CN115210574A - 通过液相色谱-质谱法进行高置信度化合物鉴定 - Google Patents
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Abstract
公开了用于改进化合物检测和表征的方法。公开了表征样品的方法。所述方法可以包括将样品提供至能够进行样品分离的液相色谱系统以生成样品组分;通过多路复用靶向选择性离子监测(SIM)分析样品组分以生成包括列表;以及从所述包括列表执行迭代质谱数据相关采集(DDA),以鉴定单个样品组分,从而表征所述样品。在一个实例中,使用多路复用靶向SIM和迭代MS2 DDA采集来增加细胞培养基分析的稳健化合物鉴定。
Description
技术领域
本发明涉及化合物鉴定,尤其涉及一种通过液相色谱-质谱法(LC-MS)进行高置信度化合物鉴定的方法,如用于抗体工艺开发。
背景技术
细胞培养基在抗体生产中起关键作用。深入了解细胞培养基中的单个组分及其代谢物如何影响生产性能是非常合乎需要,也是极具挑战性的。尽管改变了使用化学定义的培养基,但大豆基培养基仍被广泛使用。大豆水解产物的主要组分和杂质已经被证明会影响抗体的生产率和质量。质谱在高度复杂的基质中的化合物定量和鉴定中起重要作用。基于液相色谱-质谱法(LC-MS)的分析可以极大地受益于改进的数据质量,其随后可以以较高置信度和较低模糊度改进表征。
发明内容
在一个方面,本发明提供了一种表征样品的方法,其包含:将样品提供至能够进行样品分离的液相色谱系统以生成样品组分;通过多路复用靶向选择性离子监测(SIM)分析样品组分以生成包括列表;以及从包括列表执行迭代质谱数据相关采集(DDA),以鉴定单个样品组分,从而表征样品。
在一些实施例中,液相色谱系统是反相液相色谱(RPLC)系统。
在一些实施例中,通过多路复用靶向选择性离子监测(SIM)分析电离样品以生成包括列表包含利用离子阱或轨道阱质量分析器。
在一些实施例中,执行迭代质谱数据相关采集(DDA)包含利用配备有分段四极滤质器的离子阱或轨道阱质量分析器。
在一些实施例中,通过多路复用靶向选择性离子监测(SIM)分析样品组分以生成包括列表包含分割质量比窗口设置,其中包括多个段并且每个段具有多个窗口。
在一些实施例中,多个段是三个段。
在一些实施例中,多个段是四个段。
在一些实施例中,多个窗口是10个窗口。
在一些实施例中,段内的每个窗口具有相同的窗口宽度。
在一些实施例中,样品是细胞培养基。
在一些实施例中,细胞培养基是大豆基细胞培养基。
在一些实施例中,细胞培养基用于基于重组细胞的生产系统。
在一些实施例中,该方法用于在与基于重组细胞的生产系统孵育后表征细胞培养基中的组分及其代谢物。
在一些实施例中,基于重组细胞的生产系统是哺乳动物系统。
在一些实施例中,基于重组细胞的生产系统用于蛋白质生产。
在一些实施例中,蛋白质是抗体、融合蛋白、重组蛋白或其组合。
在一些实施例中,抗体是单克隆抗体。
在一些实施例中,单克隆抗体是同种型IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或混合同种型。
还公开了一种用于细胞培养基分析的化合物鉴定方法,其包含:将细胞培养基样品提供至能够进行样品分离的液相色谱系统以生成样品组分;通过多路复用靶向选择性离子监测(SIM)分析样品组分以生成包括列表;以及从包括列表中执行迭代质谱数据相关采集(DDA),以鉴定细胞培养基中的单个化合物。
在一些实施例中,液相色谱系统是反相液相色谱(RPLC)系统。
在一些实施例中,通过多路复用靶向选择性离子监测(SIM)分析碎片化样品以生成包括列表包含利用离子阱或轨道阱质量分析器。
在一些实施例中,执行迭代质谱数据相关采集(DDA)包含利用配备有分段四极滤质器的离子阱或轨道阱质量分析器。
在一些实施例中,通过多路复用靶向选择性离子监测(SIM)分析样品组分以生成包括列表包含分割质量比窗口设置,其中包括多个段并且每个段具有多个窗口。
在一些实施例中,多个段是三个段。
在一些实施例中,多个段是四个段。
在一些实施例中,多个窗口是10个窗口。
在一些实施例中,段内的每个窗口具有相同的窗口宽度。
在一些实施例中,细胞培养基是大豆基细胞培养基。
在一些实施例中,细胞培养基用于基于重组细胞的生产系统。
在一些实施例中,细胞培养基样品是在与基于重组细胞的生产系统孵育后获得的细胞培养基样品。
在一些实施例中,基于重组细胞的生产系统是哺乳动物系统。
在一些实施例中,基于重组细胞的生产系统用于蛋白质生产。
在一些实施例中,蛋白质是抗体、融合蛋白、重组蛋白或其组合。
在一些实施例中,抗体是单克隆抗体。
在一些实施例中,单克隆抗体是同种型IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或混合同种型。
在各个实施例中,上文或本文所讨论的实施例的特征或组分中的任何特征或组分可以组合,并且此类组合涵盖在本公开的范围内。上文或本文中所论述的任何特定值可以与上文或本文中所论述的另一相关值组合以列举范围,其中该值表示该范围的上限和下限,并且此类范围和落在此类范围内的所有值涵盖在本公开的范围内。上文或本文所讨论的值中的每一个都可以1%、5%、10%或20%的变化表示。通过阅读随后的具体实施方式,其它实施例将变得显而易见。
附图说明
图1示出了根据本文公开的实施例的说明两种类型的MS1数据采集的示意图:(1)传统的全扫描MS1采集和(2)靶向SIM MS1采集。如图所示,靶向SIM MS1采集允许检测到较低丰度的物种。
图2示出了说明示例性可调窗口选择协议的示意图。
图3示出了根据本文公开的实施例的在常规全扫描MS1采集(上图)或可调窗口SIMMS1采集(下图)之后采集的MS1谱。
图4示出了根据本文公开的实施例的说明两种类型的MS2 DDA的示意图:(1)常规DDA MS2采集和(2)迭代MS2 DDA平台采集。
图5示出了与仅选择和碎片化高丰度物种的常规MS2 DDA相比,选择和碎片化更多物种的迭代MS2 DDA结果。
图6示出了比较表征样品的传统方法以及根据本文公开的实施例的使用可调窗口SIM采集和迭代MS2 DDA的组合的示意图。
图7示出了说明与全扫描MS相比,可调窗口SIM采集的稳健性和增加的灵敏度的表格。随着化合物浓度的降低,检测特定分子的能力取决于所用的方法。可调窗口SIM采集能够在比全扫描MS更低的浓度下检测分子。
图8示出了说明迭代MS2 DDA的强度的曲线图。最上面的一行表示滤质器排除列表上的条目数,而最下面的一行是滤质器包括列表上的条目数,每个条目与迭代进样相关。如图所示,随着迭代进样次数的增加,物种的排除列表增加,而包括列表减少,这反过来又允许较低丰度的物种被碎片化并提供了一种稳健的、高灵敏度的检测方法。
具体实施方式
在描述本发明之前,应当理解,本发明不限于所描述的特定方法和实验条件,因为此类方法和条件可以变化。还应理解,本文所使用的术语仅出于描述具体实施方案的目的,而不旨在是限制性的,因为本发明的范围仅受所附权利要求书限制。任何实施例或实施例的特征可以彼此组合,并且此类组合明确地涵盖在本发明的范围内。
除非另外定义,否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。如本文所使用的,当用于提及具体所列举的数值时,术语“约”意指数值可以与所引用的值相差不超过1%。例如,如本文所使用的,表述“约100”包含99和101以及其之间的所有值(例如,99.1、99.2、99.3、99.4等)。
如本文所用,术语“包括(include)”、“包括(includes)”和“包括(including)”旨在是非限制性的,并且应理解为分别意指“包含(comprise)”、“包含(comprises)”和“包含(comprising)”。
尽管在本发明的实践或测试中可以使用类似于或等同于本文所描述的方法和材料的任何方法和材料,但现在描述优选的方法和材料。本说明书中提及的所有专利、申请和非专利出版物均通过引用整体并入本文。
本文使用的缩写
ACN:乙腈
CHO:中国仓鼠卵巢
CQA:关键质量属性
CV:变异系数
DDA:数据相关采集
EIC:提取离子色谱仪
ESI-MS:电喷雾电离质谱
FA:甲酸
HC:重链
HILIC:亲水相互作用液相色谱
HMW:高分子量
IgG:免疫球蛋白G
IPA:异丙醇
LC:轻链
LC-MS:液相色谱-质谱法
LMW:低分子量
mAb:单克隆抗体
MS:质谱
MW:分子量
M/Z:质荷比
NCE:归一化碰撞能量
PK:药代动力学
PQA:产品质量属性
PTM:翻译后修饰
RP-LC:反相液相色谱
SIM:选择性离子监测
定义
如本文所用,术语“蛋白质”包括具有共价连接的酰胺键的任何氨基酸聚合物。蛋白质包含一个或多个氨基酸聚合物链,在本领域中通常称为“多肽”。“多肽”是指由通过肽键连接的氨基酸残基、其相关的天然存在的结构变体和合成的非天然存在的类似物,其相关的天然存在的结构变体和合成的非天然存在的类似物组成的聚合物。“合成肽或多肽”是指非天然存在的肽或多肽。合成肽或多肽可以例如使用自动化多肽合成仪来合成。各种固相肽合成方法是本领域技术人员已知的。蛋白质可以含有一种或多种多肽以形成单一功能的生物分子。蛋白质可以包括任何生物治疗性蛋白、用于研究或治疗的重组蛋白、trap蛋白和其它嵌合受体Fc-融合蛋白、嵌合蛋白、抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、人抗体和双特异性抗体。在另一个示例性方面,蛋白质可以包括抗体片段、纳米抗体、重组抗体嵌合体、细胞因子、趋化因子、肽激素等。可以使用基于重组细胞的生产系统,如昆虫杆状病毒系统、酵母系统(例如,毕赤酵母(Pichia sp.))、哺乳动物系统(例如,CHO细胞和CHO衍生物,如CHO-K1细胞)生产蛋白质。关于讨论生物治疗性蛋白质及其生产的最近综述,参见Ghaderi等人,《生物治疗性糖蛋白的生产平台。非人类唾液酸化的发生、影响和挑战(Productionplatforms for biotherapeutic glycoproteins.Occurrence,impact,and challengesof non-human sialylation)》(《生物技术与基因工程评论(Biotechnol.Genet.Eng.Rev.)》(2012)147-75)。在一些实施例中,蛋白质包含修饰、加合物和其它共价连接的部分。这些修饰、加合物和部分包括例如抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、生物素、聚糖(例如,N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、神经氨酸、N-乙酰葡糖胺、岩藻糖、甘露糖和其它单糖)、PEG、聚组氨酸、FLAGtag、麦芽糖结合蛋白(MBP)、几丁质结合蛋白(CBP)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)myc-表位、荧光标记和其它染料等。蛋白质可以基于组成和溶解度进行分类,并且因此可以包括简单的蛋白质,如球状蛋白质和纤维状蛋白质;缀合蛋白质,如核蛋白、糖蛋白、粘蛋白、色蛋白、磷蛋白、金属蛋白和脂蛋白;以及衍生蛋白质,如初级衍生蛋白质和次级衍生蛋白质。
本文所用的“变体蛋白质”或“蛋白质变体”或“变体”可以包括由于至少一个氨基酸修饰而不同于靶蛋白质的蛋白质。蛋白质变体可以指蛋白质本身、包含蛋白质的组合物或编码它的氨基序列。优选地,蛋白质变体与亲本蛋白质相比具有至少一个氨基酸修饰,例如与亲本相比约一个至约十个氨基酸修饰,并且优选地约一个至约五个氨基酸修饰。本文的蛋白质变体序列优选地与亲本蛋白质序列具有至少约80%同源性,并且最优选地至少约90%同源性,更优选地至少约95%同源性。在一些示例性实施例中,蛋白质可以是抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、抗体片段、单克隆抗体或其组合。
本文所用的术语“抗体”是指由四条多肽链组成的免疫球蛋白分子,两条重链(H)和两条轻链(L)通过二硫键相互连接(即“全抗体分子”),以及其多聚体(例如IgM)或其抗原结合片段。每条重链由重链可变区(“HCVR”或“VH”)和重链恒定区(由结构域CH1,CH2和CH3组成)组成。在各种实施例中,重链可以是IgG同种型。在一些情况下,重链选自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在一些实施例中,重链是同种型IgG1或IgG4,任选地包括同种型IgG1/IgG2或IgG4/IgG2的嵌合铰链区。每条轻链由轻链可变区(“LCVR或“VL”)和轻链恒定区(CL)组成。VH区和VL区可以被进一步细分成被称作互补决定区(CDR)的高变区,其间散布着更保守的被称作构架区(FR)的区。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成,从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。术语“抗体”包括提及任何同种型或亚类的糖基化和非糖基化免疫球蛋白。术语“抗体”包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的抗体分子,如从转染以表达抗体的宿主细胞中分离的抗体。关于抗体结构的综述,参见Lefranc等人,《免疫球蛋白和T细胞受体可变结构域和Ig超家族V样结构域的IMGT唯一编号(IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variabledomains and Ig superfamily V-like domains)》,27(1)《发育与比较免疫学(Dev.Comp.Immunol.)》55-77(2003);和M.Potter,《免疫球蛋白多样性的结构相关性(Structural correlates of immunoglobulin diversity)》,2(1)《生存蛋白免疫学研究(Surv.Immunol.)》Res.)》27-42(1983)。
术语抗体还包括“双特异性抗体”,其包括可以结合一种以上不同表位的异四聚体免疫球蛋白。包括单个重链和单个轻链和六个CDR的双特异性抗体的一半与一个抗原或表位结合,另一半抗体与不同的抗原或表位结合。在一些情况下,双特异性抗体可以结合相同的抗原,但是在不同的表位或非重叠的表位。在一些情况下,两半的双特异性抗体具有相同的轻链,同时保持双重特异性。双特异性抗体总体上描述于美国专利申请公开第2010/0331527号(2010年12月30日)。
术语抗体的“抗原结合部分”(或“抗体片段”)是指保留特异性结合抗原的能力的抗体的一个或多个片段。涵盖在抗体的术语“抗原结合部分”内的结合片段的实例包括(i)Fab片段,由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段;(ii)F(ab′)2片段,包含通过铰链区的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段;(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段;(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段,(v)dAb片段(Ward等人(1989)《自然(Nature)》241:544-546),其由VH结构域组成,(vi)分离的CDR,以及(vii)scFv,其由Fv片段的两个结构域VL和VH组成,通过合成接头连接以形成单个蛋白质链,其中VL和VH区配对以形成单价分子。术语“抗体”也涵盖其它形式的单链抗体,如双抗体(参见例如,Holliger等人(1993)90,《美国国家科学院学报(PNAS U.S.A.)》6444-6448;和Poljak等人(1994)2,《结构(Structure)》1121-1123)。
此外,可以使用本领域通常已知的标准重组DNA技术获得抗体及其抗原结合片段(参见Sambrook等人,1989)。在转基因小鼠中生成人抗体的方法也是本领域已知的。例如,使用技术(参见,例如,US 6,596,541,再生元制药公司(RegeneronPharmaceuticals),)或用于生成单克隆抗体的任何其它已知方法,最初分离针对所需抗原的高亲和力嵌合抗体,其具有人可变区和小鼠恒定区。技术涉及具有基因组的转基因小鼠的产生,所述基因组包括可操作地连接到内源性小鼠恒定区基因座的人重链可变区和人轻链可变区,使得小鼠响应于抗原性刺激而产生包括人可变区和小鼠恒定区的抗体。对抗体的重链可变区和轻链可变区进行编码的DNA被分离,并且可操作连接到对人重链恒定区和人轻链恒定区进行编码的DNA。然后在能够表达完全人抗体的细胞中表达DNA。
术语“人抗体”旨在包括具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人mAb可包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如,通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变),例如在CDR中,特别是在CDR3中。然而,如本文所用,术语“人抗体”不旨在包括其中衍生自另一种哺乳动物物种(例如小鼠)的种系的CDR序列已经移植到人FR序列上的mAb。该术语包括在非人哺乳动物或非人哺乳动物细胞中重组产生的抗体。该术语不旨在包括从人受试者分离或在人受试者中产生的抗体。
如本文所用,术语“受试者”是指例如需要改善、预防和/或治疗疾病或病症的动物,优选哺乳动物,更优选人。
如本文所用,术语“杂质”可以包括生物制药产物中存在的任何不需要的蛋白质。杂质可以包括与工艺和产物相关的杂质。杂质还可以是已知结构、部分表征或未鉴定的。与工艺相关的杂质可以源自制造工艺并且可以包括三个主要类别:细胞底物来源、细胞培养物来源和下游来源。细胞底物来源的杂质包括但不限于源自宿主生物体的蛋白质和核酸(宿主细胞基因组、载体或总DNA)。细胞培养物来源的杂质包括但不限于诱导剂、抗生素、血清和其它培养基组分。下游来源的杂质包括但不限于酶、化学和生物化学处理试剂(例如,溴化氰、胍、氧化剂和还原剂)、无机盐(例如,重金属、砷、非金属离子)、溶剂、载体、配体(例如,单克隆抗体)和其它可浸出物。与产物相关的杂质(例如,前体、某些降解产物)可以是在制造和/或储存期间产生的分子变体,其在活性、功效和安全性方面不具有与所需产物的那些相当的性质。此类变体可能需要在分离和表征方面的相当大的努力以鉴定修饰的类型。与产物相关的杂质可以包括截短形式、修饰形式和聚集体。截短形式由水解酶或催化肽键裂解的化学物质形成。修饰形式包括但不限于脱酰胺化、异构化、错配的S-S连接、氧化或改变的缀合形式(例如,糖基化、磷酸化)。修饰形式还可以包括任何翻译后修饰形式。聚集体包括所需产物的二聚体和更高倍数(Q6B规格:生物技术/生物产物的测试程序和验收标准,ICH 1999年8月,美国卫生和人类服务部(U.S.Dept.of Health and Humans Services))。
术语“低分子量(LMW)蛋白质药物杂质”包括但不限于前体、降解产物、截短的物种、包括Fab片段的蛋白水解片段、Fc或重链片段、配体或受体片段、H2L(2条重链和1条轻链)、H2(2条重链)、HL(1条重链和1条轻链)、HC(1条重链)和LC(1条轻链)物种。LMW蛋白质药物杂质可以是蛋白质产物的不完全形式的任何变体,如多聚体蛋白质的一种或多种组分。蛋白质药物杂质、药物杂质或产物杂质是在整个说明书中可互换使用的术语。LMW药物或产物杂质通常被认为是具有可能不同于所需药物产物的如活性、功效和安全性等性质的分子变体。
在细胞培养系统中生产蛋白质药物产物的过程中,蛋白质产物的降解是有问题的。例如,蛋白质产物的蛋白水解可能由于细胞培养基中蛋白酶的释放而发生。培养基添加剂,如添加以抑制金属蛋白酶的可溶性铁源,或丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶抑制剂,已经在细胞培养中实施以防止降解(Clincke,M.-F.等人,《英国医学委员会会议录(BMC Proc.)》2011,5,P115)。C-末端片段可以在生产期间由于细胞培养物中的羧基肽酶而裂解(Dick,LW等人,《生物技术与生物工程(Biotechnol Bioeng)》2008;100:1132-43)。
术语“高分子量(HMW)蛋白质药物杂质”包括但不限于mAb三聚体和mAb二聚体。HMW物种可以分为两组:1)具有额外轻链的单体(H2L3和H2L4物种)和2)单体加Fab片段复合物。另外,在用IdeS酶消化处理后,形成不同的二聚化片段(Fab2-Fab2、Fc-Fc和Fab2-Fc)。
“翻译后修饰”(PTM)是指蛋白质生物合成后蛋白质的共价修饰。翻译后修饰可以在氨基酸侧链上或在蛋白质的C-或N-末端发生。PTM通常通过特异性酶或酶途径引入。许多发生在蛋白质主链内的特定特征性蛋白质序列(例如,特征序列)的位点处。已经记录了数百种PTM,并且这些修饰总是影响蛋白质结构或功能的某些方面(Walsh,G.《蛋白质(Proteins)》(2014)第二版,由威利父子出版公司(Wiley and Sons,Ltd.)出版,ISBN:9780470669853)。各种翻译后修饰包括但不限于裂解、N-末端延伸、蛋白质降解、N-末端的酰化、生物素酰化(用生物素酰化赖氨酸残基)、C-末端的酰胺化、糖基化、碘化、辅基的共价连接、乙酰化(通常在蛋白质的N-末端添加乙酰基)、烷基化(通常在赖氨酸或精氨酸残基处添加烷基(例如甲基、乙基、丙基))、甲基化、腺苷酸化、ADP-核糖基化、多肽链内或多肽链之间的共价交联、磺化、异戊烯化、维生素C依赖性修饰(脯氨酸和赖氨酸羟基化和羧基末端酰胺化)、维生素K依赖性修饰(其中维生素K是谷氨酸残基羧基化中的辅因子,导致形成γ-羧基谷氨酸(glu残基))、谷氨酸化(谷氨酸残基的共价连接)、甘氨酸化(甘氨酸残基的共价连接)、糖基化(向天冬酰胺、羟赖氨酸、丝氨酸或苏氨酸添加糖基,产生糖蛋白)、异戊二烯化(添加类异戊二烯基团,如法尼醇和香叶基香叶醇)、脂酰化(硫辛酸酯官能团的附接)、磷酸泛酰巯基乙胺化(添加来自辅酶A的4′-磷酸泛酰巯基乙胺基部分,如在脂肪酸、聚酮化合物、非核糖体肽和亮氨酸生物合成中)、磷酸化(添加磷酸基团,通常添加至丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸或组氨酸)和硫酸化(添加硫酸基团,通常添加至酪氨酸残基)。改变氨基酸化学性质的翻译后修饰包括但不限于瓜氨酸化(例如,通过脱亚胺将精氨酸转化成瓜氨酸)和脱酰胺化(例如,将谷氨酰胺转化成谷氨酸或将天冬酰胺转化成天冬氨酸)。涉及结构变化的翻译后修饰包括但不限于二硫桥(两个半胱氨酸氨基酸的共价连接)的形成和蛋白水解裂解(蛋白质在肽键处的裂解)。某些翻译后修饰涉及添加其它蛋白质或肽,如ISG酰化(与ISG15蛋白(干扰素刺激基因)的共价连接)、SUMO酰化(与SUMO蛋白(小泛素相关的修饰基因)的共价连接)和泛素化(与蛋白泛素的共价连接)。有关由蛋白质数据库UniProt管理的PTM的更详细的受控词汇表,请参见www.uniprot.org/docs/ptmlist。
本文所用的术语“糖肽/糖蛋白”是在其合成期间或之后具有共价键合的碳水化合物或聚糖的修饰的肽/蛋白质。在某些实施例中,糖肽获自单克隆抗体,例如获自单克隆抗体的蛋白酶消化物。
本文所用的术语“聚糖”是包含一个或多个糖单元的化合物,这些糖单元通常包括葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)、岩藻糖(Fuc)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和N-乙酰神经氨酸(NeuNAc)(Frank Kjeldsen等人《分析化学(Anal.Chem.)》2003,75,2355-2361)。如单克隆抗体等糖蛋白中的聚糖部分是鉴定其功能或细胞位置的重要特征。例如,用特定的聚糖部分修饰特定的单克隆抗体。
如本文所用,术语“样品”是指细胞培养基内的此类组分的分子的混合物,其根据本发明的方法进行处理,包括例如分离、分析或剖析。样品可以包含至少一种分析物分子,例如糖肽,如从单克隆抗体获得的糖肽,其根据本发明的方法进行处理,包括例如分离、分析、提取、浓缩或剖析。
本文所用的术语“分析(analysis)”或“分析(analyzing)”可互换使用,并且是指分离、检测、隔离、纯化、溶解、检测和/或表征感兴趣分子的各种方法中的任何一种。实例包括但不限于固相萃取、固相微萃取、电泳、质谱,例如多路复用靶向选择性离子监测(SIM)-MS,随后是迭代MS2 DDA、ESI-MS、SPE HILIC或MALDI-MS、液相色谱,例如高性能,例如反相、正相或尺寸排阻、离子对液相色谱、液液萃取,例如加速流体萃取、超临界流体萃取、微波辅助萃取、膜萃取、索氏萃取、沉淀、澄清、电化学检测、染色、元素分析、埃德曼降解、核磁共振、红外分析、流动注射分析、毛细管电色谱、紫外检测及其组合。
如本文所用,术语“剖析”是指组合使用以提供如蛋白质等化合物的含量、组成或特征比率的各种分析方法中的任一种。
如本文所用,“接触”包括将溶液或固相中的至少两种物质结合在一起。
本文所用的“肽作图分析”包括其中对蛋白质进行消化,然后分离所得肽并优选地使用LC-MS对其进行分析的实验。在一些示例性实施例中,可以应用肽作图分析来证实蛋白质生物药物的一级序列,其中可以首先使用水解剂将蛋白质分子水解成小肽片段,然后通过LC-MS分析,考虑cDNA预测的序列和所用蛋白酶的特异性来确定每个肽片段的氨基酸序列。来自肽作图分析的数据也可用于鉴定和定量翻译后修饰,证实二硫键连接,甚至检测以非常低的水平(<0.1%)存在的氨基酸取代事件(Zeck等人《公共科学图书馆期刊(PloSone)》2012,7,e40328)。在蛋白质生物药物的肽作图分析期间,LC-MS通常可以与紫外(UV)检测结合进行以生成所谓的UV指纹图谱,其可以单独用作质量控制(QC)和药物释放期间的鉴定测定。
如本文所用,术语“消化”是指蛋白质的一个或多个肽键的水解。使用合适的水解剂对样品中的蛋白质进行消化有几种方法,例如酶消化或非酶消化。如本文所用,术语“水解剂”是指能够进行蛋白质消化的大量不同试剂中的任一种或组合。可以进行酶消化的水解剂的非限制性实例包括胰蛋白酶、胞内蛋白酶Arg-C、胞内蛋白酶Asp-N、胞内蛋白酶Glu-C、外膜蛋白酶T(OmpT)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的免疫球蛋白降解酶(IdeS)、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、链霉蛋白酶和来自佐氏曲霉(Aspergillus Saitoi)的蛋白酶。可以进行非酶消化的水解剂的非限制性实例包括使用高温、微波、超声、高压、红外、溶剂(非限制性实例为乙醇和乙腈)、固定化酶消化(IMER)、磁性颗粒固定化酶和芯片上固定化酶。关于讨论蛋白质消化的可用技术的最近综述,参见Switazar等人,《蛋白质消化:可用技术和最近发展的概述(Protein Digestion:AnOverview of the Available Techniques and Recent Developments)》(《蛋白质组学研究杂志(J.Proteome Research)》2013,12,1067-1077)。水解剂的一种或组合可以以序列特异性方式裂解蛋白质或多肽中的肽键,生成可预测的较短肽的集合。
有几种方法可用于消化蛋白质。一种被广泛接受的消化样品中蛋白质的方法包括蛋白酶的使用。许多蛋白酶是可用的,并且它们中的每一种在特异性、效率和最佳消化条件方面具有其自身的特征。蛋白酶指内肽酶和外肽酶两者,根据蛋白酶在肽的非末端或末端氨基酸处裂解的能力进行分类。替代地,蛋白酶也指六个不同的类别-天冬氨酸、谷氨酸和金属蛋白酶、半胱氨酸、丝氨酸和苏氨酸蛋白酶,如根据催化机制分类的。术语“蛋白酶”和“肽酶”可互换使用,是指水解肽键的酶。蛋白酶也可以分为特异性和非特异性蛋白酶。如本文所用,术语“特异性蛋白酶”是指具有在肽的特定氨基酸侧链处裂解肽底物的能力的蛋白酶。如本文所用,术语“非特异性蛋白酶”是指在肽的特定氨基酸侧链处裂解肽底物的能力降低的蛋白酶。裂解偏好可以基于作为裂解位点的特定氨基酸的数目与蛋白质序列中裂解的氨基酸的总数的比率来确定。
可以任选地在表征之前制备蛋白质。在一些示例性实施例中,蛋白质制备包括蛋白质消化步骤。在一些具体的示例性实施例中,蛋白质制备包括蛋白质消化步骤,其中蛋白质消化可以使用胰蛋白酶进行。
在一些示例性实施例中,在蛋白质消化步骤之前,蛋白质制备可以包括使蛋白质变性、还原蛋白质、缓冲蛋白质和/或使样品脱盐的步骤。这些步骤可以根据需要以任何合适的方式完成。
为了使用肽作图分析或完整质量分析提供不同蛋白质属性的表征,可以进行多种基于LC-MS的测定。
如本文所用,术语“液相色谱”是指其中由液体携带的化学混合物可以由于化学实体在固定液相或固相周围或上方流动时的差异分布而分离成组分的过程。液相色谱的非限制性实例包括反相液相色谱、离子交换色谱、尺寸排阻色谱、亲和色谱和疏水色谱。
如本文所用,术语“质谱仪”是指能够检测特定分子种类并精确测量其质量的装置。该术语可以意指包括可以将多肽或肽洗脱到其中以进行检测和/或表征的任何分子检测器。质谱仪由三个主要部分组成:离子源、质量分析器和检测器。离子源的作用是产生气相离子。分析物原子、分子或簇可以转移到气相中并同时电离(如在电喷雾电离中)。离子源的选择取决于应用场合。
如本文所用,“质量分析器”是指可以根据物质的质量分离物种(即,原子、分子或簇)的装置。可以使用的质量分析器的非限制性实例是飞行时间(TOF)、磁/电扇区、四极滤质器(Q)、四极离子阱(QIT)、轨道阱、傅立叶变换离子回旋共振(FTICR),以及加速器质谱(AMS)技术。
如本文所用,“质荷比”或“m/z”用于表示通过将统一原子质量单位的离子质量除以其电荷数(无论符号如何)而形成的无量纲量。通常,电荷状态取决于:电离方法(如电喷射电离,ESI倾向于促进多重电离,这在MALDI中是不常见的)、肽长度(如较长的肽具有更多的基团,其中可以附接额外质子(碱性残基))、肽序列(如一些氨基酸(例如,Arg或Lys)比其它氨基酸更容易电离)、仪器设置、溶剂pH和溶剂组成。
如本文所用,术语“串联质谱”是指可以通过使用多级质量选择和质量分离获得样品分子的结构信息的技术。先决条件是样品分子可以转移到气相中并完整地电离,并且它们可以在第一质量选择步骤之后被诱导以某种可预测和可控制的方式分裂。可以通过首先选择和分离前体离子(MS2)、将其碎片化、分离初级碎片离子(MS3)、将其碎片化、分离次级碎片(MS4)等来进行多级MS/MS或MSn,只要可以获得有意义的信息或碎片离子信号是可检测的。串联MS已经用多种分析器组合成功地执行。可以通过如灵敏度、选择性和速度,以及尺寸、成本和可用性等许多不同因素来确定针对特定应用场合组合哪些分析器。串联MS方法的两个主要类别是空间串联和时间串联,但也存在其中时间串联分析器在空间或与空间串联分析器耦接的混合。
一种空间串联质谱仪包含离子源、前体离子激活装置和至少两个非捕获质量分析器。可以设计特定的m/z分离函数,使得在仪器的一个部分中选择离子,在中间区域中解离,然后将产物离子传输到另一个分析器进行m/z分离和数据采集。
在时间串联质谱仪中,在离子源中产生的离子可以在同一物理装置中被捕获、分离、碎片化和m/z分离。
本文所用的“靶向质谱”是一种在特定时间对特定质量(m/z)的离子使用多级串联质谱(n=2或3的MSn)的质谱技术。m/z和时间的值在从先前分析导出的包括列表中定义。
如本文所用,术语“四极-轨道阱混合质谱仪”是指通过将四极质谱仪耦接到轨道阱质量分析器而制成的混合系统。使用四极-轨道阱混合质谱仪的串联实时实验开始于从四极质谱仪喷射除在选定的窄m/z范围内的离子之外的所有离子。选定的离子可以被插入到轨道阱中并且最经常通过低能量CID进行碎片化。在阱的m/z接受范围内的片段应该保留在阱中,并且可以获得MS-MS谱。类似的杂交系统可用于快速蛋白质测序,例如但不限于QIT-FTICR和Qq-FTICR。
如本文所用,术语“蛋白质从头测序”是指在不依赖于从其它来源获得的信息的情况下测定肽的氨基酸序列的程序。由于质谱分析的高灵敏度,该技术可以提供经常超出常规测序方法能力的重要信息。
如本文所用,术语“蛋白质序列覆盖率”是指被鉴定的肽覆盖的蛋白质序列的百分比。覆盖率百分比可以通过将所有发现的肽中的氨基酸数目除以整个蛋白质序列中的氨基酸总数来计算。
如本文所用,术语“数据库”是指生物信息学工具,其提供了针对数据库中的所有可能序列搜索未解释的MS-MS谱的可能性。此类工具的非限制性实例是Mascot(www.matrixscience.com)、Spectrum Mill(www.chem.agilent.com)、PLGS(www.waters.com)、PEAKS(www.bioinformaticssolutions.com)、Proteinpilot(download.appliedbiosystems.com//proteinpilot)、Phenyx(www.phenyx-ms.com)、Sorcerer(www.sagenresearch.com)、OMSSA(www.pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/omssa/)、X!Tandem(www.thegpm.org/TANDEM/)、Protein Prospector(www.prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm)、Byonic(www.proteinmetrics.com/products/byonic)或Sequest(fields.scripps.edu/sequest)。
一般说明
从上文可以理解,需要改进的方法和系统来改进化合物检测和表征。所公开的发明满足了该需要。本文公开了通过液相色谱-质谱法(LC-MC)进行高置信度化合物鉴定的方法,如用于抗体工艺开发。本文所公开的实施例通过组合多路复用靶向SIM和迭代MS2 DDA采集来提供用于稳健、高灵敏度样品表征的方法。
在一些示例性实施例中,该方法包括将样品提供至能够进行样品分离的液相色谱系统以生成样品组分;通过多路复用靶向选择性离子监测(SIM)分析样品组分以生成包括列表;以及从包括列表执行迭代质谱数据相关采集(DDA),以鉴定单个样品组分,从而表征样品。
在一些实施例中,将样品提供至能够进行样品分离的液相色谱系统以生成样品组分包含将样品提供至反相液相色谱(RPLC)系统、离子交换色谱系统、尺寸排阻色谱系统、亲和色谱系统、亲水相互作用色谱系统或疏水色谱系统。
在一些实施例中,液相色谱系统是RPLC系统。在一些特定实施例中,使用SupelcoDiscovery HS F5-3柱进行RPLC分析。在整个色谱运行中,例如使用商业柱加热器,柱温可以保持在恒定温度。在一些实施例中,柱保持在约18℃至约70℃之间的温度,例如约30℃至约60℃、约40℃至约50℃,例如约20℃、约25℃、约30℃、约35℃、约40℃、约45℃、约50℃、约55℃、约60℃、约65℃或约70℃的温度。在一些实施例中,柱温为约40℃。在一些实施例中,运行时间可以为约15至约240分钟,例如约20至约70分钟、约30至约60分钟、约40至约90分钟、约50分钟至约100分钟、约60至约120分钟、约50至约80分钟。
在一些实施例中,流动相是水性流动相。代表性的水性流动相含有140mM乙酸钠和10mM碳酸氢铵。UV迹线通常在215和280nm处记录。
在一些示例性实施例中,用于洗脱蛋白质的流动相可以是与质谱仪相容的流动相。
在一些示例性实施例中,用于液相色谱装置的流动相可以包括水、乙腈、三氟乙酸、甲酸或其组合。
在一些示例性实施例中,流动相在液相色谱装置中可以具有约0.1ml/分钟至约0.4ml/分钟的流速。在一个方面,液相色谱装置中流动相的流速可以为约0.1ml/分钟、约0.15ml/分钟、约0.20ml/分钟、约0.25ml/分钟、约0.30ml/分钟、约0.35ml/分钟或约0.4ml/分钟。
在一些实施例中,通过多路复用靶向选择性离子监测(SIM)分析样品组分以生成包括列表包含利用离子阱或轨道阱质量分析器。在一些实施例中,离子阱或轨道阱质量分析器是Thermo Q Exactive HF轨道阱质谱仪。
在一些实施例中,通过多路复用靶向选择性离子监测(SIM)分析样品组分以生成包括列表包含分割质量比窗口设置,其中包括多个段并且每个段具有多个窗口。在一些实施例中,使用至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或更多个段。在一些实施例中,使用三个段。在一些实施例中,使用四个段。
在一些实施例中,每个段包括相同宽度的多个窗口。在一些实施例中,使用至少2个或更多个窗口,例如使用至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个窗口。在一些实施例中,每个段包括10个窗口。
在一些实施例中,窗口宽度在多个段之间变化。例如,最感兴趣的m/z范围内的窗口宽度比不太感兴趣的窗口宽度窄。在一些实施例中,段一和段二具有比段三和段四更窄的窗口宽度。例如,如图2所示,示例性的组可以包括从60至760.5m/z的四个段:段1,60m/z至155.5m/z,窗口宽度为10Da;段2,155m/z至250.5m/z,窗口宽度为10Da;段3,250m/z至505.5m/z,窗口宽度为25Da;和段4,505.5m/z至760.5m/z,窗口宽度为25Da,其中每个段包括10个窗口和相邻窗口之间的0.5Da重叠。
在实施例中,在生成包括列表之后,该方法包括从包括列表执行迭代MS2 DDA,以鉴定单个样品组分,从而表征样品。
在一些示例性实施例中,迭代MS DDA利用配备有分段四极滤质器的离子阱或轨道阱质量分析器。
在一些示例性实施例中,迭代MS DDA利用市售离子阱或轨道阱质量分析器,其配备有分段四极滤质器,如Thermo OrbitrapTMFusion Lumos质谱仪。
在一些示例性实施例中,在迭代MS DDA之后处理数据,例如通过使用
在一些实施例中,样品是细胞培养基,如补料分批细胞培养、连续细胞培养或灌注细胞培养中使用的细胞培养基。
在一些实施例中,样品细胞培养基是大豆基细胞培养基。
在一些示例性实施例中,细胞培养基用于基于重组细胞的生产系统,如哺乳动物系统。在一些实施例中,
在一些实施例中,该方法用于在与基于重组细胞的生产系统孵育之前或之后表征细胞培养基中的组分及其代谢物。在一些实施例中,基于重组细胞的生产系统用于蛋白质生产。示例性蛋白质包括但不限于抗体、融合蛋白、重组蛋白或其组合。
在一些实施例中,抗体是双特异性抗体、抗体片段或多特异性抗体。
在一些示例性实施例中,抗体是单克隆抗体,例如但不限于同种型IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或混合同种型的单克隆抗体。
在一些示例性实施例中,蛋白质是治疗性蛋白质。
在一些示例性实施例中,蛋白质可以是免疫球蛋白。
在一个示例性实施例中,蛋白质可以是蛋白质变体。
在一个示例性实施例中,蛋白质可以是翻译后修饰的蛋白质。
在一个示例性实施例中,翻译后修饰的蛋白质可以通过裂解、N-末端延伸、蛋白质降解、N-末端的酰化、生物素酰化、C-末端的酰胺化、氧化、糖基化、碘化、辅基的共价连接、乙酰化、烷基化、甲基化、腺苷酸化、ADP-核糖基化、多肽链内或多肽链之间的共价交联、磺化、异戊烯化、维生素C依赖性修饰、维生素K依赖性修饰、谷氨酸化、甘氨酸化、糖基化、去糖基化、异戊二烯化、脂酰化、磷酸泛酰巯基乙胺化、磷酸化、硫酸化、瓜氨酸化、脱酰胺化、二硫桥的形成、蛋白水解裂解、ISG酰化、SUMO酰化或泛素化(与蛋白质泛素的共价连接)形成。
在一个示例性实施例中,翻译后修饰的蛋白质可以在蛋白质氧化时形成。
在另一个示例性实施例中,细胞培养基可以包括降解产物,如治疗性蛋白质的翻译后修饰。
在一些示例性实施例中,蛋白质可以是pI在约4.5至约9.0范围内的蛋白质。在一个方面,蛋白质可以是pI为约4.5、约5.0、约5.5、约5.6、约5.7、约5.8、约5.9、约6.0、约6.1、约6.2、约6.3、约6.4、约6.5、约6.6、约6.7、约6.8、约6.9、约7.0、约7.1、约7.2、约7.3、约7.4、约7.5、约7.6、约7.7、约7.8、约7.9、约8.0、约8.1、约8.2、约8.3、约8.4、约8.5、约8.6、约8.7、约8.8、约8.9或约9.0的蛋白质。
在一些实施例中,所鉴定的组分包括但不限于氨基酸、二肽、三肽或其组合,其丰度动态范围为至少2个数量级,如至少3个数量级、至少4个数量级或更大。在一些实施例中,所鉴定的组分包括图7中提供的一种或多种化合物。
在一些示例性实施例中,检测到的一种或多种化合物/组分可以包括一种或多种与产物相关的杂质。示例性的与产物相关的杂质可以是但不限于分子变体、前体、降解产物、碎片化蛋白质、消化产物、聚集体、翻译后修饰形式或其组合。
在一些具体的示例性实施例中,检测到的一种或多种化合物/组分可以是与工艺相关的杂质。与工艺相关的杂质可以包括来源于制造工艺的杂质,例如,核酸和宿主细胞蛋白、抗生素、血清、其它培养基组分、酶、化学和生物化学处理试剂、无机盐、溶剂、载体、配体制造工艺中使用的可能存在或释放到细胞培养基中的其它可浸出物。
在一些实施例中,所公开的方法是一种用于细胞培养基分析的化合物鉴定方法,其包含:将细胞培养基样品提供至能够进行样品分离的液相色谱系统以生成样品组分;通过多路复用靶向选择性离子监测(SIM)分析样品组分以生成包括列表;以及从包括列表执行迭代质谱数据相关采集(DDA),以鉴定细胞培养基内的单个化合物。在一些实例中,该方法进一步包括例如在细胞培养基中培养产生重组蛋白(如抗体)的细胞、在表征细胞培养基组分之前在所需时间点从细胞培养物获得样品。
在一些实施例中,该方法包括通过使用所公开的方法鉴定细胞培养基组分,随后改变细胞培养物的一种或多种培养条件以减少在蛋白质的细胞培养期间产生的特征化合物的量。可以改变的细胞培养物的示例性条件包括但不限于温度、pH、细胞密度、氨基酸浓度、渗透压、生长因子浓度、搅动、气体分压、表面活性剂或其组合。
在一些实施例中,产生如抗体等蛋白质的细胞是CHO细胞。在其它实施例中,细胞是杂交瘤细胞。
实例
给出以下实例以向本领域普通技术人员提供如何制备和使用本发明的方法的完整公开和描述,并且不旨在限制本发明人认为是其发明的范围。已经努力确保关于所使用的数字(例如,量、温度等)的准确性,但是应该考虑一些实验误差和偏差。除非另有说明,份数是重量份数,分子量是平均分子量,温度是摄氏度,室温是约25℃,并且压力为大气压或接近大气压。
实例1:材料和方法
将合并的大豆水解物溶解在Milli-Q水中作为基质。掺入稳定同位素标记的化合物标准品,最终浓度范围为数纳摩尔至数百毫摩尔。使用Supelco Discovery HS F5-3柱进行反相液相色谱(RPLC)分离。在Thermo Q Exactive HF轨道阱质谱仪上进行多路复用靶向选择性离子监测(SIM)以生成包括列表。在Thermo Orbitrap Fusion Lumos质谱仪上进行包括列表的迭代MS2数据相关采集(DDA)。进行MS1全扫描,随后进行常规MS2 DDA作为对比。使用Compound Discoverer 3.1进行数据处理。
实例2:多路复用靶向SIM和迭代MS2 DDA采集增加了细胞培养基分析的稳健化合物鉴定。
使用实例1中描述的材料和方法,进行多路复用靶向SIM和迭代MS2 DDA采集。图1提供了根据本文公开的实施例的说明两种类型的MS1数据采集的示意图:(1)传统的全扫描MS1采集和(2)靶向SIM MS1采集。靶向SIM MS1采集依赖于基于大小的分子分类。通过比较,全扫描MS1检测特定数量的分子,而不管其大小。如图所示,当仅检测到特定数量的每种大小的分子时,靶向SIM MS1采集允许检测到较低丰度的物种,从而提高检测的置信度。靶向SIM MS1包括优化进样时间和隔离窗口。
具体地,图2提供了绘示了示例性可调窗口选择方案的示意图,该方案包括范围从60至760.5m/z的四个段:段1,60m/z至155.5m/z,窗口宽度为10Da;段2,155m/z至250.5m/z,窗口宽度为10Da;段3,250m/z至505.5m/z,窗口宽度为25Da;和段4,505.5m/z至760.5m/z,窗口宽度为25Da。每个段包括10个窗口和相邻窗口之间的0.5Da重叠。窗口的宽度在段之间变化,然而,它在特定段内没有不同。特别感兴趣的区域具有较小的窗口宽度。图3示出了根据本文公开的实施例的在常规全扫描MS1采集(上图)或可调窗口SIM MS1采集(下图)之后采集的MS1谱。与MS1全扫描相比,多路复用靶向SIM为几种掺入的稳定同位素标记的化合物提供了更清晰的背景和更高的强度。例如,10nM的稳定同位素标记的组氨酸仅通过多路复用靶向SIM方法观察到。
在MS1全扫描或多路复用靶向SIM之后,执行MS2 DDA。图4示出了根据本文公开的实施例的说明两种类型的MS2 DDA的示意图:(1)常规DDA MS2采集和(2)迭代DDA MS2平台。
图5示出了与仅选择和碎片化高丰度物种的常规DDA MS2采集相比,选择和碎片化更多物种的迭代MS2数据采集结果。图6示出了根据本文公开的实施例的比较表征样品并使用可调窗口SIM采集和迭代MS2采集的组合的传统方法的示意图。如图7所示,可调窗口SIM采集和迭代MS2采集的组合鉴定了大豆水解产物样品中具有高度复杂性的多种组分,包括氨基酸、二肽、三肽等,其丰度动态范围为至少4个数量级。图8示出了说明迭代MS2采集的强度的曲线图。最上面的一行表示滤质器排除列表上的条目数,而最下面的一行是滤质器包括列表上的条目数,每个条目与迭代进样相关。如图所示,随着迭代进样增加,物种的排除列表增加,而包括列表减少,这反过来又允许检测较低丰度的物种。在迭代MS2 DDA中,在样品运行期间成功排除了空白运行中的背景离子。通过多次迭代样品运行,在丰度低得多的离子上触发MS2扫描。除了其它在线数据库外,通过搜索含有准确质量、保留时间和碎片谱的内部库(in-house library),实现了快速和高置信度的组分鉴定。预期所公开的方法可用于分析细胞代谢物,例如用于细胞培养开发期间的CHO细胞代谢物分析。
总之,所公开的方法提供了一种用于表征如细胞培养基和其中的单个组分和代谢物等样品的更稳健、更灵敏的方法,其可用于改进抗体工艺开发。
本发明不限于本文所述的具体实施例的范围。实际上,除了本文描述的那些之外,根据前面的描述和附图,本发明的各种修改对于本领域技术人员将变得显而易见。此类修改旨在落入所附权利要求的范围内。
Claims (36)
1.一种表征样品的方法,其包含:
将所述样品提供至能够进行样品分离的液相色谱系统以生成样品组分;
通过多路复用靶向选择性离子监测(SIM)分析样品组分以生成包括列表;以及
从所述包括列表中执行迭代质谱数据相关采集(DDA),以鉴定单个样品组分。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述液相色谱系统是反相液相色谱(RPLC)系统。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法,其中通过多路复用靶向选择性离子监测(SIM)分析碎片化样品以生成包括列表包含利用离子阱或轨道阱质量分析器。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法,其中执行迭代质谱DDA包含利用配备有分段四极滤质器的离子阱或轨道阱质量分析器。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法,其中通过多路复用靶向选择性离子监测(SIM)分析样品组分以生成包括列表包含分割质量比窗口设置,其中包括多个段并且每个段具有多个窗口。
6.根据权利要求5所述的方法,其中多个段是三个段。
7.根据权利要求5所述的方法,其中多个段是四个段。
8.根据权利要求5至7中任一项所述的方法,其中多个窗口是10个窗口。
9.根据权利要求5至8中任一项所述的方法,其中段内的每个窗口具有相同的窗口宽度。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法,其中所述样品是细胞培养基。
11.根据权利要求9所述的方法,其中所述方法用于表征所述细胞培养基中的组分及其代谢物。
12.根据权利要求10或权利要求11所述的方法,其中所述细胞培养基是大豆基细胞培养基。
13.根据权利要求10或11所述的方法,其中所述细胞培养基用于基于重组细胞的生产系统。
14.根据权利要求1至10中任一项所述的方法,其中所述方法用于在与基于重组细胞的生产系统孵育后表征所述细胞培养基中的组分及其代谢物。
15.根据权利要求14所述的方法,其中所述基于重组细胞的生产系统是哺乳动物系统。
16.根据权利要求14所述的方法,其中所述基于重组细胞的生产系统用于蛋白质生产。
17.根据权利要求16所述的方法,其中所述蛋白质是抗体、融合蛋白、重组蛋白或其组合。
18.根据权利要求17所述的方法,其中所述抗体是单克隆抗体。
19.根据权利要求18所述的方法,其中所述单克隆抗体是同种型IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或混合同种型。
20.一种用于细胞培养基分析的化合物鉴定方法,其包含:
将细胞培养基样品提供至能够进行样品分离的液相色谱系统以生成样品组分;
通过多路复用靶向选择性离子监测(SIM)分析样品组分以生成包括列表;以及
从所述包括列表中执行迭代质谱数据相关采集(DDA),以鉴定所述细胞培养基中的单个化合物。
21.根据权利要求20所述的方法,其中所述液相色谱系统是反相液相色谱(RPLC)系统。
22.根据权利要求20或权利要求21所述的方法,其中通过多路复用靶向选择性离子监测(SIM)分析碎片化样品以生成包括列表包含利用离子阱或轨道阱质量分析器。
23.根据权利要求20至22中任一项所述的方法,其中执行迭代质谱DDA包含利用配备有分段四极滤质器的离子阱或轨道阱质量分析器。
24.根据权利要求20至23中任一项所述的方法,其中通过多路复用靶向选择性离子监测(SIM)分析样品组分以生成包括列表包含分割质量比窗口设置,其中包括多个段并且每个段具有多个窗口。
25.根据权利要求24所述的方法,其中多个段是三个段。
26.根据权利要求24所述的方法,其中多个段是四个段。
27.根据权利要求24至26中任一项所述的方法,其中多个窗口是10个窗口。
28.根据权利要求24至27中任一项所述的方法,其中段内的每个窗口具有相同的窗口宽度。
29.根据权利要求20至28中任一项所述的方法,其中所述细胞培养基是大豆基细胞培养基。
30.根据权利要求20至29中任一项所述的方法,其中所述细胞培养基用于基于重组细胞的生产系统。
31.根据权利要求20至30中任一项所述的方法,其中所述细胞培养基样品是在与基于重组细胞的生产系统孵育后获得的细胞培养基样品。
32.根据权利要求31或权利要求32所述的方法,其中所述基于重组细胞的生产系统是哺乳动物系统。
33.根据权利要求31或权利要求32所述的方法,其中所述基于重组细胞的生产系统用于蛋白质生产。
34.根据权利要求33所述的方法,其中所述蛋白质是抗体、融合蛋白、重组蛋白或其组合。
35.根据权利要求34所述的方法,其中所述抗体是单克隆抗体。
36.根据权利要求35所述的方法,其中所述单克隆抗体是同种型IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或混合同种型。
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