CN114981659A

CN114981659A - 无标记n-聚糖定量方法

Info

Publication number: CN114981659A
Application number: CN202080093591.5A
Authority: CN
Inventors: L·凯马利尔; J·丁; 李正剑
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 2019-11-21
Filing date: 2020-11-23
Publication date: 2022-08-30
Also published as: JP2023503442A; US20230025648A1; WO2021102437A1; EP4062176A1; KR20220101167A

Abstract

本公开文本提供了一种用于在不使用标记如荧光标记的情况下检测和定量N‑聚糖和N‑连接糖基化谱的新颖无标记的N‑聚糖分析方法。该方法允许减少样品制备和色谱分离时间，并且可用于产物批量释放。

Description

无标记N-聚糖定量方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2019年11月21日提交的美国临时申请号62/938,803的优先权益，所述申请通过引用以其整体并入本文。

对经由EFS-WEB电子提交的序列表的引用

与本申请一起提交的ASCII文本文件(名称：3338_190PC01_SL_ST25.txt；大小：14,351字节；以及创建日期：2019年11月20日)中电子提交的序列表的内容通过引用以其整体并入本文。

背景技术

糖基化通常在糖缀合物(例如糖蛋白)的一种或多种生物学功能中起重要作用。例如，糖蛋白的糖基化模式可以影响其正确折叠的能力、其稳定性(例如，对蛋白水解和/或其他降解的抗性)、催化活性、药效学和/或药代动力学特性、和/或该糖蛋白与其他分子适当相互作用的能力。可替代地或另外地，糖蛋白的糖基化模式可以影响糖蛋白的转运和靶向，例如，决定糖蛋白是否保持在细胞内(包括例如将糖蛋白正确靶向适当的一个或多个亚细胞区室)、糖蛋白是否将是膜结合的和/或糖蛋白是否将从细胞中分泌。

单克隆抗体和其他蛋白质是复合糖蛋白，其被开发用于治疗各种适应证，例如癌症和自身免疫疾病。具体而言，单克隆抗体通常在重链的保守天冬酰胺残基处被糖基化。聚糖在控制单克隆抗体治疗剂的功能和功效方面是重要的，并且因此通常被要求作为用于人类的释放测试的关键质量属性组的一部分。根据末端糖残基，“N-连接聚糖”或“N-聚糖”分为复合型、高甘露糖型和杂合型N-聚糖。

传统上，在变性和用PNGase F进行酶促消化后，N-连接聚糖从糖蛋白中释放，然后荧光标记(如用2-氨基苯甲酰胺)释放的聚糖。然后使用利用荧光检测的亲水相互作用液相色谱(HILIC)分离标记的聚糖，以生成存在于抗体样品中的聚糖的色谱图。尽管使用了数十年，但使用有毒试剂和延长的样品制备时间，该方法仍然是麻烦的。因此，需要有效地定量蛋白质的糖基化谱。

发明内容

本公开文本涉及一种定量重组蛋白的糖基化谱的方法，其包括在没有任何标记的情况下分析所述一种或多种N-连接聚糖，其中所述N-连接聚糖在分析之前通过酶促消化从所述重组蛋白释放。本公开文本还涉及一种定量重组蛋白的糖基化谱的方法，其包括在没有任何荧光团的情况下分析所述一种或多种N-连接聚糖，其中这些N-连接聚糖在分析之前通过酶促消化从所述重组蛋白释放。在一些方面，所述重组蛋白纯度为至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％。在一些方面，所述分析包括在包括柱的色谱法期间分离一种或多种N-连接聚糖。在一些方面，所述柱是混合模式柱。在一些方面，使用一种或多种流动相进行所述分离。在一些方面，所述柱是混合模式多孔石墨碳(PGC)柱。在一些方面，所述酶包括肽N-糖苷酶F(PNGaseF)。在一些方面，将所述酶与所述重组蛋白一起孵育，其中所述一种或多种N-连接聚糖在所述分离之前从所述重组蛋白释放。在一些方面，在缓冲液中稀释所述酶。在一些方面，分离的所述一种或多种N-连接聚糖通过质谱仪、ELSD、NQAD或折射率检测器测量。在一些方面，分离的所述一种或多种N-连接聚糖通过电雾式检测器(CAD)来测量。

在一些方面，所述色谱法包括第一流动相和第二流动相，其中所述第一流动相和所述第二流动相是不同的。在一些方面，所述第一流动相包含水。在一些方面，所述第二流动相包含乙腈。在一些方面，所述第一流动相包含甲酸(FA)、三氟乙酸(TFA)、三乙胺(TEA)或其任何组合。在一些方面，所述第一流动相包含0.1％FA。在一些方面，所述第一流动相包含0.1％TEA。在一些方面，所述第二流动相包含甲酸(FA)、三氟乙酸(TFA)、三乙胺(TEA)或其任何组合。在一些方面，所述第二流动相包含0.1％FA。在一些方面，所述第二流动相包含0.1％TEA。在一些方面，所述分离在低于70℃的温度下进行。

在一些方面，所述温度为在约50℃与约70℃之间、约50℃与约60℃之间、约60℃与约70℃之间、约55℃与约65℃之间、约55℃与约60℃之间、约60℃与约65℃之间、约65℃与约70℃之间、约50℃与约55℃之间。在一些方面，所述温度为约50℃、约51℃、约52℃、约53℃、约54℃、约55℃、约56℃、约57℃、约58℃、约59℃、约60℃、约61℃、约62℃、约63℃、约64℃、约65℃、约66℃、约67℃、约68℃或约69℃。

在一些方面，所述分离基于梯度。在一些方面，所述梯度为约95％至约5％。在一些方面，所述梯度为约95％至约50％、约95％至约55％、约95％至约60％、约95％至约65％、约95％至约70％、约95％至约75％、约95％至约80％、约95％至约85％、约90％至约50％、约90％至约55％、约90％至约60％、约90％至约65％、约90％至约70％、约90％至约75％、约87％至约50％、约87％至约55％、约87％至约60％、约87％至约65％、约87％至约70％、约87％至约75％、约85％至约50％、约85％至约55％、约85％至约60％、约85％至约65％、约85％至约70％、或约85％至约75％。在一些方面，所述梯度为约87％至约75％。

本公开文本还涉及一种分析目的蛋白质的聚糖谱的方法。在一些方面，所述一种或多种N-聚糖是半乳糖(Gal)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、半乳糖胺(GalN)、葡萄糖(Glc)、N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)、葡萄糖胺(GlcN)、甘露糖(Man)、N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)、甘露糖胺(ManN)、木糖(Xyl)、N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)、N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)、2-酮-3-脱氧壬酸(Kdn)、岩藻糖(Fuc)、葡萄糖醛酸(GlcA)、艾杜糖醛酸(IdoA)、半乳糖醛酸(GalA)、甘露糖醛酸(ManA)或其任何组合。在一些方面，所述一种或多种N-聚糖包含一种或多种双触角聚糖。在一些方面，所述双触角聚糖选自G0F、G0、G1F、G1、G2F、G2、S1G2F、S1G2、S2G2F、S2G2及其任何组合。在一些方面，所述糖基化谱包含一种或多种去唾液酸化聚糖、单唾液酸化聚糖、二唾液酸化聚糖和/或三唾液酸化聚糖和四唾液酸化聚糖。在一些方面，所述重组蛋白是抗体。在一些方面，所述抗体是选自IgM、IgA、IgE、IgD、和IgG的同种型。在一些方面，所述抗体是同种型IgG。在一些方面，所述IgG抗体选自IgG1、IgG2、IgG3、和IgG4。在一些方面，所述抗体是针对GITR的抗体、针对CXCR4的抗体、针对CD73的抗体、针对TIGIT的抗体、针对OX40的抗体、针对LAG3的抗体、针对CSF1R的抗体和/或针对IL8的抗体。在一些方面，所述抗体具有单个N-连接糖基化位点。在一些方面，所述单个N-连接糖基化位点是天冬酰胺297(N297)。

在一些方面，所述重组蛋白包含酶、激素、细胞因子、细胞表面受体、蛋白酶、细胞因子受体或其任何组合。在一些方面，所述重组蛋白是融合蛋白。在一些方面，所述融合蛋白与异源部分融合。在一些方面，所述异源部分是半衰期延长部分。在一些方面，所述半衰期延长部分包括白蛋白、白蛋白结合多肽、脂肪酸、PAS、人绒毛膜促性腺激素的C末端肽(CTP)的β亚基、聚乙二醇(PEG)、羟乙基淀粉(HES)、XTEN、白蛋白结合小分子、Fc或其组合。在一些方面，所述半衰期延长部分是Fc。在一些方面，所述方法是分批释放。

附图说明

图1示出了由实施例1中所示的分离分析产生的样品聚糖色谱图(流动相A：在水中的0.1％甲酸；流动相B：在乙腈中的0.1％甲酸)。

图2示出了由实施例2中所示的分离分析产生的样品聚糖色谱图(流动相A：在水中的0.1％三乙胺(TEA)；流动相B：在乙腈中的0.1％三乙胺(TEA))。

具体实施方式

本公开本文介绍了一种不使用荧光或UV标记来检测和定量N-聚糖的新颖无标记方法。使用反相多孔石墨碳柱和电雾式检测以生成聚糖谱，样品制备和色谱分离时间大大减少，并且显著节约成本。无标记方法提供与荧光标记方法相似的定量结果，证实该方法适用于产物释放。

I.定义

术语“和/或”在本文中使用的情况下被视为对两个指定特征或组分中的每一个与或不与另一个的具体公开。因此，如在本文中以短语诸如“A和/或B”使用的术语“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)和“B”(单独)。同样，如以短语如“A、B和/或C”使用的术语“和/或”旨在涵盖以下方面中的每一个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；以及C(单独)。

应当理解，本文中无论用语言“包括/包含(comprising)”描述任何方面，还提供了以“由……组成”和/或“本质上由……组成”描述的其他类似方面。

除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语均具有与本公开文本所属技术的本领域技术人员通常所理解的相同的含义。例如，Concise Dictionary ofBiomedicine and Molecular Biology,Juo,Pei-Show,第2版,2002,CRC出版社；TheDictionary of Cell and Molecular Biology,第3版,1999,学术出版社；以及OxfordDictionary Of Biochemistry And Molecular Biology,修订版,2000,牛津大学出版社，为本领域技术人员提供本公开文本中所使用的许多术语的一般解释。

单位、前缀和符号均以其国际单位制(SI)可接受的形式表示。数值范围包括定义所述范围的数字。本文提供的标题不是对本公开文本的各个方面的限制，所述各个方面可以通过参考作为整体的说明书而获得。因此，通过从整体上参考说明书，更全面地定义下文紧接着定义的术语。

替代方案(例如，“或”)的使用应理解为意指替代方案中的任一者、两者或其任何组合。如本文中所用，不定冠词“一个/一种(a)”或“一个/一种(an)”应被理解为是指任何所述或列举组分的“一个/一种或多个/多种”。

术语“约”或“基本上由……构成”是指在如通过本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分取决于如何测量或确定所述值或组成，即测量系统的限制。例如，根据本领域的实践，“约”或“基本上由……构成”可以意指在1个或多于1个标准差内。可替代地，“约”或“基本上包含……”可以意指高达20％的范围。此外，特别是关于生物系统或过程，所述术语可以意指高达值的一个数量级或高达值的5倍。当在本申请和权利要求中提供特定值或组成时，除非另有说明，否则应假定“约”或“基本上由……构成”的含义在该特定值或组成的可接受误差范围内。

如本文所述，除非另有说明，否则任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应理解为包括所列举范围内的任何整数及(在适当时)其分数(诸如整数的十分之一和百分之一)的值。

如本文所用，术语“目的蛋白质”用于包括存在于混合物中的希望纯化的任何蛋白质(天然的或重组的)。此类目的蛋白质包括但不限于酶、激素、生长因子、细胞因子、免疫球蛋白(例如抗体)和/或任何融合蛋白。

如本文所用，“生物标记物”实际上是存在于生物样品中或源自生物样品的任何可检测化合物，如蛋白质、肽、蛋白聚糖、糖蛋白、脂蛋白、碳水化合物、脂质、核酸(例如，DNA，如cDNA或扩增的DNA，或者RNA，如mRNA)、有机或无机化学物质、天然或合成聚合物、小分子(例如，代谢物)或者前述任一项的区别性分子或区别性片段；或者作为正常生物过程、发病过程或对治疗性干预的药理学反应或其适应证的指示物进行客观测量和评价的任何其他特征。

如本文所用，术语“分析物”用于包括存在于混合物中的需要进行分析或定量的任何分子或蛋白质(天然的或重组的)。此类分析物包括但不限于小分子、酶、激素、生长因子、细胞因子、免疫球蛋白(例如，抗体)和/或任何融合蛋白。

如本文可互换使用的术语“纯化”、“分开”或“分离”是指从包含分子和一种或多种杂质的组合物或样品提高所述分子的纯度。通常，通过从组合物去除(完全或部分)至少一种杂质来提高分子的纯度。

如本文所用，术语“质谱法”是指用于基于分子的质荷比(m/z)来检测、鉴定和定量分子的灵敏技术。当它们沿着平行且等距的极或杆(如四极，其包含四个极或杆)的中心轴通过时，电场用于根据离子的质荷比(m/z)、质量与电荷的整数比(z)来分离离子。每个杆施加两个电压，其中一个是固定的直流电，并且第二个是以叠加的射频循环的交流电。可以对所施加电场的大小进行排序，使得只有具有特定m/z比的离子才能穿过四极，然后进行检测。具有所有其他m/z值的离子偏转到轨迹上，这将导致它们与四极杆碰撞并放电，或者从质量分析仪场喷射并经由真空去除。四极通常被称为专用检测器，因为在任何时候只有具有特定m/z的离子在四极中是稳定的。那些具有稳定轨迹的离子通常被称为具有非碰撞、共振或稳定轨迹。

通常，对于三重四极质谱仪上的实验，第一四极(Q1)被设定为仅通过样品中预期化学种类的具有指定m/z的离子(先驱离子)。第二四极(即，Q2或碰撞单元)用于碎裂通过Q1的离子。第三四极(Q3)被设定为仅使对应于预期化学种类的预期碎裂产物的具有指定m/z的离子(片段离子)通至检测器。在一些方面，在质谱仪中将样品电离，以生成一种或多种质子化或去质子化的分子离子。在一些方面，一种或多种质子化或去质子化的分子带单电荷、带双电荷、带三电荷或带更高电荷。在一些方面，质谱仪是三重四极质谱仪。在一些方面，用于Q1和Q3的分辨率是单位分辨率。在其他方面，用于Q1和Q3的分辨率是不同的。在其他方面，用于Q1的分辨率高于Q3的单位分辨率。

如本文所用，术语“电雾式检测”或“CAD”是指基于用氮气(或空气)载气雾化洗脱液以形成液滴，然后干燥所述液滴以去除流动相，从而产生分析物颗粒的分析技术。分析物颗粒的初级流与由于通过高压铂电晕线而带正电的次级流相遇。电荷扩散地转移到分析物颗粒的相对流，并进一步转移到收集器，在那里通过高灵敏静电计测量，产生与存在的分析物的量成正比的信号。

如本文所用，术语“荧光团”是指可在光激发时再发射光的荧光化合物。荧光团通常含有若干个组合的芳族基团，或含有具有若干个π键的平面或环状分子。两种常用的荧光团是2-AB(2-氨基苯甲酰胺)和2-AA(邻氨基苯甲酸或2-氨基苯甲酸)。其他荧光团包括PA(2-氨基吡啶)、AMAC(2-氨基吖啶酮)、ANDS(7-氨基-1,3-萘二磺酸)、ANTS(8-氨基萘-1,3,6-三磺酸)、APTS(9-氨基芘-1,4,6-三磺酸)和3-(乙酰氨基)-6-氨基吖啶。

如本公开文本中使用的“聚糖谱”应理解为可以用于与源自另一样品或样品组的参考值或谱比较的聚糖的定量结果的值的任何定义集。例如，来自蛋白质样品的样品的聚糖谱可能与来自替代来源的样品的聚糖谱显著不同。聚糖谱可以通过将该谱与参考或标准谱进行比较来帮助预测或预期蛋白质的药效学(PD)或药代动力学(PK)治疗效果。可以通过能够检测聚糖的任何分析仪器(如电雾式检测器(CAD))来生成参考和样品聚糖谱。

术语“色谱”是指将目的蛋白(例如，抗体)与混合物中存在的其他分子(例如，污染物)分离的任何种类的技术。通常，由于在流动相的影响下混合物的单个分子迁移通过固定介质的速率差异，或在结合和洗脱过程中，将目的蛋白与其他分子(例如，污染物)分离。术语“基质”或“色谱基质”在本文中可互换使用，并且是指任何种类的吸附剂、树脂或固相，其在分离过程中将目的蛋白(例如，含有Fc区的蛋白质(如免疫球蛋白))与混合物中存在的其他分子分离。非限制性例子包括可置于柱或盒中的微粒状、整体的或纤维状树脂以及膜。用于形成基质的材料的例子包括多糖(诸如琼脂糖和纤维素)；以及其他机械稳定的基质，诸如二氧化硅(例如，可控孔度玻璃)、聚(苯乙烯二乙烯基)苯、聚丙烯酰胺、陶瓷颗粒和以上任何一种的衍生物。适合于本公开文本的方法的典型基质类型的例子是阳离子交换树脂、亲和树脂、阴离子交换树脂或混合模式树脂。“配体”是附接至色谱基质并且决定所述基质的结合特性的官能团。“配体”的例子包括但不限于离子交换基团、疏水相互作用基团、亲水相互作用基团、亲硫相互作用基团、金属亲和基团、亲和基团、生物亲和基团和混合模式基团(上述的组合)。可以在本文中使用的一些优选的配体包括但不限于强阳离子交换基团，如磺丙基、磺酸；强阴离子交换基团，如三甲基氯化铵；弱阳离子交换基团，如羧酸；弱阴离子交换基团，如N5N二乙氨基或DEAE；疏水相互作用基团，如苯基、丁基、丙基、己基；以及亲和基团，如蛋白质A、蛋白质G和蛋白质L。为了可以更容易地理解本公开文本，首先定义某些术语。如本申请所用，除非本文另外明确提供，否则以下术语中的每一个应当具有下文所阐述的含义。另外的定义贯穿本申请进行阐述。

术语“亲和色谱”是指这样的蛋白质分离技术，其中目的蛋白(例如，含有Fc区的目的蛋白或抗体)与对目的蛋白具有特异性的配体特异性结合。通常将这样的配体称为生物特异性配体。在一些方面中，生物特异性配体(例如，蛋白质A或其功能变体)与色谱基质材料共价附接，并且当溶液接触色谱基质时在溶液中可接近目的蛋白。在色谱步骤中，所述目的蛋白质通常保留其对生物特异性配体的结合亲和力，而混合物中的其他溶质和/或蛋白质不与配体明显地或特异性地结合。所述目的蛋白质与固定化配体的结合允许污染蛋白质或蛋白质杂质通过色谱基质，而目的蛋白质保持与固相材料上的固定化配体特异性结合。然后在合适的条件(例如，低pH、高pH、高盐、竞争配体等)下将特异性结合的目的蛋白质以活性形式从固定化配体去除，并且与洗脱缓冲液通过色谱柱，其不含先前允许通过柱的污染蛋白质或蛋白质杂质。任何组分都可以用作配体，以纯化其各自的特异性结合蛋白，例如抗体。然而，在根据本公开文本的各种方法中，使用蛋白质A作为含有Fc区的靶蛋白的配体。本领域普通技术人员可以容易地确定用于从靶蛋白(例如，含有Fc区的蛋白质)的生物特异性配体(例如，蛋白质A)洗脱的条件。在一些方面，蛋白G或蛋白L或其功能变体可以用作生物特异性配体。在一些方面，将生物特异性配体(如蛋白质A)在5-9的pH范围内用于与含有Fc区的蛋白质结合，洗涤或再平衡生物特异性配体/靶蛋白缀合物，之后用含有至少一种盐的pH高于或低于4的缓冲液进行洗脱。

如本文所用，术语“缓冲液”是指这样的物质，通过其在溶液中的存在而增加必须添加以引起pH单位变化的酸或碱的量。缓冲溶液通过其酸碱共轭组分的作用来抵抗pH的变化。用于与生物试剂一起使用的缓冲溶液通常能够维持恒定的氢离子浓度，使得溶液的pH在生理范围内。传统的缓冲液组分包括但不限于有机和无机盐、酸和碱。

如本文所用的术语“电导率”是指水溶液在两个电极之间传导电流的能力。在溶液中，电流通过离子传输流动。因此，随着水溶液中存在的离子量的增加，溶液将具有更高的电导率。电导率的测量单位为毫西门子每厘米(mS/cm)，并且可以使用电导率仪进行测量。

如本文所用，术语“流动相”是指流过色谱系统从而使待分离的材料以不同速率在固定相上移动的液体或气体。流动相可以是极性的或非极性的。极性流动相通常与非极性固定相组合使用，并且这些色谱分离被称为反相色谱法。相反，非极性流动相通常与极性固定相组合使用，并且通常被称为正相色谱法。

如本文所用，术语“固定相”是指色谱系统的固相或液相，其中待分离的物质选择性地吸附其上。通常，将二氧化硅用作固定相。

如本文所用，与色谱法相关的术语“色谱柱”或“柱”是通常呈填充有色谱基质或树脂的圆柱体或空心柱的形式的容器。色谱基质或树脂是提供用于纯化的物理和/或化学特性的材料。

术语“离子交换”和“离子交换色谱”是指这样的色谱过程，其中在适当的pH和电导率条件下，可电离的目的溶质(例如，混合物中的目的蛋白)与和固相离子交换材料连接(例如，通过共价附接)的带相反电荷的配体相互作用，使得目的溶质与带电化合物比混合物中的溶质杂质或污染物更多或更少地非特异性相互作用。混合物中的污染性溶质可以从离子交换材料的柱上洗去，或者与目的溶质相比，更快或更慢地与树脂结合或从树脂中排除。“离子交换色谱法”具体包括阳离子交换(CEX)、阴离子交换(AEX)和混合模式色谱法。

“阳离子交换树脂”或“阳离子交换膜”是指带负电荷的固相，并且其具有游离阴离子用于与经过或通过固相的水溶液中的阳离子进行交换。可以使用与适合于形成阳离子交换树脂的固相附接的任何带负电荷的配体，例如羧酸盐、磺酸盐和如下所述的其他配体。可商购的阳离子交换树脂包括但不限于例如具有基于磺酸盐的基团的那些(例如，MonoS、MiniS、Source 15S和30S、SP

快流、SP

高性能、Capto S、来自GE Healthcare的Capto SP ImpRes、来自Tosoh的

SP-650S和SP-650M、来自BioRad的

High S、陶瓷HyperD S、来自Pall Technologies的

M和LS SP以及Spherodex LS SP)；基于磺乙基的基团(例如，来自EMD的

SE、来自Applied Biosystems的

S-10和S-20)；基于磺丙基的基团(例如，来自Tosoh的TSK凝胶SP 5PW和SP-5PW-HR，来自Life Technologies的

HS-20、HS 50和

XS)；基于磺基异丁基的基团(例如，来自EMD的

EMDSO₃ ^-)；基于磺氧基乙基(sulfoxyethyl)的基团(例如，来自Whatman的SE52、SE53和Express-Ion S)；基于羧甲基的基团(例如，来自GE Healthcare的CM

快流，来自Biochrom Labs Inc.的Hydrocell CM，来自BioRad的

CM，来自PallTechnologies陶瓷HyperD CM、

M CM、

LS CM，来自Millipore的Matrx

C500和C200，来自Whatman的CM52、CM32、CM23和Express-Ion C，来自Tosoh的

CM-650S、CM-650M和CM-650C)；基于磺酸和羧酸的基团(例如，来自J.T.Baker的

Carboxy-Sulfon)；基于羧酸的基团(例如，来自J.T Baker的WP CBX，来自Dow Liquid Separations的

MAC-3，来自Sigma-Aldrich的

弱阳离子交换剂、

弱阳离子交换剂和

弱阳离子交换剂，以及

EMD COO--来自EMD)；基于磺酸的基团(例如，来自Biochrom LabsInc.的Hydrocell SP，来自Dow Liquid Separations的

细网目强酸阳离子树脂，UNOsphere S，来自J.T.Baker的WP磺酸，来自Sartorius的

S膜，来自Sigma-Aldrich的

强阳离子交换剂、

强阳离子和

强阳离子交换剂)；或基于正磷酸盐的基团(例如，来自Whatman的P11)。其他阳离子交换树脂包括羧甲基纤维素、BAKERBOND ABXTM、陶瓷HyperD Z、Matrex Cellufine C500、Matrex CellufineC200。

“阴离子交换树脂”或“阴离子交换膜”是指带正电荷的固相，其由此附接有一个或多个带正电荷的配体。可以使用附接至适合于形成阴离子交换树脂的固相的任何带正电荷的配体，如季氨基。可商购的阴离子交换树脂包括DEAE纤维素、来自Applied Biosystems的

PI 20、PI 50、HQ 10、HQ 20、HQ 50、D 50、来自Sartorius的

Q、MonoQ、MiniQ、Source 15Q和30Q、Q、DEAE和ANX

Fast Flow、Q

High Performance、QAE

和FAST Q

(GE Healthcare)、来自J.T.Baker的WP PEI、WP DEAM、WP QUAT、来自Biochrom Labs Inc.的Hydrocell DEAE和Hydrocell QA、UNOsphere Q、来自Biorad的

DEAE和

HighQ、Ceramic HyperD Q、ceramic HyperD DEAE、

M和LS DEAE、Spherodex LSDEAE、来自Pall Technologies的QMA

LS、QMA

M和

Q、来自Dow Liquid Separations的

细目强碱I型和II型阴离子树脂以及

MONOSPHER E 77弱碱阴离子、

Q膜、来自Millipore的Matrex

A200、A500、Q500、和Q800、来自EMD的

EMD TMAE、

EMD DEAE和

EMD DMAE、

弱强阴离子交换剂I型和II型、

弱和强阴离子交换剂I型和II型、

弱和强阴离子交换剂I型和II型、来自Sigma-Aldrich的

TSK gel Q以及来自Tosoh的DEAE5PW和5PW-HR、

SuperQ-650S、650M和650C、QAE-550C和650S、DEAE-650M和650C、QA52、DE23、DE32、DE51、DE52、DE53、来自Whatman的Express-Ion D或Express-Ion Q、以及

Q(Sartorius Corporation,美国纽约)。其他阴离子交换树脂包括POROSXQ、

Q、Q SEPHAROSE^TM XL、Q SEPHAROSE^TM大珠、DEAE Sephadex A-25、DEAESephadex A-50、QAE Sephadex A-25、QAE Sephadex A-50、Q SEPHAROSE^TM高性能、QSEPHAROSE^TM XL、Resource Q、Capto Q、Capto DEAE、Toyopearl GigaCap Q、Fractogel EMDTMAE HiCap、Nuvia Q、或PORGS PI。

“多孔石墨碳(PGC)柱”或“多孔石墨碳(PGC)反相柱”展现出作为固定相的独特特性，使得保留了颇具极性的分析物且使结构相关物质分离。在微观尺度上，PGC的表面由六边形排列的碳原子的扁平片层组成，如在非常大的多核芳族分子中那样。表面是结晶的且高度可再现的，并且没有微孔或化学键合的相。该柱在HPLC中作为固定相的特性可用于为通常被认为是HPLC中有问题的分离提供广泛的解决方案。该柱提供了颇具极性的化合物的独特保留和分离，并且所述表面具有立体选择性以及分离几何异构体和其他密切相关的化合物的能力。PGC提供天然聚糖种类的保留。基于分析的疏水性的反相行为和基于石墨碳材料的高极化率的石墨的极性保留作用的组合促进了PGC上的分离。PGC对结构异构体以及连接异构体敏感，并且能够拆分异构体聚糖。多孔石墨碳柱的一个例子是HYPERCARB^TM(THERMOSCIENTIFIC^TM)。

如本文所用，“N-连接聚糖”是指其中聚糖经由氮连接与糖缀合物连接的蛋白质修饰。聚糖的受体是分别进入周质或ER内腔的多肽链的所选择的天冬酰胺残基。寡糖转移酶(N-糖基化途径的中心酶)催化寡糖与通过共有序列N-X-S/T指定的天冬酰胺残基的侧链酰胺形成N-糖苷连接，其中X可以是任何氨基酸残基。所有真核生物N-聚糖共享共同的核心序列Manα1-3(Manα1-6)Manβ1-4GlcNAcβ1–4GlcNAcβ1–Asn-X-Ser/Thr，并分为三种类型：(1)寡甘露糖型，其中仅Man残基延伸核心；(2)复合型，其中GlcNAc引发的“触角”延伸核心；和(3)杂合型，其中Man延伸核心的Manα1-6臂，并且一个或两个GlcNAc延伸Manα1-3臂。

如本文所用，“N-连接糖基化”是指寡糖与氮原子(通常为天冬酰胺残基的N4)的连接。N-糖基化可以发生在分泌的或膜结合的蛋白质上，主要发生在真核生物和古细菌中。

如本文所用，术语“污染物”用于覆盖混合物内的任何不希望的组分或化合物。在细胞培养物、细胞裂解物或澄清的物料(例如，澄清的细胞培养上清液)中，污染物包括例如细胞培养基中存在的宿主细胞核酸(例如，DNA)和宿主细胞蛋白质。宿主细胞污染物蛋白质包括但不限于由宿主细胞天然或重组产生的那些蛋白质以及与目的蛋白相关或由其衍生的蛋白质(例如，蛋白水解片段)和其他过程相关的污染物。在某些方面，使用另一种手段(诸如离心、无菌过滤、深度过滤和切向流过滤)从细胞培养物中分离出污染物沉淀物。

在一些方面，术语“抗体”是指包含由二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的蛋白质。每条重链由重链可变区(在本文中缩写为VH)和重链恒定区(在本文中缩写为CH)组成。在一些抗体(例如，天然存在的IgG抗体)中，重链恒定区由铰链和三个结构域CH1、CH2和CH3组成。在一些抗体(例如，天然存在的IgG抗体)中，每条轻链由轻链可变区(在本文中缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域(在本文中缩写为CL)组成。VH和VL区可以进一步细分为具有高变性的区域，称为互补决定区(CDR)，散布有更保守的区域，称为框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR构成，按照以下顺序从氨基末端到羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。重链可以具有或不具有C末端赖氨酸。术语“抗体”可以包括双特异性抗体或多特异性抗体。

在一些方面，如本文所用的“IgG抗体”(例如，人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4抗体)具有天然存在的IgG抗体的结构，即，它具有与相同亚类的天然存在的IgG抗体相同数量的重链和轻链和二硫键。例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体可由两条重链(HC)和两条轻链(LC)组成，其中两条HC和LC分别通过在天然存在的IgG1、IgG2、IgG3和IgG4抗体中存在的相同数量和位置的二硫桥连接(除非抗体已经突变以修饰二硫桥)。

免疫球蛋白可以来自任何通常已知的同种型，包括但不限于IgA、分泌型IgA、IgG和IgM。IgG同种型在某些物种中分为以下亚类：人中的IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，以及小鼠中的IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3。免疫球蛋白(例如，IgG1)以若干种同种异型存在，它们彼此最多有几个氨基酸的差异。举例来说，“抗体”包括天然存在的抗体和非天然存在的抗体；单克隆抗体和多克隆抗体；嵌合抗体和人源化抗体；人抗体和非人抗体；以及全合成抗体。

如本文所用，术语抗体的“抗原结合部分”是指抗体中保留与抗原特异性结合的能力的一个或多个片段。已经显示抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段执行。涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”内的结合片段的例子包括(i)Fab片段(来自木瓜蛋白酶切割的片段)或由VL、VH、LC和CH1结构域组成的类似的单价片段；(ii)F(ab')2片段(来自胃蛋白酶切割的片段)或包含由铰链区的二硫桥连接的两个Fab片段的类似的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)dAb片段(Ward等人,(1989)Nature 341:544-546)，其由VH结构域组成；(vi)经分离的互补决定区(CDR)；以及(vii)可以任选地通过合成接头连接的两个或更多个经分离的CDR的组合。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由分开的基因编码，但它们可以使用重组方法通过合成接头来连接，从而使得它们能够成为单条蛋白质链，在其中VL和VH区配对以形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如，Bird等人(1988)Science 242:423-426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883)。此类单链抗体也旨在涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”内。这些抗体片段是使用本领域技术人员已知的常规技术获得的，并且以与完整抗体相同的方式筛选所述片段的效用。抗原结合部分可以通过重组DNA技术或通过完整的免疫球蛋白的酶促或化学切割来产生。

如本文所用，术语“重组人抗体”包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的所有人抗体，诸如(a)从对于人免疫球蛋白基因而言是转基因或转染色体的动物(例如，小鼠)或者由其制备的杂交瘤分离的抗体，(b)从转化用于表达抗体的宿主细胞(例如，从转染瘤)分离的抗体，(c)从重组的组合人抗体文库分离的抗体，和(d)通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列的任何其他手段制备、表达、产生或分离的抗体。

如本文所用，“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体种类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE抗体)。

氨基酸在本文中由其通常已知的三字母符号或由IUPAC-IUB生化命名委员会推荐的单字母符号来提及。同样，核苷酸由其普遍接受的单字母代码来提及。

如本文所用，术语“多肽”是指由通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)构成的分子。术语“多肽”是指两个或更多个氨基酸的任何一条或多条链，并且不涉及产物的具体长度。如本文所用，术语“蛋白质”旨在涵盖由一种或多种多肽组成的分子，所述多肽在一些情况下可以通过除酰胺键以外的键缔合。在另一方面，蛋白质也可以是单条多肽链。在后一种情况下，单条多肽链在一些情况下可以包含两个或更多个多肽亚基，其融合在一起以形成蛋白质。术语“多肽”和“蛋白质”还指代表达后修饰的产物，所述表达后修饰包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/阻断基团衍生化、蛋白水解切割或通过非天然存在的氨基酸修饰。多肽或蛋白质可以衍生自天然生物来源或通过重组技术产生，但是不一定从指定的核酸序列翻译。它可以以任何方式(包括通过化学合成)产生。

如本文所用，术语“阿巴西普”是指基因工程化的融合蛋白，其由人细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)的功能结合结构域和IgG1类人单克隆免疫球蛋白的Fc结构域组成。阿巴西普由2条各约46kDa的同源糖基化多肽链组成，它们通过单个二硫键共价连接。

如本文所用，术语“贝拉西普”是指相对于阿巴西普包含两个突变的突变体CTLA4-Fc多肽：第29位的氨基酸突变为酪氨酸，并且第104位的氨基酸突变为谷氨酸。在一些实施方案中，例如，β多肽至少包含CTLA-4^A29YL104E-Fc的胞外结构域的氨基酸序列。贝拉西普的非限制性例子包括SEQ ID NO:4。例如，贝拉西普进一步描述于2009年10月8日公开的美国临时申请号US 2009-0252749 A1中，将该申请通过引用以其整体并入本文。

如本文所用的术语“多核苷酸”或“核苷酸”旨在涵盖包含单个核酸以及多个核酸，并且是指经分离的核酸分子或构建体，例如信使RNA(mRNA)、互补DNA(cDNA)或质粒DNA(pDNA)。在某些方面，多核苷酸包含常规磷酸二酯键或非常规键(例如酰胺键，诸如见于肽核酸(PNA)中)。

术语“核酸”是指存在于多核苷酸中的任何一个或多个核酸区段，例如DNA、cDNA或RNA片段。当应用于核酸或多核苷酸时，术语“经分离的”是指已经从其天然环境中取出的核酸分子DNA或RNA，例如，出于本公开文本的目的，认为包含在载体中的编码抗原结合蛋白的重组多核苷酸是经分离的。经分离的多核苷酸的进一步的例子包括在异源宿主细胞中维持或从溶液中的其他多核苷酸纯化(部分或基本)的重组多核苷酸。经分离的RNA分子包括本公开文本的多核苷酸的体内或体外RNA转录物。根据本公开文本的经分离的多核苷酸或核酸进一步包括合成产生的此类分子。另外，多核苷酸或核酸可以包括调节元件，诸如启动子、增强子、核糖体结合位点或转录终止信号。

在以下小节中更详细地描述本公开文本的各个方面。

II.聚糖释放和分离方法

本公开文本涉及分析蛋白质中的聚糖如N-连接聚糖的方法。所有真核生物N-聚糖共享共同的核心序列Manα1-3(Manα1-6)Manβ1-4GlcNAcβ1–4GlcNAcβ1–Asn-X-Ser/Thr，并分为三种类型：(1)寡甘露糖型，其中仅Man残基延伸核心；(2)复合型，其中GlcNAc引发的“触角”延伸核心；和(3)杂合型，其中Man延伸核心的Manα1-6臂，并且一个或两个GlcNAc延伸Manα1-3臂。在内质网中初步加工后，糖蛋白被转运到高尔基体，在那里可以进行进一步加工。修剪的N-连接寡糖链可以通过添加几个甘露糖残基来修饰，从而产生“高甘露糖型寡糖。”可替代地或另外地，可将N-乙酰葡糖胺的一个或多个单糖单元添加到核心甘露糖亚基中以形成“复合型寡糖。”可以将半乳糖添加到N-乙酰葡糖胺亚基中，并且可以将唾液酸亚基添加到半乳糖亚基中，从而产生以唾液酸、半乳糖或N-乙酰葡糖胺残基中的任一种终止的链。可以将岩藻糖残基添加到核心寡糖的N-乙酰葡糖胺残基中。这些添加中的每一种均由特定糖基转移酶催化。

杂合型聚糖包括高甘露糖型和复合型聚糖二者的特征。例如，杂合型聚糖的一个分支可以主要或仅包含甘露糖残基，而另一个分支可以包含N-乙酰葡糖胺、唾液酸、半乳糖和/或岩藻糖。N-连接聚糖参与多种细胞过程。例如，N-连接聚糖有助于真核细胞中正确的蛋白质折叠。内质网中的伴侣蛋白(例如，钙连蛋白和钙网蛋白)与N-连接聚糖核心上存在的三个葡萄糖残基结合。伴侣蛋白通常有助于聚糖附接的蛋白质的折叠。正确折叠后，去除三个葡萄糖残基，并且N-连接聚糖可以继续进行进一步的加工反应。如果蛋白质不能正确折叠，则三个葡萄糖残基重新附接，使所述蛋白质与伴侣蛋白重新结合。该循环可以重复几次，直到蛋白质达到其正确的构象。如果蛋白质再次不能正确折叠，则它通常从内质网排出并被细胞质蛋白酶降解。可替代地或另外地，N-连接聚糖通过空间效应有助于蛋白质折叠。例如，由于附近聚糖的大小，因此可以暂时阻止肽中的半胱氨酸残基与其他半胱氨酸残基形成二硫键。因此，N-连接聚糖的存在可允许细胞控制哪些半胱氨酸残基将形成二硫键。初始寡糖链通常被内质网中的特定糖苷酶修剪，从而产生由两个N-乙酰葡糖胺和三个甘露糖残基组成的短的分支的核心寡糖。

N-连接聚糖可以参与细胞间相互作用。例如，肿瘤细胞经常产生异常的N-聚糖结构，其可以被自然杀伤细胞上的CD337受体识别为这样的迹象，即所讨论的细胞是癌性的。N-连接聚糖可以参与将降解性溶酶体酶靶向溶酶体。特别地，用甘露糖-6-磷酸残基修饰N-连接聚糖可以充当这样的信号，即该聚糖所附接的蛋白质应靶向溶酶体。因此，本公开文本涵盖了这样的认识，即确定N-连接聚糖(例如，缀合至糖蛋白的N-连接聚糖)的糖基化模式是重要的。本文所述的方法可用于分析任何N-连接聚糖的特征(例如，组成和/或结构)。

糖缀合物如糖蛋白的聚糖分析中的第一步是从它们所附接的分子中释放糖。糖蛋白上的N-连接聚糖可以通过酰胺酶如肽-N-糖苷酶F(PNGase F)释放。

聚糖通常用标记如荧光团衍生化以增强其分析。传统上，质谱法或荧光检测器是用于分析已经用荧光化合物如2-AB标记的释放聚糖的技术。质谱法(mass spectrometry)(“MS”或“质谱(mass-spec)”)是用于测量质荷比离子的分析技术。这可以通过以下方式来实现：电离样品并分离不同质量的粒子，并且通过测量离子流的强度来记录其相对丰度。典型的质谱仪包含三个部分：离子源、质量分析器和检测器系统。离子源是质谱仪中电离所分析物质(分析物)的部分。然后通过磁场或电场将离子运输至质量分析器，其根据离子的质荷比(m/z)来分离离子。许多质谱仪使用两个或更多个质量分析器进行串联质谱(MS/MS)。检测器记录离子经过或击中表面时诱导的电荷或产生的电流。质谱图是在用质量分析器扫描m/z离子时测量检测器中产生的信号的结果。然而，在一些方面，本公开文本涉及一种不使用标记且不使用质谱法分析聚糖谱的方法。电雾式检测(CAD)基本上是三步过程：首先，检测器将从柱中洗脱的分析物分子转化为干燥颗粒。颗粒的数量随分析物的量成比例地增加。其次，带正电的气体流与分析物颗粒碰撞。然后电荷转移到颗粒上—颗粒越大，电荷越大。最后，将颗粒转移到收集器中，在那里通过高灵敏静电计测量电荷。

本公开文本的方法可用于释放和分离N-连接聚糖而无需衍生化。本公开文本涉及一种定量重组蛋白的糖基化谱的方法，其包括在没有任何标记的情况下分析一种或多种N-连接聚糖，其中这些N-连接聚糖在分析之前通过酶从重组蛋白释放。在一些方面，本文所述的方法可以提供糖缀合物消化和/或聚糖释放、荧光标记和聚糖纯化中的一种或多种以用于随后的分析。分析来自生物来源的化合物的方法通常包括衍生化步骤，以引入可帮助色谱分离后的检测的荧光团。在一方面，标记用于在分析之前标记释放聚糖。在反应混合物的各方面，N-聚糖经由N-聚糖的还原端与标记连接。一种类型的标记是荧光团，其是吸收一种波长的光并发射另一种波长的光的分子。在一些方面，所述标记是荧光团。

本公开文本的方法可用于释放在天冬酰胺残基位点连接至蛋白质的N-聚糖。在一些方面，所述酶包括肽N-糖苷酶F(PNGaseF)。PNGaseF是一种通常来源于米尔伊丽莎白氏菌(Elizabethkingia miricola)细菌的酶，其从糖蛋白切割整个聚糖，并要求糖基化天冬酰胺部分在其氨基(R1)和羧基(R2)末端被多肽链取代。PNGase F蛋白序列可在UniProt ID:P21163中找到。PNGaseF酶的天然变体是本领域已知的。例如，PNGaseF的天然变体可以含有一个或多个选自D100N、E158Q、E246Q、或其组合的氨基酸取代。本公开文本的方法还可以使用PNGaseF酶的功能性片段从天冬酰胺残基释放N-聚糖来实现。

本公开文本的方法还考虑使用其他酶以从氨基酸释放N-聚糖。在一些方面，所述酶可以是内切糖苷酶F1、内切糖苷酶F2、内切糖苷酶F3、内切糖苷酶H、或其功能片段。在一些方面，所述酶是内切糖苷酶F1。在一些方面，所述酶是内切糖苷酶F2。在一些方面，所述酶是内切糖苷酶F3。在一些方面，所述酶是内切糖苷酶H。在其他方面，可以使用多于一种酶来切割N-聚糖。

本公开文本的方法可用于进一步将N-聚糖从蛋白质分离以及彼此分离。在一些方面，所述分析包括在包括柱的色谱法期间分离一种或多种N-连接聚糖。在一些方面，所述柱是亲水相互作用液相色谱(HILIC)-UPLC。在一些方面，所述柱是反相(RP)-UPLC柱。适用于本公开文本的方法中的柱的典型基质类型的其他例子是阳离子交换树脂、亲和树脂、阴离子交换树脂或混合模式树脂。其他结合配体可以附接到色谱树脂上以改变柱的结合特性。例子包括但不限于离子交换基团、疏水相互作用基团、亲水相互作用基团、亲硫相互作用基团、金属亲和基团、亲和基团、生物亲和基团和混合模式基团(前述的组合)。本公开文本的方法还可用于使用电泳分离N-聚糖。电泳已用于混合物的分离和分析。电泳涉及分子基于迁移率差异在电场中的迁移和分离。各种形式的电泳是已知的，包括自由区带电泳、凝胶电泳、等电聚焦和毛细管电泳。毛细管电泳(CE)针对游离和结合标记的分离。通常，CE涉及将样品引入毛细管中。由于每个样品成分具有其自身的单独电泳迁移率，因此迁移率较大的那些比迁移率较慢的那些更快地通过毛细管。因此，样品的组分在通过管迁移过程中被拆分到毛细管中的离散区域。在一些方面，所述电泳是毛细管电泳。在一些方面，所述电泳是凝胶电泳。

本公开文本的方法可用于在使用包括柱的色谱法分离后分析N-聚糖。在一些方面，所述方法包括使用混合模式色谱法。混合模式色谱法(MMC)或多模式色谱法是指利用固定相与分析物之间的多于一种形式的相互作用以实现它们的分离的色谱方法，这与基于一种关键属性分离组分的传统单模式色谱法不同。在一些方面，所述柱是混合模式柱。在一些方面，使用一种或多种流动相进行所述分离。在一些方面，所述柱是混合模式多孔石墨碳(PGC)柱。在一些方面，本公开文本提供了一种测量重组蛋白的糖基化谱的方法，其包括(i)使用酶(例如，PNGaseF)释放一种或多种N-连接聚糖，以及(ii)在混合模式色谱法的流动相中分离这些N-连接聚糖。在一些方面，本公开文本提供了一种定量重组蛋白的糖基化谱的方法，其包括(i)使用酶(例如，PNGaseF)释放一种或多种N-连接聚糖，(ii)在混合模式色谱法的流动相中分离这些N-连接聚糖，以及(iii)使用检测器测量分离的N-连接聚糖。在一些方面，本公开文本提供了一种表征重组蛋白的N-连接聚糖的方法，其包括(i)使用酶(例如，PNGaseF)释放一种或多种N-连接聚糖，(ii)通过电泳分离所述N-连接聚糖，以及(iii)使用检测器测量分离的N-连接聚糖。

在一些方面，本公开文本提供了一种测量重组蛋白的糖基化谱的方法，其包括(i)使用酶(例如，PNGaseF)释放一种或多种N-连接聚糖，以及(ii)通过电泳分离所述N-连接聚糖。在一些方面，本公开文本提供了一种定量重组蛋白的糖基化谱的方法，其包括(i)使用酶(例如，PNGaseF)释放一种或多种N-连接聚糖，(ii)通过电泳分离所述N-连接聚糖，以及(iii)使用检测器测量分离的N-连接聚糖。在一些方面，本公开文本提供了一种表征重组蛋白的N-连接聚糖的方法，其包括(i)使用酶(例如，PNGaseF)释放一种或多种N-连接聚糖，(ii)通过电泳分离所述N-连接聚糖，以及(iii)使用检测器测量分离的N-连接聚糖。

在一些方面，将所述酶与所述重组蛋白一起孵育，其中所述一种或多种N-连接聚糖在所述分离之前从所述重组蛋白释放。在一些方面，在缓冲液中稀释所述酶。在一些方面，所述缓冲液选自磷酸盐、柠檬酸盐、甲酸盐、乙酸盐和三(羟甲基)-氨基甲烷(“Tris”)。在一些方面，所述缓冲液是磷酸盐。在一些方面，所述缓冲液是柠檬酸盐。在一些方面，所述缓冲液是甲酸盐。在一些方面，所述缓冲液是乙酸盐。在一些方面，所述缓冲液是Tris。

本公开文本的方法可用于通过质谱法分析N-连接聚糖。一种常见的质谱方法是串联使用三个质谱仪，称为质谱/质谱(MS/MS)。例如，在三重四极质谱仪上的实验中，第一四极(Q1)被设定为仅通过样品中预期化学种类的具有指定m/z的离子(先驱离子)。第二四极(即，Q2或碰撞单元)用于碎裂通过Q1的离子。第三四极(Q3)被设定为仅使对应于预期化学种类的预期碎裂产物的具有指定m/z的离子(片段离子)通至检测器。可用于本方法的质谱仪的一个例子是NQAD，其是用于监测通过上述检测器的组分的质荷比的装置。在一些方面，分离的所述一种或多种N-连接聚糖通过质谱仪来测量。在一些方面，分离的所述一种或多种N-连接聚糖通过质谱仪来表征。在一些方面，分离的所述一种或多种N-连接聚糖通过质谱仪来检测。

本公开文本的方法还可用于通过蒸发光散射检测器或ELSD分析N-连接聚糖。蒸发光散射检测器(ELSD)是与高效液相色谱(HPLC)、超高效液相色谱(UHPLC)结合使用的检测器。ELSD分析从HPLC洗脱后的溶剂。当洗脱液通过HPLC时，其与惰性载气混合并强制通过喷雾器，喷雾器将液体分离成微小的雾化液滴。然后加热该喷雾，使得只有流动相蒸发，并且光聚焦在剩余的目标物质上，并检测散射光。ELSD检测器用于鉴定不能经由其他常用方法如由于组分不吸收UV光而无法经由紫外(UV)检测鉴定的样品。在一些方面，分离的所述一种或多种N-连接聚糖通过蒸发光散射检测器来测量。在一些方面，分离的所述一种或多种N-连接聚糖通过蒸发光散射检测器来表征。在一些方面，分离的所述一种或多种N-连接聚糖通过蒸发光散射检测器来检测。

本公开文本的方法还可用于使用折射率检测器分析N-连接聚糖。折射率检测器是与高效液相色谱(HPLC)、超高效液相色谱(UHPLC)结合使用的装置。该装置以涉及测量通过的柱洗脱液的折射率变化的检测原理运行，并且能够检测样品和流动相的折射率差异。折射率检测器可以含有具有两个部分的流动池：一个用于样品，并且一个用于参考溶剂。检测器测量两种组分的折射率，并且实际上从样品信号减去了流动相背景信号。在一些方面，分离的所述一种或多种N-连接聚糖通过折射率检测器来测量。在一些方面，分离的所述一种或多种N-连接聚糖通过折射率检测器来表征。在一些方面，分离的所述一种或多种N-连接聚糖通过折射率检测器来检测。

本公开文本的方法还可用于使用电雾式检测器分析N-连接聚糖。电雾式检测是指基于用氮气(或空气)载气雾化洗脱液以形成液滴，然后干燥所述液滴以去除流动相，从而产生分析物颗粒的分析技术。分析物颗粒的初级流与由于通过高压铂电晕线而带正电的次级流相遇。电荷扩散地转移到分析物颗粒的相对流，并进一步转移到收集器，在那里通过高灵敏静电计测量，产生与存在的分析物的量成正比的信号。在一些方面，分离的所述一种或多种N-连接聚糖通过电雾式检测器(CAD)来测量。在其他方面，分离的所述一种或多种N-连接聚糖通过质谱仪、ELSD、NQAD或折射率检测器来测量。

本公开文本的方法涉及通过色谱法(例如液相色谱法(LC))分离所释放的聚糖。LC是一种完善的分析技术，用于分离流体混合物的组分以供后续分析和/或鉴定，其中向柱、基于微流体芯片的通道或管填充固定相材料，所述固定相材料通常是微细固体或凝胶，如直径为几微米的小颗粒。小粒径提供可以用多种化学物质修饰的大表面积，从而产生固定相。基于柱尺寸和粒径以所需流速将液体洗脱剂泵送通过液相色谱柱(“LC柱”)。此液体洗脱剂有时被称为流动相。在LC柱之前将要分析的样品以小体积引入(例如，注入)流动相的流中。样品中的分析物的迁移速率在其横过柱的长度时受到与固定相的特定化学和/或物理相互作用的影响。特定分析物从柱末端洗脱或离开的时间被称为保留时间或洗脱时间，并且可能是给定分析物的合理鉴定特征。

在一些方面，用于本方法的分离N-连接聚糖的色谱法包括一种或多种流动相。在一些方面，所述色谱法包括至少两种流动相、至少三种流动相、至少四种流动相或至少五种流动相。在其他方面，所述色谱法包括第一流动相和第二流动相。在其他方面，所述色谱法包括第一流动相、第二流动相或第三流动相。在其他方面，所述色谱法包括第一流动相、第二流动相、第三流动相或第四流动相。在其他方面，所述色谱法包括第一流动相、第二流动相、第三流动相、第四流动相或第五流动相。在一些方面，所述第一流动相、第二流动相、第三流动相、第四流动相和/或第五流动相是不同的。

在一些方面，所述第一流动相、所述第二流动相、所述第三流动相、所述第四流动相或所述第五流动相选自己烷、甲醇、水、乙腈、乙酸乙酯、苯、氯仿、苯、醚或其混合物。在一些方面，所述第一流动相、所述第二流动相、所述第三流动相、所述第四流动相或所述第五流动相为水。在一些方面，所述第一流动相、所述第二流动相、所述第三流动相、所述第四流动相或所述第五流动相为乙腈。在一些方面，所述第一流动相、所述第二流动相、所述第三流动相、所述第四流动相或所述第五流动相为乙酸乙酯。在一些方面，所述第一流动相、所述第二流动相、所述第三流动相、所述第四流动相或所述第五流动相为苯。在一些方面，所述第一流动相、所述第二流动相、所述第三流动相、所述第四流动相或所述第五流动相为氯仿。在一些方面，所述第一流动相、所述第二流动相、所述第三流动相、所述第四流动相或所述第五流动相为苯。在一些方面，所述第一流动相、所述第二流动相、所述第三流动相、所述第四流动相或所述第五流动相为醚。

在一些方面，所述第一流动相包含水。在一些方面，所述第一流动相包含水并且所述第二流动相包含乙腈。在一些方面，所述第一流动相是水并且还包含甲酸(FA)，并且所述第二相是乙腈。在一些方面，所述第一流动相是水，并且所述第二相是乙腈并且还包含甲酸(FA)。在一些方面，所述第一流动相是水并且还包含甲酸(FA)，并且所述第二相是乙腈并且还包含甲酸(FA)。在一些方面，所述第一流动相是水并且还包含约0.01％至约1％甲酸(FA)，并且所述第二相是乙腈。在一些方面，所述第一流动相是水，并且所述第二相是乙腈并且还包含约0.01％至约1％甲酸(FA)。在一些方面，所述第一流动相是水并且还包含约0.01％至约1％甲酸(FA)，并且所述第二相是乙腈并且还包含约0.01％至约1％甲酸(FA)。在一些方面，所述第一流动相和所述第二流动相包含约0.01％甲酸(FA)。在一些方面，所述第一流动相和所述第二流动相包含约0.02％甲酸(FA)。在一些方面，所述第一流动相和所述第二流动相包含约0.03％甲酸(FA)。在一些方面，所述第一流动相和所述第二流动相包含约0.04％甲酸(FA)。在一些方面，所述第一流动相和所述第二流动相包含约0.05％甲酸(FA)。在一些方面，所述第一流动相和所述第二流动相包含约0.06％甲酸(FA)。在一些方面，所述第一流动相和所述第二流动相包含约0.07甲酸(FA)。在一些方面，所述第一流动相和所述第二流动相包含约0.08％甲酸(FA)。在一些方面，所述第一流动相和所述第二流动相包含约0.09％甲酸(FA)。在一些方面，所述第一流动相和所述第二流动相包含约0.1％甲酸(FA)。

在一些方面，所述第一流动相包含水。在一些方面，所述第一流动相包含水并且所述第二流动相包含乙腈。在一些方面，所述第一流动相是水并且还包含三氟乙酸(TFA)，并且所述第二相是乙腈。在一些方面，所述第一流动相是水，并且所述第二相是乙腈并且还包含三氟乙酸(TFA)。在一些方面，所述第一流动相是水并且还包含三氟乙酸(TFA)，并且所述第二相是乙腈并且还包含三氟乙酸(TFA)。在一些方面，所述第一流动相是水并且还包含约0.01％至约1％三氟乙酸(TFA)，并且所述第二相是乙腈。在一些方面，所述第一流动相是水，并且所述第二相是乙腈并且还包含约0.01％至约1％三氟乙酸(TFA)。在一些方面，所述第一流动相是水并且还包含约0.01％至约1％三氟乙酸(TFA)，并且所述第二相是乙腈并且还包含约0.01％至约1％三氟乙酸(TFA)。在一些方面，所述第一流动相和所述第二流动相包含约0.01％三氟乙酸(TFA)。在一些方面，所述第一流动相和所述第二流动相包含约0.02％三氟乙酸(TFA)。在一些方面，所述第一流动相和所述第二流动相包含约0.03％三氟乙酸(TFA)。在一些方面，所述第一流动相和所述第二流动相包含约0.04％三氟乙酸(TFA)。在一些方面，所述第一流动相和所述第二流动相包含约0.05％三氟乙酸(TFA)。在一些方面，所述第一流动相和所述第二流动相包含约0.06％三氟乙酸(TFA)。在一些方面，所述第一流动相和所述第二流动相包含约0.07％三氟乙酸(TFA)。在一些方面，所述第一流动相和所述第二流动相包含约0.08％三氟乙酸(TFA)。在一些方面，所述第一流动相和所述第二流动相包含约0.09％三氟乙酸(TFA)。在一些方面，所述第一流动相和所述第二流动相包含约0.1％三氟乙酸(TFA)。

在一些方面，所述第一流动相包含水。在一些方面，所述第一流动相包含水并且所述第二流动相包含乙腈。在一些方面，所述第一流动相是水并且还包含三乙胺(TEA)，并且所述第二相是乙腈。在一些方面，所述第一流动相是水，并且所述第二相是乙腈并且还包含三乙胺(TEA)。在一些方面，所述第一流动相是水并且还包含三乙胺(TEA)，并且所述第二相是乙腈并且还包含三乙胺(TEA)。在一些方面，所述第一流动相是水并且还包含约0.01％至约1％三乙胺(TEA)，并且所述第二相是乙腈。在一些方面，所述第一流动相是水，并且所述第二相是乙腈并且还包含约0.01％至约1％三乙胺(TEA)。在一些方面，所述第一流动相是水并且还包含约0.01％至约1％三乙胺(TEA)，并且所述第二相是乙腈并且还包含约0.01％至约1％三乙胺(TEA)。在一些方面，所述第一流动相和所述第二流动相包含约0.01％三乙胺(TEA)。在一些方面，所述第一流动相和所述第二流动相包含约0.02％三乙胺(TEA)。在一些方面，所述第一流动相和所述第二流动相包含约0.03％三乙胺(TEA)。在一些方面，所述第一流动相和所述第二流动相包含约0.04％三乙胺(TEA)。在一些方面，所述第一流动相和所述第二流动相包含约0.05％三乙胺(TEA)。在一些方面，所述第一流动相和所述第二流动相包含约0.06％三乙胺(TEA)。在一些方面，所述第一流动相和所述第二流动相包含约0.07％三乙胺(TEA)。在一些方面，所述第一流动相和所述第二流动相包含约0.08％三乙胺(TEA)。在一些方面，所述第一流动相和所述第二流动相包含约0.09％三乙胺(TEA)。在一些方面，所述第一流动相和所述第二流动相包含约0.1％三乙胺(TEA)。

在一些方面，所述第一流动相是水并且还包含三乙胺(TEA)，并且所述第二相是乙腈。在一些方面，所述第一流动相是水并且还包含三乙胺(TEA)，并且所述第二相是乙腈并且还包含三乙胺(TEA)。在一些方面，所述第一流动相是水并且还包含约0.05％至约1.5％三乙胺(TEA)，并且所述第二相是乙腈，其中与流动相A和/或流动相B中0.1％甲酸相比，聚糖S1G2、S2G2、S2G2F以任何组合在分离过程中对色谱柱具有增加的亲和力。在一些方面，所述第一流动相是水并且还包含三乙胺(TEA)，并且所述第二相是乙腈并且还包含约0.05％至约1.5％三乙胺(TEA)，其中与流动相A和/或流动相B中0.1％甲酸相比，聚糖S1G2、S2G2、S2G2F以任何组合在分离过程中对色谱柱具有增加的亲和力。在一些方面，所述第一流动相是水并且还包含约0.05％至约1.5％三乙胺(TEA)，并且所述第二相是乙腈并且还包含约0.05％至约1.5％三乙胺(TEA)，其中与流动相A和/或流动相B中0.1％甲酸相比，聚糖S1G2、S2G2、S2G2F以任何组合在分离过程中对色谱柱具有增加的亲和力。在一些方面，所述第一流动相包含在水中的约0.1％三甲胺(TEA)，并且所述第二流动相包含在乙腈中的约0.1％三乙胺(TEA)。在一些方面，所述第一流动相包含约0.05％三乙胺(TEA)。在一些方面，所述第一流动相包含约0.06％三乙胺(TEA)。在一些方面，所述第一流动相包含约0.07％三乙胺(TEA)。在一些方面，所述第一流动相包含约0.08％三乙胺(TEA)。在一些方面，所述第一流动相包含约0.09％三乙胺(TEA)。在一些方面，所述第一流动相包含约0.1％三乙胺(TEA)。在一些方面，所述第一流动相包含约0.11％三乙胺(TEA)。在一些方面，所述第一流动相包含约0.12％三乙胺(TEA)。在一些方面，所述第一流动相包含约0.13％三乙胺(TEA)。在一些方面，所述第一流动相包含约0.14％三乙胺(TEA)。在一些方面，所述第一流动相包含约0.15％三乙胺(TEA)。在一些方面，所述第二流动相包含约0.05％三乙胺(TEA)。在一些方面，所述第二流动相包含约0.06％三乙胺(TEA)。在一些方面，所述第二流动相包含约0.07％三乙胺(TEA)。在一些方面，所述第二流动相包含约0.08％三乙胺(TEA)。在一些方面，所述第二流动相包含约0.09％三乙胺(TEA)。在一些方面，所述第二流动相包含约0.10％三乙胺(TEA)。在一些方面，所述第二流动相包含约0.11％三乙胺(TEA)。在一些方面，所述第二流动相包含约0.12％三乙胺(TEA)。在一些方面，所述第二流动相包含约0.13％三乙胺(TEA)。在一些方面，所述第二流动相包含约0.14％三乙胺(TEA)。在一些方面，所述第二流动相包含约0.15％三乙胺(TEA)。

在一些方面，所述第一流动相、所述第二流动相、所述第三流动相、所述第四流动相或所述第五流动相包含甲酸(FA)、三氟乙酸(TFA)、三乙胺(TEA)或其任何组合。在一些方面，所述第一流动相、所述第二流动相、所述第三流动相、所述第四流动相或所述第五流动相包含约0.01％至约2％甲酸(FA)、三氟乙酸(TFA)、三乙胺(TEA)或其任何组合。

在一些方面，所述第一流动相、所述第二流动相、所述第三流动相、所述第四流动相或所述第五流动相包含约0.01％至约1％或约1％至约2％甲酸(FA)，例如0.1％FA。在一些方面，所述第一流动相、所述第二流动相、所述第三流动相、所述第四流动相或所述第五流动相包含约0.01％至约1％或约1％至约2％三氟乙酸(TFA)，例如0.1％TFA。在一些方面，所述第一流动相、所述第二流动相、所述第三流动相、所述第四流动相或所述第五流动相包含约0.01％至约1％或约1％至约2％三乙胺(TEA)，例如0.1％TEA，其中与流动相A和/或流动相B中0.1％甲酸相比，聚糖S1G2、S2G2、和/或S2G2F在分离过程中对色谱柱具有增加的亲和力。

在一些方面，本公开文本的方法使用用于还原胺化的一种或多种药剂以改善峰对称性并减少色谱分离期间的峰拖尾。在一些方面，所述一种或多种药剂包含2-甲基吡啶硼烷(pic-BH₃)和/或氰基硼氢化钠(NaBH₃CN)。

本公开文本的方法可用于使用色谱法分离N-聚糖。色谱分离可以通过在分离期间调节色谱柱的温度来改善。在一些方面，所述分离在低于70℃的温度下进行。在一些方面，所述分离在低于60℃的温度下进行。在一些方面，所述分离在低于50℃的温度下进行。在一些方面，所述分离在低于40℃的温度下进行。

在一些方面，所述温度在约50℃与约70℃之间、约50℃与约60℃之间、约60℃与约70℃之间、约55℃与约65℃之间、约55℃与约60℃之间、约60℃与约65℃之间、约65℃与约70℃之间、约50℃与约55℃之间、约50℃与约60℃之间、约50℃与约59℃之间、约51℃与约59℃之间、约51℃与约58℃之间、约52℃与约58℃之间、约52℃与约57℃之间、约53℃与约57℃之间、约53℃与约56℃之间、以及约54℃与约56℃之间。

在一些方面，所述温度在约50℃与约70℃之间。在一些方面，所述温度在约50℃与约60℃之间。在一些方面，所述温度在约60℃与约70℃之间。在一些方面，所述温度在约55℃与约65℃之间。在一些方面，所述温度在约55℃与约60℃之间。在一些方面，所述温度在约60℃与约65℃之间。在一些方面，所述温度在约65℃与约70℃之间。在一些方面，所述温度在约50℃与约55℃之间。在一些方面，所述温度在约50℃与约60℃之间。在一些方面，所述温度在约50℃与约59℃之间。在一些方面，所述温度在约51℃与约59℃之间。在一些方面，所述温度在约51℃与约58℃之间。在一些方面，所述温度在约52℃与约58℃之间。在一些方面，所述温度在约52℃与约57℃之间。在一些方面，所述温度在约53℃与约57℃之间。在一些方面，所述温度在约53℃与约56℃之间。在一些方面，所述温度在约54℃与约56℃之间。

在一些方面，所述温度在约45℃与约55℃之间、约45℃与约54℃之间、约46℃与约54℃之间、约46℃与约53℃之间、约47℃与约53℃之间、约47℃与约52℃之间、约48℃与约52℃之间、约49℃与约52℃之间、或约49℃与约51℃之间。在一些方面，所述温度在约55℃与约65℃之间、约55℃与约64℃之间、约56℃与约64℃之间、约56℃与约63℃之间、约57℃与约63℃之间、约57℃与约62℃之间、约58℃与约62℃之间、约59℃与约62℃之间、或约59℃与约61℃之间。

在一些方面，所述温度为约50℃、约51℃、约52℃、约53℃、约54℃、约55℃、约56℃、约57℃、约58℃、约59℃、约60℃、约61℃、约62℃、约63℃、约64℃、约65℃、约66℃、约67℃、约68℃或约69℃。

在一些方面，所述温度在约45℃与约55℃之间。在一些方面，所述温度在约45℃与约54℃之间。在一些方面，所述温度在约46℃与约54℃之间。在一些方面，所述温度在约46℃与约53℃之间。在一些方面，所述温度在约47℃与约53℃之间。在一些方面，所述温度在约47℃与约52℃之间。在一些方面，所述温度在约48℃与约52℃之间。在一些方面，所述温度在约49℃与约52℃之间。在一些方面，所述温度在约49℃与约51℃之间。在一些方面，所述温度在约55℃与约65℃之间。在一些方面，所述温度在约55℃与约64℃之间。在一些方面，所述温度在约56℃与约64℃之间。在一些方面，所述温度在约56℃与约63℃之间。在一些方面，所述温度在约57℃与约63℃之间。在一些方面，所述温度在约57℃与约62℃之间。在一些方面，所述温度在约58℃与约62℃之间。在一些方面，所述温度在约59℃与约62℃之间。在一些方面，所述温度在约59℃与约61℃之间。

本公开文本的方法可用于使用色谱法分离N-连接聚糖。反相HPLC中的梯度通常涉及溶剂(流动相)的在线(动态)混合以在分离过程中实现一种溶剂的稳定增加，其用于随时间改变洗脱液的洗脱强度。在一些方面，所述分离是在梯度上进行。在一些方面，所述分离是在一种或多种流动相的梯度上进行。在一些方面，所述梯度是从所述第一流动相到所述第二流动相。在一些方面，所述梯度是从所述第一流动相到所述第二流动相到所述第三流动相。在一些方面，所述梯度是从所述第一流动相到所述第二流动相到所述第三流动相到所述第四流动相。在一些方面，所述梯度是从所述第一流动相到所述第二流动相到所述第三流动相到所述第四流动相到所述第五流动相。在一些方面，所述梯度为约95％至约5％。在一些方面，所述梯度为约95％至约50％、约95％至约55％、约95％至约60％、约95％至约65％、约95％至约70％、约95％至约75％、约95％至约80％、约95％至约85％、约90％至约50％、约90％至约55％、约90％至约60％、约90％至约65％、约90％至约70％、约90％至约75％、约87％至约50％、约87％至约55％、约87％至约60％、约87％至约65％、约87％至约70％、约87％至约75％、约85％至约50％、约85％至约55％、约85％至约60％、约85％至约65％、约85％至约70％、或约85％至约75％。在一些方面，所述梯度为约87％至约75％。

在一些方面，所述梯度为约95％至约50％。在一些方面，所述梯度为约95％至约51％。在一些方面，所述梯度为约95％至约52％。在一些方面，所述梯度为约95％至约53％。在一些方面，所述梯度为约95％至约54％。在一些方面，所述梯度为约95％至约55％。在一些方面，所述梯度为约95％至约56％。在一些方面，所述梯度为约95％至约57％。在一些方面，所述梯度为约95％至约58％。在一些方面，所述梯度为约95％至约59％。在一些方面，所述梯度为约95％至约60％。在一些方面，所述梯度为约90％至约74％。在一些方面，所述梯度为约90％至约75％。在一些方面，所述梯度为约90％至约76％。在一些方面，所述梯度为约90％至约77％。在一些方面，所述梯度为约90％至约78％。在一些方面，所述梯度为约90％至约79％。在一些方面，所述梯度为约90％至约80％。在一些方面，所述梯度为约90％至约81％。在一些方面，所述梯度为约90％至约82％。在一些方面，所述梯度为约90％至约83％。在一些方面，所述梯度为约90％至约84％。在一些方面，所述梯度为约90％至约85％。在一些方面，所述梯度为约87％至约50％。在一些方面，所述梯度为约87％至约51％。在一些方面，所述梯度为约87％至约52％。在一些方面，所述梯度为约87％至约53％。在一些方面，所述梯度为约87％至约54％。在一些方面，所述梯度为约87％至约55％。在一些方面，所述梯度为约87％至约56％。在一些方面，所述梯度为约87％至约57％。在一些方面，所述梯度为约87％至约58％。在一些方面，所述梯度为约87％至约59％。在一些方面，所述梯度为约87％至约60％。在一些方面，所述梯度为约87％至约61％。在一些方面，所述梯度为约87％至约62％。在一些方面，所述梯度为约87％至约63％。在一些方面，所述梯度为约87％至约64％。在一些方面，所述梯度为约87％至约65％。在一些方面，所述梯度为约87％至约66％。在一些方面，所述梯度为约87％至约67％。在一些方面，所述梯度为约87％至约68％。在一些方面，所述梯度为约87％至约69％。在一些方面，所述梯度为约87％至约70％。在一些方面，所述梯度为约87％至约71％。在一些方面，所述梯度为约87％至约72％。在一些方面，所述梯度为约87％至约73％。在一些方面，所述梯度为约87％至约74％。在一些方面，所述梯度为约87％至约75％。

III.聚糖分析方法

本公开文本的方法还可用于分析如上所示的释放和分离的N-连接聚糖。N-连接糖基化是在称为N-糖基化的过程中寡糖(有时也称为聚糖)附接到氮原子(蛋白质的天冬酰胺(Asn)残基的酰胺氮)。本公开文本还涉及一种分析目的蛋白质的N-连接聚糖谱的方法。在一些方面，所述一种或多种N-连接聚糖是半乳糖(Gal)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、半乳糖胺(GalN)、葡萄糖(Glc)、N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)、葡萄糖胺(GlcN)、甘露糖(Man)、N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)、甘露糖胺(ManN)、木糖(Xyl)、岩藻糖(Fuc)、葡萄糖醛酸(GlcA)、艾杜糖醛酸(IdoA)、半乳糖醛酸(GalA)、甘露糖醛酸(ManA)或其任何组合。在一些方面，N-聚糖是Gal。在一些方面，N-聚糖是GalNac。在一些方面，N-聚糖是GalN。在一些方面，N-聚糖是Glc。在一些方面，N-聚糖是GlcNAc。在一些方面，N-聚糖是GlcN。在一些方面，N-聚糖是Man。在一些方面，N-聚糖是ManNAc。在一些方面，N-聚糖是ManN。在一些方面，N-聚糖是Xyl。在一些方面，N-聚糖是Fuc。在一些方面，N-聚糖是GlcA。在一些方面，N-聚糖是IdoA。在一些方面，N-聚糖是GalA。在一些方面，N-聚糖是ManA。在一些方面，所述一种或多种N-聚糖包含一种或多种双触角聚糖。在一些方面，所述双触角聚糖选自G0F、G0、G1F、G1、G2F、G2、S1G2F、S1G2、S2G2F、S2G2及其任何组合。在一些方面，所述双触角聚糖是G0F或G0。在一些方面，所述双触角聚糖是G1F或G1。在一些方面，所述双触角聚糖是G2F或G2。在一些方面，所述双触角聚糖是S1G2F或S1G2。在一些方面，所述双触角聚糖是S2G2F或S2G2。

在一些方面，所述一种或多种N-连接聚糖是高甘露糖型聚糖。高甘露糖型聚糖含有未取代的末端甘露糖。这些聚糖通常含有5至9个附接到壳二糖(GlcNAc₂)核心的甘露糖残基。在一些方面，所述一种或多种高甘露糖型N-连接聚糖是甘露糖-5。在一些方面，所述一种或多种高甘露糖型N-连接聚糖是甘露糖-6。在一些方面，所述一种或多种高甘露糖型N-连接聚糖是甘露糖-7。在一些方面，所述一种或多种高甘露糖型N-连接聚糖是甘露糖-8。在一些方面，所述一种或多种高甘露糖型N-连接聚糖是甘露糖-9。

高甘露糖型N-连接聚糖也可以被磷酸化。甘露糖-6-磷酸(M6P)是溶酶体酶转运到溶酶体的关键信号。大多数溶酶体酶是具有高甘露糖型聚糖以及复合型聚糖的糖蛋白。例如，FABRAZYME^TM是溶酶体蛋白α-半乳糖苷酶A的一个例子，其中FABRAZYME^TM被细胞吸收并随后转运至溶酶体的能力是由于在其N-连接聚糖上存在甘露糖6-磷酸(M6P)，其中FABRAZYME^TM通过与大多数细胞类型的细胞表面上存在的甘露糖-6-磷酸/IGF-II受体结合而被递送至溶酶体。在一些方面，高甘露糖型N-连接聚糖中的一个或多个甘露糖残基被磷酸化。

本公开文本的方法还可用于分离包含唾液酸化的聚糖。唾液酸化是将唾液酸基团引入作为末端单糖的分子如寡糖和碳水化合物上的过程。存在两种常见的哺乳动物唾液酸：N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac或NANA)和N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc或NGNA)。在一些方面，所述唾液酸是Neu5Ac。在一些方面，所述唾液酸是Neu5Gc。在一些方面，所述唾液酸是2-酮-3-脱氧壬酸(Kdn)。在一些方面，所述糖基化谱包含一种或多种去唾液酸化聚糖、单唾液酸化聚糖、二唾液酸化聚糖和/或三唾液酸化聚糖和四唾液酸化聚糖。在一些方面，所述糖基化谱包含一种或多种去唾液酸化聚糖。在一些方面，所述糖基化谱包含一种或多种单唾液酸化聚糖。在一些方面，所述糖基化谱包含一种或多种二唾液酸化聚糖。在一些方面，所述糖基化谱包含一种或多种三唾液酸化聚糖。在一些方面，所述糖基化谱包含一种或多种四唾液酸化聚糖。

本公开文本的方法可用于表征蛋白质的糖基化谱。在一些方面，所述蛋白质是重组蛋白质。在一些方面，所述重组蛋白纯度为至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％。

在一些方面，所述重组蛋白是融合蛋白。在一些方面，所述融合蛋白是抗肌肉生长抑制素融合蛋白。在一些方面，所述融合蛋白是他地西普α。在其他方面，所述融合蛋白是Fc融合蛋白。在一些方面，所述融合蛋白是Fc融合蛋白的同二聚体。在一些方面，所述融合蛋白包含CTLA-4胞外融合蛋白。在一些方面，CTLA-4Fc融合蛋白是阿巴西普。在其他方面，CTLA-4Fc融合蛋白是贝拉西普。CTLA4-Ig分子、其用途和方法也描述于美国专利号5,434,131；5,851,795；5,885,796；5,885,579；和7,094,874中，将其通过引用以其整体并入本文中。在一些方面，CTLA-4-Fc融合蛋白包含至少一种N-连接聚糖、至少两种N-连接聚糖或至少三种N-连接聚糖，例如T5、T7和T15。如本文所用，“T5”、“T7”和“T15”是指存在于阿巴西普或贝拉西普分子上的特定糖基化位点。这些标记分别对应于天冬酰胺76、天冬酰胺108和天冬酰胺207，并对应于SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5中的残基(粗体)。

SEQ ID NO:1[CTLA4胞外结构域序列]

MHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSD

阿巴西普(SEQ ID NO:3)[SEQ ID NO:2的氨基酸27-383]

贝拉西普(SEQ ID NO:5)[SEQ ID NO:4的氨基酸27-383]

在一些方面，所述重组蛋白是抗体。在一些方面，所述抗体是选自IgM、IgA、IgE、IgD、和IgG的同种型。在一些方面，所述抗体是同种型IgM。在一些方面，所述抗体是同种型IgA。在一些方面，所述抗体是同种型IgE。在一些方面，所述抗体是同种型IgD。在一些方面，所述抗体是同种型IgG。在一些方面，所述IgG抗体选自IgG1、IgG2、IgG3、和IgG4。在一些方面，所述抗体是双特异性的。在一些方面，所述抗体是多特异性的。

本公开文本的方法可用于分析可用于治疗目的的抗体。在一些方面，所述抗体是抗GITR抗体、抗CXCR4抗体、抗CD73抗体、抗TIGIT抗体、抗OX40抗体、抗LAG3抗体、抗CSF1R抗体或抗IL8抗体。在一些方面，所述抗体具有单个N-连接糖基化位点。在一些方面，所述单个N-连接糖基化位点是天冬酰胺297(N297)。在一些方面，抗体具有至少一个N-连接糖基化位点、至少两个N-连接糖基化位点、至少三个N-连接糖基化位点、至少四个N-连接糖基化位点或至少五个N-连接糖基化位点。

本公开文本的方法还可用于分析其他重组蛋白的N-连接聚糖。在一些方面，所述重组蛋白包含酶、激素、细胞因子、细胞表面受体、蛋白酶、细胞因子受体或其任何组合。在一些方面，所述重组蛋白是融合蛋白。在一些方面，所述融合蛋白与异源部分融合。在一些方面，所述异源部分是半衰期延长部分。在一些方面，所述半衰期延长部分包括白蛋白、白蛋白结合多肽、脂肪酸、PAS、人绒毛膜促性腺激素的C末端肽(CTP)的β亚基、聚乙二醇(PEG)、羟乙基淀粉(HES)、XTEN、白蛋白结合小分子、Fc或其组合。在一些方面，所述半衰期延长部分是Fc。

在一些方面，本方法可用于分析融合蛋白(例如抗PD-L1/TGFβR2双特异性融合蛋白)的N-连接聚糖。参见Jochems等人,Oncotarget.2017年9月26日；8(43):75217–75231。

在一些方面，本方法可用于分析BsAb-HAS(人血清白蛋白)融合蛋白。各种BsAb包括但不限于BsAb片段，例如scFv-HSA-scFv、scDiabody-HSA、串联scFv-HSA等。

在一些方面，本方法可用于分析BsAb-毒素融合蛋白。BsAb-毒素融合蛋白是免疫毒素的延伸，所述免疫毒素由蛋白毒素组成，其与抗体部分融合且作为细胞毒性部分起作用。其中，串联scFv-毒素是报道最多的形式，也称为双特异性配体定向毒素(BLT)。催化毒素如假单胞菌外毒素(PE)和白喉毒素(DT)通常被选择作为细胞毒性部分。

本公开文件的方法还可用于生物制造分析和批量释放分析。批量释放测试通常是良好生产规范(GMP)所要求的，并且是在发行销售、供应或出口之前确保高质量药品和生物制药的必要要求。在一些方面，所述方法是批量释放测定。

通过以下实施例进一步说明本公开文本，所述实施例不应当被视为进一步限制。将本申请通篇引用的所有参考文献的内容通过引用明确并入本文。

实施例

实施例1

试剂、柱和系统

重组PNGase F和快速PNGase F购自New England Biolabs,Inc.(马萨诸塞州伊普斯威奇)。聚糖标准品购自Prozyme(加利福尼亚州海沃德)。用于流动相的水和乙腈通过Fisher Scientific(新罕布什尔州汉普顿)购自J.T.Baker。所有流动相添加剂(甲酸、三氟乙酸、三乙胺等)均购自Sigma Aldrich(密苏里州圣路易斯)。AdvanceBio N-聚糖清洁盒购自Agilent Technologies(加利福尼亚州圣克拉拉)。

在开发过程中筛选各种柱，包括HILIC、反相和多孔石墨碳分离。对于HILIC分离，XBridge Glycan BEH Amide^TM

2.5μm(2.1x150mm)和Acquity UPLC Glycan BEHAmide^TM

1.7μm(2.1x150mm)柱购自Waters Corporation(马萨诸塞州米尔福德)。另外，PolyGLYCOPLEX^TM A 3μm(2.1x100mm)柱购自PolyLC Inc.(马里兰州哥伦比亚)，TSKGelAmide-80 2μm(2.0x150mm)柱购自Tosoh Biosciences LLC(日本东京)。对于反相的评价，XBridge BEH C18 2.5μm(3.0x150mm)柱、Acquity UPLC Peptide CSH C18

1.7μm(2.1x100mm)柱和CORTECS UPLC C18+^TM，1.6μm(2.1x100mm)柱均购自Waters Corporation。HYPERCARB^TM 3μm(2.1x100mm)柱购自Thermo Scientific^TM(马萨诸塞州沃尔瑟姆)。所有色谱分离均在Alliance 2695HPLC^TM系统或Acquity H-Class UPLC^TM系统上进行，所述系统与来自Thermo Scientific^TM的CORONA^TM VEO^TM电雾式检测器系统连接以用于检测聚糖。

优化的寡糖释放

通过在pH 7.5下用10μL快速PNGase F缓冲液和20mM Tris缓冲液稀释1mg mAb且最终体积为180μL，从mAb样品中释放寡糖。然后将样品短暂涡旋混合并离心以收集上清液。用HPLC水按1:10稀释快速PNGase F，并将20μL的该溶液添加至每个反应瓶中，涡旋并离心。将快速PNGase F溶液在50℃下孵育60分钟并冷却至室温。为了去除蛋白质和缓冲液组分，使用Agilent AdvanceBio N-Glycan Deglycosylation Cleanup Cartridges^TM提取寡糖。将盒首先用500μL水平衡两次，然后用500μL 85％乙腈平衡两次，用-0.05巴下的真空设定进行装备。将样品用乙腈1:5(至80％ACN)稀释并加载至预平衡的盒上。将溶液通过盒，并将盒用600μL 1:9:90甲酸:水:乙腈溶液洗涤两次。然后使用新鲜的收集瓶收集纯化的寡糖。通过用50μL水洗涤两次从盒中洗脱寡糖。使用真空浓缩器将流过液冻干，并将样品在25μL的在水中的0.1％甲酸与5％乙腈中重构，并转移至合适的小瓶中以用于LC分析。

优化的无标记寡糖的分离

使用与Waters Acquity UPLC^TM系统连接的多孔石墨碳柱(来自THERMOSCIENTIFIC^TM的HYPERCARB^TM 2.1x100mm,3μm)分离纯化的寡糖。流动相A和B分别由0.1％甲酸和100％乙腈组成。柱温设置为60℃，并且流速保持在0.3mL/min。以95％A注射样品(5μL体积)，并使用经10分钟87％A至78％A的梯度分离，且总运行时间为30分钟并平衡。电雾式检测器设置为蒸发温度为50℃，功率函数为1，数据收集速率为25Hz和过滤常数为10秒。

评价去糖基化程度

为了评价去糖基化反应的程度，对三种不同的单克隆抗体(不同IgG亚类的mAb A、mAb B和mAb C)进行时程研究。根据优化的程序制备样品，取时间点并在t＝0min、5min、60min、240min和1440min进行。对于非快速PNGase F处理，与快速对应物相同地制备样品，但对于非快速PNGase F，反应在37℃进行1440min。然后使用简化的CE-SDS和优化的色谱法评价这些样品以评价去糖基化反应的程度，以确保60分钟足以使这些分子去糖基化。

色谱优化

历史上，使用亲水相互作用液相色谱法(HILIC)进行聚糖分离，因为聚糖是极性化合物，其在高有机浓度下结合树脂表面上存在的酰胺，并且可以随着水浓度的增加而被洗脱(Veillon等人,2017)。通常，这些分离使用标记有荧光标签(例如2-AA或2-AB)的纯化聚糖进行，所述荧光标签会影响结合和分离。为了理解无标记聚糖如何与柱相互作用，评价两个HILIC HPLC柱(XBridge Glycan BEH Amide和PolyGLYCOPLEX A)作为起始点。流动相A是100％乙腈，并且流动相B是50mM甲酸铵(pH 4.4)，这是用于HILIC分离的典型流动相组成。使用来自Prozyme的非标记聚糖标准文库评价两个柱。对于两个柱都观察到了标准品中的四种主要聚糖(G0F、G1F、G2F和Man5)，但是分辨率差和信号弱限制了这些柱的潜在开发。对于这两个柱，对于单独的标准品注射观察到肩峰，这是先前使用荧光标记的标准品未观察到的。

下一步是评价基于UPLC的HILIC柱，以观察是否可以改善分辨率或峰形。用与HPLC实验相同的条件筛选UPLC HILIC柱(Acquity Glycan BEH Amide柱和TSKgel Amide柱)。由于较高的分辨能力，因此UPLC系统和BEH柱的分离是优越的。有趣的是，对于单独的聚糖标准品仍然观察到肩峰，这在研究开始时是不期望的。进一步分析HILIC固定相与极性聚糖分析物之间的相互作用。当使用HILIC进行分析时，释放的聚糖通常在游离的还原端用荧光标记进行标记。然而，在这种情况下，在不使用标签的情况下，该还原端被暴露并且可以经历异头平衡(参考文献)。这两种相同的聚糖以不同的方式与固定相相互作用，这取决于其是处于闭合还是开放构象，从而使我们得出结论，肩峰是相同聚糖的异头形式。在评价可获得的文献后，决定向流动相中添加三乙胺可以通过增加溶液的pH帮助将平衡推向一端(参考文献)。然而，当我们在HILIC的流动相中使用TEA时，聚糖不与柱结合，因为pH改变在HILIC柱的功能范围之外。这促使我们评价反相作为替代方案，因为在TEA存在下聚糖变得更加非极性。

评价了4个C18柱，均没有成功(Peptide CSH、Acquity BEH、CORTECS C18+和Kinetex C18)。这是由于聚糖不能与蛋白质或肽一样有效地结合C18固定相，并且这些柱被销售用于基于蛋白质的应用。Thermo评价了新上市的柱，一种多孔石墨碳(PGC)Hypercarb^TM柱。此柱与典型反相柱的不同之处在于固定相由扁平的六边形排列的碳原子组成，这促进平面化合物(如聚糖)之间的相互作用。与任何其他固定相相比，PGC提供了最佳的聚糖异构体分离。(Song等人,2015)。按照制造商的流动相推荐，初始筛选产生有希望的结果，因为当筛选宽梯度(95％至5％)的流动相A(在水中的0.1％TFA)和流动相B(乙腈)时，聚糖标准品文库对所有峰显示出良好的分辨率和信号强度。当梯度集中时，分离得到改善，并且没有观察到肩峰。在这些聚糖峰上可能没有肩峰，因为相互作用的模式是不同的，并且与HILIC分离过程中相比，糖的游离还原端不与固定相产生有意义的相互作用。

然后优化流动相和分离条件。具体地，评价流动相中的离子对试剂。最初，将三氟乙酸(TFA)和三乙胺(TEA)作为流动相中的离子对试剂进行评估。使用添加了0.1％TFA或0.1％TEA的流动相A进行相同梯度下的分离。与0.1％TEA相比，当向流动相中加入0.1％TFA时观察到更高的分辨率和更好的峰形。另外，与使用TEA的运行相比，在使用TFA的运行的色谱图中，观察到另外的聚糖峰(判断为在流动相或测定空白注射中未观察到峰)。与仅添加到流动相A中相比，将0.1％TFA添加到两种流动相中没有显著改善分离，因此对于流动相A，流动相的组成保持为在水中的0.1％TFA，对于流动相B为100％乙腈。在60℃和70℃下评价柱温，并且确定70℃在这些条件下提供更好的分离。最后，通过比较95％至75％A或95％至87％，然后至75％A来优化梯度。对于所评价的第二梯度而言，次峰之间的分辨率更好，因此将其选择为最佳梯度。

用于MS兼容性的分离再优化

因为聚糖是未标记的，所以开发了对质谱法友好的方法。随后优化五个参数：流动相组成(MPA和MPB)、柱温、分离时间以及样品制备和注射体积。众所周知，TFA抑制质谱信号，因此期望评价甲酸作为代替TFA的离子对试剂。这为我们提供了机会去重新开发测定以进一步提高分离性能和通量。流动相A(0.1％TFA或0.1％FA)的初步比较显示出相当的结果，这促使我们进一步提高分离效率。接下来，评价向流动相B(乙腈)中添加0.1％FA。观察到更稳定的基线，这通过较小的基线漂移来判断，并且在两种流动相中使用甲酸的峰分离更好。基于这些结果，得出结论，应将0.1％甲酸加入到流动相A(水)和流动相B(乙腈)中。下一个优化参数是柱温，并且在50℃、60℃、70℃和80℃下进行分离。结果表明，在70℃和80℃下，分离比在50℃或60℃下差得多。在升高的温度下，许多峰无法分辨并且倾向于彼此重叠。通过检查基线附近的峰，确定60℃在整个色谱图中提供最佳的峰分辨率并且被选择为优化的柱温。评价的下一个参数是从87％至78％流动相A的梯度的运行时间，选择10、20和30分钟用于评价。结果强烈表明，在10分钟时，分离远优于较长的梯度。在10分钟梯度时间时，比更长的运行时间分离更多的峰(图1)。

优化的最终参数是去糖基化条件。制造商建议在50℃下用1μL快速PNGase F使100μg蛋白质去糖基化5分钟。早期评价表明，这不足以使用CAD获得信号。在一些初步优化后，使用20μL 1:10稀释的快速PNGase F消化1mg蛋白质60分钟。为了评价去糖基化的程度，将反应设置为60分钟，以及非快速PNGase F的对照设置为24小时。然后使用CE-SDS(减去未去糖基化样品对照)和优化的聚糖方法分析这些反应。CE-SDS数据表明，60分钟后，超过98％的蛋白质被去糖基化，如通过各自电泳图谱中非还原主峰的消失和还原重链峰的消失以及非糖基化主峰/重链的形成所判断。使用聚糖方法的分离也支持这些发现，信号强度在60分钟后达到稳定。为了确保最大去糖基化，选择60分钟，因为CE-SDS和色谱结果显示60分钟后完成。

实施例2

根据实施例1从mAb样品释放并分析寡糖，对流动相条件改变如下：流动相A：在水中的0.1％三乙胺(TEA)；流动相B：在乙腈中的0.1％三乙胺(TEA)(图2)。如实施例1所示重复其他实验。分离分析所产生的样品聚糖色谱图如图2所示。

***

在本申请通篇中，依据著者姓名和日期或依据专利号或专利公开号，在括号中提及各种出版物。这些出版物的公开内容通过引用以其整体特此并入本申请中，以更全面地描述截至本文所述且要求保护的本公开文本的日期，所述出版物中如技术人员已知的最新技术水平。然而，本文对参考文献的引用不应被解释为承认这个参考文献是本公开文本的现有技术。

序列表

<110> 百时美施贵宝公司

<120> 无标记N-聚糖定量方法

<130> 3338.190PC01

<150> US 62/938,803

<151> 2019-11-21

<160> 5

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CTLA4胞外结构域序列

<400> 1

Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly Ile

1 5 10 15

Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu Val

20 25 30

Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val Cys

35 40 45

Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser

50 55 60

Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile Gln

65 70 75 80

Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu

85 90 95

Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln Ile

100 105 110

Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Asp

115 120

<210> 2

<211> 383

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 2

Met Gly Val Leu Leu Thr Gln Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala

1 5 10 15

Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Ala Met His Val Ala Gln Pro

20 25 30

Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu

35 40 45

Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg

50 55 60

Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met

65 70 75 80

Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser

85 90 95

Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp

100 105 110

Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr

115 120 125

Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu

130 135 140

Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gln Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His

145 150 155 160

Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val

165 170 175

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

180 185 190

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

195 200 205

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

210 215 220

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

225 230 235 240

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

245 250 255

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

260 265 270

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

275 280 285

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

290 295 300

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

305 310 315 320

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

325 330 335

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

340 345 350

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

355 360 365

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

370 375 380

<210> 3

<211> 357

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 阿巴西普

<400> 3

Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly Ile

1 5 10 15

Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu Val

20 25 30

Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val Cys

35 40 45

Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser

50 55 60

Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile Gln

65 70 75 80

Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu

85 90 95

Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln Ile

100 105 110

Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gln Glu Pro Lys

115 120 125

Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu

130 135 140

Leu Gly Gly Ser Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

145 150 155 160

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

165 170 175

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

180 185 190

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

195 200 205

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

210 215 220

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala

225 230 235 240

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

245 250 255

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln

260 265 270

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

275 280 285

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

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Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

305 310 315 320

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

325 330 335

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

340 345 350

Leu Ser Pro Gly Lys

355

<210> 4

<211> 384

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 4

Met Gly Val Leu Leu Thr Gln Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala

1 5 10 15

Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Ala Met His Val Ala Gln Pro

20 25 30

Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu

35 40 45

Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Tyr Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg

50 55 60

Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met

65 70 75 80

Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser

85 90 95

Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp

100 105 110

Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr

115 120 125

Tyr Glu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu

130 135 140

Pro Cys Cys Pro Asp Ser Asp Gln Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr

145 150 155 160

His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser

165 170 175

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

180 185 190

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

195 200 205

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

210 215 220

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

225 230 235 240

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

245 250 255

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

260 265 270

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

275 280 285

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

290 295 300

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

305 310 315 320

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

325 330 335

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

340 345 350

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

355 360 365

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

370 375 380

<210> 5

<211> 357

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 贝拉西普

<400> 5

Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly Ile

1 5 10 15

Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Tyr Thr Glu Val

20 25 30

Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val Cys

35 40 45

Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser

50 55 60

Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile Gln

65 70 75 80

Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu

85 90 95

Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Glu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln Ile

100 105 110

Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gln Glu Pro Lys

115 120 125

Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu

130 135 140

Leu Gly Gly Ser Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

145 150 155 160

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

165 170 175

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

180 185 190

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

195 200 205

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

210 215 220

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225 230 235 240

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

245 250 255

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln

260 265 270

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

275 280 285

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

290 295 300

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

305 310 315 320

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

325 330 335

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

340 345 350

Leu Ser Pro Gly Lys

355

Claims

1.一种定量重组蛋白的糖基化谱的方法，其包括在没有任何标记的情况下分析一种或多种N-连接聚糖，其中所述N-连接聚糖在所述分析之前通过酶从所述重组蛋白释放。

2.一种定量重组蛋白的糖基化谱的方法，其包括在没有任何荧光团的情况下分析所述一种或多种N-连接聚糖，其中所述N-连接聚糖在所述分析之前通过酶从所述重组蛋白释放。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述重组蛋白纯度为至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述分析包括在包括柱的色谱法期间分离一种或多种N-连接聚糖。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述柱是混合模式柱。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其中所述分离使用一种或多种流动相进行。

7.根据权利要求4至6中任一项所述的方法，其中所述柱是混合模式多孔石墨碳(PGC)柱。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述酶包括肽N-糖苷酶F(PNGaseF)。

9.根据权利要求8所述的方法，其中将所述酶与所述重组蛋白一起孵育，其中所述一种或多种N-连接聚糖在所述分离之前从所述重组蛋白释放。

10.根据权利要求9所述的方法，其中在缓冲液中稀释所述酶。

11.根据权利要求4至10中任一项所述的方法，其中分离的所述一种或多种N-连接聚糖通过质谱仪、ELSD、NQAD或折射率检测器来测量。

12.根据权利要求11所述的方法，其中分离的所述一种或多种N-连接聚糖通过电雾式检测器(CAD)来测量。

13.根据权利要求4至12中任一项所述的方法，其中所述色谱法包括第一流动相和第二流动相，其中所述第一流动相和所述第二流动相是不同的。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述第一流动相包含水。

15.根据权利要求13或14所述的方法，其中所述第二流动相包含乙腈。

16.根据权利要求13至15中任一项所述的方法，其中所述第一流动相包含甲酸(FA)、三氟乙酸(TFA)、三乙胺(TEA)或其任何组合。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述第一流动相包含0.1％FA。

18.根据权利要求13至17中任一项所述的方法，其中所述第二流动相包含甲酸(FA)、三氟乙酸(TFA)、三乙胺(TEA)或其任何组合。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述第二流动相包含0.1％FA。

20.根据权利要求4至19中任一项所述的方法，其中所述分离在低于70℃的温度下进行。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述温度为约50℃至约70℃、约50℃至约60℃、约60℃至约70℃、约55℃至约65℃、约55℃至约60℃、约60℃至约65℃、约65℃至约70℃、约50℃至约55℃。

22.根据权利要求20所述的方法，其中所述温度为约50℃、约51℃、约52℃、约53℃、约54℃、约55℃、约56℃、约57℃、约58℃、约59℃、约60℃、约61℃、约62℃、约63℃、约64℃、约65℃、约66℃、约67℃、约68℃或约69℃。

23.根据权利要求4至22中任一项所述的方法，其中所述分离是在梯度上进行。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述梯度为约95％至约5％。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述梯度为约95％至约50％、约95％至约55％、约95％至约60％、约95％至约65％、约95％至约70％、约95％至约75％、约95％至约80％、约95％至约85％、约90％至约50％、约90％至约55％、约90％至约60％、约90％至约65％、约90％至约70％、约90％至约75％、约87％至约50％、约87％至约55％、约87％至约60％、约87％至约65％、约87％至约70％、约87％至约75％、约85％至约50％、约85％至约55％、约85％至约60％、约85％至约65％、约85％至约70％、或约85％至约75％。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述梯度为约87％至约75％。

27.根据权利要求1至26中任一项所述的方法，其中所述一种或多种N-聚糖是半乳糖(Gal)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、半乳糖胺(GalN)、葡萄糖(Glc)、N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)、葡萄糖胺(GlcN)、甘露糖(Man)、N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)、甘露糖胺(ManN)、木糖(Xyl)、N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)、N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)、2-酮-3-脱氧壬酸(Kdn)、岩藻糖(Fuc)、葡萄糖醛酸(GlcA)、艾杜糖醛酸(IdoA)、半乳糖醛酸(GalA)、甘露糖醛酸(ManA)或其任何组合。

28.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中所述一种或多种N-聚糖包含一种或多种双触角聚糖。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述双触角聚糖选自G0F、G0、G1F、G1、G2F、G2、S1G2F、S1G2、S2G2F、S2G2及其任何组合。

30.根据权利要求1至29中任一项所述的方法，其中所述糖基化谱包含一种或多种去唾液酸化聚糖、单唾液酸化聚糖、二唾液酸化聚糖和/或三唾液酸化聚糖和四唾液酸化聚糖。

31.根据权利要求1至30中任一项所述的方法，其中所述重组蛋白是抗体。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述抗体是选自IgM、IgA、IgE、IgD和IgG的同种型。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述抗体是同种型IgG。

34.根据权利要求33所述的方法，其中所述IgG抗体选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。

35.根据权利要求31至34中任一项所述的方法，其中所述抗体是抗GITR抗体、抗CXCR4抗体、抗CD73抗体、抗TIGIT抗体、抗OX40抗体、抗LAG3抗体、抗CSF1R抗体或抗IL8抗体。

36.根据权利要求31至35中任一项所述的方法，其中所述抗体具有单个N-连接糖基化位点。

37.根据权利要求36所述的方法，其中所述单个N-连接糖基化位点是天冬酰胺297(N297)。

38.根据权利要求1至37中任一项所述的方法，其中所述重组蛋白包含酶、激素、细胞因子、细胞表面受体、蛋白酶、细胞因子受体或其任何组合。

39.根据权利要求1至38中任一项所述的方法，其中所述重组蛋白是融合蛋白。

40.根据权利要求39所述的方法，其中所述融合蛋白与异源部分融合。

41.根据权利要求40所述的方法，其中所述异源部分是半衰期延长部分。

42.根据权利要求41所述的方法，其中所述半衰期延长部分包含白蛋白、白蛋白结合多肽、脂肪酸、PAS、人绒毛膜促性腺激素的C末端肽(CTP)的β亚基、聚乙二醇(PEG)、羟乙基淀粉(HES)、XTEN、白蛋白结合小分子、Fc或其组合。

43.根据权利要求42所述的方法，其中所述半衰期延长部分是Fc。

44.根据权利要求1至43中任一项所述的方法，其是批量释放测定。