ES2914093T3 - Conjugados homogéneos de anticuerpo y fármaco mediante métodos enzimáticos - Google Patents

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Abstract

Un conjugado de anticuerpo y fármaco que comprende un anticuerpo conjugado con una fracción de conjugado a través de un resto de glutamina aceptora endógeno en el anticuerpo flanqueado por un sitio de N-glucosilación en la región Fc, en donde el conjugado de anticuerpo y fármaco está N-glucosilado en el sitio de N-glucosilación en la región Fc, y en donde el resto de glutamina aceptora endógeno está en la posición 295 y el sitio de N-glucosilación está en la posición 297 de una cadena pesada del anticuerpo, en donde la numeración es de acuerdo con el índice EU como en Kabat, en donde el anticuerpo es trastuzumab y la fracción de conjugado comprende: (i) PEGx-MMAE que tiene la estructura: **(Ver fórmula)** en donde x es 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 20 o 24; (ii) PEG3c-MMAE que tiene la estructura: **(Ver fórmula)** o (iii) un enlazador PEG de 3 brazos: **(Ver fórmula)** en donde n es 7-38 y un alquino-PEG4c-MMAE: **(Ver fórmula)** en donde cada uno de los grupos azida en el enlazador PEG de 3 brazos está conjugado con un alquino-PEG4c- MMAE.

Description

DESCRIPCIÓN
Conjugados homogéneos de anticuerpo y fármaco mediante métodos enzimáticos
Antecedentes
Las terapias basadas en anticuerpos han jugado un papel importante en la terapia dirigida para varios trastornos, tales como el cáncer y enfermedades infecciosas. En los últimos años, los conjugados de anticuerpo y fármaco (ADC, del inglés "antibody drug conjugates") se han explorado ampliamente para la administración eficaz de fármacos en los sitios diana. Por ejemplo, la modificación química se ha utilizado ampliamente para conjugar fármacos con anticuerpos a través de aminas de cadena lateral de lisina o a través de grupos sulfhidrilo de cisteína. Sin embargo, estos métodos de conjugación con frecuencia conducían a una mezcla heterogénea de conjugados que tenían diferentes proporciones molares de fármaco a anticuerpo, sitios de conjugación no específicos, así como diferente eficacia, seguridad y farmacocinética. Véase Tanaka etal., FEBS Letters 579:2092-2096 (2005). También se han creado restos de cisteína reactivos genomanipulados en sitios específicos de anticuerpos para la conjugación de fármacos específicos con estequiometría definida. Véase Junutula et al., Nature Biotechnology, 26: 925-932 (2008). Sin embargo, la expresión y la conjugación de dichos anticuerpos genomanipulados con cisteína y conjugados de anticuerpo y fármaco necesitan procedimientos de reacción largos y complicados. Véase, por ejemplo, Gomez et al., Biotechnology and Bioengineering, 105(4): 748-760 (2009). Los agregados de anticuerpos también pueden generarse durante el proceso de elaboración de los anticuerpos genomanipulados con cisteína y los conjugados de anticuerpo y fármaco. También se han incorporado restos de aminoácidos no naturales en anticuerpos como identificadores químicos para la conjugación específica del sitio. Véase Axupa et al., PNAS, 109: 16101-16106 (2012). Para implementar esta metodología, un par ortogonal de ARNt supresor de ámbar y aminoacil-ARNt sintetasa tiene que integrarse primero en un hospedador de expresión. A continuación, el anticuerpo mutante se puede expresar en este hospedador especial con un complemento medio del aminoácido no natural. Este proceso no solo requiere mucho tiempo, sino que también tiene un rendimiento de expresión de anticuerpos muy bajo.
Recientemente, se han explorado enfoques enzimáticos para preparar ADC utilizando una transglutaminasa. Las transglutaminasas (TGasa) transfieren una fracción que tiene un grupo donante de amina a un resto de glutamina aceptora a través de la transglutaminación. Los anticuerpos IgG de longitud completa de isotipo humano contienen un resto de glutamina conservado en la posición 295 de la cadena pesada (Q295). Debido a que este resto de glutamina está muy cerca de un sitio de N-glucosilación (N297), generalmente se creía que Q295 en el anticuerpo de longitud completa era inaccesible para la TGasa cuando el anticuerpo estaba N-glucosilado. Para permitir que la TGasa actúe sobre los anticuerpos de longitud completa, la región Fc del anticuerpo se desglucosiló o mutó para eliminar el sitio de N-glucosilación antes de la conjugación mediada por TGasa. Véase el documento WO2013/092998. Como alternativa, se han insertado "marcadores" de secuencia que contienen glutamina en las cadenas ligera o pesada de los anticuerpos para proporcionar sitios aceptores de glutamina. Véase el documento WO2012059882. Se proporciona una revisión de los métodos disponibles para preparar conjugados de anticuerpo y fármaco tales como conjugados de MMAE y trastuzumab en Sochaj A. M., Swiderska K. W., Otlewski J. Current methods for the synthesis of homogeneous antibody-drug conjugates. Biotechnol Adv. 1 de noviembre de 2015; 33(6 Pt 1):775-84. doi: 10.1016/j.biotechadv.2015.05.001. Publicación electrónica 14 de mayo de 2015. PMID: 25981886.
Por lo tanto, todas las tecnologías actuales de ADC específicos del sitio se basan en mutantes de anticuerpos genomanipulados, lo que puede dar lugar a una posible inmunogenicidad e inestabilidad in vivo. Existe una gran necesidad de una herramienta de conjugación de anticuerpos específica del sitio eficaz donde el anticuerpo inalterado se pueda utilizar directamente.
Sumario de la invención
La invención se define en la reivindicación 1. Los aspectos y realizaciones preferentes adicionales se definen en las reivindicaciones dependientes. Cualquier aspecto, realización y ejemplo de la presente divulgación que no esté dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas no forma parte de la invención y se proporciona meramente con fines ilustrativos.
La presente invención proporciona un conjugado de anticuerpo y fármaco que comprende un anticuerpo conjugado con una fracción de conjugado a través de un resto de glutamina aceptora endógeno en el anticuerpo flanqueado por un sitio de N-glucosilación en la región Fc, en donde el conjugado de anticuerpo y fármaco está N-glucosilado en el sitio de N-glucosilación en la región Fc, y en donde el resto de glutamina aceptora endógeno está en la posición 295 y el sitio de N-glucosilación está en la posición 297 de una cadena pesada del anticuerpo, en donde la numeración es de acuerdo con el índice EU como en Kabat, en donde el anticuerpo es trastuzumab y la fracción de conjugado comprende:
(i) PEGx-MMAE que tiene la estructura:
Figure imgf000003_0001
en donde x es 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 20 o 24;
(ii) PEG3c-MMAE que tiene la estructura:
Figure imgf000003_0002
o
(iii) un enlazador PEG de 3 brazos:
Figure imgf000003_0003
en donde n es 7-38 y un alquino-PEG4c-MMAE:
Figure imgf000003_0004
en donde cada uno de los grupos azida en el enlazador PEG de 3 brazos esta conjugado con un alquino-PEG4c-MMAE.
En el presente documento se describe un conjugado polipeptídico que contiene Fc que comprende un polipéptido que contiene Fc conjugado de manera específica en el sitio con una fracción de conjugado, en donde el polipéptido que contiene Fc comprende una región Fc N-glucosilada, en donde la región Fc N-glucosilada comprende un resto de glutamina aceptora flanqueado por un sitio de N-glucosilación, y en donde la fracción de conjugado se conjuga con el polipéptido que contiene Fc a través del resto de glutamina aceptora.
En algunos ejemplos, el resto de glutamina aceptora está flanqueado por un sitio de N-glucosilación en la posición 2 con respecto al resto de glutamina. En algunos ejemplos, la región Fc N-glucosilada comprende los aminoácidos 290 a 300 de una cadena pesada de inmunoglobulina, en donde la numeración está de acuerdo con el índice de Kabat. En algunos ejemplos, la región Fc N-glucosilada es la región Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina de origen natural.
En algunos ejemplos, la inmunoglobulina se selecciona del grupo que consiste en IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. En algunos ejemplos, el polipéptido que contiene Fc es una cadena pesada de inmunoglobulina. En algunos ejemplos, el polipéptido que contiene Fc es un anticuerpo de longitud completa. En algunos ejemplos, el anticuerpo es un anticuerpo humano o humanizado. En algunos ejemplos, ambas cadenas pesadas del anticuerpo se conjugan con la fracción de conjugado. En algunos ejemplos, el resto de glutamina aceptora está en la posición 295 y el sitio de N-glucosilación está en la posición 297, en donde la numeración está de acuerdo con el índice de Kabat.
En algunos ejemplos, la fracción de conjugado comprende una fracción activa seleccionada del grupo que consiste en: una fracción que mejora la propiedad farmacocinética del polipéptido que contiene Fc, una fracción terapéutica y una fracción de diagnóstico. En algunos ejemplos, la fracción activa es una toxina.
En algunos ejemplos, el polipéptido que contiene Fc y la fracción de conjugado se conjugan a través de un enlazador, tal como un enlazador de escisión o un enlazador no escindible.
En el presente documento también se describe una composición que comprende uno cualquiera de los conjugados polipeptídicos que contienen Fc descritos anteriormente, en donde al menos aproximadamente un 50 % (por ejemplo, al menos aproximadamente cualquiera de un 60 %, un 70 %, un 80 %, un 90 % o un 95 %) de los conjugados polipeptídicos que contienen Fc en la composición están glucosilados en la región Fc. En algunos ejemplos, al menos aproximadamente un 50 % (por ejemplo, al menos aproximadamente cualquiera de un 60 %, un 70 %, un 80 %, un 90 % o un 95 %) de los conjugados polipeptídicos que contienen Fc tienen una relación molar entre el polipéptido que contiene Fc y la fracción de conjugado de 1:1 o 1:2.
En el presente documento también se describe un conjugado de anticuerpo y fármaco que comprende un anticuerpo conjugado con una fracción de conjugación a través de un resto de glutamina aceptora endógeno en el anticuerpo, en donde el conjugado de anticuerpo y fármaco está glucosilado en la región Fc. En algunos ejemplos, el conjugado de anticuerpo y fármaco está N-glucosilado en la región Fc. En algunos ejemplos, el anticuerpo es un anticuerpo humano. En algunos ejemplos, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado.
En algunos ejemplos de acuerdo con uno cualquiera de los conjugados de anticuerpo y fármaco descritos anteriormente, ambas cadenas pesadas del anticuerpo se conjugan con la fracción de conjugado.
En algunos ejemplos de acuerdo con uno cualquiera de los conjugados de anticuerpo y fármaco descritos anteriormente, la fracción de conjugado comprende una fracción activa seleccionada del grupo que consiste en: una fracción que mejora la propiedad farmacocinética del anticuerpo, una fracción terapéutica y una fracción de diagnóstico. En algunos ejemplos, la fracción activa es una toxina.
En algunos ejemplos de acuerdo con uno cualquiera de los conjugados de anticuerpo y fármaco descritos anteriormente, el anticuerpo y la fracción de conjugado se conjugan a través de un enlazador. En algunos ejemplos, el enlazador es un enlazador escindible. En algunos ejemplos, el enlazador es un enlazador no escindible.
En el presente documento también se describe una composición que comprende uno cualquiera de los conjugados de anticuerpo y fármaco descritos anteriormente, en donde al menos aproximadamente un 50 % (por ejemplo, al menos aproximadamente cualquiera de un 60 %, un 70 %, un 80 %, un 90 % o un 95 %) de los conjugados de anticuerpo y fármaco en la composición están glucosilados en la región Fc. En algunos ejemplos, al menos un 80 % de los conjugados de anticuerpo y fármaco en la composición tienen una relación molar de anticuerpo a fracción de conjugado de 1:1 o 1:2.
En el presente documento también se describe un método para preparar un conjugado polipeptídico que contiene Fc que comprende un polipéptido que contiene Fc conjugado de manera específica con una fracción de conjugado que comprende: hacer reaccionar el polipéptido que contiene Fc con la fracción de conjugado en presencia de una transglutaminasa en una condición que es suficiente para generar el conjugado polipeptídico que contiene Fc, en donde el polipéptido que contiene Fc comprende una región Fc N-glucosilada, en donde la región Fc N-glucosilada comprende un resto de glutamina aceptora flanqueado por un sitio de N-glucosilación, y en donde la fracción de conjugado se conjuga con el polipéptido que contiene Fc a través del resto de glutamina aceptora.
En el presente documento también se describe un método para preparar un conjugado polipeptídico que contiene Fc que comprende un polipéptido que contiene Fc conjugado de manera específica con una fracción de conjugado que comprende un identificador de molécula pequeña y una fracción activa que comprende: a) hacer reaccionar el polipéptido que contiene Fc con el identificador de molécula pequeña en presencia de una transglutaminasa en una condición que es suficiente para generar un conjugado intermedio que comprende un polipéptido que contiene Fc conjugado de manera específica con el identificador de molécula pequeña, y b) acoplar el conjugado intermedio con una fracción activa obteniendo así el conjugado polipeptídico que contiene Fc, en donde el polipéptido que contiene Fc comprende una región Fc N-glucosilada, en donde la región Fc N-glucosilada comprende un resto de glutamina aceptora flanqueado por un sitio de N-glucosilación, y en donde la fracción de conjugado se conjuga con el polipéptido que contiene Fc a través del resto de glutamina aceptora. En algunos ejemplos, la transglutaminasa es una transglutaminasa de tipo silvestre que tiene la secuencia de aminoácidos de s Eq ID NO: 16. En algunos ejemplos, la transglutaminasa es una transglutaminasa genomanipulada, tal como una transglutaminasa genomanipulada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 80 % (por ejemplo, al menos aproximadamente un 85 %, un 90 %, un 95 % o un 99 %) de identidad con la SEQ ID NO: 16. En algunos ejemplos, la relación molar de la transglutaminasa y el polipéptido que contiene Fc es de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 1:100. En algunos ejemplos, la transglutaminasa se inmoviliza en un soporte sólido. En otros ejemplos, el polipéptido que contiene Fc se inmoviliza en un soporte sólido.
En algunos ejemplos de acuerdo con uno cualquiera de los métodos descritos anteriormente, el resto de glutamina aceptora está flanqueado por un sitio de N-glucosilación en la posición 2 con respecto al resto de glutamina. En algunos ejemplos, la región Fc N-glucosilada comprende los aminoácidos 290 a 300 de una cadena pesada de inmunoglobulina, en donde la numeración está de acuerdo con el índice de Kabat. En algunos ejemplos, la región Fc N-glucosilada es la región Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina de tipo silvestre. En algunos ejemplos, la inmunoglobulina se selecciona del grupo que consiste en IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. En algunos ejemplos, el polipéptido que contiene Fc es una cadena pesada de inmunoglobulina, tal como un anticuerpo de longitud completa, por ejemplo, un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado. En algunos ejemplos, ambas cadenas pesadas del anticuerpo se conjugan con la fracción de conjugado. En algunas realizaciones, el resto de glutamina aceptora está en la posición 295 y el sitio de N-glucosilación está en la posición 297, en donde la numeración está de acuerdo con la numeración de Kabat.
En algunos ejemplos de acuerdo con uno cualquiera de los métodos descritos anteriormente, la fracción de conjugado comprende una fracción activa seleccionada del grupo que consiste en: una fracción que mejora la propiedad farmacocinética del polipéptido que contiene Fc, una fracción terapéutica y una fracción de diagnóstico. En algunos ejemplos, la fracción activa es una toxina.
En el presente documento también se describe un método para preparar un conjugado de anticuerpo y fármaco que comprende poner en contacto una composición de anticuerpo con la fracción de conjugado en presencia de una transglutaminasa en condiciones suficientes para generar el conjugado de anticuerpo y fármaco, en donde al menos aproximadamente un 50 % (por ejemplo, al menos aproximadamente cualquiera de un 60 %, un 70 %, un 80 %, un 90 % o un 95 %) del anticuerpo en la composición está glucosilado en la región Fc, y en donde la fracción de conjugado está conjugado con el resto de glutamina aceptora endógeno en el anticuerpo.
En el presente documento también se describe un método para preparar un conjugado de anticuerpo y fármaco que comprende un anticuerpo conjugado de manera específica con una fracción de conjugado que comprende un identificador de molécula pequeña y una fracción activa que comprende a) poner en contacto una composición de anticuerpo con el identificador de molécula pequeña en presencia de una transglutaminasa en una condición suficiente para generar un conjugado intermedio que comprenda un anticuerpo conjugado de manera específica con el identificador de molécula pequeña, y b) poner en contacto el conjugado intermedio con una fracción activa obteniendo así el conjugado de anticuerpo y fármaco, en donde al menos aproximadamente un 50 % (por ejemplo, al menos aproximadamente cualquiera de un 60 %, un 70 %, un 80 %, un 90 % o un 95 %) del anticuerpo en la composición está glucosilado en la región Fc, y en donde la fracción de conjugado está conjugado con el resto de glutamina aceptora endógeno en el anticuerpo.
En algunos ejemplos de acuerdo con uno cualquiera de los métodos para preparar un conjugado de anticuerpo y fármaco descrito anteriormente, la transglutaminasa es una transglutaminasa de tipo silvestre. En algunos ejemplos, la transglutaminasa de tipo silvestre tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16.
En algunos ejemplos de acuerdo con uno cualquiera de los métodos para preparar un conjugado de anticuerpo y fármaco descrito anteriormente, la transglutaminasa es una transglutaminasa genomanipulada. En algunos ejemplos, la transglutaminasa genomanipulada comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 80 % (por ejemplo, al menos aproximadamente un 85 %, un 90 %, un 95 % o un 99 %) de identidad con la SEQ ID NO: 16.
En algunos ejemplos de acuerdo con uno cualquiera de los métodos para preparar un conjugado de anticuerpo y fármaco descrito anteriormente, la transglutaminasa tiene una pureza de al menos aproximadamente un 90 % (por ejemplo, al menos aproximadamente cualquiera de un 95 %, un 98 % o un 99 %).
En algunos ejemplos de acuerdo con uno cualquiera de los métodos para preparar un conjugado de anticuerpo y fármaco descrito anteriormente, la relación molar de la transglutaminasa y la composición del anticuerpo es de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 1:10.
En algunos ejemplos de acuerdo con uno cualquiera de los métodos para preparar un conjugado de anticuerpo y fármaco descrito anteriormente, la transglutaminasa se inmoviliza en un soporte sólido.
En algunos ejemplos de acuerdo con uno cualquiera de los métodos para preparar un conjugado de anticuerpo y fármaco descrito anteriormente, el anticuerpo se inmoviliza en un soporte sólido.
En algunos ejemplos de acuerdo con uno cualquiera de los métodos para preparar un conjugado de anticuerpo y fármaco descrito anteriormente, el anticuerpo es un anticuerpo humano o humanizado.
En algunos ejemplos de acuerdo con uno cualquiera de los métodos para preparar un conjugado de anticuerpo y fármaco descrito anteriormente, la fracción de conjugado comprende una fracción activa seleccionada del grupo que consiste en: una fracción que mejora la propiedad farmacocinética de la composición del anticuerpo, una fracción terapéutica y una fracción de diagnóstico. En algunos ejemplos, la fracción activa es una toxina.
En el presente documento también se describen transglutaminasas genomanipuladas. En el presente documento se describe una transglutaminasa genomanipulada capaz de conjugar un polipéptido que contiene Fc (tal como un anticuerpo) a una fracción de conjugado, en donde el polipéptido que contiene Fc (tal como el anticuerpo) comprende una región Fc N-glucosilada, en donde la región Fc N-glucosilada comprende un resto de glutamina aceptora flanqueado por un sitio de N-glucosilación, en donde, tras la reacción, la fracción de conjugado se conjuga con el polipéptido que contiene Fc (tal como el anticuerpo) a través del resto de glutamina aceptora, y en donde la conjugación es al menos aproximadamente un 10 % (por ejemplo, al menos aproximadamente cualquiera de un 20 %, un 30 %, un 40 %, un 50 % o más) más activa que una transglutaminasa de tipo silvestre en las mismas condiciones de reacción. En el presente documento también se describe una transglutaminasa genomanipulada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 80 % (por ejemplo, al menos aproximadamente un 85 %, un 90 %, un 95 % o un 99 %) de identidad con la SEQ ID NO: 16, en donde la transglutaminasa comprende una eliminación seleccionada del grupo que consiste en: D1 a E4; P244 a P247; y N282 a L285.
En el presente documento también se describen métodos para preparar conjugados polipeptídicos que contienen Fc (tales como conjugados de anticuerpo y fármaco) mediante la utilización de las transglutaminasas genomanipuladas descritas en el presente documento.
En el presente documento también se describe un método para preparar un conjugado de anticuerpo y fármaco que comprende un anticuerpo conjugado de manera específica con una fracción de conjugado que comprende: poner en contacto una composición de anticuerpo con la fracción de conjugado en presencia de una cualquiera de las transglutaminasas genomanipuladas descritas anteriormente en condiciones suficientes para generar el conjugado de anticuerpo y fármaco, en donde la fracción de conjugado se conjuga con el resto de glutamina aceptora endógeno en el anticuerpo.
En el presente documento también se describe un método para preparar un conjugado de anticuerpo y fármaco que comprende un anticuerpo conjugado de manera específica con una fracción de conjugado que comprende un identificador de molécula pequeña y una fracción activa que comprende: a) poner en contacto una composición de anticuerpo con el identificador de molécula pequeña en presencia de una cualquiera de las transglutaminasas genomanipuladas descritas anteriormente en condiciones suficientes para generar un conjugado intermedio que comprenda un anticuerpo conjugado de manera específica con el identificador de molécula pequeña, y b) poner en contacto el conjugado intermedio con una fracción activa obteniendo así el conjugado de anticuerpo y fármaco, en donde la fracción de conjugado se conjuga con el resto de glutamina aceptora endógeno en el anticuerpo.
Breve descripción de las figuras
La figura 1 proporciona alineaciones de secuencias de las secuencias del dominio CH2 de varios tipos de IgG humanas, de ratón y de rata. La glutamina endógena (Q295) para la reacción mediada por TGasa y el sitio de N-glucosilación (N297) están encuadrados.
La figura 2 proporciona la alineación de la secuencia de aminoácidos de las TGasas de Streptomyces ladakanum (TG_SL, s Eq ID NO: 16) y Streptomyces mobaraensis (TG_SM, SEQ ID NO: 18)
La figura 3 proporciona secuencias de mutantes por eliminación basados en TGasas de Streptomyces ladakanum. Se muestra la secuencia de una TG_SL de tipo silvestre recombinante (SEQ ID NO: 17).
La figura 4 proporciona un diagrama que muestra un método de conjugación de anticuerpo y fármaco en una sola etapa.
La figura 5 proporciona un diagrama que muestra un método de conjugación de anticuerpo y fármaco en dos etapas.
La figura 6 proporciona cromatogramas de HPLC para IgG1, 2 y 4 conjugadas con MDC. La figura 6A muestra la conjugación de solo la cadena pesada de IgG1 con MDC. La figura 6B muestra la conjugación de IgG1 con MDC en una relación molar de 1:1 y 1:2. La figura 6C muestra la conjugación específica de sitio de IgG2 (izquierda) e IgG4 (derecha) con MDC.
La figura 7 proporciona el análisis SDS PAGE de los conjugados de IgG1 y MDC.
La figura 8 proporciona un derivado de maitansina que contiene un enlazador lineal de PEG extendido y no escindible con un grupo amino primario de peso molecular 896,42 Da, denominado en el presente documento MAY-PEG4.
La figura 9 proporciona un derivado de maitansina que contiene un enlazador escindible con un espaciador autoinmolable y lisina terminal de peso molecular 1224,58 Da, denominado en el presente documento MAY-PVCL. La figura 10 proporciona espectros MALDI-TOF para DAR0 (es decir, IgG1 no marcada, panel superior), DAR 1 (panel central) y DAR 2 (panel inferior) de IgG1-MAY-PEG4.
La figura 11 proporciona espectros MALDI-TOF de IgG1 no marcada (panel izquierdo) e IgG1 conjugada con MAY-PVCL (panel derecho).
La figura 12 proporciona derivados de monometil auristatina E (MMAE) que contienen un enlazador no escindible con un número variable de unidades de polietilenglicol (PEG) (panel superior), denominado en el presente documento PEGx-MMAE, en donde x es 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 20 o 24; y un derivado de MMAE que contiene un enlazador escindible (panel inferior), denominado en el presente documento PEG3c-MMAE.
La figura 13 muestra la eficacia in vivo de los conjugados de trastuzumab y PEGx-MMAE preparados mediante TGasa en ratones con xenoinjerto BT474.
La figura 14 muestra la estabilidad in vivo de un conjugado de trastuzumab y PEG12-MMAE preparado mediante TGasa en ratones con xenoinjerto NCI N87.
La figura 15 muestra una comparación de la eficacia in vivo de un conjugado de trastuzumab y PEG3c-MMAE (DAR2, denominado en el presente documento TP3cE) y un conjugado TDM-1 (Genentech) en ratones con xenoinjerto NCI N87.
La figura 16 muestra una comparación de la estabilidad in vivo de un conjugado de trastuzumab y PEG3c-MMAE (DAR2, denominado en el presente documento TP3cE) y un conjugado TDM-1 (Genentech) en ratones con xenoinjerto NCI N87.
La figura 17 muestra una comparación de la eficacia in vivo de un conjugado de trastuzumab y PEG3c-MMAE (DAR2, denominado en el presente documento TP3cE) y un conjugado TDM-1 (Genentech) en ratones con xenoinjerto SK_Ov3. Las flechas en el gráfico indican puntos temporales para la administración de las dosis de conjugados de anticuerpo y fármaco.
La figura 18 muestra un grupo de enlazadores PEG de 3 brazos (panel superior; de 1 a 5 kDa) cada uno con un grupo amina y dos grupos azida, y alquino-PEG4c-MMAE (panel inferior) utilizado en la preparación del ADC DAR4.
Descripción detallada
La presente divulgación proporciona por primera vez métodos para unir una fracción de conjugado (tal como un fármaco) a un anticuerpo inalterado y no modificado (por ejemplo, la configuración de glucosilación se mantiene inalterada) de forma estequiométrica y específica del sitio. Esto se logra mediante la utilización de una TGasa de tipo silvestre en una condición de reacción específica y/o a través de una TGasa genomanipulada de manera específica para llevar a cabo la conjugación específica del sitio en un resto de glutamina endógeno en la región Fc. Los métodos de la presente divulgación permiten la producción de un conjugado homogéneo de anticuerpo y fármaco estequiométrico y específico de sitio que ofrecería un perfil PK superior, amplio índice terapéutico y potencia óptima. Los métodos permiten la conjugación de un fármaco con un anticuerpo inalterado sin introducir mutaciones y/o desglucosilar el anticuerpo, minimizando así la inmunogenia introducida por dichas etapas adicionales de manipulación. Los glucanos en el anticuerpo inalterado, cuando están presentes, protegen al anticuerpo de la degradación, dando lugar a conjugados de anticuerpo y fármaco más estables. Como no fue necesaria la manipulación del anticuerpo antes de las reacciones de transglutaminación, los métodos de conjugación de anticuerpos basados en TGasa descritos en el presente documento son significativamente más eficaces que los informados anteriormente.
Por tanto, en un aspecto, la presente divulgación proporciona conjugados polipeptídicos que contienen Fc (tal como un conjugado de anticuerpo y fármaco) que comprenden un polipéptido que contiene Fc (tal como un anticuerpo) conjugado con una fracción de conjugado, en donde el polipéptido que contiene Fc (tal como un anticuerpo) comprende una región Fc N-glucosilada que comprende un resto de glutamina aceptora flanqueado por un sitio de N-glucosilación, y en donde la fracción de conjugado se conjuga con el polipéptido que contiene Fc (tal como un anticuerpo) a través del resto de glutamina aceptora.
En otro aspecto, la divulgación proporciona métodos para preparar conjugados polipeptídicos que contienen Fc (tales como conjugados de anticuerpo y fármaco) mediante la utilización de una transglutaminasa de tipo silvestre o genomanipulada.
Además, en la divulgación se proporcionan transglutaminasas genomanipuladas de manera específica para llevar a cabo dichas reacciones.
Definiciones
"Transglutaminasa", utilizada de manera indistinta en el presente documento con "TGasa", se refiere a una enzima capaz de llevar a cabo reacciones de transglutaminación. El término "transglutaminación", como se utiliza en el presente documento, se refiere a una reacción donde el Y-glutaminilo de un resto de glutamina aceptora de una proteína/péptido se transfiere a un grupo amina, tal como una amina primaria o el grupo £-amino de la lisina.
La expresión "resto de glutamina aceptora", cuando se hace referencia a un resto de aminoácidos de un polipéptido o proteína, se refiere a un resto de glutamina que, en condiciones adecuadas, es reconocido por una TGasa y puede entrecruzarse con una fracción de conjugado que comprende un grupo amino donante mediante una TGasa a través de una reacción entre la glutamina y un grupo amino donante (tal como la lisina o una amina primaria relacionada estructuralmente tal como el grupo amino pentilo).
Un "resto de glutamina aceptora endógeno en un anticuerpo" utilizado en el presente documento se refiere a un resto de glutamina aceptora en una región Fc de un anticuerpo de origen natural. Dicho resto de glutamina aceptora endógeno es normalmente Q275 por la numeración de Kabat y está flanqueado por un sitio de N-glucosilación en la posición Asn297.
"Polipéptido que contiene Fc" utilizado en el presente documento se refiere a un polipéptido (por ejemplo, un anticuerpo o una proteína de fusión Fc) que comprende la región Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina. El término "polipéptido" utilizado en el presente documento incluye polipéptidos de cadena polipeptídica única y de unidades múltiples. Por ejemplo, el polipéptido que contiene Fc puede ser un anticuerpo de longitud completa (tal como un anticuerpo inalterado) o puede ser una sola cadena del anticuerpo de longitud completa.
"Región Fc", como se utiliza en el presente documento, se refiere al polipéptido que comprende la región constante de una cadena pesada de anticuerpo que excluye el primer dominio de inmunoglobulina de la región constante. Para IgG, la región Fc puede comprender dominios de inmunoglobulina CH2 y CH3 y la bisagra entre CH1 y CH2.
"Anticuerpo de longitud completa", como se utiliza en el presente documento, se refiere a una molécula que constituye la forma biológica natural de un anticuerpo, incluidas las regiones variables y constantes. Por ejemplo, en la mayoría de los mamíferos, incluidos los seres humanos y los ratones, el anticuerpo de longitud completa del isotipo IgG es un tetrámero y consiste en dos pares idénticos de dos cadenas de inmunoglobulina, teniendo cada par una cadena ligera y una pesada, comprendiendo cada cadena ligera los dominios de inmunoglobulina VL y CL, y comprendiendo cada cadena pesada los dominios de inmunoglobulina VH, CH1, CH2 y CH3. En algunos mamíferos, por ejemplo, en camellos y llamas, los anticuerpos IgG pueden consistir en solo dos cadenas pesadas, comprendiendo cada cadena pesada un dominio variable unido a la región Fc.
Por "modificación de aminoácidos" en el presente documento se entiende una sustitución, inserción y/o eliminación de aminoácidos en una secuencia polipeptídica. Por "sustitución de aminoácidos" o "sustitución" en el presente documento se entiende el reemplazo de un aminoácido de una posición determinada en una secuencia proteica por otro aminoácido. Una "variante" de un polipéptido se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica a un polipéptido de referencia, normalmente un polipéptido natural u "original". La variante polipeptídica puede poseer una o más sustituciones, eliminaciones y/o inserciones de aminoácidos en determinadas posiciones dentro de la secuencia de aminoácidos natural.
Las sustituciones de aminoácidos "conservadoras" son aquellas en las que un resto de aminoácido se reemplaza por un resto de aminoácido que tiene una cadena lateral con propiedades fisicoquímicas similares. Las familias de restos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares se conocen en la materia e incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina e histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico y ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina aceptora, serina, treonina, tirosina, cisteína y triptófano), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina y metionina), cadenas laterales p-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina e isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano e histidina).
La expresión "grupo protector" se refiere a un grupo que protege o bloquea temporalmente, es decir, destinado a evitar que reaccione, un grupo funcional, por ejemplo, un grupo amino, un grupo hidroxilo o un grupo carboxilo, durante la transformación de una primera molécula en una segunda molécula.
La expresión "fracción que mejora las propiedades farmacocinéticas" se refiere a una fracción que cambia las propiedades farmacocinéticas de la molécula a la que está unida la fracción de tal manera que se puede obtener un mejor efecto terapéutico o de diagnóstico. La fracción puede, por ejemplo, aumentar la solubilidad en agua, aumentar el tiempo de circulación o reducir la inmunogenia.
El término "enlazador" se refiere a un elemento estructural de un compuesto que une un elemento estructural de dicho compuesto a uno o más de otros elementos estructurales de dicho mismo compuesto.
Como se utiliza en el presente documento, "tratar" o "tratamiento" es un enfoque para obtener resultados beneficiosos o deseados que incluyen resultados clínicos. Para los fines de esta divulgación, los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero sin limitación, uno o más de los siguientes: aliviar uno o más síntomas que resultan de la enfermedad, disminuir el alcance de la enfermedad, estabilizar la enfermedad (por ejemplo, prevenir o retardar el empeoramiento de la enfermedad), prevenir o retardar la recidiva de la enfermedad, retardar o ralentizar la progresión de la enfermedad, mejorar la patología, proporcionar una remisión (parcial o total) de la enfermedad, disminuir la dosis de una o más de otras medicaciones necesarias para tratar la enfermedad, retrasar la progresión de la enfermedad y/o aumentar la calidad de vida.
El término "individuo" se refiere a un mamífero e incluye, pero sin limitación, ser humano, bovino, caballo, felino, canino, roedor o primate. En algunas realizaciones, el individuo es un ser humano.
Se entiende que los aspectos y realizaciones de la invención descritos en el presente documento incluyen "que consiste en" y "que consiste esencialmente en" aspectos y realizaciones.
La referencia a "aproximadamente" un valor o parámetro en el presente documento incluye (y describe) variaciones que se refieren a ese valor o parámetro en sí. Por ejemplo, la descripción que hace referencia a "aproximadamente X" incluye la descripción de "X". El término "aproximadamente de X a Y" utilizado en el presente documento tiene el mismo significado que "de aproximadamente X a aproximadamente Y".
Como se utiliza en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un/uno/una", "o", y "el/la" incluyen los referentes en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
Conjugados polipeptídicos que contienen Fc
La presente divulgación en un aspecto proporciona un conjugado polipeptídico que contiene Fc (tal como un conjugado de anticuerpo y fármaco) que comprende un polipéptido que contiene Fc (tal como un anticuerpo) conjugado de manera específica del sitio con una fracción de conjugado. El polipéptido que contiene Fc (tal como un anticuerpo) comprende una región Fc N-glucosilada. La región Fc N-glucosilada comprende un resto de glutamina aceptora flanqueado por un sitio de N-glucosilación, y la fracción de conjugado se conjuga con el polipéptido que contiene Fc (tal como un anticuerpo) a través del resto de glutamina aceptora.
La región Fc de una inmunoglobulina en algunos ejemplos comprende parte o la totalidad de la región bisagra. En algunos ejemplos, el polipéptido que contiene Fc comprende la región Fc de una inmunoglobulina de origen natural. En algunos ejemplos, el polipéptido que contiene Fc comprende una región Fc de los subtipos IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, o de IgA, IgE, IgD o IgM. En algunos ejemplos, la región Fc es de IgG humana, y la región Fc va desde un resto de aminoácido en la posición Glu216 o Ala231 hasta el extremo carboxilo de la misma de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat.
En algunos ejemplos, el polipéptido que contiene Fc es un polipéptido de fusión que contiene Fc en donde uno o más polipéptidos funcionales se fusionan con la región Fc. Dichos polipéptidos funcionales incluyen, pero sin limitación, la región de unión a la diana de un receptor, una molécula de adhesión, un ligando, una enzima, una citocina y una quimiocina.
Las regiones Fc descritas en el presente documento pueden estar N-glucosiladas. Por ejemplo, la cadena de polisacárido unida al sitio de N-glucosilación puede ser al menos aproximadamente cualquiera de 1, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 unidades.
El sitio de N-glucosilación flanquea el resto de glutamina aceptora al que se une la fracción de conjugado. El inventor ha demostrado por primera vez que, a través de los métodos descritos más adelante en el presente documento, es posible unir una fracción de conjugado a un resto de glutamina aceptora flanqueado por un sitio de N-glucosilación en la región Fc. En algunos ejemplos, el sitio de N-glucosilación y el resto de glutamina aceptora están separados por 5 restos de aminoácidos o menos. En algunos ejemplos, el sitio de N-glucosilación y la glutamina aceptora están separados por 5, 4, 3, 2 o 1 aminoácido. En algunos ejemplos, el sitio de N-glucosilación y la glutamina aceptora están uno al lado del otro. En algunos ejemplos, el resto de glutamina aceptora está flanqueado por un sitio de N-glucosilación en la posición 2 con respecto al resto de glutamina. En algunos ejemplos, el resto de glutamina aceptora está flanqueado por un sitio de N-glucosilación en la posición 1, 2, 3, 4 o 5 con respecto al resto de glutamina. En algunos ejemplos, el resto de glutamina aceptora está flanqueado por un sitio de N-glucosilación en la posición -1, -2, -3, -4 o -5 con respecto al resto de glutamina.
En el presente documento se describe un conjugado polipeptídico que contiene Fc que comprende un polipéptido que contiene Fc conjugado de manera específica en el sitio con una fracción de conjugado, en donde el polipéptido que contiene Fc comprende una región Fc N-glucosilada, en donde la región Fc N-glucosilada comprende un resto de glutamina aceptora flanqueado por un sitio de N-glucosilación, y en donde la fracción de conjugado se conjuga con el polipéptido que contiene Fc a través del resto de glutamina aceptora.
En el presente documento se describe un conjugado polipeptídico que contiene Fc que comprende un polipéptido que contiene Fc conjugado de manera específica en el sitio con una fracción de conjugado, en donde el polipéptido que contiene Fc comprende una región Fc N-glucosilada, en donde la región Fc N-glucosilada comprende un resto de glutamina aceptora que está separado por 5 aminoácidos o menos (incluyendo, por ejemplo, separado por 4, 3, 2 o 1 aminoácido) del sitio de N-glucosilación, y en donde la fracción de conjugado está conjugada al polipéptido que contiene Fc a través del resto de glutamina aceptora.
En el presente documento se describe un conjugado polipeptídico que contiene Fc que comprende un polipéptido que contiene Fc conjugado de manera específica en el sitio con una fracción de conjugado, en donde el polipéptido que contiene Fc comprende una región Fc N-glucosilada, en donde el resto de glutamina aceptora está flanqueado por un sitio de N-glucosilación en la posición 2 con respecto al resto de glutamina, y en donde la fracción de conjugado se conjuga con el polipéptido que contiene Fc a través del resto de glutamina aceptora.
En el presente documento se describe un conjugado polipeptídico que contiene Fc que comprende un polipéptido que contiene Fc conjugado de manera específica en el sitio con una fracción de conjugado, en donde el polipéptido que contiene Fc comprende una región Fc N-glucosilada, en donde la región Fc N-glucosilada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 KPREEQX1NSTX2R, en donde X1 es Y o F y X2 es Y o F), y en donde la fracción de conjugado se conjuga con el polipéptido que contiene Fc a través del resto de glutamina aceptora en la posición 6 de la SEQ ID NO: 1, y en donde la N-glucosilación está en la posición 8 de la SEQ ID NO: 1. También se describe en el presente documento un conjugado polipeptídico que contiene Fc que comprende un polipéptido que contiene Fc conjugado de manera específica con una fracción de conjugado, en donde el polipéptido que contiene Fc comprende una región Fc N-glucosilada, en donde la región Fc N-glucosilada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 (KPREEQYNSTYR), y en donde la fracción de conjugado se conjuga con el polipéptido que contiene Fc a través del resto de glutamina aceptora en la posición 6 de la SEQ ID NO: 2, y en donde la N-glucosilación está en la posición 8 de la SEQ ID NO: 2.
En el presente documento se describe un conjugado polipeptídico que contiene Fc que comprende un polipéptido que contiene Fc conjugado de manera específica en el sitio con una fracción de conjugado, en donde el polipéptido que contiene Fc comprende una región Fc N-glucosilada, en donde la región Fc N-glucosilada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 (secuencia CH2 de IgG1 humana, véase la figura 1), y en donde la fracción de conjugado se conjuga con el polipéptido que contiene Fc a través del resto de glutamina aceptora en la posición 65 de la SEQ ID NO: 3, y en donde la N-glucosilación está en la posición 67 de la SEQ ID NO: 3 (véanse los restos en el recuadro que se muestra en la figura 1).
En el presente documento se describe un conjugado polipeptídico que contiene Fc que comprende un polipéptido que contiene Fc conjugado de manera específica con una fracción de conjugado, en donde el polipéptido que contiene Fc comprende una región Fc N-glucosilada, en donde la región Fc N-glucosilada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 (secuencia CH2 de IgG2 humana, véase la figura 1), y en donde la fracción de conjugado se conjuga con el polipéptido que contiene Fc a través del resto de glutamina aceptora en la posición 64 de la SEQ ID NO: 4, y en donde la N-glucosilación está en la posición 66 de la SEQ ID NO: 4 (véanse los restos en el recuadro que se muestra en la figura 1).
En el presente documento se describe un conjugado polipeptídico que contiene Fc que comprende un polipéptido que contiene Fc conjugado de manera específica con una fracción de conjugado, en donde el polipéptido que contiene Fc comprende una región Fc N-glucosilada, en donde la región Fc N-glucosilada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 (secuencia CH2 de IgG3 humana, véase la figura 1), y en donde la fracción de conjugado se conjuga con el polipéptido que contiene Fc a través del resto de glutamina aceptora en la posición 65 de la SEQ ID NO: 5, y en donde la N-glucosilación está en la posición 67 de la SEQ ID NO: 5 (véanse los restos en el recuadro que se muestra en la figura 1).
En el presente documento se describe un conjugado polipeptídico que contiene Fc que comprende un polipéptido que contiene Fc conjugado de manera específica con una fracción de conjugado, en donde el polipéptido que contiene Fc comprende una región Fc N-glucosilada, en donde la región Fc N-glucosilada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 (secuencia CH2 de IgG4 humana, véase la figura 1), y en donde la fracción de conjugado se conjuga con el polipéptido que contiene Fc a través del resto de glutamina aceptora en la posición 65 de la SEQ ID NO: 6, y en donde la N-glucosilación está en la posición 67 de la SEQ ID NO: 6 (véanse los restos en el recuadro que se muestra en la figura 1).
En el presente documento se describe un conjugado de anticuerpo y fármaco que comprende un anticuerpo conjugado de manera específica con una fracción de conjugado, en donde el anticuerpo comprende una región Fc N-glucosilada, en donde la región Fc N-glucosilada comprende un resto de glutamina aceptora flanqueado por un sitio de N-glucosilación, y en donde la fracción de conjugado se conjuga con el anticuerpo a través del resto de glutamina aceptora. En algunos ejemplos, el anticuerpo es un anticuerpo humano. En algunos ejemplos, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado. En algunos ejemplos, el anticuerpo es un anticuerpo quimérico. En algunos ejemplos, el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico o multiespecífico. En algunas realizaciones, el anticuerpo es trastuzumab.
En el presente documento se describe un anticuerpo de longitud completa conjugado con una fracción de conjugado, en donde el anticuerpo de longitud completa comprende una región Fc N-glucosilada, y en donde la fracción de conjugado se conjuga con el anticuerpo de longitud completa a través del resto de glutamina aceptora en la posición 295 de una cadena pesada del anticuerpo, en donde la numeración es de acuerdo con el índice EU como en Kabat. En algunos ejemplos, se proporciona un anticuerpo conjugado a una fracción de conjugado, en donde el anticuerpo comprende una región Fc N-glucosilada, en donde la fracción de conjugado se conjuga con el anticuerpo a través del resto de glutamina aceptora en la posición 295 de una cadena pesada del anticuerpo, y en donde la N-glucosilación está en la posición 297 de la cadena pesada, en donde la numeración es de acuerdo con el índice EU como en Kabat.
En el presente documento se describe un conjugado de anticuerpo y fármaco que comprende un anticuerpo conjugado con una fracción de conjugación a través de un resto de glutamina aceptora endógeno en el anticuerpo, en donde el conjugado de anticuerpo y fármaco está glucosilado (por ejemplo, N-glucosilado) en la región Fc. En algunos ejemplos, el anticuerpo es un anticuerpo humano. En algunos ejemplos, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado. En algunos ejemplos, el anticuerpo es un anticuerpo quimérico. En algunos ejemplos, el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico o multiespecífico. En algunas realizaciones, el anticuerpo es trastuzumab.
En el presente documento se describe un conjugado de anticuerpo y fármaco que comprende trastuzumab que está N-glucosilado en la región Fc, en donde el trastuzumab se conjuga con una fracción de conjugación a través de un resto de glutamina aceptora endógeno flanqueado por el sitio de N-glucosilación. En algunos ejemplos, se proporciona un conjugado de anticuerpo y fármaco que comprende trastuzumab que está N-glucosilado en la posición 297, en donde que el trastuzumab se conjuga con una fracción de conjugación a través de un resto de glutamina aceptora endógeno en la posición 295, en donde la numeración es de acuerdo con el índice EU como en Kabat.
En el presente documento se describe una composición que comprende el polipéptido de fusión que contiene Fc descrito en el presente documento, en donde al menos algunos (pero no necesariamente todos) de los polipéptidos de fusión que contienen Fc en la composición están glucosilados (por ejemplo, N-glucosilados) en la región Fc. Por ejemplo, en el presente documento se describe una composición que comprende un conjugado de anticuerpo y fármaco, en donde el conjugado de anticuerpo y fármaco comprende un anticuerpo conjugado con una fracción de conjugación a través de un resto de glutamina aceptora endógeno en el anticuerpo, y en donde al menos alguno de (por ejemplo, al menos aproximadamente cualquiera de un 50 %, un 60 %, un 70 %, un 80 %, un 90 % o un 95 %) los conjugados de anticuerpo y fármaco en la composición están glucosilados (por ejemplo, N-glucosilados) en la región Fc. En algunos ejemplos, el anticuerpo es un anticuerpo humano. En algunos ejemplos, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado. En algunos ejemplos, el anticuerpo es un anticuerpo quimérico. En algunos ejemplos, el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico o multiespecífico. En algunas realizaciones, el anticuerpo es trastuzumab.
Los métodos de conjugación descritos en el presente documento permiten la producción de conjugados polipeptídicos que contienen Fc (tales como conjugados de anticuerpo y fármaco) que se conjugan con una fracción de conjugado de una forma específica y controlada estequiométricamente. Como se utiliza en el presente documento, la expresión "conjugado de manera específica" se refiere a la conjugación o entrecruzamiento específico de la fracción de conjugado en un sitio específico del polipéptido que contiene Fc (tal como un anticuerpo), en concreto, el resto de glutamina aceptora en la región Fc que está flanqueada por un sitio de N-glucosilación. La especificidad del sitio se puede confirmar por varias técnicas, que incluyen, pero sin limitación, mapeo de péptidos y secuenciación de proteínas. En algunos ejemplos, la relación molar de la fracción de conjugado al polipéptido que contiene Fc (tal como un anticuerpo) en el conjugado polipeptídico que contiene Fc (tal como un conjugado de anticuerpo y fármaco) es de aproximadamente 1:1. En algunas realizaciones, la relación molar de la fracción de conjugado al polipéptido que contiene Fc (tal como un anticuerpo) en el conjugado polipeptídico que contiene Fc (tal como un conjugado de anticuerpo y fármaco) es de aproximadamente 2:1. En algunos ejemplos, al menos aproximadamente un 80 % (tal como al menos aproximadamente cualquiera de un 85 %, un 90 %, un 95 % o más) del conjugado polipeptídico que contiene Fc (tal como el conjugado de anticuerpo y fármaco) en la composición tiene una relación molar entre el polipéptido que contiene Fc (tal como el anticuerpo) y la fracción de conjugado de aproximadamente 1:1. En algunos ejemplos, al menos aproximadamente un 80 % (tal como al menos aproximadamente cualquiera de un 85 %, un 90 %, un 95 % o más) del conjugado polipeptídico que contiene Fc (tal como el conjugado de anticuerpo y fármaco) en la composición tiene una relación molar entre el polipéptido que contiene Fc (tal como el anticuerpo) y la fracción de conjugado de aproximadamente 1:2. En algunos ejemplos, al menos aproximadamente un 80 % (tal como al menos aproximadamente cualquiera de un 85 %, un 90 %, un 95 % o más) del conjugado polipeptídico que contiene Fc (tal como el conjugado de anticuerpo y fármaco) en la composición tiene una relación molar entre el polipéptido que contiene Fc (tal como el anticuerpo) y la fracción de conjugado de aproximadamente 1:1 o aproximadamente 1:2.
La fracción de conjugado descrita en el presente documento puede ser cualquier fracción que se pueda conjugar con el resto de glutamina aceptora, ya sea directamente o a través de un identificador de molécula pequeña como se describe más adelante en el presente documento. La conjugación entre la fracción de conjugación y el resto de glutamina aceptora se lleva a cabo mediante la conjugación del grupo donante de amina de la fracción de conjugación o el identificador de molécula pequeña con el resto de glutamina aceptora. Por tanto, cualquier fracción de conjugado que contenga un grupo donante de amina se puede conjugar directamente con el polipéptido que contiene Fc. Cualquier fracción de conjugado que no contenga un grupo donante de amina se puede conjugar indirectamente con el polipéptido que contiene Fc a través de un identificador de molécula pequeña que contiene un grupo donante de amina.
El término "grupo donante de amina", como se utiliza en el presente documento, se refiere a un grupo reactivo que contiene una o más aminas reactivas (por ejemplo, aminas primarias). Por ejemplo, la fracción de conjugado puede comprender un grupo donante de amina (por ejemplo, amina primaria -NH2), un enlazador opcional y una fracción activa (por ejemplo, una molécula pequeña). La fracción de conjugado también puede ser un polipéptido o un polímero biocompatible que contiene una Lys reactiva (por ejemplo, una Lys endógena). El grupo donante de amina en algunos ejemplos es una amina primaria (-NH2) que proporciona un sustrato para la transglutaminasa para permitir la conjugación de la fracción del agente con el polipéptido que contiene Fc a través de la glutamina aceptora. Por consiguiente, el enlace entre la glutamina donante y el grupo donante de amina puede tener la fórmula -CH2-CH2-CO-NH-.
En algunos ejemplos, el polipéptido que contiene Fc y la fracción de conjugado están unidos a través de un enlazador. En algunos ejemplos, el enlazador es un enlazador no escindible. Los enlazadores no escindibles adecuados incluyen, pero sin limitación, NH2-R-X, NH2NH-R-X y NH2-O-R-X, en donde R es un grupo alquilo o polietilenglicol (también denominado PEG), en donde X es la fracción activa. Un grupo polietilenglicol o grupo PEG puede tener una fórmula de -(CH2CH2O)n-, en donde n un número entero de al menos 1. En algunas realizaciones, n es cualquiera de 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 20 o 24.
En algunos ejemplos, el polipéptido que contiene Fc y la fracción de conjugado están unidos a través de un enlazador escindible. Los enlazadores escindibles adecuados incluyen, pero sin limitación, Lys-Phe-X, Lys-Val-Cit-PABC-X, NH2-(CH2CH2O)n-Val-Cit-PABC-X y NH2-(CH2CH2O)n-(Val-Cit-PABC-X)2, en donde X es la fracción activa y n es un número entero de al menos 1 (tal como cualquiera de 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 20 o 24). PABC se refiere a paminobenciloxicarbonilo. Cit se refiere a la citrulina.
Otros ejemplos de enlazadores de grupos donantes de amina incluyen, pero sin limitación, ac-Lys-Gly, ácido aminocaproico, ac-Lys-p-Ala, amino-PEG2 (polietilenglicol)-C2, amino-PEG3-C2, amino-PEG6-C2, ac-Lys-Val (valina)-Cit (citrulina)-PABC (p-aminobenciloxicarbonilo), aminocaproil-Val-Cit-PABC, putrescina y ac-Lys-putrescina.
En algunos ejemplos, la fracción de conjugado está unida al resto de glutamina aceptora a través de un enlazador -NH-(C)n-, en donde el (C)n es una cadena de alquilo o heteroalquilo sustituida o no sustituida, en donde n es un número entero de aproximadamente 1 a aproximadamente 60. En algunos ejemplos, el carbono de la cadena se sustituye por un alcoxilo, hidroxilo, alquilcarboniloxi, alquil-S-, tiol, alquil-C(O)S-, amina, alquilamina, amida o alquilamida. En algunos ejemplos, n es de aproximadamente 2 a aproximadamente 20.
En algunos ejemplos, el enlazador está ramificado. En algunos ejemplos, el enlazador es lineal. En algunos ejemplos, el enlazador tiene más de uno (tal como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más) sitios de unión para la unión de fracciones activas. Estas fracciones activas pueden ser iguales o diferentes entre sí. Por ejemplo, la fracción de conjugado puede comprender un polímero basado en poliacetal o procedente de poliacetal unido a una pluralidad de fracciones activas (tales como moléculas de fármaco).
En algunos ejemplos, la fracción de conjugado se selecciona del grupo que consiste en Alexa 488 cadaverina, 5-FITC cadaverina, Alexa 647 cadaverina, Alexa 350 cadaverina, 5-TAm Ra cadaverina, 5-FAM cadaverina, SR101 cadaverina, 5,6-TAMRA cadaverina, 5-FAM lisina, ac(acetil)-LysGly-MMAD (monometil auristatina D), amino-PEG3 (polietilenglicol)-C2-MMAD, amino-PEG6 C2-MMAD, amino-PEG3-C2-amino-nonanoil-MMAD, aminocaproil-Val(valina)-Cit(citrulina)-PABC(p-aminobenciloxicarbonil)-MMAD, ac-Lys-Val-Cit-PABC-MMAD, aminocaproil-MMAD, ac-Lys-p-Ala-MMAD, amino-PEG2-C2-MMAE (monometil auristatina E), aminocaproil-MMAE, amino-PEG3-C2-MmA e , aminocaproil-MMAF (monometil auristatina F), aminocaproil-Val-Cit-PABC-MMAE, aminocaproil-Val-Cit-PA-BC-MMAF, putrescinil-geldanamicina y ac-Lys-putrescinil-geldanamicina. MMAE se refiere a monometil auristatina E o derivados de la misma.
En algunos ejemplos, la fracción de conjugado es un compuesto que comprende una diamina. En algunos ejemplos, el compuesto se selecciona del grupo que consiste en putrescina (butano-1,4-diamina), etilendiamina, cadaverina (pentano-1,5-diamina), espermidina, espermina, hidrazina, 1,3-diaminopropano, hexametilendiamina, fenilenodiamina, xilileno-diamina, difeniletilendiamina, 1,8-diaminonaftaleno y estereoisómeros, isósteros, análogos o derivados de los mismos.
En algunos ejemplos, la fracción de conjugado es un derivado de maitansina, tal como MAY-PEG4 que se muestra en la figura 8 o MAY-PVCL que se muestra en la figura 9.
En algunas realizaciones, la fracción de conjugado es un derivado de MMAE que comprende un enlazador no escindible (tal como un enlazador amino-(CH2CH2O)n-, por ejemplo, PEGx-MMAE como se muestra en la figura 12). En algunas realizaciones, la fracción de conjugado es un derivado de MMAE que comprende un enlazador escindible (tal como PEG3c-MMAE que se muestra en la figura 12).
En algunas realizaciones, se proporciona un conjugado de anticuerpo y fármaco que comprende trastuzumab que está N-glucosilado en la región Fc, en donde el trastuzumab se conjuga con una fracción de conjugación que comprende al menos un MMAE (tal como 1, 2 o más) a través de un resto de glutamina aceptora flanqueado por el sitio de N-glucosilación. En algunas realizaciones, la fracción de conjugación es PEGx-MMAE como se muestra en la figura 12, en donde x es un número entero seleccionado de 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 20 y 24. En algunas realizaciones, la fracción de conjugación es PEG3c-MMAE como se muestra en la figura 12. En algunas realizaciones, la fracción de conjugación comprende dos MMAE y un enlazador PEG de 3 brazos.
En el presente documento se describe una composición que comprende cualquiera de los conjugados de anticuerpo y fármaco descritos anteriormente que comprende trastuzumab. En algunos ejemplos, la relación molar promedia entre la fracción activa (tal como un fármaco, por ejemplo, MMAE) en la fracción de conjugación y el trastuzumab en la composición es aproximadamente cualquiera de 1:1, 2:1 o 4:1. En algunos ejemplos, al menos aproximadamente un 80 % (tal como al menos aproximadamente cualquiera de un 85 %, un 90 %, un 95 % o más) del conjugado de anticuerpo y fármaco que comprende trastuzumab en la composición tiene una relación molar entre la fracción activa (tal como el fármaco, por ejemplo, MMAE) en la fracción de conjugación y el trastuzumab de aproximadamente 2:1. En algunos ejemplos, al menos aproximadamente un 80 % (tal como al menos aproximadamente cualquiera de un 85 %, un 90 %, un 95 % o más) del conjugado de anticuerpo y fármaco que comprende trastuzumab en la composición tiene una relación molar entre la fracción activa (tal como el fármaco, por ejemplo, MMAE) en la fracción de conjugación y el trastuzumab de aproximadamente 4:1.
En algunos ejemplos, el conjugado polipeptídico que contiene Fc está presente en un individuo (por ejemplo, un mamífero) en aproximadamente un 50 % o más después de al menos aproximadamente 1 día tras la administración in vivo. En algunos ejemplos, el conjugado polipeptídico que contiene Fc está presente en un individuo (por ejemplo, un mamífero) en aproximadamente cualquiera de un 20 %, un 25 %, un 30 %, un 35 %, un 40 %, un 45 %, un 50 %, un 55 %, un 60 %, un 65 %, un 70 %, un 75 %, un 80 %, un 85 %, un 90 % o un 95 % o más después de al menos aproximadamente cualquiera de 2 horas, 2 a 6 horas, 6 a 12 horas, 12 a 18 horas, 18 a 24 horas, 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 1 semana o 2 semanas tras la administración in vivo.
Fracciones activas
Las fracciones de conjugado descritos en el presente documento en algunos ejemplos comprenden una fracción activa. En algunos ejemplos, la fracción de conjugado comprende una fracción activa que es un péptido o polipéptido. En algunos ejemplos, la fracción de conjugado comprende una fracción activa que es un polímero biocompatible.
En algunos ejemplos, la fracción de conjugado comprende una fracción activa que es un agente citotóxico, un agente inmunodepresor o un agente de formación de imágenes (por ejemplo, un fluoróforo). En algunos ejemplos, el agente citotóxico es un agente quimioterapéutico. En algunos ejemplos, la fracción activa es una cualquiera de: una fracción que mejora la propiedad farmacocinética del polipéptido que contiene Fc, una fracción terapéutica y una fracción de diagnóstico. En algunos ejemplos, la fracción activa es una molécula pequeña.
En algunos ejemplos, la fracción de conjugación comprende una fracción activa que es un agente citotóxico. Los ejemplos de un agente citotóxico incluyen, pero sin limitación, una antraciclina, una auristatina, una dolastatina, CC-1065, una duocarmicina, una enediina, una geldanamicina, una maitansina, una puromicina, un taxano, un alcaloide de la vinca, SN-38, tubulisina, hemiasterlina y estereoisómeros, isósteros, análogos o derivados de los mismos. En algunos ejemplos, la fracción de conjugación comprende monodansilcadaverina (MDC). En algunos ejemplos, la fracción de conjugación comprende TAM1. En algunos ejemplos, la fracción de conjugación comprende monometil auristatina E (MMAE).
Las antraciclinas proceden de bacterias Streptomyces y se han utilizado para tratar una amplia gama de cánceres, tales como leucemias, linfomas, cánceres de mama, de útero, de ovario y de pulmón. Las antraciclinas ilustrativas incluyen, pero sin limitación, daunorrubicina, doxorrubicina (es decir, adriamicina), epirrubicina, idarrubicina, valrrubicina y mitoxantrona.
Las dolastatinas y sus análogos peptídicos y derivados, las auristatinas, son agentes antimitóticos muy potentes que han demostrado tener actividad anticancerosa y antifúngica. Véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 5.663.149 y Pettit et al., Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965 (1998). Los ejemplos de dolastatinas y auristatinas incluyen, pero sin limitación, auristatina E, auristatina EB (AEB), auristatina EFP (AEFP), MMAD, MMAF, MMAE y éster de ácido 5-benzoilvalérico-AE (AEVB).
La duocarmicina y CC-1065 son agentes alquilantes de ADN con potencia citotóxica. Véase Boger y Johnson, PNAS 92:3642-3649 (1995). Los ejemplos de dolastatinas y auristatinas incluyen, pero sin limitación, (+)-docarmicina A y (+)-duocarmicina Sa , y (+)-CC-1065.
Las enediinas son una clase de productos bacterianos antitumorales caracterizados por anillos de nueve y diez miembros o por la presencia de un sistema cíclico de enlaces triple-doble-triple conjugados. Las enediinas ilustrativas incluyen, pero sin limitación, caliqueamicina, esperamicina y dinemicina.
Las geldanamicinas son antibióticos de benzoquinona ansamicina que se unen a Hsp90 (Heat Shock Protein 90, proteína de choque térmico 90) y se han utilizado como fármacos antitumorales. Geldanamicinas ilustrativas incluyen, pero sin limitación, 17-AAG (17-N-alilamino-17-demetoxigeldanamicina) y 17-DMAG (17-dimetilaminoetilamino-17-desmetoxigeldanamicina).
Las maitansinas o sus derivados maitansinoides inhiben la proliferación celular mediante la inhibición de la formación de microtúbulos durante la mitosis mediante la inhibición de la polimerización de la tubulina. Véase Remillard et al., Science 189:1002-1005 (1975). Las maitansinas y los maitansinoides ilustrativos incluyen, pero sin limitación, mertansina (DM1) y sus derivados, así como ansamitocina.
Los taxanos son diterpenos que actúan como agentes antitubulina o inhibidores mitóticos. Los taxanos ilustrativos incluyen, pero sin limitación, paclitaxel (por ejemplo, TAXOL®) y docetaxel (TAXOTERE®).
Los alquiloides de la vinca también son agentes antitubulina. Los alquiloides de vinca ilustrativos incluyen, pero sin limitación, vincristina, vinblastina, vindesina y vinorelbina.
En algunos ejemplos, la fracción de conjugado comprende una fracción activa que es un agente inmunodepresor. Los ejemplos de un agente inmunodepresor incluyen, pero sin limitación, ganciclovier, etanercept, tacrólimus, sirólimus, voclosporina, ciclosporina, rapamicina, ciclofosfamida, azatioprina, micofenolato mofetilo, metotrextrato y glucocorticoide y sus análogos.
En algunos ejemplos, la fracción de conjugado comprende una fracción activa que es un agente de formación de imágenes (por ejemplo, un fluoróforo), tal como fluoresceína, rodamina, fósforos lantánidos y derivados de los mismos. Entre los ejemplos de fluoróforos se incluyen, pero sin limitación, isotiocianato de fluoresceína (FITC) (por ejemplo, 5-FITC), amidita de fluoresceína (FAM) (por ejemplo, 5-FAM), eosina, carboxifluoresceína, eritrosina, Alexa Flúor® (por ejemplo, Alexa 350, 405, 430, 488, 500, 514, 532, 546, 555, 568, 594, 610, 633, 647, 660, 680, 700 o 750), carboxitetrametilrodamina (TAMRA) (por ejemplo, 5,-TAMRA), tetrametilrodamina (TMR) y sulforrodamina (SR) (por ejemplo, SR101).
En algunos ejemplos, la fracción de conjugado comprende una fracción activa que es un polipéptido. En algunos ejemplos, el polipéptido es un anticuerpo, tal como un anticuerpo monoclonal humanizado, humano, murino o quimérico.
En algunos ejemplos, la fracción de conjugado comprende una fracción activa que es un polipéptido de toxina (o una proteína de toxina). Los ejemplos de un polipéptido de toxina incluyen, pero sin limitación, la cadena A de difteria, fragmentos activos que no son fragmentos de unión de la toxina diftérica, cadena A de exotoxina, cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modeccina, a-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, tricotecenos, péptidos inhibidores del nudo de cistina (ICK) (por ejemplo, ceratotoxinas) y conotoxina (por ejemplo, KIIIA o SmlIIa).
En algunos ejemplos, la fracción de conjugado comprende un marcador tal como un radioisótopo. Los ejemplos de un radioisótopo u otros marcadores incluyen, pero sin limitación, 3H, 14C, 15N, 35S, 18F, 32P, 33P, 64Cu, 68Ga, 89Zr, 90Y, 99Tc, 1231, 1241, 1251, 1311, 111In, 131In, 153Sm, 186Re, 188Re, 211At, 212Bi e 153Pb.
En algunos ejemplos, la fracción de conjugado comprende una fracción activa que se selecciona del grupo que consiste en Alexa 488 cadaverina, 5-FlTc cadaverina, Alexa 647 cadaverina, Alexa 350 cadaverina, 5-TAMRA cadaverina, 5-FAM cadaverina, SR101 cadaverina, 5,6-TAMRA cadaverina, 5-FAM lisina, ac-Lys-Gly-MMAD, amino-PEG3-C2-MMAD, amino-PEG6-C2-MMAD, amino-PEG3-C2-amino-nonanoil-MMAD], aminocaproil-Val-Cit-PABC-MMAD, ac-Lys-p-Ala-MMAD, aminocaproil-MMAD, ac-Lys-Val-Cit-PABC-MMAD, aminocaproil-MMAE, amino-PEG3-C2-MMAE, amino-PEG2-C2-MMAE, aminocaproil-MMAF, aminocaproil-Val-Cit-PABC-MMAE, aminocaproil-Val-Cit-PA-BC-MMAF, amino-PEG2-C2-MMAF, amino-PEG3-C2-MMAF, putrescinil-geldanamicina y ac-Lys-putrescinilgeldanamicina. En algunos ejemplos, el agente donante de amina es aminocaproil-Val-Cit-PABC-MMAE, aminocaproil-Val-Cit-PABC-MMAF, ac-Lys-putrescinil-geldanamicina, ac-Lys-p-Ala-MMAD, ac-Lys-Val-Cit-PABC-MMAD, aminocaproil-Val-Cit-PABC-MMAD y amino-PEG6-C2-MMAD.
En algunos ejemplos, la fracción de conjugado comprende una fracción activa que es un polímero biocompatible. El polipéptido que contiene Fc se puede conjugar con el polímero biocompatible para mejorar las características biológicas del polipéptido que contiene Fc, por ejemplo, aumentar la semivida sérica y la bioactividad, y/o extender las semividas in vivo. Los ejemplos de polímeros biocompatibles incluyen polímeros solubles en agua, tales como polietilenglicol (PEG) o derivados del mismo y polímeros biocompatibles que contienen iones dipolares (por ejemplo, un polímero que contiene fosforilcolina).
Métodos para preparar conjugados polipeptídicos que contienen Fc
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona métodos para preparar los conjugados polipeptídicos que contienen Fc (tales como conjugados de anticuerpo y fármaco) utilizando transglutaminasa de tipo silvestre o genomanipulada.
El inventor ha creado TGasa genomanipuladas que están diseñadas para conjugar de manera específica una fracción de conjugado con un resto de glutamina aceptora en la región Fc de un polipéptido que contiene Fc (tal como un anticuerpo) que está flanqueado por un sitio de N-glucosilación. Contrariamente a la creencia previa de que un resto de glutamina en la región Fc flanqueado por un sitio de N-glucosilación sería inaccesible a la acción de la TGasa, el inventor también ha encontrado sorprendentemente que, mediante la utilización de una condición de reacción específica (por ejemplo, una concentración específica de la enzima), las TGasas de tipo silvestre también son capaces de conjugar una fracción de conjugado con un resto de glutamina aceptora en la región Fc que está flanqueada por un sitio de N-glucosilación de una forma estequiométrica y específica del sitio.
Los métodos descritos en el presente documento en algunos ejemplos implican una única etapa de conjugación. Dicho método es particularmente adecuado, por ejemplo, cuando un rendimiento de conjugación de entre el 20 y el 98 % es suficiente para generar una cantidad sustancial del conjugado polipeptídico que contiene Fc. El método de una sola etapa también es útil cuando se necesita minimizar el tamaño del enlazador, cuando hay suficiente suministro del polipéptido que contiene Fc, cuando la solubilidad del fármaco es moderada (por ejemplo, aproximadamente 100 mg/l) y cuando ahorrar tiempo es una preocupación mayor que obtener un rendimiento elevado.
En algunos ejemplos, el método implica dos etapas. En la primera, un identificador de molécula pequeña se conjuga con el polipéptido que contiene Fc a través de una TGasa para crear un conjugado intermedio. Posteriormente, una fracción activa se acopla al conjugado intermedio a través del identificador de molécula pequeña, ya sea de manera covalente o no covalente. El identificador de molécula pequeña se puede diseñar de manera específica para adaptar el acoplamiento de la fracción activa, por tanto, permite la conjugación de cualquier tipo de fracción activa con el polipéptido que contiene Fc. El método en dos etapas es particularmente útil cuando el suministro del polipéptido que contiene Fc y/o la fracción activa es limitado, y cuando la fracción activa (tal como la toxina) tiene baja solubilidad en agua y/o induce a la agregación del polipéptido. Mediante la utilización de un identificador de molécula pequeña, la primera etapa de acoplamiento enzimático puede permitir el logro de un rendimiento elevado en la conjugación. La segunda etapa de acoplamiento quimioselectivo solo necesita una relación de reactivos de la fracción activa:polipéptido que contiene Fc entre 1,2 y 1,5. Esto puede conducir a un rendimiento de conjugación general más elevado que en un proceso de una sola etapa.
En el presente documento se describe un método para preparar un conjugado polipeptídico que contiene Fc que comprende un polipéptido que contiene Fc conjugado de manera específica con una fracción de conjugado que comprende: poner en contacto el polipéptido que contiene Fc con la fracción de conjugado en presencia de una transglutaminasa en una condición que es suficiente para generar el conjugado polipeptídico que contiene Fc, en donde el polipéptido que contiene Fc comprende una región Fc N-glucosilada, en donde la región Fc N-glucosilada comprende un resto de glutamina aceptora flanqueado por un sitio de N-glucosilación, y en donde la fracción de conjugado se conjuga con el polipéptido que contiene Fc a través del resto de glutamina aceptora. En el presente documento también se describe un método para preparar un conjugado polipeptídico que contiene Fc que comprende un polipéptido que contiene Fc conjugado de manera específica con una fracción de conjugado que comprende: poner en contacto una composición que comprende polipéptidos que contienen Fc con la fracción de conjugado en presencia de una transglutaminasa en una condición que es suficiente para generar el conjugado polipeptídico que contiene Fc, en donde al menos alguno (por ejemplo, al menos aproximadamente un 50 %, un 60 %, un 70 %, un 80 %, un 90 % o más) de los polipéptidos que contienen Fc comprenden una región Fc N-glucosilada, en donde la región Fc comprende un resto de glutamina aceptora flanqueado por un sitio de N-glucosilación, y en donde la fracción de conjugado se conjuga con el polipéptido que contiene Fc a través del resto de glutamina aceptora.
En el presente documento se describe un método para preparar un conjugado de anticuerpo y fármaco que comprende un anticuerpo conjugado de manera específica con una fracción de conjugado que comprende: poner en contacto el anticuerpo con la fracción de conjugado en presencia de una transglutaminasa en una condición que sea suficiente para generar el conjugado de anticuerpo y fármaco, en donde el anticuerpo está glucosilado (por ejemplo, N-glucosilado) en la región Fc, y en donde la fracción de conjugado está conjugado con el resto de glutamina aceptora endógeno en el anticuerpo. En el presente documento también se describe un método para preparar un conjugado de anticuerpo y fármaco que comprende un anticuerpo conjugado de manera específica con una fracción de conjugado que comprende: poner en contacto una composición de anticuerpo con la fracción de conjugado en presencia de una transglutaminasa en una condición suficiente para generar el conjugado de anticuerpo y fármaco, en donde al menos aproximadamente alguno (por ejemplo, al menos aproximadamente un 50 %, un 60 %, un 70 %, un 80 %, un 90 % o más) del anticuerpo en la composición está glucosilado en la región Fc, y en donde la fracción de conjugado está conjugada con el resto de glutamina aceptora endógeno en el anticuerpo.
En el presente documento se describe un método para preparar un conjugado polipeptídico que contiene Fc que comprende un polipéptido que contiene Fc conjugado de manera específica con una fracción de conjugado que comprende un identificador de molécula pequeña y una fracción activa que comprende: a) poner en contacto el polipéptido que contiene Fc con el identificador de molécula pequeña en presencia de una transglutaminasa en una condición que es suficiente para generar un conjugado intermedio que comprende un polipéptido que contiene Fc conjugado de manera específica con el identificador de molécula pequeña, y b) poner en contacto el conjugado intermedio con una fracción activa obteniendo así el conjugado polipeptídico que contiene Fc, en donde el polipéptido que contiene Fc comprende una región Fc N-glucosilada, en donde la región Fc N-glucosilada comprende un resto de glutamina aceptora flanqueado por un sitio de N-glucosilación, y en donde la fracción de conjugado se conjuga con el polipéptido que contiene Fc a través del resto de glutamina aceptora. En el presente documento también se describe un método para preparar un conjugado polipeptídico que contiene Fc que comprende un polipéptido que contiene Fc conjugado de manera específica con una fracción de conjugado que comprende un identificador de molécula pequeña y una fracción activa que comprende: a) poner en contacto una composición que comprende polipéptidos que contienen Fc con el identificador de molécula pequeña en presencia de una transglutaminasa en una condición que es suficiente para generar un conjugado intermedio que comprende un polipéptido que contiene Fc conjugado de manera específica con el identificador de molécula pequeña, y b) poner en contacto el conjugado intermedio con una fracción activa obteniendo así el conjugado polipeptídico que contiene Fc, en donde al menos algunos (por ejemplo, un 50 %, un 60 %, un 70 %, un 80 %, un 90 % o más) de los polipéptidos que contienen Fc comprenden una región Fc N-glucosilada, en donde la región Fc comprende un resto de glutamina aceptora flanqueado por un sitio de N-glucosilación, y en donde la fracción de conjugado se conjuga con el polipéptido que contiene Fc a través del resto de glutamina aceptora.
En el presente documento se describe un método para preparar un conjugado de anticuerpo y fármaco que comprende un anticuerpo conjugado de manera específica con una fracción de conjugado que comprende un identificador de molécula pequeña y una fracción activa que comprende: a) poner en contacto el anticuerpo con el identificador de molécula pequeña en presencia de una transglutaminasa en una condición que es suficiente para generar un conjugado intermedio que comprende un anticuerpo conjugado de manera específica con el identificador de molécula pequeña, y b) poner en contacto el conjugado intermedio con una fracción activa obteniendo así el conjugado de anticuerpo y fármaco, en donde el anticuerpo está glucosilado (por ejemplo, N-glucosilado) en la región Fc, y en donde la fracción de conjugado está conjugado con el resto de glutamina aceptora endógeno en el anticuerpo. En el presente documento también se describe un método para preparar un conjugado de anticuerpo y fármaco que comprende un anticuerpo conjugado de manera específica con una fracción de conjugado que comprende un identificador de molécula pequeña y una fracción activa que comprende: a) poner en contacto una composición de anticuerpo con el identificador de molécula pequeña en presencia de una transglutaminasa en una condición suficiente para generar un conjugado intermedio que comprende un anticuerpo conjugado de manera específica con el identificador de molécula pequeña, y b) poner en contacto el conjugado intermedio con una fracción activa obteniendo así el conjugado de anticuerpo y fármaco, en donde al menos algo (por ejemplo, al menos aproximadamente cualquiera de un 50 %, un 60 %, un 70 %, un 80 %, un 90 % o más) del anticuerpo en la composición está glucosilado (por ejemplo, N-glucosilado) en la región Fc, y en donde la fracción de conjugado está conjugada con el resto de glutamina aceptora endógeno en el anticuerpo.
El identificador de molécula pequeña descrito en el presente documento generalmente tiene la estructura de -NH2-R, en donde R es una fracción que permite la unión de la fracción activada. La introducción del asa de molécula pequeña en los métodos descritos en el presente documento aumenta de manera significativa la flexibilidad de los métodos. De manera específica, la estructura del identificador de molécula pequeña se puede adaptar a la unión de la fracción activa deseada. Por ejemplo, en algunos ejemplos, R es un ligando que se une de manera específica a un compañero de unión. Esto permite la unión de cualquier molécula (tal como una proteína) que contenga el compañero de unión. Los pares adecuados de ligando/compañero de unión incluyen, pero sin limitación, anticuerpo/antígeno, antígeno/anticuerpo, avidina/biotina, biotina/avidina, estreptavidina/biotina, biotina/estreptavidina, glutatión/GST, GST/glutatión, proteína de unión a maltosa/amilosa, amilosa/proteína de unión a maltosa, proteína de unión a celulosa y celulosa, celulosa/proteína de unión a celulosa, etc.
Otros identificadores de moléculas pequeñas adecuados descritos en el presente documento incluyen, pero sin limitación, NH2-CH2-CH(OH)-CH2-NH2, NH2-R-(OR')2, NH2-R=O, NH2-R-SH, NH2-R-Azida. Estos identificadores de moléculas pequeñas permiten la unión de la fracción de conjugado a través de enlazadores adecuados tales como NH2-O-R-X, maleimida-R-X y ciclooctino-R-(R'-X)2, en donde X es la fracción activa, y R y R' son independientemente grupos enlazadores, tales como grupos enlazadores que comprenden grupos alquilo o polietilenglicol. En algunas realizaciones, el identificador de molécula pequeña es un enlazador PEG de 3 brazos con un grupo amino y dos grupos azida (tal como el enlazador PEG de 3 brazos representado en la figura 18, panel superior), en donde cada uno de los grupos azida puede conjugarse con una fracción activa.
La reacción catalizada por la TGasa se puede llevar a cabo desde varias horas hasta un día (por ejemplo, durante la noche). Se permite que la fracción conjugada o el identificador de molécula pequeña reaccionen con el polipéptido que contiene Fc (por ejemplo, 1 mg/ml) a concentraciones de ligando entre 400 y 600 pmol/l, lo que proporciona un exceso de 60 a 90 veces de los sustratos sobre el polipéptido que contiene Fc u, opcionalmente, un exceso menor de sustratos, por ejemplo, de 1 a 20 veces o de 10 a 20 veces. Las reacciones se pueden realizar en solución salina tamponada con fosfato sin potasio (PBS; pH 8) a 37 °C. Después de 4 h a varios días, se alcanzan las condiciones de estado estacionario. A continuación, el exceso de ligando y enzima se elimina mediante centrifugación-diálisis (VIVASPIN® MWCO 50 kDa, Vivascience, Winkel, Suiza) o diafiltración (PELLICON® MWMCO 50 kDa, Millipore). Las reacciones pueden controlarse mediante HPLC.
Los conjugados polipeptídicos que contienen Fc resultantes se pueden analizar con cualquier método adecuado. Por ejemplo, la estequiometría del polipéptido conjugado se puede caracterizar mediante espectrometría de masas por cromatografía líquida (LC/MS) utilizando un enfoque de arriba hacia abajo para evaluar el número de fracciones de conjugado o identificadores de moléculas pequeñas conjugadas con anticuerpos y, en particular, la homogeneidad de la composición. Los conjugados se pueden reducir antes del análisis LC/MS y las cadenas ligeras y pesadas se miden por separado.
En un ejemplo, el producto se analiza para determinar la carga de fármaco (por ejemplo, número de fracciones activas en el conjugado por polipéptido que contiene Fc). Dichos métodos se pueden utilizar para determinar el número medio de fracciones activas o de conjugado (tal como el fármaco) por polipéptido que contiene Fc, así como la distribución del número de fracciones activas o de conjugado (tal como el fármaco) por anticuerpo en una composición, es decir, el porcentaje del anticuerpo total con cualquier nivel dado de carga de fármaco o DAR. Se puede determinar la porción de anticuerpos que tiene un número (n) de glutaminas aceptoras conjugadas (por ejemplo, n=1,2, 3, 4, 5, 6, etc.). Una técnica adaptada a dicha determinación y más generalmente a la carga de fármaco es la cromatografía de interacción hidrófoba (HlC, del inglés "hydrophobic interaction chromatography"), La HIC se puede llevar a cabo como se describe, por ejemplo, en Hamblett et al. (2004) Cáncer Res. 10: 7063-7070; Wakankar et al. (2011) mAbs 3(2): 161-172; y Lyon et al. (2012) Methods in Enzymology, Vol. 502: 123-138.
La relación molar entre la transglutaminasa y el polipéptido que contiene Fc en la reacción de conjugación se puede controlar para permitir una reacción de transglutaminación eficaz. Por ejemplo, la relación molar de la transglutaminasa y el polipéptido que contiene Fc (tal como un anticuerpo o una composición de anticuerpos) puede ser de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 1:100, incluida cualquiera de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 9:1, de aproximadamente 9:1 a aproximadamente 8:1, de aproximadamente 8:1 a aproximadamente 7:1, de aproximadamente 7:1 a aproximadamente 6:1, de aproximadamente 6:1 a aproximadamente 5:1, de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 4:1, de aproximadamente 4:1 a aproximadamente 3:1, de aproximadamente 3:1 a aproximadamente 2:1, de aproximadamente 2:1 a aproximadamente 1:1, de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1:2, de aproximadamente 1:2 a aproximadamente 1:3, de aproximadamente 1:3 a aproximadamente 1:4, de aproximadamente 1:4 a aproximadamente 1:5, de aproximadamente 1:5 a aproximadamente 1:6, de aproximadamente 1:6 a aproximadamente 1:7, de aproximadamente 1:7 a aproximadamente 1:8, de aproximadamente 1:8 a aproximadamente 1:9, de aproximadamente 1:9 a aproximadamente 1:10, de aproximadamente 1:10 a aproximadamente 1:20, de aproximadamente 1:20 a aproximadamente 1:30, de aproximadamente 1:30 a aproximadamente 1:40, de aproximadamente 1:40 a aproximadamente 1:50, de aproximadamente 1:50 a aproximadamente 1:60, de aproximadamente 1:60 a aproximadamente 1:70, de aproximadamente 1:70 a aproximadamente 1:80, de aproximadamente 1:80 a aproximadamente 1:90 o de aproximadamente 1:90 a aproximadamente 1:100.
La cantidad de transglutaminasa en la mezcla de reacción se puede controlar para permitir una reacción de transglutaminasa eficaz. Por ejemplo, la concentración de la transglutaminasa en la mezcla de reacción puede ser aproximadamente cualquiera de aproximadamente 0,01 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, incluido, por ejemplo, cualquiera de aproximadamente 0,01 mg/ml a aproximadamente 0,02 mg/ml, de aproximadamente 0,02 mg/ml a aproximadamente 0,03 mg/ml, de aproximadamente 0,03 mg/ml a aproximadamente 0,04 mg/ml, de aproximadamente 0,04 mg/ml a aproximadamente 0,05 mg/ml, de aproximadamente 0,05 mg/ml a aproximadamente 0,06 mg/ml, de aproximadamente 0,06 mg/ml a aproximadamente 0,07 mg/ml, de aproximadamente 0,07 mg/ml a aproximadamente 0,08 mg/ml, de aproximadamente de 0,08 mg/ml a aproximadamente 0,09 mg/ml, de aproximadamente 0,09 mg/ml a aproximadamente 0,1 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 0,2 mg/ml, de aproximadamente 0,2 mg/ml a aproximadamente 0,3 mg/ml, de aproximadamente 0,3 mg/ml a aproximadamente 0,4 mg/ml, de aproximadamente 0,4 mg/ml a aproximadamente 0,5 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 0,6 mg/ml, de aproximadamente 0,6 mg/ml a aproximadamente 0,7 mg/ml, de aproximadamente 0,7 mg/ml a aproximadamente 0,8 mg/ml, de aproximadamente 0,8 mg/ml a aproximadamente 0,9 mg/ml, de aproximadamente 0,9 mg/ml a aproximadamente 1 mg/ml, de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 2 mg/ml, de aproximadamente 2 mg/ml a aproximadamente 3 mg/ml, de aproximadamente 3 mg/ml a aproximadamente 4 mg/ml, de aproximadamente 4 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml. En algunos ejemplos, la concentración de la transglutaminasa en la mezcla de reacción es de aproximadamente 0,05 mg/ml a aproximadamente 1 mg/ml, tal como de aproximadamente 0,2 mg/ml a aproximadamente 1 mg/ml.
En algunos ejemplos, la reacción de la transglutaminasa se lleva a cabo en un soporte sólido. Por ejemplo, el polipéptido que contiene Fc (tal como un anticuerpo) puede unirse a un soporte sólido. A continuación, los componentes restantes de la reacción de conjugación se ponen en contacto con el polipéptido que contiene Fc en el soporte sólido y posteriormente se eliminan. Como alternativa, la transglutaminasa se puede unir a un soporte sólido. A continuación, los componentes restantes de la reacción de conjugación se ponen en contacto con la transglutaminasa en el soporte sólido y posteriormente se separan de la transglutaminasa en el soporte sólido.
El soporte sólido que es útil para los métodos descritos en el presente documento incluye, por ejemplo, placas, tubos, botellas, matraces, perlas magnéticas, hojas magnéticas, matrices porosas o cualquier superficie sólida y similares. Los agentes o moléculas que pueden utilizarse para unir la TGasa o el polipéptido que contiene Fc al soporte sólido incluyen, pero sin limitación, lectinas, avidina/biotina, moléculas de unión inorgánicas u orgánicas. La separación física se puede efectuar, por ejemplo, mediante filtración, aislamiento, campo magnético, centrifugación, lavado, etc.
En algunos ejemplos, el soporte sólido es una perla, una membrana, un cartucho, un filtro, una placa de microtitulación, un tubo de ensayo, polvo sólido, un módulo moldeado por fundición o extrusión, una malla, una fibra, un compuesto de partículas magnéticas o cualquier otro material sólido. El soporte sólido se puede recubrir con una sustancia tal como polietileno, polipropileno, poli(4-metilbuteno), poliestireno, poliacrilato, tereftalato de polietileno, rayón, nailon, poli(butirato de vinilo), difluoruro de polivinilideno (PCDF), siliconas, poliformaldehído, celulosa, acetato de celulosa, nitrocelulosa y similares. En algunos ejemplos, el soporte sólido puede estar revestido con un ligando o impregnado con el ligando.
En algunos ejemplos, el material de soporte es una perla magnética. En algunos ejemplos, las perlas magnéticas tienen un tamaño promedio de aproximadamente 1 a 200 micrómetros, tal como cualquiera de aproximadamente 1 a 2 micrómetros, 2 a 10 micrómetros, 10 a 30 micrómetros, 30 a 50 micrómetros, 50 a 100 micrómetros y 10 a 200 micrómetros. En algunos ejemplos, las perlas magnéticas son monodispersas. En algunos ejemplos, las perlas magnéticas están recubiertas, por ejemplo, con proteína A.
Otro soporte sólido que se puede utilizar en los métodos descritos en el presente documento incluye, pero sin limitación, gelatina, vidrio, macroperlas de sefarosa, microportadores de dextrano tales como CYTODES® (Pharmacia, Uppsala, Suecia). También se contemplan polisacáridos tales como agarosa, alginato, carragenano, quitina, celulosa, dextrano o almidón, poliacrilamida, poliestireno, poliacroleína, alcohol polivinílico, polimetilacrilato, perfluorocarbono, compuestos inorgánicos tales como sílice, vidrio, tierra de infusorios, alúmina, óxido de hierro u otros óxidos metálicos, o copolímeros consistentes en cualquier combinación de dos o más polímeros de origen natural, polímeros sintéticos o compuestos inorgánicos.
La cantidad de transglutaminasa en la mezcla de reacción (es decir, la cantidad por ml de resina cuando se utiliza resina como soporte sólido) se puede controlar para permitir una reacción eficaz de la transglutaminasa. Por ejemplo, la concentración de la transglutaminasa en la mezcla de reacción (cantidad por ml de resina) puede ser aproximadamente cualquiera de aproximadamente 0,01 mg/ml a aproximadamente 1 mg/ml, incluido, por ejemplo, cualquiera de aproximadamente 0,01 mg/ml a aproximadamente 0,02 mg/ml, de aproximadamente 0,02 mg/ml a aproximadamente 0,03 mg/ml, de aproximadamente 0,03 mg/ml a aproximadamente 0,04 mg/ml, de aproximadamente 0,04 mg/ml a aproximadamente 0,05 mg/ml, de aproximadamente 0,05 mg/ml a aproximadamente 0,06 mg/ml, de aproximadamente 0,06 mg/ml a aproximadamente 0,07 mg/ml, de aproximadamente 0,07 mg/ml a aproximadamente 0,08 mg/ml, de aproximadamente de 0,08 mg/ml a aproximadamente 0,09 mg/ml, de aproximadamente 0,09 mg/ml a aproximadamente 0,1 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 0,2 mg/ml, de aproximadamente 0,2 mg/ml a aproximadamente 0,3 mg/ml, de aproximadamente 0,3 mg/ml a aproximadamente 0,4 mg/ml, de aproximadamente 0,4 mg/ml a aproximadamente 0,5 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 0,6 mg/ml, de aproximadamente 0,6 mg/ml a aproximadamente 0,7 mg/ml, de aproximadamente 0,7 mg/ml a aproximadamente 0,8 mg/ml, de aproximadamente 0,8 mg/ml a aproximadamente 0,9 mg/ml, de aproximadamente 0,9 mg/ml a aproximadamente 1 mg/ml.
En algunos ejemplos, la relación de concentración entre la fracción de conjugado y el polipéptido que contiene Fc (tal como un anticuerpo) es de aproximadamente 2:1 a aproximadamente 800:1, incluido, pero sin limitación, aproximadamente cualquiera de: 2:1, 3:1,4:1, 5:1,6:1, 7:1,8:1,9:1, 10:1, 15:1,20:1,25:1,30:1, 35:1, 40:1,45:1,50:1, 60:1, 70:1, 80:1, 90:1, 100:1, 200:1, 300:1, 400:1, 500:1,600:1, 700:1 y 800:1.
En algunos ejemplos, la eficacia de conjugación del polipéptido que contiene Fc (tal como un anticuerpo) y la fracción de conjugación es de al menos aproximadamente un 30 %. Como se utiliza en el presente documento, la expresión "eficacia de conjugación" o "eficacia de entrecruzamiento" es la relación entre la cantidad medida experimentalmente de conjugado polipeptídico genomanipulado dividido por la cantidad máxima esperada de conjugado polipeptídico genomanipulado. La eficacia de la conjugación o la eficacia del entrecruzamiento se pueden medir mediante diversas técnicas bien conocidas por los expertos en la materia, tales como la cromatografía de interacción hidrófoba. La eficacia de conjugación también se puede medir a diferentes temperaturas, tales como a temperatura ambiente o a 37 °C. En algunos ejemplos, la eficacia de conjugación del polipéptido que contiene Fc y la fracción de conjugación es al menos aproximadamente cualquiera de un 30 % a un 35 %, de un 35 % a un 40 %, de un 45 % a un 50 %, de un 50 % a un 55 %, de un 56 % a un 60 %, de un 61 % a un 65 %, de un 66 % a un 70 %, de un 71 % a un 75 %, de un 76 % a un 80 %, de un 81 % a un 85 %, de un 86 % a un 90 %, de un 91 % a un 95 % o de un 96 % a un 99 %. En algunos ejemplos, la eficacia de conjugación del polipéptido que contiene Fc y la fracción de conjugación es al menos aproximadamente de cualquiera de un 32 %, un 34 %, un 36 %, un 38 %, un 40 %, un 42 %, un 44 %, un 46 %, un 48 %, un 50 %, un 55 %, un 60 %, un 65 %, un 70 %, un 75 %, un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 % o un 99 %.
TGasas
Las TGasas catalizan el entrecruzamiento de proteínas covalentes mediante la formación de enlaces isopeptídicos resistentes a proteinasas entre un resto donante de lisina de una proteína y un resto de glutamina aceptora de otra proteína, y se acompaña de la liberación de amoníaco. El mecanismo catalítico de las transglutaminasas se ha propuesto de la siguiente manera. Después de que el primer sustrato que contiene glutamina (aceptora o sustrato Q) se une a la enzima, forma un Y-glutamiltioéster con el resto de cisteína en el centro activo de la TGasa, conocido como el intermedio de acilenzima, acompañado de la liberación de amoníaco. A continuación, el segundo sustrato (donante o sustrato K) se une al intermedio de acilenzima y ataca el enlace tioéster. El producto (dos proteínas entrecruzadas por un puente isopeptídico de N-£ (Y-glutamil)lisina) se forma y se libera. Esto restablece el resto Cys del centro activo de la enzima en su forma original y le permite participar en otro ciclo de catálisis. Se cree que la formación del intermedio de acilenzima covalente es la etapa limitante de la velocidad en estas reacciones. La tríada catalítica de muchas transglutaminasas es similar a la papaína, que contiene Cys-His-Asp (donde His es histidina y Asp es ácido aspártico) y, esencialmente, un resto de triptófano (Trp) ubicado a 36 restos del centro activo Cys. En cambio, las TGasas bacterianas aisladas de Streptoverticillium sp. (véase anteriormente) tienen una tríada catalítica atípica y no muestra homología de secuencia con la tríada catalítica de tipo papaína de otras TGasas.
Se han informado varios tipos de transglutaminasas en varios organismos vivos, incluidos los microbianos. Algunos ejemplos son la TGasa de hígado de cobaya (GTGasa), hígado de pescado (FTGasa) y microorganismos (mTGasa) y cualquier TGasa recombinante (rTGasa). También se pueden utilizar otras TGasas distintas de los enumerados en el presente documento. Ejemplos de TGasas útiles incluyen transglutaminasas microbianas, tales como, por ejemplo, de Streptomyces mobaraense, Streptomyces cinnamoneum y Streptomyces griseocarneum divulgadas en la patente de EE. UU. n.° 5.156.956, y Streptomyces lavendulae divulgada en la patente de EE. UU. n.° 5.252.469, y Streptomyces ladakanum divulgada en el documento JP2003199569. Se han aislado otras transglutaminasas microbianas útiles de Bacillus subtilis (divulgadas en la patente de EE. UU. n.° 5.731.183) y de varios Myxomycetes. Otros ejemplos de transglutaminasas microbianas útiles son las divulgadas en el documento WO 96/06931 (por ejemplo, transglutaminasa de Bacillus lydicus) y en el documento WO 96/22366. Las transglutaminasas no microbianas útiles incluyen transglutaminasa de hígado de cobaya y transglutaminasas de varias fuentes marinas como el pez plano Pagrus major (divulgadas en el documento EP-0555649) y la ostra japonesa Crassostrea gigas (divulgada en la patente de EE. UU. n.° 5.736.356). Una TGasa ilustrativa es la transglutaminasa bacteriana (TGB) (véase, por ejemplo, EC 2.3.2.13, proteína-glutamina-Y-glutamiltransferasa). En otro ejemplo, la TGasa es de S. mobaraense. En otro ejemplo, la TGasa es una TGasa mutante (por ejemplo, genomanipulada) que tiene al menos un 80 % de homología de secuencia con la TGasa natural. Un ejemplo es la transglutaminasa bacteriana recombinante procedente de Streptomyces mobaraensis (disponible en Zedira, Darmstadt, Alemania).
Streptomyces ladakanum ATCC 27441 o mTGasa NRRL3191 que se expresa como Pre-Pro-mTGasa (número de registro de GenBank AY241675). Hay 410 restos de aminoácidos en la pre-pro-mTGasa, 331 en enzima madura más 30 de pre y 49 de pro. El péptido pro es un fuerte inhibidor de la enzima madura. Se utilizaron cebadores diseñados de acuerdo con AY241675 para clonar la pro-mTGasa y la mTGasa madura de ATCC 27441DNA en los sitios Nde I y Xho I del vector pET29b(+). La mTGasa activa se puede obtener a partir de la digestión de la cadena ligera de enterocinasa (EKL) de la Pro-mTGasa o del replegamiento de la mTGasa madura. La mTGasa de Streptomyces ladakanum (TG_SL) es muy similar a mTGasa de Streptomyces mobaraensis (TG_SM, vendido por Ajinomoto como ACTIVA®) con algunas diferencias de aminoácidos (la alineación se muestra en la figura 2).
La transglutaminasa utilizada en los métodos descritos en el presente documento se puede obtener o preparar a partir de una variedad de fuentes. En algunos ejemplos, la transglutaminasa es una transglutaminasa dependiente de calcio que necesita calcio para inducir cambios conformacionales enzimáticos y permitir la actividad enzimática. Por ejemplo, la transglutaminasa puede proceder de hígado de cobaya y obtenerse a través de fuentes comerciales (por ejemplo, Sigma-Aldrich (St Louis, Mo.) y MP Biomedicals (Irvine, Calif.)). En algunos ejemplos, la transglutaminasa es una transglutaminasa independiente del calcio que no necesita calcio para inducir cambios conformacionales enzimáticos y permitir la actividad enzimática. En algunos ejemplos, la transglutaminasa es una transglutaminasa microbiana procedente de un genoma microbiano, tal como la transglutaminasa de Streptoverticillium o Streptomyces (por ejemplo, Streptomyces mobarensis o Streptoverticillium mobarensis). En algunos ejemplos, la transglutaminasa es una proteína de mamífero (por ejemplo, transglutaminasa humana), una proteína bacteriana, una proteína vegetal, una proteína fúngica (por ejemplo, transglutaminasas de Oomycetes y Actinomicetes) o una proteína procariota. En algunos ejemplos, la transglutaminasa es de Micrococcus, Clostridium, Turolpsis, Rhizopus, Monascus o Bacillus.
Las TGasa adecuadas incluyen, pero sin limitación, transglutaminasa bacteriana (TGB) tal como la enzima con referencia EC EC 2.3.2.13 (proteína-glutamina-Y-glutamiltransferasa). En algunos ejemplos, la TGasa es de Streptomyces ladakanum (TG_SL, SEQ ID NO. 16, véase la figura 2). En algunos ejemplos, la TGasa es de Streptomyces mobaraensis (TG-SM, SEQ ID NO: 18, véase la figura 2). En algunos ejemplos, la TGasa es una TGasa recombinante basada en la TGasa de Streptomyces ladakanum (TG SL, SEQ ID NO: 17, véase la figura 3).
En algunos ejemplos, la transglutaminasa utilizada en los métodos descritos en el presente documento es una proteína recombinante producida con técnicas recombinantes.
En algunos ejemplos, la transglutaminasa es de tipo silvestre, por ejemplo, la TGasa que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 16. En algunos ejemplos, la transglutaminasa es una TGasa recombinante de tipo silvestre que comprende la TGasa de tipo silvestre que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 16, en donde la TGasa recombinante de tipo salvaje comprende además una prolina adicional en el extremo N y, opcionalmente, un marcador de purificación (tal como un marcador de polihistidina). En algunos ejemplos, la transglutaminasa es una TGasa recombinante de tipo silvestre que tiene una secuencia de SEQ ID NO: 17 como se muestra en la figura 3. Contrariamente a la comprensión general en la materia de que la transglutaminasa de tipo silvestre no puede catalizar la reacción de transglutaminación a una glutamina aceptora flanqueada por un sitio de N-glucosilación, se encontró sorprendentemente que dicha reacción se puede llevar a cabo con eficacia y especificidad sustanciales bajo determinadas condiciones como se describe en el presente documento.
En algunos ejemplos, la transglutaminasa está genomanipulada. En algunos ejemplos, la transglutaminasa es una transglutaminasa genomanipulada de manera específica para llevar a cabo reacciones de transglutaminación en una glutamina aceptora próxima a un sitio de N-glucosilación. Dichas transglutaminasas genomanipuladas se describen más detalladamente a continuación.
En algunos ejemplos, la transglutaminasa es una proteína purificada. Por ejemplo, la transglutaminasa puede tener una pureza mínima de aproximadamente un 50 %. Como se utiliza en el presente documento, proteína "pura" o "purificada" se refiere a una proteína (por ejemplo, la transglutaminasa) sin otros contaminantes proteicos. En algunos ejemplos, la transglutaminasa purificada es al menos aproximadamente cualquiera de un 55 % a un 60 %, de un 60 % a un 65 %, de un 65 % a un 70 %, de un 70 % a un 75 %, de un 75 % a un 80 %, de un 80 % a un 85 %, de un 85 % a un 90 %, de un 90 % a un 95 %, de un 95 % a un 98 % o un 99 % pura. En algunos ejemplos, la transglutaminasa purificada es al menos aproximadamente cualquiera de un 50 %, un 55 %, un 60 %, un 65 %, un 70 %, un 75 %, un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o el 100 %.
Transglutaminasa genomanipulada
La presente divulgación en otro aspecto proporciona una transglutaminasa genomanipulada de manera específica para llevar a cabo reacciones de transglutaminación en una glutamina aceptora próxima a un sitio de N-glucosilación. Se remodeló el bolsillo de unión al sustrato de la TGasa para aumentar la accesibilidad del resto de glutamina en la región Fc (Q295 específicamente) al resto catalítico Cys64 de TGasa (Figura 3), y se obtuvo TGasas genomanipuladas que realizan de manera específica reacciones de transglutaminación en Q295.
En algunos ejemplos, la TGasa genomanipulada se basa en la TGasa de tipo silvestre de Streptomyces ladakanum (SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 17). En algunos ejemplos, la TGasa genomanipulada se basa en la TGasa de tipo silvestre de Streptomyces mobaraensis (SEQ ID NO: 18). La secuencia de una TGasa aislada de Streptomyces ladakanum tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la secuencia de Streptomyces mobaraensis excepto por un total de 22 diferencias de aminoácidos entre las dos secuencias (Yi-Sin Lin et al., Process Biochemistry 39(5), 591-598 (2004).
En algunos ejemplos, la transglutaminasa genomanipulada lleva a cabo de manera específica la reacción de transglutaminación en el sitio de glutamina aceptora en la región Fc N-glucosilada. La expresión "de manera específica" utilizada en este contexto describe una preferencia de la TGasa por reaccionar con uno o más restos de glutamina específicos en la región Fc N-glucosilada en comparación con otros restos de glutamina específicos en el polipéptido que contiene Fc (tal como un anticuerpo).
Por tanto, en el presente documento se describe una transglutaminasa genomanipulada capaz de conjugar un polipéptido que contiene Fc (tal como un anticuerpo) a una fracción de conjugado, en donde el polipéptido que contiene Fc (tal como un anticuerpo) comprende una región Fc N-glucosilada, en donde la región Fc N-glucosilada comprende un resto de glutamina aceptora flanqueado por un sitio de N-glucosilación, en donde tras la reacción, la fracción de conjugado se conjuga con el polipéptido que contiene Fc (tal como un anticuerpo) a través del resto de glutamina aceptora, y en donde la conjugación es al menos aproximadamente un 10 % más activa que con una transglutaminasa de tipo silvestre en las mismas condiciones de reacción. En algunos ejemplos, la TGasa genomanipulada tiene al menos aproximadamente un 80 % de identidad con la SEQ ID NO: 16 y además comprende al menos una mutación (tal como sustitución, eliminación o inserción).
En el presente documento se describe una transglutaminasa genomanipulada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 80 % (incluido, por ejemplo, al menos aproximadamente un 85 %, un 90 %, un 95 % o un 95 %) de identidad con la SEQ ID NO: 16, en donde la transglutaminasa comprende una eliminación seleccionada del grupo que consiste en: D1 a E4; P244 a P247; y H279 a H289. También se describe en el presente documento una transglutaminasa genomanipulada que comprende una secuencia de aminoácidos que es 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 16 excepto por una o más eliminaciones seleccionadas del grupo que consiste en: D1 a E4; P244 a P247; y H279 a H289.
En el presente documento también se describe una transglutaminasa genomanipulada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 80 % (incluido, por ejemplo, al menos aproximadamente un 85 %, un 90 %, un 95 % o un 95 %) de identidad con la SEQ ID NO: 17, en donde la transglutaminasa comprende una eliminación seleccionada del grupo que consiste en: P1 a E5; P245 a P248; y H280 a H290. También se describe en el presente documento una transglutaminasa genomanipulada que comprende una secuencia de aminoácidos que es 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 17 excepto por una o más eliminaciones seleccionadas del grupo que consiste en: P1 a E5; P245 a P248; y H280 a H290.
En el presente documento también se describe una transglutaminasa genomanipulada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 80 % (incluido, por ejemplo, al menos aproximadamente un 85 %, un 90 %, un 95 % o un 95 %) de identidad con la SEQ ID NO: 16, en donde la transglutaminasa comprende una mutación seleccionada del grupo que consiste en: eliminación de D1 a E4; eliminación de P244 a P247; eliminación de N282 a L285; sustitución de H279 a A287 con una G; y sustitución de A280 a H289 con una G. También se describe en el presente documento una transglutaminasa genomanipulada que comprende una secuencia de aminoácidos que es 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 16 excepto por una o más eliminaciones seleccionadas del grupo que consiste en: una mutación seleccionada del grupo que consiste en: eliminación de D1 a E4; eliminación de P244 a P247; eliminación de N282 a L285; sustitución de H279 a A287 con una G; y sustitución de A280 a H289 por una G.
En el presente documento también se describe una transglutaminasa genomanipulada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 80 % (incluido, por ejemplo, al menos aproximadamente un 85 %, un 90 %, un 95 % o un 95 %) de identidad con la SEQ ID NO: 17, en donde la transglutaminasa comprende una mutación seleccionada del grupo que consiste en: eliminación de P1 a E5; eliminación de P245 a P248; eliminación de N283 a L286; sustitución de H280 a A288 por una G; y sustitución de A281 a H290 con una G. También se describe en el presente documento una transglutaminasa genomanipulada que comprende una secuencia de aminoácidos que es 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 17 excepto por una o más eliminaciones seleccionadas del grupo que consiste en: una mutación seleccionada del grupo que consiste en: eliminación de P1 a E5; eliminación de P245 a p248; eliminación de N283 a L286; sustitución de H280 a A288 por una G; y sustitución de A281 a H290 por una G.
También se describe en el presente documento una transglutaminasa genomanipulada que comprende una secuencia de aminoácidos que es 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 16 excepto por una eliminación de D1 a E4. También se describe en el presente documento una transglutaminasa genomanipulada que comprende una secuencia de aminoácidos que es 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 16 excepto por una eliminación de P244 a P247. También se describe en el presente documento una transglutaminasa genomanipulada que comprende una secuencia de aminoácidos que es 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 16 excepto por una eliminación de H279 a H289. También se describe en el presente documento una transglutaminasa genomanipulada que comprende una secuencia de aminoácidos que es 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 16 excepto por una eliminación de N282 a L285. También se describe en el presente documento una transglutaminasa genomanipulada que comprende una secuencia de aminoácidos que es 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 16 excepto por una eliminación de D1 a E4 y una eliminación de N282 a L285. También se describe en el presente documento una transglutaminasa genomanipulada que comprende una secuencia de aminoácidos que es 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 16 excepto por una eliminación de D1 a E4, una eliminación de P244 a P247 y una eliminación de N282 a L285. En el presente documento también se describe una transglutaminasa genomanipulada que comprende una secuencia de aminoácidos que es 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 16 excepto por una eliminación de D1 a E4 y una sustitución de H280 a A288 con una G. También se describe en el presente documento una transglutaminasa genomanipulada que comprende una secuencia de aminoácidos que es 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 16 excepto por una eliminación de D1 a E4 y una sustitución de A280 a H289 con una G.
En el presente documento se describe una transglutaminasa genomanipulada que comprende una secuencia de aminoácidos que es 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 17 excepto por una eliminación de P1 a E5. También se describe en el presente documento una transglutaminasa genomanipulada que comprende una secuencia de aminoácidos que es 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 17 excepto por una eliminación de P245 a P248. También se describe en el presente documento una transglutaminasa genomanipulada que comprende una secuencia de aminoácidos que es 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 17 excepto por una eliminación de H280 a H290. También se describe en el presente documento una transglutaminasa genomanipulada que comprende una secuencia de aminoácidos que es 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 17 excepto por una eliminación de N283 a N286. También se describe en el presente documento una transglutaminasa genomanipulada que comprende una secuencia de aminoácidos que es 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 17 excepto por una eliminación de P1 a E5 y una eliminación de N283 a N286. También se describe en el presente documento una transglutaminasa genomanipulada que comprende una secuencia de aminoácidos que es 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 17 excepto por una eliminación de P1 a E5, una eliminación de P245 a P248 y una eliminación de N283 a N286. En el presente documento también se describe una transglutaminasa genomanipulada que comprende una secuencia de aminoácidos que es 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 17 excepto por una eliminación de P1 a E5 y una sustitución de H280 a A288 con una G. También se describe en el presente documento una transglutaminasa genomanipulada que comprende una secuencia de aminoácidos que es 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 17 excepto por una eliminación de P1 a E5 y una sustitución de A281 a H290 con una G.
La expresión "identidad de secuencia" o "identidad", como se utilizan indistintamente en el presente documento, se refieren al grado de relación de secuencia entre péptidos, determinada por el número de coincidencias entre cadenas de dos o más restos de aminoácidos. La identidad de secuencia se puede medir, por ejemplo, mediante el porcentaje de coincidencias idénticas entre la más pequeña de dos o más secuencias con alineamientos de huecos (si existen) dirigidos por un modelo matemático o programa informático particular (es decir, "algoritmos"). Algunos métodos para determinar la identidad están diseñados para proporcionar la mayor coincidencia entre las secuencias ensayadas. Los métodos para determinar la identidad se describen en programas informáticos disponibles públicamente. Los métodos de programas informáticos ilustrativos para determinar la identidad entre dos secuencias incluyen el paquete de programas GCG, que incluye GAP (Devereux et al., Nucl. Acid. Res. 12, 387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.), BLASTP, BLASTN y FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol.215, 403-410 (1990)). El programa BLASTX está disponible públicamente en el National Center for Biotechnology Information (NCBI) y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul et al., anteriormente citado). También puede utilizarse el algoritmo de Smith Waterman bien conocido para determinar la identidad.
En algunos ejemplos, la transglutaminasa genomanipulada tiene una actividad de transglutaminasa mayor que la de la TGasa codificada por la SEQ ID NO: 16 o la SEQ Id NO: 18. En algunos ejemplos, la actividad de especificidad de la transglutaminasa genomanipulada es al menos aproximadamente 1,25*, 1,5*, 2,0*, 2,5*, 3,0*, 3,5*, 4,0*, 4,5*, 5,0*, 5,5*, 6,0*, 6,5*, 7,0*, 7,5*, 8,0*, 8,5*, 9,0*, 9,5* o 10,5* mayor que la de la TGasa de tipo silvestre (tal como la TGasa codificada por la SEQ ID NO: 16 o la SEQ ID NO: 17).
Las TGasas genomanipuladas descritas en el presente documento se pueden analizar para determinar la actividad de TGasa mediante el uso de ensayos conocidos en la materia. Por ejemplo, el documento US 5.156.956 describe que la medición de la actividad de un péptido determinado se lleva a cabo mediante la realización de una reacción que utiliza benciloxicarbonil-L-glutaminil glicina e hidroxilamina como sustratos en ausencia de Ca2+, la formación de un complejo de hierro con el ácido hidroxámico resultante en presencia de ácido tricloroacético, la medición de la absorción a 525 nm y la determinación de la cantidad de ácido hidroxámico mediante una curva de calibración para calcular la actividad. Para los fines de la presente memoria descriptiva, un péptido, que presenta actividad transglutaminasa en dicho ensayo, se considera que tiene actividad transglutaminasa. En particular, los péptidos de la presente divulgación presentan una actividad que es superior al 30 %, tal como superior al 50 %, tal como superior al 70 %, tal como superior al 90 % de la de una TGasa de S. ladakanum que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16.
En el presente documento también se describen ácidos nucleicos (tales como ácidos nucleicos aislados) que codifican una cualquiera de las TGasas genomanipuladas descritas en el presente documento. Como se utiliza en el presente documento, el término "ácido nucleico" pretende indicar cualquier molécula de ácido nucleico de origen ADNc, ADN genómico, ADN sintético o ARN. El ácido nucleico puede ser monocatenario o bicatenario, y puede basarse en una secuencia de nucleótidos de origen natural completa o parcial que codifica una proteína de interés. El ácido nucleico puede contener opcionalmente otros segmentos de ácido nucleico.
En el presente documento también se describen vectores recombinantes (tales como vectores de amplificación y/o vectores de expresión) que comprenden ácidos nucleicos que codifican las TGasas genomanipuladas descritas en el presente documento. En el presente documento también se describe una célula hospedadora que comprende el vector recombinante.
El vector recombinante que comprende el ácido nucleico que codifica la TGasa genomanipulada puede ser cualquier vector que pueda someterse de manera conveniente a procedimientos de ADN recombinante, y la elección del vector puede depender de la célula hospedadora en la que se va a introducir. Por tanto, el vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido. Como alternativa, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en la célula hospedadora, se integra en el genoma de la célula hospedadora y se replique junto con el cromosoma o cromosomas en los que se ha integrado. El vector puede ser un vector de expresión en el que la secuencia de ADN que codifica la TGasa genomanipulada se une de manera operativa a segmentos adicionales necesarios para la transcripción del ADN. La expresión "unido de manera operativa" indica que los segmentos están dispuestos de modo que funcionan en conjunto para sus propósitos previstos, por ejemplo, la transcripción se inicia en un promotor y continúa a través de la secuencia de ADN que codifica la proteína. El promotor puede ser cualquier secuencia de a Dn que muestre actividad transcripcional en la célula hospedadora elegida y puede proceder de genes que codifican proteínas homólogas o heterólogas a la célula hospedadora. La secuencia de ADN que codifica la TGasa genomanipulada también puede, si fuera necesario, estar conectada de manera operativa a un finalizador adecuado.
En algunos ejemplos, el vector recombinante comprende además secuencias de ADN que permiten que el vector se replique en la célula hospedadora en cuestión, y/o un marcador seleccionable, por ejemplo, un gen cuyo producto complementa un defecto en la célula hospedadora, tal como el gen que codifica para la dihidrofolato reductasa (DHFR) o el gen TPI de Schizosaccharomyces pombe (descrito por P. R. Russell, Gene 40, 125-130 (1985)), o uno que confiere resistencia a un fármaco, por ejemplo, ampicilina, kanamicina, tetraciclina, cloranfenicol, neomicina, higromicina o metotrexato. Para hongos filamentosos, los marcadores seleccionables incluyen amdS, pyrG, argB, niaD y sC.
La célula hospedadora en la que se introduce el vector que comprende un ácido nucleico que codifica la TGasa genomanipulada puede ser cualquier célula que sea capaz de producir la TGasa genomanipulada e incluye bacterias, levaduras, hongos o células eucariotas superiores. La célula hospedadora transformada o transfectada descrita anteriormente se cultiva a continuación en un medio nutritivo adecuado en condiciones que permitan la expresión del presente péptido, después de lo cual la proteína resultante se recupera del cultivo. En algunos ejemplos, la célula hospedadora es una célula procariota. En algunos ejemplos, la célula hospedadora es S. ladakanum. En algunos ejemplos, la célula hospedadora es S. mobaraensis. En algunos ejemplos, la célula hospedadora es E. coli.
En el presente documento se describen además métodos para preparar las TGasas genomanipuladas descritas en el presente documento. Las TGasas genomanipuladas descritas en el presente documento se pueden preparar de diferentes maneras. Por ejemplo, la TGasa genomanipulada puede prepararse mediante el cultivo de una célula hospedadora que comprende un vector que comprende un ácido nucleico que codifica la TGasa genomanipulada y el aislamiento de la TGasa genomanipulada de las células.
Para dirigir una proteína de la presente divulgación a la vía secretora de las células hospedadoras, puede proporcionarse una secuencia señal secretora (también conocida como secuencia líder, preprosecuencia o presecuencia) en el vector recombinante. La secuencia señal secretora se une a la secuencia de ADN que codifica la proteína en el marco de lectura correcto. Las secuencias señal secretoras se colocan comúnmente en 5' con respecto a la secuencia de ADN que codifica la proteína. La secuencia señal secretora puede ser la normalmente asociada con la proteína o puede ser de un gen que codifica otra proteína secretada. Como alternativa, la proteína puede expresarse en el cuerpo de inclusión y obtenerse posteriormente mediante desnaturalización/renaturalización.
El medio utilizado para cultivar las células puede ser cualquier medio convencional adecuado para cultivar las células hospedadoras, tal como medios mínimos o complejos que contienen complementos adecuados. A continuación, la proteína producida por las células puede recuperarse del medio de cultivo mediante procedimientos convencionales, incluida la separación de las células hospedadoras del medio mediante centrifugación o filtración, precipitación de los componentes proteináceos del sobrenadante o filtrado por medio de una sal, por ejemplo, sulfato de amonio, purificación mediante una variedad de procedimientos cromatográficos, por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de filtración en gel, cromatografía de afinidad o similares, dependiendo del tipo de proteína en cuestión.
En el presente documento se describen métodos para purificar la TGasa, tales como una cualquiera de las TGasas descritas en el presente documento. En algunos ejemplos, el método comprende (a) proporcionar una célula hospedadora que expresa TGasa; (b) cultivar dicha célula hospedadora (tal como una célula procariota) en donde la TGasa se expresa como un cuerpo de inclusión; (c) romper dicha célula hospedadora para producir un lisado celular que tenga una fracción soluble y una fracción insoluble; y (d) separar dicha fracción soluble de dicha fracción insoluble, en donde dicha fracción insoluble comprende la TGasa. En algunos ejemplos, el método comprende además poner en contacto la fracción insoluble que comprende la TGasa en un agente desnaturalizante (tal como urea). En algunos ejemplos, el método comprende además contener la TGasa desnaturalizante en un tampón de renaturalización (tal como un tampón que comprende DTT). En algunos ejemplos, el método comprende además purificar la TGasa mediante cromatografía (tal como cromatografía de afinidad o cromatografía de intercambio iónico). En algunos ejemplos, la TGasa está marcada (tal como marcada con his) para facilitar la purificación.
En el presente documento también se describe un método para purificar la TGasa, que comprende (a) cultivar una célula hospedadora (tal como una célula procariota) que comprende un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una proenzima de TGasa, y (b) obtener la TGasa madura mediante la escisión de la prosecuencia de la proenzima (por ejemplo, mediante la cadena ligera de la endocinasa).
Las TGasas mutantes descritas en el presente documento se pueden utilizar para preparar conjugados polipeptídicos que contienen Fc (tales como conjugados de anticuerpo y fármaco). Por ejemplo, en el presente documento se describe un método para preparar un conjugado de anticuerpo y fármaco que comprende un anticuerpo conjugado de manera específica con una fracción de conjugado, que comprende: poner en contacto el anticuerpo con la fracción de conjugado en presencia de una transglutaminasa mutante (tal como cualquiera de las transglutaminasas mutantes descritas en el presente documento) en una condición que sea suficiente para generar el conjugado de anticuerpo y fármaco, en donde la fracción de conjugado se conjuga con un resto de glutamina aceptora en el anticuerpo. En el presente documento también se describe un método para preparar un conjugado de anticuerpo y fármaco que comprende un anticuerpo conjugado de manera específica con una fracción de conjugado que comprende: poner en contacto el anticuerpo con la fracción de conjugado en presencia de una transglutaminasa mutante (tal como cualquiera de las transglutaminasas mutantes descritas en el presente documento) en una condición que sea suficiente para generar el conjugado de anticuerpo y fármaco, en donde el anticuerpo está glucosilado (por ejemplo, N-glucosilado) en la región Fc, y en donde la fracción de conjugado está conjugado con el resto de glutamina aceptora endógeno en el anticuerpo. En el presente documento también se describe un método para preparar un conjugado de anticuerpo y fármaco que comprende un anticuerpo conjugado de manera específica con una fracción de conjugado que comprende: poner en contacto una composición que comprende el anticuerpo con la fracción de conjugado en presencia de una transglutaminasa mutante (tal como cualquiera de las transglutaminasas mutantes descritas en el presente documento) en una condición que sea suficiente para generar el conjugado polipeptídico que contiene Fc, en donde al menos algo (por ejemplo, un 50 %, un 60 %, un 70 %, un 80 %, 90 % o más) del anticuerpo en la composición está glucosilado (por ejemplo, N-glucosilado) en la región Fc, y en donde la fracción de conjugado está conjugada con el resto de glutamina aceptora endógeno en el anticuerpo.
En el presente documento se describe un método para preparar un conjugado de anticuerpo y fármaco que comprende un anticuerpo conjugado de manera específica con una fracción de conjugado que comprende un identificador de molécula pequeña y una fracción activa que comprende: a) poner en contacto el anticuerpo con el identificador de molécula pequeña en presencia de una transglutaminasa (tal como cualquiera de las transglutaminasas mutantes descritas en el presente documento) en una condición que sea suficiente para generar un conjugado intermedio que comprenda un anticuerpo conjugado de manera específica con el identificador de molécula pequeña, y b) poner en contacto el conjugado intermedio con una fracción activa obteniendo así el conjugado de anticuerpo y fármaco, en donde la fracción de conjugado se conjuga con un resto de glutamina aceptora en el anticuerpo. En el presente documento también se describe un método para preparar un conjugado de anticuerpo y fármaco que comprende un anticuerpo conjugado de manera específica con una fracción de conjugado que comprende un identificador de molécula pequeña y una fracción activa que comprende: a) poner en contacto el anticuerpo con el identificador de molécula pequeña en presencia de una transglutaminasa (tal como cualquiera de las transglutaminasas mutantes descritas en el presente documento) en una condición que sea suficiente para generar un conjugado intermedio que comprenda un anticuerpo conjugado de manera específica con el identificador de molécula pequeña, y b) poner en contacto el conjugado intermedio con una fracción activa obteniendo así el conjugado de anticuerpo y fármaco, en donde el anticuerpo está glucosilado (por ejemplo, N-glucosilado) en la región Fc, y en donde la fracción de conjugado está conjugado con el resto de glutamina aceptora endógeno en el anticuerpo. En el presente documento también se describe un método para preparar un conjugado de anticuerpo y fármaco que comprende un anticuerpo conjugado de manera específica con una fracción de conjugado que comprende un identificador de molécula pequeña y una fracción activa que comprende: a) poner en contacto una composición que comprende el anticuerpo con el identificador de molécula pequeña en presencia de una transglutaminasa (tal como cualquiera de las transglutaminasas mutantes descritas en el presente documento) en una condición que sea suficiente para generar un conjugado intermedio que comprenda un anticuerpo conjugado de manera específica con el identificador de molécula pequeña, y b) poner en contacto el conjugado intermedio con una fracción activa obteniendo así el conjugado de anticuerpo y fármaco, en donde al menos algo (por ejemplo, un 50 %, un 60 %, un 70 %, un 80 %, 90 % o más) del anticuerpo en la composición está glucosilado (por ejemplo, N-glucosilado) en la región Fc, y en donde la fracción de conjugado está conjugada con el resto de glutamina aceptora endógeno en el anticuerpo.
Composiciones farmacéuticas, dosis unitarias y kits
En el presente documento también se describen composiciones farmacéuticas que comprenden los conjugados polipeptídicos que contienen Fc (tales como conjugados de anticuerpo y fármaco) descritos en el presente documento. En algunos ejemplos, la composición farmacéutica comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable. En algunos ejemplos, al menos aproximadamente un 50 % (tal como al menos aproximadamente cualquiera de un 60 %, un 70 %, un 80 %, un 90 %, un 95 % o un 99 %) de los conjugados polipeptídicos que contienen Fc (tales como los conjugados de anticuerpo y fármaco) en la composición farmacéutica tienen una fracción de conjugado unida al polipéptido que contiene Fc (tal como el anticuerpo). En algunos ejemplos, al menos aproximadamente un 50 % (tal como al menos aproximadamente cualquiera de un 60 %, un 70 %, un 80 %, un 90 %, un 95 % o un 99 %) de los conjugados polipeptídicos que contienen Fc (tales como los conjugados de anticuerpo y fármaco) en la composición farmacéutica tienen dos fracciones de conjugado unidas al polipéptido que contiene Fc (tal como el anticuerpo). En algunos ejemplos, al menos aproximadamente un 50 % (tal como al menos aproximadamente cualquiera de un 60 %, un 70 %, un 80 %, un 90 %, un 95 % o un 99 %) de los conjugados polipeptídicos que contienen Fc (tales como los conjugados de anticuerpo y fármaco) en la composición farmacéutica tienen una o dos fracciones de conjugado unidas al polipéptido que contiene Fc (tal como el anticuerpo).
La expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" se utiliza en el presente documento para describir cualquier ingrediente distinto a los compuestos de la invención. La elección de los excipientes depende en gran medida de factores tales como el modo particular de administración, el efecto del excipiente en la solubilidad y la estabilidad, y la naturaleza de la forma farmacéutica. Como se utiliza en el presente documento, un "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos de disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción, y similares que sean fisiológicamente compatibles. Algunos ejemplos de excipientes farmacéuticamente aceptables son agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, así como combinaciones de los mismos. En algunos ejemplos, los agentes isotónicos, que incluyen, pero sin limitación, azúcares, polialcoholes (por ejemplo, manitol, sorbitol) o cloruro de sodio se incluyen en la composición farmacéutica. Ejemplos adicionales de sustancias farmacéuticamente aceptables incluyen, pero sin limitación, agentes humectantes o cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes o tampones, que potencian la vida útil o la eficacia del anticuerpo.
Los conjugados polipeptídicos que contienen Fc (tales como los conjugados de anticuerpo y fármaco) descritos en el presente documento se pueden desinmunizar para reducir la inmunogenia tras la administración a un sujeto utilizando técnicas conocidas como las descritas, por ejemplo, en la publicación PCT WO98/52976 y WO00/34317.
Las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento pueden prepararse, envasarse o comercializarse en grandes cantidades, como una dosis unitaria individual o como una pluralidad de dosis unitarias individuales. Como se utiliza en el presente documento, una "dosis unitaria" es una cantidad pequeña de la composición farmacéutica que comprende una cantidad predeterminada del principio activo. La cantidad del principio activo es generalmente igual a la dosificación del principio activo que se administraría a un sujeto o una fracción conveniente de dicha dosificación tal como, por ejemplo, una mitad o un tercio de una dosificación de este tipo. Cualquier método para administrar péptidos, proteínas o anticuerpos aceptado en la materia puede emplearse de manera adecuada para los conjugados polipeptídicos que contienen Fc divulgados en el presente documento.
Las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento son adecuadas para la administración parenteral. La administración parenteral de una composición farmacéutica incluye cualquier vía de administración caracterizada por la ruptura física de un tejido de un sujeto y la administración de la composición farmacéutica a través de la ruptura del tejido, lo que, en general, da lugar a la administración directa en el torrente sanguíneo, en el músculo o en un órgano interno. Por ejemplo, la administración parenteral incluye, pero sin limitación, administración de una composición farmacéutica mediante inyección de la composición, mediante la aplicación de la composición a través de una incisión quirúrgica, mediante la aplicación de la composición a través de una herida no quirúrgica que penetra en el tejido y similares. En particular, se contempla que la administración parenteral incluya, pero sin limitación, inyección subcutánea, intraperitoneal, intramuscular, intraesternal, intravenosa, intraarterial, intratecal, intraventricular, intrauretral, intracraneal, intrasinovial o infusiones; y técnicas de infusión dialítica renal. En algunos ejemplos, la administración parenteral es la vía intravenosa o subcutánea.
Las formulaciones de una composición farmacéutica adecuada para la administración oral se pueden preparar, envasar o comercializar en una forma adecuada para la administración en bolo o para la administración continua. Las formulaciones inyectables se pueden preparar, envasar o comercializar en formas farmacéuticas unitarias, tales como en ampollas o en envases multidosis que contienen un conservante. Las formulaciones para la administración parenteral incluyen, pero sin limitación, suspensiones, soluciones, emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, pastas y similares. Dichas formulaciones pueden comprender adicionalmente uno o más ingredientes adicionales incluyendo, pero sin limitación, agentes de suspensión, estabilizantes o dispersantes. En un ejemplo de una formulación para administración parenteral, el principio activo se proporciona en forma seca (por ejemplo, polvo o granulado) para la reconstitución con un vehículo adecuado (por ejemplo, agua estéril sin pirógenos) antes de la administración parenteral de la composición reconstituida. Las formulaciones parenterales también incluyen soluciones acuosas que pueden contener excipientes tales como sales, hidratos de carbono y agentes tamponantes (preferentemente a un pH de 3 a 9) pero, para algunas aplicaciones, pueden formularse de forma más adecuada como una solución no acuosa estéril 0 como una forma seca para utilizar junto con un vehículo adecuado, tal como agua estéril sin pirógenos. Las formas de administración parenteral ilustrativas incluyen soluciones o suspensiones en soluciones acuosas estériles, por ejemplo, soluciones acuosas de propilenglicol o dextrosa. Dichas formas farmacéuticas pueden tamponarse adecuadamente, si se desea. Otras formulaciones administrables por vía parenteral que son útiles incluyen aquellas que comprenden el principio activo en forma microcristalina o en una preparación liposómica. Las formulaciones para administración parenteral pueden formularse para ser de liberación inmediata y/o modificada. Las formulaciones de liberación modificada incluyen formulaciones de liberación controlada, retardada, sostenida, pulsada, dirigida y programada. Por ejemplo, en un aspecto, las soluciones inyectables estériles se pueden preparar mediante la incorporación del conjugado polipeptídico que contiene Fc, por ejemplo, conjugado de anticuerpo y fármaco o conjugado de anticuerpo biespecífico y fármaco, en la cantidad necesaria en un disolvente adecuado con uno o una combinación de los ingredientes enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido de esterilización por filtración. En general, se preparan dispersiones mediante la incorporación del compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes necesarios de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos ilustrativos de preparación son secado al vacío y criodesecado, que proporcionan un polvo del principio activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución de los mismos previamente esterilizada por filtración. Puede mantenerse la fluidez adecuada de una solución, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partículas requerido en el caso de una dispersión y mediante el uso de tensioactivos. Se puede lograr la absorción prolongada de composiciones inyectables incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.
Una composición farmacéutica ilustrativa no limitante del conjugado polipeptídico que contiene Fc (tal como un conjugado de anticuerpo y fármaco) es una formulación como una solución acuosa estéril que tiene un pH que varía de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 6,5 y que comprende de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 200 mg/ml de un conjugado polipeptídico genomanipulado divulgado en el presente documento, de aproximadamente 1 milimolar a aproximadamente 100 milimolar de tampón de histidina, de aproximadamente 0,01 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml de polisorbato 80, de aproximadamente 100 milimolar a aproximadamente 400 milimolar de trehalosa y de aproximadamente 0,01 milimolar a aproximadamente 1,0 milimolar de EDTA disódico deshidratado.
Las pautas posológicas se pueden ajustar para proporcionar la respuesta deseada óptima. Por ejemplo, puede administrarse un único bolo, pueden administrarse varias dosis divididas a lo largo del tiempo o la dosis puede reducirse o aumentarse proporcionalmente según se indique por las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular las composiciones parenterales en una forma de dosificación unitaria para facilitar la administración y la uniformidad de la dosificación. La forma de dosificación unitaria, como se utiliza en el presente documento, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para los sujetos/pacientes que se vayan a tratar; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico necesario. En general, la especificación para las formas de unidades de dosificación de la invención está dictada por y depende directamente de (a) las características únicas de la fracción del agente (por ejemplo, moléculas pequeñas tales como un agente citotóxico) y del efecto terapéutico o profiláctico concreto que se vaya a lograr y de (b) las limitaciones inherentes en la materia de formar compuestos de dicho compuesto activo para el tratamiento de la sensibilidad en individuos.
El experto en la materia apreciaría, en función de la divulgación proporcionada en el presente documento, que la dosis y el régimen de dosificación se ajustan de acuerdo con métodos bien conocidos en la materia terapéutica. Es decir, la dosis máxima tolerable se puede establecer fácilmente, y también se puede determinar la cantidad eficaz que proporciona un beneficio terapéutico detectable para un paciente, al igual que los requisitos temporales para administrar cada agente para proporcionar un beneficio terapéutico detectable al paciente. Por consiguiente, mientras que determinadas dosis y pautas posológicas se ejemplifican en el presente documento, estos ejemplos no limitan de ningún modo la dosis y la pauta posológica que se puede proporcionar a un paciente.
Cabe señalar que los valores de dosificación pueden variar con el tipo y la intensidad de la afección a aliviar, y pueden incluir dosis únicas o múltiples. Cabe entender además que para cualquier sujeto en particular, deben ajustarse las pautas posológicas específicas con el paso del tiempo según las necesidades del individuo y el criterio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones y que los intervalos de dosificación expuestos en el presente documento son únicamente ilustrativos y no pretenden limitar el alcance o la práctica de la composición reivindicada. Además, la pauta posológica con las composiciones descritas en el presente documento puede basarse en una variedad de factores, incluyendo el tipo de enfermedad, la edad, el peso, el sexo, la afección médica del paciente, la intensidad de la afección, la vía de administración y el anticuerpo particular empleado. Por tanto, la pauta posológica puede variar ampliamente, pero se puede determinar de manera rutinaria con métodos convencionales. Por ejemplo, las dosis pueden ajustarse en función de los parámetros farmacocinéticos o farmacodinámicos, que pueden incluir efectos clínicos tales como efectos tóxicos y/o valores de laboratorio. Por tanto, la presente divulgación abarca el aumento escalonado de la dosis intrapaciente según lo determine el experto en la materia. La determinación de las dosis y los regímenes adecuados son bien conocidos en la materia relevante y se entenderá que los expertos en la materia lo abarcarán una vez que se proporcionen las enseñanzas divulgadas en el presente documento.
En el presente documento se describen kits (o artículos de fabricación) para su uso en el tratamiento de los trastornos descritos anteriormente. Los kits de la divulgación incluyen uno o más recipientes que comprenden un conjugado polipeptídico que contiene Fc (tal como un conjugado de anticuerpo y fármaco) para tratar una enfermedad. Por ejemplo, las instrucciones comprenden una descripción de la administración del conjugado polipeptídico que contiene Fc diseñado (tal como un conjugado de anticuerpo y fármaco) para tratar una enfermedad, tal como cáncer (por ejemplo, cáncer pancreático, de ovario, de colon, de mama, próstata o de pulmón). El kit puede comprender además una descripción de la selección de un individuo adecuado para el tratamiento en función de la identificación de si ese individuo tiene la enfermedad y el estadio de la enfermedad. Las instrucciones relacionadas con el uso del conjugado polipeptídico que contiene Fc genomanipulado (tal como el conjugado de anticuerpo y fármaco) generalmente incluyen información sobre la dosis, la posología y la vía de administración para el tratamiento previsto. Los recipientes pueden ser dosis unitarias, envases a granel (por ejemplo, envases multidosis) o dosis subunitarias. Las instrucciones suministradas en los kits de la divulgación son normalmente instrucciones escritas en una etiqueta o en un prospecto (por ejemplo, una hoja de papel incluida en el kit), pero las instrucciones legibles por una máquina (por ejemplo, instrucciones en un disco de almacenamiento óptico u magnético) también son aceptables. Los kits de la divulgación están en un envase adecuado. Los envases adecuados incluyen, pero sin limitación, frascos, botellas, tarros, envases flexibles (por ejemplo, Mylar sellado o bolsas de plástico) y similares. También se contemplan envases para su uso en combinación con un dispositivo específico, tal como un inhalador, dispositivo de administración nasal (por ejemplo, un atomizador) o un dispositivo de infusión tal como una minibomba. Un kit puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el envase puede ser una bolsa de solución intravenosa o un frasco que tenga un tapón agujereable por una aguja de inyección hipodérmica). El envase también puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el envase puede ser una bolsa de solución intravenosa o un frasco que tenga un tapón agujereable por una aguja de inyección hipodérmica). Al menos un agente activo en la composición es un polipéptido genomanipulado como se describe en el presente documento. El recipiente puede comprender además un segundo agente farmacéuticamente activo. Opcionalmente, los kits pueden proporcionar componentes adicionales tales como tampones e información interpretativa. Normalmente, el kit comprende un recipiente y una etiqueta o prospecto o prospectos en o asociado con el recipiente.
En el presente documento se describe un kit que comprende una TGasa (tal como una TGasa genomanipulada, tal como cualquiera de las TGasa genomanipuladas descritas en el presente). El kit puede comprender además otros reactivos para llevar a cabo la reacción de transglutaminación. El kit puede comprender además una instrucción sobre la realización de uno cualquiera de los métodos de conjugación descritos en el presente documento. El kit puede comprender además un soporte sólido para inmovilizar la TGasa (tal como la TGasa genomanipulada) o el polipéptido que contiene Fc (tal como un anticuerpo). La TGasa (tal como la TGasa genomanipulada) en el kit se puede inmovilizar en el soporte sólido.
Ejemplos
La invención puede entenderse mejor con referencia a los siguientes ejemplos, que se proporcionan a modo de ilustración y no se pretende que sean limitantes.
Ejemplo 1. Generación de mutantes de TGasa
Este ejemplo describe la generación de mutantes de TGasa. Con referencia a la figura 3, tres regiones que estaban cerca de la entrada del sitio activo se eliminaron o mutaron para agrandar el bolsillo de unión al sustrato. La TG_SL de tipo silvestre se clonó en el vector pET39+ utilizando NdeI y XhoI con una prolina extra (SEQ ID NO: 17). Los siguientes mutantes por eliminación se hicieron basándose en el acoplamiento de IgG1 y TG_SM: Mutante 1: Eliminación de P1 a E5; Mutante 2: Eliminación de P245 a P248; Mutante 3: Eliminación de n 283 a L286; Mutante 4: Eliminaciones de P1 a E5 y N283 a L286; Mutante 5: Eliminación de las tres regiones especificadas por los mutantes 1, 2 y 3; Mutante 6: Eliminación de P1 a E5 y reemplazo de H280 a A288 con G; Mutante 7: Eliminación de P1 a E5 y reemplazo de A281 a H290 con G. El área de eliminación está atenuada, subrayada o tachada como se muestra en la figura 3. Estos mutantes eran más activos frente a IgG1.
Con el ADN purificado de S. ladakanum (ATCC27441) como plantilla de PCR, las secuencias de ADN que codifican la mTGasa pro o madura de tipo silvestre (TG_SL de tipo silvestre) y sus mutantes 1 a 3 (véase arriba) se clonaron en el vector pET39b en los sitios NdeI y BamHI. Se obtuvieron cuerpos de inclusión de la TG_SL de tipo silvestre madura y de los mutantes 1 a 3 a partir de células BL21 (DE3) de E. coli transformadas con los respectivos vectores. Después de la solubilización en urea 8 M, la TG_SL de tipo silvestre y los mutantes se replegaron por dilución en tampón de renaturalización (ImM DTT, Tris 50 mM, pH 8,0). Las enzimas se purificaron adicionalmente mediante Ni-NTA y columnas de intercambio catiónico. Como alternativa, la pro-mTGasa se expresó como proenzima inactiva soluble en E. coli. A continuación, la enzima activa se obtuvo después de la escisión del dominio pro por la cadena ligera de endocinasa (EKL).
Ejemplo 2. Conjugación de IgG1 con monodansilcadaverina (MDC) catalizada mediante mTGasa
Se eligió MDC para este experimento porque tiene una amina primaria y su fluorescencia se puede controlar fácilmente. La MDC se utiliza en el presente documento para demostrar su conjugación con un AcM. A la IgG1 purificada (1 a 10 mg/ml) en tampón Tris (pH 6,5 a 8,5) se le añade MDC (Sigma-Aldrich) en DMSO hasta concentraciones finales de 1 a 5 mM (DMSO final del 2 al 10 %). Se añade TG_SL de tipo silvestre purificada o sus mutante hasta una concentración final de 0,05 a 1,0 mg/ml. Se incuban las mezclas de reacción a 37 °C. La reacción se siguió mediante HPLC utilizando una columna de interacción hidrófoba de fenilo (PHIC, Tosoh Bioscience LLC). Al principio de la reacción, el producto estaba dominado por DAR1, donde solo se acopló una cadena pesada de IgG1 con MDC. A medida que progresa la reacción, DAR 2, donde ambas cadenas pesadas de IgG1 se acoplan con MDC, se convirtió en el producto principal. Hacia el final de la reacción (8 horas a 0,2 mg/ml de mTGasa a pH 7), el rendimiento de la conjugación alcanzó el 80 % para DAR2 con un 20 % de DAR 1 restante, o el 90 % para la cadena pesada (HC, del inglés "heavy chain") cuando la muestra se redujo mediante TCEP 10 mM y se analizó en la columna C4-1000A (Vydac) (véase la figura 6). La conjugación selectiva de MDC a HC se visualizó en SDS PAGE (Figura 7). Otras mTGasas, tales como TG_SM de S. mobaraensis (purificada de Activa TI de Ajinomoto), también se analizaron. Los mutantes fueron más activos que el tipo silvestre hacia IgG1, aunque la TGasa de tipo silvestre también podría catalizar la reacción del ADC a concentración elevada (>0,1 mg/ml). Además, se descubrió que TG_SM (comercializada por Ajinomoto y utilizada por Pfizer e Innate Pharma) también funciona a concentración elevada, pero solo tenía aproximadamente un 30 % de actividad en comparación con la TG_SL.
Ejemplo 3. Pegilación de IgG1 con mPEG-NH2 de 1 kDa mediante catálisis mTGasa
Este experimento se llevó a cabo esencialmente como se describe en el ejemplo 2. El aceptor de acilo MDC se reemplazó con metoxi-PEG-amina de 1 kDa (JenKem, EE. UU.) en pH 7,0 hasta una concentración final de 1 a 2 mM, Se obtuvo IgG1 PEGilada. El análisis de la muestra de una reacción durante la noche a 37 °C en una columna C4 después de la reducción con TCEP mostró una modificación del 90 % de las cadenas pesadas.
Ejemplo 4. Conjugación de IgG1 con monodansilcadaverina (MDC) catalizada mediante mTGasa inmovilizada
Para simplificar la eliminación de la mTGasa y permitir la reutilización de la enzima, la mTGasa inmovilizada se utilizó en la catálisis. Para preparar una columna de mTGasa inmovilizada, se utilizó 1 ml de mTGasa 15 mg/ml en tampón de carbonato (pH 8,3) para cada columna HITRAP® HP activada por NHS de 1,0 ml (GE) siguiendo el protocolo del fabricante. Se inyectaron 0,5 ml de IgG1 purificada a 1 a 10 mg/ml en tampón Tris (pH 6 a 8,0) con MDC 1 a 5 mM en columna HITRAP® de mTGasa. La columna se selló por ambos extremos y se incubó a 37 °C durante la noche. Al día siguiente, la mezcla de reacción se eluyó con tampón Tris. La columna se rejuveneció con TCEP 1 a 20 mM para la siguiente reacción de conjugación. No hubo pérdida de actividad de la mTGasa inmovilizada después de cada uso. Se alcanzó un rendimiento del 90 % de HC en cada ejecución, similar al rendimiento obtenido con mTGasa libre.
Ejemplo 5. Conjugación de IgG1,2 y 4 con citotoxinas catalizada mediante mTGasa
Las toxinas con un enlazador de amina podrían conjugarse con IgG1 en un protocolo de una sola etapa tal como lo hace MDC (Figura 4). Aunque un enlazador tan simple como -(CH2)n-NH2 (donde n >4 como en la cadena lateral de lisina), el uso de armazones de etilenglicol podría aumentar la solubilidad del fármaco enlazador y facilitar las reacciones de conjugación. Este ejemplo demuestra la conjugación de MAY-PEG4 (enlazador no escindible, figura 8) y MAY-PVCL (enlazador escindible, figura 9) a IgG1.
Un derivado de maitansina que contiene un enlazador lineal de PEG extendido y no escindible con un grupo de amina primaria de PM: 896,42 Da se representa en la figura 8. Se añadió MAY-PEG4 en DMSO a IgG1 (1 a 10 mg/ml en tampón Tris pH 8,0) hasta una concentración final de 1 a 2 mM. Se añadió mTGasa a una concentración final de 0,2 a 1,0 mg/ml y las reacciones se incubaron a 37 °C. La reacción se controló mediante análisis de HPLC como se describe en el ejemplo 2. Después de una noche, se obtuvo un rendimiento del 60 % de cadenas pesadas modificadas. Se observaron los productos DAR 1 y DAR 2 (Figura 10).
En la figura 9 se muestra un derivado de maitansina que contiene un enlazador escindible con un espaciador autoinmolable y lisina terminal de peso molecular 1224,58 Da. La reacción de conjugación se llevó a cabo de la misma forma que antes mediante el reemplazo de MAY-PEG4 con MAY-PVCL (1,0 mg/ml). Después de incubación a 37 °C durante 8 horas, se modificó el 40 % de la cadena pesada (Figura 11). El bajo rendimiento se atribuye a la baja solubilidad del fármaco.
Ejemplo 6. Determinación de la proporción de fármaco a anticuerpo (DAR) y mapeo del sitio de conjugación en IgG1
Debido a la heterogeneidad de las cadenas de glucanos, IgG1 mostraría múltiples máximos en sus espectros de masas. Para simplificar el análisis de masas, todos los conjugados de AcM se desglucosilaron antes del análisis con el espectrómetro de masas utilizando PNGaseF (Promega, Madison, WI), por lo que se observaría un solo máximo para cada especie de la misma carga. Al hacer esto, la asparagina (N) original ligada a glucanos se cambia a aspartato (D).
Confirmación masiva de DAR1 y DAR2. La DAR 1 y DAR 2 esperadas de IgG1-MAY-PEG4 del ejemplo 5 se purificaron en Fenil HIC. Después de la desglucosilación, las muestras se colocaron en una placa de acero de 196 pocillos y se analizaron en MALDITOF (ABI 4700, Applied Biosystems, Redwood City, CA). Como control, se utilizó IgG1 no marcada (DAR0). Los espectros de masas se adquirieron en modo lineal de alta masa positivo y se utilizaron múltiples especies cargadas (dobles y triples) para calcular el peso molecular. El fármaco MAY-PEG4 tiene un peso molecular de 896 Da. Por lo tanto, la conjugación de una molécula de MAY-PEG4 con IgG1 (DAR1) daría como resultado una diferencia de masa esperada de 879 Da (896 - 17 pérdida de NH3 = 879 Da), mientras que la conjugación de dos moléculas con IgG1 (DAR2) daría como resultado una diferencia de masa de 1758 Da. Los espectros MALDI-TOF en la figura 10 confirmaron DAR1 y DAR2
Confirmación de la conjugación solo en la cadena pesada. Para confirmar que la molécula del fármaco se conjugó con la cadena pesada (HC) de IgGl pero no con la cadena ligera (LC), la DAR2 purificada de IgG1-MAY-PVCL del ejemplo 5 se desglucosiló y se redujo con DTT 20 mM durante 30 min a 37 °C. Los espectros de masas se adquirieron en modo lineal de alta masa positivo utilizando ABI4700. El fármaco MAY-PVCL tiene un peso molecular de 1224 Da. Por lo tanto, la conjugación de un MAY-PVCL con la cadena pesada daría como resultado una diferencia de masa esperada de 1207 Da (1224 - 17 = 1207 Da) y ninguna diferencia en el peso molecular de las cadenas ligeras (Figura 11). Por otro lado, DAR1 tiene máximos no marcados de HC y HC-MAY-PVCL en su espectro de masas, lo que indica que DAR1 tiene solo una HC conjugada.
Mapeo de péptidos para verificar la conjugación específica del sitio en Q295. La DAR2 purificada del ejemplo 2 (ambas cadenas pesadas de IgG1 que contenían MDC) y la IgG1 no marcada se desglucosilaron, redujeron, alquilaron, digirieron en péptidos utilizando tripsina y/o quimotripsina (Promega, Madison, WI) y se separaron mediante cromatografía de fase inversa (C18) antes del análisis de espectrometría de masas. Los péptidos digeridos se controlaron en HPLC mediante absorbencia UV a 328 nm (Amax de MDC). Solo se identificó un máximo a 328 nm en muestras DAR2, mientras que no se detectó ningún máximo en el anticuerpo de control. El análisis MALDI-TOF identificó ese máximo como un solo péptido cargado EEQYDSTYR de la digestión con tripsina o NAKTKPREEY de la digestión con quimotripsina que contenía glutamina 298 (secuencia Q298 y es Q295 según el sistema de numeración de Kabat) con exactamente un MDC (1508,7 observado - 1190,5 de péptido 335 de MDC - 17 de NH3 = 318 Da; 1681,9 observado - 1363,6 de péptido = 318) (filas grises en la tabla 1). Para excluir otras glutaminas (que no sean Q298) como sitios de conjugación adicionales, se realizaron experimentos completos de mapeo de péptidos utilizando conjugados de IgG1 e IgG1-MDC no modificados. Las muestras digeridas se analizaron directamente sin purificación para identificar todos los péptidos que contienen glutamina en la cadena pesada. De las 16 glutaminas, Q298 fue el único sitio de conjugación con MDC unido (Tabla 1), mientras que todos los demás péptidos que contienen glutamina permanecen sin cambios.
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continuación
Figure imgf000029_0001
*Nota: Secuencia Q298 y es Q295 por el sistema de numeración Kabat. N300 (o Kabat N297) se convirtió en D300 cuando se desglucosiló.
Para confirmar Q298 como el sitio de conjugación específico en IgG1 cuando se utilizaron citotoxinas reales, los conjugados IgG1 de MAY-PEG4 y TAM1 (un derivado de tubulisina A con un enlazador de amina) se desglucosilaron, redujeron, alquilaron, digirieron en péptidos utilizando tripsina y se separaron mediante cromatografía de fase inversa antes del análisis de espectrometría de masas. El mismo péptido e Eq YNSTYR que contiene Q298 se identificó en los conjugados IgG1-TAM1 e IgG1-MAY-PEG4 con una masa correspondiente a una molécula de fármaco unida: 2134,0 (1190,5 960,5 - 17) y 2069,8 (1190,5 895,5 - 17), respectivamente (Tabla 2).
Figure imgf000029_0002
Ejemplo 7. Conjugación de subclases de IgG catalizada mediante mTGasa
Se hizo reaccionar IgG2 o IgG4 humana purificada a 1 a 10 mg/ml en tampón Tris (pH 7,0 a 8,0) con MDC 2 a 5 mM después de la adición de 0,1 a 1 mg/ml de mTGasa purificada. La mezcla se incubó a 37 °C durante 8 a 16 horas y después se analizó en una columna de interacción hidrófoba de fenilo o se redujo con TCEP 10 mM en una columna C4. De forma similar a la IgG 1, se conjugaron IgG2 e IgG4 con MDC para mostrar la acumulación de DAR1 y DAR2 con el tiempo (Figura 6).
Ejemplo 8. Protocolo de dos etapas para preparar conjugados de anticuerpo y fármaco con mTGasa
Si bien la reacción de conjugación de una etapa es simple y directa, el rendimiento se ve afectado por la solubilidad del fármaco. Cuando la concentración del fármaco es baja, el subproducto de la desamidación puede ser significativo. Para suprimir la desamidación, se utilizó un identificador químico que contenía amina altamente soluble en exceso (proporción molar de producto químico:AcM >10) en la primera etapa de conjugación catalizada mediante la mTGasa. A continuación, las moléculas del fármaco se entrecruzaron con el AcM en la segunda etapa a través de reacciones de unión quimioselectiva (Figura 5). Se pueden utilizar muchos pares quimioselectivos:
amino-oxi-/aldehído o cetona
sulfhidrilo/maleimida
azida/alquino
Conjugación con IgG1 de PEG mediante mTGasa a través de amino propil acetal. A 1 a 10 mg/ml de IgG1 en tampón Tris de pH 7,0 a 8,0, se añade 3-aminopropionaldehído dietil acetal (n.° CAS 41365-75-7) a una concentración final de 2 a 50 mM y mTGasa a 0,05 a 0,5 mg/ml. La mezcla de reacción se incubó a 37 °C durante 2 a 16 horas hasta que se completó la reacción. Después de la diafiltración para eliminar el exceso de acetal, se ajusta el pH a 2 a 4 durante 2 a 10 horas a temperatura ambiente con ácido fórmico o HCl para regenerar el grupo aldehído. Se ajusta el pH de IgG1-aldehído con carbonato de sodio de nuevo a 5 a 8. Se añade amino-oxi-PEG (20 kDa) a 3 o 4 veces IgG1 (proporción molar) más un catalizador de anilina 50 a 100 mM o de ácido 5-metoxiantranílico 10 mM. Después de incubar durante una noche a temperatura ambiente, IgG1-(PEG20k)2 alcanzó un rendimiento del 95 %.
Conjugación con IgG1 de fármaco mediante mTGasa a través de amina-azida. A 1 a 10 mg/ml de IgG1 en tampón Tris de pH 7,0 a 8,0, se añade 3-azido-1-propanamina (n.° CAS 88192-19-2) hasta una concentración final de 2 a 50 mM y mTGasa de 0,05 a 0,5 mg/ml. La mezcla de reacción se incubó a 37 °C durante 2 a 16 horas. El rendimiento alcanzó el 100 %. Después de la diafiltración para eliminar el exceso de azidopropilamina, se añadió DBCO-maitansina a 3 veces la IgG (por molar). El rendimiento de IgG1-(maitansina)2 alcanzó más del 95 %.
Ejemplo 9. Ensayo celular in vitro para evaluar la potencia del ADC preparado mediante mTGasa
Se sembraron células SK-BR-3 en placas negras de fondo transparente de 96 pocillos a 10 K células/pocillo y se cultivaron durante 24 horas. Las células se trataron durante 96 horas con conjugados de anticuerpo y fármaco diluidos 2 veces en serie por triplicado. La viabilidad de las células se determinó mediante CELLTITER™ Blue Cell Viability Assay (Promega, Madison, WI). La viabilidad celular relativa se determinó como porcentaje del control no tratado. La CI50 se calculó utilizando un modelo logístico de cuatro parámetros de XLfit. La tabla 3 muestra la proporción de fármaco a anticuerpo y la CI50 en células SK-BR-3 utilizando varios conjugados de trastuzumab y fármaco.
Figure imgf000030_0002
Ejemplo 10. Los ADC específicos del sitio preparados mediante mTGasa con enlazadores estables no escindibles son altamente estables y potentes en ratones con xenoinjerto
Trastuzumab (10 mg/ml) y monometil auristatina E (MMAE) con cada uno de los 9 enlazadores PEG no escindibles (CH2CH2O)x (x = 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 20 y 24, figura 12) se conjugaron respectivamente como se describe en el ejemplo 5. Los ADC se purificaron mediante una columna de proteína A para eliminar la mTGasa y el exceso de MMAE. Las DAR promedio son ~ 1,9 cuando las muestras de ADC reducido se analizaron en HPLC utilizando la columna C4. En el ensayo basado en células SK-BR-3, estos ADC son todos potentes con una CI50 de 38 a 148 pM (Tabla 4).
Tabla 4. CI50 (pM) de conjugados de Trastuzumab y MMAE en células SK-BR-3 o BT474
Figure imgf000030_0001
Se seleccionaron seis de los conjugados de trastuzumab y MMAE para una prueba in vivo utilizando ratones con xenoinjerto BT474. A cada ratón lampiño atímico hembra (4 semanas de edad, 18 a 22 g; Harlan) se le implantó un comprimido de estrógeno de 3 mm (60 días de liberación lenta, Innovative Research of America) 2 a 3 días antes de la inyección celular. Las células BT474 se resuspendieron hasta 50 a 60 millones de células/ml finales y se mezclaron 1:1 con matrigel, a continuación, se inyectaron 200 pl por vía subcutánea en el flanco de cada ratón. El tratamiento comienza cuando el volumen del tumor (1/2 x L x W x H) alcanza alrededor de 200 mm3 después de 3 semanas. Los ADC se diluyeron en tampón PBS hasta una concentración final de 1 mg/ml y se administraron por vía intravenosa en la cola de los ratones a aproximadamente 200 pl para alcanzar una dosis de 10 mg/kg. El tamaño del tumor se midió diariamente con un calibrador digital. Aunque el enlazador PEG6 y 8 parecían ser óptimos en el ensayo basado en células BT474 (Tabla 4), la diferencia en la eficacia in vivo es muy pequeña (Figura 13).
Dado que los 6 ADC eran potentes, solo se probó un ADC con el enlazador PEG12 para determinar su estabilidad en sangre. Los ratones con xenoinjerto NCI N87 se generaron de manera similar a los ratones con xenoinjerto BT474 con ~5 millones de células por ratón, excepto que no se utilizó el comprimido de estrógeno. Después de la administración del ADC, se tomaron muestras de sangre de 20 pl cada 1 a 2 días hasta 21 días pinchando la cola del ratón y se mezclaron con 120 pl de tampón de almacenamiento (PBS con EDTA 10 mM y NH4Cl 0,1 M). A continuación, el trastuzumab y el ADC total se analizaron mediante ELISA de tipo sándwich. Las placas negras NUNC® Maxisorp 96 se recubrieron con proteína Her2 a 100 ng/pocillo. Las muestras se diluyeron aún más con PBS según fuera necesario para adaptarse al intervalo de detección lineal de 10 pg a 2 ng (para Trastuzumab o ADC). Después de aplicar las muestras (se utilizaron diluciones frescas de ADC como patrones de ADC y AcM total) y lavarlas, se aplicaron anticuerpo policlonal de conejo antitrastuzumab (para AcM total) o anti-MMAE (para ADC total) como anticuerpos secundarios, mientras que se utilizó IgG-HRP de cabra anticonejo (Life-technologies) como anticuerpo de detección. Se utilizó la mezcla AMPLEX® Rojo (Cayman Chemical)/4-yodofenol (Sigma)/H2O2 como sustrato de fluorescencia.
Las placas se leyeron en SpectraMax GEMINI™ con 555 nm de Ex y 585 nm de Em. La proporción de ADC/AcM frente al tiempo se representó en la figura 14. Está claro que el ADC específico del sitio con un enlazador estable no escindible es completamente estable en la sangre.
Ejemplo 11. El ADC específico del sitio DAR 2 preparado mediante mTGasa con un enlazador escindible es más estable y potente que el TDM-1 comercial en modelos con xenoinjerto
Trastuzumab (10 mg/ml) y MMAE con enlazador PEG3c escindible (Figura 12) se conjugaron y purificaron como se describe en el ejemplo 10. Este ADC, denominado TP3cE), tiene una DAR de 1,9 y potencia elevada in vitro (Tabla 4). Se realizaron estudios in vivo en comparación con TDM-1 (Genentech) en modelos de xenoinjerto NCI N87 y SK_Ov3. En el modelo NCI N87, TP3cE es 4 veces más eficaz que TDM-1 con una sola inyección intravenosa (Figura 15). El análisis de muestras de sangre muestra que TP3cE es completamente estable en sangre hasta 21 días mientras que TDM-1 perdió el 50 % de su toxina en 5 días (Figura 16). En xenoinjertos SK_Ov3, TP3cE a 3 dosis semanales de 15 u 8 mg/kg dio como resultado una remisión completa del tumor mientras que TDM-1 mostró eficacia solo a 15 mg/kg (Figura 17).
Ejemplo 12. ADC específico del sitio DAR 4 preparado mediante mTGasa con proceso de dos etapas
Trastuzumab (10 mg/ml) y cada uno de un grupo de enlazadores PEG de 3 brazos (1 a 5 kDa) con un grupo amina y dos grupos azida (Figura 18, arriba; Conju-probe y Jenkem) (4 a 8 mg/ml) se conjugaron y purificaron respectivamente como se describe en el ejemplo 10. Las reacciones de conjugación de anticuerpo y enlazador alcanzaron >90 % de conversión cuando se analizaron reducidas por HPLC utilizando una columna c 4.
A continuación, se acopló un exceso molar de cinco veces de alquino-PEG4c-MMAE (Figura 18, panel inferior) a uno de los productos anteriores, trastuzumab-PEG de 3 brazos (1 kDa) (1 a 10 mg/ml), en presencia de CuSO40,1 a 1 mM y ascorbato de sodio 1 a 5 mM durante 10 a 300 minutos. El producto final de ADC DAR 4, denominado TP6TP4cE, se purificó a continuación mediante proteína A como se describe en el ejemplo 10 y la DAR real fue de 3,8 según se determinó mediante HPLC utilizando una columna C4. La actividad in vitro de TP6TP4cE es mayor que TP3cE de DAR 2 como se muestra en la tabla 5.
Tabla 5. CI50 (pM) de conjugados de trastuzumab y MMAE en células BT474
Figure imgf000031_0001

Claims (6)

REIVINDICACIONES
1. Un conjugado de anticuerpo y fármaco que comprende un anticuerpo conjugado con una fracción de conjugado a través de un resto de glutamina aceptora endógeno en el anticuerpo flanqueado por un sitio de N-glucosilación en la región Fc, en donde el conjugado de anticuerpo y fármaco está N-glucosilado en el sitio de N-glucosilación en la región Fc, y en donde el resto de glutamina aceptora endógeno está en la posición 295 y el sitio de N-glucosilación está en la posición 297 de una cadena pesada del anticuerpo, en donde la numeración es de acuerdo con el índice EU como en Kabat, en donde el anticuerpo es trastuzumab y la fracción de conjugado comprende:
(i) PEGx-MMAE que tiene la estructura:
Figure imgf000032_0001
en donde x es 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 20 o 24;
(ii) PEG3c-MMAE que tiene la estructura:
Figure imgf000032_0002
o
(iii) un enlazador PEG de 3 brazos:
Figure imgf000032_0003
en donde n es 7-38 y un alquino-PEG4c-MMAE:
Figure imgf000032_0004
en donde cada uno de los grupos azida en el enlazador PEG de 3 brazos está conjugado con un alquino-PEG4c-MMAE.
2. El conjugado de anticuerpo y fármaco de la reivindicación 1, en donde la fracción de conjugado comprende PEGx-MMAE que tiene la estructura:
Figure imgf000033_0001
en donde x es 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 20 o 24.
3. El conjugado de anticuerpo y fármaco de la reivindicación 1, en donde la fracción de conjugado comprende PEG3c-MMAE que tiene la estructura:
Figure imgf000033_0002
4. El conjugado de anticuerpo y fármaco de la reivindicación 1, en donde la fracción de conjugado comprende un enlazador PEG de 3 brazos:
Figure imgf000033_0003
en donde n es 7-38 y un alquino-PEG4c-MMAE:
Figure imgf000033_0004
en donde cada uno de los grupos azida en el enlazador PEG de 3 brazos está conjugado con un alquino-PEG4c-MMAE.
5. El conjugado de anticuerpo y fármaco de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde ambas cadenas pesadas del anticuerpo están conjugadas con la fracción de conjugado.
6. Una composición que comprende el conjugado de anticuerpo y fármaco de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde al menos un 50 % de los conjugados de anticuerpo y fármaco en la composición están glucosilados en la región Fc, opcionalmente, en donde al menos un 80 % de los conjugados de anticuerpo y fármaco en la composición tienen una relación molar de anticuerpo a fracción de conjugado de 1:1 o 1:2.
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