JP7026784B2 - ミニガストリン誘導体、特にcck2受容体陽性腫瘍の診断及び/又は治療において使用するためのミニガストリン誘導体 - Google Patents
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Description
X-Z-Ala-Tyr-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2(Y)
[式中、連結しているアミド又は末端アミドの少なくとも1つは、配列Zのアミノ酸の間、前又は後ろで、Ala、Tyr、Gly、Trp、Met、Asp、Phe及びNH2を結合し、又はY(C末端)は、1,4-二置換又は1,5-二置換の1,2,3-トリアゾールにより置き換えられる一方で、Xは、CCK-2受容体関連疾患で診断的介入及び/又は治療的介入の目的のためのペプチドに付着した化学基を表し、Yは、ペプチドのC末端修飾、例えばアミド、第一級及び第二級アミド、遊離カルボン酸、並びに制限されることなく直鎖又は分枝鎖のアルキルアルコール、アルケニルアルコール、アルキニルアルコール、芳香族アルコール及び複素環アルコールに由来するアミド及びエステルを含むカルボン酸エステル誘導体を表し、かつZは、リンカー又はDGlu*を表し、ここでDGlu*は、1~6個の繰り返しを有するDGlu鎖(-DGlu-から-DGlu-DGlu-DGlu-DGlu-DGlu-DGlu-)を表す]
を有するミニガストリン誘導体により本発明に従って達せられる。
DOTA-DGlu-DGlu-DGlu-DGlu-DGlu-DGlu-Ala-Tyr-Gly-Trp-Nle-Asp-Phe-NH2(PP-F11N)及び
DOTA-DGlu-Ala-Tyr-Gly-Trp-Nle-Asp-Phe-NH2([Nle15]-MG11)
と定義される。
R2=Boc/Fmoc
対応するFmoc保護又はBoc保護したアミノ酸(1当量)をCH2Cl2(0.1M)中で溶解し、そしてDIPEA(2.5当量)及びBOP(1当量)を添加した。その溶液を15分間撹拌し、N,O-ジメチルヒドロキシルアミン(1.2当量)を添加し、そして12~14時間室温で撹拌して反応させた。その溶液を、CH2Cl2で希釈し、0.1MのHCl(3×)、飽和NaHCC3(3×)水溶液及び水(3×)で洗浄した。その有機相を、MgSO4上で乾燥させ、濾過し、そして溶媒を減圧下で取り除いた。乾燥させたワインレブアミドを、シリカゲル上でフラッシュクロマトグラフィーにより単離した。
側鎖に保護されたカルボン酸を有するアミノ酸について、対応するFmoc保護したアミノ酸(1当量)を、アルゴン下で無水THF(0.2M)中で溶解し、0℃に冷却した(氷浴)。N-メチルモルホリン(1.1当量)及びイソブチルクロロホルメート(1.05当量)を添加し、そして15分間0℃で撹拌して反応させた。反応の完了をTLCによりモニタリングした。白色の懸濁液を、-78℃(ドライアイス、アセトン)でTHF/MeOH(3:1、又は純粋なTHF)中でのNaBH4(2当量)の予め冷却した懸濁液に滴加し、そして20分間撹拌した。還元の完了時に、残留水素化物を水性10%酢酸により急冷し、そしてその溶液を減圧下で濃縮させた。その在留物を酢酸エチルで抽出し(3×)、そしてその有機相を飽和NaHCO3水溶液(2×)及び水(1×)で洗浄した。その有機層を、Na2SO4上で乾燥させ、濾過し、そして溶媒を減圧下で取り除いた。乾燥させたα-アミノアルコールを、シリカゲル上でフラッシュクロマトグラフィーにより単離した。
C.1 Boc保護したワインレブアミドからのα-アミノアルキンの合成
対応するワインレブアミド(1当量)をアルゴン下で引火乾燥させたフラスコに入れ、そして無水CH2Cl2(0.1M)中で溶解させた。その溶液を-78℃(ドライアイス/アセトン浴)まで冷却し、そしてトルエン中1M DIBAL-Hを滴加した(3当量)。1時間撹拌した後に、その反応を、TLCにより完了を確認した。反応が終わっていなかった場合に、トルエン中1M DIBAL-H(1当量)を滴加し、-78℃で1時間再度撹拌して反応させた。出発材料の消費後に、過剰な水素化物を無水MeOHをゆっくりと添加することにより急冷し、そして0℃まで温めて反応させた(氷/水浴)。K2CO3(3当量)、ジメチル-(1-ジアゾ-2-オキソプロピル)ホスホネート(2当量)及び無水MeOHを添加し、そしてその反応混合物を12~14時間室温で撹拌した。ロッシェル塩の飽和溶液を添加し、その混合物を30分間撹拌した。その溶液を水及びCH2Cl2で希釈し、その水性相をCH2Cl2で抽出した(3×)。合した有機相を、Na2SO4上で乾燥させ、濾過し、そして溶媒を減圧下で取り除いた。乾燥させたアルキンを、シリカゲル上でフラッシュクロマトグラフィーにより単離した。
対応するワインレブアミド(1当量)をアルゴン下で引火乾燥させたフラスコに入れ、そして無水CH2Cl2(0.1M)中で溶解させた。その溶液を-78℃(ドライアイス/アセトン浴)まで冷却し、そしてトルエン中1M DIBAL-Hを滴加した(3当量)。1時間撹拌した後に、その反応を、TLCにより完了を確認した。反応が終わっていなかった場合に、トルエン中1M DIBAL-H(1当量)を添加し、-78℃で1時間再度撹拌して反応させた。出発材料の消費後に、過剰な水素化物を無水MeOHをゆっくりと添加することにより急冷し、そして0℃まで温めて反応させた(氷/水浴)。K2CO3(3当量)、ジメチル-(1-ジアゾ-2-オキソプロピル)ホスホネート(2当量)及び無水MeOHを添加し、そしてその反応混合物を12~14時間室温で撹拌した。ロッシェル塩の飽和溶液を添加し、その混合物を30分間撹拌した。その溶液を水及びCH2Cl2で希釈し、その水性相をCH2Cl2で抽出した(3×)。合した有機相を、Na2SO4上で乾燥させ、濾過し、そして溶媒を減圧下で取り除いた。Fmoc保護基の切断がTLCにより検出された場合に、粗混合物をCH2Cl2(初期スケール0.1M)中で溶解した。DIPEA(2.5当量)及びFmoc-OSu(2当量)を添加し、そして12~14時間室温で撹拌して反応させた。そしてその反応混合物をCH2Cl2及び水で希釈した。水性相をCH2Cl2で3回抽出した。合した有機相を、Na2SO4上で乾燥させ、濾過し、そして溶媒を減圧下で取り除いた。乾燥させたアルキンを、シリカゲル上でフラッシュクロマトグラフィーにより単離した。
DMSO(2.2当量)を無水CH2Cl2(1M)中で溶解し、そしてアルゴン下で-45℃(ドライアイス/MeCN浴)まで冷却した。二塩化オキサリル(1.2当量)を気体の発生下で-45℃で滴加した。その溶液を5分間撹拌して、対応するFmoc保護したα-アミノアルコール(1当量、CH2Cl2中0.13M)を-45℃で滴加し、そして30分間撹拌した。DIPEA(3当量)を添加し、-20℃まで温めて反応させ(NaCl/氷浴)、そして完了するまでTLCによりモニタリングした。そして、その溶液をCH2Cl2で希釈し、その有機相を、水、1M NaHSO4、及び水で抽出した。合した有機相を、Na2SO4上で乾燥させ、濾過し、そして溶媒を減圧下で取り除いた。続いて、その粗反応物を無水MeOH(初期収量に従って0.1M)中で溶解し、そしてK2CO3(3当量)及びジメチル-(1-ジアゾ-2-オキソプロピル)ホスホネート(2当量)を添加し、反応混合物を12~14時間室温で撹拌した。その反応混合物を水で希釈し、その水性相をCH2Cl2で3回抽出した。合した有機相を、Na2SO4上で乾燥させ、濾過し、そして溶媒を減圧下で取り除いた。Fmoc保護基の切断がTLCにより検出された場合に、粗混合物をCH2Cl2(初期スケール0.1M)中で溶解した。DIPEA(2.5当量)及びFmoc-OSu(2当量)を添加し、そして12~14時間室温で撹拌して反応させた。そしてその反応混合物をCH2Cl2及び水で希釈した。水性相をCH2Cl2で3回抽出した。合した有機相を、Na2SO4上で乾燥させ、濾過し、そして溶媒を減圧下で取り除いた。乾燥させたアルキンを、シリカゲル上でフラッシュクロマトグラフィーにより単離した。
D.1 Boc保護したα-アミノアルキンからのジペプチドの合成
対応するα-アミノアルキン(1当量)を、CH2Cl2/TFA/H2O(75:20:5)(0.05M)の溶液中で溶解し、15~30分間撹拌して反応させ、反応の完了後に、溶媒を減圧下で取り除いた。水及びTFAの残留量をトルエンでの同時蒸発により取り除いた。その残留物をCH2Cl2(0.1M)中で溶解し、そしてPG-Ala-OH(2当量、PG=Boc又はFmoc)、(ベンゾトリアゾール-1-イルオキシ)トリス(ジメチルアミノ)ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート(BOP、2当量)及びDIPEA(5当量)を添加した。室温で撹拌して反応させ、そして完了するまでTLCによりモニタリングした。溶媒を減圧下で粗混合物から取り除き、そして所望のジペプチドをシリカゲル上でフラッシュクロマトグラフィーにより単離した。
対応するα-アミノアルキン(1当量)を、DMF中25%ピペリジン(0.05M)中で溶解し、そして室温で15~30分間撹拌して反応させた。氷冷したH2Oを反応混合物に添加し、EtOAcで抽出した(3×)。合した有機画分を、MgSO4上で乾燥させ、濾過し、そして溶媒を減圧下で取り除いた。その残留物をCH2Cl2(0.1M)中で溶解し、そしてFmoc-Ala-OH(2当量)、BOP(2当量)及びDIPEA(5当量)を添加した。室温で撹拌して反応させ、そして完了するまでTLCによりモニタリングした。溶媒を減圧下で粗混合物から取り除き、そして所望のジペプチドをシリカゲル上でフラッシュクロマトグラフィーにより単離した。
rinkアミドMBHA LL樹脂(約100mg、0.03~0.04mmol)を、プロピレンフリット及びテフロンタップを有するプロピレンシリンジ中に置き、そしてCH2Cl2及びDMF中で繰り返し膨張させた。DMF中20%ピペリジンを使用して、Fmoc保護基を切断した(3×3分、室温)。配列の伸長のために、Fmoc保護したアミノ酸又はDOTA-トリス(tert-ブチルエステル)(2当量、0.06mmol)、HATU(1.9当量、0.057mmol)及びDIPEA(5当量、0.15mmol)をDMF中で(合計3mL)、樹脂に添加した。1時間室温で振盪して懸濁させた。溶媒を濾過により取り除き、そして樹脂をDMF及びCH2Cl2で繰り返し洗浄した。反応の完了をカイザー試験によりモニタリングし、そして適宜カップリングを繰り返した。
Fmoc保護基の切断後に、遊離N末端アミンを、イミダゾール-1-スルホニルアジドヒドロクロリド(3当量、0.09mmol)、DIPEA(9当量、0.27mmol)及びCuSO4(0.01当量、0.03μmol)の触媒量7でDMF中で(合計2mL)試験した。1時間室温で振盪して懸濁させた。溶媒を濾過により取り除き、そして樹脂をDMF中ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウムの0.5%溶液、DMF及びCH2Cl2で繰り返し洗浄した。反応の完了をカイザー試験によりモニタリングし、そして適宜繰り返した。
Fmoc保護したα-アミノアルキン(2当量、0.06mmol)、DIPEA(1当量、0.03mmol)、テトラキス(アセトニトリル)銅(I)ヘキサフルオロホスフェート(0.5当量、0.015mmol)及びトリス[(1-ベンジル-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)メチル]アミン(TBTA、0.5当量、0.015mmol)をDMF(2mL)中で、N末端アジド官能性に添加し、そして12~14時間室温で振盪して懸濁した。溶媒を濾過により取り除き、そして樹脂をDMF中ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウムの0.5%溶液、DMF及びCH2Cl2で繰り返し洗浄した。反応の完了を、脂肪族アジドについての比色分析試験によりモニタリングした。
Fmoc保護したα-アミノアルキン(2当量、0.06mmol)及び(クロロ(ペンタメチルシクロペンタジエニル)(シクロオクタジエン)ルテニウム(CpRu(COD)Cl、0.5当量)をDMF中(2mL)でN末端アジド官能性にアルゴン雰囲気下で添加し、そして12~14時間室温で振盪して懸濁した。溶媒を濾過により取り除き、そして樹脂をDMF中ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウムの0.5%溶液、DMF及びCH2Cl2で繰り返し洗浄した。反応の完了を、脂肪族アジドについての比色分析試験によりモニタリングした。
N末端キレーターDOTA-トリス(tert-ブチルエステル)の最終的なカップリング後に、その接合体を、5時間室温で撹拌しながらTFA/TIS/H2O/フェノール(92.5/2.5/2.5/2.5、6mL)を使用して樹脂から脱保護及び切断した。切断混合物を、樹脂から濾過により分離して、そして窒素流を揮発性成分の蒸発のために適用した。そして、粗ペプチドを氷冷ジエチルエーテル(15mL)の添加により沈澱させた。遠心分離(1800rpm、5分)及び氷冷したジエチルエーテルでの2回の洗浄工程の後に、粗ペプチド接合体を、水中20%CH3CN(1mg/mL)中で溶解し、そして逆相半調製用HPLCにより精製した。続いて凍結乾燥して、白色の粉末として最終生成物を得た。
ストック溶液を、基準物質(DOTA-[Nle15]-MG11及びDOTA-PP-F11-N)又はトリアゾロミニガストリン(1mg、750nmol)を酢酸アンモニウム緩衝液(50μL、0.5M、pH5.5)中で溶解し、そして最終ペプチド濃度250μΜ(約0.3mg/mL)まで水を添加することにより調製した。in vitroでの実験のために、DOTA官能化化合物(1nmol、4μLの250μΜストック溶液)を水性HCl(22.5μL、0.05M、pH1.3),酢酸アンモニウム緩衝液(10μL、0.5M、pH5.5)及び水性アスコルビン酸ナトリウム(5μL、0.5M)の混合物に添加した。20~25MBqの177LuCl3(約2.5μL、0.04M HCl中、20~25MBq/nmol)を添加し、そしてその混合物を加熱ブロック中で20分間95℃まで加熱した。標識後に、標識混合物の1μLアリコートを、γ-HPLCによる品質制御のために水性DTPA(200μL、25μM)に添加した。
CCK2Rを発現するヒト髄様甲状腺癌細胞(MZ-CRC1)を、NunclonTM Deltaで処理した細胞培養フラスコ中で単層で5%CO2及び37℃での加湿空気中で成長させた。細胞を、20mM L-グルタミン(L-Glu)及び10% FCSで補った培養培地DMEM(高グルコース(4.5g/L))中で維持した。0.25%トリプシン0.38‰EDTA溶液を使用して、80~90%の培養密度で培養物を定期的に継代した。アッセイを、0.1%BSAを含むアッセイ培地DMEM(高グルコース)中で実施した。
実験の前日に、MZ-CRC1細胞を細胞培養培地中で6ウェルプレート(0.85・106細胞/ウェル)に入れ、付着のために一晩インキュベートした。実験当日に、培地を取り除き、細胞を1mLのPBSで2回洗浄した。プレートを調製のために氷上に置いた。0.9mLのアッセイ培地を非特異的結合のものを除く全てのウェルに分注した。0.2pmolの177Lu標識した接合体(100μL、アッセイ培地中2nM、約4.2kBq)を全てのウェルに分注した。非特異的結合を測定するために、5000倍過剰のミニガストリン(1nmol、100μL、アッセイ培地中10μL)を、177Lu標識した接合体を含む0.8mLのアッセイ培地に添加した。プレートを5%CO2中で37℃でインキュベートして、結合及び内部移行させた。このプロセスを、30分、60分、120分及び240分後に上清を回収することによって停止した。細胞をPBSで2回(それぞれ0.6mL)洗浄した。合した上清は、放射活性の遊離した非結合部分を表す。細胞を冷却した生理食塩水グリシン緩衝液(0.6mL、0.05M、pH2.8)で2回室温で5分間インキュベートすることにより、膜結合活性を測定した。内部移行した画分を、NaOHでの細胞溶解を2サイクル(それぞれ0.6mL、1M、10分、室温)実施することによって単離した。画分の放射活性を、COBRA-IIガンマカウンターにより測定し、適用した合計の放射活性量のパーセンテージとして表す(n=3~5で3回)。
実験の前日に、MZ-CRC1細胞を細胞培養培地中で6ウェルプレート(0.85・106細胞/ウェル)に入れ、付着のために一晩インキュベートした。実験当日に、培地を取り除き、細胞を1mL PBSで2回洗浄した。氷上で、0.8mLのアッセイ培地及び放射標識した基準化合物177Lu-DOTA-PP-F11N(0.2pmol、アッセイ培地中2nM、100μL、約4.2kBq)をそれぞれのウェルに分注した(ウェル中の最終濃度=0.2nM)。175Luで標識した試験化合物を添加して、10-11~5・10-6Mの最終ウェル濃度(アッセイ培地中10-10~5・10-5Mの100μLの希釈系列)に達した。177Lu-DOTA-PP-F11Nの総結合を、試験化合物を添加せずに細胞をインキュベートすることによって確認した。プレートを4℃で1時間インキュベートした後に、上清を取り除き、細胞を1mLの冷したPBSで2回洗浄した。細胞溶解のために、NaOHを全てのウェルに2回添加した(0.6mL、1M、10分、室温)。溶解させた細胞に関連する放射活性を、COBRA-IIガンマカウンターで測定した。50%阻害濃度(IC50)を、GraphPad Prism(n=3で3回)での正規化非線形回帰によって算出した。
177Luで標識した化合物を0.9%NaClで3.75μΜの濃度に希釈し、そして窒素でフラッシュした新鮮なヒト血漿(1.5mL)中で37℃でインキュベートした(375pmol、100μL、7.5~12MBq)。異なる時点(0.5時間、1時間、2時間、4時間、6時間及び24時間)でアリコート(75μL)を取り、そしてタンパク質をCH3CN(100μL)中で沈殿させ、遠心分離した(2分、14680rpm、室温)。上清(75μL)を水(75μL)で希釈し、γ-HPLCで分析した。単相減衰非線形回帰(A=A0*e-kT)を使用して、GraphPad Prism(n=2~3)でのペプチド接合体の半減期(t1/2)を算出した。
放射標識したトリアゾロペプチドの親油性(logD)を、「振盪フラスコ法」によって測定した。放射標識した接合体(10pmol、10μL、PBS中1μl、約0.25MBq)をn-オクタノール/PBS(1mL、pH7.4)の飽和1:1混合物に添加し、ボルテックスにより1分間激しく振盪した。遠心分離(3000rpm、10分)後に、双方の相の100μLアリコートを取り出し、放射活性をガンマカウンターで測定した(n=2で4通り)。
全ての手順は、地域の動物委員会によって承認され、動物の倫理的使用に関する国際的なガイドラインに従った。6週齢のメスのCD1 nu/nuマウス(Charles River Laboratory、ドイツ)に、5 Mio MZCRC細胞を接種した。マウスを50~200mm2のサイズに達するまで2週間成長させた。実験当日に、マウスに、尾静脈を介して100μlのPBS(約0.5MBq)中でそれぞれ177Luで標識した化合物10pmolを注射した。マウスを、注射後4時間でCO2窒息により屠殺し、臓器(血液、心臓、肺、脾臓、腎臓、膵臓、胃、腸、肝臓、筋肉、骨、腫瘍)を解剖により採取し、重量を測定し、ガンマカウンターで測定した(n=4)。ブロッキング実験のために、放射標識した化合物の注射前に、マウスに100μlのPBS中100mgのミニガストリン(約60000pmol、6000倍過剰)を注射した(n=4)。組織分布データを、組織1グラムあたりの注射された活性のパーセント(%ID/g)として算出し、そして統計分析をGraphPad Prismで実施した。
Claims (6)
- 式
X-Z-Ala-Tyr-Gly-Trp-Nle-Asp-Phe-NH2(Y)
[式中、配列Z、Ala、Tyr、Gly、Trp、Nle、Asp、及びPheのアミノ酸の間、前又は後ろで連結しているアミド又は末端アミド結合の少なくとも1つは、あるいはY(C末端)は、1,4-二置換又は1,5-二置換の1,2,3-トリアゾールにより置き換えられる一方で、Xは、放射性金属のためのキレーターを含む放射性核種、光活動性物質及び光増感剤から選択される光学活性化学化合物、ゲムシタビン、ドキソルビシン及びシクロホスファミドから選択される化学療法活性化合物、又は光学活性造影剤もしくはMRI造影剤を有するナノ粒子又はリポソームを表し、Yは、アミド、第一級及び第二級アミド、遊離カルボン酸、並びに直鎖又は分枝鎖のアルキルアルコール、アルケニルアルコール、アルキニルアルコール、芳香族アルコール及び複素環アルコールに由来するアミド及びエステルを含むカルボン酸エステル誘導体から選択されるペプチドのC末端修飾を表し、かつZは、リンカー又はDGlu*を表し、ここでDGlu*は、1~6個の繰り返しを有するDGlu鎖(-DGlu-から-DGlu-DGlu-DGlu-DGlu-DGlu-DGlu-)を表す]
を有するミニガストリン誘導体。 - 1つのDGluのみを有するミニガストリン誘導体[Nle15]-MG11及び/又はミニガストリン誘導体PP-F11Nを提供する、請求項1に記載のミニガストリン誘導体。
- 放射性金属のためのキレーターが、DOTA(1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-四酢酸)、NOTA、NOTAGA、CHX-A’’-DTPA及びTCMCからなる群から選択される、請求項1に記載のミニガストリン誘導体。
- 放射性核種が、177Lu、90Y、111In、Ga-68/67、Tc-99m、Cu-64/67、Ac-225、Bi-213、Pb-212及びTh-227からなる群から選択される、請求項1に記載のミニガストリン誘導体。
- PP-F11N及び[Nle15]-MG11が、それぞれ
DOTA-DGlu-DGlu-DGlu-DGlu-DGlu-DGlu-Ala-Tyr-Gly-Trp-Nle-Asp-Phe-NH2及び
DOTA-DGlu-Ala-Tyr-Gly-Trp-Nle-Asp-Phe-NH2
と定義される、請求項2に記載のミニガストリン誘導体。 - DOTA-DGlu-DGlu-DGlu-DGlu-DGlu-DGlu-Ala-Tyr-Gly-Trp-Nle-Asp-Phe-NH2が、177Luで標識されているか、又はDOTA-DGlu-Ala-Tyr-Gly-Trp-Nle-Asp-Phe-NH2が、177Luで標識されている、請求項5に記載のミニガストリン誘導体。
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