WO2021234550A1 - 신규 뉴클레오린-결합 펩타이드 및 이의 용도 - Google Patents

신규 뉴클레오린-결합 펩타이드 및 이의 용도 Download PDF

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WO2021234550A1
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multimer
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김재일
남정석
김재현
류재하
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Definitions

  • novel nucleolin-binding peptides and uses thereof Technical Field
  • the present invention relates to novel peptides that specifically bind to nucleolins, and more particularly, to A peptide represented by an amino acid sequence and a conjugate comprising the peptide and an anticancer agent, a fusion peptide comprising the peptide and a cell-penetrating peptide, a composition for diagnosing cancer comprising the peptide, and a composition for preventing or treating cancer comprising the peptide or conjugate is about BACKGROUND ART
  • cancer-specific ligands as pharmaceutical carriers enables tissue or cell specific delivery of chemotherapeutic agents relative to that achieved by conventional drugs, thereby reducing systemic toxicity (Allen TM.
  • Nanoparticles and antibodies have been widely studied in clinical cancer diagnosis and treatment (Yao VJ, et al. J Control Release. 2016; 240: 267-8Q. Detection of cancer in individual patients at an early stage) Nanoparticles and antibodies that can simultaneously diagnose and treat (theragnostic) nanoparticles and antibodies have great potential in the field of personalized medicine because they can deliver anticancer drugs over a long period of time to monitor and enhance the therapeutic effect. 2021/234550 - 01/162021/054235 (Palmieri D, et al. Proc Natl Acad Sci US A. 2015; 112: 9418-23).
  • Nanoparticles are promising drug carrier systems, but present limitations in practical applications due to circulatory instability, inadequate tissue distribution and cytotoxicity (Sukhanova A, et al. Nanoscale Res Lett. 2018; 13:4 sh.
  • therapeutic antibodies are
  • it has limitations in slow delivery and spread to tumor tissue due to its large size (Epenetos AA, et al. Cancer Res. 1986; 46: 3183-91).
  • cancer-specific peptides can be used (Mori T. Curr Pharm Des. 2004; 10: 2335-43 ⁇ 4.
  • the hottide ligand is easy to mass synthesize, low immunogenicity, non-toxic.
  • paclitaxel (PTX)-conjugated AGM improved PTX accumulation in cancer cells, and inhibited breast cancer and colorectal cancer cells more effectively than PTX alone treatment at in i//minute D.
  • PTX-conjugated AGM treatment promoted the specific localization of PTX in tumor tissues, thereby increasing cytotoxicity in a xenograft model of breast cancer, and enhancing drug accumulation and anticancer efficacy.
  • nucleolin (NCL) was a target protein of AGM through pull-down analysis and LC-MS/MS. NCL is the most abundant protein in phosphorus (nucleolus).
  • nucleolin It is to provide a peptide that specifically binds to 1 ⁇ 1 (the 1_). Another object of the present invention is to provide a conjugate comprising the peptide and an anticancer agent. Another object of the present invention is to provide two or more multimers (1111
  • Another object of the present invention is the peptide and the cell-penetrating peptide (Cell Penetrating Peptide; CPP)-conjugated fusion hypotide and the multimer and cell permeability It is to provide a fusion peptide to which the 2021/234550 -01/162021/054235 peptide is bound.
  • CPP Cell Penetrating Peptide
  • Another object of the present invention is to provide a composition for diagnosing cancer comprising the peptide or multimer, a method for diagnosing cancer, use of the peptide or multimer for diagnosing cancer, and the use of the peptide or multimer for manufacturing a medicament for diagnosing cancer is to do
  • Another object of the present invention is the composition for preventing or treating cancer comprising the peptide, the conjugate or the multimer, the method for preventing or treating cancer, the use of the peptide, the conjugate or the multimer for preventing or treating cancer, and the prevention or treatment of cancer
  • the present invention is to provide for the use of said peptide, conjugate or multimer for the manufacture of a medicament for treatment.
  • NCL nucleolin
  • the present invention also provides a conjugate comprising the peptide and an anticancer agent.
  • the present invention also provides a multimer (multimer) comprising the peptide.
  • the present invention also provides a conjugate comprising the multimer and an anticancer agent.
  • the present invention also provides a fusion peptide in which the Hyt!tide and Cell Penetrating Peptide (CPP) are combined.
  • the present invention also provides a fusion peptide in which the multimer and the cell-penetrating peptide are combined.
  • the present invention also provides a composition for diagnosing cancer comprising the peptide or multimer, a method for diagnosing cancer, use of the peptide or multimer for diagnosing cancer, and the use of the peptide or multimer for manufacturing a medicament for diagnosing cancer.
  • the present invention also provides a composition for preventing or treating cancer comprising the peptide, the conjugate or multimer, a method for preventing or treating cancer, the use of the peptide, the conjugate or multimer for preventing or treating cancer, and preventing or treating cancer
  • a composition for preventing or treating cancer comprising the peptide, the conjugate or multimer, a method for preventing or treating cancer, the use of the peptide, the conjugate or multimer for preventing or treating cancer, and preventing or treating cancer
  • the use of said peptide, conjugate or multimer for the manufacture of a medicament is provided.
  • 1 is a view of 0! ⁇ /1-330 and de ( trivalent conjugated body ((:011 '119 6) according to the present invention) 2021/234550 - 01/162021/054235 It is a diagram showing the structure of a monomer (AGM-330m), a dimer (AGM-330d), and a tetramer (AGM-330t).
  • 2 is a diagram showing the structure of an AGM-330-CPP fusion haftide in which the AGM-330-PEG conjugate and Cell Penetrating Peptide (CPP) are combined according to the present invention.
  • Figure 3 is a schematic diagram illustrating the steps of peptide library synthesis and screening: 1, a combination 0B0C library is constructed by performing a split-mix synthesis method; 2, approximately ⁇ 2, 600, 000 library synthesis; 3, incubating the 0B0C library with cancer cells in a C0 2 incubator; 4, beads carrying ligands with affinity for cell surface molecules are covered with cells; 5, retake the positive beads with a pipette under an inverted microscope; 6, the sequence of the positive bead was measured by Edman microsequencing; 7, Cancer-specific peptide ligand candidates identified from 0B0C combinatorial peptide library screening. 4 shows the screening and MAP synthesis of the 0B0C library for cancer-specific ligands.
  • Figure 4A shows the binding specificity of the peptides for cancer cell lines and normal cells
  • Figure 4B is the result of a whole-cell binding assay showing the cell binding specificity of 8 selected beads, a number of breast cancer and colorectal cancer cells and normal breast and Colorectal cells were resuspended at 10 6 cells/ml and incubated with beads. All experiments were repeated three times, and the scale bar was 200Mm.
  • Figure 4C shows the binding specificity determined by confocal imaging of immunofluorescence of FITC-labeled AGM-330, AGM-331 and AGM-332, the nucleus was stained with DAP (blue), and the scale bar was 5 () Mm. am.
  • Figure 4D shows AGM- 2021/234550 ?01/162021/054235
  • FIG. 4E shows the synthesis procedure of AGM-330, the reagents and conditions are as follows: (i) Fmoc-Lys- (Fmoc) -OH, piperidine, DMF; (ii) Fmoc-Lys-(Fmoc)-OH, piperidine, DMF; (iii) RHGAMVYLK-OH, piperidine; (iv) piperidine, DMF.
  • 4F is a FACS analysis result showing the specificity of AGM-330 against cancer cells among a large number of breast and colorectal cancer cells and normal breast and colorectal cells.
  • the bar graph represents the mean ⁇ SD, and one-way ANOVA with Dunnett's multiple. Statistical analysis was performed by comparison. *, ** and *** indicate p ⁇ 0.05, P ⁇ 0.01 and / 7 ⁇ 0.001, respectively.
  • 5 is a result of in vivo stability evaluation of peptides by AGM-330 (AGM-330m, AGM-330d, AGM-330t).
  • the figure shows the results of Coomassie brilliant blue staining of the protein eluted from the affinity column after separation by 10% SDS-PAGE, Lane 1: protein marker; Lane 2: total lysate before biotin pull-down assay; Lane 3: flow-through after incubation with AGM-330-biotin; Lane 4-6: bead washing fraction; Lane 7-8: elution of AGM-330 binding proteins.
  • Red asterisk indicates that LC-MS/MS analysis was performed after the protein band was cleaved by in-gel digestion.
  • 7C is a result of confirming NCL as an AGM-330 binding partner by searching a protein database of peptides detected by MS.
  • FIG. 7D is a list of genes obtained from LC-MS/MS analysis, and the confidence score represents the mascot score of the identified protein.
  • Fig. is an immunoblotting analysis result of proteins eluted from biotin pull-down using an anti-NCL antibody, and arrows indicate the presence of NCL.
  • Figure 7F shows the analysis results of the NCL domain binding to AGM-330.
  • AGM-330 (20nM-2.5MM) were incubated with immobilized NCL and analyzed on a Biacore T-200 instrument.
  • 9 is a direct interaction analysis result between AGM-330 and purified NCL by biotin pull-down analysis. Immunoblotting analysis of the eluted protein forms biotin pull-down using an anti-NCL antibody. Lane 1: protein marker; Lane 2: input of purified NCL; Lane 3: flow through after incubated with AGM-330-biotin; Lane 4- 6: bead washing fraction; Lane 7-8: elution of AGM-330 binding proteins. Arrows indicate the presence of NCL. 10 is an affinity test for AGM-330 and other JSA variants.
  • Cancer cells (1 x 10 4 cells s/well) were seeded on 96-well plates and cultured for 24 hours, and then the cells were treated with 13 peptides linked to increasing concentrations of biotin for 2 hours. Then, avidin-HRP was attached through high affinity avidin-biotin interaction, and the TMB substrate was converted to blue color through HRP enzyme. Then, the reaction was terminated by adding acid, and the wells were read at 450 mm, and the affinity of 13 species was evaluated by EUSA. 11 shows the binding specificity of in vitro and in i//i/o AGM-330. 2021/234550 -01/162021/054235 FIGS.
  • 11A and 11B are fluorescence confocal microscopy results of multiple cancer and normal cells, MCF-10A, MCF-7, MDA-MB-231 (FIG. 11A) or CCD -18Co, HT-29, HCT-116 (Fig. 11 B) cells were incubated with 5jjmol/l AGM-330-FITC for 30 min at 37 °C, NCL was stained with primary anti-NCL antibody, and AGM The binding of -330 to NCL was revealed using an anti-mouse secondary antibody linked to Alexa Fluor 594, cells were fixed with 4% paraformaldehyde, and nuclei were stained with DAPI.
  • FIG. 11C is the result of analyzing the distribution of NCL in various subcellular fractions in MCF-10A, MCF-7 and MDA-MB-231 cells. Plasma membrane, cytosol, and nuclear NCL were immunoblotted using an anti-NCL antibody. was rafted. 11D shows that AGM-330 binding to the cell membrane is inhibited by knockdown of NCL using siRNA.
  • AGM-330-FITC is FITC-conjugated AGM-330, and the scale bar is 20jjm.
  • Figure 11 E is the result of analyzing the distribution of NCL in various subcellular fractions in MCF-10A, MCF-7 and MDA-MB-231 cells after siNCLI treatment. was used for immunoblotting.
  • 11 F is a schematic diagram of the experimental protocol, inoculated with 1:1 mix of Matrigel and 1 x 10 6 MDA-MB-231 -luc cells into the mammary gland fat pad of anesthetized 6-week-old male NPGä mice, and inoculated with tumor cells. Then, when the tumor volume reached approximately 100 mm 3 , free Alexa680 or AGM-330-Alexa680 was injected into the tail vein.
  • 11 H is 30 minutes and 1 hour after intravenous injection of 10 nmol free Alexa680 (FIG. 11G) or 10 nmol AGM-330-Alexa680 (FIG. 11H) in MDA-MB-231-luc tumor-bearing mice,
  • 111 and 11J are graphs showing the mean radiative efficiency of Alexa680-associated fluorescence from live imaging of three animals in tumors (FIG. 111) and other organs (FIG. 11), the bar graph representing the mean ⁇ SD and one Statistical analysis was performed by -way ANOVA with Dunnett's multiple comparison. *, ** and *** indicate P ⁇ 0.05, P ⁇ 0.01 and / 7 ⁇ 0.001, respectively.
  • MDA-MB-231 cells were transfected with non-target scrambled siRNA (Scr) or NCL target siNCLI, siNCL2 or siNCL3, 24 hours later, gene silencing efficiency was determined by real-time PCR. Based on mRNA levels, siNCl_1 was chosen for further experiments as it exhibited remarkable efficiency in target gene knockdown.
  • the bar graph represents the mean ⁇ SD, and statistical analysis was performed by one-way ANOVA with Dunnett's multiple comparison. *, ** and *** indicate P ⁇ 0.05, P ⁇ 0.01 and / 7 ⁇ 0.001, respectively.
  • 13 shows the expression profile and functional study results of NCL in breast cancer and colorectal cancer.
  • 13A shows oncogenic breast carcinoma observed in the Curtis dataset and the Alon dataset. 2021/234550 ?01/162021/054235 or with colorectal adenocarcinoma patients As a significant correlation between the two, the Oncomine dataset repository (www.oncomine.org) was used.
  • 13B is a Kaplan-Meier survival analysis performed in breast and colorectal cancer patients based on NCL expression in two independent cohorts (Bertucci and Sveen).
  • 13C and 13D show immunohistochemistry for NCL in normal tissue (FIG. 13C) and cancer tissue (FIG.
  • 13E-FIG. 13H show the cell viability of cancer cells and normal cells after treatment with the indicated amounts of anti-NCL antibody or IgG in serum-free medium for 24 hours, MCF-10A (FIG. 13E), MDA- Cell viability of MB-231 (FIG. 13F), CCD-18Co (FIG. 13G) and HCT-116 (FIG. 1H) was measured by WST assay, and apoptotic cells were visualized by staining Annexin V + cells. became Cells were neutralized with anti-NCL antibody and cultured in serum-free medium for 24 hours, and apoptotic cells were determined by FACS analysis (FIG. 131).
  • the bar graph represents the mean ⁇ SD rule, and statistical analysis was performed by one-way AN OVA with Dunnett's multiple comparison. *, ** and *** indicate P ⁇ 0.05, P ⁇ 0.01 and / 7 ⁇ 0.001, respectively.
  • 14 shows the in vivo tumor suppression efficacy of AGM-330t-PTX.
  • Figure HA shows the results of inhibition of proliferation by AGM-330t-PTX treatment, determined by WST assay for 48 hours in a number of breast cancer and colorectal cancer cells and normal cells.
  • FIG. 14E show the effects of AGM-330t-PTX treatment evaluated in a breast cancer xenograft model
  • FIG. 14C shows the primary tumor volume measured twice a week until the day of sacrifice, buoy
  • (mm 3 ) (length (mm)) x (width (mm)) 2 X 0.5 was calculated by the formula.
  • 14D shows that all primary tumors were isolated on the day of sacrifice, and FIG. 14E shows the results of evaluation of primary tumor weight.
  • 14F-FIG. 141 shows immunohistochemical sections of representative tumors using Ki-67 (FIG. 14F, FIG. 14H) and TUNTA_ (FIG. 14G, FIG.
  • ALB albumin
  • GOT glutamic oxaloacetic transaminase
  • GTP glutamate pyruvate transaminase
  • TP-PS total protein/protein scan
  • UA uric acid
  • 15F shows body weight of xenograft mice after 3 weeks of different treatments. It shows the change of 2021/234550 ?01/162021/054235.
  • FIG. 16 is a result of confirming the anticancer effect using AGM-330d-PTX, and FIG. 16A shows the structure of PTX-conjugated AGM-330d.
  • 16C and 16D are the results of tumor growth monitoring through whole-body bioluminescence imaging. Growing MDA-MB-231 cells expressing firefly luciferase were injected into the mammary gland fat pad of mice.
  • FIG. 16C The therapeutic effect of AGM-330d-PTX was evaluated by bioluminescence imaging ( FIG. 16C ), and bioluminescence intensity was shown every 5 days in 5 different mouse groups ( FIG. 16D ).
  • 16E-FIG. 16G are the results of evaluating the therapeutic effect of AGM-330d-PTX treatment in a breast cancer xenograft model. On the day of sacrifice, all primary tumors were isolated and their volume was evaluated (FIG. 16E-FIG. 16F), the primary tumor weight was measured twice per week until the day of sacrifice ( FIG. 16G ). Primary tumor volume was calculated with the following formula: buoy
  • (mm 3 ) (length (mm)) x (width (mm)) 2 X 0.5.
  • 16H is a graph showing body weight changes after indicated 3 weeks of different treatments in xenograft mice. Bar graphs represent mean ⁇ SD, statistical analysis was performed by one-way ANOVA wi ⁇ 1 Dunnett's multiple comparison, *, ** and *** are each 2021/234550 ?01/162021/054235
  • 17 is a view showing the synthesis process of the AGM-330t-mCPP fusion peptide.
  • 18 shows the results of HPLC and MS analysis of AGM-330t-mCPP fusion peptide and AGM-330t and maleimide-CPP.
  • 19 is a graph showing the cytotoxic effect of AGM-330t, mCPP and AGM-330t-mCPP fusion peptides.
  • Figure 20 shows the apoptosis effect of AGM-330t, mCPP and AGM-330t-mCPP fusion peptide, apoptotic cells were measured by FACS analysis.
  • the bar graph represents the mean ⁇ SD, and statistical analysis was performed by one-way ANOVA with Dunnett's multiple comparison. *** indicates P ⁇ 0.001, NS means Not Significant.
  • 21 is a diagram showing the apoptosis-inducing effect according to the concentration of the AGM-330t-mCPP fusion peptide. 22 is a graph showing the cytotoxic effect of each concentration of AGM-330m-mCPR AGM-330d-dCPP and AGM-330t-tCPP fusion peptides.
  • a library of 2,600,000 peptides was synthesized using a one-bead-one-compound (OBOC) combination method together with a multiple-antigen-peptide (MAP) synthesis method. Then, therefrom, the new cancer-specific peptide ligands AGM-330, AGM-331, AGM-332, AGM-333, AGM-334, AGM-335, AGM-336, AGM- 337 was identified (see FIG. 3 ) and in vitro LHC//? It was confirmed that the peptide ligands specifically bind to cancer cells in vitro) and in vivo ( ⁇ 1//1/1/ ⁇ ).
  • nucleolin is a target protein of AGM-330, AGM-331, AGM-332, AGM-333, AGM-334, AGM-335, AGM-336, AGM-337, and paclitaxel (PTX)
  • PTX paclitaxel
  • the amino acid mutation is in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1,
  • the amino acid sequence containing the mutation may be characterized in that it is selected from the group consisting of SEQ ID NO: 9 to SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 20, but is not limited thereto (Table 2).
  • peptide or "AGM peptide ligand” refers to a peptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 20, or refers to one or more peptides among them.
  • 2021/234550 ?01/162021/054235 In the present invention, The id may be characterized in that the nucleolin specifically binds to (1).
  • the 61 ⁇ /1 peptide specifically 61 ⁇ /1-330, binds specifically to cancer cells, but weakly or not at all to normal breast and colorectal cells.
  • the peptide is cancer-specific and makes it a major candidate for the development of cancer-targeting peptides.
  • 61 ⁇ /1 peptide treatment was more effective in tumors than in the heart, spleen, lung or brain. 2021/234550 ?01/162021/054235 showed more accumulation.
  • the present invention with the AGM peptide - [CH 2 -CH 2 -0]-°
  • PEG polyethylene glycol
  • the polyethylene glycol chain is used as a concept including not only the general polyethylene glycol chain having the structure of Formula 1 but also derivatives thereof, and as the derivative of the polyethylene glycol chain, an amino having the structure of Formula 2
  • Polyethylene glycol carboxylic acid amino polyethylene glycol carboxylic acid
  • the polyethylene glycol chain may be characterized as having 2 to 24 ethylene glycol units, preferably 4 to 20 units, more preferably 6 to 18 units, and most preferably 6 to 12 units. It may be characterized as having two ethylene glycol units, but is not limited thereto. the polyethylene It may be characterized in that it is connected through a linker with the id.
  • the 61 ⁇ /1 peptide-de conjugate may have the form of the following Structural Formula 1, but is not limited thereto. 6! ⁇ /1 -Nee-de (Structural Formula 1) above Structural Formula refers to a polyethylene glycol chain, and knee refers to a linker.
  • the linker preferably a single bond nieun (direct bond), -. ⁇ alkyl, - ⁇ 0 2021/234550 ?01/162021/054235 alkylene, and -0 - may be selected from the group consisting of, but not limited thereto,
  • -[(-) with the carboxy group of the amino acid at the (:-terminal) may include, but are not limited to.
  • a drug a functional group for conjugating Nii ( ⁇ 11 ⁇ :1) : 1 is 131 no
  • the functional group include, but are not limited to, carboxyl 00 ratio, amine (1 ⁇ 11 ) and thiol ( ⁇ 1) groups.
  • 61 ⁇ /1-300 and ode 61 ⁇ /1-330 which is a conjugate of 3 - 61 ⁇ /1 of a conjugate of 61 ⁇ /1 in 61 ⁇ /1 peptides
  • 11) with lysine and cysteine introduced at the end may have the same form as Structural Formula 5.
  • the drug is an agent exhibiting a pharmacological effect, specifically, a chemotherapeutic agent, a toxin, micro or a radioactive isotope.
  • the chemotherapeutic agent may be, for example, a cytotoxic agent or an immunosuppressive agent. specifically microtubulin inhibitors, mitosis inhibitors, topoisomerase inhibitors, or chemotherapeutic agents that can function as deintercalators. 2021/234550 ?01/162021/054235 there. It may also include an immunomodulatory compound, an anticancer agent and an antiviral agent, or a combination thereof.
  • the drug may be an anti-cancer agent
  • the anti-cancer agent is a taxol such as paclitaxel or docetaxel, and a taxane, maytansinoid, auristatin, aminopterin, Actinomycin, bleomycin, thalisomycin, camptothecin, N8-acetyl spermidine, 1-(2 chloroethyl)-1,2-dimethyl sulfonyl hydrazide, esperamicin, etoposide, 6- Mercaptopurine, dolastatin, tricotecen, calicheamicin, methotrexate, vincristine, vinblastine, doxorubicin, melphalan, mitomycin A, mitomycin C, chlorambucil, duocarmycin, L-asparaginase ( L-asparaginase), mercaptopurine, thioguanine, hydroxyurea, cytar
  • 62 ( ⁇ 3
  • 6 -330 - in a human breast cancer xenograft mouse model, 6 -330 - ) ( 61//1-330 - when treated with a de-conjugate and paclitaxel (conjugate with a ligament) ) (Compared to -treated group) showed a 60% and 46% reduction in the volume and weight of the tumor (see Fig. 14 [ to Fig. 14 d ].
  • the efficient targeting ability of 6-330 to cancer cells and tissues provides a promising method in the delivery of anticancer agents for cancer treatment. do.
  • Paclitaxel [ ⁇ 3X61; [Ji] is considered one of the most promising cancer chemotherapy drugs, and has been tested against many different human malignancies.
  • the 61 ⁇ /1 ht!tide or 61 ⁇ /1 httide-de conjugate may be characterized in that it is linked to a drug, preferably an anticancer agent, via a linker (knee) or directly linked. .
  • the linker (knee) may be cleavable.
  • the cleavable linker allows the drug to be released from the antibody in a form cleavable under intracellular conditions, that is, through cleavage of the linker in the intracellular environment.
  • the linker may be cleaved by a cleaving agent present in the intracellular environment, for example, lysosomes or endosomes, and may be cleaved by, for example, intracellular peptidase or protease enzymes such as lysosomal or endosomal proteases. It may be a peptide linker. In general, the peptide linker has a length of at least two or more amino acids.
  • the cleaving agent may include cathepsin 6 and cathepsin da plasmin, and hydrolyze the peptide to release the drug into the target cell.
  • the peptide linker can be cleaved by the thiol-dependent protease cathepsin-8, which is overexpressed in cancer tissues, for example, ⁇ -1_ae or ( ⁇ /-geun-1_ae-this linker can be used) .
  • the peptide linker is, for example, cleavable by an intracellular protease, and is a ⁇ 3 ⁇ -[ linker or 2021/234550 ?01/162021/054235 there.
  • the cleavable linker is ⁇ ) ⁇ sensitive, which may be sensitive to hydrolysis at certain ⁇ ) ⁇ values.
  • pH sensitive linkers can be hydrolyzed under acidic conditions.
  • acid labile linkers that can be hydrolysed in lysosomes, such as hydrazone, semicarbazone, thiosemicarbazone, cis-aconitic amide ((-3(:i1 [3171 6), orthoesters, acetals, ketals, and the like.
  • the linker may be cleaved under reducing conditions, for example Various disulfide bonds can be formed using pyridyldithio)butyrate) and SMPT (N-succinimidyl-oxycarbonyl-alpha-methyl-alpha - (2-pyridyl-dithio)toluene).
  • the linker may be, for example, a non-cleavable linker, and the drug is released through only one step of antibody hydrolysis, for example, to produce an amino acid-linker-drug conjugate.
  • This type of linker may be a thioether group or a maleimidocaproyl group ⁇ 3 ⁇ 0
  • the conjugate of id- £ (3 may be characterized in that it is directly linked to a drug, preferably an anticancer agent, through a non-covalent bond or a covalent bond, but is not limited thereto.
  • the non-covalent bonds are, for example, hydrogen bonds, electrostatic interactions, hydrophobic interactions, van der Waals interactions, table-pi interactions and cation-pi interactions. It may be at least one selected from the group consisting of.
  • the present invention includes two or more of the 61 ⁇ /1 peptide, or 61 ⁇ /1 peptide-de conjugate will be.
  • the id, peptide-conjugates preferably 2 to 6, more preferably id, It may be characterized as comprising an id-de conjugate, but is not limited thereto.
  • the dimer (a) among the multimers may be characterized in that two 61 ⁇ /1 peptides, or 61 ⁇ /1 peptide-de conjugates are linked to each other by a linker (1_ 2 ).
  • dimer is connected to each other by an additional linker (1_ 3 ), but is not limited thereto.
  • additional linker (1_ 3 )
  • a hexamer 1163111a
  • an octamer (0 3171a)
  • more multimers may be linked in a similar manner.
  • the dimers and tetramers of the 61 ⁇ /1 peptide-de conjugate according to the present invention may have the forms shown in Structural Formulas 7 and 8, but are not limited thereto. 2021/234550 1 ⁇ (:1 ⁇ 2021/054235
  • the linkers L 2 and u may be the same or different from each other, and may be independently cleavable or non-cleavable.
  • the linkers U and U are independently a single bond (direct bond), an amino acid or a derivative thereof, Q- C 20 alkyl, Q- C 20 alkylene, -S-, -NH- and -0-. It may be selected from, but not limited to, preferably an amino acid or a derivative thereof, more preferably lysine (Lys, K) or arginine (Arg, R) having two or more amine groups, but is limited thereto no.
  • lysine (Lys, K) may be used for the linkers L 2 and U, and the amine group (NH 2 ) of the lysine may be linked with de in a form similar to a peptide bond such as -C-CONH-, but , but is not limited thereto.
  • NH 2 amine group
  • 2021/234550 -01/162021/054235 at one end of the linker of the 61 ⁇ /1 peptide or the 61 ⁇ /1 peptide-de conjugate, there is a functional group ( ⁇ ) for conjugating another substance, preferably a drug ( ). 11 ⁇ :mi011 no
  • the structural formulas for the functional group bonded to the drug 119 to 1_ 3 in 1_2, Structure 8 of 7 can be introduced.
  • functional groups include, but are not limited to, amine (1 ⁇ 11) and thiol ( ⁇ ) groups, and lysine 0 ⁇ having an amine (1 ⁇ 11), and/or thiol group.
  • Cysteine [Gun, ⁇ is introduced, but is not limited thereto.
  • 61 ⁇ /1-330 bimi 61 ⁇ /1-33001) and 61 ⁇ /1- 330 1-geun113111la ( 01 ⁇ /1-3301:) are shown in Table 3 and It may have the same structure, but is not limited thereto.
  • 61 ⁇ /1-33a (Same as ⁇ 6 83 ⁇ 4 administration, mouse body weight was not affected by 61 ⁇ /1-33001- administration (Fig. 16b.
  • the cancer specificity of 61/1/1-33 can enhance the efficacy of )(, increasing the concentration of therapeutic drugs in tumor tissues).
  • the present invention provides a multimer containing two or more 61 ⁇ /1 peptide-de conjugates (1111
  • the multimer-drug conjugate is The description of the id-drug conjugate or the 61 ⁇ /1 peptide-de(]-drug conjugate may be applied mutatis mutandis, and accordingly, each linker or drug, etc. may be used as a 61 ⁇ /1 peptide-drug conjugate or 61 ⁇ /1 peptide- It is interpreted the same as the definition in the de-drug conjugate.
  • the present invention provides an AGM peptide-PEG conjugate o, cell-permeable heptide (Cell Penetrating Peptide; CPP) to an AGM hypotide-PEG-CPP fusion peptide.
  • CPP Cell Penetrating Peptide
  • CPP Cell Penetrating Peptide
  • signal peptide signal peptide
  • H!tides are either protein-permeable domains (
  • the fusion peptide of the present invention uses a cell-permeable peptide, and the cell-permeable peptide is not particularly limited as long as it has the characteristics of entering cells by a cell internalization mechanism, but preferably the cell-permeable peptides listed in Table 4 below. Or it can be used by selecting from the group consisting of variants thereof.
  • the cell-permeable peptide may be characterized in that it is selected from the group consisting of the cell-permeable peptides listed in Table 5 or variants thereof, and the preparation and properties of the peptides in Table 5 below are described in Korean Patent No. 10- See No. 1169030.
  • the cell-penetrating peptide may include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 48.
  • the AGM peptide-PEG conjugate and the cell-penetrating peptide may be linked through a linker.
  • it may be characterized in that it is linked through a maleimide-carboxy bifunctional linker, but is not limited thereto.
  • the present invention relates to a multimer-CPP fusion peptide in which a multimer comprising two or more AGM peptide-PEG conjugates and a cell penetrating peptide (CPP) are combined.
  • the multimer-[fusion peptide is 61 ⁇ /1 peptide-de-[fusion 2021/234550 ?01/162021/054235
  • each linker or cell-penetrating peptide is interpreted the same as the definition in the 61 ⁇ /1 peptide-de-fusion peptide.
  • the present invention provides the 61 ⁇ /1 peptide, 61 ⁇ /1 peptide-de conjugate, 61 ⁇ /1 peptide-de(]-drug conjugate, multimer, multimer-drug conjugate, 61 ⁇ /1 Peptide- £ ( 3 - fusion peptide or multimer- relates to a composition for diagnosing cancer comprising a fusion peptide.
  • the present invention provides the 61 ⁇ /1 peptide, 61 ⁇ /1 peptide- de conjugate, 61 ⁇ /1 Peptide-de(]-drug conjugate, multimer, multimer-drug conjugate, 61 ⁇ /1 peptide-de-[ fusion peptide or multimer-[ relates to a method for diagnosing cancer using a fusion peptide.
  • the 61 ⁇ /1 HA!tide, 61 ⁇ /1 peptide-de-conjugate, 61 ⁇ /1 peptide-de-drug conjugate, multimer, multimer-drug conjugate, 61 ⁇ / for cancer diagnosis 1 peptide- £ ( 3 - fusion peptide or multimer- relates to the use of the fusion peptide.
  • the present invention provides the 61 ⁇ /1 peptide, 61 ⁇ /1 peptide-de conjugate for the manufacture of a medicament for diagnosis of cancer. , 61 ⁇ /1 peptide-de(]-drug conjugate, multimer, multimer-drug conjugate, 61 ⁇ /1 peptide- £ ( 3 -[ fusion peptide or multimer-[ fusion peptide.
  • the diagnostic composition of the present invention it is possible to predict whether the onset or the possibility of onset of cancer is leukemia, myeloproliferative disease, lymphoma, breast cancer, liver cancer, stomach cancer, ovarian cancer, cervical cancer, glial cancer It may be carcinoma, colorectal cancer, lung cancer, pancreatic cancer, prostate cancer, liver cancer, gastric adenocarcinoma, uterine cancer, bladder cancer, thyroid cancer, melanoma, squamous cell carcinoma, hematopoietic cancer, kidney cancer, head and neck cancer, etc., but is not limited thereto.
  • the term "diagnosis” refers to determining the susceptibility of a subject to a specific disease or disorder ( 5 or 1), determining whether the subject currently has a specific disease or disorder, or having a specific disease or disorder. Determining the subject's prognosis (e.g., identification of a pre-metastatic or metastatic cancer state, determining the staging of cancer, or determining the responsiveness of the cancer to treatment) monitoring the state of an object to provide information about it). For the purposes of the present invention, the diagnosis is to determine whether or not the disease is onset or the possibility (risk) of the disease.
  • the present invention provides the 61 ⁇ /1 peptide, 61 ⁇ /1 peptide-de conjugate, 61 ⁇ /1 peptide-de(]-drug conjugate, multimer, multimer-drug conjugate, 61 ⁇ /1 It relates to a composition for preventing or treating cancer comprising a peptide-£(3-fusion peptide or multimer-fusion peptide).
  • the present invention provides the 61 ⁇ /1 peptide, 61 ⁇ /1 peptide-de conjugate, 61 ⁇ /1 peptide-de(]-drug conjugate, multimer, multimer-drug conjugate, 61 ⁇ /1 peptide-de-[ fusion peptide or multimer-[ fusion peptide to the subject 2021/234550 - It relates to a cancer prevention or treatment method comprising the step of administering 01/162021/054235.
  • the present invention provides the 61 ⁇ /1 peptide, 61 ⁇ /1 peptide-de-conjugate, 61 ⁇ /1 peptide-de-drug conjugate, multimer, multimer-drug conjugate, 61 ⁇ /1 peptide- £ ( 3 - fusion peptide or multimer- relates to the use of the fusion peptide.
  • the present invention provides the 61 ⁇ /1 peptide, 61 ⁇ for the manufacture of a medicament for the prevention or treatment of cancer.
  • Cancers or carcinomas that can be treated with the composition of the present invention are not particularly limited, and may be solid cancers and nucleolin-related cancers such as leukemia.
  • examples of such cancers include leukemia, myeloproliferative disease, lymphoma, breast cancer, liver cancer, stomach cancer, ovarian cancer, cervical cancer, glioma cancer, colorectal cancer, lung cancer, pancreatic cancer, prostate cancer, liver cancer, gastric adenocarcinoma, uterine cancer), bladder cancer, thyroid cancer, It may be melanoma, squamous cell carcinoma, hematopoietic cancers, kidney cancer, or head and neck cancers, but is not limited thereto.
  • cancer and “tumor” are used interchangeably and refer to or mean a physiological condition in a mammal that is typically characterized by unregulated cell growth/proliferation.
  • prevention refers to the composition comprising the peptide or conjugate. 2021/234550 ?01/162021/054235 It refers to any action that suppresses or delays cancer by administration.
  • treatment refers to the 61 ⁇ /1 peptide, 61 ⁇ /1 peptide-de-conjugate, 61 ⁇ /1 peptide- £ ( 3 -drug conjugate, multimer, multimer-drug conjugate, 61 ⁇ /1 Peptide-de-[fusion peptide or multimer- refers to any action in which the symptoms of cancer are improved or cured by administration of the composition containing the fusion peptide.
  • composition for preventing or treating cancer is a pharmaceutically effective amount of the 61 ⁇ /1 peptide, 61 ⁇ /1 peptide-de-conjugate, 61 ⁇ /1 peptide- £ ( 3 -drug conjugate, multimer, multimer-drug conjugate,
  • the id-de-[ fusion peptide or multimer-[ fusion peptide may be included alone, or may include one or more pharmaceutically acceptable carriers, excipients or diluents.
  • the pharmaceutically effective amount refers to an amount sufficient to prevent, improve, and treat symptoms of cancer.
  • pharmaceutically acceptable means that it is physiologically acceptable and does not normally cause gastrointestinal disorders, allergic reactions such as dizziness, or similar reactions when administered to humans.
  • Examples of such carriers, excipients and diluents include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • fillers, anti-agglomeration agents, lubricants, wetting agents, fragrances, emulsifiers and preservatives may be further included.
  • Suitable pharmaceutically acceptable carriers and agents include
  • composition of the present invention comprises 61 ⁇ /1 peptide, 61 ⁇ /1 peptide-de-conjugate, 61 ⁇ /1 peptide-de-drug conjugate, multimer, multimer-drug conjugate , 61 ⁇ /1 peptide-de-[ fusion peptide or multimer- may include one or more known active ingredients having a cancer therapeutic effect together with the fusion peptide.
  • the compositions of the present invention may be formulated using methods known in the art to provide rapid, sustained or delayed release of the active ingredient after administration to a mammal other than a human.
  • Formulations may be in the form of powders, granules, tablets, emulsions, syrups, aerosols, soft or hard gelatin capsules, sterile injectable solutions, sterile powders.
  • the composition of the present invention can be administered through several routes including oral, transdermal, subcutaneous, intravenous or intramuscular, and the dosage of the active ingredient depends on several factors such as the route of administration, the patient's age, sex, weight, and the severity of the patient. may be appropriately selected according to the present invention, and the composition for preventing or treating cancer according to the present invention may be administered in combination with a known compound having an effect of preventing, improving or treating symptoms of cancer.
  • the present invention will be described in more detail through examples.
  • Example 1 Materials and Methods 2021/234550 -01/162021/054235
  • Example 1 -1 OBOC library synthesis
  • the OBOC library was synthesized on solid-phase TentaGel MB NH2 resin (Rapp Polymere GmbH, Tubingen, Gemiany). A "split-mix" synthesis method was performed to construct combinatorial OBOC libraries, each containing a random library of millions of beads/ligands. 5 g of Tentagel MB NH2 resins (200
  • the ligand on the surface of the bead is 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) chemistry and N- hydroxybenzotriazole (HOBt) ⁇ GL Biochem, Shanghai, China)/N,N , - diisopropylcarbodiimide (DIC) (GL Biochem) standard solid-state peptide synthesis technique using coupling was synthesized by Coupling completion was confirmed by the ninhydrin test. Beads were stored in 70% ethanol at 4 °C until use.
  • Example 1-2 Ethics and cell culture All studies related to human tissue were pre-approved by the Research Ethics Review Board (IRB) of the Gwangju Institute of Science and Technology (#20191008- BR-48-03) -02).
  • MCF-7 Human breast and colorectal cancer cell lines including MCF-7, MDA-MB-231, HT-29 and HCM 16 were obtained from the Korea Cell Line Bank.
  • Jurkat T cells were also obtained from the Korea Cell Line Bank.
  • the Luciferase-expressing MDA-MB-231 cancer cell line was obtained from Perkin Elmer (Perkin Elmer, Hopkinton, Mass.).
  • Each cancer cell line contains RPMI1640 (Gibco, Waltham, USA) supplemented with 10% heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) (Gibco), 0.1 mg/ml streptomycin (Gibco) and 100 units/ml penicillin (Gibco) and this V ⁇ VI (Gibco).
  • Examples 1-3 OBOC library screening for cancer-specific ligands Before screening, beads were washed extensively with double distilled water and phosphate buffered saline (PBS; Welgene Inc., RepubHc of Korea). Cancer cells and normal cells were isolated from the culture dish using trypsin/Ti TTA (Gibco) and washed with the corresponding culture medium. It was resuspended at 10 6 cells/ml and incubated with 0B0C beads in a Petri dish and shaking (60rpm) in a 37°C humidified C0 2 incubator. Beads bound by cells appeared under the microscope as rosettes with a central bead covered with one or more cell layers.
  • PBS phosphate buffered saline
  • Example 1-6 Serum Stability Test Preheated The peptide stock solution (10 Ah) was diluted 10-fold and incubated for 0, 3, 6, 9 and 24 hours at 37° (:). Peptide from the group was included as a control. After denaturing serum protein with urea (Niyi) at a final concentration of 3! ⁇ /1 for 10 minutes at 4°(:), the final concentration 2021/234550 ?01/162021/054235
  • Fluorescence-activated cell-sorting (FACS) analysis was used to confirm the binding of FITC-hatffle. 1 ⁇ ( ; -Peptide storage solution It was prepared by dissolving.
  • HCT-116 cells were seeded at a ratio of 10 5 [ratio 15/ ⁇ 11 to 6- ⁇ 1 micro-roots containing 3
  • Control cells were treated similarly except for peptides.
  • the prepared cells were analyzed on a FACScanto ll (BD Biosciences) flow cytometer. FACS data were analyzed with FlowJo software (TreeStar).
  • Example 1-8 Biotin pull-down assay Cell lysates (500
  • Example 1-9 AGM-330 binding domain identification GFP-NCL (residues 1 -710), GFP-AN-NCL (residues 322-710) and GFP-AC-NCL (residues 1) from human NCL cDNA clone (Addgene) -321), and subcloned into the Xhol and BamHI sites of the pEGFP-C2 vector (Addgene). These vectors were transfected with Lipofectamine 2000 (1 nvitrogen, Carlsbad, CA, USA) according to the manufacturer's recommendations. Biotinylated AGM-330 HA!Tide was added to streptavidin beads (Thermo Fisher Scientific).
  • Triton X-100 1 mM marimastat (AdooQ Bioscience, Irvine, CA, USA)
  • protease inhibitor NCL was prepared by lysing 1.0X10 9 Jurkat cells in a cocktail (Millipore, Billerica, MA, USA) at 4 °C for 1 h.
  • Triton X-100, 1 mM marimastat (AdooQ Bioscience, Irvine, CA, USA), protease inhibitor cocktail (Millipore, Billerica, MA, USA).
  • the adsorbed protein was eluted with 10 ml of the same buffer containing 1 M NaCl.
  • the eluate was 50 mM Tris/HCI, pH 7.9, 5 mM MgCI 2 ,
  • MDA-MB-231 -luc xenograft tissues were formalin-fixed and paraffin-embedded for immunofluorescence staining.
  • Cells were seeded on poly-L-lysine and collagen I-coated cover glasses and fixed with 4% formalin.
  • Tissue slides and cells were permeabilized with 0.1% Triton X-100 and blocked with 2% BSA (Sigma-Aldrich). Staining was performed as described above using primary anti-NC (1 : 200), anti-TUNEL (1 : 200) and anti-Ki-67 (1 : 500) antibodies. All nuclei were counterstained with DAPI. Immunofluorescence images were matched with H&E-stained images. 2021/234550 ?01/162021/054235 Example 1 -14: 5
  • siRNA targeting NCL (NM_005381.3 in NCBI database) and scramble siRNA (scr) were purchased from Bioneer (Daejeon, Republic of Korea).
  • siRNA transfection was performed using Lipofectamine 2000 (lnvitrogen) according to the manufacturer's protocol. Three different siRNA sequences were used and their efficiency was evaluated by real-time PCR.
  • siNCLI (sense) 5 f -GAGCUAACCCUUAUCUGUA (dTdT)-3 , (SEQ ID NO: 21)
  • First-strand cDNA was synthesized using a Synthesis Kit (Takara, Shiga, Japan), and one tenth of the cDNA was used in each PCR mixture together with Power SYBR® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems).
  • Real-time PCR was performed using the StepOnePlus Real-Time PCR System (Applied Biosystems). Relative mRNA expression of selected genes was normalized to expression of p-actin and quantified using the ddCt method.
  • the sequences of the PCR primers are listed in Table 6 below.
  • Cancer and normal cell lines were seeded at 1X10 4 cells/well in 96-well plates containing 100 [jl of medium, and the plates were incubated overnight at 37 °C. After overnight incubation, cells were incubated for 24 h in the absence or presence of an anti-NCL antibody (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA) overnight at 37 °C. After incubation, cell viability was evaluated by CellVia WST-1 assay (Young In Frontier, Seoul, Korea) according to the manufacturer's instructions.
  • FITC Annexin V-fluorescein isothiocyanate
  • PI propidium iodide
  • Example 1-18 Cell proliferation assay Cancer cells and normal cells (1x10 4 cells/well) were seeded in 96-well plates. After incubation for 24 hours, cells were treated with increasing concentrations of AGM-330, PTX and AGM-330-PTX for 48 hours. Cell viability was evaluated by CellVia WST-1 assay (Young In Frontier) according to the manufacturer's instructions. The number of viable cells was measured at a wavelength of 450 nm using a Versa Max ELISA plate reader (Molecular Devices).
  • Example 1-19 Tumor formation (11
  • mice 100
  • jl volume of 1X10 6 MDA-MB-231 -luc cells were inoculated into mammary fat pad (/7 5 ⁇ 6 for each groupO. After tumor cell inoculation, when the tumor volume reached approximately 100mm 3 , Mice were randomly divided into 5 groups: (i) control, (ii) low-dose paclitaxel (2 mg/kg), (iii) high-dose paclitaxel (1 Omg/kg), (iv) AGM-330 ( 16.68 mg/kg or 8.34 mg/kg) and (v) AGM-330-PTX (19.05 mg/kg or 10.71 mg/kg).Measure the tumor size twice a week and calculate the tumor volume using the following equation Buoy
  • (mm 3 ) (length (mm)) x (width (mm)) 2 X 0.5.
  • D-luciferin 150 mg/kg (Perkinti mer) was added to each.
  • Mice were injected intraperitoneally, and an IVIS 100 imaging system (Xenogen, Corporation, Alameda, CA) was used for bioluminescence monitoring
  • the mice were anesthetized with gaseous isofurane (BK Pharm, llsan, Korea) and placed in an imaging chamber. After 10 minutes, each animal was imaged with an exposure time of 1 minute.All bioluminescence image data were provided by Living Image software (version 4.5.2, PerkinElmer).Photons detected from the tumor were measured with an average light intensity (photon/sec).
  • Average luminance values are quantitative data obtained from a region of intensity (ROI), including photons emitted by bioluminescent cells in a rectangular region allocated throughout the body of each mouse. Examples 1-20: Bioinformatics 2021/234550 ?01/162021/054235
  • Kaplan-Meier plots were generated using the R2 platform and , group patients according to NCL expression level in breast tumor and colorectal tumor.
  • Example 2 A0 [combination screening and 1 ⁇ /1 - synthesis method.
  • AGM -330 was resynthesized on Tentagel MB NH 2 resin Cell growth bead analysis results ⁇ , AGM-330 beads were synthesized from human breast cancer cell lines (MCF7 and MDA-MB-231) and human colorectal cancer cell lines (HT-29 and HCT-116) (Fig. 4D), on the other hand, AGM-331 and AGM-332 were relatively non-specific, and were not detected in human normal breast cell line (MCF-10A) and human normal colorectal cell line (CCD-18CO).
  • AGM-330 binds very weakly to MCF-10A or CCD-18CO cells or not at all, so it can be a good candidate for both imaging and therapeutic targeting agents. Because of its current low stability The use of peptides as therapeutics has been largely limited: peptides are degraded mainly by proteases and peptidases at / 1// (Bottger R, et al. PLoS One. 2017; 12: e017894 key.
  • AGM-330 in the form of a MAP dendrimer was synthesized, which may exhibit increased stability due to the acquired resistance to protease and peptidase activity.
  • Synthesis of AGM-330 (Fig. 4E) was performed to prepare lysine core-conjugated Wang resin (2,3), Fmoc-Cys (Trt) Wang resin (1) and Fmoc- in the presence of 20% piperidine and this VIF Lys(Fmoc)-OH.
  • AGM-330(4) Fmoc- and Trt-protected AGM-330(4) was prepared by treatment with RHGAMVYU ⁇ -PEG12-0H in the presence of 20% piperidine.
  • the Fmoc- and Trt- protecting groups of AGM-330(4) were rapidly removed by piperidine of this VIF to prepare AGM-330(5).
  • the selected peptide ligand AGM-330 was synthesized in the form of dimers and tetramers I through MAP (Multiple Antigen Peptide) synthesis to improve in vivo stability and binding power. To evaluate whether or not to enhance peptide stability, the in vivo half-life of the peptide was analyzed.
  • AGM-330m, AGM-330d, and AGM_330t 2mg/kg were injected through the tail vein of C57BL/6 mice, and the remaining peptide portion in the serum was immediately immobilized on the ELISA plate using an anti-AGM-330 antibody.
  • Absorbance was measured at a wavelength of 450 nm using a Versa Max ELISA plate reader (Molecular Devices), and pharmacokinetics were measured by phoenix WinNonlin. Corporation, Mountain View, CA, USA) program.
  • T 1/2 half-lives (T 1/2 ) of AGM-330m, AGM-330d, and AGM-330t were 0.42 ⁇ 0.33 hours, 1.82 ⁇ 0.36 hours, and 9.43 ⁇ 1.21 hours, respectively, and the maximum blood concentration time (T max ) was all 0.167 hours.
  • the maximum blood concentrations (C max ) were 1.27 ⁇ 0.12 ijg/mL, 1.71 ⁇ 0.11 jjg/mL, and 1.875 ⁇ 0.67 Mg/mL, respectively.
  • the area under the 2021/234550 -01/162021/054235 curve (AUC) was 0.64 ⁇ 0.09ijg/h/mL, 1.77 ⁇ 0.12ijg/h/mL, and 21.42 ⁇ 0.8lMg/h/mL, respectively (FIG. 5).
  • AGM-330t tetrameric AGM-330 had higher stability than monomeric or dimeric peptides.
  • AGM-330-FITC cancer cells treated with FITC-labeled AGM-330
  • AGM-330-FITC was incubated with cells (1X10 5 ) in serum-free medium at 37 °C for 2 h to keep the conjugates intact.
  • the intrinsic fluorescence heat-treated cells were compared and measured based on the change in mean fluorescence intensity (MFI) with respect to the untreated cells (FIG. 4F).
  • AGM-330-FITC showed significant cancer cell binding to MCF-7, MDA-MB-231, HT-29 and HCT-116, which was a relative increase in MFI of treated cells compared to untreated cells.
  • the conjugates showed significantly reduced binding to normal cells, including MCF-10A and CCD-18CO, whereas strong preferential binding to cancer cells.
  • AGM-330 exhibits cytotoxicity
  • several cancer cells including MCF-7, MDA-MB-231, HT-29, HCM 16 and MCF-10A and CCD-18Co IC 50 values were evaluated in normal cells.
  • IC 50 values of AGM-330t and AGM-330d were greater than 100MM in all cell lines regardless of serum concentration (Fig. 6). This means that AGM-330 does not significantly affect the cell viability of cancer or normal cell lines.
  • Example 3 Potential target of AGM-330 NCL, a potent regulator of cancer cell growth
  • AGM-330 To identify the unknown target protein of AGM-330, AGM-330 from cell lysates of MDA-MB-231 cells using affinity column chromatography and mass spectrometry-based proteomic approaches. -Identified the interacting protein (FIG. 7A). After affinity column chromatography, several distinct protein bands (55-100 kDa) present only in the elution fraction were identified through SDS-PAGE analysis (FIG. 7B). Six proteins were identified using LC-MS/MS analysis, and peptide identification of these excised bands showed that one of the major protein bands at 100 kDa was characterized as nucleolin (NCL).
  • NCL nucleolin
  • NCL consists of 710 amino acids and 22 other peptide fragments identified by LC-MS/MS analysis were consistent with the amino acid sequence of NCL (total scores 881 and 24 for human NCL (accession number: gi189306) in the NCBI database) % sequence coverage) ( FIGS. 7C-D ).
  • the concentration of NCL in the eluate from the AGM-330 affinity column was further confirmed by immunoblot analysis using an anti-NCL antibody (Fig. 70.
  • proteomic studies showed that NCL interacts with AGM-330 suggest that it is a protein.
  • Biotinylated AGM-330 (AGM-330-Biotin) was used as a bait to pull down the NCL mutant.
  • Several deletion mutants of NCL were generated.
  • Cell extracts were prepared from HEK293T cells transfected with expression vectors encoding wild-type and various NCL mutants, all fused to GFP, NCLK1-710), NCL2 (323-710) and NCL3 (1-322).
  • AGM-330-Biotin pulled down wild-type NCL1 (1-710) and NCL3 (1-322), but not NCL2 (323-710) ( FIG. 7F ).
  • NCL N-terminal region of NCL (1-322) is important for binding of AGM-330.
  • purified NCL and AGM-330-Biotin were used for biotin pull-down analysis.
  • the concentration of NCL in the elution fraction was confirmed by immunoblot analysis using an anti-NCL antibody (FIG. 9).
  • Example 4 Identification of amino acid residues essential for the interaction of 61 ⁇ /1-330 and ⁇ :1_ Cancer cells (1 X 10 4 [Ratio 15/ ⁇ 11) 96- ⁇ Ratio 1
  • the 13 peptides were treated with increasing concentrations for 2 hours. After that, 3 ⁇ /you ⁇
  • the absorbance of 13 PEGylated peptides is shown in FIG. 10 .
  • the four peptides of SEQ ID NOs: 9, 10, 11, and 14 showed absorbance similar to that of AGM-330.
  • the four peptides of SEQ ID NOs: 12, 13, 15, and 20 showed improved absorbance than AGM-330.
  • Substitution of methionine (M5) residue 5 with leucine or norleucine, substitution of tyrosine (Y7) residue 7 with phenylalanine, and insertion of repetitive leucine (L) and lysine (K) residues at the C-terminus enhanced binding strength. .
  • the substitution of the hydrophobic amino acids of the M5 and Y7 residues or the insertion of L and K at the C-terminus can improve the binding force.
  • the peptides of SEQ ID NOs: 16 to 19 showed reduced absorbance than AGM-330. Deletion of No. 1 arginine (RI) and No. 2 histidine (H2) residues, insertion of repetitive arginine (R) and histidine (H) residues at the N-terminus, and inversion sequence reduced binding force.
  • the orientation of the sequences, including R1 and H2 should be preserved.
  • Example 5 61 ⁇ /1-330 Specific Binding to Cancer Cells at / /I 0 and / /I 1 /0 as Cell Binding Assay for Different Cell Lines Using Fluorescence Microscopy for 61 ⁇ /1- The specificity of 330 was evaluated. majority Cells were cultured for 1 hour with -231, Bar-29 and Yes 6 and normal cell lines, 1 ⁇ /10 : -10 and (; Binding specificity was confirmed by post-confocal imaging.Cells were incubated with Dimi and counterstained for nuclei (blue fluorescence).Anti- !_ antibody binding to the ! ⁇ 1-terminal domain of !_ and 6! ⁇ /1-330 - 2021/234550 ?01/162021/054235
  • NCL and AGM-330-FITC were confirmed (Fig. 11A-3 ⁇ 4.
  • the difference in the expression level or location of NCL is related to the sensitivity of AGM-330 to cancer cells It was checked whether this exists.
  • the subcellular fraction of cells was isolated, and the expression of NCL in the cytosol, nuclear and cell membrane extracts as well as total intracellular total NCL was analyzed by Western blotting.
  • NCL expression was elevated in the membrane and cytoplasmic extracts of MCF-7, MDA-MB-231, HT-29 and HCT-116 cells compared to MCF-10A and CCD-18Co cells (Fig.
  • Fig. 12A No significant differences in nuclear levels of NCL were observed in any cell line.
  • membrane-expressing NCL is critical for AGM-330 binding to cancer cells.
  • siRNAs targeting NCL siNCL1, siNCL2 and siNCL3 showed different efficacy in NCL-knockdown cells.
  • AGM-330-Alexa680 tumor-bearing mice treated with Alexa680-labeled AGM-330
  • Aleax680 compared to mice treated alone.
  • the near-infrared fluorescent (NIRF) intensity of the AGM-330-Alexa680 fraction tumor was significantly higher than that of the control tumor: (control) 3.04 X 10 7 ⁇ 1.38 10 6 (p/sec/cm 2 /sr) )/(
  • Contrast (AGM-330-Alexa680) 1.19 X 10 9 ⁇ 1.90 10 7 (p/sec/cm 2 /sr)/(ijW/cm 2 ), n 3, P ⁇ 0.001 (FIGS.
  • Example 6 Positive correlation between NCL and cancer progression and anti-NCL antibody to confirm cell proliferation inhibitory effect through membrane NCL neutralization Based on the above Examples, NCL expression patterns in cancer cell lines were confirmed.
  • Oncomine dataset repository www.oncomine.org
  • NCL mRNA expression was significantly upregulated in breast carcinoma compared with normal breast tissue ( ⁇ 0.001, FIG. 13A).
  • NCL expression was analyzed by immunohistochemistry (IHC) analysis.
  • IHC immunohistochemistry
  • 2021/234550 ?01/162021/054235 revealed an increase in the membrane and cytoplasmic regions of human breast and colorectal cancer tissues compared with these normal breast and colorectal tissues (Fig. 13(1-)), which The results of Fig. 1 1/ ⁇ -Mi and Western blotting (Fig. 1 1(;)) are consistent with the results.
  • the up-regulated membrane interacts as a receptor for a ligand involved in the inhibition of cancer proliferation and apoptosis (Fig. 01). rain. 0% 3 . 2015; 6: 16253-7( ⁇ .
  • Membrane expression was neutralized using monoclonal anti- ⁇ antibody in 1 ⁇ /10/ ⁇ -1 ⁇ / - 231 and 4 6 cells and [ kawa and 0g -18 (;0 cells).
  • apoptotic assays were performed to investigate the cause of the cytotoxic effect of anti-antibodies on cancer cells.
  • 1 ⁇ / / ⁇ -1 ⁇ / -231 and HCT-1 16 cells treated with antibodies at different concentrations for 24 hours were stained using Annexin V and Mi.
  • the percentage of cancer cells in early and late apoptotic stages increased in an anti- 1 ⁇ 1 ⁇ that!_ antibody concentration-dependent manner ( FIG. 131 ).
  • the present inventors confirmed that this overexpression in the membrane and cytoplasm of various types of cancer is associated with poor prognostic survival of cancer patients.
  • the above results are important for the membrane part in cancer cells, especially in terms of the control of cancer cell proliferation and apoptosis.
  • Example 7 Confirmation of effective cancer growth inhibitory effect of paclitaxel-conjugated AGM-330 in vitro and in mouse xenograft model A cancer-targeting ligand linked to a well-established chemotherapeutic agent by conjugating paclitaxel (PTX) with AGM-330 ( AGM-330-PTX) was obtained. PTX was orthogonal conjugated with a maleimide-carboxy bifunctional linker.
  • PTX paclitaxel
  • M-330t-PTX inhibits cancer cell proliferation
  • IC 50 values in several cancer cell lines including MCF-7, MDA-MB-231, HT-29 and HCT-116 (Fig. 14A).
  • MDA-MB-231 cells the IC 50 values for PTX alone and AGM-330t-PTX were 6.8 and 3.6 M M, respectively.
  • the results were similar in all three cancer cell lines (MCF-7, HCT-116 and HT-23 ⁇ 4.
  • MCF-10A cells the IC 50 values for PTX alone and AGM-330t-PTX were 22.1 and 35.3MM, respectively.
  • AGM-330t-PTX was a potential in vivo therapeutic agent.
  • the mammary gland fat pads of NPG mice were inoculated with MDA-MB-231-luc cells subcutaneously. After the tumor grew to 100 mm 3 , twice a week by tail vein injection, vehicle (PBS), AGM-330t (16.68 mg/kg), PTX (2 mg/kg and 10 mg/kg, respectively), AGM-330t-PTX
  • 61/1-33 was tested for anticancer efficacy using silver 61 ⁇ /1-33001-[ ⁇ ) (Fig. 16/ ⁇ ).
  • the 61//1-33001-treatment significantly reduced the tumor volume and weight compared to the ) (-treated group (Fig. 16 (3)).
  • cell penetrating peptide Cell Penetrating Peptide
  • Example 10 Confirmation of the effect of inducing / /I ⁇ 0 cancer cell apoptosis (3 (30 nights 0 5) of the bound fusion peptide)
  • HCT-116, 1 ⁇ “-29 and ⁇ ; [-18[:0] Cells were stained using / ⁇ 6) ⁇ V and Mi.
  • Fig. As a result, it was confirmed that the apoptosis-promoting protein increased in a concentration-dependent manner ( FIG. 21 ).
  • Example 11 61 ⁇ /1-330 and 61 ⁇ /1-330 - 61//1-330 unfermented [?
  • AGM-330m-mCPR AGM-33001-dCPP and 61 ⁇ /1-330 [??The value of 1 (; 50 of the fusion peptide) was 23.3, 5.47 and 3.791 ⁇ for colorectal cancer cell lines, respectively, and in bar-29 for 20.67, 3.75 and 3.3 1 ⁇ /1, respectively.
  • the breast cancer cell line showed >20,4.208 and 3.802 ⁇ 1 for 1 -/, respectively, and >20, 3.843, and 3.49 1 ⁇ /1 for 0/ ⁇ - 231, respectively (FIG. 22).
  • 6! ⁇ /1-330 -[ fusion It can be confirmed that the 2021/234550 -01/162021/054235 peptide has a cancer cell-specific inhibitory effect.
  • ⁇ 50 values were 14.3, 4.25 and 3.15 1 ⁇ /1 for colon cancer cell line 1 ⁇ 116, respectively, and 14.2, 4.76 and 3.05! ⁇ for Bar-29, respectively.

Abstract

본 발명은 뉴클레오린에 특이적으로 결합하는 신규한 펩타이드에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 특정 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드와 상기 펩타이드 및 항암제를 포함하는 접합체, 상기 펩타이드 및 세포투과성 펩타이드를 포함하는 융합 펩타이드, 상기 펩타이드를 포함하는 암 진단용 조성물 및 상기 펩타이드 또는 접합체를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에서는 MAP 합성 방법 및 OBOC 조합 방법을 사용하여 스크리닝한 펩타이드 리간드 AGM 펩타이드 및 그 변이체들이 암 세포에 특이적으로 결합하며, 항암제와의 접합체가 암 성장을 억제하는 것을 확인하였다(in vitro 및 in vivo). 따라서, NCL-표적화 AGM 펩타이드는 암 치료요법에서 진단 및 표적 약물 전달에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

2021/234550 ?01/162021/054235 명세서 발명의 명칭: 신규 뉴클레오린-결합 펩타이드 및 이의 용도 기술분야 본 발명은 뉴클레오린에 특이적으로 결합하는 신규한 펩타이드에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 특정 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드와 상기 펩타이드 및 항암제를 포함하는 접합체, 상기 펩타이드 및 세포투과성 펩타이드를 포함하는 융합 펩타이드, 상기 펩타이드를 포함하는 암 진단용 조성물 및 상기 펩타이드 또는 접합체를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 배경기술 암-특이적 리간드를 약학적 담체로서 이용하는 것은 종래의 약물에 의해 달성되는 것보다 상대적으로 화학요법 제제의 조직 또는 세포 특이적 전달을 가능하게하여, 전신 독성을 감소시킨다 (Allen TM. Nat Rev Cancer. 2002; 2: 750- 63). 암-특이적 리간드 중에서, 나노입자 및 항체는 임상 암 진단 및 치료에서 널리 연구되어왔다 (Yao VJ, et al. J Control Release. 2016; 240: 267-8Q. 초기 단계에서 개별 환자의 암을 감지 및 모니터링하고 치료 효과를 높이기 위해 장기간에 걸쳐 항암제를 전달할 수 있기 때문에, 동시에 진단 및 치료를 할 수 있는 (theragnostic) 나노입자와 항체는 개인 맞춤형 의약품 분야에서 큰 가능성을 2021/234550 ?01/162021/054235 보이고 있다 (Palmieri D, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2015; 112: 9418-23). 나노입자는 유망한 약물 운반체 시스템이지만, 순환 불안정성, 부적절한 조직 분포 및 세포 독성 때문에 실제 적용에 한계를 나타낸다 (Sukhanova A, et al. Nanoscale Res Lett. 2018; 13: 4쉬. 또한, 치료용 항체는 크기가 커서 종양 조직으로의 전달 및 확산이 느리다는 한계가 있다 (Epenetos AA, et al. Cancer Res. 1986; 46: 3183-91). 고전적인 진단 및 치료 방법에 대한 대안으로, 치료 효율을 높이고 나노입자 및 항체 암 치료법과 관련된 부작용을 줄이기 위해서, 암-특이 펩타이드가 사용될 수 있다 (Mori T. Curr Pharm Des. 2004; 10: 2335-4¾. 핃!타이드 리간드는 쉬운 대량 합성, 낮은 면역원성, 무독성 대사산물의 생성 및 높은 in vivo 생체적합성을 포함하여 많은 장점을 가지고 있다 (McGregor DR Curr Opin Pharmacol. 2008; 8: 616-9). 핃!타이드를 발굴하는 많은 방법 중에서, OBOQone- bead-one-compound) 조합 방법은 핃!타이드 리간드를 스크리닝하는 강력한 방법 중 하나이다 (Lam KS, et al. Chem Rev. 1997; 97: 411-48). OBOC 조합 라이브러리에 기초한 펩타이드 스크리닝 접근법은 암 및 다른 질병에서의 세포 표적화를 위한 신규 펩타이드 리간드의 발견을 촉진시켰다 (Mikawa M, et al. Mol Cancer Ther. 2004; 3: 1329-34X 다수의 암-특이적 핃!타이드가 in vitro OBOC 조합 스크리닝 또는 다른 방법을 사용하여 분리되었지만, 몇 가지 과제가 남아있다. 특히, 펩타이드를 약물로 사용함에 있어 주요 단점으로는 다른 펩티다아제 (peptidase)에 의한 매우 빠른 절단으로 인한 매우 짧은 반감기를 들 수 있다 (Borchardt TR, et al. Adv Drug Deliv Rev. 1997; 27: 235-56). 본 발명자들은 2021/234550 ?01/162021/054235 다중-항원 핃!타이드 (multiple-antigen peptide; MAP) 덴드리머 형태 (dendrimeric form)의 생활성 펩타이드를 합성하는 전용 접근법을 개발함으로써 상기 기재한 문제점들을 극복하고자 하였다. 덴드리머 형태의 단량체 펩타이드의 합성은 단백질분해효소 (protease) 및 펩티다아제 활성에 대한 획득 저항성으로 인해 안정성을 증가시킬 수 있다 (McGuire MJ, et al. Sci Rep. 2014; 4: 4480). 이에 본 발명자들은, OBOC 조합 스크리닝과 MAP 합성을 결합하여, 인간 유방암 (breast cancer) 및 결장직장암 (colorectal cancer) 세포에 특이적으로 결합하는 AGM 또는 AGM 펩타이드라 명명된 펩타이드 리간드 시리즈들을 발명하였다. in vivo 형광 이미징 시험을 통해 AGM 시리즈들이 정상 조직보다는 종양에 ■씬 더 많이 분포되어 있음을 입증하였다. 또한, 파클리탁셀 (PTX)-접합 AGM 을 처리하면 암 세포에서 PTX 축적을 개선시키고, in i//分 D에서 PTX 단독 처리보다 유방암 및 결장직장암 세포를 더욱 효과적으로 억제하였다. 또한, PTX- 접합 AGM 처리는 종양 조직에서 PTX의 특이적 국소화 (localization)를 촉진하여, 유방암의 이종이식 (xenograft) 모델에서 세포독성을 증가시키고, 약물 축적 및 항암 효능을 향상시켰다. 나아가, pull-down 분석 및 LC-MS/MS을 통해 뉴클레오린 (NCL)이 AGM의 표적 단백질임을 확인하였다. NCL은 인 (nucleolus)에 가장 많이 존재하는 단백질이다. 본 발명에서는,
Figure imgf000005_0001
항- NCL 항체를 이용하여 암 세포 증식을 억제시키고 세포사멸율 (apoptotic rates)을 증가시킴으로써, 암 세포막 NCL의 과발현 및 세포 막 NCL의 중화를 확인하였다. 발암성 역할과 암 세포막에서의 발현으로 인해 은 암 치료를 위한 매력적인 2021/234550 ?01/162021/054235 표적이다. 종합하면, 상기 결과들은 시리즈들이 암 진단 및 치료를 위한 신규 종양-표적화 펩타이드임을 나타낸다. 본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다. 발명의 요약 본 발명의 목적은 뉴클레오린 이 ; 1\1（그1_）에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 제공하는 데 있다. 본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드 및 항암제를 포함하는 접합체를 제공하는 데 있다. 본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩타이드를 포함하는 2개 이상 다량체（1111||미111때를 제공하는 데 있다. 본 발명의 또 다른 목적은 상기 다량체 및 항암제를 포함하는 접합체를 제공하는 데 있다. 본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩타이드와 세포투과성 펩타이드（Cell Penetrating Peptide; CPP）가 결합된 융합 핃!타이드 및 상기 다량체와 세포투과성 2021/234550 ?01/162021/054235 펩타이드가 결합된 융합 펩타이드를 제공하는 데 있다. 본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩타이드 또는 다량체를 포함하는 암 진단용 조성물, 암 진단방법, 암 진단을 위한 상기 펩타이드 또는 다량체의 용도 및 암 진단용 약제 제조를 위한 상기 펩타이드 또는 다량체의 사용을 제공하는 데 있다. 본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩타이드, 상기 접합체 또는 다량체를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물, 암 예방 또는 치료방법, 암 예방 또는 치료를 위한 상기 펩타이드, 접합체 또는 다량체의 용도 및 암 예방 또는 치료용 약제 제조를 위한 상기 펩타이드, 접합체 또는 다량체의 사용을 제공하는 데 있다. 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
(3) 서열번호 1 내지 서열번호 8 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열; 및 山) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에서 0) 1\1-말단으로부터 5번째 메티오닌 잔기의 치환;
00 1\1-말단으로부터 7번째 타이로신 잔기의 치환; 및 말단에 류신 또는 라이신 잔기의 삽입; 으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 변이를 포함하는 아미노산 서열; 2021/234550 ?01/162021/054235 로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 뉴클레오린 (nucleolin; NCL)에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 제공한다. 본 발명은 또한, 상기 펩타이드 및 항암제를 포함하는 접합체를 제공한다. 본 발명은 또한, 상기 펩타이드를 포함하는 다량체 (multimer)를 제공한다. 본 발명은 또한, 상기 다량체 및 항암제를 포함하는 접합체를 제공한다. 본 발명은 또한, 상기 핃!타이드와 세포투과성 핃!타이드 (Cell Penetrating Peptide; CPP)가 결합된 융합 펩타이드를 제공한다. 본 발명은 또한, 상기 다량체와 세포투과성 펩타이드가 결합된 융합 펩타이드를 제공한다. 본 발명은 또한, 상기 펩타이드 또는 다량체를 포함하는 암 진단용 조성물, 암 진단방법, 암 진단을 위한 상기 펩타이드 또는 다량체의 용도 및 암 진단용 약제 제조를 위한 상기 펩타이드 또는 다량체의 사용을 제공한다. 본 발명은 또한, 상기 펩타이드, 상기 접합체 또는 다량체를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물, 암 예방 또는 치료방법, 암 예방 또는 치료를 위한 상기 펩타이드, 접합체 또는 다량체의 용도 및 암 예방 또는 치료용 약제 제조를 위한 상기 펩타이드, 접합체 또는 다량체의 사용을 제공한다. 도면의 간단한 설명 도 1은 본 발명에 따른 0!\/1-330과 드(3가 접합된 접합체 ((：011」119 6)의 2021/234550 ?01/162021/054235 단량체 (AGM-330m), 이량체 (AGM-330d), 사량체 (AGM-330t) 구조를 나타낸 도면이다. 도 2는 본 발명에 따른 AGM-330-PEG 접합체 (conjugate)와 세포투과성 핃!타이드 (Cell Penetrating Peptide; CPP)가 결합된 AGM-330-CPP 융합 핃!타이드의 구조를 나타낸 도면이다. 도 3은 펩타이드 라이브러리 합성 및 스크리닝 단계를 표현한 모식도이다: 1, Split-mix 합성 방법을 수행하여 조합 0B0C 라이브러리를 구축; 2, 대략 ~2, 600, 000개의 라이브러리 합성; 3, 0B0C 라이브러리를 C02 인큐베이터에서 암 세포와 함께 배양; 4, 세포 표면 분자에 대한 친화성을 갖는 리간드를 운반하는 비드는 세포로 덮임; 5, positive 비드를 도립 현미경 하에서 피펫으로 재취; 6, positive 비드의 서열을 Edman microsequencing으로 측정; 7, 0B0C 조합 펩타이드 라이브러리 스크리닝으로부터 확인된 암-특이적 펩타이드 리간드 후보. 도 4는 암-특이적 리간드에 대한 0B0C 라이브러리의 스크리닝 및 MAP 합성을 나타낸 것이다. 도 4A는 암 세포주 및 정상 세포에 대한 펩타이드의 결합 특이성을 나타낸 것이며, 도 4B는 선택된 8개 비드의 세포 결합 특이성을 나타내는 전체-세포 결합 분석 결과로, 다수의 유방암 및 결장직장암 세포와 정상 유방 및 결장직장 세포를 106cells/ml에 재현탁시키고 비드와 함께 배양하였다. 모든 실험을 3회 반복하였고, Scale bar는 200Mm이다. 도 4C는 FITC-labeled AGM-330, AGM-331 및 AGM-332의 면역형광의 공초점 이미징에 의해 결정된 결합 특이성을 나타낸 것으로, 핵은 DAP(blue)로 염색되었고, Scale bar는 5()Mm이다. 도 4D는 AGM- 2021/234550 ?01/162021/054235
330의 결합 특이성을 나타낸 것으로, 6 -330의 세포 결합을 결정하기 위해 전체-세포 결합 분석을 수행하였으며, Scale bar는 200Mm이다. 도 4E는 AGM- 330의 합성 절차를 나타낸 것으로, 시약 및 조건은 다음과 같다: (i) Fmoc-Lys- (Fmoc)-OH, piperidine, DMF; (ii) Fmoc-Lys-(Fmoc)-OH, piperidine, DMF; (iii) RHGAMVYLK-OH, piperidine; (iv) piperidine, DMF. Fmoc = 9- fluorenylmethoxycarbonyl, DMF = dimethylformamide. 도 4F는 다수의 유방암 및 결장직장암 세포와 정상 유방 및 결장직장 세포 중 암 세포에 대한 AGM-330의 특이성을 나타내는 FACS 분석 결과로, 막대 그래프는 평균 ± SD를 나타내고, one-way ANOVA with Dunnett's multiple comparison으로 통계 분석을 수행하였다. *, ** 및 ***는 각각 p < 0.05, P < 0.01 및 /7 < 0.001을 나타낸다. 도 5는 AGM-330(AGM-330m, AGM-330d, AGM-330t)에 의한 펩타이드 in vivo 안정성 평가 결과이다. AGM-330 2mg/kg을 마우스의 꼬리 정맥을 통해 주입한 후, 0, 0.167, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24 및 48시간마다 헤파린이 코팅된 관을 이용해 눈에서 혈액을 재취하였다 . 4°C에서 혈액 응고를 허용한 후, 4°C에서 10분 동안 5000rpm으로 원심분리하여 혈청을 수집하였다. 남아있는 혈청내 펩타이드 부분은 항- AGM-330 항체를 통해 ELISA 플레이트에 즉시 고정시켰다. 흡광도는 Versa Max ELISA plate reader(Molecular Devices)를 사용하여 450nm의 파장에서 측정되었으며 약물동태학 (Pharmacokinetics)은 phoenix WinNonlin公.八、 Pharsight Corporation, Mountain View, CA, USA) 프로그램으로 분석하였다. 도 6은 AGM-330t 또는 AGM-330d 처리시의 세포 생존력 분석 결과이다. 암 세포 및 정상 세포 (1 X 104 cells/well)를 96-well plates에 시딩 (seeding)하고, 2021/234550 ?01/162021/054235
24시간 동안 배양한 후, 세포를 혈청 농도를 달리하여 48시간 동안 증가하는 농도의 AGM-330t 또는 AGM-330d로 처리하였다. 세포 생존력은 제조사의 지시에 따라 CellVia WST-1 assay(Young In Frontier)에 의해 평가되었으며, 생존 세포의 수는 VersaMax ELISA plate reader(Molecular Devices)를 사용하여 450nm의 파장에서 측정되었다. 도 7은 AGM-330의 분자 표적 및 특성을 확인한 결과를 나타낸 것이다. 도 7A는 biotin pull-down 분석, 질량 분석 및 웨스턴 블랏의 모식도를 나타낸 것이다. 도 개는 10% SDS-PAGE에 의한 분리 후 친화성 컬럼으로부터 용출된 단백질의 Coomassie brilliant blue 염색 결과로, Lane 1 : protein marker; Lane 2: total lysate before biotin pull-down assay; Lane 3: flow-through after incubation with AGM-330-biotin; Lane 4-6: bead washing fraction; Lane 7-8: elution of AGM- 330 binding proteins이다. * 빨간색 별 표시는 단백질 밴드가 겔 내 분해를 우 I해 절단된 후 LC-MS/MS 분석이 수행되었음을 나타낸다. 도 7C는 MS로 검출된 펩타이드의 단백질 데이터베이스 검색으로 AGM-330 결합 파트너로서 NCL을 확인한 결과이다. 도 7D는 LC-MS/MS 분석으로부터 얻은 유전자 목록으로, confidence score는 식별된 단백질의 mascot score를 나타낸다. 도 는 항- NCL 항체를 사용한 biotin pull-down으로부터 용출된 단백질의 면역 블랏팅 분석 결과로, 화살표는 NCL의 존재를 의미한다. 도 7F는 AGM-330에 결합하는 NCL 도메인의 분석 결과로, 상이한 GFP-NCL construct를 HEK293T 세포로 형질주입시키고, AGM-330-biotin을 streptavidin 비드에 결합된 NCL residues 1 - 710, residues 1 -322 또는 residues 323-710에 첨가하였으며, 비드상의 단백질을 2021/234550 ?01/162021/054235 항체를 이용하여 면역 블랏팅으로 분석하였다. 도 8은 재조합 NCL에 대한 AGM-330의 친화도를 SPR에 의해 평가한 결과로, 竹로 표시되었다. 표시된 SPR 센서 그램은 유사한 결과를 가진 서로 다른 센서 칩을 사용하는 세 가지 개별 실험 세트를 대표하는 실험에서 가져온 실험 결과이다. 재조합 NCL은 CM5 센서 칩에 고정되었다. 다양한 농도의 AGM- 330(20nM-2.5MM)을 고정된 NCL과 함께 배양하고 Biacore T-200 장치에서 분석하였다. 도 9는 biotin pull-down 분석에 의한 AGM-330과 정제된 NCL 간의 직접적인 상호작용 분석 결과로, 용출된 단백질의 면역 블랏팅 분석은 항- NCL 항체를 사용하여 biotin pull-down을 형성한다. Lane 1: protein marker; Lane 2: input of purified NCL; Lane 3: flow through after incubated with AGM-330-biotin; Lane 4- 6: bead washing fraction; Lane 7-8: elution of AGM-330 binding proteins. 화살표는 NCL의 존재를 의미한다. 도 10은 AGM-330과 변이체들의 타 JSA에 대한 친화도 시험이다. 암 세포 (1 x 104 cell s/well)를 96-well plates에 시딩하고, 24시간 동안 배양한 후, 세포를 2시간 동안 증가하는 농도의 biotin이 연결된 13종 펩타이드로 처리하였다. 그 후, 고친화성 avidin-biotin 상호작용을 통해 avidin-HRP를 부착하고, HRP 효소를 통해 TMB 기질을 파란색으로 전환시켰다. 그리고 산을 첨가하여 반응을 종결 시키고, 450mm에서 웰을 판독하여 13종의 친화도를 EUSA로 평가하였다. 도 11은 in vitro 및 in i//i/o AGM-330의 결합 특이성을 나타낸 것이다. 2021/234550 ?01/162021/054235 도 11A 및 도 11 B는 다수의 암 및 정상 세포의 형광 공초점 현미경 관찰 결과로, MCF-10A, MCF-7, MDA-MB-231（도 11A） 또는 CCD-18Co, HT-29, HCT- 116（도 11 B） 세포를 37°C에서 30분 동안 5jjmol/l AGM-330-FITC와 함께 배양하였으며, NCL은 1차 항- NCL 항체로 염색되었고, AGM-330과 NCL의 결합은 Alexa Fluor 594에 연결된 항-마우스 2차 항체를 사용하여 밝혀졌으며, 세포는 4% paraformaldehyde로 고정되었고, 핵은 DAPI로 염색되었다. Merge는 DAPI에 의한 AGM-330-FITC, NCL 및 핵 염색을 나타내며, AGM-330-FITC는 FITC- conjugated AGM-330, Scale bar는 20[jm이다. 도 11C는 다양한 준세포분획에서의 NCL 분포를 MCF-10A, MCF-7 및 MDA-MB-231 세포에서 분석한 결과로, 항- NCL 항체를 사용하여 혈장 막, 세포기질 및 핵 NCL을 면역 블랏팅하였다. 도 11 D는 siRNA을 이용한 NCL의 knockdown에 의해 세포막에 대한 AGM-330의 결합이 억제됨을 나타낸 것으로, MDA-MB-231 세포를 48시간 동안 형질주입시킨 후, 5Mmol/l의 AGM-330-FITC를 2시간 동안 첨가하였으며, 세포를 PBS로 2회 세척하고 , 4% paraformaldehyde로 고정시켰다. 형광 공초점 현미경을 사용하여 형광을 관찰하였으며 AGM-330-FITC는 FITC-conjugated AGM-330, Scale bar는 20jjm이다. 도 11 E는 다양한 준세포분획에서의 NCL 분포를 siNCLI 처리 후 MCF-10A, MCF-7 및 MDA-MB-231 세포에서 분석한 결과로, 혈장 막, 세포기질 및 핵 NCL을 항- NCL 항체를 사용하여 면역 블랏팅하였다. 도 11 F는 실험 프로토콜의 모식도를 나타낸 것으로, 마취된 6주령 수컷 NPGä 마우스의 유선 지방 패드에 1:1 mix of Matrigel 및 1 x 106 MDA-MB-231 -luc 세포를 접종하였으며, 종양 세포 접종 후, 종양 부피가 대략 100mm3에 도달하였을 때, free Alexa680 또는 AGM-330-Alexa680을 꼬리 정맥에 주사하였다. 도 11G 및 도 2021/234550 ?01/162021/054235
11 H는 MDA-MB-231 -luc tumor-bearing 마우스에서 10nmol free Alexa680（도 11G） 또는 10nmol AGM-330-Alexa680（도 11 H）의 정맥 주사 후 30분, 1시간,
6시간 및 24시간의 in vivo 형광 이미지를 나타낸 것으로, 심장, 비장, 폐, 뇌, 간, 신장 및 종양을 포함한 주요 기관의 형광 이미지는 상이한 처리로 마우스에서 제거되었으며, AGM-330-FITC는 FITC-conjugated AGM-330이다. 도 111 및 도 11J는 종양（도 111） 및 다른 기관（도 11·））에서 3마리 동물의 라이브 이미징으로부터 Alexa680-연관 형광의 평균 복사 효율을 나타낸 그래프로, 막대 그래프는 평균 土 SD를 나타내며 one-way ANOVA with Dunnett's multiple comparison으로 통계 분석을 수행하였다. *, ** 및 ***는 각각 P < 0.05, P < 0.01 및 /7 < 0.001을 나타낸다. 도 12는 막 및 세포질 추출물에서 NCL 발현을 확인한 결과이다. MDA-MB- 231 세포를 비-표적 scrambled siRNA（Scr） 또는 NCL 표적 siNCLI, siNCL2 또는 siNCL3으로 형질감염시키고, 24시간 후, 유전자 침묵 효율은 실시간 PCR에 의해 결정되었다. mRNA 수준에 기초할 때, siNCl_1이 표적 유전자 knockdown에서 현저한 효율을 나타내었기 때문에 추가 실험을 위해 선택되었다. 막대 그래프는 평균 土 SD를 나타내며, one-way ANOVA with Dunnett's multiple comparison으로 통계 분석을 수행하였다. *, ** 및 ***는 각각 P < 0.05, P < 0.01 및 /7 < 0.001을 나타낸다. 도 13은 유방암 및 결장직장암에서 NCL의 발현 프로파일 및 기능적 연구 결과를 나타낸 것이다. 도 13A는 Curtis dataset 및 Alon dataset에서 관찰된 종양 발생 유방 암종 2021/234550 ?01/162021/054235 또는 결장직장 선암종 환자와
Figure imgf000015_0001
사이의 유의한 상관관계를 나타낸 것으로, Oncomine dataset repository（www.oncomine.org）를 이용하였다. 도 13B는 2개의 독립적인 cohorts（Bertucci and Sveen）에서 NCL 발현에 기초한 유방암 및 결장직장암 환자에서 수행된 Kaplan-Meier 생존 분석 결과이다. 도 13C 및 도 13D는 정상 조직（도 13C） 및 암 조직（도 13D）에서 NCL에 대한 면역 조직 화학（immunohistochemistry; IHC） 분석 결과로, Scale bar는 100|jm이다. 도 13E-도 13H는 암 세포 및 정상 세포를 24시간 동안 무혈청 배지에서 지시된 양의 항- NCL 항체 또는 IgG로 처리한 후의 세포 생존력을 나타낸 결과로, MCF- 10A（도 13E）, MDA-MB-231（도 13F）, CCD-18Co（도 13G） 및 HCT-116（도 1引 H）의 세포 생존력을 WST 분석으로 측정하였으며, 사멸세포（apoptotic cells）는 Annexin V+ 세포를 염색함으로써 가시화되었다. 세포를 항- NCL 항체로 중화시키고 24시간 동안 무혈청 배지에서 배양하였으며, 사멸세포는 FACS 분석에 의해 측정되었다（도 131）. 막대 그래프는 평균 ± SD룰 나타내며, one-way AN OVA with Dunnett's multiple comparison으로 통계 분석을 수행하였다. *, ** 및 ***는 각각 P < 0.05, P < 0.01 및 /7 < 0.001을 나타낸다. 도 14는 AGM-330t-PTX의 in vivo 종양억제 효능을 나타낸 것이다. 도 HA는 다수의 유방암 및 결장직장암 세포와 정상 세포에서 WST 검정에 의해 48시간 동안 결정된, AGM-330t-PTX 처리에 의한 증식 억제 결과를 나타낸 것이다. 도 MB는 실험 프로토콜의 모식도로, 마취된 6주령 수컷 NPG 마우스의 유선 지방 패드에 1:1 mix of Matrigel 및 1X106 MDA-MB-231-luc를 접종하고, 원발성 종양（primary tumor）의 부피가 대략 100mm3에 도달하면, tumor-bearing 2021/234550 ?01/162021/054235 마우스를 vehicle(PBS), AGM-330t(16.68mg/kg), PTX(2mg/kg or 10mg/kg, respectively), AGM-330t-PTX(19.05mg/kg) {n = 6/group)로 처리하였다. 도 14C-도 14E는 유방암 이종이식 모델에서 평가된 AGM-330t-PTX 처리 효과를 나타낸 결과로, 도 14C는 희생일까지 일주일에 두 번 측정된 원발성 종양 부피를 나타낸 것으로, 부표 |(mm3) = (길이 (mm)) x (너비 (mm))2 X 0.5의 계산식에 의해 계산되었다. 도 14D는 희생 당일, 모든 원발성 종양을 분리한 것을 나타낸 것이고, 도 14E는 원발성 종양 중량을 평가한 결과이다. 도 14F-도 141는 Ki-67(도 14F, 도 14H) 및 TUN타 _ (도 14G, 도 141) 염색을 이용한 대표적인 종양의 면역 조직 화학 섹션을 나타낸 것으로, 핵은 DAPI(blue)로 염색되었고, Scale bar는 50[jm이다. 막대 그래프는 평균 ± SD를 나타내며, one-way ANOVA wH:h Dunnett's multiple comparison으로 통계 분석을 수행했다. *, ** 및 ***는 각각 p < 0.05, P < 0.01 및 /7 < 0.001을 나타낸다. 도 15는 AGM-330t의 암 특이성에 의한 PTX의 효능 향상을 확인한 결과이다. 심장 천공에 의한 isoflurane-induced deep 마취 하에 이종이식된 마우스로부터 혈액을 수집하였으며 , 4°C에서 혈액 응고를 허용한 후, 4°C에서 10분 동안 3000rpm으로 원심분리하여 혈청을 수집하였다. 혈청에서 ALB (도 15A), GOT (도 15B), GPT (도 15C), TP-PS (도 15D) 및 UA (도 15E) 수준의 분석은 제조사의 프로토콜에 따라 veterinary hematology analyzer(Fuji DRI-Chem 3500 s, Fujifilm, Tokyo, Japan)를 사용하여 수행되었다. ALB: albumin; GOT: glutamic oxaloacetic transaminase; GTP: glutamate pyruvate transaminase; TP-PS: total protein/protein scan; UA: uric acid. 도 15F는 3주간의 상이한 처리 후 이종이식 마우스에 체중 2021/234550 ?01/162021/054235 변화를 나타낸 것이다. 막대 그래프는 평균 ± SD를 나타내며, one-way ANOVA with Dunnett's multiple comparison으로 통계 분석을 수행하였다. *, ** 및 ***는 각각 P < 0.05, P < 0.01 및 /7 < 0.001을 나타낸다. 도 16은 AGM-330d-PTX를 이용한 항암 효과 확인 결과로, 도 16A는 PTX conjugated AGM-330d의 구조를 나타낸 것이다. 도 16B는 실험 프로토콜의 모식도로, 마취된 6주령 수컷 NPG 마우스의 유선 지방 패드에 1:1 mix of matrigel and 1 X 106 MDA-MB-231-luc 세포를 접종하였으며, MDA-MB-231-luc 세포 종양을 갖는 마우스는 vehicle(PBS), AGM-330d(8.34mg/kg), PTX(2mg/kg or 10mg/kg, respectively), AGM-330d-PTX(10.71 mg/kg) {n = 6/group)로 처리되었다. 도 16C, 16D는 whole-body bioluminescence imaging을 통한 종양 성장 모니터링 결과로, firefly luciferase를 발현하는 growing MDA-MB-231 세포를 마우스의 유선 지방 패드에 주사 하였다. AGM-330d-PTX의 치료 효과는 bioluminescence imaging에 의해 평가되었으며 (도 16C), 5개의 상이한 마우스 그룹에서 5일마다의 bioluminescence 강도를 나타냈다 (도 16D). 도 16E-도 16G는 유방암 이종이식 모델에서 AGM-330d-PTX 처리의 치료 효과를 평가한 결과로, 희생 당일, 모든 원발성 종양을 분리하고 부피를 평가하였으며 (도 16E-도 16F), 원발성 종양 중량은 희생일까지 주당 2회 측정되었다 (도 16G). 원발성 종양 부피는 다음의 공식으로 계산되었다: 부표 |(mm3) = (길이 (mm)) x (너비 (mm))2 X 0.5. 도 16H는 이종이식 마우스에서 지시된 3주간의 상이한 처리 후 체중 변화를 나타낸 그래프이다. 막대 그래프는 평균 ± SD를 나타내며, one-way ANOVA wi仕 1 Dunnett's multiple comparison으로 통계 분석을 수행하였고, *, ** 및 ***는 각각 2021/234550 ?01/162021/054235
P < 0.05, P < 0.01 및 /7 < 0.001을 나타낸다. 도 17은 AGM-330t-mCPP 융합 펩타이드의 합성 과정을 나타낸 도면이다. 도 18은 AGM-330t-mCPP 융합 펩타이드와 AGM-330t 및 maleimide-CPP의 HPLC 및 MS 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 19는 AGM-330t, mCPP 및 AGM-330t-mCPP 융합 펩타이드의 세포독성 효과를 나타낸 그래프이다. 도 20은 AGM-330t, mCPP 및 AGM-330t-mCPP 융합 펩타이드에 의한 세포사멸 효과를 나타낸 것으로, 사멸세포는 FACS 분석에 의해 측정되었다. 막대 그래프는 평균 土 SD를 나타내며, one-way ANOVA with Dunnett's multiple comparison으로 통계 분석을 수행하였다. ***는 P < 0.001을 나타내고, NS는 Not Significant를 의미한다. 도 21은 AGM-330t-mCPP 융합 펩타이드의 농도별 아포토시스 유도 효과를 나타낸 도면이다. 도 22는 AGM-330m-mCPR AGM-330d-dCPP 및 AGM-330t-tCPP 융합 펩타이드의 농도별 세포독성 효과를 나타낸 그래프이다. 도 23은 AGM-330m와 AGM-330m-mCPR AGM-330d와 AGM-330d-dCPP 및 AGM-330t와 AGM-330t-tCPP 각각의 조합의 농도별 세포독성 효과를 나타낸 그래프이다. 2021/234550 ?01/162021/054235 발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예 다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다. 본 발명은 일 관점에서,
（3） 서열번호 1 내지 서열번호 8 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열; 및 （비 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에서 0） 1\1-말단으로부터 5번째 메티오닌 잔기의 치환;
00 1\1-말단으로부터 7번째 타이로신 잔기의 치환; 및 （매 말단에 류신 또는 라이신 잔기의 삽입; 으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 변이를 포함하는 아미노산 서열; 로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 뉴클레
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특이적으로 결합하는 펩타이드에 관한 것이다. 기능적이고 구체적으로 종양을 표적할 수 있는 펩타이드 리간드의 발견은 암 진단 및 치료에 새로운 기회를 제공한다. 그러나, 펩타이드 리간드의 사용은 2021/234550 ?01/162021/054235 그들의 짧은 생물학적 반감기 때문에 크게 제한되어왔다. 본 발명에서는, 다중-항원-핃!타이드 (multiple-antigen-peptide; MAP) 합성 방법과 함께 OBOC(one-bead-one-compound) 조합 방법을 사용하여 2, 600, 000개의 펩타이드 라이브러리를 합성한 후, 이로부터 표 1에 기재된 아미노산 서열을 가지는 새로운 암-특이적 펩타이드 리간드인 AGM-330, AGM- 331, AGM-332, AGM-333, AGM-334, AGM-335, AGM-336, AGM-337을 동정하였으며 (도 3 참조), 세포 결합 분석, 유세포 분석 및 형광 공초점 현미경을 이용하여 시험관 LHC//? vitro) 및 생체 내 (切 1//1/功에서 상기 펩타이드 리간드들이 암 세포에 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다. 또한, pull-down 분석 및 LC-MS/MS 분석을 통해 막 뉴클레오린 (nucleolin; NCL)이 AGM-330, AGM-331, AGM-332, AGM-333, AGM-334, AGM-335, AGM-336, AGM-337 의 표적 단백질임을 확인하였으며, 파클리탁셀 (paclitaxel; PTX)과 상기 AGM-330 등의 접합체를 처리할 경우, PTX 단독 처리에 비해 암 성장을 극적으로 억제시키는 것을 확인하였다.
【표 11
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2021/234550 ?01/162021/054235
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상기 8개의 펩타이드 중 3개 IV! -330, IV! -331 및 61\/1-332）는 유방암 세포주（1\/10/\-1\/ -231）에 대해 강하고 특이적이며, 우선적인 결합을 나타냈으며,
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결합하지 않거나, 약하게 결합하였다（도 4 및 도 48 참조 또한, 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 61\/1-330에서 일부 아미노산 잔기의 변이를 가질 경우에도 여전히 뉴클레오린에 대한 강하고 특이적인 결합 특성을 유지하는 것을 확인하였다. 구체적으로 본 발명에 있어서, 상기 아미노산 변이는 서열번호 1의 아미노산 서열에서, 2021/234550 ?01/162021/054235
0） 1\1-말단으로부터 5번째 메티오닌 잔기의 치환;
00 1\1-말단으로부터 7번째 타이로신 잔기의 치환; 및 말단에 류신 또는 라이신 잔기의 삽입; 으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 변이일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 상기 아미노산 변이는 서열번호 1의 아미노산 서열에서,
（|） 1\1-말단으로부터 5번째 메티오닌^ 비이^리 잔기의 류신（ᅵ애 !^） 또는 노르루신巾아 니 ）으로의 치환;
00 1\1-말단으로부터 7번째 타이로신（ 0 ） 잔기의 페닐알라닌（|3|1611 1311||16）으로의 치환; 및
（|||）（I -말단에 류신（ᅵ611（：||16） 및 라이신（1 116） 잔기의 삽입; 으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 변이일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에 있어서, 상기 변이를 포함하는 아미노산 서열은 서열번호 9 내지 서열번호 15 및 서열번호 20으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다（표 2）.
【표 2】 2021/234550 ?01/162021/054235
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상기 서열번호 13의 아미노산 서열에서, "는 1\1이½1^ 을 의미한다. 본 발명에 있어 7^ IV! ", 7^ IV! 펩타이드" 또는 "AGM 펩타이드 리간드"는 상기 서열번호 1 내지 서열번호 20로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 가지는 펩타이드를 통칭하거나, 그 중에서 하나 이상의 펩타이드를 의미한다. 2021/234550 ?01/162021/054235 본 발명에 있어서,
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이드는 뉴클레오린 이 ⑴ 에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 할 수 있다. 이전의 연구에 따르면, 은 주로 정상 세포의 핵에 국부적으로 존재함에도 불구하고, 상이한 유형의 암 세포에서 막 孔의 강한 과발현을 보여주었다（ 에 1\1, 31. 0%야3 . 2014; 5: 5494-509）. 이러한 연구들과 함께 본 발명에서는, !_이 활발하게 증식하는 암 세포의 막에서는 과발현되지만, 정상 세포에서는 과발현되지 않음을 입증하였다. 따라서 을 표적으로 하는 분자는 부작용을 최소화하면서 약물을 종양으로 선택적으로 전달하기 위한 효과적인 접근법을 제공할
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81. （!이11111니11. 2017; 8: 139（》. 또한, 본 발명에서는 특정 항체로의 중화를 통해 암 세포에 대한 막 |\!0_의 역할을 입증했다. 예상된 바와 같이, 아포토시스（3|30야0企） 속도가 증가한 후, 항체-매개 !_ 중화가 이어졌다（도 13」）. 결론적으로, 은 암 치료를 위한 이상적인 치료적 마커이며,
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광범위한 인간 암의 진단 및 치료를 위한 도구로서 큰 잠재력을 가지고 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 61\/1 펩타이드, 구체적으로 61\/1-330은 암 세포에 특이적으로 결합하지만, 정상 유방 및 결장직장 세포에는 약하게 또는 전혀 결합되지 않았다. 이러한 결과는
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펩타이드가 암에 특이적임을 시사하고, 암-표적화 펩타이드의 개발을 위한 주요 후보가 되게 한다. 특히, 마우스 이종이식 연구에서, 61\/1 펩타이드 처리는 심장, 비장, 폐 또는 뇌보다 종양에서 2021/234550 ?01/162021/054235 더 많은 축적을 보여주었다. 암 세포에
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이드의 특이적 표적화 능력은 암 진단을 위한 잠재적 분자 도구가 될 수 있음을 의미한다. 또한 본 발명은 상기 AGM 펩타이드와 - [CH2-CH2-0]-°| 구조를 갖는 에틸렌 글리콜기 (ethylene glycol group)를 2개 이상 포함하는 폴리에틸렌 글리콜 (polyethylene glycol, PEG) 쇄 (chain)가 접합된 AGM 핃!타이드- PEG 접합체에 대한 것이다. 본 발명에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜 쇄는 화학식 1의 구조를 가지는 일반적인 폴리에틸렌 글리콜 쇄 뿐 아니라, 이의 유도체 (derivatives)를 모두 포함하는 개념으로 사용되며, 폴리에틸렌 글리콜 쇄의 유도체로는 화학식 2의 구조를 가지는 아미노 폴리에틸렌 글리콜 카르복실산 (amino polyethylene glycol carboxylic acid)이 예시될 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.
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화학식 1 화학식 2
(Polyethylene glyco!) (Amino Po!yethyiene glycoi Carboxylic acid) 폴리에틸렌
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컨쥬게이
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치료용 단백질의 약리학적 특성을 개선하기 위해 널리 사용되어왔다 (6니야3 \4 2021/234550 ?01/162021/054235 al. J Cell Commun Signal. 2019; 13: 319-3C0. 본 발명에서, 입체 장애를 줄이고 친수성을 증가시키기 우 I해, PEGylation을 사용했다. 그러나, PEG는 면역원성 때문에, 치료 분자에 부정적인 임상적 영향을 미친다（Moreno A, et al. Cell Chem. Biol. 2019; 26: 634-44.e¾. 이전의 연구는 PEGylation된 분자에 대한 항- PEG 면역 반응이 PEGylation 정도의 면역원성과 PEG의 분자량에 의존한다는 것을 天 11안했다（Wan X, et al. Process Biochem. 2017; 52: 183-9”. 본 발명에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜 쇄는 2 내지 24개의 에틸렌 글리콜 단위를 갖는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 4 내지 20개, 더욱 바람직하게는 6 내지 18개, 가장 바람직하게는 6 내지 12개의 에틸렌 글리콜 단위를 갖는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 폴리에틸렌
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이드와 링커를 통해 연결되는 것을 특징으로 할 수 있다. 이에 따라 61\/1 펩타이드- 드 접합체는 다음 구조식 1의 형태를 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 6!\/1 -니 - 드 （구조식 1） 상기 구조식
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폴리에틸렌 글리콜 쇄를 의미하며, 니은 링커를 의미한다. 상기 링커 니은 바람직하게는 단일 결합（직접 결합）, -知。알킬, -知0 2021/234550 ?01/162021/054235 알킬렌, 및 -0 -로 구성된 군에서 선택될 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니며,
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이드의 （:-말단 아미노산의 카르복시 그룹과 함께 -〔（ - 의 형태를 이루는
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포함할 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 구조식 1의 61\/1 펩타이드- 드 접합체 중에 61\/1과 결합하고 있는 드 에 다른 쪽 말단에는 다른 물질, 바람직하게는 약물（ 니이을 접합시키기 위한 기능기（九11<：1：1이131아0니|3）가도입될 수 있다. 이러한 기능기에는 카르복실 00비, 아민（1\11 ） 및 티올（比1이） 기 등이 예시될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 예시적으로 구조식 2 내지 구조식 4와 같이 61\/1 펩타이드- 드 접합체 중에 61\/1 펩타이드와 결합하고 있는 드 의 다른 쪽 말단에 아민（1\1버）을 가지는 라이신 및/또는 티올기를 가지는
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접합된 형태일 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 61\/1 -니- £（3-1< （구조식 2） 61\/1-니中£（3-〔 （구조식 3） 61\/1 -니- £（3-1<-〔 （구조식 4） 예시적으로, 본 발명의 일 실시예에서, 61\/1 펩타이드 중에서 61\/1-300과 ¬드（3의 접합체인 61\/1-330 - 드 접합체의 61\/1과 결합하고 있는 £（3의 다른 쪽 2021/234550 ?01/162021/054235 말단에 라이신과 시스테인이 도입된 01\/1-330 171이1이11아（ 01\/||11）는 구조식 5와 같은 형태일 수 있다.
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（구조식 5） 상기 구조식 5에서, £（3는 61\/1-330（；-말단의 라이신（1＜）의 카르복시 그룹과 아민이 축합반응을 통해 구조식 6과 같은 형태의 펩타이드 결합을 포함하는 링커（내에 의해 연결된 형태일 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.
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（구조식 6） 본 발명은 다른 관점에서, 상기 61\/1 펩타이드 또는 61\/1 펩타이드- 드 접합체오ᅡ, 약물（바니 을 포함하는 61\/1 펩타이드-약물 접합체 0머니9 이 또는 01\/1 핃!타이드- 드（3 -약물 접합체（（：011」119 6）에 관한 것이다. 본 발명에 있어서, 상기 약물은 약리학적 효과를 나타내는 제제로, 구체적으로 화학요법제, 독소, 마이크로 ［ （ ［이\1/\）, ［신\1/\,北［시\1/\, 또는 방사성 동위원소일 수 있다. 상기 화학요법제는 예를 들어, 세포독성 제제 또는 면역억제제일 수 있다. 구체적으로 마이크로투불린 억제제, 유사분열 억제제, 토포이소머라아제 억제제, 또는 디 인터컬레이터로서 기능할 수 있는 화학요법제를 포함할 수 2021/234550 ?01/162021/054235 있다. 또한, 면역조절 화합물, 항암제 및 항바이러스제, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 바람직하게는 상기 약물은 항암제 (anti-cancer agent)일 수 있으며, 상기 항암제는 파클리탁셀 (paclitaxel) 또는 도세탁셀 (docetaxel) 등의 탁솔 (taxol) 및 탁산, 마이탄시노이드, 오리스타틴, 아미노프테린, 악티노마이신, 블레오마이신, 탈리소마이신, 캄프토쎄신, N8 -아세틸 스퍼미딘, 1-(2 클로로에틸)- 1,2 -다이메틸 술포닐 하이드라자이드, 에스퍼라마이신, 에토포사이드, 6 -머캅토퓨린, 돌라스타틴, 트리코테센, 칼리케아미신, 메토트렉세이트, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 A, 미토마이신 C, 클로람부실, 듀오카마이신, L- 아스파라기나제 (L-asparaginase), 머캡토퓨린 (mercaptopurine), 티오구아닌 (thioguanine), 하이드륵시우레아 (hydroxyurea), 시타라빈 (cytarabine), 사이클로포스파미드 (cyclophosphamide), 이포스파미드 (ifosfamide), 니트로소우레아 (nitrosourea), 시스플라틴 (cisplatin), 카보플라틴 (carboplatin), 미토마이신 (mitomycin), 다카바진 (dacarbazine), 프로카바진 (procarbazine), 토포테칸 (topotecan), 질소 머스터드 (nitrogen mustard), 사이톡산 (cytoxan), 알파- 아마니틴, 에토포시드 (etoposide), 5 -플루오로우라실 (5-fluorouracil), CNU(bischloroethyl nitrosourea), 이리노테칸 (irinotecan), 캄포토테신 (campto仕 lecin), 블레오마이신 (bleomycin), 이다루비신 (idarubicin), 다우노루비신 (daunorubicin), 닥티노마이신 (dactinomycin), 플리카마이신 (plicamycin), 미톡산트론 (mitoxantrone), 아스파라기나제 (asparaginase), 비노렐빈 (vinorelbine), 클로로람부실 (chlorambucil), 2021/234550 ?01/162021/054235 멜파란 (melphalan), 피롤로벤조디아제 ¾ 카르무스틴 (carmustine), 로무스틴 (lomustine), 부설판 (busuLfan), 트레오설판 (treosulfan), 데카바진 (decarbazine), 에토포시드 (etoposide), 테니포시드 (teniposide), 토포테칸 (topotecan), 9 -아미노캠프토테신 (9-aminocamptothecin), 크리스나톨 (crisnatol), 미토마이신 C(mitomycin C), 트리메트렉세이트 (trimetrexate), 마이코페놀산 (mycophenoHc acid), 티아조퓨린 (tiazofurin), 리바비린 (ribavirin), EICAR(5-ethynyl-1 -beta-Dribofuranosylimidazole-4-carboxamide), 하이드륵시우레아 (hydroxyurea), 데프륵사민 (deferoxamine), 플룩수리딘 (floxuridine), 독시플루리딘 (doxifluridine), 랄티트렉세드 (raltitrexed), 시타라빈 (cytarabine(ara C)), 시토신 아라비노시드 (cytosine arabinoside), 플루다·라·빈 (fludarabine), 드卜목시펜 (tamoxifen), 리·륵시펜 (raloxifene), 메게스트롤 (megestrol), 고세렐린 (goserelin), 류프롤리드 아세 테이트 (leuprolide acetate), 플루타미드 (flutamide), 바이칼루타마이드 (bicalutamide), EB1089, CB1093, KH1060, 베르베린, 베르테포르핀 (verteporfin), 커큐민, 아브락세인, 폴피리녹스, 옥살리플라틴, 젤로다 및 인돌카르복스아미드, 프탈로시아닌 (phthalocyanine), 튜블리신, 광감작제 Pe4(photosensitizer Pe4), 데메톡시-하이포크레린 A(demethoxy-hypocrellin A), 인터페론 -a(lnterferon-a), 인터페론 -Y(lnterferon-Y), 종양 괴사 인자 (tumor necrosis factor), 겜사이타빈 (Gemcitabine), 벨케이드 (velcade), 레발미드 (revamid), 탈라미드 (thalamid), 로바스타틴 (lovastatin),
1 -메틸- 4 -페닐피리디늄이온 (1 -methyl -4-phenylpyridiniumion), 스타우로스포린 (staurosporine), 악티노마이신 D(actinomycin D), 닥티노마이신 (dactinomycin), 블레오마이신 A2(bleomycin A2), 블레오마이신 2021/234550 ?01/162021/054235
62（ᅵ3|601 （ 1182）, 페플로마이신（peplomycin）, 에피루비신（6 10止＞1（ 「1）, 피라루비신（|3^10止）1（：||1）, 조루비신（¥10止＞ 11）, 마이토산트론（17111:0X311110116）, 베라파밀（verapamil）, 탑시가르긴
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핵산 분해 효소 및 세균이나 동식물 유래의 독소로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서, 인간 유방암 이종이식 마우스 모델에서 6 -330 - ）（ 61\/1-330 - 드 접합체와 파클리탁셀（ 지을 접합시킨 접합체）를 처리한 경우, ）（ -처리군과 비교하여 종양의 부피 및 중량의 60% 및 46% 감소를 나타냈다（도 14〔 내지 도 14드 참조 암 세포 및 조직에 대한 6 -330의 효율적인 표적화 능력은 암 치료를 위한 항암제 전달에 있어 유망한 방법을 제공한다. 파클리탁셀（ 〔^3X61;［可지은 가장 유망한 암 화학요법 약물 중 하나로 여겨지며, 많은 상이한 인간 악성 종양에 대해 테스트되
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8비3미〔 Expert 0미
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2004; 5: 1771-80）. 그러나 ［「） á로 치료하는 데에는 ）（의 높은 소수성 및 이의 제형 관련 어려움으로 인해 제한이 있다. 또한, 치료와 관련된 많은 부작용은 제제화에 사용되는 희석 용매에 기인한다（卜! 6111161 61거:［（!_,（30 11〔1311
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011001. 2006; 17: 735-49）. 그러나, ）（와 달리, 61\/1 펩타이드, 특히 61\/1 펩타이드- 드 접합체와 접합된 ）（는 매우 친수성인 특성을 나타낸다. 이러한 친수성은 약물동력학적 프로파일을 개선시키고, 소량의 독성 희석 버퍼의 사용을 가능하게 하여, 화학요법의 일반적인 독성을 추가로 감소시킬 수 있다. 6!\/1 펩타이드를 이용하여 표적화된 2021/234550 ?01/162021/054235 전달을 통해 독성 등의 부작용을 감소시킬 수 있을 뿐 아니라, 치료효과를 현저하게 제고할 수 있는 장점이 있다. 본 발명에 있어서, 상기 61\/1 핃!타이드 또는 61\/1 핃!타이드- 드 접합체는 약물, 바람직하게는 항암제와 링커（니）를 통해 연결되거나 또는 직접 연결되는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 링커（니）는 절단성 일 수 있다. 상기 절단성 링커（니）는 세포내 조건에서 절단 가능한 형태 즉, 세포 내 환경에서 항체에서 약물이 링커의 절단을 통해 방출될 수 있도록 한다. 상기 링커（니）는 세포 내 환경 예를 들어 리소좀 또는 엔도좀에 존재하는 절단제에 의해 절단될 수 있으며, 예를 들어 세포 내 펩티다아제 또는 프로테아제 효소 예를 들어 리소좀 또는 엔도좀 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 펩타이드 링커일 수 있다. 일반적으로 펩타이드 링커는 적어도 2개 이상의 아미노산 길이를 가진다. 상기 절단제는 카텝신 6 및 카텝신 다 플라스민을 포함할 수 있으며, 펩타이드를 가수분해 하여 약물을 표적 세포 내로 방출할 수 있도록 한다. 상기 펩타이드 링커는 티올 의존성 프로테아제 카텝신- 8에 의해 절단될 수 있고, 이는 암 조직에서 과발현되며, 예를 들어 ᅡ - 1_애 또는（此/ - 근 - 1_애 -이 링커가 사용될 수 있다. 또한, 상기 펩타이드 링커는 예를 들어 세포 내 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 것으로, ▽3ᅵ-〔 링커이거나
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2021/234550 ?01/162021/054235 있다. 하나의 실시예에서, 상기 절단성 링커는 ᅣ）ᅡᅥ 민감성으로, 특정 ᅣ）ᅡᅥ 값에서 가수분해에 민감할 수 있다. 일반적으로, pH 민감성 링커는 산성 조건에서 가수분해될 수 있음을 나타낸다. 예를 들어, 리소좀에서 가수분해될 수 있는 산성 불안정 링커 예를 들어, 하이드라존, 세미카바존, 티오세미카바존, 시스-아코니틱 아마이드（（ -3（：이1 〔 3171 6）, 오르쏘에스테르, 아세탈, 케탈 등일 수 있다. 다른 실시예에서, 상기 링커는 환원 조건에서 절단될 수도 있으며, 예를 들어
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pyridyldithio）butyrate） 및 SMPT（N-succinimidyl-oxycarbonyl-alpha-methyl-alpha - （2 - pyridyl-dithio）toluene）를 사용하여 다양한 이황화 결합이 형성될 수 있다. 또한, 상기 링커는 예를 들어 비절단성 링커일 수 있으며, 항체 가수분해 한 단계만을 통해 약물이 방출되어, 예를 들어 아미노산-링커-약물 접합체를 생산한다. 이러한 유형의 링커는 티오에테르기 또는 말레이미도카프로일기如3ᅵ 0|0〔3|31^1）일 수 있고, 이에 의해 혈액 내 안정성을 유지할 수 있다. 경우에 따라서,
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이드,
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이드- £（3의 접합체는 약물, 바람직하게는 항암제와 비공유성 결합 또는 공유성 결합을 통해 직접 연결되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 2021/234550 ?01/162021/054235 상기 비공유성 결합은 예를 들어, 수소결합, 정전기적 상호작용, 소수성 상호작용, 반데르 발스 상호작용, 표ᅡ이-파이 상호작용 및 양이온-파이 상호작용으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 본 발명은 다른 관점에서, 상기 61\/1 펩타이드, 또는 61\/1 펩타이드- 드 접합체를 2개 이상 포함하는
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것이다. 본 발명에 있어서, 상기
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이드,
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펩타이드- 접합체를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 2 내지 6, 더욱 바람직하게는
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이드,
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이드- 드 접합체를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예시적으로 본 발명에 있어서, 상기 다량체 중 이량체 아）는 2개의 61\/1 펩타이드, 또는 61\/1 펩타이드- 드 접합체가 링커（1_2）에 의해 서로 연결되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 다량체 중 사량체 이아）는 상기 이량체가 추가적인 링커（1_3）에 의해 서로 연결되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 나아가, 육량체（1163111라）나 팔량체（0 3171아） 및 그 이상의 다량체도 유사한 형태로 연결될 수 있음은 통상의 기술자에게는 자명하다. 예시적으로 본 발명에 따른 61\/1 펩타이드- 드 접합체의 이량체 및 사량체는 구조식 7 및 구조식 8과 같은 형태를 가질 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다. 2021/234550 1^(:1^2021/054235
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(구조식 8) 상기 링커 L2 및 u는 서로 동일 또는 상이한 것일 수 있으며, 독립적으로 절단성 (cleavable) 또는 비절단성 (non-cleavable)일 수 있다. 상기 링커 U 및 U는 독립적으로 단일 결합 (직접 결합), 아미노산 또는 그 유도체 (derivatives), Q- C20 알킬, Q- C20 알킬렌, -S-, -NH- 및 -0- 로 구성된 군에서 선택될 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 아미노산 또는 그 유도체, 더욱 바람직하게는 2 이상의 아민기를 가지는 라이신 (Lys, K) 또는 아르기 닌 (Arg, R) 일 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다. 가장 바람직하게는 상기 링커 L2 및 U는 라이신 (Lys, K)이 사용될 수 있으며, 상기 라이신의 아민 그룹 (NH2)이 -C-CONH-와 같은 펩타이드 결합과 유사한 형태로 드 와 연결될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 2021/234550 ?01/162021/054235 또한, 상기 61\/1 펩타이드, 또는 61\/1 펩타이드- 드 접합체의 링커의 일 말단에는 다른 물질, 바람직하게는 약물（ ）을 접합시키기 위한 기능기（九11＜：미011 아0니|3）가 도입될 수 있다. 예를 들면, 상기 구조식 7에서의 1_2, 구조식 8에서의 1_3에 약물（ 119）을 접합시키기 위한 기능기（ 미:신아ᅵ 아011|3）가 도입될 수 있다. 이러한 기능기에는 아민（1\11 ） 및 티올（比 ） 기 등이 예시될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니며, 예시적으로 아민（1\11 ）을 가지는 라이신 0^ , 및/또는 티올기를 가지는 시스테인（〔 근,幻이 도입된 형태일 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 예시적으로 본 발명의 일 실시예에서, 61\/1-330비미61 \/1-33001） 및 61\/1- 330 1근113111라（ 01\/1-3301:）는 하기 표 3과 같은 구조를 가질 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.
【표 3】
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2021/234550 1^(:1^2021/054235
Figure imgf000037_0001
본 발명의 일 실시예에서, AGM-330d-PTX를 사용하여 항암 효능을 시험하였다（도 16A）. 그 결고 K AGM-330d-PTX-처리 마우스는 PTX-처리 마우스와 비교하여 luciferase 활성의 극적인 감소를 보여주었다（도 16C-D）. 또한, AGM- 2021/234550 ?01/162021/054235
33애- 처리는 ）（ -처리군과 비교하여, 종양의 부피 및 중량이 현저하게 감소되었다（도 16 （3）. 61\/1-33아 ）（와 동일하게, 마우스 체중은 ▽ 6 8¾ 투여와 비교하여 61\/1-33001- 투여에 의해 영향을 받지 않았다（도 16비. 61\/1-33애의 암 특이성은 ）（의 효능을 향상시켜, 종양 조직에서 치료 약물의 농도를 증가시킬 수 있다. 본 발명은 또 다른 관점에서, 61\/1 펩타이드- 드 접합체를 2개 이상 포함하는 다량체（1111||미111아）와 약물, 바람직하게는 항암제（ 신 미:라 으에!:）를 포함하는 다량체-약물 접합체（«때 ）에 관한 것이다. 본 발명에 있어서, 다량체-약물 접합체는
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이드-약물 접합체 또는 61\/1 펩타이드- 드（］ -약물 접합체에 관한 설명이 준용될 수 있으며, 이에 따라 각 링커나 약물 등은 앞서 61\/1 펩타이드-약물 접합체 또는 61\/1 펩타이드- 드 약물 접합체에서의 정의와 동일하게 해석된다. 본 발명은 또 다른 관점에서, AGM 펩타이드- PEG 접합체오ᅡ, 세포투과성 핃!타이드（Cell Penetrating Peptide; CPP）가 결합된 AGM 핃!타이드- PEG-CPP 융합 펩타이드에 관한 것이다. 본 발명에서 용어, "세포투과성 핃!타이드（Cell Penetrating Peptide; CPP）"는 일종의 신호 핃!타이드（signal peptide）로서 단백질, DNA, RNA 등과 같은 고분자 물질을 세포 내로 전달하고자 하는 목적으로 사용되는 특정 아미노산 서열의 2021/234550 ?01/162021/054235 조합인 펩타이드이다. 현재까지 다양한 저분자 화합물, 단백질, 펩타이드, ［小1/\, 디 등 고분자 물질의 세포 내 전달을 위해 이용되고 있다. 세포투과성 핃!타이드 대부분 단백질-투과 도메인（|31 11-1131150|11（：1：|011 선이 !!）이나 막-이동 시퀀스（1716111 3116113115|0〔31：||19 5근0|116미：6）로부터 유도되었으며, 일반적인 외부 물질의 세포 내 유입 경로와는 달리 세포막 손상을 주지 않으면서도 세포 내로 이동하고, 세포막을 통과하지 못하는 것으로 알려져 있는
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단백질까지도 세포 내로 전달시킬 수 있는 획기적인 역할을 할 것으로 기대되고 있다. 본 발명의 융합 펩타이드는 세포투과성 펩타이드를 이용하고 있으며, 상기 세포투과성 펩타이드는 세포 내재화 切 인 기전에 의해 세포 내로 들어가는 특징을 가지고 있는 것이라면 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 하기 표 4에 나열된 세포투과성 펩타이드 또는 이의 변이체로 구성된 군에서 선택하여 사용할 수 있다.
【표 4】
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더욱 바람직하게는, 상기 세포투과성 펩타이드는 하기 표 5에 나열된 세포투과성 펩타이드 또는 이의 변이체로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 하기 표 5의 펩타이드의 제조 및 특성은 한국등록특허 제 10- 1169030호를 참조할 수 있다. 가장 바람직하게는, 상기 세포투과성 펩타이드는 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
【표 5】
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본 발명의 일 실시예에서는 상기 표 5의 DS4-3 펩타이드로 표시된 서열번호 48의 세포투과성 펩타이드를 선택하여 실험을 수행하였으며, 상기 실제로 사용한 세포투과성 펩타이드 외에 다른 세포투과성 펩타이드를 본 발명의 펩타이드와 융합시킨 경우에도 본 발명과 유사한 효과가 나타남은 당업자에게 자명할 것이다. 본 발명에 있어서, 상기 AGM 펩타이드- PEG 접합체와 세포투과성 펩타이드는 링커를 통해 연결되는 것을 특징으로 할 수 있다. 바람직하게는 maleimide- carboxy bifunctional linker를 통해 연결되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명은 또 다른 관점에서, AGM 펩타이드- PEG 접합체를 2개 이상 포함하는 다량체 (multimer)와 세포투과성 핃!타이드 (Cell Penetrating Peptide; CPP)가 결합된 다량체- CPP 융합 펩타이드에 관한 것이다. 본 발명에 있어서, 다량체-〔 융합 펩타이드는 61\/1 펩타이드- 드 -〔 융합 2021/234550 ?01/162021/054235 펩타이드에 관한 설명이 준용될 수 있으며, 이에 따라 각 링커나 세포투과성 펩타이드 등은 앞서 61\/1 펩타이드- 드 - 융합 펩타이드에서의 정의와 동일하게 해석된다. 본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 61\/1 펩타이드, 61\/1 펩타이드- 드 접합체, 61\/1 펩타이드- 드(] -약물 접합체, 다량체, 다량체-약물 접합체, 61\/1 펩타이드- £(3 - 융합 펩타이드 또는 다량체- 융합 펩타이드를 포함하는 암 진단용 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 61\/1 펩타이드, 61\/1 펩타이드- 드 접합체, 61\/1 펩타이드- 드(] -약물 접합체, 다량체, 다량체-약물 접합체, 61\/1 펩타이드- 드 -〔 융합 펩타이드 또는 다량체-〔 융합 펩타이드를 이용한 암 진단방법에 관한 것이다. 본 발명은 또 다른 관점에서, 암 진단을 위한 상기 61\/1 핃!타이드, 61\/1 펩타이드- 드 접합체, 61\/1 펩타이드- 드 -약물 접합체, 다량체, 다량체-약물 접합체, 61\/1 펩타이드- £(3 - 융합 펩타이드 또는 다량체- 융합 펩타이드의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또 다른 관점에서, 암 진단용 약제 제조를 위한 상기 61\/1 펩타이드, 61\/1 펩타이드- 드 접합체, 61\/1 펩타이드- 드(] -약물 접합체, 다량체, 다량체-약물 접합체, 61\/1 펩타이드- £(3 -〔 융합 펩타이드 또는 다량체-〔 융합 펩타이드의 사용에 관한 것이다. 2021/234550 ?01/162021/054235 본 발명의 진단용 조성물을 이용하여 발병 여부 또는 발병 가능성을 예측할 수 암으로는 백혈병, 골수증식성질환, 림프종, 유방암, 간암, 위암, 난소암, 자궁경부암, 신경교종암, 대장암, 폐암, 췌장암, 전립선암, 간암, 위선암, 자궁암, 방광암, 갑상선암, 흑색종, 편평상피암, 조혈암, 신장암 및 두경부암 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 명세서에서, 용어 "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한 대상如 예의 감수성（ 5 야 1 을 판정하는 것, 대상이 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 대상의 예후吹0 0 ）（예컨대, 전-전이성 또는 전이성 암 상태의 동정, 암의 단계 결정 또는 치료에 대한 암의 반응성 결정）를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스（比아 （예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링하는 것）을 포함한다. 본 발명의 목적상, 상기 진단은 상기한 질환의 발병 여부 또는 발병 가능성（위험성）을 확인하는 것이다. 본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 61\/1 펩타이드, 61\/1 펩타이드- 드 접합체, 61\/1 펩타이드- 드（］ -약물 접합체, 다량체, 다량체-약물 접합체, 61\/1 펩타이드- £（3 - 융합 펩타이드 또는 다량체- 융합 펩타이드를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 61\/1 펩타이드, 61\/1 펩타이드- 드 접합체, 61\/1 펩타이드- 드（］ -약물 접합체, 다량체, 다량체-약물 접합체, 61\/1 펩타이드- 드 -〔 융합 펩타이드 또는 다량체-〔 융합 펩타이드를 대상체에 2021/234550 ?01/162021/054235 투여하는 단계를 포함하는 암 예방 또는 치료방법에 관한 것이다. 본 발명은 또 다른 관점에서, 암 예방 또는 치료를 위한 상기 61\/1 펩타이드, 61\/1 펩타이드- 드 접합체, 61\/1 펩타이드- 드 -약물 접합체, 다량체, 다량체- 약물 접합체, 61\/1 펩타이드- £(3 - 융합 펩타이드 또는 다량체- 융합 펩타이드의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또 다른 관점에서, 암 예방 또는 치료용 약제 제조를 위한 상기 61\/1 펩타이드, 61\/1 펩타이드- 드 접합체, 61\/1 펩타이드- £(3 -약물 접합체, 다량체, 다량체-약물 접합체,
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이드- 드 -〔 융합 펩타이드 또는 다량체- 융합 펩타이드의 사용에 관한 것이다. 본 발명의 조성물로 치료할 수 있는 암 또는 암종은 특별히 제한되지 않으며, 고형암 및 백혈병과 같은 뉴클레오린 관련 암일 수 있다. 이러한 암의 예로는 백혈병, 골수증식성질환, 림프종, 유방암, 간암, 위암, 난소암, 자궁경부암, 신경교종암, 대장암, 폐암, 췌장암, 전립선암, 간암, 위선암, 자궁암), 방광암, 갑상선암, 흑색종, 편평상피암, 조혈암 (hematopoietk cancers), 신장암 또는 두경부암 (head and neck cancers) 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 있어서, "암"과 "종양"은 동일한 의미로 사용되며, 전형적으로 조절되지 않은 세포 성장/증식을 특징으로 하는 포유동물의 생리학적 상태를 지칭하거나 의미한다. 본 발명에서, 용어 "예방"은, 상기 펩타이드 또는 접합체를 포함하는 조성물의 2021/234550 ?01/162021/054235 투여로 암을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 또한, 용어 "치료"는, 상기 61\/1 펩타이드, 61\/1 펩타이드- 드 접합체, 61\/1 펩타이드- £(3 -약물 접합체, 다량체, 다량체-약물 접합체, 61\/1 펩타이드- 드 -〔 융합 펩타이드 또는 다량체- 융합 펩타이드를 포함하는 조성물의 투여로 암의 증세가 호전되거나 완치되는 모든 행위를 의미한다. 본 발명에 따른 암 예방 또는 치료용 조성물은 약학적으로 유효한 양의 상기 61\/1 펩타이드, 61\/1 펩타이드- 드 접합체, 61\/1 펩타이드- £(3 -약물 접합체, 다량체, 다량체-약물 접합체,
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이드- 드 -〔 융합 펩타이드 또는 다량체-〔 융합 펩타이드를 단독으로 포함하거나, 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 암의 증상을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다. 상기 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 의미한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비 닐피롤리돈, 물, 메틸하이드륵시벤조에이트, 프로필하이드륵시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는
Remington 's Pharmaceutical Science 、 19th ed 1995)에 상세히 기天 H도 I어 있다. 2021/234550 ?01/162021/054235 또한, 본 발명의 조성물은 61\/1 펩타이드, 61\/1 펩타이드- 드 접합체, 61\/1 펩타이드- 드 -약물 접합체, 다량체, 다량체-약물 접합체, 61\/1 펩타이드- 드 -〔 융합 펩타이드 또는 다량체- 융합 펩타이드와 함께 암 치료 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 인간을 제외한 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀전, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다. 본 발명의 조성물은 경구, 경표 |, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있고, 본 발명에 따른 암 예방 또는 치료용 조성물은 암의 증상을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다. 이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범우 I가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다. 실시예 1: 재료 및 방법 2021/234550 ?01/162021/054235 실시예 1 -1: OBOC 라이브러리 합성
OBOC 라이브러리를 solid-phase TentaGel MB NH2 resin(Rapp Polymere GmbH, Tubingen, Gemiany)에서 합성하였다. "split-mix" 합성 방법을 수행하여 각각 수백만 개의 beads/ligands의 랜덤 라이브러리를 함유하는 조합 OBOC 라이브러리를 구축하였다. 약 2, 600, 000개의 OBOC 라이브러리 합성을 위해 5g의 Tentagel MB NH2 resins(200|jm, 520,000beads/g)이 사용되었다. 비드 표면상의 리간드는 9-fluorenylmethoxycarbonyl(Fmoc) chemistry 및 N- hydroxybenzotriazole(HOBt) {GL Biochem, Shanghai, China)/N,N,- diisopropylcarbodiimide(DIC) (GL Biochem) coupling을 이용한 표준 고체상 펩타이드 합성 기술에 의해 합성되었다. 커플링 완료는 ninhydrin 테스트로 확인하였다. 비드는 사용하기 전까지 4°C에서 70% 에탄올에 저장되었다. 실시예 1 -2: 윤리 및 세포 배양 인간 조직과 관련된 모든 연구는 광주과학기술원 (Gwangju Institute of Science and Technology)의 연구윤리심의위원회 (IRB)에 의해 사전 승인되었다 (#20191008- BR-48-03-02). 모든 동물 실험은 광주과학기술원의 실험동물운영위원회 (IACUC)의 지침에 따라 수행되었다 (GIST-2019-040). 모든 배양물을 95% air/5% C02와 함께 37°C에서 유지되는 가습 인큐베이터에서 성장시켰다. 정상 인간 유방 세포주 MCF-10A는 American Type Culture Collection으로부터 입수하였고, bovine pituitary extract(Cambrex Bioscience, Walkersville, MD)이 보충된 MEGM 완전 성장 배지 (MEGM, Lonza, Walkersville, MD)에 증식시켰다. 정상 인간 결장직장 2021/234550 ?01/162021/054235 세포주 CCD-18Co는 한국세포주은행 (Seoul, Republic of Korea)에서 입수하였다. MCF-7, MDA-MB-231, HT-29 및 HCM 16을 포함하는 인간 유방암 및 결장직장암 세포주는 한국세포주은행에서 입수했다. Jurkat T 세포 역시 한국세포주은행에서 입수하였다. Luciferase-발현 MDA-MB-231 암 세포주는 Perkin Elmer(Perkin Elmer, Hopkinton, MA)로부터 입수했다. 각각의 암 세포주는 10% heat-inactivated fetal bovine serum(FBS)(Gibco), 0.1 mg/ml streptomycin(Gibco) 및 100units/ml penicillin(Gibco)이 보충된 RPMI1640(Gibco, Waltham, USA) 및 이 V旧 VI(Gibco)에서 성장시켰다. 실시예 1 -3: 암-특이적 리간드에 대한 OBOC 라이브러리 스크리닝 스크리닝 전에 비드를 이중 증류수 및 인산염완충식염수 (PBS; Welgene Inc., RepubHc of Korea)로 광범위하게 세척하였다. trypsin/티 TTA(Gibco)를 이용하여 암 세포 및 정상 세포를 배양 접시로부터 분리하고, 상응하는 배양 배지로 세척하였다. 106cells/ml로 재현탁시키고, 페트리 접시의 0B0C 비드와 37°C 가습 C02 인큐베이터에서 진탕하면서 (60rpm) 배양하였다. 세포에 의해 결합된 비드는 현미경 하에서 하나 이상의 세포 층으로 덮인 중심 비드를 갖는 장미 모양 (rosettes)으로 나타났다. 도립 현미경 (inverted microscope) 하에서 positive 비드를 피펫으로 골라내고, guanidine-HCL(8M, 20min)로 처리하여 비드 표면의 세포 및 단백질을 제거하고, 정상 유방 상피 세포로 2차 스크리닝을 수행하여 false 양성 결합을 제거하였다. 양 라운드에서 세포 결합을 갖는 비드만을 선별하여 펩타이드 시퀀싱을 수행하였다. 2021/234550 ?01/162021/054235 실시예 1 -4: 펩타이드 및 2'-maleimide-PTX의 화학적 합성 모든 핃!타이드 및 2'-maleimide-PTX는 각각 solid-phase peptide synthesis 및 Steglich esterification을 이용하여 AnyGen(Gwangju, Republic of Korea)에 의해 합성되었다. 펩타이드 및 2'-maleimide-PTX의 순도 및 분자량은 각각 HPLC 및 matrix-assisted laser desorption ionbation time-of-flight mass spectrometry(MALDI-TOF MS)를 사용하여 결정되었다 (Shimadzu, Kyoto, Japan). 실시예 1 -5: AGM-330-PTX의 합성
Peptide branched-thiol intermediates를 DMF(500|jM)(Duksan Chemical,
Korea)에 용해시키고, DMF(5mM)(10Equivalents) 및 0.1%v/v DIPEA(Duksan)에서 2'-maleimide-PTX 용액과 혼합시켰다. 반응물을 실온에서 30분 동안 교반한 다음, HPLC(Shimadzu)로 정제하였다. HPLC로 정제한 후, MALDI-TOF MS(Shimadzu)를 사용하여 6!\/1-330 - ）（의 분자량을 측정하였다. 실시예 1 -6: 혈청 안정성 시험 예열된
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이용하여 펩타이드의 저장용액（10아 ）을 10배로 희석하고, 37°（:에서 0, 3, 6, 9 및 24시간 동안 배양하였다. 단 에서의 펩타이드가 대조군으로 포함되었다 . 4°（:에서 10분 동안 3!\/1의 최종 농도에서 요소（니^이로 혈청 단백질을 변성시킨 후, 최종 농도 2021/234550 ?01/162021/054235
7%(v/v)(4°C, 10분)에서 trichloroacetic acid으로 혈청 단백질을 침전시키고 원심분리 (17,000xg, 10분)하여 반응을 정지시켰다. 각각의 샘플의 상층액을 회수하고, solvent A(0.05%(v/v) TFA in hbO)에서 5-65 % solvent B(acetonitrile 90%(v/v) with 0.045%(v/v) TFA in H20)의 선형 구배를 사용하여 215nm에서 모니터링하면서 1ml/min의 유속에서 25분에 걸쳐 analytical column을 수행하였다. 각 펩타이드의 용출 프로파일은 0 시점으로부터 PBS 샘플에 의해 확인되었다. 혈청-처리된 샘플에 남아있는 펩타이드의 백분율은 각 시점에서 수득된 펩타이드 피크의 높이와 0 시점에서 수득된 펩타이드 피크의 높이를 비교함으로써 결정하였다. 각 실험은 3회 수행되었다. 실시예 1-7: 유세포 분석 (Flow cytometry)
Fluorescence-activated cell-sorting(FACS) 분석을 사용하여 FITC-핃!타이드의 결합을 확인하였다. 1丁「(； -펩타이드용 저장용액 (10아_11비은 펩타이드를
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용해시켜 제조하였다.
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HCT-116 세포를 3|71ᅵ 배지를 함유하는 6-\^ 1 미 근드에 105〔비15/\^11로 시딩하고, 플레이트를 37。〔에서 밤새 배양하였다. 다음날, 1 「(；-1北6 펩타이드 ( 를 함유하는 새로운
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배지를 교체하고, 37° (:에서 30분 동안 추가로 배양하였다. 그 후, 배지를 제거하고, 세포를 차가운
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세척하여 임의의 잔류 펩타이드를 제거하였다. 적절한 trypsin/EDTA를 각 웰에 첨가한 후 37。〔에서 3~5분 동안 배양하였다. 배지를 첨가함으로써 trypsin/EDTA를 즉시 중화시키고, 세포 현탁액을 원심분리 튜브로 옮겼다. 세포를 분리하고 2회 2021/234550 ?01/162021/054235 세척하였다. 대조군 세포도 펩타이드를 제외하고 유사하게 처리되었다. 제조된 세포를 FACScanto ll(BD Biosciences) flow cytometer에서 분석하였다. FACS 데이터는 FlowJo software(TreeStar)로 분석되었다. 실시예 1 -8: Biotin pull-down 분석 세포 용해물 (500|jg/ml)을 biotinylated AGM-330(500ng/ml)과 함께 4°C에서 12시간 동안 배양한 후, streptavidin beads(Thermo Fisher Scientific, Rockford,
IL)에 의해 1시간 동안 실온에서 pull-down시켰다. 배양 후, 비드를 세척 버퍼로 3회 세척하였다. 용출 버퍼를 비드에 첨가하고, 비드로부터 단백질을 추출한 두 I, 최종적으로 SDS-PAGE로 분석하였다. Biotin pull-down 분석에서 유래된 단백질을 식별하고 특징 짓기 우 |해, ProteomeTech(Seoul, Korea)에서 LC-coupled ESI- MS/MS 분석을 수행하였다. 실시예 1 -9: AGM-330 결합 도메인 식별 인간 NCL cDNA clone(Addgene)으로부터 GFP-NCL(residues 1 -710), GFP-AN- NCL(residues 322-710) 및 GFP-AC-NCL(residues 1 -321)을 포함하는 NCL constructs를 만들었고, pEGFP-C2 벡터 (Addgene)의 Xhol 및 BamHI sites로 서브클로닝시켰다. 이들 벡터는 제조사의 권고에 따라 Lipofectamine 2000(1 nvitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 의해 형질주입 (transfection)시켰다. Biotinylated AGM-330 핃!타이드를 streptavidin beads(Thermo Fisher Scientific)에 2021/234550 ?01/162021/054235 첨가하고, 혼합물을 실온에서 1시간 동안 진탕하면서 배양하였다. 비드는 세척 버퍼로 3회 세척되었다. 세척 후,
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孔 단백질을 함유하는 형질주입된 세포 용해물로부터 제조된 용해물 (300매에 비드를 첨가하였다. 반응 혼합물을 4° (:에서 12시간 동안 배양하여 61\/1-330과 - 139900! 孔 단백질이 결합되도록 하였다. 이어서 비드를 세척 버퍼로 세척하였다. 동일한 부피의 2 전기영동 샘플 버퍼를 비드에 첨가하고, 95 에서 5분 동안 가열함으로써 비드로부터 단백질을 추출하였다.
Figure imgf000054_0002
및 면역블랏 분석으로 단백질을 최종적으로 분석하였다. 실시예 1-10: Jurkat 세포로부터 NCL의 정제
25ml의 20mM Tris/HCI, pH 7.5, 150mM NaCI, 5mM MgCI2, 5mM p- mercaptoethanol, 0.5%(v/v) Triton X-100, 1 mM marimastat(AdooQ Bioscience, Irvine, CA, USA), protease inhibitor cocktail(Millipore, Billerica, MA, USA)에서 1.0X109 Jurkat 세포를 4°C에서 1시간 동안 용해시켜 NCL을 제조하였다 . v) 트리톤 X-100, 1mM 마리 마 스타트 (AdooQ Bioscience, Irvine, CA, USA), 프로테아제 저해제 칵테일 (Millipore, Billerica, MA, USA). 핵을 1200xg에서 5분 동안 원심분리하여 펠렛화 한 다음, 상층액을 12,000xg에서 30분 동안 원심분리하고 -80°C에서 저장하였다. 핵이 없는 (nucleus-free) 추출물로부터 NCL을 정제하기 위해 빠른 2단계 크로마토그래피 절차를 사용하였다. 모든 단계는 1mM marimastat 및 완전한 protease inhibitor cocktail의 존재 하에 빙냉 (ice-cold) 버퍼 및 컬럼을 사용하여 4°C에서 수행하였다. Jurkat 세포 (25ml)의 2021/234550 ?01/162021/054235 세포질 추출물을 pH 7.0, 20m M 인산나트륨으로 10배 희석하고 , 5ml의 Mono Q 5/50 GL 컬럼 (Sigma-Aldrich)에 통과시켰다. pH 7.0, 150ml의 20mM 인산나트륨으로 컬럼을 세척한 후, 1 M NaCI을 함유하는 동일 버퍼 10ml로 흡착된 단백질을 용출시켰다. 용출액을 50mM Tris/HCI, pH 7.9, 5mM MgCI2,
0.1 mM EDTA, 1 mM p-mercaptoethanol(buffer A)로 10배 희석하고, 동일 버퍼로 평형시킨 1ml HiFiQ heparin HP column(Protein Ark, UK)에 로딩하였다. 0.2M ammonium sulfate를 함유하는 20ml의 버퍼 A로 겔을 세척하고, 0.6M ammonium sulfate를 함유한 2ml의 버퍼 A로 단백질을 50[jl 분획으로 용출시켰다. NCL을 모아 4°C에서 2시간 동안 1mM marimastat를 함유하는 PBS에 투석한 뒤, -80°C에서 저장하였다. Coomassie blue로 염색된 10% SDS acrylamide gel에 대한 추가 제어는 단일 105 kDa 단백질 밴드로서 정제된 NCL의 존재를 확인하였다. NCL의 부분 분해 산물에 해당하는 2개의 70 및 50 kDa 단백질 밴드가 전체 단백질의 10% 미만의 양으로 관찰되었다. 실시예 1-11: 결합 친화도 결합친화도는 SPR(surface plasmone resonance) spectroscopy(Biacore T-200)에 의해 테스트되었다. 재조합 nucleolin 단백질을 CM5 sensorchip에 고정한 후, AGM-330을 농도별로 (20nM - 2.5jjM)로 처리하여 각각에 대한 sensogram을 분석하고 KD 값을 결정하였다. 2021/234550 ?01/162021/054235 실시예 1 -12: 단백질 분리 및 웨스턴 블랏 분석
Protease inhibitor cocktail(Millipore)을 함유하는 RIPA 버퍼 (20mM Tris-HCI, pH 7.5, 200mM NaCI, 0.5% Triton X-100)에 세포를 용해시켰다. 제조사의 프로토콜에 따라 단백질 분석 키트 (Bio-Rad)로 단백질 농도를 측정하였다. 총 단백질을 SDS- PAGE에 적용하고 polyvinylidene difluoride 막으로 이동시켰다. 블랏은 NCL(Abcam) 및 GFP(Abcam)에 대한 1차 항체로 프로브되었다. 로딩 대조군으로서, 항- p-actin 항처 |(Santa Cruz Biotechnology), 항- P-cadherin(Abcam) 및 항- Lamin A/C(Abcam)가 사용되었다. 이어서, 블랏을 TBST(10mM Tris-HCI, 50mM NaCI 및 0.25% Tween-20)에서 세척하고, horseradish peroxidase-접합 2차 항체와 함께 배양하였다. 강화된 chemiluminescence 시약 (Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 표적 단백질의 존재를 탐지하였다. 실시예 1 -13: 면역형광 염색
MDA-MB-231 -luc 이종이식 조직은 면역형광 염색을 위해 포르말린-고정 및 파라핀-매립되었다. 세포를 poly-L-lysine 및 collagen I -coated cover glasses에 시딩하고 4% 포르말린으로 고정시켰다. 조직 슬라이드 및 세포를 0.1% Triton X- 100으로 투과성 있게 만들고, 2% BSA(Sigma-Aldrich)로 블로킹하였다. 1차 항- NC(1 : 200), 항- TUNEL(1 : 200) 및 항- Ki-67(1 : 500) 항체를 사용하여 전술한 바와 같이 염색을 수행하였다. 모든 핵은 DAPI로 대조 염색되었다. 면역형광 이미지를 H&E-염색 이미지와 매칭시켰다. 2021/234550 ?01/162021/054235 실시예 1 -14: 5|7비1
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NCL을 표적하는 siRNA(NM_005381.3 in NCBI database) 및 scramble siRNA(scr)는 Bioneer(Daejeon, Republic of Korea)로부터 구입하였다. 효율적인 NCL 형질주입을 우 I해, 제조사의 프로토콜에 따라 Lipofectamine 2000(lnvitrogen)을 사용하여 siRNA 형질주입을 수행하였다. 3개의 상이한 siRNA 서열이 사용되었고, 이들의 효율성은 실시간 PCR에 의해 평가되었다. siNCLI: (sense) 5f-GAGCUAACCCUUAUCUGUA (dTdT)-3, (서열번호 21)
(antisense) 5f-UACAGAUAAGGGUUAGCUC (dTdT)-3, (서열번호 22) siNCL2: (sense) 5f-CACAAGGAAAGAAGACGAA (dTdT)-3, (서열번호 23)
(antisense) 5f-UUCGUCUUCUUUCCUUGUG (dTdT)-3, (서열번호 24) siNCL3: (sense) 5f-GACGAAGUUUGAAUAGCUU (dTdT)-3, (서열번호 25)
(antisense) 5，- AAGCUAUUCAAACUUC GUC (dTdT)-3, (서열번호 26) qRT-PCR 분석에 의해 결정된 mRNA 수준에 기초하여 가장 효과적인 siRNA를 선택하였고, 생성된 단백질 수준을 웨스턴 블랏 분석으로 검증하였다. 실시예 1 -15: 실시간 PCR
RNAiso(Takara, Shiga, Japan)를 사용하여 전체 RNA를 추출하고, 260/280 흡광도 비율을 측정하여 RNA 순도를 검증하였다. PrimeScriptä 1st strand cDNA 2021/234550 ?01/162021/054235
Synthesis Kit(Takara, Shiga, Japan)를 사용하여 제 1가닥 cDNA를 합성하고, Power SYBR® Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)와 함께 각 PCR 혼합물에 10분의 1의 cDNA를 사용하였다. 실시간 PCR은 StepOnePlus Real-Time PCR System(Applied Biosystems)을 사용하여 수행되었다. 선택된 유전자의 상대적 mRNA 발현을 p-actin의 발현으로 표준화하고, ddCt 방법을 사용하여 정량화하였다. PCR 프라이머의 서열을 하기 표 6에 나열하였다.
【표 6】
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실시예 1 -16: 항체 중화 분석
100[jl의 배지를 함유하는 96-well plates에 1X104cells/well로 암 및 정상 세포주를 시딩하고, 플레이트를 37°C에서 밤새 배양하였다. 밤새 배양 후, 세포를 37°C에서 밤새 항- NCL 항체 (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA)의 부재 또는 존재 하에 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, 제조사의 지시에 따라 CellVia WST-1 assay(Young In Frontier, Seoul, Korea)로 세포 생존력을 평가하였다. 2021/234550 ?01/162021/054235 실시예 1-17: 아포토시스 (8|30|31：0
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아포토시스 세포의 정량적 평가는 Annexin V-fluorescein isothiocyanate(FITC) Apoptosis Detection Kit l(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)를 사용하여 수행되었다. 세포를 수집하고 차가운 단 로 2회 세척한 다음, 결합 버퍼 (1x106cells/ml)에 재현탁시켰다. 다음으로, 100녀의 현탁액을 튜브로 옮기고 5|jl의 FITC Annexin V 및 propidium iodide(PI)와 혼합하였다. 이어서, 혼합물을 온화한 vortexing 후 암실에서, 15분 동안 실온에서 배양하였다. 배양 후, 400MI의 1X 결합 버퍼를 첨가하고, 세포를 유세포 분석으로 분석하였다. 실시예 1-18: 세포 증식 분석 암 세포 및 정상 세포 (1x104cells/well)를 96-well plates에 시딩하였다. 24시간 동안 배양한 후, 세포를 증가하는 농도의 AGM-330, PTX 및 AGM-330-PTX로 48시간 동안 처리하였다. 세포 생존력은 제조사의 지시에 따라 CellVia WST-1 assay(Young In Frontier)로 평가하였다. 생존 세포의 수는 Versa Max ELISA plate reader(Molecular Devices)를 사용하여 450nm의 파장에서 측정되었다. 실시예 1-19: 종양형성 (11|11101^6116 5) 실험 모든 동물 실험은 1 (；니〔 지침에 따라 수행되었다 (<31計-2019-040). 종양형성 실험을 우 I해, 마취된 6주령 암컷 !\!0 - /公/ /^- 마우스 (^(3ä, \ZITALSTAR)를 2021/234550 ?01/162021/054235
100|jl 부피의 1X106 MDA-MB-231 -luc 세포가 있는 mammary fat pad에 접종하였다 (/7 = 5~6 for each groupO. 종양 세포 접종 후, 종양 부피가 대략 100mm3 에 도달했을 때, 마우스를 하기 5개 군으로 무작위로 나누었다: (i) control, (ii) low-dose paclitaxel(2mg/kg), (iii) high-dose paclitaxel(1 Omg/kg), (iv) AGM-330(16.68mg/kg 또는 8.34mg/kg) 및 (v) AGM-330-PTX(19.05mg/kg 또는 10.71 mg/kg). 일주일에 두 번 종양 크기를 측정하고, 다음 식을 이용하여 종양 부피를 계산하였다: 부표 |(mm3) = (길이 (mm)) x (너비 (mm))2 X 0.5. 생물발광 이미징 실험을 우 I해, D-luciferin(150mg/kg)(Perkin티 mer)을 각 마우스에 복강 내 주사하고, IVIS 100 imaging system(Xenogen, Corporation, Alameda, CA)을 생물발광 모니터링에 사용하였다. 기체 isofurane(BK Pharm, llsan, Korea)으로 마우스를 마취시키고, 이미징 챔버에 배치하였다. 10분 후, 각 동물을 1분의 노출 시간으로 이미징하였다. 모든 생물발광 이미지 데이터는 Living Image software(version 4.5.2, PerkinElmer)에 의해 제공되었다. 종양으로부터 검출된 광자는 평균 광도 (photon/sec/cm2/sr)로 변환되었다. 평균 광도 값은 강도 영역 (region of intensity; ROI)에서 얻은 정량적 데이터이며, 각 마우스의 몸 전체에 할당된 직사각형 영역에서 생물발광 세포에 의해 방출된 광자를 포함한다. 실시예 1 -20: 생물 정보학 2021/234550 ?01/162021/054235
0|(：01下 116〔石미:아
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선 3匕356( :" www.oncomine.org八를 사용하여 정상 유방 및 결장직장 조직과 유방 암종 및 결장직장 선암종 조직에서 0_의 발현 수준을 분석했다. 이들 유전자 발현 데이터는 log2 변환되었고, 중앙값 중심이었다. 모든 그래픽 및 통계 값은 Graph Pad Prism 5.0으로 분석하였고, P- value는 two-tailed Student's t-test(P < 0.05)에 의해 계산되었다. R2 플랫폼을 사용하여 Kaplan-Meier plots을 생성하고, 유방 종양 및 결장직장 종양에서 NCL 발현 수준에 따라 환자를 그룹화하였다. 실시예 1 -21 : 통계 분석 모든 통계 데이터는 평균 ±SD(/7 = 3)로 표시되었다. 두 그룹 사이의 통계적 비교는 Student's i test에 의해 결정되었고, 여러 그룹 사이의 비교는 one-way AN OVA with Dunnett's multiple comparison에 의해 결정되었다. in vivo 실험의 경우, 마우스의 수는 각 범례에 표시되었다. Log-rank 테스트는 Kaplan-Meier analyses에 사용되었다. *, ** 및 ***는 각각 P < 0.05, P < 0.01 및 /7 < 0.001을 나타낸다. 실시예 2: 애0〔조합 스크리닝 및 1\/1 ? 합성 방법에 의한 암-표적화 펩타이드 리간드의 동정 및 특성 확인 새로운 암-특이적 펩타이드 리간드를 동정하기 우 I해, ¾의 근 明비 1\/ 1\11 田 115(200 111, 520,000匕630|5/9, 도 3)을 사용하여 ~ 2, 600, 000개 라이브러리를 2021/234550 ?01/162021/054235 합성했다. 비드에 나열된 펩타이드 라이브러리 (한 번에 50,000 - 100, 000개의 비드가 사용됨)를 인간 유방암 세포주 (MDA-MB-231)와 혼합했다. 총 - 1,000, 000개의 비드를 스크리닝하고, 8개의 positive 비드를 검출하였으며, 마이크로시퀀싱을 위해 분리하였다. 이들 8개 펩타이드 중 3개 (AGM-330, AGM- 331 및 AGM-332)는 MDA-MB-231에 대해 강한 우선적인 결합을 나타냈으며, 인간 정상 유방 세포주 (MCF-10A)에는 결합하지 않거나, 약하게 결합하였다 (도 4A, 도 4¾. 그 다음, 이 3개의 핃!타이드를 fluorescein isothiocyanate(HTC)로 라벨링하고, MDA-MB-231 세포에 결합할 수 있는지 여부를 확인하였다. AGM- 331 및 AGM-332와 비교할 때, AGM-330에서 가장 강한 형광 신호가 검출되었다 (도 4C). 세포 성장 비드 분석 (cell-growth-on-bead assay) 및 형광 이미징으로부터 스크리닝 결과를 확인하기 우 I해, AGM-330을 Tentagel MB NH2 resin에서 재합성 하였다. 세포 성장 비드 분석 결고ᅡ, AGM-330 비드는 15분 내에 인간 유방암 세포주 (MCF7 및 MDA-MB-231)와 인간 결장직장암 세포주 (HT-29 및 HCT-116)에 의해 완전히 덮였다 (도 4D). 한편, AGM-331 및 AGM-332는 상대적으로 비특이적이며, 인간 정상 유방 세포주 (MCF-10A) 및 인간 정상 결장직장 세포주 (CCD-18CO)에 결합하였다. 또한, AGM-330은 MCF-10A 또는 CCD-18CO 세포에 매우 약하게 결합하거나, 전혀 결합하지 않았으므로, 이미징 및 치료적 표적화 제제 모두에 대한 우수한 후보가 될 수 있다. 현재 안정성이 낮기 때문에 치료제로서 펩타이드의 사용은 크게 제한되어왔다: 펩타이드는 / 1// 에서 주로 프로테아제 및 펩티다아제에 의해 분해된다 (Bottger R, et al. PLoS One. 2017; 12: e017894키. 본 발명에서는, 2021/234550 ?01/162021/054235 펩타이드 리간드의 안정성을 개선하기 우 I해, MAP 덴드리머 형태의 AGM-330을 합성하였으며, 이는 프로테아제 및 펩티다아제 활성에 대해 획득된 저항성으로 인해 증가된 안정성을 나타낼 수 있다. AGM-330의 합성 (도 4E)은 lysine core- conjugated Wang resin(2,3)을 만들기 우 I해, 20% piperidine 및 이 VIF의 존재 하에 Fmoc-Cys(Trt) Wang resin(1) 및 Fmoc-Lys(Fmoc)-OH로 개시된다. 이어서, 20% piperidine 존재 하에 RHGAMVYU<-PEG12-0H로 처리하여 Fmoc- 및 Trt-보호된 AGM-330(4)을 제조하였다. AGM-330(4)의 Fmoc- 및 Trt- 보호기는 이 VIF의 piperidine에 의해 신속하게 제거되어 AGM-330(5)이 제조되었다. 선정된 펩타이드 리간드 AGM-330의 생체 내 안정성과 결합력 증진을 우 I해, MAP(Multiple Antigen Peptide) 합성법을 통하여 이량체, 사량처 I 형태로 합성하였다. 펩타이드 안정성을 증진 여부를 평가하기 위해, 펩타이드의 in vivo 반감기를 분석하였다. AGM-330m, AGM-330d, AGM_330t 2mg/kg을 C57BL/6 마우스의 꼬리 정맥을 통해 주입하였고, 남아있는 혈청내 펩타이드 부분은 항- AGM-330 항체를 통해 ELISA 플레이트에 즉시 고정시켰다. 흡광도는 Versa Max ELISA plate reader(Molecular Devices)를 사용하여 450nm의 파장에서 측정되었으며, 약물동태 (Pharmacokinetics)는 phoenix WinNonlin
Figure imgf000063_0001
Corporation, Mountain View, CA, USA) 프로그램으로 분석하였다. 분석 결과, AGM-330m, AGM-330d, AGM-330t의 반감기 (T1/2)는 각각 0.42±0.33시간, 1.82±0.36시간, 9.43± 1.21시간이었으며, 혈중 최대 집중 시간 (Tmax)은 모두 0.167시간이었다. 혈중 최대 농도 (Cmax)는 각각 1.27±0.12ijg/mL, 1.71 ±0.11 jjg/mL, 1.875±0.67Mg/mL였고, 2021/234550 ?01/162021/054235 커브 밑의 면적 (AUC)은 각각 0.64±0.09ijg/h/mL, 1.77±0.12ijg/h/mL, 21.42±0.8lMg/h/mL였다 (도 5). 결과적으로, 사량체 AGM-330(AGM-330t)가 단량체 또는 이량체 펩타이드보다 안정성이 높은 것으로 확인되었다. 다음으로, MAP 리간드가 암 세포에 선택적으로 결합할 수 있는지를 조사하기 우 |해, FITC-표지된 AGM-330(AGM-330-FITC)으로 처리된 암 세포를 비처리 세포와 비교하였다. AGM-330-FITC를 무혈청 배지에서 37°C, 2시간 동안 세포 (1X105)와 배양하여 접합체 (conjugates)를 온전하게 유지시켰다. 그 다음, 고유 형광 핃!타이드-처리된 세포를 비처리 세포에 대해, 평균 형광 강도 (mean fluorescence intensity; MFI)의 변화에 기초하여 비교하고 측정하였다 (도 4F). 그 결과, AGM- 330-FITC는 MCF-7, MDA-MB-231, HT-29 및 HCT-116에 대한 유의한 암 세포 결합을 나타냈으며, 이는 비처리 세포에 대비 처리 세포의 MFI의 상대적인 증가에 의해 입증된 바와 같다. 대조적으로 , 2시간 배양 후 접합체는 MCF-10A 및 CCD-18CO를 포함하는 정상 세포에 대해 현저히 감소된 결합을 나타낸 반면, 암 세포에 대해서는 강한 우선적 결합을 나타냈다.
AGM-330이 세포독성을 나타내는지 여부를 조사하기 우 |해, MCF-7, MDA-MB- 231, HT-29, HCM 16를 포함하는 여러 암 세포와 MCF-10A 및 CCD-18Co를 포함하는 정상 세포들에서 IC50 값을 평가했다. AGM-330t 및 AGM-330d의 IC50 값은 혈청 농도에 무관하게 모든 세포주에서 100MM보다 컸다 (도 6). 이는 AGM- 330이 암 또는 정상 세포주의 세포 생존력에 현저하게 영향을 미치지 않음을 의미한다. 종합하면, 상기 데이터들은 AGM-330이 표적 세포 생존력에 영향을 미치지 않으면서 암 세포의 표적화에 이용될 수 있음을 시사한다. 2021/234550 ?01/162021/054235 실시예 3: AGM-330의 잠재적 표적인 암 세포 성장의 강력한 조절인자 NCL
AGM-330의 미지의 표적 단백질을 확인하기 위해, 친화성 컬럼 크로마토그래피 (affinity column chromatography) 및 질량 분석법 기반의 단백질체학적 접근 방식을 사용하여, MDA-MB-231 세포의 세포 용해물로부터 AGM -330-상호작용 단백질을 확인하였다 (도 7A). 친화성 컬럼 크로마토그래피 후, SDS-PAGE 분석을 통해 용출 분획에만 존재하는 여러 가지 별개의 단백질 밴드 (55-100kDa)를 확인하였다 (도 7B). LC-MS/MS 분석을 사용하여 6개의 단백질을 확인하였고, 이들 절제된 밴드의 펩타이드 식별은 100kDa에서 주요 단백질 밴드 중 하나가 뉴클레오린 (NCL)으로 특성화되었음을 보여 주었다. NCL은 710개의 아미노산으로 구성되며 LC-MS/MS 분석에 의해 식별된 22개의 다른 펩타이드 단편은 NCL의 아미노산 서열과 일치하였다 (NCBI 데이터베이스의 인간 NCL(accession number: gi189306)에 대한 total score 881 및 24% sequence coverage) (도 7C-D). 또한, 항- NCL 항체를 사용한 면역블랏 분석을 통해 AGM- 330 친화성 컬럼에서의 용출물에서 NCL의 농축을 추가로 확인하였다 (도 70. 따라서, 단백질체학적 연구는 NCL이 AGM-330-상호작용 단백질이라는 것을 시사한다.
AGM-330의 NCL에 대한 결합 친화도를 확인하기 우 I해, AGM-330을 사용하여 SPR(surface plasmone resonance) test를 수행하였다. 도 8에 도시된 바와 같이,
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값이 약 57.7nM로, NCL에 대해 매우 높은 결합 친화도를 나타냄을 확인하였다.
AGM-330과 NCL 간의 상호작용에 관여하는 도메인을 조사하기 위해 biotin 2021/234550 ?01/162021/054235 pull-down 분석을 사용했다. Biotinylated AGM-330(AGM-330-Biotin)을 bait로 사용하여 NCL 돌연변이체를 풀다운시켰다. NCL의 몇몇 결실 돌연변이체가 생성되었다. 모두 GFP에 융합된 야생형 및 다양한 NCL 돌연변이체, NCLK1-710), NCL2(323-710) 및 NCL3(1-322)을 코딩하는 발현 벡터로 형질주입된 HEK293T 세포로부터 세포 추출물을 제조하였다. AGM-330-Biotin은 야생형 NCL1(1-710) 및 NCL3(1-322)을 풀다운시켰지만, NCL2(323-710)는 풀다운시키지 않았다 (도 7F). 이러한 결과는 NCL의 N-말단 영역 (1-322)이 AGM-330의 결합에 중요하다는 것을 나타낸다. AGM-330과 NCL 사이의 직접적인 상호작용을 추가로 확인하기 우 I해, 정제된 NCL 및 AGM-330-Biotin을 biotin pull-down 분석에 사용하였다. 항- NCL 항체를 사용한 면역블랏 분석을 통해 용출 분획에서 NCL의 농축을 확인하였다 (도 9). 종합하면, AGM-330이 NCL과 직접적으로 상호작용하는 것을 의미한다. 실시예 4: 61\/1-330과 ＜：1_의 상호작용에 필수적인 아미노산 잔기 확인 암 세포 (1 X 104〔비15/\^11)를 96-\^비1 |31 65에 24시간 동안 배양하였다. 01\/1- 330
Figure imgf000066_0001
표 2의 12종 핃!타이드를 비0신11 연결시키고, 세포를
2시간 동안 증가하는 농도의 상기 13종 펩타이드로 처리하였다. 그 후, 고친화성 너 -비야 상호작용을 통해 3\/너 斗|［사3를 부착하고, 효소를 통해 11\ 기질을 파란색으로 전환시켰다. 그 후, 산을 첨가하여 반응을 종결시키고, 45(^이에서 웰을 판독하여 13종의 친화도를 미 /ᅡ로 평가하였다. 2021/234550 ?01/162021/054235
PEGylation된 13종 펩타이드의 흡광도를 도 10에 나타내었다. 서열번호 9, 10, 11, 14의 4종의 펩타이드는 AGM-330과 유사한 흡광도를 보여주었다. 또한, 서열번호 12, 13, 15, 20의 4종의 펩타이드는 AGM-330보다 증진된 흡광도를 보여주었다. 5번 methionine(M5) 잔기의 leucine 또는 norleucine으로 치환, 7번 tyrosine(Y7) 잔기의 phenylalanine으로 치환, 그리고 C-말단에 반복적인 leucine(L) 및 lysine(K) 잔기의 삽입이 결합력을 증진 시켰다. 따라서, M5 및 Y7 잔기의 소수성 아미노산으로 치환 또는 C-말단의 L 및 K의 삽입이 결합력을 향상시킬 수 있음을 시사한다. 그러나, 서열번호 16 내지 서열번호 19의 펩타이드는 AGM-330보다 감소된 흡광도를 보여주었다. 1번 arginine(RI)과 2번 histidine(H2) 잔기의 결실, N-말단에 반복적인 arginine(R) 및 histidine(H) 잔기의 삽입, 그리고 반전 서열은 결합력을 감소시켰다. 따라서, R1 및 H2를 포함하여 서열의 방향성이 보존되어야 함을 시사한다. 실시예 5: / /I 0 및 / /I 1 /0에서 암 세포에 특이적으로 결합하는 61\/1-330 형광 현미경을 사용하여 다른 세포주에 대한 세포 결합 분석으로 에 대한 61\/1-330의 특이성을 평가했다. 다수의
Figure imgf000067_0001
-231, 바-29 및 네 6와 정상 세포주, 1\/10:-10 및 (；〔 -18(；0를 이용하여 수행하였다. 5^ 이八 斗印；로 세포를 1시간 동안 배양한 후 공초점 이미징에 의해 결합 특이성을 확인하였다. 세포를 디 미와 함께 배양하여 핵 (청색 형광)을 대조염색하였다. !_의 !\1-말단 도메인에 결합하는 항- !_ 항체 및 6!\/1-330 - 2021/234550 ?01/162021/054235
1=ᅲ（；로의 이중-면역형광 염색을 통해 61\/1-330이 1\1（孔에 결합함을 나타내는
NCL과 AGM-330-FITC 사이의 중첩을 확인하였다（도 11A-¾. 다음으로, MCF-7, MDA-MB-231 및 MCF-10A 세포에서 NCL의 상대적인 양 및 세포 내 위치를 확인하여, NCL의 발현 수준 또는 위치의 차이가 암 세포에 대한 AGM-330의 감수성과 관련이 있는지 여부를 확인하였다. 세포의 준세포분획（subcellular fraction）을 분리하고, 웨스턴 블랏팅에 의해 세포 내 총 NCL뿐만 아니라, 세포기질（cytosol）, 핵 및 세포막 추출물에서의 NCL의 발현을 분석하였다. 그 결과, NCL 발현은 MCF-10A 및 CCD-18Co 세포와 비교하여 MCF- 7, MDA-MB-231, HT-29 및 HCT-116 세포의 막 및 세포질 추출물에서 상승되었다（도 11C, 도 12A）. 모든 세포주에서 NCL의 핵 수준의 유의미한 차이는 관찰되지 않았다. 막-발현 NCL이 암 세포에 대한 AGM-330 결합에 결정적인지 여부를 조사하고자 하였다. NCL을 knockdown시키기 위해 특이적으로 표적화하는 siRNA를 사용하였다. NCL을 표적으로 하는 3개의 siRNA（siNCL1, siNCL2 및 siNCL3）가 NCL-knockdown 세포에서 상이한 효능을 나타냄을 확인하였다. siNCLl O| MDA-MB-231 세포에서 가장 높은 knockdown 효능을 나타내었기 때문에, 추가 실험을 위해 선택하였다（도 12B）. 그 다음, siNCLI 처리 후 암 세포막에서 NCL 발현이 감소되는지를 확인하기 위해, siNCl_1 처리된 세포의 준세포분획을 분리하고, 웨스턴 블랏팅을 통해 세포기질, 핵 및 세포막 추출물에서 NCL의 발현을 분석하였다. 그 결과, siNai 처리는 세포기질 및 세포막 분획에서 NCL의 기저 발현을 강력하게 억제하였다（도 11 D）. NCL의 발현 2021/234550 ?01/162021/054235 수준 연구 결과에 따라, 본 발명자들은 막 NCL의 발현 감소가 AGM-330 결합에 영향을 미치는 것을 확인하였다. Scrambled siRNA-처리 세포는 대조군과 유사한 형광 신호를 나타냈다. 그러나, 감소된 AGM-330 결합으로 인해 SINCL1- 처리군에서 형광 신호가 거의 또는 전혀 검출되지 않았다 (도 11 E). 형광 이미징은 암 세포의 막에 결합하는 항- NCL 항체와 AGM-330-FITC가 항- NCL 항체 형광과 함께 colocalize됨을 나타냈다 (도 11A-B). 또한, 돌연변이 분석을 통해 NCL의 N- 말단 도메인이 NCL과 AGM-330 사이의 상호작용을 담당하는 것을 확인하였다 (도 7F). 상기 결과들은 AGM-330이 암 세포막에서 발현되는 NCL과 직접 상호작용한다는 것을 시사한다. 다음으로, 인간 유방암의 이종이식 모델을 사용하여 in vivo 이미징을 통해 AGM-330의 암-표적화 특성을 평가하였다 (도 11F). AGM-330이 />? i//k?에서 암 세포를 선택적으로 표적화할 수 있는지 조사하기 우 |해, Alexa680으로 표지된 AGM-330(AGM-330-Alexa680)이 처리된 종양-보유 마우스 (tumor-bearing mice)를 Aleax680 단독 처리된 마우스와 비교하였다. 1시간 후 AGM-330-Alexa680 분획 종양의 근적외선 형광 (near-infrared fluorescent; NIRF) 강도는 대조군 종양보다 유의하게 높았다: (대조군) 3.04 X 107 ± 1.38 106 (p/sec/cm2/sr)/(|jW/cm2) 대비 (AGM-330-Alexa680) 1.19 X 109 ± 1.90 107 (p/sec/cm2/sr)/(ijW/cm2), n = 3, P < 0.001 (도 11G-I). 또한, 2시간 째에 종양 및 다른 주요 장기에서 AGM-330- Alexa680고！· Alexa680 단독의 주사 용량 백분율을 분석하여 접합 형광 (conjugated fluorescent) 분포에 대한 AGM-330의 효과를 정량적으로 조사하였다. 신장과 간을 제외하고, 종양 조직에서 각 기관의 그램 당 NIRF 총 광자 수는 다른 2021/234550 ?01/162021/054235 기관의 것보다 훨씬 높았으며, 이는 61\/1-330의 종양-표적화 특성이 대조군보다 ■ 씬 높다는 결정적인 증거이다 (도 11 . 종합하면,
Figure imgf000070_0001
이미지는 61\/1-330이 /＞? 1 / /1/0에서 정상적인 기관이 아닌 종양 조직 전체에 주로 축적되는 것을 나타낸다. 실시예 6: NCL과 암 진행의 양의 상관관계 및 항- NCL 항체의 막 NCL 중화를 통한 세포 증식 억제 효과 확인 상기 실시예들에 기초하여, 암 세포주에서 NCL 발현 패턴을 확인하였다. 인간 암 조직에서의 NCL 발현을 조사하기 우 I해, Oncomine dataset repository(www.oncomine.org)를 사용하여 이용 가능한 유방암 및 결장직장암 데이터 세트를 분석했다. 144개 1차 유방 조직 대비 67개 유방 암종에서의 NCL의 상대적 발현을 Curtis datasets에서 분석하였다. NCL mRNA 발현은 정상 유방 조직과 비교하여 유방 암종에서 유의하게 상향 조절되었다 (戶＜ 0.001, 도 13A). 또한, Alon datasets에서, NCL mRNA의 발현은 결장직장 선암종에서 정상 조직보다 유의하게 높았다 ( ＜ 0.01, 도 13/M. 그 다음, 본 발명자들은 유방암과 결장직장암 환자에서 높은 NCL 발현이 질병이 없는 낮은 생존율과 같은 불량한 예후와 관련이 있음을 확인하였다 (Bertucci and Sveen dataset from 'R2: Genomics Analysis and Visualization platform(http://r2.amc.nl)’) (도 13B). 이는 높은 NCL 발현이 유방암 및 결장직장암 환자에서 불량한 예후 마커 역할을 한다는 이전의 보고서와 일치한다 (van Long FN, et al. Cancers. 2018; 10: 390). 인간 암 및 정상 조직에서의 NCL 발현 분포를 결정하기 우 I해, 면역 조직 화학 (immunohistochemistry; IHC) 분석으로 NCL 발현을 분석하였다. IHC 분석을 2021/234550 ?01/162021/054235 통해 이 정상 유방 및 결장직장 조직과 비교하여 인간 유방암 및 결장직장암 조직의 막 및 세포질 영역에서 증가된 것으로 밝혀졌으며（도 13（1- ）, 이는 면역 형광 이미징（도 1 1/\-미 및 웨스턴 블랏팅（도 1 1（；）의 결과와 일치한다. 또한, 이전의 보고서에 따르면, 상향 조절된 막 이 암 증식 및 아포토시스의 억제에 관여하는 리간드에 대한 수용체로서 상호작용하는 것이 밝혀진 바 있다（01에
Figure imgf000071_0001
비. 0%야3 . 2015; 6: 16253-7（》. 이에 따라, 막 발현 孔이 암 세포에서의 기능 조절에 필수적인지 여부를 조사하기 우 I해, 본 발명자들은 />? 1//? 1\/10/\-1\/ - 231과 네 6 세포 및 〔 川 과 0그 -18（；0 세포에서 단일클론 항- 孔 항체를 사용하여 막 발현 을 중화시켰다. 먼저, 24시간 동안 상이한 농도에서 항체로 처리된 정상 및 암 세포에서 세포 생존력을 평가하였다. 항체（501 / ） 처리시 1\/10/\-1\/ -231 및 HCT-1 16 세포에서 세포 생존율이 각각 35%와 32% 감소했지만, 대조군 및
Figure imgf000071_0002
처리군와 비교하여 정상 세포에서는 유의미한 감소가 관찰되지 않았다（1\/10=-10 및 （；〔 -18（；0）（도 13 비. 또한, 암 세포에 대한 항- 항체의 세포독성 효과의 원인을 조사하기 위해 아포토시스 분석을 수행하였다 . 24시간 동안 상이한 농도에서 항체로 처리한 1\/ /\-1\/ -231 및 HCT-1 16 세포를 Annexin V 및 미를 사용하여 염색하였다. 유세포 분석에 따르면, 초기 및 후기 아포토시스 단계에서 암 세포의 백분율이 항- 1\1<그!_ 항체 농도-의존적 방식으로 증가하였다（도 131）. 본 발명자들은 다양한 유형의 암의 막과 세포질에서 이 과발현되고, 암 환자의 불량한 예후 생존과 관련됨을 확인하였다. 상기 결과들은 특히 암 세포 증식 및 아포토시스의 제어 측면에서, 암 세포에서의 막 부분에 대한 중요한 2021/234550 ?01/162021/054235 역할을 설명한다. 종합하면, 상기 결과들은 이 암 성장에 중요한 역할을 하고, 막 표적화가 화학요법 약물을 이용한 암 치료와 관련하여 유망한 바이오마커가 될 수 있음을 시사한다. 실시예 7: 파클리탁셀-접합 AGM-330의 in vitro 및 마우스 이종이식 모델에서의 효과적인 암 성장 억제 효과 확인 파클리탁셀 (PTX)을 AGM-330과 접합시켜 잘 확립된 화학요법제에 연결된 암- 표적 리간드 (AGM-330-PTX)를 얻었다. PTX는 maleimide-carboxy bifunctional linker와 orthogonal conjugation되었다. AG M-330t-PTX가 암 세포 증식을 억제하는지 여부를 조사하기 위해, MCF-7, MDA-MB-231, HT-29 및 HCT-116을 포함한 여러 암 세포주에서 IC50 값을 평가했다 (도 14A). MDA-MB-231 세포에서, PTX 단독 및 AGM-330t-PTX에 대한 IC50 값은 각각 6.8 및 3.6MM이었다. 결과는 3가지 암 세포주 모두에서 유사하였다 (MCF-7, HCT-116 및 HT-2¾. 그러나, MCF- 10A 세포에서, PTX 단독 및 AGM-330t-PTX에 대한 IC50 값은 각각 22.1 및 35.3MM이었다. 암 세포주에서 in vitro 증식 분석에 따라, AGM-330t-PTX이 잠재적인 in vivo 치료제가 될 수 있는지 조사하였다. NPG 마우스의 유선 지방 패드에 MDA-MB- 231 -luc 세포를 접종했다. 피하 종양이 100mm3으로 성장한 후, 꼬리 정맥 주사로 일주일에 두 번 각각 vehicle(PBS), AGM-330t(16.68mg/kg), PTX (각각 2mg/kg 및 10 mg/kg), AGM-330t-PTX(19.05mg/kg)를 처리한 5개의 군 (" = 5/group)으로 동물을 나누어, 비교 효능 연구를 수행하였다 (도 14B). 3주에 걸쳐 caliber 2021/234550 ?01/162021/054235근으로 일주일에 2회 부피를 측정함으로써 종양 성장을 모니터 링하였다. ▽ 6中8 -처리 마우스 및 61\/1-330 -처리 마우스는 평균 종양 부피에서 유의한 차이를 나타내지 않았으며, 이는 111、， 0 실험과 일치한다. 그러나,
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3301^1X（807 ± 90 미 19.05 미9/1<9, /? = 5） 처리 마우스의 평균 종양 부피는 동일한 용량의 ）（（1671 ± 199 미이3 2 이9/1<9, n = 5, P < 0.001） 처리 동물에 비해 대략 52% 감소했다. 또한, 61\/1-330니可）（-처리 마우스는 0|3 21에 ［可）（ -처리 마우스의 5배 증가된 용량과 비교하여 향상된 약물 효능을 나타냈다（988 ± 78 1下11下13 10 1下19/1<9, " = 5,戶 < 0.05）（도 14（1-1〕）. 상기 결과와 일치하여, 6 -330 （1.3 ± 0.1 9 19.05 미9/1<9） 처리 마우스의 최종 평균 종양 무게는 ）（（각각 2.1 ± 0.4 9 2 1下19/1<9 및 1.5 ± 0.1 으 아 10 1下19/1<9, " = 5）에 비해 현저하게 감소하였다（도 140. 또한, 절제된 종양의 조직학적 염색을 수행하였으며, 독립적인 병리학자가 슬라이드를 평가했다. 각각 H&E 염색,
Figure imgf000073_0002
분석에 의해 입증된 바와 같이, 61\/1-33야- ）（-처리 마우스로부터 절제된 중간 종양은 암성 세포 수의 감소 및 아포토시스 세포 핵의 증가를 나타냈다（도 141=니）. 대조적으로,
Figure imgf000073_0003
종양은 더 많은 수의 종양 세포를 함유하였고, 아포토시스의 징후는 거의 없었다. 또한, 마우스 체중은
Figure imgf000073_0004
투여와 비교하여 61\/1-330니31 투여에 의해 영향을 받지 않았으며, 혈액 화학 분석은 61\/1-330니可）（-처리 마우스에서 독성의 유해한 징후를 나타내지 않았다（도 15/\- |=）. 따라서, 이러한 발견은 6 -330의 종양 특이성이 검출 가능한 부작용 없이 ）（의 효능을 향상시킬 수 있음을 시사한다. 결과적으로, 본 발명에 따른 6!\/1 - 2021/234550 ?01/162021/054235
330은 암 치료에 대한 잠재적인 치료 약물 전달체가 될 수 있음을 시사한다. 면역원성의 영향을 감소시키기 위해, 61\/1-33야보다
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은 61\/1-33001-［可）（를 사용하여 항암 효능을 시험하였다（도 16/\）. 그 결고ᅡ, 61\/1-33001-［可）（-처리 마우스는 ［可）（ -처리 마우스와 비교하여 1니〔 라356 활성의 극적인 감소를 보여주었다（도 16（1- ）. 또한, 61\/1-33001- 처리는 ）（ -처리군과 비교하여, 종양의 부피 및 중량이 현저하게 감소되었다（도 16 （3）. 61\/1-330 -［可）（와 동일하게, 마우스 체중은 ▽6비리6 8¾ 투여와 비교하여 61\/1-33001- 투여에 의해 영향을 받지 않았다（도 16비. 61\/1-33001의 암 특이성은 ）（의 효능을 향상시켜, 종양 조직에서 치료 약물의 농도를 증가시킬 수 있다. 실시예 8: AGM-330과 CPP가 결합된 융합 펩타이드의 합성
AGM-330의 세포 투과성을 증가시키기 위하여, 세포투과성 펩타이드（Cell Penetrating Peptide; CPP）를 결합시켜 융합 핃!타이드를 제작하였다.
AGM-330t에 maleimide와 결합한 CPP（RIMRILRILKLAR; 서열번호 48）를 pH 7.0~_7.5에서 반응시키면, AGM-330t의 기능기인 thiol기와 thiol-maleimide reaction에 의해 결합되어 AGM-330t-mCPP 융합 펩타이드가 합성된다（도 17）. 제작된 AGM-330t-mCPP 융합 핃!타이드의 HPLC 및 MS 분석 결과, retention time 23.2분 및 분자량 7876 Da인 것을 확인하였으며, AGM-330t, maleimide- mCPP 의 분석 결과와 함께 도 18에 도시하였다. 2021/234550 ?01/162021/054235 ¬드의 세포독성 확인
Figure imgf000075_0001
이드의 세포독성을 조사하기 위하여, 1、/10=-7, 1\ /\-1\ -231,바-29, 1北ᅡ116 및 ? 1\1〔:-1을 포함하는 여러 암 세포와 띠18 （；0의 정상 세포에서 ^50 값을 평가했다（표 7）.
【표 7]
Figure imgf000075_0003
61\/1-330 ?? 융합 펩타이드의 ^50 값은 대장암 세포주 너_「-29 및 ᅡ 116에 대하여 각각 7.829 및 4.714^1 , 유방암 세포주 0=-7 및 0/\- 231에 대하여 각각 7.173 및 2아 이상을 나타냈다（
Figure imgf000075_0002
2021/234550 ?01/162021/054235 융합 펩타이드가 암세포 특이적인 억제 효과를 갖는 것을 의미한다. 실시예 10:
Figure imgf000076_0001
결합된 융합펩타이드의 / /I ^0암세포 아포토시스（3（30야0 5） 유도 효과확인 실시예 8에서 제작된
Figure imgf000076_0002
이드의 암 세포 아포토시스 유도 효과를 조사하기 위하여, 48시간 동안 CPR AGM-330t및 61\/1-330 〔??로 처리한 HCT-116, 1＜「-29 및 ＜；〔 -18〔:0세포를 /\ 6）＜ V및 미를 사용하여 염색하였다. 그 결고ᅡ, 암세포 특이적 아포토시스 유도 효과를 확인하였으며（도
Figure imgf000076_0003
결과, 농도-의존적 방식으로 아포토시스 촉진 단백질이 증가하는 것을 확인하였다（도 21）. 실시예 11: 61\/1-330 및 61\/1-330 -
Figure imgf000076_0004
실시예 8과 같은 방법에 의해 제작된 61\/1-330미배〔? 61\/1-33001 〔?? 및 61\/1-330뱌〔??융합 펩타이드 각각과 이들 조합의 세포독성을 조사하기 위하여, ¬네 氏 1＜「-29, 이1-/ 및 1\/10/\-1\/ -231에서 1〔:50값을 평가하였다.
AGM-330m-mCPR AGM -33001 -dCPP 및 61\/1-330 ［??융합 펩타이드의 1（；50 값은 대장암 세포주 니 에 대하여 각각 23.3, 5.47 및 3.791^을 나타냈으며, 바-29에 대하여 각각 20.67, 3.75 및 3.3 1\/1을 나타냈다. 유방암 세포주 이1-/에 대하여 각각 ＞20,4.208 및 3.802^1 을 나타냈으며, 0/\- 231에 대하여 각각 ＞20, 3.843 및 3.49 1\/1을 나타냈다（도 22）. 결과적으로, 6!\/1-330 -〔 융합 2021/234550 ?01/162021/054235 펩타이드가 암세포 특이적 억제 효과를 갖는 것을 확인할 수 있다. 61\/1-330미 및 61\/1-330미-미〔? 1\/1（3-33001 및 61\/1-33001 〔?? 그리고 61\/1-33야 및 61\/1-330니〔?? 융합 펩타이드 병용시, ^50 값은 대장암 세포주 1^ᅡ116에 대하여 각각 14.3, 4.25 및 3.15 1\/1을 나타냈으며, 바-29에 대하여 각각 14.2, 4.76 및 3.05!^을 나타냈다. 유방암 세포주 〔!=-7에 대하여 각각 18.7, 3.416 및 3.309 ᅵ\/1을 나타냈으며, 1\/10/\-1\/ -231에 대하여 각각 14.7, 3.662 및 3.258 ᅵ、/1을 나타냈다（도 23）. 결과적으로, 61\/1-330 및 61\/1-330 -〔 병용시에도 암세포 특이적 억제 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있다. 산업상 이용가능성 본 발명에서는 1\/^ 합성 방법
Figure imgf000077_0001
방법을 사용하여 스크리 닝한 61\/1 펩타이드 리간드 및 그 변이체들이 암 세포에 특이적으로 결합하며, 항암제와의 접합체가 암 성장을 억제하는 것을 확인하였다（/ *0 및 / >7 —）. 따라서, （11_-표적화
Figure imgf000077_0002
치료요법에서 진단 및 표적 약물 전달에 유용하게 이용될 수 있다. 이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범우 I가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 2021/234550 1^(:1^ 2021/054235 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

2021/234550 ?01/162021/054235 청구범위
【청구항 1 ] 다음의 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 뉴클레오린 니리근이 ; ⑴에 특이적으로 결합하는 61\/1 펩타이드:
(3) 서열번호 1 내지 서열번호 8 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열; 및
(비 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에서 하기의 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 변이를 포함하는 아미노산 서열:
0) 1\1-말단으로부터 5번째 메티오닌 잔기의 치환;
00 1\1-말단으로부터 7번째 타이로신 잔기의 치환; 및
(매 말단에 류신 또는 라이신 잔기의 삽입.
【청구항 2】 제 1항에 있어서, 상기 山)의 아미노산 변이를 포함하는 아미노산 서열은 서열번호 9 내지 서열번호 15 및 서열번호 20으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 6!\/1 펩타이드.
【청구항 3】 제 1항에 따른 AGM 핃!타이드와 폴리에틸렌 글리콜 (polyethylene glycol, PEG) 2021/234550 ?01/162021/054235 소 미가 접합된 0!\/1 핃!타이드- 드 접합체（〔이성니으 이.
【청구항 4】 제 3항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜 쇄는 2 내지 24개의 에틸렌 글리콜기를 포함하는 것을 특징으로 하는 6!\/1 펩타이드- 드 접합체.
【청구항 5】 제 3항에 있어서,
Figure imgf000080_0001
이드와 폴리에틸렌 글리콜 쇄는 링커를 통해 연결되는 것을 특징으로 하는 61\/1 펩타이드- 드 접합체.
【청구항 6】 제 3항에
Figure imgf000080_0002
이드- 드 접합체오ᅡ, 약물（바니 을 포함하는
Figure imgf000080_0003
핃!타이드- 드（3 -약물 접합체（（:이^ 이.
【청구항 7] 제 6항에 있어서, 상기 약물은파클리탁셀 리 ） 또는 도세탁셀（0100^3X61） 등의 탁솔（13X01） 및 탁산, 마이탄시노이드, 오리스타틴, 아미노프테린, 악티노마이신, 블레오마이신, 탈리소마이신, 캄프토쎄신, 8-아세틸 스퍼미딘, 1-（2 클로로에틸）- 1,2 -다이메틸 술포닐 하이드라자이드, 에스퍼라마이신, 에토포사이드, 2021/234550 ?01/162021/054235
6 -머캅토퓨린, 돌라스타틴, 트리코테센, 칼리케아미신, 메토트렉세이트, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 A, 미토마이신 C, 클로 람부실, 듀오카마이신, L-아스파라기나제 (L-asparaginase), 머캡토퓨린 (mercaptopurine), 티오구아닌 (thioguanine), 하이드륵시우레 아 (hydroxyurea), 시타라빈 (cytarabine), 사이클로포스파 미드 (cyclophosphamide), 이포스파미드 (ifosfamide), 니트로소우레아 (nitrosourea), 시스플라틴 (cisplatin), 카보플라틴 (carboplatin), 미토마이신 (mitomycin), 다카바진 (dacarbazine), 프로카바진 (procarbazine), 토포테 칸 (topotecan), 질소 머스터드 (nitrogen mustard), 사이톡산 (cytoxan), 알파- 아마니틴, 에토포시드 (etoposide), 5 -플루오로우라실 (5-fluorouracil), CNU(bischloroethyl nitrosourea), 이리노테칸 (irinotecan), 캄포토 테신 (campto仕 lecin), 블레오마이신 (bleomycin), 이다루비신 (idarubicin), 다우노루비신 (daunorubicin), 닥티노마이신 (dactinomycin), 플리 카마이신 (plicamycin), 미톡산트론 (mitoxantrone), 아스파라기나제 (asparaginase), 비노렐빈 (vinorelbine), 클로로람부실 (chlorambucil), 멜파란 (melphalan), 피롤로벤조디아제 ¾ 카르무스틴 (carmustine), 로무스 틴 (lomustine), 부설판 (busuLfan), 트레오설판 (treosulfan), 데카바진 (decarbazine), 에토포시드 (etoposide), 테니포시드 (teniposide), 토포 테칸 (topotecan), 9 -아미노캠프토테신 (9-aminocamptothecin), 크리스나톨 (crisnatol), 미토마이신 C(mitomycin C), 트리메트렉세이트 (trimetrexate), 마이코페놀산 (mycophenoHc acid), 티아조퓨린 (tiazofurin), 리바비린 (ribavirin),
Figure imgf000081_0001
2021/234550 ?01/162021/054235 하이드륵시우레아 (hydroxyurea), 데프륵사민 (deferoxamine), 플룩수리딘 (floxuridine), 독시플루리딘 (doxifluridine), 랄티트렉세드 (raltitrexed), 시타라빈 (cytarabine(ara C)), 시토신 아라비노시드 (cytosine arabinoside), 플루다·라·빈 (fludarabine), 드卜목시펜 (tamoxifen), 리·륵시펜 (raloxifene), 메게스트롤 (megestrol), 고세렐린 (goserelin), 류프롤리드 아세 테이트 (leuprolide acetate), 플루타미드 (flutamide), 바이칼루타마이드 (bicalutamide), EB1089, CB1093, KH1060, 베르베린, 베르테포르핀 (verteporfin), 커큐민, 아브락세인, 폴피리녹스, 옥살리플라틴, 젤로다 및 인돌카르복스아미드, 프탈로시아닌 (phthalocyanine), 튜블리신, 광감작제 Pe4(photosensitizer Pe4), 데메톡시-하이포크레린 A(demethoxy-hypocrellin A), 인터페론 -a(lnterferon-a), 인터페론 -Y(lnterferon-Y), 종양 괴사 인자 (tumor necrosis factor), 겜사이타빈 (Gemcitabine), 벨케이드 (velcade), 레발미드 (revamid), 탈라미드 (thalamid), 로바스타틴 (lovastatin),
1 -메틸- 4 -페닐피리디늄이온 (1 -methyl -4-phenylpyridiniumion), 스타우로스포린 (staurosporine), 악티노마이신 D(actinomycin D), 닥티노마이신 (dactinomycin), 블레오마이신 A2(bleomycin A2), 블레오마이신 B2(bleomycinB2), 페플로마이신 (peplomycin), 에피루비신 (epirubicin), 피라루비신 (pirarubicin), 조루비신 (zorubicin), 마이토산트론 (mitoxantrone), 베라파밀 (verapamil), 탑시가르긴 (thapsigargin), 핵산 분해 효소 및 세균이나 동식물 유래의 독소로이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 AGM 펩타이드- PEG-약물 접합체. 2021/234550 ?01/162021/054235
【청구항 8】 제 6항에 있어서,
Figure imgf000083_0001
이드-
Figure imgf000083_0002
접합체와 약물은 링커를 통해 연결되는 것을 특징으로 하는 61\/1 펩타이드- 드（］ -약물 접합체.
【청구항 9】 제 3항에
Figure imgf000083_0003
이드- 드 접합체를 2개 이상 포함하는 다량체（111」1미11아）.
【청구항 10】 제 9항에 있어서,
Figure imgf000083_0004
이드-
Figure imgf000083_0005
접합체를 포함하는 것을 특징으로 하는 다량체.
【청구항 11】 제 9항에 있어서, 상기 2개 이상의 61\/1 펩타이드- 드 접합체가 링커에 의해 서로 연결되는 것을 특징으로 하는 다량체.
【청구항 12】 제 9항의 다량체와 약물을 포함하는 다량체-약물 접합체
Figure imgf000083_0006
2021/234550 ?01/162021/054235
【청구항 13】 제 12항에 있어서, 상기 약물은 파클리탁셀 (paclitaxel) 또는 도세탁셀 (docetaxel) 등의 탁솔 (taxol) 및 탁산, 마이탄시노이드, 오리스타틴, 아미노프테린, 악티노마이신, 블레오마이신, 탈리소마이신, 캄프토쎄신, N8 -아세틸 스퍼미딘, 1 -(2 클로로에틸)- 1,2 -다이메틸 술포닐 하이드라자이드, 에스퍼라마이신, 에토포사이드, 6 -머캅토퓨린, 돌라스타틴, 트리코테센, 칼리케아미신, 메토트렉세이트, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 A, 미토마이신 C, 클로람부실, 듀오카마이신, L-아스파라기나제 (L-asparaginase), 머캡토퓨린 (mercaptopurine), 티오구아닌 (thioguanine), 하이드륵시우레아 (hydroxyurea), 시타라빈 (cytarabine), 사이클로포스파미드 (cyclophosphamide), 이포스파미드 (ifosfamide), 니트로소우레아 (nitrosourea), 시스플라틴 (cisplatin), 카보플라틴 (carboplatin), 미토마이신 (mitomycin), 다카바진 (dacarbazine), 프로카바진 (procarbazine), 토포테칸 (topotecan), 질소 머스터드 (nitrogen mustard), 사이톡산 (cytoxan), 알파- 아마니틴, 에토포시드 (etoposide), 5 -플루오로우라실 (5-fluorouracil), CNU(bischloroethyl nitrosourea), 이리노테칸 (irinotecan), 캄포토테신 (campto仕 lecin), 블레오마이신 (bleomycin), 이다루비신 (idarubicin), 다우노루비신 (daunorubicin), 닥티노마이신 (dactinomycin), 플리카마이신 (plicamycin), 미톡산트론 (mitoxantrone), 아스파라기나제 (asparaginase), 비노렐빈 (vinorelbine), 클로로람부실 (chlorambucil), 2021/234550 ?01/162021/054235 멜파란 (melphalan), 피롤로벤조디아제 ¾ 카르무스틴 (carmustine), 로무스틴 (lomustine), 부설판 (busuLfan), 트레오설판 (treosulfan), 데카바진 (decarbazine), 에토포시드 (etoposide), 테니포시드 (teniposide), 토포테칸 (topotecan), 9 -아미노캠프토테신 (9-aminocamptothecin), 크리스나톨 (crisnatol), 미토마이신 C(mitomycin C), 트리메트렉세이트 (trimetrexate), 마이코페놀산 (mycophenoHc acid), 티아조퓨린 (tiazofurin), 리바비린 (ribavirin), EICAR(5-ethynyl-1 -beta-Dribofuranosylimidazole-4-carboxamide), 하이드륵시우레아 (hydroxyurea), 데프륵사민 (deferoxamine), 플룩수리딘 (floxuridine), 독시플루리딘 (doxifluridine), 랄티트렉세드 (raltitrexed), 시타라빈 (cytarabine(ara C)), 시토신 아라비노시드 (cytosine arabinoside), 플루다·라·빈 (fludarabine), 드卜목시펜 (tamoxifen), 리·륵시펜 (raloxifene), 메게스트롤 (megestrol), 고세렐린 (goserelin), 류프롤리드 아세 테이트 (leuprolide acetate), 플루타미드 (flutamide), 바이칼루타마이드 (bicalutamide), EB1089, CB1093, KH1060, 베르베린, 베르테포르핀 (verteporfin), 커큐민, 아브락세인, 폴피리녹스, 옥살리플라틴, 젤로다 및 인돌카르복스아미드, 프탈로시아닌 (phthalocyanine), 튜블리신, 광감작제 Pe4(photosensitizer Pe4), 데메톡시-하이포크레린 A(demethoxy-hypocrellin A), 인터페론 -a(lnterferon-a), 인터페론 -Y(lnterferon-Y), 종양 괴사 인자 (tumor necrosis factor), 겜사이타빈 (Gemcitabine), 벨케이드 (velcade), 레발미드 (revamid), 탈라미드 (thalamid), 로바스타틴 (lovastatin),
1 -메틸- 4 -페닐피리디늄이온 (1 -methyl -4-phenylpyridiniumion), 스타우로스포린 (staurosporine), 악티노마이신 D(actinomycin D), 닥티노마이신 (dactinomycin), 블레오마이신 A2(bleomycin A2), 블레오마이신 2021/234550 ?01/162021/054235
62（ᅵ3|601 （ 1182）, 페플로마이신（peplomycin）, 에피루비신（6 10止＞1（「1）, 피라루비신（|3^10止）1（：||1）, 조루비신（¥10止＞ 11）, 마이토산트론（17111:0X311110116）, 베라파밀（verapamil）, 탑시가르긴
Figure imgf000086_0001
핵산 분해 효소 및 세균이나 동식물 유래의 독소로이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 다량체-약물 접합체.
【청구항 14】 제 13항에 있어서, 상기 다량체와 약물은 링커를 통해 연결되는 것을 특징으로 하는 다량체-약물 접합체.
【청구항 15】 제 3항에 따른 AGM 펩타이드- PEG 접합체오ᅡ, 세포투과성 펩타이드（Cell Penetrating Peptide; CPP）가 결합된 AGM ¾타이드- PEG-CPP 융합 ¾타이드.
【청구항 16】 제 15항에 있어서, 상기 세포투과성 펩타이드는 서열번호 31 내지 서열번호 80의 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 AGM 펩타이드- PEG-CPP 융합 펩타이드. 2021/234550 ?01/162021/054235
【청구항 1기 제 15항에 있어서, 상기 61\/1 펩타이드- 드 접합체와 세포투과성 펩타이드는 링커를 통해 연결되는 것을 특징으로 하는 61\/1 펩타이드- 드 - 융합 펩타이드.
【청구항 18】 제 9항의 다량체와 세포투과성 핃!타이드 (Cell Penetrating Peptide; CPP)가 결합된 다량체- CPP 융합 펩타이드.
【청구항 19】 제 1항 내지 제 3항에 따른 61\/1 펩타이드, 제 4항 내지 제 5항에 따른 61\/1 펩타이드- 드 접합체, 제 6항 내지 제 8항에
Figure imgf000087_0001
이드- 드 -약물 접합체, 제 9항 내지 제 11항에 따른 다량체, 제 12항 내지 제 14항에 따른 다량체- 약물 접합체, 제 15항 내지 제 17항에 따른 61\/1 펩타이드- £(3 - 융합 펩타이드 또는 제 18항에 따른 다량체- 융합 펩타이드를 포함하는 암 진단용 조성물.
【청구항 20】 제 1항 내지 제 3항에 따른 61\/1 펩타이드, 제 4항 내지 제 5항에 따른 61\/1 펩타이드- 드 접합체, 제 6항 내지 제 8항에
Figure imgf000087_0002
이드- 드 -약물 2021/234550 ?01/162021/054235 접합체, 제 9항 내지 제 11항에 따른 다량체, 제 12항 내지 제 14항에 따른 다량체 약물 접합체, 제 15항 내지 제 17항에 따른 61\/1 펩타이드- £(3 - 융합 펩타이드 또는 제 18항에 따른 다량체- 융합 펩타이드를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물.
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