ES2549077T3 - Espectrometría de masas de conjugados de anticuerpos - Google Patents

Espectrometría de masas de conjugados de anticuerpos Download PDF

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Abstract

Un método para detectar compuestos conjugados de anticuerpo-fármaco que comprende: (i) procesar mediante selección con membrana de inmunoafinidad una muestra biológica que se ha recogido de una fuente biológica en contacto previamente con un compuesto conjugado de anticuerpo-fármaco que tiene la Fórmula I: Ab-(L-D)p I en la que Ab es un anticuerpo que se une a uno o más antígenos asociados a tumores o receptores de superficie celular; D es un resto de fármaco seleccionado de un maitansinoide o de auristatina; L es un enlazador unido covalentemente a Ab y unido covalentemente a D, en donde L se forma a partir de un reactivo enlazador seleccionado de 4-(2-piridiltio) propanoato de N-succinimidilo (SPDP), succinimidil-4- (N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato (SMCC) y N-succinimidil-4-(2-piridiltio)pentanoato (SPP), o L se selecciona de maleimidocaproilo (MC), maleimidopropanoilo (MP) y maleimidocaproil-valina-citrulina-paraaminobenciloxicarbonilo (MC-vc-PAB); y p es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8; en el que una muestra de análisis se forma poniendo en contacto la muestra biológica con una membrana de inmunoafinidad que comprende un antígeno inmovilizado y la elución de la muestra de análisis; (ii) aplicar la muestra de análisis a un medio de separación para efectuar la separación de más de una muestra constituyente en donde un constituyente de la muestra separada comprende un fragmento de anticuerpo de un compuesto conjugado de anticuerpo-fármaco que tiene la Fórmula I, o un fragmento de anticuerpo o metabolito del mismo, y en la que p es 0, 1, 2, 3 , 4, 5, 6, 7 u 8; y (iii) establecer la masa o la relación entre la masa y la carga y cuantificar uno o más constituyentes de la muestra separados que es un fragmento de anticuerpo o un compuesto conjugado de anticuerpo-fármaco que tiene la Fórmula I o un metabolito del mismo, en donde p es 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8, mediante espectrometría de masas con monitorización de ion único (SIM).

Description

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de anticuerpos (CCDA); fagocitosis; y regulación por disminución de los receptores de superficie (por ejemplo, el receptor de células B y BCR) etc.
En función de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos intactos se pueden asignar a diferentes “clases”. Hay cinco clases principales de anticuerpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, y varios de éstos pueden además dividirse en “subclases” (isotipos), por ejemplo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2. Los dominios constantes de la cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de anticuerpos se denominan α, δ, ε, γ y µ, respectivamente. Las estructuras de las subunidades y las configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas.
La expresión “variante de la secuencia de aminoácidos" se refiere a polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos que difieren hasta cierto punto de un polipéptido de secuencia nativa. Ordinariamente, las variantes de secuencia de aminoácidos poseerán al menos aproximadamente un 70 % de identidad de secuencia con al menos un dominio de unión al receptor de un anticuerpo nativo o con al menos un dominio de unión a ligando de un receptor nativo y, preferentemente, serán al menos aproximadamente 80 % más preferentemente, al menos aproximadamente 90 % homóloga en secuencia con dichos dominios de unión al receptor o ligando. Las variantes de secuencia de aminoácidos poseen sustituciones, deleciones y/o inserciones en determinadas posiciones dentro de la secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos nativa. Los aminoácidos se designan por los nombres convencionales, códigos de una letra y de tres letras.
“Identidad de secuencia” se define como el porcentaje de residuos en la variante de la secuencia de aminoácidos que son idénticos después de alinear las secuencias e introducir los huecos, en caso necesario, para alcanzar la identidad se secuencia máxima en porcentaje. En la técnica se conocen bien los métodos y programas informáticos para la alineación. Uno de estos programas informáticos es "Align 2," de Genentech, Inc., que se presentó con documentación para el usuario y la oficina de copyright de EE.UU., Washington, DC 20559, el 10 de diciembre de1991.
Los anticuerpos monoclonales útiles son poblaciones homogéneas de anticuerpos frente a un determinante antigénico concreto (por ejemplo, un antígeno de célula de cáncer, un antígeno viral, un antígeno microbiano, una proteína, un péptido, un carbohidrato, una sustancia química, ácido nucleico, o fragmentos de los mismos). Un anticuerpo monoclonal (Mab) frente a un antígeno de interés se puede preparar usando cualquier técnica conocida en la materia que proporcione la producción de moléculas de anticuerpos mediante líneas celulares continuas en cultivo. Estas incluyen, entre otras, la técnica del hibridoma inicialmente descrita Koehler y Milstein (1975, Nature 256,495-497), la técnica del hibridoma de células B humanas (Kozbor et al, 1983, Immununology Today 4: 72), y la técnica del hibridoma de EBV (Cole et al, 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96). Dichos anticuerpos pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina, incluidas IgG, IgM, IgE, IgA e IgD, y cualquier subclase de las mismas. El hibridoma que produce los MAb de uso en la presente invención puede cultivarse in vitro o in vivo.
Los anticuerpos monoclonales útiles incluyen, entre otros, anticuerpos monoclonales humanos, anticuerpos monoclonales humanizados, fragmentos de anticuerpos o anticuerpos monoclonales quiméricos de ser humano – ratón (o de otras especies). Los anticuerpos monoclonales humanos pueden prepararse mediante cualquiera de numerosas técnicas conocidas en la materia (por ejemplo, Teng et al, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80,73087312; Kozbor et al, 1983, Immununology Today 4, 72-79; y Olsson et al, 1982, Meth. Enzymol. 92, 3-16).
El anticuerpo también puede ser un anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos pueden tener una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en un brazo, y un par de cadena pesadacadena ligera de inmunoglobulina híbrida (que proporciona una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de combinaciones de cadenas de inmunoglobulina no deseadas, como la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en sólo una mitad de la molécula biespecífica proporciona una manera fácil de separación (documento WO 94/04690; Suresh et al, Methods in Enzymology, 1986, 121:210; Rodrigues et al, 1993, J. of Immunology 151:6954-6961; Carter et al, 1992, Bio/Technology 10:163-167; Carter et al, 1995, J. of Hematotherapy 4:463-470; Merchant et al, 1998, Nature Biotechnology 16:677-681. Methods for making bispecific antibodies are known in the art (Milstein et al, 1983, Nature 305:537-539; documento WO 93/08829; Traunecker et al, EMBO J. 10:3655-3659 (1991). Usando tales técnicas, los anticuerpos biespecíficos se pueden preparar para la conjugación como ADC en el tratamiento o prevención de la enfermedad como se define en el presente documento.
De acuerdo con un enfoque diferente, los dominios variables de anticuerpos con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación anticuerpo-antígeno) se fusionan con secuencias del dominio constante de inmunoglobulina. La fusión puede ser con un dominio constante de la cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende al menos parte de las regiones bisagra, CH2 y CH3. La primera región constante de la cadena pesada (CH1) puede contener el sitio necesario para la unión a la cadena ligera, presente en al menos una de las condensaciones. Los ácidos nucleicos con secuencias que codifican las condensaciones de la cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados y son co-transfectados en un organismo huésped adecuado. Esto proporciona una gran flexibilidad en el
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Ejemplos de realización de restos de fármaco de maitansinoide incluyen: DM1, (CR2)m = CH2CH2; DM3, (CR2)m = CH2CH2CH(CH3); y DM4, (CR2)m = CH2CH2C(CH3)2, que tienen las estructuras:
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Unidad de aminoácido
El enlazador puede comprender restos de aminoácidos. La unidad de aminoácidos (-Ww-), cuando está presente, 5 une el anticuerpo (Ab) al resto de fármaco (D) en un conjugado de anticuerpo-fármaco (ADC) de la invención.
La unidad de aminoácido -Ww-es una unidad de dipéptido, tripéptido, tetrapéptido, pentapéptido, hexapéptido,
heptapéptido, octapéptido, nonapéptido, decapéptido, undecapéptido o dodecapéptido. Los restos de aminoácidos
que comprenden la unidad de aminoácidos incluyen los que se producen de forma natural, así como aminoácidos 10 minoritarios y análogos de aminoácidos no naturales, tales como citrulina. Cada unidad -W-tiene
independientemente la fórmula indicada a continuación entre corchetes, y w es un número entero que varía de 0 a
12: R19 R19es
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15 en la que hidrógeno, metilo, isopropilo, isobutilo, sec-butilo, bencilo, p-hidroxibencilo, -CH2OH,-CH(OH)CH3, -CH2CH2SCH3, -CH2CONH2, -CH2COOH, -CH2CH2CONH2, -CH2CH2COOH, -(CH2)3NHC(=NH)NH2, (CH2)3NH2, -(CH2)3NHCOCH3, -(CH2)3NHCHO, -(CH2)4NHC(=NH)NH2, -(CH2)4NH2, -(CH2)4NHCOCH3, (CH2)4NHCHO, -(CH2)3NHCONH2, -(CH2)4NHCONH2, -CH2CH2CH(OH)CH2NH2, 2-piridilmetil-, 3-piridilmetil-, 4piridilmetil-, fenilo, ciclohexilo,
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Cuando R19 es distinto de hidrógeno, el átomo de carbono al que R1 9 se une es quiral. Cada átomo de carbono al 25 que R19 está unido de forma independiente en la (configuración S) o (R), o una mezcla racémica. Por tanto, las unidades de aminoácidos pueden ser enantioméricamente puras, racémicas, o diastereoméricas.
En realizaciones ejemplares, w puede ser 1, 2 o 3, para formar unidades de aminoácidos de un solo aminoácido, dipéptido, y tripéptido, respectivamente. Las unidades de aminoácido W se seleccionan de aminoácidos de origen 30 natural y no natural. El carbono de la cadena lateral puede estar en la configuración D o L (S o R). La unidad de aminoácido Z puede ser alanina, ácido 2-amino-2-ciclohexilacético, ácido 2-amino-2-fenilacético, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano, tirosina, valina, ácido γ-aminobutírico, ácido α,-dimetil-γ
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Figuras 25 y 26 fue 3,5 MMAE/2H9. La carga total promedio de fármaco por 2H9 para la preparación de ADC en la parte inferior de las Figuras 25 y 26 fue 5,1 MMAE/2H9.
Tabla 1. Caracterización CL/EM de fragmentos de dos preparaciones de 2H9-MC-vc-PAB-MMAE, de la solución: MMAE/2H9 = 3,5 y 5,1
MMAE/2H9 = 3,5
fragmento
MMAE por fragmento Área % proporción
Cadena pesada
0 151,1 16,7
Cadena pesada
1 336,2 37,1
Cadena pesada
2 266,7 29,5
Cadena pesada
3 125,8 13,9
Cadena pesada
4 25,2 2,8
MMAE/HC = 1,49
Cadena ligera:¡
0 304,9 75,4
Cadena ligera
1 99,4 24,6
MMAE/LC = 0,25
MMAE/2H9 = 5,1
fragmento
MMAE por fragmento Área % proporción
Cadena pesada
0 126,3 12,6
Cadena pesada
1 135,1 13,5
Cadena pesada
2 182,2 18,1
Cadena pesada
3 250,8 25,0
Cadena pesada
4 310 30,9
MMAE/HC = 2,48
Cadena ligera
0 384,4 91,2
Cadena ligera
1 37,3 8,8
MMAE/LC = 0,088
Se realizó una identificación CL/EM similar y caracterización del conjugado anticuerpo-fármaco, trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAE. Una preparación dio una carga de la cadena ligera de 1,0 (MMAF/LC) y una carga de la cadena pesada
10 de 2,9 (MMAE/HC), por lo tanto, una carga total de fármaco de 7,8 (MMAE/trastuzumab). Otra preparación dio una carga de la cadena ligera de 1,0 (MMAF/LC) y una carga de la cadena pesada de 1,6 (MMAE/HC), por lo tanto, una carga total de fármaco de 5,1 (MMAE/trastuzumab).
Las figuras 28 -31 muestran los resultados del análisis farmacocinético (FC) de muestras de plasma mediante
15 CL/EM. A ratas Sprague-Dawley se les administraron dos preparaciones de trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAE cargadas con un promedio de 8,7 o 5, 3 MMAE, restos de fármaco por anticuerpo, trastuzumab. Las figuras 28 y 29 muestran el análisis FC de muestras de CL/EM de plasma de ratas Sprague-Dawley a las que se ha administrado: trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAE (8,7 MMAE/trastuzumab), 2 mg MMAE/kg (Figura 28); y trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAE (5,3 MMAE/trastuzumab), 2 mg MMAE/kg (Figura 29). Se calcularon las concentraciones de las diversas
20 cadenas pesadas y ligeras, con y sin restos de fármacos conjugados. La Figura 30 muestra el gráfico de la relación porcentual del nivel de conjugación de MMAE de fragmentos de LC (cadena ligera) y de HC (cadena pesada) de trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAE (5.3 MMAE/trastuzumab). La Figura 31 muestra una comparación de variaciones en la distribución del fármaco (MMAE) y el anticuerpo (trastuzumab) en el tiempo para dos preparaciones de trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAE: Una preparación tenía una relación de fármaco a anticuerpo de 8,7
25 MMAE/trastuzumab, y la otra fue la preparación mostrada en la Figura 31, que tenía una relación de 5,3.
Las figuras 32-36 de muestran los resultados de un estudio farmacocinético de comparación del efecto de carga del fármaco. Se preparó un lote único de conjugado anticuerpo-fármaco trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAF. Los picos del cromatograma se identificaron mediante EM, que indicó las cargas de fármaco de 2, 4 y 6 de MMAF por anticuerpo, 30 trastuzumab (Figura 32). La figura 32 muestra los cromatogramas de interacción hidrofóbica (HIC) de: arriba) mezcla bruta de trastuzumab-MC-vc-MMAF con carga de fármaco de 0, 2, 4, 6; (segundo desde arriba) trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAF con carga de fármaco de 6; (centro) trastuzumab-MC-vc-MMAF con carga de fármaco de 4; (segundo
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2) La inmovilización del antígeno/anticuerpo en la placa de 96 pocillos de afinidad Empore™ de 3M La membrana de afinidad debe permanecer en el recipiente sellado justo hasta la adición de la proteína. Una cantidad diana típica de la proteína es de 100 µg por pocillo (aunque se puede añadir más o menos basado en el uso previsto). El volumen de solución proteica rica en sal (etapa 1) necesaria por pocillo se calcula con un volumen mínimo de 80 µl. El paquete que contiene la membrana de afinidad se abre y se añaden 100 µg de proteína por pocillo. La membrana se incubó a 37 °C durante dos horas. Dentro de los primeros 5 minutos después de la adición de la solución, las membranas pueden hincharse visiblemente. 3) Inactivación de la membrana de afinidad Empore™ de 3M La solución de proteína se debe pasar por la membrana con un vacío ligero (-10 mm Hg). Se usa etanolamina para enfriar los sitios de azalactona sin reaccionar sobre la membrana. Se añaden aproximadamente 500 µl de etanolamina 3M para ajustar a pH 8 y tirar a través de la membrana utilizando un colector de vacío. Se añaden otros 500 µl de de etanolamina 3M a pH = 8 y la membrana se incuba durante una hora a 37 °C. La etanolamina es extrae mediante vacío a través de la membrana y cada pocillo se lava con 500 µl de PBS (solución salina tamponada con fosfato). 4) El bloqueo de los sitios de unión no específica. Aproximadamente 1 ml de de seroalbúmina bovina (BSA) al 0,5 % se añadió a cada pocillo de la membrana de afinidad. Esta se dejó incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente. La solución de BSA se tiró a través de cada pocillo mediante vacío y después se lavó adicionalmente con 1 ml de PBS. Ahora, la membrana está lista para su uso. La membrana se almacena en una solución cubierta a 4 °C con 200 µl de de azida de sodio al 0,02 % en PBS por pocillo. Se añade PBS adicional si es necesario para evitar que los pocillos se sequen.
Procedimiento membrana de afinidad para uso
1) Captura de la diana en la membrana de 96 pocillos de afinidad Empore™ de 3M Una membrana de inmunoafinidad preparada con antígeno/anticuerpo inmovilizado se utiliza para la captura de una proteína o anticuerpo diana en plasma. La proteína/anticuerpo diana en solución puede capturarse utilizando la membrana, sin embargo la unión no específica a los pocillos puede ser un problema. Lavar cada pocillo con 1 ml de PBS (solución salina tamponada con fosfato) antes de su uso. Añadir 100 µl de plasma o suero neto que contiene la proteína/anticuerpo diana a la membrana. Incubar la membrana a 37 ºC durante 30 minutos. Tirar de la muestra a través de la membrana con un vacío suave (-10 mm Hg). 2) Lavado/Desglicosilación de la diana capturada. Cada pocillo deberá lavarse con los siguientes lavados de 1 ml consecutivos: una vez con PBS, una vez con PBS + 1,6 % de Tween 20, y tres veces con agua. Si se desea la desglicosilación del compuesto capturado, añadir 100-µl de solución de desglicosilación a cada pocillo de la membrana e incubar en la membrana durante 2 días a 37 °C. Lavar cada pocillo dos veces con 1 ml de agua después de una reacción de desglicosilación en membrana. (Solución desglicosilación = 110 µl de la enzima Nglicanasa (Prozyme) + 8140 µl de agua + 2750 µl de solución de fosfato sódico 80 mM a pH = 7,5). 3) Elución de la diana. Cada par antígeno-anticuerpo tiene un volumen de elución único basado en la afinidad. Determinar experimentalmente el volumen de elución requerido para sus compuestos antes de su uso. Tratar un pocillo cuadrado de 2 ml de fondo de una placa de 96 pocillos, con tampón de bloqueo 3M Empore mediante la adición de 2 ml a cada pocillo, incubar la placa durante 15 minutos a 37 °C, lavar la placa cinco veces con agua y secar la placa. Este recubre la placa para evitar la adherencia de la diana. Este recubrimiento sólo se puede utilizar en soluciones acuosas, ya que se disolverá en disolventes orgánicos. Eluir la diana utilizando un pH alto (típico es de 300-500 µl de 0,2 % de TFA) en la placa de 96 pocillos bloqueada con un vacío suave. La diana eluida está lista para su análisis. 4) Reducción de la muestra. Si se requiere una reducción de la muestra, añadir 8 µl de solución reductora para muestrear en la placa de 96 pocillos. Mezclar suavemente con una pipeta. Incubar la placa de 96 pocillos cubierta durante 1 hora a 37 °C. (solución de reducción = 900 µl de acetato de amonio 5M y 100 µl de clorhidrato de tris-(2-carboxi-etil) fosfina 1 M (TCEP)).
Ejemplo 3
Método en chip nanomate ESI
Se desarrolló un método en chip de nanoelectropulverización automática para el análisis de espectrometría de masas de las muestras en plasma de conjugados de anticuerpo-fármaco (Kadkhodayan, M. and Mann, E. "Rapid Antibody Characterization and Quantitation using Automated Chip-based Nanoelectrospray/MS", 52nd Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics, American Society for Mass Spectrometry, Nashville, TN, May 23-27, 2004).
Se utilizó un API 3000 equipado con NANOMATE 100 y se usó el ESI CHIP. El sistema de instrumentos NANOMATE 100 es una interfaz de nanopulverización comercialmente disponible que utiliza un chip de ESI que contiene 100 boquillas individuales para infusión de nanopulverización automatizada en el espectrómetro de masas, lo que tiene resultado un caudal bao y controlada con una sensibilidad más alta (LIC más bajo), consumo de muestra reducido, automatización y la eliminación de beneficios remanentes de la muestra. La muestra se aspira a través de puntas de puntas de pipeta conductoras se libera en la parte posterior de una boquilla en el chip. Se aplica alto voltaje a la pipeta, formando un penacho de electropulverización de 100 nl/min. Los ajustes NANOMATE fueron aspiración de la muestra de 5 ml, seguido de un espacio de aire de 3 ml para proporcionar 0,2 minutos de basal antes del pico de la muestra. La presión del gas usada fue 0,4 psi y la tensión aplicada para nanopulverización fue
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