JP7412407B2 - グリコシル化ペプチドの検出及び定量 - Google Patents
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Description
本発明は、バイオ医薬品に関するものであり、治療用抗体及びそのフラグメントなどのタンパク質のインビボでの翻訳後グリコシル化の検出及び定量化に関する。
治療用モノクローナル抗体(mAb)は、翻訳後修飾(PTM)から生じる変種を含む、多くの生成物の変種を有する哺乳動物細胞で産生される不均一な分子である。N-結合型グリコシル化は、治療用抗体の主要なPTMである。医薬品の品質を定義し、ロット間の一貫性を示し、製造プロセスの制御を確実にするために、N結合型グリカン構造の特徴付け及び個々のグリコフォームの定量化が、規制当局によって要求される。従来、抗体内のN結合型グリカンは、抗体からグリカンを酵素的に遊離させてから蛍光試薬で標識することによって、定量化される。あるいは、グリコシル化は、抗体のトリプシン消化により生成された糖ペプチドを分析することによって、ペプチドレベルで特徴付けされ得る。ただし、不均一なグリコフォームを持つ糖ペプチドは、ペプチドマッピングに伝統的に使用されている逆相ベースの液体クロマトグラフィー(RPLC)では十分に分離されないことが多い。さらに、オンライン質量分析(MS)によって誘発される糖ペプチドの糖鎖のインソースフラグメンテーションは、切断されたグリコフォームアーティファクトを生成し得、これによってMSを使用したさまざまなグリコフォームの相対存在量の正確な定量が損なわれる。
[本発明1001]
糖ペプチドを分離する方法であって、
糖ペプチドが親水性濃縮基材に結合することを可能にする条件下で、前記糖ペプチドを含む試料を前記親水性濃縮基材に接触させる工程;
前記親水性濃縮基材を洗浄して、前記親水性濃縮基材から非糖ペプチド混入物質を除去する工程;
ギ酸アンモニウム及びアセトニトリル(ACN)の水溶液を用いて前記親水性濃縮基材から前記糖ペプチドを溶出させて、濃縮糖ペプチド試料を作製する工程;
前記濃縮糖ペプチド試料を分離カラムに適用する工程;ならびに
前記分離カラムから前記糖ペプチドを溶出させる工程であって、それによって前記試料中の糖ペプチドを分離する、溶出させる工程
を含む、前記方法。
[本発明1002]
前記親水性濃縮基材が固相抽出(SPE)クロマトグラフィー基材を含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記親水性濃縮基材がシリカベースのアミノプロピル吸着剤材料を含む、本発明1001または本発明1002の方法。
[本発明1004]
前記ギ酸アンモニウム及びACNの水溶液が、水中に約100~400mMのギ酸アンモニウム及び約2.5%~約10%のACNを含む、本発明1001~1003のいずれかの方法。
[本発明1005]
前記ギ酸アンモニウムACN溶液が、水中に約200mMのギ酸アンモニウム及び約5%のACNを含む、本発明1004の方法。
[本発明1006]
前記親水性濃縮基材を、約0.5体積%~約5体積%のギ酸、及び約85体積%~約95%のACN、残りは水を含む、ギ酸及びACNの洗浄溶液で洗浄して、非糖ペプチド混入物質を除去する、本発明1001~1005のいずれかの方法。
[本発明1007]
前記ギ酸及びACNの洗浄溶液が、約1体積%のギ酸、約9%のH 2 O、及び約90体積%のACNを含む、本発明1006の方法。
[本発明1008]
前記分離カラムが親水性相互作用(HILIC)カラムを含む、本発明1001~1007のいずれかの方法。
[本発明1009]
前記分離カラムから前記糖ペプチドを溶出させる工程が、前記糖ペプチドを1つ以上の画分に分離することをさらに含む、本発明1001~1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
前記糖ペプチドを1つ以上の画分に分離することが、前記分離カラムに移動相勾配を適用することを含む、本発明1009~1011のいずれかの方法。
[本発明1011]
前記移動相勾配が、約10mMのギ酸アンモニウム(pH4.5)から約90%のACNと10mMのギ酸アンモニウム(pH4.5)までを含む、本発明1010の方法。
[本発明1012]
前記移動相勾配が、H 2 O中の約0.05%のTFAまたはACN中の約0.045%のTFAを含む、本発明1010の方法。
[本発明1013]
前記1つ以上の画分に存在する前記糖ペプチドを同定する工程をさらに含む、本発明1009~1012のいずれかの方法。
[本発明1014]
前記1つ以上の画分に存在する前記糖ペプチドに結合しているグリカンを同定する工程をさらに含む、本発明1009~1013のいずれかの方法。
[本発明1015]
前記グリカンがN-グリカンを含む、本発明1014の方法。
[本発明1016]
前記糖ペプチドがモノクローナル抗体から得られる、本発明1009~1015のいずれかの方法。
[本発明1017]
前記モノクローナル抗体が、アイソタイプIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、または混合アイソタイプである、本発明1016の方法。
[本発明1018]
前記モノクローナル抗体をプロテアーゼで消化する工程をさらに含む、本発明1016または1017の方法。
[本発明1019]
前記プロテアーゼがトリプシンを含む、本発明1018の方法。
[本発明1020]
溶出された前記糖ペプチドに対して質量分析を実施する工程をさらに含む、本発明1001~1019のいずれかの方法。
[本発明1021]
溶出された前記糖ペプチドの糖ペプチドレベルでのグリコシル化プロファイリングをさらに含む、本発明1001~1020のいずれかの方法。
[本発明1022]
前記親水性濃縮基材をアセトニトリル(ACN)の水溶液で予備洗浄する工程をさらに含む、本発明1001~1021のいずれかの方法。
[本発明1023]
前記親水性濃縮基材との接触の前に、ACNの水溶液中に糖ペプチドを含む前記試料を希釈する工程をさらに含む、本発明1001~1022のいずれかの方法。
本発明が記載される前に、本発明は、記載された特定の方法及び実験条件に限定されないことを理解されたい(そのような方法及び条件は変動し得るからである)。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書で使用される用語は特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを意図しないことも理解されたい。任意の実施形態または実施形態の特徴は、互いに組み合わせてもよく、そのような組み合わせは、本発明の範囲内に明示的に含まれる。
PTM:翻訳後修飾
RP-LC-MS/MS:逆相液体クロマトグラフィータンデム質量分析法
mAb:モノクローナル抗体
IgG:免疫グロブリンG
LC:軽鎖
HC:重鎖
MS:質量分析法
SPE:固相抽出
HILIC:親水性相互作用液体クロマトグラフィー
UV:紫外線
TFA:トリフルオロ酢酸
ACN:アセトニトリル
本明細書で使用される「抗体」という用語は、ジスルフィド結合によって相互接続された、4つのポリペプチド鎖、2つの重(H)鎖及び2つの軽(L)鎖からなる免疫グロブリン分子(すなわち、「完全な抗体分子」)、ならびにその多量体(例えば、IgM)またはその抗原結合フラグメントを指すものとする。各重鎖は、重鎖可変領域(「HCVR」または「VH」)及び重鎖定常領域(ドメインCH1、CH2、及びCH3で構成される)で構成されている。様々な実施形態では、重鎖は、IgGアイソタイプであってもよい。場合によっては、重鎖はIgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4から選択される。いくつかの実施形態では、重鎖は、アイソタイプIgG1またはIgG4の重鎖であり、必要に応じて、アイソタイプIgG1/IgG2またはIgG4/IgG2のキメラヒンジ領域を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域(「LCVR」または「VL」)及び軽鎖定常領域(CL)で構成されている。VH及びVL領域は、フレームワーク領域(FR)と呼ばれる、より保存された領域が点在する、相補性決定領域(CDR)と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分化され得る。各VH及びVLは、3つのCDR及び4つのFRで構成され、これはアミノ末端からカルボキシ末端に向かって、FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順序で配置されている。「抗体」という用語は、任意のアイソタイプまたはサブクラスのグリコシル化及び非グリコシル化免疫グロブリンの両方への言及を含む。「抗体」という用語は、抗体を発現するようにトランスフェクトされた宿主細胞から単離された抗体などの組換え手段によって調製、発現、作製または単離された抗体分子を含む。抗体構造のレビューについては、Lefranc et al.,IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains,27(1)Dev.Comp.Immunol.55-77(2003);及びM.Potter,Structural correlates of immunoglobulin diversity,2(1)Surv.Immunol.Res.27-42(1983)を参照のこと。
モノクローナル抗体(MAb)は、標的抗原に対するこれらの薬物の特異性に起因して、例えば、免疫系を活性化して腫瘍細胞を殺すこと、腫瘍細胞が増殖するためのシグナル伝達を遮断すること、腫瘍細胞に薬物を運ぶことによって、または放射線標的として、がん及び他の慢性疾患に対する効果的な生物製剤として浮上している。免疫グロブリンのグリコシル化は、それらの物理化学的特性と、補体の結合及び活性化などのそれらの細胞媒介性エフェクター機能との両方に影響する。これらの生物学的機能は、N-結合型オリゴ糖の有無だけでなく、オリゴ糖の特定の構造にも依存している場合がある。さらに、抗体のN-グリコシル化は、バイオ医薬品の製造において慣用的に特徴付けられている。特に、モノクローナル抗体のグリカンプロファイルは、有効性、免疫原性、及び製造条件の尺度となり得るので、重要な品質属性として定義されることもある。したがって、グリカン分析のアプローチは、詳細な特徴付けを容易にするために高感度を示すことが重要である。治療用モノクローナル抗体の製造では、部位特異的なN-グリコシル化及びN-グリカン部位の占有率の評価が重要である。したがって、モノクローナル抗体から得られた糖ペプチドを分離するための高効率/高分解能の方法が必要である。開示された本発明はその必要性を満たす。
図1は、糖ペプチド定量の現在の方法を図示する概略ワークフロー図である。治療用抗体は、変性、還元、及びアルキル化された後、トリプシンで消化された。相対的な定量は、糖ペプチドの質量ピークのピーク強度(高さ)によって行った。遊離グリカン法は、MSシグナルではなく、遊離グリカンに結合した標識の蛍光によってグリコフォームを定量化する。図2は、遊離されたグリカン(蛍光試薬、WatersのRapiFluor-MSで標識)及び糖ペプチドによって定量化された各糖鎖の相対定量の比較を示す表である。方法間の定量の主な違いを3、5、7、及び8行目に示す。図3は、糖ペプチドによるグリコフォームの定量と遊離グリカン方法との間の不一致が、糖ペプチド分析においてMSによる糖骨格のインソースフラグメンテーションによる可能性が高く、切断されたグリカンアーティファクト(すなわち、G0F-GlcNAc及びG1F-GlcNAc)が増加し、主なグリカン(すなわち、G0F及びG1F)が減少することを実証している質量スペクトルである。この結果は、ペプチドレベルでのグリカン分析には、新しくかつ改良された方法が必要であることを実証している。
治療用抗体由来のペプチドは、日常的に実施される還元または非還元ペプチドマッピング法のいずれかによって調製された。次に、HILIC-UV-MS分析の前に、消化物を最終80%ACN(v/v)に希釈した。
LCシステム:PDA(UV)検出器を備えたWaters ACQUITY I-Class UPLC(登録商標)System
MSシステム:Waters XEVO G2-S QTofまたはThermo Scientific Q Exactive Plus
カラム:Waters ACQUITY UPLC(登録商標)Glycan BEH Amide HILIC Column
Claims (23)
- 糖ペプチドを分離する方法であって、
糖ペプチドが親水性濃縮基材に結合することを可能にする条件下で、前記糖ペプチドを含む試料を前記親水性濃縮基材に接触させる工程;
前記親水性濃縮基材を洗浄して、前記親水性濃縮基材から非糖ペプチド混入物質を除去する工程;
ギ酸アンモニウム及びアセトニトリル(ACN)の水溶液を用いて前記親水性濃縮基材から前記糖ペプチドを溶出させて、濃縮糖ペプチド試料を作製する工程;
前記濃縮糖ペプチド試料を分離カラムに適用する工程;ならびに
前記分離カラムから前記糖ペプチドを溶出させる工程であって、それによって前記試料中の糖ペプチドを分離する、溶出させる工程
を含む、前記方法。 - 前記親水性濃縮基材が固相抽出(SPE)クロマトグラフィー基材を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記親水性濃縮基材がシリカベースのアミノプロピル吸着剤材料を含む、請求項1または請求項2に記載の方法。
- 前記ギ酸アンモニウム及びACNの水溶液が、水中に約100~400mMのギ酸アンモニウム及び約2.5%~約10%のACNを含む、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ギ酸アンモニウム及びACNの水溶液が、水中に約200mMのギ酸アンモニウム及び約5%のACNを含む、請求項4に記載の方法。
- 前記親水性濃縮基材を、約0.5体積%~約5体積%のギ酸、及び約85体積%~約95%のACN、残りは水を含む、ギ酸及びACNの洗浄溶液で洗浄して、非糖ペプチド混入物質を除去する、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ギ酸及びACNの洗浄溶液が、約1体積%のギ酸、約9体積%のH2O、及び約90体積%のACNを含む、請求項6に記載の方法。
- 前記分離カラムが親水性相互作用(HILIC)カラムを含む、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記分離カラムから前記糖ペプチドを溶出させる工程が、前記糖ペプチドを1つ以上の画分に分離することをさらに含む、請求項1~8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記糖ペプチドを1つ以上の画分に分離することが、前記分離カラムに移動相勾配を適用することを含む、請求項9に記載の方法。
- 前記移動相勾配が、約10mMのギ酸アンモニウム(pH4.5)から約90%のACNと10mMのギ酸アンモニウム(pH4.5)までを含む、請求項10に記載の方法。
- 前記移動相勾配が、H2O中の約0.05%のTFAまたはACN中の約0.045%のTFAを含む、請求項10に記載の方法。
- 前記1つ以上の画分に存在する前記糖ペプチドを同定する工程をさらに含む、請求項9~12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つ以上の画分に存在する前記糖ペプチドに結合しているグリカンを同定する工程をさらに含む、請求項9~13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記グリカンがN-グリカンを含む、請求項14に記載の方法。
- 前記糖ペプチドがモノクローナル抗体から得られる、請求項9~15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記モノクローナル抗体が、アイソタイプIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、または混合アイソタイプである、請求項16記載の方法。
- 前記モノクローナル抗体をプロテアーゼで消化する工程をさらに含む、請求項16または17に記載の方法。
- 前記プロテアーゼがトリプシンを含む、請求項18に記載の方法。
- 溶出された前記糖ペプチドに対して質量分析を実施する工程をさらに含む、請求項1~19のいずれか一項に記載の方法。
- 溶出された前記糖ペプチドの糖ペプチドレベルでのグリコシル化プロファイリングをさらに含む、請求項1~20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記親水性濃縮基材をアセトニトリル(ACN)の水溶液で予備洗浄する工程をさらに含む、請求項1~21のいずれか一項に記載の方法。
- 前記親水性濃縮基材との接触の前に、ACNの水溶液中に糖ペプチドを含む前記試料を希釈する工程をさらに含む、請求項1~22のいずれか一項に記載の方法。
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Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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WO2017037829A1 (ja) | 2015-08-31 | 2017-03-09 | 株式会社島津製作所 | 高分子化合物の定量分析方法及び該定量分析のためのデータ処理装置 |
WO2017189357A2 (en) | 2016-04-24 | 2017-11-02 | Waters Technologies Corporation | Charged surface reversed phase chromatographic materials method for analysis of glycans modified with amphipathic, strongly basic moieties |
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