CN115210564A

CN115210564A - 用于天然液相色谱-质谱的平台

Info

Publication number: CN115210564A
Application number: CN202180011767.2A
Authority: CN
Inventors: 王顺海; 严恬悦
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2020-01-30
Filing date: 2021-01-29
Publication date: 2022-10-18
Also published as: EP4097464A1; KR20220133942A; IL294864A; US20210239661A1; BR112022015097A2; JP2023512521A; WO2021155215A1; AU2021214764A1; MX2022009356A; US11598756B2; US20230266286A1; CA3166301A1

Abstract

公开了天然液相色谱‑质谱系统和使用方法。天然液相色谱‑质谱系统可以包含：能够分离样品的液相色谱系统；以及电喷雾电离质谱(ESI‑MS)系统，所述ESI‑MS系统与所述液相色谱系统流体连通，其中所述ESI‑MS系统包括多喷嘴电喷雾电离发射器和用于对去溶剂化气体进行改性的系统以及质谱仪，其中所述质谱仪被配置成接收离子并且表征离子的质荷比。

Description

用于天然液相色谱-质谱的平台

技术领域

本发明涉及表征蛋白质的系统和方法，并且具体地，涉及用于蛋白质表征的天然液相色谱-质谱(LC-MC)平台，如蛋白质生物制药。

背景技术

与色谱和电泳分离技术相结合的电喷雾电离(ESI)-质谱法(MS)是蛋白质组学中的一项关键技术。它已成为在分析实验室中深入表征蛋白质生物制药以支持其开发和监管文件的重要工具。蛋白质生物制药必须满足非常高的纯度标准，因此在药物开发和生产的不同阶段监测和表征蛋白质非常重要。

基于液相色谱-质谱法(LC-MS)的蛋白质生物制药分析可以从改进的数据质量中受益匪浅，这可以随后以更高的置信度和更少的模糊性产生改进的药物表征。为了提供不同蛋白质属性的表征，可以进行各种基于LC-MS的测定，其中肽图分析和完整质量分析是最常规和广泛应用的。为了提高分析的置信度并减少与数据解释相关的模糊性，需要不断努力提高LC-MS分析的数据质量，包含使用优化的实验程序、微调的仪器参数以及更先进的质谱仪。

发明内容

一方面，本发明提供了一种天然液相色谱-质谱系统，其包括：液相色谱系统，所述液相色谱系统能够分离样品；以及电喷雾电离质谱(ESI-MS)系统，所述ESI-MS系统与所述液相色谱系统流体连通，其中所述ESI-MS系统包括多喷嘴电喷雾电离发射器、用于对去溶剂化气体进行改性的系统以及质谱仪，其中所述质谱仪被配置成接收离子并且表征离子的质荷比。

在一些实施例中，所述用于对去溶剂化气体进行改性的系统包括：具有盖的容器，其中所述盖具有入口管线端口和出口管线端口；用于向所述入口管线端口提供鞘气的鞘气入口管线；以及能够将经改性的去溶剂化气体出口管线端口连接到所述多喷嘴电喷雾电离发射器的经改性的去溶剂化气体出口管线。

在一些实施例中，所述容器包括有机溶剂和另外的化学组分。

在一些实施例中，另外的化学组分是酸。

在一些实施例中，酸是三氟乙酸。

在一些实施例中，另外的化学组分是碱。

在一些实施例中，碱是三乙胺。

在一些实施例中，有机溶剂是乙腈。

在一些实施例中，鞘气是氮气。

在一些实施例中，所述鞘气入口管线部分地插入到所述入口管线端口中。

在一些实施例中，所述经修改的去溶剂化气体出口管线部分地插入到所述出口管线端口中。

在一些实施例中，所述鞘气从所述鞘气入口管线流动通过所述含有有机溶剂的容器进入所述去溶剂化气体出口管线中。

在一些实施例中，所述多喷嘴电喷雾电离发射器包含八个喷嘴。

在一些实施例中，所述液相色谱系统包括尺寸排阻色谱(SEC)柱。

在一些实施例中，所述液相色谱系统包括离子交换色谱(IEX)柱。

在一些实施例中，所述液相色谱-质谱系统进一步包括用于调节从液相色谱仪到所述质谱仪的流速的分析流量分离器。

在一些实施例中，所述分析分流器能够提供溶剂流速为约1到5微升/分钟的电喷雾。

在一些实施例中，质谱仪包括轨道阱质量分析仪。

在一些实施例中，公开了一种表征样品中的蛋白质的方法，所述方法包括：将所述样品供应到能够进行样品分离和碎裂的液相色谱系统；以及通过使用电喷雾电离质谱(ESI-MS)系统分析碎裂样品以鉴定所述蛋白质的组分，从而表征所述蛋白质，所述ESI-MS系统与所述液相色谱系统流体连通，其中所述ESI-MS系统包括多喷嘴电喷雾电离发射器、用于对去溶剂化气体进行改性的系统以及质谱仪，其中所述质谱仪被配置成接收离子并且表征离子的质荷比。

在一些实施例中，所述蛋白质是抗体、融合蛋白、重组蛋白或其组合。

在一些实施例中，抗体是单克隆抗体。

在一些实施例中，同种型IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或混合同种型的所述单克隆抗体。

在一些实施例中，所述方法不需要在将所述样品供应到所述液相色谱系统之前对所述样品中的所述蛋白质进行去糖基化。

在一些实施例中，所述方法用于表征高分子量和低分子量杂质。

在所述方法的一些实施例中，所述用于对去溶剂化气体进行改性的系统包括：具有盖的容器，其中所述盖具有入口管线端口和出口管线端口；用于向所述入口管线端口提供鞘气的鞘气入口管线；以及能够将经改性的去溶剂化气体出口管线端口连接到所述多喷嘴电喷雾电离发射器的经改性的去溶剂化气体出口管线。

在所述方法的一些实施例中，所述容器包括有机溶剂和另外的化学组分。

在所述方法的一些实施例中，另外的化学组分是酸。

在所述方法的一些实施例中，酸是三氟乙酸。

在所述方法的一些实施例中，另外的化学组分是碱。

在所述方法的一些实施例中，碱是三乙胺。

在所述方法的一些实施例中，有机溶剂是乙腈。

在所述方法的一些实施例中，鞘气是氮气。

在所述方法的一些实施例中，所述鞘气入口管线部分地插入到所述入口管线端口中。

在所述方法的一些实施例中，所述经改性的去溶剂化气体出口管线部分地插入到所述出口管线端口中。

在所述方法的一些实施例中，所述鞘气从所述鞘气入口管线流动通过所述含有有机溶剂的容器进入所述去溶剂化气体出口管线中。

在所述方法的一些实施例中，所述多喷嘴电喷雾电离发射器包含八个喷嘴。

在所述方法的一些实施例中，所述液相色谱系统包括尺寸排阻色谱(SEC)柱。

在所述方法的一些实施例中，所述液相色谱系统包括离子交换色谱(IEX)柱。

在所述方法的一些实施例中，所述方法进一步包括使用用于调节从液相色谱仪到所述质谱仪的流速的分析流量分离器。

在所述方法的一些实施例中，所述分析流量分离器能够提供溶剂流速为约1到5微升/分钟的电喷雾。

在所述方法的一些实施例中，质谱仪包括轨道阱质量分析仪。

在各个实施例中，上文或本文所讨论的实施例的特征或组分中的任何特征或组分可以组合，并且此类组合涵盖在本公开的范围内。上文或本文所讨论的任何特定值可以与上文或本文所讨论的另一个相关值组合以列举具有表示范围的上端和下端的值的范围，并且该范围和落入该范围内的所有值都涵盖在本公开的范围内。上文或本文所讨论的值中的每一个都可以1％、5％、10％或20％的变化表示。例如，10mM的浓度可表示为10mM±0.1mM(1％变化)、10mM±0.5mM(5％变化)、10mM±1mM(10％变化)或10mM±2mM(20％变化)。通过阅读随后的具体实施方式，其它实施例将变得显而易见。

附图说明

图1示出了本文所公开的天然LC-MS平台的示例性实施例的示意图，其提供灵敏、稳健和通用的天然LC-MS平台。

图2示出了在本文所公开的天然LC-MS平台的实施例中使用的微制造的单片多喷嘴(M3)发射器。

图3示出了通过SEC-MS分析NISTmAb(10μg)的平台灵敏度。样品量消耗低，注入10μg NISTmAb样品会导致约E9 TIC强度。由于IPA改性的去溶剂化气体辅助的高效去溶剂化，数据质量出色。无需去糖基化即可灵敏检测低丰度物种(例如，HMW和LMW物种)。准确的质量测量能够明确鉴定这些物种。

图4A和4B示出了平台稳健性，如101次NISTmAb连续天然SEC-MS运行所表明的。

图5A和5B示出了在天然SCX-MS分析期间通过对去溶剂化气体进行改性实现的电荷减少效果。图5A展示了与电荷减少相关的轻微TIC强度下降。图5B示出了抗体B所表明的电荷减少效果。

图6示出了异质和/或不稳定生物分子的电荷减少辅助分析。上图提供了在电荷减少的情况下半胱氨酸ADC模拟物的天然SEC-MS分析结果，并且下图提供了在没有电荷减少的情况下，半胱氨酸ADC模拟物的天然SEC-MS分析结果。如所展示的，由于空间分辨率的提高，电荷减少防止了电荷状态的重叠，从而能够分析具有高质量异质性的样品。进一步地，电荷减少有助于在电离过程期间保留不稳定的生物分子(非共价连接)，并且最小化不期望的解离事件。

图7示出了根据本文所公开的实施例的nLC-MS平台。

图8A示出了在不同流速下mAb1的脱盐SEC-MS分析生成的UV和TIC迹线；

图8B示出了mAb2以0.8毫升/分钟进行90次脱盐SEC-MS运行的TIC迹线。每种注入量(0.1、1和10μg)重复分析30次。插图显示了含有4次脱盐SEC-MS运行的放大区域。

图9A和9B示出了mAb1的脱盐SEC-MS分析。图9A是使用150、300、450和600mM乙酸铵作为流动相(每个一式三份分析)获得的MS信号强度(左y轴)和质量准确度(右y轴)的比较。图9B是使用600mM乙酸铵获得的mAb1原始质谱的实例，示出了成功检测到不同糖型，这是由于Fc N-糖基化的宏观和微观异质性。

图10A示出了在不同电荷减少条件下获得的mAb5的代表性天然质谱。

图10B和10C示出了通过对四mAb混合物样品进行nSEC-MS和nIEX-MS分析来评估不同有机改性剂的在线电荷减少能力。一式三份测量每个mAb分子的MS强度(左y轴)和平均电荷状态(右y轴)，并且在每种条件下作图。

图11示出了去卷积质谱。

图12A和12B示出了使用0.1、0.2、0.4、0.6和0.8毫升/分钟的流动相流速对mAb1进行脱盐SEC-MS分析的天然质谱。

图13A和13B示出了在天然LC-MS平台上使用补充分流策略对不同mAb进行的九个连续天然HIC-MS分析的TIC。

图14A、14B和14C示出了mAb混合物的ACN/NH3辅助nIEX-MS分析，示出了(图14A)nIEX-TIC、(图14B)每个mAb的主峰的原始质谱和(图14C)原始质谱的z＝7的放大视图。

图15示出了在nLC-MS平台上使用未经改性的去溶剂化气体(上图)或IPA改性的去溶剂化气体(下图)进行长时间分析(>24小时)后获得的mAb2的天然质谱。

图16-1和16-2示出了NISTmAb的天然SCX-MS分析，其中注入量为10μg。

图17示出了通过使用nSEC-MS(顶部，24分钟占空比)或nIEX-MS(底部，30分钟占空比)连续分析，每次>24小时来评估天然LC-MS平台的稳健性。

图18示出了从10μg NISTmAb参考标准样品的nSEC-MS和nIEX-MS分析中检测到的大小和电荷变体的汇总。

具体实施方式

在描述本发明之前，应当理解，本发明不限于所描述的特定方法和实验条件，因为此类方法和条件可以变化。还应了解，在此所使用的术语仅用于描述具体实施例的目的，并且不打算为限制性的，因为本发明的范围仅受所附权利要求限制。任何实施例或实施例的特征可以彼此组合，并且此类组合明确地涵盖在本发明的范围内。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。如本文所使用的，当用于提及具体所列举的数值时，术语“约”意指数值可以与所引用的值相差不超过1％。例如，如本文所使用的，表述“约100”包含99和101以及其之间的所有值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

如本文所使用的，术语“包含(include、includes和including)”意指非限制性的，并且分别被理解为意指“包括(comprise、comprises和comprising)”。

尽管在本发明的实践或测试中可以使用类似于或等同于本文所描述的方法和材料的任何方法和材料，但现在描述优选的方法和材料。本说明书中提及的所有专利、申请和非专利出版物均通过引用整体并入本文。

本文使用的缩写

ACN：乙腈

Asn：天冬酰胺

CQA：关键质量属性

CV：变异系数

EIC：提取离子色谱

ESI-MS：电喷雾电离质谱

FA：甲酸

FDA：食品和药物管理局

FG：完全糖基化

FLR：荧光检测

HBA：4-羟基苯甲酸

HC：重链

HIC：疏水相互作用色谱

HILIC：亲水相互作用液相色谱

HMW：高分子量

IEX：离子交换色谱

IgG：免疫球蛋白G

IPA：异丙醇

LC：轻链

LC-MS：液相色谱-质谱

LMW：低分子量

mAb：单克隆抗体

MS：质谱

MW：分子量

NCE：归一化碰撞能量

NG：非糖基化

nLC：天然液相色谱

PA：丙酸

PG：部分糖基化

PK：药代动力学

PQA：产品质量属性

PTM：翻译后修饰

RP-LC：反相液相色谱

SPE：固相提取

SEC：尺寸排阻色谱

TCEP-HCl：三(2-羧乙基)膦盐酸盐

TFA：三氟乙酸

TMT：串联质量标签

UV：紫外线

定义

如本文所使用的，术语“蛋白质”包含具有共价连接的酰胺键的任何氨基酸聚合物。蛋白质包括一个或多个氨基酸聚合物链，在本领域中通常称为“多肽”。“多肽”是指由氨基酸残基、相关的天然存在的结构变体以及通过肽键连接的其合成的非天然存在的类似物、相关的天然存在的结构变体及其合成的非天然存在的类似物构成的聚合物。“合成肽或多肽”是指非天然存在的肽或多肽。合成肽或多肽可以例如使用自动化多肽合成仪合成。各种固相肽合成方法是本领域的技术人员已知的。蛋白质可以含有一个或多个多肽以形成单一功能性生物分子。蛋白质可以包含任何生物治疗性蛋白质、用于研究或疗法的重组蛋白、trap蛋白和其它嵌合受体Fc融合蛋白、嵌合蛋白、抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、人抗体和双特异性抗体。另一个示例性方面，蛋白质可以包含抗体片段、纳米抗体、重组抗体嵌合体、细胞因子、趋化因子、肽激素等。蛋白质可以使用基于重组细胞的生产系统来生产，如昆虫杆状病毒系统、酵母系统(例如，毕赤酵母(Pichia sp.))、哺乳动物系统(例如，CHO细胞和CHO衍生物，如CHO-K1细胞)。对于最近讨论生物治疗性蛋白质及其生产的综述，参见Ghaderi等人,“用于生物治疗性糖蛋白的生产平台非人唾液酸化的发生、影响和挑战(Production platforms for biotherapeutic glycoproteins.Occurrence,impact,andchallenges of non-human sialylation)”(《生物技术与基因工程评论(Biotechnol.Genet.Eng.Rev.)》(2012)147-75)。在一些实施例中，蛋白质包括修饰、加合物和其它共价连接的部分。这些修饰、加合物和部分包含例如抗生物素蛋白、链霉亲和素、生物素、聚糖(例如，N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、神经氨酸、N-乙酰葡糖胺、岩藻糖、甘露糖和其它单糖)、PEG、聚组氨酸、FLAGtag、麦芽糖结合蛋白(MBP)、几丁质结合蛋白(CBP)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)myc表位、荧光标记以及其它染料等。蛋白质可以根据组成和溶解度来分类，并且因此可以包含简单蛋白质，如球状蛋白质和纤维状蛋白质；缀合蛋白，如核蛋白、糖蛋白、粘蛋白、色蛋白、磷蛋白、金属蛋白和脂蛋白；以及源性蛋白质，如初级源性蛋白质和次级源性蛋白质。

如本文所使用的，“变体蛋白质”或“蛋白质变体”或“变体”可以包含通过至少一种氨基酸修饰而不同于靶蛋白质的蛋白质。蛋白质变体可以指代蛋白质本身、包括所述蛋白质的组合物或编码所述蛋白质的氨基酸序列。优选地，蛋白质变体与亲本蛋白相比具有至少一种氨基酸修饰，例如，与亲本相比，从约一种到约十种氨基酸修饰，并且优选地从约一种到约五种氨基酸修饰。本文的蛋白质变体序列将优选地与亲本蛋白序列具有至少约80％的同源性，并且最优选地至少约90％的同源性，更优选至少约95％的同源性。在一些示例性实施例中，蛋白质可以是抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、抗体片段、单克隆抗体或其组合。

如本文所使用的，术语“抗体”旨在指免疫球蛋白分子，其包含四个多肽链，通过二硫键互连的两个重(H)链和两个轻(L)链(即，“全抗体分子”)，以及其多聚体(例如，IgM)或其抗原结合片段。每个重链包含重链可变区(“HCVR”或“V_H”)和重链恒定区(包含结构域C_H1、C_H2和C_H3)。在各个实施例中，重链可以是IgG同种型。在一些情况下，重链选自IgG1，IgG2，IgG3或IgG4。在一些实施例中，重链是同种型IgG1或IgG4，任选地包含同种型IgG1/IgG2或IgG4/IgG2的嵌合铰链区。每个轻链包含轻链可变区(“LCVR”或“V_L”)和轻链恒定区(C_L)。V_H区和V_L区可以被进一步细分成被称作互补决定区(CDR)的高变区，其间散布着更保守的被称作构架区(FR)的区。每个V_H和V_L由按以下顺序从氨基末端到羧基末端布置的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。术语“抗体”包含提及任何同种型或亚类的糖基化和非糖基化免疫球蛋白。术语“抗体”包含通过重组方式制备、表达、产生或分离的抗体分子，如从经转染以表达抗体的宿主细胞中分离的抗体。关于抗体结构的综述，参见Lefranc等人,“免疫球蛋白和T细胞受体可变结构域和Ig超家族V样结构域的IMGT唯一编号(IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variabledomains and Ig superfamily V-like domains)”,27(1)《发育与比较免疫学(Dev.Comp.Immunol.)》55-77(2003)；和M.Potter,“免疫球蛋白多样性的结构相关性(Structural correlates of immunoglobulin diversity)”,2(1)《免疫学研究调查(Surv.Immunol.Res.)》27-42(1983)。

术语抗体还涵盖“双特异性抗体”，所述双特异性抗体包含可以与多于一个不同表位结合的异四聚体免疫球蛋白。包含单个重链和单个轻链和六个CDR的双特异性抗体的一半与一个抗原或表位结合，另一半抗体与不同的抗原或表位结合。在一些情况下，双特异性抗体可以结合相同的抗原，但是在不同的表位或非重叠的表位。在一些情况下，两半的双特异性抗体具有相同的轻链，同时保持双重特异性。双特异性抗体一般描述于美国专利申请公开第2010/0331527号(2010年12月30日)。

术语抗体的“抗原结合部分”(或“抗体片段”)是指保留特异性结合抗原的能力的抗体的一个或多个片段。术语抗体的“抗原结合部分”中涵盖的结合片段的实例包含：(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，包括在铰链区处由二硫桥连接的两个Fab片段的双价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等人,(1989)《自然(Nature)》241:544-546)；(vi)分离的CDR；以及(vii)由Fv片段的两个结构域VL和VH组成的scFv，所述两个结构域通过合成接头连接以形成单个蛋白质链，其中所述VL区和VH区域配对以形成单价分子。其它形式的单链抗体，如双抗体也涵盖在术语“抗体”下(参见例如，Holliger等人(1993)90《美国国家科学院院刊(PNAS U.S.A.)》6444-6448；以及Poljak等人(1994)2《结构(Structure)》1121-1123)。

此外，抗体及其抗原结合片段可以使用本领域公知的标准重组DNA技术获得(参见Sambrook等人，1989)。用于在转基因小鼠中产生人抗体的方法也是本领域已知的。例如，使用

技术(参见例如，US 6,596,541，再生元制药公司(RegeneronPharmaceuticals)，

)或用于产生单克隆抗体的任何其它已知方法，初步分离出具有人可变区和小鼠恒定区的针对所需抗原的高亲和力嵌合抗体。

技术涉及具有基因组的转基因小鼠的产生，所述基因组包括可操作地连接到内源性小鼠恒定区基因座的人重链可变区和人轻链可变区，使得小鼠响应于抗原性刺激而产生包括人可变区和小鼠恒定区的抗体。对抗体的重链可变区和轻链可变区进行编码的DNA被分离，并且可操作连接到对人重链恒定区和人轻链恒定区进行编码的DNA。然后DNA在能够表达完全人抗体的细胞中表达

术语“人抗体”旨在包含具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人mAb可以包含并非由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)，例如在CDR中，特别是在CDR3中。然而，如本文所用，术语“人抗体”不旨在包含其中衍生自另一种哺乳动物物种(例如小鼠)的种系的CDR序列已经移植到人FR序列上的mAb。所述术语包含在非人哺乳动物或非人哺乳动物细胞中重组产生的抗体。所述术语不旨在包含从人类受试者中分离或产生的抗体。

如本文所用，术语“受试者”是指动物，优选哺乳动物，更优选人，例如需要改善，预防和/或治疗疾病或病症。

如本文所使用的，术语“杂质”可以包含存在于生物制药产品中的任何不期望的蛋白质。杂质可以包含与工艺和产品相关的杂质。杂质可以进一步具有已知结构、部分表征或未鉴定。与工艺相关的杂质可以来源于制造过程，并且可以包含三大类：细胞底物源性、细胞培养物源性和下游源性。细胞底物源性杂质包含但不限于源自宿主生物体的蛋白质和核酸(宿主细胞基因组、载体或总DNA)。细胞培养物源性杂质包含但不限于诱导剂、抗生素、血清和其它介质组分。下游源性杂质包含但不限于酶、化学和生化加工试剂(例如，溴化氰、胍、氧化剂和还原剂)、无机盐(例如，重金属、砷、非金属离子)、溶剂、载体、配体(例如，单克隆抗体)和其它可浸出物。与产品相关的杂质(例如，前体、某些降解产物)可以是在制造和/或储存期间产生的分子变体，所述分子变体在活性、功效和安全性方面不具有与期望产品相当的特性。此类变体可能需要在分离和表征方面付出相当大的努力以便鉴定修饰的类型。与产品相关的杂质可以包含截短形式、修饰形式和聚集体。截短形式是由水解酶或催化肽键断裂的化学物质形成的。修饰形式包含但不限于脱酰胺化、异构化、错配的S-S连接、氧化或改变的缀合形式(例如，糖基化、磷酸化)。修饰形式还可以包含任何翻译后修饰形式。聚集体包含期望产物的二聚体和更高倍数(Q6B规范：生物技术/生物产物的测试程序和验收标准，ICH 1999年8月，美国卫生与人类服务部(U.S.Dept.of Health and HumansServices))。

术语“低分子量(LMW)蛋白质药物杂质”包含但不限于前体、降解产物、截短物种、包含Fab片段、Fc或重链片段、配体或受体片段的蛋白水解片段、H2L(2条重链和1条轻链)、H2(2条重链)、HL(1条重链和1条轻链)、HC(1条重链)和LC(1条轻链)物种。LMW蛋白质药物杂质可以是作为蛋白质产物不完整形式的任何变体，如多聚体蛋白质的一种或多种组分。蛋白质药物杂质、药物杂质或产物杂质是可以在整个说明书中互换使用的术语。LMW药物或产物杂质通常被认为是分子变体，其如活性、功效和安全性等特性可能与期望药物产物不同。

在细胞培养系统中产生蛋白质药物产物期间，蛋白质产物的降解是一个问题。例如，蛋白质产物的蛋白水解可能由于细胞培养基中蛋白酶的释放而发生。培养基添加剂，如添加可溶性铁源以抑制金属蛋白酶或丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶抑制剂，已在细胞培养中实施以防止降解(Clincke,M.-F.等人,《BMC会议录(BMC Proc.)》2011,5,P115)。由于细胞培养中的羧基肽酶，C末端片段可以在产生期间被切割(Dick,LW等人,《生物技术与生物工程(Biotechnol Bioeng)》2008；100:1132-43)。

术语“高分子量(HMW)蛋白质药物杂质”包含但不限于mAb三聚体和mAb二聚体。HMW物种可以分为两组：1)具有额外轻链的单体(H2L3和H2L4物种)和2)单体加Fab片段复合物。另外，在通过IdeS酶消化处理后，形成了不同的二聚化片段(Fab2-Fab2、Fc-Fc和Fab2-Fc)。

“翻译后修饰”(PTM)是指蛋白质生物合成后蛋白质的共价修饰。翻译后修饰可以在氨基酸侧链上或在蛋白质的C-或N-末端发生。PTM通常由特定的酶或酶途径引入。许多发生在蛋白质骨架内的特定特征蛋白质序列(例如，特征序列)的位点处。已经记录了数百个PTM，并且这些修饰总是影响蛋白质结构或功能的某个方面(Walsh,G.“蛋白质(Proteins)”(2014)第二版，由威利父子公司出版(Wiley and Sons,Ltd.),ISBN:9780470669853)。各种翻译后修饰包含但不限于切割、N末端延伸、蛋白质降解、N末端酰化、生物素化(赖氨酸残基与生物素的酰化)、C末端酰胺化、糖基化、碘化、辅基的共价连接、乙酰化(添加乙酰基，通常在蛋白质的N末端处)、烷基化(添加烷基(例如，甲基、乙基、丙基)，通常在赖氨酸或精氨酸残基处)、甲基化、腺苷酸化、ADP-核糖基化、多肽链内或之间的共价交联、磺化、异戊二烯化、维生素C依赖性修饰(脯氨酸和赖氨酸羟基化和羧基末端酰胺化)、维生素K依赖性修饰，其中维生素K是谷氨酸残基羧化的辅助因子，导致形成γ-羧基谷氨酸(谷氨酸残基)、谷氨酰化(谷氨酸残基的共价键)、甘氨酸化(共价键甘氨酸残基)、糖基化(将糖基添加到天冬酰胺、羟赖氨酸、丝氨酸或苏氨酸，生成糖蛋白)、异戊二烯化(添加类异戊二烯基团，如法尼醇和香叶基香叶醇)、脂酰化(脂酸酯功能的连接)、磷酸巯基乙胺化(从辅酶A中添加4'-磷酸泛酰巯基乙胺基部分，如在脂肪酸、聚酮化合物、非核糖体肽和亮氨酸生物合成中)、磷酸化(添加磷酸基团，通常是丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸或组氨酸)和硫酸化(添加硫酸基团，通常添加到酪氨酸残基)。改变氨基酸化学性质的翻译后修饰包含但不限于瓜氨酸化(例如，通过脱氨基化将精氨酸转化为瓜氨酸)和脱酰胺化(例如，将谷氨酰胺转化为谷氨酸酸或天冬酰胺转化为天冬氨酸)。涉及结构变化的翻译后修饰包含但不限于二硫键的形成(两个半胱氨酸氨基酸的共价连接)和蛋白水解切割(蛋白质在肽键处的切割)。某些翻译后修饰涉及添加其它蛋白质或肽，如ISG化(与ISG15蛋白共价连接(干扰素刺激基因))、SUMO化(与SUMO蛋白共价连接(小泛素相关修饰剂))和泛素化(与蛋白质泛素共价连接)。关于UniProt编策的PTM的更详细的受控词汇表，参见www.uniprot.org/docs/ptmlist。

如本文所使用的，术语“糖肽/糖蛋白”是经修饰的肽/蛋白质，在它们合成期间或之后，具有共价键合的碳水化合物或聚糖。在某些实施例中，糖肽获自单克隆抗体，例如获自单克隆抗体的蛋白酶消化物。

如本文所使用的，术语“聚糖”是包括一个或多个糖单元的化合物，其通常包含葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)、岩藻糖(Fuc)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)和N-乙酰神经氨酸(NeuNAc)(Frank Kjeldsen等人《分析化学(Anal.Chem.)》2003,75,2355-2361)。糖蛋白(如单克隆抗体)中的聚糖部分是鉴定其功能或细胞位置的重要特征。例如，特定的单克隆抗体被特定的聚糖部分修饰。

如本文所使用的，术语“样品”是指分子混合物，其包括至少一种分析物分子，例如糖肽，如从单克隆抗体获得的糖肽，根据本发明的方法对其进行操纵，包含例如分离、分析、提取、浓缩或分析。

如本文所使用的，术语“分析(analysis或analyzing)”可互换使用，并且是指分隔、检测、分离、纯化、溶解、检测和/或表征所关注的分子(例如，肽)的各种方法中的任何一种方法。实例包含但不限于固相提取、固相微提取、电泳、质谱法(例如，ESI-MS、SPE HILIC或MALDI-MS)、液相色谱(例如，高效液相色谱，例如，反相、正相或尺寸排阻、离子对液相色谱)、液-液提取(例如，加速流体提取、超临界流体提取、微波辅助提取、膜提取、索氏提取)、沉淀、澄清、电化学检测、染色、元素分析、埃德蒙降解(Edmund degradation)、核磁共振、红外分析、流动注入分析、毛细管电色谱法、紫外检测及其组合。

如本文所使用的，术语“分析”是指各种分析方法中的任何一种，这些方法组合使用以提供样品中的蛋白质的含量、组成或特征比率，如肽。

如本文所使用的，“接触”包含将溶液或固相中的至少两种物质聚集在一起。

如本文所使用的“完整质量分析”包含自上而下的实验，其中蛋白质被表征为完整蛋白质。完整质量分析可以将样品制备减少到最低限度，并且保留有时可以在其它蛋白质组学策略中丢失的信息，如多个PTM的连接性。

如本文所使用的“肽图分析”包含实验，其中蛋白质经历消化，随后分离所得肽并对其进行分析，优选地使用LC-MS。在一些示例性实施例中，可以应用肽图分析来确认蛋白质生物制药的一级序列，其中蛋白质分子可以首先使用水解剂水解成小肽片段，然后考虑到cDNA预测序列和所用蛋白酶的特异性，通过LC-MS分析确定每个肽片段的氨基酸序列。肽图分析的数据也可以用于鉴定和定量翻译后修饰，确认二硫键连接，甚至检测以极低水平(<0.1％)存在的氨基酸取代事件(Zeck等人《公共科学图书馆期刊(PloS one)》2012,7,e40328)。在蛋白质生物制药的肽图分析期间，LC-MS通常可以结合紫外(UV)检测进行，以生成所谓的紫外指纹，所述紫外指纹单独可以用作质量控制(QC)和药物释放期间的鉴定测定。

如本文所使用的，术语“消化”是指蛋白质的一个或多个肽键的水解。存在若干种方法用于使用适当的水解剂进行样品中的蛋白质的消化，例如酶消化或非酶消化。如本文所使用的，术语“水解剂”是指可以进行蛋白质的消化的大量不同药剂中的任何一种或其组合。可以进行酶消化的水解剂的非限制性实例包含胰蛋白酶、内切蛋白酶Arg-C、内切蛋白酶Asp-N、内切蛋白酶Glu-C、外膜蛋白酶T(OmpT)、化脓链球菌的免疫球蛋白降解酶(IdeS)、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、链霉蛋白酶以及来自佐氏曲霉(Aspergillus Saitoi)的蛋白酶。可以进行非酶消化的水解剂的非限制性实例包含使用高温、微波、超声、高压、红外、溶剂(非限制性实例是乙醇和乙腈)、固定化酶消化(IMER)、磁性颗粒固定化酶和芯片上固定化酶。对于讨论蛋白质消化的可用技术的最近综述，参见Switazar等人,“蛋白质消化：可用技术和最新开发的概述(Protein Digestion:AnOverview of the Available Techniques and Recent Developments)”(《蛋白质组学研究杂志(J.Proteome Research)》2013,12,1067-1077)。水解剂中的一种或组合可以以序列特异的方式切割蛋白质或多肽中的肽键，从而产生可预测的较短肽的集合。

有若干种方法可用于消化蛋白质。用于消化样品中的蛋白质的广泛接受的方法之一涉及使用蛋白酶。许多蛋白酶都是可用的，并且所述蛋白酶中的每种蛋白酶在特异性、效率和最佳消化条件方面都具有其自己的特性。蛋白酶是指内肽酶和外肽酶两者，如基于蛋白酶在肽内的非末端或末端氨基酸处切割的能力而分类的。可替代地，蛋白酶也指六个不同的类别：天冬氨酸、谷氨酸和金属蛋白酶、半胱氨酸、丝氨酸和苏氨酸蛋白酶，如根据催化机制分类的。术语“蛋白酶”和“肽酶”可互换使用，是指水解肽键的酶。蛋白酶也可以分为特异性和非特异性蛋白酶。如本文所使用的，术语“特异性蛋白酶”是指具有在肽的特定氨基酸侧链处切割肽底物的能力的蛋白酶。如本文所使用的，术语“非特异性蛋白酶”是指在肽的特定氨基酸侧链处切割肽底物的能力降低的蛋白酶。可以基于作为切割位点的特定氨基酸的数量与蛋白质序列中切割的氨基酸总数的比率来确定切割偏好。

在表征之前可以任选地制备蛋白质。在一些示例性实施例中，蛋白质制备包含蛋白质消化步骤。在一些具体的示例性实施例中，蛋白质制备包含蛋白质消化的步骤，其中蛋白质消化可以使用胰蛋白酶进行。

在一些示例性实施例中，蛋白质制备可以包含在蛋白质消化步骤之前使蛋白质变性、还原蛋白质、缓冲蛋白质和/或使样品脱盐的步骤。这些步骤可以按所期望的任何合适方式来完成。

为了使用肽图分析或完整质量分析提供不同蛋白质属性的表征，可以进行多种基于LC-MS的分析。

如本文所使用的，术语“液相色谱”是指其中由液体携带的化学混合物可以由于化学实体在其固定液相或固相周围或在固定液相或固相上方流动时的差异分布而分离成组分的过程。液相色谱的非限制性实例包含反相液相色谱、离子交换色谱、尺寸排阻色谱、亲和色谱和疏水性色谱。

如本文所使用的，术语“质谱仪”是指能够检测特定分子物种并准确测量其质量的装置。所述术语可以意指包含任何分子检测器，多肽或肽可以洗脱到所述分子检测器中以进行检测和/或表征。质谱仪由三个主要部分组成：离子源、质量分析仪和检测器。离子源的作用是产生气相离子。分析物原子、分子或簇可以被转移到气相中，并且同时(如以电喷雾电离的方式)被电离。离子源的选择取决于应用。

如本文所使用的，术语“电喷雾电离”或“ESI”是指喷雾电离过程，其中溶液中的阳离子或阴离子在高带电液滴流的大气压下通过形成和去溶剂化转移到气相，所述高带电液滴流是由在含有溶液的电喷雾发射器针的尖端与对电极之间施加电位差而产生的。由溶液中的电解质离子产生气相离子有三个主要步骤。这些步骤是：(a)在ES注入尖端产生带电液滴；(b)带电液滴通过溶剂蒸发而收缩，并且液滴重复分解，得到能够产生气相离子的高电荷小液滴；以及(c)气相离子由非常小且高电荷液滴产生的机制。阶段(a)-(c)通常发生在设备的大气压区域。

如本文所使用的，术语“电喷雾电离源”是指可以与用于蛋白质质量分析的质谱仪兼容的电喷雾电离系统。

天然MS是基于电喷雾电离的特定方法，其中生物分析物从非变性溶剂中喷出。它被定义为通过电喷雾电离质谱(ESI-MS)过程，如大生物分子等生物分子和其复合物可以从凝聚液相中的三维功能性存在转移到气相的过程。

如本文所使用的，术语“纳米电喷雾”或“纳米喷雾”是指通常在不使用外部溶剂递送的情况下，在非常低的溶剂流速下，通常每分钟样品溶液数百纳升或更低，的电喷雾离子化。

如本文所使用的，“质量分析仪”是指可以根据物种的质量分离物种，即原子、分子或簇的装置。可以用于快速蛋白质测序的质量分析仪的非限制性实例是飞行时间(TOF)、磁/电扇区、四极质量过滤器(Q)、四极离子阱(QIT)、轨道阱、傅里叶变换离子回旋共振(Fourier transform ion cyclotron resonance，FTICR)以及加速器质谱(AMS)技术。

如本文所使用的，“质荷比”或“m/z”用于表示通过将统一原子质量单位表示的离子质量除以其电荷数(不考虑符号)形成的无量纲量。通常，电荷状态取决于：电离方法(如电喷雾电离，ESI倾向于促进多重电离，这在MALDI中并不常见)、肽段长度(因为更长的肽有更多的基团，其中可以连接另外的质子(碱性残基))、肽序列(因为一些氨基酸(例如，Arg或Lys)比其它氨基酸更容易电离)、仪器设置、溶剂pH和溶剂组成。

如本文所使用的，术语“串联质谱”是指可以通过使用质量选择和质量分离的多个阶段获得样品分子上的结构信息的技术。先决条件是样品分子可以被转移到气相中并被完整地电离，并且样品基质分子可以在第一质量选择步骤之后以一些可预测和可控制的方式被诱导分裂。多级MS/MS或MSn可以通过首先选择和分离亲体离子(MS2)、将其碎裂、分离初级碎片离子(MS3)、将其碎裂、分离次级碎片(MS4)等来进行，只要可以获得有意义的信息或者碎片离子信号是可检测到的。串联MS已通过各种分析仪组合成功地执行。对于特定应用，组合哪种分析仪可以由许多不同的因素确定，如灵敏度、选择性和速度，以及大小、成本和可用性。串联MS方法的两个主要类别是空间串联和时间串联，但也存在混合的情况，其中时间串联分析仪在空间上耦合或与空间串联分析仪耦合。

空间串联质谱仪包括离子源、前体离子激活装置和至少两个非捕获质量分析仪。可以设计特定的m/z分离函数，使得在仪器的一个区段中离子被选择、在中间区域中离解，并且然后将产物离子传输到另一个分析仪进行m/z分离和数据采集。

在时间串联中，离子源中产生的质谱仪离子可以在同一物理装置中被捕获、隔离、碎裂和m/z分离。

如本文所使用的，“靶向质谱”是在特定时间对特定质量(m/z)的离子使用多级串联质谱(MSn，其中n＝2或3)的质谱技术。m/z和时间的值在包含列表中定义，所述包含列表源自先前的分析。

如本文所使用的，术语“四极-轨道阱混合质谱仪”是指通过将四极质谱仪与轨道阱质量分析仪耦合而制成的混合系统。使用四极-轨道阱混合质谱仪的时间串联实验开始喷射所有离子，除了从四极质谱仪选定的窄m/z范围内的离子。选定的离子可以插入轨道阱并最常通过低能CID进行碎裂。阱的m/z接受范围内的碎片应保留在阱中，并且可以获得MS-MS谱。类似的混合系统可以用于快速蛋白质测序，如但不限于QIT-FTICR和Qq-FTICR。

如本文所使用的，术语“蛋白质从头测序”是指在不依赖从其它来源获得的信息的情况下，用于确定肽的氨基酸序列的程序。由于质谱的高灵敏度水平，此技术可以提供通常超出常规测序方法能力的重要信息。

如本文所使用的，术语“蛋白质序列覆盖率”是指被鉴定的肽覆盖的蛋白质序列的百分比。覆盖率百分比可以通过将所有发现的肽中的氨基酸数量除以整个蛋白质序列中的氨基酸总数来计算。

如本文所使用的，术语“数据库”是指生物信息学工具，所述生物信息学工具提供了针对数据库中的所有可能序列搜索未解读的MS-MS谱的可能性。此类工具的非限制性实例是Mascot(www.matrixscience.com)、Spectrum Mill(www.chem.agilent.com)、PLGS(www.waters.com)、PEAKS(www.bioinformaticssolutions.com)、Proteinpilot(download.appliedbiosystems.com//proteinpilot)、Phenyx(www.phenyx-ms.com)、Sorcerer(www.sagenresearch.com)、OMSSA(www.pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/omssa/)、X！Tandem(www.thegpm.org/TANDEM/)、蛋白质探勘者(www.prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm)、Byonic(www.proteinmetrics.com/products/byonic)或Sequest(fields.scripps.edu/sequest)。

一般说明

从上文将理解，需要改进的方法和系统来改进蛋白质表征。所公开的发明满足了所述需要。本文公开了具有改进性能的LC-MS平台。在各实施例中，天然LC-MS平台将发射器与多个喷嘴和去溶剂化气体的改性集成在一起，从而产生更稳健的平台。

本文所公开的实施例提供用于快速、高灵敏度地表征样品中的蛋白质的系统和方法。

在一些示例性实施例中，本公开提供了一种液相色谱质谱系统，其包括(i)液相色谱装置；(iii)电喷雾电离源；以及(iii)质谱装置。

在一些示例性实施例中，本公开提供了改性剂系统106，其包括(i)容器110；(ii)鞘气入口管线112；以及(iii)经改性的去溶剂化气体出口管线114，其馈入具有多个喷嘴108的电喷雾电离发射器。在一些实施例中，电喷雾电离发射器是可商购获得的发射器，如M3发射器(加利福尼亚州伯克利Newomics公司(Newomics,Berkeley,CA))。

在一些示例性实施例中，本公开提供了一种表征样品中的蛋白质的方法，所述方法包括(i)将样品供应到电喷雾电离源的入口；(ii)在电喷雾离子源的出口处生成样品中蛋白质组分的离子；以及(iii)使用质谱仪分析离子以鉴定蛋白质的组分，从而表征蛋白质。

参考图1，公开了提供稳健信号的示例性天然LC-MS平台。如图1所展示的，天然LC-MS平台100包含分析柱102、分离器104、改性剂系统106、电喷雾电离发射器108和质谱装置118。

在各实施例中，分析柱102是液相色谱(LC)分离柱。液相色谱装置的非限制性实例可以包含反相液相色谱、离子交换色谱、尺寸排阻色谱、亲和色谱、亲水性相互作用色谱和疏水性色谱。包含HPLC的液相色谱可以用于分析包含单克隆抗体的肽。各种形式的液相色谱可用于研究这些结构，包含阴离子交换色谱、反相HPLC、尺寸排阻色谱、高效阴离子交换色谱和正相(NP)色谱，包含NP-HPLC(参见例如，Alpert等人,《色谱杂志A(J.Chromatogr.A)》676:191-202(1994))。亲水相互作用色谱(HILIC)是NP-HPLC的一种变体，其可以使用部分水性流动相进行，从而允许肽、碳水化合物、核酸和许多蛋白质的正相分离。HILIC的洗脱顺序是极性最小到极性最大，这与反相HPLC中的洗脱顺序相反。HPLC可以在例如来自Waters(例如Waters 2695Alliance HPLC系统)、Agilent、Perkin Elmer、Gilson等的HPLC系统上进行。

在一些实施例中，通过使用ACQUITY UPLC肽BEH C18柱进行LC分析。柱温可在整个色谱运行期间保持在恒定温度，例如，使用商业柱加热器。在一些实施例中，将柱保持在介于约18℃到约70℃之间的温度，例如，约30℃到约60℃、约40℃到约50℃，例如，约20℃、约25℃、约30℃、约35℃、约40℃、约45℃、约50℃、约55℃、约60℃、约65℃或约70℃。在一些实施例中，柱温为约40℃。在一些实施例中，运行时间可以介于约15到约240分钟之间，例如，约20到约70分钟、约30到约60分钟、约40到约90分钟、约50分钟到约100分钟、约60到约120分钟、约50到约80分钟。

在一些实施例中，LC分析包含尺寸排阻色谱(SEC)柱或与天然质谱系统流体连通的离子交换色谱(IEX)系统。所述柱适合与去糖基化蛋白质一起使用。在一个实施例中，SEC柱是沃特世(Waters)

SEC柱(4.6×300mm)。在一个实施例中，IEX柱是强阳离子交换柱。

如SEC或IEX柱等柱通过分析流量分离器104与质谱仪流体连通，所述分析流量分离器可以调节到质谱仪的流速。

在一些实施例中，流动相是水性流动相。代表性水性流动相含有140mM乙酸钠和10mM碳酸氢铵。UV迹线通常在215和280nm处记录。

在一些示例性实施例中，用于洗脱蛋白质的流动相可以是可以与质谱仪兼容的流动相。

在一些示例性实施例中，液相色谱装置中使用的流动相可以包含水、乙腈、三氟乙酸、甲酸或其组合。

在一些示例性实施例中，流动相在液相色谱装置中可以具有约0.1毫升/分钟到约0.8毫升/分钟，如在约0.1毫升/分钟到约0.4毫升/分钟之间的流速。一方面，液相色谱装置中流动相的流速可以是约0.1毫升/分钟、约0.15毫升/分钟、约0.20毫升/分钟、约0.25毫升/分钟、约0.30毫升/分钟、约0.35毫升/分钟、约0.4毫升/分钟、约0.45毫升/分钟、约0.50毫升/分钟、约0.55毫升/分钟、约0.60毫升/分钟、约0.65毫升/分钟、约0.70毫升/分钟、约0.75毫升/分钟或约0.80毫升/分钟。

在一些示例性实施例中，流动相的盐浓度可以高达约600mM。一方面，盐浓度为约100mM、约150mM、约200mM、250mM、约300mM、约350mM、约400mM、约450mM、约500mM、约550mM或约600mM。

应当理解，所述系统不限于上述蛋白质、杂质、流动相、质谱仪、有机溶剂、酸、碱或色谱柱中的任何一种。

在一个实施例中，尺寸排阻分离是在室温下使用0.2毫升/分钟的等度流持续24分钟实现的。

在一个实施例中，用于电喷雾的电压是通过发射器之前的液接三通施加的。

在一些示例性实施例中，如图1所展示的，改性剂系统106包含容器110、鞘气入口管线112、鞘气出口管线114和盖116。

在一些示例性实施例中，鞘气入口管线112可以是特氟隆管。

在一些示例性实施例中，鞘气入口管线112可以是柔性不锈钢管。

在一些示例性实施例中，鞘气入口管线112可以是使用聚醚酮制成的管。

在一些示例性实施例中，经修改的去溶剂化气体出口管线114可以是特氟隆管。

在一些示例性实施例中，经修改的去溶剂化气体出口管线114可以是柔性不锈钢管。

在一些示例性实施例中，经修改的去溶剂化气体出口管线114可以是使用聚醚酮制成的管。

在一些示例性实施例中，容器110可以包括盖116。盖116可以安全地与流动相一起使用。

在一些示例性实施例中，容器110可以包括盖116，其中盖110能够在盖116与容器110之间形成气密密封。可以使用的盖的非限制性实例包含分析销售公司(AnalyticalSales)的Canary-Safe盖、瑞斯泰克公司(Restek)的Eco-cap瓶顶、瑞斯泰克公司的Opti-cap瓶顶和VWR公司(VWR)的惰性流动相瓶盖。

在一些示例性实施例中，盖116可以包括螺旋盖。

在一些示例性实施例中，盖116可以由聚四氟乙烯(PTFE)材料制成。

在一些示例性实施例中，盖116可以进一步包括O形环以确保盖与容器之间的气密密封。

在一些示例性实施例中，容器110中的盖116可以具有至少一个用于管道的端口。一方面，容器110中的帽116可以具有两个用于管道的端口。

在一些示例性实施例中，容器中的盖116可以具有至少一个入口端口160。

在一些示例性实施例中，容器110中的盖116可以具有至少一个用于管道的出口端口。

在一些示例性实施例中，电喷雾电离发射器108耦合到鞘气出口管线114。

在一些示例性实施例中，改性剂系统106可以包括具有带有入口管线端口和出口管线端口的盖116的容器110以及能够向入口管线端口提供鞘气的鞘气入口管线112。

在一些示例性实施例中，改性剂系统106可以包括具有带有入口管线端口和出口管线端口的盖116的容器110以及能够将出口管线端口连接到电喷雾电离发射器108的经改性的去溶剂化气体出口管线114。

在一些示例性实施例中，电喷雾电离发射器108包括多个发射器喷嘴，如至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个发射器喷嘴，如两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个发射器喷嘴。

在一些示例性实施例中，电喷雾电离发射器108是来自Newomics公司(加利福尼亚州伯克利)的M3发射器，所述发射器包含8个发射器喷嘴。

在一些示例性实施例中，可以通过鞘气源向容器110提供鞘气，所述容器具有盖116，所述盖带有通过鞘气入口管线112的入口管线端口。鞘气的非限制性实例包含空气、氮气、IPA、ACN和/或ACN/NH₃。

在一些示例性实施例中，可以通过鞘气源向容器提供的鞘气可以是氮气，所述容器具有盖，所述盖带有通过鞘气入口管线112的入口管线端口。

在一些示例性实施例中，电喷雾电离发射器108可以自动化以执行样品抽吸、样品分配、样品递送和/或用于对样品进行喷雾。

在一些示例性实施例中，容器110具有带有入口管线端口和鞘气入口管线112的盖116，其中鞘气入口管线112可以部分地插入到入口管线端口中。

在一些示例性实施例中，具有出口管线端口的盖116和经改性的去溶剂化气体出口管线114，其中经改性的去溶剂化气体出口管线114可以部分地插入到出口管线端口中。

在一些示例性实施例中，改性剂系统106可以被配置成允许鞘气从鞘气入口管线112流动通过容器110进入去溶剂化气体出口管线114，例如鞘气是氮气。

在一些示例性实施例中，容器可以被第二容器包围。在一些具体的示例性实施例中，第二容器可以由聚乙烯制成。一方面，第二容器能够为玻璃瓶提供防碎保护。另一方面，第二容器可以在顶部具有开口。

在一些示例性实施例中，容器110可以由硼硅酸盐玻璃材料制成。

在一些示例性实施例中，容器110的体积可以在约10ml到约5000ml的范围内。一方面，容器110的体积可以是约10ml、约20ml、约30ml、约40ml、约50ml、约60ml、约70ml、约80ml、约90ml、约100ml、约110ml、约120ml、约130ml、约140ml、约150ml、约160ml、约170ml、约180ml、约190ml、约200ml、约210ml、约220ml、约230ml、约240ml、约250ml、约260ml、约270ml、约280ml、约290ml、约300ml、约310ml、约320ml、约330ml、约340ml、约350ml、约360ml、约370ml、约380ml、约390ml、约400ml、约410ml、约420ml、约430ml、约440ml、约450ml、约460ml、约470ml、约480ml、约490ml、约1000ml、约1100ml、约1200ml、约1300ml、约1400ml、约1500ml、约1600ml、约1700ml、约1800ml、约1900ml、约2000ml、约2500ml、约3000ml、约3500ml、约4000ml、约4500ml或约5000ml。

在一些示例性实施例中，容器110可以是耐压容器。

在一些示例性实施例中，容器110的耐压性可以是至少约0.5巴表压。一方面，容器110的耐压性可以是至少约0.5巴表压、至少约0.6巴表压、至少约0.7巴表压、至少约0.8巴表压、至少约0.9巴表压、至少约1巴表压、至少约1.1巴表压、至少约1.2巴表压、至少约1.3巴表压、至少约1.4巴表压、至少约1.5巴表压、至少约1.6巴表压、至少约1.7巴表压、至少约1.8巴表压、至少约1.9巴表压或至少约2.0巴表压。

在一些示例性实施例中，容器110可以能够填充有至少一种有机溶剂。有机溶剂的非限制性实例包含乙腈、丙醇、异丙醇、水和甲醇。

在一些示例性实施例中，容器110可以能够填充有至少一种酸。酸的非限制性实例包含乙酸、丙酸和甲酸。

在一些示例性实施例中，容器110能够填充有至少一种碱。碱的非限制性实例包含氨、二乙胺、三乙胺、N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)和哌啶。在一些示例性实施例中，容器110能够填充有至少一种有机溶剂和至少一种酸。

在一些示例性实施例中，容器110能够填充有至少一种有机溶剂和至少一种碱。

在一些示例性实施例中，改性剂系统可以被配置成允许鞘气从鞘气入口管线112流动通过容器110进入去溶剂化气体出口管线114，所述容器能够填充有有机溶剂和另外的化学组分。

在一些示例性实施例中，电喷雾电离源能够提供溶剂流速大于约1-5微升/分钟的电喷雾。一方面，电喷雾电离源能够提供溶剂流速大于约1微升/分钟、大于约2微升/分钟、大于约3微升/分钟、大于约4微升/分钟、大于约5微升/分钟、大于约6微升/分钟、大于约7微升/分钟、大于约8微升/分钟、大于约9微升/分钟、大于约10微升/分钟、大于约11微升/分钟、大于约12微升/分钟、大于约13微升/分钟、大于约14微升/分钟、大于约15微升/分钟、大于约16微升/分钟、大于约17微升/分钟、大于约18微升/分钟、大于约19微升/分钟、大于约20微升/分钟、大于约25微升/分钟、大于约30微升/分钟、大于约35微升/分钟、大于约40微升/分钟、大于约45微升/分钟、大于约50微升/分钟、大于约55微升/分钟、大于约60微升/分钟、大于约65微升/分钟、大于约70微升/分钟、大于约75微升/分钟、大于约80微升/分钟、大于约85微升/分钟、大于约90微升/分钟、大于约95微升/分钟、大于约100微升/分钟、大于约110微升/分钟、大于约120微升/分钟、大于约130微升/分钟、大于约140微升/分钟、大于约150微升/分钟、大于约160微升/分钟、大于约170微升/分钟、大于约180微升/分钟、大于约190微升/分钟、大于约200微升/分钟、大于约225微升/分钟、大于约250微升/分钟、大于约275微升/分钟、大于约300微升/分钟、大于约325微升/分钟、大于约350微升/分钟、大于约375微升/分钟、大于约700微升/分钟、大于约425微升/分钟、大于约450微升/分钟或大于约500微升/分钟的电喷雾。

在一些实施例中，为了适应分析级分离中使用的各种流速(0.1-0.8毫升/分钟)，应用柱后分流策略将流速降低到如NSI的M3发射器等多喷嘴发射器可以轻松适应的小于10微升/分钟的范围，如小于1微升/分钟、小于0.1微升/分钟或小于0.01微升/分钟(参见图7)。在一些实施例中，分流比由连接到如不锈钢三通等三通的两个不同尺寸的固定管道控制，如两个不同尺寸的Viper管道。在一些实施例中，不锈钢三通定位于柱后，所述柱后连接两个不同尺寸(20μm×15cm和100μm×65cm)的Viper管道，以将不同的分析流量(≤0.8毫升/分钟)减少到微流量范围(亚微升/分钟)，用于天然MS检测，并且将剩余的高流量转移用于UV检测(如在280nm处)。

在一些示例性实施例中，天然质谱仪118能够鉴定蛋白质的组分以表征蛋白质。天然质谱系统可以是天然ESI质谱系统。

在一些示例性实施例中，质谱仪118可以是四极-轨道阱混合质谱仪。四极-轨道阱混合质谱仪可以是Q Exactive^TMFocus Hybrid Quadrupole-Orbitrap^TM质谱仪、QExactive^TMPlus Hybrid Quadrupole-Orbitrap^TM质谱仪、Q Exactive^TMBioPharma平台、QExactive^TMUHMR Hybrid Quadrupole-Orbitrap^TM质谱仪、Q Exactive^TMHF HybridQuadrupole-Orbitrap^TM质谱仪、Q Exactive^TMHF-X Hybrid Quadrupole-Orbitrap^TM质谱仪和Q Exactive^TMHybrid Quadrupole-Orbitrap^TM质谱仪。

在一些示例性实施例中，质谱系统是Thermo Exactive EMR质谱仪。质谱系统还可以含有紫外光检测器。

在一些示例性实施例中，质谱仪118可以是QIT-FTICR。

在一些示例性实施例中，质谱仪118可以是Qq-FTICR。

在一些示例性实施例中，质谱仪118可以是串联质谱仪。

在一些示例性实施例中，质谱仪118可以是时间串联质谱仪。

在一些示例性实施例中，质谱仪118可以是空间串联质谱仪。

在一些示例性实施例中，质谱仪118可以是混合的，其中时间串联分析仪可以在空间中耦合或与空间串联分析仪耦合。

在一些示例性实施例中，表征样品中的蛋白质的方法可以包括检测或定量样品中的蛋白质。

在一个示例性实施例中，蛋白质可以包含抗体、双特异性抗体、抗体片段或多特异性抗体。

在一些示例性实施例中，蛋白质可以是治疗性抗体。

在一些示例性实施例中，蛋白质可以是免疫球蛋白。

在一个示例性实施例中，免疫球蛋白可以是IgG1。

在一个示例性实施例中，免疫球蛋白可以是IgG4。

在一些示例性实施例中，蛋白质可以是双特异性抗体。

在一些示例性实施例中，蛋白质可以是在抗体消化时形成的抗体片段。

在一个示例性实施例中，蛋白质可以是蛋白质变体。

在一个示例性实施例中，蛋白质可以是翻译后修饰的蛋白质。

在一个示例性实施例中，翻译后修饰的蛋白质可以通过切割、N末端延伸、蛋白质降解、N末端的酰化、生物素化、C末端的酰胺化、氧化、糖基化、碘化、辅基的共价连接、乙酰化、烷基化、甲基化、腺苷酸化、ADP-核糖基化、多肽链内或之间的共价交联、磺化、异戊二烯化、维生素C依赖性修饰、维生素K依赖性修饰、谷氨酰化、甘氨酰化、糖基化、去糖基化、异戊二烯化、脂酰化、磷酸巯基乙胺化、磷酸化、硫酸化、瓜氨酸化、脱酰胺化、二硫键的形成、蛋白水解切割、ISG化、SUMO化或泛素化(与蛋白质泛素共价连接)来形成。

在一个示例性实施例中，翻译后修饰的蛋白质可以在蛋白质氧化时形成。

在另一个示例性实施例中，降解产物可以包含治疗性蛋白质的翻译后修饰。

在另一个示例性实施例中，蛋白质可以是蛋白质的降解产物。

在又另一个示例性实施例中，蛋白质可以是在生物制药产品中发现的杂质。

在另一个示例性实施例中，蛋白质可以是在生物制药产品的制造期间发现的杂质。

在一些示例性实施例中，蛋白质可以是pI在约4.5到约9.0范围内的蛋白质。一方面，蛋白质可以是pI为约4.5、约5.0、约5.5、约5.6、约5.7、约5.8、约5.9、约6.0、约6.1、约6.2、约6.3、约6.4、约6.5、约6.6、约6.7、约6.8、约6.9、约7.0、约7.1、约7.2、约7.3、约7.4、约7.5、约7.6、约7.7、约7.8、约7.9、约8.0、约8.1、约8.2、约8.3、约8.4、约8.5、约8.6、约8.7、约8.8、约8.9或约9.0的蛋白质。

在一些示例性实施例中，蛋白质可以是产物相关杂质。产物相关杂质可以是分子变体、前体、降解产物、碎裂蛋白、消化产物、聚集体、翻译后修饰形式或其组合。

在一些具体的示例性实施例中，蛋白质可以是工艺相关杂质。工艺相关杂质可以包含源自制造工艺的杂质，例如核酸和宿主细胞蛋白、抗生素、血清、其它培养基组分、酶、化学和生化加工试剂、无机盐、溶剂、载体、配体以及制造工艺中使用的其它可浸出物。

在一些具体的示例性实施例中，蛋白质可以是杂质。在一个示例性实施例中，样品中的杂质的数量可以是至少两个。

所公开的系统和方法可以用于表征大小变体、电荷变体、抗体-抗原结合、PTM表征、部分还原和烷基化mAb的表征、共同调配药物的二聚体表征、IgG4 Fab交换表征和使用电荷减少的高度异质样品表征。可以检测和鉴定出导致酸性变体的示例性翻译后修饰(PTM)包含但不限于糖基化、葡糖醛酸化、羧甲基化、唾液酸化、Fab区处的非一致糖基化。可以检测和鉴定出导致碱性变体的PTM包含但不限于琥珀酰亚胺形成、N末端谷氨酰胺(未转化为焦谷氨酸)、C末端赖氨酸和非/部分糖基化物种。

1.大小变体

一个实施例提供了一种用于表征蛋白质药物产品杂质的大小变体的方法，所述方法包含使用水性流动相通过天然SEC色谱分离蛋白质药物产品样品的蛋白质组分；以及使用所公开的平台通过质谱分析分离的蛋白质组分以表征蛋白质药物产品样品中蛋白质药物产品杂质的高分子量物种、低分子量物种和中间高重量物种。在一个实施例中，流动相包含乙酸铵和碳酸氢铵。使用所公开的平台消除了在分离和分析之前对蛋白质药物产品样品进行去糖基化的需要。

在一个实施例中，蛋白质药物产品样品取自分批补料细胞培养物、连续细胞培养物或灌注细胞培养物或由其纯化。

示例性蛋白质药物产品包含但不限于抗体、融合蛋白、重组蛋白或其组合。

示例性低分子量蛋白质药物产品杂质包含但不限于前体、降解产物、截短物种、包含Fab、配体或受体片段或重链片段的蛋白水解片段、游离轻链、半抗体、H2L、H2、HL、HC或其组合。

示例性HMW杂质包含但不限于mAb三聚体和mAb二聚体。

示例性中间HMW包含但不限于具有额外轻链的单体(H2L3和H2L4物种)、单体加Fab片段复合物、Fab2-Fab2、Fc-Fc和Fab2-Fc。

2.电荷变体表征

一个实施例提供了一种用于表征蛋白质药物产品杂质的电荷变体的方法，所述方法包含以下的步骤：任选地去糖基化蛋白质药物产品样品；任选地用来自酿脓链球菌(Streptocoocus pyogenes)的IdeS处理样品；使用水性流动相通过天然强阳离子交换色谱分离蛋白质药物产品样品的蛋白质组分；以及通过质谱分析分离的蛋白质组分以表征蛋白质药物产品样品中蛋白质药物产品杂质的电荷变体物种。在一个实施例中，流动相包含乙酸铵和碳酸氢铵。使用所公开的平台消除了在表征之前对蛋白质药物产品样品进行去糖基化的需要。

示例性电荷变体包含但不限于糖基化、葡糖醛酸化、羧甲基化、唾液酸化、Fab区处的非一致糖基化。可以检测和鉴定出导致碱性变体的PTM包含但不限于琥珀酰亚胺形成、N末端谷氨酰胺(未转化为焦谷氨酸)、C末端赖氨酸和非/部分糖基化物种。

还公开了产生高纯度蛋白质药物产品的方法。一些实施例提供了一种产生抗体的方法，所述方法包含以下的步骤：培养产生抗体的细胞，例如在分批补料培养物中；从细胞培养物中获得样品；使用本文所公开的系统和方法表征和定量样品中的低分子量、高分子量和中等分子量杂质；以及改变细胞培养物的一种或多种培养条件以减少在抗体的细胞培养过程中产生的特征性低分子蛋白质药物杂质的量。通常，改变条件以使蛋白质药物杂质在0.05％与30.0％，优选地0.05％到15％、0.05％到10％、0.05％到5％或0.05％到2％(w/w)的范围内。

被改变以减少低分子量蛋白质药物杂质的量的细胞培养的所述一种或多种条件选自由以下组成的组：温度、pH、细胞密度、氨基酸浓度、渗透压、生长因子浓度、搅拌、气体分压、表面活性剂或其组合。

在一些实施例中，产生抗体的细胞是中国仓鼠卵巢细胞。在其它实施例中，细胞是杂交瘤细胞。

另一个实施例提供了根据本文提供的方法产生的抗体，所述抗体具有1％到5％、5％到10％、10％到15％、15％到20％的蛋白质药物杂质。

实例

提出以下实例，以向本领域的普通技术人员提供关于如何制备和使用本发明的方法的完整公开和描述，并且不旨在限制发明人认为是其发明的范围。已经努力确保关于所使用的数字(例如，量，温度等)的准确性，但是应该考虑一些实验误差和偏差。除非另有说明，份数是重量份数，分子量是平均分子量，温度是摄氏度，室温是约25℃，并且压力为大气压或接近大气压。

实例1：材料与方法

样品制备。NISTmAb储备样品在10μg/μL的浓度下使用。

天然SEC LC-MS分析。对于NISTmAb的天然SEC LC-MS分析，使用ACQUITY UPLCProtein BEH C18柱(

1.7μm，4.6mm×300mm)(马萨诸塞州米尔福德沃特世公司(Waters,Milford,MA))分离10μg NISTmAb，用于在Q-Exactive UHMR质谱仪上进行在线LC-MS分析。对于分离，流动相是含150mM乙酸铵的水。详细的LC梯度和MS参数分别包含在表1和表2中。

表1.用于天然SEC LC-MS分析的LC梯度

表2.用于天然SEC LC-MS分析的MS参数

MS参数	对照实验	去溶剂化气体改性方法
			源电压[kV]	3.0	3.0
毛细管温度[℃]	320	320
			S透镜RF水平	200	200
鞘气[升/分钟]	2.0	2.0
			扫描范围[m/z]	2000-15000	2000-15000

天然SCX LC-MS分析。对于NISTmAb的天然SCX LC-MS分析，使用YMC BioPro IEXSF 4.6×100mm(日本YMC公司(YMC,Japan))分离10μg NISTmAb，用于在Q-Exactive UHMR质谱仪上进行在线LC-MS分析。对于分离，流动相A是在pH 5.6下含20mM乙酸铵的水，流动相B是含150mM乙酸铵的水。详细的LC梯度条件包含在表3中，并且MS参数与天然SEC-MS分析相同。

表3.用于天然SCX LC-MS分析的LC梯度

去溶剂化气体的改性。鞘气流使用1/8”特氟龙管道通过Canary-Safe盖(新泽西州弗兰德分析销售与服务公司(Analytical Sales and Services,Inc.,Flander,NJ))被引导到Duran压力加瓶(纽约州埃尔姆斯福德肖特北美公司(SCHOTT North America,Inc.,Elmsford,NY))(参见图1)。然后将瓶的引出管道直接连接到Thermo Scientific Ion Max离子源中的Newomics M3发射器。对于天然完整MS分析，将200mL异丙醇(IPA)转移到瓶中。

实例2：天然SEC-MS平台灵敏度和稳健性

使用实例1中描述的方法和材料，所公开的平台的灵敏度通过对NISTmAb进行天然SEC-MS分析来表明。对10μg NISTmAb进行了天然SEC-MS分析。如图3所展示的，注入10μgNISTmAb样品导致约E9 TIC强度，所述强度表明所公开的平台的样品量消耗低。由于IPA改性的去溶剂化气体辅助的有效去溶剂化，在所公开的平台上也观察到了卓越的数据质量。无需去糖基化即可对低丰度物种(例如，HMW和LMW物种)进行灵敏检测。准确的质量测量能够明确鉴定这些物种。进一步地，图4A和4B展示了平台稳健性，如NISTmAb的101次连续天然SEC-MS运行所表明的，并且第一次运行与第101次运行之间的相对丰度几乎相同。

实例3：用于减少电荷的有效去溶剂化气体改性

进行了研究以确定在天然SCX-MS分析期间对去溶剂化气体进行改性的效果。如图5A和5B所展示的，当用IPA、ACN或ACN/NH3对去溶剂化气体进行改性时，TIC强度的轻微下降与电荷减少相关。如图6所示，异质和/或不稳定生物分子的电荷减少辅助分析。图6的上图示出了在电荷减少的情况下半胱氨酸ADC模拟物的天然SEC-MS分析，而下图是在没有减少的情况下。由于空间分辨率的提高，电荷减少防止了电荷状态重叠，从而能够分析具有高质量异质性的样品。由于空间分辨率的提高，电荷减少防止了电荷状态重叠，从而能够分析具有高质量异质性的样品。此外，电荷减少帮助在电离过程期间保留不稳定的生物分子(非共价连接)，并且最小化不期望的解离事件。

实例4：用于完整蛋白质质量分析的通用、灵敏和稳健的天然LC-MS平台

下文提供了根据本文公开的实施例的通用、灵敏和稳健的天然LC-MS平台的另外的实例。

在过去的几年中，天然(非变性)液相色谱(nLC)方法，如尺寸排阻色谱(SEC)、离子交换色谱(IEX)和疏水性相互作用色谱(HIC)与质谱(MS)的联用在研究蛋白质药物产品的大小、电荷和结构异质性方面引起了极大的关注。尽管有多种nLC-MS方法可供使用，但仍然缺乏可以适应不同应用的集成平台。在此实例中，描述了新型nLC-MS平台的开发，所述平台可以轻松实现不同的nLC-MS应用，并且具有巨大的通用性、灵敏度和稳健性。特别是，开发的平台可以承受广泛的LC流速和高盐浓度，这是实现适应不同nLC方法的通用性的关键。另外，可以使用此平台轻松应用掺杂剂改性的去溶剂化气体来实现电荷减少的天然MS，以便改善异质和不稳定生物分子的表征。最后，表明了此nLC-MS平台是高度灵敏的和稳健的，可以常规应用于蛋白质药物表征。

材料。去离子水由安装有MilliPak Express 20过滤器(马萨诸塞州伯灵顿密理博西格玛公司(Millipore Sigma,Burlington,MA))的MilliQ整体水净化系统提供。NIST单克隆抗体参考材料8671(NIST-mAb，人源化IgG1κ单克隆抗体)购自国家标准与技术研究所(马里兰州盖瑟斯堡(Gaithersburg,MD))。乙酸铵(LC/MS级)和SigmaMAb抗体药物缀合物(ADC)模拟物购自西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)(密苏里州圣路易斯(St.Louis,MO))。肽N-糖苷酶F(PNGase F)购自新英格兰生物实验室公司(New England Biolabs Inc)(马萨诸塞州伊普斯威奇(Ipswich,MA))。Invitrogen UltraPure 1M Tris-HCl缓冲液，pH 7.5购自赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)(马萨诸塞州沃尔瑟姆(Waltham,MA))。乙腈(ACN)(Optima LC/MS级)购自赛默飞世尔科技公司(马萨诸塞州沃尔瑟姆)，氢氧化铵(NH3)(30％)购自J.T.Baker公司(J.T.Baker)(宾夕法尼亚州中央谷(Center Valley,PA))。2-丙醇(IPA)(HPLC级)购自霍尼韦尔公司(Honeywell)(密歇根州马斯基根(Muskegon,MI))。包含IgG1和IgG4亚类的所有其它单克隆抗体都在再生元公司(Regeneron)(纽约州塔里敦)处产生。

样品制备。mAb混合物样品是通过混合四种内部mAb制备的，每种mAb的最终浓度为5mg/mL。在nSEC-MS分析之前，在100mM Tris-HCl(pH 7.5)中在45℃下用PNGase F(每10μg蛋白质1IUB毫单位)处理一等份试样混合物持续1小时。另一等分试样不经样品处理直接经受nIEX-MS分析。包含SigmaMAb ADC模拟物的所有其它mAb样品在注入nLC-MS分析之前用水稀释到2-5mg/mL。

nLC-MS方法。所有LC分离都在UltiMate 3000UHPLC系统(德国不莱梅赛默飞世尔科技公司)上进行。对于nSEC-MS分析，在室温下通过150mM乙酸铵在0.2毫升/分钟下进行等度洗脱来使用Acquity BEH200 SEC柱(4.6×300mm，1.7μm，

)(马萨诸塞州米尔福德沃特世公司)。对于nIEX-MS分析，在45℃下通过在16分钟内从20mM乙酸铵(pH5.6，用乙酸调节)到150mM乙酸铵(pH 6.8)在0.4毫升/分钟下进行线性梯度来使用BioPro IEX SF柱(4.6mm×100mm，5μm)(日本东京YMC有限公司)。对于脱盐SEC-MS分析，在室温下通过150mM乙酸铵在以下流速下进行等度洗脱来使用Acquity BEH200 SEC保护柱(4.6×30mm，1.7μm，

)(马萨诸塞州米尔福德沃特世公司)：0.1毫升/分钟、0.2毫升/分钟、0.4毫升/分钟、0.6毫升/分钟或0.8毫升/分钟。为了启用在线天然MS检测，在柱后应用了不锈钢三通，所述柱后连接两个不同尺寸(20μm×15cm和100μm×65cm)的Viper管道(马萨诸塞州沃尔瑟姆赛默飞世尔科技公司)，以将不同的分析流量(≤0.8毫升/分钟)减少到微流量范围(亚微升/分钟)，用于天然MS检测，并且将剩余的高流量转移用于UV检测(280nm)。使用配备有Nanospray Flex^TM离子源(德国不莱梅赛默飞世尔科技公司)的Thermo Q Exactive UHMR或Exactive Plus EMR质谱仪以进行天然MS分析。为了实现具有微流量的纳米电喷雾(NSI)，应用了Newomics微制造整体式多喷嘴(M3)发射器(加利福尼亚州伯克利)。为了实现电荷减少天然MS，将如通过使气体流动通过含有200mL的各种改性剂(例如，IPA、ACN或含5％氨的ACN)的DURAN压力加瓶(1L)(纽约州埃尔姆斯福德肖特北美公司)的顶部空间实现的掺杂剂改性的去溶剂化气体(2升/分钟，氮气)应用于辅助NSI(图7)。除非另有说明，否则此实例中的所有实验都使用IPA辅助的天然MS分析进行。MS分辨率设置为12,500(UHMR)或17,500(EMR)，毛细管喷雾电压设置为3.0kV，毛细管温度设置为350℃，S透镜RF水平设置为200，源内碎裂能量设置为100(或对于ADC模拟分析是50)，HCD捕获气体压力设置为3。使用2000与15000之间的m/z范围窗口获取质谱。

集成nLC-MS平台。对于通过nLC-MS对蛋白质药物进行表征，使用分析级柱(I.D.为2.1mm或4.6mm)，因为所述分析级柱具有许多优点。首先，与毛细管柱形式相比，更广泛的分析级柱可供选择，因此有助于方法开发，尤其是对于那些具有挑战性的分子。此外，分析级柱在稳健性和通量方面占优势，并且广泛用于质量控制(QC)测定中的光学检测。通过在相同的分析柱上进行nLC-MS分析，尽管使用不同的流动相条件，但与使用毛细管柱相比，仍然更有可能生成与QC测定相当的结果。为应对分析级分离中使用的各种流速(0.1-0.8毫升/分钟)，应用柱后分流策略将流速降低到NSI的多喷嘴发射器(M3)可以轻松适应的范围(<10微升/分钟)(图7)。分流比主要由连接到不锈钢三通(图7)的两个不同尺寸的固定Viper管道控制，并且对于此研究中所有测试的nLC方法保持不变。值得注意的是，M3发射器的多喷嘴设计与在亚微流速下成功执行NSI相关，因为所述多喷嘴设计通过在NSI之前将亚微流量分流进入八个喷嘴来进一步降低流速。同时，NSI的应用不仅降低了软电离源条件的苛刻性，而且显著增加了MS灵敏度以及对高盐浓度的耐受性，这是适应各种nLC方法(例如，SEC、IEX和HIC)的关键的特征。此外，与大多数其它NSI设置不同，这种基于M3发射器的方法允许通过内置的去溶剂化气体管线(图7)将去溶剂化气体施加到喷雾发射器，这有助于实现改进的喷雾稳定性和去溶剂化效率。另外，这也为通过去溶剂化气体改性进一步扩展平台的通用性提供了机会。例如，通过简单地用具有降低电荷能力的挥发性有机改性剂掺杂去溶剂化气体(图7)，可以轻松实现天然MS分析的在线电荷降低。因为此平台是用所有易于触及的零件构建的而没有任何定制，因此所述平台可以轻松维护以保持一致性能。在以下段落中，进行了广泛的评估，以展示此nLC-MS平台的通用性、灵敏度和稳健性。

用于nLC集成的平台通用性。当采用不同的nLC方法(例如，SEC、IEX和HIC)进行nLC-MS分析时，通常需要优化流动相中使用的挥发性盐浓度和/或LC流速以实现最佳色谱性能。因此，期望开发的nLC-MS平台可以处理各种LC流速和盐浓度，以适应不同的nLC-MS应用。为了评估此nLC-MS平台对不同流速和盐浓度的耐受性，通过使用沃特世BEH200 SEC保护柱(4.6mm×30mm)在快速在线脱盐步骤后对mAb1样品进行天然MS分析，进行了两项测试。首先，使用150mM乙酸铵作为流动相和10μg注入量，测试了0.1到0.8毫升/分钟范围内的五种不同流速。在不更改分流设置或MS源参数的情况下，由五种流速生成的总离子色谱图(TIC)都展现出良好的信号强度、喷雾稳定性以及与其对应的UV曲线的高度相似性(图8A)。特别是，UV和TIC峰的相对强度通常在不同流速下相互关联，这表明在较高流速下NSI-MS灵敏度并未因去溶剂化不足而受到影响。另外，在这五种条件下获得的平均原始MS谱都展现出高度对称的m/z峰和出色的信噪比(图12A和12B)，表明即使在测试的最快流速下也有足够的去溶剂化(0.8毫升/分钟)。这些观察表明，这个开发的nLC-MS平台可以很好地耐受0.1到0.8毫升/分钟之间的LC流速，这应该足以满足大多数nLC-MS应用的需要。此外，值得注意的是，在这个平台上成功地在短SEC柱上操作高流速以实现快速高效的脱盐为基于天然MS的高通量筛选应用带来了巨大的希望。作为概念验证，将2μL三种不同浓度(0.05、0.5和5μg/μL)的mAb2样品各自重复注入30次并以0.8毫升/分钟进行分析，并且所得TIC呈现在图8B中。由于应用的高流速，注入之间的工作周期短至42秒，这对应于每天约2,050个样品的通量。尽管与某些基于直接输注的MS平台相比时实现的通量并不高，但这种基于SEC-MS的方法在样品处理最少的情况下占优势，这不仅节省了工作时间，还降低了引入样品制备诱导的伪影的风险。另外，对30次重复的分析表明了出色的MS灵敏度和可重复性，如低变异系数值(对于0.1、1和10μg注入量，CV分别为17％、5％和4％)所证明的。分析0.1μg注入的CV较高可能归因于储备蛋白质浓度(0.05μg/μL)的逐渐降低，这是由于重复注入，针头吸附诱导的样品损失的结果。

在第二个测试中，通过将流速维持在0.4毫升/分钟下并改变流动相中的乙酸铵浓度，还使用相同的脱盐SEC-MS方法评估了平台对盐浓度的耐受性。出于实际考虑，研究了150mM到600mM范围内的乙酸铵浓度对MS灵敏度和谱质量两者的影响。如图9A所示，在每种盐浓度(150、300、450和600mM)下在mAb1的一式三份分析中始终获得高MS强度。可能是由于盐浓度较高时电离效率较低，尽管随着盐浓度的增加观察到MS强度显著下降，但对于大多数nLC-MS应用来说，整体MS信号仍然被认为是足够的。此外，对在600mM盐浓度下获得的mAb1的天然MS谱的仔细检查表明了出色的谱质量，具有高度对称的m/z峰和良好的信噪比(图9B)。由Fc N-糖基化的宏观和微观异质性产生的不同糖型可以很好地分辨，并且以良好的质量准确度可靠地分配。最后，值得注意的是，评估的乙酸铵浓度范围(150-600mM)足以支持大多数nLC-MS应用，如nIEX-MS和nSEC-MS，其中大部分是使用含有20-200mM基于铵的盐的流动相开发和报告的。为了在测试范围内使用盐浓度进行nHIC-MS分析，可以应用小组最近引入的补充和分流策略34。简而言之，通过在柱后引入稀释剂流(水)，HIC流动相(最至多3M乙酸铵)可以在天然MS检测之前稀释六倍(至多500mM)。应用此策略，在这个平台上对多个mAb样品进行nHIC-MS分析，并且始终获得高质量数据(图13A和13B)。因此，开发的nLC-MS平台可以广泛应用于支持大多数nLC-MS应用。

用于在线电荷减少天然MS分析的平台通用性。电荷减少是经常用于促进不稳定蛋白质复合物或高度异质蛋白质样品的天然MS分析的策略。通过电荷减少，由于库仑排斥(Coulombic repulsion)降低，蛋白质复合物中存在的非共价相互作用可以在天然MS分析期间更好地保留。另外，通过将电荷状态包络向更高m/z区域移动，可以大大提高相邻电荷态之间的空间分辨率，从而降低谱复杂性。实现电荷减少天然MS的最常见方法是在ESI之前将电荷减少试剂如咪唑或三乙胺(TEA)添加到本体分析物溶液中。使用这个开发的nLC-MS平台，通过在去溶剂化气体中掺杂各种有机改性剂，可以很容易地在线实现电荷减少天然MS。为了评估三种不同改性剂(IPA、ACN和含5％(v/v)氨的ACN)的电荷减少效果，通过nSEC-MS和nIEX-MS分析，用掺杂剂改性的去溶剂化气体对pI范围为6.8到8.5的四种不同mAb的混合物进行分析。随后，计算每种mAb在每种电荷减少条件下的平均电荷状态，并且将其与使用未经改性的氮气作为去溶剂化气体进行的对照实验的平均电荷状态进行比较(图10A-10C)。所述研究表明，无论mAb分析物(例如，不同pI)、NSI的溶剂条件(例如，来自IEX梯度的不同pH和盐浓度)或nLC方法(例如，SEC对IEX)如何，观察到电荷减少能力的一致顺序，其中ACN/NH3(含5％氨的ACN)导致最大范围的电荷减少(约9.5个电荷)，随后是ACN(约8个电荷)和IPA(约5个电荷)。

电荷减少还导致整体MS强度对应降低(图10A-10C)，这可能归因于轨道阱仪器对较大m/z离子的传输和检测效率较低。尽管如此，即使在最大的电荷减少条件下，如通过ACN/NH3改性的去溶剂化气体所实现的，5μg mAb样品分析的整体MS强度仍可达到具有高质量MS谱的E8水平(图14A-14C)。值得注意的是，与一旦引入MS仪器就难以去除的TEA不同，通过这种方法减少电荷被认为是完全无污染的。有趣的是，发现用IPA或ACN对去溶剂化气体进行改性也可以提高NSI期间的去溶剂化效率，从而最小化倾向于在扩展分析中形成的加合物形成，得到改进的谱质量(图15)和更长的长期喷雾稳定性。因此，此平台上的所有nLC-MS应用默认应用最温和的电荷减少改性剂IPA。

实现在线电荷减少天然MS的能力对于分析不稳定和/或异质蛋白质药物是有价值的。例如，由于缺乏链间二硫键而在气相中不稳定，并且由不同数量的有效载荷引起的高质量异质性，因此Cys连接的抗体-药物缀合物(ADC)常常对完整蛋白质分析提出挑战。使用SigmaMab ADC模拟物作为模型系统，评估了在Cys连接的ADC的天然MS分析中应用在线电荷减少的优势(图6和11)。此ADC模拟物由载药物质的混合物组成，其中0到4对有效载荷(约668Da)在IgG1 mAb的链间二硫键Cys残基处缀合。在不从分子中去除Fc N-糖基化的情况下，在有和没有在线电荷减少的情况下进行nSEC-MS分析。示出当在没有电荷减少的情况下进行分析时，即使通过施加最小源内能量(SID＝50eV)也很容易观察到非共价ADC复合物的解离，从而导致形成高电荷轻链(LC)物质和带电荷的H2L物质(图6)。相比之下，当应用ACN/NH₃辅助的电荷减少时，即使应用更高的源内能量(SID＝100eV，针对有效去溶剂化进行了优化)，此类解离事件也会显著减少(图6)。通过计算LC相对于完整ADC的相对MS强度，估计这种解离倾向在电荷减少时从8.3％降低到0.4％。ADC复合物在气相中的这种稳定性增加可能归因于较低电荷状态下库仑排斥的降低，以及通过蒸发冷却(通过电荷减少剂)离子内能的降低。此外，由于不同数量的有效载荷引入的质量异质性增加，在没有电荷减少的情况下，不同DAR(药物与抗体比)物质的电荷状态包络在某些m/z区域中重叠。例如，来自DAR8物质的+30、+29和+28电荷状态分别出现在与来自DAR0物质的+29、+28和+27电荷状态类似的m/z区域中(图6)。此类m/z重叠可能会导致谱去卷积困难，在所述情况下，去卷积后未检测到DAR0物质(图11，下图)。相比之下，通过ACN/NH₃辅助的电荷减少，整个电荷状态包络转移到更高的m/z区域，其中相邻电荷状态之间的空间分辨率大大提高。因此，观察到来自不同DAR物质的电荷状态之间没有重叠(例如，来自DAR8的z＝+20和来自DAR0的z＝+19)(图6)，促进了可靠的谱去卷积(图11，上图)。对于Cys连接的ADC，为了准确测量平均DAR和表征有效载荷分布，最小化不期望的链解离和谱重叠都很重要。由于高DAR物质的优先解离，气相中的链解离可能会导致平均DAR的低估。在去卷积期间，谱重叠将会导致模糊甚至信息丢失。在此实例中，尽管在两种条件下获得的平均DAR值相当(电荷减少方法的DAR＝4.3对对照方法的DAR＝4.2)，但有效载荷分布不同。在没有电荷减少的情况下，去卷积后没有观察到DAR0物质，而高DAR物质的相对丰度由于它们的优先解离而被低估了。这两个原因影响了相反方向的平均DAR计算，并且导致了相当的平均DAR。然而，只有在电荷减少条件下，此Cys-ADC模拟物的平均DAR和有效载荷分布两者都得到了准确的表征。

平台敏感度和动态范围。蛋白质药物异质性的深入表征需要分析方法的高灵敏度和大动态范围两者。前者允许以最少的样品消耗来实现表征，而后者则可以鉴定那些低丰度的变体。为了评估开发的nLC-MS平台的灵敏度和动态范围，NISTmAb参考标准被用作测试制品，并且经受nSEC-MS分析和nIEX-MS分析两者。在不进行任何样品处理的情况下，将10μgNISTmAb注入沃特世BEH200 SEC柱(4.6mm×300mm)，随后进行IPA辅助的天然MS分析。nSEC-MS分析的TIC显示了与主峰分离或部分分离的两个高分子量(HMW)峰和两个低分子量(LMW)峰(图3)。在约1E9的总离子强度下检测到的主峰归因于NISTmAb单体。根据基于UV的定量，分别以约0.1％和约1.3％存在的HMW峰1和HMW峰2两者被指定为NISTmAb的二聚体形式，由于所述二聚体形式的不同构象，所述二聚体形式可能通过SEC分开。值得注意的是，即使在如此低的水平下，也可以获得这两种二聚体物质的高质量MS数据，在去卷积后展现出糖型分辨的质量峰(图3，插图)。另外，两个LMW峰还展现了出色的谱质量，并且被明确鉴定为两个互补片段，所述互补片段是由上铰链区处发生的一系列剪切事件产生的(图3，插图)。随后，通过在此nLC-MS平台中采用已报道的强阳离子交换方法，对10μg未处理的NISTmAb进行nIEX-MS分析。基于高质量的MS数据，以非常不同的水平存在的包含相同的截短mAb片段的多种电荷变体物质全都被可靠地鉴定出来(图16-1和16-2)。最后，如通过这两种nLC-MS方法鉴定的NISTmAb中的大小和电荷变体都总结在图18中，所述变体的相对丰度通过对应的UV峰进行定量。由于可以在低至约0.02％的水平下轻松检测到少量物质，因此通过在此开发的nLC-MS平台上应用nSEC-MS和nIEX-MS方法，可以实现大约四个数量级的动态范围，其中注入量为10μg NISTmAb。最后，由于10μg注入中0.02％的少量物质表示柱上2ng的绝对量，因此此平台也被认为是高度灵敏的，并且可能对基于MS的生物分析应用有价值。

平台稳健性。在为工业实验室的常规应用开发分析方法时，稳健性是另一个主要考虑因素。特别是，nLC-MS方法不断将盐水溶液引入MS离子源，导致难以在延长的分析时间内维持喷雾稳定性和信号强度。为了评估开发的nLC-MS平台是否可以应用于连续分析并且喷雾稳定性和方法灵敏度是否可以长时间段维持，mAb分子的nSEC-MS分析和nIEX-MS分析两者在24小时内重复进行，每次进行超过50次运行。如图17所示，在24小时内实现了良好的信号强度和稳定性，nSEC-MS和nIEX-MS分析的CV值分别为6.0％和4.1％。此nLC-MS平台实现的高稳健性可能归因于多喷嘴发射器和IPA辅助的天然MS的应用。前者不仅减少了引入到NSI的液滴的大小，而且还降低了蛋白质沉淀和积累造成堵塞的风险。IPA辅助的天然MS可能通过降低液滴的表面张力进一步提高了去溶剂化效率。

结论

由于对应用各种nLC-MS方法进行蛋白质药物表征的关注和需求日益增加，生物制药界对开发适于工业实验室应用的nLC-MS平台非常关注。在此实例中，公开了新型nLC-MS平台的开发，所述平台可以轻松地与各种nLC方法集成，并且具有出色的通用性、灵敏度和稳健性。通过创新设计，表明开发的平台可以处理各种LC流速(0.1到0.8毫升/分钟)并且耐受高盐浓度(流动相中至多600mM)，这共同促成了适应各种nLC方法的实现的通用性。然后探索了不同的掺杂剂改性的去溶剂化气体，以在此平台上实现在线电荷减少天然MS。随后，Cys连接的ADC模拟物的案例研究展示了应用电荷减少天然MS来表征不稳定和/或异质蛋白质分子的适用性和优势。另外，使用此平台通过nSEC-MS分析和nIEX-MS分析两者对NISTmAb的大小和电荷异质性进行了深入表征，并且表明了大动态范围和高灵敏度。此外，此nLC-MS平台也被证明是高度稳健的，因此适于长时间(>24小时)的连续分析。最后，本平台由所有可商购获得的零件构建，因此其它实验室可以很容易地实施以实现一致的性能。

总体而言，正如在此在不同案例研究中分析单克隆抗体样品所表明的那样，与常规方法相比，开发的方法提供了一种更有效的方法，以更好地支持在药物开发的不同阶段对单克隆抗体表征不断增长的需求。

本发明不限于本文所描述的具体实施例的范围。事实上，除了本文所述的那些之外，本发明的各种修改对于本领域技术人员来说将从前面的描述和附图中变得显而易见。此类修改旨在落入所附权利要求的范围内。

Claims

1.一种天然液相色谱-质谱系统，其包括：

液相色谱系统，所述液相色谱系统能够分离样品；以及

电喷雾电离质谱(ESI-MS)系统，所述ESI-MS系统与所述液相色谱系统流体连通，其中所述ESI-MS系统包括多喷嘴电喷雾电离发射器、用于对去溶剂化气体进行改性的系统以及质谱仪，其中所述质谱仪被配置成接收离子并且表征离子的质荷比。

2.根据权利要求1所述的天然液相色谱-质谱系统，其中所述用于对去溶剂化气体进行改性的系统包括：具有盖的容器，其中所述盖具有入口管线端口和出口管线端口；用于向所述入口管线端口提供鞘气的鞘气入口管线；以及能够将经改性的去溶剂化气体出口管线端口连接到所述多喷嘴电喷雾电离发射器的经改性的去溶剂化气体出口管线。

3.根据权利要求2所述的天然液相色谱-质谱系统，其中所述容器包括有机溶剂和另外的化学组分。

4.根据权利要求3所述的天然液相色谱-质谱系统，其中所述另外的化学组分是酸。

5.根据权利要求4所述的天然液相色谱-质谱系统，其中所述酸是三氟乙酸。

6.根据权利要求3所述的天然液相色谱-质谱系统，其中所述另外的化学组分是碱。

7.根据权利要求6所述的天然液相色谱-质谱系统，其中所述碱是三乙胺。

8.根据权利要求3到7中任一项所述的天然液相色谱-质谱系统，其中所述有机溶剂是乙腈。

9.根据权利要求2到8中任一项所述的天然液相色谱-质谱系统，其中所述鞘气是氮气。

10.根据权利要求2到9中任一项所述的天然液相色谱-质谱系统，其中所述鞘气入口管线部分地插入到所述入口管线端口中。

11.根据权利要求2到10中任一项所述的天然液相色谱-质谱系统，其中所述经改性的去溶剂化气体出口管线部分地插入到所述出口管线端口中。

12.根据权利要求2到11中任一项所述的天然液相色谱-质谱系统，其中所述鞘气从所述鞘气入口管线流动通过所述含有有机溶剂的容器进入所述去溶剂化气体出口管线中。

13.根据权利要求1到12中任一项所述的天然液相色谱-质谱系统，其中所述多喷嘴电喷雾电离发射器包含八个喷嘴。

14.根据权利要求1到13中任一项所述的天然液相色谱-质谱系统，其中所述液相色谱系统包括尺寸排阻色谱(SEC)柱。

15.根据权利要求1到13中任一项所述的天然液相色谱-质谱系统，其中所述液相色谱系统包括离子交换色谱(IEX)柱。

16.根据权利要求1到15中任一项所述的天然液相色谱-质谱系统，其中所述液相色谱-质谱系统进一步包括用于调节从液相色谱仪到所述质谱仪的流速的分析流量分离器。

17.根据权利要求16所述的天然液相色谱-质谱系统，其中所述分析流量分离器能够提供溶剂流速为约1到5微升/分钟的电喷雾。

18.根据权利要求1到17中任一项所述的天然液相色谱-质谱系统，其中所述质谱仪包括轨道阱质量分析仪。

19.一种表征样品中的蛋白质的方法，所述方法包括：

将所述样品供应到能够进行样品分离和碎裂的液相色谱系统；以及

通过使用电喷雾电离质谱(ESI-MS)系统分析碎裂样品以鉴定所述蛋白质的组分，从而表征所述蛋白质，所述ESI-MS系统与所述液相色谱系统流体连通，其中所述ESI-MS系统包括多喷嘴电喷雾电离发射器、用于对去溶剂化气体进行改性的系统以及质谱仪，其中所述质谱仪被配置成接收离子并且表征离子的质荷比。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述蛋白质是抗体、融合蛋白、重组蛋白或其组合。

21.根据权利要求21所述的方法，其中所述抗体是单克隆抗体。

22.根据权利要求22所述的方法，其中同种型IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或混合同种型的所述单克隆抗体。

23.根据权利要求19到23中任一项所述的方法，其中所述方法不需要在将所述样品供应到所述液相色谱系统之前对所述样品中的所述蛋白质进行去糖基化。

24.根据权利要求19到24中任一项所述的方法，其中所述方法用于表征高分子量和低分子量杂质。

25.根据权利要求19到25中任一项所述的方法，其中所述用于对去溶剂化气体进行改性的系统包括：具有盖的容器，其中所述盖具有入口管线端口和出口管线端口；用于向所述入口管线端口提供鞘气的鞘气入口管线；以及能够将经改性的去溶剂化气体出口管线端口连接到所述多喷嘴电喷雾电离发射器的经改性的去溶剂化气体出口管线。

26.根据权利要求26所述的方法，其中所述容器包括有机溶剂和另外的化学组分。

27.根据权利要求27所述的方法，其中所述另外的化学组分是酸。

28.根据权利要求28所述的方法，其中所述酸是三氟乙酸。

29.根据权利要求27所述的方法，其中所述另外的化学组分是碱。

30.根据权利要求30所述的方法，其中所述碱是三乙胺。

31.根据权利要求27到31中任一项所述的方法，其中所述有机溶剂是乙腈。

32.根据权利要求26到32中任一项所述的方法，其中所述鞘气是氮气。

33.根据权利要求27到33中任一项所述的方法，其中所述鞘气入口管线部分地插入到所述入口管线端口中。

34.根据权利要求27到34中任一项所述的方法，其中所述经改性的去溶剂化气体出口管线部分地插入到所述出口管线端口中。

35.根据权利要求27到35中任一项所述的方法，其中所述鞘气从所述鞘气入口管线流动通过所述含有有机溶剂的容器进入所述去溶剂化气体出口管线中。

36.根据权利要求26到36中任一项所述的方法，其中所述多喷嘴电喷雾电离发射器包含八个喷嘴。

37.根据权利要求19到37中任一项所述的方法，其中所述液相色谱系统包括尺寸排阻色谱(SEC)柱。

38.根据权利要求19到37中任一项所述的方法，其中所述液相色谱系统包括离子交换色谱(IEX)柱。

39.根据权利要求29到39中任一项所述的方法，其进一步包括用于调节从液相色谱仪到所述质谱仪的流速的分析流量分离器。

40.根据权利要求40所述的方法，其中所述分析流量分离器能够提供溶剂流速为约1到5微升/分钟的电喷雾。

41.根据权利要求19到41中任一项所述的方法，其中所述质谱仪包括轨道阱质量分析仪。