KR101323846B1 - 타겟 친화도가 유지되고 안정성이 개선된 ｄ－앱타이드 - Google Patents

타겟 친화도가 유지되고 안정성이 개선된 ｄ－앱타이드 Download PDF

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Abstract

본 발명은 (a) 가닥간(interstrand) 비공유결합이 형성된 패러럴(parallel), 안티패러럴(antiparallel) 또는 패러럴(parallel)과 안티패러럴(antiparallel) D-아미노산 가닥들을 포함하는 구조 안정화 부위(structure stabilizing region); 및 (b) 상기 구조 안정화 부위의 양 말단에 결합되어 있고 무작위적으로 선택된 각각 n 및 m개의 D-아미노산을 포함하는 타겟 결합 부위 I(target binding region I) 및 타겟 결합 부위 Ⅱ(target binding region Ⅱ)를 포함하는 타겟에 특이적으로 결합하는 D-앱타머-유사 펩타이드(D-Aptide), 상기 D-Aptide는 L-Aptide와 비교하여 타겟에 대한 친화도는 유지하면서 단백질 분해효소에 대한 안정성을 증가된 것을 특징으로 하는 L-Aptide와 동일한 또는 반대방향의 서열을 가지는 D-앱타이드(D-Aptide)에 관한 것이다. 본 발명의 D-Aptide는 통상적 기술 상식과 다르게, L-Aptide와 비교하여 타겟 친화도는 실질적으로 동일하며 안정성은 크게 개선되어 있다. 본 발명의 D-Aptide는 의약으로서의 용도를 가질 뿐만 아니라, 생체 내 물질의 검출, 인 비보 분자 이미징, 인 비트로 세포 이미징 및 약물전달용 타겟팅을 하는 데 이용될 수 있으며, 에스코트 분자로도 이용될 수 있다.

Description

타겟 친화도가 유지되고 안정성이 개선된 Ｄ－앱타이드{D-Aptide Having Maintained Target Affinity and Enhanced Stability}
본 발명은 타겟 친화도가 유지되고 안정성이 개선된 D-아미노산으로 이루어진 앱타머-유사 펩타이드(Aptamer-Like Peptide: Aptide), 즉 D-앱타이드에 관한 것이다.
항원-항체 반응의 특이성과 고도의 친화도 및 수천만 종류의 항원을 구별할 수 있는 항체의 다양성을 응용하여 오늘날 진단제와 치료제 등을 포함하는 많은 종류의 항체 제품이 출현하였다. 현재 FDA에서는 21개의 단일클론항체를 승인하였으며 리턱시맵(Rituximab) 및 헤르셉틴(Herceptin)과 같은 항체는 다른 치료에서 전혀 반응을 보이지 않던 환자들의 50% 이상에서 효과를 보인바 있으며 실질적으로 여러 연구에서 단일클론항체를 이용하여 림프종, 대장암 또는 유방암 등에 성공적인 임상치료를 보여주고 있다. 치료용 항체의 전체 시장 규모는 2004년 100억 달러 규모에서 2010년에는 300억 달러로 연평균 20%의 성장률을 보일 것으로 추정하고 있으며, 그 시장 규모는 기하급수적으로 증가할 것으로 추정되고 있다.
항체를 이용한 신약개발이 활발해지는 이유는 약품의 개발기간이 짧으며 투자비용이 작고 부작용을 쉽게 예측할 수 있기 때문이다. 또한 항체는 생약이어서 인체가 거의 영향을 받지 않으며 체내에서의 반감기가 저 분자량 약품에 비하여 압도적으로 길어서 환자에게 친화적이다.
이러한 유용성에도 불구하고 인간에서 단일클론항체는 외래 항원으로 인식하여 심한 알레르기 반응 또는 과민반응을 일으키기도 한다. 또한, 이러한 항암 기능의 단클론 항체를 임상적으로 사용할 경우 생산 단가가 높기 때문에 치료제로서의 가격이 급격히 상승한다는 단점이 있으며, 항체를 배양하는 방법 및 정제 방법 등 광범위한 분야의 기술들이 각종 지적 소유권에 의해 보호받고 있기 때문에 비싼 라이센싱비를 지불해야 한다.
따라서 이 문제를 해결하기 위해서 항체 대체 단백질을 개발하려는 연구활동이 활발하게 이루어지고 있다. 항체 대체 단백질은 항체와 같이 불변영역과 가변영역을 가질 수 있도록 만든 재조합 단백질로 크기가 작고 안정한 단백질의 일정부분을 무작위 서열의 아미노산으로 바꾸어 라이브러리를 만들고 이를 표적물질에 대해 스크리닝을 하여 높은 친화력과 좋은 특이성을 가진 물질을 찾을 수 있다.
예를 들어 항체 대체 단백질 중 아비머(avimer)와 아피바디(affibody)는 표적물질에 대해 피코몰(picomole) 정도의 친화력을 가진 예시가 보고되어 있다. 이런 항체 대체 단백질은 크기가 작고 안정해서 암세포에 깊이 침투 가능하며 일반적으로 면역반응을 적게 일으킨다고 보고되어 있다. 그리고 무엇보다도 광범위한 항체 특허 문제에서 벗어 날 수 있으며 박테리아에서 쉽게 대량정제 할 수 있기 때문에 생산단가가 낮아 경제적으로 항체보다 큰 장점을 가진다.
현재 개발된 항체 대체 단백질은 40개가 있으나 이 중 벤처 회사나 다국적 제약회사에서 상용화를 시도하고 있는 항체 대체 단백질은 피브로넥틴 타입 Ⅲ 도메인, 리포칼린, LDLR-A 도메인, 크리스탈린, 프로테인 A, 안키린 리피트(Ankyrin repeat), BPTI 라는 단백질을 이용하고 있으며 타겟에 대한 피코몰에서 수 나노몰정도의 높은 친화력을 가지고 있다. 그 중 애드넥틴(Adnectin), 아비머, 쿠니츠(Kunitz) 도메인은 현재 FDA 임상 실험이 진행 중이다.
한편, 본 발명자들은 항체 대체 물질로서 독특한 구조를 가지는 앱타머-유사 펩타이드(bipodal peptide binder: BPB)를 제안한 바 있다(WO 2010/047515). 상기 BPB는 "앱타머-유사 펩타이드(Aptamer-Like Peptide: Aptide)"로 명칭이 변경되었다.
이 Aptide는 분자량이 매우 작으면서도 그 독특한 구조에 의해 타겟에 대한 친화도가 매우 큰 항체 대체 물질이다.
그러나 이 Aptide를 임상적으로 적용하는 경우를 대비하여, 인 비보 안정성을 개선할 필요가 있다. 이러한 인 비보 안정성의 개선은 Aptide가 가지고 있는 타겟에 대한 친화도는 손상시키지 않으면서 달성되어야 한다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 본 발명자들에 의해 이미 개발된 앱타머-유사 펩타이드(Aptide)의 타겟에 대한 친화도는 유지하면서 안정성을 개선할 수 있는 기술을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 통상적으로는 타겟에 대한 친화도를 감소시키는 것으로 알려진 D-아미노산을 이용하여 D-앱타머-유사 펩타이드(D-Aptide)를 제조하는 경우에는, 통상적인 당업계의 상식에서 벗어나, L-Aptide(L-아미노산으로 이루어진 Aptide)와 거의 동일한 타겟 친화도를 가지면서 안정성은 크게 개선된 D-Aptide를 얻을 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 L-아미노산으로 이루어진 Aptide(L-Aptide)의 타겟에 대한 친화도는 유지하면서 단백질 분해효소에 대한 안정성을 증가시키는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 L-Aptide와 비교하여 타겟에 대한 친화도는 유지하면서 단백질 분해효소에 대한 안정성을 증가된 것을 특징으로 하는 D-앱타머-유사 펩타이드(D-Aptide)를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (i) 가닥간(interstrand) 비공유결합이 형성되는 패러럴(parallel), 안티패러럴(antiparallel) 또는 패러럴(parallel)과 안티패러럴(antiparallel) 아미노산 가닥들을 포함하는 구조 안정화 부위(structure stabilizing region); (ⅱ) 상기 구조 안정화 부위의 양 말단에 결합되어 있고 무작위적으로 선택된 각각 n 및 m개의 아미노산을 포함하는 타겟 결합 부위 I(target binding region I) 및 타겟 결합 부위 Ⅱ(target binding region Ⅱ)를 포함하는 앱타머-유사 펩타이드(Aptamer-Like Peptide: Aptide)를 제조하는 단계를 포함하며, 상기 구조화 안정화 부위, 타겟 결합 부위 I 및 타겟 결합 부위 Ⅱ에 포함된 아미노산을 D-아미노산을 이용하여 제조하여 D-앱타머-유사 펩타이드(D-Aptide)를 제조하는 것을 특징으로 하는 L-아미노산으로 이루어진 Aptide(L-Aptide)의 타겟에 대한 친화도는 유지하면서 단백질 분해효소에 대한 안정성을 증가시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은
(a) 가닥간(interstrand) 비공유결합이 형성된 패러럴(parallel), 안티패러럴(antiparallel) 또는 패러럴(parallel)과 안티패러럴(antiparallel) D-아미노산 가닥들을 포함하는 구조 안정화 부위(structure stabilizing region); 및
(b) 상기 구조 안정화 부위의 양 말단에 결합되어 있고 무작위적으로 선택된 각각 n 및 m개의 D-아미노산을 포함하는 타겟 결합 부위 I(target binding region I) 및 타겟 결합 부위 Ⅱ(target binding region Ⅱ)를 포함하는 타겟에 특이적으로 결합하는 D-앱타머-유사 펩타이드(D-Aptide), 상기 D-Aptide는 동일한 아미노산 서열을 가지는 L-Aptide와 비교하여 타겟에 대한 친화도는 유지하면서 단백질 분해효소에 대한 안정성이 증가된 것을 특징으로 하는 D-앱타머-유사 펩타이드(D-Aptide)를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 상기 D-앱타머-유사 펩타이드(D-Aptide)와 동일한 D-아미노산 서열을 가지면서 반대의 방향성을 갖는 레트로 인버소(retro inverso)-앱타머-유사 펩타이드(RI-Aptide), 상기 RI-Aptide는 상기 D-Aptide와 유사한 타겟 친화도를 가지는 것을 특징으로 하는 레트로 인버소-앱타머-유사 펩타이드(RI-Aptide)를 제공한다.
본 발명자들은 본 발명자들에 의해 이미 개발된 앱타머-유사 펩타이드(Aptamer-Like Peptide: Aptide)의 타겟에 대한 친화도는 유지하면서 안정성을 개선할 수 있는 기술을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 통상적으로는 타겟에 대한 친화도를 감소시키는 것으로 알려진 D-아미노산을 이용하여 D-앱타머-유사 펩타이드(D-Aptide)를 제조하는 경우에는, 통상적인 당업계의 상식에서 벗어나, L-Aptide와 거의 동일한 타겟 친화도를 가지면서 안정성은 크게 개선된 D-Aptide를 얻을 수 있음을 확인하였다.
본 명세서에서 용어 “앱타머-유사 펩타이드( Apt amer-Like Pep tide : Aptide)”는 본 발명자들에 의해 개발되고 특허출원한 펩타이드 물질을 의미하며, 본 발명자들의 특허출원 WO 2010/047515에 개시된 BPB 펩타이드를 의미한다. 상기 BPB는 Aptide로 명칭이 변경되었다. WO 2010/047515의 개시 내용은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. Aptide는 종래의 펩타이드 앱타머와 유사하게 특정 타겟에 결합하는 펩타이드 물질로서, 종래의 펩타이드 앱타머와는 크게 다른 구조적 특징을 갖는다.
WO 2010/047515는 Aptide에 대하여 상세한 설명을 하고 있으나, D-아미노산으로 이루어진 Aptide에 대한 구체적인 언급은 없다. 더욱이, 본 발명의 가장 큰 특징인 타겟에 대한 친화도는 유지하면서 안정성은 크게 개선되는 D-아미노산으로 이루어진 Aptide에 대한 개시는 없다.
비록 본 발명은 WO 2010/047515에 개시된 Aptide의 기본적인 구조를 이용하지만, D-아미노산을 이용하여 Aptide를 제조함으로써 기존의 Aptide에 대한 타겟 친화도는 유지하면서 안정성을 크게 개선한 점은, 당업계의 기술적 상식을 고려하였을 때, 매우 특이하고 진보성이 있는 측면이다.
바람직하게는, 본 발명의 특징은 L-아미노산으로 이루어진 Aptide(L-Aptide)와 동일한 서열을 가지면서 D-아미노산으로 이루어진 Aptide(D-Aptide)가 L-Aptide와 타겟에 대한 친화도가 거의 동일하고 안정성을 크게 개선된다는 점을 발견한 것이다. 당업계의 기술 상식에 따르면, L-아미노산으로 이루어진 타겟 결합 펩타이드에 대하여 동일한 서열을 가지면서 D-아미노산으로 이루어진 펩타이드를 제작하면 타겟 친화도는 크게 감소된다(R. C.deL. Milton, et al., Science 256:1445(1992); S. A. Funke, D. Willbold, Mol . Biosyst . 5:783(2009)).
그러나, Aptide 구조에서는, 이러한 기술적 상식과 다르게, 동일한 서열의 L-Aptide 및 D-Aptide는 거의 동일한 타겟 친화도를 가지며 이는 매우 놀라운 발견이다.
본 명세서에서 용어 “L-Aptide"는 L-아미노산으로 이루어진 Aptide 분자를 의미한다. 용어 ”D-Aptide"는 상기 L-Aptide와 동일한 아미노산 서열을 가지면서 D-아미노산으로 이루어진 Aptide 분자를 의미한다.
본 명세서에서 D-Aptide를 언급하면서 사용되는 표현 “L-Aptide의 타겟에 대한 친화도 유지”는 L-Aptide와 동일한 서열을 가지면서 D-아미노산으로 이루어진 D-Aptide가 L-Aptide와 실질적으로 동일한 타겟 친화도를 가지는 것을 의미한다. 타겟 친화도는 예를 들어, SPR(surface plasmon resonance, Smith EA, Corn RM. Surface Plasmon Resonance Imaging as a Tool to Monitor Biomolecular Interactions in an Array Based Format. Appl . Spectroscopy, 2003, 57, 320A-332A)을 이용하여 측정된 타겟에 대한 해리상수(K d )로 결정될 수 있다. L-Aptide 및 D-Aptide의 실질적으로 동일한 타겟 친화도 또는 거의 동일한 타겟 친화도는, 예컨대, SPR을 이용하여 측정된 타겟에 대한 해리상수가 실질적으로 동일한 것을 의미하며, 바람직하게는 D-Aptide의 타겟에 대한 해리상수(K d ) 대(to) L-Aptide의 타겟에 대한 해리상수(K d )의 비율이 0.1-10, 보다 바람직하게는 0.5-2.0, 가장 바람직하게는 0.7-1.8인 것을 의미한다.
본 명세서에서 D-Aptide를 언급하면서 사용되는 용어 “안정성”은 D-Aptide의 물리적, 화학적 및 생물학적 안정성을 의미하며, 바람직하게는 생물학적 안정성을 의미한다. 용어 “생물학적 안정성”은 D-Aptide가 생체 내 투입된 경우 생체 내 단백질 분해효소의 작용에 대한 내성(resistance)을 의미한다.
D-Aptide는 L-Aptide와 비교하여 증가된 단백질 분해효소 안정성을 나타낸다. 단백질 분해효소 안정성은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통하여 결정할 수 있다. 예를 들어, 단백질 분해효소의 대표적인 효소인 키모트립신 또는 트립신을 D-Aptide에 처리하고 시간 경과에 따른 D-Aptide의 분해 정도를 측정하여 안정성을 결정할 수 있다.
본 명세서에서 D-Aptide가 L-Aptide보다 증가된 단백질 분해효소 안정성을 가지고 있다는 것은, D-Aptide가 L-Aptide와 비교하여 단백질 분해효소에 의한 분해 정도가 1/2 이하, 1/10 이하 또는 1/100 이하인 것을 의미한다.
본 발명은 기본적으로 WO 2010/047515에 개시된 Aptide 구조를 이용하기 때문에, 우선 Aptide를 상세하게 설명한다.
본 발명에서 이용 가능한 구조안정화 부위는 패러럴, 안티패러럴 또는 패러럴과 안티패러럴 아미노산 가닥들을 포함하며, 가닥간(interstrand) 수소결합, 정전기적 상호작용, 소수성상호작용, 반데르 발스 상호작용, 파이-파이 상호작용, 양이온-파이 상호작용 또는 이들의 조합에 의한 비공유결합이 형성되는 단백질 구조 모티프들을 포함한다. 가닥간 수소결합, 정전기적 상호작용, 소수성상호작용, 반데르 발스 상호작용, 파이-파이 상호작용, 양이온-파이 상호작용 또는 이들의 조합에 의한 형성되는 비공유결합은 구조안정화 부위의 견고성(rigidity)에 기여한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 구조안정화 부위에서의 가닥간(interstrand) 비공유결합은 수소결합, 소수성상호작용, 반데르 발스 상호작용, 파이-파이 상호작용 또는 이들의 조합을 포함한다.
선택적으로, 구조화안정화 부위에 공유결합이 있을 수 있다. 예를 들어, 구조화안정화 부위에 이황화결합을 형성시켜 구조안정화 부위의 견고성을 더 증가시킬 수 있다. 이러한 공유결합에 의한 견고성 증가는 Aptide의 타겟에 대한 특이도 및 친화도를 고려하여 부여한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 구조 안정화 부위의 아미노산 가닥들은 링커로 연결되어 있다. 본 명세서에서 가닥을 언급하면서 사용되는 용어 “링커”는 가닥과 가닥을 연결시켜 주는 물질을 의미한다. 예컨대, 구조안정화 부위로서 β-헤어핀이 이용되는 경우에는 β-헤어핀에 있는 턴 서열이 링커의 역할을 하며, 루이신 지퍼가 이용되는 경우에는 루이신 지퍼의 두 C-말단을 연결하는 물질(예컨대, 펩타이드 링커)이 링커의 역할을 한다.
링커는 패러럴, 안티패러럴 또는 패러럴과 안티패러럴 아미노산 가닥들을 연결한다. 예컨대, 패러럴 방식으로 정렬된 최소 2개의 가닥(바람직하게는 2개의 가닥), 안티패러럴 방식으로 정렬된 최소 2개의 가닥(바람직하게는 2개의 가닥), 패러럴 및 안티패러럴 방식으로 정렬된 최소 3개의 가닥(바람직하게는 3개의 가닥)을 링커가 연결하게 된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 링커는 턴 서열 또는 펩타이드 링커이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 턴 서열은 β-턴, γ-턴, α-턴, π-턴 또는 ω-loop이다(Venkatachalam CM (1968), Biopolymers, 6, 1425-1436; Nemethy G and Printz MP. (1972), Macromolecules, 5, 755-758; Lewis PN et al., (1973), Biochim . Biophys . Acta, 303, 211-229; Toniolo C. (1980) CRC Crit . Rev . Biochem ., 9, 1-44; Richardson JS. (1981), Adv . Protein Chem., 34, 167-339; Rose GD et al., (1985), Adv . Protein Chem ., 37, 1-109; Milner-White EJ and Poet R. (1987), TIBS, 12, 189-192; Wilmot CM and Thornton JM. (1988), J. Mol . Biol ., 203, 221-232; Milner-White EJ. (1990), J. Mol . Biol ., 216, 385-397; Pavone V et al. (1996), Biopolymers, 38, 705-721; Rajashankar KR and Ramakumar S. (1996), Protein Sci ., 5, 932-946). 가장 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 턴 서열은 β-턴이다.
턴 서열로서 β-턴이 이용되는 경우, 바람직하게는 타입 I, 타입 I', 타입 Ⅱ, 타입 Ⅱ', 타입 Ⅲ 또는 타입 Ⅲ' 턴 서열이고, 보다 바람직하게는 타입 I, 타입 I', 타입 Ⅱ, 타입 Ⅱ' 턴 서열이고, 보다 더 바람직하게는 타입 I' 또는 타입 Ⅱ' 턴 서열이며, 가장 바람직하게는 타입 I' 턴 서열이다(B. L. Sibanda et al., J. Mol . Biol ., 1989, 206, 4, 759-777; B. L. Sibanda et al., Methods Enzymol., 1991, 202, 59-82).
본 발명의 다른 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 턴 서열로서 이용될 수 있는 것은 H. Jane Dyson et al., Eur . J. Biochem . 255:462-471(1998)에 개시되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 턴 서열로 이용될 수 있는 것은 다음의 아미노산 서열을 포함한다: X-Pro-Gly-Glu-Val; Ala-X-Gly-Glu-Val (X는 20개의 아미노산으로부터 선택된다).
본 발명의 일 구현예에 따라, 구조안정화 부위로서 β-쉬트 또는 루이신 지퍼가 이용되는 경우, 패러럴 방식으로 정렬된 2개의 가닥 또는 안티패러럴 방식으로 정렬된 2개의 가닥을 펩타이드 링커가 연결하는 것이 바람직하다.
펩타이드 링커는 당업계에 공지된 어떠한 것도 이용 가능하다. 적합한 펩타이드 링커의 서열은 다음과 같은 요소를 고려하여 선택될 수 있다: (a) 유연한 연장된 컨포메이션(flexible extended conformation)에 적용될 수 있는 능력; (b) 생물학적 타겟 분자와 상호작용 하는 이차구조를 생성하지 않는 능력; 및 (c) 생물학적 타겟 분자와 상호작용하는 소수성 잔기 또는 전하를 갖는 잔기의 부재. 바람직한 펩타이드 링커는 Gly, Asn 및 Ser 잔기를 포함한다. Thr 및 Ala과 같은 다른 중성 아미노산들도 링커 서열에 포함될 수 있다. 링커에 적합한 아미노산 서열은 Maratea et al., Gene 40:39-46( 1985); Murphy et al., Proc . Natl . Acad Sci . USA 83:8258-8562(1986); 미국 특허 제4,935,233호, 제4,751,180호 및 제5,990,275호에 개시되어 있다. 펩타이드 링커 서열은 1-50 아미노산 잔기로 구성될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 구조안정화 부위는 β-헤어핀, 헤어핀, 링커로 연결된 β-쉬트 또는 링커로 연결된 루이신 지퍼이고, 보다 바람직하게는 구조안정화 부위는 β-헤어핀 또는 링커로 연결된 β-쉬트이며, 가장 바람직하게는 β-헤어핀이다.
본 명세서에서 용어 “β-헤어핀”은 두 개의 β 가닥을 포함하는 가장 간단한 단백질 모티프를 의미하며, 이 두 개의 β 가닥은 서로 안티패러럴한 정렬을 나타낸다. 이 β-헤어핀에서 두 개의 β 가닥은 일반적으로 턴 서열에 의해 연결된다.
바람직하게는, β-헤어핀에 적용되는 턴 서열은 타입 I, 타입 I', 타입 Ⅱ, 타입 Ⅱ', 타입 Ⅲ 또는 타입 Ⅲ' 턴 서열이고, 보다 바람직하게는 타입 I, 타입 I', 타입 Ⅱ, 타입 Ⅱ' 턴 서열이고, 보다 더 바람직하게는 타입 I' 또는 타입 Ⅱ' 턴 서열이며, 가장 바람직하게는 타입 I' 턴 서열이다. 또한, X-Pro-Gly-Glu-Val; 또는 Ala-X-Gly-Glu-Val (X는 20개의 아미노산으로부터 선택된다)으로 표시되는 턴 서열도 β-헤어핀에 이용될 수 있다.
본 발명의 예시적인 실시예에 따르면, 타입 I 턴 서열은 Asp-Asp-Ala-Thr-Lys-Thr이고, 타입 I' 턴 서열은 Glu-Asn-Gly-Lys이며, 타입 Ⅱ 턴 서열은 X-Pro-Gly-Glu-Val; 또는 Ala-X-Gly-Glu-Val (X는 20개의 아미노산으로부터 선택된다)이고, 타입 Ⅱ' 턴 서열은 Glu-Gly-Asn-Lys 또는 Glu-D-Pro-Asn-Lys이다.
β-헤어핀 콘포메이션을 갖는 펩타이드는 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 미국 특허 제6,914,123호 및 Andrea G. Cochran et al., PNAS, 98(10):5578-5583)에 개시되어 있는 트립토판 지퍼, WO 2005/047503에 개시되어 있는 주형-고정된 β-헤어핀 미멕틱, 미국 특허 제5,807,979호에 개시되어 있는 β-헤어핀 변형체들이 잘 알려져 있다. 이외에도, β-헤어핀 콘포메이션을 갖는 펩타이드는 Smith & Regan (1995) Science 270:980-982; Chou & Fassman (1978) Annu. Rev. Biochem. 47:251-276; Kim & Berg (1993) Nature 362:267-270; Minor & Kim (1994) Nature 367:660-663; Minor & Kim (1993) Nature 371:264-267; Smith et al. Biochemistry (1994) 33:5510-5517; Searle et al. (1995) Nat. Struct. Biol. 2:999-1006; Haque & Gellman (1997) J. Am. Chem. Soc. 119:2303-2304; Blanco et al. (1993) J. Am. Chem. Soc. 115:5887-5888; de Alba et al. (1996) Fold. Des. 1: 133-144; de Alba et al. (1997) Protein Sci. 6:2548-2560; Ramirez-Alvarado et al. (1996) Nat. Struct. Biol. 3:604-612; Stanger & Gellman (1998) J. Am. Chem. Soc. 120:4236-4237; Maynard & Searle (1997) Chem. Commun. 1297-1298; Griffiths-Jones et al. (1998) Chem. Commun. 789-790; Maynard et al. (1998) J. Am. Chem. Soc. 120:1996-2007; 및 Blanco et al. (1994) Nat. Struct. Biol. 1:584-590에 개시되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
β-헤어핀 콘포메이션을 갖는 펩타이드를 구조안정화 부위로 이용하는 경우, 가장 바람직하게는 트립토판 지퍼(trpzip)를 이용한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 트립토판 지퍼는 다음 일반식 I로 표시된다:
일반식 I
X1-Trp(X2)X3-X4-X5(X'2)X6-X7
X1은 Ser 또는 Gly-Glu이고, X2 및 X'2는 서로 독립적으로 Thr, His, Val, Ile, Phe 또는 Tyr이며, X3는 Trp 또는 Tyr이고, X4는 타입 I, 타입 I', 타입 Ⅱ, 타입 Ⅱ' 또는 타입 Ⅲ 또는 타입 Ⅲ' 턴 서열이고, X5는 Trp 또는 Phe이며, X6는 Trp 또는 Val이고, X7는 Lys 또는 Thr-Glu이다.
보다 바람직하게는, 상기 일반식 I에서 X1은 Ser 또는 Gly-Glu이고, X2 및 X'2는 서로 독립적으로 Thr, His 또는 Val이며, X3는 Trp 또는 Tyr이고, X4는 타입 I, 타입 I', 타입 Ⅱ 또는 타입 Ⅱ' 턴 서열이고, X5는 Trp 또는 Phe이며, X6는 Trp 또는 Val이고, X7는 Lys 또는 Thr-Glu이다.
보다 더 바람직하게는, 일반식 I에서 X1은 Ser 또는 Gly-Glu이고, X2 및 X'2는 서로 독립적으로 Thr, His 또는 Val이며, X3는 Trp이고, X4는 타입 I, 타입 I', 타입 Ⅱ 또는 타입 Ⅱ' 턴 서열이고, X5는 Trp이며, X6는 Trp이고, X7는 Lys 또는 Thr-Glu이다.
보다 더욱 더 바람직하게는, 일반식 I에서 X1은 Ser이고, X2 및 X'2는 Thr이며, X3는 Trp이고, X4는 타입 I' 또는 타입 Ⅱ' 턴 서열이고, X5는 Trp이며, X6는 Trp이고, X7는 Lys이다.
가장 바람직하게는, 일반식 I에서 X1은 Ser이고, X2 및 X'2는 Thr이며, X3는 Trp이고, X4는 타입 I' 턴 서열 (ENGK) 또는 타입 Ⅱ' 턴 서열(EGNK)이고, X5는 Trp이며, X6는 Trp이고, X7는 Lys이다.
본 발명에 적합한 트립토판 지퍼의 예시적인 아미노산 서열은 서열목록 제1서열 내지 제3서열 및 제5서열 내지 제10서열에 기재되어 있다.
본 발명에서 구조안정화 부위로서 이용가능한 β-헤어핀 펩타이드는 단백질 G의 B1 도멘인으로부터 유래된 펩타이드, 즉 GB1 펩타이드이다.
본 발명에서 GB1 펩타이드가 이용되는 경우, 바람직하게는 구조안정화 부위는 다음 일반식 Ⅱ로 표시된다:
일반식 Ⅱ
X1-Trp-X2-Tyr-X3-Phe-Thr-Val-X4
X1은 Arg, Gly-Glu 또는 Lys-Lys이고, X2는 Gln 또는 Thr이며, X3는 타입 I, 타입 I', 타입 Ⅱ, 타입 Ⅱ' 또는 타입 Ⅲ 또는 타입 Ⅲ' 턴 서열이고, X4는 Gln, Thr-Glu 또는 Gln-Glu이다.
보다 바람직하게는, 일반식 Ⅱ의 구조안정화 부위는 다음 일반식 II'으로 표시된다:
일반식 Ⅱ
X1-Trp-Thr-Tyr-X2-Phe-Thr-Val-X3
X1은 Gly-Glu 또는 Lys-Lys이고, X2는 타입 I, 타입 I', 타입 Ⅱ, 타입 Ⅱ' 또는 타입 Ⅲ 또는 타입 Ⅲ' 턴 서열이고, X3는 Thr-Glu 또는 Gln-Glu이다.
본 발명에 적합한 GB1 β-헤어핀의 예시적인 아미노산 서열은 서열목록 제4서열 및 제14서열 내지 제15서열에 기재되어 있다.
본 발명에서 구조안정화 부위로서 이용 가능한 β-헤어핀 펩타이드는 HP 펩타이드이다. 본 발명에서 HP 펩타이드가 이용되는 경우, 바람직하게는 구조안정화 부위는 다음 일반식 Ⅲ으로 표시된다:
일반식 Ⅲ
X1-X2-X3-Trp-X4-X5-Thr-X6-X7
X1은 Lys 또는 Lys-Lys이고, X2는 Trp 또는 Tyr이고, X3는 Val 또는 Thr이며, X4는 타입 I, 타입 I', 타입 Ⅱ, 타입 Ⅱ' 또는 타입 Ⅲ 또는 타입 Ⅲ' 턴 서열이고, X5는 Trp 또는 Ala이며, X6는 Trp 또는 Val이고, X7은 Glu 또는 Gln-Glu이다.
본 발명에서 구조안정화 부위로서 이용 가능한 또 다른 β-헤어핀 펩타이드는 다음 일반식 Ⅳ로 표시된다:
일반식 Ⅳ
X1-X2-X3-Trp-X4
X1은 Lys-Thr 또는 Gly이고, X2는 Trp 또는 Tyr이고, X3는 타입 I, 타입 I', 타입 Ⅱ, 타입 Ⅱ' 또는 타입 Ⅲ 또는 타입 Ⅲ' 턴 서열이고, X4는 Thr-Glu 또는 Gly이다.
일반식 III 및 IV의 β-헤어핀의 예시적인 아미노산 서열은 서열목록 제11서열 내지 제12서열, 제15서열 및 제16서열 내지 제19서열에 기재되어 있다.
본 발명에 따르면, 구조안정화 부위로서 링커로 연결된 β-쉬트를 이용할 수 있다. β-쉬트 구조에서 패러럴 또는 안티패러럴한, 바람직하게는 안티패러럴한 두 개의 아미노산 가닥이 뻗은 구조(extended form)로 되어 있으며, 아미노산 가닥 사이에 수소 결합이 형성된다.
β-쉬트 구조에서 두 개의 아미노산 가닥의 인접한 두 말단은 링커에 의해 연결된다. 링커로서는 상술한 다양한 턴-서열 또는 펩타이드 링커가 이용될 수 있다. 턴-서열이 링커로 이용되는 경우, β-턴 서열이 가장 바람직하다.
본 발명의 다른 변형예에 따르면, 구조안정화 부위로서 루이신 지퍼 또는 링커로 연결된 루이신 지퍼가 이용될 수 있다. 루이신 지퍼는 패러럴한 2개의 α-사슬의 다이머화를 야기하는 보존성 펩타이드 도메인이며, 일반적으로 유전자 발현에 관여하는 단백질에 발견되는 다이머화 도메인이다("Leucine scissors". Glossary of Biochemistry and Molecular Biology (Revised). (1997). Ed. David M. Glick. London: Portland Press; Landschulz WH, et al. (1988) Science 240:1759-1764). 루이신 지퍼는 일반적으로 헵태드(heptad) 반복 서열을 포함하며, 루이신 잔기가 4번째 또는 5번째에 위치해 있다. 예를 들어, 본 발명에 이용될 수 있는 루이신 지퍼는 LEALKEK, LKALEKE, LKKLVGE, LEDKVEE, LENEVAR 또는 LLSKNYH의 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명에서 이용되는 루이신 지퍼의 구체적인 예를 서열목록 제39서열에 기재되어 있다. 루이신 지퍼의 각각의 반은 짧은 α-사슬로 이루어져 있으며, α-사슬간의 직접적인 루이신 접촉이 있다. 전사인자에 있는 루이신 지퍼는 일반적으로 소수성 루이신 지퍼 부위 및 염기성 부위(DNA 분자의 주 그루브와 상호작용하는 부위)로 이루어져 있다. 본 발명에서 루이신 지퍼가 이용되는 경우에는 염기성 부위는 반드시 필요로 하지 않는다. 루이신 지퍼 구조에서 두 개의 아미노산 가닥(즉, 두 개의 α-사슬)의 인접한 두 말단은 링커에 의해 연결될 수 있다. 링커로서는 상술한 다양한 턴-서열 또는 펩타이드 링커가 이용될 수 있으며, 바람직하게는 루이신 지퍼의 구조에 영향을 미치지 않는 펩타이드 링커가 이용된다.
상술한 구조안정화 부위의 양 말단에는 무작위 아미노산 서열이 결합된다. 상기 무작위 아미노산 서열이 타겟 결합 부위 I 및 타겟 결합 부위 Ⅱ를 형성한다. 본 발명의 가장 큰 특징 중 하나는, 구조안정화 부위의 양쪽 말단에 타겟 결합 부위 I 및 타겟 결합 부위 Ⅱ를 연결하여 바이포달 방식으로 펩타이드 바인더를 제작하는 것이다. 타겟 결합 부위 I 및 타겟 결합 부위 Ⅱ는 서로 협동적으로(cooperatively) 타겟에 결합함으로써, 타겟에 대한 친화도를 크게 증가시킨다.
타겟 결합 부위 I의 아미노산 개수 n은 특별하게 제한되지 않으며, 바람직하게는 2-100의 정수, 보다 바람직하게는 2-50의 정수, 보다 더욱 더 바람직하게는 2-20의 정수, 가장 바람직하게는 3-10의 정수이다.
타겟 결합 부위 Ⅱ의 아미노산 개수 m은 특별하게 제한되지 않으며, 바람직하게는 2-100의 정수, 보다 바람직하게는 2-50의 정수, 보다 더욱 더 바람직하게는 2-20의 정수, 가장 바람직하게는 3-10의 정수이다.
타겟 결합 부위 I 및 타겟 결합 부위 Ⅱ에는 서로 각각 다른 또는 동일한 개수의 아미노산 잔기가 포함될 수 있다. 타겟 결합 부위 I 및 타겟 결합 부위 Ⅱ에는 서로 각각 다른 또는 동일한 아미노산 서열이 포함될 수 있으며, 바람직하게는 서로 각각 다른 아미노산 서열이 포함된다.
타겟 결합 부위 I 및/또는 타겟 결합 부위 Ⅱ에 포함되는 아미노산 서열은 선형의 아미노산 서열 또는 환형의 아미노산 서열이다. 타겟 결합 부위의 펩타이드 서열의 안정성을 증가시키기 위하여, 타겟 결합 부위 I 및/또는 타겟 결합 부위 Ⅱ에 포함되는 아미노산 서열 중에서 적어도 하나의 아미노산 잔기는 아세틸기, 플루오레닐 메톡시 카르보닐기, 포르밀기, 팔미토일기, 미리스틸기, 스테아릴기 또는 폴리에틸렌글리콜(PEG)로 변형될 수 있다.
생물학적 타겟 분자에 결합되는 본 발명의 D-Aptide는 생체 내 생리학적 반응의 조절, 생체 내 물질의 검출, 인 비보 분자 이미징, 인 비트로 세포 이미징 및 약물전달용 타겟팅을 하는 데 이용될 수 있으며, 에스코트 분자로도 이용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 구조 안정화 부위, 타겟 결합 부위 I 또는 타겟 결합 부위 Ⅱ(보다 바람직하게는, 구조안정화 부위, 보다 더 바람직하게는 구조안정화 부위의 링커)에 추가적으로 기능성 분자가 결합되어 있다. 상기 기능성 분자의 예는 검출가능한 신호를 발생시키는 레이블, 화학약물, 바이오약물, 세포막투과 펩타이드(CPP) 또는 나노입자를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 검출가능한 신호를 발생시키는 레이블은 T1 조영물질(예컨대, Gd 킬레이트 화합물), T2 조영물질(예컨대, 초상자성 물질(예: 마그네타이트, Fe3O4,γ-Fe2O3, 망간 페라이트, 코발트 페라이트 및 니켈 페라이트)), 방사성 동위 원소(예컨대, 11C, 15O, 13N, P32, S35, 44Sc, 45Ti, 118I, 136La, 198Tl, 200Tl, 205Bi 및 206Bi), 형광물질(플루오리신 (fluorescein), 피코에리트린 (phycoerythrin), 로다민, 리사민 (lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5), 화학발광단, 자기입자, 매스 표지 또는 전자밀집입자를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 화학약물은 예를 들어, 항염증제, 진통제, 항관절염제, 진경제, 항우울증제, 항정신병약물, 신경안정제, 항불안제, 마약길항제, 항파킨스질환 약물, 콜린성 아고니스트, 항암제, 항혈관신생억제제, 면역억제제, 항바이러스제, 항생제, 식욕억제제, 진통제, 항콜린제, 항히스타민제, 항편두통제, 호르몬제, 관상혈관, 뇌혈관 또는 말초혈관 확장제, 피임약, 항혈전제, 이뇨제, 항고혈압제, 심혈관질환 치료제, 미용성분(예컨대, 주름개선제, 피부노화 억제제 및 피부미백제) 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 바이오약물은 인슐린, IGF-1(insulin-like growth factor 1), 성장호르몬, 에리쓰로포이에틴, G-CSFs (granulocyte-colony stimulating factors), GM-CSFs (granulocyte/macrophage-colony stimulating factors), 인터페론 알파, 인터페론 베타, 인터페론 감마, 인터루킨-1 알파 및 베타, 인터루킨-3, 인터루킨-4, 인터루킨-6, 인터루킨-2, EGFs (epidermal growth factors), 칼시토닌(calcitonin), ACTH (adrenocorticotropic hormone), TNF (tumor necrosis factor), 아토비스반(atobisban), 부세레린(buserelin), 세트로렉릭스(cetrorelix), 데스로레린(deslorelin), 데스모프레신(desmopressin), 디노르핀 A (dynorphin A) (1-13), 엘카토닌(elcatonin), 엘레이도신(eleidosin), 엡티피바타이드(eptifibatide), GHRH-II(growth hormone releasing hormone-II), 고나도레린(gonadorelin), 고세레린(goserelin), 히스트레린(histrelin), 류프로레린(leuprorelin), 라이프레신(lypressin), 옥트레오타이드(octreotide), 옥시토신(oxytocin), 피트레신(pitressin), 세크레틴(secretin), 신칼라이드(sincalide), 테르리프레신(terlipressin), 티모펜틴(thymopentin), 티모신(thymosine) α1, 트리프토레린(triptorelin), 바이발리루딘(bivalirudin), 카르베토신(carbetocin), 사이클로스포린, 엑세딘(exedine), 란레오타이드(lanreotide), LHRH (luteinizing hormone-releasing hormone), 나파레린(nafarelin), 부갑상선 호르몬, 프람린타이드(pramlintide), T-20 (enfuvirtide), 타이말파신(thymalfasin), 지코노타이드, RNA, DNA, cDNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 siRNA가 될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
타겟 결합 부위 I 및/또는 타겟 결합 부위 Ⅱ는 다양한 타겟에 결합하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 D-Aptide에 의해 타겟팅 될 수 있는 것은, 생화학물질, 펩타이드, 폴리펩타이드, 핵산, 탄수화물, 지질, 세포 및 조직과 같은 생물학적 타겟, 화합물, 금속 또는 비금속 물질을 포함하며, 바람직하게는 생물학적 타겟이다.
타겟 결합 부위가 결합하는 생물학적 타겟은, 바람직하게는 생화학물질, 펩타이드, 폴리펩타이드, 당단백질,핵산, 탄수화물, 프로테오글리칸, 지질 또는 당지질이다.
예를 들어, 타겟 결합 부위가 결합하는 생화학물질은 다양한 생체 내 대사산물(예컨대, ATP, NADH, NADPH, 탄수화물 대사산물, 지질 대사산물 및 아미노산 대사산물)을 포함한다.
타겟 결합 부위가 결합하는 예시적인 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 효소, 리간드, 수용체, 바이오마커, 호르몬, 전사인자, 성장인자, 면역글로블린, 신호전달단백질, 결합단백질, 이온 채널, 항원, 부착단백질, 구조단백질, 조절단백질, 독소단백질, 사이토카인 및 혈액 응고 인자를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 보다 상세하게는, D-Aptide의 타겟은 Fibronectin extra domain B(ED-B), VEGF(vascular endothelial growth factor), VEGFR(vascular endothelial growth factor receptor), VCAM1(vascular cell adhesion molecule-1), nAchR(Nicotinic acetylcholine receptor), HSA(Human serum albumin), MyD88, EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor), HER2/neu, CD20, CD33, CD52, EpCAM (Epithelial Cell Adhesion Molecule), TNF-α (Tumor Necrosis Factor-α), IgE (Immunoglobulin E), CD11A (α-chain of lymphocyte function-associated antigen 1), CD3, CD25, Glycoprotein IIb/IIIa, 인테그린, AFP(Alpha-fetoprotein), β2M (Beta2-microglobulin), BTA(Bladder Tumor Antigens), NMP22, Cancer Antigen 125, Cancer Antigen 15-3, 칼시토닌, Carcinoembryonic Antigen, Chromogranin A, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, Human Chorionic Gonadotropin, Neuron-Specific Enolase, PSA(Prostate-Specific Antigen), PAP(Prostatic Acid Phosphatase) 및 Thyroglobulin을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
타겟 결합 부위가 결합하는 예시적인 핵산 분자는 gDNA, mRNA, cDNA, rRNA(ribosomal RNA), rDNA(ribosomal DNA) 및 tRNA를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 타겟 결합 부위가 결합하는 예시적인 탄수화물은 생체 내 탄수화물로서, 단당류, 이당류, 삼당류 및 다당류를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 타겟 결합 부위가 결합하는 예시적인 지질은, 지방산, 트리아실글라이세롤, 스핑고지질, 강글리오사이드 및 콜레스테롤를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 D-Aptide는 세포 표면에 노출된 생체 분자(예컨대, 단백질)에 결합할 수도 있지만, 세포 내 생체 분자(예컨대, 단백질)에도 결합하여 생체 분자의 활성을 조절할 수 있다.
D-Aptide가 세포 내 단백질을 타겟팅 하는 경우, 바람직하게는 D-Aptide는 추가적으로 세포막투과 펩타이드(CPP)를 포함한다.
상기 CPP는 당업계에 공지된 다양한 CPP를 포함하며, 예를 들어 HIV-1 Tat 단백질, Tat 펩타이드 유사체(예컨대, 올리고알지닌), ANTP 펩타이드, HSV VP22 전사조절단백질, vFGF에서 유래된 MTS 펩타이드, Penetratin, Transportan 또는 Pep-1 펩타이드를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 CPP를 바이포달 펩타이드에 결합시키는 방법은 다양한 방법이 있으며, 예를 들어 D-Aptide의 구조 안정화 부위에 있는 루프 부분의 라이신 잔기와 CPP를 공유결합 시킨다.
세포 내에는 생리 활성에 중요한 역할을 하는 많은 타겟 단백질이 있으며, CPP가 결합된 D-Aptide는 세포 내로 유입되어 이 타겟 단백질에 결합하여 활성을 조절(예컨대, 억제)한다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 D-Aptide는 전형적으로 "N-타겟 결합 부위 I-구조안정화 부위의 한 가닥-링커-구조안정화 부위의 다른 가닥-타겟 결합 부위 Ⅱ-C"의 컨스트럭트를 갖는다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 D-Aptide에서 타겟 결합 부위 I과 구조안정화 부위의 한 가닥 사이 및/또는 구조안정화 부위의 다른 가닥-타겟 결합 부위 Ⅱ 사이에는, 타겟 결합 부위와 구조안정화 부위 간의 상호 구조적 영향을 차단하는 구조영향 억제부위(structure influence inhibiting region)를 포함한다. 회전 부위에는 펩타이드 분자에서 φ와 ψ의 회전이 비교적 자유로운 아미노산이 위치한다. 바람직하게는, φ와 ψ의 회전이 비교적 자유로운 아미노산은 글라이신, 알라닌 및 세린이다. 구조영향 억제부위에는 1-10개, 바람직하게는 1-8개, 보다 바람직하게는 1-3개의 아미노산 잔기가 위치할 수 있다.
본 발명의 방법은 구체적으로 다음의 소단계를 포함한다:
(a) (i) 가닥간(interstrand) 비공유결합이 형성되는 패러럴(parallel), 안티패러럴(antiparallel) 또는 패러럴(parallel)과 안티패러럴(antiparallel) L-아미노산 가닥들을 포함하는 구조 안정화 부위(structure stabilizing region); (ⅱ) 상기 구조 안정화 부위의 양 말단에 결합되어 있고 무작위적으로 선택된 각각 n 및 m개의 L-아미노산을 포함하는 타겟 결합 부위 I(target binding region I) 및 타겟 결합 부위 Ⅱ(target binding region Ⅱ)를 포함하는 L-Aptide의 라이브러리를 제공하는 단계;
(b) 상기 라이브러리와 타겟을 접촉시키는 단계; 그리고,
(c) 상기 타겟과 결합된 L-Aptide를 선택하는 단계;
(d) 상기 L-Aptide의 아미노산 서열을 결정하는 단계; 및
(e) 상기 L-Aptide에 포함된 L-아미노산을 D-아미노산으로 치환하여 D-Aptide를 제조하는 단계.
상술한 컨스트럭트를 갖는 L-Aptide의 라이브러리는 당업계에 공지된 다양한 방법으로 얻을 수 있다. 이 라이브러리에서 L-Aptide는 무작위 서열을 갖게 되며, 이는 타겟 결합 부위 I 및/또는 타겟 결합 부위 Ⅱ의 어떤 위치에서도 서열 선호도(sequence preference)가 없거나 또는 지정(또는 고정)된 아미노산 잔기가 없다는 것을 의미한다.
예를 들어, L-Aptide의 라이브러리는 고상지지체(예컨대, 폴리스틸렌 또는 폴리아크릴아미드 수지) 상에서 실시되는 스플리트-합성 방법(Lam et al. (1991) Nature 354:82; WO 92/00091)에 따라 구축될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, L-Aptide는 세포 표면 전시(cell surface display)방식(예컨대, 파아지 디스플레이, 박테리아 디스플레이 또는 이스트 디스플레이)으로 구축된다. 바람직하게는, L-Aptide의 라이브러리는 플라스미드, 박테리오파아지, 파아지미드, 이스트, 박테리아, mRNA 또는 라이보좀을 기반으로 하는 디스플레이방법을 통하여 제작될 수 있다.
파아지 디스플레이는 파아지의 표면 상의 코트 단백질에 융합된 단백질 형태로 다양한 폴리펩타이드를 디스플레이하는 기술이다(Scott, J. K. and Smith, G. P. (1990) Science 249: 386; Sambrook, J. et al., Molecular Cloning . A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Clackson and Lowman, Phage Display, Oxford University Press(2004)). 필라멘트성 파아지(예컨대, M13)의 유전자 Ⅲ 또는 유전자 Ⅷ에 발현하고자 하는 유전자를 융합시켜 무작위 펩타이드를 디스플레이한다.
파이지 디스플레이에는 파아지미드가 이용될 수 있다. 파아지미드는 박테리아의 복제원점(예컨대, ColE1) 및 박테리오파아지의 인터제닉(intergenic) 부위의 한 카피를 갖는 플라스미드 벡터이다. 이 파아지미드에 클로닝된 DNA 단편은 플라스미드처럼 증식된다.
L-Aptide의 라이브러리를 파아지 디스플레이 방식으로 구축하는 경우, 본 발명의 바람직한 구현예는 다음의 단계를 포함한다: (i) 파아지 코트 단백질(예컨대, M13과 같은 필라멘트성 파아지의 유전자 Ⅲ 또는 유전자 Ⅷ 코트 단백질)을 코딩하는 유전자와 앱타머-유사 펩타이드를 코딩하는 유전자가 융합된 융합 유전자; 및 상기 융합 유전자에 작동적으로 결합된 전사 조절 서열(예컨대, lac 프로모터)을 포함하는 발현 벡터의 라이브러리를 제작하는 단계; (ⅱ) 상기 발현 벡터 라이브러리를 적합한 숙주 세포에 도입시키는 단계; (ⅲ) 상기 숙주세포를 배양하여 재조합 파아지 또는 파아지미드 바이러스 파티클을 형성시켜 융합 단백질이 표면에 디스플레이 되도록 하는 단계; (ⅳ) 생물학적 타겟 분자와 상기 바이러스 파티클을 접촉시켜 파티클을 타겟 분자에 결합시키는 단계; 및 (v) 타겟 분자에 결합하지 않은 파티클을 분리하는 단계.
파아지 디스플레이를 이용하여 펩타이드 라이브러리를 구축하고 이들 라이브러리를 스크리닝 하는 방법은 미국 특허 제5,723,286호, 제5,432,018호, 제5,580,717호, 제5,427,908호, 제5,498,530호, 제5,770,434호, 제5,734,018호, 제5,698,426호, 제5,763,192호 및 제5,723,323호에 개시되어 있다.
앱타머-유사 펩타이드를 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제작하는 방법은 당업계에 공지된 방법에 따라 실시될 수 있다. 예를 들어, 공지의 파아지미드 또는 파아지 벡터(예컨대, pIGT2, fUSE5, fAFF1, fd-CAT1, m663, fdtetDOG, pHEN1, pComb3, pComb8, pCANTAB 5E (Pharmacia), LamdaSurfZap, pIF4, PM48, PM52, PM54, fdH 및 p8V5)에 L-Aptide 유전자를 삽입시켜 발현 벡터를 제작할 수 있다.
대부분의 파아지 디스플레이 방법이 필라멘트성 파아지를 이용하여 실시되지만, 람다 파아지 디스플레이(WO 95/34683; 미국 특허 제5,627,024호), T4 파아지 디스플레이(Ren et al. (1998) Gene 215:439; Zhu (1997) CAN 33:534) 및 T7 파아지 디스플레이(미국 특허 제5,766,905호)도 L-Aptide의 라이브러리를 구축하는 데 이용될 수 있다.
벡터 라이브러리를 적합한 숙주 세포에 도입시키는 방법은 다양한 형질전환 방법에 따라 실시될 수 있으며, 가장 바람직하게는 전기천공(electroporation) 방법에 따라 실시된다(참조: 미국 특허 제5,186,800호, 제5,422,272호, 제5,750,373호). 본 발명에 적합한 숙주는 세포는 E. coli와 같은 그람 음성 박테리아 세포이며, 적합한 E. coli 숙주는 JM101, E. coli K12 strain 294, E. coli strain W3110 및 E. coli XL-1Blue (Stratagene)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 숙주세포는 형질전환 전에 컴피턴스 세포로 준비하는 것이 바람직하다(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)). 형질전환된 세포의 선별은 일반적으로 항생제(예컨대, 테트라사이클린 및 암피실린)를 포함하는 배지에서 배양하여 실시된다. 선별된 형질전환 세포를 헬퍼 파아지의 존재 하에서 추가적으로 배양하여 재조합 파아지 또는 파아지미드 바이러스 파티클을 생성시킨다. 상기 헬퍼 파아지 파아지로 적합한 것은, Ex 헬퍼 파아지, M13-KO7, M13-VCS 및 R408을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
생물학적 타겟 분자와 결합하는 바이러스 파티클의 선별은 통상적으로 바이오패닝 과정을 통하여 실시될 수 있다(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning . A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Clackson and Lowman, Phage Display, Oxford University Press(2004)).
상술한 과정을 통하여 선택된 타겟 친화성 L-Aptide의 아미노산 서열을 결정한다. L-Aptide의 아미노산 서열 결정은 당업계에 공지된 방법을 통하여 실시할 수 있다(Hanno Steen & Matthias Mann. The abc's (and xyz's) of peptide sequencing. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 5:699-711, 2004).
최종적으로, L-Aptide에 포함된 L-아미노산을 D-아미노산으로 치환하여 D-Aptide를 제조한다. D-Aptide의 제조는 당업계에 공지된 화학적 합성 방법, 특히 고상 합성 기술(solid-phase synthesis techniques)에 따라 제조될 수 있다(Merrifield, J. Amer . Chem . Soc . 85:2149-54(1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111(1984)).
본 발명의 D-Aptide의 구체적인 예는 서열목록 제20서열-제38서열 및 제40서열-제42서열에 기재되어 있으며, 상기 서열목록에 기재된 아미노산은 D-아미노산이다.
본 발명에 의해 구축된 D-Aptide는 L-Aptide와 실질적으로 동일한 타겟 친화도를 갖는다. 바람직하게는, D-Aptide의 타겟에 대한 해리상수(K d ) 대(to) L-Aptide의 타겟에 대한 해리상수(K d )의 비율은 0.7-2.5이고, 보다 바람직하게는 0.8-2.0, 가장 바람직하게는 0.85-1.8이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 D-Aptide는 0.01-500 nM, 보다 바람직하게는 0.1-300 nM, 보다 더 바람직하게는 1-200 nM, 보다 더욱 더 바람직하게는 10-200 nM의 타겟에 대한 해리상수(K d ) 값을 가지고 있어, 타겟 분자에 매우 높은 친화도를 나타낸다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, D-Aptide는 L-Aptide와 동일한 서열 및 동일한 방향성을 갖는다.
택일적으로, D-Aptide는 L-Aptide와 동일한 서열 및 반대의 방향성을 갖는다. L-Aptide와 서열은 동일하지만 반대의 방향성을 갖는 펩타이드를 레트로 인버소(retro inverso: RI)-Aptide라 한다. L-Aptide의 아미노산 서열을 참조하여, RI-Aptide로 제작하여도 D-Aptide에서 발견되는 것과 유사하게 L-Aptide와 실질적으로 동일한 타겟 친화도를 가지면서 단백질 분해효소에 대한 안정성은 크게 증가된다.
본 발명의 D-Aptide는 매우 낮은 수준(예컨대, nM 수준)의 K D 값(해리상수)을 나타내어, 생물학적 타겟 분자에 매우 높은 친화도를 나타내는 펩타이드를 제공한다.
본 발명의 D-Aptide는 의약으로서의 용도를 가질 뿐만 아니라, 생체 내 물질의 검출, 인 비보 분자 이미징, 인 비트로 세포 이미징 및 약물전달용 타겟팅을 하는 데 이용될 수 있으며, 에스코트 분자로도 이용될 수 있다.
특히, 본 발명의 D-Aptide는 L-Aptide와 비교하여 타겟에 대한 친화도는 유지하면서 단백질 분해효소에 대한 안정성이 크게 증가되어 있어, Aptide 분자의 의약으로서의 적용 가능성을 크게 개선한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 타겟 친화도는 유지되고 안정성은 크게 개선된 D-Aptide를 제공한다.
(b) 본 발명의 D-Aptide는 통상적 기술 상식과 다르게, L-Aptide와 비교하여 타겟 친화도는 실질적으로 동일하며 안정성은 크게 개선되어 있다.
(c) 본 발명의 D-Aptide는 매우 낮은 수준(예컨대, nM 수준)의 KD 값(해리상수)을 나타내어, 타겟에 매우 높은 친화도를 나타낸다.
(d) 본 발명의 D-Aptide는 의약으로서의 용도를 가질 뿐만 아니라, 생체 내 물질의 검출, 인 비보 분자 이미징, 인 비트로 세포 이미징 및 약물전달용 타겟팅을 하는 데 이용될 수 있으며, 에스코트 분자로도 이용될 수 있다.
(e) 특히, 본 발명의 D-Aptide는 L-Aptide와 비교하여 타겟에 대한 친화도는 유지하면서 단백질 분해효소에 대한 안정성이 크게 증가되어 있어, Aptide 분자의 의약으로서의 적용 가능성을 크게 개선한다.
도 1은 L-Aptide1EDB 및 D-Aptide1EDB의 피브로넥틴 EDB에 대한 결합 동력학적 패턴(binding kinetic pattern) 및 친화력를 보여주는 BIAcore X 측정 결과이다.
도 2는 L-Aptide1EDB 및 D-Aptide1EDB의 원편광 이색성 분광(CD) 분석 결과이다.
도 3은 L-Aptide1EDB 및 D-Aptide1EDB의 단백질 분해효소에 대한 안정성 분석 결과이다.
도 4는 L-Aptide1VEGF 및 D-Aptide1VEGF의 VEGF 활성 억제 정도를 보여주는 그래프이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실험 방법
Aptide1 EDB 의 L-형, D-형 및 레트로 인버소-형(Retro inverso-form)의 합성 및 친화력 측정
피브로넥틴 EDB에 특이적으로 결합하는 앱타머-유사 펩타이드인 L-Aptide1EDB를 D-형 및 레트로 인버소(RI)형으로 치환하였을 때, 활성이 유지되는지 여부를 확인하기 위하여 타겟에 대한 친화력을 측정하였다. 우선 L-Aptide1EDB (HCSSAVGSWTWENGKWTWKGIIRLEQ, 모두 L-아미노산, 서열목록 제21서열), D-Aptide1EDB (HCSSAVGSWTWENGKWTWKGIIRLEQ, 모두 D-아미노산, 서열목록 제21서열) 그리고 레트로 인버소 형 RI-Aptide1EDB(QELRIIGKWTWKGNEWTWSGVASSCH, 모두 D-아미노산)의 3개의 펩타이드를 (주)애니젠(대한민국)에서 합성하였다. 이들의 타겟에 대한 친화력은 BIAcore X(Biacore AB, Uppsala, Sweden)을 이용하여 측정하였다. 스트렙타비딘 SA 칩(Biacore)에 바이오틴-EDB을 2000RU 만큼 흘려주어 고정시켰다. 런닝 완충액으로는 PBS(pH 7.4)을 사용했고, 유속은 30 ㎕/min으로 하였으며 여러 농도로 동력학을 측정한 후 BIAevaluation 소프트웨어(Biacore AB, Uppsala, Sweden)로 친화도를 계산하였다.
Aptide1 VEGF 의 L-형, D-형 및 레트로 인버소-형(Retro inverso-form)의 합성 및 친화력 측정
VEGF(Vascular endothelial growth factor)에 특이적으로 결합하는 앱타머-유사 펩타이드인 L-Aptide1VEGF를 D-형 및 레트로 인버소(RI) 형으로 치환하였을 때 활성이 유지되는지 여부를 확인하기 위하여 친화력을 측정하였다. 우선 L-Aptide1VEGF (HANFFQGSWTWENGKWTWKGWKYNQS, 모두 L-아미노산, 서열목록 제23서열), D-Aptide1VEGF (HANFFQGSWTWENGKWTWKGWKYNQS, 모두 D-아미노산, 서열목록 제23서열) 그리고 레트로 인버소 형RI-Aptide1VEGF(SQNYKWGKWTWKGNEWTWSGQFFNAH, 모두 D-아미노산)의 3개의 펩타이드를 (주)애니젠에서 합성하였다. 이들의 타겟에 대한 친화력은 BIAcore X(Biacore AB, Uppsala, Sweden)을 이용하여 측정하였다. CM5 칩(Biacore)에 VEGF121을 3000RU 만큼 고정시켰다. 런닝 완충액으로는 PBS(pH 7.4)을 사용하였고 유속은 30 ㎕/min으로 하였으며 여러 농도로 동력학을 측정한 후 BIAevaluation 소프트웨어(Biacore AB, Uppsala, Sweden)로 친화도를 계산하였다.
AptideHSA의 L-형, D-형 및 레트로 인버소-형(Retro inverso-form)의 합성 및 친화력 측정
HSA(Human serum albumin)에 특이적으로 결합하는 앱타머-유사 펩타이드인 L-AptideHSA를 D-형 및 레트로 인버소(RI) 형으로 치환하였을 때 활성이 유지되는지 여부를 확인하기 위하여 타겟에 대한 친화력을 측정하였다. 우선 L-AptideHSA (HAHFNFGSWTWENGKWTWKGIWLPAR, 모두 L-아미노산, 서열목록 제42서열), D-AptideHSA (HAHFNFGSWTWENGKWTWKGIWLPAR, 모두 D-아미노산, 서열목록 제42서열) 그리고 레트로 인버소 형 RI-AptideHSA (RAPLWIGKWTWKGNEWTWSGFNFHAH, 모두 D-아미노산) 3개의 펩타이드를 (주)애니젠에서 합성하였다. 이들의 타겟에 대한 친화력은 BIAcore X(Biacore AB, Uppsala, Sweden)을 이용하여 측정하였다. CM5 칩(Biacore)에 HSA을 3000RU 만큼 고정시켰다. 런닝 완충액으로는 PBS(pH 7.4)을 사용하였고 유속은 30 ㎕/min으로 하였으며 여러 농도로 동력학을 측정한 후 BIAevaluation 소프트웨어(Biacore AB, Uppsala, Sweden)로 친화도를 계산하였다.
원편광 이색성 분광( Circular Dichroism : CD ) 측정
L- 또는 D-Aptide1EDB의 CD 패턴을 측정하기 위해, 20 mM 포타슘 포스페이트 (pH 7)에 용해된 300 ㎍/ml의 L- 또는 D-Aptide1EDB를 0.1 mm 셀을 이용하여 스펙트럼을 얻었다. CD 기계는 Jasco J-810 spectopolarimeter를 사용하였고 스펙트럼은 190-250 nm을 세 번 찍어 평균을 구했다.
단백질 분해 효소에 의한 앱타머-유사 펩타이드의 분해 실험
단백질 분해효소인 α-키모트립신 및 트립신(Sigma)을 이용하여 L-Aptide1EDB 및 D-Aptide1EDB의 분해 정도를 측정하였다. 각각 100 ㎍ 펩타이드에 10 유니트의 단백질 분해효소를 넣고 30분, 60분, 120분 및 720분 동안 반응시킨 후, SDS 시료 완충액(Invitron)을 넣고 끓여서 반응을 정지시켰다. 이어, SDS-PAGE로 펩타이드 분해 결과를 확인하였다.
L- 또는 D-Aptide1 VEGF 에 의한 VEGF 억제 실험
HUVEC 세포(Human Umbilical Vein Endothelial Cell, ATCC)를 1% FBS가 들어간 M199 배지(Gibco)에서 기아(starvation)시킨 다음 96-웰 플레이트에 각 웰 당 5000개의 세포를 부착시켰다. 12시간 후에 여러 농도의 L-Aptide1VEGF 와 D-Aptide1VEGF 와 20ng/ml의 VEGF165(R&D Systems)를 동시에 넣은 배지를 세포에 처리하였다. 그런 다음, 72시간 후에 세포의 성장도를 측정하기 위한 EZ-cytox cell 생존도 분석 키트(Daeil Labservice, 대한민국)를 이용하여 L-AptideVEGF 와 D-AptideVEGF 가 HUVEC 세포의 성장을 얼마나 저해했는지 측정하였다.
실험 결과
L- 또는 D- Aptide1 EDB 의 피브로넥틴 EDB 에 대한 친화력
L-Aptide1EDB 및 D-Aptide1EDB의 피브로넥틴 EDB에 대한 친화력를 BIAcore X를 측정하였다. 도 1에서 볼 수 있듯이, L-Aptide1EDB 및 D-Aptide1EDB은 유사한 동력학적(kinetics) 특성을 나타내며, 해리상수(K d ) 값도 각각 65 nM 및 58 nM로서 거의 유사한 값을 나타내어 피브로넥틴 EDB에 대한 친화력이 거의 동일함을 알 수 있다. 대부분의 펩타이드들이 D-형의 아미노산으로 구성된 경우에는 타겟에 대한 친화력이 감소한다는 종래의 보고를 참조하면, 본 실험 결과는 매우 흥미로운 것이다.
L-, D- 및 RI-Aptide1 EDB , L-, D- 및 RI-Aptide1 VEGF , 그리고 L-, D- 및 RI-Aptide HSA 의 친화력
SPR(surface plasmon resonance)을 이용하여 피브로넥틴 EDB에 결합하는 Aptide1EDB, VEGF에 결합하는 AptideVEGF, HSA에 결합하는 AptideHSA의 L-형, D-형, 레트로 인버소(RI)-형에 대한 친화력을 측정하였다. 표 1에서 확인할 수 있듯이, D-Aptide는 L-Aptide와 유사한 친화력을 가지고 타겟에 결합을 함을 알 수 있다. 한편, RI-형의 경우, RI-Aptide1EDB 및 RI-AptideHSA은 L-Aptide와 유사한 친화력을 가지고 각각의 타겟에 결합을 하였으나, RI-Aptide1VEGF는 타겟인 VEGF에 거의 결합을 하지 않았다.
EDB, VEGF 또는 HSA에 대한 L-, D- 및 RI-Aptide의 동력학적 결합 데이터
타겟 Aptide 명 k a [M-1s-1] k d [s-1] K d [M]

EDB		 L-Aptide1EDB 1.0 x 104 9.5 x 10-4 65 x 10-9
D-Aptide1EDB 1.5 x 104 9.0 x 10-4 58 x 10-9
RI-Aptide1EDB 1.9 x 104 1.1 x 10-3 58 x 10-9

VEGF
 L-Aptide1VEGF 3.5 x 105 1.0 x 10-2 30 x 10-9
D-Aptide1VEGF 1.3 x 105 6.6 x 10-3 50 x 10-9
RI-Aptide1VEGF 비결합 비결합 비결합

HSA
 L-AptideHSA 9.5 x 104 1.3 x 10-2 142 x 10-9
D-AptideHSA 9.7 x 104 1.4 x 10-2 153 x 10-9
RI-AptideHSA 5.8 x 104 8.2 x 10-3 141 x 10-9
원편광 이색성 분광 분석
L-Aptide1EDB 및 D-Aptide1EDB의 원편광 이색성 분광(CD)을 190-250 nm에서 측정하였다. 도 2에서 볼 수 있듯이, L-Aptide1EDB의 CD 스펙트럼 패턴은 L-Aptide1EDB의 구조적 골격인 트립집(trpzip)가 유사한 패턴을 나타내었다. D-Aptide1EDB는 예상 되로 L-Aptide1EDB의 역전된 스펙트럼(reciprocal spectrum)으로 측정되었다.
단백질 분해효소 실험
단백질 분해효소인 α-키모트립신 및 트립신을 이용하여 L-Aptide1EDB 및 D-Aptide1EDB의 분해 정도를 측정하였다. 도 3에서 볼 수 있듯이, L-Aptide1EDB는 α-키모트립신 또는 트립신 처리에 의해 30분 안에 모두 분해되었지만, D-Aptide1EDB는 360 분까지도 분해되지 않음을 알 수 있다. 따라서, D-Aptide1EDB는 단백질 분해효소의 분해에 대하여 상당한 내성을 가지며, 이에 D-Aptide1EDB를 인 비보 주입한 경우 우수한 인 비보 안정성을 보여줄 것으로 판단된다.
VEGF 활성 억제 실험( HUVEC 증식 분석)
세포에서 L-Aptide1VEGF 및 D-Aptide1VEGF가 VEGF의 활성을 억제시킬 수 있는지 HUVEC 증식 분석을 시도 하였다. VEGF는 상피세포의 성장을 촉진시키는 성장호르몬으로서 이를 막으면 상피세포의 성장을 억제할 수 있다. 도 4에서 볼 수 있듯이, 20 μM, 10 μM 및 5 μM L-Aptide1VEGF 와 20 μM, 10 μM 및 5 μM D-Aptide1VEGF을 처리했을 때, 두 형 모두 20 μM에서 VEGF의 활성을 완전히 저해하였다. 또한, 10 μM 농도에서는 오히려 D-형이 L-형 보다 VEGF 활성을 더 억제함을 볼 수 있다. 이와 같은 결과는, D-형이 단백질 분해효소에 대하여 L-형 보다 더 안정하기 때문에 나온 것으로 판단된다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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Claims (20)

  1. (i) 가닥간(interstrand) 비공유결합이 형성되는 패러럴(parallel), 안티패러럴(antiparallel) 또는 패러럴(parallel)과 안티패러럴(antiparallel) 아미노산 가닥들을 포함하는 구조 안정화 부위(structure stabilizing region); (ⅱ) 상기 구조 안정화 부위의 양 말단에 결합되어 있고 무작위적으로 선택된 각각 n 및 m개의 아미노산을 포함하는 타겟 결합 부위 I(target binding region I) 및 타겟 결합 부위 Ⅱ(target binding region Ⅱ)를 포함하는 앱타머-유사 펩타이드(Aptamer-Like Peptide: Aptide, 앱타이드)를 제조하는 단계를 포함하며, 상기 구조화 안정화 부위, 타겟 결합 부위 I 및 타겟 결합 부위 Ⅱ에 포함된 아미노산을 D-아미노산을 이용하여 제조하여 D-앱타이드(D-Aptide)를 제조하는 것을 특징으로 하는 L-아미노산으로 이루어진 앱타이드(L-앱타이드)의 타겟에 대한 친화도는 유지하면서 단백질 분해효소에 대한 안정성을 증가시키는 방법으로서, 상기 D-앱타이드의 타겟에 대한 해리상수(Kd ) 대(to) L-앱타이드의 타겟에 대한 해리상수(Kd )의 비율이 0.1-10인 것을 특징으로 하는 L-앱타이드의 타겟에 대한 친화도는 유지하면서 단백질 분해효소에 대한 안정성을 증가시키는 방법.
  2. 삭제
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 D-앱타이드의 타겟에 대한 해리상수(Kd ) 대(to) L-앱타이드의 타겟에 대한 해리상수(Kd )의 비율은 0.5-2.0인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 구조 안정화 부위에 형성되는 가닥간 비공유결합은 수소결합, 정전기적 상호작용, 소수성상호작용, 반데르 발스 상호작용, 파이-파이 상호작용, 양이온-파이 상호작용 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 구조 안정화 부위의 아미노산 가닥들은 링커로 연결된 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 구조 안정화 부위는 β-헤어핀, 헤어핀, 링커로 연결된 β-쉬트, 루이신 지퍼, 링커로 연결된 루이신 지퍼, 루이신 리치 모티프 또는 링커로 연결된 루이신 리치 모티프인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 타겟 결합 부위 I 및 타겟 결합 부위 Ⅱ는 타겟에 공동으로 작용하여 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 구조 안정화 부위, 타겟 결합 부위 I 또는 타겟 결합 부위 Ⅱ에 추가적으로 기능성 분자가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 방법은 다음의 소단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    (a) (i) 가닥간(interstrand) 비공유결합이 형성되는 패러럴(parallel), 안티패러럴(antiparallel) 또는 패러럴(parallel)과 안티패러럴(antiparallel) L-아미노산 가닥들을 포함하는 구조 안정화 부위(structure stabilizing region); (ⅱ) 상기 구조 안정화 부위의 양 말단에 결합되어 있고 무작위적으로 선택된 각각 n 및 m개의 L-아미노산을 포함하는 타겟 결합 부위 I(target binding region I) 및 타겟 결합 부위 Ⅱ(target binding region Ⅱ)를 포함하는 L-앱타이드의 라이브러리를 제공하는 단계;
    (b) 상기 라이브러리와 타겟을 접촉시키는 단계; 그리고,
    (c) 상기 타겟과 결합된 L-앱타이드를 선택하는 단계;
    (d) 상기 L-앱타이드의 아미노산 서열을 결정하는 단계; 및
    (e) 상기 L-앱타이드에 포함된 L-아미노산을 D-아미노산으로 치환하여 D-앱타이드를 제조하는 단계.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 D-앱타이드는 상기 L-앱타이드와 동일한 서열 및 동일한 방향성을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 9 항에 있어서, 상기 D-앱타이드는 상기 L-앱타이드와 동일한 서열 및 반대의 방향성을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. (a) 가닥간(interstrand) 비공유결합이 형성된 패러럴(parallel), 안티패러럴(antiparallel) 또는 패러럴(parallel)과 안티패러럴(antiparallel) D-아미노산 가닥들을 포함하는 구조 안정화 부위(structure stabilizing region); 및
    (b) 상기 구조 안정화 부위의 양 말단에 결합되어 있고 무작위적으로 선택된 각각 n 및 m개의 D-아미노산을 포함하는 타겟 결합 부위 I(target binding region I) 및 타겟 결합 부위 Ⅱ(target binding region Ⅱ)를 포함하는 타겟에 특이적으로 결합하는 D-앱타이드(D-Aptide), 상기 D-앱타이드는 동일한 아미노산 서열을 가지는 L-앱타이드와 비교하여 타겟에 대한 친화도는 유지하면서 단백질 분해효소에 대한 안정성이 증가되며, 상기 D-앱타이드의 타겟에 대한 해리상수(Kd ) 대(to) L-앱타이드의 타겟에 대한 해리상수(Kd )의 비율이 0.1-10인 것을 특징으로 하는 D-앱타이드(D-Aptide).
  13. 삭제
  14. 제 12 항에 있어서, 상기 D-Aptide의 타겟에 대한 해리상수(Kd ) 대(to) L-Aptide의 타겟에 대한 해리상수(Kd )의 비율은 0.5-2.0인 것을 특징으로 하는 D-앱타이드(D-Aptide).
  15. 제 12 항에 있어서, 상기 구조 안정화 부위에 형성되는 가닥간 비공유결합은 수소결합, 정전기적 상호작용, 소수성상호작용, 반데르 발스 상호작용, 파이-파이 상호작용, 양이온-파이 상호작용 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는 D-앱타이드(D-Aptide).
  16. 제 12 항에 있어서, 상기 구조 안정화 부위의 아미노산 가닥들은 링커로 연결된 것을 특징으로 하는 D-앱타이드(D-Aptide).
  17. 제 12 항에 있어서, 상기 구조 안정화 부위는 β-헤어핀, 헤어핀, 링커로 연결된 β-쉬트, 루이신 지퍼, 링커로 연결된 루이신 지퍼, 루이신 리치 모티프 또는 링커로 연결된 루이신 리치 모티프인 것을 특징으로 하는 D-앱타이드(D-Aptide).
  18. 제 12 항에 있어서, 상기 타겟 결합 부위 I 및 타겟 결합 부위 Ⅱ는 타겟에 공동으로 작용하여 결합하는 것을 특징으로 하는 D-앱타이드(D-Aptide).
  19. 제 12 항에 있어서, 상기 구조 안정화 부위, 타겟 결합 부위 I 또는 타겟 결합 부위 Ⅱ에 추가적으로 기능성 분자가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 D-앱타이드(D-Aptide).
  20. 상기 제 12 항 및 제 14 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항의 D-앱타머-유사 펩타이드(D-Aptide)와 동일한 D-아미노산 서열을 가지면서 반대의 방향성을 갖는 레트로 인버소(retro inverso)-앱타이드(RI-Aptide), 상기 RI-Aptide는 상기 D-Aptide와 유사한 타겟 친화도를 가지는 것을 특징으로 하는 레트로 인버소-앱타이드(RI-Aptide).
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014059530A1 (en) * 2012-10-19 2014-04-24 National Research Council Of Canada Derivatives of collagen-binding hairpin peptides
GB201410507D0 (en) * 2014-06-12 2014-07-30 Univ Bath Drug delivery enhancement agents
CN111233975A (zh) * 2018-11-28 2020-06-05 复旦大学 可靶向整合素的多肽mn及其在制备肿瘤靶向药物中的应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20100044128A (ko) * 2008-10-20 2010-04-29 광주과학기술원 바이포달 펩타이드 바인더

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2234723A1 (en) * 1995-10-10 1997-04-17 Gryphon Sciences Generating d-peptides: methods and compositions
US7115571B1 (en) * 2000-06-16 2006-10-03 Myelos Corporation Retro-inverso peptides derived from interleukin-3
CA2950465A1 (en) * 2006-02-20 2007-08-30 Phylogica Limited Method of constructing and screening libraries of peptide structures
WO2011071279A2 (ko) * 2009-12-11 2011-06-16 광주과학기술원 Bpb-기반 카르고 운반 시스템
WO2011071280A2 (ko) * 2009-12-11 2011-06-16 광주과학기술원 세포내 타겟 결합용 바이포달 펩타이드 바인더

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20100044128A (ko) * 2008-10-20 2010-04-29 광주과학기술원 바이포달 펩타이드 바인더

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Brett D. Welch et al. Potent D-peptide inhibitors of HIV-1 entry. PNAS, October 23, 2007, Vol.104, No.43, pp.16828-1683 *
Brett D. Welch et al. Potent D-peptide inhibitors of HIV-1 entry. PNAS, October 23, 2007, Vol.104, No.43, pp.16828-1683*

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