ES2615805T3

ES2615805T3 - Conjugados de antagonista de péptido análogo de la bombesina

Info

Publication number: ES2615805T3
Application number: ES09717301.7T
Authority: ES
Inventors: Helmut Maecke; Jean Claude Reubi; Rosalba Mansi
Original assignee: Universitaet Bern; Universitaetsspital Basel USB
Current assignee: Universitaet Bern; Universitaetsspital Basel USB
Priority date: 2008-03-07
Filing date: 2009-02-27
Publication date: 2017-06-08
Anticipated expiration: 2029-02-27
Also published as: EP2252628A1; CO6290707A2; CY1118687T1; AR070809A1; CL2009000537A1; EP2100900A1; ZA201006385B; SV2010003660A; PT2252628T; ECSP10010467A; CN101965358A; PE20091753A1; SI2252628T1; AU2009221204B2; KR20160128425A; AU2009221204C1; JP5784911B2; CN101965358B; DOP2010000269A; PA8818501A1

Abstract

Conjugado de antagonista de péptido análogo de la bombesina que presenta la fórmula general (I) (I) [A-(B)n]x-C en la que x es un número entero de 1 a 3, n es un número entero de 1 a 6, A es un quelante de metal que comprende por lo menos un metal radionúclido, B es un espaciador unido al extremo N de C o un enlace covalente, C es un antagonista de péptido análogo de la bombesina de secuencia C-1 a C-3, en la que: C-1: Xaa1 6-Gln7-Trp8-Ala9-Val10-Xaa2 11-His12-Xaa3 13-Xaa4 14-ZH, en la que: Xaa1 es D-Phe, D-Cpa, D-Tyr, D-Trp o un residuo que presenta cualquiera de las fórmulas descritas a continuación**Fórmula** , y K es F, Cl, I o NO2, Xaa2 es Gly o ß-Ala, Xaa3 es estatina, 4-Am,5-MeHpA o 4-Am,5-MeHxA, Xaa4 es Leu, Cpa, Cba, CpnA, Cha, t-buGly, tBuAla, Met, Nle o iso-Bu-Gly, y Z es NH, O; C-2: Xaa1 6-Gln7-Trp8-Ala9-Val10-Xaa2 11-His12-LeuΨ (CHOH-CH2)-(CH2)2-CH3, en la que: LeuΨ (CHOH-CH2)-(CH2)2-CH3 es**Fórmula** Xaa1 es D-Phe, D-Cpa, D-Tyr, D-Trp o un residuo que presenta cualquiera de las fórmulas descritas a continuación**Fórmula** y K es F, Cl, I o NO2, Xaa2 es Gly o ß-Ala; C-3: Xaa1 6-Gln7-Trp8-Ala9-Val10-Xaa2 11-His12-Xaa5 13-Xaa6 14-ZH, en la que: Xaa1 es D-Phe, Xaa2 es Gly, Xaa5 es LeuΨ-CH2NH-, Xaa6 es Cys o Phe, y Z es NH, y sales farmacéuticamente aceptables de un ácido inorgánico u orgánico del mismo, hidratos, complejos, ésteres, amidas y solvatos del mismo.

Description

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DESCRIPCION

Conjugados de antagonista de peptido analogo de la bombesina.

Introduccion

La invencion se refiere a productos radiofarmaceuticos terapeuticos o diagnosticos/de formacion de imagenes (“imaging”), a la preparacion y utilizacion de los mismos, en la que los productos radiofarmaceuticos terapeuticos o diagnosticos se definen como fracciones de union que presentan una afinidad y son capaces de union a receptores de bombesina y mas particularmente a un receptor de peptido liberador de gastrina (pLg). Las fracciones de union se marcan con un grupo acomplejante de metal para isotopos emisores de partlculas alfa, beta, gamma y positrones. La utilizacion incluye tratar un sujeto que presenta una enfermedad neoplasica, comprendiendo la etapa de administrar en el sujeto una cantidad eficaz de un producto radiofarmaceutico terapeutico que presenta un metal quelado con un grupo quelante unido a una fraccion capaz de unirse a receptores de la bombesina y mas particularmente a receptor de peptido liberador de gastrina (PLG) que se sobreexpresa sobre las celulas tumorales. La utilizacion incluye el diagnostico o formacion de imagenes de un sujeto que presenta una enfermedad neoplasica utilizando un producto radiofarmaceutico diagnostico/de formacion de imagenes que presenta un metal quelado con un grupo quelante unido a una fraccion capaz de union a receptores de bombesina y mas particularmente a receptor de peptido liberador de gastrina (PLG) sobreexpresado sobre celulas tumorales. El procedimiento consiste en formar un compuesto terapeutico o diagnostico a partir de un compuesto precursor que consiste en un grupo quelante de metales unido covalentemente a una fraccion capaz de unirse a receptores de bombesina y mas particularmente a receptores del peptido liberador de gastrina (PLG).

Antecedentes

Durante el diseno de un trazador radiofarmaceutico eficaz para la utilizacion como agente diagnostico resulta imperativo que los farmacos presenten propiedades farmacocineticas y de reconocimiento in vivo apropiadas. Fritzberg et al. (J. Nucl. Med. 33:394, 1992) indican ademas que la qulmica de los radionuclidos y los enlaces asociados subrayan la necesidad de optimizar la union y modificaciones qulmicas de marcaje de la biomolecula portadora. Por lo tanto, el tipo de radionuclido, el tipo de molecula biologica y el metodo utilizado para unirlos entre si pueden presentar un efecto crucial sobre las propiedades del radiotrazador.

Los peptidos son moleculas biologicas que desempenan un papel crucial en muchos procesos fisiologicos, incluyendo las actividades como neurotransmisores, hormonas y antibioticos. La investigation ha demostrado su importancia en campos tales como la neurociencia, la inmunologla, la farmacologla y la biologla celular. Algunos peptidos actuan como mensajeros qulmicos. Se unen a receptores sobre la superficie de la celula diana y el efecto biologico del ligando se transmite al tejido diana. Por lo tanto, la propiedad de union a receptores especlficos del ligando puede explotarse mediante el marcaje del ligando con un radionuclido. En teorla, la elevada afinidad del ligando para el receptor facilita la retention del ligando radiomarcado en los tejidos que expresan el receptor. Sin embargo, todavla se investiga que peptidos pueden marcarse con eficiencia y bajo que condiciones debe producirse el marcaje. Es bien conocido que la especificidad de receptor del peptido ligando puede alterarse durante la reaction qulmica. Por lo tanto, debe determinarse un constructo peptldico optimo.

Los tumores sobreexpresan diversos tipos de receptor a los que se unen especlficamente los peptidos. Las publicaciones siguientes de Boerman et al., Seminar in Nuclear Medicine 30(3):195, 2000); Reubi et al., J. Nucl. Med. 46(supl. 1):67S, 2005; Reubi J.C., Endocrine Reviews 24(4):389, 2003, proporcionan una lista no exhaustiva de peptidos que se unen especlficamente a receptores de superficie celular en los neoplasmas, es decir, la somatostatina, el peptido intestinal vasoactivo (PIV), la union de la bombesina al receptor del peptido liberador de gastrina (PLG), la gastrina, la colecistocinina (CCK) y la calcitonina.

La utilidad potencial de los peptidos especlficos de receptor marcados con metal para la formacion de imagenes escintigraficas y la radioterapia se ejemplifica con analogos de somatostatina, por ejemplo octreotido conjugado con 111In-DTPA, un agente de formacion de imagenes diagnosticas autorizado por la FDA, Octreoscan®, comercializado por Covidien en los Estados Unidos (Lowbertz et al., Seminars in Oncology, 1994, 1) y Reubi et al., J. Nucl. Med. 46:67S-75S, 2005, y referencias en las mismas, respectivamente. El octreotido y analogos del mismos han sido unidos covalentemente a varios isotopos metalicos para la formacion de imagenes (99mTc, 111In, 68Ga) y a isotopos metalicos terapeuticos (105Rh, 186/188Re, 153Sm, 90Y, 166Ho y 177Lu). Los conjugados marcados con metales se unen especlficamente al receptor y tras la union al receptor, el constructo es internalizado por el receptor y los peptidos especlficos de receptor marcados con metal o los metabolitos de los mismos resultan atrapados en las celulas diana.

El principio anteriormente indicado se extiende adicionalmente a peptidos avidos de receptores de PLG (peptidos que presentan una afinidad elevada para el receptor) en los que se utilizan agonistas de bombesina conjugados con metal para la formacion de imagenes escintigraficas y la radioterapia (Smith et al., Anticancer Res. 23:63-70, 2003; Baidoo et al., Bioconjug. Chem. 9:218-225, 1998; Gali et al., Bioconjug. Chem. 12:354-363, 2001; Smith et al., Bioconjug. Chem. 14:93-102, 2003; Cancer Res. 63:4082-4088, 2003; Rogers et al., en: M. Nicolini y U. Mazzi,

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editores, Technetium, rhenium and other metals in chemistry and nuclear medicine, SGE Editoriali, Italia, 519-525, 1999; Zhang et al., Cancer Res. 64:6707-6715, 2004, Lantry et al., EANM, Helsinki (Finlandia), 2004; Linder et al., J. Nucl. Med. 45(5):169P, 2004 [resumen n° 482]. Chen et al., J. Nucl. Med. 45:1390-1397, 2004; Johnson et al., Cancer Biother. Radiopharm. 21(2):155-66, 2006; Smith et al., Nucl. Med. Biol. 32:733-40, 2005).

En Chen et al. (Appl. Radiat. Isot., 2003 (en prensa)), Waser et al. (Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging 34:95-100, 2007) y Lantry et al. (J. Nucl. Med. 47:1144-52, 2006) se ha descrito la formacion de imagenes y la radioterapia de un agonista de la bombesina, 177Lu-DOTA acoplado con -NH-CH2-CO-[4-aminobenzoil]-QWAVGHLM-NH2)(177Lu- AMBA).

Varias patentes y solicitudes de patente se refieren a agonistas de bombesina marcados con metal. Volkert et al. (documento US 2007/0065362 A) reivindican agonistas de bombesina marcados con metal de la estructura general Fraccion de marcaje de metal-Grupo espaciador-Agonista de bombesina para la utilizacion en la formacion de imagenes y terapeutica. Entre otras patentes y solicitudes de patente por los mismos inventores se incluyen US 6.921.526 B (2005), 7.060.247 B y 7.147.838 B (2006) y WO 2002/087631 A1.

Estado de la tecnica

El principio subyacente a la selection de los agonistas como productos radiofarmaceuticos en la totalidad de las publicaciones anteriormente indicadas es que producen o inducen una respuesta de los receptores de GPR con la interaction, en la que el producto radiofarmaceutico a continuation resulta internalizado en la celula mediante endocitosis. Los antagonistas de PLG contrarrestan el efecto de un agonista y no resultan internalizados en la celula y, por lo tanto, se cree que los antagonistas no resultan muy adecuados para la formacion de imagenes radioescintigraficas y la radioterapia. Hasta ahora el consenso ha sido en desarrollar compuestos con buenas propiedades de internalizacion de radioligandos que conduzcan a una elevada acumulacion in vivo de los radioligandos en los tumores, que aparentemente resulta necesaria para la visualization optima y la terapia de radionuclidos in vivo. Es bien conocido a partir de investigaciones moleculares-farmacologicas que habitualmente son los agonistas que predominantemente proporcionan una internalization eficiente (Bodei et al., J. Nucl. Med. 47:375-377, 2006; Koenig et al., Trends Pharmacol. Sci. 18:276-287, 1997; Cescato et al., J. Nucl. Med. 47:502-511, 2006; Ginj et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:16436-16441, 2006), y recientemente se ha demostrado que, en el caso de los receptores de la somatostatina, los antagonistas de receptores de la somatostatina marcados con metales de alta afinidad se internalizan pobremente en las celulas tumorales y que funcionan igual o incluso mejor en terminos de incorporation tumoral in vivo en modelos tumorales animales que los agonistas correspondientes, los cuales se internalizan masivamente. Los receptores de PLG se sobreexpresan en varios neoplasmas (Cornelio et al., Ann. Onco. 18:1457-1466, 2007 y referencias en la misma), tal como el cancer y metastasis de prostata, el cancer y metastasis de mama, tumores estromales gastrointestinales, carcinomas pulmonares de celulas pequenas, carcinomas de celulas renales, tumores neuroendocrinos gastroenteropancreaticos, canceres de cabeza y cuello de celulas escamosas, neuroblastomas y carcinomas esofagicos de celulas escamosas. Los receptores de PLG tambien se expresan en vasos sangulneos asociados a tumor de canceres ovaricos, endometriales y pancreaticos humanos (Fleischmann et al., Cell Onc. 29:421-33, 2007). Por lo tanto, resulta altamente deseable disenar productos radiofarmaceuticos potentes con propiedades antagonistas para la formacion de imagenes y radioterapia.

Jensen et al. (Pharma. Reviews, 2008 (en prensa)) recientemente han revisado la farmacologla de tres subtipos diferentes de receptor de bombesina de entre los que el receptor de PLG pertenece al subtipo 2.

En una publication reciente, Cescato et al. (J. Nucl. Med. 49:318-26, 2008) han demostrado que el antagonista de bombesina marcado con 99mTc-N4 podrla resultar preferente frente a los agonistas para el reconocimiento tumoral.

Las invenciones anteriores en el campo de los compuestos dirigidos con receptor de PLG se describen en los documentos n° WO 2007/109475 A2, n° WO 2007/095443 A2, n° US 2008/0008649 A1 y n° US 7.226.577 B2, con el esquema general que se muestra a continuacion:

Quelante de metales-Conector-Analogo de bombesina

Segun el documento n° WO 2007/095443 A2, la muestra L70, con la secuencia particular 177Lu-DOTA-Gly-4- aminobenzoil-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2 se comporto como un agonista, en el que se midio la incorporacion a las 1 y 24 horas. La incorporacion no es optima para fines terapeuticos y debe mejorarse.

Aparte de dichas patentes y solicitudes, se incluyen estudios precllnicos y cllnicos en las publicaciones (Waser et al., Eur. J. Nucl. Medicine 34:95-100, 2007; J. Nucl. Med. 47:1144-52, 2006).

En virtud de la seleccion de un antagonista con diana en el receptor de GPR en un sitio diferente con alta afinidad, se muestra en la presente invention que una combination de estrategia de espaciadores resulta en una incorporacion tumoral inesperadamente elevada y persistente en combinacion con una baja incorporacion y rapida elimination en organos no diana. En un estudio comparativo, se observo una notable incorporacion mas alta (>2X) al utilizar un conector similar. Partiendo de ensayos in vitro que validaban las propiedades antagonistas de los

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analogos de bombesina se encontro que incluso tras la adicion N-terminal de un espaciador, un quelante y un metal se reteman dichos efectos antagonistas y se tradudan en un excelente comportamiento in vivo de las proporciones de tumor-nivel de fondo.

Por lo tanto, es un objetivo de la presente invention proporcionar nuevos conjugados de antagonista de peptido bombesina que muestran una elevada incorporation y una elevada estabilidad in vivo (suero y tejido humanos).

Sumario

Description de la invencion

En un primer aspecto, la invencion se refiere a conjugados de antagonista de peptido analogo de bombesina que se unen selectivamente a los receptores de bombesina y mas particularmente al receptor de PLG, sin inducir la internalization en la celula y sin senalizar mediante movilizacion del calcio, antagonizando simultaneamente los efectos inducidos por agonistas en dichos dos sistemas, en el que el conjugado antagonista de peptido analogo de la bombesina presenta la formula general (I):

(I) [A-(B)n]x-C

en la que:

x es un numero entero entre 1 y 3, n es un numero entero entre 1 y 6,

A es un quelante de metal que comprende por lo menos un metal radionuclido, preferentemente adecuado para la utilization diagnostica o terapeutica, mas preferentemente para la formation de imagenes o la radioterapia,

B es un espaciador unido al extremo N-terminal de C o un enlace covalente,

C es un antagonista de peptido analogo de bombesina de secuencia C-1 a C-3, en el que:

C-1: Xaa16-Gln7-Trp8-Ala9-Val10-Xaa211-His12-Xaa313-Xaa414-ZH,

en la que:

Xaai es D-Phe, D-Cpa, D-Tyr, D-Trp o un residuo que presenta cualquiera de las formulas indicadas a continuacion:

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K es F, Cl, I o NO2,

Xaa2 es Gly o p-Ala,

Xaa3 es estatina, analogos de estatina e isomeros, 4-Am, 5-MeHpA o 4-Am, 5-MeHxA,

Xaa4 es Leu, Cpa, Cba, CpnA, Cha, t-buGly, tBuAla, Met, Nle o iso-Bu-Gly y Z es NH o O,

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C-2: Xaai6-Gln7-Trp8-Ala9-Val10-Xaa211-His12-LeuY(CHOH-CH2)-(CH2)2-CH3, en la que:

Leu^(CHOH-CH2)-(CH2)2-CH3 es:

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Xaa1 es D-Phe, D-Cpa, D-Tyr, D-Trp o un residuo que presenta cualquiera de las formulas indicadas a continuation:

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y

K es F, Cl, I o NO2,

Xaa2 es Gly o p-Ala,

C-3: Xaa16-Gln7-Trp8-Ala9-Val10-Xaa211-His12-Xaa513-Xaa6

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-ZH,

en la que:

Xaai es D-Phe,

Xaa2 es Gly,

Xaa5 es Leu^-CH2NH-, Xaa6 es Cys o Phe,

y

Z es NH.

La invention se refiere ademas a sales farmaceuticamente aceptables de dichos conjugados de antagonista de peptido analogo de bombesina con un acido inorganico u organico de los mismos y ademas a hidratos, complejos, esteres, amidas y solvatos de dichos compuestos que presentan la formula quimica general (I).

Description A (quelante de metal):

En una forma de realization preferida de la presente invencion, el quelante de metal (A) es un quelante de metal para metales trivalentes o para metales pentavalentes y los analogos proximos de los mismos.

Preferentemente, el quelante de metales (A) para metales trivalentes se selecciono de entre el grupo que comprende: quelantes basados en DOTA-, NODASA-, NODAGA-, NOTA-, DTPA-, EDTA-, TETA- y TRITA- y los analogos proximos de los mismos,

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en el que:

DOTA se refiere a acido 1,4,7,10-tetrazaciclododecano-N,N',N'',N'''-tetraacetico,

DTPA se refiere a acido dietilentriaminapenta-acetico,

EDTA se refiere a acido etilendiamina-N,N'-tetraacetico,

TETA se refiere a acido 1,4,8,11-tetraazaciclododecano-1,4,8,11-tetraacetico y NOTA se refiere a acido 1,4,7-triazaciclononatriacetico.

Mas preferentemente, el quelante de metal (A) para metales trivalentes se selecciona de entre el grupo que comprende:

quelantes basados en DOTA-, NOTA-, DTPA- y TETA- y analogos proximos de los mismos.

Las estructuras de dichos ligandos quelantes en su forma totalmente desprotonada se muestran a continuacion:

imagen4

Todavia mas preferentemente, el quelante de metal (A) para metales trivalentes se selecciona de entre el grupo que comprende DTPA (acido dietilentriaminapentaacetico) y macrociclos poliaza-policarboxilato, tal como DOTA (acido 1,4,7,10-tetrazaciclododecano-N,N',N'',N'''-tetraacetico).

Preferentemente, el quelante de metal (A) para metales pentavalentes se selecciona de entre el grupo que comprende 2-hidrazino-nicotinamida (HYNIC), quelantes N4, N4-X (N4 puede ser lineal o macrociclico y X puede ser una azida amina, OH, halogeno, o-, m-, p-amino-bencil-metaparacarboxibencilo y carboxi (Nock B. et al., [99mTc]Demobesina 1, un nuevo analogo de bombesina para la formacion de imagenes tumorales con diana en receptor de PLG, Eur. I. Nucl. Mol. Imaging 30:247-258, 2003), desferrioxamina (DFO) y quelantes NrS(4_r), y

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en la que:

R1 a R15 son, independientemente uno de otro, otros atomos de hidrogeno o grupos alquilo C1-C4, en la que, en la

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fraccion de la formula anteriormente indicada, t es 1 o 2 o 3 y por lo menos uno de los atomos de carbono en dicha

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fraccion se encuentra sustituido por Y o no se encuentra sustituido por Y,

Ri6 es un atomo de hidrogeno o un grupo alquilo CO2-alquilo C1-C4,

R17 y R18 son, independientemente uno de otro, grupos alquilo C1-C4 o grupos fenilo,

R1g es CH2-COOH o un derivado funcional del mismo,

E es alquileno C1-C4 o fenileno,

opcionalmente alquileno C1-C4 se sustituye con CO2-alquilo, CH2-CO-alquilo, CONH2 o CONHCH2-CO2-alquilo,

opcionalmente fenileno se sustituye con CO2-alquilo,

en el que los grupos alquilo presentan 1 a 4 atomos de carbono,

G es NH o S,

Y es un grupo funcional capaz de union a un grupo amino libre del peptido (N-terminal) o con el espaciador, y Z' es S o O.

El quelante N4 preferentemente es:

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en el que:

m se refiere a un numero entero entre 1 y 4.

Se define el quelante NrS(4-r) en el que r es un numero entero entre 1 y 4.

Dicho grupo funcional Y preferentemente comprende isocianato, isotiocianato, formilo, halonitrofenilo, diazonio, epoxi, tricloro-s-triazinilo, etilenimino, clorosulfonilo, alcoxicarbimidoilo, alquilcarboniloxicarbonilo (sustituido o no sustituido), alquilcarbonilimidazolilo, succinimido-oxicarbonilo, estando dicho grupo unido a un birradical hidrocarburo C1-C10. Son ejemplos adecuados de birradicales hidrocarburo los birradicales derivados de benceno, alcanos C1-C6, alquenos C2-C6 y alquilbencenos C1-C4.

Preferentemente los quelantes NtS(4-t) se seleccionan de entre el grupo que comprende quelantes basados en bisamino bistiol (BAT) para el metal radionuclido tecnecio, mercapto-acetil-glicil-glicil-glicina (MAG3) para el metal radionuclido tecnecio. Mas preferentemente, el quelante de metal (A) para metales pentavalentes se selecciona de

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entre el grupo que comprende:

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en la que R -R , Z', Y, G y t se definen tal como anteriormente.

Preferentemente, r es un numero entero entre 2 y 4, y mas preferentemente r es 2 o 3.

Preferentemente, m se refiere a un numero entero entre 1 y 2, mas preferentemente m es 1.

Se dan a conocer quelantes de metal bien conocidos, tales como quelantes lineales, macrociclicas, tetrapiridina y N3S, N2S2 o N4, en los documentos US 5.367.080 A, US 5.364.613 A, US 5.021.556 A, US 5.075.099 A y US 5.886.142 A.

Se dan a conocer quelantes de metal, tales como los quelantes basados en HYNIC, DTPA, EDTA, DOTA, TETA, bisamino bistiol (BaT) en el documento US 5.720.934 A.

Se dan a conocer quelantes de metal bien conocidos, tales como desferrioxamina (DFO) en Doulias et al., Endosomal and lysosomal effects of desferrioxamine: protection of HeLa cells from hydrogen peroxide-induced DNA damage and induction of cell-cycle arrest, Free Radic. Biol. Med. 35(7):719-28, 2003.

Se encuentra disponible una amplia diversidad de agentes quelantes que ha sido revisada por Banerjee et al. (Nucl. Med. and Biology 32:1-20, 2005, y referencias en la misma).

La 2-hidrazino-nicotinamida (HYNIC) es otra clase de grupo quelante (A) que en presencia de un coligando ha sido ampliamente utilizada para la incorporacion de 99mTc y 186,188Re (Schwartz et al., Bioconj. Chem. 2:333-6, 1991; Babich et al., J. Nucl. Med. 34:1964-70, 1993; Nucl. Med. Biol. 22:25-30, 1995; Nucl. Med. Biol. 22, 32, 1-10, 1995).

Se utiliza DTPA en Octreoscan® (comercializado por Covidian) para el acomplejamiento de In y se describen varias modificaciones en la literatura (Brechbiel et al., Biocon. Chem. 2:187-194, 1991; Li et al., Nucl. Med. Biol. 28:145-154, 2001).

Los quelatos de tipo DOTA para aplicaciones de radioterapia se describen en Tweedle et al., patente US n° 4.885.363. Se describen otros macrociclos poliaza para quelar metales isotopos trivalentes en Macke et al., Bioconj. Chem. 13:530, 2002.

Los quelantes N4 y el quelante 99mTc-N4 han sido utilizados para el marcaje peptidico en el caso de la minigastrina para el reconocimiento de receptores de CCK-2 (Nock et al., J. Nucl. Med. 46:1727-36, 2005).

En una forma de realizacion preferida de la presente invencion, el metal radionuclido resulta adecuado para el acomplejamiento del mismo con un quelante de metal y que conduce a producir un quelante de metal radioactivo

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para la formation de imagenes. Preferentemente, el metal radionuclido se selecciona de entre el grupo que comprende 133mIn, 99mTc, 67Ga, 52Fe, 68Ga, 72As, 111In, 97Ru, 203Pb, 62Cu, 64Cu, 51Cr, 52mMn, 157Gd, 123I, 124I, 131I, 75Br,

76Br, 77Br, 64Cu y 82Br. Mas preferentemente, el metal radionuclido se selecciona de entre el grupo que comprende 99mTc, 67Ga, 68Ga, 111In y 123I. Todavia mas preferentemente, el metal radionuclido es 68Ga. Todavia mas preferentemente el metal radionuclido es 99mTc.

En una forma de realization preferida de la presente invention, el metal radionuclido resulta adecuado para el acomplejamiento con un quelante de metal y conduce a un quelante de metal radioactivo para la radioterapia. Preferentemente, el metal radionuclido se selecciona de entre el grupo que comprende 186Re, 90Y, 67Cu, 68Ga, 69Er,

121Sn, 127Te, 142Pr, 143Pr, 198Au, 199Au, 161Tb, 109Pd, 188Rd, 186Re, 188Re, 77As, 166Dy, 166Ho, 149Pm, 151Pm, 153Sm, 159Gd, 172Tm, 90Y, 111In, 169Yb, 175Yb, 177Lu, 105Rh, 111Ag, 125I, 123I, 213Bi, 225Ac, 129I, 64Cu y 177mSn. Mas preferentemente, el metal radionuclido se selecciona de entre el grupo que comprende 186Re, 188Re, 90Y, 153Sm, 68Ga y 177Lu.

En una alternativa adicional del primer aspecto, el metal radionuclido adecuado es un halogeno radioactivo (isotopos de yodo y bromo), el halogeno radioactivo se une directamente al peptido, tal como mediante reaction quimica a una fraction de Tyr o Trp dentro del peptido, u opcionalmente A puede ser Tyr o Trp.

Los agentes radiodiagnosticos preferentes (67Ga, 111In) y agentes radioterapeuticos (90Y, 153Sm, 177Lu) opcionalmente contienen un ion metalico +3 quelado de la clase de elementos conocida como lantanidos. Entre los metales radioactivos tipicos en esta clase se incluyen los isotopos 90Itrio, 111Indio, 149Prometio, 153Samario, 166Disprosio, 166Holmio, 175Iterbio y 177Lutecio. La totalidad de dichos metales (y otros en la serie de los lantanidos) presentan quimicas muy similares, en el aspecto de que se mantienen en el estado de oxidation +3 y prefieren quelarse con ligandos que portan atomos donantes duros (oxigeno/nitrogeno).

Description B (espaciador):

B es un espaciador unido en el lado N-terminal de C o mediante un enlace covalente.

En una forma de realizacion preferida de la presente invencion, B es un compuesto que presenta la formula (II): II B1-B2

en la que:

B1 es un enlace covalente, un aminoacido natural, un aminoacido no natural, una diamina lineal o una diamina ciclica,

B2 es un enlace covalente, un aminoacido natural, un aminoacido no natural, un acido carboxilico lineal o un acido carboxilico ciclico,

con la condition de que Bi y B2 no pueden ser enlaces covalentes simultaneamente y, en el caso de que Bi es una diamina, B2 es un acido carboxilico (es decir, B2 no puede ser un enlace o un aminoacido natural o no natural en este caso).

Preferentemente, el aminoacido no natural es un compuesto que presenta cualquiera de las formulas (III), (IV), (V) o (VI),

en las que:

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en la que:

a es un numero entero entre 0 y 3, b es un numero entero entre 0 y 3,

y patrones de sustitucion relativos u opcionalmente 1,2-, 1,3- o 1,4- Preferentemente,

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a es 0 o 1, b es 0 o 1,

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en la que:

c es un numero entero entre 1 y 24, d es un numero entero entre 1 y 6.

Preferentemente,

c es un numero entero entre 1 y 15, mas preferentemente c es entre 1 y 8, d es un numero entero entre 1 y 3, mas preferentemente d es 1.

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en la que:

E' es NH o CH2,

f es un numero entero entre 0 y 6, g es un numero entero entre 0 y 6,

en el caso de que E' sea CH2, el anillo de 6 elementos se sustituye opcionalmente en cualquier posicion de carbono del anillo de 6 elementos en el mismo carbono del anillo o en diferentes carbonos,

en el caso de que E' sea NH, el anillo de 6 elementos se sustituye opcionalmente en cualquier posicion de carbono del anillo de 6 elementos en el mismo atomo de carbono del anillo o en diferentes atomos de carbono y/o en el atomo de nitrogeno con la condicion de que f o g sea un numero entero igual o superior a 1.

Preferentemente,

E' es NH,

f es un numero entero entre 0 y 3, g es un numero entero de 0 y 3,

en la que:

i es un numero entero entre 1 y 6, j es un numero entero entre 1 y 6, P es O o H2.

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Preferentemente, i es un numero entero entre 1 y 3, j es un numero entero entre 1 y 3,

P es O.

Mas preferentemente, el espaciador se selecciona de entre el grupo que comprende 4-amino-1- carboximetilpiperidina, acido (R,S)-diaminoacetico, PEG1-24, Sar5-10, acido 8-aminooctanoico, acido 6- aminocaproico, 4-(2-aminoetil)-1-carboximetil-piperazina, acido diaminobutlrico, acido hipurico, acido 4-amino-1- Boc-piperidln-4-carboxllico, acido Gly-aminobenzoico, acido 5-amino-3-oxa-pentil-succinamico, Peg1-24-4-amino- 1-carboximetil-piperidina, Dab(acido shiklmico), (D-Gln)x, (D-Asn)x.

Description C (secuencia del antagonista de peptido analogo de bombesina)

En una forma de realization preferida de la presente invention, la secuencia del antagonista del peptido analogo de bombesina se selecciona de entre el grupo que comprende C-1 a C-3, preferentemente C-1 a C-2.

Preferentemente, la secuencia del antagonista del peptido analogo de bombesina se selecciona de entre el grupo que comprende:

Sec. del compuesto 1: D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2,

Sec. del compuesto 9: D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu^(CHOH-CH2)-(CH2)2-CH3,

Sec. del compuesto 12: D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu^(CH2NH)-Phe-NH2,

Sec. del compuesto 13: D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu^(CH2NH)-Cys-NH2.

Preferentemente, el conjugado de antagonista del peptido analogo de bombesina que presenta la formula (I) que comprende por lo menos un metal radionuclido se selecciona de entre el grupo que comprende:

compuesto 1: DOTA-Gly-aminobenzoil-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2,

compuesto 2: DOTA-4-amino-1-carboximetil-piperidln-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2,

compuesto 3: acido DOTA-4-amino-1-piperidln-4-carboxllico-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2,

compuesto 4: acido DOTA-15-amino-4,7,10,13-tetraoxapentadecanoico-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu- NH2,

compuesto 5: acido DOTA-(15-amino-4,7,10,13-tetraoxapentadecanoico)-(4-amino-1-carboximetil-piperidln)-D- Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2,

compuesto 6: acido DOTA-diaminobutlrico-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2,

compuesto 7: DOTA-4-(2-aminoetil)-1-carboximetil-piperazln-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2,

compuesto 8: acido DOTA-(5-amino-3-oxa-pentil)-succinamico-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2,

compuesto 9: DOTA-4-amino-1-carboximetil-piperidln-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu^(CHOH-CH2)-(CH2)2- CH3,

compuesto 10: acido DOTA-(15-amino-4,7,10,13-tetraoxapentadecanoico-4-amino-1-carboximetil-piperidln-D- Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu^(CHOH-CH2)-(CH2)2-CHa,

compuesto 11: acido DOTA-15-amino-4,7,10,13-tetraoxapentadecanoico-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His- Leu^(CHOH-CH2)-(CH2)2-CHa,

compuesto 12: DOTA-4-amino-1-carboximetil-piperidln-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu^(CH2NH)-Phe-NH2, compuesto 13: DOTA-4-amino-1-carboximetil-piperidln-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu^(CH2NH)-Cys-NH2, compuesto 14: N4-triazolas-dPEG1-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2.

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Otras formas de realizacion preferidas:

En una forma de realizacion preferida de la presente invencion, para el compuesto que presenta la formula (I), x es un numero entero entre 1 y 2, preferentemente x es 1.

En el caso de que x sea igual o superior a 2, (B)n es un espaciador lineal o un espaciador ramificado unido al extremo N-terminal del antagonista del peptido analogo de bombesina (C).

En una forma de realizacion preferida de la presente invencion, para el compuesto que presenta la formula (I), n es un numero entero entre 1 y 4, preferentemente n es 1 o 3, mas preferentemente 1.

En una forma de realizacion preferida de la presente invencion, para el compuesto que presenta la formula (I), A es adicionalmente un quelante de metal que comprende por lo menos un atomo de metal en frlo correspondiente o equivalente al metal radionuclido listado anteriormente. Dichos compuestos resultan utiles para los ensayos de union in vitro in vivo y como compuestos de referencia. Las formas de realizacion preferidas listadas anteriormente resultan de aplicacion en este caso.

En una forma de realizacion preferida de la presente invencion, para los compuestos que presentan la formula (I), K es adicionalmente H o preferentemente H.

En un segundo aspecto, la invencion se refiere a precursores de conjugado de antagonista de peptido analogo de la bombesina que se unen selectivamente a los receptores de bombesina y que mas particularmente se unen al receptor de PLG sin inducir la internalizacion en la celula y sin senalizar mediante la movilizacion del calcio, antagonizando simultaneamente los efectos inducidos por agonista en dichos dos sistemas, en donde el conjugado de antagonista de peptido analogo de la bombesina presenta la formula (I') a continuacion:

(I') [A'-(B)n]x-C

en la que:

x es un numero entero entre 1 y 3, n es un numero entero entre 1 y 6,

A' es un quelante de metal,

B es un espaciador unido al lado N-terminal de C o un enlace covalente,

C es un antagonista de peptido analogo de la bombesina de secuencia C-1 a C-3.

El quelante de metal A' es un quelante de metal libre de metal radionuclido tal como se define en el primer aspecto para A.

El espaciador B y el antagonista C de peptido analogo de la bombesina se definen tal como anteriormente, en el primer aspecto.

La invencion se refiere ademas a sales farmaceuticamente aceptables de los conjugados de antagonista de peptido analogo de bombesina de un acido inorganico u organico del mismo y a hidratos, complejos, esteres, amidas, solvatos y profarmacos de dichos compuestos que presentan la formula qulmica general (I').

En una forma de realizacion preferida de la presente invencion, x es un numero entero entre 1 y 2, preferentemente x es 1. En el caso de que x sea igual o superior a 2, (B)n es un espaciador lineal o un espaciador ramificado unido al lado N-terminal del antagonista del peptido analogo de la bombesina (C).

En una forma de realizacion preferida de la presente invencion, en la formula (I'), n es un numero entero entre 1 y 4, preferentemente n es 1 o 3, mas preferentemente es 1.

En un tercer aspecto, la invencion se refiere a una composicion farmaceutica que comprende conjugados de antagonista de peptido analogo de la bombesina que presentan la formula (I) o (I') y un portador farmaceuticamente aceptable.

En un cuarto aspecto, la invencion se refiere a la utilizacion de conjugados de antagonista de peptido analogo de la bombesina que presentan la formula (I) o (I') para la union a receptores de bombesina y mas particularmente a receptor de peptido liberador de gastrina (PLG) y/o para la inhibicion de receptores de la bombesina y mas particularmente al receptor del peptido liberador de gastrina (PLG).

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En un quinto aspecto, la invencion se refiere a un metodo para la preparacion de un conjugado de antagonista de peptido analogo de la bombesina que presenta la formula general (I):

(I) [A-(B)n]x-C

en la que n, x, A, B y C son tal como se ha definido anteriormente, que comprende la etapa de:

- radioquelacion del conjugado de antagonista de peptido analogo de la bombesina que presenta la formula general (I') tal como se ha definido anteriormente con un metal radionuclido o atomo de metal adecuado correspondiente a los metales radionuclidos listados anteriormente.

Preferentemente, el metodo para la preparacion de un conjugado de antagonista de peptido analogo de la bombesina que presenta la formula general (I) comprende la etapa de radioquelar con un metal radionuclido adecuado.

En una forma de realizacion adicional, el metodo para la preparacion de un conjugado de antagonista de peptido analogo de la bombesina presenta la formula general (I):

(II) [A-(B)n]x-C

en la que n, x, A, A', B y C se han definido anteriormente, comprende adicionalmente las etapas siguientes:

a) acoplamiento de un espaciador B a un antagonista de peptido analogo de la bombesina C para la obtencion de espaciador-antagonista de peptido analogo de la bombesina de secuencia C-1 a C-3, opcionalmente repitiendo la etapa a), y

b) acoplamiento de espaciador-antagonista de peptido analogo de la bombesina con un quelante de metal A' para la obtencion de conjugado de antagonista de peptido analogo de la bombesina que presenta la formula general (I'), opcionalmente repitiendo la etapa b),

produciendose las etapas anteriormente indicadas antes del radioquelado del conjugado de antagonista de peptido analogo de la bombesina que presenta la formula general (I') con un metal radionuclido o atomo de metal adecuado correspondiente o equivalente a un metal radionuclido listado anteriormente.

En una forma de realizacion preferida de la presente invencion, n, x, el quelante de metal A, el quelante de metal A', el espaciador B y el antagonista de peptido analogo de la bombesina C son tal como se ha definido anteriormente.

En un sexto aspecto, la invencion se refiere a un metodo para la formation de imagenes de receptores de la bombesina y mas particularmente a celulas tumorales y/o vasos tumorales y peritumorales que expresan receptor de PLG en un paciente, comprendiendo las etapas siguientes:

- administration en un paciente de una cantidad eficaz de producto radiofarmaceutico de un conjugado de antagonista de peptido analogo de bombesina que presenta la formula (I), y

- obtencion de imagenes del metal radionuclido en el paciente.

Una forma de realizacion preferida del sexto aspecto se refiere a la utilization de una cantidad radiofarmaceuticamente eficaz de un conjugado de antagonista de peptido analogo de la bombesina que presenta la formula (I) para la preparacion de un agente de formacion de imagenes para obtener imagenes de receptores de bombesina y mas particularmente de celulas tumorales y/o vasos tumorales o peritumorales que expresan el receptor de PLG.

En una forma de realizacion preferida, las celulas tumorales se refieren a canceres que se seleccionan de entre el grupo que comprende:

- cancer de prostata, incluyendo metastasis,

- cancer de mama, incluyendo metastasis,

- tumores estromales gastrointestinales,

- carcinomas pulmonares de celulas pequenas,

- carcinomas de celulas renales,

- tumores neuroendocrinos gastroenteropancreaticos,

- canceres de cabeza y cuello de celulas escamosas,

- neuroblastomas y

- carcinomas esofagicos de celulas escamosas.

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Todavla mas preferentemente, celulas tumorales se refiere a canceres seleccionados de entre:

- cancer de prostata, incluyendo metastasis, y

- cancer de mama, incluyendo metastasis.

En una forma de realizacion preferida adicional, vasos tumorales y peritumorales se refiere a canceres seleccionados de entre:

- canceres ovaricos,

- canceres endometriales y

- canceres pancreaticos.

Preferentemente, los vasos tumorales y peritumorales se refieren a canceres ovaricos.

Una forma de realizacion preferida se refiere a la utilizacion de una cantidad terapeuticamente eficaz de un conjugado de antagonista de peptido analogo de la bombesina que presenta la formula (I) para la preparacion de un medicamento para el tratamiento o la prevencion de enfermedades relacionadas con celulas tumorales y/o vasos tumorales y peritumorales.

En una forma de realizacion preferida, las enfermedades relacionadas con celulas tumorales se refieren a canceres seleccionados de entre el grupo que comprende:

- cancer de prostata, incluyendo metastasis,

- cancer de mama, incluyendo metastasis,

- tumores estromales gastrointestinales,

- carcinomas pulmonares de celulas pequenas,

- carcinomas de celulas renales,

- tumores neuroendocrinos gastroenteropancreaticos,

- canceres de cabeza y cuello de celulas escamosas,

- neuroblastomas y

- carcinomas esofagicos de celulas escamosas.

Todavla mas preferentemente, las enfermedades relacionadas con celulas tumorales se refieren a canceres seleccionados de entre el grupo que comprende:

- cancer de prostata, incluyendo metastasis, y

- cancer de mama, incluyendo metastasis.

En una forma de realizacion preferida adicional, las enfermedades relacionadas con vasos tumorales y peritumorales se refieren a canceres seleccionados de entre el grupo que comprende:

- canceres ovaricos,

- canceres endometriales y

- canceres pancreaticos.

Preferentemente, las enfermedades relacionadas con vasos tumorales y peritumorales se refieren a canceres ovaricos.

En un septimo aspecto, la invencion se refiere a un kit para la preparacion de un agente radioterapeutico o un agente radiofarmaceutico de formacion de imagenes que presenta la formula (I), comprendiendo el kit un vial que contiene una cantidad predeterminada de conjugado de antagonista de peptido analogo de la bombesina de formula (I') y un portador, diluyente, excipiente o adyuvante aceptable para el radiomarcaje de un quelante de metal.

En un octavo aspecto, la invencion se refiere a un antagonista de peptido analogo de bombesina de secuencia C-1 a C-2, en el que:

C-1: Xaai6-Gln7-Trp8-Ala9-Val10-Xaa211-His12-Xaa313-Xaa414-ZH,

en la que:

Xaa1 es D-Phe, D-Cpa, D-Tyr, D-Trp o un residuo que presenta cualquiera de las formulas indicadas a continuacion:

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K es F, Cl, I o NO2,

Xaa2 es Gly o p-Ala,

Xaa3 es estatina, analogos e isomeros de la estatina, 4-Am,5-MeHpA o 4-Am,5-MeHxA, Xaa4 es Leu, Cpa, Cba, CpnA, Cha, t-buGly, tBuAla, Met, Nle o iso-Bu-Gly y Z es NH o O,

C-2: Xaai 6-Gln7-Trp8-Ala9-Val10-Xaa2 11-His12-Leu^(CHOH-CH2)-(CH2)2-CH3,

en la que:

LeuY(CHOH-CH2)-(CH2)2-CH3 es:

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y

K es F, Cl, I o NO2,

Xaa2 es Gly o p-Ala,

C-3: Xaa16-Gln7-Trp8-Ala9-Val10-Xaa211-His12-Xaa513-Xaa614-XH,

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en la que:

Xaa1 es D-Phe,

Xaa2 es Gly,

Xaa5 es Leu^-C^NH-,

Xaa6 es Cys o Phe,

y

Z es NH.

Definiciones

Tal como se utiliza a continuation en la presente memoria, en la description de la invention y en las

reivindicaciones, el termino "alquilo", por si mismo o como parte de otro grupo, se refiere a un grupo alquilo de

cadena lineal o de cadena ramificada con 1 a 20 atomos de carbono, tal como, por ejemplo, metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, terc-butilo, pentilo, isopentilo, neopentilo, heptilo, hexilo y decilo. Los grupos alquilo tambien pueden encontrarse sustituidos, tal como con atomos de halogeno, grupos hidroxilo, grupos alcoxi C1-C4 o grupos arilo C6-C12. Mas preferentemente, el alquilo es alquilo C1-C10, alquilo C1-C6 o alquilo C1-C4.

Tal como se utiliza a continuacion en la presente memoria, en la descripcion de la invencion y en las

reivindicaciones, la expresion "alquil(eno) inferior ramificado o no ramificado" presenta el significado siguiente: un radical monovalente, divalente o trivalente de cadena lineal o ramificada sustituido o no sustituido que consiste en carbonos e hidrogenos, que no contiene ninguna insaturacion y que presenta entre uno y ocho atomos de carbono, por ejemplo, aunque sin limitation, metilo, etilo, n-propilo, n-pentilo, 1, 1 -dimetiletilo (t-butilo), n-heptilo y similares. Dicha fraction puede encontrarse sustituida o no sustituida, tal como con atomos de halogeno, atomos de hidroxilo, grupos alcoxi C1-C4 o grupos arilo C6-C12.

reivindicaciones, el termino "fenileno" se basa en un anillo de benceno disustituido u opcionalmente trisustituido. Por ejemplo, poli(p-fenileno) es un pollmero construido a partir de unidades repetidas para-fenileno. El fenileno puede encontrarse sustituido o no sustituido. Puede encontrarse sustituido con halogeno, OH, alcoxi, preferentemente alcoxi C1-C4, carboxi, ester, preferentemente ester C1-C4, amida y nitro.

reivindicaciones, el termino "alqueno" presenta el significado siguiente: un compuesto qulmico alifatico o aliclclico insaturado que contiene por lo menos un doble enlace carbono-carbono. Los alquenos aclclicos mas simples, con unicamente un doble enlace y ningun otro grupo funcional, forman una serie homologa de hidrocarburos con la formula general CnH2n, por ejemplo etileno (C2H4) y propileno (C3H6). Los alquenos puede encontrarse sustituidos o no sustituidos. En el caso de que el alqueno se encuentre sustituido, puede encontrarse sustituido con atomos de halogeno, grupos hidroxilo, grupos alcoxi C1-C4, grupos arilo C6-C12 o similares.

reivindicaciones, el termino "arilo" presenta el significado de sistema de anillos insaturado, preferentemente un sistema de anillos aromaticos, mas preferentemente con 6 a 12 atomos de carbono en el esqueleto del anillo. Son ejemplos de lo anterior, fenilo y naftalenilo. Las fracciones arilo puede encontrarse sustituidas o no sustituidas, tal

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como con atomos de halogeno, grupos hidroxilo, grupos alcoxi C1-C4 o grupos arilo C6-C12.

reivindicaciones, el termino "benceno" presenta el significado siguiente: un compuesto qulmico organico con la formula C6H6. Un benceno es un hidrocarburo aromatico y el segundo [n]-anuleno ([6]-anuleno), un hidrocarburo clclico con un enlace pi continuo. El benceno puede encontrarse sustituido o no sustituido, tal como con atomos de halogeno, grupos hidroxilo, grupos alcoxi C1-C4 o grupos arilo C6-C12.

reivindicaciones, los terminos "alquenilo" y "alquinilo" se definen de manera similar al alquilo, aunque contienen por lo menos un doble o triple enlace carbono-carbono, respectivamente. El alquenilo puede ser mas preferentemente alquenilo C2-C6 y el alquinilo puede ser mas preferentemente alquinilo C2-C6.

reivindicaciones, el termino "halogeno" presenta el significado de F, Cl, Br o I.

reivindicaciones, las expresiones "sales de acidos organicos o inorganicos", "acido inorganico" y "acido organico" se refieren a acidos minerales, incluyendo, aunque sin limitacion, acidos tales como los acidos carbonico, nltrico, fosforico, clorhldrico, perclorico o sulfurico o las sales acidas de los mismos, tales como las sales de potasio, sodio, calcio o magnesio, por ejemplo hidrogenosulfato de potasio, o a acidos organicos apropiados, entre los que se incluyen, aunque sin limitacion, acidos tales como los acidos alifatico, cicloalifatico, aromatico, aralifatico, heteroclclico, carboxllico y sulfonico, ejemplos de los cuales son los acidos formico, acetico, trifluoroacetico, propionico, succlnico, glicolico, gluconico, lactico, malico, fumarico, piruvico, benzoico, antranllico, mesllico, fumarico, salicllico, fenilacetico, mandelico, embonico, metanosulfonico, etanosulfonico, bencenosulfonico, pantotenico, toluenosulfonico, trifluorometanosulfonico y sulfanllico, respectivamente. De manera similar, los acidos organicos tambien pueden encontrarse presentes en forma de las sales de los mismos, tales como sales de potasio, sodio, calcio o magnesio.

reivindicaciones, la expresion "sal farmaceuticamente aceptable" se refiere a sales de acidos inorganicos y organicos, tales como acidos minerales, incluyendo, aunque sin limitacion, acidos tales como los acidos carbonico, nltrico o sulfurico, o acidos organicos, incluyendo, aunque sin limitacion, acidos tales como los acidos alifatico, cicloalifatico, aromatico, aralifatico, heteroclclico, carboxllico y sulfonico, ejemplos de los cuales son acidos formico, acetico, trifluoroacetico, propionico, succlnico, glicolico, gluconico, lactico, malico, fumarico, piruvico, benzoico, antranllico, mesllico, salicllico, fenilacetico, mandelico, embonico, metanosulfonico, etanosulfonico, bencenosulfonico, pantotenico, toluenosulfonico y sulfanllico.

reivindicaciones, las expresiones "secuencia de aminoacidos" y "peptido" se definen en la presente memoria como una poliamida obtenible mediante (poli)condensacion de por lo menos dos aminoacidos.

reivindicaciones, el termino "aminoacido" se refiere a cualquier molecula que comprende por lo menos un grupo

amino y por lo menos un grupo carboxilo, aunque sin ningun enlace peptldico dentro de la molecula. En otras palabras, un aminoacido es una molecula que presenta una funcionalidad acido carboxllico y un nitrogeno de amina que presenta por lo menos un hidrogeno libre, preferentemente en posicion alfa, pero ningun enlace amida en la estructura de la molecula. De esta manera, un dipeptido que presenta un grupo amino libre en el extremo N-terminal y un grupo carboxilo libre en el extremo C-terminal no debe considerarse una unico "aminoacido" en la definicion anteriormente proporcionada. El enlace amida entre dos residuos aminoacidos contiguos que se obtiene a partir de dicha condensacion se denomina "enlace peptldico".

Un enlace amida tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a cualquier enlace covalente que presenta la estructura siguiente:

-C(=O)-NH-CH- o -HC-HN-(O=)C-

en la que una molecula proporciona el grupo carbonilo y la otra molecula que debe unirse proporciona el grupo NH. Un enlace amida entre dos residuos aminoacidos contiguos que se obtiene a partir de dicha policondensacion se define como un "enlace peptldico". Opcionalmente, los atomos de nitrogeno del esqueleto poliamida (indicado como NH anteriormente) puede alquilarse independientemente, por ejemplo con -alquilo C1-C6, preferentemente con -CH3.

Tal como se utiliza a continuacion en la presente memoria, en la descripcion de la invencion y en las reivindicaciones, se deriva un residuo aminoacido del aminoacido correspondiente mediante la formacion de un enlace peptldico con otro aminoacido.

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Tal como se utiliza a continuacion en la presente memoria, en la descripcion de la invencion y en las reivindicaciones, un aminoacido es un aminoacido natural o no natural, en el que los aminoacidos no naturales son residuos aminoacidos sinteticos/artificiales, o residuos aminoacidos proteinogenos y/o no proteinogenos. Los residuos aminoacidos no proteinogenos pueden clasificarse ademas como (a) homoanalogos de aminoacidos proteinogenos, (b) p-homoanalogos de residuos aminoacidos proteinogenos y (c) residuos aminoacidos no proteinogenos adicionales.

De acuerdo con lo anteriormente expuesto, los residuos aminoacidos se obtienen a partir de los aminoacidos correspondientes, por ejemplo de aminoacidos proteinogenos, es decir, Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val, o

aminoacidos no proteinogenos, tales como homoanalogos de aminoacidos proteinogenos, en los que la cadena lateral se ha extendido con un grupo metileno, por ejemplo homoalanina (Hal), homoarginina (Har), homocistelna (Hcy), homoglutamina (Hgl), homohistidina (Hhi), homoisoleucina (Hil), homoleucina (Hle), homolisina (Hly), homometionina (Hme), homofenilalanina (Hph), homoprolina (Hpr), homoserina (Hse), homotreonina (Hth), homotriptofano (Htr), homotirosina (Hty) y homovalina (Hva),

Los p-homoanalogos de aminoacidos proteinogenos, en los que se ha insertado un grupo metileno entre el carbono a y el grupo carboxilo, proporcionando p-aminoacidos, por ejemplo p-homoalanina (pHal), p-homoarginina (pHar), p- homoasparagina (pHas), p-homocistelna (pHcy), p-homoglutamina (pHgl), p-homocistidina (pHhi), p-homoisoleucina (pHil), p-homoleucina (pHle), p-homolisina (pHly), p-homometionina (pHme), p-homofenilalanina (pHph), p- homoprolina (pHpr), p-homoserina (pHse), p-homotreonina (pHth), p-homotriptofano (pHtr), p-homotirosina (pHty) y p-homovalina (pHva),

son aminoacidos no proteinogenos adicionales, por ejemplo, a-aminoadlpico (Aad), acido p-aminoadlpico (p Aad), acido a-aminobutlrico (Abu), acido a-aminoisobutlrico (Aib), p-alanina (pAla), acido 4-aminobutlrico (4-Abu), acido 5aminovalerico (5-Ava), acido 6-aminohexanoico (6-Ahx), acido 8-aminooctanoico (8-Aoc), acido 9-aminononanoico (9-Anc), acido 10-aminodecanoico (10-Adc), acido 12-aminododecanoico (12-Ado), acido a-aminosuberico (Asu), acido azetidln-2-carboxllico (Aze), p-ciclohexilalanina (Cha), citrulina (Cit), deshidroalanina (Dha), acido y- carboxiglutamico, a-ciclohexilglicina (Chg), propargilglicina (Pra), acido piroglutamico(Glp), a-terc-butilglicina (Tle), 4- benzoilfenilalanina (Bpa), 5-hidroxilisina (Hyl), 4-hidroxiprolina (Hyp), aloisoleucina (alle), lantionina (Lan), (1- naftil)alanina (1-Nal), (2-naftil)alanina (2-Nal), norleucina (Nle), norvalina (Nva), ornitina (Orn), fenilglicina (Phg), acido pipecolico (Pip), sarcosina (Sar), selenocistelna (Sec), estatina (Sta), p-tienilalanina (Thi), acido 1,2,3,4- tetrahidroisoquinolln-3-carboxllico (Tic), alotreonina (aThr), acido tiazolidln-4-carboxllico (Thz), acido Y-aminobutlrico (GABA), isocistelna (iso-Cys), acido diaminopropionico (Dpr), acido 2,4-diaminobutlrico (Dab), acido 3,4- diaminobutlrico (YpDab), bifenilalanina (Bip), fenilalanina sustituida en posicion para con alquilo C1-C6, -haluro, -NH2, -CO2H o Phe(4-R) (en la que R=alquilo C1-C6, -haluro, -NH2 o -CO2H), acidos peptido nucleicos (APN, ver P.E. Nielsen, Acc. Chem. Res. 32:624-30) o analogos N-alquilados de los mismos, tales como los analogos N-metilados de los mismos.

Los aminoacidos clclicos pueden ser proteinogenos o no proteinogenos, tales como Pro, Aze, Glp, Hyp, Pip, Tic y Thz.

Para mas ejemplos e informacion, puede hacerse referencia a, por ejemplo, J.H. Jones, J. Peptide Sci. 9:1-8, 2003, cuya exposicion se incorpora como referencia en su totalidad a la presente memoria.

Tal como se utiliza a continuacion en la presente memoria, en la descripcion de la invencion y en las reivindicaciones, las expresiones "aminoacido no proteinogeno" y "residuo aminoacido no proteinogeno" comprenden ademas derivados de aminoacidos proteinogenos. Por ejemplo, la cadena lateral de un residuo aminoacido proteinogeno puede derivatizarse, convirtiendo de esta manera el residuo aminoacido proteinogeno en "no proteinogeno". Lo mismo se aplica a los derivados del extremo C-terminal y/o N-terminal de un residuo aminoacido proteinogeno terminador de la secuencia de aminoacidos.

reivindicaciones, un residuo aminoacido proteinogeno se obtiene de un aminoacido proteinogeno seleccionado de entre el grupo que consiste en Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp,

Tyr y Val, en configuracion L o D; el segundo centro quiral en Thr e Ile puede presentar una configuracion R o S. Por

lo tanto, por ejemplo, cualquier modificacion post-traduccional de una secuencia de aminoacidos, tal como la N- alquilacion, que puede producirse naturalmente convierte al residuo aminoacido modificado correspondiente en "no proteinogeno", aunque en la naturaleza dicho residuo aminoacido se encuentra incorporado en una protelna. Preferentemente los aminoacidos modificados se seleccionan de entre los aminoacidos N-alquilados, los p- aminoacidos, los y-aminoacidos, las lantioninas, los deshidroaminoacidos y los aminoacidos con fracciones de guanidina alquilada.

reivindicaciones, la expresion "acido carboxllico" o "acido dicarboxllico" se refiere a compuestos organicos que

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presentan una fraccion COOH o dos fracciones COOH, respectivamente, tales como, por ejemplo, acido formico, acido acetico, acido propionico, acido butlrico, acido ciclohexano carboxllico, acido benzoico, acido salicllico, acido lactico (acidos carboxllicos) o acido oxalico, acido malonico, acido succlnico, acido adlpico, acido fumarico, acido maleico, acido malico y acido ftalico (acidos dicarboxllicos), respectivamente.

Tal como se utiliza a continuacion en la presente memoria, en la descripcion de la invencion y en las reivindicaciones, el termino "diamina" se refiere a compuestos organicos que presentan dos fracciones NR'R'', en las que R' y R'' pueden ser, independientemente uno de otro, alquilo, alquenilo, alquinilo y arilo. Las diaminas pueden ser, por ejemplo, etilendiamina, 1,4-ciclohexano-diamina y piperazina.

Respecto a los aminoacidos, acidos carboxllicos, acido dicarboxllicos o diaminas anteriormente indicadas en la presente memoria, tambien se incluyen especlficamente los radicales respectivos obtenidos en el caso de que dichos aminoacidos, acidos carboxllicos, acidos dicarboxllicos o diaminas, respectivamente, se encuentren comprendidos en los compuestos de la invencion, es decir, -HN-...-CO- (aminoacido), -OC-... (acido carboxllico), - OC-...-CO- (acido dicarboxllico), -HN-...-NH- (diamina), por ejemplo.

reivindicaciones, la expresion "quelante de metal" se define como una molecula que acompleja un metal radionuclido para formar un complejo metalico que es estable bajo condiciones fisiologicas y que tambien puede conjugarse con un grupo de reconocimiento mediante un espaciador. El quelante de metal se acompleja o no con un metal radionuclido.

reivindicaciones, la expresion "metal radionuclido" se define como un radionuclido que es un atomo con un nucleo inestable, estando caracterizado el numero por un exceso de energla que se encuentra disponible para proporcionarlo a una partlcula de radiacion de nueva creacion dentro del nucleo o a un electron atomico (ver la conversion interna). Los metales radionuclidos utilizados en la presente memoria resultan especialmente adecuados para la utilizacion diagnostico o terapeutica, mas preferentemente para la formacion de imagenes o la radioterapia. El radionuclido, en dicho procedimiento, experimenta desintegracion radioactiva y emite (a) rayos gamma y/o partlculas subatomicas. Estas partlculas constituyen radiacion ionizante. Los radionuclidos pueden encontrarse naturalmente aunque tambien pueden producirse artificialmente.

Entre estos metales radionuclidos se incluyen, aunque sin limitation, galio (por ejemplo 67Ga y 68Ga), cobre (por ejemplo 67Cu y 64Cu), tecnecio (por ejemplo 99mTc y 94mTc), renio (por ejemplo 186Re y 188Re), plomo (por ejemplo

Pb), bismuto (por ejemplo Bi) y paladio (por ejemplo Pd). Los metodos para preparar dichos isotopos son

conocidos. Los generadores de molibdeno/tecnecio para producir 99mTc se encuentran disponibles comercialmente. Entre los procedimientos para producir 186Re se incluyen los procedimientos descritos en Deutsch et al. (Nucl. Med. Biol. 13(4):465-477, 1986) y Vanderheyden et al. (Inorganic Chemistry 24:1666-1673, 1985) y metodos para la production de 188Re han sido descritos por Blachot et al. (Intl. J. of Applied Radiation and Isotopes 20:467-470, 1969) y por Klofutar et al. (J. of Radioanalytical Chem. 5:3-10, 1970). La produccion de 212Pd se describe en Fawwaz et al., J. Nucl. Med. 25:796, 1984. La produccion de 212Pb y 21Bi se describe en Gansow et al., Amer. Chem. Soc. Symp. Ser. 241:215-217, 1984, y Kozah et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA (enero de 1986) 83:474-478. Resulta preferente 99mTc para la utilizacion diagnostica y los demas radionuclidos listados anteriormente presenta un uso terapeutico.

reivindicaciones, el termino "espaciador" se define como un grupo de enlace entre el quelante de metal y los

antagonistas de peptido bombesina. Tal como se utiliza a continuacion en la presente memoria, en la descripcion de la invencion y en las reivindicaciones, el termino "agonista" se refiere a una sustancia (ligando) que se une a un sitio especlfico en una molecula de receptor de una celula y, de esta manera, activa la transduction de senales en la celula. Lo anterior conduce a un efecto medible.

reivindicaciones, el termino "antagonista" se refiere a una sustancia (ligando) que se une a un sitio en la celula receptora que es especlfico de una sustancia agonista, bloqueando de esta manera dicho sitio al agonista sin activar un efecto. De esta manera, el antagonista inhibe el efecto del agonista.

reivindicaciones, la expresion "analogo de estatina" se define como un mimetico dipeptldico con la estructura generica siguiente:

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Estatina R2=OH, R1 puede modificarse significativamente aunque tlpicamente son iguales a cadenas laterales de aminoacidos.

Analogos de estatina R2=H, R1 puede modificarse significativamente aunque tlpicamente son iguales a cadenas laterales de aminoacidos.

Abreviaturas:

NODASA=acido 1,4,7-triazaciclononano-1-succlnico-acido 4,7-diacetico NODAGA=acido 1,4,7-triazaciclononano-N-glutarico-acido N',N''-diacetico TRITA=1,4,7,10-tetraazaciclotridecano-acido 1,4,7,10-N,N',N'',N''-tetraacetico Cpa=(S)-4-carboxamidofenilalanina 4-Am-5-MeHpA=acido 4-amino-5-metilheptanoico 4-Am-5-MeHxA=acido 4-amino-5-metilhexanoico

DFO=N'-[5-(acetil-hidroxiamino)pentil]-N-[5-[3-(5-aminopentil-hidroxi-carbamoil)propanoilamino]pentil]-N-hidroxi-

butanodiamida

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Sin elaboration adicional, se cree que el experto en la materia puede, a partir de la description anterior, utilizar la presente invention en su totalidad. Por lo tanto, las formas de realization espetificas preferidas son proporcionadas a continuation de manera ilustrativa y no limitativa del resto de la exposition en modo alguno.

Figuras

Figura 1: curvas de dosis-respuesta de analogos de bombesina determinadas mediante el ensayo de liberation de calcio. El ensayo de liberation de calcio se llevo a cabo tal como se indica en la section de Materiales y metodos. Las celulas PC3 se trataron con bombesina a concentraciones de entre 0,01 nmoles/l y 10 pmoles/l (•) sola en presencia de 10 pmol/l del compuesto de analogos de bombesina 1 (A) o In- compuesto 1 (♦) o analogos de bombesina Compuesto 1a (■). El compuesto 1, sometido a ensayo por si solo a una concentration de 1 pmol/l y compuesto 1 a una concentration de 10 pmoles/l (A), ln- Compuesto 1 (X) y compuesto 1a (□) no presentan ningun efecto sobre la liberation del calcio en las celulas PC3. El compuesto 1a se refiere a la secuencia de union de 1, sin el conector ni el quelato (D- Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2). El compuesto 1 se refiere al quelato (D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val- Gly-His-Sta-Leu-NH2). ln-Compuesto 1 se refiere a ln-quelato (D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu- NH2).

Figura 2: de inmunofluorescencia de celulas HEK-RPLG

Microscopia de inmunofluorescencia del compuesto 1, ln-Compuesto 1, Compuesto 1b y RPLG-ANTAG utilizando el anticuerpo monoclonal de HA-eprtopo de raton y celulas HEK-RPLG. (a) Ningun peptido, (b) bombesina 10 nmoles/l, (c) Compuesto 1b, (d) Compuesto 1b + bombesina 10 nmoles/l, (d, f, h, j) celulas tratadas con bombesina 10 nmoles/l en presencia de 1 pmol/l de los analogos Compuesto 1b, RPLG- ANTAG, Compuesto 1 y ln-Compuesto 1, (c, e, g, i) celulas tratadas con Compuesto 1b, RPLG-ANTAG y Compuesto 1.

Figura 3a, 3b, 4a, 4b: obtencion de imagenes de PET en ratones portadores de tumores PC-3 (3) y LNCaP (4) de Compuesto 2 Ga-68-DOTA. a) Una hora despues de la inyeccion de 10 MBq de radiotrazador, b) bloqueo con 100 pg de bombesina.

Figura 6: imagen de SPECT/CT de 99mTc-ARN4-06 (15 MBq/200 pmoles) en ratones portadores de tumor PC-3. Figura 8: imagen de SPECT/CT de 99mTc-ARN04-05 (15 MBq/200 pmoles) en ratones portadores de tumor PC-3. Figura 9: analisis de HPLC de Compuesto 2 Ga-68-DOTA en una columna de fase inversa.

Figura 10a, b, c, d, e:ensayo de estabilidad de Compuesto 2 Ga-68-DOTA en plasma y orina de raton analizados mediante HPLC.

Figura 11: estabilidad en suero humano de Compuesto 2 Lu-177-DOTA Figura 12: comparacion entre tumor/tejido Ga-68 RM2 con F18 FDG y F18 colina

La exposition o exposiciones completas de todas las solicitudes, patentes y publicaciones citadas en la presente memoria se incorporan en la misma como referencia en su totalidad.

Los ejemplos, a continuation, pueden repetirse con el mismo exito mediante la sustitucion de los reactivos y/o condiciones operativas generica o espetificamente descritas de la presente invention por las utilizadas en los ejemplos anteriores.

A partir de la description anteriormente proporcionada el experto en la materia podra determinar facilmente las caractensticas esenciales de la presente invention y, sin apartarse del espmtu y alcance de la misma, podra realizar diversos cambios y modificaciones en la invention para adaptarla a diversos usos y condiciones.

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Ejemplos

En los que A se refiere a A pero tambien a A', segun resulte apropiado para todos los ejemplos dados a conocer a continuacion.

Ejemplo 1 (A-B-C)

En el que A se refiere a A pero tambien a A', segun resulte apropiado para todos los ejemplos dados a conocer a continuacion.

a) Sintesis de conjugados de antagonista de peptido bombesina con la secuencia general (A=DOTA, B=Espaciador B1-B2. C=Peptido con amida N-terminal Z rZ=NH1)

DOTA-Espaciador-Xaai6-Gln7-Trp8-Ala9-Val10-Xaa211-His12-Sta13-Leu14-NH2

Se sintetizaron los peptidos manualmente sobre fase solida utilizando la estrategia de Fmoc. Con el fin de obtener amidas N-terminales, se utilizo resina de amida de Rink MBHA LL (malla 100-200) (resina 4-(2',4'-dimetoxifenil- Fmoc-aminometil)-fenoxiacetamido-norleucil-4-metilbenzhidrilamina). En general, se introdujo en el reactor amida de Rink MBHA con una carga teorica de 0,34 mmoles/g de resina. Se anadio N,N-dimetilformamida (DMF) al reactor y se agito durante 30 minutos para permitir el hinchado de la resina. Tras eliminar el solvente, se anadio una solucion de piperidina al 20% en DMF y la resina se agito durante 15 minutos para eliminar el grupo protector 9- fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc). Se repitio esta etapa dos veces. Despues de este procedimiento, se lavo la resina tres veces durante 5 minutos con DMF. Se recolecto la solucion de piperidina y la solucion de DMF de los ultimos tres lavados y se enraso a 100 ml con etanol. A partir de esta solucion se extrajo una allcuota para determinar espectrofotometricamente la cantidad de grupos protectores Fmoc eliminados.

Antes de acoplar el derivado de aminoacido-Fmoc, la resina se lavo dos veces durante 2 minutos con DMF. Se anadieron a la resina 2 equivalentes de aminoacidos-Fmoc, preactivados con 2 equivalentes de N,N- diisopropilcarbodiimida (DIC)/N-hidroxibenzotriazol (HOBt) y se ajusto el pH a un valor de 8 a 9 mediante la adicion de aproximadamente 4 equivalentes de N-etildiisopropilamina (DIPEA). La reaccion se incubo durante 2 h bajo agitacion suave. Tras la reaccion, se retiro la solucion y la fase solida se lavo dos veces durante 5 minutos con DMF. Se realizo un seguimiento de la reaccion con la prueba de Kaiser. Una determinada cantidad de perlas de la resina se lavo 3 veces con etanol, 50 pl de la solucion 1 (se mezclaron 20 g de fenol en 10 ml de etanol con 1 ml de una solucion de KCN 0,01 M en 49 ml de piridina) y se anadieron 50 pl de solucion 2 (500 g de ninhidridina en 10 ml de etanol) y las perlas se incubaron durante 10 minutos a 95°C. Las perlas azules indican funciones amino libres no acopladas.

Todos los aminoacidos se utilizaron en forma de derivados protegidos con Fmoc N-terminal y se acoplaron de una manera similar. Se utilizo triptofano con un grupo protector terc-butiloxicarbonilo (Boc) en la cadena lateral, mientras que la histidina y la glutamina se protegieron con Trt. En el caso de que la prueba de Kaiser realizada despues del acoplamiento de cada aminoacido indicase un acoplamiento incompleto de las funciones amino, se repetla el acoplamiento.

Tras construir la secuencia peptldica deseada completa, se lavo la resina 5 veces con DCM, seguido del lavado 5 veces con eter dietllico, cada uno durante 2 minutos y se secaron al vaclo.

b) Acoplamiento con ESPACIADOR y pro-quelante DOTA (*Bu)3

El proquelante DOTA(tBu)3 se obtuvo de Macrocyclics Inc., Dallas, USA. Antes del acoplamiento del ESPACIADOR, se elimino la protection de Fmoc N-terminal de los peptidos unidos a la resina. La resina se hincho durante 15 min. en DMF, se trato dos veces con una solucion de piperidina al 20% en DMF (15 min.) y se lavo tres veces con DMF. La solucion de los tratamientos de piperidina y los lavados con DMF siguientes se recolectaron para determinar la cantidad de grupos Fmoc cortados.

Se anadieron a la resina 2 equivalentes del ESPACIADOR, preactivos con hexafluorofosfato de 2-(1H-9- azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametil-amonio (HATU) durante 20 min. en DMF. Se ajusto el pH a 8-9 mediante la adicion de DIPEA. La mezcla de reaccion se agito durante 2 h y se realizo un seguimiento del acoplamiento utilizando la prueba de Kaiser. El proquelante DOTA(tBu)3 se acoplo de la misma manera tras la elimination del Fmoc tal como se ha indicado anteriormente. El acoplamiento de DOTA(tBu)3 se agito durante la noche. Tras eliminar la solucion, la resina se lavo 3 veces con DMF, 5 veces con DCM, seguido de 5 veces con eter dietllico, cada uno durante 2 minutos, y se seco al vaclo.

c) Desproteccion, corte y purification

El peptido- resina se introdujo en una jeringa dotada de una frita. Se anadio una solucion de acido trifluoroacetico

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(TFA)/tioanisol (TA)/triisopropilsilano (TIS)/H2O (94/2/2/1) y la jeringa se agito durante 2 h. Se anadio la solucion a una mezcla de 50% eter diisopropllico y 50% eter dietllico sobre hielo para permitir la precipitacion del peptido. Se recogio el peptido mediante centrifugacion a 3.000 rpm durante 5 min. y se descanto el sobrenadante. El precipitado se lavo varias veces con eter dietllico y se seco al vaclo. El producto en bruto se disolvio en agua y se purifico mediante RP-HPLC semipreparativa en un sistema de HPLC Metrohm LC-CaDi 22-14 (Herisau, Suiza) con una columna C18 Macherey-Nagel VP 250/21 Nucleosil 100-5 (eluyentes: eluyente 1=TFA al 0,1% en agua y eluyente 2=acetonitrilo; gradiente: 0 a 20 min., 90%-50% de eluyente 1; flujo: 15 ml/min.).

Los conjugados fueron analizados mediante RP-HPLC analltica y se caracterizo mediante espectroscopla de masas (EM-IEP).

A-B-C-1

DOTA-Espaciador-Xaai-Gln-Trp8-Ala9-Val-Xaa2-His-Xaa3-Xaa4-ZH (Z=NH)

Compuesto 1: A=DOTA, B1=Gly, B2=4-aminobenzoilo; Xaa1=DPhe; Xaa2=Gly; Xaa3=Sta; Xaa4=Leu,

DOTA-Gly-aminobenzoilo-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2; C80H114N20O2o, calculado (m/z): 1.675,8, observado [M+K]+: 1.715,1.

Compuesto 2: A=DOTA, B1=4-amino-1-carboximetil-piperidinil; B2=ninguno, Xaa1=DPhe; Xaa2=Gly; Xaa3=Sta; Xaa4 =Leu

DOTA-4-amino-1-carboximetil-piperidln-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2; C79H118N20O19; calculado (m/z): 1639,9, observado [M+K]+: 1.678,1

Compuesto 3: A=DOTA, B1=4-amino-1-piperidina-4-carboxi; B2=ninguno, Xaa1=DPhe; Xaa2=Gly; Xaa3=Sta; Xaa4=Leu,

DOTA-4-amino-1-piperidina-4-carboxilicacid-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2 C77H116N20O19, calculado (m/z): 1624,9, observado [M+K]+: 1.663,7.

Compuesto 4: A=DOTA, B1=15-amino-4,7,10,13-tetraoxapentadecanoilo; B2=ninguno, Xaa1=DPhe; Xaa2=Gly; Xaa3=Sta; Xaa4=Leu,

DOTA-acido 15-amino-4,7,10,13-tetraoxapentadecanoico-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2;

C82H127N19O23, calculado (m/z): 1.747,8, observado [M+K]+: 1.785,1.

Compuesto 5: A=DOTA, B1=15-amino-4,7,10,13-tetraoxapentadecanoilo; B2=4-amino-1-piperidln-4-carboxi,

Xaa1=DPhe; Xaa2=Gly; Xaa3=Sta; Xaa4=Leu,

DOTA-(acido 15-amino-4,7,10,13-tetraoxapentadecanoico)-(4-amino-1-carboximetil-piperidina)-D-Phe-Gln-Trp-Ala- Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2; C89H139N21O24, calculado (m/z): 1.886,0, observado [M+K]+: 1.924,9.

Compuesto 6: A=DOTA, B1=acido diaminobutlrico; B2=ninguno, Xaa1=DPhe; Xaa2=Gly; Xaa3=Sta; Xaa4=Leu,

DOTA-acido diaminobutlrico-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2; C75Hn4N20o19, calculado (m/z): 1.598,9, observado [M+K]+: 1.638,4.

Compuesto 7: A=DOTA, B1=4-(2-aminoetil)-1-carboximetil-piperazinilo; B2=ninguno, Xaa1=DPhe; Xaa2=Gly;

Xaa3=Sta; Xaa4=Leu,

DOTA-4-(2-aminoetil)-1-carboximetil-piperazln-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2; C79H121N21O19, calculado (m/z): 1.667,9, observado [M+Na]+: 1.691,2.

Compuesto 8: A=DOTA, B1=acido (5-amino-3-oxa-pentil)-succinamico; B2=ninguno, Xaa1=DPhe; Xaa2=Gly;

Xaa3=Sta; Xaa4=Leu,

DOTA-acido (5-amino-3-oxa-pentil)-succinamico-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2 C79H120N20O21, calculado (m/z): 1.685,9, observado [M+K]+: 1.723,7.

Ejemplo 2 (A-B-C)

a) Slntesis de conjugados de antagonista de peptido bombesina con la secuencia general (A=N4-azido, B=Espaciador B1-B2, C=Peptido con amida N-terminal Z [Z=NH2])

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N4-triazolas-dPEGi-Xaai6-Gln7-Trp8-Ala9-Val10-Xaa211-His12-Sta13-Leu14-NH2

a) Sintesis de los peptidos: Fmoc-Xaa16-Gln7-Trp8-Ala9-Val10-Xaa711-His12-Sta13-Leu14-NH?

Se sintetizaron los peptidos manualmente sobre fase solida utilizando la estrategia de Fmoc. Para obtener amidas N-terminales, se utilizo la resina de amida de Rink MBHA (malla de 100 a 200). La sintesis se llevo a cabo tal como se ha indicado en el Ejemplo 1.

b) Acoplamiento con grupo alquilo propargil-dPEG1-ester de NHS

Antes del acoplamiento con el grupo alquilo, se elimino la proteccion de Fmoc N-terminal de los peptidos unidos a la resina. La resina se hincho durante 15 min. en DMF, se trato dos veces con una solucion de piperidina al 20% en DMF (15 min.) y se lavo tres veces con DMF. La solucion del tratamiento de piperidina y los lavados con DMF siguientes se recolectaron para la determination de Fmoc.

Se anadieron a la resina 2 equivalentes de propargil-dPEGrester de NHS. Se ajusto el pH a 8-9 mediante la adicion de DIPEA. La mezcla de reaction se agito durante 24 h y se realizo un seguimiento del acoplamiento utilizando una prueba de Kaiser.

c) Desproteccion, corte y purification

Se introdujo el peptido-resina en una jeringa dotada de una frita. Se anadio una solucion de TFA/TIS/H2O (94/2,5/2,5) y la jeringa se agito durante 2 h. Se anadio la solucion a una mezcla de 50% eter diisopropllico y 50% eter dietllico sobre hielo para permitir la precipitation del peptido. Se recogio el peptido mediante centrifugation a 3.000 rpm durante 5 min. y se decanto el sobrenadante. El precipitado se lavo varias veces con eter dietllico y se seco al vaclo. El producto en bruto se disolvio en agua y se purifico mediante RP-HPLC semipreparativa tal como se ha indicado anteriormente.

Los conjugados se analizaron mediante RP-HPLC preparativa y se caracterizaron mediante espectroscopla de masas (Em-IEP).

d) Sintesis de quelante N4-azido. La sintesis implicaba 3 etapas.

i) Sintesis de N.N'.N''.N'''-tetracis(terc-butiloxicarbonil)-6-(azido)-1.4.8.11-tetraazaundecano (N4(Boc)4-N3) 131:

a) N,N',N'',N'''-tetracis(terc-butiloxicarbonil)-6-(hidroxi)-1,4,8,11-tetraazaundecano (N4(Bob)4-OH) [1]: una solucion de 6-(hidroxi)-1,4,8,11-tetraazaundecano (1 g, 3,1 mmoles) en DMF (10 ml) se enfrio a 0°C. A lo anterior se anadio una solucion de dicarbonato de di-terc-butilo (3,32 ml, 15,5 mmoles) en DMF (5 ml) seguido de DIPEA (2,7 ml, 15,5 mmoles). A continuation, la mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 18 h. Despues de este tiempo de reaccion, la mezcla de reaccion se dividio entre agua y acetato de etilo. La capa acuosa se extrajo tres veces con acetato de etilo y la fase de acetato de etilo agrupada se lavo con solucion de cloruro sodico y se seco sobre sulfato sodico anhidro. La filtration y la evaporation del solvente bajo presion reducida rindio el compuesto del titulo con un rendimiento de 86%.

ii) N.N'.N''.N'''-tetracis(terc-butiloxicarbonil)-6-(O-metil-sulfonil)-1.4.8.11-tetraazaundecano (N4(Bob)4-O-SO2CH3) [21:

A una solucion de 1 (300 mg, 0,54 mmoles) en piridina (3 ml) se anadio cloruro de metilsulfonilo (84 pl, 1,08 mmoles). La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente hasta completarla segun el seguimiento mediante CCF. Se evaporo el solvente bajo presion reducida y se introdujo el residuo en acetato de etilo. El acetato de etilo se lavo tres veces con NaHCO3 al 10% y agua y se seco sobre sulfato sodico anhidro. La filtracion y la evaporacion del solvente bajo presion reducida rindio el producto en bruto, que se purifico adicionalmente mediante cromatografia de columna de gel de silice, rindiendo el compuesto del titulo (84%).

iii) N.N'.N''.N'''-tetracis(terc-butiloxicarbonil)-6-(azido)-1,4,8,11-tetraazaundecano (N4(Boc)4-N3) [31:

Una suspension de 2 (250 mg, 0,38 mmoles) y azida sodica (100 mg, 1,52 mmoles) en DMF (3 ml) se agito a 75°C durante 5 h. Despues, la mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 18 h. A continuacion, la mezcla de reaccion se dividio entre agua y acetato de etilo. La capa acuosa se extrajo tres veces con acetato de etilo y el acetato de etilo agrupado se lavo con solucion de cloruro sodico y se seco sobre sulfato sodico anhidro. La filtracion y la evaporacion del solvente bajo presion reducida rindio el producto en bruto, que seguidamente se purifico mediante cromatografia de columna (rendimiento: 88%).

d) Acoplamiento en solucion

El peptido (6,2 mg, 5 pm) con grupo alquilo terminal y 3 (3 mg, 5 pm) se disolvio en una mezcla 1:1 de agua y

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alcohol terc-butllico (1 ml). Se anadieron polvos de cobre (10 mg) seguido de solucion acuosa 0,1 M de pentahidrato de sulfato de cobre (II) (60 pl, 6 pm, 1,2 equiv.) y la mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 24 h. Se separaron los polvos de cobre mediante filtracion y se elimino el solvente bajo presion reducida. El peptido en bruto se purifico mediante RP-HPLC semipreparativa.

El conjugado de quelante-peptido se trato con TFA:TIS:H2O (95:2:3). Se elimino el solvente bajo presion reducida. El producto en bruto se trituro con eter dietllico y se purifico mediante RP-HPLC semipreparativa tal como se ha indicado anteriormente.

Los conjugados se analizaron mediante RP-HPLC analltica y se caracterizaron mediante espectroscopla de masas (EM-IEP).

Compuesto 14: A =N4-azido, B1 = propargil-dPEG1-ester de NHS; B2=ninguno, Xaa1=DPhe; Xaa2=Gly; Xaa3=Sta; Xaa4=Leu,

N4-triazoles-dPEG1-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2; C68H105N21O13, calculado (m/z): 1.424,7,

observado: [M+H]+: 1.425,5.

Ejemplo 3 (A-B-C2)

DOTA-Espaciador-Xaa16-Gln7-Trp8-Ala9-Val10-Xaa211-His12-Leu^(CHOH)-(CH2)2-CH3

Todos los pseudopeptidos se sintetizaron en fase solucion mediante condensacion del heptapeptido Fmoc-D-Phe- Gln-Trp-Ala-Val-Xaa2-His-OH con el aminoacido modificado H-Leu^(CHOH)-(CH2)3-CH3.

a) Sintesis del heptapeptido Fmoc-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Xaa2-His-OH

Los peptidos se sintetizaron manualmente en resina de cloruro de 2-clorotritilo utilizando la estrategia de Fmoc. En general, se introdujo en el reactor resina de cloruro de 2-clorotritilo con una carga teorica de 1,4 mmoles/g de resina. La resina se hincho en DCM durante 30 min. y se acoplo el primer aminoacido mediante la adicion de 1 equivalente de aminoacido, mezclado con un exceso molar de 4 veces de DIPEA en DCM. La mezcla de reaccion de acoplamiento se agito a temperatura ambiente durante 2 h y despues la resina se lavo dos veces con una mezcla de DCM/MeOH/DIPEA (17/2/1), dos veces con DCM y finalmente se hincho en DMF. Se desprotegio el Fmoc utilizando piperidina al 20% en DMF y la cantidad de grupo protector Fmoc eliminado se determino espectrofotometricamente a 300 nm. El siguiente aminoacido se acoplo mediante la adicion de un exceso molar de 2 veces de aminoacido y se mezclo con cantidades equimolares de DIC/HOBt y un exceso molar de 4 veces de DIPEA en DMF. La resina se agito a temperatura ambiente durante 2 h y se realizo un seguimiento del acoplamiento utilizando la prueba de la ninhidrina de Kaiser. Cada aminoacido se acoplo utilizando la misma estrategia.

b) Acoplamiento con ESPACIADOR y proquelante DOTA (*Bu)3

Los acoplamientos se llevaron a cabo tal como se ha indicado anteriormente.

c) Corte y purificacion

Los peptidos totalmente protegidos se cortaron del soporte solido mediante suspension de la resina en una mezcla de TFA/TIS/DCM (1/5/94). Se extrajo varias veces un volumen de 5 ml de la solucion de corte con la jeringa, se incubaron durante 10 min. y las fracciones cortadas se recolectaron en un matraz de 50 ml. Tras la recoleccion de todas las fracciones, se anadieron 3x10 ml de tolueno al matraz, se evaporaron los solventes y el producto se seco seguidamente durante 1 h en una bomba de vaclo de aceite.

d) Sintesis de Boc-Leuw(CHOH)-(CH2)3-CH3. La sintesis implicaba tres etapas.

i) Sintesis de Boc-Leu-N(OCH3)CH3

Se disolvio Boc-Leu-OH (1 g, 4,3 mmoles) en DCM (30 ml) y se anadio tetrafluoroborato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)- 1,1,3,3-tetrametiluronio (TbTU) (1,380 g, 4,3 mmoles), HOBt (0,581 g, 4,3 mmoles) y DIPEA (743 pl, 4,3 mmoles) a 0°C. Tras 5 min. de agitacion, se anadio hidrocloruro de O,N-dimetilhidroxilamina (0,461 g, 4,73 mmoles) y DIPEA (817 pl, 4,73 mmoles). Todos el material solido se disolvio en 10 min. y la mezcla se agito durante la noche a TA. Se evaporo el solvente, la mezcla de reaccion se redisolvio en AcOEt y se lavo con H2O, acido citrico al 5%, H2O, solucion acuosa al 5% de NaHCO3 y solucion saturada de NaCl varias veces. La solucion se seco sobre MgSO4 y se elimino el solvente al vacio. El compuesto deseado se purifico mediante cromatografia de columna de gel de silice. EM-IEP: calculado 269; observado 292 [M+Na]+.

ii) Sintesis de Boc-Leu-(CH2)3-CH3

Se activo magnesio (0,330 g, 13,6 mmoles) mediante suspension en tolueno durante 30 min. bajo N2. Se elimino el

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tolueno y se seco el Mg bajo N2. A la suspension de Mg en THF (20 ml) se anadio bromobutano (1,46 ml, 13,6 mmoles) gota a gota y la mezcla se calento bajo reflujo. Tras disolver todo el magnesio, se anadio Boc-Leu- N(OCH3)CH3 en THF gota a gota y la reaccion se agito durante 2 h a 0°C. Se anadio HCl 1 M (150 ml), seguido de acetato de etilo (100 ml). La capa organica se lavo con hidrogenosulfato potasico 1 M y agua, se seco (Na2SO4) y se concentro al vaclo. El producto esperado se purifico mediante cromatografla de columna de gel de sllice. El producto se caracterizo mediante RMN-1H y RMN-13C.

EM-IEP: calculado 271; observado 293,3 [M+Na]+.

iii) Sintesis de Boc-Leuw(CHOH)-(CH?)3-CH3

A una solucion de Boc-Leu-(CH2)3-CH3 (0,190 g, 0,7 mmoles) en metanol (5 ml) se anadio NaBH4 (0,104 g, 2,8 mmoles). La mezcla de reaccion se agito adicionalmente durante 1 h, despues se neutralizo con acido acetico y el solvente se elimino bajo presion reducida. El producto esperado se precipito con una solucion saturada de bicarbonato. El peptido se recolecto mediante filtracion, se lavo con agua y hexano y se seco. El producto se caracterizo mediante RMN-1H y RMN-13C. EM-IEP: calculado, 272; observado, 273 [M+H]+; 547,7 [2M+H]+.

iv) Acoplamiento en solucion

Se desprotegio Boc-Leu^(CHOH)-(CH2)3-CH3 utilizando una solucion de TFA al 80% en DCM. Tras 1 h, se concentro la solucion, se lavo varias veces con DCM y se seco. Se disolvio el quelante-espaciador-peptido en DMF, se anadio HATU (1,2 equivalentes) y la mezcla se agito durante 1 h. Se disolvio H-Leu^(CHOH)-(CH2)3-CH3 en DMF y se anadio al peptido. Se ajusto el pH a 8 utilizando DIPEA y la reaccion se agito durante 4 h a TA.

Se concentro el solvente y se obtuvo el peptido, totalmente protegido, mediante precipitacion con H2O sobre hielo. El peptido en bruto se precipito, se enfrio, se centrifugo y se separo del solvente mediante decantacion. Con el fin de obtener el peptido totalmente desprotegido, se solubilizo en una mezcla de DCM/TFA/TIS/H2O 10/85/2,5/2,5. Tras 4 h, se concentro la solucion y el peptido se precipito utilizando una mezcla de 50% eter dietllico y 50% eter diisopropllico sobre hielo. A continuacion, se recogio el peptido mediante centrifugacion a 3.000 rpm durante 5 min. y se decanto el sobrenadante. Se lavo varias veces el precipitado con eter dietllico y el producto en bruto se mantuvo a continuacion al vaclo durante la noche para eliminar los solventes restantes. El producto en bruto se disolvio en agua y se purifico mediante cromatografla preparativa tal como se ha indicado anteriormente.

El conjugado se analizo mediante RP-HPLC analltica y se caracterizo mediante espectroscopla de masas (EM-IEP).

Compuesto 9: A=DOTA, B1=4-amino-1-carboximetil-piperidina:B2=ninguno, Xaa1 DPhe; Xaa2=Gly; DOTA-4-amino-1- carboximetil-piperidln-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu^(CHOH-CH2 (CH2)2-CH3, C74H112N18O17, calculado (m/z): 1.524,8, observado [M+K]+: 1564,3.

Compuesto 10: A=DOTA, B1=15-amino-4,7,10,13-tetraoxapentadecanoilo; B2=4-amino-1-carboximetil-piperidina, Xaa1=DPhe; Xaa2=Gly;

DOTA-PEG4-4-amino-1-carboximetil-piperidln-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu^(CHOH-CH2)-(CH2)2-CH3; C86H135N19O22, calculado (m/z): 1786,9, observado [M+K]+: 1811,1.

Compuesto 11: A=DOTA, B1=15-amino-4,7,10,13-tetraoxapentadecanoilo; B2=ninguno, Xaa1=DPhe; Xaa2=Gly;

DOTA-PEG4-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-LeuY(CHOH-CH2)-(CH2)2-CH3 C78H121N17O21, calculado (m/z): 1632,8, observado [M+K]+: 1672,2.

Ejemplo 4 (A-B-C-3)

DOTA-Espaciador-Xaa16-Gln7-Trp8-Ala9-Val10-Xaa211-His12-Xaa313-Xaa414-NH2

Sintesis de conjugados de bombesina con la secuencia general: DOTA-Espaciador-Xaa16-Gln7-Trp8-Ala9-Val10- Xaa211-His12- Leu^(CH2NH)-Phe-NH2

a) Sintesis del peptido: Fmoc- Xaa16-Gln7-Trp8-Ala9-Val10-Xaa211-His12- Leuw(CH2NH)-Phe-NH2

Los peptidos se sintetizaron manualmente en resina MBHA LL (malla de 100 a 200) HCl utilizando estrategia de Boc. En general, se introdujo en el reactor resina MBHA con una carga teorica de 0,59 mmoles/g y se hincho en DCM durante 30 min. La resina se trato 3 veces (10 min.) con una solucion de DIPEA al 10% en DCM. El primer acoplamiento de Boc-Leu^(CH2NH)-Phe-OH se consiguio utilizando 2 equivalentes de Boc-aminoacido activado con 2 equivalentes de HOBt y 2 equivalentes de DIC. La mezcla de reaccion de acoplamiento se agito a temperatura ambiente durante 2 h y se llevo a cabo un seguimiento de la reaccion utilizando la prueba de ninhidrina de Kaiser. Se desprotegio el Boc utilizando TFA al 30% en DCM y esta etapa se repitio dos veces. A continuacion, la resina se trato con una solucion de DIPEA al 10% en DCM y se llevaron a cabo los acoplamientos tal como se ha indicado

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anteriormente.

(H-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-LeuY(CH2NH)-Phe-NH2: C56H76N14O9, calculado (m/z): 1089,3, observado [M+H]+: 1089,8.

b) Acoplamiento con ESPACIADOR y proquelante DOTA (*Bu)3

Los acoplamientos se llevaron a cabo tal como se ha indicado anteriormente.

c) Desproteccion, corte y purificacion

El peptido se trato con TFA (1 ml) y TIS (30 pl) y la mezcla se agito a temperatura ambiente durante 5 min. A continuacion, la mezcla se enfrio en un bano de hielo y se anadio acido trifluorometanosulfonico (TFMSA) (100 pl) gota a gota bajo agitacion. Se sello el matraz con un tapon y la mezcla se agito a temperatura ambiente durante 2 h. El volumen se redujo bajo vacfo y el peptido se precipito mediante la adicion de eter dietflico frfo. El precipitado se lavo varias veces con eter dietflico y el producto en bruto se seco bajo vacfo. El producto en bruto se disolvio en agua y se purifico mediante HPLC preparativa tal como se ha indicado anteriormente.

Los conjugados se analizaron mediante RP-HPLC analftica y se caracterizo mediante espectroscopfa de masas (EM-IEP).

Compuesto 12: A=DOTA, B1=4-amino-1-carboximetil-piperidina; B2=ninguno, Xaa1 DPhe; Xaa2=Gly;

Xaa3=Leu^(CH2NTH); Xaa4=Phe

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DOTA-4-amino-1-carboximetil-piperidfn-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu^(CH2NH)-Phe-NH2 C79H114N20O17, calculado (m/z): 1615,9, observado [M+K]+: 1654,9.

Sfntesis de conjugados de bombesina con la secuencia general: DOTA-Espaciador-Xaa16-Gln7-Trp8-Ala9-Val10- Xaa211-His12-LeuY(CH2NH)-Cys-NH2

a) Sfntesis del peptido: Fmoc- Xaa16-Gln7-Trp8-Ala9-Val

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12-Leu^(CH7NH)-Cvs-NH2

Se sintetizaron los peptidos manualmente mediante fase solida en resina MBHA (0,59 mmoles/g) utilizando la estrategia de Boc. Se acoplo Boc-Cys(4-MeOBzl)-OH (2,5 eq.) a la resina utilizando DlC (2,5 eq.) y HOBt (2,5 eq.) como reactivo activador. Se ajusto el pH a 8 con DIPEA (5 eq.). Se introdujo el enlace reducido 13^14(CH2-NH) utilizando Boc-Leu-aldehfdo (2,5 eq.) disuelto en dimetilformamida acidificada. Se anadio lentamente NaBH3CN (2,5 eq.) en DMF, durante 20 min., y la reaccion se agito durante 1 h a TA. Tras la formacion de un enlace peptfdico reducido, se llevaron a cabo todas las reacciones de acoplamiento utilizando aminoacidos protegidos con N-Boc.

b) Acoplamiento con ESPACIADOR y pro-quelante DOTA (*Bu)3

Los acoplamientos se llevaron a cabo tal como se ha indicado anteriormente.

c) Desproteccion, corte y purificacion

La desproteccion, corte y purificacion se llevaron a cabo tal como se ha indicado anteriormente. Los conjugados se analizaron mediante RP-HPLC analftica y se caracterizaron mediante espectroscopfa de masas (EM-IEP).

Compuesto 13: A=DOTA, B1=4-amino-1-carboximetil-piperidina; B2=ninguno, Xaa1=DPhe; Xaa2=Gly;

Xaa3=Leu^(CH2NH)-; Xaa4=Cys

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DOTA-4-amino-1-carboximetil-piperidln-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu^(CH2NH)-Cys-NH2; C73H110N20O17S, calculado (m/z): 1571,8, observado [M+Na]+: 1593,6.

Ejemplo 4

Radiomarcaje de los coniuaados sintetizados (Compuestos 1 a 13)

Procedimiento general

A una allcuota de 10 pg del conjugado de quelante-antagonista de peptido bombesina en agua se anadieron 1 a 2 mCi de una solucion acuosa de (111InCl3, 171LuCl3 o 67/68GaCl3) y 250 a 500 pl de tampon de acetato sodico 0,4 M (pH=5). Dicha solucion se calento durante 30 min. a 95°C y se enfrio hasta la temperatura ambiente durante 10 min. Se anadio una allcuota de 5 pl de la mezcla de reaccion a 25 pl de solucion de Ca-DTPA (0,1 M, pH 5,2) y se analizo mediante HPLC para determinar la cantidad de radionuclido no marcado.

Ejemplo 5

Marcaie de los coniugados sintetizados con 115In.

El acomplejamiento de los analogos de bombesina con natIn se llevo a cabo siguiendo el mismo protocolo. Se utilizo natIn en forma de solucion de natInCl3 y en una proporcion molar de 1:1.

Ejemplo 6 (ensayos in vitro)

Materiales y metodos para la caracterizacion in vitro de antagonistas del receptor de PLG Reactivos y peptidos

Todos los reactivos eran del mejor grado disponible y se obtuvieron de proveedores habituales. El anticuerpo monoclonal de epltopo de hemaglutinina (HA) de raton se obtuvo de Covance (Berkeley, CA). Los anticuerpos secundarios Alexa Fluor 488 de cabra anti-IgG de raton (H+L) se obtuvieron de Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR). La bombesina y el antagonista [D-Phe6, Leu-NHEt18 des-Met14]-bombesina(6-14) (RPLG-ANTAG) se obtuvo de Bachem (Bubendorf, Suiza). RM26, RM1b, In-RMlb y 175Lu-AMBA fueron proporcionados por H.R. Macke (Basel, Suiza). El kit de ensayo de Fluo-4NW calcio se obtuvo de Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR).

Lineas celulares

Se generaron celulas 293 de rinon embrionario humanas (HEK293) que expresaban establemente el receptor de PLG humana etiquetada por epltopo HA (HEK-RPLG) se generaron tal como se ha descrito anteriormente (Cescato et al., 2008) y se cultivaron a 37°C y con 5% de CO2 en medio de Eagle modificado por Dulbecco con GlutaMAXTM-I (DMEM) que contenla suero de feto bovino (SFB) al 10% (v/v), 100 U/ml de penicilina, 100 p/ml de estreptomicina y 750 pg/ml de G418. Se obtuvieron celulas de cancer de prostata humano (celulas PC3) del DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH; DSMZ n° ACC465) y se cultivaron a 37°C y con 5% de CO2 en medio F12K de Ham que contenla L-glutamina 2 mM y complementado con SFB al 10% (v/v), 100 U/ml de penicilina y 100 pg/ml de estreptomicina. Todos los reactivos de cultivo eran de Gibco BRL (Grand Island, NY).

Mediciones de afinidad de union

Se determino la afinidad de union del receptor de PLG de los diversos compuestos mediante autorradiografla de receptores in vitro en secciones criostaticas de carcinomas de prostata bien caracterizados o en secciones de pellets de celulas HEK-RPLG o PC3 tal como se ha indicado anteriormente (Markwalder et al., Can. Res. 59:1152-1159, 1999; Reubi et al., Eur. J. Nucl. Med. 27: 273-282, 2000; Reubi et al., Clin. Cancer Res. 8:1139-1146, 2002). Los radioligandos utilizados eran I25I-[Tyr4]-bombesina, que es conocido que marca preferentemente los receptores de

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PLG (Vigna et al., Gastroenterology 93: 1287-1295, 1987) y 125I-[D-Tyr6, p-Ala11, Phe13, Nle14]-bombesina (6-14) como ligando universal de receptor de bombesina (Gastroenterology 93:1287-1295, 1987).

Ver los resultados en la Tabla 1.

Microscopia de inmunofluorescencia

Se llevaron a cabo ensayos de internalizacion basados en microscopia de inmunofluorescencia con celulas HEK- RPLG tal como se ha indicado anteriormente (Cescato et al., 2006; Cescato et al., 2008). Brevemente, se cultivaron celulas HEK-RPLG en placas de cuatro pocillos de 35 mm recubiertas con poli-D-lisina (20 pg/ml) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) (Cellstar, Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Alemania). Para el experimento, las celulas se trataron con bombesina 10 nM o con 1 pM de los diversos analogos de bombesina o para evaluar el antagonismo potencial con bombesina 10 nM en presencia de un exceso de 100 veces de estos diversos analogos durante 30 min. a 37°C y con 5% de CO2 en medio de cultivo y despues se procesaron para microscopia de inmunofluorescencia utilizando el anticuerpo monoclonal de raton de epitopo HA a una dilucion de 1:1.000 como primer anticuerpo y Alexa Fluor 488-anticuerpo de cabra anti-IgG de raton (H+L) a una dilucion de 1:600 como anticuerpo secundario. Se obtuvieron imagenes de las celulas utilizando un microscopio de inmunofluorescencia Leica DM RB y una camara Olympus DP10.

La internalizacion de receptor de PLG inducida por la bombesina resulto eficientemente antagonizada por los analogos de bombesina Compuesto 1, ln-Compuesto 1, Compuesto 1b y RPLG-ANTAG. Las celulas HEK-RPLG se trataron durante 30 min. con vehiculo (sin peptido, a) o con 10 nmoles/l de bombesina (b), una concentracion inductora de un efecto de internalizacion submaximo. Los paneles (d, f, h, j) muestran celulas tratadas con 10 nmoles/l de bombesina en presencia de 1 pmoles/l de los analogos Compuesto 1b, RPLG-ANTAG, Compuesto 1 y ln-Compuesto 1. El efecto del Compuesto 1b, RPLG-ANTAG, Compuesto 1 y ln-Compuesto 1 por si solo a una concentracion de 1 pmol/ se muestra en los paneles (c, e, g, i, k). Tras la incubacion con los peptidos, las celulas se procesaron para la inmunocitoquimica tal como se ha indicado anteriormente. Una clara tincion perinuclear punteada era detectable para las celulas tratadas con bombesina. Esta tincion punteada resulto anulada eficientemente con un exceso de los analogos Compuesto 1, ln-Compuesto 1, Compuesto 1b y RPLG-ANTAG. El Compuesto-1, ln- Compuesto 1, Compuesto 1b y RPLG-ANTAG administrados solos no presentaron ningun efecto sobre la internalizacion del receptor de PLG.

Ver los resultados en la Tabla 1 y en la figura 2.

Ensayo de liberacion de calcio

Se midio la liberacion del calcio intracelular en celulas PC3 utilizando el kit de ensayo Fluo-4NW Calcio tal como se ha descrito anteriormente (Magrys et al., J. Clin. Immunol. 27:181-192, 2007; Michel et al., Cescato et al., J. Nucl. Med. 49: 318-326, 2008). Brevemente, se sembraron placas de 96 pocillos con celulas PC3 (10.000 celulas en cada pocillo) y se cultivaron durante 2 dias a 37°C y con 5% de CO2 en medio de cultivo. El dia del experimento las celulas se lavaron con tampon de ensayo (1xHBSS, HEPES 20 mM) que contenia probenecid 2,5 mM y despues se cargaron con 100 pl/pocillo de pigmento Fluo-4NW en tampon de ensayo que contenia probenecid 2,5 mM durante 30 min. a 37°C y con 5% de CO2 y despues durante 30 min. adicionales a temperatura ambiente. Para medir la movilizacion del calcio intracelular tras la estimulacion con los analogos de bombesina que debian someterse a ensayo, las celulas cargadas con pigmento se transfirieron a un aparato SpectraMax M2e (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Se registro la movilizacion del calcio intracelular en un analisis cinetico durante 60 s a temperatura ambiente, realizando un seguimiento de la emision de la fluorescencia a 520 nm (con Aex=485 nm) en presencia de los analogos a las concentraciones indicadas. Se midio la fluorescencia maxima (F-max) tras la adicion de yonomicina 25 pM. Se realizaron mediciones de linea base (linea base F) para las celulas no tratadas y cargadas de pigmento. Se muestran los datos como porcentaje de la respuesta maxima de calcio (F-max - F-linea base=100% de respuesta maxima de calcio), tal como se ha descrito anteriormente (Magrys et al., J. Clin. Immunol. 27:181-192, 2007; Michel et al., Cescato et al., J. Nucl. Med. 49: 318-326, 2008).Todos los experimentos se repitieron por lo menos tres veces por triplicado.

La figura 1 muestra que ln-Compuesto 1 y el compuesto 1a se comportan como antagonistas que desplazan la curva de dosis-respuesta de la bombesina hacia la derecha en presencia de bombesina (BB).

Ver los resultados en la Tabla 1 y en la figura 1.

Compuesto 1: DOTA-Gly-aminobenzoil-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2

Compuesto 2: DOTA-4-amino-1-carboximetil-piperidin-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2

Compuesto 3: DOTA-acido 4-amino-1-piperidin-4-carboxilico-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2

Compuesto 4: DOTA-acido 15-amino-4,7,10,13-tetraoxapentadecanoico-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu- NH2

Compuesto 5: DOTA-(acido 15-amino-4,7,10,13-tetraoxapentadecanoico)-(4-amino-1-carboximetil-piperidin)-D-Phe-

5

10

15

20

25

30

35

Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2

Compuesto 6: DOTA-acido diaminobutlrico-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2

Compuesto 7: DOTA-4-(2-aminoetil)-1-carboximetil-piperazln-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2

Compuesto 8: DOTA-acido (5-amino-3-oxa-pentil)-succinamico-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2

Compuesto 9: DOTA-4-amino-1-carboximetil-piperidln-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu^(CHOH-CH2)-(CH2)2-CH3

Compuesto 10: DOTA-(acido 15-amino-4,7,10,13-tetraoxapentadecanoico-4-amino-1-carboximetil-piperidln-D-Phe- Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu^(CHOH-CH2)-(CH2)2-CH3

Compuesto 11: DOTA-acido 15-amino-4,7,10,13-tetraoxapentadecanoico-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-

Leu^(CHOH-CH2)-(CH2)2-CH3

Compuesto 12: DOTA-4-amino-1-carboximetil-piperidln-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu^(CH2NH)-Phe-NH2 Compuesto 13: DOTA-4-amino-1-carboximetil-piperidln-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu^(CH2NH)-Cys-NH2 Compuesto 14: N4-triazoles-dPEG1-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2.

TABLA 1. Union in vitro de receptor de PLG, senalizacion y propiedades de internalizacion de los analogos de BN

Compuesto: Media de IC50 (nM) de union ± SEM Senalizacion de movilizacion del Ca++ Internalizacion de receptor

1: 30 ± 4,5 ANTAG/ningun efecto agonista ANTAG/ningun efecto agonista

115In-1: 16 ± 5,3 ANTAG/ningun efecto agonista ANTAG/ningun efecto agonista

2: 9,7 ± 3,8 ANTAG/ningun efecto agonista ANTAG/ningun efecto agonista

115In-2: 9,3 ± 1,9 ANTAG/ningun efecto agonista ANTAG/ningun efecto agonista

3: 43 ± 14 ANTAG/ningun efecto agonista ANTAG/ningun efecto agonista

4: 21 ± 6,5 ANTAG/ningun efecto agonista ANTAG/ningun efecto agonista

5: 7,3 ± 0,6 ANTAG/ningun efecto agonista ANTAG/ningun efecto agonista

6: 7,4 ± 2,2 ANTAG/ningun efecto agonista ANTAG/ningun efecto agonista

7: 11 ± 0 NA NA

8: 19 ± 3,0 NA NA

9: 3,2 ± 1,3 ANTAG/ningun efecto agonista ANTAG/ningun efecto agonista

115In-9: 2,5 ± 0,2 ANTAG/ningun efecto agonista ANTAG/ningun efecto agonista

10: 6,9 ± 0,5 ANTAG/ningun efecto agonista NA

Se midieron las afinidades de union de los compuestos 1, 2 y 9 tras el acomplejamiento con el isotopo no radioactivo 115In. Los datos revelan que el acomplejamiento con isotopo no afecta a la afinidad de union al receptor ni a las propiedades del antagonista.

Metodos estandares en publicaciones relevantes:

Cescato R, Schulz S, Waser B, et al. Internalization of sst2, sst3 and sst5 receptors: Effects of somatostatin agonists and antagonists. J. Nucl. Med. 47:502-511, 2006.

Cescato R, Maina T, Nock B, Nikolopoulou A, Charalambidis D, Piccand V, Reubi JC. Bombesin Receptor Antagonists May Be Preferable to Agonists for Tumor Targeting. J. Nucl. Med. 49:318-326, 2008.

Magrys, A.; Anekonda, T.; Ren, G.; Adamus, G. The role of anti-alpha-enolase autoantibodies in pathogenicity of autoimmune-mediated retinopathy. J. Clin. Immunol. 27:181-192, 2007.

5

10

15

20

25

30

35

Markwalder R, Reubi JC. Gastrin-releasing peptide receptors in the human prostate: relation to neoplastic transformation. Cancer Res. 59:1152-1159, 1999.

Michel, N.; Ganter, K.; Venzke, S.; Bitzegeio, J.; Fackler, O. T.; Kepplet, O. T. The Nef protein of human immunodeficiency virus is a broad-spectrum modulator of chemokine receptor cell surface levels that acts independently of classical motifs for receptor endocytosis and Galphai signaling. Mol. Biol. Cell. 17:3578-3590, 2006.

Reubi JC, Schaer JC, Waser B, et al. Affinity profiles for Human somatostatin receptor sst1-sst5 of somatostatin radiotracers selected for scintigraphic and radiotherapeutic use. Eur. J. Nucl. Med. 27:273-282, 2000.

Reubi JC, Wenger S, Schmuckli-Maurer J, et al. Bombesin Receptor Subtypes in Human Cancers: Detection with the Universal Radioligand (125)I-[D-TYR(6), beta ALA(11), PHE(13), NLE(14)] Bonabesin(6-14). Clin. Cancer Res. 8:1139-1146, 2002.

Vigna SR, Mantyh CR, Giraud AS, et al. Localization of specific binding sites for bombesin in the canine gastrointestinal tract. Gastroenterology 93:1287-1295, 1987.

Ejemplo 7

Experimentos de biodistribucion en ratones desnudos portadores de tumor PC-3

En ratones desnudos hembra se implantaron por via subcutanea 10 millones de celulas tumorales PC-3 que se hablan expandido recientemente en una solucion salina tamponada con fosfato esterilizada (PBS, pH 7,4). Once dlas despues de la inoculacion en los ratones se inyectaron en la vena de la cola 10 pmoles de peptidos marcados radioactivamente (aproximadamente 0,18 MBq) diluidos en NaCl (albumina de suero bovino al 0,1%, pH 7,4, volumen inyectado total=100 pl). Para la determinacion de la incorporation no especlfica en el tumor o en organos positivos para receptor, en un grupo de 4 animales se preinyectaron 0,02 pmoles de peptido no marcado en solucion de NaCl al 0,9% y tras 5 min., se inyecto peptido radiomarcado. A intervalos de 1, 4, 24, 48 y 72 h, se sacrificaron los ratones (en grupos de 3 o 4) y se recolectaron los organos de interes, se enjuagaron en exceso de sangre, se pesaron y se realizo un recuento en un contador y.

111In-COMPUESTO 1

111In- DOTA-Gly-aminobenzoil-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2

Cantidad de inyeccion:: 5 pCi / 10 pmoles / 100 pl/raton

Compuesto de bloqueo: 2.000 veces

Animal:: Ratones desnudos portadores de tumor PC3: 3 ratones/grupo

Punto temporal:: 1h, 4h, 4h de bloqueo, 24 h, 48 h, 72 h

Organo: 1h 4 h 4 h de bloqueo 24 h 48 h 72 h

Sangre: 0,86±0,17 0,04±0,00 0,02±0,01 0,01±0,00 0,00±0,00 0,00±0,00

corazon: 0,28±0,05 0,04±0,01 0,04±0,01 0,03±0,01 0,00±0,00 0,01±0,00

Hlgado: 1,93±0,29 0,38±0,05 0,39±0,08 0,19±0,01 0,10±0,01 0,09±0,02

bazo: 0,57±0,21 0,12±0,01 0,09±0,01 0,05±0,01 0,04±0,01 0,02±0,00

pulmon: 0,82±0,13 0,12±0,04 0,10±0,03 0,05±0-01 0,02±0,01 0,01±0,00

rinon: 3,99±0,33 1,93±0,18 2,67±0,10 1,01±:0,06 0,50+0,09 0,28±0,02

estomago: 3,31±0,63 0,76±0,14 0,07±0,03 0,05±0,02 0,01±0,00 0,02±0,01

intestino: 1,73±0,48 0,20±0,10 0,07±0,01 0,04±0,00 0,01±0,00 0,01±0,00

adrenal: 4,14±1,46 1,20±0,12 0,10±0,06 1,24±0,16 0,38±0,09 0,36±0,04

pancreas: 21,92±1,34 0,32±0,31 0,07±0,02 0,15±0,02 0,06±0,01 0,06±0,01

pituitaria: 7,80±1,90 0,85±0,45 0,11±0,09 0,21±0,19 0,03±0,03 0,05±0,07

musculo: 0,19±0,06 0,03±0,01 0,02±0,00 0,03±0,00 0,00+0,00 0,00±0,00

hueso: 0,40±0,10 0,18±0,07 0,04±0,01 0,14±0,03 0,03±0,00 0,03±0,01

tumor: 14,24±1,75 13,46±0,80 0,46±0,00 6,58±1,14 2,08±0,12 1,31±023

Tumor a tejido: 1 h 4 h 24 h 48 h 72 h

tumor:rinon: 3,6 7,0 6,5 4,2 4,7

tumor:hlgado: 7,4 35,4 34,6 20,8 14,5

tumor:sangre: 16,5 336,5 658,0 1600,0 1871,4

tumor:musculo: 75,0 448,7 219,3 693,3 1091,7

68Ga-COMPUESTO 1

68Ga-DOTA-Gly-aminobenzoil-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2

Animal:: Ratones desnudos portadores de tumor PC3; 3 ratones/grupo

Cantidad de inyeccion:: 1,27 qCi / 10 pmoles / 100 ql/raton

Compuesto de bloqueo: 3.000 veces Compuesto 1

Punto temporal:: 1 h, 1 h bloqueo, 2 h,

5

Organo: 1h 1 h de bloqueo 2 h

Sangre: 0,86±0,09 0,55±0,30 0,39±0,15

corazon: 0,33±0,21 0,30±0,18 0,14±0,02

Higado: 1,14±0,37 1,05±0,60 0,98±0,32

bazo: 1,29±0,53 0,08±0,05 0,03±0,01

pulmon: 0,80±0,33 0,71±0,23 0,21±0,09

rinon: 2,79±0,39 3,18±1,79 1,21 ±0,12

estomago: 3,09±0,51 0,41±0,31 1,68±0,02

intestino: 2,09±0,17 1,06±0,55 5,39±0,52

adrenal: 3,31±0,78 0,07±0,06 0,89±0,62

pancreas: 27,84±4,88 0,96±0,45 10,73±2,76

pituitaria: 13,35±1,32 0,28±0,08 0,22±0,00

musculo: 0,26±0,08 0,07±0,05 0,20±0,02

hueso: 0,03±0,01 0,18±0,11 0,03±0,01

tumor: 8,71±0,67 2,04±1,04 10,45± 1,61

: 1 h 2 h

tumor:rinon: 3,13 8,64

tumor:higado: 7,66 10,68

tumor:pancreas: 0,31 0,97

tumor:sangre: 10,18 27,08

tumor:musculo: 33,74 53,51

111In-COMPUESTO 2

111In-DOTA-4-amino-1-carboximetil-piperidm-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2

10

Cantidad de inyeccion:: 5 qCi / 10 pmoles / 100 ql/raton

Compuesto de bloqueo: 2.000 veces

Animal:: ratones desnudos portadores de tumor PC3: 3 ratones/grupo

Punto temporal:: 1h, 4h, 4h de bloqueo, 24 h, 48 h, 72 h

Organo: 1h 4 h 4 h de bloqueo 24 h 48 h 72 h

Sangre: 0,77±0,28 0,05±0,04 0,13±0,02 0,00±0,00 0,00±0,00 0,00±0,00

corazon: 0,32±0,09 0,04±0,03 0,09±0,01 0,02±0,01 0,01±0,00 0,02±0,02

Higado: 0,49±0,12 0,118±0,06 0,34±0,03 0,09±0,01 0,07±0,01 0,06±0,02

bazo: 0,53±0,20 0,12±0,06 0,16±0,02 0,06±0,02 0,05±0,01 0,06±0,03

pulmon: 0,70±0,30 0,10±0,07 0,19±0,01 0,04±0,03 0,11±0,24 0,04±0,02

Rinon: 4,78±1,11 2,14±0,73 2,98±0,20 1,25±0,16 0,91±0,09 0,74±0,18

estomago: 3,15±0,78 1,07±0,15 0,12±0,02 0,06±0,02 0,03±0,01 0,05±001

intestino: 2,11±0,47 0,25±0,15 0,11±0,01 0,04±0,01 0,03±0,01 0,03±0,01

adrenal: 3,46±2,07 1,17±0,54 1,10±0,60 0,71±0,29 0,54±0,29 1,01±0,74

pancreas: 22,64±4,71 1,55±0,48 0,10±0,00 0,32±0,09 0,19±0,04 0,19±0,02

pituitaria: 7,00±5,68 0,59±0,55 0,58±0,49 0,07±0,33 0,21±0,33 0,51±0,24

musculo: 0,29±0,17 0,05±004 0,06±0,02 0,02±0,01 0,01±0,01 0,02±0,01

hueso: 0,91±0,68 0,35±0,57 0,35±0,11 0,20±0,18 0,12±0,11 0,15±0,05

tumor: 15,23±4,78 11,75±2043 0,45±0,04 6,84±1,02 4,67±0,39 4,07±0,34

Tumor a tejido: 1 h 4 h 24 h 48 h 72 h

tumor:rinon: 3,2 5,5 5,5 5,1 5,5

tumortngado: 30,9 64,6 74,1 67,2 63,0

tumor:sangre: 19,9 243,9 2744,6 3823,7 3391,2

tumor:pancreas: 0,7 7,6 21,4 24,6 21,4

| tumor:musculo |_____52,0_____| 260,2____|____436,6____|____354,5____|____165,4

68Ga-COMPUESTO 2

68Ga-DOTA-4-amino-1-carboximetil-piperidln-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2

5

Radioligando: 68Ga-COMPUESTO 2

Animal:: Ratones desnudos portadores de tumor PC3; 3 ratones/grupo

Cantidad de inyeccion:: 1,27 uCi / 10 pmoles / 100 gl/raton

Punto temporal:: 1h

Organo: 1h

Sangre: 0,03±0,01

corazon: 0,19±0,02

Hlgado: 0,41±0,04

bazo: 0,36±0,01

pulmon: 0,34±0,03

rinon: 1,87±0,08

estomago: 2,13±0,34

intestino: 1,54±0,22

adrenal: 2,48±0,48

pancreas: 11,63±0,19

pituitaria: 0,36±019

musculo: 0,13±0,00

hueso: 0,23±0,03

tumor: 9,31±1,58

: 1 h

tumor: rinon: 4,98

tumor: hlgado: 22,60

tumor:pancreas: 0,80

tumor:sangre: 20,85

tumor:musculo: 74,02

111In-COMPUESTO 4

10

111In-DOTA-(acido 15-amino-4,7,10,13-tetraoxapentadecanoico)-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2

Cantidad de inyeccion:: 5 gCi / 10 pmoles / 100 gl/raton

Compuesto de bloqueo: 2.000 veces

Animal:: ratones desnudos portadores de tumor PC3: 3 ratones/grupo

Punto temporal:: 1h, 4h, 4h de bloqueo, 24 h, 48 h, 72 h

Organo: 1h 4 h 4 h de bloqueo 24 h

Sangre: 0,21±0,02 0,02±0,00 0,01±0,00 0,00±0,00

Corazon: 0,08±0,01 0,02±0,00 0,02±0,00 0,00±0,00

Hlgado: 0,22±0,01 0,09±0,01 0,09±0,01 0,03±0,01

bazo: 0,18±0,10 0,07±0,02 0,04±0,01 0,01±0,00

Pulmon: 0,24±0,01 0,07±0,01 0,04±0,01 0,01±0,01

rinon: 1,85±0,15 1,38±0,37 1,40±0,29 0,24±0,01

estomago: 2,01±0,36 0,56±0,18 0,03±0,01 0,01±0,01

intestino: 1,16±0,24 0,10±0,04 0,05±0,04 0,02±0,00

adrenal: 2,18±0,93 0,86±0,17 0,07±0,06 0,59±0,16

pancreas: 10,96±0,57 0,52±0,05 0,02±0,00 0,01±0,01

pituitaria: 4,23±1,46 0,55±0,20 0,17±0,10 0,00±0,00

musculo: 0,08±0,02 0,02±0,01 0,01±0,00 0,00±0,00

Hueso: 0,16±0,06 0,12±0,04 0,02±0,01 0,04±0,02

tumor: 10,56±0,70 8,63± 1,13 0,45±0,06 3,23±0,52

Tumor a tejido: 1 h 4 h 24 h

tumor:rinon: 5,71 6,27 13,40

tumor:pancreas: 0,96 16,71 345,16

tumor:sangre: 49,67 552,10 3457,24

tumor:musculo: 140,10 349,48 808,55

tumor:hueso: 64,16 71,75 86,62

111In-COMPUESTO 5

111In-DOTA-(acido 15-amino-4,7,10,13-tetraoxapentadecanoico)-(4-amino-1-carboxi-metil-piperidln)-D-Phe-Gln-Trp- 5 Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2

Animal:: ratones desnudos portadores de tumor PC3: 3-4 ratones/grupo

Cantidad de inyeccion:: 5 pCi / 10 pmoles / 100 pl/raton

Compuesto de bloqueo: 2.000 veces

Punto temporal:: 1h, 4h, 4h de bloqueo, 24 h

Organo: 1 h 4 h de bloqueo 4 h 24 h

Sangre: 0,75 ± 0,21 0,02 ± 0,00 0,03 ± 0,01 0,01 ± 0,00

corazon: 0,28 ± 0,06 0,02 ± 0,00 0,03 ± 0,01 0,02 ± 0,00

Hlgado: 0,40 ± 0,09 0,14 ± 0,01 0,15 ± 0,05 0,11 ± 0,02

bazo: 0,80 ± 0,28 0,06 ± 0,01 0,09 ± 0,03 0,07 ± 0,01

pulmon: 0,62 ± 0,15 0,05 ± 0,01 0,15 ± 0,19 0,51 ± 0,73

rinon: 5,08 ± 0,72 1,76 ± 0,36 2,04 ± 0,15 1,37 ± 0,22

estomago: 3,92 ± 1,26 0,06 ± 0,01 0,87 ± 0,58 0,05 ± 0,01

intestino: 2,39 ± 0,42 0,03 ± 0,01 0,17 ± 0,10 0,05 ± 0,02

adrenal: 3,63 ± 0,53 0,07 ± 0,02 0,68 ± 0,31 0,62 ± 0,16

pancreas: 26,83 ± 4,34 0,06 ± 0,02 1,36 ± 0,81 0,33 ± 0,05

pituitaria: 9,02 ± 0,99 0,23 ± 0,14 0,38 ±0,16 0,46 ± 0,52

musculo: 0,19 ± 0,07 0,01 ± 0,00 0,02 ± 0,00 0,02 ± 0,00

hueso: 0,34 ± 0,04 0,03 ± 0,03 0,08 ± 0,02 0,08 ± 0,02

tumor: 10,27 ± 0,36 0,61 ± 0,07 9,35 ± 0,73 6,33 ± 0,76

Tumor a tejido: 1 h 4 h 24 h

tumor:sangre: 13,73 319,66 1155,51

tumor:rinon: 2,02 4,59 4,62

tumor:pancreas: 0,38 6,90 19,16

tumor:musculo: 53,65 475,17 364,92

tumor:hueso: 29,93 124,55 76,65

10 111In-COMPUESTO 9

111In-DOTA-DOTA-4-amino-1-carboximetil-piperidln-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu^(CHOH-CH2)-(CH2)2-CH3

Cantidad de inyeccion:: 5 pCi / 10 pmoles / 100 pl/raton

Compuesto de bloqueo: 2.000 veces

Animal:: ratones desnudos portadores de tumor PC3: 3 ratones/grupo

Punto temporal:: 1h, 4h, 4h de bloqueo, 24 h, 48 h, 72 h

Organo: 1h 4 h 4 h de bloqueo 24 h 48 h 72 h

Sangre: 0,43±0,10 0,12±0,03 0,04±0,00 0,01±0,00 0,01±0,00 0,01±0,00

corazon: 0,17±0,03 0,09±0,02 0,15±0,05 0,03±0,01 0,02±0,00 0,08±0,03

Hlgado: 0,73±0,12 0,49±0,14 0,40±0,02 0,20±0,02 0,11±0,01 0,10±0,02

bazo: 1, 13±0,41 0,57±0,24 0,23±0,03 0,21±0,06 0,15±0,04 0,15±0,04

pulmon: 0,45±0,05 0,21±0,06 0,38±0,06 0,08±0,04 0,05±0,02 0,18±0,07

rinon: 5,23±3,01 2,43±0,47 2,88±1,52 1,41±0,22 0,97±0,06 0,55±0,15

estomago: 4,433±2,48 5,72±4,04 0,16±0,03 1,08±0,15 0,43±0,10 0,28±0,09

intestino: 3,61±0,61 3,31±1,61 0,14±0,02 0,35±0,05 0,16±0,07 0,10±0,01

adrenal: 10,66±2,64 5,16±1,55 1,36±0,56 2,31±0,96 2,24±1,43 1,84±0,36

pancreas: 65,69±8,14 39,80±9,,25 0,18±0,04 4,52±0,53 2,30±0,19 1,06±0,19

pituitaria: 12,63±3,26 5,54±2,07 3,72±1,62 0,71±0,37 0,56±0,24 2,56±0,28

musculo: 0,22±0,06 0,14±0,04 0,13±0,07 0,05±0,01 0,03±0,01 0,08±0,04

hueso: 1,31±1,29 0,71±0,25 1,61±0,52 0,29±0,14 0,23±0,13 1,08±0,83

tumor: 9,18± 1,16 13,17±5,01 038±0,08 8,39±0,88 5,89±0,351 3,04±1,44

5

10

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35

40

45

50

Tumor a tejido: 1 h 4 h 24 h 48 h 72 h

tumor:rinon: 1,8 5,4 6,0 6,1 6,2

tumonhlgado: 12,7 26,7 42,4 53,0 35,0

tumor: Sangre: 21,1 109,7 631,4 803,8 304,0

tumor:pancreas: 0,2 0,3 1,9 2,6 2,9

tumor:musculo: 42,6 94,7 169,2 191,9 42,9

Ejemplo 8

Imageries de PET/TC, experimento de biodistribucion en ratones portadores de tumor PC-3 y LNCaP de Ga-68- DOTA Compuesto 2, afinidad de union y estabilidad

Obtencion de imagenes + Biodistribucion

Compuesto 2: DOTA-4-amino-1-carboximetil-piperidln-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2

imagen25

Se obtuvieron imagenes de Ga-68-DOTA-Compuesto 2 en un microPET/TC (Inveon, Siemens) en ratones portadores de tumor PC-3 y LNCaP 1 h despues de la inyeccion de 10 MBq de radiotrazador. Debido a la rapida eliminacion renal de dicho antagonista de bombesina se observo una actividad de fondo muy baja con solo algo de incorporacion en rinon y vejiga. Se bloqueo eficazmente un contraste tumoral elevado visible en ambos xenoinjertos con 100 |jg de bombesina o con el Compuesto no radioactivo 2 mismo. Los receptores de bombesina se bloquearon con exito utilizando bombesina, conduciendo a una perdida crltica de senal en el tumor, figura 3a y 3b en ratones portadores de tumor PC-3 + figura 4a y 4b, ratones portadores de tumor LNCaP.

Afinidad de union

Se determino la afinidad de union de Ga-68-DOTA-Compuesto 2 para PLGr mediante dos metodos diferentes: la autorradiografla de receptores sobre tejidos humanos y un ensayo celular con celulas PC-3. Ambos metodos proporcionaron una afinidad de union elevada del Compuesto 2, con una IC50 de ~8 nM basada en el peptido no radioactivo DOTA-Compuesto 2.

Estabilidad en plasma y microsomas de raton

Ga-68-DOTA-Compuesto 2 mostro una buena estabilidad metabolica, medida mediante metodos in vitro e in vivo diferentes. Se investigo la estabilidad in vivo en el plasma de Ga-68-DOTA-compuesto 2 en ratones no portadores de tumor. Se analizo el plasma y la orina de los ratones mediante HPLC 1, 3, 5, 10 y 15 min. despues de la inyeccion intravenosa de aprox. 20 MBq de Ga-68-DOTA-Compuesto 2 (figura 10a, b, c, d y e). Tras algunos minutos, se observo una degradacion plasmatica menor del radiotrazador, mostrando dos metabolitos muy pequenos/polares en tiempos de retencion 1,3 min. y 1,5 min., que tambien se observaron como metabolitos principales en la orina. Aparecio el compuesto mismo en un tiempo de retencion de 11,6-11,7, mostrando un doble pico desde 5 min. p.i.

Se determino la estabilidad microsomica de Ga-68-DOTA-Compuesto 2 utilizando microsomas de raton y humanos incubados con el radiotrazador y analizados mediante HPLC. No se observo degradacion por microsomas de raton o humanos de Ga-68-DOTA-Compuesto 2. Las impurezas menores detectadas en los cromatogramas tambien se observaron sin el cofactor microsomico.

Ejemplo 9

Imagenes de SPECT/TC y experimento de biodistribucion en ratones portadores de tumor PC-3 de 99mTc-ARN4-06 Ver el protocolo experimental anteriormente.

Radioligando: 99mTc-ARN4-06

Animal:: ratones desnudos portadores de tumor PC3; 3 ratones/grupo

Cantidad de inyeccion:: 10 pCi / 10 pmoles / 100 pl/raton

Punto temporal:: 1 h, 4h y 24 h

imagen26

Organo: 1 h desv. est. 4 h desv. est. 24 h desv. est.

Sangre: 1,32 0,07 0,33 0,05 0,04 0,01

corazon: 0,64 0,15 0,22 0,03 0,10 0,04

hlgado: 6,31 1,16 3,62 1,16 1,19 0,36

bazo: 3,91 0,66 1,29 0,53 0,87 0,18

pulmon: 5,11 1,00 3,17 1,51 1,69 0,84

Rinon izquierdo: 6,55 0,59 2,73 0,42 1,28 0,30

estomago: 8,09 1,45 5,44 1,26 0,61 0,19

intestino: 8,41 2,39 2,02 0,80 0,16 0,08

adrenal: 11,99 1,62 6,31 0,27 1,41 0,45

pancreas: 72,50 8,98 11,18 2,89 0,41 0,20

pituitaria: 6,86 2,85 2,12 0,59 0,83 0,31

musculo: 0,27 0,03 0,07 0,00 0,18 0,12

hueso: 0,78 0,13 0,45 0,18 0,35 0,20

tumor: 28,66 1,75 34,68 3,71 18,40 2,58

Rinon: 6,26 0,48 2,84 0,49 1,24 0,32

Radioligando: 99mTc-ARN4-05

Radioligando: 99mTc-ARN4-05

5

Proporcion tumor:organo: 1 h 4 h 24 h

tumor:sangre: 20,79 85,11 455,94

tumor:corazon: 36,75 150,38 176,45

tumor:hlgado: 4,37 9,50 15,47

tumor:bazo: 7,50 20,51 21,05

tumor:pulmon: 5,64 11,78 10,88

tumor:rinon: 4,26 12,92 14,35

tumor:estomago: 3,32 5,83 30,02

tumor:intestino: 3,20 16,51 117,53

tumor:adrenal: 2,31 2,62 13,07

tumor:pancreas: 0,38 3,28 44,93

tumor:pituitaria: 4,43 4,40 22,14

tumor:musculo: 116,82 283,06 99,65

tumor:hueso: 34,10 35,16 52,06

tumor:rinon: 4,25 12,25 14,87

La figura 6 muestra una imagen de SPECT/TC de 99mTc-ARN4-06 (15 MBq/200 pmoles).

Ejemplo 10

10

Imagenes de SPECT/TC y experimento de biodistribucion en ratones portadores de tumor PC-3 de 99mTc-ARN4-05 Ver el protocolo experimental anteriormente.

Animal:: ratones desnudos portadores de tumor PC3; 6 a 9 ratones/grupo

Cantidad de inyeccion:: 10 pCi / 10 pmoles / 100 pl/raton

Punto temporal:: 1h, 4h, 24 h

5

10

15

20

25

imagen27

Organo: 1 h desv. est. 4 h desv. est. 24 h desv. est.

Sangre: 1,69 0,14 0,40 0,05 0,09 0,02

corazon: 0,68 0,02 0,20 0,03 0,14 0,07

hfgado: 12,32 1,01 7,75 0,62 3,88 0,40

bazo: 4,00 0,60 1,72 0,34 0,83 0,22

Pulmon: 3,11 0,47 1,24 0,41 1,15 1,47

Rinon izquierdo: 10,50 1,20 6,12 1,17 1,42 0,13

estomago: 5,68 0,01 4,86 1,04 0,42 0,15

intestino: 6,97 1,57 2,12 0,37 0,12 0,01

adrenal: 19,05 3,06 7,91 2,70 2,08 0,31

pancreas: 64,86 6,72 19,86 2,35 0,57 0,21

pituitaria: 3,67 2,03 1,15 0,11 1,53 1,33

musculo: 0,43 0,16 0,08 0,02 0,11 0,04

hueso: 1,34 0,26 0,57 0,11 0,41 0,19

tumor: 22,50 2,62 29,91 4,00 15,16 0,45

Proporcion tumor:organo: 1 h 4 h 24 h

tumor:sangre: 13,30 74,77 167,74

tumor: corazon: 33,19 149,55 105,06

tumor:hfgado: 1,83 3,86 3,91

tumor:bazo: 5,62 17,41 18,21

tumor:pulmon: 7,24 24,11 13,21

tumor:rinon: 2,14 4,89 10,71

tumor:estomago: 3,96 6,15 35,99

tumor:intestino: 3,23 14,09 129,43

tumor:adrenal: 1,18 3,78 7,30

tumor: pancreas: 0,35 1,51 26,66

tumor:pituitaria: 6,14 25,96 9,93

tumor:musculo: 52,54 364,22 133,21

tumor:hueso: 16,80 52,85 37,06

La figura 8 muestra una imagen de SPECT/TC de 99mTc-ARN4-05 (15 MBq/200 pmoles).

Ejemplo 11

Sfntesis de Ga-68-DOTA-Compuesto 2

Etapa 1: se sintetizaron peptidos no radioactivos mediante sfntesis peptfdica en fase solida (SPFS) siguiendo la estrategia estandar de Fmoc con resina de amida de Rink soportada en poliestireno. Etapa 2:

350 pl de HEPES 0,25 M en vial Wheaton V

• Adicion de [68Ga]GaCl3 en 400 pl de acetona al 97,6%/HCl 0,05N

• Ajustar pH a ~3,5 con HCl 0,1M

• Adicion de 40 pg de peptido en 40 pl de agua

• Calentamiento 75 W (95°C) durante 30 s

• Reposo durante 30 s

• Repeticion de calentamiento y reposo tres veces mas

• Adicion de 5 ml de agua a la mezcla de reaccion

• Inmovilizacion sobre tC 18 Light SPE

• Lavado con agua (5 ml)

• Elucion con EtOH (500 pl)

imagen28

,N-Boc

'RESIN

CONH-T rt

CONH.

H2N-RESINA

1. tri-t-butil-DOTA, HOBT. HBTU

2. TFA, ague, TIS, fenol

(20-40 ug)

[68Ga]GaCI3, 95°C, HEPES 0,25 M

Microondas, 3 X 30 s

Rendimiento radioqulmico (no optimizado): 79 a 231 MBq (32 - 60% d.c.)

Actividad inicial: 189 a 593 MBq

N° de marcajes: 10

Negativos: 0

Pureza radioqulmica: >98% (segun HPLC e ITLC)

Actividad especlfica: 3,2 a 11,8 GBq/qmol

5 La figura 9 muestra el analisis de HPLC de Ga-68-DOTA-Compuesto 2 en una columna de fase inversa. Pureza del producto

Columna:: ACE 5q C18 50 x 4,6mm

Solvente:: Solvente A: H2O + TFA al 0,1%

Solvente B:: MeCN + TFA al 0,1%

Gradiente:: 5% a 95% en 7 min.

Caudal: 2 ml/min.

Ejemplo 12

10

Estabilidad en suero de Lu-177-DOTA-Compuesto 2

5

10

15

20

25

Tambien se investigo la estabilidad en suero humano de Lu-177-DOTA-Compuesto 2 marcado radioactivamente con Lu-177. Tras 96 h de incubacion de Lu-177-DOTA-Compuesto 2 en suero humano todavia se encontraba intacto 70% del compuesto, segun analisis mediante metodos de HPLC (figura 11). A 1 ml de suero humano recien preparado, previamente equilibrado en un medio con 5% de CO2 a 37°C, se anadieron 0,03 nmoles de solucion estandar de peptido marcado con 177Lu. La mezcla se incubo en un medio con 5% de CO2 a 37°C. En diferentes puntos temporales se extrajeron alicuotas de 100 pl (por triplicado) y se trataron con 200 pl de EtOH para precipitar las protemas en el suero. A continuation, las muestras se centrifugaron durante 15 min. a 5.000 rpm. Se extrajeron 50 pl del sobrenadante para el recuento de la actividad en un contador de pocillos y, se lavo dos veces el sedimento con 1 ml de EtOH y se conto, y se comparo la actividad del sobrenadante con la actividad del pellet, proporcionando el porcentaje de peptidos no unidos a proteinas o el metal radioactivo transferido a las proteinas del suero. Se analizo el sobrenadante mediante HPLC (eluyentes: A=acido trifluoroacetico al 0,1% en agua y B=acetonitrilo; gradiente: 0 min. 95% de A; 20 minutos: 50% de A) para determinar la estabilidad del peptido en el suero.

La figura 11 muestra la estabilidad de Lu-177-DOTA-Compuesto 2 en el suero humano.

Ejemplo 13

Comparacion entre F18-Colina y F18-FDG Biodistribucion de Ga-68-RM2, ver la Tabla a continuacion.

a 1 h p.i. en ratones portadores de tumor PC-3 se comparo con el trazador F-18 [18F]fluoroetilcolina (FEC) utilizado para la formation de imagenes de cancer de prostata y FDG, el trazador F18 estandar de oro en oncologia. Las proporciones de tumor a tejido elevadas subrayan la utilidad diagnostica del compuesto con Ga-68 RM2 para la formacion de imagenes de PET.

Ver la figura 12.

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

REIVINDICACIONES

1. Conjugado de antagonista de peptido analogo de la bombesina que presenta la formula general (I) (I) [A-(B)n]x-C

en la que

x es un numero entero de 1 a 3, n es un numero entero de 1 a 6,

A es un quelante de metal que comprende por lo menos un metal radionuclido,

B es un espaciador unido al extremo N de C o un enlace covalente,

C es un antagonista de peptido analogo de la bombesina de secuencia C-1 a C-3, en la que:

C-1: Xaa16-Gln7-Trp8-Ala9-Val10-Xaa211-His12-Xaa313-Xaa414-ZH,

en la que:

Xaa1 es D-Phe, D-Cpa, D-Tyr, D-Trp o un residuo que presenta cualquiera de las formulas descritas a continuacion

imagen1

imagen2

y

K es F, Cl, I o NO2,

Xaa2 es Gly o p-Ala,

Xaa3 es estatina, 4-Am,5-MeHpA o 4-Am,5-MeHxA,

Xaa4 es Leu, Cpa, Cba, CpnA, Cha, t-buGly, tBuAla, Met, Nle o iso-Bu-Gly, y Z es NH, O;

C-2: Xaa16-Gln7-Trp8-Ala9-Val10-Xaa211-His12-Leu^(CHOH-CH2)-(CH2)2-CH3, en la que:

Leu^(CHOH-CH2)-(CH2)2-CH3 es

imagen3

Xaa1 es D-Phe, D-Cpa, D-Tyr, D-Trp o un residuo que presenta cualquiera de las formulas descritas a continuacion

5

10

15

20

25

30

imagen4

y

K es F, Cl, I o NO2, Xaa2 es Gly o p-Ala;

C-3: Xaa16-Gln7-Trp8-Ala9-Val10-Xaa211-His12-Xaa513-Xaa614-ZH, en la que:

Xaa1 es D-Phe,

Xaa2 es Gly,

Xaa5 es Leu^-CH2NH-, Xaa6 es Cys o Phe,

y

Z es NH,

y sales farmaceuticamente aceptables de un acido inorganico u organico del mismo, hidratos, complejos, esteres, amidas y solvatos del mismo.
2. Conjugado de antagonista de peptido analogo de la bombesina segun la reivindicacion 1, en el que el quelante de metal (A) es un quelante de metal para metales trivalentes o para metales pentavalentes.
3. Conjugado de antagonista de peptido analogo de la bombesina segun la reivindicacion 2, en el que el quelante de metal para metales trivalentes se selecciona de entre el grupo que comprende quelantes a base de DOTA, NODASA, NODAGA, NOTA, DTPA, EDTA, TETA y TRITA.
4. Conjugado de antagonista de peptido analogo de la bombesina segun la reivindicacion 2, en el que el quelante de metal para metales pentavalentes se selecciona de entre el grupo que comprende:

imagen5

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

imagen6

en las que

R1-R15 son independientemente entre si atomos de hidrogeno o grupos alquilo (C1-C4), en las que, en la

Jf

~C\)t

fraccion de la formula anterior, t es 1 o 2 o 3 y por lo menos uno de los atomos de carbono en dicha

/Y

imagen7

fraccion esta sustituida con Y o no esta sustituida con Y,

R16 es un atomo de hidrogeno o un grupo CO2 alquilo (C1-C4);

R17 y R18 son independientemente entre si grupos alquilo (C1-C4) o grupos fenilo;

R19 es CH2-COOH o un derivado funcional del mismo;

E es alquileno (C1-C4) o fenileno

opcionalmente el alquileno (C1-C4) se sustituye con CO2-alquilo, CH2-CO-alquilo, CONH2, o CONHCH2-CO2- alquilo,

opcionalmente el fenileno se sustituye con CO2-alquilo,

en las que los grupos alquilo presentan 1 a 4 atomos de carbono;

G es NH o S;

Y es un grupo funcional que puede unirse a un grupo amino libre del peptido (extremo N) o con el espaciador, y Z' es S o O.
5. Conjugado de antagonista de peptido analogo de la bombesina segun la reivindicacion 1, en el que el metal radionuclido para la formacion de imagenes se selecciona de entre el grupo que comprende 133mIn, 99mTc, 67Ga, 52Fe, 68Ga, 72As, 111In, 97Ru, 203Pb, 62Cu, 64Cu, 51Cr, 52mMn, 157Gd, 123I, 124I, 131I, 75Br, 76Br, 77Br y 82Br.
6. Conjugado de antagonista de peptido analogo de la bombesina segun la reivindicacion 1, en el q radionuclido para radioterapia se selecciona de entre el grupo que comprende 186Re, 90Y, 67Cu, 69Er, 1 142Pr, A4>, 1 98au, 19>, ^Tb, 109Pd, ^Rd, 18_Re, ^Re, "As, ^Dy, 166Ho, 149Pm, 151Pm, 153Sm, 159Gd, 7

111In, 169Yb, 175Yb, 177Lu, 105Rh, 111Ag, 125I, 123I, 213Bi, 225Ac, 129I y 177mSn

ue el metal

21Sn, 127Te, 172Tm, 90Y,
7. Conjugado de antagonista de peptido analogo de la bombesina segun la reivindicacion 1, en el que el espaciador B unido al extremo N de C presenta la formula general II:

II B1-B2

en la que

B1 es un enlace covalente o un aminoacido natural o un aminoacido no natural o una diamina lineal o una diamina clclica,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

B2 es un enlace covalente o un aminoacido natural o un aminoacido no natural o un acido carboxllico lineal o un acido carboxllico clclico,

con la condicion de que tanto Bi como B2 no puedan ser enlaces covalentes simultaneamente y de que, cuando Bi sea una diamina, B2 sea un acido carboxllico.
8. Conjugado de antagonista de peptido analogo de la bombesina segun la reivindicacion 7, en el que el aminoacido no natural es un compuesto que presenta cualquiera de las formulas generales III, IV, V o VI, en el que

imagen8

en la que

a es un numero entero de 0 a 3, b es un numero entero de 0 a 3,

y los patrones de sustitucion relativa u opcionalmente 1,2-, 1,3- o 1,4-;

IV

■HN'h~'H;<CH’VCO'

en la que

c es un numero entero de 1 a 24, d es un numero entero de 1 a 6;

V

imagen9

en la que

E' es NH o CH2, f es un numero entero de 0 a 6, g es un numero entero de 0 a 6;

cuando E' es CH2, entonces el anillo de 6 miembros se sustituye opcionalmente en cualquier posicion de carbono del anillo de 6 miembros en el mismo carbono del anillo o en carbonos diferentes,

cuando E' es NH, entonces el anillo de 6 miembros se sustituye opcionalmente en cualquier posicion de carbono del anillo de 6 miembros en el mismo atomo de carbono del anillo o en diferentes atomos de carbono y/o en el atomo de nitrogeno con la condicion de que f o g sea un numero entero igual o superior a 1;

imagen10

en la que

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

i es un numero entero de 1 a 6, j es un numero entero de 1 a 6,

P es O o H2, preferentemente, i es un numero entero de 1 a 3, j es un numero entero de 1 a 3,

P es O.
9. Conjugado de antagonista de peptido analogo de la bombesina segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, con la condicion de que el conjugado de antagonista de peptido analogo de la bombesina presente la formula general (I'):

(I') [A'-(B)n]x-C

en la que

se incluye A' en lugar de A y presenta el mismo significado que A con la excepcion de que es un quelante de metal libre de metal radionuclido.
10. Composicion farmaceutica que comprende cualquiera de los conjugados de antagonista de peptido analogo de la bombesina segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
11. Utilization de cualquiera de los conjugados de antagonista de peptido analogo de la bombesina segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para la union a receptores de bombesina, preferentemente al receptor de peptido liberador de gastrina (PLG) y/o para la inhibicion de receptores de bombesina, preferentemente el receptor de peptido liberador de gastrina (PLG).
12. Procedimiento para preparar cualquiera de los conjugados de antagonista de peptido analogo de la bombesina segun la reivindicacion 1, que comprende la etapa de:

- radioquelar el conjugado de antagonista de peptido analogo de la bombesina que presenta la formula general (I') como se ha definido anteriormente con un metal radionuclido o atomo de metal adecuado.
13. Conjugado de antagonista de peptido analogo de la bombesina segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para la utilizacion en un procedimiento para la formation de imagenes de receptores de bombesina, preferentemente un receptor de PLG que expresan las celulas tumorales y/o los vasos tumorales y peritumorales en un paciente, que comprende las etapas de:

- administrar a un paciente una cantidad radiofarmaceutica eficaz de dicho conjugado de antagonista de peptido analogo de la bombesina; y

- formar imagenes del metal radionuclido en el paciente.
14. Utilizacion de una cantidad radiofarmaceuticamente eficaz de un conjugado de antagonista de peptido analogo de la bombesina segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para la preparation de un agente de formacion de imagenes para la formacion de imagenes de receptores de bombesina, preferentemente un receptor de PLG que expresan las celulas tumorales y/o los vasos tumorales y peritumorales.
15. Utilizacion segun la reivindicacion 14, en la que dichas celulas tumorales se refieren a canceres seleccionados de entre el grupo que comprende:

- cancer de prostata, incluyendo las metastasis

- cancer de mama, incluyendo las metastasis

- tumores estromales gastrointestinal es

- carcinomas pulmonares de celulas pequenas

- carcinomas de celulas renales,

- tumores neuroendocrinos gastroenteropancreaticos,

- canceres de celulas escamosas de cabeza y cuello,

- neuroblastomas, y

- carcinomas de celulas escamosas esofagicos, y en la que

dichos vasos tumorales y peritumorales se refieren a canceres que son seleccionados de entre el grupo que comprende:

5

10

15

20

25

30

- canceres ovaricos,

- canceres endometriales, y

- canceres pancreaticos.
16. Utilizacion de una cantidad terapeuticamente eficaz de un conjugado de antagonista de peptido anaiogo de la bombesina segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para la preparacion de un medicamento para tratar o prevenir las enfermedades relacionadas con celulas tumorales y/o vasos tumorales y peritumorales.
17. Utilizacion segun la reivindicacion 16, en la que dichas enfermedades relacionadas con celulas tumorales se seleccionan de entre el grupo que comprende:

- cancer de prostata, incluyendo las metastasis,

- cancer de mama, incluyendo las metastasis,

- tumores estromales gastrointestinales,

- carcinoma pulmonar de celulas pequenas,

- carcinomas de celulas renales,

- tumores neuroendocrinos gastroenteropancreaticos,

- canceres de celulas escamosas de cabeza y cuello,

- neuroblastomas, y

- carcinomas de celulas escamosas esofagicos,

y en la que dichas enfermedades relacionadas con vasos tumorales y peritumorales se seleccionan de entre el grupo que comprende:

- cancer de prostata, incluyendo las metastasis, y

- cancer de mama, incluyendo las metastasis.
18. Utilizacion del conjugado de antagonista de peptido analogo de la bombesina segun la reivindicacion 9 y un vehlculo, diluyente, excipiente o adyuvante aceptables para el radiomarcaje de un quelante de metal en un kit para la preparacion de un agente radioterapeutico o de un agente radiofarmaceutico de formacion de imagenes que comprende un vial que contiene una cantidad predeterminada de dicho conjugado.