KR20120106763A

KR20120106763A - Ｂｐｂ－기반 카르고 운반 시스템

Info

Publication number: KR20120106763A
Application number: KR1020127015782A
Authority: KR
Inventors: 전상용; 김성현; 박세호; 김동규; 박진호; 어 쏘우페이
Original assignee: 광주과학기술원
Priority date: 2009-12-11
Filing date: 2010-12-03
Publication date: 2012-09-26
Also published as: US20120321697A1; WO2011071279A3; JP5677453B2; WO2011071279A2; JP2013513601A

Abstract

본 발명은 (a) 다음을 포함하는 바이포달 펩타이드 바인더(Bipodal Peptide Binder: BPB): (i) 가닥간(interstrand) 비공유결합이 형성된 패러럴(parallel), 안티패러럴(antiparallel) 또는 패러럴(parallel)과 안티패러럴(antiparallel) 아미노산 가닥들을 포함하는 구조 안정화 부위(structure stabilizing region); 및 (ii) 상기 구조 안정화 부위의 양말단에 결합되어 있고 무작위적으로 선택된 각각 n 및 m 개의 아미노산을 포함하는 타겟 결합 부위 I(target binding region I) 및 타겟 결합 부위 II(target binding region II); 그리고, (b) 상기 바이포달 펩타이드 바인더에 결합된 카르고를 포함하는 BPB-기반 카르고 운반시스템(Cargo Delivery System)에 관한 것으로서, 본 발명의 BPB-기반 카르고 운반시스템은 BPB 의 타겟 결합성 및 특이성에 기초하여 다양한 물질들을 세포표면 또는 세포 내로 운반할 수 있다. 바이포달 펩타이드 바인더는 매우 낮은 수준(예컨대, nM 수준)의 K_D 값(해리상수)을 나타내어, 타겟에 매우 높은 친화도를 나타낸다. 본 발명의 BPB-기반 카르고 운반시스템은 의약, 인 비보 분자 이미징, 인 비트로 세포 이미징 및 약물전달용 타겟팅을 하는 데 이용될 수 있으며, 에스코트 분자로도 매우 유용하게 이용될 수 있다.

Description

BPB-기반 카르고 운반 시스템{BPB-BASED CARGO DELIVERY SYSTEM}

본 발명은 BPB-기반 카르고 운반 시스템에 관한 것이다.

항체는 B 세포가 생산하는 혈장단백질의 일종인 면역글로불린 단백질로써 외부에서 들어온 항원의 특정부위를 특이적으로 인식하여 결합함으로써 항원을 비활성화하거나 무력화시킨다. 이러한 항원-항체 반응의 특이성과 고도의 친화도 및 수천만 종류의 항원을 구별할 수 있는 항체의 다양성을 응용하여 오늘날 진단제와 치료제 등을 포함하는 많은 종류의 항체 제품이 출현하게 되었다. 현재 FDA 에서는 21 개의 단일클론항체를 승인하였으며 리턱시맵(Rituximab) 및 헤르셉틴(Herceptin)과 같은 항체는 다른 치료에서 전혀 반응을 보이지 않던 환자들의 50％ 이상에서 효과를 보인바 있으며 실질적으로 여러 연구에서 단일클론항체를 이용하여 림프종, 대장암 또는 유방암 등에 성공적인 임상치료를 보여주고 있다. 치료용 항체의 전체 시장 규모는 2004 년 100 억 달러 규모에서 2010 년에는 300 억 달러로 연평균 20％의 성장률을 보일 것으로 추정하고 있으며, 그 시장 규모는 기하급수적으로 증가할 것으로 추정되고 있다. 항체를 이용한 신약개발이 활발해지는 이유는 약품의 개발기간이 짧으며 투자비용이 작고 부작용을 쉽게 예측할 수 있기 때문이다. 또한 항체는 생약이어서 인체가 거의 영향을 받지 않으며 체내에서의 반감기가 저 분자량 약품에 비하여 압도적으로 길어서 환자에게 친화적이다. 이러한 유용성에도 불구하고 인간에서 단일클론항체는 외래 항원으로 인식하여 심한 알레르기 반응 또는 과민반응을 일으키기도 한다. 또한, 이러한 항암 기능의 단클론 항체를 임상적으로 사용할 경우 생산 단가가 높기 때문에 치료제로서의 가격이 급격히 상승한다는 단점이 있으며, 항체를 배양하는 방법 및 정제 방법 등 광범위한 분야의 기술들이 각종 지적 소유권에 의해 보호받고 있기 때문에 비싼 라이센싱비를 지불해야 한다.

따라서 이 문제를 해결하기 위해서 미국을 중심으로 유럽연합에서 항체 대체 단백질 개발이 태동기에 있다. 항체 대체 단백질은 항체와 같이 불변영역과 가변영역을 가질 수 있도록 만든 재조합 단백질로 크기가 작고 안정한 단백질의 일정부분을 무작위 서열의 아미노산으로 바꾸어 라이브러리를 만들고 이를 표적물질에 대해 스크리닝을 하여 높은 친화력과 좋은 특이성을 가진 물질을 찾을 수 있다. 예를 들어 항체 대체 단백질중 아비머(avimer)와 아피바디(affibody)는 표적물질에 대해 피코몰(picomole) 정도의 친화력을 가진 예시가 보고되어 있다. 이런 항체 대체 단백질은 크기가 작고 안정해서 암세포에 깊이 침투 가능하며 일반적으로 면역반응을 적게 일으킨다고 보고되어 있다. 그리고 무엇보다도 광범위한 항체 특허 문제에서 벗어 날 수 있으며 박테리아에서 쉽게 대량정제 할 수 있기 때문에 생산단가가 낮아 경제적으로 항체보다 큰 장점을 가진다. 현재 개발된 항체 대체 단백질은 40 개가 있으나 이 중 벤처 회사나 다국적 제약회사에서 상용화를 시도하고 있는 항체 대체 단백질은 피브로넥틴 타입 III 도메인, 리포칼린, LDLR-A 도메인, 크리스탈린, 프로테인 A, 안키린 리피트(Ankyrin repeat), BPTI 라는 단백질을 이용하고 있으며 타겟에 대한 피코몰에서 수 나노몰정도의 높은 친화력을 가지고 있다. 그 중 애드넥틴(Adnectin), 아비머, 쿠니츠(Kunitz) 도메인은 현재 FDA 임상 실험이 진행 중이다.

본 발명은 지금까지의 단백질을 이용한 항체대체 단백질과는 다른 펩타이드 기반 항체대체 단백질에 초점을 맞추었다. 펩타이드는 항체에 비해 적절한 약물동력학, 대량생산성, 낮은 독성, 항원성 억제 및 낮은 생산 단가 등으로 인해 현재 항체 치료제를 대체하여 다양하게 활용되고 있다. 치료용 약으로서의 펩타이드의 장점은 생산 단가가 낮고, 안전성 및 반응성이 높으며, 특허 로얄티가 상대적으로 저렴하고, 원하지 않는 면역시스템에 덜 노출되어 펩타이드 자체에 대한 항체 생산을 억제 할 수 있으며, 합성을 통한 변형이 쉽고 정확하다는 것이다. 그러나 대부분의 펩타이드는 항체에 비해 특정 단백질 타켓에 대해 낮은 친화력 및 특이성을 보이기 때문에 여러 응용분야에 사용되지 못하는 단점이 있다. 따라서, 펩타이드의 단점을 극복할 수 있는 새로운 펩타이드 기반 항체 대체 단백질 개발에 대한 요구가 당업계에 대두되고 있다. 이에 본 발명자들은 생물학적 타겟 분자에 높은 친화성으로 특이적 결합이 가능한 펩타이드 물질을 개발하고자 노력하였다. 이는 현재 매우 많은 타겟에 대해 보고된 낮은 친화력를 가진 펩타이드를 이용하여 빠른 시간안에 높은 친화성 및 특이성을 가진 신약후보를 만들 수 있는 기술이 될 것으로 기대된다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 본 발명자들은 타겟 결합성 및 특이성에 기초하여 다양한 물질들을 세포 내 또는 세포 표면에 운반할 수 시스템을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 비교적 리지드(rigid)한 펩타이드 골격을 가지는 구조안정화 부위의 양 말단에 무작위적(random)으로 펩타이드를 결합시키고, 이 두 펩타이드를 공동으로 타겟 분자에 결합시키는 경우에는 크게 증가된 결합능 및 특이성을 가지는 바이포달 펩타이드 바인더(BPB)를 얻을 수 있고, 이 BPB 에 운반대상의 카르고를 결합시키는 겨우에는 BPB 의 타겟 결합성 및 특이성에 기초하여 다양한 물질들을 세포표면 또는 세포 내로 운반할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 BPB-기반 카르고 운반 시스템을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 BPB-기반 카르고 운반시스템(Cargo Delivery System)을 제공한다:

(a) 다음을 포함하는 바이포달 펩타이드 바인더(Bipodal Peptide Binder: BPB):

(i) 가닥간(interstrand) 비공유결합이 형성된 패러럴(parallel), 안티패러럴(antiparallel) 또는 패러럴(parallel)과 안티패러럴(antiparallel) 아미노산 가닥들을 포함하는 구조 안정화 부위(structure stabilizing region); 및

(ii) 상기 구조 안정화 부위의 양 말단에 결합되어 있고 무작위적으로 선택된 각각 n 및 m 개의 아미노산을 포함하는 타겟 결합 부위 I(target binding region I) 및 타겟 결합 부위 II(target binding region II); 그리고,

(b) 상기 바이포달 펩타이드 바인더에 결합된 카르고.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 BPB-기반 카르고 운반시스템(Cargo Delivery System)을 개체, 조직 또는 세포에 처리하는 단계를 포함하는 카르고를 운반하는 방법을 제공한다.

(a) 다음을 포함하는 바이포달 펩타이드 바인더(Bipodal Peptide Binder: BPB): (i) 가닥간(interstrand) 비공유결합이 형성된 패러럴(parallel), 안티패러럴(antiparallel) 또는 패러럴(parallel)과 안티패러럴(antiparallel) 아미노산 가닥들을 포함하는 구조 안정화 부위(structure stabilizing region); 및 (ii) 상기 구조 안정화 부위의 양 말단에 결합되어 있고 무작위적으로 선택된 각각 n 및 m 개의 아미노산을 포함하는 타겟 결합 부위 I(target binding region I) 및 타겟 결합 부위 II(target binding region II); 그리고,

(b) 상기 바이포달 펩타이드 바인더에 결합된 카르고.

본 발명자들은 본 발명자들은 타겟 결합성 및 특이성에 기초하여 다양한 물질들을 세포 내 또는 세포 표면에 운반할 수 시스템을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 비교적 리지드(rigid)한 펩타이드 골격을 가지는 구조안정화 부위의 양 말단에 무작위적(random)으로 펩타이드를 결합시키고, 이 두 펩타이드를 공동으로 타겟 분자에 결합시키는 경우에는 크게 증가된 결합능 및 특이성을 가지는 바이포달 펩타이드 바인더(BPB)를 얻을 수 있고, 이 BPB 에 운반대상의 카르고를 결합시키는 겨우에는 BPB 의 타겟 결합성 및 특이성에 기초하여 다양한 물질들을 세포표면 또는 세포 내로 운반할 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 기본적인 전략은 리지드한 펩타이드 골격의 양 말단에 타겟에 결합되는 펩타이드를 연결하는 것이다. 이 경우 리지드한 펩타이드 골격은 바이포달 펩타이드 바이더의 전체적인 구조를 안정화시키는 작용을 하며, 타겟 결합 부위 I 및 타겟 결합 부위 II가 타겟 분자에 결합되는 것을 강화시킨다.

본 발명에서 이용 가능한 구조안정화 부위는 패러럴, 안티패러럴 또는 패러럴과 안티패러럴 아미노산 가닥들을 포함하며, 가닥간(interstrand) 수소결합, 정전기적 상호작용, 소수성상호작용, 반데르 발스 상호작용, 파이-파이 상호작용, 양이온-파이 상호작용 또는 이들의 조합에 의한 비공유결합이 형성되는 단백질 구조 모티프들을 포함한다. 가닥간 수소결합, 정전기적 상호작용, 소수성상호작용, 반데르 발스 상호작용, 파이-파이 상호작용, 양이온-파이 상호작용 또는 이들의 조합에 의한 형성되는 비공유결합은 구조안정화 부위의 견고성(rigidity)에 기여한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 구조안정화 부위에서의 가닥간(interstrand) 비공유결합은 수소결합, 소수성상호작용, 반데르 발스 상호작용, 파이-파이 상호작용 또는 이들의 조합을 포함한다.

선택적으로, 구조화안정화 부위에 공유결합이 있을 수 있다. 예를 들어, 구조화안정화 부위에 이황화결합을 형성시켜 구조안정화 부위의 견고성을 더 증가시킬 수 있다. 이러한 공유결합에 의한 견고성 증가는 바이포달 펩타이드 바인더의 타겟에 대한 특이도 및 친화도를 고려하여 부여한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 구조 안정화 부위의 아미노산 가닥들은 링커로 연결되어 있다. 본 명세서에서 가닥을 언급하면서 사용되는 용어 "링커" 는 가닥과 가닥을 연결시켜 주는 물질을 의미한다. 예컨대, 구조안정화 부위로서 β-헤어핀이 이용되는 경우에는 β-헤어핀에 있는 턴 서열이 링커의 역할을 하며, 루이신 지퍼가 이용되는 경우에는 루이신 지퍼의 두 C-말단을 연결하는 물질(예컨대, 펩타이드 링커)이 링커의 역할을 한다.

링커는 패러럴, 안티패러럴 또는 패러럴과 안티패러럴 아미노산 가닥들을 연결한다. 예컨대, 패러럴 방식으로 정렬된 최소 2 개의 가닥(바람직하게는 2 개의 가닥), 안티패러럴 방식으로 정렬된 최소 2 개의 가닥(바람직하게는 2 개의 가닥), 패러럴 및 안티패러럴 방식으로 정렬된 최소 3 개의 가닥(바람직하게는 3 개의 가닥)을 링커가 연결하게 된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 링커는 턴 서열 또는 펩타이드 링커이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 턴 서열은 β-턴, γ-턴, α-턴, π-턴 또는 ω-loop 이다(Venkatachalam CM (1968), Biopolymers, 6, 1425-1436; Nemethy G and Printz MP. (1972), Macromolecules, 5, 755-758; Lewis PN et al., (1973), Biochim . Biophys . Acta, 303, 211-229; Toniolo C. (1980) CRC Crit . Rev. Biochem ., 9, 1-44; Richardson JS. (1981), Adv. Protein Chem., 34, 167-339; Rose GD et al., (1985), Adv . Protein Chem., 37, 1-109; Milner-White EJ and Poet R. (1987), TIBS, 12, 189-192; Wilmot CM and Thornton JM. (1988), J. Mol. Biol., 203, 221-232; Milner-White EJ. (1990), J. Mol . Biol ., 216, 385-397; Pavone V et al. (1996), Biopolymers, 38, 705-721; Rajashankar KR and Ramakumar S. (1996), Protein Sci., 5, 932-946). 가장 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 턴 서열은 β-턴이다.

턴 서열로서 β-턴이 이용되는 경우, 바람직하게는 타입 I, 타입 I', 타입 II, 타입 II', 타입 III 또는 타입 III' 턴 서열이고, 보다 바람직하게는 타입 I, 타입 I', 타입 II, 타입 II' 턴 서열이고, 보다 더 바람직하게는 타입 I' 또는 타입 II' 턴 서열이며, 가장 바람직하게는 타입 I' 턴 서열이다(B. L. Sibanda et al., J. Mol . Biol., 1989, 206, 4, 759-777; B. L. Sibanda et al., Methods Enzymol., 1991, 202, 59-82).

본 발명의 다른 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 턴 서열로서 이용될 수 있는 것은 H. Jane Dyson et al., Eur . J. Biochem. 255:462-471(1998)에 개시되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 턴 서열로 이용될 수 있는 것은 다음의 아미노산 서열을 포함한다: X-Pro-Gly-Glu-Val; Ala-X-Gly-Glu-Val (X 는 20 개의 아미노산으로부터 선택된다).

본 발명의 일 구현예에 따라, 구조안정화 부위로서 β-쉬트 또는 루이신 지퍼가 이용되는 경우, 패러럴 방식으로 정렬된 2 개의 가닥 또는 안티패러럴 방식으로 정렬된 2 개의 가닥을 펩타이드 링커가 연결하는 것이 바람직하다.

펩타이드 링커는 당업계에 공지된 어떠한 것도 이용 가능하다. 적합한 펩타이드 링커의 서열은 다음과 같은 요소를 고려하여 선택될 수 있다: (a) 유연한 연장된 컨포메이션(flexible extended conformation)에 적용될 수 있는 능력; (b) 생물학적 타겟 분자와 상호작용 하는 이차구조를 생성하지 않는 능력; 및 (c) 생물학적 타겟 분자와 상호작용하는 소수성 잔기 또는 전하를 갖는 잔기의 부재. 바람직한 펩타이드 링커는 Gly, Asn 및 Ser 잔기를 포함한다. Thr 및 Ala 과 같은 다른 중성 아미노산들도 링커 서열에 포함될 수 있다. 링커에 적합한 아미노산 서열은 Maratea et al., Gene 40:39-46( 1985); Murphy et al., Proc . Natl . Acad Sci . USA 83:8258-8562(1986); 미국 특허 제 4,935,233 호, 제 4,751,180 호 및 제 5,990,275 호에 개시되어 있다. 펩타이드 링커 서열은 1-50 아미노산 잔기로 구성될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 구조안정화 부위는 헤어핀, β-헤어핀, 베타-턴, 링커로 연결된 β-쉬트 또는 링커로 연결된 루이신 지퍼이고, 보다 바람직하게는 구조안정화 부위는 β-헤어핀 또는 링커로 연결된 β-쉬트이며, 가장 바람직하게는 β-헤어핀이다.

본 명세서에서 용어 "β-헤어핀" 은 두 개의 β 가닥을 포함하는 가장 간단한 단백질 모티프를 의미하며, 이 두 개의 β 가닥은 서로 안티패러럴한 정렬을 나타낸다. 이 β-헤어핀에서 두 개의 β 가닥은 일반적으로 턴 서열에 의해 연결된다.

바람직하게는, β-헤어핀에 적용되는 턴 서열은 타입 I, 타입 I', 타입 II, 타입 II', 타입 III 또는 타입 III' 턴 서열이고, 보다 바람직하게는 타입 I, 타입 I', 타입 II, 타입 II' 턴 서열이고, 보다 더 바람직하게는 타입 I' 또는 타입 II' 턴 서열이며, 가장 바람직하게는 타입 I' 턴 서열이다. 또한, X-Pro-Gly-Glu-Val; 또는 Ala-X-Gly-Glu-Val (X 는 20 개의 아미노산으로부터 선택된다)으로 표시되는 턴 서열도 β-헤어핀에 이용될 수 있다.

본 발명의 예시적인 실시예에 따르면, 타입 I 턴 서열은 Asp-Asp-Ala-Thr-Lys-Thr 이고, 타입 I' 턴 서열은 Glu-Asn-Gly-Lys 이며, 타입 II 턴 서열은 X-Pro-Gly-Glu-Val; 또는 Ala-X-Gly-Glu-Val (X 는 20 개의 아미노산으로부터 선택된다)이고, 타입 II' 턴 서열은 Glu-Gly-Asn-Lys 또는 Glu-D-Pro-Asn-Lys 이다.

β-헤어핀 콘포메이션을 갖는 펩타이드는 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 미국 특허 제 6,914,123 호 및 Andrea G. Cochran et al., PNAS, 98(10):5578-5583)에 개시되어 있는 트립토판 지퍼, WO 2005/047503 에 개시되어 있는 주형-고정된 β-헤어핀 미멕틱, 미국 특허 제 5,807,979 호에 개시되어 있는 β-헤어핀 변형체들이 잘 알려져 있다. 이외에도, β-헤어핀 콘포메이션을 갖는 펩타이드는 Smith ＆ Regan (1995) Science 270:980-982; Chou ＆ Fassman (1978) Annu. Rev. Biochem. 47:251-276; Kim ＆ Berg (1993) Nature 362:267-270; Minor ＆ Kim (1994) Nature 367:660-663; Minor ＆ Kim (1993) Nature 371:264-267; Smith et al. Biochemistry (1994) 33:5510-5517; Searle et al. (1995) Nat. Struct. Biol. 2:999-1006; Haque ＆ Gellman (1997) J. Am. Chem. Soc. 119:2303-2304; Blanco et al. (1993) J. Am. Chem. Soc. 115:5887-5888; de Alba et al. (1996) Fold. Des. 1: 133-144; de Alba et al. (1997) Protein Sci. 6:2548-2560; Ramirez-Alvarado et al. (1996) Nat. Struct. Biol. 3:604-612; Stanger ＆ Gellman (1998) J. Am. Chem. Soc. 120:4236-4237; Maynard ＆ Searle (1997) Chem. Commun. 1297-1298; Griffiths-Jones et al. (1998) Chem. Commun. 789-790; Maynard et al. (1998) J. Am. Chem. Soc. 120:1996-2007; 및 Blanco et al. (1994) Nat. Struct. Biol. 1:584-590 에 개시되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

β-헤어핀 콘포메이션을 갖는 펩타이드를 구조안정화 부위로 이용하는 경우, 가장 바람직하게는 트립토판 지퍼를 이용한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 트립토판 지퍼는 다음 일반식 I 로 표시된다:

일반식 I

X₁ 은 Ser 또는 Gly-Glu 이고, X₂ 및 X'₂ 는 서로 독립적으로 Thr, His, Val, Ile, Phe 또는 Tyr 이며, X₃ 는 Trp 또는 Tyr 이고, X₄ 는 타입 I, 타입 I', 타입 II, 타입 II' 또는 타입 III 또는 타입 III' 턴 서열이고, X₅ 는 Trp 또는 Phe 이며, X₆ 는 Trp 또는 Val 이고, X₇ 는 Lys 또는 Thr-Glu 이다.

보다 바람직하게는, 상기 일반식 I 에서 X₁ 은 Ser 또는 Gly-Glu 이고, X₂ 및 X'₂ 는 서로 독립적으로 Thr, His 또는 Val 이며, X₃ 는 Trp 또는 Tyr 이고, X₄ 는 타입 I, 타입 I', 타입 II 또는 타입 II' 턴 서열이고, X₅ 는 Trp 또는 Phe 이며, X₆ 는 Trp 또는 Val 이고, X₇ 는 Lys 또는 Thr-Glu 이다.

보다 더 바람직하게는, 일반식 I 에서 X₁ 은 Ser 또는 Gly-Glu 이고, X₂ 및 X'₂ 는 서로 독립적으로 Thr, His 또는 Val 이며, X₃ 는 Trp 이고, X₄ 는 타입 I, 타입 I', 타입 II 또는 타입 II' 턴 서열이고, X₅ 는 Trp 이며, X₆ 는 Trp 이고, X₇ 는 Lys 또는 Thr-Glu 이다.

보다 더욱 더 바람직하게는, 일반식 I 에서 X₁ 은 Ser 이고, X₂ 및 X'₂ 는 Thr 이며, X₃ 는 Trp 이고, X₄ 는 타입 I' 또는 타입 II' 턴 서열이고, X₅ 는 Trp 이며, X₆ 는 Trp 이고, X₇ 는 Lys 이다.

가장 바람직하게는, 일반식 I 에서 X₁ 은 Ser 이고, X₂ 및 X'₂ 는 Thr 이며, X₃ 는 Trp 이고, X₄ 는 타입 I' 턴 서열 (ENGK) 또는 타입 II' 턴 서열(EGNK)이고, X₅ 는 Trp 이며, X₆ 는 Trp 이고, X₇ 는 Lys 이다.

본 발명에 적합한 트립토판 지퍼의 예시적인 아미노산 서열은 서열목록 제 1 서열 내지 제 3 서열 및 제 5 서열 내지 제 10 서열에 기재되어 있다.

본 발명에서 구조안정화 부위로서 이용가능한 β-헤어핀 펩타이드는 단백질 G 의 B1 도멘인으로부터 유래된 펩타이드, 즉 GB1 펩타이드이다.

본 발명에서 GB1 펩타이드가 이용되는 경우, 바람직하게는 구조안정화 부위는 다음 일반식 II로 표시된다:

일반식 II

X₁ 은 Arg, Gly-Glu 또는 Lys-Lys 이고, X₂ 는 Gln 또는 Thr 이며, X₃ 는 타입 I, 타입 I', 타입 II, 타입 II' 또는 타입 III 또는 타입 III' 턴 서열이고, X₄ 는 Gln, Thr-Glu 또는 Gln-Glu 이다.

보다 바람직하게는, 일반식 II의 구조안정화 부위는 다음 일반식 II'으로 표시된다:

일반식 II

X₁ 은 Gly-Glu 또는 Lys-Lys 이고, X₂ 는 타입 I, 타입 I', 타입 II, 타입 II' 또는 타입 III 또는 타입 III' 턴 서열이고, X₃ 는 Thr-Glu 또는 Gln-Glu 이다.

본 발명에 적합한 GB1 β-헤어핀의 예시적인 아미노산 서열은 서열목록 제 4 서열 및 제 14 서열 내지 제 15 서열에 기재되어 있다.

본 발명에서 구조안정화 부위로서 이용 가능한 β-헤어핀 펩타이드는 HP 펩타이드이다. 본 발명에서 HP 펩타이드가 이용되는 경우, 바람직하게는 구조안정화 부위는 다음 일반식 III으로 표시된다:

일반식 III

X₁ 은 Lys 또는 Lys-Lys 이고, X₂ 는 Trp 또는 Tyr 이고, X₃ 는 Val 또는 Thr 이며, X₄ 는 타입 I, 타입 I', 타입 II, 타입 II' 또는 타입 III 또는 타입 III' 턴 서열이고, X₅ 는 Trp 또는 Ala 이며, X₆ 는 Trp 또는 Val 이고, X₇ 은 Glu 또는 Gln-Glu 이다.

본 발명에서 구조안정화 부위로서 이용 가능한 또 다른 β-헤어핀 펩타이드는 다음 일반식 IV로 표시된다:

일반식 IV

X₁ 은 Lys-Thr 또는 Gly 이고, X₂ 는 Trp 또는 Tyr 이고, X₃ 는 타입 I, 타입 I', 타입 II, 타입 II' 또는 타입 III 또는 타입 III' 턴 서열이고, X₄ 는 Thr-Glu 또는 Gly 이다.

일반식 III 및 IV 의 β-헤어핀의 예시적인 아미노산 서열은 서열목록 제 11 서열 내지 제 12 서열, 제 15 서열 및 제 16 서열 내지 제 19 서열에 기재되어 있다.

본 발명에 따르면, 구조안정화 부위로서 헤어핀(알파-헤어핀, 베타-헤어핀, 감마-헤어핀, p-헤어핀 등)이 이용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따르면, 구조안정화 부위로서 베타-턴이 이용될 수 있다.

본 발명에 따르면, 구조안정화 부위로서 링커로 연결된 β-쉬트를 이용할 수 있다. β-쉬트 구조에서 패러럴 또는 안티패러럴한, 바람직하게는 안티패러럴한 두 개의 아미노산 가닥이 뻗은 구조(extended form)로 되어 있으며, 아미노산 가닥 사이에 수소 결합이 형성된다.

β-쉬트 구조에서 두 개의 아미노산 가닥의 인접한 두 말단은 링커에 의해 연결된다. 링커로서는 상술한 다양한 턴-서열 또는 펩타이드 링커가 이용될 수 있다. 턴-서열이 링커로 이용되는 경우, β-턴 서열이 가장 바람직하다.

본 발명의 다른 변형예에 따르면, 구조안정화 부위로서 루이신 지퍼 또는 링커로 연결된 루이신 지퍼가 이용될 수 있다. 루이신 지퍼는 패러럴한 2 개의 α-사슬의 다이머화를 야기하는 보존성 펩타이드 도메인이며, 일반적으로 유전자 발현에 관여하는 단백질에 발견되는 다이머화 도메인이다("Leucine scissors". Glossary of Biochemistry and Molecular Biology (Revised). (1997). Ed. David M. Glick. London: Portland Press; Landschulz WH, et al. (1988) Science 240:1759-1764). 루이신 지퍼는 일반적으로 헵태드(heptad) 반복 서열을 포함하며, 루이신 잔기가 4 번째 또는 5 번째에 위치해 있다. 예를 들어, 본 발명에 이용될 수 있는 루이신 지퍼는 LEALKEK, LKALEKE, LKKLVGE, LEDKVEE, LENEVAR 또는 LLSKNYH 의 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명에서 이용되는 루이신 지퍼의 구체적인 예를 서열목록 제 39 서열에 기재되어 있다. 루이신 지퍼의 각각의 반은 짧은 α-사슬로 이루어져 있으며, α-사슬간의 직접적인 루이신 접촉이 있다. 전사인자에 있는 루이신 지퍼는 일반적으로 소수성 루이신 지퍼 부위 및 염기성 부위(DNA 분자의 주 그루브와 상호작용하는 부위)로 이루어져 있다. 본 발명에서 루이신 지퍼가 이용되는 경우에는 염기성 부위는 반드시 필요로 하지 않는다. 루이신 지퍼 구조에서 두 개의 아미노산 가닥(즉, 두 개의 α-사슬)의 인접한 두 말단은 링커에 의해 연결될 수 있다. 링커로서는 상술한 다양한 턴-서열 또는 펩타이드 링커가 이용될 수 있으며, 바람직하게는 루이신 지퍼의 구조에 영향을 미치지 않는 펩타이드 링커가 이용된다.

상술한 구조안정화 부위의 양 말단에는 무작위 아미노산 서열이 결합된다. 상기 무작위 아미노산 서열이 타겟 결합 부위 I 및 타겟 결합 부위 II를 형성한다. 본 발명의 가장 큰 특징 중 하나는, 구조안정화 부위의 양쪽 말단에 타겟 결합 부위 I 및 타겟 결합 부위 II를 연결하여 바이포달 방식으로 펩타이드 바인더를 제작하는 것이다. 타겟 결합 부위 I 및 타겟 결합 부위 II는 서로 협동적으로(cooperatively) 타겟에 결합함으로써, 타겟에 대한 친화도를 크게 증가시킨다.

타겟 결합 부위 I 의 아미노산 개수 n 은 특별하게 제한되지 않으며, 바람직하게는 2-100 의 정수, 보다 바람직하게는 2-50 의 정수, 보다 더욱 더 바람직하게는 2-20 의 정수, 가장 바람직하게는 3-10 의 정수이다.

타겟 결합 부위 II의 아미노산 개수 m 은 특별하게 제한되지 않으며, 바람직하게는 2-100 의 정수, 보다 바람직하게는 2-50 의 정수, 보다 더욱 더 바람직하게는 2-20 의 정수, 가장 바람직하게는 3-10 의 정수이다.

타겟 결합 부위 I 및 타겟 결합 부위 II에는 서로 각각 다른 또는 동일한 개수의 아미노산 잔기가 포함될 수 있다. 타겟 결합 부위 I 및 타겟 결합 부위 II에는 서로 각각 다른 또는 동일한 아미노산 서열이 포함될 수 있으며, 바람직하게는 서로 각각 다른 아미노산 서열이 포함된다.

타겟 결합 부위 I 및/또는 타겟 결합 부위 II에 포함되는 아미노산 서열은 선형의 아미노산 서열 또는 환형의 아미노산 서열이다. 타겟 결합 부위의 펩타이드 서열의 안정성을 증가시키기 위하여, 타겟 결합 부위 I 및/또는 타겟 결합 부위 II에 포함되는 아미노산 서열 중에서 적어도 하나의 아미노산 잔기는 아세틸기, 플루오레닐 메톡시 카르보닐기, 포르밀기, 팔미토일기, 미리스틸기, 스테아릴기 또는 폴리에틸렌글리콜(PEG)로 변형될 수 있다.

생물학적 타겟 분자에 결합되는 본 발명의 바이포달 펩타이드 바인더는 생체 내 생리학적 반응의 조절, 생체 내 물질의 검출, 인 비보 분자 이미징, 인 비트로 세포 이미징 및 약물전달용 타겟팅을 하는 데 이용될 수 있으며, 에스코트 분자로도 이용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 구조 안정화 부위, 타겟 결합 부위 I 또는 타겟 결합 부위 II(보다 바람직하게는, 구조안정화 부위, 보다 더 바람직하게는 구조안정화 부위의 링커)에 카르고가 결합되어 있다. 상기 카르고의 예는 제 1 항에 있어서, 상기 카르고는 화합물, 화학약물, 바이오약물, 무기입자, 나노입자, 단백질, 펩타이드, 핵산 분자, 지질, 탄수화물, 리포좀 및 검출가능한 신호를 발생시키는 레이블 분자를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 검출가능한 신호를 발생시키는 레이블은 T1 조영물질(예컨대, Gd 킬레이트 화합물), T2 조영물질(예컨대, 초상자성 물질(예: 마그네타이트, Fe₃O₄, γ-Fe₂O₃, 망간 페라이트, 코발트 페라이트 및 니켈 페라이트)), 방사성 동위 원소(예컨대, ¹¹C, ¹⁵O, ¹³N, P³², S³⁵, ⁴⁴Sc, ⁴⁵Ti, ¹¹⁸I, ¹³⁶La, ¹⁹⁸Tl, ²⁰⁰Tl, ²⁰⁵Bi 및 ²⁰⁶Bi), 형광물질(플루오리신 (fluorescein), 피코에리트린 (phycoerythrin), 로다민, 리사민 (lissamine), 그리고 Cy3 와 Cy5), 화학발광단, 자기입자, 매스 표지 또는 전자밀집입자를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 화학약물은 예를 들어, 항염증제, 진통제, 항관절염제, 진경제, 항우울증제, 항정신병약물, 신경안정제, 항불안제, 마약길항제, 항파킨스질환약물, 콜린성 아고니스트, 항암제, 항혈관신생억제제, 면역억제제, 항바이러스제, 항생제, 식욕억제제, 진통제, 항콜린제, 항히스타민제, 항편두통제, 호르몬제, 관상혈관, 뇌혈관 또는 말초혈관 확장제, 피임약, 항혈전제, 이뇨제, 항고혈압제, 심혈관질환 치료제, 미용성분(예컨대, 주름개선제, 피부노화 억제제 및 피부미백제) 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 바이오약물은 인슐린, IGF-1(insulin-like growth factor 1), 성장호르몬, 에리쓰로포이에틴, G-CSFs(granulocyte-colony stimulating factors), GM-CSFs (granulocyte/macrophage-colony stimulating factors), 인터페론 알파, 인터페론 베타, 인터페론 감마, 인터루킨-1 알파 및 베타, 인터루킨-3, 인터루킨-4, 인터루킨-6, 인터루킨-2, EGFs (epidermal growth factors), 칼시토닌(calcitonin), ACTH (adrenocorticotropic hormone), TNF(tumor necrosis factor), 아토비스반(atobisban), 부세레린(buserelin), 세트로렉릭스(cetrorelix), 데스로레린(deslorelin), 데스모프레신(desmopressin), 디노르핀 A (dynorphin A) (1-13), 엘카토닌(elcatonin), 엘레이도신(eleidosin), 엡티피바타이드(eptifibatide), GHRH-II(growth hormone releasing hormone-II), 고나도레린(gonadorelin), 고세레린(goserelin), 히스트레린(histrelin), 류프로레린(leuprorelin), 라이프레신(lypressin), 옥트레오타이드(octreotide), 옥시토신(oxytocin), 피트레신(pitressin), 세크레틴(secretin), 신칼라이드(sincalide), 테르리프레신(terlipressin), 티모펜틴(thymopentin), 티모신(thymosine) α1, 트리프토레린(triptorelin), 바이발리루딘(bivalirudin), 카르베토신(carbetocin), 사이클로스포린, 엑세딘(exedine), 란레오타이드(lanreotide), LHRH (luteinizing hormone-releasing hormone), 나파레린(nafarelin), 부갑상선 호르몬, 프람린타이드(pramlintide), T-20(enfuvirtide), 타이말파신(thymalfasin), 지코노타이드, RNA, DNA, cDNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 siRNA 가 될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

타겟 결합 부위 I 및/또는 타겟 결합 부위 II는 다양한 타겟에 결합하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 바이포달 펩타이드 바인더에 의해 타겟팅 될 수 있는 것은, 생화학물질, 펩타이드, 폴리펩타이드, 핵산, 탄수화물, 지질, 세포 및 조직과 같은 생물학적 타겟, 화합물, 금속 또는 비금속 물질을 포함하며, 바람직하게는 생물학적 타겟이다.

타겟 결합 부위가 결합하는 생물학적 타겟은, 바람직하게는 생화학물질, 펩타이드, 폴리펩타이드, 당단백질,핵산, 탄수화물, 프로테오글리칸, 지질 또는 당지질이다.

예를 들어, 타겟 결합 부위가 결합하는 생화학물질은 다양한 생체 내 대사산물(예컨대, ATP, NADH, NADPH, 탄수화물 대사산물, 지질 대사산물 및 아미노산 대사산물)을 포함한다.

타겟 결합 부위가 결합하는 예시적인 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 효소, 리간드, 수용체, 바이오마커, 호르몬, 전사인자, 성장인자, 면역글로블린, 신호전달단백질, 결합단백질, 이온 채널, 항원, 부착단백질, 구조단백질, 조절단백질, 독소단백질, 사이토카인 및 혈액 응고 인자를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 보다 상세하게는, 바이포달 펩타이드 바인더의 타겟은 Fibronectin extra domain B(ED-B), VEGF(vascular endothelial growth factor), VEGFR(vascular endothelial growth factor receptor), VCAM1(vascular cell adhesion molecule-1), nAchR(Nicotinic acetylcholine receptor), HSA(Human serum albumin), MyD88, EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor), HER2/neu, CD20, CD33, CD52, EpCAM (Epithelial Cell Adhesion Molecule), TNF-α (Tumor Necrosis Factor-α), IgE (Immunoglobulin E), CD11A (α-chain of lymphocyte function-associated antigen 1), CD3, CD25, Glycoprotein IIb/IIIa, 인테그린, AFP(Alpha-fetoprotein), β₂M (Beta₂-microglobulin), BTA(Bladder Tumor Antigens), NMP22, Cancer Antigen 125, Cancer Antigen 15-3, 칼시토닌, Carcinoembryonic Antigen, Chromogranin A, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, Human Chorionic Gonadotropin, Neuron-Specific Enolase, PSA(Prostate-Specific Antigen), PAP(Prostatic Acid Phosphatase) 및 Thyroglobulin 을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

타겟 결합 부위가 결합하는 예시적인 핵산 분자는 gDNA, mRNA, cDNA, rRNA(ribosomal RNA), rDNA(ribosomal DNA) 및 tRNA 를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 타겟 결합 부위가 결합하는 예시적인 탄수화물은 생체 내 탄수화물로서, 단당류, 이당류, 삼당류 및 다당류를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 타겟 결합 부위가 결합하는 예시적인 지질은, 지방산, 트리아실글라이세롤, 스핑고지질, 강글리오사이드 및 콜레스테롤를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 바이포달 펩타이드 바인더는 세포 표면에 노출된 생체 분자(예컨대, 단백질)에 결합할 수도 있지만, 세포 내 생체 분자(예컨대, 단백질)에도 결합하여 생체 분자의 활성을 조절할 수 있다.

바이포달 펩타이드 바인더가 세포 내 단백질을 타겟팅 하는 경우, 바람직하게는 바이포달 펩타이드 바인더는 추가적으로 세포막투과 펩타이드(CPP)를 포함한다.

상기 CPP 는 당업계에 공지된 다양한 CPP 를 포함하며, 예를 들어 HIV-1 Tat 단백질, 올리고알지닌, ANTP 펩타이드, HSV VP22 전사조절단백질, vFGF 에서 유래된 MTS 펩타이드, Penetratin, Transportan, Pep-1 펩타이드, Pep-7 펩타이드, Buforin II, MAP(model amphiphatic peptide), k-FGF, Ku 70, pVEC, SynB1 또는 HN-1 를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 CPP 를 바이포달 펩타이드에 결합시키는 방법은 다양한 방법이 있으며, 예를 들어 바이포달 펩타이드의 구조 안정화 부위에 있는 루프 부분의 라이신 잔기와 CPP 를 공유결합 시킨다.

세포 내에는 생리 활성에 중요한 역할을 하는 많은 타겟 단백질이 있으며, CPP 가 결합된 바이포달 펩타이드 바인더는 세포 내로 유입되어 이 타겟 단백질에 결합하여 활성을 조절(예컨대, 억제)한다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 바이포달 펩타이드 바인더는 전형적으로 "N-타겟 결합 부위 I-구조안정화 부위의 한 가닥-링커-구조안정화 부위의 다른 가닥-타겟 결합 부위 II-C"의 컨스트럭트를 갖는다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 바이포달 펩타이드 바인더에서 타겟 결합 부위 I 과 구조안정화 부위의 한 가닥 사이 및/또는 구조안정화 부위의 다른 가닥-타겟 결합 부위 II 사이에는, 타겟 결합 부위와 구조안정화 부위 간의 상호 구조적 영향을 차단하는 구조영향 억제부위(structure influence inhibiting region)를 포함한다. 회전 부위에는 펩타이드 분자에서 φ와 ψ의 회전이 비교적 자유로운 아미노산이 위치한다. 바람직하게는, φ와 ψ의 회전이 비교적 자유로운 아미노산은 글라이신, 알라닌 및 세린이다. 구조영향 억제부위에는 1-10 개, 바람직하게는 1-8 개, 보다 바람직하게는 1-3 개의 아미노산 잔기가 위치할 수 있다.

상술한 컨스트럭트를 갖는 본 발명의 바이포달 펩타이드 바인더의 라이브러리는 당업계에 공지된 다양한 방법으로 얻을 수 있다. 이 라이브러리에서 바이포달 펩타이드 바인더는 무작위 서열을 갖게 되며, 이는 타겟 결합 부위 I 및/또는 타겟 결합 부위 II의 어떤 위치에서도 서열 선호도(sequence preference)가 없거나 또는 지정(또는 고정)된 아미노산 잔기가 없다는 것을 의미한다.

예를 들어, 바이포달 펩타이드 바인더의 라이브러리는 고상지지체(예컨대, 폴리스틸렌 또는 폴리아크릴아미드 수지) 상에서 실시되는 스플리트-합성 방법(Lam et al. (1991) Nature 354:82; WO 92/00091)에 따라 구축될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 바이포달 펩타이드 바인더의 라이브러리는 세포 표면 전시(cell surface display)방식(예컨대, 파아지 디스플레이, 박테리아 디스플레이 또는 이스트 디스플레이)으로 구축된다. 바람직하게는, 바이포달 펩타이드 바인더의 라이브러리는 플라스미드, 박테리오파아지, 파아지미드, 이스트, 박테리아, mRNA 또는 라이보좀을 기반으로 하는 디스플레이방법을 통하여 제작될 수 있다.

파아지 디스플레이는 파아지의 표면 상의 코트 단백질에 융합된 단백질 형태로 다양한 폴리펩타이드를 디스플레이하는 기술이다(Scott, J. K. and Smith, G. P. (1990) Science 249: 386; Sambrook, J. et al., Molecular Cloning . A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Clackson and Lowman, Phage Display, Oxford University Press(2004)). 필라멘트성 파아지(예컨대, M13)의 유전자 III 또는 유전자 VIII에 발현하고자 하는 유전자를 융합시켜 무작위 펩타이드를 디스플레이한다.

파이지 디스플레이에는 파아지미드가 이용될 수 있다. 파아지미드는 박테리아의 복제원점(예컨대, ColE1) 및 박테리오파아지의 인터제닉(intergenic) 부위의 한 카피를 갖는 플라스미드 벡터이다. 이 파아지미드에 클로닝된 DNA 단편은 플라스미드처럼 증식된다.

바이포달 펩타이드 바인더의 라이브러리를 파아지 디스플레이 방식으로 구축하는 경우, 본 발명의 바람직한 구현예는 다음의 단계를 포함한다: (i) 파아지 코트 단백질(예컨대, M13 과 같은 필라멘트성 파아지의 유전자 III 또는 유전자 VIII 코트 단백질)을 코딩하는 유전자와 바이포달 펩타이드 바인더를 코딩하는 유전자가 융합된 융합 유전자; 및 상기 융합 유전자에 작동적으로 결합된 전사 조절 서열(예컨대, lac 프로모터)을 포함하는 발현 벡터의 라이브러리를 제작하는 단계; (ii) 상기 발현 벡터 라이브러리를 적합한 숙주세포에 도입시키는 단계; (iii) 상기 숙주세포를 배양하여 재조합 파아지 또는 파아지미드 바이러스 파티클을 형성시켜 융합 단백질이 표면에 디스플레이 되도록 하는 단계; (iv) 생물학적 타겟 분자와 상기 바이러스 파티클을 접촉시켜 파티클을 타겟 분자에 결합시키는 단계; 및 (v) 타겟 분자에 결합하지 않은 파티클을 분리하는 단계.

파아지 디스플레이를 이용하여 펩타이드 라이브러리를 구축하고 이들 라이브러리를 스크리닝 하는 방법은 미국 특허 제 5,723,286 호, 제 5,432,018 호, 제 5,580,717 호, 제 5,427,908 호, 제 5,498,530 호, 제 5,770,434 호, 제 5,734,018 호, 제 5,698,426 호, 제 5,763,192 호 및 제 5,723,323 호에 개시되어 있다.

바이포달 펩타이드 바인더를 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제작하는 방법은 당업계에 공지된 방법에 따라 실시될 수 있다. 예를 들어, 공지의 파아지미드 또는 파아지 벡터(예컨대, pIGT2, fUSE5, fAFF1, fd-CAT1, m663, fdtetDOG, pHEN1, pComb3, pComb8, pCANTAB 5E (Pharmacia), LamdaSurfZap, pIF4, PM48, PM52, PM54, fdH 및 p8V5)에 바이포달 펩타이드 바인더를 유전자를 삽입시켜 발현 벡터를 제작할 수 있다.

대부분의 파아지 디스플레이 방법이 필라멘트성 파아지를 이용하여 실시되지만, 람다 파아지 디스플레이(WO 95/34683; 미국 특허 제 5,627,024 호), T4 파아지 디스플레이(Ren et al. (1998) Gene 215:439; Zhu (1997) CAN 33:534) 및 T7 파아지 디스플레이(미국 특허 제 5,766,905 호)도 바이포달 펩타이드 바인더의 라이브러리를 구축하는 데 이용될 수 있다.

벡터 라이브러리를 적합한 숙주 세포에 도입시키는 방법은 다양한 형질전환 방법에 따라 실시될 수 있으며, 가장 바람직하게는 전기천공(electroporation) 방법에 따라 실시된다(참조: 미국 특허 제 5,186,800 호, 제 5,422,272 호, 제 5,750,373 호). 본 발명에 적합한 숙주는 세포는 E. coli 와 같은 그람 음성 박테리아 세포이며, 적합한 E. coli 숙주는 JM101, E. coli K12 strain 294, E. coli strain W3110 및 E. coli XL-1Blue (Stratagene)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 숙주세포는 형질전환 전에 컴피턴스 세포로 준비하는 것이 바람직하다(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning . A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)). 형질전환된 세포의 선별은 일반적으로 항생제(예컨대, 테트라사이클린 및 암피실린)를 포함하는 배지에서 배양하여 실시된다. 선별된 형질전환 세포를 헬퍼 파아지의 존재 하에서 추가적으로 배양하여 재조합 파아지 또는 파아지미드 바이러스 파티클을 생성시킨다. 상기 헬퍼 파아지 파아지로 적합한 것은, Ex 헬퍼 파아지, M13-KO7, M13-VCS 및 R408 을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

생물학적 타겟 분자와 결합하는 바이러스 파티클의 선별은 통상적으로 바이오패닝 과정을 통하여 실시될 수 있다(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning . A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Clackson and Lowman, Phage Display, Oxford University Press(2004)).

본 발명의 바이포달 펩타이드 바인더의 구체적인 예는 서열목록 제 20 서열-제 38 서열 및 제 40 서열-제 41 서열에 기재되어 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 바이포달 펩타이드 바인더를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 바이포달 펩타이드 바인더를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 바이포달 펩타이드 바인더의 발현용 벡터를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 바이포달 펩타이드 바인더의 발현용 벡터를 포함하는 형질전환체를 제공한다.

본 명세서에서 용어 "핵산 분자" 는 DNA (gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다 (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 벡터는 바이포달 펩타이드 바인더를 코딩하는 핵산 분자 이외에 상기 핵산 분자에, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, p_L ^λ프로모터, p_R ^λ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로머터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 벡터는 바이포달 펩타이드 바인더를 코딩하는 핵산 분자의 5 '-방향쪽에 시그널 서열(예컨대, pelB)를 추가적으로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 벡터는 바이포달 펩타이드 바인더가 파아지의 표면에 잘 발현되었는지를 확인하기 위한 태깅 서열(예컨대, myc tag)을 추가적으로 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 벡터는 파아지 코트 단백질, 바람직하게는 M13 과 같은 필라멘트성 파아지의 유전자 III 또는 유전자 VIII 코트 단백질을 코딩하는 유전자를 포함한다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 벡터는 박테리아의 복제원점(예컨대, ColE1) 및/또는 박테리오파아지의 복제원점을 포함한다. 한편, 본 발명의 벡터는 선택표지로서 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자를 포함할 수 있다.

본 발명의 형질전환체는 바람직하게는 E. coli 와 같은 그람 음성 박테리아 세포이며, 적합한 E. coli 숙주는 JM101, E. coli K12 strain 294, E. coli strain W3110 및 E. coli XL-1Blue (Stratagene)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 벡터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은, CaCl₂ 방법 (Cohen, S.N. et al., Proc . Natl . Acac . Sci . USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법 (Cohen, S.N. et al., Proc . Natl . Acac . Sci . USA , 9:2110-2114(1973); 및 Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기 천공 방법 (미국 특허 제 5,186,800 호, 제 5,422,272 호, 제 5,750,373 호) 등에 의해 실시될 수 있다.

본 발명의 바이포달 펩타이드 바인더는 매우 낮은 수준(예컨대, nM 수준)의 K_D 값(해리상수)을 나타내어, 생물학적 타겟 분자에 매우 높은 친화도를 나타내는 펩타이드를 제공한다. 하기 실시예에 기재된 바와 같이, 모노포달 방식으로 제작된 바인더와 비교하여 바이포달 펩타이드 바인더는 약 10²-10⁵ 배 (바람직하게는, 약 10³-10⁴배) 높은 친화도를 나타낸다.

본 발명의 바이포달 펩타이드 바인더는 의약으로서의 용도를 가질 뿐만 아니라, 생체 내 물질의 검출, 인 비보 분자 이미징, 인 비트로 세포 이미징 및 약물전달용 타겟팅을 하는 데 이용될 수 있으며, 에스코트 분자로도 이용될 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(i) 본 발명은 BPB-기반 카르고 운반시스템을 제공한다.

(ii) 본 발명의 바이포달 펩타이드 바인더에서 구조안정성 부위의 양 말단에 결합되어 있는 이격된(distal) 두 개의 타겟 결합 부위는 서로 협동적으로(cooperatively), 시너직(synergetically)하게 타겟에 결합한다.

(iii) 이에, 본 발명의 바이포달 펩타이드 바인더는 매우 낮은 수준(예컨대, nM 수준)의 K_D 값(해리상수)을 나타내어, 타겟에 매우 높은 친화도를 나타낸다.

(iv) 본 발명의 BPB-기반 카르고 운반시스템은 BPB 의 타겟 결합성 및 특이성에 기초하여 다양한 물질들을 세포표면 또는 세포 내로 운반할 수 있다.

도 1a 는 구조안정화 부위로서 β-헤어핀(hairpin)을 포함하는 바이포달 펩타이드 바인더(bipodal-peptide binder)의 모식도를 나타낸다.
도 1b 는 구조안정화 부위로서 링커로 연결된 β-쉬트를 포함하는 바이포달 펩타이드 바인더(bipodal-peptide binder)의 모식도를 나타낸다.
도 1c 는 구조안정화 부위로서 링커로 연결된 루이신 지퍼를 포함하는 바이포달 펩타이드 바인더(bipodal peptide binder)의 모식도를 나타낸다.
도 1d 는 구조안정화 부위로서 링커로 연결된 루이신-리치 모티프(leucine-rich motif)를 포함하는 바이포달 펩타이드 바인더(bipodal-peptide binder)의 모식도를 나타낸다.
도 2 는 바이포달 펩타이드 바인더 라이브러리를 클로닝하기 위한 전략을 나타낸다. pIGT2 파이지미드 벡터 맵에서, pelB 시그널서열, myc tag 은 목적 유전자가 파아지의 표면에 잘 발현되었는지를 확인하기 위한 태깅 서열이다. 프로모터로서 lac 프로모터가 이용되었다.
도 3 은 피르로넥틴 ED-B 바이오패닝 과정 중 인풋 파아지에 대한 ED-B, 스트랩타비딘 및 BSA 의 바이오패닝 결과를 나타낸다.
도 4 는 피르로넥틴 ED-B 바이오패닝 과정 중 바이포달 펩타이드 바인더 라이브러리의 바이오패닝의 3 차 단계에서 회수한 60 개의 재조합 파아지의 ED-B 및 BSA 에 대한 ELISA 결과이다.
도 5a 는 피르로넥틴 ED-B 단백질에 결합하는 특정 바이포달 펩타이드 바인더의 친화력을 측정한 결과이다.
도 5b 는 VEGF 에 결합하는 특정 바이포달 펩타이드 바인더의 친화력을 측정한 결과이다.
도 5c 는 VCAM1 에 결합하는 특정 바이포달 펩타이드 바인더의 친화력을 측정한 결과이다.
도 5d 는 nAchR(Nicotinic acetylcholine receptor)에 결합하는 특정 바이포달 펩타이드 바인더의 친화력을 측정한 결과이다.
도 5e 는 HSA(Human Serum Albumin)에 결합하는 특정 바이포달 펩타이드 바인더의 친화력을 측정한 결과이다.
도 6a 은 피르로넥틴 ED-B 에 대해 특이성 검사를 하기 위해 바이포달 펩타이드 바인더를 가지고 있는 재조합 파아지를 여러 단백질에 대해 ELISA 를 수행하여 흡광도를 측정한 결과이다. 왼쪽 막대부터 스트랩타비딘, ED-B, 아세틸콜린 α1, BSA, VCAM, TNF-α, 트롬빈, 미오글로불린, 리소자임 및 비스파틴에 대한 결과이다.
도 6b 은 VEGF 에 대해 특이성 검사를 하기 위해 바이포달 펩타이드 바인더를 가지고 있는 재조합 파아지를 여러 단백질에 대해 ELISA 를 수행하여 흡광도를 측정한 결과이다.
도 6c 은 VCAM1 에 대해 특이성 검사를 하기 위해 바이포달 펩타이드 바인더를 가지고 있는 재조합 파아지를 여러 단백질에 대해 ELISA 를 수행하여 흡광도를 측정한 결과이다.
도 6d 은 nAchR 단편 펩타이드에 대해 특이성 검사를 하기 위해 바이포달 펩타이드 바인더를 가지고 있는 재조합 파아지를 여러 단백질에 대해 ELISA 를 수행하여 흡광도를 측정한 결과이다.
도 6e 은 HSA 에 대해 특이성 검사를 하기 위해 바이포달 펩타이드 바인더를 가지고 있는 재조합 파아지를 여러 단백질에 대해 ELISA 를 수행하여 흡광도를 측정한 결과이다.
도 6f 은 MyD88 에 대해 특이성 검사를 하기 위해 바이포달 펩타이드 바인더를 가지고 있는 재조합 파아지를 여러 단백질에 대해 ELISA 를 수행하여 흡광도를 측정한 결과이다.
도 7 은 바이포달 펩타이드 바인더의 공동 작용 효과의 증명을 위한 친화력을 측정한 결과이다.
도 8 은 바이포달 펩타이드 바인더에서 구조 안정화 부위를 트립토판 지퍼 대신 여러 β-헤어핀 모티프로 바꾸어 바이포달 펩타이드 바인더의 친화력을 측정한 결과이다.
도 9 은 바이포달 펩타이드 바인더에서 구조 안정화 부위를 트립토판 지퍼 대신 루이신 지퍼로 바꾸어 바이포달 펩타이드 바인더의 친화력을 측정한 결과이다.
도 10 은 암 바이오마커인 피브로넥틴 ED-B 에 특이적인 바이포달 펩타이드 바인더의 암 표적화 결과이다. 시간에 경과함에 따라서 암에 바이포달 펩타이드 바인더가 축적됨이 보인다. 각각의 장기를 분리해서 형광을 측정했을 때도 암에 상당부분 축적됨이 보인다.
도 11a 는 GST-BPB fusion protein 의 정제를 보여준다.
도 11b 는 GST-BPB 의 Fibronectin EDB 에 대한 affinity 측정 결과이다.
도 12a 는 TNFα-BPB 의 정제를 보여준다.
도 12b 는 TNFα-BPB 의 Fibronectin EDB 에 대한 affinity 를 측정 결과이다.
도 12c 는 TNFα-BPB 의 cytotoxicitiy 측정 결과이다.
도 13a 는 BPB_css-LS 내에 9R/siRNA 의 encapsulation efficiency 를 분석한 결과이다. Green box 는 9R/siRNA 복합체를 포함하는 liposomal fraction 을 나타내고 red box 는 free unencapsulated siRNA fraction 을 나타낸다.
도 13b 는 EDB over-expressing cell line 에서 BPB_css-LS 의 uptake 를 분석한 결과이다. Negative 는 미처리 세포를 나타내고, LS 는 liposome 만 처리된 세포, CSS-LS 는 BPB_css-LS 로 처리된 세포를 나타낸다.
도 13c 는 EDB non-expressing cell line 에서 BPB_css-LS 의 uptake 를 분석한 결과이다. Negative 는 미처리 세포를 나타내고, LS 는 liposome 만 처리된 세포, CSS-LS 는 BPB_css-LS 로 처리된 세포를 나타낸다.
도 13d 는 MCF-7 cell 에 VEGF-C siRNA knockdown efficiency 를 분석한 결과이다.
도 14a 는 DSPE-PEG₂₀₀₀-Mal 와 BPB(SSS) peptide 의 conjugation 을 MALDI 를 이용하여 분석한 결과이다.
도 14b 는 일주일 동안 SPION-BPB 의 Hydrodynamic size 변화를 관찰한 ELS 분석결과이다.
도 14c 는 (a) DSPE-PEG₂₀₀₀ coated SPION 및 (b) BPB conjugated DSPE-PEG₂₀₀₀ coated SPION 의 TEM 이미지이다.
도 14d 는 DSPE-PEG₂₀₀₀ coated SPION(DSPE-SPION) 및 BPB conjugated DSPE-PEG₂₀₀₀ coated SPION(SSS-SPION)의 T2-weighted MR phantom study 결과이다.
도 14e 는 DSPE-PEG₂₀₀₀ coated SPION 및 BPB conjugated DSPE-PEG₂₀₀₀ coated SPION 을 처리한 세포의 (a) MRI 이미지와 (b) T2 신호를 분석한 결과이다.
도 14f 는 DSPE-PEG₂₀₀₀ coated SPION 과 BPB conjugated DSPE-PEG₂₀₀₀ coated SPION 을 처리한 세포의 confocal 현미경 이미지이다.
도 14g 는 DSPE-PEG₂₀₀₀ coated SPION 과 BPB conjugated DSPE-PEG₂₀₀₀ coated SPION 의 MTT assay 결과이다.
도 14h 는 DSPE-PEG₂₀₀₀ coated SPION 및 BPB conjugated DSPE-PEG₂₀₀₀ coated SPION 의 뇌암 동물 모델에서의 MRI 이미지이다.
도 15a 는 Gold Nanoparticle-BPB 의 TEM image 이다.
도 15b 는 U87MG 세포를 이용하여 BPB conjugated 금나노입자를 동일한 농도로 넣어준 후, ICP-MS 를 이용해 세포내의 Au 의 양의 차이를 측정한 결과이다.
도 15c 는 U87MG 세포에 (a) GNP 또는 (b) BPB-GNP 를 처리한 후 silver enhancement 한 현미경 사진이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험 재료 및 실험 방법

실시예 1: 라이브러리의 제작

바이포달 펩타이드 바인더 유전자 제작 및 파아지미드 벡터에의 삽입

두 개의 올리고뉴클레오티드 Beta-F1 (5'-TTCTATGCGGCCCAGCTGGCC(NNK)₆GGATCTTGGACATGGGAAAACGGAAAA-3') 및 Beta-B1 (5'-AACAGTTTCTGCGGCCGCTCCTCC TCC(MNN)₆TCCCTTCCATGTCCATTTTCCGTT-3')(N 은 A, T, G 또는 C; K 는 G 또는 T; M 은 C 또는 A)를 합성하였다. 이중 사슬을 만들기 위해서 Beta-F1 4 μM, Beta-B1 4 μM, 2.5 mM dNTP 혼합액 4 ㎕, ExTaq DNA 중합효소 1 ㎕(Takara, Seoul, Korea) 및 10×PCR 버퍼 5 ㎕를 혼합하여 총 50 ㎕가 되도록 증류수를 첨가한 혼합액을 총 25 개 만들었다. 이 혼합액을 PCR 반응(94℃에서 5 분, 60 싸이클: 30℃에서 30 초, 72℃에서 30 초 및 72℃에서 7 분)을 하여 이중 사슬로 만든 후 PCR 정제 키트(GeneAll, Seoul, Korea) 를 이용하여 정제하여, 바이포달 펩타이드 바인더 유전자를 얻었다. 바이포달 펩타이드 바인더에 삽입시킬 유전자를 pIGT2 파아지미드 벡터(Ig therapy, Chuncheon, Korea) 에 연결하기 위해 인서트 유전자와 pIGT2 파아지미드 벡터에 제한효소를 처리하였다. 약 11 ㎍의 인서트 DNA 를 SfiI(New England Biolabs(NEB, Ipswich) 및 NotI(NEB, Ipswich)으로 각각 4 시간 씩 반응시킨 후 PCR 정제 키트를 이용하여 정제하였다. 또한, 약 40 ㎍의 pIGT2 파아지미드 벡터를 SfiI 및 NotI 으로 각각 4 시간 씩 반응시킨 후 CIAP(Calf Intestinal Alkaline Phosphatase)(NEB, Ipswich)를 넣고 1 시간 동안 반응시킨 후, PCR 정제 키트를 이용하여 정제하였다. 이들을 UV-가시광선 분광기(Ultrospec 2100pro, Amersham Bioscience)로 정량하여 2.9 ㎍의 인서트 유전자를 T4 DNA 리가아제(Bioneer, Daejeon, Korea)를 이용하여 pIGT2 파아지미드 벡터 12 ㎍과 18℃에서 15 시간 동안 연결한 후, 에탄올로 침전시켜 TE 버퍼 100 ㎕로 DNA 를 용해시켰다.

컴피턴트 세포의 준비

E. coli XL1-BLUE 세포(American Type Culture Collection, Manassas, USA)를 LB 아가-플레이트에 선상 도말하였다. 한천 평판 배지에서 자란 군락을 5 ㎖의 LB 배지에 접종한 후 37℃에서 200 rpm 의 속도로 혼합하면서 하루 동안 배양하였다. 배양된 10 ㎖의 세포들을 2 ℓ의 LB 배지에 접종하고 같은 방식으로 600 nm 의 파장에서 흡광도가 0.3-0.4 가 될 때까지 배양하였다. 배양된 플라스크를 30 분 동안 얼음에 방치한 후, 4℃ 에서 4,000× g 로 20 분 동안 원심 분리하여 가라앉은 세포들을 제외한 상층액을 모두 제거하고, 1 ℓ의 냉각된 멸균 증류수로 현탁시켰다. 이것을 다시 같은 방법으로 원심분리하고 상층액을 제거한 후, 1 ℓ의 냉각된 멸균 증류수로 재현탁시키고 같은 방식으로 10％ 글리세롤 용액 40 ㎖로 세척을 반복하여 원심 분리한 후, 마지막으로 10％ 글리세롤 용액 4 ㎖으로 현탁시킨 후, 200 ㎕씩 분주하여 액체 질소에 냉동시킨 뒤 -80℃에 보관하였다.

전기 천공법

파아지미드 벡터 12 ㎍과 바이포달 펩타이드 바인더에 인서트 DNA 2.9 ㎍을 연결 반응시킨 100 ㎕를 25 개로 분주하여 전기 천공을 수행하였다. 컴피턴트 세포를 얼음 위에서 녹이고, 200 ㎕의 컴피턴트 세포를 연결 반응시킨 용액 4 ㎕와 혼합한 후, 냉각하여 준비된 0.2 cm 의 큐벳에 넣은 뒤 1 분 동안 얼음 위에 두었다. 전기 천공기 (BioRad, Hercules, CA)를 200 Ω에서 25 μF 및 2.5 kV 의 조건으로 프로그램하고 준비된 큐벳의 물기를 제거하고 전기 천공기에 위치시킨 후 펄스를 주었다(시간 상수는 4.5-5 msec). 이후 즉시 37℃로 준비한 20 mM 의 글루코오스가 포함된 1 ㎖의 LB 액체배지에 넣고 얻어진 총 25 ㎖의 세포를 100 ㎖ 시험관에 옮겼다. 한 시간 동안 37℃에서 200 rpm 의 속도로 혼합하며 배양한 후 라이브러리의 개수를 측정하기 위해 10 ㎕를 희석해서 암피실린 아가 배지에 도말하였다. 남은 세포를 1 ℓ의 LB 에 20 mM 글루코오스 및 50 ㎍/㎖의 암피실린을 넣고 30℃에서 하루 동안 배양하였다. 4℃ 에서 4,000×g 로 20 분 동안 원심 분리하여 침전된 세포들을 제외한 상층액을 모두 제거하고, 40 ㎖의 LB 로 재현탁시킨 후 글리세롤을 최종 농도 20％ 이상 넣고 -80℃에 보관하였다.

라이브러리에서 재조합 파아지 생산과 PEG 침전

-80℃에 저장된 바이포달 펩타이드 바인더 라이브러리에서 재조합 파아지를 생산하였다. 500 ㎖ 플라스크에 100 ㎖의 LB 액체배지에 암피실린(50 ㎍/㎖) 및 20 mM 의 글루코오스를 넣은 후, -80℃ 에 보관된 라이브러리 1 ㎖을 추가하여 한 시간 동안 37℃에서 150 rpm 의 속도로 혼합하며 배양하였다. 여기에 1×10¹¹ pfu 의 Ex 헬퍼 파아지(Ig therapy, Chuncheon, Korea)를 넣고 다시 한 시간 동안 같은 조건으로 배양하였다. 1,000×g 로 10 분 동안 원심 분리하여 상층액을 제거하고 여기에 암피실린(50 ㎍/㎖) 및 카나마이신(25 ㎍/㎖)이 포함된 LB 액체배지 100 ㎖을 넣고 하루 동안 배양하여 재조합 파아지를 생산하였다. 배양액을 3,000×g 로 10 분 동안 원심 분리하여 얻은 상층액 100 ㎖에 PEG/NaCl 25 ㎖을 혼합하고 얼음에 1 시간 동안 방치시킨 후, 4℃에서 20 분 동안 10,000×g 로 원심 분리하여 상층액은 조심스럽게 제거하고 2 ㎖의 PBS(pH 7.4)로 펠렛을 재현탁시켰다.

실시예 2: 단백질의 준비

실시예에 이용할 피르로텍틴(Fibronectin) ED-B, VEGF(vascular endothelial growth factor), VCAM1(vascular cell adhesion molecule-1), nAchR(Nicotinic acetylcholine receptor), HSA(Human serum albumin) 및 MyD88 를 다음과 같이 준비하였다.

피브로넥틴 ED -B 유전자 제작 및 발현 벡터에의 삽입

한국생명공학 연구원에서 부분적인 인간의 피브로넥틴 ED-B(ID=KU017225) 유전자를 공급받았다. 프라이머 EDB_F1(5'-TTCATAACATATGCCAGAGGTGCCCCAA-3') 및 EDB_B1(5'-ATTGGATCCTTACGTTTGTTGTGTCAGTGTAGTAGGGGCACTCTCGCCGCCATTAATGAGAGTGATAACGCTGATATCATAGTCAATGCCCGGCTCCAGCCCTGTG-3')을 합성하여, EDB-F1 20 pmol, EDB-B1 20 pmol, 2.5 mM dNTP 혼합액 4 ㎕, ExTaq DNA 중합효소 1 ㎕(10 U) 및 10×PCR 버퍼 5 ㎕를 혼합하여 총 50 ㎕가 되도록 증류수를 첨가한 혼합액을 만들었다. 이 혼합액을 PCR 반응(94℃에서 5 분, 30 싸이클: 55℃에서 30 초, 72℃에서 1 분 및 94℃에서 30 초)을 하여 EDB 인서트로 만든 후 PCR 정제 키트를 이용하여 정제하였다. EDB 인서트 유전자를 pET28b 벡터(Novagen)에 연결하기 위해 EDB 인서트 유전자 및 pET28b 벡터에 제한효소를 처리하였다. 약 2 ㎍의 인서트 DNA 를 BamHI(NEB, Ipswich) 및 NdeI(NEB, Ipswich)로 4 시간씩 반응시킨 후 PCR 정제 키트를 이용하여 정제하였다. 또한, 약 2 ㎍의 pIGT2 파아지미드 벡터를 BamHI 및 NdeI 로 3 시간씩 반응시킨 후 CIAP 를 넣고 1 시간 동안 반응시킨 후, PCR 정제 키트를 이용하여 정제하였다. 이들을 벡터와 인서트가 약 1:3 의 몰 비율이 되도록 첨가하고, T4 DNA 리가아제(Bioneer, Daejeon, Korea)를 이용하여 18℃에서 10 시간 동안 연결시키고, XL-1 컴피턴트 세포에 형질전환을 한 후, 카나마이신이 포함된 아가 배지에 도말하였다. 한천 평판 배지에서 자란 군락을 5 ㎖의 LB 배지에 접종한 뒤 37℃에서 200 rpm 의 속도로 혼합하면서 하루 동안 배양한 후, 플라스미드 프랩 키트(GeneAll, Seoul, Korea)를 이용하여 플라스미드를 정제하고, 시퀀싱을 하여 클로닝이 성공했는지 여부를 확인하였다.

VEGF121 유전자 제작 및 발현 벡터에의 삽입

싸이토카인 은행(Jeonju, Korea)에서 부분적인 인간의 VEGF(ID=G157) 유전자를 공급받았다. 프라이머 VEGF_F1(5'-ATAGAATTCGCACCCATGGCAGAA-3') 및 VEGF_B1(5'-ATTAAGCTTTCACCGCCTCGGCTTGTCACAATTTTCTTGTCTTGC-3')을 합성하여, VEGF-F1 20 pmol, VEGF-B1 20 pmol, 2.5 mM dNTP 혼합액 4 ㎕, ExTaq DNA 중합효소 1 ㎕(10 U) 및 10×PCR 버퍼 5 ㎕를 혼합하여 총 50 ㎕가 되도록 증류수를 첨가한 혼합액을 만들었다. 이 혼합액을 PCR 반응(94℃에서 5 분, 30 싸이클: 55℃에서 30 초, 72℃에서 1 분 및 94℃에서 30 초)을 하여 VEGF 인서트로 만든 후 PCR 정제 키트를 이용하여 정제하였다. VEGF 인서트 유전자를 pET32a 벡터(Novagen)에 연결하기 위해 VEGF 인서트 유전자 및 pET32a 벡터에 제한효소를 처리하였다. 약 2 ㎍의 인서트 DNA 를 EcoRI(NEB, Ipswich) 및 HindIII(NEB, Ipswich)로 4 시간씩 반응시킨 후 PCR 정제 키트를 이용하여 정제하였다 이들을 벡터와 인서트가 약 1:3 의 몰 비율이 되도록 첨가하고, T4 DNA 리가아제(Bioneer, Daejeon, Korea)를 이용하여 18℃에서 10 시간 동안 연결시키고, XL-1 컴피턴트 세포에 형질전환을 한 후, 암피실린이 포함된 아가 배지에 도말하였다. 한천 평판 배지에서 자란 군락을 5 ㎖의 LB 배지에 접종한 뒤 37℃에서 200 rpm 의 속도로 혼합하면서 하루 동안 배양한 후, 플라스미드 프랩 키트(GeneAll, Seoul, Korea)를 이용하여 플라스미드를 정제하고, 시퀀싱을 하여 클로닝이 성공했는지 여부를 확인하였다.

VCAM1 유전자 제작 및 발현 벡터에의 삽입

한국생명공학 연구원에서 인간의 VCAM1 유전자를 공급받았다. VCAM1 인서트 유전자를 pET32a 벡터에 연결하기 위해 VCAM1 인서트 유전자 및 pET32a 벡터에 제한효소를 처리하였다. 이들을 벡터와 인서트가 약 1:3 의 몰 비율이 되도록 첨가하고, T4 DNA 리가아제(Bioneer, Daejeon, Korea)를 이용하여 18℃에서 10 시간 동안 연결시키고, XL-1 컴피턴트 세포에 형질전환을 한 후, 암피실린이 포함된 아가 배지에 도말하였다. 한천 평판 배지에서 자란 군락을 5 ㎖의 LB 배지에 접종한 뒤 37℃에서 200 rpm 의 속도로 혼합하면서 하루 동안 배양한 후, 플라스미드 프랩 키트(GeneAll, Seoul, Korea)를 이용하여 플라스미드를 정제하고, 시퀀싱을 하여 클로닝이 성공했는지 여부를 확인하였다.

피브로넥틴 ED - B 의 발현 및 정제

피브로넥틴 ED-B 를 클로닝한 pET28b 벡터를 BL21 세포에 형질 전환한 후 카나마이신이 포함된 아가 배지에 도말하였다. 한천 평판 배지에서 자란 군락을 카나마이신(25 ㎍/㎖)이 포함된 5 ㎖의 LB 배지에 접종한 뒤 37℃에서 200 rpm 의 속도로 혼합하면서 하루 동안 배양한 후, 카나마이신(25 ㎍/㎖)이 포함된 50 ㎖의 LB 배지에 옮겨 3 시간 배양하였다. 배양한 E. coli 를 카나마이신(25 ㎍/㎖)이 포함된 2 ℓ의 LB 에 접종하고 OD=0.6-0.8 까지 배양하였다. 이후 1 mM 이소프로필-β-D-키오갈락토피라노사이드(IPTG)를 넣어주어 37℃에서 200 rpm 의 속도로 혼합하면서 8 시간 동안 배양하였다. 4,000×g 로 20 분 동안 원심 분리하여 침전된 세포들을 제외한 상층액을 모두 제거하고, 라이시스 버퍼(50 mM 소듐 포스페이트(pH 8.0), 300 mM NaCl 및 5 mM 이미다졸)로 현탁시켰다. -80℃에 하루 동안 보관한 후 소니케이터를 이용하여 E. coli 를 용해시킨 후에 15,000×g 로 1 시간 동안 원심 분리하여 상층액을 Ni-NTA 친화성 레진(Elpisbio, Daejeon, Korea)에 결합시킨다. 라이시스 버퍼로 레진을 세척한 후 일루션 버퍼(50 mM 소듐 포스페이트(pH 8.0), 300 mM NaCl 및 300 mM 이미다졸)을 이용하여 N-말단 His-tag ED-B 단백질을 용출시켜 획득하였다. 이렇게 획득한 단백질을 Superdex75 컬럼(GE Healthcare, United Kingdom) 및 PBS(pH 7.4) 버퍼를 이용하여 겔 여과법(gel filtration)으로 순도 높은 ED-B 단백질을 얻었다. 바이오패닝을 위해 ED-B 단백질에 바이오틴을 연결하였다. 6 mg의 설포-NHS-SS-바이오틴(PIERCE, Illinois, USA) 및 1.5 mg의 ED-B 단백질을 상온에서 0.1 M 소듐 보레이트(pH 9.0) 하에 2 시간 동안 반응시키고, 반응이 되지 않은 설포-NHS-SS-바이오틴을 제거하기 위해 단백질을 Superdex75 컬럼 및 PBS(pH 7.4) 버퍼를 이용하여 겔 여과법(gel filtration)으로 바이오틴-EDB 단백질을 정제하였다.

VEGF121 와 VCAM1 - Trx 의 발현 및 정제

VEGF121 와 VCAM1 를 클로닝한 pET32a 벡터를 각각 AD494 세포에 형질 전환한 후 암피실린이 포함된 아가 배지에 도말하였다. 한천 평판 배지에서 자란 군락을 암피실린(25 ㎍/㎖)이 포함된 5 ㎖의 LB 배지에 접종한 뒤 37℃에서 200 rpm 의 속도로 혼합하면서 하루 동안 배양한 후, 암피실린(25 ㎍/㎖)이 포함된 50 ㎖의 LB 배지에 옮겨 3 시간 배양하였다. 배양한 E. coli 를 암피실린(25 ㎍/㎖)이 포함된 2 ℓ의 LB 에 접종하고 OD=0.6-0.8 까지 배양하였다. 이후 1 mM 이소프로필-β-D-키오갈락토피라노사이드(IPTG)를 넣어주어 37℃에서 200 rpm 의 속도로 혼합하면서 8 시간 동안 배양하였다. 4,000×g 로 20 분 동안 원심 분리하여 침전된 세포들을 제외한 상층액을 모두 제거하고, 라이시스 버퍼(50 mM 소듐 포스페이트(pH 8.0), 300 mM NaCl 및 5 mM 이미다졸)로 현탁시켰다. -80℃에 하루 동안 보관한 후 소니케이터를 이용하여 E. coli 를 용해시킨 후에 15,000×g 로 1 시간 동안 원심 분리하여 상층액을 Ni-NTA 친화성 레진(Elpisbio, Daejeon, Korea)에 결합시킨다. 라이시스 버퍼로 레진을 세척한 후 일루션 버퍼(50 mM 소듐 포스페이트(pH 8.0), 300 mM NaCl 및 300 mM 이미다졸)을 이용하여 Trx-VEGF121 단백질을 용출시켜 획득하였다. 이렇게 획득한 단백질을 Superdex75 컬럼(GE Healthcare, United Kingdom) 및 PBS(pH 7.4) 버퍼를 이용하여 겔 여과법(gel filtration)으로 순도 높은 VEGF-Trx 와 VCAM1-Trx 단백질을 얻었다. 순수한 VEGF 을 얻기 위하여 트롬빈으로 VEGF 와 Trx 사이를 잘라 VEGF121 을 얻었다.

한편, HSA 는 Genetex 회사(Irvine)에서 구매하여 이용하였다. nAchR(Nicotinic acetylcholine receptor)의 단편 펩타이드인 biotin-SGEWVIKEARGWKHWVFYSCCPTTPYLDITYH (32 mer)는 애니젠(Korea, Kwangju)에서 합성하였다. Human MyD88 은 Santa Cruz Biotechnology(sc-4540 WB)(California)에서 구매하였다.

실시예 3: 바이오 패닝 방법

Biotin 피르로넥틴 ED -B 단백질과 Biotin - nAchR 펩타이드의 바이오 패닝 방법

2 ㎖의 스트랩타비딘(10 ㎍/㎖)을 96 웰 ELISA 플레이트(Corning)의 40 개의 웰에 50 ㎕씩 넣은 후, 4℃에서 하룻밤 동안 방치하였고, 다음날 20 개의 웰에만 0.1％의 PBST(tween-20)로 3 회 세척한 후, 바이오틴 ED-B 와 바이오틴 nAchR (10 ㎍/㎖)를 각각 넣고 상온에서 1 시간 동안 방치하였다. 이후 40 개의 웰 모두를 0.1％ PBST 로 3 회 세척하고 PBS 로 희석한 2％ BSA 를 사용하여 상온에서 2 시간 동안 블로킹한 후, 용액을 모두 버리고 0.1％ PBST 로 3 회 세척하였다. 여기에 바이포달 펩타이드 바인더 재조합 파아지 포함용액 800 ㎕ 및 10％ BSA 200 ㎕을 혼합하여 스트랩타비딘 및 BSA 에 결합하는 파아지들을 제거하기 위해 스트랩타비딘에 BSA 코팅했던 20 개의 웰에 넣어 1 시간 동안 27℃에 두었다. 상층액을 회수하여 ED-B 와 nAchR 가 결합한 20 개의 웰에 옮겨 27℃에서 45 분 동안 방치하였다. 20 개 웰의 용액을 모두 제거하고 0.5％ PBST 로 15 회 세척한 뒤 0.2 M 글리신/HCl(pH 2.2) 1 ㎖을 각 웰당 50 ㎕씩 넣어 20 분간 파아지를 용리시키고 1 ㎖을 튜브에 모아 여기에 2M Tris-base(pH 9.0) 150 ㎕를 넣어 용액을 중화시켰다. 각 바이오패닝마다 인풋 파아지 및 일루트 파아지의 수를 측정하기 위해 OD=0.7 인 XL-1 BLUE 세포에 섞어 주어 암피실린이 포함된 아가 배지에 도말하였다. 패닝을 반복하기 위해 10 ㎖의 E. coli XL1-BLUE 세포와 섞어 37℃에서 1 시간 동안 200 rpm 의 속도로 혼합하며 배양하였다. 암피실린(50 ㎍/㎖) 및 20 mM 글루코오스를 혼합한 후, 2×10¹⁰ pfu 의 Ex 헬퍼 파아지를 첨가하여 37℃에서 1 시간 동안 200 rpm 의 속도로 혼합하며 배양하였다. 배양액을 1,000×g 로 10 분 동안 원심 분리한 후 상층액은 제거하고 침전된 세포들을 암피실린(50 ㎍/㎖) 및 카나마이신(25 ㎍/㎖)이 포함된 40 ㎖ LB 액체 배지로 재현탁하여 30℃에서 200 rpm 의 속도로 혼합하며 하루 동안 배양하였다. 배양액을 4,000×g, 20 분 및 4℃의 조건으로 원심 분리하였다. 상층액에 8 ㎖의 5x PEG/NaCl[20％ PEG(w/v) 및 15％ NaCl(w/v)]을 첨가한 후 4℃에서 1 시간 동안 정치시켰다. 원심분리 후 PEG 용액을 완전히 제거하고 1 ㎖의 PBS 용액으로 파아지 펩타이드 펠렛을 녹인 다음 2 차 바이오패닝에 사용하였다. 각 패닝 단계마다 상기와 동일한 방법을 사용했으며, 세척과정만 단계별로 각각 25 회 및 35 회(0.5％ PBST) 증가시켰다.

VEGF 와 VCAM1 - Trx 와 Human serum albumin ( HSA ), MyD88 의 바이오 패닝 방법

VEGF 와 VCAM1-trx 와 HSA 와 MyD 88(5 ㎍/㎖)을 96 웰 ELISA 플레이트(Corning)의 10 개의 웰에 50 ㎕씩 넣은 후, 4℃에서 하룻밤 동안 방치하였고, 다음날 2％ BSA 를 사용하여 상온에서 2 시간 동안 블로킹한 후, 용액을 모두 버리고 0.1％ PBST 로 3 회 세척하였다. 여기에 바이포달 펩타이드 바인더 재조합 파아지 포함용액 800 ㎕ 및 10％ BSA 200 ㎕을 혼합하여 VEGF 와 VCAM1-Trx 와 HSA 가 결합한 10 개의 웰에 옮겨 상온에서 1 시간 동안 방치하였다. 10 개 웰의 용액을 모두 제거하고 0.1％ PBST 로 10 회 세척한 뒤 0.2 M 글리신/HCl(pH 2.2) 1 ㎖을 각 웰당 50 ㎕씩 넣어 20 분간 파아지를 용리시키고 1 ㎖을 튜브에 모아 여기에 2M Tris-base(pH 9.0) 150 ㎕를 넣어 용액을 중화시켰다. 각 바이오패닝마다 인풋 파아지 및 일루트 파아지의 수를 측정하기 위해 OD=0.7 인 XL-1 BLUE 세포에 섞어 주어 암피실린이 포함된 아가 배지에 도말하였다. 패닝을 반복하기 위해 10 ㎖의 E. coli XL1-BLUE 세포와 섞어 37℃에서 1 시간 동안 200 rpm 의 속도로 혼합하며 배양하였다. 암피실린(50 ㎍/㎖) 및 20 mM 글루코오스를 혼합한 후, 2×10¹⁰ pfu 의 Ex 헬퍼 파아지를 첨가하여 37℃에서 1 시간 동안 200 rpm 의 속도로 혼합하며 배양하였다. 배양액을 1,000×g 로 10 분 동안 원심 분리한 후 상층액은 제거하고 침전된 세포들을 암피실린(50 ㎍/㎖) 및 카나마이신(25 ㎍/㎖)이 포함된 40 ㎖ LB 액체 배지로 재현탁하여 30℃에서 200 rpm 의 속도로 혼합하며 하루 동안 배양하였다. 배양액을 4,000×g, 20 분 및 4℃의 조건으로 원심 분리하였다. 상층액에 8 ㎖의 5x PEG/NaCl[20％ PEG(w/v) 및 15％ NaCl(w/v)]을 첨가한 후 4℃에서 1 시간 동안 정치시켰다. 원심분리 후 PEG 용액을 완전히 제거하고 1 ㎖의 PBS 용액으로 파아지 펩타이드 펠렛을 녹인 다음 2 차 바이오패닝에 사용하였다. 각 패닝 단계마다 상기와 동일한 방법을 사용했으며, 세척과정만 단계별로 각각 20 회 및 30 회(0.1％ PBST) 증가시켰다.

실시예 4: 피르로넥틴 ED - B 의 인풋 파아지의 ELISA

바이포달 펩타이드 바인더 라이브러리의 각 인풋 파아지의 ELISA 를 스트랩타비딘, BSA 및 ED-B 에 대해 수행하였다. 96 웰 ELISA 플레이트에 10 ㎍/㎖ 스트랩타비딘을 각 웰당 50 ㎕씩 18 개의 웰에 넣고 10 ㎍/㎖ BSA 를 각 웰당 50 ㎕씩 9 개의 웰에 넣고 4℃에서 하루 동안 방치하였다. 다음날 스트랩타비딘이 있는 18 개의 웰 중 9 개의 웰만 0.1％ PBST(tween-20)로 3 회 세척하고, 바이오틴 ED-B(10 ㎍/㎖)를 넣고 상온에서 1 시간 동안 두었다. 이후 모든 웰을 0.1％ PBST 로 3 회 세척하고 PBS 로 희석한 2％ BSA 를 사용하여 상온에서 2 시간 동안 블로킹한 후, 용액을 모두 버리고 0.1％ PBST 로 3 회 세척하였다. 여기에 바이포달 펩타이드 바인더 재조합 파아지인 첫 번째, 두 번째 및 세 번째 인풋 파아지 800 ㎕ 및 10％ BSA 200 ㎕를 혼합하여 100 ㎕씩 ED-B, 스트랩타비딘 및 BSA 웰에 각각 3 웰 씩 분주하고 27℃에서 1 시간 30 분 동안 정치하였다. 0.1％ PBST 용액으로 10 회 세척한 다음 HRP-컨쥬게이트 항-M13 항체(GE Healthcare)를 1:1,000 으로 희석하여 27℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. 0.1％ PBST 로 5 회 세척한 후 퍼옥시다아제의 기질인 테트라메틸벤지딘(TMB)(BD Science) 용액 100 ㎕를 분주하여 발색반응을 유도한 다음 100 ㎕의 1 M HCl 을 첨가하여 반응을 중지시켰다. 이후 450 nm 에서 흡광도를 측정하였다.

실시예 5: 피브로넥틴 ED -B, VEGF , VCAM1 , nAchR , HSA , MyD88 단백질에 특이적인 파아지 펩타이드 검색( 파아지 ELISA )

아웃풋 파아지/인풋 파아지 비율이 가장 높은 바이오패닝 단계에서 회수한 파아지를 XL1-BLUE 세포에 감염시킨 후 플라크가 플레이트당 100-200 개 정도가 되도록 도말하였다. 멸균된 팁을 이용하여 플라크 60 개를 2 ㎖의 LB-암피실린(50 ㎍/㎖) 배양액에 접종한 후 37℃에서 5 시간 동안 진탕 배양하여 OD=0.8-1 에서 5×10⁹ pfu 의 Ex 헬퍼 파아지를 첨가하여 37℃에서 1 시간 동안 200 rpm 의 속도로 혼합하며 배양하였다. 배양액을 1,000×g 로 10 분 동안 원심 분리한 후 상층액은 제거하고 침전된 세포들을 암피실린(50 ㎍/㎖) 및 카나마이신(25 ㎍/㎖)이 포함된 1 ㎖의 LB 액체배지로 재현탁하여 30℃에서 200 rpm 의 속도로 혼합하며 하루 동안 배양하였다. 배양액을 10,000×g, 20 분 및 4℃의 조건으로 원심 분리하여 상층액을 회수한 후 2％의 탈지 우유를 넣고 이를 파아지 펩타이드 검색에 사용하였다. 96 웰 ELISA 플레이트에 5 ㎍/㎖의 Fibronectin ED-B, VEGF, VCAM1, Nicotinic acetylcholine receptor(nAchR), Human serum albumin, MyD88 을 각 웰당 50 ㎕씩 30 개의 웰에 넣고, 또한 10 ㎍/㎖의 BSA 을 각 웰당 50 ㎕씩 30 개의 웰에 넣어 4℃에서 하루 동안 방치하였다. 다음날 모든 웰을 0.1％ PBST 로 3 회 세척하고 PBS 로 희석한 2％ 탈지 우유를 사용하여 상온에서 2 시간 동안 블로킹한 뒤, 용액을 모두 버리고 0.1％ PBST 로 3 회 세척하였다. 각 클론별로 증폭된 파아지 펩타이드 용액 100 ㎕씩을 모든 웰에 분주하고 27℃에서 1 시간 30 분 동안 정치하였다. 0.1％ PBST 용액으로 5 회 세척한 다음 HRP-컨쥬게이트 항-M13 항체(GE Healthcare)를 1:1,000 으로 희석하여 27℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. 0.1％ PBST 로 5 회 세척한 후 TMB 용액 100 ㎕를 분주하여 발색반응을 유도한 다음 100 ㎕의 1 M HCl 를 첨가하여 반응을 중지시켰다. 450 nm 에서 흡광도를 측정하여 BSA 에 비해 흡광도가 높은 클론들을 선택하였다. 이들의 파아지를 XL1 세포에 감염시킨 후 플라크가 플레이트당 100-200 개 정도가 되도록 도말하였다. 멸균된 팁을 이용하여 플라크를 4 ㎖의 LB-암피실린(50 ㎍/㎖) 배양액에 접종한 후 37℃에서 하루 동안 진탕 배양하여 플라스미드 프랩 키트을 이용하여 플라스미드를 정제하여 시퀀싱을 의뢰하였다(Genotech, Daejeon, Korea). 시퀀싱 프라이머는 벡터 시퀀스인 5'-GATTACGCCAAGCTTTGGAGC-3'을 사용하였다.

실시예 6: 피르로넥틴 ED -B, VEGF , nAchR 바인딩 어세이

DNA 시퀀싱에서 중복되어 나온 ED-B, VEGF, nAchR 에 특이적인 바이포달 펩타이드 바인더 펩타이드를 합성(애니젠, 한국)을 하였다. 친화도의 측정은 BIAcore X(Biacore AB, Uppsala, Sweden)를 이용하여 수행하였다. ED-B와 nAchR 은 스트랩타비딘 SA 칩(Biacore)에 바이오틴-EDB 을 2,000 RU 만큼 흘려주어 고정시켰다. VEGF 는 EDC/NHS 을 이용하여 CM5 칩(Biacore)에 고정하였다. 러닝 버퍼로는 PBS(pH 7.4)을 사용하였고, 플로우는 분당 30 ㎕로 흘리면서 여러 농도로 동력학을 측정한 후 BIAevaluation 소프트웨어(Biacore AB, Uppsala, Sweden)로 친화도를 계산하였다.

실시예 7: 암 바이오마커인 피르보넥틴 ED -B 에 특이적인 바이포달 펩타이드 바인더의 암 표적화

암에 많이 분포하는 피르로넥틴 ED-B 를 타겟하는 바이포달 펩타이드 바인더(펩타이드 2)에 Cy5.5-NHS 형광다이(flurorescence dye)(Amersham Pharmacia, Piscataway)을 50 mM 소듐 보레이트 완충액(pH 9.7)에서 12 시간동안 상온 반응 시켰다. 반응 후에 Sephadex G25(Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)로 Cy5.5 와 바이포달 펩타이드 바인더-Cy5.5 를 분리하였다. Balb/c 누드 마우스에 Human U87MG(ATCC) 2 x 10⁶ cell 을 피하에 넣어 암을 10 일 동안 키운 후에 0.5 nmol 의 바이포달 펩타이드 바인더-Cy5.5 을 정맥주사로 넣은 다음 IVIS(Caliper Life Sience, Hopkinton)로 형광을 측정하였다. 이 실험은 암 바이오마커인 피브로넥틴 ED-B 에 특이적인 바이포달 펩타이드 바인더가 인 비보 동물에서 암에 축적이 됨을 증명하는 결과이며 실제 암 진단제로서의 응용성을 보여준다(도 11).

실시예 8: 세포내에 존재하는 MyD88 에 특이적인 바이포달 펩타이드 바인더의 활성 억제 실험

MyD88 은 세포내에 존재하는 단백질이기 때문에 바이포달 펩타이드 바인더의 loop 의 라이신 (lysine) 잔기를 이용하여 세포투과펩타이드(cell penetrating peptide)인 9 개의 아지닌(arginine)(애니젠, 한국)을 EDC/NHS(Sigma)를 이용하여 바이포달 펩타이드 바인더에 공유결합시켜 세포투과를 가능하게 만들었다. MyD88 의 활성이 활성화되면 MMP-13 의 양의 증가하기 때문에 MMP-13 의 양을 측정하면 MyD88 의 활성이 억제되는지 판별할 수 있다. MyD88 의 활성을 활성화 시키는 IL-1beta(10 ng/ml)(R＆D systems, Minneapolis MN)를 연골세포에 처리하였다. 그 다음 MyD88 에 특이적인 바이포달 펩타이드 바인더(표 3f 의 펩타이드 1)를 연골세포에 10 μM 처리하고 12 시간 후에 mRNA 을 분리한 다음 MMP-13 과 GAPDH 에 대해 RT-PCR 을 진행하였다. 또한 연골세포를 파괴하여 세포 내 단백질을 얻은 다음 Anti-MMP 13 항체(Abcam, ab3208, Cambridge)와 세미 드라이 transfer 기계(Amersham Bioscience, Piscataway)를 이용하여 웨스턴 블롯팅을 실시하여 MMP-13 의 양을 측정하였다.

실험 결과

실시예 9: 바이포달 펩타이드 바인더 라이브러리의 제작

바이포달 펩타이드 바인더의 구조 안정화 부위로는 안정한 베타-헤어핀 모티프를 사용하였다. 특히 트립토판-트립토판 아미노산의 상호 작용에 의해 베타-헤어핀 모티프 구조를 안정하게 이루어 주는 트립토판 지퍼(Andrea et al., Proc . Natl. Acad . Sci. 98:5578-5583(2001))을 이용하였다. 뼈대인 트립토판 지퍼의 N- 및 C-말단 부분에 각각 6 개 아미노산을 무작위로 배열함으로써 두 부분에 가변적 부위를 생성하였다(도 1a). 이를 바이포달 펩타이드 바인더라고 명명하였으며 양쪽의 가변적 부위를 가지고 있어 항원에 공동작용으로 붙을 수 있어 높은 친화력 및 특이성을 가질 수 있다. 또한, 바이포달 펩타이드 바인더의 구조 안정화 부위는 도 1b 내지 도 1e 와 같이 여러 가지로 구성될 수 있다.

합성한 2 개의 무작위 서열 올리고뉴클레오티드를 PCR 반응을 통해 이중 사슬로 만든 후 제한효소인 SfiI 및 NotI 으로 자른 후 pIGT2 파아지미드 벡터에 클로닝을 하여 8×10⁸ 이상의 라이브러리를 구축하였다(도 2).

실시예 10: 바이오 패닝 결과

바이포달 펩타이드 바인더 라이브러리를 피브로넥틴 ED-B, VEGF, VCAM1, nAchR, HSA 단백질에 대해 3-5 차에 걸쳐 바이오 패닝을 실시하고 각 패닝 단계에서 회수한 파아지 펩타이드들의 아웃풋 파아지/인풋 파아지의 비율을 결정하였다(표 1a).

[표 1a]

[표 1b]

[표 1c]

[표 1d]

[표 1e]

[표 1f]

실시예 11: 피브로넥틴 ED - B 의 인풋 파아지의 파아지 ELISA 결과

바이포달 펩타이드 바인더의 라이브러리의 각 인풋 파아지를 ED-B, 스트랩타비딘 및 BSA 에 대해 ELISA 를 수행하였다. 첫 번째 인풋 파아지의 반응성은 ED-B, 스트랩타비딘 및 BSA 모두 흡광도가 비슷하나, 두 번째 인풋 파아지부터 ED-B 흡광도가 스트랩타비딘에 비해 5.1 배, BSA 에 비해 3.4 배 높았다. 마지막 세 번째 인풋 파아지에서는 ED-B 흡광도가 스트랩타비딘에 비해 22 배, BSA 에 비해 15 배 높은 반응성을 보여 ED-B 에 대해 성공적으로 바이오 패닝이 이루어짐을 알 수 있다(도 3 및 표 2).

[표 2]

실시예 12: 피브로넥틴 ED -B, VEGF , VCAM1 , nAchR , HSA 및 MyD88 에 대해 특이적인 파아지 펩타이드 검색( 파아지 ELISA ) 및 시퀀싱

각 라이브러리의 패닝 단계중 아웃풋/인풋의 비율이 가장 높은 단계에서 회수한 파아지를 플라크 형태로 확보하였다. 각 플라크로부터 60 개의 파아지를 증폭시킨 후 BSA 에 대해 ELISA 를 수행하였다(도 4). BSA 에 비해 흡광도가 높은 클론들을 선택하여 DNA 시퀀싱을 의뢰하였다. 이로부터 중복된 각각의 단백질에 특이적인 펩타이드 시퀀스를 얻었다(표 3).

[표 3a]

[표 3b]

[표 3c]

[표 3d]

[표 3e]

[표 3f]

실시예 13: 피브로넥틴 ED -B, VEGF , VCAM1 , nAchR 및 HSA 의 친화도의 측정

피브로넥틴 ED-B, VEGF, VCAM1, nAchR 및 HSA 에 대한 상기 펩타이드를 합성하여 SPR Biacore system(Biacore AB, Uppsala, Sweden)을 이용하여 친화도를 측정하였다. 피브로넥틴 ED-B 에 대한 친화도를 측정한 결과 펩타이드 1 은 620 nM 를 나타내었고, 펩타이드 2 는 75 nM 를 나타내었으며, 펩타이드 3 은 2.5 μM 을 나타내었다(도 5a). VEGF 에 대한 친화도를 측정한 결과 펩타이드 1 은 60 nM, 펩타이드 2 는 326 nM 을 나타냈다(도 5b). VCAM1 의 단편 펩타이드에 대한 친화도를 측정한 결과 펩타이드 1 은 318 nM 을 보였다(도 5c). nAchR 의 단편 펩타이드에 대한 친화도를 측정한 결과 펩타이드 1 은 73 nM 을 보였다(도 5d). HSA 의 단편 펩타이드에 대한 친화도를 측정한 결과 펩타이드 1 은 115 nM 을 보였다(도 5e).

실시예 14: 피브로넥틴 ED -B, VEGF , VCAM1 , nAchR , HSA 및 MyD88 에 대한 특이성 분석

각각의 단백질에 특이적으로 결합하는 재조합 파아지를 여러 단백질에 대해서 특이성 검사를 ELISA 을 이용하여 시행하였다. 96-웰 ELISA 플레이트에 각각의 단백질을 5 ㎍/㎖을 50 ㎕씩 웰에 넣고 다음날 0.1％ PBST(Tween-20)로 3 회 세척하고 2％ BSA 를 사용하여 상온에서 2 시간 동안 블로킹을 한 후, 용액을 모두 버리고 0.1％ PBST 로 3 회 세척하였다. 여기에 본 발명의 펩타이드를 가지는 재조합 파아지를 2％ BSA 와 잘 혼합하여 100 ㎕씩 10 개의 단백질이 결합되어 있는 웰에 분주하고 27℃에서 2 시간 동안 정치하였다. 0.1％ PBST 용액으로 5 회 세척한 다음 HRP-컨쥬게이션 항-M13 항체(GE Healthcare)를 1:1,000 으로 희석하여 27℃에서 1 시간 반응시켰다. 0.1％ PBST 로 5 회 세척한 후 TMB 용액 100 ㎕를 분주하여 발색반응을 유도한 다음 1M HCl 100 ㎕을 첨가하여 반응을 중지시킨 다음 450 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 도 6a 에서 볼 수 있듯이, 바이포달 펩타이드 바인더에서 찾은 ED-B 에 특이적인 표 3a 의 펩타이드 2 는 다른 단백질의 흡광도와 비교할 때 30 배 이상의 차이를 나타내었으며 이는 펩타이드 2 시퀀스가 ED-B 에 대해서 특이적임을 나타내는 결과이다. 도 6b-6f 에서 볼 수 있듯이, 표 3b-3f 각각의 펩타이드 1 에 대한 특이성 분석 결과, 이들 각각의 펩타이드는 VEGF, VCAM1, nAchR, HSA 및 MyD88 에 대하여 특이성을 갖는다는 것을 알 수 있다.

실시예 15: SPR ( Surface Plasmon Resonance )의 공동 작용 효과 확인

바이포달 펩타이드 바인더의 항원에 대한 공동 작용 효과를 증명하기 위해서 친화력이 가장 좋은 표 3a 의 ED-B 에 대한 펩타이드 2 의 N- 및 C-말단 한쪽 부위만 각각 제거한 펩타이드를 합성하여 친화력을 측정하였다. N-말단 부분은 592 μM 을 가지며 C-말단 부분은 12.8 μM 을 나타내었다(도 7). 바이포달 펩타이드 바인더에서 양발(bipodal)을 가지고 있음으로써 나타내는 공동 작용 효과는 43 nM 의 친화력임을 증명하였다(도 5a).

실시예 16: 다른 β-헤어핀에 대한 바인딩 어세이

트립토판 지퍼 이외에 다른 β-헤어핀 골격인 GB1m3 및 HP7 에 ED-B 에 특이적으로 결합하는 Peptide2 의 N-말단 시퀀스(HCSSAV)와 C-말단 시퀀스(IIRLEQ)를 가지도록 펩타이드를 합성하였다(애니젠, 한국). 즉, 트립토판 지퍼를 포함한 바이포달 펩타이드 바인더의 시퀀스는 HCSSAVGSWTWENGKWTWKGIIRLEQ 이며 GB1m3 을 포함한 바이포달 펩타이드 바인더는 HCSSAVGKKWTYNPATGKFTVQEGIIRLEQ 이고, HP7 을 포함한 바이포달 펩타이드 바인더는 HCSSAVGKTWNPATGKWTEGIIRLEQ 이다. 각 펩타이드의 친화도는 BIAcore X(Biacore AB, Uppsala, Sweden)를 사용하여 측정하였다. 스트랩타비딘 SA 칩(Biacore AB, Uppsala, Sweden)에 비오틴-EDB 를 2,000 RU 만큼 흘려주어 고정시켰다. 러닝 버퍼로는 PBS(pH 7.4)를 사용하였고 플로우는 분당 30 ㎕로 흘리면서 여러 농도로 동력학을 측정한 후 BIAevaluation 으로 친화도를 계산하였다. 친화도를 측정한 결과 GB1m3 가 70 nM, HP7 이 84 nM 로 트립토판 지퍼(43 nM)와 비슷한 친화력을 가짐을 확인하였다(도 8). 이는 모든 안정한 β-헤어핀 모티프가 구조 안정화 부위로서 가능함을 증명하는 결과이다.

실시예 17: 구조안정화 부위로서 루이신 지퍼를 포함하는 바이포달 펩타이드 바인더에 대한 바인딩 어세이

β-헤어핀 골격 대신 구조안정화 부위로서 루이신 지퍼에 ED-B 에 특이적으로 결합하는 펩타이드 2 의 N-말단 시퀀스(HCSSAV)와 C-말단 시퀀스(IIRLEQ)를 가지도록 CSSPIQGGSMKQLEDKVEELLSKNYHLENEVARLKKLVGER 및 IIRLEQGGSMKQLEDKVEELLSKNYHLENEVARLKKLVGER 펩타이드를 합성하였다(애니젠, 한국). 두 펩타이드를 다이머로 만든 다음 BIAcore X(Biacore AB, Uppsala, Sweden)를 사용하여 친화도를 측정하였다. 친화도를 측정한 결과, 루이신 지퍼는 5 μM 의 친화도를 나타내었고 이는 트립토판 지퍼(43 nM)의 비슷한 친화도보다 떨어지는 친화도이기는 하지만 루이신 지퍼도 바이포달 펩타이드 바인더의 구조 안정화 부위로서 기능할 수 있음을 알 수 있다(도 9).

실시예 18: 암 바이오마커인 피브로넥틴 ED -B 에 특이적인 바이포달 펩타이드 바인더의 암 표적화

암에 많이 분포하는 피브로넥틴 ED-B 를 타겟팅 하는 바이포달 펩타이드 바인더에 Cy5.5 형광다이를 붙인 다음 Human U87MG 암이 있는 쥐에 정맥주사로 투여하여 IVIS 기계를 이용하여 바이포달 펩타이드 바인더가 암에 타겟하는 지 형광을 확인하였다(도 10). 실험 결과, 암 바이오마커인 피브로넥틴 ED-B 에 특이적인 바이포달 펩타이드 바인더는 암 조직에 축적되는 것이 관찰되었으며, 이는 본 발명의 바이포달 펩타이드 바인더가 인 비보 이미징에 이용될 수 있음을 보여주는 것이다.

실시예 19: GST - BPB fusion protein for Fibronectin EDB

1. GST - BPB 유전자 제작

Glutathione S-transferase(GST) 유전자가 포함된 pGEX4T-1 벡터(GE Healthcare)에 Fibronectin EDB 을 인식하는 BPB 유전자 시퀀스를 클로닝하였다. 2 개의 올리고뉴클레오타이드 GST-F1(5' -ACCGGATCCCATTGTTCTAGT-3' )와 GST-B1(5'-ATTCTCGAGTTACGCTCCTCCTCC-3')을 이용하여 EDB 단백질에 붙는 phage 에서 얻은 phagemid vector 를 template(실시예 1 및 3)로 PCR 하여 Fibronectin EDB 에 붙는 BPB 펩타이드 유전자를 얻었다. 이 BPB 펩타이드의 펩타이드 서열은 HCSSAVGSWTWENGKWTWKGIIRLEQ 이다. GST-F1 20 pmol, GST-B1 20 pmol, 주형 선별한 phagemid template 1ul, 2.5mM dNTP mixture 4μl, Ex Taq DNA polymerase 1μl (10 U), 10 x PCR buffer 5μl 를 섞고 총 50μl 가 되도록 증류수를 추가한 혼합액을 만들었다. 이 혼합액을 PCR 반응 (94℃ 5 분, 30 cycle: 55 ℃ 30 초와 72 ℃ 1 분, 94℃ 30 초)을 하여 BPB Insert 로 만든 후 PCR purification kit(GeneAll, Seoul, Korea)을 이용하여 정제하였다. BPB Insert 유전자를 pGEX4T-1 벡터에 연결하기 위해 BPB Insert 유전자와 pGEX4T-1 벡터에 제한효소처리를 시행하였다. 약 2μg 의 Insert DNA 를 BamHI (NEB)와 XhoI (NEB)로 4 시간씩 반응시킨 후 PCR purification kit 을 이용하여 정제하였다. 이들을 molar ratio vector:Insert=1:3 으로 T4 DNA ligase(Bioneer)를 이용하여 18℃, 10 시간 동안 연결한 후 E. coli XL-1 competent cell(Stratagene)에 transformation 을 한 후 Ampicillin agar 배지에 도말하였다. 한천 평판 배지에서 자란 집락을 5 ml 의 LB 배지에 접종한 뒤 37 ℃ 에서 200 rpm 의 속도로 섞어주면서 하룻동안 배양한 후 plasmid preparation kit(GeneAll, Seoul, Korea)을 이용하여 plasmid 을 정제하여 sequencing 을 하여 클로닝이 성공했는지 확인하였다.

2. GST - BPB 발현 및 정제

GST-BPB 를 클로닝한 vector 를 E. coli BL21 cell 에 transformation 한 후 2 L LB 에 Ampicillin(25 ug/ml)을 넣고 OD=0.6-0.8 까지 키웠다. 그 다음 1mM isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside(IPTG)를 넣어주어 37℃ 에서 200rpm 의 속도로 섞어주면서 8 시간 키웠다. 4,000 g 로 20 분간 원심 분리하여 가라앉은 세포들을 제외한 상청액을 모두 제거하고, lysis buffer (50 mM sodium phosphate (pH 8.0), 300 mM NaCl and 5 mM imidazole)로 재부유시켰다. -80℃ 에 하루동안 보관한 후 Sonicator 를 이용하여 E. coli 용해시킨 후에 15,000 g 로 1 시간 동안 원심 분리하여 상청액을 GST affinity resin(Peptron)에 결합시켰다. PBS buffer 로 resin 을 씻어 준 후 Elution buffer (20mM GSH in 10mM Tris-HCl, pH 8)을 이용하여 GST-BPB 단백질을 떨어뜨려 수집하였다. 이렇게 모은 단백질을 Superdex75 column(Amersham)와 PBS(pH7.4) buffer 을 이용하여 gel filtration 을 하여 순도 높은 GST-BPB 단백질을 수집하였다.

3. GST - BPB 의 Fibronectin EDB binding 실험

정제된 GST-BPB 를 Fibronectin EDB 에 binding 하는지 SPR 기계를 이용하여 확인하였다. Affinity 측정은 BIAcore X 을 이용하여 수행하였다. Streptavidin SA chip(Biacore)에 biotin-EDB 을 2000RU 만큼 흘려주어 고정시켰다. Running buffer 로는 PBS(pH7.4)을 사용했고 flow 는 30ul/min 으로 흘리면서 여러 농도로 kinetics 을 측정을 한 후 BIAevaluation 으로 affinity 를 계산하였다.

4. 실험 결과

(1) GST - BPB 제작

Fibronectin ED-B 를 특이적으로 인식하는 BPB 를 GST fusion vector 에 클로닝을 한 후 GST-BPB 를 대장균에서 발현하고 정제하였다(도 11a).

(2) GST - BPB 의 친화도 측정

GST-BPB 를 SPR biacore system 을 이용하여 Fibronectin EDB 에 대한 affinity 를 측정하였다. Affinity 를 측정한 결과 284 nM 의 affinity 를 가졌고 GST 가 있음에도 충분히 Fibronectin EDB 를 인식할 수 있음을 보여주었다(도 11b).

실시예 20: TNF α- BPB fusion protein

1. TNF α- BPB 유전자 제작

pET28b vector(Novagen)에 human TNFα(tumor necrosis factor α)와 Fibronectin EDB 을 인식하는 BPB 유전자 시퀀스를 클로닝하였다. 두 개의 oligonucleotides TNF-F1(AATAAAACATATG TCTCGAACCCCGA)와 TNF-B1(ATGGATCCCAGGGCAATGATC)을 이용하여 human TNFα가 클로닝 되어 있는 벡터 Gh75 (Cytokine Bank, Korea)에서 TNFα 유전자를 증폭하고 이를 pET28b 에 클로닝 하였다. 그리고 두 개의 oligonucleotides BPB-F1 (AAT GAATTCTCTTCCTCATCGGGTTCTTCCTCATCGGGTTGTAGTTCTCCTATTC)와 BPB-B1 (AAT AAGCTTTCATTGCTCCAACCTAAT)을 이용하여 EDB 단백질에 붙는 phage 에서 얻은 phagemid vector(실시예 1 및 3)를 template 로 PCR 하여 Fibronectin EDB 에 붙는 BPB 펩타이드 유전자를 얻었다. 이 BPB 펩타이드의 펩타이드 서열은 CSSPIQGSWTWENGKWTWKGIIRLEQ 이다.

상기 BPB 유전자를 TNFα가 들어간 pET28b vector 에 클로닝하였다. plasmid preparation kit 을 이용하여 plasmid 을 정제하여 sequencing 을 하여 클로닝이 성공했는지 확인하였다.

2. TNF α- BPB 발현 및 정제

TNFα-BPB 를 클로닝한 pET28b vector 를 BL21 cell 에 transformation 한 후 kanamycine agar 배지에 도말하였다. 2L LB 에 kanamycine(25ug/ml)을 넣고 OD=0.6-0.8 까지 키운 다음 1mM isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside(IPTG)를 넣어주어 37 ℃ 에서 200rpm 의 속도로 섞어주면서 8 시간 키웠다. 4,000 g 로 20 분간 원심 분리하여 가라앉은 세포들을 제외한 상청액을 모두 제거하고, lysis buffer (50 mM sodium phosphate (pH 8.0), 300 mM NaCl and 5 mM imidazole)로 재부유시켰다. -80 ℃ 에 하루동안 보관한 후 Sonicator 를 이용하여 E.coli 용해시킨 후에 15,000 g 로 1 시간 동안 원심 분리하여 상청액을 Ni-NTA affinity resin(ELPIS biotech.)에 붙였다. Lysis buffer 로 resin 을 씻어 준 후 Elution buffer (50 mM sodium phosphate (pH 8.0), 300 mM NaCl and 300 mM imidazole)을 이용하여 TNFα-BPB 단백질을 떨어뜨려 수집하였다. 이렇게 모은 단백질을 Superdex75 column 와 PBS(pH7.4) buffer 을 이용하여 gel filtration 을 하여 순도 높은 TNFα-BPB 단백질을 수득하였다.

3. TNF α- BPB 의 Fibronectin EDB binding 실험

정제된 TNFα-BPB 를 Fibronectin EDB 에 binding 하는지 SPR 기계를 이용하여 확인하였다. Affinity 측정은 BIAcore X 을 이용하여 수행하였다. Streptavidin SA chip(Biacore)에 biotin-EDB 을 2000RU 만큼 흘려주어 고정시켰다. Running buffer 로는 PBS (pH 7.4)을 사용했고 flow 는 30 ul/min 으로 흘리면서 여러 농도로 kinetics 을 측정을 한 후 BIAevaluation 으로 affinity 를 계산하였다.

4. TNF α- BPB 의 cytotoxicity 실험

L-M mouse fibroblasts 을 이용하여 TNFα-BPB 와 TNFα의 cytotoxicitiy 를 MTT 분석으로 측정하였다. 우선 L-M mouse fibroblast 를 96 well microplate 에 5000 개를 깔은 다음 18 시간 후에 TNFα와 TNFα-BPB 을 농도별로 넣고 30 시간 후에 MTT 를 시행하여 cytotoxicitiy 를 측정하였다.

5. 실험 결과

(1) TNF α- BPB 제작

Fibronectin ED-B 를 특이적으로 인식하는 BPB 를 TNFα에 클로닝을 한 후 TNFα-BPB 를 대장균에서 발현하고 정제하였다(도 12a).

(2) TNF α- BPB 의 친화도 측정

TNFα-BPB 를 SPR biacore system 을 이용하여 Fibronectin EDB 에 대한 affinity 를 측정하였다. Affinity 를 측정한 결과 80nM 의 affinity 를 가졌고 TNFα가 있음에도 충분히 Fibronectin EDB 를 인식할 수 있음을 보여주었다(도 12b).

(3) TNF α- BPB 의 cytotoxicitiy 측정

L-M mouse fibroblast cell 에서 TNFn 와 TNFn-BPB 의 cytotoxicity 를 MTT 로 측정하였다. TNFα-BPB 가 TNFα 보다 5 배 정도 cytotoxicity 가 높다(도 12c).

실시예 21: Liposome - BPB

1. Conjugation of BPB _css to Mal - PEG ₂₀₀₀ - DSPE

Mal-PEG₂₀₀₀-DSPE 를 이용하여 BPB_EDB(CSSPIQGSWTWENGK(Cys, lysine 잔기에 cys 을 연결)WTWKGIIRLEQ)의 시스테인 잔기에 컨쥬게이션 시켰다. 간단하게는, Mal-PEG₂₀₀₀-DSPE 의 1.1 fold molar excess 를 chloroform/DMSO(1:1 v/v)에서 BPB_EDB 와 혼합하였다. 12 시간 동안 상온에서 교반하여 반응을 진행시켰다.

2. Encapsulation efficiency of 9R/ siRNA in BPB _css - LS

9R peptide 및 VEGF-C siRNA(sense 5' CAG AUG GAU UCC AUG ACA dTdT, anti-sense 5' AUG UCA UGG AAU CCA UGU G dTdT)를 HEPES-buffered 5％ glucose (pH 7.4)에서 희석하여 최종 부피 250 μl 가 되도록 하고 실온에서 10 분 동안 인큐베이션 하였다. 상기 용액을 혼합하고 볼텍싱 하여 500 μl 9R/siRNA complexes at a +/- charge ratio of 1:6 을 얻었다. 동시에 BPB-DSPE 가 내포된 liposome 을 만들기 위한 POPC/Chol/POPG/PEG2000-DSPE/BPB-DSPE (4:3:3:1:0.5)mixture 와 대조군 liposome 을 위한 POPC/Chol/POPG/PEG2000-DSPE (4:3:3:1)mixture 을 이용하여 lipid film 을 만든다. 여기에 500ul Hepes buffer glucose 5％ (HBG 5％)을 넣은 다음 lipid film 에 500ul 9R/siRNA complex 을 넣었다. 이 혼합물을 간단하게 소니케이션 한 다음, hand-held extruder (Avanti Polar Lipid, AL, USA)를 이용하여 2 개의 polycarbonate membranes (100 nm pore size)의 스택을 통하여 11 번 익스트루젼을 하였다. 9R/siRNA-loaded BPB-liposomes(BPB_css-LS)과 대조군인 9R/siRNA-loaded-liposomes 을 size-exclusion chromatography (CL-4B column)로 정제하였다. Sepharose CL4B column eluent 의 분획을 OliGreen (Invitrogen)으로 분석하여 siRNA 함량을 분석하였다.

3. 크기 분포 및 zeta - potentials

9R/siRNA 가 로딩된 BPB_css-LS 를 HBS(Hepes Buffer Saline)로 희석하여 최적의 scattering intensity 를 얻었다. Hydrodynamic diameter 및 zeta potential 을 ELS 8000 장치(Otsuka Electronics Korea, Seoul, South Korea)를 이용하여 electrophoretic light scattering 방법으로 측정하였다.

4. Uptake of BPB _css - LS in EDB positive and EDB negative cell line

세포를 cover glass coated with 2％ gelatin 상에서 밤샘 배양하였다. 24 시간 후에 세포에 200ug 의 BPB-liposome(0.3％ rhodomaime 포함)과 대조군인 200ug 의 liposome (0.3％ rhodamine)을 각각 처리하였다. 37℃ 1 시간 처리 후, 세포를 3 번 세척하고 4％ paraformaldehyde 로 고정화 한 다음 공초점 현미경으로 관찰하였다.

5. siRNA transfection efficiency in MCF -7 cells in vitro

BPB_css-LS 에 encapsulat 된 siRNA 의 MCF-7 cell 내로의 transfection 효율을 평가하기 위하여, MCF-7 cell 을 50 nM VEGF-C siRNA in lipofectamine(positive control), 50 nM BPB_css-LS 및 100 nM BPB_css-LS 로 형질전환시켰다. 4 시간 경과 후, 세포를 24 시간 더 인큐베이션 하고 이어 RNA 분리, cDNA 합성 및 실시간 RT-PCR 을 실시하였다.

6. 실험 결과

(1) BPB - liposome 크기 및 제타 포텐셜

BPB_css-LS 의 측정된 크기 및 제타 포텐셜은 하기 표와 같다.

[표 4]

(2) BPB - liposome 에 siRNA 내포

도 13a 에서 볼 수 있듯이, BPB-liposome(CSS-LS)에 siRNA 을 내포한 것과 free siRNA 을 제거하기 위해서 size exculsion CL-4B 컬럼을 이용해서 분리하였다. 크기가 큰 siRNA/BPB-liposome 이 먼저 나오고 그 다음 free siRNA 가 나옴을 관찰 할 수 있다. 이 방법으로 siRNA 가 내포된 정제된 BPB-liposome 을 얻을 수 있다.

(3) BPB - liposome 의 특이성

타겟 단백질인 EDB 가 과발현 되는 U87MG, MCF-7, MCF-7/ADR 세포주를 이용하여 BPB-liposome 이 잘 인식하는지 확인하였다. 0.3％ rhodamine 이 포함된 BPB-liposome 와 대조군인 liposome 을 세 개의 세포에 한 시간 동안 처리한 후 세척하고 현미경으로 관찰하였다. 도 13b 에서 볼 수 있듯이, BPB-liposome(CSS-LS)은 모든 세포에 잘 붙음을 확인하였다. 그러나 대조군인 BPB 가 없는 liposome (LS)은 EDB 과발현 세포주에 붙지 않았다. 이는 BPB-liposome 이 EDB 를 세포내에서 특이적으로 인식 할 수 있음을 보여 준다.

또한 EDB negative cell 인 PC3 와 LnCap 을 이용하여 위와 같은 방법으로 BPB-liposome 과 대조군인 liposome 을 처리하였을 때 둘 다 각각의 세포에 붙지 않음을 그림 13c 에서 보여준다. 이는 타겟 단백질인 EDB 가 없으면 BPB-liposome 라도 붙지 않음을 보여주며 BPB-liposome 이 EDB 에 매우 특이적임을 나타낸다.

(4) MCF -7 세포에 BPB - LS / siRNA 내포 효능 test

도 13d 에서 볼 수 있듯이, VEGF-C siRNA 을 내포한 BPB-LS 가 세포내에서 VEGF-C 의 mRNA 을 억제할 수 있는지를 MCF-7 세포에서 확인하였다. 50nM 과 100nM VEGF-C siRNA 을 내포한 BPB-LS 을 세포에 처리하였을 때 일반적으로 많이 쓰이는 lipofectamine 과 비슷하게 VEGF-C mRNA 을 억제할 수 있음을 보여주었다.

실시예 22: Oleic SPION - BPB

1. Oleic SPION - BPB 제조

500 ug/100 ul(CHCl₃) DSPE-PEG₂₀₀₀-Mal(Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL, USA)(1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine-N-[Maleimide(Polyethylene Glycol)2000])와 BPB (SSS) peptide(

) 250 ug/100 ul(DMSO)을 CHCl₃/DMSO co-solvent 하에서 overnight 반응시켰다. 반응후 MALDI-TOF-MS(SHIMADZU Axima-CFR,SHIMADZE, Japen)를 이용해서 반응여부를 확인하였다. DSPE-PEG₂₀₀₀ polymer 와 BPB conjugated DSPE-PEG₂₀₀₀ 및 Rhodamine-DSPE 을(5:94:1)의 비율로 D.W.에 넣은 후, Oleic SPION(superparamagnetic iron oxide nanoparticle, 열분해법으로 합성)을 Hexane 에 녹인후 위의 polymer solution 에 넣고, probe 타입의 sonicator 를 이용해 sonication 해준 후, stirring 방법과 centrifuge 그리고 magnet 을 이용해 정제하였다. 그리고 BPB 가 없는 그룹도 위와 동일한 방법으로 합성하였다.

2. 합성후 Size 측정 ELS 와 TEM 를 이용하여 BPB conjugated 된 DSPE - PEG ₂₀₀₀ 코팅 Oleic SPION 확인

electrophoretic light scattering(ELS 8000 instrument of Otsuka Electronics, Otsuka Electronics Korea, Seoul, South Korea)를 이용해 Hydrodynamic size 를 측정하여 BPB conjugate 유무의 size 변화를 측정하며, 또한 일정시간동안 D.W.에서의 안정성을 확인하였고, transmission electron microscopy(Philips TECNAI F20 instrument (Philips ElectronicInstruments Corp., Mahwah, NJ))을 이용해 나노입자들의 aggregation 정도를 확인하였다.

3. T2 - weighted MR 팬텀 연구를 통해서 합성한 BPB conjugated 된 DSPE -PEG ₂₀₀₀ 코팅 Oleic SPION 이 MR 조영제로 사용 가능한지 확인

BPB conjugated DSPE-PEG₂₀₀₀ coated oleic SPION 과 DSPE-PEG₂₀₀₀ coated oleic SPION 을 각각 농도별로 e-tube 에 담아서 3T MRI scanner (Magnetom Avanto, Siemens, Germany)를 이용 T2 Time 을 측정 하여, r2 값을 계산하였다.

4. 세포실험을 이용하여 active targeting 확인

6 well plate 에 U87MG 세포를 37℃ CO₂ incubator 에서 confluency 90-100％로 배양후, 같은 농도의 BPB conjugated DSGPE-PEG₂₀₀₀ coated SPION 과 DSGPE-PEG₂₀₀₀ coated SPION 을 배지에 섞어서 30 분 동안 배양한 후 세포를 모아서, 3T MRI scanner (Magnetom Avanto, Siemens, Germany)를 통해서 신호강도의 차이를 확인하였다. 또한, confocal microscope (Olympus, FV1000)를 이용해서 세포에서의 rhodamine 신호의 차이를 확인하였다.

5. 세포 독성 실험

96 well plate 에 U87MG 세포를 37℃ CO₂ incubator 에서 confluency 50％로 배양후, 같은 농도의 BPB conjugated DSPE-PEG₂₀₀₀ coated oleic SPION 과 DSPE-PEG₂₀₀₀ coated oleic SPION 을 배지에 섞어서 12 시간동안 배양해 후 MTT assay 를 통해서 세포독성이 있는지를 확인하였다.

6. 뇌암 동물 모델을 이용한 active targeting MR 실험

Balb/c nude(female) 6 weeks mice 의 오른쪽 뒷다리 위쪽에 U87MG 세포 5 x 10⁶ 개의 세포를 이식하여 2 주정도 키운 후, 암의 크기가 약 100-150 mm³ 되었을 때 BPB conjugated DSPE-PEG₂₀₀₀ coated oleic SPION 과 DSPE-PEG₂₀₀₀ coated oleic SPION 을 20 mg Fe/kg 씩 꼬리정맥 투여후, 3T MRI 를 이용해 암부위의 신호강도를 시간별로 모니터하였다.

7. 실험 결과

(1) SPION - BPB 의 제작

DSPE-PEG₂₀₀₀-Mal 와 BPB(SSS) peptide 의 conjugation 을 MALDI 를 이용해서 확인하였다(도 14a).

DSPE 를 이용해 SPION 을 합성할 경우 Hydrodynamic size(수용액 상태에서 size 측정)를 측정하면 약 30 nm 정도의 size 가 나오고, BPB(SSS peptide)를 conjugate 한 DSPE 를 사용 할 경우 size 가 약 20 nm 정도 증가하였다.

[표 5]

일주일동안 ELS 를 이용하여 Hydrodynamic size 변화를 관찰하였는데, 일주일동안 나노입자 크기에 큰 변화가 없이 안정한 상태임을 확인하였다(도 14b). TEM 이미지를 통해 나노입자(SPION)에 BPB 가 conjugate 된 후에도 잘 분산됨을 확인하였다. 또한 중심 core 의 size 가 약 12 nm 정도 됨을 확인하였다(도 14c).

(2) T2 - weighted MR 팬텀 연구를 통해서 BPB conjugated DSPE - PEG ₂₀₀₀ 코팅 Oleic SPION 이 MR 조영제로 사용 가능한지 확인

DSPE-PEG₂₀₀₀ coated oleic SPION 및 BPB conjugated DSPE-PEG₂₀₀₀ coated oleic SPION 모두 r2 값은 120 mM^-1S^- ¹ 으로 MRI T2 조영제로 사용할 수 있음을 확인하였다(도 14d).

(3) 세포실험을 이용하여 active targeting 확인

세포 실험에서 BPB 가 있는 그룹과 없는 그룹간의 MR 이미지 및 신호강도의 차이를 확인하였다(도 14e). BPB conjugated DSPE-PEG₂₀₀₀ coated SPION 이 세포에 더 많이 uptake 되어 MR 이미지에서 더 검게 나타나며,또한 MR 신호비교(ROI 신호비교)에서도 DSPE-PEG₂₀₀₀ coated SPION 보다 더 낮은 값을 보여주었다.

Confocal 현미경을 이용해 DSPE-PEG₂₀₀₀ coated SPION 과 BPB conjugated DSPE-PEG₂₀₀₀ coated SPION 의 로다민 신호의 차이를 확인하였다(도 14f). BPB conjugation 된 그룹에서 세포의 로다민 신호가 더 강하게 나타났다.

(4) 세포독성 실험

MTT 실험을 통해 DSPE-PEG₂₀₀₀ coated SPION 과 BPB conjugated DSPE-PEG₂₀₀₀ coated SPION 의 세포독성 실험을 한 결과 두 그룹 모두 낮은 세포 독성을 보였다(도 14g).

(5) 뇌암 동물모델을 이용한 active targeting MR 실험

뇌암 동물모델에서 BPB conjugated DSPE-PEG₂₀₀₀ coated SPION 그룹이 injection 1 시간 후 암부위 가 검게 나타나는 것을 확인하였다(도 14h). 그에 반해 BPB conjugate 되지 않은 DSPE-PEG₂₀₀₀ coated SPION 그룹에서는 injection 전과 후에서 큰 변화가 나타나지 않았다.

실시예 23: Gold NPs - BPB

1. Pegylated Gold nanoparticle 제조

금 이온을 환원제를 사용하여 약 5nm 크기를 가지는 금 나노입자를 합성하였다. 5 nm 금나노입자가 생체내에서의 안정성 즉 RES(reticuloendothelial system) 등으로의 uptake 를 줄이며 목표 세포로의 전달 효율을 증가시키기 위하여 금나노입자 표면을 생체적합성 고분자의 PEG 로 코팅이 필요하다. 따라서 PEG 에 thiol 그룹을 도입하기 위해 dithiol 그룹과 카르복실 그룹이 포함된 lipoic acid 와 반응시켰다. Lipoic acid 에 PEG 를 결합하기 위하여 우선 lipoic acid 의 카르복실 그룹을 DCC(dicyclohexylcarbodiimide)와 NHS (N-hydroxylsucciniimide)로 활성화 시킨 후 100ug 의 NH₂-PEG-OCH₃ 와 반응시킴으로써 lipoic-PEG 합성하였다. 금 나노입자에 PEG 가 코팅됨을 1M NaCl 을 첨가하여 aggregation 이 되는지를 측정하여 PEG 가 완벽하게 coating 됨을 측정하였다.

2. Gold nanoparticle - BPB conjugation

합성된 lipoic-PEG-maleimde 와 thiol 그룹이 노출된 BPB(CSS 펩타이드, CSSPIQGSWTWENGK(cys)WTWKGIIRLEQ)를 CHCl₃/DMSO(3:1) co-solvent 하에서 overnight 반응한 후에 lipoic-PEG-maleimde-BPB 이용하여 gold nanoparticle 을 코팅하였다.

3. Gold nanoparticle - BPB 의 암 세포 인식 실험

BPB-금나노입자가 Fibronectin ED-B 를 인식하는지 Fibronectin ED-B 가 overexpression 되는 U87MG glioblastoma 를 이용하여 암 세포 인식을 확인하였다. Human U87MG glioblastoma cell 을 90-100％ confluency 로 cover slip 에 키운 다음 BPB-금나노입자를 1 시간동안 37℃에서 cell 과 incubation 을 하였다. 그리고 나서 PBS 로 세 번 washing 을 한 후 세포를 Trypsin 으로 떼어 낸 후에 세포를 모아서 Inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS)를 이용해 세포내 Au 의 양을 측정하였다.

4. 금나노입자에 양쪽성 이온( zwitterions ) 코팅

금 나노입자는 기존조영제가 가지는 단점(짧은 영상 시간, 신장독성)을 극복할 수 있으나 금 나노입자 역시 크기 등의 문제로 인해 체외로 배출되지 않는 문제점을 가지고 있다. 이러한 문제점을 극복하기 PEG 대신에 PEG 와 같은 역할을 할 수 있으면서 나노입자의 hydrodynamic 크기를 크게 증가시키지 않은 양쪽성 이온을 금 나노입자에 코팅시킴으로써 최종 금 나노입자의 hydrodynamic 크기를 8nm 이하로 줄여 체외로 빠져나갈 수 있도록 나노입자를 디자인 하였다. 또한 본 연구진에서 사용한 양쪽성 이온은 금 나노입자와 결합할 수 있는 부분으로 모노티올(mono-thiol)그룹이 아닌 고리형다이티올(cyclic dithio) 그룹을 도입함으로써 혈액내에서 금나노입자와 양쪽성 이온간의 안정성(stability)를 증가시켰다. 양쪽성 이온의 구조는 다음과 같다.

다음으로 금 나노입자가 혈청(serum)과 1M NaCl 하에서 안정하기 위해 필요한 양쪽성 이온과 금 나노입자 사이의 최적의 비율을 금 나노입자의 표면 플라스몬 공명(surface Plasmon resonance) 최대 피이크(peak)의 변화를 관찰하면서 측정하였다. 먼저 금 나노입자와 양쪽성 이온간의 다양한 비율(1:3000, 1:5000, 1:7000, 1:10000, 1:12000, 1:15000)을 섞어서 12 시간 반응 후 원심분리기를 이용하여 분리하였다. 10％ 혈청과 1M NaCl 첨가 하고 24 시간이 지난후 표면 플라스몬 공명 최대 피이크를 UV-Vis spectrum 을 이용하여 측정하였다.

5. 금나노입자에 BPB 를 붙여주기 위한 BPB 변형

금 나노입자와 BPB 사이의 결합력 즉 혈액내에서의 안정성을 증가시키기 위해 BPB 에서도 역시 고리형다이티올(cyclic dithio) 그룹을 도입하였다. 즉 lipoic acid 를 DCC(N,N'-Dicyclohexylcarbodiimide)/NHS(N-hydroxl succinimides)와 THF(tetrahydrofuran)에서 72 시간동안 반응시켜 lipoic-NHS 형태를 만들었으며 toluene 을 통한 재결정 방법으로 정제하였다. 정제한 lipoic-NHS 는 N-말단기가 아세틸화(acetylation)된 BPB 의 라이신(lysine) 잔기의 아민(NH₂)그룹과 DMSO(Dimethyl sulfoxide)에서 2 시간 반응시켜 BPB 에 고리형다이티올 그룹을 도입할 수 있었다.

6. 실험 결과

(1) Gold Nanoparticle - BPB 제작

금 나노입자는 현재 널리 사용되고 있는 아이오다인 기반 CT 조영제의 단점인 신장 독성, 짧은 영상화 시간 등을 극복할 수 있을 뿐만 아니라 간암 조영이 가능한 생체적합성 고분자로 코팅한 금나노 입자를 차세대 CT 조영제 로 개발할 수 있다. 여기서는 암 표적 BPB 를 붙임으로써 CT 로 암을 이미징 할 수 있는 금 나노입자를 개발하였다. 5nm 의 금나노입자에 Fibronectin EDB 를 인식하는 BPB 를 conjugation 을 하였다. TEM 이미지를 통해 나노입자가 BPB 가 conjugate 된 후에도 잘 분산 되어져있음을 확인하였다(도 15a).

(2) Gold Nanoparticle - BPB 의 암세포 표적 실험

U87MG 세포를 이용하여 BPB conjugated 금나노입자를 동일한 농도로 넣어준 후, ICP-MS 를 이용해 세포내의 Au 의 양의 차이를 측정하였다. BPB 가 있는 그룹이 없는 그룹보다 세포내 Au 의 양이 많음을 확인되었다. 따라서 BPB conjugated 금 나노입자가 EDB 에 의한 세포 표면 흡착과 세포내 전달이 더 잘됨을 확인하였다(도 15b). 또한 BPB 가 conjugation 되지 않은 금 나노입자보다 BPB 가 conjugation 된 금 나노입자가 선택적으로 U87MG 세포에 흡착하는 것을 silver enhancement 방법을 이용하여 현미경관찰로도 확인할 수 있었다(도 15c).

(3) 금 나노입자의 양쪽성이온 코팅

BPB 를 금 나노입자에 붙였을 시 선택적으로 암세포에 흡착되는 것을 확인 후 금 나노입자가 생체내에 주입되었을 시 혈액내에서 안정할 수 있도록 금 나노입자 표면을 양쪽성 이온으로 코팅을 시켜 주었다. 금 나노입자와 양쪽성 이온간의 비율이 1:10000 이상일 때 금나노입자의 표면 플라즈몬 공면 최대 피이크가 혈청 및 1 M NaCl 을 첨가하고 24 시간이 지났어도 변화가 없는 것으로 보아 혈청 및 1M NaCl 의 환경에서도 금나노입자가 안정한 것을 확인할 수 있었다.

(4) 금 나노입자에 BPB 를 붙여주기 위한 BPB 변형

BPB 에 고리형다이티올 그룹을 도입한 Lipoic-BPB 를 HPLC 로 분리하였으며 MALDI-TOF 를 통해 합성물을 확인할 수 있었다.

실시예 24: Drug - BPB conjugates

1. Docetaxel ( DTX )- NHS 제조 및 확인

DTX 의 hydroxyl 기를 succinic anhydride 와 상온, 12 시간 반응시켜 DTX succinic acid 를 제조하였다. BPB 의 lysine 이 가지고 있는 free amine 에 DTX succinic acid 를 콘쥬게이션 시키기 위해 먼저 amine 에 반응하는 NHS 그룹을 DTX succinic acid 에 결합시켰다. 반응 조건은 DTX succinic acid 를 MC(methylene choloride)용액에 먼저 녹이고 EDC/NHS 를 추가하여 상온 12 시간 반응시켰다. 이때 mole 비는 DTX succinic acide : EDC : NHS = 1 : 1.2 : 1.5 로 수행하였다. 반응 후 이동상 용매를 EA(ethyl acetate)로 하여 TLC(thin liquid chromatography)분석을 수행하였다.

2. DTX - NHS 와 BPB 콘쥬게이션

DTX-NHS 를 콘쥬게이션 반응 직전에 DMF 에 녹이고, BPB 를 추가하여 녹였다. 완전히 녹지 않는 경우 DMSO 를 조금씩 첨가해 주었다. 여기에 BPB 의 free amine 형성을 도와주는 base DIEA(di-isoethyl amine)를 첨가해 주고 상온 12 시간 반응시켰다. DIEA 는 BPB 의 2 당량 이상 넣어주었다. BPB 서열은 N-terminal acetylated BPB 로서 서열은 SSSPIQGSWTWENGKWTWRGIIRLEQ 이다.

3. DTX - BPB 의 정제 및 분석

DTX-NHS 와 BPB 콘쥬게이션 반응액을 진공건조기에서 건조시킨 후 50％ ACN 에 녹이고 HPLC 에서 분석하였고, DTX-BPB 콘쥬게이트에 해당하는 HPLC peak 샘플을 질량분석(MALD TOF)을 수행하여 DTX-BPB 콘쥬게이트 형성을 확인하였다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Gwangju Institute of Science and Technology <120> BPB-based Cargo Delivery System <150> KR2009-0123237 <151> 2009-12-11 <160> 41 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Trpzip1 <400> 1 Ser Trp Thr Trp Glu Gly Asn Lys Trp Thr Trp Lys 1 5 10 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Trpzip2 <400> 2 Ser Trp Thr Trp Glu Asn Gly Lys Trp Thr Trp Lys 1 5 10 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Trpzip3 <400> 3 Ser Trp Thr Trp Glu Pro Asn Lys Trp Thr Trp Lys 1 5 10 <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> gb1, 41-56 <400> 4 Gly Glu Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu 1 5 10 15 <210> 5 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Trpzip4 <400> 5 Gly Glu Trp Thr Trp Asp Asp Ala Thr Lys Thr Trp Thr Trp Thr Glu 1 5 10 15 <210> 6 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Trpzip5 <400> 6 Gly Glu Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr Trp Thr Glu 1 5 10 15 <210> 7 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Trpzip6 <400> 7 Gly Glu Trp Thr Trp Asp Asp Ala Thr Lys Thr Trp Thr Val Thr Glu 1 5 10 15 <210> 8 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Trpzip7 <400> 8 Gly Glu Trp His Trp Asp Asp Ala Thr Lys Thr Trp Val Trp Thr Glu 1 5 10 15 <210> 9 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Trpzip8 <400> 9 Gly Glu Trp Val Trp Asp Asp Ala Thr Lys Thr Trp His Trp Thr Glu 1 5 10 15 <210> 10 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Trpzip9 <400> 10 Gly Glu Trp Val Trp Asp Asp Ala Thr Lys Thr Trp Val Trp Thr Glu 1 5 10 15 <210> 11 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> (T3V)-HP6 <400> 11 Lys Tyr Val Trp Ser Asn Gly Lys Trp Thr Val Glu 1 5 10 <210> 12 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Espinosa-GB1(b) <400> 12 Arg Trp Gln Tyr Val Asn Gly Lys Phe Thr Val Gln 1 5 10 <210> 13 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GB1m2 <400> 13 Gly Glu Trp Thr Tyr Asn Pro Ala Thr Gly Lys Phe Thr Val Thr Glu 1 5 10 15 <210> 14 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GB1m3 <400> 14 Lys Lys Trp Thr Tyr Asn Pro Ala Thr Gly Lys Phe Thr Val Gln Glu 1 5 10 15 <210> 15 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HP5W4 <400> 15 Lys Lys Trp Thr Tyr Asn Pro Ala Thr Gly Lys Trp Thr Trp Gln Glu 1 5 10 15 <210> 16 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HP5W <400> 16 Lys Lys Tyr Thr Trp Asn Pro Ala Thr Gly Lys Trp Thr Val Gln Glu 1 5 10 15 <210> 17 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HP5A <400> 17 Lys Lys Tyr Thr Trp Asn Pro Ala Thr Gly Lys Ala Thr Val Gln Glu 1 5 10 15 <210> 18 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HP7 <400> 18 Lys Thr Trp Asn Pro Ala Thr Gly Lys Trp Thr Glu 1 5 10 <210> 19 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chignolin <400> 19 Gly Tyr Asp Pro Glu Thr Gly Thr Trp Gly 1 5 10 <210> 20 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BPB-EB-B1 <400> 20 Met Ser Ala Asp Lys Ser Gly Ser Trp Thr Trp Glu Asn Gly Lys Trp 1 5 10 15 Thr Trp Lys Gly Gln Val Arg Thr Arg Asp 20 25 <210> 21 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BPB-ED-B2 <400> 21 His Cys Ser Ser Ala Val Gly Ser Trp Thr Trp Glu Asn Gly Lys Trp 1 5 10 15 Thr Trp Lys Gly Ile Ile Arg Leu Glu Gln 20 25 <210> 22 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BPB-ED-B3 <400> 22 His Ser Gln Gly Ser Pro Gly Ser Trp Thr Trp Glu Asn Gly Lys Trp 1 5 10 15 Thr Trp Lys Gly Arg Tyr Ser His Arg Ala 20 25 <210> 23 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BPB-VEGF1 <400> 23 His Ala Asn Phe Phe Gln Gly Ser Trp Thr Trp Glu Asn Gly Lys Trp 1 5 10 15 Thr Trp Lys Gly Trp Lys Tyr Asn Gln Ser 20 25 <210> 24 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BPB-VEGF2 <400> 24 Ala Ser Pro Phe Trp Ala Gly Ser Trp Thr Trp Glu Asn Gly Lys Trp 1 5 10 15 Thr Trp Lys Gly Trp Val Pro Ser Asn Ala 20 25 <210> 25 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BPB-VEGF3 <400> 25 His Ala Phe Tyr Tyr Thr Gly Ser Trp Thr Trp Glu Asn Gly Lys Trp 1 5 10 15 Thr Trp Lys Gly Trp Pro Val Thr Thr Ser 20 25 <210> 26 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BPB-VEGF4 <400> 26 Tyr Gly Ala Tyr Pro Trp Gly Ser Trp Thr Trp Glu Asn Gly Lys Trp 1 5 10 15 Thr Trp Lys Gly Trp Arg Val Ser Arg Asp 20 25 <210> 27 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BPB-VEGF5 <400> 27 Ala Ala Pro Thr Ser Phe Gly Ser Trp Thr Trp Glu Asn Gly Lys Trp 1 5 10 15 Thr Trp Lys Gly Trp Gln Met Trp His Arg 20 25 <210> 28 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BPB-VCAM1 <400> 28 Gln Ala Arg Asp Cys Thr Gly Ser Trp Thr Trp Glu Asn Gly Lys Trp 1 5 10 15 Thr Trp Lys Gly Pro Ser Ile Cys Pro Ile 20 25 <210> 29 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BPB-nAchR1 <400> 29 Glu Ala Ser Phe Trp Leu Gly Ser Trp Thr Trp Glu Asn Gly Lys Trp 1 5 10 15 Thr Trp Lys Gly Lys Gly Thr Leu Asn Arg 20 25 <210> 30 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BPB-nAchR2 <400> 30 Tyr Ala Tyr Pro Leu Leu Gly Ser Trp Thr Trp Glu Asn Gly Lys Trp 1 5 10 15 Thr Trp Lys Gly Trp Tyr Gln Lys Trp Ile 20 25 <210> 31 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BPB-nAchR3 <400> 31 Ala Ser Leu Pro Ala Trp Gly Ser Trp Thr Trp Glu Asn Gly Lys Trp 1 5 10 15 Thr Trp Lys Gly Trp Ser Thr Arg Thr Ala 20 25 <210> 32 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BPB-BSA1 <400> 32 Ala Ala Ser Pro Tyr Lys Gly Ser Trp Thr Trp Glu Asn Gly Lys Trp 1 5 10 15 Thr Trp Lys Gly Gly Trp Arg Met Lys Met 20 25 <210> 33 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BPB-BSA2 <400> 33 Ser Ala Asn Ser Leu Tyr Gly Ser Trp Thr Trp Glu Asn Gly Lys Trp 1 5 10 15 Thr Trp Lys Gly Thr Ser Arg Gln Arg Trp 20 25 <210> 34 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BPB-BSA3 <400> 34 Tyr Ala His Val Tyr Tyr Gly Ser Trp Thr Trp Glu Asn Gly Lys Trp 1 5 10 15 Thr Trp Lys Gly His Arg Val Thr Gln Thr 20 25 <210> 35 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BPB-BSA4 <400> 35 Tyr Gly Ala Tyr Pro Trp Gly Ser Trp Thr Trp Glu Asn Gly Lys Trp 1 5 10 15 Thr Trp Lys Gly Trp Arg Val Ser Arg Asp 20 25 <210> 36 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BPB-BSA5 <400> 36 Tyr Ala His Phe Gly Trp Gly Ser Trp Thr Trp Glu Asn Gly Lys Trp 1 5 10 15 Thr Trp Lys Gly Thr Thr Asp Ser Gln Ser 20 25 <210> 37 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BPB-MyD88-1 <400> 37 His Ser His Ala Phe Tyr Gly Ser Trp Thr Trp Glu Asn Gly Lys Trp 1 5 10 15 Thr Trp Lys Gly Asn Pro Gly Trp Trp Thr 20 25 <210> 38 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BPB-MyD88-2 <400> 38 Ala Ser Thr Ile Asn Phe Gly Ser Trp Thr Trp Glu Asn Gly Lys Trp 1 5 10 15 Thr Trp Lys Gly Tyr Thr Arg Arg Trp Asn 20 25 <210> 39 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Leucine zipper for BPB <400> 39 Gly Gly Ser Met Lys Gln Leu Glu Asp Lys Val Glu Glu Leu Leu Ser 1 5 10 15 Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Lys Leu Val 20 25 30 Gly Glu Arg 35 <210> 40 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BPBLeu-ED-B-1 <400> 40 Cys Ser Ser Pro Ile Gln Gly Gly Ser Met Lys Gln Leu Glu Asp Lys 1 5 10 15 Val Glu Glu Leu Leu Ser Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala 20 25 30 Arg Leu Lys Lys Leu Val Gly Glu Arg 35 40 <210> 41 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BPBLeu-ED-B-2 <400> 41 Ile Ile Arg Leu Glu Gln Gly Gly Ser Met Lys Gln Leu Glu Asp Lys 1 5 10 15 Val Glu Glu Leu Leu Ser Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala 20 25 30 Arg Leu Lys Lys Leu Val Gly Glu Arg 35 40

Claims

다음을 포함하는 BPB-기반 카르고 운반시스템(Cargo Delivery System):
(a) 다음을 포함하는 바이포달 펩타이드 바인더(Bipodal Peptide Binder: BPB):
(i) 가닥간(interstrand) 비공유결합이 형성된 패러럴(parallel), 안티패러럴(antiparallel) 또는 패러럴(parallel)과 안티패러럴(antiparallel) 아미노산 가닥들을 포함하는 구조 안정화 부위(structure stabilizing region); 및
(ii) 상기 구조 안정화 부위의 양 말단에 결합되어 있고 무작위적으로 선택된 각각 n 및 m 개의 아미노산을 포함하는 타겟 결합 부위 I(target binding region I) 및 타겟 결합 부위 II(target binding region II); 그리고,
(b) 상기 바이포달 펩타이드 바인더에 결합된 카르고.
제 1 항에 있어서, 상기 구조 안정화 부위에 형성된 가닥간 비공유결합은 수소결합, 정전기적 상호작용, 소수성상호작용, 반데르 발스 상호작용, 파이-파이 상호작용, 양이온-파이 상호작용 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는 운반시스템.
제 1 항에 있어서, 상기 구조 안정화 부위의 아미노산 가닥들은 링커로 연결된 것을 특징으로 하는 운반시스템.
제 1 항에 있어서, 상기 구조 안정화 부위는 β-헤어핀, 링커로 연결된 β-쉬트, 루이신 지퍼 또는 링커로 연결된 루이신 지퍼, 루이신 리치 모티프인 것을 특징으로 하는 운반시스템.
제 1 항에 있어서, 상기 구조 안정화 부위는 β-헤어핀인 것을 특징으로 하는 운반시스템.
제 5 항에 있어서, 상기 β-헤어핀은 서열목록 제 1 서열 내지 제 19 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 운반시스템.
제 6 항에 있어서, 상기 β-헤어핀은 서열목록 제 2 서열, 제 14 서열 또는 제 18 서열로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 운반시스템.
제 5 항에 있어서, 상기 β-헤어핀은 다음 일반식 I 로 표시되는 것을 특징으로 하는 운반시스템:
일반식 I

X₁ 은 Ser 또는 Gly-Glu 이고, X₂ 및 X'₂ 는 서로 독립적으로 Thr, His, Val, Ile, Phe 또는 Tyr 이며, X₃ 는 Trp 또는 Tyr 이고, X₄ 는 타입 I, 타입 I', 타입 II, 타입 II' 또는 타입 III 또는 타입 III' 턴 서열이고, X₅ 는 Trp 또는 Phe 이며, X₆ 는 Trp 또는 Val 이고, X₇ 는 Lys 또는 Thr-Glu 이다.
제 5 항에 있어서, 상기 β-헤어핀은 다음 일반식 II로 표시되는 것을 특징으로 하는 운반시스템:
일반식 II

X₁ 은 Arg, Gly-Glu 또는 Lys-Lys 이고, X₂ 는 Gln 또는 Thr 이며, X₃ 는 타입 I, 타입 I', 타입 II, 타입 II' 또는 타입 III 또는 타입 III' 턴 서열이고, X₄ 는 Gln, Thr-Glu 또는 Gln-Glu 이다.
제 5 항에 있어서, 상기 β-헤어핀은 다음 일반식 III으로 표시되는 것을 특징으로 하는 운반시스템:
일반식 III

X₁ 은 Lys 또는 Lys-Lys 이고, X₂ 는 Trp 또는 Tyr 이고, X₃ 는 Val 또는 Thr 이며, X₄ 는 타입 I, 타입 I', 타입 II, 타입 II' 또는 타입 III 또는 타입 III' 턴 서열이고, X₅ 는 Trp 또는 Ala 이며, X₆ 는 Trp 또는 Val 이고, X₇ 은 Glu 또는 Gln-Glu 이다.
제 5 항에 있어서, 상기 β-헤어핀은 다음 일반식 IV로 표시되는 것을 특징으로 하는 운반시스템:
일반식 IV

X₁ 은 Lys-Thr 또는 Gly 이고, X₂ 는 Trp 또는 Tyr 이고, X₃ 는 타입 I, 타입 I', 타입 II, 타입 II' 또는 타입 III 또는 타입 III' 턴 서열이고, X₄ 는 Thr-Glu 또는 Gly 이다.
제 8 항에 있어서, 상기 β-헤어핀은 상기 일반식 I 에서 X₁ 은 Ser 또는 Gly-Glu 이고, X₂ 및 X'₂ 는 서로 독립적으로 Thr, His 또는 Val 이며, X₃ 는 Trp 또는 Tyr 이고, X₄ 는 타입 I, 타입 I', 타입 II 또는 타입 II' 서열이고, X₅ 는 Trp 또는 Phe 이며, X₆ 는 Trp 또는 Val 이고, X₇ 는 Lys 또는 Thr-Glu 인 것을 특징으로 하는 운반시스템.
제 1 항에 있어서, 상기 타겟 결합 부위 I 의 아미노산 개수 n 은 2-20 인 것을 특징으로 하는 운반시스템.
제 1 항에 있어서, 상기 타겟 결합 부위 II의 아미노산 개수 m 은 2-20 인 것을 특징으로 하는 운반시스템.
제 1 항에 있어서, 상기 타겟 결합 부위 I 및 타겟 결합 부위 II는 타겟에 공동으로 작용하여 결합하는 것을 특징으로 하는 운반시스템.
제 1 항에 있어서, 상기 구조 안정화 부위, 타겟 결합 부위 I 또는 타겟 결합 부위 II에 다른 추가적인 기능성 분자가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 운반시스템.
제 16 항에 있어서, 상기 기능성 분자는 세포막투과 펩타이드(CPP)인 것을 특징으로 하는 운반시스템.
제 1 항에 있어서, 상기 타겟은 생화학물질, 펩타이드, 폴리펩타이드, 핵산, 탄수화물, 지질, 세포, 조직, 화합물, 금속 또는 비금속 물질인 것을 특징으로 하는 운반시스템.
제 1 항에 있어서, 상기 카르고는 화합물, 화학약물, 바이오약물, 무기입자, 나노입자, 단백질, 펩타이드, 핵산 분자, 지질, 탄수화물, 리포좀 또는 검출가능한 신호를 발생시키는 레이블 분자인 것을 특징으로 하는 운반시스템.