TWI515011B - 鈴蟾素類似物胜肽拮抗劑共軛物 - Google Patents

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Description

鈴蟾素類似物胜肽拮抗劑共軛物
本發明係關於治療或診斷/成像放射性藥物，其製備及其用途，其中該治療或診斷放射性藥物係定義為對於鈴蟾素受體有親和力且能夠與鈴蟾素受體結合且更特定言之與胃泌素釋放胜肽(GRP)受體結合之結合部分。將結合部分以α-、β-、γ-及正電子發射同位素標記至金屬錯合基團。該用途包括治療患有贅生性疾病之個體，其包含以下步驟：向個體投與有效量之具有與螯合基螯合之金屬的治療放射性藥物，該螯合基連接至能夠與在腫瘤細胞上過度表現之鈴蟾素受體，且更特定言之，胃泌素釋放胜肽(GRP)受體結合之部分。該用途包括使用具有與螯合基螯合之金屬的診斷/成像放射性藥物來診斷患有贅生性疾病之個體或使該個體成像，該螯合基連接至能夠與在腫瘤細胞上過度表現之鈴蟾素受體，且更特定言之，胃泌素釋放胜肽(GRP)受體結合之部分。該方法係由以下步驟組成：自由與能夠結合鈴蟾素受體，且更特定言之，胃泌素釋放胜肽(GRP)受體之部分共價連接之金屬螯合基組成的前驅體化合物形成治療或診斷化合物。
在設計用作診斷劑之有效放射性藥物示蹤劑時，藥物具有適當的活體內靶向及藥物動力學性質為必要的。Fritzberg等人，(1992,J. Nucl. Med.,33:394)進一步指出放射性核種化學及相關鍵聯強調對於最優化生物分子載劑之連接及標記化學修飾的需要。因此，放射性核種之類型、生物分子之類型及用於將其相互連接之方法可對放射性示蹤劑性質具有關鍵作用。
胜肽係在許多生理過程中起關鍵作用(包括起神經傳遞質、激素及抗生素作用)的生物分子。研究已顯示其在諸如神經科學、免疫學、藥理學及細胞生物學之領域中的重要性。一些胜肽可充當化學信使。其與靶細胞表面上之受體結合且將配位體之生物效應傳遞至靶組織。因此，該配位體之特異性受體結合性質可藉由用放射性核種標記配位體而得以利用。理論上，配位體對於受體之高親和力有助於使放射性標記之配位體保留在受體表現組織中。然而，仍在研究何種胜肽可有效地經標記且該標記應在何種條件下進行。熟知配位體胜肽之受體特異性可在化學反應期間改變。因此，必須確定最佳胜肽構築體。
腫瘤過度表現胜肽所特異性結合之多種受體類型。以下公開案：Boerman等人，Seminar in Nuclear Medicine ,2000,30(3),195)；Reubi等人J. Nucl. Med .,2005,46,(增刊)67S；Reubi,J.C.,Endocrine Reviews ,2003,24(4),389提供特異性結合至贅瘤中之細胞表面受體之胜肽的不完全列表，亦即，生長抑素、血管活性腸胜肽(vasoactive intestinal peptide,VIP)、結合至胃泌素釋放胜肽(GRP)受體之鈴蟾素、胃泌素、膽囊收縮素(CCK)及降血鈣素。
金屬標記之受體特異性胜肽對於閃爍攝影成像及放射性療法之潛在效用係藉由生長抑素類似物(例如分別為111 In-DTPA共軛之奧曲肽(Octreotide)，其為一種FDA核准之診斷成像劑；Octreoscan，由Covidien在美國銷售(Lowbertz等人，Seminars in Oncology ,1994,1)及Reubi等人，J. Nucl. Med .,2005,46,67S-75S及其中之文獻)來例示。奧曲肽及其類似物已共價連接至若干成像金屬同位素(99m Tc、111 In、68 Ga)及治療金屬同位素(105 Rh、186/188 Re、153 Sm、90 Y、166 Ho、177 Lu)。經金屬標記之共軛物特異性結合至受體，且一旦結合至受體，構築體即藉由受體而內在化且經金屬標記之受體特異性胜肽或其代謝物在靶細胞中被捕獲。
上述原則進一步擴展至GRP受體avid胜肽(對受體具有高親和力之胜肽)，其中將金屬共軛之鈴蟾素促效劑用於閃爍攝影成像及放射性療法。(Smith等人，Anticancer Res ,,23(2003),63-70；Baidoo等人，Bioconjug. Chem .,9(1998),218-225；Gali等人，Bioconjug .Chem .,12(2001),354-363；Smith等人，Bioconjug. Chem .,14(2003),93-102,Cancer Res .,63(2003),4082-4088；Rogers等人，在M. Nicolini及U. Mazzi編輯之Technetium,rhenium and other metals in chemistry and nuclear medicine ,SGE Editoriali,Italy(1999),519-525中；Zhang等人，Cancer Res .,64(2004),6707-6715；Lantry等人，EANM ,Helsinki(Finland)(2004)；Linder等人,J. Nucl. Med .,45,(2004)(5),169P[摘要482]. Chen等人,J. Nucl. Med .,45(2004),1390-1397；Johnson等人，Cancer Biother Radiopharm . 2006,21(2),155-66,Smith等人，Nucl. Med. Biol. ,2005,32733-40)。
在Chen等人(Appl. Radiat. Isot. ,2007,(待刊))，Waser等人(Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. 2007 34,95-100)及Lantry等人(J. Nucl. Med. ,2006,47,1144-52)中，描述鈴蟾素促效劑(偶合至-NH-CH2 -CO-[4-胺基苯甲醯基]-QWAVGHLM-NH2 ))之177 Lu-DOTA(177 Lu-AMBA))之成像及放射性療法。
若干專利及專利申請案涉及經金屬標記之鈴蟾素促效劑。Volkert等人(US 2007/0065362 A)主張具有通用結構(金屬標記部分-間隔基-鈴蟾素促效劑)之經金屬標記之鈴蟾素促效劑用於成像及治療用途。同一發明者之其他專利及專利申請案包括：US 6,921,526 B(2005)、US 7,060,247 B、US 7,147,838 B(2006)及WO 2002/087631 A1。
在所有上述公開案中選擇作為放射性藥物之促效劑的根本原則在於其藉由GRP受體對相互作用產生或引起反應，其中放射性藥物隨後藉由內飲作用進入細胞內。GRP拮抗劑對抗促效劑之作用且並不進入細胞內且因此假定拮抗劑可能不太適用於放射性閃爍攝影成像及放射性治療目的。到目前為止共識為開發具有良好放射性配位體內在化性質之化合物，造成似乎最佳化觀測及活體內放射性核種治療所需之腫瘤中放射性配位體的高活體內積累。自分子藥理學研究熟知有效內在化作用通常係主要由促效劑提供(Bodei等人，J. Nucl. Med. ,2006;47,375-377;Koenig等人，Trends Pharmacol. Sci .,1997;18,276-287；Cescato等人，J. Nucl. Med .,2006;47,502-511；Ginj等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006；103,16436-16441)且最近，有證據顯示在生長抑素受體之情況下，高親和力經金屬標記之生長抑素受體拮抗劑不良內在化至腫瘤細胞中且與大規模內在化之相應促效劑相比，其在活體內吸收至動物腫瘤模型中之腫瘤方面效能相等或甚至更佳。GRP受體在諸如前列腺癌及癌轉移、乳癌及癌轉移、胃腸基質腫瘤、小細胞肺癌、腎細胞癌、胃腸胰神經內分泌腫瘤、頭部及頸部鱗狀細胞癌、神經母細胞瘤及食道鱗狀細胞癌之若干種贅瘤中過度表現(Cornelio等人，Ann. Onco .,2007,18,1457-1466及其中之文獻)。GRP受體亦在人類卵巢癌、子宮內膜癌及胰腺癌之腫瘤相關血管中表現。(Fleischmann等人，Cell Onc .,2007,29,421-33)。因此，非常需要設計具有拮抗劑性質之有效放射性藥物用於成像及放射性療法。
Jensen等人(Pharma. Reviews ,2008(待刊))最近評論了GRP受體屬於亞型2之三種不同鈴蟾素受體亞型的受體藥理學。
在最近Cescato等人(J. Nucl. Med .,2008,49,318-26)之公開案中證明對於腫瘤靶向而言經99m Tc-N4 -標記之鈴蟾素拮抗劑可優於促效劑。
GRP-受體靶向化合物領域中之先前發明在WO 2007/109475 A2、WO 2007/095443 A2、US 2008/0008649 A1及US 7,226,577 B2中描述，其中金屬螯合-連接子-鈴蟾素具有以下所示之通用方案：金屬-螯合劑-連接子-鈴蟾素類似物。
根據WO 2007/095443 A2，具有特定序列177 Lu-DOTA-Gly-4-胺基苯甲醯基-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2 之L70樣品係用作促效劑，其中量測1及24小時時之吸收。吸收對於治療目的而言不理想且需經改良。
除此等專利及申請案以外，在以下公開案中包括臨床前及臨床研究(Waser等人，Eur. J. Nucl. Medicine ,2007,34,95-100；J. Nucl. Med .,2006,47,1144-52)。
依靠選擇以高親和力在不同位點靶向GPR受體之拮抗劑，本發明展示間隔基策略之組合得到意想不到之高及持續之腫瘤吸收同時在非靶器官中低吸收且快速清除。在一比較研究中，當使用類似連接子時，觀察到在腫瘤中的顯著較高吸收(>2X)。由確認鈴蟾素類似物之拮抗性質的活體外檢定開始，發現甚至在添加N-末端之間隔基、螯合劑及金屬之後，此等拮抗作用仍得以保留且將其轉化(translate)為優異的關於腫瘤：背景比率之活體內特性。
因此，本發明之一目標為提供展示高吸收及高活體內穩定性(人類血清及組織)之新穎鈴蟾素胜肽拮抗劑共軛物。
在第一態樣中，本發明係關於選擇性結合至鈴蟾素受體(且更特定言之GRP受體)之鈴蟾素類似物胜肽拮抗劑共軛物，當在此兩種系統中拮抗促效劑誘發之作用時，其不觸發進入細胞之內在化且不經由鈣動員來發送信號，其中該鈴蟾素類似物胜肽拮抗劑共軛物具有通式(I)：
(I)　[A-(B) n ] x -C
其中x為1至3之整數，n為1至6之整數，A 為包含至少一種放射性核種金屬之金屬螯合劑，較佳適用於診斷或治療用途，更佳適用於成像或放射性療法，B 為連接至C 之N-末端之間隔基或一共價鍵，C 為序列C-1至C-4之鈴蟾素類似物胜肽拮抗劑，其中C-1: Xaa1 6 -Gln7 -Trp8 -Ala9 -Val10 -Xaa2 11 -His12 -Xaa3 13 -Xaa4 14 -ZH，其中Xaa1 為D-Phe、D-Cpa、D-Tyr、D-Trp或具有以下所述之式之任一者之殘基：
K為F、Cl、I或NO2 ，Xaa2 為Gly或β-Ala，Xaa3 為抑制素(Statine)、抑制素類似物及異構體、4-Am,5-MeHpA、4-Am,5-MeHxA或α-取代胺基酸，Xaa4 為Leu、Cpa、Cba、CpnA、Cha、t-buGly、tBuAla、Met、Nle或異-Bu-Gly，且Z為NH或O；C-2: Xaa1 6 -Gln7 -Trp8 -Ala9 -Val10 -Xaa2 11 -His12 -LeuΨ(CHOH-CH2 )-(cH2 )2 -CH3 ，其中LeuΨ(CHOH-CH2 )-(CH2 )2 -CH3 為
Xaa1 為D-Phe、D-Cpa、D-Tyr、D-Trp或具有以下所述之式之任一者之殘基：
且K為F、Cl、I或NO2 ，Xaa2 為Gly或β-Ala；C-3: Xaa1 6 -Gln7 -Trp8 -Ala9 -Val10 -Xaa2 11 -His12 -Xaa5 13 -Xaa6 14 -ZH，其中Xaa1 為D-Phe、D-Cpa、D-Tyr、D-Trp或具有以下所述之式之任一者之殘基：
K為F、Cl、I或NO2 ，Xaa2 為Gly或β-Ala，Xaa5 為LeuΨ-CH2 NH-，Xaa6 為Cys、Phe、Trp、Tpi或Tac，其中Tpi及Tac具有以下含義：
且Z為NH或O；C-4: Xaa1 6 -Gln7 -Trp8 -Ala9 -Val10 -Xaa2 11 -HiS12 -Xaa7 ，其中Xaa1 為D-Phe、D-Cpa、D-Tyr、D-Trp或具有以下所述之式之任一者之殘基：
K為F、Cl、I或NO2 ，Xaa2 為Gly或β-Ala，Xaa7 為Leu-O-烷基或Leu-NH-烷基。
本發明進一步係關於此等鈴蟾素類似物胜肽拮抗劑共軛物之無機酸或有機酸的醫藥學上可接受之鹽，且進一步係關於具有通用化學式(I)之此等化合物的水合物、錯合物、酯、醯胺、溶劑合物及前藥。
描述A (金屬螯合劑)：
在本發明之一較佳實施例中，金屬螯合劑(A)為三價金屬或五價金屬之金屬螯合劑及其相近類似物。
三價金屬之金屬螯合劑(A)較佳係選自包含以下各物之群：DOTA-、NODASA-、NODAGA-、NOTA-、DTPA-、EDTA-、TETA-及TRITA-基螯合劑及其相近類似物，其中DOTA表示1,4,7,10-四氮雜環十二烷-N,N',N",N'''四乙酸，DTPA表示二伸乙三胺五乙酸，EDTA表示乙二胺-N,N'-四乙酸，TETA表示1,4,8,11-四氮雜環十二烷-1,4,8,11-四乙酸，且NOTA表示1,4,7-三氮雜環壬烷三乙酸。
三價金屬之金屬螯合劑(A)更佳係選自包含以下各物之群：DOTA-、NOTA-、DTPA-及TETA-基螯合劑及其相近類似物。
如下展示此等螯合配位體之完全去質子形式之結構。
三價金屬之金屬螯合劑(A)甚至更佳係選自包含以下各物之群：DTPA(二伸乙三胺五乙酸)及多氮雜-多羧酸鹽巨環，諸如DOTA(1,4,7,10-四氮雜環十二烷-N,N',N",N'''四乙酸)及其相近類似物。
五價金屬之金屬螯合劑(A)較佳係選自包含以下各物之群：2-肼基菸鹼醯胺(HYNIC)、N4 -螯合劑、N4 -X(N4 可為直鏈或巨環且X可為疊氮胺，OH，鹵素，鄰-、間-、對-胺基苯甲基，間、對羧基苯甲基及羧基(Nock,B.等人(2003[99m Tc]Demobesin 1,a novel bombesin analogue for GRP receptor-targeted tumour imaging.Eur .I .Nucl .Mol .Imaging ,30,247-258))，去鐵敏(Desferrioxamin，DFO)及Nr S(4-r) 螯合劑，及
其中R1 -R15 相互獨立地為氫原子或(C1 -C4 )烷基，其中，在上式之部分中，t為1或2或3且在該部分中之碳原子之至少一者係經Y取代或未經Y取代，R16 為氫原子或CO2 (C1 -C4 )烷基；R17 及R18 相互獨立地為(C1 -C4 )烷基或苯基；R19 為CH2 -COOH或其官能衍生物；E為(C1 -C4 )伸烷基或伸苯基；視情況(C1 -C4 )伸烷基經CO2 -烷基、CH2 -CO烷基、CONH2 或CONHCH2 -CO2 -烷基取代；視情況伸苯基經CO2 -烷基取代，其中烷基具有1至4個碳原子；G為NH或S；Y為能夠與胜肽之游離胺基(N-末端)或間隔基結合之官能基；且Z'為S或O。
N4 -螯合劑較佳為
其中m意謂1至4之整數。
Nr S(4-r) 螯合劑係定義為其中r為1至4之整數。
該官能基Y較佳包含異氰酸基、異硫氰基、甲醯基、鹵代硝基苯基、重氮基(diazonium)、環氧基、三氯聚三嗪基、伸乙亞胺基、氯磺醯基、烷氧基伸亞胺醯基、(經取代或未經取代)烷基羰基氧基羰基、烷基羰基咪唑基、琥珀醯亞胺醯基-氧基羰基；該基團連接於(C1 -C10 )烴雙基。烴雙基之適當實例為衍生自苯、(C1 -C6 )烷烴、(C2 -C6 )烯烴及(C1 -C4 )-烷基苯及其相近類似物之雙基。
Nt S(4-t) 螯合劑較佳係選自包含以下各物之群：用於鍀放射性核種金屬之雙胺基雙硫醇(BAT)基螯合劑，用於鍀放射性核種金屬之巰基-乙醯基-甘胺醯基-甘胺醯基-甘胺酸(MAG3)及其相近類似物。
五價金屬之金屬螯合劑(A)更佳係選自包含以下各物之群：
及其相近類似物，其中R1 -R19 、Z'、Y、G及t係如上所定義。
r較佳為2至4之整數且r更佳為2或3。
m較佳意謂1至2之整數，m更佳為1。
為人所熟知之金屬螯合劑，諸如直鏈、巨環、四吡啶及N3 S、N2 S2 或N4 螯合劑係於US 5,367,080 A、US 5,364,613 A、US 5,021,556 A、US 5,075,099 A、US 5,886,142 A中揭示，該等文獻之揭示內容全文以引用之方式併入本文中。
為人所熟知之金屬螯合劑，諸如HYNIC、DTPA、EDTA、DOTA、TETA、雙胺基雙硫醇(BAT)基螯合劑係於US 5,720,934 A中揭示，該文獻之揭示內容全文以引用之方式併入本文中。
為人所熟知之金屬螯合劑，諸如去鐵敏(DFO)係於Doulias等人(2003)Endosomal and lysosomal effects of desferrioxamine:protection of HeLa cells from hydrogen peroxide-induced DNA damage and induction of cell-cycle arrest. Free Radic. Biol. Med. ，第35卷，第7期：719-28中揭示。
Banerjee等人，(Nucl. Med. and Biology, 2005,32,1-20及其中之參考文獻)(其以引用之方式包括於本文中)利用且評論多種螯合劑。
在已廣泛用於99m Tc及186,188 Re之合併的共配位體存在下，2-肼基菸鹼醯胺(HYNIC)為另一類螯合基(A)(Schwartz等人Bioconj. Chem. ,1991,2,333-6；Babich等人，J. Nucl. Med .,1993,34,1964-70；Nucl. Med. Biol .,1995,22,25-30；Nucl. Med. Biol .,1995,22，第32頁，第1-10頁)。
DTPA係以Octreoscan(由Covidian市售)用於錯合111 In且在文獻中描述若干修改(Brechbiel等人，Biocon. Chem .,1991,2,187-194；Li等人，Nucl. Med. Biol .,2001,28,145-154)。
用於放射性療法應用之DOTA型螯合劑係由Tweedle等人之美國專利第48885363號中描述。其他用於與三價同位素金屬螯合之多氮雜巨環係由Maecke等人在Bioconj. Chem .,2002,13,530中描述，且該文獻以引用之方式包括於本文中。
在靶向CCK-2受體之微小胃泌素之情況下，已將N4 -螯合劑、99m Tc-N4 -螯合劑用於胜肽標記(Nock等人，J. Nucl. Med .,2005,46,1727-36)。
在本發明之一較佳實施例中，放射性核種金屬適用於與金屬螯合劑錯合且產生用於成像之放射性金屬螯合劑。放射性核種金屬較佳係選自包含以下金屬之群：133m In、99m Tc、67 Ga、52 Fe、68 Ga、72 As、111 In、97 Ru、203 Pb、62 Cu、64 Cu、51 Cr、52m Mn、157 Gd、123 I、124 I、131 I、75 Br、76 Br、77 Br、64 Cu及82 Br。放射性核種金屬更佳係選自包含以下金屬之群：99m Tc、67 Ga、68 Ga、111 In及123 I。放射性核種金屬甚至更佳為68 Ga。放射性核種金屬甚至更佳為99m Tc。
在本發明之一較佳實施例中，放射性核種金屬適用於與金屬螯合劑錯合且產生用於放射性療法之放射性金屬螯合劑。放射性核種金屬較佳係選自包含以下金屬之群：186 Re、90 Y、67 Cu、68 Ga、69 Er、121 Sn、127 Te、142 Pr、143 Pr、198 Au、199 Au、161 Tb、109 Pd、188 Rd、186 Re、188 Re、77 As、166 Dy、166 Ho、149 Pm、151 Pm、153 Sm、159 Gd、172 Tm、90 Y、111 In、169 Yb、175 Yb、177 Lu、105 Rh、111 Ag、125 I、123 I、213 Bi、225 Ac、129 I、64 Cu及177m Sn。放射性核種金屬更佳係選自包含以下金屬之群：186 Re、188 Re、90 Y、153 Sm、68 Ga及177 Lu。
在第一態樣之其他替代中，適當之放射性核種金屬為放射性鹵素(碘及溴同位素)，該放射性鹵素直接與胜肽鍵結，諸如藉由化學反應鍵結至胜肽內之Tyr或Trp部分或視情況A 可為Tyr或Trp。
較佳之放射性診斷劑(67 Ga、111 In)及放射性治療劑(90 Y、153 Sm、177 Lu)視情況含有經螯合之+3金屬離子，該離子係來自稱為鑭系元素之元素類別。此類別中之典型放射性金屬包括同位素90 釔、111 銦、149 鉕、153 釤、166 鏑、166 鈥、175 鐿及177 鑥。所有此等金屬(及鑭系元素中之其他者)具有極其類似之化學性質，因為其保持在+3氧化態且偏好螯合至帶有硬(氧/氮)供體原子之配位體。
描述B (間隔基)：
B為連接至C 之N-末端之間隔基或一共價鍵。
在本發明之一較佳實施例中，B 為具有式(II)之化合物：
II　B1 -B2
其中B1 為一共價鍵、天然胺基酸、非天然胺基酸、直鏈二胺或環二胺，B2 為一共價鍵、天然胺基酸、非天然胺基酸、直鏈羧酸或環狀羧酸，其限制條件為B1 及B2 不可同時為共價鍵且當B1 為二胺時，B2 為羧酸(亦即在此情況下，B2 不可為一鍵或天然或非天然胺基酸)。
非天然胺基酸較佳為具有式(III)、(IV)、(V)或(VI)中任一者之化合物
其中
其中a為0至3之整數，b為0至3之整數，且相對取代模式視情況為1,2-、1,3-或1,4-。
較佳地，a為0或1，b為0或1，
其中c為1至24之整數，d為1至6之整數。
較佳地，c為1至15之整數，c更佳為1至8，d為1至3之整數，d更佳為1。
其中E'為NH或CH2 ，f為0至6之整數，g為0至6之整數；當E'為CH2 時，則6員環視情況在6員環之任何碳位置處在該環之同一碳上或不同碳上經取代，當E' 為NH時，則6員環視情況在6員環之任何碳位置處在該環之同一碳原子上或不同碳原子上及/或氮原子上經取代，其限制條件為f或g為等於或大於1之整數。
較佳地，E'為NH，f為0至3之整數，g為0至3之整數；
其中i為1至6之整數，j為1至6之整數，P為O或H2 。
較佳地，i為1至3之整數，j為1至3之整數，P為O。
間隔基更佳係選自包含以下各物之群：4-胺基-1-羧甲基哌啶、(R,S)-二胺基乙酸、PEG1-24 、Sar5-10 、8-胺基辛酸、6-胺基己酸、4-(2胺基乙基)-1-羧甲基哌嗪、二胺基丁酸、馬尿酸、4-胺基-1-Boc-哌啶-4-羧酸、Gly-胺基苯甲酸、5-胺基-3-氧雜-戊基-琥珀醯胺酸、Peg1-24 -4-胺基-1-羧甲基哌啶、Dab(莽草酸)、(D-Gln)x、(D-Asn)x。
描述C (鈴蟾素類似物胜肽拮抗劑序列)
在本發明之一較佳實施例中，鈴蟾素類似物胜肽拮抗劑序列係選自包含以下各序列之群：C-1至C-3，較佳C-1至C-2。
鈴蟾素類似物胜肽拮抗劑序列較佳係選自包含以下各者之群：化合物1序列：D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2 ；化合物9序列：D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-LeuΨ(CHOH-CH2 )-(CH2 )2 -CH3 ；化合物12序列：D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-LeuΨ(CH2 NH)-Phe-NH2 ；化合物13序列：Dphe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-LeuΨ(CH2 NH)-Cys-NH2 。
包含至少一種放射性核種金屬之具有式(I)的鈴蟾素類似物胜肽拮抗劑共軛物較佳係選自包含以下各物之群：化合物1：DOTA-Gly-胺基苯甲醯基-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2 ；化合物2：DOTA-4-胺基-1-羧甲基-哌啶-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2 ；化合物3：DOTA-4-胺基-1-哌啶-4-羧酸-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2 ；化合物4：DOTA-15-胺基-4,7,10,13-四氧雜十五烷酸-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2 ；化合物5：DOTA-(15-胺基-4,7,10,13-四氧雜十五烷酸)-(4-胺基-1-羧甲基-哌啶)-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2 ；化合物6：DOTA-二胺基丁酸-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2 ；化合物7：DOTA-4-(2-胺基乙基)-1-羧甲基-哌嗪-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2 ；化合物8：DOTA-(5-胺基-3-氧雜-戊基)-琥珀醯胺酸-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2 ；化合物9：DOTA-4-胺基-1-羧甲基-哌啶-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-LeuΨ(CHOH-CH2 )-(CH2 )2 -CH3 ；化合物10:DOTA-(15-胺基-4,7,10,13-四氧雜十五烷酸-4-胺基-1-羧甲基-哌啶-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-LeuΨ(CHOH-CH2 )-(CH2 )2 -CH3 ；化合物11:DOTA-15-胺基-4,7,10，13-四氧雜十五烷酸-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-HiS-LeuΨ(CHoH-CH2 )-(CH2 )2 -CH3 ；化合物12:DOTA-4-胺基-1-羧甲基-哌啶-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-LeuΨ(CH2 N H)-Phe-NH2 ；化合物13:DOTA-4-胺基-1-羧甲基-哌啶-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-LeuΨ(CH2 N H)-Cys-NH2 ；化合物14:N4 -三唑-dPEG1 -D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-HiS-Sta-Leu-NH2 。
其他較佳實施例：
在本發明之一較佳實施例中，對於具有式(I)之化合物，X為1至2之整數，x較佳為1。
當x等於或大於2時，則(B)n 為連接至鈴蟾素類似物胜肽拮抗劑(C)之N-末端的直鏈間隔基或支鏈間隔基。
在本發明之一較佳實施例中，對於具有式(I)之化合物，n為1至4之整數，n較佳為1或3，更佳為1。
在本發明之一較佳實施例中，對於具有式(I)之化合物，A另外為包含至少一種對應於或相當於以上所列放射性核種金屬之冷金屬原子的金屬螯合劑。該等化合物適用於活體外活體內結合檢定且係用作參考化合物。以上所列較佳實施例在本文中得以應用。
在本發明之一較佳實施例中，對於具有式(I)之化合物，K另外為H或較佳為H。
在第二態樣中，本發明係關於選擇性結合至鈴蟾素受體，且其更特定言之結合至GRP受體之鈴蟾素類似物胜肽拮抗劑共軛物前驅體，當在此兩種系統中拮抗促效劑誘發之作用時，不觸發進入細胞之內在化且不經由鈣動員發送信號，其中該鈴蟾素類似物胜肽拮抗劑共軛物具有通式(I')
(I')　[A'-(B) n ] x -C
其中x為1至3之整數，n為1至6之整數；A' 為金屬螯合劑，B 為連接至C 之N-末端之間隔基或一共價鍵，C 為序列C-1至C-4之鈴蟾素類似物胜肽拮抗劑。
金屬螯合劑A'為 不含如第一態樣中對於A 所定義之放射性核種金屬的金屬螯合劑。
間隔基B 及鈴蟾素類似物胜肽拮抗劑C 係如上文第一態樣中所定義。
本發明進一步係關於此等鈴蟾素類似物胜肽拮抗劑共軛物之無機酸或有機酸的醫藥學上可接受之鹽，且係關於具有通用化學式(I')之此等化合物的水合物、錯合物、酯、醯胺、溶劑合物及前藥。
在本發明之一較佳實施例中，x為1至2之整數，x較佳為1。當x等於或大於2時，則(B)n 為連接至鈴蟾素類似物胜肽拮抗劑(C)之N-末端的直鏈間隔基或支鏈間隔基。
在本發明之一較佳實施例中，式(I')中，n為1至4之整數，n較佳為1或3，更佳為1。
在第三態樣中，本發明係關於一種醫藥組合物，其包含具有式(I)或(I')之鈴蟾素類似物胜肽拮抗劑共軛物及醫藥學上可接受之載劑。
在第四態樣中，本發明係關於具有式(I)或(I')之鈴蟾素類似物胜肽拮抗劑共軛物的用途，其係用於結合至鈴蟾素受體，且更特定言之胃泌素釋放胜肽受體(GRP)，及/或用於抑制鈴蟾素受體，且更特定言之胃泌素釋放胜肽受體(GRP)。
在第五態樣中，本發明係關於一種製備具有通式(I)之鈴蟾素類似物胜肽拮抗劑共軛物的方法
(I)　[A-(B) n ] x - C
其中n、x、A 、B 及C 係如上所定義，其包含以下步驟：
-將具有如上所定義之通式(I')之鈴蟾素類似物胜肽拮抗劑共軛物與適當放射性核種金屬或對應於上列放射性核種金屬之金屬原子放射性螯合。
製備具有通式(I)之鈴蟾素類似物胜肽拮抗劑共軛物的方法較佳包含與適當放射性核種金屬放射性螯合之步驟。
在另一實施例中，製備具有通式(I)之鈴蟾素類似物胜肽拮抗劑共軛物的方法
(II)　[A-(B) n ] x -C
其中n、X、A 、A' 、B 及C 係如上所定義，另外包含以下步驟：
a)使間隔基B 與鈴蟾素類似物胜肽拮抗劑C 偶合以獲得序列C-1至C-4之間隔基-鈴蟾素類似物胜肽拮抗劑，視情況重複步驟a)；及
b)使間隔基-鈴蟾素類似物胜肽拮抗劑與金屬螯合劑A' 偶合以獲得具有通式(I')之鈴蟾素類似物胜肽拮抗劑共軛物，視情況重複步驟b)，上述步驟在具有通式(I')之鈴蟾素類似物胜肽拮抗劑共軛物與適當放射性核種金屬或對應於或相當於上列放射性核種金屬之金屬原子的放射性螯合之前進行。
在本發明之一較佳實施例中，n、x、金屬螯合劑A 、金屬螯合劑A' 、間隔基B 及鈴蟾素類似物胜肽拮抗劑C 係如上所定義。
在第六態樣中，本發明係關於一種使患者體內表現腫瘤細胞及/或腫瘤及腫瘤周圍血管之鈴蟾素受體(且更特定言之GRP受體)成像之方法，其包含以下步驟：
-將放射性醫藥有效量的具有式(I)之鈴蟾素類似物胜肽拮抗劑共軛物投與患者；及
-使患者體內之放射性核種金屬成像。
第六態樣之一較佳實施例係關於使用放射性醫藥有效量的具有式(I)之鈴蟾素類似物胜肽拮抗劑共軛物的用途，其係用於製造用於使表現腫瘤細胞及/或腫瘤及腫瘤周圍血管的鈴蟾素受體(且更特定言之GRP受體)成像之成像劑。
在一較佳實施例中，腫瘤細胞係指選自包含以下各者之群之癌：
-前列腺癌，包括癌轉移，
-乳癌，包括癌轉移，
-胃腸基質腫瘤，
-小細胞肺癌，
-腎細胞癌，
-胃腸胰神經內分泌腫瘤，
-頭部及頸部鱗狀細胞癌，
-神經母細胞瘤，及
-食道鱗狀細胞癌。
腫瘤細胞甚至更佳係指選自以下各者之癌：
-前列腺癌，包括癌轉移，及
-乳癌，包括癌轉移。
在另一較佳實施例中，腫瘤及腫瘤周圍血管係指選自以下各者之癌：
-卵巢癌，
-子宮內膜癌，及
-胰腺癌。
腫瘤及腫瘤周圍血管較佳係指卵巢癌。
在第七態樣中，本發明係關於一種用於治療或預防腫瘤細胞及/或腫瘤及腫瘤周圍血管相關之疾病的方法，其包含以下步驟：
-投與治療有效量的具有式(I)之鈴蟾素類似物胜肽拮抗劑共軛物。
第七態樣之一較佳實施例係關於治療有效量的具有式(I)之鈴蟾素類似物胜肽拮抗劑共軛物之用途，其係供製造用於治療或預防腫瘤細胞及/或腫瘤及腫瘤周圍血管相關之疾病的藥物。
在一較佳實施例中，腫瘤細胞相關之疾病係指選自包含以下各者之群之癌：
-前列腺癌，包括癌轉移，
-乳癌，包括癌轉移，
-胃腸基質腫瘤，
-小細胞肺癌，
-腎細胞癌，
-胃腸胰神經內分泌腫瘤，
-頭部及頸部鱗狀細胞癌，
-神經母細胞瘤，及
-食道鱗狀細胞癌。
腫瘤細胞相關之疾病甚至更佳係指選自包含以下各者之群之癌：
-前列腺癌，包括癌轉移，及
-乳癌，包括癌轉移。
在另一較佳實施例中，腫瘤及腫瘤周圍血管相關之疾病係指選自包含以下各者之群之癌：
-卵巢癌，
-子宮內膜癌，及
-胰腺癌。
腫瘤及腫瘤周圍血管相關之疾病較佳係指卵巢癌。
在第八態樣中，本發明係關於一種用於製備具有式(I)之放射性治療劑或放射性醫藥成像劑的套組，該套組包含一含有預定量的式(I')之鈴蟾素類似物胜肽拮抗劑共軛物及在放射性標記金屬螯合劑時可接受之載劑、稀釋劑、賦形劑或佐劑的瓶。
在第九態樣中，本發明係關於序列C-1至C-4之鈴蟾素類似物胜胅拮抗劑，其中C-1: Xaa1 6 -Gln7 -Trp8 -Ala9 -Val10 -Xaa2 11 -His12 -Xaa3 13 -Xaa4 14 -ZH，其中Xaa1 為D-Phe、D-Cpa、D-Tyr、D-Trp或具有以下所述之式之任一者之殘基：
K為F、Cl、I或NO2 ，Xaa2 為Gly或β-Ala，Xaa3 為抑制素、抑制素類似物及異構體、4-Am,5-MeHpA、4-Am,5-MeHxA或α-取代胺基酸，Xaa4 為Leu、Cpa、Cba、CpnA、Cha、t-buGly、tBuAla、Met、Nle或異-Bu-Gly，且Z為NH或O；C-2: Xaa1 6 -Gln7 -Trp8 -Ala9 -Val10 -Xaa2 11 -His12 -LeuΨ(CHOH-CH2 )-(CH2 )2 -CH3 ，其中LeuΨ(CHOH-CH2 )-(CH2 )2 -CH3 為
Xaa1 為D-Phe、D-Cpa、D-Tyr、D-Trp或具有以下所述之式之任一者之殘基：
且K為F、Cl、I或NO2 ，Xaa2 為Gly或 β-Ala；C-3:Xaa1 6 -Gln7 -Trp8 -Ala9 -Val10 -Xaa2 11 -His12 -Xaa5 13 -Xaa6 14 -ZH，其中Xaa1 為D-Phe、D-Cpa、D-Tyr、D-Trp或具有以下所述之式之任一者之殘基：
K為F、Cl、I或NO2 ，Xaa2 為Gly或β-Ala，Xaa5 為LeuΨ-CH2 NH-，Xaa6 為Cys、Phe、Trp、Tpi或Tac，其中Tpi及Tac具有以下含義：
且Z為NH或O；C-4: Xaa1 6 -Gln7 -Trp8 -Ala9 -Val10 -Xaa2 11 -His12 -Xaa7 ，其中Xaa1 為D-Phe、D-Cpa、D-Tyr、D-Trp或具有以下所述之式之任一者之殘基：
K為F、Cl、I或NO2 ，Xaa2 為Gly或β-Ala，Xaa7 為Leu-O-烷基或Leu-NH-烷基。
定義
如下文本發明之描述中及申請專利範圍中所使用，術語「烷基」單獨或作為另一基團之部分時係指具有1至20個碳原子之直鏈或支鏈烷基，諸如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、第三丁基、戊基、異戊基、新戊基、庚基、己基、癸基。烷基亦可經諸如鹵素原子、羥基、C1 -C4 烷氧基或C6 -C12 芳基取代。烷基更佳為C1 -C10 烷基、C1 -C6 烷基或C1 -C4 烷基。
如下文本發明之描述中及申請專利範圍中所使用，術語「低碳非支鏈或支鏈烷基(alkyl(en))」應具有以下含義：由碳及氫組成之經取代或未經取代，直鏈或支鏈單價、二價或三價基團，其不含有不飽和度且具有1至8個碳原子，例如(但不限於)甲基、乙基、正丙基、正戊基、1,1-二甲基乙基(第三丁基)、正庚基及其類似者。此部分可未經取代或經諸如鹵素原子、羥基原子、C1 -C4 烷氧基或C6 -C12 芳基取代。
如下文本發明之描述中及申請專利範圍中所使用，術語「伸苯基」係基於二取代苯環或視情況三取代苯環。舉例而言，聚(對伸苯基)為由對伸苯基重複單元構造之聚合物。伸苯基可經取代或未經取代。其可經鹵素、OH、烷氧基，較佳C1 -C4 烷氧基、羧基、酯，較佳C1 -C4 -酯、醯胺、硝基取代。
如下文本發明之描述中及申請專利範圍中所使用，術語「烯烴」應具有以下含義：含有至少一個碳碳雙鍵之不飽和脂肪族或脂環族化合物。最簡單之非環狀烯烴，僅具有一個雙鍵且無其他官能基，形成具有通式Cn H2n 之烴同系物，例如，乙烯(C2 H4 )、丙烯(C3 H6 )。烯烴可經取代或未經取代。若烯烴經取代，其可經鹵素原子、羥基、C1 -C4 烷氧基、C6 -C12 芳基或其類似者取代。
如下文本發明之描述中及申請專利範圍中所使用，術語「芳基」應具有不飽和環系統，較佳芳環系統，更佳在環骨架中具有6至12個碳原子之含義。其實例為苯基及萘基。芳基部分可未經取代或經諸如鹵素原子、羥基、C1 -C4 烷氧基或C6 -C12 芳基取代。
如下文本發明之描述中及申請專利範圍中所使用，術語「苯」應具有以下含義：具有式C6 H6 之有機化合物。苯為芳族烴及第二[n ]-輪烯([6]-輪烯)，具有連續π鍵的環烴。苯可未經取代或經諸如鹵素原子、羥基、C1 -C4 烷氧基或C6 -C12 芳基取代。
如下文本發明之描述中及申請專利範圍中所使用，術語「烯基」及「炔基」類似地如對於烷基所定義，但分別含有至少一個碳-碳雙鍵或參鍵。烯基更佳可為C2 -C6 烯基且炔基更佳可為C2 -C6 -炔基。
如下文本發明之描述中及申請專利範圍中所使用，術語「鹵素」應具有F、Cl、Br或I之含義。
如下文本發明之描述中及申請專利範圍中所使用，術語「無機酸或有機酸之鹽」、「無機酸」及「有機酸」係指無機酸，包括(但不限於)諸如：碳酸、硝酸、磷酸、鹽酸、過氯酸或硫酸之酸或其酸式鹽，諸如鉀、鈉、鈣、鎂鹽，例如硫酸氫鉀，或係指合適之有機酸，其包括(但不限於)：諸如脂肪酸、環脂肪酸、芳族酸、芳脂族酸、雜環酸、羧酸及磺酸之酸，其實例分別為甲酸、乙酸、三氟乙酸、丙酸、丁二酸、乙醇酸、葡萄糖酸、乳酸、蘋果酸、反丁烯二酸、丙酮酸、苯甲酸、鄰胺基苯甲酸、甲磺酸、反丁烯二酸、水楊酸、苯乙酸、扁桃酸、恩波酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、泛酸(phantothenic)、甲苯磺酸、三氟甲磺酸及對胺基苯磺酸。同樣，有機酸亦可以如下其鹽形式存在：諸如鉀、鈉、鈣、鎂鹽。
如下文本發明之描述中及申請專利範圍中所使用，術語「醫藥學上可接受之鹽」係指無機酸及有機酸之鹽，諸如無機酸，包括(但不限於)諸如碳酸、硝酸或硫酸之酸；或有機酸，包括(但不限於)諸如脂族酸、環脂族酸、芳族酸、芳脂族酸、雜環酸、羧酸及磺酸之酸，其實例為甲酸、乙酸、三氟乙酸、丙酸、丁二酸、乙醇酸、葡萄糖酸、乳酸、蘋果酸、反丁烯二酸、丙酮酸、苯甲酸、鄰胺基苯甲酸、甲磺酸、水楊酸、苯基乙酸、扁桃酸、恩波酸、甲烷磺酸、乙烷磺酸、苯磺酸、泛酸、甲苯磺酸及對胺基苯磺酸。
如下文本發明之描述中及申請專利範圍中所使用，術語「前藥」意謂任何共價鍵結之化合物，其釋放式(I)之活性母體藥物。
如此申請案通篇所使用之術語「前藥」亦包含藥理學上可接受之衍生物，諸如酯、醯胺及磷酸酯，以便該衍生物之所得活體內生物轉化產物為如式(I)中所定義之活性藥物。Goodman及Gilman(The Pharmacological Basis of Therapeutics ，第8版，McGraw-HiM,Int. Ed. 1992,「Biotransformation of Drugs 」,13-15)之參考案描述前藥，其揭示內容以引用之方式併入本文中。本發明之化合物的前藥係藉由以如下方式修飾存在於該化合物中之官能基來製備：以常規操作或活體內裂解該等修飾物從而得到母體化合物。本發明之化合物的前藥包括其中例如羥基(諸如不對稱碳原子上之羥基)或胺基與任何基團鍵結之彼等化合物，當將前藥投予患者時，該基圍裂解以分別形成游離羥基或游離胺基。
前藥之典型實例係於(例如)WO 99/33795、WO 99/33815 A、WO 99/33793 A及WO 99/33792 A中描述，該等文獻之揭示內容均以引用之方式全文併入本文中。
前藥之特徵為水溶性極佳、生物可用性提高且在活體內容易代謝成活性抑制劑。
如下文本發明之描述中及申請專利範圍中所使用，術語「胺基酸序列」及「胜肽」在本文中係定義為可藉由至少兩個胺基酸之(聚)縮合反應獲得之聚醯胺。
如下文本發明之描述中及申請專利範圍中所使用，術語「胺基酸」意謂包含至少一個胺基及至少一個羧基，但在分子內無肽鍵之任何分子。換言之，胺基酸為具有羧酸官能基及較佳在其α位具有至少一個游離氫之胺氮，但在分子結構內無醯胺鍵之分子。因此，並不將在N末端具有游離胺基及在C末端具有游離羧基之二胜肽視作上文所定義中之單一「胺基酸」。自該縮合反應獲得之介於兩個相鄰胺基酸殘基之間的醯胺鍵係定義為「肽鍵」。
如本文中所使用之醯胺鍵意謂具有以下結構之任何共價鍵
-C(=O)-NH-CH-或-HC-HN-(O=)C-
其中羰基係由一個分子提供且NH-基團係由欲連接之其他分子提供。自該聚縮合反應獲得之介於兩個相鄰胺基酸殘基之間的醯胺鍵係定義為「肽鍵」。視情況，聚醯胺主鏈之氮原子(上文表示為NH)可獨立地(例如)經-C1 -C6 烷基，較佳經-CH3 烷基化。
如下文本發明之描述中及申請專利範圍中所使用，胺基酸殘基係藉由與另一胺基酸形成肽鍵而自相應胺基酸獲得。
如下文本發明之描述中及申請專利範圍中所使用，胺基酸為天然存在之胺基酸或非天然胺基酸，其中非天然胺基酸為合成/人造胺基酸殘基、蛋白型及/或非蛋白型胺基酸殘基。該等非蛋白型胺基酸殘基可進一步分類為(a)蛋白型胺基酸之高類似物，(b)蛋白型胺基酸殘基之β-高類似物及(c)其他非蛋白型胺基酸殘基。
因此，胺基酸殘基係自相應胺基酸衍生，例如，自蛋白型胺基酸，即Ala、Arg、Asn、Asp、CyS、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr及Val；或非蛋白型胺基酸，諸如蛋白型胺基酸之高類似物，其中側鏈已由亞甲基延伸，例如，高丙胺酸(Hal)、高精胺酸(Har)、高半胱胺酸(Hcy)、高麩醯胺酸(Hgl)、高組胺酸(Hhi)、高異白胺酸(Hil)、高白胺酸(Hle)、高離胺酸(Hly)、高甲硫胺酸(Hme)、高苯丙胺酸(Hph)、高脯胺酸(Hpr)、高絲胺酸(Hse)、高蘇胺酸(Hth)、高色胺酸(Htr)、高酪胺酸(Hty)及高纈胺酸(Hva)；蛋白型胺基酸之β-高類似物，其中已將亞甲基插入α-碳與羧基之間，得到β-胺基酸，例如，β-高丙胺酸(βHal)、β-高精胺酸(βHar)、β-高天冬醯胺酸(βHas)、β-高半胱胺酸(βHcy)、β-高麩醯胺酸(βHgl)、β-高組胺酸(βHhi)、β-高異白胺酸(βHil)、β-高白胺酸(βHle)、β-高離胺酸(βHly)、β-高甲硫胺酸(βHme)、β-高苯丙胺酸(βHph)、β-高脯胺酸(βHpr)、β-高絲胺酸(βHse)、β-高蘇胺酸(βHth)、β-高色胺酸(βHtr)、β-高酪胺酸(βHty)及β-高纈胺酸(βHva)；其他非蛋白型胺基酸，例如，α-胺基己二酸(Aad)、β-胺基己二酸(βAad)、α-胺基丁酸(Abu)、α-胺基異丁酸(Aib)、β丙胺酸(βAla)、4-胺基丁酸(4-Abu)、5-胺基戊酸(5-Ava)、6-胺基己酸(6-Ahx)、8-胺基辛酸(8-Aoc)、9-胺基壬酸(9-Anc)、10-胺基癸酸(10-Adc)、12-胺基十二烷酸(12-Ado)、α-胺基辛二酸(Asu)、吖丁啶-2-羧酸(Aze)、β-環己基丙胺酸(Cha)、瓜胺酸(Cit)、脫氫丙胺酸(Dha)、γ-羧基麩胺酸(Gla)、α-環己基甘胺酸(Chg)、炔丙基甘胺酸(Pra)、焦麩胺酸(Glp)、α-第三丁基甘胺酸(Tle)、4-苯甲醯基苯丙胺酸(Bpa)、δ-羥基離胺酸(Hyl)、4-羥基脯胺酸(Hyp)、別異白胺酸(aIle)、羊毛硫胺酸(Lan)、(1-萘基)丙胺酸(1-Nal)、(2-萘基)丙胺酸(2-Nal)、正白胺酸(Nle)、正纈胺酸(Nva)、鳥胺酸(Orn)、苯基甘胺酸(Phg)、哌啶酸(pipecolic acid，Pip)、肌胺酸(Sar)、硒代半胱胺酸(Sec)、抑制素(Sta)、β-噻吩基丙胺酸(Thi)、1,2,3,4-四氫異喹啉-3-羧酸(Tic)、別蘇胺酸(aThr)、噻唑烷-4-羧酸(Thz)、γ-胺基丁酸(GABA)、異半胱胺酸(異-CyS)、二胺基丙酸(Dpr)、2,4-二胺基丁酸(Dab)、3,4-二胺基丁酸(γβDab)、二苯丙胺酸(Bip)、對位經-C1 -C6 烷基、-鹵化物、-NH2 、-CO2 H或Phe(4-R)取代之苯丙胺酸(其中R=-C1 -C6 烷基、-鹵化物、-NH2 或-CO2 H)；胜肽核酸(PNA,cf ，P.E.NielSen,Acc. Chem. Res .,32,624-30)；或其N-烷基化類似物，諸如其N-甲基化類似物。
環狀胺基酸可為蛋白型或非蛋白型，諸如Pro、Aze、Glp、Hyp、Pip、Tic及Thz。
對於其他實例及細節而言，可參考(例如)J.H. Jones,J .Peptide Sci .,2003,9,1-8，該文獻之揭示內容全文以引用的方式併入本文中。
如下文本發明之描述中及申請專利範圍中所使用，術語「非蛋白型胺基酸」及「非蛋白型胺基酸殘基」亦包括蛋白型胺基酸之衍生物。舉例而言，蛋白型胺基酸殘基之側鏈可經衍生化，藉此使該蛋白型胺基酸殘基變成「非蛋白型」。上述情況亦適用於終止胺基酸序列之蛋白型胺基酸殘基之C末端及/或N末端的衍生物。
如下文本發明之描述中及申請專利範圍中所使用，蛋白型胺基酸殘基係源自選自由以下胺基酸組成之群的蛋白型胺基酸：呈L-構型或D-構型之Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、ser、Thr、Trp、Tyr及Val；Thr及Ile中之第二對掌中心可具有R-構型或S-構型。因此，舉例而言，可能天然產生之胺基酸序列之任何轉譯後修飾(諸如N-烷基化作用)使相應經修飾之胺基酸殘基變成「非蛋白型」，但實質上該胺基酸殘基係併入蛋白質中。較佳地，經修飾之胺基酸係選自N-烷基化之胺基酸、β-胺基酸、γ-胺基酸、羊毛硫胺酸、脫氫胺基酸及具有烷基化胍部分之胺基酸。
如下文本發明之描述中及申請專利範圍中所使用，術語「羧酸」或「二羧酸」意謂分別具有一個COOH部分或兩個COOH部分之有機化合物，例如，分別為甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、環己烷羧酸、苯甲酸、水楊酸、乳酸(羧酸)或草酸、丙二酸、丁二酸、己二酸、反丁烯二酸、順丁烯二酸、蘋果酸、鄰苯二甲酸(二羧酸)。
如下文本發明之描述中及申請專利範圍中所使用，術語「二胺」意謂具有兩個NR'R"部分之有機化合物，其中R'及R"可相互獨立地為烷基、烯基、炔基、芳基。二胺可例如為乙二胺、1,4-環己烷二胺、哌嗪。
就上文中所指之胺基酸、羧酸、二羧酸或二胺而言，當該等胺基酸、羧酸、二羧酸或二胺分別包含於本發明之化合物中時，此亦特別包括所獲得之個別基團，亦即，例如，-HN-...-CO-(胺基酸)、-OC-...(羧酸)、-OC-...-CO-(二羧酸)、-HN-...-NH-(二胺)。
如下文本發明之描述中及申請專利範圍中所使用，術語「金屬螯合劑」係定義為與放射性核種金屬錯合以形成在生理條件下穩定之金屬錯合物的分子，且其亦可經由間隔基與靶向基團共軛。金屬螯合劑與金屬放射性核種錯合或不錯合。
如下文本發明之描述中及申請專利範圍中所使用，措詞「放射性核種金屬」係定義為具有不穩定核之原子的放射性核種，該核之特徵在於將可利用之過量能量賦予核中新產生之放射性粒子或者賦予原子中之電子(參見內轉化)。本文所使用之放射性核種金屬尤其適用於診斷或治療用途，更佳適用於成像或放射性療法。在此過程中，放射性核種經受放射性衰變，且發出(a)γ射線及/或次原子粒子。此等粒子構成游離輻射。放射性核種可天然存在，但亦可人工製造。
此等放射性核種金屬包括(但不限於)鎵(例如67 Ga、68 Ga)；銅(例如67 Cu及64 Cu)；鍀(例如99m Tc及94m Tc)；錸(例如186 Re及188 Re)；鉛(例如212 Pb)；鉍(例如212 Bi)；及鈀(例如109 Pd)。製備此等同位素之方法已知。用於生成99m Tc之鉬/鍀產生器為市售的。生成186 Re之程序包括由Deutsch等人，(Nucl. Med. Biol. ，第13卷：4:465-477,1986)及Vanderheyden等人(Inorganic Chemistry ，第24卷：1666-1673,1985)描述之程序，且生成188 Re之方法已由Blachot等人(Intl. J. ofApplied Radiation and Isotopes ，第20卷：467-470,1969)及由Klofutar等人(J. of Radioanalytical Chem ，第5卷：3-10，1970)描述。212 Pd之生成係在Fawwaz等人，J. Nucl. Med ,(1984)，25:796中描述。212 Pb及21 Bi之生成係在Gansow等人，Amer. Chem. Soc. Symp,Ser. (1984)，241:215-217及Kozah等人，Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA ,(1986年1月)，83:474-478中描述。99m Tc較佳係用於診斷用途，且上列之其他放射性核種具有治療用途。
如下文本發明之描述中及申請專利範圍中所使用，術語「間隔基」係定義為金屬螯合劑與鈴蟾素胜肽拮抗劑之間的連接基。
如下文本發明之描述中及申請專利範圍中所使用，措詞「促效劑」意謂結合至細胞之受體分子處的特異性位點且因此啟動細胞中之信號轉導之物質(配位體)。此造成可測量之效應。
如下文本發明之描述中及申請專利範圍中所使用，措詞「拮抗劑」意謂結合至受體細胞上對促效劑物質有特異性之位點因此將此位點與促效劑阻斷而無激活作用的物質(配位體)。因此拮抗劑抑制促效劑之作用。
如下文本發明之描述中及申請專利範圍中所使用，術語「抑制素類似物」係定義為具有以下通用結構之二胜肽模擬物
抑制素 R2=OH，R1可顯著變化但通常與胺基酸側鏈相同
抑制素類似物 R2=H，R1可顯著變化但通常與胺基酸側鏈相同
縮寫：
NODASA=1,4,7-三氮雜環壬烷-1-丁二酸-4,7-二乙酸
NODAGA=1,4,7-三氮雜環壬烷-N-戊二酸-N',N''-二乙酸
TRITA=1,4,7,10四氮雜環十三烷-1,4,7,10 N,N',N",N'''-四乙酸
Cpa=(S )-4-甲醯胺基苯丙胺酸
4-Am-5-MeHpA=4-胺基-5-甲基庚酸
4-Am-5-MeHxA=4-胺基-5-甲基己酸
DFO=N'-[5-(乙醯基-羥基-胺基)戊基]-N-[5-[3-(5-胺基戊基-羥基-胺甲醯基)丙醯基胺基]戊基]-N-羥基-丁二醯胺
三醯胺單硫醇(MAG3)　雙胺雙硫醇(BAT)
NODAGA
無需進一步詳細描述，咸信熟習此項技術者可使用上文描述最大程度地利用本發明。因此，以下較佳特定實施例應僅視作說明性的，而不以任何方式限制本揭示案之其餘部分。
本文所引用之所有申請案、專利及公開案之整個揭示內容係以引用的方式全部併入本文中。
藉由用本發明所一般或特定描述之反應物及/或操作條件替換先前實例中所用之彼等者可同樣成功地重複以下實例。
根據上文描述，熟習此項技術者可易於確定本發明之基本特徵且在不悖離本發明之精神及範疇之情況下可對本發明作出各種變化及修改以使其適合於各種用途及條件。
實例
當對於以下所揭示之所有實例合適時，A不僅具有A之含義，亦具有A'之含義。
實例1(A-B-C)
當對於以下所揭示之所有實例合適時，A不僅具有A之含義，亦具有A'之含義。
a)合成具有通用序列之鈴蟾素胜肽拮抗劑共軛物
(A =DOTA，B =間隔基B 1 - B 2 ，C=具有N-末端醯胺Z之胜肽[Z =NH])
DOTA-間隔基-Xaa1 6 -Gln7 -Trp8 -Ala9 -Val10 -Xaa2 11 -His12 -Sta13 -Leu14 -NH2
使用Fmoc策略在固體相上手動合成胜肽。為獲得N -末端醯胺，使用Rink醯胺MBHA樹脂LL(100-200目)(4-(2',4'-二甲氧基苯基-Fmoc-胺基甲基)-苯氧基乙醯胺基-降白胺醯基-4-甲基二苯甲基胺樹脂)。一般而言，將具有理論負載為0.34mmole/g樹脂之Rink醯胺MBHA樹脂供應於反應器中。將N,N-二甲基甲醯胺(DMF)添加至反應器中且震盪30分鐘以使樹脂膨脹。移除溶劑後，添加20%哌啶於DMF中之溶液，且將樹脂震盪15分鐘以移除9-茀基甲氧基羰基(Fmoc)保護基。將此步驟重複兩次。此程序之後，用DMF將樹脂洗滌3次歷時5min。收集最後3次洗滌之哌啶溶液及DMF溶液且填充乙醇至100mL。自此溶液得到等分試樣以便用分光光度法測啶所移除之Fmoc-保護基之量。
在與Fmoc-胺基酸衍生物偶合之前，用DMF將樹脂洗滌兩次歷時2min。將用2當量N,N-二異丙基碳化二亞胺(DIC)/N-羥基苯并三唑(HOBt)預活化之2當量Fmoc-胺基酸添加至樹脂中且藉由添加約4當量N-乙基二異丙胺(DIPEA)將pH值調節至8-9。在平緩震盪下將反應培育2h。反應後，移除溶液且用DMF將固相洗滌兩次歷時5min。藉由凱撒測試(Kaiser-test)監測反應。將特定量之樹脂珠粒用乙醇洗滌3次，添加50μL溶液1(將20g苯酚於10mL乙醇中之溶液與1mL0.01M KCN於49mL吡啶中之溶液混合)及50μL溶液2(500g茚三酮於10mL乙醇中)且將珠粒在95℃下加熱10min。藍色珠粒指示未偶合之游離胺基官能基。
所有胺基酸皆以N -末端Fmoc-保護之衍生物形式使用，且將其以類似方式偶合。將色胺酸以在側鏈上之第三丁氧羰基(Boc)保護基形式使用，而組胺酸及麩醯胺酸係經Trt保護。若在各胺基酸之偶合後進行凱撒測試，表明胺基官能基之偶合不完全，則重複偶合。
在構建整個確定之胜肽序列之後，將樹脂用DCM洗滌5次，隨後用乙醚洗滌5次，每次歷時2分鐘且在真空下乾燥。
b)與間隔基及前螯合劑(prochelator)DOTA( t Bu)3 偶合
前螯合劑DOTA( t Bu)3 係購自Macrocyclics Inc.,Dallas,USA。在與間隔基偶合前，將N -末端Fmoc-保護自結合胜肽之樹脂移除。使樹脂在DMF中膨脹15min，以DMF中之20%哌啶溶液處理兩次(15min)，且用DMF洗滌三次。收集來自哌啶處理及隨後之DMF洗滌液中之溶液以測定裂解之Fmoc基團之量。
將用六氟磷酸2-(1H-9-氮雜苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基-銨(HATU)在DMF中預活化20min之2當量間隔基添加至樹脂中。藉由添加DIPEA將pH值調節至8-9。將反應混合物震盪2h且藉由凱撒測試監測偶合。如前所述移除Fmoc之後以相同方式使前螯合劑DOTA( t Bu)3 偶合。將DOTA( t Bu)3 偶合震盪隔夜。移除溶液後，將樹脂用DMF洗滌3次，用DCM洗滌5次，隨後用乙醚洗滌5次，每次2分鐘，且在真空下乾燥。
c)去保護，裂解及純化
將胜肽-樹脂放入裝備有玻璃料之注射器中。添加三氟乙酸(TFA)/硫代苯甲醚(TA)/三異丙基矽烷(TIS)/H2 O(94/2/2/1)之溶液且將注射器攪拌2h。在冰上將該溶液添加至50%二異丙醚與50%乙醚之混合物中以使胜肽沈澱。藉由在3000rpm下離心5min收集胜肽且傾析上清液。用乙醚洗滌沈澱若干次且在真空下乾燥。將粗產物溶於水中，且藉由半製備型RP-HPLC在具有Macherey-Nagel VP 250/21 Nucleosil 100-5 C18 管柱之Metrohm HPLC系統LC-CaDI 22-14(Herisau,Switzerland)上純化(溶離劑：溶離劑1=水中之0.1% TFA且溶離劑2=乙腈；梯度：0-20min，90%-50%溶離劑1；流速：15mL/min)。
將共軛物藉由分析型RP-HPLC分析且藉由質譜法(ESI-MS)表徵。
A-B-C-1
DOTA-間隔基-Xaa1 6 -Gln7 -Trp8 -Ala9 -Val10 -Xaa2 11 -His12 -Xaa3 13 -Xaa4 14 -ZH(Z=NH)
化合物1：A =DOTA，B １ =Gly，B 2 =4-胺基苯甲醯基；Xaa1= DPhe；Xaa2 =Gly；Xaa3= Sta；Xaa4= Leu，DOTA-Gly-胺基苯甲醯基-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2 ；C80 H114 N20 O20 ，計算值(m/z)：1675.8，實驗值[M+K]+ ：1715.1。
化合物2：A =DOTA，B 1 =4-胺基-1-羧甲基-哌啶基；B 2 =無，Xaa1= DPhe；Xaa2 =Gly；Xaa3= Sta；Xaa4= LeuDOTA-4-胺基-1-羧甲基-哌啶-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2 ；C79 H118 N20 O19 ；計算值(m/z)：1639.9，實驗值[M+K]+ ：1678.1
化合物3：A =DOTA，B 1 =4-胺基-1-哌啶-4-羧基；B 2 =無，Xaa1= DPhe；Xaa2 =Gly；Xaa3= Sta；Xaa4= LeuDOTA-4-胺基-1-哌啶-4-羧酸-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2
C77 H116 N20 O19 ，計算值(m/z)：1624.9，實驗值[M+K]+ ：1663.7
化合物4：A =DOTA，B 1 =15-胺基-4,7,10,13-四氧雜十五醯基；B 2 =無，Xaa1= DPhe；Xaa2 =Gly；Xaa3= Sta；Xaa4= Leu
DOTA-15-胺基-4,7,10,13-四氧雜十五烷酸-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2 ；C82 H127 N19 O23 ，計算值(m/z)：1747.8，實驗值[M+K]+ ：1785.1
化合物5:A =DOTA，B 1 =15-胺基-4,7,10,13-四氧雜十五醯基；B 2 =4-胺基-1-哌啶-4-羧基，Xaa1 =DPhe；Xaa2 =Gly；Xaa3 =Sta；Xaa4 =Leu
DOTA-(15-胺基-4,7,10,13-四氧雜十五烷酸)-(4-胺基-1-羧甲基-哌啶)-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2 ；C89 H139 N21 O24 ，計算值(m/z)：1886.0，實驗值[M+K]+ ：1924.9
化合物6:A =DOTA，B 1 =二胺基丁酸；B 2 =無，Xaa1 =DPhe；Xaa2 =Gly；Xaa3 =Sta；Xaa4 =Leu
DOTA-二胺基丁酸-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2 ；C75 H114 N20 O19 ，計算值(m/z)：1598.9，實驗值[M+K]+ ：1638.4
化合物7:A =DOTA，B 1 =4-(2-胺基乙基)-1-羧甲基-哌嗪基；B 2 =無，Xaa1 =DPhe；Xaa2 =Gly；Xaa3 =Sta；Xaa4 =Leu DOTA-4-(2-胺基乙基)-1-羧甲基-哌嗪-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2 ；C79 H121 N21 O19 ，計算值(m/z)：1667.9，實驗值[M+Na]+ ：1691.2
化合物8:A =DOTA，B 1 =(5-胺基-3-氧雜-戊基)-琥珀醯胺酸；B 2 =無，Xaa1 =DPhe；Xaa2 =Gly；Xaa3 =Sta；Xaa4 =Leu
DOTA-(5-胺基-3-氧雜-戊基)-琥珀醯胺酸-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2
C79 H120 N20 O21 ，計算值(m/z)：1685.9，實驗值[M+K]+ ：1723.7
實例2(A-B-C)
a)合成具有通用序列之鈴蟾素胜肽拮抗劑共軛物(A =N4 -疊氮基，B= 間隔基B 1 -B 2 ，C=具有N-末端醯胺Z之 胜肽[Z= NH2 ])
N4 -三唑-dPEG1 -Xaa1 6 -Gln7 -Trp8 -Ala9 -Val10 -Xaa2 11 -His12 -Sta13 -Leu14 -NH2
a)合成胜肽：Fmoc-Xaa1 6 -Gln7 -Trp8 -Ala9 -Val10 -Xaa2 11 -His12 -Sta13 -Leu14 -NH2
使用Fmoc策略在固相上手動合成胜肽。為獲得N -末端醯胺，使用Rink醯胺MBHA樹脂LL(100-200目)。如實例1中所述進行合成。
b)與烷基炔丙基-dPEG1 -NHS-酯偶合
在與烷基偶合之前，將N -末端Fmoc保護自結合胜肽之樹脂上移除。使樹脂在DMF中膨脹15min，以DMF中之20%哌啶溶液處理兩次(15min)，且用DMF洗滌三次。收集來自哌啶處理及隨後之DMF洗滌液之溶液用於Fmoc測定。
將2當量炔丙基-dPEG1 -NHS-酯添加至樹脂中。藉由添加DIPEA將pH值調節至8-9。將反應混合物震盪24h且藉由凱撒測試監測偶合。
c)去保護，裂解及純化
將胜肽-樹脂放入裝備有玻璃料之注射器中。添加TFA/TIS/H2 O(94/2.5/2.5)溶液且將注射器攪拌2h。在冰上將該溶液添加至50%二異丙醚與50%乙醚之混合物中以使胜肽沈澱。藉由在3000rpm下離心5min收集胜肽且傾析上清液。用乙醚洗滌沈澱若干次且在真空下乾燥。將粗產物溶於水中，且如前所述藉由半製備型RP-HPLC來純化。
將共軛物藉由分析型RP-HPLC分析且藉由質譜法(ESI-MS)表徵。
d)合成N4 -疊氮基螯合劑。該合成包括3個步驟。
i)合成N,N ',N '',N '''-肆(第三丁氧羰基)-6-(疊氮基)-1,4,8,11-四氮雜十一烷(N4 (Boc)4 -N3 )[3]：
a)N,N '，N '',N '''-肆(第三丁氧羰基)-6-(羥基)-1,4,8,11-四氮雜十一烷(N4 (Bob)4 -OH)[1]：將6-(羥基)-1,4,8,11-四氮雜十一烷(1g，3.1mmol)於DMF(10mL)中之溶液冷卻至0℃。向其中添加二碳酸二第三丁酯(3.32mL，15.5mmol)於DMF(5mL)中之溶液，隨後添加DIPEA(2.7mL，15.5mmol)。隨後將反應混合物在室溫下攪拌18h。在此反應時間之後，使反應混合物在水與乙酸乙酯之間分溶。用乙酸乙酯萃取水層三次，且用氯化鈉溶液洗滌合併之乙酸乙酯相且將其經無水硫酸鈉乾燥。過濾且在減壓下蒸發溶劑得到產率為86%之標題化合物。
ii)N，N ',N '',N '''-肆(第三丁氧羰基)-6-(O-甲基磺醯基))-1,4,8,11-四氮雜十一烷(N4 (Bob)4 -O-SO2 CH3 )[2]：向1(300mg，0.54mmol)於吡啶(3mL)中之溶液中添加甲基磺醯氯(84μL，1.08mmol)。將反應混合物在室溫下攪拌直至藉由TLC監測到其完全反應。在減壓下蒸發溶劑，將殘餘物吸收於乙酸乙酯中。用10% NaHCO3 及水將乙酸乙酯洗滌三次且經無水硫酸鈉乾燥。過濾且在減壓下蒸發溶劑得到粗產物，將其進一步藉由矽膠管柱層析法純化得到產率為84%之標題化合物。
iii)N ,N ',N ",N '''-肆(第三丁氧羰基)-6-(疊氮基)-1,4,8,11-四氮雜十一烷(N4 (Boc)4 -N3 )[3 ]：在75℃下將2 (250mg，0.38mmol)及疊氮化鈉(100mg，1.52mmol)於DMF(3mL)中之懸浮液攪拌5h。之後將反應混合物在室溫下攪拌18h。接著使反應混合物在水與乙酸乙酯之間分溶。用乙酸乙酯萃取水層三次，且將合併之乙酸乙酯用氯化鈉溶液洗滌並經無水硫酸鈉乾燥。過濾且在減壓下蒸發溶劑得到粗產物，接著藉由管柱層析法純化其(產率88%)。
d)在溶液中偶合
將具有末端烷基之胜肽(6.2mg，5μm)及3 (3mg，5μm)溶於水與第三丁醇(1mL)之1:1混合物中。添加銅粉(10mg)隨後添加0.1M硫酸銅(II)五水合物水溶液(60μL，6μm，1.2當量)且將反應混合物在室溫下攪拌24h。濾除銅粉，在減壓下移除溶劑。藉由半製備型RP-HPLC純化粗胜肽。
用TFA:TIS:H2 O(95:2:3)處理螯合劑-胜肽共軛物歷時2h。在減壓下移除溶劑。將粗產物用乙醚濕磨且如前所述藉由半製備型RP-HPLC純化其。
將共軛物藉由分析型RP-HPLC分析且藉由質譜法(ESI-MS)表徵。
化合物14:A =N4 -疊氮基，B 1 = 炔丙基-dPEG1 -NHS-酯；B 2 = 無，Xaa1 =DPhe；Xaa2 =Gly；Xaa3 =Sta；Xaa4 =Leu N4 -三唑-dPEG1 -D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2 ；C68 Hl05 N2l Ol3 ，計算值(m/z)：l424.7，實驗值[M+H]+：1425.5
實例3(A-B-C2 )
DoTA-間隔基-Xaal 6 -Gln7 -Trp8 -Ala9 -Val10 -Xaa2 11 -His12 -LeuΨ(CHOH)-(CH2 )2 -CH3
在溶液相中藉由使七胜肽Fmoc-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Xaa2 -His-OH與經修飾之胺基酸H-LeuΨ(CHOH)-(CH2 )3 -CH3 縮合來合成所有偽胜肽。
a)合成七胜肽Fmoc-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Xaa2 -His-OH
使用Fmoc策略在2-氯三苯甲基氯化物樹脂上手動合成胜肽。一般而言，將具有理論負載為1.4mmole/g樹脂之2-氯三苯甲基氯化物樹脂供應於反應器中。使樹脂在DCM中膨脹30min且藉由添加與4-倍莫耳濃度過量的DCM中之DIPEA混合的1當量胺基酸使第一胺基酸偶合。將偶合反應混合物在室溫下攪拌2h且接著將樹脂以DCM/MeOH/DIPEA(17/2/1)之混合物洗滌兩次，以DCM洗滌兩次且最後在DMF中膨脹。使用DMF中之20%哌啶將Fmoc去保護，且所移除之Fmoc-保護基之量係經分光光度法在300nm下測定。藉由添加與等莫耳量之DIC/HOBt，及4-倍莫耳濃度過量之DMF中之DIPEA混合的2-倍莫耳濃度過量之胺基酸使下一胺基酸偶合。將樹脂在室溫下攪動2h且藉由凱撒茚三酮測試監測該偶合。使用相同策略來偶合各胺基酸。
b)與間隔基及前螯合劑DOTA( t Bu)3 偶合如上所述進行偶合。
c)裂解及純化
藉由將樹脂懸浮於TFA/TIS/DCM(1/5/94)之混合物中使完全經保護之胜肽自固體載體上裂解下來。用注射器數次吸取5mL體積之裂解溶液，將其培育10min且將裂解部分收集於50mL燒瓶中。在將所有部分收集起來後，將3X10mL甲苯添加至該燒瓶中，蒸發溶劑且之後將產物在油泵真空下乾燥1h。
d)合成Boc-LeuΨ(CHOH)-(CH2 )3 -CH2 。該合成包括3個步驟。
i)合成Boc-Leu-N(OCH3 )CH3
在0℃下將Boc-Leu-OH(1g，4.3mmol)溶於DCM(30mL)中且添加四氟硼酸2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基(TBTU)(1.380g，4.3mmol)、HOBt(0.581g，4.3mmol)及DIPEA(743μL，4.3mmol)。攪拌5min後，添加O,N-二甲基羥基胺鹽酸鹽(0.461g，4.73mmol)及DIPEA(817μL，4.73mmol)。所有固體物質在10min內溶解且將該混合物在RT下攪拌隔夜。蒸發溶劑，將反應混合物再溶解於AcOEt中且以H2 O、5%檸檬酸、H2 O、5% NaHCO3 水溶液、飽和NaCl溶液洗滌若干次。將溶液經MgSO4 乾燥且在真空下移除溶劑。藉由矽膠管柱層析法純化所想要之化合物。ESI-MS：計算值269；實驗值292[M+Na]+ 。
ii)合成Boc-Leu-(CH2 )3 -CH3
藉由將鎂(0.330g，13.6mmol)在N2 下懸浮於甲苯中歷時30min使其活化。移除甲苯且在N2 下將Mg乾燥。向Mg於THF(20mL)中之懸浮液中逐滴添加溴丁烷(1.46mL，13.6mmol)且將混合物在回流下加熱。當所有鎂溶解後，在0℃下逐滴添加Boc-Leu-N(OCH3 )CH3 於THF中之溶液且將反應物攪拌2h。添加1M HCl(150mL)隨後添加乙酸乙酯(100mL)。用1M硫酸氫鉀、水洗滌有機層，將其乾燥(Na2 SO4 )且在真空下濃縮。藉由矽膠管柱層析法純化所預期之產物。藉由1 H-NMR及13 C-NMR表徵產物。ESI-MS：計算值271；實驗值293.3[M+Na]+ 。
iii)合成Boc-LeuΨ(CHOH)-(CH2 )3 -CH3
向Boc-Leu-(CH2 )3 -CH3 (0.190g，0.7mmol)於甲醇(5mL)中之溶液中添加NaBH4 (0.104g，2.8mmol)。將反應混合物另外攪拌1h，接著用乙酸中和，且在減壓下移除溶劑。用飽和碳酸氫鹽溶液使所預期之產物沈澱。藉由過濾收集胜肽，將其用水、己烷洗滌且乾燥。藉由1 H-NMR及13 C-NMR表徵產物。ESI-MS：計算值272；實驗值273[M+H]+ ；547.7[2M+H]+ 。
iv)在溶液中偶合
使用80% TFA於DCM中之溶液使Boc-LeuΨ(CHOH)-(CH2 )3 -CH3 去保護。1h後濃縮溶液，將其用DCM洗滌數次且乾燥。將螯合劑-間隔基-胜肽溶於DMF中，添加HATU(1.2當量)且將混合物攪拌1h。將H-LeuΨ(CHOH)-(CH2 )3 -CH3 溶於DMF中且添加至胜肽中。使用DIPEA將pH值調節至8且在RT下將該反應攪拌4h。
濃縮溶劑且藉由以H2 O在冰上沈澱獲得完全經保護之胜肽。將粗胜肽沈澱、冷卻、離心且藉由傾析與溶劑分離。為得到完全去保護之胜肽，將其溶於DCM/TFA/TIS/H2 O 10/85/2.5/2.5之混合物中。4h後濃縮溶液且在冰上使用50%乙醚與50%二異丙醚之混合物使胜肽沈澱。接著藉由在3000rpm下離心5min收集胜肽且傾析上清液。用乙醚洗滌沈澱若干次且將粗產物保持原樣在真空下隔夜以移除殘餘溶劑。將粗產物溶於水中且如前所述藉由製備純化其。
將共軛物藉由分析型RP-HPLC分析且藉由質譜法(ESI-MS)表徵。
化合物9:A =DOTA，B 1 =4-胺基-1-羧甲基-哌啶；B 2 = 無，Xaa1 =DPhe；Xaa2 =Gly；
DOTA-4-胺基-1-羧甲基-哌啶-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-LeuΨ(CHOH-CH2 )-(CH2 )2 -CH3 ，C74 H112 N18 O17 ，計算值(m/z)：1524.8，實驗值[M+K]+ ：1564.3
化合物10:A =DOTA，B 1 =15-胺基-4,7,10,13-四氧雜十五醯基；B 2 =4-胺基-1-羧甲基-哌啶，Xaa1 =DPhe；Xaa2 =Gly；
DOTA-PEG4 -4-胺基-1-羧甲基-哌啶-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-LeuΨ(CHOH-CH2 )-(CH2 )2 -CH3 ；C86 H135 N19 O22 ，計算值(m/z)：1786.9，實驗值[M+K]+ ：1811.1
化合物11:A =DOTA，B 1 =15-胺基-4,7,10,13-四氧雜十五醯基；B 2 =無，Xaa1 =DPhe；Xaa2 =Gly；DOTA-PEG4 -D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-LeuΨ(CHOH-CH2 )-(CH2 )2 -CH3
C78 H121 N17 O21 ，計算值(m/z)：1632.8，實驗值[M+K]+ ：1672.2
實例4(A-B-C-3)
DOTA-間隔基-Xaa1 6 -Gln7 -Trp8 -Ala9 -Val10 -Xaa2 11 -His12 -Xaa3 13 -Xaa4 14 -NH2
合成具有以下通用序列之鈴蟾素共軛物：DOTA-間隔基-Xaa1 6 -Gln7 -Trp8 -Ala9 -Val10 -Xaa2 11 -His12 -LeuΨ(CH2 NH)-Phe-NH2
a)合成胜肰：Fmoc-Xaa1 6 -Gln7 -Trp8 -Ala9 -Val10 -Xaa2 11 -His12 -LeuΨ(CH2 NH)-Phe-NH2
使用Boc策略在MBHA樹脂LL(100-200目)HC1上手動合成胜肽。一般而言，將具有理論負載為0.59mmol/g之MBHA樹脂供應於反應器中且使其在DCM中膨脹30min。用10% DIPEA於DCM中之溶液處理樹脂3次(10min)。Boc-LeuΨ(CH2 NH)-Phe-OH之第一偶合係使用經2當量HOBt及2當量DIC活化之2當量Boc-胺基酸實現。將偶合反應混合物在室溫下攪拌2h且用凱撒茚三酮測試監測反應。使用於DCM中之30% TFA使Boc去保護且將此步驟重複兩次。接著將樹脂用10% DIPEA於DCM中之溶液處理且如上所述進行偶合。
(H-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-LeuΨ(CH2 NH)-Phe-NH2 ：C56 H76 N14 O9 ，計算值(m/z)：1089.3，實驗值[M+H]+ ：1089.8
b)與間隔基及前螯合劑DOTA( t Bu)3 偶合
如上所述進行偶合。
c)去保護，裂解及純化
用TFA(1mL)及TIS(30μL)處理胜肽且將混合物在室溫下攪拌5min。接著將混合物在冰浴中冷卻且在攪拌下逐滴添加三氟甲磺酸(TFMSA)(100μL)。以塞子密封燒瓶且將混合物在室溫下攪拌2h。在真空下使體積減少且添加冷乙醚使胜肽沈澱。用乙醚將沈澱洗滌數次且將粗產物在真空下乾燥。將粗產物溶於水中且如上所述藉由HPLC製備型來純化。
將共軛物藉由分析型RP-HPLC分析且藉由質譜法(ESI-MS)表徵。
化合物12：A =DOTA，B 1 = 4-胺基-1-羧甲基-哌啶；B 2 = 無，Xaa1 =DPhe；Xaa2 =Gly；Xaa3 =LeuΨ(CH2 NH)；Xaa4 =Phe
DOTA-4-胺基-1-羧甲基-哌啶-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-HiS-LeuΨ(CH2 NH)-Phe-NH2
C79 H114 N20 O17 ，計算值(m/z)：1615.9，實驗值[M+K]+ ：1654.9
合成具有以下通用序列之鈴蟾素共軛物：DOTA-間隔基-Xaa1 6 -Gln7 -Trp8 -Ala9 -Val10 -Xaa2 11 -His12 -LeuΨ(CH2 NH)-Cys-NH2
a)合成胜肽：Fmoc-Xaa1 6 -Gln7 -Trp8 -Ala9 -Val10 -Xaa2 11 -His12 -LeuΨ(CH2 NH)-Cys-NH2
使用Boc-策略藉由在MBHA樹脂(0.59mmol/g)上之固相手動合成胜肽。使用DIC(2.5eq.)及HOBt(2.5eq.)作為活化劑將Boc-Cys(4-MeOBzl)-OH(2.5eq.)偶合至樹脂。用DIPEA(5eq.)將pH值調節至8。還原鍵13 Ψ14 (CH2 -NH)之引入係使用溶於經酸化之二甲基甲醯胺中之Boc-Leu-醛(2.5eq.)來進行。在20min內緩慢添加NaBH3 CN(2.5eq.)於DMF中之溶液，且將反應在RT下攪拌1h。在形成還原肽鍵後，使用經N -Boc-保護之胺基酸進行所有偶合反應。
b)與間隔基及前螯合劑DOTA( t Bu)3 偶合如上所述進行偶合。
c)去保護，裂解及純化
去保護，裂解及純化係如前所述進行。將共軛物藉由分析型RP-HPLC分析且藉由質譜法(ESI-MS)表徵。
化合物13：A =DOTA，B 1 =4-胺基-1-羧甲基-哌啶；B 2 =無，Xaa1 =DPhe；Xaa2 =Gly；Xaa3 =LeuΨ(CH2 NH)-；Xaa4 =Cys
DOTA-4-胺基-1-羧甲基-哌啶-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-LeuΨ(CH2 NH)-Cys-NH2 ；C73 H110 N20 O17 S，計算值(m/z)：1571.8，實驗值[M+Na]+ ：1593.6
實例4
合成之共軛物(化合物1-13)的放射性標記一般程序
向螯合劑-鈴蟾素胜肽拮抗劑共軛物於水中之10μg等分試樣中添加1-2mCi(111 InCl3 ，177 LuCl3 或67/68 GaCl3 )之水溶液及250-500μL之0.4M乙酸鈉緩衝液(pH=5)。在95℃下將此溶液加熱30min且冷卻至室溫歷時10min。將5μl反應混合物之等分試樣添加至25μ1之Ca-DTPA溶液(0.1M，pH 5.2)中且藉由HPLC分析以便測定未標記之放射性核種之量。
實例5
用115 In標記合成之共軛物。
鈴蟾素類似物與天然 In之錯合係遵循相同實驗程序進行。天然 In係以天然 InCl3 溶液之形式使用且莫耳比為1:1。
實例6(活體外檢定)
GRP受體拮抗劑之活體外表徵之材料及方法
試劑及胜肽
所有試劑皆為可獲得之最佳等級且係購自普通供應商。小鼠單株血球凝集素(HA)抗原決定基抗體係購自Covance(Berkeley,CA)。二次抗體Alexa Fluor 488山羊抗-小鼠IgG(H+L)係購自Molecular Probes,Inc.(Eugene,OR)。鈴蟾素及拮抗劑[D-Phe6 ，Leu-NHEt13 ，des -Met14 ]-鈴蟾素(6-14)(GRPR-ANTAG)係購自Bachem(Bubendorf,Switzerland)。RM26、RM1b、In-RM1b及175 Lu-AMBA係由H.R.(Basel,Switzerland)提供。Fluo-4NW鈣檢定套組係購自Molecular Probes,Inc.(Eugene,OR)，
細胞株
穩定表現HA-抗原決定基標記之人類GRP受體(HEK-GRPR)的人類胚胎腎293(HEK293)細胞係如先前所述生成(Cescato等人，2008)且將其在37℃及5% CO2 下在具有含有10%(v/v)胎牛血清(FBS)、100U/ml盤尼西林(penicillin)、100μg/ml鏈黴素(streptomycin)及750μg/ml G418之GlutaMAXTM -I(DMEM)的Dulbecco's改良之Eagle培養基中培養。人類前列腺癌細胞(PC3細胞)係購自DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH；DSMZ No：ACC465)且將其在37℃及5% CO2 下在含有2mM L-麩醯胺酸且補充有10%(v/v)FBS、100U/ml盤尼西林及100μg/ml鏈黴素之Ham's F12K中培養。所有培養試劑皆購自Gibco BRL(Grand Island,NY)。
結合-親和力量測
藉由對良好表徵之前列腺癌之低溫恆溫器切片或來自如前所述之HEK-GRPR或PC3細胞球粒之切片進行活體外受體自動放射照相法來測定各種化合物之GRP受體結合親和力(Markwalder等人，Can. Res., 1999；59,1152-1159；Reubi等人，Eur. J. Nucl.Med., 2000;27:273-282；Reubi等人，Clin. Cancer Res. 2002;8 1139-1146)。所使用之放射性配位體為125 I-[Tyr4 ]-鈴蟾素，已知較佳標記GRP受體(Vigna等人，Gastroenterology. 1987;93:1287-1295)且125 I-[D-Tyr6 ，β-Ala11 ，Phe13 ，Nle14 ]-鈴蟾素(6-14)作為通用鈴蟾素受體配位體(Gastroenterology. 1987;93:1287-1295)。
參見表1中之結果。
免疫螢光顯微法
如前所述進行HEK-GRPR細胞之基於免疫螢光顯微法的內在化檢定(Cescato等人，2006；Cescato等人，2008)。簡言之，將HEK-GRPR細胞在塗佈聚-D-離胺酸(20μg/ml)(Sigma-Aldrich,St. Louis,MO)之35mm四孔板(Cellstar,Greiner Bio-One GmbH,Frickenhausen,Germany)上生長。對於實驗，在37℃及5% CO2 下於生長介質中在100-倍過量之此等各種類似物存在下以10nM鈴蟾素或以1μM各種鈴蟾素類似物處理細胞30min，或為了評估潛在拮抗性，以10nM鈴蟾素處理30min，且接著使用小鼠單株HA-抗原決定基抗體在1:1,000稀釋度下作為第一抗體且Alexa Fluor 488山羊抗-小鼠IgG(H+L)在1:600稀釋度下作為第二抗體處理以用於免疫螢光顯微法。使用Leica DM RB免疫螢光顯微鏡及Olympus DP10相機使該等細胞成像。
由鈴蟾素誘發之GRP受體內在化係由鈴蟾素類似物化合物1、In-化合物1、化合物1b及GRPR-ANTAG有效拮抗。用媒劑(無胜肽，a)，或用10nmol/L鈴蟾素(b)處理HEK-GRPR細胞30min，該濃度誘發次最大內在化作用。圖(d、f、h、j)展示在1μmol/L類似物化合物1b、GRPR-ANTAG、化合物1及In-化合物1存在下用10nmol/L鈴蟾素處理之細胞。化合物1b、GRPR-ANTAG、化合物1及In-化合物1在1μmol/L濃度下單獨之作用展示於圖(c、e、g、i、k)中。以胜肽培育之後，將細胞如上所述處理以用於免疫細胞化學。對於經鈴蟾素處理之細胞可偵測到清晰之點狀核周染色。此點狀染色係藉由過量之類似物化合物1、In-化合物1、化合物1b及GRPR-ANTAG有效消除。單獨提供之化合物-1、In-化合物1、化合物1b及GRPR-ANTAG對於GRP受體內在化無作用。
參見表1及圖2中之結果。
鈣釋放檢定
使用Fluo-4NW鈣檢定套組如前所述在PC3細胞中量測細胞內鈣釋放(Magrys等人，J. Clin. Immunol . 2007,27 ,181-192；Michel等人；Cescato等人，J. Nucl. Med .2008；49:318-326)。簡言之，在96孔板中接種PC3細胞(10,000個細胞/孔)且將其在37℃及5% CO2 下在培養基中培養2日。在實驗當日，用含有2.5mM丙磺舒(probenecid)之檢定緩衝液(1×HBSS,20mM HEPES)洗滌細胞，且接著在37℃及5%CO2 下以100μL/孔Fluo-4NW染料載入含有2.5mM丙磺舒之檢定緩衝液中歷時30min且接著在室溫下再歷時30min。為量測在以待測試之鈴蟾素類似物刺激後細胞內鈣動員，將載有染料之細胞轉移至SpectraMax M2e (Molecular Devices,Sunnyvale,CA)中。在指示濃度之類似物存在下，在室溫下於520nm(其中λex =485nm)下監控螢光發射以動力學記錄細胞內鈣動員歷時60秒。在添加25μM離子黴素(ionomycin)後量測到最大螢光(F-max)。對於載有染料的未處理之細胞進行基線量測(F-基線)。如先前報導，資料係以最大鈣反應之百分數(F-max-F-基線=100%之最大鈣反應)形式展示(Magrys等人，J. Clin. Immunol. 2007,27 ,181-192；Michel等人，Cescato等人，J. Nucl.Med. 2008；49:318-326)。所有實驗皆一式三份至少重複三次。
圖1展示在鈴蟾素(BB)存在下In-化合物1及化合物1a表現類似拮抗劑，使鈴蟾素之劑量-反應曲線向右移動。
參見表1及圖1中之結果。
化合物1：DOTA-Gly-胺基苯甲醯基-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2
化合物2：DOTA-4-胺基-1-羧甲基-哌啶-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2
化合物3：DOTA-4-胺基-1-哌啶-4-羧酸-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2
化合物4：DOTA-15-胺基-4,7,10,13-四氧雜十五烷酸-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2
化合物5：DOTA-(15-胺基-4,7,10,13-四氧雜十五烷酸)-(4-胺基-1-羧基-甲基-哌啶)-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2
化合物6：DOTA-二胺基丁酸-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2
化合物7：DOTA-4-(2-胺基乙基)-1-羧甲基-哌嗪-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-HiS-Sta-Leu-NH2
化合物8：DOTA-(5-胺基-3-氧雜-戊基)-琥珀醯胺酸-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2
化合物9：DOTA-4-胺基-1-羧甲基-哌啶-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-LeuΨ(CHOH-CH2 )-(CH2 )2 -CH3
化合物10：DOTA-(15-胺基-4,7,10,13-四氧雜十五烷酸-4-胺基-1-羧甲基-哌啶-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-LeuΨ(CHOH-CH2 )-(CH2 )2 -CH3
化合物11：DOTA-15-胺基-4,7,10,13-四氧雜十五烷酸-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-LeuΨ(CHOH-CH2 )-(CH2 )2 -CH3
化合物12：DOTA-4-胺基-1-羧甲基-哌啶-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-HiS-LeuΨ(CH2 NH)-Phe-NH2
化合物13：DOTA-4-胺基-1-羧甲基-哌啶-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-LeuΨ(CH2 NH)-Cys-NH2
化合物14：N4 -三唑-dPEG1 -D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2 。
在與115 In非放射性同位素錯合後量測化合物1、2及9之結合親和力。資料顯示與同位素之錯合併不影響與受體之結合親和力以及拮抗性。
在相關公開案中之標準方法：Cescato R,Schulz S,Waser B，等人Internalization of sst2, sst3 and sst5 receptors:Effects of somatostatin agonists and antagonists. J. Nucl. Med .,2006;47:502-511.
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實例7 帶有PC-3腫瘤之裸小鼠之生物分布實驗
將10,000,000個在無菌磷酸鹽緩衝生理食鹽水溶液(PBS，pH 7.4)中新鮮展開之PC-3腫瘤細胞經皮下植入雌性裸小鼠中。接種11日後，將10pmol放射性標記之胜肽(約0.18MBq)(在NaCl中稀釋(0.1%牛血清白蛋白，pH 7.4，總注射體積=100μL))注射入小鼠之尾部靜脈。為測定腫瘤或受體陽性器官中非特異性吸收，將一組4個動物以0.02μmol未經標記之胜肽於0.9% NaCl中之溶液預注射且在5min後注射經放射性標記之胜肽。在1、4、24、48及72h時間間隔中，將小鼠(3-4個一組)處死且收集所關注之器官，用過量血液沖洗，稱重並在γ-計數器中計數。
111 In-化合物1
111 In-DOTA-Gly-胺基苯甲醯基-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2
111 In-化合物2
111 In-DOTA-4-胺基-1-羧甲基-哌啶-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2
111 In-化合物4
111 In-DOTA-(15-胺基-4,7,10,13-四氧雜十五烷酸)-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2
111 In-化合物5
111 In-DOTA-(15-胺基-4,7,10,13-四氧雜十五烷酸)-(4-胺基-1-羧基-甲基-哌啶)-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2
111 In-化合物9
111 In-DOTA-DOTA-4-胺基-1-羧甲基-哌啶-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-LeuΨ(CHOH-CH2 )-(CH2 )2 -CH3
實例8
Ga-68-DOTA化合物2在帶有PC-3及LNCaP-腫瘤之小鼠中之PET/CT-成像、生物分布實驗、結合親和力及穩定性 成像+生物分布
化合物2:DOTA-4-胺基-1-羧甲基-哌啶-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2
經驗式：C78H115N20O19Ga；分子量：1704.89
在注射10MBq放射性示蹤劑1h後在微型PET/CT(lnveon,Siemens)上對帶有PC-3及LNCaP腫瘤之小鼠體內之Ga-68-DOTA-化合物2成像。由於此鈴蟾素拮抗劑之快速腎清除率極低，因此背景活性僅在一些腎及膀胱吸收中觀測到。在異種移植物中可視之高腫瘤對比度係由100μg鈴蟾素或非放射性化合物2自身有效阻斷。鈴蟾素受體成功地經鈴蟾素阻斷，造成關鍵的腫瘤信號缺失(圖3a及3b為帶有PC-3腫瘤之小鼠+圖4a及4b為帶有LNCaP-腫瘤之小鼠)。
結合親和力
Ga-68-DOTA-化合物2與GRPr之結合親和力係經由兩種不同方法測定，該等方法包含受體在人類組織上之自動放射照相法及使用PC-3細胞進行細胞檢定。兩種方法皆得到高結合親和力之化合物2，其中基於非放射性DOTA-化合物2胜肽之IC50 約為8nM。
小鼠血漿及微粒體中之穩定性
藉由不同活體外及活體內方法所量測，Ga-68-DOTA-化合物2展示良好之代謝穩定性。在不帶有腫瘤之小鼠中研究Ga-68-DOTA-化合物2之活體內血漿穩定性。靜脈內注射約20MBq之Ga-68-DOTA-化合物2後1、3、5、10及15min時藉由HPLC分析小鼠血漿及尿(圖8a、b、c、d、e)。數分鐘後，發現放射性示蹤劑之極小血漿降級，在1.3min及1.5min滯留時間處展示兩個極小/極性代謝物，其亦在尿中作為主要代謝物出現。化合物自身出現之滯留時間為11.6-11.7，在p.i. 5min處開始展示雙峰。
Ga-68-DOTA-化合物2之微粒體穩定性係使用以放射性示蹤劑培育之小鼠及人類微粒體測定，且藉由HPLC分析。未發現小鼠或人類微粒體中Ga-68-DOTA-化合物2之降級。在層析圖上偵測之極少雜質亦無需微粒體輔助因子而存在。
實例9
在帶有PC-3-腫瘤之小鼠中99mTc-ARN4-06之SPECT/CT-成像及生物分布實驗
參見上述實驗程序
圖5展示99m Tc-ARN4-06之SPECT/CT影像(15MBq/200pmol)
實例10
在帶有PC-3-腫瘤之小鼠中99mTc-ARN4-05之SPECT/CT-成像及生物分布實驗
參見上述實驗程序
圖6展示99m Tc-ARN4-05(15MBq/200pmol)之SPECT/CT影像
實例11 合成Ga-68-DOTA化合物2
步驟1：藉由固相胜肽合成(SPPS)合成非放射性胜肽，隨後使用聚苯乙烯-支撐之Rink醯胺樹脂的標準Fmoc策略
步驟2：350μl 0.25M HEPES於惠頓(Wheaton)V瓶中
‧在400μl 97.6%丙酮/0.05N HCl中添加[68Ga]GaCl3
‧用0.1M HCl將pH值調節至約3.5
‧在40μl水中添加40μg胜肽
‧加熱75W(95℃)歷時30s
‧靜置30s
‧重複加熱且再靜止三次
‧將5ml水添加至反應混合物中
‧在tC18 Light SPE上固定
‧洗滌水(5ml)
‧洗提EtOH(500μl)
放射性化學產率(未最佳化)　79-231MBq(32-60%d.c.)
起始活性　189-593MBq
標記編號　10
無效　0
放射性化學純度　>98%(藉由HPLC及ITLC)
特異性活性　3,2-11.8GBq/μmol
圖7展示Ga-68-DOTA化合物2於逆相管柱上之HPLC分析產物純度
管柱：ACE 5μ Cl8 50×4,6mm
溶劑：溶劑A:H2 O+0.1% TFA
溶劑B：MeCN+0.1% TFA
梯度：7min內5-95%
流速：2ml/min
實例12 Lu-177-DOTA化合物2之血清穩定性
化合物2：DOTA-4-胺基-1-羧甲基-哌啶-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2
亦在人類血清中研究經Lu-177放射性標記之Lu-177-DOTA化合物2之血清穩定性。如藉由HPLC方法所分析，在將Lu-177-DOTA化合物2在人類血清中培育96h後，仍有70%之化合物為完整的(圖9)。向先前已在37℃及5% CO2 環境下平衡之1mL新鮮製備之人類血清中添加0.03nmol經177 Lu-標記之胜肽標準溶液。將混合物在5% CO2 、37℃環境下培育。在不同時間點，將100-μL等分試樣(一式三份)移除且用200μL EtOH處理以沈澱血清蛋白。接著將樣品在5000rpm下離心15min。移除50μL上清液以便在γ-孔計數器中進行活性計數，將沈澱物用1mL EtOH洗滌兩次且計數，且將上清液中之活性與離心塊中之活性比較以得到未與蛋白或轉移至血清蛋白中之放射性金屬結合之胜肽的百分比。用HPLC(溶離劑：A=0.1%三氟乙酸於水中之溶液及B=乙腈；梯度：0min 95% A；20min 50% A)分析上清液以測定胜肽在血清中之穩定性。
圖9展示Lu-177-DOTA化合物2在人類血清中之穩定性
實例13
比較F18-膽鹼與F18-FDG
Ga-68 RM2之生物分布參見下表
在p.i. 1h時，在帶有PC-3腫瘤之小鼠中，比較用於前列腺癌成像之F-18示蹤劑[18 F]氟乙基膽鹼(FEC)與FDG(腫瘤學中金標準F18示蹤劑)。高的腫瘤：組織比率強調Ga-68化合物RM2對於PET成像之診斷有用性
參見圖10。
圖1：鈴蟾素類似物之劑量-反應曲線係由鈣釋放檢定來測定。鈣釋放檢定係如材料及方法中所述進行。將PC3細胞經濃度範圍介於0.01nmol/L與10μmol/L(●)之間的單獨之鈴蟾素處理，或在10μmol/L鈴蟾素類似物化合物1(▲)或In-化合物1(◆)或鈴蟾素類似物化合物1a(■)存在下處理。化合物1(單獨在1μmol/L及10μmol/L化合物1(△)下測試)、In-化合物1(×)及化合物1a(□)對於PC3細胞中之鈣釋放無影響。化合物1a係指無連接子及螯合劑(D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2 )之結合序列1。化合物1係指螯合劑(D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2 )。In-化合物1係指In-螯合之(D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2 )。
圖2：HEK-GRPR細胞免疫螢光顯微法使用小鼠單株HA-抗原決定基抗體及HEK-GRPR細胞進行化合物1、In-化合物1、化合物1b及GRPR-ANTAG之免疫螢光顯微法。(a)無胜肽，(b)10nmol/L鈴蟾素，(c)化合物1b，(d)化合物1b+10nmol/L鈴蟾素，將(d、f、h、j)細胞在1μmol/L類似物化合物1b、GRPR-ANTAG、化合物1及In-化合物1存在下以10nmol/L鈴蟾素處理，將(c、e、g、i)細胞以化合物1b、GRPR-ANTAG及化合物1處理。
圖3a、3b、4a、4b：在Ga-68-DOTA化合物2之帶有PC-3(3)及LNCaP(4)-腫瘤小鼠中的PET-成像。a)在注射10MBq放射性示蹤劑1h後，b)以100μg鈴蟾素阻斷。
圖5：在帶有PC-3-腫瘤之小鼠中99m Tc-ARN4-06(15MBq/200pmol)之SPECT/CT影像。
圖6：在帶有PC-3-腫瘤之小鼠中99m Tc-ARN4-05(15MBq/200pmol)之SPECT/CT影像。
圖7：在逆相管柱上進行Ga-68-DOTA化合物2之HPLC分析。
圖8a、b、c、d、e：藉由HPLC分析小鼠血漿及尿中Ga-68-DOTA化合物2之穩定性檢定。
圖9：Lu-177-DOTA化合物2之人類血清穩定性。
圖10：比較腫瘤/組織Ga-68 RM2之F18 FDG與F18膽鹼。
(無元件符號說明)

Claims (19)

  1. 一種具有通式(I)之鈴蟾素(bombesin)類似物胜肽拮抗劑共軛物(I)[A-(B) n ] x -C其中x為1至3之整數，n為1至6之整數，A為包含至少一種放射性核種金屬之金屬螯合劑，B為連接至C之N-末端之間隔基或一共價鍵，C為選自序列C-1至C-4之鈴蟾素類似物胜肽拮抗劑，其中：C-1：Xaa1 6-Gln7-Trp8-Ala9-Val10-Xaa2 11-His12-Xaa3 13-Xaa4 14-ZH，其中：Xaa1為D-Phe、D-Cpa、D-Tyr、D-Trp或具有以下所述之式之任一者之殘基 K為F、Cl、I或NO2，Xaa2為Gly或β-Ala，Xaa3為抑制素、4-Am,5-MeHpA或4-Am,5-MeHxA，Xaa4為Leu、(S)-4-甲醯胺基苯基丙胺酸(Cpa)、4-氰基胺基丁酸(Cba)、Cha、t-buGly、tBuAla、Met、Nle或異-Bu-Gly，且Z為NH、O；C-2：Xaa1 6-Gln7-Trp8-Ala9-Val10-Xaa2 11-His12-Leuψ(CHOH-CH2)-(CH2)2-CH3，其中： Leuψ(CHOH-CH2)-(CH2)2-CH3為Xaa1為D-Phe、D-Cpa、D-Tyr、D-Trp或具有以下所述之式之任一者之殘基 ，且K為F、Cl、I或NO2， Xaa2為Gly或β-Ala；C-3：Xaa1 6-Gln7-Trp8-Ala9-Val10-Xaa2 11-His12-Xaa5 13-Xaa6 14-ZH，其中：Xaa1為D-Phe、D-Cpa、D-Tyr、D-Trp或具有以下所述之式之任一者之殘基 K為F、Cl、I或NO2，Xaa2為Gly或β-Ala，Xaa5為Leuψ-CH2NH-，Xaa6為Cys、Phe、Trp、Tpi或Tac，其中Tpi及Tac具有以下含義： 且Z為NH或O；C-4：Xaa1 6-Gln7-Trp8-Ala9-Val10-Xaa2 11-His12-Xaa7，其中：Xaa1為D-Phe、D-Cpa、D-Tyr、D-Trp或具有以下所述之式之任一者之殘基 K為F、Cl、I或NO2Xaa2為Gly或β-Ala，Xaa7為Leu-O-烷基，及其無機酸或有機酸之醫藥學上可接受之鹽，其錯合物、酯及醯胺。
  2. 如請求項1之鈴蟾素類似物胜肽拮抗劑共軛物，其中該金屬螯合劑(A)為三價金屬或五價金屬之金屬螯合劑。
  3. 如請求項2之鈴蟾素類似物胜肽拮抗劑共軛物，其中該三價金屬之金屬螯合劑係選自包含以下各物之群：DOTA-、NODASA-、NODAGA-、NOTA-、DTPA-、EDTA-、TETA-及TRITA-基螯合劑。
  4. 如請求項2之鈴蟾素類似物胜肽拮抗劑共軛物，其中該五價金屬之金屬螯合劑係選自包含以下各物之群： 其中R1-R15相互獨立地為氫原子或(C1-C4)烷基，其中，在 上式之部分中，t為1或2或3且在該部分中之碳原子之至少一者係經Y取代或未經Y取代，R16為氫原子或CO2(C1-C4)烷基； R17及R18相互獨立地為(C1-C4)烷基或苯基；R19為CH2-COOH或其官能衍生物；E為(C1-C4)伸烷基或伸苯基；視情況(C1-C4)伸烷基經CO2-烷基、CH2-CO烷基、CONH2或CONHCH2-CO2-烷基取代；視情況伸苯基經CO2-烷基取代，其中該烷基具有1至4個碳原子；G為NH或S；Y為能夠與該胜肽之游離胺基(N-末端)或該間隔基結合之官能基；且Z'為S或O。
  5. 如請求項1之鈴蟾素類似物胜肽拮抗劑共軛物，其中用於成像之該放射性核種金屬係選自包含以下金屬之群：133mIn、99mTc、67Ga、52Fe、68Ga、72As、111In、97Ru、203Pb、62Cu、64Cu、51Cr、52mMn、157Gd、123I、124I、131I、75Br、76Br、77Br及82Br。
  6. 如請求項1之鈴蟾素類似物胜肽拮抗劑共軛物，其中用於放射性療法之該放射性核種金屬係選自包含以下金屬之群：186Re、90Y、67Cu、69Er、121Sn、127Te、142Pr、143Pr、198Au、199Au、161Tb、109Pd、188Rd、186Re、188Re、77As、166Dy、166Ho、149Pm、151Pm、153Sm、159Gd、172Tm、90Y、111In、169Yb、175Yb、177Lu、105Rh、111Ag、125I、123I、213Bi、225Ac、129I及177mSn。
  7. 如請求項1之鈴蟾素類似物胜肽拮抗劑共軛物，其中連 接至C之N-末端之該間隔基B具有通式II：II B1-B2其中B1為共價鍵或天然胺基酸或非天然胺基酸或直鏈二胺或環狀二胺，B2為共價鍵或天然胺基酸或非天然胺基酸或直鏈羧酸或環狀羧酸，其限制條件為B1及B2不可同時為共價鍵且當B1為二胺時，B2為羧酸。
  8. 如請求項7之鈴蟾素類似物胜肽拮抗劑共軛物，其中該非天然胺基酸為具有通式III、IV、V或VI中之任一者之化合物其中 其中a為0至3之整數，b為0至3之整數，且相對取代模式視情況為1,2-、1,3-或1,4-； 其中c為1至24之整數， d為1至6之整數； 其中E'為NH或CH2，f為0至6之整數，g為0至6之整數；當E'為CH2時，則該6員環視情況在該6員環之任何碳位置處在該環之同一碳上或不同碳上經取代，當E'為NH時，則該6員環視情況在該6員環之任何碳位置處在該環之同一碳原子上或不同碳原子上及/或氮原子上經取代，其限制條件為f或g為等於或大於1之整數； 其中i為1至3之整數，j為1至3之整數，P為O或H2。
  9. 如請求項1至8中任一項之鈴蟾素類似物胜肽拮抗劑共軛物，其限制條件為該鈴蟾素類似物胜肽拮抗劑共軛物具有通式(I')(I')[A'-(B) n ] x -C 其中包括A'來替代A且A'具有與A相同之含義，例外在於其為不含放射性核種金屬之金屬螯合劑。
  10. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至9中任一項之鈴蟾素類似物胜肽拮抗劑共軛物之任一者。
  11. 一種如請求項1至9中任一項之鈴蟾素類似物胜肽拮抗劑共軛物之任一者的用途，其係用以製備用於結合至鈴蟾素受體及/或用於抑制鈴蟾素受體之藥物。
  12. 如請求項11之用途，其中該藥物係用於結合至胃泌素釋放胜肽受體(GRP)及/或用於抑制胃泌素釋放胜肽受體(GRP)。
  13. 一種用於製備如請求項1之鈴蟾素類似物胜肽拮抗劑共軛物之任一者的方法，其包含以下步驟：將具有如上所定義之通式(I')之鈴蟾素類似物胜肽拮抗劑共軛物與適當放射性核種金屬或金屬原子放射性螯合。
  14. 一種放射性醫藥有效量的如請求項1至8中任一項之鈴蟾素類似物胜肽拮抗劑共軛物之用途，其供製造用於使表現腫瘤細胞及/或腫瘤及腫瘤周圍血管的鈴蟾素受體成像之成像劑。
  15. 如請求項14之用途，其中該成像劑係用於使表現腫瘤細胞及/或腫瘤及腫瘤周圍血管的GRP受體成像。
  16. 如請求項14之用途，其中該腫瘤細胞係指選自包含以下 各者之群之癌：前列腺癌，包括癌轉移，乳癌，包括癌轉移，胃腸基質腫瘤，小細胞肺癌，腎細胞癌，胃腸胰神經內分泌腫瘤，頭部及頸部鱗狀細胞癌，神經母細胞瘤，及食道鱗狀細胞癌，且其中該腫瘤及腫瘤周圍血管係指選自包含以下各者之群之癌：卵巢癌，子宮內膜癌，及胰腺癌。
  17. 一種治療有效量的如請求項1至8中任一項之鈴蟾素類似物胜肽拮抗劑共軛物之用途，其供製造用於治療或預防腫瘤細胞及/或腫瘤及腫瘤周圍血管相關之疾病的藥物。
  18. 如請求項17之用途，其中該等腫瘤細胞相關之疾病係選自包含以下各者之群：前列腺癌，包括癌轉移，乳癌，包括癌轉移，胃腸基質腫瘤， 小細胞肺癌，腎細胞癌，胃腸胰神經內分泌腫瘤，頭部及頸部鱗狀細胞癌，神經母細胞瘤，及食道鱗狀細胞癌，且其中該等腫瘤及腫瘤周圍血管相關之疾病係選自包含以下各者之群：前列腺癌，包括癌轉移，及乳癌，包括癌轉移。
  19. 一種用於製備放射性治療劑或放射性醫藥成像劑的套組，其包含一含有預定量的如請求項9之鈴蟾素類似物胜肽拮抗劑共軛物及在放射性標記金屬螯合劑時可接受之載劑、稀釋劑、賦形劑或佐劑的瓶。
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