JP5496220B2 - アルブミン結合ペプチド介在性の疾患標的化 - Google Patents

Description

優先権主張
本願は2009年4月17日に出願された米国仮出願第61/170,368号及び2008年12月5日に出願された同第61/120,234号の利益を主張する。これら両出願の内容は全て、参照することにより本明細書に組み込まれる。

発明の背景
システインに富む酸性分泌タンパク質（Secreted Protein, Acidic, Rich in Cysteines; SPARC）（オステオネクチンとしても知られる）は人体で発現する303アミノ酸のグリコプロテインである。

SPARCの発現は発生学的に調節されており、正常発生の間の又は傷害への応答の際のリモデリングしている組織中に優先的に発現する。例えば、Lane et al., FASEB J., 8, 163-173 (1994)を参照。例えば、ネズミ、ウシ、及びヒトの胚において、発生中の骨及び歯（主に、骨芽細胞、象牙芽細胞、軟骨膜線維芽細胞、及び分化中の軟骨細胞）において高レベルのSPARCタンパク質が発現する。SPARCは組織リモデリングの間の細胞とマトリクスとの相互作用、創傷修復、形態形成、細胞分化、細胞移動、及び血管形成（これらの過程が疾患状態に関連する場合を含む）においても重要な役割を果たす。例えば、SPARCは腎間質性線維症において発現し、また、ブレオマイシン誘導性肺線維症等の肺損傷に対する宿主応答において役割を果たす。

SPARCは多くの特性を有するが、そのうちの１つがアルブミンへの結合能である。例えば、Schnitzer, J. Biol. Chem., 269, 6072 (1994)を参照。この特性を使用した一例は、転移性乳癌の治療に適応とされたパクリタキセルの、FDAに承認された溶媒フリーの製剤であるアブラキサン（登録商標）（Abraxis BioScience, Inc., Santa Monica, California）である。「Nab-パクリタキセル」とも呼ばれるが、この活性（active）は、パクリタキセルに可逆的に結合し、それを内皮細胞を越えて輸送し、そして腫瘍の領域にパクリタキセルを濃縮するという、アルブミンの生来的な特性を利用する。より具体的には、薬物送達機構には、部分的に、グリコプロテイン60の仲介によるパクリタキセル結合アルブミンの内皮細胞トランスサイトーシス、及び、SPARCに結合したアルブミンによる腫瘍の領域における蓄積が関与する。nab-パクリタキセルは他のパクリタキセル製剤よりも有意に効果的でり、前者は、奏効率をほぼ倍増させ、疾患進行のための時間を増大させ、そして二次選択治療患者の生存率を増大させることが臨床研究により示されている。Gradishar, Expert Opin. Pharmacother 7(8):1041-53(2006)を参照。

発明の要旨
本発明は、活性物質にコンジュゲートしたペプチドリガンドドメインを含むコンジュゲート分子（「ペプチドリガンドドメイン含有コンジュゲート」）を含む組成物を提供し、ここで該ペプチドリガンドドメインは、配列番号１〜６７のペプチド、それらのホモログ及びそれらの組合せを含み、好ましくは、それらのうち、配列番号１、２、６６及び６７のペプチド、それらのホモログ及びそれらの組合せを含む。図１及び１１を参照。該ペプチドリガンドドメイン含有コンジュゲートは、２つ以上のペプチドを含んでいてもよく、各ペプチドは、１つ以上のアルブミン結合性ペプチドリガンドドメインを含み、各ペプチドリガンドドメインは、配列番号１〜６７からの１つ以上（one of more）のペプチド、それらのホモログ及びそれらの組合せを含み、好ましくは、それらのうち、配列番号１、２、６６及び６７のペプチド、それらのホモログ及びそれらの組合せを含む。

本発明はまた、動物の組織内における活性物質の分布を調節するための方法を提供し、該方法は、活性物質にコンジュゲートしたペプチドリガンドドメインを含むコンジュゲート分子を含む組成物を該動物に投与することを含み、ここで該ペプチドリガンドドメインは、配列番号１〜６７からの１つ以上（one of more）のペプチド、それらのホモログ及びそれらの組合せを含み、好ましくは、それらのうち、配列番号１、２、６６及び６７のペプチド、それらのホモログ及びそれらの組合せを含み、且つ、動物への該組成物の投与は、該活性物質を単独で投与した際に得られる組織分布とは異なる該活性物質の組織分布を生じる。望ましくは、この方法は、疾患部位における該活性物質の濃度の上昇を提供し、且つ／又は、該活性物質（コンジュゲートしていない形態）を該動物に投与した場合に提供されるであろう該活性物質の血中レベルよりも大きい、上昇したまたは延長された該血中レベルを提供する。

本発明は、組成物およびそれを使用するための方法を提供し、ここで該コンジュゲート分子は第二のペプチドリガンドドメインを更に含み、後者は、望ましくは、配列番号のペプチド、配列番号１、２、６６及び６７からの１つ以上（one of more）のペプチド、それらのホモログ及びそれらの組合せを含む。この第二のペプチドリガンドドメインは、第一のペプチドリガンド結合ドメインと同一のポリペプチド上にあってもよいし、又は別のポリペプチド上にあってもよい。

更に、本発明は、腫瘍の治療用のキットを提供し、該キットは、医薬製剤、及び、腫瘍の治療において該製剤を使用するための指示書（例、FDAの添付文書）を含み、該医薬製剤は、活性物質にコンジュゲートしたペプチドリガンドドメインを含むコンジュゲート分子を含み、且つ、該ペプチドリガンドドメインは、配列番号１〜６７からの１つ以上（one of more）のペプチド、それらのホモログ及びそれらの組合せを含み、好ましくは、それらのうち、配列番号１、２、６６及び６７のペプチド、それらのホモログ及びそれらの組合せを含む。

図１は、配列番号１、２及び６６を示す。 図２は、野生型全長SPARC及びSPARCのQ3変異体のアルブミン結合活性を示す。 図３は、SPARCのカテプシンK消化産物のポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す。 図４は、SPARCのアミノ酸配列におけるカテプシンKの切断部位及び生成するSPARCの3つのカテプシンK切断断片のアミノ酸配列を示す。 図５は、SPARCのアルブミン結合に対する、SPARCのカテプシンK前消化の影響を示す。 図６は、SPARCのC末端のシステイン欠乏ドメイン由来の例示的な15merペプチドを示す。 図７は、競合結合アッセイにおける、SPARCのC末端のシステイン欠乏ドメイン由来の15merペプチドの成績を示す。 図８は、SPARCのC末端のシステイン欠乏ドメイン由来の例示的なSPARC小断片ペプチド（太字で示す）を示す。 図９は、競合結合アッセイにおける、SPARC小断片ペプチドの成績を示す。 図１０は、ファージディスプレイスクリーニングの大まかな方法を示す。 図１１は、配列番号２〜６５のアミノ酸配列を含むアルブミン結合ペプチドについての、ファージディスプレイスクリーニングの結果を示す。

発明の詳細な説明
I.本発明はペプチドリガンドドメインを使用する

用語「ペプチドリガンドドメイン」は、アミノ酸配列であって、単独で、及び／又は、より大きなペプチド配列内に存在してもよく、且つ、他の生体分子に特異性を伴って結合するものを意味する。例えば、脂肪酸、ビリルビン、トリプトファン、カルシウム、ステロイドホルモン及び他の生理学的に重要な化合物のための主要な血液輸送系は、これらの生体分子の血清アルブミンへの結合を伴う。同様に、経内皮アルブミン輸送の第一段階として、アルブミンは内皮細胞表面のグリコプロテイン60に特異的に結合する。脂肪酸、ビリルビン、トリプトファン、カルシウム、ステロイドホルモン及びグリコプロテイン60に結合するアルブミンポリペプチド内の特定のアミノ酸は、「ペプチドリガンドドメイン」である。従って、アルブミンは「ペプチドリガンドドメイン含有ポリペプチド」である。本明細書で用いる場合、用語「アルブミン」は、任意の動物のアルブミン分子、特に、とりわけヒト血清アルブミンを含む任意の哺乳動物の血清アルブミンを含み、当該アルブミンは野生型又は実質的に野生型のアミノ酸配列のものである。「実質的に野生型のアミノ酸配列」のアルブミンは、「野生型」アルブミンの生体内機能の実質的に全てを保持している。

１つの態様において、本発明は配列番号１〜６５のいずれか１つ以上のアミノ酸配列をペプチドリガンドドメインとして含むポリペプチドを企図する。驚くべきことに、配列番号１〜６５のアミノ酸配列のペプチドは、ヒトアルブミンに高い親和性で結合することがわかった。本発明はこの発見を利用し、配列番号１〜６５を含むポリペプチド及びそれらのホモログの多様な用途を企図する。

１つの態様において、本発明は配列番号１（即ち、アミノ酸配列MYIFPVHWQFGQLDQ）をペプチドリガンドドメインとして含むポリペプチドを企図するが、これらのポリペプチドはヒトSPARCタンパク質のアミノ酸209〜223と同一である。驚くべきことに、配列番号１は、ヒトアルブミンに高い親和性で結合することがわかり、少なくとも部分的に、SPARCのアルブミン結合に関与するらしいことがわかった。本発明はこの発見を利用し、配列番号１を含むポリペプチドの多様な用途を企図する。

他の態様においては、本発明は配列番号２（即ち、アミノ酸配列KNHGATRTTRAS）をペプチドリガンドドメインとして含むポリペプチドを企図する。このペプチドはファージディスプレイ法でヒト血清アルブミン結合配列を単離することによって同定された。驚くべきことに、配列番号２は、ヒトアルブミンに高い親和性で結合することがわかった。本発明はこの発見を利用し、配列番号２を含むポリペプチドの多様な用途を企図する。

配列番号１〜６７からの１つ以上（one of more）のペプチド、それらのホモログ及びそれらの組合せ、好ましくはそれらのうち配列番号１、２、６６及び６７のペプチド、それらのホモログ及びそれらの組合せについて企図される用途としては、例えば：（１）アルブミン輸送系を用いることにより、治療剤を腫瘍に送達すること；及び（２）ヒトアルブミンへの強固な結合により、アルブミンと同様の安定な血漿動態で組成物を血漿コンパートメント中に隔離すること、が挙げられる。前者の用途のためには、アルブミン結合定数は、望ましくはアルブミンのもの（約0.7μM〜約700μMの平衡解離定数（Kd））と同じオーダーの大きさであることが望ましく、後者の用途のためには、アルブミン結合定数は、nM〜μMの範囲内（即ち、約0.7nM〜約7μMのKd）であることが望ましい。従って、本発明は、関連する結合パートナーについてのKdが、例えば約700μM以下、好ましくは約10μM以下、より好ましくは、更に最も好ましくは約100nM以下、そして最も好ましくは約10nM以下である、ペプチドリガンドドメインを提供する。

本発明の組成物及び方法による腫瘍への治療剤又は診断剤の送達は、任意の好適な方法（例えば、放射活性標識又は放射線不透過性標識を組成物に加え、適切且つ当業者に周知のように、イメージングすることが挙げられる）によりモニタリング及び測定され得る。血漿コンパートメント中の組成物の隔離は、例えば静脈穿刺（venupuncture）を含む任意の好適な方法によりモニタリングできる。

関連する態様において、本発明は活性物質にコンジュゲートしたポリペプチドリガンドドメインを含むコンジュゲート分子を含む組成物であって、ポリペプチドリガンドドメインが、配列番号１〜６７からの1つ以上のペプチドのホモログ、好ましくは配列番号１、２、６６及び６７のペプチドのホモログであるポリペプチドを含む、組成物も提供する。用語「ホモログ」は元の配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、元の配列が示す特性と実質的に同様の関連する特性を示すポリペプチドを意味する。そのような特性の１つの例は、活性物質の組織分布を調節する能力であり、配列番号１又は２又は６６のホモログは、配列番号１又は２又は６６により提供される調節と実質的に同レベルの調節を提供できるであろう。この関係で、例えば、そして望ましくは、そのような実質的に同様の調節を示す配列番号１又は２又は６６のホモログは、配列番号１〜６７により提供される血中レベルに対して、少なくとも約80％、好ましくは少なくとも約85％、より好ましくは少なくとも約90％、そして最も好ましくは少なくとも約95％の活性物質の血中レベルを提供するであろう。或いは、用語「ホモログ」は例えば、配列番号１の少なくとも11個の連続するアミノ酸のペプチド配列又は配列番号２の少なくとも8個の連続するアミノ酸のペプチド配列も指す。

そのような特性の他の例は、例えば、アルブミン結合のKdが約700μM以下、好ましくは約10μM以下、より好ましくは、更により好ましくは約100nM以下、そして最も好ましくは約10nM以下である、配列番号１〜６７のホモログのペプチドリガンドドメインである。

元の配列に対する変更に関して、元の配列のホモログは望ましくは、元の配列と少なくとも約80％同一であり、好ましくは元の配列と少なくとも約90％同一であり、更により好ましくは元の配列と少なくとも約95％同一であり、そして最も好ましくは元の配列と少なくとも約99％同一である。また同様に、配列番号３〜６５は本発明に従って使用され得るホモログ、即ち元の配列と少なくとも約80％同一であり、好ましくは元の配列と少なくとも約90％同一であり、更により好ましくは元の配列と少なくとも約95％同一であり、そして最も好ましくは元の配列と少なくとも約99％同一であるペプチド配列も有し得る。更なる特定の例として、そして（配列番号１により記載されたような）15アミノ酸配列に関係して、ホモログは望ましくは元の配列中に存在するアミノ酸の少なくとも11個を含み、好ましくはそのようなアミノ酸の少なくとも12個を含み、より好ましくはそのようなアミノ酸の少なくとも13個、そして最も好ましくはそのようなアミノ酸の少なくとも14個を含むであろう。同様に、（配列番号２により記載されたような）12アミノ酸配列に関係して、ホモログは望ましくは元の配列中に存在するアミノ酸の少なくとも8個を含み、好ましくはそのようなアミノ酸の少なくとも9個を含み、より好ましくはそのようなアミノ酸の少なくとも10個、そして最も好ましくはそのようなアミノ酸の少なくとも11個を含むであろう。また同様に、配列番号３〜６５は本発明に従って使用され得るホモログ、即ち元の配列中に存在するアミノ酸の少なくとも8個を含む、好ましくはそのようなアミノ酸の少なくとも9個を含む、より好ましくはそのようなアミノ酸の少なくとも10個、そして最も好ましくはそのようなアミノ酸の少なくとも11個を含むホモログを有し得る。

本明細書で使用する場合、「配列同一性のパーセンテージ」は、比較ウィンドウ上で最適に並べられた2配列を比較することにより決定された値を意味する。更に、比較ウィンドウ中のポリペプチド配列の一部分は、2配列を最適に並べるために、参照配列（付加又は欠失を含まない）に対して、付加又は欠失（すなわち、ギャップ）を含むことができる。パーセンテージは、両配列においてアミノ酸残基が同一である位置の個数を決定して、マッチした位置の個数を得、マッチした位置の個数を比較ウィンドウ中の位置の総数で除し、その結果に100を乗じて配列同一性のパーセンテージを得ることにより、算出される。好ましくは、最適アラインメントは、Needleman及びWunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443 453のホモロジーアラインメントアルゴリズムを用いて行われる。

ホモログが同一のアミノ酸を含有しない場合、変異はアミノ酸の保存的な変化のみを生じることも望ましい。すなわち、同一でない残基の位置の差異は、アミノ酸残基が同様の化学的性質（例、電荷又は疎水性）を有する他のアミノ酸残基と置換され、従って分子の機能特性が変化しないようなものである。保存的置換で配列が異なる場合、配列同一性のパーセンテージは、置換の保存的な性質のための訂正をするために上方に調整され得る。そのような保存的置換によって相違する配列は、「配列類似性」又は「類似性」を有するという。この調整をするための手段は、当業者には周知である。

本発明の文脈における「保存的な」アミノ酸の置換又は変化の意味するところをさらに例示するために、グループA〜Fを以下に列挙する。以下のグループのメンバーの１つを、同じグループの別のメンバーにより交換することは、「保存的な」置換であるとみなされる。

グループAは、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、システイン（cysteinee）、トレオニン、及び以下の側鎖を有する修飾アミノ酸を含む：エチル、イソブチル、-CH2CH2OH、-CH2CH2CH2OH、-CH2CHOHCH3、及びCH2SCH3。

グループBは、グリシン、アラニン、バリン、セリン、システイン（cysteinee）、トレオニン、及びエチル側鎖を有する修飾アミノ酸を含む。

グループCは、フェニルアラニン、フェニルグリシン、チロシン、トリプトファン、シクロヘキシルメチル、及び置換ベンジル又はフェニル側鎖を有する修飾アミノ残基を含む。

グループDは、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸若しくはアスパラギン酸の、置換若しくは非置換の、脂肪族、芳香族若しくはベンジルエステル(例、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、シクロヘキシル、ベンジル、若しくは置換ベンジル)、グルタミン、アスパラギン、CO-NH-アルキル化グルタミン若しくはアスパラギン(例、メチル、エチル、n-プロピル、及びイソプロピル)、及び側鎖-(CH2)3COOHを有する修飾アミノ酸、それらのエステル(置換若しくは非置換の、脂肪族、芳香族、若しくはベンジルエステル)、それらのアミド、及びそれらの置換若しくは非置換のN-アルキル化アミドを含む。

グループEは、ヒスチジン、リジン、アルギニン、N-ニトロアルギニン、p-シクロアルギニン、g-ヒドロキシアルギニン、N-アミジノシトルリン、2-アミノ（2-arnino）グアニジノブタン酸、リジンのホモログ、アルギニンのホモログ、及びオルニチンを含む。

グループＦは、セリン、トレオニン、システイン（cysteinee）、及び-OH若しくは-SHで置換されたCl-C5直鎖若しくは分岐鎖アルキル側鎖を有する修飾アミノ酸を含む。

本発明は更に、コンジュゲート分子を含む組成物を提供し、ここで該コンジュゲート分子は、活性物質にコンジュゲートしたペプチドリガンドドメインを含み、該ペプチドリガンドドメインは、アミノ末端又はカルボキシ末端或いは両末端に付加された、更なる最大約50アミノ酸、好ましくは更なる最大約25アミノ酸、より好ましくは更なる最大約15アミノ酸、そして最も好ましくは更なる最大約10アミノ酸を含む。結果生じる、本発明によるポリペプチドとしては、全長50個未満、40個未満、30個未満、25個未満又は20個未満のアミノ酸のポリペプチドが挙げられる。

本発明は、コンジュゲート分子を含む組成物を更に提供し、該コンジュゲート分子は、活性物質にコンジュゲートしたペプチドリガンドドメインを含み、例えば配列番号１又は２、１及び２或いはそれらのホモログを含む1つの複数の（one multiple）ペプチドリガンドドメインペプチドが存在する。

本発明は更に、単離されたポリヌクレオチドであって、ペプチドリガンド結合ドメインのアミノ酸配列を有するポリペプチド（前記の更なるアミノ酸がアミノ末端及び／又はカルボキシル末端に付加されているものを含む）をコードするものを提供する。

II.ペプチドリガンドドメインの製造方法

本発明により提供されるペプチドリガンドドメイン含有ポリペプチドは、公知の技術を用いて合成し、検出し、定量し、及び精製することができる。例えば、外因性のペプチドリガンドドメイン含有ポリペプチドを発現する細胞の作製は、cDNAを強力なプロモーター／翻訳開始の制御下に置き、ベクターを好適な原核細胞又は真核細胞にトランスフェクト又は形質転換して、当業者に周知の方法によりペプチドリガンドドメイン含有ポリペプチドの発現を駆動することにより行うことができる。或いは、ペプチドリガンドドメイン含有ポリペプチドの作製は、当業者に周知の方法により化学的に行なうことができる。

ペプチドリガンドドメイン含有ポリペプチドは、標準的な固相合成により作製できる。一般に知られているように、必要な長さのペプチドの作製は、市販の器具及び試薬を用いて、邪魔な基のブロック、反応させるアミノ酸の保護、反応しない残基のカップリング、脱保護及びキャッピングに関する製造者の指示に従って行うことができる。適切な器具は、例えば、Applied BioSystems, Foster City, CA又はBiosearch Corporation, San Raphael, CAから入手できる。

例えば、該ペプチドは、適切に側鎖を保護されたt-ブトキシカルボニル−アルファ−アミノ酸を使用して標準的な自動固相合成プロトコルを用いて合成される。完成したペプチドを、固相支持体から除去し、それと同時に、標準的なフッ化水素法を用いて、側鎖の脱保護を行う。粗精製ペプチドを、更に、セミ分取（semi-preparative）逆相-HPLC（Vydac C18）によって、0.1%のトリフルオロ酢酸（TFA）中のアセトニトリル勾配を用いて精製する。ペプチドを真空乾燥させることによりアセトニトリルを除去し、そして、0.1%TFA水溶液から凍結乾燥させる。純度を分析RP-HPLCによって確認する。ペプチドは、凍結乾燥でき、後に水又は0.01Mの酢酸中に重量1〜2mg/mLの濃度で溶解できる。

前記の合成方法の使用は、コードされていないアミノ酸又はD型のアミノ酸がペプチド中にある場合に必要となる。しかし、遺伝子にコードされるペプチドに関しては、市販の発現システムで容易に合成されるDNA配列を使用する組換え技術を用いることもできる。

従って、本発明は、ペプチドリガンドドメイン含有ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の発現を制御する因子を含む（comprising the comprising）組換えベクターを提供する。更に、本発明は、ペプチドリガンドドメイン含有ポリペプチドをコードする核酸を含む細胞であって、原核細胞又は真核細胞である細胞を提供する。微生物培養及び組織培養の方法は当業者に周知である(例えば、Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2001), pp. 16.1- 16.54を参照)。従って本発明は：（a）請求項１のポリペプチドをコードする核酸により細胞を形質転換すること；（b）形質転換された細胞による該ポリペプチドの発現を誘導すること；及び（c）該ポリペプチドを精製することを含む、ペプチドリガンドドメイン含有ポリペプチドの製造方法を提供する。

タンパク質の発現はRNAの転写レベルに依存し、更に、RNAの転写レベルは、DNAシグナルにより調節されている。同様に、mRNAの翻訳は、最低でも、AUG開始コドン（これは通常、メッセージの5’末端の10から100ヌクレオチド内に位置する）を必要とする。AUG開始コドンに隣接する配列はその認識に影響することが示されている。例えば真核リボソームによる認識のために、完全な「コザックコンセンサス」配列に一致する配列中に埋め込まれたAUG開始コドンは、最適な翻訳をもたらす（例えば、Kozak, J. Molec. Biol. 196: 947-950 (1987)を参照）。また、細胞における外因性核酸の発現を成功させるためには、生じるタンパク質の翻訳後修飾が必要とされ得る。

本明細書中に記載された核酸分子は、好適なプロモーター（例えば、真核細胞において機能的なプロモーター）に作動可能に連結されたコーディング領域を含むことが好ましい。RSVプロモーター及びアデノウイルス主要後期プロモーター等（これらに限定されない）のウイルスプロモーターが、本発明において使用され得る。好適な非ウイルスプロモーターとしては、ホスホグリセロキナーゼ（PGK）プロモーター及び伸長因子1αプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。非ウイルスプロモーターは、望ましくはヒトプロモーターである。付加的な機能、発現レベル又は発現パターンを提供するために、更なる好適な遺伝因子（これらの多くは当該技術分野において公知である）を本発明の核酸及びコンストラクトに連結又は挿入することもできる。

更に、本明細書中に記載される核酸分子は、転写を促進するためにエンハンサーに作動可能に連結され得る。エンハンサーは、隣接遺伝子の転写を刺激する、DNAのシス作用性因子である。多数の種からの多数の異なる細胞型において、連結された遺伝子に対して高レベルの転写を付与するエンハンサーの例としては、SV40及びRSV-LTRからのエンハンサーが挙げられるが、これらに限定されない。そのようなエンハンサーは、細胞型特異的な効果を有する他のエンハンサーと組み合わせられてもよく、又は任意のエンハンサーが、単独で使用されてもよい。

真核細胞におけるタンパク質産生を最適化するために、本発明の核酸分子は、この核酸分子のコーディング領域の後にポリアデニル化部位を更に含み得る。また、全ての適切な転写シグナル（及び必要に応じて翻訳シグナル）は、外因性核酸が導入される細胞中で適切に発現するように正しく配置されるのが好ましいであろう。所望の場合、外因性核酸はまた、インフレームの全長転写産物を維持しながらmRNA産生を促進するために、スプライス部位（即ち、スプライスアクセプター部位及びスプライスドナー部位）を組み込み得る。更に、本発明の核酸分子は、プロセシング、分泌、細胞内局在等のための適切な配列を更に含み得る。

核酸分子は、任意の好適なベクターに挿入され得る。好適なベクターとしてはウイルスベクターが挙げられるが、これに限定されない。好適なウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、アルファウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、及び鶏痘ウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。ベクターは好ましくは、真核細胞（例えば、CHO-K1細胞）を形質転換するための、天然の又は遺伝子改変による能力を有する。更に、本発明に関して有用なベクターは、プラスミド若しくはエピソームのような「裸の」核酸ベクター（即ち、ベクターを封入するタンパク質、糖、及び／又は脂質をほとんど又は全く有さないベクター）であり得、又はベクターは、他の分子と複合体化され得る。本発明の核酸と好適に組み合わせられ得る他の分子としては、ウイルス被膜、陽イオン性脂質、リポソーム、ポリアミン、金粒子、及び細胞分子を標的化するリガンド、受容体、又は抗体などの標的化部分が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書中に記載される核酸分子は、好適ないずれかの細胞、典型的には、例えば、CHO、HEK293又はBHK等の真核細胞に形質転換でき、望ましくは、例えば、本明細書中に記載のとおりの、配列番号１又は２を含むポリペプチド或いはそれらの変異体又はホモログ（hoomolog）等のペプチドリガンドドメイン含有ポリペプチドの発現をもたらす。細胞を培養して、該核酸分子の発現、ひいては、例えば、本明細書中に記載のとおりの、配列番号１又は２のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれらのホモログ等のペプチドリガンドドメイン含有ポリペプチドの生成をもたらすことができる。

従って、本発明は、本明細書中に記載の本発明の核酸分子で形質転換又はトランスフェクトされた細胞を提供する。外因性DNA分子で細胞を形質転換又はトランスフェクトする手段は、当該技術分野で周知である。例えば、以下に限定されるものではないが、DNA分子の細胞内への導入は、当該技術分野で周知の標準的な形質転換又はトランスフェクション技術（例えばリン酸カルシウム又はDEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、プロトプラスト（protoblast）融合、エレクトロポレーション、リポソーム及び直接的マイクロインジェクションなど）を使用して行われる（例えば、Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, ColdSpring HarborLaboratory Press, New York(2001), pp. 1.1-1.162, 15.1-15.53, 16.1- 16.54を参照）。

形質転換法の別の例は、プロトプラスト融合法であり、高コピー数の目的のプラスミドを保有する細菌由来のプロトプラストが、培養哺乳動物細胞と直接混合される。細胞膜の融合（通常ポリエチレングリコールを用いる）の後、細菌の内容物が哺乳動物細胞の細胞質中に伝達され、プラスミドDNAが核へ移行する。

エレクトロポレーション（種々の哺乳動物細胞及び植物細胞への短時間の高電圧の電気パルスの印加）は、原形質膜にナノメートルサイズの孔を形成させる。DNAは、これらの孔を通過するか、又は孔の閉鎖に伴う膜成分の再分布の結果として、細胞の細胞質中に直接取り込まれる。エレクトロポレーションは極めて効率的であり得、クローンの遺伝子の一過性の発現、及び、目的の遺伝子のコピーを組み込んで保有する細胞株の樹立の両方のために用いられ得る。

そのような技術は、真核細胞の安定的な形質転換及び一過性の形質転換の両方のために用いられ得る。安定的に形質転換された細胞の単離には、目的の遺伝子での形質転換と併せて選択マーカーの導入が必要である。そのような選択マーカーとしては、ネオマイシンへの耐性を付与する遺伝子、及びHPRT陰性細胞におけるHPRT遺伝子が挙げられる。選択には、少なくとも約2〜7日間、好ましくは少なくとも約1〜5週間の、選択培地中での長期培養が必要とされ得る（例えば、Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2001), pp. 16.1-16.54を参照）。

ペプチドリガンドドメイン含有ポリペプチドは、組換え宿主細胞から発現し得、精製され得る。組換え宿主細胞としては、原核細胞であっても、真核細胞であってもよいが、E. coli等の細菌、酵母等の真菌細胞、ショウジョウバエ又はカイコ由来の細胞株が挙げられるが、これらに限定されない昆虫細胞、並びに哺乳動物細胞及び細胞株が挙げられるが、これらに限定されない。細胞（例、ヒト細胞）においてペプチドリガンドドメイン含有ポリペプチドを発現する場合、生体外であろうと生体内であろうと、ペプチドをコードするそのようなポリヌクレオチド用に選択されるコドンは、所定の細胞型（即ち、種）のために最適化され得る。コドン最適化のための多くの技術が当該技術分野で公知である（例えば、Jayaraj et al, Nucleic Acids Res. 33(9):3011-6 (2005); Fuglsang et al., Protein Expr. Purif. 31(2):247-9 (2003); Wu et al., "The Synthetic Gene Designer: a Flexible Web Platform to Explore Sequence Space of Synthetic Genes for Heterologous Expression," csbw, 2005 IEEE Computational Systems Bioinformatics Conference - Workshops (CSBW’05), pp. 258-259 (2005)を参照。）。

ペプチドリガンドドメイン含有ポリペプチドは、組換え宿主細胞から発現され得、精製され得る。組換え宿主細胞としては、原核細胞であっても、真核細胞であってもよいが、E. coli等の細菌、酵母等の真菌細胞、ショウジョウバエ又はカイコ由来の細胞株が挙げられるが、これらに限定されない昆虫細胞、並びに哺乳動物細胞及び細胞株が挙げられるが、これらに限定されない。細胞（例、ヒト細胞）においてペプチドリガンドドメイン含有ポリペプチドを発現する場合、生体外であろうと生体内であろうと、ペプチドをコードするそのようなポリヌクレオチド用に選択されるコドンは、所定の細胞型（即ち、種）のために最適化され得る。コドン最適化のための多くの技術が当該技術分野で公知である（例えば、Jayaraj et al, Nucleic Acids Res. 33(9):3011-6 (2005); Fuglsang et al., Protein Expr. Purif. 31(2):247-9 (2003)を参照）。原核生物における最適なポリペプチド発現のために考慮されなければならない問題としては、使用される発現系、宿主株の選択、mRNAの安定性、コドンのバイアス、封入体の形成及び阻害、融合タンパク質及び部位特異的タンパク質分解、コンパートメントに向けた分泌が挙げられる。（参照することにより本明細書に組み込まれるSorensen et al., Journal of Biotechnology 115 (2005) 113-128を参照）。

通常、発現は系に適合する遺伝的バックグラウンドにより保有されるプラスミドから誘導される。発現プラスミドの遺伝学的要素としては、複製起点（ori）、抗生物質耐性マーカー、転写プロモーター、翻訳開始領域（TIR）並びに転写及び翻訳のターミネーターが挙げられる。

任意の好適な発現系が用いられ得る。例えば、Escherichia coliは、その相対的な単純さ、高密度培養、遺伝学的な周知性及び適合するツール（ポリペプチドの発現用に利用できる様々な利用可能なプラスミド、組換え融合パートナー及び変異株が挙げられる）が多くあることにより、タンパク質発現を容易にする。組換え発現用のE. coliの株又は遺伝的バックグラウンドは非常に重要である。発現株は、最も有害な天然プロテアーゼを欠損し、発現プラスミドを安定的に維持し、且つ発現系（例、DE3）に関連する遺伝学的要素を付与しなくてはならない。

プラスミドのコピー数は、リラックスしたした様式で複製することが好ましい複製起点により制御される（Baneyx, 1999）。現代の発現プラスミド中に存在するColE1レプリコンは、pBR322（コピー数15-20）又はpUC（コピー数500-700）ファミリーのプラスミドに由来するが、p15AレプリコンはpACYC184（コピー数10-12）に由来する。組換え発現プラスミドにおける最も一般的な薬剤耐性マーカーは、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール又はテトラサイクリンに対する耐性を付与する。

E. coliの発現系としては、T7ベースのpET発現系（Novagenにより市販）ラムダPLプロモーター/cIリプレッサー（例、Invitrogen pLEX）、Trcプロモーター（例、Amersham Biosciences pTrc）、Tacプロモーター（例、Amersham Biosciences pGEX）及びハイブリッドlac/T5（例、Qiagen pQE）及びBADプロモーター（例、Invitrogen pBAD）が挙げられる。

転写されたメッセンジャーRNAの、翻訳開始領域（TIR）からの翻訳開始には、Shine-Dalgarno（SD）配列を含むリボソーム結合部位（RBS）及び翻訳開始コドンが必要である。Shine-Dalgarno配列は、開始コドン（それは、効率的な組換え発現系においては、標準のAUGである）から7±2ヌクレオチド上流に位置する。最適な翻訳開始は、SD配列（UAAGGAGG）を有するmRNAより得られる。

E. coliにおけるコドン使用頻度は、細胞質中で利用可能な関連するアミノアシル化tRNAのレベルを反映する。メジャーコドンは高発現遺伝子中に存在する一方、マイナー又はレアなコドンは、低レベルで発現する遺伝子中にある傾向がある。E. coliにおいてレアなコドンが、真核生物、古細菌、及びコドン頻度の嗜好性が異なる遠縁のその他の生物等のソースからの異種遺伝子中に多いことが、しばしばある(Kane, 1995)。レアなコドンを含有する遺伝子の発現は、マイナーなコドンのtRNAに結合したアミノ酸の取り込みを要する部位でリボソームがストールする結果、翻訳の誤りをもたらし得る（McNulty et al., 2003）。レアコドンをダブレット及びトリプレット等のクラスターで含む転写産物が、大量に蓄積する場合に、組換え発現系においてコドンバイアスの問題がよく見られるようになる。

タンパク質の活性は、正確な３次元構造へのフォールディングを必要とする。熱ショック等のストレス状態により生体内でのフォールディングが損なわれ、フォールディング中間体は、結合して封入体と呼ばれる不定形のタンパク質顆粒となる傾向がある。

封入体は、構造的に複雑な一連の凝集体であり、組換えタンパク質が高率で発現する場合に、ストレス応答として生じるとしばしば考えられている。E. coliの細胞質における、200〜300mg/mlの濃度でのタンパク質の巨大分子的な込み合いは、特に高レベルの組換え発現の間の非常に好ましくないタンパク質のフォールディング環境を示唆する(van den Berg et al., 1999)。封入体の形成が、フォールディングされていない鎖上の露出した区画間の疎水的相互作用によって起こる受動的なイベントによるのか、それとも特定のクラスター化機構によるのかは知られていない(Villaverde and Carrio, 2003)。精製された凝集体は、尿素及び塩酸グアニジン等の界面活性剤を用いて可溶化され得る。天然タンパク質は、希釈、透析、又はカラム上のリフォールディング法のいずれかによる、可溶化した封入体からの生体外でのリフォールディングによって調製され得る(Middelberg, 2002; Sorensen et al., 2003a)。

リフォールディングの戦略は、分子シャペロンを含めることにより改善され得る(Mogk et al., 2002)。しかしながら、所定のタンパク質についてのリフォールディング手順の最適化は、時間を要する努力を必要とし、また生成物の高い収率を常にもたらすわけではない。封入体の形成を防止するための一つの可能な戦略は、分子シャペロンの過剰な共発現である。

組換えタンパク質の精製及び発現を単純化するために、広範なタンパク質融合パートナーが開発されている(Stevens, 2000)。融合タンパク質又はキメラタンパク質は、通常、パートナー、又は「タグ」を含み、これは、特異的プロテアーゼ用の認識部位によりパッセンジャータンパク質又は標的タンパク質に連結されている。大抵の融合パートナーは特特異的親和性による精製の戦略用に利用されている。融合パートナーは、生体内においても有益であり、それらは、パッセンジャーを細胞内タンパク質分解から保護する可能性があり(Jacquet et al., 1999; Martinez et al., 1995)、溶解度を亢進する可能性があり(Davis et al., 1999; Kapust and Waugh, 1999; Sorensen et al., 2003b)、又は特異的な発現のレポーターとして用いられ得る(Waldo et al., 1999)。mRNAの安定化の結果として、N末端の融合パートナーから、発現が乏しいパッセンジャーへと高発現レベルが移ることがしばしばあり得る(Arechaga et al., 2003)。一般的なアフィニティータグとしては、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)と適合性があるポリヒスチジンタグ（His-タグ）及びグルタチオンベースの樹脂での精製用のグルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）タグである。他のアフィニティータグがいくつか存在し、それらは広範にわたって総説されている(Terpe, 2003)。

組換え発現タンパク質は、原則的に、異なる3つの場所、即ち細胞質、ペリプラズム、又は培養培地に向かい得る。様々な利点及び欠点が、組換えタンパク質が特定の細胞コンパートメントに向かうことと関連する。細胞質における発現は、生産収率が高いため、通常は好ましい。E. coli中ではジスルフィド結合形成は隔離され、Dsb系によりペリプラズムにおいて盛んに触媒される（Rietsch and Beckwith, 1998）。細胞質におけるシステインの還元は、チオレドキシン及びグルタレドキシンにより達成される。チオレドキシンはチオレドキシンレダクターゼにより、グルタレドキシンはグルタチオンにより、還元状態に保たれる。低分子量のグルタチオン分子は、グルタチオンレダクターゼにより還元される。2つのレダクターゼをコードするtrxB及びgor遺伝子を破壊すると、E. coli細胞質においてジスルフィド結合の形成が可能になる。

細胞ベースの発現系は、生成タンパク質の質及び量の観点では欠点があり、ハイスループット生産用に必ずしも適切とは限らない。これらの不十分な点の多くは、無細胞翻訳系の使用により回避され得る。

生体外の遺伝子発現用及びタンパク質合成用の無細胞系が、多くの種類の原核生物の系及び真核生物の系に関して記載されている（Endo & Sawasaki Current Opinion in Biotechnology 2006, 17:373-380を参照）。ウサギ網膜細胞ライセート及びコムギ胚芽エキス等の真核生物無細胞系は、生体外で転写されたRNAテンプレートの翻訳に必要な構成成分の全てを含有する未精製抽出物から調製される。真核生物無細胞系は、生体内又は生体外で合成された単離RNAを、翻訳反応用のテンプレートとして用いる（例、Rabbit Reticulocyte Lysate Systems又はWheat Germ Extract Systems）。共役型（Coupled）の真核生物無細胞系は、原核生物型のファージRNAポリメラーゼを真核生物の抽出物と組み合わせ、外来DNA又はPCRで生成したテンプレートを、生体外のタンパク質合成のためにファージプロモーターと共に用いる（例、TNT（登録商標）Coupled Reticulocyte Lysate）。

TNT（登録商標）Coupled Systemsを用いて翻訳されたタンパク質は、多くのタイプの機能解析において用いられ得る。TNT（登録商標）Coupled Transcription/Translationの反応は、従来、オープンリーディングフレームを確認するため、タンパク質の変異を研究するため、及び、そしてタンパク質-DNA結合の研究用、タンパク質活性のアッセイ用、又はタンパク質-タンパク質相互作用の研究用に、タンパク質を生体外で作製するために用いられてきた。最近、TNT（登録商標）Coupled Systemsを用いて発現させたタンパク質は、酵母ツーハイブリッド相互作用を確認するためのアッセイ、生体外発現クローニング（IVEC）を行うためのアッセイ、及び、酵素活性又はタンパク質修飾のアッセイ用のタンパク質基質を作製するためのアッセイにおいても用いられている。種々の応用においてTNT（登録商標）Coupled Systemsを用いた最近の引用文献のリストについては、www.promega.comを参照されたい。

精製されたペプチドリガンドドメイン含有ポリペプチドの溶解度は、当該技術分野で公知の方法によって向上され得る。例えば、（例えば、E. coli中で）発現したタンパク質の溶解性を増大させるために、Georgiou & Valax（Current Opinion Biotechnol. 7: 190-197 (1996)）に記載されているように、増殖温度を低下させ、より弱いプロモーターを使用し、より低いコピー数のプラスミドを使用し、誘導因子濃度を低下させ、増殖培地を変えることによって、タンパク質の合成速度を低下させることができる。これは、タンパク質の合成速度を低下させ、通常、より溶解性の高いタンパク質が得られる。また、適切なフォールディング若しくはタンパク質の安定性に必須な補欠分子族（prostethic groups）又は補因子を添加してもよいし、或いは、緩衝液を添加して増殖の間の培地中のpHの変動を制御してもよいし、或いは1%グルコースを添加してラクトース（これは、ほとんどの栄養豊富な培地（例えばLB、2xYT等）中に存在する）によるlacプロモーターの誘導を抑制してもよい。ポリオール（例えば、ソルビトール）及びスクロースを培地に添加してもよい。それらの添加に起因する浸透圧の上昇は、細胞において浸透圧保護因子の蓄積を引き起こし、これがネイティブなタンパク質の構造を安定化するためである。エタノール、低分子量チオール類及びジスルフィド類、並びにNaClを添加してもよい。更に、シャペロン及び／又はフォールダーゼを、所望のポリペプチドと共発現させてもよい。分子シャペロンは、フォールディング中間体と一過的に相互作用することによって、適切な異性化及び細胞内標的化を促進する。E. coliのシャペロン系としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：GroES-GroEL、DnaK-DnaJ-GrpE、CIpB。

フォールダーゼは、フォールディング経路における律速段階を加速する。3つの型のフォールダーゼが、重要な役割を果たしている。ペプチジルプロリルシス／トランスイソメラーゼ（PPI’s）、ジスルフィドオキシドレダクターゼ（DsbA）及びジスルフィドイソメラーゼ（DsbC）、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（PDI）（これは、タンパク質のシステインの酸化及びジスルフィド結合の異性化の両方を触媒する真核生物のタンパク質である）である。これらのタンパク質の1つ以上と標的タンパク質との共発現は、より高いレベルの可溶性標的タンパク質を生じ得る。

ペプチドリガンドドメイン含有ポリペプチドは、その溶解性及び産生量を向上するために、融合タンパク質として産生され得る。融合タンパク質は、インフレームで一緒に融合したペプチドリガンドドメイン含有ポリペプチド及び第２のポリペプチドを含む。第2のポリペプチドは、それが融合されたポリペプチドの溶解性を改善することが当該技術分野で公知の融合パートナーであり得る（例えば、NusA、バクテリオフェリチン（BFR）、GrpE、チオレドキシン（TRX）及びグルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST））。Novagen Inc.（Madison, WI）は、NusA-標的融合物の形成を可能にするpET43.1ベクターシリーズを提供している。DsbA及びDsbCも、融合パートナーとして使用されたときに、発現レベルに対して正の効果を示しており、従ってより高い溶解性を達成するためにペプチドリガンドドメインと融合するために用いられ得る。

そのような融合タンパク質の一つの態様においては、発現したペプチドリガンドドメイン含有ポリペプチドは、プロテアーゼにより加水分解され得るペプチド結合を含むプロテアーゼ切断部位を含むリンカーポリペプチドを含む。結果として、ポリペプチド中のペプチドリガンドドメインは、タンパク質分解により、発現後、残りのポリペプチドから分離され得る。リンカーは、該結合のいずれかの側（プロテアーゼの触媒部位もまた、そこに結合する）に、1つ以上の更なるアミノ酸を含み得る（例えば、Schecter & Berger, Biochem. Biophys. Res. Commun. 27, 157-62 (1967)を参照）。或いは、リンカーの切断部位は、プロテアーゼの認識部位から離れてあり得、切断部位及び認識部位の2つは、1つ以上（例、２から４）のアミノ酸により隔てられ得る。一態様において、リンカーは、少なくとも約2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、約10個、約20個、約30個、約40個、約50個又はそれより多くのアミノ酸を含む。より好ましくは、リンカーは、約5〜約25アミノ酸長であり、最も好ましくは、リンカーは約8〜約15アミノ酸長である。

本発明に従って有用であるいくつかのプロテアーゼが以下の参考文献において論じられている：Hooper et al, Biochem. J. 321: 265-279 (1997)；Werb, Cell 91 : 439-442 (1997)；Wolfsberg et al., J. Cell Biol. 131 : 275-278 (1995)；Murakami & Etlinger, Biochem. Biophys. Res. Comm. 146: 1249-1259 (1987)；Berg et al., Biochem. J. 307: 313-326 (1995)；Smyth and Trapani, Immunology Today 16: 202-206 (1995)；Talanian et al., J. Biol. Chem. 272: 9677-9682 (1997)；及びThornberry et al., J. Biol. Chem. 272: 17907-17911 (1997)。細胞表面プロテアーゼも、本発明に従って切断可能なリンカーと共に用いられ得、以下が挙げられるが、これらに限定されない：アミノペプチダーゼＮ；ピューロマイシン感受性アミノペプチダーゼ；アンギオテンシン変換酵素；ピログルタミルペプチダーゼII；ジペプチジルペプチダーゼIV；N-アルギニン二塩基性転換酵素；エンドペプチダーゼ24.15；エンドペプチダーゼ24.16；アミロイド前駆体タンパク質セクレターゼアルファ、ベータ及びガンマ；アンギオテンシン変換酵素セクレターゼ；TGFアルファセクレターゼ；TNFアルファセクレターゼ；FASリガンドセクレターゼ；TNF受容体−I及び−IIセクレターゼ；CD30セクレターゼ；KL1及びKL2セクレターゼ；IL6受容体セクレターゼ；CD43、CD44セクレターゼ；CD16-I及びCD16-IIセクレターゼ；L-セレクチンセクレターゼ；葉酸受容体セクレターゼ；MMP 1、2、3、7、8、9、10、11、12、13、14、及び15；ウロキナーゼ・プラスミノーゲン活性化因子；組織プラスミノーゲン活性化因子；プラスミン;トロンビン；BMP-1（プロコラーゲンC-ペプチダーゼ）；ADAM 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10及び11；並びにグランザイムA、B、C、D、E、F、G、及びH。

細胞結合型プロテアーゼに依存することの代替手段は、自己切断リンカーを用いることである。例えば、口蹄疫ウイルス（FMDV）2Aプロテアーゼが、リンカーとして使用され得る。これは、2A/2B接合部においてFMDVのポリタンパク質を切断する、アミノ酸17個の短いポリペプチドである。FMDV 2Aプロペプチドの配列は、NFDLLKLAGDVESNPGPである。切断は、ペプチドのC末端において、最後のグリシン−プロリンアミノ酸ペアにおいて起こり、他のFMDV配列の存在には非依存的であり、異種配列の存在下であっても切断する。

アフィニティークロマトグラフィーは、ペプチドリガンドドメイン含有ポリペプチドの精製において、単独で用いることもできるし、或いはイオン交換、分子サイジング、若しくはHPLCクロマトグラフィー技術と組み合わせて用いることもできる。そのようなクロマトグラフィーアプローチは、カラムを用いて、又はバッチ形式で実施され得る。そのようなクロマトグラフィーによる精製方法は、当該技術分野において周知である。

更に、本発明は、配列番号１及び／又は２の配列において、1つ以上のアミノ酸の置換及びアミノ酸約1個〜約5個、好ましくはアミノ酸約1個〜約3個、より好ましくはアミノ酸1個の挿入又は欠失を伴うペプチドリガンドドメイン含有ポリペプチドをコードする単離された核酸であって、関連する特性が元の配列によって示される特性と実質的に同様である核酸を提供する。

突然変異誘発は、当該技術分野で公知の、いくつかの方法のいずれかにより行われ得る。一般的には、突然変異誘発は、核酸配列をプラスミド又は配列操作を容易にするための他の何らかのベクター中へクローニングすることにより達成され得る。次いで、その部位において該核酸配列中に更なる核酸を付加することができる特有の制限部位が同定されるか、或いはそれが該核酸配列中に挿入される。二本鎖オリゴヌクレオチドが、一般的には、オーバーラップする合成の一本鎖のセンスオリゴヌクレオチド及びアンチセンスオリゴヌクレオチドから作製される。該二本鎖オリゴヌクレオチドは、標的配列に隣接して制限部位を組み込んでおり、例えば、置換DNAを組み込むために使用され得る。プラスミド又は他のベクターが制限酵素で切断され、適合する付着末端を有するオリゴヌクレオチド配列が、該プラスミド又は他のベクターにライゲーションされて、元のDNAに取って代わる。

生体外部位特異的突然変異誘発の他の手段は当業者に公知であり、（特に、オーバーラップエクステンションポリメラーゼ連鎖反応（PCR）（例えば、Parikh & Guengerich, Biotechniques 24:428-431 (1998)を参照)を用いて）達成され得る。変異させる部位を覆う相補的プライマーを使用して、500mM dNTP、2ユニットのPfuポリメラーゼ、各250ngのセンス及びアンチセンスプライマー、並びに200ngの、ペプチドリガンドドメイン含有ペプチドをコードする配列を含むプラスミドDNAを含有する混合物中でプラスミド全体をPCR増幅することができる。PCRは、DNA 1Kbにつき2.5分の伸長時間で、18サイクルを含むことが望ましい。PCR産物をDpnI（アデニンがメチル化されたプラスミドDNAのみを消化する）で処理し、Escherichia coli DH5α細胞に形質転換できる。形質転換体は、当該変異の組み込みについて、制限酵素消化によりスクリーニングされ得、次いで、DNAシークエンス解析により確認され得る。

ペプチドリガンドドメイン含有ポリペプチドのタンパク質検出及び定量の好適な方法としては、ウエスタンブロット、酵素結合免疫測定法（ELISA）、銀染色、BCAアッセイ（例えば、Smith et al.,Anal.Biochem.150,76-85(1985)を参照）、タンパク質−銅錯体に基づく比色アッセイであるLowryタンパク質アッセイ（例えば、Lowry et al.,J.Biol.Chem.193,265-275(1951)に記載されている）、及びタンパク質結合の際のCoomassie Blue G-250における吸光度の変化に依存するBradfordタンパク質アッセイ（例えば、Bradford et al.,Anal.Biochem.72,248(1976)に記載されている）が挙げられる。ひとたび発現すれば、ペプチドリガンドドメイン含有ポリペプチドは、イオン交換、サイズ排除、又はC18クロマトグラフィー等の従来の精製方法により精製され得る。

III.ペプチドリガンドドメインのカップリング方法

ペプチドリガンドドメイン含有ポリペプチドへの、好適な活性物質（例、治療剤、化学療法剤、放射性核種、及びポリペプチド等）の「カップリング」（又は「コンジュゲート化」又は「架橋」）方法は、当該技術分野において十分に記載されている。本明細書に提供されるコンジュゲートの調製において、コンジュゲート又はカップリング部分のペプチドリガンドドメインへの取付けが該ペプチドリガンドドメインの機能を実質的に妨げないか、或いは活性物質の機能を実質的に妨げない限り、2つの部分の取付けについて技術分野で現在知られている任意の方法により、活性物質は、ペプチドリガンドドメインに直接的又は間接的に連結される。カップリングは、任意の好適な手段により行うことができ、該手段としては、以下に限定されないが、標的薬剤の分布を調節することになる、イオン結合及び共有結合、並びに任意の他の十分に安定な結合が挙げられる。

アミノ基とチオール基との間に共有結合を形成し、チオール基をタンパク質に導入するのに用いられる多数のヘテロ二官能性架試薬は当業者には公知である（例えば、Cumber et al. (1992) Bioconjugate Chem. 3’:397 401; Thorpe et al. (1987) Cancer Res. 47:5924 5931; Gordon et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. 84:308 312; Walden et al. (1986) J. Mol. Cell Immunol. 2:191 197; Carlsson et al. (1978) Biochem. J. 173:723 737; Mahan et al. (1987) Anal. Biochem. 162:163 170; Wawryznaczak et al. (1992) Br. J. Cancer 66:361 366; Fattom et al. (1992) Infection & Immun. 60:584 589を参照）。これらの試薬は、ペプチドリガンドドメイン又はペプチドリガンドドメイン含有ポリペプチドと本明細書中に開示されるいずれかの活性物質との間の共有結合の形成に用いられ得る。これらの試薬としては、限定されるものではないが、以下が挙げられる。N-スクシンイミジル-3-(-2-ピリジルジチオ（pyridyidithio）)-プロピオネート（SPDP;ジスルフィドリンカー）、スルホスクシンイミジル6-[3-(2-ピリジルジチオ)プロピオンアミド]ヘキサノエート（スルホ-LC-SPDP）、スクシンイミジルオキシカルボニル-アルファ-メチルベンジルチオスルフェート（SMBT、立体障害ジスルフェートリンカー）、スクシンイミジル6-[3-(2-ピリジルジチオ（pyridyidithio）)プロピオンアミド]ヘキサノエート（LC-SPDP）、スルホスクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート(スルホ-SMCC）、スクシンイミジル3-(2-ピリジルジチオ)ブチレート（SPDB;立体障害ジスルフィド結合リンカー）、スルホスクシンイミジル2-(7-アジド-4-メチルクマリン-3-アセトアミド)エチル-1,3-ジチオプロピオネート（SAED）、スルホ-スクシンイミジル7-アジド-4-メチルクマリン-3-アセテート（SAMCA）、スルホスクシンイミジル6-[アルファ-メチル-アルファ-(2-ピリジルジチオ)トルアミド]ヘキサノエート（スルホ-LC-SMPT）、1,4-ジ-[3'-(2'-ピリジルジチオ)プロピオンアミド]ブタン（DPDPB）、4-スクシンイミジルオキシカルボニル-アルファ-メチル-アルファ-(2-ピリジルチオ)トルエン（SMPT、立体障害ジスルフェートリンカー）、スルホスクシンイミジル6[アルファ-メチル-アルファ-(2-ピリジルジチオ)トルアミド]ヘキサノエート（スルホ-LC-SMPT）、m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（MBS）、m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル（スルホ-MBS）、N-スクシンイミジル(4-ヨードアセチル)アミノベンゾエート（SIAB;チオエーテルリンカー）、スルホスクシンイミジル(4-ヨードアセチル)アミノベンゾエート（スルホ-SIAB）、スクシンイミジル4(p-マレイミドフェニル)ブチレート（SMPB）、スルホスクシンイミジル4-(p-マレイミドフェニル)ブチレート（スルホ-SMPB）、アジドベンゾイルヒドラジド(ABH）。

他のヘテロ二官能性切断性カップリング試薬としてはN-スクシンイミジル(4-ヨードアセチル)-アミノベンゾエート、スルホスクシンイミジル(4-ヨードアセチル)-アミノベンゾエート、4-スクシンイミジル-オキシカルボニル-a-(2-ピリジルジチオ)トルエン、スルホスクシンイミジル-6-[a-メチル-a-(ピリジルジチオール)-トルアミド]ヘキサノエート、N-スクシンイミジル-3-(-2-ピリジルジチオ)-プロピオネート（proprionate）、スクシンイミジル6[3(-(-2-ピリジルジチオ)-プロピオンアミド（proprionamido）]ヘキサノエート、スルホスクシンイミジル6[3(-(-2-ピリジルジチオ)-プロピオンアミド（proprionamido）]ヘキサノエート、3-(2-ピリジルジチオ（pyridyidithio）)-プロピオニルヒドラジド、エルマン試薬、ジクロロトリアジン酸、S-(2-チオピリジル)-L-システインが挙げられる。さらなる例示的な二官能性結合化合物は米国特許第5,349,066号、同第5,618,528号、同第4,569,789号、同第4,952,394号及び同第5,137,877号に開示されている。

或いは、例えば、ポリペプチドのスルフィドリル基が、コンジュゲート化用に用いられ得る。更に、グリコプロテイン、例えば、抗体に結合した糖部分を酸化して、当該技術分野で公知の多くのカップリング手順において有用なアルデヒド基を形成させることができる。本発明に従って形成されるコンジュゲートは、生体内で安定又は不安定（酵素分解可能なテトラペプチドリンケージ又は酸に不安定なcis-アコニットリンケージ又はヒドラゾンリンケージ等）であり得る。

ペプチドリガンドドメイン含有ポリペプチドは、1つ以上のリンカーを介して活性物質に連結されてもよい。リンカー部分は所望の特性に依存して選択される。例えば、リンカー部分の長さは、標的受容体へのリガンドの結合により誘導されるいずれかの構造変化を含むリガンド結合の動態及び特異性を最適化するように選ばれ得る。リンカー部分の長さ及び柔軟性は、ポリペプチドリガンド部分と標的細胞受容体との自由な相互作用を可能とするのに十分なものでなくてはならない。リンカーが短すぎる又は堅固すぎる場合、ポリペプチドリガンド部分と細胞毒との間に立体障害が生じ得る。リンカー部分が長すぎる場合、製造過程において活性物質が分解し得るか、又はその所望の効果を、標的細胞に効果的に送達し得ない。

当業者に公知の任意の好適なリンカーが本発明で用いられ得る。一般的には、融合タンパク質であるコンジュゲートにおいては、化学的に製造されたコンジュゲート中のリンカーとは異なるセットのリンカーが用いられる。化学的に連結されたコンジュゲートのために好適なリンカー及び連結としては、限定されるものではないが、ジスルフィド結合、チオエーテル結合、立体障害ジスルフィド結合、及びアミン及びチオール基等の遊離の反応基間の共有結合が挙げられる。これらの結合の生成は、ヘテロ二官能性試薬を用いて、ポリペプチドの一方又は双方に反応性チオール基を生じさせた後、一方のポリペプチド上の該チオール基を、他方における反応性マレイミド基又はチオール基が結合し得る反応性チオール基又はアミン基と反応させることにより行われる。他のリンカーとしては、ビスマレイミドオトキシプロパン（bismaleimideothoxy propane）、酸不安定性トランスフェリンコンジュゲート及びアジピン酸ジヒドラジド等、より酸性度の高い細胞内コンパートメントで切断される酸切断性リンカー;紫外光又は可視光に露光した際に切断される架橋リンカー及びリンカーが挙げられる。いくつかの実施形態においては、いくつかのリンカーが、各リンカーの所望の特性を利用するために、含められ得る。化学リンカー及びペプチドリンカーは、リンカーをペプチドリガンドドメイン含有ポリペプチド及び標的薬剤に共有結合的にカップリングさせることによって挿入され得る。以下に記載のヘテロ二官能性試薬は、そのような共有結合的なカップリングを達成するために用いられ得る。ペプチドリンカーは、リンカー及びペプチドリガンドドメイン、リンカー及び活性物質、又はペプチドリガンドドメイン、リンカー及び活性物質を融合タンパク質としてコードするDNAを発現させることによっても、連結させ得る。本明細書ではフレキシブルリンカー及びコンジュゲートの溶解度を高めるリンカーを、単独で又は他のリンカーと共に使用することも企図される。

従ってリンカーは、ペプチド性の結合、アミノ酸及びペプチド結合(典型的には1〜約60の間のアミノ酸、より好ましくは約10〜30のアミノ酸を含有する)を含み得るがこれらに限定されない。或いは、化学的リンカーは、N-スクシンイミジル(4-ヨードアセチル)-アミノベンゾエート、スルホスクシンイミジル(4-ヨードアセチル)-アミノベンゾエート、4-スクシンイミジル-オキシカルボニル-a-(2-ピリジルジチオ（pyridyidithio）)トルエン、スルホスクシンイミジル-6-a-メチル-a-(ピリジルジチオール)-トルアミド)ヘキサノエート、N-スクシンイミジル-3-(-2-ピリジルジチオ)-プロピオネート（proprionate）、スクシンイミジル6(3(-(-2-ピリジルジチオ)-プロピオンアミド（proprionamido）)ヘキサノエート、スルホスクシンイミジル6(3(-(-2-ピリジルジチオ)-プロピオンアミド)ヘキサノエート、3-(2-ピリジルジチオ)-プロピオニルヒドラジド、エルマン試薬、ジクロロトリアジン酸、及びS-(2-チオピリジル)-L-システインが挙げられるが、これらに限定されないヘテロ二官能性切断架橋リンカー等である。

他のリンカーとしては、トリチルリンカー、特に誘導体化トリチル基が挙げられ、これらは、種々の酸性度又はアルカリ性度において治療薬の放出を提供するコンジュゲート種を生成する。このようにして治療薬が放出されるpH範囲を予め選択できることによってもたらされる柔軟性は、治療薬の送達を必要とする組織間の既知の生理的差異に基づくリンカーの選択を可能にする(例えば、米国特許第5,612,474号参照)。例えば、腫瘍組織の酸性度は正常組織のものよりも低いと思われる。

酸切断性リンカー、光切断性リンカー及び熱感受性リンカーも、標的薬剤を切断して、より容易に反応に利用できるようにすることが必要であり得る場合に用いられ得る。酸切断性リンカーとしては、ビスマレイミドオトキシプロパン;及びアジピン酸ジヒドラジドリンカー(例えば、Fattom et al. (1992) Infection & Immun. 60:584 589を参照)及び細胞内トランスフェリン循環経路に入るのを可能にするのに十分なトランスフェリンの部分を含有する酸不安定性トランスフェリンコンジュゲート (例えば、Welhoner et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:4309 4314を参照)が挙げられるが、これらに限定されない。

光切断性リンカーは露光した際に切断されるリンカーであり(例えば、Goldmacher et al. (1992) Bioconj. Chem. 3:104 107参照、なおこのリンカーは、本明細書に参照することにより組み込まれる)、その結果、露光の際に標的薬剤を放出する。露光の際に切断される光切断性リンカーは公知であり(例えば、システインに対する光切断性保護基としてのニトロベンジル基の使用を記載したHazum et al. (1981) in Pept., Proc. Eur. Pept. Symp., 16th, Brunfeldt, K (Ed), pp. 105 110;ヒドロキシプロピルメタクリルアミド共重合体、グリシン共重合体、フルオレセイン共重合体及びメチルローダミン共重合体を含む水溶性光切断性共重合体を記載したYen et al. (1989) Makromol. Chem 190:69 82;近紫外光(350nm)露光の際に光分解を受ける架橋リンカー及び試薬を記載したGoldmacher et al. (1992) Bioconj. Chem. 3:104 107;及び光切断性結合を生じる塩化ニトロベンジルオキシカルボニル架橋試薬を記載したSenter et al. (1985) Photochem. Photobiol 42:231 237を参照)、その結果、露光の際に標的薬剤を放出する。そのようなリンカーは、光ファイバーを用いて露光できる皮膚科又は眼科的な状態の治療において特有の用途を有する。コンジュゲートを投与した後に眼又は皮膚又は他の身体部分が露光され得、結果としてコンジュゲートから標的部分が放出される。そのような光切断性リンカーは、動物の体内から迅速なクリアランスを可能にするべく標的薬剤を除去することが望ましい診断プロトコールに関して有用である。

IV.本発明は複数の活性物質を提供する

本発明の種々の態様は、ペプチドリガンドドメイン含有ポリペプチドが活性物質、即ち治療剤又は診断剤にカップリングされることを企図する。

本明細書中で用いられる場合、用語「治療剤」は、化合物、生物学的高分子、或いは細菌、植物、真菌、又は動物（特に哺乳動物）の細胞又は組織等の生物材料から作製された抽出物であって、治療的特性を有すると思われるもの（例、化学療法剤又は放射線療法剤）をいう。本明細書中で用いられる場合、用語「治療的」は、被験哺乳動物を苦しめる疾患又は関連状態の影響を改善するか、治癒又は予防すること（例えば癌又は他の増殖性疾患といった標的疾患の危険性の予防又は軽減により示される）をいう。治癒的療法とは、哺乳動物における既存の疾患又は状態を、全体的又は部分的に、緩和することをいう。

剤は、精製され得るか、実質的に精製され得るか、又は部分的に精製され得る。更に、そのような治療剤はリポソーム又は免疫リポソーム中に存在するか、又はそれらと結合され得、コンジュゲート化は剤に直にか、又はリポソーム／免疫リポソームへのものであり得る。「リポソーム」は、薬物（例、薬物、抗体、毒物）の送達に有用な、種々のタイプの脂質、リン脂質及び/又は界面活性剤から構成される小胞である。一般的に、リポソームの構成要素は、生体膜の脂質配置と同様の二重層構造中に配置される。

本発明により企図される態様において、ペプチドリガンドドメイン含有ポリペプチドにカップリングされ得る治療剤の例としては、化学療法剤（例、ドセタキセル、パクリタキセル、タキサン類及びプラチナ化合物）、抗葉酸剤、代謝拮抗物質、抗有糸分裂薬、DNA損傷剤、アポトーシス促進剤、分化誘導剤、血管新生阻害剤、抗生物質、ホルモン、ペプチド、抗体、チロシンキナーゼ阻害剤、生物活性物質、生体分子、放射性核種、アドリアマイシン、アンサマイシン抗生物質、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、ブスルファン、シスプラチン、カルボプラチン、カルムスチン、カペシタビン、クロラムブシル、シタラビン、シクロホスファミド、カンプトセシン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デクスラゾキサン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エトポシド、エポチロン類、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルカプトプリン、メルファラン（meplhalan）、メトトレキサート、ラパマイシン(シロリムス)、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ニトロソ尿素（nitrosurea）、パクリタキセル、パミドロネート、ペントスタチン、プリカマイシン、プロカルバジン、リツキシマブ、ストレプトゾシン、テニポシド、チオグアニン、チオテパ、タキサン類、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、タキソール、コンブレタスタチン類、ディスコデルモライド類、トランスプラチナ(transplatinum)、チロシンキナーゼ阻害剤(ゲニステイン)、並びに他の化学療法剤が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書中で用いられる場合、用語「化学療法剤」は、癌、新生物、及び／又は増殖性疾患に対抗する活性を有する剤をいう。好ましい化学療法剤としては、50％より多くの化学療法剤がナノ粒子の形態であるアルブミンを含む粒子としての、ドセタキセル及びパクリタキセルが挙げられる。最も好ましくは、化学療法剤はアルブミン結合パクリタキセルの粒子、例えばアブラキサン（登録商標）を含む。

好適な治療剤としては、例えば、生物学的活性物質（TNF、又は（of）tTF）、放射性核種（131I、90Y、111In、211At、32P及び他の公知の治療放射性核種）、例えば、INF-α、フマギリン、アンジオスタチン、エンドスタチン、サリドマイド等の血管新生抑制剤（血管新生阻害剤）、他の生理活性ポリペプチド、治療増感剤、抗体、レクチン、及び毒素も挙げられる。

本発明の適用に好適な疾患としては、悪性及び前癌性の状態並びに、増殖性の疾患が、例えば、良性前立腺過形成、子宮内膜症、子宮内膜増殖症、アテローム性動脈硬化症、乾癬、免疫学的増殖又は増殖性腎糸球体症の場合が挙げられるが、これらに限定されない増殖性疾患が挙げられる。

用語「治療有効量」は、疾患又は状態に関連するか、又はその原因となる生理学的又は生化学的パラメータを部分的に又は完全に正常に戻す量を意味する。専門技術を有する臨床医は、特定の疾患又は状態に対して、治療的に有効であろう医薬組成物の量を決定できるはずである。例として、治療剤がパクリタキセルである好ましい実施形態によれば、投与されるパクリタキセル用量は、約3週間の投与周期（即ち、パクリタキセル用量を約3週間ごとに1回投与）で、約30mg/m2〜約1000 mg/m2の範囲、望ましくは、約3週間の投与周期、好ましくは約2週間の周期、より好ましくは毎週の周期で約50mg/m2〜約800 mg/m2の範囲、好ましくは約80mg/m2〜約700 mg/m2の範囲、最も好ましくは約250mg/m2〜約300 mg/m2の範囲であり得る。

本発明は診断的な態様も有する。例えば、診断剤は、放射活性剤、MRI造影剤、X線造影剤、超音波造影剤、及びPET造影剤が挙げられるが、これらに限定されないトレーサー又は標識であり得る。治療剤に関して記載した、これらの剤のカップリングは、この本発明の態様によっても企図される。更に、用語「診断有効量」は、関連の臨床背景において、組織及び器官における、異常増殖活性、過形成活性、リモデリング活性、炎症活性の存在及び／又は程度の、合理的に正確な決定を可能にする医薬組成物の量である。例えば、本発明により「診断される」状態は良性又は悪性の腫瘍であり得る。

本明細書中で教示される診断剤としては、検出可能なシグナルを提供する物質に、共有結合又は非共有結合のいずれかで結合することにより標識され得る、抗体等のポリペプチドが挙げられる。広範で多様な標識及びコンジュゲート化技術が公知であり、科学文献及び特許文献の両方で盛んに報告されている。好適な標識としては、放射性核種、酵素、基質、補助因子、阻害剤、蛍光部分、化学発光部分、及び磁性粒子等が挙げられる。そのような標識の使用を教示する特許としては、米国特許第3,817,837号;同第3,850,752号;同第3,939,350号;同第3,996,345号;同第4,277,437号;同第4,275,149号;及び同第4,366,241号が挙げられる。また、組換え免疫グロブリンも製造され得る（Cabilly, 米国特許第4,816,567号; Moore, et al., 米国特許第4,642,334号;及びQueen, et al. (1989) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033を参照）。

更に、そして関連の態様においては、本発明は、化学療法剤に対する腫瘍応答の予測又は測定方法、及び化学療法剤に対する増殖性疾患の応答の予測又は測定方法又は増殖性疾患の治療方法を提供する。ここで、増殖性疾患としては、以下に限定されないが、例えば、良性前立腺過形成、子宮内膜症、子宮内膜増殖症、アテローム性動脈硬化症、乾癬、免疫学的増殖又は増殖性腎糸球体症が挙げられる。

V.抗体又は抗体断片の活性物質

本発明の特定の態様においては、治療剤は、補体活性化、細胞介在性細胞傷害性、アポトーシス、壊死的細胞死、及びオプソニン化（opsinization）の1つ以上を媒介する抗体又は抗体断片であり得る。

本明細書中、用語「抗体」は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ダイマー、マルチマー、多重特異性抗体(例えば二重特異性抗体)を含むが、これらに限定されない。抗体は、ネズミ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、又は他の種由来のものであり得る。抗体は、免疫系により生じ、特異的な抗原を認識し、それと結合することができるタンパク質である。一般的に、標的抗原は、複数の抗体上のCDRにより認識される多くの結合部位(エピトープとも呼ばれる)を有する。異なるエピトープと特異的に結合する各抗体は異なる構造を有する。従って、1つの抗原は1つより多くの対応する抗体を有し得る。抗体としては、全長免疫グロブリン分子又は全長免疫グロブリン分子の免疫的活性部分、即ち、目的とする標的の抗原又はその部分と免疫学的に特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子が挙げられる。そのような標的としては、癌細胞、又は自己免疫疾患と関連する自己免疫抗体を産生する細胞が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に開示される免疫グロブリンは、免疫グロブリン分子のいずれかのクラス(例、IgG、IgE、IgM、IgD、及びIgA)又はサブクラス(例、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、及びIgA2)のものであり得る。免疫グロブリンはいずれの種由来であってもよい。

「抗体断片」は、所望の生物学的活性を保持している全長抗体の部分を含む。「抗体断片」は、しばしばその抗原結合領域又は可変領域である。抗体断片の例としては、Fab、Fab'、F(ab')2、及びFv断片；ダイアボディ；直鎖抗体；Fab発現ライブラリーにより生じる断片、抗イデオタイプ(抗Id)抗体、CDR(相補性決定領域)、及び癌細胞抗原、ウイルス抗原若しくは微生物抗原と免疫特異的に結合する上記のいずれかのエピトープ結合断片、一本鎖抗体分子；及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。しかしながら、抗体の他の非抗原結合部分が本明細書中で意味される「抗体断片」であり得、例えば、限定されないが、抗体断片は完全Fcドメイン又は部分Fcドメインであり得る。

本明細書中、モノクローナル抗体としては、具体的には、重鎖及び/又は軽鎖の部分が特定の種由来の抗体の対応する配列と同一又は相同であるか又は特定の抗体クラス又はサブクラスに属するが、鎖の残りの部分は別の種由来の抗体の対応する配列と同一又は相同であるか別の抗体のクラス又はサブクラスに属する「キメラ」抗体、及び所望の生物活性を示す限りそのような抗体の断片が挙げられる (米国特許No.4,816,567)。本明細書中、目的のキメラ抗体としては、非ヒト霊長類(例えば旧世界ザル又は類人猿)由来の可変ドメイン抗原結合配列、及びヒト定常領域配列を含む「霊長類化」抗体が挙げられる。

「抗体依存性細胞介在性細胞傷害性」及び「ADCC」は、Fcレセプター(FcR)を発現する非特異的細胞傷害性細胞(例えば、ナチュラルキラー(NK)細胞、好中球、及びマクロファージ)が標的細胞上の結合抗体を認識し、次いで標的細胞の溶解をもたらす細胞介在性反応をいう。ADCCを介在する主な細胞であるNK細胞はFcガンマRIIIのみを発現するが、単球はFcガンマRI、FcガンマRII、及びFcガンマRIIIを発現する。目的とする分子のADCC活性を評価するには、生体外 ADCCアッセイを行うことができる(米国特許第No.55,003,621号；米国特許第No. 5,821,337号)。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞(PBMC)及びナチュラルキラー(NK)細胞が挙げられる。或いは、又は更に、目的とする分子のADCC活性は、生体内、例えばClynes et al PNAS(USA)、95:652-656(1998)に開示されているような動物モデル中で評価できる。

「細胞死を誘導する」抗体は、生存細胞を生存できなくさせる抗体である。生体外において細胞死を補体及び免疫エフェクター細胞の非存在下で決定することにより、抗体依存性細胞介在性細胞傷害性(ADCC)により誘導された細胞死であるのか、それとも補体依存性細胞傷害性(CDC)により誘導された細胞死であるのかを区別することができる。従って、細胞死のアッセイは、加熱不活化血清(すなわち補体非存在下)を用い、免疫エフェクター細胞の非存在下で行うことができる。抗体が細胞死を誘導できるか否かを決定するために、プロピジウムアイオダイド(PI)、トリパンブルー、又は7AADの取り込みにより評価される膜の完全性の喪失を、非処理細胞に対して評価してもよい。細胞死誘導抗体は、BT474細胞におけるPI取り込みアッセイにおいてPI取り込みを誘導する抗体である。

「アポトーシスを誘導する」抗体は、アネキシンVの結合、DNAの断片化、細胞収縮、小胞体の膨張、細胞の断片化、及び/又は膜小胞(アポトーシス小体と呼ばれる)の形成により決定される、プログラム細胞死を誘導する抗体である。

VI.本発明はペプチドリガンドドメインをポリペプチドの活性物質にカップリングする融合タンパク質を提供する。

本発明は、融合タンパク質におけるペプチドリガンドドメインのポリペプチド活性物質へのカップリングを更に企図する。限定するものではないが、例えば、ペプチドリガンドドメイン配列は、診断に有用なタンパク質ドメイン（ハプテン、GFP等）、治療増感剤、活性タンパク質ドメイン（以下に限定されないが例えば、tTF、TNF、Smarl由来のp44ペプチド、インターフェロン、TRAIL、Smac、VHL、プロカスパーゼ、カスパーゼ、及びIL-2）又は毒素（以下に限定されないが例えば、リシン、PAP、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素）の上流又は下流に融合され得る。

「融合タンパク質」及び「融合ポリペプチド」は、共有結合的に連結された、少なくとも2つの部分を有するポリペプチドであって、該部分がそれぞれ異なる特性を有するポリペプチドであるものをいう。特性は、生体外又は生体内の活性等といった、生物学的特性であり得る。特性はまた、標的分子への結合、及び反応の触媒等といった、単純な化学的特性又は物理的特性であり得る。該部分は単一のペプチド結合により直接連結されていてもよいし、或いは、1つ以上のアミノ酸残基を含有するペプチドリンカーを通して連結されていてもよい。一般的には、該部分とリンカーとは、互いにリーディングフレームにあるであろう。

VII.活性物質分布の調節方法

本発明の他の態様は、本明細書中に開示されるペプチドリガンドドメイン含有コンジュゲートの特性を利用して、動物組織内の活性物質分布を調節する方法を提供し、該方法は、活性物質にコンジュゲートしたペプチドリガンドドメインを含むコンジュゲート分子を含む組成物を該動物に投与することを含み、ここで該ペプチドリガンドドメインは、配列番号１又は２のペプチド或いはそれらのホモログを含み、且つ、動物への該組成物の投与は、該活性物質を単独で投与した際に得られる組織分布とは異なる該活性物質の組織分布を生じる。

本発明の組成物及び方法は、疾患部位への活性物質の組織分布の調節をもたらす。これは、活性物質（コンジュゲートしていない形態）を該動物に投与した場合に提供されるであろうものよりも大きい、疾患部位における該活性物質の濃度及び／又は、上昇したまたは延長された（半減期）該活性物質の血中レベルの提供という形で現れることが望ましい。この調節は、コンジュゲートペプチド分子の組織への取り込み速度の亢進、組織中のコンジュゲートペプチド分子の拡散速度の亢進、及び／又は組織を通過するコンジュゲートペプチド分子の分散の亢進、並びにコンジュゲートペプチド分子の組織への取り込み速度と、1つ以上の組織受容体の内在化速度との一致の形でも現れ得る。そのような亢進は、当該技術分野で公知の、任意の好適な方法によって測定することができ、該方法としては、例えば、ラジオグラフィー技術、顕微鏡技術、化学的技術、免疫学的技術又はMRI技術を用いた、好適に標識された活性物質の検出、局在確認及び相対的定量（quantization）が挙げられるが、これらに限定されない。

「速度亢進」により、少なくとも約33％大きい、好ましくは少なくとも約25％大きい、より好ましくは少なくとも約15％大きい、最も好ましくは少なくとも約10％大きい速度が意味される。「疾患部位におけるより大きい濃度」により、比較され得る疾患部位における非コンジュゲートの活性物質の濃度よりも、少なくとも約33％大きい、好ましくは少なくとも約25％大きい、より好ましくは少なくとも約15％大きい、最も好ましくは少なくとも約10％大きい、疾患部位におけるコンジュゲート中の活性物質の濃度が意味される。

好適な疾患部位としては、軟組織、結合組織、骨、固形臓器及び血管等を含む任意の体内組織中の増殖異常状態、組織リモデリング、過形成、過剰な創傷治癒の部位が挙げられるが、これらに限定されない。そのような疾患のより具体的な例としては、癌、糖尿病性又はその他の網膜症、炎症、線維症、関節炎、及び血管又は人工血管移植片又は血管内装置における再狭窄等が挙げられる。

好ましい態様において、本発明は腫瘍を診断及び／又は治療する方法を提供する。該腫瘍は、口腔腫瘍、咽頭腫瘍、消化器系腫瘍、呼吸器系腫瘍、骨腫瘍、軟骨腫瘍、骨転移、肉腫、皮膚腫瘍、メラノーマ、乳房腫瘍、生殖器系腫瘍、尿路腫瘍、眼窩腫瘍、脳及び中枢神経系腫瘍、グリオーマ、内分泌系腫瘍、甲状腺腫瘍、食道腫瘍、胃腫瘍、小腸腫瘍、結腸腫瘍、直腸腫瘍、肛門腫瘍、肝臓腫瘍、胆嚢腫瘍、膵臓腫瘍、喉頭腫瘍、肺腫瘍、気管支腫瘍、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、子宮頸腫瘍、子宮体腫瘍、卵巣腫瘍、外陰腫瘍、膣腫瘍、前立腺腫瘍、前立腺癌、精巣腫瘍、陰茎腫瘍、膀胱腫瘍、腎臓腫瘍、腎盂腫瘍、尿管腫瘍、頭頸部腫瘍、副甲状腺腫瘍、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病からなる群より選ばれる。更に、本発明は、化学療法剤に対する腫瘍の応答の予測又は判定方法、腫瘍の治療方法、並びに化学療法剤に対する哺乳動物の腫瘍の応答を予測するためのキットを提供し、ここで、該腫瘍は、肉腫、腺癌、扁平上皮癌、大細胞癌、小細胞癌、基底細胞癌、明細胞癌、膨大細胞腫（oncytoma）又はそれらの組み合わせである。

他の態様において、本発明は組成物及び当該組成物の使用方法を提供し、ここで動物への該組成物の投与は、活性物質単独の投与の際に得られる血中レベルよりも大きい該活性物質の血中レベルを生じる。Cmax、Cmin、及びAUCが挙げられるが、これらに限定されない、活性物質の血中レベルの任意の好適な指標が用いられ得る。「活性物質単独の投与の際に得られる血中レベルよりも大きい」により、少なくとも約33％大きい、好ましくは少なくとも25％大きい、より好ましくは少なくとも約15％大きい、最も好ましくは少なくとも約10％大きい血中レベルが意味される。

なお他の態様においては、本発明は組成物及び該組成物の使用方法を提供し、ここで動物への該組成物の投与は、該活性物質を単独で投与した際に得られる血中レベルの半減期よりも大きい、該活性物質の血中レベルの半減期を提供する。「該活性物質を単独で投与した際に得られる血中の半減期よりも大きい」により、少なくとも約33％大きい、好ましくは少なくとも約25％大きい、より好ましくは少なくとも約15％大きい、最も好ましくは少なくとも約10％大きい半減期が意味される。

VIII. 製剤と投与

生体内での使用のために、配列番号１及び２並びにそれらのホモログ等のペプチドリガンドドメインとカップリングされた活性物質は望ましくは、生理学的に許容可能な担体を含む医薬組成物に製剤化される。任意の好適な生理学的に許容可能な担体が、投与経路に応じて、本発明の文脈内で用いられ得る。当業者は、所望の投与方法に好適な医薬組成物を提供する担体を用いることができると理解するであろう。

本発明の医薬組成物の投与は、静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、腫瘍内、経口、直腸内、膣内、膀胱内、及び吸入投与を含むが、これらに限定されないいずれかの好適な経路を介して達成され得るが、静脈内及び腫瘍内投与が最も好ましい。組成物は、他のいずれかの好適な成分、特に組成物及び／又はそのエンドユースの安定性を亢進するための成分を更に含み得る。従って、本発明の組成物には様々な好適な製剤がある。以下の製剤及び方法は単に例示的なだけであり、限定するものでは全くない。

所望の場合、医薬組成物は、更なる治療剤又は生物活性物質を含むこともできる。例えば、特定の適応症の治療に有用な治療因子が存在してもよい。イブプロフェン又はステロイド等の炎症を制御する因子が、医薬組成物の生体内投与と関連する腫脹及び炎症及び生理学的苦痛を低減するために、組成物の一部であり得る。

担体は、典型的には液体であるが、固体、又は液体成分と固体成分との組み合わせでもあり得る。担体は、望ましくは、生理学的に許容される（例えば、医薬上又は薬理学的に許容される）担体（例えば、賦形剤又は希釈剤）である。生理学的に許容される担体は周知であり、容易に入手可能である。担体の選択は、少なくとも部分的には、標的組織及び／又は細胞の位置、並びに組成物を投与するために用いられる特定の方法によって、決定されるであろう。

典型的には、そのような組成物は、液体の溶液又は懸濁液のいずれかとして、注射剤として調製することができ、注射前に液体を添加して溶液又は懸濁液を調製するために用いるのに好適な固体形態に調製することもでき、又、製剤は乳化されていてもよい。注射での使用に好適な医薬製剤としては、無菌の水溶液又は分散物；公知のタンパク質安定剤及び凍結保護剤（lyoprotectants）を含有する製剤、ゴマ油、ピーナツ油又は水性プロピレングリコールを含む製剤、並びに無菌の注射可能な溶液又は分散物の即時調製のための無菌粉末、が挙げられる。いずれの場合も、製剤は無菌でなければならず、容易な注射可能性（syringability）が存在する程度まで流動的でなければならない。製剤は、製造及び保存の条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌等の微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。遊離塩基又は薬理学的に許容される塩としての活性化合物の溶液は、好適には界面活性剤（ヒドロキシセルロース等）と混合された水の中で調製され得る。分散物はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びそれらの混合物中、並びに油中で調製され得る。通常の保存及び使用条件下では、これらの製剤は、微生物の増殖を防ぐために、保存剤を含有する。

ペプチドリガンドドメイン含有コンジュゲートは、中性又は塩の形態で組成物中に製剤化され得る。医薬上許容される塩としては、無機酸（例えば、塩酸若しくはリン酸等）又は有機酸（酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸等）等と形成される酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基と形成される）が挙げられる。遊離カルボキシル基と形成される塩は、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、又は水酸化第二鉄等）及び有機塩基（イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカイン等）からも得られる。

非経口投与に好適な製剤としては、水性及び非水性の、等張の無菌注射溶液（酸化防止剤、緩衝液、静菌剤、及びこの製剤を、対象とするレシピエントの血液と等張にする溶質を含有し得る）、並びに水性及び非水性の無菌懸濁液（懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、及び保存剤を含み得る）が挙げられる。製剤は、単回用量又は複数回用量の密封容器（アンプル及びバイアル等）中で提供され得、使用直前に、注射のために無菌液体賦形剤（例えば、水）の添加のみを要する、フリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存され得る。即席の注射溶液及び懸濁液は、これまでに記載された種類の無菌の粉末、顆粒、及び錠剤から調製され得る。本発明の好ましい実施形態においては、ペプチドリガンドドメイン含有コンジュゲートは、注射（例、非経口投与）用に製剤化される。この関連で、製剤は、望ましくは、腫瘍内投与用に好適であるが、静脈注射、腹腔内注射、皮下注射等用にも製剤化され得る。

本発明は、所望により、ペプチドリガンドドメイン含有コンジュゲート（即ち、活性物質にコンジュゲートしたペプチドリガンドドメイン含有ポリペプチド）がポリエチレングリコール（PEG）へと更にコンジュゲートしている実施形態も提供する。PEGコンジュゲート化によりこれらのポリペプチドの循環半減期を増大させ、ポリペプチドの免疫原性及び抗原性を低減し、そしてそれらの生物活性を向上させることができる。使用する場合、メトキシ-PEGをペプチドの利用可能なアミノ基或いは例えば、ヒスチジン又はシステイン（cysteinees）等の他の反応部位と反応させることを含むがこれらに限定されない、PEGコンジュゲート化のいずれかの好適な方法が用いられ得る。更に、組換えDNAアプローチを用いて、ペプチドリガンドドメイン含有コンジュゲートにPEG反応性の基を有するアミノ酸を付加することができる。更に、ペプチドリガンドドメイン含有コンジュゲート分子中のある部位に付加されたPEG分子が生体内で放出される、ポリペプチドのPEG化等の、放出可能且つハイブリッドなPEG化戦略が本発明の態様に従って用いられ得る。PEGコンジュゲート化の方法の例は当該技術分野で公知である。例えば、Greenwald et al., Adv. Drug Delivery Rev. 55:217-250(2003)を参照。

吸入による投与に好適な製剤としては、エアロゾル製剤が挙げられる。エアロゾル製剤は、加圧された許容される噴霧剤（ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素等）等の中に入れられ得る。それらは、ネブライザー又はアトマイザーからの送達のために、非加圧製剤としても製剤化され得る。

肛門投与に好適な製剤は、活性成分を種々の基剤（乳化基剤又は水溶性基剤等）と混合することによって坐剤として調製され得る。膣投与に好適な製剤は、活性成分に加えて、適切であることが当該技術分野で公知であるような担体を含有する、ペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォーム、又はスプレー製剤として提供され得る。

更に、本発明の組成物は、更なる治療剤又は生物活性物質を含み得る。例えば、特定の適応症の治療において有用な治療因子が存在し得る。炎症を制御する因子（イブプロフェン又はステロイド等）を組成物の一部とすることにより、医薬組成物の生体内投与に関連する腫脹及び炎症、並びに生理学的な苦痛を低減させ得る。

吸入治療の場合は、本発明の医薬組成物は望ましくは、エアロゾルの形態である。個体形態であっても、薬剤の投与のためのエアロゾル発生器及び霧発生器が入手可能である。これらの発生器は呼吸可能又は吸入可能な粒子を提供し、ヒトへの投与に好適な速さで、計量された所定の用量の医薬を含有する量のエアロゾルを発生させる。そのようなエアロゾル発生器及び霧発生器の例としては、当該技術分野で公知の定量噴霧器及び吸入器が挙げられる。液体形態の場合、本発明の医薬組成物は、いずれかの好適な装置によりエアロゾル化され得る。

静脈内、腹腔内又は腫瘍内投与との関係で用いられる場合、本発明の医薬組成物は、活性化合物の無菌の水性及び非水性の注射溶液、懸濁液又は乳液であって、好ましくは意図される受容者の血液と等張である製剤、を含み得る。これらの製剤は、抗酸化剤、緩衝液、界面活性剤、共溶媒、静菌剤、組成物を、意図された受容者の血液と等張にする溶質、及び当該技術分野で公知の他の製剤成分の1つ以上を含有することができる。水性及び非水性の無菌懸濁液は懸濁剤及び増粘剤を含むことができる。組成物は単回用量容器又は複数回用量容器、例えば密封されたアンプル及びバイアルとして提供され得る。

本発明の方法は、併用療法の一部でもあり得る。語句「併用療法」は、本発明による治療剤を、他の治療組成物と共に、この併用の恩恵的効果が、治療を受けている哺乳動物において実現されるように、連続的又は同時的な態様で、投与することをいう。

XI.本発明は多くの状態に適用可能である

本発明の組成物及び方法は、疾患部位が、軟組織、結合組織、骨、固形臓器及び血管等を含むいずれかの体内組織中の増殖異常状態、組織リモデリング、過形成、過剰な創傷治癒が挙げられるが、これらに限定されない種々の疾患の診断及び治療における使用に好適である。そのような疾患のより具体的な例としては、癌、糖尿病性又はその他の網膜症、炎症、線維症、関節炎及び血管又は人工血管移植片又は血管内装置における再狭窄等が挙げられる。

好ましい態様において、本発明は腫瘍の診断及び／又は治療方法を提供する。該腫瘍は、口腔腫瘍、咽頭腫瘍、消化器系腫瘍、呼吸器系腫瘍、骨腫瘍、軟骨腫瘍、骨転移、肉腫、皮膚腫瘍、メラノーマ、乳房腫瘍、生殖器系腫瘍、尿路腫瘍、眼窩腫瘍、脳及び中枢神経系腫瘍、グリオーマ、内分泌系腫瘍、甲状腺腫瘍、食道腫瘍、胃腫瘍、小腸腫瘍、結腸腫瘍、直腸腫瘍、肛門腫瘍、肝臓腫瘍、胆嚢腫瘍、膵臓腫瘍、喉頭腫瘍、肺腫瘍、気管支腫瘍、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、子宮頸腫瘍、子宮体腫瘍、卵巣腫瘍、外陰腫瘍、膣腫瘍、前立腺腫瘍、前立腺癌、精巣腫瘍、陰茎腫瘍、膀胱腫瘍、腎臓腫瘍、腎盂腫瘍、尿管腫瘍、頭頸部腫瘍、副甲状腺腫瘍、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病からなる群より選ばれる。さらに、本発明は、化学療法剤に対する腫瘍の応答の予測又は判定方法、腫瘍の治療方法、並びに化学療法剤に対する哺乳動物の腫瘍の応答を予測するためのキットを提供し、ここで、該腫瘍は、肉腫、腺癌、扁平上皮癌、大細胞癌、小細胞癌、基底細胞癌、明細胞癌、膨大細胞腫（oncytoma）又はそれらの組み合わせである。

本発明は、疾患が、ヒトを含むが、これに限定されない哺乳動物におけるものである実施形態を提供する。

X.キット

本発明は、医薬製剤及び当該医薬製剤を腫瘍の治療において用いるための指示書を含む、腫瘍の治療のためのキットを提供し、当該医薬製剤は、活性物質にコンジュゲートしたペプチドリガンドドメインを含むコンジュゲート分子を含み、ペプチドリガンドドメインは配列番号１のペプチド又はそのホモログを含み、該ペプチドリガンドドメインは、約700μM以下の平衡解離定数（Kd）によって特徴付けられるヒト血清アルブミンに対する親和性を有し、且つ、任意に、コンジュゲート分子は第二のペプチドリガンドドメイン（例、配列番号２）を更に含み、且つ前記キットを用いるための指示書（例、FDA承認の添付文書）を含む。

以下の実施例により本発明を更に説明するが、決して、その範囲を限定するものと解釈してはならない。

実施例１
本実施例では抗SPARC抗体の、SPARCへの特異的な結合を実証する。

超音波破砕によって、HUVEC細胞から全細胞抽出物を調製した。タンパク質を5〜15%SDS-PAGEで分離し、PVDF膜に転写してSPARCに対するポリクローナル抗体及びSPARCに対するモノクローナル抗体で可視化した。両抗体とも、SPARCの正確な分子量である38kDaの単一バンドに反応した。同じ方法によってMX-1腫瘍細胞株を解析すると、SPARCは澄んだ細胞ライセート又は膜に富む膜画分の両方に検出された。

実施例２
本実施例では正常組織において、SPARCが発現していないことを実証する。

ヒト及びマウスの正常組織を免疫染色し、腫瘍組織及び正常組織のアレイを用いてSPARC染色についてスコア付け（0〜4）した。免疫染色はウサギ抗SPARCポリクローナル抗体を用いて行った。SPARCは、食道を除き、正常組織のいずれにも発現していなかった。同様に、SPARCは、雌性マウスの腎臓を除き、マウス正常組織のいずれにも発現していなかった。しかしこの発現は、SPARCに相同性があるフォリスタチンに起因するものの可能性がある。

実施例３
本実施例ではMX-1腫瘍細胞におけるSPARCの発現を示す。

当該技術分野で公知の方法を用いて、MX-1細胞をカバーグラス上で培養し、ヒトSPARCに対する抗体で染色した。抗体染色を観察し、MX-1がSPARCを発現していることを証明した。これらの結果は、MX-1腫瘍細胞において検出されたSPARCの発現は、MX-1腫瘍細胞によるSPARCの分泌の結果であることを示唆している。MX-1腫瘍細胞に対する染色は、HUVEC（ヒト臍帯静脈内皮細胞）、HLMVEC（ヒト肺微小血管内皮細胞）、及びHMEC（ヒト乳房上皮細胞）等の正常初代細胞の染色よりも強かった。共焦点顕微鏡及び未透過処理細胞の染色によって証明されたとおり、SPARC染色の大部分が内部のSPARCであったが、有意なレベルの表面SPARCが検出された。

実施例４
本実施例ではヒト乳癌細胞におけるSPARCタンパク質の過剰発現を示す。

Cybrdi, Inc.（Gaithersburg, MD）の腫瘍アレイを用い、ヒト乳癌細胞におけるSPARCの発現を測定した。本解析の結果を表１に示す。染色強度は、「陰性」〜4+でスコア付けし、より大きな数はより大きな過剰発現の強さに対応している。正常組織が1%であるのに対し、49%の乳癌がSPARCに関して染色が陽性（2+以上）であった（p<0.0001）。

実施例５
本実施例では、ナノ粒子アルブミン結合パクリタキセル（ABI-007）を用いて高奏効率を伴う頭頸部扁平上皮細胞癌における、SPARCの過剰発現を証明する。

頭頸部（H&N）及び肛門管扁平上皮細胞癌（SCC）を有する患者の第I相及び第II相の臨床研究において、経動脈的に送達されたナノ粒子アルブミン結合パクリタキセル（アブラキサン（登録商標）、ABX又はABI-007）（例えば、Damascelli et al., Cancer, 92(10), 2592-2602 (2001)、及びDamascelli et al.,AJR, 181, 253-260 (2003)を参照）について、それぞれ78%及び64%の奏効率が観察された。我々は、ABX及びタキソール（TAX）の生体外細胞傷害性の比較において、頸部扁平上皮細胞株（A431）がTAX（0.012μｇ/ｍｌ）に対して、ABX（0.004μｇ/ｍｌ）でIC50の向上を示すことを観察した。パクリタキセル（P）の、アルブミン介在性経内皮カベオラ輸送、及び、TAXに対してABXについてのPの腫瘍内蓄積の増加が、最近証明された（例えば、Desai, SABCS 2003を参照）。

ヒトH＆N腫瘍組織（n=119）及びヒト正常H＆N組織（n=15）を免疫染色し、腫瘍組織及び正常組織のアレイを用いてSPARC染色についてスコア付け（0〜4+）した。免疫染色はウサギ抗SPARCポリクローナル抗体を用いて行った。新たな第I相投与量増加の研究（ABXを3週間毎に30分にわたって静脈内に与える）において、頭頸部癌の患者のサブセット（n=3）をABXへの応答について解析した。

SPARCは、正常組織の0％（0/15）に対して、H&N腫瘍の60％（72/119）で過剰発現（スコア＞2+）していた（p<0.0001）。

新たな第I相投与量増加の研究（ABXを3週間毎に30分にわたって静脈内に与える）において、頭頸部癌の患者のサブセット（n=3）をABXへの応答について解析した。本研究においては、H＆N患者の2/3が、投与レベル135mg/ｍ2（1pt）及び225mg/m2（1pt）での2サイクルの治療後に、部分的寛解（PR）を達成した。1/3の患者は260mg/m2で進行した。これらの患者からの腫瘍組織をSPARCについて染色したところ、寛解している患者の１人がSPARCの強い過剰発現を示した。

実施例５
本実施例では、SPARC-アルブミン相互作用を実証する。

全長の野生型SPARC（「WT」）、残基３のグルタミンが欠失したSPARC欠損変異体「Q3」又はカテプシンKで処理したSPARCをPVDF膜上に固定し、Alexa fluor 488をコンジュゲートしたウシ血清アルブミンを入れた減少していく濃度のヒト血清アルブミンに曝露した。

最初の実験においては、全長の野生型SPARC及び「Q3」変異体のSPARCポリペプチドを、PVDFが付着した96ウェルプレート上に、4℃で一晩インキュベーションすることにより固定した（5μg/ウェル）。翌日、DPBSでプレートを洗浄し、DPBS中5％の脱脂粉乳で1時間ブロッキングした。100μlのDPBSを各ウェルに加えた。1バイアルのAlexa 488-BSA（5mg）を1.2mlの25％ヒト血清アルブミン（「HSA」）で溶解し、100μlのBSA-HSAミックスをプレートの第一列目のウェルに加えた（第一列目におけるAlexa 488-BSAの最終濃度は約200μg/ウェルとなる）。各列に段階希釈を作製し、プレートを1時間暗所でインキュベーションした。1時間のインキュベーション後、膜をPBSで洗浄し、残存するアルブミン量を蛍光プレートリーダーにより定量した。

図２は、SPARC及びQ3変異体の両方がアルブミンに結合することを示す。フォローアップの比較研究により、SPARCへのアルブミン結合は5％のIC50を示すことが示された。WTとQ3ポリペプチドで、同様な結合が観察された。

実施例６
本実施例は、SPARC-アルブミン相互作用配列である例示的なペプチドリガンドドメインの位置として配列番号１に相当するSPARC配列を特定する。

30μgの組換えヒト（「rh」）SPARCを0.4μgのカテプシンKと共に10、30、60及び120分間インキュベーションした。カテプシンK消化産物のポリアクリルアミド電気泳動を図３に示す。図４は、カテプシンKがSPARCを3つの断片に切断することを示す。結合実験により、rhSPARCへのアルブミンの結合は、カテプシンK消化（60分）により消失することが示され、このことは、SPARCのアルブミン結合ドメインはC末端のシステイン欠乏ドメイン中にあることを示唆している（図５）。従って、SPARCのC末端のシステイン欠乏ドメインにわたる、重なり合う15merペプチドを調製した（図６）。

SPARC C末端のシステイン欠乏ドメインにわたる15merペプチドを、競合結合アッセイに用いた。具体的には、SPARCペプチドをPVDFが付着した96ウェルプレート上に、4℃で一晩インキュベーションすることで固定した（5μg/ウェル）。翌日、DPBSでプレートを洗浄し、DPBS中5％の脱脂粉乳で１時間ブロッキングした。次に、100μlのDPBSを第一列目にあるウェル以外の各ウェルに加えた。1バイアルのAlexa 488-BSA（5mg）を1.2mlの25％HSAで溶解した。100μlのBSA-HSAを、DPBS中4mg/mlとして調製した100μlのSPARCペプチドと混合した（第一列目におけるAlexa 488-BSA及びペプチドの最終濃度は各ウェルあたり約200ugとなる）。各列に段階希釈を作製した。プレートを1時間暗所でインキュベーションして洗浄し、蛍光を読んだ。図７中に示す通り、2つの実験において、ペプチド#47だけがアルブミンのSPARCへの結合を阻害した。SPARCのアルブミン結合部位の位置を更に突き止めるために、SPARCのサブフラグメントを作製した（図８）。特に、ペプチド＃103（MYIFPVHWQFG）（配列番号６６）及び＃104（FPVHWQFGQLDQHPI）（配列番号６７）は、単独で活性のあるペプチドであるペプチド＃47のサブフラグメントである。図９中に示す通り、これらのペプチドは部分的な活性を有する。このことは、完全な活性には全長のペプチド47が必要なことを示唆している。

実施例７
本実施例は、アルブミン結合配列としての配列番号２の発見を実証する。市販のペプチドファージディスプレイライブラリー（M13中12merのペプチド）を、ヒト血清アルブミン（HSA）に結合するペプチドについてスクリーニングした（図１０参照）。4回のパニングを、以下のようにして完了した。

１．100ug/ml HSA溶液を12ウェルプレートのウェル上にコーティングし、ウェルを1〜2 x 10 ¹¹ pfuのファージに曝露することにより、ファージライブラリーをスクリーニングした。結合したファージを0.2Mグリシン（pH2.2）緩衝液で溶出し、15 x 10 ⁵ pfu/ml（増幅の後5 x 10 ¹³ pfu/mlとなった）を得た。

２．第二パニングを0.2Mグリシン（pH2.2）緩衝液で溶出し、12 x 10 ⁶ pfu/ml（増幅の後は8 x 10 ¹³ pfu/ml）を得た。

３．第三パニングを250 ug/mlHSAで1時間溶出し、5 x 10 ⁵ pfu/ml（増幅の後は2 x 10 ¹² pfu/ml）を得た。

４．第四パニングを0.2Mグリシン（pH2.2）緩衝液で溶出し、14 x 10 ⁸ pfu/mlを得た。第四回目のパニングの後、約100プラークを選択し、増幅してシークエンスした。シークエンスの結果を図１１に示す。最も共通する配列KNHGATRTTRAS（ペプチド４７；配列番号２）は、おそらく本物のリガンドだと考えられ、その次に最も共通する配列WPHHHHTRLSTV（配列番号３）（高度に塩基性）は、非特異的結合の結果であろうと考えられる。

本明細書中に引用された全ての参考文献（刊行物、特許出願、及び特許を含む）は、各参考文献が参照により組み込まれることが個々に且つ具体的に示され、またその全体が本明細書中で説明されたのと同程度まで、参照により本明細書中に組み込まれる。

本発明（特に添付の特許請求の範囲に関して）を記載することに関して、用語「a」及び「an」及び「the」並びに同様の指示語の使用は、本明細書中に別途示されない限り、又は文脈により明らかに矛盾しない限り、単数及び複数の両方を含むと解釈されるべきである。用語「含む（comprising）」、「有する（having）」、「含む（including）」、及び「含有する（containing）」は、別途言及されない限り、オープンエンドの（open-ended）用語（即ち、「含むが、それに限定されない」を意味する）と解釈されるべきである。本明細書中の値の範囲の列挙は、本明細書中に別途示されない限り、この範囲内に入る各個別の値に個々に言及することの省略方法として機能することを意図するに過ぎず、各個別の値は、それが本明細書中に個々に列挙されたかのように、本明細書中に組み込まれる。本明細書中に記載される全ての方法は、本明細書中に別途示されない限り、又はさもなくば文脈により明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施され得る。本明細書中に提供されるあらゆる全ての例、又は例示的語句（例えば、「等（such as）」）の使用は、本発明をより明確にすることを意図するに過ぎず、別途主張されない限り、本発明の範囲を限定しない。本明細書中のいかなる語句も、特許請求されていない任意の要素を本発明の実施に必須なものとして示していると解釈されるべきではない。

本発明を実施するための本発明者らが知る最良の形態を含めて、本発明の好ましい実施形態が本明細書中に記載されている。これらの好ましい実施形態のバリエーションは、前述の記載を読めば、当業者に明らかになり得る。本発明者らは、当業者が必要に応じてそのようなバリエーションを使用することを予期し、また本発明者らは、本明細書中に具体的に記載されたもの以外の方法で、本発明が実施されることを意図する。従って、本発明は、適用法により許容されるような、本明細書に添付された特許請求の範囲に列挙された主題の全ての改変物及び均等物を含む。更に、上記要素の全ての可能なバリエーションでの上記要素の任意の組み合わせが、本明細書中に別途示されない限り、又はさもなくば文脈により明らかに矛盾しない限り、本発明により包含される。

Claims (20)

1. 活性物質にコンジュゲートしたペプチドリガンドドメインを１つ以上含むコンジュゲート分子を含む組成物であって、各ペプチドリガンドドメインが配列番号１、２又は６６のペプチドからなる、組成物。
2. 動物への組成物の投与により：
   （a）活性物質単独の送達に比べて亢進した、疾患部位への活性物質の送達
   又は
   （b）活性物質を単独で投与した際に得られる血中レベルの半減期に比べて大きい、活性物質の血中レベルの半減期
   がもたらされる、請求項１記載の組成物。
3. 疾患部位が腫瘍性疾患、増殖性疾患又は炎症性疾患の部位である、請求項１記載の組成物。
4. 前記活性物質が、治療剤又は診断剤を含む、請求項１記載の組成物。
5. 前記活性物質が、チロシンキナーゼ阻害剤、キナーゼ阻害剤、生物活性物質、生体分子、放射性核種、アドリアマイシン、アンサマイシン抗生物質、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、ブスルファン、シスプラチン、カルボプラチン、カルムスチン、カペシタビン、クロラムブシル、シタラビン、シクロホスファミド、カンプトセシン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デクスラゾキサン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エトポシド、エポチロン類、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルカプトプリン、メルファラン、メトトレキサート、ラパマイシン(シロリムス)、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ニトロソ尿素、パクリタキセル、パミドロネート、ペントスタチン、プリカマイシン、プロカルバジン、リツキシマブ、ストレプトゾシン、テニポシド、チオグアニン、チオテパ、タキサン類、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、タキソール、コンブレタスタチン類、ディスコデルモライド類、トランスプラチナ、抗血管内皮増殖因子化合物（「抗VEGF」）、抗上皮細胞増殖因子受容体化合物（「抗EGFR」）、５-フルオロウラシル及び誘導体類、放射性核種、ポリペプチド毒素、アポトーシス誘導剤、治療増感剤、酵素又は活性のあるその断片、及びそれらの組合せからなる群から選択される治療剤である、請求項４記載の組成物。
6. 前記治療剤が、抗体又は抗体断片である、請求項４記載の組成物。
7. 前記抗体断片がFc断片である、請求項６記載の組成物。
8. 前記抗体又は抗体断片が、補体活性化、細胞介在性細胞傷害性又はオプソニン化の1つ以上を媒介する、請求項６記載の組成物。
9. 診断剤が、放射活性剤、MRI造影剤、X線造影剤、超音波造影剤、及びPET造影剤からなる群から選択される、請求項４記載の組成物。
10. 注射を介して、吸入を介して、鼻内に、又は経口的に患者に投与される、請求項１記載の組成物。
11. 好適な医薬担体を更に含む、請求項１記載の組成物。
12. 非ヒト動物組織内の活性物質分布の調節方法であって、該方法は、活性物質にコンジュゲートしたペプチドリガンドドメインを１つ以上含むコンジュゲート分子を含む組成物を該非ヒト動物に投与することを含み、各ペプチドリガンドドメインが配列番号６６若しくは２のペプチドからなり、且つ組成物の該非ヒト動物への投与が、活性物質の疾患部位への送達の亢進をもたらす、方法。
13. 該非ヒト動物への組成物の投与により、活性物質を単独で投与した際に得られる血中レベルの半減期に比べて大きい、活性物質の血中レベルの半減期がもたらされる、請求項１２記載の方法。
14. 前記活性物質が、治療剤又は診断剤を含む、請求項１２記載の方法。
15. 前記治療剤が、チロシンキナーゼ阻害剤、キナーゼ阻害剤、生物活性物質、生体分子、放射性核種、アドリアマイシン、アンサマイシン抗生物質、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、ブスルファン、シスプラチン、カルボプラチン、カルムスチン、カペシタビン、クロラムブシル、シタラビン、シクロホスファミド、カンプトセシン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デクスラゾキサン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エトポシド、エポチロン類、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルカプトプリン、メルファラン、メトトレキサート、ラパマイシン(シロリムス)、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ニトロソ尿素、パクリタキセル、パミドロネート、ペントスタチン、プリカマイシン、プロカルバジン、リツキシマブ、ストレプトゾシン、テニポシド、チオグアニン、チオテパ、タキサン類、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、タキソール、コンブレタスタチン類、ディスコデルモライド類、トランスプラチナ、抗血管内皮増殖因子化合物（「抗VEGF」）、抗上皮細胞増殖因子受容体化合物（「抗EGFR」）、５-フルオロウラシル及び誘導体類、放射性核種、ポリペプチド毒素、アポトーシス誘導剤、治療増感剤、酵素又は活性のあるその断片、及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１４記載の方法。
16. 前記治療剤が、補体活性化、細胞介在性細胞傷害性又はオプソニン化の1つ以上を媒介する抗体又は抗体断片である、請求項１４記載の方法。
17. 前記活性物質が、放射活性剤、MRI造影剤、X線造影剤、超音波造影剤、及びPET造影剤からなる群から選択される、請求項１４記載の方法。
18. 前記組成物が、注射を介して、吸入を介して、鼻内に、又は経口的に患者に投与される、請求項１２記載の方法。
19. 医薬製剤及び腫瘍の治療における当該製剤の使用のための指示書を含む、腫瘍を治療するためのキットであって、該医薬製剤が、活性物質にコンジュゲートしたペプチドリガンドドメインを１つ以上含むコンジュゲート分子を含み、各ペプチドリガンドドメインが配列番号１若しくは２のペプチドからなる、キット。
20. 動物への組成物の投与により
    （a）活性物質単独の送達に比べて亢進した、疾患部位への活性物質の送達
    又は
    （b）活性物質を単独で投与した際に得られる血中レベルの半減期にくらべて大きい、活性物質の血中レベルの半減期
    がもたらされる、請求項１９記載のキット。
    

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