RU2815199C2

RU2815199C2 - Линкеры на основе сульфомалеимида и соответствующие конъюгаты

Info

Publication number: RU2815199C2
Application number: RU2021110933A
Authority: RU
Inventors: Мишель ПЕРЕС; Фредерик МАРИОН; Жан-Франсуа ЁВ; Сирилл ДРЕЙФЮ
Original assignee: Пьер Фабр Медикамент
Priority date: 2018-09-27
Filing date: 2019-09-27
Publication date: 2024-03-12

Abstract

Изобретение относится к линкеру формулы (I) или к его фармацевтически приемлемой соли, к конъюгату линкер-лекарственное средство формулы (II) или к его фармацевтически приемлемой соли, к конъюгату связывающее звено-лекарственное средство, такому как конъюгат антитело-лекарственное средство формулы (III) или (IV) или к его фармацевтически приемлемой соли, а также к фармацевтической композиции, включающей в себя такой конъюгат связывающее звено-лекарственное средство, и к его применению для лечения рака. 6 н. и 13 з.п. ф-лы, 28 ил., 15 табл., 7 пр.

Description

Область техники

Настоящее изобретение относится к линкеру на основе сульфомалеимида, пригодному для получения конъюгатов, таких как конъюгаты антитело-лекарственное средство (англ. ADC, antibody-drug conjugates), путем ковалентного связывания молекулы (молекул) лекарственного средства со связывающим звеном, предпочтительно представляющим собой антитело.

Предшествующий уровень техники

Все ADC представляют собой регулируемые смеси различных частиц, несущих лекарственное средство (DAR (соотношение лекарственного средства и антитела) может составлять от 0 до 8 молекул лекарственного средства на антитело), и имеют типичное среднее значение DAR 3,5 или 4. Неконъюгироваанные частицы обычно являются неактивными и конкурируют с частицами, несущими лекарственное средство, за связывание с антигеном. В дополнение к этому, было показано, что частицы со значением DAR выше 4 приводят к более низкой переносимости, более высоким показателям плазменного клиренса и имеют меньшую эффективность. Большинство ADC, в настоящее время представленных на рынке и проходящих клинические испытания, имеют общие структурные особенности, такие как наличие тиосукцинимидной связи, образующейся посредством реакции тиолов и алкилмалеимидов. Такой тип химии находит широкое применение, поскольку реакция малеимидов с тиолами в физиологических условиях протекает достаточно быстро и является количественной (не требуя при этом большого избытка обоих исходных веществ). Однако образование тиосукцинимида в физиологических условиях является медленно обратимым процессом. При продолжительной циркуляции ADC, содержащие алкилмалеимиды, могут в результате приводить к ощутимой потере лекарственных средств. Фармакологические последствия такой элиминации малеимида из ADC (посредством обратной реакции Михаэля) включают в себя снижение противоопухолевой активности из-за уменьшения воздействия конъюгированной с антителами формы лекарственного средства и повышения токсичности, возникающего в результате нецелевого высвобождения лекарственного средства и линкера. Это явление было описано для ADC, связанных с цистеином и связанных с лизином через тиоэфирный линкер SMCC (сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат).

Вследствие этого настоящее изобретение относится к соединениям, применимым для конъюгирования лекарственного средства со связывающими звеньями, причем получаемые в результате конъюгаты являются более стабильными и более эффективными.

Краткое описание сущности изобретения

Таким образом, настоящее изобретение относится к линкеру следующей формулы (I):

предпочтительно, следующей формулы (Ia):

или к его соли,

где:

- X₁ и Х₂ независимо друг от друга представляют собой Н, атом галогена, (С₁-С₆)алкокси, необязательно замещенный арилокси, или -О-(CH₂CH₂O)_rH (-O-PEG), при условии, Х₁ что и Х₂ одновременно не являются Н;

- L₁ представляет собой группу формулы L₁'-(CO-Z')_z' где L₁' представляет собой -(СН₂)_n-, -(CH₂CH₂O)_m-СН₂-СН₂-, арилен, гетероарилен, циклоалкандиил, -(СН₂)_n-арилен-, -(СН₂)_n-гетероарилен-, -(СН₂)_n-циклоалкандиил-, -арилен-(СН₂)_р-, -гетероарилен-(СН₂)_р-, -циклоалкандиил-(СН₂)_р-, -(СН₂)_n-арилен-(СН₂)_р-, -(СН₂)_n-гетероарилен-(СН₂)_р-, -(СН₂)_n-циклоалкандиил-(СН₂)_р-, - (CH₂CH₂O)_m-СН₂-СН₂-арилен-(СН₂)_р-, -(CH₂CH₂O)_m-СН₂-СН₂-гетероарилен-(СН₂)_р-, -(CH₂CH₂O)_m-СН₂-СН₂-цикпоалкандиил-(СН₂)_р-, -(СН₂)_n-арилен-СН₂-СН₂- (ОСН₂СН₂)_m-, -(СН₂)_n-гетероарилен-СН₂-СН₂-(ОСН₂СН₂)_m- или -(СН₂)_n- циклоалкандиил-СН₂-СН₂-(ОСН₂СН₂)_m-;

- каждый W независимо представляет собой аминокислотное звено;

- Y представляет собой -PAB-CO-(Z)_z-, где РАВ является (кислород звена РАВ связан с CO-(Z)_z);

- Z представляет собой -NR₄-(CH₂)_u-NR₅-, или -NR₄-(CH₂)_u-NR₅-CO-, или -NR₄-(CH₂)_u-NR₅-CO-(CH₂)_v-, или -NR₄-(CH₂)_u-NR₅-CO-(CH₂)_v-CO- (при этом группа NR₄ связана с группой СО группы РАВ-СО);

- Z' представляет собой -NR₄-(CH₂)_u-NR₅- или -NR₄-(CH₂)_u-NR₅-CO-(CH₂)_v- (при этом группа NR₄ связана с группой СО группы CO-Z');

- R₄ и R₅ независимо представляют собой Н или (С₁-С₆)алкильную группу;

- с равно 0 или 1, предпочтительно,1;

- m является целым числом от 1 до 15;

- n является целым числом от 1 до 6;

- р является целым числом от 1 до 6;

- q равно 0, 1 или 2, предпочтительно, 2;

- r является целым числом от 1 до 24, в особенности, от 1 до 12;

- u является целым числом от 1 до 6;

- v является целым числом от 1 до 6;

- w является целым числом от 0 до 5, предпочтительно, 0 или 2;

- у равно 0 или 1 (предпочтительно, у равно 0, когда w равно 0, и у равно 0 или 1, когда w является целым числом от 1 до 5);

- z равно 0 или 1;

- z' равно 0 или 1, в особенности, 0; и

- Х₃ является Н, когда у равно z равно 1, a Z представляет собой -NR₄-(CH₂)_u-NR₅-, или когда с равно w равно у равно 0, z'равно 1, а Z' представляет собой -NR₄-(CH₂)_u-NR₅-, в других случаях Х₃ представляет собой ОН, NH₂ или уходящую группу.

Уходящая группа, в частности, является атомом галогена, сульфонатом формулы -OSO₂-R_LG, N-сукцинимидилокси, 4-нитрофенилокси, пентафторфенокси или N-бензотриазолокси, R_LG представляет собой группу (С₁-С₆)алкил, арил, арил-(С₁-С₆)алкил или (С₁-С₆)алкиларил, при этом указанная группа необязательно замещена одним или несколькими атомами галогена, такими как атомы фтора.

Предпочтительно, соединение формулы (I) не является соединением формулы (I), для которого:

- X₁ представляет собой Cl, Х₂ представляет собой Н, q равно 0, L₁ представляет собой с равно 0, w равно 0, у равно 0 и Х₃ представляет собой Cl;

- X₁ представляет собой Cl, Х₂ представляет собой Cl, q равно 0, L₁ представляет собой с равно 0, w равно 0, у равно 0 и Х₃ представляет собой Cl;

- X₁ представляет собой Cl, Х₂ представляет собой Н, q равно 0, L₁ представляет собой , с равно 0, w равно 0, у равно 0 и Х₃ представляет собой Cl;

- X₁ представляет собой Cl, Х₂ представляет собой Н, q равно 0, L₁ представляет собой , с равно 0, w равно 0, у равно 0 и Х₃ представляет собой Br;

- X₁ представляет собой Cl, Х₂ представляет собой Н, q равно 0, L₁ представляет собой , с равно 0, w равно 0, у равно 0 и Х₃ представляет собой I;

- X₁ представляет собой Н, Х₂ представляет собой Cl, q равно 0, L₁ представляет собой , с равно 0, w равно 0, у равно 0 и Х₃ представляет собой Cl;

- X₁ представляет собой Н, Х₂ представляет собой Br, q равно 0, L₁ представляет собой , с равно 0, w равно 0, у равно 0 и Х₃ представляет собой Cl;

- X₁ представляет собой Cl, Х₂ представляет собой Cl, q равно 0, L₁ представляет собой , с равно 0, w равно 0, у равно 0 и Х₃ представляет собой Cl;

- X₁ представляет собой Cl, Х₂ представляет собой Br, q равно 0, L₁ представляет собой , с равно 0, w равно 0, у равно 0 и Х₃ представляет собой Cl;

- Х₁ представляет собой Cl, Х₂ представляет собой Br, q равно 0, L₁ представляет собой , с равно 0, w равно 0, у равно 0 и Х₃ представляет собой Cl; или

- X₁ представляет собой Br, Х₂ представляет собой Br, q равно 0, L₁ представляет собой , с равно 0, w равно 0, у равно 0 и Х₃ представляет собой Cl;

где пунктирной линией обозначена точка присоединения L₁ к атому азота группы , а волнистой линией - точка присоединения L₁ кХ₃.

Эти соединения раскрыты в патентных документах WO 2007/001932 или US 4127687, но не в качестве линкера, в частности, предназначенного для получение конъюгатов, таких как ADC.

Настоящее изобретение также относится к конъюгату линкер-лекарственное средство следующей формулы (II):

предпочтительно, следующей формулы (IIa):

или к его соли, где:

- X₁ и Х₂ независимо друг от друга представляют собой Н, атом галогена, (С₁-С₆)алкокси, необязательно замещенный арилокси, или -О-(CH₂CH₂O)_rH, при условии, что X₁ и Х₂ одновременно не являются Н;

- L₁ представляет собой группу формулы L₁'-(CO-Z')_z', где L₁' представляет собой -(CH₂)_n-, -(CH₂CH₂O)_m-CH₂-CH₂-, арилен, гетероарилен, циклоалкандиил, -(СН₂)_n-арилен-, -(СН₂)_n-гетероарилен-, -(СН₂)_n-циклоалкандиил-, -арилен-(СН₂)_р-, -гетероарилен-(СН₂)_р-, -циклоалкандиил-(СН₂)_р-, -(СН₂)_n-арилен-(СН₂)_p-, -(СН₂)_n-гетероарилен-(СН₂)_р-, -(СН₂)_n-циклоалкандиил-(СН₂)_р-, (CH₂CH₂O)_m-СН₂-СН₂-арилен-(СН₂)_р-, -(CH₂CH₂O)_m-СН₂-СН₂-гетероарилен-(СН₂)_р-, -(CH₂CH₂O)_m-СН₂-СН₂-циклоалкандиил-(СН₂)_р-, -(СН₂)_n-арилен-СН₂-СН₂-(ОСН₂СН₂)_m-, -(СН₂)_n-гетероарилен-СН₂-СН₂-(ОСН₂СН₂)_m- или -(СН₂)_n-цикпоалкандиил-СН₂-СН₂-(ОСН₂СН₂)_m-;

- Q представляет собой фрагмент лекарственного средства;

- с равно 0 или 1, предпочтительно, 1;

- m является целым числом от 1 до 15;

- т является целым числом от 1 до 6;

- р является целым числом от 1 до 6;

- q равно 0, 1 или 2, предпочтительно, 2;

- r является целым числом от 1 до 24, в особенности, от 1 до 12; и является целым числом от 1 до 6; v является целым числом от 1 до 6;

- z равно 0 или 1; и

- z' равно 0 или 1, в особенности, 0.

Настоящее изобретение также относится к конъюгату связывающее звено-лекарственное средство следующей формулы (III) или (IV):

или к его соли, предпочтительно, к его фармацевтически приемлемой соли,

где:

- связывающее звено является пептидом, белком (например, сконструированным белком), антителом (например, моноклональным антителом) или антигенсвязывающим фрагментом этого;

- L₁ представляет собой группу формулы L₁'-(CO-Z')_z', где L₁' представляет собой -(CH₂)_n-, -(CH₂CH₂O)_m-CH₂-СН₂-, арилен, гетероарилен, циклоалкандиил, -(СН₂)_n-арилен-, -(СН₂)_n-гетероарилен-, -(СН₂)_n-циклоалкандиил-, -арилен-(СН₂)_р-, -гетероарилен-(СН₂)_р-, -циклоалкандиил-(СН₂)_р-, -(СН₂)_n-арилен-(СН₂)_p-, -(СН₂)_n-гетероарилен-(СН₂)_р-, -(СН₂)_n-циклоалкандиил-(СН₂)_р-, (CH₂CH₂O)_m-СН₂-СН₂-арилен-(СН₂)_р-, -(CH₂CH₂O)_m-СН₂-СН₂-гетероарилен-(СН₂)_р-, -(CH₂CH₂O)_m-СН₂-СН₂-циклоалкандиил-(СН₂)_р-, -(СН₂)_n-арилен-СН₂-СН₂-(OCH₂CH₂)_m-, -(СН₂)_n-гетероарилен-СН₂-СН₂-(ОСН₂СН₂)_m- или -(CH₂)_n-цикпоалкандиил-СН₂-СН₂-(ОСН₂СН₂)_m-;

- Y представляет собой -PAB-CO-(Z)_z-, где РАВ является (кислород звена РАВ связан с CO-(Z)_z;

- с равно 0 или 1, предпочтительно, 1;

- m является целым числом от 1 до 15;

- n является целым числом от 1 до 6;

- р является целым числом от 1 до 6;

- s является целым числом от 1 до 8;

- u является целым числом от 1 до 6;

- v является целым числом от 1 до 6;

- z равно 0 или 1; и

- z' равно 0 или 1, в особенности, 0.

Согласно предпочтительному варианту осуществления, связывающее звено является антителом IGF-1R, антителом HER2 (например, трастузумабом) или антигенсвязывающим фрагментом этого.

Настоящее изобретение также относится к применению линкера формулы (I) или конъюгата лекарственное средство-линкер формулы (II), предпочтительно, в которых q равно 2, для ковалентного связывания лекарственного средства со связывающим звеном, таким как антитело (например, моноклональное антитело) или его антигенсвязывающий фрагмент. Такая ковалентная связь образуется при посредстве линкерного фрагмента.

Фактически, соединения формулы (I) или (II), предпочтительно, в которых q равно 2, пригодны для ковалентного связывания лекарственного средства со связывающим звеном, таким как антитело (например, моноклональное антитело) или его антигенсвязывающий фрагмент.

Соединения формулы (I) или (II), в которых q равно 0 или 1, также могут использоваться в качестве промежуточных продуктов для получения соединений формулы (I) или (II), в которых q равно 2. Следовательно, настоящее изобретение также относится к соединениям формулы (I) или (II), как определены выше, в которых q равно 0 или 1, в качестве промежуточных продуктов синтеза.

Настоящее изобретение также относится к способам получения линкера формулы (I) или конъюгатов формулы (II), (III) или (IV).

Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, включающей в себя конъюгат связывающее звено-лекарственное средство формулы (III) или (IV) и по меньшей мере одно фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.

Настоящее изобретение также относится к конъюгату связывающее звено-лекарственное средство формулы (III) или (IV) или к фармацевтической композиции, включающей в себя конъюгат связывающее звено-лекарственное средство формулы (III) или (IV) и по меньшей мере одно фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, для применения при лечении рака.

Настоящее изобретение также относится к применению конъюгата связывающее звено-лекарственное средство формулы (III) или (IV) для изготовления медицинского препарата, предназначенного для применения при лечении рака.

Настоящее изобретение также относится к способу лечения рака, включающему в себя введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества конъюгата связывающее звено-лекарственное средство формулы (III) или (IV) или фармацевтической композиции, в состав которой входит конъюгат связывающее звено-лекарственное средство формулы (III) или (IV) и по меньшей мере одно фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.

Определения

В контексте изобретения термин "фармацевтически приемлемый" подразумевает что-либо, что может быть использовано при изготовлении фармацевтической композиции и является в целом безопасным и нетоксичным для фармацевтического применения.

Термин "фармацевтически приемлемая соль" в рамках настоящего изобретения предназначен для обозначения соли соединения, являющейся фармацевтически приемлемой, как определено выше, и обладающей фармакологической активностью соответствующего соединения.

Фармацевтически приемлемые соли включают:

(1) соли присоединения кислоты, образованные с неорганическими кислотами, такими как соляная, бромистоводородная, серная, азотная и фосфорная кислота и т.п.; или образованные с органическими кислотами, такими как уксусная, бензолсульфоновая, фумаровая, глюкогептоновая, глюконовая, глутаминовая, гликолевая, гидроксинафтойная, 2-гидроксиэтансульфоновая, молочная, малеиновая, яблочная, миндальная, метансульфоновая, муконовая, 2-нафталенсульфоновая, пропионовая, янтарная, дибензоил-L-винная, винная, пара-толуолсульфоновая, триметилуксусная и трифторуксусная кислота и т.п., и

(2) соли, образованные в случае, когда кислотный протон, присутствующий в соединении, либо замещен ионом металла, таким как ион щелочного металла, ион щелочноземельного металла или ион алюминия; либо координирован с органическим или неорганическим основанием. Приемлемые органические основания включают диэтаноламин, этаноламин, N-метилглюкамин, триэтаноламин, трометамин и т.п. Приемлемые неорганические основания включают гидроксид алюминия, гидроксид кальция, гидроксид калия, карбонат натрия и гидроксид натрия.

Термин "галоген" при использовании в контексте настоящего изобретения относится к атому фтора, брома, хлора или йода.

Термин "(С₁-С₆)алкил" при использовании в контексте настоящего изобретения относится к одновалентной прямой или разветвленной насыщенной углеводородной цепи, содержащей от 1 до 6 атомов углерода, и включает, не ограничиваясь перечнем, метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, втор-бутил, трет-бутил, н-пентил, н-гексил и т.п.

Термин "(С₁-С₆)алкокси" при использовании в контексте настоящего изобретения относится к (С₁-С₆)алкильной группе, как определена выше, соединенной с молекулой через атом кислорода, и включает, не ограничиваясь перечнем, метокси, этокси, н-пропокси, изопропокси, н-бутокси, изобутокси, втор-бутокси, трет-бутокси, н-пентокси, н-гексокси и т.п.

Термин "(С₂-С₆)алкенил" при использовании в контексте настоящего изобретения относится к прямой или разветвленной одновалентной ненасыщенной углеводородной цепи, содержащей от 2 до 6 атомов углерода и содержащей по меньшей мере одну двойную связь, и включает, не ограничиваясь перечнем, этенил, пропенил, бутенил, пентенил, гексенил и т.п.

Термин "циклоалкандиил" при использовании в контексте настоящего изобретения относится к двухвалентному насыщенному углеводородному кольцу, содержащему преимущественно от 4 до 10 атомов углерода, в особенности, 5 или 6 атомов углерода, и включает, не ограничиваясь перечнем, циклопентандиил, циклогександиил и т.п. Предпочтительно, циклоалкандиил представляет собой циклогександиильную группу.

Термин "арил" при использовании в контексте настоящего изобретения относится к одновалентной ароматической углеводородной группе, предпочтительно содержащей от 6 до 10 атомов углерода и включающей в себя одно или несколько конденсированных колец, такой, как, например, фенильная или нафтильная группа. Предпочтительно, арил будет представлять собой фенильную группу.

Термин "арил-(С₁-С₆)алкил" при использовании в контексте настоящего изобретения относится к (С₁-С₆)алкильной группе, как определена выше, замещенной арильной группой, как определена выше. В частности, арил-(С₁-С₆)алкил может представлять собой бензильную группу.

Термин "(С₁-С₆)алкиларил" при использовании в контексте настоящего изобретения относится к арильной группе, как определена выше, замещенной (С₁-С₆)алкильной группой, как определена выше. В частности, (С₁-С₆)алкиларил может представлять собой тол ильную группу (CH₃Ph).

Термин "арилокси" при использовании в контексте настоящего изобретения относится к арильной группе, как определена выше, соединенной с молекулой через атом кислорода, и включает, не ограничиваясь перечнем, фенилокси.

Термин "арилен" при использовании в контексте настоящего изобретения относится к двухвалентной ароматической углеводородной группе, содержащей предпочтительно от 6 до 10 атомов углерода и включающей в себя одно или несколько конденсированных колец, такой, как, например, фениленовая или нафтиленовая группа. Предпочтительно, арилен будет фениленовой группой.

Термин "гетероарилен" при использовании в контексте настоящего изобретения относится к двухвалентной ароматической группе, содержащей один или несколько, в особенности, один или два, конденсированных углеводородных циклов, в которых один или несколько, в особенности, от одного до четырех, предпочтительно, от одного до трех, атомов углерода заменены гетероатомом, выбранным из атома серы, атома кислорода и атома азота, предпочтительно, выбранным из атома кислорода и атома азота, более предпочтителен атом азота. Предпочтительно, гетероарилен является двухвалентным 1,2,3-триазолом, таким как двухвалентный 1Н-1,2,3-триазол.

Термин "уходящая группа" при использовании в контексте настоящего изобретения относится к химической группе, которая может быть легко заменена нуклеофилом (таким как амин или спирт, соответственно, несущим функциональную группу NH или ОН) во время реакции нуклеофильного замещения. Такой уходящей группой может быть, в частности, атом галогена, сульфонат, N-сукцинимидилокси, 4-нитрофенилокси, пентафторфенокси или N-бензотриазолокси. Сульфонат представляет собой, в частности, группу -OSO₂-R_LG, где R_LG является группой (С₁-С₆)алкил, арил, арил-(С₁-С₆)алкил или (С₁-С₆)алкиларил, при этом указанная группа необязательно замещена одним или несколькими атомами галогена, такими как атомы фтора. Сульфонат может быть, в частности, мезилатом (OMs, CH₃-S(О₂)O-), трифлатом (OTf, CF₃-S(O)₂O-) или тозилатом (OTs, пара-Me-C₆H₄-S(O)₂O-). Уходящая группа может представлять собой, в частности, Cl, Br, I, OTf, OMs, OTf, N-сукцинимидилокси, 4-нитрофенилокси или N-бензотриазолокси.

Термин "триалкилсилильная группа" при использовании в контексте настоящего изобретения относится к группе -SiAlk₁Alk₂Alk₃, в которой Alk₁, Alk₂ и Alk₃, одинаковые или разные, представляют собой (С₁-С₆)алкильную группу, как определена выше. Например, триалкилсилильная группа может быть триметилсилильной или триэтилсилильной группой.

Термин "защищенная форма" означает, что по меньшей мере функциональная группа ОН или NH, присутствующая в данной молекуле, защищена О-защитной группой или N-защитной группой, соответственно.

Термин "защитная группа" при использовании в контексте настоящего изобретения относится к химической группе, избирательно блокирующей реакционноспособный центр в соединении с несколькими функциональными группами, позволяя проводить химическую реакцию избирательно на другом незащищенном реакционноспособном центре.

Термин "О-защитная группа" при использовании в контексте настоящего изобретения относится к заместителю, защищающему гидроксильные группы (ОН) от нежелательных реакций в процессе синтеза, такому как О-защитные группы, раскрытые в работе "Greene's Protective Groups In Organic Synthesis (Защитные группы Грина в органическом синтезе)", 4^th ed., 2007, John Wiley & Sons, Hoboken, New Jersey. Гидроксильная группа, защищенная О-защитной группой, может представлять собой, например, простой эфир, сложный эфир, карбонат, ацеталь и т.п. В частности, О-защитные группы могут представлять собой (С₁-С₆)алкил, необязательно замещенный одним или несколькими (в особенности, от 1 до 3) атомами галогенов (такими как атомы хлора), такой как метил, этил, трет-бутил или 2,2,2-трихлорэтил; арил-(С₁-С₆)алкил, такой как бензил, в котором арильный фрагмент необязательно замещен одной или несколькими метоксильными группами, такой как бензил (Bn) или пара-метоксибензил (РМВ); тритильное (трифенилметильное) производное формулы -CAr₁Ar₂Ar₃, такое как трифенилметил (также называемый тритилом - Tr), (4-метоксифенил)дифенилметил (также называемый метокситритилом - NMT) или бис(4-метоксифенил)фенилметил (также называемый диметокситритилом - DMT); замещенную метильную группу формулы -CH₂OR_GP2 или -CH₂SR_GP2 (в частности, -CH₂OR_GP2), например, метоксиметил (MOM), бензилоксиметил, 2 метоксиэтоксиметил (MEM), 2-(триметилсилил)этоксиметил или метилтиометил; замещенную этильную группу формулы -CH₂CH₂OR_GP2 или -CH₂CH₂SR_GP2 (в частности, -CH₂CH₂OR_GP2), например, этоксиэтил (ЕЕ); силильную группу формулы -SiR_GP3R_GP4R_GP5, например, триметилсилил (TMS), триэтилсилил (TES), трет-бутилдиметилсилил (TBS или TBDMS) и трет-бутилдифенилсилил (TBDPS); карбонилированную группу формулы -CO-R_GP6, такую как ацетил (Ас), пивалоил (Piv или Pv) или бензоил (Bz), или формулы -CO₂-R_GP7, такую как аллилоксикарбонил (Alloc) или 9-флуоренилметилоксикарбонил (Fmoc); или тетрагидропиранил (ТНР) или тетрагидрофуранил

где Ar₁, Ar₂ и Ar₃ независимо друг от друга представляют собой арил, такой как фенил, необязательно замещенный одной или несколькими метоксильными группами; R_GP2 представляет собой (С₁-С₆)алкил (такой как метил или этил), необязательно замещенный арилом (таким как фенил), (С₁-С₆)алкокси (такой как метокси) или триалкилсилильную группу (такую как SiMe₃); R_GP3, R_GP4 и R_GP5 независимо друг от друга представляют собой (С₁-С₆)алкильную или арильную (такую как фенильная) группу; и R_GP6 и R_GP7 независимо друг от друга представляют собой (С₁-С₆)алкильную, (С₂-С₆)алкенильную, арильную, арил-(C₁-С₆)алкильную или 9-флуоренилметильную группу.

Термин "N-защитная группа" при использовании в контексте настоящего изобретения относится к группам, предназначенным для защиты функциональной аминогруппы (в особенности, первичной аминогруппы) от нежелательных реакций в процессе синтеза. Обычно используемые N-защитные группы раскрыты в работе "Greene's Protective Groups In Organic Synthesis", 4^th edition, 2007, John Wiley & Sons, Hoboken, New Jersey. Функциональная аминогруппа, защищенная N-защитной группой, может представлять собой карбамат, амид, сульфонамид, N-алкильное производное, аминоацетальное производное, N-бензильное производное, иминопроизводное, енаминопроизводное или N-гетероатомное производное. В частности, N-защитными группами могут быть формил; арил, такой как фенил, необязательно замещенный одной или несколькими метоксильными группами, такой как пара-метоксифенил (РМР); арил-(С₁-С₆)алкил, такой как бензил, в котором арильный фрагмент необязательно замещен одной или несколькими метоксильными группами, такой как бензил (Bn), пара-метоксибензил (РМВ) или 3,4-диметоксибензил (DMPM); -CO-R_GP1, такой как ацетил (Ас), пивалоил (Piv или Pv), бензоил (Bz) или пара-метоксибензилкарбонил (Moz); -CO₂-R_GP1, такой как трет-бутилокси карбон ил (Вос), трихлорэтоксикарбонил (TROC), аллилокси карбон ил (Alloc), бензилоксикарбонил (Cbz или Z) или 9-флуоренилметилоксикарбонил (Fmoc); -SO₂-R_GP1, такой как фенилсульфонил, тозил (Ts или Tos) или 2-нитробензолсульфонил (также называемый нозилом - Nos или Ns); и т.п.,

где R_GP1 представляет собой (С₁-С₆)алкил, необязательно замещенный одним или несколькими атомами галогена, такими как F или Cl; (С₂-С₆)алкенил, такой как аллил; арил, такой как фенил, необязательно замещенный одной или несколькими группами, выбранными из ОМе (метокси) и NO₂ (нитро); арил-(С₁-С₆)алкил, такой как бензил, в котором арильный фрагмент необязательно замещен одной или несколькими метоксильными группами; или 9-флуоренилметил.

Термины "антитело", "антитела" "ab", "Ab", "MAb" или "иммуноглобулин" используются взаимозаменяемо в самом широком смысле и включают в себя моноклональные антитела, выделенные, сконструированные или рекомбинантные антитела (например, полноразмерные или интактные моноклональные антитела), поликлональные антитела, поливалентные антитела или полиспецифические антитела (например, биспецифические антитела), а также фрагменты этих антител, при условии, что они проявляют требуемую биологическую активность.

Термин "рекомбинантное антитело" относится к антителу, являющемуся результатом экспресии рекомбинантной ДНК внутри живых клеток. Рекомбинантное антитело согласно изобретению получают с использованием лабораторных методов генетической рекомбинации, хорошо известных специалисту в данной области техники, создавая последовательности ДНК, которые не могут быть обнаружены в биологических организмах.

Термин "антигенсвязывающий фрагмент" антитела согласно изобретению предназначен для обозначения любого пептида, полипептида или белка, сохраняющего способность связываться с мишенью (также обычно называемой антигеном) антитела.

Под "связывание", "связывается" или т.п.подразумевается, что антитело или любой его антигенсвязывающий фрагмент образует комплекс с антигеном, являющийся относительно стабильным в физиологических условиях.

Специфическое связывание можно охарактеризовать при помощи равновесной константы диссоциации, составляющей по меньшей мере приблизительно 1×10^-6 М. Методы определения того, связываются ли две молекулы, хорошо известны в данной области техники и включают, например, равновесный диализ, резонанс поверхностных плазмонов, анализы с использованием радиоактивной метки и т.п. Во избежание неоднозначного толкования, это не означает, что указанное антитело не могло связываться или влиять на низком уровне на другой антиген. Тем не менее, в качестве варианта осуществления, указанное антитело связывается только с указанным антигеном.

При использовании в настоящем описании выражение "антитело к IGF-1R" следует рассматривать как аналогичное выражению "анти-IGF-1R антитело", при этом оно означает антитело, способное связываться с IGF-1R.

При использовании в настоящем описании выражение "антитело к HER2" следует рассматривать как аналогичное выражению "анти-HER2 антитело", при этом оно означает антитело, способное связываться с HER2.

Термин «половинная максимальная эффективная концентрация» (ЕС₅₀) соответствует концентрации лекарственного средства, антитела или токсического вещества, индуцирующей ответ, находящийся между исходным уровнем и максимумом, после определенного времени воздействия. Обычно этот термин используют в качестве меры эффективности лекарственного средства. Таким образом, величина ЕС₅₀ градуальной кривой доза-эффект представляет собой концентрацию соединения, при которой наблюдается 50% от его максимального эффекта. ЕС₅₀ квантовой кривой доза-эффект представляет собой концентрацию соединения, при которой 50% популяции проявляет ответ после заданной продолжительности воздействия. Показатели концентрации обычно следуют сигмоидальной кривой, быстро возрастая при относительно небольшом изменении концентрации. Это можно определить математически с помощью выведения линии наибольшего соответствия.

В качестве предпочтительного варианта осуществления, ЕС₅₀, определенная в настоящем изобретении, характеризует способность антитела связываться с IGF-1R ECD, выявленным на поверхности опухолевых клеток человека. Параметр ЕС₅₀ определяют при помощи анализа методом FACS (англ. Fluorescence-Activated Cell Sorting - сортировка клеток с активированной флуоресценцией). Параметр ЕС₅₀ отражает концентрацию антитела, при которой получают 50% максимального связывания с человеческим IGF-1R, экспрессируемым на опухолевых клетках человека. Каждое значение ЕС₅₀ вычисляли как среднюю точку кривой доза-эффект с использованием программы четырехпараметрической аппроксимации кривой регрессии (программное обеспечение Prism). Этот параметр был выбран в качестве репрезентативного параметра физиологических/патологических условий.

Термин "эпитоп" означает участок антигена, связываемый антителом. Эпитопы могут быть определены как структурные или функциональные. Функциональные эпитопы обычно представляют собой подгруппу структурных эпитопов и содержат остатки, непосредственно участвующие в аффинности взаимодействия. Эпитопы также могут быть конформационными, то есть состоящими из нелинейных аминокислот. Согласно некоторым вариантам осуществления, эпитопы могут включать детерминанты, представляющие собой химически активные поверхностные группировки молекул, таких как аминокислоты, боковые цепи Сахаров, фосфорильные группы или сульфонильные группы, и, согласно некоторым вариантам осуществления, могут обладать специфичными трехмерными структурными характеристиками и/или специфичными характеристиками заряда.

Термин "моноклональное антитело" или "Mab" при использовании в данном контексте относится к антителу, полученному из популяции по существу однородных антител, т.е. отдельные антитела популяции являются идентичными за исключением возможных встречающихся в природе мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. Моноклональные антитела обладают высокой специфичностью, будучи направленными против одного эпитопа. Такое моноклональное антитело может продуцироваться одним клоном В клеток или гибридомы. Моноклональные антитела также могут быть рекомбинантными, т.е. полученными методами белковой инженерии или химического синтеза. Моноклональные антитела также могут быть выделены из фаговых библиотек антител. Кроме того, в отличие от препаратов поликлональных антител, обычно включающих различные антитела, направленные против различных детерминант или эпитопов, каждое моноклональное антитело направлено против единственного эпитопа антигена. В данном контексте моноклональное антитело включает мышиное, химерное и гуманизированное антитело.

Термин "химерное антитело" относится к антителу, содержащему природную вариабельная область (легкой цепи и тяжелой цепи), полученную из антитела данного вида, в комбинации с константными областями легкой цепи и тяжелой цепи антитела вида, гетерологичного к указанному виду. Химерные антитела могут быть получены с использованием методов рекомбинантной генетики. Например, химерное антитело может быть получено клонированием рекомбинантной ДНК, содержащей промотор и последовательность, кодирующую вариабельную область нечеловеческого монокпонального антитела, в частности, мышиного, и последовательность, кодирующую константную область антитела гетерологичного вида, предпочтительно, человека. Химерное антитело согласно изобретению, кодируемое одним таким рекомбинантным геном, может представлять собой, например, химерное антитело мыши-человека, при этом специфичность такого антитела определяется вариабельной областью, полученной из мышиной ДНК, а его изотип определяется константной областью, полученной из человеческой ДНК.

Термин "гуманизированные антитела" означает антитело, содержащее области CDR (англ. complementary determining region - область, определяющая комплементарность), полученные из антитела нечеловеческого происхождения, при этом другие части молекулы антитела получены из одного (или нескольких) человеческих антител. Кроме того, некоторые из остатков каркасного сегмента (называемого FR (англ. framework region - каркасная область)) могут быть модифицированы для сохранения аффинности связывания. Гуманизированные антитела или их фрагменты могут быть получены способами, известными специалисту в данной области техники. Такие гуманизированные антитела являются предпочтительными для применения в способах, включающих диагностику in vitro или профилактическое и/или терапевтическое лечение in vivo. Другие способы гуманизации, также известные специалисту в данной области техники, такие, как, например, способ "прививания CDR", описаны PDL в патентных документах и заявках на патенты ЕР 0451216, ЕР 0682040, ЕР 0939127, ЕР 0566647, US 5530101, US 6180370, US 5585089, US 5693761. Можно также упомянуть патенты США US 5639641, 6054297, 5886152, 5877293.

В отсутствие противоречивых указаний в настоящем описании области, определяющие комплементарность, или CDR означают гипервариабельные области тяжелой и легкой цепей иммуноглобулинов, как определено в соответствии с системой нумерации IMGT.

Тем не менее CDR также можно определить в соответствии с системой нумерации Кэбота (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest (Последовательности белков, представляющих иммунологический интерес), 5^th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, NIH, 1991, и более поздние редакции). Существует три области CDR тяжелой цепи и три области CDR легкой цепи. В данном контексте термины "область CDR" и "области CDR" используют для обозначения, в зависимости от ситуации, одной или более или даже всех областей, содержащих большинство аминокислотных остатков, ответственных за аффинность связывания антитела с распознаваемым им антигеном или эпитопом. Для упрощения чтения настоящей заявки CDR по Кэботу не определяли. Тем не менее специалисту в данной области, использующему определение CDR в соответствии с IMGT, будет очевидно, как определить CDR по Кэботу.

В контексте настоящего изобретения "идентичность" или "процент идентичности" между двумя последовательностями нуклеиновых кислот или аминокислот означает количество в процентах идентичных нуклеотидов или аминокислотных остатков между двумя сравниваемыми последовательностями, полученное после их оптимального выравнивания, при этом данные проценты являются исключительно статистическими, а различия между двумя последовательностями распределены случайным образом по всей их длине. Сравнение двух последовательностей нуклеиновых кислот или аминокислот традиционно проводят путем сравнения последовательностей после их оптимального выравнивания, при этом указанное сравнение можно проводить посегментно или с использованием "окна выравнивания". Помимо сравнения вручную оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения можно проводить с помощью алгоритма поиска локальной гомологии Смита-Уотермана (анг. Smith and Waterman) (1981) [Ad. App. Math. 2:482], с помощью алгоритма поиска локальной гомологии Нидлмана-Вунша (англ. Neddleman and Wunsch) (1970) [J. Mol. Biol. 48:443], с использованием метода поиска подобия Пирсона и Липмана (Pearson and Lipman) (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444] или с помощью компьютерного программного обеспечения, использующего данные алгоритмы (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в пакете программного обеспечения Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl, или с помощью программ сравнения BLAST NR или BLAST Р).

Процент идентичности вычисляют путем определения числа положений, в которых аминокислота, нуклеотид или остаток являются идентичными между двумя последовательностями, предпочтительно, между двумя полноразмерными последовательностями, деления числа идентичных положений на общее число положений в окне выравнивания и умножения результата на 100 с получением процента идентичности между двумя последовательностями.

Например, можно использовать программу BLAST, "BLAST 2 sequences" (Tatusova et al., "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences (Blast 2 sequences - новый инструмент сравнения белковых и нуклеотидных последовательностей)", FEMS Microbiol., 1999, Lett. 174:247-250), доступную на сайте http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html, с параметрами по умолчанию (в частности, для параметров "штраф за внесение пропуска": 5, и "штраф за продление пропуска": 2; при этом выбранная матрица представляет собой, например, матрицу "BLOSUM 62", предложенную программой); процент идентичности между двумя сравниваемыми последовательностями вычисляется непосредственно программой.

Под выражениями "обратная мутация" или "реверсивная мутация" подразумевают мутацию или замену остатка, присутствующего в зародышевой линии человека, соответствующим остатком, исходно присутствующим в мышиной последовательности.

Термины "нуклеиновая кислота", "нуклеиново-кислотная последовательность", "последовательность нуклеиновой кислоты", "полинуклеотид", "олигонуклеотид", "полинуклеотидная последовательность" и "нуклеотидная последовательность", используемые в настоящем описании взаимозаменяемо, означают точную последовательность нуклеотидов, модифицированную или немодифицированную, определяющую фрагмент или область нуклеиновой кислоты, содержащую или не содержащую нуклеозиды неприродного происхождения и представляющую собой двухцепочечную ДНК, одноцепочечную ДНК либо продукты транскрипции указанных ДНК.

Термин "пептид" относится к цепи аминокислотных мономеров, связанных друг с другом при помощи пептидных (амидных) связей. Ковалентные пептидные (амидные) связи образуются в результате реакции карбоксильной группы (СООН) одной аминокислоты с аминогруппой (NH₂) другой аминокислоты. Термин пептид включает в себя олигопептид и полипептид.

Термин "белок" относится к совокупности одного или нескольких пептидов, как определены выше, претерпевших посттрансляционные модификации и сворачивание белка, так что они организованы биологически функциональным образом.

Термин "аминокислота" при использовании в контексте настоящего изобретения относится к природным α-аминокислотам (таким как аланин (Ala), аргинин (Arg), аспарагин (Asn), аспарагиновая кислота (Asp), цистеин (Cys), глутамин (Gin), глутаминовая кислота (Glu), глицин (Gly), гистидин (His), изолейцин (Ile), лейцин (Leu), лизин (Lys), метионин (Met), фенилаланин (Phe), пролин (Pro), серии (Ser), треонин (Thr), триптофан (Trp), тирозин (Tyr) и валин (Val)) в D или L форме, а также к неприродным аминокислотам (таким как β-аланин, аллилглицин, трет-лейцин, 3-аминоадипиновая кислота, 2-аминобензойная кислота, 3-аминобензойная кислота, 4-аминобензойная кислота, 2-аминомасляная кислота, 4-амино-1-карбоксиметилпиперидин, 1-амино-1-циклобутанкарбоновая кислота, 4-аминоциклогексануксусная кислота, 1-амино-1-циклогексанкарбоновая кислота, (1R,2R)-2-аминоциклогексанкарбоновая кислота, (1R,2R)-2-аминоциклогексанкарбоновая кислота, (1S,2R)-2-аминоциклогексанкарбоновая кислота, (1S,2S)-2-аминоциклогексанкарбоновая кислота, 3-аминоциклогексанкарбоновая кислота, 4-аминоциклогексанкарбоновая кислота, (1R,2R)-2-аминоциклопентанкарбоновая кислота, (IR,2S)-2-аминоциклопентанкарбоновая кислота, 1-амино-1-циклопентанкарбоновая кислота, 1-амино-1-циклопропанкарбоновая кислота, 4-(2-аминоэтокси)бензойная кислота, 3-аминометилбензойная кислота, 4-аминометилбензойная кислота, 2-аминомасляная кислота, 4-аминомасляная кислота, 6-аминокапроновая кислота, 1-аминоиндан-1-карбоновая кислота, 4-аминометил-фенилуксусная кислота, 4-аминофенилуксусная кислота, 3-амино-2-нафтойная кислота, 4-аминофенилмасляная кислота, 4-амино-5-(3-индолил)валериановая кислота, (4R,5S)-4-амино-5-метилгептановая кислота, (R)-4-амино-5-метилкапроновая кислота, (R)-4-амино-6-метилтиокапроновая кислота, (S)-4-аминовалериановая кислота, (R)-4-амино-5-фенилвалериановая кислота, 4-аминофенилпропионовая кислота, (R)-4-аминопимеровая кислота, (4R,5R)-4-амино-5-гидроксикапроновая кислота, (R)-4-амино-5-гидроксивалериановая кислота, (R)-4-амино-5-(р-гидроксифенил)валериановая кислота, 8-аминооктановая кислота, (2S,4S)-4-аминопирролидин-2-карбоновая кислота, (2S,4S)-4-аминопирролидин-2-карбоновая кислота, азетидин-2-карбоновая кислота, (2S,4R)-4-бензилпирролидин-2-карбоновая кислота, (S)-4,8-диаминооктановая кислота, трет-бутилглициновая кислота, γ-карбоксиглутамат, β-циклогексилаланин, цитруллин, 2,3-диаминопропионовая кислота, гиппуровая кислота, гомоциклогексилаланин, гомолейцин, гомофенилаланин, 4-гидроксипролин, индолин-2-карбоновая кислота, изонипекотиновая кислота, α-метилаланин, нипекотиновая кислота, норлейцин, норвалин, октагидроиндол-2-карбоновая кислота, орнитин, пеницилламин, фенилглицин, 4-фенилпирролидин-2-карбоновая кислота, пипеколиновая кислота, пропаргилглицин, 3-пиридинилаланин, 4-пиридинилаланин, 1-пирролидин-3-карбоновая кислота, саркозин, статины, тетрагидроизохинолин-1-карбоновая кислота, 1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-карбоновая кислота, или транексамовая кислота).

Подробное описание изобретения

Линкерный фрагмент

Линкерный фрагмент по настоящему изобретению обеспечивает возможность ковалентно связывать антитело с по меньшей мере одним фрагментом лекарственного средства.

Линкерный фрагмент может быть "нерасщепляемым" или "расщепляемым".

Согласно предпочтительному варианту осуществления, линкер представляет собой "расщепляемый" линкерный фрагмент, облегчающий высвобождение лекарственного средства в клетке.

Например, согласно некоторым вариантам осуществления, линкер расщепляется при помощи расщепляющего агента, присутствующего во внутриклеточной среде (например, внутри лизосомы, или эндосомы, или кавеолы). Линкер может представлять собой, например, пептидильный линкер, расщепляемый внутриклеточными ферментами пептидазой или протеазой, включая, но не ограничиваясь перечнем, лизосомальную или эндосомальную протеазу. Как правило, пептидильный линкер содержит по меньшей мере две последовательные аминокислоты или по меньшей мере три последовательные аминокислоты. Расщепляющие агенты могут включать катепсины В и D и плазмин, все эти агенты, как известно, гидролизуют дипептидные производные лекарственных средств, приводя в результате к высвобождению активного лекарственного средства внутри клеток-мишеней. Например, можно использовать пептидильный линкер, расщепляемый тиолзависимой протеазой катепсином-В, обладающей высоким уровнем экспрессии в раковой ткани (например, линкер, содержащий Phe-Leu или Gly-Phe-Leu-Gly). Согласно конкретным вариантам осуществления, пептидильный линкер, расщепляемый внутриклеточной протеазой, содержит или представляет собой Val-Cit, Phe-Lys или Val-Ala. Одним из преимуществ использования внутриклеточного протеолитического высвобождения лекарственного средства является то, что при конъюгации лекарственное средство обычно ослаблено, а стабильность конъюгатов в сыворотке, как правило, высока.

Группа -L₁-(СО)_с- представляет собой обязательно присутствующее растягивающее звено линкерного фрагмента. Группа -L₁-(СО)_с- представляет собой группу формулы -L₁'-(CO-Z')_z'-(CO)_c-, где z' и с равны 0 или 1, например, группу -L₁'-(CO)_c-, где z' равно 0. Предпочтительно, если по меньшей мере одно из w и у не равно 0, то z' равно 0, в других случаях z' равно 0 или 1.

L₁' представляет собой -(CH₂)_n-, -(CH₂CH₂O)_m-CH₂-СН₂-, арилен, гетероарилен, циклоалкандиил, -(СН₂)_n-арилен-, -(СН₂)_n-гетероарилен-, -(СН₂)_n-циклоалкандиил-, -арилен-(СН₂)_р-, -гетероарилен-(СН₂)_р-, -циклоалкандиил-(СН₂)_р-, -(СН₂)_n-арилен-(СН₂)_р-, -(СН₂)_n-гетероарилен-(СН₂)_р-, -(СН₂)_n-циклоалкандиил-(СН₂)_р-, -(CH₂CH₂O)_m-CH₂-СН₂-арилен-(СН₂)_р-, -(CH₂CH₂O)_m-СН₂-СН₂-гетероарилен-(СН₂)_р-, -(CH₂CH₂O)_m-CH₂-СН₂-циклоалкандиил-(СН₂)_р-, -(СН₂)_n-арилен-СН₂-СН₂-(OCH₂CH₂)_m-, -(СН₂)_n-гетероарилен-СН₂-СН₂-(ОСН₂СН₂)_m- или -(CH₂)_n-циклоалкандиил-СН₂-СН₂-(ОСН₂СН₂)_m-. В частности, арилен является фениленом; циклоалкандиил является циклогександиилом, таким как пара-циклогександиил; а гетероарилен является двухвалентным 1,2,3-триазолом, таким как двухвалентный 1Н-1,2,3-триазол.

Согласно частному варианту осуществления, L₁' представляет собой -(СН₂)_n-, -(CH₂CH₂O)_m-CH₂-CH₂-, арилен, -циклоалкандиил-, -(СН₂)_n-арилен-, -арилен-(СН₂)_n-, -(СН₂)_n-циклоалкандиил-, -циклоалкандиил-(СН₂)_n-,

. В частности, арилен является фениленом; а циклоалкандиил является циклогександиилом, таким как пара-циклогександиил.

Согласно другому частному варианту осуществления, L₁' представляет собой -(СН₂)_n- или -(CH₂CH₂O)_m-СН₂-СН₂-, в особенности, -(СН₂)_n-, такой как -(СН₂)₅-.

Фрагмент растягивающего звена L₁' может быть дополнен фрагментом CO-Z' растягивающего звена, где Z' представляет собой -CO-NR₄-(CH₂)_u-NR₅- или -CO-NR₄-(CH₂)_u-NR₅-CO-(CH₂)_v-, когда z'равно 1. R₄ и R₅ независимо представляют собой Н или (С₁-С₆)алкил, такой как Н или Me. u и v независимо представляют собой целое число от 1 до 6, такое как от 1 до 4, в особенности, 1 или 2, например, 2.

(W)_w представляет собой аминокислотное звено линкера.

Аминокислотное звено линкера может ферментативно расщепляться под воздействием фермента, включая, но не ограничиваясь перечнем, опухоль-ассоциированную протеазу, с высвобождением лекарственного средства.

Аминокислотное звено может быть сконструировано и оптимизировано по его селективности к ферментативному расщеплению конкретной опухоль-ассоциированной протеазой. Подходящими являются звенья, расщепление которых катализируется протеазами, катепсином В, С и D и плазмином.

(W)_w может отсутствовать (w равно 0) или может представлять собой дипептидное, трипептидное, тетрапептидное или пентапептидное звено (w равно 1, 2, 3, 4 или 5), где аминокислоты, образующие пептиды, могут отличаться друг от друга.

Так, (W)_w может быть представлен следующей формулой: (W1)_w1(W2)_w2(W3)_w3(W4)_w4(W5)_w5, где каждый из заместителей от W1 до W5 независимо друг от друга представляет собой аминокислотное звено, а каждое из от w1 до w5 равно 0 или 1.

Согласно некоторым вариантам осуществления, аминокислотное звено (W)_w может содержать аминокислотные остатки, такие как встречающиеся в природе, а также минорные аминокислоты и не встречающиеся в природе аналоги аминокислот, такие как цитруллин.

Аминокислотные остатки аминокислотного звена (W)_w включают, не ограничиваясь перечнем, аланин, валин, лейцин, изолейцин, метионин, фенилаланин, триптофан, пролин, лизин, незащищенный или защищенный ацетилом или формилом, аргинин, аргинин, незащищенный или защищенный тозильной или нитрогруппой (группами), гистидин, орнитин, орнитин, защищенный ацетилом или формилом, и цитруллин. Примеры типичных компонентов аминокислотного линкера предпочтительно включают дипептид или трипептид.

Типичные примеры дипептидов включают: Val-Cit, Ala-Val, Ala-Ala, Val-Ala, Lys-Lys, Cit-Cit, Val-Lys, Ala-Phe, Phe-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp-Cit, Phe-Ala, Phe-N⁹-тозил-Arg и Phe-N⁹-нитро-Arg, предпочтительно, Val-Cit или Val-Ala.

Типичные примеры трипептидов включают: Val-Ala-Val, Ala-Asn-Val, Val-Leu-Lys, Ala-Ala-Asn, Phe-Phe-Lys, Gly-Gly-Gly, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys.

Типичные примеры тетрапептидов включают: Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO: 53), Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 54).

Типичный пример пентапептида включает: Pro-Val-Gly-Val-Val (SEQ ID NO: 55).

Согласно частному варианту осуществления, (W)_w может представлять собой дипептид (т.е. w равно 2), такой как Val-Cit или Val-Ala, предпочтительно, Val-Cit, либо в линкере отсутствует аминокислотное звено (w равно 0). При отсутствии в линкере аминокислотного звена, предпочтительно, в нем также отсутствует спейсерное звено Y (у равно 0).

Согласно предпочтительному варианту осуществления, w равно 0 (т.е. (W)_w представляет собой одинарную связь) или w равно 2 (т.е. (W)_w представляет собой дипептид) и, таким образом, (W)_w может быть выбран из:

и, в частности, представляет собой Val-Cit, где

звездочкой обозначена точка присоединения к спейсерному звену (Y)_y; а волнистой линией - точка присоединения к -L₁-(СО)_с- (СО, если с равно 1, или L₁, если с равно 0).

Y представляет собой спейсерное звено линкера.

Спейсерные звенья бывают двух основных типов: саморасщепляющиеся и несаморасщепляющиеся.

Несаморасщепляющееся спейсерное звено представляет собой звено, в котором все спейсерное звено или его часть остается связанным с лекарственным средством после ферментативного отщепления аминокислотного звена от конъюгата антитело-лекарственное средство. Примеры несаморасщепляющегося спейсерного звена включают, не ограничиваясь перечнем, спейсерное звено (глицин-глицин) и глициновое спейсерное звено. Для высвобождения лекарственного средства внутри клетки-мишени должна протекать независимая реакция гидролиза для расщепления связи глицин-лекарственное средство.

Саморасщепляющиеся спейсерное звено может высвобождать лекарственное средство без необходимости в отдельной стадии гидролиза. Согласно этим вариантам осуществления, (Y) представляет собой остаток звена пара-аминобензилового спирта (РАВ), который связан с (W)_w через атом азота группы РАВ и напрямую соединен с лекарственным средством сложноэирной, карбонатной, карбаматной или простой эфирной группой. Такой линкер, содержащий фрагмент РАВ, также можно рассматривать как бесследный линкер.

В настоящем изобретении спейсерное звено (Y) представляет собой -РАВ-CO-(Z)_z-, где РАВ является (при этом атом кислорода звена РАВ связан с карбонилом), также называемым -пара-аминобензил-О-СО-, а у равно 1, либо в линкере отсутствует спейсерное звено (у равно 0).

Спейсер -пара-аминобензил-О-СО- может быть дополнен спейсером Z, представляющим собой -NR₄-(CH₂)_u-NR₅-, или -NR₄-(CH₂)_u-NR₅-CO-, или -NR₄-(CH₂)_u-NR₅-CO-(CH₂)_v-, или -NR₄-(CH₂)_u-NR₅-CO-(CH₂)_v-CO-, где z равно 1. R₄ и R₅ независимо представляют собой Н или (С₁-С₆)алкил, такой как Н или Me. u и v независимо представляют собой целое число от 1 до 6, такое как от 1 до 4, в особенности, 1 или 2, например, 2.

Преимущественно, у равно 0, когда w равно 0, и у равно 0 или 1, когда w является целым числом от 1 до 5, что означает, что спейсерное звено Y может присутствовать только тогда, когда присутствует аминокислотное звено W.

Предпочтительно, у равно 0, когда w равно 0, и у равно 1, когда w является целым числом от 1 до 5, что означает, что спейсерное звено Y присутствует, когда присутствует аминокислотное звено (W)_w, и отсутствует, когда аминокислотное звено (W)_w отсутствует.

Согласно частному варианту осуществления, группа -L₁-(CO)_c-(W)_w-(Y)_y-представляет собой -(CH₂)_n-, -(CH₂)_n-CO-, -(CH₂CH₂O)_m-CH₂-CH₂-, -(CH₂CH₂O)_m-СН₂-СН₂-СО-, -СН₂-пара-циклогексил-СО-, -арил-(СН₂)_n-, -(CH₂)_n-Val-Cit-пара-аминобензил-О-СО-, -(СН₂)_n-СО-Val-Cit-пара-аминобензил-O-СО-, -(CH₂CH₂O)_m-СН₂-СН₂-Val-Cit-пара-аминобензил-O-СО-, -(CH₂CH₂O)_m-CH₂-CH₂-CO-Val-Cit-пара-аминобензил-О-СО-, -СН₂-пара-циклогексил-СО-Val-Cit-пара-аминобензил-O-СО-, -арил-(СН₂)_n-Val-Cit-пара-аминобензил-O-СО-, -арил-CO-Val-Cit-пара-аминобензил-О-СО-, -(СН₂)_n-Val-Ala-пара-аминобензил-O-СО-, -(CH₂)_n-CO-Val-Ala-пара-аминобензил-О-СО-, -(CH₂CH₂O)_m-СН₂-СН₂-Val-Ala-пара-аминобензил-O-СО, -(CH₂CH₂O)_m-СН₂-СН₂-СО-Val-Ala-пара-аминобензил-O-СО-, -СН₂-пара-циклогексил-СО-Val-Ala-пара-аминобензил-O-СО-, -арил-(CH₂)_n-Val-Ala-пара-аминобензил-О-СО-, -арил-СО-Val-Ala-пара-аминобензил-O-СО-, -(CH₂)_n-Val-Cit-пара-аминобензил-O-СО-NH-(СН₂)_n-NH-, -(СН₂)_n-СО-Val-Cit-пара-аминобензил-O-CO-N H-(CH₂)_u-NH-, -(CH₂CH₂O)_m-СН₂-СН₂-Val-Cit-пара-аминобензил-O-СО- NH-(CH₂)_u-NH-, -(CH₂CH₂O)_m-CH₂-CH₂-CO-Val-Cit-пара-аминобензил-O-CO-NH-(CH₂)_u-NH-, -СН₂-пара-циклогексил-СО-Val-Cit-пара-аминобензил-O-СО-МН-(СН₂)_u-NH-, -арил-(СН₂)_n-Val-Cit-пара-аминобензил-O-СО-NH-(СН₂)_u-NH-, -арил-CO-Val-Cit-пара-аминобензил-O-СО-МН-(СН₂)_u-NH-, -(СН₂)_n-Val-Ala-пара-аминобензил-O-СО-NH-(CH₂)_u- NH-, -(CH₂)_n-CO-Val-Ala-пара-аминобензил-O-CO-NH -(CH₂)_u-NH-, (CH₂CH₂O)_m-СН₂-СН₂-Val-Ala-пара-аминобензил-O-СО-NH-(СН₂)_u-NH-, (CH₂CH₂O)_m-СН₂-СН₂-СО-Val-Ala-пара-аминобензил-O-СО-NH-(СН₂)_u-NH-, -СН₂-пара-цикпогексил-СО-Val-Ala-пара-аминобензил-O-СО-NH-(СН₂)_u-NH-, -арил-(CH₂)_n-Val-Ala-пара-аминобензил-O-CO-NH-(CH₂)_u-NH-, -арил-CO-Val-Ala-пара-аминобензил-О-СО-NH-(СН₂)_u-NH-, -(СН₂)_n-Val-Cit-пара-аминобензил-O-СО-NCH₃-(CH₂)_u-NCH₃-CO-, -(CH₂)_n-CO-Val-Cit-пара-аминобензил-O-CO-NCH₃-(CH₂)_u-NCH₃-СО-, -(CH₂CH₂O)_m-CH₂-CH₂-Val-Cit-пара-аминобензил-O-CO-NCH₃-(CH₂)_u-NCH₃-CO-, -(CH₂CH₂O)_m-СН₂-СН₂-СО-Val-Cit-пара-аминобензил-O-СО-NCH₃-(СН₂)_u-NCH₃-CO, -СН₂-пара-циклогексил-СО-Val-Cit-пара-аминобензил-O-СО-NCH₃-(CH₂)_u-NCH₃-CO-, -арил-(СН₂)_n-Val-Cit-пара-аминобензил-O-СО-NCH₃-(СН₂)_u-NCH₃-CO-, -арил-СО-Val-Cit-пара-аминобензил-O-СО-NCH₃-(СН₂)_u-NCH₃-СО-, -(CH₂)_n-Val-Ala-пара-аминобензил-O-CO-NCH₃-(CH₂)_u-NCH₃-CO-, -(CH₂)_n-CO-Val-Ala-пара-аминобензил-O-СО-NCH₃-(СН₂)_u-NCH₃-СО-, -(CH₂CH₂O)_m-CH₂-CH₂-Val-Ala-пара-аминобензил-O-СО-NCH₃-(СН₂)_u-NCH₃-СО-, -(CH₂CH₂O)_m-CH₂-CH₂-CO-Val-Ala-пара-аминоьензил-O-CO-NCH₃-(CH₂)_u-NCH₃-CO-, -СН₂-пара-циклогексил-CO-Val-Ala-пара-аминобензил-O-CO-NCH₃-(CH₂)_u-NCH₃-CO-, -арил-(СН₂)_n-Val-Ala-пара-аминобензил-O-СО-NCH₃-(СН₂)_u-NCH₃-СО-, -арил-CO-Val-Ala-пара-аминобензил-O-CO-NCH₃-(CH₂)_u-NCH₃-CO-,

,

или

Группа -L₁-(CO)_c-(W)_w-(Y)_y- также может представлять собой -(СН₂)_n-СО-NCH₃-(CH₂)_u-NCH₃-CO-(CH₂)_v-, -(CH₂)_n-CO-NCH₃-(CH₂)_u-NCH₃-CO-(CH₂)_v-CO-, -(CH₂CH₂O)_m-CH₂-CH₂-CO-NCH₃-(CH₂)_u-NCH₃-CO-(CH₂)_v-, -(CH₂CH₂O)_m-CH₂-CH₂-CO-NCH₃-(CH₂)_u-NCH₃-CO-(CH₂)_v-CO-, -СН₂-пара-циклогексил-СО-NCH₃-(СН₂)_u-NCH₃-CO-(CH₂)_v-, -СН₂-пара-цикпогексил-СО-NCH₃-(СН₂)_u-NCH₃-СО-(СН₂)_v-СО-, -арил-(СН₂)_n-СО-NCH₃-(СН₂)_u-NCH₃-СО-(СН₂)_v-, -арил-(СН₂)_n-СО-NCH₃-(СН₂)_u-NCH₃-CO-(CH₂)_v-CO-, -(CH₂)_n-CO-NCH₃-(CH₂)_u-NCH₃-, -(CH₂)_n-CO-NCH₃-(CH₂)_u-NCH₃-CO-, -(CH₂CH₂O)_m-CH₂-CH₂-CO-NCH₃-(CH₂)_u-NCH₃-, -(CH₂CH₂O)_m-CH₂-CH₂-CO-NCH₃-(CH₂)_u-NCH₃-, -(CH₂CH₂O)_m-CH₂-CH₂-CO-NCH₃-(CH₂)_u-NCH₃-CO-, -CH₂-пара-циклогексил-СО-NCH₃-(СН₂)_u-NCH₃-, -СН₂-пара-циклогексил-СО-NCH₃-(CH₂)_u-NCH₃-CO-, -арил-(CH₂)_n-CO-NCH₃-(CH₂)_u-NCH₃-, -арил-(СН₂)_n-СО-NCH₃-(CH₂)_u-NCH₃-, -арил-(СН₂)_n-СО-NCH₃-(СН₂)_u-NCH₃-СО-, -(CH₂)_n-CO-NH-(CH₂)_u-NH-, -(CH₂)_n-CO-NH -(CH₂)_u-NH-CO-, -(CH₂CH₂O)_m-CH₂-CH₂-CO-NH-(CH₂)_u-NH-, (CH₂CH₂O)_m-CH₂-CH₂-CO-NH-(CH₂)_u- NH-CO-, -СН₂-пара-циклогексил-СО-NH-(CH₂)_u-NH-, -СН₂-пара-цикпогексил-СО-NH-(CH₂)_u-NH-CO-, -арил-(СН₂)_n-CO-NH-(CH₂)_u-NH-, -арил-(СН₂)_n-СО-NH-(CH₂)_u-NH-CO-, -(СН₂)_n-Val-Cit-пара-аминобензил-O-CO-NCH₃-(CH₂)_u-NCH₃-CO-(CH₂)_v-, -(СН₂)_n-Val-Cit-пара-аминобензил-O-СО-NCH₃-(CH₂)_u-NCH₃-CO-(CH₂)_v-CO-, -(СН₂)_n-СО-Val-Cit-пара-аминобензил-O-СО-NCH₃-(CH₂)_u-NCH₃-CO-(CH₂)_v-, -(СН₂)_n-СО-Val-Cit-пара-аминобензил-O-СО-NCH₃-(CH₂)_u-NCH₃-CO-(CH₂)_v-CO-, -(CH₂CH₂O)_m-СН₂-СН₂-Val-Cit-пара-аминобензил-O-CO-NCH₃-(CH₂)_u-NCH₃-CO-(CH₂)_v-, -(CH₂CH₂O)_m-CH₂-CH₂-Val-Cit-пара-аминобензил-О-СО-NCH₃-(СН₂)_u-NCH₃-СО-(СН₂)_vCO-, -(CH₂CH₂O)_m-CH₂-CH₂-CO-Val-Cit-пара-аминобензил-O-CO-NCH₃-(CH₂)_u-NCH₃-CO-(CH₂)_v-, -(CH₂CH₂O)_m-CH₂-CH₂-CO-Val-Cit-пара-аминобензил-O-CO-NCH₃-(CH₂)_u-NCH₃-CO-(CH₂)_v-CO-, -CH₂-пара-циклогексил-СО-Val-Cit-пара-аминобензил-О-СО-NCH₃-(СН₂)_u-NCH₃-СО-(CH₂)_v-, -СН₂-пара-цикпогексил-СО-Val-Cit-пара-аминобензил-O-СО-NCH₃-(СН₂)_u-NCH₃-CO-(CH₂)_v-CO-, -арил-(СН₂)_n-Val-Cit-пара-аминобензил-O-СО-NCH₃-(СН₂)_u-NCH₃-CO-(CH₂)_v-, -арил-(CH₂)_n-Val-Cit-пара-аминобензил-O-CO-NCH₃-(CH₂)_u-NCH₃-CO-(CH₂)_v-CO-, -арил-CO-Val-Cit-пара-аминобензил-O-CO-NCH₃-(CH₂)_u-NCH₃-CO-(CH₂)_v-, -арил-СО-Val-Cit-пара-аминобензил-O-СО-NCH₃-(СН₂)_u-NCH₃-СО-(СН₂)_у-CO-, -(СН₂)_n-Val-Ala-пара-аминобензил-O-СО-NCH₃-(СН₂)_u-NCH₃-СО-(СН₂)_у-, (CH₂)_n-Val-Ala-пара-аминобензил-O-CO-NCH₃-(CH₂)_u-NCH₃-CO-(CH₂)_v-CO-, -(CH₂)_n-CO-Val-Ala-пара-аминобензил-O-CO-NCH₃-(CH₂)_u-NCH₃-CO-(CH₂)_v-, -(CH₂)_n-CO-Val-Ala-пара-аминобензил-O-CO-NCH₃-(CH₂)_u-NCH₃-CO-(CH₂)_v-CO-, -(CH₂CH₂O)_m-CH₂-CH₂-Val-Ala-пара-аминобензил-О-СО-NCH₃-(СН₂)_u-NCH₃-СО-(СН₂)_v-(CH₂CH₂O)_m-CH₂-CH₂-Val-Ala-пара-аминобензил-O-CO-NCH₃-(CH₂)_u-NCH₃-CO-(CH₂)_v-CO, -(CH₂CH₂O)_m-СН₂-СН₂-СО-Val-Ala-пара-аминобензил-O-СО-NCH₃-(CH₂)_u-NCH₃-CO-(CH₂)_v-, -(CH₂CH₂O)_m-СН₂-СН₂-СО-Val-Ala-пара-аминобензил-O-CO-NCH₃-(CH₂)_u-NCH₃-CO-(CH₂)_v-CO-, -СН₂-пара-циклогексил-СО-Val-Ala-пара-аминобензил-O-CO-NCH₃-(CH₂)_u-NCH₃-CO-(CH₂)_v-, -СН₂-пара-циклогексил-СО-Val-Ala-пара-аминобензил-O-CO-NCH₃-(CH₂)_u-NCH₃-CO-(CH₂)_v-CO-, -арил-(СН₂)_n-Val-Ala-пара-аминобензил-O-CO-NCH₃-(CH₂)_u-NCH₃-CO-(CH₂)_v-, -арил-(СН₂)_n-Val-Ala-пара-аминобензил-O-СО-NCH₃-(СН₂)_u-NCH₃-СО-(СН₂)_v-СО-, -арил-CO-Val-Ala-пара-аминобензил-O-СО-NCH₃-(СН₂)_u-NCH₃-СО-(СН₂)_v- или -арил-CO-Val-Ala-пара-аминобензил-O-СО-NCH₃-(СН₂)_u-NCH₃-СО-(СН₂)_v-СО-.

Согласно другому частному варианту осуществления, группа -L₁-(СО)_с-(W)_w-(Y)_y- представляет собой -(CH₂)_n-, -(CH₂)_n-CO-, -(CH₂)_n-Val-Cit-пара-аминобензил-О-СО-, -(СН₂)_n-СО-Val-Cit-пара-аминобензил-O-СО-, -(CH₂)_n-Val-Ala-пара-аминобензил-О-СО, -(СН₂)_n-СО-Val-Ala-пара-аминобензил-О-СО, -(СН₂)_n-Val-Cit-пара-аминобензил-O-СО-NH-(СН₂)_u-NH-, -(CH₂)_n-CO-Val-Cit-пара-аминобензил-O-СО-NH-(СН₂)_u-NH-, -(СН₂)_n-Val-Ala-пара-аминобензил-O-СО-NH-(CH₂)_u-NH-, -(СН₂)_n-СО-Val-Ala-пара-аминобензил-O-СО-МН-(СН₂)_u-NH-, -(СН₂)_n-Val-Cit-пара-аминобензил-O-СО-NCH₃-(СН₂)_u-NCH₃-СО-, -(CH₂)_n-CO-Val-Cit-пара-аминобензил-O-CO-NCH₃-(CH₂)_u-NCH₃-CO-, -(СН₂)_n-Val-Ala-пара-аминобензил-O-CO-NCH₃-(CH₂)_u-NCH₃-CO- или -(СН₂)_n-СО-Val-Ala-пара-аминобензил-O-СО-NCH₃-(CH₂)_u-NCH₃-CO-, где n и u такие, как определены выше, и в особенности, где n равно 5, а и равно 2.

Группа -L₁-(CO)_с-(W)_w-(Y)_y- также может представлять собой -(СН₂)_n-СО-NH-(CH₂)_u-NH-, -(CH₂)_n-CO-NH-(CH₂)_u-NH-CO-, -(CH₂)_n-CO-NCH₃-(CH₂)_u-NCH₃-, -(CH₂)_n-CO-NCH₃-(CH₂)_u-NCH₃-CO-, -(CH₂)_n-CO-NCH₃-(CH₂)_u-NCH₃-CO-(CH₂)_v-, -(CH₂)_n-CO-NCH₃-(CH₂)_u-NCH₃-CO-(CH₂)_v-CO-, -(СН₂)_n-Val-Cit-пара-аминобензил-О-CO-NCH₃-(CH₂)_u-NCH₃-CO-(CH2)_u, -(СН₂)_n-Val-Cit-пара-аминобензил-O-СО-NCH₃-(CH₂)_u-NCH₃-CO-(CH₂)_v-CO-, -(CH₂)_n-CO-Val-Cit-пара-аминобензил-O-CO-NCH₃-(CH₂)_u-NCH₃-CO-(CH₂)_v-, -(СН₂)_n-СО-Val-Cit-пара-аминобензил-O-СО-NCH₃-(СН₂)_u-NCH₃-CO-(CH₂)_v-CO-, -(CH₂)_n-Val-Ala-пара-аминобензил-O-CO-NCH₃-(CH₂)_u-NCH₃-CO-(CH₂)_v-, -(СН₂)_n-Val-Ala-пара-аминобензил-O-СО-NCH₃-(СН₂)_u-NCH₃-СО-(СН₂)у-CO-, -(СН₂)_n-СО-Val-Ala-пара-аминобензил-O-СО-NCH₃-(СН₂)_u-NCH₃-СО-(СН₂)_v-или -(СН₂)_n-СО-Val-Ala-пара-аминобензил-O-СО-NCH₃-(СН₂)_u-NCH₃-СО-(СН₂)_v-СО-, где n, и u v такие, как определены выше и, в особенности, где n равно 5, а и равно v равно 2.

Согласно предпочтительному варианту осуществления, группа -L₁-(СО)_с-(W)_w-(Y)_y- представляет собой -(СН₂)_n-СО-, -(СН₂)_n-СО-Val-Cit-пара-аминобензил-О-СО-, -(СН₂)_n-СО-Val-Ala-пара-аминобензил-O-СО-, -(CH₂)_n-CO-Val-Cit-napa-аминобензил-O-СО-NH-(СН₂)_u-NH-, -(СН₂)_n-СО-Val-Ala-пара-аминобензил-O-СО-NH-(CH₂)_u-NH-, -(CH₂)_n-CO-Val-Cit-пара-аминобензил-O-CO-NCH₃-(CH₂)_u-NCH₃-CO-или -(СН₂)_n-СО-Val-Ala-пара-аминобензил-O-СО-NCH₃-(СН₂)_u-NCH₃-СО-, где n и u такие, как определены выше и, в особенности, где n равно 5, а u равно 2.

Группа -L₁-(CO)_c-(W)_w-(Y)_y- также может представлять собой -(СН₂)_n-СО-NH-(CH₂)_u-NH-, -(CH₂)_n-CO-NH-(CH₂)_u-NH-CO-, -(CH₂)_n-CO-NCH₃-(CH₂)_u-NCH₃-, -(CH₂)_n-CO-NCH₃-(CH₂)_u-NCH₃-CO-, -(CH₂)_n-CO-NCH₃-(CH₂)_u-NCH₃-CO-(CH₂)_v-, -(CH₂)_n-CO-NCH₃-(CH₂)_u-NCH3-CO-(CH₂)_v-CO-, -(CH₂)_n-CO-Val-Cit-пара-аминобензил-O-CO-NCH₃-(CH₂)_u-NCH₃-CO-(CH₂)_v-, -(CH₂)_n-CO-Val-Cit-пара-аминобензил-О-СО-NCH₃-СН₂)_u-NCH₃-СО-(CH₂)_v-(СН₂)_v-СО-, -(CH₂)_n-CO-Val-Ala-пара-аминобензил-O-CO-NCH₃-(CH₂)_u-NCH₃-CO-(CH₂)_v- или -(CH₂)_n-CO-Val-Ala-пара-аминобензил-O-CO-NCH₃-(CH₂)_u-NCH₃-CO-(CH₂)_v-CO-, где n, u и v такие, как определены выше и, в особенности, где n равно 5, а и равно v равно 2.

Группа , предпочтительно, , представляет собой функциональную группу, которая будет реагировать со связывающим звеном, таким как антитело, для присоединения к ней фрагмента лекарственного средства благодаря сульфгидрильным группам, присутствующим на указанном связывающем звене. Сульфгидрильные группы могут быть образованы путем восстановления внутримолекулярных дисульфидных связей связывающего звена при их наличии, в частности, в антителах. В качестве альтернативы, сульфгидрильные группы могут быть образованы путем взаимодействия аминогруппы лизинового фрагмента связывающего звена с 2-иминотиоланом или с другими реагентами, образующими сульфгидрил. Согласно конкретным вариантам осуществления, связывающее звено, такое как антитело, сконструировано таким образом, что оно содержит один или более лизинов. Более предпочтительно, связывающее звено, такое как антитело, может быть сконструировано таким образом, что оно содержит один или более цистеинов (см. ThioMabs).

X₁ и Х₂ независимо друг от друга представляют собой Н, атом галогена, такой как Cl или Br, (С₁-С₆)алкокси, необязательно замещенный арилокси, или -О-(CH₂CH₂O)_rH, при условии, что Х₁ и Х₂ одновременно не являются Н. В частности, арилокси необязательно замещен одной или несколькими (например, одной) группами, выбранными из галогена, CN, NO₂ и арилокси (например, фенилокси), необязательно замещенного одним или несколькими атомами галогена, такими как атомы фтора. В частности, арилокси необязательно замещен одной или несколькими (например, одной) группами, выбранными из CN, NO₂ и пентафторфенилокси, в особенности, необязательно замещен CN. Арилокси может представлять собой, в частности, фенилокси.

Согласно частному варианту осуществления, X₁ и Х₂ независимо друг от друга представляют собой Н, атом галогена, такой как CI или Br, (С₁-С₆)алкокси или необязательно замещенный арилокси, при условии, что X₁ и Х₂ одновременно не являются Н. В частности, арилокси необязательно замещен одной или несколькими (например, одной) группами, выбранными из галогена, CN, NO₂ и арилокси (например, фенилокси), необязательно замещенного одним или несколькими атомами галогена, такими как атомы фтора. В частности, арилокси необязательно замещен одной или несколькими (например, одной) группами, выбранными из CN, NO₂ и пентафторфенилокси, в особенности, необязательно замещен CN. Арилокси может представлять собой, в частности, фенилокси.

Согласно другому частному варианту осуществления, Х₁ и Х₂ независимо друг от друга представляют собой Н, Cl, Br, метокси или фенилокси, замещенный CN, в особенности, Н, Cl или Br, при условии, что X₁ и Х₂ одновременно не являются Н.

Преимущественно, Х₁ и Х₂ являются идентичными и не являются Н, или один из Х₁ и Х₂ представляет собой Н, а другой не является Н. В случае, когда X₁ и/или Х₂ не является Н, он представляет собой атом галогена, такой как Cl или Br, (С₁-С₆)алкокси, необязательно замещенный арилокси, или -O-(CH₂CH₂O)_rH; в частности, атом галогена, такой как Cl или Br, (С₁-С₆)алкокси илинеобязательно замещенный арилокси; предпочтительно, Cl, Br, метокси или фенилокси, замещенный CN; в частности, Cl или Br.

q равно 0, 1 или 2. Предпочтительно, q равно 2.

Х₃ представляет собой функциональную группу (необязательно с концевым азотом, Z, когда у равно z равно 1, при этом Z представляет собой -NR₄-(CH₂)_u-NR₅-, или с концевым азотом, Z', когда с равно w равно у равно 0, a z' равно 1, при этом Z' представляет собой -NR₄-(CH₂)_u-NR₅-), нацеленную на взаимодействие с лекарственным средством (QH или Q-OH) для ковалентного связывания лекарственного средства со связывающим звеном, таким как антитело.

Можно также предусмотреть предварительное размещение спейсерного звена Y и аминокислотного звена (W)_w, если оно присутствует, на фрагменте лекарственного средства перед связыванием растягивающего звена, несущего сульфомалеимидную группу. В этом случае будет использовано соединение формулы (I), где w равно у равно 0 (т.е. содержащее только растягивающее звено и сульфомалеимидную группу), а Х₃ в этом случае будет представлять собой функциональную группу, реагирующую с аминокислотным звеном (W)_w или спейсерным звеном Y, уже присоединенным к звену лекарственного средства.

Х₃ представляет собой Н, когда у равно z равно 1 и Z представляет собой -NR₄-(CH₂)_u-NR₅-, или когда с равно w равно у равно 0, z' равно 1 и Z' представляет собой -NR₄-(CH₂)_u-NR₅- (и образует функциональную группу NH с концевым азотом группы Z или Z'), в других случаях Х₃ представляет собой ОН, NH₂ или уходящую группу, такую как ОН или уходящая группа. Уходящая группа может быть атомом галогена (например, Cl, Br, I), сульфонатом (например, OTf, OMs, OTs), N-сукцинимидилокси, 4-нитрофенилокси, пентафторфенилокси или N-бензотриазолокси. В частности, Х₃ является Н, когда у равно z равно 1 и Z представляет собой -NR₄-(CH₂)_u-NR₅-, или когда с равно w равно у равно О, z' равно 1 и Z' представляет собой -NR₄-(CH₂)_u-NR₅-, в других случаях Х₃ может быть, в частности, ОН, Cl или N-сукцинимидилокси.

Фрагмент лекарственного средства

Фрагмент лекарственного средства (Q) представляет собой остаток лекарственного средства QH или лекарственного средства Q-OH.

Лекарственное средство согласно настоящему изобретению может быть любым лекарственным средством, применяемым в терапии человека или животных, в особенности, для лечения рака. В частности, лекарственное средство может представлять собой цитотоксическое средство. Преимущественно, такое лекарственное средство содержит функциональную группу, позволяющую связывать данное лекарственное средство с линкерным фрагментом. Можно также предусмотреть введение такой функциональной группы в лекарственное средство для выполнения связывания. Такая функциональная группа может представлять собой, например, ОН, SH, NH или СООН, при этом она будет реагировать с концом Х₃ линкера, связывая лекарственное средство с линкерным фрагментом. Реакция связывания может представлять собой, например, реакцию нуклеофильного замещения (например, реакция ОН, SH, NH или СООН с Х₃ представляющим собой уходящюю группу), реакцию пептидного сочетания (например, реакция СООН с Х₃ представляющим собой NH₂ или ZX₃ или Z'X₃, с концевой группой NH), реакцию этерификации (реакцию между СООН и ОН), реакцию Мицунобу и т.п.

Фрагмент лекарственного средства Q может представлять собой, например:

- остаток производного ауристатина, такой как остаток монометилауристатина F (MMAF) (связанный при помощи его концевой группы NH или СООН), монометилауристатина Е (ММАЕ) (связанный при помощи его концевой группы NH или ОН), монометилдоластатина-10 (связанный при помощи его концевой группы NH) или его производного, такого как фрагмент лекарственного средства формулы (С), как определено ниже:

- остаток антрациклина, такой как остаток даунорубицина, доксорубицина, эпирубицина или идарубицина (связанный при помощи группы NH₂ или группы ОН фрагмента -СОСН₂ОН), или его производного, такого как 2-пирролинодоксорубицин или про-2-пирролинодоксорубицин (связанный при помощи ОН группы фрагмента -СОСН₂ОН), или PNU-159682 (связанный при помощи ОН группы фрагмента -СОСН₂ОН) или его производного; в частности, остаток доксорубицина (связанный при помощи группы NH₂ или группы ОН фрагмента -СОСН₂ОН), 2-пирролинодоксорубицина, про-2-пирролинодоксорубицина (связанный при помощи ОН группы фрагмента -СОСН₂ОН), или PNU-159682 (связанный при помощи ОН группы фрагмента -СОСН₂ОН), или производного PNU-159682, в особенности, такого как изображено ниже; предпочтительно, остаток PNU-159682 (связанный при помощи ОН группы фрагмента -СОСН₂ОН) или остаток производного PNU-159682, такого как изображен ниже (связанный посредством СООН);

- остаток камптотецина или его производного, такого как SN-38 (связанный посредством его группы ОН);

- остаток тубулизина, такого как тубулизин А, тубулизин В, тубулизин С или тубулизин D (связанный посредством группы СООН или группы ОН, при наличии);

- остаток калихеамицина, такого как эсперамицин или калихеамицин γ1, или его производного, такого как N-ацетилди метил гидр азид калихеамицина (связанный при помощи его гидразидного фрагмента);

- остаток майтансиноида, такого как майтансин (также называемым мейтансином) или его производного, такого как DM1 или DM4 (связанный при помощи группы SH); в частности, остаток DM1 или DM4 (связанный при помощи группы SH);

- остаток дуокармицина, такого как дуокармицин А, дуокармицин В1, дуокармицин В2, дуокармицин С1, дуокармицин С2, дуокармицин D, дуокармицин SA или СС-1065 (связанный посредством группы CONH₂); в частности, остаток СС-1065 (связанный посредством группы CONH₂);

- остаток аманитина (связанный при помощи группы ОН, NH, СООН или CONH₂, в частности, группы ОН), такого как α-аманитин, β-аманитин, γ-аманитин или ε-аманитин; в частности, остаток α-аманитина (связанный, в особенности, посредством группы СН₂ОН);

- остаток пирролобензодиазепина (PBD), такого как антрамицин (связанный посредством его группы ОН или группы NH₂) или SGD-1882 (связанный посредством его группы NH₂); в частности, SGD-1882 (связанный посредством его группы NH₂);

- остаток активатора иммунной контрольной точки, такой как остаток агониста STING (стимулятора генов интерферона) преимущественно формулы (D), как определено ниже (связанный посредством ОН, SH или NH) или остаток ингибитора IDO (индоламин-2,3-диоксигеназы), такого как эпакадостат (INCB024360) или BMS-986205.

Преимущественно, фрагмент лекарственного средства Q представляет собой:

- остаток производного ауристатина, такого как остаток MMAF (связанный при помощи его концевой группы NH или СООН), ММАЕ (связанный при помощи его концевой группы NH или ОН) или монометилдоластатин-10 (связанный при помощи его концевой группы NH) или фрагмент лекарственного средства формулы (С), как определено ниже;

- остаток агониста STING, в особенности, формулы (D), как определено ниже; или

- остаток антрациклина, как определено выше и, предпочтительно, остаток PNU-159682 или его производного, как показано ниже:

Фрагмент лекарственного средства Q представляет собой, в частности, остаток антрациклина, как определено выше и, предпочтительно, остаток PNU-159682 или его производного, как показано ниже:

Согласно первому варианту осуществления, остаток производного ауристатина имеет следующую формулу (С):

где:

- R₁ представляет собой Н или ОН,

- R₂ представляет собой (С₁-С₆)алкил (например, метил), СООН, СОО-((С₁-С₆)алкил) (такой как СООМе) или тиазолил (такой кактиазол-2-ил),

- R₃ представляет собой Н или (С₁-С₆)алкил (такой как метил), в частности, является (С₁-С₆)алкильной группой,

- Х₄ является О или NR₉,

- R₉ представляет собой Н или (С₁-С₆)алкил (такой как метил), и

- t представляет собой целое число от 1 до 8, в частности, от 1 до 6, преимущественно, от 1 до 4, предпочтительно, равное 1 или 2.

Согласно частному варианту осуществления:

- R₁ представляет собой ОН, a R₂ представляет собой (С₁-С₆)алкил, такой как метил; или

- R₁ представляет собой Н, a R₂ представляет собой тиазолил, такой как тиазол-2-ил, СОО-(C₁-С₆)алкил, такой как СООМе, или СООН.

Преимущественно, представляет собой Н, a R₂ представляет собой тиазолил, такой как тиазол-2-ил, СОО-(С₁-С₆)алкил, такой как СООМе, или СООН. Предпочтительно, R₁ представляет собой Н, a R₂ представляет собой СООН или СООМе, в частности, СООН.

Преимущественно, R₃ представляет собой (С₁-С₆)алкильную группу и, предпочтительно, метильную группу.

Согласно частному варианту осуществления, R₁ представляет собой Н, R₂ представляет собой СООН или СООМе (предпочтительно, СООН), R₃ является метилом, a t равно 1 или 2.

Преимущественно, Х₄ представляет собой NR₉, где R₉ является Н или (С₁-С₆)алкилом, предпочтительно, является Н или метилом.

Согласно предпочтительному варианту осуществления:

- R₁ представляет собой Н, R₂ представляет собой СООН, R₃ является метилом, Х₄ представляет собой NR₉, R₉ является метилом, a t равно 1 или 2, или

- R₁ представляет собой Н, R₂ представляет собой СООН, R₃ является метилом, Х₄ представляет собой NR₉, R₉ представляет собой Н, a t равно 1 или 2.

Согласно предпочтительному варианту осуществления, группа Х₄ находится в фенильном кольце в пара-положении относительно группы (CH₂)_t.

Преимущественно, остаток ауристатина формулы (С) выбран из следующих фрагментов:

и

Получение такого производного ауристатина раскрыто, например, в патентном документе WO2014/174064 или патентном документе WO2015/162293.

Согласно второму варианту осуществления, агонист STING имеет следующую формулу (X):

где:

- Х₁₁ и Х₂₁ независимо представляют собой О или S, предпочтительно, О,

- Х₁₂ и Х₂₂ независимо представляют собой ОН или SH, предпочтительно, SH,

- А₁₁ и А₂₁ независимо представляют собой группу формулы:

предпочтительно, или где:

Z₁ является OR₁₁ или NR₁₁R₁₂, где R₁₁ и R₁₂ независимо представляют собой Н, R₁₃ или COR₁₃, где R₁₃ представляет собой (С₁-С₆)алкил, арил или арил-(С₁-С₆)алкил,

Z₂ представляет собой Н или NR₂₁R₂₂, где R₂₁ и R₂₂ независимо представляют собой Н, R₂₃ или COR₂₃, где R₂₃ представляет собой (С₁-С₆)алкил, арил или арил-(С₁-С₆)алкил,

Z₃ является N или CR₃₃, предпочтительно, N, где R₃₃ представляет собой Н или атом галогена, такой как F или Cl, и

Z₄ представляет собой Н или (С₁-С₆)алкил,

- А₁₂ и А₂₂ независимо представляют собой Н, ОН или F, и

- А₂ представляет собой Н, или А₂ и А₂₂ соединены друг с другом, при этом А₂ представляет собой СН₂, а А₂₂ является О.

В случае, когда Z₁ является ОН или Z₄ представляет собой Н, могут быть получены следующие таутомерные формы:

Согласно частному варианту осуществления, агонист STING имеет одну из следующих формул:

где Х₁₁, Х₂₁, Х₁₂, Х₂₂, А₁₁, А₂₁, А₁₂, А₂₂ и А₂ - такие как определено выше или ниже.

Согласно другому частному варианту осуществления, агонист STING имеет одну из следующих формул:

где Х₁₁, Х₂₁, Х₁₂, Х₂₂, A₁₁, А₂₁, А₁₂, А₂₂ и А₂ - такие как определено выше или ниже.

Преимущественно, Х₁₁ и Х₂₁ оба являются О. Преимущественно, по меньшей мере один из Х₁₂ и Х₂₂ является SH и, предпочтительно, Х₁₂ и Х₂₂ оба являются SH. Предпочтительно, Х₁₁ и Х₂₁ оба являются О, а Х₁₂ и Х₂₂ оба являются SH.

В частности, R₁₁ и R₁₂ оба являются Н и, преимущественно, каждый из R₁₁, R₁₂, R₂₁ и R₂₂ является Н.

В частности, Z₃ представляет собой N. Преимущественно, Z₁ является ОН или NH₂; Z₂ представляет собой Н или NH₂; Z₃ является N; и Z₄ представляет собой Н.

Предпочтительно, А₁₁ и А₂₁ независимо выбраны из (цитозина),

(аденин-6-бензамида), (2,6-диаминопурина), (гипоксантина), (гуанина) и (гуанин-2-изобутирамида); более предпочтительно, выбраны из цитозина, аденина, аденин-6-бензамида, 2,6-диаминопурина, гипоксантина, гуанина и гуанин-2-изобутирамида; наиболее предпочтительно, выбраны из аденина, гипоксантина и гуанина.

В частности, агонист STING может представлять собой ADU-S100 следующей формулы:

В качестве альтернативы, агонист STING может представлять собой одно из соединений, раскрытых, в частности, в работе Lioux et al. J. Med. Chem., 2016, 59 (22), pp.10253-10267.

Получение такого агониста STING раскрыто, например, в патентных документах WO2014/179335, WO2016/096174, WO2016/145102, WO2017/106740 или WO2018/100558.

Указанный агонист STING соединен с линкерным фрагментом посредством группы SH, ОН или NH, присутствующей в молекуле, т.е. посредством группы Х₁₂ (ОН или SH), Х₂₂ (ОН или SH), Z₁, когда по меньшей мере один из и R₁₂ представляет собой Н (ОН, NHR₁₁ или NHR₁₂), или Z₂, когда по меньшей мере один из R₂₁ и R₂₂ представляет собой Н (NHR₂₁ или NHR₂₂). Предпочтительно, по меньшей мере один из Х₁₂ и Х₂₂ является SH, и агонист STING присоединен при помощи этой группы SH.

Следовательно, остаток агониста STING преимущественно имеет следующую формулу (D), (D-1), (D-2), (D-3), (D-1a), (D-2a) или (D-3a):

где:

- Х₁₁ и Х₂₁ такие, как определены выше,

- Х₁₂ и Х₂₂ такие, как определены выше, или О, или S,

- A₁₁ и А₂₁ такие, как определены выше, т.е. независимо представляют собой группу формулы:

предпочтительно, или где:

Z₁ такой, как определено выше, или О, или NR₁₁,

Z₂ такой, как определено выше, или NR₂₁,

Z₃ такой, как определено выше, и

Z₄ такой, как определено выше,

- А₁₂ и А₂₂ такие, как определены выше, и

- А₂ такой, как определено выше,

где:

в случае, если Х₁₂ является О или S, то Х₂₂ не является О и не является S, Z₁ не является О и не является NR₁₁, Z₂ не является NR₂₁, и остаток агониста STING соединен с остальной частью молекулы посредством Х₁₂;

если Х₂₂ является О или S, то Х₁₂ не является О и не является S, Z₁ не является О и не является NR₁₁ Z₂ не является NR₂₁, и остаток агониста STING соединен с остальной частью молекулы посредством Х₂₂;

если Z₁ является О или NR₁₁, то Х₁₂ не является О и не является S, Х₂₂ не является О и не является S, Z₂ не является NR₂₁, и остаток агониста STING соединен с остальной частью молекулы посредством Z₁;

если Z₂ представляет собой NR₂₁, то Х₁₂ не является О и не является S, Х₂₂ не является О и не является S, Z₁ не является О и не является NR₁₁, и остаток агониста STING соединен с остальной частью молекулы посредством Z₂.

Фрагмент связывающего звена

Связывающее звено представляет собой пептид, белок (например, сконструированный белок), антитело (например, моноклональное антитело) или его антигенсвязывающий фрагмент.

Предпочтительно, связывающее звено согласно изобретению представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент и, соответственно, конъюгат связывающее звено-лекарственное средство согласно изобретению представляет собой конъюгат антитело-лекарственное средство (ADC). Согласно одному из вариантов осуществления, антитело по изобретению состоит из рекомбинантного антитела. Согласно другому варианту осуществления, антитело ADC по изобретению состоит из синтезированного химическим способом антитела.

В частности, такая молекула состоит из гликопротеина, содержащего по меньшей мере две тяжелые (Н) цепи и две легкие (L) цепи, соединенные между собой дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь содержит вариабельную область (или домен) тяжелой цепи (сокращенно HCVR или VH) и константную область тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи содержит три домена, СН1, СН2 и СН3. Каждая легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи (сокращенно LCVR или VL) и константную область легкой цепи. Константная область легкой цепи содержит один домен, CL. Области VH и VL могут быть дополнительно подразделены на области гипервариабельности, называемые областями, определяющими комплементарность (англ. CDR, complementarity determining regions), чередующиеся с более консервативными областями, называемыми каркасными областями (англ. FR, framework regions). Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от амино-конца к карбокси-концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей содержат связывающий домен, взаимодействующий с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент (Clq) классической системы комплемента.

Согласно одному из вариантов осуществления, "антигенсвязывающие фрагменты" выбраны из группы, состоящей из фрагментов или диател Fv, scFv (sc для одноцепочечной), Fab, F(ab')₂, Fab', scFv-Fc или любого фрагмента, время полужизни которого увеличено в результате химической модификации, такой как присоединение поли(алкилен)гликоля, такого как поли (этилен) гликоль ("PEG-илирование") (пегилированные фрагменты, называемые Fv-PEG, scFv-PEG, Fab-PEG, F(ab')₂-PEG или Fab'-PEG) ("PEG" означает полиэтиленгликоль), или путем включения в липосому, при этом данные фрагменты имеют по меньшей мере одну из областей CDR, характерных для антитела согласно изобретению. Предпочтительно, указанные "антигенсвязывающие фрагменты" состоят из частичной последовательности тяжелой или легкой вариабельной цепи антитела, из которого они выделены, или содержат эту последовательность, причем данная частичная последовательность является достаточной для сохранения такой же специфичности связывания, как у антитела, от которого она происходит, и достаточного сродства по отношению к мишени, предпочтительно, равного по меньшей мере 1/100, более предпочтительно, по меньшей мере 1/10, от сродства антитела, от которого она происходит. Более предпочтительно, указанные "антигенсвязывающие фрагменты" состоят из по меньшей мере трех областей CDR CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 тяжелой вариабельной цепи и трех областей CDR CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 легкой вариабельной цепи антитела, из которого они выделены, или содержат эти области.

Согласно предпочтительному варианту осуществления, связывающее звено представляет собой антитело к IGF-1R, антитело к HER2 или антигенсвязывающий фрагмент этого.

В частности, антитело к HER2 представляет собой трастузумаб.

Согласно одному из вариантов осуществления настоящей заявки, антитело представляет собой антитело к IGF-1R, а эпитоп антитела предпочтительно локализован во внеклеточном домене IGF-1R человека (также называемом IGF-1R ECD).

Согласно конкретному варианту осуществления, антитело или любой его антигенсвязывающий фрагмент способны связываться с IGF-1R с ЕС₅₀, составляющей от 10×10^-10 до 1×10^-10 и, более предпочтительно, от 8×10^-10 до 2×10^-10.

Конкуренция за связывание с IGF-1R может быть определена с помощью любых методов или технологий, известных специалисту в данной области техники, таких как, не ограничиваясь перечнем, радиоактивность, Biacore, ELISA (англ. Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay - твердофазный иммуноферментный анализ), проточная цитометрия и т.п. Фраза "конкурирующий за связывание с IGF-1R'' подразумевает конкуренцию по меньшей мере 20%, предпочтительно, по меньшей мере 50% и, более предпочтительно, по меньшей мере 70%.

Связывание с одним и тем же эпитопом может быть определено с использованием любых методов или технологий, известных специалисту в данной области техники, таких как, не ограничиваясь перечнем, радиоактивность, Biacore, ELISA, проточная цитометрия и т.п. Фраза "связывающийся с одним и тем же эпитопом IGF-1R'' подразумевает конкуренцию по меньшей мере 20%, предпочтительно, по меньшей мере 50% и, более предпочтительно, по меньшей мере 70%.

Как упоминалось выше и в противоположность общепринятым сведениям, настоящее изобретение уделяет особое внимание специфическим антителам к IGF-1R, обладающим высокой способностью к интернализации после связывания IGF-1R. При использовании в данном контексте, антитело, которое "интернализуется" или "интернализовано" (эти два выражения идентичны) представляет собой антитело, которое поглощается клеткой (то есть "проникает в клетку") после связывания с IGF-1R на клетке млекопитающего. Такое антитело представляет интерес в составе ADC, поскольку оно адресует или направляет связанный с ним цитотоксический агент в целевые раковые клетки. После интернализации цитотоксический агент инициирует гибель раковых клеток.

Преимущественно, все антитела к IGF-1R согласно изобретению имеют одни и те же последовательности CDR-H2, CDR-H3 и CDR-L2, при этом другие 3 CDR различаются. Это наблюдение кажется логичным, поскольку является частью общедоступных сведений о том, что в отношении специфичности связывания антитела область CDR-H3 описывается как наиболее важная и наиболее вовлеченная в распознавание эпитопа.

Считается, что важным аспектом успеха терапии ADC является специфичность к ангтигену-мишени и интернализация комплексов антиген-антитело в раковые клетки. Очевидно, что неинтернализующие антигены являются менее эффективными для доставки цитотоксических средств, чем интернализующие антигены. Процессы интернализации являются различными для разных антигенов и зависят от множества параметров, на которые могут влиять антитела.

В ADC фрагмент лекарственного средства придает цитотоксичесгую активность, а используемое антитело отвечает за специфичность в отношении раковых клеток, а также используется в качестве вектора для проникновения в клетку для правильного направления цитотоксического действия. Таким образом, при усовершенствовании ADC антитело должно проявлять высокую способность к интернализации в целевые раковые клетки. Эффективность опосредованной антителами интернализации значительно различается в зависимости от эпитопа-мишени. Для выбора действенных антител, интернализующих IGF-1R, необходимы различные экспериментальные данные исследований, изучающих не только понижающую регуляцию IGF-1R, но также и последующую интернализацию антител к IGF-1 R в клетки.

Согласно одному из вариантов осуществления, интернализацию антитела ADC согласно изобретению можно оценивать с помощью иммунофлуоресценции или FACS (проточной цитометрии) (как проиллюстрировано далее в качестве примера в настоящей заявке), либо с помощью любого способа или процесса, известного специалисту в данной области техники, специфичного для механизма интернализации. Согласно предпочтительному варианту осуществления, антитело ADC согласно изобретению может индуцировать интернализацию после связывания с IGF-1R по меньшей мере на 30%, предпочтительно, на 50% и, более предпочтительно, на 80%.

Комплекс IGF-1 R/антитело интернализуется после связывания антитела с ECD указанного IGF-1R, при этом индуцируется уменьшение количества IGF-1R на поверхности клеток. Это уменьшение можно определить количественно при помощи любого способа, известного специалисту в данной области техники, такого как, в качестве неограничивающих примеров, вестерн-блоттинг, FACS (англ. fluorescence-activated cell sorting - сортировка флуоресцентно-активированных клеток) и иммунофлуоресценция.

Согласно одному из вариантов осуществления, это уменьшение, отражающее, таким образом, интернализацию, может быть предпочтительно измерено с помощью FACS и выражено в виде разности или дельты между средней интенсивностью флуоресценции (англ. MFI, Mean Fluorescence Intensity), измеренной при температуре 4°С, и MFI, измеренной при температуре 37°С, после 4 часов инкубации с антителом.

В качестве неограничивающего примера, эту дельту определяют на основании MFI, полученных для необработанных клеток и клеток, обработанных антителом, при использовании i) клеток рака молочной железы MCF7 после 4 ч инкубации с антителом, описанным в данном документе, и ii) второго антитела, меченного Alexa488. Данный параметр определяют по следующей формуле: Δ(MFI_4°C-MFI_37°C).

Эта разность между MFI отражает понижающую регуляцию IGF-1R, поскольку MFI пропорциональны IGF-1R, экспрессируемым на клеточной поверхности.

Согласно преимущественному аспекту, антитела состоят из антител, инициирующих Δ(MFI_4°C - MFI_37°C) на MCF-7 по меньшей мере 280, предпочтительно, по меньшей мере 400.

Более подробно, упомянутая выше дельта может быть измерена следующим способом, который следует рассматривать в качестве иллюстративного и неограничивающего примера:

Обработка и инкубация представляющих интерес опухолевых клеток антителом по изобретению в холодной (4°С) либо теплой (37°С) полной культуральной среде;

Обработка клеток, обработанных на стадии а), и параллельно -необработанных клеток вторым антителом;

Измерение MFI (характеризующей количество IGF-1R, присутствующего на поверхности) для обработанных и необработанных клеток с помощью второго меченого антитела, способного связываться с антителом по изобретению; и

Вычисление дельта путем вычитания MFI, полученной для обработанных клеток, из MFI, полученной для необработанных клеток.

На основания полученного значения дельта MFI можно определить процент интернализации как:

100×(MFI_4°C-MFI_37°C) / MF_4°C.

Антитела в ADC согласно изобретению, присутствующие, предпочтительно, на клетках MCF7 имеют процент интернализации от 50% до 99%, от 70% до 90%, предпочтительно, от 75% до 87%.

Особое преимущество антител, описанных в данной работе, обуславливается скоростью их интернализации.

Общеизвестно, что для ADC желательно, чтобы используемые антитела проявляли высокую скорость интернализации, предпочтительно, в течение 24 часов после введения антитела и, более предпочтительно в течение 12 часов и, еще более предпочтительно, в течение 6 часов.

В настоящем изобретении скорость интернализации, также называемая уменьшением количества антител, связанных с поверхностью клетки, или распадом антител на клеточной поверхности, выражена в виде t1/2 (время полужизни) и соответствует времени, необходимому для получения уменьшения ΔMFI на 50% (данный аспект будет более понятен из следующих примеров).

Особым преимуществом является тот факт, что антитела в ADC по изобретению имеют t1/2, составляющее от 5 до 25 минут и, предпочтительно, от 10 до 20 минут.

Согласно частному варианту осуществления изобретения, антитело содержит три CDR тяжелой цепи, имеющих последовательности SEQ ID NO: 1, 2 и 3, и три CDR легкой цепи, имеющих последовательности SEQ ID NO: 4, 5 и 6.

Согласно частному варианту осуществления изобретения, антитело содержит три CDR тяжелой цепи, содержащие или состоящие из последовательностей SEQ ID NO: 1, 2 и 3 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80%, предпочтительно, 85%, 90%, 95% и 98% идентичности SEQ ID NO: 1, 2 или 3; и три CDR легкой цепи, содержащие или состоящие из последовательностей SEQ ID NO: 4, 5 и 6 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80%, предпочтительно, 85%, 90%, 95% и 98% идентичности SEQ ID NO: 4, 5 или 6.

Согласно частному варианту осуществления изобретения, связывающее звено представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способные связываться с человеческим IGF-1R, выбранные из:

i) антитела, содержащего три CDR тяжелой цепи с CDR-H2 последовательности SEQ ID NO: 2 и CDR-H3 последовательности SEQ ID NO: 3, и три CDR легкой цепи с CDR-L2 последовательности SEQ ID NO: 5;

ii) антитела, конкурирующего за связывание с IGF-1R с антителом i); и

iii) антитела, связывающегося тем же эпитопом IGF-1R, что и антитело i).

i) антитела, содержащего три CDR тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 1, 2 и 3 и три CDR легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 4, 5 и 6;

iii) антитела, связывающегося с тем же эпитопом IGF-1R, что и антитело i).

Согласно другому варианту осуществления, антитело или любой его антигенсвязывающий фрагмент содержит три CDR тяжелой цепи, содержащие последовательности SEQ ID NO: 1, 2 и 3; и три CDR легкой цепи, содержащие последовательности SEQ ID NO: 4, 5 и 6.

Для сравнения вариабельных доменов независимо от рецептора антигена, типа цепи или вида была определена уникальная нумерация IMGT [Lefranc М.-Р., Immunology Today 18, 509 (1997) / Lefranc М.-Р., The Immunologist, 7, 132-136 (1999) / Lefranc, M.-P., C., Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. and Lefranc, Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)]. В уникальной нумерации IMGT консервативные аминокислоты всегда имеют одно и то же положение, например, цистеин 23 (1st-CYS), триптофан 41 (CONSERVED-TRP), гидрофобная аминокислота 89, цистеин 104 (2nd-CYS), фенилаланин или триптофан 118 (J-PHE или J-TRP). Уникальная нумерация IMGT обеспечивает стандартизированное разграничение каркасных областей (FR1-IMGT: позиции с 1 по 26, FR2-IMGT: с 39 по 55, FR3-IMGT: с 66 по 104 и FR4-IMGT: с 118 по 128) и областей, определяющих комплементарность: CDR1-IMGT: с 27 по 38, CDR2-IMGT: с 56 по 65 и CDR3-IMGT: с 105 по 117. Поскольку гэпы представляют собой незанятые позиции, длины CDR-IMGT (указанные в квадратных скобках и разделенные точками, например, [8.8.13]) становятся важной информацией. Уникальную нумерацию IMGT используют в 2D графических изображениях, обозначаемых как IMGT Colliers de Perles [Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002) / Kaas, Q. and Lefranc, M.-P., Current Bioinformatics, 2, 21-30 (2007)], и в 3D структурах в IMGT/3Dstructure-DB [Kaas, Q., Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., T cell receptor and MHC structural data (Т-клеточный рецептор и структурные данные МНС). Nucl. Acids. Res., 32, D208-D210 (2004)].

Для аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере 80%, предпочтительно, 85%, 90%, 95% и 98% идентичности эталонной аминокислотной последовательности, предпочтительные примеры включают примеры, содержащие эталонную последовательность, некоторые модификации, в частности, делецию, добавление или замену по меньшей мере одной аминокислоты, усечение или удлинение. В случае замены одной или более последовательных или непоследовательных аминокислот, предпочтительными являются замены, при которых заменяемые аминокислоты замещаются "эквивалентными" аминокислотами. В данном контексте под выражением "эквивалентные аминокислоты" подразумевают любые аминокислоты, которые могут заменить одну из структурных аминокислот, при этом, однако, без изменения биологической активности соответствующих антител, конкретные примеры таких аминокислот приведены ниже.

Эквивалентные аминокислоты могут быть определены либо по их структурной гомологии с аминокислотами, которые они заменяют, либо по результатам сравнительных тестов на биологическую активность между различными антителами, которые могут быть получены.

В качестве неограничивающего примера в приведенной ниже Таблице 1 представлена сводная информация о возможных заменах, которые могут быть выполнены без существенного изменения биологической активности соответствующего модифицированного антитела; обратные замены, естественно, возможны при тех же условиях.

Конкретным аспектом изобретения является тот факт, что антитело не связывается с инсулиновым рецептором (IR). Данный аспект представляет интерес, поскольку описанное в данной работе антитело не будет оказывать никакого отрицательного воздействия на IR, то есть на метаболизм инсулина.

Согласно другому варианту осуществления, еще одним преимущественным аспектом антитела является тот факт, что оно способно связываться не только с IGF-1R человека, но также и с IGF-1R обезьяны и, в частности, с IGF-1R яванского макака. Данный аспект также представляет интерес, поскольку облегчает оценку токсичности, необходимую для клинических испытаний.

Согласно еще одному варианту осуществления, антитело состоит из моноклонального антитела. Монокпональное антитело в данном контексте включает мышиное, химерное и гуманизированное антитело, такие как описаны ниже.

Антитело предпочтительно получают из гибридомы мышиного происхождения, зарегистрированной во французской коллекции культур микроорганизмов (CNCM, Институт Пастера, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Париж Седекс 15, Франция), где указанная гибридома получена путем слияния спленоцитов/лимфоцитов мышей, иммунизированных Balb/C, и клеток миелономной Sp 2/O-Ag 14 клеточной линии.

Согласно одному из вариантов осуществления, антитело к IGF-1R состоит из мышиного антитела, далее обозначенного как m\[название антитела].

Согласно одному из вариантов осуществления, антитело к IGF-1R состоит из химерного антитела, далее обозначенного как с[название антитела].

Согласно одному из вариантов осуществления, антитело к IGF-1R состоит из гуманизированного антитела, далее обозначенного как hz[название антитела].

Во избежание неоднозначного толкования, в последующем описании выражения "антитело к IGF-1R" и "[название антитела]" являются аналогичными и включают (в отсутствие обратного описания) мышиный, химерный и гуманизированный варианты указанного антитела к IGF-1R или указанного "[название антитела]". При необходимости используют префиксы m-(мышиное), с-(химерное) или hz-(гуманизированное).

Для большей ясности в следующей Таблице 2 представлены последовательности CDR, определенные в соответствии с IMGT, для предпочтительных антител.

Специалисту в данной области техники будет очевидно, что любую комбинацию из 6 CDR, как описано выше, следует рассматривать, как часть настоящего изобретения.

Как можно видеть из данной Таблицы 2, все описанные в настоящем документе антитела имеют одинаковые последовательности CDR-H2, CDR-H3 и CDR-L2, и это свойство представляет особый интерес, как описано выше.

Согласно конкретному аспекту, антитело представляет собой мышиное антитело, отличающееся тем, что указанное антитело также содержит константные области легкой цепи и тяжелой цепи, происходящие из антитела вида, гетерологичного для мыши, в особенности, человека.

Согласно другому конкретному аспекту, антитело представляет собой химерное (с) антитело, отличающееся тем, что указанное антитело также содержит константные области легкой цепи и тяжелой цепи, происходящие из антитела вида, гетерологичного для мыши, в особенности, человека.

Химерное антитело представляет собой антитело, содержащее природную вариабельную область (легкой цепи и тяжелой цепи), происходящую из антитела данного вида, в комбинации с константными областями легкой цепи и тяжелой цепи антитела видов, гетерологичных для данного вида.

Химерные антитела могут быть получены с использованием методов рекомбинантной генетики. Например, химерное антитело может быть получено путем клонирования рекомбинантной ДНК, содержащей промотор и последовательность, кодирующую вариабельную область моноклонального антитела нечеловеческого происхождения, в особенности, мышиного, и последовательность, кодирующую константную область антитела гетерологичных видов, предпочтительно, человека. Химерное антитело ADC согласно изобретению, кодируемое одним таким рекомбинантным геном, может представлять собой, например, химерное антитело мыши-человека, при этом специфичность такого антитела определяется вариабельной областью, происходящей из мышиной ДНК, а его изотип определяется константной областью, происходящей из ДНК человека.

Согласно варианту осуществления изобретения, антитело выбрано из:

a) антитела, содержащего три CDR тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 7, 2 и 3 и три CDR легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 9, 5 и 11;

b) антитела, содержащего три CDR тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 7, 2 и 3 и три CDR легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 10, 5 и 11;

c) антитела, содержащего три CDR тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 7, 2 и 3 и три CDR легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 9, 5 и 12; и

d) антитела, содержащего три CDR тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 8, 2 и 3 и три CDR легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 9, 5 и 11.

Согласно предпочтительному, но не ограничивающему варианту осуществления, антитело выбрано из:

a) антитела, содержащего вариабельный домен тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 13 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80% идентичности SEQ ID NO: 13, и три CDR легкой цепи с последовательностями SEQ ID NO: 9, 5 и 11;

b) антитела, содержащего вариабельный домен тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 14 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80% идентичности SEQ ID NO: 14, и три CDR легкой цепи с последовательностями SEQ ID NO: 10, 5 и 11;

c) антитела, содержащего вариабельный домен тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 15 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80% идентичности SEQ ID NO: 15, и три CDR легкой цепи с последовательностями SEQ ID NO: 9, 5 и 12;

d) антитела, содержащего вариабельный домен тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 16 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80% идентичности SEQ ID NO: 16, и три CDR легкой цепи с последовательностями SEQ ID NO: 9, 5 и 11; и

e) антитела, содержащего вариабельный домен тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 17 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80% идентичности SEQ ID NO: 17, и три CDR легкой цепи с последовательностями SEQ ID NO: 9, 5 и 12.

Под "любой последовательностью, имеющей по меньшей мере 80%, предпочтительно, 85%, 90%, 95% и 98% идентичности последовательностям SEQ ID NO: с 13 по 17" подразумевают последовательности, содержащие три CDR тяжелой цепи SEQ ID NO: 1, 2 и 3 и, кроме того, проявляющие по меньшей мере 80%, предпочтительно, 85%, 90%, 95% и 98%, идентичности полноразмерной последовательности SEQ ID NO: с 13 по 17 вне последовательностей, соответствующих CDR (т.е. SEQ ID NO: 1, 2 и 3).

a) антитела, содержащего вариабельный домен тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 13 и три CDR легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 9, 5 и 11;

b) антитела, содержащего вариабельный домен тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 14 и три CDR легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 10, 5 и 11;

c) антитела, содержащего вариабельный домен тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 15 и три CDR легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 9, 5 и 12;

d) антитела, содержащего вариабельный домен тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 16 и три CDR легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 9, 5 и 11; и

e) антитела, содержащего вариабельный домен тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 17 и три CDR легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 9, 5 и 12.

Согласно другому предпочтительному, но не ограничивающему варианту осуществления, антитело выбрано из:

а) антитела, содержащего вариабельный домен легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 18 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80% идентичности SEQ ID NO: 18, и три CDR тяжелой цепи с последовательностями SEQ ID NO: 7, 2 и 3;

b) антитела, содержащего вариабельный домен легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 19 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80% идентичности SEQ ID NO: 19, и три CDR тяжелой цепи с последовательностями SEQ ID NO: 7, 2 и 3;

c) антитела, содержащего вариабельный домен легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 20 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80% идентичности SEQ ID NO: 20, и три CDR тяжелой цепи с последовательностями SEQ ID NO: 7, 2 и 3;

d) антитела, содержащего вариабельный домен легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 21 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80% идентичности SEQ ID NO: 21, и три CDR тяжелой цепи с последовательностями SEQ ID NO: 8, 2 и 3; и

e) антитела, содержащего вариабельный домен легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 22 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80% идентичности SEQ ID NO: 22, и три CDR тяжелой цепи с последовательностями SEQ ID NO: 7, 2 и 3.

Под "любой последовательностью, имеющей по меньшей мере 80%, предпочтительно, 85%, 90%, 95% и 98% идентичности последовательностям SEQ ID NO: с 18 по 22" подразумевают, соответственно, последовательности, содержащие три CDR легкой цепи SEQ ID NO: 4, 5 и 6 и, кроме того, проявляющие по меньшей мере 80%, предпочтительно, 85%, 90%, 95% и 98% идентичности полноразмерной последовательности SEQ ID NO: с 18 по 22 вне последовательностей, соответствующих CDR (т.е. SEQ ID NO: 4, 5 и 6).

a) антитела, содержащего вариабельный домен легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 18 и три CDR тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 7, 2 и 3;

b) антитела, содержащего вариабельный домен легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 19 и три CDR тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 7, 2 и 3;

c) антитела, содержащего вариабельный домен легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 20 и три CDR тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 7, 2 и 3;

d) антитела, содержащего вариабельный домен легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 21 и три CDR тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 8, 2 и 3; и

e) антитела, содержащего вариабельный домен легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 22 и три CDR тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 7, 2 и 3.

Согласно варианту осуществления изобретения, антитело представляет собой антитело, выбранное из:

a) антитела, содержащего вариабельный домен тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 13 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80% идентичности SEQ ID NO: 13, и вариабельный домен легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 18 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80% идентичности SEQ ID NO: 18;

b) антитела, содержащего вариабельный домен тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 14 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80% идентичности SEQ ID NO: 14, и вариабельный домен легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 19 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80% идентичности SEQ ID NO: 19;

c) антитела, содержащего вариабельный домен тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 15 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80% идентичности SEQ ID NO: 15, и вариабельный домен легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 20 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80% идентичности SEQ ID NO: 20;

d) антитела, содержащего вариабельный домен тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 16 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80% идентичности SEQ ID NO: 16, и вариабельный домен легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 21 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80% идентичности SEQ ID NO: 21; и

e) антитела, содержащего вариабельный домен тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 17 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80% идентичности SEQ ID NO: 17, и вариабельный домен легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 22 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80% идентичности SEQ ID NO: 22.

Химерные антитела, описанные в данном контексте, также могут характеризоваться константным доменом и, в частности, химерные антитела могут быть выбраны или сконструированы, как, не ограничиваясь перечнем, IgG1, IgG2, IgG3, IgM, IgA, IgD или IgE. Более предпочтительно, в контексте настоящего изобретения химерные антитела представляют собой IgG1 или IgG4.

Согласно варианту осуществления изобретения, антитело является химерным антителом, содержащим вариабельные домены VH и VL, как описано выше, в формате IgG1. Более предпочтительно, указанное химерное антитело содержит константный домен для VH последовательности SEQ ID NO: 43 и каппа-домен для VL последовательности SEQ ID NO: 45.

Согласно варианту осуществления изобретения, антитело представляет собой химерное антитело, содержащее вариабельные домены VH и VL, как описано выше, в формате IgG4. Более предпочтительно, химерное антитело содержит константный домен для VH последовательности SEQ ID NO: 44 и каппа-домен для VL последовательности SEQ ID NO: 45.

a) антитела, содержащего или состоящего из тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 23 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80% идентичности SEQ ID NO: 23, и легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 28 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80% идентичности SEQ ID NO: 28;

b) антитела, содержащего или состоящего из тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 24 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80% идентичности SEQ ID NO: 24, и легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 29 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80% идентичности SEQ ID NO: 29;

c) антитела, содержащего или состоящего из тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 25 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80% идентичности SEQ ID NO: 25, и легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 30 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80% идентичности SEQ ID NO: 30;

d) антитела, содержащего или состоящего из тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 26 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80% идентичности SEQ ID NO: 26, и легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 31 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80% идентичности SEQ ID NO: 31; и

e) антитела, содержащего или состоящего из тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 27 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80% идентичности SEQ ID NO: 27, и легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 32 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80% идентичности SEQ ID NO: 32.

Для большей ясности в следующей Таблице 3 представлены последовательности VH и VL, соответственно, для предпочтительных химерных антител.

Согласно другому конкретному аспекту настоящего изобретения, антитело представляет собой гуманизированное антитело, отличающееся тем, что константные области легкой цепи и тяжелой цепи, полученные из антитела человека, представляют собой, соответственно, лямбда- или каппа-область и область гамма-1, гамма-2 или гамма-4.

Гуманизированные антитела или их фрагменты могут быть получены способами, известными специалисту в данной области техники. Такие гуманизированные антитела являются предпочтительными для применения в способах, включающих диагностику in vitro или профилактическое и/или терапевтическое лечение in vivo. Можно также упомянуть и другие способы гуманизации, также известные специалисту в данной области техники, такие как, например, метод "прививания CDR", описанный PDL в патентных документах ЕР 0451216, ЕР 0682040, ЕР 0939127, ЕР 0566647 или US 5530101, US 6180370, US 5585089 и US 5693761, US 5639641 или 6054297, 5886152 и 5877293.

Согласно предпочтительному варианту осуществления, антитело содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH), имеющий:

i) CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 с последовательностями SEQ ID NO: 7, 2 и 3, соответственно, и

ii) FR1, FR2 и FR3, полученные из IGHV1-46*01 зародышевой линии человека (SEQ ID NO: 46), и

iii) FR4, полученную из IGHJ4*01 зародышевой линии человека (SEQ ID NO: 48).

Согласно предпочтительному варианту осуществления, антитело содержит вариабельный домен легкой цепи (VL), имеющий:

i) CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 с последовательностями SEQ ID NO: 9, 5 и 11, соответственно, и

ii) FR1, FR2 и FR3, полученные из IGKV1-39*01 зародышевой линии человека (SEQ ID NO: 47), и

iii) FR4, полученную из IGKJ4*01 зародышевой линии человека (SEQ ID NO: 49).

Согласно предпочтительному, но не ограничивающему варианту осуществления изобретения, антитело содержит:

a) тяжелую цепь, имеющую CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 с последовательностями SEQ ID NO: 7, 2 и 3, соответственно, и FR1, FR2 и FR3, полученные из IGHV1-46*01 зародышевой линии человека (SEQ ID NO: 46), и FR4, полученную из IGHJ4*01 зародышевой линии человека (SEQ ID NO: 48); и

b) легкую цепь, имеющую CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 с последовательностями SEQ ID NO: 9, 5 и 11, соответственно, и FR1, FR2 и FR3, полученные из IGKV1-39*01 зародышевой линии человека (SEQ ID NO: 47), и FR4, полученную из IGKJ4*01 зародышевой линии человека (SEQ ID NO: 49).

Согласно одному из вариантов осуществления, антитело содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH) последовательности SEQ ID NO: 33 и вариабельный домен легкой цепи (VL) последовательности SEQ ID NO: 35. Далее в настоящем документе данное гуманизированное антитело будет называться hz208F2 ("Вариант 1" или "Вар. 1").

Согласно другому варианту осуществления, антитело содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH) последовательности SEQ ID NO: 33, где указанная последовательность SEQ ID NO: 33 содержит по меньшей мере 1 обратную мутацию, выбранную из остатков 20, 34, 35, 38, 48, 50, 59, 61, 62, 70, 72, 74, 76, 77, 79, 82 и 95.

Согласно другому варианту осуществления, антитело содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH) последовательности SEQ ID NO: 33, где указанная последовательность SEQ ID NO: 33 содержит 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 или 17 обратных мутаций, выбранных из остатков 20, 34, 35, 38, 48, 50, 59, 61, 62, 70, 72, 74, 76, 77, 79, 82 и 95.

Для большей ясности в следующей Таблице 4 проиллюстрированы предпочтительные обратные мутации.

Согласно одному из вариантов осуществления, антитело содержит вариабельный домен легкой цепи (VL) последовательности SEQ ID NO: 35, где указанная последовательность SEQ ID NO: 35 содержит по меньшей мере 1 обратную мутацию, выбранную из остатков 22, 53, 55, 65, 71, 72, 77 и 87.

Согласно одному из вариантов осуществления, антитело содержит вариабельный домен легкой цепи (VL) последовательности SEQ ID NO: 35, где указанная последовательность SEQ ID NO: 35 содержит 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 обратных мутаций, выбранных из остатков 22, 53, 55, 65, 71, 72, 77 или 87.

Согласно другому варианту осуществления, антитело содержит:

a) вариабельный домен тяжелой цепи (VH) последовательности SEQ ID NO: 33, где указанная последовательность SEQ ID NO: 33 содержит по меньшей мере 1 обратную мутацию, выбранную из остатков 20, 34, 35, 38, 48, 50, 59, 61, 62, 70, 72, 74, 76, 77, 79, 82 и 95; и

b) вариабельный домен легкой цепи (VL) последовательности SEQ ID NO: 35, где указанная последовательность SEQ ID NO: 35 содержит по меньшей мере 1 обратную мутацию, выбранную из остатков 22, 53, 55, 65, 71, 72, 77 и 87.

Для большей ясности в следующей Таблице 5 проиллюстрированы предпочтительные обратные мутации.

В таком варианте осуществления антитело содержит все упомянутые выше обратные мутации и соответствует антителу, содержащему вариабельный домен тяжелой цепи (VH) последовательности SEQ ID NO: 34 и вариабельный домен легкой цепи (VL) последовательности SEQ ID NO: 36. Далее в настоящем документе данное гуманизированное антитело будет называться hz208F2 ("Вариант 3" или "Вар. 3").

Согласно другому варианту осуществления, все гуманизированные формы, содержащиеся между Вариантом 1 и Вариантом 3, также охвачены настоящим изобретением. Другими словами, антитело соответствует антителу, содержащему вариабельный домен тяжелой цепи (VH) "консенсусной" последовательности SEQ ID NO: 41 и вариабельный домен легкой цепи (VL) "консенсусной" последовательности SEQ ID NO: 42. Далее в настоящем документе данное гуманизированное антитело в целом будет называться hz208F2 ("Вариант 2" или "Вар. 2").

a) антитела, содержащего вариабельный домен тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 33 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80%, предпочтительно, 85%, 90%, 95% и 98% идентичности SEQ ID NO: 33, и три CDR легкой цепи с последовательностями SEQ ID NO: 9, 5 и 11; и

b) антитела, содержащего вариабельный домен тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 34 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80%, предпочтительно, 85%, 90%, 95% и 98% идентичности SEQ ID NO: 34, и три CDR легкой цепи с последовательностями SEQ ID NO: 9, 5 и 11.

Под "любой последовательностью, имеющей по меньшей мере 80%, предпочтительно, 85%, 90%, 95% и 98% идентичности SEQ ID NO: 33 или 34" подразумевают последовательности, содержащие три CDR тяжелой цепи SEQ ID NO: 1, 2 и 3, и, кроме того, проявляющие по меньшей мере 80%, предпочтительно, 85%, 90%, 95% и 98%, идентичности полноразмерной последовательности SEQ ID NO: 33 или 34 вне последовательностей, соответствующих CDR (т.е. SEQ ID NO: 1, 2 и 3).

Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, антитело выбрано из:

a) антитела, содержащего вариабельный домен тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 33 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80% идентичности SEQ ID NO: 33, и три CDR легкой цепи с последовательностями SEQ ID NO: 9, 5 и 11; и

b) антитела, содержащего вариабельный домен тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 34 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80% идентичности SEQ ID NO: 34, и три CDR легкой цепи с последовательностями SEQ ID NO: 9, 5 и 11.

Если не указано в соответствующих параграфах, в настоящем описании под любой последовательностью или последовательностью, проявляющей по меньшей мере 80% идентичности конкретной последовательности, следует понимать, что эта последовательность проявляет по меньшей мере 80% и, предпочтительно, 85%, 90%, 95% и 98% идентичности эталонной последовательности. Независимо от того, содержат ли эти последовательности CDR последовательности, предполагается, что последовательности, проявляющие идентичность по меньшей мере этих областей CDR областям CDR эталонной последовательности, на 80%, предпочтительно, 85%, 90%, 95% и 98%, идентичны полноразмерной последовательности, которая должна быть рассчитана для остальной последовательности, расположенной вне последовательностей, соответствующих этим областям CDR.

a) антитела, содержащего вариабельный домен легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 35 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80%, предпочтительно, 85%, 90%, 95% и 98% идентичности SEQ ID NO: 35, и три CDR тяжелой цепи с последовательностями SEQ ID NO: 7, 2 и 3; и

b) антитела, содержащего вариабельный домен легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 36 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80%, предпочтительно, 85%, 90%, 95% и 98% идентичности SEQ ID NO: 36, и три CDR тяжелой цепи с последовательностями SEQ ID NO: 7, 2 и 3.

Под "любой последовательностью, имеющей по меньшей мере 80%, предпочтительно, 85%, 90%, 95% и 98% идентичности SEQ ID NO: 35 или 36", подразумевается последовательность, содержащая три CDR легкой цепи SEQ ID NO: 4, 5 и 6 и, кроме того, проявляющая по меньшей мере 80%, предпочтительно, 85%, 90%, 95% и 98% идентичности полноразмерной последовательности SEQ ID NO: 35 или 36 вне последовательностей, соответствующих CDR (т.е. SEQ ID NO: 4, 5 и 6).

a) антитела, содержащего вариабельный домен легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 35 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80% идентичности SEQ ID NO: 35, и три CDR тяжелой цепи с последовательностями SEQ ID NO: 7, 2 и 3; и

b) антитела, содержащего вариабельный домен тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 36 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80% идентичности SEQ ID NO: 36, и три CDR тяжелой цепи с последовательностями SEQ ID NO: 7, 2 и 3.

Гуманизированные антитела, описанные в данном контексте, также могут быть охарактеризованы константным доменом и, в частности, гуманизированные антитела могут быть выбраны или сконструированы как, не ограничиваясь перечнем, IgG1, IgG2, IgG3, IgM, IgA, IgD или IgE. Более предпочтительно, в контексте настоящего изобретения гуманизированные антитела представляют собой IgG1 или IgG4.

Согласно варианту осуществления изобретения, антитело представляет собой гуманизированное антитело, содержащее вариабельные домены VH и VL, как описано выше, в формате IgG1. Более предпочтительно, указанное гуманизированное антитело содержит константный домен для VH последовательности SEQ ID NO: 43 и каппа-домен для VL последовательности SEQ ID NO: 45.

Согласно варианту осуществления изобретения, антитело представляет собой гуманизированное антитело, содержащее вариабельные домены VH и VL, как описано выше, в формате IgG4. Более предпочтительно, указанное гуманизированное антитело содержит константный домен для VH последовательности SEQ ID NO: 44 и каппа-домен для VL последовательности SEQ ID NO: 45.

Согласно еще одному варианту осуществления изобретения, антитело выбрано из:

a) антитела, содержащего или состоящего из тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 37 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80% идентичности SEQ ID NO: 37, и легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 39 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80% идентичности SEQ ID NO: 39; и

b) антитела, содержащего или состоящего из тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 38 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80% идентичности SEQ ID NO: 38, и легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 40 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80% идентичности SEQ ID NO: 40.

Для большей ясности в следующей Таблице 6а проиллюстрированы неограничивающие примеры последовательностей VH и VL для варианта 1 (Вар. 1) и варианта 3 (Вар. 3) гуманизированного антитела hz208F2. Таблица также содержит консенсусную последовательность для варианта 2 (Вар. 2).

a) антитела, содержащего вариабельный домен тяжелой цепи последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 и 80 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80%, предпочтительно, 85%, 90%, 95% и 98% идентичности SEQ ID No, 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 и 80; и три CDR легкой цепи с последовательностями SEQ ID NO: 9, 5 и 11;

b) антитела, содержащего вариабельный домен легкой цепи последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 57 или 60, или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80%, предпочтительно, 85%, 90%, 95% и 98% идентичности SEQ ID NO: 57 или 60; и три CDR тяжелой цепи с последовательностями SEQ ID NO: 7, 2 и 3; и

c) антитела, содержащего вариабельный домен тяжелой цепи последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 и 80 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80%, предпочтительно, 85%, 90%, 95% и 98% идентичности SEQ ID NO: 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 и 80; и вариабельный домен легкой цепи последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 57 или 60 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80%, предпочтительно, 85%, 90%, 95% и 98% идентичности SEQ ID NO: 57 или 60.

а) антитела, содержащего тяжелую цепь последовательности SEQ ID NO: 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 и 80 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80% идентичности SEQ ID NO: 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 или 80, и легкую цепь последовательности SEQ ID NO: 57 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80% идентичности SEQ ID NO: 57; и

b) антитела, содержащего тяжелую цепь последовательности SEQ ID NO: 56, 64, 68 и 78 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80% идентичности SEQ ID NO: 56, 64, 68 или 78 и легкую цепь последовательности SEQ ID NO: 60 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80% идентичности SEQ ID NO: 60.

a) антитела, содержащего или состоящего из тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 58 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80% идентичности SEQ ID NO: 58, и легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 59 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80% идентичности SEQ ID NO: 59;

b) антитела, содержащего или состоящего из тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 58 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80% идентичности SEQ ID NO: 58, и легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 61 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80% идентичности SEQ ID NO: 61;

c) антитела, содержащего или состоящего из тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 63 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80% идентичности SEQ ID NO: 63, и легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 59 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80% идентичности SEQ ID NO: 59;

d) антитела, содержащего или состоящего из тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 65 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80% идентичности SEQ ID NO: 65, и легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 59 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80% идентичности SEQ ID NO: 59;

e) антитела, содержащего или состоящего из тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 65 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80% идентичности SEQ ID NO: 65, и легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 61 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80% идентичности SEQ ID NO: 61;

f) антитела, содержащего или состоящего из тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 67 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80% идентичности SEQ ID NO: 67, и легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 59 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80% идентичности SEQ ID NO: 59;

g) антитела, содержащего или состоящего из тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 69 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80% идентичности SEQ ID NO: 69, и легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 59 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80% идентичности SEQ ID NO: 59;

h) антитела, содержащего или состоящего из тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 69 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80% идентичности SEQ ID NO: 69, и легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 61 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80% идентичности SEQ ID NO: 61;

i) антитела, содержащего или состоящего из тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 71 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80% идентичности SEQ ID NO: 71, и легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 59 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80% идентичности SEQ ID NO: 59;

j) антитела, содержащего или состоящего из тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 73 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80% идентичности SEQ ID NO: 73, и легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 59 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80% идентичности SEQ ID NO: 59;

k) антитела, содержащего или состоящего из тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 75 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80% идентичности SEQ ID NO: 75, и легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 59 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80% идентичности SEQ ID NO: 59;

I) антитела, содержащего или состоящего из тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 77 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80% идентичности SEQ ID NO: 77, и легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 59 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80% идентичности SEQ ID NO: 59;

m) антитела, содержащего или состоящего из тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 79 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80% идентичности SEQ ID NO: 79, и легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 59 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80% идентичности SEQ ID NO: 59;

n) антитела, содержащего или состоящего из тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 79 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80% идентичности SEQ ID NO: 79, и легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 61 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80% идентичности SEQ ID NO: 61; и

о) антитела, содержащего или состоящего из тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 81 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80% идентичности SEQ ID NO: 81, и легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 59 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80% идентичности SEQ ID NO: 59.

Другими словами, антитело может представлять собой антитело, содержащее:

a) тяжелую цепь последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 58, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79 и 81 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80% идентичности SEQ ID NO: 58, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79 и 81; и

b) легкую цепь последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 59 и 61 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80% идентичности SEQ ID NO: 59 и 61.

а) тяжелой цепи последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 58, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79 и 81 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80% идентичности SEQ ID NO: 58, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79 или 81; и

b) легкой цепи последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 59 and 61 или любой последовательности, имеющей по меньшей мере 80% идентичности SEQ ID NO: 59 или 61.

Для большей ясности в следующей Таблице 6b представлены неограничивающие примеры последовательностей VH и VL (вариабельного домена и полноразмерной) для различных вариантов гуманизированного антитела hz208F2.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения, антитело представляет собой антитело, выбранное из i) антитела, продуцируемого гибридомой I-4757, I-4773, I-4775, I-4736 или I-4774, депонированной в CNCM, Институт Пастера, Франция, 30 мая 2013 года, 26 июня 2013 года, 26 июня 2013 года, 24 апреля 2013 и 26 июня 2013 года, соответственно, или ii) антитела, конкурирующего за связывание с IGF-1R с антителом i); или iii) антитела, связывающегося с тем же эпитопом IGF-1R, что и антитело i).

Согласно конкретному аспекту, связывающее звено представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, как описано выше, для применения в качестве адресующего носителя для доставки цитотоксического агента в сайт-мишень хозяина, при этом указанный сайт-мишень хозяина состоит из эпитопа, локализованного в IGF-1R, предпочтительно, во внеклеточном домене IGF-1R, более предпочтительно, в человеческом IGF-1R (SEQ ID NO: 50) и, еще более предпочтительно, во внеклеточном домене человеческого IGF-1R (SEQ ID NO: 51) и, еще более предпочтительно, на N-конце внеклеточного домена человеческого IGF-1R (SEQ ID NO: 52), или последовательности любого их природного варианта.

Согласно предпочтительному варианту осуществления, указанный сайт-мишень хозяина представляет собой сайт-мишень клетки млекопитающего, более предпочтительно, клетки человека, более предпочтительно, клеток, которые естественным образом или посредством генетической рекомбинации экспрессируют IGF-1R.

Согласно дополнительному варианту осуществления, указанный сайт-мишень хозяина представляет собой сайт-мишень клетки пациента, предпочтительно, человека, страдающего раком, предпочтительно, раком, экспрессирующим IGF-1R, или раком, обусловленным IGF-1R.

Рак, экспрессирующий IGF-1R, или рак, обусловленный IGF-1R, включает, в частности, формы рака, при которых опухолевые клетки экспрессируют или сверхэкспрессируют полноразмерный IGF-1R или его участок на своей поверхности.

Антитела к IGF-1R, которые можно использовать в качестве связывающего звена в настоящем изобретении, описаны, в частности, в патентных документах WO 2015/162291, WO 2015/162292 или WO 2015/162293.

Линкерная молекула

Линкер формулы (I) согласно настоящему изобретению, предпочтительно, в котором q равно 2, можно использовать для ковалентного связывания лекарственного средства со связывающим звеном, таким как антитело (например, монокпональное антитело) или его антигенсвязывающий фрагмент.

Для этого сульфомалеимидный фрагмент линкера может взаимодействовать с тиольными фрагментами, присутствующими на связывающем звене, тогда как Х₃-конец линкера может взаимодействовать с функциональной группой, присутствующей на лекарственном средстве (QH или Q-OH).

Линкерная молекула может быть получена с помощью различных способов синтеза, примеры которых приведены в экспериментальной части.

В случае, когда X₁ и Х₂ независимо выбраны из Н и Cl, причем по меньшей мере один из них является Cl, линкер согласно изобретению может быть получен из дисульфидного соединения формулы L-NHCO-CH₂CH₂-S-S-CH₂CH₂-CONH-L, где L представляет собой L₁-(CO)_c-(W)_w-(Y)_y-X₃, необязательно в защищенной форме, реакцией с хлорирующим агентом, таким как SO₂Cl₂.

В случае, когда Х₁ и Х₂ независимо выбраны из Н и Br, причем по меньшей мере один из них представляет собой Br, линкер согласно изобретению может быть получен из соединения формулы где L представляет собой L₁-(CO)_c-(W)_w-(Y)_y-X₃, необязательно в защищенной форме, реакцией с бромирующим агентом, таким как Br₂.

В случае, когда по меньшей мере один из X₁ и Х₂ представляет собой (С₁-С₆)алкокси, необязательно замещенный арилокси, или -O-(CH₂CH₂O)_rH, линкер согласно изобретению может быть получен из соответствующего линкера формулы (I), где по меньшей мере один из X₁ и Х₂ является Cl или Br, необязательно в защищенной форме, реакцией нуклеофильного замещения со спиртом формулы R_a-OH, где R_a представляет собой (С₁-С₆)алкил, арил, необязательно замещенный, или -(CH₂CH₂O)_rH.

Можно также предусмотреть образование сульфомалеимидного фрагмента с привитым на него укороченным линкерным фрагментом (например, где L представляет собой L₁-(СО)_с-X₆, где Х₆ представляет собой функциональную группу, такую как NH2, ОН или уходящая группа, необязательно в защищенной форме) и завершение синтеза линкера после образования сульфомалеимидного фрагмента, как показано ниже для синтеза конъюгата лекарственное средство-линкер.

Кроме того, можно провести стадию окисления для получения требуемой степени окисления группы S(O)_q (т.е. предпочтительно q равно 2). Такая стадия окисления хорошо известна специалисту в данной области техники. В качестве окислителя можно использовать, например, mCPBA, RuO₄ или RuCl₃/NaIO₄.

При проведении описанных выше способов могут выполняться дополнительные стадии введения/снятия защиты, такие стадии и их реакционные условия хорошо известны специалисту в данной области техники.

Полученный линкер можно отделить от реакционной среды при помощи способов, хорошо известных специалисту в данной области, например, путем экстракции, упаривания растворителя либо с помощью осаждения или кристаллизации (с последующей фильтрацией).

При необходимости линкер также можно очищать с помощью способов, хорошо известных специалисту в данной области техники, например, при помощи перекристаллизации, перегонки, хроматографии на колонке с силикагелем или высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ, англ. HPLC).

Конъюгаты лекарственное средство-линкер

Конъюгат лекарственное средство-линкер формулы (II) согласно настоящему изобретению, предпочтительно, в котором q равно 2, может использоваться для ковалентного связывания лекарственного средства со связывающим звеном, таким как антитело (например, моноклональное антитело) или его антигенсвязывающий фрагмент.

Для этого сульфомалеимидный фрагмент конъюгата лекарственное средство-линкер может взаимодействовать с тиольными фрагментами, присутствующими на связывающем звене.

Конъюгаты лекарственное средство-линкер могут быть получены при помощи различных способов синтеза. Фактически, линкер формулы (I) может реагировать с лекарственным средством (QH или Q-OH) с образованием конъюгата. Однако можно предусмотреть и другие возможности, при которых линкер на молекуле лекарственногое средства образуется постепенно, т.е. на лекарственное средство сначала прививают первую часть линкера, после этого полученное соединение вступает в реакцию с укороченной молекулой линкера с образованием конъюгата лекарственное средство-линкер.

Таким образом, для получения конъюгатов лекарственное средство-линкер формулы (II) согласно настоящему изобретению можно использовать следующие неограничивающие способы синтеза, хотя можно рассматривать и другие пути синтеза.

Во всех этих способах синтеза можно использовать дополнительные стадии введения защиты/снятия защиты/замещения, причем такие стадии и их реакционные условия хорошо известны специалисту в данной области техники.

Полученный конъюгат лекарственное средство-линкер можно отделять от реакционной среды при помощи способов, хорошо известных специалисту в данной области, например, с помощью экстракции, упаривания растворителя либо путем осаждения или кристаллизации (с последующей фильтрацией).

При необходимости конъюгат лекарственное средство-линкер также можно очищать при помощи способов, хорошо известных специалисту в данной области техники, таких как перекристаллизация, перегонка, хроматография на колонке с силикагелем или высокоэффективная жидкостная хроматография(ВЭЖХ).

Способ синтеза I, представленный на Схеме I

Конечный сульфомалеимидный фрагмент может быть образован из группы, уже имеющейся на лекарственном средстве, привитом предшественником линкерного фрагмента, как подробно описано ниже.

Стадия 1: 3-(2-хлоркарбонилэтилдисульфанил)пропионилхлорид взаимодействует с молекулой формулы H₂N-L₁-(CO)_c-(W)_w-(Y)_y-Q (т.е. с молекулой лекарственного средства, на которую привита часть линкера). Эту реакцию можно проводить в присутствии основания, такого как триметиламин. Реакцию можно проводить в растворителе, таком как ДХМ (англ. DCM, dichloromethane - дихлорметан), в особенности, при температуре от 0°С до комнатной температуры.

3-(2-Хлоркарбонилэтилдисульфанил)пропионилхлорид может быть получен из 3,3'-дитиодипропионовой кислоты хорошо известным способом с образованием ацилхлорида, например, реакцией с (COCl)₂. Реакцию можно проводить в растворителе, таком как ДХМ, в особенности, при комнатной температуре. При этом может быть добавлено каталитическое количество ДМФА (англ. DMF, Dimethyl Formamide - диметилформамид).

Можно также предусмотреть взаимодействие 3-(2-хлоркарбонилэтилдисульфанил)пропионилхлорида, например, с молекулой формулы H₂N-L₁-(CO)_c-X₃ необязательно в защищенной форме и завершить синтез линкерного фрагмента, привитого Q на более поздней стадии, в особенности, в соответствии с одним из других способов синтеза, описанных ниже.

Стадия 2: молекула, полученная на стадии 1, может быть циклизована и хлорирована в присутствии SO₂Cl₂, в особенности присутствующего в значительном избытке (например, от 5 до 10 экв., к примеру, приблизительно 9 экв.). Реакцию можно проводить в растворителе, таком как ДХМ, в особенности, при комнатной температуре.

Атом хлора можно преобразовать в другую группу X₁ и Х₂ (отличную от Н) с помощью хорошо известных способов, таких как нуклеофильное замещение.

Стадия 3: при необходимости, молекула, полученная на стадии 2, может быть окислена с получением конъюгата лекарственное средство-линкер формулы (IIa). Такую стадию окисления можно проводить в условиях, хорошо известных специалисту в данной области техники, в особенности, в присутствии mCPBA (например, 10 экв.). Реакцию можно проводить в растворителе, таком как ДХМ, в особенности, при комнатной температуре.

Способ синтеза II, представленный на Схеме II

Можно осуществить прямое взаимодействие лекарственного средства (QH или Q-OH) с линкером формулы (I), условия такого взаимодействия зависят от природы Х₃ и функциональной группы, присутствующей на лекарственном средстве.

Это взаимодействие может представлять собой замещение, такое как нуклеофильное замещение или реакция Мицунобу, условия проведения таких химических реакций хорошо известны специалисту в данной областитехники.

В случае, когда Х₃ представляет собой ОН и по меньшей мере y равно 1, w не равно 0 или с равно 1 (т.е. концевая функциональная группа линкера формулы (I) представляет собой СООН) и QH содержит NH-группу, взаимодействие линкера формулы (I) с лекарственным средством (QH) может представлять собой пептидное сочетание, хорошо известное специалисту в данной области. Конечную группу СООН также можно преобразовать в ацилхлорид COCl, который далее может реагировать с нуклеофильной группой, присутствующей в лекарственном средстве (QH) (например, NH или ОН).

В случае, когда Х₃ представляет собой NH₂; или Х₃ представляет собой Н, y равно z равно 1 и Z представляет собой -NR₄-(CH₂)_u-NR₅-; или Х₃ представляет собой Н, с равно w равно у равно 0, z' равно 1 и Z' представляет собой -NR₄-(CH₂)_u-NR₅- (т.е. концевая функциональная группа линкера формулы (I) представляет собой NH), a Q-OH содержит группу СООН, взаимодействие между линкером формулы (I) и лекарственным средством (Q-OH) может быть пептидным сочетанием, хорошо известным специалисту в данной области. Конечную группу СООН лекарственного средства также можно преобразовать в ацилхлорид COCl, который далее будет реагировать с группой NH.

При необходимости может быть проведена дополнительная стадия окисления для получения требуемой степени окисления группы S(O)_q (т.е. предпочтительно q равно 2). Такая стадия окисления хорошо известна специалисту в данной области. В качестве окислителя можно использовать, например, mCPBA, RuO₄ или RuCl₃/NaIO₄.

Способ синтеза III, представленный на Схемах IIIa и IIIb

Можно также выполнить пептидное сочетание между укороченным линкером, несущим группу СООН, и фрагментом лекарственного средства, привитым другой частью линкера, как показано на Схемах IIIa и IIIb. Конечную группу СООН укороченного линкера также можно преобразовать в ацилхлорид COCl, который далее будет реагировать с группой NH другого реагента. Условия проведения таких реакций хорошо известны специалисту в данной области техники.

При необходимости может быть проведена дополнительная стадия окисления для получения требуемой степени окисления группы S(O)_q (т.е. предпочтительно q равно 2), например, в присутствии mCPBA, RuO4 или RuCl₃/NaIO₄.

Способ синтеза IV, представленный на Схеме IV

Также можно осуществлять взаимодействие между сульфомалеимидным фрагментом и лекарственным средством, на которое уже привита остальная часть линкера, как показано на Схеме IV, где Х₅ представляет собой ОН или уходящую группу, такую как определено выше.

Это взаимодействие может представлять собой замещение, такое как нуклеофильное замещение.

При необходимости может быть проведена дополнительная стадия окисления для получения требуемой степени окисления группы S(O)_q (т.е. предпочтительно q равно 2), например, в присутствии mCPBA, RuO₄ или RuCl₃/NaIO₄.

Способ синтеза V, представленный на Схемах Va и Vb

В случае, если линкер содержит гетероариленовый фрагмент, представляющий собой двухвалентный 1Н-1,2,3-триазол, такая гетероариленовая группа может быть получена при помощи клик-химии между азидом и алкином в условиях, хорошо известных специалисту в данной области техники, как показано на Схемах Va и Vb выше, где L₂ представляет собой -(СН₂)_n- или -(CH₂CH₂O)_m-CH₂-CH₂-, a L₃ представляет собой -(СН₂)_p- или -(CH₂CH₂O)_m-CH₂-CH₂-, причем L₂ и L₃ не являются одновременно группой -(CH₂CH₂O)_m-CH₂-CH₂-.

Конъюгаты связывающее звено-лекарственное средство

Конъюгаты связывающее звено-лекарственное средство, такие как конъюгаты антитело-лекарственное средство, могут быть получены с помощью:

1) образования тиольных функциональных групп на связывающем звене, в особенности, путем восстановления дисульфидной связи (связей); и

2) взаимодействия указанного связывающего звена, несущего тиольные функциональные группы, с конъюгатом (конъюгатами) лекарственное средство-линкер для ковалентного связывания фрагмента (фрагментов) лекарственного средства со связывающим звеном путем взаимодействия сульфомалеимидной группы с тиольными группами.

Такой способ проиллюстрирован на Схеме VI ниже.

Фармацевтическая композиция

Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению содержит конъюгат связывающее звено-лекарственное средство формулы (III) или (IV) и по меньшей мере одно фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.

Фармацевтические композиции по изобретению могут быть предназначены для энтерального (например, перорального) или парентерального (например, внутривенного) введения, предпочтительно, для перорального или внутривенного введения. Активный ингредиент можно вводить в стандартных формах введения, в смеси с традиционными фармацевтическими вспомогательными веществами, животным, предпочтительно, млекопитающим, включая человека.

Фармацевтическая композиция для перорального применения может иметь твердую или жидкую (раствор либо суспензия) форму.

Твердая композиция может иметь форму таблеток, желатиновых капсул, порошков, гранул и т.п. В таблетках перед прессованием активный ингредиент может быть смешан с фармацевтическим носителем (носителями), таким как желатин, крахмал, лактоза, стеарат магния, тальк, аравийская камедь и т.п. Таблетки могут быть дополнительно покрыты, в частности, сахарозой или другими подходящими материалами либо могут быть обработаны таким образом, чтобы обладать пролонгированной или отсроченной активностью. В порошках или гранулах активный ингредиент может быть смешан или гранулирован с диспергирующими агентами, увлажняющими агентами или суспендирующими агентами, а также с корректорами вкуса или подсластителями. В желатиновых капсулах активный ингредиент может быть помещен в мягкие или твердые желатиновые капсулы в форме порошка или гранул, как упоминались выше, либо в форме жидкой композиции, такой как указана ниже.

Жидкая композиция может содержать активный ингредиент вместе с подсластителем, усилителем вкуса или подходящим красителем в растворителе, таком как вода. Жидкая композиция также может быть получена путем суспендирования или растворения порошка или гранул, как упоминались выше, в жидкости, такой как вода, сок, молоко и т.п. Жидкая композиция может представлять собой, например, сироп или эликсир.

Композиция для парентерального введения может иметь форму водной суспензии или раствора, которые могут содержать суспендирующие агенты и/или увлажняющие агенты. Композиция преимущественно является стерильной. Она может иметь форму изотонического раствора (в частности, относительно крови).

Такие парентеральные композиции будут содержать преимущественно физиологически приемлемую среду, обычно на основе изотонического солевого раствора, т.е. 0,9% водного раствора NaCl (физиологического раствора). Также можно использовать неводный смешивающийся с водой сорастворитель, такой как этанол, глицерин, пропиленгликоль или н-лактамамид.

Парентеральная композиция по изобретению также может содержать одну или более добавок, таких как суспендирующие агенты, увлажняющие агенты, консерванты, антиокислители, хелатирующие агенты, буферные агенты, регуляторы тоничности и т.п. Такие добавки известны специалистам в данной области техники.

Суспендирующие агенты могут представлять собой альгинат, карбоксиметилцеллюлозу натрия, метилцеллюлозу, гидроксиметилцеллюлозу, гидроксиэтилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, микрокристаллическую целлюлозу, камедь, такую как аравийская камедь, трагакант или ксантановая камедь, желатин, каррагенан, поливинилпирролидон и т.п.

Увлажняющие агенты могут представлять собой глицерин, про пилен гликоль или неионные поверхностно-активные вещества, такие как лецитин, полисорбат или полоксамер.

Консерванты могут представлять собой бензиловый спирт, фенол, крезол, хлорбутанол, парабен такой как метилпарабен, пропилпарабен или пропилпарабен, хлорид бензалкония, хлорид бензетония и т.п.

Антиокислители могут представлять собой аскорбиновую кислоту, лимонную кислоту, ацетилцистеин, соли сернистой кислоты (бисульфит, метабисульфит), монотиоглицерин, формальдегидсульфоксилат натрия, тиомочевину, токоферол и т.п.

Хелатирующие агенты могут представлять собой соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (англ. EDTA).

Буферные агенты могут представлять собой ацетат, цитрат, тартрат, фосфат, триэтаноламин (TRIS) и т.п.

Регуляторы тоничности могут представлять собой декстрозу, глицерин, хлорид натрия, глицерин, маннит и т.п.

Конъюгат связывающее звено-лекарственное средство по изобретению можно применять в фармацевтической композиции в дозе от 0,01 мг до 1000 мг/сутки, вводимой в виде одной дозы раз в сутки либо несколькими дозами в течение суток, например, дважды в сутки в равных дозах. Вводимая суточная доза предпочтительно составляет от 5 мг до 500 мг и, более предпочтительно, от 10 мг до 200 мг. Однако может возникнуть необходимость в использовании доз, выходящих за пределы указанных диапазонов, и это может быть отмечено специалистом в данной области техники.

Лечение рака

Конъюгат связывающее звено-лекарственное средство формулы (III) или (IV) или фармацевтическая композиция, включающая связывающее звено формулы (III) или (IV), могут применяться для лечения рака, в частности, когда конъюгат или фармацевтическая композиция содержат фрагмент лекарственного средства (Q), представляющий собой остаток лекарственного средства (QH), применяемого для лечения рака, такого как цитотоксическое средство.

Конъюгаты связывающее звено-лекарственное средство, такие как конъюгаты антитело-лекарственное средство (ADC), сочетают в себе специфичность связывания связывающего звена, такого как антитело, с активностью лекарственных средств, таких как, например, цитотоксические средства. Применение конъюгатов связывающее звено-лекарственное средство, таких как ADC, позволяет осуществлять локальную доставку лекарственных средств, которые при введении в виде неконъюгированных лекарственных средств могут привести к неприемлемым для нормальных клеток уровням токсичности. Другими словами, применение конъюгатов позволяет достичь максимальной эффективности при минимальной токсичности.

Примерами форм рака могут быть, не ограничиваясь перечнем, рак предстательной железы, остеосаркома, рак легких, рак молочной железы, рак эндометрия, глиобластома, рак толстой кишки, рак желудка, рак почек, рак поджелудочной железы, рак головы и шеи или любой другой рак, связанный с экспрессией антигена, нацеленного антителом на опухолевые клетки.

Далее настоящее изобретение будет проиллюстрировано следующими неограничивающими примерами и графическими материалами.

Краткое описание графических материалов

Фиг. 1А, 2, 3А, 4А, 5А, 6А, 7А, 21 и 22А представляют собой масс-спектры конъюгатов лекарственное средство-линкер согласно изобретению.

Фиг. 1В, 3В, 4В, 5В, 6В, 7В, 8 и 9 представляют собой спектры ¹H ЯМР конъюгатов лекарственное средство-линкер согласно изобретению.

Фиг. 10 и 11 представляют собой масс-спектры конъюгатов лекарственное средство-соматостатин согласно изобретению.

На Фиг. 12 представлен анализ SDS-PAGE (анализ методом электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия) антитела Ab1 (1) и очищенных ADC согласно изобретению (ADC1-A (2), ADC1-B (3), ADC1-С (4), ADC1-D (5), ADC1-E (6), ADC1-F (7) и ADC1-G (8)) в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях. Полосы, наблюдаемые в гелях, соответствуют полностью мостиковому антителу (т.е. LHHL); частично мостиковому антителу (т.е. HHL, НН, HL) и отсутствию образования мостиков (т.е. Н и L).

На Фиг. 13 представлен анализ методом SEC антитела Ab1 и ADC согласно изобретению (ADC1-A, ADC1-B, ADC1-C, ADC1-D, ADC1-E, ADC1-F и ADC1-G).

На Фиг. 14А, 14В, 14С и 14D представлены масс-спектры m/z ADC до деконволюции ADC согласно изобретению: (A) ADC1-А, (В) ADC1-В, (С) ADC1-С и (D) ADC-1D, соответственно.

На Фиг. 15А, 15В и 15С представлено распределение DAR после деконволюции Максента для (А) ADC1-A, (В) ADC1-B и (С) ADC1-D, соответственно.

На Фиг. 16А и 16В представлен анализ методом нативной масс-спектрометрии ADC: (А) эталонного ADC Ref-A и (В) ADC1-C согласно изобретению.

На Фиг. 17А, 17 В и 17С представлены результаты исследования стабильности in vitro в процентах общего количества антител (100%) и ADC в каждый момент времени (D0, D3, D7 и D14) в сыворотке (1) человека, (2) яванского макака, (3) мыши и (4) крысы для (А) эталонного ADC Ref-B, (В) ADC1-С и (С) ADC1-E, соответственно.

Фиг. 18А и 18В представляют собой оценку цитотоксичности клеток in vitro для различных ADC в клетках NCI-H2122 (А) и MCF-7 (В), соответственно.

На Фиг. 19 и 20 представлена активность in vitro ADC1-C и эталонного ADC Ref-A на модели рака яичников.

Фиг. 22В представляет собой спектр TOF-MC конъюгата лекарственное средство-линкер согласно изобретению.

Фиг. 23А представляет собой анализ методом SEC антитела Ab1 и ADC согласно изобретению, синтезированных с использованием производных PNU-159682.

Фиг. 23В представляет собой анализ методом SEC антитела Ab2 и ADC согласно изобретению, синтезированных с использованием производных PNU-159682.

Фиг. 24: 24А, 24В, 24С и 24D представляют собой масс-спектры m/z ADC перед деконволюцией для ADC согласно изобретению: (A) hz208F2-F562524, (В) C9G4-F562524, (С) hz208F2-F562616 и (D) C9G4-F562646, соответственно.

На Фиг. 25: 25А, 25В, 25С и 25D представлено распределение DAR после деконволюции Максента для ADC согласно изобретению: (А) hz208F2-F562524, (В) C9G4-F562524, (С) hz208F2-F562616 и (D) C9G4-F562646, соответственно.

Фиг. 26: 26А и 26В представляют собой оценку цитотоксичности клеток in vitro для ADC hz208F2-F562524 и соответствующего контрольного ADC C9G4-F562524 в клетках NCI-H2122 (А) и MCF-7 (В), соответственно.

Фиг. 27: 27А и 27В представляют собой оценку цитотоксичности клеток in vitro для ADC hz208F2-F562646 и соответствующего контрольного ADC C9G4-F562646 в клетках NCI-H2122 (А) и MCF-7 (В), соответственно.

Фиг. 28 представляет собой активность in vivo ADC hz208F2-F562524 и соответствующего контрольного ADC C9G4-F562524 на модели рака яичников.

Описание примеров осуществления изобретения

Сокращения

ACN - Ацетонитрил

ADC - Конъюгат антитело-лекарственное средство

водн. - водный

ВВО - Широкополосное наблюдение

ВСА - Бицинхониновая кислота

CDR - Область, определяющая комплементарность

DAR - Соотношение лекарственное средство-антитело

ДХМ - Дихлорметан

DIPEA - N,N-Диизопропилэтиламин

ДМФА - Диметилформамид

ДМСО - Диметилсульфоксид

EDCI - 1-Этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид

EDTA - Этилендиаминтетрауксусная кислота

экв. - эквивалент

ES - Электрораспыление

ESI - Электрораспылительная ионизация

HATU - Гексафторфосфат 1-[бис(диметиламино)метилен]-1Н-1,2,3-триазоло[4,5-b]пиридиний-3-оксида

HOBt - 1-Гидроксибензотриазол

HIC - Хроматография с гидрофобным взаимодействием

ВЭЖХ - Высокоэффективная жидкостная Хроматография

HRMS - Масс-спектрометрия высокого разрешения

LBA - Анализ связывания с лигандом

ЖХ - Жидкостная Хроматография

ЖХ-МС - Жидкостная Хроматография-масс-спектрометрия

mCPBA - мета-Хлорпероксибензойная кислота

Ms - Мезил

МС - Масс-спектр

ЯМР - Ядерно-магнитный резонанс

PBS - Фосфатно-солевой буферный раствор

Q-TOF - Квадрупольный времяпролетный

Rf - Коэффициент удерживания

Тк - Комнатная температура

насыщ. - Насыщенный

SDS-PAGE - Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия

SEC - Эксклюзионная Хроматография

ТВМЕ - Простой трет-бутилметиловый эфир

ТСЕР - Трис(2-карбоксиэтил)фосфин

ТЭА - Триэтиламин

TFA - Трифторуксусная кислота

ТГФ - Тетрагидрофуран

ТСХ - Тонкослойная Хроматография

TOF - Время пролета

Ts - Тозил

УФ – Ультрафиолетовый.

Экспериментальная часть

Все реакции, для проведения которых требуются безводные условия, проводили в посуде, высушенной в сушильном шкафу, в атмосфере азота. Безводные растворители приобретали в герметизированных бутылях в инертной атмосфере. Все реагенты использовали непосредственно после получения, не подвергая обработке. Колоночную хроматографию проводили на колонках puriFlash®, заполненных силикагелем (50 мкм), на приборах Interchim puriFlash® 430 и Grace Reveleris® X2. Для ТСХ использовали алюминиевые пластины с нанесенным силикагелевым покрытием (силикагель Merck 60 F254), результаты визуализировали при помощи лампы с УФ излучением, 254 нм. Спектры ЯМР протонов (¹Н) и углерода (¹³С) записывали в CDCl₃ и ДМСО при комнатной температуре на приборе Bruker 500 МГц Ascend™, оборудованном датчиком ВВО Prodigy (5 мм). Спектры интерпретировали при помощи программного обеспечения Topspin™ 3.2. Химические сдвиги (δ_н и δ_с) указаны в миллионных долях (м.д.) и приведены относительно CDCl₃ (¹Н ЯМР 7,26, ¹³С ЯМР 77,0, центральный сигнал триплета) либо относительно ДМСО (¹H ЯМР 2,50, ¹³С ЯМР 37,9, центральный сигнал септуплета). Отнесение сигналов осуществляли при помощи экспериментов с использованием COSY (англ. Correlation Spectroscopy-корреляционная спектроскопия) и HSQC (англ. Heteronuclear Single Quantum Coherence-гетероядерная спектроскопия с одноквантовым переносом когеренции). Константы взаимодействия (J: вицинальные протоны, Jcis: вицинальные протоны в цис-положении, Jo: протон в орто-положении, Jm: протон в мета-положении) приведены в герцах с точностью до плюс/минус 0,1 Гц. Мультиплетность представлена в виде синглета (с), дублета (д), триплета (т), квартета (кв.), триплета триплетов (тт), мультиплета (м) и уширения (ушир.), где это применимо. Масс-спектры (m/z) записывали на спектрометре Waters® ZQ Mass Detector с использованием метода ионизации электрораспылением (ES+), температура источника: 120°С, температура десольватации: 350°С, напряжение на капилляре: 3,20 кВ, напряжение на конусе: 25 В, напряжение экстрактора: 5 В, напряжение Rf линз: 0,5 В, диапазон развертки МС: 100-2000. Анализы методом ВЭЖХ выполняли с использованием колонки Waters® X-Bridge Shield RP18 3,5 мкм (3,0 мм × 30 мм) и предколонки Waters® X-Bridge Shield RP18 3,5 мкм (3,0 мм × 20 мм) на приборе ВЭЖХ Waters® Alliance 2695 с программным обеспечением Mass Lynx 4.1 и детектором Waters 2996 PDA Dectector UV/vis при длине волны, подходящей для анализируемого образца. Значения времени удерживания (Rf) приведены в минутах с точностью до 0,01 мин. Были использованы следующие два метода.

Время удерживания, указанное в Методе 1, обозначено как R_t,1, а время удерживания, указанное в Методе 2-как R_t,2.

1. Синтез линкеров

Пример схемы синтеза оксоизотиазолонов

1.1. 3,3'-Дисульфандиилдипропаноилхлорид

1.2. 3,3'-Дисульфандиилдипропионовую кислоту (4 г, 0,019 моль, 1 экв.) суспендировали в безводном ДХМ (100 мл) и добавляли безводный ДМФА (300 мкл), затем при температуре 0°С в инертной атмосфере добавляли оксалилхлорид (7,24 г, 0,057 моль, 3 экв). Раствор становился прозрачным. Смесь оставляли на 3 ч при комнатной температуре до осветления и прекращения выделения газа. Неочищенный продукт упаривали и выдерживали при пониженном давлении в течение еще 30 мин для удаления остатков оксалилхлорида. Было получено масло желтого цвета (4,70 г, 100%). Неочищенный продукт использовали без дополнительной очистки; R_t,1 (в МеОН): 2,13; MC ES+ m/z: 206.86.

1.3. Дибензил-6,6'-((3,3'-дисульфандиил-бис(пропаноил))бис(азандиил))дигексаноат

4-Метилбензолсульфонат 6-(бензилокси)-6-оксогексан-1-аминия (12,20 г, 0,031 моль, 2,2 экв.) суспендировали при интенсивном перемешивании в безводном ДХМ (75 мл) на ледяной бане при температуре 0°С в инертной атмосфере. В раствор добавляли ТЭА (15,72 мл, 0,113, 8 экв.). К раствору, поддерживаемому при температуре 0°С, медленно по каплям прибавляли раствор свежеприготовленного 3,3'-дисульфандиилдипропаноилхлорида (3,88 г, 0,014 моль, 1 экв.) в ДХМ (25 мл). Перемешивание продолжали в течение 24 часов, пока раствор остывал до комнатной температуры. Добавляли воду (50 мл), и смесь переносили в делительную воронку. Органический слой отделяли и промывали солевым раствором (1×100 мл), затем промывали 1М раствором HCl (1×100 мл), насыщенным раствором NaHCO₃ (2×100 мл) и снова солевым раствором (1×100 мл). Объединенные водные фракции экстрагировали ДХМ (2×100 мл). Органические фракции сушили над MgSO₄, фильтровали и упаривали досуха с получением твердого вещества желтого цвета, которое растирали в МеОН и получали дибензил-6,6'-((3,3'-дисульфандиил-бис(пропаноил))бис(азандиил))дигексаноат в виде порошка светло-желтого цвета (6,0 г, 66%). ¹H ЯМР (500 МГц, CDCl₃), δ: 7,35 (м, 10Н), 6,0 (с, 2Н), 5,11 (с, 4Н), 3,25 (кв., J=5,9 Гц, 4Н), 3,00 (т, J=7,0 Гц, 4Н), 2,55 (т, J=7,10 Гц, 4Н), 2,36 (т, J=7,30 Гц, 4Н), 1,66 (тт, J=8,10 Гц, 4Н), 1,52 (тт, J=8,10 Гц, 4Н), 1,35 (тт, J=8,52 Гц, 4Н); ¹³С ЯМР (500 МГц, CDCl₃), δ: 173,5 (2-NH-C=O), 170,9 (-O-C=O), 136,0 (2 C_quat из ароматических циклов), 128.6 (2 H-C_aromatic), 128,3 (H-C_aromatic), 128,2 (2 H-C_aromatic), 66,2 (2-СН₂-O-), 39,4 (2-СН₂-N), 35,8 (2-СН₂-СОО-), 34,3 (2-СН₂-S-), 34,1 (2-СН₂-CNO-), 29,1 (2 С), 26,3 (2 С), 24,4 (2 C); R_t,1 (в МеОН): 2,50; MC ES+ M/Z: 617,00.

1.4. Бензил-6-(5-хлор-3-оксоизотиазол-2(3Н)-ил)гексаноат

Дибензил-6,6'-((3,3'-дисульфандиил-бис(пропаноил))бис(азандиил))дигексаноат (2,50 г, 4,05 ммоль, 1 экв.) растворяли в безводном ДХМ (20,3 мл). К раствору по каплям прибавляли SO₂Cl₂ (чистота 97%, 2,96 мл, 0,036 моль, 9 экв.), и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 5 ч в инертной атмосфере. Раствор становился прозрачным и приобретал бледно-желтую окраску. Затем раствор промывали водой (2×100 мл) и солевым раствором (1×100 мл). Объединенные водные слои экстрагировали ДХМ (2×100 мл). Органические слои сушили над MgSO₄ и фильтровали, концентрировали при пониженном давлении и очищали на хроматографической колонке. Бензил-6-(5-хлор-3-оксоизотиазол-2(3Н)-ил)гексаноат (0,824 г, 29,9%) получали в виде масла светло-желтого цвета вместе с бензил-6-(3-оксоизотиазол-2(3Н)-ил)гексаноатом. ¹H ЯМР (CDCl₃), δ: 7,35 (м, 5Н), 6,25 (с, 1Н), 5,11 (с, 2Н), 3,72 (т, J=7,34 Гц, 2Н), 2,37 (т, J=7,39 Гц, 2Н), 1,69 (м, 4Н), 1,38 (м, 2Н); ¹³С ЯМР (500 МГц, CDCl₃), δ: 173,2 (-O-С=O), 166,9 (-N-C=O), 145,6 (CI-HC=CH-), 136,0 (C_quat. из ароматического цикла), 128,6-128,3 (5 H-C_aromatic), 114,8 (CI-HC=CH-), 66,2 (-СН₂-О-), 43,5 (-СН₂-N-), 34,0 (-СН₂-С=O), 29,4, 25,9, 24,4; R_t,1 (в ACN): 2,35; MC ES+ m/z: 339,84.

1.5. Бензил-6-(5-хлор-1-оксидо-3-оксоизотиазол-2(3Н)-ил)гексаноат

Бензил-6-(5-хлор-3-оксоизотиазол-2(3Н)-ил)гексаноат (802 г, 3,58 ммоль) разбавляли безводным ДХМ (25 мл). Добавляли 3-хлорбензопероксоевую кислоту (1,2 экв.). Раствор перемешивали в течение 48 ч при комнатной температуре в инертной атмосфере. Затем раствор разбавляли ДХМ и обрабатывали 10% водным раствором Na₂S₂O₃. Далее органическую фракцию последовательно экстрагировали насыщенным раствором NaHCO₃ (2×100 мл), затем солевым раствором (1×100 мл). Объединенные водные слои экстрагировали ДХМ (2×100 мл). Органические слои сушили над MgSO₄, фильтровали, концентрировали при пониженном давлении и очищали на хроматографической колонке. В результате получали бензил-6-(5-хлор-1-оксидо-3-оксоизотиазол-2(3Н)-ил)гексаноат (753 мг) в виде бесцветного масла.

1.6. Бензил-6-(5-хлор-1,1-диоксидо-3-оксоизотиазол-2(3Н)-ил)гексаноат

Стандартная методика окисления монохлоридов:

Бензил-6-(5-хлор-3-оксоизотиазол-2(3Н)-ил)гексаноат (1,11 г, 0,0036 моль, 1 экв.) разбавляли безводным ДХМ (7 мл). Добавляли 3-хлорбензопероксоевую кислоту (2,69 г, 0,0109 моль, 3 экв.). Раствор перемешивали в течение 48 ч при комнатной температуре в инертной атмосфере. Затем раствор разбавляли ДХМ и обрабатывали 10% водным раствором Na₂S₂O₃. Далее органическую фракцию последовательно экстрагировали насыщенным раствором NaHCO₃ (2×100 мл), затем солевым раствором (1×100 мл). Объединенные водные слои экстрагировали ДХМ (2×100 мл). Органические слои сушили над MgSO₄, фильтровали, концентрировали при пониженном давлении и очищали на хроматографической колонке. Бензил-6-(5-хлор-1,1-диоксидо-3-оксоизотиазол-2(3Н)-ил)гексаноат получали в виде масла светло-желтого цвета (0,760 г, 64,3%). ¹H ЯМР (CDCl₃), δ: 7,36 (м, 5Н), 6,68 (с, 1Н), 5,11 (с, 2Н), 3,67 (т, J=7,68 Гц, 2Н), 2,37 (т, J=7,27 Гц, 2Н), 1,78 (тт, J=7,73 Гц, 2Н), 1,70 (тт, J=7,38 Гц, 2Н), 1,40 (м, 2Н); ¹³С ЯМР (500 МГц, CDCl₃), δ: 173,2 (-O-С=O), 157,0 (-N-C=O), 144,6 (CI-HC=CH-), 136,0 (C_quat. из ароматического цикла), 128,6-128,2 (H-C_aromatics), 123,6 (CI-HC=CH-), 66,2 (-СН₂-O), 40,3 (-СН₂-N-), 34,0 (-СН₂-С=O), 27,9, 26,0, 24,2; R_t,1 (в ACN): 2,49; MC ES+ M/Z: 371,83.

Пример 1

6-(5-Хлор-1,1-диоксидо-3-оксоизотиазол-2(3Н)-ил)капроновая кислота

6-(5-Хлор-1,1-диоксидо-3-оксоизотиазол-2(3Н)-ил)капроновую кислоту получали в виде порошка белого цвета по стандартной методике снятия бензильной защиты исходя из бензил-6-(5-хлор-1,1-диоксидо-3-оксоизотиазол-2(3Н)-ил)гексаноата (0,445 г, 77%). ¹H ЯМР (CDCl₃), δ: 10,89 (ушир. с, 1Н), 6,70 (с, 1Н), 3,70 (т, J=7,43 Гц, 2Н), 2,38 (т, J=7,38 Гц, 2Н), 1,81 (тт, J=7,60 Гц, 2Н), 1,69 (тт, J=7,71 Гц, 2Н), 1,43 (расщепл. тт, J=7,75 Гц, J=3,31 Гц, 2Н); ¹³С ЯМР (500 МГц, CDCl₃), δ: 178,7 (O=С-ОН), 157,1 (-N-C=O), 144,7 (CI-HC=CH-), 123,6 (CI-HC=CH-), 40,2 (-СН₂-N), 33,5 (-СН₂-С=O), 27,9, 25,9, 23,9; R_t,1 (в ACN): 1,98; MC ES+ m/z: 349,89.

1.7. Бензил-6-(4,5-дихлор-3-оксоизотиазол-2(3Н)-ил)гексаноат

Дибензил-6,6'-((3,3'-дисульфандиил-бис(пропаноил))бис(азандиил))дигексаноат (3,21 г, 0,0052 моль, 1 экв.) растворяли в безводном ДХМ (26 мл). К раствору по каплям прибавляли SO₂Cl₂ (чистота 97%, 3,80 мл, 0,047 моль, 9 экв.), и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 24 ч в инертной атмосфере. Раствор становился прозрачным и приобретал бледно-желтую окраску. После этого смесь промывали водой (2×100 мл) и солевым раствором (1×100 мл). Объединенные водные фракции экстрагировали ДХМ (2×100 мл). Органические фракции сушили над MgSO₄ и фильтровали, концентрировали при пониженном давлении и очищали на хроматографической колонке. Бензил-6-(4,5-дихлор-3-оксоизотиазол-2(3Н)-ил)гексаноат получали в виде масла светло-желтого цвета (1,391 г, 35,7%). ¹H ЯМР (CDCl₃), δ: 7,35 (м, 5Н), 5,11 (с, 2Н), 3,79 (т, J=7,18 Гц, 2Н), 2,37 (т, J=7,33 Гц, 2Н), 1,70 (м, 4Н), 1,38 (м, 2H); ¹³C ЯМР (500 МГц, CDCl₃), δ: 173,2 (-O-С=O), 161,9 (-N-C=O), 138(-СН₂-O-),3 (CI-C-S-), 135,6 (C_quat. из ароматического цикла), 128,6-128,3 (5 H-C_aromatic), 115,1 (CI-C-C=O), 66,2, 44,9 (-СН₂-N-), 33,9 (-СН₂-C=O), 29,1, 25,9, 24,3; R_t,1 (в ACN): 2,50; MC ES+ m/z: 373,75.

1.8. Бензил-6-(4,5-дихлор-1,1-диоксидо-3-оксоизотиазол-2(3Н)-ил)гексаноат

Стандартная методика окисления дихлоридов

Моногидрат трихлорида рутения (16 мг, 0,07 ммоль, 0,013 экв.) добавляли одной порцией в перемешиваемый раствор бензил-6-(4,5-дихлор-3-оксоизотиазол-2(3Н)-ил)гексаноата (1,94 г, 0,0052 моль, 1 экв.) в смеси вода:ДХМ:АСМ (2:1:1, 1 мл). Затем в течение 5 мин прибавляли периодат натрия (3,33 г, 0,0156 моль, 3 экв.) и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 90 минут в инертной атмосфере. Твердые вещества отфильтровывали, фильтрат разбавляли водой (50 мл), экстрагировали EtOAc (2×100 мл), сушили над MgSO₄, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Полученное твердое вещество серого цвета очищали при помощи хроматографической колонки и получали бензил-6-(4,5-дихлор-1,1-диоксидо-3-оксоизотиазол-2(3Н)-ил)гексаноат в виде масла бледно-желтого цвета (0,930 г, 44,2%). ¹H ЯМР (CDCl₃), δ: 7,36 (м, 5Н), 5,12 (с, 2Н), 3,72 (т, J=7,53 Гц, 2Н), 2,73 (т, J=7,50 Гц, 2Н), 1,80 (тт, J=7,53 Гц, 2Н), 1,70 (тт, J=7,70 Гц), 1,41 (м, 2Н); ¹³С ЯМР (500 МГц, CDCl₃), δ: 173,1 (-O-С=O-), 154,1 (N-С=O), 138,0 (CI-C-SO₂-), 136,0 (C_quat. из ароматического цикла), 130,7 1 (CI-C-C=O), 128,6-128,3 (5 H-C_aromatic), 66,2 (-СН₂-O-), 41,1 (-СН₂-N-), 33,9 (-СН₂-С=O), 27,9, 26,0, 24,2; R_t,1 (в ACN): 2,59; MC ES+ m/z: 405,76.

Пример 2

6-(4,5-Дихлор-1,1-диоксидо-3-оксоизотиазол-2(3Н)-ил)капроновая кислота

Стандартная методика снятия бензильной защиты

Бензил-6-(4,5-дихлор-1,1-диоксидо-3-оксоизотиазол-2(3Н)-ил)гексаноат (0,930 г, 2,23 ммоль, 1 экв.) разбавляли безводным ДХМ (11,5 мл). Добавляли метансульфоновую кислоту (1,5 мл, 0,023 моль, 10 экв.). Раствор перемешивали в течение 24 ч при комнатной температуре в инертной атмосфере. Затем раствор разбавляли ДХМ и обрабатывали водой (50 мл). Органический слой экстрагировали водой (2×100 мл), затем солевым раствором (1×100 мл). Объединенные водные слои экстрагировали ДХМ (2×100 мл). Органические слои сушили над MgSO₄ и концентрировали при пониженном давлении, затем очищали при помощи хроматографической колонки. 6-(4,5-Дихлор-1,1-диоксидо-3-оксоизотиазол-2(3Н)-ил)капроновую кислоту получали в виде порошка белого цвета (0,563 г, 78%). ¹H ЯМР (500 МГц, CDCl₃), δ: 3,76 (т, J=7,34 Гц, 2Н), 2,38 (т, J=7,32 Гц, 2Н), 1,83 (тт, J=7,65 Гц, 2Н), 1,70 (тт, J=7,77 Гц, 2Н), 1,45 (тт, J=7,54 Гц, J=3,31 Гц, 2Н); ¹³С ЯМР (500 МГц, CDCl₃), δ: 178,2 (O=С-ОН), 154,2 (N-C=O), 138,1 (CI-C-SO₂-), 130,9 (CI-C-C=O), 41,1 (-CH₂-N-), 33,4 (-СН₂-C=O), 27,9, 25,9, 23,9; R_t,1 (в ACN): 2,09; MC ES+ m/z: 315,76.

1.9. Бензил-6-(4-бром-1,1-диоксидо-3-оксоизотиазол-2(3Н)-ил)гексаноат

К раствору бензил-6-(1,1-диоксидо-3-оксоизотиазол-2(3Н)-ил)гексаноата (полученного по стандартной методике окисления монохлоридов исходя из бензил-6-(3-оксоизотиазол-2(3Н)-ил)гексаноата) (3 г, 8,89 ммоль, 1,00 экв.) в CCl₄ (40 мл) по каплям прибавляли Br₂ (1,2 мл, 19,58 ммоль, 2,2 экв.) при перемешивании при температуре окружающей среды в течение 30 мин и перемешивали в течение ночи при температуре 75°С. Реакционную смесь концентрировали в вакууме и разбавляли CHCl₃ (40 мл) с последующим добавлением пиридина (0,9 г). Полученный раствор перемешивали в течение 30 мин при температуре окружающей среды и затем гасили добавлением 50 мл насыщенного раствора NaHCO₃. Полученную смесь промывали насыщенным раствором карбоната натрия (2×50 мл) и 50 мл солевого раствора. Полученную смесь концентрировали в вакууме, остаток очищали на колонке с силикагелем с использованием смеси этилацетат/петролейный эфир (1:5) и получали 0,4 г (10,8%) бензил-6-(4-бром-1,1-диоксидо-3-оксоизотиазол-2(3Н)-ил)гексаноата в виде масла светло-желтого цвета. ЖХ-МС (ES, m/z): 416 [М+Н]⁺, 433 [M+NH₄]⁺; ¹H ЯМР (400 МГц, хлороформ-d) δ: 7,42-7,28 (м, 2Н), 5,12 (с, 1Н), 3,69 (т, J=7,4 Гц, 1Н), 2,38 (т, J=7,4 Гц, 1Н), 1,86-1,64 (м, 2Н), 1,47-1,34 (м, 1Н).

Пример 3

6-(4-Бром-1,1-диоксидо-3-оксоизотиазол-2(3Н)-ил)капроновая кислота

К раствору бензил-6-(4-бром-1,1-диоксидо-3-оксоизотиазол-2(3Н)-ил)гексаноата (1 г, 2,40 ммоль, 1,00 экв.) в диоксане (10 мл) по каплям прибавляли 4N HCl (10 мл) при перемешивании при температуре 0°С. Полученный раствор перемешивали в течение 2 дней при комнатной температуре. Полученную смесь концентрировали в вакууме и экстрагировали дихлорметаном (3×50 мл). Объединенный органический слой промывали солевым раствором (2×100 мл), сушили над безводным сульфатом натрия и концентрировли в вакууме. Остаток очищали на колонке с силикагелем смесью ДХМ/МеОН (10:1) и получали 100 мг (13%) 6-(4-бром-1,1-диоксидо-3-оксоизотиазол-2(3Н)-ил)капроновой кислоты в виде твердого вещества белого цвета. ЖХ-МС (ES, m/z): 308 [М+NH₄]⁺, 326/328 [М+Н]⁺; ¹Н ЯМР (300 МГц, хлороформ-d) δ: 7,58 (с, 1Н), 3,75 (т, J=7,4 Гц, 2Н), 2,41 (т, J=7,4 Гц, 2Н), 1,78 (дкв, J=34,6, 7,4 Гц, 4Н), 1,47 (т, J=7,7 Гц, 2Н).

Пример схемы синтеза линкера, где X1 представляет собой OR

1.10. Бензил-6-(5-(4-цианофенокси)-1-оксидо-3-оксоизотиазол-2(3Н)-ил)гексаноат

Раствор 4-гидроксибензолкарбонитрила (76 мг, 0639 ммоль) в ТГФ (2 мл) добавляли при температуре 0°С в смесь NaH (0,639 ммоль) в ТГФ (2 мл). Через 30 мин при перемешивании добавляли бензил-6-(5-хлор-1-оксидо-3-оксоизотиазол-2(3Н)-ил)гексаноат (250 мг, 0,703 ммоль) в ТГФ (2 мл). После этого реакционную массу перемешивали при комнатной температуре в течение 18 ч. Реакционную смесь разбавляли AcOEt и добавляли NH₄Cl (10% водный раствор). Затем органическую фракцию промывали солевым раствором и сушили над MgSO₄, фильтровали и концентрировали. Неочищенный продукт очищали на колонке с силикагелем, используя смесь ДХМ/МеОН (80/20), и получали бензил-6-(5-(4-цианофенокси)-1-оксидо-3-оксоизотиазол-2(3Н)-ил)гексаноат (210 мг, выход 75%) в виде бесцветного масла. ЖХ-МС (ES, m/z): 439,0 [М+Н]+; ¹H ЯМР (300 МГц, хлороформ-d) δ: 7,79 (м, 2Н), 7,35 (м, 7Н), 5,59 (с, 1Н), 5,12 (с, 2Н), 3,69 (м, 2Н), 2,37 (м, 2Н), 1,71 (м, 4Н), 1,39 (м, 2Н).

1.11. Бензил-6-(5-(4-цианофенокси)-1,1-диоксидо-3-оксоизотиазол-2(3Н)-ил)гексаноат

Получали в виде бесцветного масла по стандартной методике окисления монохлоридов (136 мг, выход 48%) исходя из бензил-6-(5-(4-цианофенокси)-1-оксидо-3-оксоизотиазол-2(3Н)-ил)гексаноата. ЖХ-МС (ES, m/z): 455,0 [М+Н]+; ¹H ЯМР (300 МГц, хлороформ-d) δ: 7,82 (м, 2Н), 7,40 (м, 2Н), 7,35 (м, 5Н), 5,63 (с, 1Н), 5,12 (с, 2Н), 3,65 (м, 2Н), 2,38 (м, 2Н), 1,79 (м, 2Н), 1,70 (м, 2Н), 1,41 (м, 2Н).

Пример 4

6-(5-(4-Цианофенокси)-1,1-диоксидо-3-оксоизотиазол-2(3Н)-ил)капроновая кислота

Получали в виде твердого вещества белого цвета по стандартной методике снятия бензильной защиты (38 мг, выход 35%) исходя из бензил-6-(5-(4-цианофенокси)-1,1-диоксидо-3-оксоизотиазол-2(3Н)-ил)гексаноата. ЖХ-МС (ES, m/z): 365,0 [М+Н]⁺; ¹H-MR (300 МГц, хлороформ-d) 7,82 (м, 2Н), 7,41 (м, 2Н), 5,65 (с, 1Н), 3,67 (м, 2Н), 2,38 (м, 2Н), 1,80 (м, 2Н), 1,69 (м, 2Н), 1,44 (м, 2Н).

1.12. Бензил-6-(5-метокси-1-оксидо-3-оксоизотиазол-2(3Н)-ил)гексаноат

Смесь бензил-6-(5-хлор-1-оксидо-3-оксоизотиазол-2(3Н)-ил)гексаноата (270 мг, 0,759 ммоль) в метаноле (5 мл) и триэтиламине (113 мкл, 0,835 ммоль) перемешивали при комнатной температуре в течение 18 ч. Затем удаляли в вакууме летучие вещества, остаток очищали на колонке с силикагелем смесью циклогексан/AcOEt (1/1) и получали бензил-6-(5-метокси-1-оксидо-3-оксоизотиазол-2(3Н)-ил)гексаноат (107 мг, 40%) в виде масла желтого цвета. ЖХ-МС (ES, m/z): 352,0 [М+Н]+; ¹H ЯМР (300 МГц, хлороформ-d) δ: 7,36 (м, 5Н), 5,57 (с, 1Н), 5,11 (с, 2Н), 4,04 (с, 3Н), 3,60 (м, 2Н), 2,37 (м, 2Н), 1,75 (м, 2Н), 1,69 (м, 2Н), 1,39 (м, 2Н).

1.13. Бензил-6-(5-метокси-1,1-диоксидо-3-оксоизотиазол-2(3Н)-ил)гексаноат

Получали в виде твердого вещества белого цвета по стандартной методике окисления монохлоридов (62 мг, выход 36%) исходя из бензил-6-(5-метокси-1-оксидо-3-оксоизотиазол-2(3Н)-ил)гексаноата. ЖХ-МС (ES, m/z): 368,0 [М+Н]+; ¹H ЯМР (300 МГц, хлороформ-d) δ: 7,36 (м, 5Н), 5,57 (с, 1Н), 5,11 (с, 2Н), 4,04 (с, 3Н), 3,60 (м, 2Н), 2,37 (м, 2Н), 1,75 (м, 2Н), 1,69 (м, 2Н), 1,39 (м, 2Н).

Пример 5

6-(5-Метокси-1,1-диоксидо-3-оксоизотиазол-2(3Н)-ил)капроновая кислота

Получали в виде твердого вещества белого цвета по стандартной методике снятия бензильной защиты (37 мг, выход 67%) исходя из бензил-6-(5-метокси-1,1-диоксидо-3-оксоизотиазол-2(3Н)-ил)гексаноата. HRMS (ES, m/z): [М+Н] найдено 278,0691; 278,0698 вычислено; ¹H ЯМР (300 МГц, хлороформ-d) δ: 5,60 (с, 1Н), 4,05 (с, 3Н), 3,62 (м, 2Н), 2,36 (м, 2Н), 1,77 (м, 2Н), 1,68 (м, 2Н), 1,42 (м, 2Н).

1.14. Бензил-4-(аминометил)циклогексан-1-карбоксилат-4-метилбензолсульфонат

Смесь 4-(аминометил)циклогексанкарбоновой кислоты (10 г, 63,61 ммоль, 1 экв.), фенилметанола (55,03 г, 508,87 ммоль, 52,91 мл, 8 экв.) и TsOH⋅Н₂О (12,70 г, 66,79 ммоль, 1,05 экв.) в толуоле (50 мл) перемешивали в течение 16 часов при температуре 140°С с насадкой Дина-Старка для сбора воды, выделяющейся при реакции конденсации и из моногидрата толуолсульфоновой кислоты. После кипячения в течение нескольких часов с обратным холодильником реакционная масса становилась прозрачной. Прозрачную реакционную смесь выливали в ТВМЕ (500 мл), полученное твердое вещество белого цвета отфильтровывали, промывали ТВМЕ (200 мл) и сушили в вакууме. Бензил-4-(аминометил)циклогексанкарбоксилат-4-метилбензолсульфоновую кислоту (26,6 г, 63,40 ммоль, 99,68% выход) получали в виде твердого вещества белого цвета; ¹H ЯМР (400 МГц, МЕТАНОЛ-d4) δ: м.д. 7,71 (д, J=8,16 Гц, 2Н), 7,28-7,40 (м, 5Н), 7,23 (д, J=7,94 Гц, 2Н), 5,11 (с, 2Н), 2,77 (д, J=7,06 Гц, 2Н), 2,29-2,39 (м, 4Н), 1,99-2,08 (м, 2Н), 1,85 (ушир. д, J=11,25 Гц, 2Н), 1,53-1,65 (м, 1Н), 1,43 (кв.д, J=12,97,3,20 Гц, 2Н), 1,06 (кв. д, J=12,75, 3,20 Гц, 2Н).

1.15. Дибензил-4,4'-(((3,3'-дисульфандиил-бис(пропаноил))бис(азандиил))бис(метилен))бис(циклогексан-1-карбоксилат)

В раствор 3-(2-карбоксиэтилдисульфанил)пропионовой кислоты (6,64 г, 31,58 ммоль, 1 экв.), HOBt (9,39 г, 69,48 ммоль, 2,2 экв.) и ТЭА (12,78 г, 126,33 ммоль, 17,58 мл, 4 экв.) в ДХМ (300 мл) добавляли EDCI (13,32 г, 69,48 ммоль, 2,2 экв.) при температуре 0°С. Затем при этой же температуре добавляли бензил-4-(аминометил)циклогексанкарбоксилат-4-метилбензолсульфоновую кислоту (26,5 г, 63,17 ммоль, 2 экв.). Реакционную массу перемешивали при температуре 0-20°С в течение 4 ч. Анализ методом ТСХ (в системе петролейный эфир:этилацетат, 2:1, R_f=0,5) показал, что реакция завершилась. Смесь выливали в насыщенный раствор NaHCO₃ (100 мл) в H₂O (100 мл) и отделяли органический слой. Водный слой экстрагировали ДХМ (200 мл). Объединенные органические слои промывали Н₂О (100 мл), солевым раствором (100 мл), сушили над Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток растворяли в ДХМ (50 мл) и очень медленно добавляли петролейный эфир до появления осадка белого цвета. Осадок отфильтровывали и промывали петролейным эфиром, сушили в вакууме. Бензил-4-[[3-[[3-[(4-бензилоксикарбонилциклогексил)метиламино]-3-оксопропил]дисульфанил]пропаноиламино]метил]циклогексанкарбоксилат (19 г, 28,40 ммоль, выход 89,94%) получали в виде твердого вещества белого цвета; ¹H ЯМР (400 МГц, хлороформ-d) δ: м.д. 7,27-7,41 (м, 10Н), 6,05 (ушир. с, 2Н), 5,11 (д, J=1,54 Гц, 4Н), 3,10-3,17 (м, 4Н), 2,96-3,02 (м, 4Н), 2,54-2,63 (м, 4Н), 2,30 (тд, J=12,24, 1,76 Гц, 2Н), 2,04 (ушир. д, J=12,57 Гц, 4Н), 1,85 (ушир. д, J=12,79 Гц, 4Н), 1,38-1,54 (м, 6H), 0,99 (кв., J=12,72 Гц, 4Н).

1.16. Бензил-4-((5-хлор-3-оксоизотиазол-2(3Н)-ил)метил)циклогексан-1-карбоксилат

1.17. Бензил-4-((4,5-дихлор-3-оксоизотиазол-2(3Н)-ил)метил)циклогексан-1-карбоксилат

К раствору бензил-4-[[3-[[3-[(4-бензилоксикарбонилциклогексил)метиламино]-3-оксопропил]дисульфанил]пропаноиламино]метил]циклогексанкарбоксилата (10 г, 14,95 ммоль, 1 экв.) в ДХМ (100 мл) по каплям прибавляли сульфурилхлорид (10,09 г, 74,75 ммоль, 7,47 мл, 5 экв.) при температуре 0°С. Реакционную массу перемешивали при температуре 0-20°С в течение 12 ч. После добавления сульфурилхлорида получали прозрачный раствор. Анализ методом ТСХ (петролейный эфир:этилацетат, 2:1, Rf. (основное) = 0,5) показал, что реакция завершилась. Смесь выливали в Н₂О (30 мл), экстрагировали ДХМ (50 мл*2). Объединенные органические слои промывали H₂O (50 мл), солевым раствором (50 мл), сушили над Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали в вакууме. После очистки на колонке с силикагелем получали бензил-4-[(3-оксоизотиазол-2-ил)метил]циклогексанкарбоксилат (2,1 г, 3,42 ммоль, выход 11,44%, чистота 54%) в виде твердого вещества коричневого цвета, бензил-4-[(5-хлор-3-оксоизотиазол-2-ил)метил]циклогексанкарбоксилат (7,1 г, 18,82 ммоль, выход 62,96%, чистота 97%) в виде твердого вещества грязно-белого цвета и бензил-4-[(4,5-дихлор-3-оксоизотиазол-2-ил)метил]циклогексанкарбоксилат (0,4 г, 869,31 мкмоль, выход 2,91%, чистота 87%) в виде масла коричневого цвета.

1.18. Бензил-4-((5-хлор-1,1-диоксидо-3-оксоизотиазол-2(3Н)-ил)метил)циклогексан-1-карбоксилат

В смесь бензил-4-[(5-хлор-3-оксоизотиазол-2-ил)метил]циклогексанкарбоксилата (2 г, 5,01 ммоль, 1 экв.) в H₂O (20 мл), ACN (10 мл) и ДХМ (10 мл) добавляли RuCl₃⋅H₂O (22,58 мг, 100,14 мкмоль, 0,02 экв.) и NalO₄ (6,43 г, 30,04 ммоль, 1,66 мл, 6 экв.) одной порцией при температуре 0°С в атмосфере N₂. Затем смесь нагревали до температуры 20°С и перемешивали в течение 16 часов. Анализ методом ТСХ показал, что реакция завершилась (петролейный эфир:этилацетат, 2:1, Rf-p1=0,6). Смесь фильтровали, фильтрат концентрировали в токе азота, образовавшееся твердое вещество отфильтровывали, фильтрат концентрировали в токе азота. Остаток очищали при помощи препаративной ТСХ (высота колонки: 250 мм, диаметр: 100 мм, силикагель 100-200 меш, петролейный эфир:этилацетат, 2:1) и получали бензил-4-[(5-хлор-1,1,3-триоксоизотиазол-2-ил)метил]циклогексанкарбоксилат (1,4 г, 3,17 ммоль, выход 63,25%, чистота 90%) в виде твердого вещества белого цвета.

Пример 6

4-((5-Хлор-1,1-диоксидо-3-оксоизотиазол-2(3Н)-ил)метил)циклогексан-1-карбоновая кислота

В смесь бензил-4-[(5-хлор-1,1,3-триоксоизотиазол-2-ил)метил]циклогексанкарбоксилата (0,1 г, 226,20 мкмоль, 1 экв.) в ДХМ (5 мл) добавляли MsOH (217,39 мг, 2,26 ммоль, 161,03 мкл, 10 экв.) одной порцией при температуре 30°С в атмосфере N₂. Реакционную массу перемешивали при температуре 30°С в течение 16 часов. Анализ методом ТСХ показал, что реакция завершилась. Анализ ЖХ-МС (ЕТ17992-54-Р1А) показал наличие ожидаемого МС. Реакционную массу выливали в смесь воды со льдом (5 мл) и перемешивали в течение 5 мин. Водную фракцию экстрагировали ДХМ (3 мл*2). Объединенные органические фракции промывали солевым раствором (3 мл), сушили над безводным Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток очищали при помощи препаративной ТСХ (высота колонки: 250 мм, диаметр: 100 мм, силикагель 100-200 меш, петролейный эфир:/этилацетат, 2:1) и получали 4-[(5-хлор-1,1,3-триоксоизотиазол-2-ил)метил]циклогексанкарбоновую кислоту (0,02 г, 64,99 мкмоль, выход 28,73%) в виде бесцветного масла; ЖХ-МС (ES, m/z): 306,0 [М-Н]-; ¹H ЯМР (300 МГц, ДМСО-D6) δ: 12,01 (ушир. с, 1Н), 7,62 (с, 1Н), 3,45 (м, 2Н), 2,11 (м, 1Н), 1,90 (м, 2Н), 1,76 (м, 2Н), 1,73(м, 1Н), 1,23 (м, 2Н), 0,96 (м, 2Н).

1.19 Бензил-4-((4,5-дихлор-1,1-диоксидо-3-оксоизотиазол-2(3Н)-ил)метил)циклогексан-1-карбоксилат

В смесь бензил-4-[(4,5-дихлор-3-оксоизотиазол-2-ил)метил]циклогексанкарбоксилата (1,2 г, 2,70 ммоль, 1 экв.) в H₂O (20 мл), ДХМ (10 мл) и ACN (10 мл) добавляли RuCl₃⋅H₂O (12,16 мг, 53,96 мкмоль, 0,02 экв.) и NalO₄ (3,46 г, 16,19 ммоль, 896,96 мкл, 6 экв.) одной порцией при температуре 0°С в атмосфере N₂. Реакционную массу перемешивали при температуре 20°С в течение 2 часов. Анализ методом ТСХ показал, что реакция завершилась (петролейный эфир:этилацетат, 2:1, Rf-p1=0,7). Реакционную массу выливали в смесь воды со льдом (30 мл) и перемешивали в течение 5 мин. Водную фракцию экстрагировали этилацетатом (20 мл*2). Объединенные органические фракции промывали солевым раствором (20 мл), сушили над безводным Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток очищали хроматографией на силикагеле (высота колонки: 250 мм, диаметр: 100 мм, силикагель 100-200 меш, петролейный эфир:этилацетат, от 5:1 до 3:1) и получали бензил-4-[(4,5-дихлор-1,1,3-триоксоизотиазол-2-ил)метил]циклогексанкарбоксилат (0,8 г, 1,67 ммоль, выход 61,73%, чистота 90%) в виде твердого вещества белого цвета.

Пример 7

4-((4,5-Дихлор-1,1-диоксидо-3-оксоизотиазол-2(3Н)-ил)метил)циклогексан-1-карбоновая кислота

В смесь бензил-4-[(4,5-дихлор-1,1,3-триоксоизотиазол-2-ил)метил]циклогексанкарбоксилата (0,8 г, 1,67 ммоль, 1 экв.) в ДХМ (20 мл) добавляли MsOH (1,60 г, 16,65 ммоль, 1,19 мл, 10 экв.) одной порцией при температуре 30°С в атмосфере N2. Реакционную массу перемешивали при температуре 30°С в течение 16 часов. Анализ методом ЖХ-МС показал, что реакция завершилась. Реакционную массу выливали в смесь воды со льдом (5 мл) и концентрировали при пониженном давлении с образованием твердого вещества. Раствор фильтровали и растирали с EtOAc (2 мл*3), осадок на фильтре сушили в вакууме и получали 4-[(4,5-дихлор-1,1,3-триоксоизотиазол-2-ил)метил]циклогексанкарбоновую кислоту (0,170 г, 486,86 мкмоль, выход 29,23%, чистота 98%) в виде твердого вещества белого цвета; ЖХ-МС (ES, m/z): 364,0 [M+Na]⁺; ¹H ЯМР (300 МГц, ДМСО-D6) δ: 11,99 (ушир. с, 1Н), 3,49 (м, 2Н), 2,11 (м, 1Н), 1,88 (м, 2Н), 1,79 (м, 2Н), 1,66 (м, 1Н), 1,23 (м, 2Н), 0,96 (м, 2Н).

1.20 Дибензил-3,3'-(((3,3'-дисульфандиил-бис(пропаноил))бис(азандиил))бис(4,1-фенилен))дипропионат

В раствор 3-(2-карбоксиэтилдисульфанил)пропионовой кислоты (651,56 мг, 3,10 ммоль, 1 экв.), HOBt (921,15 мг, 6,82 ммоль, 2,2 экв.) и ТЭА (1,25 г, 12,39 ммоль, 1,73 мл, 4 экв.) в ДХМ (50 мл) добавляли EDCI (1,31 г, 6,82 ммоль, 2,2 экв.) при температуре 0°С. Затем при этой же температуре добавляли бензил-4-(аминометил)циклогексанкарбоксилат-4-метилбензолсульфоновую кислоту (2,6 г, 6,20 ммоль, 2 экв.). Реакционную массу перемешивали при температуре 0-20°С в течение 12 ч. Анализ методом ТСХ (петролейный эфир:этилацетат, 2:1, Rf=0,5) показал, что реакция завершилась. Смесь выливали в насыщенный раствор NaHCO₃ (20 мл) и H₂O (20 мл) и отделяли органический слой. Водный слой экстрагировали ДХМ (50 мл). Объединенные органические слои промывали H₂O (50 мл), солевым раствором (50 мл), сушили над Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали в вакууме. Бензил-4-[[3-[[3-[(4-бензилоксикарбонилциклогексил)метиламино]-3-оксопропил]дисульфанил]пропаноиламино]метил]циклогексанкарбоксилат (1,1 г, 1,64 ммоль, выход 53,07%) получали в виде твердого вещества белого цвета; ¹H ЯМР (400 МГц, хлороформ-d) δ: м.д. 7,28-7,41 (м, 10Н), 5,96 (ушир. с, 2Н), 5,10 (с, 4Н), 3,13 (т, J=6,39 Гц, 4Н), 2,98 (т, J=6,84 Гц, 4Н), 2,57 (т, J=6,95 Гц, 4Н), 2,23-2,34 (м, 2Н), 2,03 (ушир. д, J=12,79 Гц, 4Н), 1,84 (ушир. д, J=12,13 Гц, 4Н), 1,37-1,63 (м, 6Н), 0,91-1,05 (м, 4Н).

1.21. Бензил-3-(4-(5-хлор-3-оксоизотиазол-2(3Н)-ил)фенил)пропаноат

К раствору бензил-3-[4-[3-[[3-[4-(3-бензилокси-3-оксопропил)анилино]-3-оксопропил]дисульфанил]пропаноиламино]фенил]пропаноата (10 г, 14,60 ммоль, 1 экв.) в ДХМ (200 мл) по каплям прибавляли сульфурилхлорид (5,91 г, 43,80 ммоль, 4,38 мл, 3 экв.) при температуре 25°С в атмосфере N₂. Раствор перемешивали при температуре 25°С в течение 8 часов. При добавлении сульфурилхлорида цвет раствора изменялся с бесцветного на черный и затем через 1 ч - на желтый. Анализ методом ТСХ (петролейный эфир:этилацетат, 2:1, Rf=0,60) показал расходование исходного материала и образование двух новых пятен. Остаток выливали в смесь воды со льдом (200 мл) и концентрировали в вакууме для удаления ДХМ. После концентрирования водную фракцию экстрагировали этилацетатом (200 мл*3), объединенные органические фракции промывали водой (200 мл*1), сушили над безводным Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток очищали при помощи колоночной хроматографии (SiO₂, петролейный эфир:этилацетат, от 5:1 до 1:1) и получали бензил-3-[4-(3-оксоизотиазол-2-ил)фенил]пропаноат (2,5 г, 7,37 ммоль, выход 50,47%) ¹H ЯМР (400 МГц, метанол-d4) δ: 8,56 (д, J=6,2 Гц, 1Н), 7,44-7,39 (м, 2Н), 7,37-7,26 (м, 7Н), 6,30 (д, J=6,4 Гц, 1Н), 5,09 (с, 2Н), 2,98 (т, J=7,4 Гц, 2Н), 2,78-2,66 (м, 2Н); и бензил-3-[4-(5-хлор-3-оксоизотиазол-2-ил)фенил]пропаноат (5 г, 13,37 ммоль, 91,60% выход) в виде твердого вещества желтого цвета; ¹H ЯМР (ЕТ17992-22-Р2А) подтверждено ЕТ17992-22-Р2. ¹H ЯМР (400 МГц, метанол-d4) δ: 7,42-7,36 (м, 2Н), 7,35-7,25 (м, 7Н), 6,49-6,45 (м, 1Н), 5,08 (с, 2Н), 2,99-2,91 (м, 2Н),2,69 (т, J=7,5 Гц, 2Н).

1.22. Бензил-3-(4-(5-хлор-1,1-диоксидо-3-оксоизотиазол-2(3Н)-ил)фенил)пропаноат

В смесь бензил-3-[4-(5-хлор-3-оксоизотиазол-2-ил)фенил]пропаноата (1,4 г, 3,74 ммоль, 1 экв.) в Н₂О (12 мл), ДХМ (6 мл) и ACN (6 мл) добавляли NalO₄ (4,81 г, 22,47 ммоль, 1,25 мл, 6 экв.) одной порцией при температуре 25°С, после чего смесь трижды продували N₂. Затем добавляли RuCl₃⋅H₂O (42,21 мг, 187,24 мкмоль, 0,05 экв.) в атмосфере N₂. Реакционную массу перемешивали при температуре 25°С в течение 12 ч. Смесь мутнела и приобретала серую окраску. Остаток выливали в этилацетат (100 мл) и затем фильтровали. Фильтрат концентрировали в вакууме. Остаток очищали при помощи колоночной хроматографии (SiO₂, петролейный эфир:этилацетат, от 10:1 до 4:1) и получали бензил-3-[4-(5-хлор-1,1,3-триоксоизотиазол-2-ил)фенил]пропаноат (460 мг, 1,08 ммоль, выход 28,75%, чистота 95%) в виде твердого вещества желтого цвета; ¹H ЯМР (ЕТ17992-63-Р1А) подтверждено ЕТ17992-63-Р1. ¹H ЯМР (400 МГц, хлороформ-d) δ: 7,41-7,30 (м, 7Н), 6,84 (с, 1Н), 5,13 (с, 2Н), 3,04 (т, J=7,6 Гц, 2Н), 2,72 (т, J=7,7 Гц, 2Н).

Пример 8

3-(4-(5-Хлор-1,1-диоксидо-3-оксоизотиазол-2(3Н)-ил)фенил)пропионовая кислота

К раствору бензил-3-[4-(5-хлор-1,1,3-триоксоизотиазол-2-ил)фенил]пропаноата (460 мг, 1,13 ммоль, 1 экв.) в ДХМ (15 мл) по каплям прибавляли метансульфоновую кислоту (1,09 г, 11,33 ммоль, 806,87 мкл, 10 экв.) при температуре 10°С. Затем раствор нагревали до температуры 35°С и перемешивали в течение 12 ч. Остаток промывали водой (15 мл*3), сушили над безводным Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток выливали в воду (20 мл) и фильтровали. Осадок на фильтре растворяли в ДХМ (5 мл) и затем добавляли петролейный эфир (30 мл), раствор перемешивали при температуре 10°С в течение 2 мин, фильтровали, осадок на фильтре сушили в вакууме и получали 3-[4-(5-хлор-1,1,3-триоксоизотиазол-2-ил)фенил]пропионовую кислоту (162 мг, 501,81 мкмоль, выход 44,27%, чистота 97,8%) в виде твердого вещества белого цвета; ЖХ-МС (ES, m/z): 313,9 [М-Н]^-;¹H ЯМР (300 МГц, ДМСО-D6) δ: 12,18 (ушир. с, 1Н), 7,81 (с, 1Н), 7,45 (м, 2Н), 7,37 (м, 2Н), 2,89 (м, 2Н), 2,58 (м, 2Н).

1.23. Бензил-3-(4-(4,5-дихлор-3-оксоизотиазол-2(3Н)-ил)фенил)пропаноат

В смесь бензил-4-[(3-оксоизотиазол-2-ил)метил]циклогексанкарбоксилата (1,2 г, 3,32 ммоль, 1 экв.) в H₂O (20 мл), ACN (10 мл) и ДХМ (10 мл) добавляли RuCl₃⋅H₂O (14,95 мг, 66,33 мкмоль, 0,02 экв.) и NalO₄ (4,26 г, 19,90 ммоль, 1,10 мл, 6 экв.) одной порцией при температуре 0°С в атмосфере N₂. Затем смесь нагревали до температуры 20°С и перемешивали в течение 16 часов. Смесь фильтровали, фильтрат концентрировали в токе азота до повторного появления твердого вещества, которое отфильтровывали, фильтрат концентрировали в токе азота. Остаток очищали при помощи препаративной ТСХ (высота колонки: 250 мм, диаметр: 100 мм, силикагель 100-200 меш, петролейный эфир:этилацетат, 2:1) и получали бензил-4-[(1,1,3-триоксоизотиазол-2-ил)метил]циклогексанкарбоксилат (0,45 г, 1,11 ммоль, выход 33,60%, чистота 90%) в виде бесцветного масла; ¹H ЯМР (400 МГц, хлороформ-d) δ: 7,53 (дд, J=3,2, 8,7 Гц, 2Н), 7,17 (ддд, J=3,2, 7,6, 9,0 Гц, 2Н), 6,97-6,89 (м, 2Н), 5,56 (ушир. с 1Н), 4,12-4,06 (м, 4Н), 3,92 (с, 5Н), 3,55 (кв., J=5,1 Гц, 5Н).

1.24. Бензил-3-(4-(4,5-дихлор-1,1-диоксидо-3-оксоизотиазол-2(3Н)-ил)фенил)пропаноат

В смесь бензил-3-[4-(4,5-дихлор-3-оксоизотиазол-2-ил)фенил]пропаноата (650 мг, 1,59 ммоль, 1 экв.) и NalO₄ (1,36 г, 6,37 ммоль, 352,86 мкл, 4 экв.) в H₂O (10 мл), ДХМ (5 мл), ACN (5 мл) добавляли RuCl₃⋅H₂O (7,18 мг, 31,84 мкмоль, 0,02 экв.) одной порцией при температуре 0°С в атмосфере N₂. Реакционную массу перемешивали при температуре 20°С в течение 2 ч. Остаток экстрагировали этилацетатом (30 мл*2). Объединенные органические фракции сушили над безводным Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток очищали при помощи колоночной хроматографии (SiO₂, петролейный эфир:этилацетат, от 30:1 до 5:1) и получали бензил-3-[4-(4,5-дихлор-1,1,3-триоксоизотиазол-2-ил)фенил]пропаноат (180 мг, выход 25,68%) в виде твердого вещества желтого цвета; ¹H ЯМР (400 МГц, хлороформ-d) δ: 7,43-7,29 (м, 9Н), 5,13 (с, 2Н), 3,05 (т, J=7,6 Гц, 2Н), 2,73 (т, J=7,6 Гц, 2Н).

Пример 9

3-(4-(4,5-Дихлор-1,1-диоксидо-3-оксоизотиазол-2(3Н)-ил)фенил)пропионовая кислота

К раствору бензил-3-[4-(4,5-дихлор-1,1,3-триоксоизотиазол-2-ил)фенил]пропаноат (180 мг, 408,81 мкмоль, 1 экв.) в ДХМ (5 мл) по каплям прибавляли метансульфоновую кислоту (392,89 мг, 4,09 ммоль, 291,03 мкл, 10 экв.) при температуре 10°С. Раствор перемешивали при температуре 35°С в течение 12 ч. Остаток выливали в воду (5 мл) и фильтровали. Осадок на фильтре промывали водой (10 мл*3) и сушили в вакууме. Остаток растворяли в смеси дихлорметан:метанол (5,5 мл, об./об. равен 10:1), очищали при помощи препаративной ТСХ (этилацетат, Rf=0,26) и получали 3-[4-(4,5-дихлор-1,1,3-триоксоизотиазол-2-ил)фенил]пропионовую кислоту (57,64 мг, 156,83 мкмоль, выход 38,36%, чистота 95,278%) в виде твердого вещества белого цвета; ЖХ-МС (ES, m/z): 347,9 [М-Н]-; ¹H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ: 12,22 (ушир. с 1Н), 7,51-7,40 (м, 4Н), 2,90 (ушир. т, J=7,6 Гц, 2Н), 2,60 (ушир. т, J=7,6 Гц, 2Н).

1.25. Дибензил-4,4'-((3,3'-дисульфандиил-бис(пропаноил))бис(азандиил))дибензоат

В раствор 3-(2-карбоксиэтилдисульфанил)пропионовой кислоты (6,01 г, 28,60 ммоль, 1 экв.) и пиридина (14,93 г, 188,77 ммоль, 15,24 мл, 6,6 экв.) в ДМФА (120 мл) добавляли EDCI (12,06 г, 62,92 ммоль, 2,2 экв.) и бензил-4-аминобензоат (13 г, 57,20 ммоль, 2 экв.) при температуре 10°С. После этого реакционную массу перемешивали при температуре 50°С в течение 12 ч. Остаток выливали в смесь воды со льдом (200 мл) и перемешивали в течение 20 мин. Водную фракцию экстрагировали этилацетатом (200 мл*3). Объединенные органические фракции промывали насыщенным раствором NaCl (200 мл*3), сушили над безводным Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток перекристаллизовывали из смеси петролейный эфир:ДХМ, 50:1 и получали твердое вещество. Твердое вещество трижды промывали петролейным эфиром (150 мл*3), сушили в вакууме и получали бензил-4-[3-[[3-(4-бензилоксикарбониланилино)-3-оксопропил]дисульфанил]пропаноиламино]бензоат (14 г, неочищенный продукт) в виде твердого вещества белого цвета; ¹H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ: 10,37 (с, 2Н), 8,02-7,83 (м, 4Н), 7,72 (д, J=8,8 Гц, 4Н), 7,48-7,32 (м, 10Н), 5,31 (с, 4Н), 3,05-2,98 (м, 4Н), 2,81-2,75 (м, 4Н).

1.26. Бензил-4-(5-хлор-3-оксоизотиазол-2(3Н)-ил)бензоат

1.27. Бензил-4-(4,5-дихлор-3-оксоизотиазол-2(3Н)-ил)бензоат

К раствору бензил-4-[3-[[3-(4-бензилоксикарбониланилино)-3-оксопропил]дисульфанил]пропаноиламино]бензоата (9,4 г, 14,95 ммоль, 1 экв.) в ДХМ (120 мл) по каплям прибавляли сульфурилхлорид (10,09 г, 74,75 ммоль, 7,47 мл, 5 экв.) при температуре 0°С. Реакционную массу перемешивали при температуре 0-20°С в течение 12 ч. После перемешивания в течение нескольких минут смесь становилась прозрачной. Анализ методом ТСХ (петролейный эфир:этилацетат, 2:1) показал, что реакция завершилась. Смесь выливали в H₂O (200 мл), экстрагировали ДХМ (200 мл*2). Объединенные органические слои промывали H₂O (200 мл*2), сушили над Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток очищали при помощи колоночной хроматографии на силикагеле (петролейный эфир:этилацетат, от 5:1 до 1:1) и получали бензил-4-(3-оксоизотиазол-2-ил)бензоат (1,2 г, 3,43 ммоль, выход 11,47%, чистота 89%) в виде твердого вещества грязно-белого цвета; ¹H ЯМР (400 МГц, хлороформ-d) δ: м.д. 8,09-8,27 (м, 3Н), 7,63-7,82 (м, 2Н), 7,32-7,52 (м, 5Н), 6,34 (ушир. д, J=6,36 Гц, 1Н), 5,39 (с, 2Н); бензил-4-(5-хлор-3-оксоизотиазол-2-ил)бензоат (3,5 г, 10,01 ммоль, выход 33,49%, чистота 98,92%) в виде твердого вещества грязно-белого цвета; ¹H ЯМР (400 МГц, хлороформ-d) δ: м.д. 8,15 (д, J=8,60 Гц, 2Н), 7,69 (д, J=8,82 Гц, 2Н), 7,33-7,49 (м, 4Н), 6,38 (с, 1Н), 5,38 (с, 2Н), и бензил-4-(4,5-дихлор-3-оксоизотиазол-2-ил)бензоат (2,8 г, 7,19 ммоль, выход 24,06%, чистота 97,68%) в виде твердого вещества грязно-белого цвета; ¹H ЯМР (400 МГц, хлороформ-d) δ: м.д. 8,18 (д, J=8,60 Гц, 2Н), 7,71 (д, J=8,60 Гц, 2Н), 7,33-7,50 (м, 4Н), 5,39 (с, 2Н).

1.28. Бензил-4-(5-хлор-1,1-диоксидо-3-оксоизотиазол-2(3Н)-ил)бензоат

В смесь бензил-4-(5-хлор-3-оксоизотиазол-2-ил)бензоата (1 г, 2,89 ммоль, 1 экв.) в H₂O (10 мл), ACN (5 мл) и ДХМ (5 мл) добавляли RuCl₃⋅H₂O (13,04 мг, 57,84 мкмоль, 0,02 экв.) и NalO₄ (2,47 г, 11,57 ммоль, 640,97 мкл, 4 экв.) одной порцией при температуре 0°С в атмосфере N₂. Затем смесь нагревали до температуры 20°С и перемешивали в течение 2 часов. Остаток фильтровали, фильтрат выливали в воду (40 мл). Водную фракцию экстрагировали этилацетатом (50 мл*1). Органическую фракцию промывали насыщенным раствором NaCl (30 мл*3), сушили над безводным Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток очищали при помощи колоночной хроматографии (SiO₂, петролейный эфир:этилацетат, от 15:1 до 5:1) и получали бензил-4-(5-хлор-1,1,3-триоксоизотиазол-2-ил)бензоат (500 мг, 1,32 ммоль, выход 45,77%) в виде масла желтого цвета; ¹H ЯМР (400 МГц, хлороформ-d) δ: 8,27-8,21 (м, 2Н), 7,61-7,55 (м, 2Н), 7,49-7,34 (м, 5Н), 6,87 (с, 1Н), 5,40 (с, 2Н).

Пример 10

4-(5-Хлор-1,1-диоксидо-3-оксоизотиазол-2(3Н)-ил)бензойная кислота

К раствору бензил-4-(5-хлор-1,1,3-триоксоизотиазол-2-ил)бензоата (450 мг, 1,19 ммоль, 1 экв.) в ДХМ (20 мл) по каплям прибавляли метансульфоновую кислоту (1,14 г, 11,91 ммоль, 847,94 мкл, 10 экв.) при температуре 10°С. Раствор перемешивали при температуре 35°С в течение 10 ч. Остаток концентрировали в вакууме для удаления ДХМ. После этого остаток растворяли в этилацетате (10 мл), органическую фракцию промывали водой (20 мл*5), сушили над безводным Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток растворяли в метаноле (3 мл) и добавляли петролейный эфир (30 мл), раствор перемешивали при температуре 10°С в течение 2 мин, фильтровали, осадок на фильтре сушили в вакууме и получали 4-(5-хлор-1,1,3-триоксоизотиазол-2-ил)бензойную кислоту (112,56 мг, 379,48 мкмоль, выход 31,86%, чистота 96,986%) в виде твердого вещества белого цвета; ЖХ-МС (ES, m/z): 285,9 [М-Н]-; ¹H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ: 13,33 (ушир. с 1Н), 8,17-8,11 (м, 2Н), 7,87 (д, J=1,5 Гц, 1Н), 7,67-7,61 (м, 2Н).

1.29. Бензил-4-(4,5-дихлор-1,1-диоксидо-3-оксоизотиазол-2(3Н)-ил)бензоат

В смесь бензил-4-(4,5-дихлор-3-оксоизотиазол-2-ил)бензоата (1 г, 2,63 ммоль, 1 экв.) в H₂O (10 мл), ACN (5 мл) и ДХМ (5 мл) добавляли RuCl₃⋅H₂O (11,86 мг, 52,60 мкмоль, 0,02 экв.) и NalO₄ (2,25 г, 10,52 ммоль, 582,91 мкл, 4 экв.) одной порцией при температуре 0°С в атмосфере N₂. Затем смесь нагревали до температуры 20°С и перемешивали в течение 2 часов. Остаток фильтровали и фильтрат концентрировали в вакууме. Остаток очищали при помощи колоночной хроматографии (SiO₂, петролейный эфир:этилацетат, от 20:1 до 5:1) и получали бензил-4-(4,5-дихлор-1,1,3-триоксоизотиазол-2-ил)бензоат (130 мг, 315,35 мкмоль, выход 11,99%) в виде твердого вещества белого цвета; ¹H ЯМР (400 МГц, хлороформ-d) δ: 8,25 (д, J=8,6 Гц, 2Н), 7,58 (д, J=8,8 Гц, 2Н), 7,49-7,34 (м, 5Н), 5,41 (с, 2Н).

Пример 11

4-(4,5-Дихлор-1,1-диоксидо-3-оксоизотиазол-2(3Н)-ил)бензойная кислота

К раствору бензил-4-(4,5-дихлор-1,1,3-триоксоизотиазол-2-ил)бензоата (130 мг, 315,35 мкмоль, 1 экв.) в ДХМ (5 мл) по каплям прибавляли метансульфоновую кислоту (303,07 мг, 3,15 ммоль, 224,49 мкл, 10 экв.) при температуре 10°С. Раствор перемешивали при температуре 10°С в течение 5 мин, после чего нагревали до температуры 35°С и перемешивали в течение 10 часов. Цвет раствора изменялся с бесцветного на желтый. Реакционный раствор выливали в воду (20 мл) и фильтровали. Осадок на фильтре трижды промывали водой (10 мл*3) и ДХМ (10 мл*3), соответственно. Осадок на фильтре сушили в вакууме. Остаток диспергировали в ДХМ (10 мл) и затем добавляли петролейный эфир (30 мл), смесь перемешивали при температуре 10°С в течение 2 мин, затем фильтровали, осадок на фильтре сушили в вакууме и получали 4-(4,5-дихлор-1,1,3-триоксоизотиазол-2-ил)бензойную кислоту (93,4 мг, 282,97 мкмоль, выход 89,73%, чистота 97,590%) в виде твердого вещества белого цвета; ЖХ-МС (ES, m/z): 319,9 [М-Н]^-; ¹H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ: 8,16 (д, J=8,4 Гц, 2Н), 7,68 (д, J=8,4 Гц, 2Н).

1.30. Бензил-3-(2-(2-(2-аминоэтокси)этокси)этокси)пропаноат 4-метилбензолсульфонат

Смесь 3-[2-[2-(2-аминоэтокси)этокси]этокси]пропионовой кислоты (4 г, 18,08 ммоль, 1 экв.), фенилметанола (15,64 г, 144,63 ммоль, 15,04 мл, 8 экв.) и TsOH⋅H₂O (3,61 г, 18,98 ммоль, 1,05 экв.) в толуоле (30 мл) перемешивали при температуре 140°С в течение 8 часов с насадкой Дина-Старка для сбора воды, образующейся при реакции конденсации. После кипячения в течение нескольких часов с обратным холодильником реакционная масса становилась прозрачной. Анализ методом ТСХ (дихлорметан:метанол, 10:1, Rf=0,3) показал, что реакция завершилась. Прозрачную реакционную массу выливали в смесь ТВМЕ:петролейный эфир (1:1, 50 мл) и удаляли прозрачный раствор. Остаток дважды промывали смесью ТВМЕ:петролейный эфир (1:1, 50 мл) и сушили в вакууме. Неочищенный продукт бензил-3-[2-[2-(2-аминоэтокси)этокси]этокси]пропаноат-4-метилбензолсульфоновую кислоту (8,9 г, неочищенный продукт) получали в виде масла желтого цвета; ¹H ЯМР (400 МГц, хлороформ-d) δ: м.д. 7,76 (ушир. д, J=8,07 Гц, 2Н), 7,33-7,38 (м, 5Н), 7,15 (д, J=7,95 Гц, 2Н), 5,11 (с, 2Н), 3,72 (кв., J=6,11 Гц, 4Н), 3,53-3,64 (м, 8Н), 3,11-3,24 (м, 2Н), 2,53-2,69 (м, 2Н), 2,30-2,41 (м, 1Н), 2,34 (с, 3Н).

1.31. Бензил-3-[2-[2-[2-[3-[[3-[2-[2-[2-(3-бензилокси-3-оксопропокси)этокси]этокси]этиламино]-3-оксопропил]дисульфанил]пропаноиламино]этокси]этокси]этокси]пропаноат

В смесь 3-(2-карбоксиэтилдисульфанил)пропионовой кислоты (1,90 г, 9,04 ммоль, 1 экв.), HOBt (2,69 г, 19,88 ммоль, 2,2 экв.) и ТЭА (4,57 г, 45,18 ммоль, 6,29 мл, 5 экв.) в ДХМ (100 мл) добавляли EDCI (3,81 г, 19,88 ммоль, 2,2 экв.) при температуре 20°С. Затем в полученный раствор добавляли бензил-3-[2-[2-(2-аминоэтокси)этокси]этокси]пропаноат-4-метилбензолсульфоновую кислоту (8,74 г, 18,07 ммоль, 2 экв.). Реакционную массу перемешивали при температуре 20°С в течение 12 часов. Анализ методом ТСХ (петролейный эфир:этилацетат, 2:1, Rf=0,25) показал, что реакция завершилась. Добавляли МеОН, раствор концентрировали при пониженном давлении и сушили в вакууме. Остаток выливали в Н₂О (20 мл), экстрагировали EtOAc (50 мл). Органический слой сушили над Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали в вакууме. Неочищенный продукт очищали при помощи препаративной ТСХ (петролейный эфир:этилацетат, 1:1, Rf=0,5) и получали бензил-3-[2-[2-[2-[3-[[3-[2-[2-[2-(3-бензилокси-3-оксопропокси)этокси]этокси]этиламино]-3-оксопропил]дисульфанил]пропаноиламино]этокси]этокси]этокси]пропаноат (6,52 г, 7,94 ммоль, выход 87,81%, чистота 97%) в виде масла желтого цвета; ¹H ЯМР (400 МГц, хлороформ-d) δ: м.д. 7,29-7,42 (м, 10Н), 6,42 (ушир. с, 2Н), 5,15 (с, 4Н), 3,79 (т, J=6,42 Гц, 4Н), 3,53-3,69 (м, 18Н), 2,92-3,00 (м, 4Н), 2,62-2,71 (м, 4Н), 2,53-2,62 (м, 4Н).

1.32. Бензил-3-(2-(2-(2-(5-хлор-3-оксоизотиазол-2(3Н)-ил)этокси)этокси)этокси)пропаноат

К раствору бензил-3-[2-[2-[2-[3-[[3-[2-[2-[2-(3-бензилокси-3-оксопропокси)этокси]этокси]этиламино]-3-оксопропил]дисульфанил]пропаноиламино]этокси]этокси]этокси]пропаноата (6,4 г, 8,03 ммоль, 1 экв.) в ДХМ (50 мл) по каплям прибавляли раствор сульфурилхлорида (4,34 г, 32,12 ммоль, 3,21 мл, 4 экв.) в ДХМ (10 мл) при температуре 0°С. Реакционную массу перемешивали при температуре 0-10°С в течение 12 ч. Анализ методом ТСХ (петролейный эфир:этилацетат, 0:1, R_f=0,15, 0,35) показал, что реакция завершилась. Реакционную массу выливали в смесь воды со льдом (100 мл), экстрагировали ДХМ (200 мл*2). Объединенные органические слои промывали H₂O (100 мл*2), солевым раствором (100 мл), сушили над Na₂SO₄. Фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток очищали при помощи колоночной хроматографии на силикагеле (петролейный эфир:этилацетат, от 1:1 до 0:1) и получали бензил-3-[2-[2-[2-(3-оксоизотиазол-2-ил)этокси]этокси]этокси]пропаноат (820 мг, 1,66 ммоль, выход 10,33%, чистота 80%) в виде масла коричневого цвета; ¹H ЯМР (400 МГц, хлороформ-d) δ: м.д. 8,06 (д, J=6,17 Гц, 1Н), 7,30 - 7,41 (м, 5Н), 6,24 (д, J=6,39 Гц, 1Н), 5,15 (с, 2Н), 3,95 - 4,03 (м, 2Н), 3,79 (т, J=6,39 Гц, 2Н), 3,68 - 3,75 (м, 2Н), 3,59 - 3,68 (м, 8Н), 2,63 - 2,70 (м, 2Н) и бензил-3-[2-[2-[2-(5-хлор-3-оксоизотиазол-2-ил)этокси]этокси]этокси]пропаноат (2,5 г, 4,30 ммоль, выход 26,79%, чистота 74%) в виде бесцветного масла; ¹H ЯМР (400 МГц, хлороформ-d) δ: м.д. 7,28 - 7,43 (м, 5Н), 6,25 (с, 1Н), 5,15 (с, 2Н), 3,92 - 3,98 (м, 2Н), 3,77 - 3,81 (м, 2Н), 3,59 - 3,71 (м, 10 Н), 2,66 (т, J=6,39 Гц, 2Н).

I.33. Бензил-3-(2-(2-(2-(5-хлор-1,1-диоксидо-3-оксоизотиазол-2(3H)-ил)этокси)этокси)этокси)пропаноат

В смесь бензил-3-[2-[2-[2-(5-хлор-3-оксоизотиазол-2-ил)этокси]этокси]этокси]пропаноата (1 г, 2,33 ммоль, 1 экв.) и NaIO₄ (1,99 г, 9,30 ммоль, 515,57 мкл, 4 экв.) в H₂O (20 мл), ДХМ (10 мл), ACN (10 мл) добавляли RuCl₃⋅H₂O (26,22 мг, 116,30 мкмоль, 0,05 экв.) одной порцией при температуре 20°С в атмосфере N₂. После этого реакционную массу перемешивали при температуре 20°С в течение 1 ч. Остаток экстрагировали этилацетатом (20 мл*2). Объединенные органические фракции сушили над безводным Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток очищали при помощи колоночной хроматографии (SiO₂, петролейный эфир:этилацетат, от 5:1 до 1:1) и получали бензил-3-[2-[2-[2-(5-хлор-1,1,3-триоксоизотиазол-2-ил)этокси]этокси]этокси]пропаноат (560 мг, 1,21 ммоль, выход 52,12%, чистота 100%) в виде масла пурпурного цвета; ¹H ЯМР (400 МГц, хлороформ-d) δ: 7,42 - 7,29 (м, 5Н), 6,70 (с, 1Н), 5,15 (с, 2Н), 3,92 - 3,86 (м, 2Н), 3,77 (тд, J=6,0, 11,9 Гц, 4Н), 3,68 - 3,58 (м, 8Н), 2,67 (т, J=6,5 Гц, 2Н).

Пример 12

3-(2-(2-(2-(5-Хлор-1,1-диоксидо-3-оксоизотиазол-2(3H)-ил)этокси)этокси)этокси)пропионовая кислота

К раствору бензил-3-[2-[2-[2-(5-хлор-1,1,3-триоксоизотиазол-2-ил)этокси]этокси]этокси]пропаноата (560 мг, 1,21 ммоль, 1 экв.) в ДХМ (30 мл) по каплям прибавляли метансульфоновую кислоту (1,17 г, 12,12 ммоль, 863,06 мкл, 10 экв.) при температуре 10°С. Смесь нагревали до температуры 35°С и перемешивали в течение 10 ч. Раствор приобретал желтую окраску. Остаток промывали водой (30 мл*3), органическую фракцию сушили над безводным Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток очищали при помощи препаративной ТСХ (этилацетат:метанол:уксусная кислота, 40:8:1, Rf=0,77) и получали 3-[2-[2-[2-(5-хлор-1,1,3-триоксоизотиазол-2-ил)этокси]этокси]этокси]пропионовую кислоту (95,61 мг, 240,16 мкмоль, выход 19,81%, чистота 93,389%) в виде бесцветного масла; ЖХ-МС (ES, m/z): 372,1 [М+Н]⁺; ¹H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ: 12,13 (ушир. с 1Н), 7,64 (с, 1Н), 3,86-3,74 (м, 2Н), 3,61 (тд, J=6,0, 16,9 Гц, 4Н), 3,54 - 3,46 (м, 8Н), 2,43 (т, J=6,4 Гц, 2Н).

I.34. Бензил-3-(2-(2-(2-(4,5-дихлор-3-оксоизотиазол-2(3H)-ил)этокси)этокси)этокси)пропаноат

К раствору бензил-3-[2-[2-[2-(5-хлор-3-оксоизотиазол-2-ил)этокси]этокси]этокси]пропаноата (1,6 г, 3,72 ммоль, 1 экв.) в ДХМ (30 мл) по каплям прибавляли сульфурилхлорид (1,00 г, 7,44 ммоль, 744,17 мкл, 2 экв.) при температуре 0°С. Реакционную массу перемешивали при температуре 0-10°С в течение 12 ч. После добавления сульфурилхлорида образовывался прозрачный раствор. Анализ методом ТСХ (этилацетат:петролейный эфир, 2:1, Rf=0,5) показал, что реакция завершилась. Смесь концентрировали в вакууме и получали неочищенный продукт. Остаток выливали в H₂O (50 мл), экстрагировали ДХМ (50 мл*2). Объединенные органические слои промывали H₂O (50 мл), сушили над Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток очищали при помощи колоночной хроматографии на силикагеле (этилацетат:петролейный эфир, от 1:2 до 2:1) и получали бензил-3-[2-[2-[2-(4,5-дихлор-3-оксоизотиазол-2-ил)этокси]этокси]этокси]пропаноат (1,06 г, 1,76 ммоль, выход 47,17%, чистота 76,9%) в виде бесцветного масла; ¹H ЯМР (400 МГц, хлороформ-d) δ: м.д. 7,28 - 7,40 (м, 4Н), 5,13 (с, 2Н), 3,98 - 4,04 (м, 2Н), 3,77 (т, J=6,39 Гц, 2Н), 3,67 - 3,72 (м, 2Н), 3,57 - 3,67 (м, 8Н), 2,65 (т, J=6,39 Гц, 2Н).

I.35. Бензил-3-(2-(2-(2-(4,5-дихлор-1,1-диоксидо-3-оксоизотиазол-2(3H)-ил)этокси)этокси) этокси)пропаноат

В смесь бензил-3-[2-[2-[2-(4,5-дихлор-3-оксоизотиазол-2-ил)этокси]этокси]этокси]пропаноата (1 г, 2,15 ммоль, 1 экв.) и NaIO₄ (1,84 г, 8,61 ммоль, 477,32 мкл, 4 экв.) в N₂O (20 мл), CH₃CN (10 мл) и ДХМ (10 мл) добавляли RuCl₃.H₂O (7,28 мг, 32,30 мкмоль, 0,015 экв.) в атмосфере N₂ при температуре 0°С. Реакционную массу перемешивали при температуре 0-10°С в течение 2 ч. Анализ методом ТСХ показал, что реакция завершилась. Смесь разбавляли EtOAc (50 мл), фильтровали для удаления нерастворимых твердых веществ. Органический слой отделяли и концентрировали в вакууме. Остаток очищали при помощи препаративной ТСХ (петролейный эфир:этилацетат, 1:1, Rf=0,6) и получали бензил-3-[2-[2-[2-(4,5-дихлор-1,1,3-триоксоизотиазол-2-ил)этокси]этокси]этокси]пропаноат (830 мг, 1,61 ммоль, выход 74,96%, чистота 96,533%) в виде бесцветного масла; ¹H ЯМР (400 МГц, хлороформ-d) δ: м.д. 7,28 - 7,41 (м, 5Н), 5,15 (с, 2Н), 3,91 - 3,97 (м, 2Н), 3,75 - 3,83 (м, 4Н), 3,59 - 3,68 (м, 8Н), 2,66 (т, J=6,50 Гц, 2Н).

Пример 13

3-(2-(2-(2-(4,5-Дихлор-1,1-диоксидо-3-оксоизотиазол-2(3H)-ил)этокси)этокси)этокси)пропионовая кислота

К раствору бензил-3-[2-[2-[2-(4,5-дихлор-1,1,3-триоксоизотиазол-2-ил)этокси]этокси]этокси]пропаноата (820,00 мг, 1,65 ммоль, 1 экв.) в ДХМ (10 мл) по каплям прибавляли метансульфоновую кислоту (1,59 г, 16,52 ммоль, 1,18 мл, 10 экв.) при температуре 10°С. После этого раствор нагревали до температуры 35°С и перемешивали в течение 10 ч. Остаток разбавляли ДХМ (20 мл), полученный раствор промывали водой (15 мл*3), органическую фракцию сушили над безводным Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток очищали при помощи препаративной ТСХ (этилацетат:уксусная кислота, 250:1, Rf=0,55) и получали 3-[2-[2-[2-(4,5-дихлор-1,1,3-триоксоизотиазол-2-ил)этокси]этокси]этокси]пропионовую кислоту (249,4 мг, 602,76 мкмоль, выход 36,49%, чистота 98,180%) в виде масла желтого цвета; ЖХ-МС (ES, m/z): 406,0 [М+Н]⁺; ¹H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ: 12,16 (ушир. с 1Н), 3,85 (т, J=5,5 Гц, 2Н), 3,65 (ушир. т, J=5,4 Гц, 2Н), 3,61 - 3,45 (м, 10Н), 2,43 (т, J=6,3 Гц, 2Н).

I.36. Бензил-1-амино-3,6,9,12,15,18-гексаоксагеникозан-21-оат-4-метилбензолсульфонат

Смесь фенилметанола (2,45 г, 22,64 ммоль, 2,35 мл, 8 экв.), 3-[2-[2-[2-[2-[2-(2-аминоэтокси)этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]пропионовой кислоты (1 г, 2,83 ммоль, 1 экв.) и TsOH⋅H₂O (565,16 мг, 2,97 ммоль, 1,05 экв.) в толуоле (30 мл) перемешивали при температуре 140°С с насадкой Дина-Старка в течение 14 ч. Через несколько часов мутная смесь становилась прозрачной. Остаток концентрировали в вакууме для удаления толуола, в остаток вливали ТВМЕ (50 мл) и перемешивали в течение 1 мин. После этого удаляли надосадочную жидкость и сушили с получением бензил-3-[2-[2-[2-[2-[2-(2-аминоэтокси)этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]пропаноат-4-метилбензолсульфокислоты (1,45 г, неочищенный продукт) в виде масла желтого цвета; ¹H ЯМР (400 МГц, хлороформ-d) δ: 7,80 (д, J=8,1 Гц, 2Н), 7,67 - 7,46 (м, 2Н), 7,39 - 7,31 (м, 5Н), 7,15 (д, J=7,8 Гц, 2Н), 5,13 (с, 2Н), 3,96 - 3,83 (м, 2Н), 3,75 -3,50 (м, 22Н), 3,24 - 3,14 (м, 2Н), 2,63 (т, J=6,2 Гц, 2Н), 2,34 (с, 3H).

I.37. Дибензил-23,30-диоксо-4,7,10,13,16,19,34,37,40,43,46,49-додекаокса-26,27-дитиа-22,31-диазадопентаконтандиоат

К смеси 3-(2-карбоксиэтилдисульфанил)пропионовой кислоты (47,41 мг, 225,47 мкмоль, 1 экв.) и ТЭА (91,26 мг, 901,86 мкмоль, 125,53 мкл, 4 экв.), HOBt (91,40 мг, 676,40 мкмоль, 3 экв.), EDCl (129,67 мг, 676,40 мкмоль, 3 экв.) в ДХМ (5 мл) по каплям прибавляли бензил-3-[2-[2-[2-[2-[2-(2-аминоэтокси)этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]пропаноат-4-метилбензолсульфоновую кислоту (277,65 мг, 450,93 мкмоль, 2 экв.) при температуре 25°С. После этого реакционную массу перемешивали при температуре 25°С в течение 8 часов. Анализ методом ТСХ (этилацетат:метанол, 3:1, Rf=0,33) показал, что исходный материал израсходовался и появилось новое пятно. Остаток выливали в насыщенный раствор NaCl (10 мл) и перемешивали в течение 2 мин. Затем водную фракцию экстрагировали ДХМ (5 мл*3). Объединенные органические фракции промывали насыщенным раствором NaCl (10 мл*2), сушили над безводным Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток очищали при помощи препаративной ВЭЖХ (колонка: Waters Xbridge 150*25 5u; подвижная фаза: [вода(10 мМ NH₄HCO₃)-ACN]; В%: 32%-62%, 12 мин) и получали бензил-3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(3-бензилокси-3-оксопропокси)этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этиламино]-3-оксопропил]дисульфанил]пропаноиламино]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]пропаноат (70 мг, 65,96 мкмоль, выход 29,25%) в виде бесцветного масла; ¹H ЯМР (400 МГц, хлороформ-d) δ: 7,41 - 7,29 (м, 10Н), 6,50 (ушир. с, 2Н), 5,14 (с, 4Н), 3,78 (т, J=6,5 Гц, 4Н), 3,67 - 3,61 (м, 40Н), 3,59 - 3,55 (м, 4Н), 3,45 (кв., J=5,1 Гц, 4Н), 2,97 (т, J=7,2 Гц, 4Н), 2,66 (т, J=6,5 Гц, 4Н), 2,60 (т, J=7,1 Гц, 4Н).

I.38. Бензил-1-(5-хлор-3-оксоизотиазол-2(3H)-ил)-3,6,9,12,15,18-гексаоксагеникозан-21-оат

К раствору бензил-3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(3-бензилокси-3-оксопропокси)этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этиламино]-3-оксопропил]дисульфанил]пропаноиламино]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]пропаноата (5,5 г, 5,18 ммоль, 1 экв.) в ДХМ (60 мл) по каплям прибавляли сульфурилхлорид (3,50 г, 25,91 ммоль, 2,59 мл, 5 экв.) при температуре 0°С. Реакционную массу перемешивали при температуре 0-20°С в течение 12 ч. Анализ методом ТСХ (этилацетат:метанол, 10:1, Rf=0,3, 0,5) показал, что реакция завершилась. Реакционную массу выливали в смесь воды со льдом (10 мл), экстрагировали ДХМ (20 мл*2). Объединенные органические слои промывали H₂O (20 мл*2), солевым раствором (20 мл), сушили над Na₂SO₄. Фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток очищали при помощи колоночной хроматографии на силикагеле (петролейный эфир:этилацетат, 1:1 to 0:1) и получали бензил-3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(3-оксоизотиазол-2-ил)этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]пропаноат (1,4 г, 2,29 ммоль, выход 22,05%, чистота 86,148%) в виде масла коричневого цвета; ¹H ЯМР (400 МГц, хлороформ-d) δ: м.д. 8,02 (д, J=6,17 Гц, 1Н), 7,22 - 7,32 (м, 5Н), 6,17 (ушир. д, J=6,17 Гц, 1Н), 5,07 (с, 2Н) 3,92 (ушир. т, J=4,30 Гц, 2Н), 3,51 - 3,73 (м, 24Н), 2,58 (т, J=6,39 Гц, 2Н) и бензил-3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(5-хлор-3-оксоизотиазол-2-ил)этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]пропаноат (3,1 г, 4,44 ммоль, выход 42,85%, чистота 80,532%) в виде бесцветного масла; ¹H ЯМР (400 МГц, хлороформ-d) δ: м.д. 7,30 - 7,40 (м, 5Н), 6,26 (с, 1Н), 5,15 (с, 2Н), 3,93 - 3,99 (м, 2Н),3,78 (т, J=6,50 Гц, 2Н), 3,60 - 3,72 (м, 23 Н), 2,66 (т, J=6,50 Гц, 2Н).

I.39 Бензил-1-(5-хлор-1,1-диоксидо-3-оксоизотиазол-2(3H)-ил)-3,6,9,12,15,18-гексаоксагеникозан-21-оат

В смесь бензил-3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(5-хлор-3-оксоизотиазол-2-ил)этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]пропаноата (1 г, 1,78 ммоль, 1 экв.) и NaIO₄ (1,52 г, 7,12 ммоль, 394,34 мкл, 4 экв.) в H₂O (20 мл), ДХМ (10 мл), ACN (10 мл) добавляли RuCl₃⋅H₂O (20,05 мг, 88,96 мкмоль, 0,05 экв.) одной порцией при температуре 20°С в атмосфере N₂. После этого реакционную массу перемешивали при температуре 20°С в течение 1 ч. Остаток экстрагировали этилацетатом (20 мл*2). Объединенные органические фракции сушили над безводным Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток очищали при помощи колоночной хроматографии (SiO₂, петролейный эфир:этилацетат, 1:1 до этилацетат:метанол, 10:1) и получали бензил-3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(5-хлор-1,1,3-триоксоизотиазол-2-ил)этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]пропаноат (520 мг, 849,06 мкмоль, выход 47,72%, чистота 97%) в виде масла желтого цвета; ¹H ЯМР (400 МГц, хлороформ-d) δ: 7,44 - 7,29 (м, 5Н), 6,72 (с, 1Н), 5,14 (с, 2Н), 3,92 - 3,86 (м, 2Н), 3,80 - 3,73 (м, 4Н), 3,69 - 3,59 (м, 20Н), 2,66 (т, J=6,4 Гц, 2Н).

Пример 14

1-(5-Хлор-1,1-диоксидо-3-оксоизотиазол-2(3H)-ил)-3,6,9,12,15,18-гексаоксагеникозан-21-овая кислота

К раствору бензил-3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(5-хлор-1,1,3-триоксоизотиазол-2-ил)этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]пропаноата (520 мг, 875,32 мкмоль, 1 экв.) в ДХМ (30 мл) по каплям прибавляли метансульфоновую кислоту (841,23 мг, 8,75 ммоль, 623,13 мкл, 10 экв.) при температуре 10°С. Раствор нагревали до температуры 35°С и перемешивали в течение 10 ч. Остаток промывали водой (30 мл*3), органическую фракцию сушили над безводным Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток очищали при помощи препаративной ТСХ (этилацетат:метанол:уксусная кислота, 40:8:1, Rf равно 0,58). Остаток повторно очищали при помощи препаративной ВЭЖХ (колонка: наномикро Кромасил С18 100*30 мМ 5 мкм; подвижная фаза: [вода(0,05%HCl)-ACN]; В%: 1%-30%,10 мин) и получали 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(5-хлор-1,1,3-триоксоизотиазол-2-ил)этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]пропионовую кислоту (55,93 мг, 106,24 мкмоль, выход 12,14%, чистота 95,726%) в виде бесцветного масла; ЖХ-МС (ES, m/z): 504,2 [М+Н]⁺; ¹H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ: 12,30 - 11,96 (м, 1Н), 7,64 (с, 1 Н), 3,83 - 3,76 (м, 2Н), 3,65 - 3,58 (м, 4Н), 3,54 - 3,52 (м, 2Н), 3,52 - 3,48 (м, 18Н), 2,44-2,42 (м, 2Н).

I.40 Бензил-3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(4,5-дихлор-3-оксоизотиазол-2-ил)этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]пропаноат

К раствору бензил-3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(5-хлор-3-оксоизотиазол-2-ил)этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]пропаноата (1,3 г, 2,31 ммоль, 1 экв.) в ДХМ (30 мл) по каплям прибавляли сульфурилхлорид (624,34 мг, 4,63 ммоль, 462,47 мкл, 2 экв.) при температуре 20°С. Раствор перемешивали при температуре 20°С в течение 2 ч. Раствор приобретал желтую окраску. Остаток выливали в смесь воды со льдом (30 мл) и перемешивали в течение 30 мин. Фракцию ДХМ промывали водой (50 мл*6), сушили над безводным Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток очищали при помощи препаративной ТСХ (этилацетат:метанол, 10:1, Rf равно 0,50) и получали бензил-3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(4,5-дихлор-3-оксоизотиазол-2-ил)этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]пропаноат (800 мг, 1,21 ммоль, выход 52,19%, чистота 90%) в виде масла желтого цвета; ¹H ЯМР (400 МГц, хлороформ-d) δ: 7,40 - 7,29 (м, 5Н), 5,15 (с, 2Н), 4,04 (т, J=4,7 Гц, 2Н), 3,78 (т, J=6,4 Гц, 2Н), 3,72 (т, J=4,7 Гц, 2Н), 3,69 - 3,63 (м, 16Н), 3,62 (с, 4Н), 2,66 (т, J=6,5 Гц, 2Н).

I.41 Бензил-1-(4,5-дихлор-1,1-диоксидо-3-оксоизотиазол-2(3H)-ил)-3,6,9,12,15,18-гексаоксагеникозан-21-оат

В смесь бензил-3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(4,5-дихлор-3-оксоизотиазол-2-ил)этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]пропаноата (600 мг, 1,01 ммоль, 1 экв.) и NaIO₄ (860,56 мг, 4,02 ммоль, 222,94 мкл, 4 экв.) в H₂O (20 мл), ДХМ (10 мл), ACN (10 мл) добавляли RuCl₃⋅H₂O (11,34 мг, 50,29 мкмоль, 0,05 экв.) одной порцией при температуре 0°С в атмосфере N₂. Реакционную массу перемешивали при температуре 0°С в течение 2 мин, затем нагревали до температуры 25°С и перемешивали в течение 1 ч. Остаток выливали в этилацетат (30 мл) и фильтровали. Фильтрат экстрагировали этилацетатом (30 мл*3). Объединенные органические фракции концентрировали в вакууме. Остаток очищали при помощи препаративной ТСХ (этилацетат, Rf=0,50) и получали бензил-3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(4,5-дихлор-1,1,3-триоксоизотиазол-2-ил)этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]пропаноат (220 мг, 350,03 мкмоль, выход 34,80%, чистота 100%) в виде бесцветного масла; ¹H ЯМР (400 МГц, хлороформ-d) δ: 7,40 - 7,27 (м, 4Н), 5,15 (с, 2Н), 3,99 - 3,90 (м, 2Н), 3,78 (т, J=6,2 Гц, 4Н), 3,70 - 3,58 (м, 20Н), 2,66 (т, J=6,4 Гц, 2Н).

Пример 15

1-(4,5-Дихлор-1,1-диоксидо-3-оксоизотиазол-2(3H)-ил)-3,6,9,12,15,18-гексаоксагеникозан-21-овая кислота

К раствору бензил-3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(4,5-дихлор-1,1,3-триоксоизотиазол-2-ил)этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]пропаноата (220 мг, 350,03 мкмоль, 1 экв.) в ДХМ (5 мл) по каплям прибавляли метансульфоновую кислоту (504,60 мг, 5,25 ммоль, 373,78 мкл, 15 экв.) при температуре 10°С. Затем раствор нагревали до температуры 40°С и перемешивали в течение 20 ч. Остаток разбавляли ДХМ (20 мл), раствор промывали водой (15 мл*3), органическую фракцию сушили над безводным Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток очищали при помощи препаративной ВЭЖХ (колонка: наномикро Кромасил С18 100*30 мМ 5 мкм; подвижная фаза: [вода(0,05%HCl)-ACN], В%: 25%-55%,10 мин) и получали 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(4,5-дихлор-1,1,3-триоксоизотиазол-2-ил)этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]пропионовую кислоту (53,79 мг, 98,63 мкмоль, выход 28,18%, чистота 98,724%) в виде масла желтого цвета; ЖХ-МС (ES, m/z): 538,2 [М+Н]⁺; 1Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ: 12,13 (ушир. с 1Н), 3,89 - 3,81 (м, 2Н), 3,65 (т, J=5,5 Гц, 2Н), 3,59 (т, J=6,4 Гц, 2Н), 3,56 - 3,48 (м, 20Н), 2,43 (т, J=6,4 Гц, 2Н).

Пример 16

В колбу в атмосфере аргона помещали 6-(5-хлор-1,1-диоксидо-3-оксоизотиазол-2(3H)-ил)капроновую кислоту (12,58 мг, 0,045 ммоль), ДХМ (2 мл) и ДМФА (10 мкл). Смесь охлаждали до температуры 0°С, затем по каплям прибавляли оксалилдихлорид (11,65 мкл, 0,136 ммоль). Смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали до полного превращения, контролируя методом ЖХ-МС (наблюдая с помощью ЖХ-МС путем добавления к аликвотному количеству сухого МеОН с образованием сложного метилового эфира). Неочищенный продукт упаривали в вакууме. Остаток обрабатывали ДХМ и повторно сушили в вакууме с получением твердого вещества желтого цвета. Неочищенный материал использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.

2. Синтез конъюгатов лекарственное средство-линкер

Пример А

((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-(6-(5-Хлор-1,1-диоксидо-3-оксоизотиазол-2(3H)-ил)-N-метилгексанамидо)фенетил)(метиламино)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропаноил)-L-фенилаланин

Стандартная методика синтеза конъюгатов лекарственное средство-линкер:

В колбу в атмосфере азота при комнатной температуре помещали 6-(5-хлор-1,1-диоксидо-3-оксоизотиазол-2(3H)-ил)капроновую кислоту (205 мг, 0,73 ммоль) (Пример 1), дихлорметан (10 мл) и ДМФА (100 мкл). Смесь охлаждали до температуры 0°С с помощью ледяной бани, затем добавляли оксалилхлорид (190,4 мкл, 2,18 ммоль). Смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 2 ч. Реакционную смесь упаривали в вакууме. Остаток обрабатывали CH₂Cl₂, повторно сушили в вакууме и получали 6-(5-хлор-1,1-диоксидо-3-оксоизотиазол-2(3H)-ил)гексаноилхлорид в виде твердого вещества желтого цвета. Во флакон в атмосфере N₂ при комнатной температуре помещали (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метил-(4-(метиламино)фенетил)амино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропионовую кислоту, смесь (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метил-(4-(метиламино)фенетил)амино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропионовой кислоты с 2,2,2-трифторуксусной кислотой (1:1) (111 мг, 0,102 ммоль) и дихлорметан (3,7 мл). Смесь охлаждали до температуры 0°С и добавляли DIPEA (70,9 мкл, 0,406 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 10 мин при температуре 0°С, затем по каплям прибавляли 6-(5-хлор-1,1-диоксидо-3-оксоизотиазол-2(3H)-ил)гексаноилхлорид (36,6 мг, 0,122 ммоль) в виде раствора в ДХМ (248 мг хлорангидрида в 2 мл ДХМ). Реакционную массу перемешивали при температуре 0°С в течение 1 ч 15 мин. Реакцию останавливали добавлением в смесь трифторуксусной кислоты (32,9 мкл, 0,426 ммоль), ацетонитрила (2,1 мл) и воды (0,3 мл) при температуре 0°С. Неочищенный материал концентрировали в вакууме, остаток очищали при помощи препаративной ВЭЖХ (колонка X-Bridge C18 (100*30) с использованием градиента ACN и воды с 0,1% TFA в качестве подвижной фазы) и получали ((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-(6-(5-хлор-1,1-диоксидо-3-оксоизотиазол-2(3H)-ил)-N-метилгексанамидо)фенетил)(метиламино)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропаноил)-L-фенилаланин. Масс-спектр и спектр ¹H ЯМР данного конъюгата лекарственное средство-линкер представлены соответственно на Фиг. 1А и 1В.

Пример В

((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-(6-(4,5-Дихлор-1,1-диоксидо-3-оксоизотиазол-2(3H)-ил)-N-метилгексанамидо)фенетил)(метиламино)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропаноил)-L-фенилаланин

Данное соединение получали по стандартной методике синтеза конъюгатов лекарственное средство-линкер, используя в качестве исходных материалов 6-(4,5-дихлор-1,1-диоксидо-3-оксоизотиазол-2(3H)-ил)капроновую кислоту (Пример 2) и смесь ((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метил-(4-(метиламино)фенетил)амино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропаноил)-L-фенилаланина с 2,2,2-трифторуксусной кислотой (1:1).

Масс-спектр данного конъюгата лекарственное средство-линкер представлен на Фиг. 2.

Пример С

((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((((4-((S)-2-((S)-2-(6-(5-Хлор-1,1-диоксидо-3-оксоизотиазол-2(3H)-ил)гексанамидо)-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил)окси)карбонил)(метиламино)фенетил)(метиламино)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропаноил)-1-фенилаланин

Данное соединение получали по стандартной методике синтеза лекарственное средство-линкер, используя в качестве исходных материалов 6-(5-хлор-1,1-диоксидо-3-оксоизотиазол-2(3H)-ил)капроновую кислоту (Пример 1) и ((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((((4-((S)-2-((S)-2-амино-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил)окси)карбонил)(метиламино)фенетил)(метиламино)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропаноил)-L-фенилаланин.

Масс-спектр и спектр ¹H ЯМР данного конъюгата лекарственное средство-линкер представлены соответственно на Фиг. 3А и 3В.

Пример D

((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((((4-((S)-2-((S)-2-(6-(4,5-Дихлор-1,1-диоксидо-3-оксоизотиазол-2(3H)-ил)гексанамидо)-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил)окси)карбонил)(метиламино)фенетил)(метиламино)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропаноил)-1-фенилаланин

Данное соединение получали по стандартной методике синтеза лекарственное средство-линкер, используя в качестве исходных материалов 6-(4,5-дихлор-1,1-диоксидо-3-оксоизотиазол-2(3H)-ил)капроновую кислоту (Пример 2) и ((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((((4-((S)-2-((S)-2-амино-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил)окси)карбонил)(метиламино)фенетил)(метиламино)-

3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропаноил)-L-фенилаланин.

Масс-спектр и спектр ¹H ЯМР данного конъюгата лекарственное средство-линкер представлены соответственно на Фиг. 4А и 4В.

Пример Е

Соль ((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((((4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2-(2-(5-хлор-1,1-диоксидо-3-оксоизотиазол-2(3H)-ил)этокси)этокси)этокси)пропанамидо)-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил)окси)карбонил)(метиламино)фенетил)(метиламино)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропаноил)-L-фенилаланина и 2,2,2-трифторуксусной кислоты

Синтезировали по стандартной методике синтеза конъюгатов лекарственное средство-линкер, используя в качестве исходных материалов 3-(2-(2-(2-(5-хлор-1,1-диоксидо-3-оксоизотиазол-2(3H)-ил)этокси)этокси)этокси)пропионовую кислоту (Пример 12) и (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((((4-((S)-2-((S)-2-амино-3-метилбутанамидо)-5 уреидопентанамидо)бензил)окси)карбонил)(метиламино)фенетил)(метиламино)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропионовую кислоту.

Масс-спектр и спектр ¹H ЯМР данного конъюгата лекарственное средство-линкер представлены соответственно на Фиг. 5А и 5В.

Пример F

((2R,3R)-3-(1-((3R,4R,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2-(2-(5-Хлор-1,1-диоксидо-3-оксоизотиазол-2(3H)-ил)этокси)этокси)этокси)пропанамидо)-3-метилбутанамидо)-N-метилпропанамидо)фенетил)(метиламино)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропаноил)-D-фенилаланин

Синтезировали по стандартной методике синтеза конъюгатов лекарственное средство-линкер, используя в качестве исходных материалов 3-(2-(2-(2-(5-хлор-1,1-диоксидо-3-оксоизотиазол-2(3H)-ил)этокси)этокси)этокси)пропионовую кислоту (Пример 12) и ((2R,3R)-3-(1-((3R,4R,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((S)-2-((S)-2-амино-3-метилбутанамидо)-N-метилпропанамидо)фенетил)(метиламино)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропаноил)-D-фенилаланин.

Масс-спектр и спектр ¹H ЯМР данного конъюгата лекарственное средство-линкер представлены соответственно на Фиг. 6А и 6В.

Пример G

((2R,3R)-3-(1-((3R,4R,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((S)-2-((S)-2-(6-(5-Хлор-1,1-диоксидо-3-оксоизотиазол-2(3H)-ил)гексанамидо)-3-метилбутанамидо)-N-метилпропанамидо)фенетил)(метиламино)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропаноил)-D-фенилаланин

Синтезировали по стандартной методике синтеза конъюгатов лекарственное средство-линкер, используя в качестве исходных материалов 6-(5-хлор-1,1-диоксидо-3-оксоизотиазол-2(3H)-ил)капроновую кислоту (Пример 1) и ((2R,3R)-3-(1-((3R,4R,53)-4-((3)-2-((3)-2-((4-((3)-2-((3)-2-амино-3-метилбутанамидо)-N-метилпропанамидо)фенетил)(метиламино)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропаноил)-D-фенилаланин.

Масс-спектр и спектр ¹H ЯМР данного конъюгата лекарственное средство-линкер представлены соответственно на Фиг. 7А и 7В.

Пример Н

4-((S)-2-((S)-2-(6-(5-Хлор-1,1-диоксидо-3-оксоизотиазол-2(3H)-ил)гексанамидо)-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил-(2-((2S,4S)-2,5,12-тригидрокси-7-метокси-4-(((1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-метокси-1-метилокгагидро-1Н-пирано[4',3':4,5]оксазоло[2,3-с][1,4]оксазин-3-ил)окси)-6,11-диоксо-1,2,3,4,6,11-гексагидротетрацен-2-карбоксамидо)этил)карбамат

Синтез Примера Н проводили в соответствии со следующей схемой:

I.42. (2S,4S)-2,5,12-Тригидрокси-7-метокси-4-(((1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-метокси-1-метилоктагидро-1Н-пирано[4',3':4,5]оксазоло[2,3-с][1,4]оксазин-3-ил)окси)-6,11-диоксо-1,2,3,4,6,11-гексагидротетрацен-2-карбоновая кислота

В колбу помещали PNU-159682 (52 мг, 0,081 ммоль) в смеси метанола (15 мл) с водой (10 мл). Добавляли раствор NaIO₄ (34,7 мг, 0,162 ммоль) в воде (5 мл). Реакционную массу перемешивали при комнатной температуре до полного превращения, контролируя методом ЖХ-МС. Растворители удаляли в вакууме и получали I.42 в виде твердого вещества красного цвета, которое использовали непосредственно на следующей стадии.

I.43 (9Н-Флуорен-9-ил)метил-((S)-1-(((S)-1-((4-((((2-аминоэтил)карбамоил)окси)метил)фенил)амино)-1-оксо-5-уреидопентан-2-ил)амино)-3-метил-1-оксобутан-2-ил)карбамат

В колбу в атмосфере аргона помещали (9Н-флуорен-9-ил)метил-((S)-1-(((S)-1-((4-(гидроксиметил)фенил)амино)-1-оксо-5-уреидопентан-2-ил)амино)-3-метил-1-оксобутан-2-ил)карбамат (1 г, 1,662 ммоль) и бис(4-нитрофенил)карбонат (1,011 г, 3,32 ммоль) в ДМФА (0,443 моль/л). Затем смесь охлаждали до температуры 0°С и по каплям прибавляли DIPEA (639 мкл, 3,66 ммоль). Реакционную смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 18 ч. Неочищенную смесь концентрировали в вакууме. Неочищенный продукт обрабатывали смесью Et₂O/EtOAc, 1:1 и фильтровали. Осадок промывали Et₂O, 5% раствором лимонной кислоты, H₂O, снова Et₂O и получали твердое вещество желтого цвета. Полученное твердое вещество очищали при помощи автоматической колоночной хроматографии на силикагеле (от 100 ДХМ:0 МеОН до 80 ДХМ:20 МеОН) и получали 345 мг (9Н-флуорен-9-ил)метил-((S)-3-метил-1-(((S)-1-((4-((((4-нитрофенокси)карбонил)окси)метил)фенил)амино)-1-оксо-5-уреидопентан-2-ил)амино)-1-оксобутан-2-ил)карбамата (твердое вещество белого цвета), выход 27,1%.

В раствор предыдущего продукта (150 мг, 0,196 ммоль) в ДМФА (6 мл) добавляли HOBt (34,4 мг, 0,254 ммоль) и пиридин (63,3 мкл, 0,782 ммоль) при температуре 0°С. Через 5 мин в смесь добавляли трет-бутил-(2-аминоэтил)карбамат 1-2 (40,7 мг, 0,254 ммоль) в ДМФА (1,5 мл), затем DIPEA (102 мкл, 0,587 ммоль). Смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 2 ч. Неочищенный продукт концентрировали в вакууме и получали твердое вещество белого цвета, которое очищали при помощи автоматической колоночной хроматографии на силикагеле (от 100 ДХМ:0 МеОН до 80 ДХМ:20 МеОН) и получали 129 мг 4-((S)-2-((S)-2-((((9Н-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил-трет-бутилэтан-1,2-диилдикарбамата (твердое вещество белого цвета), выход 84%.

В колбу помещали предыдущий продукт (154 мг, 0,195 ммоль) в ДХМ (6 мл). Смесь охлаждали до температуры 0°С и добавляли TFA (753 мкл, 9,77 ммоль), после чего реакционную массу перемешивали при температуре 0°С до полного превращения, контролируя методом ЖХ-МС. Неочищенную смесь концентрировали в вакууме и получали I.43 в виде твердого вещества белого цвета (количественный выход).

I.44 4-((S)-2-((S)-2-Амино-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил-(2-((2S,4S)-2,5,12-тригидрокси-7-метокси-4-(((1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-метокси-1-метилоктагидро-1Н-пирано[4',3':4,5]оксазоло[2,3-с][1,4]оксазин-3-ил)окси)-6,11-диоксо-1,2,3,4,6,11-гексагидротетрацен-2-карбоксамидо)этил)карбамат

В колбу добавляли I.42 (50,9 мг, 0,081 ммоль), I.43 (78,0 мг, 0,097 ммоль) и ДМФА (8 мл), затем HATU (30,8 мг, 0,081 ммоль) и DIPEA (56,7 мкл, 0,324 ммоль). Реакционную массу перемешивали при комнатной температуре в течение 18 ч. После этого в смесь добавляли пиперидин (80 мкл, 0,811 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 1 ч (до полного превращения, контролируя методом ЖХ-МС). Смесь концентрировали в вакууме. Полученный неочищенный продукт сразу же очищали при помощи автоматической колоночной хроматографии на силикагеле (от 100 ДХМ:0 МеОН/NH₃ водн. до 85 ДХМ:25 МеОН/NH₃ водн.) и получали 20 мг I.44 (масло красного цвета), выход 23%.

Пример Н

В колбу в атмосфере N₂ помещали 6-(5-хлор-1,1-диоксидо-3-оксоизотиазол-2(3H)-ил)капроновую кислоту (Пример 1) (7,86 мг, 0,028 ммоль) в ДХМ (1 мл) и ДМФА (10 мкл).

Смесь охлаждали до температуры 0°С, затем по каплям прибавляли оксалилхлорид (7,28 мкл, 0,085 ммоль). Смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали до полного превращения, контролируя методом ЖХ-МС (наблюдая с помощью ЖХ-МС путем добавления к аликвотному количеству сухого МеОН с образованием сложного метилового эфира). Неочищенную смесь упаривали в вакууме. Остаток обрабатывали ДХМ и повторно сушили в вакууме с получением 6-(5-хлор-1,1-диоксидо-3-оксоизотиазол-2(3H)-ил)гексаноилхлорида в виде твердого вещества желтого цвета (выход количественный). Неочищенный материал использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.

В колбу в атмосфере N₂ помещали при комнатной температуре I.44 (20 мг, 0,019 ммоль) в ДХМ (2 мл). Смесь охлаждали до температуры 0°С и добавляли DIPEA (12,96 мкл, 0,074 ммоль). Реакционную массу перемешивали при температуре 0°С в течение 10 мин, затем добавляли продукт с предыдущей стадии (8,40 мг, 0,028 ммоль), растворенный в ДХМ (1 мл). После этого смесь перемешивали при температуре 0°С в течение 2 ч (до полного превращения, контролируя методом ЖХ-МС). Неочищенную смесь концентрировали в вакууме и очищали при помощи автоматической колоночной хроматографии на силикагеле (от 100 ДХМ:0 МеОН до 85 ДХМ:15 МеОН) и получали 6,85 мг Примера Н (также называемого соединением F562524) в виде твердого вещества красного цвета, выход 27%.

Спектр ¹H ЯМР данного конъюгата лекарственное средство-линкер представлен на Фиг. 8.

Пример I

4-((S)-2-((S)-2-(6-(5-Хлор-1,1-диоксидо-3-оксоизотиазол-2(3H)-ил)гексанамидо)-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил-(2-оксо-2-((2S,4S)-2,5,12-тригидрокси-7-метокси-4-(((1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-метокси-1-метилоктагидро-1Н-пирано[4',3':4,5]оксазоло[2,3-с][1,4]оксазин-3-ил)окси)-6,11-диоксо-1,2,3,4,6,11-гексагидротетрацен-2-ил)этил)этан-1,2-диил-бис(метилкарбамат)

Пример I синтезировали в соответствии со следующей схемой:

I.45 2-Оксо-2-((2S,4S)-2,5,12-тригидрокси-7-метокси-4-(((13,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-метокси-1-метилоктагидро-1Н-пирано[4',3':4,5]оксазоло[2,3-с][1,4]оксазин-3-ил)окси)-6,11-диоксо-1,2,3,4,6,11-гексагидротетрацен-2-ил)этил (перфторфенил)карбонат

В колбу в атмосфере аргона помещали PNU-159682 (12 мг, 0,0180 ммоль) и ДМФА (1,5 мл). Смесь охлаждали до температуры 0°С и добавляли бис(перфторфенил)карбонат (36,9 мг, 0,094 ммоль). После этого в течение 5 мин медленно прибавляли раствор DIPEA (9,80 мкп, 0,056 ммоль) в ДМФА (0,5 мл). И, наконец, смесь перемешивали в течение 3 ч при температуре 0°С (превращение контролировали методом ЖХ-МС). Неочищенную смесь концентрировали в вакууме и очищали при помощи автоматической колоночной хроматографии на силикагеле (от 100 ДХМ:0 [80 ДХМ:20 МеОН] до 50 ДХМ:50 [80 ДХМ:2 0МеОН]) и получали 5,52 мг I.45 в виде масла красного цвета, выход 36%.

I.46 (9Н-Флуорен-9-ил)метил-((S)-3-метил-1-(((S)-1-((4-((((4-нитрофенокси)карбонил)оху)метил)фенил)амино)-1-оксо-5-уреидопентан-2-ил)амино)-1-оксобутан-2-ил)карбамат 2,2,2-трифторацетат

В колбу в атмосфере аргона помещали (9Н-флуорен-9-ил)метил-((S)-1-(((S)-1-((4-(гидроксиметил)фенил)амино)-1-оксо-5-уреидопентан-2-ил)амино)-3-метил-1-оксобутан-2-ил)карбамат (1 г, 1,662 ммоль) и бис(4-нитрофенил)карбонат (1,011 г, 3,32 ммоль) в ДМФА (0,443 моль/л). Затем смесь охлаждали до температуры 0°С и по каплям прибавляли DIPEA (639 мкл, 3,66 ммоль). Реакционную смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 18 ч. Неочищенную смесь концентрировали в вакууме, обрабатывали смесью Et₂O/EtOAc (1/1) и фильтровали. Осадок промывали Et₂O, 5% раствором лимонной кислоты, Н₂О, затем снова Et₂O и получали твердое вещество желтого цвета. Это твердое вещество очищали при помощи автоматической колоночной хроматографии на силикагеле (от 100 ДХМ:0 МеОН до 80 ДХМ:20 МеОН) и получали 345 мг твердого вещества белого цвета, 27,1% выход. В раствор полученного соединения (118 мг, 0,154 ммоль) в ДМФА (6 мл) добавляли HOBt (27,0 мг, 0,200 ммоль) и пиридин (49,8 мкл, 0,616 ммоль) при температуре 0°С. Через 5 мин в смесь добавляли трет-бутилметил-(2-(метиламино)этил)карбамат (37,7 мг, 0,200 ммоль) в ДМФА (1,5 мл), затем DIPEA (81,0 мкл, 0,462 ммоль). После этого смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 2 ч (до полного превращения, контролируя методом ЖХ-МС). Неочищенную смесь концентрировали в вакууме с получением масла желтого цвета, которое очищали при помощи автоматической колоночной хроматографии на силикагеле (от 100 ДХМ:0 МеОН до 80 ДХМ:20 МеОН) и получали 103 мг твердого вещества белого цвета, выход 82%.

Полученный продукт помещали в колбу (198 мг, 0,243 ммоль) с ДХМ (12 мл). Смесь охлаждали до температуры 0°С, добавляли TFA (935 мкл, 12,13 ммоль) и реакционную массу перемешивали в течение 4 ч при температуре 0°С (до полного превращения, контролируя методом ЖХ-МС). Неочищенную смесь концентрировали в вакууме и получали 220 мг I.46 в виде твердого вещества чисто желтого цвета (количественный выход).

I.47 4-((S)-2-((S)-2-Амино-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил-(2-оксо-2-((2S,4S)-2,5,12-тригидрокси-7-метокси-4-(((1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-метокси-1-метилоктагидро-1Н-пирано[4',3':4,5]оксазоло[2,3-с][1,4]оксазин-3-ил)окси)-6,11-диоксо-1,2,3,4,6,11-гексагидротетрацен-2-ил)этил)этан-1,2-диил-бис(метилкарбамат)

В раствор продукта I.45 (19 мг, 0,022 ммоль) в ДМФА (1 мл) добавляли при комнатной температуре раствор продукта I.46 (22,2 мг, 0,027 ммоль) и DIPEA (15,59 мкл, 0,089 ммоль) в ДМФА (1 мл). Реакционную массу перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч (до полного превращения, контролируя методом ЖХ-МС). Затем в смесь добавляли пиперидин (22,09 мкл, 0,223 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 1 ч (полноту превращения контролировали методом ЖХ-МС). Неочищенную смесь концентрировали в вакууме и очищали при помощи автоматической колоночной хроматографии на силикагеле (от 100 ДХМ:0 МеОН/NH₃ (9/1) до 75 ДХМ:25 МеОН/NH₃ (9/1)) и получали 10 мг I.47 в виде масла красного цвета, выход 39%.

Пример I

В колбу в атмосфере N₂ добавляли 6-(5-хлор-1,1-диоксидо-3-оксоизотиазол-2(3H)-ил)капроновую кислоту (Пример 1) (7,86 мг, 0,028 ммоль) в ДХМ (1 мл) и ДМФА (10 мкл).

В колбу в атмосфере N₂ при комнатной температуре помещали продукт I.47 (10 мг, 0,0086 ммоль) в ДХМ (2 мл). Смесь охлаждали до температуры 0°С и добавляли DIPEA (6,0 мкл, 0,034 ммоль). Реакционную массу перемешивали при температуре 0°С в течение 10 мин, затем добавляли предыдущий продукт (3,90 мг, 0,013 ммоль), растворенный в ДХМ (1 мл). После этого смесь перемешивали при температуре 0°С в течение 2 ч (до полного превращения, контролируя методом ЖХ-МС). Неочищенный продукт концентрировали в вакууме и очищали при помощи автоматической колоночной хроматографии на силикагеле (от 100 ДХМ:0 МеОН до 85 ДХМ:15 МеОН) и получали 2,45 мг Примера I в виде твердого вещества красного цвета, выход 19%.

Спектр ¹H ЯМР данного конъюгата лекарственное средство-линкер представлен на Фиг. 9.

Пример J

Пример J синтезировали в соответствии со следующей схемой:

Соединение I.50 получали по следующей схеме:

Соединение I.48

В колбу в атмосфере аргона помещали 2-([1,1'-бифенил]-4-ил)пропан-2-ол (1 г, 4,71 ммоль) и пиридин (0,465 мл, 5,75 ммоль) в ДХМ (5 мл). После этого смесь охлаждали до температуры 0°С и по каплям прибавляли фенилхлороформиат (0,662 мл, 5,28 ммоль) в сухом ДХМ (2,4 мл). Реакционную смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 18 ч (контроль методом ЖХ-МС). Неочищенный продукт концентрировали в вакууме. Твердую смесь растворяли в ДХМ и трижды промывали солевым раствором. Органический слой сушили над Na₂SO₄, фильтровали, концентрировали в вакууме и получали требуемое соединение I.48, выход 880 мг, 56%, в виде твердого вещества белого цвета. ЖХ-МС (ESI): 333,40 (МН+).

Соединение I.49:

В колбу, содержащую N,N'-диметил-1,2-этандиамин (2791 мкл, 26,2 ммоль), N-этил-N-изопропилпропан-2-амин (305 мкл, 1,748 ммоль) и ДМФА (4 мл) в атмосфере аргона, добавляли раствор 2-([1,1'-бифенил]-4-ил)пропан-2-илфенилкарбоната (581 мг, 1,748 ммоль) в ДМФА (1,5 мл) при температуре 0°С. Реакционную смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 24 ч (контроль методом ЖХ-МС). Неочищенный продукт концентрировали в вакууме, остаток очищали при помощи автоматической колоночной хроматографии (Interchim, твердое осаждение): ДХМ/МеОН: 9/I. Требуемые фракции концентрировали в вакууме и получали требуемое соединение I.49, выход 433 мг, 76%, в виде масла желтого цвета. ЖХ-МС (ESI): 327,43 (МН+).

Соединение I.50

В колбу, содержащую в атмосфере аргона бис(трихлорметил)карбонат (157 мг, 0,531 ммоль) и толуол (4,3 мл), добавляли при температуре 0°С раствор 2-([1,1'-бифенил]-4-ил)пропан-2-илметил-(2-(метиламино)этил)карбамата (433 мг, 1,326 ммоль) и триэтиламина (368 мкл, 2,65 ммоль) в толуоле (2,9 мл). Реакционную смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 1 ч (контроль методом ЖХ-МС). Раствор фильтровали, растворитель концентрировали в вакууме и остаток очищали при помощи автоматической колоночной хроматографии (Interchim, твердое осаждение): циклогексан/этилацетат: 7/3. Требуемые фракции концентрировали в вакууме и получали требуемое соединение I.50, выход 166 мг, 33%, в виде твердого вещества белого цвета. ЖХ-МС (ESI): 405,60 (МН+).

Соединение I.52 получали по следующей схеме:

Соединение I.51

В колбу, содержащую в атмосфере аргона (8S,10S)-6,8,11-тригидрокси-8-(2-гидроксиацетил)-1-метокси-10-(((1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-метокси-1-метилоктагидро-1Н-пирано[4',3':4,5]оксазоло[2,3-с][1,4]оксазин-3-ил)окси)-7,8,9,10-тетрагидротетрацен-5,12-дион (50 мг, 0,078 ммоль), 4-диметиламинопиридин (47,6 мг, 0,390 ммоль), молекулярные сита 0,4 нм (33 мг) и ДХМ (1 мл), добавляли раствор 2-([1,1'-бифенил]-4-ил)пропан-2-ил-(2-((хлоркарбонил)(метиламино)этил)(метил)карбамата (91 мг, 0,234 ммоль)) в ДХМ (0,5 мл). Полученную смесь перемешивали в темноте при температуре 25°С в течение 5 дней. Раствор фильтровали, растворитель концентрировали в вакууме и остаток использовали без дополнительной очистки на следующей стадии.

Соединение I.52

В раствор продукта I.51 в ДХМ (1 мл) на ледяной бане добавляли раствор дихлоруксусной кислоты (96 мкл, 1,169 ммоль) в 0,5 мл ДХМ. Раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Растворитель концентрировали в вакууме, остаток очищали при помощи автоматической колоночной хроматографии (Interchim, твердое осаждение): ДХМ/МеОН: 9/I. Требуемые фракции концентрировали в вакууме и получали требуемое соединение I.52, выход 13 мг, 22% в виде твердого вещества красного цвета. ЖХ-МС (ESI): 756,76 (МН+).

Соединение I.53

В колбу в атмосфере аргона помещали (9Н-флуорен-9-ил)метил-((S)-1-(((S)-1-((4-(гидроксиметил)фенил)амино)-1-оксопропан-2-ил)амино)-3-метил-1-оксобутан-2-ил)карбамат (250 мг, 0,485 ммоль), бис(перфторфенил)карбонат (382 мг, 0,970 ммоль) и ДМФА (4 мл). Смесь охлаждали до температуры 0°С и по каплям прибавляли N-этил-N-изопропилпропан-2-амин (127 мкл, 0,727 ммоль). Реакционную смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 2 ч (контроль методом ЖХ-МС). Неочищенный продукт концентрировали в вакууме. Неочищенный продукт очищали при помощи автоматической колоночной хроматографии (Interchim, твердое осаждение): ДХМ/МеОН: 9/I. Требуемые фракции концентрировали в вакууме и получали требуемое соединение I.53, выход 281 мг, 80%, в виде масла желтого цвета. ЖХ-МС (ESI): 726,65 (МН+).

Соединение I.54

В колбу в атмосфере аргона помещали 2-оксо-2-((2S,4S)-2,5,12-тригидрокси-7-метокси-4-(((1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-метокси-1-метилоктагидро-1Н-пирано[4',3':4,5]оксазоло[2,3-с][1,4]оксазин-3-ил)окси)-6,11-диоксо-1,2,3,4,6,11-гексагидротетрацен-2-ил)этилметил-(2-(метиламино)этил)карбамат (78 мг, 0,103 ммоль), 1-гидроксибензотриазол (27,9 мг, 0,206 ммоль), N,N'-диизопропилэтиламин (35,1 мкл, 0,206 ммоль) и ДМФА (2 мл). Смесь охлаждали до температуры 0°С и по каплям прибавляли (9Н-флуорен-9-ил)метил-((S)-3-метил-1-оксо-1-(((S)-1-оксо-1-((4-((((перфторфенокси)карбонил)окси)метил)фенил)амино)пропан-2-ил)амино)бутан-2-ил)карбамат (112 мг, 0,155 ммоль). Реакционную смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 2 ч (контроль методом ЖХ-МС). Неочищенный продукт концентрировали в вакууме. Неочищенный продукт очищали при помощи автоматической колоночной хроматографии (Interchim, твердое осаждение): ДХМ/МеОН: 9/I. Требуемые фракции концентрировали в вакууме и получали требуемое соединение I.54, выход 77 мг, 58%, в виде масла красного цвета. ЖХ-МС (ESI): 1298,0 (МН+).

Соединение I.55

В колбу в атмосфере аргона помещали 4-((S)-2-((S)-2-((((9Н-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-метилбутанамидо)пропанамидо)бензил-(2-оксо-2-((28,48)-2,5,12-тригидрокси-7-метокси-4-(((1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-метокси-1-метилоктагидро-1Н-пирано[4',3':4,5]оксазоло[2,3-с][1,4]оксазин-3-ил)окси)-6,11-диоксо-1,2,3,4,6,11-гексагидротетрацен-2-ил)этил)этан-1,2-диил-бис(метилкарбамат) (77,7 мг, 0,060 ммоль) и ДМФА (2 мл). Смесь охлаждали до температуры 0°С и по каплям прибавляли морфолин (259 мкл, 2,99 ммоль). Реакционную смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 2 ч (контроль методом ЖХ-МС). Неочищенный продукт концентрировали в вакууме. Неочищенный продукт очищали при помощи автоматической колоночной хроматографии (Interchim, твердое осаждение): ДХМ/МеОН: 9/I. Требуемые фракции концентрировали в вакууме и получали требуемое соединение I.55, выход 32 мг, 50%, в виде масла красного цвета. ЖХ-МС (ES1): 1075,80 (МН+).

Пример J

В колбу в атмосфере аргона при температуре 25°С помещали 4-((S)-2-((S)-2-амино-3-метилбутанамидо)пропанамидо)бензил(2-оксо-2-((2S,4S)-2,5,12-тригидрокси-7-метокси-4-(((1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-метокси-1-метилоктагидро-1Н-пирано[4',3':4,5]оксазоло[2,3-с][1,4]оксазин-3-ил)окси)-6,11-диоксо-1,2,3,4,6,11-гексагидротетрацен-2-ил)этил)этан-1,2-диил-бис(метилкарбамат) (32 мг, 0,030 ммоль, 1 экв.) в дихлорметане (2 мл). Смесь охлаждали до температуры 0°С и добавляли N-этил-N-изопропилпропан-2-амин (20,74 мкл, 0,119 ммоль). Реакционную массу перемешивали при температуре 0°С в течение 10 мин, затем добавляли продукт Примера 16, разбавленный дихлорметаном (2 мл). После этого смесь перемешивали при температуре 0°С в течение 2 ч (до полного превращения, контролируя методом ЖХ-МС). Неочищенный продукт концентрировали в вакууме и очищали при помощи автоматической колоночной хроматографии (Interchim, 12g, твердое осаждение): ДХМ/МеОН: 9/I. Требуемые фракции концентрировали в вакууме и получали требуемый Пример J (также называемый соединением F562646), выход 17,4 мг, 40%, в виде масла красного цвета. ЖХ-МС (ESI): 1338,41 (МН+).

Масс-спектр данного конъюгата лекарственное средство-линкер представлен на Фиг. 2I.

Пример K

Пример K синтезировали в соответствии со следующей схемой:

Соединение I.56

В колбу в атмосфере аргона помещали исходный материал SM1 (100 мг, 0,135 ммоль) и ДМФА (1 мл). Смесь охлаждали до температуры 0°С, затем по каплям прибавляли раствор 3-бромпропионовой кислоты (22,79 мг, 0,149 ммоль) и 2,3,4,6,7,8,9,10-октагидропиримидо[1,2-а]азепин (40,5 мкл, 0,271 ммоль) в ДМФА (0,5 мл). Смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали до полного превращения, контролируя методом ЖХ-МС. Неочищенный продукт концентрировали в вакууме и очищали при помощи автоматической колоночной хроматографии (Interchim, 12g, твердое осаждение): ДХМ/МеОН: 80/20. Требуемые фракции концентрировали в вакууме и получали требуемое соединение I.56, выход 108 мг, 98%, в виде твердого вещества белого цвета. ЖХ-МС (ESI): 811,35(МН+).

Соединение I.57

В колбу в атмосфере аргона помещали соединение I.56 (87,0 мг, 0,107 ммоль) и ДХМ (2 мл). Смесь охлаждали до температуры 0°С и добавляли N-гидроксисукцинимид (13,59 мг, 0,118 ммоль) и гидрохлорид 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида (30,9 мг, 0,161 ммоль). Реакционную смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 2 ч (контроль ЖХ-МС). Неочищенный продукт концентрировали в вакууме. Неочищенный материал использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.

Соединение I.58

В колбу в атмосфере аргона помещали соединение I.57 (97 мг, 0,107 ммоль) и ДХМ (1 мл), затем по каплям прибавляли раствор соединения I.49 в 1 мл ДХМ и М,М'-диизопропилэтиламин (37,3 мкл, 0,214 ммоль). Реакционную массу перемешивали до полного превращения, контролируя методом ЖХ-МС. Неочищенный продукт концентрировали в вакууме и использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.

Соединение I.59

В колбу в атмосфере аргона помещали соединение I.58 (58 мг, 0,052 ммоль) и ДХМ (1 мл). Смесь охлаждали до температуры 0°С, затем по каплям прибавляли дихлоруксусную кислоту (86 мкл, 1,037 ммоль). Смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали до полного превращения, контролируя методом ЖХ-МС. Неочищенный продукт концентрировали в вакууме и очищали при помощи автоматической колоночной хроматографии (Interchim, 12g, твердое осаждение): ДХМ/МеОН: 80/20. Требуемые фракции концентрировали в вакууме и получали требуемое соединение I.59, выход 39 мг, 86%, в виде твердого вещества белого цвета. ЖХ-МС (ESI): 882,6 (МН+).

Пример K

В колбу в атмосфере аргона при температуре 25°С помещали соединение I.59 в дихлорметане (1 мл). Смесь охлаждали до температуры 0°С и добавляли N-этил-N-изопропилпропан-2-амин (15,83 мкл, 0,091 ммоль). Реакционную массу перемешивали при температуре 0°С в течение 10 мин, затем добавляли продукт Примера 16, разбавленный дихлорметаном (2 мл). После этого смесь перемешивали при температуре 0°С в течение 2 ч (до полного превращения, контролируя методом ЖХ-МС). Неочищенный продукт концентрировали в вакууме, очищали при помощи препаративной ВЭЖХ (среда НСООН) и получали требуемый Пример K, выход 6 мг, 22%, в виде твердого вещества белого цвета. ЖХ-МС (ESI): 1165,37 (M+Na)⁺.

Масс-спектр и спектр TOF-MC данного конъюгата лекарственное средство-линкер представлены, соответственно, на Фиг. 22А и 22В.

3. Конъюгация с соматостатином

VI1. Реакция соматостатина с бензил-6-(5-хлор-1,1-диоксидо-3-оксоизотиазол-2(3H)-ил)гексаноатом

1 мг лиофилизованного соматостатина (m_exact=1636,72) растворяли в 4 мл буфера (57,5% NaH₂PO₄ 20 мМ, рН 6,5, 40% ACN, 2,5% ДМФА) с получением концентрации 153 мкМ (0,25 мг/мл). 33,5 мг ТСЕР растворяли в 4 мл буфера (57,5% NaH₂PO₄ 20 мМ, рН 6,5, 40% ACN, 2,5% ДМФА). К 300 мкл раствора соматостатина (1 экв.) добавляли 3 мкл раствора ТСЕР (1,1 экв.). Полученный раствор перемешивали при температуре 37°С в течение 1 ч. Коммерческий соматостатин: R_t,1 (в ACN): 1,57; МС ES+: M⁺³/3=546,4, M⁺²=819,2. Соматостатин с восстановленной дисульфидной связью: R_t,1 (в ACN): 1,50; МС ES+: M⁺³/3=547,2, M⁺²/2=820,3. 5 мг бензил-6-(5-хлор-1,1-диоксидо-3-оксоизотиазол-2(3H)-ил)гексаноата (I.6) растворяли в 800 мкл ACN. 3 мкл раствора бензил-6-(5-хлор-1,1-диоксидо-3-оксоизотиазол-2(3H)-ил)гексаноата (1,1 экв.) добавляли в раствор соматостатина. Полученный раствор перемешивали при температуре 37°С. R_t,1 (в ACN): 1,66; МС ES+: М⁺³/3=637,6, М⁺²/2=956,0.

Эту же реакцию проводили в буфере, рН 8 (57,5% NaH₂PO₄ 20 мМ, рН 8, 40% ACN, 2,5% ДМФА).

Масс-спектр полученного конъюгата представлен на Фиг. 10.

VI2. Реакция соматостатина с бензил-6-(4,5-дихлор-1,1-диоксидо-3-оксоизотиазол-2(3Н)-ил)гексаноатом

1 мг лиофилизованного соматостатина (m_exact=1636,72) растворяли в 4 мл буфера (57,5% NaH₂PO₄ 20 мМ, рН 6,5, 40% ACN, 2,5% ДМФА) с получением концентрации 153 мкМ (0,25 мг/мл). 33,5 мг ТСЕР растворяли в 4 мл буфера (57,5% NaH₂PO₄ 20 мМ, рН 6,5, 40% ACN, 2,5% ДМФА). К 300 мкл раствора соматостатина (1 экв.) добавляли 3 мкл раствора ТСЕР (1,1 экв.). Полученный раствор перемешивали при температуре 37°С в течение 1 ч. Коммерческий соматостатин: R_t,1 (в ACN): 1,57; МС ES+: М⁺³/3=546,4, М⁺²/2=819,2. Соматостатин с восстановленной дисульфидной связью: R_t,1 (в ACN): 1,50; МС ES+: М⁺³/3=547,2, М⁺²/2=820,3. 5,4 мг бензил-6-(4,5-дихлор-1,1-диоксидо-3-оксоизотиазол-2(3Н)-ил)гексаноата (I.7) растворяли в 800 мкл ACN. 3 мкл раствора бензил-6-(4,5-дихлор-1,1-диоксидо-3-оксоизотиазол-2(3Н)-ил)гексаноата (1,1 экв.) добавляли в раствор соматостатина. Полученный раствор перемешивали при температуре 37°С. R_t,1 (в ACN): 1,65; МС ES+: М⁺³/3=637,3, М⁺²/2=955,5.

Масс-спектр полученного конъюгата представлен на Фиг. 11.

4. Конъюгация с моноклональными антителами

4.1. Синтез, очистка и характеризация ADC

Описанная ниже методика применима к химерным, гуманизированным и человеческим формам IgGI. Следует понимать, что специалист в данной области техники с помощью общедоступных знаний сможет адаптировать эту методику для любых других форм, таких как IgG2, IgG4 и т.д.

Антитело AM представляет собой моноклональное анти-IGFI R-антитело IgG1. Это антитело соответствует антителу 208F2 патентного документа WO 2015162291 (см. Таблицу 3, стр. 36), для которого три CDR легкой цепи имеют последовательности SEQ ID NO: 9, 5 и 11; три CDR тяжелой цепи имеют последовательности SEQ ID NO: 7, 2 и 3; вариабельный домен легкой цепи имеет последовательность SEQ ID NO: 18; а вариабельный домен тяжелой цепи имеет последовательность SEQ ID NO: 13.

Антитело Ab2 представляет собой нерелевантное химерное (IgG1) антитело, нацеленное на бактериальный белок, являющийся белком А внешней мембраны Е. coli, и обозначается как c9G4 (Haeuw J.F. and Beck A. Proteomics for development of immunotherapies (Протеомика для развития иммунотерапии), в Proteomics: Biomedical and Pharmaceutical Applications (Протеомика: биомедицинское и фармацевтическое применение), Kluwer Academic Publishers, Ed. Hondermarck H., 2014, p.243-278; WO 2015162291).

Антитела (1-5 мг/мл) частично восстанавливали гидрохлоридом трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР) в 10 мМ боратном буфере, рН 8,4, содержащем 150 мМ NaCl и 2 мМ EDTA, в течение 2-4 часов при температуре 37°С. Как правило, использовали 6-20 молярных эквивалентов ТСЕР для получения DAR приблизительно 4. Частичное восстановление антител подтверждали с помощью анализа SDS-PAGE в невосстанавливающих условиях. Затем концентрацию антител доводили до 1 мг/мл с помощью 10 мМ боратного буфера с рН 8,4, содержащего 150 мМ NaCl, 2 мМ EDTA, 6% сахарозы, и добавляли 5-20 кратный молярный избыток конъюгата лекарственное средство-линкер к антителу из 10 мМ раствора в ДМСО.

К антителу Ab1 были присоединены семь примеров конъюгата лекарственное средство-линкер согласно изобретению:

- Пример А и Пример В, образующие, соответственно, конъюгаты ADC1-A и ADC1-B (нерасщепляемые линкеры);

- Пример С, Пример D, Пример Е, Пример F и Пример G, образующие, соответственно, конъюгаты ADC1-C, ADC1-D, ADC1-E, ADC1-F и ADC1-G (расщепляемые линкеры).

Конечную концентрацию ДМСО доводили до 10% для сохранения растворимости лекарственного средства в водной среде во время связывания. Реакцию проводили в течение 1-4 ч при комнатной температуре или температуре 37°С. Избыток лекарственного средства гасили добавлением 2,5 моль N-ацетилцистеина на моль лекарственного средства и инкубацией в течение 1 ч при комнатной температуре.

После диализа против 25 мМ His-буфера, рН 6,5, содержащего 150 мМ NaCl и 6% сахарозы, в течение ночи при температуре 4°С, очищали повторно соединенные мостиком конъюгаты антитело-лекарственное средство при помощи способов, известных специалистам в данной области, основанных на применении коммерческих хромато графических колонок и ультрафильтрационных блоков. После стерильной фильтрации через фильтр с размером пор 0,2 мкм очищенные ADC хранили при температуре 4°С.

Далее их анализировали с помощью SDS-PAGE в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях для подтверждения конъюгации лекарственного средства и с помощью SEC на аналитической колонке TSK G3000 SWXL для определения содержания мономеров и агрегированных форм. Как можно видеть из Таблицы 9, содержание агрегированных форм, определенное на основании хроматограмм SEC (Фиг. 13), составляло менее 5%.

Анализы методом SDS-PAGE подтверждают образование полностью мостикового антитела H2L2 (Фиг. 12). Однако при этом также были обнаружены и другие продукты (H2L, Н2 и HL), соответствующие частично мостиковому антителу. Важно отметить, что эти продукты были заметны, когда образцы перед анализом подвергали термической обработке в восстанавливающих условиях, чтобы гарантировать полную диссоциацию тяжелых и легких цепей (Н и L), не связанных интактным межцепочечным мостиком.

Концентрацию белка определяли с помощью анализа ВСА с IgG в качестве стандарта. DAR оценивали для каждого очищенного ADC с помощью HIC, используя колонку TSK-Butyl-NPR. DAR составляло от 3,5 до 4,3 (Таблица 10). Профили HIC показали, что для большинства синтезированных ADC не наблюдалось ни DAR0, ни основного пика DAR4. В действительности, лишь ADC1-C и Е показывали следы DAR0. Более того, в случае ADC1-A, В, С и G наблюдались лишь DAR3, DAR4 и DAR5. За исключением ADC1-D, основным пиком являлся DAR4. По сравнению с ADC второго поколения эти ADC были более однородными, как показано в Таблице 10.

В качестве эталона был выбран Адцетрис® (брентуксимаб ведотин), поскольку в нем используется малеимидный линкер второго поколения, конъюгированный с цистеинами антитела. Это лучший типичный пример ADC второго поколения; технология, описанная в данной заявке, может рассматриваться как третье поколение.

4.2. Анализ ADC методом нативной масс-спектрометрии

Все реактивы закупали в компании Sigma-Aldrich: ацетат аммония (А1542), йодид цезия (21004), 2-пропанол (19516). Фермент IgGZERO (A0-IZ1-010) получали из компании Genovis. Водные растворы готовили с использованием системы для получения особо чистой воды (Sartorius, Göttingen, Germany).

Перед нативной МС конъюгаты ADC1-A - ADC1-G дегликозилировали. Дегликозилирование выполняли путем инкубирования 1 единицы IgGZERO на 1 мкг ADC в течение 30 мин при температуре 37°С. Затем буфер ADC заменяли на 150 мМ раствор ацетата аммония (рН 6,9), используя шесть циклов концентрирования/разбавления при помощи микроконцентратора (Vivaspin, предельная концентрация 10 кД, Sartorius, Геттинген, Германия). Концентрацию белка определяли по УФ-поглощению на спектрофотометре NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, Франция).

Неденатурирующую (нативную) масс-спектрометрию ADC выполняли на масс-спектрометре Q-TOF (Synapt G2 HDMS, Waters, Манчестер, Великобритания), работающем в режиме положительных ионов, соединенном с автоматическим устройством наноэлектрораспыления на основе микросхем (Triversa Nanomate, Advion, Итака, США). Анализы выполняли в диапазоне m/z 1000-10000. Образцы разводили в 150 мМ NH₄OAc при рН 6,9 и инфузировали при 10 мкМ. Внешнюю калибровку проводили с использованием однозарядных ионов, полученных из раствора 2 г/л йодида цезия в смеси 2-пропанол/вода (50/50 об./об.).

Напряжение наноэлектрораспыления устанавливали на 1,75 кВ, а нанопоток азота - на 0,75 psi. Напряжение на конусе устанавливали на 180 В, а поддерживающее давление - на 6 мбар.

На Фиг. 14 представлены примеры МС спектра без деконволюции.

Распределение DAR (Фиг. 15) определяли после деконволюции с использованием алгоритма MaxEnt™ из программного обеспечения Mass Lynx 4.1 (Waters, Манчестер, Великобритания). Параметры программы оптимизированы для каждого спектра.

Средние значения DAR (Фиг. 15) вычисляли при помощи следующего уравнения (где j - максимальное количество лекарственной нагрузки).

Результаты, полученные на основании относительных максимумов интенсивности каждого зарядового состояния в необработанных спектрах, представлены в Таблице 11 ниже.

На Фиг. 16 представлено сравнение распределения DAR, определенного для необработанных спектров после массовой деконволюции, для 2 разных ADC, т.е.:

- ADC1-C согласно изобретению, полученного из антитела AM, и конъюгата лекарственное средство-линкер С (Фиг. 16 В), и

- эталонного ADC Ref-A, представляющего собой ADC сравнения, синтезированного из того же антитела (AM) и конъюгата лекарственное средство-линкер, соответствующего конъюгату лекарственное средство-линкер С, в котором сульфомалеимидный фрагмент () заменен малеимидным фрагментом () (Фиг. 16А).

Неоднородное распределение DAR от DAR 0 до DAR 8 наблюдалось в случае ADC, синтезированного путем связывания лекарственного средства с антителом с использованием классической химии малеимидов (Фиг. 16А), тогда как ADC, полученный при использовании химии сульфомалеимидов согласно изобретению, имел высокую степень однородности с 75% DAR 4 и без DAR 0/2 и 6/8 (Фиг. 16 В). Полученные результаты представлены в Таблице 12.

4.3. Изучение стабильности конъюгатов ADC in vitro в 4 сыворотках млекопитающих с использованием анализа связывания с лигандом

Для того, чтобы определить повышение стабильности, изучали стабильность in vitro. Исследование заключалось в инкубировании ADC при температуре 37°С в течение 14 дней. Образцы отбирали в 0, 3, 7 и 14 день. Затем различные образцы (D0, D3, D7 и D14) анализировали при помощи LBA для определения концентрации суммарных антител в сравнении с концентрацией ADC. На практике готовили раствор каждого ADC в концентрации 100 мкг/мл в 4 сыворотках (человеческой, яванского макака, мыши и крысы) и инкубировали при температуре 37°С в течение максимум 14 дней. Затем отбирали аликвоты D0, D3, D7 и D14 и хранили их при температуре -80°С до дозировки. Для качественного определения суммарных Ab и ADC планшеты размораживали при комнатной температуре, изредка встряхивая, и параллельно проводили оба анализа LBA. Вкратце, стандартные планшеты для микротитрования (MSD, Гейтерсберг, США) покрывали 50 мкл раствора анти-His антитела с концентрацией 2 мкг/мл, приготовленного в PBS 1 × (англ. phosphate-buffered saline - фосфатно-буферный раствор). После инкубации в течение ночи при температуре 4°С аналитические планшеты обрабатывали блокирующим буфером (3% MSD Blocker A (MSD, Гейтерсберг, США)) в течение 1 ч при температуре 37°С. Затем в течение 1 ч при температуре 37°С добавляли рекомбинантный His-tagged антиген в концентрации 2,5 мкг/мл в аналитическом буфере. После промывки образцы анализировали в двух параллелях при разведении 1/5000° и инкубировали в течение 1 ч при температуре 37°С, одновременно с этим в аналитический планшет помещали стандартные ADC в двух параллелях. Для детектирования использовали либо раствор меченного сульфо-tag антитела козы к Ig каппа человека в концентрации 1 мкг/мл для обнаружения суммарных Ab, либо мышиные моноклональные антитела к лекарственному средству, меченные сульфогруппой, для выявления ADC. После инкубации в течение 1 часа при температуре 37°С выполняли детектирование с использованием 150 мкл буфера считывания Т (2×) MSD, содержащего поверхностно-активное вещество (MSD, Гейтерсберг, США), непосредственно перед считыванием с помощью MSD Sector Imager.

Концентрации суммарных антител и ADC определяли в каждый момент времени и преобразовывали в проценты, принимая за 100% количество суммарных ADC или антител в каждый момент времени.

Данные проиллюстрированы на Фиг. 17А, 17В и 17С для 3 ADC: ADC1-C (Фиг. 17В) и ADC1-E (Фиг. 17С), в которых лекарственное средство связано с антителом AM с использованием сульфомалеимидной химии согласно изобретению (посредством конъюгата лекарственное средство-линкер С или Е, соответственно), в сравнении с эталонным ADC Ref-B, в котором лекарственное средство связано с антителом с использованием классической малеимидной химии (Фиг. 17А).

Фрагмент лекарственное средство-линкер, использованный для получения эталонного ADC Ref-B

В качестве препарата сравнения был выбран фрагмент лекарственное средство-линкер с такой же полезной нагрузкой и нерасщепляемым линкером (лекарственное средство-линкер ADC Ref-B). Его конъюгировали с тем же антителом посредством малеимидной химии. Выбор этого препарата сравнения ограничивает "нестабильность" эталонного ADC в сыворотке за счет деконъюгации с антителом в результате обратной реакции Михаэля. По сравнению с нашими конструкциями, основанными на расщепляемом линкере, данный препарат сравнения, таким образом, является более предпочтительным, что делает повышение стабильности наших конъюгатов лекарственное средство-линкер еще более впечатляющими.

Как и ожидалось, для ADC, синтезированных с использованием классической малеимидной химии (ADC Ref-B), наблюдалось уменьшение концентрации ADC, тогда как ADC, полученные с использованием сульфомалеимидной химии согласно изобретению (ADC1-C & ADC1-E), неожиданно были значительно более стабильными в течение 14 дней.

4.4. Цитотоксичность ADC in vitro

Оценивали цитотоксичность in vitro ADC согласно изобретению. Для оценки неспецифичной цитотоксичности соединения также связывали с нерелевантным химерным антителом (АЬ2), называемым c9G4, при том же соотношении DAR и с использованием тех же конъюгатов лекарственное средство-линкер с получением ADC2-C в случае Примера С, ADC2-E в случае Примера Е и ADC2-F в случае Примера F.

Клетки MCF-7 и NCl-H2122 высевали в 96-луночные планшеты (2500 клеток на лунку) в готовой питательной среде. На следующий день в соответствующие лунки добавляли серийные разведения испытываемых ADC и инкубировали при температуре 37°С в течение 6 дней. Через 6 дней после добавления ADC планшеты анализировали с помощью Cell Titer Glo (PROMEGA) для оценки жизнеспособности клеток.

Полученные результаты, выраженные в процентах жизнеспособности, представлены на Фиг. 18А и 18В. Как и ожидалось, ADC, синтезированные с нерелевантным антителом, не показали цитотоксической активности либо показали умеренную цитотоксическую активность как в отношении клеток MCF-7, так и NCl-H2122. Напротив, ADC по изобретению: ADC1-C, ADC1-E и ADC1-F резко снижали жизнеспособность клеток. Для ADC1-C, ADC1-E и ADC1-F были получены значения ЕС₅₀ 7,61⋅10^-11, 7,16⋅10^-11 и 3,64⋅10^-11М, соответственно, в отношении клеток NCl-H2122, а для ADC1-C, ADC1-E и ADC1-F были получены значения ЕС₅₀ 1,04⋅10^-11, 1,33⋅10^-11 и 7,39⋅10^-11М, соответственно, в отношении клеток MCF7, что указывает на высокую цитотоксическую активность.

4.5. In vivo

Все протоколы экспериментов были одобрены Комитетом по содержанию и использованию лабораторных животных Пьера Фабра.

Для модели рака яичников самкам мышей SClD в возрасте 7 недель (Charles RIVER Laboratories) подкожно прививали 10,10⁶ клеток CaoV3 (по 6 животных в группе).

Лечение путем внутривенного введения ADC1-C согласно изобретению, эталонного ADC Ref-A или носителя ADC начинали, когда объем опухоли достигал приблизительно 150 мм³. Животным делали одну инъекцию (Q1d1) либо 3 инъекции (один раз в неделю) (Q7d3). Объем опухоли (длина × ширина × высота × 0,52) измеряли при помощи электронного штанген-циркуля по меньшей мере два раза в неделю в течение приблизительно 25 дней после первой инъекции. Результаты представлены на Фиг. 19 (для животных, получавших Q1d1) и Фиг. 20 (для животных, получавших Q7d3).

Как можно видеть на Фиг. 19 и 20, ADC согласно изобретению обладают высокой эффективностью при полном регрессе опухоли даже после однократной инъекции.

5. Конъюгирование производных PNU-159682 с моноклональными антителами

5.1. Синтез, очистка и характеристика ADC

Два производных PNU-159682, а именно, F562524 (Пример J) и F562646 (Пример Н), были соединены с антителами 208F2 (AM) и c9G4 (Ab2), в условиях, описанных ранее в Примере 4. Антитела 208F2 (AM) и c9G4 (Ab2) - такие, как раскрыто в Примере 4. Вкратце, антитела (1-5 мг/мл) частично восстанавливали 6-20 эквивалентами гидрохлорида ТСЕР в 10 мМ боратном буфере, рН 8,4, содержащем 150 мМ NaCl и 2 мМ EDTA, в течение 2-4 часов при температуре 37°С. Затем концентрацию антител доводили до 1 мг/мл с помощью 10 мМ боратного буфера с рН 8,4, содержащего 150 мМ NaCl, 2 мМ EDTA, 6% сахарозы, и добавляли 5-20 кратный молярный избыток конъюгата лекарственное средство-линкер к антителу из 10 мМ раствора в ДМСО. Реакцию проводили в течение 1-4 ч при комнатной температуре или температуре 37°С в присутствии 10% ДМСО. Избыток лекарственного средства гасили добавлением 2,5 моль N-ацетилцистеина на моль лекарственного средства и инкубацией в течение 1 ч при комнатной температуре. После диализа против 25 мМ His-буфера, рН 6,5, содержащего 150 мМ NaCl и 6% сахарозы, в течение ночи при температуре 4°С, ADC очищали при помощи хроматографии или ультрафильтрации. Концентрации ADC определяли с помощью анализа ВСА с IgG в качестве стандарта, после стерильной фильтрации через фильтр с размером пор 0,2 мкм очищенные ADC хранили при температуре 4°С.

ADC дополнительно анализировали с помощью SDS-PAGE и SEC (колонка TSK G3000 SWXL), как было описано ранее в Примере 4, для подтверждения конъюгации лекарственного средства и повторного образования мостиков с лекарственным средством, а также для определения содержания мономеров и агрегатов. Содержание мономеров составляло приблизительно 95% (Фиг. 23 и Таблица 13).

5.2. Анализ ADC нативной ЖХ-МС

ADC анализировали при помощи нативной жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии на системе UPLC Acquity Н Class Bio, соединенной с масс-спектрометром Synapt G2Si (Waters). Разделение методом ЖХ выполняли на 2 колонках Polyhydroxyethyl A (Poly-LC, 150 × 1 мм, 300 А, 5 мкм), соединенных последовательно. Образцы разбавляли до 0,2 мг/мл буфером для элюирования (150 мМ ацетат аммония). Вводили по 4 мкг образца и элюировали со скоростью 40 мкл/мин. Масс-спектрометр работал в положительном режиме с напряжением на капилляре 2,9 кВ. Напряжение на пробоотборном конусе устанавливали на 150 В. Анализы проводили в диапазоне mfz 1000-8000 при времени цикла 1 с. На Фиг. 24 показаны спектры m/z до деконволюции. Распределение DAR определяли после деконволюции МС спектров с использованием алгоритма MaxEnt™ из программного обеспечения Mass Lynx (Waters) (Фиг. 25). Средние значения DAR вычисляли при помощи следующего уравнения (где j - максимальное количество лекарственной нагрузки):

Результаты представлены ниже в Таблице 14.

5.3. Стабильность in vitro

ADC hz208F2-F562524 инкубировали при концентрации 200 мкг/мл в сыворотке яванского макака при температуре 37° С в течение 14 дней. Образцы отбирали в 0, 3, 7 и 14 день и хранили при температуре -80°С до проведения анализа методом ЖХ-МС для определения среднего DAR.

Перед анализом методом ЖХ-МС образцы очищали иммуноаффинным методом с использованием магнитных гранул стрептавидина (М-280, Invitrogen), покрытых конъюгатом CaptureSelect анти-Ig человека-Biotin (Life Technologies, 8 мкг антител / 200 мкл гранул). Образцы инкубировали с гранулами, покрытыми анти-IgG, в течение 2 ч при комнатной температуре (100 мкл образца / 200 мкл гранул), после чего элюировали кислотой - 40 мкл 0,4% трифторуксусной кислоты. Величину рН повышали добавлением 4 мкл 3М раствора Tris/HCL, рН 8,8. Очищенные иммунноаффинным методом образцы инкубировали с 2 мкл IgGZero в течение 30 минут при температуре 37°С перед анализом методом ЖХ-МС в нативных условиях, как описано выше. Распределение DAR определяли после деконволюции МС спектров с использованием алгоритма MaxEnt™ из программного обеспечения Mass Lynx (Waters), средние значения DAR вычисляли при помощи следующего уравнения (где j - максимальное количество лекарственной нагрузки):

Результаты представлены ниже в Таблице 15. Было показано, что ADC hz208F2-F562524 обладает высокой стабильностью в течение до 14 дней после инкубации in vitro в сыворотке яванского макака.

5.4. Цитотоксичность in vitro

Цитотоксичность ADC оценивали на клетках MCF-7 и NCl-H2122. Клетки высевали в 96-луночные планшеты (2500 клеток на лунку) в готовой питательной среде. На следующий день в соответствующие лунки добавляли серийные разведения испытываемых ADC и инкубировали при температуре 37°С в течение 6 дней. Жизнеспособность клеток определяли путем измерения АТР с помощью набора Cell Titer Glo (Promega). Люминесценцию считывали с помощью планшетного ридера Mithras компании Berthold Company. Полученные результаты, выраженные в процентах жизнеспособности, представлены на Фиг. 26 и 27. Жизнеспособность в необработанных лунках принимали за 100%.

Как и ожидалось, ADC hz208F2-F562524 и hz208F2-F562646 резко снижали жизнеспособность клеток. Для hz208F2-F562524 и hz208F2-F5626463 были получены значения ЕС₅₀ 2,48⋅10^-11 и 1,92⋅10^-12 М, соответственно, в отношении клеток NCl-H2122, и для hz208F2-F562524 и hz208F2-F562646 были получены значения ЕС₅₀ 5,86⋅10^-12 и 9,45⋅10^-13 М, соответственно, в отношении клеток MCF-7, что указывает на высокую цитотоксическую активность. Напротив, соответствующие ADC, синтезированные с нерелевантным антителом, показали умеренную цитотоксическую активность в отношении как клеток MCF-7, так и клеток NCl-H2122.

5.5. Противоопухолевая активность in vivo

Самкам мышей SClD в возрасте 7 недель (Charles River Laboratories) подкожно прививали 10⋅10⁶ клеток Caov3 (по 6 животных в группе). Лечение путем внутривенного введения (Q7d2) ADC hz208F2-F562524 (0,3 мг/кг), соответствующего контрольного ADC C9G4-F562524 (0,3 мг/кг) или носителя начинали, когда объем опухоли достигал приблизительно 150 мм³. Объем опухоли (длина × ширина × высота × 0,52) измеряли при помощи электронного штанген-циркуля два раза в неделю в течение приблизительно 50 дней после первой инъекции. Результаты представлены на Фиг. 28. Полный регресс опухоли наблюдался после 2 инъекций ADC hz208F2-F562524, при этом в случае контрольного ADC или носителя противоопухолевого эффекта не наблюдалось.

5.6. Заключение

ADC, синтезированные с производными PNU-159682 с использованием технологии сульфомалеимидных линкеров, имеют высокую степень однородности и стабильны в сыворотке крови. Их эффективность была продемонстрирована на различных моделях in vitro и in vivo.

6. Общие выводы

В целом, технология с использованием линкеров на основе сульфомалеимидов, описанная в данном изобретении, дает лучшую стабильность в плазме различных видов и лучшую эффективность на моделях in vitro по сравнению с обычными малеимидными линкерами, используемыми для соединений, имеющихся на рынке, таких как Адцетрис. Эти свойства выразились в явном улучшении эффективности in vivo на различных клеточных линиях и, в частности, на клеточных линиях с более низкой экспрессией антигена (CAOV3).

Также можно ожидать лучшую переносимость, поскольку ADC согласно изобретению являются более стабильными в кровотоке, что связано с улучшенной эффективностью и резервом безопасности при лечении человека.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> PIERRE FABRE MEDICAMENT

<120> ЛИНКЕРЫ НА ОСНОВЕ СУЛЬФОМАЛЕИМИДА И СООТВЕТСТВУЮЩИЕ КОНЪЮГАТЫ

<130> B376705PCTD37611

<150> B73896EPD37611

<151> 2018-09-27

<160> 81

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 8

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Консенсусная CDR -H1

<220>

<221> Прочий_признак

<222> (3)..(3)

<223> Thr может быть заменен на Ser

<220>

<221> Прочий_признак

<222> (8)..(8)

<223> Tyr может быть заменен на Phe

<400> 1

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Консенсусная CDR -H2

<400> 2

Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr

1 5

<210> 3

<211> 13

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Консенсусная CDR -H3

<400> 3

Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 4

<211> 6

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Консенсусная CDR -L1

<220>

<221> Прочий_признак

<222> (4)..(4)

<223> Ser может быть заменен на Asn

<400> 4

Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

1 5

<210> 5

<211> 3

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Консенсусная CDR -L2

<400> 5

Tyr Thr Ser

1

<210> 6

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Консенсусная CDR -L3

<220>

<221> Прочий_признак

<222> (5)..(5)

<223> Thr может быть заменен на Ala

<400> 6

Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Tyr Thr

1 5

<210> 7

<211> 8

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> CDR-H1

<400> 7

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr

1 5

<210> 8

<211> 8

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> CDR-H1

<400> 8

Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Phe

1 5

<210> 9

<211> 6

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> CDR-L1

<400> 9

Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

1 5

<210> 10

<211> 6

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> CDR-L1

<400> 10

Gln Asp Ile Asn Lys Tyr

1 5

<210> 11

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> CDR-L3

<400> 11

Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Tyr Thr

1 5

<210> 12

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> CDR-L3

<400> 12

Gln Gln Gly Ser Ala Leu Pro Tyr Thr

1 5

<210> 13

<211> 120

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> c208F2, тяжелая цепь, вариабельная область тяжелой цепи

<400> 13

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Ile Tyr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Phe Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 14

<211> 120

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> c212A11, тяжелая цепь, вариабельная область тяжелой цепи

<400> 14

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Phe Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 15

<211> 120

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> c214F8, тяжелая цепь, вариабельная область тяжелой цепи

<400> 15

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ser Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Arg Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Phe Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 16

<211> 120

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> c219D6, тяжелая цепь, вариабельная область тяжелой цепи

<400> 16

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Asp

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Phe Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Thr Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Phe Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 17

<211> 120

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> c213B10, тяжелая цепь, вариабельная область тяжелой цепи

<400> 17

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ser Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Arg Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Phe Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 18

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> c208F2, легкая цепь, вариабельная область легкой цепи

<400> 18

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Asp Gly Thr Ile Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Arg Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Val Glu Gln

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 19

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> c212A11, легкая цепь, вариабельная область легкой цепи

<400> 19

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Arg Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 20

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> c214F8, легкая цепь, вариабельная область легкой цепи

<400> 20

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Asp Gly Thr Ile Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Arg Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Thr Asn Leu Glu Gln

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ser Ala Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 21

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> c219D6, легкая цепь, вариабельная область легкой цепи

<400> 21

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Arg Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 22

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> c213B10, легкая цепь, вариабельная область легкой цепи

<400> 22

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Asp Gly Thr Ile Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Arg Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Thr Asn Leu Glu Gln

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ser Ala Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 23

<211> 449

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> c208F2, тяжелая цепь, полноразмерный

<400> 23

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Ile Tyr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Phe Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<210> 24

<211> 449

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> c212A11, тяжелая цепь, полноразмерный

<400> 24

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Phe Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<210> 25

<211> 449

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> c214F8, тяжелая цепь, полноразмерный

<400> 25

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ser Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Arg Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Phe Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<210> 26

<211> 449

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> c219D6, тяжелая цепь, полноразмерный

<400> 26

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Asp

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Phe Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Thr Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Phe Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<210> 27

<211> 449

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> c213B10, тяжелая цепь, полноразмерный

<400> 27

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ser Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Arg Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Phe Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<210> 28

<211> 214

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> c208F2, легкая цепь, полноразмерный

<400> 28

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Asp Gly Thr Ile Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Arg Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Val Glu Gln

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 29

<211> 214

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> c212A11, легкая цепь, полноразмерный

<400> 29

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Arg Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 30

<211> 214

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> c214F8, легкая цепь, полноразмерный

<400> 30

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Asp Gly Thr Ile Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Arg Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Thr Asn Leu Glu Gln

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ser Ala Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 31

<211> 214

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> c219D6, легкая цепь, полноразмерный

<400> 31

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Arg Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 32

<211> 214

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> c213B10, легкая цепь, полноразмерный

<400> 32

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Asp Gly Thr Ile Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Arg Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Thr Asn Leu Glu Gln

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ser Ala Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 33

<211> 120

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> hz208F2 (var.1) тяжелая цепь, вариабельная область тяжелой цепи

<400> 33

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 34

<211> 120

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> hz208F2 (var. 3), вариабельная область тяжелой цепи

<400> 34

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Ile Tyr Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Phe Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 35

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> hz208F2 (var. 1), вариабельная область легкой цепи

<400> 35

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 36

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> hz208F2 (var.3), вариабельная область легкой цепи

<400> 36

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Arg Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 37

<211> 449

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> hz208F2 (var. 1), тяжелая цепь, полноразмерный

<400> 37

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<210> 38

<211> 449

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> hz208F2 (var.3), тяжелая цепь, полноразмерный

<400> 38

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Ile Tyr Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Phe Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<210> 39

<211> 214

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> hz208F2 (var. 1), легкая цепь, полноразмерный

<400> 39

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 40

<211> 214

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> hz208F2 (var.3), легкая цепь, полноразмерный

<400> 40

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Arg Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 41

<211> 120

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> hz208F2 (var.2) тяжелая цепь, вариабельная область тяжелой цепи

<220>

<221> Прочий_признак

<222> (20)..(20)

<223> Met может быть заменен на Val

<220>

<221> Прочий_признак

<222> (34)..(34)

<223> Ile может быть заменен на Met

<220>

<221> Прочий_признак

<222> (35)..(35)

<223> Tyr может быть заменен на His

<220>

<221> Прочий_признак

<222> (38)..(38)

<223> Lys может быть заменен на Arg

<220>

<221> Прочий_признак

<222> (48)..(48)

<223> Leu может быть заменен на Met

<220>

<221> Прочий_признак

<222> (50)..(50)

<223> Trp может быть заменен на Ile

<220>

<221> Прочий_признак

<222> (59)..(59)

<223> Lys может быть заменен на Ser

<220>

<221> Прочий_признак

<222> (61)..(61)

<223> Asn может быть заменен на Ala

<220>

<221> Прочий_признак

<222> (62)..(62)

<223> Glu может быть заменен на Gln

<220>

<221> Прочий_признак

<222> (70)..(70)

<223> Leu может быть заменен на Met

<220>

<221> Прочий_признак

<222> (72)..(72)

<223> Ala может быть заменен на Arg

<220>

<221> Прочий_признак

<222> (74)..(74)

<223> Lys может быть заменен на Thr

<220>

<221> Прочий_признак

<222> (76)..(76)

<223> Ser может быть заменен на Thr

<220>

<221> Прочий_признак

<222> (77)..(77)

<223> Asn может быть заменен на Ser

<220>

<221> Прочий_признак

<222> (79)..(79)

<223> Ala может быть заменен на Val

<220>

<221> Прочий_признак

<222> (82)..(82)

<223> Phe может быть заменен на Glu

<220>

<221> Прочий_признак

<222> (95)..(95)

<223> Phe может быть заменен на Tyr

<400> 41

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Ile Tyr Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Phe Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 42

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> hz208F2 (var. 2), легкая цепь, вариабельная область легкой цепи

<220>

<221> Прочий_признак

<222> (22)..(22)

<223> Ser может быть заменен на Thr

<220>

<221> Прочий_признак

<222> (53)..(53)

<223> Arg может быть заменен на Ser

<220>

<221> Прочий_признак

<222> (55)..(55)

<223> His может быть заменен на Gln

<220>

<221> Прочий_признак

<222> (65)..(65)

<223> Arg может быть заменен на Ser

<220>

<221> Прочий_признак

<222> (71)..(71)

<223> Tyr может быть заменен на Phe

<220>

<221> Прочий_признак

<222> (72)..(72)

<223> Ser может быть заменен на Thr

<220>

<221> Прочий_признак

<222> (77)..(77)

<223> Asn может быть заменен на Ser

<220>

<221> Прочий_признак

<222> (87)..(87)

<223> Phe может быть заменен на Tyr

<400> 42

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Arg Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 43

<211> 329

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Константная область (вариабельная область тяжелой цепи) IgG1

<400> 43

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

325

<210> 44

<211> 326

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Константная область (вариабельная область тяжелой цепи) IgG4 (S228P)

<400> 44

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

115 120 125

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

130 135 140

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

145 150 155 160

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

165 170 175

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

180 185 190

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

195 200 205

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

210 215 220

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

225 230 235 240

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

245 250 255

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

260 265 270

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

275 280 285

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

290 295 300

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

305 310 315 320

Leu Ser Leu Ser Leu Gly

325

<210> 45

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Домен каппа (вариабельная область легкой цепи)

<400> 45

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 46

<211> 98

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Зародышевая линия человека IGHV1-46*01

<400> 46

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg

<210> 47

<211> 95

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Зародышевая линия человека IGKV1-39*01

<400> 47

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro

85 90 95

<210> 48

<211> 15

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Зародышевая линия человека IGHJ4*01

<400> 48

Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

1 5 10 15

<210> 49

<211> 12

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Зародышевая линия человека IGKJ4*01

<400> 49

Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

1 5 10

<210> 50

<211> 1367

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> IGF-1R (человеческий)

<400> 50

Met Lys Ser Gly Ser Gly Gly Gly Ser Pro Thr Ser Leu Trp Gly Leu

1 5 10 15

Leu Phe Leu Ser Ala Ala Leu Ser Leu Trp Pro Thr Ser Gly Glu Ile

20 25 30

Cys Gly Pro Gly Ile Asp Ile Arg Asn Asp Tyr Gln Gln Leu Lys Arg

35 40 45

Leu Glu Asn Cys Thr Val Ile Glu Gly Tyr Leu His Ile Leu Leu Ile

50 55 60

Ser Lys Ala Glu Asp Tyr Arg Ser Tyr Arg Phe Pro Lys Leu Thr Val

65 70 75 80

Ile Thr Glu Tyr Leu Leu Leu Phe Arg Val Ala Gly Leu Glu Ser Leu

85 90 95

Gly Asp Leu Phe Pro Asn Leu Thr Val Ile Arg Gly Trp Lys Leu Phe

100 105 110

Tyr Asn Tyr Ala Leu Val Ile Phe Glu Met Thr Asn Leu Lys Asp Ile

115 120 125

Gly Leu Tyr Asn Leu Arg Asn Ile Thr Arg Gly Ala Ile Arg Ile Glu

130 135 140

Lys Asn Ala Asp Leu Cys Tyr Leu Ser Thr Val Asp Trp Ser Leu Ile

145 150 155 160

Leu Asp Ala Val Ser Asn Asn Tyr Ile Val Gly Asn Lys Pro Pro Lys

165 170 175

Glu Cys Gly Asp Leu Cys Pro Gly Thr Met Glu Glu Lys Pro Met Cys

180 185 190

Glu Lys Thr Thr Ile Asn Asn Glu Tyr Asn Tyr Arg Cys Trp Thr Thr

195 200 205

Asn Arg Cys Gln Lys Met Cys Pro Ser Thr Cys Gly Lys Arg Ala Cys

210 215 220

Thr Glu Asn Asn Glu Cys Cys His Pro Glu Cys Leu Gly Ser Cys Ser

225 230 235 240

Ala Pro Asp Asn Asp Thr Ala Cys Val Ala Cys Arg His Tyr Tyr Tyr

245 250 255

Ala Gly Val Cys Val Pro Ala Cys Pro Pro Asn Thr Tyr Arg Phe Glu

260 265 270

Gly Trp Arg Cys Val Asp Arg Asp Phe Cys Ala Asn Ile Leu Ser Ala

275 280 285

Glu Ser Ser Asp Ser Glu Gly Phe Val Ile His Asp Gly Glu Cys Met

290 295 300

Gln Glu Cys Pro Ser Gly Phe Ile Arg Asn Gly Ser Gln Ser Met Tyr

305 310 315 320

Cys Ile Pro Cys Glu Gly Pro Cys Pro Lys Val Cys Glu Glu Glu Lys

325 330 335

Lys Thr Lys Thr Ile Asp Ser Val Thr Ser Ala Gln Met Leu Gln Gly

340 345 350

Cys Thr Ile Phe Lys Gly Asn Leu Leu Ile Asn Ile Arg Arg Gly Asn

355 360 365

Asn Ile Ala Ser Glu Leu Glu Asn Phe Met Gly Leu Ile Glu Val Val

370 375 380

Thr Gly Tyr Val Lys Ile Arg His Ser His Ala Leu Val Ser Leu Ser

385 390 395 400

Phe Leu Lys Asn Leu Arg Leu Ile Leu Gly Glu Glu Gln Leu Glu Gly

405 410 415

Asn Tyr Ser Phe Tyr Val Leu Asp Asn Gln Asn Leu Gln Gln Leu Trp

420 425 430

Asp Trp Asp His Arg Asn Leu Thr Ile Lys Ala Gly Lys Met Tyr Phe

435 440 445

Ala Phe Asn Pro Lys Leu Cys Val Ser Glu Ile Tyr Arg Met Glu Glu

450 455 460

Val Thr Gly Thr Lys Gly Arg Gln Ser Lys Gly Asp Ile Asn Thr Arg

465 470 475 480

Asn Asn Gly Glu Arg Ala Ser Cys Glu Ser Asp Val Leu His Phe Thr

485 490 495

Ser Thr Thr Thr Ser Lys Asn Arg Ile Ile Ile Thr Trp His Arg Tyr

500 505 510

Arg Pro Pro Asp Tyr Arg Asp Leu Ile Ser Phe Thr Val Tyr Tyr Lys

515 520 525

Glu Ala Pro Phe Lys Asn Val Thr Glu Tyr Asp Gly Gln Asp Ala Cys

530 535 540

Gly Ser Asn Ser Trp Asn Met Val Asp Val Asp Leu Pro Pro Asn Lys

545 550 555 560

Asp Val Glu Pro Gly Ile Leu Leu His Gly Leu Lys Pro Trp Thr Gln

565 570 575

Tyr Ala Val Tyr Val Lys Ala Val Thr Leu Thr Met Val Glu Asn Asp

580 585 590

His Ile Arg Gly Ala Lys Ser Glu Ile Leu Tyr Ile Arg Thr Asn Ala

595 600 605

Ser Val Pro Ser Ile Pro Leu Asp Val Leu Ser Ala Ser Asn Ser Ser

610 615 620

Ser Gln Leu Ile Val Lys Trp Asn Pro Pro Ser Leu Pro Asn Gly Asn

625 630 635 640

Leu Ser Tyr Tyr Ile Val Arg Trp Gln Arg Gln Pro Gln Asp Gly Tyr

645 650 655

Leu Tyr Arg His Asn Tyr Cys Ser Lys Asp Lys Ile Pro Ile Arg Lys

660 665 670

Tyr Ala Asp Gly Thr Ile Asp Ile Glu Glu Val Thr Glu Asn Pro Lys

675 680 685

Thr Glu Val Cys Gly Gly Glu Lys Gly Pro Cys Cys Ala Cys Pro Lys

690 695 700

Thr Glu Ala Glu Lys Gln Ala Glu Lys Glu Glu Ala Glu Tyr Arg Lys

705 710 715 720

Val Phe Glu Asn Phe Leu His Asn Ser Ile Phe Val Pro Arg Pro Glu

725 730 735

Arg Lys Arg Arg Asp Val Met Gln Val Ala Asn Thr Thr Met Ser Ser

740 745 750

Arg Ser Arg Asn Thr Thr Ala Ala Asp Thr Tyr Asn Ile Thr Asp Pro

755 760 765

Glu Glu Leu Glu Thr Glu Tyr Pro Phe Phe Glu Ser Arg Val Asp Asn

770 775 780

Lys Glu Arg Thr Val Ile Ser Asn Leu Arg Pro Phe Thr Leu Tyr Arg

785 790 795 800

Ile Asp Ile His Ser Cys Asn His Glu Ala Glu Lys Leu Gly Cys Ser

805 810 815

Ala Ser Asn Phe Val Phe Ala Arg Thr Met Pro Ala Glu Gly Ala Asp

820 825 830

Asp Ile Pro Gly Pro Val Thr Trp Glu Pro Arg Pro Glu Asn Ser Ile

835 840 845

Phe Leu Lys Trp Pro Glu Pro Glu Asn Pro Asn Gly Leu Ile Leu Met

850 855 860

Tyr Glu Ile Lys Tyr Gly Ser Gln Val Glu Asp Gln Arg Glu Cys Val

865 870 875 880

Ser Arg Gln Glu Tyr Arg Lys Tyr Gly Gly Ala Lys Leu Asn Arg Leu

885 890 895

Asn Pro Gly Asn Tyr Thr Ala Arg Ile Gln Ala Thr Ser Leu Ser Gly

900 905 910

Asn Gly Ser Trp Thr Asp Pro Val Phe Phe Tyr Val Gln Ala Lys Thr

915 920 925

Gly Tyr Glu Asn Phe Ile His Leu Ile Ile Ala Leu Pro Val Ala Val

930 935 940

Leu Leu Ile Val Gly Gly Leu Val Ile Met Leu Tyr Val Phe His Arg

945 950 955 960

Lys Arg Asn Asn Ser Arg Leu Gly Asn Gly Val Leu Tyr Ala Ser Val

965 970 975

Asn Pro Glu Tyr Phe Ser Ala Ala Asp Val Tyr Val Pro Asp Glu Trp

980 985 990

Glu Val Ala Arg Glu Lys Ile Thr Met Ser Arg Glu Leu Gly Gln Gly

995 1000 1005

Ser Phe Gly Met Val Tyr Glu Gly Val Ala Lys Gly Val Val Lys

1010 1015 1020

Asp Glu Pro Glu Thr Arg Val Ala Ile Lys Thr Val Asn Glu Ala

1025 1030 1035

Ala Ser Met Arg Glu Arg Ile Glu Phe Leu Asn Glu Ala Ser Val

1040 1045 1050

Met Lys Glu Phe Asn Cys His His Val Val Arg Leu Leu Gly Val

1055 1060 1065

Val Ser Gln Gly Gln Pro Thr Leu Val Ile Met Glu Leu Met Thr

1070 1075 1080

Arg Gly Asp Leu Lys Ser Tyr Leu Arg Ser Leu Arg Pro Glu Met

1085 1090 1095

Glu Asn Asn Pro Val Leu Ala Pro Pro Ser Leu Ser Lys Met Ile

1100 1105 1110

Gln Met Ala Gly Glu Ile Ala Asp Gly Met Ala Tyr Leu Asn Ala

1115 1120 1125

Asn Lys Phe Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Cys Met Val

1130 1135 1140

Ala Glu Asp Phe Thr Val Lys Ile Gly Asp Phe Gly Met Thr Arg

1145 1150 1155

Asp Ile Tyr Glu Thr Asp Tyr Tyr Arg Lys Gly Gly Lys Gly Leu

1160 1165 1170

Leu Pro Val Arg Trp Met Ser Pro Glu Ser Leu Lys Asp Gly Val

1175 1180 1185

Phe Thr Thr Tyr Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Val Val Leu Trp

1190 1195 1200

Glu Ile Ala Thr Leu Ala Glu Gln Pro Tyr Gln Gly Leu Ser Asn

1205 1210 1215

Glu Gln Val Leu Arg Phe Val Met Glu Gly Gly Leu Leu Asp Lys

1220 1225 1230

Pro Asp Asn Cys Pro Asp Met Leu Phe Glu Leu Met Arg Met Cys

1235 1240 1245

Trp Gln Tyr Asn Pro Lys Met Arg Pro Ser Phe Leu Glu Ile Ile

1250 1255 1260

Ser Ser Ile Lys Glu Glu Met Glu Pro Gly Phe Arg Glu Val Ser

1265 1270 1275

Phe Tyr Tyr Ser Glu Glu Asn Lys Leu Pro Glu Pro Glu Glu Leu

1280 1285 1290

Asp Leu Glu Pro Glu Asn Met Glu Ser Val Pro Leu Asp Pro Ser

1295 1300 1305

Ala Ser Ser Ser Ser Leu Pro Leu Pro Asp Arg His Ser Gly His

1310 1315 1320

Lys Ala Glu Asn Gly Pro Gly Pro Gly Val Leu Val Leu Arg Ala

1325 1330 1335

Ser Phe Asp Glu Arg Gln Pro Tyr Ala His Met Asn Gly Gly Arg

1340 1345 1350

Lys Asn Glu Arg Ala Leu Pro Leu Pro Gln Ser Ser Thr Cys

1355 1360 1365

<210> 51

<211> 932

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> IGF-1R ECD (человеческий)

<400> 51

Met Lys Ser Gly Ser Gly Gly Gly Ser Pro Thr Ser Leu Trp Gly Leu

1 5 10 15

Leu Phe Leu Ser Ala Ala Leu Ser Leu Trp Pro Thr Ser Gly Glu Ile

20 25 30

Cys Gly Pro Gly Ile Asp Ile Arg Asn Asp Tyr Gln Gln Leu Lys Arg

35 40 45

Leu Glu Asn Cys Thr Val Ile Glu Gly Tyr Leu His Ile Leu Leu Ile

50 55 60

Ser Lys Ala Glu Asp Tyr Arg Ser Tyr Arg Phe Pro Lys Leu Thr Val

65 70 75 80

Ile Thr Glu Tyr Leu Leu Leu Phe Arg Val Ala Gly Leu Glu Ser Leu

85 90 95

Gly Asp Leu Phe Pro Asn Leu Thr Val Ile Arg Gly Trp Lys Leu Phe

100 105 110

Tyr Asn Tyr Ala Leu Val Ile Phe Glu Met Thr Asn Leu Lys Asp Ile

115 120 125

Gly Leu Tyr Asn Leu Arg Asn Ile Thr Arg Gly Ala Ile Arg Ile Glu

130 135 140

Lys Asn Ala Asp Leu Cys Tyr Leu Ser Thr Val Asp Trp Ser Leu Ile

145 150 155 160

Leu Asp Ala Val Ser Asn Asn Tyr Ile Val Gly Asn Lys Pro Pro Lys

165 170 175

Glu Cys Gly Asp Leu Cys Pro Gly Thr Met Glu Glu Lys Pro Met Cys

180 185 190

Glu Lys Thr Thr Ile Asn Asn Glu Tyr Asn Tyr Arg Cys Trp Thr Thr

195 200 205

Asn Arg Cys Gln Lys Met Cys Pro Ser Thr Cys Gly Lys Arg Ala Cys

210 215 220

Thr Glu Asn Asn Glu Cys Cys His Pro Glu Cys Leu Gly Ser Cys Ser

225 230 235 240

Ala Pro Asp Asn Asp Thr Ala Cys Val Ala Cys Arg His Tyr Tyr Tyr

245 250 255

Ala Gly Val Cys Val Pro Ala Cys Pro Pro Asn Thr Tyr Arg Phe Glu

260 265 270

Gly Trp Arg Cys Val Asp Arg Asp Phe Cys Ala Asn Ile Leu Ser Ala

275 280 285

Glu Ser Ser Asp Ser Glu Gly Phe Val Ile His Asp Gly Glu Cys Met

290 295 300

Gln Glu Cys Pro Ser Gly Phe Ile Arg Asn Gly Ser Gln Ser Met Tyr

305 310 315 320

Cys Ile Pro Cys Glu Gly Pro Cys Pro Lys Val Cys Glu Glu Glu Lys

325 330 335

Lys Thr Lys Thr Ile Asp Ser Val Thr Ser Ala Gln Met Leu Gln Gly

340 345 350

Cys Thr Ile Phe Lys Gly Asn Leu Leu Ile Asn Ile Arg Arg Gly Asn

355 360 365

Asn Ile Ala Ser Glu Leu Glu Asn Phe Met Gly Leu Ile Glu Val Val

370 375 380

Thr Gly Tyr Val Lys Ile Arg His Ser His Ala Leu Val Ser Leu Ser

385 390 395 400

Phe Leu Lys Asn Leu Arg Leu Ile Leu Gly Glu Glu Gln Leu Glu Gly

405 410 415

Asn Tyr Ser Phe Tyr Val Leu Asp Asn Gln Asn Leu Gln Gln Leu Trp

420 425 430

Asp Trp Asp His Arg Asn Leu Thr Ile Lys Ala Gly Lys Met Tyr Phe

435 440 445

Ala Phe Asn Pro Lys Leu Cys Val Ser Glu Ile Tyr Arg Met Glu Glu

450 455 460

Val Thr Gly Thr Lys Gly Arg Gln Ser Lys Gly Asp Ile Asn Thr Arg

465 470 475 480

Asn Asn Gly Glu Arg Ala Ser Cys Glu Ser Asp Val Leu His Phe Thr

485 490 495

Ser Thr Thr Thr Ser Lys Asn Arg Ile Ile Ile Thr Trp His Arg Tyr

500 505 510

Arg Pro Pro Asp Tyr Arg Asp Leu Ile Ser Phe Thr Val Tyr Tyr Lys

515 520 525

Glu Ala Pro Phe Lys Asn Val Thr Glu Tyr Asp Gly Gln Asp Ala Cys

530 535 540

Gly Ser Asn Ser Trp Asn Met Val Asp Val Asp Leu Pro Pro Asn Lys

545 550 555 560

Asp Val Glu Pro Gly Ile Leu Leu His Gly Leu Lys Pro Trp Thr Gln

565 570 575

Tyr Ala Val Tyr Val Lys Ala Val Thr Leu Thr Met Val Glu Asn Asp

580 585 590

His Ile Arg Gly Ala Lys Ser Glu Ile Leu Tyr Ile Arg Thr Asn Ala

595 600 605

Ser Val Pro Ser Ile Pro Leu Asp Val Leu Ser Ala Ser Asn Ser Ser

610 615 620

Ser Gln Leu Ile Val Lys Trp Asn Pro Pro Ser Leu Pro Asn Gly Asn

625 630 635 640

Leu Ser Tyr Tyr Ile Val Arg Trp Gln Arg Gln Pro Gln Asp Gly Tyr

645 650 655

Leu Tyr Arg His Asn Tyr Cys Ser Lys Asp Lys Ile Pro Ile Arg Lys

660 665 670

Tyr Ala Asp Gly Thr Ile Asp Ile Glu Glu Val Thr Glu Asn Pro Lys

675 680 685

Thr Glu Val Cys Gly Gly Glu Lys Gly Pro Cys Cys Ala Cys Pro Lys

690 695 700

Thr Glu Ala Glu Lys Gln Ala Glu Lys Glu Glu Ala Glu Tyr Arg Lys

705 710 715 720

Val Phe Glu Asn Phe Leu His Asn Ser Ile Phe Val Pro Arg Pro Glu

725 730 735

Arg Lys Arg Arg Asp Val Met Gln Val Ala Asn Thr Thr Met Ser Ser

740 745 750

Arg Ser Arg Asn Thr Thr Ala Ala Asp Thr Tyr Asn Ile Thr Asp Pro

755 760 765

Glu Glu Leu Glu Thr Glu Tyr Pro Phe Phe Glu Ser Arg Val Asp Asn

770 775 780

Lys Glu Arg Thr Val Ile Ser Asn Leu Arg Pro Phe Thr Leu Tyr Arg

785 790 795 800

Ile Asp Ile His Ser Cys Asn His Glu Ala Glu Lys Leu Gly Cys Ser

805 810 815

Ala Ser Asn Phe Val Phe Ala Arg Thr Met Pro Ala Glu Gly Ala Asp

820 825 830

Asp Ile Pro Gly Pro Val Thr Trp Glu Pro Arg Pro Glu Asn Ser Ile

835 840 845

Phe Leu Lys Trp Pro Glu Pro Glu Asn Pro Asn Gly Leu Ile Leu Met

850 855 860

Tyr Glu Ile Lys Tyr Gly Ser Gln Val Glu Asp Gln Arg Glu Cys Val

865 870 875 880

Ser Arg Gln Glu Tyr Arg Lys Tyr Gly Gly Ala Lys Leu Asn Arg Leu

885 890 895

Asn Pro Gly Asn Tyr Thr Ala Arg Ile Gln Ala Thr Ser Leu Ser Gly

900 905 910

Asn Gly Ser Trp Thr Asp Pro Val Phe Phe Tyr Val Gln Ala Lys Thr

915 920 925

Gly Tyr Glu Asn

930

<210> 52

<211> 512

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> IGF-1R ECD N-конец (человеческий)

<400> 52

Met Lys Ser Gly Ser Gly Gly Gly Ser Pro Thr Ser Leu Trp Gly Leu

1 5 10 15

Leu Phe Leu Ser Ala Ala Leu Ser Leu Trp Pro Thr Ser Gly Glu Ile

20 25 30

Cys Gly Pro Gly Ile Asp Ile Arg Asn Asp Tyr Gln Gln Leu Lys Arg

35 40 45

Leu Glu Asn Cys Thr Val Ile Glu Gly Tyr Leu His Ile Leu Leu Ile

50 55 60

Ser Lys Ala Glu Asp Tyr Arg Ser Tyr Arg Phe Pro Lys Leu Thr Val

65 70 75 80

Ile Thr Glu Tyr Leu Leu Leu Phe Arg Val Ala Gly Leu Glu Ser Leu

85 90 95

Gly Asp Leu Phe Pro Asn Leu Thr Val Ile Arg Gly Trp Lys Leu Phe

100 105 110

Tyr Asn Tyr Ala Leu Val Ile Phe Glu Met Thr Asn Leu Lys Asp Ile

115 120 125

Gly Leu Tyr Asn Leu Arg Asn Ile Thr Arg Gly Ala Ile Arg Ile Glu

130 135 140

Lys Asn Ala Asp Leu Cys Tyr Leu Ser Thr Val Asp Trp Ser Leu Ile

145 150 155 160

Leu Asp Ala Val Ser Asn Asn Tyr Ile Val Gly Asn Lys Pro Pro Lys

165 170 175

Glu Cys Gly Asp Leu Cys Pro Gly Thr Met Glu Glu Lys Pro Met Cys

180 185 190

Glu Lys Thr Thr Ile Asn Asn Glu Tyr Asn Tyr Arg Cys Trp Thr Thr

195 200 205

Asn Arg Cys Gln Lys Met Cys Pro Ser Thr Cys Gly Lys Arg Ala Cys

210 215 220

Thr Glu Asn Asn Glu Cys Cys His Pro Glu Cys Leu Gly Ser Cys Ser

225 230 235 240

Ala Pro Asp Asn Asp Thr Ala Cys Val Ala Cys Arg His Tyr Tyr Tyr

245 250 255

Ala Gly Val Cys Val Pro Ala Cys Pro Pro Asn Thr Tyr Arg Phe Glu

260 265 270

Gly Trp Arg Cys Val Asp Arg Asp Phe Cys Ala Asn Ile Leu Ser Ala

275 280 285

Glu Ser Ser Asp Ser Glu Gly Phe Val Ile His Asp Gly Glu Cys Met

290 295 300

Gln Glu Cys Pro Ser Gly Phe Ile Arg Asn Gly Ser Gln Ser Met Tyr

305 310 315 320

Cys Ile Pro Cys Glu Gly Pro Cys Pro Lys Val Cys Glu Glu Glu Lys

325 330 335

Lys Thr Lys Thr Ile Asp Ser Val Thr Ser Ala Gln Met Leu Gln Gly

340 345 350

Cys Thr Ile Phe Lys Gly Asn Leu Leu Ile Asn Ile Arg Arg Gly Asn

355 360 365

Asn Ile Ala Ser Glu Leu Glu Asn Phe Met Gly Leu Ile Glu Val Val

370 375 380

Thr Gly Tyr Val Lys Ile Arg His Ser His Ala Leu Val Ser Leu Ser

385 390 395 400

Phe Leu Lys Asn Leu Arg Leu Ile Leu Gly Glu Glu Gln Leu Glu Gly

405 410 415

Asn Tyr Ser Phe Tyr Val Leu Asp Asn Gln Asn Leu Gln Gln Leu Trp

420 425 430

Asp Trp Asp His Arg Asn Leu Thr Ile Lys Ala Gly Lys Met Tyr Phe

435 440 445

Ala Phe Asn Pro Lys Leu Cys Val Ser Glu Ile Tyr Arg Met Glu Glu

450 455 460

Val Thr Gly Thr Lys Gly Arg Gln Ser Lys Gly Asp Ile Asn Thr Arg

465 470 475 480

Asn Asn Gly Glu Arg Ala Ser Cys Glu Ser Asp Val Leu His Phe Thr

485 490 495

Ser Thr Thr Thr Ser Lys Asn Arg Ile Ile Ile Thr Trp His Arg Tyr

500 505 510

<210> 53

<211> 4

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Тетрапептид (линкер)

<400> 53

Gly Phe Leu Gly

1

<210> 54

<211> 4

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Тетрапептид (линкер)

<400> 54

Ala Leu Ala Leu

1

<210> 55

<211> 5

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> Тетрапептид (линкер)

<400> 55

Pro Val Gly Val Val

1 5

<210> 56

<211> 120

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> hz208F2 тяжелая цепь H037, вариабельная область тяжелой цепи

<400> 56

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 57

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> hz208F2 легкая цепь L018, вариабельная область легкой цепи

<400> 57

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Arg Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 58

<211> 449

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> hz208F2 тяжелая цепь H037 полноразмерный

<400> 58

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<210> 59

<211> 214

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> hz208F2 легкая цепь L018 полноразмерный

<400> 59

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Arg Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 60

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> hz208F2 легкая цепь L021, вариабельная область легкой цепи

<400> 60

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 61

<211> 214

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> hz208F2 легкая цепь L021 полноразмерный

<400> 61

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 62

<211> 120

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> hz208F2 тяжелая цепь H047, вариабельная область тяжелой цепи

<400> 62

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ser Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 63

<211> 449

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> hz208F2 тяжелая цепь H047 полноразмерный

<400> 63

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ser Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<210> 64

<211> 120

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> hz208F2 тяжелая цепь H049, вариабельная область тяжелой цепи

<400> 64

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 65

<211> 449

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> hz208F2 тяжелая цепь H049 полноразмерный

<400> 65

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<210> 66

<211> 120

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> hz208F2 тяжелая цепь H051, вариабельная область тяжелой цепи

<400> 66

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ser Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 67

<211> 449

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> hz208F2 тяжелая цепь H051 полноразмерный

<400> 67

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ser Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<210> 68

<211> 120

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> hz208F2 тяжелая цепь H052, вариабельная область тяжелой цепи

<400> 68

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 69

<211> 449

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> hz208F2 тяжелая цепь H052 полноразмерный

<400> 69

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<210> 70

<211> 120

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> hz208F2 тяжелая цепь H057, вариабельная область тяжелой цепи

<400> 70

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Lys Ser Thr Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 71

<211> 449

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> hz208F2 тяжелая цепь H057 полноразмерный

<400> 71

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Lys Ser Thr Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<210> 72

<211> 120

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> hz208F2 тяжелая цепь H068, вариабельная область тяжелой цепи

<400> 72

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 73

<211> 449

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> hz208F2 тяжелая цепь H068 полноразмерный

<400> 73

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<210> 74

<211> 120

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> hz208F2 тяжелая цепь H070, вариабельная область тяжелой цепи

<400> 74

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 75

<211> 449

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> hz208F2 тяжелая цепь H070 полноразмерный

<400> 75

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<210> 76

<211> 120

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> hz208F2 тяжелая цепь H071, вариабельная область тяжелой цепи

<400> 76

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 77

<211> 449

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> hz208F2 тяжелая цепь H071 полноразмерный

<400> 77

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<210> 78

<211> 120

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> hz208F2 тяжелая цепь H076, вариабельная область тяжелой цепи

<400> 78

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 79

<211> 449

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> hz208F2 тяжелая цепь H076 полноразмерный

<400> 79

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<210> 80

<211> 120

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> hz208F2 тяжелая цепь H077, вариабельная область тяжелой цепи

<400> 80

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 81

<211> 449

<212> Белок

<213> Искусственный

<220>

<223> hz208F2 тяжелая цепь H077 полноразмерный

<400> 81

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<---

Claims

1. Линкер следующей формулы (I):

или его фармацевтически приемлемая соль, где:

- X₁ и Х₂ независимо друг от друга представляют собой Н или атом галогена, при условии, что X₁ и Х₂ одновременно не являются Н;

- L₁ представляет собой группу формулы L₁'-(CO-Z')_z', где L₁' представляет собой -(СН₂)_n- или -(СН₂СН₂O)_m-СН₂-СН₂-;

- Y представляет собой PAB-CO-(Z)_z-, где РАВ является а кислород звена РАВ связан с CO-(Z)_z;

- Z представляет собой -NR₄-(CH₂)_u-NR₅-, -NR₄-(CH₂)_u-NR₅-CO-, -NR₄-(CH₂)_u-NR₅-CO-(CH₂)_v- или -NR₄-(CH₂)_u-NR₅-CO-(CH₂)_v-CO-, при этом группа NR₄связана с группой СО группы РАВ-СО;

- Z' представляет собой -NR₄-(CH₂)_u-NR₅- или -NR₄-(CH₂)_u-NR₅-CO-(CH₂)_v-, при этом группа NR₄ связана с группой СО группы CO-Z';

R₄ и R₅ независимо представляют собой Н или (С₁-С₆)алкильную группу;

- с равно 0 или 1;

- m является целым числом от 1 до 15;

- n является целым числом от 1 до 6;

- р является целым числом от 1 до 6;

- q равно 2;

- u является целым числом от 1 до 6;

- v является целым числом от 1 до 6;

- w является целым числом от 0 до 2;

- у равно 0 или 1;

- z равно 0 или 1;

- z' равно 0 или 1; и

- Х₃ является Н, когда у равно z равно 1, a Z представляет собой -NR₄-(CH₂)_u-NR₅-, или когда с равно w равно у равно 0, z' равно 1, a Z' представляет собой -NR₄-(CH₂)_u-NR₅-, в других случаях Х₃ представляет собой ОН, NH₂ или уходящую группу, где уходящая группа является атомом галогена.

2. Линкер по п. 1, где у равно 0, когда w равно 0, и у равно 0 или 1, когда w является целым числом от 1 до 2.

3. Линкер по п. 2, где по меньшей мере X₁ или Х₂ является Вr или Cl.

4. Линкер по п. 3, где один из X₁ и Х₂ является Вr или Cl, а другая группа представляет собой Н, Cl или Вr.

5. Линкер по любому из пп. 1-4, где каждый W выбран из аланина, валина, лейцина, изолейцина, метионина, фенилаланина, триптофана, пролина, лизина, лизина, защищенного ацетилом или формилом, аргинина, аргинина, защищенного тозильной или нитрогруппой (группами), гистидина, орнитина, орнитина, защищенного ацетилом или формилом, и цитруллина.

6. Линкер по любому из пп. 1-5, где:

- w равно 0, a (W)_w представляет собой связь, или

- w равно 2, a (W)_w представляет собой Val-Cit или Val-Ala.

7. Линкер по любому из пп. 1, 2 и 5-6, где:

- X₁ и Х₂ являются одинаковыми и выбраны из Cl и Вr, или - один из X₁ и Х₂ представляет собой Н, а другой выбран из Cl и Вr.

8. Линкер по любому из пп. 1-7, где Х₃ является Н, когда у равно z равно 1, a Z представляет собой -NR₄-(CH₂)_u-NR₅-, или когда с равно w равно у равно 0, z' равно 1, a Z' представляет собой -NR₄-(CH₂)_u-NR₅-, в других случаях Х₃ является ОН или Cl.

9. Конъюгат линкер-лекарственное средство следующей формулы (II):

- Y представляет собой PAB-CO-(Z)_z-, где РАВ является

при этом кислород звена РАВ связан с CO-(Z)_z;

- Z представляет собой -NR₄-(CH₂)_u-NR₅-,-NR₄-(CH₂)_u-NR₅-CO-, -NR₄-(CH₂)_u-NR₅-CO-(CH₂)_v- или -NR₄-(CH₂)_u-NR₅-CO-(CH₂)_v-CO-, при этом группа NR₄связана с группой СО группы РАВ-СО;

- Q представляет собой фрагмент лекарственного средства; - с равно 0 или 1;

- m является целым числом от 1 до 15;

- n является целым числом от 1 до 6;

- р является целым числом от 1 до 6;

- q равно 2;

- u является целым числом от 1 до 6;

- v является целым числом от 1 до 6;

- w является целым числом от 0 до 2;

- у равно 0 или 1;

- z равно 0 или 1; и

- z' равно 0 или 1,

где

указанный фрагмент лекарственного средства выбран из:

- остатка майтансина, DM1 или DM4, или имеет:

- следующую формулу (А):

- следующую формулу (В):

- следующую формулу (С):

где:

- R₁ представляет собой Н или ОН,

- R₂ представляет собой (С₁-С₆)алкил, СООН, СОО-((С₁-С₆)алкил) или тиазолил,

- R₃ представляет собой Н или (С₁-С₆)алкил, в частности (С₁-С₆)алкил,

- Х₄ является О или NR₉,

- R₉представляет собой Н или (С₁-С₆)алкил, а

10. Конъюгат линкер-лекарственное средство по п. 9, где у равно 0, когда w равно 0, и у равно 0 или 1, когда w является целым числом от 1 до 2.

11. Конъюгат линкер-лекарственное средство по п. 9 или 10, где L₁', W, w, Х₁ и Х₂ - такие как определено по любому из пп. 3-7.

12. Применение линкера по любому из пп. 1-8 или конъюгата лекарственное средство-линкер по любому из пп. 9-11 для ковалентного связывания лекарственного средства со связывающим звеном, выбранным из пептида, белка, антитела и его антигенсвязывающего фрагмента.

13. Конъюгат связывающее звено-лекарственное средство следующей формулы (III) или (IV):

или его фармацевтически приемлемая соль,

где:

- связывающее звено является антителом или его антигенсвязывающим фрагментом;

- Y представляет собой PAB-CO-(Z)_z-, где РАВ является (кислород звена РАВ связан с CO-(Z)_z;

- с равно 0 или 1;

- m является целым числом от 1 до 15;

- n является целым числом от 1 до 6;

- р является целым числом от 1 до 6;

- s является целым числом от 1 до 8;

- u является целым числом от 1 до 6;

- v является целым числом от 1 до 6;

- w является целым числом от 0 до 5;

- у равно 0 или 1;

- z равно 0 или 1; и

- z' равно 0 или 1, где указанный фрагмент лекарственного средства выбран из:

- остатка майтансина, DM1 или DM4, или имеет:

- следующую формулу (А):

- следующую формулу (В):

- следующую формулу (С):

где:

- R₁ представляет собой Н или ОН,

- R₃ представляет собой Н или (С₁-С₆)алкил, в частности, (С₁-С₆)алкил,

- Х₄ является О или NR₉,

- R₉ представляет собой Н или (С₁-С₆)алкил, а

14. Конъюгат связывающее звено-лекарственное средство по п. 13, где L₁', W, и w – такие, как определено по любому из пп. 5-6.

15. Конъюгат связывающее звено-лекарственное средство по п. 13 или 14, где антитело представляет собой антитело к IGF-1R или антитело к HER2.

16. Фармацевтическая композиция для лечения рака, включающая эффективное количество конъюгата связывающее звено-лекарственное средство по любому из пп. 13-15 и по меньшей мере одно фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.

17. Фармацевтическая композиция по п. 15, где рак представляет собой рак предстательной железы, остеосаркому, рак легких, рак молочной железы, рак эндометрия, глиобластому, рак толстой кишки, рак желудка, рак почек, рак поджелудочной железы или рак головы и шеи.

18. Применение конъюгата связывающее звено-лекарственное средство по любому из пп. 13-15 для изготовления медицинского препарата, предназначенного для лечения рака.

19. Применение по п. 18, где рак представляет собой рак предстательной железы, остеосаркому, рак легких, рак молочной железы, рак эндометрия, глиобластому, рак толстой кишки, рак желудка, рак почек, рак поджелудочной железы или рак головы и шеи.