KR102051503B1 - 항체 약물 접합체에 사용하기 위한 안정성-조정 링커 - Google Patents

항체 약물 접합체에 사용하기 위한 안정성-조정 링커 Download PDF

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Abstract

본 발명은 안정성-조정된 항체-약물 접합체, 이들 안정성-조정된 항체-약물 접합체를 제조하는데 사용된 안정성-조정 링커 성분, 안정성-조정된 항체-약물 접합체를 사용하는 치료 방법, 및 안정성 조정 링커 및 안정성-조정된 항체-약물 접합체를 제조하는 방법을 제공한다.

Description

항체 약물 접합체에 사용하기 위한 안정성-조정 링커 {STABILITY-MODULATING LINKERS FOR USE WITH ANTIBODY DRUG CONJUGATES}
분야
본 발명은 항체-약물 접합체 (ADC)의 세포외 및/또는 세포내 안정성을 상향- 및 하향-조정할 수 있는 항체-약물 접합체와 관련하여 사용되는 링커에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 임상적으로 유리한 안정성-조정된 항체-약물 접합체를 사용하는 치료 용도 및 치료 요법에 관한 것이다. 마지막으로, 본 발명은 안정성 조정 링커 및 안정성-조정된 항체-약물 접합체를 제조하는 방법에 관한 것이다.
서열 목록에 대한 참조
본 출원은 EFS-웹을 통해 전자적으로 출원되었으며 .txt 포맷의 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함한다. 상기 .txt 파일은 2015년 8월 14일에 생성되었으며10 KB의 크기를 갖는 파일명 "PC72108A_SEQ_LISTING_ST25.txt"의 서열 목록을 함유한다. 상기 .txt 파일에 함유된 서열 목록은 본 명세서의 일부이며 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
항체 요법은 다양한 장애, 예컨대 암 및 면역 질환을 갖는 환자에서 표적화된 치유적 치료를 제공하고, 따라서 생물학적 연구에서 중요한 역할을 해왔다. 항체-약물 접합체 (ADC)를 포함한 표적화된 항체 요법의 다양한 접근법이 연구되었다. 문헌 [Chari, R. V., Miller, M. L., and Widdison, W. C. (2014) Antibody-drug conjugates: an emerging concept in cancer therapy. Angewandte Chemie 53, 3796-827; Senter, P. D., and Sievers, E. L. (2012) The discovery and development of ADCETRIS® (brentuximab vedotin) for use in relapsed Hodgkin lymphoma and systemic anaplastic large cell lymphoma. Nature biotechnology 30, 631-7; Lambert, J. M. (2013) Drug-conjugated antibodies for the treatment of cancer. British journal of clinical pharmacology 76, 248-62].
ADC (또한 특정 문맥에서 면역접합체로 불림)의 경우에, 종종 세포독성 소분자 (약물 모이어티)인 소분자 "페이로드"는 종양으로의 약물 모이어티의 표적화된 국부 전달을 위해 항체에 공유 연결 (접합)된다. ADC에 대한 통상적인 접합 방법은 리신 측쇄 아민을 통한 또는 쇄간 디술피드 결합을 환원시킴으로써 활성화된 시스테인 술프히드릴 기를 통한 화학적 변형을 포함한다. 브렌툭시맙 베도틴 및 카드실라(KADCYLA)® (아도-트라스투주맙 엠탄신)는 이들 통상적인 방법을 사용하는 ADC의 2가지 예이다.
ADC를 제조하기 위해 트랜스글루타미나제를 사용하는 효소적 접근법이 또한 연구되었다. 트랜스글루타미나제는 1급 아민에의 아실 부가를 촉매하는 효소의 패밀리에 속한다. 트랜스글루타미나제를 사용하는 접합은 높은 선택성, 단순화된 반응 절차 및 경도 반응 조건의 이점을 제공한다. 예를 들어, 문헌 [Strop et al., Chemistry & Biology, 20:161-167 (2013); 및 Farias et al., Bioconj. Chem. 25(2):240-250 (2014)]을 참조한다. US2013-0230543 및 US2013-0122020은 항체 및 소분자의 트랜스글루타미나제-매개 부위-특이적 접합을 기재한다.
통상적인 ADC 접합 방법은 주어진 생물계에서 고유한 안정성을 갖는 ADC를 생성한다. 목적하는 부위, 전형적으로 종양에의 페이로드의 전달은 페이로드의 특성, 공유 링커, 항체 및 ADC가 도입되는 생물계에 좌우된다. 종종, 상당량의 페이로드는, 예를 들어 혈장에서 최적-안정성 미만의 ADC로부터 조기에 방출되고, 따라서 종양 부위에서 페이로드의 목적하는 노출을 달성하기 위해 보다 높은 ADC 투여 수준을 필요로 한다. 다른 상황에서 과도하게 안정한 ADC의 사용은 표적화된 종양 세포 내에 최적 미만의 페이로드 방출 활성을 유발한다.
p-아미노벤질옥시카르보닐 (PABC) 희생 요소를 사용하는 단백질분해적으로 절단가능한 펩티드-기반 연결은 2002년에 그의 도입 이후로 항체-약물 접합체 (ADC) 연구에에서 폭넓게 사용되어 왔다 (Dubowchik, G.M. et al. Bioconjugate Chem. 2002, 13, 855-869). 이러한 연결은 보고된 바로는 항원-표적화된 세포 내로의 내재화 및 엔도솜 및 리소솜 소기관에서 발견된 분해적 단백질분해 환경에의 ADC 노출 시에 절단을 겪는다. 이들 디펩티드-PABC 링커의 시스테인-연결된 변이체는 특허를 받았고 (US 6,214,345 B2), 이들 및 다른 연결의 아민-함유 버전은 미생물 트랜스글루타미나제에 의해 촉진되는 효소적 접합을 사용하는 글루타민 잔기에 대한 부위-특이적 접합, 뿐만 아니라 이러한 효소적 접합 접근법을 사용하여 효율적 접합을 겪는 비-글리코실화 항체 및 조작된 항체 변이체의 사용에 적절하다는 것이 입증되었다 (WO2012/059882 A2).
본원에 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허 및 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 참조로 포함되도록 나타낸 바와 동일한 정도로 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 정의된 용어, 용어 용법, 기재된 기술 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 포함된 문헌 및 유사한 자료 중 하나 이상이 본 출원과 상이하거나 모순되는 경우에, 본 출원이 우선한다.
본 발명은 일반적으로 ADC에 관한 것이며, 전형적으로 ADC의 링커 상의 조정 모이어티의 존재에 의해 변경되는 안정성 특성을 갖는, 트랜스글루타미나제-매개 접합을 사용함으로써 제조된 ADC에 관한 것이다. 본 발명자들은 놀랍게도 ADC 링커 상의 특정 위치에 위치하는 이러한 조정 모이어티 및 보다 구체적으로 이들 조정 모이어티 내로 혼입된 특정 화학적 특색부가 ADC의 안정성을 목적하는 대로 증가 또는 감소시켜 목적하는 작용 부위에서 보다 많은 또는 보다 적은 비율의 ADC 페이로드가 방출되도록 하는 능력을 갖는다는 것을 발견하였다.
따라서, 본원에서 생성된 ADC의 시험관내 혈장 안정성 및 생체내 노출에 대한 심오한 효과를 가질 수 있는, 종종 리신의 아실화 유도체인 아민-함유 접합 핸들 상의 특정 치환이 제공된다. 접합체 안정성은 아민-함유 접합 핸들 상에 존재하는 치환기의 성질을 변경시킴으로써 조정될 수 있고, 추가로 치환기는 각각의 고유한 접합 부위의 안정성을 최적화하도록 선택될 수 있다는 것이 입증된다. 따라서 본 발명은 생체내 ADC 안정성의 미세-조율을 허용하고, 따라서 생체내 효능 및 안전성 둘 다에 영향을 미치는 파라미터의 조정을 가능하게 하고, 따라서 ADC의 치료 지수의 최적화를 허용한다.
도 1a 내지 1i는 아미노-카프로일 (C6) vcAur0101 세포독성 페이로드와 소정 범위의 부위에서 접합된 키메라 항-Trop2 항체의 시험관내 세포독성 연구를 제시한다.
도 1j 내지 1o는 실시예 2, 3 및 5의 링커-페이로드와 부위 LCQ04 및 L11B에서 접합된 키메라 항 Trop2 항체의 시험관내 세포독성 연구를 제시한다.
도 2는 Trop2 항체 상의 LCQ04 부위를 통해 연결되는 실시예 12 및 14 ADC 화합물 (도 2a); 실시예 16 및 13 ADC 화합물 (도 2b); 및 실시예 11, 18 및 17 ADC 화합물 (도 2c)의 생체내 안정성을 제시한다. 파선은 페이로드 농도를 나타내고, 실선은 항체 농도를 나타낸다.
도 3은 마우스 녹아웃 균주 c56/bl6 ces1c-/-, 이형접합 균주 c56/bl6 ces1c+/- 및 야생형 균주 c56/bl6 ces1c+/+의 비교에 의한, 혈장에서 vc-pabc 링커 절단을 담당하는 효소로서 마우스 카르복실에스테라제 1c의 확인을 제공한다.
본 발명은 일반적으로 설계된 안정성 정도를 갖는 항체-약물 접합체 (ADC)에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 화학식 I의 화합물을 제공한다:
<화학식 I>
Figure 112017018870512-pct00001
여기서
M은 안정성 조정제이고;
P는 1개 이상의 글루타민 잔기를 포함하는 펩티드 서열이고;
Q는 P에 존재하는 상기 글루타민 잔기 중 1개이고;
각각의 E는 독립적으로 -C(R1)2-, r이 적어도 2인 경우에 -O-C(R1)2-C(R1)2-, 및 s가 적어도 1인 경우에 -C(R1)2-C(R1)2-O-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 R1은 독립적으로 H, C1-C6 직쇄형 또는 분지형 알킬, C2-C6 직쇄형 또는 분지형 알케닐, 및 C2-C6 직쇄형 또는 분지형 알키닐로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 X는 독립적으로 아미노산이며, 여기서 각각의 아미노산 X는 동일하거나 상이하고;
각각의 Y는 독립적으로 아미노산이며, 여기서 각각의 아미노산 Y는 동일하거나 상이하고;
각각의 Z는 독립적으로 스페이서 요소이며, 여기서 각각의 스페이서 요소는 동일하거나 상이하고;
m은 0-5이고, n은 1-5이고, p는 0-2이고, q는 0-10이고, r은 0-2이고, s는 0-2이며, 여기서 q+r+s=2 이상이고;
D는 세포독성제 또는 다른 치료제이거나, 또는 D는 영상화제이다.
본 발명의 실시양태는 또한 화학식 II의 화합물을 포함한다:
<화학식 II>
Figure 112017018870512-pct00002
여기서
M은 안정성 조정제이고;
P는 1개 이상의 글루타민 잔기를 포함하는 펩티드 서열이고;
Q는 P에 존재하는 상기 글루타민 잔기 중 1개이고;
각각의 E는 -C(R1)2-, r이 적어도 2인 경우에 -O-C(R1)2-C(R1)2-, 및 s가 적어도 1인 경우에 -C(R1)2-C(R1)2-O-로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
각각의 R1은 독립적으로 H, C1-C6 직쇄형 또는 분지형 알킬, C2-C6 직쇄형 또는 분지형 알케닐, 및 C2-C6 직쇄형 또는 분지형 알키닐로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 X는 독립적으로 아미노산이며, 여기서 각각의 아미노산 X는 동일하거나 상이하고;
각각의 Y는 독립적으로 아미노산이며, 여기서 각각의 아미노산 Y는 동일하거나 상이하고;
각각의 Z는 독립적으로 스페이서 요소이며, 여기서 각각의 스페이서 요소는 동일하거나 상이하고;
m은 0-5이고, n은 1-5이고, p는 0-2이고, q는 0-10이고, r은 0-2이고, s는 0-2이며, 여기서 q+r+s=2 이상이고;
D는 세포독성제 또는 다른 치료제이거나, 또는 D는 영상화제이다.
추가의 실시양태는 항체 약물 접합체의 제조에 유용한 화학식 III의 화합물을 포함한다:
<화학식 III>
Figure 112017018870512-pct00003
여기서
M은 안정성 조정제이고;
각각의 E는 독립적으로 -C(R1)2-, r이 적어도 2인 경우에 -O-C(R1)2-C(R1)2-, 및 s가 적어도 1인 경우에 -C(R1)2-C(R1)2-O-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 R1은 독립적으로 H, C1-C6 직쇄형 또는 분지형 알킬, C2-C6 직쇄형 또는 분지형 알케닐, 및 C2-C6 직쇄형 또는 분지형 알키닐로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 X는 독립적으로 아미노산이며, 여기서 각각의 아미노산 X는 동일하거나 상이하고;
각각의 Y는 독립적으로 아미노산이며, 여기서 각각의 아미노산 Y는 동일하거나 상이하고;
각각의 Z는 독립적으로 스페이서 요소이며, 여기서 각각의 스페이서 요소는 동일하거나 상이하고;
m은 0-5이고, n은 1-5이고, p는 0-2이고, q는 0-10이고, r은 0-2이고, s는 0-2이며, 여기서 q+r+s=2 이상이고;
D는 세포독성제 또는 다른 치료제이거나, 또는 D는 영상화제이다.
본 발명의 실시양태는 M이 -M1-M2이며, 여기서 M1은 -NR1-C(O)-, -NR1-S(O)2-이거나 또는 부재하고, M2는 치환된 메틸, -C2-C20 알킬, -C1-C20 헤테로알킬, -C2-C6 알케닐, -C2-C6 알키닐, C1-C6 알콕시, 카르복시, -N(R1)2, -C6-C14 아릴, -C6-C14 헤테로아릴, -C1-C10 헤테로시클릴 및 -C3-C10 카르보시클릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 M2는 -C1-C6 알킬, -C1-C6 알케닐, -C1-C6 알키닐, 할로, C1-C6 알콕시, 히드록실, -N(R1)2, -C(O) N(R1)2, -NO2, -C6-C14 아릴, -C6-C14 헤테로아릴, -C1-C10 헤테로시클릴, -C3-C10 카르보시클릴, 카르복시, -SH, -S(C1-C6 알킬), -S(C6-C14 아릴), -S(C6-C14 헤테로아릴), -S(C1-C10 헤테로시클릴), -S(C3-C10 카르보시클릴), -C1-C8 알킬-C(O)-C1-C8 알킬, -C1-C8 알킬-C(O)-H, -C1-C8 알킬-C(O)-O-C1-C8 알킬, -NR1-C(O)-N(R1)2, -C1-C8 알킬-O-C(O)-N(R1)2, -C1-C8 알킬-S(O)2-N(R1)2, -C1-C8 알킬-S(O)2-OH, -C1-C8 알킬-S(O)2-C1-C8 알킬 및 -C1-C8 알킬-S(O)-C1-C8 알킬로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 치환기로 임의로 추가로 치환되며; 단 M1이 -NH-C(O)-이고 -(C(R1)2)r-Eq-(C(R1)2)s-가 직쇄 C4-알킬인 경우에, M2는 비치환된 메틸이 아닌 것인 본원에 기재된 바와 같은 화합물을 포함한다.
본 발명의 실시양태는 M이 -M1-M2이며, 여기서 M1은 -NR1-C(O)-, -NR1-S(O)2-이거나 또는 부재하고, M2는 -C2-C10 알킬, -C1-C10 헤테로알킬, -C6-C14 아릴, -C6-C14 헤테로아릴, -C1-C10 헤테로시클릴 및 -C3-C10 카르보시클릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 M2는 -C1-C6 알킬, 할로, -C6-C14 아릴 및 -C6-C14 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 치환기로 임의로 추가로 치환된 것인 본원에 기재된 바와 같은 화합물을 포함한다.
추가의 실시양태는 M2가 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 본원에 기재된 바와 같은 화합물을 포함한다:
Figure 112017018870512-pct00004
일부 실시양태에서, 본 발명의 ADC는 변형된 아실 조정 모이어티를 갖는 리신-기반 링커 시스템을 포함하며, 여기서 변형된 아실 조정 모이어티는 하기이다:
Figure 112017018870512-pct00005
일부 실시양태에서, 본 발명의 ADC는 변형된 아실 조정 모이어티를 갖는 리신-기반 링커 시스템을 포함하며, 여기서 변형된 아실 조정 모이어티는 하기이다:
Figure 112017018870512-pct00006
일부 실시양태에서, 본 발명의 ADC는 변형된 아실 조정 모이어티를 갖는 리신-기반 링커 시스템을 포함하며, 여기서 변형된 아실 조정 모이어티는 하기이다:
Figure 112017018870512-pct00007
일부 실시양태에서, 본 발명의 ADC는 변형된 아실 조정 모이어티를 갖는 리신-기반 링커 시스템을 포함하며, 여기서 변형된 아실 조정 모이어티는 하기이다:
Figure 112017018870512-pct00008
일부 실시양태에서, 본 발명의 ADC는 변형된 아실 조정 모이어티를 갖는 리신-기반 링커 시스템을 포함하며, 여기서 변형된 아실 조정 모이어티는 하기이다:
Figure 112017018870512-pct00009
일부 실시양태에서, 본 발명의 ADC는 변형된 아실 조정 모이어티를 갖는 리신-기반 링커 시스템을 포함하며, 여기서 변형된 아실 조정 모이어티는 하기이다:
Figure 112017018870512-pct00010
일부 실시양태에서, 본 발명의 ADC는 변형된 아실 조정 모이어티를 갖는 리신-기반 링커 시스템을 포함하며, 여기서 변형된 아실 조정 모이어티는 하기이다:
Figure 112017018870512-pct00011
일부 실시양태에서, 본 발명의 ADC는 변형된 아실 조정 모이어티를 갖는 리신-기반 링커 시스템을 포함하며, 여기서 변형된 아실 조정 모이어티는 하기이다:
Figure 112017018870512-pct00012
일부 실시양태에서, 본 발명의 ADC는 변형된 아실 조정 모이어티를 갖는 리신-기반 링커 시스템을 포함하며, 여기서 변형된 아실 조정 모이어티는 하기이다:
Figure 112017018870512-pct00013
일부 실시양태에서, 본 발명의 ADC는 변형된 아실 조정 모이어티를 갖는 리신-기반 링커 시스템을 포함하며, 여기서 변형된 아실 조정 모이어티는 하기이다:
Figure 112017018870512-pct00014
일부 실시양태에서, 본 발명의 ADC는 변형된 아실 조정 모이어티를 갖는 리신-기반 링커 시스템을 포함하며, 여기서 변형된 아실 조정 모이어티는 하기이다:
Figure 112017018870512-pct00015
일부 실시양태에서, 본 발명의 ADC는 변형된 아실 조정 모이어티를 갖는 리신-기반 링커 시스템을 포함하며, 여기서 변형된 아실 조정 모이어티는 하기이다:
Figure 112017018870512-pct00016
일부 실시양태에서, 본 발명의 ADC는 변형된 아실 조정 모이어티를 갖는 리신-기반 링커 시스템을 포함하며, 여기서 변형된 아실 조정 모이어티는 하기이다:
Figure 112017018870512-pct00017
일부 실시양태에서, 본 발명의 ADC는 변형된 아실 조정 모이어티를 갖는 리신-기반 링커 시스템을 포함하며, 여기서 변형된 아실 조정 모이어티는 하기이다:
Figure 112017018870512-pct00018
일부 실시양태에서, 본 발명의 ADC는 변형된 아실 조정 모이어티를 갖는 리신-기반 링커 시스템을 포함하며, 여기서 변형된 아실 조정 모이어티는 하기이다:
Figure 112017018870512-pct00019
일부 실시양태에서, 본 발명의 ADC는 변형된 아실 조정 모이어티를 갖는 리신-기반 링커 시스템을 포함하며, 여기서 변형된 아실 조정 모이어티는 하기이다:
Figure 112017018870512-pct00020
일부 실시양태에서, 본 발명의 ADC는 변형된 아실 조정 모이어티를 갖는 리신-기반 링커 시스템을 포함하며, 여기서 변형된 아실 조정 모이어티는 하기이다:
Figure 112017018870512-pct00021
일부 실시양태에서, 본 발명의 ADC는 변형된 아실 조정 모이어티를 갖는 리신-기반 링커 시스템을 포함하며, 여기서 변형된 아실 조정 모이어티는 하기이다:
Figure 112017018870512-pct00022
일부 실시양태에서, 본 발명의 ADC는 변형된 아실 조정 모이어티를 갖는 리신-기반 링커 시스템을 포함하며, 여기서 변형된 아실 조정 모이어티는 하기이다:
Figure 112017018870512-pct00023
일부 실시양태에서, 본 발명의 ADC는 변형된 아실 조정 모이어티를 갖는 리신-기반 링커 시스템을 포함하며, 여기서 변형된 아실 조정 모이어티는 하기이다:
Figure 112017018870512-pct00024
일부 실시양태에서, 본 발명의 ADC는 변형된 아실 조정 모이어티를 갖는 리신-기반 링커 시스템을 포함하며, 여기서 변형된 아실 조정 모이어티는 하기이다:
Figure 112017018870512-pct00025
일부 실시양태에서, 본 발명의 ADC는 변형된 아실 조정 모이어티를 갖는 리신-기반 링커 시스템을 포함하며, 여기서 변형된 아실 조정 모이어티는 하기이다:
Figure 112017018870512-pct00026
일부 실시양태에서, 본 발명의 ADC는 변형된 아실 조정 모이어티를 갖는 리신-기반 링커 시스템을 포함하며, 여기서 변형된 아실 조정 모이어티는 하기이다:
Figure 112017018870512-pct00027
일부 실시양태에서 상기 화합물의 세포외 안정성을 조정할 수 있는 조정제 M을 선택하는 단계; 상기 조정제 M을 상기 접합체 내로 혼입시키는 단계; 및 상기 접합체를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, ADC의 생체내 안정성을 조정하는 방법이 제공된다.
일부 실시양태에서 안정성은 표적 세포 내부에서 방출된 세포독성제와 비교하여 표적 세포 외부에서 방출된 세포독성제의 비가 증가하도록 조정된다.
일부 실시양태에서 안정성은 표적 세포 내부에서 방출된 세포독성제와 비교하여 표적 세포 외부에서 방출된 세포독성제의 비가 감소하도록 조정된다.
일부 실시양태에서 안정성은 표적 세포 외부에서 방출된 세포독성제와 비교하여 표적 세포 내부에서 방출된 세포독성제의 비가 증가하도록 조정된다.
일부 실시양태에서 안정성은 표적 세포 외부에서 방출된 세포독성제와 비교하여 표적 세포 내부에서 방출된 세포독성제의 비가 감소하도록 조정된다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 정제 단계를 추가로 포함하며, 여기서 ADC는 크로마토그래피 단계에 의해 정제된다.
일부 실시양태에서, 트랜스글루타미나제는 미생물 트랜스글루타미나제, 정제된 트랜스글루타미나제 또는 조작된 트랜스글루타미나제이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 암의 치료를 필요로 하는 대상체에게 ADC 또는 본원에 기재된 바와 같은 ADC를 포함하는 제약 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 종양 성장 또는 진행의 억제를 필요로 하는 대상체에게 본원에 기재된 바와 같은 ADC를 포함하는 제약 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 종양 성장 또는 진행을 억제하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 a) 암을 앓고 있는 것으로 의심되는 대상체의 샘플을 본원에 기재된 바와 같은 ADC와, 암-관련 단백질과의 ADC의 결합을 유발하는 조건 하에 접촉시키는 단계, 및 b) 암-관련 단백질에 대한 ADC의 결합을 결정하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 암을 진단하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 ADC 내의 항체는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 이중특이적 항체, 미니바디, 디아바디 또는 항체 단편이다.
본 발명의 실시양태는 세포독성제 D가 안트라시클린, 아우리스타틴, 스플라이세오스타틴, CBI/CPI 이량체 (미국 특허 가출원 61/932,118에 기재된 바와 같은 CBI 및 CPI 성분 둘 다를 포함하는 "혼합된" 이량체를 포함함), 칼리케아미신, 두오카르마이신, 에네디인, 겔다나마이신, 메이탄신, 퓨로마이신, 탁산, 빈카 알칼로이드, SN-38, 튜부리신, 헤미아스텔린, 캄프토테신, 콤브레타스타틴, 돌라스타틴, 인돌리노-벤조디아제핀 이량체, 피롤로벤조디아제핀 이량체 및 플라디에놀리드, 및 그의 입체이성질체, 동배체, 유사체 또는 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 본원에 기재된 바와 같은 화합물을 포함한다. 예를 들어, 실시양태에서 세포독성제 D가 돌라스타틴, MMAD, MMAE, MMAF, PF-06380101, PF-06463377 및 PF-06456780으로 이루어진 군으로부터 선택된 아우리스타틴이다.
본 발명의 추가의 실시양태는 D가 세포독성제 이외의 것이고, 예를 들어 D가 치료적 특성을 갖는 모이어티 (즉, 치료제)이며 펩티드(들), 단백질(들), 핵산(들), 성장 인자(들), 항바이러스제(들) 또는 면역학적 작용제(들)를 포함하거나, 또는 D가 형광단(들) 또는 다른 영상화제(들)인 것을 포함한다. D가 세포독성제인 경우에서와 같이, 본 발명은 D가 세포독성제 이외의 것인 화합물의 안정성 조정을 포함한다.
본 발명의 추가의 실시양태는 P가 Q, LQG, LLQGG (서열식별번호(SEQ ID NO: 1), LLQG (서열식별번호: 2), LSLSQG (서열식별번호: 3), GGGLLQGG (서열식별번호: 4), GLLQG (서열식별번호: 5), LLQ, GSPLAQSHGG (서열식별번호: 6), GLLQGGG (서열식별번호: 7), GLLQGG (서열식별번호: 8), GLLQ (서열식별번호: 9), LLQLLQGA (서열식별번호: 10), LLQGA (서열식별번호: 11), LLQYQGA (서열식별번호: 12), LLQGSG (서열식별번호: 13), LLQYQG (서열식별번호: 14), LLQLLQG (서열식별번호: 15), SLLQG (서열식별번호: 16), LLQLQ (서열식별번호: 17), LLQLLQ (서열식별번호: 18), LLQGR (서열식별번호: 19), LLQGPP (서열식별번호: 20), LLQGPA (서열식별번호: 21), GGLLQGPP (서열식별번호: 22), GGLLQGA (서열식별번호: 23), LLQGA (서열식별번호: 24), LLQGPGK (서열식별번호: 25), LLQGPG (서열식별번호: 26), LLQGP (서열식별번호: 27), LLQP (서열식별번호: 28), LLQPGK (서열식별번호: 29), LLQAPGK (서열식별번호: 30), LLQGAPG (서열식별번호: 31), LLQGAP (서열식별번호: 32), LLQGPA (서열식별번호: 33), LLQGPP (서열식별번호: 34), GGLLQGPP (서열식별번호: 35) 및 LLQLQG (서열식별번호: 36)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드인 화합물을 포함한다.
또한, 본 발명의 실시양태는 P가 아미노산 서열 XXQX (서열식별번호: 37) (여기서 X는 임의의 아미노산임)를 포함하는 펩티드인 본원에 기재된 바와 같은 화합물을 포함한다.
본 발명의 실시양태는 상기 화합물의 안정성이, 상기 조정제 M이 결여된 상응하는 화합물에 비해 적어도 1-, 5-, 10-, 25-, 50-, 75- 또는 100배 감소된 것인 본원에 기재된 바와 같은 화합물을 포함한다.
본 발명의 실시양태는 상기 화합물의 안정성이, 상기 조정제 M이 결여된 상응하는 화합물에 비해 적어도 1-, 5-, 10-, 25-, 50-, 75- 또는 100배 증가된 것인 본원에 기재된 바와 같은 화합물을 포함한다.
본 발명의 실시양태는 X-Y가 Gly, β-Ala, Val-Cit, Phe-Lys, Val-Lys, Phe-Phe-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ala-Cit, Trp-Cit, Phe-Ala, Gly-Phe-Leu-Gly, Ala-Leu-Ala-Leu, Phe-N9-토실-Arg, Phe-N9-니트로-Arg, Val-Ala 및 Ala-Ala-Asn으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 본원에 기재된 바와 같은 화합물을 포함한다.
본 발명의 실시양태는 P가 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 이중특이적 항체, 미니바디 및 항체 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 본원에 기재된 바와 같은 화합물을 포함한다.
본 발명의 실시양태는 항체가 트라스투주맙, 트라스투주맙 돌연변이체 (예를 들어 본원 또는 국제 특허 출원 PCT/IB2012/056234에 개시된 트라스투주맙 돌연변이체), 오레고보맙, 에드레콜로맙, 세툭시맙, 비트로넥틴 수용체 (αvβ3)에 대한 인간화 모노클로날 항체, 알렘투주맙, 비-호지킨 림프종의 치료를 위한 인간화 항-HLA-DR 항체를 포함한 항-HLA-DR 항체, 131I Lym-1, 비-호지킨 림프종의 치료를 위한 뮤린 항-HLA-Dr10 항체를 포함한 항-HLA-Dr10 항체, 항-cd33 항체, 호지킨병 또는 비-호지킨 림프종의 치료를 위한 인간화 항-CD22 mAb를 포함한 항-cd22 항체, 라베투주맙, 베바시주맙, 이브리투모맙 티욱세탄, 오파투무맙, 파니투무맙, 리툭시맙, 토시투모맙, 이필리무맙 및 겜투주맙으로부터 선택된 것인 본원에 기재된 바와 같은 화합물을 포함한다.
본 발명의 추가의 실시양태는 각각의 Q가 독립적으로 펩티드 서열 P에 내인성인 글루타민 잔기, 또는 상기 펩티드 서열 P 상의 조작된 태그 서열에 제공된 글루타민 잔기 (여기서 태그는 글루타민을 함유하는 다중 아미노산 서열, 또는 단순히 글루타민일 수 있음)인 본원에 기재된 바와 같은 화합물을 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면에서 항체는 안정성-조정된 절단가능한 링커를 통해 페이로드 D의 제어 방출을 용이하게 하는, 표적화된 전달 특색을 갖거나 갖지 않는 거대분자 담체로서의 역할을 한다.
본 발명의 실시양태는 각각의 Q가 상기 펩티드 서열 P에 내인성인 글루타민 잔기인 본원에 기재된 바와 같은 화합물을 포함한다.
본 발명의 실시양태는 각각의 Q가 상기 펩티드 서열 P 상의 조작된 태그 서열에 제공된 글루타민 잔기 (다시, 여기서 태그는 글루타민을 함유하는 다중 아미노산 서열, 또는 단순히 글루타민일 수 있음)인 본원에 기재된 바와 같은 화합물을 포함한다.
본 발명의 추가 실시양태는
화학식 II의 항체 약물 접합체 화합물의 세포외 안정성을 조정할 수 있는 조정제 M을 선택하는 단계;
상기 조정제 M을 상기 접합체 내로 혼입시키는 단계; 및
상기 접합체를 환자에게 투여하는 단계
를 포함하는, 화학식 II의 항체 약물 접합체의 생체내 안정성을 조정하는 방법을 포함한다:
<화학식 II>
Figure 112017018870512-pct00028
여기서
M은 안정성 조정제이고;
P는 1개 이상의 글루타민 잔기를 포함하는 펩티드 서열이고;
Q는 P에 존재하는 상기 글루타민 잔기 중 1개이고;
각각의 E는 독립적으로 -C(R1)2-, r이 적어도 2인 경우에 -O-C(R1)2-C(R1)2-, 및 s가 적어도 1인 경우에 -C(R1)2-C(R1)2-O-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 R1은 독립적으로 H, C1-C6 직쇄형 또는 분지형 알킬, C2-C6 직쇄형 또는 분지형 알케닐, 및 C2-C6 직쇄형 또는 분지형 알키닐로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 X는 독립적으로 아미노산이며, 여기서 각각의 아미노산 X는 동일하거나 상이하고;
각각의 Y는 독립적으로 아미노산이며, 여기서 각각의 아미노산 Y는 동일하거나 상이하고;
각각의 Z는 독립적으로 스페이서 요소이며, 여기서 각각의 스페이서 요소는 동일하거나 상이하고;
m은 0-5이고, n은 1-5이고, p는 0-2이고, q는 0-10이고, r은 0-2이고, s는 0-2이며, 여기서 q+r+s=2 이상이고;
D는 세포독성제이다.
본 발명의 실시양태는 표적 세포 내부에서 방출된 세포독성제와 비교하여 표적 세포 외부에서 방출된 세포독성제의 비가 증가된 것인 본원에 기재된 바와 같은 치료 방법을 포함한다.
본 발명의 실시양태는 표적 세포 내부에서 방출된 세포독성제와 비교하여 표적 세포 외부에서 방출된 세포독성제의 비가 감소된 것인 본원에 기재된 바와 같은 치료 방법을 포함한다.
본 발명의 실시양태는 표적 세포 외부에서 방출된 세포독성제와 비교하여 표적 세포 내부에서 방출된 세포독성제의 비가 증가된 것인 본원에 기재된 바와 같은 치료 방법을 포함한다.
본 발명의 실시양태는 표적 세포 외부에서 방출된 세포독성제와 비교하여 표적 세포 내부에서 방출된 세포독성제의 비가 감소된 것인 본원에 기재된 바와 같은 치료 방법을 포함한다.
본 발명의 추가 실시양태는
하기 구조의 제1 화합물의 소정량을 제공하는 단계;
Figure 112017018870512-pct00029
글루타민이 혼입된 펩티드 서열을 포함하는 제2 화합물의 소정량을 제공하는 단계; 및
상기 소정량의 제1 및 제2 화합물을 트랜스글루타미나제의 존재 하에 반응시키는 단계
를 포함하는, 화학식 II의 화합물을 합성하는 방법을 포함한다:
<화학식 II>
Figure 112017018870512-pct00030
여기서
M은 안정성 조정제이고;
P는 1개 이상의 글루타민 잔기를 포함하는 펩티드 서열이고;
Q는 P에 존재하는 상기 글루타민 잔기 중 1개이고;
각각의 E는 독립적으로 -C(R1)2-, r이 적어도 2인 경우에 -O-C(R1)2-C(R1)2-, 및 s가 적어도 1인 경우에 -C(R1)2-C(R1)2-O-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 R1은 독립적으로 H, C1-C6 직쇄형 또는 분지형 알킬, C2-C6 직쇄형 또는 분지형 알케닐, 및 C2-C6 직쇄형 또는 분지형 알키닐로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 X는 독립적으로 아미노산이며, 여기서 각각의 아미노산 X는 동일하거나 상이하고;
각각의 Y는 독립적으로 아미노산이며, 여기서 각각의 아미노산 Y는 동일하거나 상이하고;
각각의 Z는 독립적으로 스페이서 요소이며, 여기서 각각의 스페이서 요소는 동일하거나 상이하고;
m은 0-5이고, n은 1-5이고, p는 0-2이고, q는 0-10이고, r은 0-2이고, s는 0-2이며, 여기서 q+r+s=2 이상이고;
D는 세포독성제이다.
본 발명의 실시양태는 Z가 PABC (p-아미노벤질-카르바모일), PAB-OH (p-아미노카르바모일옥시),
Figure 112017018870512-pct00031
(여기서 T는 O, NH 또는 S임)로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 본원에 기재된 바와 같은 화합물을 포함한다.
본 발명의 실시양태는 Z가 Z1-Z2이며, 여기서 Z1은 p-아미노벤질-카르바모일 (PABC), p-아미노벤질옥시, o-아미노벤질-카르바모일, o-아미노벤질옥시, -NH-U-C(R1)2OCO- 및 -NH-U-C(R1)2O-로 이루어진 군으로부터 선택되고; Z2는 부재하거나 또는 -N(R1)2-(C1-C6-알킬렌)-OCO-, -N(R1)2-(C1-C6-알킬렌)-N(R1)2CO-, -N(R1)2-(C1-C6-알킬렌)-SCO-, -N(R1)2-(C3-C9-시클로알킬렌)-OCO-, -N(R1)2-(C3-C9-시클로알킬렌)-N(R1)2CO- 및 -N(R1)2-(C3-C9-알킬렌)-SCO-로 이루어진 군으로부터 선택되고; 여기서 U는 -C1-C6 알킬, -C1-C6 알케닐, -C1-C6 알키닐, 할로, C1-C6 알콕시, 히드록실, -N(R1)2, -C(O) N(R1)2, -NO2, -C6-C14 아릴, -C6-C14 헤테로아릴, -C1-C10 헤테로시클릴, -C3-C10 카르보시클릴, 카르복시, -SH, -S(C1-C6 알킬), -S(C6-C14 아릴), -S(C6-C14 헤테로아릴), -S(C1-C10 헤테로시클릴), -S(C3-C10 카르보시클릴), -C1-C8 알킬-C(O)-C1-C8 알킬, -C1-C8 알킬-C(O)-H, -C1-C8 알킬-C(O)-O-C1-C8 알킬, -NR1-C(O)-N(R1)2, -C1-C8 알킬-O-C(O)-N(R1)2, -C1-C8 알킬-S(O)2-N(R1)2, -C1-C8 알킬-S(O)2-OH, -C1-C8 알킬-S(O)2-C1-C8 알킬 및 -C1-C8 알킬-S(O)-C1-C8 알킬로 이루어진 군으로부터 선택된 5개 이하의 추가의 치환기로 임의로 치환된 C5-C20 방향족 또는 헤테로방향족 고리인 본원에 기재된 바와 같은 화합물을 포함한다. U에서 -NH- 및 -C(R1)2OCO- 또는 -C(R1)2O-의 치환 패턴은 Y-Z 결합의 절단 시에 Z2-D의 효율적 제거를 허용하도록 배열되어야 한다. 예를 들어, US 7,754,681 B2 및 US 6214345 B2를 참조한다.
용어 "알킬"은 그 자체로 또는 또 다른 용어의 일부로서, 나타낸 수의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지형 포화 탄화수소를 지칭한다 (예를 들어, "C1-C8" 알킬은 1 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 알킬 기를 지칭함). 탄소 원자의 수를 나타내지 않은 경우에, 알킬 기는 1 내지 8개의 탄소 원자를 갖는다. 대표적인 직쇄 C1-C8 알킬은 메틸, 에틸, n-프로필, n-부틸, n-펜틸, n-헥실, n-헵틸 및 n-옥틸을 포함하나 이에 제한되지는 않고; 분지형 C1-C8 알킬은 -이소프로필, -sec-부틸, -이소부틸, -tert-부틸, -이소펜틸 및 -2-메틸부틸을 포함하나 이에 제한되지는 않고; 불포화 C2-C8 알킬은 비닐, 알릴, 1-부테닐, 2-부테닐, 이소부틸레닐, 1-펜테닐, 2-펜테닐, 3-메틸-1-부테닐, 2-메틸-2-부테닐, 2,3-디메틸-2-부테닐, 1-헥실, 2-헥실, 3-헥실, 아세틸레닐, 프로피닐, 1-부티닐, 2-부티닐, 1-펜티닐, 2-펜티닐 및 3-메틸-1-부티닐을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
용어 "헤테로알킬"은 그 자체로 또는 또 다른 용어와 조합되어, 달리 언급되지 않는 한 언급된 수의 탄소 원자, 및 O, N, Si 및 S (여기서 질소 및 황 원자는 임의로 산화될 수 있고, 질소 헤테로원자는 임의로 4급화될 수 있음)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 내지 3개의 헤테로원자로 이루어진, 완전 포화 또는 1 내지 3의 불포화도를 함유하는 안정한 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소 또는 그의 조합을 의미한다. 헤테로원자(들) O, N 및 S는 헤테로알킬 기의 임의의 내부 위치에 배치될 수 있다. 헤테로원자 Si는 알킬 기가 분자의 나머지에 부착되는 위치를 포함한, 헤테로알킬 기의 임의의 위치에 배치될 수 있다. 2개 이하의 헤테로원자는 연속적일 수 있다.
용어 "아릴"은 그 자체로 또는 또 다른 용어의 일부로서, 달리 나타내지 않는 한, 모 방향족 고리계의 단일 탄소 원자로부터의 1개의 수소 원자의 제거에 의해 유도된, 6-20개, 바람직하게는 6-14개의 탄소 원자의 치환 또는 비치환된 1가 카르보시클릭 방향족 탄화수소 라디칼을 의미한다. 전형적인 아릴 기는 벤젠, 치환된 벤젠, 나프탈렌, 안트라센, 비페닐 등으로부터 유도된 라디칼을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 아릴 기는 하기 기: C1-C8 알킬, -O-(C1-C8 알킬), -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, 할로겐, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 및 -CN 중 1개 이상, 바람직하게는 1 내지 5개로 치환될 수 있고; 여기서 각각의 R'는 독립적으로 -H, C1-C8 알킬 및 비치환된 아릴로부터 선택된다. 용어 "헤테로시클릴"은 그 자체로 또는 또 다른 용어의 일부로서, 달리 나타내지 않는 한 1 내지 10개, 바람직하게는 3 내지 8개의 탄소 원자 (또한 고리원으로 지칭됨) 및 N, O, P 또는 S로부터 독립적으로 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자 고리원을 가지며, 모 고리계의 고리 원자로부터의 1개의 수소 원자의 제거에 의해 유도된, 1가 치환 또는 비치환된 방향족 또는 비-방향족 모노시클릭, 비시클릭 또는 트리시클릭 고리계를 지칭한다. 헤테로시클릴 내의 1개 이상의 N, C 또는 S 원자는 산화될 수 있다. 헤테로원자를 포함하는 고리는 방향족 또는 비방향족일 수 있다. 달리 나타내지 않는 한, 헤테로시클릴은 임의의 헤테로원자 또는 탄소 원자에서 그의 펜던트 기에 부착되어 안정한 구조를 생성한다. C1-C10 헤테로시클릴의 대표적인 예는 테트라히드로푸라닐, 옥세타닐, 피라닐, 피롤리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 벤조푸라닐, 벤조티오펜, 벤조티아졸릴, 인돌릴, 벤조피라졸릴, 피롤릴, 티오페닐 (티오펜), 푸라닐, 티아졸릴, 이미다졸릴, 피라졸릴, 트리아졸릴, 1,2,3,4-테트라히드로-퀴놀리닐과 같은 모이어티를 포함한 퀴놀리닐, 피리미디닐, 피리디닐, 피리도닐, 피라지닐, 피리다지닐, 이소티아졸릴, 이속사졸릴, 테트라졸릴, 에폭시드, 옥세탄 및 바디피(BODIPY) (치환 또는 비치환됨)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. C1-C10 헤테로시클릴은 C1-C8 알킬, C1-C8 헤테로알킬, -OR', 아릴, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -S(=O)2R', -S(O)R', 할로겐, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 및 -CN (여기서 각각의 R'는 -H, C1-C8 알킬, C1-C8 헤테로알킬 및 아릴로부터 독립적으로 선택됨)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 7개 이하의 기로 치환될 수 있다. 일부 실시양태에서, 치환된 헤테로시클릴은 또한 -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=O)2R' 및 -SR' 중 1개 이상을 포함할 수 있다.
용어 "카르보시클릴"은 그 자체로 또는 또 다른 용어의 일부로서, 달리 나타내지 않는 한 모 고리계의 고리 원자로부터의 1개의 수소 원자의 제거에 의해 유도된 3-, 4-, 5-, 6-, 7- 또는 8원 1가, 치환 또는 비치환된, 포화 또는 불포화 비-방향족 모노시클릭 또는 비시클릭 카르보시클릭 고리를 지칭한다. 대표적인 카르보시클릴은 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로펜타디에닐, 시클로헥실, 시클로헥세닐, 1,3-시클로헥사디에닐, 1,4-시클로헥사디에닐, 시클로헵틸, 1,3-시클로헵타디에닐, 1,3,5-시클로헵타트리에닐, 시클로옥틸, 시클로옥타디에닐, 비시클로(1.1.1.)펜탄 및 비시클로(2.2.2.)옥탄을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 카르보시클릴 기는 비치환되거나 또는 C1-C8 알킬, C1-C8 헤테로알킬, -OR', 아릴, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -S(=O)2R', -S(=O)R', -OH, -할로겐, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 및 -CN (여기서 각각의 R'는 상기 나타낸 바와 같음)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 7개 이하의 기로 치환될 수 있다.
용어 "알케닐-"은, 달리 나타내지 않는 한 적어도 1개의 이중 결합 및 바람직하게는 2 내지 10개의 탄소 원자를 함유하는 직쇄 또는 분지쇄 불포화 탄화수소를 지칭한다. 알케닐- 기의 예는 에틸렌, 프로필렌, 1-부틸렌, 2-부틸렌, 이소부틸렌, sec-부틸렌, 1-펜텐, 2-펜텐, 이소펜텐, 1-헥센, 2-헥센, 3-헥센, 이소헥센, 1-헵텐, 2-헵텐, 3-헵텐, 1-옥텐, 2-옥텐, 3-옥텐, 4-옥텐, 1-노넨, 2-노넨, 3-노넨, 4-노넨, 1-데센, 2-데센, 3-데센, 4-데센 및 5-데센을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 알케닐- 기는 비치환 또는 치환될 수 있다.
용어 "알콕시-"는 알킬이 본원에 정의된 것인 기 알킬-O-를 지칭한다. 예시적인 알콕시- 기는 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 1-프로폭시, n-부톡시 및 t-부톡시를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 알콕시 기는 비치환 또는 치환될 수 있다.
용어 "알키닐-"은 적어도 1개의 삼중 결합 및 바람직하게는 2 내지 10개의 탄소 원자를 함유하는 직쇄 또는 분지쇄 불포화 탄화수소를 지칭한다. 알키닐- 기의 예는 아세틸렌, 프로핀, 1-부틴, 2-부틴, 이소부틴, sec-부틴, 1-펜틴, 2-펜틴, 이소펜틴, 1-헥신, 2-헥신, 3-헥신, 이소헥신, 1-헵틴, 2-헵틴, 3-헵틴, 1-옥틴, 2-옥틴, 3-옥틴, 4-옥틴, 1-노닌, 2-노닌, 3-노닌, 4-노닌, 1-데신, 2-데신, 3-데신, 4-데신 및 5-데신을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 알키닐 기는 비치환 또는 치환될 수 있다.
용어 "헤테로아릴-"은 산소, 황 및 질소로부터 선택된 적어도 1개의 헤테로원자 및 전형적으로 1 내지 9개의 탄소 원자를 함유하는 5-10원 모노 및 비시클릭 방향족 기를 지칭한다. 모노시클릭 헤테로아릴- 라디칼의 예는 옥사지닐, 티아지닐, 디아지닐, 트리아지닐, 티아디아조일, 테트라지닐, 이미다졸릴, 테트라졸릴, 이속사졸릴, 푸라닐, 푸라자닐, 옥사졸릴, 티아졸릴, 티오페닐, 피라졸릴, 트리아졸릴, 피리미디닐, N-피리딜, 2-피리딜, 3-피리딜 및 4-피리딜을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 비시클릭 헤테로아릴- 라디칼의 예는 벤즈이미다졸릴, 인돌릴, 이소퀴놀리닐, 벤조푸라닐, 벤조티오페닐, 인다졸릴, 퀴놀리닐, 퀴나졸리닐, 퓨리닐, 벤즈이속사졸릴, 벤족사졸릴, 벤즈티아졸릴, 벤조디아졸릴, 벤조트리아졸릴, 이소인돌릴 및 인다졸릴을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 헤테로아릴 기는 비치환 또는 치환될 수 있다.
용어 "카르복실-"은 카르복실 (C(O)-O-) 관능기의 산소 원자를 통해 모 구조에 부착된 기, 전형적으로 본원에 정의된 바와 같은 알킬 기를 지칭한다. 카르복실- 기의 예는 아세톡시, 프로피온옥시, 프로필카르복실 및 이소펜틸카르복실을 포함한다.
예를 들어 화학적 모이어티, 예컨대 "치환된 알킬"과 관련하여 "치환된"은, 달리 명시되지 않는 한 모이어티에서 1개 이상의 수소 원자가 각각 독립적으로 치환기로 대체된 것을 의미한다. 전형적인 치환기는 -X, -R, -O-, -OR, -SR, -S-, -NR2, -NR3, =NR, -CX3, -CN, -OCN, -SCN, -N=C=O, -NCS, -NO, -NO2, =N2, -N3, -NRC(=O)R, -C(=O)NR2, -SO3 -, -SO3H, -S(=O)2R, -OS(=O)2OR, -S(=O)2NR, -S(=O)R, -OP(=O)(OR)2, -P(=O)(OR)2, -PO3 2-, PO3H2, -AsO2H2, -C(=O)R, -C(=O)X, -C(=S)R, -CO2R, -CO2 -, -C(=S)OR, -C(=O)SR, -C(=S)SR, -C(=O)NR2, -C(=S)NR2 또는 -C(=NR)NR2 (여기서 각각의 X는 독립적으로 할로겐: -F, -Cl, -Br 또는 -I이고; 각각의 R은 독립적으로 -H, C1-C20 알킬, C1-C20 헤테로알킬, C6-C20 아릴, C1-C10 헤테로시클릴, 보호기 또는 전구약물 모이어티임)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
또한, 암의 치료, 종양 성장 또는 진행의 억제, 암 세포 또는 종양의 전이의 억제, 또는 종양 퇴행의 유도를 필요로 하는 대상체에게 본원에 기재된 바와 같은 ADC를 포함하는 제약 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 암을 치료하거나, 종양 성장 또는 진행을 억제하거나, 암 세포 또는 종양의 전이를 억제하거나, 또는 종양 퇴행을 유도하는 방법이 제공된다.
일반적 기술 및 정의
본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본 발명과 관련하여 사용된 과학 기술 용어는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 추가로, 문맥에서 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수형을 포함할 것이고, 복수 용어는 단수형을 포함할 것이다. 일반적으로, 본원에 기재된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학, 및 단백질 및 핵산 화학 및 혼성화와 관련되어 사용되는 명명법 및 그의 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명의 방법 및 기술은, 달리 나타내지 않는 한, 일반적으로 관련 기술분야에 널리 공지된 통상적인 방법에 따라 및 본 명세서 전반에 걸쳐 인용되고 논의된 다양한 일반적인 참고문헌 및 보다 구체적인 참고문헌에 기재된 바와 같이 수행된다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook J. & Russell D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2000); Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, John & Sons, Inc. (2002); Harlow and Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1998); 및 Coligan et al., Short Protocols in Protein Science, Wiley, John & Sons, Inc. (2003)]을 참조한다. 효소적 반응 및 정제 기술은 제조업체의 지침서에 따라, 관련 기술분야에서 통상적으로 수행되는 바와 같이 또는 본원에 기재된 바와 같이 수행된다. 본원에 기재된 분자 생물학, 생화학, 면역학, 분석 화학, 합성 유기 화학, 및 의약 및 제약 화학과 관련하여 사용된 명명법 및 그의 실험실 절차 및 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고 통상적으로 사용되는 것이다. 본 명세서 및 청구범위 전반에 걸쳐, 용어 "포함하다", 또는 "포함한다" 또는 "포함하는"과 같은 변형은 언급된 정수 또는 정수 군을 포함하지만 임의의 다른 정수 또는 정수 군을 배제하지는 않는다는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다.
본원에 사용된 용어 "글루타민-함유 태그", "글루타민 태그", "Q-함유 태그", "Q-태그" 또는 "트랜스글루타미나제 태그"는 1개 이상의 Gln 잔기(들)를 함유하는 폴리펩티드 또는 단백질을 지칭하거나, 또는 단일 글루타민 또는 글루타민 잔기를 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "부위 특이성", "부위-특이적으로 접합된" 또는 "부위-특이적으로 가교된"은 글루타민-함유 태그, 내인성 글루타민, 및/또는 항체 조작 또는 조작된 트랜스글루타미나제에 의해 반응성이도록 만들어진 내인성 글루타민을 통해 특정 부위 (예를 들어, 표 1에 열거된 다양한 위치)에서의 항체에 아민-함유 모이어티가 특이적 접합 또는 가교되는 것을 지칭한다. 부위 특이성은 질량 분광측정법 (예를 들어, 매트릭스-보조 레이저 탈착 이온화 질량 분광측정법 (MALDI-MS), 전기분무 이온화 질량 분광측정법 (ESI-MS), 탠덤 질량 분광측정법 (MS-MS) 및 비행 시간 질량 분광측정법 (TOF-MS), 소수성 상호작용 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 부위-지정 돌연변이유발, 형광-표지, 크기 배제 크로마토그래피, 및 X선 결정학을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 기술에 의해 측정될 수 있다.
용어 "로딩" 또는 "약물 로딩" 또는 "페이로드 로딩"은 ADC 분자 내 항체당 페이로드 ("페이로드" 및 "페이로드들"은 본원에서 "약물" 및 "약물들"과 상호교환가능하게 사용됨)의 평균 수를 나타내거나 지칭한다. 약물 로딩은 항체당 1 내지 20개 약물의 범위일 수 있다. 이는 때로는 DAR 또는 약물 대 항체 비로서 지칭된다. 본 발명의 ADC의 약물-항체 비 (DAR)는 약 1 내지 약 60이다. 일부 실시양태에서, DAR은 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 및 60 중 어느 것이다. 항체당 약물의 평균 수 또는 DAR 값은 통상적인 수단, 예컨대 UV/가시 분광분석법, 질량 분광측정법, ELISA 검정 및 HPLC에 의해 특징화될 수 있다. 정량적 DAR 값이 또한 결정될 수 있다. 일부 경우에, 특정한 DAR 값을 갖는 동종 ADC의 분리, 정제 및 특징화는 역상 HPLC 또는 전기영동과 같은 수단에 의해 달성될 수 있다. DAR은 항체 상의 부착 부위의 수에 의해 제한될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서와 같이 글루타민에서 부착되는 경우에 항체는 링커 단위가 부착될 수 있는 단지 1개 또는 여러개의 적합한 글루타민 잔기를 가질 수 있다. 전형적으로, 이론적 최대치 미만의 약물 모이어티가 접합 반응 동안 항체에 접합된다.
본원에 사용된 용어 "반응성이도록 만들어진 내인성 글루타민 (Q)"은 항체 조작 (예를 들어, 효소적 탈글리코실화 및/또는 아미노산 변형)에 의해 또는 조작된 트랜스글루타미나제에 의해 트랜스글루타미나제의 존재 하의 아민-함유 모이어티에 대해 접근가능하도록, 노출되도록 또는 반응성이도록 만들어진 내인성 글루타민을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "생체적합성 중합체"는 수용자에서 어떠한 바람직하지 않은 국부 또는 전신 효과도 도출하지 않으면서 수용자 (예를 들어, 인간)에서의 치유적 또는 의학적 치료에 적합한 중합체 (예를 들어, 반복되는 단량체 또는 구조 단위)를 지칭한다. 생체적합성 중합체 (합성, 재조합 또는 천연)는 수용성 또는 수불용성 중합체일 수 있다. 생체적합성 중합체는 또한 선형 또는 분지형 중합체일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "항체"는 이뮤노글로불린 분자의 가변 영역에 위치하는 적어도 1개의 항원 인식 부위를 통해 표적, 예컨대 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 지질, 폴리펩티드 등에 특이적 결합할 수 있는 이뮤노글로불린 분자이다. 본원에 사용된 바와 같이, 문맥에서 달리 나타내지 않는 한, 용어는 무손상 폴리클로날 또는 모노클로날 항체, 뿐만 아니라 그의 단편 (예컨대 Fab, Fab', F(ab')2, Fv), 단일 쇄 (ScFv) 및 도메인 항체 (상어 및 낙타류 항체 포함), 및 항체 부분을 포함하는 융합 단백질, 다가 항체 (예를 들어, COVX-BODY™), 다중특이적 항체 (예를 들어, 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한 이중특이적 항체) 및 본원에 기재된 바와 같은 항체 단편, 및 항원 인식 부위를 포함하는 이뮤노글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 형상을 포괄하도록 의도된다. 항체는 임의의 부류, 예컨대 IgG, IgA 또는 IgM (또는 그의 하위부류)의 항체를 포함하고, 항체가 임의의 특정한 부류일 필요는 없다. 그의 중쇄의 불변 도메인의 항체 아미노산 서열에 따라, 이뮤노글로불린은 상이한 부류로 배정될 수 있다. 5종의 주요 부류의 이뮤노글로불린: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하고, 이들 중 몇몇은 하위부류 (이소형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 분류될 수 있다. 상이한 부류의 이뮤노글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤로 불린다. 상이한 부류의 이뮤노글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 형상은 널리 공지되어 있다. 한 측면에서, 이뮤노글로불린은 인간, 뮤린, 원숭이 또는 토끼 이뮤노글로불린이다.
본원에 사용된 용어 "Fab 함유 폴리펩티드"는 Fab 단편, Fab' 단편 또는 "(Fab')2 단편"을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. Fab-함유 폴리펩티드는 야생형 힌지 서열의 일부 또는 모두를 (일반적으로 폴리펩티드의 Fab 부분의 카르복실 말단에) 포함할 수 있다. Fab-함유 폴리펩티드는 임의의 적합한 이뮤노글로불린으로부터, 예컨대 다양한 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 하위유형 중 적어도 1종으로부터 또는 IgA, IgE, IgD 또는 IgM으로부터 수득되거나 유래될 수 있다. Fab-함유 폴리펩티드는 1종 이상의 폴리펩티드가 Fab-함유 폴리펩티드에 연결된 Fab-함유 융합 폴리펩티드일 수 있다. Fab 융합체는 이뮤노글로불린의 Fab 폴리펩티드를 일반적으로 임의의 단백질, 폴리펩티드 또는 소형 분자일 수 있는 융합 파트너와 조합된다. 실제로 임의의 단백질 또는 소형 분자가 Fab 폴리펩티드에 연결되어 Fab-함유 융합 폴리펩티드가 생성될 수 있다. Fab-함유 융합 파트너는 수용체, 부착 분자, 리간드, 효소, 시토카인, 케모카인, 또는 일부 다른 단백질 또는 단백질 도메인의 표적-결합 영역을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
"Fab 단편"은 1개의 경쇄, 및 1개의 중쇄의 CH1 및 가변 영역으로 구성된다. Fab 분자의 중쇄는 또 다른 중쇄 분자와 디술피드 결합을 형성할 수 없다.
"Fab' 단편"은 1개의 경쇄, 및 VH 도메인 및 CH1 도메인을 함유하고 CH1 도메인과 CH2 도메인 사이의 영역을 또한 함유하는 1개의 중쇄의 부분을 함유하여, F(ab')2 분자가 형성되도록 2개의 Fab' 단편의 2개의 중쇄 사이에 쇄간 디술피드 결합이 형성될 수 있다.
"F(ab')2 단편"은 2개의 경쇄, 및 CH1 도메인과 CH2 도메인 사이의 불변 영역의 부분을 함유하는 2개의 중쇄를 함유하여, 2개의 중쇄 사이에 쇄간 디술피드 결합이 형성된다. 따라서 F(ab')2 단편은 2개의 중쇄 사이의 디술피드 결합에 의해 함께 유지되는 2개의 Fab' 단편으로 구성된다.
본원에 사용된 "항체 단편"은 단지 무손상 항체의 부분만을 포함하며, 여기서 부분은 무손상 항체 내에 존재하는 경우에 그 부분과 통상적으로 연관된 기능들 중 바람직하게는 적어도 1종, 바람직하게는 대부분 또는 모두를 보유한다.
"다중특이적 항체"는 1개 초과의 항원 또는 에피토프를 표적화하는 것이다. "이중특이적", "이중-특이적" 또는 "이관능성" 항체는 2개의 상이한 항원 결합 부위를 갖는 하이브리드 항체이다. 이중특이적 항체는 다중특이적 항체의 종이며, 하이브리도마의 융합, Fab' 단편의 연결, 또는 항체 힌지 및 CH3 도메인에서의 돌연변이를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 방법에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148:1547-1553 (1992); 및 Strop et al., J. Mol. Biol. 420(3):204-219 (2012)]을 참조한다. 이중특이적 항체의 2개의 결합 부위는 동일하거나 상이한 단백질 표적 상에 있을 수 있는 2개의 상이한 에피토프에 결합할 것이다.
본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하고, 즉, 집단을 구성하는 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 고도로 특이적이며, 단일 항원에 대하여 지시된다. 추가로, 상이한 결정기 (에피토프)에 대하여 지시된 상이한 항체들을 전형적으로 포함하는 폴리클로날 항체 제제와 대조적으로, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대하여 지시된다.
본원에서 모노클로날 항체는, 특정 실시양태에서 구체적으로 중쇄 및/또는 경쇄의 부분이 특정한 종으로부터 유래되거나 특정한 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체에서의 상응하는 서열과 동일하거나 상동이고, 쇄(들)의 나머지는 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체에서의 상응하는 서열과 동일하거나 상동인 "키메라" 항체, 뿐만 아니라 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한 이러한 항체의 단편을 포함한다 (미국 특허 번호 4,816,567; 및 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)]).
비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 부분에 대해, 인간화 항체는 인간 이뮤노글로불린 (수용자 항체)이며, 여기서 수용자의 초가변 영역으로부터의 잔기는 목적하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류와 같은 비-인간 종 (공여자 항체)의 초가변 영역으로부터의 잔기에 의해 대체된다. 일부 경우에, 인간 이뮤노글로불린의 프레임워크 영역 (FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 대체된다. 또한, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능을 추가로 정밀화하기 위해 이루어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 1개, 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 이뮤노글로불린의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 이뮤노글로불린 서열의 것이다. 또한, 인간화 항체는 임의로 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc) 중 적어도 한 부분, 전형적으로 인간 이뮤노글로불린의 것을 포함할 것이다. 추가의 세부사항에 대해서는, 문헌 [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]을 참조한다. 또한 하기 종설 논문 및 그에 인용된 참고문헌: [Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)]을 참조한다.
"인간 항체"는 인간에 의해 생산된 항체의 것에 상응하는 아미노산 서열을 보유하고/거나 본원에 개시된 바와 같은 인간 항체를 제조하는 임의의 기술을 사용하여 제조된 것이다. 인간 항체의 이러한 정의에서 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체는 구체적으로 배제된다.
본원에 사용된 "힌지 영역", "힌지 서열" 및 그의 변형은 관련 기술분야에 공지된, 예를 들어 문헌 [Janeway et al., ImmunoBiology: the immune system in health and disease, (Elsevier Science Ltd., NY) (4th ed., 1999); Bloom et al., Protein Science (1997), 6:407-415; Humphreys et al., J. Immunol. Methods (1997), 209:193-202]에 예시된 의미를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "Fc-함유 폴리펩티드"는 이뮤노글로불린 중쇄의 카르복실 말단 폴리펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드 (예를 들어, 항체 또는 이뮤노어드헤신)를 지칭한다. Fc-함유 폴리펩티드는 천연 또는 변이체 Fc 영역 (즉, 서열)을 포함할 수 있다. 이뮤노글로불린의 Fc 영역은 일반적으로 2개의 불변 도메인인 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고, 임의로 CH4 도메인을 포함한다. Fc-함유 폴리펩티드는 야생형 힌지 서열의 일부 또는 모두를 (일반적으로 Fc-함유 폴리펩티드의 아미노 말단에) 포함할 수 있다. Fc-함유 폴리펩티드는 또한 이량체일 수 있다. Fc-함유 폴리펩티드는 임의의 적합한 이뮤노글로불린으로부터, 예컨대 다양한 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 하위유형 중 적어도 1종으로부터, 또는 IgA, IgE, IgD 또는 IgM으로부터 수득되거나 유래될 수 있다. 이뮤노글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계가 달라질 수 있지만, 예를 들어 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 위치 Glu216의 아미노산 잔기로부터 또는 Ala231로부터 그의 카르복실-말단까지에 이르는 것으로 통상적으로 정의된다. Fc 영역 내 잔기의 넘버링은 카바트(Kabat)에서와 같은 EU 인덱스의 넘버링이다. 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991].
Fc-함유 폴리펩티드는 1개 이상의 폴리펩티드가 Fc-함유 폴리펩티드에 연결된 Fc-함유 융합 폴리펩티드일 수 있다. Fc 융합체는 이뮤노글로불린의 Fc 폴리펩티드를 일반적으로 임의의 단백질, 폴리펩티드 또는 소형 분자일 수 있는 융합 파트너와 조합된다. 실제로 임의의 단백질 또는 소형 분자가 Fc 영역에 연결되어 Fc-함유 융합 폴리펩티드가 생성될 수 있다. Fc-함유 융합 파트너는 수용체, 부착 분자, 리간드, 효소, 시토카인, 케모카인, 또는 일부 다른 단백질 또는 단백질 도메인의 표적-결합 영역을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 용어 "이뮤노어드헤신"은 이종 단백질 ("어드헤신", 예를 들어 수용체, 리간드 또는 효소)의 "결합 도메인"이 이뮤노글로불린 불변 도메인의 이펙터 성분 (즉, Fc 도메인)과 조합된 항체-유사 또는 이뮤노글로불린-유사 분자를 가리킨다. 구조적으로, 이뮤노어드헤신은 항체의 항원 인식 및 결합 부위 (항원 결합 부위) 이외인 (즉,"이종"인) 목적하는 결합 특이성을 갖는 어드헤신 아미노산 서열 및 이뮤노글로불린 불변 도메인 서열의 융합체를 포함한다. 이뮤노어드헤신 내의 이뮤노글로불린 불변 도메인 서열은 임의의 이뮤노글로불린, 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 하위유형, IgA, IgE, IgD 또는 IgM으로부터 수득될 수 있다.
용어 "폴리펩티드", "올리고펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 임의의 길이, 바람직하게는 비교적 짧은 (예를 들어, 10-100개 아미노산)의 아미노산 쇄를 지칭하는 것으로 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 쇄는 선형 또는 분지형일 수 있고, 이는 변형된 아미노산을 포함할 수 있고/거나 비-아미노산이 개재될 수 있다. 용어는 또한 자연적으로 또는 개입에 의해 변형된 아미노산 쇄를 포괄한다; 예를 들어, 디술피드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예컨대 표지 성분과의 접합. 또한 상기 정의 내에는, 예를 들어 아미노산의 1개 이상의 유사체 (예를 들어, 비천연 아미노산 등 포함), 뿐만 아니라 관련 기술분야에 공지된 다른 변형을 함유하는 폴리펩티드가 포함된다. 폴리펩티드는 단일 쇄 또는 회합된 쇄로서 발생할 수 있는 것으로 이해된다.
본원에 사용된 용어 "야생형 아미노산", "야생형 IgG" 또는 "야생형 mAb"는 특정 집단 (예를 들어, 인간, 마우스, 래트, 세포 등) 내에서 자연적으로 발생하는 아미노산 또는 핵산의 서열을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "접합 효율" 또는 "가교 효율"은 본원에 기재된 바와 같은 ADC의 실험적으로 측정된 양을 최대 예상된 ADC 양으로 나눈 비이다. 접합 효율 또는 가교 효율은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 다양한 기술, 예컨대 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 측정될 수 있다. 또한, 접합 효율은 다양한 온도, 예컨대 실온 또는 37℃에서 측정될 수 있다.
용어 "이펙터 기능"은 항체의 Fc 영역에서 기인한 생물학적 활성을 지칭한다. 항체 이펙터 기능의 예는 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC), Fc 수용체 결합, 보체 의존성 세포독성 (CDC), 식세포작용, C1q 결합, 및 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체; BCR)의 하향 조절을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 미국 특허 번호 6,737,056을 참조한다. 이러한 이펙터 기능은 일반적으로 Fc 영역이 결합 도메인 (예를 들어, 항체 가변 도메인)과 조합될 것이 요구되며, 이러한 항체 이펙터 기능을 평가하기 위한 관련 기술분야에 공지된 다양한 검정을 사용하여 평가될 수 있다. 이펙터 기능의 예시적인 측정은 Fcγ3 및/또는 C1q 결합을 통해 이루어진다.
본원에 사용된 "항체-의존성 세포-매개 세포독성" 또는 "ADCC"는 Fc 수용체 (FcR)를 발현하는 비특이적 세포독성 세포 (예를 들어 자연 킬러 (NK) 세포, 호중구 및 대식세포)가 표적 세포 상의 결합된 항체를 인식하고, 이후 표적 세포의 용해를 유발하는 세포-매개 반응을 지칭한다. 관심 분자의 ADCC 활성은 시험관내 ADCC 검정, 예컨대 미국 특허 번호 5,500,362 또는 5,821,337에 기재된 것을 사용하여 평가될 수 있다. 이러한 검정에 유용한 이펙터 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 NK 세포를 포함한다. 대안적으로 또는 추가로, 관심 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예컨대 문헌 [Clynes et al., 1998, PNAS (USA), 95:652-656]에 개시된 것과 같은 동물 모델에서 평가될 수 있다.
"보체 의존성 세포독성" 및 "CDC"는 보체의 존재 하의 표적의 용해를 지칭한다. 보체 활성화 경로는 보체계의 제1 성분 (C1q)이, 동족 항원과 복합체화된 분자 (예를 들어, 항체)에 결합함으로써 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들어 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202: 163 (1996)]에 기재된 바와 같은 CDC 검정이 수행될 수 있다.
본원에 사용된 "Fc 수용체" 및 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 기재한다. 바람직한 FcR은 천연 서열 인간 FcR이다. 또한, 바람직한 FcR은 IgG 항체에 결합하는 것이며 (감마 수용체), FcγRI, FcγRII, FcγRIII 및 FcγRIV 하위부류의 수용체 (이들 수용체의 대립유전자 변이체 및 대안적으로 스플라이싱된 형태 포함)를 포함한다. FcγRII 수용체는 FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("억제 수용체")를 포함하며, 이들은 주로 세포질 도메인에서 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는다. FcR이 문헌 [Ravetch and Kinet, 1991, Ann. Rev. Immunol., 9:457-92; Capel et al., 1994, Immunomethods, 4:25-34; de Haas et al., 1995, J. Lab. Clin. Med., 126:330-41; Nimmerjahn et al., 2005, Immunity 23:2-4]에서 검토된다. "FcR"은 또한 네오나탈 수용체 FcRn을 포함하며, 이는 모체 IgG의 태아로의 전달을 담당한다 (Guyer et al., 1976, J. Immunol., 117:587; 및 Kim et al., 1994, J. Immunol., 24:249).
용어 "정제하다" 및 그의 문법적 변형은 ADC 및 1종 이상의 불순물을 함유하는 혼합물로부터 적어도 1종의 불순물을 완전히든 또는 부분적으로든 제거하고, 이에 의해 (즉, 조성물 내 불순물(들)의 양 (ppm)을 감소시킴으로써) 조성물 내 ADC의 순도 수준을 개선하는 것을 의미하도록 사용된다.
본원에서 "약" 값 또는 파라미터에 대한 언급은 그 값 또는 파라미터 그 자체에 관한 실시양태를 포함 (및 기재)한다. 예를 들어, "약 X"를 언급하는 기재는 "X"의 기재를 포함한다. 수치 범위는 범위를 정의하는 수를 포함한다.
"개체" 또는 "대상체"는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간이다. 포유동물은 가축, 스포츠 동물, 애완동물, 영장류, 말, 개, 고양이, 마우스 및 래트를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
실시양태가 표현 "포함하는"을 사용하여 본원에 기재된 경우에, "로 이루어진" 및/또는 "로 본질적으로 이루어진"의 용어로 기재된 다른 유사한 실시양태가 또한 제공되는 것으로 이해된다.
본 발명의 측면 또는 실시양태가 마쿠쉬 군 또는 다른 대안적 그룹화의 면에서 기재되는 경우에, 본 발명은 총괄적으로 열거된 전체 군, 뿐만 아니라 상기 군의 개별적인 각각의 구성원, 및 주요 군의 모든 가능한 하위군, 뿐만 아니라 군 구성원 중 1개 이상이 부재하는 주요 군을 포괄한다. 본 발명은 또한 청구된 발명에서 임의의 군 구성원 중 1개 이상의 명확한 배제를 고려한다.
본 출원에서의 잔기 지정은 불변 도메인의 EU 넘버링 체계를 기반으로 한다 (Edelman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 63(1):78-85 (1969)).
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 예시적인 방법 및 물질이 본원에 기재되어 있지만, 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질도 또한 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있다. 본원에 언급된 모든 간행물 및 다른 참고문헌은 그 전문이 참조로 포함된다. 상충되는 경우, 본 명세서 (정의 포함)가 우선할 것이다. 수많은 문헌이 본원에 인용되어 있지만, 이러한 인용이 이들 문헌 중 어느 것이 관련 기술분야의 통상의 일반 지식 중 일부를 형성한다는 것을 인정한다는 것은 아니다. 본 명세서 및 청구범위 전반에 걸쳐, 용어 "포함하다", 또는 "포함한다" 또는 "포함하는"과 같은 변형은 언급된 정수 또는 정수 군을 포함하지만 임의의 다른 정수 또는 정수 군을 배제하지는 않는다는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 문맥에서 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수형을 포함할 것이고, 복수 용어는 단수형을 포함할 것이다. 물질, 방법 및 예는 단지 예시적이며 제한적으로 의도되지 않는다.
트랜스글루타미나제는 단백질-글루타민 γ-글루타밀트랜스퍼라제이며, 이는 전형적으로 글루타민 잔기와 리신 잔기와의 pH-의존적 아미드교환을 촉매한다. 본원에 기재된 발명에 사용된 트랜스글루타미나제는 다양한 공급원으로부터 수득 또는 제조될 수 있거나, 또는 1개 이상의 내인성 글루타민 잔기와 1개 이상의 리신 잔기 또는 다른 아민-함유 모이어티와의 아미드교환을 촉매하도록 조작될 수 있다. 일부 실시양태에서, 트랜스글루타미나제는 효소 입체형태 변화를 유도하고 효소 활성을 가능하게 하기 위해 칼슘을 요구하는 칼슘 의존적 트랜스글루타미나제이다. 예를 들어, 트랜스글루타미나제가 기니 피그 간으로부터 유래될 수 있고, 상업적 공급원 (예를 들어, 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich) (미주리주 세인트 루이스) 및 엠피 바이오메디칼스(MP Biomedicals) (캘리포니아주 어바인))을 통해 수득될 수 있다. 일부 실시양태에서, 트랜스글루타미나제는 효소 입체형태 변화를 유도하고 효소 활성을 가능하게 하기 위해 칼슘을 요구하지 않는 칼슘 비의존적 트랜스글루타미나제이다. 일부 실시양태에서, 트랜스글루타미나제는 미생물 게놈으로부터 유래된 미생물 트랜스글루타미나제, 예컨대 스트렙토베르티실리움(Streptoverticillium) 또는 스트렙토미세스(Streptomyces) (예를 들어, 스트렙토미세스 모바라엔시스(Streptomyces mobaraensis) 또는 스트렙토베르티실리움 모바라엔세(Streptoverticillium mobaraense))로부터의 트랜스글루타미나제이다. 상업적으로 입수가능한 칼슘 비의존적 트랜스글루타미나제, 예컨대 악티바(ACTIVA)™ (아지노모토(Ajinomoto), 일본)가 본 발명에 적합하다. 일부 실시양태에서, 트랜스글루타미나제는 포유동물 단백질 (예를 들어, 인간 트랜스글루타미나제), 박테리아 단백질, 식물 단백질, 진균 단백질 (예를 들어, 난균류 및 악티노미세테스(Actinomycetes) 트랜스글루타미나제) 또는 원핵 단백질이다. 일부 실시양태에서, 트랜스글루타미나제는 미크로코쿠스(Micrococcus), 클로스트리디움(Clostridium), 토룰롭시스(Torulopsis), 리조푸스(Rhizopus), 모나스쿠스(Monascus) 또는 바실루스(Bacillus)로부터의 것이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 발명에 사용된 트랜스글루타미나제는 항체 내의 1개 이상의 내인성 글루타민 잔기와 1개 이상의 리신 잔기 또는 다른 아민-함유 모이어티와의 아미드교환을 촉매하는 조작된 트랜스글루타미나제이다. 예를 들어, 자연 발생 트랜스글루타미나제 내의 1개 이상의 야생형 아미노산 잔기가 결실되거나, 또는 또 다른 아미노산 잔기(들)로 대체 또는 치환되어, 조작된 트랜스글루타미나제가 제조될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 발명에 사용된 트랜스글루타미나제는 또한 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 재조합 기술을 사용하여 생산된 재조합 단백질일 수도 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 발명에 사용된 트랜스글루타미나제는 정제된 단백질일 수 있다. 예를 들어, 정제된 트랜스글루타미나제는 적어도 약 50% 순수하다. 본원에 사용된 "순수한" 또는 "정제된" 단백질은 다른 단백질 오염물이 없는 단백질 (예를 들어, 트랜스글루타미나제)을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 정제된 트랜스글루타미나제는 적어도 약 55%-60%, 60%-65%, 65%-70%, 70%-75%, 75%-80%, 80%-85%, 85%-90%, 90%-95%, 95%-98% 또는 99% 순수한 것 중 어느 것이다. 일부 실시양태에서, 정제된 트랜스글루타미나제는 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 순수한 것 중 어느 것이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 ADC는 항체 조작에 의해 또는 조작된 트랜스글루타미나제에 의해 아미드교환 반응에서 반응성이도록 만들어진 적어도 1개의 내인성 글루타민을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 조작은 항체 탈글리코실화 (예를 들어, 효소적 탈글리코실화); 또는 항체 상에서의 아미노산 결실, 삽입, 치환, 돌연변이 또는 그의 임의의 조합을 포함한 아미노산 변형이다. 예를 들어, 항체 내의 위치 297에서의 야생형 아미노산 Asn (N)이 아미노산 Ala (A)로 치환 또는 대체되어, 위치 297에서의 비-글리코실화 및 위치 295에서의 반응성 내인성 글루타민 (Q)이 생성된다. 또 다른 예에서, 항체 내의 아미노산 변형이 위치 297에서의 N으로부터 Q로의 아미노산 치환이어서, 위치 297에서의 비-글리코실화, 위치 295에서의 반응성 내인성 Q, 및 N297Q 및 Q295와 1개 이상의 아민-함유 모이어티 사이에 트랜스글루타미나제의 존재 하에서 이들 2개의 부위에서의 부위-특이적 접합이 생성된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 ADC는 1) 경쇄, 중쇄, 또는 경쇄 및 중쇄 둘 다의 카르복실 말단; 2) 경쇄, 중쇄, 또는 경쇄 및 중쇄 둘 다의 아미노 말단; 및 3) S60-R61, R108, T135, S160, S168, S190-S192, P189-S192, G200-S202, K222-T225, K222-T223, T223, L251-S254, M252-I253, E294-N297, E293-N297, N297 및/또는 G385를 포함하나 이에 제한되지는 않는 적어도 1개 이상의 위치에서 조작된 글루타민-함유 태그를 포함하며, 여기서 글루타민-함유 태그는 항체 내에 삽입되거나 또는 항체 내의 1개 이상의 내인성 아미노산을 대체한다.
태그를 함유하는 특정 글루타민 및 그의 상응하는 조작된 위치의 예가 표 1에 제공되며, 이들은 본원에 참조로 포함된 WO2012/059882 및 WO2015/015448에 기재되어 있다.
표 1
Figure 112017018870512-pct00032
Figure 112017018870512-pct00033
일부 실시양태에서, ADC의 항체는 위치 222, 340 또는 370 (EU 넘버링)에서 동일한 위치에서의 야생형 항체에 비해 아미노산 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형은 아미노산 결실, 삽입, 치환, 돌연변이 또는 그의 임의의 조합이다. 일부 실시양태에서, 치환은 야생형 아미노산을 또 다른 아미노산 (예를 들어, 비-야생형 아미노산)으로 대체하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다른 (예를 들어, 비-야생형) 또는 삽입된 아미노산은 Arg (예를 들어, K222R, K340R 또는 K370R)이다. 일부 실시양태에서, 삽입은 1개 이상의 아미노산(들)을 삽입하는 것 (예를 들어, 1, 2, 3개 또는 그 초과의 아미노산을 삽입하는 것)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다른 (예를 들어, 비-야생형) 아미노산은 Ala, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이다.
따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명의 ADC는 a) 아민-함유 모이어티가 위치 295에서의 내인성 글루타민 및 위치 297에서의 치환된 글루타민에 부위-특이적으로 접합되는, 위치 N297Q 및 K222R에서의 아미노산 치환; 및/또는 b) 아민-함유 모이어티가 항체의 경쇄의 카르복실 말단에서의 글루타민-함유 태그(들)에 부위-특이적으로 접합되는, 1개 이상의 글루타민-함유 태그(들)를 포함한다. 일부 실시양태에서 약물-항체 비 (DAR)는 약 3-9이다. 일부 실시양태에서, 항체의 경쇄의 카르복실 말단에서의 글루타민-함유 태그는 GGLLQGA (서열식별번호: 23)이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 ADC는 a) 아민-함유 모이어티가 위치 295에서의 내인성 글루타민 및 위치 297에서의 치환된 글루타민에 부위-특이적으로 접합되는, 위치 N297Q 및 K222R에서의 아미노산 치환; b) 아민-함유 모이어티가 항체의 경쇄의 카르복실 말단에서의 글루타민-함유 태그(들)에 부위-특이적으로 접합되는, 1개 이상의 글루타민-함유 태그(들); 및/또는 c) 아민-함유 모이어티가 항체 내의 S60-R61, R108, T135, S160, S168, S190-S192, P189-S192, G200-S202, K222-T225, K222-T223, T223, L251-S254, M252-I253, E294-N297, E293-N297, N297 및 G385로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 위치에서의 글루타민-함유 태그에 추가로 부위-특이적으로 접합되는, 1개 이상의 글루타민-함유 태그(들)를 포함하며, 여기서 글루타민-함유 태그는 항체 내에 삽입되거나 또는 항체 내의 1개 이상의 내인성 아미노산을 대체한다. 일부 실시양태에서 약물-항체 비는 적어도 약 6이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 발명의 ADC는 또한 a) 아민-함유 모이어티가 위치 295에서의 내인성 글루타민 및 위치 297에서의 치환된 글루타민에 부위-특이적으로 접합되는, 위치 N297Q 및 K222R에서의 아미노산 치환; b) 아민-함유 모이어티가 항체의 경쇄의 카르복실 말단에서의 글루타민-함유 태그(들)에 부위-특이적으로 접합되는, 1개 이상의 글루타민-함유 태그(들); c) 아민-함유 모이어티가 항체의 중쇄의 카르복실 말단에서의 글루타민-함유 태그에 추가로 부위-특이적으로 접합되는, 1개 이상의 글루타민-함유 태그(들)를 포함하고, 약물-항체 비 (DAR)는 약 6-9이다. 일부 실시양태에서, 항체의 경쇄의 카르복실 말단에서의 글루타민-함유 태그는 GGLLQGA (서열식별번호: 23)이고, 항체의 중쇄의 카르복실 말단에서의 글루타민-함유 태그는 LLQGA (서열식별번호: 11)이다.
한 변형에서, 본 발명의 ADC는 a) 아민-함유 모이어티가 위치 295에서의 내인성 글루타민 및 위치 297에서의 치환된 글루타민에 부위-특이적으로 접합되는, 위치 N297Q 및 K222R에서의 아미노산 치환; b) 아민-함유 모이어티가 항체의 경쇄의 카르복실 말단에서의 글루타민-함유 태그(들)에 부위-특이적으로 접합되는, 1개 이상의 글루타민-함유 태그(들); c) 아민-함유 모이어티가 항체의 중쇄 내의 아미노산 위치 T135 뒤에 삽입된 글루타민-함유 태그에 추가로 부위-특이적으로 접합되는, 1개 이상의 글루타민-함유 태그(들)를 포함하고, 약물-항체 비 (DAR)는 약 6-9이다. 일부 실시양태에서, 항체의 경쇄의 카르복실 말단에서의 글루타민-함유 태그는 GGLLQGA (서열식별번호: 23)이고, 항체의 중쇄 내의 T135 뒤에 삽입된 글루타민-함유 태그는 LLQG (서열식별번호: 2)이다.
또 다른 변형에서, 본 발명의 ADC는 a) 아민-함유 모이어티가 위치 295에서의 내인성 글루타민 및 위치 297에서의 치환된 글루타민에 부위-특이적으로 접합되는, 위치 N297Q 및 K222R에서의 아미노산 치환; b) 아민-함유 모이어티가 항체의 경쇄의 카르복실 말단에서의 글루타민-함유 태그(들)에 부위-특이적으로 접합되는, 1개 이상의 글루타민-함유 태그(들); c) 아민-함유 모이어티가 항체의 중쇄 내의 아미노산 위치 G200-S202에서의 글루타민-함유 태그에 추가로 부위-특이적으로 접합되는, 1개 이상의 글루타민-함유 태그(들)를 포함하고, 약물-항체 비 (DAR)는 약 6-9이다. 일부 실시양태에서, 항체의 경쇄의 카르복실 말단에서의 글루타민-함유 태그는 GGLLQGA (서열식별번호: 23)이고, 항체의 중쇄 내의 T135 뒤에 삽입된 글루타민-함유 태그는 LLQG (서열식별번호: 2)이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 ADC에 대한 글루타민-함유 태그는 아미노산 서열 XXQX (서열식별번호: 37)를 포함하며, 여기서 X는 본원에 기재된 바와 같은 통상적인 아미노산 또는 비-통상적인 아미노산일 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, X는 L (Leu), A (Ala), G (Gly), S (Ser), V (Val), F (Phe), Y (Tyr), H (His), R (Arg), N (Asn), E (Glu), D (Asp), C (Cys), Q (Gln), I (Ile), M (Met), P (Pro), T (Thr), K (Lys) 또는 W (Trp)이다.
일부 실시양태에서, 글루타민-함유 태그는 Q, LQG, LLQGG (서열식별번호: 1), LLQG (서열식별번호: 2), LSLSQG (서열식별번호: 3), GGGLLQGG (서열식별번호: 4), GLLQG (서열식별번호: 5), LLQ, GSPLAQSHGG (서열식별번호: 6), GLLQGGG (서열식별번호: 7), GLLQGG (서열식별번호: 8), GLLQ (서열식별번호: 9), LLQLLQGA (서열식별번호: 10), LLQGA (서열식별번호: 11), LLQYQGA (서열식별번호: 12), LLQGSG (서열식별번호: 13), LLQYQG (서열식별번호: 14), LLQLLQG (서열식별번호: 15), SLLQG (서열식별번호: 16), LLQLQ (서열식별번호: 17), LLQLLQ (서열식별번호: 18), LLQGR (서열식별번호: 19), LLQGPP (서열식별번호: 20), LLQGPA (서열식별번호: 21), GGLLQGPP (서열식별번호: 22), GGLLQGA (서열식별번호: 23), LLQGA (서열식별번호: 24), LLQGPGK (서열식별번호: 25), LLQGPG (서열식별번호: 26), LLQGP (서열식별번호: 27), LLQP (서열식별번호: 28), LLQPGK (서열식별번호: 29), LLQAPGK (서열식별번호: 30), LLQGAPG (서열식별번호: 31), LLQGAP (서열식별번호: 32), LLQGPA (서열식별번호: 33), LLQGPP (서열식별번호: 34), GGLLQGPP (서열식별번호: 35) 및 LLQLQG (서열식별번호: 36)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 글루타민-함유 태그는 아미노산 서열 LLQGA (서열식별번호: 24), LQG, GGLLQGA (서열식별번호: 23), LLQGPA (서열식별번호: 33), LLQGPP (서열식별번호: 34), GGLLQGPP (서열식별번호: 35), LLQGSG (서열식별번호: 13), LLQG (서열식별번호: 2), LLQYQG (서열식별번호: 14), LLQLLQG (서열식별번호: 15), LLQLQG (서열식별번호: 36), LLQLLQ (서열식별번호: 18), LLQLQ (서열식별번호: 17), LLQGR (서열식별번호: 19), LLQYQGA (서열식별번호: 12), SLLQG (서열식별번호: 16) 또는 LLQLLQGA (서열식별번호: 10)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 글루타민-함유 태그는 LGGQGGG (서열식별번호: 41), GGGQGGL (서열식별번호: 42), GXGQGGG (서열식별번호: 43), GGXQGGG (서열식별번호: 44), GGGQXGG (서열식별번호: 45) 및 GGGQGXG (서열식별번호: 46) (여기서 X는 G, A, S, L, V, F, Y, R, N 또는 E임)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하지 않는다. 다른 예시적인 태그는 또한 예를 들어 US2013/0230543 및 US2013/0122020에 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 ADC의 항체는 카르복실 말단에서의 마지막 아미노산 위치에, 동일한 위치에서의 야생형 항체에 비해 아미노산 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형은 아미노산 결실, 삽입, 치환, 돌연변이 또는 그의 임의의 조합이다. 일부 실시양태에서, 치환은 야생형 아미노산을 또 다른 아미노산 (예를 들어, 비-야생형 아미노산)으로 대체하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 삽입은 1개 이상의 아미노산(들)을 삽입하는 것 (예를 들어, 1, 2, 3개 또는 그 초과의 아미노산을 삽입하는 것)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다른 (예를 들어, 비-야생형) 또는 삽입된 아미노산은 Arg이다. 일부 실시양태에서, 다른 (예를 들어, 비-야생형) 아미노산은 Ala, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 항체 (예를 들어 항체의 중쇄)의 카르복실 말단에서의 마지막 아미노산이 결실될 수 있고, 폴리펩티드의 C-말단에 조작된 글루타민-함유 태그는 아미노산 서열 LLQGA (서열식별번호: 11) 또는 GGLLQGA (서열식별번호: 23)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체는 아미노 말단에서의 제1 아미노산 위치에서 동일한 위치에, 야생형 항체에 비해 아미노산 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형은 아미노산 결실, 삽입, 치환, 돌연변이 또는 그의 임의의 조합이다. 일부 실시양태에서, 치환은 야생형 아미노산을 또 다른 (예를 들어, 비-야생형) 아미노산으로 대체하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 삽입은 아미노산을 삽입하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-야생형 또는 삽입된 아미노산은 Arg이다. 일부 실시양태에서, 다른 (비-야생형 또는 삽입된) 아미노산은 Ala, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 ADC는 전장 항체 중쇄 및 항체 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 이중특이적 항체, 미니바디, 디아바디 또는 항체 단편이다. 일부 실시양태에서, 항체는 IgG이다. 일부 실시양태에서, IgG는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 항체는 IgA, IgE, IgD 또는 IgM이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 ADC의 이펙터 기능 (예를 들어, Fcγ3 및/또는 C1q 결합에 의해 측정되는 바와 같음)은 야생형 항체에 비해 약 1배, 2배, 3배, 4배 또는 5배 중 어느 것 이하로 감소된다. 일부 실시양태에서, ADC의 항체는 IgG의 이펙터 기능이 야생형 IgG에 비해 약 2배 이하로 감소된 IgG이다. 다른 실시양태에서, IgG의 이펙터 기능은 야생형 IgG에 비해 약 2배로 감소된다. 다른 실시양태에서, IgG의 이펙터 기능은 야생형 IgG에 비해 약 2배 초과로 감소된다. 일부 실시양태에서, ADC의 항체는 IgG의 이펙터 기능이 야생형 IgG에 비해 약 1배 이하로 감소된 IgG이다. 다른 실시양태에서, IgG의 이펙터 기능은 야생형 IgG에 비해 약 1배로 감소된다. 일부 실시양태에서, IgG의 이펙터 기능은 야생형 IgG에 비해 약 1배, 3배, 4배 또는 5배 중 어느 것 초과로 감소된다.
항체에 접합될 수 있는 아민-함유 모이어티의 수는 1) 항체에 연결/삽입된 글루타민-함유 태그의 수, 뿐만 아니라 글루타민-함유 태그 상의 글루타민의 수; 및/또는 2) 항체 상의 내인성 글루타민 (즉, 조작되지 않은 천연 글루타민, 예컨대 가변 도메인, CDR 등 내의 글루타민)의 수; 및/또는 3) 본원에 기재된 바와 같은 항체 조작 또는 조작된 트랜스글루타미나제에 의해 반응성이도록 만들어진 내인성 글루타민의 수에 좌우된다. 예를 들어, 2개의 아민-함유 모이어티가 2개의 경쇄의 카르복실 말단에서 항체에 부위-특이적으로 접합될 수 있고, 4개의 아민-함유 모이어티가 위치 Q295 및 N297Q에서 항체에 부위-특이적으로 접합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 아민-함유 모이어티는 각각의 접합 위치에서 동일하거나 상이한 것일 수 있다.
세포독성제의 예는 안트라시클린, 아우리스타틴 (예를 들어, 돌라스타틴, MMAD, MMAE, MMAF, PF-06380101, PF-06463377 및 PF-06456780), 스플라이세오스타틴, CBI/CPI 이량체 (미국 특허 가출원 61/932,118에 기재된 바와 같은 CBI 및 CPI 성분 둘 다를 포함하는 "혼합된" 이량체를 포함함), 칼리케아미신, 두오카르마이신, 에네디인, 겔다나마이신, 메이탄신, 퓨로마이신, 탁산, 빈카 알칼로이드, SN-38, 튜부리신, 헤미아스텔린, 캄프토테신, 콤브레타스타틴, 돌라스타틴, 인돌리노-벤조디아제핀 이량체, 피롤로벤조디아제핀 이량체 및 플라디에놀리드, 및 그의 입체이성질체, 동배체, 유사체 또는 유도체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
안트라시클린은 박테리아 스트렙토미세스로부터 유래되고, 폭넓은 범위의 암, 예컨대 백혈병, 림프종, 유방암, 자궁암, 난소암 및 폐암을 치료하기 위해 사용되어 왔다. 예시적인 안트라시클린은 다우노루비신, 독소루비신 (즉, 아드리아마이신), 에피루비신, 이다루비신, 발루비신 및 미톡산트론을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
돌라스타틴 및 그의 펩티드성 유사체 및 유도체인 아우리스타틴은 항암 및 항진균 활성을 갖는 것으로 제시된 고도로 강력한 항유사분열제이다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,663,149 및 문헌 [Pettit et al., Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965, 1998]을 참조한다. 예시적인 돌라스타틴 및 아우리스타틴은 돌라스타틴 10, 아우리스타틴 E, 아우리스타틴 EB (AEB), 아우리스타틴 EFP (AEFP), MMAD (모노메틸 아우리스타틴 D 또는 모노메틸 돌라스타틴 10), MMAF (모노메틸 아우리스타틴 F 또는 N-메틸발린-발린-돌라이소류인-돌라프로인-페닐알라닌), MMAE (모노메틸 아우리스타틴 E 또는 N-메틸발린-발린-돌라이소류인-돌라프로인-노르에페드린), 5-벤조일발레르산-AE 에스테르 (AEVB) 및 다른 신규 아우리스타틴 (예컨대 미국 공개 번호 2013/0129753에 기재된 것)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 아우리스타틴은 하기 구조를 갖는 0101 (2-메틸알라닐-N-[(3R,4S,5S)-3-메톡시-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드)이다:
Figure 112017018870512-pct00034
일부 실시양태에서, 아우리스타틴은 하기 구조를 갖는 3377 (N,2-디메틸알라닐-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-카르복실-2-페닐에틸]아미노}-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필]피롤리딘-1-일}-2-메톡시-1-[(1S)-1-메틸프로필]-4-옥소부틸}-N-메틸-L-발린아미드)이다:
Figure 112017018870512-pct00035
다른 실시양태에서, 아우리스타틴은 하기 구조를 갖는 0131 (2-메틸-L-프롤릴-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-카르복시-2-페닐에틸]아미노}-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필]피롤리딘-1-일}-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드)이다:
Figure 112017018870512-pct00036
다른 실시양태에서, 아우리스타틴은 하기 구조를 갖는 0121 (2-메틸-L-프롤릴-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-1-메톡시-1-옥소-3-페닐프로판-2-일]아미노}-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필]피롤리딘-1-일}-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드)이다:
Figure 112017018870512-pct00037
캄프토테신은 토포이소머라제 I 효소를 억제하는 세포독성 퀴놀린 알칼로이드이다. 캄프토테신 및 그의 유도체의 예는 토포테칸 및 이리노테칸, 및 그의 대사물, 예컨대 SN-38을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
콤브레타스타틴은 종양에서의 혈관 파괴 특성을 갖는 천연 페놀이다. 예시적인 콤브레타스타틴 및 그의 유도체는 콤브레타스타틴 A-4 (CA-4) 및 옴브라불린을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
두오카르마이신 및 CC-1065는 세포독성 효력을 갖는 DNA 알킬화제이다. 문헌 [Boger and Johnson, PNAS 92:3642-3649 (1995)]을 참조한다. 예시적인 돌라스타틴 및 아우리스타틴은 (+)-두오카르마이신 A 및 (+)-두오카르마이신 SA, 및 (+)-CC-1065를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
에네디인은 9- 및 10원 고리 또는 접합된 삼중-이중-삼중 결합의 시클릭계의 존재를 특징으로 하는 항종양 박테리아 생성물 부류이다. 예시적인 엔다이인은 칼리케아미신, 에스페라미신, 운시알라미신, 다이네미신 및 그의 유도체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
헤미아스텔린 및 그의 유사체 (예를 들어, HTI-286)는 튜불린에 결합하고, 정상적인 미세관 역학을 파괴하며, 화학양론적 양으로 미세관을 탈중합시킨다.
겔다나마이신은 Hsp90 (열 쇼크 단백질 90)에 결합하고 항종양 약물로 사용되어 온 벤조퀴논 안사마이신 항생제이다. 예시적인 겔다나마이신은 17-AAG (17-N-알릴아미노-17-데메톡시겔다나마이신) 및 17-DMAG (17-디메틸아미노에틸아미노-17-데메톡시겔다나마이신)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
메이탄신 또는 그의 유사체인 메이탄시노이드는 튜불린 중합 억제를 통해 유사분열 동안 미세관 형성을 억제함으로써 세포 증식을 억제한다. 문헌 [Remillard et al., Science 189:1002-1005 (1975)]을 참조한다. 예시적인 메이탄신 및 메이탄시노이드는 메르탄신 (DM1) 및 그의 유도체, 뿐만 아니라 안사미토신을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
피롤로벤조디아제핀 이량체 (PBD) 및 인돌리노-벤조디아제핀 이량체 (IGN)는 1개 이상의 이민 관능기를 함유하는 항-종양제이거나, 또는 듀플렉스 DNA에 결합하는 그의 등가물이다. PBD 및 IGN 분자는 천연 생성물 안트라마이신을 기반으로 하고, DNA와 서열-선택적 방식으로 상호작용하며, 이때 퓨린-구아닌-퓨린 서열이 바람직하다. 예시적인 PBD 및 그의 유사체는 SJG-136을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
스플라이세오스타틴 및 플라디에놀리드는 스플라이싱을 억제하며 스플라이세오솜, SF3b와 상호작용하는 항-종양 화합물이다. 스플라이세오스타틴의 예는 스플라이세오스타틴 A, FR901464를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 플라디에놀리드의 예는 플라디에놀리드 B, 플라디에놀리드 D 및 E7107을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
탁산은 항튜불린제 또는 유사분열 억제제로서 작용하는 디테르펜이다. 예시적인 탁산은 파클리탁셀 (예를 들어, 탁솔(TAXOL)®) 및 도세탁셀 (탁소테레(TAXOTERE)®)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
빈카 알킬로이드가 또한 항튜불린제이다. 예시적인 빈카 알킬로이드는 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신 및 비노렐빈을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 작용제 모이어티는 독소 폴리펩티드 (또는 독소 단백질)이다. 독소 폴리펩티드의 예는 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄, 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피톨라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신, 트리코테센, 억제제 시스틴 노트 (ICK) 펩티드 (예를 들어, 세라토톡신), 및 코노톡신 (예를 들어, KIIIA 또는 SmIIIa)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
ADC를 접합시키는 방법
항-Trop2 항체와 본 발명의 링커-페이로드와의 접합은 항체의 양을 25 mM 트리스-HCl 함유 완충제, pH 8.0-8.5 중에서 5 mg/mL로 조정함으로써 수행된다. 링커-페이로드의 양을 항체에 비해 5-50배 또는 5-500배 몰 과량으로 첨가하고, 효소적 반응을 2% (w/v) 박테리아 트랜스글루타미나제 (아지노모토 악티바(Ajinomoto Activa) TI, 일본)의 첨가에 의해 개시하고, 37℃에서 16-24시간 동안 서서히 진탕하면서 인큐베이션한다. 0.75 M 황산암모늄, 25 mM 인산칼륨, pH 7 (완충제 A)의 완충제 조성물을 수득하도록 반응 혼합물을 조정함으로써 부틸 세파로스(Butyl Sepharose)™ 하이 퍼포먼스 (부틸 HP, 지이 헬스케어 바이오사이언시스(GE Healthcare Biosciences))를 사용하여 ADC를 정제한다. 물질을 부틸 HP에 적용하고, 5 CV 완충제 A로 세척하고, 20 CV 선형 구배로 25 mM 인산칼륨, pH 7 내로 용리시킨다. ADC를 함유하는 분획을 풀링하고, PBS에 대하여 투석하고, 10 kDa 아미콘 울트라(Amicon Ultra) 원심 여과 유닛 (밀리포어 코포레이션(Millipore Corporation))을 사용하여 농축시키고, 0.2 μm 필터를 통해 멸균 여과한다. 대안적으로, 맙셀렉트 프로테인 A(MabSelect Protein A) 수지 (지이 헬스케어 바이오사이언시스)를 사용하여 표준 프로토콜에 따라 ADC를 정제하고, PBS로 완충제 교환한다. WO2012/059882에 기재된 방법을 포함한, ADC를 접합시키는 다른 방법이 공지되어 있다.
본 발명의 항체-약물 접합체를 사용하는 방법
본 발명의 ADC는 치유적 치료 방법 및 진단적 치료 방법을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 적용에 유용하다.
한 측면에서, 본 발명은 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 암의 치료를 필요로 하는 대상체에게 본원에 기재된 바와 같은 ADC를 포함하는 조성물 (예를 들어, 제약 조성물)의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 암을 치료하는 방법이 제공된다. 본원에 사용된 암은 고형 암 (예컨대 방광암, 유방암, 자궁경부암, 융모막암종, 결장암, 식도암, 위암, 교모세포종, 두경부암, 신장암, 간암, 폐암 (예를 들어, 비소세포 폐암 (NSCLC)), 구강암, 난소암, 췌장암, 전립선암 및 피부암); 및 액상 암 (예컨대 급성 림프모구성 백혈병 (ALL), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 골수성 백혈병 (CML), 모발상 세포 백혈병 (HCL), T-세포 전림프구성 백혈병 (T-PLL), 거대 과립 림프구성 백혈병, 성인 T-세포 백혈병 및 다발성 골수종)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 종양 성장 또는 진행의 억제를 필요로 하는 대상체에게 본원에 기재된 바와 같은 ADC를 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 종양 성장 또는 진행을 억제하는 방법이 제공된다. 다른 실시양태에서, 암 세포 또는 종양 (예를 들어, 고형 또는 액상 종양)의 전이의 억제를 필요로 하는 대상체에게 본원에 기재된 바와 같은 ADC를 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 암 세포 또는 종양 (예를 들어, 고형 또는 액상 종양)의 전이를 억제하는 방법이 제공된다. 다른 실시양태에서, 종양 퇴행의 유도를 필요로 하는 대상체에게 본원에 기재된 바와 같은 ADC를 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 종양 퇴행을 유도하는 방법이 제공된다.
본원에 기재된 바와 같은 ADC 내의 작용제 모이어티는 검출가능한 모이어티, 예컨대 영상화제 및 효소-기질 표지일 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 ADC는 또한 생체내 진단 검정, 예컨대 생체내 영상화 (예를 들어, PET 또는 SPECT), 또는 염색 시약을 위해 사용될 수도 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 대상체를 추가의 형태의 요법으로 치료하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 추가의 형태의 요법은 화학요법, 방사선, 수술, 호르몬 요법 및/또는 추가의 면역요법을 포함하나 이에 제한되지는 않는 추가의 항암 요법이다.
일부 실시양태에서, 추가의 형태의 요법은 본원에 기재된 바와 같은 ADC에 더하여 1종 이상의 치료제를 투여하는 것을 포함한다. 치료제는 제2 ADC (예를 들어, 통상적인 ADC, 예컨대 브렌툭시맙 베도틴 (애드세트리스(ADCETRIS)®) 및 아도-트라스투주맙 엠탄신 (카드실라®)), 항체 (예를 들어, 항-VEGF 항체, 항-HER2 항체, 항-CD25 항체 및/또는 항-CD20 항체), 혈관신생 억제제, 세포독성제 (예를 들어, 도세탁셀, 시스플라틴, 독소루비신, 미토마이신, 타목시펜 또는 플루오로우라실), 및 항염증제 (예를 들어, 프레드니손 및 프로게스테론)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
제약 조성물
본 발명은 또한 제약상 허용되는 부형제 또는 담체 내에 본원에 기재된 바와 같은 ADC를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. ADC는 단독으로 또는 본 발명의 1종 이상의 다른 ADC와 조합되어 또는 1종 이상의 다른 약물과 조합되어 (또는 그의 임의의 조합으로서) 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 ADC는 통상적인 ADC (즉, 안정성 조정 특색으로 설계되지 않은 것)와 조합되어 투여될 수 있다. 따라서 본 발명의 방법 및 용도는 또한 하기 상술된 바와 같은 다른 활성제와의 조합 (공-투여)의 실시양태를 포괄한다.
본원에 사용된 용어 "공-투여", "공-투여된" 또는 "와 조합되어"는 하기를 의미하도록 의도되고, 하기를 지칭한다: (i) 본원에 개시된 ADC 및 치료제(들)의 조합을 이를 필요로 하는 환자에게 동시에 투여하며, 이때 이러한 성분들은 함께 단일 투여 형태로 제제화되어 이것이 상기 성분들을 실질적으로 동시에 상기 환자에게 방출함; (ii) 본원에 개시된 ADC 및 치료제(들)의 조합을 이를 필요로 하는 환자에게 실질적으로 동시에 투여하며, 이때 이러한 성분들이 서로 떨어져 개별 투여 형태로 제제화되어 이것이 상기 환자에 의해 실질적으로 동시에 취해졌을 때 상기 성분들이 실질적으로 동시에 상기 환자에게 방출됨; (iii) 본원에 개시된 ADC 및 치료제(들)의 조합을 이를 필요로 하는 환자에게 순차적으로 투여하며, 이때 이러한 성분들은 서로 떨어져 개별 투여 형태로 제제화되어 이것이 상기 환자에 의해 각각의 투여 사이의 유의한 시간 간격으로 연속적인 시간에서 취해졌을 때 상기 성분들이 실질적으로 상이한 시간에 상기 환자에게 방출됨; 및 (iv) 본원에 개시된 ADC 및 치료제(들)의 조합을 이를 필요로 하는 환자에게 순차적으로 투여하며, 이때 이러한 성분들은 함께 단일 투여 형태로 제제화되어 이것이 상기 성분들을 제어 방식으로 방출하였을 때 이들이 공동으로, 연속적으로 및/또는 중첩되어 동시에 및/또는 상이한 시간에 상기 환자에게 방출됨 (여기서 각각의 부분은 동일한 또는 상이한 경로에 의해 투여될 수 있음).
일반적으로, 본원에 기재된 ADC는 1종 이상의 제약상 허용되는 부형제(들)와 회합된 제제로서 투여하기에 적합하다. 용어 '부형제'는 본 발명의 화합물(들) 이외의 다른 임의의 성분을 기재하는 것으로 본원에 사용된다. 부형제(들)의 선택은 대체로 특정한 투여 방식, 용해도 및 안정성에 대한 부형제의 효과, 및 투여 형태의 성질과 같은 인자에 좌우된다. 본원에 사용된 "제약상 허용되는 부형제"는 생리학상 상용성인 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항박테리아제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 제약상 허용되는 부형제의 일부 예는 물, 염수, 포스페이트 완충 염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등, 뿐만 아니라 그의 조합이다. 일부 실시양태에서, 당, 폴리알콜 (예를 들어, 만니톨, 소르비톨) 또는 염화나트륨을 포함한 등장화제가 제약 조성물에 포함된다. 제약상 허용되는 물질의 추가의 예는 항체의 보관 수명 또는 유효성을 증진시키는 습윤제 또는 미량의 보조 물질, 예컨대 습윤제 또는 유화제, 보존제 또는 완충제를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 ADC는 대상체게 투여 시에 면역원성을 감소시키도록 공지된 기술, 예컨대 PCT 공개 WO98/52976 및 WO00/34317에 기재된 것을 사용하여 탈면역화될 수 있다.
본 발명의 제약 조성물 및 그의 제조 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 자명하다. 예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 22nd Edition (Mack Publishing Company, 2012)]에서 이러한 조성물 및 그의 제조 방법을 찾아볼 수 있다. 제약 조성물은 바람직하게는 GMP 조건 하에서 제조된다.
본 발명의 제약 조성물은 벌크로, 단일 단위 용량으로 또는 복수회의 단일 단위 용량으로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 본원에 사용된 "단위 용량"은 미리 결정된 양의 활성 성분을 포함하는 제약 조성물의 개별 양이다. 활성 성분의 양은 일반적으로 대상체에게 투여될 활성 성분의 투여량 또는 이러한 투여량의 편리한 분획, 예컨대, 예를 들어 이러한 투여량의 1/2 또는 1/3과 동일하다. 관련 기술분야에서 허용되는 펩티드, 단백질 또는 항체를 투여하는 임의의 방법이 본원에 개시된 조작된 폴리펩티드 접합체에 적합하게 사용될 수 있다.
본 발명의 제약 조성물은 전형적으로 비경구 투여에 적합하다. 제약 조성물의 비경구 투여는 대상체의 조직에 물리적으로 틈을 내고, 조직 내의 틈을 통해 제약 조성물을 투여하여, 일반적으로 혈류, 근육 또는 내부 기관 내로의 직접적인 투여를 유발하는 것을 특징으로 하는 임의의 투여 경로를 포함한다. 예를 들어, 비경구 투여는 조성물의 주사, 외과적 절개를 통한 조성물의 적용, 조직-침투성 비-수술 상처를 통한 조성물의 적용 등에 의한 제약 조성물의 투여를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특히, 비경구 투여는 피하, 복강내, 근육내, 흉골내, 정맥내, 동맥내, 척수강내, 뇌실내, 요도내, 두개내, 활막내 주사 또는 주입; 및 신장 투석 주입 기술을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 비경구 투여는 정맥내 또는 피하 경로이다.
전형적으로, 비경구 투여에 적합한 제약 조성물의 제제는 제약상 허용되는 담체, 예컨대 멸균수 또는 멸균 등장성 염수와 조합된 활성 성분을 일반적으로 포함한다. 이러한 제제는 볼루스 투여 또는 연속 투여에 적합한 형태로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 주사가능한 제제는 단위 투여 형태로, 예컨대 앰플로 또는 보존제를 함유하는 다중 용량 용기로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제는 현탁액, 용액, 유성 또는 수성 비히클 내의 에멀젼, 페이스트 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 이러한 제제는 현탁화제, 안정화제 또는 분산제를 포함하나 이에 제한되지는 않는 1종 이상의 추가의 성분을 추가로 포함할 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제의 한 실시양태에서, 적합한 비히클 (예를 들어 발열원 무함유 멸균수)로 재구성시킨 후에 재구성된 조성물을 비경구 투여하기 위한 건조 (즉 분말 또는 과립) 형태로 활성 성분이 제공된다. 비경구 제제는 부형제, 예컨대 염, 탄수화물 및 완충제 (바람직하게는 pH 3 내지 9)를 함유할 수 있는 수용액을 또한 포함하지만, 일부 적용의 경우, 이들은 멸균 비-수용액으로서 또는 적합한 비히클, 예컨대 발열원 무함유 멸균수와 함께 사용될 건조 형태로서 보다 적합하게 제제화될 수 있다. 예시적인 비경구 투여 형태는 멸균 수용액, 예를 들어 수성 프로필렌 글리콜 또는 덱스트로스 용액 내의 용액 또는 현탁액을 포함한다. 원하는 경우에, 이러한 투여 형태는 적합하게는 완충될 수 있다. 유용한 다른 비경구로 투여가능한 제제는 미세결정질 형태 또는 리포솜 제제 내의 활성 성분을 포함하는 것을 포함한다. 비경구 투여를 위한 제제는 즉시 및/또는 변형 방출되도록 제제화될 수 있다. 변형 방출 제제는 제어, 지연, 지속, 펄스형, 표적화 및 프로그램화 방출 제제를 포함한다. 예를 들어, 한 측면에서, 요구되는 경우 상기 열거된 성분들 중 1종 또는 그의 조합과 함께, 조작된 Fc-함유 폴리펩티드, 예를 들어 항체-약물 접합체 또는 이중특이적 항체를 요구량으로 적절한 용매 내에 혼입시킨 후, 멸균 여과함으로써 멸균 주사가능한 용액이 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 염기성 분산 매질 및 상기 열거된 것으로부터 요구되는 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내에 혼입시켜 제조된다. 멸균 주사가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 활성 성분에 더하여 예비 멸균 여과된 용액으로부터의 임의의 추가의 목적 성분의 분말을 생성하는 진공 건조 및 동결 건조이다. 용액의 적절한 유동성은, 예를 들어 코팅, 예컨대 레시틴의 사용, 분산액의 경우에 요구되는 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 주사가능한 조성물의 지속 흡수는 조성물에 흡수 지연제, 예를 들어 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 포함시킴으로써 일어날 수 있다.
투여 요법은 최적의 목적하는 반응을 제공하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 단일 볼루스가 투여될 수 있거나, 여러 분할 용량이 시간에 걸쳐 투여될 수 있거나, 또는 치료 상황의 위급성에 의해 나타난 바와 같이 용량이 비례적으로 감소 또는 증가될 수 있다. 비경구 조성물은 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 투여 단위 형태로 제제화하는 것이 특히 유리하다. 본원에 사용된 투여 단위 형태는 치료될 환자/대상체에 대한 단일 투여형으로서 적합한 물리적 이산 단위를 지칭하고, 각각의 단위는 요구되는 제약 담체와 함께 목적하는 치료 효과를 가져오도록 계산된 미리 결정된 양의 활성 화합물을 함유한다. 본 발명의 투여 단위 형태에 대한 상세사항은 (a) 작용제 모이어티 (예를 들어, 소형 분자, 예컨대 세포독성제)의 고유한 특성, 및 달성될 특정한 치료 또는 예방 효과, 및 (b) 개체에서의 감수성의 치료를 위한 이러한 활성 화합물을 배합하는 분야의 고유한 제한사항에 의해 일반적으로 지시되고, 이에 직접적으로 좌우된다.
따라서, 통상의 기술자는 본원에 제공된 개시내용을 기반으로 용량 및 투여 요법이 치료 기술분야에 널리 공지된 방법에 따라 조정된다는 것을 인지할 것이다. 즉, 최대 허용 용량이 용이하게 확립될 수 있고, 환자에게 검출가능한 치료 이익을 제공하는 유효량이 또한 결정될 수 있으며, 환자에게 검출가능한 치료 이익을 제공하도록 각각의 작용제를 투여하기 위한 일시적 요건도 결정될 수 있다. 따라서, 특정 용량 및 투여 요법이 본원에 예시되지만, 이들 예는 어떠한 방식으로도 본 발명을 실시하는데 있어서 환자에게 제공될 수 있는 용량 및 투여 요법을 제한하지 않는다.
투여량 값은 완화될 상태의 유형 및 중증도에 따라 달라질 수 있고, 단일 또는 다중 용량을 포함할 수 있음을 주목해야 한다. 추가로, 임의의 특정한 대상체에 대해, 특정 투여 요법은 개별 필요성, 및 조성물을 투여하거나 투여를 관리하는 사람의 전문적 판단에 따라 시간에 걸쳐 조정되어야 하고, 본원에 제시된 투여량 범위는 단지 예시적이며 청구된 조성물의 범주 또는 실시를 제한하는 것으로 의도되지 않음을 이해해야 한다. 추가로, 본 발명의 조성물을 사용한 투여 요법은 질환의 유형, 환자의 연령, 체중, 성별, 의학적 상태, 상태의 중증도, 투여 경로, 및 사용된 특정한 항체를 포함한 다양한 인자를 기반으로 할 수 있다. 따라서, 투여 요법은 폭넓게 달라질 수 있지만, 표준 방법을 사용하여 상용적으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 용량은 독성 효과 및/또는 실험실 값과 같은 임상 효과를 포함할 수 있는 약동학적 및 약역학적 파라미터를 기반으로 하여 조정될 수 있다. 따라서, 본 발명은 통상의 기술자에 의해 결정된 바와 같은 환자내 용량-증량을 포괄한다. 적절한 투여량 및 요법을 결정하는 것은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 본원에 개시된 교시가 제공되면 통상의 기술자에 의해 달성되는 것으로 이해될 것이다.
인간 대상체에게 투여하는 경우, 본원에 개시된 ADC의 총 1개월 용량은, 물론 투여 방식에 따라 전형적으로 환자당 약 0.01 mg 내지 약 1200 mg의 범위이다. 예를 들어, 정맥내 1개월 용량은 약 1 내지 약 1000 mg/환자를 요구할 수 있다. 총 1개월 용량은 단일 또는 분할 용량으로 투여될 수 있고, 의사의 판단으로 본원에 제공된 전형적인 범위를 벗어날 수 있다.
본원에 개시된 바와 같은 ADC의 치료 또는 예방 유효량에 대한 예시적인 비제한적 범위는 약 0.01 내지 약 1000 mg/환자/개월이다. 특정 실시양태에서, ADC는 약 1 내지 약 200 또는 약 1 내지 약 150 mg/환자/개월로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 환자는 인간이다.
키트
본 발명은 또한 상기 기재된 장애의 치료에서 사용하기 위한 키트 (또는 제조 물품)를 제공한다. 본 발명의 키트는 정제된 ADC를 포함하는 1개 이상의 용기 및 질환을 치료하기 위해 접합체를 사용하는 것에 대한 지침서를 포함한다. 예를 들어, 지침서는 질환, 예컨대 암 (예를 들어, 고형 또는 액상 암)을 치료하기 위한 ADC의 투여의 설명을 포함한다. 키트는 개체가 질환을 갖는지 여부 및 질환의 병기를 확인하는 것을 기반으로 하여 치료에 적합한 개체를 선택하는 것의 설명을 추가로 포함할 수 있다.
ADC의 사용에 관련된 지침서는 일반적으로 의도된 치료를 위한 투여량, 투여 스케줄 및 투여 경로에 관한 정보를 포함한다. 용기는 단위 용량, 벌크 패키지 (예를 들어, 다중-용량 패키지) 또는 서브유닛 용량일 수 있다. 본 발명의 키트에 공급되는 지침서는 전형적으로 라벨 또는 패키지 삽입물 (예를 들어, 키트 내에 포함된 종이 시트) 상의 서면 지침서이지만, 기계-판독가능한 지침서 (예를 들어, 자기 또는 광학 저장 디스크에 실린 지침서)가 또한 허용될 수 있다.
본 발명의 키트는 적합한 패키지 중에 존재한다. 적합한 패키지는 바이알, 병, 자르, 가요성 패키지 (예를 들어, 밀봉된 마일라(Mylar) 또는 플라스틱 백) 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정 장치, 예컨대 흡입기, 비강 투여 장치 (예를 들어, 아토마이저) 또는 주입 장치, 예컨대 미니펌프와 조합하여 사용하기 위한 패키지가 또한 고려된다. 키트는 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘에 의해 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있음). 용기는 또한 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘에 의해 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있음). 조성물 내의 적어도 1종의 활성제는 본원에 기재된 바와 같은 보다 고도로 로딩된 ADC이다. 용기는 제2 제약 활성제를 추가로 포함할 수 있다.
키트는 임의로, 추가의 성분, 예컨대 완충제 및 해석 정보를 제공할 수 있다. 통상적으로, 키트는 용기, 및 용기 상의 또는 그와 회합된 라벨 또는 패키지 삽입물(들)을 포함한다.
실시예
본원에 기재된 실시예 및 실시양태는 단지 예시적 목적을 위한 것이고, 이에 비추어 다양한 변형 또는 변화가 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 시사될 것이며, 이는 본 출원의 취지 및 범위 내에 포함됨을 이해한다.
분석에 사용된 HPLC 및 LC-MS 조건:
분석용 HPLC 조건: 페노메넥스(Phenomenex) 루나(Luna) C18 (2), 150 x 3.0 mm, 5 μm 칼럼; 이동상 A: 물 중 0.02% 트리플루오로아세트산 (v/v); 이동상 B: 아세토니트릴 중 0.02% 트리플루오로아세트산 (v/v); 구배: 8.5분에 걸쳐 0%에서 100% B, 이어서 1.5분 동안 100% B; 유량: 1.5 mL/분. 온도: 제어되지 않음; 검출: DAD 210, 254 nm; 주입 부피: 10 μL; 기기: 애질런트(Agilent) 1100 HPLC.
분석 LC-MS 조건: 워터스(Waters) 액퀴티(Acquity) UPLC HSS T3, C18, 2.1 x 50 mm, 1.7 μm; 이동상 A: 물 중 0.1% 포름산 (v/v); 이동상 B: 아세토니트릴 중 0.1% 포름산 (v/v); 구배: 0.1분에 걸쳐 5% B, 2.5분에 걸쳐 5%에서 95% B, 0.35분에 걸쳐 95% B; 유량: 1.25 mL/분. 온도: 60℃; 검출: 200-450nm; MS (+) 범위 100-2000 달톤; 주입 부피: 5 μL; 기기: 워터스 액퀴티.
정제에 사용된 정제용 HPLC 조건:
방법 A: 페노메넥스 루나 C18, 100 x 30 mm, 5 μm 칼럼; 이동상 A: 물 중 0.02% 트리플루오로아세트산 (v/v); 이동상 B: 아세토니트릴 중 0.02% 트리플루오로아세트산 (v/v); 구배: 20분에 걸쳐 5%에서 50% B; 유량: 20 mL/분. 온도: 제어되지 않음; 검출: DAD 210, 254 nm; 주입 부피: 5 mL 이하. 기기: 길슨(Gilson) 215.
방법 B: 페노메넥스 루나 C18, 100 x 30 mm, 5 μm 칼럼; 이동상 A: 물 중 0.02% 트리플루오로아세트산 (v/v); 이동상 B: 아세토니트릴 중 0.02% 트리플루오로아세트산 (v/v); 구배: 20분에 걸쳐 20%에서 80% B; 유량: 20 mL/분. 온도: 제어되지 않음; 검출: DAD 210, 254 nm; 주입 부피: 5 mL 이하. 기기: 길슨 215.
방법 C: 페노메넥스 루나 C18, 100 x 30 mm, 5 μm 칼럼; 이동상 A: 물 중 0.02% 트리플루오로아세트산 (v/v); 이동상 B: 아세토니트릴 중 0.02% 트리플루오로아세트산 (v/v); 구배: 20분에 걸쳐 5%에서 70% B; 유량: 20 mL/분. 온도: 제어되지 않음; 검출: DAD 210, 254 nm; 주입 부피: 5 mL 이하. 기기: 길슨 215.
방법 D: 페노메넥스 루나 C18, 100 x 30 mm, 5 μm 칼럼; 이동상 A: 물 중 0.02% 트리플루오로아세트산 (v/v); 이동상 B: 아세토니트릴 중 0.02% 트리플루오로아세트산 (v/v); 구배: 20분에 걸쳐 10%에서 70% B; 유량: 20 mL/분. 온도: 제어되지 않음; 검출: DAD 210, 254 nm; 주입 부피: 5 mL 이하. 기기: 길슨 215.
방법 E: 페노메넥스 루나 C18, 100 x 30 mm, 5 μm 칼럼; 이동상 A: 물 중 0.02% 트리플루오로아세트산 (v/v); 이동상 B: 아세토니트릴 중 0.02% 트리플루오로아세트산 (v/v); 구배: 20분에 걸쳐 30%에서 85% B; 유량: 20 mL/분. 온도: 제어되지 않음; 검출: DAD 210, 254 nm; 주입 부피: 5 mL 이하. 기기: 길슨 215.
방법 F: 페노메넥스 루나 C18, 100 x 30 mm, 5 μm 칼럼; 이동상 A: 물 중 0.02% 트리플루오로아세트산 (v/v); 이동상 B: 아세토니트릴 중 0.02% 트리플루오로아세트산 (v/v); 구배: 20분에 걸쳐 10%에서 90% B; 유량: 20 mL/분. 온도: 제어되지 않음; 검출: DAD 210, 254 nm; 주입 부피: 5 mL 이하. 기기: 길슨 215.
방법 G: 페노메넥스 루나 C18, 100 x 30 mm, 5 μm 칼럼; 이동상 A: 물 중 0.02% 트리플루오로아세트산 (v/v); 이동상 B: 아세토니트릴 중 0.02% 트리플루오로아세트산 (v/v); 구배: 20분에 걸쳐 10%에서 95% B; 유량: 20 mL/분. 온도: 제어되지 않음; 검출: DAD 210, 254 nm; 주입 부피: 5 mL 이하. 기기: 길슨 215.
방법 H: 페노메넥스 루나 C18, 100 x 30 mm, 5 μm 칼럼; 이동상 A: 물 중 0.02% 트리플루오로아세트산 (v/v); 이동상 B: 아세토니트릴 중 0.02% 트리플루오로아세트산 (v/v); 구배: 20분에 걸쳐 25%에서 65% B; 유량: 20 mL/분. 온도: 제어되지 않음; 검출: DAD 210, 254 nm; 주입 부피: 5 mL 이하. 기기: 길슨 215.
방법 I: 페노메넥스 시너지 맥스(Synergi Max) C18, 250x50mm, 10um 칼럼; 이동상 A: 물 중 0.2% 포름산 (v/v); 이동상 B: 아세토니트릴; 구배: 25분간 33.0%에서 58% B, 이어서 2분간 100% B로 상승, 5분 동안 유지; 유량: 80 mL/분. 온도: 제어되지 않음; 검출: DAD 220 nm.
방법 J: DIKMA 다이아몬실(Diamonsil)(2) C18, 200x20mm, 5um 칼럼; 이동상 A: 물 중 0.225% 포름산 (v/v); 이동상 B: 아세토니트릴; 구배: 11분에 걸쳐 53%에서 73% B, 이어서 0.5분간 100% B로 상승, 2분 동안 유지; 유량: 35 mL/분. 온도: 제어되지 않음; 검출: DAD 220 nm.
방법 K: 페노메넥스 루나 C18, 100 x 30 mm, 5 μm 칼럼; 이동상 A: 물 중 0.02% 트리플루오로아세트산 (v/v); 이동상 B: 아세토니트릴 중 0.02% 트리플루오로아세트산 (v/v); 구배: 20분에 걸쳐 20%에서 90% B; 유량: 20 mL/분. 온도: 제어되지 않음; 검출: DAD 210, 254 nm; 주입 부피: 5 mL 이하. 기기: 길슨 215.
방법 L: 페노메넥스 루나 C18, 100 x 30 mm, 5 μm 칼럼; 이동상 A: 물 중 0.02% 트리플루오로아세트산 (v/v); 이동상 B: 아세토니트릴 중 0.02% 트리플루오로아세트산 (v/v); 구배: 20분에 걸쳐 10%에서 80% B; 유량: 20 mL/분. 온도: 제어되지 않음; 검출: DAD 210, 254 nm; 주입 부피: 5 mL 이하. 기기: 길슨 215.
방법 M: 페노메넥스 루나 C18, 150 x 21.2 mm, 5 μm 칼럼; 이동상 A: 물 중 0.02% 아세트산 (v/v); 이동상 B: 아세토니트릴 중 0.02% 아세트산 (v/v); 구배: 8.5분에 걸쳐 1%에서 100% B, 이어서 2분에 걸쳐 100% B에서 유지; 유량: 27 mL/분. 온도: 25℃; 검출: DAD 215 nm, 254 nm; MS (+) 범위 150-2000 달톤; 주입 부피: 5 mL 이하. 기기: 305 RP 워터스 프랙션링스(FractionLynx) LCMS.
방법 N: 페노메넥스 루나 C18, 100 x 30 mm, 5 μm 칼럼; 이동상 A: 물 중 0.02% 트리플루오로아세트산 (v/v); 이동상 B: 아세토니트릴 중 0.02% 트리플루오로아세트산 (v/v); 구배: 20분에 걸쳐 50%에서 100% B; 유량: 20 mL/분. 온도: 제어되지 않음; 검출: DAD 210, 254 nm; 주입 부피: 5 mL 이하. 기기: 길슨 215.
방법 O: 페노메넥스 루나 C18, 150 x 21.2 mm, 5 μm 칼럼; 이동상 A: 물 중 0.02% 아세트산 (v/v); 이동상 B: 아세토니트릴 중 0.02% 아세트산 (v/v); 구배: 8.5분에 걸쳐 35%에서 50% B, 이어서 2분에 걸쳐 100% B에서 유지; 유량: 27 mL/분. 온도: 25℃; 검출: DAD 215 nm, 254 nm; MS (+) 범위 150-2000 달톤; 주입 부피: 5 mL 이하. 기기: 305 RP 워터스 프랙션링스 LCMS.
방법 P: 페노메넥스 루나 C18, 100 x 30 mm, 5 μm 칼럼; 이동상 A: 물 중 0.02% 트리플루오로아세트산 (v/v); 이동상 B: 아세토니트릴 중 0.02% 트리플루오로아세트산 (v/v); 구배: 20분에 걸쳐 25%에서 100% B; 유량: 20 mL/분. 온도: 제어되지 않음; 검출: DAD 210, 254 nm; 주입 부피: 5 mL 이하. 기기: 길슨 215.
방법 Q: 페노메넥스 루나 C18, 100 x 30 mm, 5 μm 칼럼; 이동상 A: 물 중 0.02% 트리플루오로아세트산 (v/v); 이동상 B: 아세토니트릴 중 0.02% 트리플루오로아세트산 (v/v); 구배: 20분에 걸쳐 20%에서 100% B; 유량: 20 mL/분. 온도: 제어되지 않음; 검출: DAD 210, 254 nm; 주입 부피: 5 mL 이하. 기기: 길슨 215.
방법 R: 페노메넥스 루나 C18, 150 x 21.2 mm, 5 μm 칼럼; 이동상 A: 물 중 0.02% 아세트산 (v/v); 이동상 B: 아세토니트릴 중 0.02% 아세트산 (v/v); 구배: 8.5분에 걸쳐 35%에서 50% B, 이어서 2분에 걸쳐 100% B에서 유지; 유량: 27 mL/분. 온도: 25℃; 검출: DAD 215 nm, 254 nm; MS (+) 범위 150-2000 달톤; 주입 부피: 5 mL 이하. 기기: 305 RP 워터스 프랙션링스 LCMS.
방법 S: 페노메넥스 루나 C18, 100 x 30 mm, 5 μm 칼럼; 이동상 A: 물 중 0.02% 트리플루오로아세트산 (v/v); 이동상 B: 아세토니트릴 중 0.02% 트리플루오로아세트산 (v/v); 구배: 20분에 걸쳐 20%에서 90% B; 유량: 20 mL/분. 온도: 제어되지 않음; 검출: DAD 210, 254 nm; 주입 부피: 5 mL 이하. 기기: 길슨 215.
방법 T: 페노메넥스 시너지 맥스 C18, 250x50mm, 10um 칼럼; 이동상 A: 물 중 0.2% 포름산 (v/v); 이동상 B: 아세토니트릴; 구배: 30분간 35.0%에서 65% B, 이어서 2분간 100% B로 상승, 5분 동안 유지; 유량: 30 mL/분. 온도: 제어되지 않음; 검출: DAD 220 nm.
방법 U: 이스코(Isco) MPLC, 레디셉(RediSep) 43 g C18 칼럼 골드(Gold); 이동상 A: 물 중 0.02% 트리플루오로아세트산 (v/v); 이동상 B: 아세토니트릴 중 0.02% 트리플루오로아세트산 (v/v); 구배: 20분간 20-100% B; 유량: 40 ml/분; 온도: 제어되지 않음; DAD 214, 254 nm.
방법 V: 이스코 MPLC, 레디셉 43 g C18 칼럼 골드; 이동상 A: 물 중 0.02% 트리플루오로아세트산 (v/v); 이동상 B: 아세토니트릴 중 0.02% 트리플루오로아세트산 (v/v); 구배 20분간 10-80% B; 유량: 40 ml/분; 온도: 제어되지 않음; DAD 214, 254 nm.
방법 W: 페노메넥스 시너지 맥스-RP 250 x 50 mm, 10 μm 칼럼; 이동상 A: 물 중 0.1% 트리플루오로아세트산 (v/v); 이동상 B: 아세토니트릴 중 0.1% 트리플루오로아세트산 (v/v); 구배: 30분에 걸쳐 24%에서 54% B; 유량: 30 mL/분. 온도: 제어되지 않음; 검출: DAD 210, 254 nm; 주입 부피: 5 mL 이하.
방법 X: 루나 C18 150 x 25, 5 μm 칼럼; 이동상 A: 물 중 0.2% 트리플루오로아세트산 (v/v); 이동상 B: 아세토니트릴 중 0.2% 트리플루오로아세트산 (v/v); 구배: 11분에 걸쳐 30%에서 50% B; 유량: 35 mL/분. 온도: 제어되지 않음; 검출: DAD 210, 254 nm; 주입 부피: 5 mL 이하.
방법 Y: 페노메넥스 시너지 맥스-RP 250 x 50 mm, 100 x 30 mm, 10 μm 칼럼; 이동상 A: 물 중 0.1% 트리플루오로아세트산 (v/v); 이동상 B: 아세토니트릴 중 0.1% 트리플루오로아세트산 (v/v); 구배: 22분에 걸쳐 30%에서 60% B; 유량: 80 mL/분. 온도: 제어되지 않음; 검출: DAD 210, 254 nm; 주입 부피: 5 mL 이하.
방법 Z: 페노메넥스 시너지 맥스-RP 250 x 50 mm, 10 μm 칼럼; 이동상 A: 물 중 0.1% 트리플루오로아세트산 (v/v); 이동상 B: 아세토니트릴 중 0.1% 트리플루오로아세트산 (v/v); 구배: 21.5분에 걸쳐 30%에서 60% B; 유량: 80 mL/분. 온도: 제어되지 않음; 검출: DAD 210, 254 nm; 주입 부피: 5 mL 이하.
방법 AA: 페노메넥스 시너지 맥스-RP 250 x 80, 10 μm 칼럼; 이동상 A: 물 중 0.1% 트리플루오로아세트산 (v/v); 이동상 B: 아세토니트릴 중 0.1% 트리플루오로아세트산 (v/v); 구배: 30분에 걸쳐 40%에서 70% B; 유량: 30 mL/분. 온도: 제어되지 않음; 검출: DAD 220 nm; 주입 부피: 5 mL 이하.
실시예 1: N~2~-벤조일-L-리실-L-발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (6)의 제조
Figure 112017018870512-pct00038
단계 1: N~2~-벤조일-N~6~-(tert-부톡시카르보닐)-L-리실-L-발릴-N~5~-카르바모일-N-[4-(히드록시메틸)페닐]-L-오르니틴아미드 (2)의 합성. N,N-디메틸포름아미드 1 mL 중 N~2~-벤조일-N~6~-(tert-부톡시카르보닐)-L-리신 (100 mg, 0.285 mmol) 및 L-발릴-N~5~-카르바모일-N-[4-(히드록시메틸)페닐]-L-오르니틴아미드 (1, 108 mg, 0.285 mmol)의 용액에 O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HATU, 111 mg, 0.285 mmol)에 이어서 N,N-디이소프로필에틸아민 (201 ul, 149 mg, 1.14 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 LC-MS에 의해 모니터링하고, 실온에서 16시간 동안 교반되도록 하였다. 이어서, 반응물을 농축시키고, 역상 HPLC (방법 A)에 의해 정제하였다. 생성물 함유 분획을 동결건조시켜 목적 생성물 127 mg (63%)을 수득하였다. LC-MS m/z 712.4 [M+H+]; 710.4 [M-H+]; 체류 시간 = 1.30분.
단계 2: N~2~-벤조일-N~6~-(tert-부톡시카르보닐)-L-리실-L-발릴-N~5~-카르바모일-N-[4-({[(4-니트로페녹시)카르보닐]옥시}메틸)페닐]-L-오르니틴아미드 (3)의 합성. N,N-디메틸포름아미드 1 mL 중 N~2~-벤조일-N~6~-(tert-부톡시카르보닐)-L-리실-L-발릴-N~5~-카르바모일-N-[4-(히드록시메틸)페닐]-L-오르니틴아미드 (2, 125 mg, 0.352 mmol)의 용액을 p-니트로페닐 카르보네이트 (107 mg, 0.352 mmol) 및 트리에틸아민 (101 ul, 73.4 mg, 0.704 mmol)으로 처리하였다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반한 다음, 농축시켜 거의 건조시키고, 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 디클로로메탄 중 5% 내지 20% 메탄올의 구배 용리를 사용하여 정제하여 목적 생성물 129 mg (83.6%)을 수득하였다. LC-MS m/z 877.4 [M+H+]; 899.3 [M+Na+]; 체류 시간 = 1.73분.
단계 3: N~2~-벤조일-N~6~-(tert-부톡시카르보닐)-L-리실-L-발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (5)의 합성. N,N-디메틸포름아미드 0.2 mL 중 2-메틸알라닐-N-[(3R,4S,5S)-3-메톡시-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드 (4, 20 mg, 0.027 mmol), N~2~-벤조일-N~6~-(tert-부톡시카르보닐)-L-리실-L-발릴-N~5~-카르바모일-N-[4-({[(4-니트로페녹시)카르보닐]옥시}메틸)페닐]-L-오르니틴아미드 (3, 28 mg, 0.032 mmol)의 용액에 2,6-루티딘 (5.8 mg, 0.032 mmol), N,N-디이소프로필에틸아민 (9 ul, 7 mg, 0.054 mmol) 및 3H-[1,2,3]트리아졸로[4,5-b]피리딘-3-올 (HOAt, 4.4 mg, 0.032 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 LC-MS에 의해 모니터링하고, 실온에서 16시간 동안 교반되도록 하였다. 이어서, 반응물을 농축시키고, 역상 HPLC (방법 B)에 의해 정제하였다. 생성물 함유 분획을 동결건조시켜 목적 생성물 30 mg (75%)을 수득하였다. LC-MS m/z 1481.8 [M+H+]; 1478.8 [M-H+]; 체류 시간 = 1.91분.
단계 4: N~2~-벤조일-L-리실-L-발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (6)의 합성. 디클로로메탄 2.5 mL 중 N~2~-벤조일-N~6~-(tert-부톡시카르보닐)-L-리실-L-발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (5, 30 mg, 0.02 mmol)의 용액에 디클로로메탄 중 트리플루오로아세트산의 10% 용액 2.5 mL를 첨가하였다. 혼합물을 LC-MS에 의해 모니터링하고, 실온에서 2.25시간 동안 교반되도록 하였다. 이어서, 반응물을 농축시키고, 역상 HPLC (방법 C)에 의해 정제하였다. 생성물 함유 분획을 동결건조시켜 목적 생성물 22 mg (74%)을 수득하였다. LC-MS m/z 1381.7 [M+H+]; 체류 시간 = 1.54분. 분석용 HPLC 체류 시간 = 6.00분.
실시예 2: N~2~-(2,2-디메틸프로파노일)-L-리실-L-발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (12)의 제조
Figure 112017018870512-pct00039
단계 1: N-(tert-부톡시카르보닐)-L-발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (8)의 합성. N,N-디메틸포름아미드 0.5 mL 중 2-메틸알라닐-N-[(3R,4S,5S)-3-메톡시-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드 (4, 80 mg, 0.11 mmol) 및 N-(tert-부톡시카르보닐)-L-발릴-N~5~-카르바모일-N-[4-({[(4-니트로페녹시)카르보닐]옥시}메틸)페닐]-L-오르니틴아미드 (7, 76.7 mg, 0.119 mmol)의 용액에 2,6-루티딘 (46.3 mg, 0.432 mmol), N,N-디이소프로필에틸아민 (67.7 ul, 56.4 mg, 0.432 mmol) 및 3H-[1,2,3]트리아졸로[4,5-b]피리딘-3-올 (HOAt, 17.7 mg, 0.130 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 LC-MS에 의해 모니터링하고, 45℃에서 16시간 동안 교반되도록 하였다. 이어서, 반응물을 농축시키고, 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 디클로로메탄 중 5% 내지 20% 메탄올의 구배 용리를 사용하여 정제하여 목적 생성물 90 mg (67%)을 수득하였다. LC-MS m/z 1248.7 [M+H+]; 체류 시간 = 1.84분.
단계 2: L-발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (9)의 합성. 디클로로메탄 5 mL 중 N-(tert-부톡시카르보닐)-L-발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (8, 91 mg, 0.072 mmol)의 용액에 디클로로메탄 중 트리플루오로아세트산 20% 용액 2 mL를 첨가하였다. 혼합물을 LC-MS에 의해 모니터링하고, 실온에서 2.75시간 동안 교반되도록 하였다. 이어서, 반응물을 농축시켜 목적 생성물 91 mg (100%)을 수득하였으며, 이를 직접 후속 단계에 정제 없이 사용하였다. LC-MS m/z 1148.7 [M+H+]; 체류 시간 = 1.43분.
단계 3: N~6~-(tert-부톡시카르보닐)-L-리실-L-발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (10)의 합성. N,N-디메틸포름아미드 0.5 mL 중 N~6~-(tert-부톡시카르보닐)-N~2~-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-리신 (50.6 mg, 0.108 mmol)의 용액에 O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HATU, 41.6 mg, 0.108 mmol)에 이어서 N,N-디이소프로필에틸아민 (51 ul, 37.6 mg, .288 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 15분 동안 교반하였다. 이어서, N,N-디메틸포름아미드 1 mL 중 L-발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (9, 91mg, 0.072 mmol)의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 LC-MS에 의해 모니터링하고, 실온에서 2시간 동안 교반되도록 한 후에 디에틸아민 (2 ml, 1.41 g, 19.3 mmol)을 천천히 첨가하였다. 반응물을 16시간 동안 교반되도록 한 다음, 트리플루오로아세트산의 첨가에 의해 산성화시키고, 농축시키고, 역상 HPLC (방법 D)에 의해 정제하였다. 생성물 함유 분획을 동결건조시켜 목적 생성물 99 mg (92%)을 수득하였다. LC-MS m/z 1376.8 [M+H+]; 1374.8 [M-H+]; 체류 시간 = 1.40분.
단계 4: N~6~-(tert-부톡시카르보닐)-N~2~-(2,2-디메틸프로파노일)-L-리실-L-발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (11)의 합성. N,N-디메틸포름아미드 0.2 mL 중 N~6~-(tert-부톡시카르보닐)-L-리실-L-발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 트리플루오르아세테이트 (10, 21.5 mg, 0.015 mmol) 및 피발산 무수물 (5.6 mg, 0.030 mmol)의 용액에 N,N-디이소프로필에틸아민 (26 ul, 19.4 mg, 0.15 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 45분 동안 교반하였다. 이어서, 용액을 농축시키고, 역상 HPLC (방법 E)에 의해 정제하였다. 생성물 함유 분획을 동결건조시켜 목적 생성물 21.9 mg (100%)을 수득하였다. LC-MS m/z 1460.7 [M+H+]; 1458.5 [M-H+]; 체류 시간 = 1.93분.
단계 5: N~2~-(2,2-디메틸프로파노일)-L-리실-L-발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (12)의 합성. 디클로로메탄 1 mL 중 N~6~-(tert-부톡시카르보닐)-N~2~-(2,2-디메틸프로파노일)-L-리실-L-발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (11, 21.9 mg, 0.015 mmol)의 용액에 트리플루오로아세트산 0.33 mL를 첨가하였다. 혼합물을 LC-MS에 의해 모니터링하고, 실온에서 1시간 동안 교반되도록 하였다. 이어서, 반응물을 농축시키고, 역상 HPLC (방법 F)에 의해 정제하였다. 생성물 함유 분획을 동결건조시켜 목적 생성물 8 mg (36%)을 수득하였다. LC-MS m/z 1360.7 [M+H+]; 체류 시간 = 1.45분. 분석용 HPLC 체류 시간 = 6.01분.
실시예 3: N~2~-(페닐아세틸)-L-리실-L-발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (14)의 제조
Figure 112017018870512-pct00040
단계 1: N~6~-(tert-부톡시카르보닐)-N~2~-(페닐아세틸)-L-리실-L-발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (13)의 합성. N,N-디메틸포름아미드 0.2 mL 중 페닐아세트산 (15 mg, 0.11 mmol)의 용액에 O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HATU, 43.1 mg, 0.11 mmol)에 이어서 N,N-디이소프로필에틸아민 (20 ul, 14.5 mg, 0.11 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 45분 동안 교반하였다. N,N-디메틸포름아미드 0.2 mL 중 N~6~-(tert-부톡시카르보닐)-L-리실-L-발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 트리플루오로아세테이트 (10, 20 mg, 0.013 mmol)의 용액을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 이어서, 용액을 농축시키고, 역상 HPLC (방법 G)에 의해 정제하였다. 생성물 함유 분획을 동결건조시켜 목적 생성물 10 mg (52%)을 수득하였다. LC-MS m/z 1495.3 [M+H+]; 1493.1 [M-H+]; 체류 시간 = 1.93분.
단계 2: N~2~-(페닐아세틸)-L-리실-L-발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (14)의 합성. 디클로로메탄 1 mL 중 N~6~-(tert-부톡시카르보닐)-N~2~-(페닐아세틸)-L-리실-L-발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (13, 10 mg, 0.007 mmol)의 용액에 디클로로메탄 중 트리플루오로아세트산의 20% 용액 1 mL를 첨가하였다. 혼합물을 LC-MS에 의해 모니터링하고, 실온에서 2시간 동안 교반되도록 하였다. 이어서, 반응물을 농축시키고, 역상 HPLC (방법 G)에 의해 정제하였다. 생성물 함유 분획을 동결건조시켜 목적 생성물 10 mg (100%)을 수득하였다. LC-MS m/z 1394.7 [M+H+]; 체류 시간 = 1.52분. 분석용 HPLC 체류 시간 = 5.39분.
실시예 4: N~2~-(1H-이미다졸-5-일카르보닐)-L-리실-L-발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (16)의 제조
Figure 112017018870512-pct00041
단계 1: N~6~-(tert-부톡시카르보닐)-N~2~-(1H-이미다졸-5-일카르보닐)-L-리실-L-발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (15)의 합성. N,N-디메틸포름아미드 0.2 mL 중 N~6~-(tert-부톡시카르보닐)-L-리실-L-발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 트리플루오로아세테이트 (10, 20.5 mg, 0.014 mmol) 및 1H-이미다졸-5-카르복실산 (15.7 mg, 0.14 mmol)의 용액에 N,N-디이소프로필에틸아민 (25 ul, 18.3mg, 0.14 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 5분 동안 교반하였다. O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HATU, 54.3 mg, 0.14 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 용액을 농축시키고, 역상 HPLC (방법 G)에 의해 정제하였다. 생성물 함유 분획을 동결건조시켜 목적 생성물 13 mg (59%)을 수득하였다. LC-MS m/z 1471.6 [M+H+]; 1469.0 [M-H+]; 체류 시간 = 1.70분.
단계 2: N~2~-(1H-이미다졸-5-일카르보닐)-L-리실-L-발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (16)의 합성. 디클로로메탄 5 mL 중 N~6~-(tert-부톡시카르보닐)-N~2~-(1H-이미다졸-5-일카르보닐)-L-리실-L-발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (15, 13 mg, 0.008 mmol)의 용액에 디클로로메탄 중 트리플루오로아세트산의 20% 용액 2 mL를 첨가하였다. 혼합물을 LC-MS에 의해 모니터링하고, 실온에서 15분 동안 교반되도록 하였다. 이어서, 반응물을 농축시키고, 역상 HPLC (방법 D)에 의해 정제하였다. 생성물 함유 분획을 동결건조시켜 목적 생성물 6 mg (50%)을 수득하였다. LC-MS m/z 1370.7 [M+H+]; 1368.6 [M-H+]; 체류 시간 = 1.39분. 분석용 HPLC 체류 시간 = 5.30분.
실시예 5: N~2~-(1H-이미다졸-5-일아세틸)-L-리실-L-발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (18)의 제조
Figure 112017018870512-pct00042
단계 1: N~6~-(tert-부톡시카르보닐)-N~2~-(1H-이미다졸-5-일아세틸)-L-리실-L-발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (17)의 합성. N,N-디메틸포름아미드 0.2 mL 중 N~6~-(tert-부톡시카르보닐)-L-리실-L-발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 트리플루오로아세테이트 (10, 20 mg, 0.013 mmol) 및 2-(1H-이미다졸-5-일)아세트산 (30.0 mg, 0.20 mmol)의 용액에 N,N-디이소프로필에틸아민 (23 ul, 17mg, 0.13 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 5분 동안 교반하였다. O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HATU, 50.4 mg, 0.13 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 용액을 농축시키고, 역상 HPLC (방법 G)에 의해 정제하였다. 생성물 함유 분획을 동결건조시켜 목적 생성물 13.6 mg (65%)을 수득하였다. LC-MS m/z 1485.6 [M+H+]; 1483.5 [M-H+]; 체류 시간 = 1.44분.
단계 2: N~2~-(1H-이미다졸-5-일아세틸)-L-리실-L-발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (18)의 합성. 디클로로메탄 5 mL 중 N~6~-(tert-부톡시카르보닐)-N~2~-(1H-이미다졸-5-일아세틸)-L-리실-L-발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (17, 13.6 mg, 0.009 mmol)의 용액에 디클로로메탄 중 트리플루오로아세트산의 20% 용액 2 mL를 첨가하였다. 혼합물을 LC-MS에 의해 모니터링하고, 실온에서 15분 동안 교반되도록 하였다. 이어서, 반응물을 농축시키고, 역상 HPLC (방법 D)에 의해 정제하였다. 생성물 함유 분획을 동결건조시켜 목적 생성물 13 mg (96%)을 수득하였다. LC-MS m/z 1384.9 [M+H+]; 1382.8 [M-H+]; 체류 시간 = 1.26분. 분석용 HPLC 체류 시간 = 5.21분.
실시예 6: N~2~-(3-메틸부타노일)-L-리실-L-발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (19)의 제조
Figure 112017018870512-pct00043
N,N-디메틸포름아미드 0.4 mL 중 3-메틸부탄산 (10.2 mg, 0.100 mmol)의 용액을 N,N-디이소프로필에틸아민 (35 ul, 26.1mg, 0.200 mmol) 및 O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HATU, 77.6mg, 0.200 mmol)로 처리하고, 혼합물을 실온에서 5분 동안 교반하였다. N,N-디메틸포름아미드 0.4 mL 중 N~6~-(tert-부톡시카르보닐)-L-리실-L-발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 트리플루오로아세테이트 (10, 30 mg, 0.020 mmol)의 용액을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반되도록 하였다. 이어서, 용액을 농축시켜 거의 건조시킨 다음, 디클로로메탄 2 mL 중에 용해시키고, 트리플루오로아세트산 0.5 mL로 처리하였다. 실온에서 추가로 30분간 교반한 후에, 반응물을 농축시키고, 역상 HPLC (방법 H)에 의해 정제하였다. 생성물 함유 분획을 동결건조시켜 목적 생성물 13 mg (44%)을 수득하였다. LC-MS m/z 1360.8 [M+H+]; 1358.4[M-H+]; 체류 시간 = 1.49분. 분석용 HPLC 체류 시간 = 5.98분.
실시예 7: N~2~-(2-메틸프로파노일)-L-리실-L-발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (25)의 제조
Figure 112017018870512-pct00044
단계 1: N~2~-(tert-부톡시카르보닐)-N~6~-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-리실-L-발릴-N~5~-카르바모일-N-[4-(히드록시메틸)페닐]-L-오르니틴아미드 (20)의 합성. N,N-디메틸포름아미드 200 mL 중 L-발릴-N~5~-카르바모일-N-[4-(히드록시메틸)페닐]-L-오르니틴아미드 (1, 6.5 g, 17.1mmol) 및 N~2~-(tert-부톡시카르보닐)-N~6~-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-리신 (8.03 g, 17.1 mmol)의 용액에 N,N-디이소프로필에틸아민 (3.32 g, 25.7 mmol) 및 O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HATU, 7.8 g, 20.56 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반한 다음, 농축시키고, 실리카 크로마토그래피에 의해 디클로로메탄 중 5% 내지 17% 메탄올의 구배 용리를 사용하여 정제하여 목적 생성물 4.00 g (28.2%)을 백색 고체로서 수득하였다.
단계 2: N~6~-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-리실-L-발릴-N~5~-카르바모일-N-[4-(히드록시메틸)페닐]-L-오르니틴아미드 (21)의 합성. 4M 수성 염산 96 mL 중 N~2~-(tert-부톡시카르보닐)-N~6~-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-리실-L-발릴-N~5~-카르바모일-N-[4-(히드록시메틸)페닐]-L-오르니틴아미드 (20, 4.8 g, 5.78 mmol)의 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 포화 수성 K2CO3을 천천히 첨가하여 pH 7.5로 조정한 다음, 생성된 현탁액을 여과하였다. 고체를 수집하고, 진공 하에 건조시켜 목적 생성물 4.00 g (94.9%)을 황색 고체로서 수득하였다.
단계 3: N~6~-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-N~2~-(2-메틸프로파노일)-L-리실-L-발릴-N~5~-카르바모일-N-[4-(히드록시메틸)페닐]-L-오르니틴아미드 (22)의 합성. N,N-디메틸포름아미드 20 mL 중 N~6~-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-리실-L-발릴-N~5~-카르바모일-N-[4-(히드록시메틸)페닐]-L-오르니틴아미드 (21, 500 mg, 0.685 mmol) 및 1-[(2-메틸프로파노일)옥시]피롤리딘-2,5-디온 (190 mg, 1.03 mmol)의 용액에 N-N-디이소프로필에틸아민 (221 mg, 1.7 mmol)을 첨가하였다. 실온에서 2시간 동안 교반한 후에, 혼합물을 농축시키고, 역상 HPLC (방법 I)에 의해 정제하여 목적 생성물 100 mg (18.2%)을 백색 고체로서 수득하였다.
단계 4: N~6~-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-N~2~-(2-메틸프로파노일)-L-리실-L-발릴-N~5~-카르바모일-N-[4-({[(4-니트로페녹시)카르보닐]옥시}메틸)페닐]-L-오르니틴아미드 (23)의 합성. N,N-디메틸포름아미드 5 mL 중 N~6~-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-N~2~-(2-메틸프로파노일)-L-리실-L-발릴-N~5~-카르바모일-N-[4-(히드록시메틸)페닐]-L-오르니틴아미드 (22, 100 mg, 0.125 mmol) 및 p-니트로페닐 카르보네이트 (42 mg, 0.138 mmol)의 용액에 N,N-디이소프로필에틸아민 (32 mg, 0.25 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 이어서, 용액을 농축시키고, 역상 HPLC (방법 J)에 의해 정제하여 목적 생성물 110 mg (91.7%)을 백색 고체로서 수득하였다. C50H60N8O12에 대한 HRMS m/z: 987.4036 (M+Na)+. 1H NMR (400 MHz, DMSO): δ 10.12 (s, 1H), 8.30 (m, 2H), 8.18 (m, 1H), 7.88 (m, 3H), 7.64 (m, 6H), 7.27 (m, 6H), 6.00 (s, 1H), 5.44 (s, 2H), 5.23 (s, 2H), 4.21 (m, 6H), 2.95 (m, 5H), 1.99 (m, 1H), 1.24 (m, 12H), 0.99 (d, 6H), 0.85 (d, 6H);
단계 4: N~6~-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-N~2~-(2-메틸프로파노일)-L-리실-L-발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (24)의 합성. N,N-디메틸아세트아미드 1 mL 중 2-메틸알라닐-N-[(3R,4S,5S)-3-메톡시-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드 (4, 27.5 mg, 0.032 mmol) 및 N~6~-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-N~2~-(2-메틸프로파노일)-L-리실-L-발릴-N~5~-카르바모일-N-[4-({[(4-니트로페녹시)카르보닐]옥시}메틸)페닐]-L-오르니틴아미드 (23, 36.7 mg, 0.038 mmol)의 용액에 2,6-루티딘 (13.7 mg, 0.128 mmol), N,N-디이소프로필에틸아민 (23 ul, 16.7 mg, 0.128mmol) 및 3H-[1,2,3]트리아졸로[4,5-b]피리딘-3-올 (HOAt, 5.2 mg, 0.038 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 LC-MS에 의해 모니터링하고, 실온에서 16시간 동안 교반되도록 하였다. 이어서, 용액을 농축시키고, 역상 HPLC (방법 K)에 의해 정제하였다. 생성물 함유 분획을 동결건조시켜 목적 생성물 30 mg (60%)을 수득하였다.
단계 5: N~2~-(2-메틸프로파노일)-L-리실-L-발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (25)의 합성. 디클로로메탄 1 mL 중 N~6~-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-N~2~-(2-메틸프로파노일)-L-리실-L-발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (24, 30 mg, 0.019 mmol)의 용액을 디에틸아민 1 mL로 처리하였다. 용액을 실온에서 5시간 동안 교반한 다음, 농축시키고, 역상 HPLC (방법 K)에 의해 정제하였다. 생성물 함유 분획을 동결건조시켜 목적 생성물 6.0 mg (21%)을 수득하였다. LC-MS m/z 1346.9 [M+H+]; 체류 시간 = 1.47분. 분석용 HPLC 체류 시간 = 5.87분.
실시예 8-18 및 49-71에 대한 절차: 부위-특이적 항-Trop2 ADC의 접합, 정제
항-Trop2 항체와 실시예 1 내지 7의 링커-페이로드 (LP)와의 접합을 위해, 항체의 나타낸 양을 25 mM 트리스-HCl 함유 완충제, pH 8.0-8.5 중에서 5 mg/mL로 조정하였다. LP의 나타낸 양을 항체에 비해 5-50배 몰 과량으로 첨가하고, 효소적 반응을 2% (w/v) 박테리아 트랜스글루타미나제 (아지노모토 악티바 TI, 일본)의 첨가에 의해 개시하고, 37℃에서 16-24시간 동안 서서히 진탕하면서 인큐베이션하였다. 0.75 M 황산암모늄, 25 mM 인산칼륨, pH 7 (완충제 A)의 완충제 조성물을 수득하도록 반응 혼합물을 조정함으로써 부틸 세파로스™ 하이 퍼포먼스 (부틸 HP, 지이 헬스케어 바이오사이언시스)를 사용하여 ADC를 정제하였다. 물질을 부틸 HP에 적용하고, 5 CV 완충제 A로 세척하고, 20 CV 선형 구배로 25 mM 인산칼륨, pH 7 내로 용리시켰다. ADC를 함유하는 분획을 풀링하고, PBS에 대하여 투석하고, 10 kDa 아미콘 울트라 원심 여과 유닛 (밀리포어 코포레이션)을 사용하여 농축시키고, 0.2 μm 필터를 통해 멸균 여과하였다. 대안적으로, 맙셀렉트 프로테인 A 수지 (지이 헬스케어 바이오사이언시스)를 사용하여 표준 프로토콜에 따라 ADC를 정제하고, PBS로 완충제 교환하였다.
하기 ADC (표 2 내지 7에 나타낸 바와 같이 Trop2 항체 상의 다양한 위치에 및 다양한 태그 상에 부착됨)는 상기 기재된 기술을 사용하여 제조하였다 (괄호 부분은 글루타민 잔기를 나타내고, 여기서 파상선은 항-Trop2 항체의 나머지에 대한 부착 지점을 나타냄):
비교 실시예 8: C6vcMMAD:
Figure 112017018870512-pct00045
비교 실시예 9: AcLys-vcMMAD:
Figure 112017018870512-pct00046
비교 실시예 10: C6vc0101:
Figure 112017018870512-pct00047
비교 실시예 11: AcLys-vc0101:
Figure 112017018870512-pct00048
실시예 12:
Figure 112017018870512-pct00049
실시예 13:
Figure 112017018870512-pct00050
실시예 14:
Figure 112017018870512-pct00051
실시예 15:
Figure 112017018870512-pct00052
실시예 16:
Figure 112017018870512-pct00053
실시예 17:
Figure 112017018870512-pct00054
실시예 18:
Figure 112017018870512-pct00055
실시예 19: 생체내 안정성 검정 - 마우스
혈장 샘플을 마우스로부터 ADC의 단일 9 mg/kg 투여 후 1 내지 10일 범위의 시점에서 수득하였다. 샘플을 동등 부피의 1x PBS로 희석하고, ADC를 맙셀렉트 비드 또는 CNBr-활성화 세파로스 (지이 헬스케어)에 커플링된 Trop2 항원을 사용하여 표준 프로토콜을 사용하여 단리시켰다. 약물-항체 비를 생체내 노출 전후에 HIC 방법 및 질량 분광측정법을 사용하여 평가하였다.
실시예 20: 생체내 안정성 검정 - 래트
혈장 샘플을 래트로부터 ADC의 단일 9 mg/kg 투여 후 1 내지 10일 범위의 시점에서 수득하였다. 샘플을 동등 부피의 1x PBS로 희석하고, ADC를 CNBr-활성화 세파로스 (지이 헬스케어)에 커플링된 Trop2 항원을 사용하여 표준 프로토콜을 사용하여 단리시켰다. 약물-항체 비를 생체내 노출 전후에 HIC 방법 및 질량 분광측정법을 사용하여 평가하였다.
실시예 21A: 시험관내 안정성 검정 - 마우스 혈장
ADC 100-200 ug을 0.125 mg/mL의 최종 ADC 농도로 1x PBS가 보충된 마우스 혈장 (바이오리클레메이션(Bioreclamation)에 의해 제공됨)에서 인큐베이션하였다. 3-7일 동안 인큐베이션한 후에, 샘플을 동등 부피의 1x PBS로 희석하고, ADC를 CNBr-활성화 세파로스 (지이 헬스케어)에 커플링된 Trop2 항원을 사용하여 표준 프로토콜을 사용하여 단리시켰다. 약물-항체 비를 시험관내 노출 전후에 HIC 방법 및 질량 분광측정법을 사용하여 평가하였다.
실시예 21B: 링커 절단을 담당하는 마우스 혈장 효소의 확인
마우스 혈장 효소를 분류하기 위해, 기질로서 항-Trop2 L11B C6 vc0101 접합체를 사용하여 다양한 프로테아제 억제제의 존재 하에 시험관내 안정성 검정을 수행하였다. 결과는 마우스 혈장 효소가 아마도 1 mM 페파블록(Pefabloc) (로슈(Roche)) 및 100 uM BNPP (시그마)에 의해 억제되는 세린 히드롤라제라는 것을 제시하였다. 효소를 확인하기 위해, 본 발명자들은 일련의 단계를 사용하여 Balb/c 마우스 혈청을 분획화함으로써 항-Trop2 L11B C6 vc0101 링커 가수분해 활성을 풍부화시켰다. 먼저, Balb/c 혈청 (바이오리클레메이션IVT)에서 상업적으로 입수가능한 맙셀렉트 프로테인 A 및 프로테인 G 수지 (지이 헬스케어)에 이어 큐프로테옴 뮤린 알부민 디플레션 키트(Qproteome Murine Albumin Depletion Kit) (퀴아젠(Qiagen))를 사용하여 IgG 및 알부민을 고갈시켰다. 이어서, 고갈된 혈청을 황산암모늄에 의해 순차적 침전시켰다. 이어서, 가장 높은 링커 히드롤라제 활성을 갖는 분획을 염화나트륨에 의한 단계 구배 용리를 사용하여 양이온 교환 하이트랩(HiTrap) SP 칼럼 (지이 헬스케어)에 적용하였다. 그 후에, 가장 높은 활성을 갖는 SP 분획을 염화나트륨에 의한 단계 구배 용리를 사용하여 음이온 교환 하이트랩 Q 칼럼 (지이 헬스케어)에 적용하였다. 이어서, 가장 높은 히드롤라제 활성을 갖는 분획을 합하고, 슈퍼덱스(Superdex) 200 칼럼 (지이 헬스케어)을 사용하여 크기 분획화하였다. 가장 높은 활성을 갖는 풀링된 슈퍼덱스 200 분획의 단백질체학 분석은 아미드 결합을 가수분해할 수 있으며 페파블록 및 BNPP에 의해 억제될 수 있는 카르복실에스테라제 1C를 밝혀냈다. 링커 절단을 담당하는 혈장 효소로서 마우스 카르복실에스테라제 1C의 정확한 확인을 검증하기 위해, 재조합 단백질을 엑스피(Expi) 293 세포에서 발현시키고, HIS 태그를 사용하여 표준 프로토콜에 따라 정제하였다. 정제된 단백질이 마우스 혈장에 대해 제시된 바와 동일한 상대 활성으로 VC-기반 링커를 갖는 다중 접합체를 절단하는 것으로 확인하였다.
실시예 22: 시험관내 안정성 검정 - 래트 혈장
ADC 100-200 ug을 0.125 mg/mL의 최종 ADC 농도로 1x PBS가 보충된 래트 혈장 (바이오리클레메이션에 의해 제공됨)에서 인큐베이션하였다. 3-7일 동안 인큐베이션한 후에, 샘플을 동등 부피의 1x PBS로 희석하고, ADC를 CNBr-활성화 세파로스 (지이 헬스케어)에 커플링된 Trop2 항원을 사용하여 표준 프로토콜을 사용하여 단리시켰다. 약물-항체 비를 시험관내 노출 전후에 HIC 방법 및 질량 분광측정법을 사용하여 평가하였다.
실시예 23: 시험관내 안정성 검정 - 시노몰구스 혈장
ADC 100-200 ug을 0.125 mg/mL의 최종 ADC 농도로 1x PBS가 보충된 시노몰구스 혈장 (바이오리클레메이션에 의해 제공됨)에서 인큐베이션하였다. 3-7일 동안 인큐베이션한 후에, 샘플을 동등 부피의 1x PBS로 희석하고, ADC를 CNBr-활성화 세파로스 (지이 헬스케어)에 커플링된 Trop2 항원을 사용하여 표준 프로토콜을 사용하여 단리시켰다. 약물-항체 비를 시험관내 노출 전후에 HIC 방법 및 질량 분광측정법을 사용하여 평가하였다.
실시예 24: 시험관내 세포독성 검정
도 1 (a 내지 i)에 제시된 바와 같이, 아미노카프로일 (C6) vc Aur0101 세포독성 페이로드와 소정 범위의 부위에서 접합된 키메라 항-Trop2 항체의 시험관내 세포독성 연구를 표적-발현 BxPC3 세포를 사용하여 수행하였다. 비처리 화합물 (실선) 및 마우스 혈장에서 처리 4.5일 후에 단리된 그의 대사물 (파선)을 나란히 시험하여 세포독성에서의 임의의 변화를 결정하였다. BxPc3은 높은 표적 발현 수준을 갖는 암 세포주 (Trop-2 +++)이다. 세포를 처리 전에 24시간 동안 백색 벽 투명 바닥 플레이트 상에 웰당 2000개의 세포로 시딩하였다. 세포를 4배 연속 희석된 항체-약물 접합체로 삼중으로 처리하였다. 세포 생존율을 처리 96시간 후에 셀타이터-글로(CellTiter-Glo)® 발광 세포 생존율 검정 96 (프로메가(Promega), 위스콘신주 매디슨)에 의해 결정하였다. 상대 세포 생존율을 비처리 대조군의 백분율로서 결정하였다.
또한 도 1 (j 내지 o)에 제시된 바와 같이, 3종의 링커-페이로드 (실시예 2, 3 및 5의 링커 페이로드) 중 1종과 LCQ04 또는 L11B 부위에서 접합된 키메라 항-Trop2 항체의 시험관내 세포독성 연구를 표적-발현 BxPC3 세포를 사용하여 수행하였다. 비처리 화합물 (실선) 및 마우스 혈장에서 처리 4.5일 후에 단리된 그의 대사물 (파선)을 나란히 시험하여 세포독성에서의 임의의 변화를 결정하였다. BxPc3은 높은 표적 발현 수준을 갖는 암 세포주 (Trop-2 +++)이다. 세포를 처리 전에 24시간 동안 백색 벽 투명 바닥 플레이트 상에 웰당 2000개의 세포로 시딩하였다. 세포를 4배 연속 희석된 항체-약물 접합체로 삼중으로 처리하였다. 세포 생존율을 처리 96시간 후에 셀타이터-글로® 발광 세포 생존율 검정 96 (프로메가, 위스콘신주 매디슨)에 의해 결정하였다. 상대 세포 생존율을 비처리 대조군의 백분율로서 결정하였다.
실시예 25: N~2~-(히드록시아세틸)-L-리실발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (30)의 제조
Figure 112017018870512-pct00056
단계 1: N~2~-(tert-부톡시카르보닐)-N~6~-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-리실-L-발릴-N~5~-카르바모일-N-[4-({[(4-니트로페녹시)카르보닐]옥시}메틸)페닐]-L-오르니틴아미드 (26)의 합성. N,N-디메틸포름아미드 7 mL 및 디클로로메탄 7 mL 중 N~2~-(tert-부톡시카르보닐)-N~6~-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-리실-L-발릴-N~5~-카르바모일-N-[4-(히드록시메틸)페닐]-L-오르니틴아미드 (20, 998 mg, 1.20 mmol) 및 p-니트로페닐 카르보네이트 (748 mg, 2.41 mmol)의 용액에 N,N-디이소프로필에틸아민 (452 uL, 0.328 g, 2.41 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 잔류물을 에틸 아세테이트 및 디에틸 에테르로 희석하고, 생성된 슬러리를 30분 동안 교반하였다. 고체를 여과에 의해 단리시키고, 에테르로 수회 세척하여 공기 건조 후에 목적 생성물 (1319 mg)을 황색 고체로서 수득하였으며, 이를 그 자체로 추가 정제 없이 사용하였다. LC-MS m/z 995.5 [M+H+]; 체류 시간 = 1.02분. 분석용 HPLC 체류 시간 = 8.181분.
단계 2: N~2~-(tert-부톡시카르보닐)-N~6~-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-리실-L-발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (27)의 합성. N,N-디메틸아세트아미드 2.5 mL 중 2-메틸알라닐-N-[(3R,4S,5S)-3-메톡시-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드 (4, 371 mg, 0.499 mmol) 및 N~2~-(tert-부톡시카르보닐)-N~6~-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-리실-L-발릴-N~5~-카르바모일-N-[4-({[(4-니트로페녹시)카르보닐]옥시}메틸)페닐]-L-오르니틴아미드 (26, 802 mg, 0.64 mmol)의 용액에 2,6-루티딘 (216 uL, 200 mg, 1.9 mmol,) N,N-디이소프로필에틸아민 (326 uL, 240 mg, 1.9 mmol) 및 3H-[1,2,3]트리아졸로[4,5-b]피리딘-3-올 (HOAt, 17.7 mg, 0.130 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 LC-MS에 의해 모니터링하고, 50℃에서 90분 동안에 이어 실온에서 16시간 동안 교반되도록 하였다. 이어서, 반응물을 역상 크로마토그래피 (방법 U)에 의해 정제하여 동결건조 후에 목적 생성물 339 mg (42%, 2 단계)을 백색 고체로서 수득하였다. LC-MS m/z 1599.9 [M+H+]; 체류 시간 = 1.09분. 분석용 HPLC 체류 시간 = 8.163분.
단계 3: N~6~-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-리실발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (28)의 합성. 디클로로메탄 2 mL 중 N~2~-(tert-부톡시카르보닐)-N~6~-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-리실-L-발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (27, 439 mg, 0.275 mmol)의 현탁액에 트리플루오로아세트산 1 mL를 첨가하였다. 혼합물을 LC-MS에 의해 모니터링하고, 실온에서 20분 동안 교반되도록 하였다. 이어서, 반응물을 농축시키고, 역상 크로마토그래피 (방법 V)에 의해 정제하여 동결건조 후에 410 mg (96%)을 수득하였다. LC-MS m/z 1499.8 [M+H+]; 체류 시간 = 0.86분. 분석용 HPLC 체류 시간 = 6.778분.
단계 4: N~6~-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-N~2~-(히드록시아세틸)-L-리실발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (29)의 합성. N,N-디메틸포름아미드 0.3 mL 중 히드록시아세트산 (14.7 mg, 0.193 mmol)의 용액에 N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDCI, 7.99 mg, 0.0417 mmol), 에틸 (히드록시이미노)시아노아세테이트 (옥시마(Oxyma), 20 mg, 0.14 mmol) 및 N-메틸 모르폴린 (40 uL, 37 mg, 0.36 mmol)을 첨가하였다. 생성된 황색 용액을 20분 동안 교반한 다음, N,N-디메틸포름아미드 0.5 mL 중 N~6~-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-리실발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (28, 50 mg, 0.032 mmol)의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 LC-MS에 의해 모니터링하고, 실온에서 1시간 동안 교반되도록 한 다음, 농축시키고, 역상 HPLC (방법 F)에 의해 정제하였다. 생성물 함유 분획을 동결건조시켜 동결건조 후에 12.2 mg (24%)을 수득하였다. LC-MS m/z 1557.8 [M+H+]; 체류 시간 = 0.98분. 분석용 HPLC 체류 시간 = 7.371분.
단계 5: N~2~-(히드록시아세틸)-L-리실발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (30)의 합성. N,N-디메틸포름아미드 0.3 mL 중 N~6~-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-N~2~-(히드록시아세틸)-L-리실발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (29, 12.2 mg, 0.00784 mmol)의 용액에 피페리딘 (0.1 mL, 90 mg, 1 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 용액을 농축시키고, 역상 HPLC (방법 E)에 의해 정제하였다. 생성물 함유 분획을 동결건조시켜 목적 생성물 8 mg (70%)을 수득하였다. LC-MS m/z 1334.8 [M+H+]; 체류 시간 = 0.76분. 분석용 HPLC 체류 시간 = 5.788분.
실시예 26: N~2~-(메틸카르바모일)-L-리실발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (33)의 제조
Figure 112017018870512-pct00057
단계 1: N-메틸-1H-이미다졸-1-카르복스아미드 (31)의 합성. 1,1'-카르보닐디이미다졸 (1.76 g, 10.7 mmol) 및 메틸아민 히드로클로라이드의 혼합물 (661 mg, 9.7 mmol)을 N,N-디메틸포름아미드 1.8 mL 및 아세토니트릴 5.5 mL 중에 용해시켰다. 혼합물을 LC-MS에 의해 모니터링하고, 실온에서 3.25시간 동안 교반되도록 하였다. 이어서, 반응물을 농축시키고, 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 디클로로메탄 중 0% 내지 10% 메탄올의 구배 용리를 사용하여 정제하여 목적 생성물 696 mg (57%)을 수득하였다. LC-MS m/z 126.0 [M+H+]; 체류 시간 = 0.17분. 1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ = 8.22 (s, 1H), 7.65 (s, 1H), 7.03 (s, 1H), 2.83 (d, J=4.3 Hz, 3H).
단계 2: N~6~-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-N~2~-(메틸카르바모일)-L-리실발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (32)의 합성. N,N-디메틸포름아미드 0.5 mL 중 N-메틸-1H-이미다졸-1-카르복스아미드 (40.1 mg, 0.321 mmol) 및 N~6~-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-리실발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (28, 50 mg, 0.032 mmol)의 혼합물에 트리에틸아민 (44.7 uL, 32.5 mg, 0.321 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 LC-MS에 의해 모니터링하고, 실온에서 1.5 동안 교반되도록 한 다음, 디메틸술폭시드로 희석하고, 역상 HPLC (방법 L)에 의해 정제하여 동결건조 후에 목적 생성물 8.8 mg (18%) 수득하였다. LC-MS m/z 1556.8 [M+H+]; 체류 시간 = 0.99분. 분석용 HPLC 체류 시간 = 7.521분.
단계 3: N~2~-(메틸카르바모일)-L-리실발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (33)의 합성. N,N-디메틸포름아미드 0.3 mL 중 N~6~-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-N~2~-(메틸카르바모일)-L-리실발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (32, 8.8 mg, 0.0057 mmol)의 용액에 피페리딘 (0.1 mL, 90 mg, 1 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 1.5시간 동안 교반하였다. 이어서, 용액을 농축시키고, 역상 HPLC (방법 E에 이어서 M)에 의해 정제하였다. 생성물 함유 분획을 동결건조시켜 목적 생성물 4.6 mg (58%)을 수득하였다. LC-MS m/z 1333.7 [M+H+]; 체류 시간 = 0.76분. 분석용 HPLC 체류 시간 = 5.825분.
실시예 27: N-메틸글리실-L-리실발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (34)의 제조
Figure 112017018870512-pct00058
N,N-디메틸포름아미드 0.1 mL 중 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-N-메틸글리시네이트 (11.9 mg, 0.0416 mmol)의 용액에 N~6~-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-리실발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (28, 50 mg, 0.032 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (17 uL, 13 mg, 0.096 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 LC-MS에 의해 모니터링하고, 실온에서 1시간 동안 교반되도록 하였다 (LC-MS m/z 1670.7 1[M+H+]; 체류 시간 = 1.03분). 혼합물을 질소의 강한 유동 하에 농축시키고, 잔류물을 메탄올 중에 다시 용해시키고, SCX 칼럼 (메탄올의 2 칼럼 부피로 사전세척됨)에 통과시켰다. 카트리지를 메탄올의 칼럼 부피로 세척하고, 생성물을 밤새 칼럼 상에 정치시켰다. 칼럼을 메탄올 중 암모니아의 7M 용액으로 플러싱하고, 농축 후에 잔류물을 역상 HPLC (방법 L)에 의해 정제하였다. 생성물 함유 분획을 동결건조시켜 목적 생성물 4.2 mg (8%)을 수득하였다. LC-MS m/z 1347.51 [M+H+]; 체류 시간 = 0.68분. 분석용 HPLC 체류 시간 = 5.486분.
실시예 28: N,N-디메틸글리실-L-리실발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (35)의 제조
Figure 112017018870512-pct00059
N,N-디메틸포름아미드 0.1 mL 중 N,N-디메틸글리신 (4.5 mg, 0.044 mmol)의 용액에 N,N-디메틸포름아미드 1 mL 중 N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDCI, 79.9 mg, 0.417 mmol), 에틸 (히드록시이미노)시아노아세테이트 (옥시마, 10 mg, 0.07 mmol) 및 N-메틸 모르폴린 (10 uL, 9 mg, 0.09 mmol)의 원액 0.1 mL를 첨가하였다. 생성된 황색 용액을 15분 동안 교반한 다음, N,N-디메틸포름아미드 0.5 mL 중 N~6~-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-리실발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (28, 50 mg, 0.032 mmol)의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 LC-MS에 의해 모니터링하고, 실온에서 40분 동안 교반되도록 하고, 추가로 N-메틸 모르폴린 (50 uL, 45 mg, 0.45 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 16시간 동안 교반하고, 농축시키고, 역상 HPLC (방법 L)에 의해 정제하였다. 생성물 함유 분획을 동결건조시켜 목적 생성물 5.4 mg (11%)을 수득하였다. LC-MS m/z 1361.8 [M+H+]; 체류 시간 = 0.71분. 분석용 HPLC 체류 시간 = 5.481분.
실시예 29: 글리실-L-리실발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (37)의 제조
Figure 112017018870512-pct00060
단계 1: N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]글리실-N~6~-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-리실-L-발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (36)의 합성. N,N-디메틸포름아미드 0.650 mL 중 N~6~-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-리실발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (28, 65.0 mg, 0.043 mmol)의 용액에 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]글리시네이트 (68.4 mg, 0.173 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (23.1 mg, 0.173 mmol, 30.8 uL)을 첨가하였다. 혼합물을 LC-MS에 의해 모니터링하고, 실온에서 2시간 동안 교반되도록 하고, 직접 역상 HPLC (방법 N)에 의해 정제하였다. 생성물 함유 분획을 동결건조시켜 목적 생성물 22.3 mg (29%)을 수득하였다. LC-MS m/z 1777.2 [M+H+]; 체류 시간 = 1.10분. 분석용 HPLC 체류 시간 = 8.544분.
단계 2: 글리실-L-리실발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (37)의 합성. N,N-디메틸아세트아미드 0.6 mL 중 N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]글리실-N~6~-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-리실-L-발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (36, 20 mg, 0.011 mmol)의 용액에 피페리딘 (0.3 mL, 270 mg, 3 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 15분 동안 교반하였다. 이어서, 용액을 농축시키고, 역상 HPLC (방법 L에 이어서 M)에 의해 정제하였다. 생성물 함유 분획을 동결건조시켜 목적 생성물 14.4 mg (90%)을 수득하였다. LC-MS m/z 1333.8 [M+H+]; 체류 시간 = 0.70분. 분석용 HPLC 체류 시간 = 5.825분.
실시예 30: N~2~-[(3-메틸옥세탄-3-일)카르보닐]-L-리실-L-발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (39)의 제조
Figure 112017018870512-pct00061
단계 1: N~6~-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-N~2~-[(3-메틸옥세탄-3-일)카르보닐]-L-리실-L-발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (38)의 합성. 빙수조에서, N,N-디메틸아세트아미드 0.5 mL 중 N~6~-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-리실발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (28, 50.0 mg, 0.031 mmol)의 용액에 3-메틸옥세탄-3-카르복실산 (22 mg, 0.19 mmol), O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HATU, 65 mg, 0.17 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (35 uL, 26 mg, 0.20 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 빙수조에서 추가로 40분 동안 교반하였다. 이어서, 용액을 직접 역상 HPLC (방법 P)에 의해 정제하였다. 생성물 함유 분획을 동결건조시켜 목적 생성물 37.4 mg (55%)을 수득하였다. LC-MS m/z 1597.8 [M+H+]; 체류 시간 = 1.00분. 분석용 HPLC 체류 시간 = 7.567분.
단계 2: N~2~-[(3-메틸옥세탄-3-일)카르보닐]-L-리실-L-발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (39)의 합성. N,N-디메틸아세트아미드 0.5 mL 중 N~6~-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-N~2~-[(3-메틸옥세탄-3-일)카르보닐]-L-리실-L-발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (38, 27.4 mg, 0.0172 mmol)의 용액에 수산화리튬의 수용액 (411 uL, 41.1 mg, 0.0343 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 용액을 농축시키고, 역상 HPLC (방법 L)에 의해 정제하였다. 생성물 함유 분획을 동결건조시켜 목적 생성물 9.3 mg (36%)을 수득하였다. LC-MS m/z 1374.4 [M+H+]; 체류 시간 = 0.77분. 분석용 HPLC 체류 시간 = 5.841분.
실시예 31: 2-메틸알라닐-L-리실발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (41)의 제조
Figure 112017018870512-pct00062
단계 1: N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-2-메틸알라닐-N~6~-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-리실-L-발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (40)의 합성. 빙수조에서, N,N-디메틸아세트아미드 0.5 mL 중 N~6~-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-리실발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (28, 50.0 mg, 0.031 mmol)의 용액에 N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-2-메틸알라닌 (17.5 mg, 0.0538 mmol), O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HATU, 25.9 mg, 0.0681 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (25 uL, 19 mg, 0.14 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 빙수조에서 추가로 40분 동안 교반하였다. 이어서, 용액을 직접 역상 HPLC (방법 Q)에 의해 정제하였다. 생성물 함유 분획을 동결건조시켜 목적 생성물 56 mg (100%)을 수득하였다. LC-MS m/z 1806.9 [M+H+]; 체류 시간 = 1.12분. 분석용 HPLC 체류 시간 = 8.817분.
단계 2: 2-메틸알라닐-L-리실발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (40)의 합성. N,N-디메틸아세트아미드 0.5 mL 중 N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-2-메틸알라닐-N~6~-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-리실-L-발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (40, 56 mg, 0.031 mmol)의 용액에 수산화리튬의 수용액 (100 uL, 10 mg, 0.4 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 용액을 농축시키고, 역상 HPLC (방법 L)에 의해 정제하였다. 생성물 함유 분획을 동결건조시켜 목적 생성물 7.6 mg (15%)을 수득하였다. LC-MS m/z 1384.2 [M+Na+]; 체류 시간 = 0.71분. 분석용 HPLC 체류 시간 = 5.467분.
실시예 32: N~2~-(메톡시카르보닐)-L-리실발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (43)의 제조
Figure 112017018870512-pct00063
단계 1: N-(메톡시카르보닐)-2-메틸알라닐-N~6~-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-리실-L-발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (42)의 합성. N,N-디메틸아세트아미드 0.3 mL 및 디클로로메탄 0.2 mL 중 N~6~-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-리실발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (28, 30.0 mg, 0.019 mmol)의 용액에 메틸클로로포르메이트 (29 uL, 35.2 mg, 0.372 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 LC-MS에 의해 모니터링하고, 실온에서 2시간 동안 교반되도록 하였다. 2시간 후에, N,N-디이소프로필에틸아민 (10.0 uL, 7.5 mg, 0.056 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 추가로 16시간 동안 교반하였다. LC-MS는 여전히 반응이 불완전한 것으로 나타내어, 메틸클로로포르메이트 (60 uL, 73 mg, 0.78 mmol)를 첨가하고, 이어서 N,N-디이소프로필에틸아민 (10 uL, 7.5 mg, 0.056 mmol)을 첨가하였다. 실온에서 추가로 4시간 동안 교반한 후에, 혼합물을 직접 역상 HPLC (방법 Q)에 의해 정제하였다. 생성물 함유 분획을 동결건조시켜 목적 생성물 6.4 mg (22%)을 수득하였다. LC-MS m/z 1557.9 [M+H+]; 체류 시간 = 1.05분. 분석용 HPLC 체류 시간 = 7.709분.
단계 2: N~2~-(메톡시카르보닐)-L-리실발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (43)의 합성. N,N-디메틸아세트아미드 0.5 mL 중 N-(메톡시카르보닐)-2-메틸알라닐-N~6~-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-리실-L-발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (42, 6.4 mg, 0.0041 mmol)의 용액에 디에틸아민 (0.3 mL, 200 mg, 3 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 이어서, 용액을 농축시키고, 역상 HPLC (방법 L)에 의해 정제하였다. 생성물 함유 분획을 동결건조시켜 목적 생성물 2.6 mg (44%)을 수득하였다. LC-MS m/z 1334.8 [M+H+]; 체류 시간 = 0.83분. 분석용 HPLC 체류 시간 = 5.908분.
실시예 33: L-리실발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (44)의 제조
Figure 112017018870512-pct00064
N,N-디메틸아세트아미드 0.2 mL 중 N~6~-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-리실발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (28, 20.0 mg, 0.012 mmol)의 용액에 피페리딘 (0.1 mL, 90 mg, 1 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 이어서, 용액을 직접 역상 HPLC (방법 L에 이어서 R)에 의해 정제하였다. 생성물 함유 분획을 동결건조시켜 목적 생성물 7.6 mg (44%)을 수득하였다. LC-MS m/z 1276.7 [M+H+]; 체류 시간 = 0.70분. 분석용 HPLC 체류 시간 = 5.516분.
실시예 34: L-알라닐-L-리실발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필] 피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (46)의 제조
Figure 112017018870512-pct00065
단계 1: N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-알라닐-N~6~-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-리실-L-발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (45)의 합성. 빙수조에서, N,N-디메틸아세트아미드 0.5 mL 중 N~6~-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-리실발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (28, 8.7 mg, 0.0054 mmol)의 용액에 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-알라니네이트 (8.81 mg, 0.0216 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (10.0 uL, 7.5 mg, 0.056 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 LC-MS에 의해 모니터링하고, 실온에서 16시간 동안 교반되도록 하고, 직접 역상 HPLC (방법 S)에 의해 정제하였다. 생성물 함유 분획을 동결건조시켜 목적 생성물 5.3 mg (55%)을 수득하였다. LC-MS m/z 1791.7 [M+H+]; 체류 시간 = 1.11분. 분석용 HPLC 체류 시간 = 8.655분.
단계 2: L-알라닐-L-리실발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필] 피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (46)의 합성. N,N-디메틸아세트아미드 0.5 mL 중 N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-알라닐-N~6~-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-리실-L-발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (45, 5.3 mg, 0.0030 mmol)의 용액에 수산화리튬의 수용액 (210 uL, 20 mg, 0.9 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 용액을 농축시키고, 역상 HPLC (방법 L)에 의해 정제하였다. 생성물 함유 분획을 동결건조시켜 목적 생성물 3.4 mg (73%)을 수득하였다. LC-MS m/z 1347.7 [M+H]+; 체류 시간 = 0.69분. 분석용 HPLC 체류 시간 = 5.487분.
실시예 35: D-알라닐-L-리실발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (48)의 제조
Figure 112017018870512-pct00066
단계 1: N-(tert-부톡시카르보닐)-D-알라닐-N~6~-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-리실-L-발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (47)의 합성. 빙수조에서, N,N-디메틸아세트아미드 0.5 mL 중 N~6~-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-리실발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (28, 50 mg, 0.03 mmol)의 용액에 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 N-(tert-부톡시카르보닐)-D-알라니네이트 (15.7 mg, 0.0548 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (22.0 uL, 16 mg, 0.12 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 LC-MS에 의해 모니터링하고, 실온에서 16시간 동안 교반되도록 하고, 직접 역상 HPLC (방법 S)에 의해 정제하였다. 생성물 함유 분획을 동결건조시켜 목적 생성물 20.0 mg (40%)을 수득하였다. LC-MS m/z 1791.7 [M+H+]; 체류 시간 = 1.08분. 분석용 HPLC 체류 시간 = 8.024분.
단계 2: D-알라닐-L-리실발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (48)의 합성. 아세토니트릴 1 mL 중 N-(tert-부톡시카르보닐)-D-알라닐-N~6~-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-리실-L-발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (47, 20.0 mg, 0.012 mmol)의 용액에 트리플루오로아세트산 0.5 mL를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 15분 동안 교반한 다음, 농축시켰다. 잔류물을 N,N-디메틸아세트아미드 0.5 mL 중에 용해시키고, 빙수조를 사용하여 냉각시켰다. 여기에 수산화리튬의 수용액 (50.3 uL, 5.3 mg, 0.12 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 이어서, 용액을 직접 역상 HPLC (방법 L)에 의해 정제하였다. 생성물 함유 분획을 동결건조시켜 목적 생성물 8.9 mg (47%)을 수득하였다. LC-MS m/z 1347.9 [M+H]+; 체류 시간 = 0.77분. 분석용 HPLC 체류 시간 = 5.429분.
실시예 36: L-알파-아스파르틸-L-리실-L-발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (50)의 제조
Figure 112017018870512-pct00067
단계 1: tert-부틸 (6S,9S,12S,15S)-1-아미노-6-({4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노} 프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}카르바모일)-15-{[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노}-12-(4-{[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노}부틸)-1,8,11,14-테트라옥소-9-(프로판-2-일)-2,7,10,13-테트라아자헵타데칸-17-오에이트 (49)의 합성. 빙수조에서, N,N-디메틸아세트아미드 0.5 mL 중 N~6~-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-리실발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (28, 50 mg, 0.03 mmol)의 용액에 (2S)-4-tert-부톡시-2-{[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노}-4-옥소부탄산 (20.9 mg, 0.0722 mmol), O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HATU, 28.0 mg, 0.074 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (22.0 uL, 16 mg, 0.12 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 LC-MS에 의해 모니터링하고, 1시간 동안 교반되도록 하고, 직접 역상 HPLC (방법 Q)에 의해 정제하였다. 생성물 함유 분획을 동결건조시켜 목적 생성물 41 mg (70%)을 수득하였다. LC-MS m/z 1771.2 [M+H+]; 체류 시간 = 1.16분. 분석용 HPLC 체류 시간 = 8.591분.
단계 2: L-알파-아스파르틸-L-리실-L-발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (50)의 합성. 아세토니트릴 1 mL 중 tert-부틸 (6S,9S,12S,15S)-1-아미노-6-({4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노} 프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}카르바모일)-15-{[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노}-12-(4-{[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노}부틸)-1,8,11,14-테트라옥소-9-(프로판-2-일)-2,7,10,13-테트라아자헵타데칸-17-오에이트 (49, 41.0 mg, 0.023 mmol)의 용액에 트리플루오로아세트산 0.5 mL를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 25분 동안 교반하고 (LC-MS m/z 1671.0 [M+H]+; 체류 시간 = 0.93분), 이어서 농축시켰다. 잔류물을 N,N-디메틸아세트아미드 0.5 mL 중에 용해시키고, 빙수조를 사용하여 냉각시켰다. 여기에 수산화리튬의 수용액 (50.3 uL, 5.3 mg, 0.12 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 20분 동안 교반하였다. 이어서, 용액을 직접 역상 HPLC (방법 Q)에 의해 정제하였다. 생성물 함유 분획을 동결건조시켜 목적 생성물 1.1 mg (3%)을 수득하였다. LC-MS m/z 1392.1 [M+H]+; 체류 시간 = 0.80분. 분석용 HPLC 체류 시간 = 5.309분.
실시예 37: N-아세틸글리실-L-리실-L-발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노} 프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (52)의 제조
Figure 112017018870512-pct00068
단계 1: N-아세틸글리실-N~6~-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-리실-L-발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (51)의 합성. 빙수조에서, N,N-디메틸아세트아미드 0.3 mL 중 N~6~-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-리실발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (28, 30 mg, 0.02 mmol)의 용액에 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 N-아세틸글리시네이트 (13.7 mg, 0.0640 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (22 uL, 16 mg, 0.12 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 LC-MS에 의해 모니터링하고, 실온에서 16시간 동안 교반되도록 하고, 직접 역상 HPLC (방법 Q)에 의해 정제하였다. 생성물 함유 분획을 동결건조시켜 목적 생성물 17.4 mg (60%)을 수득하였다. LC-MS m/z 1598.9 [M+H+]; 체류 시간 = 1.04분. 분석용 HPLC 체류 시간 = 7.326분.
단계 2: N-아세틸글리실-L-리실-L-발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노} 프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (52)의 합성. N,N-디메틸아세트아미드 0.5 mL 중 N-아세틸글리실-N~6~-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-리실-L-발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (51, 17.4 mg, 0.0109 mmol)의 용액에 수산화리튬의 수용액 (100 uL, 10 mg, 0.2 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 20분 동안 교반하였다. 이어서, 용액을 직접 역상 HPLC (방법 B)에 의해 정제하였다. 생성물 함유 분획을 동결건조시켜 목적 생성물 9.4 mg (58%)을 수득하였다. LC-MS m/z 1398.1 [M+Na+]; 체류 시간 = 0.84분. 분석용 HPLC 체류 시간 = 5.715분.
실시예 38: L-세릴-L-리실발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (57)의 제조
Figure 112017018870512-pct00069
단계 1: N~6~-(tert-부톡시카르보닐)-N~2~-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-리실발릴-N~5~-카르바모일-N-[4-(히드록시메틸)페닐]-L-오르니틴아미드 (53)의 합성. 빙수조에서, N,N-디메틸포름아미드 15 mL 중 N~6~-(tert-부톡시카르보닐)-N~2~-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-리신 (1090 mg, 2.32 mmol)의 용액에 O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HATU, 882 mg, 2.32 mmol)를 첨가하였다. 40분 후, L-발릴-N~5~-카르바모일-N-[4-(히드록시메틸)페닐]-L-오르니틴아미드 (1, 800 mg, 2.11 mmol)를 첨가하고, 이어서 N,N-디이소프로필에틸아민 (1.114 ml, 817 mg, 6.32 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 LC-MS에 의해 모니터링하고, 실온에서 2시간 동안 교반되도록 하였다. 이어서, 반응물을 메틸 tert-부틸 에테르 (150 mL) 중에 붓고, 15분 동안 교반한 다음, 여과하였다. 생성된 고체를 디클로로메탄:메틸 tert-부틸 에테르:메탄올 (10:10:2) 혼합물로 세척하여 조 생성물 (1.3 g)을 회색 고체로서 수득하였다. 이 고체를 역상 HPLC (방법 T)에 의해 정제하였다. 생성물 함유 분획을 동결건조시켜 목적 생성물 570 mg (33%)을 수득하였다. 분석용 HPLC 체류 시간 = 4.55분. 1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ = 9.97 (br. s., 1H), 8.14 (d, J=6.5 Hz, 1H), 7.90 (d, J=7.5 Hz, 2H), 7.73 (br. s., 3H), 7.54 (d, J=8.5 Hz, 3H), 7.42 (t, J=7.3 Hz, 2H), 7.33 (t, J=7.3 Hz, 2H), 7.23 (d, J=8.0 Hz, 2H), 6.78 (br. s., 1H), 5.98 (br. s., 1H), 5.43 (br. s., 2H), 5.11 (br. s., 1H), 4.45 - 4.34 (m, 3H), 4.34 - 4.15 (m, 4H), 4.02 (br. s., 1H), 3.02 (d, J=5.5 Hz, 1H), 2.89 (br. s., 3H), 1.98 (d, J=6.5 Hz, 1H), 1.61 (br. s., 3H), 1.52 (br. s., 1H), 1.42-1.30 (m, 13H), 1.24 (br. s., 2H), 0.83 (d, J=12.0 Hz, 3H), 0.85 (d, J=11.5 Hz, 3H).
단계 2: N~6~-(tert-부톡시카르보닐)-N~2~-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-리실발릴-N~5~-카르바모일-N-[4-({[(4-니트로페녹시)카르보닐]옥시}메틸)페닐]-L-오르니틴아미드 (54)의 합성. 빙수조에서, N,N-디메틸포름아미드 10 mL 중 N~6~-(tert-부톡시카르보닐)-N~2~-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-리실발릴-N~5~-카르바모일-N-[4-(히드록시메틸)페닐]-L-오르니틴아미드 (53, 570 mg, 0.687 mmol) 및 p-니트로페닐 카르보네이트 (418 mg, 1.37 mmol)의 용액에 N,N-디이소프로필에틸아민 (257 uL, 178 mg, 1.37 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 6시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응물을 메틸 tert-부틸 에테르 (150 mL) 중에 붓고, 15분 동안 교반한 다음, 여과하였다. 생성된 고체를 디클로로메탄 (20 mL) 중에 20분 동안 분산시킨 다음 여과하여 목적 생성물 400 mg (58%)을 수득하였다. LC-MS m/z 996.0 [M+H+]; 체류 시간 = 4.829분. 분석용 HPLC 체류 시간 = 5.43분. 1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ = 10.14 (s, 1H), 8.36 - 8.29 (m, 2H), 8.18 (d, J=7.5 Hz, 1H), 7.90 (d, J=7.5 Hz, 2H), 7.74 (d, J=7.0 Hz, 2H), 7.66 (d, J=8.0 Hz, 2H), 7.62 - 7.50 (m, 2H), 7.42 (d, J=7.0 Hz, 3H), 7.38 - 7.11 (m, 3H), 6.78 (br. s., 1H), 6.00 (br. s., 1H), 5.44 (br. s., 2H), 5.26 (s, 2H), 4.39 (br. s., 1H), 4.35 - 4.16 (m, 4H), 4.04 (br. s., 1H), 3.05 (d, J=7.0 Hz, 1H), 2.90 (br. s., 3H), 2.74 (s, 1H), 2.34 (br. s., 1H), 2.10 (s, 1H), 1.99 (d, J=6.0 Hz, 1H), 1.68 (br. s., 1H), 1.62 (br. s., 2H), 1.53 (br. s., 2H), 1.38 (s, 11H), 1.42 - 1.20 (m, 1H), 1.42 - 1.20 (m, 1H), 0.85 (d, J=12.5 Hz, 3H), 0.86 (d, J=12.5 Hz, 3H).
단계 3: N~6~-(tert-부톡시카르보닐)-N~2~-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-리실발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필] 피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (55)의 합성. N,N-디메틸아세트아미드 1.3 mL 중 2-메틸알라닐-N-[(3R,4S,5S)-3-메톡시-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드 (4, 440 mg, 0.59 mmol) 및 N~6~-(tert-부톡시카르보닐)-N~2~-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-리실발릴-N~5~-카르바모일-N-[4-({[(4-니트로페녹시)카르보닐]옥시}메틸)페닐]-L-오르니틴아미드 (54, 658.0 mg, 0.661 mmol)의 용액에 2,6-루티딘 (137 uL, 130 mg, 1.2 mmol), N,N-디이소프로필에틸아민 (207.0 uL, 160 mg, 1.2 mmol) 및 3H-[1,2,3]트리아졸로[4,5-b]피리딘-3-올 (HOAt, 92.1 mg, 0.677 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 LC-MS에 의해 모니터링하고, 50℃에서 2.5시간 동안에 이어 실온에서 16시간 동안 교반되도록 하였다. 이어서, 반응물을 역상 크로마토그래피 (방법 U)에 의해 정제하여 동결건조 후에 목적 생성물 630 mg (67%)을 백색 고체로서 수득하였다. LC-MS m/z 1600.6 [M+H+]; 체류 시간 = 1.07분. 분석용 HPLC 체류 시간 = 8.213분.
단계 4: N~6~-(tert-부톡시카르보닐)-L-리실발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (56)의 합성. 빙수조에서, N,N-디메틸아세트아미드 5 mL 중 N~6~-(tert-부톡시카르보닐)-N~2~-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-리실발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (55, 630 mg, 0.394 mmol)의 용액에 물 0.5 mL 중 수산화리튬 (29.4 mg, 1.23 mmol)의 용액을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하고, 이때 수산화리튬 (40.4 mg, 1.69 mmol)을 첨가하였다. 총 3시간 후에, 용액을 빙수조에서 냉각시킨 다음, 아세트산 (0.2 mL)에 의해 켄칭하고, 역상 HPLC (방법 2)에 의해 정제하였다. 생성물 함유 분획을 동결건조시켜 목적 생성물 350 mg (60%)을 수득하였다. LC-MS m/z 1377.6 [M+H+]; 체류 시간 = 0.77분. 분석용 HPLC 체류 시간 = 6.181분.
단계 5: L-세릴-L-리실발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (57)의 합성. 빙수조에서, N,N-디메틸아세트아미드 0.5 mL 중 N~6~-(tert-부톡시카르보닐)-L-리실발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (56, 50.0 mg, 0.0335 mmol)의 용액에 N,N-디메틸아세트아미드 0.1 mL 중 N-(tert-부톡시카르보닐)-L-세린 (6.88 mg, 0.0335 mmol), N,N-디메틸아세트아미드 0.1 mL 중 O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HATU, 15.3 mg, 0.0402 mmol mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (l7.9 uL, 13.4 mg, 0.101 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 LC-MS에 의해 모니터링하고, 실온에서 45분 동안 교반되도록 하고, 질소의 강한 유동 하에 농축시켜 조물질 (LC-MS m/z 1565.6 [M+H+], 체류 시간 = 0.96분)을 수득하였다. 황색 잔류물을 메탄올 1.2 mL 중에 용해시키고, 메탄올의 3 칼럼 부피로 사전-용리시킨 2개의 SCX 카트리지 상에 동등하게 로딩시켰다. 칼럼을 메탄올의 3 칼럼 부피로 세척하였다 (LC-MS에 따르면 세척물 중 미량의 생성물도 없었음). 생성물을 밤새 칼럼 상에 정치시켰다. 목적 생성물을 메탄올 중 1 N 트리에틸아민의 2 칼럼 부피로 용리시켰다. 감압 하에 농축시킨 후에, 이어서 잔류물을 역상 크로마토그래피 (방법 V)에 의해 정제하여 동결건조 후에 목적 생성물 8.3 mg (16%)을 수득하였다. LC-MS m/z 1364.5 [M+H+], 체류 시간 = 0.68분. 분석용 HPLC 체류 시간 = 5.464분.
실시예 39: D-세릴-L-리실발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (58)의 제조
Figure 112017018870512-pct00070
빙수조에서, N,N-디메틸아세트아미드 0.5 mL 중 N~6~-(tert-부톡시카르보닐)-L-리실발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (56, 50.0 mg, 0.0335 mmol)의 용액에 N,N-디메틸아세트아미드 0.1 mL 중 N-(tert-부톡시카르보닐)-D-세린 (6.88 mg, 0.0335 mmol), N,N-디메틸아세트아미드 0.1 mL 중 O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HATU, 15.3 mg, 0.0402 mmol mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (l7.9 uL, 13.4 mg, 0.101 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 LC-MS에 의해 모니터링하고, 실온에서 45분 동안 교반되도록 한 다음, 질소의 강한 유동 하에 농축시켜 조물질 (LC-MS m/z 1565.6 [M+H+], 체류 시간 = 0.96분)을 수득하였다. 황색 잔류물을 메탄올 1.2 mL 중에 용해시키고, 메탄올의 3 칼럼 부피로 사전-용리시킨 2개의 SCX 카트리지 상에 동등하게 로딩하였다. 칼럼을 메탄올의 3 칼럼 부피로 세척하였다 (LC-MS에 따르면 세척물 중 미량의 생성물도 없었음). 생성물을 밤새 칼럼 상에 정치시켰다. 목적 생성물을 메탄올 중 1 N 트리에틸아민의 2 칼럼 부피로 용리시켰다. 감압 하에 농축시킨 후에, 이어서 잔류물을 역상 크로마토그래피 (방법 V)에 의해 정제하여 동결건조 후에 목적 생성물 10.4 mg (19%)을 수득하였다. LC-MS m/z 1364.5 [M+H+], 체류 시간 = 0.67분. 분석용 HPLC 체류 시간 = 5.424분.
실시예 40: N~2~-[(2S)-2-히드록시프로파노일]-L-리실발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (59)의 제조
Figure 112017018870512-pct00071
빙수조에서, N,N-디메틸아세트아미드 0.5 mL 중 N~6~-(tert-부톡시카르보닐)-L-리실발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (56, 50.0 mg, 0.0335 mmol)의 용액에 N,N-디메틸아세트아미드 0.1 mL 중 (2S)-2-히드록시프로판산 (3.02 mg, 0.0335 mmol), N,N-디메틸아세트아미드 0.1 mL 중 O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HATU, 15.3 mg, 0.0402 mmol mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (l7.9 uL, 13.4 mg, 0.101 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 LC-MS의해 모니터링하고, 실온에서 45분 동안 교반되도록 한 다음, 질소의 강한 유동 하에 농축시켜 조물질 (LC-MS m/z 1449.5 [M+H+], 체류 시간 = 0.91분)을 수득하였다. 황색 잔류물을 메탄올 1.2 mL 중에 용해시키고, 메탄올의 3 칼럼 부피로 사전-용리시킨 2개의 SCX 카트리지 상에 동등하게 로딩하였다. 칼럼을 메탄올의 3 칼럼 부피로 세척하였다 (LC-MS에 따르면 세척물 중 미량의 생성물도 없었음). 생성물을 밤새 칼럼 상에 정치시켰다. 목적 생성물을 메탄올 중 1 N 트리에틸아민의 2 칼럼 부피로 용리시켰다. 감압 하에 농축시킨 후에, 이어서 잔류물을 역상 크로마토그래피 (방법 V)에 의해 정제하여 동결건조 후에 목적 생성물 12.9 mg (26%)을 수득하였다. LC-MS m/z 1349.4 [M+H+], 체류 시간 = 0.74분. 분석용 HPLC 체류 시간 = 5.813분.
실시예 41: N~2~-[(2R)-2-히드록시프로파노일]-L-리실발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (60)의 제조
Figure 112017018870512-pct00072
빙수조에서, N,N-디메틸아세트아미드 0.5 mL 중 N~6~-(tert-부톡시카르보닐)-L-리실발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (56, 50.0 mg, 0.0335 mmol)의 용액에 N,N-디메틸아세트아미드 0.1 mL 중 (2R)-2-히드록시프로판산 (3.01 mg, 0.0334 mmol), N,N-디메틸아세트아미드 0.1 mL 중 O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HATU, 15.3 mg, 0.0402 mmol mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (l7.9 uL, 13.4 mg, 0.101 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 LC-MS에 의해 모니터링하고, 실온에서 45분 동안 교반되도록 한 다음, 질소의 강한 유동 하에 농축시켜 조물질 (LC-MS m/z 1449.4 [M+H+], 체류 시간 = 0.90분)을 수득하였다. 이어서, 잔류물을 역상 크로마토그래피 (방법 V)에 의해 정제하여 동결건조 후에 목적 생성물 29.6 mg (60%)을 수득하였다. LC-MS m/z 1349.4 [M+H+], 체류 시간 = 0.75분. 분석용 HPLC 체류 시간 = 5.740분.
실시예 42: N~2~-[(2S)-2,3-디히드록시프로파노일]-L-리실발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (62)의 제조
Figure 112017018870512-pct00073
단계 1: N~6~-(tert-부톡시카르보닐)-N~2~-[(2S)-2,3-디히드록시프로파노일]-L-리실발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (61)의 합성. 빙수조에서, N,N-디메틸아세트아미드 0.5 mL 중 N~6~-(tert-부톡시카르보닐)-L-리실발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (56, 50.0 mg, 0.0335 mmol)의 용액에 N,N-디메틸아세트아미드 0.1 mL 중 (2S)-2,3-디히드록시프로판산 (4.02 mg, 0.0379 mmol), N,N-디메틸아세트아미드 0.1 mL 중 O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HATU, 15.3 mg, 0.0402 mmol mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (l7.9 uL, 13.4 mg, 0.101 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 LC-MS에 의해 모니터링하고, 실온에서 45분 동안 교반되도록 한 다음, 질소의 강한 유동 하에 농축시켰다. 이어서, 황색 잔류물을 역상 크로마토그래피 (방법 U)에 의해 정제하여 동결건조 후에 목적 생성물 10.8 mg (22%)을 수득하였다. LC-MS m/z 1465.5 [M+H+], 체류 시간 = 0.89분. 분석용 HPLC 체류 시간 = 6.607분.
단계 2: N~2~-[(2S)-2,3-디히드록시프로파노일]-L-리실발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (62)의 합성. 디클로로메탄 1 mL 중 N~6~-(tert-부톡시카르보닐)-N~2~-[(2S)-2,3-디히드록시프로파노일]-L-리실발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (61, 10.8 mg, 0.0074 mmol)의 현탁액에 트리플루오로아세트산 0.5 mL를 첨가하였다. 혼합물을 LC-MS에 의해 모니터링하고, 실온에서 20분 동안 교반되도록 하였다. 이어서, 반응물을 농축시키고, 역상 크로마토그래피 (방법 V)에 의해 정제하여 동결건조 후에 3.6 mg (33%)을 수득하였다. LC-MS m/z 1365.4 [M+H+]; 체류 시간 = 0.74분. 분석용 HPLC 체류 시간 = 5.749분.
실시예 43: N~2~-(3-히드록시프로파노일)-L-리실발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (64)의 제조
Figure 112017018870512-pct00074
단계 1: N~6~-(tert-부톡시카르보닐)-N~2~-(3-히드록시프로파노일)-L-리실발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (63)의 합성. 빙수조에서, N,N-디메틸아세트아미드 0.5 mL 중 N~6~-(tert-부톡시카르보닐)-L-리실발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (56, 50.0 mg, 0.0335 mmol)의 용액에 N,N-디메틸아세트아미드 0.1 mL 중 3-히드록시프로판산 (4.01 mg, 0.0445 mmol), N,N-디메틸아세트아미드 0.1 mL 중 O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HATU, 15.3 mg, 0.0402 mmol mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (l7.9 uL, 13.4 mg, 0.101 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 LC-MS에 의해 모니터링하고, 실온에서 45분 동안 교반되도록 한 다음, 질소의 강한 유동 하에 농축시켰다. 이어서, 황색 잔류물을 역상 크로마토그래피 (방법 U)에 의해 정제하여 동결건조 후에 목적 생성물 13.9 mg (29%)을 수득하였다. LC-MS m/z 1449.6 [M+H+], 체류 시간 = 0.91분. 분석용 HPLC 체류 시간 = 6.721분.
단계 2: N~2~-(3-히드록시프로파노일)-L-리실발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (64)의 합성. 디클로로메탄 1 mL 중 N~6~-(tert-부톡시카르보닐)-N~2~-(3-히드록시프로파노일)-L-리실발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (63, 13.9 mg, 0.0096 mmol)의 현탁액에 트리플루오로아세트산 0.5 mL를 첨가하였다. 혼합물을 LC-MS에 의해 모니터링하고, 실온에서 20분 동안 교반되도록 하였다. 이어서, 반응물을 농축시키고, 역상 크로마토그래피 (방법 V)에 의해 정제하여 동결건조 후에 4.1 mg (29%)을 수득하였다. LC-MS m/z 1349.4 [M+H+]; 체류 시간 = 0.75분. 분석용 HPLC 체류 시간 = 5.758분.
실시예 44: N~2~-(메틸술포닐)리실-L-발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일오르니틴아미드, 트리플루오로아세트산 염 (70)의 제조
Figure 112017018870512-pct00075
단계 1: 메틸 N~6~-(tert-부톡시카르보닐)-N~2~-(메틸술포닐)-L-리시네이트 (65)의 합성. 테트라히드로푸란:물 (1:1, 20 mL) 중 메틸 N~6~-(tert-부톡시카르보닐)-L-리시네이트 (2.0 g, 6.73 mmol)의 빙냉 용액에 탄산칼륨 (4.6 g, 33.7 mmol)을 첨가하고, 이어서 메실 클로라이드 (0.62 mL, 8.08 mmol)를 적가하였다. 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반한 다음, 혼합물을 여과하였다. 여과물을 에틸 아세테이트로 3회 추출하였다. 합한 추출물을 염수로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 디클로로메탄 중 0% 내지 2% 메탄올의 구배 용리를 사용하여 정제하여 목적 생성물 2.0 g (87%)을 무색 오일로서 수득하였다. 1H NMR (400MHz, 클로로포름-d) δ = 5.23 (d, J=9.0 Hz, 1H), 4.62 (br. s., 1H), 4.10 (dt, J=5.0, 8.5 Hz, 1H), 3.78 (s, 3H), 3.16 - 3.04 (m, 2H), 2.95 (s, 3H), 1.88 - 1.78 (m, 2H), 1.77 - 1.64 (m, 1H), 1.59 - 1.47 (m, 3H), 1.45 (s, 9H).
단계 2: N~6~-(tert-부톡시카르보닐)-N~2~-(메틸술포닐)-L-리신 (66)의 합성. 테트라히드로푸란:물:메탄올 (1:1:1, 30 mL) 중 메틸 N~6~-(tert-부톡시카르보닐)-N~2~-(메틸술포닐)-L-리시네이트 (65, 2.0 g, 5.90 mmol)의 교반 용액에 수산화리튬 1수화물 (496 mg, 11.8 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 혼합물을 감압 하에 농축시켰다. 나머지 수성 층을 에틸 아세테이트로 2회 추출하였다. 수층을 염산의 1N 수용액을 사용하여 pH 3으로 산성화시킨 다음, 이소프로필 알콜:에틸 아세테이트 (1:5)로 2회 추출하였다. 합한 유기 추출물을 염수로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 감압 하에 농축시켜 목적 생성물 1.3 g (68%)을 백색 고체로서 수득하였다. MS m/z 323.1 [M-H+]; 1H NMR (400MHz, 클로로포름-d) δ = 6.40 (br. s., 1H), 5.81 - 5.66 (m, 1H), 4.79 (br. s., 1H), 3.23 - 3.06 (m, 2H), 2.99 (s, 3H), 1.96 - 1.71 (m, 2H), 1.55 - 1.39 (m, 13H).
단계 3: N~6~-(tert-부톡시카르보닐)-N~2~-(메틸술포닐)-L-리실-L-발릴-N~5~-카르바모일-N-[4-(히드록시메틸)페닐]오르니틴아미드 (67)의 합성. N,N-디메틸포름아미드 20 mL 중 N~6~-(tert-부톡시카르보닐)-N~2~-(메틸술포닐)-L-리신 (66, 1.0 g, 3.09 mmol) 및 L-발릴-N~5~-카르바모일-N-[4-(히드록시메틸)페닐]-L-오르니틴아미드 (1, 1.28 g, 3.40 mmol)의 빙냉 용액에 N,N-디이소프로필에틸아민 (600 uL, 438 mg, 3.40 mmol), N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드 (649 mg, 3.40 mmol) 및 1-히드록시벤조트리아졸 수화물 (459 mg, 3.40 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온으로 가온되도록 하고, 16시간 동안 교반하였다. 이어서, 혼합물을 tert-부틸 메틸 에테르 150 mL에 적가하였다. 고체를 역상 HPLC에 의해 정제하였다. 생성물 함유 분획을 동결건조시켜 목적 생성물 580 mg (28%)을 백색 고체로서 수득하였다.
단계 4: N~6~-(tert-부톡시카르보닐)-N~2~-(메틸술포닐)-L-리실-L-발릴-N~5~-카르바모일-N-[4-({[(4-니트로페녹시)카르보닐]옥시}메틸)페닐]오르니틴아미드 (68)의 합성. N,N-디메틸포름아미드 10 mL 중 N~6~-(tert-부톡시카르보닐)-N~2~-(메틸술포닐)-L-리실-L-발릴-N~5~-카르바모일-N-[4-(히드록시메틸)페닐]오르니틴아미드 (67, 580 mg, 0.85 mmol) 및 p-니트로페닐 카르보네이트 (770 mg, 2.56 mmol)의 교반 용액에 N,N-디이소프로필에틸아민 (451 ul, 330 mg, 2.56 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 혼합물을 tert-부틸 메틸 에테르 150 mL에 적가하였다. 고체를 역상 HPLC (방법 XXX)에 의해 정제하였다. 생성물 함유 분획을 동결건조시켜 목적 생성물 200 mg (28%)을 백색 고체로서 수득하였다. MS m/z 851.4 [M+H+]. 1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ = 10.16 (s, 1H), 8.32 (d, J=9.5 Hz, 2H), 8.26 (d, J=6.5 Hz, 1H), 7.95 (t, J=7.4 Hz, 1H), 7.65 (d, J=8.5 Hz, 2H), 7.58 (t, J=5.9 Hz, 2H), 7.45 (d, J=9.0 Hz, 1H), 7.42 (d, J=8.5 Hz, 2H), 6.79 (t, J=5.5 Hz, 1H), 6.00 (t, J=5.8 Hz, 1H), 5.45 (s, 2H), 4.40 (d, J=5.0 Hz, 1H), 4.33 - 4.06 (m, 1H), 3.84 (d, J=4.5 Hz, 1H), 3.30 (br. s., 1H), 3.09 - 2.99 (m, 1H), 2.98 - 2.93 (m, 1H), 2.93 - 2.86 (m, 2H), 2.83 (s, 3H), 2.01 (d, J=6.5 Hz, 1H), 1.59 (br. s., 3H), 1.47 (d, J=13.1 Hz, 2H), 1.38 (s, 13H), 0.89 (d, J=7.0 Hz, 3H), 0.85 (d, J=7.0 Hz, 3H).
단계 5: N~6~-(tert-부톡시카르보닐)-N~2~-(메틸술포닐)-D-리실-L-발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일오르니틴아미드 (69)의 합성. N,N-디메틸아세트아미드 2 mL 중 2-메틸알라닐-N-[(3R,4S,5S)-3-메톡시-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드 (4, 52.0 mg, 0.070 mmol) 및 N~6~-(tert-부톡시카르보닐)-N~2~-(메틸술포닐)-L-리실-L-발릴-N~5~-카르바모일-N-[4-({[(4-니트로페녹시)카르보닐]옥시}메틸)페닐]오르니틴아미드 (68, 60.6 mg, 0.0710 mmol)의 용액에 2,6-루티딘 (31 uL, 28.3 mg, 0.264 mmol) N,N-디이소프로필에틸아민 (46 uL, 34.1 mg, 0.264 mmol) 및 3H-[1,2,3]트리아졸로[4,5-b]피리딘-3-올 (9 mg, 0.066 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 45℃에서 16시간 동안 교반되도록 하였다. 이어서, 반응물을 역상 HPLC (방법 S)에 의해 정제하여 동결건조 후에 목적 생성물 70 mg (69%)을 백색 고체로서 수득하였다. LC-MS m/z 1455.09 [M+H+], 1453.77 [M-H+]; 체류 시간 = 1.80분.
단계 6: N~2~-(메틸술포닐)리실-L-발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일오르니틴아미드, 트리플루오로아세트산 염 (70)의 합성. 디클로로메탄 0.8 mL 중 N~6~-(tert-부톡시카르보닐)-N~2~-(메틸술포닐)-D-리실-L-발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일오르니틴아미드 (69, 30 mg, 0.021 mmol)의 용액에 트리플루오로아세트산 0.2 mL를 첨가하였다. 혼합물을 LC-MS에 의해 모니터링하고, 실온에서 30분 동안 교반되도록 하였다. 이어서, 용액을 직접 역상 HPLC (방법 B)에 의해 정제하였다. 생성물 함유 분획을 동결건조시켜 동결건조 후에 15 mg (48%)을 수득하였다. LC-MS m/z 1355.4 [M+H+], 1353.3 [M-H+]; 체류 시간 = 1.42분.
실시예 45: N~2~-(페닐술포닐)리실-L-발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일오르니틴아미드, 트리플루오로아세트산 염 (75)의 제조
Figure 112017018870512-pct00076
단계 1: N~6~-(tert-부톡시카르보닐)-N~2~-(페닐술포닐)-L-리신 (71)의 합성. 테트라히드로푸란:물 (1:1, 100 mL) 중 N~6~-(tert-부톡시카르보닐)-L-리신 (3.0 g, 12.2 mmol)의 빙냉 용액에 탄산칼륨 (8.4 g, 61.0 mmol)을 첨가하고, 이어서 벤젠술포닐 클로라이드 (1.86 mL, 14.6 mmol)를 적가하였다. 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반한 다음, 혼합물을 여과하였다. 여과물을 에틸 아세테이트:이소프로필 알콜 10:1로 3회 추출하였다. 합한 추출물을 염수로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 감압 하에 농축시켰다. 잔류물에 tert-부틸 메틸 에테르 100 mL를 첨가하고, 혼합물을 30분 동안 교반하였다. 고체를 여과에 의해 수집하고, 역상 HPLC에 의해 정제하였다. 생성물 함유 분획을 동결건조시켜 목적 생성물 538 mg (11%)을 백색 고체로서 수득하였다. MS m/z 408.9 [M+Na+]. 1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ = 7.76 (d, J=7.5 Hz, 2H), 7.63 - 7.50 (m, 3H), 3.61 - 3.53 (m, 1H), 2.82 - 2.73 (m, 2H), 1.61 - 1.40 (m, 2H), 1.35 (s, 9H), 1.28 - 1.06 (m, 4H).
단계 2: N~6~-(tert-부톡시카르보닐)-N~2~-(페닐술포닐)-L-리실-L-발릴-N~5~-카르바모일-N-[4-(히드록시메틸)페닐]오르니틴아미드 (72)의 합성. N,N-디메틸포름아미드 20 mL 중 N~6~-(tert-부톡시카르보닐)-N~2~-(페닐술포닐)-L-리신 (71, 1.2 g, 3.10 mmol) 및 L-발릴-N~5~-카르바모일-N-[4-(히드록시메틸)페닐]-L-오르니틴아미드 (1, 1.30 g, 3.41mmol)의 빙냉 용액에 N,N-디이소프로필에틸아민 (600 uL, 438 mg, 3.40 mmol), N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드 (650 mg, 3.41 mmol) 및 1-히드록시벤조트리아졸 수화물 (460 mg, 3.41 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온으로 가온되도록 하고, 16시간 동안 교반하였다. 혼합물을 tert-부틸 메틸 에테르 150 mL에 적가하였다. 고체를 여과에 의해 단리시킨 다음, 역상 HPLC에 의해 정제하였다. 생성물 함유 분획을 동결건조시켜 목적 생성물 850 mg (37%)을 백색 고체로서 수득하였다.
단계 3: N~6~-(tert-부톡시카르보닐)-N~2~-(페닐술포닐)-L-리실-L-발릴-N~5~-카르바모일-N-[4-({[(4-니트로페녹시)카르보닐]옥시}메틸)페닐]오르니틴아미드 (73)의 합성. N,N-디메틸포름아미드 15 mL 중 N~6~-(tert-부톡시카르보닐)-N~2~-(페닐술포닐)-L-리실-L-발릴-N~5~-카르바모일-N-[4-(히드록시메틸)페닐]오르니틴아미드 (72, 850 mg, 1.14mmol) 및 p-니트로페닐 카르보네이트 (853 mg, 2.85 mmol)의 교반 용액에 N,N-디이소프로필에틸아민 (501 ul, 365 mg, 2.85 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 혼합물을 tert-부틸 메틸 에테르 150 mL에 적가하였다. 고체를 역상 HPLC에 의해 정제하였다. 생성물 함유 분획을 동결건조시켜 목적 생성물 450 mg (43%)을 백색 고체로서 수득하였다. MS m/z 935.1 [M+Na+]; 1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ = 10.11 (s, 1H), 8.35 - 8.27 (m, 2H), 8.10 (d, J=7.0 Hz, 1H), 7.94 (d, J=8.5 Hz, 1H), 7.83 (d, J=8.5 Hz, 1H), 7.76 (d, J=7.5 Hz, 2H), 7.63 (d, J=8.5 Hz, 2H), 7.60 - 7.48 (m, 5H), 7.40 (t, J=5.8 Hz, 2H), 6.70 (s, J=5.6, 5.6 Hz, 1H), 6.01 - 5.93 (m, 1H), 5.43 (s, 2H), 4.36 (d, J=6.0 Hz, 1H), 4.01 (t, J=7.5 Hz, 1H), 3.78 (d, J=5.0 Hz, 1H), 3.01 (d, J=6.0 Hz, 1H), 2.97 - 2.88 (m, 1H), 2.76 (q, J=6.5 Hz, 2H), 1.86 (d, J=6.5 Hz, 1H), 1.44 (d, J=5.5 Hz, 4H), 1.41 - 1.40 (m, 1H), 1.36 (s, 9H), 1.31 - 1.13 (m, 3H), 1.05 (br. s., 1H), 0.75 (d, J=7.0 Hz, 3H), 0.73 (d, J=7.0 Hz, 3H).
단계 4: N~6~-(tert-부톡시카르보닐)-N~2~-(페닐술포닐)리실-L-발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일오르니틴아미드 (74)의 합성. N,N-디메틸아세트아미드 2 mL 중 2-메틸알라닐-N-[(3R,4S,5S)-3-메톡시-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드 (4, 52.0 mg, 0.070 mmol) 및 N~6~-(tert-부톡시카르보닐)-N~2~-(페닐술포닐)-L-리실-L-발릴-N~5~-카르바모일-N-[4-({[(4-니트로페녹시)카르보닐]옥시}메틸)페닐]오르니틴아미드 (73, 60.4 mg, 0.066 mmol)의 용액에 2,6-루티딘 (31 uL, 28.3 mg, 0.264 mmol), N,N-디이소프로필에틸아민 (46 uL, 34.1 mg, 0.264 mmol) 및 3H-[1,2,3]트리아졸로[4,5-b]피리딘-3-올 (9 mg, 0.066 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 45℃에서 16시간 동안 교반되도록 하였다. 이어서, 반응물을 역상 HPLC (방법 S)에 의해 정제하여 동결건조 후에 목적 생성물 85 mg (85%)을 백색 고체로서 수득하였다. LC-MS m/z 1518.4 [M+H+], 1516.3 [M-H+]; 체류 시간 = 1.93분.
단계 5: N~2~-(페닐술포닐)리실-L-발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일오르니틴아미드, 트리플루오로아세트산 염 (75)의 합성. 디클로로메탄 0.8 mL 중 N~6~-(tert-부톡시카르보닐)-N~2~-(페닐술포닐)리실-L-발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일오르니틴아미드 (75, 82 mg, 0.054 mmol)의 용액에 트리플루오로아세트산 0.2 mL를 첨가하였다. 혼합물을 LC-MS에 의해 모니터링하고, 실온에서 30분 동안 교반되도록 하였다. 이어서, 용액을 직접 역상 HPLC (방법 B)에 의해 정제하였다. 생성물 함유 분획을 동결건조시켜 동결건조 후에 35 mg (42%)을 수득하였다. LC-MS m/z 1416.87 [M+H+]; 체류 시간 = 1.35분.
실시예 46: N-아세틸-O-(2-아미노에틸)-D-세릴-L-발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일오르니틴아미드, 트리플루오로아세트산 염 (83)의 제조
Figure 112017018870512-pct00077
단계 1: 메틸 N-아세틸-O-(2-{[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐] 아미노}에틸)-L-세리네이트 (78)의 합성. -30℃에서 디클로로메탄 20 mL 중 9H-플루오렌-9-일메틸 (2-히드록시에틸)카르바메이트 (1000 mg, 3.53 mmol) 및 메틸 (2S)-1-아세틸아지리딘-2-카르복실레이트 (US 20110021482, 758 mg, 5.29 mmol)의 현탁액에 삼플루오린화붕소 디에틸 에테레이트 (532 uL, 601 mg, 4.24 mmol)를 적가하였다. 혼합물을 그 온도에서 2시간 동안 교반한 다음, 실온으로 가온되도록 하였다. 추가의 1시간 후에, 반응물에 중탄산나트륨의 포화 수용액을 첨가하고, 디클로로메탄 (80 mL)으로 희석하였다. 유기 상을 분리하고, 염수로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 역상 HPLC (방법 W)에 의해 정제하였다. 적절한 분획을 합하고, 유기 용매를 감압 하에 제거하였다. 나머지 수성 혼합물을 에틸 아세테이트 (2 x 100 mL)로 추출하였다. 합한 추출물을 염수로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 농축시켰다. 잔류물을 디클로로메탄 (50 mL)과 함께 1회 공증발시켜 표제 화합물 160 mg (11%)을 담황색 검으로서 수득하였다. MS m/z 448.9 [M+Na+]; 1H NMR (400MHz, 클로로포름-d) δ = 7.78 (d, J=7.5 Hz, 2H), 7.60 (d, J=7.5 Hz, 2H), 7.42 (t, J=7.5 Hz, 2H), 7.37 - 7.31 (m, 2H), 6.66 (br. s., 1H), 5.07 (br. s., 1H), 4.89 - 4.72 (m, 1H), 4.45 (d, J=6.5 Hz, 2H), 4.23 (d, J=6.5 Hz, 1H), 3.88 (d, J=6.5 Hz, 1H), 3.72 (br. s., 4H), 3.54 (br. s., 2H), 3.36 (br. s., 2H), 2.09 (s, 3H).
단계 2: N-아세틸-O-(2-{[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노}에틸)-L-세린 (79)의 합성. 이소프로판올:물 (7:3, 10 mL) 중 N-아세틸-O-(2-{[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노}에틸)-L-세리네이트 (78, 160 mg, 0.375 mmol)의 용액에 염화칼슘 (833 g, 7.5 mmol)을 첨가하였다. 혼합물이 투명해졌을 때, 수산화나트륨 (18 mg, 0.450 mmol)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 이어서, 혼합물을 염산의 3M 수용액을 사용하여 pH~1-2로 산성화시키고, 물 (10 mL)로 희석하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트 (20 mL)로 추출하고, 유기부를 단리시키고, 감압 하에 농축시켜 대부분의 이소프로판올을 제거하였다. 수성 상을 에틸 아세테이트 (2 x 100 mL)로 추출하였다. 합한 유기 층을 염수로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 농축시켜 목적 화합물 107 mg (96%)을 청색 고체로서 수득하였으며, 이를 후속 단계에서 추가 정제 없이 사용할 것이다. MS m/z 434.8 [M+Na+]; 1H NMR (400MHz, 클로로포름-d) δ = 8.48 (d, J=9.0 Hz, 1H), 7.78 (d, J=7.5 Hz, 2H), 7.56 (d, J=7.5 Hz, 2H), 7.47 - 7.37 (m, 2H), 7.35 - 7.29 (m, 2H), 7.15 (t, J=6.1 Hz, 1H), 5.03 (d, J=9.0 Hz, 1H), 4.51 (dd, J=6.8, 10.8 Hz, 1H), 4.41 (dd, J=7.0, 10.5 Hz, 2H), 4.30 - 4.23 (m, 1H), 4.32 - 4.21 (m, 1H), 4.21 - 4.09 (m, 1H), 3.57 (t, J=8.3 Hz, 3H), 3.53 - 3.45 (m, 2H), 3.40 (br. s., 1H), 3.31 (d, J=9.0 Hz, 1H), 2.00 (s, 3H).
단계 3: N-아세틸-O-(2-{[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노}에틸)-L-세릴발릴-N~5~-카르바모일-N-[4-(히드록시메틸)페닐]-L-오르니틴아미드 (80)의 합성. N,N-디메틸포름아미드 3 mL 중 N-아세틸-O-(2-{[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노}에틸)-L-세린 (79, 105 mg, 0.255 mmol) 및 L-발릴-N~5~-카르바모일-N-[4-(히드록시메틸)페닐]-L-오르니틴아미드 (1, 96.6 mg, 0.255 mmol)의 용액에 O-(7 아자벤조트리아졸 1 일) N,N,N',N' 테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (106 mg, 0.280 mmol)에 이어서 N,N 디이소프로필에틸아민 (98.7 mg, 0.764 mmol)을 첨가하였다. 황색 투명한 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 tert-부틸 메틸 에테르 (60 mL)로 희석하고, 30분 동안 교반하였다. 고체를 여과에 의해 단리시킨 다음, 역상 HPLC (방법 X)에 의해 정제하였다. 생성물 함유 분획을 동결건조시켜 목적 생성물 84 mg (43%)을 백색 고체로서 수득하였다. MS m/z 774.2 [M+H+].
단계 4: N-아세틸-O-(2-{[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노}에틸)세릴발릴-N~5~-카르바모일-N-[4-({[(4-니트로페녹시)카르보닐]옥시}메틸)페닐]-L-오르니틴아미드 (81)의 합성. N,N-디메틸포름아미드 5 mL 중 N-아세틸-O-(2-{[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노}에틸)-L-세릴발릴-N~5~-카르바모일-N-[4-(히드록시메틸)페닐]-L-오르니틴아미드 (80, 200 mg, 0.258 mmol) 및 p-니트로페닐 카르보네이트 (853 mg, 2.85 mmol)의 교반 용액에 N,N-디이소프로필에틸아민 (100.8 ul, 73.5 mg, 0.569 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반한 다음, 추가로 p-니트로페닐 카르보네이트 (78.6 mg, 0.258 mmol)를 첨가하였다. 추가로 1시간 후에, 혼합물을 tert-부틸 메틸 에테르 100 mL에 적가하였다. 고체를 여과에 의해 단리시키고, 일부 tert-부틸 메틸 에테르로 세척하여 공기 건조 후에 목적 생성물 180 mg (74%)을 황색 고체로서 수득하였다. MS m/z 939.2 [M+H+] 961.1 [M+Na+].
단계 5: N-아세틸-O-(2-{[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노}에틸)-D-세릴-L-발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일오르니틴아미드 (82)의 합성. N,N-디메틸아세트아미드 2.5 mL 중 2-메틸알라닐-N-[(3R,4S,5S)-3-메톡시-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드 (4, 60.0 mg, 0.081 mmol) 및 N-아세틸-O-(2-{[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노}에틸)세릴발릴-N~5~-카르바모일-N-[4-({[(4-니트로페녹시)카르보닐]옥시}메틸)페닐]-L-오르니틴아미드 (81, 121 mg, 0.188 mmol)의 용액에 2,6-루티딘 (37.4 uL, 34.6 mg, 0.323 mmol), N,N-디이소프로필에틸아민 (42.2 uL, 31.3 mg, 0.242 mmol) 및 3H-[1,2,3]트리아졸로[4,5-b] 피리딘-3-올 (11.0 mg, 0.081 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 45℃에서 6시간 동안 교반되도록 하였다. 이어서, 반응물을 역상 HPLC (방법 G)에 의해 정제하여 동결건조 후에 목적 생성물 62 mg (50%)을 백색 고체로서 수득하였다. LC-MS m/z 1543.3 [M+H+]; 체류 시간 = 2.25분. 분석용 HPLC 체류 시간 = 7.435분.
단계 6: N-아세틸-O-(2-아미노에틸)-D-세릴-L-발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일오르니틴아미드, 트리플루오로아세트산 염 (83)의 합성. N,N-디메틸포름아미드 2.5 mL 중 N-아세틸-O-(2-{[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노}에틸)-D-세릴-L-발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일오르니틴아미드 (82, 42 mg, 0.027 mmol)의 용액에 수산화리튬의 수용액 (3.26 mg, 0.136 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 용액을 농축시키고, 역상 HPLC (방법 L)에 의해 정제하였다. 생성물 함유 분획을 동결건조시켜 목적 생성물 29 mg (74%)을 수득하였다. LC-MS m/z 1321.2 [M+H+]; 체류 시간 = 1.30분. 분석용 HPLC 체류 시간 = 5.804분.
실시예 47: N-아세틸-O-[2-(2-아미노에톡시)에틸]-L-세릴-L-발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일오르니틴아미드, 트리플루오로아세트산 염 (90)
Figure 112017018870512-pct00078
단계 1: 메틸 N-아세틸-O-[2-(2-{[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노}에톡시)에틸]-L-세리네이트 (85)의 합성. 디클로로메탄 130 mL 중 9H-플루오렌-9-일메틸 [2-(2-히드록시에톡시)에틸]카르바메이트 (84, 7.55 g, 23.1 mmol) 및 메틸 (2S)-1-아세틸아지리딘-2-카르복실레이트 (758 mg, 5.29 mmol)의 용액에 삼플루오린화붕소 디에틸 에테레이트 (3.94 mL, 4.46 g, 31.4 mmol )를 적가하였다. 1시간 후에, 반응물에 중탄산나트륨의 포화 수용액을 첨가하였다. 유기 상을 분리하고, 염수로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 역상 HPLC (방법 Y)에 의해 정제하였다. 적절한 분획을 합하고, 유기 용매를 감압 하에 제거하였다. 나머지 수성 혼합물을 디클로로메탄 (2 x 100 mL)으로 추출하였다. 합한 추출물을 염수로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 감압 하에 농축시켜 표제 화합물 3.8 g (26%)을 무색 오일로서 수득하였다. MS m/z 493.0 [M+Na+]; 1H NMR (400MHz, 클로로포름-d) δ = 7.77 (d, J=7.5 Hz, 2H), 7.62 (d, J=7.0 Hz, 2H), 7.44 - 7.37 (m, 2H), 7.35 - 7.29 (m, 2H), 6.69 (d, J=6.5 Hz, 1H), 5.49 (br. s., 1H), 4.78 (d, J=8.0 Hz, 1H), 4.42 (d, J=6.5 Hz, 2H), 4.25 (d, J=7.0 Hz, 1H), 3.95 (d, J=10.0 Hz, 1H), 3.75 (s, 3H), 3.66 - 3.50 (m, 6H), 3.41 (br. s., 2H), 2.04 (s, 3H).
단계 2: N-아세틸-O-[2-(2-{[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노} 에톡시)에틸]-L-세린 (86)의 합성. 이소프로판올 90 mL 및 물 40 mL 중 메틸 N-아세틸-O-[2-(2-{[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노}에톡시)에틸]-L-세리네이트 (85, 3200 mg, 6.8 mmol)의 용액에 염화칼슘 (15.1 g, 136 mmol)을 첨가하였다. 혼합물이 투명해졌을 때, 수산화나트륨 (326 mg, 8.16 mmol)을 첨가하였다. 2시간 후에, 이어서 혼합물을 염산의 3M 수용액을 사용하여 pH~1-2로 산성화시키고, 물 (300 mL)로 희석하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트 (3 x 250 mL)로 추출하고, 유기부를 단리시키고, 감압 하에 농축시켜 목적 화합물 3000 mg (97%)을 백색 고체로서 수득하였으며, 이를 추가 정제 없이 후속 단계에 그대로 사용하였다. MS m/z 456.9 [M+H+]; 1H NMR (400MHz, 클로로포름-d) δ = 7.77 (d, J=7.5 Hz, 2H), 7.63 - 7.53 (m, 2H), 7.44 - 7.38 (m, 2H), 7.36 - 7.30 (m, 2H), 6.65 (d, J=6.0 Hz, 1H), 4.77 (br. s., 1H), 4.51 (br. s., 1H), 4.43 (d, J=6.5 Hz, 1H), 4.26 (d, J=6.0 Hz, 1H), 3.95 (br. s., 1H), 3.76 (br. s., 1H), 3.70 - 3.57 (m, 3H), 3.54 (d, J=7.5 Hz, 2H), 3.41 (d, J=13.1 Hz, 2H), 3.29 (br. s., 1H), 2.05 (br. s., 3H).
단계 3: N-아세틸-O-[2-(2-{[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노} 에톡시)에틸]-L-세릴발릴-N~5~-카르바모일-N-[4-(히드록시메틸)페닐]-L-오르니틴아미드 (87)의 합성. N,N-디메틸포름아미드 45 mL 중 N-아세틸-O-[2-(2-{[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노}에톡시)에틸]-L-세린 (86, 3000 mg, 6.57 mmol)의 용액에 O-(7 아자벤조트리아졸 1 일) N,N,N',N' 테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HATU, 3000 mg, 7.89 mmol)를 첨가하였다. 20분 후, L-발릴-N~5~-카르바모일-N-[4-(히드록시메틸)페닐]-L-오르니틴아미드 (1, 2490 mg, 6.57 mmol)를 첨가하고, 이어서 N,N-디이소프로필에틸아민 (2550 mg, 19.7 mmol)을 첨가하였다. 3시간 후에, 혼합물을 tert-부틸 메틸 에테르 (500 mL) 및 석유 에테르 (200 mL)의 혼합물에 붓고, 20분 동안 교반하였다. 고체를 여과에 의해 단리시킨 다음, 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 디클로로메탄 중 1% 내지 20% 메탄올의 구배 용리를 사용하여 정제하여 목적 생성물 3100 mg (58%)을 백색 고체로서 수득하였다. MS m/z 818.1[M+H+].
단계 4: N-아세틸-O-[2-(2-{[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노}에톡시)에틸]-L-세릴발릴-N~5~-카르바모일-N-[4-({[(4-니트로페녹시)카르보닐]옥시}메틸)페닐]-L-오르니틴아미드 (88)의 합성. N,N-디메틸포름아미드 6 mL 중 N-아세틸-O-[2-(2-{[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노}에톡시)에틸]-L-세릴발릴-N~5~-카르바모일-N-[4-(히드록시메틸)페닐]-L-오르니틴아미드 (87, 500 mg, 0.611 mmol) 및 p-니트로페닐 카르보네이트 (279 mg, 0.917 mmol)의 빙냉 교반 용액에 N,N-디이소프로필에틸아민 (216.7 ul, 158 mg, 1.22 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 5시간 동안 교반하고, 이어서 추가의 p-니트로페닐 카르보네이트 (100 mg, 0.538 mmol)를 첨가하였다. 추가로 12시간 후에, 혼합물을 tert-부틸 메틸 에테르 (60 mL) 및 석유 에테르 (20 mL)의 혼합물에 붓고, 15분 동안 교반하였다. 고체를 여과에 의해 단리시킨 다음, 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 디클로로메탄 중 1% 내지 10% 메탄올의 구배 용리를 사용하여 정제하여 목적 생성물 300 mg (50%)을 백색 고체로서 수득하였다. MS m/z 983.5 [M+H+].
단계 5: N-아세틸-O-[2-(2-{[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노}에톡시)에틸]-L-세릴-L-발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일오르니틴아미드 (89)의 합성. N,N-디메틸아세트아미드 2.5 mL 중 2-메틸알라닐-N-[(3R,4S,5S)-3-메톡시-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드 (4, 60.0 mg, 0.081 mmol) 및 N-아세틸-O-[2-(2-{[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노}에톡시)에틸]-L-세릴발릴-N~5~-카르바모일-N-[4-({[(4-니트로페녹시)카르보닐]옥시}메틸)페닐]-L-오르니틴아미드 (88, 75.4 mg, 0.077 mmol)의 용액에 2,6-루티딘 (37.4 uL, 34.6 mg, 0.323 mmol), N,N-디이소프로필에틸아민 (42.2 uL, 31.3 mg, 0.242 mmol) 및 3H-[1,2,3]트리아졸로[4,5-b]피리딘-3-올 (HOAt, 11.0 mg, 0.081 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 45℃에서 16시간 동안 교반되도록 하였다. 이어서, 반응물을 역상 HPLC (방법 G)에 의해 정제하여 동결건조 후에 목적 생성물 76 mg (58%)을 백색 고체로서 수득하였다. LC-MS m/z 1587.3 [M+H+]; 체류 시간 = 2.26분. 분석용 HPLC 체류 시간 = 7.459분.
단계 6: N-아세틸-O-[2-(2-아미노에톡시)에틸]-L-세릴-L-발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일오르니틴아미드, 트리플루오로아세트산 염 (90)의 합성. N,N-디메틸포름아미드 2.5 mL 중 N-아세틸-O-[2-(2-{[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노}에톡시)에틸]-L-세릴-L-발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일오르니틴아미드 (89, 40 mg, 0.025 mmol)의 용액에 수산화리튬의 수용액 (3.02 mg, 0.126 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 이어서, 용액을 역상 HPLC (방법 D)에 의해 정제하였다. 생성물 함유 분획을 동결건조시켜 목적 생성물 27 mg (72%)을 수득하였다. LC-MS m/z 1365.2 [M+H+]; 체류 시간 = 1.26분. 분석용 HPLC 체류 시간 = 5.768분.
실시예 48: N~2~-(3-히드록시프로파노일)-L-리실발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드, 트리플루오로아세트산 염 (97)의 제조
Figure 112017018870512-pct00079
단계 1: 메틸 N-아세틸-O-[1-(9H-플루오렌-9-일)-3-옥소-2,7,10,13,16,19-헥사옥사-4-아자헤니코산-21-일]-L-세리네이트 (92)의 합성. 디클로로메탄 150 mL 중 9H-플루오렌-9-일메틸 (17-히드록시-3,6,9,12,15-펜타옥사헵타데스-1-일)카르바메이트 (91, 7600 mg, 15.09 mmol) 및 메틸 (2S)-1-아세틸아지리딘-2-카르복실레이트 (4320 mg, 30.2 mmol)의 용액에 삼플루오린화붕소 디에틸 에테레이트 (2.84 mL, 3210 mg, 22.6 mmol)를 적가하였다. 2.5시간 후에, 반응물을 중탄산나트륨의 포화 수용액에 이어서 염수로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 역상 HPLC (방법 Z)에 의해 정제하였다. 적절한 분획을 합하고, 유기 용매를 감압 하에 제거하였다. 나머지 수성 혼합물을 에틸 아세테이트 (2 x 100 mL)로 추출하였다. 합한 추출물을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 농축시켜 표제 화합물 5 g (51%)을 오일로서 수득하였다. MS m/z 647.1 [M+H+]; 1H NMR (400MHz, 클로로포름-d) δ = 7.76 (d, J=7.5 Hz, 2H), 7.61 (d, J=7.5 Hz, 2H), 7.40 (t, J=7.5 Hz, 2H), 7.31 (t, J=7.4 Hz, 2H), 6.72 (d, J=7.5 Hz, 1H), 5.47 (br. s., 1H), 4.73 (td, J=3.5, 8.0 Hz, 1H), 4.41 (d, J=7.0 Hz, 2H), 4.26 - 4.19 (m, 1H), 3.94 (dd, J=3.5, 10.0 Hz, 1H), 3.75 (s, 3H), 3.70 (dd, J=3.5, 10.0 Hz, 1H), 3.67 - 3.56 (m, 22H), 3.40 (q, J=5.2 Hz, 2H), 2.07 (s, 3H).
단계 2: N-아세틸-O-[1-(9H-플루오렌-9-일)-3-옥소-2,7,10,13,16,19-헥사옥사-4-아자헤니코산-21-일]-L-세린 (93)의 합성. 이소프로판올:물 (7:3, 170 mL) 중 메틸 N-아세틸-O-[1-(9H-플루오렌-9-일)-3-옥소-2,7,10,13,16,19-헥사옥사-4-아자헤니코산-21-일]-L-세리네이트 (92, 4200 mg, 6.49 mmol)의 용액에 염화칼슘 (14.4 g, 130 mmol)을 첨가하였다. 혼합물이 투명해졌을 때, 수산화나트륨 (312 mg, 7.79 mmol)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 이어서, 혼합물을 염산의 3M 수용액을 사용하여 pH~1-2로 산성화시키고, 물 (100 mL)로 희석하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트 (100 mL)로 추출하고, 유기부를 단리시키고, 감압 하에 농축시켜 대부분의 이소프로판올을 제거하였다. 수성 상을 에틸 아세테이트 (2 x 100 mL)로 추출하였다. 합한 유기 층을 염수로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 감압 하에 농축시켰다. 이어서, 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 디클로로메탄 중 0% 내지 15% 메탄올의 구배 용리를 사용하여 정제하여 3.4 g (83%) 목적 화합물을 황색 오일로서 수득하였다. MS m/z 633.1 [M+H+].
단계 3: N-아세틸-O-[1-(9H-플루오렌-9-일)-3-옥소-2,7,10,13,16,19-헥사옥사-4-아자헤니코산-21-일]-L-세릴발릴-N~5~-카르바모일-N-[4-(히드록시메틸)페닐]-L-오르니틴아미드 (94)의 합성. N,N-디메틸포름아미드 15 mL 중 N-아세틸-O-[1-(9H-플루오렌-9-일)-3-옥소-2,7,10,13,16,19-헥사옥사-4-아자헤니코산-21-일]-L-세린 (93, 1.20 g, 1.90 mmol) 및 L-발릴-N~5~-카르바모일-N-[4-(히드록시메틸)페닐]-L-오르니틴아미드 (1, 720 mg, 1.90 mmol)의 빙냉 용액에 O-(7 아자벤조트리아졸 1 일) N,N,N',N' 테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (794 mg, 2.09 mmol)에 이어서 N,N 디이소프로필에틸아민 (736 mg, 5.69 mmol)을 첨가하였다. 황색 투명한 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트 (3 x 30 mL)로 희석하고, 물 (60 mL)로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 감압 하에 농축시켰다. 이어서, 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 디클로로메탄 중 0% 내지 15% 메탄올의 구배 용리를 사용하여 정제하여 목적 생성물 1.5 g (80%)을 무색 유리로서 수득하였다. MS m/z 994.8 [M+H+].
단계 4: N-아세틸-O-[2-(2-아미노에톡시)에틸]-L-세릴-L-발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일오르니틴아미드 (95)의 합성. 빙조에서, N,N-디메틸포름아미드 15 mL 중 N-아세틸-O-[1-(9H-플루오렌-9-일)-3-옥소-2,7,10,13,16,19-헥사옥사-4-아자헤니코산-21-일]-L-세릴발릴-N~5~-카르바모일-N-[4-(히드록시메틸)페닐]-L-오르니틴아미드 (94, 1.5 g, 1.5 mmol) 및 p-니트로페닐 카르보네이트 (918 mg, 3.02mmol)의 교반 용액에 N,N-디이소프로필에틸아민 (402 ul, 293 mg, 2.26 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반한 다음, 추가의 p-니트로페닐 카르보네이트 (918 mg, 3.02mmol)를 첨가하였다. 추가로 3시간 후에, 혼합물을 에틸 아세테이트 (30 mL)로 희석하고, 물 (40 mL)로 세척하였다. 수성 상을 에틸 아세테이트 (30mL)로 추출하였다. 합한 유기 층을 감압 하에 농축시킨 다음, 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 디클로로메탄 중 0% 내지 15% 메탄올의 구배 용리를 사용하여 정제한 다음, 역상 HPLC (방법 AA)에 의해 정제하여 동결건조 후에 목적 생성물 944 mg (54%)을 백색 고체로서 수득하였다. MS m/z 1159.8[M+H+].
단계 5: N-아세틸-O-[1-(9H-플루오렌-9-일)-3-옥소-2,7,10,13,16,19-헥사옥사-4-아자헤니코산-21-일]-L-세릴-L-발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일오르니틴아미드 (96)의 합성. N,N-디메틸아세트아미드 2.5 mL 중 2-메틸알라닐-N-[(3R,4S,5S)-3-메톡시-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드 (4, 55.0 mg, 0.074 mmol) 및 N-아세틸-O-[2-(2-아미노에톡시)에틸]-L-세릴-L-발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일오르니틴아미드 (95, 85.8 mg, 0.074 mmol)의 용액에 2,6-루티딘 (34.3 uL, 31.7 mg, 0.296 mmol), N,N-디이소프로필에틸아민 (38.7 uL, 28.7 mg, 0.222 mmol) 및 3H-[1,2,3]트리아졸로[4,5-b]피리딘-3-올 (10.1 mg, 0.074 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 45℃에서 6시간 동안 교반되도록 하였다. 이어서, 반응물을 역상 HPLC (방법 G)에 의해 정제하여 동결건조 후에 목적 생성물 90 mg (69%)을 백색 고체로서 수득하였다. LC-MS m/z 1764.4 [M+H+]; 체류 시간 = 1.99분. 분석용 HPLC 체류 시간 = 7.476분.
단계 6: N-아세틸-O-(17-아미노-3,6,9,12,15-펜타옥사헵타데스-1-일)-L-세릴-L-발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일오르니틴아미드, 트리플루오로아세트산 염 (97)의 합성. N,N-디메틸포름아미드 2.5 mL 중 N-아세틸-O-[1-(9H-플루오렌-9-일)-3-옥소-2,7,10,13,16,19-헥사옥사-4-아자헤니코산-21-일]-L-세릴-L-발릴-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-부탄-2-일]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-2-옥소에틸)-5,5,10-트리메틸-3,6,9-트리옥소-8-(프로판-2-일)-2,13-디옥사-4,7,10-트리아자테트라데스-1-일]페닐}-N~5~-카르바모일오르니틴아미드 (96, 46 mg, 0.026 mmol)의 용액에 수산화리튬의 수용액 (3.1 mg, 0.130 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 20분 동안 교반하였다. 이어서, 용액을 농축시키고, 역상 HPLC (방법 D에 이어서 방법 H)에 의해 정제하였다. 생성물 함유 분획을 동결건조시켜 목적 생성물 15 mg (35%)을 수득하였다. LC-MS m/z 1542.2 [M+H+]; 체류 시간 = 1.41분. 분석용 HPLC 체류 시간 = 5.836분.
하기 추가의 ADC (표 2 내지 7에 나타낸 바와 같이 Trop2 항체 상의 다양한 위치에 및 다양한 태그 상에 부착됨)는 상기 기재된 접합 기술을 사용하여 제조하였다 (괄호 부분은 글루타민 잔기를 나타내고, 여기서 파상선은 항-Trop2 항체의 나머지에 대한 부착 지점을 나타냄):
실시예 49:
Figure 112017018870512-pct00080
실시예 50:
Figure 112017018870512-pct00081
실시예 51:
Figure 112017018870512-pct00082
실시예 52:
Figure 112017018870512-pct00083
실시예 53:
Figure 112017018870512-pct00084
실시예 54:
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실시예 55:
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실시예 56:
Figure 112017018870512-pct00087
실시예 57:
Figure 112017018870512-pct00088
실시예 58:
Figure 112017018870512-pct00089
실시예 59:
Figure 112017018870512-pct00090
실시예 60:
Figure 112017018870512-pct00091
실시예 61:
Figure 112017018870512-pct00092
실시예 62:
Figure 112017018870512-pct00093
실시예 63:
Figure 112017018870512-pct00094
실시예 64:
Figure 112017018870512-pct00095
실시예 65:
Figure 112017018870512-pct00096
실시예 66:
Figure 112017018870512-pct00097
실시예 67:
Figure 112017018870512-pct00098
실시예 68:
Figure 112017018870512-pct00099
실시예 69:
Figure 112017018870512-pct00100
실시예 70:
Figure 112017018870512-pct00101
실시예 71:
Figure 112017018870512-pct00102
실시예 72: 혈장에서 VC-PABC 링커 절단을 담당하는 효소로서의 마우스 카르복실에스테라제 1C의 확인
마우스 녹아웃 균주 C56/BL6 Ces1C-/-, 이형접합 균주 C56/BL6 Ces1C+/- 및 야생형 균주 C56/BL6 Ces1C+/+로부터의 혈장 샘플을 사용하여 항-Trop2 L11B-C6-VC-PABC-Aur0101 접합체의 안정성을 시험하였다. ADC 56 ug을 0.125 mg/mL의 최종 ADC 농도로 1x PBS가 보충된 35% 혈장 중에서 인큐베이션하였다. 18시간 동안 인큐베이션한 후에, ADC를 CNBr-활성화 세파로스 (지이 헬스케어)에 커플링된 M1S1 항원을 사용하여 표준 프로토콜을 사용하여 단리시켰다. DAR 값을 인큐베이션 전후에 HIC 분석을 사용하여 평가하였다. 접합체 안정성 (%)은 인큐베이션 후에 남아있는 % DAR로서 계산된다. 도 3을 참조한다.
생물학적 데이터
실시예 8 내지 18에 약술된 절차에서 생성된 안정성 데이터가 표 2 내지 7에 요약되어 있다.
표 2 - 마우스에서의 생체내 접합체 안정성
Figure 112017018870512-pct00103
마우스에서의 생체내 접합체 안정성. 9 mg/kg으로 투여된 동물로부터 정제된 접합체에 대한 DAR 값을 생체내 노출 전 DAR 값과 비교하였다. 상기 안정성 값은 주어진 노출 기간 후에 남아있는 % DAR로서 표현되어 있다 (괄호 안에 제시됨).
표 3 - 래트에서의 생체내 접합체 안정성
Figure 112017018870512-pct00104
래트에서의 생체내 접합체 안정성. 9 mg/kg으로 투여된 동물로부터 정제된 접합체에 대한 DAR 값을 생체내 노출 전 DAR 값과 비교하였다. 상기 안정성 값은 주어진 노출 기간 후에 남아있는 % DAR로서 표현되어 있다 (괄호 안에 제시됨).
표 4 - 마우스 혈장에서의 시험관내 접합체 안정성
Figure 112017018870512-pct00105
Figure 112017018870512-pct00106
Figure 112017018870512-pct00107
마우스 혈장에서의 시험관내 접합체 안정성. 혈장 인큐베이션 후에 정제된 접합체에 대한 DAR 값을 혈장 처리 전 DAR 값과 비교하였다. 상기 안정성 값은 주어진 인큐베이션 기간 후에 남아있는 % DAR로서 표현되어 있다 (괄호 안에 제시됨).
표 5 - 래트 혈장에서의 시험관내 접합체 안정성
Figure 112017018870512-pct00108
래트 혈장에서의 시험관내 접합체 안정성. 혈장 인큐베이션 후에 정제된 접합체에 대한 DAR 값을 혈장 처리 전 DAR 값과 비교하였다. 상기 안정성 값은 주어진 인큐베이션 기간 후에 남아있는 % DAR로서 표현되어 있다 (괄호 안에 제시됨).
표 6 - 시노 혈장에서의 시험관내 접합체 안정성
Figure 112017018870512-pct00109
시노 혈장에서의 시험관내 접합체 안정성. 혈장 인큐베이션 후에 정제된 접합체에 대한 DAR 값을 혈장 처리 전 DAR 값과 비교하였다. 상기 안정성 값은 주어진 인큐베이션 기간 후에 남아있는 % DAR로서 표현되어 있다 (괄호 안에 제시됨).
표 7A - 계산된 % 안정성을 사용한 실험적 DAR 값
모든 DAR 값은 HIC 또는 질량 분광측정법 분석을 사용하여 항체에 부착된 약물의 수를 평가함으로써 결정하였다. 접합체 안정성은 3 또는 4.5일 동안 혈장에서 인큐베이션한 후에 남아있는 % DAR로서 계산된다.
Figure 112017018870512-pct00110
Figure 112017018870512-pct00111
표 7B - 계산된 % 안정성을 사용한 추가의 실험적 DAR 값
모든 DAR 값은 HIC 또는 질량 분광측정법 분석을 사용하여 항체에 부착된 약물의 수를 평가함으로써 결정하였다. 접합체 안정성은 3 또는 4.5일 동안 혈장에서 인큐베이션한 후에 남아있는 % DAR로서 계산된다.
Figure 112017018870512-pct00112
Figure 112017018870512-pct00113
* WO2012/059882 및 WO2015/015448에 기재된 바와 같이 제조됨.
표 8 - 계산된 % 안정성, LCQ05 글루타민-함유 태그를 갖는 콤보(Combo)_Rd4_0.6nM_C29 항체에 접합된 링커-페이로드를 사용한 추가의 실험적 DAR 값
접합 방법은 항-Trop2 항체에 대해 본원에 기재된 바와 같았다. 콤보_Rd4_0.6nM_C29 항체는 미국 특허 가출원 번호 62/146,843에 기재된 바와 같은 항-BCMA 항체이다. SCID 마우스 혈장에서 인큐베이션한 후에, 화합물을 맙셀렉트 프로테인 A 수지 (지이 헬스케어)를 사용하여 표준 방법에 따라 정제하였다. 모든 DAR 값은 HIC 분석을 사용하여 항체에 부착된 약물의 수를 평가함으로써 결정하였다. 접합체 안정성은 4.5일 동안 SCID 마우스 혈장에서 인큐베이션한 후에 남아있는 % DAR로서 계산된다.
Figure 112017018870512-pct00114
개시된 교시가 다양한 적용, 방법 및 조성물과 관련하여 기재되었더라도, 본원의 교시 및 하기 청구된 발명을 벗어나지 않으면서 다양한 변화 및 변형이 이루어질 수 있는 것으로 인지될 것이다. 상기 예는 개시된 교시를 보다 잘 예시하기 위해 제공되고, 본원에 제시된 교시의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 본 교시가 이들 예시적 실시양태의 면에서 기재되었지만, 이들 예시적 실시양태의 수많은 변경 및 변형이 과도한 실험 없이 가능하다는 것을 통상의 기술자는 용이하게 이해할 것이다. 모든 이러한 변경 및 변형은 본 교시의 범주 내에 있다.
특허, 특허 출원, 논문, 교재 등을 포함한 본원에 인용된 모든 참고문헌 및 그에 인용된 참고문헌은 이들이 이미 포함되어 있지는 않은 정도로, 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 정의된 용어, 용어 용법, 기재된 기술 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 포함된 문헌 및 유사한 자료 중 하나 이상이 본 출원과 상이하거나 모순되는 경우에, 본 출원이 우선한다.
상기 기재 및 실시예는 본 발명의 특정의 구체적 실시양태를 상술하고, 본 발명자들에 의해 고려된 최적 방식을 기재한다. 그러나, 상기를 본문에서 아무리 상세하게 나타내 보일수 있을 지라도, 본 발명이 많은 방식으로 실시될 수 있고, 본 발명이 첨부된 청구범위 및 그의 임의의 등가물에 따라 해석되어야 하는 것으로 인지될 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> Pfizer Inc. Rinat Neuroscience Corp. DUSHIN, Russell George STROP, Pavel DORYWALSKA, Magdalena MOINE, Ludivine <120> STABILITY-MODULATING LINKERS FOR USE WITH ANTIBODY DRUG CONJUGATES <130> PC72108A <150> 62/042,901 <151> 2014-08-28 <160> 37 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 1 Leu Leu Gln Gly Gly 1 5 <210> 2 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 Leu Leu Gln Gly 1 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 3 Leu Ser Leu Ser Gln Gly 1 5 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 4 Gly Gly Gly Leu Leu Gln Gly Gly 1 5 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 5 Gly Leu Leu Gln Gly 1 5 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 6 Gly Ser Pro Leu Ala Gln Ser His Gly Gly 1 5 10 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 7 Gly Leu Leu Gln Gly Gly Gly 1 5 <210> 8 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 8 Gly Leu Leu Gln Gly Gly 1 5 <210> 9 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 9 Gly Leu Leu Gln 1 <210> 10 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 10 Leu Leu Gln Leu Leu Gln Gly Ala 1 5 <210> 11 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 11 Leu Leu Gln Gly Ala 1 5 <210> 12 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 12 Leu Leu Gln Tyr Gln Gly Ala 1 5 <210> 13 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 13 Leu Leu Gln Gly Ser Gly 1 5 <210> 14 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 14 Leu Leu Gln Tyr Gln Gly 1 5 <210> 15 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 15 Leu Leu Gln Leu Leu Gln Gly 1 5 <210> 16 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 16 Ser Leu Leu Gln Gly 1 5 <210> 17 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 17 Leu Leu Gln Leu Gln 1 5 <210> 18 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 18 Leu Leu Gln Leu Leu Gln 1 5 <210> 19 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 19 Leu Leu Gln Gly Arg 1 5 <210> 20 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 20 Leu Leu Gln Gly Pro Pro 1 5 <210> 21 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 21 Leu Leu Gln Gly Pro Ala 1 5 <210> 22 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 22 Gly Gly Leu Leu Gln Gly Pro Pro 1 5 <210> 23 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 23 Gly Gly Leu Leu Gln Gly Ala 1 5 <210> 24 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 24 Leu Leu Gln Gly Ala 1 5 <210> 25 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 25 Leu Leu Gln Gly Pro Gly Lys 1 5 <210> 26 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 26 Leu Leu Gln Gly Pro Gly 1 5 <210> 27 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 27 Leu Leu Gln Gly Pro 1 5 <210> 28 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 28 Leu Leu Gln Pro 1 <210> 29 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 29 Leu Leu Gln Pro Gly Lys 1 5 <210> 30 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 30 Leu Leu Gln Ala Pro Gly Lys 1 5 <210> 31 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 31 Leu Leu Gln Gly Ala Pro Gly 1 5 <210> 32 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 32 Leu Leu Gln Gly Ala Pro 1 5 <210> 33 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 33 Leu Leu Gln Gly Pro Ala 1 5 <210> 34 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 34 Leu Leu Gln Gly Pro Pro 1 5 <210> 35 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 35 Gly Gly Leu Leu Gln Gly Pro Pro 1 5 <210> 36 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 36 Leu Leu Gln Leu Gln Gly 1 5 <210> 37 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Xaa = Leu, Ala, Gly, Ser, Val, Phe, Tyr, His, Arg, Asn, Glu, Asp, Cys, Gln, Ile, Met, Pro, Thr, Lys, or Trp <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa = Leu, Ala, Gly, Ser, Val, Phe, Tyr, His, Arg, Asn, Glu, Asp, Cys, Gln, Ile, Met, Pro, Thr, Lys, or Trp <400> 37 Xaa Xaa Gln Xaa 1

Claims (29)

  1. 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물.
    <화학식 I>
    Figure 112019083745854-pct00115

    여기서
    M은 안정성 조정제이고,
    M은 -M1-M2이며, 여기서 M1은 -NR1-C(O)-, -NR1-S(O)2-이거나 또는 부재하고, M2는
    Figure 112019083745854-pct00157

    으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    P는 1개 이상의 글루타민 잔기를 포함하는 펩티드 서열이고;
    Q는 P에 존재하는 글루타민 잔기이고;
    각각의 E는 독립적으로 -C(R1)2-, -O-C(R1)2-C(R1)2-, 및 -C(R1)2-C(R1)2-O-로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 E가 -O-C(R1)2-C(R1)2-인 경우 r이 적어도 2이고, E가 -C(R1)2-C(R1)2-O-인 경우 s가 적어도 1이고;
    각각의 R1은 독립적으로 H, 및 C1-C6 직쇄형 또는 분지형 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    -Xm-Yn-는 -X-Y-이고, 여기서 X-Y는 Gly, β-Ala, Val-Cit, Phe-Lys, Val-Lys, Phe-Phe-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ala-Cit, Trp-Cit, Phe-Ala, Gly-Phe-Leu-Gly, Ala-Leu-Ala-Leu, Phe-N9-토실-Arg, Phe-N9-니트로-Arg, Val-Ala 및 Ala-Ala-Asn으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    각각의 Z는 PABC(p-아미노벤질-카르바모일)이고;
    p는 0-2이고, q는 0-10이고, r은 0-2이고, s는 0-2이며, 여기서 q+r+s는 2 이상이고;
    D는 세포독성제이다.
  2. 화학식 II의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물.
    <화학식 II>
    Figure 112019083745854-pct00116

    여기서
    M은 안정성 조정제이고,
    M은 -M1-M2이며, 여기서 M1은 -NR1-C(O)-, -NR1-S(O)2-이거나 또는 부재하고, M2는
    Figure 112019083745854-pct00158

    으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    P는 1개 이상의 글루타민 잔기를 포함하는 펩티드 서열이고;
    Q는 P에 존재하는 상기 글루타민 잔기 중 1개이고;
    각각의 E는 독립적으로 -C(R1)2-, -O-C(R1)2-C(R1)2-, 및 -C(R1)2-C(R1)2-O-로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 E가 -O-C(R1)2-C(R1)2-인 경우 r이 적어도 2이고, E가 -C(R1)2-C(R1)2-O-인 경우 s가 적어도 1이고;
    각각의 R1은 독립적으로 H, 및 C1-C6 직쇄형 또는 분지형 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    -Xm-Yn-는 -X-Y-이고, 여기서 X-Y는 Gly, β-Ala, Val-Cit, Phe-Lys, Val-Lys, Phe-Phe-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ala-Cit, Trp-Cit, Phe-Ala, Gly-Phe-Leu-Gly, Ala-Leu-Ala-Leu, Phe-N9-토실-Arg, Phe-N9-니트로-Arg, Val-Ala 및 Ala-Ala-Asn으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    각각의 Z는 PABC(p-아미노벤질-카르바모일)이고;
    p는 0-2이고, q는 0-10이고, r은 0-2이고, s는 0-2이며, 여기서 q+r+s는 2 이상이고;
    D는 세포독성제이다.
  3. 화학식 III의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물.
    <화학식 III>
    Figure 112019083745854-pct00117

    여기서
    M은 안정성 조정제이고,
    M은 -M1-M2이며, 여기서 M1은 -NR1-C(O)-, -NR1-S(O)2-이거나 또는 부재하고, M2는
    Figure 112019083745854-pct00159

    으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    각각의 E는 독립적으로 -C(R1)2-, -O-C(R1)2-C(R1)2-, 및 -C(R1)2-C(R1)2-O-로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 E가 -O-C(R1)2-C(R1)2-인 경우 r이 적어도 2이고, E가 -C(R1)2-C(R1)2-O-인 경우 s가 적어도 1이고;
    각각의 R1은 독립적으로 H, 및 C1-C6 직쇄형 또는 분지형 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    -Xm-Yn-는 -X-Y-이고, 여기서 X-Y는 Gly, β-Ala, Val-Cit, Phe-Lys, Val-Lys, Phe-Phe-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ala-Cit, Trp-Cit, Phe-Ala, Gly-Phe-Leu-Gly, Ala-Leu-Ala-Leu, Phe-N9-토실-Arg, Phe-N9-니트로-Arg, Val-Ala 및 Ala-Ala-Asn으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    각각의 Z는 PABC(p-아미노벤질-카르바모일)이고;
    p는 0-2이고, q는 0-10이고, r은 0-2이고, s는 0-2이며, 여기서 q+r+s는 2 이상이고;
    D는 세포독성제이다.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 세포독성제 D가 안트라시클린, 아우리스타틴, 스플라이세오스타틴, CBI/CPI 이량체, 칼리케아미신, 두오카르마이신, 에네디인, 겔다나마이신, 메이탄신, 퓨로마이신, 탁산, 빈카 알칼로이드, 이리노테칸의 대사물인 SN-38, 튜부리신, 헤미아스텔린, 캄프토테신, 콤브레타스타틴, 돌라스타틴, 인돌리노-벤조디아제핀 이량체, 피롤로벤조디아제핀 이량체, 및 플라디에놀리드로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 화합물.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 세포독성제 D가 돌라스타틴, MMAD (모노메틸 아우리스타틴 D 또는 모노메틸 돌라스타틴 10), MMAF (모노메틸 아우리스타틴 F 또는 N-메틸발린-발린-돌라이소류인-돌라프로인-페닐알라닌), MMAE (모노메틸 아우리스타틴 E 또는 N-메틸발린-발린-돌라이소류인-돌라프로인-노르에페드린),
    하기 구조를 갖는 2-메틸알라닐-N-[(3R,4S,5S)-3-메톡시-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드(PF-06380101):
    Figure 112019083745854-pct00160
    ,
    하기 구조를 갖는 N,2-디메틸알라닐-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-카르복실-2-페닐에틸]아미노}-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필]피롤리딘-1-일}-2-메톡시-1-[(1S)-1-메틸프로필]-4-옥소부틸}-N-메틸-L-발린아미드(PF-06463377):
    Figure 112019083745854-pct00161
    ,
    하기 구조를 갖는 2-메틸-L-프롤릴-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-카르복시-2-페닐에틸]아미노}-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필]피롤리딘-1-일}-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드:
    Figure 112019083745854-pct00162
    , 및
    하기 구조를 갖는 2-메틸-L-프롤릴-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-1-메톡시-1-옥소-3-페닐프로판-2-일]아미노}-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필]피롤리딘-1-일}-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드:
    Figure 112019083745854-pct00163

    으로 이루어진 군으로부터 선택된 아우리스타틴인 화합물.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, P가 Q (Gln), LQG (Leu-Gln-Gly), LLQGG (서열식별번호: 1), LLQG (서열식별번호: 2), LSLSQG (서열식별번호: 3), GGGLLQGG (서열식별번호: 4), GLLQG (서열식별번호: 5), LLQ (Leu-Leu-Gln), GSPLAQSHGG (서열식별번호: 6), GLLQGGG (서열식별번호: 7), GLLQGG (서열식별번호: 8), GLLQ (서열식별번호: 9), LLQLLQGA (서열식별번호: 10), LLQGA (서열식별번호: 11), LLQYQGA (서열식별번호: 12), LLQGSG (서열식별번호: 13), LLQYQG (서열식별번호: 14), LLQLLQG (서열식별번호: 15), SLLQG (서열식별번호: 16), LLQLQ (서열식별번호: 17), LLQLLQ (서열식별번호: 18), LLQGR (서열식별번호: 19), LLQGPP (서열식별번호: 20), LLQGPA (서열식별번호: 21), GGLLQGPP (서열식별번호: 22), GGLLQGA (서열식별번호: 23), LLQGA (서열식별번호: 24), LLQGPGK (서열식별번호: 25), LLQGPG (서열식별번호: 26), LLQGP (서열식별번호: 27), LLQP (서열식별번호: 28), LLQPGK (서열식별번호: 29), LLQAPGK (서열식별번호: 30), LLQGAPG (서열식별번호: 31), LLQGAP (서열식별번호: 32), LLQGPA (서열식별번호: 33), LLQGPP (서열식별번호: 34), GGLLQGPP (서열식별번호: 35), LLQLQG (서열식별번호: 36), 및 XXQX (서열식별번호: 37)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드인 화합물.
  7. 제3항에 있어서, 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물.
    Figure 112019083745854-pct00164

    Figure 112019083745854-pct00165

    Figure 112019083745854-pct00166

    Figure 112019083745854-pct00167

    Figure 112019083745854-pct00168

    Figure 112019083745854-pct00169
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물.
    Figure 112019083745854-pct00170

    Figure 112019083745854-pct00171

    Figure 112019083745854-pct00172

    Figure 112019083745854-pct00173

    Figure 112019083745854-pct00174

    Figure 112019083745854-pct00175

    Figure 112019083745854-pct00176

    Figure 112019083745854-pct00177

    여기서 화합물의 괄호표시된 부분은 펩티드 서열 내의 글루타민 잔기를 나타낸다.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, P가 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 이중특이적 항체, 미니바디, 및 항체 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 화합물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 항체가 트라스투주맙, 트라스투주맙 돌연변이체, 오레고보맙, 에드레콜로맙, 세툭시맙, 비트로넥틴 수용체 (αvβ3)에 대한 인간화 모노클로날 항체, 알렘투주맙, 항-HLA-DR 항체, 131I Lym-1, 항-HLA-Dr10 항체, 항-cd33 항체, 항-cd22 항체, 라베투주맙, 베바시주맙, 이브리투모맙 티욱세탄, 오파투무맙, 파니투무맙, 리툭시맙, 토시투모맙, 이필리무맙, 및 겜투주맙으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 화합물.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서, 각각의 Q가 독립적으로 상기 펩티드 서열 P에 내인성인 글루타민 잔기, 또는 상기 펩티드 서열 P 상의 조작된 태그 서열에 제공된 글루타민 잔기인 화합물.
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서, 1개 이상의 Q가 상기 펩티드 서열 P에 내인성인 글루타민 잔기인 화합물.
  13. 제1항 또는 제2항에 있어서, 1개 이상의 Q가 상기 펩티드 서열 P 상의 조작된 태그 서열에 제공된 글루타민 잔기인 화합물.
  14. 제13항에 있어서, 1개 이상의 태그가 단일 아미노산 글루타민인 화합물.
  15. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염, 및 제약상 허용되는 부형제 또는 담체를 포함하는 암의 치료에 사용하기 위한 제약 조성물.
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