, 2nd ed., Benjamin/Cummings Publishing Co., California (1972); and James Fritz, et al., ION CHROMATOGRAPHY, 3rd ed., Wiley-VHC, New York (2002). ニッケルチューブはValco Instrument, Inc., Houston, TXから入手できる。カーボンナノチューブの作製は次の文献を含めて色々な刊行物に記述されている。Kenichiro Koga，et al., Nature, 412:802 (2001).
開放チューブで蛋白質を分離することについて、フローの曲がりくねりの影響は、流れている溶液内の分子拡散に与える影響の為、非常に重要な点である。
ターゲットにする分子の物理的サイズはデバイスが開放チューブ固体相抽出デバイスが壁に抽出する性能に影響を与える。微小の分子(例えば、500 Da)の場合, 拡散コンスタントは1.5 x 10-5 cm 2 /sである。しかしながら、蛋白質の場合、小さな蛋白質のオーダー17,000 Da でも、拡散コンスタントはおよそ十倍低く1.3 x 10-6 cm 2 /sである。小さな分子の拡散コンスタントが高い方は、もし設定された条件下で毛細管を通る流れの中に溶解しているのであれば、毛細管の壁に接触し、拡散しやすい。その反面、もし蛋白質が溶解して、同じ条件下で同じ毛細管中を流れているのであれば、毛細管の壁と接触して、最終的には拡散するが、小さな分子に比べてかなり遅い割合で拡散する。従って、BOTSPEの蛋白質は、蛋白質が或る手法で特別速く動かなければ、普通小さな分子よりも効率が低い。
分子と蛋白質の拡散係数はテーブルAに表記されている。
Figure 2005529335
大きな蛋白質を壁の方へ動かすのを援助する一つの方法はアジテートフローをつくる事である。「アジテートフロー」は毛細管の内側の壁に垂直になるフローの構成要素の方法(壁と平行に流れるのと反対に)と定義される。アジテーションをシステムにもたらす或る一つのやり方はフローの流れる管を曲がりくねった状態にすることである。すなわち、フローの方向を人為的に変えるか、変更することで、直線状のフローのパターンを効率的に妨げ(アジテート)することである。
曲がりくねりを作る方法は色々あるが、一つのやり方は、液体の流れているチューブをコイル状にするか、節を入れることである。この仕方はHPLCのフローインジェクション分析かポストカラム化学反応器で使われ、化学反応器用のコンティニュアスフローを作る為に頻繁に適応されている。結節状の反応器はチューブの壁に当たったり、離れたりすることにって（ラジアルフロー）、溶解したサンプルの混合を最大限する事と、同時に、サンプルの領域の直線軸フロー（アクシアルフロー）の拡散を最小限にとどめる。曲がりくねったフローをすることによって、このラジアルフローの部分を最大限活用し、蛋白質が毛細管の壁へ動く速度を増進させる。
この発明の毛細管チャンネルデバイスが行うタイプの抽出の特色は内側の特性と化学である。アジテートフローは抽出プロセスやデバイスに関連することで今まで発表されていないことである。アジテートフローは不規則なチャンネルの表面か曲がりくねった管を使うことによってつくられる。アジテートフローは開放チャンネルカラムの性能を、もしチャンネルの内径が10mｍ以上であれば、表面への動きの率を高める事によって向上できる。各小直径(例えば、10−20mｍ) にアジテーションは必要ではないが、それでも性能は上がる。曲がりくねったチャンネルの形態はアジテーションアスペクト比で発現できる(AAR)。AARは有効チューブの直径をチューブの中心軸の有効カーブの直径で割った比率である。毛細管チャンネルの少なくともAARは、半径が一番狭いカーブで壁が最も薄い条件の下で、1である。チャンネルのAARが1.75以下は非常に薄い壁で達成できる。この算出はチャンネルのどの直径でも当てはまる。一般的な形状の場合、AARの範囲は1.75から2000で、最適な範囲は10から100である。
オプションとして、検体に損傷の危険性がなければ、高温を使って動きのレートを上げる事ができる。サンプルの前後の動きも抽出プロセス中にアジテーションを超せる。フローを前後に揺さぶることも接触時間の増加につながる。
チャンネルの内側の壁は比較的スムーズにも荒くも模様をつけることもパターン化することもできる。できれば、比較的非孔的であることである。内側の壁はPaul Kenis, et al.，Acc. Chem. Res., 33:841 (2000) とPaul Kenis, et al., Science, 285:83 (1999) の文献に記述されているように不規則な構造でも良い。液体の溶出がチューブ濃縮係数を上げることにつながれば、どのような内側の構造でもよい。チャンネルに溶液が通る管があれば、チューブが一体化した構造でも良い。
抽出系の化学物質は内側の壁の表面に適用される。抽出相分子は表面に結合した分子か、表面に結合したポリマー相である。ポリマー相はチャンネルの外にマルチ機能サイト分子として延びている。ポリマー相のコーティングは厚さが5μｍ以下で、抽出が壁との相互作用で生じ、抽出相マトリックスとの相互作用で生じるのではない。これは抽出がサンプル分しの壁への動きによって大きく左右され、サンプル分子が抽出マトリックスを通る事には左右されない。
抽出作用薬は抽出プロセスと検体用に具体的に選択される。抽出プロセスは親和性、逆相、順相、イオン交換、親水性相互作用クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー担体である。
数多くのクロマトグラフィーで使われている化学物質はBOTSPEで使うことができる。
アフィ二ティー分離は生体分子抽出に具体的に関連した技法で、具体的な、酵素、抗体、ホルモンのような、リガンドを結合して、必要としているマクロ分子が固体形状で用意される。この固定されたリガンドは、選択された分子と相互作用し、結合する。結合しなっかた分子は溶出される。この相互作用は選択式で、元に戻すことが可能である。下記の文献に記述されているように、色々異なったタイプのアフィ二ティーグループが固体相抽出に使われており、ここに文献を記載する。Antibody Purification Handbook, Amersham Biosciences, Edition AB, 18-1037-46 (2002); Protein Purification Handbook, Amersham Biosciences, Edition AC, 18-1132-29 (2001); Affinity Chromatography Principles and Methods, Amersham Pharmacia Biotech, Edition AC, 18-1022-29 (2001); The Recombinant Protein Handbook, Amersham Pharmacia Biotech, Edition AB, 18-1142-75 (2002); and Protein Purification: Principles, High Resolution Methods, and Applications, Jan-Christen Janson (Editor), Lars G. Ryden (Editor), Wiley, John & Sons, Incorporated (1989).
アフィ二ティー分子がテーブルBにリストアップされた担体から適応する親和性結合担体から選択でき、親和性担体は下記の相互作用分類表から選択できる。
1 キレート環を有する金属−リガンドの相互作用
2 蛋白質−蛋白質の相互作用
3 有機分子かその一部−蛋白質の相互作用
4 糖−蛋白質の相互作用
5 核酸−蛋白質の相互作用
6 核酸−核酸の相互作用
Figure 2005529335
Figure 2005529335
Figure 2005529335
逆相クロマトグラフィーにいて、水溶媒中での有機混合物は一般的に移動相として使われ、広表面積の非極性固体が固定相に使われる。後者はアルキル化シリカの包装物で、例えば、シリカの表面をC8 かC18のグループで塗る。逆相クロマトグラフィーの溶出液残留の根底は論争中であるが、或る試験官は吸着相を好み、他のユーザーは非極性固定相に溶出液の区分を使っている。色々なサンプルを扱う上において、多分両方重要であろう。溶出液と移動相分子の間に、固定相に対応する上において競り合いが生じる。すなわち、吸着した分子は事前に吸着されて或る数の分子を入れ替える (Chromatography. 5th edition, PART A: FUNDAMENTALS AND TECHNIQUES, editor: E. Heftmann, Elsevier Science Publishing Company, New York, pp A25 (1992)). 逆相クロマトグラフィーの一般的な使用応用はほぼ有機分子のすべてが、疎水性の領域をその構造内に有していて、固定相と相互に作用できるようになっている。移動相は極性で普通水含性である為、この方法は、有機溶液に不溶解か普通の溶液の無機酸化吸着剤は強く結合しすぎる、極性分子の分離に理想的に適合している。
酸性の低値イオン溶出液を使う逆相クロマトグラフィーは蛋白質の構造把握や精製化の一般的に広く使われている。しかし、生体ポリマーの構造は移動相構成用やｐＨや複合化する分子に敏感に作用し、その結果、変則的な残留液や蛋白質の変性が生じる。逆相システムの一般的な特徴は、移動相の極性の低下、 すなわち、水含有機移動相内の有機溶液のヴォリュームを上げることで、残留液を減らすことである。これは液体固体クロマトグラフィーか順相クロマトグラフィーの一般的に見識されているトレンドとは反対である。逆相クロマトグラフィーの一般的見識は同族列かオリゴマ−シリーズ用のロガリズムの溶出液許容係数はメスリーングループの数かオリゴマ−構造のリピートユニットの数の線形関数である(ADVANCED CHROMATOGRAPHIC AND ELECTROMIGRATION METHODS IN BIOSCIENCES, editor:Z. Deyl, Elesevier Science BV, Amsterdam, The Netherlands, pp 528 (1998); CHROMATGRAPHY TODAY, Colin F. Poole and Salwa K. Poole, and Elsevier Science Publishing Company, New York, pp 394 (1991)). 下記の参考文献は逆相分離に使われる異なったタイプの表面が表記されおり、ここに参考文献をお表記する。CHROMATGRAPHY, 5th edition, Part A: Fundamentals and Techniques, editor: E. Heftmann, Elsevier Science Publishing Company, New York, pp A25 (1992); ADVANCED CHROMATOGRAPHIC AND ELECTRMIGRATIN MEYHODS IN BIOSCIENCES, editor: Z deyl, Elsevier Science BV, Amsterdam, The Netherlands, pp 528 (1998); CHRMATOGRAPHY TODAY, Colin F. Pooole and Salwa K. Pole, and Elsevier Science Publishing Company, New York, pp 394 (1991).
イオン対クロマトグラフィーのカラムパッキングは普通逆相クロマトグラフィーと同じである、例えば、C8 か C18シリカ。移動相も同じように逆相クロオマトグラフィーデ使われている通り同じであり、水溶媒中での有機混合物は緩衝液とイオン対試薬を有する。イオン対試薬は正イオンでサンプルアニオンを分離し、保持し、サンプルカチオンを負イオンで保持する。典型的なイオン対試薬はヘクセインサルフォネイトとテトラビューティルアンモニュームである。イオン対クロマトグラフィーでの保持の理由は未だに論争点であり、二つ異なったプロセスが可能である。(a)イオン対の吸着か (b)原位置でのイオン交換が形成。この二つのプロセスは異なったように見えるが、実験条件の機能として、予測どおり同じように保持されて出てくる。イオン対クロマトグラフィーの保持材は逆相プロセスからイオン交換プロセスへと継続的に変化する。この機能は幾つかの実用的な利点がある。例えば、移動相の構成の相違点は各サンプルイオンの保持の大幅なコントロールができる。これを使って特に難しいサンプル、例えば、アニオンと(又は)カチオンと(又は)中性の分子の混合物、の分離ができる (CHROMATOGRAPHY, 5th Edition, Part A: Fundamentals and Techniques, editor: E. Heftmann, Elsevier Science Publishing Company, New York, pp A28 (1992))。
順相クロオマトグラフィーの固定相は広表面領域極性吸着剤、例えば、シリカかシリカ結合の極性表面グループ、である。移動相 (有機溶液の混合物) は固定相より極性である。従って、極性溶出液の方が優先的に保持され、異なった同族体や或る化合物群の保持材の違いはそんなにない。これが理由で、化合物群(グループタイプ)分離、例えば、アルコールはモノエスターと他の化合物群から分離される、の為には、順相クロマトグラフィー使うようになった。順相クロマトグラフィー保持の根拠は吸着/排出プロセスである。順相クロマトグラフィー保持のもう一つの特徴は固定相表面上に吸着溶液と移動相分子を一般的に呼ばれる、局所に限定できる。局所限定とは、溶出液分子内の極性代用液と吸着液の極性位置の間の選定された結合(双極子/双極子か水素結合相互作用)の形成の事を指す。更に、局所限定は吸着表面と溶出同質異性体の相互作用の特性を授けることで、典型的に順相クロオマトグラフィーの方が他のクロマトグラフィー方式よりも同質異性体の分離が良くできる(CHROMATGRAPHY, 5th edition, Part A: Fundamentals and Techniques, editor: E. Heftmann, Elsevier Science Publishing Company, New York, pp. A27 (1992).
下記の参考文献はイオン対クロマトグラフィーを使うことができる異なったタイプのグループが表記されており、ここにその文献を記述する。Reference: CHROMATGRAPHY, 5th Edition, Part A: Fundamentals and Techniques, editor: E. Heftmann, Elsevier Science Publishing Company, New York, pp A28 (1992); CHROMATOGRAPHY TODAY, Colin F. Poole and Salwa K. Poole, Elsevier Science Publishing Company, New York, pp 411 (1991)).
順相クロマトグラフィーでは、固定相は広表面領域極性吸着材、例えば、シリカや極性表面グループと結合したシリカ、である。移動相 (有機溶液の混合物) は固定相に比べて極性度が低い。従って、極性度の高いほうが優先的に保持され、異なった同族体や或る化合物群の保持材の違いはそんなにない。これが理由で、化合物群(グループタイプ)分離、例えば、アルコールはモノエスターと他の化合物群から分離される、の為には、順相クロマトグラフィー使うようになった。順相クロマトグラフィー保持の根拠は吸着/排出プロセスである。順相クロマトグラフィー保持のもう一つの特徴は固定相表面上に吸着溶液と移動相分子を一般的に呼ばれる、局所に限定できる。局所限定とは、溶出液分子内の極性代用液と吸着液の極性位置の間の選定された結合(双極子/双極子か水素結合相互作用)の形成の事を指す。更に、局所限定は吸着表面と溶出同質異性体の相互作用の特性を授けることで、典型的に順相クロオマトグラフィーの方が他のクロマトグラフィー方式よりも同質異性体の分離が良くできる(CHROMATGRAPHY, 5th edition, Part A: Fundamentals and Techniques, editor: E. Heftmann, Elsevier Science Publishing Company, New York, pp. A27 (1992))。
下記の参考文献は順相クロマトグラフィーを使うことができる異なったタイプのアフィ二ティーグループが表記されており、ここにその文献を記述する。CHROMATGRAPHY, 5th Edition, Part A: Fundamentals and Techniques, editor: E. Heftmann, Elsevier Science Publishing Company, New York, pp A27 (1992); CHROMATOGRAPHY TODAY, Colin F. Poole and Salwa K. Poole, Elsevier Science Publishing Company, New York, pp 375 (1991)).
イオン交換(IEX)はクロマトグラフィーの方式で、イオン化された物質がパッキングのカチオンかアニオンサイトで分離される。イオン交換の表面は普通イオングループ、例えば、サルフォネートかトライメシルアンモニュウム、で代用された有機マトリックスである。移動相は典型的には水や緩衝液や(又は)塩から構成されている。溶出液イオンの保持は移動相イオンか同じような(陽か陰)の電荷のイオン交換を介して行われる。イオン交換クロマトオグラフィーは電荷によってpHが変わる酸性か塩基性サンプルの分離に頻繁に使われる。簡単なケースの溶出液分子が単一の酸性か塩基性の物質の場合、溶質液は荷電された物質と中性の物質で存在する。イオン交換の場合、非荷電物質の保持は無視される(CHRMATOGRAPHY, 5th Edition, Part A: Fundamentals and Techniques, editor: E. Heftmann, Elsevier Science Publishing Company, New York, pp A28 (1992))。 イオン交換クロマトグラフィーは蛋白質の複合体混合物の分離のための最も古く、一番伝統的な 技術である。下記の参考文献はイオン交換クロマトグラフィーに使用される異なったグループのタイプや表面が表記されており、ここにその文献を記述する。CHROMATOGRAPHY, 5th Edition, Part A: Fundamentals and Techniques, editor: E. Heftmann, Elsevier Science Publishing Company, New York, pp A28 (1992); CHROMATOGRAPHY TODAY, Colin F. Poole and Salwa K. Poole, Elsevier Science Publishing Company, New York, pp 422 (1991); and ADVANCED CHROMATGRAPHIC AND ELECTROMIGRATION METHODS IN BIOSCIENCES, editor: Z Deyl, Elsevier Science BV, Amsterdam, The Netherlands, pp 540 (1998)).
疎水性相互作用クロマトグラフィーは蛋白質の精製や分離に広く使われている。分離中に、蛋白質は緩衝液化した強イオンの移動相を使って、弱疎水性の固定相との結合を促進させ、塩分濃度のグラジエントを減らしながら、選抜的に脱離する。蛋白質は普通疎水性相互作用クロマトグラフィー内で、逆相クロマトグラフィーと同じように、疎水度に基づいて、分離されるが、分離過程が緩やか過ぎるため、適合構造(生物的活動)がそのまま溶出される確立が高い。逆相クロマトグラフィー内で、移動相と固定結合層との間の高インターフェーステンションの為、蛋白質が結合相表面上に広がる。このような状態を、疎水性相互作用クロマトグラフィー内で疎水度の低い固定相を水100%移動相といっしょに使うことによって、最小限に留め、一般的には、有機緩衝液のヴォリュ−ムを増やすことより、溶液の度合いはイオンの度合いを変化することによってコントロールされる。疎水性相互作用クロマトグラフィーの保持と選択度は固定相のタイプにほぼ依存している。疎水性リガンドを増やせば、保持度は増えるが、或る蛋白質の変性の確立も高くなる。疎水性固定相では、ある種の蛋白質は固定的にしか扱うことができない。リガンド濃度や構造、更に、固定相の疎水性は根本的に固定相の調節できる点で、各蛋白質の分離のため、最適化されるべきである。最適化されるべき移動相パラメーターは塩分濃度、塩のタイプ、塩のグラジエントのスロープ、pH、表面液か有機緩衝液の添加、温度である。蛋白質分子に具体的に塩が結合しない状態で、移動相内で比較的塩の濃度が高い場合、保持性は塩のモル量と水の移動相内の塩分のコンスタント塩分濃度下での表面張力の増進に線形的に増える。
下記の参考文献は疎水性相互作用に使用される異なったグループのタイプや表面が表記されており、ここにその文献を記述する。CHROMATOGRAPHY TODAY, Colin F. Poole and Salwa K. Poole, Elsevier Science Publishing Company, New York, 402 (1991).
毛細管チャンネル用の新規の表面が次に書かれており、その合成体は下記の実施例内に記述されている。
1) 毛細管チャンネルの蛋白質の表面で、抗体に結合親和性がある、例えば、蛋白質G，蛋白質A、蛋白質A/G, と蛋白質L。
a) 毛細管チャンネルの蛋白質の表面で、抗体のFcの領域、例えば、蛋白質Ｇ、蛋白質A，蛋白質A/G，に結合親和性がある。
b) 毛細管チャンネルの蛋白質表面で、抗体のFabの領域、例えば、蛋白質L、に結合親和性がある。
2) キレート環を有する金属の表面がある毛細管チャンネル(Zinc IDAを除く)
a) キレート環を有する金属NTA（ナイトリロトライアセテート）
i) 錫NTA
ii) 銅NTA
iii) 鉄NTA
iv) コバルトNTA
v) 亜鉛NTA
b) キレート環を有する金属NTA (イミノダイアセテート)（Zinc IDAを除く）
i) 錫IDA
ii) 銅IDA
iii) 鉄IDA
iv) コバルトIDA
c) キレート環を有する金属 CMA（カーボクシメシルアスパーテート）
i) 錫CMA
ii) 銅CMA
iii) 鉄CMA
iv) コバルトCMA
v) 亜鉛CMA
d) 蛋白質に親和性があるポリヒスグループを持ったキレート環を有する金属表面（Zinc IDAを除く）
e) 蛋白質に親和性があるフォスフェ−トグループを持ったキレート環を有する金属表面
3) グルタチオン表面を持つ毛細管チャンネル
4) ヌクレオチド(そのアナログ)表面を持つ毛細管チャンネル
a) ATP
5) レクチン表面を持つ毛細管チャンネル
6) ヘパリン表面を持つ毛細管チャンネル
7) アビジン表面を持つ毛細管チャンネル
a) 単量体
b) マルチの量体
チャンネルは抽出デバイスと運搬デバイスの両方機能する。抽出チャンネルはサンプルをピックアップするため移動し、洗浄液をピックアップし排泄し、その後、ターゲットにサンプルを落とす。これは抽出デバイスのサンプルや検出器に対しての動き(ナノスケール)の必要性があり、検出器に永久的に接続されていて、サンプルをデバイスの所に持ってくるのとおは正反対である。
サンプルはチャンネルを通して入れるか、ポンプと使って注入できる。サンプルはチャンネル内で何度も、脱離目標が達成できるまで、前後に動かすことができる。小さな粉塵や気泡はパフォーマンスには影響うがない。これは過去の固体抽出システムとは比較にならないぐらい卓越している。
洗浄液や脱離液もどちらの端部からでも注入し、幾度もチャンネル内で前後に動かすことができる。
一般的に、この発明の生体分子用の開放チャンネルデバイスと親和性抽出表面を介しての開放チューブ生体分子固体抽出のための方法は次のステップから構成されている。生体分子に親和性がある抽出表面の入ったサンプル溶液が毛細管チャンネル内を、生体分子のほとんどが抽出表面に結合できる速さで、通る。その後、脱離液が、生体分子のほとんどが溶出液内に溶出できる速さと時間で、毛細管チャンネル内を通る。
この工程は性能を上げる為、他のステップを足し、拡張できる。足すことのできるステップには、開放チャンネルカラムの表面を、抽出洗浄液や脱離液で洗浄、調節する。
抽出中は、サンプルの中に小さな粉塵や気泡が入っていてもかまわない。オプションとして、気体層をサンプルと同時に引き入れ、アジテートフローを、乱流も含めて、起すことができる。チャンネルの形状をアジテートのフローを起すために変えることができる。サンプルは開放チューブカラムのどちらの端部からでも注入できる。サンプルは抽出相との接触を促進せるため、前後に振るか、サンプルの動きを、吸着運動の遅いサンプルのために、止めて、とぎらせても良い。抽出の後、残存液は空気のようなガスを使って、チューブから、洗浄のステップを短くするため、押し出すことができる。
気泡の入った洗浄液や気体層を使うことができるし、チャンネル内の洗浄液を前後に振り、洗浄効果を上げることもできる。洗浄後、洗浄残存液は空気のようなガスを使って、脱離を容易にするため、押し出すことができる。
一般的に、脱離液の固まりをどちらの端部からでも、サンプルのヴォリュームを小さくし、濃度をあげるために、入れることができる。この固まりを抽出相上に前後に動かし、脱離を助長することができる。
開放チャンネルと沈積ターゲットの沈積チューブは、脱離された検体の沈積を助長させるため、連続的なチャンネルになっている。この形状において、脱離液は開放チャンネルの開いている端部から注入し、開放チャンネルを通ってターゲットに運搬され、脱離液は動くフロントがあり、検体を最初の層で脱離される。継続的に、このフローが沈積チューブを通ってターゲットに流れ、脱離された検体は高濃度の形態になり、ターゲットに到着する。ターゲットがチップの場合には、抽出はアレーを形成する工程の一環として行われる。解析計器にサンプルを直接入れる場合は、脱離された物質を計器のインターフェースのサンプル注入口に入れることができる。
脱離溶液は流水か溶液のプラグとして使うことができる。溶液のプラグを使用する場合は、溶液の緩衝液プラグを脱離液プラグの後に使い、サンプルがターゲットに沈積された時、緩衝液も沈積され、沈積されたサンプルを適切なpHにすることができる。この例は、蛋白質Gの表面から、ハイブリッドオマ溶液から抽出した、抗体IgGの脱離である。チューブからIgGを脱離するために10ｍMのpH2.5の燐酸プラグが使われる。沈積した溶液のpHを中性にするため、脱離溶液プラグの後に、100ｍMのpH7.5の燐酸塩プラグを使う。沈積した物質をSPRチップに置くことができる。
3種類の溶液、ローディング液、洗浄液、脱離液、がBOTSPEで使われる。ローディング液は一般的には検体抽出か混合のために使われる溶液と同じである。SPEの毛細管に検体の大部分が吸着することを保証するために、溶液を弱くするべきである。
洗浄液を使うのは随意である。使うときには、検体を残留させるためチャンネル内で妨げとなるルースな汚染物や他の物質を洗浄し、溶出する。ローディング溶液より強いが検体を脱離するほど強力ではない洗浄液を使うべきである。
脱離溶液は大部分の検体が脱離できる強さで、強く結合するのに妨害になる物質を残存させることである。溶液は最終検出と検体に適合性があるも物が選択される。この溶液は一般的によく知られている溶液である。典型的な、適切な溶液は塩化メチレン、アセトニトリル(少量のアルカリか酸性緩衝液といっしょに)、メタノール(大量の緩衝液、例えば、酢酸かトリエチラミンか水とメタン−ルかアセトニトリルの混合物)、エチルアセテート、クロロホルム、ヘキサン、イソプロパノ−ル、アセトン、アルカリ性の緩衝液、高強度のイオン緩衝液、酸性緩衝液、強い酸、強い塩基、酸性か塩基有機混合物、酸性か塩基性メタノ−ル、テトラハイドロフランと水、である。脱離溶液は吸着溶液とは違った混合性かもしれない。
テーブルDに固体相中抽出と脱離溶液に適切な相の例が記述されている。
Figure 2005529335
Figure 2005529335
第8図はこの発明の動かせるプラットフォームシステムとサンプル溶液とガスの入ったバイアルとプラットフォームに支えられたターゲットの見取り図である。この形態の中で、プラットフォーム36は普通のｘとｙ軸の水平面上の動きのコントロールシステム(xとｙ軸の動き)とターゲット40への沈積と複数のバイアルをサポートしている。抽出チャンネル42は開放チューブラー生体分子固体相抽出用の開放チューブデバイスである。抽出チャンネル42の内側の表面には結合する属性がある。例えば、親和性結合剤のような抽出作用剤で塗布されている。
ポンプ44は、抽出チャンネル42とつながっていて、抽出チャンネルを介して溶液を動かしている。この形態の中で、抽出チャンネル42とポンプ44はたての動き(z−軸の動き)用に普通のz-軸の動きのコントローラー42にサポートされている。コンピューターコントローラー48はポンプ44とｘとy−軸プラットフォームコントロ−ラーとz−軸ポンプと抽出チューブコントローラー46に接続されている。プラットフォーム36上のバイアル50、52、54、56は同じか異なった受容器である。例えば、バイアル50は溶液調節用のバイアル、バイアル52は溶液サンプル用バイアル、バイアル54は空気の入った空のバイアル、バイアル56は脱離溶液用のバイアルである。
ここに表記された、ポンプ44と他の形態内のポンプはスポイトか電気浸透フローポンプかUS特許6,149,815に記述されている流動体用誘導(IBF)ポンプかその他の微量のヴォオリュ−ムのフローを的確に測定するデバイスである。
開放チューブラー固体相抽出システムの、親和性結合の属性のあるチューブ抽出チャンネルの表面を使った、一般的な操作法は次のステップの順序で行われる。
1) 任意な最初のステップとして、抽出チャンネル42がコントローラー46で緩衝液用バイアル50に下げられ、緩衝液が緩衝液バイアル54よりポンプ44で吸い上げられる。
2) 抽出チューブ42とポンプはコントローラー48で上げられ、プラットフォーム36が抽出チューブの下に空のバイアルか廃棄物の受容器(表記されていない)を動かし、抽出チューブ42とポンプはコントローラー46で下げられ、緩衝液が空のバイアル54か廃棄物の受容器に出される。
3) プラットフォーム36が抽出チャンネルチューブ42の下にサンプルバイアルを動かし、抽出チューブ42の端部とポンプがコントローラー46で下げられ、サンプルが抽出チャンネルチューブ42に出される。これは生体分子のほとんどが抽出表面に結合される速度で行われる。その後、抽出チューブ42とポンプがコントローラー46で上げられ、プラットフォーム36が抽出チューブの下に空のバイアルか廃棄物の受容器(表記されていない)を動かし、抽出チューブ42とポンプはコントローラー42で下げられ、残存液が空のバイアル54か廃棄物の受容器に出される。
緩衝液バイアル50は抽出チャンネル42の下にプラットフォーム36で動かされ、抽出チャンネル42がコントローラー46で緩衝液バイアル50に下げられ、緩衝液がポンプ44で緩衝液バイアル50から抽出チャンネルチューブ42を介して吸い上げられる。
その後、抽出チューブ42とポンプがコントローラー46で上げられ、プラットフォーム36が抽出チューブの下に空のバイアルか廃棄物の受容器(表記されていない)を動かし、抽出チューブ42とポンプはコントローラー42で下げられ、残存液が空のバイアル54か廃棄物の受容器に出される。
抽出チューブ42とポンプがその後コントローラー46で上げられ、脱離液バイアル56がプラットフォオーム36で抽出チャンネル42の下に動かされ、抽出チャンネル42がコントローラー46で脱離液バイアル56に下げられる。
脱離液がポンプ44で、生体分子のほとんどが脱離溶液に脱離する時間と速度で抽出チャンネル42を介して緩衝液バイアル50から吸い上げられる。どのようにこれが行われるかは重要な点であり、詳細はここに詳説される。
抽出チューブ42とポンプはその後コントローラー46で上げられ、沈積ターゲットはプラットフォーム36で抽出チャンネル42の下に動かされ、抽出チャンネル42が抽出された表面を沈積する検体のターゲットにその端部が接触するように下げる。
第9図はこの発明の動かせるプラットフォオームシステムで、貯水槽からバルブシステムを通してサンプルや洗浄液/緩衝液や脱離液やガスが供給できる見取り図で、プラットフォームは電動スプレーインターフェースとターゲット両方サポートしている。この形態では、プラットフォーム60が形式的なx−とy−軸コントロ−ルシステム62に、水平面(ｘとy−軸の動き)の動きのため、接続され、沈積ターゲット64と質量分析器(表記されていない)の電動スプレー用インターフェース66をサポートしている。抽出チャンネル68は開放チューブラー生体分子固体相抽出の開放チューブラーデバイスある。抽出チャンネル68の内側の表面には、親和性結合作用剤やその他の抽出作用剤のような、結合する属性がある。
ポンプ70は、抽出チャンネル68と連絡して、ここで詳説されるように、抽出チャンネルに溶液を送り、通す。この形態の中で、抽出チャンネル68とポンプ70がたての動き(z−軸の動き)のため、形式的なz−軸の動きのコントローラー72にサポートされている。コンピュ−ターコントローラ−74がポンプ70、x−とy−軸プラットフォオームコントローラー62、z−軸コントローラー72、バルブ76に接続されている。
バルブ76は抽出チャンネル68、緩衝液・洗浄液78の供給チューブ、サンプル溶液80、ガス(空気の場合もある)82、脱離溶液84と連絡している。
第9図に記述されているシステムで、このシステムの、親和性結合属性があるチューブラー抽出チャンネルを使う開放チューブラー固体相抽出の一般的な操作法は、次の順序で行われる。
1) 随意の最初のステップとして、バルブ76が抽出チューブ68に導管78を介して緩衝液が流し込むように設置され、廃棄物へ排出される。
2) その後、サンプル溶液がサンプル導管80から抽出チャンネル68へバルブ76で検体を抽出するため使われる。
3) その後、ガスの導管82から抽出チャンネル68へ、ガスがサンプル溶液を廃棄物へお送り込むために使われる。
4) その後、脱離溶液が脱離液供給導管84からバルブ76で検体を脱離するため抽出チャンネル68に送られる。
5) 最後に、検体が入っている脱離溶液がポンプ70により電動スプレーのインターフェース66に排出される。交互的に、プラットフォーム60が抽出チューブ下の蛋白質チップのようなターゲット64にx−とy−軸プラットフォームコントローラー92によって位置され、検体が入った脱離溶液がポンプ100によって抽出チューブの先よりターゲットに排出される。
第10図はこの発明の動かせるプラットフォームシステムで、貯水槽からバルブシステムを通してサンプルや洗浄液・緩衝液や脱離液やガスが供給できる見取り図で、プラットフォームはサンプルと電動スプレーとターゲットをサポートしている。この形態では、プラットフォーム90が平面上(x−とy−軸の動き)の動きのために普通のx−とy−軸コントロールシステム92に接続され、沈積ターゲット94、質量分析器の電動スプレーインターフェース96(表記されていない)、サンプルバイアル108がサポートされている。抽出チャンネル98は開放チューブラー生体分子固体相抽出用の開放チューブラーデバイスである。抽出チャンネル98の内側の表面には親和性結合作用剤や他の抽出作用剤のような結合する属性がある。
ポンプ100は、抽出チャンネル98と連絡して、ここで詳説されるように、抽出チャンネルに溶液を送り、通す。この形態の中で、抽出チャンネル98とポンプ100がたての動き(z−軸の動き)のため、形式的なz−軸の動きのコントローラー102にサポートされている。コンピュ−ターコントローラ−104がポンプ70、x−とy−軸プラットフォオームコントローラー92、z−軸コントローラー102、バルブ106に接続されている。
バルブ106は抽出チャンネル98、緩衝液・洗浄液110の供給チューブ、ガス(空気の場合もある)112、脱離溶液114と連絡している。
第10図に記述されているシステムで、このシステムの、親和性結合属性があるチューブラー抽出チャンネルを使う開放チューブラー固体相抽出の一般的な操作法は、次の順序で行われる。
1) 随意の最初のステップとして、バルブ76が抽出チューブ68に導管78を介して緩衝液が流し込むように設置され、廃棄物へ排出される。
2) その後、サンプル溶液がサンプルバイアル108からポンプ100で抽出チャンネル98へ入れられ、検体をサンプルから抽出するため、バルブ106によって、ポンプと抽出チューブ98の連絡が開始する。
3) ガス導管112からガスが随意的に、使われたサンプル溶液を廃棄物へ排出するため、抽出チャンネル98へ送られる。
4) その後、脱離溶液が脱離液供給導管114からバルブ106で検体を脱離するため抽出チャンネル98に送られる。
5) 最後に、検体が入っている脱離溶液がポンプ100により電動スプレーのインターフェース96に排出される。交互的に、プラットフォーム90が抽出チューブ98下の蛋白質チップのようなターゲット94にx−とy−軸プラットフォームコントローラー92によって位置され、検体が入った脱離溶液がポンプ70によって抽出チューブの先よりターゲット94に排出される。
第11図はサンプルと洗浄液/緩衝液と脱離液とガスが圧力容器から供給できる見取り図で、動かせるプラットフォームはむだ物やターゲットをサポートしてり、抽出チャンネルの両端部は動かすことができる。この形態では、プラットフォーム120が平面上(x−とy−軸の動き)の動きのために普通のx−とy−軸コントロールシステム122に接続され、沈積ターゲット124と廃棄物受容器126をサポートしている。抽出チャンネル68は開放チューブラー生体分子固体相抽出の開放チューブラーデバイスで、その注入口の先129と抽出口の先131は両方動かすことができる。抽出チャンネル98の内側の表面には親和性結合作用剤や他の抽出作用剤のような結合する属性がある。緩衝液・洗浄液バイアル132、サンプルバイアル134、ガスバイアル136、脱離液バイアル138はガス圧力導管140にバイアルに圧力を掛けるため接続されている。
第11図に記述されているシステムで、このシステムの、親和性結合属性があるチューブラー抽出チャンネルを使う開放チューブラー固体相抽出の一般的な操作法は、次の順序で行われる。
1) 任意的な最初のステップとして、抽出チャンネル128の注入口の先129は圧力が掛かった緩衝液バイアル132の中に位置され、抽出口の先131は廃棄物バイアル126の中に位置され、緩衝液を抽出チューブを通して送られる。
2) その後、注入口の先129が圧力の掛かったサンプルバイアル134の中に位置され、抽出口の先131は、サンプル溶液を検体を抽出するため抽出チャンネル128へ送るために、位置される。
3) その後、注入口の先129は圧力の掛かったガスバイアル136の中に位置され、抽出口の先131は、使用済みのサンプル溶液を抽出チューブ128から廃棄物受容器126に排泄するように位置されている。
4) その後、注入口の先129は圧力の掛かった脱離液バイアル136の中に位置され、抽出口の先はターゲット124の沈積ゾーンの中に位置される。ターゲットの沈積ゾーンの配置はコンピューターコントロ−ラー130で制御されている。このステップは脱離溶液を抽出チャンネルを通し、脱離する検体を脱離溶液の先端層へ送り、先端層を沈積ゾーンに沈積する。
第12図はこの発明の毛細管スポイトの単体である。スポイト200は環状のピストンリングが付いた普通のプランジャー202で、外側の表面206がスポイトの胴体210の内側の壁208を密封するようにできている。典型的にはこの容積は1−100mlで、コンピューターか手動でコントロールできる。単体のスポイトが使われた場合は、スポイトのヴォリュームはプロセスされたサンプルヴォリュームと溶出液のヴォリュ−ムと分かち合うことになる。ほぼ全面的にサンプルをプロセスするスポイト(ヴォリュームの大きさを保つため)は、溶出液(ヴォリュームを小さく保つ)をプロセスするのとは異なったスポイトを使う。典型的にこれは抽出チューブとスポイトをつなげるルアーアダプターである。使い捨てのスポイトが使われない場合、ピペットの先やプラスチックデバイスのような使い捨てのチェンバーを使って、抽出チューブとスポイトを接続できる。スポイトの端部は先が次第に細くなっているコネクター212で、毛細管の取り付けの受容器がかみ合うようになっている。
毛細管218は抽出相がある金属かガラスか熔融シリカかプラスチックｎチューブである。典型的な、普通の形状は、長さ1−10cmで容積0.1-100mlである。毛細管218の上側の端部の外の表面220は毛細管218の取り付け220の内側の表面222と結合されている。毛細管220の内側の壁の表面224に抽出作用剤を第1図に記述されているように塗布することができる。毛細管218の下部の先226は抽出される検体が入ったサンプル溶液に接するように位置される。
プランジャー202の上に動く動作が毛細管の先226から毛細管218へ溶液を吸い上げ、プランジャー202の下に動く動作が毛細管の先226の方か先を通して溶液をはきだし、プランジャー202を前後に細かく動かす動作が溶液の固まりを毛細管の上下に、溶液の中の検体と毛細管の壁とそこに付着した抽出作用剤の、詳細が第1−4図に記述されているように、相互作用を促進させるため、動かすことができる。
この発明のデバイスや装置や方法は蛋白質チップや蛋白質や他の生体分子分析用に表面にスポットをつける物質の準備に使うことができる。
蛋白質チップの表面力学は下記の方程式によって発現される。

A + B = AB
ABはぶん分解シグナルを発生することができ、Aはチップ結合の半分で、Bはチップの同種の結合要素である。或る種の具体的な相互作用があることが前提になっている。「AB」以外の結合の出来事がABのような体裁があるが、バリアンスはA以外の (すなわち、汚染された)、Bと或る親和性がある、部分が理由で生じるかB以外の (すなわち、汚染された)、Aと或る親和性がある、部分が理由で生じるかこれらのコンビネーションで起き、どの出来事もABの体裁がある。この特性が或る蛋白質チップの実験の成功か失敗を決め、この技術の最も無視され、平凡かされた点である。
蛋白質チップ以外のチップ(具体的にDNAチップ)の場合、Aのグループは精製や濃縮は、チップの中で合成され、PCRで増幅され、スポットされる為、必要ではない。非常に短いペプチド以外は、蛋白質の複雑な構造のため、Aのチップ上での合成はできない。それ故に、蛋白質チップ用にA物質を準備することはその物質の精製の重要性を物がったている。更に、A物質は頻繁に、ABが最大の確立で生じるようにするため、高度の濃縮を必要とする。
蛋白質チップは表面上に微量のお「A」適応することが特徴とされている。しばしば、その量は各スポットに対して10 nLかそれ以下である。数多くの蛋白質は準備するのが難しいし(又は)、コストが嵩むので、スポットと同じ大きさで精製でき、濃縮できれば、廃棄の量を削減すことである。これは「ジャストインタイム」の精製にもつながり、チップの準備を精製と同時にできる。
異なった物質がチップにAとして持ってこられるが、各物質は精製と(か)濃縮を必要とする。これらの物質の例は、親和性分子の抗体(例えば、IgG, IgY，etc)、親和性分子としての一般的な親和性蛋白質(例えば、scFvs, Fabs, 抗体、ペプチド、etc.)、他の一般的な親和性の特性がある蛋白質、親和性分子としての核酸・(フォト)アプタマ−である。
チップの表面にAを付着させる各異なった手法は精製と濃縮を必要とし、付着化学に準拠していなければならない。付着化学の例は、蛋白質チップの基板に直接・間接的に固定させることで、例えば、金の表面にチオール基が共有結合するケースがある。共有結合付着はチップの表面上で付着する機能グループのもう一つの付着方法であり、これらは自己重合の単一層で、固定化したハイドロゲル等のような他のグループといっしょにか無関係に、付着する。チップ表面上で機能グループ・リガンドに非共有結合・親和性付着するのはもう一つの付着方法で、この方法の例は、IgGs、サリチルヒドロキシム酸グループと結合したフェニルホウ素酸、ビオチン化したリシン基・システィン基と結合した単一層ストレプタビジン、等の蛋白質Aか蛋白質Gである。
チップに持って来るサンプルか検体は構成と相互作用の形態が色々ある。
Bを操って、具体的なAB相互作用を達成するには幾つかの方法がある。一つの仕方は、汚染物がアルブミンやフィブリン等のように十分に定義化されていれば、Bではない、抵触可能な汚染物を取り除くことである。
もう一つの仕方は、Bをトラップ(一つ一つか群で)することでB以外の汚染物を取り除くことで、汚染物を洗浄し、放出する。その時、同時にBが濃縮化され、その結果、ABが生じる感度を上げることができる。
スケールのチップが非常に小さいように、サンプルのスケールも、微量のサンプルが分析できれば、小さくする機会がある。サンプルは貴重な物質故に、精製と濃縮することによって、これを現実化できる。チップの準備のようにこれも「ジャストインタイム」の形態で実現できる。
検出のイベントは或る種のAとBの相互作用を必要とし、検出イベントの中心プレーヤー(蛋白質チップの一部ではないが故に)はBである。B(又は、Bのような上記の物質)の存在の検出の手法は色々あり、その中には、表面プラズモン共鳴イメジング(HTS Biosystemsが提唱しているGrating-coupled SPRかBiaCoreのプリズムかKretschmannベースSPRかProtiverisのミクロカンチレバーをつかった検出案)のようなAがBと相互作用し、ラベル無しのBの検出ができる。
検出方法にはAと相互作用するB(Bのような物質)の物理的なラベル、その次が、ABの対の空間イメ−ジング(すなわち、BD Biosciences Clontechが提唱する標準蛍光イメージングのCy3/Cy5差動ラベリング、Jeriniが提唱するオートラジオグラフィーイメージングのキネ−ゼ基板の放射性ATPラベリング)かその他の適切な技術が含まれる。蛍光タグの場合、ZeptoSensが提唱する蛍光導波イメージングで高感度を達成できる。
検出方法は具体的な第三者のBの親和性パートナーCと相互作用するAB複合体、Cは蛍光タグ化されてシグナルを発生できるかグループといっしょにタグ化され、その場所で化学作用できる(蛍光部分の発生、光の直接発生、等)、を含む。ZymyxとSomaLogicが提唱する蛍光イメージング、HTS BiosystemsとHypromatrixが提唱するケミルミイメージング、導波技術を使った蛍光イメージング、その他の適切な検出方法でこのAB-C結合イベントの検出が発生する。
アレイヤーは生体分子生物研究や診断用に使用されるチップ上に核酸や蛋白質やその他の試薬のスポットを配置する器具である。アレイヤーはチップの製造と使用の両方に使われる。製造工程ではアレイヤーは化学試薬を決められたチップのスポット運搬するために使われる。これは、検出用に使われる化学複合体が各決められたアレーのスポットで形成されるため、複数のステップのプロセスになることもある。
各プロセスでサンプルの準備が必要になるかもしれない。或るケースの場合、DNAが精製され、チップ上に沈積される。その後、相補的DNAかRNAの入ったサンプルがチップと作用する。サンプルが作用する前に、核酸がサンプル内の他の物質(蛋白質、粉塵、炭水化物、等)から精製される。他のケースでは、蛋白質チップがアレー内に具体的な蛋白質が位置され、製造されることもある。その後、蛋白質の入っているサンプルが蛋白質・蛋白質の相互作用を計測するため異なったアレーの場所で作用することができる。
今日のサンプル準備用の技術は伝統的な過去の技術、例えば、沈降、カラム抽出、遠心分離、等、に依存しており、最後に、精製された物質かサンプルがバイアルかプレートか複数のバイアルに入れられる。バイアルないの精製された物質はスポッターで取り上げられ、アレー上にデポジットされる。この発明の中では、サンプル準備用に使われる開放チューブカラムの端部が、アレー上に物質をスポットするために使われるスポッターの先に直接接触している。開放チューブカラム内で溶液を取り上げ、排出する技術はキャピラリー電気泳動機器で使われるのと似ていて、微量のサンプルが取り上げられ、キャピラリーに排出される。これはDNAシーケンス用のキャピラーリーのそうちのような、96と384のキャピラーリーアレー上でもできる。関連した技法がAndre Marziali, et al., Annu. Rev. Bimet. Eng., 3:195 (2001), に記述され、その内容の全部がここに参考文献として含まれている。或るケースの場合、固体相抽出に使われる開放チューブカラムの端部がスポッター自身である。関連した技法はMICROAARAY BIOCHIP TECHNOLOGY, Chapter 2:Microfluuidic Technologies and Instrumentation for Printing DNA Microarrays, Mark Schena (Editor), Telechem International, Eaton Publishing, ISBN1-881299-37-6 (2000), に記述され、その内容の全部がここに参考文献として含まれている。
生体分子の分析の為の質量分析計の応用として、分子は液体か固体相から気体と真空相に移動されなければならない。分子のほとんどが大きく、壊れやすい為、最大に効果的な真空相から移動する方法はマトリックス支援レーザ脱離イオン化法(MALDI)かエレクトロスプレーイオン化法(ESI)である。
質量分析計には根本的に蛋白質を分析する上において、二つの方法, ボトムアップとトップダウン分析、がある。ボトムアップ分析では、蛋白質がコントロールされた環境で操作、破壊し（普通、酵素によって消化されるプロセス）、分析し、その後、色々な部分のデータをもとに、組み立てられる。トップダウンの分析は蛋白質全体を使い、随意的にイオン源で蛋白質を解体し、蛋白質の主体を明らかにする。両方法とも質量分析計で分析するのに長時間掛かるが、トップダウンのアプロ−チの方が一般的一番時間が掛かる。理想的な環境下では、静的なサンプルが測定され、パラメーターはソースが履行されたパラメーターである。データが分析される方法は、蛋白質をフルに分析するため多岐にわたる。
サンプル注入方法の数多くは「ぶっつけ本番」方法である。HPLCのカラムから出てくるサンプルはエレクトロスプレーイオン化ソースのノズルに継続的フローとして出てくる。トップダウン分析ができるようにサンプルを出すには、サンプルのフローを遅らすことができる。この方法はピークパーキングと呼ばれる。このように、サンプル居留時間を十倍以上に上げることができ、分析の感度を八倍以上に上げる事ができる。しかしながら、この方法は、分析が速く行われなくてはならないため、頻繁に計器が実行できる速さより速くする為、柔軟性に欠け、不十分である。
このことは、固体相抽出デバイスからサンプルを出す場合もあてはまる。サンプル全部を、分析が完了する前に、取り入れることができる。質量分析計器にサンプルを非連続的に、均一的に取り入れる方が望ましい。このように、質量分析計法と工程をサンプルに適合させ、最適化することができる。
開放チューブ抽出デバイスから装置を使って脱離した物質を直接エレクトロスプレーノズルにデポジットすることができる。
MALDIは一般的には飛行時間 (TOF) 型質量分析装置 (MALDI-TOF) にインターフェースしていて、ESIは四重極型、イオン透過性、TOF質量分析装置にインターフェースしている。MALDIとESIのアプローチは両方、蛋白質とペプチドの混合物全貌を判明するために有益であり、精製の前と後に、ms・ms分析のためペプチドオの分解を誘発するためである。最近の質量分析計は生体分子の化学合成や移行の正確性を評価するために有益である。サンプルの質量分析計で測定した数値と計算で算出した数値の違いは合成の間違えか移行後か化学的変化が起きたことを示唆する。生体分子は任意的に質量分析装置内で分解し、その結果分解された分子が的確に判明できる。このように分解された分子のパターンはペプチドのms・msシーケンス用とデータバンクでの正体究明に有益である。
エレクトロスプレーは揮発性の酸と有機溶液がサンプルと混合され、高圧にされた誘電針を通って行われる。チャージされた小滴は針の先から吹き(か噴出される)だされ、質量分析装置に入れられ、熱と真空で、入れられる時に乾燥させる。水滴が渇いた後、残りのチャージされた分子が電磁レンズでマス検出器に導入され、分析される。エレクトロスプレー質量分析計を使って異なった分子、小さなペプチドから大きな形を保った蛋白質まで、の質量を測定することができる。今日使われている計器の測定できる質量の範囲は2000から10000マスユニットではあるが、蛋白質のほとんどがエレクトロスプレー時にマルチチャージされ、計器は分子の質量とチャージの比率を測定するが故に、蛋白質のほとんどがチャージされて、m/zは質量の範囲に収まる。測定された、異なったm/zから蛋白質の質量の全貌を算出するには、結果を除算し、蛋白質の質量をフルにもどすことである。
MALDI-TOFでは、蛋白質が金属ターゲットに結晶化した有機マトリックスとしてデポジットされる。サンプルは乾燥され、質量分析器に搬入される。真空ができた後、マトリックス結晶体が光のエネルギーを高エネルギーレーザの短い閃光から吸収する。マトリックスはすばやく昇華し、真空相へ生体分子を運び込む。サンプルとマトリックスのプルームが強い電磁界に入り、チャージされた分子が自由飛行地帯に入り、一番遠く離れた端部にある検出器にぶつかるまで飛んでいる。蛋白質の質量はこの飛行時間で算出される。質量の正確な測定は解かっている標準的な飛行時間と比較して得られる。飛行時間は蛋白質の質量のロガリズムと比例していて、大きな蛋白質ほど遅く、検出器に遅れて到着する。
組み換え蛋白質を毛細管チャンネルで精製する際、組み換え蛋白質は一般的に融合タグを処理し、マトリックスから発現蛋白質を親和性ベースの分離を可能にする。融合タグは各種色々アリ、従って、数多くの異なった表面機能がある。
最も通常な融合タグは「6-ヒス」と一般的に呼ばれるタグで、六つの連続的につながったヒスチヂン残基で構成されている。毛細管の表面で使われる幾つかのキレート環を有する金属グループ、金属IDA、金属NTA、金属CMA(CMA: carboxymethylated aspertate)がある。透過した融合蛋白質はイミダゾールやエチレンヂアミン四酢酸(EDTA)のような適切な塩によってヒスチジン金属の配位を崩壊し、溶出する。
組み換え蛋白質を融合タグを通して精製するのは他の方法もある。抗体はどのペプチドシーケンスを通す(一般的なのは、FLAGタグである)ことでできる。アビジン(単量体か複量体の) は発現システム内の選択されたビオチン標識化されたペプチドシーケンスを精製することができる。カルシュームでチャージされたカルモジュリンを使って、よく「カルモジュリン」（CBD）と呼ばれる、ペプチドシーケンスを精製し、溶出はカルシュームをエチレングリコール四酢酸(EGTA)を使って取り除く。グルタチオンを使って、グルタチオンS−トランスフェラーゼ蛋白質(GST)を運ぶ融合蛋白質を精製し、GSTは頻繁に特定のプロテアーゼで切断される。アミローゼは、マルト−ゼと結合した蛋白質(MBP)を運ぶ融合蛋白質を精製し、MBPは頻繁に特定のプロテアーゼで切断される。セルロースはセルロース結合ドメインタグと呼ばれるペプチドを運ぶ融合蛋白質を精製し、その後、エチレングリコールで溶出する。S-蛋白質(リボヌクレア−ゼAから誘導された)は、S-蛋白質に特定の親和性があるペプチドを運ぶ融合蛋白質を精製し、特定のプロテアーゼで切断する。
Bis-arsenical fluoresceinの染色FIAsHがある親和性表面を作ることも可能である。例えば、FIAsH染色はペプチドシーケンスタグCCxxCC(xxはREのようなどのアミノ酸でも良い)を運ぶ融合蛋白質を精製する。その後、蛋白質は1,4-dithiothreitolかDTTで溶出される。
毛細管チャンネルは抗体を精製するために使うことができる。抗体は頻繁に強く構造を維持する特色があることを前提に精製される。例えば、A蛋白質かG蛋白質かA/G蛋白質融合体の表面を造り、IgG 抗体をそのFc領域(G蛋白質の場合、Fab抗体破片領域の低親和性で)を通して精製可能である。これらは頻繁に低いpH2.5で溶出される。IgG抗体をそのFab抗体破片領域を通して、軽鎖か k軽鎖であれば、精製可能である。これはL蛋白質の表面を使って達成できる。
微小分子のリガンドも疎水性チャージ相互作用の原理をもとに、分離することが可能である。4−メルカプトエチルピリヂンや2−メルカプトピリヂンのようなリガンドはIgGのような抗体を透過することができ、A蛋白質かG蛋白質の場合よりは低いマイルドなpHに変えることで溶出できる。例えば、溶出は4−メルカプトエチルピリヂンのpHを4(その反面、A蛋白質とG蛋白質のｐHは2.5)にすることによってできる。
更に、他の抗体を使って抗体を精製することができる。例えば、毛細管の表面上の固定された抗体を使って、IgE (抗IgEと)の精製、IgM (抗IgMと)の精製、IgA(抗IgAと)の精製、IgD(抗IgDと)の精製、IgG(抗IgGと)の精製が可能である。
毛細管チャンネル使ってホスホペプチドとホスホ蛋白質を毛細管の壁に適切な表面を作ることによって精製できる。一つの仕方は、燐酸塩グループと金属イオンの自然に生じる相互作用を利用して行うことである。それ故、ホスホペプチドとホスホ蛋白質はIDAかNTAかCMAで作られたキレート環を有する金属上で精製できる。
これらのホスホペプチドとホスホ蛋白質を毛細管の表面で固定された抗体で精製することも可能である。毛細管のお壁に、ホスホチロシン残基とホスホセリンとホスホトレオニン残基に特定された抗体を固定することが可能である。蛋白質内の、特定のキナーゼ内の特定に結合された燐酸化したチロシンのような燐酸化された特定の場所へ結合する抗体を固定することも可能である。これらの抗体は一般的に燐酸化した特定場所の抗体(PSSAs)と呼ばれる。一度吸着し、透過したホスホ蛋白質とホスホペプチドは低いpHで溶出することができる。
更にもう一つのホスホペプチドとホスホ蛋白質を精製するアプローチはビオチンが付着した燐酸塩グループからの誘導体が関係している。ビオチン化したホスホ蛋白質かホスホペプチドはアビヂン(単量体か複量体の)が塗布された毛細管で精製することができる。ホスホペプチドとホスホ蛋白質の精製の為に使われた毛細管チャンネルの説明。
開放チューブ毛細管で蛋白質複合体を精製する方法は幾つかある。その一つのやり方は、自然に相互作用するパートナーと複合体を組み換えの「えさ」の蛋白質と作ることに関係している。これらの複数の蛋白質複合体はその後、「えさ」に付着したフュージョンタグを通して精製される。これらのタグ化された「えさ」の蛋白質は毛細管の表面に付着した、キレート環を有する金属グループや抗体やカルモジュリンやその他の上記の組み換え蛋白質の精製んための表面グループのようなグループを通して精製される。
フュージョンタグを通さず、「ネイティブ」(組み換えされていない)の蛋白質複合体を精製することは可能である。これは複数の蛋白質複合体の一つの蛋白質の抗体を固定することによって達成する。このプロセスは一般的に「共同免疫沈降」と呼ばれる。複数の蛋白質複合体は低いpHで溶出することができる。
毛細管チャンネルは蛋白質のクラス全体を構造内の強く保存されるモチーフを根本原理として精製することができ、毛細管の表面に付着した親和性のリガンドは保存されるモチーフと反転可能な形で結合する。例えば、特定のヌクレオチドを毛細管の内側の表面に固定化できる。これらのヌクレオチドはadenosine
5’-triphosphate (ATP), adenosine 5’-diphosphate (ADP), adenosine 5’-monophsphate (AMP), nicotinamide adenine dinucleotide (NAD), nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP) を含む。これらのヌクレオチドは酵素を精製するために使われ、キナーゼ、ホフハターゼ、熱ショック蛋白質、脱水素酵素、(数多い内の一部を記載)のようなヌクレオチドに依存する。
毛細管の内側の表面に固定する、蛋白質群を精製する他の親和性グループがある。レクチンは毛細管の内側の壁に固定し、糖蛋白質を精製することができる。コンカナビリンA(コンA)とレンチルレクチンは糖蛋白質と膜蛋白質を固定することで、精製し、麦芽レクチンは糖蛋白質と細胞(特に、T-細胞 リンフォサイト)を固定することによって、精製する。レクチンではないが、フェニルホウ素酸の小さな分子が毛細管の内側の壁に固定化され、糖蛋白質の精製に使うことができる。へパリンを毛細管内の表面に固定化し、DNA結合蛋白質(例えば、RNAポリマレーゼIとIIとIII, DNAポリマレーゼ、DNAリガーゼ)の精製に有効的に使うことが可能である。更に、固定化されたヘパリンは各種の凝固化する蛋白質(例えば、アンチトロンビンIII，ファクターVII, ファクターIX, ファクターXI、ファクターXIIとXIIａ，トロンビン)、他のプラズマ蛋白質(例えば、プロペルジン、ベータIH, フィブロネクチン、リプセーゼ)、リポ蛋白質(例えば、VLDL, LDL, VLDLアポ蛋白質、HOLP, 数多い内の一部記載)とその他の蛋白質(血小板ファクター４、HBs抗原、ヒアルロニダーゼ)の精製に使われる。これらの蛋白質のタイプは普通血液や(か)血漿内で作られる。この種の蛋白質は蛋白質チップのような技術を駆使して、すばやく分析することを余儀なくされている為、蛋白質チップでの分析の前に、ターゲットの精製と濃縮を初期段階ですることは、チップの性能を上げることである。
更に、毛細管の内側の表面に、ドメインと相互作用するように作られた蛋白質の精製用の蛋白質相互作用のドメインを付着できる。毛細管の内側の表面に固定化される或る相互作用のドメインの一つはSrc-homology ２(SH2)ドメインで、多種の蛋白質の中の特定のホスホチロシンが入ったペプチドモチーフと結合する。SH2ドメインは先に樹脂上に固定化され, 上皮増殖因子(EGFR)の燐酸化を試験管の中で分析が、親和性クロマトグラフィー・質量分析計での実験を行うため、親和性試薬として使われる。(Christian Lombardo, et al.., Biochemistry, 34:16456 (1995)を参照). SH2ドメイン以外に、毛細管の内側の表面上に、蛋白質でその認識ドメインがあるを生成するため、他の蛋白質相互作用ドメインを固定化できる。数多くの蛋白質相互作用ドメインは(Tony Pawson, Protein Interaction Domains, Cell Signaling Technology Catalog, 264-279 (2002) を参照)に記述されている。
他の特定な種類のリガンドとして、ベンザミジンを、セリンプロテアーゼを精製するため、毛細管の内側の表面に固定化することができる。染色リガンドを毛細管の内側の表面に、脱水素酵素や還元酵素やインターフェロンと数ある中の一部を記載、を精製するため、固定化できる。
毛細管チャンネル内の流れる水路の自然形態のため、蛋白質と比較しても比較的大きな構造をもった、分子、或いは分子群を取り込み、精製し、濃縮できる。毛細管チャンネルは表面に適切な結合機能あれば、一般的な抽出カラムで起こる亀裂や(フリット、或いは、パックドベッド)ろ過作用のような問題なしにこれらの構造を抽出することができる。溶液を毛細管チャンネルに入れる場合、或いは、毛細管チャンネルに溶液を流し込む時は、構造に亀裂が生じないよう、慎重に扱うべきである。フローの速度を遅くすることが必要になるかもしれない。抽出される大きな構造の例は蛋白質複合体やウイルスや特定表面グループで捕える細胞全体である。
実施例44は同位体符号化親和性タグ(ICAT)ペプチドの固体相抽出の複数次元のステップごとの工程が記述されている。或る実施例で、大量の蛋白質を分離したい場合は、抽出のため固体相表面領域を増やすため、パックドベッド、或いは、チューブの二次的構造が必要になるかもしれない。このような場合、パッキング、或いは、二次的構造は液層や気体層の通過ができるようになっている。一部は強度なイオンか高いpHで回収され、下記の親和性分離方法でプロセスされるが、適切な調節が、親和性毛細管に大量のサンプルが入れられることや(か)pHの変化のため、必要になる。
或る実施例の場合、アビヂン親和性カラムで集められた部分は、同位体符号領域から切断するため、下記の逆相分離法で分離する前に、よりもっとプロセスされる。切断は集められた部分に直接、Huilin Zhou, et al., Nature Biotech., 19:512 (2002),に記述されているように光開裂で行われるか、又は、Brian Williamson, et al., Proceedings of the 50th ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics, Orland, FL June 2nd-6th 2002, Orland, FL, Poster #WPA023 に記述されているように、酸で切断されるか、又は、標準的な手法で集められた部分が乾くまで行われ、Williamson, et al., 50th ASMS Conference Proceedings, June 2nd-6th 2002, Orland, FL, Poster #WPA023 (2002)に記述されているように、酸での切断はTFA-トリエチルサイレインを加えることによって達成される。或るケースのリリースとラベリングで得られるペプチド混合物とプロテオリシスがそれほど複雑でない場合、イオン交換分離の次元をスキップし、親和性分離の次元に直接進むことができる。イオン交換分離の次元を飛ばす例は LC Packings/Dionex’ application Note, “2D Analysis of Isotope Coded Affinity Tag (ICAT) Labeled Proteins," Application Note UltiMate Capillary and Nano LC System, Proteomics #09に記述されている。しかし、この手法を使う場合は、イオン交換分離の次元で排除されるので、サンプルを単量体アビジンカラムに入れる前に、合体していないICATタグを除去してから使うよう勧める。
或る実施例の場合、イオン交換分離と親和性分離の次元を飛ばし、サンプル蛋白質のリリース、リシス、ラベリングのステップから(すなわち、この例の始めの最初のステップに記述されているように)、固体相同位体符号化タグ試薬、Huilin Zhou, et al., Nature Bitech., 19:512 (2002)に記述されているように、が使われる時のように 、逆相分離次元へ進められか、このケースの中では、同位体符号化ペプチドが固体相サポートから光開裂で、Huilin Zhou, et al., Nature Bitech., 19:512 (2002) に記述されているように、切断されか、Brian Williamson, et al., Proceedings of the 50th ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics, Orland, FL June 2nd-6th 2002, Orland, FL, Poster #WPA023 に記述されているように、酸で切断される。
この発明は下記の具体的な実施例で説明され、その中で過去形で説明されている工程はラボで行われた実施例である。現在形の例はラボで実際に行われなかった手順で、この書き物の為に推定的に道理付けられたものである。
実施例１
毛細管チャンネルをHFエッチ調節する
毛細管(Polymicro Technologies, Phoenix, AZ)の太さ25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300 mm IDと長さ1cmから5mを購入する。この例では、長さ1m100mm IDの熔融シリカ毛細管をメタノールの中に5%(w/v)のフッ化水素アンモニウムが入った溶液で満たし、常温で一時間10mL/分の流れの速さで流して洗う。溶液は15分でHPLCグレードの非イオン化された水に変わり、その後、窒素ガスで洗われ、二時間続けて300°Cでガスフローで熱せられる。この高温で、フッ化水素アンモニウムの残基がフッ化水素ガスとアンモニアに分離し、窒素ガスでチャンネルから排出される。最後に、毛細管は冷却され、0.1 M HCL で30分洗浄され、15分間HPCLグレードの非イオン化された水で10mL/分の流れの速さで流し洗われ、その後、HPCLグレードのメタノールで洗浄され、保管される。食刻されるチャンネルの直径の長さを伸ばすかは、減らすかは使われる溶液の流れの速度が速くなるか、遅くなるかにつながっている。
実施例2
毛細管を水酸化エッチ調節する
毛細管(Polymicro Technologies, Phoenix, AZ)の太さ25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300 mm IDと長さ1cmから5mを購入された。この例では、長さ1m 100mm IDの熔融シリカ毛細管を0.1 Mの苛性ソーダで満たし、常温で一時間流し洗われた。その後、塩基溶液はHPLCグレードの非イオン化された水で30分間洗浄され排出された。溶液は0.1 M HCLに変えられ、毛細管は30分間流し洗われた。その後、溶液はHPLCグレードの非イオン化された水に変えられ、毛細管は15分間流し洗われ、最後に、HPLCグレードｎアセトンで流し洗われ、保管された。溶媒の流れの速さは10mL/分であった。食刻されるチャンネルの直径の長さを伸ばすかは、減らすかは使われる溶媒の流れの速度が速くなるか、遅くなるかにつながっていた。
実施例3
ポリアクリルアミドを毛細管チャンネルに付着させる事
200 mm ID 50 cmの毛細管が実施例１か２のように食刻される。熔融シリカ毛細管がg-methacryloxypropyltrimethoxysilane (Sigma-Aldrich, Milwaukee, WI, PN 44,015-9) (30mLが1.0 mLの60%(v/v)のアセトン/水と混合される)と反応する。毛細管が満たされ、流れが止められ、毛細管が常温で反応する。一時間後、毛細管が水で反応を止めるため洗浄される。触媒の入った3% (v/v) アクリルアミドの溶媒が準備され、毛細管内にすぐポンプで注入される。アクリルアミド(30mL)と1.0 mL の2mgのアンモニウム過硫酸塩と0.8mgのTEMED (N,N,N’,N’-tetramethyl-ethylenediamine)の入った1.0 mLのガスが抜かれた水が混合される。毛細管は50 mL/分ですばやく満たされ、フローが止められ、毛細管が一時間常温で反応される。一時間後、毛細管は反応を止めるため、非イオン化された水で流し洗われる。二者拓一的に、重合化したアクリルアミド溶媒を4°Cで準備して、ポンプで毛細管に注入し、重合化した溶媒が常温で暖められ、一時間反応される。最後に、毛細管は非イオン化された水で洗浄され、保管される。
実施例4
毛細管チャンネルに強い酸性カチオン交換体のスルホン酸を結合する事
200 mm ID 50 cmの毛細管が実施例1か２のように食刻される。熔融シリカ毛細管がg-methacryloxypropyltrimethoxysilane (Sigma-Aldrich, Milwaukee, WI, PN 44,015-9) (30mLが1.0 mLの60%(v/v)のアセトン/水と混合される)と反応する。毛細管が満たされ、流れが止められ、毛細管が常温で反応する。一時間後、毛細管が水で反応を止めるため洗浄される。その後、毛細管がドライTHFで流し洗われる。
二者択一的に、g-methacryloxypropyltrimethoxysilane毛細管が水で洗浄され、フリーラジカル消去剤が入っていない2−アクリルアミド−2−メチル−1−プロパンスルホン酸(Lubrizola)(Sigma-Aldrich, Milwaukee, WI, PN 28,273-1)と反応する。触媒の入った3% (v/v) Lubrizolaの溶媒が準備され、すぐポンプで注入される。Lubrizola(30mL)と1.0 mL の2mgのアンモニウム過硫酸塩と0.8mgのTEMED (N,N,N’,N’-tetramethyl-ethylenediamine)の入った1.0 mLのガスが抜かれた水が混合される。毛細管は50 mL/分ですばやく満たされ、フローが止められ、毛細管が一時間常温で反応される。一時間後、毛細管は反応を止めるため、非イオン化された水で流し洗われる。二者拓一的に、重合化したLubrizola溶媒を4°Cで準備して、ポンプで毛細管に注入し、重合化した溶媒が常温で暖められ、一時間反応される。低密度カチオン交換の壁が100% Lubrizolaの代わりにアクリルアミド・Lubrizolの50/50の混合物で上記のように用意される。最後に、毛細管は非イオン化された水で洗浄され、保管される。
実施例5
毛細管チャンネルに強い酸性カチオン交換体のスルホン酸を結合する事
毛細管(Polymicro Technologies, Phoenix, AZ)の太さ25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300 mm IDと長さ1cmから5mを購入される。この例では、長さ1m 100mm IDの熔融シリカ毛細管を0.1 Mの苛性ソーダで満たし、常温で一時間流し洗われる。その後、塩基溶液はHPLCグレードの非イオン化された水で30分間洗浄され排出される。
毛細管は100% HPLCグレードメタノールで流し洗われ、その後、毛細管は50% (v/v) 1,3-プロパンスルホン酸 (Sigma-Aldrich, Milwaukee, WI, PN P5,070-6)の入ったトルエンで満たし、一時間 10 mL/分で反応させる。毛細管は100% HPLCグレードメタノールで流し洗われ、その後、100% HPLCグレード非イオン化された水で洗浄される。
実施例6
毛細管チャンネルに強い酸性カチオン交換体の四級アミンを結合する事
200 mm ID 50 cmの毛細管が実施例1か２のように食刻される。熔融シリカ毛細管がg-methacryloxypropyltrimethoxysilane (Sigma-Aldrich, Milwaukee, WI, PN 44,015-9) (30mLが1.0 mLの60%(v/v)のアセトン/水と混合される)と反応する。毛細管が満たされ、流れが止められ、毛細管が常温で反応する。一時間後、毛細管が水で反応を止めるため洗浄される。その後、毛細管がドライTHFで流し洗われる。
その後、毛細管はフリーラジカル消去剤の入っていない(3−アクリルアミドプロピル)トリメチルアンモニウムクロリド(Sigma-Aldrich, Milwaukee, WI, PN 44,828-1)溶媒と反応する。触媒の入った3%(v/v)(3-アクリルアミドプロピル)トリメチルアンモオニウムクロリド溶媒は40 mL の75%の溶媒が、(3−アクリルアミドプロピル) トリメチルアンモオニウムクロリドと1.0 mL の2mgのアンモニウム過硫酸塩と0.8mgのTEMED (N,N,N’,N’-tetramethyl-ethylenediamine)の入った1.0 mLのガスが抜かれた水が混合され用意される。毛細管は50 mL/分ですばやく満たされ、フローが止められ、毛細管が一時間常温で反応される。一時間後、毛細管は反応を止めるため、非イオン化された水で流し洗われる。二者拓一的に、重合化したLubrizola溶媒を4°Cで準備して、ポンプで毛細管に注入し、重合化した溶媒が常温で暖められ、一時間反応される。低密度カチオン交換の壁が100% 四級アミン単体の代わりにアクリルアミド・四級アミン単体の50/50の混合物で上記のように用意される。最後に、毛細管は非イオン化された水で洗浄され、保管される。
実施例7
毛細管チャンネルに弱い酸性カチオン交換体のカルボン酸を結合する事
200 mm ID 50 cmの毛細管が実施例1か２のように食刻される。熔融シリカ毛細管がg-methacryloxypropyltrimethoxysilane (Sigma-Aldrich, Milwaukee, WI, PN 44,015-9) (30mLが1.0 mLの60%(v/v)のアセトン/水と混合される)と反応する。毛細管が満たされ、流れが止められ、毛細管が常温で反応する。一時間後、毛細管が水で反応を止めるため洗浄される。その後、毛細管がドライTHFで流し洗われる。毛細管を非イオン化された水で洗い流す。毛細管をTHF, その後、非イオン化された水で洗い流す。その後、毛細管は、次の工程、フリーラジカル消去剤(Sigma-Aldrich, Milwaukee, WI)の無いアクリル酸と1.0 mLのガスの抜かれた2mgのアンモニウム過硫酸塩と0.8mgのTEMED (N,N,N’,N’-tetramethyl-ethylenediamine)の入った0.05 M 燐酸ナトリウム緩衝液溶液, pH 7.0、で混合されたアクリル酸単体溶媒で満たされる。毛細管は50 mL/分ですばやく満たされ、フローが止められ、毛細管が一時間常温で反応される。二時間後、毛細管は反応を止めるため、非イオン化された水で流し洗われる。二者拓一的に、重合化したアクリルアミド溶媒を4°Cで準備して、ポンプで毛細管に注入し、重合化した溶媒が常温で暖められ、二時間反応される。最後に、毛細管は非イオン化された水で洗浄され、保管される。
実施例8
毛細管チャンネルに弱い酸塩基交換体の第一級アミンを結合する事
100 mm ID 50 cmの毛細管が実施例1か２のように食刻される。ドライな毛細管が、ドライトルエンの中の10％の(v/v) g-グリシジルオキシプロピルトリメトキシシラン(Sigma-Aldrich, Milwaukee, WI, PN 44,016-7)の溶媒を110°Cで注いで、二時間反応させる。毛細管は非イオン化された水で洗い流され、その後、エチレンヂアミンの１Ｍの溶液で30分40°Ｃで反応させ、非イオン化された水で洗い流し、保管される。二者択一的に、エポキサイド グループが、アミン グループの親和性ポリエチレングリコール(PEG)の架橋剤を入れ込むため、反応することができる。保護基付きアミノ酸が選択的に一端部で反応し、その後、もう一つのアミンの端部を反応用に供給するためトリフロロ酢酸(TFA)で非保護する。毛細管が満たされ、四時間45°Ｃで、50 mg/mL のmono-N-t-bcamido-dPEG3a-amine (Quanta BioDesign, Ltd. PN 10225, Powell, OH) で反応させる。毛細管は毛細管を1％のTFA溶液で、一時間45°Cで、10 mL/分の速度で、満たし、反応させることで、非保護化される。その後、毛細管は100％のメタノールで洗い流され、非イオン化された水の中に保管される。
二者択一的に、実施例1か2の熔融シリカ毛細管は100％メタノールで洗い流され、その後、65°Cで3-aminoprpyltriethoxysilane (3 mL のドライトルエンの中の0.6 mL のシラン)溶液で満たし、二時間 10 mL/分の速度で、反応させる。その後、毛細管は100％のメタノールで洗い流され、100％非イオン化された水の中に保管される。
実施例9
毛細管チャンネルにジイソチオシアン酸1,4-フェニレン(PDITC)を使って抗体や他の蛋白質を付着させる事
150 mm ID 30 cmの毛細管が第一級アミングループに付着させるために実施例8のように準備される。その後、毛細管はテトラヒドロフウランで洗い流し、その後、PDITC(10 mLのドライテトラヒドロフランの中に500 mgのジイソチオシアン酸フェニレンの入った)溶液で満たし、毛細管を常温で保ち、四時間かけてゆっくりしたフローの2 mL/分で反応させる。毛細管は100％HPLCグレードメタノールで洗い流される。
1 mg/ml のモノクローナル抗体の溶媒は緩衝液 (0.2 M Na2HPO4, pH 7.5, 0.2% Nonidet P-40活性剤) に対して広範囲にわたって、透析される。その後、緩衝液された抗体溶媒が、PDITCの官能性を持った熔融シリカ毛細管に、常温で四時間かけて、ゆっくり1 mL/分の速度で、ポンプで注入する。毛細管は10 mMの燐酸塩緩衝液 pH 7.5 で30分間洗浄され、その後、非イオン化された水で一時間洗い流し、4°Cで保管される。
二者択一的に、PDITCのかプリングはpH9.0でか化学反応のスピードを上げる事ができる。しかしながら、毛細管の壁が高度pH緩衝液で朽ちるのを防ぐ為に、抗体との反応を四時間かけて、4°Cで行う。
他の蛋白質をジイソチオシアン酸1,4-フェニレン(PDITC)架橋剤を通して、付着させることができる。蛋白質は本来の蛋白質か、リシン残基に付着した蛋白質か、組み換えの蛋白質か、蛋白質の端部のポリリシンに付着しているかもしれない。
毛細管は10mMの燐酸塩緩衝液pH7.5で30分間洗浄され、その後、一時間非イオン化された水で洗い流され、4°Cで保管される。
実施例10
毛細管チャンネルにポリエチレングリコール(PEG)を結合させる事
300 mm ID 4 mの長さの毛細管が実施例1か２のように食刻される。毛細管は蒸留水の後メタノールで洗浄され、その後、窒素のガスで四時間130°Cで乾燥される。毛細管が、その後、10% (w/v)のPEG 8M-10(塩化メチレンの中のPEG) の溶液で満たされる。PEG 8M-10 ポリマー溶媒はInnophase Corporation (Portland, CT, USA)から購入でき、他のPEG(低分子重量)の物質はShearwater Corporation, Huntsville, ALより入手できる。毛細管が次にVarian3700ガスクロマトグラフのカラムオーブンに高純度化された窒素ガスフロー下で、30°Cから225°Cに5°C/分ごとに上げる温度調節プログラムで、上限の温度で十二時間保持し、入れる。その後、毛細管は塩化メチレンで一時間、次にメタノールで30分間洗浄され、最後、100%の非イオン化された水で洗い流され、保管される。
実施例11−毛細管チャンネルにCibacron Blueを付着すること
200 mm ID 30 cmの長さの毛細管が実施例1か２のように食刻される。毛細管が、その後、ドライトルエンの中の10％の(v/v) g-グリシジルオキシプロピルトリメトキシシラン(Sigma-Aldrich, Milwaukee, WI, PN 44,016-7)の溶媒を110°Cで注いで、ゆっくりしたフローの 2mL/分の状態下で四時間反応させる。毛細管はトルエンで洗浄され、その後、メタノールで洗浄し、その後、メタノール・水50・50の割合、次に水で各30分間ごと、洗浄する。毛細管は50°Cで10 mM の燐酸塩緩衝液pH7.5の中の100mg/mLのChibacron Blue F3GA (1-Amino-4-[[4-[[4-chloro-6-[[3 (or 4)-sulfophenyl]amino]-1,3,5-triazin-2- yl]amino] -3-sulfophenyl]amino]-9,10-dihydro-9,10-dioxo-2-anthracenesulfonic acid, Sigma-Aldrich, Milwaukee, WI, PN 24,222-5) で満たし、ゆっくりしたフローの 2mL/分の状態下で十六時間反応させる。毛細管は非イオン化された水で一時間洗い流され、使用されるまで、4°Cで保管される。
二者択一的に、g−アミノフェニル−ATP 分子グループが毛細管の壁に付着される。毛細管は水の中の15 mg/mL のアデノシン-5’-[g-(4-アミノフェニル)]三燐酸とナトリウム塩(Jena Bioscience, Jena, Germany, PN NU-801L)で満たし、ゆっくりしたフローの状態、常温で四時間反応させる。毛細管は非イオン化された水で一時間洗い流され、使用されるまで、4°Cで保管される。
毛細管は参考文献, Timothy Hayasyead, Current Drug Discovery, Proteome mining: exploiting serendipity in drug discovery, 22-24 (March 2001)の中に記述されている工程に基づいて使われる。
実施例12−C18逆相毛細管チャンネルを準備する事
200 mm ID 100 cmの長さの毛細管が実施例1か２のように食刻される。食刻された毛細管チューブは 10% (w/v) のコロイド状の熔融シリカ溶液で満たされ、密封され(Ludox HS-40, Du Pont, Willmington, DE)、一時間250°Cで熱せられる。この処理が三回繰り返され、最後に、毛細管がHPLCグレードのエタノールで洗い流される。毛細管は0.2 gm/mL のdimethyloctadecyl-chlorosilaneかoctadecyltrichlorosilane (Petrarch Systems Inc., Bristol, PA, USA) 溶液が入ったトルエン溶媒で80°Cで満たされ、二時間 10mL/分の速度で反応される。この処理が二回繰り返される。毛細管は0.2 g/mLのmethyltrichlorosilane が入ったトルエン溶媒で80°Cでエンドキャップされ、二時間10 mL/分の速さで反応される。この処理の後、毛細管は100% HPLCグレードのメタノールで洗い流される。
実施例13
熔融シリカ毛細管チャンネルにIDAとNTAとCMAキレート環を有する金属グループを結合させる事
200 mm ID 100 cmの長さの毛細管が実施例1か２のように食刻される。毛細管はドライトルエンの中の10％の(v/v) g-グリシジルオキシプロピルトリメトキシシラン(Sigma-Aldrich, Milwaukee, WI, PN 44,016-7)の溶媒を100°Cで満たされ、一時間10 mL/分の速さで反応される。この処理が二回繰り返される。毛細管は100%のHPLCグレードメタノールで洗い流される。IDAキレート環を有する金属を作るには、エポキシ−に結合された毛細管は10% (w/v) のイミノ二酢酸が入った、pH 8.2 に水酸化リチウムで調節された、メタノールで満たされ、65°Cで四時間10mL/分の速度で反応される。NTAキレート環を有する金属を作るには、エポキシ−が活性化された毛細管は10% (w/v) のR-代用の水酸化リチウムとN-[3-アミノ-1-カーボクシプロピル]-イミノ二酢酸かN-[5-アミノ-1-カーボクシペンチル]-イミノ二酢酸が入った、pH 7.5に水酸化リチウムで調節された、メタノール溶媒と四時間10 mL/分の速度で反応される。R代用試薬の合成工程はUS特許4,877,830に記述されている。カルボクシメチル化されたアスパルタート(CMA)キレート環を有する金属毛細管チャンネルは、L-アスパラギン酸溶液(100 mg/mL)がpH 8.6に炭酸ナトリウムで調節され、毛細管チャンネルに5 mL/分の速度、30°Cで十二時間、ポンプで注入される。毛細管は非イオン化された水で洗浄され、ブロモ酢酸(100 mg/mL)溶液が、炭酸ナトリウムでpH 8.6に炭酸ナトリウムで調節され、毛細管チャンネルに5 mL/分の速度、30°Cで十二時間、ポンプで注入される。毛細管チャンネルは非イオン化された水で洗浄され、キレート環を有する金属の形状に金属塩溶液をポンプで注入する事で、US特許5,962,641に記述されているように、変換されるように準備される。過剰部分のエポキサイドグループは１Mのエタノールアミン溶液で一時間常温でエンドキャップされる。最後に、キレート剤化した毛細管は洗い流され、非イオン化された水に保管される。
キレート剤化された毛細管はキレート環を有する金属の形状に使う前に変換される。毛細管を適切な金属塩溶液で洗い流すことでこれを達成する。毛細管は30 mM 二ナトリウムEDTAと非イオン化された水を各30分間洗い流し、その後、0.2 M ZnCl2, Hg(NO3)2・H2O かFeCl3 の入った1 mMのHNO3で洗い流し、毛細管をZnかNIかFeの形状にそれぞれ変換する。毛細管は非イオン化された水で洗い流され、保管される。
実施例14
熔融シリカ毛細管チャンネルにG蛋白質とA蛋白質とA/G蛋白質とL蛋白質を固定化する工程
200 mm ID 100 cmの長さの毛細管が実施例1か２のように食刻される。毛細管がドライトルエンの中の10％の(v/v) g-グリシジルオキシプロピルトリメトキシシラン(Sigma-Aldrich, Milwaukee, WI, PN 44,016-7)で満たされ、毛細管はゆっくりしたフローの 1mL/分, 50°Cの状態下で四時間熱せられる。毛細管は冷却され、トルエンとメタノールで各30分間洗浄され、その後、非イオン化された水で洗浄される。毛細管はG蛋白質溶媒の溶液(5 mg/mL が入った10 mM 燐酸塩緩衝液、pH 7.5)で満たされる。蛋白質はリシン残基か組み換えられたG蛋白質形状(Calbiochem, San Diego, Ca, PN 539303-Y)に付着するG蛋白質で、蛋白質の端部いポリリシンフュジョンタグを通して付着する、ネイティブG蛋白質(Calbiochem, San Diego, Ca, PN 539302-Y)かもしれない。毛細管は蛋白質溶媒を1 mL/分, 25°Cで四時間毛細管を通してポンプで注入し、反応させる。毛細管は10 mM 燐酸塩緩衝液溶液のpH 7.0 で一時間洗い流され、調節され、その後、非イオン化された水で洗い流され、使われるまで4°Cで保管される。
G蛋白質の他に、組み換えられたL蛋白質 (Calbiochem, San Diego, Ca, PN 539203-Y) や組み換えられたA/G蛋白質(Pierce, Rockford, IL, PN 21186)のような蛋白質もこの例に記述されている工程を使うことができる。
実施例15
熔融シリカ毛細管チャンネルにストレプトアビジン ビオチン合成反応を使って一本鎖と二本鎖DNAを固定化する事
150 mm ID 75 cmの長さの毛細管が実施例1か２のように食刻される。その後、4% (v/v) 溶液 3-aminopropyltriethoxy-silaneの入ったメタノールで満たされ、ゆっくりしたフローの2 mL/分の速さで十二時間反応される。100%のメタノールと、その後、非イオン化された水で洗い流した後、チューブは5.0 mg/mLのNHS-LC ビオチン(Quanta BioDesign, Ltd., Powell, OH, PN 10206) の入った50 mMの重炭酸ナトリウム溶媒pH 8.3で満たされ、常温で四時間反応される。N-ヒドロキシスクシンイミドビオチン (NHS-ビオチン) の代わりの分子も使われる。 (Quanta BioDesign, Ltd., Powell, OH, PN 10205; かSigma-Aldrich, Milwaukee, WI, PN H1 759)。親和性ポリエチレングリコールスペーサー(NHS-dPEG4a-Biotin, Quanta BioDesign, Ltd., Powell, OH, PN 10200) が入っているNHS-ビオチン試薬は他のビオチン反応試薬と同じ反応状態下で使われる。
ビオチン化の後、毛細管は非イオン化された水で洗い流され、その後、毛細管は4.0 mg/ml のストレプトアビジン溶液(Sigma-Aldrich, Milwaukee, WI, PN S0677)の入った50 mM の燐酸ナトリウム緩衝液溶媒で満たされる。ストレプトアビジン溶液は四時間4°Cで反応させ、残ったフリーストレプトアビジンは毛細管チューブを非イオン化された水で洗浄する事で除去する。ストレプトアビジン毛細管は最後のビオチン化されたDNAが付着するまで冷蔵庫に保管される。
或るケースでは、一本鎖DNAはビオチン化された二本鎖DNA PCRの製品をすばやく95°Cに数分熱し、その後すぐ5°Cに冷却し、反応器内に溶液をすぐポンプで注入し、毛細管の壁に固定される。過剰のテンプレートは非イオン化された水で洗浄される。非イオン化された水を、DNAの変性を完全に保証し、一本鎖DNAの保つため、熱することができる。二者択一的に、ビオチン化された一本鎖DNAを準備し、精製し、その後、ストレプトアビジン毛細管に注入できる。二本鎖DNAは毛細管の壁にビオチン化された二本鎖DNA PCR製品をポンプで注入し、熱する前に、固定化できる。
実施例16
イオンの電力で毛細管に蛋白質を付着させる事
蛋白質は毛細管の表面にイオンの電力で付着できる。蛋白質は、等電点と蛋白質が溶解している緩衝液溶液のpHに依存し、正電荷分子か負電荷分子か中性の分子として存在できる。蛋白質とその等電点がテーブルDに表記されている。
Figure 2005529335
蛋白質が等電点で緩衝液に溶解している場合は、正味電荷はゼロである(蛋白質沈殿の危険性が、添加物で蛋白質を溶液中に溶解させなければ、ある)。蛋白質が等電点より相当低い点で緩衝液に溶解している場合は、すなわち、pHの度が１か２以上の場合は、蛋白質は正味正電荷を帯びている。蛋白質が等電点より高い点でがっファーに溶解している場合は、蛋白質は正味負電荷を帯びている。

実施例 4か5か純シリカ(実施例 1か2の工程から)の工程で準備されたカチオン交換熔融シリカ毛細管は25 mM の燐酸ナトリウムpH７で30分間調整される。5 mg/mL のアビジンかリゾチ−ムかチトクロームの溶液が入った25 mM の燐酸ナトリウム緩衝液pH 7.0の溶媒はゆっくり毛細管内にポンプで100%を超えるまで、すなわち、毛細管から溶出される蛋白質の濃度が注入されるのと同じになるまで、注入する。この時点で毛細管の壁が完全に塗布される。毛細管は10% (v/v) エタノールと水の割合の溶液で洗い流され、使われるまで、冷蔵庫に保管される。
実施例17
リゾチ−ムを開放シリカ毛細管で濃縮化する事
75 mm ID 長さ 74 cm の食刻されたシリカ毛細管は (Polymicro Technologies, Phoenix, AZ)実施例2記述されている方法で購入された。毛細管の端部が毛細管にポンプで注入される溶液の入った、密封された2 mL のバイアルの中に入れられた。6 psi に排出圧力がセットされたダイアフラムポンプが空気を毛細管に溶液を通すため密封されたバイアルにポンプで注入した。毛細管の抽出口の側に、窓が焼かれこみ、波長220にセットされたLinear Model Spectra 200 UV検出器(Therma Analytical, Pleasanton, CA)が、毛細管内を通る緩衝液(と蛋白質)のフローを監視するため使われた。バイアルは20 mM のトリス塩化物緩衝液pH 8.0で満たされ、10分間平均化させた。毛細管はリゾチ−ム(2 mg/mL が水の中に溶解)で満たされ、吸着度合いが220 nmにあがって、レべリングするまでポンプで毛細管内へ注入した。リゾチ−ムのポンプでの注入は六分間続けられた。毛細管は20 mM トリス塩化物緩衝液pH 8.0 で洗い流され、その後、非イオン化された水で使われるまで保管された。
蛋白質用に改変された毛細管の容量は蛋白質を酸で脱離し、検出器を通った時の脱離した蛋白質のピーク時の領域を測定し、測定された。20 mM のトリス塩化物pH 8.0 が入っている緩衝液が6 psi の圧力で毛細管を通してポンプで注入された。0.1 M HCLの注入が10分間6 psi でリゾチ−ムを脱離するためポンプでおこなわれ、脱離されたピークの領域が測定された。ピーク時の領域は0.095 mg に相当した。
実施例18
ヘパリンを熔融シリカ毛細管チャンネルの壁に付着させる事
150 mm ID 30 cmの毛細管が実施例1か２のように食刻される。熔融シリカ毛細管が3-aminopropyltrimethoxysilane (0.5 mL のシランの入った 1 mLのドライトルエン)の45°Cの溶液で満たされ、一時間 10 mL/分の速度で反応される。その後、毛細管は100% HPLCグレード メタノールで、最後に、100%非イオン化された水で洗い流される。ヘパリン溶液と水に溶解したDCCと1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethyylcarbodiimie がヘパリン上のカルボン酸グループの一部を活性化するために用意される。10 mg のヘパリンと 1 mL の非イオン化された水の中の 5 mg の 1-(3-dimethylaminopropyl)- 3-ethylcarbodiimide の溶液が二時間常温で反応される。その後、溶液が毛細管にポンプで注入され、二時間常温で反応される。毛細管は100%非イオン化された水で洗い流され、使われるまで、保管される。
実施例19
熔融シリカ毛細管チャンネルの壁にレクチンを付着させる事
200 mm ID 100 cmの長さの毛細管が実施例1か２のように食刻される。毛細管が、ドライトルエンの中の10％のw/vグリシジルオキシプロピルトリメトキシシラン(Sigma-Aldrich, Milwaukee, WI, PN 44,016-7)の50°Cの溶媒で満たされ、その後、毛細管は 2 mL/分のゆっくりしたフローの状態下で四時間熱せられる。毛細管が冷却され、トルエンとメタノールで各30分間、非イオン化された水で洗浄される。
レクチンは非常に特質な炭水化物を一、又は二、個所(頻繁に二箇所)で組み入れた、ほとんどの生物の組織内に有る蛋白質である。毛細管は Con A のレクチン(10 mM の燐酸塩緩衝液pH 8.0内に溶解した 5 mg/mL)の溶液で満たされる。毛細管は1 mL/分の速さで、25°Cで四時間毛細管に蛋白質溶液をポンプで注入し、反応させる。毛細管は 10 mM の燐酸塩緩衝液溶液pH 7.0 で一時間洗い流し、調節し、その後、非イオン化された水で洗い流し、使われるまで保管される。
Con A を含めて、数多くのレクチンのタイプがある。Canavalia ensiformis のレクチンはa-D-マンノピラノシルとa-D-グルコピラノシルと原子の空間的位置的に関連した残基の入った分子と結合した金属たんぱく質である。Lens culinaris (レンチル) のレクチンはa-D-グルコースとa-D-マンノーズの残基とも結合する。麦芽(Triticum vulgare)レクチン(WGL)はN-アセチル-D-グルコサミン残基と相互作用し、大豆(Glycine max)レクチンはガラクト−スとN-アセチル-ガラクトーサミン残基を認識する。
実施例20
毛細管チャンネルに蛋白質をEDCとN-ヒドロキシスルフォスクシンイミドを使って付着させる事
200 mm IDの長さ50 cm の毛細管は実施例 7に記述されている工程に従ってカルボン酸グループで準備される。二者択一的に、カルボン酸毛細管は二つの他の合成方法で作ることができる。手法１は実施例１か２の工程で用意されたドライ毛細管を70°Cの純塩化チオニルで満たし、十二時間 10 mL/分の速度で反応させる。毛細管はドライTHFで洗い流され、その後、THF (Sigma-Aldrich, Milwaukee, WI, PN 25,725-7)内の20% (v/v) の臭化ビニルマグネシウムの溶液で満たされ、十二時間10 mL/分の速度で反応される。毛細管は3%の過酸化水素溶液内の50°Cの10% (v/v) の3-メルカプロプロピオニックアシド (Sigma-Aldrich, Milwaukee, WI, PN M580-1)の溶液か3%の過酸化水素溶液内の50°Cの10% (v/v) チオ-dPEG4aアシド(Quanta BioDesign, Ltd., Powell, OH, PN 10247) の溶液で満たされ、十二時間 10 mL/分の速度で反応させる。その後、毛細管は非イオン化された水で洗い流される。手法２実施例１か２の工程で用意された毛細管は、allyldimethylchlorosilane (Petrarch Systems Inc., Levittown, PA, PN A0552) か allyltriethoxysilane (Petrarch Systems Inc., Levittown, PA, PN A0564) の純溶液でフロー速度の10 mL/分常温で満たされ、反応される。六時間後、毛細管は100%のメタノールで、その後、非イオン化された水で洗い流される。毛細管は3%の過酸化水素溶液内の50°Cの10% (v/v) の3-メルカプロプロピオニックアシド(Sigma-Aldrich, Milwaukee, WI, PN M580-1)の溶液か3%の過酸化水素溶液内の50°Cの10% (v/v) チオ-dPEG4aアシド(Quanta BioDesign, Ltd., Powell, OH, PN 10247) の溶液で満たされ、十二時間 10 mL/分の速度で反応させる。その後、毛細管は非イオン化された水で洗い流される。
上記のカルボン酸毛細管はEDC (1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボヂイミド) (Sigma-Aldrich, Milwaukee, WI, PN 16,146-2) とスルフォ-NHS (N-ヒドロクシスルフォスクシンイミドのナトリウム塩)の各10% (w/v)の溶液で満たし、六時間常温で反応させる。毛細管は非イオン化された水で洗い流され、10 mg/mL の蛋白質の溶液で満たされ、二時間常温で反応される。毛細管は非イオン化された水で洗い流され、使うまで4°Cで保管する。
実施例21
(His)6 フュージョン蛋白質を生成する事
寸法 25 cm x 100 mm IDの毛細管は実施例13に記述されている工程に基づいて結合されたNTA-Ni (II)キレート環を有する金属に官能性を持たせる。毛細管は「数字８」のタイプの形状に、直径 8 mmのコイルで、上と下の5cmの部分が真っ直ぐな形状で、コイル化されている。毛細管は100 ml か 1 mL の注入器が開放チューブカラムの先につながっている スポイト (Tecan Systems, San Jose, CA, CAVRO Model No. XP-3000) に接続されている。毛細管は 20 mM の燐酸ナトリウムと0.5 M の塩化ナトリウムと10 mM のイミダゾールで、pH 7.4, 25 ml/分の速度で二分間調整される。緩衝液は排出され、毛細管はE.coli発現のHis６フュージョン蛋白質の精製されたライセートのサンプルで満たされる。毛細管を通して25 mL/分の速度で合計が100 mL になるまで、二回前後に通し、毛細管を四回通して行われる。サンプルと小さなプラグは毛細管から噴出され、50 nL (長さおよそ7 mm) の脱離緩衝液と20 mM の燐酸ナトリウムと0.5 M の塩化ナトリウムと0.5 M のイミダゾールpH 7 が毛細管を通され、次のアレーのオペレーションのためプレート上のナノのくぼみに沈殿される。
内部の直径が200 mm でサンプルと緩衝液容積が四倍の毛細管の同じタイプが使われる。
実施例22
蛋白質上で(His)6 フュージョン蛋白質と統合されたアレーされる蛋白質の精製の事
寸法 25 cm x 100 mm IDの毛細管は実施例13に記述されている工程に基づいて結合されたNTA-Ni (II)キレート環を有する金属に官能性を持たせる。毛細管は「数字８」のタイプの形状に、直径 8 mmのコイルで、上と下の5cmの部分が真っ直ぐな形状で、コイル化されている。毛細管は100 ml か 1 mL の注入器が開放チューブカラムの先につながっている スポイト (Tecan Systems, San Jose, CA, CAVRO Model No. XP-3000) に接続され、片方の端部は動かすことができ、物を色々な場所で取り上げるか沈積できる装置に接続されている。毛細管は 20 mM の燐酸ナトリウムと0.5 M の塩化ナトリウムと10 mM のイミダゾールで、pH 7.4, 25 ml/分の速度で二分間調整される。緩衝液は排出され、毛細管はE.coli発現のHis6タグフュージョン蛋白質とシステイン残基の精製された細胞全体のライセートのサンプルで満たされる。毛細管を通して25 mL/分の速度で合計が100 mL になるまで、三回前後に通し、毛細管を六回通して行われる。残りのサンプルは毛細管から3 psi の空気で噴出され、10 mL のスタンダードPBS (0.9% w/v NaCl, 10mM の燐酸ナトリウム, pH 7.2) 洗浄緩衝液が毛細管に出し入れ25 mL/分の速度で行われる。
合計三回このサイクルが毛細管の表面上でおこなわれ、残った洗浄液は3 psi の圧力の空気で毛細管から噴出される。小さなプラグと50 nL (およそ長さ7 mm)の脱離緩衝液と 20 mM の燐酸ナトリウムと0.5 M の塩化ナトリウムと 0.5 M のイミダゾーる、pH 7.4, が毛細管内へ注入され、合計六回毛細管の表面上に 5 mL/分の速度で通される。溶出液プラグが毛細管カラムの開け口に位置され、金の格子対SPRチップ上にシステインのチオルグループを通して相跨原子化した付着で沈殿される。蛋白質のシステイン残基での金の表面への付着は、三つの表面から集めるGC-SPRデータの説明と共に以前に(Jennifer Brockman, et al., Poster Presentation “Grating-Coupled SPR," Antibody Engineering Conference, December 2-6. 2001, San Diego, CA) に記述されている。
実施例24
A蛋白質を官能性化した蛋白質チップをアレー化することによってモノクローナルひとIgG蛋白質を精製する事
寸法 100 cm x 200 mm ID の毛細管が、実施例14、又は16、に記述された工程に従って組み換えられたG蛋白質の毛細管上に抽出相の官能性を持たすようにする。
毛細管の形状は真っ直ぐで、一つの端部は動くようになっていて、ポンプに接続されていて、もう一つの端部は動くようになっていて、異なった場所で物を取り上げるか沈積できる装置に接続されている。ポンプ用の手段は200 mL のバイアルで、調整液かサンプルか洗浄液か窒素ガスで満たすことができる。バイアルは多種の液体を、古い液体を抽出し、押し出し、その後、何回も新しい液体で、バイアルが洗浄され、用意されるまで、補充する。バイアルには、毛細管の直径と長さによって、普通0.1 から300 psi の圧力で液体を毛細管内を通して、押し出す用にできている。この毛細管用には 3 psi の圧力が使われている。
バッファーは排出され、 毛細管は1000 mL のモノクローナルひとIgGが入ったハイブリドーマ細胞培養上清サンプルを(できれば、牛の胎児の血清ではない)ポンプで注入する。毛細管は 100 mM の燐酸ナトリウムと100 mM のクエン酸ナトリウムと2.5 M の塩化ナトリウム、pH 7.4, 圧力 3psi で十分間洗浄される。もし濃縮度が高く、サンプルの残基物資の耐容性がない場合は、洗浄するステップを省くことができる。
洗浄液は毛細管から噴出され、100 mMの燐酸ナトリウムの脱離緩衝液の小さなプラグ、 2 nL (およそ長さ6.4 cm)、と100 mM のクエン酸ナトリウム、pH 3.0に調整された, が毛細管を通してポンプで押し出される。液体層が毛細管の内側の表面に合計五回30mL/分の流れの速度で通される。この層全体がその後、384のくぼみのあるプレートに、各くぼみには2 mL のH2NaPO4/100mM HNa2PO4, pH 7.5の中性化する緩衝液が入っていて、位置される。その後、サンプルはA蛋白質で塗布された格子対SPR (GC-SPR) チップ上に有用な手段で、ターゲットが抗体と結合するその後の分析のためアレー化する。A蛋白質で塗布されたGC-SPRチップとチップをアレー化する事とSPRに関連したデータ収集の準備のための装置や工程や環境に関しての事は (Jennifer Brockman, et al., Poster Presentation “Grating-Coupled SPR," Antibody Engineering Conference, December 2-6. 2001, San Diego, CA) に記述されている。
二者択一的に、実施例14に説明されているように、この例の中で、L 蛋白質毛細管チャンネルを使うことができる。
実施例25
モノクローナルねずみIgG蛋白質を精製する事
寸法 60 cm x 200 mm ID の毛細管が、実施例14、又は16、に記述された工程に従って組み換えられたG蛋白質の毛細管上に抽出相の官能性を持たすようにする。
毛細管は「数字８」のタイプの形状に位置され、半径 8 mmで、注入口と抽出口に5 cmの直線の部分があり、すばやく曲がるポリマー化されたアポリウレタン(Tao Plastics Inc., Dublin, CA) に、毛細管構造を固定化させるため、浸ける。毛細管はスポイト(Tecan Systems, San Jose, CA, CAVRO Model No. XP-3000) に接続され、一つの端部が、 1 mL の注入器は開放チューブカラムに接続され、ある。毛細管は20 mM の燐酸ナトリウム、 pH 7.0で二分間100 mL/分の速度で調整される。緩衝液は排出され、毛細管は800 mL のねずみIgG ハイブリドーマ細胞培養上清サンプルで満たされる。脱離液層は幾度も溶出され、排出される。この例の中では、層は合計3200 mLを100 mL/分の速度で毛細管を通して何回も続けて行われ、毛細管に二回前後に通して、合計四回行われる。サンプルが毛細管から噴出され、0.1 M, pH 2.7 のグリシン−HCLの200 nL (およそ７mmの長さ) の脱離溶液の小さなプラグが毛細管に通され、直接100 nL の中性化できる緩衝液(500 mM トリス-HCL, pH 9.0)が入った、ナノくぼみがあるプレートに沈積される。
実施例26
酵素的に消化された赤血球細胞膜蛋白質の非燐酸化されたペプチドから燐酸化されたペプチドを分離する事。
寸法 25 cm x 100 mm ID の毛細管は、キレート剤がエポキサイドグループを通して付着したイミノ二酢酸がg-グリシジルオキシプロピルトリメトキシシラン(Sigma-Aldrich, Milwaukee, WI, PN 44,016-7)を通して、実施例13に記述されている工程に従って、IDA イミノ二酢酸鉄(III)キレート剤と結合され、官能性がもたされる。毛細管は「数字８」のタイプの形状に、直径 6 mmのコイルで、上と下の5cmの部分が真っ直ぐな形状で、コイル化されている。毛細管は100 ml か 1 mL の注入器が開放チューブカラムの先につながっている スポイト (Tecan Systems, San Jose, CA, CAVRO Model No. XP-3000) に接続されている。毛細管は50 mM MES (2-モルホリノエタンスルホン酸)緩衝液、pH 6.0, 25 mL/分の速度で、二分間調整される。緩衝液は排出され、毛細管は25 mL の、参考文献: Guenther Bonn, et al., Chromatographia, 30 (9/10):484 (1990) の工程に従って血清と白血球から精製された赤血球のサンプルで満たされる。サンプルは繰り返し毛細管を通して25 mL/分の速度で汲み上げられ、合計100 mL が毛細管を二回前後に通し、合計四回通される。サンプルが毛細管から噴出され、0.1 M, pH 2.7 のグリシン−HCLの50 nL (およそ７mmの長さ) の脱離溶液と20 mM 二ナトリウムEDTA, pH 6.0, の小さなプラグが毛細管に通され、直接バイアルに沈積される。
同じタイプの、内側の直径が異なる200 mmで同じ容積で、緩衝液が四倍の容量の、毛細管が使われる。
実施例27
ラベルフリーの格子対SPRで抗体をふるいにかける事
個々のIgG抗体のクローンがハイブリドーマ内で発現され、実施例22と23とG蛋白質が表面に固定化される実施例14に記述されているように、ハイブリドーマ上清が200 mm IDと50 cmの開放チューブ分離毛細管(Polymicro Technologies, Phoenix, AZ) に通される。一度表面にIgG群が捕獲された後、チューブは適切な緩衝液(すなわち、燐酸緩衝液塩水、100 mM 燐酸、100 mM NaCl, pH 7.0)で洗浄され、残留液は噴出される。非常に微量な容量(1 mL)の10 mM の燐酸 (pH 2.3) がチューブ内に注入され、固定化されたG蛋白質からIgGを脱離するため内側の壁に当てるように前後に動かす。IgGがチューブから噴出され、ナノのくぼみのある、250 nL の燐酸緩衝液(100 mM の H2NaPO4/100mM HNa2PO4, pH 7.5) でpH を~7にし、が入ったプレートに位置される。これはGC-SPRアレー上への非相跨原子価のスポッティング用に準備され、G蛋白質が表面化学においてmercapto undecanoic acid に相跨原子価的に付着させる。更に、脱離・中性化のプロセスがアレー化する装置の一部として行われ、抗体が、チップ全体の統合されたプロセスの一部として、完全にプロセスできる。
実施例28
Fab抗体フラグメントをラベルフリー格子対SPRでファージディスプレイスクリーニングする事
異なったFab抗体フラグメントシーケンスのファージに誘導されたクローンは全細胞バクテリアのライセ−として解放され、Fab抗体フラグメントに対して二つのフュージョンタグ、一つはc-myc (精製のため)ともう一つは端部のシステイン残基(固定化のため)である。精製されたライセ−トは開放チューブ分離毛細管 (Polymicro Technologies, Phoenix, AZ) の寸法200 mm ID と60 cm で、実施例14に記述されているように、G蛋白質が表面に固定化され、抗-c-myc モノクローナル、又は、ポリクローナル抗体がG蛋白質に結合されている（架橋剤が抗体をG蛋白質に相跨原子価的に付着し、架橋剤はdimethylpimelimidate (DMP) である。成功させるための架橋の工程は「ImmunoPure Protein G IgG Orientation Kit」Instructions (Pierce, Rockford, IL, PN 44896) に記述されている。
Fab抗体フラグメントが一度、チューブの内側の壁上の抗-c-myc で捕獲された後、非常に微量な容量(1 mL) の10 mM の燐酸 (pH 2.3) がチューブ内に注入され、固定化された抗-c-myc からFab 抗体フラグメントを脱離するため内側の壁に当てるように前後に動かす。これがチューブから250 nL の燐酸緩衝液(100 mM の H2NaPO4/100mM HNa2PO4, pH 7.5) pH を~7にし、噴出される。これは格子対表面プラズモン共鳴 (GC-SPR) アレー上への非相跨原子価のスポッティング用に準備され、表面化学はGC-SPRチップの金の表面に結合する端部のシステインチオールグループに基づいている。更に、脱離・中性化のプロセスがアレー化する装置の一部として行われ、Fab抗体フラグメントが、チップ全体の統合されたプロセスの一部として、完全にプロセスできる。
G蛋白質の他に、A蛋白質、又は、A/G蛋白質(実施例14に記述されているように)にもこの例に記述された工程を使うことができる。
実施例29
グルタチオン毛細管チャンネルを準備する事
実施例13に記述された工程に基づいて用意された、100 mm ID 長さ25 cm の非キレート化されたIDA熔融シリカ毛細管は非イオン化された水で洗い流され、その後、0.1 M のHg(NO3)2・H2O で2 mL/分の速度で二時間処理される。毛細管は非イオン化された水で洗い流された後、5 mg/mL の還元された単量体のグルタチオン(Sigma-Aldrich,Milwaukee, WI, PN G4251) の溶液で2 mL/分の速度で一時間反応される。毛細管は非イオン化された水で洗い流され、冷蔵庫に保管される。
実施例30
蛍光イメージングでの蛋白質-蛋白質相互作用のスクリーニングをする工程
異なった組み換えられた酵母菌の蛋白質が全細胞酵母菌のライセートとして放出され、ベクトルの説明と細胞溶解の状態がHeng Zhu. Et al., Science, 293:2101 (2001) に記述され、各蛋白質み二つのフュージョンタグ、一つはGST (グルタチオン S-トランスフェラーゼ) (精製の為) ともう一つは端部の6-ヒスタグ (固定化するため) である。精製されたライセート (25 mL) 寸法 150 mm ID と 40 cm でグルタチオンが、実施例29に記述されているように、表面に固定化されている開放チューブ分離毛細管 (Polymicro Technologies, Phoenix, AZ) を通される。蛋白質が一度チューブの内側の壁にグルタチオンで捕獲されれば、微量の (0.8 mL, およそ長さ 2.8 cm) の 20 mMのグルタチオンがチューブに取り入れられ、蛋白質 (GST との競争で) を脱離するため内側の壁に当てるように前後に動かす。
これがチューブから放出され、Heng Zhu. Et al., Science, 293:2101 (2001) に記述されているように、HlS6 を通して錫で塗布されたアレー表面上にアレーできるように準備される。この時点で、「ターゲット」蛋白質が、アレー上で種々の異なった相互作用パートナーを選別するため、ビオチン化するためアレーに取り入れられる。ストレプトアビジンのCy3-標識がターゲットが結合されているスポットを検出するためチップに取り入れられ、標準的な蛍光イメージングで確定される。ターゲットの取り入れや洗浄や検出に関連した状態やその他蛋白質アレーに関連した状態はHeng Zhu. Et al., Science, 293:2101 (2001) に記述されている。
実施例31
蛍光イメージングで抗原蛋白質のレベルを監視する為の量測定チップを用意する事
寸法 150 mm ID と長さ40 cmで、G蛋白質が固定化された毛細管チャンネルが実施例9や14や20に記述されている工程に従って準備される。一つの毛細管の先に 1.0 mL のスポイト (Tecan Systems, San Jose, CA, CAVRO Model No. XP-3000) が接続される。毛細管は非イオン化された水で洗い流される。その後、抗ホスホチロシン(抗−pY) モノクローナル抗体 (BD Biosciences, PN 610430) が、1 mg/mL の抗-pY 溶媒を毛細管を 1 mL/分の速度で十五分間通して、G蛋白質の表面に結合され、その後、非イオン化された水で洗い流される。G蛋白質の表面が形成された後、架橋剤dimethylpimelimidate (DMP) を使って、表面に抗体を相跨原子価的に架橋化するか、固定化する。架橋化するのと残基グループを防御するために使われる試薬は ImmunoPurea Protein G IgG Orientation Kit (Pierce, Rockford, IL, PN 44896) のものである。抗体を架橋化する工程と残基が反応しない場所を防御する工程は関連した説明書にPierce (Rockford, IL) によって用意されている。キットの各試薬は 1 mL/分の速度で三十分間毛細管にポンプで注入され、抗-pY 抗体毛細管は非イオン化された水で洗い流される。
500 mL の精製された細胞ライセート (Huilin Zhou, et al., Nature Biotech., 19:375 (2001) に記述されている工程に従って用意された) が25 mL/分の速度で毛細管に通される。このプロセスが燐酸化された蛋白質の一部を孤立化し、濃縮し、潜在的に妨害する・混同する可能性のあるアルブミンのような蛋白質を除去する。燐酸化された抗原蛋白質(すなわち、チロシン領域が燐酸化された)が一度抗-pY 抗体毛細管で捕獲されれば、毛細管はPBS (0.9% w/v NaCl, 10 mM の燐酸ナトリウム, pH 7.2) によって洗浄される。溶液は窒素ガスで噴出され、その後、微量 (0.5 mL, およそ長さ2.8 cm) の 10 mM 燐酸 (pH 2.3) の溶媒がチューブに取り入れられ、毛細管チャンネルから燐酸化された蛋白質を脱離するため前後に壁の内側に当たるように二回動かす。液体層がチューブから 125 nL の燐酸塩緩衝液に放出し、pHを7.0 ± 0.2 にする。
その後、精製され、回収されたサンプル内の蛋白質はCy5 か Cy3のラベルを付ける。ラベル化され、精製され、燐酸化された蛋白質サンプルは抗体のアレーが入ったガラスのスライドに載せられる。各アレーのスポットは異なった燐酸化された蛋白質に対しての異なった抗体が入っている。各特定の抗原蛋白質があるかないかは蛍光イメージングで測定される。結果はコントロールサンプルの結果と比較される。種々のラベリングとアレー工程の説明は BD Biosciences Clonetech, Antibody Microarrays User Manual, PN K1847-1, PT 3648-1 (PR2X045) Published 10/14/2002 に記述されている。
実施例32
熔融シリカ毛細管チャンネルにアビジンを付着する事
200 mm ID 100 cmの長さの毛細管が実施例1か２のように食刻される。毛細管が、その後、ドライトルエンの中の10％の(v/v) g-グリシジルオキシプロピルトリメトキシシラン(Sigma-Aldrich, Milwaukee, WI, PN 44,016-7)の溶媒を50°Cで満たし、ゆっくりしたフローの 2mL/分の状態下で四時間反応させる。毛細管は冷却され、トルエンとメタノールで各30分間洗浄され、その後、非イオン化された水で洗浄される。毛細管は単量体アビジン溶媒 (20 mg/ml が10 mM 燐酸緩衝液, pH 8.5, の中に入った) の溶液で満たされている。蛋白質は、ネイティブリシン残基を通して付着するネイティブ単量体アビジンか、蛋白質の端部のポリリシンフュージョンタグを通して付着する、組み換えられたアビジンであるかもしれない。ネイティブ単量体アビジンはBioline (London, UK) から購入することができる, 又は, Green, Avidin and Streptavidin Method Enzymol., 184:51 (1990) に記述されている工程に従って、用意することができる。毛細管は蛋白質溶液は毛細管を1 μL/分の速度で通し、25?Cで四時間反応させる。毛細管は10 mM 燐酸緩衝液 pH 7.0 で一時間洗い流し、調整し、その後、非イオン化された水で洗い流し、4?Cで使うまで、保管する。
二者択一的に、組み換えられた三量体アビジン (Sigma-Aldrich, Milwauekee, WI, PN A8706) のような複量体を、この例に記述されているように、使うことができる。
実施例33
アビジン開放チューブ毛細管を使って同位体符号化親和性タグ(ICAT)ペプチドを精製し、濃縮する事
この実施例の本来の目的は同位体符号化親和性タグ(ICAT)ペプチドを単量体アビジン親和性グループを通して、濃縮し、精製する事である。単量体アビジンの説明と準備につてはN. Michael Green, Methods Enzymol., 184:51 (1990) で読むことができる。使い捨て開放チューブ抽出カラム(実施例32に記述されているいるように製造されている)が、100 μL か 1 mL のスポイトと一緒に使われる。イオン交換で画分されたペプチド(およそ 10 μg か 1 mL) は寸法200 μm ID の長さ 1 メートルの単量体アビジン毛細管 (Polymicro Tchnologies, Phoenix, AZ) に取り入れられる。一度取り入れられた後、サンプルは表面を合計四回 100 μL/分の速度で通される。ビオチン化されたペプチド(1 μg 程度の)は選択的に単量体アビジン毛細管の表面上に捕獲される。 毛細管は水で 100 μL/分の速度で五分間洗浄され、水は噴出される。ビオチン化されたペプチドは 1 μL (およそ3.2 cm の長さ) の 0.3 % の蟻酸へ、この溶出液を単量体のアビジンの表面に合計四回 20 μL/分の速度で通すことで、選択的に取り入れられる。 ペプチドが入っている溶出領域は毛細管から押し出され、その後、Steven Gygi, et al., Nature Biotech., 17:994 (1999); David Han, et al., Nature Biotech., 19:946 (2001) に記述されているようにμLC-MS/MSの方法で分離される。
実施例34
質量分析法による同定のペプチドで同位体符号化親和性タグのペプチドを濃縮する事
この実施例の本来の目的は同位体符号化親和性タグ(ICAT)ペプチドを単量体アビジン親和性グループを通して、濃縮し、精製する事である。単量体アビジンの説明と準備につてはN. Michael Green, Methods Enzymol., 184:51 (1990) で読むことができる。使い捨て開放チューブ抽出カラム(実施例32に記述されているいるように製造されている)が、100 μL か 1 mL のスポイトと一緒に使われる。イオン交換で画分されたペプチド(およそ 10 μg か 1 mL) は寸法200 μm ID の長さ 1 メートルの単量体アビジン毛細管 (Polymicro Tchnologies, Phoenix, AZ) に取り入れられる。
一度取り入れられた後、サンプルは表面を合計四回 100 μL/分の速度で通される。ビオチン化されたペプチド(1 μg 程度の)は選択的に単量体アビジン毛細管の表面上に捕獲される。毛細管は水で 100 μL/分の速度で五分間洗浄され、水は圧縮された空気で噴出される。ビオチン化されたペプチドは 1 μL (およそ3.2 cm の長さ) の 0.3 % の蟻酸へ、この溶出液を単量体のアビジンの表面に合計六回 20 μL/分の速度で通すことで、選択的に取り入れられる。ペプチドが入っている溶出領域は毛細管から特定のマトリックス支援レーザー脱離イオン化(MALDI)のターゲットのX-Y の位置に押し出され、MALDIターゲットの準備とクロマトグラフィー分離を統合するデバイスを使うことで容易にする事ができる (LC Packings, S. San Francisco, CA, Probot? Micro Fraction Collector)。
この同じデバイスがエネルギー吸収マトッリックス溶液の均一容量化するために使うことができ、他のMALDI関連の説明と共に詳細が (Martin Yarmush, et al., Annu. Rev. Biomed. Eng., 4:349 (2002)) に記述されている。MALDIターゲットが一度十分に準備されれば、比較的数の多いペプチドの検証と測定の質量分析法での解析をする。このことは或る観点からすでに行われている (Martin Yarmush, et al., Annu. Rev. Biomed. Eng., 4:349 (2002); Timothy Griffin, et al., J. Biol. Chem., 276:45497 (2001))。
実施例35
複合体構成の質量分析による同定で複数のDNA結合された蛋白質複合体を抽出する事
150 mm ID 75 cmの長さの毛細管が実施例1か２のように食刻される。その後、毛細管は4% (v/v) 溶液 3-aminopropyltriethoxy-silaneの入った65°C のメタノールで満たされ、ゆっくりしたフローの1 mL/分の速さで十二時間反応される。100%のメタノールと、その後、非イオン化された水で洗い流した後、チューブは5.0 mg/mLのNHS-LC ビオチン(N-ヒドロキシスクシンイミドビオチン, Sigma-Aldrich, Milwaukee, WI, PN H1759) の入った50 mMの重炭酸ナトリウム溶媒pH 8.3で満たされ、常温で四時間反応される。ビオチン化の後、毛細管は非イオン化された水で洗い流され、その後、毛細管は4.0 mg/ml のストレプトアビジン溶液(Sigma-Aldrich, Milwaukee, WI, PN S0677)の入った50 mM の燐酸ナトリウム緩衝液溶媒 (pH 7.3) で満たされる。ストレプトアビジン溶液は四時間4°Cで反応させ、残ったフリーストレプトアビジンは毛細管チューブを非イオン化された水で洗浄する事で除去する。
DNA シーケンスがその複数の蛋白質複合体との相互作用のため選別することを用意する。すべてのケースで、ターゲットシーケンスは5’の端部でビオ沈下される、複数の蛋白質複合体の例は Eckhard Nordhoff, et al., Nature Biotech., 17:884 (1999) に記述されている。短い一本鎖のビオチン化されたDNA (＜＜50 bp) は標準のDNA合成技術 (すなわち、オリゴヌクレオチド合成) を使って用意される。長い一本鎖のビオチン化されたDNA (? 50 bp) は標準PCRの技術で用意され、PCR用のプライマーの一つ、又は、両方の端部は5’ ラベル化される。標準的な精製技術で、DNAクロマトグラフィー (Douglas Gjerde, et al., DNA Chromatography, Chapter 6, Wiley-VCH, Weinheim, Germany (2002)) を含んでの、PCR反応後、プライマーは除去される。精製されたPCRの物質は、その後、＞＞ 95oCで熱せられ、その後、一本鎖のビオチン化されたDNAを作製するため、すぐ4oCに冷却される。
長い二本鎖のビオチン化されたDNA (?50 bp) は、最後の加熱で変性し冷却するステップ以外は、一本鎖と全く同じ方法で用意される。一度、必要なビオチン化されたDNAが適切に用意されれば、DNA相互作用のために選別された蛋白質が培養できる。蛋白質はほとんどの場合、全細胞抽出物か核の抽出物かその他の標準的な方法で用意されたDNAに結合した蛋白質から誘導される。ビオチン化されたDNA (100 ng) は抽出物に足され、DNAに結合した蛋白質は、すでに記述されているように、培養される (Eckhard Nordhoff, et al., Nature Biotech., 17:884 (1999))。一度、培養が完全に終わった後、結合しなかった、ビオチン化されたDNAはポリエチレンイミン (PEI) で選別的に沈殿されサンプルから、すでにDNAの沈殿と除去の事が記述されているように (Jasper Svejstrup, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:6075 (1997)), 除去される。一度、結合されなかったDNAが除去されれば、ビオチン化されたDNAが入ったサンプル全部が、上記に記述されているように、ストレプトアビジン毛細管に取り入れられる。
すべてのサンプルは毛細管に、50 μL/分のフローの速度で全部取り入れられ、押し出され、この行為が五回繰り返される。一度終われば、毛細管は15 μL の水で、別々に100 μL/分の速度で取り入れられ、排出し、洗浄され、この行為が五回繰り返される。その後、毛細管は毛細管を10 psi に圧縮された空気を30秒流し入れる事で、空にする。その後、50%メタノール・50%水の1 μL 単一層 (およそ5.6 cm の長さ) が毛細管に全部取り入れられ、この溶出液がストレプトビジンの表面全体に合計五回20 μL/分の速度で通される。
基のDNAシーケンスと結合した、溶出された蛋白質の入った、1 μL の溶出液全部が、その後、エレクトロスプレーのノズル (Advion NanoMate? 100, Advion BioSciences, Inc., Ithaca, NY; Nanospray needle holder, PN NSI-01 and NSI-02, Nanospray needles, PN NSI-NDL-01 and NSI-NDL-02, LC Packings Inc., San Francisco, CA) に押し込められ、ESI-MS/MSで分析される。このエレクトロスプレーノズルとMSとMS/MSで使うことの実施例はXian Huang, et al., Proceedings of the 50th ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics, Orlando, Florida, June 2-6, 2002 に記述されている。ESI-MS/MSは, (Martin Yarmush, et al., Annu. Rev. Biomed. Eng., 4:349 (2002) に記述されているように、DNA結合複合体を形成する蛋白質の同定のために使われる。
実施例36
開放チューブラー固定抽出の曲がりくねったフローが蛋白質に及ぼす影響
ポリイミドで被膜化された、寸法 200 μm ID の 360 μm OD の長さ63 cm の二つのシリカチューブが二つの異なった形体で用意された。一番目の形体は非コイル化された、又は、この形体は「真っ直ぐな」と第13-17, 19, 21図のデータに表記されているように、「真っ直ぐな」形体と称された。二番目の形体は連続したシリーズの「8の字」にコイル化された形体であった。各形体の個々のループの直径の平均値は9 mm で、63 cm のカラムの長さ の中55 cmがコイルの形状で、コイルの両端部は4 cm の真っ直ぐなチューブになっていた。これらのコイルは第13-18, 20 図でコイルと称されている。「コイル」カラムは毛細管チャンネルの形状と機械工学的な整合性を保つためにすばやく曲がるポリウレタンに組み入れられ、注入口と抽出口は完全に露出された。両形体は0.1 M NaOH で一時間、非イオン化された水で十五分間、その後、最後に非イオン化された水で六十分間、全工程120 μL/分の速度で洗浄された。
システムは二つの3方弁とTの字形の弁一つ (Upchurch, Oak Harbor, WA) で構成され20 mM トリス-HCL 緩衝液 (pH 8) かリソチーム。又は、ベンジルアルコールが各毛細管に2.5 ml のスポイト (Tecan Systems, San Jose, CA＜＜ CAVRO Model No. XP-3000) で取り入れられた。検出はカラムの先から2 cm のポリイミドの上塗りの所に焼き入れられたUV-透過の窓を通してリアルタイムに達成され、窓は検出器Linear Model Spectra 200 UV の波長を 215 nm に調節し、光路内に位置された。毛細管は120 μL/分の速度で五分間トリス−HCL緩衝液で調整された。その後、フローが止められ、2 mg/mL のりソチームか0.01% ベンジルアルコール中性マーカーが60, 120, 300, 600 μL/分の速度で、吸収度のシグナル回収と一緒に、リアルタイムで取り入れられた。3 Hz データ速度での吸収度の記録が毛細管を通るベンジルアルコール中性マーカーとリソチームのフローの突破を監視するため使われた。実験の始動時は吸収度はゼロであった。
ベンジルアルコール、又は、リソチームが毛細管カラムに突破し始めると、吸収度が上がる。吸収度は、毛細管に物質が入って来る濃度と出てくる濃度が同じになるまで上がり続ける。その時、シグナルは平衡で、100%の物質である。リソチ−ムのシグナルが一度平衡に到達すれば、同じトリス−HCL緩衝液溶液がもう一度チューブに通され、残された(すなわち、結合しなかった)リソチームが洗浄された。トリス−HCLはその後0.1 M HCL に入れ替えられ、毛細管に120 μL/分の速度でリソチームを脱離するか溶出するため取り入れられる。脱離されたリソチームのピークは吸収度のリアルタイムの記録(3 Hz, 215 nm)で検出された。
第13-16図は「突破」カーブと称される。第13図は60 μL/分での中性マーカー (ベンジルアルコール) とリソチームの突破カーブである。ダッシュ符号の線はベンジルアルコール(真っ直ぐなチャンネル)で、黒く塗りつぶされた線はベンジルアルコール(コイルチャンネル)で、真っ直ぐな線はリソチーム(真っ直ぐなチャンネル)で薄く塗りつぶされた線はリソチーム(コイルチャンネル)である。
第14図は120 μL/分での中性マーカー(ベンジルアルコール)とリソチームの突破カーブである。ダッシュ符号の線はベンジルアルコール(真っ直ぐなチャンネル)で、黒く塗りつぶされた線はベンジルアルコール(コイルチャンネル)で、真っ直ぐな線はリソチーム(真っ直ぐなチャンネル)で薄く塗りつぶされた線はリソチーム(コイルチャンネル)である。
第15図は300 μL/分での中性マーカー(ベンジルアルコール)とリソチームの突破カーブである。ダッシュ符号の線はベンジルアルコール(真っ直ぐなチャンネル)で、黒く塗りつぶされた線はベンジルアルコール(コイルチャンネル)で、真っ直ぐな線はリソチーム(真っ直ぐなチャンネル)で薄く塗りつぶされた線はリソチーム(コイルチャンネル)である。
第16図は600 μL/分での中性マーカー(ベンジルアルコール)とリソチームの突破カーブである。ダッシュ符号の線はベンジルアルコール(真っ直ぐなチャンネル)で、黒く塗りつぶされた線はベンジルアルコール(コイルチャンネル)で、真っ直ぐな線はリソチーム(真っ直ぐなチャンネル)で薄く塗りつぶされた線はリソチーム(コイルチャンネル)である。
第17図は60 μL/分での中性マーカー(ベンジルアルコール)と60 μL/分と600 μL/分でのリソチームの突破カーブである。黒く塗りつぶされた線は60 μL/分でのベンジルアルコール(コイルチャンネル)で、薄黒く塗りつぶされた線は60 μL/分でのベンジルアルコール(コイルチャンネル)で薄く塗りつぶされた線は60 μL/分でのリソチーム(コイルチャンネル)である。
全図形で、ダッシュ符号の線と直線は「真っ直ぐな」カラムから収集されたデータで、黒くか薄く塗りつぶされた線は「コイル」カラムから収集されたデータである。更に、第12-16図の全データは標準化されている。標準化されたシグナルの強度を時間の関数として記入する代わりに、各時間の点は或る特定のフローの速度を直線の速度に掛けられる。これがx-軸上の標準化された距離なり、これをすることで、異なったフローの速度を直接比較することができる。200 μm ID の毛細管の調査された各フローの速度の直線速度は60 μL/分では3.18 cm/sec, 120 μL/分では6.38 cm/sec, 300 μL/分では15.90 cm/sec, 600 μL/分では31.80 cm/sec である。
第13図は壁との相互作用しない中性の小さな分子(ベンジルアルコール)で、平衡状態にコイル化された形状と真っ直ぐな形状と同じ速さで到達する(ダッシュ符号の線と黒く塗りつぶされた線は重なっているが故)。第1図も蛋白質分子(リソチーム) が壁と相互作用した (壁に吸着する) 事を示し、ベンジルアルコールよりももっと遅れて平衡状態に達する。蛋白質が平衡状態になる最中、リソチームが壁の表面と相互作用する為、これは理屈に適っている。これが故、リソチームのカーブが右にシフトしている(第13図)。しかしながら、ベンジルアルコール中性マーカーのように、平衡状態にコイル化された形状と真っ直ぐな形状と同じ速さで到達する(ダッシュ符号の線と黒く塗りつぶされた線は重なっているが故)。
第14-16図はフローの速度を上げる影響が立証されていて、これがコイルと直線の反応器のより際立った違いの結果につながる。この全三図形(第14-16図)では、中性マーカーのデータ(ダッシュ符号の線と黒く塗りつぶされた線)はコイルと直線のカラムのほんの少しの違い(もし相であれば)、特に平衡状態にシグナルが到達したことを加味して、でしかない。しかしながら、リソチームが取り入れられ、突破カーブがより浅かった場合は、すなわち、フロー速度が上がるにつれて、100%突破を達成するのにより長く掛かる。影響は真っ直ぐな毛細管の方が大きい。しかしながら、コイル状の毛細管のフローの速度の場合、影響は余り際立っていないか、小さくなる。
例えば、第14-16図では真っ直ぐな毛細管のリソチームのカーブ(直線)はいつもスロープがコイル化された毛細管のリソチーム(薄く塗りつぶされた線)のより浅い。壁の方へ押す込む理由がないケースの場合は、真っ直ぐなカラムデータの浅いほうのスロープはリソチームが壁によって「食い尽くされる」により時間が掛かることを示しており、この影響はフローの速度が上がればより際立つようになっている。その反面、コイル化されたカラムの急なスロープはリソチームが、蛋白質が壁の方へ曲がりくねったフローのため押しやられ、壁によって効果的に「食い尽くされている」事を物語っている。
更に、最高速度のフロー(第1７図を参照)は、少なくとも速度のフローと比較して(第13図を参照)、中性マーカーとリソチームの間のギャップが狭められていることが示されている。これは曲がりくねりとフローの高速度の組み合わせが放射状のフローを高める環境を作っていることを物語っている。この観察は他の異なった環境での観察と終始一貫している (R. Tijjsen, Sep. Sci. Technol., 13:681 (1978))。
第17図に記述されているように、コイル化されたカラムの600 μL/分での突破カーブはコイル化されたカラムの60 μL/分での突破カーブ(又は、真っ直ぐなカラムでも)とほとんど同じである。これは、もしBOTSPEカラムの壁へ蛋白質を放射状に効率的に運ぶ曲がりくねった流路が保証できれば蛋白質サンプルが少なくとも十倍の速さでプロセスできる。
毛細管チャンネルの抽出容量がチャンネルの形状(真っ直ぐかコイル状か)か蛋白質が吸収されるフローの速度かに影響をされるかを判別するため、実験が行われた。リソチームは二つのフロー速度、60 μL/分と600 μL/分、で吸収された。トリス-HCL緩衝液が、余ったリソチーム (すなわち、結合されなかった) を洗浄するため、チューブを通してポンプで流し込まれた。その後、0.1 M HCL は、ピークとして検出されたリソチームを脱離するため120 μL/分の速度でポンプで流し込まれる。
第18-20図のグラフがこの実験の結果を表している。第18図はコイルのようにチャンネル化されたカラムから溶出された、60 μL/分で流し込まれた、リソチームの突破カーブを表している。矢印は統合の窓 (ピークの統合が139.1 sec. で始まり、156.6 sec. で終わる) の限界である。統合ピークの領域は0.118 Abs-sec. である。
第19図は真っ直ぐなチャンネルカラムから溶出された、60 μL/分で流し込まれた、リソチームの突破カーブを表している。矢印は統合の窓 (ピークの統合が139.5 sec. で始まり、157.8 sec. で終わる) の限界である。統合ピークの領域は0.147 Abs-sec. である。
第20図は真っ直ぐなチャンネルカラムから溶出された、600 μL/分で流し込まれた、リソチームの突破カーブを表している。矢印は統合の窓 (ピークの統合が136.5 sec. で始まり、151.3 sec. で終わる) の限界である。統合ピークの領域は0.138 Abs-sec. である。
第21図は真っ直ぐなチャンネルカラムから溶出された、600 μL/分で流し込まれた、リソチームの突破カーブを表している。矢印は統合の窓 (ピークの統合が139.6 sec. で始まり、158.3 sec. で終わる) の限界である。統合ピークの領域は0.143 Abs-sec. である。
ピーク統合データでは、表面から捕獲され、回収されたリソチームの物質の量は捕獲した時に使われた状態をは無関係である (すなわち、量は毛細管チャンネルの形状と蛋白質吸着のフロー速度には無関係である)。従って、異なった吸着状態はこの毛細管の容量を満たす効率だけ影響し、容量の量には影響しない。
実施例37
ヘパリン親和性毛細管チャンネルを使って内皮細胞増殖因子(ECG)の精製

US特許 4,882,275 に記述されている内皮細胞増殖因子 (ECG) は治療法や細胞培養の添加物としてや治療法やECG免疫測定法に使われるために有益である。寸法 200 mm ID の長さ 25 cm の毛細管が、実施例18 に記述された工程に従って、ヘパリングループに結合するように官能性を持たすようにする。毛細管は直線チューブの形状で, 毛細管はスポイト (Tecan Systems, San Jose, CA, CAVRO Model No., XP-3000) に繋げられ、100 ml か 1 mL の注入器が開放チューブ毛細管の先 に接続され、片方の端部は動かすことができ、物を色々な場所で取り上げるか沈積できる装置に接続されている。
0.01 μg の 20 mer のオリゴヌクレオチドの入った 50 μL の溶液と taacgggcccaaattatcgc の充填配列の 10mM の燐酸ナトリウム緩衝液, pH 7.0, が毛細管に 常温で10 μL/分の速度で 通され、核酸のサンプルがチャンネルの壁に付着した充填ストランドと交配する。チューブは 10 μL の 100% の非イオン化された水で洗浄され、毛細管から排出される。毛細管はオーブンに置かれ、10 mM のトリス-HCl 0.1 mM EDTA (二ナトリウム) pH 8.0 溶液の 10 cm 層の溶液が熱い90°Cで、毛細管チャンネルにゆっくりと通され、核酸の充填ストランドを脱離し、変性し、変性された核酸がバイアルに沈殿される。
実施例38
特定の核酸シーケンスを修飾された核酸毛細管チャンネルを使って精製する事
100 μm ID の長さ 25 cmの毛細管は実施例15に記述された工程に従って一本鎖のDNAグループが用意される。毛細管チャンネルに付着した核酸のストランドは20 mer オリゴヌクレオチドのシーケンスattgcccgggtttaatagcg である。毛細管は真っ直ぐな形状でスポイト (Tecan Systems, San Jose, CA, CAVRO Model No. XP-3000) に接続され、100 ml か 1 mL の注入器が開放チューブ毛細管の先 に接続され、片方の端部は動かすことができ、物を色々な場所で取り上げるか沈積できる装置に接続されている。
0.01 μg の20 mer オリゴヌクレオチドの充填配列の taacgggcccaaattatcgc が入った 10 mM 燐酸ナトリウム緩衝液, pH 7.0, が毛細管に常温で、10 μL/分の速度で通され、サンプルの核酸が、チャンネルの壁に付着した充填ストランドと交配される。チューブは10 μL の100%の非イオン化された水で洗浄され、毛細管かあら除去される。毛細管はオーブン内に置かれ、90°C の熱い10 cm 層の10 mM トリス-HCl 0.1 mM EDTA (二ナトリウム塩), pH 8.0, 溶液が毛細管チャンネルにゆっくり流し込まれ、核酸の充填ストランドを変性し、脱離し、バイアル内に変性された核酸を沈殿する。
実施例39
疎水性相互作用の蛋白質に適切な疎水性の毛細管チャンネルの準備
200 μm ID の長さ 50 cm の毛細管は実施例7の中に記述された工程に従ってカルボン酸で用意される。二者択一的に、カルボン酸毛細管は他の二つの合成の仕方で作ることができる。一つ目の方法は毛細管は実施例1、又は、2の工程で用意ができ、70°Cの純塩化チオニルで満たされ、10 μL/分の速度で十二時間反応させる。毛細管はドライTHFで洗い流され、その後、THF(Sigma-Aldrich, Milwaukee, WI, PN 25,725-7)内の20% (v/v) の臭化ビニルマグネシウムの溶液で満たされ、十二時間10 mL/分の速度で反応される。毛細管はTHFで、その後、非イオン化された水で洗い流される。毛細管は3%の過酸化水素溶液内の50°Cの10% (v/v) の3-メルカプロプロピオニックアシド(Sigma-Aldrich, Milwaukee, WI, PN M580-1)の溶液か3%の過酸化水素溶液内の50°Cの10% (v/v) チオ-dPEG4aアシド(Quanta BioDesign, Ltd., Powell, OH, PN 10247) の溶液で満たされ、十二時間 2 mL/分の速度で反応させる。
その後、毛細管は非イオン化された水で洗い流される。手法２実施例１か２の工程で用意された毛細管は、allyldimethylchlorosilane (Petrarch Systems Inc., Levittown, PA, PN A0552) か allyltriethoxysilane (Petrarch Systems Inc., Levittown, PA, PN A0564) の純溶液でフロー速度の1 mL/分常温で満たされ、反応される。六時間後、毛細管は100%のメタノールで、その後、非イオン化された水で、反応を止めるため、洗い流される。毛細管は3%の過酸化水素溶液内の50°Cの10% (v/v) の3-メルカプロプロピオニックアシド(Sigma-Aldrich, Milwaukee, WI, PN M580-1)の溶液か3%の過酸化水素溶液内の50°Cの10% (v/v) チオ-dPEG4aアシド(Quanta BioDesign, Ltd., Powell, OH, PN 10247) の溶液で満たされ、十二時間 2 mL/分の速度で反応させる。その後、毛細管は非イオン化された水で洗い流される。
上記のカルボン酸毛細管はEDC (1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボヂイミド) (Sigma-Aldrich, Milwaukee, WI, PN 16,146-2) とスルフォ-NHS (N-ヒドロクシスルフォスクシンイミドのナトリウム塩) (Sigma-Aldrich, Milwaukee, WI, PN 56485) の各10% (w/v)の溶液で満たし、六時間常温で反応させる。毛細管は非イオン化された水で洗い流され、その後、10% (w/v) 溶液の4-フェニルブチルアミンの入ったメタノール液で満たされ、二時間常温で反応される。毛細管は100%メタノールで洗い流され、使うまで4°Cで保管される。
二者択一的に、200 mm ID 100 cmの長さの毛細管が実施例1か２のように食刻される。毛細管は 50°C の 純フェネチルトリメトキシシラン溶液 (Gelest, Tullytown, PA, PN SIP6722.6) で満たされ、その後、毛細管はゆっくりしたフローの状態下の 1 μL/分で四時間熱せられる。毛細管は冷却され、トルエンとその後100% メタノールで各三十分洗浄される。
実施例40
疎水性毛細管チャンネルを使って蛋白質から脱塩する事
毛細管の寸法 200 μm ID の長さ 50 cm は、実施例39に記述されている工程に従って疎水性の表面結合の官能性を持たせる。二者択一的に、毛細管の寸法 200 μm ID の長さ 50 cm は、実施例18に記述されている工程に従って疎水性のC18表面結合の官能性を持たせる。毛細管は「数字８」のタイプの形状に、直径 8 mmのコイルで、上と下の5cmの部分が真っ直ぐな形状で、コイル化されている。毛細管は100 ml か 1 mL の注入器が開放チューブカラムの先につながっている スポイト (Tecan Systems, San Jose, CA, CAVRO Model No. XP-3000) に接続され、片方の端部は動かすことができ、物質を色々な場所で取り上げるか沈積できる装置に接続されている。
サンプルは 0.1 μg のIgG蛋白質の入った 1.5 M の硫酸アンモニウム緩衝液の入った、200 μl の溶液である。サンプルは毛細管に溶液を三回前後に振って取り入れられ、毛細管チャンネルの疎水性相によって吸着される。残されたサンプル溶液は毛細管から噴出され、小さな10 cm の100%の非イオン化された水層が毛細管に通され、壁から蛋白質を脱離し、サンプルはバイアルに分析用に沈積される。
実施例41
逆相毛細管チャンネルとイオン対試薬でAキナーゼの蛋白質を精製する工程
毛細管の寸法 100 μm ID の長さ 25 cm が実施例12に記述されている工程に従って逆相表面に結合する官能性を持たせる。毛細管は直線チューブの形状で, 毛細管はスポイト (Tecan Systems, San Jose, CA, CAVRO Model No., XP-3000) に繋げられ、100 ml の注入器が開放チューブ毛細管の先 に接続され、片方の端部は動かすことができ、物を色々な場所で取り上げるか沈積できる装置に接続されている。
サンプルは 0.1 μg のAキナーゼの蛋白質が入った燐酸緩衝食塩水 (0.9% w/v NaCl, 10 mM の燐酸ナトリウム, pH 7.2) が入った100 μL の溶媒である。10 μL の 10% トリフロロ酢酸 (TFA) が足され、最終溶液量が 110 μL になり、サンプル内のTFAの濃度が 0.1% になるようにする。サンプルが毛細管に取り入れられ、蛋白質・TFAの複合体が毛細管チャンネルの逆相に吸着される。
サンプルは毛細管から噴出され、小さな 10 cm 層の50% (v/v) アセトニトリル・水が毛細管に通され、壁から蛋白質が脱離され、サンプルはバイアルに分析用に沈積される。
二者択一的に、毛細管チャンネルは 10 μL の液状の 0.1% TFAで洗浄しても良い。この溶液は毛細管チャンネルから除去され、蛋白質は脱離され、バイアルに沈積される。
必要であれば、二者択一的に、1%のヘプタフロロブチル酸(HFBA)が、イオン対試薬として、サンプルがエレクトロスプレーイオントラップ質量分析計で分析されるとき、イオン対試薬のイオン抑圧効果を軽減するために使われる。
実施例42
核酸混合物を逆相毛細管チャンネルとイオン対試薬で精製する事
毛細管の寸法 100 μm ID の長さ 25 cm が実施例12に記述されている工程に従って逆相表面に結合する官能性を持たせる。毛細管は直線チューブの形状で, 毛細管はスポイト (Tecan Systems, San Jose, CA, CAVRO Model No., XP-3000) に繋げられ、100 ml か 1 mL の注入器が開放チューブ毛細管の先 に接続され、片方の端部は動かすことができ、物を色々な場所で取り上げるか沈積できる装置に接続されている。
0.01μg のDNAが入った100 μL のサンプルが、US特許 4,683,195 に記述されいる工程に従ってヒト・ヘモグロビン遺伝子内のアレリック MstII の場所に及ぶ110 bp 配列をPCRを使って増幅し、準備する。10 μL のトリエチルアンモニウム (TEAA) 濃縮液が足され、最終溶液が110 μL になり、サンプル内のTEAAの濃度が100 mM になる。サンプルが毛細管に取り入れら、DNA/TEAAのイオン対複合体は毛細管チャンネルの逆相に吸着される。
サンプルは毛細管から噴出され、小さな 10 cm 層の50% (v/v) アセトニトリル・水が毛細管に通され、壁から蛋白質が脱離され、サンプルはバイアルに分析用に沈積される。
実施例43
飲料水からベンジンとベンジン代用の化合物を抽出する工程
200 μm ID の長さ 1 m の逆相C18毛細管は実施例12に記述されている工程に従って準備され、毛細管チューブの注入口と抽出口に 10 cm の真っ直ぐな端部と直径 1 cm の「8の字形」のコイルの形状である。5 mL の注入器が付いているスポイト (Tecan Syetems, San Jose, CA, CAVRO Model No. XP-3000) は毛細管に接続されている。毛細管は 100 μL のHPLCグレードのアセトンと 100 μL のHPLCグレードのメタノールで、50 μL/分のフローの速度でカラムを調整するため、洗浄される。メタノールが毛細管から排出され、4.5 mL の飲料水のサンプルが毛細管に取り入れられる。飲料水は毛細管を 200 mL/分の速度で、サンプル全部がカラムを通るまで、通される。その後、フローが逆流され、サンプルが逆に 50 μL/分の速度でサンプル全部が排出されるまで、押し入れられる。残った溶液は毛細管から排出され、100%HPLCグレードのメタノールの小さな 2 cm 層のプラグが入れられ、一度、ゆっくりと毛細管上下に有機物を毛細管の壁から脱離するため通され、メタノールは小さなバイアルに沈積される。サンプルはEPAの502、又は、524.2 の方法によってベンジンとベンジン代用化合物用に分析される。
実施例44
同位体符号親和性タグ(ICAT)ペプチドのマルチディメンショナル段階的な固体相抽出の工程
生体サンプルがすでに Steven Gygi, et al., Nature Biotech., 17:994 (1999); David Han, et al., Nature Biotech., 19:946 (2001); Marcus Smolka, et al., Analytical Biochemistry, 297:25 (2001); Huilin Zhou, et al., Nature Biotech., 19:512 (2002); and W. Andy Tao, et al., Current Opinion in Biotechnology, 14:110 (2003) に記述されているレリースや同位体符号化ラベリングやターゲット蛋白質の加水分解に基づいてプロセスされる。
2-3 μg のラベル化されたペプチドの入った5 mM NaH2PO4 (pH = 3) は、200 μm ID の長さ1 m の、5 mM NaH2PO4 (pH = 3) に平行化された、強い酸性カチオン交換毛細管 (実施例5に記述されているように) に取り入れられる。サンプル内の蛋白質全量は、100 μL/分の速度で、合計八回表面上にサンプル全量を通すことによって、カチオン交換体上に吸着することができ、吸着されなかった物質は空気で押し出され、将来の分析のため回収される。
10 μL の 5 mM NaH2PO4 + 10 mM KCl (pH = 3) の容量層が毛細管に取り入れられ、毛細管の内側の表面に合計八回, 100 μL/分の速度で、表面から容量層にこのイオンの強度で溶解する蛋白を溶出するため、通される。この 10 μL の容量層は空気で押し出され、適切な容器に将来の分析のため集められる。このプロセスはKCｌ(すなわち、10 mM KCl の増分が 300 mM KCl までで、合計31区分で)の濃度を上げる度に、これらのイオンの強度を増すたびに溶解する蛋白質は将来の分析のため溶出と回収のため、繰り返される。
イオン交換ディメンションから集められた個々の 10 μL の各部分は個別に10 μL の5 mM NaH2PO4 と混合され、pH を7.2 にする。その後の各20 μL サンプルは、200 μm ID の長さ1 m の単量体のアビジンカラム(実施例32に記述されているように)に取り入れられ、その複量体のアビジンサイトは、300 μL 2 mM D-ビオチンが入っているPBS (0.9% w/v NaCl, 10 mM 燐酸ナトリウム, pH 7.2) を100 μL/分の速度で流し込み、次に、300 μL 0.1 M グリシン, pH 2.8, を 100 μL/分の速度で流し込み、次に、300 μL PBSを100 μL/分の速度で流し込み、pH 7.2 の平衡状態にし、残った溶液は圧力の掛かった空気で押し出される。毛細管に20 μL のサンプルが一度取り入れられれば、サンプルが単量体のアビジン毛細管の内側の表面に、100 μL/分のフローの速度で合計八回通される。残った溶液は圧力の掛かった空気で押し出され、300 μL のPBSが毛細管を通して廃棄物へ300 μL/分の速度で通され、毛細管はもう一度溶液を圧力の掛かった空気で除去される。
10 μL の容量の0.1 M のグリシン, pH 2.8, は毛細管に取り入れられ、このpH表面から容量層に溶解できる蛋白質を100 μL/分の速度で、合計八回毛細管の中の表面に、グリシンが通される。この10 μL の容量層は空気で押し出され、適切な容器に将来の分析のため回収される。
上記のアビジン分離ディメンションから集められた個々の部分は個別に同じ容積 (10 μL) の, MALDIイオン化で質量分析計の検出をする場合、0.2% のトリフロロ酢酸(TFA) と混合されるか、エレクトロスプレーイオン化(ESI)を使って質量分析計の検出をする場合、0.2% のヘプタフロロブチル酸(HFBA)と混合される。このTFA/HFBAのステップは必要になるか、ならないか、もし、酸の切断が、アビジン分離ディメンションの後、使われた場合、判らない。その後の各20 μL サンプルが、200 μm ID の長さ1 m の、C-18グループ(実施例12に記述されているように)で塗布された開放チューブ毛細管に取り入れられ、MALDIイオン化の場合、0.1% TFA で平衡化され、ESIの場合、0.1% のHFBAで平衡化される。サンプル内の全部の蛋白質は、100 μL/分の速度で合計八回表面上に全サンプル容量を通すことによって、逆相表面の表面上に吸着させることができ、吸着しなかった物質は空気で押し出される。
0.1% TFA か4%アセトニトリルの中の0.1% HFBAの1 μL の容量層は毛細
管に取り入れられ、30 μL/分のフロー速度で、合計八回毛細管の内側の表面を、表面から容量層にこのアセトニトリルの濃度で溶解できる蛋白質を溶出するため、通される。この1 μL の容量層は空気で押し出され、適切な容器に将来の分析のため集められるか、適切なMALDIターゲットにその後のMSかMS/MSかMSｎ分析のため、スポットされるか、適切なESIノズルにその後のMSかMS/MSかMSnの分析のため分与される。このプロセスはアセトニトリル(すなわち、4% アセトニトリルの増分で96%までで、合計24区分で) の濃度を上げる度に、これらのアセトニトリルの濃度を上げる度に溶解する蛋白質をMS, 又はMS/MS、又はMSnの将来の分析のための溶出と回収のため、繰り返される。
実施例45
Ni-IDA表面上のヒスタグ用の工程
毛細管の寸法 200 μm ID の長さ60 cm は次の工程で食刻された。毛細管は1 mL のHPLCグレード非イオン化された水ですすがれた。その後、毛細管は0.1 M の苛性ソーダで満たされ、三十分間常温で洗い流された。その後、塩基溶媒は1 mL HPLCグレードの非イオン化された水ですすがれ、除去された。溶液は 1 mL 0.1 M HCl に変えられ、次に1 mL の非イオン化された水で再度すすがれた。水は空気で噴出された。
毛細管は3-グリシジルオキシプロピルトリメトキシシラン (Sigma-Aldrich, Milwaukee, WI, PN 44,016-7)の溶液 をスポイトで0.07 mL/分のフロー速度で十から十二時間55°Cで流し込み、反応させた。試薬は空気で噴出された。その後、毛細管は1 mL の非イオン化された水で常温ですすがれた。
0.25 M 苛性ソーダの中に入った0.2 M イミノ二酢酸溶液 (IDA) (Sigma-Aldrich, Milwaukee, WI, PN 56781) 、pH が~9、が用意された。溶液は、スポイトで0.07 mL/分のフロー速度で十から十二時間50°Cで毛細管を通して注入された。毛細管は2-3 mL の非イオン化された水ですすがれ、最後に、水の中に保管された。
キレート剤化された毛細管は水で洗い流され、Ni の形体に0.1 mM のNiSO4溶液で変換して、水で再度洗い流された。毛細管はヒスタグ蛋白質を抽出するように用意される。
スポイトが二つ付いたFIALab 3500 (FIALab Instruments, Inc., Bellevue, WA) システムが毛細管を試験するために使われた。各注入器は三方弁バルブが抽出口に、独自に注入器の内容物を満たす事や(か) 交換が、毛細管をポンプで満たす前に、設けられた。各注入器の抽出物は三方「Tの字形の部品」につながり、抽出物はNi-IDA毛細管につなげられた。
1 mL の注入器は、20倍に薄められた0.01 M のトリス緩衝液, pH 8, が全ヒスタグ蛋白質の濃度を 12.5 μg/mL にした、 Qiagenのヒスタグ蛋白質ラダ−標準物質 (Qiagen, Santa Clarita, CA, PN 34705) で積み込まれた。この 1 mL の注入器は毛細管にヒスタグ蛋白質を積み込むために使われた。
2.5 mL の注入器は0.01 M のトリス緩衝液, pH 8(すなわち、毛細管が積み込まれる前に平衡化された時か、積み込まれた後、洗浄された時), 又は、0.01 M クエン酸, pH 3 (すなわち、ヒスタグ蛋白質が毛細管から溶出された時) が積み込まれた。
FIALab 3500 はソフトウエア−で、錫が入った毛細管を 2.5 mL のスポイトを介して、0.01 M トリス, pH 8, を 3 μL/秒の速度で 120 秒間コントロールし、その後、止められた。その後、1 mL 注入器が 12.5 μg/mL のヒスタグ蛋白質標準物質を 2 μL/秒の速度で 100 秒間ポンプで注入し、その後、止められた。2.5 mL の注入器が、その後、0.01 M のトリス緩衝液, pH 8, が毛細管内にポンプで注入し、 3 μL/秒の速度で 120 秒間洗浄するため使われた。2.5 mL 注入器の内容物は、その後、洗い流され、0.01 M のクエン酸, pH 3, で入れ替えられた。2.5 mL 注入器は、その後、0.01 M のクエン酸, pH 3, が毛細管に 3 μL/秒の速度で100 秒間ポンプで注入するため、使われた。溶出の段階中、200 μm ID 毛細管の端部全体の吸着度は、3 MHz データのデータ基点速度で測定するSpectraPhysics の検出器 (プログラム化できる波長検出器Spectra 200) で監視された。
この全工程が錫の入っていない毛細管と共に、0.01 M のトリス緩衝液, pH 8 (すなわち、ヒスタグ蛋白質の入っていない)だけが入っているサンプルの錫が入っているカラムにも繰り返し行われた。これら三つの実験状態の結果は第22図に表記されている。ヒスタグ蛋白質サンプルと錫の入ったカラムのピーク統合は 1.1 μg のヒスタグやんぱく質の溶出された質量を示していた。注釈事項として、ベースラインの~140秒での上昇は0.01 M のクエン酸の存在で変わる屈折率によるものである。
実施例46
G蛋白質毛細管チャンネルの使用と準備の工程
熔融シリカ毛細管200 μm ID の長さ 114 cm 部分二つは、実施例２に記述されている工程に従って食刻された。毛細管は、その後、連続的な窒素の流れで、160°Cで三時間乾燥された。ドライトルエン (Sigma-Aldrich, Milwaukee, WI, 99.8%無水) の中の15％のg-グリシジルオキシプロピルトリメトキシシラン (Sigma-Aldrich, Milwaukee, WI, PN 44,016-7) 溶液が引力で60 μL/分の速度で、三時間110°Cで毛細管に通された。シラン貯水槽はこの時間中一回補充された。
7 センチが各端部から切り落とされ、必要な100 cm の毛細管が作られた。25 mL 容量がナトリウム上に位置され、蒸留され、ドライトルエンが作られた。この溶液を使って、シラン試薬が作られた。一つの毛細管はシラン試薬を削除するためトルエンですすがれ、一晩保管された。G蛋白質結合は次の日に行われた。1 mg のG蛋白質 (CalBiochem, San Diego, CA, PN 539303) は燐酸ナトリウム緩衝液の中に、pH = 8.0, 25 mM の緩衝液濃度で、溶解された。毛細管はトルエンを除去するため空気で洗い流され、シリカ表面に吸着したトルエンを除去するためメタノールで短時間すすぎ、その後、水で短時間すすがれた。G蛋白質は毛細管を通して洗い流され、毛細管の端部はリトマス紙のpHが塩基(~pH 8) になるまで監視する。G蛋白質の二つのカラム容量分が毛細管を通すようにされた。その後、満たされた毛細管の端部は、毛細管を密封するため、GC隔壁に入れて、プレスし、37°Cのエアーオーブンに三時間半入れた。
20 μL の 4.9 mg/mL anti-FLAG M2 ねずみモノクローナル IgG1 サンプル (Sigma-Aldrich, Milwaukee, WI, PN, F-3165) は 1 メートルのG蛋白質毛細管に吹き込れ、従って、毛細管の内容量のおよそ三分の二の容量を占める。この 20 μL サンプルゾーンは目で確かめられ、毛細管から出されず、50 μL の注入器で毛細管の上へ引き上げられた。サンプルゾーンは毛細管の中で常温で五分間培養することができた。サンプルゾーンは、その後、毛細管の下へ、毛細管から出されず、同じ形態で押し込められ、毛細管の中で常温で五分間培養させ、従って、毛細管の上に 10 μL の内容量を空けたままにした。毛細管の上と下でサンプルゾーンを培養するプロセスは、この同じサンプルで二回繰り返され、次に、最後に、毛細管のサンプルゾーンは1 mL の空気の 10-20 mL/分の速度の流れで排出された。この毛細管は、その後、10 mM NaH2PO4/10 mM NaHPO4の緩衝液で, pH 7, 500 μL の緩衝液を毛細管に1 mL/分の速度で通すことによって、洗浄され、次に、毛細管から緩衝液が1 mL の空気の 10-20 mL/分の速度の流れで排出された。
10 μL の14.7 mM 燐酸 (pH 2.2) がこの同じ毛細管に吹き込まれ、従って、毛細管の30 μL 内容量のおよそ三分の一の容量を占める。溶出ゾーンは、その後、毛細管の下へ、毛細管から出されず、同じ形態で押し込められ、毛細管の中で常温で一分間培養させ、従って、毛細管の上に 20 μL の内容量を空けたままにした。毛細管の上と下でサンプルゾーンを培養するプロセスは、この同じサンプルで二回繰り返され、次に、最後に、溶出ゾーンを0.5 mL のEppendorfバイアルに1 mL の空気の 10-20 mL/分の速度の流れで排出し、集められた。この回収された溶出ゾーンは10 μL のBradfordアッセイ試薬 (Pierce, Rockford, IL, PN 23236) と混合され、十分間常温で培養され、吸着度数はSpectraPhysics の検出器 (Spectra FOCUS forward optical scanning detector) で波長595 nm で読まれた。目定めは14.7 mM 燐酸ブランクと490 μg/mL anti-FLAG IgG スタアンダード の入った14.7 mM 燐酸を測定することで行われ、各溶液に同量のGradfordアッセイ試薬が混合された。溶出サンプルの目定めの分析は2.5 μg のIgG が捕獲され、G蛋白質毛細管から10 μL の 14,7 mM 燐酸 (250 μg/mL IgG の入った溶出ゾーンの濃度に相当する) へ溶出されたことを示していた。
実施例47
１チャンネルと８チャンネルの液体の動きの工程
200 μm ID 1 m の毛細管は実施例50に記述されているように直径1.5 cm コイルに形状化される。毛細管は一つのコイルか、八つのコイルが入ったルアーコネクションでつないだ一つのマニホルドの形状である。毛細管は実施例46に記述されているように、IgGサンプルと反応する。八つの注入器 (World Precision Products, Sarasota, FL, Model 230) が付いたスポイトは一から八つのサンプルが一度にプロセスできる。各チャンネルに、50 μL (Hamilton, Reno, NV, PN 1706TLL) と1.0 mL (Hamilton, Reno, NV, PN 1001 LT) の注入器が三方弁、２ポジションスイッチバルブ (Upchurch Scientific, Oak Harbor, WA, PN V1101L) に接続されている。三方弁バルブは、使われているステップが注入と洗浄と溶出によって適切な注入器を選ぶことができる。コンピュターのハードウエアー (Dell, Roundrock, TX, SamrtStep?, Model 200M) がPhyNexusのポンプをコントロールするソフトウエアーのインターフェースを用意できる。適切なバイアルか、その他の容器がガス、又は、液体を引き込むため毛細管の先の下に置かれる。
スポイトは或る容量に相応した動くステップの数が注入器の大きさの調整をする。毛細管チャンネルは最初に洗浄液によって洗浄、又は、調整される。スポイトは、PhyNexusのポンプコントロールソフトウエアーを介して、750 μL のIgGサンプルを300 μL/分の速度で引き込まれる。その後、洗浄ステップが、非特定の結合した分子を、毛細管チャンネルから洗浄するため、100 μL の洗浄液で300 μL/分の速度で毛細管に行われる。溶液は噴出され、その後、脱離液層がサンプルを溶出するため使われる。サンプルは実施例35に記述されているようにエレクトロスプレーノズルを含めて、どこにでも沈積することができる。
実施例48
96チャンネルで複合化する事と抽出する事の工程
Sciclone iNL10? Liquid Handler (Zymark, Hopkinton, MA) は96の独立したチャンネルヘッドの20ポジションデックである。実際に各チャンネルが移動できる量の範囲は10 nL から1.0 mL とリポートされている。マイクロフローメーターバルブの組み立て部品とマイクロプロセッサーのコントロールが各チャンネル内に取り付けられている為、各チャンネルが同時に異なった容量を吹き込むか、排出できるようになっている。これは世の中で始めてのリアルタイムにどのように展開しているかフィードバックができる溶液ハンドラーである。システムは各チャンネルが実際に移動した量を報告し、移動した物質の性質を報告し、各チャンネルの状況の診断情報を供給することができる。
四つのデックが、各96毛細管の入ったパック用に使われる。三つのデックポジションはサンプルとサンプルをプロセスする溶液(すなわち、洗浄液と脱離溶液)が入っている。四つ目のポジションは、精製され、濃縮されたサンプルが入ったバイアルが入っている。
100 μm ID 25 cm の毛細管は下記の実施例50に記述されているように、直径1 cm のコイルの形状に作られている。毛細管は実施例46に記述されているように、IgGサンプルと反応される。適切なバイアル、或いは、その他の容器がガス、又は、液体を引き込むため毛細管の先の下に置かれる。
スポイトは或る容量に相応した動くステップの数が注入器の大きさの調整をする。毛細管チャンネルは最初に洗浄液によって洗浄、又は、調整される。スポイトは、PhyNexusのポンプコントロールソフトウエアーを介して、250 μL のIサンプルを300 μL/分の速度で引き込まれる。その後、洗浄ステップが、非特定の結合した分子を、毛細管チャンネルから洗浄するため、25 μL の洗浄液で300 μL/分の速度で毛細管に行われる。洗浄液は廃棄ステーションに沈殿され、チャンネルを空気だけにしておく。その後、4 μL のサンプルが50 μL/分のフローの速度で溶出される。
実施例49
チューブ濃縮係数の蛋白質濃度への影響
寸法 200 μm ID, 360 μm OD の長さ66 cm で、ポリイミドカラムで被膜された真っ直ぐな熔融シリカチューブは、0.1 M NaOH で六十分間、非イオン化された水で十五分間、0.1 M HClで十五分間、その後、最後に非イオン化されたみずで120 μL/分のフロー速度で、六十分間、洗浄された。毛細管は、その後、500 μL 20 mM トリス-HCl 緩衝液 (pH 8) で、120 μL/分の速度で、調整された。水の中に入った1 mL の50 μg/mL リソチームは、合計六回360 μL/分のフロー速度で毛細管に通された。残された溶液は圧力の掛かった空気で押し出され、毛細管は二回500 μL の20 mM トリス-HCl 緩衝液 (pH 8) で、360 μL/分の速度で、洗い流された。このトリス-HCl 洗浄緩衝液は、その蛋白質の全内容物の吸着度の検出をBradfordアッセイで、595 nm の波長で(酸性Coomassie/Bradford蛋白質染色Pierce, Rockford, IL, PN 23200 から入手可能で、この試薬に付属されている書き物「Commassie Protein Assay Reagent Kit」に記述されているアッセイの工程に従った行われた)、分析された。トリス-HCl 緩衝液のリソチーム蛋白質修正カーブに対して、洗浄液内に検出可能なリソチームは存在しないと、判明した。
10 μL 0.1 M HCl 層が100 μL/分の速度で毛細管内に引き込まれた。この層は、毛細管内の表面全体に100 μL/分の速度で合計六回通され、層は確実に毛細管から排出されないようにされた。一度これが終わった後、層は圧力の掛かった空気で毛細管から押し出され、集められた。このトリス-HCl 洗浄緩衝液は、その蛋白質の全内容物の吸着度の検出をBradfordアッセイで、595 nm の波長で(酸性Coomassie/Bradford蛋白質染色Pierce, Rockford, IL, PN 23200 から入手可能で、この試薬に付属されている書き物「Commassie Protein Assay Reagent Kit」に記述されているアッセイの工程に従った行われた)、分析された。
0.1 M HCl のリソチーム蛋白質修正カーブに対して、10 μL 層内に246 μg/mL のリソチームが存在した事が、判明した。これらの観察は濃縮係数の4.92 (=246 μg mL-1/50 μg mL-1) とチューブ濃縮係数の2.07 (=20.7 μL/10 μL) と2.46 μg のリソチーム (=0.01 mL x (246 μg mL-1)) 容量、に相応した。この同じ溶出工程が、同じ毛細管に別の10 μL の0.1 M HCl 層で繰り返され、これも将来の分析のため回収された。二つ目の10 μL 0.1 M HCl 層には検出可能な蛋白質が存在しないことがBradfordアッセイで判明した。
実施例50
ヒスタグGST蛋白質スタンダードのNi-NTAを捕獲する工程
毛細管の寸法200 μm ID の長さ60 cm が次の工程で食刻された。毛細管は1 mL のHPLCグレード非イオン化された水ですすがれた。その後、毛細管は0.1 M の苛性ソーダで満たされ、三十分間常温で洗い流された。その後、塩基溶媒は1 mL HPLCグレードの非イオン化された水ですすがれ、除去された。溶液は 1 mL 0.1 M HCl に変えられ、次に1 mL の非イオン化された水で再度すすがれた。水は空気で噴出された。
Nα, Nα-ビス(カルボキシルメチル)-L-リシン ハイドレート (Sigma-Aldrich, Milwaukee, WI, PN 14580) (0.300g) が4mLのジメチルホルムアミド液中に浮いた状態になった。十分後、2 mL のN,N-ジ-イソプロピルエチルアミン (Sigma-Aldrich, Milwaukee,WI, PN 496219) が足された。更に、十分後、0.21 g (又は、およそ200 μL) の3-グリシドキシプロピルトリメトキシシラン (Sigma-Aldrich, Milwaukee, WI, PN 44,016-7) が足された。溶液は75°Cに熱せられ、もしpH が8以下であれば、N,N-ジ-イソプロピルエチルアミンがもっと足された。溶液は75°Cで14-16時間反応された。
1 mL の注入器が上記のように準備された溶液で満たされ、溶解しなかった固体物は注入器直接取り入れられるべきではなく、最初に、0.45 μm のフィルターを通してろ過されべきである。溶液は毛細管に0.07 mL/時間のフロー速度で十から十二時間65°Cでポンプで注入された。その後、毛細管は2-3 mL の非イオン化された水で洗い流され、水の中に保管された。
キレート剤化された毛細管は水で洗い流され、Ni の形体に0.1 mM のNiSO4溶液で変換して、水で再度洗い流された。毛細管はヒスタグ蛋白質を抽出するように用意される。
ヒスタグGSTスタンダード (2.5 mg/mL) Ni-NTA の毛細管の表面の作用機能を立証するために使われた。ヒスタグGSTスタンダードはE.Coli BL21 DE3 のコンピテント細胞 (Stratagene, La Jolla, CA, PN 200131) のpET41a のベクトル (Novagen, Madison, WI, PN 70556-3) を変性し、用意された。変性、接種、培養、細胞収穫、遠心分離は細胞培養業者の手引書に忠実に従って行われた。ペレット化された細胞はBugbuster蛋白質抽出試薬 (Novagen, Madison, WI, PN 70584-3) で分離され、製造業者の手引書に忠実に従って、3 mL のヒスタグGSTが入った上清を作るために使われた。これは3 mL の50%のグルタチオンのスラリー Sepharose FastFlow (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, PN 17-5132-01) と混合され、精製は製造業者の手引書に忠実に従ってGSTグループを通して行われた。
この蛋白質の存在のグルタチオン精製の前と後はSDS-PAGEによって立証された。精製された蛋白質の部分は一緒に集められ、1X PBS (0.9% w/v NaCl, 10 mM 燐酸ナトリウム, pH 7.2) に対して透析され、標準化された方法でフリーズドライされた。2 mL の非イオン化された水の付加が2 mL の2.5 mg/mL のヒスタグGSTが入った1X PBS に成った。
これらの準備用の工程に加えて、この蛋白質の物質は、15 μL の透析された普通の蛋白質溶液を200 μL のNi-NTAアガロース (Qiagen, Santa Clarita, CA, PN 30210) に取り入れることによって、機能的な、判別できる、6xヒスフュージョンタグの存在のため、分析された。全Ni-NTA精製のステップは製造業者の手引書に忠実に従って行われた。Ni-NTAアガロースから放出されたヒスタグ蛋白質の存在がSDS-PAGEによって立証された。
20 μL の2.5 mg/mL のヒスタグGSTサンプルは1 m の錫の入ったNTA毛細管へ吹き込まれ、従って、毛細管内の30 μL のおよそ三分の二を占めた。この 20 μL サンプルゾーンは目で確かめられ、毛細管から出されず、50 μL の注入器で毛細管の上へ引き上げられた。これは毛細管の中で常温で五分間培養することができ、従って、毛細管の下に10 μL の内容量を空けたままにした。サンプルゾーンは、その後、毛細管の下へ、毛細管から出されず、同じ形態で押し込められ、毛細管の中で常温で五分間培養させ、従って、毛細管の上に 10 μL の内容量を空けたままにした。毛細管の上と下でサンプルゾーンを培養するプロセスは、この同じサンプルで二回繰り返され、次に、最後に、毛細管のサンプルゾーンは1 mL の空気の 10-20 mL/分の速度の流れで排出された。この毛細管は、その後、10 mM NaH2PO4/10 mM NaHPO4の緩衝液で, pH 7, 500 μL の緩衝液を毛細管に1 mL/分の速度で通すことによって、洗浄され、次に、毛細管から緩衝液が1 mL の空気の 10-20 mL/分の速度の流れで排出された。
10 μL の200 mM のイミダゾール溶出液はこの同じ毛細管に吹き込まれ、従って、毛細管内の30 μL の容量のおよそ三分の一を占めた。この 10 μL 溶出ゾーンは目で確かめられ、毛細管から出されず、50 μL の注入器で毛細管の上へ引き上げられた。これは毛細管の中で常温で一分間培養することができ、従って、毛細管の下に10 μL の内容量を空けたままにした。溶出ゾーンは、その後、毛細管の下へ、毛細管から出されず、同じ形態で押し込められ、毛細管の中で常温で一分間培養させ、従って、毛細管の上に 20 μL の内容量を空けたままにした。毛細管の上と下で溶出ゾーンを培養するプロセスは、この同じ溶出ゾーンで二回繰り返され、次に、最後に、溶出ゾーンは1 mL の空気の 10-20 mL/分の速度の流れで排出され、0.5 mL のEppendorfバイアルに集められた。
の集められた溶出ゾーンは、10 μL のBradfordアッセイ試薬 (Pierce, Rockford, IL, PN 23236) 混合され、常温で十分間培養され、吸着度数はSpectraPhysics の検出器 (Spectra FOCUS forward optical scanning detector) で波長595 nm で読まれた。調整は、200 mM イミダゾールブランクと250 μg/mL ヒスタグGSTスタンダードの入った200 mM のイミダゾールを測定することによって行われ、各物質は同量のBradfordアッセイ試薬と混合された。この調整された標準に対しての溶出されたサンプルの分析は、0.8 μg のヒスタグGSTが捕獲され、Ni-NTAの毛細管から10 μL の200 mM のイミダゾールに溶出されたこと(溶出ゾーンの中の80 μg/mL のヒスタグGSTの濃度に相応している)を、示していた。
第1−4図はこの発明の開放チューブ抽出チャンネルを操作する際の見取り図を示している。 第1−4図はこの発明の開放チューブ抽出チャンネルを操作する際の見取り図を示している。 第1−4図はこの発明の開放チューブ抽出チャンネルを操作する際の見取り図を示している。 第1−4図はこの発明の開放チューブ抽出チャンネルを操作する際の見取り図を示している。 第5図はこの発明の毛細管チャンネルチューブのループが入った形状の図である。 第6図は第5図の毛細管チャンネルチューブを複数化した図である。 第7図は毛細管チャンネルチューブ複数化した第5図をケースの中に入れた図で、各チャンネルチューブをサンプルプロセス用に指示でき、抽出し、濃縮された検体の沈積物を各チャンネルチューブからターゲットへ指示できる。 第8図はこの発明の動かせるプラットフォームシステムとサンプル溶液とガスの入ったバイアルとプラットフォームに支えられたターゲットの見取り図である。 第9図はこの発明の動かせるプラットフォオームシステムで、貯水槽からバルブシステムを通してサンプルや洗浄液/緩衝液や脱離液やガスが供給できる見取り図で、プラットフォームは電動スプレーインターフェースとターゲット両方サポートしている。 第10図はこの発明の動かせるプラットフォームシステムで、貯水槽からバルブシステムを通してサンプルや洗浄液・緩衝液や脱離液やガスが供給できる見取り図で、プラットフォームはサンプルと電動スプレーとターゲットをサポートしている。 第11図はサンプルと洗浄液/緩衝液と脱離液とガスが圧力容器から供給できる見取り図で、動かせるプラットフォームはむだ物やターゲットをサポートしてり、抽出チャンネルの両端部は動かすことができる。 第12図はこの発明の毛細管スポイトの単体である。 第13図は60mL/minでのベンジルアルコールとライソザイムのブレイクスルー曲線で、実施例36の60mL/minで描かれた中性マーカー(ベンジルアルコール)とライソザイムのブレイクスルー曲線である。 第14図は120mL/minでのベンジルアルコールとライソザイムのブレイクスルー曲線で、120mL/minで描かれた中性マーカー(ベンジルアルコール)とライソザイムのブレイクスルー曲線である。 第15図は300mL/minでのベンジルアルコールとライソザイムのブレイクスルー曲線で、300mL/minで描かれた中性マーカー(ベンジルアルコール)とライソザイムのブレイクスルー曲線である。 第16図は600mL/minでのベンジルアルコールとライソザイムのブレイクスルー曲線で、600mL/minで描かれた中性マーカー(ベンジルアルコール)とライソザイムのブレイクスルー曲線である。 第17図は60mL/minでのベンジルアルコールと60mL/minと600mL/minでのライソザイムのブレイクスルー曲線で、60mL/minで描かれた中性マーカー(ベンジルアルコール)と60mL/minと600mL/minで描かれたライソザイムのブレイクスルー曲線である。 第18図はコイル状のカラムで薄められたライソザイムで、60mL/minで入れられ、60mL/minで入れられ、コイル状のカラムで薄められたライソザイムのブレイクスルー曲線である。 第19図は60mL/minで入れられ、まっすぐなカラムで薄められたライソザイムで、60mL/minで入れられ、まっすぐなカラムで薄められたライソザイムのブレイクスルー曲線である。 第20図は600mL/minで入れられ、コイル状のカラムで薄められたライソザイムで、600mL/minで入れられ、コイル状のカラムで薄められたライソザイムのブレイクスルー曲線である。 第21図は600mL/minで入れられ、まっすぐなカラムで薄められたライソザイムで、600mL/minで入れられ、まっすぐなカラムで薄められたライソザイムのブレイクスルー曲線である。 第22図はすずを除いたIDA毛細管からのヒスタグ蛋白質の梯子とすずが入ったIDA毛細管のブレイクスルー曲線である。

Claims (45)

  1. a) サンプル溶液内の検体分子を、毛細管容積を有する毛細管の抽出表面上に吸着させ、
    b) １以上のチューブ濃縮係数で、毛細管を通過した脱着液と共に、抽出表面から検体分子の大部分を脱着させる、
    過程を含む、検体分子に結合する抽出表面を有する開放毛細管による開放チューブ固体相分子抽出方法。
  2. サンプル溶液を希釈し、検体の生体分子の大部分が抽出表面上に結合する流量と時間だけ毛細管内にサンプル溶液を通す請求項１に記載の方法。
  3. サンプル溶液を管内に流し込む方向を2回以上反転させて、サンプル溶液と結合する抽出表面との接触時間を増やす請求項１に記載の方法。
  4. 脱着溶液を管内に流し込む方向を2回以上反転させて、脱着溶液と結合する抽出表面との接触時間を増やす請求項１に記載の方法。
  5. ステップ(a)とステップ(b)の間で洗浄液を毛細管内に流し込む請求項１に記載の方法。
  6. ステップ(b)の前に、毛細管の洗浄液をガスによって移動させる請求項５に記載の方法。
  7. 抽出表面上は、当該表面に結合した親和力結合体を有し、当該親和力結合体は、
    a) 生体分子検体に結合親和力を持つキレートされた金属、
    b) 蛋白質検体に結合親和力を持つ蛋白質、
    c) 蛋白質検体に結合親和力を持つ有機分子、或いは有機基、
    d) 蛋白質検体に結合親和力を持つ糖、
    e) 蛋白質検体に結合親和力を持つ核酸、
    f) 核酸検体に結合親和力を持つ核酸、或いは核酸のシーケンス、
    g) 極小分子検体に結合親和力を持つ極小分子結合体、
    の内の何れかである請求項１に記載の方法。
  8. ステップ(b)において、毛細管内の洗浄液を吸収剤で移動させる請求項５に記載の方法。
  9. 検体の濃度を１０００倍以上に上げる請求項１に記載の方法。
  10. 前記検体が生体分子で、ステップ(b)の成果物を蛋白質チップに適用する請求項１に記載の方法。
  11. ステップ(b)の成果物を質量分析計に導入する請求項１に記載の方法。
  12. 前記開放毛細管のチャンネルアスペクト比が10以上で、アジテーションアスペクト比が1から2000の範囲である請求項１に記載の方法。
  13. 前記検体分子がチューブ濃縮係数が1から400の範囲で脱着される請求項１に記載の方法。
  14. 前記開放毛細管の少なくとも一部分について、アジテーションアスペクト比が1から2000の範囲である請求項１に記載の方法。
  15. 前記開放毛細管の少なくとも一部分について、チャンネルアスペクト比が10から40,000の範囲である請求項１に記載の方法。
  16. 検体をチューブ濃縮係数が１以上で分離して濃縮する開放毛細管手段であって、当該毛細管手段は第１の端部が液と機体の吐出のためにポンプに接続された第１の端部を有する少なくとも一定の長さを有し、該ポンプはシリンジポンプ、圧力容器、遠心ポンプあるいは電動ポンプの何れかであり、前記毛細管の内側の表面は検体分子と結合する抽出表面を有し、毛細管のチャンネルアスペクト比は10以上である開放毛細管手段。
  17. 毛細管は非線形構造で１以上のアジテーションアスペクト比を有する請求項１６に記載の検体を分離、濃縮する開放毛細管手段。
  18. 検体をチューブ濃縮係数が１以上で分離して濃縮する開放毛細管装置であって、当該毛細管手段は第１の端部が液と機体の吐出のためにポンプに接続された第１の端部を有する少なくとも一定の長さを有し、第２の端部を有し、該ポンプはシリンジポンプ、圧力容器、遠心ポンプあるいは電動ポンプの何れかであり、前記毛細管の内側の表面は検体分子と結合する抽出表面を有し、毛細管のチャンネルアスペクト比は10以上である開放毛細管装置。
  19. 毛細管は非線形構造で、アジテーションアスペクト比が１以上である検体を分離し濃縮するための開放毛細管装置。
  20. 第２の端部が、蛋白質チップ用のサンプルアプリケーターか質量分析計のインターフェースに接続された請求項１８二記載の開放毛細管装置。
  21. 抽出表面上に抽出剤が結合している請求項１８に記載の開放毛細管装置。
  22. 前記抽出剤は、検体に結合親和力を持つ親和力結合体で、この結合体の作用物は
    a) 生体分子検体に結合親和力を持つキレートされた金属、
    b) 蛋白質検体に結合親和力を持つ蛋白質、
    c) 蛋白質検体に結合親和力を持つ有機分子、或いは有機基、
    d) 蛋白質検体に結合親和力を持つ糖、
    e) 蛋白質検体に結合親和力を持つ核酸、
    f) 選択された核酸検体に結合親和力を持つ核酸、或いは核酸のシーケンス、または、
    g) 極小分子検体に結合親和力を持つ極小分子結合体
    である請求項２１に記載の開放毛細管装置。
  23. 前記抽出表面は非極性表面、移動相の水性および有機溶媒混合物と相互作用する非極性逆相表面、非極性移動相と相互作用する極性表面, イオン交換剤である請求項１８二記載の開放毛細管装置。
  24. 前記開放毛細管デバイスの抽出表面は弱い疎水性か親水性について中性である請求項１８に記載の開放毛細管装置。
  25. 毛細管は、2mmから500cmの範囲の固体層抽出長さを有する請求項１８二記載の開放毛細管。
  26. 毛細管の少なくとも一部分の中心軸は実質的に非線形で、アジテーションアスペクト比が1以上請求項２５に記載の開放毛細管装置。
  27. 少なくとも一部分がコイル状の管を有する請求項１８に記載の開放毛細管装置。
  28. ２つの端部を有し、２つめの端部は手動で位置決めできる管を有する請求項１８に記載の開放毛細管装置。
  29. 実質的に平行な複数の毛細管を有する請求項１８に記載の開放毛細管装置。
  30. 実質的に平行な複数の毛細管を有するブロックを供えた請求項１８に記載の開放毛細管装置。
  31. 前記毛細管の少なくとも１つは、内部通路の断面形状が円形、楕円形または多角形である請求項１８に記載の開放毛細管装置。
  32. 前記ポンプはシリンジポンプである請求項１８に記載の開放毛細管装置。
  33. 前記ポンプは圧力容器である請求項１８に記載の開放毛細管装置。
  34. 前記ポンプは電動ポンプである請求項１８に記載の開放毛細管装置。
  35. 前記ポンプは往復運動ポンプである請求項１８に記載の開放毛細管装置。
  36. 毛細管の壁の表面の少なくとも一部分には突起が形成されている請求項１８に記載の開放毛細管装置。
  37. 管の内側の表面に検体に結合親和性のある親和性試薬を結合させ、毛細管は非線形で、チャンネルアスペクト比が10以上で、アジテーションアスペクト比が1から2000の範囲である固体相抽出のための開放毛細管。
  38. 前記親和性試薬は、
    a)生体分子検体に結合親和力を持つキレートされた金属、
    b)蛋白質検体に結合親和力を持つ蛋白質、
    c)蛋白質検体に結合親和力を持つ有機分子、或いは有機基、
    d)蛋白質検体に結合親和力を持つ糖、
    e)蛋白質検体に結合親和力を持つ核酸、
    f)核酸検体に結合親和力を持つ核酸、或いは核酸のシーケンス、
    g)極小分子検体に結合親和力を持つ極小分子結合体、
    の何れかである請求項３７に記載の開放毛細管。
  39. 毛細管は0.5cmから300cmの範囲の固体相抽出長さを有する請求項３７に記載の開放毛細管。
  40. 少なくとも一部分コイル状になっている管を有する請求項３７に記載の開放毛細管。
  41. 複数の毛細管には実質的に平行な中心軸を有する毛細管が含まれる、請求項３７に記載の開放毛細管。
  42. 複数の毛細管には実質的に平行な中心軸を有する毛細管が含まれる、請求項３７に記載の開放毛細管。
  43. 実質的に平行な中心軸を有する複数の毛細管を含むブロックを備えた請求項３７に記載の開放毛細管。
  44. 管の流路断面は円形、楕円形または多角形の何れかである請求項３７に記載の開放毛細管。
  45. 毛細管の表面は少なくとも一部分突出している請求項３７に記載の開放毛細管。
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