JP2023511857A - 付加環化を介して両側官能化された抗体 - Google Patents

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Abstract

本発明は、ペイロード抗体比１を有する抗体－ペイロードコンジュゲートを提供する。抗体－ペイロードコンジュゲートは、構造（１）：式（１）（式中、ａ、ｂ及びｃはそれぞれ独立に、０又は１であり；Ｌ１、Ｌ２及びＬ３はリンカーであり；Ｄはペイロードであり；ＢＭは分岐部分であり；Ｚは付加環化反応によって得ることができる接続基である）を有する。本発明は、本発明による抗体－ペイロードコンジュゲートを調製する方法、その調製方法における中間体化合物、及び本発明による抗体－ペイロードコンジュゲートの医学的使用をさらに提供する。

Description

［０００１］本発明は、バイオコンジュゲーションの分野、特に単一ペイロードを含有する抗体コンジュゲート（薬物抗体比１）に関する。より詳細には、本発明は、付加環化反応を介したＩｇＧ型抗体へのペイロードの付着に適したコンジュゲート、組成物及び方法に関する。化合物、組成物、及び方法としての単官能化抗体コンジュゲートは、例えば、極めて強力な細胞傷害剤又は免疫調節剤などのペイロードの標的化送達用の新規な薬物の提供において有用となり得る。
［０００２］治療における魔法の弾丸と考えられている抗体－薬物複合体（ＡＤＣ）は、医薬品が付着している抗体から構成されている。抗体（リガンドとしても知られる）は、小型タンパク質フォーマット（ｓｃＦｖ、Ｆａｂフラグメント、ＤＡＲＰｉｎ、アフィボディ等）であり得るが、一般的には、所与の抗原に対するその高い選択性及び親和性、その長い循環半減期、並びに免疫原性がほとんど～全くないことに基づいて選択されているモノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。よって、慎重に選択された生物学的受容体のタンパク質リガンドとしてのｍＡｂは、医薬品の選択的標的化のための理想的な送達プラットフォームを提供する。例えば、特定のがん関連抗原と選択的に結合することが知られているモノクローナル抗体を、活性異化産物の結合、内部移行、細胞内プロセシング及び最終的には放出を介した、化学的にコンジュゲートされた細胞傷害剤の腫瘍への送達に使用することができる。細胞傷害剤は低分子毒素、タンパク質毒素又は他のフォーマット、例えばオリゴヌクレオチドであり得る。結果として、抗体によって標的化されなかった正常細胞を温存しながら、腫瘍細胞を選択的に根絶することができる。同様に、抗菌薬（抗生物質）の抗体への化学的コンジュゲーションを細菌感染症の処置に適用することができ、一方、抗炎症薬のコンジュゲートは自己免疫疾患の処置について調査中であり、例えば、オリゴヌクレオチドの抗体への付着は神経筋疾患の処置のための潜在的に有望なアプローチである。よって、活性医薬品の、選択された特定の細胞位置への標的化送達の概念は、同じ薬物の全身送達と比較して多くの有益な側面を有する、広範囲の疾患を処置するための強力なアプローチである。
［０００３］特定のタンパク質薬剤の標的化送達のためにモノクローナル抗体を採用する代替戦略は、軽鎖又は重鎖（又は両方）のＮ末端又はＣ末端であり得る１つ（又は複数）の抗体の末端への前者のタンパク質の遺伝子融合によるものである。この場合、目的の生物学的に活性なタンパク質、例えばシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素Ａ（ＰＥ３８）などのタンパク質毒素又は抗ＣＤ３単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）は、必ずしもそうではないがおそらくペプチドスペーサーを介した、抗体との融合体として遺伝的にコードされるので、抗体は融合タンパク質として発現される。ペプチドスペーサーは、プロテアーゼ感受性切断部位を含有してもよいし、しなくてもよい。
［０００４］モノクローナル抗体は、タンパク質配列自体を遺伝子改変して、その構造を修飾し、それによって、特定の特性を導入（又は除去）することもできる。例えば、抗体Ｆｃフラグメントに突然変異を導入して、Ｆｃガンマ受容体への結合を無化する（ｎｉｈｉｌａｔｅ）ことができ、ＦｃＲｎ受容体への結合、若しくは特定のがん標的への結合を調節することができ、又は抗体を操作してｐＩを低下させ、循環からのクリアランス速度を制御することができる。がん処置において新たに出現した戦略は、Ｔ細胞又はＮＫ細胞再指向性抗体としても知られる、上方制御された腫瘍関連抗原（ＴＡＡ又は単に標的）並びにがん破壊免疫細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）上に存在する受容体に結合することができる抗体の使用を伴う。免疫細胞再指向のアプローチの歴史は既に３０年を超えているが、新たな技術が、第一世代免疫細胞再指向性抗体の制限を克服している、特に、半減期を延長して間欠性投薬を可能にし、免疫原性を低下させ、安全性プロファイルを改善している。最も一般的には、Ｔ細胞再指向性二重特異性抗体（ＴＲＢＡ）は、ＦＡＢフラグメントのアームの一方の補体依存性領域（ＣＤＲ）を、Ｔ細胞上のＣＤ３又はＣＤ１３７（４－１ＢＢ）に密接に結合する抗体フラグメントに遺伝子スワッピングすることによって作製される。しかしながら、これらの伝統的なＴ細胞エンゲージング二重特異性抗体に加えて、多種多様な他の分子構造、典型的にはＩｇＧ型も、例えばＹｕ及びＷａｎｇ、Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２０１９、１４５、９４１～９５６に開示されるように開発されている。同様に、腫瘍微小環境へのＮＫ細胞動員も広範に調査されている。ＮＫ細胞エンゲージメントは、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＮＫｐ４６、又は他のＮＫ細胞特異的受容体に選択的に結合する抗体（フラグメント）のＩｇＧ足場への挿入に典型的に基づく。
［０００５］ＡＤＣの分野並びに免疫細胞エンゲージメントの分野で一般的な戦略は、抗体のＦｃガンマ受容体への結合能の無化（ｎｉｈｉｌａｔｉｏｎ）又は除去を採用し、これには複数の製薬上の意味がある。Ｆｃガンマ受容体への結合の除去の最初の結果は、例えばカドサイラ（Ｋａｄｃｙｌａ）（登録商標）（トラスツズマブ－ＤＭ１）及びＬＯＰ６２８について報告されるように用量制限毒性がもたらし得る、例えばマクロファージ又は巨核球による抗体のＦｃガンマ受容体媒介取り込みの減少である。インビボでの抗体の選択的脱グリコシル化は、抗体媒介自己免疫を有する患者を処置する機会を与える。例えばＧｏｒｏｖｉｔｓ及びＫｒｉｎｏｓ－Ｆｉｏｒｏｔｔｉ、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０１３、６２、２１７～２２３並びにＧｏｅｔｚｅら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２０１１、２１、９４９～９５９（共に参照により組み込まれる）によって記載されるように、高マンノースグリコフォームは内因性マンノース受容体による非特異的取り込み及び急速なクリアランスをもたらすことによって治療有効性を損なうことが知られているので、組換え治療用糖タンパク質の高マンノースグリコフォームの除去は有益となり得る。さらに、Ｖａｎ ｄｅ Ｂｏｖｅｎｋａｍｐら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１６、１９６、１４３５～１４４１（参照により組み込まれる）は、高マンノースグリカンが免疫にどのように影響を及ぼし得るかを記載している。モノクローナル抗体の不適切なグリコシル化は、発現されるＩｇ遺伝子からの無効な産生に寄与し得ることがＲｅｕｓｃｈ及びＴｅｊａｄａ、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２０１５、２５、１３２５～１３３４（参照により組み込まれる）によって記載された。免疫療法の分野では、グリコシル化抗体の免疫細胞上のＦｃガンマ受容体への結合が、抗体の腫瘍関連抗原への結合の前に、免疫系の全身活性化を誘導し、サイトカインストーム（サイトカイン放出症候群、ＣＲＳ）をもたらし得る。したがって、ＣＲＳのリスクを低下させるために、臨床における免疫細胞エンゲージャーの大多数は、Ｆｃガンマ受容体に結合する能力を欠くＦｃサイレンシング抗体に基づく。さらに、二重特異性抗体の分野における様々な企業が、免疫細胞エンゲージング抗体ドメインに対する標的結合に関して規定の比を有するように分子構造を適合させている。例えば、Ｒｏｃｈｅは、両ＣＤＲによるＴＡＡ（例えば、ＣＤ２０又はＣＥＡ）への二価結合能を保持しているが、２本の重鎖のうちの一方のみに改変された追加の抗ＣＤ３フラグメントを有する（２：１比の標的結合：ＣＤ３結合）、非対称モノクローナル抗体に基づくＴ細胞エンゲージャーを開発している。同様の戦略は、抗ＣＤ１３７（４－１ＢＢＢ）によるＴ細胞のエンゲージメント／活性化又は抗ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＮＫｐ４６、若しくは他のＮＫ細胞特異的受容体によるＮＫ細胞エンゲージメント／活性化に採用することができる。
［０００６］Ｆｃガンマ受容体への結合の抑止は、様々な方法で、例えば抗体（詳細には、Ｆｃフラグメント）の特定の変異によって、又はＦｃフラグメント（ＣＨ２ドメイン、Ｎ２９７の周り）に天然に存在するグリカンの除去によって達成することができる。グリカン除去は、Ｆｃドメインの遺伝子改変、例えばＮ２９７Ｑ変異若しくはＴ２９９Ａ変異によって、又は例えばＰＮＧａｓｅ Ｆ若しくはエンドグリコシダーゼを使用した、抗体の組換え発現後のグリカンの酵素的除去によって達成することができる。例えば、エンドグリコシダーゼＨは高マンノース及びハイブリッドグリコフォームをトリミングするが、複合型グリカンをトリミングしないことが知られているが、エンドグリコシダーゼＳは複合型グリカン及びある程度はハイブリッドグリカンをトリミングすることができるが、高マンノース形態をトリミングすることができない。エンドグリコシダーゼＦ２は複合型グリカンをトリミングすることができ（但し、ハイブリッドをトリミングすることはできない）、エンドグリコシダーゼＦ３は１，６－フコシル化もされている複合型グリカンをトリミングすることができるだけである。別のエンドグリコシダーゼであるエンドグリコシダーゼＤはＭａｎ５（Ｍ５）グリカンのみを加水分解することができる。様々なエンドグリコシダーゼの詳細な活性の概要は、参照により本明細書に組み込まれる、Ｆｒｅｅｚｅら Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２０１０、８９：１７．１３Ａ．１～１７に開示されている。治療用途のためのタンパク質の脱グリコシル化の追加の利点は、促進されたバッチ間一貫性及び有意に改善した均質性である。
［０００７］ＡＤＣの分野においては、化学的リンカーを典型的に採用して、医薬品を抗体に付着させる。このリンカーは、薬物投与後、長期間にわたって血漿中で安定であるための要件を含む、いくつかの重要な属性を有する必要がある。安定なリンカーは、体内の計画された部位又は細胞へのＡＤＣの局在化を可能にし、あらゆる種類の望ましくない生物学的応答を無差別に誘導し、それによってＡＤＣの治療指数を低下させるであろう、循環中へのペイロードの早すぎる放出を防止する。内部移行すると、ＡＤＣは、ペイロードが有効に放出され、その標的に結合することができるようにプロセシングされるべきである。
［０００８］非切断可能と切断可能の２つのファミリーのリンカーが存在する。非切断可能リンカーは、どの器官又は生物学的区画に抗体－薬物コンジュゲートが存在するかにかかわらず生理的条件下で完全に安定である、抗体とペイロードとの間の原子の鎖からなる。結果として、非切断可能リンカーを含むＡＤＣからのペイロードの遊離は、ＡＤＣの細胞への内部移行後の抗体の完全な（リソソーム）分解に依拠する。この分解の結果として、リンカー、並びにリンカーが元々付着していた抗体由来のペプチドフラグメント及び／又はアミノ酸を依然として保有するペイロードが放出される。切断可能リンカーは、ＡＤＣからのペイロードの選択的放出のために細胞又は細胞区画の固有の特性を利用し、代謝プロセシング後にリンカーの痕跡を一般的に残さない。切断可能リンカーについては、以下の３つの一般的に使用される機序が存在する：１）特定の酵素に対する感受性、２）ｐＨ感受性、及び３）細胞（又はその微小環境）の酸化還元状態に対する感受性。
［０００９］酵素ベースの戦略は、特定のプロテアーゼ、エステラーゼ、グリコシダーゼなどの内因的存在に一般的に基づく。例えば、腫瘍学で使用されるＡＤＣの大部分は、リンカーの特定のペプチド配列の認識及び切断に腫瘍細胞リソソームに見られる優勢なプロテアーゼを利用する。参照により組み込まれる、Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ．２００２、１３、８５５－６９は、カテプシンによる細胞内切断機序としての特定のジペプチドの発見を開拓した。腫瘍リゾチーム又は腫瘍微小環境において上方制御されることが知られている他の酵素は、プラスミン、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、ウロキナーゼなどであり、これらの全てが、ＡＤＣの特定のペプチド配列を認識し、ペプチド結合のうちの１つの加水分解性切断によってリンカーからのペイロードの放出を誘導し得る。エステラーゼもエステル結合の加水分解でのペイロードの細胞内放出に採用され得、例えば、ヒトカルボキシルエステラーゼ２（ＣＥＳ２、ｈｉＣＥ）が、ペイロード自体のインビボ抗腫瘍有効性よりも優れているか、又はこれと同等である、ＣＥＳ２陽性異種移植片に対するドキソルビシンプロドラッグのインビボ抗腫瘍有効性を示したことが、参照により組み込まれる、Ｂａｒｔｈｅｌら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１２、５５、６５９５～６６０７によって実証された。第３に、様々なグリコシダーゼ、特に例えば参照により組み込まれる、Ｔｏｒｇｏｖら、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．２００５、１６、７１７～７２１及びＪｅｆｆｒｅｙら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００６、１７、８３１～８４０にそれぞれ例示されるガラクトシダーゼ（ガラクトースの除去のため）又はグルクロニダーゼ（グルクロン酸の除去のため）が、特定の単糖の選択的切断に採用され得る。結合の腫瘍特異的加水分解性切断に採用され得る他の内因性酵素は、例えばホスファターゼ又はスルファターゼである。
［００１０］内因性酵素の使用に加えて、天然では豊富ではない場合がある、選択されるいずれかの酵素の局所濃度増強を、静脈内注射、腫瘍内注射又はＡＤＥＰＴ（抗体による指向性を用いた酵素プロドラッグ療法（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｎｚｙｍｅ ｐｒｏｄｒｕｇ ｔｈｅｒａｐｙ））などの他の方法による全身投与などの戦略によって達成することができる。
［００１１］酸感受性戦略は、ヒト細胞のサイトゾル（ｐＨ７．４）と比較して低いエンドソーム（ｐＨ５～６）及びリソソーム（ｐＨ４．８）区画のｐＨを利用して、ヒドラゾンなどのリンカー内の酸不安定基の加水分解を誘因する。例えば、参照により組み込まれる、Ｒｉｔｃｈｉｅら、ｍＡｂｓ ２０１３、５、１３～２１を参照されたい。例えば米国特許出願公開第２０１８０２００２７３号に開示されるシリルエーテルに基づく、代替の酸感受性リンカーも採用され得る。
［００１２］酸化還元機序に基づく第３の放出戦略は、血漿中よりも高濃度の細胞内グルタチオンを活用する。よって、ジスルフィド架橋を含有するリンカーは、グルタチオンによる還元で遊離チオール基を放出し、ペイロードの一部のままであり得るか、又はさらなる自壊性により遊離ペイロードを放出し得る。遊離ペイロードの放出についての代替の還元機序は、（芳香族）ニトロ基又は（芳香族）アジド基のアニリンへの変換に基づくことができ、アニリンはペイロードの一部又は自壊性組み立て単位（ｓｅｌｆ－ｉｍｍｏｌａｔｉｖｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｕｎｉｔ）の一部であり得る。
［００１３］抗体－薬物コンジュゲートの自壊性組み立て単位は、薬物単位をコンジュゲートの残り又はその薬物－リンカー中間体に連結する。自壊性組み立て単位の主な機能は、リガンド単位によって標的化された部位で遊離薬物を条件的に放出することである。活性化可能自壊性部分は、活性化可能基及び自壊性スペーサー単位を含む。例えばアミド基のアミノ基への酵素的変換によって、又はジスルフィドの遊離チオール基への還元によって、活性化可能基が活性化すると、任意選択で二酸化炭素の放出を伴う、及び／又は第２の環化放出機序が続く、ｐ－アミノベンジル基のｐ－キノンメチドへの（一時的な）１，６－脱離を伴い得る、様々な機序のうちの１つ又は複数によって遊離薬物の放出をもたらす自壊性反応順序が開始される。自壊性組み立て単位は、（官能基を介して）抗体とペイロードを接続する化学的スペーサーの一部であり得る。或いは、自壊性基は、化学的スペーサーの固有の部分ではないが、抗体とペイロードを接続する化学的スペーサーから分岐する。
［００１４］販売承認されているか、又は現在後期臨床試験中である抗体－薬物コンジュゲートの大部分は、活性薬物の放出のために上記の機序のうちの１つを採用している。例えば、アドセトリス（Ａｄｃｅｔｒｉｓ）（登録商標）は、様々な血液腫瘍の処置に使用されるＡＤＣであり、自壊性ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル基（ＰＡＢ）に接続されたカテプシン感受性フラグメントからなるリンカーを介して極めて強力なチューブリン阻害剤ＭＭＡＥ（ペイロード）に接続された、ＣＤ３０標的化抗体（リガンド）で構成される。ＭＭＡＥの放出について同じ機序が、ポラツズマブ－ベドチン（ポライビー（Ｐｏｌｉｖｙ）（登録商標））について有効である。プロテアーゼ／ペプチダーゼ感受性リンカーを採用する主試験中の他のＡＤＣは、ＳＹＤ９８５、ＡＤＣＴ－４０２、ＡＳＧ－２２ＣＥ及びＤＳ－８２０１ａである。ペイロードのプロテアーゼ媒介放出は、腫瘍学の外側の領域において、詳細には細菌感染症を処置するために開発中のＡＤＣであるＲＧ７８６１（ＤＳＴＡ４６３７Ｓ）の設計の一部でもある。
［００１５］酸感受性基、特にヒドラゾン基を介してＤＮＡ損傷ペイロード（カリケアミシン）に接続された抗体からなる２種類のＡＤＣが承認されている（ベスポンサ（Ｂｅｓｐｏｎｓａ）（登録商標）及びマイロターグ（Ｍｙｌｏｔａｒｇ）（登録商標））。同様に、第ＩＩＩ相臨床試験中のＡＤＣであるサシツズマブゴビテカンは、カーボネート基の酸加水分解を介したペイロードの放出を採用する。グルタチオン感受性ジスルフィド基は、抗体をメイタンシノイドペイロードＤＭ４に接続するためのミルベツキシマブソラブタンシンにおける、及びまたＩＭＧＮ８５３におけるリンカーの一部である。現在、７５種を超えるＡＤＣが様々な臨床試験段階にあり、そのうちの少なくとも７０％がある形態の切断可能リンカーを含有している。
［００１６］上記のように、自壊性単位は、アミノ基の酵素的放出のためにプロテアーゼ感受性ペプチドフラグメントに接続された（アシル化）パラ－アミノベンジル単位の、ほとんどの場合少なくとも存在する多くのＡＤＣのリンカーの一部である。アミノベンジル基に加えて、他の芳香族部分、例えばピリジン又はチアゾールなどの複素芳香族部分も自壊性単位のための部分として採用され得る。例えば、米国特許第７７５４６８１号及び米国特許出願公開第２００５／０２５６０３０号を参照されたい。アミノベンジル基の置換はパラ位又はオルト位であり得、両方の場合で、同じ１，６－脱離機序をもたらし得る。ベンジル位は、例えば参照により組み込まれる、国際公開第２０１５／０３８４２６号に開示されるように、アルキル又はカルボニル誘導体、例えばマンデル酸から誘導されるエステル又はアミドで置換され得る。自壊性単位のベンジル位は、典型的には、それだけに限らないが、酸素又は窒素に基づく、ヘテロ原子脱離基に接続されている。主に、１，６－脱離機序の誘因で二酸化炭素を放出する、カルバメート部分のベンジル官能基、及び第一級又は第二級アミノ基が存在する。第一級又は第二級アミノ基は、毒性ペイロード自体の一部であり得、芳香族アミノ基又は脂肪族アミノ基であり得る。後者の場合、遊離ペイロードのアミノ基が、おそらくより高いｐＫａを有し、したがって、主に生理的条件（ｐＨ７～７．５）、及び詳細には腫瘍の酸性環境（ｐＨ＜７）でプロトン化状態となる。
［００１７］第一級又は第二級アミノ基は、別の自壊性基、例えばＮ，Ｎ－ジアルキルエチレンジアミン部分の一部であってもよい。他方でＮ，Ｎ－ジアルキルエチレンジアミン部分は、例えば参照により組み込まれる、Ｅｌｇｅｒｓｍａら、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．２０１５、１２、１８１３～１８３５によって実証されるように、別のカルバメート基に接続されており、環化すると、毒性ペイロードの一部としてアルコール基を遊離し得る。カルバメート部分の第一級又は第二級アミノ基はまた、Ｎ，Ｏ－アセタールの一部を形成してもよく、例えば５－フルオロウラシル（Ｍａｄｅｃ－Ｌｏｕｇｅｒｓｔａｙら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ Ｉ、１９９９、１３６９～１３７５）及びＳＮ－３８（Ｓａｎｔｉら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１４、５７、２３０３～２３１４）を放出するためのいくつかの薬物送達戦略で使用されている方法である。ごく最近では、脂肪族アルコールを放出するために、ベータ－グルクロニダーゼ促進放出機序と組み合わせて、ＡＤＣの長い循環時間のために長期血清曝露を有するリンカーを設計するために、同様の構成が、参照により組み込まれる、Ｋｏｌａｋｏｗｓｋｉら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１６、５５、７９４８～７９５１によって採用された。自壊性芳香族部分のベンジル位の官能基はまた、フェノール酸素であってもよい（例えば、参照により組み込まれる、Ｔｏｋｉら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２００２、６７、１８６６～１８７２及び米国特許第７５５３８１６号参照）が、脂肪族アルコールは十分な脱離基能力（典型的にはｐＫａ１３～１５）を有さないので、脂肪族アルコールであることはできない。ベンジル官能基の別の選択肢は、参照により組み込まれる、Ｂｕｒｋｅら、Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．２０１６、１５、９３８～９４５及びＳｔａｂｅｎら、Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．２０１６、８、１１１２～１１１９によって報告されるように、脱離でトリアルキルアミノ基又はヘテロアリールアミンを放出する第四級アンモニウム基である。
［００１８］現在、ＡＤＣに利用されているペイロードは、微小管破壊剤［例えば、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）並びにメイタンシノイド由来ＤＭ１及びＤＭ４］、ＤＮＡ損傷剤［例えば、カリケアミシン、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）二量体、インドリノベンゾジアゼピン二量体、デュオカルマイシン、アントラサイクリン］、トポイソメラーゼ阻害剤［例えば、ＳＮ－３８、エキサテカン及びその誘導体、シミテカン］又はＲＮＡポリメラーゼＩＩ阻害剤［例えば、アマニチン］を含む。ＡＤＣは臨床及び前臨床活性を示しているが、標的化腫瘍細胞上の抗原発現に加えて、どの因子がこのような効力を決定するかはずっと不明確である。例えば、薬物：抗体比（ＤＡＲ）、ＡＤＣ結合親和性、ペイロードの効力、受容体発現レベル、内部移行速度、輸送、多剤耐性（ＭＤＲ）状態、及び他の因子は全て、インビトロでＡＤＣ処置の転帰に影響を及ぼすことが暗に示されている。抗原陽性腫瘍細胞の直接的な殺傷に加えて、ＡＤＣはまた、Ｓａｈｉｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９０、５０、６９４４～６９４８によって最初に報告され、例えばＬｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１６、７６、２７１０～２７１９によって研究されるように、隣接する抗原陰性腫瘍細胞も殺傷する能力：いわゆる「バイスタンダー殺傷」効果を有する。一般的に言うと、中性の細胞傷害性ペイロードはバイスタンダー殺傷を示すが、イオン性（帯電）ペイロードは、イオン性種が受動拡散によって細胞膜を容易に通過しないという事実の結果として、バイスタンダー殺傷を示さない。例えば、参照により組み込まれる、Ｏｇｉｔａｎｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ．２０１６、１０７、１０３９～１０４６によって開示されるように、様々なエキサテカン誘導体の評価は、ヒドロキシ酢酸による第一級アミンのアシル化が、様々なアミノアシル化エキサテカン誘導体と比較して実質的に増強されたバイスタンダー殺傷体を伴う誘導体（ＤＸｄ）を提供することを示した。
［００１９］この分野の臨床試験及び販売されているＡＤＣの大部分の欠点は、毒性ペイロードが、参照により組み込まれる、Ｄｏｎａｇｈｙら、ＭＡｂｓ ２０１６、８、６５９～７１によって概説される用量制限オフターゲット毒性を誘導し得ることである。例えば、ＡＤＣは分化中の造血幹細胞に取り込まれて、毒性ペイロードの放出、巨核球増殖及び分化の阻害をもたらし、よって、血小板の生成を妨げ、最終的に血小板減少症をもたらし得ることが、参照により組み込まれる、Ｔｈｏｎら Ｂｌｏｏｄ ２０１２、１２０、１９７５～８４によって実証された。同様に、ヒドラゾンリンカーの不安定性が、２０１０年に市場から撤退した（しかしながら、後に再導入された）マイロターグ（Ｍｙｌｏｔａｒｇ）（登録商標）の安全性の問題に関与していたと考えられている。カテプシンによるタンパク質分解性切断のために設計されたリンカーが、エステラーゼＣｅｓ１ｃなどの他の酵素によっても切断され得ることが示されている（参照により組み込まれる、Ｄｏｒｙｗａｌｓｋａら、Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．２０１６、１５、９５８～９７０によって報告されている）。実際、カテプシンＢの非存在下でさえ、ペプチドベースの切断可能リンカーは細胞プロセシングを容易に受けて遊離ペイロードを放出することが、参照によって組み込まれる、Ｃａｃｕｌｉｔａｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１７、７０２７～７０３７によって実証された。さらに、分化中の好中球によるエラスターゼの排出が、毒性ペイロードの早すぎる放出を引き起こし得、ＭＭＡＥベースのＡＤＣで処置されたがん患者において一般的な有害事象である好中球減少症の原因の１つであることが、Ｚｈａｏら（参照により組み込まれる、Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．２０１７、１６、１８６６～１８７６）によって実証された。
［００２０］当技術分野で公知の抗体コンジュゲートはいくつかの欠点が問題となり得る。抗体－薬物コンジュゲートについては、抗体への毒素の担持の尺度が、薬物抗体比（ＤＡＲ）によって与えられ、この比は抗体１つ当たりの活性物質分子の平均数を与える。一般に、ＡＤＣの作製のために２つの一般的なアプローチを特定することができ、１つは内因性アミノ酸へのランダム（確率的）コンジュゲーションを介するものであり、１つは抗体の天然部位又はこのような目的のために抗体内に設計された部位であり得る抗体中の１つ又は複数の特定の部位へのコンジュゲーションを伴うものである。
［００２１］確率的コンジュゲーションによってＡＤＣを調製する方法は、２．５～４の間のＤＡＲを有する生成物を一般的にもたらすが、実際は、このようなＡＤＣは、０～８又はそれ以上で変化する目的の分子の数を有する抗体コンジュゲートの混合物を含む。換言すれば、確率的コンジュゲーションによる抗体コンジュゲートは、高い標準偏差を有するＤＡＲで一般的に形成される。例えば、ゲムツズマブオゾガマイシンは、５０％のコンジュゲート抗体（抗体の溶媒露出リジン残基にランダムに連結した、平均２又は３のＩｇＧ分子１つ当たり０～８個のカリケアミシン部分）と５０％の非コンジュゲート抗体の不均一混合物である（共に参照により組み込まれる、Ｂｒｏｓｓら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００１、７、１４９０；Ｌａｂｒｉｊｎら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００９、２７、７６７）。臨床におけるブレンツキシマブベドチン（アドセトリス（登録商標））、カドサイラ（Ｋａｄｃｙｌａ）（登録商標）（Ｔ－ＤＭ１）、及び他のＡＤＣについては、正確に何個の薬物が任意の所与の抗体に付着しているかは依然として制御不能であり、したがって、大部分がＤＡＲ３～４を有するコンジュゲートの統計分布としてＡＤＣが得られる。より高いＤＡＲを達成するための１つのアプローチは、モノクローナル抗体中の全ての（４つの）鎖間ジスルフィド結合を還元し、それによって、遊離チオールとしての合計８個のシステイン側鎖を遊離し、引き続いてマレイミド官能化ペイロードとの全体的なコンジュゲーションをして、６～８の間の最終的なＤＡＲに到達することによるものである。この方法論は、例えばＩＭＭＵ－１３２、ＩＭＭＵ－１１０、ＤＳ－８２０１ａ、Ｕ３－１４０２、ＳＧＮ－ＣＤ４８ａ及びＳＧＮ－ＣＤ２２８Ａを含む、様々な臨床段階のＡＤＣで適用されており、様々なペイロードに適用することができるが、還元ステップ中のフラグメントスクランブリングのためにＩｇＧ１以外の抗体にはあまり適さない。
［００２２］参照により組み込まれる、Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、第３版 ２０１３に要約されるように、バイオコンジュゲーションについて多くの技術が知られている。２つの主要な技術が、リジン側鎖のアシル化に基づくか、又はシステイン側鎖のアルキル化に基づく、ランダムコンジュゲーションによるＡＤＣの調製について認識され得る。リジン側鎖のε－アミノ基のアシル化は、タンパク質を活性化エステル又は活性化カーボネート誘導体に基づく試薬に供することによって典型的に達成され、例えばカドサイラ（登録商標）の製造にはＳＭＣＣが適用される。システイン側鎖のチオール基のアルキル化についての主要な化学は、例えばアドセトリス（Ａｄｃｅｔｒｉｓ）（登録商標）の製造に適用されるように、マレイミド試薬の使用に基づく。標準的なマレイミド誘導体に加えて、例えば共に参照により組み込まれる、Ｊａｍｅｓ Ｃｈｒｉｓｔｉｅら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒ．Ｒｅｌ．２０１５、２２０、６６０～６７０及びＬｙｏｎら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４、３２、１０５９～１０６２によって実証されるように、ある範囲のマレイミドバリアントもより安定なシステインコンジュゲーションに適用される。システイン側鎖へのコンジュゲーションのための別の重要な技術は、タンパク質毒素、化学療法薬、及びプローブを担体分子に可逆的に接続するために利用されている生物活性化可能接続であるジスルフィド結合によるものである（例えば、Ｐｉｌｌｏｗら、Ｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２０１７、８、３６６～３７０参照）。システインアルキル化のための他のアプローチは、例えばハロアセトアミド（典型的にはブロモアセトアミド又はヨードアセトアミド）の求核置換（例えば参照により組み込まれる、Ａｌｌｅｙら、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．２００８、１９、７５９～７６５参照）、又はアクリレート試薬との反応（例えば、共に参照により組み込まれる、Ｂｅｒｎａｒｄｉｍら、Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１６、７、ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１３１２８及びＡｒｉｙａｓｕら、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．２０１７、２８、８９７～９０２参照）、ホスホンアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｎａｍｉｄａｔｅ）との反応（例えば、参照により組み込まれる、Ｋａｓｐｅｒら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１９、５８、１１６２５～１１６３０参照）、アレンアミドとの反応（例えば、参照により組み込まれる、Ａｂｂａｓら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１４、５３、７４９１～７４９４参照）、シアノエチニル試薬との反応（例えば、参照により組み込まれる、Ｋｏｌｏｄｙｃｈら、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．２０１５、２６、１９７～２００参照）、ビニルスルホンとの反応（例えば、参照により組み込まれる、Ｇｉｌ ｄｅ Ｍｏｎｔｅｓら、Ｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２０１９、１０、４５１５～４５２２参照）、若しくはビニルピリジンとの反応（例えば、ｈｔｔｐｓ：／／ｉｋｓｕｄａ．ｃｏｍ／ｓｃｉｅｎｃｅ／ｐｅｒｍａｌｉｎｋ／（２０２０年１月７日にアクセス）参照）などの、不飽和結合への求核付加に基づく様々なアプローチを伴う。メチルスルホニルフェニルオキサジアゾールとの反応も、参照により組み込まれる、Ｔｏｄａら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１３、５２、１２５９２～１２５９６によってシステインコンジュゲーションについて報告されている。
［００２３］臨床的ＡＤＣの大部分（約６５％）はランダムペイロード付着に基づくが、部位特異的ＡＤＣに改善した治療指数がついてくるという知見に基づいて、部位特異的コンジュゲートＡＤＣに向かう明らかな傾向がある。このため、抗体の１つ（又は複数）の所定の部位（複数可）への部位特異的コンジュゲーションによって、規定のＤＡＲを有する抗体－薬物コンジュゲートの作製を可能にするいくつかの方法が開発されている。部位特異的コンジュゲーションは、ペイロード付着のためのアンカー点として働く、特定のアミノ酸（又は配列）の抗体への設計（例えば、参照により組み込まれる、Ａｇｇｅｒｗａｌ及びＢｅｒｔｏｚｚｉ、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．２０１４、５３、１７６～１９２参照）、最も典型的にはシステインの設計によって典型的に達成される。そのうえ、過去１０年間で、ある範囲の他の部位特異的コンジュゲーション技術、最も顕著には非天然アミノ酸、例えばオキシムライゲーションに適したｐ－アセトフェニルアラニン、又はクリックケミストリーコンジュゲーションに適したｐ－アジドメチルフェニルアラニンの遺伝子コードが調査されている。抗体の遺伝子再設計に基づくアプローチの大部分は、約２のＤＡＲを有するＡＤＣをもたらす。抗体の再設計を伴わない抗体コンジュゲーションへの代替アプローチは、鎖間ジスルフィド架橋の還元、引き続いてシステイン架橋試薬、例えばビス－スルホン試薬（例えば、共に参照により組み込まれる、Ｂａｌａｎら、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．２００７、１８、６１～７６及びＢｒｙａｎｔら、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ２０１５、１２、１８７２～１８７９参照）、モノ－若しくはビス－ブロモマレイミド（例えば、共に参照により組み込まれる、Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１０、１３２、１９６０～１９６５及びＳｃｈｕｍａｃｈｅｒら、Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０１４、３７、７２６１～７２６９参照）、ビス－マレイミド試薬（例えば、国際公開第２０１４１１４２０７号参照）、ビス（フェニルチオ）マレイミド（例えば、共に参照により組み込まれる、Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒら、Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０１４、３７、７２６１～７２６９及びＡｕｂｒｅｙら、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．２０１８、２９、３５１６～３５２１参照）、ビス－ブロモピリダジンジオン（例えば、参照により組み込まれる、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、ＲＳＣ Ａｄｖａｎｃｅｓ ２０１７、７、９０７３～９０７７参照）、ビス（ハロメチル）ベンゼン（例えば、参照により組み込まれる、Ｒａｍｏｓ－Ｔｏｍｉｌｌｅｒｏら、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．２０１８、２９、１１９９～１２０８参照）又は他のビス（ハロメチル）芳香族（例えば、国際公開第２０１３１７３３９１号参照）に付着したペイロードの付加を伴う。典型的には、システインの架橋によって調製されたＡＤＣは、約４の薬物抗体担持（ＤＡＲ４）を有する。
［００２４］Ｎ２９７での天然抗体グリカンの酵素的リモデリング（エンドグリコシダーゼによるトリミング及びグリコシルトランスフェラーゼの作用下でのアジド修飾ＧａｌＮＡｃ誘導体の導入）、引き続いてクリックケミストリーを使用した細胞傷害性ペイロードの付着に基づいて、均質ＡＤＣを調製し、ＤＡＲ２又はＤＡＲ４に選択的に適合させることができることが、全て参照により組み込まれる、国際公開第２０１４０６５６６１号、ｖａｎ Ｇｅｅｌら、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．２０１５、２６、２２３３～２２４２及びＶｅｒｋａｄｅら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ２０１８、７、１２によって示されている。この技術によって調製されたＡＤＣは、ある範囲の他のコンジュゲーション技術及び例えばＡＤＣＴ－６０１（ＡＤＣ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）で現在臨床的に適用されているグリカンリモデリングコンジュゲーションの技術と比較して有意に増加した治療指数を示すことが分かった。
［００２５］参照により組み込まれる、Ｌｈｏｓｐｉｃｅら、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．２０１５、１２、１８６３～１８７１によって報告された、抗体をアジド修飾抗体に変換する同様の酵素的アプローチは、細菌酵素トランスグルタミナーゼ（ＢＴＧ又はＴＧａｓｅ）を採用する。ＰＮＧａｓｅ Ｆによる天然グリコシル化部位Ｎ２９７の脱グリコシル化は、ＴＧａｓｅ媒介導入の基質になるように隣接Ｎ２９５を遊離させ、これは、ＴＧａｓｅの存在下でアジド保有分子に供すると、脱グリコシル化抗体をビス－アジド抗体に変換することが示された。その後、ビス－アジド抗体をＤＢＣＯ修飾細胞毒と反応させると、ＤＡＲ２を有するＡＤＣが得られた。Ｃ末端ＴＧａｓｅ媒介アジド導入、引き続いてメタルフリークリックケミストリーによるＡＤＣの変換に基づく遺伝子法が、参照により組み込まれる、Ｃｈｅｎｇら、Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐ．２０１８、１７、２６６５～２６７５によって報告された。
［００２６］例えば参照により組み込まれる、Ａｘｕｐら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２０１２、１０９、１６１０１～１６１０６によって実証されるように、抗体の事前遺伝子改変、引き続いてＡＭＢＥＲ抑制コドンに基づく遺伝子コードを使用した非天然アミノ酸の導入に基づく、アジドを抗体に導入する他の方法が報告されている。同様に、参照により組み込まれる、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎら、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．２０１４、２５、３５１～３６１は、メタルフリークリックケミストリーによってＡＤＣに変換するためにアジドメチルフェニルアラニン（ＡｚＰｈｅ）をモノクローナル抗体に導入する無細胞タンパク質合成法を採用している。また、この場合、ＤＡＲ２、又は２個のＡｚＰｈｅアミノ酸が最初に導入される場合にはＤＡＲ４を有するＡＤＣが調製される。また、アジドホモアラニン（Ａｈａ）などのメチオニン類似体を、栄養要求菌によってタンパク質に導入し、（銅触媒）クリックケミストリーによってタンパク質コンジュゲートにさらに変換することができることも、参照により組み込まれる、Ｎａｉｒｎら、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．２０１２、２３、２０８７～２０９７によって示されている。最後に、ピロリシル－ｔＲＮＡシンテターゼ／ｔＲＮＡＣＵＡペアを使用した組換えタンパク質への脂肪族アジドの遺伝子コードは、参照により組み込まれる、Ｎｇｕｙｅｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００９、１３１、８７２０～８７２１によって示され、標識はクリックケミストリーによって確保された。後者の方法も、Ｏｌｌｅｒ－Ｓａｌｖｉａら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１８、５７、２８３１～２８３４によって報告された方法と同様に、ＤＡＲ２ ＡＤＣを作製するために適用可能であるはずである。
［００２７］後に歪みアルキン又はアルケンによる付加環化を受けることができる中間体１，２－キノンを介した、適切に配置されたチロシンのチロシナーゼ媒介酸化によって、抗体を細胞傷害性ペイロードに部位特異的にコンジュゲートすることができることも、参照により組み込まれる、Ｂｒｕｉｎｓら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２０１７、２８、１１８９～１１９３によって示されている。
［００２８］例えばＹａｍａｄａ及びＩｔｏ、ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ．２０１９、２０、２７２９～２７３７によって強調されるように、事前遺伝子改変を用いない抗体の部位特異的修飾のための化学的アプローチも開発されている。
［００２９］部位特異的修飾のための親和性ペプチドによる化学的コンジュゲーション（ＣＣＡＰ）は、ヒトＩｇＧ－Ｆｃに高い親和性で結合し、それによって、ビオチン部分又は細胞傷害性ペイロードによるＦｃフラグメント中の単一リジンの選択的修飾を可能にするペプチドを使用することによって、Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏら、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．２０１９によって開発されている。同様に、Ｍａｔｓｕｄａら、ＡＣＳ Ｏｍｅｇａ ２０１９、４、２０５６４～２０５７０は、同様のアプローチ（アジキャップ（ＡＪＩＣＡＰ）（商標）技術）を抗体重鎖の単一リジンへのチオール基の部位特異的導入に適用することができることを実証している。ＣＣＡＰ又はアジキャップ（商標）技術はまた、アジド基又は他の官能基の導入にも採用され得る。
［００３０］市場及び臨床でのＡＤＣの主流は、上記のように、およそ２～８の間の薬物担持を有するが、ＰＢＤ二量体のほとんど、関連ＩＧＮ型ペイロード、またエンジインベースのペイロード、アマニチンなどの一部の高度細胞傷害性ペイロードについては、より低いＤＡＲが好ましいだろう。極めて強力なペイロードについてのヒトにおける最大耐用量は、１ｍｇ／ｋｇをはるかに下回る、通常さらには３００μｇ／ｋｇ未満又はさらには１００μｇ／ｋｇ未満の値まで低下し得ることが分かっている。結果として、投与（典型的には静脈内）後にインビボ受容体飽和に到達せず、最適以下の腫瘍取り込み及び増強したクリアランスにつながる。このような場合については、同様のＤＡＲ２バージョンと比較してＭＴＤがおそらく２倍高いので、同じペイロードを有するＤＡＲ１フォーマットが好ましくなり得る。Ｒｕｄｄｌｅら、ＣｈｅｍＭｅｄＣｈｅｍ ２０１９、１４、１１８５～１１９５は、ＤＡＲ１コンジュゲートを、ＣＨ１及びＣＬ鎖間ジスルフィド鎖の選択的還元、引き続いて２つのマレイミド単位を含有する対称なＰＤＢ二量体による処理によるフラグメントの再架橋によって、（完全抗体のパパイン消化又は組換え発現によって調製される）抗体Ｆａｂフラグメントから調製することができることを最近示した。得られたＤＡＲ１型Ｆａｂフラグメントは、極めて均質であり、血清中で安定であり、優れた細胞傷害性を示すことが示された。参照により組み込まれる、フォローアップ刊行物であるＷｈｉｔｅら、ＭＡｂｓ ２０１９、１１、５００～５１５、及びまた国際公開第２０１９０３４７６４号において、ＤＡＲ１コンジュゲートを、抗体の事前設計後に、完全ＩｇＧ抗体から調製することもできることが示された：ヒンジ領域にただ１つの鎖内ジスルフィド架橋を有する抗体が使用される（Ｆｌｅｘｍａｂ技術、参照により組み込まれる、Ｄｉｍａｓｉら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００９、３９３、６７２～６９２に報告される）か、又は天然アミノ酸の変異（例えば、ＨＣ－Ｓ２３９Ｃ）によって、若しくは配列への挿入（例えば、ＨＣ－ｉ２３９Ｃ、Ｄｉｍａｓｉら、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．２０１７、１４、１５０１～１５１６によって報告される）によって得ることができる、追加の遊離システインを有する抗体が使用される。いずれの設計された抗体も、得られたシステイン設計ＡＤＣとビス－マレイミド誘導ＰＢＤ二量体の反応によりＤＡＲ１ ＡＤＣの作製を可能にすることが示された。Ｆｌｅｘｍａｂ誘導ＤＡＲ１ ＡＤＣは、血清中でのペイロード損失に極めて耐性であり、ＨＥＲ２陽性胃癌異種移植モデルで強力な抗腫瘍活性を示すことが示された。さらに、このＡＤＣは、単一マレイミド含有ＰＢＤ二量体を使用して調製された部位特異的ＤＡＲ２ ＡＤＣと比較して２倍の用量でラットにおいて忍容性を示した。しかしながら、ＤＡＲ２ ＡＤＣと比較したＤＡＲ１ ＡＤＣの最小有効量（ＭＥＤ）は同じ係数２で増加したので、治療濃度域の改善は認められなかった。
［００３１］現在まで、ＤＡＲ２ ＡＤＣと比較して治療指数を改善するＤＡＲ１技術は報告されていない。また、モノクローナル抗体の再設計を要しない、完全抗体からのＤＡＲ１ ＡＤＣによる作製のための技術は報告されていない。治療指数の改善及び／又はＤＡＲ１ ＡＤＣに向けた非遺伝子アプローチの両方が、より速い臨床までの時間を有するより優れたＡＤＣの開発への有意な寄与となるだろう。
［００３２］抗体の事前再設計を要することなく、完全長抗体を、単一薬物担持（ＤＡＲ１）を有する安定で部位特異的なＡＤＣに変換するための技術が提示される。この技術は、いずれのＩｇＧアイソタイプにも適用可能であり、付加環化コンジュゲーション反応を介して、低分子細胞傷害剤からタンパク質足場（サイトカイン、ｓｃＦｖ）、オリゴヌクレオチドなどに及ぶペイロードの、抗体への付着を可能にする。エンドグリコシダーゼによるグリカンの事前トリミングを伴う、好ましい実施形態による手順は、Ｆｃガンマ受容体結合の付随する抑止と共に進行し、よって、エフェクター機能を除去する。
［００３３］本発明による抗体－ペイロードコンジュゲートは、構造（１）：
Figure 2023511857000002
（式中、
ａ、ｂ及びｃはそれぞれ独立に、０又は１であり；
Ｌ１、Ｌ２及びＬ３はリンカーであり；
Ｄはペイロードであり；
ＢＭは分岐部分であり；
Ｚは付加環化反応によって得ることができる接続基である）
によるものである。
［００３４］本発明は、本発明による抗体－ペイロードコンジュゲートを調製する方法、その調製方法における中間体化合物、及び本発明による抗体－ペイロードコンジュゲートの医学的使用をさらに提供する。
反応性基と反応すると、接続基Ｚをもたらす、天然に存在するか、又は設計によって導入された、生体分子中の官能基（Ｆ）の代表的な（但し、包括的ではない）セットを示す図である。官能基Ｆは、任意の選択された位置で生体分子に人工的に導入（設計）することができる。ピリダジン接続基（下の段）は、Ｎ２の喪失を伴って、テトラジンとアルキンの反応で形成される、テトラアザビシクロ［２．２．２］オクタン接続基の再配列の生成物である。本明細書において、Ｘはハロゲンであり得、Ｘ９はＨ、アルキル又はピリジルであり得る。構造（１０ｅ）～（１０ｈ）の接続基Ｚが、本発明で使用される好ましい接続基である。 例えば２位においてアジドアセチル基（１１ｂ）、若しくはアジドジフルオロアセチル基（１１ｃ）、又はＮ－アセチルガラクトサミンの６位においてアジド基（１１ｄ）で修飾され得る、ガラクトサミンのＵＤＰ糖の誘導体のいくつかの構造を示す図である。単糖（すなわち、ＵＤＰが除去されている）が、本発明で使用される好ましい部分Ｓｕである。 ２つのアジド基（１つはいずれかの天然グリコシル化部位）を含有する、グリカンリモデリング抗体へのモノクローナル抗体の非遺伝子変換の一般的な方法を示す図である。二価シクロオクチン構築物と反応すると、単一ペイロード（Ｒ）はビス－アジド抗体に付着される。このようなクリッピングは、２つの末端アセチレン基を有する二価構築物を使用した銅触媒クリック反応によっても達成することができる（図示しない）。 メタルフリークリックケミストリーに適したシクロオクチンを示す図である。このリストは包括的ではなく、例えば、アルキンを、フッ素化、芳香環の置換、又は芳香環へのヘテロ原子の導入によってさらに活性化することができる。 抗体－薬物コンジュゲートにおいてペイロードとして定義される、図３及び図４の二価構築物中に存在するＲ基の例を示す図である。Ｒ基は、切断可能部分、例えば上の構造に描かれるペプチド切断可能リンカーを介して二価構築物に付着され得る。酸切断可能リンカー若しくはジスルフィドベースのリンカー、又はさらに別の機序によって切断されるリンカーも使用され得る（図示しない）。Ｒ基は非切断可能リンカー（下の構造）を介しても付着され得る。Ｒ基自体が、例えば細胞傷害性分子であってもよい（但し、細胞傷害性分子に限定されない）。 ２つのシクロオクチン部分が二量体構造を有するペイロード、例えばＰＢＤ二量体又はデュオカルマイシン二量体の２つの部位に付着されている、ビス－アジド抗体上にクリッピングすることによるＤＡＲ１ ＡＤＣの作製に適した二価シクロオクチン構築物の図である。リンカーは、ＰＢＤ二量体について例示されるように、切断可能な性質のものであっても、非切断可能な性質のものであってもよい。二量体細胞傷害性ペイロードは、必ずしも例示される例のように対称的な性質でなく、例えばデュオカルマイシン単量体とＰＢＤ単量体の組み合わせも可能である。 ビスアジド－ｍＡｂと反応し、１つのシクロオクチンをその後のクリックケミストリーのために残しておく三価シクロオクチン構築物を使用することによって、ＤＡＲ１フォーマットでペイロードを付着するための間接的アプローチを示す図である（アジド修飾ペイロードで例示される、他の選択肢はニトロン、ニトリルオキシド、ジアゾ化合物、テトラジン等を用いたクリックケミストリーであり得る）。 ビス－グリカン修飾ｍＡｂとの反応のための三価構築物についての様々な選択肢を示す図である。三価構築物はホモ三価（ｈｏｍｏｔｒｉｖａｌｅｎｔ）又はヘテロ三価（ｈｅｔｅｒｏｔｒｉｖａｌｅｎｔ）（２＋１フォーマット）であり得る。ホモ三価構築物（Ｘ＝Ｙ）は、３×シクロオクチン又は３×アセチレン又は３×マレイミド又は３×他のチオール反応性基からなり得る。ヘテロ三価構築物（Ｘ≠Ｙ）は、例えば２つのシクロオクチン基と１つのマレイミド基、又は１つのトランス－シクロオクテン基からなり得る。Ｘ及びＹが互いに反応性（例えば、ＢＣＮ＋テトラジン）でない限り、ＸとＹの任意の組み合わせのヘテロ三価構築物が存在し得る。 様々な二価ＢＣＮ試薬（１０５、１０７、１１８、１２５、１２９、１３４）、三価ＢＣＮ試薬（１４３、１４５、１５０）、ソルタギングのための一価ＢＣＮ試薬（１５７、１６１、１６３、１６８）又はソルタギングのための一価テトラジン試薬（１５４）を示す図である。 様々な二価又は三価架橋剤（ＸＬ０７～ＸＬ１３）を示す図である。 抗体コンジュゲートへのその後の変換のための出発物質としての様々な抗体バリアントを示す図である。 ビス－アジド修飾抗体との架橋によってＤＡＲ１ ＡＤＣを作製するためのＭＭＡＥ又はＭＭＡＦに基づく様々なビス－ＢＣＮ修飾細胞傷害性薬物を示す図である。 ビス－アジド修飾抗体との架橋によってＤＡＲ１ ＡＤＣを作製するためのＭＭＡＥ（３０３）、ＰＢＤ二量体（３０４）、カリケアミシン（３０５）又はＰＮＵ１５９，６８２（３０６）に基づく様々なさらなるビス－ＢＣＮ修飾細胞傷害性薬物を示す図である。 ビス－アジド修飾抗体又はビス－アルキン修飾抗体との架橋によってＤＡＲ１ ＡＤＣを作製するためのＭＭＡＥ又はＭＭＡＦに基づく様々なシクロオクチン（ＢＣＮ、ＤＩＢＯ、ＤＢＣＯ、様々なシクロオクチン間リンカーバリエーションを有する）又はアジドを含む様々な二価細胞傷害性薬物を示す図である。 ＢＣＮ－ＭＭＡＥ（３１２）又はアジド－ＭＭＡＦ（３１３）に基づく２つの一価直鎖リンカー－薬物の構造を示す図である。 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す図である：１レーン－リツキシマブ；２レーン－ｒｉｔ－ｖ１ａ；３レーン－ｒｉｔ－ｖ１ａ－１４５；４レーン－ｒｉｔ－ｖ１ａ－（２０１）２；５レーン－ｒｉｔ－ｖ１ａ－１４５－２０４；６レーン－ｒｉｔ－ｖ１ａ－１４５－ＰＦ０１；７レーン－ｒｉｔ－ｖ１ａ－１４５－ＰＦ０２。ゲルをクーマシーで染色して全タンパク質を可視化した。試料を、非還元条件下６％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（左）及び還元条件下１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（右）で分析した。 Ｂ１２－ｖ１ａ（上のトレース）及びＢ１２－ｖ１ａ－１４５（下のトレース）のＲＰ－ＨＰＬＣトレースを示す図である。試料を、ＲＰ－ＨＰＬＣ分析前にＩｄｅＳで消化している。 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す図である：１レーン－ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ；２レーン－ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－ＸＬ１１；３及び４レーン－ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－ＸＬ１１－ＰＦ０１；５レーン－ｒｉｔ－ｖ１ａ；６レーン－ｒｉｔ－ｖ１ａ－ＸＬ１１；７及び８レーン－ｒｉｔ－ｖ１ａ－ＸＬ１１－ＰＦ０１。ゲルをクーマシーで染色して全タンパク質を可視化した。試料を、非還元条件下６％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（左）及び還元条件下１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（右）で分析した。 ビス－ＢＣＮ－ＭＭＡＥ ＬＤ０３（＝３０３）による処理後の脱グリコシル化トラスツズマブについてのＲＰ－ＨＰＬＣデータを示す図である。 非還元条件下６％ゲルでのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す図である：１レーン－リツキシマブ；２レーン－ｒｉｔ－ｖ１ａ－（２０１）２；３レーン－ｒｉｔ－ｖ１ａ－１４５－ＰＦ０８；４レーン－Ｂ１２－ｖ１ａ－１４５－ＰＦ０１；５レーン－Ｂ１２－ｖ１ａ－１４５－ＰＦ０８。ゲルをクーマシーで染色して全タンパク質を可視化した。１レーン及び２レーンを、非コンジュゲートｍＡｂ及び２：２分子フォーマットについての参照として含める。 非還元条件下６％ゲルでのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す図である：１レーン－ｒｉｔ－ｖ１ａ－（２０１）２；２レーン－ｒｉｔ－ｖ１ａ－１４５－ＰＦ０１；３レーン－ｒｉｔ－ｖ１ａ；４レーン－ｒｉｔ－ｖ１ａ－ＰＦ２２；５レーン－ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－ＰＦ２２。ゲルをクーマシーで染色して全タンパク質を可視化した。１レーン及び２レーンを、非コンジュゲートｍＡｂ及び２：２分子フォーマットについての参照として含める。 非還元条件下６％ゲルでのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す図である：１レーン－ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ；２レーン－ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－ＰＦ２３。ゲルをクーマシーで染色して全タンパク質を可視化した。１レーンを、非コンジュゲートｍＡｂについての参照として含める。 非還元条件下６％ゲルでのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す図である：１レーン－ｒｉｔ－ｖ１ａ；２レーン－ｒｉｔ－ｖ１ａ－（２０１）２；３レーン－ｒｉｔ－ｖ１ａ－１４５－ＰＦ０１；４レーン－ｒｉｔ－ｖ１ａ－ＰＦ２２；５レーン－ｒｉｔ－ｖ１ａ－ＰＦ２３。ゲルをクーマシーで染色して全タンパク質を可視化した。１～４レーンを、非コンジュゲートｍＡｂ、２：１及び２：２分子フォーマットについての参照として含める。 非還元条件下６％ゲルでのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す図である：１レーン－ｒｉｔ－ｖ１ａ－１４５；２レーン－ｒｉｔ－ｖ１ａ－１４５－ＰＦ０９；３レーン－ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－１４５；４レーン－ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－１４５－ＰＦ０９；５レーン－ｒｉｔ－ｖ１ａ；６レーン－ｒｉｔ－ｖ１ａ－（ＰＦ０７）２；７レーン－ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ；８レーン－ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－（ＰＦ０７）２。ゲルをクーマシーで染色して全タンパク質を可視化した。 非還元ＳＤＳ－ｐａｇｅ分析を示す図である：１レーン－Ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－（ＰＦ．）１～２；２レーン－ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－（２０９）１～２；３レーン－ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－（ＰＦ１１）１～２；４レーン－ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ；５レーン－ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－１４５－ＰＦ１２；６レーン－ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－１４５。ゲルをクーマシーで染色して全タンパク質を可視化した。 非還元条件下６％ゲルでのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す図である：１レーン－ｒｉｔ－ｖ１ａ－１４５；２レーン－ｒｉｔ－ｖ１ａ－１４５－ＰＦ１７；３レーン－ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－１４５；４レーン－ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－１４５－ＰＦ１７。ゲルをクーマシーで染色して全タンパク質を可視化した。 非還元条件下６％ゲルでのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す図である：１レーン－ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ；２レーン－ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－ＰＦ２９；３レーン－ｒｉｔ－ｖ１ａ；４レーン－ｒｉｔ－ｖ１ａ－ＰＦ２９。ゲルをクーマシーで染色して全タンパク質を可視化した。 ヒトＰＢＭＣを用いたｈＯＫＴ３ ２００に基づく二重特異性抗体のＲａｊｉＢ腫瘍細胞殺傷に対する効果を示す図である。二重特異性抗体及び計算したＥＣ５０値を凡例に示す。Ｂ１２－ｖ１ａ－１４５－ＰＦ０１を陰性対照として含めた。 ヒトＰＢＭＣを用いた抗４－１ＢＢ ＰＦ３１に基づく二重特異性抗体のＲａｊｉＢ腫瘍細胞殺傷に対する効果を示す図である。二重特異性抗体及び計算したＥＣ５０値を凡例に示す。Ｂ１２－ｖ１ａ－１４５－ＰＦ３１を陰性対照として含めた。 ｈＯＫＴ３ ２００に基づく二重特異性抗体とのインキュベーション後のＲａｊｉＢ－ＰＢＭＣ共培養物の上清中のサイトカインレベルを示す図である。マウスＯＫＴ３ ｍＩｇＧ２ａ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １６－００３７－８１）を陽性対照として含めた。 抗４－１ＢＢ ＰＦ３１に基づく二重特異性抗体とのインキュベーション後のＲａｊｉＢ－ＰＢＭＣ共培養物の上清中のサイトカインレベルを示す図である。マウスＯＫＴ３ ｍＩｇＧ２ａ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １６－００３７－８１）を陽性対照として含めた。
定義
［００６６］動詞「含む（ｔｏ ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、及びその活用形は、本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、非限定的な意味で使用されて、この単語の後の項目が含まれるが、詳細に言及されていない項目が除外されないことを意味する。さらに、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」による要素への言及は、文脈が１つ及びただ１つの要素が存在することを明確に要求しない限り、２つ以上の要素が存在する可能性を除外しない。よって、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」は「少なくとも１つの」を通常意味する。
［００６７］本明細書及び特許請求の範囲に開示される化合物は、１つ又は複数の不斉中心を含むことがあり、化合物の様々なジアステレオマー及び／又はエナンチオマーが存在し得る。本明細書及び特許請求の範囲におけるいずれの化合物の説明も、特に明記しない限り、全てのジアステレオマー、及びその混合物を含むことを意味する。さらに、本明細書及び特許請求の範囲におけるいずれの化合物の説明も、特に明記しない限り、個々のエナンチオマーとエナンチオマーの任意の混合物、ラセミ体などの両方を含むことを意味する。化合物の構造が特定のエナンチオマーとして描かれている場合、本出願の本発明はその特定のエナンチオマーに限定されないことを理解すべきである。
［００６８］化合物は、様々な互変異性型で生じ得る。本発明による化合物は、特に明記しない限り、全ての互変異性型を含むことを意味する。化合物の構造が特定の互変異性体として描かれている場合、本出願の本発明はその特定の互変異性体に限定されないことを理解すべきである。
［００６９］本明細書及び特許請求の範囲に開示される化合物は、エキソ及びエンドジアステレオ異性体としてさらに存在し得る。特に明記しない限り、本明細書及び特許請求の範囲におけるいずれの化合物の説明も、化合物の個々のエキソジアステレオ異性体及び個々のエンドジアステレオ異性体とその混合物の両方を含むことを意味する。化合物の構造が特定のエンド又はエキソジアステレオマーとして描かれている場合、本出願の本発明はその特定のエンド又はエキソジアステレオマーに限定されないことを理解すべきである。
［００７０］さらに、本明細書及び特許請求の範囲に開示される化合物は、シス及びトランス異性体として存在し得る。特に明記しない限り、本明細書及び特許請求の範囲におけるいずれの化合物の説明も、化合物の個々のシス異性体及び個々のトランス異性体とその混合物の両方を含むことを意味する。例として、化合物の構造がシス異性体として描かれている場合、対応するトランス異性体又はシス異性体とトランス異性体の混合物が本出願の本発明から除外されないことを理解すべきである。化合物の構造が特定のシス又はトランス異性体として描かれている場合、本出願の本発明はその特定のシス又はトランス異性体に限定されないことを理解すべきである。
［００７１］本発明による化合物は塩形態で存在してもよく、これも本発明によって網羅される。塩は、典型的には薬学的に許容できるアニオンを含有する、薬学的に許容できる塩である。「その塩」という用語は、酸性プロトン、典型的には酸のプロトンが、金属カチオン又は有機カチオンなどのカチオンによって置き換えられる場合に形成される化合物を意味する。適用可能な場合、塩は薬学的に許容できる塩であるが、これは患者への投与を意図しない塩については要求されない。例えば、化合物の塩においては、化合物は無機又は有機酸によってプロトン化されて、塩のアニオン性成分としての無機又は有機酸の共役塩基を伴うカチオンを形成することができる。
［００７２］「薬学的に許容できる」塩という用語は、哺乳動物などの患者への投与に許容される塩（所与の投薬体制について許容される哺乳動物の安全性を有する対イオンを伴う塩）を意味する。このような塩は、薬学的に許容できる無機又は有機塩基及び薬学的に許容できる無機又は有機酸から誘導され得る。「薬学的に許容できる塩」は、その塩が当技術分野で公知の様々な有機及び無機対イオンから誘導され、例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウム、テトラアルキルアンモニウム等、及び分子が塩基性官能基を含有する場合には、有機又は無機酸の塩、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、ギ酸塩、酒石酸塩、ベシル酸塩、メシル酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、シュウ酸塩等を含む、化合物の薬学的に許容できる塩を指す。
［００７３］「タンパク質」という用語は、その通常の科学的意味で本明細書において使用される。本明細書では、約１０個以上のアミノ酸を含むポリペプチドがタンパク質と考えられる。タンパク質は天然アミノ酸だけでなく、非天然アミノ酸も含み得る。
［００７４］「単糖」という用語は、その通常の科学的意味で本明細書において使用され、最も一般的には５個の炭素原子（ペントース）、６個の炭素原子（ヘキソース）又は９個の炭素原子（シアル酸）を含有する、５～９個の（ヒドロキシル化）炭素原子の鎖の環化で分子内ヘミアセタール形成から生じる酸素含有複素環を指す。典型的な単糖は、リボース（Ｒｉｂ）、キシロース（Ｘｙｌ）、アラビノース（Ａｒａ）、グルコース（Ｇｌｕ）、ガラクトース（Ｇａｌ）、マンノース（Ｍａｎ）、グルクロン酸（ＧｌｃＡ）、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）及びＮ－アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＡｃ）である。
［００７５］「抗体」という用語は、その通常の科学的意味で本明細書において使用される。抗体は、特異的抗原を認識し、これに結合することができる、免疫系によって産生されるタンパク質である。抗体は糖タンパク質の一例である。抗体という用語は、本明細書において、広義に使用され、詳細にはモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ダイマー、マルチマー、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、抗体フラグメント、並びに二本鎖及び単鎖抗体を含む。「抗体」という用語はまた、本明細書において、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体及びがん抗原に特異的に結合する抗体を含むことを意味する。「抗体」という用語は、免疫グロブリン全体を含むが、抗体の抗原結合フラグメントも含むことを意味する。さらに、この用語は、遺伝子改変抗体及び抗体の誘導体を含む。抗体、抗体のフラグメント及び遺伝子改変抗体は、当技術分野で公知の方法によって得ることができる。抗体の典型的な例としては、数ある中でも、アブシキシマブ、リツキシマブ、バシリキシマブ、パリビズマブ、インフリキシマブ、トラスツズマブ、エファリズマブ、アレムツズマブ、アダリムマブ、トシツモマブ－Ｉ１３１、セツキシマブ、イブリツキシマブチウキセタン、オマリズマブ、ベバシズマブ、ナタリズマブ、ラニビズマブ、パニツムマブ、エクリズマブ、セルトリズマブペゴル、ゴリムマブ、カナキヌマブ、カツマキソマブ、ウステキヌマブ、トシリズマブ、オファツムマブ、デノスマブ、ベリムマブ、イピリムマブ及びブレンツキシマブが挙げられる。
［００７６］「抗体フラグメント」は、その抗原結合領域又は可変領域を含む、インタクト抗体の一部として本明細書において定義される。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖフラグメント、ダイアボディ、ミニボディ、トリアボディ、テトラボディ、直鎖抗体、単鎖抗体分子、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、抗体フラグメント（複数可）から形成される多重特異性抗体フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって作製されるフラグメント（複数可）、又は標的抗原（例えば、がん細胞抗原、ウイルス抗原若しくは微生物抗原）に免疫特異的に（ｉｍｍｕｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ）結合する上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントが挙げられる。
［００７７］「抗原」は、抗体が特異的に結合する実体として本明細書において定義される。
［００７８］「特異的結合」及び「特異的に結合する」という用語は、抗体が標的抗原の対応するエピトープと結合するが、多数の他の抗原とは結合しない高度に選択的な方法として本明細書において定義される。典型的には、抗体又は抗体誘導体は、少なくとも約１×１０－７Ｍ、好ましくは１０－８Ｍ～１０－９Ｍ、１０－１０Ｍ、１０－１１Ｍ、又は１０－１２Ｍの親和性で結合し、所定の抗原又は密接に関連する抗原以外の非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）への結合についての親和性よりも少なくとも２倍高い親和性で所定の抗原に結合する。
［００７９］「実質的な」又は「実質的に」という用語は、集団、混合物又は試料の大部分、すなわち、５０％超、好ましくは集団の５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、９１％超、９２％超、９３％超、９４％超、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超、又は９９％超として本明細書において定義される。
［００８０］「リンカー」は、化合物の２つ以上の要素を接続する部分として本明細書において定義される。例えば、抗体コンジュゲートにおいては、抗体とペイロードがリンカーを介して互いに共有結合的に接続される。リンカーは、１つ又は複数のリンカー、及びリンカー内の様々な部分を接続するスペーサー部分を含み得る。
［００８１］「極性リンカー」は、リンカーの極性を増加させ、それによって、水溶解度を改善する特定の目的を有する構造要素を含有するリンカーとして本明細書において定義される。極性リンカーは、例えば、エチレングリコール、カルボン酸部分、スルホネート部分、スルホン部分、アシル化スルファミド部分、ホスフェート部分、ホスフィネート部分、アミノ基又はアンモニウム基から選択される、１つ又は複数の単位、又はその組み合わせを含み得る。
［００８２］「スペーサー」又はスペーサー部分は、リンカーの２つ（又はそれ以上）の部分の間隔をあけ（すなわち、間に距離を提供し）、これらの部分を共有結合する部分として本明細書において定義される。リンカーは、例えばリンカー構築物、リンカーコンジュゲート又は以下に定義されるバイオコンジュゲートの一部であり得る。
［００８３］「自壊性基」は、リガンド単位によって標的化された部位で遊離薬物を条件的に放出する機能を有する抗体－薬物コンジュゲート中のリンカーの一部として本明細書において定義される。活性化可能自壊性部分は、活性化可能基（ＡＧ）及び自壊性スペーサー単位を含む。例えばアミド基のアミノ基への酵素的変換によって、又はジスルフィドの遊離チオール基への還元によって、活性化可能基が活性化すると、任意選択で二酸化炭素の放出を伴う、及び／又は第２の環化放出機序が続く、ｐ－アミノベンジル基のｐ－キノンメチドへの（一時的な）１，６－脱離を伴い得る、様々な機序のうちの１つ又は複数によって遊離薬物の放出をもたらす自壊性反応順序が開始される。自壊性組み立て単位は、（官能基を介して）抗体とペイロードを接続する化学的スペーサーの一部であり得る。或いは、自壊性基は、化学的スペーサーの固有の部分ではないが、抗体とペイロードを接続する化学的スペーサーから分岐する。
［００８４］「活性化可能基」は、アミド結合のタンパク質分解性加水分解又はジスルフィド結合の還元などの生化学的プロセシングステップを受け得る芳香族基に付着した官能基として本明細書において定義され、その生化学的プロセシングステップで、芳香族基の自壊性プロセスが開始される。活性化可能基は、「活性化基」とも呼ばれ得る。
［００８５］「バイオコンジュゲート」は、生体分子がリンカーを介してペイロードに共有結合的に接続されている化合物として本明細書において定義される。バイオコンジュゲートは、１つ若しくは複数の生体分子及び／又は１つ若しくは複数のペイロードを含む。抗体－ペイロードコンジュゲート及び抗体－薬物コンジュゲートなどの抗体コンジュゲートは、生体分子が抗体であるバイオコンジュゲートである。
［００８６］「生体分子」は、自然から単離することができる任意の分子、又は自然に由来する高分子構造の構成成分である低分子構築ブロックで構成される任意の分子、特に核酸、タンパク質、グリカン及び脂質として本明細書において定義される。生体分子の例としては、酵素、（非触媒）タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、アミノ酸、オリゴヌクレオチド、単糖、オリゴ糖、多糖、グリカン、脂質及びホルモンが挙げられる。
［００８７］「ペイロード」という用語は、抗体などの標的化部分に共有結合的に付着されている部分を指すが、リンカーの切断でコンジュゲートから放出される分子も指す。よって、ペイロードは、本発明の文脈においてＤと呼ばれる、リンカーを介して標的化部分に共有結合的に付着されている１つの開口端を有する一価部分を指し、そこから放出される分子も指す。
［００８８］「２：１分子フォーマット」という用語は、単一官能性ペイロードにコンジュゲートした二価モノクローナル抗体（ＩｇＧ型）からなるタンパク質コンジュゲートを指す。
本発明による抗体－ペイロードコンジュゲート
［００８９］本発明は、構造（１）：
Figure 2023511857000003
（式中、
ａ、ｂ及びｃはそれぞれ独立に、０又は１であり；
Ｌ１、Ｌ２及びＬ３はリンカーであり；
Ｄはペイロードであり；
ＢＭは分岐部分であり；
Ｚは付加環化反応によって得ることができる接続基である）
を有する抗体－ペイロードコンジュゲートに関する。
［００９０］抗体－ペイロードコンジュゲート（１）中、ペイロードＤは、接続基Ｚ、任意選択のリンカーＬ１、Ｌ２及びＬ３並びに分岐部分ＢＭを介して、抗体ＡＢに接続されている。（１）中、ａ、ｂ及びｃはそれぞれ０及び１から独立的に選択される。本発明による好ましい抗体－ペイロードコンジュゲートはａ＝ｂ＝１を有する、すなわち、Ｌ１とＬ２の両方が存在し、より好ましくはＬ１とＬ２が同じである。特に好ましいのは、出現するＺ、ａ／ｂ及びＬ１／Ｌ２の各々が同じである対称的な抗体－ペイロードコンジュゲートである。
［００９１］好ましい実施形態では、抗体がグリカンを介してペイロードＤにコンジュゲートされており、その場合、本発明による抗体－ペイロードコンジュゲートが構造（５）：
Figure 2023511857000004
（式中、
ｅは０～１０の範囲の整数であり；
Ｓｕは単糖であり；
Ｇは単糖部分であり；
ＧｌｃＮＡｃはＮ－アセチルグルコサミン部分であり；
Ｆｕｃはフコース部分であり；
ｄは０又は１である）
を有する。
抗体ＡＢ
［００９２］（１）中、ＡＢは抗体である。好ましくは、ＡＢがモノクローナル抗体であり、より好ましくはＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ抗体からなる群から選択される。さらにより好ましくはＡＢがＩｇＧ抗体である。ＩｇＧ抗体は任意のＩｇＧアイソタイプのものであり得る。抗体は任意のＩｇＧアイソタイプ、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＩ３又はＩｇＧ４であり得る。好ましくはＡＢが完全長抗体であるが、ＡＢがＦｃフラグメントであってもよい。
［００９３］（５）中のＧｌｃＮＡｃ部分は、好ましくは抗体ＡＢのＦｃフラグメント中の天然Ｎグリコシル化部位に存在する。好ましくは前記ＧｌｃＮＡｃ部分がＡＢの領域２９０～３０５中のアスパラギンアミノ酸に付着している。さらなる好ましい実施形態では、抗体がＩｇＧ型抗体であり、特定のＩｇＧ型抗体に応じて、前記ＧｌｃＮＡｃ部分がＡＢのアミノ酸アスパラギン２９７（Ａｓｎ２９７又はＮ２９７）上に存在する。
接続基Ｚ
［００９４］抗体－ペイロードコンジュゲート（１）中、Ｚは接続基である。上でさらに詳細に記載されるように、「接続基」という用語は、化合物の一方の部分と同化合物の別の部分を接続する構造要素を指す。（１）中、Ｚは、存在する場合、Ｌ１及び／又はＬ２を介して、抗体を、おそらくスペーサーを介して、分岐部分ＢＭと接続する。Ｌ１及び／又はＬ２が存在するかしないかは、ａ及びｂの値に依存する。好ましい実施形態では、出現する両方のＺが同じである。
［００９５］当業者によって理解されるように、接続基の性質は、前記化合物の部分間の接続が得られた付加環化反応の種類に依存する。例えば、Ｚは［４＋２］付加環化又は１，３－双極子付加環化によって得ることができる。
［００９６］反応性基Ｑを反応性基Ｆに付着するための付加環化反応は当技術分野で公知である。結果として、多種多様な接続基Ｚが本発明によるコンジュゲートに存在し得る。一実施形態では、接続基Ｚが、好ましくは図１に描かれる、上記の選択肢から選択される。
［００９７］例えば、Ｆがアルキニル基を含むか、又はアルキニル基である場合、相補的基Ｑはアジド基を含み、対応する接続基Ｚは図１に示される通りである。
［００９８］例えば、Ｆがアジド基を含むか、又はアジド基である場合、相補的基Ｑはアルキニル基を含み、対応する接続基Ｚは図１に示される通りである。
［００９９］例えば、Ｆがシクロプロペニル基、トランス－シクロオクテン基若しくはシクロアルキン基を含むか、又はシクロプロペニル基、トランス－シクロオクテン基若しくはシクロアルキン基である場合、相補的基Ｑはテトラジニル基を含み、対応する接続基Ｚは図１に示される通りである。特定の場合、Ｚは単に中間体構造であり、Ｎ２を排出し、それによって、ジヒドロピリダジン（アルケンとの反応から）又はピリダジン（アルキンとの反応から）を生成する。
［０１００］例えば、Ｆがテトラジニル基を含むか、又はテトラジニル基である場合、相補的基Ｑはシクロプロペニル基、トランス－シクロオクテン基又はシクロアルキン基を含み、対応する接続基Ｚは図１に示される通りである。特定の場合、Ｚは単に中間体構造であり、Ｎ２を排出し、それによって、ジヒドロピリダジン（アルケンとの反応から）又はピリダジン（アルキンとの反応から）を生成する。
［０１０１］ＦとＱの追加の適切な組み合わせ、及び得られた接続基Ｚの性質は当業者に公知であり、例えば参照により組み込まれる、Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、第３版 ２０１３（ＩＳＢＮ：９７８－０－１２－３８２２３９－０）、特に第３章、２２９～２５８頁に記載されている。バイオコンジュゲーション法に適した相補的反応性基のリストは、Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、第３版 ２０１３（ＩＳＢＮ：９７８－０－１２－３８２２３９－０）の第３章の２３０～２３２頁、表３．１に開示されており、この表の内容は参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
［０１０２］好ましい実施形態では、接続基Ｚが、以下に定義される構造（Ｚａ）、（Ｚｅ）～（Ｚｈ）、（Ｚｊ）及び（Ｚｋ）のうちのいずれか１つによるものである。好ましくは、Ｚが構造（Ｚａ）、（Ｚｅ）又は（Ｚｊ）：
Figure 2023511857000005
によるものである。
本明細書において、
Ｘ９はＨ、Ｃ１～１２アルキル及びピリジルから選択され、Ｃ１～１２アルキルは、好ましくはＣ１～４アルキルであり、最も好ましくはメチルである。
構造（Ｚｇ）及び（Ｚｈ）中、
Figure 2023511857000006
結合は単結合又は二重結合のいずれかを表し、リンカーＬにこの結合のいずれの側を介して接続されていてもよい。
波線はリンカーＬとの接続を示す。接続性はＱ及びＦの詳細な性質に依存する。（Ｚａ）～（Ｚｈ）による接続基のいずれの部位もＬに接続され得るが、描かれるこれらの基の最も左が（Ｌ１）ａ／（Ｌ２）ｂに接続されることが好ましい。
［０１０３］接続基（Ｚｈ）は、典型的にはＮ２の遊離により（Ｚｇ）に再配列する。
［０１０４］好ましい実施形態では、各Ｚが独立に、トリアゾール、シクロヘキセン、シクロヘキサジエン、イソオキサゾリン、イソオキサゾリジン、ピラゾリン、ピペラジン、チオエーテル、アミド又はイミド基からなる群から選択される部分を含有する。トリアゾール部分がＺ中に存在することが特に好ましい。
［０１０５］特に好ましい実施形態では、接続基Ｚがトリアゾール部分を含み、構造（Ｚｊ）：
Figure 2023511857000007
によるものである。
本明細書において、Ｒ１５、Ｘ１０、ｕ、ｕ’及びｖは（Ｑ３６）について定義される通りであり、その全ての好ましい実施形態を（Ｚｊ）に等しく適用する。波線は、隣接部分（Ｓｕ及び（Ｌ１）ａ又は（Ｌ２）ｂ）との接続を示し、接続性はＱ及びＦの詳細な性質に依存する。（Ｚｊ）による接続基のいずれの部位も（Ｌ１）ａ／（Ｌ２）ｂに接続され得るが、描かれる上の波線結合がＳｕとの接続性を表すことが好ましい。構造（Ｚｆ）及び（Ｚｋ）による接続基は（Ｚｊ）による接続基の好ましい実施形態である。
［０１０６］特に好ましい実施形態では、接続基Ｚがトリアゾール部分を含み、構造（Ｚｋ）：
Figure 2023511857000008
によるものである。
［０１０７］本明細書において、Ｒ１５、Ｒ１８、Ｒ１９、及びｌは（Ｑ３７）について定義される通りであり、その全ての好ましい実施形態を（Ｚｊ）に等しく適用する。波線は、隣接部分（Ｓｕ及び（Ｌ１）ａ又は（Ｌ２）ｂ）との接続を示し、接続性はＱ及びＦの詳細な性質に依存する。（Ｚｊ）による接続基のいずれの部位も（Ｌ１）ａに接続され得るが、描かれる左の波線結合がＳｕとの接続性を表すことが好ましい。
［０１０８］好ましい実施形態では、Ｑがアルキン部分を含むか、又はアルキン部分であり、Ｆがアジド部分であり、結果として接続基Ｚがトリアゾール部分を含む。トリアゾール部分を含む好ましい接続基は構造（Ｚｅ）又は（Ｚｊ）による接続基であり、構造（Ｚｊ）による接続基は、好ましくは構造（Ｚｋ）又は（Ｚｆ）によるものである。好ましい実施形態では、接続基が構造（Ｚｊ）によるものであり、より好ましくは構造（Ｚｋ）又は（Ｚｆ）によるものである。
分岐部分ＢＭ
［０１０９］本発明の文脈における「分岐部分」は、３つの部分を接続するリンカーに埋め込まれている部分を指す。換言すれば、分岐部分は、他の部分との少なくとも３つの結合、反応性基Ｆ、接続基Ｚ又はペイロードＤとの１つの結合、反応性基Ｑ又は接続基Ｚとの１つの結合、及び反応性基Ｑ又は接続基Ｚとの１つの結合を含む。
［０１１０］他の部分との少なくとも３つの結合を含有するいずれの部分も本発明の文脈における分岐部分として適している。適切な分岐部分は、炭素原子（ＢＭ－１）、窒素原子（ＢＭ－３）、リン原子（ホスフィン（ＢＭ－５）及びホスフィンオキシド（ＢＭ－６））、フェニル環（例えば、ＢＭ－７）又はピリジル環（例えば、ＢＭ－９）などの芳香環、（複素）環（例えば、ＢＭ－１１及びＢＭ－１２）及び多環式部分（例えば、ＢＭ－１３、ＢＭ－１４及びＢＭ－１５）を含む。好ましい分岐部分は炭素原子及びフェニル環から選択され、最も好ましくはＢＭが炭素原子である。構造（ＢＭ－１）～（ＢＭ－１５）を以下に描くが、ここでは３つの分岐、すなわち、上に定義される他の部分との結合が＊によって示される（＊で標識される結合）。
Figure 2023511857000009
［０１１１］（ＢＭ－１）においては、＊で標識された分岐のうちの１つは単結合又は二重結合であり得、
Figure 2023511857000010
で示される。（ＢＭ－１１）～（ＢＭ－１５）においては、以下を適用する：
ｎ、ｐ、ｑ及びｑの各々は個別に０～５の範囲の整数、好ましくは０又は１、最も好ましくは１であり；
Ｗ１、Ｗ２及びＷ３の各々は、Ｃ（Ｒ２１）ｗ及びＮから独立的に選択され；
Ｗ４、Ｗ５及びＷ６の各々は、Ｃ（Ｒ２１）ｗ＋１、Ｎ（Ｒ２２）ｗ、Ｏ及びＳから独立的に選択され；
各
Figure 2023511857000011
は単結合又は二重結合を表し；
ｗは０又は１又は２、好ましくは０又は１であり；
各Ｒ２１は、水素、ＯＨ、Ｃ１～Ｃ２４アルキル基、Ｃ１～Ｃ２４アルコキシ基、Ｃ３～Ｃ２４シクロアルキル基、Ｃ２～Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ３～Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ３～Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から独立的に選択され、Ｃ１～Ｃ２４アルキル基、Ｃ１～Ｃ２４アルコキシ基、Ｃ３～Ｃ２４シクロアルキル基、Ｃ２～Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ３～Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ３～Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基は任意選択で置換されており、Ｏ、Ｓ及びＮＲ３から選択される１個又は複数のヘテロ原子によって任意選択で中断されており、Ｒ３は、水素及びＣ１～Ｃ４アルキル基からなる群から独立的に選択され；
各Ｒ２２は、水素、Ｃ１～Ｃ２４アルキル基、Ｃ３～Ｃ２４シクロアルキル基、Ｃ２～Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ３～Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ３～Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から独立的に選択され、Ｃ１～Ｃ２４アルキル基、Ｃ１～Ｃ２４アルコキシ基、Ｃ３～Ｃ２４シクロアルキル基、Ｃ２～Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ３～Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ３～Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基は任意選択で置換されており、Ｏ、Ｓ及びＮＲ３から選択される１個又は複数のヘテロ原子によって任意選択で中断されており、Ｒ３は、水素及びＣ１～Ｃ４アルキル基からなる群から独立的に選択される。
［０１１２］当業者であれば、ｗの値と
Figure 2023511857000012
によって表される結合の結合次数が相互依存的であることを認識する。よって、出現するＷが環内二重結合に結合している場合はいつでも、その出現するＷについてｗ＝１であり、出現するＷが２つの環内単結合に結合している場合はいつでも、その出現するＷについてｗ＝０である。ＢＭ－１２については、ｏ及びｐのうちの少なくとも１つが０ではない。
［０１１３］構造（ＢＭ－１１）及び（ＢＭ－１２）による分岐部分の代表的な例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニル、シクロオクテニル、アジリジン、アゼチジン、ジアゼチジン、オキセタン、チエタン、ピロリジン、ジヒドロピロリル、テトラヒドロフラニル、ジヒドロフラニル、チオラニル、イミダゾリニル、ピラゾリジニル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、ジオキソラニル、ジチオラニル、ピペリジニル、オキサニル、チアニル、ピペラジニル、モルホリノ、チオモルホリノ、ジオキサニル、トリオキサニル、ジチアニル、トリチアニル、アゼパニル、オキセパニル及びチエパニルが挙げられる。分岐部分として使用するのに好ましい環式部分には、シクロプロペニル、シクロヘキシル、オキサニル（テトラヒドロピラン）及びジオキサニルが含まれる。３つの分岐の置換パターンが、分岐部分が構造（ＢＭ－１１）のものか、又は構造（ＢＭ－１２）のものかを決定する。
［０１１４］構造（ＢＭ－１３）～（ＢＭ－１５）による分岐部分の代表的な例としては、デカリン、テトラリン、ジアリン、ナフタレン、インデン、インダン、イソインデン、インドール、イソインドール、インドリン、イソインドリンなどが挙げられる。
［０１１５］好ましい実施形態では、ＢＭが炭素原子である。炭素原子が構造（ＢＭ－１）によるものであり、別個の部分との全４つの結合を有する場合、炭素原子がキラルである。炭素原子の立体化学は本発明にとって重要ではなく、ＳであってもＲであってもよい。同じことがホスフィン（ＢＭ－６）にも当てはまる。最も好ましくは、炭素原子が構造（ＢＭ－１）によるものである。構造（ＢＭ－１）による炭素原子において＊で示される分岐のうちの１つは二重結合であってもよく、その場合、炭素原子はアルケン又はイミンの一部であり得る。ＢＭが炭素原子である場合、炭素原子は、アセタール、ケタール、ヘミケタール、オルトエステル、オルト炭酸エステル、アミノ酸などのより大きな官能基の一部であり得る。このことは、ＢＭが窒素又はリン原子である場合にも当てはまり、その場合、窒素又はリン原子はアミド、イミド、イミン、ホスフィンオキシド（ＢＭ－６の場合）又はホスホトリエステルの一部であり得る。
［０１１６］好ましい実施形態では、ＢＭがフェニル環である。最も好ましくは、フェニル環が構造（ＢＭ－７）によるものである。フェニル環の置換パターンは、１，２，３－置換フェニル環、１，２，４－置換フェニル環、又は１，３，５－置換フェニル環などの、任意の位置化学のものであり得る。最適な柔軟性及びコンフォメーションの自由を可能にするために、フェニル環が構造（ＢＭ－７）によるものであり、最も好ましくはフェニル環が１，３，５－置換されていることが好ましい。同じことが（ＢＭ－９）のピリジン環にも当てはまる。
［０１１７］好ましい実施形態では、分岐部分ＢＭが、炭素原子、窒素原子、リン原子、（複素）芳香環、（複素）環又は多環式部分から選択される。
リンカー
［０１１８］Ｌ１、Ｌ２及びＬ３の各々は非存在であっても存在していてもよいが、好ましくは３つの連結単位全てが存在する。好ましい実施形態では、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３の各々が、存在する場合、独立に、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓ及びＰから選択される少なくとも２個、好ましくは５～１００個の原子の鎖である。本明細書において、原子の鎖は、連結単位の端から出てくる原子の最短の鎖を指す。鎖内の原子は骨格原子とも呼ばれ得る。当業者が認識するように、Ｃ、Ｎ及びＰなどの、３以上の結合価を有する原子は、これらの原子の結合価を満たすために適切に官能化され得る。換言すれば、骨格原子は任意選択で官能化される。好ましい実施形態では、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３の各々が、存在する場合、独立に、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓ及びＰから選択される少なくとも５～５０個、好ましくは６～２５個の原子の鎖である。骨格原子は、好ましくはＣ、Ｎ及びＯから選択される。
［０１１９］リンカーＬ１及びＬ２は、ＢＭと反応性部分Ｑ又は接続基Ｚを接続する。Ｌ１とＬ２が共に存在する、すなわち、ａ＝ｂ＝１であることが好ましく、より好ましくはＬ１とＬ２が同じである。特に好ましい実施形態では、（Ｌ１）ａ－Ｚが（Ｌ２）ｂ－Ｚと同一であり、（Ｌ１）ａ－Ｑが（Ｌ２）ｂ－Ｑと同一である。
［０１２０］Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、直鎖又は分岐Ｃ１～Ｃ２００アルキレン基、Ｃ２～Ｃ２００アルケニレン基、Ｃ２～Ｃ２００アルキニレン基、Ｃ３～Ｃ２００シクロアルキレン基、Ｃ５～Ｃ２００シクロアルケニレン基、Ｃ８～Ｃ２００シクロアルキニレン基、Ｃ７～Ｃ２００アルキルアリーレン基、Ｃ７～Ｃ２００アリールアルキレン基、Ｃ８～Ｃ２００アリールアルケニレン基及びＣ９～Ｃ２００アリールアルキニレン基からなる群から独立的に選択され得、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、シクロアルキレン基、シクロアルケニレン基、シクロアルキニレン基、アルキルアリーレン基、アリールアルキレン基、アリールアルケニレン基及びアリールアルキニレン基は任意選択で置換されており、Ｏ、Ｓ及びＮＲ３の群から選択される１個又は複数のヘテロ原子によって任意選択で中断されており、Ｒ３は水素、Ｃ１～Ｃ２４アルキル基、Ｃ２～Ｃ２４アルケニル基、Ｃ２～Ｃ２４アルキニル基及びＣ３～Ｃ２４シクロアルキル基からなる群から独立的に選択され、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基及びシクロアルキル基は任意選択で置換されている。アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、シクロアルキレン基、シクロアルケニレン基、シクロアルキニレン基、アルキルアリーレン基、アリールアルキレン基、アリールアルケニレン基及びアリールアルキニレン基が上に定義される１個又は複数のヘテロ原子によって中断されている場合、前記基が１個若しくは複数のＯ原子によって、及び／又は１つ若しくは複数のＳ－Ｓ基によって中断されていることが好ましい。
［０１２１］より好ましくは、Ｌ１及びＬ２が、存在する場合、直鎖又は分岐Ｃ１～Ｃ１００アルキレン基、Ｃ２～Ｃ１００アルケニレン基、Ｃ２～Ｃ１００アルキニレン基、Ｃ３～Ｃ１００シクロアルキレン基、Ｃ５～Ｃ１００シクロアルケニレン基、Ｃ８～Ｃ１００シクロアルキニレン基、Ｃ７～Ｃ１００アルキルアリーレン基、Ｃ７～Ｃ１００アリールアルキレン基、Ｃ８～Ｃ１００アリールアルケニレン基及びＣ９～Ｃ１００アリールアルキニレン基からなる群から独立的に選択され、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、シクロアルキレン基、シクロアルケニレン基、シクロアルキニレン基、アルキルアリーレン基、アリールアルキレン基、アリールアルケニレン基及びアリールアルキニレン基が任意選択で置換されており、Ｏ、Ｓ及びＮＲ３の群から選択される１個又は複数のヘテロ原子によって任意選択で中断されており、Ｒ３が水素、Ｃ１～Ｃ２４アルキル基、Ｃ２～Ｃ２４アルケニル基、Ｃ２～Ｃ２４アルキニル基及びＣ３～Ｃ２４シクロアルキル基からなる群から独立的に選択され、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基及びシクロアルキル基が任意選択で置換されている。
［０１２２］さらにより好ましくは、Ｌ１及びＬ２が、存在する場合、直鎖又は分岐Ｃ１～Ｃ５０アルキレン基、Ｃ２～Ｃ５０アルケニレン基、Ｃ２～Ｃ５０アルキニレン基、Ｃ３～Ｃ５０シクロアルキレン基、Ｃ５～Ｃ５０シクロアルケニレン基、Ｃ８～Ｃ５０シクロアルキニレン基、Ｃ７～Ｃ５０アルキルアリーレン基、Ｃ７～Ｃ５０アリールアルキレン基、Ｃ８～Ｃ５０アリールアルケニレン基及びＣ９～Ｃ５０アリールアルキニレン基からなる群から独立的に選択され、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、シクロアルキレン基、シクロアルケニレン基、シクロアルキニレン基、アルキルアリーレン基、アリールアルキレン基、アリールアルケニレン基及びアリールアルキニレン基が任意選択で置換されており、Ｏ、Ｓ及びＮＲ３の群から選択される１個又は複数のヘテロ原子によって任意選択で中断されており、Ｒ３が水素、Ｃ１～Ｃ２４アルキル基、Ｃ２～Ｃ２４アルケニル基、Ｃ２～Ｃ２４アルキニル基及びＣ３～Ｃ２４シクロアルキル基からなる群から独立的に選択され、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基及びシクロアルキル基が任意選択で置換されている。
［０１２３］なおさらにより好ましくは、Ｌ１及びＬ２が、存在する場合、直鎖又は分岐Ｃ１～Ｃ２０アルキレン基、Ｃ２～Ｃ２０アルケニレン基、Ｃ２～Ｃ２０アルキニレン基、Ｃ３～Ｃ２０シクロアルキレン基、Ｃ５～Ｃ２０シクロアルケニレン基、Ｃ８～Ｃ２０シクロアルキニレン基、Ｃ７～Ｃ２０アルキルアリーレン基、Ｃ７～Ｃ２０アリールアルキレン基、Ｃ８～Ｃ２０アリールアルケニレン基及びＣ９～Ｃ２０アリールアルキニレン基からなる群から独立的に選択され、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、シクロアルキレン基、シクロアルケニレン基、シクロアルキニレン基、アルキルアリーレン基、アリールアルキレン基、アリールアルケニレン基及びアリールアルキニレン基が任意選択で置換されており、Ｏ、Ｓ及びＮＲ３の群から選択される１個又は複数のヘテロ原子によって任意選択で中断されており、Ｒ３が水素、Ｃ１～Ｃ２４アルキル基、Ｃ２～Ｃ２４アルケニル基、Ｃ２～Ｃ２４アルキニル基及びＣ３～Ｃ２４シクロアルキル基からなる群から独立的に選択され、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基及びシクロアルキル基が任意選択で置換されている。
［０１２４］これらの好ましい実施形態では、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、シクロアルキレン基、シクロアルケニレン基、シクロアルキニレン基、アルキルアリーレン基、アリールアルキレン基、アリールアルケニレン基及びアリールアルキニレン基が非置換であり、Ｏ、Ｓ及びＮＲ３、好ましくはＯの群から選択される１個又は複数のヘテロ原子によって任意選択で中断されており、Ｒ３が水素及びＣ１～Ｃ４アルキル基、好ましくは水素又はメチルからなる群から独立的に選択されることがさらに好ましい。
［０１２５］最も好ましくは、Ｌ１及びＬ２が、存在する場合、直鎖又は分岐Ｃ１～Ｃ２０アルキレン基からなる群から独立的に選択され、アルキレン基が任意選択で置換されており、Ｏ、Ｓ及びＮＲ３の群から選択される１個又は複数のヘテロ原子によって任意選択で中断されており、Ｒ３が水素、Ｃ１～Ｃ２４アルキル基、Ｃ２～Ｃ２４アルケニル基、Ｃ２～Ｃ２４アルキニル基及びＣ３～Ｃ２４シクロアルキル基からなる群から独立的に選択され、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基及びシクロアルキル基が任意選択で置換されている。この実施形態では、アルキレン基が非置換であり、Ｏ、Ｓ及びＮＲ３、好ましくはＯ及び／又はＳ－Ｓの群から選択される１個又は複数のヘテロ原子によって任意選択で中断されており、Ｒ３が水素及びＣ１～Ｃ４アルキル基、好ましくは水素又はメチルからなる群から独立的に選択されることがさらに好ましい。
［０１２６］好ましいリンカーＬ１及びＬ２には、－（ＣＨ２）ｎ１－、－（ＣＨ２ＣＨ２）ｎ１－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ１－、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ１－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ１ＣＨ２ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ１－、－（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ１－、－（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）ｎ１－、－（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ１ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－及び－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）ｎ１－（式中、ｎ１は１～５０の範囲、好ましくは１～４０の範囲、より好ましくは１～３０の範囲、さらにより好ましくは１～２０の範囲、なおさらにより好ましくは１～１５の範囲の整数である）が含まれる。より好ましくは、ｎ１が１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０、より好ましくは１、２、３、４、５、６、７又は８、さらにより好ましくは１、２、３、４、５又は６、なおさらにより好ましくは１、２、３又は４である。
［０１２７］一実施形態では、Ｌ３が非存在であり、ｃ＝０である。代替のより好ましい実施形態では、Ｌ３が存在し、ｃ＝１である。Ｌ３が存在する場合、Ｌ３はＬ１及びＬ２と同じであっても異なっていてもよく、好ましくは異なる。
［０１２８］好ましい実施形態では、Ｌ３がＬ４、Ｌ５、Ｌ６及びＬ７のうちの１つ又は複数を含有し得る。よって、一実施形態では、Ｌ３が－（Ｌ４）ｎ－（Ｌ５）ｏ－（Ｌ６）ｐ－（Ｌ７）ｑ－（式中、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６及びＬ７は一緒になって以下でさらに定義されるリンカーＬを形成するリンカーであり；ｎ、ｏ、ｐ及びｑは個別に０又は１である）である。好ましい実施形態では、少なくともリンカーＬ４及びＬ５が存在し（すなわち、ｎ＝１；ｏ＝１；ｐ＝０又は１；ｑ＝０又は１）、より好ましくはリンカーＬ４、Ｌ５及びＬ６が存在し、Ｌ７が存在するか、又は存在しない（すなわち、ｎ＝１；ｏ＝１；ｐ＝１；ｑ＝０又は１）。一実施形態では、リンカーＬ４、Ｌ５、Ｌ６及びＬ７が存在する（すなわち、ｎ＝１；ｏ＝１；ｐ＝１；ｑ＝１）。一実施形態では、リンカーＬ４、Ｌ５及びＬ６が存在し、Ｌ７が存在しない（すなわち、ｎ＝１；ｏ＝１；ｐ＝１；ｑ＝０）。一実施形態では、ｎ＋ｏ＋ｐ＋ｑ＝１、２、３又は４、好ましくは２、３又は４、より好ましくは３又は４である。好ましい実施形態では、Ｌ５及びＬ６が共に存在する、すなわち、ｏ＋ｐ＝２である。最も好ましくは、ｎ＋ｏ＋ｐ＋ｑ＝４である。
［０１２９］リンカーＬ３は、リンカー構築物（特に反応性部分Ｑ）と官能化抗体（特に反応性部分Ｆ）の反応前又は後のいずれかであり得る、ペイロードＤがリンカー構築物に接続されると形成される接続基Ｚ３を含有し得る。リンカーＬ３内の接続基は、連結単位Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６及びＬ７のいずれかの接合部で形成され得るか、又はリンカーＬ３内に別々に存在し得る。例えば、Ｌ３は－Ｚ３－（Ｌ４）ｎ－（Ｌ５）ｏ－（Ｌ６）ｐ－（Ｌ７）ｑ－又は－（Ｌ４）ｎ－Ｚ３－（Ｌ５）ｏ－（Ｌ６）ｐ－（Ｌ７）ｑ－によって表され得る。本明細書において、Ｚは任意の形態をとることができ、好ましくはＱとＦの反応によって得られる接続基について以下でさらに定義される通りである。
リンカーＬ４
［０１３０］リンカーＬ４は非存在であるか（ｎ＝０）、又は存在する（ｎ＝１）。好ましくは、リンカーＬ４が存在し、ｎ＝１である。Ｌ４は、例えば直鎖又は分岐Ｃ１～Ｃ２００アルキレン基、Ｃ２～Ｃ２００アルケニレン基、Ｃ２～Ｃ２００アルキニレン基、Ｃ３～Ｃ２００シクロアルキレン基、Ｃ５～Ｃ２００シクロアルケニレン基、Ｃ８～Ｃ２００シクロアルキニレン基、Ｃ７～Ｃ２００アルキルアリーレン基、Ｃ７～Ｃ２００アリールアルキレン基、Ｃ８～Ｃ２００アリールアルケニレン基、Ｃ９～Ｃ２００アリールアルキニレン基からなる群から選択され得る。任意選択で、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、シクロアルキレン基、シクロアルケニレン基、シクロアルキニレン基、アルキルアリーレン基、アリールアルキレン基、アリールアルケニレン基及びアリールアルキニレン基は置換されていてもよく、任意選択で前記基は１個又は複数のヘテロ原子、好ましくは１～１００個のヘテロ原子によって中断されていてもよく、前記ヘテロ原子は、好ましくはＯ、Ｓ（Ｏ）ｙ及びＮＲ１５からなる群から選択され、ｙは０、１又は２であり、好ましくはｙ＝２であり、Ｒ１５は水素、ハロゲン、Ｃ１～Ｃ２４アルキル基、Ｃ６～Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ７～Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ７～Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から独立的に選択される。
［０１３１］Ｌ４は、（ポリ）エチレングリコールジアミン（例えば、１，８－ジアミノ－３，６－ジオキサオクタン又はより長いエチレングリコール鎖を含む等価物）、ポリエチレングリコール又はポリエチレンオキシド鎖、ポリプロピレングリコール又はポリプロピレンオキシド鎖及び１，ｚ－ジアミノアルカン（式中、ｚはアルカン中の炭素原子の数である）（ｚは例えば１～１０の範囲の整数であり得る）を含有し得る。
［０１３２］好ましい実施形態では、リンカーＬ４がエチレングリコール基、カルボン酸部分、スルホネート部分、スルホン部分、ホスフェート部分、ホスフィネート部分、アミノ基、アンモニウム基又はスルファミド基を含む。
［０１３３］好ましい実施形態では、リンカーＬ４がスルファミド基、好ましくは構造（２３）：
Figure 2023511857000013
によるスルファミド基を含む。
［０１３４］波線は、化合物の残り、典型的にはＢＭ及びＬ５、Ｌ６、Ｌ７又はＤ、好ましくはＢＭ及びＬ５への接続を表す。好ましくは、（Ｏ）ａＣ（Ｏ）部分がＢＭに接続されており、ＮＲ１３部分がＬ５、Ｌ６、Ｌ７又はＤ、好ましくはＬ５に接続されている。
［０１３５］構造（２３）中、ａ１＝０又は１であり、好ましくはａ１＝１であり、Ｒ１３は水素、Ｃ１～Ｃ２４アルキル基、Ｃ３～Ｃ２４シクロアルキル基、Ｃ２～Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ３～Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ３～Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から選択され、Ｃ１～Ｃ２４アルキル基、Ｃ３～Ｃ２４シクロアルキル基、Ｃ２～Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ３～Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ３～Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基は任意選択で置換されており、Ｏ、Ｓ及びＮＲ１４から選択される１個又は複数のヘテロ原子によって任意選択で中断されており、Ｒ１４は水素及びＣ１～Ｃ４アルキル基からなる群から独立的に選択される。
［０１３６］或いは、Ｒ１３は、おそらくスペーサー部分を介して、Ｎに接続されたＤである。一実施形態では、この接続が、以下に定義されるスペーサー部分Ｓｐ２を介しており、好ましくはＤが、以下でさらに定義される、－（Ｂ）ｅ１－（Ａ）ｆ１－（Ｂ）ｇ１－Ｃ（Ｏ）－を介して、又は－（Ｂ）ｅ１－（Ａ）ｆ１－（Ｂ）ｇ１－Ｃ（Ｏ）－（Ｌ５）ｏ－（Ｌ６）ｐ－（Ｌ７）ｑ－を介してＮに接続されている。別の実施形態では、Ｒ１３がまた、環状構造が形成されるようにペイロードＤの第１のインスタンスに接続されている。例えば、Ｎは、炭素原子又は窒素原子を介して、好ましくはピペラジン環の第２の窒素原子を介してＤに接続されている、ピペラジン部分の一部である。好ましくは、環状構造、例えばピペラジン環が、以下でさらに定義される、－（Ｂ）ｅ１－（Ａ）ｆ１－（Ｂ）ｇ１－Ｃ（Ｏ）－を介して、又は－（Ｂ）ｅ１－（Ａ）ｆ１－（Ｂ）ｇ１－Ｃ（Ｏ）－（Ｌ５）ｏ－（Ｌ６）ｐ－（Ｌ７）ｑ－を介してＤに接続されている。
［０１３７］好ましい実施形態では、Ｒ１３が水素又はＣ１～Ｃ２０アルキル基であり、より好ましくはＲ１３が水素又はＣ１～Ｃ１６アルキル基であり、さらにより好ましくはＲ１３が水素又はＣ１～Ｃ１０アルキル基であり、アルキル基が任意選択で置換されており、Ｏ、Ｓ及びＮＲ１４、好ましくはＯから選択される１個又は複数のヘテロ原子によって任意選択で中断されており、Ｒ１４が水素及びＣ１～Ｃ４アルキル基からなる群から独立的に選択される。好ましい実施形態では、Ｒ１３が水素である。別の好ましい実施形態では、Ｒ１３がＣ１～Ｃ２０アルキル基、より好ましくはＣ１～Ｃ１６アルキル基、さらにより好ましくはＣ１～Ｃ１０アルキル基であり、アルキル基が１個又は複数のＯ原子によって任意選択で中断されており、アルキル基が－ＯＨ基、好ましくは末端－ＯＨ基で任意選択で置換されている。この実施形態では、Ｒ１３が末端－ＯＨ基を含む（ポリ）エチレングリコール鎖であることがさらに好ましい。別の好ましい実施形態では、Ｒ１３が水素、メチル、エチル、ｎ－プロピル、ｉ－プロピル、ｎ－ブチル、ｓ－ブチル及びｔ－ブチルからなる群、より好ましくは水素、メチル、エチル、ｎ－プロピル及びｉ－プロピルからなる群、さらにより好ましくは水素、メチル及びエチルからなる群から選択される。なおさらにより好ましくは、Ｒ１３が水素又はメチルであり、最も好ましくはＲ１３が水素である。
［０１３８］好ましい実施形態では、Ｌ４が構造（２４）：
Figure 2023511857000014
によるものである。
［０１３９］本明細書において、ａ及びＲ１３は上に定義される通りであり、Ｓｐ１及びＳｐ２は独立にスペーサー部分であり、ｂ１及びｃ１は独立に０又は１である。好ましくは、ｂ１＝０又は１であり、ｃ１＝１であり、より好ましくはｂ１＝０であり、ｃ１＝１である。一実施形態では、スペーサーＳｐ１及びＳｐ２が直鎖又は分岐Ｃ１～Ｃ２００アルキレン基、Ｃ２～Ｃ２００アルケニレン基、Ｃ２～Ｃ２００アルキニレン基、Ｃ３～Ｃ２００シクロアルキレン基、Ｃ５～Ｃ２００シクロアルケニレン基、Ｃ８～Ｃ２００シクロアルキニレン基、Ｃ７～Ｃ２００アルキルアリーレン基、Ｃ７～Ｃ２００アリールアルキレン基、Ｃ８～Ｃ２００アリールアルケニレン基及びＣ９～Ｃ２００アリールアルキニレン基からなる群から独立的に選択され、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、シクロアルキレン基、シクロアルケニレン基、シクロアルキニレン基、アルキルアリーレン基、アリールアルキレン基、アリールアルケニレン基及びアリールアルキニレン基が任意選択で置換されており、Ｏ、Ｓ及びＮＲ１６の群から選択される１個又は複数のヘテロ原子によって任意選択で中断されており、Ｒ１６が水素、Ｃ１～Ｃ２４アルキル基、Ｃ２～Ｃ２４アルケニル基、Ｃ２～Ｃ２４アルキニル基及びＣ３～Ｃ２４シクロアルキル基からなる群から独立的に選択され、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基及びシクロアルキル基が任意選択で置換されている。アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、シクロアルキレン基、シクロアルケニレン基、シクロアルキニレン基、アルキルアリーレン基、アリールアルキレン基、アリールアルケニレン基及びアリールアルキニレン基が上に定義される１個又は複数のヘテロ原子によって中断されている場合、前記基が１個若しくは複数のＯ原子によって、及び／又は１個若しくは複数のＳ－Ｓ基によって中断されていることが好ましい。
［０１４０］より好ましくは、スペーサー部分Ｓｐ１及びＳｐ２が、存在する場合、直鎖又は分岐Ｃ１～Ｃ１００アルキレン基、Ｃ２～Ｃ１００アルケニレン基、Ｃ２～Ｃ１００アルキニレン基、Ｃ３～Ｃ１００シクロアルキレン基、Ｃ５～Ｃ１００シクロアルケニレン基、Ｃ８～Ｃ１００シクロアルキニレン基、Ｃ７～Ｃ１００アルキルアリーレン基、Ｃ７～Ｃ１００アリールアルキレン基、Ｃ８～Ｃ１００アリールアルケニレン基及びＣ９～Ｃ１００アリールアルキニレン基からなる群から独立的に選択され、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、シクロアルキレン基、シクロアルケニレン基、シクロアルキニレン基、アルキルアリーレン基、アリールアルキレン基、アリールアルケニレン基及びアリールアルキニレン基が任意選択で置換されており、Ｏ、Ｓ及びＮＲ１６の群から選択される１個又は複数のヘテロ原子によって任意選択で中断されており、Ｒ１６が水素、Ｃ１～Ｃ２４アルキル基、Ｃ２～Ｃ２４アルケニル基、Ｃ２～Ｃ２４アルキニル基及びＣ３～Ｃ２４シクロアルキル基からなる群から独立的に選択され、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基及びシクロアルキル基が任意選択で置換されている。
［０１４１］さらにより好ましくは、スペーサー部分Ｓｐ１及びＳｐ２が、存在する場合、直鎖又は分岐Ｃ１～Ｃ５０アルキレン基、Ｃ２～Ｃ５０アルケニレン基、Ｃ２～Ｃ５０アルキニレン基、Ｃ３～Ｃ５０シクロアルキレン基、Ｃ５～Ｃ５０シクロアルケニレン基、Ｃ８～Ｃ５０シクロアルキニレン基、Ｃ７～Ｃ５０アルキルアリーレン基、Ｃ７～Ｃ５０アリールアルキレン基、Ｃ８～Ｃ５０アリールアルケニレン基及びＣ９～Ｃ５０アリールアルキニレン基からなる群から独立的に選択され、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、シクロアルキレン基、シクロアルケニレン基、シクロアルキニレン基、アルキルアリーレン基、アリールアルキレン基、アリールアルケニレン基及びアリールアルキニレン基が任意選択で置換されており、Ｏ、Ｓ及びＮＲ１６の群から選択される１個又は複数のヘテロ原子によって任意選択で中断されており、Ｒ１６が水素、Ｃ１～Ｃ２４アルキル基、Ｃ２～Ｃ２４アルケニル基、Ｃ２～Ｃ２４アルキニル基及びＣ３～Ｃ２４シクロアルキル基からなる群から独立的に選択され、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基及びシクロアルキル基が任意選択で置換されている。
［０１４２］なおさらにより好ましくは、スペーサー部分Ｓｐ１及びＳｐ２が、存在する場合、直鎖又は分岐Ｃ１～Ｃ２０アルキレン基、Ｃ２～Ｃ２０アルケニレン基、Ｃ２～Ｃ２０アルキニレン基、Ｃ３～Ｃ２０シクロアルキレン基、Ｃ５～Ｃ２０シクロアルケニレン基、Ｃ８～Ｃ２０シクロアルキニレン基、Ｃ７～Ｃ２０アルキルアリーレン基、Ｃ７～Ｃ２０アリールアルキレン基、Ｃ８～Ｃ２０アリールアルケニレン基及びＣ９～Ｃ２０アリールアルキニレン基からなる群から独立的に選択され、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、シクロアルキレン基、シクロアルケニレン基、シクロアルキニレン基、アルキルアリーレン基、アリールアルキレン基、アリールアルケニレン基及びアリールアルキニレン基が任意選択で置換されており、Ｏ、Ｓ及びＮＲ１６の群から選択される１個又は複数のヘテロ原子によって任意選択で中断されており、Ｒ１６が水素、Ｃ１～Ｃ２４アルキル基、Ｃ２～Ｃ２４アルケニル基、Ｃ２～Ｃ２４アルキニル基及びＣ３～Ｃ２４シクロアルキル基からなる群から独立的に選択され、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基及びシクロアルキル基が任意選択で置換されている。
［０１４３］これらの好ましい実施形態では、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、シクロアルキレン基、シクロアルケニレン基、シクロアルキニレン基、アルキルアリーレン基、アリールアルキレン基、アリールアルケニレン基及びアリールアルキニレン基が非置換であり、Ｏ、Ｓ及びＮＲ１６、好ましくはＯの群から選択される１個又は複数のヘテロ原子によって任意選択で中断されており、Ｒ１６が水素及びＣ１～Ｃ４アルキル基、好ましくは水素又はメチルからなる群から独立的に選択されることがさらに好ましい。
［０１４４］最も好ましくは、スペーサー部分Ｓｐ１及びＳｐ２が、存在する場合、直鎖又は分岐Ｃ１～Ｃ２０アルキレン基からなる群から独立的に選択され、アルキレン基が任意選択で置換されており、Ｏ、Ｓ及びＮＲ１６の群から選択される１個又は複数のヘテロ原子によって任意選択で中断されており、Ｒ１６が水素、Ｃ１～Ｃ２４アルキル基、Ｃ２～Ｃ２４アルケニル基、Ｃ２～Ｃ２４アルキニル基及びＣ３～Ｃ２４シクロアルキル基からなる群から独立的に選択され、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基及びシクロアルキル基が任意選択で置換されている。この実施形態では、アルキレン基が非置換であり、Ｏ、Ｓ及びＮＲ１６、好ましくはＯ及び／又はＳ－Ｓの群から選択される１個又は複数のヘテロ原子によって任意選択で中断されており、Ｒ３が水素及びＣ１～Ｃ４アルキル基、好ましくは水素又はメチルからなる群から独立的に選択されることがさらに好ましい。
［０１４５］よって、好ましいスペーサー部分Ｓｐ１及びＳｐ２は－（ＣＨ２）ｒ－、－（ＣＨ２ＣＨ２）ｒ－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ－、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｒ－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒＣＨ２ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｒ－、－（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ－、－（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）ｒ－、－（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－及び－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）ｒ－（式中、ｒは１～５０の範囲、好ましくは１～４０の範囲、より好ましくは１～３０の範囲、さらにより好ましくは１～２０の範囲、なおさらにより好ましくは１～１５の範囲の整数である）を含む。より好ましくは、ｒが１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０、より好ましくは１、２、３、４、５、６、７又は８、さらにより好ましくは１、２、３、４、５又は６、なおさらにより好ましくは１、２、３又は４である。
［０１４６］或いは、好ましいリンカーＬ４は、－（Ｗ）ｋ１－（Ａ）ｄ１－（Ｂ）ｅ１－（Ａ）ｆ１－（Ｃ（Ｏ））ｇ１－（式中、
ｄ１＝０又は１、好ましくはｄ１＝１であり；
ｅ１＝０～１０の範囲の整数であり、好ましくはｅ１＝０、１、２、３、４、５又は６、好ましくは１～１０の範囲の整数であり、最も好ましくはｅ１＝１、２、３又は４であり；
ｆ１＝０又は１であり、好ましくはｆ１＝０であり；
ｄ１＋ｅ１＋ｆ１は少なくとも１、好ましくは１～５の範囲であり；好ましくはｄ１＋ｆ１は少なくとも１であり、好ましくはｄ１＋ｆ１＝１であり；
ｇ１＝０又は１であり、好ましくはｇ１＝１であり；
ｋ１＝０又は１であり、好ましくはｋ１＝１であり；
Ａは構造（２３）によるスルファミド基であり；
Ｂは－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－若しくは－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－部分であるか、又は（Ｂ）ｅ１は－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｅ３－ＣＨ２－ＣＨ２－部分（式中、ｅ３はｅ１と同じ方法で定義される）であり；
Ｗは－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－、－ＮＨＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）ＮＨ－、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍＣ（Ｏ）ＮＨ－又は－（４－Ｐｈ）ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍＣ（Ｏ）ＮＨ－であり、好ましくは、Ｗは－ＯＣ（Ｏ）ＮＨ－、－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍＣ（Ｏ）ＮＨ－又は－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－であり、ｍは０～１０の範囲の整数であり、好ましくはｍ＝０、１、２、３、４、５又は６であり、最も好ましくはｍ＝２又は３であり；
好ましくは、Ｌ４は（Ａ）ｄ１－（Ｂ）ｅ１を介してＢＭに、及び（Ｃ（Ｏ））ｇ１、好ましくはＣ（Ｏ）を介して（Ｌ５）ｏに接続されている）
によって表され得る。
［０１４７］本実施形態の文脈では、構造（２３）中の波線が、（Ｗ）ｋ１、（Ｂ）ｅ１及び（Ｃ（Ｏ））ｇ１などの隣接基への接続を表す。Ａが構造（２３）によるものであり、ａ１＝１であり、Ｒ１３＝Ｈ又はＣ１～Ｃ２０アルキル基であることが好ましく、より好ましくはＲ１３＝Ｈ又はメチルであり、最も好ましくはＲ１３＝Ｈである。
［０１４８］好ましいリンカーＬ４は以下の通りである：
（ａ）ｋ１＝０；ｄ１＝１；ｇ１＝１；ｆ１＝０；Ｂ＝－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－；ｅ１＝１、２、３又は４、好ましくはｅ１＝２。
（ｂ）ｋ１＝１；Ｗ＝－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍＣ（Ｏ）ＮＨ－；ｍ＝２；ｄ１＝０；（Ｂ）ｅ１＝－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｅ３－ＣＨ２－ＣＨ２－；ｆ１＝０；ｇ１＝１；ｅ３＝１、２、３又は４、好ましくはｅ１＝１。
（ｃ）ｋ１＝１；Ｗ＝－ＯＣ（Ｏ）ＮＨ－；ｄ１＝０；Ｂ＝－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－；ｇ１＝１；ｆ１＝０；ｅ１＝１、２、３又は４、好ましくはｅ１＝２。
（ｄ）ｋ１＝１；Ｗ＝－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍＣ（Ｏ）ＮＨ－；ｍ＝２；ｄ１＝０；（Ｂ）ｅ１＝－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｅ３－ＣＨ２－ＣＨ２－；ｆ１＝０；ｇ１＝１；ｅ３＝１、２、３又は４、好ましくはｅ３＝４。
（ｅ）ｋ１＝１；Ｗ＝－ＯＣ（Ｏ）ＮＨ－；ｄ１＝０；（Ｂ）ｅ１＝－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｅ３－ＣＨ２－ＣＨ２－；ｇ１＝１；ｆ１＝０；ｅ３＝１、２、３又は４、好ましくはｅ３＝４。
（ｆ）ｋ１＝１；Ｗ＝－（４－Ｐｈ）ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍＣ（Ｏ）ＮＨ－、ｍ＝３；ｄ１＝０；（Ｂ）ｅ１＝－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｅ３－ＣＨ２－ＣＨ２－；ｇ１＝１；ｆ１＝０；ｅ３＝１、２、３又は４、好ましくはｅ３＝４。
（ｇ）ｋ１＝０；ｄ１＝０；ｇ１＝１；ｆ１＝０；Ｂ＝－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－；ｅ１＝１、２、３又は４、好ましくはｅ１＝２。
（ｈ）ｋ１＝１；Ｗ＝－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－；ｄ１＝０；ｇ１＝１；ｆ１＝０；Ｂ＝－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－；ｅ１＝１、２、３又は４、好ましくはｅ１＝２。
［０１４９］一実施形態では、リンカーＬ４が、ＢＭと（Ｌ５）ｏとの間の骨格に位置し、好ましくはリンカーを介して分岐窒素原子に連結されている、置換基としてのさらなる部分Ｄを含有する分岐窒素原子を含む。分岐窒素原子の例は、構造（２３）中の窒素原子ＮＲ１３であり、Ｒ１３はスペーサー部分を介して、出現する第２のＤに接続されている。或いは、分岐窒素原子は、構造－（Ｗ）ｋ１－（Ａ）ｄ１－（Ｂ）ｅ１－（Ａ）ｆ１－（Ｃ（Ｏ））ｇ１－によるＬ４内に位置し得る。一実施形態では、Ｌ４が－（Ｗ）ｋ１－（Ａ）ｄ１－（Ｂ）ｅ１－（Ａ）ｆ１－（Ｃ（Ｏ））ｇ１－Ｎ＊［－（Ａ）ｄ１－（Ｂ）ｅ１－（Ａ）ｆ１－（Ｃ（Ｏ））ｇ１－］２（式中、Ａ、Ｂ、Ｗ、ｄ１、ｅ１、ｆ１、ｇ１及びｋ１は上に定義される通りであり、各出現について個別に選択され、Ｎ＊は、－（Ａ）ｄ１－（Ｂ）ｅ１－（Ａ）ｆ１－（Ｃ（Ｏ））ｇ１－の２つのインスタンスが接続されている、分岐窒素原子である）によって表される。本明細書において、両（Ｃ（Ｏ））ｇ１部分は－（Ｌ５）ｏ－（Ｌ６）ｐ－（Ｌ７）ｑ－Ｄ（式中、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７、ｏ、ｐ、ｑ及びＤは上に定義される通りであり、それぞれ個別に選択される）に接続されている。最も好ましい実施形態では、このような分岐原子が存在せず、リンカーＬ４がさらなる部分Ｄへの接続を含有しない。
リンカーＬ５
［０１５０］リンカーＬ５は非存在であるか（ｏ＝０）又は存在する（ｏ＝１）。好ましくは、リンカーＬ５が存在し、ｏ＝１である。リンカーＬ５は、好ましくは２～５個のアミノ酸を含む、当技術分野で公知のペプチドスペーサー、より好ましくはジペプチド又はトリペプチドスペーサー、最も好ましくはジペプチドスペーサーである。任意のペプチドスペーサーが使用され得るが、好ましくはリンカーＬ５がＶａｌ－Ｃｉｔ、Ｖａｌ－Ａｌａ、Ｖａｌ－Ｌｙｓ、Ｖａｌ－Ａｒｇ、Ｐｈｅ－Ｃｉｔ、Ｐｈｅ－Ａｌａ、Ｐｈｅ－Ｌｙｓ、Ｐｈｅ－Ａｒｇ、Ａｌａ－Ｌｙｓ、Ｌｅｕ－Ｃｉｔ、Ｉｌｅ－Ｃｉｔ、Ｔｒｐ－Ｃｉｔ、Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｓｎ、Ａｌａ－Ａｓｎ、より好ましくはＶａｌ－Ｃｉｔ、Ｖａｌ－Ａｌａ、Ｖａｌ－Ｌｙｓ、Ｐｈｅ－Ｃｉｔ、Ｐｈｅ－Ａｌａ、Ｐｈｅ－Ｌｙｓ、Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｓｎ、より好ましくはＶａｌ－Ｃｉｔ、Ｖａｌ－Ａｌａ、Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｓｎから選択される。一実施形態では、Ｌ５＝Ｖａｌ－Ｃｉｔである。一実施形態では、Ｌ５＝Ｖａｌ－Ａｌａである。
［０１５１］好ましい実施形態では、Ｌ５が一般構造（２７）：
Figure 2023511857000015
によって表される。
［０１５２］本明細書において、Ｒ１７＝ＣＨ３又はＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ２である。波線は（Ｌ４）ｎ及び（Ｌ６）ｐへの接続を示し、好ましくは構造（２７）によるＬ５がＮＨを介して（Ｌ４）ｎに、及びＣ（Ｏ）を介して（Ｌ６）ｐに接続されている。
リンカーＬ６
［０１５３］リンカーＬ６は非存在であるか（ｐ＝０）又は存在する（ｐ＝１）。好ましくは、リンカーＬ６が存在し、ｐ＝１である。リンカーＬ６は、自壊性スペーサーとも呼ばれる、自己切断可能スペーサーである。好ましくは、Ｌ６がパラ－アミノベンジルオキシカルボニル（ＰＡＢＣ）誘導体、より好ましくは構造（２５）によるＰＡＢＣ誘導体である。
Figure 2023511857000016
［０１５４］本明細書において、波線は（Ｌ５）ｎ及び（Ｌ７）ｐへの接続を示す。典型的には、ＰＡＢＣ誘導体がＮＨを介して（Ｌ５）ｎに、及びＯを介して（Ｌ７）ｐに接続されている。
［０１５５］Ｒ３はＨ、Ｒ４又はＣ（Ｏ）Ｒ４であり、Ｒ４は、任意選択で置換されており、Ｏ、Ｓ及びＮＲ５（式中、Ｒ５は水素及びＣ１～Ｃ４アルキル基からなる群から独立的に選択される）から選択される１個又は複数のヘテロ原子によって任意選択で中断されているＣ１～Ｃ２４（ヘテロ）アルキル基、Ｃ３～Ｃ１０（ヘテロ）シクロアルキル基、Ｃ２～Ｃ１０（ヘテロ）アリール基、Ｃ３～Ｃ１０アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ３～Ｃ１０（ヘテロ）アリールアルキル基である。好ましくは、Ｒ４がＣ３～Ｃ１０（ヘテロ）シクロアルキル又はポリアルキレングリコールである。ポリアルキレングリコールは、好ましくはポリエチレングリコール又はポリプロピレングリコール、より好ましくは－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓＨ又は－（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓＨである。ポリアルキレングリコールは、最も好ましくはポリエチレングリコール、好ましくは－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓＨ（式中、ｓは１～１０、好ましくは１～５の範囲の整数であり、最も好ましくはｓ＝１、２、３又は４である）である。より好ましくは、Ｒ３がＨ又はＣ（Ｏ）Ｒ４であり、Ｒ４が４－メチル－ピペラジン又はモルホリンである。最も好ましくは、Ｒ３がＨである。
リンカーＬ７
［０１５６］リンカーＬ７は非存在であるか（ｑ＝０）又は存在する（ｑ＝１）。好ましくは、リンカーＬ７が存在し、ｑ＝１である。リンカーＬ７はアミノアルカン酸スペーサー、すなわち、－Ｎ－（Ｃｈ－アルキレン）－Ｃ（Ｏ）－（式中、ｈは１～２０、好ましくは１～１０、最も好ましくは１～６の範囲の整数である）である。本明細書において、アミノアルカン酸スペーサーは、窒素原子を介してＬ６に、及びカルボニル部分を介してＤに典型的に接続されている。好ましいリンカーＬ７は６－アミノヘキサン酸（Ａｈｘ、ｈ＝６）、β－アラニン（ｈ＝２）及びグリシン（Ｇｌｙ、ｈ＝１）、さらにより好ましくは６－アミノヘキサン酸又はグリシンから選択される。一実施形態では、Ｌ７＝６－アミノヘキサン酸である。一実施形態では、Ｌ７＝グリシンである。或いは、リンカーＬ７が構造－Ｎ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｅ６－（ＣＨ２）ｅ７－（Ｃ（Ｏ）－（式中、ｅ６は１～１０の範囲の整数であり、ｅ７は１～３の範囲の整数である）によるエチレングリコールスペーサーである。
ペイロードＤ
［０１５７］本発明によるリンカーコンジュゲートの好ましい実施形態では、ペイロードが活性物質、レポーター分子、ポリマー、固体表面、ヒドロゲル、ナノ粒子、微粒子及び生体分子からなる群から選択される。特に好ましいペイロードは活性物質及びレポーター分子、特に活性物質である。
［０１５８］「活性物質」という用語は、本明細書において、薬理学的及び／又は生物学的物質、すなわち、生物学的に及び／又は薬学的に活性である物質、例えば薬物、プロドラッグ、診断用薬、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、ペプチドタグ、アミノ酸、グリカン、脂質、ビタミン、ステロイド、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ポリヌクレオチド、ＲＮＡ又はＤＮＡに関する。ペプチドタグの例としては、ヒトラクトフェリン又はポリアルギニンなどの細胞膜透過性ペプチドが挙げられる。グリカンの例はオリゴマンノースである。アミノ酸の例はリジンである。
［０１５９］ペイロードが活性物質である場合、活性物質は、好ましくは薬物及びプロドラッグからなる群から選択される。より好ましくは、活性物質が、薬学的に活性の化合物、特に低～中分子量化合物（例えば、約２００～約２５００Ｄａ、好ましくは約３００～約１７５０Ｄａ）からなる群から選択される。さらなる好ましい実施形態では、活性物質が細胞毒、抗ウイルス薬、抗菌薬、ペプチド及びオリゴヌクレオチドからなる群から選択される。細胞毒の例としては、コルヒチン、ビンカアルカロイド、アントラサイクリン、カンプトテシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、タキサン、カリケアミシン、チューブリシン、イリノテカン、抑制ペプチド、アマニチン、デボウガニン（ｄｅＢｏｕｇａｎｉｎ）、デュオカルマイシン、メイタンシン、オーリスタチン、エンジイン、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）又はインドリノベンゾジアゼピン二量体（ＩＧＮ）又はＰＮＵ１５９，６８２が挙げられる。
［０１６０］「レポーター分子」という用語は、本明細書において、その存在が容易に検出される分子、例えば診断用薬、色素、フルオロフォア、放射性同位体標識、造影剤、磁気共鳴イメージング剤又は質量標識を指す。
［０１６１］蛍光プローブとも呼ばれる、多種多様なフルオロフォアが当業者に公知である。いくつかのフルオロフォアは、例えば参照により組み込まれる、Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、第３版 ２０１３、第１０章：「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｂｅｓ」、３９５～４６３頁により詳細に記載されている。フルオロフォアの例としては、あらゆる種類のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（例えば、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５）、シアニン色素（例えば、Ｃｙ３又はＣｙ５）及びシアニン色素誘導体、クマリン誘導体、フルオレセイン及びフルオレセイン誘導体、ローダミン及びローダミン誘導体、ホウ素ジピロメテン誘導体、ピレン誘導体、ナフタルイミド誘導体、フィコビリンタンパク質誘導体（例えば、アロフィコシアニン）、クロモマイシン、ランタニドキレート及び量子ドットナノ結晶が挙げられる。
［０１６２］放射性同位体標識の例としては、例えばＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸無水物）、ＤＯＴＡ（１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’－四酢酸）、ＮＯＴＡ（１，４，７－トリアザシクロノナンＮ，Ｎ’，Ｎ’’－三酢酸）、ＴＥＴＡ（１，４，８，１１－テトラアザシクロテトラデカン－Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’－四酢酸）、ＤＴＴＡ（Ｎ１－（ｐ－イソチオシアナトベンジル）－ジエチレントリアミン－Ｎ１，Ｎ２，Ｎ３，Ｎ３－四酢酸）、デフェロキサミン又はＤＦＡ（Ｎ’－［５－［［４－［［５－（アセチルヒドロキシアミノ）ペンチル］アミノ］－１，４－ジオキソブチル］ヒドロキシアミノ］ペンチル］－Ｎ－（５－アミノペンチル）－Ｎ－ヒドロキシブタンジアミド）又はＨＹＮＩＣ（ヒドラジノニコチンアミド）などのキレート部分を介して任意選択で接続されている９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１１４ｍＩｎ、１１５Ｉｎ、１８Ｆ、１４Ｃ、６４Ｃｕ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、２１２Ｂｉ、８８Ｙ、９０Ｙ、６７Ｃｕ、１８６Ｒｈ、１８８Ｒｈ、６６Ｇａ、６７Ｇａ及び１０Ｂが挙げられる。同位体標識技術は当業者に公知であり、例えば参照により組み込まれる、Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、第３版 ２０１３、第１２章：「Ｉｓｏｔｏｐｉｃ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、５０７～５３４頁により詳細に記載されている。
［０１６３］本発明による化合物でペイロードＤとして使用するのに適したポリマーは当業者に公知であり、いくつかの例が、例えば参照により組み込まれる、Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、第３版 ２０１３、第１８章：「ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｏｌｙｍｅｒ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ」、７８７～８３８頁により詳細に記載されている。ペイロードＤがポリマーである場合、ペイロードＤは、好ましくはポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリプロピレンオキシド（ＰＰＯ）、１，ｘ－ジアミノアルカンポリマー（式中、ｘはアルカン中の炭素原子の数であり、好ましくは、ｘは２～２００、好ましくは２～１０の範囲の整数である）、（ポリ）エチレングリコールジアミン（例えば、１，８－ジアミノ－３，６－ジオキサオクタン及びより長いエチレングリコール鎖を含む等価物）、多糖（例えば、デキストラン）、ポリ（アミノ酸）（例えば、ポリ（Ｌ－リジン））及びポリ（ビニルアルコール）からなる群から独立的に選択される。
［０１６４］ペイロードＤとして使用するのに適した固体表面は当業者に公知である。固体表面は、例えば機能表面（例えば、ナノ材料、カーボンナノチューブ、フラーレン又はウイルスカプシドの表面）、金属表面（例えば、チタン、金、銀、銅、ニッケル、スズ、ロジウム又は亜鉛表面）、金属合金表面（合金は、例えばアルミニウム、ビスマス、クロム、コバルト、銅、ガリウム、金、インジウム、鉄、鉛、マグネシウム、水銀、ニッケル、カリウム、プルトニウム、ロジウム、スカンジウム、銀、ナトリウム、チタン、スズ、ウラン、亜鉛及び／又はジルコニウム由来である）、ポリマー表面（ポリマーは、例えばポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（ジメチルシロキサン）又はポリメチルメタクリレート、ポリアクリルアミドである）、ガラス表面、シリコーン表面、クロマトグラフィー支持体表面（クロマトグラフィー支持体は、例えばシリカ支持体、アガロース支持体、セルロース支持体又はアルミナ支持体である）等である。ペイロードＤが固体表面である場合、Ｄが機能表面又はポリマー表面からなる群から独立的に選択されることが好ましい。
［０１６５］ヒドロゲルは当業者に公知である。ヒドロゲルは、ポリマー構成成分間の架橋によって形成される、水膨潤ネットワークである。例えば参照により組み込まれる、Ａ．Ｓ．Ｈｏｆｆｍａｎ、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．２０１２、６４、１８を参照されたい。ペイロードがヒドロゲルである場合、ヒドロゲルがポリマーベースとしてのポリ（エチレン）グリコール（ＰＥＧ）で構成されることが好ましい。
［０１６６］ペイロードＤとして使用するのに適した微粒子及びナノ粒子は当業者に公知である。様々な適切な微粒子及びナノ粒子が、例えば参照により組み込まれる、Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、第３版 ２０１３、第１４章：「Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｎｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ」、５４９～５８７頁に記載されている。微粒子又はナノ粒子は、任意の形状、例えば球、ロッド、チューブ、キューブ、三角形及び円錐のものであり得る。好ましくは、微粒子又はナノ粒子が球形状のものである。微粒子及びナノ粒子の化学組成は変動し得る。ペイロードＤが微粒子又はナノ粒子である場合、微粒子又はナノ粒子は、例えばポリマー微粒子若しくはナノ粒子、シリカ微粒子若しくはナノ粒子、又は金微粒子若しくはナノ粒子である。粒子がポリマー微粒子又はナノ粒子である場合、ポリマーは、好ましくはポリスチレン又はスチレンのコポリマー（例えば、スチレンとジビニルベンゼン、ブタジエン、アクリレート及び／又はビニルトルエンのコポリマー）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリビニルトルエン、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート（ｐＨＥＭＡ）又はポリ（エチレングリコールジメタクリレート／２－ヒドロキシエチルメタクリレート）［ポリ（ＥＤＧＭＡ／ＨＥＭＡ）］である。任意選択で、微粒子又はナノ粒子の表面は、二次ポリマーのグラフト重合、又は別のポリマー若しくはスペーサー部分の共有結合的付着等によって、例えば界面活性剤で修飾される。
［０１６７］ペイロードＤは生体分子であってもよい。生体分子、及びその好ましい実施形態は以下でさらに詳細に記載される。ペイロードＤが生体分子である場合、生体分子がタンパク質（糖タンパク質及び抗体を含む）、ポリペプチド、ペプチド、グリカン、脂質、核酸、オリゴヌクレオチド、多糖、オリゴ糖、酵素、ホルモン、アミノ酸及び単糖からなる群から選択されることが好ましい。
［０１６８］本発明によるＤＡＲ１抗体－ペイロードコンジュゲートは、ＰＢＤ二量体、インドリノベンゾジアゼピン二量体（ＩＧＮ）、エンジイン、ＰＮＵ１５９，６８２、デュオカルマイシン二量体、アマニチン及びオーリスタチン、好ましくはＰＢＤ二量体、インドリノベンゾジアゼピン二量体（ＩＧＮ）、エンジイン又はＰＮＵ１５９，６８２などの極めて強力な細胞毒で使用するのに特に適している。特に好ましい実施形態では、ペイロードがＰＢＤ二量体、インドリノベンゾジアゼピン二量体（ＩＧＮ）、エンジイン、ＰＮＵ１５９，６８２、デュオカルマイシン二量体、アマニチン及びオーリスタチン、好ましくはＰＢＤ二量体、インドリノベンゾジアゼピン二量体（ＩＧＮ）、エンジイン又はＰＮＵ１５９，６８２からなる群から選択される。さらなる好ましい実施形態では、ペイロードが対称ペイロードでも二量体ペイロードでもない。
［０１６９］好ましい実施形態では、本発明による抗体－ペイロードコンジュゲートが構造（５）によるものである。この実施形態によるコンジュゲートは、以下でさらに定義される（Ｇ）ｅ及びＳｕを含む。
［０１７０］（４）中の２つのＧｌｃＮＡｃ部分の各々が、好ましくは抗体ＡＢのＦｃフラグメント中の天然Ｎ－グリコシル化部位に存在する。好ましくは、前記ＧｌｃＮＡｃ部分がＡＢの領域２９０～３０５中のアスパラギンアミノ酸に付着している。さらに好ましい実施形態では、抗体がＩｇＧ型抗体であり、特定のＩｇＧ型抗体に応じて、前記ＧｌｃＮＡｃ部分が抗体のアミノ酸アスパラギン２９７（Ａｓｎ２９７又はＮ２９７）上に存在する。
［０１７１］Ｇは単糖部分であり、ｅは０～１０の範囲の整数である。Ｇが、好ましくはグルコース（Ｇｌｃ）、ガラクトース（Ｇａｌ）、マンノース（Ｍａｎ）、フコース（Ｆｕｃ）、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ－アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＮＡｃ）及びシアル酸及びキシロース（Ｘｙｌ）からなる群から選択される。より好ましくは、Ｇが、グルコース（Ｇｌｃ）、ガラクトース（Ｇａｌ）、マンノース（Ｍａｎ）、フコース（Ｆｕｃ）、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）及びＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）からなる群から選択される。
［０１７２］好ましい実施形態では、ｅが０であり、Ｇが非存在である。抗体のグリカンがトリミングされている場合、Ｇが典型的には非存在である。トリミングは、グリカンのコアＧｌｃＮＡｃ部分のみが残るような、エンドグリコシダーゼによる処理を指す。
［０１７３］別の好ましい実施形態では、ｅが１～１０の範囲の整数である。この実施形態では、Ｇがグルコース（Ｇｌｃ）、ガラクトース（Ｇａｌ）、マンノース（Ｍａｎ）、フコース（Ｆｕｃ）、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ－アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＮＡｃ）又はシアル酸及びキシロース（Ｘｙｌ）からなる群、より好ましくはグルコース（Ｇｌｃ）、ガラクトース（Ｇａｌ）、マンノース（Ｍａｎ）、フコース（Ｆｕｃ）、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）及びＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）からなる群から選択されることがさらに好ましい。
［０１７４］ｅが３～１０である場合、（Ｇ）ｅは直鎖又は分岐であり得る。分岐オリゴ糖（Ｇ）ｅの好ましい例は、以下に示される（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｈ）及び（ｈ）である。
Figure 2023511857000017
［０１７５］Ｇが存在している場合、ＧがＧｌｃＮＡｃで終わることが好ましい。換言すれば、Ｓｕに直接接続している単糖残基がＧｌｃＮＡｃである。単糖誘導体Ｓｕは末端ＧｌｃＮＡｃ残基上にグリコシル転移（ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒ）によって容易に導入され得るので、ＧｌｃＮＡｃ部分の存在は官能化抗体の合成を促進する。構造（ａ）～（ｈ）を有する、（Ｇ）ｅについての上記の好ましい実施形態では、部分Ｓｕが末端ＧｌｃＮＡｃ残基のいずれかに接続され得る、すなわち、抗体上のコアＧｌｃＮＡｃ残基に接続されている、波線結合を有するものではない。
［０１７６］Ｇが非存在であること、すなわち、ｅ＝０であることが特に好ましい。ｅ＝０である抗体－ペイロードコンジュゲート（１）の利点は、このようなコンジュゲートが臨床的に使用される場合、Ｆｃガンマ受容体ＣＤ１６、ＣＤ３２及びＣＤ６４への結合が有意に減少するか、又は完全に抑止されることである。
［０１７７］Ｓｕは単糖誘導体であり、糖誘導体とも呼ばれる。好ましくは、糖誘導体が、グリコシル転移によって官能化抗体に組み込まれ得る。導入することができるヌクレオチド－糖誘導体の一部の好ましい例については図２を参照されたい。より好ましくは、ＳｕがＧａｌ、Ｇｌｃ、ＧａｌＮＡｃ又はＧｌｃＮＡｃ、より好ましくはＧａｌ又はＧａｌＮＡｃ、最も好ましくはＧａｌＮＡｃである。誘導体という用語は、（Ｇ）ｅ及びＦに接続するために適切に官能化されている単糖を指す。
調製方法
［０１７８］本発明はまた、仮定のペイロード抗体比１を有する抗体－ペイロードコンジュゲートを調製する方法であって、
（ａ）少なくとも２つの反応性基Ｑを含有する構造（２）を有する化合物を、２つの反応性基Ｆで官能化されている構造（３）を有する抗体と反応させて：
Figure 2023511857000018
（式中、
Ａｂは抗体であり；
ａ、ｂ及びｃはそれぞれ個別に０又は１であり；
Ｌ１、Ｌ２及びＬ３はリンカーであり；
Ｖは反応性基Ｑ’又はペイロードＤであり；
ＢＭは分岐部分であり；
Ｑ及びＦは、これらが連結して接続基Ｚになる付加環化反応を受けることができる反応性基である）
構造（１’）による官能化抗体：
Figure 2023511857000019
（式中、ＺはＱとＦの反応によって得られる接続基であり；
構造（１’）による官能化抗体は、ＶがペイロードＤである場合、抗体－ペイロードコンジュゲートである；
又は構造（１’）による官能化抗体は、Ｖが反応性基Ｑ’である場合、ＶがペイロードＤである場合の抗体－ペイロードコンジュゲートを得るために、ステップ（ｂ）によりさらに反応させられる）
を得るステップと；
（ｂ）Ｖ＝Ｑ’である場合、反応性基Ｑ’を、反応性基Ｆ’を含有するペイロードと反応させて、ＶがペイロードＤである抗体－ペイロードコンジュゲートを得るステップと
を含む方法に関する。
［０１７９］好ましい実施形態では、構造（３）を有する抗体が構造（３ｂ）：
Figure 2023511857000020
を有する。
［０１８０］好ましい実施形態では、構造（１）による官能化抗体が構造（５ｂ）：
Figure 2023511857000021
を有する。
［０１８１］本発明による方法は、ステップ（ｂ）が実施されない形態とステップ（ｂ）が実施される形態の２つの主な形態をとることができる。
［０１８２］一実施形態では、ステップ（ｂ）が実施されず、構造（２）を有する化合物上に存在するＶがペイロードＤである。その場合、ステップ（ａ）が最終コンジュゲート（構造（１））を直接与える。この好ましい実施形態による方法はスキーム１によって表され得る。
［０１８３］スキーム１
Figure 2023511857000022
［０１８４］本明細書において、ＬＢは構造（９）による三価リンカーを表し、上にさらに定義される。
Figure 2023511857000023
［０１８５］よって、好ましい実施形態では、構造（１）による官能化抗体がステップ（ａ）で得られ、Ｄがペイロードであり、ステップ（ｂ）が実施されない。
［０１８６］一実施形態では、ステップ（ｂ）が実施され、構造（２）を有する化合物上に存在するＶが反応性基Ｑ’である。その場合、ステップ（ａ）が構造（１）（式中、Ｖ＝Ｑ’（以下（１ｂ）として描かれる））を有する中間官能化抗体を与える。この中間官能化抗体は、反応性基Ｆを有する適切に官能化されたペイロードと反応して、構造（１）（式中、Ｖ＝Ｄ）を有する最終コンジュゲートを与えるさらなる反応性基Ｑ’を含有する。この好ましい実施形態による方法はスキーム２によって表され得る。
［０１８７］スキーム２
Figure 2023511857000024
［０１８８］本明細書において、Ｑ１及びＦ１は、Ｑ及びＦと同じように反応性部分であり、Ｑ及びＦの定義及び好ましい実施形態はＱ１及びＦ１に等しく適用される。リンカー化合物（２）中のＱ’の存在は、反応に干渉すべきではなく、これはＱ１とＦ１との間の反応においてＱ’が不活性であることにより達成され得る。本発明者らは、Ｑ１とＱ’の両方が同じ反応性部分である三価リンカー化合物で、Ａｂ（Ｆ１）２との反応は２つの組み合わせＱ１／Ｑ’についてのみ起こり、第３の反応性部分は未反応のままであることを見出した。リンカー化合物で起こる第３の反応のさらなる減少は、希薄濃度で反応を実施することによって達成される。
［０１８９］よって、好ましい実施形態では、構造（１’）による官能化抗体がステップ（ａ）で得られ、Ｖが反応性基Ｑ’である、すなわち、構造（１ｂ）であり、ステップ（ｂ）が実施される。
［０１９０］薬物抗体比（ＤＡＲ）としても知られる、「ペイロード抗体比」は、コンジュゲート中のペイロード分子の抗体分子に対する比を指す。本発明は、ＤＡＲ１を有するコンジュゲート（すなわち、１つのペイロード分子が１つの抗体分子にコンジュゲートされている）に向けた効率的な経路を提供する。全ての官能化抗体が構造（２）のリンカー化合物と反応し得るわけではなく、結果として実際のペイロード抗体比が仮定のペイロード抗体比から幾分逸脱し得る（すなわち、幾分低くなり得る）ので、生成物のペイロード抗体比は仮定のペイロード抗体比よりもわずかに低くなり得る。本発明による方法は、仮定の比１に近いペイロード抗体比を有する生成物混合物を提供する。
［０１９１］本発明は、従来の方法と比較して、ペイロード抗体比１を有する抗体コンジュゲートを調製する大いに改善された方法を提供する。従来の方法は、抗体への単一付着点のみの導入で苦労している。抗体は、マレイミド－システインコンジュゲーションなどのランダムコンジュゲーションが、最大８個又はさらにより多いペイロードを保有するコンジュゲートに広範な分布を典型的に与えるように、多くのアミノ酸を含有する。他のコンジュゲーション方法は、抗体が対称的であり、よって、少なくとも２つの使用され得る任意の付着点を提供するという事実が問題となる。よって、遺伝子改変に頼ってただ１つの付着点を含有する組換え抗体を設計することができる。
［０１９２］代替の先行技術のアプローチは、対称的なペイロード（二量体）がリンカーを介して２つの同一の反応性部分で対称的に官能化されている対称的に官能化されたペイロードの使用を伴う。そのため、これらの２つの反応性部分が、抗体に提供される２つの付着点と反応する。
［０１９３］本発明による方法は、二官能性リンカー化合物を抗体上の２つの付着点にクリッピングすることによって、抗体の２つの付着点を単一付着点に優雅に変換する。例で実証されるように、ペイロード抗体比１を有するコンジュゲートをそのまま優雅に得ることができる。また、分岐部分によって、いかなるペイロードも抗体にコンジュゲートすることができるので、結果として本方法は対称的なペイロードに限定されない。
［０１９４］Ｖ＝Ｄである場合、ステップ（ａ）の反応がコンジュゲーション反応である。そうでなければ、Ｖ＝Ｑ’である場合、ステップ（ｂ）の反応がコンジュゲーション反応である。本発明による方法はいずれのコンジュゲーション技術とも適合性であり、いずれのこのような技術も、実施する場合、ステップ（ａ）とステップ（ｂ）の両方に使用することができる。
［０１９５］好ましい実施形態では、ステップ（ａ）の反応が［４＋２］付加環化又は１，３－双極子付加環化である。
［０１９６］構造（３）による抗体は当技術分野で公知の任意の手段によって調製され得る。例えば、抗体の鎖間ジスルフィド結合の還元、引き続いてマレイミド構築物（又は他のチオール反応性構築物）を含有する規定の数の反応性部分Ｆとの反応によって、化学量論によって適合させることができる基Ｆの担持がもたらされる。抗体コンジュゲーションのより制御された、部位特異的方法は、例えば２つのペアになっていないシステイン（重鎖１本当たり１つ又は軽鎖１本当たり１つ）を含有する抗体の遺伝子改変によって、抗体をＦ含有マレイミド構築物に供して正確に２つの反応性部分Ｆを抗体に提供することによって達成することができる。遺伝子コードは、ＡＭＢＥＲ終止コドンを適用することによって、特定の部位で予め定義された数の反応性部分Ｆを含有する抗体の直接発現が可能になる。例えばトランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）、ソルターゼ、ホルミル－グリシン生成酵素（ＦＧＥ）などに基づく、規定の数の反応性部分Ｆを抗体に取り付けるための様々な酵素的アプローチも報告されている。よって、一実施形態では、官能化抗体が、鎖間ジスルフィド結合の還元、引き続いてＦ含有チオール反応性構築物との反応、ペアになっていないシステイン残基の導入、引き続いてＦ含有チオール反応性構築物との反応、反応性部分Ｆの酵素的導入、及び遺伝子改変による反応性部分の導入によって調製される。遺伝子改変の使用が本出願の文脈において最も好ましくなく、反応性部分Ｆの酵素的導入が最も好ましい。
［０１９７］好ましい実施形態では、ＧｌｙｃｏＣｏｎｎｅｃｔ技術（例えば、参照により組み込まれる、国際公開第２０１４／０６５６６１号及びｖａｎ Ｇｅｅｌら、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．２０１５、２６、２２３３～２２４２参照）は、モノクローナル抗体の重鎖に天然に存在するグリカンを利用して、一定数のクリックプローブ、特にアジドを導入する。よって、好ましい実施形態では、官能化抗体が、（ｉ）任意選択で適切なエンドグリコシダーゼにより天然グリカンをトリミングし、それによって、Ａｓｎ－２９７上に典型的に存在するコアＧｌｃＮＡｃを遊離させるステップ、引き続いて（ｉｉ）適切なグリコシルトランスフェラーゼの作用下で、対応するＵＤＰ－糖から非天然のアジド保有糖基質を移動させる、例えば、ガラクトシルトランスフェラーゼ変異体Ｇａｌ－Ｔ（Ｙ２８９Ｌ）によりＧａｌＮＡｚ又はＧａｌＮＡｃ－トランスフェラーゼ（ＧａｌＮＡｃ－Ｔ）により６－アジドＧａｌＮＡｃを移動させるステップによって調製される。或いは、ＧａｌＮＡｃ－Ｔを適用して、Ａｃ基上に芳香族部分又はチオール官能基を保有するＧａｌＮＡｃ誘導体をコアＧｌｃＮＡｃ上に取り付けることもできる。構造（５）による官能化抗体をこの技術によって得ることができ、ここではトリミングステップ（ｉ）を採用してｅ＝０を有する官能化抗体を得ることができるか、又はトリミングステップ（ｉ）を省略してｅ＝１～１０を有する官能化抗体を得ることができる。好ましくは、ステップ（ｉ）が実施され、ｅ＝０である。
反応性部分Ｑ及びＦ
［０１９８］本発明の文脈において、「反応性部分」という用語は、官能基を含む化学部分を指し得るが、官能基自体も指し得る。例えば、シクロオクチニル基は、官能基、すなわちＣ－Ｃ三重結合を含む反応性基である。しかしながら、官能基、例えばアジド官能基、チオール官能基又はアルキニル官能基も、本明細書において、反応性基と呼ばれ得る。
［０１９９］本発明による方法において反応性であるためには、反応性部分Ｑは、官能化抗体上に存在する反応性部分Ｆと反応することができるべきである。換言すれば、反応性部分Ｑは、官能化抗体上に存在する反応性部分Ｆに対して反応性である。本明細書において、反応性部分は、別の反応性部分に対して、前記第１の反応性部分が、任意選択で他の官能基の存在下で、選択的に前記第２の反応性部分と反応する場合に、「反応性」であると定義される。相補的反応性部分は当業者に公知であり、以下でさらに詳細に記載され、図１に例示される。よって、コンジュゲーション反応は、抗体とペイロードとの間の共有結合的接続を含むコンジュゲートを形成する、ＱとＦとの間の化学反応である。ここで提供される反応性部分Ｑの定義をＦ、Ｑ１、Ｆ１及びＱ’に等しく適用する。
［０２００］好ましい実施形態では、反応性部分が、任意選択で置換された、アルケニル基、アルキニル基、テトラジニル基、アジド基、ニトリルオキシド基、ニトロン基、ニトリルイミン基、ジアゾ基、ケトン基、（Ｏ－アルキル）ヒドロキシルアミノ基、ヒドラジン基、アレンアミド基、トリアジン基、ホスホンアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｎａｍｉｄｉｔｅ）基からなる群から選択される。特に好ましい実施形態では、反応性部分Ｑがアジド基又はアルキニル基であり、最も好ましくは、反応性部分Ｑがアルキニル基である。Ｑがアルキニル基である場合、Ｑが末端アルキン基、（ヘテロ）シクロアルキニル基及びビシクロ［６．１．０］ノナ－４－イン－９－イル］基から選択されることが好ましい。
［０２０１］別の好ましい実施形態では、Ｑがシクロアルケニル基を含むアルケニル基を含むか、又はシクロアルケニル基を含むアルケニル基であり、好ましくはＱがアルケニル基である。アルケニル基は直鎖又は分岐であり得、任意選択で置換されている。アルケニル基は末端又は内部アルケニル基であり得る。アルケニル基は、２つ以上のＣ－Ｃ二重結合を含むことができ、好ましくは、１つ又は２つのＣ－Ｃ二重結合を含む。アルケニル基がジエニル基である場合、２つのＣ－Ｃ二重結合が１つのＣ－Ｃ単結合によって分離されていることがさらに好ましい（すなわち、ジエニル基が共役ジエニル基であることが好ましい）。好ましくは、前記アルケニル基が、Ｃ２～Ｃ２４アルケニル基、より好ましくはＣ２～Ｃ１２アルケニル基、さらにより好ましくはＣ２～Ｃ６アルケニル基である。アルケニル基が末端アルケニル基であることがさらに好ましい。より好ましくは、アルケニル基が、以下に示される構造（Ｑ８）によるものであり、ｌが０～１０の範囲、好ましくは０～６の範囲の整数であり、ｐが０～１０の範囲、好ましくは０～６の範囲の整数である。より好ましくは、ｌが０、１、２、３又は４であり、より好ましくはｌが０、１又は２であり、最も好ましくはｌが０又は１である。より好ましくは、ｐが０、１、２、３又は４であり、より好ましくはｐが０、１又は２であり、最も好ましくはｐが０又は１である。ｐが０であり、ｌが０又は１であるか、又はｐが１であり、ｌが０又は１であることが特に好ましい。
［０２０２］特に好ましいアルケニル基は、ヘテロシクロアルケニル基を含むシクロアルケニル基であり、シクロアルケニル基は任意選択で置換されている。好ましくは、前記シクロアルケニル基が、Ｃ３～Ｃ２４シクロアルケニル基、より好ましくはＣ３～Ｃ１２シクロアルケニル基、さらにより好ましくはＣ３～Ｃ８シクロアルケニル基である。好ましい実施形態では、シクロアルケニル基が、トランス－シクロアルケニル基、より好ましくはトランス－シクロオクテニル基（ＴＣＯ基とも呼ばれる）、最も好ましくは以下に示される構造（Ｑ９）又は（Ｑ１０）によるトランス－シクロオクテニル基である。別の好ましい実施形態では、シクロアルケニル基がシクロプロペニル基であり、シクロプロペニル基が任意選択で置換されている。別の好ましい実施形態では、シクロアルケニル基が、ノルボルネニル基、オキサノルボルネニル基、ノルボルナジエニル基又はオキサノルボルナジエニル基であり、ノルボルネニル基、オキサノルボルネニル基、ノルボルナジエニル基又はオキサノルボルナジエニル基が任意選択で置換されている。さらに好ましい実施形態では、シクロアルケニル基が以下に示される構造（Ｑ１１）、（Ｑ１２）、（Ｑ１３）又は（Ｑ１４）によるものであり、Ｘ４がＣＨ２又はＯであり、Ｒ２７が水素、直鎖若しくは分岐Ｃ１～Ｃ１２アルキル基又はＣ４～Ｃ１２（ヘテロ）アリール基からなる群から独立的に選択され、Ｒ１４が水素及びフッ素化炭化水素からなる群から選択される。好ましくは、Ｒ２７が独立に、水素又はＣ１～Ｃ６アルキル基であり、より好ましくはＲ２７が独立に、水素又はＣ１～Ｃ４アルキル基である。さらにより好ましくは、Ｒ２７が独立に、水素又はメチル、エチル、ｎ－プロピル、ｉ－プロピル、ｎ－ブチル、ｓ－ブチル又はｔ－ブチルである。なおさらにより好ましくは、Ｒ２７が独立に、水素又はメチルである。さらに好ましい実施形態では、Ｒ１４が、水素及び－ＣＦ３、－Ｃ２Ｆ５、－Ｃ３Ｆ７及び－Ｃ４Ｆ９、より好ましくは水素及び－ＣＦ３の群から選択される。さらに好ましい実施形態では、シクロアルケニル基が構造（Ｑ１１）によるものであり、一方のＲ２７が水素であり、他方のＲ２７がメチル基である。別のさらに好ましい実施形態では、シクロアルケニル基が構造（Ｑ１２）によるものであり、両Ｒ２７が水素である。これらの実施形態では、ｌが０又は１であることがさらに好ましい。別のさらに好ましい実施形態では、シクロアルケニル基が、構造（Ｑ１３）によるノルボルネニル（Ｘ４がＣＨ２である）若しくはオキサノルボルネニル（Ｘ４がＯである）基、又は構造（Ｑ１４）によるノルボルナジエニル（Ｘ４がＣＨ２である）若しくはオキサノルボルナジエニル（Ｘ４がＯである）基であり、Ｒ２７が水素であり、Ｒ１４が水素又は－ＣＦ３、好ましくは－ＣＦ３である。
［０２０３］別の好ましい実施形態では、Ｑがシクロアルキニル基を含むアルキニル基を含むか、又はシクロアルキニル基を含むアルキニル基であり、好ましくはＱがアルキニル基を含む。アルキニル基は直鎖又は分岐であり得、任意選択で置換されている。アルキニル基は末端又は内部アルキニル基であり得る。好ましくは、前記アルキニル基が、Ｃ２～Ｃ２４アルキニル基、より好ましくはＣ２～Ｃ１２アルキニル基、さらにより好ましくはＣ２～Ｃ６アルキニル基である。アルキニル基が末端アルキニル基であることがさらに好ましい。より好ましくは、アルキニル基が以下に示される構造（Ｑ１５）によるものであり、ｌが０～１０の範囲、好ましくは０～６の範囲の整数である。より好ましくは、ｌが０、１、２、３又は４であり、より好ましくはｌが０、１又は２であり、最も好ましくはｌが０又は１である。
［０２０４］特に好ましいアルキニル基はヘテロシクロアルキニル基を含むシクロアルキニル基であり、シクロアルケニル基は、任意選択で置換されている。好ましくは、（ヘテロ）シクロアルキニル基が（ヘテロ）シクロオクチニル基、すなわち、ヘテロシクロオクチニル基又はシクロオクチニル基であり、（ヘテロ）シクロオクチニル基が任意選択で置換されている。さらに好ましい実施形態では、（ヘテロ）シクロオクチニル基が構造（Ｑ３６）によるものであり、以下でさらに定義される。（ヘテロ）シクロオクチニル基の好ましい例としては、全ての以下に示される、ＤＩＢＯ基とも呼ばれる構造（Ｑ１６）、ＤＩＢＡＣ基とも呼ばれる（Ｑ１７）、又はＢＡＲＡＣ基とも呼ばれる（Ｑ１８）、ＣＯＭＢＯ基とも呼ばれる（Ｑ１９）、及びＢＣＮ基とも呼ばれる（Ｑ２０）が挙げられ、Ｘ５はＯ又はＮＲ２７であり、Ｒ２７の好ましい実施形態は上に定義される通りである。（Ｑ１６）中の芳香環は、１つ又は複数の位置で、好ましくは２つの位置で、最も好ましくは（Ｑ４０）（スルホニル化ジベンゾシクロオクチン（ｓ－ＤＩＢＯ））のように任意選択でＯ－スルホニル化されているのに対して、（Ｑ１７）及び（Ｑ１８）の環は、１つ又は複数の位置でハロゲン化され得る。特に好ましいシクロアルキニル基は、任意選択で置換されている、ビシクロ［６．１．０］ノナ－４－イン－９－イル］基（ＢＣＮ基）である。好ましくは、ビシクロ［６．１．０］ノナ－４－イン－９－イル］基が以下に示される構造（Ｑ２０）によるものである。
［０２０５］別の好ましい実施形態では、Ｑが共役（ヘテロ）ジエン基を含むか、又は共役（ヘテロ）ジエン基であり、好ましくはＱがディールス－アルダー反応で反応することができる共役（ヘテロ）ジエン基である。好ましい（ヘテロ）ジエン基には、任意選択で置換されたテトラジニル基、任意選択で置換された１，２－キノン基及び任意選択で置換されたトリアジン基が含まれる。より好ましくは、前記テトラジニル基が以下に示される構造（Ｑ２１）によるものであり、Ｒ２７が水素、直鎖若しくは分岐Ｃ１～Ｃ１２アルキル基又はＣ４～Ｃ１２（ヘテロ）アリール基からなる群から選択される。好ましくは、Ｒ２７が水素、Ｃ１～Ｃ６アルキル基又はＣ４～Ｃ１０（ヘテロ）アリール基であり、より好ましくはＲ２７が水素、Ｃ１～Ｃ４アルキル基又はＣ４～Ｃ６（ヘテロ）アリール基である。さらにより好ましくは、Ｒ２７が水素、メチル、エチル、ｎ－プロピル、ｉ－プロピル、ｎ－ブチル、ｓ－ブチル、ｔ－ブチル又はピリジルである。なおさらにより好ましくは、Ｒ２７が水素、メチル又はピリジルである。より好ましくは、前記１，２－キノン基が構造（Ｑ２２）又は（Ｑ２３）によるものである。前記トリアジン基は任意の位置異性体であり得る。より好ましくは、前記トリアジン基が、構造（Ｑ２４）に示されるように、任意の可能な位置を介して付着され得る１，２，３－トリアジン基又は１，２，４－トリアジン基である。１，２，３－トリアジンがトリアジン基として最も好ましい。
［０２０６］別の好ましい実施形態では、Ｑがアジド基を含むか、又はアジド基であり、好ましくはＱがアジド基である。好ましくは、アジド基が以下に示される構造（Ｑ２５）によるものである。
［０２０７］別の好ましい実施形態では、Ｑがニトリルオキシド基を含むか、又はニトリルオキシド基であり、好ましくはＱがニトリルオキシド基である。好ましくは、ニトリルオキシド基が以下に示される構造（Ｑ２７）によるものである。
［０２０８］別の好ましい実施形態では、Ｑがニトロン基を含むか、又はニトロン基であり、好ましくはＱがニトロン基である。好ましくは、ニトロン基が以下に示される構造（Ｑ２８）によるものであり、Ｒ２９が直鎖又は分岐Ｃ１～Ｃ１２アルキル基及びＣ６～Ｃ１２アリール基からなる群から選択される。好ましくは、Ｒ２９がＣ１～Ｃ６アルキル基であり、より好ましくはＲ２９がＣ１～Ｃ４アルキル基である。さらにより好ましくはＲ２９がメチル、エチル、ｎ－プロピル、ｉ－プロピル、ｎ－ブチル、ｓ－ブチル又はｔ－ブチルである。なおさらにより好ましくはＲ２９がメチルである。
［０２０９］別の好ましい実施形態では、Ｑがニトリルイミン基を含むか、又はニトリルイミン基であり、好ましくはＱがニトリルイミン基である。好ましくは、ニトリルイミン基が以下に示される構造（Ｑ２９）又は（Ｑ３０）によるものであり、Ｒ３０が直鎖又は分岐Ｃ１～Ｃ１２アルキル基及びＣ６～Ｃ１２アリール基からなる群から選択される。好ましくは、Ｒ３０がＣ１～Ｃ６アルキル基であり、より好ましくはＲ３０がＣ１～Ｃ４アルキル基である。さらにより好ましくはＲ３０がメチル、エチル、ｎ－プロピル、ｉ－プロピル、ｎ－ブチル、ｓ－ブチル又はｔ－ブチルである。なおさらにより好ましくはＲ３０がメチルである。
［０２１０］別の好ましい実施形態では、Ｑがジアゾ基を含むか、又はジアゾ基であり、好ましくはＱがジアゾ基である。好ましくは、ジアゾ基が以下に示される構造（Ｑ３１）によるものであり、Ｒ３３が水素又はカルボニル誘導体からなる群から選択される。より好ましくは、Ｒ３３が水素である。
［０２１１］別の好ましい実施形態では、Ｑがケトン基を含むか、又はケトン基であり、好ましくはＱがケトン基である。好ましくは、ケトン基が以下に示される構造（Ｑ３２）によるものであり、Ｒ３４が直鎖又は分岐Ｃ１～Ｃ１２アルキル基及びＣ６～Ｃ１２アリール基からなる群から選択される。好ましくは、Ｒ３４がＣ１～Ｃ６アルキル基であり、より好ましくはＲ３４がＣ１～Ｃ４アルキル基である。さらにより好ましくは、Ｒ３４がメチル、エチル、ｎ－プロピル、ｉ－プロピル、ｎ－ブチル、ｓ－ブチル又はｔ－ブチルである。なおさらにより好ましくは、Ｒ３４がメチルである。
［０２１２］別の好ましい実施形態では、Ｑが（Ｏ－アルキル）ヒドロキシルアミノ基を含むか、又は（Ｏ－アルキル）ヒドロキシルアミノ基であり、好ましくはＱが（Ｏ－アルキル）ヒドロキシルアミノ基である。好ましくは、（Ｏ－アルキル）ヒドロキシルアミノ基が以下に示される構造（Ｑ３３）によるものである。
［０２１３］別の好ましい実施形態では、Ｑがヒドラジン基を含むか、又はヒドラジン基であり、好ましくはＱがヒドラジン基である。好ましくは、ヒドラジン基が以下に示される構造（Ｑ３４）によるものである。
［０２１４］別の好ましい実施形態では、Ｑがアレンアミド基を含むか、又はアレンアミド基であり、好ましくはＱがアレンアミド基である。好ましくは、アレンアミド基が構造（Ｑ３５）によるものである。
［０２１５］別の好ましい実施形態では、Ｑがホスホンアミダイト基を含むか、又はホスホンアミダイト基であり、好ましくはＱがホスホンアミダイト基である。好ましくは、ホスホンアミダイト基が構造（Ｑ３６）によるものである。
Figure 2023511857000025
［０２１６］本明細書において、（Ｑ１６）中の芳香環は、１つ又は複数の位置で、任意選択でＯ－スルホニル化されているのに対して、（Ｑ１７）及び（Ｑ１８）の環は、１つ又は複数の位置でハロゲン化され得る。
［０２１７］Ｑが（ヘテロ）シクロアルキニル基である場合、Ｑが（Ｑ４２）～（Ｑ６０）：
Figure 2023511857000026
からなる群から選択されることが好ましい。
［０２１８］本明細書において、波線結合で描かれる、分子の残りとの接続は、Ｑの任意の利用可能な炭素又は窒素原子であり得る。（Ｑ５０）、（Ｑ５３）、（Ｑ５４）及び（Ｑ５５）の窒素原子は接続を保有し得るか、又は水素原子を含有し得るか、又は任意選択で官能化され得る。Ｂ（－）はアニオンであり、好ましくは（－）ＯＴｆ、Ｃｌ（－）、Ｂｒ（－）又はＩ（－）から選択され、最も好ましくはＢ（－）が（－）ＯＴｆである。コンジュゲーション反応において、Ｂ（－）はどのようにしても反応混合物中に存在するアニオンと交換するので、Ｂ（－）は薬学的に許容できるアニオンである必要はない。（Ｑ５９）がＱに使用される場合、抗体コンジュゲートが医薬品として容易に使用可能となるように、負に帯電した対イオンは、好ましくは、本発明による抗体コンジュゲートの単離で薬学的に許容できる。
［０２１９］ＦとＱとの間の反応及びそれらの対応する生成物（接続基Ｚ）の一部の代表的な例が図１に描かれている。
［０２２０］コンジュゲーションは付加環化によって達成される。好ましい実施形態では、コンジュゲーションが［４＋２］付加環化又は１，３－双極子付加環化によって達成され、求核反応がマイケル付加又は求核置換である。よって、本発明によるコンジュゲーション方法の好ましい実施形態では、コンジュゲーションが、［４＋２］付加環化又は１，３－双極子付加環化、好ましくは１，３－双極子付加環化を介して達成される。
［０２２１］典型的な［４＋２］付加環化はディールス－アルダー反応であり、Ｑはジエン又はジエノフィル（ｄｉｅｎｏｐｈｉｌｅ）である。当業者によって認識されるように、ディールス－アルダー反応の文脈における「ジエン」という用語は、１，３－（ヘテロ）ジエンを指し、共役ジエン（Ｒ２Ｃ＝ＣＲ－ＣＲ＝ＣＲ２）、イミン（例えば、Ｒ２Ｃ＝ＣＲ－Ｎ＝ＣＲ２又はＲ２Ｃ＝ＣＲ－ＣＲ＝ＮＲ、Ｒ２Ｃ＝Ｎ－Ｎ＝ＣＲ２）及びカルボニル（例えば、Ｒ２Ｃ＝ＣＲ－ＣＲ＝Ｏ又はＯ＝ＣＲ－ＣＲ＝Ｏ）を含む。Ｎ及びＯ含有ジエンとのヘテロ－ディールス－アルダー反応は当技術分野で公知である。［４＋２］付加環化に適していることが当技術分野で知られている任意のジエンを反応性基Ｑとして使用することができる。好ましいジエンには、上記のテトラジン、上記の１，２－キノン及び上記のトリアジンが含まれる。［４＋２］付加環化に適していることが当技術分野で知られている任意のジエノフィルを反応性基Ｑとして使用することができるが、ジエノフィルは、好ましくは上記のアルケン又はアルキン基、最も好ましくはアルキン基である。［４＋２］付加環化を介したコンジュゲーションについては、Ｑがジエノフィルである（及びＦがジエンである）ことが好ましく、より好ましくはＱがアルキニル基であるか、又はアルキニル基を含む。
［０２２２］１，３－双極子付加環化については、Ｑが１，３－双極子又は親双極子である。１，３－双極子付加環化に適していることが当技術分野で知られている任意の１，３－双極子を反応性基Ｑとして使用することができる。好ましい１，３－双極子には、アジド基、ニトロン基、ニトリルオキシド基、ニトリルイミン基及びジアゾ基が含まれる。１，３－双極子付加環化に適していることが当技術分野で知られている任意の親双極子を反応性基Ｑとして使用することができるが、親双極子は、好ましくはアルケン又はアルキン基、最も好ましくはアルキン基である。１，３－双極子付加環化を介したコンジュゲーションについては、Ｑが親双極子である（及びＦが１，３－双極子である）ことが好ましく、より好ましくはＱがアルキニル基であるか、又はアルキニル基を含む。
［０２２３］よって、好ましい実施形態では、Ｑが親双極子及びジエノフィルから選択される。好ましくは、Ｑがアルケン又はアルキン基である。特に好ましい実施形態では、Ｑが、好ましくは上記のアルキニル基、上記のシクロアルケニル基、上記の（ヘテロ）シクロアルキニル基及びビシクロ［６．１．０］ノナ－４－イン－９－イル］基から選択される、アルキン基を含む。より好ましくは、Ｑが、末端アルキン又はシクロオクチン部分、好ましくはビシクロノニン（ＢＣＮ）、アザジベンゾシクロオクチン（ＤＩＢＡＣ／ＤＢＣＯ）又はジベンゾシクロオクチン（ＤＩＢＯ）、より好ましくはＢＣＮ又はＤＩＢＡＣ／ＤＢＣＯ、最も好ましくはＢＣＮを含む。代替の好ましい実施形態では、Ｑが、式（Ｑ５）、（Ｑ６）、（Ｑ７）、（Ｑ８）、（Ｑ２０）及び（Ｑ９）から選択され、より好ましくは式（Ｑ６）、（Ｑ７）、（Ｑ８）、（Ｑ２０）及び（Ｑ９）から選択される。最も好ましくは、Ｑが、好ましくは式（Ｑ２０）の、ビシクロ［６．１．０］ノナ－４－イン－９－イル］基である。これらの基は、アジド官能化抗体とのコンジュゲーションにおいて極めて有効であることが知られている。
［０２２４］特に好ましい実施形態では、反応性基Ｑがアルキニル基を含み、構造（Ｑ３６）：
Figure 2023511857000027
によるものである。
本明細書において、
Ｒ１５は、水素、ハロゲン、－ＯＲ１６、－ＮＯ２、－ＣＮ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ１６、Ｃ１～Ｃ２４アルキル基、Ｃ６～Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ７～Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ７～Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から独立的に選択され、アルキル基、（ヘテロ）アリール基、アルキル（ヘテロ）アリール基及び（ヘテロ）アリールアルキル基は任意選択で置換されており、２つの置換基Ｒ１５は連結して、縮環シクロアルキル又は縮環（ヘテロ）アレーン置換基を形成してもよく、Ｒ１６は、水素、ハロゲン、Ｃ１～Ｃ２４アルキル基、Ｃ６～Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ７～Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ７～Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から独立的に選択され；
Ｘ１０はＣ（Ｒ１７）２、Ｏ、Ｓ又はＮＲ１７であり、Ｒ１７はＲ１５であり；
ｕは０、１、２、３、４又は５であり；
ｕ’は０、１、２、３、４又は５であり；
ｕ＋ｕ’＝５であり；
ｖ＝９又は１０である。
［０２２５］構造（Ｑ３６）による反応性基の好ましい実施形態は、構造（Ｑ３７）、（Ｑ６）、（Ｑ７）、（Ｑ８）、（Ｑ９）及び（Ｑ２０）による反応性基である。
［０２２６］特に好ましい実施形態では、反応性基Ｑがアルキニル基を含み、構造（Ｑ３７）：
Figure 2023511857000028
によるものである。
本明細書において、
Ｒ１５は、水素、ハロゲン、－ＯＲ１６、－ＮＯ２、－ＣＮ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ１６、Ｃ１～Ｃ２４アルキル基、Ｃ５～Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ７～Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ７～Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から独立的に選択され、アルキル基、（ヘテロ）アリール基、アルキル（ヘテロ）アリール基及び（ヘテロ）アリールアルキル基は任意選択で置換されており、２つの置換基Ｒ１５は連結して、縮環シクロアルキル又は縮環（ヘテロ）アレーン置換基を形成してもよく、Ｒ１６は、水素、ハロゲン、Ｃ１～Ｃ２４アルキル基、Ｃ６～Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ７～Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ７～Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から独立的に選択され；
Ｒ１８は、水素、ハロゲン、Ｃ１～Ｃ２４アルキル基、Ｃ６～Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ７～Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ７～Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から独立的に選択され；
Ｒ１９は、水素、ハロゲン、Ｃ１～Ｃ２４アルキル基、Ｃ６～Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ７～Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ７～Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から選択され、アルキル基はＯ、Ｎ及びＳからなる群から選択される１個又は複数のヘテロ原子によって任意選択で中断されており、アルキル基、（ヘテロ）アリール基、アルキル（ヘテロ）アリール基及び（ヘテロ）アリールアルキル基は独立に、任意選択で置換されており；
ｌは０～１０の範囲の整数である。
［０２２７］構造（Ｑ３７）による反応性基の好ましい実施形態では、Ｒ１５が、水素、ハロゲン、－ＯＲ１６、Ｃ１～Ｃ６アルキル基、Ｃ５～Ｃ６（ヘテロ）アリール基からなる群から独立的に選択され、Ｒ１６が水素又はＣ１～Ｃ６アルキルであり、より好ましくはＲ１５が水素及びＣ１～Ｃ６アルキルからなる群から独立的に選択され、最も好ましくは全てのＲ１５がＨである。構造（Ｑ３７）による反応性基の好ましい実施形態では、Ｒ１８が、水素、Ｃ１～Ｃ６アルキル基からなる群から独立的に選択され、最も好ましくは両Ｒ１８がＨである。構造（Ｑ３７）による反応性基の好ましい実施形態では、Ｒ１９がＨである。構造（Ｑ３７）による反応性基の好ましい実施形態では、ｌが０又は１であり、より好ましくはｌが１である。構造（Ｑ３７）による反応性基の特に好ましい実施形態は構造（Ｑ２０）による反応性基である。
化合物
［０２２８］さらなる態様では、本発明は構造（２）：
Figure 2023511857000029
（式中、
ａ、ｂ及びｃはそれぞれ個別に０又は１であり；
Ｌ１、Ｌ２及びＬ３はリンカーであり；
Ｄはペイロードであり；
ＢＭは分岐部分であり；
Ｑは（ヘテロ）シクロオクチン部分を含む）
の化合物に関する。
［０２２９］部分ａ、ｂ、ｃ、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｄ、ＢＭ及びＱは上にさらに定義され、上に定義される好ましい実施形態を含めて、本態様に等しく適用される。好ましい実施形態では、Ｄが上にさらに定義される細胞毒である。構造（２）の好ましい化合物は対称的である、すなわち、出現するａ／ｂ、Ｌ１／Ｌ２及びＱの各々が同じである。好ましくは、ａ＝ｂ＝１であり、より好ましくはｃ＝１でもある。
［０２３０］本態様の文脈において、Ｑは、任意選択で置換されており、ヘテロシクロオクチニル基又はシクロオクチニル基、好ましくはシクロオクチニル基であり得る（ヘテロ）シクロオクチン部分を含む。さらなる好ましい実施形態では、（ヘテロ）シクロオクチニル基が構造（Ｑ３６）によるものである。（ヘテロ）シクロオクチニル基の好ましい例としては、ＤＩＢＯ基とも呼ばれる構造（Ｑ１６）、ＤＩＢＡＣ基とも呼ばれる（Ｑ１７）、又はＢＡＲＡＣ基とも呼ばれる（Ｑ１８）、ＣＯＭＢＯ基とも呼ばれる（Ｑ１９）、及びＢＣＮ基とも呼ばれる（Ｑ２０）が挙げられ、Ｘ５はＯ又はＮＲ２７であり、Ｒ２７の好ましい実施形態は上に定義される通りである。（Ｑ１６）の芳香環は、１つ又は複数の位置で、好ましくは２つの位置で、最も好ましくは（Ｑ３７）によって、任意選択でＯ－スルホニル化されており、（Ｑ１７）及び（Ｑ１８）の環は、１つ又は複数の位置でハロゲン化され得る。特に好ましいシクロオクチニル基は、任意選択で置換されている、ビシクロ［６．１．０］ノナ－４－イン－９－イル］基（ＢＣＮ基）である。好ましくは、ビシクロ［６．１．０］ノナ－４－イン－９－イル］基が以下に示される構造（Ｑ２０）によるものである。一実施形態では、Ｑがビシクロノニン（ＢＣＮ）、アザジベンゾシクロオクチン（ＤＩＢＡＣ／ＤＢＣＯ）、ジベンゾシクロオクチン（ＤＩＢＯ）又はスルホニル化ジベンゾシクロオクチン（ｓ－ＤＩＢＯ）、より好ましくはＢＣＮ又はＤＩＢＡＣ／ＤＢＣＯ、最も好ましくはＢＣＮである。
［０２３１］この態様による化合物は、理想的には、本発明による抗体－ペイロードコンジュゲートの調製における中間体として適している。
用途
［０２３２］本発明によるコンジュゲートは、がんの処置において特に適している。よって、本発明は、医薬品における本発明によるコンジュゲートの使用にさらに関する。さらなる態様では、本発明はまた、それを必要とする対象を処置する方法であって、本発明によるコンジュゲートを対象に投与するステップを含む方法に関する。この態様による方法は、処置に使用するための本発明によるコンジュゲートと言い表すこともできる。この態様による方法は、医薬品を製造するための本発明によるコンジュゲートの使用と言い表すこともできる。本明細書において、投与は、治療上有効量の本発明によるコンジュゲートを用いて典型的に行われる。
［０２３３］本発明は、それを必要とする対象の特定の疾患を処置する方法であって、上に定義される本発明によるコンジュゲートを投与するステップを含む方法にさらに関する。特定の疾患は、がん、ウイルス感染症、細菌感染症、神経学的疾患、自己免疫疾患、眼疾患、高コレステロール血症及びアミロイドーシス、より好ましくはがん及びウイルス感染症から選択され得、最も好ましくは疾患が、がんである。それを必要とする対象は、典型的にはがん患者である。本発明によるコンジュゲートの使用は、このような処置において、特にがん処置の分野において周知であり、本発明によるコンジュゲートはこの点で特に適している。この態様による方法では、コンジュゲートが、治療上有効量で典型的に投与される。本発明の本態様は、それを必要とする対象の特定の疾患の処置に使用するための、好ましくはがんを処置するための、本発明によるコンジュゲートと言い表すこともできる。換言すれば、この態様は、それを必要とする対象の特定の疾患の処置に使用するための、好ましくはがんの処置に使用するための医薬品又は医薬組成物を調製するための、本発明によるコンジュゲートの使用に関する。
［０２３４］本発明によるコンジュゲートがＦｃサイレントである、すなわち、臨床的に使用した場合に、Ｆｃガンマ受容体ＣＤ１６、ＣＤ３２及びＣＤ６４に有意には結合しないことが好ましい。これは、Ｇが非存在である、すなわち、ｅ＝０である場合である。
［０２３５］本発明の文脈における投与は全身投与を指す。したがって、一実施形態では、本明細書に定義される方法がコンジュゲートの全身投与のためのものである。コンジュゲートの特異性に照らして、コンジュゲートを全身投与することができるが、それでもこれらの抗体は目的の組織（例えば、腫瘍）で又はその近くで活性を及ぼすことができる。全身投与は、薬物が画像化技術で検出可能ではない腫瘍転移にも到達することができ、血液腫瘍に適用可能であり得るので、局所投与と比較して大きな利点を有する。
［０２３６］本発明は、本発明による抗体－ペイロードコンジュゲートと薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物にさらに関する。
本発明を以下の実施例によって例示する。
一般的手順
化学物質は、一般的に使用される供給業者（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａｃｒｏｓ、Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ、Ｆｌｕｏｒｏｃｈｅｍ、Ａｐｏｌｌｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｌｔｄ及びＴＣＩ）から購入し、さらに精製することなく使用した。化学的変換、後処理及びクロマトグラフィーのための溶媒（脱水溶媒を含む）は、ＨＰＬＣグレードでＡｌｄｒｉｃｈ（英国、ドーセット）から購入し、さらに蒸留することなく使用した。シリカゲル６０ Ｆ２５４分析用薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）プレートは、Ｍｅｒｃｋ（ドイツ、ダルムシュタット）製のものとし、ＵＶ光下で、過マンガン酸カリウム染色又はアニスアルデヒド染色を用いて可視化した。クロマトグラフィー精製は、Ｂｕｃｈｉ Ｓｅｐａｃｏｒｅ Ｃ６６０フラクションコレクター（スイス、フラヴィル）と組み合わせたＡｃｒｏｓシリカゲル（０．０６～０．２００、６０Ａ）又は充填済カラム（Ｓｉｌｉｃｙｃｌｅ）を使用して実施した。逆相ＨＰＬＣ精製は、Ｗａｔｅｒｓ Ｘｂｒｉｄｇｅ Ｃ１８カラム（５μｍ ＯＢＤ、３０×１００ｍｍ、ＰＮ１８６００２９８２）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ １２００システムを使用して実施した。ＮＭＲ分光法に使用される重水素化溶媒は、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した。Ｈ－Ｖａｌ－Ａｌａ－ＰＡＢＣ－ＭＭＡＦ．ＴＦＡはＬｅｖｅｎａ Ｂｉｏｐｈａｒｍから入手し、ビス－ｍａｌ－Ｌｙｓ－ＰＥＧ４－ＴＦＰエステル（１７７）はＱｕａｎｔａ Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎから入手し、Ｏ－（２－アミノエチル）－Ｏ’－（２－アジドエチル）ジエチレングリコール（ＸＬ０７）並びに化合物３４４及び１７９はＢｒｏａｄｐｈａｒｍから入手し、２，３－ビス（ブロモメチル）－６－キノキサリンカルボン酸（１７８）はＣｈｅｍＳｃｅｎｅから入手し、３２－アジド－５－オキソ－３，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７，３０－ノナオキサ－６－アザドトリアコンタン酸（３４８）はＣａｒｂｏｓｙｎｔｈから入手した。
モノクローナル抗体及びＡＤＣの質量スペクトル分析の一般的手順
質量スペクトル分析の前に、ＩｇＧを、Ｆｃ／２フラグメントの分析のためにＩｄｅＳ（ファブリケーター（Ｆａｂｒｉｃａｔｏｒ）（商標））で処理した。２０μｇの（修飾）ＩｇＧの溶液を、総体積１０μＬでリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ６．６中０．５μＬのＩｄｅＳ（５０Ｕ／μＬ）と共に３７℃で１時間インキュベートした。試料を４０μＬに希釈し、引き続いてＪＥＯＬ ＡｃｃｕＴＯＦでエレクトロスプレーイオン化飛行時間（ＥＳＩ－ＴＯＦ）分析をした。Ｍａｇｔｒａｎソフトウェアを使用して、デコンボリューションスペクトルを得た。
分析ＲＰ－ＨＰＬＣの一般的手順
ＲＰ－ＨＰＬＣ分析の前に、ＩｇＧを、Ｆｃ／２フラグメントの分析を可能にするＩｄｅＳで処理した。（修飾）ＩｇＧの溶液（１００μＬ、ＰＢＳ ｐＨ７．４中１ｍｇ／ｍＬ）を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ６．６中１．５μＬのＩｄｅＳ／ファブリケーター（商標）（５０Ｕ／μＬ）と共に３７℃で１時間インキュベートした。４９％アセトニトリル、４９％水、２％ギ酸（１００μＬ）を添加することによって、反応物をクエンチした。ＲＰ－ＨＰＬＣ分析をＡｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズ（Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ）で実施した。試料（１０μＬ）を、０．５ｍＬ／分で、カラム温度７０℃のＺＯＲＢＡＸ Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ ３００ＳＢ－Ｃ８カラム（１×７５ｍｍ、５μｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ）に注入した。線形勾配を３０～５４％アセトニトリル及び０．１％ＴＦＡ中水で２５分間適用した。
分析ＨＰＬＣ－ＳＥＣの一般的手順
ＨＰＬＣ－ＳＥＣ分析をＡｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズ（Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ）で実施した。試料（４μＬ、１ｍｇ／ｍＬ）を、０．８６ｍＬ／分で、Ｘｂｒｉｄｇｅ ＢＥＨ２００Ａ（３．５μＭ、７．８×３００ｍｍ、ＰＮ１８６００７６４０ Ｗａｔｅｒｓ）カラムに注入した。０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．９（ＮａＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４）を使用したアイソクラティック溶出を１６分間実施した。
実施例１．化合物１０２の合成
Figure 2023511857000030
４－ニトロフェニルクロロホルメート（３０．５ｇ、１５１ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（５００ｍＬ）中冷却（０℃）溶液に、ピリジン（２４．２ｍＬ、２３．７ｇ、２９９ｍｍｏｌ）を添加した。ＢＣＮ－ＯＨ（１０１、１８．０ｇ、１２０ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（２００ｍＬ）中溶液を反応混合物に滴加した。添加が完了した後、ＮＨ４Ｃｌの飽和水溶液（５００ｍＬ）及び水（２００ｍＬ）を添加した。分離後、水相をＤＣＭ（２×５００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機相を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮した。粗物質をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製すると、所望の生成物１０２が灰白色固体（１８．７ｇ、５９ｍｍｏｌ、３９％）として得られた。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ （ｐｐｍ） ８．３２－８．２３ （ｍ， ２Ｈ）， ７．４５－７．３４ （ｍ， ２Ｈ）， ４．４０ （ｄ， Ｊ ＝ ８．３ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．４０－２．１８ （ｍ， ６Ｈ）， １．６９－ １．５４ （ｍ， ２Ｈ）， １．５１ （五重線， Ｊ ＝ ９．０ Ｈｚ， １Ｈ）， １．１２－１．００ （ｍ， ２Ｈ）
Figure 2023511857000031
実施例２．化合物１０４の合成
アジド－ＰＥＧ１１－アミン（１０３）（１８２ｍｇ、０．３１９ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（３ｍＬ）中冷却溶液（－５℃）に、１０％ ＮａＨＣＯ３水溶液（１．５ｍＬ）及びＴＨＦ（２ｍＬ）に溶解した９－フルオレニルメトキシカルボニルクロリド（９９ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ）を添加した。２時間後、ＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ）を添加し、混合物をブライン（２×６ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中０→１１％ＭｅＯＨ）による精製によって、１０４が透明な油として収率９８％（２５１ｍｇ、０．３１６ｍｍｏｌ）で得られた。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ３９Ｈ６０Ｎ４Ｏ１３ ＋ （Ｍ＋Ｎａ＋）の計算値８１５．４２ 実測値８１５．５３．
実施例３．化合物１０５の合成
１０４（４８ｍｇ、０．０６０ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（３ｍＬ）及び水（０．２ｍＬ）中溶液を調製し、０℃まで冷却した。トリメチルホスフィン（トルエン中１Ｍ、０．２４ｍＬ、０．２４ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を２３時間攪拌したままにした。水をＤＣＭ（６ｍＬ）による抽出を介して除去した。この溶液に、（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）－ビシクロ［６．１．０］ノナ－４－イン－９－イルメチル（４－ニトロフェニル）カーボネート（１０２）（２５ｍｇ、０．０７９ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（１０μＬ、０．０７０ｍｍｏｌ）を添加した。２７時間後、混合物を濃縮し、残渣をＤＭＦ（３ｍＬ）に溶解し、引き続いてピペリジン（４００μＬ）を添加した。１時間後、混合物を濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中０→２１％ＭｅＯＨ）によって精製すると、１０５が無色油（８．３ｍｇ、０．００９２ｍｍｏｌ）として得られた。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ４６Ｈ７６Ｎ２Ｏ１５ ＋ （Ｍ＋ＮＨ４ ＋）の計算値９１４．５２ 実測値９１４．７３．
Figure 2023511857000032
実施例４．化合物１０７の合成
（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）－ビシクロ［６．１．０］ノナ－４－イン－９－イルメチル（４－ニトロフェニル）カーボネート（１０２）（４．１ｍｇ、０．０１３ｍｍｏｌ）の脱水ＤＣＭ（５００μＬ）中溶液を、アミノ－ＰＥＧ２３－アミン（１０６）（１２．３ｍｇ、０．０１１４ｍｍｏｌ）の脱水ＤＣＭ（５００μＬ）中溶液にゆっくり添加した。２０時間後、混合物を濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中０→２５％ＭｅＯＨ）によって精製すると、所望の化合物１０７が収率７３％（１２ｍｇ、０．００８０ｍｍｏｌ）で得られた。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ７０Ｈ１２４Ｎ２Ｏ２７ ＋ （Ｍ＋ ＮＨ４ ＋）の計算値１４４３．７３ 実測値１４４４．０８．
Figure 2023511857000033
実施例５．化合物１０８の合成
ＢＣＮ－ＯＨ（１０１、２１．０ｇ、０．１４ｍｏｌ）のＭｅＣＮ（４５０ｍＬ）中溶液に、ジスクシンイミジルカーボネート（５３．８ｇ、０．２１ｍｏｌ）及びトリエチルアミン（５８．５ｍＬ、０．４２ｍｏｌ）を添加した。混合物を１４０分間攪拌した後、これを真空中で濃縮し、残渣をＭｅＣＮ（４００ｍＬ）と１回共蒸発させた。残渣をＥｔＯＡｃ（６００ｍＬ）に溶解し、Ｈ２Ｏ（３×２００ｍＬ）で洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、真空中で濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中０→４％ＥｔＯＡｃ）によって精製すると、１０８（１１．２ｇ、３８．４ｍｍｏｌ、収率２７％）が白色固体として得られた。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ （ｐｐｍ） ４．４５ （ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ）， ２．８５ （ｓ， ４Ｈ）， ２．３８－ ２．１８ （ｍ， ６Ｈ）， １．６５－ １．４４ （ｍ， ３Ｈ）， １．１２－１．００ （ｍ， ２Ｈ）．
実施例６．化合物１１０の合成
（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）－ビシクロ［６．１．０］ノナ－４－イン－９－イルメチルＮ－スクシンイミジルカーボネート（１０８）（５００ｍｇ、１．７１ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（１５ｍＬ）中溶液に、トリエチルアミン（７１８μＬ、５．１４ｍｍｏｌ）及びモノ－Ｆｍｏｃエチレンジアミン塩酸塩（１０９）（６５７ｍｇ、２．０６ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を４５分間攪拌し、ＥｔＯＡｃ（１５０ｍＬ）で希釈し、５０％飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液（５０ｍＬ）で洗浄した。水層をＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）で抽出し、合わせた有機層をＨ２Ｏ（１０ｍＬ）で洗浄した。合わせた有機抽出物を真空中で濃縮し、残渣の半分をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中０→３％ＭｅＯＨ）によって精製すると、所望の化合物１１０が収率４２％（３３２ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）で得られた。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ （ｐｐｍ） ７．７７ （ｄ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．５９ （ｄ， Ｊ ＝ ７．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．４４－７．３７ （ｍ， ２Ｈ）， ７．３６－７．２８ （ｍ， ２Ｈ）， ５．１２ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ４．９７ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ４４．４１ （ｄ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ４．２１ （ｔ， Ｊ ＝ ６．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．１３ （ｄ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．３３ （ｂｒ ｓ， ４Ｈ）， ２．３６－２．０９ （ｍ， ６Ｈ）， １．６７－１．４５ （ｍ， ２Ｈ）， １．３３ （五重線， Ｊ ＝ ８．６ Ｈｚ， １Ｈ）， １．０１－ ０．８５ （ｍ， ２Ｈ）． ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ２８Ｈ３１Ｎ２Ｏ４ ＋ （Ｍ＋ Ｈ＋）の計算値４５９．２３ 実測値４５９．５２．
実施例７．化合物１１１の合成
化合物１１０（３２７ｍｇ、０．７１３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（６ｍＬ）に溶解し、ピペリジン（０．５ｍＬ）を添加した。２時間後、混合物を濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中０→３２％ ０．７Ｎ ＮＨ３ ＭｅＯＨ）によって精製すると、所望の化合物１１１が黄色油（１２８ｍｇ、０．５４２ｍｍｏｌ、７６％）として得られた。１Ｈ－ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ （ｐｐｍ， 回転異性体） ５．２ （ｂｓ， １Ｈ）， ４．１５ （ｄ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．４８－３．４０ （ｍ， ２／３Ｈ）， ３．３３－３．２７ （ｍ， ２／３Ｈ）， ３．２７－３．１９ （ｍ， １１／３Ｈ）， ２．８５－２．８０ （ｍ， １１／３Ｈ）， ２．３６－２．１７ （ｍ， ６Ｈ）， １．６７－１．５０ （ｍ， ２Ｈ）， １．３６ （五重線， Ｊ ＝ ８．５ Ｈｚ， １Ｈ）， １．０１－０．８９ （ｍ， ２Ｈ）
Figure 2023511857000034
実施例８．化合物１１４の合成
ジエタノールアミン（１１２）（２０８ｍｇ、１．９８ｍｍｏｌ）の水（２０ｍＬ）中溶液に、ＭｅＣＮ（２０ｍＬ）、ＮａＨＣＯ３（２５０ｍｇ、２．９７ｍｍｏｌ）及びＦｍｏｃ－ＯＳｕ（１１３）（６０１ｍｇ、１．７８ｍｍｏｌ）のＭｅＣＮ（２０ｍＬ）中溶液を添加した。混合物を２時間攪拌し、ＤＣＭ（５０ｍＬ）を添加した。分離後、有機相を水（２０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮した。所望の生成物１１４が無色の濃厚な油（５７３ｍｇ、１．７５ｍｍｏｌ、９８％）として得られた。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ （ｐｐｍ） ７．７９－７．７４ （ｍ， ２Ｈ）， ７．６０－７．５４ （ｍ， ２Ｈ）， ７．４４－７．３７ （ｍ， ２Ｈ）， ７．３６－７．３０ （ｍ， ２Ｈ）， ４．５８ （ｄ， Ｊ ＝ ５．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ４．２３ （ｔ， Ｊ ＝ ５．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．８２－３．７２ （ｍ， ２Ｈ）， ３．４８－３．３３ （ｍ， ４Ｈ）， ３．２５－３．１１ （ｍ， ２Ｈ）．
実施例９．化合物１１６の合成
１１４（５６７ｍｇ、１．７３ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（５０ｍＬ）中溶液に、４－ニトロフェニルクロロホルメート（１１５）（７６８ｍｇ、３．８１ｍｍｏｌ）及びＥｔ３Ｎ（１．２ｍＬ、８７５ｍｇ）を添加した。混合物を１８時間攪拌し、濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ＤＣＭ中０％→１０％ＭｅＯＨ、次いで、ヘプタン中２０％→７０％ＥｔＯＡｃ）によって精製すると、所望の生成物１１６ ３２ｍｇ（４９μｍｏｌ、２．８％）が得られた。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ （ｐｐｍ） ８．３１－８．２０ （ｍ， ４Ｈ）， ７．８０－７．７４ （ｍ， ２Ｈ）， ７．５９－７．５４ （ｍ， ２Ｈ）， ７．４４－７．３７ （ｍ， ２Ｈ）， ７．３７－７．２９ （ｍ， ６Ｈ）， ４．６１ （ｄ， Ｊ ＝ ５．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ４．３９ （ｔ， Ｊ ＝ ５．１ Ｈｚ， ２Ｈ）， ４．２５ （ｔ， Ｊ ＝ ５．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．０２ （ｔ， Ｊ ＝ ５．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．６７ （ｔ， Ｊ ＝ ４．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．４５ （ｔ， Ｊ ＝ ５．２ Ｈｚ， ２Ｈ）．
Figure 2023511857000035
実施例１０．化合物１１７の合成
１１６（３４ｍｇ、０．０５０ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（２ｍＬ）中溶液に、１１１（４９ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（２０μＬ、０．１４ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で一晩攪拌したままにした。２３時間後、混合物を濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中０→４０％ＭｅＯＨ）による精製によって、１１７が白色固体として収率６１％（２７ｍｇ、０．０３１ｍｍｏｌ）で得られた。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ４７Ｈ５７Ｎ５Ｏ１０ ＋ （Ｍ＋Ｈ＋）の計算値８５１．４１ 実測値８５２．４９．
実施例１１．化合物１１８の合成
化合物１１８は１１７の調製中に得られた（３．８ｍｇ、０．００６０ｍｍｏｌ）。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ３２Ｈ４７Ｎ５Ｏ８ ＋ （Ｍ＋Ｈ＋）の計算値６２９．３４ 実測値６３０．５４．
Figure 2023511857000036
実施例１２．化合物１２１の合成
ジエチレントリアミン（１１９）（７３μＬ、０．６７ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（２８３μＬ、２．０３ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（６ｍＬ）中溶液を－５℃まで冷却し、窒素雰囲気下に置いた。２－（Ｂｏｃ－オキシイミノ）－２－フェニルアセトニトリル（１２０）（３３４ｍｇ、１．３５ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（４ｍＬ）に溶解し、冷却した溶液にゆっくり添加した。２．５時間後、氷浴を除去し、混合物を室温でさらに２．５時間攪拌し、真空中で濃縮した。残渣をＤＣＭ（１５ｍＬ）に再溶解し、５％ ＮａＯＨ水溶液（２×５ｍＬ）、ブライン（２×５ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させた。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中０→１４％ＭｅＯＨ）による精製によって、１２１が無色油として収率９１％（１８５ｍｇ、０．６１０ｍｍｏｌ）で得られた。１Ｈ－ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ （ｐｐｍ） ５．０８ （ｓ， ２Ｈ）， ３．３０－３．１２ （ｍ， ４Ｈ）， ２．７４ （ｔ， Ｊ ＝ ５．９ Ｈｚ， ４Ｈ）， １．４５ （ｓ， １８Ｈ）．
実施例１３．化合物１２３の合成
１２１（３３．５ｍｇ、０．１１０ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（２ｍＬ）中冷却溶液（－１０℃）に、１０％ ＮａＨＣＯ３水溶液（５００μＬ）及びＴＨＦ（１ｍＬ）に溶解した９－フルオレニルメトキシカルボニルクロリド（１２２）（３４ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）を添加した。１時間後、混合物を濃縮し、残渣をＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）に再溶解し、ブライン（２×５ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中０→５０％ＭｅＯＨ）による精製によって、１２３が収率８６％（５０ｍｇ、０．０９０ｍｍｏｌ）で得られた。１Ｈ－ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ （ｐｐｍ） ７．７７ （ｄ， Ｊ ＝ ７．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．５７ （ｄ， Ｊ ＝ ７．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．４３－７．３８ （ｍ， ２Ｈ）， ７．３６－７．３１ （ｍ， ２Ｈ）， ５．５７ （ｄ， Ｊ ＝ ５．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， ４．２３ （ｔ， Ｊ ＝ ５．１ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．４０－２．８３ （ｍ， ８Ｈ）， １．４１ （ｓ， １８Ｈ）．
Figure 2023511857000037
実施例１４．化合物１２４の合成
１２３（５０ｍｇ、０．０９５ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（３ｍＬ）中溶液に、ジオキサン中４Ｍ ＨＣｌ（２００μＬ）を添加した。混合物を１９時間攪拌し、濃縮すると、白色固体が得られた（３５ｍｇ）。精製することなく、脱保護中間体及び（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）－ビシクロ［６．１．０］ノナ－４－イン－９－イルメチル（４－ニトロフェニル）カーボネート（１０２）（７０ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（３ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（３４μＬ、０．２４ｍｍｏｌ）を添加した。２時間後、混合物を濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中０→２５％ＭｅＯＨ）によって精製すると、１２４が４８％（３１ｍｇ、０．０４５ｍｍｏｌ）で得られた。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ４１Ｈ４７Ｎ３Ｏ６ ＋ （Ｍ＋Ｈ＋）の計算値６７７．３５ 実測値６７８．５７．
実施例１５．化合物１２５の合成
１２４（１０ｍｇ、０．０１４ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（５００μＬ）中溶液に、ピペリジン（２０μＬ）を添加した。３．５時間後、混合物を濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中０→２０％ＭｅＯＨ）による精製によって、１２５が収率５８％（３．７ｍｇ、０．００８０ｍｍｏｌ）で得られた。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ２６Ｈ３７Ｎ３Ｏ４ ＋ （Ｍ＋Ｈ＋）の計算値４５５．２８ 実測値４５６．４１．
Figure 2023511857000038
実施例１６．化合物１２７及び１２８の合成
ジエチレングリコール（１２６）（４４６μＬ、０．５０ｇ、４．７１ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（２０ｍＬ）中溶液に、４－ニトロフェノールクロロホルメート（１１５）（１．４ｇ、７．０７ｍｍｏｌ）及びＥｔ３Ｎ（３．３ｍＬ、２．４ｇ、２３．６ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を攪拌し、濾過し、真空中（５５℃で）濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘプタン中１５％→７５％ＥｔＯＡｃ）によって精製し、２種類の生成物を単離した。生成物１２７が白色固体（５１１ｍｇ、１．１７ｍｍｏｌ、２５％）として得られた。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ （ｐｐｍ） ８．３１－ ８．２３ （ｍ， ４Ｈ）， ７．４３－７．３４ （ｍ， ４Ｈ）， ４．５４－４．４４ （ｍ， ４Ｈ）， ３．９１－３．８３ （ｍ， ４Ｈ）．生成物１２８が無色油（３２１ｍｇ、１．１８ｍｍｏｌ、２５％）として得られた。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ （ｐｐｍ） ８．３２－８．２４ （ｍ， ２Ｈ）， ７．４３－７．３６ （ｍ， ２Ｈ）， ４．５０－４．４４ （ｍ， ２Ｈ）， ３．８６－３．８０ （ｍ， ２Ｈ）， ３．８１－３．７４ （ｍ， ２Ｈ）， ３．６９－３．６４ （ｍ， ２Ｈ）．
Figure 2023511857000039
実施例１７．化合物１３１の合成
１１８（２．３ｍｇ、３．７μｍｏｌ）のＤＭＦ（２９５μＬ）中溶液に、１２７（３．２ｍｇ、７．４μｍｏｌ）のＤＭＦ（６５μＬ）中溶液及びＥｔ３Ｎ（１．６μＬ、１．１ｍｇ、１１．１μｍｏｌ）を添加した。混合物を１７時間静置し、ＨＯＢｔ（０．５ｍｇ、３．７μｍｏｌ）のＤＭＦ（１４μＬ）中溶液を添加した。４時間後、Ｅｔ３Ｎ（５．２μＬ、３．８ｍｇ、３７μｍｏｌ）及びｖｃ－ＰＡＢＣ－ＭＭＡＥ．ＴＦＡ（１３０、１３．８ｍｇ、１１μｍｏｌ）のＤＭＦ（２７６μＬ）中溶液を添加した。３日後、混合物をＲＰ ＨＰＬＣ（Ｃ１８、水（１％ＡｃＯＨ）中３０％→９０％ＭｅＣＮ（１％ＡｃＯＨ））によって精製した。所望の生成物１３１が無色フィルム（１．５ｍｇ、０．７８μｍｏｌ、２１％）として得られた。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ９６Ｈ１４８Ｎ１５Ｏ２５ ＋ （Ｍ＋Ｈ＋）の計算値１９１１．０８ 実測値１９１２．０８．
Figure 2023511857000040
実施例１８．化合物１３２の合成
１２１（１６８ｍｇ、０．５５４ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（２ｍＬ）中溶液に、１２８（２４０ｍｇ、０．８９ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（１ｍＬ）中溶液、ＤＣＭ（１ｍＬ）及びＥｔ３Ｎ（１６９ｍｇ、２３３μＬ）を添加した。混合物を１７時間攪拌し、濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー（ヘプタン中ＥｔＯＡｃの勾配）によって精製した。所望の生成物１３２がわずかに黄色の油（８５ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ、３５％）として得られた。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ （ｐｐｍ） ５．２４－５．０２ （ｍ， ２Ｈ）， ４．３６－４．２０ （ｍ， ３Ｈ）， ３．８４－３．６７ （ｍ， ４Ｈ）， ３．６５－３．５８ （ｍ， ２Ｈ）， ３．４７－３．３４ （ｍ， ４Ｈ）， ３．３４－３．１８ （ｍ， ４Ｈ）， １．４４ （ｂｓ， １８Ｈ）．
実施例１９．化合物１３４の合成
１３２（８１ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（３ｍＬ）中溶液に、ジオキサン中４Ｎ ＨＣｌ（７００μＬ）を添加した。混合物を１９時間攪拌し、濃縮し、残渣をＤＭＦ（０．５ｍＬ）に溶解した。Ｅｔ３Ｎ（１３２μＬ、９６ｍｇ、０．９５ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（０．５ｍＬ）及び（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）－ビシクロ［６．１．０］ノナ－４－イン－９－イルメチル（４－ニトロフェニル）カーボネート（１０２）（１３２ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）を添加し、得られた混合物を２時間攪拌した。混合物を濃縮し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ＤＣＭ中０％→３％ＭｅＯＨ）によって精製した。所望の生成物１３４が無色フィルム（６４ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ、５７％）として得られた。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ （ｐｐｍ） ４．３１－４．２３ （ｍ， ２Ｈ）， ４．２２－４．０８ （ｍ， ４Ｈ）， ３．８０－３．６８ （ｍ， ４Ｈ）， ３．６６－３．５８ （ｍ， ２Ｈ）， ３．５０－３．２８ （ｍ， ８Ｈ）， ２．８０－２．６５ （ｍ， １Ｈ）， ２．４０－２．１０ （ｍ， １２Ｈ）， １．６８－１．４８ （ｍ， ４Ｈ）， １．３５ （五重線， Ｊ ＝ ８．１ Ｈｚ， １Ｈ）， １．０２－０．８７ （ｍ， ２Ｈ）． ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ３１Ｈ４６Ｎ３Ｏ８ ＋ （Ｍ＋Ｈ＋）の計算値５８８．３３ 実測値５８８．４３．
Figure 2023511857000041
実施例２０．化合物１３７の合成
１３４（６３ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（１ｍＬ）中溶液に、ビス（４－ニトロフェニル）カーボネート（３５）（３２．６ｍｇ、０．１０７ｍｍｏｌ）及びＥｔ３Ｎ（３２．５ｍｇ、４５μＬ、０．３２ｍｍｏｌ）を添加した。２時間後、７７μＬを主反応混合物から除去し、ｖｃ－ＰＡＢＣ－ＭＭＡＥ．ＴＦＡ（１３０、１０ｍｇ、８．１μｍｏｌ）のＤＭＦ（２００μＬ）中溶液及びＥｔ３Ｎ（３．４μＬ、２．５ｍｇ、２４μｍｏｌ）を添加した。１８時間後、２，２’－（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）（４．９μＬ、５．０ｍｇ、３４μｍｏｌ）を添加し、混合物を４５分間静置した。混合物をＲＰ ＨＰＬＣ（Ｃ１８、水（１％ＡｃＯＨ）中３０％→９０％ＭｅＣＮ（１％ＡｃＯＨ））によって精製した。所望の生成物１３７が無色フィルム（８．７ｍｇ、５．０μｍｏｌ、６１％）として得られた。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ９０Ｈ１３８Ｎ１３Ｏ２１ ＋ （Ｍ＋Ｈ＋）の計算値１７３７．０１ 実測値１７３８．０１．
Figure 2023511857000042
実施例２１．化合物１３９の合成
１３４（６３ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（１ｍＬ）中溶液に、ビス（４－ニトロフェニル）カーボネート（３５）（３２．６ｍｇ、０．１０７ｍｍｏｌ）及びＥｔ３Ｎ（３２．５ｍｇ、４５μＬ、０．３２ｍｍｏｌ）を添加した。２０時間後、７７μＬを主反応混合物から除去し、ｖｃ－ＰＡＢＣ－ＭＭＡＦ．ＴＦＡ（１３８、９．６ｍｇ、８．２μｍｏｌ）のＤＭＦ（２４０μＬ）中溶液及びＥｔ３Ｎ（３．４μＬ、２．５ｍｇ、２４μｍｏｌ）を添加した。３時間後、２，２’－（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）（２０μＬ、２０ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を２０分間静置した。混合物をＲＰ ＨＰＬＣ（Ｃ１８、水（１％ＡｃＯＨ）中３０％→９０％ＭｅＣＮ（１％ＡｃＯＨ））によって精製した。所望の生成物１３９が無色フィルム（５．３ｍｇ、３．２μｍｏｌ、３９％）として得られた。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ８７Ｈ１３０Ｎ１１Ｏ２１ ＋ （Ｍ＋Ｈ＋）の計算値１６６４．９４ 実測値１６６５．９９．
Figure 2023511857000043
実施例２２．化合物１４１の合成
（１Ｒ，８Ｓ，９Ｓ）－ビシクロ［６．１．０］ノナ－４－イン－９－イルメチルＮ－スクシンイミジルカーボネート（１０８）（１６．３５ｇ、５６．１３ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（４００ｍｌ）中溶液に、２－（２－アミノエトキシ）エタノール（１４０）（６．７６ｍｌ、６７．３５ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（２３．４７ｍｌ、１６８．３９ｍｍｏｌ）を添加した。得られた淡黄色溶液を室温で９０分間攪拌した。混合物を真空中で濃縮し、残渣をアセトニトリル（４００ｍＬ）と１回共蒸発させた。得られた油をＥｔＯＡｃ（４００ｍＬ）に溶解し、Ｈ２Ｏ（３×２００ｍＬ）で洗浄した。有機層を真空中で濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘプタン中５０％→８８％ＥｔＯＡｃ）によって精製すると、１４１（１１．２ｇ、３９．８１ｍｍｏｌ、収率７１％）が淡黄色油として得られた。１Ｈ－ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ （ｐｐｍ） ５．０１ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ４．１７ （ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ １２．０ Ｈｚ）， ３．７９－３．６８ （ｍ， ２Ｈ）， ３．６４－３．５０ （ｍ， ４Ｈ）， ３．４７－３．３０ （ｍ， ２Ｈ）， ２．３６－２．１４ （ｍ， ６Ｈ）， １．９３ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， １．６８－ １．４９ （ｍ， ２Ｈ）， １．３７ （五重線， １Ｈ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ）， １．０１－０．８９ （ｍ， ２Ｈ）．
実施例２３．化合物１４２の合成
１４１（６６３ｍｇ、２．３６ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（１５ｍＬ）中溶液に、トリエチルアミン（９８６μＬ、７．０７ｍｍｏｌ）及び４－ニトロフェニルクロロホルメート（１１５）（７１２ｍｇ、３．５３ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を４時間攪拌し、真空中で濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘプタン中０→２０％ＥｔＯＡｃ）による精製によって、１４２（４００ｍｇ、０．９ｍｍｏｌ、収率３８％）が淡黄色油として得られた。１Ｈ－ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ （ｐｐｍ） ８．２９ （ｄ， Ｊ ＝ ９．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．４０ （ｄ， Ｊ ＝ ９．３ Ｈｚ， ２Ｈ）， ５．０５ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ４．４８－４．４１ （ｍ， ２Ｈ）， ４．１６ （ｄ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．８１－３．７５ （ｍ， ２Ｈ）， ３．６１ （ｔ， Ｊ ＝ ５．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．４２ （ｑ， Ｊ ＝ ５．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．３５－２．１６ （ｍ， ６Ｈ）， １．６６－１．５０ （ｍ， ２Ｈ）， １．３５ （五重線， Ｊ ＝ ８．６ Ｈｚ， １Ｈ）， １．０２－０．８８ （ｍ， ２Ｈ）． ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ２２Ｈ２６Ｎ２ＮａＯ８ ＋ （Ｍ＋Ｎａ＋）の計算値４６９．１６ 実測値４６９．３６．
Figure 2023511857000044
実施例２４．化合物１４３の合成
１４２（２．７ｍｇ、６．０μｍｏｌ）のＤＭＦ（４８μＬ）中溶液及びＥｔ３Ｎ（２．１μＬ、１．５ｍｇ、１５μｍｏｌ）を１２５（２．３ｍｇ、５．０μｍｏｌ）のＤＭＦ（０．３２ｍＬ）中溶液に添加した。混合物を４日間静置し、ＤＭＦ（１００μＬ）で希釈し、ＲＰ ＨＰＬＣ（Ｃ１８、水（１％ＡｃＯＨ）中３０％→１００％ＭｅＣＮ（１％ＡｃＯＨ））によって精製した。生成物１４３が無色フィルム（２．８ｍｇ、３．７μｍｏｌ、７４％）として得られた。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ４２Ｈ５９Ｎ４Ｏ９ ＋ （Ｍ＋Ｈ＋）の計算値７６３．４３ 実測値７６３．５３．
Figure 2023511857000045
実施例２５．化合物１４５の合成
１２８（２００ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（１ｍＬ）中溶液に、トリエチルアミン（４１．６μＬ、０．３０ｍｍｏｌ）及びトリス（２－アミノエチル）アミン１４４（１４．９μＬ、０．１０ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を１５０分間攪拌した後、混合物を真空中で濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中２５％→１００％ＥｔＯＡｃ、次いで、ＤＣＭ中０％→１０％ＭｅＯＨ）によって精製すると、１４５が収率４３％（４５．４ｍｇ、４２．５μｍｏｌ）で黄色油として得られた。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ （ｐｐｍ） ５．６８－５．１８ （ｍ， ６Ｈ）， ４．３２－４．１８ （ｍ， ６Ｈ）， ４．１８－４．１１ （ｄ， Ｊ ＝ ７．９ Ｈｚ， ６Ｈ）， ３．７４－３．６１ （ｍ， ６Ｈ）， ３．６１－３．５１ （ｍ， ６Ｈ）， ３．４３－ ３．２９ （ｍ， ６Ｈ）， ３．２９－３．１５ （ｍ， ６Ｈ）， ２．６５－２．４７ （ｍ， ６Ｈ）， ２．３７－２．１６ （ｍ， １８Ｈ）， １．６９－１．４９ （ｍ， ６Ｈ）， １．３５ （五重線， Ｊ ＝ ８．９ Ｈｚ， ３Ｈ）， １．０３－０．８７ （ｍ， ６Ｈ）．
Figure 2023511857000046
実施例２６．化合物１４８の合成
ＢＣＮ－ＯＨ（１０１）（３．０ｇ、２０ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（３００ｍＬ）中溶液に、ＣＳＩ（１４６）（１．７４ｍＬ、２．８３ｇ、２０ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を１５分間攪拌した後、Ｅｔ３Ｎ（５．６ｍＬ、４．０ｇ、４０ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を５分間攪拌し、２－（２－アミノエトキシ）エタノール（１４７）（２．２ｍＬ、２．３ｇ、２２ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を１５分間攪拌し、飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液（３００ｍＬ）を添加した。層を分離し、水相をＤＣＭ（２００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ＤＣＭ中０％～１０％ＭｅＯＨ）によって精製した。所望の生成物を含有する画分を濃縮した。残渣をＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）に溶解し、濃縮した。所望の生成物１４８がわずかに黄色の油（４．２４ｇ、１１．８ｍｍｏｌ、５９％）として得られた。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ （ｐｐｍ） ５．９９－５．７９ （ｂｓ， １Ｈ）， ４．２９ （ｄ， Ｊ ＝ ８．３ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．７８－３．７４ （ｍ， ２Ｈ）， ３．６６－３．５６ （ｍ， ４Ｈ）， ３．３７－３．３０ （ｍ， ２Ｈ）， ２．３６－２．１６ （ｍ， ６Ｈ）， １．６３－１．４９ （ｍ， ２Ｈ）， １．４０ （五重線， Ｊ ＝ ８．７ Ｈｚ， １Ｈ）， １．０５－０．９４ （ｍ， ２Ｈ）．
実施例２７．化合物１４９の合成
１４８（３．６２ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（２００ｍＬ）中溶液に、４－ニトロフェニルクロロホルメート（１５）（２．０２ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）及びＥｔ３Ｎ（４．２ｍＬ、３．０４ｇ、３０．０ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を１．５時間攪拌し、濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘプタン（１％ＡｃＯＨ）中２０％→７０％ＥｔＯＡｃ（１％ＡｃＯＨ））によって精製した。生成物１４９が白色泡（４．０７ｇ、７．７４ｍｍｏｌ、７４％）として得られた。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ （ｐｐｍ） ８．３２－８．２６ （ｍ， ２Ｈ）， ７．４５－７．４０ （ｍ， ２Ｈ）， ５．６２－５．５２ （ｍ， １Ｈ）， ４．４８－４．４２ （ｍ， ２Ｈ）， ４．２８ （ｄ， Ｊ ＝ ８．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．８１－３．７６ （ｍ， ２Ｈ）， ３．７０－３．６５ （ｍ， ２Ｈ）， ３．３８－３．３０ （ｍ， ２Ｈ）， ２．３５－２．１６ （ｍ， ６Ｈ）， １．６２－１．４６ （ｍ， ２Ｈ）， １．３８ （五重線， Ｊ ＝ ８．７ Ｈｚ， １Ｈ）， １．０４－０．９３ （ｍ， ２Ｈ）．
Figure 2023511857000047
実施例２８．化合物１５０の合成
１４９（２００ｍｇ、０．３８ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（１ｍＬ）中溶液に、トリエチルアミン（３５．４μＬ、０．２４ｍｍｏｌ）及びトリス（２－アミノエチル）アミン（１４４）（１２．６μＬ、８４．６μｍｏｌ）を添加した。混合物を１２０分間攪拌し、真空中で濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中２５％→１００％ＥｔＯＡｃ、次いで、ＤＣＭ中０％→１０％ＭｅＯＨ）によって精製すると、１５０が収率３６％（４０．０ｍｇ、３０．６μｍｏｌ）で白色泡として得られた。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ （ｐｐｍ） ６．３４－５．７２ （ｍ， ６Ｈ）， ４．３４－４．１８ （ｍ， １２Ｈ）， ３．７６－３．５８ （ｍ， １２Ｈ）， ３．４３－３．３０ （ｍ， ６Ｈ）， ３．３０－３．１８ （ｍ， ６Ｈ）， ２．６４－２．４９ （ｍ， ６Ｈ）， ２．３８－２．１４ （ｍ， １８Ｈ）， １．６５－１．４７ （ｍ， ６Ｈ）， １．３９ （五重線， Ｊ ＝ ９．１ Ｈｚ， ３Ｈ）， １．０６－０．９０ （ｍ， ６Ｈ）．
Figure 2023511857000048
実施例２９．化合物１５３の合成
無水ＤＭＦ（１ｍＬ）中のＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－ＯＨ（１５１）（３１．２ｍｇ、７５．８μｍｏｌ）の混合物に、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（４０μＬ、２９ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）及びＨＡＴＵ（３０．３ｍｇ、７９．６μｍｏｌ）を添加した。１０分間後、テトラジン－ＰＥＧ３－エチルアミン（１５２）（３０．３ｍｇ、７５．８μｍｏｌ）を添加し、混合物をボルテックスした。２時間後、混合物をＲＰ ＨＰＬＣ（Ｃ１８、水（１％ＡｃＯＨ）中３０％→９０％ＭｅＣＮ（１％ＡｃＯＨ））によって精製した。所望の生成物がピンク色フィルム（２４．１ｍｇ、３１．８μｍｏｌ、４２％）として得られた。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ３８Ｈ４５Ｎ８Ｏ９ ＋ （Ｍ＋Ｈ＋）の計算値７５７．３３ 実測値７５７．４６．
実施例３０．化合物１５４の合成
１５３（２４．１ｍｇ、３１．８μｍｏｌ）のＤＭＦ（５００μＬ）中溶液に、ジエチルアミン（２０μＬ、１４ｍｇ、１９１μｍｏｌ）を添加した。混合物を２時間静置し、ＲＰ ＨＰＬＣ（Ｃ１８、水（１％ＡｃＯＨ）中５％→９０％ＭｅＣＮ（１％ＡｃＯＨ））によって精製した。所望の生成物１５４がピンク色フィルム（１７．５ｍｇ、３２．７μｍｏｌ、定量的）として得られた。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ２３Ｈ３５Ｎ８Ｏ７ ＋ （Ｍ＋Ｈ＋）の計算値５３５．２６ 実測値５３５．３７．
Figure 2023511857000049
実施例３１．化合物１５６の合成
Ｎ－［（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）－ビシクロ［６．１．０］ノナ－４－イン－９－イルメチルオキシカルボニル］－１，８－ジアミノ－３，６－ジオキサオクタン（１５５）（６８ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）の脱水ＤＭＦ（２ｍＬ）中溶液をＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－ＯＨ（１５１）（８６ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）の脱水ＤＭＦ（２ｍＬ）中溶液に移した。ＤＩＰＥＡ（１００μＬ、０．６３０ｍｍｏｌ）及びＨＡＴＵ（７９ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）を添加した。１．５時間後、混合物を濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中０→１１％ＭｅＯＨ）によって精製すると、所望の化合物１５６が収率３４％（５２ｍｇ、０．０７２ｍｍｏｌ）で得られた。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ３５Ｈ４７Ｎ５Ｏ９ ＋ （Ｍ＋ Ｈ＋）の計算値７１７．３４ 実測値７１８．３９．
実施例３２．化合物１５７の合成
化合物１５６（２１ｍｇ、０．０２９ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２．４ｍＬ）に溶解し、ピペリジン（６００μＬ）を添加した。２０分後、混合物を濃縮し、残渣を分取ＨＰＬＣによって精製すると、所望の化合物１５７が白色固体（９．３ｍｇ、０．０１８ｍｍｏｌ、６４％）として得られた。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ２３Ｈ３７Ｎ５Ｏ７ ＋ （Ｍ＋ Ｈ＋）の計算値４９５．２７ 実測値４９６．５６．
Figure 2023511857000050
実施例３３．化合物１５９の合成
アミノ－ＰＥＧ１１－アミン（１５８）（１４３ｍｇ、０．２６０ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（５ｍＬ）中溶液に、ＤＣＭ（５ｍＬ）に溶解した（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）－ビシクロ［６．１．０］ノナ－４－イン－９－イルメチル（４－ニトロフェニル）カーボネート（１０２）（４１ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）をゆっくり添加した。１．５時間後、混合物を還元し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中０→２０％ ０．７Ｎ ＮＨ３ ＭｅＯＨ）によって精製すると、所望の化合物１５９が透明な油（６２ｍｇ、０．０８６ｍｍｏｌ、６６％）として得られた。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ３５Ｈ４６Ｎ２Ｏ１３ ＋ （Ｍ＋ Ｈ＋）の計算値７２０．４４ 実測値７２１．５６．
実施例３４．化合物１６０の合成
１５９（６２ｍｇ、０．０８６ｍｍｏｌ）の脱水ＤＭＦ（２ｍＬ）中溶液をＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－ＯＨ（１５１）（３６ｍｇ、０．０８６ｍｍｏｌ）の脱水ＤＭＦ（２ｍＬ）中溶液に移した。ＤＩＰＥＡ（４３μＬ、０．２５ｍｍｏｌ）及びＨＡＴＵ（３３ｍｇ、０．０８６ｍｍｏｌ）を添加した。１８時間後、混合物を濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中０→２０％ＭｅＯＨ）によって精製すると、所望の化合物１６０が収率６２％（６０ｍｇ、０．０５４ｍｍｏｌ）で得られた。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ５６Ｈ８３Ｎ５Ｏ１８ ＋ （Ｍ＋Ｈ＋）の計算値１１１３．５７ 実測値１１１４．９３．
実施例３５．化合物１６１の合成
化合物１６０（３６ｍｇ、０．０３２ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍＬ）に溶解し、ピペリジン（２００μＬ）を添加した。２時間後、混合物を濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中０→４０％０．７Ｎ ＮＨ３ ＭｅＯＨ）によって精製すると、所望の化合物１６１が黄色油（１６．７ｍｇ、０．０１８７ｍｍｏｌ、５８％）として得られた。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ４１Ｈ７３Ｎ５Ｏ１６ ＋ （Ｍ＋Ｈ＋）の計算値８９１．５１ 実測値８９２．８２．
Figure 2023511857000051
実施例３６．化合物１６２の合成
アミノ－ＰＥＧ２３－アミン（１０６）（６０ｍｇ、０．０５６ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（３ｍＬ）中溶液に、ＤＣＭ（５ｍＬ）に溶解した（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）－ビシクロ［６．１．０］ノナ－４－イン－９－イルメチル（４－ニトロフェニル）カーボネート（１０２）（１２ｍｇ、０．０３７ｍｍｏｌ）をゆっくり添加した。４時間後、混合物を濃縮し、ＤＭＦ（２ｍＬ）に再溶解し、その後、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－ＯＨ（５１）（２３ｍｇ、０．０５６ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（２１ｍｇ、０．０５６ｍｍｏｌ）、及びＤＩＰＥＡ（２７μＬ、０．１６ｍｍｏｌ）を添加した。２０時間後、混合物を濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中０→２７％ＭｅＯＨ）によって精製すると、所望の化合物１６２が９３％（５７ｍｇ、０．０４３ｍｍｏｌ）で得られた。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ８０Ｈ１３１Ｎ５Ｏ３０ ＋ （Ｍ＋ＮＨ４ ＋）の計算値１６４１．８９ 実測値１６５９．９２．
実施例３７．化合物１６３の合成
化合物１６２（５７ｍｇ、０．０３４ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解し、ピペリジン（１２０μＬ）を添加した。２時間後、混合物を濃縮し、水に再溶解し、Ｆｍｏｃ－ピペリジン副産物をジエチルエーテル（３×１０ｍＬ）による抽出で除去した。凍結乾燥後、１６３が黄色油（４６．１ｍｇ、０．０３２ｍｍｏｌ、９５％）として得られた。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ６５Ｈ１２１Ｎ５Ｏ２８ ＋ （Ｍ＋Ｈ＋）の計算値１４１９．８２ 実測値１４２０．９１．
Figure 2023511857000052
実施例３８．化合物１６５の合成
（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）－ビシクロ［６．１．０］ノナ－４－イン－９－イルメチル（４－ニトロフェニル）カーボネート（１０２）（２０４ｍｇ、０．６５０ｍｍｏｌ）の溶液に、アミノ－ＰＥＧ１２－アルコール（１６４）（４９６ｍｇ、０．９０８ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（３５０μＬ、２．２７ｍｍｏｌ）を添加した。１９時間後、混合物を濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中２→２０％ＭｅＯＨ）によって精製すると、１６５が透明な黄色油（４１０ｍｇ、０．５６０ｍｍｏｌ、８７％）として得られた。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ３５Ｈ６３ＮＯ１４ ＋ （Ｍ＋ Ｎａ＋）の計算値７２１．４２ 実測値７４４．４３．
実施例３９．化合物１６６の合成
１６５（４１０ｍｇ、０．５６０ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（６ｍＬ）中溶液に、４－ニトロフェニルクロロホルメート（１７１、０．８４８ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（２６０μＬ、１．８９ｍｍｏｌ）を添加した。１８時間後、混合物を濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中０→７％ＭｅＯＨ）によって精製すると、所望の化合物１６６が透明な油（３５０ｍｇ、０．３９４ｍｍｏｌ、７０％）として得られた。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ４２Ｈ６６Ｎ２Ｏ１８ ＋ （Ｍ＋ Ｎａ＋）の計算値８８６．４３ 実測値９０９．６１．
Figure 2023511857000053
実施例４０．化合物１６８の合成
１６６（１５ｍｇ、０．０１７ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２ｍＬ）中溶液に、ペプチドＬＰＥＴＧＧ（１６７）（９．７ｍｇ、０．０１７ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（７μＬ、０．０５ｍｍｏｌ）を添加した。４６時間後、混合物を濃縮し、残渣を分取ＨＰＬＣによって精製すると、所望の化合物１６８が６３％（１４ｍｇ、０．０１０ｍｍｏｌ）で得られた。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ６０Ｈ１０１Ｎ７Ｏ２５＋ （Ｍ＋Ｈ＋）の計算値１３１９．６８ 実測値１３２０．９２．
Figure 2023511857000054
実施例４２．１８２の合成
１８０（メチルテトラジン－ＮＨＳエステル、１９ｍｇ、０．０５８ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（０．８ｍＬ）中溶液に、１８１（３３．６ｍｇ、０．０６１ｍｍｏｌ）及びＥｔ３Ｎ（２４μＬ、０．１７ｍｍｏｌ）を添加した。室温で２．５時間攪拌した後、混合物を真空中で濃縮し、シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中０→１５％ＭｅＯＨ）によって精製すると、所望の化合物１８２が収率９３％（４１ｍｇ、０．０５４ｍｍｏｌ）で得られた。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ３５Ｈ６０Ｎ５Ｏ１３ ＋ （Ｍ＋Ｈ＋）の計算値７５８．８８ 実測値７５８．６４．
実施例４３．１８３の合成
１８２（４１ｍｇ、０．０５４ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（３ｍＬ）中溶液に、４－ニトロフェニルクロロホルメート（１６ｍｇ、０．０８１ｍｍｏｌ）及びＥｔ３Ｎ（２３μＬ、０．１６ｍｍｏｌ）を添加した。室温で２１時間攪拌した後、混合物を真空中で濃縮し、シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（勾配：Ａ．ＤＣＭ中０％→２０％ＥｔＯＡｃ（ｐ－ニトロフェノールが逃げるまで）、引き続いて勾配Ｂ．ＤＣＭ中０％→１３％ＭｅＯＨ）によって精製すると、所望の化合物１８３が収率７６％（３７．９ｍｇ、０．０４１ｍｍｏｌ）で得られた。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ４２Ｈ６３Ｎ６Ｏ１７ ＋ （Ｍ＋Ｈ＋）の計算値９２３．９８ 実測値９２３．６１．
実施例４４．ＸＬ１０の合成
参照により組み込まれる、ＭａｃＤｏｎａｌｄら、Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１５、１１、３２６～３３４により調製された１８４（５．６ｍｇ、０．０２３ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ（０．１ｍＬ）中溶液に、無水ＤＭＦ（０．３ｍｌ）に溶解した１８３（１４．３ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ）及びＥｔ３Ｎ（７μＬ、０．０４６ｍｍｏｌ）を添加した。室温で２時間攪拌した後、混合物を真空中で濃縮し、シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中０→１５％ＭｅＯＨ）によって精製すると、所望の化合物ＸＬ１０が収率５０％（７．５ｍｇ、０．００７６ｍｍｏｌ）で得られた。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ４７Ｈ７３Ｎ８Ｏ１５ ＋ （Ｍ＋Ｈ＋）の計算値９９０．１３ 実測値９９０．６６．
Figure 2023511857000055
実施例４５．１８６の合成
オクタ－エチレングリコール１８５のＤＣＭ（１０ｍＬ）中溶液に、トリエチルアミン（１．０ｍＬ、７．２４ｍｍｏｌ、２．５当量）を添加し、引き続いてＤＣＭ（５ｍＬ）中４－ニトロフェニルクロロホルメート（０．５８ｇ、２．９０ｍｍｏｌ、１当量）溶液を２８分で滴加した。混合物を９０分間攪拌した後、混合物を真空中で濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中７５％→０％ＥｔＯＡｃ、引き続いてＤＣＭ中０％→７％ＭｅＯＨ）によって精製した。生成物１８６が収率３８％で無色油（５８４．６ｍｇ、１．０９ｍｍｏｌ）として得られた。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ２３Ｈ３８ＮＯ１３ ＋ （Ｍ＋Ｈ＋）の計算値５３６．２３， 実測値５３６．９３． １Ｈ－ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ （ｐｐｍ） ８．２８ （ｄ， Ｊ ＝ １２．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．４０ （ｄ， Ｊ ＝ １２．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ４．４７ － ４．４２ （ｍ， ２Ｈ）， ３．８４ － ３．７９ （ｍ， ２Ｈ）， ３．７５ － ３．６３ （ｍ， ２６Ｈ）， ３．６３ － ３．５９ （ｍ， ２Ｈ）， ２．７０ － ２．５５ （ｂｓ， １Ｈ）．
実施例４６．１８８の合成
１８７（ＢｏｃＮＨ－ＰＥＧ２）２ＮＨ、２０２ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（１ｍＬ）中溶液に、１８６の調製したストック溶液（ＤＣＭ（１ｍＬ）中５８４ｍｇ）の一部（０．５ｍＬ、０．５４ｍｍｏｌ、１．３当量）、引き続いてトリエチルアミン（１７６μＬ、１．２６ｍｍｏｌ、３当量）及びＨＯＢｔ（５７ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ、１当量）を添加した。混合物を８日間攪拌した後、混合物を真空中で濃縮した。残渣をアセトニトリル（４．２ｍＬ）及び０．１Ｎ ＮａＯＨ（水溶液）（４．２ｍＬ、１当量）及びさらなる量の固体ＮａＯＨ（９１．５ｍｇ）の混合物に溶解した。混合物をさらに２１．５時間攪拌した後、混合物をＤＣＭ（３×４０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を真空中で濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中０％→１５％ＭｅＯＨ）によって精製した。生成物１８８が収率８７％で淡黄色油（３２０．４ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）として得られた。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ３９Ｈ７８Ｎ３Ｏ１８ ＋ （Ｍ＋Ｈ＋）の計算値８７６．５３， 実測値８７６．５４．
１Ｈ－ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ （ｐｐｍ） ５．１５ － ５．０２ （ｂｓ， ２Ｈ）， ４．２５ － ４．１９ （ｍ， ２Ｈ）， ３．７６ － ３．４６ （ｍ， ５０Ｈ）， ３．３５ － ３．２６ （ｍ， ４Ｈ）， ２．７９ － ２．６９ （ｂｒ． ｓ， １Ｈ）， １．４４ （ｓ， １８Ｈ）．
実施例４７．１８９の合成
１８８（３２０ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１ｍＬ）に溶解した。次いで、ジオキサン中４Ｍ ＨＣｌ（４５６μＬ、１．８３ｍｍｏｌ、５当量）を添加した。混合物を３．５時間攪拌した後、さらなるジオキサン中４Ｍ ＨＣｌ（４５０μＬ、１．８０ｍｍｏｌ、４．９当量）を添加した。混合物をさらに３．５時間攪拌した後、さらなるジオキサン中４Ｍ ＨＣｌ（４５０μＬ、１．８０ｍｍｏｌ、４．９当量）を添加した。混合物を１６．５時間攪拌した後、混合物を真空中で濃縮した。生成物１８９が定量的収率で白色粘着性固体として得られた。これを次のステップに直接使用した。１Ｈ－ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６）： δ （ｐｐｍ） ８．０７ － ７．８１ （ｂｓ， ６Ｈ）， ４．１５ － ４．０６ （ｍ， ２Ｈ）， ３．７５ － ３．６６ （ｍ， ２Ｈ）， ３．６５ － ３．４８ （ｍ， ４８Ｈ）， ３．０３ － ２．９２ （ｍ， ４Ｈ）．
Figure 2023511857000056
実施例４８．１９０の合成
ＢＣＮ－ＯＨ（１０１、１６４ｍｇ、１．１０ｍｍｏｌ、３当量）のＤＣＭ（３ｍＬ）中溶液に、ＣＳＩ（７６μＬ、０．８８ｍｍｏｌ、２．４当量）を添加した。１５分間攪拌した後、トリエチルアミン（２５５μＬ、５．５０ｍｍｏｌ、５当量）を添加した。ＤＣＭ（３ｍＬ）及びトリエチルアミン（５０８μＬ、１１．０ｍｍｏｌ、１０当量）を添加することによって、１８９の溶液を調製した。このストック溶液を６分後に元の反応混合物に添加した。混合物を２１．５時間攪拌した後、混合物を真空中で濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中０％→１０％ＭｅＯＨ）によって調製した。生成物１９０が収率３９％で淡黄色油（１６５．０ｍｇ、１３９μｍｏｌ）として得られた。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ４３Ｈ７２Ｎ５Ｏ１８Ｓ２ ＋ （Ｍ＋Ｈ＋）の計算値１１８６．５４， 実測値１１８６．６５．
１Ｈ－ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ （ｐｐｍ） ６．０９ － ５．８７ （ｍ， ２Ｈ）， ４．３１ － ４．１９ （ｍ， ６Ｈ）， ３．７６ － ３．５０ （ｍ， ５０Ｈ）， ３．４０ － ３．２９ （ｍ， ４Ｈ）， ２．３８ － ２．１６ （ｍ， １２Ｈ）， １．６６ － １．４７ （ｍ， ４Ｈ）， １．４０ （五重線， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．０４ － ０．９４ （ｍ， ４Ｈ）．
実施例４９．１９１の合成
１９０（１０１ｍｇ、０．０８５ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（２．０ｍＬ）中溶液に、ビス（４－ニトロフェニル）カーボネート（３９ｍｇ、０．１２７ｍｍｏｌ）及びＥｔ３Ｎ（３６μＬ、０．２５ｍｍｏｌ）を添加した。室温で４２時間攪拌した後、粗混合物を真空中で濃縮し、シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（Ａ．ＤＣＭ中０％→２５％ＥｔＯＡｃ（ｐ－ニトロフェノールが逃げるまで）、引き続いて勾配Ｂ．ＤＣＭ中０％→１２％ＭｅＯＨ）によって精製すると、１９１が透明な油（４９ｍｇ、０．０３６ｍｍｏｌ、４２％）として得られた。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ５８Ｈ９１Ｎ６Ｏ２６Ｓ２ ＋ （Ｍ＋Ｈ＋）の計算値１３５２．５０ 実測値１３５２．７８．
実施例５０．ＸＬ１１の合成
１９１（７ｍｇ、０．００５９ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ（１３０μＬ）中溶液に、Ｅｔ３Ｎ（２．２μＬ、０．０１５ｍｍｏｌ）及びＴＣＯ－アミン塩酸塩（Ｂｒｏａｄｐｈａｒｍ）（１．８ｍｇ、０．００６８ｍｍｏｌ）を添加した。室温で１９時間攪拌した後、粗混合物をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中０％→１５％ＭｅＯＨ）によって精製すると、ＸＬ１１が透明な油（１．５ｍｇ、０．００１ｍｍｏｌ、１７％）として得られた。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ６４Ｈ１１１Ｎ８Ｏ２５Ｓ２ ＋ （Ｍ＋ＮＨ４ ＋）の計算値１４５６．７３ 実測値１４５６．８１．
Figure 2023511857000057
実施例５１．１９４の合成
利用可能な１８７（６３８ｍｇ、１．３３ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（８．０ｍＬ）中溶液に、１２８（４７０ｍｇ、１．７３ｍｍｏｌ）、Ｅｔ３Ｎ（５５６．０μＬ、４．０ｍｍｏｌ）、及び１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（１７９．０ｍｇ、１．３３ｍｍｏｌ）を添加した。周囲温度で４１時間攪拌した後、混合物を真空中で濃縮し、ＭｅＣＮ（１０ｍＬ）に再溶解し、引き続いて０．１Ｍ ＮａＯＨ水溶液（１０ｍＬ）及び固体ＮａＯＨペレット（１００．０ｍｇ）を添加した。１．５時間後、ＤＣＭ（２０ｍＬ）を添加し、所望の化合物を４回抽出した。有機層を真空中で濃縮し、残渣をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中０％→１２％ＭｅＯＨ）によって精製すると、１９４が透明な黄色油（７３３ｍｇ、１．１９ｍｍｏｌ、９０％）として得られた。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ （ｐｐｍ） ４．２９ － ４．２３ （ｍ， ２Ｈ）， ３．７７ － ３．６８ （ｍ， ４Ｈ）， ３．６５ － ３．５６ （ｍ， １４Ｈ）， ３．５６ － ３．４９ （ｍ， ８Ｈ）， ３．３７ － ３．２４ （ｍ， ４Ｈ）， １．４５ （ｓ， １８Ｈ）． ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ２７Ｈ５４Ｎ３Ｏ１２ ＋ （Ｍ＋Ｈ＋）の計算値６１２．７３ 実測値６１２．５５．
実施例５２．１９５の合成
１９４（３１．８ｍｇ、０．０５２ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（１．０ｍＬ）中溶液に、ジオキサン中４．０Ｍ ＨＣｌ（０．４ｍＬ）を添加した。周囲温度で２．５時間攪拌した後、反応混合物を真空中で濃縮し、その合間にＤＣＭ（２ｍＬ）に再溶解し、濃縮した。化合物１９５が透明な油として定量的収率で得られた。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ１７Ｈ３８Ｎ３Ｏ８ ＋ （Ｍ＋Ｈ＋）の計算値４１２．５０ 実測値４１２．４５
実施例５３．１９６の合成
１９５（２１．４ｍｇ、０．０５２ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（１．０ｍＬ）中冷溶液（０℃）に、Ｅｔ３Ｎ（３６μＬ、０．２６ｍｍｏｌ）及び２－ブロモアセチルブロミド（１０．５μＬ、０．１２ｍｍｏｌ）を添加した。氷上で１０分間攪拌した後、氷浴を除去し、０．１Ｍ ＮａＯＨ水溶液（０．８ｍＬ）を添加した。室温で２０分間攪拌した後、水層をＤＣＭ（２×５ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、真空中で濃縮した。粗褐色油をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中０％→１８％ＭｅＯＨ）によって精製すると、１９６が透明な油（６．９ｍｇ、０．０１１ｍｍｏｌ、２０％）として得られた。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ２１Ｈ４０Ｂｒ２Ｎ３Ｏ１０ ＋ （Ｍ＋Ｈ＋）の計算値６５４．３６ 実測値６５４．２９．
実施例５４．ＸＬ１２の合成
１９６（６．９ｍｇ、０．０１１ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（０．８ｍＬ）中溶液に、ビス（４－ニトロフェニル）カーボネート（３．８ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ）及びＥｔ３Ｎ（５μＬ、０．０３ｍｍｏｌ）を添加した。室温で１８時間攪拌した後、ＤＣＭ（０．５ｍＬ）に溶解した１５５（ＢＣＮ－ＰＥＧ２－ＮＨ２、３．３ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ）を添加した。さらに２時間攪拌した後、混合物を真空中で濃縮し、シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（勾配：Ａ．ＤＣＭ中０％→３０％ＥｔＯＡｃ（ｐ－ニトロフェノールが逃げるまで）、引き続いて勾配Ｂ．ＤＣＭ中０％→２０％ＭｅＯＨ）によって精製すると、ＸＬ１２が透明な油（１．０ｍｇ、０．００１ｍｍｏｌ、９％）として得られた。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ３９Ｈ６６Ｂｒ２Ｎ５Ｏ１５ ＋ （Ｍ＋Ｈ＋）の計算値１００４．７７ 実測値１００４．５１．
Figure 2023511857000058
実施例５５．１９７の合成
１０２（２０４ｍｇ、０．６４７ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（２０ｍＬ）中溶液に、１８１（４９６ｍｇ、０．９０９ｍｍｏｌ）及びＥｔ３Ｎ（３５０μＬ、２．２７ｍｍｏｌ）を添加した。室温で１９時間攪拌した後、溶媒を真空中で減少させ、残渣をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中２→２０％ＭｅＯＨ）によって精製すると、所望の化合物１９７が黄色油として収率８７％（４１０ｍｇ、０．５６７ｍｍｏｌ）で得られた。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ３５Ｈ６３ＮＯ１４Ｎａ＋ （Ｍ＋Ｎａ＋）の計算値７４４．８６ 実測値７４４．４３．
実施例５６．１９８の合成
１９７（４１０ｍｇ、０．５６７ｍｍｏｌ）及び４－ニトロフェニルクロロホルメート（１７２ｍｇ、０．８５３ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（６ｍＬ）中溶液に、Ｅｔ３Ｎ（２６０μＬ、１．８８ｍｍｏｌ）を添加した。室温で１８時間攪拌した後、溶媒を真空中で減少させ、残渣をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中０→７％ＭｅＯＨ）によって精製すると、所望の化合物１９８が透明な油として収率７０％（３５０ｍｇ、０．３９４ｍｍｏｌ）で得られた。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ４２Ｈ６６Ｎ２Ｏ１８Ｎａ＋ （Ｍ＋Ｎａ＋）の計算値９０９．９６ 実測値９０９．６１．
実施例５７．ＸＬ１３の合成
１９８（４４．２ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（５ｍＬ）中溶液に、１９９（ビス－アミノオキシ－ＰＥＧ２、３３．３ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）及びＥｔ３Ｎ（１１μＬ、０．０７ｍｍｏｌ）を添加した。室温で６７時間攪拌した後、混合物を真空中で濃縮し、ＲＰ ＨＰＬＣ（カラムＸＢｒｉｄｇｅ ｐｒｅｐ Ｃ１８ ５μｍ ＯＢＤ、３０×１００ｍｍ、Ｈ２Ｏ中５％→９０％ＭｅＣＮ（共に１％酢酸を含有する））によって精製した。生成物ＸＬ１３が透明な油（８．１ｍｇ、０．００８７μｍｏｌ、１７％）として得られた。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ４２Ｈ７８Ｎ３Ｏ１９ ＋ （Ｍ＋Ｈ＋）の計算値９２９．０８ 実測値９２８．７９．
Figure 2023511857000059
実施例５８．３１９の合成
化合物１２１（４４２ｍｇ、１．４６ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（１ｍＬ）及びＤＭＦ（２００μＬ）中溶液に、化合物１２８のＤＣＭ（１ｍＬ）及びトリエチルアミン（６０９μＬ、４．３７ｍｍｏｌ）中溶液を添加した。混合物を１６時間攪拌した後、混合物を真空中で濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘプタン中５０％→１００％ＥｔＯＡｃ）によって精製すると、３１９（３１６ｍｇ）が得られた。これをＲＰ ＨＰＬＣ（カラムＸｂｒｉｄｇｅ ｐｒｅｐ Ｃ１８ ５μｍ ＯＢＤ、３０×１００ｍｍ、水（１％ＡｃＯＨ）中５％→９０％ＭｅＣＮ（１％ＡｃＯＨ））によってさらに精製した。生成物３１９が収率１７％で無色油（１１０ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）として得られた。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ１９Ｈ３７Ｎ３ＮａＯ８ ＋ （Ｍ＋Ｎａ＋）の計算値４５８．２５， 実測値４５８．３３． １Ｈ－ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ （ｐｐｍ） ５．４１ － ４．８９ （ｍ， ２Ｈ）， ４．３１ － ４．２４ （ｍ， ２Ｈ）， ３．７８ － ３．６８ （ｍ， ４Ｈ）， ３．６５ － ３．５９ （ｍ， ２Ｈ）， ３．４４ － ３．３４ （ｍ， ４Ｈ）， ３．３４ － ３．１９ （ｍ， ４Ｈ）， １．４３ （ｓ， １８Ｈ）．
実施例５９．３２０の合成
化合物３１９（１０７ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１ｍＬ）に溶解した。次いで、ジオキサン中４Ｍ ＨＣｌ（３００μＬ、１．２ｍｍｏｌ、４．８当量）を添加した。混合物を１５時間攪拌した後、混合物を沈殿からデカントし、沈殿をＤＣＭ（２ｍＬ）で１回洗浄した。生成物３２０が定量的収率で白色粘着性固体（８９．９ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）として得られた。これを次のステップに直接使用した。
実施例６０．３２１の合成
１０１（７５ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ、２当量）のＤＣＭ（１ｍＬ）中溶液に、ＣＳＩ（４１μＬ、０．４８ｍｍｏｌ、１．９当量）を添加した。６分間攪拌した後、トリエチルアミン（１３９μＬ、１．０ｍｍｏｌ、４当量）を添加した。ＤＭＦ（２００μＬ）及びＤＣＭ（２ｍＬ）、引き続いてトリエチルアミン（１３９μＬ、０．７５ｍｍｏｌ、３当量）を添加することによって、３２０のストック溶液を調製した。３２０のこのストック溶液の一部（３２μＬ、０．２５ｍｍｏｌ）を、ＣＳＩを含有する元の反応混合物に添加した。混合物を１６時間攪拌した後、混合物を真空中で濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中０％→１０％ＭｅＯＨ）によって精製した。生成物３２１が収率３％で無色油（１１ｍｇ、１４．２μｍｏｌ）として得られた。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ３１Ｈ４８Ｎ５Ｏ１２Ｓ２ ＋ （（Ｍ＋Ｈ＋）の計算値７４６．２７， 実測値７４６．９６． １Ｈ－ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ （ｐｐｍ） ６．３６ － ５．９４ （ｍ， ２Ｈ）， ４．３８ － ４．１７ （ｍ， ６Ｈ）， ３．８４ － ３．７９ （ｍ， ２Ｈ）， ３．７７ － ３．７２ （ｍ， ２Ｈ）， ３．６８ － ３．６３ （ｍ， ２Ｈ）， ３．５４ － ３．４５ （ｍ， ４Ｈ）， ３．３９ － ３．２７ （ｍ， ４Ｈ）， ２．３８ － ２．１６ （ｍ， １２Ｈ）， １．６７ － １．４７ （ｍ， ５Ｈ）， １．４０ （五重線， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．０５ － ０．９３ （ｍ， ４Ｈ）．
実施例６１．３０１（ＬＤ０１）の合成
３２１（１０．６ｍｇ、１４．２μｍｏｌ）のＤＣＭ（１００μＬ）中溶液に、ビス（４－ニトロフェニル）カーボネート（４．３ｍｇ、１４．２μｍｏｌ、１．０当量）及びトリエチルアミン（５．９μＬ、４２．６μｍｏｌ、３．０当量）を添加した。６６時間攪拌した後、この混合物の一部をｖｃ－ＰＡＢＣ－ＭＭＡＥ．ＴＦＡのＤＭＦ中ストック溶液（２００μＬ、５０ｍｇ／ｍＬ）及びさらなる量のトリエチルアミン（５．９μＬ、４２．６μｍｏｌ、３．０当量）で処理した。２４時間後、これを真空中で部分的に濃縮した。残渣をＲＰ ＨＰＬＣ（カラムＸｂｒｉｄｇｅ ｐｒｅｐ Ｃ１８ ５μｍ ＯＢＤ、３０×１００ｍｍ、水（１％ＡｃＯＨ）中５％→９０％ＭｅＣＮ（１％ＡｃＯＨ））によって精製した。化合物３０１が収率２８％でフィルム（３．４ｍｇ、１．９μｍｏｌ）として得られた。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ９０Ｈ１４０Ｎ１５Ｏ２５Ｓ２ ＋ （（Ｍ＋Ｈ＋）の計算値１８９４．９６， 実測値１８９５．００．
Figure 2023511857000060
実施例６２．３２２の合成
１８５（オクタエチレングリコール）のＤＣＭ（１０ｍＬ）中溶液に、トリエチルアミン（１．０ｍＬ、７．２４ｍｍｏｌ；２．５当量）を添加し、引き続いてＤＣＭ（５ｍＬ）中４－ニトロフェニルクロロホルメート（０．５８ｇ；２．９０ｍｍｏｌ；１当量）溶液を２８分で滴加した。混合物を９０分間攪拌した後、混合物を真空中で濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中７５％→０％ＥｔＯＡｃ、引き続いてＤＣＭ中０％→７％ＭｅＯＨ）によって精製した。生成物３２２が収率３８％で無色油（５８４．６ｍｇ；１．０９ｍｍｏｌ）として得られた。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ２３Ｈ３８ＮＯ１３ ＋ （Ｍ＋Ｈ＋）の計算値５３６．２３， 実測値５３６．９３． １Ｈ－ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ （ｐｐｍ） ８．２８ （ｄ， Ｊ ＝ １２．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．４０ （ｄ， Ｊ ＝ １２．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ４．４７ － ４．４２ （ｍ， ２Ｈ）， ３．８４ － ３．７９ （ｍ， ２Ｈ）， ３．７５ － ３．６３ （ｍ， ２６Ｈ）， ３．６３ － ３．５９ （ｍ， ２Ｈ）， ２．７０ － ２．５５ （ｂｒ． ｓ， １Ｈ）．
実施例６３．３２３の合成
化合物１２１（１２７ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（１ｍＬ）中溶液に、３２２の調製したストック溶液（ＤＣＭ（１ｍＬ）中５８４ｍｇ）の一部（０．５ｍＬ；０．５４ｍｍｏｌ；１．３当量）、引き続いてトリエチルアミン（１７６μＬ、１．２６ｍｍｏｌ；３当量）及びＨＯＢｔ（５７ｍｇ；０．４２ｍｍｏｌ；１当量）を添加した。混合物を４．５日間攪拌した後、混合物を真空中で濃縮した。残渣をアセトニトリル（４．２ｍＬ）と０．１Ｎ ＮａＯＨ（４．２ｍＬ、１当量）の混合物に溶解した。混合物を２４時間攪拌した後、さらなる固体ＮａＯＨ（１０４．５ｍｇ）を添加した。混合物をさらに５時間攪拌した後、混合物をＤＣＭ（２×１０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を真空中で濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中０％→１５％ＭｅＯＨ）によって精製した。生成物３２３が収率５４％で淡黄色油（１６４．５ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）として得られた。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ２６Ｈ５４Ｎ３Ｏ１２ ＋ （Ｍ－ＢＯＣ＋）の計算値６００．３６， 実測値６００．４９． １Ｈ－ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ （ｐｐｍ） ５．２７ － ５．０５ （ｍ， ２Ｈ）， ４．２６ － ４．２１ （ｍ， ２Ｈ）， ３．７６ － ３．５９ （ｍ， ３０Ｈ）， ３．４３ － ３．３３ （ｍ， ４Ｈ）， ３．３３ － ３．２２ （ｍ， ４Ｈ）， １．４３ （ｓ， １８Ｈ）．
実施例６４．３２４の合成
化合物３２３（１６４ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１ｍＬ）に溶解した。次いで、ジオキサン中４Ｍ ＨＣｌ（２９３μＬ、１．１７ｍｍｏｌ、５当量）を添加した。混合物を１８時間攪拌した後、さらなるジオキサン中４Ｍ ＨＣｌ（２９３μＬ、１．１７ｍｍｏｌ、５当量）を添加した。混合物をさらに５時間攪拌した後、混合物を真空中で濃縮した。生成物３２４が定量的収率で白色粘着性固体（１３２ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）として得られた。これを次のステップに直接使用した。
実施例６５．３２５の合成
１０１（８１ｍｇ、０．５４ｍｍｏｌ、２．３当量）のＤＣＭ（２ｍＬ）中溶液に、ＣＳＩ（４３μＬ、０．４９ｍｍｏｌ、２．１当量）を添加した。１５分間攪拌した後、トリエチルアミン（１６４μＬ、１．１７ｍｍｏｌ、５当量）を添加した。ＤＣＭ（２ｍＬ）及びトリエチルアミン（１６４μＬ、１．１７ｍｍｏｌ、５当量）を添加することによって、３２４の溶液を調製した。このストック溶液を６分後に元の反応混合物に添加した。混合物を２３時間攪拌した後、混合物を真空中で濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中０％→１２％ＭｅＯＨ）によって精製した。生成物３２５が収率３１％で淡黄色油（７３．０ｍｇ、７２．２μｍｏｌ）として得られた。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ４３Ｈ７２Ｎ５Ｏ１８Ｓ２ ＋ （Ｍ＋Ｈ＋）の計算値１０１０．４３， 実測値１０１０．５０．
１Ｈ－ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： δ （ｐｐｍ） ６．２１ － ５．８５ （ｍ， ２Ｈ）， ４．３８ － ４．１７ （ｍ， ６Ｈ）， ３．８０ － ３．５７ （ｍ， ３０Ｈ）， ３．５７ － ３．４４ （ｍ， ４Ｈ）， ３．４４ － ３．３０ （ｍ， ４Ｈ）， ２．３８ － ２．１６ （ｍ， １２Ｈ）， １．６４ － １．４８ （ｍ， ４Ｈ）， １．４０ （五重線， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．０５ － ０．９１ （ｍ， ４Ｈ）．
実施例６６．３０２（ＬＤ０２）の合成
３２５（１９．５ｍｇ、１９．７μｍｏｌ）のＤＣＭ（１００μＬ）中溶液に、ビス（４－ニトロフェニル）カーボネート（６．０ｍｇ、１９．７μｍｏｌ、１．０当量）及びトリエチルアミン（８．２μＬ、５９．１μｍｏｌ、３．０当量）を添加した。６６時間攪拌した後、この混合物の一部をｖｃ－ＰＡＢＣ－ＭＭＡＥ．ＴＦＡのＤＭＦ中ストック溶液（２００μＬ、５０ｍｇ／ｍＬ）及びさらなる量のトリエチルアミン（８．２μＬ、５９．１μｍｏｌ、３．０当量）で処理した。９５時間後、これを真空中で部分的に濃縮した。残渣をＲＰ ＨＰＬＣ（カラムＸｂｒｉｄｇｅ ｐｒｅｐ Ｃ１８ ５μｍ ＯＢＤ、３０×１００ｍｍ、水（１％ＡｃＯＨ）中５％→９０％ＭｅＣＮ（１％ＡｃＯＨ））によって精製した。化合物３０２が収率９％でフィルム（３．７ｍｇ、１．７１μｍｏｌ）として得られた。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ１０２Ｈ１６５Ｎ１５Ｏ３１Ｓ２ ２＋ （Ｍ＋２Ｈ＋）の計算値１０８０．５６， 実測値１０８０．７４．
Figure 2023511857000061
実施例６７．３２９の合成
１０１（１８ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（１ｍＬ）中溶液に、クロロスルホニルイソシアネート（ＣＳＩ）を添加した。３０分後、Ｅｔ３Ｎ（３７μＬ、２７ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）を添加した。１９５（２６ｍｇ、０．０５４ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（１ｍＬ）中溶液に、Ｅｔ３Ｎ（３７μＬ、２７ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を反応混合物に添加した。４５分後、反応混合物を濃縮し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ＤＣＭ→ＤＣＭ中７％ＭｅＯＨ）によって精製した。生成物３２９が無色フィルム（２７ｍｇ、０．０２９ｍｍｏｌ、５４％）として得られた。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ３９Ｈ６４Ｎ５Ｏ１６Ｓ２ ＋ （Ｍ＋Ｈ＋）の計算値９２２．３８， 実測値９２２．５０．
実施例６８．３３０の合成
３２９のＤＣＭ（１ｍＬ）中溶液に、ビス（４－ニトロフェニル）カーボネート（８．９ｍｇ、２９．３μｍｏｌ）及びＥｔ３Ｎ（１２．２μＬ、８．９ｍｇ、８７．９μｍｏｌ）を添加した。１日後、０．２８ｍＬを化合物３０３の調製に使用した。２日後、余分のビス（４－ニトロフェニル）カーボネート（７．０ｍｇ、２３μｍｏｌ）を主反応混合物に添加した。１日後、反応混合物を濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製した。生成物３３０が無色フィルム（１７．５ｍｇ、０．０１６ｍｍｏｌ、５５％（補正７６％））として得られた。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ４６Ｈ６７Ｎ６Ｏ２０Ｓ２ ＋ （Ｍ＋Ｈ＋）の計算値１０８７．３８， 実測値１０８７．４７．
実施例６９．３０３（ＬＤ０３）の合成
３３０の反応混合物（０．２８ｍＬ、８．８ｍｇ、８．１μｍｏｌを理論上含有する）に、Ｅｔ３Ｎ（３．４μＬ、２．５ｍｇ、２４．３μｍｏｌ）及びｖｃ－ＰＡＢＣ－ＭＭＡＥ．ＴＦＡ（１０ｍｇ、８．１μｍｏｌ）のＤＭＦ（２００μＬ）中溶液を添加した。２１時間後、２，２’－（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）（４．７μＬ、４．８ｍｇ、３２μｍｏｌ）を添加した。４５分後、反応混合物を窒素ガス流下で濃縮した。残渣をＲＰ－ＨＰＬＣ（カラムＸｂｒｉｄｇｅ ｐｒｅｐ Ｃ１８ ５μｍ ＯＢＤ、３０×１００ｍｍ、水（１％ＡｃＯＨ）中３０％～９０％ＭｅＣＮ（１％ＡｃＯＨ））によって精製した。生成物３０３が無色フィルム（５．６ｍｇ、２．７μｍｏｌ）として得られた。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ９８Ｈ１５７Ｎ１５Ｏ２９Ｓ２ ２＋ （（Ｍ＋２Ｈ＋）／２）の計算値１０３６．５３， 実測値１０３６．７０．
Figure 2023511857000062
実施例７０．３３２の合成
Ａｌｌｏｃ２－ｖａ－ＰＡＢＣ－ＰＢＤ ３３１（１０．０ｍｇ、０．００９ｍｍｏｌ）の脱気ＤＣＭ（４００μＬ、ＤＣＭを通してＮ２を５分間パージすることによって得られる）中溶液に、ピロリジン（１．９μＬ、０．０２７ｍｍｏｌ）及びＰｄ（ＰＰｈ３）４（１．６ｍｇ、０．００１４ｍｍｏｌ）を添加した。周囲温度で１５分間攪拌した後、反応混合物をＤＣＭ（１０ｍＬ）で希釈し、飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液（１０ｍＬ）を添加した。粗混合物をＤＣＭ（３×１０ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮した。黄色残渣をＤＭＦ（４５０μＬ）及びＭｅＣＮ（４５０μＬ）に再溶解し、ＲＰ ＨＰＬＣ（カラムＸｂｒｉｄｇｅ ｐｒｅｐ Ｃ１８ ５μｍ ＯＢＤ、３０×１００ｍｍ、Ｈ２Ｏ中５％→９０％ＭｅＣＮ（共に０．１％ギ酸を含有する））によって精製した。純粋な画分をＳＰＥカラム（ＰＬ－ＨＣＯ３ ＭＰ、５００ｍｇ／６ｍＬ）上で中和し、濃縮し、ＭｅＣＮ（２×５ｍＬ）と共蒸発させると、３３２が白色固体（４．８ｍｇ、０．００５ｍｍｏｌ、５８％）として得られた。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ４９Ｈ６０Ｎ７Ｏ１１ ＋ （Ｍ＋Ｈ＋）の計算値９２３．０４ 実測値９２３．６１．
実施例７１．３０４（ＬＤ０４）の合成
３３２（４．８ｍｇ、０．００５ｍｍｏｌ）の無水脱気ＤＭＦ（６０μＬ、ＤＭＦを通してＮ２を５分間パージすることによって得られる）中溶液に、３３０（１０ｍｇ、０．００９ｍｍｏｌ、無水脱気ＤＭＦ ４８μＬに溶解）、Ｅｔ３Ｎ（３．６μＬ、０．０２６ｍｍｏｌ）、及びＨＯＢｔ（無水脱気ＤＭＦ中ストック、５．１μＬ、０．３５ｍｇ、０．００２６ｍｍｏｌ、０．５当量）を添加した。暗所中周囲温度で４１時間攪拌した後、粗反応混合物をＤＣＭ（３００μＬ）で希釈し、シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中０％→１２％ＭｅＯＨ）によって精製すると、３０４が透明な黄色油（４．０ｍｇ、０．００２１ｍｍｏｌ、４１％）として得られた。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ８９Ｈ１２１Ｎ１２Ｏ２８Ｓ２ ＋ （Ｍ＋Ｈ＋）の計算値１８７１．１１ 実測値１８７１．０９．
Figure 2023511857000063
実施例７２．３０５（ＬＤ０５）の合成
参照により組み込まれる、国際公開第２０１９１１０７２５号、実施例５－５により調製した、３３３（２．９ｍｇ、０．００１３ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ（６０μＬ）中溶液に、３３０（１．４５ｍｇ、０．００１３ｍｍｏｌ）及びＥｔ３Ｎ（１．２μＬ、０．０２３ｍｍｏｌ）を添加した。室温で４８時間攪拌した後、反応混合物をＤＭＦ（５００μＬ）で希釈し、ＲＰ ＨＰＬＣ（カラムＸｂｒｉｄｇｅ ｐｒｅｐ Ｃ１８ ５μｍ ＯＢＤ、３０×１００ｍｍ、Ｈ２Ｏ中３０％→１００％ＭｅＣＮ（共に１％酢酸を含有する））によって精製した。生成物３０５が無色フィルム（０．６ｍｇ、０．２０７μｍｏｌ、１６％）として得られた。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ１２４Ｈ１８２ＩＮ１４Ｏ４６Ｓ５ ＋ （Ｍ／２＋Ｈ＋）の計算値１４４７．０３ 実測値１４４７．１９．
Figure 2023511857000064
実施例７３．３０６（ＬＤ０６）の合成
３３０（７ｍｇ、０．００６ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ（１５０μＬ）中溶液に、ｖｃ－ＰＡＢＣ－ＤＭＥＡ－ＰＮＵ（３３４）の無水ＤＭＦ（１２５μＬ、５．７ｍｇ、０．００５ｍｍｏｌ）中ストック及びＥｔ３Ｎ（２μＬ、０．０１５ｍｍｏｌ）を添加した。室温で２５時間攪拌した後、反応混合物をＤＣＭ（０．３ｍＬ）で希釈し、シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中０％→２０％ＭｅＯＨ）によって精製すると、３０６が赤色フィルム（５ｍｇ、０．００２４ｍｍｏｌ、４７％）として得られた。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ９６Ｈ１３３Ｎ１３Ｏ３６Ｓ３ ＋ （Ｍ／２＋Ｈ＋）の計算値１０５５．６４ 実測値１０５５．５０．
Figure 2023511857000065
実施例７４．３３７の合成
化合物３３６（ＤＩＢＯ、９５ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１．０ｍＬ）に溶解し、クロロスルホニルイソシアネート（３３．０μＬ、０．３７ｍｍｏｌ）を室温で添加すると、２分後、不溶性物質が形成された。室温でさらに１５分間攪拌した後、Ｅｔ３Ｎ（１２０．０μＬ、０．８５ｍｍｏｌ）を添加すると、全ての不溶性物質が消滅し、ＤＣＭ（１．０ｍＬ）に溶解した１９５（７１ｍｇ、０．０１７１）とＥｔ３Ｎ（１２０．０μＬ、０．８５ｍｍｏｌ）の混合物の添加を実施した。室温で１６時間攪拌した後、粗混合物を真空中で濃縮し、シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中０％→１５％ＭｅＯＨ）によって精製し、その後、これをＥｔＯＡｃ（２×）と共蒸発させてＭｅＯＨを完全に除去した。生成物３３７が蝋様白色固体（１３６．０ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ、７５％）として得られた。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ５１Ｈ６３Ｎ６Ｏ１６Ｓ２ ＋ （Ｍ＋ＮＨ４ ＋）の計算値１０８０．２１ 実測値１０８０．５９．
実施例７５．３３８の合成
３３７（１３６．０ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（２．０ｍＬ）中溶液に、ビス（４－ニトロフェニル）カーボネート（４７．０ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）及びＥｔ３Ｎ（５４．０μＬ、０．３８ｍｍｏｌ）を添加した。室温で１８時間攪拌した後、粗混合物を真空中で濃縮し、シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（勾配：Ａ．ＤＣＭ中０％→３５％ＥｔＯＡｃ（ｐ－ニトロフェノールが逃げるまで）、引き続いて勾配、Ｂ．ＤＣＭ中０％→１３％ＭｅＯＨ）によって精製すると、３３８が淡黄色油（８９．０ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ、６０％）として得られた。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ４８Ｈ６６Ｎ７Ｏ２０Ｓ２ ＋ （Ｍ＋ＮＨ４ ＋）の計算値１２４５．３１ 実測値１２４５．６４．
実施例７６．３０７（ＬＤ０７）の合成
３３８（６．９５ｍｇ、０．００５ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ（９３．０μＬ）中溶液に、Ｅｔ３Ｎ（２．４μＬ、０．０１７ｍｍｏｌ）及びｖｃ－ＰＡＢＣ－ＭＭＡＥ．ＴＦＡ（Ｌｅｖｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）の無水ＤＭＦ（７０μＬ、７．０ｍｇ、０．００５ｍｍｏｌ）中ストック溶液を添加した。室温で１８時間攪拌した後、ＤＭＦ（４５０μＬ）を添加し、粗混合物をＲＰ ＨＰＬＣ（カラムＸｂｒｉｄｇｅ ｐｒｅｐ Ｃ１８ ５μｍ ＯＢＤ、３０×１００ｍｍ、Ｈ２Ｏ中３０％→１００％ＭｅＣＮ（共に１％酢酸を含有する））によって精製した。生成物３０７が無色フィルム（４．５ｍｇ、０．００２ｍｍｏｌ、３６％）として得られた。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ１１０Ｈ１５２Ｎ１５Ｏ２９Ｓ２ ＋ （Ｍ／２＋Ｈ＋）の計算値１１０６．３０ 実測値１１０６．７９．
Figure 2023511857000066
実施例７７．３４１の合成
化合物１０１（１６．３ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（０．８ｍＬ）に溶解し、クロロスルホニルイソシアネート（８．６μＬ、０．０９９ｍｍｏｌ）を室温で添加した。室温で１５分間攪拌した後、Ｅｔ３Ｎ（６９．０μＬ、０．４９ｍｍｏｌ）を添加し、引き続いてＤＣＭ（１．０ｍＬ）に溶解した３３５（４０ｍｇ、０．０９９ｍｍｏｌ）とＥｔ３Ｎ（６９．０μＬ、０．４９ｍｍｏｌ）の混合物を添加した。この混合物を室温で１．５時間攪拌すると（混合物１）、粗３３９が得られた。別のバイアルで、３４０（ＤＢＣＯ－Ｃ２－ＯＨ、Ｂｒｏａｄｐｈａｒｍ）（３４．０ｍｇ、０．０９９ｍｍｏｌ）を室温でＤＣＭ（０．８ｍＬ）に溶解し、クロロスルホニルイソシアネート（７．７５μＬ、０．０８９ｍｍｏｌ）を添加した。室温で１５分間攪拌した後、Ｅｔ３Ｎ（６９．０μＬ、０．４９ｍｍｏｌ）、引き続いて粗３３９を添加した。室温でさらに２時間攪拌した後、反応混合物を真空中で濃縮し、シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中０％→１５％ＭｅＯＨ）によって精製し、その後、これをＥｔＯＡＣ（２×）と共蒸発させて、ＭｅＯＨを完全に除去した。生成物３４１が透明な黄色油（２０．０ｍｇ、０．０１７ｍｍｏｌ、１７％）として得られた。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ５０Ｈ７０Ｎ７Ｏ１８Ｓ２ ＋ （Ｍ＋Ｈ＋）の計算値１１２１．２６ 実測値１１２１．５９．
実施例７８．３４２の合成
３４１（２０．０ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（１．０ｍＬ）中溶液に、ビス（４－ニトロフェニル）カーボネート（５．６ｍｇ、０．０１９ｍｍｏｌ）及びＥｔ３Ｎ（７．５μＬ、０．０５３ｍｍｏｌ）を添加した。室温で４０時間攪拌した後、粗混合物を真空中で濃縮し、シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（勾配：Ａ．ＤＣＭ中０％→３０％ＥｔＯＡｃ（ｐ－ニトロフェノールが逃げるまで）、引き続いて勾配Ｂ．ＤＣＭ中０％→２０％ＭｅＯＨ）によって精製すると、３４２が透明な淡黄色油（６．９ｍｇ、０．００５ｍｍｏｌ、３０％）として得られた。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ５７Ｈ７３Ｎ８Ｏ２２Ｓ２ ＋ （Ｍ＋Ｈ＋）の計算値１２８６．３６ 実測値１２８６．５７．
実施例７９．３０８（ＬＤ０８）の合成
３４２（３．６ｍｇ、０．００２８ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ（３５．０μＬ）中溶液に、Ｅｔ３Ｎ（１．２μＬ、０．００８ｍｍｏｌ）及びｖｃ－ＰＡＢＣ－ＭＭＡＥ．ＴＦＡ（Ｌｅｖｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）の無水ＤＭＦ中ストック溶液（３４μＬ、３．４ｍｇ、０．００２８ｍｍｏｌ）を添加した。室温で２７時間攪拌した後、ＤＣＭ（４００μＬ）を添加し、粗混合物をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中０％→３０％ＭｅＯＨ）によって精製すると、３０８が無色フィルム（３．７ｍｇ、０．００１６ｍｍｏｌ、５８％）として得られた。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ１０９Ｈ１６１Ｎ１７Ｏ３１Ｓ２ ＋ （Ｍ／２＋Ｈ＋）の計算値１１３５．８４ 実測値１１３５．７３．
Figure 2023511857000067
実施例８０．３１０（ＬＤ１０）の合成
３４４（４．３ｍｇ、６．０μｍｏｌ、１．７当量）を含有するエッペンドルフバイアルに、ＤＭＦ中ｖｃ－ＰＡＢＣ－ＭＭＡＦ．ＴＦＡ塩（４．００ｍｇ、１００μＬ、３４．３１ミリモル濃度、３．４３μｍｏｌ、１．０当量）、引き続いてトリエチルアミン（１．４３μＬ、１０．３μｍｏｌ、３．０当量）を添加した。混合物を混合し、得られた無色溶液を室温でおよそ３時間放置した。次いで、反応混合物を、ＲＰ ＨＰＬＣ（カラムＸｂｒｉｄｇｅ ｐｒｅｐ Ｃ１８ ５μｍ ＯＢＤ、３０×１００ｍｍ、水（１％ＡｃＯＨ）中３０％→９０％ＭｅＣＮ（１％ＡｃＯＨ））を介して直接精製した。所望の生成物３１０が無色残渣（４．５ｍｇ、２．７μｍｏｌ、収率７９％）として得られた。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ８０Ｈ１３４Ｎ１５Ｏ２２ ＋ （Ｍ＋Ｈ＋）の計算値１６５６．９８． 実測値１６５７．０３．
Figure 2023511857000068
実施例８１．３４６の合成
１０２（５４．７ｍｇ、１．００当量、１７３μｍｏｌ）及び３４５（トリグリシン、２８．８ｍｇ、０．８７８当量、１５２μｍｏｌ）を含有するエッペンドルフバイアルに、脱水ＤＭＦ（２５０μＬ）及びトリエチルアミン（５２．７ｍｇ、７２．５μＬ、３当量、５２０μｍｏｌ）を添加した。得られた黄色懸濁液を室温で２１時間攪拌し、引き続いてＨ２Ｏ ５０μＬを反応混合物に添加した。反応混合物を室温でさらに１日攪拌し、さらなるＨ２Ｏ（２００μＬ）を添加し、反応混合物を室温でさらに３日間攪拌した。次に、ＭｅＣＮ（およそ０．５ｍＬ）及びさらなるＥｔ３Ｎ（およそ１０滴）を添加し、得られた懸濁液を室温で１時間攪拌した後、真空中で濃縮した。黄色残渣をＤＭＦ（６００μＬ）に溶解し、得られた黄色懸濁液をメンブレンフィルターで濾過した。メンブレンフィルターをさらなるＤＭＦ ２００μＬで洗浄し、合わせた濾液を、ＲＰ ＨＰＬＣ（カラムＸｂｒｉｄｇｅ ｐｒｅｐ Ｃ１８ ５μｍ ＯＢＤ、３０×１００ｍｍ、水（１％ＡｃＯＨ）中３０％→９０％ＭｅＣＮ（１％ＡｃＯＨ））を介して直接精製した。所望の生成物３４６が褐色油（４１．５ｍｇ、１１４μｍｏｌ、収率６６％）として得られた。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ１７Ｈ２４Ｎ３Ｏ６ ＋ （Ｍ＋Ｈ＋）の計算値３６６．１７． 実測値３６６．２７．
実施例８２．３４７の合成
３４６（２１．６ｍｇ、０．０５６ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ（０．３ｍＬ）中溶液に、ＤＩＰＥＡ（３０μＬ、０．１７１ｍｍｏｌ）及びＨＡＴＵ（２１．６ｍｇ、０．０５６ｍｍｏｌ）を添加した。室温で１０分間攪拌した後、ＤＣＭ（３１０μＬ）に溶解した３２０（７．３７ｍｇ、０．０３１ｍｍｏｌ）を添加した。室温で２４時間攪拌した後、混合物をＲＰ ＨＰＬＣ（カラムＸｂｒｉｄｇｅ ｐｒｅｐ Ｃ１８ ５μｍ ＯＢＤ、３０×１００ｍｍ、Ｈ２Ｏ中３０％→１００％ＭｅＣＮ（共に１％ＡｃＯＨを含有する））によって精製した。生成物３４７が灰白色油（５．２ｍｇ、０．００５ｍｍｏｌ、２０％）として得られた。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ４３Ｈ６４Ｎ９Ｏ１４ ＋ （Ｍ＋Ｈ＋）の計算値９３１．０２ 実測値９３１．６８．
実施例８３．３１１（ＬＤ１３）の合成
３４７（５．２ｍｇ、０．００５６ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ（２００μＬ）中溶液に、ビス（４－ニトロフェニル）カーボネート（１．９ｍｇ、０．００６ｍｍｏｌ）及びＥｔ３Ｎ（２．４μＬ、０．０１６ｍｍｏｌ）を添加した。室温で２７時間攪拌した後、ｖｃ－ＰＡＢＣ－ＭＭＡＥ．ＴＦＡのストック溶液（Ｌｅｖｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）（６６μＬ、６．６ｍｇ、０．００５３ｍｍｏｌ）及びＥｔ３Ｎ（２μＬ、０．０１４ｍｍｏｌ）を添加した。室温でさらに１７時間攪拌した後、粗混合物をＤＭＦ（２５０μＬ）で希釈し、ＲＰ ＨＰＬＣ（カラムＸｂｒｉｄｇｅ ｐｒｅｐ Ｃ１８ ５μｍ ＯＢＤ、３０×１００ｍｍ、Ｈ２Ｏ中５％→９０％ＭｅＣＮ（共に１％ＡｃＯＨを含有する））によって精製した。生成物３１１が透明な油（０．６ｍｇ、０．２８μｍｏｌ、５％）として得られた。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ１０２Ｈ１５６Ｎ１９Ｏ２７ ＋ （Ｍ／２＋Ｈ＋）の計算値１０４０．７１ 実測値１０４０．８５．
実施例８４．化合物３１２（ＬＤ１１）の合成
化合物３１２（ＬＤ１１）を、参照により組み込まれる、Ｖｅｒｋａｄｅら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ２０１８、７、ｄｏｉ：１０．３３９０／ａｎｔｉｂ７０１００１２によって記載される手順によって調製した。
Figure 2023511857000069
実施例８５．３１３（ＬＤ１２）の合成
３４８（２．７ｍｇ、１．１当量、４．９μｍｏｌ）を含有するバイアルに、ＤＭＦ（６０μＬ）及びニートなトリエチルアミン（１．９μＬ、３当量、１３μｍｏｌ）を添加した。次に、ＨＢＴＵの脱水ＤＭＦ中溶液（２．０ｍｇ、１１μＬ、４７２ミリモル濃度、１．２当量、５．３μｍｏｌ）を添加し、混合物を混合した。反応混合物を室温で３０分間放置し、引き続いてｖａ－ＰＡＢＣ－ＭＭＡＦ．ＴＦＡ塩（５．２ｍｇ、０．１３ｍＬ、３４．３１ミリモル濃度、１当量、４．４μｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を混合し、室温で１１０分間放置し、次いで、ＲＰ ＨＰＬＣ（カラムＸｂｒｉｄｇｅ ｐｒｅｐ Ｃ１８ ５μｍ ＯＢＤ、３０×１００ｍｍ、水（１％ＡｃＯＨ）中３０％→９０％ＭｅＣＮ（１％ＡｃＯＨ））を介して直接精製した。所望の生成物３１３が無色油（１．８ｍｇ、１．１μｍｏｌ、収率２６％）として得られた。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ７７Ｈ１２７Ｎ１２Ｏ２３ ＋ （Ｍ＋Ｈ＋）の計算値１５８７．９１． 実測値１５８８．０５．
Figure 2023511857000070
実施例８６．３５０の合成
メチルテトラジン－ＮＨＳエステル３４９（１９ｍｇ、０．０５７ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（４００μＬ）中溶液に、ＤＣＭ（８００μＬ）に溶解したアミノ－ＰＥＧ１１－アミン（４７ｍｇ、０．０８６ｍｍｏｌ）を添加した。室温で２０分間攪拌した後、混合物を真空中で濃縮し、シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中０→５０％ＭｅＯＨ（０．７Ｍ ＮＨ３））によって精製すると、所望の化合物３５０がピンク色油（１７ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ、３９％）として得られた。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ３５Ｈ６１Ｎ６Ｏ１２ ＋ （Ｍ＋Ｈ＋）の計算値７５７．８９ 実測値７５７．４６．
実施例８７．３５１の合成
１５１（Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－ＯＨ、１０ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ（５００μＬ）中攪拌溶液に、ＤＩＰＥＡ（１１μＬ、０．０６７ｍｍｏｌ）及びＨＡＴＵ（８．５ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ）を添加した。１０分後、無水ＤＭＦ（５００μＬ）に溶解した３５０（１７ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ）を添加した。室温で１８．５時間攪拌した後、混合物を真空中で濃縮し、シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中０→１７％ＭｅＯＨ）によって精製すると、所望の化合物３５１がピンク色油（２６ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ、定量的）として得られた。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ５６Ｈ８３Ｎ１０Ｏ１７ ＋（Ｍ＋ＮＨ４ ＋）の計算値１１６８．３２ 実測値１１６８．６７
実施例８８．１６９の合成
３５１（２６ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ（５００μＬ）中溶液に、ジエチルアミン（１２μＬ、０．１１ｍｍｏｌ）を添加した。室温で１．５時間攪拌した後、粗混合物をＲＰ ＨＰＬＣ（カラムＸｂｒｉｄｇｅ ｐｒｅｐ Ｃ１８ ５μｍ ＯＢＤ、３０×１００ｍｍ、Ｈ２Ｏ中５％→９０％ＭｅＣＮ（共に１％酢酸を含有する））によって精製した。生成物１６９が透明なピンク色油（１０．９ｍｇ、０．０１１ｍｍｏｌ、５３％）として得られた。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ４１Ｈ７０Ｎ９Ｏ１５ ＋ （Ｍ＋Ｈ＋）の計算値９２９．０５ 実測値９２９．６１．
Figure 2023511857000071
実施例８９．３５２の合成
３４９（メチルテトラジン－ＮＨＳエステル、１０．３ｍｇ、０．０３１ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（２００μＬ）中溶液に、ＤＣＭ（２００μＬ）に溶解したアミノ－ＰＥＧ２３－アミン（５０ｍｇ、０．０４６ｍｍｏｌ）を添加した。室温で５０分間攪拌した後、混合物を真空中で濃縮し、シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中０→６０％ＭｅＯＨ（０．７Ｍ ＮＨ３））によって精製すると、所望の化合物３５２がピンク色油（１７．７ｍｇ、０．０１３ｍｍｏｌ、４４％）として得られた。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ５９Ｈ１０９Ｎ６Ｏ２４ ＋ （Ｍ＋Ｈ＋）の計算値１２８６．５２ 実測値１２８６．７２．
実施例９０．３５３の合成
１５１（５．７ｍｇ、０．０１３ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ（５００μＬ）中攪拌溶液に、ＤＩＰＥＡ（７μＬ、０．０４ｍｍｏｌ）及びＨＡＴＵ（５．３ｍｇ、０．０１３ｍｍｏｌ）を添加した。１０分後、無水ＤＭＦ（５００μＬ）に溶解した３５２（１７．７ｍｇ、０．０１３ｍｍｏｌ）を添加した。室温で６時間攪拌した後、混合物を真空中で濃縮し、シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中０→１８％ＭｅＯＨ）によって精製すると、所望の化合物３５３がピンク色油（２１ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ、９１％）として得られた。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ８０Ｈ１３１Ｎ１０Ｏ２９ ＋ （Ｍ／２＋ＮＨ４ ＋）の計算値８５７．４５ 実測値８５７．０８
実施例９１．１７０の合成
３５３（２１ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ（５００μＬ）中溶液に、ジエチルアミン（６．７μＬ、０．０６ｍｍｏｌ）を添加した。室温で４時間攪拌した後、粗混合物をＲＰ ＨＰＬＣ（カラムＸｂｒｉｄｇｅ ｐｒｅｐ Ｃ１８ ５μｍ ＯＢＤ、３０×１００ｍｍ、Ｈ２Ｏ中５％→９０％ＭｅＣＮ（共に１％酢酸を含有する））によって精製した。生成物１７０がピンク色油（１１．６ｍｇ、０．００８ｍｍｏｌ、６６％）として得られた。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ６５Ｈ１１８Ｎ９Ｏ２７ ＋ （Ｍ＋Ｈ＋）の計算値１４５７．６８ 実測値１４５７．９２．
Figure 2023511857000072
実施例９２．３５６の合成
３５４（テトラフルオロフェニルアジド－ＮＨＳエステル、４０ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（１ｍＬ）中溶液に、３５５（Ｂｏｃ－ＮＨ－ＰＥＧ２－ＮＨ２、３３ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）及びＥｔ３Ｎ（５０μＬ、０．３６ｍｍｏｌ）を添加した。暗所中室温で３０分間攪拌した後、混合物を真空中で濃縮し、シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中０→７％ＭｅＯＨ）によって精製すると、所望の化合物３５６が透明な油（４７ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ、８４％）として得られた。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ１８Ｈ２４Ｆ４Ｎ５Ｏ５ ＋ （Ｍ＋Ｈ＋）の計算値４６６．４１ 実測値４６６．２３．
実施例９３．３５７の合成
３５６（４７ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（２ｍＬ）中溶液に、ジオキサン中４．０Ｍ ＨＣｌ（３００μＬ）を添加した。暗所中室温で１７．５時間攪拌した後、混合物を濃縮すると、３５７が白色固体として定量的収率（３６ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）で得られた。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ１３Ｈ１６Ｆ４Ｎ５Ｏ３ ＋ （Ｍ＋Ｈ＋）の計算値３６６．２９ 実測値３６６．２０．
実施例９４．３５８の合成
１５１（Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－ＯＨ、４２ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ（６００μＬ）中攪拌溶液に、ＤＩＰＥＡ（５０μＬ、０．３０ｍｍｏｌ）及びＨＡＴＵ（３９ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）を添加した。暗所中で１５分後、無水ＤＭＦ（５００μＬ）に溶解した３５７（３６ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）を添加した。暗所中室温で４１時間攪拌した後、混合物を真空中で濃縮し、シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中０→２０％ＭｅＯＨ）によって精製すると、所望の化合物３５８が透明な油（３６ｍｇ、０．０４７ｍｍｏｌ、４７％）として得られた。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ３４Ｈ３５Ｆ４Ｎ８Ｏ８ ＋ （Ｍ＋Ｈ＋）の計算値７５９．６８ 実測値７５９．３８．
実施例９５．１７１の合成
３５８（３６ｍｇ、０．０４７ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ（７５０μＬ）中溶液に、ジエチルアミン（２４μＬ、０．２４ｍｍｏｌ）を添加した。暗所中室温で５５分間攪拌した後、粗混合物をＲＰ ＨＰＬＣ（カラムＸｂｒｉｄｇｅ ｐｒｅｐ Ｃ１８ ５μｍ ＯＢＤ、３０×１００ｍｍ、Ｈ２Ｏ中５％→９０％ＭｅＣＮ（共に１％酢酸を含有する））によって精製した。生成物１７１が透明な油（１８．７ｍｇ、０．０３４ｍｍｏｌ、７４％）として得られた。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ１９Ｈ２５Ｆ４Ｎ８Ｏ６ ＋ （Ｍ＋Ｈ＋）の計算値５３７．４５ 実測値５３７．２９．
Figure 2023511857000073
実施例９６．３５９の合成
１０２（５６ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（８ｍＬ）中溶液に、アミノ－ＰＥＧ２４－アルコール（２１４ｍｇ、０．１９９ｍｍｏｌ）及びＥｔ３Ｎ（８０μＬ、０．５３ｍｍｏｌ）を添加した。室温で２０時間攪拌した後、溶媒を真空中で減少させ、残渣をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中２→３０％ＭｅＯＨ）によって精製すると、所望の化合物３５９が黄色油として収率９５％（２１０ｍｇ、０．１６８ｍｍｏｌ）で得られた。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ５９Ｈ１１１ＮＯ２６Ｎａ＋ （Ｍ＋Ｎａ＋）の計算値１２７３．５０ 実測値１２７３．０７．
実施例９７．３６０の合成
３５９（１７０ｍｇ、０．１３６ｍｍｏｌ）及び４－ニトロフェニルクロロホルメート（４４ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（７ｍＬ）中溶液に、Ｅｔ３Ｎ（６３μＬ、０．４０ｍｍｏｌ）を添加した。室温で４１時間攪拌した後、溶媒を減少させ、残渣をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中０→１０％ＭｅＯＨ）によって精製すると、所望の化合物３６０が透明な油として収率６７％（１２９ｍｇ、０．０９１ｍｍｏｌ）で得られた。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ６６Ｈ１１４Ｎ２Ｏ３０Ｎａ＋ （Ｍ＋Ｎａ＋）の計算値１４３８．５９ 実測値１４３８．１３．
実施例９８．１７３の合成
３６０（１６ｍｇ、０．０１１ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ（８００μＬ）中溶液に、１６７（ペプチドＨ－ＬＰＥＴＧＧ－ＯＨ、６．５ｍｇ、０．０１１ｍｍｏｌ）及びＥｔ３Ｎ（５μＬ、０．０４ｍｍｏｌ）を添加した。室温で９５時間攪拌した後、粗混合物をＲＰ ＨＰＬＣ（カラムＸｂｒｉｄｇｅ ｐｒｅｐ Ｃ１８ ５μｍ ＯＢＤ、３０×１００ｍｍ、Ｈ２Ｏ中５％→９０％ＭｅＣＮ（共に１％酢酸を含有する））によって精製した。生成物１７３が透明な油（１２．６ｍｇ、０．００６８ｍｍｏｌ、６２％）として得られた。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ８４Ｈ１５３Ｎ８Ｏ３７ ＋ （Ｍ／２＋ＮＨ４ ＋）の計算値９４２．５５ 実測値９２４．２６．
Figure 2023511857000074
実施例９９．１７４の合成
３６１（メチルテトラジン－ＰＥＧ５－ＮＨＳエステル、６．１ｍｇ、０．０１１ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ（２３０μＬ）中溶液に、ペプチドＨ－ＬＰＥＴＧＧ－ＯＨ（６．５ｍｇ、０．０１１ｍｍｏｌ）及びＥｔ３Ｎ（４μＬ、０．０２８ｍｍｏｌ）を添加した。室温で２２時間攪拌した後、粗混合物をＲＰ ＨＰＬＣ（カラムＸｂｒｉｄｇｅ ｐｒｅｐ Ｃ１８ ５μｍ ＯＢＤ、３０×１００ｍｍ、Ｈ２Ｏ中５％→９０％ＭｅＣＮ（共に１％酢酸を含有する））によって精製した。生成物１７４が透明なピンク色油（９．９ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ、９１％）として得られた。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ４４Ｈ７０Ｎ１１Ｏ１６ ＋ （Ｍ＋ＮＨ４ ＋）の計算値１００９．０９ 実測値１００９．６１．
Figure 2023511857000075
実施例１００．３６２の合成
３５４（３１ｍｇ、０．０９３ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（１ｍＬ）中溶液に、１８１（５６ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）及びＥｔ３Ｎ（４０μＬ、０．２８ｍｍｏｌ）を添加した。暗所中室温で２５分間攪拌した後、混合物を真空中で濃縮し、シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中０→１５％ＭｅＯＨ）によって精製すると、所望の化合物３６２が透明な油（５５ｍｇ、０．０７２ｍｍｏｌ、７７％）として得られた。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ３１Ｈ５１Ｆ４Ｎ４Ｏ１３ ＋ （Ｍ＋Ｈ＋）の計算値７６３．７５ 実測値７６３．０８．
実施例１０１．３６３の合成
３６２（５５ｍｇ、０．０７２ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（２ｍＬ）中溶液に、４－ニトロフェニルクロロホルメート（１３ｍｇ、０．０６４ｍｍｏｌ）及びＥｔ３Ｎ（３０μＬ、０．２１ｍｍｏｌ）を添加した。暗所中室温で２１時間攪拌した後、混合物を真空中で濃縮し、ＲＰ ＨＰＬＣ（カラムＸｂｒｉｄｇｅ ｐｒｅｐ Ｃ１８ ５μｍ ＯＢＤ、３０×１００ｍｍ、水（１％ＡｃＯＨ）中５％→９０％ＭｅＣＮ（１％ＡｃＯＨ））によって精製した。生成物３６３が黄色油（１３．３ｍｇ、０．０１４ｍｍｏｌ、２０％）として得られた。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ３８Ｈ５４Ｆ４Ｎ５Ｏ１７ ＋ （Ｍ＋Ｈ＋）の計算値９２８．８５ 実測値９２８．５７．
実施例１０２．１７５の合成
３６３（１３．３ｍｇ、０．０１４ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ（３００μＬ）中溶液に、１６７（ペプチドＨ－ＬＰＥＴＧＧ－ＯＨ、８．２ｍｇ、０．０１４ｍｍｏｌ）及びＥｔ３Ｎ（６μＬ、０．０４３ｍｍｏｌ）を添加した。暗所中で２６時間後、粗混合物をＲＰ ＨＰＬＣ（カラムＸｂｒｉｄｇｅ ｐｒｅｐ Ｃ１８ ５μｍ ＯＢＤ、３０×１００ｍｍ、Ｈ２Ｏ中５％→９０％ＭｅＣＮ（共に１％酢酸を含有する））によって精製した。生成物１７５が透明な油（１１．４ｍｇ、０．００８４ｍｍｏｌ、５９％）として得られた。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ５６Ｈ８９Ｆ４Ｎ１０Ｏ２４ ＋ （Ｍ＋Ｈ＋）の計算値１３６２．３５ 実測値１３６２．８１．
Figure 2023511857000076
実施例１０３．３６５の合成
１５１（Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－ＯＨ、２０ｍｇ、０．０４９ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ（３５０μＬ）中攪拌溶液に、ＤＩＰＥＡ（２５μＬ、０．１５ｍｍｏｌ）及びＨＡＴＵ（１８ｍｇ、０．０４９ｍｍｏｌ）を添加した。１０分後、無水に溶解した化合物３６４（Ｎ－Ｂｏｃ－エチレンジアミン、７．８ｍｇ、０．０４９ｍｍｏｌ）を添加した。室温で４５分間攪拌した後、混合物を真空中で濃縮し、シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中０→３０％ＭｅＯＨ）によって精製すると、所望の化合物３６５が透明な油（１２．４ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ、４６％）として得られた。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ２８Ｈ３６Ｎ５Ｏ７ ＋ （Ｍ＋Ｈ＋）の計算値５５４．６１ 実測値５５４．４６．
実施例１０４．３６６の合成
３６５（１２．４ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（０．７ｍＬ）中攪拌溶液に、ジオキサン中４．０Ｍ ＨＣｌ（４００μＬ）を添加した。室温で１時間攪拌した後、混合物を濃縮すると、３６６が白色固体（１１ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ、定量的）として得られた。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ２３Ｈ２８Ｎ５Ｏ７＋ （Ｍ＋Ｈ＋）の計算値５４５．５０ 実測値４５４．３３
実施例１０５．１７６の合成
１９１（８ｍｇ、０．００５９ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ（３００μＬ）中溶液に、Ｅｔ３Ｎ（２．５μＬ、０．０１７ｍｍｏｌ）及び３６６の無水ＤＭＦ中ストック（１１０μＬ、３．０ｍｇ、０．００５９ｍｍｏｌ）を添加した。室温で１８時間攪拌した後、ジエチルアミン（２μＬ）を添加した。さらに２時間後、混合物をＲＰ ＨＰＬＣ（カラムＸｂｒｉｄｇｅ ｐｒｅｐ Ｃ１８ ５μｍ ＯＢＤ、３０×１００ｍｍ、Ｈ２Ｏ中５％→９０％ＭｅＣＮ（共に１％酢酸を含有する））によって精製した。生成物１７６が透明な油（１．３ｍｇ、０．０００９ｍｍｏｌ、１５％）として得られた。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ６０Ｈ１０３Ｎ１０Ｏ２６Ｓ２ ＋ （Ｍ＋Ｈ＋）の計算値１４４４．６４ 実測値１４４４．７５．
実施例１０６．抗４－１ＢＢ ＰＦ３１
抗４－１ＢＢ ｓｃＦｖを、Ｃ末端ソルターゼＡ認識配列、引き続いてＨｉｓタグ（アミノ酸配列は配列番号４によって識別される）を用いて設計した。抗４－１ＢＢ ｓｃＦｖをＨＥＫ２９３細胞で一過的に発現させ、引き続いてＡｂｓｏｌｕｔｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｌｔｄ（英国、オックスフォード）によるＩＭＡＣ精製を行った。質量スペクトル分析は、１つの主生成物（実測質量２８０１３Ｄａ、予測質量２８０１８Ｄａ）を示した。
実施例１０７．ＳＹＲ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ１５（ＰＦ１８）のｐＥＴ３２ａ発現ベクターへのクローニング
ＳＹＲ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ１５（ＰＦ１８）（アミノ酸配列は配列番号５によって識別される）を、Ｎ末端（Ｍ）ＳＹＲ配列を用いて設計し、メチオニンを発現後に切断してＮ末端セリン、及びＳＹＲ配列とＩＬ１５との間のフレキシブル（Ｇ４Ｓ）３スペーサーを残す。コドン最適化ＤＮＡ配列を、ｐＥＴ３２Ａ発現ベクターのＮｄｅＩとＸｈｏＩとの間に挿入し、それによって、チオレドキシン融合タンパク質をコードする配列を除去し、米国ピスカタウェイのＧｅｎｓｃｒｉｐｔから入手した。
実施例１０８．ＳＹＲ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ１５（ＰＦ１８）の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現及び封入体単離
ＳＹＲ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ１５（ＰＦ１８）の発現は、プラスミド（ｐＥＴ３２ａ－ＳＹＲ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ１５）のＢＬ２１細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）への形質転換により開始する。形質転換細胞を、アンピシリンを含むＬＢ寒天上に蒔き、３７℃で一晩インキュベートした。単一コロニーを摘み取り、これを使用して５０ｍＬのＴＢ培地＋アンピシリンに接種し、引き続いて３７℃で一晩インキュベートした。次に、一晩培養物を使用して１０００ｍＬのＴＢ培地＋アンピシリンに接種した。培養物を１６０ＲＰＭにおいて３７℃でインキュベートし、ＯＤ６００が１．５に達したら、１ｍＭ ＩＰＴＧ（１ｍＬの１Ｍストック溶液）で誘導した。１６０ＲＰＭにおいて３７℃で１６時間超の誘導後、培養物を遠心分離（５０００×ｇ－５分間）によってペレット化した。１０００ｍＬ培養物から得た細胞ペレットを、１５００ユニットのＢｅｎｚｏｎａｓｅを含む６０ｍＬのバグバスター（ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ）（商標）に溶解し、ローラーバンク上室温で３０分間インキュベートした。溶解後、不溶性画分を遠心分離（１５分間、１５０００×ｇ）によって可溶性画分から分離した。不溶性画分の半分を、リゾチーム（最終濃度：２００μｇ／ｍＬ）を含む３０ｍＬのバグバスター（商標）に溶解し、ローラーバンク上で１０分間インキュベートした。次に、溶液を６倍体積の１：１０希釈バグバスター（商標）で希釈し、１５分間、１５０００×ｇで遠心分離した。ペレットを２００ｍＬの１：１０希釈バグバスター（商標）にホモジナイザーを使用することによって再懸濁し、１０分間、１２０００×ｇで遠心分離した。最後のステップを３回繰り返した。
実施例１０９．単離した封入体からのＳＹＲ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ１５（ＰＦ１８）のリフォールディング
ＳＹＲ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ１５（ＰＦ１８）を含有する精製した封入体を、４０ｍＭシステアミン及び２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０を含む３０ｍＬの５Ｍグアニジンに溶解し、変性させた。懸濁液を１６．０００×ｇで５分間遠心分離して、残っている細胞片をペレット化した。上清を、４０ｍＭシステアミン及び２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０を含む５Ｍグアニジンで１ｍｇ／ｍＬに希釈し、ローラーバンク上室温で２時間インキュベートした。１ｍｇ／ｍＬ溶液を、４℃の低温室中、１０倍体積のリフォールディング緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０．５３ｍＭ ＮａＣｌ、０．４４ｍＭ ＫＣｌ、２．２ｍＭ ＭｇＣｌ２、２．２ｍＭ ＣａＣｌ２、０．０５５％ＰＥＧ－４０００、０．５５Ｍ Ｌ－アルギニン、４ｍＭシステアミン、４ｍＭシスタミン、ｐＨ８．０）に滴加する（攪拌を要する）。溶液を４℃で少なくとも２４時間放置する。スペクトラム（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ）（商標）スペクトラ／ポア（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ）（商標）３ ＲＣ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｔｕｂｉｎｇ ３５００ダルトンＭＷＣＯを使用して、溶液を１０ｍＭ ＮａＣｌ及び２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０に１×一晩及び２×４時間透析する。リフォールディングしたＳＹＲ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ１５（ＰＦ１８）を、ＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ－１０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で平衡化Ｑトラップ陰イオン交換カラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈ ｃａｒｅ）に充填した。カラムを最初に緩衝液Ａ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）で洗浄した。保持されたタンパク質を緩衝液Ｂ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）で、緩衝液Ａから緩衝液Ｂまでの３０ｍＬの勾配で溶出した。質量分析は、ＰＦ１８に対応する１４１２２Ｄａの重量（予測質量：１４１２２Ｄａ）を示した。ＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ－１０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上ハイプレップ（ＨｉＰｒｅｐ）（商標）２６／１０脱塩カラム（Ｃｙｔｉｖａ）を使用して、精製したＳＹＲ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ１５（ＰＦ１８）をＰＢＳに緩衝液交換した。
実施例１１０．ＳＹＲ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ１５Ｒａ－リンカー－ＩＬ１５（ＰＦ２６）のｐＥＴ３２ａ発現ベクターへのクローニング
ＳＹＲ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ１５Ｒａ－リンカー－ＩＬ１５（ＰＦ２６）（アミノ酸配列は配列番号６によって識別される）を、Ｎ末端（Ｍ）ＳＹＲ配列を用いて設計し、メチオニンを発現後に切断してＮ末端セリン、及びＳＹＲ配列とＩＬ１５Ｒａ－リンカー－ＩＬ１５との間のフレキシブル（Ｇ４Ｓ）３スペーサーを残す。コドン最適化ＤＮＡ配列を、ｐＥＴ３２Ａ発現ベクターのＮｄｅＩとＸｈｏＩとの間に挿入し、それによって、チオレドキシン融合タンパク質をコードする配列を除去し、米国ピスカタウェイのＧｅｎｓｃｒｉｐｔから入手した。
実施例１１１．ＳＹＲ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ１５Ｒａ－リンカー－ＩＬ１５（ＰＦ２６）の大腸菌発現及び封入体単離
ＳＹＲ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ１５Ｒａ－リンカー－ＩＬ１５（ＰＦ２６）の発現は、プラスミド（ｐＥＴ３２ａ－ＳＹＲ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ１５Ｒａ－リンカー－ＩＬ１５）のＢＬ２１細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）への形質転換により開始する。次のステップは、ＢＬ２１細胞での１０００ｍＬの培養物（ＴＢ培地＋アンピシリン）への接種であった。ＯＤ６００が１．５に達したら、培養物を１ｍＭ ＩＰＴＧ（１ｍＬの１Ｍストック溶液）で誘導した。１６０ＲＰＭにおいて３７℃で１６時間超の誘導後、培養物を遠心分離（５０００×ｇ－５分間）によってペレット化した。１０００ｍＬ培養物から得た細胞ペレットを、１５００ユニットのＢｅｎｚｏｎａｓｅを含む６０ｍＬのバグバスター（商標）に溶解し、ローラーバンク上室温で３０分間インキュベートした。溶解後、不溶性画分を遠心分離（１５分間、１５０００×ｇ）によって可溶性画分から分離した。不溶性画分の半分を、リゾチーム（最終濃度：２００μｇ／ｍＬ）を含む３０ｍＬのバグバスター（商標）に溶解し、ローラーバンク上で１０分間インキュベートした。次に、溶液を６倍体積の１：１０希釈バグバスター（商標）で希釈し、１５分間、１５０００×ｇで遠心分離した。ペレットを２００ｍＬの１：１０希釈バグバスター（商標）にホモジナイザーを使用することによって再懸濁し、１０分間、１２０００×ｇで遠心分離した。最後のステップを３回繰り返した。
実施例１１２．単離した封入体からのＳＹＲ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ１５Ｒａ－リンカー－ＩＬ１５（ＰＦ２６）のリフォールディング
ＳＹＲ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ１５Ｒａ－リンカー－ＩＬ１５（ＰＦ２６）を含有する精製した封入体を、４０ｍＭシステアミン及び２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０を含む３０ｍＬの５Ｍグアニジンに溶解し、変性させた。懸濁液を１６．０００×ｇで５分間遠心分離して、残っている細胞片をペレット化した。上清を、４０ｍＭシステアミン及び２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０を含む５Ｍグアニジンで１ｍｇ／ｍＬに希釈し、ローラーバンク上室温で２時間インキュベートした。１ｍｇ／ｍＬ溶液を、４℃の低温室中、１０倍体積のリフォールディング緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０．５３ｍＭ ＮａＣｌ、０．４４ｍＭ ＫＣｌ、２．２ｍＭ ＭｇＣｌ２、２．２ｍＭ ＣａＣｌ２、０．０５５％ＰＥＧ－４０００、０．５５Ｍ Ｌ－アルギニン、４ｍＭシステアミン、４ｍＭシスタミン、ｐＨ８．０）に滴加する（攪拌を要する）。溶液を４℃で少なくとも２４時間放置する。スペクトラム（商標）スペクトラ／ポア（商標）３ ＲＣ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｔｕｂｉｎｇ ３５００ダルトンＭＷＣＯを使用して、溶液を１０ｍＭ ＮａＣｌ及び２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０に１×一晩及び２×４時間透析する。リフォールディングしたＳＹＲ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ１５Ｒａ－リンカー－ＩＬ１５（ＰＦ２６）を、ＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ－１０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で平衡化Ｑトラップ陰イオン交換カラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈ ｃａｒｅ）に充填した。カラムを最初に緩衝液Ａ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）で洗浄した。保持されたタンパク質を緩衝液Ｂ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）で、緩衝液Ａから緩衝液Ｂまでの３０ｍＬの勾配で溶出した。質量分析は、ＰＦ２６に対応する２４１４６Ｄａの重量（予測質量：２４１４６Ｄａ）を示した。ＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ－１０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上ハイプレップ（商標）２６／１０脱塩カラム（ｃｙｔｉｖａ製）を使用して、精製したＳＹＲ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ１５Ｒａ－リンカー－ＩＬ１５（ＰＦ２６）をＰＢＳに緩衝液交換した。
実施例１１３．ヒト化ＯＫＴ３ ２００
Ｃ末端ソルターゼＡ認識配列（Ｃ末端タグは配列番号１によって識別される）を有するヒト化ＯＫＴ３（ｈＯＫＴ３）をＡｂｓｏｌｕｔｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｌｔｄ（英国、オックスフォード）から入手した。質量スペクトル分析は、１つの主生成物（実測質量２８８３６Ｄａ）を示した。
実施例１１４．ｈＯＫＴ３－ＰＥＧ２－ＢＣＮ ２０１を得るためのソルターゼＡを使用した化合物ＧＧＧ－ＰＥＧ２－ＢＣＮ（１５７）のｈＯＫＴ３ ２００へのＣ末端ソルタギング
ソルターゼＡ（配列番号２によって識別される）を使用したＣ末端ソルタギングによって、本発明によるバイオコンジュゲートを調製した。ｈＯＫＴ３ ２００の溶液（５００μＬ、５００μｇ、ＰＢＳ ｐＨ７．４中３５μＭ）に、ソルターゼＡ（５８μＬ、３８４μｇ、ＴＢＳ ｐＨ７．５中３０２μＭ＋１０％グリセロール）、ＧＧＧ－ＰＥＧ２－ＢＣＮ（１５７、２８μＬ、ＤＭＳＯ中５０ｍＭ）、ＣａＣｌ２（６９μＬ、ＭＱ中１００ｍＭ）及びＴＢＳ ｐＨ７．５（３９μＬ）を添加した。反応物を３７℃で一晩インキュベートし、引き続いてＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ－１００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上Ｈｉｓ－ｔｒａｐ ｅｘｃｅｌ １ｍＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。カラムを緩衝液Ａ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．５）と平衡化し、試料を１ｍＬ／分で充填した。フロースルーを回収すると、質量スペクトル分析は、２０１に対応する１つの主生成物（実測質量２７８２９Ｄａ）を示した。試料をＰＢＳ ｐＨ７．４に対して透析し、スピンフィルトレーション（ｓｐｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５、Ｕｌｔｒａｃｅｌ－１０ Ｍｅｍｂｒａｎｅ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によって濃縮すると、ｈＯＫＴ３－ＰＥＧ２－ＢＣＮ ２０１（６０μＬ、１６９μｇ、ＰＢＳ ｐＨ７．４中１０１μＭ）が得られた。
実施例１１５．ｈＯＫＴ３－ＰＥＧ２－ＢＣＮ ２０１を得るためのソルターゼＡ ペンタ変異体（ｐｅｎｔａｍｕｔａｎｔ）を使用した化合物ＧＧＧ－ＰＥＧ２－ＢＣＮ（１５７）のｈＯＫＴ３ ２００へのＣ末端ソルタギング
ソルターゼＡペンタ変異体（ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号７１０４６）を使用したＣ末端ソルタギングによって、本発明によるバイオコンジュゲートを調製した。ｈＯＫＴ３ ２００の溶液（１４．３μＬ、１４μｇ、ＰＢＳ ｐＨ７．４中３５μＭ）に、ソルターゼＡペンタ変異体（０．５μＬ、１μｇ、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０中９２μＭ、１１０ｍＭ ＮａＣｌ、２．２ｍＭ ＫＣｌ、４００ｍＭイミダゾール及び２０％グリセロール）、ＧＧＧ－ＰＥＧ２－ＢＣＮ（１５７、２μＬ、ＤＭＳＯ：ＭＱ＝２：３中２０ｍＭ）、ＣａＣｌ２（２μＬ、ＭＱ中１００ｍＭ）及びＴＢＳ ｐＨ７．５（１．２μＬ）を添加した。反応物を３７℃で一晩インキュベートした。質量スペクトル分析は、ｈＯＫＴ３－ＰＥＧ２－ＢＣＮ ２０１に対応する１つの主生成物（実測質量２７８２９Ｄａ）を示した。
実施例１１６．ｈＯＫＴ３－ＰＥＧ１１－ＢＣＮ ２０２を得るためのソルターゼＡを使用した化合物ＧＧＧ－ＰＥＧ１１－ＢＣＮ（１６１）のｈＯＫＴ３ ２００へのＣ末端ソルタギング
ソルターゼＡ（配列番号２によって識別される）を使用したＣ末端ソルタギングによって、本発明によるバイオコンジュゲートを調製した。ｈＯＫＴ３ ２００の溶液（１４．３μＬ、１４μｇ、ＰＢＳ ｐＨ７．４中３５μＭ）に、ソルターゼＡ（０．９μＬ、１２μｇ、ＴＢＳ ｐＨ７．５中５８２μＭ＋１０％グリセロール）、ＧＧＧ－ＰＥＧ１１－ＢＣＮ（１６１、２μＬ、ＭＱ中２０ｍＭ）、ＣａＣｌ２（２μＬ、ＭＱ中１００ｍＭ）及びＴＢＳ ｐＨ７．５（０．９μＬ）を添加した。反応物を３７℃で一晩インキュベートした。質量スペクトル分析は、ソルターゼＡに対応する１つの主生成物（実測質量２１９５１Ｄａ、およそ８５％）、ｈＯＫＴ３－ＰＥＧ１１－ＢＣＮ ２０２に対応する少量生成物（実測質量２８２２７Ｄａ、およそ５％）、及び２つの他の少量生成物（実測質量２８０５１Ｄａ及び２８３２５Ｄａ、それぞれおよそ５％）を示した。
実施例１１７．ｈＯＫＴ３－ＰＥＧ１１－ＢＣＮ ２０２を得るためのソルターゼＡペンタ変異体を使用した化合物ＧＧＧ－ＰＥＧ１１－ＢＣＮ（１６１）のｈＯＫＴ３ ２００へのＣ末端ソルタギング
ソルターゼＡペンタ変異体（ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号７１０４６）を使用したＣ末端ソルタギングによって、本発明によるバイオコンジュゲートを調製した。ｈＯＫＴ３ ２００の溶液（１４．３μＬ、１４μｇ、ＰＢＳ ｐＨ７．４中３５μＭ）に、ソルターゼＡペンタ変異体（０．５μＬ、１μｇ、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０中９２μＭ、１１０ｍＭ ＮａＣｌ、２．２ｍＭ ＫＣｌ、４００ｍＭイミダゾール及び２０％グリセロール）、ＧＧＧ－ＰＥＧ１１－ＢＣＮ（１６１、２μＬ、ＭＱ中２０ｍＭ）、ＣａＣｌ２（２μＬ、ＭＱ中１００ｍＭ）及びＴＢＳ ｐＨ７．５（１．２μＬ）を添加した。反応物を３７℃で一晩インキュベートした。質量スペクトル分析は、ｈＯＫＴ３－ＰＥＧ１１－ＢＣＮ ２０２に対応する１つの主生成物（実測質量２８２２５Ｄａ、およそ６０％）、及び１つの少量生成物（実測質量２８３２６Ｄａ、およそ４０％）を示した。
実施例１１８．ｈＯＫＴ３－ＰＥＧ２３－ＢＣＮ ２０３を得るためのソルターゼＡを使用した化合物ＧＧＧ－ＰＥＧ２３－ＢＣＮ（１６３）のｈＯＫＴ３ ２００へのＣ末端ソルタギング
ソルターゼＡ（配列番号２によって識別される）を使用したＣ末端ソルタギングによって、本発明によるバイオコンジュゲートを調製した。ｈＯＫＴ３ ２００の溶液（１４．３μＬ、１４μｇ、ＰＢＳ ｐＨ７．４中３５μＭ）に、ソルターゼＡ（０．９μＬ、１２μｇ、ＴＢＳ ｐＨ７．５中５８２μＭ＋１０％グリセロール）、ＧＧＧ－ＰＥＧ２３－ＢＣＮ（１６３、２μＬ、ＭＱ中２０ｍＭ）、ＣａＣｌ２（２μＬ、ＭＱ中１００ｍＭ）及びＴＢＳ ｐＨ７．５（０．９μＬ）を添加した。反応物を３７℃で一晩インキュベートした。質量スペクトル分析は、ソルターゼＡに対応する１つの主生成物（実測質量２１９５１Ｄａ、およそ７０％）、及びｈＯＫＴ３－ＰＥＧ２３－ＢＣＮ ２０３に対応する１つの少量生成物（実測質量２８７５５Ｄａ、およそ３０％）を示した。
実施例１１９．ｈＯＫＴ３－ＰＥＧ２３－ＢＣＮ ２０３を得るためのソルターゼＡペンタ変異体を使用した化合物ＧＧＧ－ＰＥＧ２３－ＢＣＮ（１６３）のｈＯＫＴ３ ２００へのＣ末端ソルタギング
ソルターゼＡペンタ変異体（ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号７１０４６）を使用したＣ末端ソルタギングによって、本発明によるバイオコンジュゲートを調製した。ｈＯＫＴ３ ２００の溶液（１４．３μＬ、１４μｇ、ＰＢＳ ｐＨ７．４中３５μＭ）に、ソルターゼＡペンタ変異体（０．５μＬ、１μｇ、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０中９２μＭ、１１０ｍＭ ＮａＣｌ、２．２ｍＭ ＫＣｌ、４００ｍＭイミダゾール及び２０％グリセロール）、ＧＧＧ－ＰＥＧ２３－ＢＣＮ（１６３、２μＬ、ＭＱ中２０ｍＭ）、ＣａＣｌ２（２μＬ、ＭＱ中１００ｍＭ）及びＴＢＳ ｐＨ７．５（１．２μＬ）を添加した。反応物を３７℃で一晩インキュベートした。質量スペクトル分析は、ｈＯＫＴ３－ＰＥＧ２３－ＢＣＮ ２０３に対応する１つの主生成物（実測質量２８７５４Ｄａ）を示した。
実施例１２０．ｈＯＫＴ３－ＰＥＧ４－テトラジン ２０４を得るためのソルターゼＡを使用した化合物ＧＧＧ－ＰＥＧ４－テトラジン（１５４）のｈＯＫＴ３ ２００へのＣ末端ソルタギング
ソルターゼＡ（配列番号２によって識別される）を使用したＣ末端ソルタギングによって、本発明によるバイオコンジュゲートを調製した。ｈＯＫＴ３ ２００の溶液（５００μＬ、５００μｇ、ＰＢＳ ｐＨ７．４中３５μＭ）に、ソルターゼＡ（５８μＬ、３８４μｇ、ＴＢＳ ｐＨ７．５中３０２μＭ＋１０％グリセロール）、ＧＧＧ－ＰＥＧ４－テトラジン（１５４、３５μＬ、ＭＱ中４０ｍＭ）、ＣａＣｌ２（６９μＬ、ＭＱ中１００ｍＭ）及びＴＢＳ ｐＨ７．５（３２μＬ）を添加した。反応物を３７℃で一晩インキュベートし、引き続いてＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ－１００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上Ｈｉｓ－ｔｒａｐ ｅｘｃｅｌ １ｍＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。カラムを緩衝液Ａ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．５）と平衡化し、試料を１ｍＬ／分で充填した。フロースルーを回収すると、質量スペクトル分析は、１０４に対応する１つの主生成物（実測質量２７８６８Ｄａ）を示した。試料をＰＢＳ ｐＨ７．４に対して透析し、スピンフィルトレーション（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５、Ｕｌｔｒａｃｅｌ－１０ Ｍｅｍｂｒａｎｅ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によって濃縮すると、ｈＯＫＴ３－ＰＥＧ４－テトラジン ２０４（７０μＬ、２７７μｇ、ＰＢＳ ｐＨ７．４中１４３μＭ）が得られた。
実施例１２１．ｈＯＫＴ３－ＰＥＧ４－テトラジン ２０４を得るためのソルターゼＡペンタ変異体を使用した化合物ＧＧＧ－ＰＥＧ４－テトラジン（１５４）のｈＯＫＴ３ ２００へのＣ末端ソルタギング
ソルターゼＡペンタ変異体（ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号７１０４６）を使用したＣ末端ソルタギングによって、本発明によるバイオコンジュゲートを調製した。ｈＯＫＴ３ ２００の溶液（１４．３μＬ、１４μｇ、ＰＢＳ ｐＨ７．４中３５μＭ）に、ソルターゼＡペンタ変異体（０．５μＬ、１μｇ、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０中９２μＭ、１１０ｍＭ ＮａＣｌ、２．２ｍＭ ＫＣｌ、４００ｍＭイミダゾール及び２０％グリセロール）、ＧＧＧ－ＰＥＧ４－テトラジン（１５４、２μＬ、ＭＱ中２０ｍＭ）、ＣａＣｌ２（２μＬ、ＭＱ中１００ｍＭ）及びＴＢＳ ｐＨ７．５（１．２μＬ）を添加した。反応物を３７℃で一晩インキュベートした。質量スペクトル分析は、ｈＯＫＴ３－ＰＥＧ４－テトラジン ２０４に対応する１つの主生成物（実測質量２７８６８Ｄａ）を示した。
実施例１２２．ｈＯＫＴ３－ＰＥＧ１１－テトラジン ＰＦ０１を得るためのソルターゼＡを使用したＧＧＧ－ＰＥＧ１１－テトラジン（１６９）のｈＯＫＴ３ ２００へのＣ末端ソルタギング
ソルターゼＡ（配列番号２によって識別される）を使用したＣ末端ソルタギングによって、本発明によるバイオコンジュゲートを調製した。ｈＯＫＴ３ ２００の溶液（１９０８μＬ、５ｍｇ、ＰＢＳ ｐＨ７．４中９１μＭ）に、ソルターゼＡ（８１μＬ、９４８μｇ、ＴＢＳ ｐＨ７．５中５３３μＭ＋１０％グリセロール）、ＧＧＧ－ＰＥＧ１１－テトラジン（１６９、３４７μＬ、ＭＱ中２０ｍＭ）、ＣａＣｌ２（３４７μＬ、ＭＱ中１００ｍＭ）及びＴＢＳ ｐＨ７．５（７８９μＬ）を添加した。反応物を３７℃で一晩インキュベートした。質量スペクトル分析は、ｈＯＫＴ３－ＰＥＧ１１－テトラジン ＰＦ０１に対応する１つの主生成物（実測質量２８２５８Ｄａ）を示した。反応物をＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ－１００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上Ｈｉｓ－ｔｒａｐ ｅｘｃｅｌ １ｍＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。カラムを緩衝液Ａ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．５）と平衡化し、試料を１ｍＬ／分で充填した。フロースルーを回収し、ＨｉＰｒｅｐ ２６／１０脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してＰＢＳ ｐＨ６．５に緩衝液交換した。ＰＢＳ ｐＨ６．５に対して４℃で３日間さらなる透析を実施して、残留１６９を除去した。
実施例１２３．ｈＯＫＴ３－ＰＥＧ２３－テトラジン ＰＦ０２を得るためのソルターゼＡを使用したＧＧＧ－ＰＥＧ２３－テトラジン（１７０）のｈＯＫＴ３ ２００へのＣ末端ソルタギング
ソルターゼＡ（配列番号２によって識別される）を使用したＣ末端ソルタギングによって、本発明によるバイオコンジュゲートを調製した。ｈＯＫＴ３ ２００の溶液（１９０８μＬ、５ｍｇ、ＰＢＳ ｐＨ７．４中９１μＭ）に、ソルターゼＡ（８１μＬ、９４８μｇ、ＴＢＳ ｐＨ７．５中５３３μＭ＋１０％グリセロール）、ＧＧＧ－ＰＥＧ２３－テトラジン（１７０、３４７μＬ、ＭＱ中２０ｍＭ）、ＣａＣｌ２（３４７μＬ、ＭＱ中１００ｍＭ）及びＴＢＳ ｐＨ７．５（７８９μＬ）を添加した。反応物を３７℃で一晩インキュベートした。質量スペクトル分析は、ｈＯＫＴ３－ＰＥＧ２３－テトラジン ＰＦ０２に対応する１つの主生成物（実測質量２８７８７Ｄａ）を示した。反応物をＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ－１００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上Ｈｉｓ－ｔｒａｐ ｅｘｃｅｌ １ｍＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。カラムを緩衝液Ａ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．５）と平衡化し、試料を１ｍＬ／分で充填した。フロースルーをＰＢＳ ｐＨ６．５に透析し、引き続いてＰＢＳ ｐＨ６．５を移動相として使用して、ＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ－１０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ １０／３００ ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。
実施例１２４．ｈＯＫＴ３－ＰＥＧ２－アリールアジド ＰＦ０３を得るためのソルターゼＡを使用したＧＧＧ－ＰＥＧ２－アリールアジド（１７１）のｈＯＫＴ３ ２００へのＣ末端ソルタギング
ソルターゼＡ（配列番号２によって識別される）を使用したＣ末端ソルタギングによって、本発明によるバイオコンジュゲートを調製した。ｈＯＫＴ３ ２００の溶液（２０９２μＬ、５ｍｇ、ＰＢＳ ｐＨ７．４中８３μＭ）に、ソルターゼＡ（９５μＬ、９５０μｇ、ＴＢＳ ｐＨ７．５中４５６μＭ＋１０％グリセロール）、ＧＧＧ－ＰＥＧ２－アリールアジド（１７１、３４７μＬ、ＭＱ中２０ｍＭ）、ＣａＣｌ２（３４７μＬ、ＭＱ中１００ｍＭ）及びＴＢＳ ｐＨ７．５（５９１μＬ）を添加した。反応物を３７℃で一晩インキュベートした。質量スペクトル分析は、ｈＯＫＴ３－ＰＥＧ２－アリールアジド ＰＦ０３に対応する１つの主生成物（実測質量２７８６５Ｄａ）を示した。反応物をＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ－１０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上Ｈｉｓ－ｔｒａｐ ｅｘｃｅｌ １ｍＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。カラムを緩衝液Ａ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．５）と平衡化し、試料を１ｍＬ／分で充填した。フロースルーを、ＰＢＳ ｐＨ７．４を移動相として使用して、ＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ－１０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ １０／３００ ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。
実施例１２５．抗４－１ＢＢ－ＰＥＧ１１－テトラジン ＰＦ０８を得るためのソルターゼＡを使用したＧＧＧ－ＰＥＧ１１－テトラジン（１６９）の抗４－１ＢＢ ＰＦ３１へのＣ末端ソルタギング
タンパク質ＰＦ３１（１１５１μＬ、ＴＢＳ ｐＨ７．５中９３μＭ）を含有する溶液に、ＴＢＳ ｐＨ７．５（５１２μＬ）、ＣａＣｌ２（２１４μＬ、１００ｍＭ）及びＧＧＧ－ＰＥＧ１１－テトラジン（１６９、２２０μＬ、ＭＱ中２０ｍＭ）及びソルターゼＡ（５０μＬ、ＴＢＳ ｐＨ７．５中５３３μＭ）を添加した。反応物を３７℃で一晩インキュベートし、引き続いてＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ－１００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上Ｈｉｓ－ｔｒａｐ ｅｘｃｅｌ １ｍＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。カラムを緩衝液Ａ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．５）と平衡化し、試料を１ｍＬ／分で充填した。フロースルーを回収すると、質量スペクトル分析は、４－１ＢＢ－テトラジン ＰＦ０８に対応する１つの主生成物（実測質量２７９８９Ｄａ）を示した。
実施例１２６．抗４－１ＢＢ ＰＦ０９を得るためのソルターゼＡを使用した化合物ＧＧＧ－ＰＥＧ２－アリールアジド（１７１）の抗４－１ＢＢ－ＰＦ３１へのＣ末端ソルタギング
ソルターゼＡ（配列番号２によって識別される）を使用したＣ末端ソルタギングによって、本発明によるバイオコンジュゲートを調製した。抗４－１ＢＢ－ＰＦ３１の溶液（６６５μＬ、２ｍｇ、ＰＢＳ ｐＨ７．４中１０７μＭ）に、ソルターゼＡ（１００μＬ、１ｍｇ、ＴＢＳ ｐＨ７．５中３５７μＭ＋１０％グリセロール）、ＧＧＧ－ＰＥＧ２－アリールアジド（１７１、１４０μＬ、ＭＱ中２０ｍＭ）、ＣａＣｌ２（１４０μＬ、ＭＱ中１００ｍＭ）及びＴＢＳ ｐＨ７．５（３５５μＬ）を添加した。反応物を３７℃で一晩インキュベートし、引き続いてＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ－１００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上Ｈｉｓ－ｔｒａｐ ｅｘｃｅｌ １ｍＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。カラムを緩衝液Ａ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．５）と平衡化し、試料を１ｍＬ／分で充填した。フロースルーを回収すると、質量スペクトル分析は、抗４－１ＢＢ－アジド ＰＦ０９に対応する１つの主生成物（実測質量２７５９２Ｄａ）を示した。
実施例１２７．アリールアジド－ＰＥＧ１１－ＧＧＧ－ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５（ＰＦ１３）を得るためのソルターゼＡを使用したアリールアジド－ＰＥＧ１１－ＬＰＥＴＧＧ（１７５）のＧＧＧ－ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５（２０８）へのＮ末端ソルタギング
タンパク質２０８を含有する溶液（２０００μＬ、ＴＢＳ ｐＨ７．５中１４０μＭ）に、ＴＢＳ ｐＨ７．５（２６８６μＬ）、ＣａＣｌ２（５５９μＬ、１００ｍＭ）及び１７５（８３μＬ、ＤＭＳＯ中５０ｍＭ）及びソルターゼＡ（２６０μＬ、ＴＢＳ ｐＨ７．５中５３７μＭ）を添加し、３７℃で３時間インキュベートした（光から遮断して）。インキュベーション後、Ｎｉ－ＮＴＡビーズ（５００μＬビーズ＝１ｍＬスラリー）を使用して、ソルターゼＡを溶液から除去した。溶液をローラーバンク上Ｎｉ－ＮＴＡビーズと共に４℃で一晩インキュベートし、その後、溶液を遠心分離（５分間、７．０００×ｇ）した。生成物ＰＦ１３を含有する上清を、ペレットから上清を分離することによって回収した。反応混合物を、移動相としてのＰＢＳ ｐＨ７．４及び流量０．５ｍＬ／分を使用して、ＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ－１０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ １０／３００ ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に充填した。質量分析は、ＰＦ１３に対応する２４１９３Ｄａの重量（予測質量：２４１９３Ｄａ）を示した。
実施例１２８．ＢＣＮ－ＰＥＧ１２－ＳＹＲ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５（ＰＦ１４）を得るためのＢＣＮ－ＰＥＧ１２－アミノオキシ（ＸＬ１３）のＳＹＲ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５（ＰＦ２６）へのＮ末端オキシムライゲーション
ＰＦ２６の標識の前に、過ヨウ素酸ナトリウムを使用して、Ｎ末端セリンを酸化した。タンパク質ＰＦ２６を含有する溶液（７００μＬ、ＰＢＳ ｐＨ７．４中７０μＭ）に、ＰＢＳ ｐＨ７．４（２８６μＬ）、ＮａＩＯ４（０．９８μＬ、ＭＱ中１００ｍＭ）及びＬ－メチオニン（５μＬ、ＭＱ中１００ｍＭ）を添加し、４℃で５分間インキュベートした。質量分析は、２４１１４Ｄａ（アルデヒド）及び２４１３２Ｄａ（水和物）の予測質量に対応する２４１１４Ｄａ及び２４１３０Ｄａの重量を示した。ＰＤ－１０脱塩カラムを使用して、過剰なＮａＩＯ４及びＬ－メチオニンを除去した。酸化したＰＦ２６を、Ａｍｉｃｏｎスピンフィルター０．５、ＭＷＣＯ１０ｋＤａ（Ｍｅｒｃｋ－Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して５０μＭの濃度まで濃縮した。酸化したＰＦ２６を含有する溶液（４１６μＬ、ＰＢＳ ｐＨ７．４中５０μＭ）に、ＸＬ１３（４１．６μＬ、ＤＭＳＯ中５０ｍＭ）を添加した。３７℃で一晩のインキュベーション後、反応混合物を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５樹脂（Ｃｙｔｉｖａ）を充填したＰＤ－１０脱塩カラムを使用して精製し、ＰＢＳを使用して溶出した。質量分析は、ＰＦ１４に対応する２５０２４Ｄａの重量（予測質量：２５０４２Ｄａ）を示した。
実施例１２９．ＢＣＮ－ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５ ＰＦ１５を得るためのＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５ ＰＦ２６のＮ末端ＢＣＮ官能化
ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５ ＰＦ２６（２．９ｍｇ、ＰＢＳ中５０μＭ）に、２当量のＮａＩＯ４（４．８μＬのＰＢＳ中５０ｍＭストック）及び１０当量のＬ－メチオニン（１２．５μＬのＰＢＳ中１００ｍＭストック）を添加した。反応物を４℃で５分間インキュベートした。質量スペクトル分析は、セリンの対応するアルデヒド及び水和物（実測質量２４１１４Ｄａ及び２４１３２Ｄａ）への酸化を示した。反応混合物を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５樹脂（Ｃｙｔｉｖａ）を充填したＰＤ－１０脱塩カラムを使用して精製し、ＰＢＳを使用して溶出した。溶離液（２．６ｍｇ、ＰＢＳ中５０μＭ）に、１６０当量のＮ－メチルヒドロキシルアミン．ＨＣｌ（３４０μＬのＰＢＳ中５０ｍＭストック）及び１６０当量のｐ－アニシジン（３４０μＬのＰＢＳ中５０ｍＭストック）を添加した。反応混合物を２５℃で３時間インキュベートした。質量スペクトル分析は、Ｎ－メチル－イミン－オキシド－ＩＬ１５に対応する単一ピーク（実測質量２４１４３Ｄａ）を示した。反応混合物を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５樹脂（Ｃｙｔｉｖａ）を充填したＰＤ－１０脱塩カラムを使用して精製し、ＰＢＳを使用して溶出した。溶離液（２．４７ｍｇ、ＰＢＳ中５０μＭ）に、２５当量のビス－ＢＣＮ－ＰＥＧ１１（１０５）（５１μＬ、ＤＭＳＯ中５０ｍＭ）及び１５０μＬのＤＭＦを添加した。反応物を室温で一晩インキュベートした。反応物を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ １０／３００カラム（Ｃｙｔｉｖａ）を使用して精製した。質量スペクトル分析は、ＢＣＮ－ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５ ＰＦ１５に対応する１つの主ピークを示した（実測質量２５０４１Ｄａ）。
実施例１３０．アジド－ＩＬ１５ ＰＦ１９を得るためのＩＬ１５ ＰＦ１８のＮ末端ジアゾ転移反応
ＩＬ１５ ＰＦ１８（５ｍｇ、０．１Ｍ ＴＥＡ緩衝液ｐＨ８．０中５０μＭ）に、イミダゾール－１－スルホニルアジド塩酸塩（７０８μＬ、５０ｍＭ ＮａＯＨ中５０ｍＭ）を添加し、３７℃で一晩インキュベートした。反応物を、ハイプレップ（商標）２６／１０脱塩カラム（Ｃｙｔｉｖａ）を使用して精製した。質量スペクトル分析は、アジド－ＩＬ１５ ＰＦ１９に対応する１つの主ピーク（実測質量１４１４７Ｄａ）を示した。
実施例１３１．テトラジン－ＰＥＧ１２－ＳＹＲ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ１５（ＰＦ２１）を得るための２ＰＣＡを使用したテトラジン－ＰＥＧ１２－２ＰＣＡ（ＸＬ１０）のＳＹＲ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ１５（ＰＦ１８）へのＮ末端組み込み
ＳＹＲ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ１５（ＰＦ１８）（１０５２μＬ、ＰＢＳ中５０μＭ）に、２０当量のテトラジン－ＰＥＧ１２－２ＰＣＡ（ＸＬ１０）（１１２μＬのＤＭＳＯ中５０ｍＭストック）及び４３５９μＬのＰＢＳを添加した。反応物を３７℃で一晩インキュベートした。スピンフィルトレーション（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５、Ｕｌｔｒａｃｅｌ－１０ Ｍｅｍｂｒａｎｅ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、試料を１ｍＬ未満に濃縮し、移動相としてのＰＢＳ ｐＨ７．４及び流量０．５ｍＬ／分を使用して、ＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ－１０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ １０／３００ ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に充填した。質量スペクトル分析は、出発物質ＳＹＲ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ１５（ＰＦ１８）（予測質量：１４１２１Ｄａ）に対応する２４１２１Ｄａの重量及び生成物ＰＦ２１（予測質量：１５０９４Ｄａ）に対応する１５０９３Ｄａの質量を示した。
実施例１３２．ビス－ＢＣＮ－ｈＯＫＴ３ ＰＦ２２を得るための、トリ－ＢＣＮ（１５０）のｈＯＫＴ３－ＰＥＧ２－アリールアジド ＰＦ０３へのコンジュゲーション
ｈＯＫＴ３－ＰＥＧ２－アリールアジド ＰＦ０３の溶液（８７μＬ、１ｍｇ、ＰＢＳ ｐＨ７．４中４１１μＭ）に、ＰＢＳ ｐＨ７．４（５５９μＬ）、ＤＭＦ（４９μＬ）及び化合物１５０（２２μＬ、ＤＭＦ中４０ｍＭ溶液、２５当量）を添加した。反応物を室温で一晩インキュベートした。質量スペクトル分析は、ビス－ＢＣＮ－ｈＯＫＴ３ ＰＦ２２に対応する１つの主生成物（実測質量２９１７１Ｄａ）を示した。反応物を、ＰＢＳ ｐＨ７．４を移動相として使用して、ＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ－１０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ １０／３００ ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。
実施例１３３．ビス－ＢＣＮ－ｈＯＫＴ３ ＰＦ２３を得るためのソルターゼＡを使用したＧＧＧ－ビス－ＢＣＮ １７６のｈＯＫＴ３ ２００へのＣ末端ソルタギング
ソルターゼＡ（配列番号２によって識別される）を使用したＣ末端ソルタギングによって、本発明によるバイオコンジュゲートを調製した。ｈＯＫＴ３ ２００の溶液（２７２μＬ、０．７ｍｇ、ＰＢＳ ｐＨ７．４中８３μＭ）に、ソルターゼＡ（２５μＬ、２５０μｇ、ＴＢＳ ｐＨ７．５中４５６μＭ＋１０％グリセロール）、ＧＧＧ－ビス－ＢＣＮ（１７６、４５μＬ、ＤＭＳＯ中２０ｍＭ）、ＣａＣｌ２（４５μＬ、ＭＱ中１００ｍＭ）及びＴＢＳ ｐＨ７．５（６４μＬ）を添加した。反応物を３７℃で一晩インキュベートした。質量スペクトル分析は、ビス－ＢＣＮ－ｈＯＫＴ３ ＰＦ２３に対応する１つの主生成物（実測質量２８７７２Ｄａ）を示した。反応物を、ＰＢＳ ｐＨ７．４を移動相として使用して、ＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ－１０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ １０／３００ ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。
実施例１３４．ビス－ＢＣＮ－ＳＹＲ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ１５（ＰＦ２９）を得るための歪み促進型アルキン－アジド付加環化を使用したトリ－ＢＣＮ（１５０）のＮ３－ＳＹＲ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ１５（ＰＦ１９）へのＮ末端組み込み
Ｎ３－ＩＬ１５ ＰＦ１９（７０６μＬ、ＰＢＳ中５０μＭ）に、４当量のトリ－ＢＣＮ（１５０）（３．５μＬのＤＭＦ中４０ｍＭストック）及び６７μＬのＤＭＦを添加した。反応物を室温で一晩インキュベートした。質量スペクトル分析は、ビス－ＢＣＮ－ＳＹＲ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ１５ ＰＦ２９（実測質量１５４５３Ｄａ、予測質量１５４５３Ｄａ）の形成を確認した。反応混合物を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５樹脂（Ｃｙｔｉｖａ）を充填したＰＤ－１０脱塩カラムを使用して精製し、ＰＢＳを使用して溶出した。さらなる洗浄を、スピンフィルトレーション（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５、Ｕｌｔｒａｃｅｌ－１０ Ｍｅｍｂｒａｎｅ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して４００μＬのＰＢＳで６回実施して、残っているトリ－ＢＣＮ（１５０）を除去した。
実施例１３５．ＰＮＧａｓｅ Ｆによるトラスツズマブの酵素的脱グリコシル化
トラスツズマブ（Ｈｅｒｚｕｍａ）（２０ｍｇ、ＰＢＳ ｐＨ７．４中１２．５ｍｇ／ｍＬ）をＰＮＧａｓｅ Ｆ（１６μＬ、８０００ユニット）と３７℃でインキュベートした。ＩｄｅＳ処理後の試料の質量スペクトル分析は、予測生成物に対応する１つの主Ｆｃ／２生成物（実測質量２３７８７Ｄａ）を示した。
実施例１３６．ＰＮＧａｓｅ Ｆによるリツキシマブの酵素的脱グリコシル化
リツキシマブ（６ｍｇ、ＰＢＳ ｐＨ７．４中１０ｍｇ／ｍＬ）をＰＮＧａｓｅ Ｆ（６μＬ、３０００ユニット）と３７℃でインキュベートした。ＩｄｅＳ処理後の試料の質量スペクトル分析は、予測生成物に対応する１つの主Ｆｃ／２生成物（実測質量２３７５４Ｄａ）を示した。
実施例１３７．ビス－アジド－トラスツズマブ ｔｒａｓｔ－ｖ３を得るためのアジド－ＰＥＧ３－アミンの脱グリコシル化トラスツズマブへのＭＴＧａｓｅ触媒組み込み
脱グリコシル化トラスツズマブの溶液（８０６μＬ、１０ｍｇ、ＰＢＳ ｐＨ７．４中１２．４ｍｇ／ｍＬ）に、ＰＢＳ ｐＨ７．４（３５４４μＬ）、アジド－ＰＥＧ３－アミン（ＢｒｏａｄＰｈａｒｍから商業的に入手可能、５００μＬ、ＭＱ中１０ｍＭ溶液、ＩｇＧに対して７５当量）及び組換え微生物トランスグルタミナーゼ（Ｚｅｄｉｒａから商業的に入手可能、１５０μＬ、１５Ｕ、０．１Ｕ／μＬ）を添加した。反応物を３７℃で一晩インキュベートした。ＩｄｅＳ消化試料の質量スペクトル分析は、ビス－アジド－トラスツズマブ ｔｒａｓｔ－ｖ３に対応する１つの主生成物（実測質量２３９８８Ｄａ）を示した。反応物を、ＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ－１００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上ｐｒｏｔＡカラム（５ｍＬ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して精製し、引き続いてＰＢＳ ｐＨ７．４に透析した。
実施例１３８．ビス－アジド－リツキシマブ ｒｉｔ－ｖ３を得るためのアジド－ＰＥＧ３－アミンの脱グリコシル化リツキシマブへのＭＴＧａｓｅ触媒組み込み
脱グリコシル化リツキシマブの溶液（９０μＬ、１．８ｍｇ、ＰＢＳ ｐＨ７．４中２０．２ｍｇ／ｍＬ）に、ＰＢＳ ｐＨ７．４（６９３μＬ）、アジド－ＰＥＧ３－アミン（ＢｒｏａｄＰｈａｒｍから商業的に入手可能、９０μＬ、ＭＱ中１０ｍＭ溶液、ＩｇＧに対して７５当量）及び組換え微生物トランスグルタミナーゼ（Ｚｅｄｉｒａから商業的に入手可能、２７μＬ、２．７Ｕ、０．１Ｕ／μＬ）を添加した。反応物を３７℃で一晩インキュベートした。ＩｄｅＳ消化試料の質量スペクトル分析は、ビス－アジド－リツキシマブ ｒｉｔ－ｖ３に対応する１つの主生成物（実測質量２３９５６Ｄａ）を示した。遠心濾過機（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５ｍＬ ＭＷＣＯ １０ｋＤａ、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、反応物をＰＢＳ ｐＨ７．４に緩衝液交換した。
実施例１３９．コンジュゲート２０６を得るためのトラスツズマブ（６－Ｎ３－ＧａｌＮＡｃ）２ ２０５と２０１のコンジュゲーション
ＢＣＮ修飾ｈＯＫＴ３ ２０１のアジド修飾トラスツズマブ２０５へのコンジュゲーションによって、本発明によるバイオコンジュゲートを調製した。国際公開第２０１６１７０１８６号により調製したトラスツズマブ－（６－Ｎ３－ＧａｌＮＡｃ）２の溶液（２０５、２μＬ、７５μｇ、ＰＢＳ ｐＨ７．４中２５０μＭ）に、ｈＯＫＴ３－ＰＥＧ２－ＢＣＮ ２０１（９．９μＬ、２８μｇ、ＰＢＳ ｐＨ７．４中１０１μＭ）を添加した。反応物を室温で一晩インキュベートした。ファブリケーター（商標）消化試料の質量スペクトル分析は、それぞれアジド修飾Ｆｃ／２フラグメント及びコンジュゲート２０６に対応する２つの主生成物（実測質量２４３６８Ｄａ及び５２１９６Ｄａ、それぞれおよそ５０％）を示した。
実施例１４０．Ｈｉｓ６－ＳＳＧＥＮＬＹＦＱ－ＧＧＧ－ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５のｐＥＴ３２ａ発現ベクターへのクローニング
ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５融合タンパク質２０７を、Ｎ末端Ｈｉｓタグ（ＨＨＨＨＨＨ）、ＴＥＶプロテアーゼ認識配列（ＳＳＧＥＮＬＹＦＱ）及びＮ末端ソルターゼＡ認識配列（ＧＧＧ）を用いて設計した。塩基対１５８と６９２との間にＨｉｓ６－ＳＳＧＥＮＬＹＦＱ－ＧＧＧ－ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５（配列番号３）をコードし、それによってチオレドキシンコード配列を除去するＤＮＡ配列を含有するｐＥＴ３２ＡベクターをＧｅｎｓｃｒｉｐｔから入手した。
実施例１４１．Ｈｉｓ６－ＳＳＧＥＮＬＹＦＱ－ＧＧＧ－ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５（２０７）の大腸菌発現及び封入体単離
Ｈｉｓ６－ＳＳＧＥＮＬＹＦＱ－ＧＧＧ－ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５ ２０７の発現は、プラスミド（ｐＥＴ３２ａ－ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５）のＢＬ２１細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）への形質転換により開始する。次のステップは、ＢＬ２１細胞での５００ｍＬの培養物（ＬＢ培地＋アンピシリン）への接種であった。ＯＤ６００が０．７に達したら、培養物を１ｍＭ ＩＰＴＧ（５００μＬの１Ｍストック溶液）で誘導した。３７℃で４時間の誘導後、培養物を遠心分離によってペレット化した。５００ｍＬ培養物から得た細胞ペレットを、６２５ユニットのｂｅｎｚｏｎａｓｅを含む２５ｍＬのバグバスター（商標）に溶解し、ローラーバンク上室温で２０分間インキュベートした。溶解後、不溶性画分を遠心分離（２０分間、１２０００×ｇ、４℃）によって可溶性画分から分離した。不溶性画分を、リゾチーム（最終濃度：２００μｇ／ｍＬ）を含む２５ｍＬのバグバスター（商標）に溶解し、ローラーバンク上で５分間インキュベートした。次に、溶液を６倍体積の１：１０希釈バグバスター（商標）で希釈し、４℃で１５分間、９０００×ｇで遠心分離した。ペレットを２５０ｍＬの１：１０希釈バグバスター（商標）にホモジナイザーを使用することによって再懸濁し、４℃で１５分間、９０００×ｇで遠心分離した。最後のステップを３回繰り返した。
実施例１４２．単離した封入体からのＨｉｓ６－ＳＳＧＥＮＬＹＦＱ－ＧＧＧ－ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５ ２０７のリフォールディング
Ｈｉｓ６－ＳＳＧＥＮＬＹＦＱ－ＧＧＧ－ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５ ２０７を含有する精製した封入体を、２５ｍＬの変性緩衝液（５Ｍグアニジン、０．３Ｍ亜硫酸ナトリウム）及び２．５ｍＬの５０ｍＭ ２－ニトロ－５－スルホ安息香酸二ナトリウム中、４℃で一晩スルホン化した。溶液を１０倍体積の冷Ｍｉｌｌｉ－Ｑで希釈し、遠心分離した（８０００×ｇで１０分間）。ペレットを、１２５ｍＬの冷Ｍｉｌｌｉ－Ｑにホモジナイザーを使用して溶解し、遠心分離した（８００００×ｇで１０分間）。最後のステップを３回繰り返した。精製したＨｉｓ６－ＳＳＧＥＮＬＹＦＱ－ＧＧＧ－ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５ ２０７を５Ｍグアニジン中で変性させ、１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度に希釈した。直径０．８ｍｍのシリンジを使用して、変性したタンパク質を、氷上で１０倍体積のリフォールディング緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０．５３ｍＭ ＮａＣｌ、０．４４ｍＭ ＫＣｌ、２．２ｍＭ ＭｇＣｌ２、２．２ｍＭ ＣａＣｌ２、０．０５５％ ＰＥＧ－４０００、０．５５Ｍ Ｌ－アルギニン、８ｍＭシステアミン、４ｍＭシスタミン、ｐＨ８．０）に滴加し、４℃で４８時間インキュベートした（攪拌を要しない）。リフォールディングしたＨｉｓ６－ＳＳＧＥＮＬＹＦＱ－ＧＧＧ－ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５ ２０７を、ＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ－１０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で２０ｍＬ ＨｉｓＴｒａｐ ｅｘｃｅｌカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈ ｃａｒｅ）に充填した。カラムを最初に緩衝液Ａ（５ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液、２０ｍＭ イミダゾール、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）で洗浄した。保持されたタンパク質を緩衝液Ｂ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液、５００ｍＭイミダゾール、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）で、緩衝液Ａから緩衝液Ｂまでの２５ｍＬの勾配で溶出した。画分をポリアクリルアミドゲル（１６％）上ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。精製した標的タンパク質を含有する画分を合わせ、緩衝液を、４℃で一晩実施する透析によってＴＢＳ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５及び１５０ｍＭ ＮａＣｌ２）に対して交換した。精製したタンパク質を、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５、ＭＷＣＯ ３ｋＤａ（Ｍｅｒｃｋ－Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して少なくとも２ｍｇ／ｍＬに濃縮した。質量スペクトル分析は２５０４４Ｄａの重量（予測：２５０４４Ｄａ）を示した。生成物を、さらに使用する前に－８０℃で保管した。
実施例１４３．ＧＧＧ－ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５ ２０８を得るためのＨｉｓ６－ＳＳＧＥＮＬＹＦＱ－ＧＧＧ－ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５ ２０７のＴＥＶ切断
Ｈｉｓ６－ＳＳＧＥＮＬＹＦＱ－ＧＧＧ－ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５の溶液（２０７、３３０μＬ、ＴＢＳ ｐＨ７．５中２．３ｍｇ／ｍＬ）に、ＴＥＶプロテアーゼ（５０．５μＬ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＴＣＥＰ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０％グリセロール、ｐＨ７．５中１０ユニット／μＬ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を添加した。反応物を３０℃で１時間インキュベートした。ＴＥＶ切断後、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して溶液を精製した。反応混合物を、移動相としてのＴＢＳ ｐＨ７．５及び流量０．５ｍＬ／分を使用して、ＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ－１０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ １０／３００ ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に充填した。ＧＧＧ－ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５ ２０８は１２ｍＬの保持時間で溶出した。精製したタンパク質を、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５、ＭＷＣＯ ３ｋＤａ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して少なくとも２ｍｇ／ｍＬに濃縮した。生成物を質量分析（実測質量：２２９６５Ｄａ、予測質量：２２９６４Ｄａ）で分析すると、ＧＧＧ－ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５ ２０８に対応していた。生成物を、さらに使用する前に－８０℃で保管した。
実施例１４４．ＢＣＮ－ＰＥＧ１２－ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５（２０９）を得るためのソルターゼＡを使用したＢＣＮ－ＰＥＧ１２－ＬＰＥＴＧＧ（１６８）のＧＧＧ－ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５ ２０８への組み込み
ＧＧＧ－ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５の溶液（２０８、２１９μＬ、ＴＢＳ ｐＨ７．５中９１．４μＭ）に、ＴＢＳ ｐＨ７．５（３２１μＬ）、ＣａＣｌ２（４０．０μＬ、１００ｍＭ）及びＢＣＮ－ＰＥＧ１２－ＬＰＥＴＧＧ（１６８、１２０μＬ、ＤＭＳＯ中５ｍＭ）を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。１６８の組み込みが完了した後、反応体積（８００μＬ）と同じ体積のＮｉ－ＮＴＡビーズを使用して、ソルターゼＡを溶液から除去した。溶液を回転ホイール／又はテーブルシェーカーで１時間インキュベートし、その後、溶液を遠心分離（２分間、１３０００ｒｐｍ）し、上清を捨てた。８００ｒｐｍのテーブルシェーカーにおいてビーズを５分間８００μＬの洗浄緩衝液（４０ｍＭイミダゾール、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．５Ｍ ＮａＣｌ）とインキュベートすることによって、ＢＣＮ－ＰＥＧ１２－ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５（２０９）をビーズから回収した。ビーズを遠心分離（２分間、１３０００×ｒｐｍ）し、２０９を含有する上清を分離し、緩衝液を４℃で一晩の透析によってＴＢＳに交換した。最後に、溶液を、Ａｍｉｃｏｎスピンフィルター０．５、ＭＷＣＯ ３ｋＤａ（Ｍｅｒｃｋ－Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して０．５～１ｍｇ／ｍＬに濃縮した。質量分析は、ＢＣＮ－ＰＥＧ１２－ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５（２０９）に対応する２４１５５Ｄａの重量（予測質量：２４１５２）を示した。
実施例１４５．コンジュゲート２１０を得るためのＢＣＮ－ＰＥＧ１２－ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５（２０９）のトラスツズマブ（６－Ｎ３－ＧａｌＮＡｃ）２ ２０５へのコンジュゲーション
２：１モル比での２０９のアジド修飾トラスツズマブ（２０５、トラスツズマブ（６－Ｎ３－ＧａｌＮＡｃ）２、国際公開第２０１６１７０１８６号により調製）へのコンジュゲーションによって、本発明によるバイオコンジュゲートを調製した。よって、ＢＣＮ－ＰＥＧ１２－ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５の溶液（２０９、２０μＬ、ＴＢＳ ｐＨ７．４中２０μＭ）に、トラスツズマブ（６－Ｎ３－ＧａｌＮＡｃ）２（２０５、１．２μＬ、ＰＢＳ ｐＨ７．４中８２μＭ）を添加し、３７℃で一晩インキュベートした。ＩｄｅＳ消化試料の質量スペクトル分析は、コンジュゲート２１０のＦｃ／２フラグメントに対応する４８５２６Ｄａの質量（予測質量：４８５１８Ｄａ）を示した。
実施例１４６．２１１を得るためのトラスツズマブ－（アジド）２と二価リンカー１０５の分子内架橋
国際公開第２０１６１７０１８６号により調製した、トラスツズマブ－（６－アジドＧａｌＮＡｃ）２の溶液（７．５μＬ、１５０μｇ、ＰＢＳ ｐＨ７．４中１７．５６ｍｇ／ｍＬ；ｔｒａｓｔ－ｖ１ａとも呼ばれる）に、化合物１０５（２．５μＬ、ＤＭＦ中０．８ｍＭ溶液、ＩｇＧに対して２当量）を添加した。反応物を室温で１日間インキュベートし、引き続いて遠心濾過機（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５ｍＬ ＭＷＣＯ １０ｋＤａ、Ｍｅｒｃｋ－Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用してＰＢＳ ｐＨ７．４に緩衝液交換した。ＩｄｅＳ消化試料の質量スペクトル分析は、分子内架橋トラスツズマブ誘導体２１１に対応する１つの主生成物（計算質量４９６２５Ｄａ、実測質量４９６２６Ｄａ）を示した。ＨＰＬＣ－ＳＥＣは４％未満の凝集を示し、よって、分子間架橋を除外した。
実施例１４７．２１２を得るためのトラスツズマブ－（アジド）２と二価リンカー１０７の分子内架橋
トラスツズマブ－（６－アジド－ＧａｌＮＡｃ）２の溶液（７．５μＬ、１５０μｇ、ＰＢＳ ｐＨ７．４中１７．５６ｍｇ／ｍＬ）に、化合物１０７（２．５μＬ、ＤＭＦ中４ｍＭ溶液、ＩｇＧに対して１０当量）を添加した。反応物を室温で１日間インキュベートし、引き続いて遠心濾過機（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５ｍＬ ＭＷＣＯ １０ｋＤａ、Ｍｅｒｃｋ－Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用してＰＢＳ ｐＨ７．４に緩衝液交換した。ＩｄｅＳ消化試料の質量スペクトル分析は、分子内架橋トラスツズマブ誘導体２１２に対応する生成物（計算質量５０１５３Ｄａ、実測質量５０１５８Ｄａ）を示した。ＨＰＬＣ－ＳＥＣは４％未満の凝集を示し、よって、分子間架橋を除外した。
実施例１４８．２１３を得るためのトラスツズマブ－（アジド）２と二価リンカー１１７の分子内架橋
トラスツズマブ－（６－アジドＧａｌＮＡｃ）２の溶液（７．５μＬ、１５０μｇ、ＰＢＳ ｐＨ７．４中１７．５６ｍｇ／ｍＬ）に、化合物１１７（２．５μＬ、ＤＭＦ中０．８ｍＭ溶液、ＩｇＧに対して２当量）を添加した。反応物を室温で１日間インキュベートし、引き続いて遠心濾過機（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５ｍＬ ＭＷＣＯ １０ｋＤａ、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用してＰＢＳ ｐＨ７．４に緩衝液交換した。ＩｄｅＳ消化試料の質量スペクトル分析は、分子内架橋トラスツズマブ誘導体２１３に対応する１つの主生成物（計算質量４９５８０Ｄａ、実測質量４９６２６Ｄａ）を示した。ＨＰＬＣ－ＳＥＣは４％未満の凝集を示し、よって、分子間架橋を除外した。
実施例１４９．２１４を得るためのトラスツズマブ－（アジド）２と二価リンカー１１８の分子内架橋
トラスツズマブ－（６－アジドＧａｌＮＡｃ）２の溶液（７．５μＬ、１５０μｇ、ＰＢＳ ｐＨ７．４中１７．５６ｍｇ／ｍＬ）に、化合物１１８（２．５μＬ、ＤＭＦ中４ｍＭ溶液、ＩｇＧに対して１０当量）を添加した。反応物を室温で１日間インキュベートし、引き続いて遠心濾過機（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５ｍＬ ＭＷＣＯ １０ｋＤａ、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用してＰＢＳ ｐＨ７．４に緩衝液交換した。ＩｄｅＳ消化試料の質量スペクトル分析は、分子内架橋トラスツズマブ誘導体２１４に対応する生成物（計算質量４９３５８Ｄａ、実測質量４９３６１Ｄａ）を示した。ＨＰＬＣ－ＳＥＣは４％未満の凝集を示し、よって、分子間架橋を除外した。
実施例１５０．２１５を得るためのトラスツズマブ－（アジド）２と二価リンカー１２４の分子内架橋
トラスツズマブ－（６－アジドＧａｌＮＡｃ）２の溶液（７．５μＬ、１５０μｇ、ＰＢＳ ｐＨ７．４中１７．５６ｍｇ／ｍＬ）に、化合物１２４（２．５μＬ、ＤＭＦ中４ｍＭ溶液、ＩｇＧに対して１０当量）を添加した。反応物を室温で１日間インキュベートし、引き続いて遠心濾過機（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５ｍＬ ＭＷＣＯ １０ｋＤａ、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用してＰＢＳ ｐＨ７．４に緩衝液交換した。ＩｄｅＳ消化試料の質量スペクトル分析は、分子内架橋トラスツズマブ誘導体２１５に対応する生成物（計算質量４９４０６Ｄａ、実測質量４９４０９Ｄａ）を示した。ＨＰＬＣ－ＳＥＣは４％未満の凝集を示し、よって、分子間架橋を除外した。
実施例１５１．２１６を得るためのトラスツズマブ－（アジド）２と二価リンカー１２５の分子内架橋
トラスツズマブ－（６－アジドＧａｌＮＡｃ）２の溶液（７．５μＬ、１５０μｇ、ＰＢＳ ｐＨ７．４中１７．５６ｍｇ／ｍＬ）に、化合物１２５（２．５μＬ、ＤＭＦ中０．８ｍＭ溶液、ＩｇＧに対して２当量）を添加した。反応物を室温で１日間インキュベートし、引き続いて遠心濾過機（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５ｍＬ ＭＷＣＯ １０ｋＤａ、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用してＰＢＳ ｐＨ７．４に緩衝液交換した。ＩｄｅＳ消化試料の質量スペクトル分析は、分子内架橋トラスツズマブ誘導体２１６に対応する１つの主生成物（計算質量４９１８４Ｄａ、実測質量４９１８４Ｄａ）を示した。ＨＰＬＣ－ＳＥＣは４％未満の凝集を示し、よって、分子間架橋を除外した。
実施例１５２．２１７を得るためのトラスツズマブ－（アジド）２と二価リンカー１４５の分子内架橋
トラスツズマブ－（６－アジドＧａｌＮＡｃ）２の溶液（３２０μＬ、２ｍｇ、ＰＢＳ ｐＨ７．４中５．５６ｍｇ／ｍＬ）に、化合物１４５（８０μＬ、ＤＭＦ中１．６６ｍＭ溶液、ＩｇＧに対して１０当量）を添加した。反応物を室温で１日間インキュベートし、引き続いて遠心濾過機（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５ｍＬ ＭＷＣＯ １０ｋＤａ、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用してＰＢＳ ｐＨ７．４に緩衝液交換した。ＩｄｅＳ消化試料の質量スペクトル分析は、分子内架橋トラスツズマブ誘導体２１７に対応する１つの主生成物（計算質量４９７９６Ｄａ、実測質量４９８０７Ｄａ）を示した。ＨＰＬＣ－ＳＥＣは４％未満の凝集を示し、よって、分子間架橋を除外した。
実施例１５３．ＤＡＲ１ ＡＤＣ ２１８を得るためのトラスツズマブ－（アジド）２と二価リンカー－ペイロード構築物１３７の分子内架橋
トラスツズマブ－（６－アジドＧａｌＮＡｃ）２の溶液（３７．５μＬ、２５０μｇ、ＰＢＳ ｐＨ７．４中６．６７ｍｇ／ｍＬ）に、化合物１３７（１２．５μＬ、ＤＭＦ中０．６７ｍＭ溶液、ＩｇＧに対して５当量）を添加した。反応物を室温で１日インキュベートし、引き続いて遠心濾過機（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５ｍＬ ＭＷＣＯ １０ｋＤａ、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用してＰＢＳ ｐＨ７．４に緩衝液交換した。ＩｄｅＳ消化試料の質量スペクトル分析は、分子内架橋を介して得られたコンジュゲートＡＤＣ ２１８に対応する１つの主生成物（計算質量５０４６４Ｄａ、実測質量５０４７４Ｄａ）を示した。ＨＰＬＣ－ＳＥＣは４％未満の凝集を示し、よって、分子間架橋を除外した。ＲＰ－ＨＰＬＣは、Ｆｃ／２（ｔｒ６．０９９）、Ｆｃ－毒素（ｔｒ８．２７５、全Ｆｃ／２フラグメントの８２．４％に対応する）及びＦａｂ（ｔｒ９．３２０）フラグメントを示した。
実施例１５４．ＤＡＲ１ ＡＤＣ ２１９を得るためのトラスツズマブ－（アジド）２と二価リンカー－ペイロード構築物１３１の分子内架橋
トラスツズマブ－（６－アジドＧａｌＮＡｃ）２の溶液（３７．５μＬ、２５０μｇ、ＰＢＳ ｐＨ７．４中６．６７ｍｇ／ｍＬ）に、化合物１３１（１２．５μＬ、ＤＭＦ中０．６７ｍＭ溶液、ＩｇＧに対して５当量）を添加した。反応物を室温で１日インキュベートし、引き続いて遠心濾過機（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５ｍＬ ＭＷＣＯ １０ｋＤａ、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用してＰＢＳ ｐＨ７．４に緩衝液交換した。ＩｄｅＳ消化試料の質量スペクトル分析は、分子内架橋を介して得られたＡＤＣ ２１９に対応する１つの主生成物（計算質量５０６３８Ｄａ、実測質量５０６４９Ｄａ）を示した。ＨＰＬＣ－ＳＥＣは４％未満の凝集を示し、よって、分子間架橋を除外した。ＲＰ－ＨＰＬＣは、Ｆｃ／２（ｔｒ６．０８２）、Ｆｃ－毒素（ｔｒ９．３２７、全Ｆｃ／２フラグメントの７６．７％に対応する）及びＦａｂ（ｔｒ９．３４７）フラグメントを示した。
実施例１５５．ＤＡＲ１ ＡＤＣ ２２０を得るためのトラスツズマブ－（アジド）２と二価リンカー－ペイロード構築物１３９の分子内架橋
トラスツズマブ－（６－アジドＧａｌＮＡｃ）２の溶液（３７．５μＬ、２５０μｇ、ＰＢＳ ｐＨ７．４中６．６７ｍｇ／ｍＬ）に、化合物１３９（１２．５μＬ、ＤＭＦ中０．６７ｍＭ溶液、ＩｇＧに対して５当量）を添加した。反応物を室温で１日インキュベートし、引き続いて遠心濾過機（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５ｍＬ ＭＷＣＯ １０ｋＤａ、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用してＰＢＳ ｐＨ７．４に緩衝液交換した。ＩｄｅＳ消化試料の質量スペクトル分析は、分子内架橋を介して得られたＡＤＣ ２２０に対応する１つの主生成物（計算質量５０３９２Ｄａ、実測質量５０４０２Ｄａ）を示した。ＨＰＬＣ－ＳＥＣは４％未満の凝集を示し、よって、分子間架橋を除外した。ＲＰ－ＨＰＬＣは、Ｆｃ／２（ｔｒ６．０６２）、Ｆｃ－毒素（ｔｒ８．５４８、全Ｆｃ／２フラグメントの８９．５％に対応する）及びＦａｂ（ｔｒ９．２９５）フラグメントを示した。
実施例１５６．２：１分子フォーマットを有するＴ細胞エンゲージャー２２１を得るためのトラスツズマブ誘導体２１７（単一ＢＣＮを含有する）とテトラジン修飾抗ＣＤ３免疫細胞エンゲージャー２０４の分子内架橋
２１７の溶液（８μＬ、１４１μｇ、ＰＢＳ ｐＨ７．４中１７．７ｍｇ／ｍＬ）に、ｈＯＫＴ－ＰＥＧ４－テトラジン（２０４、１３．１５μＬ、２８０μｇ、ＰＢＳ ｐＨ７．４中２１．４５ｍｇ／ｍＬ、ＩｇＧに対して２当量）を添加した。ＩｄｅＳ消化試料の質量スペクトル分析は、コンジュゲートＦｃ－ＰＥＧ４－ｈＯＫＴ３（２２１）に対応する１つの主生成物（計算質量７７６６４Ｄａ、実測質量７７６４７Ｄａ）を示した。
実施例１５７．ＢＣＮ－リツキシマブ ｒｉｔ－ｖ１ａ－１４５を得るためのビス－アジド－リツキシマブ ｒｉｔ－ｖ１ａと三価リンカー１４５の分子内架橋
国際公開第２０１６１７０１８６号により調製したビス－アジド－リツキシマブ ｒｉｔ－ｖ１ａの溶液（４９４μＬ、３０ｍｇ、ＰＢＳ ｐＨ７．４中６０．７ｍｇ／ｍＬ）に、ＰＢＳ ｐＨ７．４（２５０６μＬ）、プロピレングリコール（２９８０μＬ）及び三価リンカー１４５（２０μＬ、ＤＭＦ中４０ｍＭ溶液、ＩｇＧに対して４．０当量）を添加した。反応物を室温で一晩インキュベートし、引き続いてＰＢＳ ｐＨ７．４を移動相として使用して、ＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ－１０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ １０／３００ ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥは、ｒｉｔ－ｖ１ａ－１４５の形成を示す、架橋重鎖に対応する１つの主ＨＣ生成物（図１６、右のパネル、３レーン参照）を示した。さらに、非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥは、ｒｉｔ－ｖ１ａとほぼ同じ高さの１つの主バンド（図１６、左のパネル、３レーン参照）を示し、分子内架橋のみが起こったことを実証した。
実施例１５８．ＢＣＮ－Ｂ１２ Ｂ１２－ｖ１ａ－１４５を得るためのビス－アジド－Ｂ１２ Ｂ１２－ｖ１ａと三価リンカー１４５の分子内架橋
国際公開第２０１６１７０１８６号により調製したビス－アジド－Ｂ１２ Ｂ１２－ｖ１ａの溶液（４１５μＬ、４ｍｇ、ＰＢＳ ｐＨ７．４中９．６ｍｇ／ｍＬ）に、プロピレングリコール（４１２μＬ）及び三価リンカー１４５（２．７μＬ、ＤＭＦ中４０ｍＭ溶液、ＩｇＧに対して４．０当量）を添加した。反応物を室温で一晩インキュベートし、引き続いてＰＢＳ ｐＨ７．４を移動相として使用して、ＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ－１０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ １０／３００ ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。ＩｄｅＳ消化試料のＲＰ－ＨＰＬＣ分析はＢ１２－ｖ１ａ－１４５の形成を示している（図１７参照）。
実施例１５９．ＴＣＯ－トラスツズマブ ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－ＸＬ１１を得るためのビス－アジド－トラスツズマブ ｔｒａｓｔ－ｖ１ａとビス－ＢＣＮ－ＴＣＯ ＸＬ１１の分子内架橋
国際公開第２０１６１７０１８６号により調製したビス－アジド－トラスツズマブ ｔｒａｓｔ－ｖ１ａの溶液（３６μＬ、２ｍｇ、ＰＢＳ ｐＨ７．４中５６．１ｍｇ／ｍＬ）に、ＰＢＳ ｐＨ７．４（１６４μＬ）、プロピレングリコール（１９５μＬ）及びビス－ＢＣＮ－ＴＣＯ ＸＬ１１（５．３μＬ、ＤＭＦ中１０ｍＭ溶液、ＩｇＧに対して４．０当量）を添加した。反応物を室温で一晩インキュベートし、引き続いて遠心濾過機（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５ｍＬ ＭＷＣＯ １０ｋＤａ、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用してＰＢＳ ｐＨ７．４に緩衝液交換した。還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥは、非コンジュゲート重鎖及び架橋重鎖に対応する２つの主ＨＣ生成物を示し（図１８、右のパネル、２レーン参照）、ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－ＸＬ１１への部分的変換を示した。さらに、非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥはｔｒａｓｔ－ｖ１ａの高さに１つの主バンドを示し（図１８、左のパネル、２レーン参照）、分子内架橋のみが起こったことを示した。
実施例１６０．ＴＣＯ－リツキシマブ ｒｉｔ－ｖ１ａ－ＸＬ１１を得るためのビス－アジド－リツキシマブ ｒｉｔ－ｖ１ａとビス－ＢＣＮ－ＴＣＯ ＸＬ１１の分子内架橋
ビス－アジド－リツキシマブ ｒｉｔ－ｖ１ａの溶液（３７μＬ、２ｍｇ、ＰＢＳ ｐＨ７．４中５４．５ｍｇ／ｍＬ）に、ＰＢＳ ｐＨ７．４（１６３μＬ）、プロピレングリコール（１９５μＬ）及びビス－ＢＣＮ－ＴＣＯ ＸＬ１１（５．３μＬ、ＤＭＦ中１０ｍＭ溶液、ＩｇＧに対して４．０当量）を添加した。反応物を室温で一晩インキュベートし、引き続いて遠心濾過機（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５ｍＬ ＭＷＣＯ １０ｋＤａ、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用してＰＢＳ ｐＨ７．４に緩衝液交換した。還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥは、非コンジュゲート重鎖及び架橋重鎖に対応する２つの主ＨＣ生成物を示し（図１８、右のパネル、６レーン参照）、ｒｉｔ－ｖ１ａ－ＸＬ１１への部分的変換を示した。さらに、非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥは、ｒｉｔ－ｖ１ａの高さの１つの主バンドを示し（図１８、左のパネル、２レーン参照）、分子内架橋のみが起こったことを示した。
実施例１６１．ＤＡＲ１ ＡＤＣ ｔｒａｓｔ－ｖ３－１３７を得るためのビス－アジド－トラスツズマブ ｔｒａｓｔ－ｖ３とビス－ＢＣＮ－ＭＭＡＥ １３７の分子内架橋
ｔｒａｓｔ－ｖ３の溶液（１５μＬ、１５０μｇ、ＰＢＳ ｐＨ７．４中１０ｍｇ／ｍＬ）に、ビス－ＢＣＮ－ＭＭＡＥ（１３７、１５μＬ、ＰＧ中０．２７ｍＭ溶液、ＩｇＧに対して４当量）を添加した。反応物を室温で１６時間インキュベートし、引き続いて遠心濾過機（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５ｍＬ ＭＷＣＯ １０ｋＤａ、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用してＰＢＳ ｐＨ７．４に緩衝液交換した。ＩｄｅＳ消化試料の質量スペクトル分析は、分子内架橋を介して得られたｔｒａｓｔ－ｖ３－１３７に対応する１つの主生成物（実測質量４８７１９Ｄａ）を示した。
実施例１６２．脱グリコシル化トラスツズマブとビス－ＢＣＮ－ＭＭＡＥ ＬＤ０３の分子内架橋
脱グリコシル化トラスツズマブ（８．３μＬ、０．１５ｍｇ、ＰＢＳ ５．５中１８．１ｍｇ／ｍＬ）をビス－ＢＣＮ－ＭＭＡＥ（ＬＤ０３、８．３μＬ、ＰＧ中１．２ｍＭ）及びマッシュルームチロシナーゼ（３μＬ、リン酸緩衝液ｐＨ６．０中１０ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｔ３８２４）と室温で１６時間インキュベートした。参照により本明細書に組み込まれる、オランダ特許出願第２０２６９４７号も参照されたい。ＤＴＴ処理ＡＤＣのＲＰ－ＨＰＬＣ分析は、ｔｒａｓｔ－ｖ４－ＬＤ０３への３５％変換を示した（図１９参照）。
実施例１６３．ＤＡＲ１ ＡＤＣ ｔｒａｓｔ－ｖ３－ＬＤ０３を得るためのビス－アジド－トラスツズマブ ｔｒａｓｔ－ｖ３とビス－ＢＣＮ－ＭＭＡＥ ＬＤ０３の分子内架橋
ｔｒａｓｔ－ｖ３の溶液（２２．５μＬ、５ｍｇ、ＰＢＳ ｐＨ７．４中６．７ｍｇ／ｍＬ）に、ビス－ＢＣＮ－ＭＭＡＥ（ＬＤ０３、７．５μＬ、ＤＭＦ中０．５３ｍＭ溶液、ＩｇＧに対して４当量）を添加した。反応物を室温で１６時間インキュベートし、引き続いて遠心濾過機（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５ｍＬ ＭＷＣＯ １０ｋＤａ、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用してＰＢＳ ｐＨ７．４に緩衝液交換した。ＩｄｅＳ消化試料の質量スペクトル分析は、分子内架橋を介して得られたｔｒａｓｔ－ｖ３－ＬＤ０３に対応する１つの主生成物（実測質量５００５２Ｄａ）を示した。
実施例１６４．ＤＡＲ１ ＡＤＣ ｒｉｔ－ｖ３－ＬＤ０３を得るためのビス－アジド－リツキシマブ ｒｉｔ－ｖ３とビス－ＢＣＮ－ＭＭＡＥ ＬＤ０３の分子内架橋
ｒｉｔ－ｖ３の溶液（２２．５μＬ、５ｍｇ、ＰＢＳ ｐＨ７．４中６．７ｍｇ／ｍＬ）に、ビス－ＢＣＮ－ＭＭＡＥ（ＬＤ０３、７．５μＬ、ＤＭＦ中０．５３ｍＭ溶液、ＩｇＧに対して４当量）を添加した。反応物を室温で１６時間インキュベートし、引き続いて遠心濾過機（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５ｍＬ ＭＷＣＯ １０ｋＤａ、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用してＰＢＳ ｐＨ７．４に緩衝液交換した。ＩｄｅＳ消化試料の質量スペクトル分析は、分子内架橋を介して得られたｒｉｔ－ｖ３－ＬＤ０３に対応する１つの主生成物（質量４９９８９Ｄａ）を示した。
実施例１６５．歪み促進型アルキン－アジド付加環化（ＳＰＡＡＣ）を介したビス－ＢＣＮ－ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５ ＰＦ２７のｔｒａｓｔ－ｖ３への分子内架橋（Ｐ：Ａ比１：１）
ｔｒａｓｔ－ｖ３（２．５７μＬ、０．０５ｍｇ、ＰＢＳ中１９．５ｍｇ／ｍＬ）をビス－ＢＣＮ－ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５（ＰＦ２７、５．６μＬ、３当量のビス－ＢＣＮ標識ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５、ＰＢＳ中７．６ｍｇ／ｍＬ）と室温で１６時間インキュベートした。ＩｄｅＳ処理後の試料の質量スペクトル分析は、予測生成物ｔｒａｓｔ－ｖ３－ＰＦ２７に対応する１つの主Ｆｃ／２生成物（実測質量７３４３２Ｄａ）を示した。
実施例１６６．ＳＰＡＡＣを介したｈＯＫＴ３－ビス－ＢＣＮ ＰＦ２２のｔｒａｓｔ－ｖ３への分子内架橋（Ｐ：Ａ比１：１）
ｔｒａｓｔ－ｖ３（２．５７μＬ、０．０５ｍｇ、ＰＢＳ中１９．５ｍｇ／ｍＬ）をｈＯＫＴ３－ビス－ＢＣＮ ＰＦ２２（５．１５μＬ、３当量、ＰＢＳ中５．７ｍｇ／ｍＬ）と室温で１６時間インキュベートした。ＩｄｅＳ処理後の試料の質量スペクトル分析は、予測生成物ｔｒａｓｔ－ｖ３－ＰＦ２２に対応する１つの主Ｆｃ／２生成物（実測質量７７１５０Ｄａ）を示した。
実施例１６７．２：１分子フォーマットを有するＴ細胞エンゲージャー ｒｉｔ－ｖ１ａ－１４５－２０４を得るためのｈＯＫＴ３－ＰＥＧ４－テトラジン ２０４のＢＣＮ－リツキシマブ ｒｉｔ－ｖ１ａ－１４５へのコンジュゲーション
ｒｉｔ－ｖ１ａ－１４５の溶液（２８７μＬ、６．６ｍｇ、ＰＢＳ ｐＨ７．４中１５４μＭ）に、ｈＯＫＴ３－ＰＥＧ４－テトラジン ２０４（２４７μＬ、１．９ｍｇ、ＰＢＳ ｐＨ６．５中２６９μＭ、ＩｇＧに対して１．５当量）を添加した。反応物を室温で一晩インキュベートし、引き続いてＰＢＳ ｐＨ７．４を移動相として使用して、ＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ－１０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ １０／３００ ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、単一ｈＯＫＴ３にコンジュゲートした抗体からなる１つの主生成物を示し（図１６、左のパネル、５レーン参照）、それによって、ｒｉｔ－ｖ１ａ－１４５－２０４の形成を確認した。さらに、還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥは、単一ｈＯＫＴ３にコンジュゲートした２本の重鎖に対応する１つの主ＨＣ生成物を確認している（図１６、右のパネル、５レーン参照）。
実施例１６８．２：１分子フォーマットを有するＴ細胞エンゲージャー ｒｉｔ－ｖ１ａ－１４５－ＰＦ０１を得るためのｈＯＫＴ３－ＰＥＧ１１－テトラジン ＰＦ０１のＢＣＮ－リツキシマブ ｒｉｔ－ｖ１ａ－１４５へのコンジュゲーション
ｒｉｔ－ｖ１ａ－１４５の溶液（２４７μＬ、６．３ｍｇ、ＰＢＳ ｐＨ７．４中１７１μＭ）に、ｈＯＫＴ３－ＰＥＧ１１－テトラジン ＰＦ０１（３０４μＬ、２．０ｍｇ、ＰＢＳ ｐＨ６．５中２３０μＭ、ＩｇＧに対して１．７当量）を添加した。反応物を室温で一晩インキュベートし、引き続いてＰＢＳ ｐＨ７．４を移動相として使用して、ＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ－１０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ １０／３００ ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、単一ｈＯＫＴ３にコンジュゲートした抗体からなる１つの主生成物を示し（図１６、左のパネル、６レーン参照）、それによって、ｒｉｔ－ｖ１ａ－１４５－ＰＦ０１の形成を確認した。さらに、還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥは、単一ｈＯＫＴ３にコンジュゲートした２本の重鎖に対応する１つの主ＨＣ生成物を確認している（図１６、右のパネル、６レーン参照）。
実施例１６９．２：１分子フォーマットを有するＴ細胞エンゲージャー Ｂ１２－ｖ１ａ－１４５－ＰＦ０１を得るためのｈＯＫＴ３－ＰＥＧ１１－テトラジン ＰＦ０１のＢＣＮ－Ｂ１２ Ｂ１２－ｖ１ａ－１４５へのコンジュゲーション
Ｂ１２－ｖ１ａ－１４５の溶液（３８μＬ、１．０ｍｇ、ＰＢＳ ｐＨ７．４中１７８μＭ）に、ｈＯＫＴ３－ＰＥＧ１１－テトラジン ＰＦ０１（４４μＬ、０．３ｍｇ、ＰＢＳ ｐＨ６．５中２３０μＭ、ＩｇＧに対して１．５当量）を添加した。反応物を室温で一晩インキュベートし、引き続いてＰＢＳ ｐＨ７．４を移動相として使用して、ＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ－１０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ １０／３００ ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、単一ｈＯＫＴ３にコンジュゲートした抗体からなる１つの主生成物を示し（図２０、４レーン参照）、それによって、Ｂ１２－ｖ１ａ－１４５－ＰＦ０１の形成を確認した。
実施例１７０．２：１分子フォーマットを有するＴ細胞エンゲージャー ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－ＸＬ１１－２０４を得るためのｈＯＫＴ３－ＰＥＧ４－テトラジン ２０４のＴＣＯ－トラスツズマブ ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－ＸＬ１１へのコンジュゲーション
ＴＣＯ－トラスツズマブ ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－ＸＬ１１の溶液（５．７μＬ、１００μｇ、ＰＢＳ ｐＨ７．４中１１７μＭ）に、ｈＯＫＴ３－ＰＥＧ４－テトラジン ２０４（５μＬ、３８μｇ、ＰＢＳ ｐＨ６．５中２６９μＭ、ＩｇＧに対して２．０当量）を添加した。反応物を室温で一晩インキュベートした。非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、非コンジュゲート抗体及び単一ｈＯＫＴ３にコンジュゲートした抗体に対応する２つの主生成物を示し（図２２、左のパネル、３レーン参照）、それによって、ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－ＸＬ１１－２０４の形成を確認した。さらに、還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥは、ＯＫＴ３がＴＣＯ反応性ハンドルを含有する架橋重鎖にコンジュゲートしていることを確認している（図２２、右のパネル、３レーン参照）。
実施例１７１．２：１分子フォーマットを有するＴ細胞エンゲージャー ｒｉｔ－ｖ１ａ－ＸＬ１１－２０４を得るためのｈＯＫＴ３－ＰＥＧ４－テトラジン ２０４のＴＣＯ－リツキシマブ ｒｉｔ－ｖ１ａ－ＸＬ１１へのコンジュゲーション
ＴＣＯ－リツキシマブ ｒｉｔ－ｖ１ａ－ＸＬ１１の溶液（５６．３μＬ、１００μｇ、ＰＢＳ ｐＨ７．４中１０６μＭ）に、ｈＯＫＴ３－ＰＥＧ４－テトラジン ２０４（５μＬ、３８μｇ、ＰＢＳ ｐＨ６．５中２６９μＭ、ＩｇＧに対して２．０当量）を添加した。反応物を室温で一晩インキュベートした。非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、非コンジュゲート抗体及び単一ｈＯＫＴ３にコンジュゲートした抗体に対応する２つの主生成物を示し（図２２、左のパネル、７レーン参照）、それによって、ｒｉｔ－ｖ１ａ－ＸＬ１１－２０４の形成を確認した。さらに、還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥは、ＯＫＴ３がＴＣＯ反応性ハンドルを含有する架橋重鎖にコンジュゲートしていることを確認している（図２２、右のパネル、７レーン参照）。
実施例１７２．２：１分子フォーマットを有するＴ細胞エンゲージャー ｒｉｔ－ｖ１ａ－１４５－ＰＦ０２を得るためのｈＯＫＴ３－ＰＥＧ２３－テトラジン ＰＦ０２のＢＣＮ－リツキシマブ ｒｉｔ－ｖ１ａ－１４５へのコンジュゲーション
ｒｉｔ－ｖ１ａ－１４５の溶液（２４７μＬ、６．３ｍｇ、ＰＢＳ ｐＨ７．４中１７１μＭ）に、ｈＯＫＴ３－ＰＥＧ２３－テトラジン ＰＦ０２（２６２μＬ、２．０ｍｇ、ＰＢＳ ｐＨ６．５中２６７μＭ、ＩｇＧに対して１．７当量）を添加した。反応物を室温で一晩インキュベートし、引き続いてＰＢＳ ｐＨ７．４を移動相として使用して、ＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ－１０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ １０／３００ ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、単一ｈＯＫＴ３にコンジュゲートした抗体からなる１つの主生成物を示し（図１８、左のパネル、７レーン参照）、それによって、ｒｉｔ－ｖ１ａ－１４５－ＰＦ０２の形成を確認した。さらに、還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥは、単一ｈＯＫＴ３にコンジュゲートした２本の重鎖に対応する１つの主ＨＣ生成物を確認している（図１８、右のパネル、７レーン参照）。
実施例１７３．２：１分子フォーマットを有するＴ細胞エンゲージャー ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－１４５－ＰＦ０３を得るためのｈＯＫＴ３－ＰＥＧ２－アリールアジド ＰＦ０３のＢＣＮ－トラスツズマブ ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－１４５へのコンジュゲーション
ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－１４５の溶液（２．９μＬ、１５０μｇ、ＰＢＳ ｐＨ７．４中３４７μＭ）に、ｈＯＫＴ３－ＰＥＧ２－アリールアジド ＰＦ０３（４．９μＬ、５６μｇ、ＰＢＳ ｐＨ７．４中４１１μＭ、ＩｇＧに対して２．０当量）を添加した。反応物を室温で一晩インキュベートした。還元試料の質量スペクトル分析は、ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－１４５－ＰＦ０３に対応する１つの主重鎖生成物（実測質量１２８３８８Ｄａ）を示した。
実施例１７４．２：１分子フォーマットを有するＴ細胞エンゲージャーｒｉｔ－ｖ１ａ－１４５－ＰＦ０３を得るためのｈＯＫＴ３－ＰＥＧ２－アリールアジド ＰＦ０３のＢＣＮ－リツキシマブ ｒｉｔ－ｖ１ａ－１４５へのコンジュゲーション
ｒｉｔ－ｖ１ａ－１４５の溶液（３０μＬ、１．５ｍｇ、ＰＢＳ ｐＨ７．４中３３７μＭ）に、ｈＯＫＴ３－ＰＥＧ２－アリールアジド ＰＦ０３（４９μＬ、０．６ｍｇ、ＰＢＳ ｐＨ７．４中４１１μＭ、ＩｇＧに対して２．０当量）を添加した。反応物を室温で一晩インキュベートし、引き続いてＰＢＳ ｐＨ７．４を移動相として使用して、ＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ－１０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ １０／３００ ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。還元試料の質量スペクトル分析は、ｒｉｔ－ｖ１ａ－１４５－ＰＦ０３に対応する１つの主重鎖生成物（実測質量１２８２１１Ｄａ）を示した。
実施例１７５．２：１分子フォーマットを有するＴ細胞エンゲージャー ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－ＰＦ２２を得るためのビス－ＢＣＮ－ｈＯＫＴ３ ＰＦ２２のビス－アジド－トラスツズマブ ｔｒａｓｔ－ｖ１ａへのコンジュゲーション
ｔｒａｓｔ－ｖ１ａの溶液（１．８μＬ、１００μｇ、ＰＢＳ ｐＨ７．４中３７４μＭ）に、ＰＢＳ ｐＨ７．４（４．５μＬ）及びビス－ＢＣＮ－ｈＯＫＴ３ ＰＦ２２（１３．７μＬ、７８μｇ、ＰＢＳ ｐＨ７．４中１９４μＭ、ＩｇＧに対して４．０当量）を添加した。反応物を室温で一晩インキュベートした。非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、単一ｈＯＫＴ３にコンジュゲートした抗体からなる１つの主生成物を示し（図２１、５レーン参照）、それによって、ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－ＰＦ２２の形成を確認した。
実施例１７６．２：１分子フォーマットを有するＴ細胞エンゲージャー ｒｉｔ－ｖ１ａ－１４５－ＰＦ２２を得るためのビス－ＢＣＮ－ｈＯＫＴ３ ＰＦ２２のビス－アジド－リツキシマブ ｒｉｔ－ｖ１ａへのコンジュゲーション
ｒｉｔ－ｖ１ａの溶液（１．８μＬ、１００μｇ、ＰＢＳ ｐＨ７．４中３６３μＭ）に、ＰＢＳ ｐＨ７．４（７．９μＬ）及びビス－ＢＣＮ－ｈＯＫＴ３ ＰＦ２２（１０．３μＬ、５８μｇ、ＰＢＳ ｐＨ７．４中１９４μＭ、ＩｇＧに対して３．０当量）を添加した。反応物を室温で一晩インキュベートした。非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、単一ｈＯＫＴ３にコンジュゲートした抗体からなる１つの主生成物を示し（図２１、４レーン参照）、それによって、ｒｉｔ－ｖ１ａ－ＰＦ２２の形成を確認した。
実施例１７７．２：１分子フォーマットを有するＴ細胞エンゲージャー ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－ＰＦ２３を得るためのビス－ＢＣＮ－ｈＯＫＴ３ ＰＦ２３のビス－アジド－トラスツズマブ ｔｒａｓｔ－ｖ１ａへのコンジュゲーション
ｔｒａｓｔ－ｖ１ａの溶液（１．８μＬ、１００μｇ、ＰＢＳ ｐＨ７．４中３７４μＭ）に、ＰＢＳ ｐＨ７．４（９．９μＬ）及びビス－ＢＣＮ－ｈＯＫＴ３ ＰＦ２３（８．４μＬ、５８μｇ、ＰＢＳ ｐＨ７．４中２３９μＭ、ＩｇＧに対して３．０当量）を添加した。反応物を３７℃で一晩インキュベートした。非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、非コンジュゲートトラスツズマブ及びビス－ＢＣＮ－ｈＯＫＴ３ ＰＦ２３にコンジュゲートしたトラスツズマブからなる２つの主生成物を示し（図２２、２レーン参照）、それによって、ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－ＰＦ２３の部分的形成を確認した。
実施例１７８．２：１分子フォーマットを有するＴ細胞エンゲージャー ｒｉｔ－ｖ１ａ－ＰＦ２３を得るためのビス－ＢＣＮ－ｈＯＫＴ３ ＰＦ２３のビス－アジド－リツキシマブ ｒｉｔ－ｖ１ａへのコンジュゲーション
ｒｉｔ－ｖ１ａの溶液（１．８μＬ、１００μｇ、ＰＢＳ ｐＨ７．４中３６３μＭ）に、ＰＢＳ ｐＨ７．４（１３．６μＬ）及びビス－ＢＣＮ－ｈＯＫＴ３ ＰＦ２３（４．３μＬ、３０μｇ、ＰＢＳ ｐＨ７．４中２３９μＭ、ＩｇＧに対して１．５当量）を添加した。反応物を３７℃で一晩インキュベートした。非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、非コンジュゲートリツキシマブ及びビス－ＢＣＮ－ｈＯＫＴ３ ＰＦ２３に１回コンジュゲートしたリツキシマブからなる２つの主生成物を示し（図２３、５レーン参照）、それによって、ｒｉｔ－ｖ１ａ－ＰＦ２３の部分的形成を確認した。
実施例１７９．２：１分子フォーマットを有するＴ細胞エンゲージャー ｒｉｔ－ｖ１ａ－１４５－ＰＦ０８を得るための４－１ＢＢ－ＰＥＧ１１－テトラジン ＰＦ０８のＢＣＮ－リツキシマブ ｒｉｔ－ｖ１ａ－１４５へのコンジュゲーション
ｒｉｔ－ｖ１ａ－１４５の溶液（３５μＬ、０．９ｍｇ、ＰＢＳ ｐＨ７．４中１７０μＭ）に、４－１ＢＢ－ＰＥＧ１１－テトラジン ＰＦ０８（４０μＬ、２４８μｇ、ＰＢＳ ｐＨ７．４中２２２μＭ、ＩｇＧに対して１．５当量）を添加した。反応物を室温で一晩インキュベートした。非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、４－１ＢＢ－ＰＥＧ２３－ＢＣＮ ＰＦ０８にコンジュゲートしたリツキシマブからなる１つの主生成物を示し（図２０、３レーン参照）、それによって、ｒｉｔ－ｖ１ａ－１４５－ＰＦ０８の部分的形成を確認した。
実施例１８０．２：１分子フォーマットを有するＴ細胞エンゲージャー Ｂ１２－ｖ１ａ－１４５－ＰＦ０８を得るための４－１ＢＢ－ＰＥＧ１１－テトラジン ＰＦ０８のＢＣＮ－Ｂ１２ Ｂ１２－ｖ１ａ－１４５へのコンジュゲーション
Ｂ１２－ｖ１ａ－１４５の溶液（３４μＬ、０．９ｍｇ、ＰＢＳ ｐＨ７．４中１７８μＭ）に、４－１ＢＢ－ＰＥＧ１１－テトラジン ＰＦ０８（４０μＬ、２４８μｇ、ＰＢＳ ｐＨ７．４中２２２μＭ、ＩｇＧに対して１．５当量）を添加した。反応物を室温で一晩インキュベートした。非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、４－１ＢＢ－ＰＥＧ２３－ＢＣＮ ＰＦ０８にコンジュゲートしたＢ１２からなる１つの主生成物を示し（図２０、５レーン参照）、それによって、Ｂ１２－ｖ１ａ－１４５－ＰＦ０８の部分的形成を確認した。
実施例１８１．２：１分子フォーマットを有するＴ細胞エンゲージャー ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－１４５－ＰＦ０９を得るための４－１ＢＢ－ＰＥＧ２－アリールアジド ＰＦ０９のＢＣＮ－トラスツズマブ ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－１４５へのコンジュゲーション
ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－１４５の溶液（１．９μＬ、１００μｇ、ＰＢＳ ｐＨ７．４中３４７μＭ）に、４－１ＢＢ－ＰＥＧ２－アリールアジド ＰＦ０９（５．９μＬ、３７μｇ、ＰＢＳ ｐＨ７．４中２２５μＭ、ＩｇＧに対して２．０当量）を添加した。反応物を室温で一晩インキュベートした。非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、単一４－１ＢＢ－ＰＥＧ２－アリールアジド ＰＦ０９にコンジュゲートしたトラスツズマブからなる１つの主生成物を示し（図２４、４レーン参照）、それによって、ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－１４５－ＰＦ０９の形成を確認した。
実施例１８２．２：１分子フォーマットを有するＴ細胞エンゲージャー ｒｉｔ－ｖ１ａ－１４５－ＰＦ０９を得るための４－１ＢＢ－ＰＥＧ２－アリールアジド ＰＦ０９のＢＣＮ－リツキシマブ ｒｉｔ－ｖ１ａ－１４５へのコンジュゲーション
ｒｉｔ－ｖ１ａ－１４５の溶液（２．０μＬ、１００μｇ、ＰＢＳ ｐＨ７．４中３３７μＭ）に、４－１ＢＢ－ＰＥＧ２－アリールアジド ＰＦ０９（５．９μＬ、３７μｇ、ＰＢＳ ｐＨ７．４中２２５μＭ、ＩｇＧに対して２．０当量）を添加した。反応物を室温で一晩インキュベートした。非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、単一４－１ＢＢ－ＰＥＧ２－アリールアジド ＰＦ０９にコンジュゲートしたリツキシマブからなる１つの主生成物を示し（図２４、２レーン参照）、それによって、ｒｉｔ－ｖ１ａ－１４５－ＰＦ０９の形成を確認した。
実施例１８３．２：１分子フォーマットを有するＴ細胞エンゲージャー ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－１４５－ＰＦ１２を得るためのテトラジン－ＰＥＧ３－ＧＧＧ－ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５（ＰＦ１２）のＢＣＮ－トラスツズマブ ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－１４５へのコンジュゲーション
ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－１４５（７５μＬ、１．５７５ｍｇ、ＰＢＳ中２１ｍｇ／ｍＬ）をＰＦ１２（８０μＬ、２当量、ＰＢＳ中６．５ｍｇ／ｍＬ）と３７℃で１６時間インキュベートした。非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥでの分析は、Ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－１４５－ＰＦ１２の形成を確認した（図２５、５レーン参照）。
実施例１８４．２：１分子フォーマットを有するＴ細胞エンゲージャー ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－１４５－ＰＦ１３を得るためのアリールアジド－ＰＥＧ１１－ＧＧＧ－ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５（ＰＦ１３）のＢＣＮ－トラスツズマブ ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－１４５へのコンジュゲーション
ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－１４５（２８０μＬ、５．２ｍｇ、ＰＢＳ中１８．６ｍｇ／ｍＬ）をＰＦ１３（４７７μＬ、１．５当量、ＰＢＳ中２．６ｍｇ／ｍＬ）と３７℃で１６時間インキュベートした。ＩｄｅＳ処理後の試料の質量スペクトル分析は、ＰＦ１３にコンジュゲートした架橋Ｆｃフラグメントに対応する、７３９９１Ｄａの１つの主生成物（予測質量：７３９８９Ｄａ）を示し、それによって、ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－１４５－ＰＦ１３の形成を確認した。
実施例１８５．２：１分子フォーマットを有するＴ細胞エンゲージャー Ｒｉｔ－ｖ１ａ－１４５－ＰＦ１３を得るためのアリールアジド－ＰＥＧ１１－ＧＧＧ－ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５（ＰＦ１３）のＢＣＮ－リツキシマブ Ｒｉｔ－ｖ１ａ－１４５へのコンジュゲーション
Ｒｉｔ－ｖ１ａ－１４５（０．５μＬ、０．０２５ｍｇ、ＰＢＳ中５０．６ｍｇ／ｍＬ）をＰＦ１３（６．６μＬ、４当量、ＰＢＳ中２．６ｍｇ／ｍＬ）と室温で１６時間インキュベートした。ＩｄｅＳ処理後の試料の質量スペクトル分析は、ＰＦ１３にコンジュゲートした架橋Ｆｃフラグメントに対応する、７３９２７Ｄａの１つの主生成物（予測質量：７３９２５Ｄａ）を示し、それによって、ｒｉｔ－ｖ１ａ－１４５－ＰＦ１３の形成を確認した。
実施例１８６．２：１分子フォーマットを有するＴ細胞エンゲージャー ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－１４５－ＰＦ２７を得るためのビス－ＢＣＮ－ＳＹＲ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５（ＰＦ２７）のビス－アジド－トラスツズマブ ｔｒａｓｔ－ｖ１ａへのコンジュゲーション
ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ（１．７８μＬ、０．０９９ｍｇ、ＰＢＳ中５６．１ｍｇ／ｍＬ）をＰＦ２７（１８．４μＬ、４当量、ＰＢＳ中７．６２ｍｇ／ｍＬ）及び２．８７μＬのＰＢＳと３７℃で１６時間インキュベートした。ＩｄｅＳ処理後の試料の質量スペクトル分析は、ＰＦ２７にコンジュゲートした架橋Ｆｃフラグメントに対応する、７４１９３Ｄａの１つの主生成物（予測質量：７４１７８Ｄａ）を示し、それによって、ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－１４５－ＰＦ２７の形成を確認した。
実施例１８７．２：１分子フォーマットを有するＴ細胞エンゲージャーＲｉｔ－ｖ１ａ－１４５－ＰＦ２７を得るためのビス－ＢＣＮ－ＳＹＲ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５（ＰＦ２７）のビス－アジド－リツキシマブ Ｒｉｔ－ｖ１ａへのコンジュゲーション
Ｒｉｔ－ｖ１ａ（１μＬ、０．０５５ｍｇ、ＰＢＳ中５４．６ｍｇ／ｍＬ）をＰＦ２７（８．９μＬ、４当量、ＰＢＳ中６．２ｍｇ／ｍＬ）及び１．６μＬのＰＢＳと３７℃で１６時間インキュベートした。ＩｄｅＳ処理後の試料の質量スペクトル分析は、ＰＦ２７にコンジュゲートした架橋Ｆｃフラグメントに対応する、７４１１８Ｄａの１つの主生成物（予測質量：７４１１４Ｄａ）を示し、それによって、ｒｉｔ－ｖ１ａ－１４５－ＰＦ２７の形成を確認した。
実施例１８８．２：１分子フォーマットを有するＴ細胞エンゲージャー ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－１４５－ＰＦ１７を得るためのアジド－ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５ ＰＦ１７のＢＣＮ－トラスツズマブ ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－１４５へのコンジュゲーション
ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－１４５の溶液（２９μＬ、１．５ｍｇ、ＰＢＳ ｐＨ７．４中３４７μＭ）に、アジド－ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５ ＰＦ１７（９７μＬ、１．１ｍｇ、ＰＢＳ ｐＨ７．４中４１１μＭ、ＩｇＧに対して４．０当量）を添加した。反応物を３７℃で一晩インキュベートした。非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、単一アジド－ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５ ＰＦ１７にコンジュゲートしたトラスツズマブからなる１つの主生成物を示し（図２６、４レーン参照）、それによって、ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－１４５－ＰＦ１７の形成を確認した。
実施例１８９．２：１分子フォーマットを有するＴ細胞エンゲージャー ｒｉｔ－ｖ１ａ－１４５－ＰＦ１７を得るためのアジド－ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５ ＰＦ１７のＢＣＮ－リツキシマブ ｒｉｔ－ｖ１ａ－１４５へのコンジュゲーション
ｒｉｔ－ｖ１ａ－１４５の溶液（３μＬ、１５０μｇ、ＰＢＳ ｐＨ７．４中３３７μＭ）に、アジド－ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５ ＰＦ１７（９．７μＬ、１１１μｇ、ＰＢＳ ｐＨ７．４中４１１μＭ、ＩｇＧに対して４．０当量）を添加した。反応物を３７℃で一晩インキュベートした。非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、単一アジド－ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５ ＰＦ１７にコンジュゲートしたリツキシマブからなる１つの主生成物を示し（図２６、２レーン参照）、それによって、ｒｉｔ－ｖ１ａ－１４５－ＰＦ１７の形成を確認した。
実施例１９０．２：１分子フォーマットを有するＴ細胞エンゲージャー ｔｒａｓ－ｖ１ａ－１４５－ＰＦ１９を得るためのアジド－ＩＬ１５ ＰＦ１９のＢＣＮ－トラスツズマブ ｔｒａｓ－ｖ１ａ－１４５へのコンジュゲーション
ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－１４５（４．０μＬ、０．０７５ｍｇ、ＰＢＳ中１８．６ｍｇ／ｍＬ）をＰＦ１９（４．６μＬ、５当量、ＰＢＳ中７．７ｍｇ／ｍＬ）と室温で１６時間インキュベートした。ＩｄｅＳ処理後の試料の質量スペクトル分析は、ＰＦ１９にコンジュゲートした架橋Ｆｃフラグメントに対応する、６３９４１Ｄａの１つの主生成物（予測質量：６３９３６Ｄａ）を示し、それによって、ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－１４５－ＰＦ１９の形成を確認した。
実施例１９１．２：１分子フォーマットを有するＴ細胞エンゲージャー ｒｉｔ－ｖ１ａ－１４５－ＰＦ１９を得るためのアジド－ＩＬ１５ ＰＦ１９のＢＣＮ－リツキシマブ ｒｉｔ－ｖ１ａ－１４５へのコンジュゲーション
ｒｉｔ－ｖ１ａ－１４５（２．０μＬ、０．１１２ｍｇ、ＰＢＳ中５０．６ｍｇ／ｍＬ）をＰＦ１９（５．１μＬ、４当量、ＰＢＳ中７．７ｍｇ／ｍＬ）と室温で１６時間インキュベートした。ＩｄｅＳ処理後の試料の質量スペクトル分析は、ＰＦ１９にコンジュゲートした架橋Ｆｃフラグメントに対応する、６３８８２Ｄａの１つの主生成物を示し（予測質量：６３８７９Ｄａ）、それによって、ｒｉｔ－ｖ１ａ－１４５－ＰＦ１９の形成を確認した。
実施例１９２．２：１分子フォーマットを有するＴ細胞エンゲージャー Ｔｒａｓ－ｖ１ａ－ＰＦ２９を得るためのビス－ＢＣＮ－ＳＹＲ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ１５（ＰＦ２９）のビス－アジド－トラスツズマブ ｔｒａｓ－ｖ１ａへのコンジュゲーション
ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ（１μＬ、０．０５６ｍｇ、ＰＢＳ中５６．１ｍｇ／ｍＬ）をＰＦ２９（１１μＬ、４当量、ＰＢＳ中３．６ｍｇ／ｍＬ）と３７℃で１６時間インキュベートした。非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、非コンジュゲートトラスツズマブ及び単一ビス－ＢＣＮ－ＳＹＲ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ１５ ＰＦ２９にコンジュゲートしたトラスツズマブに対応する２つの主生成物を示し（図２７、２レーン参照）、それによって、Ｔｒａｓ－ｖ１ａ－ＰＦ２９への部分的変換を確認した。
実施例１９３．２：１分子フォーマットを有するＴ細胞エンゲージャー Ｒｉｔ－ｖ１ａ－ＰＦ２９を得るためのビス－ＢＣＮ－ＳＹＲ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ１５（ＰＦ２９）のビス－アジド－リツキシマブ Ｒｉｔ－ｖ１ａへのコンジュゲーション
Ｒｉｔ－ｖ１ａ（１μＬ、０．０５５ｍｇ、ＰＢＳ中５４．６ｍｇ／ｍＬ）をＰＦ２９（１１μＬ、４当量、ＰＢＳ中３．６ｍｇ／ｍＬ）と３７℃で１６時間インキュベートした。非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、非コンジュゲートリツキシマブ及び単一ビス－ＢＣＮ－ＳＹＲ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ１５ ＰＦ２９にコンジュゲートしたリツキシマブに対応する２つの主生成物を示し（図２７、４レーン参照）、それによって、ｒｉｔ－ｖ１ａ－ＰＦ２９への部分的変換を確認した。
実施例１９４．２：１分子フォーマットを有するＴ細胞エンゲージャー ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－１４５－ＰＦ２１を得るためのテトラジン－ＰＥＧ１２－ＳＹＲ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ１５（ＰＦ２１）のＢＣＮ－トラスツズマブ ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－１４５へのコンジュゲーション
ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ（２μＬ、０．０４２ｍｇ、ＰＢＳ中２１ｍｇ／ｍＬ）をＰＦ２１（１０μＬ、６．７当量、ＰＢＳ中２．９ｍｇ／ｍＬ）と３７℃で１６時間インキュベートした。ＩｄｅＳ処理後の試料の質量スペクトル分析は、ＰＦ２１にコンジュゲートした架橋Ｆｃフラグメントに対応する、６４８６５Ｄａの１つの主生成物を示し（予測質量：６４８６３Ｄａ）、それによって、ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－１４５－ＰＦ２１の形成を確認した。
実施例１９５．ＣＤ３結合分析
細胞表面でＣＤ３を発現するＪｕｒｋａｔ Ｅ６．１細胞及び細胞表面でＣＤ３を発現しないＭＯＬＴ－４細胞を使用して、ＣＤ３への特異的結合を評価した。両細胞株を、２×１０５～１×１０６細胞／ｍｌの濃度で、１％ペニシリン／ストレプトマイシン及び１０％ウシ胎児血清を補充したＲＰＭＩ １６４０中で培養した。細胞を実験前に新鮮な培地で洗浄し、１ウェル当たり１００，０００個の細胞を９６ウェルプレート（２連ウェル）に播種した。６つの抗体の希釈系列をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で作製した。抗体を細胞懸濁液に１０倍希釈し、暗所中４℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を冷ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡで２回洗浄し、暗所中４℃で３０分間、抗ＨＩＳ－ＰＥ（２００についてのみ）又は抗ＩｇＧ１－ＰＥ（他の全ての化合物）とインキュベートした。第２のインキュベーションステップ後、細胞を２回洗浄した。７ＡＡＤをｌｉｖｅ－ｄｅａｄ染色として添加した。Ｙｅｌｌｏｗ－Ｂチャネル（抗ＩｇＧ１－ＰＥ及び抗ＨＩＳ－ＰＥ）及びＲｅｄ－Ｂチャネル（７ＡＡＤ）での蛍光の検出をＧｕａｖａ ５ＨＴフローサイトメーターで行った。生細胞におけるＹｅｌｌｏｗ－Ｂチャネル（抗ＩｇＧ１－ＰＥ及び抗ＨＩＳ－ＰＥ）の蛍光強度中央値をＫａｌｕｚａソフトウェアで決定した。全ての二重特異性抗体（但し、陰性対照リツキシマブは除く）が、ＣＤ３陽性Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１細胞株への濃度依存的結合を示す（表１）。対照的に、ＣＤ３陰性ＭＯＬＴ－４細胞株への結合は観察されなかった（表２）。
Figure 2023511857000077
Figure 2023511857000078
実施例１９６．ＦｃＲｎ結合分析
単一サイクル速度論を使用したＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（シリアル番号１９０９９１３）を使用し、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖ２．０．１を実行して、ＦｃＲｎ受容体への結合をｐＨ７．４及びｐＨ６．０で決定した。標準的なアミン化学を使用して、酢酸ナトリウムｐＨ５．５中でＣＭ５チップをＦｃＲｎとカップリングした。二重特異性抗体の段階希釈及び対照を、０．０５％ ｔｗｅｅｎ－２０を用いてＰＢＳ ｐＨ７．４中で（９点；２倍希釈系列；最高濃度８０００ｎＭ）、及び０．０５％ ｔｗｅｅｎ－２０を用いてＰＢＳ ｐＨ６．０中で（３点；２倍希釈系列；最高濃度４０００ｎＭ）測定した。流量３０μｌ／分、及び会合時間４０秒及び解離時間７５秒を使用した。定常状態分析を使用して試料を分析した。ＦｃＲｎ結合はｐＨ６．０で全ての二重特異性抗体について観察されたが、ｐＨ７．４では結合が観察されなかった（表３）。
Figure 2023511857000079
実施例１９７．ヒトＰＢＭＣを用いたＲａｊｉ－Ｂ腫瘍細胞殺傷に対する二重特異性抗体の効果
２連ウェルに、９６ウェルプレートでＲａｊｉ－Ｂ細胞（５ｅ４細胞）及びヒトＰＢＭＣ（５ｅ５）（１：１０細胞比）を蒔いた。二重特異性抗体の段階希釈（１：１０希釈；８点；最高濃度１０ｎＭ）をウェルに添加し、組織培養インキュベーター中３７℃で２４時間インキュベートした。試料をＣＤ１９、ＣＤ２０抗体で染色し、ＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒの取得前にヨウ化プロピジウムを添加した。生ＲａｊｉＢ細胞を、フローサイトメトリー分析を介したＰＩ－／ＣＤ１９＋／ＣＤ２０＋染色に基づいて定量化した。未処理細胞に対する、生ＲａｊｉＢ細胞のパーセンテージを計算した。ｈＯＫＴ３ ２００に基づく二重特異性抗体（図２８）と抗４－１ＢＢ ＰＦ３１に基づく二重特異性抗体（図２９）の両方について、標的依存性細胞殺傷が実証された。
実施例１９８．Ｒａｊｉ－Ｂ腫瘍細胞及びヒトＰＢＭＣの共培養におけるサイトカイン分泌に対する二重特異性抗体の効果
２連ウェルに、９６ウェルプレートでＲａｊｉ－Ｂ細胞（５ｅ４細胞）及びヒトＰＢＭＣ（５ｅ５）（１：１０細胞比）を蒔いた。二重特異性抗体の段階希釈（１：１０希釈；８点；最高濃度１０ｎＭ）をウェルに添加し、組織培養インキュベーター中３７℃で２４時間インキュベートした。ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ及びＩＬ－１０についてのサイトカイン分析を上清で行った（キット：ＨＣＹＴＯＭＡＧ－６０Ｋ－０５、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）。図３０はｈＯＫＴ３ ２００に基づく二重特異性抗体についてのサイトカインレベルを示し、図３１は抗４－１ＢＢ ＰＦ３１に基づく二重特異性抗体についてのサイトカインレベルを示す。
配列表
Ｃ末端ソルターゼＡ認識配列の配列識別（配列番号１）：
GGGGSGGGGSLPETGGHHHHHHHHHH
ソルターゼＡの配列識別（配列番号２）：
TGSHHHHHHGSKPHIDNYLHDKDKDEKIEQYDKNVKEQASKDKKQQAKPQIPKDKSKVAGYIEIPDADIKEPVYPGPATPEQLNRGVSFAEENESLDDQNISIAGHTFIDRPNYQFTNLKAAKKGSMVYFKVGNETRKYKMTSIRDVKPTDVGVLDEQKGKDKQLTLITCDDYNEKTGVWEKRKIFVATEVK
Ｈｉｓ６－ＴＥＶ部位－ＧＧＧ－ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５の配列識別（配列番号３）：
MGSSHHHHHHSSGENLYFQGGGITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSGGSGGGGSGGGSGGGGSLQNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
抗４－１ＢＢ ＰＦ３１の配列識別（配列番号４）：
DIVMTQSPPTLSLSPGERVTLSCRASQSISDYLHWYQQKPGQSPRLLIKYASQSISGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQDGHSFPPTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFSSYWMHWVRQAPGQRLEWMGEINPGNGHTNYSQKFQGRVTITVDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSFTTARAFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSLPETGGHHHHHH
ＳＹＲ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ１５（ＰＦ１８）の配列識別（配列番号５）：
SYRGGGGSGGGGSGGGGSNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
ＳＹＲ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ１５Ｒα－リンカー－ＩＬ１５（ＰＦ２６）の配列識別（配列番号６）：
SYRGGGGSGGGGSGGGGSITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSGGSGGGGSGGGSGGGGSLQNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS

Claims (23)

  1. 構造（１）：
    Figure 2023511857000080
    （式中、
    Ａｂは抗体であり；
    ａ、ｂ及びｃはそれぞれ独立に、０又は１であり；
    Ｌ１、Ｌ２及びＬ３はリンカーであり；
    Ｄはペイロードであり；
    ＢＭは分岐部分であり；
    Ｚは付加環化反応によって得ることができる接続基である）
    を有する抗体－ペイロードコンジュゲート。
  2. Ｚが［４＋２］付加環化又は１，３－双極子付加環化によって得ることができる、請求項１に記載の抗体－ペイロードコンジュゲート。
  3. Ｚがトリアゾール、シクロヘキセン、シクロヘキサジエン、イソオキサゾリン、イソオキサゾリジン、ピラゾリン、ピペラジンを含有する、請求項１又は２に記載の抗体－ペイロードコンジュゲート。
  4. Ｌ１、Ｌ２及びＬ３の各々が、存在する場合、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓ及びＰから選択される少なくとも２個、好ましくは５～１００個の原子の鎖である、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体－ペイロードコンジュゲート。
  5. 構造（５）：
    Figure 2023511857000081
    （式中、
    ｅは０～１０の範囲の整数であり；
    Ｓｕは単糖であり；
    Ｇは単糖部分であり；
    ＧｌｃＮＡｃはＮ－アセチルグルコサミン部分であり；
    Ｆｕｃはフコース部分であり；
    ｄは０又は１である）
    を有する、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体－ペイロードコンジュゲート。
  6. ａ及びｂが１であり、好ましくはＬ１とＬ２が同じであり、より好ましくは前記抗体－ペイロードコンジュゲートが請求項５に記載のものであり、出現するＳｕ、Ｚ、Ｇ及びｅの各々も同じである、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体－ペイロードコンジュゲート。
  7. 分岐部分ＢＭが炭素原子、窒素原子、リン原子、（複素）芳香環、（複素）環又は多環式部分から選択される、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体－ペイロードコンジュゲート。
  8. Ｌ３が－（Ｌ４）ｎ－（Ｌ５）ｏ－（Ｌ６）ｐ－（Ｌ７）ｑ－（式中、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６及びＬ７は一緒になってリンカーＬ３を形成するリンカーであり；ｎ、ｏ、ｐ及びｑは個別に０又は１であり、好ましくは
    （ａ）リンカーＬ４は－（Ｗ）ｋ１－（Ａ）ｄ１－（Ｂ）ｅ１－（Ａ）ｆ１－（Ｂ）ｇ１－Ｃ（Ｏ）－（式中、
    ｄ１＝０又は１であり；
    ｅ１＝１～１０の範囲の整数であり；
    ｆ１＝０又は１であり；
    ｇ１＝０～１０の範囲の整数であり；
    ｋ１＝０又は１であり、但し、ｋ１＝１である場合、ｄ１＝０であり；
    Ａは構造（２３）
    Figure 2023511857000082
    （式中、ａ１＝０又は１であり、Ｒ１３は水素、Ｃ１～Ｃ２４アルキル基、Ｃ３～Ｃ２４シクロアルキル基、Ｃ２～Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ３～Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ３～Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から選択され、前記Ｃ１～Ｃ２４アルキル基、Ｃ３～Ｃ２４シクロアルキル基、Ｃ２～Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ３～Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ３～Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基は任意選択で置換されており、Ｏ、Ｓ及びＮＲ１４から選択される１個又は複数のヘテロ原子によって任意選択で中断されており、Ｒ１４は水素及びＣ１～Ｃ４アルキル基からなる群から独立的に選択される、又はＲ１３は、おそらくスペーサー部分を介して、Ｎに接続されたＤである）
    によるスルファミド基であり；
    Ｂは－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－若しくは－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－部分であるか、又は（Ｂ）ｅ１は－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｅ３－ＣＨ２－ＣＨ２－部分（式中、ｅ３はｅ１と同じ方法で定義される）であり；
    Ｗは－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－、－ＮＨＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）ＮＨ－、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍＣ（Ｏ）ＮＨ－又は－（４－Ｐｈ）ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍＣ（Ｏ）ＮＨ－（式中、ｍは０～１０の範囲の整数である）である）
    によって表される；
    及び／又は
    （ｂ）リンカーＬ５はペプチドスペーサー、好ましくはＬ５が一般構造（２７）：
    Figure 2023511857000083
    （式中、Ｒ１７＝ＣＨ３又はＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ２である）
    によって表されるジペプチドである；
    及び／又は
    （ｃ）リンカーＬ６は自壊性スペーサー、好ましくは構造（２５）
    Figure 2023511857000084
    （式中、Ｒ３はＨ、Ｒ４又はＣ（Ｏ）Ｒ４であり、Ｒ４は、任意選択で置換されており、Ｏ、Ｓ及びＮＲ５から選択される１個又は複数のヘテロ原子によって任意選択で中断されているＣ１～Ｃ２４（ヘテロ）アルキル基、Ｃ３～Ｃ１０（ヘテロ）シクロアルキル基、Ｃ２～Ｃ１０（ヘテロ）アリール基、Ｃ３～Ｃ１０アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ３～Ｃ１０（ヘテロ）アリールアルキル基であり、Ｒ５は水素及びＣ１～Ｃ４アルキル基からなる群から独立的に選択され、好ましくはＲ３はＨ又はＣ（Ｏ）Ｒ４であり、Ｒ４＝４－メチル－ピペラジン又はモルホリンであり、最も好ましくはＲ３はＨである）
    によるパラ－アミノベンジルオキシカルボニル（ＰＡＢＣ）誘導体である；
    及び／又は
    （ｄ）リンカーＬ７は構造－Ｎ－（Ｃｘ－アルキレン）－Ｃ（Ｏ）－（式中、ｘは１～１０の範囲の整数である）によるアミノアルカン酸スペーサーであるか；若しくは
    リンカーＬ７は構造－Ｎ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｅ６－（ＣＨ２）ｅ７－Ｃ（Ｏ）－（式中、ｅ６は１～１０の範囲の整数であり、ｅ７は１～３の範囲の整数である）によるエチレングリコールスペーサーである）
    である、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体－ペイロードコンジュゲート。
  9. ＤがＰＢＤ二量体、インドリノベンゾジアゼピン二量体（ＩＧＮ）、エンジイン、ＰＮＵ１５９，６８２、デュオカルマイシン二量体、アマニチン及びオーリスタチン、好ましくはＰＢＤ二量体、インドリノベンゾジアゼピン二量体（ＩＧＮ）、エンジイン又はＰＮＵ１５９，６８２から選択される細胞毒である、請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体－ペイロードコンジュゲート。
  10. 仮定のペイロード抗体比１を有する抗体－ペイロードコンジュゲートを調製する方法であって、
    （ａ）少なくとも２つの反応性基Ｑを含有する構造（２）を有する化合物を、２つの反応性基Ｆで対称的に官能化されている構造（３）を有する抗体と反応させて：
    Figure 2023511857000085
    （式中、
    Ａｂは抗体であり；
    ａ、ｂ及びｃはそれぞれ個別に０又は１であり；
    Ｌ１、Ｌ２及びＬ３はリンカーであり；
    Ｖは反応性基Ｑ’又はペイロードＤであり；
    ＢＭは分岐部分であり；
    Ｑ及びＦは、これらが連結して接続基Ｚになる付加環化反応を受けることができる反応性基である）
    構造（１）：
    Figure 2023511857000086
    （式中、Ｚは、ＱとＦの付加環化反応によって得られる接続基であり：
    構造（１’）による官能化抗体は、ＶがペイロードＤである場合、抗体－ペイロードコンジュゲートであるか；又は構造（１’）による官能化抗体は、Ｖが反応性基Ｑ’である場合、ステップ（ｂ）によりさらに反応させられる）
    による官能化抗体を得るステップと；
    （ｂ）Ｖ＝Ｑ’である場合、反応性基Ｑ’を、反応性基Ｆ’を含有するペイロードと反応させて、ＶがペイロードＤである抗体－ペイロードコンジュゲートを得るステップと
    を含む方法。
  11. 前記付加環化反応が［４＋２］付加環化又は１，３－双極子付加環化である、請求項１０に記載の方法。
  12. Ｑが末端アルキン又はシクロオクチン部分、好ましくはＱがビシクロノニン（ＢＣＮ）、アザジベンゾシクロオクチン（ＤＩＢＡＣ／ＤＢＣＯ）、ジベンゾシクロオクチン（ＤＩＢＯ）又はスルホニル化ジベンゾシクロオクチン（ｓ－ＤＩＢＯ）、より好ましくはＢＣＮ又はＤＩＢＡＣ／ＤＢＣＯ、最も好ましくはＢＣＮを含む、請求項１０又は１１に記載の方法。
  13. ステップ（ａ）で、構造（１）による官能化抗体が得られ、Ｄが前記ペイロードであり、ステップ（ｂ）が実施されない、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. ステップ（ａ）で、構造（１）による官能化抗体が得られ、Ｄが反応性基Ｑであり、ステップ（ｂ）が実施される、請求項１０～１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 構造（２）：
    Figure 2023511857000087
    （式中、
    ａ、ｂ及びｃはそれぞれ個別に０又は１であり；
    Ｌ１、Ｌ２及びＬ３はリンカーであり；
    Ｄはペイロードであり；
    ＢＭは分岐部分であり；
    Ｑはシクロオクチン部分を含む）
    を有する化合物。
  16. Ｑがビシクロノニン（ＢＣＮ）、アザジベンゾシクロオクチン（ＤＩＢＡＣ／ＤＢＣＯ）、ジベンゾシクロオクチン（ＤＩＢＯ）又はスルホニル化ジベンゾシクロオクチン（ｓ－ＤＩＢＯ）、より好ましくはＢＣＮ又はＤＩＢＡＣ／ＤＢＣＯ、最も好ましくはＢＣＮである、請求項１５に記載の化合物。
  17. Ｄが細胞毒である、請求項１５又は１６に記載の化合物。
  18. Ｌ１とＬ２が共に存在し、同一である、請求項１５～１７のいずれか一項に記載の化合物。
  19. ａ＝ｂ＝ｃ＝１である、請求項１５～１８のいずれか一項に記載の化合物。
  20. 請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体－ペイロードコンジュゲートと、薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物。
  21. それを必要とする対象の処置に使用するための請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体－ペイロードコンジュゲート。
  22. がんの処置に使用するための請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体－ペイロードコンジュゲート。
  23. ｅ＝０であり、前記コンジュゲートがＦｃガンマ受容体ＣＤ１６に結合しない、請求項２１又は２２に記載の抗体－ペイロードコンジュゲート。
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