CN117120458A - 靶向碳酸酐酶ix的肽配体、包含其的肽结构体及它们的用途 - Google Patents

靶向碳酸酐酶ix的肽配体、包含其的肽结构体及它们的用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及与碳酸酐酶IX(Carbonic Anhydrase IX，CAIX)特异性结合的肽配体、包含其的肽结构体及它们的用途。本发明的CAIX结合肽配体包括D‑氨基酸，从而在体内稳定，且对CAIX具有高的结合特异性，并且，包含其的线形或环形的CAIX结合肽结构体在体内能够以高的亲和性与CAIX结合，从而在由CAIX介导的疾病的诊断、预防、抑制或治疗方面有效。

Description

靶向碳酸酐酶IX的肽配体、包含其的肽结构体及它们的用途
技术领域
本发明涉及与碳酸酐酶IX(Carbonic Anhydrase IX，CAIX)特异性结合的肽配体及包含其的肽结构体。具体地，本发明涉及对CAIX具有特异性，且包含D-氨基酸以提高稳定性的CAIX结合肽配体；包含上述肽配体的线形或环形的高亲和性CAIX结合肽结构体；及它们在用于诊断、预防、抑制或治疗由CAIX介导的疾病中的用途。
背景技术
碳酸酐酶(Carbonic Anhydrase，CA)作为共同存在于包括人类在内的高等脊椎动物中的锌(Zn2+)金属酶，是一种用于催化可逆性水化反应的酶，上述水化反应是用于将二氧化碳转换为氢离子和碳酸氢离子这种CA已发现有16种同工酶形态，并且在人体中存在于胃肠道、生殖道、神经系统、肾脏、肺、皮肤及眼球等多个组织中。已知CA同工酶大部分参与重要的生理学过程，如呼吸、钙化、酸碱平衡、骨吸收及房水、脑脊液、唾液和胃酸的形成等(Thiry et al.，TRENDS in Pharmacological Sciences，27(11):566-573，2006)。
据报道，在CA家族中，碳酸酐酶IX(CAIX)特别地在正常组织中表达非常有限，相反，在大多数实体瘤中异常地过度表达，这主要是由于实体瘤的过度增殖而发生的缺氧(hypoxia)使作为转录因子的缺氧诱导因子(HIF-1)被诱导，从而由于HIF-1的强转录活化所致(De Simone et al.，Biochimica et BiophysicaActa，1804:404-409，2010；Thiry etal.，ditto)。
肿瘤缺氧是实体瘤以超过宿主的血管系统所提供的血液供应能力的速度生长产生氧气稀薄的环境而引起的。即使在缺氧微环境下，实体瘤也通过各种遗传变异来维持持续的生长和增殖。抗癌化学药剂通过血液难以传递到这种缺氧性肿瘤细胞中，并且在放疗中，由于源自放射线的自由基的细胞毒性作用所需的氧气会不足，因此对化疗和放疗的抗性会有所增加。此外，缺氧性肿瘤细胞在细胞表面诱导CAIX的过表达，通过CAIX的细胞外催化结构域而进行的CO2水化反应来降低肿瘤细胞的细胞外环境的pH。由此形成的酸性肿瘤微环境能够促进肿瘤细胞的侵袭和迁移，并能够使pH敏感性药剂失效(Thiry et al.，ditto)。因此，肿瘤缺氧通常被认为是癌症患者的不良的预后因素。
最近，正在积极进行有关通过以在肿瘤细胞中过表达的CAIX为靶点或通过干扰CAIX的催化活性来破坏由肿瘤细胞引起的pH调节，从而抑制与CAIX相关的肿瘤的生长和增殖的研究。这种研究的重点主要在于，与CAIX结合的单克隆抗体或磺酰胺类的小分子抑制剂的开发上。但是，对于实体瘤靶向性方面，分子量大的单克隆抗体存在难以有效地进行传递的问题，并且磺酰胺类的小分子抑制剂在溶液状态下相对不稳定，从而作为药物化合物的实用性会被限制。
因此，亟需开发一种适合于包含癌症的治疗、预防、诊断、预后预测、影像化在内的癌症治疗的医药学用途，且具有高亲和性以及稳定的新型CAIX-特异性结合剂及抑制剂。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Thiry et al.，TRENDS in Pharmacological Sciences，27(11):566-573，2006
非专利文献2：De Simone et al.，Biochimica et Biophysica Acta，1804:404-409，2010
发明内容
发明所要解决的问题
本发明的一目的在于，提供一种适合于癌症的治疗、预防、诊断或预后预测用途，且稳定的CAIX-特异性结合剂及抑制剂。
本发明的一目的在于，提供一种稳定的CAIX-特异性结合肽配体。
本发明的一目的在于，提供一种高亲和性CAIX-特异性肽结构体，包括CAIX-特异性结合肽配体以及磺酰胺官能团在内的一种以上的效应子(effector)或官能团。
本发明的附加目的在于，提供一种包括上述肽结构体的偶联物(conjugate)。
本发明的附加目的在于，提供一种包括上述肽配体、肽结构体或偶联物的癌症的诊断、预防或治疗用组合物。
本发明的附加目的在于，提供一种利用上述肽配体、肽结构体或偶联物来诊断癌症的方法。
本发明的附加目的在于，提供一种利用上述肽配体、肽结构体或偶联物来治疗癌症的方法。
本发明的附加目的在于，提供一种利用上述肽配体、肽结构体或偶联物来在癌症治疗后对预后进行预测的方法。
用于解决问题的方案
为了达到上述目的而进行深入研究的结果，本申请的发明人开发了一种新型CAIX-特异性结合剂及抑制剂，其包括D-氨基酸，从而具有稳定性，且能够以高亲和性与CAIX特异性结合。
本发明的一方面，提供一种包括SEQ ID NO.1至44中任一氨基酸序列的CAIX-特异性肽配体。上述CAIX-特异性肽配体的组成氨基酸(constitutive aminoacid)中至少一个是由D-氨基酸构成，从而上述CAIX-特异性肽配体可以稳定地维持在体内。上述CAIX-特异性肽配体的组成氨基酸中赖氨酸(Lys)残基的侧链ε-氨基能够被化学官能团所取代。上述化学官能团的非限制性例包括五氟苯甲酸(pentafluorobenzoic acid)或双酚酸(diphenolic acid)。
本发明的一方面提供一种肽结构体，其包括：直接或通过间隔基(spacer)与上述CAIX-特异性肽配体连接的含磺酰胺官能团的氨基酸残基。上述肽结构体可以进一步包括含除了磺酰胺官能团以外的一个以上的其他官能团的氨基酸残基，并可以选择环形或线形结构。
本发明的一方面，提供一种具有如下化学式1的环形结构的CAIX-特异性肽结构体。
【化学式1】
上述式中，
P为本发明的CAIX-特异性结合肽，
F1为甘氨酸(Gly)或含磺酰胺官能团的氨基酸残基，
F2为含磺酰胺官能团的氨基酸残基，
F3为甘氨酸(Gly)或含除了磺酰胺以外的官能团的氨基酸残基，
n和m分别独立地为0或1，
F4为通式-(S1)o-(F5)p-(S2)q-(F6)r-NH2的基团，其中，
S1和S2分别独立地为间隔基，
F5和F6分别独立地为含除了磺酰胺以外的官能团的氨基酸残基，
o、p、q和r分别独立地表示0至6的整数。
本发明的一方面，提供一种具有如下化学式2的线形结构的CAIX-特异性肽结构体。
【化学式2】
CH3C(＝O)-Gly-(F7)s-F8-(S3)t-P-(F9)u-(S4)v-(F10)w-NH2
上述式中，
P为本发明的CAIX-特异性结合肽，
F8为含磺酰胺官能团的氨基酸残基，
F7、F9和F10分别独立地为含除了磺酰胺以外的官能团的氨基酸残基，或
在F9为多个的情况下，至少一个F9为含磺酰胺官能团的氨基酸残基，其余F9和F7、F10分别独立地为含除了磺酰胺以外的官能团的氨基酸残基，
S3和S4分别独立地为间隔基，
s、t、u、v和w分别独立地表示0至3的整数。
上述CAIX-特异性肽结构体中，含磺酰胺官能团的氨基酸残基可具有如下结构，但不限于此。
上述CAIX-特异性肽结构体中，含除了磺酰胺以外的官能团的氨基酸残基可以通过赖氨酸残基的侧链ε-氨基而引入，例如，包括螯合物(chelator)、环烷烃(cycloalkane)、生物素(biotin)、葡庚糖酸(glucoheptonic acid)、4-(p-碘苯基)丁酸(IB)、荧光染料或细胞毒性剂。
本发明的一方面，提供一种在上述CAIX-特异性肽结构体中缀合有荧光染料、细胞毒性剂或放射性同位素的偶联物。
本发明的一方面，提供一种包括上述CAIX-特异性肽结构体或上述偶联物的癌症的诊断、预防或治疗用药物组合物。上述癌症可以是表达CAIX的癌症。上述癌症可以选自肝癌、肺癌、大肠癌、胃癌、乳腺癌、结肠癌、骨癌、胰腺癌、头颈癌、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、食管癌、小肠癌、肛门周围癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、前列腺癌、胆管癌、膀胱癌、肾癌、输尿管癌、肾细胞癌、肾骨盆癌、黑色素瘤、甲状腺癌、星形细胞瘤和胶质母细胞瘤组成的组，但不限于此。
本发明的一方面，提供一种癌症的诊断方法，其包括将上述CAIX-特异性肽结构体或上述偶联物施用于个体。
本发明的一方面，提供一种癌症的治疗方法，其包括将上述CAIX-特异性肽结构体或上述偶联物施用于个体。
本发明的一方面，提供一种癌症治疗后预后预测方法，其包括将上述CAIX-特异性肽结构体或上述偶联物施用于个体。
发明效果
根据本发明，提供了与CAIX特异性结合且稳定的新型高亲和性CAIX结合剂及抑制剂。本发明的CAIX结合剂包括含有一个以上的D-氨基酸的CAIX-特异性结合肽配体，从而在体内显示出优异的稳定性并且对CAIX靶向性方面有效。此外，本发明提供一种通过氨基酸残基的侧链将包括磺酰胺官能团在内的一个以上的效应子或官能团引入上述CAIX-特异性肽配体的肽结构体，从而可以提供，由于对CAIX的高结合亲和性，在癌症的影像化或诊断用途方面尤其实用的CAIX结合剂。本发明的CAIX-特异性肽结构体还可以通过结合荧光染料、细胞毒性剂或放射性同位素等来用作在诊断、预防或治疗癌症方面有效的药物。
附图说明
图1是示出针对根据本发明一实施例的人类碳酸酐酶IX(hCAIX)蛋白质的肽筛选过程的流程图。
图2示出了用于在根据本发明一实施例的肽库中引入磺酰胺官能团的点击反应及用于hCAIX筛选的库结构。
图3示出了使用根据本发明一实施例的COPAS对与hCAIX结合的阳性珠进行筛选的结果。
图4a示出了根据本发明一实施例的hCAIX细胞外结构域(ECD)结合肽的质谱分析结果。
图4b示出了根据本发明一实施例的hCAIX ECD结合肽的MS/MS序列分析结果。
图5a和图5b是示出根据本发明一实施例的肽结构体(35号)在血清和血浆中的稳定性试验结果的图表。
图6a和图6b是示出根据本发明一实施例的肽结构体(48号)在血清和血浆中的稳定性试验结果的图表。
图7a至图7d是示出对根据本发明一实施例的肽结构体的hCAIX ECD及人类碳酸酐酶XII(hCAXII)ECD的结合亲和力及结合动力学特性进行分析的结果图表。
图8a至图8d为使用了根据本发明一实施例的肽结构体的SK-RC-52细胞株的荧光激活细胞分类(FACS)分析结果图表。
图8e至图8h为使用了根据本发明一实施例的肽结构体的A549细胞株的FACS分析结果图表。
图9是示出使用了根据本发明一实施例的肽结构体(22号)的SK-RC-52细胞株的免疫荧光分析结果的图。
图10为根据本发明一实施例的肽结构体(94号)的Z-stack共焦显微镜分析图像。
图11a至图11c示出了在异种移植SK-RC-52细胞株的小鼠中，根据本发明一实施例的肽结构体的生物分布分析结果。图11a示出了利用小鼠的实验计划安排，图11b是在小鼠中切除的肿瘤和器官的体外(ex vivo)成像图，图11c是对每个肿瘤和器官进行均质化并测量荧光强度的结果图表。
图12a和图12b是示出在异种移植SK-RC-52细胞株的小鼠中，根据本发明一实施例的肽结构体-药物缀合物(86号)引起的小鼠的体重变化(图12a)和肿瘤大小变化(图12b)的图表。
图13示出了在异种移植SK-RC-52细胞株的小鼠中使用了根据本发明一实施例的同位素(177Lu)标记的肽结构体(95号)的体内(in vivo)SPECT/CT影像实验结果。
图14是将同位素(177Lu)标记的肽结构体(95号)用LC进行提纯的结果的色谱图。
图15a至图15c是示出在异种移植SK-RC-52细胞株的小鼠中，根据本发明一实施例的同位素(177Lu)标记的肽结构体(95号)而引起的小鼠的肿瘤大小变化的图(图15a)和图表(图15c)，以及体重变化的图表(图15b)。
具体实施方式
除非另有定义，本文中所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员的常规理解的相同的含义。与本文中所记载的内容类似或等同的任意方法和物质可以用于本发明的实施或试验中。
本发明能够在后述的权利要求书的记载以及由此解释的等同范围内进行各种改变和应用。
本发明的CAIX-特异性肽配体
本发明提供与CAIX特异性结合的肽配体。本发明的CAIX-特异性肽配体可以包括SEQ ID NO.1至44中任一氨基酸序列。上述肽配体可以包括D-氨基酸或仅由D-氨基酸构成。此外，上述肽配体中，组成氨基酸残基中的赖氨酸(Lys)残基的侧链ε-氨基可以被一个以上的化学官能团取代，例如，上述官能团包括五氟苯甲酸或双酚酸，但不限于此。并且，上述肽配体还可以包括在组成氨基酸残基中苯丙氨酸(Phe)残基的侧链的一种以上的化学修饰(chemicalmodification)。这种修饰包括：苯丙氨酸残基被修饰为高苯丙氨酸残基；苯基被修饰为萘基；或苯基中卤代基、氨基或苯基取代基的取代等，但不限于此。
本发明的肽配体可以是以具有特定序列的氨基酸残基彼此结合来组成线形或环形的分子的方式来制备的。本发明的肽配体可以通过公知的肽合成方法来制备，并不进行特别限制。一实施方式中，本发明的肽配体可以通过在固相单珠上重复肽合成过程直至完成所需的长度和序列的肽来制备。
本发明的CAIX-特异性肽配体还包括其的盐形态。
本发明的CAIX-特异性肽结构体
本发明提供一种肽结构体，其包括：直接或通过间隔基(spacer)与CAIX-特异性肽配体连接的含磺酰胺官能团的氨基酸残基。上述肽结构体可以进一步包括含除了磺酰胺官能团以外的一个以上的其他官能团的氨基酸残基。本发明的肽结构体中包括磺酰胺官能团在内的化学官能团可以通过氨基酸残基的侧链引入。引入上述官能团的氨基酸残基优选为赖氨酸。
本发明的肽结构体可以包括一个或两个磺酰胺官能团。上述磺酰胺官能团的引入可以通过公知的合成反应来实现，对此并不进行特别限定。本发明的一实施方式中，可以通过点击化学(click chemistry)反应来将磺酰胺官能团引入到本发明的肽结构体中。作为能够引入到本发明的肽结构体的优选的含磺酰胺官能团的氨基酸残基的例子包括以下结构，但不限于此。
一实施方式中，作为能够引入到本发明的肽结构体的除了磺酰胺以外的官能团的非限制性例，可以包括螯合物(chelator)、碳数为5至15的环烷烃(cycloalkane)、生物素(biotin)、葡庚糖酸(glucoheptonic acid)、4-(p-碘苯基)丁酸(IB)、荧光染料或细胞毒性剂。
上述螯合物可以是选自1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)、1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)、乙二胺四乙酸2,2',2”,2”'-(乙烷-1,2-二基二次氮基)四乙酸(EDTA)、1,4,7,10,13,16-六氮杂环十八烷-N,N',N”,N”',N””,N””'-六乙酸(HEHA)、2-[4-硝基苄基]-1,4,7,10,13-五氮杂环十五烷-N,N',N”,N”',N””-五乙酸(PEPA)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四(亚甲基膦酸)(DOTP)、(1R,4R,7R,10R)-α,α',α”,α”'-四甲基-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸)四钠盐(DOTMA)、2-[双[2-[双(羧甲基)氨基]乙基]氨基]乙酸(DTPA)及三亚乙基四胺(TETA)中的一个以上，但不限于此。
例如，上述碳数为5至15的环烷烃可以是选自环戊烷、环己烷、环庚烷、环辛烷、环壬烷、环癸烷、金刚烷、降冰片烷(norbornane)、异冰片烷及三环癸烷中的一个以上，但不限于此。
本发明的肽结构体还可以通过间隔基将含磺酰胺官能团等化学官能团的氨基酸残基与CAIX-特异性结合肽配体连接。例如，上述间隔基可以是选自聚乙二醇(PEG)链接剂、甘氨酸、肌氨酸(sarcosine)、及由1至5的D-氨基酸或L-氨基酸组成的肽链接剂中的一个以上，但不限于此。
本发明的肽结构体可以具有环形或线形的结构。优选地，本发明的肽结构体具有如下化学式1的环形结构。
【化学式1】
上述式中，
P、F1、F2、F3、F4、n及m分别如上述所定义的内容。
虽然不受特定的理论的约束，但是与线形肽相比，如本发明的环形肽结构体的环形结构，其灵活性(flexibility)会较差，因此认为，当靶向结合时，熵损失少，从而结合亲和力更高且对靶点的结合特异性有所增加。
本发明的肽结构体显示出高选择性，即，上述肽结构体与CAIX特异性结合，但不与CAIX的其他同工酶(例如，碳酸酐酶XII)结合。
偶联物
本发明的CAIX-特异性肽结构体直接或通过链接剂(linker)与荧光染料、细胞毒性剂或放射性同位素等进行结合，从而可以形成偶联物。上述偶联物可以靶向CAIX，且能够通过荧光染料或放射性同位素对CAIX进行表达的癌进行标记或者将放射性同位素或细胞毒性剂等药物有效地传递到上述癌中，从而在癌症的诊断、预防或治疗用途方面有效。
一实施方式中，上述链接剂可以是选自6-马来酰亚胺己酰基(6-maleimidocaproyl，MC)、马来酰亚胺丙酰基(maleimidopropanoyl，MP)、缬氨酸-瓜氨酸(valine-citrulline，val-cit)、丙氨酸-苯丙氨酸(alanine-phenylalanine，ala-phe)、p-氨基苄氧基羰基(p-aminobenzyloxycarbonyl，PAB)、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(N-Succinimidyl 4-(2-pyridylthio)pentanoate，SPP)、N-琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯(N-Succinimidyl4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1carboxylate，SMCC)、4-(2-吡啶二硫代)丁酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDB)及N-琥珀酰亚胺基(4-碘代-乙酰基)氨基苯甲酸酯(N-Succinimidyl(4-iodo-acetyl)aminobenzoate，SIAB)中的一种以上，但不限于此。
一实施方式中，上述荧光染料的非限制性例可以包括选自近红外(near-infrared)荧光染料、荧光素(fluorescein)类、若丹明(rhodamine)类、Alexa Fluor、4,4-二氟-4-硼-3a,4a-二氮杂-s-茚(BODIPY)、德克萨斯红(TexasRed)、丹磺酰(dansyl)、丽丝胺(Lissamine)、赛恩宁(Cy)及藻红素(phycoerythrin)中的一种以上。
一实施方式中，上述细胞毒性剂可以是选自毒素、化学治疗剂、药物部分(moiety)、抗生素及核酸酶中的一种以上，但不限于此。
一实施方式中，上述放射性同位素可以是选自氟-18(F-18)、碳-11(C-11)、碳-14(C-14)、锝-99m(Tc-99m)、铜-64(Cu-64)、铜-67(Cu-67)、镝-168(Dy-168)、铋-213(Bi-213)、钐-153(Sm-153)、锶-89(St-89)、锶-90(St-90)、铒-169(Er-169)、磷-32(P-32)、钯-103(Pd-103)、铼-186(Re-186)、铼-188(Re-188)、氧-15(O-15)、硒-75(Se-75)、钠-24(Na-24)、锶-85(Sr-85)、镥-177(Lu-177)、钇-90(Y-90)、碘-123(I-123)、碘-125(I-125)、碘-131(I-131)、铱-192(Ir-192)、铱-196(Ir-196)、镱-166(Yb-166)、铟-111(In-111)、氙-133(Xe-133)、氮-13(N-13)、钙-47(Ca-47)、钴-57(Co-57)、钴-60(Co-60)、铬-51(Cr-51)、氪-81(Kr-81)、钾-42(K-42)、钬-166(Ho-166)、镓-67(Ga-67)、镓-68(Ga-68)、锕-225(Ac-225)、锆-89(Zr-89)、铅-212(Pb-212)及砹-211(At-211)中的一种以上。
治疗性给药及剂型
本发明提供一种癌症的诊断、预防或治疗用药物组合物，其包括本发明的CAIX-特异性肽配体、肽结构体或偶联物。本发明的癌症优选为实体癌。更优选地，本发明的癌症是表达CAIX的癌。例如，本发明的癌症可以是诸如肝癌、肺癌、大肠癌、胃癌、乳腺癌、结肠癌、骨癌、胰腺癌、头颈癌、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、食管癌、小肠癌、肛门周围癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、前列腺癌、胆管癌、膀胱癌、肾癌、输尿管癌、肾细胞癌、肾骨盆癌、黑色素瘤、甲状腺癌、星形细胞瘤或胶质母细胞瘤等实体癌，但不限于此。
本发明的癌症的诊断、预防或治疗用药物组合物的给药对象可以是有患癌症风险、被诊断为癌症或接受癌症治疗的哺乳类。上述哺乳类可以是人类或除人类以外的哺乳类。
根据本发明的癌症的诊断、预防或治疗用药物组合物分别可以根据常规的方法以散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬液、乳液、糖浆、气雾剂等口服剂型；外用药；栓剂；和灭菌注射溶液的形态剂型化来使用，为了剂型化，可以包括在药物组合物的制备中常规使用的适当的载体、赋形剂或稀释剂。
作为上述载体、赋形剂或稀释剂可以使用包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、海藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟苯甲酯、羟苯丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油等的多种化合物或混合物。
当进行制剂化时，可以通过使用在制药行业中常规所使用的填充剂、重量剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂等的稀释剂或赋形剂来制备。
根据本发明的癌症的预防或治疗用药物组合物的优选给药量根据患者的状态、体重、疾病的程度、药物形态、给药途径及期间而有所不同，但可以由本领域技术人员适当进行选择。然而，为了理想的效果，能够以一天0.0001mg/kg至2000mg/kg的量，优选地以0.001mg/kg至2000mg/kg的量进行给药。给药方式上，能够以一天一次的方式给药，也能够分多次给药。但是，本发明的范围不限于上述给药量。
根据本发明的癌症的预防或治疗用药物组合物可以通过多种途径向鼠、裸鼠、家畜、人类等哺乳动物进行给药。给药方式上，例如可以通过经口、直肠或静脉、肌肉、皮下、子宫内膜或脑血管内(脑室内(intracerebroventricular))注射等方式进行给药。
本发明还提供一种癌症的治疗方法，其包括将本发明的CAIX-特异性肽结构体或偶联物施用于需要治疗癌症的个体。
本发明的CAIX-特异性肽结构体和偶联物还可以用于通过靶向癌症以及对癌症进行影像化来诊断癌症的用途，或者可以施用于接受癌症治疗的个体中，用于在癌症治疗后预测治疗预后或进行观察的用途。
以下，通过实施例对本发明进行更加详细地说明。这些实施例仅仅是用于更加具体地示出本发明，而不是为了限制本发明的正当的权利范围而提供的，并且，在本发明的权利要求范围内能够进行多种改变，对于本领域技术人员来说显而易见的。
【实施例】
实施例1.筛选与人类碳酸酐酶IX结合的肽
合成肽库，以便获得与人类碳酸酐酶IX(hCAIX)的细胞外结构域(ECD)特异性结合的肽。针对合成的肽库进行筛选来筛选出的肽，评价了对hCAIX ECD的结合力和特异性。
图1中示出了针对hCAIX ECD的肽筛选过程的流程图。
1-1.合成引入有珠的肽库
为了合成肽库，通过使用TentaGel珠合成了随机OBOC(组合的单珠单化合物(combinatorial one-bead-one-compound))库。S-NH2树脂(Cat#NSD30902)购自Rapp Polymere GmbH(德国)。
在S-NH2珠(聚乙二醇接枝聚苯乙烯珠(polyethyleneglycol-graftedpolystyrene beads))上的每个残基位置，使用除半胱氨酸(cysteine)和蛋氨酸(methionine)以外的18种D型氨基酸，用自动合成仪(Apex 396，爱谱肽客(AAPPTEC))重复进行分离混合(split and mix)过程来合成。尤其，对于Fmoc(芴甲氧羰基)-D-异亮氨酸(Fmoc(fluorenylmethoxycarbonyl)-D-isoleucine-OH)和Fmoc-D-谷氨酸(Fmoc-D-glutamine-OH)，当进行肽的氨基酸序列分析时，为了区分同位素残基，分别添加了10mol％的Fmoc-甘氨酸(Fmoc-glycine-OH)。在NMP(N-甲基吡咯烷酮(N-Methylpyrrolidone))溶剂中将TentaGel进行膨润，并装有能够进行光裂解(photocleavage)的链接剂(linker)后，通过自动合成仪合成了肽库。当引入Fmoc-ANP链接剂(3-(Fmoc-氨基)-3-(2-硝基苯基)丙酸，Cat#LSP308，爱谱肽客)时，通过添加N-乙酰甘氨酸(3当量，Cat#A16300，西格玛奥德里(Sigma-Aldrich))将装载比例调整为1/4，并与TBTU(3当量，Cat#12806，西格玛奥德里)、DIPEA(7.5当量，Cat#8.00894，Sigma-Aldrich)一同进行反应。将固相珠用NMP清洗，并为除去Fmoc保护基与哌啶/NMP(1:4)溶液进行反应，然后使用NMP、DCM(二氯甲烷)以及NMP依次进行清洗。接着，通过相同的方法合成Fmoc-Arg(pbf)-OH(3当量，Cat#36404，GL Biochem)和Fmoc-PEG1-OH(3当量，Cat#246201，ChemPep)来制备链接剂。为了合成肽库，将安装有链接剂的珠分成相同的量并装在自动合成仪RV(反应容器(reactionvessel))的18个孔(well)中。当完成一个循环的偶联(coupling)以及Fmoc保护基的去除时，将固相珠聚集到CV(收集容器(collector vessel))中进行混合后，再以相同的量分到18个RV孔中并进行了偶联及Fmoc保护基的去除，重复进行分离混合过程直至达到所期望的肽长度。
1-2.合成引入有磺酰胺官能团的肽库
在上述实施例1-1中所合成的肽中引入叠氮(azido)取代基之后，将18个RV的珠回收到一个管中，然后与4-乙炔基苯磺酰胺(4-ethynylbenzenesulfonamide)进行点击反应(图2)。具体地，在氩气(Ar)气氛下，在NMP溶液中将装有肽库的珠1当量、4-乙炔基苯磺酰胺(3当量)、CuI(1当量)、三(苄基三唑基甲基)胺(TBTA，3当量，Cat#T2993，TCI公司)、DIPEA(10当量)进行混合后在常温下反应12小时。反应完成后，用NMP以及0.1M二乙基二硫代氨基甲酸钠(西格玛奥德里，Cat#D3506)/NMP溶液清洗珠以除去铜杂质。为了去除氨基酸残基的保护基，在三氟乙酸(95％，TFA，Cat#299537，西格玛奥德里)、三蒸水(2.5％)、三异丙基硅烷(2.5％，TIS，Cat#233781，西格玛奥德里)中反应2小时，然后用DCM清洗并在真空下进行干燥，并且在4℃下以避光状态进行保存。
图2中示出了用于在肽库中引入磺酰胺官能团的点击反应及用于hCAIX筛选的库结构的一实施例。
实施例2.与人类CAIX结合的肽的筛选
2-1.肽库首次筛选
将50mg的引入了上述实施例1中合成的肽库的珠转移到Extract-Clean过滤柱(Cat#211104，S*PURE，新加坡)，然后添加2mL的pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液(PBS)，并通过超声波清洗机(ultrasonic cleaner)(Cat#5210R-DTH，必能信(BRANSON)，美国)进行超声波处理(sonication)使其膨润。将PBS溶液替换为2mL封闭(blocking)溶液[10％FBS，0.1％吐温20(Cat#69295-1601，纯正化学，日本)溶于pH7.4PBS]之后，在常温下在360°振荡器(Shaker)(Cat#M04-238-157，赛洛捷克，美国)中进行恒温处理(incubation)。然后加入60nM的装载有荧光染料的hCAIX ECD(百普赛斯，Cat#CA9-H5226)溶液并进一步进行恒温处理后去除溶液。将珠转移到锥形管(Conical tube)中，然后用45mL的含有0.1％吐温20的PBST缓冲溶液进行稀释后，分为小份。在每个已分为小份的溶液中添加含有0.1％吐温20的PBST缓冲溶液进一步进行稀释，并装入COPAS的样本容器(sample vessel)中后进行筛选。筛选是通过激发波长(Excitation)640nm、发射波长680/30BP(Emission 680/30BP)来进行，并且在富集模式(Enrichment mode)、PMT690、增益(Gain)3.0的条件下筛选出荧光强度高的珠约5000个。通过重复5次上述过程来筛选出用于二次筛选的共25000个阳性珠(即，装有与hCAIX ECD结合的肽的珠)(图3)。
2-2.肽库二次筛选
从上述实施例2-1中通过首次筛选获得的约25000个阳性珠中除去装载荧光染料的hCAIX ECD。之后，在上述珠中加入1mL封闭溶液并使用360°振荡器进行恒温处理后除去溶液。然后加入250nM装载有荧光染料的hCAIX ECD溶液并进一步进行恒温处理后除去溶液。将珠转移到锥形管中，然后用45mL的含有0.1％吐温20的PBST缓冲溶液进行稀释后，分为小份。在每个分为小份的溶液中添加含有0.1％吐温20的PBST缓冲溶液进一步进行稀释，并装入COPAS的样本容器中，在激发波长(Excitation)640nm、发射波长680/30BP(Emission680/30BP)的条件下分两个步骤进行。第一步骤中，在富集模式(Enrichmentmode)、PMT630、增益3.0条件下筛选出荧光强度高的珠约1000个。用三蒸水对所获得的1000个珠进行稀释，然后在纯净模式(Pure mode)、PMT620、增益3.0条件下使用96-孔板进行了第二次COPAS筛选。
2-3.通过二次筛选获得的肽的分离及分析
通过光分解反应从通过上述实施例2-2的二次筛选获得的固相单珠中分离出肽。具体地，在氩气气氛下，对装有上述珠的96-孔板进行密封后，使用UVP交联剂(Cat#849-30101-2，耶拿，德国)，在365nm波长、9000μJ/cm2照射量的条件下进行光分解反应10分钟。在打开96-孔板之后，使用耐酸型台式浓缩机(acid benchtop concentrator)(Cat#7310042，LABCONCO，美国)在常温下进行浓缩。
之后，基于使用增强型ultrafleXtreme MALDI-TOF/TOF质谱仪(massspectrometer)(布鲁克，美国)获得的MS和MS/MS对肽的分子量和氨基酸序列进行分析。图4a(质谱分析结果)和图4b(MS/MS序列分析结果)中分别示出了每个分析结果的示例。
2-4.用于选定候选肽的肽库三次筛选
在具有上述实施例2-3中获得的氨基酸序列的250-300种肽中筛选出约50多种，并通过与上述实施例1相同的方法在装有光分解链接剂的TentaGel珠(0.08mmole/g，每种肽10mg)上使用Apex396自动合成仪来合成后，使用TFA(95％)/三蒸水(2.5％)/TIS(2.5％)混合溶液来去除氨基酸残基的保护基。
之后，为了进行用于导出最终肽候选物质的三次COPAS筛选，针对分别装有50多种不同的肽的TentaGel珠，分别取1mg(共50mg)，将其聚集到4mLExtract-Clean过滤柱并混合后，加入2mL的PBS进行超声波处理来使珠膨润。之后，在将装有荧光染料的hCAIX ECD的最终浓度保持在250nM的状态下，通过与二次肽库筛选相同的方法进行了COPAS筛选操作。为了确保结果的重现性，将此过程重复了三次。MS及MS/MS数据分析结果，按照阳性命中数(hit number)顺序对肽进行序列化后，基于靠前的肽来选定了候选物质。
实施例3.含有被筛选的肽的肽结构体的合成及纯化
3-1.生物素(biotin)链接剂的合成
使用自动微波多肽合成仪(Liberty BlueTMautomated microwavepeptidesynthesizer，CEM公司)来合成固相生物素链接剂。具体地，将在NMP中进行膨润的Rink酰胺-树脂(0.45mmole/g)中处理哌啶/NMP(v/v＝1:4，0.1MOxymaPure)混合溶液，以去除Fmoc保护基后，用NMP进行清洗。之后，在NMP溶剂中处理Fmoc-Lys(mtt)-OH(5当量)、Oxyma Pure(5当量)及二异丙基碳二亚胺(DIC，Cat#D0254，TCI)(10当量)并进行偶联后，去除了Fmoc保护基。使用Fmoc-PEG1-OH(5eq)并重复2次相同的过程来进行连接。在从微波多肽合成仪回收的树脂中处理1.5％TFA/2.5％TIS/96％DCM混合溶液以去除4-甲基三苯甲基保护基(Mtt)。为了引入生物素，用生物素-NHS(3当量)和DIPEA(10当量)在NMP溶液中在常温下进行反应1小时，然后依次用NMP、DCM来清洗并进行真空干燥。
以下，示出了用于合成生物素链接剂的示例性的反应式。
【反应式1】
3-2.所筛选的肽的合成
通过使用上述实施例3-1中合成的生物素链接剂来合成所筛选的氨基酸序列的肽。首先，用哌啶/NMP(v/v＝1:4)混合溶液从引入了生物素链接剂的珠中去除Fmoc保护基，然后依次使用NMP、DCM、NMP来进行清洗。在常温下用具有Fmoc保护基的氨基酸(3当量)、TBTU(3当量)、DIPEA(7当量)进行反应后，用NMP进行清洗。重复进行上述过程直至完成所需序列的肽。尤其，为了合成环形结构的肽，首先将Fmoc-E(OAll)-OH引入到生物素链接剂后，进行了肽连接(环化)反应。
3-3.线形结构的肽结构体的合成及纯化
通过在上述实施例3-2中合成的肽中引入磺酰胺、金刚烷(adamantane)、环辛烷(cyclooctane)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(1,4,7,10-Tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid，DOTA)或生物素官能团来制备线形肽结构体。
磺酰胺官能团是通过对含有叠氮(azido)取代基的肽进行如上述实施例1-2中所记载的点击反应来引入的。
金刚烷、环辛烷或DOTA官能团的引入是通过从装有肽的珠中去除Mtt或Dde保护基来进行的，上述肽包括由Mtt或1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己-1-亚基)乙基(Dde)取代基保护的赖氨酸(lysine)。通过用1.5％TFA/2.5％TIS/96％DCM混合溶液进行处理来去除Mtt保护基，并且通过在氩气(Ar)气氛下将Pd(PPh3)4(1当量)、1,3-二甲基巴比妥酸(1,3-Dimethylbarbituric acid)(30当量)在DCM溶液中混合后进行反应来去除Dde保护基。之后，分别与1-金刚烷甲酸(1-adamantanecarboxylic acid，Cat#106399-25G，西格玛奥德里)、环辛烷甲酸(cyclooctanecarboxylic acid，Cat#EN300-85433，Enamine)或DOTA-三(叔丁酯)(2当量)，及TBTU(2当量)、DIPEA(5当量)一同在NMP溶剂中在常温下进行反应来引入。
通过在NMP溶剂中用生物素-NHS(3当量)和DIPEA(10当量)在常温下进行反应来引入生物素官能团。
反应结束后，依次用NMP和DCM对珠进行清洗并真空干燥。以下是用于在所筛选的肽中引入金刚烷官能团的反应式的例。
【反应式2】
3-4.环形结构的肽结构体的合成及纯化
环形结构的肽结构体是通过在上述实施例3-2中合成的引入谷氨酸的肽中，结合到氨基酸的C端的谷氨酸的羧基和氨基酸的N端的酰胺基之间形成共价键的环化(cyclization)反应来形成环形结构。
首先，进行了去除固相珠的肽中谷氨酸的烯丙基(allyl)保护基的反应。在氩气(Ar)气氛下，在DCM溶剂中混合Pd(PPh3)4(0.5当量)、PhSiH3(20当量)后，在常温下进行了反应。依次用0.1M二乙基二硫代氨基甲酸钠/NMP溶液清洗珠以除去Pd杂质。用哌啶/NMP(v/v＝1:4)混合溶液去除Fmoc保护基，然后依次使用NMP、DCM、NMP来进行清洗。环化反应在常温下使用PyAOP(3当量，Cat#36813，吉尔生化)、DIPEA(10当量)来进行，在反应结束后，依次使用NMP、DCM清洗珠后进行了真空干燥。
以下为用于合成环形肽的环化反应式的例。
【反应式3】
3-5.所获得的线形或环形肽结构体的分离及纯化
通过使用95％TFA/2.5％TIS/2.5％H2O混合溶液处理装有上述实施例3-3和3-4中获得的处于干燥状态的线形肽或环形肽的珠。使用过滤器来去除珠，并将含有肽的TFA混合溶液聚集到锥形管(conical tube)之后，通过用氮气吹扫来除去了大部分的混合溶液。接着，通过加入乙醚(diethyl ether)来将肽进行沉淀后，放入离心机进行旋转，之后除去上层的乙醚和少量残留的TFA混合溶液，然后对剩余的固相的肽进行真空干燥。
将在固相珠中切割的肽溶解在ACN/H2O(1:1)混合溶液中，然后使用过滤器(45μm针式过滤器(syringe filter)，Cat#DISMIC-3HP，Advantec，日本)除去未溶解的杂质，并且通过1260Infinity II LC系统(安捷伦(Agilent))在如下条件下进行纯化：(1)固定相为Kromasil 100-5-C18色谱柱(21.2×250mm，5μm)；流动相溶剂为添加了0.1％TFA的三蒸水和ACN的混合液；(3)流速为15mL/min；(4)检测波长为214nm和254nm。对于纯化的肽的纯度和分子量的测定，使用LC-MS(1260infinity II、Infinity Lab LC/MSD，安捷伦)以及使用MNOVA(v.14.2.0，Mestrelab research，西班牙)来对数据进行了分析。
对于固定相，使用了安捷伦poroshell 120ec-c18色谱柱(4.6×50mm，2.7μm)，色谱柱温度保持在40℃。此外，将添加有0.1％TFA的三蒸水和ACN的混合液用作流动相溶剂，波长为214nm和254nm，流速保持在1mL/min。对于纯化的肽溶液，在使用冷冻干燥器来除去溶剂之后，以粉末形态来使用。
其结果，获得了包括与人类CAIX特异性结合的肽且具有1个或2个磺酰胺官能团的如下化学式3至8的独特的线形或环形肽结构体。
【化学式3的线形肽结构体】
编号 α β γ AA1 AA2 AA3 AA4 AA5 AA6 AA7 θ δ
1 0 1 1 r a h k h y h 0 0
2 0 1 1 h r k h d d n 0 0
3 0 1 1 a y y r k k w 0 0
4 0 1 1 r r l l f s G 0 0
5 0 0 1 r r f h f t h 0 0
6 0 0 1 a y y r k k w 0 0
7 0 0 1 r r l l f d G 0 0
8 0 0 1 r r f h f t h 0 0
9 0 0 1 f h d r r d v 0 0
10 0 0 1 v l r n k s d 0 0
11 0 0 1 r s r h f h y 0 0
12 0 0 1 f h r i k h l 0 0
13 0 0 1 r i t a i n y 0 0
14 0 0 2 y h k h i r q 0 0
15 0 0 3 h f v k k f r 0 0
16 0 0 3 f f k r k h e 0 0
17 0 0 3 h G h l f k r 0 0
18 0 0 3 r f h h f r n 0 0
19 0 0 3 r l s k f h s 0 0
20 0 0 3 y e t f r t r 0 0
21 0 0 0 r r f r h y h 0 0
22 0 0 0 r r f r h y h 1 0
23 1 0 0 r r f r h y h 0 0
24 0 0 0 r r f r h y h 0 1
【化学式4的线形肽结构体】
编号 AA1 AA2 AA3 AA4 AA5 AA6 AA7 R1
25 r r f r h y h (PEG1)2-K(生物素)-NH2
26 r r f r h y h Uk(DOTA)-(PEG1)2-K(生物素)-NH2
27 r t U(1-Nal) r h Uk(PhF5) h Uk(DOTA)-(PEG1)2-K(生物素)-NH2
【化学式5的线形肽结构体】
编号 AA1 AA2 AA3 AA4 AA5 R2
28 r r f r y (PEG1)2-K(生物素)-NH2
29 r r f r y Uk(DOTA)-(PEG1)2-K(生物素)-NH2
30 r r U(1-Nal) r y (PEG1)2-K(生物素)-NH2
31 r r f r Uk(联苯酚) (PEG1)2-K(生物素)-NH2
32 r r U(1-Nal) r Uk(PhF5) Uk(DOTA)-(PEG1)2-K(生物素)-NH2
33 e r U(1-Nal) r Uk(PhF5) Uk(DOTA)-(PEG1)2-K(生物素)-NH2
34 r r U(1-Nal) e Uk(PhF5) Uk(DOTA)-(PEG1)2-K(生物素)-NH2
【化学式6的环形肽结构体】
编号 R4 R3 α AA7 AA6 AA5 AA4 AA3 AA2 AA1 R5
35 K(SFA) 1 r r f h f t h NH2
36 K(SFA) 1 r r f h f t h (PEG1)2-K(生物素)-NH2
37 K(环辛烷) K(SFA) 1 r r f h f t h (PEG1)2-K(生物素)-NH2
38 K(SFA) 0 r r f r h y h (PEG1)2-K(生物素)-NH2
39 K(金刚烷) K(SFA) 0 r r f r h y h (PEG1)2-K(生物素)-NH2
40 K(环辛烷) K(SFA) 0 r r f r h y h (PEG1)2-K(生物素)-NH2
41 Uk(SFA) 0 h y h r f r r (PEG1)2-K(生物素)-NH2
42 Uk(环辛烷) Uk(SFA) 0 h y h r f r r (PEG1)2-K(生物素)-NH2
43 uk(SFA) 0 h y h r f r r (Sar)6-K(AF488)-NH2
44 ukl环辛烷) uk(SFA) 0 h y h r f r r (Sar)6-K(AF488)-NH2
45 Uk(金刚烷) Uk(SFA) 0 h y h r f r r (PEG1)2-K(AF488)-NH2
46 Uk(金刚烷) Uk(SFA) 0 h y h r f r r (PEG1)2-K(生物素)-NH2
47 Uk(金刚烷) Uk(SFA) O h y h r f r r K(DOTA)-(PEG1)2-K(生物素)-NH2
48 Uk(金刚烷) Uk(SFA) 0 h y h r f r r (PEG1)2-K(DOTA)-NH2
49 Uk(金刚烷) Uk(SFA) 0 h y h r f r r (Sar)6-K(AF488)-NH2
50 Uk(金刚烷) Uk(SFA) 0 h y h r f r r K(AF488)-NH2
51 Uk(金刚烷) UAha(AZA) 0 h y h r f r r (PEG1)2-K(生物素)-NH2
52 G UAha(AZA) 0 h y h r f r r (PEG1)2-K(生物素)-NH2
53 Uk(金刚烷) Uk(噻吩) 0 h y h r f r r (PEG1)2-K(生物素)-NH2
54 G Uk(噻吩) 0 h y h r f r r (PEG1)2-K(生物素)-NH2
55 K(金刚烷) K(SFA) 0 h u(Phe(F5)) h r f r r (PEG1)2-K(生物素)-NH2
56 K(金刚烷) K(SFA) 0 h U(Phe(4-NH2)) h r f r r (PEG1)2-K(生物素)-NH2
57 K(金刚烷) K(SFA) 0 h U(1-Nal) h r f r r (PEG1)2-K(生物素)-NH2
58 K(金刚烷) K(SFA) 0 h U(BiP(4，4-)) h r f r r (PEG1)2-K(生物素)-NH2
59 Uk(金刚烷) Uk(SFA) 0 h y h r U(Phe(F5)) r r (PEG1)2-K(生物素)-NH2
60 Uk(金刚烷) Uk(SFA) 0 h y h r U(Phe(4-NH2)) r r (PEG1)2-K(生物素)-NH2
61 Uk(金刚烷) Uk(SFA) 0 h y h r U(1-Nal) r r (PEG1)2-K(生物素)-NH2
62 Uk(金刚烷) Uk(SFA) 0 h y h r U(BiP(4，4-)) r r (PEG1)2-K(生物素)-NH2
【化学式7的环形肽结构体】
编号 R7 AA7 AA6 AA5 AA4 AA3 AA2 AA1 R6 R8
63 K(SFA) r r f r h y h KlSFA) UK(DOTA)-(PEG1)2-K(生物素)-NH2
64 Uk(SFA) h y h r f r r Uk(SFA) (PEG1)2-K(生物素)-NH2
65 Uk(SFA) h y h r f r r Uk(SFA) UK(DOTA)-(PEG1)2-K(生物素)-NH2
【化学式8的环形肽结构体】
编号 R10 AA5 AA4 AA3 AA2 AA1 R9 R11
66 K(SFA) r r f r y K(SFA) UK(DOTA)-(PEG1)2-K(生物素)-NH2
67 K(SFA) r r U(homo-f) r y K(SFA) UK(DOTA)-(PEG1)2-K(生物素)-NH2
68 K(SFA) r r U(1-Nal) r uk(PhF5) K(SFA) UK(DOTA)-(PEG1)2-K(生物素)-NH2
69 K(SFA) r r μ(1-Nal) e Uk(PhF5) K(SFA) UK(DOTA)-(PEG1)2-K(生物素)-NH2
70 K(SFA) e r U(1-Nal) e Uk(PhF5) K(SFA) UK(DOTA)-(PEG1)2-K(生物素)-NH2
71 Uk(SFA) y r f r r Uk(SFA) UK(DOTA)-(PEG1)2-K(生物素)-NH2
72 Uk(SFA) y r f r r Uk(SFA) Uk(6OH)-Uk(DOTA)-(PEG1)2-K(生物素)-NH2
73 UAha(AZA) y r f r r UAha(AZA) K(DOTA)-(PEG1)2-K(生物素)-NH2
74 Uk(SFA) y R f r r Uk(SFA) UK(DOTA)-(PEG1)2-K(生物素)-NH2
75 UOrn(SFA) y R f r r UOrn(SFA UK(DOTA)-(PEG1)2-K(生物素)-NH2
76 UAha(SFA) y R f r r UAha(SFA UK(DOTA)-(PEG1)2-K(生物素)-NH2
77 UAza(SFA) y R f r r UAza(SFA) UK(DOTA)-(PEG1)2-K(生物素)-NH2
78 Uk(SFA) y R f r r UAha(SFA UK(DOTA)-(PEG1)2-K(生物素)-NH2
79 UAha(SFA) y R f r r Uk(SFA) UK(DOTA)-(PEG1)2-K(生物素)-NH2
80 Uk(SFA) y R f r r Uk(SFA) se-k(DoTA)-ee-Pra(AF488)-NH2
81 UAha(SFA) y R f r r UAha(SFA) se-k(DOTA)-ee-Pra(AF488)-NH2
82 Uk(SFA) y R f r r UAha(SFA se-k(DOTA)-ee-pra(AF488)-NH2
83 Uk(SFA) y R f r r Uk(SFA) sdrds-Uk(DOTA)-(PEG1)2-K(生物素)-NH2
84 Uk(SFA) y R f r r Uk(SFA) sdrd-Uk(6OH)-Uk(DOTA)-(PEG1)2-K(生物素)-NH2
85 Uk(SFA) y R f r r Uk(SFA) sd-Uk(6OH)-d-NH2
86 Uk(SFA) y R f r r Uk(SFA) sd-Uk(6OH)-d-缬氨酸-瓜氯酸-PABC-MMAE
87 Uk(SFA) y e f r r Uk(SFA) UKfDOTA)-(PEG1)2-K(生物素)-NH2
88 Uk(SFA) y r f e r Uk(SFA) UK(DOTA)-(PEG1)2-K(生物素)-NH2
89 Uk(SFA) y r f r e Uk(SFA) UK(DOTA)-(PEG1)2-K(生物素)-NH2
90 Uk(SFA) Uk(PhF5) r U(1-Nal) r r Uk(SFA) UK(DOTA)-(PEG1)2-K(生物素)-NH2
91 Uk(SFA) y r U(1-Nal) r r Uk(SFA) UK(DOTA)-(PEG1)2-K(生物素)-NH2
92 Uk(SFA) uk(PhF5) r f r r Uk(SFA) UK(DOTA)-(PEG1)2-K(生物素)-NH2
93 Uk(SFA) U(Phe(4-NH2)) r U(1-Nal) r r Uk(SFA) UK(DOTA)-(PEG1)2-K(生物素)-NH2
94 Uk(SFA) y R f r r Uk(SFA) VPTLQ-Uk(AF488)-NH2
95 Uk(SFA) y R f r r Uk(SFA) sd-Uk(DOTA)-dds-Uk(IB)-Uk(6OH)-NH2
上述化学式3至8中，AA1至AA7表示氨基酸残基，小写字母表示D-氨基酸，大写字母表示L-氨基酸，U是指被修饰(modified)或者常规不存在(unnatural)的D-氨基酸，具有在本说明书中所定义的以下结构。
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实施例4.肽结构的稳定性评价
在血清(serum)和血浆(plasma)中对上述实施例3中获得的肽结构体进行了稳定性试验。将在1mL的100％纯的人的血清(Cat#S1，默克(Merk))或血浆(Cat#70039.1，干细胞科技公司(STEMCELL Technologies))【或者100％纯的小鼠的血清(西格玛(Sigma)，Cat#S7273)或血浆(罗克兰(Rockland)，Cat#D508-06-0050)】中以最终浓度为50μM的方式稀释肽结构体的溶液，以每份100μL的方式分为小份，然后在37℃下进行保管的同时，七天内以每天一次的方式使用装有安捷伦poroshell 120ec-c18色谱柱(4.6×50mm，2.7μm)的LC-MS(1260infinity II、Infinity Lab LC/MSD，安捷伦)来进行分析。在将样本注入LC之前，在含有肽的血清或血浆溶液中添加100μL的ACN，然后置于离心机进行旋转，在沉淀物沉淀之后，仅将10μL的上层液用于分析。
图5a和图5b，及图6a和图6b中分别示出了肽结构体35号和48号在血清和血浆中的稳定性试验结果。经确认，含有D-氨基酸的肽结构体35号在6天后也完全未被分解并完整地保持在血清和血浆中，但是，在将35号的所有氨基酸残基变更为L-型(L-form)的情况下，在血清中1天内被完全分解，在血浆中3天内被完全分解(图5a和图5b)。
同样地，获得了如下结果：在人类或小鼠的血清和血浆中含有D-氨基酸的肽结构体48号在7天后也完全未被分解并保持完整，但是，在将48号的所有氨基酸残基变更为L-型的情况下，在血清中1天内被完全分解，在血浆中7天内大部分都被分解(图6a和图6b)。
实施例5.肽结构体的生物学特性的确认
5-1.对hCAIX ECD的结合亲和力(binding affinity)及结合动力学(bindingkinetics)分析
针对肽结构体分析了对hCAIX ECD的结合亲和力及结合动力学特性。为了确认对hCAIX ECD的特异性结合选择性，对作为碳酸酐酶的另一异构体(Isoforms)的人类碳酸酐酶XII(hCAXII)的细胞外结构域也进行了肽结构体的结合动力学特性的分析。
针对结合亲和力，使用了基于生物膜干涉(Bio-Layer Interferometry，BLI)技术的系统(Cat#45-5000，Forte Bio，美国)和BLItz Pro ver1.3软件的高级动力学(advanced kinetics)模块。并且在所有测定中使用了链酶亲和素生物传感器(Cat#18-5019，赛多利斯(Sartorius)，法国)。此外，为了非特异性结合及背景(background)修改，将蛋白质浓度0nM用作基准值(reference)。首先使用DPBS(Biowest，Cat#L0615)将10X Octet动力学缓冲液(10X Octet kinetics buffer)(Cat#18-1105，赛多利斯)制备为1X并用作分析用缓冲溶液。然后，将分析用缓冲溶液以200μl/孔的方式种到96-孔黑色聚丙烯平底板(96-well，black，flat-bottom polypylene)(Cat#655209，葛莱娜第一生化(Greiner Bio-One)，奥地利)之后，在使链霉亲和素生物传感器浸泡的状态下进行水化(hydration)10分钟。并且，在装置中安装生物传感器之后，为了使肽附着，以1μM浓度在2200rpm下进行负载(loading)120秒。之后，在2200rpm条件下，对各浓度的蛋白质进行缔合(association)及解离(dissociation)，动力学数据(kinetics data)使用全局拟合(global fitting)功能，通过kd与ka的比例来进行计算KD值。此外，动力学参数(kinetic parameter)则通过基线校正(baseline correction)和拟合(Fitting)的1:1结合模型(binding model)来获得。
其结果示于图7a至图7d。与hCAXII ECD相比，肽结构体对hCAIX ECD显示出明显高的选择性。
5-2.与靶细胞的结合特异性分析
为了确认肽结构体是否与表达CAIX的靶细胞特异性结合，对体外细胞结合特性进行了分析。表达CAIX的人类肾癌细胞株SK-RC-52购自斯隆-凯特林癌症中心(MemorialSloan Kettering Cancer Center，MSK，美国)，表达CAXII的人类肺癌细胞株A549购自韩国细胞系银行(Cat#10185，KCLB，韩国)。
荧光激活细胞分类(FACS)分析
要在分析中使用的肽结构体是溶解在DMSO中制备1mM溶液后，使用含有1％FBS的DMEM混合液(FACS用缓冲溶液)稀释成所需的浓度(10000nM、100nM、30nM、10nM、5nM)。
在进行FACS分析的2～3天前，针对A549细胞株，接种(seeding)了5×105个细胞，针对SK-RC-52细胞株，接种了1～1.5×106个细胞。在实验当日，从以80％的密集度培养有A549细胞株或SK-RC-52细胞株的T75烧瓶中除去培养液，并用15mL的PBS清洗一次。将1mL的胰蛋白酶-EDTA在Galaxy 170S CO2恒温处理器(37℃，5％CO2，潮湿的条件)中进行处理后，用9mL的培养液对胰蛋白酶-EDTA进行了中和。将经过中和的细胞混合液置于15mL试管中，并利用VARISPIN 15R离心机在1000RPM条件下进行旋转4分钟。除去经过离心的细胞混合液的上层液，添加新的培养液并以每100μL中细胞数达到5×105个的方式进行稀释之后，以每孔100μL注入到96圆孔板(96-well round plate)(Cat#34096，SPL生命科学)中。利用VARISPIN 15R离心机在1000RPM条件下旋转4分钟后，每个孔中除去上层液，并添加预先准备好的肽结构体溶液200μL，然后在Galaxy 170S CO2恒温处理器中在37℃、5％CO2、潮湿的条件下进行培养。1小时后，利用VARISPIN 15R离心机在1000RPM条件下旋转4分钟后，除去上层液并用200μL的FACS用缓冲溶液进行清洗。进行离心(在1000RPM条件下旋转4分钟)后除去清洗液，然后用在FACS用缓冲溶液中稀释成1μg/mL浓度的链酶亲和素-Alexa fluor488(Cat#S11223，英杰(Invitrogen)，美国)200μL进行处理，并在Galaxy 170S CO2恒温处理器中在37℃、5％CO2、潮湿的条件下培养1小时(针对肽结构体80、81、82省略链酶亲和素-Alexa fluor488处理过程)。在经过VARISPIN 15R离心(在1000RPM条件下旋转4分钟)后除去上层液，并用200μL的FACS用缓冲溶液进行清洗。通过相同的方法进一步清洗一次之后，在每个孔中添加200μL的FACS用缓冲溶液并与细胞进行混合后，转移到带有细胞筛网(cellstrainer)的5ml圆底(round bottom)试管(Cat#352235，康宁，美国)中，并利用BD AccuriC6 Plus(BD生物科学，新加坡)来测量每个细胞的荧光强度。通过FlowJo 10.7.1(BD生物科学，美国)来分析了所测定的数据。
利用VARISPIN 15R离心机将完成FACS分析的细胞混合液在1000RPM条件下离心4分钟后除去上层液，接着用在FACS用缓冲溶液中稀释成1μg/mL浓度的赫斯特荧光染料33342(Hoechst 33342)200μL进行处理并在4℃下进行核染色30分钟。利用VARISPIN 15R离心机在1000RPM条件下进行离心4分钟后，除去上层液并用200μL的PBS进行清洗(重复两次)。将添加有200μL的PBS的细胞混合液转移到共聚焦培养皿(confocal dish)(Cat#100350，SPL生命科学)中，并通过Axio Observer 3(蔡司，德国)来观察了荧光。
图8a至图8d中示出了使用SK-RC-52细胞株的FACS分析结果，图8e至图8h中示出了使用A549细胞株的FACS分析结果。从FACS分析结果可以确认，本发明的肽结构体以高的亲和力和选择性与表达CAIX的靶细胞结合。
免疫荧光分析(共定位(colocalization))
针对A549细胞株，在共聚焦培养皿(confocal dish)中接种了5×104个细胞，针对SK-RC-52细胞株，在共聚焦培养皿中接种了1×105个细胞，并在Galaxy 170S CO2恒温处理器(37℃、5％CO2、潮湿的条件)中培养2天。接着，将在2mL的FACS用缓冲溶液中稀释的M75-FITC抗体或肽结构体处理到每个细胞株中，使得最终浓度分别达到1:200(与原液的稀释比例)及1μM，然后在Galaxy 170S CO2恒温处理器中在37℃、5％CO2、潮湿的条件下培养1小时。接着，用3mL的FACS用缓冲溶液清洗2次后，用在2mL的FACS用缓冲溶液中稀释的链酶亲和素-德克萨斯红(streptavidin-Texas red)和赫斯特荧光染料33342(Hoechst33342)进行处理，使得最终浓度分别达到1:50(与原液的稀释比例)和0.5μg/mL，并在Galaxy 170S CO2恒温处理器中在37℃、5％CO2、潮湿的条件下培养1小时。然后，用3mL的FACS用缓冲溶液清洗两次，用PBS清洗一次后，利用Axio Observer 3来观察了荧光。
图9中示出了肽结构体22号的免疫荧光分析结果。可以确认，肽结构体22号与M75抗体相同地，与表达CAIX的SK-RC-52细胞株特异性地结合。
共聚焦显微成像(confocal microscopy imaging)
对于SK-RC-52细胞株，将1×105个细胞接种在共聚焦培养皿中，并在Galaxy170SCO2恒温处理器(37℃、5％CO2、潮湿的条件)中培养2天。接着，将在2mL的FACS用缓冲溶液中稀释的肽结构体在细胞株中进行处理，使得最终浓度达到100nM，然后在Galaxy 170S CO2恒温处理器中在37℃、5％CO2、潮湿的条件下培养1小时。接着，用3mL的FACS用缓冲溶液清洗三次后，用在2mL的FACS用缓冲溶液中稀释的赫斯特荧光染料33342进行处理，使得最终浓度达到0.5μg/mL，并且在Galaxy 170S CO2恒温处理器中在37℃、5％CO2、潮湿的条件下反应15分钟后，用3mL的PBS清洗三次，然后利用Leica SP5共聚焦显微镜观察了荧光。
图10中示出了使用SK-RC-52细胞株的肽结构体94号的Z-stack共聚焦显微成像。经确认，肽结构体94号表现出与在细胞中表达的CAIX ECD良好的结合。
5-3.利用实验动物模型的生物分布(biodistribution)分析
利用6周龄的雌性BALB/c裸鼠(orientbio，韩国)，将细胞数为2×106的SK-RC-52通过皮下注射的方式注入到裸鼠的左前肢的上侧。在皮下注入后的第13、20、27、35天对重量和肿瘤的大小进行了测定(图11a)。肿瘤的大小是利用卡尺(caliper)通过[体积＝(宽度(width))2×(长度(length))/2]来进行测定。
在将SK-RC-52细胞株异种移植后的第36天，将5μM的肽结构体以每份200μL(盐水溶液中含5％DMSO)的方式通过尾静脉注射进行注入。对于注入后的24小时拍摄的鼠，通过注入过量二氧化碳的方式处死后，开腹并切除肿瘤和器官(肝、肾、肠、肺、脾、胃、胰腺、心脏)来拍摄离体成像(ex vivo imaging)(图11b)。
对于从动物实验中获得的各组的肿瘤、肝、肾脏、肠、肺、脾、胃、心脏，在拍摄离体成像(ex vivo imaging)后用干冰(dry ice)进行冷冻，且实验前在-80℃下进行保管。在实验前对各肿瘤的重量进行测定后，以每器官重量100mg加入100μL的缓冲溶液的方式加入冰冷均质缓冲液(ice-cold homogenization buffer)(40mM EDTA、6mg/mL胰蛋白酶、1.6％曲拉通X-100中含有微量的脱氧核糖核酸酶1(DNase 1)的pH7.4的PBS)，并利用FastPrep-245G(MP生物医疗，美国)进行均质化5分钟。针对均质化的器官，在黑色96孔板中以每孔100μL的方式注入均质化物，并通过EnSpire多功能微孔板酶标仪(铂金埃尔默，美国)来测定了荧光(图11c)。经确认，与其它器官相比，肽结构体与过表达CAIX的肿瘤特异性结合。
5-4.肽结构体-药物缀合物的抗癌效果分析
为了确认药物与肽结构体缀合的缀合物在生物体内是否显示出抗癌作用而实施了动物实验。将作为过表达CAIX的肾癌细胞的SK-RC-52细胞株在PBS中以2×106的细胞数进行稀释并通过皮下注射的方式注入到6周龄的雌性BLAB/c裸鼠(orientbio，韩国)的右前侧面。对移植肿瘤细胞的小鼠，为了测量小鼠的健康变化，进行了2-3周的体重测量，并利用电子数显卡尺(Digimatic Caliper)(Cat#500-151-30，三丰，日本)来测量了肿瘤的大小(宽度×宽度×长度/2)。当肿瘤的大小达到约100mm3时，分为如下组：将含有1％DMSO和2％EtOH的盐水注入到尾静脉的对照组；仅将肽结构体注入到尾静脉的肽处理组(即，肽结构体85号)；用肽结构体和药物(MMAE)通过链接剂进行结合的PDC1(即，药物缀合物形态的肽结构体86号)在尾静脉中进行处理的PDC1处理组，上述PDC1中。每组为三只，而肽处理组以两只为对象进行了实验。给药浓度为250nmole/kg，将200μl的含有1％DMSO和2％EtOH的盐水作为载体进行给药。针对给药频率，以两天为间隔且每周三次的方式通过尾静脉给药共7次。每1～3天测量一次体重和肿瘤的大小。
其结果示于图12a和图12b。如图12a和图12b所示，肽结构体86号不会引起小鼠体重的显著变化(图12a)，并且显示出显著减小过表达CAIX的肿瘤的大小的抗癌效果(图12b)，上述肽结构体86号为将MMAE药物通过链接剂与肽结构体85号进行缀合的药物缀合物形态。
5-5.同位素(177Lu)标记的肽结构体的体内(in vivo)SPECT/CT影像实验
通过标记肽结构体的同位素来确认影像诊断及治疗功能性。将肽结构体95号溶解在DMSO中制备10mM的储备溶液(stock solution)后，用pH5.5的乙酸铵缓冲溶液进行稀释，制备出1mM的肽结构体溶液。从1mM溶液中取7nmole的体积并与1mCi同位素(177LuCl3，Eckert&Ziegler Radiopharma GmbH)进行混合后，通过加入pH7.0的乙酸铵缓冲溶液来将pH调节至5.5。在90℃的条件下进行同位素标记1小时，当完成标记后冷却至常温，然后利用Sep-Pak柱(Cat#186005125，沃特世)来进行纯化。在活化的Sep-Pak柱(5mL乙醇、5mL蒸馏水)中装载样本并用5mL蒸馏水进行清洗之后，用1.5mL乙醇洗脱得到溶液，针对上述溶液用氮气吹扫并进行浓缩。被浓缩的乙醇溶液用盐水稀释来使用。
将作为源自人类来源的肾细胞癌(Renal Cell Carcinoma，RCC)细胞株的SK-RC-52细胞株(斯隆—凯特林癌症研究所(MSK)，纽约，美国)，以每只鼠2×106细胞/100μL的方式在6周龄的雄性BALB/c裸鼠(orientbio，首尔，韩国)的右前肢腋下进行皮下给药(Subcutaneous Injection)。当所移植的癌细胞SK-RC-52植入而生成的肿瘤的大小为平均100mm3(80～100mm3)时，基于肿瘤的大小来进行了组分离。对体重和肿瘤的大小每周测量两次，对于肿瘤的大小，利用游标卡尺(Vernier Calipers)(三丰，川崎，日本，肿瘤体积)对肿瘤的宽度(width)和长度(length)进行测量后，通过代入如下式来计算了肿瘤的体积。
肿瘤体积(mm3)＝宽度2×长度/2
当通过移植作为肾细胞癌细胞株的SK-RC-52而生成的肿瘤的大小达到平均100mm3(80～100mm3)时，将相当于放射线量600-700μCi的，100-150μL的同位素177Lu标记的100-150μL的肽结构体95号通过尾静脉注射(Tail Vein injection)方法进行一次给药，并在6小时、第二天、第八天分别测量了SPECT/CT(西门子Inveon，软件：Inveon采集工作平台)。为了进行拍摄，通过氧气中带0.2％异氟烷的方式对小鼠进行呼吸麻醉约3-5分钟，然后将其位于装置后使麻醉剂以1.5L/min继续注入，通过SPECT50分钟、CT7分钟的方式进行测量，并通过Inveon Research Workplace 4.2来获得图像。
图13中示出了从上述获得的SPECT/CT影像图像。经确认，在经过8天后同位素177Lu标记的肽结构体95号也仍以与癌细胞SK-RC-52结合的方式存在。
之后，注入样本后至8天，针对完成SPECT/CT测量的小鼠，通过给小鼠吸入二氧化碳气体(CO2)来使其安乐死并开腹后切除肿瘤和器官(肝、肾脏、脾脏)，并分别测量重量，然后通过便携式放射性测量仪(Inspector survey meter，INSPECTER(078-510))测量每个器官的放射线照射量。通过这种方法测量的、同位素177Lu标记的肽结构体95号的剩余量换算成每单位重量的辐射强度，然后基于肿瘤数值来计算其余器官的相对辐射强度并表示为如下表1。
【表1】
器官/组织 注射后第8天
肿瘤 1
肝 0.08
肾脏 0.33
脾 0.07
5-6.同位素(177Lu)标记的CAIX靶向肽(肽结构体95号)的抗癌效果分析
将肽结构体95号溶解在DMSO中制备10mM的储备溶液(stock solution)后，用pH5.5的乙酸铵缓冲溶液进行稀释，制备出1mM的肽结构体溶液。从1mM溶液中取40nmole的体积并与14mCi同位素(177LuCl3，Eckert&ZieglerRadiopharma GmbH)进行混合后，通过加入pH7.0的乙酸铵缓冲溶液来将pH调节至5.5。在90℃的条件下进行同位素标记1小时，当完成标记后冷却至常温，然后通过1200 Infinity LC系统(安捷伦)在如下条件下进行纯化：(1)固定相为安捷伦Poroshell 120 EC-C18色谱柱(4.6×50mm，2.7μm)；(2)流动相溶剂为添加了0.1％TFA的三蒸水和ACN的混合液；(3)流速为1mL/min；(4)检测波长为254nm和214nm。图14中示出了177Lu标记的95号靶向肽结构体的色谱图。
将通过纯化获得的177Lu标记的95号靶向肽结构体装载于活化的Sep-Pak柱(Sep-Pak column)(5mL乙醇、5mL蒸馏水)中，用5mL蒸馏水进行清洗并除去有机溶剂之后，依次用500μL的CAN∶H2O(1∶1)、700μL的乙醇进行洗脱(elution)而获得溶液，针对上述溶液用氮气吹扫(purge)并进行浓缩。被浓缩的乙醇溶液用盐水稀释(EtOH20％、DMSO1％)来使用。
将作为过表达CAIX的肾癌细胞的SK-RC-52细胞株在PBS中以2×106个的细胞数进行稀释，并通过皮下注射的方式注入到6周龄的雌性BLAB/c裸鼠(orientbio，韩国)的右前侧面。对移植肿瘤细胞的小鼠，为了测量小鼠的健康变化，进行了2～3周的体重测量，并利用电子数显卡尺(Digimatic Caliper)(Cat#500-151-30，三丰，日本)来测量了肿瘤的大小(宽度2×长度/2)。当肿瘤的大小达到约100mm3时，分为如下组：将盐水作为载体进行注入的6只对照组；以及将约500μCi的177Lu标记的95号靶向肽结构体注入到尾静脉的6只实验组。针对体重和肿瘤的大小，每周测量三次。
将其结果示于图15a至图15c。如图15a至图15c所示，177Lu标记的95号靶向肽结构体并未引起小鼠体重的显著变化(图15b)，同时显示出显著减小过表达CAIX的肿瘤大小的抗癌效果(图15a和图15c)。
如上所述的本发明的说明是示例性的，本发明所属技术领域的普通技术人员能够理解，本发明的保护范围不限于所公开的实施例和附图，在不脱离本发明的技术思想的范围内能够以其他具体形态进行多样化的改变。
序列表
【表2】
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Claims (24)

1.一种肽配体，包括SEQ ID NO.1至44中任一氨基酸序列，组成氨基酸中至少一个由D-氨基酸构成，并且在组成氨基酸中赖氨酸(Lys)残基的侧链ε-氨基能够被化学官能团取代。
2.根据权利要求1中所述的肽配体，其特征在于，所述化学官能团为五氟苯甲酸(pentafluorobenzoic acid)或双酚酸(diphenolic acid)。
3.一种肽结构体，包括：
根据权利要求1所述的肽配体；及
直接或通过间隔基与所述肽配体连接的含磺酰胺官能团的氨基酸残基。
4.根据权利要求3中所述的肽结构体，其特征在于，具有如下化学式1的环形结构，
【化学式1】
所述式中，
P为权利要求1中所述的肽，
F1为甘氨酸(Gly)或含磺酰胺官能团的氨基酸残基，
F2为含磺酰胺官能团的氨基酸残基，
F3为甘氨酸(Gly)或含除了磺酰胺以外的官能团的氨基酸残基，
n和m分别独立地为0或1，
F4为通式-(S1)o-(F5)p-(S2)q-(F6)r-NH2的基团；其中，
S1和S2分别独立地为间隔基，
F5和F6分别独立地为含除了磺酰胺以外的官能团的氨基酸残基，
o、p、q和r分别独立地表示0至6的整数。
5.根据权利要求3中所述的肽结构体，其特征在于，具有如下化学式2的线形结构，
【化学式2】
CH3C(＝O)-Gly-(F7)s-F8-(S3)t-P-(F9)u-(S4)v-(F10)w-NH2
所述式中，
P为权利要求1中所述的肽，
F8为含磺酰胺官能团的氨基酸残基；
F7、F9和F10分别独立地为含除了磺酰胺以外的官能团的氨基酸残基，或
在F9为多个的情况下，至少一个F9为含磺酰胺官能团的氨基酸残基，其余F9和F7及F10分别独立地为含除了磺酰胺以外的官能团的氨基酸残基；
S3和S4分别独立地为间隔基；
s、t、u、v和w分别独立地表示0至3的整数。
6.根据权利要求3至5中任一项所述的肽结构体，其特征在于，所述含磺酰胺官能团的氨基酸残基具有如下结构，
7.根据权利要求3至5中任一项所述的肽结构体，其特征在于，所述除了磺酰胺以外的官能团通过赖氨酸残基的侧链ε-氨基而引入。
8.根据权利要求7中所述的肽结构体，其特征在于，所述除了磺酰胺以外的官能团为螯合物(chelator)、碳数为5至15的环烷烃(cycloalkane)、生物素(biotin)、葡庚糖酸(glucoheptonic acid)、4-(p-碘苯基)丁酸(IB)、荧光染料或细胞毒性剂。
9.根据权利要求8中所述的肽结构体，其特征在于，所述螯合物选自1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)、1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)、乙二胺四乙酸2,2',2”,2”'-(乙烷-1,2-二基二次氮基)四乙酸(EDTA)、1,4,7,10,13,16-六氮杂环十八烷-N,N',N”,N”',N””,N””'-六乙酸(HEHA)、2-[4-硝基苄基]-1,4,7,10,13-五氮杂环十五烷-N,N',N”,N”',N””-五乙酸(PEPA)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四(亚甲基膦酸)(DOTP)、(1R,4R,7R,10R)-α,α',α”,α”'-四甲基-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸)四钠盐(DOTMA)、2-[双[2-[双(羧甲基)氨基]乙基]氨基]乙酸(DTPA)及三亚乙基四胺(TETA)中的一个以上。
10.根据权利要求8中所述的肽结构体，其特征在于，所述碳数为5至15的环烷烃选自环戊烷、环己烷、环庚烷、环辛烷、环壬烷、环癸烷、金刚烷、降冰片烷、异冰片烷及三环癸烷中的一种以上。
11.根据权利要求3至5中任一项所述的肽结构体，其特征在于，间隔基选自聚乙二醇(PEG)链接剂、甘氨酸、肌氨酸(sarcosine)、及由1至5的D-氨基酸或L-氨基酸组成的肽链接剂中的一个以上。
12.根据权利要求5中所述的肽结构体，其特征在于，具有如下化学式3、4或5的结构，
【化学式3】
编号 α β γ AA1 AA2 AA3 AA4 AA5 AA6 AA7 θ δ 1 0 1 1 r a h k h y h 0 0 2 0 1 1 h r k h d d n 0 0 3 0 1 1 a y y r k k w 0 0 4 0 1 1 r r l l f S G 0 0 5 0 0 1 r r f h f t h 0 0 6 0 0 1 a y y r k k w 0 0 7 0 0 1 r r l l f s G 0 0 8 0 0 1 r r f h f t h 0 0 9 0 0 1 f h S r r d v 0 0 10 0 0 1 v l r n k s d 0 0 11 0 0 1 r s r h f h y 0 0 12 0 0 1 f h r i k h l 0 0 13 0 0 1 r i t a i n y 0 0 14 0 0 2 y h k h i r q 0 0 15 0 0 3 h f v k k f r 0 0 16 0 0 3 f f k r k h e 0 0 17 0 0 3 h G h l f k r 0 0 18 0 0 3 r f h h f r n 0 0 19 0 0 3 r l s k f h s 0 0 20 0 0 3 y e t f r t r 0 0 21 0 0 0 r r f r h y h 0 0 22 0 0 0 r r f r h y h 1 0 23 1 0 0 r r f r h y h 0 0 24 0 0 0 r r f r h y h 0 1
【化学式4】
编号 AA1 AA2 AA3 AA4 AA5 AA6 AA7 R1 25 r r f r h y h (PEG1)2-K(生物素)-NH2 26 r r f r h y h Uk(DOTA)-(PEG1)2-K(生物素)-NH2 27 r r U(1-Nal) r h Uk(PhF5) h Uk(DOTA)-(PEG1)2-K(生物素)-NH2
【化学式5】
编号 AA1 AA2 AA3 AA4 AA5 R2 28 r r f r y (PEG1)2-K(生物素)-NH2 29 r r f r y Uk(DOTA)-(PEG1)2-K(生物素)-NH2 30 r r U(1-Nal) r y (PEG1)2-K(生物素)-NH2 31 r r f r Uk(联苯酚) (PEG1)2-K(生物素)-NH2 32 r r U(1-Nal) r Uk(PhF5) Uk(DOTA)-(PEG1)2-K(生物素)-NH2 33 e r U(1-Nal) r Uk(PhF5) Uk(DOTA)-(PEG1)2-K(生物素)-NH2 34 r r U(1-Nal) e Uk(PhF5) Uk(DOTA)-(PEG1)2-K(生物素)-NH2
所述化学式中，小写字母表示D-氨基酸，大写字母表示L-氨基酸，通过U来表示的取代基分别如下所定义，
13.根据权利要求4中所述的肽结构体，其特征在于，具有如下化学式6、7或8的结构，
【化学式6】
编号 R4 R3 α AA7 AA6 AA5 AA4 AA3 AA2 AA1 R5 35 K(SFA) 1 r r f h f t h NH2 36 K(SFA) 1 r r f h f t h (PEG1)2-K(生物素)-NH2 37 K(环辛烷) K(SFA) 1 r r f h f t h (PEG1)2-K(生物素)-NH2 38 K(SFA) 0 r r f r h y h (PEG1)2-K(生物素)-NH2 39 K(金刚烷) K(SFA) 0 r r f r h y h (PEG1)2-K(生物素)-NH2 40 K(环辛烷) K(SFA) 0 r r f r h y h (PEG1)2-K(生物素)-NH2 41 Uk(SFA) 0 h y h r f r r (PEG1)2-K(生物素)-NH2 42 Uk(环辛烷) Uk(SFA) 0 h y h r f r r (PEG1)2-K(生物素)-NH2 43 Uk(SFA) 0 h y h r f r r (Sar)6-K(AF488)-NH2 44 Uk(环辛烷) Uk(SFA) 0 h y h r f r r (Sar)6-K(AF488)-NH2 45 Uk(金刚烷) Uk(SFA) 0 h y h r f r r (PEG1)2-K(AF488)-NH2 46 Uk(金刚烷) Uk(SFA) 0 h y h r f r r (PEG1)2-K(生物素)-NH2 47 Uk(金刚烷) Uk(SFA) 0 h y h r f r r K(DOTA)-(PEG1)2-K(生物素)-NH2 48 Uk(金刚烷) Uk(SFA) 0 h y h r f r r (PEG1)2-K(DoTA)-NH2 49 Uk(金刚烷) Uk(SFA) 0 h y h r f r r (Sar)6-K(AF488)-NH2 50 Uk(金刚烷) Uk(SFA) 0 h y h r f r r K(AF488)-NH2 51 Uk(金刚烷) UAha(AZA) 0 h y h r f r r (PEG1)1-K(生物素)-NH2 52 G UAha(AZA) 0 h y h r f r r (PEG1)2-K(生物求)-NH2 53 Uk(金刚烷) Uk(噻吩) 0 h y h r f r r (PEG1)2-K(生物素)-NH2 54 G Uk(噻吩) 0 h y h r f r r (PEG1)2-K(生物素)-NH2 55 K(金刚烷) K(SFA) 0 h U(Phe(F5)) h r f r r (PEG1)2-k(生物素)-NH2 56 K(金刚烷) K(SFA) 0 h U(Phe(4-NH2)) h r f r r (PEG1)2-K(生物素)-NH2 57 K(金刚烷) K(SFA) 0 h U(1-Nal) h r f r r (PEG1)2-K(生物素)-NH2 58 K(金刚烷) K(SFA) 0 h U(BiP(4，4-)) h r f r r (PEG1)2-K(生物素)-NH2 59 Uk(金刚烷) Uk(SFA) 0 h y h r U(Phe(F5)) r r (PEG1)2-K(生物素)-NH2 60 Uk(金刚烷) Uk(SFA) 0 h y h r U(Phe(4-NH2)) r r (PEG1)2-K(生物素)-NH2 61 Uk(金刚烷) Uk(SFA) 0 h y h r U(1-Nal) r r (PEG1)2-K(生物素)-NH2 62 Uk(金刚烷) Uk(SFA) 0 h y h r U(BiP(4，4-)) r r (PEG1)2-K(生物素)-NH2
【化学式7】
编号 R7 AA7 AA6 AA5 AA4 AA3 AA2 AA1 R6 R8 63 K(SFA) r r f r h y h K(SFA) UK(DOTA)-(PEG1)2-K(生物素)-NH2 64 Uk(SFA) h y h r f r r Uk(SFA) (PEG1)2-K(生物素)-NH2 65 Uk(SFA) h y h r f r r Uk(SFA) UK(DOTA)-(PEG1)2-K(生物素)-NH2
【化学式8】
编号 R10 AA5 AA4 AA3 AA2 AA1 R9 R11 66 K(SFA) r r f r y K(SFA) UK(DOTA)-(PEG1)2-K(生物素)-NH2 67 K(SFA) r r U(homo-f) r y K(SFA) UK(DOTA)-(PEG1)2-K(生物素)-NH2 68 K(SFA) r r U(1-Nal) r Uk(PhF5) K(SFA) UK(DOTA)-(PEG1)2-K(生物素)-NH2 69 K(SFA) r r U(1-Nal) e Uk(PhF5) K(SFA) UK(DOTA)-(PEG1)2-K(生物素)-NH2 70 K(SFA) e r U(1-Nal) e Uk(PhF5) K(SFA) UK(DOTA)-(PEG1)2-K(生物素)-NH2 71 Uk(SFA) y r f r r Uk(SFA) UK(DOTA)-(PEG1)2-K(生物素)-NH2 72 Uk(SFA) y r f r r Uk(SFA) Uk(6OH)-Uk(DOTA)-(PEG1)2-K(生物素)-NH2 73 UAha(AZA) y r f r r UAha(AZA) K(DOTA)-(PEG1)2-K(生物素)-NH2 74 Uk(SFA) y R f r r Uk(SFA) UK(DOTA)-(PEG1)2-K(生物素)-NH2 75 UOrn(SFA) y R f r r UOrn(SFA) UK(DOTA)-(PEG1)2-K(生物素)-NH2 76 UAha(SFA) y R f r r UAha(SFA) UK(DOTA)-(PEG1)2-K(生物素)-NH2 77 UAza(SFA) y R f r r UAza(SFA) UK(DOT-A)-(PEG1)2-K(生物素)-NH2 78 Uk(SFA) y R f r r UAha(SFA) UK(DOTA)-(PEG1)2-K(生物素)-NH2 79 UAha(SFA) y R f r r Uk(SFA) UK(DOTA)-(PEG1)2-K(生物素)-NH2 80 Uk(SFA) y R f r r Uk(SFA) se-k(DOTA)-ee-Pra(AF488)-NH2 81 UAha(SFA) y R f r r UAha(SFA) se-k(DOTA)-ee-Pra(AF488)-NH2 82 Uk(SFA) y R f r r UAha(SFA) se-k(DOTA)-ee-pra(AF488)-NH2 83 Uk(SFA) y R f r r Uk(SFA) sdrds-Uk(DOTA)-(PEG1)2-K(生物素)-NH2 84 Uk(SFA) y R f r r Uk(SFA) sdrd-Uk(6OH)-Uk(DOTA)-(PEG1)2-K(生物素)-NH2 85 Uk(SFA) y R f r r Uk(SFA) sd-Uk(6OH)-d-NH2 86 Uk(SFA) y R f r r Uk(SFA) sd-Uk(6OH)-d-缬氨酸-瓜氯酸-PABC-MMAE 87 Uk(SFA) y e f r r Uk(SFA) UK(DOTA)-(PEG1)2-K(生物素)-NH2 88 Uk(SFA) y r f e r Uk(SFA) UK(DOTA)-(PEG1)2-K(生物素)-NH2 89 Uk(SFA) y r f r e Uk(SFA) UK(DOTA)-(PEG1)2-K(生物素)-NH2 90 Uk(SFA) Uk(PhF5) r U(1-Nal) r r Uk(SFA) UK(DOTA)-(PEG1)2-K(生物素)-NH2 91 Uk(SFA) y r U(1-Nal) r r Uk(SFA) UK(DOTA)-(PEG1)2-K(生物素)-NH2 92 Uk(SFA) Uk(PhF5) r f r r Uk(SFA) UK(DOTA)-(PEG1)2-K(生物素)-NH2 93 Uk(SFA) U(Phe(4-NH2)) r U(1-Nal) r r Uk(SFA) UK(DOTA)-(PE61)2-K(生物素)-NH2 94 Uk(SFA) y R f r r Uk(SFA) VPTLQ-Uk(AF488)-NH2 95 Uk(SFA) y R f r r Uk(SFA) sd-Uk(DOTA)-dds-Uk(IB)-Uk(6OH)-NH2
所述化学式中，小写字母表示D-氨基酸，大写字母表示L-氨基酸，通过U来表示的取代基分别如下所定义，
/>
14.一种偶联物，包括直接或通过链接剂与荧光染料、细胞毒性剂或放射性同位素结合的根据权利要求3至5、2及13中任一项所述的肽结构体。
15.根据权利要求14中所述的偶联物，其特征在于，所述链接剂选自6-马来酰亚胺己酰基(MC)、马来酰亚胺丙酰基(MP)、缬氨酸-瓜氨酸(val-cit)、丙氨酸-苯丙氨酸(ala-phe)、p-氨基苄氧基羰基(PAB)、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(SPP)、N-琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、4-(2-吡啶二硫代)丁酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDB)及N-琥珀酰亚胺基(4-碘代-乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)中的一种以上。
16.根据权利要求14中所述的偶联物，其特征在于，所述荧光染料选自近红外(near-infrared)荧光染料、荧光素类、若丹明类、Alexa Fluor、4,4-二氟-4-硼-3a，4a-二氮杂-s-茚(BODIPY)、德克萨斯红(Texas Red)、丹磺酰(dansyl)、丽丝胺(Lissamine)、赛恩宁(Cy)及藻红素(phycoerythrin)中的一种以上。
17.根据权利要求14中所述的偶联物，其特征在于，所述细胞毒性剂选自毒素、化学治疗剂、药物部分(moiety)、抗生素及核酸酶中的一种以上。
18.根据权利要求14中所述的偶联物，其特征在于，所述放射性同位素选自氟-18(F-18)、碳-11(C-11)、碳-14(C-14)、锝-99m(Tc-99m)、铜-64(Cu-64)、铜-67(Cu-67)、镝-168(Dy-168)、铋-213(Bi-213)、钐-153(Sm-153)、锶-89(St-89)、锶-90(St-90)、铒-169(Er-169)、磷-32(P-32)、钯-103(Pd-103)、铼-186(Re-186)、铼-188(Re-188)、氧-15(O-15)、硒-75(Se-75)、钠-24(Na-24)、锶-85(Sr-85)、镥-177(Lu-177)、钇-90(Y-90)、碘-123(I-123)、碘-125(I-125)、碘-131(I-131)、铱-192(Ir-192)、铱-196(Ir-196)、镱-166(Yb-166)、铟-111(In-111)、氙-133(Xe-133)、氮-13(N-13)、钙-47(Ca-47)、钴-57(Co-57)、钴-60(Co-60)、铬-51(Cr-51)、氪-81(Kr-81)、钾-42(K-42)、钬-166(Ho-166)、镓-67(Ga-67)、镓-68(Ga-68)、锕-225(Ac-225)、锆-89(Zr-89)、铅-212(Pb-212)及砹-211(At-211)中的一种以上。
19.一种用于癌症的诊断、预防或治疗的药物组合物，包括根据权利要求3至5、12及13中任一项所述的肽结构体。
20.一种用于癌症的诊断、预防或治疗的药物组合物，包括根据权利要求14中所述的偶联物。
21.根据权利要求19中所述的药物组合物，其中，所述癌症是表达碳酸酐酶IX的癌症。
22.根据权利要求19中所述的药物组合物，其中，所述癌症是肝癌、肺癌、大肠癌、胃癌、乳腺癌、结肠癌、骨癌、胰腺癌、头颈癌、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、食管癌、小肠癌、肛门周围癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、前列腺癌、胆管癌、膀胱癌、肾癌、输尿管癌、肾细胞癌、肾骨盆癌、黑色素瘤、甲状腺癌、星形细胞瘤或胶质母细胞瘤。
23.根据权利要求20中所述的药物组合物，其中，所述癌症是表达碳酸酐酶IX的癌症。
24.根据权利要求20中所述的药物组合物，其中，所述癌症是肝癌、肺癌、大肠癌、胃癌、乳腺癌、结肠癌、骨癌、胰腺癌、头颈癌、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、食管癌、小肠癌、肛门周围癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、前列腺癌、胆管癌、膀胱癌、肾癌、输尿管癌、肾细胞癌、肾骨盆癌、黑色素瘤、甲状腺癌、星形细胞瘤或胶质母细胞瘤。
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