KR102451080B1 - 효소적 방법을 통한 균일한 항체 약물 접합체 - Google Patents

효소적 방법을 통한 균일한 항체 약물 접합체 Download PDF

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Abstract

본 출원은 한 관점으로써, 접합체 모이어티에 접합된 Fc-함유 폴리펩타이드를 함유하는 Fc-함유 폴리펩타이드 접합체를 제공하며, 상기 Fc-함유 폴리펩타이드는 N-글리코실화 부위 옆에 위치한 수용체 글루타민 잔기를 함유하는 N-글리코실화된 Fc 영역을 함유하고, 상기 접합체 모이어티는 수용체 글루타민 잔기를 통해 상기 Fc-함유 폴리펩타이드에 접합된다. 또한, 이러한 Fc-함유 폴리펩타이드 접합체를 야생형 또는 조작된 트란스글루타미나제를 이용하여 제조하는 방법도 제공한다. 또한, 이러한 반응을 수행하기 위해 특이적으로 디자인된, 조작된 트란스글루타미나제도 제공한다.

Description

효소적 방법을 통한 균일한 항체 약물 접합체{HOMOGENEOUS ANTIBODY DRUG CONJUGATES VIA ENZYMATIC METHODS}
관련 출원에 대한 참조 설명
본 출원은 2014년 6월 12일에 출원한 미국 임시출원번호 62/011,534(전문이 참고 인용됨)의 우선권을 주장한다.
항체계 치료제는 암 및 면역학적 질환과 같은 다양한 질병의 표적 치료에 중요한 역할을 하고 있다. 최근, 항체 약물 접합체(ADC)는 약물을 표적 부위로 효과적으로 전달하기 위해 광범위하게 연구되고 있다. 예를 들어, 약물을 항체에 리신 측쇄 아민을 통해 또는 시스테인 설프하이드릴 기를 통해 접합시키기 위해 화학적 변형이 널리 이용되고 있다. 하지만, 이러한 접합 방법은 흔히 항체에 대한 약물의 다른 몰 비, 비특이적인 접합 부위 뿐만 아니라 다른 효율, 안전성 및 약동학을 갖는 접합체의 불균일한 혼합물을 초래했다. 문헌[Tanaka et al., FEBS Letters 579: 2092-2096(2005)] 참조. 또한, 한정된 화학량론으로 특이적인 약물 접합을 이루기 위해 항체의 특정 부위에 반응성 시스테인 잔기가 만들어지기도 했다. 문헌[Junutula et al., Nature Biotechnology, 26: 925-932(2008)] 참조. 하지만, 이러한 시스테인 조작된(engineered) 항체 및 항체-약물 접합체의 발현 및 접합은 길고 복잡한 반응 절차를 필요로 한다. 문헌[Gomez et al., Biotechnology and Bioengineering, 105(4): 748-760(2009)] 참조. 또한, 시스테인-조작된 항체 및 항체-약물 접합체를 제조하는 방법 중에 항체 응집체가 생성될 수도 있다. 또한, 부위 특이적 접합을 위한 화학적 핸들로써, 비천연의 아미노산 잔기가 항체에 혼입되기도 한다[Axupa et al., PNAS, 109: 16101-16106(2012) 참조]. 이 방법을 수행하기 위해, 먼저 발현 숙주에 호박색 억제인자 tRNA 및 아미노아실-tRNA 합성효소의 직교 쌍이 통합되어야 한다. 그 다음, 돌연변이 항체는 비천연 아미노산의 배지 보충에 의해 상기 특정 숙주 내에서 발현될 수 있다. 이 방법은 시간소모적일 뿐만 아니라 항체 발현 수율이 매우 낮다.
최근, 트란스글루타미나제를 사용하여 ADC를 제조하기 위한 효소적 시도들이 연구되었다. 트란스글루타미나제(TGase)는 트란스글루타민화를 통해 아민 공여체 기를 가진 모이어티를 수용체 글루타민 잔기로 전달한다. 인간 이소형(isotype)의 전장(full-length)의 IgG 항체는 중쇄의 295번 위치에 보존적인 글루타민 잔기(Q295)를 함유한다. 이 글루타민 잔기가 N-글리코실화 부위(N297) 옆에 근접하게 위치하기 때문에, 일반적으로 전장의 항체에 있는 Q295는 항체가 N-글리코실화될 때 TGase에 접근할 수 없다고 생각되었다. TGase가 전장의 항체에 작용하도록 하기 위해서는 항체의 Fc 영역이 TGase 매개의 접합 전에 N-글리코실화 부위를 제거하기 위해 탈글리코실화되거나 변이되어야 한다. WO2013/092998 참조. 대안적으로, 글루타민 함유 서열 "태그(tag)"는 항체의 경쇄 또는 중쇄에 삽입되어 수용체 글루타민 부위를 제공했다. WO 2012059882 참조. 따라서, 현재의 모든 부위 특이적 ADC 기술들은 조작된 항체 돌연변이체에 의존적이고, 이 돌연변이체는 잠재적 면역원성 및 생체내 불안정성을 야기할 수 있다.
따라서, 무처리 항체가 직접 사용될 수 있는 효과적인 부위 특이적 항체 접합 도구가 절실히 필요로 된다.
본원에 인용된 모든 공보, 특허 및 특허출원은 그 전문이 본원에 참고 인용된다.
본 발명은 하나의 관점으로 접합체 모이어티에 부위 특이적으로 접합된 Fc-함유 폴리펩타이드를 함유하는 Fc-함유 폴리펩타이드 접합체로써, 상기 Fc-함유 폴리펩타이드는 N-글리코실화된 Fc 영역을 함유하고, 이 N-글리코실화된 Fc 영역은 N-글리코실화 부위 옆에 위치한 수용체 글루타민 잔기를 함유하고, 접합체 모이어티는 수용체 글루타민 잔기를 통해 Fc-함유 폴리펩타이드에 접합되는, Fc-함유 폴리펩타이드 접합체를 제공한다.
몇몇 양태들에서, 수용체 글루타민 잔기는 글루타민 잔기에 대해 +2 위치에서 N-글리코실화 부위 옆에 위치한다. 몇몇 양태들에서, N-글리코실화된 Fc 영역은 면역글로불린 중쇄의 아미노산 290 내지 300을 함유하고, 여기서 숫자는 Kabat 지수에 따른 것이다. 몇몇 양태들에서, N-글리코실화된 Fc 영역은 천연 발생의 면역글로불린 중쇄의 Fc 영역이다.
전술한 양태들 중 어느 한 양태에 따른 몇몇 양태들에서, 면역글로불린은 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 이루어진 군으로부터 선택된다. 몇몇 양태들에서, Fc-함유 폴리펩타이드는 면역글로불린 중쇄이다. 몇몇 양태들에서, Fc-함유 폴리펩타이드는 전장의 항체이다. 몇몇 양태들에서, 항체는 인간 항체 또는 인간화된 항체이다. 몇몇 양태들에서, 항체의 두 중쇄는 접합체 모이어티에 접합된다. 몇몇 양태들에서, 수용체 글루타민 잔기는 위치 295번에 있고, N-글리코실화 부위는 위치 297번에 있으며, 숫자는 Kabat 지수에 따른 것이다.
상기 양태들 중 임의의 양태에 따른 몇몇 양태들에서, 접합체 모이어티는 Fc 함유 폴리펩타이드의 약동학적 성질을 향상시키는 모이어티, 치료 모이어티 및 진단 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택되는 활성 모이어티를 함유한다. 몇몇 양태들에서, 활성 모이어티는 독소이다.
상기 양태들 중 임의의 양태에 따른 몇몇 양태들에서, Fc-함유 폴리펩타이드 및 접합체 모이어티는 절단성 링커 또는 비-절단성 링커와 같은 링커를 통해 접합된다.
몇몇 양태들에 따르면, 전술한 Fc-함유 폴리펩타이드 접합체 중 어느 하나를 함유하는 조성물로써, 이 조성물에 존재하는 Fc-함유 폴리펩타이드 접합체의 적어도 약 50%(예컨대, 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 어느 하나)는 Fc 영역이 글리코실화되어 있는 조성물이 제공된다. 몇몇 양태들에 따르면, Fc-함유 폴리펩타이드 접합체의 적어도 약 50%(예컨대, 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 어느 하나)는 Fc-함유 폴리펩타이드 대 접합체 모이어티의 몰 비가 1:1 또는 1:2이다.
한 관점에 따르면, 항체 상의 내인성 수용체 글루타민 잔기를 통해 항체가 접합 모이어티에 접합되어 있는 항체 약물 접합체로써, Fc 영역이 글리코실화되어 있는 항체 약물 접합체가 제공된다. 몇몇 양태들에서, 항체 약물 접합체는 Fc 영역이 N-글리코실화되어 있다. 몇몇 양태들에서, 항체는 인간 항체이다. 몇몇 양태들에서, 항체는 인간화된 항체이다.
전술한 항체 약물 접합체 중 어느 하나에 따른 몇몇 양태들에서, 항체의 두 중쇄는 접합체 모이어티에 접합되어 있다.
전술한 항체 약물 접합체 중 어느 하나에 따른 몇몇 양태들에서, 접합체 모이어티는 항체의 약동학적 성질을 향상시키는 모이어티, 치료 모이어티 및 진단 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체 모이어티를 함유한다. 몇몇 양태들에서, 활성 모이어티는 독소이다.
전술한 항체 약물 접합체 중 어느 하나에 따른 몇몇 양태들에서, 항체 및 접합체 모이어티는 링커를 통해 접합된다. 몇몇 양태들에서, 링커는 절단성 링커이다. 몇몇 양태들에서, 링커는 비-절단성 링커이다.
몇몇 양태들에 따르면, 전술한 항체 약물 접합체 중 어느 하나를 함유하는 조성물로써, 이 조성물에 존재하는 항체 약물 접합체 중 적어도 약 50%(예컨대, 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 적어도 하나)가 Fc 영역이 글리코실화되어 있는 조성물이 제공된다. 몇몇 양태들에 따르면, 조성물에 존재하는 항체 약물 접합체 중 적어도 80%는 항체 대 접합체 모이어티 몰 비가 1:1 내지 1:2이다.
다른 관점에 따르면, 접합체 모이어티에 특이적으로 접합된 Fc-함유 폴리펩타이드를 함유하는 Fc-함유 폴리펩타이드 접합체를 제조하는 방법으로써, Fc-함유 폴리펩타이드를 트란스글루타미나제의 존재하에 Fc-함유 폴리펩타이드 접합체를 생성하기에 충분한 조건하에서 접합체 모이어티와 반응시키는 단계를 포함하고, 상기 Fc-함유 폴리펩타이드는 N-글리코실화된 Fc 영역을 함유하고, N-글리코실화된 Fc 영역은 N-글리코실화 부위 옆에 위치한 수용체 글루타민 잔기를 함유하며, 접합체 모이어티는 수용체 글루타민 잔기를 통해 Fc-함유 폴리펩타이드에 접합되는, 방법이 제공된다.
몇몇 양태들에 따르면, 활성 모이어티 및 소분자 핸들(handle)을 함유하는 접합체 모이어티에 특이적으로 접합된 Fc-함유 폴리펩타이드를 함유하는 Fc-함유 폴리펩타이드 접합체를 제조하는 방법으로써, a) Fc-함유 폴리펩타이드를 트란스글루타미나제의 존재하에 소분자 핸들에 특이적으로 접합된 Fc-함유 폴리펩타이드를 함유하는 중간 접합체를 생성하기에 충분한 조건하에서 소분자 핸들과 반응시키는 단계를 포함하고; b) 이 중간 접합체를 활성 모이어티와 커플링시켜 Fc-함유 폴리펩타이드 접합체를 수득하는 단계를 포함하고, 상기 Fc-함유 폴리펩타이드는 N-글리코실화된 Fc 영역을 함유하고, N-글리코실화된 Fc 영역은 N-글리코실화 부위 옆에 위치한 수용체 글루타민 잔기를 함유하며, 접합체 모이어티는 수용체 글루타민 잔기를 통해 Fc-함유 폴리펩타이드에 접합되는, 방법이 제공된다. 몇몇 양태들에 따르면, 트란스글루타미나제는 서열번호 16의 아미노산 서열을 가진 야생형 트란스글루타미나제이다. 몇몇 양태들에 따르면, 트란스글루타미나제는 조작된 트란스글루타미나제, 예컨대 서열번호 16과 적어도 약 80%(예컨대, 적어도 약 85%, 90%, 95% 또는 99%) 동일성이 있는 아미노산 서열을 함유하는 조작된 트란스글루타미나제이다. 몇몇 양태들에 따르면, 트란스글루타미나제와 Fc-함유 폴리펩타이드의 몰 비는 약 10;1 내지 약 1:100이다. 몇몇 양태들에 따르면, 트란스글루타미나제는 고체 지지체 위에 고정된다. 다른 양태들에 따르면, Fc-함유 폴리펩타이드는 고체 지지체 위에 고정된다.
전술한 방법들 중 어느 한 방법에 따른 몇몇 양태들에 따르면, 수용체 글루타민 잔기는 글루타민 잔기에 대해 +2 위치에서 N-글리코실화 부위 옆에 위치한다. 몇몇 양태들에 따르면, N-글리코실화된 Fc 영역은 면역글로불린 중쇄의 아미노산 290 내지 300을 함유하고, 이 숫자는 Kabat 지수에 따른 것이다. 몇몇 양태들에 따르면, N-글리코실화된 Fc 영역은 야생형 면역글로불린 중쇄의 Fc 영역이다. 몇몇 양태들에 따르면, 면역글로불린은 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 이루어진 군으로부터 선택된다. 몇몇 양태들에 따르면, Fc-함유 폴리펩타이드는 면역글로불린 중쇄, 예컨대 전장 항체, 예컨대 인간 항체 또는 인간화된 항체이다. 몇몇 양태들에 따르면, 항체의 두 중쇄는 접합체 모이어티에 접합된다. 몇몇 양태들에 따르면, 수용체 글루타민 잔기는 위치 295에 있고, N-글리코실화된 부위는 위치 297이며, 숫자는 Kabat 번호매김에 따른 것이다.
전술한 방법들 중 어느 한 방법에 따른 몇몇 양태들에 따르면, 접합체 모이어티는 Fc-함유 폴리펩타이드의 약동학적 성질을 향상시키는 모이어티, 치료 모이어티, 및 진단 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택되는 활성 모이어티를 함유한다. 몇몇 양태들에서, 활성 모이어티는 독소이다.
다른 관점에 따르면, 항체 조성물을 트란스글루타미나제의 존재하에 항체 약물 접합체를 생성하기에 충분한 조건하에서 접합체 모이어티와 접촉시키는 단계를 포함하여 항체 약물 접합체를 제조하는 방법으로써, 상기 조성물에 항체의 적어도 약 50%(예컨대, 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 어느 하나)가 Fc 영역이 글리코실화되어 있고, 접합체 모이어티는 항체 상의 내인성 수용체 글루타민 잔기에 접합되는, 방법이 제공된다.
다른 관점에 따르면, 활성 모이어티 및 소분자 핸들을 함유하는 접합체 모이어티에 특이적으로 접합된 항체를 함유하는 항체 약물 접합체를 제조하는 방법으로써, a) 항체 조성물을 소분자 핸들과 트란스글루타미나제의 존재하에 소분자 핸들에 특이적으로 접하된 항체를 함유하는 중간 접합체를 생성하기에 충분한 조건하에서 접촉시키는 단계, 및 b) 중간 접합체를 활성 모이어티와 접촉시켜 항체 약물 접합체를 수득하는 단계를 포함하고, 조성물에 존재하는 항체의 적어도 약 50%(예컨대, 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 어느 하나)가 Fc 영역에서 글리코실화되어 있고, 접합체 모이어티는 항체의 내인성 수용체 글루타민 잔기에 접합되는, 방법이 제공된다.
전술한 항체 약물 접합체를 제조하는 방법들 중 어느 한 방법에 따른 몇몇 양태들에서, 트란스글루타미나제는 야생형 트란스글루타미나제이다. 몇몇 양태들에서, 야생형 트란스글루타미나제는 서열번호 16의 아미노산 서열을 보유한다.
전술한 항체 약물 접합체를 제조하는 방법들 중 어느 한 방법에 따른 몇몇 양태들에서, 트란스글루타미나제는 조작된 트란스글루타미나제이다. 몇몇 양태들에서, 조작된 트란스글루타미나제는 서열번호 16과 적어도 약 80%(예컨대, 적어도 약 85%, 90%, 95% 또는 99%)의 동일성이 있는 아미노산 서열을 함유한다.
전술한 항체 약물 접합체를 제조하는 방법들 중 어느 한 방법에 따른 몇몇 양태들에 따르면, 트란스글루타미나제는 순도가 적어도 약 90%(예컨대, 적어도 약 95%, 98% 또는 99% 중 어느 하나)이다.
전술한 항체 약물 접합체를 제조하는 방법들 중 어느 한 방법에 따른 몇몇 양태들에 따르면, 트란스글루타미나제와 항체 조성물의 몰 비는 약 10:1 내지 약 1:10이다.
전술한 항체 약물 접합체를 제조하는 방법들 중 어느 한 방법에 따른 몇몇 양태들에 따르면, 트란스글루타미나제는 고체 지지체 위에 고정된다.
전술한 항체 약물 접합체를 제조하는 방법들 중 어느 한 방법에 따른 몇몇 양태들에 따르면, 항체는 고체 지지체 위에 고정된다.
전술한 항체 약물 접합체를 제조하는 방법들 중 어느 한 방법에 따른 몇몇 양태들에 따르면, 항체는 인간 또는 인간화된 항체이다.
전술한 항체 약물 접합체를 제조하는 방법들 중 어느 한 방법에 따른 몇몇 양태들에 따르면, 접합체 모이어티는 항체 조성물의 약동학적 성질을 향상시키는 모이어티, 치료 모이어티 및 진단 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택되는 활성 모이어티를 함유한다. 몇몇 양태들에 따르면, 활성 모이어티는 독소이다.
다른 관점으로써, 조작된 트란스글루타미나제가 제공된다. 몇몇 양태들에 따르면, Fc-함유 폴리펩타이드(예, 항체)를 접합체 모이어티에 접합시킬 수 있는 조작된 트란스글루타미나제로서, Fc-함유 폴리펩타이드(예, 항체)가 N-글리코실화된 Fc 영역을 함유하고, N-글리코실화된 Fc 영역이 N-글리코실화 부위 인접에 수용체 글루타민 잔기를 함유하고, 반응 시, 접합체 모이어티가 수용체 글루타민 잔기를 통해 Fc-함유 폴리펩타이드(예, 항체)에 접합하고, 접합은 동일한 반응 조건하에서 야생형 트란스글루타미나제보다 적어도 약 10%(예컨대, 적어도 약 20%. 30%, 40%, 50% 또는 그 이상 중 어느 하나) 더 활성인, 조작된 트란스글루타미나제가 제공된다. 몇몇 양태들에 따르면, 아미노산 서열이 서열번호 16과 적어도 약 80%(예컨대, 적어도 약 85%, 90%, 95% 또는 99%) 동일성이 있고, 트란스글루타미나제가 D1-E4; P244-P247; 및 N282-L285로 이루어진 군으로부터 선택되는 결실을 함유하는, 조작된 트란스글루타미나제가 제공된다.
또한, 본원에 기술된 조작된 트란스글루타미나제를 사용하여 Fc-함유 폴리펩타이드 접합체(예, 항체 약물 접합체)를 제조하는 방법이 제공된다.
몇몇 양태들에 따르면, 접합체 모이어티에 특이적으로 접합된 항체를 함유하는 항체 약물 접합체를 제조하는 방법으로써, 항체 조성물을 전술한 조작된 트란스글루타미나제 중 어느 하나의 트란스글루타미나제의 존재하에 항체 약물 접합체를 생성하기에 충분한 조건하에 접합체 모이어티와 접촉시키는 단계를 포함하고, 접합체 모이어티가 항체 상의 내인성 수용체 글루타민 잔기에 접합되는, 방법이 제공된다.
몇몇 양태들에 따르면, 활성 모이어티 및 소분자 핸들을 함유하는 접합체 모이어티에 특이적으로 접합된 항체를 함유하는 항체 약물 접합체를 제조하는 방법으로써, a) 항체 조성물을 전술한 조작된 트란스글루타미나제 중 어느 하나의 존재하에, 소분자 핸들에 특이적으로 접합된 항체를 함유하는 중간 접합체를 생성하기에 충분한 조건하에서 소분자 핸들과 접촉시키는 단계, 및 b) 중간 접합체를 활성 모이어티와 접촉시켜 항체 약물 접합체를 수득하는 단계를 포함하고, 상기 접합체 모이어티는 항체 상의 내인성 수용체 글루타민 잔기에 접합되는, 방법이 제공된다.
전술한 다양한 양태들의 성질들 중 하나, 몇몇 또는 전부는 조합되어 본 발명의 다른 양태들을 형성할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명의 이러한 관점 및 여타 관점들은 당업자에게 명백해질 것이다.
도 1은 인간, 마우스 및 쥐 IgG의 다양한 종류의 CH2 도메인 서열을 정렬한 것이다. TGase-매개의 반응을 위한 내인성 글루타민(Q295) 및 N-글리코실화 부위(N297)는 박스 표시된 부분이다.
도 2는 Strep Ladakanum(TG_SL, 서열번호 16) 및 Strep Mobaraensis(TG_SM, 서열번호 18) 유래의 TGase의 아미노산 서열을 정렬한 것이다.
도 3은 Strep Ladakanum 유래의 TGase를 기반으로 한 결실 돌연변이체의 서열을 제공한 것이다. 재조합 야생형 TG_SL의 서열이 제시된다(서열번호 17).
도 4는 1단계 항체-약물 접합 방법을 나타내는 모식도이다.
도 5는 2단계 항체-약물 접합 방법을 나타내는 모식도이다.
도 6은 MDC와 접합된 IgG1, 2 및 4의 HPLC 크로마토그램을 제공한다. 도 6a는 MDC와 IgG1의 중쇄만의 접합을 나타낸 것이다. 도 6b는 IgG1과 MDC의 1:1 및 1:2의 몰비의 접합을 나타낸 것이다. 도 6c는 MDC와 IgG2(왼쪽) 및 IgG4(오른쪽)의 부위 특이적 접합을 나타낸 것이다.
도 7은 IgG1-MDC 접합체의 SDS PAGE 분석을 제공한다.
도 8은 본원에서 MAY-PEG4라 지칭하고, 분자량이 896.42 Da인, 1차 아민 기를 가진 확장된 비-절단성 선형 PEG 링커를 함유하는 메이탄신(maytansine) 유도체를 제공한다.
도 9는 본원에서 MAY-PVCL이라 지칭되고, 분자량이 1224.58 Da인, 말단 리신과 자가-희생 기를 가진 절단가능한 링커를 함유하는 메이탄신 유도체를 제공한다.
도 10은 IgG1-MAY-PEG4의 DAR0(즉, 미접합 IgG1, 상단 패널), DAR 1(중간 패널) 및 DAR 2(바닥 패널)에 대한 MALDI-TOF 스펙트럼을 제공한다.
도 11은 미접합 IgG1(왼쪽 패널) 및 MAY-PVCL에 접합된 IgG1(오른쪽 패널)의 MALDI-TOF 스펙트럼을 제공한다.
도 12는 본원에서 PEGx-MMAE로 지칭되는 다양한 수의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 단위를 가진 비-절단성 링커를 함유하는 모노메틸 아우리스타틴 E(MMAE) 유도체(여기서, x는 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 20 또는 24이다); 및 본원에서 PEG3c-MMAE로 지칭되는 절단성 링커를 함유하는 MMAE 유도체(바닥 패널)를 제공한다.
도 13은 BT474 이종이식 마우스에서 Tgase에 의해 제조된 트라스투주마브-PEGx-MMAE 접합체의 생체내 효능을 제공한다.
도 14는 NCI N87 이종이식 마우스에서 Tgase에 의해 제조된 트라스투주마브-PEG12-MMAE 접합체의 생체내 안정성을 제공한다.
도 15는 NCI N87 이종이식 마우스에서 트라스투주마브-PEG3c-MMAE 접합체(DAR2, 본원에서 TP3cE라 지칭됨) 및 TDM-1(Genentech) 접합체의 생체내 효능을 비교한 것이다.
도 16은 NCI N87 이종이식 마우스에서 트라스투주마드-PEG3c-MMAE 접합체(DAR2, 본원에서 TP3cE라 지칭됨) 및 TDM-1(Genentech) 접합체의 생체내 안정성을 비교한 것이다.
도 17은 SK_Ov3 이종이식 마우스에서 트라스투주마브-PEG3c-MMAE 접합체(DAR2, 본원에서 TP3cE라 지칭됨) 및 TDM-1(Genentech) 접합체의 생체내 효능을 비교한 것이다. 플롯 중의 화살표는 항체 약물 접합체의 용량을 투여한 시점을 나타낸다.
도 18은 하나의 아민 기와 2개의 아지드 기를 각각 보유하는 3-암(arm) PEG 링커 그룹(상단 패널; 1 내지 5k Da), 및 DAR4 ADC 제조에 사용된 알킨-PEG4c-MMAE(바닥 패널)를 제공한다.
본 출원은 먼저 무손상 미변형된(예, 글리코실화 구성이 변경되지 않은채 남아 있다) 항체에 부위 특이적 및 화학량론적 방식으로 접합체 모이어티(예, 약물)를 부착시키는 방법을 제공한다. 이는 야생형 TGase를 특이적 반응 조건하에 사용하여 달성하고(또는) Fc 영역의 내인성 글루타민 잔기에서 부위 특이적 접합을 수행하도록 특별히 디자인된 조작된 TGase를 통해 달성한다. 본 출원의 방법은 우수한 PK 프로필, 광범위한 치료 지수 및 최적의 효능을 제공할 수 있는 균일한 부위 특이적, 화학량론적 항체 약물 접합체를 생산하도록 한다. 이 방법은 항체에 돌연변이 및/또는 탈글리코실화를 도입함이 없이 무손상 항체에 약물이 접합할 수 있게 하여, 그러한 추가 조작 단계에 의해 도입되는 면역원성을 최소화한다. 무손상 항체 상의 글리칸은 존재하는 경우, 항체를 분해로부터 보호하여 더욱 안정한 항체-약물 접합체를 산출한다. 트란스글루타민화 반응 전에 항체의 어떠한 조작도 필요하지 않기 때문에, 본원에 기술된 TGase계 항체 접합 방법은 종래 보고된 것보다 훨씬 더 효과적이다.
따라서, 본 출원은 하나의 관점으로써, 접합체 모이어티에 접합된 Fc-함유 폴리펩타이드(예, 항체)를 함유하는 Fc-함유 폴리펩타이드 접합체(예, 항체 약물 접합체)를 제공하고, 이 Fc-함유 폴리펩타이드(예, 항체)는 N-글리코실화 부위 옆에 위치한 수용체 글루타민 잔기를 함유하는 N-글리코실화된 Fc 영역을 함유하고, 접합체 모이어티는 수용체 글루타민 잔기를 통해 Fc-함유 폴리펩타이드(예, 항체)에 접합된다.
다른 관점으로써, Fc-함유 폴리펩타이드 접합체(예, 항체 약물 접합체)를 야생형 또는 조작된 트란스글루타미나제를 사용하여 제조하는 방법이 제공된다.
또한, 상기 반응을 수행하기 위해 특별히 디자인된 조작된 트란스글루타미나제도 제공한다.
정의
본원에서 "TGase"와 호환사용되는 "트란스글루타미나제"는 트란스글루타민화 반응을 수행할 수 있는 효소를 의미한다. 본원에 사용된 "트란스글루타민화"란 용어는 단백질/펩타이드 유래의 수용체 글루타민 잔기의 γ-글루타미닐이 아민 기, 예컨대 리신의 ε-아미노 기 또는 1차 아민으로 전달되는 반응을 의미한다.
폴리펩타이드 또는 단백질의 아미노산 잔기를 언급할 때 "수용체 글루타민 잔기"란 용어는 적합한 조건하에서 TGase에 의해 인식되고 TGase에 의해 글루타민과 공여체 아민 기(예, 리신 또는 구조적으로 관련된 1차 아민, 예컨대 아미노 펜틸 기) 사이의 반응을 통해 공여체 아민 기를 함유하는 접합체 모이어티에 가교결합할 수 있는 글루타민 잔기를 의미한다.
본원에 사용된 "항체 상의 내인성 수용체 글루타민 잔기"는 천연 발생의 항체 Fc 영역에 있는 수용체 글루타민 잔기를 의미한다. 이러한 내인성 수용체 글루타민 잔기는 일반적으로 카벳 번호매김 시, Q275이고 Asn297위치의 N-글리코실화 부위 옆에 위치한다.
본원에 사용된 "Fc-함유 폴리펩타이드"는 면역글로불린 중쇄의 Fc 영역을 함유하는 폴리펩타이드(즉, 항체 또는 Fc 융합 단백질)를 의미한다. 본원에 사용된 "폴리펩타이드"란 용어는 단일 폴리펩타이드 사슬 및 멀티유닛 폴리펩타이드를 모두 포함한다. 예를 들어, Fc-함유 폴리펩타이드는 전장 항체(예, 무손상 항체)일 수 있고, 또는 전장 항체의 단일 사슬일 수 있다.
본원에 사용된 "Fc 영역"은 제1 불변 영역 면역글로불린 도메인을 제외한 항체 중쇄의 불변 영역을 함유하는 폴리펩타이드를 의미한다. IgG에서 Fc 영역은 면역글로불린 도메인 CH2 및 CH3, 및 CH1과 CH2 사이의 힌지(hinge)를 함유할 수 있다.
본원에 사용된 "전장 항체"는 가변 영역과 불변 영역을 포함하는 항체의 천연 생물학적 형태를 구성하는 분자를 의미한다. 예를 들어, 인간 및 마우스를 비롯한 대부분의 포유동물에서 IgG 이소형의 전장 항체는 4량체(tetramer)이고, 2개의 면역글로불린 사슬의 2개의 동일한 쌍으로 이루어지고, 각 쌍은 하나의 경쇄와 하나의 중쇄를 보유하고, 각 경쇄는 면역글로불린 도메인 VL 및 CL을 함유하고 각 중쇄는 면역글로불린 도메인 VH, CH1, CH2 및 CH3을 함유한다. 낙타 및 라마와 같은 몇몇 포유동물에서 IgG 항체는 2개의 중쇄만으로 이루어질 수 있고, 각 중쇄는 Fc 영역에 부착된 가변 도메인을 함유한다.
본원에 사용된 "아미노산 변형"이란, 폴리펩타이드 서열에 존재하는 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실을 의미한다. 본원에서 "아미노산 치환" 또는 "치환"은 단백질 서열 중 주어진 위치에 있는 아미노산이 다른 아미노산으로 교체된 것을 의미한다. 폴리펩타이드의 "변형체"는 참조 폴리펩타이드, 일반적으로 천연 또는 "모(parent)" 폴리펩타이드와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 가진 폴리펩타이드를 의미한다. 폴리펩타이드 변형체는 천연 아미노산 서열 내의 특정 위치들에 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 보유할 수 있다.
"보존적" 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 이화학적 성질이 유사한 측쇄를 가진 아미노산 잔기로 교체된 것이다. 유사한 측쇄를 가진 아미노산 잔기의 패밀리들은 당업계에 공지되어 있고, 염기성 측쇄(예, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전된 극성 측쇄(예, 글리신, 아스파라긴, 수용체 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄(예, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지형 측쇄(예, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 가진 아미노산을 포함한다.
"보호기"란 용어는 일시적으로 보호하거나 차단하는 기, 즉 제1 분자의 제2 분자로의 변형동안 작용기, 예컨대 아미노 기, 하이드록시 기 또는 카르복시 기가 반응하지 않도록 하기 위한 기를 의미한다.
"약동학적 성질을 향상시키는 모이어티"란 어구는 더 우수한 치료적 또는 진단적 효과가 수득될 수 있도록 모이어티가 부착되는 분자의 약동학적 성질을 변화시키는 모이어티를 의미한다. 이 모이어티는 예컨대 수용성을 증가시키거나, 순환 시간을 증가시키거나, 또는 면역원성을 감소시킬 수 있다.
"링커"란 어구는 화합물의 하나의 구조적 요소를 동일한 화합물의 하나 이상의 다른 구조적 요소에 연결시키는 화합물의 구조적 요소를 의미한다.
본원에 사용된 "치료하는" 또는 "치료"는 임상 결과를 비롯하여 유익한 또는 바람직한 결과를 수득하기 위한 시도이다. 본 발명의 목적을 위한 유익한 또는 바람직한 결과는 비제한적으로 다음 중 하나 이상을 포함한다: 질환으로부터 초래되는 하나 이상의 증상의 경감, 질환 정도의 감소, 질환의 안정화(질환 악화의 방지 또는 지연), 질환 재발의 방지 또는 지연, 질환 진행의 지연 또는 서행, 질환 상태의 완화, 질환의 회복(부분 또는 완전) 제공, 질환의 치료에 필요한 하나 이상의 다른 투약 용량의 감소, 질환 진행의 지연, 및/또는 삶의 질의 증가.
"개체"란 용어는 포유동물을 의미하고, 비제한적으로 인간, 소, 말, 고양이, 개, 설치류 또는 영장류를 포함한다. 몇몇 양태에 따르면, 개체는 인간이다.
본원에 기술된 본 발명의 관점 및 양태는 관점 및 양태로 "이루어지는" 및 "본질적으로 이루어지는" 관점 및 양태를 포함하는 것을 이해한다.
본원에서 값 또는 파라미터에 "약"이란 언급은 그 값 또는 파라미터 자체에 관한 변형을 포함한다(나타낸다). 예를 들어, "약 X"라고 언급한 설명은 "X"의 설명을 포함한다. 본원에 사용된 "약 X-Y"란 용어는 "약 X 내지 약 Y"와 같은 의미이다.
본원에 사용되고 후속 청구범위에서, 단수적 표현은 다른 분명한 표시가 없는 한 복수의 의미를 포함한다.
Fc -함유 폴리펩타이드 접합체
본 출원은 하나의 관점에서 접합체 모이어티에 부위 특이적으로 접합된 Fc-함유 폴리펩타이드(예, 항체)를 함유하는 Fc-함유 폴리펩타이드 접합체(예, 항체 약물 접합체)를 제공한다. Fc-함유 폴리펩타이드(예, 항체)는 N-글리코실화된 Fc 영역을 함유한다. N-글루코실화된 Fc 영역은 N-글리코실화 부위 옆에 위치한 수용체 글루타민 잔기를 함유하고, 접합체 모이어티는 수용체 글루타민 잔기를 통해 Fc-함유 폴리펩타이드(예, 항체)에 접합되어 있다.
면역글로불린의 Fc 영역은 몇몇 양태에 따르면 힌지 영역의 일부 또는 전부를 함유한다. 몇몇 양태에 따르면, Fc-함유 폴리펩타이드는 천연 발생의 면역글로불린의 Fc 영역을 함유한다. 몇몇 양태에 따르면, Fc-함유 폴리펩타이드는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 아형의 Fc 영역, 또는 IgA, IgE, IgD 또는 IgM 유래의 Fc 영역을 함유한다. 몇몇 양태에서, Fc 영역은 인간 IgG에서 유래되고, Fc 영역은 카벳 번호매김 시스템에 따르면 위치 Glu216 또는 Ala231의 아미노산 잔기부터 이의 카르복시 말단까지이다.
몇몇 양태들에서, Fc 함유 폴리펩타이드는 하나 이상의 기능성 폴리펩타이드가 Fc 영역에 융합되어 있는 Fc-함유 융합 폴리펩타이드이다. 이러한 기능성 폴리펩타이드로는 비제한적으로 수용체의 표적-결합 영역, 접착 분자, 리간드, 효소, 사이토킨(cytokine) 및 케모킨(chemokine)을 포함한다.
본원에 기술된 Fc 영역은 N-글리코실화될 수 있다. 예컨대, 몇몇 양태들에서, N-글리코실화 부위에 부착된 폴리사카라이드 사슬은 적어도 약 1, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100개의 단위 중 임의의 단위이다.
N-글리코실화 부위는 접합체 모이어티가 부착되는 수용체 글루타민 잔기 옆에 위치한다. 본 발명자는 처음으로 본원에 기술된 방법을 통해 Fc 영역의 N-글리코실화 부위 옆에 위치한 수용체 글루타민 잔기에 접합체 모이어티를 부착시키는 것이 가능하다는 것을 입증했다. 몇몇 양태에서, N-글리코실화 부위 및 수용체 글루타민 잔기는 5개 또는 그 이하의 아미노산 잔기에 의해 이격되어 있다. 몇몇 양태에서, N-글리코실화 부위 및 수용체 글루타민은 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개의 아미노산에 의해 이격되어 있다. 몇몇 양태에서, N-글리코실화 부위 및 수용체 글루타민은 바로 옆에 위치한다. 몇몇 양태에서, 수용체 글루타민 잔기는 글루타민 잔기에 대해 +2 위치에서 N-글리코실화 부위 옆에 위치한다. 몇몇 양태에서, 수용체 글루타민 잔기는 글루타민 잔기에 대해 +1, +2, +3, +4 또는 +5 위치에서 N-글리코실화 부위 옆에 위치한다. 몇몇 양태에서, 수용체 글루타민 잔기는 글루타민 잔기에 대해 -1, -2, -3, -4 또는 -5 위치에서 N-글리코실화 부위 옆에 위치한다.
따라서, 몇몇 양태들에 따르면, 접합체 모이어티에 부위-특이적으로 접합된 Fc-함유 폴리펩타이드를 함유하고, 이 Fc-함유 폴리펩타이드가 N-글리코실화된 Fc 영역을 함유하고, 이 N-글리코실화된 Fc 영역이 N-글리코실화 부위 옆에 위치한 수용체 글루타민 잔기를 함유하고, 접합체 모이어티가 수용체 글루타민 잔기를 통해 Fc-함유 폴리펩타이드에 접합되는, Fc-함유 폴리펩타이드 접합체가 제공된다.
몇몇 양태들에 따르면, 접합체 모이어티에 부위-특이적으로 접합된 Fc-함유 폴리펩타이드를 함유하고, 이 Fc-함유 폴리펩타이드가 N-글리코실화된 Fc 영역을 함유하고, 이 N-글리코실화된 Fc 영역이 N-글리코실화 부위로부터 5개 이하의 아미노산(예컨대, 4개, 3개, 2개 또는 1개의 아미노산)에 의해 이격된 수용체 글루타민 잔기를 함유하고, 접합체 모이어티가 수용체 글루타민 잔기를 통해 Fc-함유 폴리펩타이드에 접합되는, Fc-함유 폴리펩타이드 접합체가 제공된다.
몇몇 양태들에 따르면, 접합체 모이어티에 부위-특이적으로 접합된 Fc-함유 폴리펩타이드를 함유하고, 이 Fc-함유 폴리펩타이드가 N-글리코실화된 Fc 영역을 함유하고, 이 수용체 글루타민 잔기가 글루타민 잔기에 대해 +2 위치에서 N-글리코실화 부위 옆에 위치하고, 접합체 모이어티가 수용체 글루타민 잔기를 통해 Fc-함유 폴리펩타이드에 접합되는, Fc-함유 폴리펩타이드 접합체가 제공된다.
몇몇 양태들에 따르면, 접합체 모이어티에 부위-특이적으로 접합된 Fc-함유 폴리펩타이드를 함유하고, 이 Fc-함유 폴리펩타이드가 N-글리코실화된 Fc 영역을 함유하고, 이 N-글리코실화된 Fc 영역이 서열번호 1의 아미노산 서열(KPREEQX1NSTX2R, 여기서, X1은 Y 또는 F이고 X2는 Y 또는 F이다)을 함유하고, 접합체 모이어티가 수용체 글루타민 잔기를 통해 서열번호 1의 위치 6에서 Fc-함유 폴리펩타이드에 접합되며, N-글리코실화가 서열번호 1의 위치 8에서 이루어지는, Fc-함유 폴리펩타이드 접합체가 제공된다. 몇몇 양태들에 따르면, 접합체 모이어티에 특이적으로 접합된 Fc-함유 폴리펩타이드를 함유하고, 이 Fc-함유 폴리펩타이드가 N-글리코실화된 Fc 영역을 함유하고, 이 N-글리코실화된 Fc 영역이 서열번호 2의 아미노산 서열(KPREEQYNSTYR)을 함유하고, 접합체 모이어티가 수용체 글루타민 잔기를 통해 서열번호 2의 위치 6에서 Fc-함유 폴리펩타이드에 접합되며, N-글리코실화가 서열번호 2의 위치 8에서 이루어지는, Fc-함유 폴리펩타이드 접합체가 제공된다.
몇몇 양태들에 따르면, 접합체 모이어티에 부위-특이적으로 접합된 Fc-함유 폴리펩타이드를 함유하고, 이 Fc-함유 폴리펩타이드가 N-글리코실화된 Fc 영역을 함유하고, 이 N-글리코실화된 Fc 영역이 서열번호 3의 아미노산 서열(인간 IgG1의 CH2 서열, 도 1 참조)을 함유하고, 접합체 모이어티가 서열번호 3의 65번 위치에서 수용체 글루타민 잔기를 통해 Fc-함유 폴리펩타이드에 접합되며, N-글리코실화가 서열번호 3(도 1에 표시된 박스 내의 잔기 참조)의 67번 위치에서 이루어지는, Fc-함유 폴리펩타이드 접합체가 제공된다.
몇몇 양태들에 따르면, 접합체 모이어티에 특이적으로 접합된 Fc-함유 폴리펩타이드를 함유하고, 이 Fc-함유 폴리펩타이드가 N-글리코실화된 Fc 영역을 함유하고, 이 N-글리코실화된 Fc 영역이 서열번호 4의 아미노산 서열(인간 IgG2의 CH2 서열, 도 1 참조)을 함유하고, 접합체 모이어티가 서열번호 4의 64번 위치에서 수용체 글루타민 잔기를 통해 Fc-함유 폴리펩타이드에 접합되며, N-글리코실화가 서열번호 4(도 1에 표시된 박스 내의 잔기 참조)의 66번 위치에서 이루어지는, Fc-함유 폴리펩타이드 접합체가 제공된다.
몇몇 양태들에 따르면, 접합체 모이어티에 특이적으로 접합된 Fc-함유 폴리펩타이드를 함유하고, 이 Fc-함유 폴리펩타이드가 N-글리코실화된 Fc 영역을 함유하고, 이 N-글리코실화된 Fc 영역이 서열번호 5의 아미노산 서열(인간 IgG3의 CH2 서열, 도 1 참조)을 함유하고, 접합체 모이어티가 서열번호 5의 65번 위치에서 수용체 글루타민 잔기를 통해 Fc-함유 폴리펩타이드에 접합되며, N-글리코실화가 서열번호 5(도 1에 표시된 박스 내의 잔기 참조)의 67번 위치에서 이루어지는, Fc-함유 폴리펩타이드 접합체가 제공된다.
몇몇 양태들에 따르면, 접합체 모이어티에 특이적으로 접합된 Fc-함유 폴리펩타이드를 함유하고, 이 Fc-함유 폴리펩타이드가 N-글리코실화된 Fc 영역을 함유하고, 이 N-글리코실화된 Fc 영역이 서열번호 6의 아미노산 서열(인간 IgG4의 CH2 서열, 도 1 참조)을 함유하고, 접합체 모이어티가 서열번호 6의 65번 위치에서 수용체 글루타민 잔기를 통해 Fc-함유 폴리펩타이드에 접합되며, N-글리코실화가 서열번호 6(도 1에 표시된 박스 내의 잔기 참조)의 67번 위치에서 이루어지는, Fc-함유 폴리펩타이드 접합체가 제공된다.
몇몇 양태들에 따르면, 접합체 모이어티에 특이적으로 접합된 항체를 함유하고, 이 항체가 N-글리코실화된 Fc 영역을 함유하고, 이 N-글리코실화된 Fc 영역이 N-글리코실화 부위 옆에 위치한 수용체 글루타민 잔기를 함유하고, 접합체 모이어티가 수용체 글루타민 잔기를 통해 항체에 접합되는, 항체 약물 접합체가 제공된다. 몇몇 양태들에 따르면, 항체는 인간 항체이다. 몇몇 양태들에 따르면, 항체는 인간화된 항체이다. 몇몇 양태들에 따르면, 항체는 키메라 항체이다. 몇몇 양태들에 따르면, 항체는 이중특이적 또는 다중특이적 항체이다. 몇몇 양태들에 따르면, 항체는 트라스투주마브이다.
몇몇 양태들에 따르면, 접합체 모이어티에 접합된 전장의 항체로써, 이 전장의 항체가 N-글리코실화된 Fc 영역을 함유하고, 접합체 모이어티가 항체 중쇄의 295번 위치(번호매김은 카벳에서와 같이 EU 인덱스에 따른다)에서 수용체 글루타민 잔기를 통해 전장의 항체에 접합되는, 전장의 항체가 제공된다. 몇몇 양태들에 따르면, 접합체 모이어티에 접합된 항체로써, 이 항체가 N-글리코실화된 Fc 영역을 함유하고, 접합체 모이어티가 항체 중쇄의 295번 위치에서 수용체 글루타민 잔기를 통해 항체에 접합되고, N-글리코실화는 중쇄의 297번 위치에서 이루어지며, 여기서 번호매김은 카벳에서처럼 EU 인덱스에 따른 것인, 상기 항체가 제공된다.
몇몇 양태들에 따르면, 항체 상의 내인성 수용체 글루타민 잔기를 통해 접합 모이어티에 접합된 항체를 함유하는 항체 약물 접합체로써, 이 항체 약물 접합체는 Fc 영역에서 글리코실화(예컨대, N-글리코실화)되는 항체 약물 접합체가 제공된다. 몇몇 양태들에 따르면, 항체는 인간 항체이다. 몇몇 양태들에 따르면, 항체는 인간화된 항체이다. 몇몇 양태들에 따르면, 항체는 키메라 항체이다. 몇몇 양태들에 따르면, 항체는 이중특이적 또는 다중특이적 항체이다. 몇몇 양태들에서, 항체는 트라스투주마브이다.
몇몇 양태들에 따르면, Fc 영역에서 N-글리코실화된 트라스투주마브를 함유하는 항체 약물 접합체로써, 상기 트라스투주마브가 N-글리코실화 부위 옆에 위치한 내인성 수용체 글루타민 잔기를 통해 접합 모이어티에 접합되는, 항체 약물 접합체가 제공된다. 몇몇 양태들에 따르면, 번호매김이 카벳에서와 같이 EU 인덱스에 따르는, 297번 위치에서 N-글리코실화된 트라스투주마브를 함유하고, 이 트라스투주마브가 295번 위치에서 내인성 수용체 글루타민 잔기를 통해 접합 모이어티에 접합되어 있는 항체 약물 접합체가 제공된다.
몇몇 양태들에 따르면, 조성물 중의 Fc 함유 융합 폴리펩타이드의 적어도 일부(반드시 전부인 것은 아니다)가 Fc 영역이 글리코실화(예, N-글리코실화)되어 있는, 본원에 기술된 Fc-함유 융합 폴리펩타이드를 함유하는 조성물이 제공된다. 예를 들어, 몇몇 양태들에 따르면, 항체 약물 접합체를 함유하는 조성물로써, 이 항체 약물 접합체가 항체 상의 내인성 수용체 글루타민 잔기를 통해 접합 모이어티에 접합된 항체를 함유하고, 조성물에 존재하는 항체 약물 접합체의 적어도 일부(예컨대, 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 중 어느 하나)가 Fc 영역이 글리코실화(예컨대, N-글리코실화)되어 있는 조성물이 제공된다. 몇몇 양태들에 따르면, 항체는 인간 항체이다. 몇몇 양태들에 따르면, 항체는 인간화된 항체이다. 몇몇 양태들에 따르면, 항체는 키메라 항체이다. 몇몇 양태들에 따르면, 항체는 이중특이적 또는 다중특이적 항체이다. 몇몇 양태들에 따르면, 항체는 트라스투주마브이다.
본원에 기술된 접합 방법은 접합체 모이어티에 특이적이고 화학량론적으로 조절된 방식으로 접합되는 Fc-함유 폴리펩타이드 접합체(예, 항체 약물 접합체)의 생산을 가능하게 한다. 본원에 사용된, "특이적으로 접합된"이란 용어는 Fc-함유 폴리펩타이드(예, 항체)의 특이적 부위에서, 즉 N-글리코실화 부위 옆에 위치한 Fc 영역의 수용체 글루타민 잔기에서 이루어지는 접합체 모이어티의 특이적 접합 또는 가교결합을 의미한다. 부위 특이성은 다양한 기술, 예컨대 비제한적으로 펩타이드 맵핑(mapping) 및 단백질 서열분석에 의해 확인할 수 있다. 몇몇 양태들에서, Fc-함유 폴리펩타이드 접합체(예, 항체 약물 접합체) 상의 접합체 모이어티 대 Fc-함유 폴리펩타이드(예, 항체)의 몰 비는 약 1:1이다. 몇몇 양태들에 따르면, Fc-함유 폴리펩타이드 접합체(예, 항체 약물 접합체) 상의 접합체 모이어티 대 Fc-함유 폴리펩타이드(예, 항체)의 몰 비는 약 2:1이다. 몇몇 양태들에 따르면, 조성물에 존재하는 Fc-함유 폴리펩타이드 접합체(예, 항체 약물 접합체)의 적어도 약 80%(예, 적어도 약 85%, 90%, 95% 또는 그 이상 중 어느 하나)는 Fc-함유 폴리펩타이드(예, 항체) 대 접합체 모이어티의 몰 비가 약 1:1인 것이다. 몇몇 양태들에 따르면, 조성물에 존재하는 Fc-함유 폴리펩타이드 접합체(예, 항체 약물 접합체)의 적어도 약 80%(예, 적어도 약 85%, 90%, 95% 또는 그 이상 중 어느 하나)는 Fc-함유 폴리펩타이드(예, 항체) 대 접합체 모이어티의 몰 비가 약 1:2인 것이다. 몇몇 양태들에 따르면, 조성물에 존재하는 Fc-함유 폴리펩타이드 접합체(예, 항체 약물 접합체)의 적어도 약 80%(예, 적어도 약 85%, 90%, 95% 또는 그 이상 중 어느 하나)는 Fc-함유 폴리펩타이드(예, 항체) 대 접합체 모이어티의 몰 비가 약 1:1 또는 약 1:2인 것이다.
본원에 기술된 접합체 모이어티는 수용체 글루타민 잔기에, 직접 또는 본원에 더 상세히 기술된 바와 같은 소분자 핸들을 통해 접합될 수 있는 임의의 모이어티일 수 있다. 접합 모이어티와 수용체 글루타민 잔기 사이의 접합은 접합 모이어티의 아민 공여체 기 또는 소분자 핸들을 수용체 글루타민 잔기에 접합시켜 수행한다. 따라서, 아민 공여체 기를 함유하는 임의의 접합체 모이어티는 Fc-함유 폴리펩타이드에 직접 접합될 수 있다. 아민 공여체 기를 함유하지 않는 임의의 접합체 모이어티는 아민 공여체 기를 함유하는 소분자 핸들을 통해 Fc-함유 폴리펩타이드에 간접적으로 접합될 수 있다.
본원에 사용된 "아민 공여체 기"란 용어는 하나 이상의 반응성 아민(예, 1차 아민)을 함유하는 반응성 기를 의미한다. 예를 들어, 접합체 모이어티는 아민 공여체 기(예, 1차 아민 -NH2), 선택적인 링커, 및 활성 모이어티(예, 소분자)를 함유할 수 있다. 접합체 모이어티는 또한 반응성 Lys(예, 내인성 Lys)을 함유하는 생체적합성 중합체 또는 폴리펩타이드일 수 있다. 아민 공여체 기는 몇몇 양태에서 제제 모이어티가 수용체 글루타민을 통해 Fc-함유 폴리펩타이드에 접합할 수 있도록 하는 트란스글루타미나제의 기질을 제공하는 1차 아민(-NH2)이다. 따라서, 공여체 글루타민과 아민 공여체 기 사이의 결합은 식 -CH2-CH2-CO-NH-로 표시될 수 있다.
몇몇 양태들에서, Fc-함유 폴리펩타이드 및 접합체 모이어티는 링커를 통해 결합된다. 몇몇 양태들에서, 링커는 비-절단성 링커이다. 적당한 비-절단성 링커는 비제한적으로 NH2-R-X, NH2NH-R-X 및 NH2-O-R-X를 포함하고, 여기서 R은 알킬 또는 폴리에틸렌 글리콜 기(PEG라고도 지칭됨)이고, X는 활성 모이어티이다. 폴리에틸렌 글리콜 기 또는 PEG 기는 식 -(CH2CH2O)n-로 표시될 수 있고, 여기서 n은 적어도 1의 정수이다. 몇몇 양태들에서, n은 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 20 또는 24 중 어느 하나이다.
몇몇 양태들에서, Fc-함유 폴리펩타이드 및 접합체 모이어티는 절단성 링커를 통해 결합한다. 적당한 절단성 링커로는 비제한적으로 Lys-Phe-X, Lys-Val-Cit-PABC-X, NH2-(CH2CH2O)n-Val-Cit-PABC-X 및 NH2-(CH2CH2O)n-(Val-Cit-PABC-X)2를 포함하고, 여기서 X는 활성 모이어티이고, n은 적어도 1의 정수이다(예컨대, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 20 또는 24 중 어느 하나). PABC는 p-아미노벤질옥시카르보닐을 의미한다. Cit는 시트룰린을 의미한다.
다른 예시적인 아민 공여체 기-링커로는 비제한적으로, Ac-Lys-Gly, 아미노카프로산, Ac-Lys-베타-Ala, 아미노-PEG2(폴리에틸렌 글리콜)-C2, 아미노-PEG3-C2, 아미노-PEG6-C2, Ac-Lys-Val(발린)-Cit(시트룰린)-PABC(p-아미노벤질옥시카르보닐), 아미노카프로일-Val-Cit-PABC, 푸트레신, 및 Ac-Lys-푸트레신을 포함한다.
몇몇 양태들에 따르면, 접합체 모이어티는 -NH-(C)n- 링커를 통해 수용체 글루타민 잔기에 결합하고, 여기서 (C)n은 치환 또는 비치환된 알킬 또는 헤테로알킬 사슬이며, n은 약 1 내지 약 60의 정수이다. 몇몇 양태들에 따르면, 사슬의 탄소는 알콕실, 하이드록실, 알킬카르보닐옥시, 알킬-S-, 티올, 알킬-C(O)S-, 아민, 알킬아민, 아미드 또는 알킬아미드로 치환된다. 몇몇 양태들에 따르면, n은 약 2 내지 약 20이다.
몇몇 양태들에 따르면, 링커는 분지형이다. 몇몇 양태들에 따르면, 링커는 선형이다. 몇몇 양태들에 따르면, 링커는 활성 모이어티를 부착시키기 위한 하나보다 많은(예컨대, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 이상) 부착 부위를 보유한다. 이러한 활성 모이어티는 서로 동일하거나 상이할 수 있다. 예를 들어, 접합체 모이어티는 다수의 활성 모이어티(예, 약물 분자)에 결합한 폴리아세탈계 중합체 또는 폴리아세탈 유도체계 중합체를 함유할 수 있다.
몇몇 양태들에 따르면, 접합체 모이어티는 Alexa 488 카다베린, 5-FITC 카다베린, Alexa 647 카다베린, Alexa 350 카다베린, 5-TAMRA 카다베린, 5-FAM 카다베린, SR101 카다베린, 5,6-TAMRA 카다베린, 5-FAM 리신, Ac(아세틸)-LysGly-MMAD(모노메틸 아우리스타틴 D), 아미노-PEG3(폴리에틸렌 글리콜)-C2-MMAD, 아미노-PEG6 C2-MMAD, 아미노-PEG3-C2-아미노-노나노일-MMAD, 아미노카프로일-Val(발린)-Cit(시트룰린)-PABC(p-아미노벤질옥시카르보닐)-MMAD, Ac-Lys-Val-Cit-PABC-MMAD, 아미노카프로일-MMAD, Ac-Lys-베타-Ala-MMAD, 아미노-PEG2-C2-MMAE(모노메틸 아우리스타틴 E), 아미노카프로일-MMAE, 아미노-PEG3-C2-MMAE, 아미노카프로일-MMAF(모노메틸 아우리스타틴 F), 아미노카프로일-Val-Cit-PABC-MMAE, 아미노카프로일-Val-Cit-PABC-MMAF, 푸트레시닐-겔다나마이신 및 Ac-Lys-푸트레시닐-겔다나마이신으로 이루어진 군으로부터 선택된다. MMAE는 모노메틸 아우리스타틴 E 또는 이의 유도체를 의미한다.
몇몇 양태들에 따르면, 접합체 모이어티는 디아민을 함유하는 화합물이다. 몇몇 양태들에 따르면, 이 화합물은 푸트레신(부탄-1,4-디아민), 에틸렌디아민, 카다베린(펜탄-1,5-디아민), 스퍼미딘, 스퍼민, 하이드라진, 1,3-디아미노프로판, 헥사메틸렌디아민, 페닐렌디아민, 자일릴렌디아민, 디페닐에틸렌디아민, 1,8-디아미노나프탈렌, 및 입체이성질체, 등배전자체(isosteres), 유사체 또는 이의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
몇몇 양태들에 따르면, 접합체 모이어티는 메이탄신 유도체, 예컨대 도 8에 도시된 MAY-PEG4 또는 도 9에 도시된 MAY-PVCL이다.
몇몇 양태들에 따르면, 접합체 모이어티는 비-절단성 링커를 함유하는 MMAE 유도체이다(예컨대, 아미노-(CH2CH2O)n-링커, 예를 들어, 도 12에 도시된 것과 같은 PEGx-MMAE). 몇몇 양태들에 따르면, 접합체 모이어티는 절단성 링커를 함유하는 MMAE 유도체이다(예컨대, 도 12에 도시된 PEG3c-MMAE).
몇몇 양태들에 따르면, Fc 영역이 N-글리코실화된 트라스투주마브를 함유하는 항체 약물 접합체로써, 상기 트라스투주마브는 N-글리코실화 부위 옆에 위치한 수용체 글루타민 잔기를 통해 적어도 하나의 MMAE(예, 1개, 2개 또는 그 이상)를 함유하는 접합 모이어티에 접합한다. 몇몇 양태들에 따르면, 접합 모이어티는 도 12에 도시된 PEGx-MMAE이며, 여기서 x는 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 20 및 24 중에서 선택되는 정수이다. 몇몇 양태들에 따르면, 접합 모이어티는 도 12에 도시된 바와 같은 PEG3c-MMAE이다. 몇몇 양태들에 따르면, 접합 모이어티는 2개의 MMAE와 3-암(arm) PEG 링커를 함유한다.
몇몇 양태들에 따르면, 트라스투주마브를 함유하는 전술한 항체 약물 접합체 중 임의의 접합체를 함유하는 조성물이 제공된다. 몇몇 양태들에서, 접합 모이어티에 존재하는 활성 모이어티(예, 약물, 예, MMAE) 대 조성물에 존재하는 트라스투주마브 사이의 평균 몰 비는 약 1:1, 2:1 또는 4:1 중 어느 하나이다. 몇몇 양태들에 따르면, 조성물에 트라스투주마브를 함유하는 항체 약물 접합체의 적어도 약 80%(예컨대, 적어도 약 85%, 90%, 95% 또는 그 이상 중 어느 하나)는 접합 모이어티에 존재하는 활성 모이어티(예컨대 약물, 예, MMAE) 대 트라스투주마브의 몰 비가 약 2:1이다. 몇몇 양태들에 따르면, 조성물에 트라스투주마브를 함유하는 항체 약물 접합체의 적어도 약 80%(예컨대, 적어도 약 85%, 90%, 95% 또는 그 이상 중 어느 하나)는 접합 모이어티에 존재하는 활성 모이어티(예컨대 약물, 예, MMAE) 대 트라스투주마브의 몰 비가 약 4:1이다.
몇몇 양태들에 따르면, Fc-함유 폴리펩타이드 접합체는 생체내 투여 후 적어도 약 1일 후에 약 50% 이상으로 개체(예, 포유동물)에 존재한다. 몇몇 양태들에 따르면, Fc-함유 폴리펩타이드 접합체는 생체내 투여 후 적어도 약 2시간, 2 내지 6시간, 6 내지 12시간, 12 내지 18시간, 18 내지 24시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주 또는 2주 중 어느 시간 후에 약 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 또는 그 이상 중 어느 하나의 양으로 개체(예, 포유동물)에 존재한다.
활성 모이어티
본원에 기술된 접합체 모이어티는 몇몇 양태에서 활성 모이어티를 함유한다. 몇몇 양태들에 따르면, 접합체 모이어티는 펩타이드 또는 폴리펩타이드인 활성 모이어티를 함유한다. 몇몇 양태들에 따르면, 접합체 모이어티는 생체적합성 중합체인 활성 모이어티를 함유한다.
몇몇 양태들에 따르면, 접합체 모이어티는 세포독성제, 면역억제제 또는 영상화제(예, 형광단)인 활성 모이어티를 함유한다. 몇몇 양태들에 따르면, 세포독성제는 화학치료제이다. 몇몇 양태들에 따르면, 활성 모이어티는 Fc-함유 폴리펩타이드의 약동학적 성질을 향상시키는 모이어티, 치료 모이어티 및 진단 모이어티 중 어느 하나이다. 몇몇 양태들에 따르면, 활성 모이어티는 소분자이다.
몇몇 양태들에 따르면, 접합 모이어티는 세포독성제인 활성 모이어티를 함유한다. 세포독성제의 예로는 비제한적으로 안트라사이클린, 아우리스타틴, 돌라스타틴, CC-1065, 듀오카마이신, 에네디인, 겔다나마이신, 메이탄신, 퓨로마이신, 탁산, 빈카 알칼로이드, SN-38, 튜불리신, 헤미아스텔린 및 이의 입체이성질체, 등배전자체, 유사체 또는 유도체를 포함한다. 몇몇 양태들에 따르면, 접합 모이어티는 모노단실카다베린(MDC)을 함유한다. 몇몇 양태들에 따르면, 접합 모이어티는 TAM1을 함유한다. 몇몇 양태들에 따르면, 접합 모이어티는 모노메틸 아우리스타틴 E(MMAE)를 함유한다.
안트라사이클린은 박테리아 스트렙토마이세스에서 유래되는 것으로, 광범위한 암, 예컨대 백혈병, 림프종, 유방암, 자궁암, 난소암 및 폐암의 치료에 사용되고 있다. 안트라사이클린의 예로는 비제한적으로 다우노루비신, 독소루비신(즉, 아드리아마이신), 에피루비신, 이다루비신, 발루비신 및 미톡산트론을 포함한다.
돌라스타틴 및 이의 펩타이드 유사체 및 유도체, 아우리스타틴은 항암 및 항진균 활성이 있는 것으로 밝혀져 있는 매우 강력한 항유사분열성 제제이다. 예컨대, 미국 특허 5,663,149 및 Pettit et al. Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965(1998) 참조. 예시적인 돌라스타틴 및 아우리스타틴은 비제한적으로 아우리스타틴 E, 아우리스타틴 EB(AEB), 아우리스타틴 EFP(AEFP), MMAD, MMAF, MMAE 및 5-벤조일발레르산-AE 에스테르(AEVB)를 포함한다.
듀오카마이신 및 CC-1065는 세포독성 효능을 가진 DNA 알킬화제이다. Boger and Johnson, PNAS 92: 3642-3649(1995) 참조. 예시적인 돌라스타틴 및 아우리스타틴은 비제한적으로 (+)-도카마이신 A 및 (+)-듀오카마이신 SA, 및 (+)-CC-1065를 포함한다.
에네디인(enediyne)은 9원 및 10원 고리, 또는 접합된 삼중-이중-삼중 결합의 환형 시스템의 존재를 특징으로 하는 항암 박테리아 산물의 클래스이다. 예시적인 에네디인은 비제한적으로 칼케아미신, 에스퍼라미신 및 다이네미신을 포함한다.
겔다나마이신은 Hsp90(열충격 단백질 90)에 결합하는 벤조퀴논 안사마이신 항생체로써, 항암 약물로 사용되고 있다. 겔다나마이신의 예로는 비제한적으로 17-AAG(17-N-알릴아미노-17-디메톡시겔다나마이신) 및 17-DMAG(17-디메틸아미노에틸아미노-17-디메톡시겔다나마이신)을 포함한다.
메이탄신 또는 이의 유도체 메이탄시노이드는 튜불린의 중합 억제를 통해 유사분열 중 미세소관 형성을 저지하여 세포 증식을 억제한다. Remillard et al., Science 189: 1002-1005(1975) 참조. 메이탄신 및 메이탄시노이드의 예로는 비제한적으로 머탄신(DM1) 및 이의 유도체뿐만 아니라 안사미토신을 포함한다.
탁산은 항튜불린 제제 또는 유사분열 억제제로써 작용하는 디테르펜이다. 탁산의 예로는 비제한적으로 파클리탁셀(예, TAXOL®) 및 도세탁셀(TAXOTERE®)을 포함한다.
또한, 빈카 알킬로이드도 항-튜불린 제제이다. 빈카 알킬로이드의 예로는 비제한적으로 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신 및 비노렐빈을 포함한다.
몇몇 양태에 따르면, 접합체 모이어티는 면역억제제인 활성 모이어티를 함유한다. 면역억제제의 예로는 비제한적으로 간사이클로비어, 에타너셉트, 태크롤리무스, 시롤리무스, 보클로스포린, 사이클로스포린, 라파마이신, 사이클로포스파미드, 아자티오프린, 마이코페놀게이트 모페틸, 메토트렉스트레이트, 및 글루코코르티코이드 및 이의 유사체를 포함한다.
몇몇 양태들에 따르면, 접합체 모이어티는 영상화제(예, 형광단)인 활성 모이어티, 예컨대 플루오레세인, 로다민, 란탄나이드 인광물질 및 이의 유도체를 포함한다. 형광단의 예로는 비제한적으로 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)(예, 5-FITC), 및 플루오레세인 아미다이트(FAM)(예, 5-FAM), 에오신, 카르복시플루오레세인, 에리트로신, Alexa Fluor®(예, Alexa 350, 405, 430, 488, 500, 514, 532, 546, 555, 568, 594, 610, 633, 647, 660, 680, 700 또는 750), 카르복시테트라메틸로다민(TAMRA)(예, 5-TAMRA), 테트라메틸로다민(TMR) 및 설포로다민(SR)(예, SR101)을 포함한다.
몇몇 양태들에 따르면, 접합체 모이어티는 폴리펩타이드인 활성 모이어티를 함유한다. 몇몇 양태들에 따르면, 폴리펩타이드는 항체, 예컨대 인간화된 항체, 인간 항체, 키메라성 항체 또는 쥐의 모노클로널 항체이다.
몇몇 양태들에 따르면, 접합체 모이어티는 독소 폴리펩타이드(또는 독소 단백질)인 활성 모이어티를 함유한다. 독소 폴리펩타이드의 예로는 비제한적으로 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 사슬, 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파-사르신, 알루라이츠 포르디(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 파이토라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질(PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모디카 차란티아(momordica charantia) 억제제, 커신(curcin), 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 억제제, 젤로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신, 트리코테세네스, 억제제 시스틴 노트(cystine knot)(ICK) 펩타이드(예, 세라토톡신) 및 코노톡신(예, KIIIA 또는 SmIIIa)을 포함한다.
몇몇 양태들에 따르면, 접합체 모이어티는 방사능동위원소와 같은 표지를 함유한다. 방사능동위원소 또는 다른 표지의 예로는 비제한적으로 3H, 14C, 15N, 35S, 18F, 32P, 33P, 64Cu, 68Ga, 89Zr, 90Y, 99Tc, 123I, 124I, 125I, 131I, 111In, 131In, 153Sm, 186Re, 188Re, 211At, 212Bi 및 153Pb를 포함한다.
몇몇 양태들에 따르면, 접합체 모이어티는 Alexa 488 카다베린, 5-FITC 카다베린, Alexa 647 카다베린, Alexa 350 카다베린, 5-TAMRA 카다베린, 5-FAM 카다베린, SR101 카다베린, 5,6-TAMRA 카다베린, 5-FAM 리신, Ac-Lys-Gly-MMAD, 아미노-PEG3-C2-MMAD, 아미노-PEG6-C2-MMAD, 아미노-PEG3-C2-아미노-노나노일-MMAD], 아미노카프로일-Val-Cit-PABC-MMAD, Ac-Lys-베타-Ala-MMAD, 아미노카프로일-MMAD, Ac-Lys-Val-Cit-PABC-MMAD, 아미노카프로일-MMAE, 아미노-PEG3-C2-MMAE, 아미노-PEG2-C2-MMAE, 아미노카프로일-MMAF, 아미노카프로일-Val-Cit-PABC-MMAE, 아미노카프로일-Val-Cit-PABC-MMAF, 아미노-PEG2-C2-MMAF, 아미노-PEG3-C2-MMAF, 푸트레시닐-겔다나마이신, 및 Ac-Lys-푸트레시닐-겔다나마이신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 활성 모이어티를 함유한다. 몇몇 양태들에 따르면, 아민 공여체 제제는 아미노카프로일-Val-Cit-PABC-MMAE, 아미노카프로일-Val-Cit-PABC-MMAF, Ac-Lys-푸트레시닐-겔다나마이신, Ac-Lys-베타-Ala-MMAD, Ac-Lys-Val-Cit-PABC-MMAD, 아미노카프로일-Val-Cit-PABC-MMAD 및 아미노-PEG6-C2-MMAD이다.
몇몇 양태들에 따르면, 접합체 모이어티는 생체적합성 중합체인 활성 모이어티를 함유한다. Fc-함유 폴리펩타이드는 생체적합성 중합체에 접합시켜 Fc-함유 폴리펩타이드의 생물학적 특성, 예컨대 혈청 반감기 및 생체활성의 증가, 및 생체내 반감기의 연장 등을 향상시킬 수 있다. 생체적합성 중합체의 예로는 수용성 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 이의 유도체 및 양쪽성이온-함유 생체적합성 중합체(예, 포스포릴콜린 함유 중합체)를 포함한다.
Fc -함유 폴리펩타이드 접합체를 제조하는 방법
다른 관점으로, 본 출원은 야생형 트란스글루타미나제 또는 조작된 트란스글루타미나제를 사용하여 Fc-함유 폴리펩타이드 접합체(예, 항체 약물 접합체)를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명자는 N-글리코실화 부위 옆에 위치한 Fc-함유 폴리펩타이드(예, 항체)의 Fc 영역에 존재하는 수용체 글루타민 잔기에 접합체 모이어티를 특이적으로 접합시키도록 디자인된 조작된 TGase를 제조했다. N-글리코실화 부위 옆에 위치한 Fc 영역에 존재하는 글루타민 잔기가 TGase의 작용에 접근할 수 없을 것이라는 종래의 믿음과 반대로, 본 발명자는 더 놀랍게도 특이적 반응 조건(예, 효소의 특이적 농도)을 이용함으로써 야생형 TGase도 N-글리코실화 부위 옆에 위치한 Fc 영역에서 수용체 글루타민 잔기에 접합체 모이어티를 부위 특이적이고 화학량론적 방식으로 접합시킬 수 있다는 것을 발견했다.
본원에 기술된 방법들은 몇몇 양태들에 따르면 단일 접합 단계를 수반한다. 이러한 방법은 특히 적합하고, 예컨대 상당량의 Fc-함유 폴리펩타이드 접합체를 생성하기에 20 내지 98% 사이의 접합 수율이 충분할 때 특히 적합하다. 1단계 방법은 링커의 크기가 최소화될 필요가 있을 때, 다량의 Fc-함유 폴리펩타이드의 공급이 있을 때, 약물 용해성이 적당할 때(예컨대 100mg/L), 그리고 높은 수율을 얻는 것보다 시간 절감이 더 큰 문제일 때에도 유용하다.
몇몇 양태들에 따르면, 이 방법은 2단계를 수반한다. 먼저, 소분자 핸들을 TGase를 통해 Fc-함유 폴리펩타이드에 접합시켜 중간 접합체를 수득한다. 이어서, 활성 모이어티를 소분자 핸들을 통해, 공유적으로 또는 비공유적으로 중간 접합체에 커플링시킨다. 소분자 핸들은 활성 모이어티의 커플링을 맞춤조정하도록 특이적으로 디자인되어, 임의의 종류의 활성 모이어티가 Fc-함유 폴리펩타이드에 접합되게 할 수 있다. 2단계 방법은 특히 Fc-함유 폴리펩타이드 및/또는 활성 모이어티의 공급이 제한적일 때, 그리고 활성 모이어티(예, 독소)가 낮은 수용해성을 갖고(또는) 폴리펩타이드의 응집을 유도할 때, 유용하다. 소분자 핸들을 사용함으로써, 1차 효소적 커플링 단계는 접합을 고수율로 달성하게 할 수 있다. 그 다음, 2차 화학선택적 커플링 단계는 활성 모이어티:Fc-함유 폴리펩타이드의 반응물 비를 1.2 내지 1.5 사이로만 필요로 한다. 이로써, 총 접합 수율은 1단계 방법보다 높아질 수 있다.
따라서, 몇몇 양태들에 따르면, 접합체 모이어티에 특이적으로 접합된 Fc-함유 폴리펩타이드를 함유하는 Fc-함유 폴리펩타이드 접합체를 제조하는 방법으로써, Fc-함유 폴리펩타이드를 트란스글루타미나제의 존재하에 Fc-함유 폴리펩타이드 접합체를 생성하기에 충분한 조건하에서 접합체 모이어티와 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 Fc-함유 폴리펩타이드가 N-글리코실화된 Fc 영역을 함유하고, 이 N-글리코실화된 Fc 영역이 N-글리코실화 부위 옆에 위치한 수용체 글루타민 잔기를 함유하고, 접합체 모이어티가 수용체 글루타민 잔기를 통해 Fc-함유 폴리펩타이드에 접합되는, 방법이 제공된다. 몇몇 양태들에 따르면, 접합체 모이어티에 특이적으로 접합된 Fc-함유 폴리펩타이드를 함유하는 Fc-함유 폴리펩타이드 접합체를 제조하는 방법으로써, Fc-함유 폴리펩타이드를 함유하는 조성물을 트란스글루타미나제의 존재하에 Fc-함유 폴리펩타이드 접합체를 생성하기에 충분한 조건하에서 접합체 모이어티와 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 적어도 일부(예컨대, 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 그 이상)의 Fc-함유 폴리펩타이드가 N-글리코실화된 Fc 영역을 함유하고, 이 Fc 영역은 N-글리코실화 부위 옆에 위치한 수용체 글루타민 잔기를 함유하고, 접합체 모이어티는 수용체 글루타민 잔기를 통해 Fc-함유 폴리펩타이드에 접합되는, 방법이 제공된다.
몇몇 양태들에 따르면, 접합체 모이어티에 특이적으로 접합된 항체를 함유하는 항체 약물 접합체를 제조하는 방법으로써, 항체를 트란스글루타미나제의 존재하에 항체 약물 접합체를 생성하기에 충분한 조건하에서 접합체 모이어티와 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 항체는 Fc-영역에 글리코실화(예, N-글리코실화)가 되어 있고, 접합체 모이어티는 항체 상의 내인성 수용체 글루타민 잔기에 접합되는, 방법이 제공된다. 몇몇 양태들에 따르면, 접합체 모이어티에 특이적으로 접합된 항체를 함유하는 항체 약물 접합체를 제조하는 방법으로써, 항체 조성물을 트란스글루타미나제의 존재하에 항체 약물 접합체를 생성하기에 충분한 조건하에서 접합체 모이어티와 접촉시키는 단계를 포함하고, 조성물에 존재하는 항체의 적어도 약 일부(예컨대, 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상)는 Fc-영역에 글리코실화되고, 접합체 모이어티는 항체 상의 내인성 수용체 글루타민 잔기에 접합되는, 방법이 제공된다.
몇몇 양태들에 따르면, 활성 모이어티 및 소분자 핸들을 함유하는 접합체 모이어티에 특이적으로 접합된 Fc-함유 폴리펩타이드를 함유하는 Fc-함유 폴리펩타이드 접합체를 제조하는 방법으로써, a) Fc-함유 폴리펩타이드를 트란스글루타미나제의 존재하에, 소분자 핸들에 특이적으로 접합된 Fc-함유 폴리펩타이드를 함유하는 중간 접합체를 생성하기에 충분한 조건하에서 소분자 핸들과 접촉시키는 단계, 및 b) 상기 중간 접합체를 활성 모이어티와 접촉시켜 Fc-함유 폴리펩타이드 접합체를 수득하는 단계를 포함하고, 상기 Fc-함유 폴리펩타이드는 N-글리코실화된 Fc 영역을 함유하고, 이 N-글리코실화된 Fc 영역은 N-글리코실화 부위 옆에 위치한 수용체 글리타민 잔기를 함유하고, 접합체 모이어티는 수용체 글루타민 잔기를 통해 Fc-함유 폴리펩타이드에 접합되는, 방법이 제공된다. 몇몇 양태들에 따르면, 활성 모이어티 및 소분자 핸들을 함유하는 접합체 모이어티에 특이적으로 접합된 Fc-함유 폴리펩타이드를 함유하는 Fc-함유 폴리펩타이드 접합체를 제조하는 방법으로써, a) Fc-함유 폴리펩타이드를 함유하는 조성물을 트란스글루타미나제의 존재하에, 소분자 핸들에 특이적으로 접합된 Fc-함유 폴리펩타이드를 함유하는 중간 접합체를 생성하기에 충분한 조건하에서 소분자 핸들과 접촉시키는 단계, 및 b) 상기 중간 접합체를 활성 모이어티와 접촉시켜 Fc-함유 폴리펩타이드 접합체를 수득하는 단계를 포함하고, 상기 Fc-함유 폴리펩타이드의 적어도 일부(예, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상)는 N-글리코실화된 Fc 영역을 함유하고, 이 Fc 영역은 N-글리코실화 부위 옆에 위치한 수용체 글리타민 잔기를 함유하고, 접합체 모이어티는 수용체 글루타민 잔기를 통해 Fc-함유 폴리펩타이드에 접합되는, 방법이 제공된다.
몇몇 양태들에 따르면, 활성 모이어티 및 소분자 핸들을 함유하는 접합체 모이어티에 특이적으로 접합된 항체를 함유하는 항체 약물 접합체를 제조하는 방법으로써, a) 항체를 트란스글루타미나제의 존재하에, 소분자 핸들에 특이적으로 접합된 항체를 함유하는 중간 접합체를 생성하기에 충분한 조건하에서 소분자 핸들과 접촉시키는 단계, 및 b) 상기 중간 접합체를 활성 모이어티와 접촉시켜 항체 약물 접합체를 수득하는 단계를 포함하고, 상기 항체는 Fc 영역에 글리코실화(예, N-글리코실화)가 되어 있고, 이 접합체 모이어티는 항체 상의 내인성 수용체 글루타민 잔기에 접합되는, 방법이 제공된다. 몇몇 양태들에 따르면, 활성 모이어티 및 소분자 핸들을 함유하는 접합체 모이어티에 특이적으로 접합된 항체를 함유하는 항체 약물 접합체를 제조하는 방법으로써, a) 항체 조성물을 소분자 핸들과 트란스글루타미나제의 존재하에, 소분자 핸들에 특이적으로 접합된 항체를 함유하는 중간 접합체를 생성하기에 충분한 조건하에서 접촉시키는 단계, 및 b) 상기 중간 접합체를 활성 모이어티와 접촉시켜 항체 약물 접합체를 수득하는 단계를 포함하고, 상기 조성물에 존재하는 항체의 적어도 일부(예, 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상 중 임의의 양)는 Fc 영역에 글리코실화(예, N-글리코실화)가 되어 있고, 이 접합체 모이어티는 항체 상의 내인성 수용체 글루타민 잔기에 접합되는, 방법이 제공된다.
본원에 기술된 소분자 핸들은 일반적으로 -NH2-R의 구조를 가진 것으로, 여기서 R은 활성 모이어티의 부착을 허용하는 모이어티이다. 본원에 기술된 방법들에 소분자 핸들의 도입은 방법의 융통성을 유의적으로 증가시킨다. 구체적으로, 소분자 핸들의 구조는 원하는 활성 모이어티가 부착되도록 맞춤조정될 수 있다. 예를 들어, 몇몇 양태들에서, R은 결합 파트너에 특이적으로 결합하는 리간드이다. 이것은 결합 파트너를 함유하는 임의의 분자(예, 단백질)의 부착을 허용한다. 적당한 리간드/결합 파트너 쌍은 비제한적으로 항체/항원, 항원/항체, 아비딘/비오틴, 비오틴/아비딘, 스트렙타비딘/비오틴, 비오틴/스트렙타비딘, 글루타치온/GST, GST/글루타치온, 말토오스 결합 단백질/아밀로오스, 아밀로오스/말토오스 결합 단백질, 셀룰로오스 결합 단백질 및 셀룰로오스, 셀룰로오스/셀룰로오스 결합 단백질 등을 포함한다.
본원에 기술된 다른 적당한 소분자 핸들로는 비제한적으로 NH2-CH2-CH(OH)-CH2-NH2, NH2-R-(OR')2, NH2-R=O, NH2-R-SH, NH2-R-아지드를 포함한다. 이러한 소분자 핸들은 적당한 링커, 예컨대 NH2-O-R-X, 말레이미드-R-X 및 사이클로옥틴-R-(R'-X)2(여기서, X는 활성 모이어티이고, R 및 R'는 독립적으로 링커 기, 예컨대 알킬 또는 폴리에틸렌 글리콜 기를 함유하는 링커 기이다)를 통해 접합체 모이어티의 부착을 허용한다. 몇몇 양태들에 따르면, 소분자 핸들은 아미노 기와 2개의 아지드 기를 가진 3-암 PEG 링커(도 18, 상단 패널에 도시한 3-암 PEG 링커)이고, 아지드 기는 각각 활성 모이어티에 접합될 수 있다.
TGase-촉매된 반응은 수 시간 내지 1일(예컨대, 밤새) 동안 수행할 수 있다. 접합체 모이어티 또는 소분자 핸들은 400 내지 600 μmol/L 사이의 리간드 농도에서, Fc-함유 폴리펩타이드(예, 1mg/ml)와 반응하여 Fc-함유 폴리펩타이드보다 60 내지 90배 과량의 기질을 제공하거나, 또는 경우에 따라 더 적은 과량의 기질, 예컨대 1 내지 20배, 또는 10 내지 20배의 기질을 제공한다. 반응은 무칼륨 인산염 완충 식염수(PBS; pH 8)에서 37℃에서 수행할 수 있다. 4h 내지 수일 후, 인정 상태의 조건이 달성된다. 그 다음, 과량의 리간드와 효소는 원심분리-투석(VIVASPIN® MWCO 50kDa, Vivascience, Winkel Switzerland) 또는 정용여과(PELLICON® MWMCO 50kDa, Millipore)를 사용하여 제거한다. 반응은 HPLC로 모니터할 수 있다.
그 결과 수득되는 Fc-함유 폴리펩타이드 접합체는 임의의 적당한 방법을 사용하여 분석할 수 있다. 예를 들어, 접합된 폴리펩타이드의 화학량론은 상하 방식을 사용하는 액체 크로마토그래피 질량 분광분석(LC/MS)으로 특성화하여 항체에 접합된 접합체 모이어티의 수를 평가하거나 또는 소분자 핸들의 수를 평가할 수 있고, 특히 조성물의 균일성을 평가할 수 있다. 접합체는 LC/MS 분석 전에 환원시킬 수 있고, 경쇄 및 중쇄를 별도로 측정한다.
한 양태에 따르면, 산물은 약물 부하량(예, Fc-함유 폴리펩타이드당 접합체 중의 활성 모이어티의 수)에 대해 분석한다. 이 방법들은 Fc-함유 폴리펩타이드당 접합체 또는 활성 모이어티(예, 약물)의 평균 수, 뿐만 아니라 조성물에 존재하는 항체당 접합체 또는 활성 모이어티(예, 약물) 수의 분포, 즉 임의의 주어진 약물 부하량의 수준 또는 DAR을 가진 총 항체의 백분율을 측정하는데 사용할 수 있다. 접합된 수용체 글루타민의 수(n)(예컨대, n=1, 2, 3, 4, 5, 6 등)를 가진 항체의 부분을 측정할 수 있다. 이러한 측정 및 더욱 일반적으로 약물 부하량에 따라 개조되는 한가지 기술은 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)이고, HIC는 예컨대 본원에 참고 인용된 문헌[Hamblett et al.(2004) Cancer Res. 10: 7063-7070; Wakankar et al.(2011) mAbs 3(2); 161-172; 및 Lyon et al(2012) Methods in Enzymology, Vol. 502: 123-138]에 기술된 바와 같이 수행할 수 있다.
접합 반응에서 트란스글루타미나제와 Fc-함유 폴리펩타이드 사이의 몰 비는 효과적인 트란스글루타민화 반응이 이루어지도록 조절할 수 있다. 예를 들어, 몇몇 양태들에 따르면, 트란스글루타미나제와 Fc-함유 폴리펩타이드(예컨대, 항체 또는 항체 조성물)의 몰 비는 약 10:1 내지 약 1:100, 예컨대 약 10:1 내지 약 9:1, 약 9:1 내지 약 8:1, 약 8:1 내지 약 7:1, 약 7:1 내지 약 6:1, 약 6:1 내지 약 5:1, 약 5:1 내지 약 4:1, 약 4:1 내지 약 3:1, 약 3:1 내지 약 2:1, 약 2:1 내지 약 1:1, 약 1:1 내지 약 1:2, 약 1:2 내지 약 1:3, 약 1:3 내지 약 1:4, 약 1:4 내지 약 1:5, 약 1:5 내지 약 1:6, 약 1:6 내지 약 1:7, 약 1:7 내지 약 1:8, 약 1:8 내지 약 1:9, 약 1:9 내지 약 1:10, 약 1:10 내지 약 1:20, 약 1:20 내지 약 1:30, 약 1:30 내지 약 1:40, 약 1:40 내지 약 1:50, 약 1:50 내지 약 1:60, 약 1:60 내지 약 1:70, 약 1:70 내지 약 1:80, 약 1:80 내지 약 1:90, 또는 약 1:90 내지 약 1:100 중 임의의 비율이다.
반응 혼합물에 존재하는 트란스글루타미나제의 양은 효과적인 트란스글루타미나제 반응이 이루어지도록 조절할 수 있다. 예를 들어, 몇몇 양태들에 따르면, 반응 혼합물에 존재하는 트란스글루타미나제의 농도는 약 0.01mg/ml 내지 약 5 mg/ml, 예컨대 약 0.01 mg/ml 내지 약 0.02 mg/ml, 약 0.02 mg/ml 내지 약 0.03 mg/ml, 약 0.03 mg/ml 내지 약 0.04 mg/ml, 약 0.04 mg/ml 내지 약 0.05 mg/ml, 약 0.05 mg/ml 내지 약 0.06 mg/ml, 약 0.06 mg/ml 내지 약 0.07 mg/ml, 약 0.07 mg/ml 내지 약 0.08 mg/ml, 약 0.08 mg/ml 내지 약 0.09 mg/ml, 약 0.09 mg/ml 내지 약 0.1 mg/ml, 약 0.1 mg/ml 내지 약 0.2 mg/ml, 약 0.2 mg/ml 내지 약 0.3 mg/ml, 약 0.3 mg/ml 내지 약 0.4 mg/ml, 약 0.4 mg/ml 내지 약 0.5 mg/ml, 약 0.5 mg/ml 내지 약 0.6 mg/ml, 약 0.6 mg/ml 내지 약 0.7 mg/ml, 약 0.7 mg/ml 내지 약 0.8 mg/ml, 약 0.8 mg/ml 내지 약 0.9 mg/ml, 약 0.9 mg/ml 내지 약 1 mg/ml, 약 1 mg/ml 내지 약 2 mg/ml, 약 2 mg/ml 내지 약 3 mg/ml, 약 3 mg/ml 내지 약 4 mg/ml, 약 4 mg/ml 내지 약 5 mg/ml 중 임의의 범위이다. 몇몇 양태들에 따르면, 반응 혼합물 중에 트란스글루타미나제의 농도는 약 0.05 mg/ml 내지 약 1 mg/ml, 예컨대 약 0.2 mg/ml 내지 약 1 mg/ml이다.
몇몇 양태들에 따르면, 트란스글루타미나제 반응은 고체 지지체 위에서 수행한다. 예를 들어, Fc-함유 폴리펩타이드(예, 항체)는 고체 지지체에 부착될 수 있다. 그 다음, 접합 반응의 나머지 성분들을 고체 지지체 상의 Fc-함유 폴리펩타이드와 접촉시키고, 이어서 제거한다. 대안적으로, 트란스글루타미나제를 고체 지지체에 부착시킬 수도 있다. 그 다음, 접합 반응의 나머지 성분들을 고체 지지체 상의 트란스글루타미나제와 접촉시키고, 이어서 고체 지지체 상의 트란스글루타미나제로부터 분리한다.
본원에 기술된 방법들에 유용한 고체 지지체는 예컨대, 평판, 튜브, 병, 플라스크, 자기 비드, 자기 시트, 다공성 매트릭스 또는 임의의 고체 표면 등을 포함한다. TGase 또는 Fc-함유 폴리펩타이드를 고체 지지체에 결합시키는데 사용될 수 있는 제제 또는 분자는 비제한적으로 렉틴, 아비딘/비오틴, 무기 또는 유기 결합 분자를 포함한다. 물리적 분리는 예컨대 여과, 분리, 자기장, 원심분리, 세척 등으로 수행할 수 있다.
몇몇 양태들에 따르면, 고체 지지체는 비드, 막, 카트리지, 필터, 미량역가 평판, 시험관, 고체 분말, 주조 또는 압출 성형 모듈, 메쉬, 섬유, 자기 입자 복합체, 또는 임의의 다른 고체 물질이다. 고체 지지체는 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리(4-메틸부텐), 폴리스티렌, 폴리아크릴레이트, 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 레이온, 나일론, 폴리(비닐 부티레이트), 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PCDF), 실리콘, 폴리포름알데하이드, 셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트, 니트로셀룰로오스 등과 같은 물질로 코팅할 수 있다. 몇몇 양태들에 따르면, 고체 지지체는 리간드로 코팅되거나 또는 리간드에 의해 함침될 수 있다.
몇몇 양태들에 따르면, 지지 물질은 자기 비드이다. 몇몇 양태들에 따르면, 자기 비드는 평균 크기가 약 1 내지 200 미크론, 예컨대 약 1 내지 2 미크론, 2 내지 10 미크론, 10 내지 30 미크론, 30 내지 50 미크론, 50 내지 100 미크론, 및 10 내지 200 미크론 중 임의의 범위이다. 몇몇 양태들에 따르면, 자기 비드는 단분산성(monodisperse)이다. 몇몇 양태들에 따르면, 자기 비드는 단백질 A 등으로 코팅된다.
본원에 기술된 방법들에 사용될 수 있는 다른 고체 지지체는 비제한적으로 젤라틴, 유리, 세파로오스 마크로비드, 덱스트란 마이크로캐리어, 예컨대 CYTODES®(Pharmacia, Uppsala, Sweden)을 포함한다. 또한, 폴리사카라이드, 예컨대 아가로오스, 알긴산염, 카라기난, 키틴, 셀룰로오스, 덱스트란 또는 전분, 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌, 폴리아크롤레인, 폴리비닐 알코올, 폴리메틸아크릴레이트, 퍼플루오로카본, 무기 화합물, 예컨대 실리카, 유리, 규조토, 알루미나, 철 산화물 또는 다른 금속 산화물, 또는 2 이상의 자연 발생의 중합체, 합성 중합체 또는 무기 화합물의 임의의 조합으로 이루어지는 공중합체도 고찰된다.
반응 혼합물에 존재하는 트란스글루타미나제의 양(즉, 고체 지지체로써 수지가 사용될 때 수지 ml당 양)은 효과적인 트란스글루타미나제 반응이 이루어지도록 조절할 수 있다. 예를 들어, 몇몇 양태들에 따르면, 반응 혼합물에 존재하는 트란스글루타미나제의 농도(수지 1ml당 양)는 약 0.01 mg/ml 내지 약 1 mg/ml, 예컨대 약 0.01 mg/ml 내지 약 0.02 mg/ml, 약 0.02 mg/ml 내지 약 0.03 mg/ml, 약 0.03 mg/ml 내지 약 0.04 mg/ml, 약 0.04 mg/ml 내지 약 0.05 mg/ml, 약 0.05 mg/ml 내지 약 0.06 mg/ml, 약 0.06 mg/ml 내지 약 0.07 mg/ml, 약 0.07 mg/ml 내지 약 0.08 mg/ml, 약 0.08 mg/ml 내지 약 0.09 mg/ml, 약 0.09 mg/ml 내지 약 0.1 mg/ml, 약 0.1 mg/ml 내지 약 0.2 mg/ml, 약 0.2 mg/ml 내지 약 0.3 mg/ml, 약 0.3 mg/ml 내지 약 0.4 mg/ml, 약 0.4 mg/ml 내지 약 0.5 mg/ml, 약 0.5 mg/ml 내지 약 0.6 mg/ml, 약 0.6 mg/ml 내지 약 0.7 mg/ml, 약 0.7 mg/ml 내지 약 0.8 mg/ml, 약 0.8 mg/ml 내지 약 0.9 mg/ml, 약 0.9 mg/ml 내지 약 1 mg/ml 중 임의의 범위이다.
몇몇 양태들에 따르면, 접합체 모이어티와 Fc-함유 폴리펩타이드(예, 항체) 사이의 농도 비는 약 2:1 내지 약 800:1, 예컨대 비제한적으로 약 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1, 60:1, 70:1, 80:1, 90:1, 100:1, 200:1, 300:1, 400:1, 500:1, 600:1, 700:1, 및 800:1 중 임의의 비이다.
몇몇 양태들에 따르면, Fc-함유 폴리펩타이드(예, 항체)와 접합 모이어티의 접합 효율은 적어도 약 30%이다. 본원에 사용된, "접합 효율" 또는 "가교결합 효율"이란 용어는 조작된 폴리펩타이드 접합체의 실험적으로 측정된 양을 조작된 폴리펩타이드 접합체의 최대 예측량으로 나눈 비이다. 접합 효율 또는 가교결합 효율은 당업자에게 공지된 다양한 기술, 예컨대 소수성 상호작용 크로마토그래피로 측정할 수 있다. 접합 효율은 또한 다른 온도, 예컨대 실온 또는 37℃에서 측정할 수도 있다. 몇몇 양태들에 따르면, Fc-함유 폴리펩타이드 및 접합 모이어티의 접합 효율은 적어도 약 30% 내지 35%, 35% 내지 40%, 45% 내지 50%, 50% 내지 55%, 56% 내지 60%, 61% 내지 65%, 66% 내지 70%, 71% 내지 75%, 76% 내지 80%, 81% 내지 85%, 86% 내지 90%, 91% 내지 95%, 또는 96% 내지 99% 중 임의의 비율이다. 몇몇 양태들에 따르면, Fc-함유 폴리펩타이드와 접합 모이어티의 접합 효율은 적어도 약 32%, 34%, 36%, 38%, 40%, 42%, 44%, 46%, 48%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 중 임의의 비율이다.
TGase
TGase는 한 단백질의 리신 공여체 잔기와 다른 단백질의 수용체 글루타민 잔기 사이에 프로테이나제 내성 이소펩타이드 결합을 형성시켜 공유 단백질 가교결합을 촉진하고, 암모니아의 방출을 동반한다. 트란스글루타미나제의 촉매적 기전은 다음과 같이 제안되었다. 글루타민 함유 제1 기질(수용체 또는 Q-기질)은 효소에 결합한 후, TGase의 활성 중심에서 시스테인 잔기와 감마-글루타밀티오에스테르를 형성하고, 이는 아실효소 중간체로 알려져 있고, 암모니아 방출을 동반한다. 제2 기질(공여체 또는 K-기질)은 그 다음 아실효소 중간체에 결합하고 티오에스테르 결합을 공격한다. 산물(넵실론(감마-글루타밀)리신 이소펩타이드 가교에 의해 가교결합된 2개의 단백질)이 형성되고 방출된다. 이는 효소의 원형에 있는 활성 중심 Cys 잔기를 재형성시켜 다른 촉매작용의 사이클에 참여할 수 있게 한다. 공유 아실효소 중간체의 형성은 이들 반응에서 속도 제한 단계인 것으로 생각된다. 많은 트란스글루타미나제의 촉매성 3인조는 파파인-유사 Cys-His-Asp(여기서 His는 히스티딘이고 Asp는 아스파르트산이다)을 함유하고, 결정적으로 활성 중심 Cys으로부터 36잔기가 떨어진 위치에 트립토판(Trp) 잔기가 존재한다. 이와 반대로, 스트렙토버티실리움 속(상기 참조)에서 분리한 박테리아 TGase는 비전형적인 촉매성 3인조를 보유하며 다른 TGase의 파파인-유사 촉매성 3인조와 서열 상동성이 전혀 없다.
트란스글루타미나제는 다양한 생물 유기체, 예컨대 미생물에서 여러 종류가 보고되어 있다. 그 예로는 기니아 피그 간(GTGase), 어류 간(FTGase) 및 미생물(mTGase) 유래의 TGase와 임의의 재조합 TGase(rTGase)이다. 나열된 것 외에 다른 TGase도 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 유용한 TGase의 예로는 미생물 트란스글루타미나제, 예컨대 미국 특허 5,156,956에 개시된 바와 같은 스트렙토마이세스 모바라엔스(Streptomyces mobaraense), 스트렙토마이세스 신나모늄(Streptomyces cinnamoneum) 및 스트렙토마이세스 그리세오카늄(Streptomyces griseocarneum) 유래, 및 미국 특허 5,252,469에 개시된 스트렙토마이세스 라벤둘레(Streptomyces lavendulae) 및 JP2003199569에 개시된 스트렙토마이세스 라다카넘(Streptomyces ladakanum) 유래의 것을 포함한다. 다른 유용한 미생물 트란스글루타미나제는 바실러스 서브틸리스(미국 특허 5,731,183에 개시됨) 및 다양한 믹소마이세테스에서 분리되었다. 다른 유용한 미생물 트란스글루타미나제의 예는 WO96/06931(예, 바실러스 리디커스 유래의 트란스글루타미나제) 및 WO 96/22366에 개시된 것이다. 유용한 비-미생물 트란스글루타미나제로는 기니아 피그 간 트란스글루타미나제, 및 다양한 해양 근원, 예컨대 넙치류 참돔(EP 0555649에 개시), 및 일본 굴 Crassostrea gigas (미국 특허 5,736,356에 개시) 유래의 트란스글루타미나제를 포함한다. 예시적인 TGase는 박테리아 트란스글루타미나제(BTG)(예컨대, EC 2.3.2.13., 단백질-글루타민-감마-글루타밀트란스퍼라제)이다. 다른 예시적인 양태에서 TGase는 S.모바라엔스(S.mobaraense)에서 유래된 것이다. 다른 양태에서, TGase는 천연 TGase와 적어도 80% 서열 상동성을 가진 돌연변이(예, 조작된) TGase이다. 한 예는 스트렙토마이세스 모바라엔시스 유래의 재조합 박테라아 트란스글루타미나제(Zedira에서 입수용이, 독일 담스타트 소재)이다.
스트렙토마이세스 라다카넘 ATCC 27441 또는 NRRL 3191 mTgase는 Pre-Pro-mTgase로써 발현된다(GenBank 수탁번호 AY 241675). pre-pro-mTgase에는 410개의 아미노산 잔기가 있는데, 성숙 효소의 331개와 pre의 30개 및 pro의 49개로 이루어진다. pro 펩타이드는 성숙 효소의 강한 억제제이다. AY241675에 따라 디자인된 프라이머는 ATCC 27441DNA 유래의 pro-mTgase와 성숙 mTgase를 pET29b(+) 벡터의 Nde I 및 Xho I 부위에 클로닝하는데 사용했다. 활성 mTgase는 Pro-mTgase를 엔테로키나제 경쇄(EKL) 분해하거나 또는 성숙 mTgase를 리폴딩(refolding)하여 수득할 수 있다. 스트렙토마이세스 라다카넘 유래의 mTgase(TG_SL)는 스트렙토마이세스 모바라엔시스 유래의 mTgase(TG_SM, 아지노모토에서 ACTIVA®로 판매)와 매우 유사하며 아미노산 차이가 몇 개뿐이다(도 2에 제시된 정렬).
본원에 기술된 방법들에 사용된 트란스글루타미나제는 다양한 급원에서 수득하거나 제조할 수 있다. 몇몇 양태들에 따르면, 트란스글루타미나제는 효소의 구성 변화를 유도하고 효소 활성을 허용하는데 칼슘을 필요로 하는 칼슘 의존적 트란스글루타미나제이다. 예를 들어, 트란스글루타미나제는 기니아 피그 간에서 유래될 수 있고, 시중에서 입수할 수 있다(예컨대, Sigma-Aldrich(St Louis, Mo) 및 MP Biomedicals(Irvine, Calif.)). 몇몇 양태들에 따르면, 트란스글루타미나제는 효소 구성 변화를 유도하고 효소 활성을 허용하는데 칼슘을 필요로 하지 않는 칼슘 독립적 트란스글루타미나제이다. 몇몇 양태들에 따르면, 트란스글루타미나제는 미생물 게놈 유래의 미생물 트란스글루타미나제, 예컨대 스트렙토버티실리움 또는 스트렙토마이세스(예, 스트렙토마이세스 모바렌시스 또는 스트렙토버티실리움 모바렌시스) 유래의 트란스글루타미나제이다. 몇몇 양태들에 따르면, 트란스글루타미나제는 포유동물의 단백질(예, 인간 트란스글루타미나제), 박테리아 단백질, 식물 단백질, 진균 단백질(예, 오오마이세테스 및 악티노마이세테스 트란스글루타미나제) 또는 원핵생물 단백질이다. 몇몇 양태들에 따르면, 트란스글루타미나제는 마이크로코커스, 클로스트리디움, 튜롤프시스, 리조푸스, 모나스커스 또는 바실러스 유래이다.
적당한 TGase는 비제한적으로 박테리아 트란스글루타미나제(BTG), 예컨대 EC 참조 번호 EC 2.3.2.13(단백질-글루타민-γ-글루타밀트란스퍼라제)인 효소를 포함한다. 몇몇 양태들에 따르면, TGase는 스트렙토마이세스 라다카넘에서 유래하는 것이다(TG_SL, 서열번호 16, 도 2 참조). 몇몇 양태들에 따르면, TGase는 스트렙토마이세스 모바라엔시스 유래인 것이다(TG-SM, 서열번호 18, 도 2 참조). 몇몇 양태들에 따르면, TGase는 스트렙토마이세스 라다카넘 유래의 TGase를 기반으로 하는 재조합 TGase이다(TG_SL, 서열번호 17, 도 3 참조).
몇몇 양태들에 따르면, 본원에 기술된 방법들에 사용된 트란스글루타미나제는 재조합 기술을 이용하여 생산한 재조합 단백질이다.
몇몇 양태들에 따르면, 트란스글루타미나제는 야생형, 예컨대 서열번호 16의 서열을 가진 TGase이다. 몇몇 양태들에 따르면, 트란스글루타미나제는 서열번호 16의 서열을 가진 야생형 TGase를 함유하는 재조합 야생형 TGase이며, 여기서 재조합 야생형 TGase는 추가로 N-말단에 추가 프롤린과 경우에 따라 정제 태그(예컨대, 폴리히스티딘 태그)를 함유한다. 몇몇 양태들에 따르면, 트란스글루타미나제는 도 3에 도시된 바와 같은 서열번호 17의 서열을 가진 재조합 야생형 TGase이다. 야생형 트란스글루타미나제는 N-글리코실화 부위 옆에 위치한 수용체 글루타민에 대한 트란스글루타민화 반응을 촉매할 수 없다는 당업계의 일반적인 이해와는 반대로, 놀랍게도 이러한 반응이 본원에 기술된 특정 조건하에서 상당한 효능과 특이성으로 수행될 수 있다는 것이 발견되었다.
몇몇 양태들에 따르면, 트란스글루타미나제는 조작된 것이다. 몇몇 양태들에 따르면, 트란스글루타미나제는 N-글리코실화 부위에 근접 위치한 수용체 글루타민에 트란스글루타민화 반응을 수행하도록 특이적으로 디자인된 조작된 트란스글루타미나제이다. 이러한 조작된 트란스글루타미나제는 이하에 더 상세하게 설명된다.
몇몇 양태들에 따르면, 트란스글루타미나제는 정제된 단백질이다. 예를 들어, 몇몇 양태들에 따르면, 트란스글루타미나제는 적어도 약 50% 순수하다. 본원에 사용된 "순수" 또는 "정제된" 단백질은 다른 단백질 불순물이 없는 단백질(예, 트란스글루타미나제)을 의미한다. 몇몇 양태들에 따르면, 정제된 트란스글루타미나제는 적어도 약 55% 내지 60%, 60% 내지 65%, 65% 내지 70%, 70% 내지 75%, 75% 내지 80%, 80% 내지 85%, 85% 내지 90%, 90% 내지 95%, 95% 내지 98% 또는 99% 순수하다. 몇몇 양태들에 따르면, 정제된 트란스글루타미나제는 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 순수하다.
조작된 트란스글루타미나제
본 출원은 다른 관점으로써 N-글리코실화 부위에 근접한 수용체 글루타민에 대해 트란스글루타민화 반응을 수행하도록 특이적으로 디자인된 조작된 트란스글루타미나제를 제공한다. 본 발명자들은 TGase의 촉매성 잔기 Cys64(도 3)에 대한 Fc 영역의 글루타민 잔기(특이적으로 Q295)의 접근성을 증가시키기 위해 TGase의 기질 결합 포켓을 리모델링했고, Q295에서 트란스글루타민화 반응을 특이적으로 수행하는 조작된 TGase를 수득했다.
몇몇 양태들에 따르면, 조작된 TGase는 스트렙토마이세스 라달라넘 유래의 야생형 TGase(서열번호 16 또는 서열번호 17)를 기반으로 한다. 몇몇 양태들에 따르면, 조작된 TGase는 스트렙토마이세스 모바라엔시스 유래의 야생형 TGase를 기반으로 한다(서열번호 18). 스트렙토마이세스 라다카넘에서 분리된 TGase의 서열은 스트렙토마이세스 모바라엔시스의 서열과 동일한 아미노산 서열을 갖고 있고, 단 두 서열 사이에는 총 22개의 아미노산 차이가 있다[Yi-Sin Lin et al., Process Biochemistry 39(5), 591-598(2004)].
몇몇 양태들에 따르면, 조작된 트란스글루타미나제는 N-글리코실화된 Fc 영역에 있는 수용체 글루타민 부위에서 트란스글루타민화 반응을 특이적으로 수행한다. 본 문맥에 사용된 "특이적으로"란 용어는 Fc-함유 폴리펩타이드(예, 항체) 상의 다른 특이적 글루타민 잔기에 비해 N-글리코실화된 Fc 영역에 있는 하나 이상의 특이적 글루타민 잔기와 반응하는 TGase의 선호성을 의미한다.
즉, 예컨대 몇몇 양태들에 따르면, 접합체 모이어티에 Fc-함유 폴리펩타이드(예, 항체)를 접합시킬 수 있는 조작된 트란스글루타미나제가 제공되며, 상기 Fc-함유 폴리펩타이드(예, 항체)는 N-글리코실화된 Fc 영역을 함유하고, 이 N-글리코실화된 Fc 영역은 N-글리코실화 부위 옆에 위치한 수용체 글루타민 잔기를 함유하고, 반응 시, 접합체 모이어티는 수용체 글루타민 잔기를 통해 Fc-함유 폴리펩타이드(예, 항체)에 접합되고, 이 접합은 동일한 반응 조건하에서 야생형 트란스글루타미나제보다 적어도 약 10% 더 활성적이다. 몇몇 양태들에서, 조작된 TGase는 서열번호 16과 적어도 약 80% 동일성이 있고, 추가로 적어도 하나의 돌연변이(예, 치환, 결실 또는 삽입)를 함유한다.
몇몇 양태들에 따르면, 서열번호 16과 적어도 약 80%(예컨대, 적어도 약 85%, 90%, 95% 또는 95%) 동일성이 있는 아미노산 서열을 함유하는 조작된 트란스글루타미나제가 제공되고, 이 트란스글루타미나제는 D1-E4; P244-P247; 및 H279-H289로 이루어진 군으로부터 선택되는 결실을 함유한다. 몇몇 양태들에 따르면, D1-E4; P244-P247; 및 H279-H289로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 결실을 제외하고는 서열번호 16과 100% 동일한 아미노산 서열을 함유하는 조작된 트란스글루타미나제가 제공된다.
몇몇 양태들에 따르면, 서열번호 17과 적어도 약 80%(예컨대, 적어도 약 85%, 90%, 95% 또는 95%) 동일성이 있는 아미노산 서열을 함유하는 조작된 트란스글루타미나제가 제공되고, 이 트란스글루타미나제는 P1-E5; P245-P248; 및 H280-H290으로 이루어진 군으로부터 선택되는 결실을 함유한다. 몇몇 양태들에 따르면, P1-E5; P245-P248; 및 H280-H290으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 결실을 제외하고는 서열번호 17과 100% 동일한 아미노산 서열을 함유하는 조작된 트란스글루타미나제가 제공된다.
몇몇 양태들에 따르면, 서열번호 16과 적어도 약 80%(예컨대, 적어도 약 85%, 90%, 95% 또는 95%) 동일성이 있는 아미노산 서열을 함유하는 조작된 트란스글루타미나제가 제공되고, 이 트란스글루타미나제는 D1-E4의 결실; P244-P247의 결실; N282-L285의 결실; H279-A287의 G로의 치환; 및 A280-H289의 G로의 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 돌연변이를 함유한다. 몇몇 양태들에 따르면, D1-E4의 결실; P244-P247의 결실; N282-L285의 결실; H279-A287의 G로의 치환; 및 A280-H289의 G로의 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 돌연변이를 함유하는 것을 제외하고는 서열번호 16과 100% 동일한 아미노산 서열을 함유하는 조작된 트란스글루타미나제가 제공된다.
몇몇 양태에 따르면, 서열번호 17과 적어도 약 80%(예컨대, 적어도 약 85%, 90%, 95% 또는 95%) 동일성이 있는 아미노산 서열을 함유하는 조작된 트란스글루타미나제가 제공되고, 이 트란스글루타미나제는 P1-E5의 결실; P245-P248의 결실; N283-L286의 결실; H280-A288의 G로의 치환; 및 A281-H290의 G로의 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 돌연변이를 함유한다. 몇몇 양태들에 따르면, P1-E5의 결실; P245-P248의 결실; N283-L286의 결실; H280-A288의 G로의 치환; 및 A281-H290의 G로의 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 돌연변이를 함유하는 것을 제외하고는 서열번호 17과 100% 동일한 아미노산 서열을 함유하는 조작된 트란스글루타미나제가 제공된다.
몇몇 양태들에 따르면, D1-E4의 결실을 제외하고는 서열번호 16과 100% 동일한 아미노산 서열을 함유하는 조작된 트란스글루타미나제가 제공된다. 몇몇 양태들에 따르면, P244-P247의 결실을 제외하고는 서열번호 16과 100% 동일한 아미노산 서열을 함유하는 조작된 트란스글루타미나제가 제공된다. 몇몇 양태들에 따르면, H279-H289의 결실을 제외하고는 서열번호 16과 100% 동일한 아미노산 서열을 함유하는 조작된 트란스글루타미나제가 제공된다. 몇몇 양태들에 따르면, N282-L285의 결실을 제외하고는 서열번호 16과 100% 동일한 아미노산 서열을 함유하는 조작된 트란스글루타미나제가 제공된다. 몇몇 양태들에 따르면, D1-E4의 결실 및 N282-L285의 결실을 제외하고는 서열번호 16과 100% 동일한 아미노산 서열을 함유하는 조작된 트란스글루타미나제가 제공된다. 몇몇 양태들에 따르면, D1-E4의 결실, P244-P247의 결실 및 N282-L285의 결실을 제외하고는 서열번호 16과 100% 동일한 아미노산 서열을 함유하는 조작된 트란스글루타미나제가 제공된다. 몇몇 양태들에 따르면, D1-E4의 결실 및 H280 내지 A288의 G로의 치환을 제외하고는 서열번호 16과 100% 동일한 아미노산 서열을 함유하는 조작된 트란스글루타미나제가 제공된다. 몇몇 양태들에 따르면, D1-E4의 결실 및 A280-H289의 G로의 치환을 제외하고는 서열번호 16과 100% 동일한 아미노산 서열을 함유하는 조작된 트란스글루타미나제가 제공된다.
몇몇 양태들에 따르면, P1-E5의 결실을 제외하고는 서열번호 17과 100% 동일한 아미노산 서열을 함유하는 조작된 트란스글루타미나제가 제공된다. 몇몇 양태들에 따르면, P245-P248의 결실을 제외하고는 서열번호 17과 100% 동일한 아미노산 서열을 함유하는 조작된 트란스글루타미나제가 제공된다. 몇몇 양태들에 따르면, H280-H290의 결실을 제외하고는 서열번호 17과 100% 동일한 아미노산 서열을 함유하는 조작된 트란스글루타미나제가 제공된다. 몇몇 양태들에 따르면, N283-N286의 결실을 제외하고는 서열번호 17과 100% 동일한 아미노산 서열을 함유하는 조작된 트란스글루타미나제가 제공된다. 몇몇 양태들에 따르면, P1-E5의 결실 및 N283-N286의 결실을 제외하고는 서열번호 17과 100% 동일한 아미노산 서열을 함유하는 조작된 트란스글루타미나제가 제공된다. 몇몇 양태들에 따르면, P1-E5의 결실, P245-P248의 결실 및 N283-N286의 결실을 제외하고는 서열번호 17과 100% 동일한 아미노산 서열을 함유하는 조작된 트란스글루타미나제가 제공된다. 몇몇 양태들에 따르면, P1-E5의 결실 및 H280-A288의 G로의 치환을 제외하고는 서열번호 17과 100% 동일한 아미노산 서열을 함유하는 조작된 트란스글루타미나제가 제공된다. 몇몇 양태들에 따르면, P1-E5의 결실 및 A281-H290의 G로의 치환을 제외하고는 서열번호 17과 100% 동일한 아미노산 서열을 함유하는 조작된 트란스글루타미나제가 제공된다.
본원에서 호환해서 사용된 "서열 동일성" 또는 "동일성"이란 용어는 2 이상의 아미노산 잔기들의 스트링들 간에 정합(match)의 수에 의해 측정된, 펩타이드간 서열 관련성의 정도를 의미한다. 서열 동일성은 예컨대 특정 수학적 모델 또는 컴퓨터 프로그램(즉, "알고리듬")으로 갭(존재한다면)을 정렬시켜 더 적은 2 이상의 서열 간에 동일한 정합의 퍼센트를 통해 측정할 수 있다. 동일성을 측정하는 몇몇 방법들은 시험된 서열간에 최대의 정합을 제공하도록 디자인한다. 동일성을 측정하는 방법들은 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 프로그램으로 설명되어 있다. 두 서열간에 동일성을 측정하는 컴퓨터 프로그램 방법의 예로는 GCG 프로그램 패키지, 예컨대 GAP(Devereux et al., Nucl.Acid.Res. 12, 387(1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.), BLASTP, BLASTN 및 FASTA(Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-410(1990))를 포함한다. BLASTX 프로그램은 NCBI(National Center for Biotechnology Information) 및 기타 공급원(BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul et al., 상기 참조)으로부터 공개적으로 이용가능하다. 공지된 Smith Waterman 알고리듬도 동일성을 측정하는데 사용할 수 있다.
몇몇 양태들에 따르면, 조작된 트란스글루타미나제는 서열번호 16 또는 서열번호 18에 의해 암호화된 TGase보다 트란스글루타미나제 활성이 더 크다. 몇몇 양태들에 따르면, 조작된 트란스글루타미나제의 특이성 활성은 야생형 TGase(예컨대, 서열번호 16 또는 서열번호 17에 의해 암호화된 TGase)보다 적어도 약 1.25x, 1.5x, 2.0x, 2.5x, 3.0x, 3.5x, 4.0x, 4.5x, 5.0x, 5.5x, 6.0x, 6.5x, 7.0x, 7.5x, 8.0x, 8.5x, 9.0x, 9.5x 또는 10.5x 더 크다.
본원에 기술된 조작된 TGase는 당업계에 공지된 분석법을 사용하여 TGase 활성에 대해 분석할 수 있다. 예컨대, US 5,156,956은 주어진 펩타이드의 활성 측정이 Ca2 +의 부재하에 기질로써 벤질옥시카르보닐-L-글루타미닐 글리신 및 하이드록실아민을 사용하여 반응을 수행하고 트리클로로아세트산의 존재하에 결과적으로 수득되는 하이드록사믹 산과 철 착물을 형성하고, 525nm에서 흡광도를 측정하고, 활성을 계산하는 보정 곡선에 의해 하이드록사믹 산의 양을 측정하여 실시한다고 설명하고 있다. 본 명세서의 목적 상, 상기 분석에서 트란스글루타미나제 활성을 나타내는 펩타이드는 트란스글루타미나제 활성이 있는 것으로 간주한다. 특히, 본 발명의 펩타이드는 서열번호 16의 아미노산 서열을 가진 S.라다카넘 유래의 TGase와 30%가 넘는, 예컨대 50% 초과, 예컨대 70% 초과, 예컨대 90% 초과의 활성을 나타낸다.
또한, 본원에 기술된 조작된 TGase 중 어느 하나를 암호화하는 핵산(예, 분리된 핵산)도 제공된다. 본원에 사용된 "핵산"이란 용어는 cDNA, 게놈 DNA, 합성 DNA 또는 RNA 기원의 임의의 핵산 분자를 나타내는 것이다. 핵산은 일본쇄 또는 이본쇄일 수 있고, 당해의 단백질을 암호화하는 완전 또는 부분 자연 발생의 뉴클레오타이드 서열을 기반으로 할 수 있다. 핵산은 경우에 따라 다른 핵산 분절을 함유할 수 있다.
또한, 본원에 기술된 조작된 TGase를 암호화하는 핵산을 함유하는 재조합 벡터(예, 증폭 벡터 및/또는 발현 벡터)도 제공된다. 몇몇 양태들에 따르면, 재조합 벡터를 함유하는 숙주 세포도 제공된다.
조작된 TGase를 암호화하는 핵산을 함유하는 재조합 벡터는 편리하게는 재조합 DNA 절차로 처리될 수 있는 임의의 벡터일 수 있고, 벡터의 선택은 이것이 도입되는 숙주 세포에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 벡터는 자율 복제 벡터, 즉 복제가 염색체 복제와는 무관한, 염색체외 실체(entity)로써 존재하는 벡터일 수 있고, 예컨대 플라스미드이다. 대안적으로, 벡터는 숙주 세포에 도입되었을 때 숙주 세포 게놈 내로 통합되고 통합된 염색체(들)와 함께 복제되는 것일 수 있다. 이 벡터는 몇몇 양태에 따르면 조작된 TGase를 암호화하는 DNA 서열이 이 DNA의 전사에 필요한 추가 분절에 작동적으로 결합된 발현 벡터이다. "작동적으로 결합된"이란 용어는 분절들이 의도한 목적을 위해 함께 기능하도록 배열된 것을 나타내며, 예컨대 전사가 프로모터에서 개시하여 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 통해 진행하도록 배열된 것을 나타낸다. 프로모터는 최상의 숙주 세포에서 전사 활성을 나타내는 임의의 DNA 서열일 수 있고 숙주 세포에 동종성 또는 이종성인 단백질을 암호화하는 유전자에서 유래될 수 있다. 조작된 TGase를 암호화하는 DNA 서열은 또한 필요하다면 적당한 종결인자에 작동적으로 연결될 수도 있다.
몇몇 양태들에 따르면, 재조합 벡터는 추가로 벡터가 당해의 숙주 세포에서 복제할 수 있게 하는 DNA 서열(들) 및/또는 선택가능한 마커, 예컨대 산물이 숙주 세포의 결함을 보완하는 유전자, 예컨대 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR)를 암호화하는 유전자 또는 시조사카로마이세스 폼베 TPI 유전자(P.R.Russell, Gene 40, 125-130(1985)에 기술된 것), 또는 앰피실린, 카나마이신, 테트라사이클린, 클로람페니콜, 네오마이신, 하이그로마이신 또는 메토트렉세이트와 같은 약물에 대한 내성을 부여하는 유전자를 함유한다. 사상성 진균인 경우에는 선택가능한 마커는 amdS, pyrG, argB, niaD 및 sC를 포함한다.
조작된 TGase를 암호화하는 핵산을 함유하는 벡터가 도입된 숙주 세포는 조작된 TGase를 생산할 수 있는 임의의 세포일 수 있고, 박테리아, 효소, 진균 및 고등 진핵생물 세포를 포함한다. 상기 기술된 형질전환된 또는 형질감염된 숙주 세포는 그 다음 당해 펩타이드을 발현시킬 수 있는 조건하에 적당한 영양 배지에서 배양되고, 그 후 수득되는 단백질은 배양물로부터 회수한다. 몇몇 양태들에 따르면, 숙주 세포는 원핵생물 세포이다. 몇몇 양태들에 따르면, 숙주 세포는 S.라다카넘이다. 몇몇 양태들에 따르면, 숙주 세포는 S.모다라엔시스이다. 몇몇 양태들에 따르면, 숙주 세포는 이.콜리이다.
또한, 본원에 기술된 조작된 TGase를 제조하는 방법도 제공된다. 본원에 기술된 조작된 TGase는 여러 방식으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 몇몇 양태들에 따르면 조작된 TGase는 조작된 TGase를 암호화하는 핵산을 함유하는 벡터를 함유한 숙주 세포를 배양하는 단계 및 이 세포로부터 조작된 TGase를 분리하는 단계에 의해 제조된다.
본 발명의 단백질을 숙주 세포의 분비 경로로 유도하기 위해, 재조합 벡터에는 분비 시그널 서열(리더 서열, 프리프로 서열 또는 프리 서열이라고도 공지됨)을 제공할 수 있다. 분비 시그널 서열은 단백질을 암호화하는 DNA 서열에 정확한 리딩 프레임으로 결합된다. 분비 시그널 서열은 단백질을 암호화하는 DNA 서열에 일반적으로 5' 위치에 존재한다. 분비 시그널 서열은 보통 단백질과 결합되어 있을 수 있고, 또는 다른 분비된 단백질을 암호화하는 유전자에서 유래할 수 있다. 대안적으로, 단백질은 봉입체에서 발현될 수 있고, 이어서 변성/복원을 통해 수득할 수 있다.
세포를 배양하는데 사용된 배지는 숙주 세포의 성장에 적합한 임의의 통상적인 배지일 수 있고, 예컨대 적당한 보충제를 함유하는 최소 또는 복합 배지일 수 있다. 세포에 의해 생산된 단백질은 그 다음 통상적인 절차, 예컨대 원심분리 또는 여과에 의해 배지로부터 숙주 세포를 분리하거나, 상청액 또는 여액의 단백질성 성분을 황산암모늄과 같은 염을 이용하여 침전시키거나, 또는 당해의 단백질 종류에 따라 이온교환 크로마토그래피, 겔여과 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등과 같은 다양한 크로마토그래피 절차로 정제하여 배양 배지로부터 회수할 수 있다.
몇몇 양태들에 따르면, 본원에 기술된 TGase 중 어느 하나와 같은 TGase를 정제하는 방법이 제공된다. 몇몇 양태들에 따르면, 이 방법은 (a) TGase를 발현하는 숙주 세포를 준비하는 단계; (b) TGase가 봉입체로써 발현되는 상기 숙주 세포(예, 원핵생물 세포)를 배양하는 단계; (c) 상기 숙주 세포를 파괴하여 용해성 분획과 불용성 분획을 보유하는 세포 용해물을 생산하는 단계; 및 (d) 상기 용해성 분획을 상기 불용성 분획으로부터 분리하는 단계를 포함하고, 이 불용성 분획이 TGase를 함유한다. 몇몇 양태들에 따르면, 이 방법은 추가로 TGase를 함유하는 불용성 분획을 변성제(예, 우레아) 중에서 접촉시키는 단계를 포함한다. 몇몇 양태들에 따르면, 이 방법은 추가로 변성 TGase를 복원 완충액(예, DTT를 함유하는 완충액)에 첨가하는 단계를 포함한다. 몇몇 양태들에 따르면, 이 방법은 추가로 TGase를 크로마토그래피(예컨대, 친화성 크로마토그래피 또는 이온교환 크로마토그래피)로 정제하는 단계를 포함한다. 몇몇 양태들에 따르면, TGase는 정제를 용이하게 하기 위해 태그화(예컨대, his-태그화)한다.
몇몇 양태들에 따르면, (a) TGase의 프로-효소를 암호화하는 핵산을 함유하는 벡터를 함유한 숙주 세포(예컨대, 원핵생물 세포)를 배양하는 단계, 및 (b) 프로-효소의 프로-서열을 절단하여(예컨대, 엔도키나제 경쇄를 이용하여) 성숙한 TGase를 수득하는 단계를 포함하여, TGase를 정제하는 방법이 제공된다.
본원에 기술된 돌연변이 TGase는 Fc-함유 폴리펩타이드 접합체(예, 항체 약물 접합체)를 제조하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 몇몇 양태들에 따르면, 접합체 모이어티에 특이적으로 접합된 항체를 함유하는 항체 약물 접합체를 제조하는 방법으로써, 항체를 돌연변이 트란스글루타미나제(예, 본원에 기술된 임의의 돌연변이 트란스글루타미나제)의 존재하에 항체 약물 접합체를 생성하기에 충분한 조건하에서 접합체 모이어티와 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 접합체 모이어티는 항체 상의 수용체 글루타민 잔기에 접합되어 있는 것인, 방법이 제공된다. 몇몇 양태들에 따르면, 접합체 모이어티에 특이적으로 접합된 항체를 함유하는 항체 약물 접합체를 제조하는 방법으로써, 항체를 돌연변이 트란스글루타미나제(예, 본원에 기술된 임의의 돌연변이 트란스글루타미나제)의 존재하에 항체 약물 접합체를 생성하기에 충분한 조건하에서 접합체 모이어티와 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 항체는 Fc-영역에 글리코실화(예, N-글리코실화)가 되어있고, 상기 접합체 모이어티는 항체 상의 내인성 수용체 글루타민 잔기에 접합되는 것인, 방법이 제공된다. 몇몇 양태들에 따르면, 접합체 모이어티에 특이적으로 접합된 항체를 함유하는 항체 약물 접합체를 제조하는 방법으로써, 항체를 함유하는 조성물을 돌연변이 트란스글루타미나제(예, 본원에 기술된 임의의 돌연변이 트란스글루타미나제)의 존재하에 Fc-함유 폴리펩타이드 접합체를 생성하기에 충분한 조건하에서 접합체 모이어티와 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 조성물에 함유된 항체의 적어도 일부(예, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상)가 Fc 영역에 글리코실화(예, N-글리코실화)되어 있고, 상기 접합체 모이어티는 항체 상의 내인성 수용체 글루타민 잔기에 접합되는 것인, 방법이 제공된다.
몇몇 양태들에 따르면, 활성 모이어티 및 소분자 핸들을 함유하는 접합체 모이어티에 특이적으로 접합된 항체를 함유하는 항체 약물 접합체를 제조하는 방법으로써, a) 상기 항체를 트란스글루타미나제(예, 본원에 기술된 임의의 돌연변이 트란스글루타미나제)의 존재하에 소분자 핸들에 특이적으로 접합된 항체를 함유하는 중간 접합체를 생성하기에 충분한 조건하에서 소분자 핸들과 접촉시키는 단계, 및 b) 상기 중간 접합체를 활성 모이어티와 접촉시켜 항체 약물 접합체를 수득하는 단계를 포함하고, 상기 접합체 모이어티가 항체 상의 수용체 글루타민 잔기에 접합되는, 방법이 제공된다. 몇몇 양태들에 따르면, 활성 모이어티 및 소분자 핸들을 함유하는 접합체 모이어티에 특이적으로 접합된 항체를 함유하는 항체 약물 접합체를 제조하는 방법으로써, a) 항체를 트란스글루타미나제(예컨대, 전술한 임의의 돌연변이 트란스글루타미나제)의 존재하에 소분자 핸들에 특이적으로 접합된 항체를 함유하는 중간 접합체를 생성하기에 충분한 조건하에서 소분자 핸들과 접촉시키는 단계, 및 b) 상기 중간 접합체를 활성 모이어티와 접촉시켜 항체 약물 접합체를 수득하는 단계를 포함하고, 상기 항체는 Fc 영역에 글리코실화(예, N-글리코실화)가 되어 있고, 접합체 모이어티는 항체 상의 내인성 수용체 글루타민 잔기에 접합되는, 방법이 제공된다. 몇몇 양태들에 따르면, 활성 모이어티 및 소분자 핸들을 함유하는 접합체 모이어티에 특이적으로 접합된 항체를 함유하는 항체 약물 접합체를 제조하는 방법으로써, a) 항체를 함유하는 조성물을 트란스글루타미나제(예, 전술한 임의의 돌연변이 트란스글루타미나제)의 존재하에 상기 소분자 핸들에 특이적으로 접합된 항체를 함유하는 중간 접합체를 생성하기에 충분한 조건하에서 소분자 핸들과 접촉시키는 단계, b) 상기 중간 접합체를 활성 모이어티와 접촉시켜 항체 약물 접합체를 수득하는 단계를 포함하고, 상기 조성물에 존재하는 항체의 적어도 일부(예, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상)는 Fc 영역에 글리코실화(예, N-글리코실화)가 되어 있고, 접합체 모이어티는 항체 상의 내인성 수용체 글루타민 잔기에 접합되는 방법이 제공된다.
약학 조성물, 단위 용량 및 키트
또한, 본원에 기술된 Fc-함유 폴리펩타이드 접합체(예, 항체 약물 접합체)를 함유하는 약학 조성물이 제공된다. 몇몇 양태들에 따르면, 약학 조성물은 추가로 약학 허용성 운반체를 함유한다. 몇몇 양태들에 따르면, 약학 조성물에 존재하는 Fc-함유 폴리펩타이드 접합체(예, 항체 약물 접합체)의 적어도 약 50%(예컨대, 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%)는 Fc-함유 폴리펩타이드(예, 항체)에 부착된 하나의 접합체 모이어티를 보유한다. 몇몇 양태들에 따르면, 약학 조성물에 존재하는 Fc-함유 폴리펩타이드 접합체(예, 항체 약물 접합체)의 적어도 약 50%(예컨대, 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%)는 Fc-함유 폴리펩타이드(예, 항체)에 부착된 2개의 접합체 모이어티를 보유한다. 몇몇 양태들에 따르면, 약학 조성물에 존재하는 Fc-함유 폴리펩타이드 접합체(예, 항체 약물 접합체)의 적어도 약 50%(예컨대, 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%)는 Fc-함유 폴리펩타이드(예, 항체)에 부착된 하나 또는 2개의 접합체 모이어티를 보유한다.
본원에 사용된 "약학적 허용성 운반체"란 용어는 본 발명의 화합물(들)과 다른 임의의 성분을 의미한다. 부형제(들)의 선택은 대부분 특정 투여 방식, 용해성 및 안정성에 대한 부형제의 효과 및 투약량 형태의 본성과 같은 요인에 따라 달라진다. 본원에 사용된 "약학적 허용성 운반체"는 생리적으로 적합한 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 약학적 허용성 부형제의 몇가지 예는 물, 식염수, 인산염 완충 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등뿐만 아니라 이의 배합물이다. 몇몇 양태들에서, 등장제, 예컨대 비제한적으로 당, 폴리알코올(예, 만니톨, 소르비톨) 또는 염화나트륨은 약학 조성물에 포함된다. 약학적 허용성 물질의 또 다른 예는 비제한적으로 항체의 저장수명 또는 유효성을 증진시키는, 습윤제, 또는 소량의 보조 물질, 예컨대 습윤화 또는 유화 제제, 보존제 또는 완충액을 포함한다.
몇몇 양태들에 따르면, 본원에 기술된 Fc-함유 폴리펩타이드 접합체(예, 항체 약물 접합체)는 PCT 공개번호 WO 98/52976 및 WO 00/34317에 기술된 바와 같은 공지된 기술을 사용하여 피검체에게 투여 시 면역원성을 감소시키도록 탈면역화될 수 있다.
본원에 기술된 약학 조성물은 벌크(bulk), 단일 단위 용량으로써 또는 복수의 단일 단위 용량으로써 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 본원에 사용된, "단위 용량"은 소정량의 활성 성분을 함유하는 약학 조성물의 분리된 양이다. 활성 성분의 양은 일반적으로 피검체에게 투여될 수 있는 활성 성분의 투약량 또는 이러한 투약량의 편리한 분획, 예컨대 1/2 또는 1/3 투약량과 동일하다. 당업계에서 허용되는 펩타이드, 단백질 또는 항체를 투여하는 모든 방법은 본원에 개시된 Fc-함유 폴리펩타이드 접합체에도 적당하게 이용될 수 있다.
본원에 기술된 약학 조성물은 몇몇 양태들에 따르면, 비경구 투여에 적합하다. 약학 조성물의 비경구 투여는 피검체 조직이 물리적 개공(breaching) 및 이 개공을 통해 조직 내로 약학 조성물의 투여를 특징으로 하는 임의의 투여 경로를 포함하고, 그 결과 일반적으로 혈류, 근육 또는 내부 기관 내로 직접 투여된다. 예를 들어, 비경구 투여는 비제한적으로 조성물의 주사, 외과적 절개를 통한 조성물의 적용, 조직 침투성 비외과적 상처를 통한 조성물의 적용 등에 의한 약학 조성물의 투여를 포함한다. 특히, 비경구 투여는 비제한적으로 피하, 복강내, 근육내, 흉골내, 정맥내, 동맥내, 척추강내, 심실내, 자궁내, 두개내, 활막내 주사 또는 주입; 및 신장 투석 주입 기술을 포함한다. 몇몇 양태들에 따르면, 비경구 투여는 정맥내 또는 피하 경로이다.
비경구 투여에 적합한 약학 조성물의 제형은 볼러스(bolus) 투여 또는 연속 투여에 적합한 형태로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 주사성 제형은 단위 투약 형태, 예컨대 앰플 또는 보존제를 함유하는 다용량 용기로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 비경구 투여용 제형은 비제한적으로 현탁액, 용액, 오일 또는 수성 매개제 중의 유제, 페이스트 등을 포함한다. 이러한 제형은 추가로 하나 이상의 추가 성분, 예컨대 비제한적으로 제제를 현탁, 안정화 또는 분산시키는 성분을 함유할 수 있다. 비경구 투여용 제형의 한 양태에 따르면, 활성 성분은 적당한 매개제(예, 멸균된 발열원이 없는 물)로 재구성되는 무수(즉, 분말 또는 과립) 형태로 제공되고, 그 후 재구성된 조성물이 비경구 투여된다. 비경구 제형은 또한 염, 탄수화물 및 완충화제(바람직하게는 pH 3 내지 9)와 같은 부형제를 함유할 수 있는 수성 용액을 포함하지만, 더 적합하게는 멸균된 발열원이 없는 물과 같은 적당한 매개제와 함께 사용되는 무수 형태 또는 멸균된 비수성 용액으로 조제될 수도 있다. 비경구 투여 형태의 예로는 멸균 수성 용액 중의 현탁액 또는 용액, 예컨대 수성 프로필렌 글리콜 용액 또는 덱스트로스 용액을 포함한다. 이러한 투약 형태는 필요하다면 적당히 완충될 수 있다. 다른 유용한 비경구 투여성 제형은 활성 성분을 미세결정형 형태 또는 리포좀 제제로 함유하는 것을 포함한다. 비경구 투여용 제형은 즉시 방출 및/또는 조작된 방출형으로 조제될 수 있다. 조작 방출 제형은 조절, 지연, 지속, 맥동형, 표적화된 및 프로그램된 방출 제형을 포함한다. 예를 들어, 한 관점에 따르면, 멸균 주사성 용액은 Fc-함유 폴리펩타이드 접합체, 예컨대 항체-약물 접합체 또는 이중특이성 항체-약물 접합체를 필요하다면 앞서 열거한 하나의 성분 또는 성분들의 조합과 함께 적당한 용매에 첨가한 뒤, 여과 멸균하여 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 기본 분산 매질 및 앞서 열거한 것 중에서 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 매개제에 첨가하여 제조한다. 멸균 주사성 용액을 제조하기 위한 멸균 분말의 경우, 예시적인 제조 방법은 상기 멸균 여과된 용액으로부터 활성 성분과 임의의 바람직한 추가 성분의 분말을 산출하는 진공 건조 및 동결 건조이다. 용액의 적당한 유동성은 예컨대 레시틴과 같은 코팅을 사용하여, 분산액의 경우에는 필요한 입자 크기의 유지를 통해, 그리고 계면활성제를 사용하여 유지할 수 있다. 주사성 조성물의 장기적인 흡수는 조성물에 흡수를 지연시키는 제제, 예컨대 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 첨가하여 야기할 수 있다.
Fc-함유 폴리펩타이드 접합체(예, 항체 약물 접합체)의 예시적인 비제한적 약학 조성물은 pH가 약 5.0 내지 약 6.5 범위이고 본원에 개시된 조작된 폴리펩타이드 접합체 약 1mg/ml 내지 약 200 mg/ml, 히스티딘 완충액 약 1 mmol 내지 약 100 mmol, 폴리소르베이트 80 약 0.01 mg/ml 내지 약 10 mg/ml, 트레할로스 약 100 mmol 내지 약 400 mmol 및 디소듐 EDTA 탈수화물 약 0.01 mmol 내지 약 1.0 mmol을 함유하는 멸균 수용액과 같은 제형이다.
투약 요법은 최적의 원하는 반응을 제공하도록 조정할 수 있다. 예를 들어, 단일 볼러스를 투여할 수 있거나, 여러 분할 용량을 경시적으로 투여할 수 있거나, 또는 치료 상황의 위급에 따라 표시된 바대로 비례적으로 감소 또는 증가시킬 수 있다. 특히, 용이한 투여 및 투약량의 균일성을 위한 투약 단위 형태로 비경구 조성물을 제조하는 것이 유리하다. 본원에 사용된 투약 단위 형태는 치료받는 환자/피검체에게 단위 투약량으로써 적합한 물리적으로 분리된 단위를 의미하며; 각 단위는 필요한 약학적 운반체와 함께 원하는 치료 효과를 산출하는 것으로 계산된 소정량의 활성 화합물을 함유한다. 본 발명의 투약 단위 형태에 대한 세부사항은 (a) 제제 모이어티(예, 세포독성제와 같은 소분자)의 고유한 특성 및 달성하고자 하는 특별한 치료 또는 예방 효과, 및 (b) 개체의 민감성을 치료하기 위해 상기 활성 화합물을 배합하는 기술 고유의 문제점에 의해 일반적으로 좌우되고 직접 달라진다.
당업자는 본원에 제공된 개시내용에 따라 용량 및 투약 요법이 치료 분야에 공지된 방법에 따라 조정된다는 것을 이해할 것이다. 즉, 환자에게 검출가능한 치료 이익을 제공하기 위한 각 제제의 투여 요건들은 일시적일 수 있는 바, 최대 허용 용량은 쉽게 확립할 수 있고, 환자에게 검출가능한 치료 이익을 제공하는 유효량도 측정할 수 있다. 따라서, 특정 용량 및 투여 요법은 본원에서 예시되지만, 이러한 예들은 본 발명을 수행하는데 있어서 환자에게 제공할 수 있는 용량 및 투여 요법을 제한하려는 것이 전혀 아니다.
특히, 투여량 값들은 경감되어야 하는 상태의 종류 및 중증도에 따라 달라질 수 있고 단일 용량 또는 다회 용량을 포함할 수 있다. 또한, 임의의 특정 피검체마다 특정한 투여량 요법은 개개인의 필요 및 조성물을 투여하거나 투여를 감독하는 자의 전문적인 판단에 따라 경시적으로 조정되어야 하고, 본원에 제시된 투여량 범위는 예시적일뿐이며 청구한 조성물의 범위 또는 실시를 제한하려는 것이 아님을 이해해야 한다. 또한, 본 발명의 조성물을 이용한 투여량 요법은 다양한 요인들, 예컨대 질병의 종류, 연령, 체중, 성별, 환자의 의학적 상태, 상태의 중증도, 투여 경로 및 이용된 특정 항체를 기반으로 할 수 있다. 따라서, 투여량 요법은 광범위하게 변동될 수 있지만, 표준 방법을 사용하여 통상적으로 결정할 수 있다. 예를 들어, 용량은 독성 효과 및/또는 실험실 값과 같은 임상 효과를 포함할 수 있는 약동학적 또는 약력학적 파라미터를 기반으로 하여 조정할 수 있다. 따라서, 본 발명은 당업자에게 의해 측정된 환자내 용량-단계별 투여를 포함한다. 적당한 투여량 및 요법의 결정은 관련 업계에 공지되어 있고 본원에 개시된 교시를 통해 당업자라면 금방 포함되는 투여량 및 용량을 이해할 것이다.
또한, 본 발명은 전술한 질병의 치료에 사용하기 위한 키트(또는 제조 물품)를 제공한다. 본 발명의 키트는 질환을 치료하기 위한 Fc-함유 폴리펩타이드 접합체(예, 항체 약물 접합체)를 함유하는 하나 이상의 용기를 포함한다. 예를 들어, 지침서는 암(예, 췌장암, 난소암, 결장암, 유방암, 전립선암 또는 폐암)과 같은 질환을 치료하는 조작된 Fc-함유 폴리펩타이드 접합체(예, 항체 약물 접합체)의 투여에 대한 설명을 포함한다. 키트는 추가로 개체가 질병이 있는지, 그리고 질병 단계를 동정하는 것을 기반으로 한 치료에 적합한 개체의 선택에 대한 설명을 포함할 수도 있다. 조작된 Fc-함유 폴리펩타이드 접합체(예, 항체 약물 접합체)의 사용에 관한 지침서는 일반적으로 의도한 치료에 대한 투여량, 용량투여 계획 및 투여 경로에 관한 정보를 포함한다. 용기는 단위 용량, 벌크 패키지(예, 다회용량 패키지) 또는 소단위 용량일 수 있다. 본 발명의 키트에 공급된 지침서는 일반적으로 라벨 또는 패키지 인서트(예컨대, 키트에 포함된 종이)에 기재된 지침들이지만, 기계-판독성 지침(예컨대, 자기 또는 광학 저장 디스크에 담긴 지침)도 사용가능하다. 본 발명의 키트는 적당한 패키지로 포장되어 있다. 적당한 패키지로는 바이엘, 보틀, 병(jar), 가요성 패키지(예컨대, 밀봉된 Mylar 또는 플라스틱 백) 및 이의 유사물을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 또한, 특정 장치, 예컨대 흡입기, 비측 투여 장치(예, 아토마이저) 또는 미니펌프와 같은 주입 장치와 함께 사용되는 패키지도 고찰된다. 키트는 멸균 입구를 보유할 수 있다(예컨대, 용기는 정맥내 용액 백(bag) 또는 피하 주사 바늘로 찌를 수 있는, 스토퍼를 가진 바이엘일 수 있다). 또한, 용기는 멸균 입구를 보유할 수 있다(예컨대, 용기는 정맥내 용액 백(bag) 또는 피하 주사 바늘로 찌를 수 있는, 스토퍼를 가진 바이엘일 수 있다). 조성물 중의 적어도 하나의 활성 제제는 본원에 기술된, 조작된 폴리펩타이드이다. 또한, 용기는 제2의 약학적 활성 제제를 함유할 수도 있다. 키트는 경우에 따라 완충액과 같은 추가 성분 및 설명서를 제공할 수 있다. 보통, 키트는 용기 및 이 용기 위 또는 용기와 관련된 라벨 또는 패키지 인서트(들)를 함유한다.
몇몇 양태들에 따르면, TGase(예컨대, 조작된 TGase, 예컨대 본원에 설명된 조작된 TGase 중 어느 하나)를 함유하는 키트가 제공된다. 몇몇 양태들에 따르면, 이 키트는 추가로 트란스글루타민화 반응을 수행하기 위한 다른 시약도 함유한다. 몇몇 양태들에 따르면, 이 키트는 추가로 본원에 기술된 접합 방법 중 어느 하나를 수행하는 것에 관한 지침서를 함유한다. 몇몇 양태들에 따르면, 키트는 추가로 TGase(예컨대, 조작된 TGase) 또는 Fc-함유 폴리펩타이드(예, 항체)를 고정시키기 위한 고체 지지체를 함유한다. 몇몇 양태들에 따르면, 키트 중의 TGase(예컨대, 조작된 TGase)는 고체 지지체 위에 고정된다.
실시예
본 발명은 이하 실시예를 참고로 하여 더 상세히 이해할 수 있을 것이며, 이 실시예는 예시적이고, 제한하려는 것이 아니다.
실시예 1. TGase 돌연변이체의 생성
본 실시예는 TGase 돌연변이체의 생성을 설명한다. 도 3을 참고로 하여, 활성 부위 입구 부근의 3개의 영역이 삭제 또는 돌연변이되어 기질 결합 포켓을 확장시켰다. 야생형 TG_SL은 초과 프롤린과 함께 NdeI 및 XhoI을 사용하여 pET39+ 벡터에 클로닝했다(서열번호 17). IgG1 및 TG_SM 도킹(docking)을 기반으로 하여 다음과 같은 결실 돌연변이체를 제조했다: 돌연변이체 1: P1-E5의 결실; 돌연변이체 2: P245-P248의 결실; 돌연변이체 3: N283-L286의 결실; 돌연변이체 4: P1-E5 및 N283-L286의 결실; 돌연변이체 5: 돌연변이체 1, 2 및 3에서 특정된 3 영역 전부의 결실; 돌연변이체 6: P1-E5의 결실 및 H280-A288의 G로의 교체; 돌연변이체 7: P1-E5의 결실 및 A281-H290의 G로의 교체. 결실 영역은 도 3에 도시된 바와 같이 회색, 밑줄 없는 부분 또는 지움 표시 부분이다. 이 돌연변이체들은 IgG1에 대해 더 활성적이었다.
PCR 주형으로써 S. 라다카넘(ATCC27441)으로부터 정제된 DNA를 사용하여, 야생형 프로- 또는 성숙 mTGase(야생형 TG_SL)를 암호화하는 DNA 서열 및 이의 돌연변이체 1 내지 3(상기 참조)은 NdeI 및 BamHI 부위에서 pET39b 벡터에 클로닝했다. 각 벡터들로 형질전환된 이.콜리 BL21(DE3) 세포로부터 성숙 야생형 TG_SL 및 돌연변이체 1 내지 3의 봉입체를 수득했다. 8M 우레아에 가용화한 후, 야생형 TG_SL 및 돌연변이체는 복원 완충액(1mM DTT, 50mM Tris, pH 8.0)에 희석하여 리폴딩시켰다. 또한, 효소는 Ni-NTA 및 양이온 교환 컬럼으로 정제했다. 대안적으로, Pro-mTgase는 이.콜리에서 용해성 불활성 프로-효소로써 발현되었다. 그 다음, 활성 효소는 엔도키나제 경쇄(EKL)로 프로 도메인을 절단한 후 수득했다.
실시예 2. mTgase에 의해 촉매화된 모노단실카다베린(MDC)와 IgG1의 접합
MDC는 1차 아민을 보유하고 이의 형광성이 쉽게 모니터될 수 있기 때문에 본 실험에 선택했다. MDC는 여기서 mAB에 대한 접합을 증명하는데 사용된다. Tris-완충액(pH 6.5-8.5) 중의 정제된 IgG1(1 내지 10mg/ml)에 DMSO 중의 MDC(Sigma-Aldrich)를 1 내지 5mM의 최종 농도로 첨가한다(최종 DMSO 2 내지 10%). 정제된 야생형 TG_SL 또는 이의 돌연변이체는 0.05 내지 1.0mg/ml의 최종 농도로 첨가한다. 반응 혼합물을 37℃에서 항온처리한다. 반응은 페닐 소수성 상호작용 컬럼(PHIC, Tosoh Bioscience LLC)을 사용하여 HPLC로 추적했다. 반응 초기에 산물은 주로 IgG1의 한 중쇄만이 DMC와 커플링하고 있는 DAR1이었다. 반응이 진행될수록, IgG1의 두 중쇄가 MDC와 커플링하고 있는 DAR2가 주요 산물이 되었다. 반응 말기로 갈수록(pH 7, mTgase 0.2mg/ml에서 8시간), 접합 수율은 DAR2가 80%에 달하고, DAR1이 20% 남아 있거나, 또는 샘플이 10mM TCEP에 의해 환원되어 C4-1000A 컬럼(Vydac)에서 분석되었을 때에는 중쇄(HC)가 90%였다(도 6 참조). MDC의 HC에 대한 선택적인 접합은 SDS PAGE로 가시화했다(도 7). 다른 mTgase들, 예컨대 S.모바라엔시스(Ajinomoto의 Activa TI로부터 정제됨) 유래의 TG_SM도 시험했다. 야생형 TGase도 고농도(>0.1mg/ml)에서 ADC 반응을 촉진시킬 수 있을지라도, 돌연변이체들은 IgG1에 대하여 야생형보다 더 활성적이었다. 또한, TG_SM(Ajinomoto에서 판매하고 Pfizer 및 Innate Pharma에서 사용)도 고농도에서 작용하지만, TG_SL에 비해 약 30% 활성만을 나타내는 것으로 발견되었다.
실시예 3. mTgase 촉매작용에 의한 1kDa mPEG-NH2에 의한 IgG1의 Peg화
본 실험은 본질적으로 실시예 2에 기술된 바와 같이 수행했다. 아실 수용체 MDC는 pH 7.0에서 1kDa 메톡시-PEG-아민(JenKem, USA)으로 1 내지 2mM 최종 농도로 교체하여, PEG화된 IgG1을 수득했다. 37℃에서 밤새 반응시킨 샘플은 TCEP로 환원 후 C4 컬럼에서 분석한 결과, 중쇄가 90% 변형된 것으로 나타났다.
실시예 4. 고정된 mTgase에 의해 촉진된 모노단실카다베린(MDC)과 IgG1의 접합
mTgase 제거를 간단하게 하고 효소를 재사용하기 위해, 고정된 mTgase를 촉매작용에 사용했다. 고정된 mTgase의 컬럼을 제조하는 데에는 제조업자의 프로토콜에 따라 각 NHS 활성화된 HITRAP® HP 컬럼 1.0ml (GE)에 대해 탄산염 완충액(pH 8.3) 중의 15mg/ml mTgase 1ml를 사용했다. 트리스 완충액(pH 6 내지 8.0)에 1 내지 10mg/ml의 정제된 IgG1 0.5ml를 1 내지 5mM의 MDC와 함께 HITRAP®-mTgase 컬럼에 주입했다. 이 컬럼의 양 말단을 밀봉하고 37℃에서 밤새 항온처리했다. 다음날, 반응 혼합물은 트리스 완충액으로 용출시켰다. 컬럼은 다음 접합 반응을 위해 1 내지 2mM TCEP로 활성화시켰다. 각각 사용한 후에 고정된 mTgase의 활성의 손실은 전혀 없었다. 각 진행마다 90% HC의 수율이 달성되었고, 이는 유리 mTgase 하에 수득되는 수율과 유사했다.
실시예 5. mTgase에 의해 촉진된 세포독소와 IgG1 , 2 및 4의 접합
아민 링커를 가진 독소는 MDC와 마찬가지로 1단계 프로토콜에 따라 IgG1에 접합될 수 있다(도 4). 링커는 -(CH2)n-NH2(여기서, n은 리신 측쇄에서처럼 4 이상이다)처럼 간단할지라도, 에틸렌 글리콜 스캐폴드의 사용은 링커-약물의 용해성을 증가시키고 접합 반응을 촉진시킬 수 있다. 본 실시예는 IgG1에 대한 MAY-PEG4(비절단성 링커, 도 8) 및 MAY-PVCL(절단성 링커, 도 9)의 접합을 입증한다.
MW가 896.42Da인 1차 아민 기와 연장된 비절단성 선형 PEG 링커를 함유하는 메이탄신 유도체는 도 8에 도시했다. DMSO 중의 MAY-PEG4는 1 내지 2mM의 최종 농도로 IgG1(pH 8.0 트리스 완충액 중에 1 내지 10mg/ml)에 첨가했다. mTgase는 0.2 내지 1.0mg/ml의 최종 농도로 첨가했고, 반응은 37℃에서 항온처리했다. 반응은 실시예 2에 기술된 바와 같이 HPLC 분석으로 모니터했다. 하룻밤 후, 60% 변형된 중쇄 수율이 수득된다. DAR1 및 DAR2 산물 모두가 관찰되었다(도 10).
자가-희생 기를 가진 절단성 링커 및 분자량 1224.58 Da의 말단 리신을 함유하는 메이탄신 유도체는 도 9에 도시했다. 접합 반응은 MAY-PEG4를 MAY-PVCL(1.0mg/ml)로 교체하여 전술한 바와 같은 방식으로 진행했다. 37℃에서 8시간 동안 항온처리한 후, 40%의 중쇄는 변형되었다(도 11). 낮은 수율은 약물의 낮은 용해성에 기인하는 것이다.
실시예 6. 약물 대 항체 비(DAR) 측정 및 IgG1 상의 접합 부위 맵핑
글리칸 사슬의 불균일성으로 인해, IgG1은 이의 질량 스펙트럼에서 다수의 피크를 나타낼 것이다. 질량 분석을 간단히 하기 위해, 모든 mAB 접합체를 PNGaseF(Promega, Madison, WI)를 이용하여 질량분광분석하기 전에 탈글리코실화하여, 같은 하전의 각 종마다 단일 피크가 관찰될 것이다. 이렇게 함으로써, 아스파라긴(N)에 결합한 초기 글리칸은 아스파테이트(D)로 변한다.
DAR1 및 DAR2의 질량 확인. 실시예 5로부터 IgG1-MAY-PEG4의 예측된 DAR1 및 DAR2는 페닐 HIC 상에서 정제했다. 탈글리코실화 후, 샘플은 196개 웰 강철판 위에 점적하고, MALDI-TOF(ABI4700, Applied Biosystems, Redwood City, CA) 상에서 분석했다. 대조군으로, 미접합 IgG1을 사용했다(DAR0). 질량 스펙트럼은 포지티브 High Mass 선형 방식으로 획득하고, 분자량 계산을 위해 복수 하전을 띤 종(이중 및 삼중)을 사용했다. MAY-PEG4 약물은 분자량이 896 Da이었다. 따라서, IgG1에 대한 MAY-PEG4 한 분자의 접합(DAR1)은 예측된 질량 차이 879Da(896 - NH3의 17 손실 = 879Da)을 산출할 것이고, 반면 IgG1에 대한 두 분자의 접합(DAR2)은 1758Da의 질량 차이를 산출할 것이다. 도 10에서 MALDI-TOF 스펙트럼은 DAR1 및 DAR2를 확인시켜주었다.
중쇄에만 접합 확인. 약물 분자가 경쇄(LC)가 아닌 IgG1의 중쇄(HC)에 접합되었는지를 확인하기 위해, 실시예 5로부터 IgG1-MAY-PVCL의 정제된 DAR2를 탈글리코실화하고, 20mM DTT로 37℃에서 30분 동안 환원시켰다. 질량 스펙트럼은 ABI4700을 사용하여 포지티브 High Mass 선형 방식으로 획득했다. MAY-PVCL 약물의 분자량은 1224Da이었다. 따라서, 중쇄에 하나의 MAY-PVCL의 접합은 1207Da(1224-17 = 1207Da)의 예측된 질량차를 산출할 것이고, 경쇄 분자량에는 어떠한 차이도 나타나지 않을 것이다(도 11). 한편, DAR1은 질량 스펙트럼에 미접합 HC 및 HC-MAY-PVCL 피크가 둘 다 존재하여, DAR1은 하나의 HC 접합형만을 보유한다는 것을 시사한다.
Q295에서 부위 특이적 접합을 입증하는 펩타이드 맵핑. 실시예 2로부터 정제된 DAR2(MDC를 함유하는 IgG1의 두 중쇄) 및 미접합 IgG1을 탈글리코실화하고, 환원시킨 뒤, 알킬화하고, 트립신 및/또는 키모트립신(Promega, Madison, WI)을 이용하여 펩타이드로 분해하고, 역상크로마토그래피(C18)로 분리한 뒤 질량분광분석했다. 분해된 펩타이드는 328nm(MDC의 λmax)에서 UV 흡광도를 이용하여 HPLC로 모니터했다. 328nm에서 단 하나의 피크는 DAR2 샘플에서 동정되었고, 반면 대조용 항체에서 피크가 검출되지 않았다. MALDI-TOF 분석은 이 피크를 트립신 분해 유래의 단일 하전된 펩타이드 EEQYDSTYR 또는 글루타민 298(순차적 Q298, 카벳 번호매김 시스템에 의해서는 Q295)을 함유하고 정확하게 하나의 MDC를 보유하는 키모트립신 분해 유래의 NAKTKPREEY로써 동정했다(관찰된 1508.7 - 1190.5 펩타이드 + 335 MDC - 17 NH3 = 318 Da; 관찰된 1681.9 - 1363.3 펩타이드 = 318) (표 1의 회색 줄). 추가 접합 부위로써 다른 글루타민(Q298 외에)을 제외하기 위해, 전체 펩타이드 맵핑 실험을 미변형 IgG1 및 IgG1-MDC 접합체를 이용하여 수행했다. 분해된 샘플은 정제하지 않고 직접 분석하여 중쇄에서 모든 글루타민-함유 펩타이드를 확인했다. 총 16개 글루타민 중에서 Q298은 DMC가 부착된 유일한 접합 부위였고(표 1), 반면 다른 모든 글루타민 함유 펩타이드는 변함없이 남아 있었다.
Figure 112017001507016-pct00001
* 주 : 순차적 Q298 및 카벳 번호매김 시스템에 의해서는 Q295이다. N300(또는 Kabat N297)은 탈글리코실화되었을 때 D300이 되었다.
실제 세포독소가 사용되었을 때 IgG1 상의 특이적 접합 부위로써 Q298을 확인하기 위해, MAY-PEG4 및 TAM1(아민 링커를 가진 튜불리신 A 유도체)의 IgG1 접합체를 탈글리코실화하고, 환원시킨 뒤, 알킬화하고, 트립신을 이용하여 펩타이드로 분해하고, 역상 크로마토그래피로 분리한 뒤, 질량분광법으로 분석했다. Q298을 함유하는 동일한 펩타이드 EEQYNSTYR이 하나의 약물 분자가 부착된 것과 대등한 질량을 가진 IgG1-TAM1 접합체 및 IgG1-MAY-PEG4 접합체 모두에서 동정되었다: 각각 2134.0(1190.5 + 960.5 - 17) 및 2069.8(1190.5 + 895.5 - 17)(표 2).
트립신 분해 후 동정된 Q298 함유 펩타이드
펩타이드
 펩타이드 위치
 글루타민
(Q)
 예측된 질량
 IgG1 IgG1-TAM1 IgG1-MAY-PEG4
관찰된 질량 관찰된 질량 관찰된 질량
EEQYDSTRY 296-304 Q298 1190.5 1190.5 2134.0(1190.5 + 960.5 - 17) 2069.8(1190.5 + 895.5 - 17)
실시예 7. mTGase에 의해 촉진된 IgG 서브클래스들의 접합
정제된 인간 IgG2 또는 IgG4는 트리스 완충액(pH 7.0 내지 8.0)에서 1 내지 10mg/ml로 만들어 정제된 mTgase 0.1 내지 1 mg/ml를 첨가한 후 MDC 2 내지 5mM과 반응시켰다. 혼합물을 37℃에서 8 내지 16시간 동안 항온처리한 뒤, 페닐 소수성 상호작용 컬럼에서 분석하거나, C4 컬럼에서 10mM TCEP로 환원시켰다. IgG1과 유사하게, IgG2 및 IgG4를 MDC에 접합시켜 경시적으로 축적되는 DAR1 및 DAR2를 확인했다(도 6).
실시예 8. mTGase를 이용하여 항체 약물 접합체를 제조하는 2단계 프로토콜
1단계 접합 반응은 간단하고 직선적인 반면, 수율은 약물의 용해성에 의해 영향을 받는다. 약물 농도가 낮으면, 탈아미드화 유래의 부산물이 상당할 수 있다. 탈아미드화를 억제하기 위해 mTgase에 의해 촉진되는 제1 단계 접합에 화학적 핸들을 함유하는 고도로 용해성 아민을 과량으로 사용했다(화학적 핸들 : mAb의 몰 비 >10). 그 다음, 약물 분자를 제2 단계에서 화학선택적 결찰 반응을 통해 mAB에 가교결합시켰다(도 5). 많은 화학선택적 쌍이 사용될 수 있다:
아미노-옥시-/알데하이드 또는 케톤
설프하이드릴/말레이미드
아지드/알킨
아미노 프로필 아세탈을 통한 mTgase에 의한 PEG의 IgG1 접합. pH 7.0-8.0 트리스 완충액 중의 1-10mg/ml IgG1에 최종 2 내지 50mM의 3-아미노프로피온알데하이드 디에틸 아세탈(CAS# 41365-75-7) 및 0.05 내지 0.5mg/ml의 mTgase를 첨가한다. 반응 혼합물을 반응이 완료될 때까지 37℃에서 2 내지 16시간 동안 항온처리했다. 과량의 아세탈을 제거하기 위해 정용여과한 후, pH를 실온에서 포름산 또는 HCl로 2 내지 10시간 동안 2 내지 4로 조정하여 알데하이드 기를 재생시켰다. IgG1-알데하이드의 pH는 탄산나트륨으로 다시 5 내지 8로 조정한다. 아미노-옥시-PEG(20kDa)를 3 내지 4배의 IgG1(몰 비) + 촉매 50 내지 100 mM 아닐린 또는 10mM 5-메톡시안트라닐산에 첨가한다. 실온에서 밤새 항온처리한 후, IgG1-(PEG20k)2는 95%의 수율에 도달했다.
아민 -아지드를 통한 mTgase에 의한 약물의 IgG1 접합. pH 7.0-8.0 트리스 완충액 중의 1 내지 10mg/ml IgG1에 3-아지도-1-프로판아민(CAS# 88192-19-2)을 2 내지 50mM의 최종 농도로, 그리고 mTgase를 0.05 내지 0.5 mg/ml로 첨가한다. 반응 혼합물을 37℃에서 2 내지 16시간 동안 항온처리했다. 수율은 100%에 이르렀다. 과량의 아지도 프로필 아민을 제거하기 위해 정용여과한 후, DBCO-메이탄신을 IgG의 3배(몰 기준)로 첨가했다. IgG1-(메이탄신)2 수율은 95% 이상이었다.
실시예 9. mTgase에 의해 제조된 ADC 효능을 평가하기 위한 시험관내 세포 분석
SK-BR-3 세포는 96웰 흑색 투명 바닥 평판에서 10K 세포/웰로 접종하고 24시간 동안 배양했다. 세포는 2배 연속 희석된 항체-약물 접합체로 3반복으로 96시간 동안 처리했다. 세포 생육성은 CELLTITER™ Blue 세포 생육성 분석(Promega, Madison, WI)으로 측정했다. 상대적 세포 생육성은 미처리 대조군의 백분율로 측정했다. IC50은 XLfit로부터 4개의 파라미터 기호논리학 모델을 사용하여 계산했다. 표 3은 다양한 트라스투주마브-약물 접합체를 이용하여 SK-BR-3 세포에서 측정한 약물 대 항체 비 및 IC50을 나타낸다.
SK-BR-3 세포에서 항체-약물 접합체의 IC50
약물 DAR IC50 (㎍/ml ADC) IC50 (nM 약물 당량)
ADC-TAM1 DAR1 0.033 0.22
ADC-TAM1 DAR2 0.017 0.22
ADC-MAY-PEG4 DAR1 0.046 0.31
ADC-MAY-PEG4 DAR2 0.028 0.38
ADC-MAY-PVCL DAR1 0.081 0.54
ADC-MAY-PVCL DAR2 0.055 0.72
실시예 10. 안정한 비절단성 링커와 mTase에 의해 제조된 부위-특이적 ADC는 이종이식 마우스에서 매우 안정하고 강력하다.
트라스트주마브(10mg/ml) 및 모노메틸 아우리스타틴 E(MMAE)는 각각 9개의 비절단성 PEG 링커(CH2CH2O)x(x=2,4,6,8,10,12,16,20 및 24, 도 12)와 각각 실시예 5에 기술된 바와 같이 접합시켰다. ADC는 mTgase 및 과량의 MMAE를 제거하는 단백질 A 컬럼으로 정제했다. 평균 DAR은 환원된 ADC 샘플이 C4 컬럼에서 HPLC로 분석했을 때 약 1.9였다. SK-BR-3 세포 기반의 분석에서, 이 ADC들은 IC50이 38 내지 148 pM로 모두 강력했다(표 4).
SK-BR-3 또는 BT474 세포에서 트라스투주마브-MMAE 접합체의 IC50(pM)
링커 IC50 SK-BR-3 IC50 BT474 링커 IC50 SK-BR-3 IC50 BT474
PEG2 148 1095 PEG12 38 267
PEG4 61 273 PEG16 40 281
PEG6 50 234 PEG20 72 495
PEG8 42 230 PEG24 114 807
PEG10 40 271 PEG3c 60 283
BT474 이종이식 마우스를 사용하여 생체내 시험하기 위해 6가지 트라스투주마브-MMAE 접합체를 선택했다. 세포를 주입하기 2 내지 3일 전에 에스트로겐 3mm 1정(60일 서방형, Innovative Research of America)을 무흉선 누드 마우스 암컷(4주, 18-22g; Harlan)에 각각 이식했다. BT474 세포는 최종 50 내지 60 x106 세포/ml로 재현탁시키고, 마트리겔과 1:1로 혼합한 뒤, 200㎕를 각 마우스의 옆구리에 피하 주사했다. 3주 후 종양 부피(1/2 x L x W x H)가 약 200㎣에 도달하면 치료를 시작한다. ADC는 PBS 완충액에 최종 농도가 1mg/ml가 되게 희석하고 10mg/kg 용량이 되도록 약 200㎕씩 마우스 꼬리로 정맥내 투여했다. 종양 크기는 디지털 캘리퍼스로 매일 측정했다. 링커 PEG6 및 8이 BT474 세포 기반 분석에서 최적인 것으로 보이지만(표 4), 생체내 효능의 차이는 매우 작다(도 13).
6개 ADC 모두 강력하기 때문에, PEG12 링커를 가진 하나의 ADC만을 혈액내 안정성에 대해 시험했다. 에스트로겐 정제를 사용하지 않은 것을 제외하고는 마우스당 약 5x106 세포를 이용하여 BT474 이종이식 마우스와 유사한 방식으로 NCI N87 이종이식 마우스를 만들었다. ADC 투여 후, 마우스 꼬리를 찔러서 20㎕의 혈액 샘플을 1 내지 2일마다 21일까지 채취하고, 저장 완충액(10mM EDTA 및 0.1M NH4Cl 함유 PBS) 120㎕와 혼합했다. 그 다음, 총 트라스투주마브 및 ADC는 샌드위치 ELISA로 분석했다. 흑색 NUNC® Maxisorp 96 평판은 Her2 단백질로 100ng/웰씩 코팅했다. 샘플은 필요한 경우 PBS로 추가 희석하여 10pg 내지 2ng(트라스투주마브 또는 ADC)의 선형 검출 범위가 되게 조정했다. 샘플(새로운 ADC 희석물을 사용하여 총 mAb 및 ADC 기준으로 사용했다)을 적용하고 세척한 후, 래빗 폴리클로널 항-트라스투주마브(총 mAb) 또는 항-MMAE(총 ADC)를 2차 항체로 적용하는 한편, 염소 항-래빗 IgG-HRP(Life-technologies)는 검출 항체로써 사용했다. AMPLEX® Red(Cayman Chemical)/4-요오도페놀(Sigma)/H2O2 혼합물은 형광 기질로써 사용했다. 평판은 555nm Ex 및 585nm Em으로 SpectraMax GEMINI™에서 판독했다. ADC/mAb vs 시간의 비는 도 14에 플로팅했다. 안정한 비절단성 링커를 가진 부위 특이적 ADC가 혈액에서 완전히 안정하다는 것이 분명하다.
실시예 11. 절단성 링커와 mTgase에 의해 제조된 DAR 2 부위 특이적 ADC는 이종이식 모델에서 시판 TDM-1보다 더 안정적이고 강력하다.
절단성 PEG3c 링커를 이용하여 트라스투주마브(10mg/ml)와 MMAE(도 12)를 실시예 10에 기술된 바와 같이 접합시키고 정제했다. 이 ADC는 TP3cE라 명명했고, 1.9의 DAR을 보유하며 시험관내에서 높은 효능을 나타냈다(표 4). 생체내 연구는 NCI N87 모델과 SK_Ov3 이종이식 모델에서 TDM-1(Genetech)과 비교하여 수행했다. NCI N87 모델에서 TP3cE는 단일 정맥내 주사 시, TDM-1보다 4배 더 효능적이다(도 15). 혈액 샘플 분석은 TP3cE가 최대 21일 동안 혈액에서 완전하게 안정적인 반면, TDM-1은 5일 후 독성의 50%를 상실했다(도 16). SK_Ov3 이종이식편에서, TP3cE는 15 또는 8 mg/kg의 3회 주간 용량에서 완전한 종양 경감을 초래한 반면, TDM-1은 15mg/kg에서만 효능을 나타냈다(도 17).
실시예 12. 2단계 방법으로 mTgase에 의해 제조된 DAR 4 부위 특이적 ADC
트라스투주마브(10mg/ml) 및 하나의 아민 기와 2개의 아지드 기를 가진 3-암 PEG 링커 그룹(1-5kDa) 각각(도 18: 상단; Conju-probe 및 Jenken)(4-8mg/ml)을 실시예 10에 기술된 바와 같이 접합시키고 각각 정제했다. 항체-링커 접합 반응은 C4 컬럼을 사용하여 HPLC로 분석했을 때 >90% 변환을 달성했다.
그 다음 상기 산물 중 하나, 트라스투주마브-3-암-PEG(1kDa)(1-10mg/ml)에 5배 몰 과량의 알킨-PEG4c-MMAE(도 18, 하단 패널)를, 0.1-1mM CuSO4 및 1-5mM 아스코르브산 나트륨의 존재하에 10 내지 300분 동안 커플링시켰다. 최종 DAR4 ADC 산물(TP6TP4cE라 명명)을 그 다음 실시예 10에 기술된 바와 같이 단백질 A로 정제했고, 실제 DAR은 C4 컬럼을 이용한 HPLC로 측정했을 때 3.8이었다. TP6TP4cE의 시험관내 활성은 표 5에 나타낸 바와 같이 DAR2의 TP3cE보다 높다.
BT474 세포에서 트라스투주마브-MMAE 접합체의 IC50(pM)
링커 DAR IC50 BT474
TP3cE 2 280
TP6TP4cE 3.8 80

Claims (29)

  1. 항체 상의 내인성 수용체 글루타민 잔기를 통해 접합 모이어티(moiety)에 접합된 항체를 함유하고, Fc 영역에 글리코실화 되어 있는 것으로,
    상기 수용체 글루타민 잔기는 위치 295번에 있고, N-글리코실화 부위는 위치 297번에 있으며, 넘버링은 Kabat 지수에 따르며, 항체는 트라스투주마브이고, 접합 모이어티는 하기를 포함하는 것으로,
    i) 하기와 같이 표시되는 모노메틸 아우리스타틴 E(MMAE) 및 비절단성 PEG 링커(x=2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 20, 24)
    Figure 112022050414923-pct00020
    ; 또는
    ii) 하기와 같이 표시되는 MMAE 및 절단성 PEG3c 링커
    Figure 112022050414923-pct00021
    ; 또는
    iii) 하기와 같이 표시되는 3-암(arm) PEG 링커(n=7-38)
    Figure 112022050414923-pct00022
    , 및 하기와 같이 표시되는 알킨-PEG4-MMAE
    Figure 112022050414923-pct00023
    ,
    여기서 알킨-PEG4-MMAE은 트라스투주마브-3-암-PEG와 아지드/알킨 쌍을 통해 결합되는 것인, 항체 약물 접합체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체는 인간 항체인 것인, 항체 약물 접합체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 항체는 인간화된 항체인 것인, 항체 약물 접합체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 항체의 두 중쇄들은 접합 모이어티에 접합되는 것인, 항체 약물 접합체.
  5. 제1항에 있어서, 상기 접합 모이어티는 하기와 같이 표시되는 것인, 항체 약물 접합체:
    Figure 112022059639482-pct00024
    .
  6. 활성 성분으로서 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체 약물 접합체를 함유하는 암 치료용 약학적 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 조성물에 존재하는 항체 약물 접합체의 80% 이상은 1:1 또는 1:2의 항체 대 접합 모이어티의 몰 비를 갖는 것인, 암 치료용 약학적 조성물.
  8. 항체 조성물을 0.01 mg/ml 내지 5 mg/ml의 트란스글루타미나제의 존재하에, 접합 모이어티와 접촉시키는 단계를 포함하고, 조성물 중 항체의 약 50% 이상이 Fc 영역에 글리코실화되고, 상기 접합 모이어티는 항체 상의 내인성 수용체 글루타민 잔기에 접합되는 것인, 접합 모이어티에 접합된 항체를 함유하는 것으로,
    상기 수용체 글루타민 잔기는 위치 295번에 있고, N-글리코실화 부위는 위치 297번에 있으며, 넘버링은 Kabat 지수에 따르며, 항체는 트라스투주마브이고, 접합 모이어티는 하기를 포함하는 것으로,
    i) 하기와 같이 표시되는 모노메틸 아우리스타틴 E(MMAE) 및 비절단성 PEG 링커(x=2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 20, 24)
    Figure 112022050414923-pct00025
    ; 또는
    ii) 하기와 같이 표시되는 MMAE 및 절단성 PEG3c 링커
    Figure 112022050414923-pct00026
    ; 또는
    iii) 하기와 같이 표시되는 3-암(arm) PEG 링커(n=7-38)
    Figure 112022050414923-pct00027
    , 및 하기와 같이 표시되는 알킨-PEG4-MMAE
    Figure 112022050414923-pct00028
    ,
    여기서 알킨-PEG4-MMAE은 트라스투주마브-3-암-PEG와 아지드/알킨 쌍을 통해 결합되는 것이며, 트란스글루타미나제가 D1-E4; P244-P247; 및 N282-L285로 이루어진 군으로부터 선택되는 결실을 서열번호 16에 도입함으로써 수득된 아미노산 서열을 포함하는 조작된 트란스글루타미나제인, 항체 약물 접합체를 제조하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 접합 모이어티는 3-암 PEG 링커 및 활성 모이어티를 포함하고, 여기서 방법은
    a) 항체 조성물을 0.01 mg/ml 내지 5 mg/ml의 트란스글루타미나제의 존재하에 3-암 PEG 링커와 접촉시키는 단계, 및
    b) 상기 중간 접합체를 활성 모이어티와 접촉시켜 항체 약물 접합체를 수득하고, 접합 모이어티가 항체 상의 내인성 수용체 글루타민 잔기에 접합되는 단계를 포함하는 항체 약물 접합체를 제조하는 방법.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 트란스글루타미나제는 약 90% 이상의 순도를 갖는 것인, 방법.
  11. 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 트란스글루타미나제와 항체 조성물의 몰 비는 약 10:1 내지 약 1:10인 것인, 방법.
  12. 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 트란스글루타미나제는 고체 지지체 상에 고정된 것인, 방법.
  13. 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 항체는 고체 지지체 상에 고정되어 있는 것인, 방법.
  14. 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 항체는 인간 항체 또는 인간화된 항체인 것인, 방법.
  15. 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 접합 모이어티는 하기와 같이 표시되는 것인 방법:
    Figure 112022050414923-pct00029
    .
  16. Fc-함유 폴리펩타이드를 접합 모이어티에 접합시킬 수 있는 조작된 트란스글루타미나제로서,
    상기 Fc-함유 폴리펩타이드는 N-글리코실화된 Fc 영역을 함유하고,
    상기 N-글리코실화된 Fc 영역은 N-글리코실화 부위 옆에 위치한 수용체 글루타민 잔기를 함유하고,
    반응시, 접합 모이어티가 수용체 글루타민 잔기를 통해 Fc-함유 폴리펩타이드에 접합되며,
    상기 수용체 글루타민 잔기는 위치 295번에 있고, N-글리코실화 부위는 위치 297번에 있으며, 넘버링은 Kabat 지수에 따르며,
    이 접합이 동일한 반응 조건하에서 야생형 트란스글루타미나제보다 약 10% 이상 더 활성적이고, 조작된 트란스글루타미나제는 D1-E4; P244-P247; 및 N282-L285로 이루어진 군으로부터 선택되는 결실을 서열번호 16에 도입함으로써 수득된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 조작된 트란스글루타미나제.
  17. 삭제
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