WO2011071280A2 - 세포내 타겟 결합용 바이포달 펩타이드 바인더 - Google Patents

세포내 타겟 결합용 바이포달 펩타이드 바인더 Download PDF

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WO2011071280A2
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peptide
bipodal
trp
thr
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전상용
김성현
김대진
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광주과학기술원
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a bipodal peptide binder for intracellular target binding and a preparation method thereof.
  • Antibodies are immunoglobulin proteins, a type of plasma protein produced by B cells, that specifically inactivate and inactivate antigens by specifically recognizing and binding to specific sites of antigens.
  • the specificity and high affinity of these antigen-antibody reactions and the diversity of antibodies that can distinguish tens of millions of antigens have led to the emergence of many types of antibody products, including diagnostics and therapeutics.
  • the FDA has approved 21 monoclonal antibodies .
  • Antibodies such as Rituximab and Herceptin have been effective in more than 50% of patients who have not responded to any other treatment. Substantially, several studies have used monoclonal antibodies to treat lymphoma and colon cancer. Or successful clinical treatment of breast cancer.
  • the overall market size of therapeutic antibodies is estimated to grow at an annual rate of 20%, from $ 10 billion in 2004 to $ 30 billion in 2010.
  • the market is expected to grow exponentially.
  • the development of new drugs using antibody dispersal is active because the drug development period is short, investment costs are low, and side effects can be easily predicted.
  • the antibody is a herbal medicine, the human body is hardly affected, and the half-life in the body is overwhelmingly long compared to low molecular weight drugs, so the patient is friendly.
  • monoclonal antibodies in humans are recognized as foreign antigens and can cause severe allergic reactions or hypersensitivity.
  • the anti-cancer function of the cloned antibody is produced in a three-phased manner, the production cost is high.
  • a wide range of technologies including methods for culturing and purifying antibodies, are protected by various intellectual property rights, and high licensing fees must be paid.
  • Antibody-replacement protein is a recombinant protein made to have constant and variable regions like an antibody.
  • a small and stable protein is replaced with a random sequence of amino acids to make a library, which is then screened for the target material, thereby providing high affinity and good Substances with specificity can be found.
  • avimers and affibodies among antibody replacement proteins have been reported to have a picomol affinity for a target substance. It is reported that these antibody replacement proteins are small and stable and can penetrate deep into cancer cells and generally produce less immune responses.
  • antibody replacement proteins There are currently 40 antibody replacement proteins that have been developed. Among them, the antibody replacement proteins that are being commercialized by venture companies and multinational pharmaceutical companies are fibronectin type m domain, lipocalin, LDLR-A domain, crystallin, protein A and ankyrin repeat. (Ankyrin repeat), which uses a protein called BPTI and has a high affinity of several nanomolar to picomolar to the target. Among them, Adnectin, Avimer, and Kunitz domains are currently under FDA clinical trial.
  • the present invention focused on peptide-based antibody replacement proteins that are different from antibody replacement proteins using proteins up to now.
  • Peptides have been widely used in place of antibody therapeutics due to their proper pharmacokinetics, mass productivity, low toxicity, antigenic inhibition and low production cost compared to antibodies.
  • the advantages of peptides as therapeutic drugs are low production costs, high safety and reactivity, relatively low patent royalties, and less exposure to unwanted immune systems, which can inhibit the production of antibodies to the peptides themselves. Modifications are easy and accurate, but most peptides have low affinity and specificity for specific protein levels compared to antibodies, making them unusable for many applications. There are disadvantages.
  • the present inventors have tried to develop a peptide material that can be efficiently targeted to intracellular target molecules when treated in vitro, exemplified by intracellular.
  • a peptide is randomly coupled to both ends of a structure stabilization site having a relatively rigid peptide backbone, and when the cell membrane penetrating peptide (CPP) is bound to the peptide, intracellular target molecules are bound.
  • CPP cell membrane penetrating peptide
  • an object of the present invention is to provide a method for preparing intracellular targeting bipodal-peptide binder that specifically binds to intracellular target molecules.
  • Another object of the present invention is to provide an intracellular targeting bipodal peptide binder that specifically binds to intracellular target molecules.
  • Another object of the present invention is to provide a transformant comprising a vector for expressing intracellular targeting bipodal peptide binder that specifically binds to intracellular target molecules.
  • the present invention provides a method for preparing an intracellular targeting bipodal peptide binder that specifically binds to intracellular target molecules, comprising the following steps:
  • the invention comprises: (a) parallel, antiparallel or parallel and antiparallel amino acid strands formed with non-covalent bonds between the strands; Structure stabilizing regions; (b) ⁇ and m amino acids each bound to both ends of the structural stabilization site and selected at random; Including target binding region I and target binding region ⁇ ; And (c) an intracellular targeting bipodal peptide binder that specifically binds to intracellular target molecules, including a cell transmembrane peptide (CPP) bound to the structural stabilization site or the target binding site.
  • CPP cell transmembrane peptide
  • the present inventors sought to develop a peptide material that can be efficiently targeted to intracellular target molecules when treated in vitro, and ex vivo.
  • a peptide is randomly coupled to both ends of a structure stabilization site having a relatively rigid peptide backbone, and when the cell membrane penetrating peptide (CPP) is bound to the peptide, intracellular target molecules are bound.
  • CPP cell membrane penetrating peptide
  • the basic strategy of the present invention is to connect a peptide that is bound to a target at both ends of a rigid peptide backbone.
  • the rigid peptide backbone acts to stabilize the overall structure of the bipodal peptide provider and enhances the binding of the target binding site I and the target binding site ⁇ to the target molecule.
  • Structural stabilization sites available in the present invention include parallel, antiparallel or parallel and antiparallel amino acid strands, interstrand hydrogen bonds, electrostatic interactions, hydrophobic interactions, van der Waals interactions, pi-pi Protein structural motifs in which non-covalent bonds are formed by interactions, cation-pi interactions, or combinations thereof; hydrogen-bonding, electrostatic interactions, hydrophobic interactions, van der Waals interactions, pi-pi interactions Non-covalent bonds formed by action, cation-pi interaction, or a combination thereof contribute to the rigidity of the structure stabilization site.
  • interstrand non-covalent bonds at the structure stabilization site include hydrogen bonding, hydrophobic interaction, van der Waals interaction, pi-pi interaction or a combination thereof ⁇
  • a covalent bond to the structured stabilization site.
  • the increase in firmness by such covalent bonds is given in consideration of the specificity and affinity of the bipodal peptide binder for the target.
  • the amino acid strands of the structure stabilization site are linked by a linker.
  • linker as used to refer to the strands refers to the material that connects the strands.
  • the turn sequence in ⁇ -hairpin serves as a linker
  • a substance connecting two C-terminus of leucine zipper eg , Peptide linkers
  • Linkers link parallel, antiparallel or parallel and antiparallel amino acid strands. For example, at least two strands (preferably two strands) arranged in parallel fashion, at least two strands (preferably two strands) arranged in antiparallel fashion, and at least three strands arranged in parallel and antiparallel fashion.
  • the linker (preferably three strands) is joined by the linker.
  • the linker is a turn sequence or peptide linker.
  • the turn sequence is ⁇ -turn, ⁇ -turn, ⁇ -turn, ⁇ -turn or ⁇ —loop (Venkatachalam CM (1968), Biopolymers, 6, 1425-1436; Nemethy G and Print z MP. (1972), Macromolecules, 5, 755-758; Lewis PN et al., (1973), Biochim. Biophys. Acta, 303, 211-229; Toniolo C. (1980) CRC Crit. Rev. Biochem., 9, 1-44; Richardson JS. (1981), Adv. Protein Chem., 34, 167-339; Rose GD et al., (1985), Adv.
  • the turn sequence used in the present invention is ⁇ -turn.
  • ⁇ -turn When ⁇ -turn is used as the turn sequence, it is preferably a type I, type, type ⁇ , type ⁇ ', type m or type ⁇ turn sequence, more preferably type I, type 1', type ⁇ , type ⁇ 'turn sequence, even more preferably type ⁇ or Type ⁇ 'turn sequence, most preferably the type ⁇ turn sequence (BL Sibanda et al., J. Mo J. Biol., 1989, 206, 4, 759-777; BL Sibanda et al., Methods Enzymol. , 1991, 202, 59-82).
  • the turn sequence in the present invention is H. Jane Dyson et al. , Eur. J. Biochem. 255: 462-471 (1998), which is incorporated herein by reference.
  • Available for the turn sequence include the following amino acid sequences: X—Pro-Gly-Glu- Val; Ala-X-Gly-Glu-Val (X is selected from 20 amino acids).
  • the peptide linker connects two strands arranged in a parallel manner or two strands arranged in an antiparallel manner. desirable.
  • Peptide linkers can be used in any known in the art.
  • the sequence of a suitable peptide linker may be selected in consideration of the following factors: (a) the ability to be applied to flexible extended conformation; (b) the ability not to create secondary structures that interact with biological target molecules; And (c) the absence of hydrophobic residues or residues with charges that interact with the biological target molecule.
  • Preferred peptide linkers include Gly, Asn and Ser residues. Other neutral amino acids such as Thr and Ala can also be included in the linker sequence.
  • Suitable amino acid sequences for linkers are Maratea et al., Gene 40: 39-46 (1985); Murphy et al. , Proc. Natl. Acad Sci. USA 83: 8258-8562 (1986); US Pat. Nos. 4,935,233, 4,751,180, and 5,990,275.
  • the peptide linker sequence may consist of 1-50 amino acid residues.
  • the structure stabilization site is a hairpin, ⁇ -hairpin, beta-turn, a linker-linked ⁇ -sheet or a linker-linked leucine zipper, and more preferably, the structure stabilization site is ⁇ -hairpin. Or ⁇ -sheets linked by linkers, most preferably ⁇ -hairpins.
  • ⁇ -hairpin refers to two ⁇ Containing means liver _ simple protein motif, these two ⁇ strands are antiparallel to each other Indicates an alignment. In this ⁇ -hairpin the two ⁇ strands are generally linked by turn sequences.
  • the turn sequence applied to the ⁇ -hairpin is a type I, type ⁇ , type ⁇ , type ⁇ ', type ⁇ or type ⁇ turn sequence, more preferably type I, type I', type ⁇ , type ⁇ 'turn sequence, even more preferably a type ⁇ or type ⁇ ' turn sequence, and most preferably a type ⁇ turn sequence.
  • X-Pro-Gly-Glu-Val Or a turn sequence represented by Ala—X-Gly-Glu—Val (X is selected from 20 amino acids) can also be used for ⁇ -hairpins.
  • the type I turn sequence is Asp-Asp-Ala- Thr-Lys-Thr
  • the type ⁇ turn sequence is Glu—Asn-Gly-Lys
  • the type ⁇ turn sequence is X-Pro -Gly-Glu-Val
  • Ala-X-Gly-Glu-Val X is selected from 20 amino acids
  • the type ⁇ 'turn sequence is Glu-Gly-Asn-Lys or Glu-D-Pro-Asn -Lys.
  • Peptides with ⁇ -hairpin formulations are well known in the art. Tryptophan zipper, disclosed in, for example, US Pat. No. 6,914,123 and Andrea G. Cochran et al., PNAS, 98 (10): 5578-5583, template-fixed ⁇ - disclosed in WO 2005/047503. Hairpin Memetic, ⁇ -hairpin variants disclosed in US Pat. No. 5,807,979 are well known.
  • peptides having a ⁇ -hairpin conformation include Smith & Regan (1995) Science 270: 980-982; Chou & Fassman (1978) Annu. Rev. Biochem.
  • a tryptophan zipper is used.
  • the tryptophan zipper to be groomed in the present invention is represented by the following general formula (I):
  • Xi is Ser or Gly-Glu
  • X 2 and X ' 2 are independently of each other Thr, His, Val, He, Phe or Tyr
  • X 3 is Trp or Tyr
  • X 7 is Lys or Thr—Glu.
  • 3 ⁇ 4 is ser or Gly-Glu
  • X 2 and X'2 are independently of each other Thr, His or Val
  • 3 ⁇ 4 is Trp or Tyr
  • X4 is Type I, Type 1 ', Type ⁇ or type ⁇ ' turn sequence
  • 3 ⁇ 4 is Trp or Phe
  • 3 ⁇ 4 is Trp or Val
  • X 7 is Lys or Thr-Glu.
  • 3 ⁇ 4 is Ser or Gly-Glu
  • 3 ⁇ 4 and X'2 are independently of each other Thr, His or Val
  • 3 ⁇ 4 is Trp
  • X4 is type I, type 1 ', type ⁇ or type ⁇ ′ turn sequence
  • 3 ⁇ 4 is Trp
  • 3 ⁇ 4 is Trp
  • X 7 is Lys or Thr-Glu.
  • Thr is 3 ⁇ 4 is Trp, is type ⁇ or type ⁇ 'turn sequence, 3 ⁇ 4 is Trp, 3 ⁇ 4 is Trp and X 7 is Lys.
  • 3 ⁇ 4 is Ser, 3 ⁇ 4 and X'2 are Thr, 3 ⁇ 4 is Trp, is type ⁇ turn sequence (ENGK) or type ⁇ 'turn sequence (EGNK), 3 ⁇ 4 is Trp 3 ⁇ 4 is Trp and X 7 is Lys.
  • ENGK type ⁇ turn sequence
  • EGNK type ⁇ 'turn sequence
  • ⁇ -hairpin peptides usable as structural stabilization sites in the present invention are peptides derived from B1 domainin of protein G, ie GB1 peptides.
  • the structural stabilization site is preferably represented by the following general formula:
  • Xi is Arg, Gly-Glu or Lys-Lys
  • 3 ⁇ 4 is Gin or Thr
  • 3 ⁇ 4 is type I, type r, type ⁇ , type ⁇ 'or type m or type nr turn sequence, is Gin, Thr-Glu Or Gln-Glu.
  • Xi is Gly-Glu or Lys-Lys
  • X 2 is type I, type ⁇ , type ⁇ , type ⁇ 'or type m or type ⁇ turn sequence
  • 3 ⁇ 4 is Thr-Glu or Gln-Glu.
  • Exemplary amino acid sequences of GB1 ⁇ -hairpins suitable for the present invention are described in SEQ ID NO: 4 and 14 to 15 sequences.
  • ⁇ -hairpin peptides usable as structural stabilization sites in the present invention are HP peptides.
  • the structural stabilization site is preferably represented by the following general formula m:
  • Xi is Lys or Lys-Lys
  • X 2 is Trp or Tyr
  • 3 ⁇ 4 is Val or Thr
  • 3 ⁇ 4 is type I, type ⁇ , type ⁇ , type ⁇ 'or type ⁇ or type ⁇ turn sequence
  • 3 ⁇ 4 is Trp or Ala
  • 3 ⁇ 4 is Trp or Val
  • X 7 is Glu or Gln-Glu.
  • Another ⁇ -hairpin peptide that can be used as the structural stabilization site in the present invention is represented by the following general formula IV:
  • X 3 ⁇ 4 is Lys-Thr or Gly
  • X 2 is Trp or Tyr
  • X 3 is Type I ⁇ Type 1 ', Type ⁇ , Type ⁇ ' or Type m or Type ⁇ turn sequence and is Thr-Glu or Gly .
  • Exemplary amino acid sequences of the ⁇ -hairpins of Formulas III and IV are described in SEQ ID NOs: 11-12, 15, and 16-19.
  • a hairpin (alpha-hairpin, beta-hairpin, gamma-hairpin, ⁇ -hairpin, etc.) may be used as the structural stabilization site.
  • beta-turns may be used as structural stabilization sites.
  • a ⁇ -sheet connected by a linker may be used as the structure stabilization site.
  • two amino acid strands, which are parallel or antiparallel, preferably antiparallel, are in an extended form, and hydrogen bonds are formed between the amino acid strands.
  • ⁇ -sheet structure two adjacent ends of two amino acid strands are connected by a linker.
  • linker various turn-sequences or peptide linkers described above may be used. If the turn-sequence is used as a linker, the -turn sequence is most preferred.
  • leucine zippers or leucine zippers linked by linkers may be used as structural stabilization sites.
  • Leucine zippers are conservative peptide domains that cause parallel dimerization of two ⁇ -chains and are generally dimerized domains found in proteins involved in gene expression ("Leucine scissors". Glossary of Biochemistry and Molecular Biology ( Revised) (1997) Ed. David M. Gick. London: Portland Press; Landschulz WH, et al. (1988) Science 240: 1759-1764).
  • Leucine zippers generally comprise a heptad repeat sequence, with the leucine residues located at the fourth or fifth.
  • Use of the present invention 1_ specific examples of leucine branch 3 ⁇ 4 is described in SEQ ID NO: 39 sequence.
  • Each half of the leucine zipper consists of short ⁇ -chains with direct leucine contact between the ⁇ -chains.
  • the leucine zipper in the transcription factor generally consists of a hydrophobic leucine zipper site and a basic site (site that interacts with the main groove of the DNA molecule). When the leucine zipper is used in the present invention, the basic site is not necessarily required.
  • two adjacent ends of two amino acid strands may be linked by a linker.
  • a linker various turn-sequences or peptide linkers described above may be used, and preferably, a peptide linker that does not affect the structure of the leucine zipper is used.
  • Random amino acid sequences are coupled to both ends of the above-described structural stabilization site.
  • the random amino acid sequence forms the target binding site I and the target binding site ⁇ .
  • One of the greatest features of the present invention is to prepare a peptide binder in a bipodal manner by connecting the target binding site I and the target binding site ⁇ at both ends of the structure stabilization site.
  • Target binding site I and target binding site ⁇ bind to the target cooperatively with each other, thereby greatly increasing the affinity for the target.
  • the amino acid number n of the target binding site I is not particularly limited, preferably an integer of 2-100, more preferably an integer of 2-50, even more preferably an integer of 2-20, most preferably It is an integer of 3-10.
  • the amino acid number m of the target binding site ⁇ is not particularly limited, preferably an integer of 2-100, more preferably an integer of 2-50, even more preferably an integer of 2-20, most preferably It is an integer of 3-10.
  • the target binding site I and the target binding site ⁇ may each contain different or the same number of amino acid residues.
  • the target binding site I and the target binding site ⁇ may include different or identical amino acid sequences, and preferably include different amino acid sequences from each other.
  • the amino acid sequence included in the target binding site I and / or the target binding site ⁇ is a linear amino acid sequence or a cyclic amino acid sequence.
  • at least one amino acid residue of the amino acid sequence included in the target binding site I and / or binding site ⁇ Acetyl group, fluorenyl methoxy carbonyl group, formyl group, palmitoyl group myristyl group, stearyl group or polyethylene glycol (PEG).
  • the bipodal peptide binder of the present invention bound to a biological target molecule can be used for the regulation of physiological responses in vivo, detection of in vivo substances, in vivo molecular imaging, in vitro cell imaging and drug delivery targeting. It can also be used as an escort molecule.
  • a functional molecule is additionally bound to the structure stabilization site, the target binding site I or the target binding site ⁇ (more preferably, the structure stabilization site, even more preferably the linker of the structure stabilization site) have.
  • functional molecules include, but are not limited to, labels, chemicals, biopharmaceuticals, cell transmembrane peptides (CPPs) or nanoparticles that generate detectable signals.
  • Labels that generate the detectable signal include T1 contrast material (eg Gd chelate compound), T2 contrast material (eg superparamagnetic material (eg magnetite, Fe 3 0 4 , Y-Fe 2 0 3) manganese ferrite, cobalt Ferrites and nickel ferrites)), radioisotopes (e.g., 15 0, 13 N, P 32 , S 35 , 44 Sc, 45 Ti, 118 I, 136 La, 198 T1, 200 T1, 205 Bi and 206 Bi) , Including but not limited to fluorescent materials (fluorescein, phycoerythrin, rhodamine, lissamine, and Cy3 and Cy5), chemiluminescence groups, magnetic particles, mass labels or electron-dense particles It doesn't happen.
  • T1 contrast material eg Gd chelate compound
  • T2 contrast material eg superparamagnetic material (eg magnetite, Fe 3 0 4 , Y-Fe 2 0
  • the chemicals include, for example, anti-inflammatory drugs, analgesics, anti-arthritis agents, antispasmodics, antidepressants, antipsychotics, neurostabilizers, anti-anxiety drugs, antagonists, antiparkin's disease drugs, cholinergic agonists, anticancer agents, antiangiogenic agents, Immunosuppressants, antivirals, antibiotics, appetite suppressants, analgesics, anticholiners, antihistamines, antimigraine, hormones, coronary, cerebrovascular or peripheral vasodilators, contraceptives, antithrombotics, diuretics, antihypertensives, cardiovascular diseases , Cosmetic ingredients (eg, anti-wrinkle agent, anti-aging agent and skin lightening agent) and the like, but are not limited thereto.
  • Cosmetic ingredients eg, anti-wrinkle agent, anti-aging agent and skin lightening agent
  • the biopharmaceuticals include insulin, IGF-K insulin-like growth factor 1), growth hormone, erythropoietin, G-CSFs (granulocyte-colony stimulating factors), GM-CSFs (granulocyte / macrophage—colony stimulating factors), Interferon alpha, interferon beta, interferon gamma, interleukin-1 alpha and beta, interleukin-3, interleukin-4, interleukin-6, interleukin-2, EGFs (epidermal growth factors), calcitonin, adrenocorticotropic hormone (ACTH), TNF (tumor necrosis factor), atobisban, buserelin, cetrorelix, deslorelin, desmopressin, dynorphin A ) (1-13), elcatonin, eleidosin, epitif ibatide, GHRH— 11 (growth hormone releasing hormone ⁇ II), gonadorelin, gonsere Gos
  • Target binding site I and / or target binding site ⁇ may comprise amino acid sequences that bind to various targets.
  • Targetable by the bipodal peptide binders of the present invention include biochemicals, peptides, polypeptides, nucleic acids, carbohydrates, lipids, biological targets such as cells and tissues, compounds, metals or nonmetallic materials, preferably It is a biological target.
  • the biological target to which the target binding site binds is preferably a biochemical, a peptide, a polypeptide, a glycoprotein, a nucleic acid, a carbohydrate, a proteoglycan, a lipid or a glycolipid.
  • the biochemicals to which the target binding site binds include a variety of in vivo metabolites (eg, AT ⁇ NADH, NADPH, carbohydrate metabolites, lipid metabolites ' and amino acid metabolites).
  • exemplary peptides or polypeptides to which a target binding site binds include enzymes, ligands, receptors, biomarkers, hormones, transcription factors, growth factors, immunoglobulins, signaling proteins, binding proteins, ion channels, antigens, adhesion proteins, structural proteins. , Regulatory proteins, toxin proteins, cytokines and hematological factors. More specifically, the target of the bipodal peptide binder is
  • Fibronectin extra domain B VEGFCvascular endothel ial growth factor (VEGFR), vascular endothel ial growth factor receptor (VEGFR), VCAMK vascular cell adhesion molecule— 1), nicotinic acetylcholine receptor (nAchR), human serum albumin (HSA), MyD88, Epi dermal Growth Factor Receptor (EGFR), HER2 / neu, CD20, CD33, CD52, Epithelial Cell Adhesion Molecule (EpCAM), TNF-a (Tumor Necrosis Factor—a), IgE (Immunoglobulin E), CD11A (a- chain of lymphocyte funct ion ⁇ associated antigen 1), CD3, CD25, Glycoprotein Ilb / IIIa, integrin, alpha-fetoprotein (AFP), (beta2-microglobul in), and B ladder Tumor (BTA)
  • VEGFCvascular endothel ial growth factor VEGFC
  • NMP22 Cancer Antigen 125
  • Cancer Antigen 15-3 Calcitonin
  • Carcinoembryonic Antigen Chromogranin A
  • Estrogen Receptor Progesterone Receptor
  • Human Chorionic Gonadotropin Neuron-Specific Enolase
  • PAP Prostate-Specific Antigen
  • Thyroglobul Thyroglobul in, but are not limited thereto.
  • Exemplary nucleic acid molecules to which the target binding site binds include, but are not limited to, gDNA, mRNA, cDNA, ribosomal RNA (rRNA), ribosomal DNA (rDNA), and tRNA.
  • Exemplary carbohydrates to which the target binding site binds are intracellular carbohydrates, including but not limited to monosaccharides, disaccharides, trisaccharides, and polysaccharides.
  • Exemplary lipids to which the target binding site binds include, but are not limited to, fatty acids, triacylglies, sphingolipids, gangliosides, and cholesterol.
  • the bipodal peptides of the present invention can bind to biomolecules (eg proteins) in cells to modulate the activity of the biomolecules.
  • biomolecules eg proteins
  • the cell transmembrane peptide is bound to a structural stabilization site.
  • the CPP includes various CPPs known in the art and include, for example, HIV-1 Tat protein, oligoarginine, ANTP peptide, HSV VP22 transcriptional regulator protein, MTS peptide derived from vFGF, Penetratin, Transport an, Pep -1 peptide, Pep-7 peptide, Buforin II, model amphiphatic peptide (MAP), k-FGF, Ku 70, pVEC, SynBl or HN-1.
  • the CPP covalently binds the lysine residue of the loop portion at the structural stabilization site of the bipodal peptide.
  • bipodal peptide binders bound to CPP enter the cell to bind to and regulate (eg, inhibit) the activity.
  • Example 19 below shows specific examples of targeting of intracellular proteins of bipodal peptide binders.
  • MyD88 is well known as an intracellular protein that interacts with TLR 4, interleukin 1 receptor, RACl, IRAK2 and IRAKI.
  • the CPP-bipodal peptide binder having binding specificity to MyD88 enters cells and inhibits the function of MyD88, thereby effectively blocking the expression of MMP-13.
  • the intracellular target molecule is a cytoplasmic region, a cytoplasmic protein, an organelled protein, a nuclear protein or an intracellular nucleic acid molecule or an intracellular chemical of a cell membrane protein, more preferably the cell My target molecules are cancer-associated proteins, apoptosis-related proteins, receptor cytoplasmic domains, G-protein coupled receptor cytoplasmic domains, hormones, hormone receptors, enzymes, Histone deacetylase (HDAC), immune-related proteins, Toll-like receptors Intracellular proteins involved in signaling, proteins in blood coagulation, proteins in ERCendoplasmic reticulum, proteins in mitochondria or nuclear proteins.
  • the cell My target molecules are cancer-associated proteins, apoptosis-related proteins, receptor cytoplasmic domains, G-protein coupled receptor cytoplasmic domains, hormones, hormone receptors, enzymes, Histone deacetylase (HDAC), immune-related proteins, Toll-like receptors
  • the bipodal peptide binder of the present invention typically has a construct of one strand-linker-structural stabilization site of the target binding site I-structure stabilization site, and the other strand-target binding site ⁇ -C ′′.
  • a structure influence inhibiting region is provided that blocks the mutual structural effects between the target binding site and the structure stabilization site.
  • ⁇ is amino acids that are relatively free to rotate ⁇ and ⁇ in the peptide molecule.
  • ⁇ is amino acids that are relatively free to rotate ⁇ and ⁇ in the peptide molecule.
  • Amino acids that are relatively free of ⁇ are glycine, alanine and serine.
  • 1-10 amino acid residues preferably 1-8, and more preferably 1-3 amino acid residues may be located in the structure influence inhibitory site.
  • the bipodal peptide binder will have a random sequence, indicating that there is no sequence preference or no designated (or fixed) amino acid residue at any position of target binding site I and / or target binding site ⁇ . it means.
  • a library of bipodal peptide binders can be used in a split-synthesis method (Lam et al. (1991) Nature 354: 82; WO 92/00091) carried out on a solid support (eg, polystyrene or polyacrylamide resin). Can be built accordingly.
  • the library of bipodal peptide binders is constructed in a cell surface display manner (eg phage display, bacterial display or yeast display).
  • the library of bipodal peptide binders may be prepared through a display method based on plasmids, bacteriophages, phagemids, yeasts, bacteria, mRNA or ribosomes.
  • Phage display is a technique for displaying various polypeptides in the form of proteins fused to coat proteins on the surface of the phage (Scott, J. K. and Smith,
  • Phageimide may be used for the fiji display.
  • Phageimide is a plasmid vector with one copy of the bacterial origin of replication (eg, ColEl) and the intergenic site of the bacteriophage. DNA fragments cloned in this phagemid are propagated like polamide.
  • a preferred embodiment of the present invention comprises the following steps: (i) Phage coat protein (e.g., filamentous phage gene ⁇ or gene ⁇ , such as M13) A fusion gene in which a gene encoding a coat protein) and a gene encoding a bipodal peptide binder are fused; And constructing a library of expression vectors comprising transcriptional regulatory sequences (eg, lac promoters) operably linked to the fusion gene; ( ⁇ ) introducing the expression vector library into a suitable host cell; (iii) culturing the host cell to form recombinant phage or phagemid virus particles so that the fusion protein is displayed on the surface; (iv) contacting a biological target molecule with the viral particle to bind the particle to the target molecule; And (V) separating particles not bound to the target molecule.
  • Phage coat protein e.g., filamentous phage gene ⁇ or gene ⁇ , such as M13
  • the method of producing an expression vector comprising a bipodal peptide binder gene may be carried out according to methods known in the art.
  • known phagemids or phage vectors eg, pIGT2, fUSE5, fAFFl, fd-CATl, m663, fdtetDOG, pHENl, pComb3, pComb8, pCANTAB 5E (Pharmacia), LamdaSur f Zap, pIF4, PM48, PM52,
  • Expression vectors can be prepared by inserting a bipodal peptide binder gene into PM54, fdH and p8V5).
  • phage display methods are performed using filamentous phage, lambda phage display (W095 / 34683; US Pat. No. 5,627,024), T4 phage display (Ren et al. (1998) Gene 215: 439; Zhu (1997) CAN 33: 534) and T7 phage display (US Pat. No. 5,766,905) also build a library of bipodal peptide binders. It can be used to.
  • Suitable hosts for the present invention are gram negative bacterial cells such as E. coli, and suitable E. coli hosts include JM101, E. coli K12 strain 294, E. coli strain W3110 and E. coli XL-lBlue (Stratagene). Including, but not limited to. Host cells are preferably prepared as competent cells prior to transformation (Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press (2001)).
  • Selection of transformed cells is generally carried out by culturing in a medium containing antibiotics (eg tetracycline and ampicillin). Selected transformed cells are further cultured in the presence of helper phage to generate recombinant phage or phagemid virus particles.
  • Suitable helper phage phages include, but are not limited to, Ex helper phages, M13-K07, M13-VCS, and R408.
  • bipodal peptide binders of the present invention are described in SEQ ID NO: 20-38 and 40-41.
  • the invention provides a nucleic acid molecule encoding the intracellular targeting bipodal peptide binder described above.
  • the present invention provides a vector for expression of a bipodal peptide binder comprising a nucleic acid molecule encoding an intracellular targeting bipodal peptide binder.
  • the present invention provides a transformant comprising a vector for expression of the intracellular targeting bipodal peptide binder.
  • nucleic acid molecule is meant to encompass DNA (gDNA and cDNA) and RNA molecules inclusively, and the nucleotides that are the basic building blocks of nucleic acid molecules are naturally modified nucleotides, as well as modified sugar or base sites. Analogues (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York (1980); Uhlman and Peyman, Chemical Reviews, 90: 543-584 (1990)).
  • the vector of the present invention is a strong promoter (for example, tac promoter, lac promoter, / adJV5 promoter, which is capable of promoting transcription to the nucleic acid molecule in addition to the nucleic acid molecule encoding the bipodal peptide binder, Ipp promoter, p L x promoter, p / promoter, ra (S promoter, amp promoter, recA promoter, SP6 promoter, trp promoter and T7 promoter, etc.), ribosomal binding site and transcription / detox termination sequence for initiation of translation It includes.
  • a strong promoter for example, tac promoter, lac promoter, / adJV5 promoter, which is capable of promoting transcription to the nucleic acid molecule in addition to the nucleic acid molecule encoding the bipodal peptide binder, Ipp promoter, p L x promoter, p / promoter, ra (S promoter, amp promoter, recA promote
  • the vector of the invention may further comprise a signal sequence (eg pelB) on the 5'-direction of the nucleic acid molecule encoding the bipodal peptide binder.
  • the vector of the present invention further comprises a tagging sequence (eg, myc tag) for confirming that the bipodal peptide binder is well expressed on the surface of the phage.
  • the vector of the invention comprises a phage coat protein, preferably a gene encoding the gene m or gene vm coat protein of filamentous phage such as M13.
  • the vector of the present invention comprises an origin of replication of bacteria (eg ColEl) and / or a bacteriophage.
  • the vector of the present invention may include an antibiotic resistance gene commonly used in the art as a selection marker, for example, ampicillin, gentamicin, carbenicillin, chloramphenicol, streptomycin, kanamycin, geneticin, neo Genes against resistance to mycin and tetracycline.
  • the transformants of the present invention are preferably Gram-negative bacterial cells such as E. coli, and suitable E. coli hosts are JM101, E. coli K12 strain 294, E. coli strain W3110 and E. coli XL-lBlue (Stratagene ), But is not limited thereto.
  • the method of carrying the vector of the present invention into a host cell may be performed by CaCl 2 method (Cohen, SN et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9: 2110-2114 (1973)), one method (Cohen, SN et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9: 2110-2114 (1973); and Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166: 557-580 (1983)) and electroporation methods (US Pat. Nos. 5,186,800, 5,422,272, 5,750,373) and the like.
  • the bipodal peptide binders of the present invention exhibit very low levels (eg, nM levels) of values (dissociation constants) to provide peptides with very high affinity to biological target molecules.
  • the bipodal peptide binder exhibits about 10 2 -10 5 times (preferably about 10 3 -10 4 times) high affinity as compared to the binder made in the monopodal manner.
  • the bipodal peptide binder of the present invention not only has a use as a medicament, but also can be used for the detection of intracellular substances, in vivo molecular imaging, in vitro cell imaging and drug delivery, and also as an escort molecule. Can be.
  • the present invention provides intracellular targeting bipodal peptide binders with novel constructs.
  • the intracellular targeting bipodal peptide binder of the present invention thus exhibits very low levels (e.g., nM levels) of K D values (dissociation constants), resulting in very high affinity to the target.
  • the intracellular targeting bipodal peptide binder of the present invention not only has a use as a medicament, but also can be used for the detection of intracellular substances, in vivo molecular imaging, in vitro cell imaging and drug delivery, It can also be used as an escort molecule.
  • La shows a schematic diagram of a bipodal-peptide binder comprising ⁇ -hairpin as a structural stabilization site.
  • FIG. Lb shows a schematic diagram of a bipodal-peptide binder comprising ⁇ -sheets linked by linkers as structural stabilization sites.
  • FIG. Lc shows a schematic diagram of a bipodal peptide binder comprising leucine zippers linked by linkers as structural stabilization sites.
  • Figure ID shows a schematic of a bipodal-peptide binder comprising a leucine-rich motif linked by a linker as a structural stabilization site.
  • the pelB signal sequence myc tag
  • the lac promoter was used as a promoter.
  • FIG. 3 shows the biopanning results of ED-B, straptavidin and BSA for input phage during pyronectin ED-B biopanning.
  • FIG. 4 shows ELISA results for ED-B and BSA of 60 recombinant phages recovered in the third stage of biopanning of bipodal peptide binder library during pyronectin ED-B biopanning.
  • Figure 5a is a result of measuring the affinity of a specific bipodal peptide binder that binds to the pyronectin ED-B protein.
  • Figure 5b is the result of measuring the affinity of a specific bipodal peptide binder that binds to VEGF.
  • Figure 5c is the result of measuring the affinity of a specific bipodal peptide binder that binds to VCAMl.
  • Figure 5d is a result of measuring the affinity of a specific bipodal peptide binder binding to nAchR (Nicotinic acetylcholine receptor).
  • Figure 5e is the result of measuring the affinity of a specific bipodal peptide binder that binds to HSAOluman Serum Albumin).
  • Figure 6a is a result of measuring the absorbance of the recombinant phage having a bipodal peptide binder ELISA for a number of proteins for specificity test for pyronectin ED-B. From the left bar, results for straptavidin, ED-B, acetylcholine al, BSA, VCAM, TNF- ⁇ , thrombin, myoglobulin, lysozyme and bispartin.
  • Figure 6b is a result of measuring the absorbance of the recombinant phage having a bipodal peptide binder ELISA for a variety of proteins to test for specificity for VEGF. '
  • Figure 6c is a result of measuring the absorbance of the recombinant phage having a bipodal peptide binder ELISA for a variety of proteins for specificity test for VCAM1.
  • Figure 6d is a result of measuring the absorbance of the recombinant phage having a bipodal peptide binder ELISA for a number of proteins to test the specificity for the nAchR fragment peptide.
  • Figure 6e is a result of measuring the hop brightness by performing an ELISA for a number of proteins recombinant phage having a bipodal peptide binder to test the specificity for HSA.
  • Figure 6f is a result of measuring the absorbance of the recombinant phage having a bipodal peptide binder ELISA for a variety of proteins to test for specificity for MyD88.
  • 7 is a result of measuring the affinity for the demonstration of the synergistic effect of the bipodal temptide binder.
  • 8 is a result of measuring the affinity of the bipodal peptide binder by replacing the structural stabilization site with a variety of ⁇ -hairpin motifs instead of tryptophan zipper in the bipodal peptide binder.
  • bipodal peptide binders specific for cancer biomarker fibronectin ED-B. Over time, it appears that bipodal peptide binders accumulate in cancer. When the individual organs are separated and measured for fluorescence, they also accumulate in the cancer.
  • 11 is a result showing the effect of the intracellular targeting bipodal peptide binder to inhibit the activity of MyD88 present in the cell.
  • Figure 12a is a result of measuring the absorbance of the recombinant phage having a bipodal peptide binder ELISA for a variety of proteins for specificity test for AR-DBD.
  • FIG. 12B shows ELISA results of AR-DBD of recombinant phage recovered from biopanning of bipodal peptide binder library during Androgen receptor DNA binding domain (AR-DBD) biopanning.
  • FIG. 13A shows ELISA results for STAT3 of recombinant phage recovered from biopanning of a bipodal peptide binder library during STAT3 biopanning.
  • Figure 13b and Figure 13c is a result of measuring the absorbance of the recombinant phage having a bipodal peptide binder ELISA for a variety of proteins to test for specificity for STAT3.
  • 13B is an experimental result for Peptide KQAYYIP GSWTWENGKWTWKG LWGPEF)
  • FIG. 13C is an experimental result for Peptide2 (HGFQWP GSWTWENGKWTWKG AYQFLK).
  • Figure 13d is the result of measuring the affinity of a specific bipodal peptide binder that binds to STAT3.
  • FIG. 13E is an image showing cell delivery capacity specific for STAT3 of a bipodal peptide binder in which 01igo-9 R peptide is bound to a loop.
  • FIG. 13F is an image showing the cell delivery capacity of igo-specific R-binding peptide bound to C-terminus of 01igo-9 R peptide.
  • Figure 13g is an experimental result showing the activity inhibiting ability of the bipodal peptide binder specific for STAT3 present in the cells.
  • Figure 14 is an image showing the cell delivery capacity of the bipodal peptide binder OIigo-9 R peptide to the loop specific for AR-DBD.
  • Beta-Fl TOTATGCGGCCCAGCTGGCC (NNK) 6 GGATCTTGGACATGGGAAAACGGAAM-3 '
  • Beta-Bl 5'-TOTATGCGGCCCAGCTGGCC (NNK) 6 GGATCTTGGACATGGGAAAACGGAAM-3 '
  • N is A, T, G or C; K is G or T; M is C or A.
  • Beta-Fl 4 ⁇ , Beta-Bl 4 yM, 2.5 mM dNTP mixture 4 ⁇ , ExTaq DNA polymerase 1 / ⁇ (Takara, Seoul, Korea), and 5 ⁇ of lOxPCR buffer were mixed. A total of 25 mixtures containing distilled water were prepared.
  • E.col i XL1 BLUE cells (American Type Culture Collection, Manassas, USA) were plated on LB agar-plates. After the inoculating colonies grown in an agar plate medium in LB medium with 5 heunhap at 37 ° C at a rate of 200 rpm and incubated for one day. Cultured 10 cells were inoculated in 2 LB medium and cultured in the same manner until the absorbance was 0.3-0.4 at a wavelength of 600 nm. The incubated flask was left on ice for 30 minutes, then centrifuged at 4 ° C. at 4,000 ⁇ g for 20 minutes to remove all supernatants except the sunk cells and suspended in 1 sterile sterile distilled water.
  • Electroporation was performed by dispensing 25 phagemid vectors 12 / g and bi ⁇ dal peptide binders into 100 ⁇ which linked 2.9 / g insert DNA. Melting competent cells on ice and connecting 200 ⁇ competent cells. After mixing with solution ⁇ , it was placed in a 0.2 cm cuvette prepared for cooling and placed on ice for 1 minute. The electroporator (BioRad, Hercules, CA) was programmed at 200 ⁇ at 25 uF and 2.5 kV and the prepared cuvette was drained and placed in an electroporator and pilsed (time constant 4.5-5 msec).
  • the cells were placed in 1 l LB liquid medium containing 20 mM glucose prepared at 37 ° C., and a total of 25 ⁇ cells obtained were transferred to a 100 ra ⁇ tube. After incubation at 200 rpm at 37 ° C. for one hour, 10 ⁇ was diluted and plated in ampicillin agar medium to determine the number of libraries. The remaining cells were put in 1 LB of 20 mM glucose and 50 ⁇ g / mi 0 kpicillin and incubated at 30 ° C for one day. Centrifugation at 4 ° C.
  • Recombinant phage was produced in a bipodal peptide binder library stored at -80 ° C.
  • Ampicillin LB liquid medium of 100 to 500 flask insert the glucose of 50 and 20 mM, in the library 1 ⁇ 37 ° C for one hour by adding stored at -80 ° C heunhap at a rate of 150 rpm and incubated 1 10 11 pfu of Ex helper phage (Ig therapy, Chuncheon, Korea) was added and cultured under the same conditions for another hour. The supernatant was removed by centrifugation at l, 000Xg for 10 minutes and ampicillin ( Recombinant phages were produced by incubating for one day with 100 LB liquid medium containing 50 ig / mi) and kanamycin (25 / g / m «).
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • VCAM1 vascular cell adhes i on molecule one 1
  • Nicotinic acetylcholine receptor nAchR
  • HSA human serum albumin
  • MyD88 was prepared as follows.
  • TCATAGTCMTGCCCGGCTCCAGCCCTGTG-3 ' was synthesized and combined with EDB-F1 20 pmol, EDB-B1 20 pmol, 2.5 mM dNTP mixture 4 ⁇ , ExTaq DNA polymerase 1 ⁇ (10 U) and 10XPCR buffer 5 ⁇ in total. The mixed solution to which distilled water was added was made.
  • the common hapaek PCR reaction a by (5 minutes at 94 ° C, 30 cycles at 55 ° C 30 sec, 1 min and 30 sec at 94 ° C at 72 ° C) and then made to EDB insert using the PCR purification kit Purification by The EDB insert gene and the pET28b vector were subjected to restriction enzymes to link the EDB insert gene to the pET28b vector (Novagen). About 2 / g of insert DNA was reacted with Ba HKWB, Ipswich) and y1 ⁇ 2fe / (NEB, Ipswich) for 4 hours, and then purified using a PCR purification kit.
  • the pIGT2 phagemid vector of about 2 was reacted with BamHI and Ndel for 3 hours, and then CIAP was added and reacted for 1 hour, followed by purification using a PCR purification kit. Add them with a molar ratio of about 1: 3 to the vector and insert, connect them for 10 hours at 18 ° C using T4 DNA ligase (Bioneer, Dae j eon, Korea), and attach to XL-1 competent cells. After transformation, they were plated in agar medium containing kanamycin.
  • VEGF-Fl 5'-ATAGMTTCGCACCCATGGCAGAA-3 '
  • VEGF_B1 5' - ⁇ (; ⁇ 0 ⁇ € 0 ⁇ ( ⁇ ⁇ 0 ⁇ 0 ⁇ 0 ⁇ € -3 ') were synthesized to prepare VEGF-F1 20 pmol, VEGF-B1 20 mM dNTP mixture 4 ⁇ , ExTaq DNA
  • the polymerase 1 ⁇ (10 U) and 10XPCR buffer 5 were mixed to prepare a mixture solution in which distilled water was added to a total of 50 ⁇ .
  • the common hapaek PCR reaction a by (5 minutes at 94 ° C, 30 cycles at 55 ° C 30 sec, 1 min and 30 sec at 94 ° C at 72 ° C) and then made to VEGF inserts using the PCR purification kit Purification by The VEGF insert gene and the pET32a vector were subjected to restriction enzymes to link the VEGF insert gene to the pET32a vector (Novagen). Approximately 2 / g of insert DNA was reacted for 4 hours with ⁇ ⁇ ? / ( ⁇ , Ipswich) and HindIlKW &, Ipswich) and purified using a PCR purification kit. The molar ratio of vector to insert was about 1: 3.
  • T4 DNA ligase (Bioneer Dae j eon, Korea) was used for ligation at 18 ° C for 10 hours, transformed into XL-1 competent cells, and smeared in agar medium containing ampicillin. It was. The colonies grown on agar plate medium were inoculated in 5 LB medium and incubated for one day while mixing at a speed of 200 rpm at 37 ° C., and the plasmids were purified using a plasmid flap kit (GeneAll, Seoul, Korea). Sequencing confirmed whether cloning was successful.
  • the Korea Biotechnology Research Institute received the human VCAM1 gene. Restriction enzymes were treated with the VCAM1 insert gene and the pET32a vector to link the VCAM1 insert gene to the pET32a vector. Add them with a molar ratio of about 1: 3 to the vector and insert, connect them for 10 hours at 18 ° C using T4 DNA ligase (Bioneer, Dae j eon, Korea), and attach to XL-1 competent cells. After transformation, the cells were plated in agar medium containing ampicillin.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -D-kiogalactopyranoside
  • the resin was washed with Lysis buffer and then obtained by eluting the N-terminal His-tag ED-B protein using Illution buffer (50 mM sodium phosphate (pH 8.0), 300 mM NaCl and 300 mM imidazole).
  • Illution buffer 50 mM sodium phosphate (pH 8.0), 300 mM NaCl and 300 mM imidazole.
  • the protein thus obtained was purified by gel filtration using a Superdex75 column (GE Healthcare, United Kingdom) and PBS (pH 7.4) buffer to obtain high-purity ED-B protein.
  • Biotin was linked to ED-B protein for biopanning.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -D-kiogalactopyranoside
  • coli was dissolved using a sonicator, and then centrifuged at 15,000 Xg for 1 hour to allow the supernatant to be Ni-NTA affinity resin (Elpisbio, Dae j eon, Korea). To The resin was washed with Lysis buffer and then obtained by eluting the Trx-VEGF121 protein using Illution buffer (50 mM sodium phosphate (pH 8.0), 300 mM NaCl and 300 mM imidazole). The protein thus obtained was purified by gel filtration using a Superdex75 column (GE Healthcare, United Kingdom) and PBS (pH 7.4) buffer to obtain high purity VEGF-Trx and VCAMl-Trx proteins. VEGF121 was obtained by cutting between VEGF and Trx with thrombin to obtain pure VEGF.
  • Illution buffer 50 mM sodium phosphate (pH 8.0), 300 mM NaCl and 300 mM imidazole.
  • Illution buffer 50 mM
  • HSA was purchased from Genetex Company (Irvine).
  • Human MyD88 was purchased from Santa Cruz Biotechnology (sc-4540 WBX California).
  • a mixture of the bipodal peptide binder recombinant phage containing solution 800 ⁇ and 10% BSA 200! ⁇ was added to 20 wells that were BSA-coated with straptavidin to remove phages binding to straptavidin and BSA for 1 hour. Placed at 27 ° C. The supernatant was recovered and transferred to 20 wells combined with ED-B and nAchR and left at 27 ° C. for 45 minutes. Remove all 20 wells, wash 15 times with 0.5% PBST, and add phages of 0.2 M glycine / HCKpH 2.2) 1 ⁇ to 50 ⁇ each well for 20 minutes.
  • 10 E. coli XL1-BLUE cells were mixed and incubated at 37 ° C for 1 hour at 200 rpm. Ampicillin (50 g / m) and 20 mM glucose were mixed and then 2 ⁇ 10 10 pfu of Ex helper phage was added and incubated at 37 ° C. for 1 hour at 200 rpm.
  • the culture was centrifuged with l.OOOXg for 10 minutes, then the supernatant was removed and the precipitated cells were resuspended in 40 ra ⁇ LB liquid medium containing ampicillin (50 g / l) and kanamycin (25 g / mi ⁇ ]. Cultures were incubated for one day at 200 rpm at 30 ° C. Cultures were centrifuged at 4,000 ⁇ g, 20 min and 4 ° C. Supernatant was added to 8 ⁇ 5 ⁇ PEG / NaCl [20% PEG (w). / v) and 15% NaCKw / v)] and then left at 4 ° C. for 1 hour.
  • VEGF, VCAMl-trx, HSA and MyD 88 (5 / g /) were placed in 10 wells of 96 well ELISA plates (Corning) at 50 ⁇ , then allowed to stand overnight at 4 ° C, using 2% BSA the next day. After blocking for 2 hours at room temperature, the solution was discarded and washed three times with 0.1% PBST. In addition, the bipodal peptide binder recombinant phage containing solution 800 id and 10% BSA 200 ⁇ was mixed and transferred to 10 wells in which VEGF, VCAMl-Trx, and HSA were combined and left at room temperature for 1 hour.
  • Straptavidin was placed in 18 wells with 50 ⁇ each well and 10 g / J> BSA was placed in 9 wells with 50 ⁇ each well and left at 4 ° C. for one day. The following day, only nine wells of 18 wells with strramtadine were washed three times with 0.13 ⁇ 4 PBST (tween-20), and biotin ED-BC10 «g / m £) was added and left at room temperature for 1 hour. Then all wells were washed three times with 0.1% PBST and blocked for 2 hours at room temperature using 1% BSA diluted with PBS, then the solution was discarded and washed three times with 0.1% PBST.
  • the first, second and third input phages which are bipodal peptide binder recombinant phages, were divided into 800 ⁇ and 10% BSA 200 (iH in combination with 100 ⁇ each of 3 wells in ED-B, straptavidin and BSA wells). It was allowed to stand for 1 hour 30 minutes at 27 ° C. After washing 10 times with 0.1% PBST solution, HRP-conjugate anti-M13 antibody (GE Healthcare) was reacted with 1: 1,000 and reacted at 27 ° C. for 1 hour. After washing 5 times with 0.1% PBST, 100 ...
  • Phages recovered at the biopanning stage with the highest output phage / input phage ratio were infected with XL1-BLUE cells and plated at about 100-200 plaques per plate. Using a sterile tip, 60 plaques were inoculated in 2 LB-ampicillins (50 cultures and shaken at 37 ° C for 5 hours.
  • 0D from 0.8 to 1 by the addition of Ex helper phages of 5xi0 9 pfu heunhap at a rate of 200 rpm for one hour at 37 ° C, and were cultured.
  • Culture medium to l then centrifuged for 10 min 000Xg supernatant ampicillin the removed and the precipitated cells (50 ⁇ / ⁇ ) and kanamycin (and resuspended in LB broth for 1 a 25 comprises from 30 ° C 200
  • the cultures were incubated for one day at a rate of rpm, and the culture was centrifuged at 10,000Xg, 20 minutes, and 4 ° C.
  • Busy ssikeul amplified for each phage peptide clone solution 100 ⁇ to all wells and wash was allowed to stand for 1.5 hours at 27 ° C. With 0.1% PBST 5 times, and then the solution HRP- conjugated anti -M13 antibody ( GE Healthcare) was diluted to 1: 1,000 and reacted for 1 hour at 27 ° C. After washing 5 times with 0.1% PBST, 100MB of TMB solution was used to induce color reaction, and then 100 M of 1 M HC1 was added. Clones were stopped and absorbances were measured at 450 nm to select clones with higher absorbance compared to BSA, and their phages were infected with XL1 cells and plated to about 100-200 plaques per plate.
  • the matching primer is the vector sequence 5'-
  • MyD88 is a bipodal peptide because it is a protein present in the cell. Korea) EDC / NHS (Sigma) was used to covalently bind the bipodal peptide binder to enable cell permeation. Since the amount of MMP-13 is increased when the activity of MyD88 is activated, it is possible to determine whether the activity of MyD88 is inhibited by measuring the amount of MMP-13. Cartilage cells were treated with IL-lbeta (10 ng / ml) (R & D systems, Minneapolis), which activates the activity of MyD88.
  • chondrocytes were treated with MyD88-specific bipodal peptide binder (peptide 1 in Table 3f), mRNA was isolated after 12 hours, and RT-PCR was performed for MMP—13 and GAPDH.
  • cartilage cells were destroyed to obtain intracellular proteins, followed by Western blotting using an Anti-MMP 13 antibody (Abeam, ab3208, Cambridge) and a semi-dry transfer machine (Amersham Bioscience, Piscat away) 3 ⁇ 4 ⁇ MMP-13. The amount of was measured.
  • the structure stabilization site of the bipodal peptide binder As the structure stabilization site of the bipodal peptide binder, a stable beta-hairpin motif was used.
  • tryptophan zippers (Andrea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 98: 5578-5583 (2001)) which stabilized the beta-hairpin motif structure by the interaction of tryptophan-tryptophan amino acids were used.
  • Variable regions were created in two portions by randomly arranging six amino acids in each of the N- and C-terminal portions of the backbone tryptophan zipper (FIG. La).
  • This is called a bipodal peptide binder and has variable regions on both sides so that it can be cooperatively attached to the antigen and thus have high affinity and specificity.
  • the structure stabilization site of the bipodal peptide binder may be configured in various ways as shown in FIGS.
  • the bipodal peptide binder library was subjected to biopanning three to five times for fibronectin ED-B, VEGF, VCAM1, nAchR, and HSA proteins, and the ratio of output phage / input phage of phage peptides recovered in each panning step was determined. (Table la). [Table la]
  • Each input phage in the library of bipodal peptide binders was subjected to ELISA for ED-B, strapavidin and BSA.
  • the reaction of the first input phage is similar in absorbance for ED—B, straptavidin and BSA, but the second input From phage, ED-B absorbance was 5.1 times higher than that of straptavidin and 3.4 times higher than that of BSA.
  • ED-B absorbance was 22 times higher than that of straptavidin and 15 times higher than that of BSA, indicating that biopanning was successfully achieved for ED-B (FIG. 3 and Table 2). .
  • Example 12 Phage Peptide Screening (Phase ELISA) and Sequencing Specific for Fibronectin ED-B, VEGF, VCAM1, nAchR, HSA and MyD88
  • Phages recovered at the highest output / input ratio during the panning stage of each library were obtained in the form of plaques.
  • ELISA was performed on BSA after amplifying 60 phages from each plaque (FIG. 4). Clones with higher absorbance than BSA were selected and requested for DNA sequencing. From this a peptide sequence specific to each overlapped protein was obtained (Table 3).
  • Peptide 2 SANSLYGSWTWENG WTWKGTSRQRW
  • Example 13 Determination of affinity of fibronectin ED-B, VEGF, VCAM1, nAchR and HSA
  • peptides for fibronectin ED—B, VEGF, VCAM1, nAchR and HSA were synthesized and measured for affinity using the SPR Biacore system (Biacore AB, Uppsala, Sweden).
  • affinity for fibronectin ED-B peptide 1 was 620. nM, peptide 2 showed 75 nM and peptide 3 showed 2.5 ⁇ (FIG. 5A).
  • affinity of the fragment peptide of VCAM1 was measured and peptide 1 showed 318 nM (FIG. 5C).
  • Peptide 1 showed 73 nM of the affinity of the fragment peptide of nAchR (Fig. 5d), peptide 1 showed 115 nM of the affinity of the fragment peptide of HSA (Fig. 5e).
  • the solution was discarded and washed three times with 0.1% PBST.
  • the recombinant phage having the peptide of the present invention was well mixed with 2% BSA, dispensed into wells containing 10 proteins by 100, and left at 27 ° C. for 2 hours.
  • HRP—conjugated anti-M13 antibody (GE Healthcare) was diluted 1: 1,000 and reacted at 27 ° C. for 1 hour.
  • HCSSAV N-terminal sequence
  • IIRLEQ C-terminal sequence of Peptide2 that specifically bind ED-B to other ⁇ -hairpin skeletons GBlm3 and HP7 in addition to tryptophan zippers (Anigen, Korea). That is, the sequence of the bipodal peptide binder containing tryptophan zipper is HCSSAVGSWTWENGKWTWKGIIRLEQ, the bipodal peptide binder containing GBlm3 is HCSSAVGKKWTYNPAIXiKFTVQEGI IRLEQ, and the bipodal peptide binder including HP7 is HCSSAVGKTWNPATGKWTEG IIRLEQ.
  • HSSAV ⁇ -terminal sequences
  • IIRLEQ C-terminal sequences
  • MyD 88 (5 g /) was placed in 10 wells of a 96 well ELISA plate (Corning), and then left overnight at 4 ° C., and blocked for 2 hours at room temperature using 2% BSA the next day. The solution was discarded and washed three times with 0.1% PBST. The bipodal peptide binder recombinant phage containing solution 800 ⁇ and 10% BSA 200 ⁇ were mixed and transferred to 10 wells to which Myd88 was bound and left at room temperature for 1 hour.
  • Ampicillin 50 and 20 ⁇ glucose was mixed, then 2X1010 pfu of Ex helper phage was added and incubated at 37 ° C for 1 hour at 200 rpm. The culture was centrifuged at l, 000Xg for 10 minutes. The supernatant was then removed and resuspended in precipitated cells with Ampicillin (50 and 40 mi LB liquid medium containing kanamycin (25 g / m «), incubated at 30 ° C for 200 rpm and incubated for one day. The cultures were centrifuged at 4,000 ⁇ g, 20 min and 4 ° C.
  • Phage peptide detection specific to MyD88 protein Phage ELISA
  • HRP-conjugated anti—M13 antibody (GE Healthcare) was diluted 1: 1,000 and reacted at 27 0 C for 1 hour. After washing 5 times with 0.1% PBST, 100 ⁇ l of TMB solution was dispensed to induce color reaction, and then reaction was stopped by adding lOOul of 1M HC1. By measuring absorbance at 450 nm, clones with more than 20-fold higher absorbance of AR-DBD were selected. These phages were infected with XL1 cells and plated to 100-200 plaques per plate.
  • Plaque was inoculated into 4 ml of LB-Ampici 11 in (50ug / ml) culture using a sterilized tip, followed by shaking culture at 37 ° C for 1 day.
  • the plasmids were purified using a plasmid preparation kit for sequencing.
  • the sequencing primer used the vector sequence 5-GAT TAC GCC AAG CTT TGG AGC -3 '.
  • the bipodal-peptide binder library was biopanned 5 times for myd88 protein and the output phage / input phage ratio of the phage peptides recovered at each panning step was determined (Table 4a).
  • ELISA was performed on BSA after amplifying 60 phages from each plaque. Clones with higher absorbance than BSA were selected and requested for DNA sequencing. From this, a peptide sequence specific to each overlapped protein was obtained.
  • DBD Androgen receptor DNA binding domain
  • Total mRNA was extracted from LNCaP cells, a prostate cancer cell line, and cDNA was generated using oligo dT.
  • Two primers 5'- GAC TAT TAC ⁇ CCA CCC CA-3 '(AR_F1) and 5'-TAG TTT CAG ATT ACC AAG TTT C— 3 '(AR ⁇ Bl) was synthesized to produce 20 pmol of AR-F1, 20 pmol of AR-Bl, 2.5mM dNTP mixture 4y 1, Ex Taq DNA polymerase 1 ⁇ 1 (10 U), 10 x PCR buffer 5 ⁇ 1 was mixed and distilled water was added so that the total amount was 50 ⁇ l.
  • This mixture was prepared by AR reaction to PCR reaction (94 5 minutes, 30 cycles: 57 ° C 30 seconds and 72 0 C 1 minutes, 94 0 C 30 seconds) and purified using a PCR purification kit.
  • Two primers, 5'- TAT GGA TCC GAC TAT TAC TTT CCA CC— 3 '(AR_F1- BamHl) and 5'-ATA CTC GAG TCA TAG TTT CAG ATT ACC AAG-3' (AR_Bl-Xhol) was synthesized and mixed with 20 pmol of AR-F1, 20 pmol of AR-Bl, 4 ⁇ 1 of 2.5mM dNTP mixture, 1 ⁇ 1 of Ex Taq DNA polymerase (10 U), 5 ⁇ 1 of 10 x PCR buffer, and a total of 50 ⁇ 1.
  • the mixed solution to which distilled water was added was made. This mixture was prepared by AR reaction to PCR reaction (94 0 C 5 min, 30 cycle: 57 ° C 30 sec and 72 0 C 1 min, 94 0 C 30 sec) and purified using PCR purification kit. .
  • AR reaction to PCR reaction 94 0 C 5 min, 30 cycle: 57 ° C 30 sec and 72 0 C 1 min, 94 0 C 30 sec
  • restriction enzyme treatment was performed on the AR-DBD insert gene and the pGEX-4T-1 vector. About 2yg of insert DNA was reacted with B HI (NEB) and i / (NEB) for 4 hours and purified using a PCR purification kit.
  • Colonies grown on agar plate medium were inoculated into 5 ml of LB medium, incubated for 1 day while mixing at 200 rpm at 37 0 C, and then purified by plasmid preparation using a plasmid preparation kit. It was.
  • the pGEX_4T_l vector cloned from Androgen receptor DBD was transformed into BL21 cells and plated in ampici 11 in agar medium.
  • ImM isopropyl-pD-thiogalactopyranosidedPTG was added thereto, and the mixture was grown at 37 ° C. at 200 rpm for 8 hours. Centrifugation was performed at 4,000 g for 20 minutes to remove all supernatants except the sunk cells and resuspended in PBS buffer. Store at -80 ° C for one day, dissolve E. coli using Sonicator, and centrifuge for 1 hour at 15 ⁇ 000 g to attach supernatant to GST affinity resin. After washing the resin with PBS, N-terminal GST-AR DBD protein was collected using Elution buffer (25 mM glutathione, 50 mM Tris pH 8.8, 200 mM NaCl). The protein thus collected is subjected to gel filtration using superdex75 column and PBS (pH7.4) buffer to collect high purity GST-AR DBD protein.
  • Elution buffer 25 mM glutathione, 50 mM Tris pH 8.8, 200 mM NaCl
  • pGEX-4T-l vector itself was transformed into BL21 cells and plated in ampicillin agar medium. Colonies grown on agar plate medium were inoculated in 5ml LB medium loaded with ampicillin (25ug / ml) at a rate of 200 rpm at 37 ° C. After culturing for one day with mixing, it was transferred to 50ml ampicillin (25ug / ml) LB medium and grown for 3 hours. E. coli grown in this way was put in 2L LB ampicillin (25ug / ml), 50ml E. coli was added to 0DO.6-0.8.
  • IPTG ImM isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside
  • EMSA was performed to determine whether the purified AR-DBD binds to DNA.
  • 5'-CCA GAA CAT C GAA CAC-3 '5'-GTG TTC TTG ATG TTC TGG-3' a DNA sequence to which AR DBD binds, was synthesized. Then, a shift buffer (4 mMTris-HCl (pH7.5) , 80 mM NaCl, 0.5 mM ZnC12, 2.5 mM MgS04, 1 mM EDTA, 0.5 mM DTT, 1 lg polyCdl-dC) and 4% glycerol) were added and incubated with purified AR DBD and DNA. And retardation was confirmed by electrophoresis on agarose gel.
  • GST-AR DBD 10ug / ml
  • GST (10ug / ml) lml was placed in 96 well EL ISA plate (Corning). 50ul was added to 20wells and left overnight at 4 ° C. The next day, all 40 wells were washed three times with 0.1% PBST and blocked for 2 hours at room temperature using 2% BSA diluted with PBS. Then, the solutions were discarded and washed three times with 0.1% PBST.
  • Bipodal-peptide binder recombinant phages containing solution and 800ul 10% BSA were combined well common to 200ul was placed in 20wells BSA coating on GST to ssegeo the phage attached to the streptavidin and BSA for 1 hour, placed in a 27 0 C. The supernatant was recovered and transferred to 20 wells with GST-AR-DBD attached at 27 0 C for 45 minutes. It was political. Remove all 20 wells of solution, wash 15 times with 0.5% PBST, add 1 ml of 0.2 M glycine / HCl (pH2.2) to 50ul / each well to elute the phage for 20 minutes and collect lml on E-tube.
  • the PEG solution was completely removed, the phage peptide pellet was dissolved in 1 ml of PBS solution, and then used for secondary biopanning. The same method was used for each panning step, and the washing process was increased in steps of 0.5% PBST 25 and 35 times.
  • Each input phage of the bipodal-peptide binder library was subjected to ELISA for GST, BSA, and GST-AR-DBD.
  • All wells were washed three times with 0.1% PBST and blocked for 2 hours at room temperature using 2% BSA diluted with PBS. Then, the solutions were discarded and washed three times with 0.1% PBST.
  • HRP-conjugated anti—M13 antibody (GE Healthcare) was diluted 1: 1,000 and reacted for 1 hour at 27 ° C. After washing 5 times with 0.1% PBST, 100 ⁇ of TMB solution was dispensed to induce color reaction, and then reaction was stopped by adding lOOul of 1M HC1. By measuring absorbance at 450 nm, clones with more than 20-fold higher absorbance of AR-DBD were selected. These phages were infected with XL1 cells and plated to 100-200 plaques per plate.
  • Plaque was inoculated into 4 ml of LB-Ampici 11 in (50ug / ml) culture using a sterile tip, followed by shaking culture at 37 ° C for 1 day. Purification was commissioned. Sequencing primer was used as the vector sequence 5 ⁇ GAT TAC GCC AAG CTT TGG AGC -3 '.
  • EMSA was performed to determine whether the synthesized bipodal-peptide binder inhibits the binding of AR-DBD to DNA.
  • FITC was conjugated to the N-term of AR DBD BPB, and oligo 9R peptide, a cell permeation peptide, was conjugated to the lysine residue of the loop portion of BPB, and FITC-BPB-9R and FITC-BPB were 0.5yg for PC3 cell. Treated for 1 hour. After washing three times, the cells were fixed, and confocal microscopy confirmed that BPB had entered the cells.
  • the bipodal-peptide binder library was biopanned 5 times for AR-DBD protein and the output phage / input phage ratio of the phage peptides recovered at each panning step was determined (Table 4b).
  • ELISA was performed on AR-DBD, GST, and BSA for each input phage in the bipodal-peptide binder library.
  • the absorbance of AR-DBD, GST, and BSA was similar, but from the third input phage, ED-B absorbance was 5.1 times higher than GST and 3.4 times higher than BSA.
  • ED-B absorbance was higher than GST and BSA, indicating that biopanning was successfully performed on AR-DBD (FIG. 12A).
  • Peptide 2 GGHNIQGSWTWENGKWTWKGWQHIWG (6/20 clones)
  • EMSA was performed to determine whether the bipodal peptide binder binds to AR-DBD. As the BPB treatment concentration increased, AR-DBD gradually lost its ability to bind to DNA. This means that AR can block its ability to bind with DNA (FIG. 12C).
  • the supernatants were taken at 8 ⁇ 5 ⁇ PEG / NaCl [20% PEG (w / v) and 15 % NaCl (w / v)] was added and then left for 1 hour at 4 ° C. After centrifugation, the PEG solution was completely removed and the phage peptide pellet was dissolved in 1 PBS solution and used for secondary biopanning. The same method was used for each panning step, and the washing process was increased 20 times and 30 times (0.1% PBST), respectively.
  • BPB1 affinity was measured. Affinity was measured using Biacore X. STAT3 protein was fixed to 4000RU in pH5.5 buffer on the CM5 chip. And affinity was measured by peptide concentration 3 ⁇ 4 ⁇ , 5 ⁇ , 7.5 ⁇ . 4. Cell Delivery Experiment of Bipodal Peptide Binder Specific for STAT3
  • FITC was conjugated to N-term of STAT3 BPB1 peptide (QAYYIP GSWTWENGKWTWKG LWGPEF), and oligo 9R peptide, a cell permeation peptide, was conjugated to the lysine residue of the loop portion of BPB.
  • FITC-BPB-9R and FITC-BPB were treated in PC3 cells for 1 hour. After washing three times, the cells were fixed, and confocal microscopy confirmed that BPB had entered the cells.
  • Oligo 9R a cell-penetrating peptide
  • STAT3 BPB1 peptide QYYIP GSWTWENGKWTWKG LWGPEF
  • FITC was conjugated to the N-terminal.
  • FITC-BPB-9R and FITC-BPB were treated in PC3 cells for 1 hour. After washing three times, the cells were fixed, and confocal microscopy confirmed that BPB had entered the cells.
  • the bipodal-peptide binder library was subjected to biopanning for Stat3 protein for 4 times and the output phage / input phage ratio of phage peptides recovered at each panning step was determined (Table 4c).
  • the phage recovered in the 4th stage with the highest 0/1 ratio among the panning stages of each library was secured in the form of plaque.
  • ELISA was performed on STAT3 and streptaividin (FIG. 13A).
  • DNA sequencing of six clones with more than twice the absorbance of streptavidin showed two sequences: Peptidel: QAYYIP GSWTWENGKWTWKG LWGPEF; Peptides HGFQWP GSWTWENGKWTWKG AYQFLK
  • FIG. 13B is an experimental result for Peptide 1 (QAYYIP GSWTWENGKWTWKG LWGPEF)
  • FIG. 13C is an experimental result for Peptide2 (HGFQWP GSWTWENGKWTWKG AYQFLK).
  • SPRCBiacore X was used to measure the affinity of the bipodal peptide binder.
  • BBPl QAYYIP GSWTWENGKWTWKG LWGPEF
  • the cell penetrating peptide and FITC were added to the loop of the bipodal peptide binder and introduced into the cell through confocal microscopy. With and without OHgo-9 R peptide, a cell penetrating peptide As a result of the comparison, it was confirmed that the cell penetrating peptides effectively enter the cells (FIG. 13E).
  • STAT3-specific BPB Peptide 1; QAYYIP GSWTWENG WTWKG LWGPEF

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Abstract

본 발명은 (a) 가닥간(interstrand) 비공유결합이 형성된 패러럴(parallel), 안티패러럴(antiparallel) 또는 패러럴(parallel)과 안티패러럴(antiparallel) 아미노산 가닥들을 포함하는 구조 안정화 부위(structure stabilizing region); (b) 상기 구조 안정화 부위의 양 말단에 결합되어 있고 무작위적으로 선택된 각각 n 및 m개의 아미노산을 포함하는 타겟 결합 부위 I(target binding region I) 및 타겟 결합 부위 Ⅱ(target binding region Ⅱ); 및 (c) 상기 구조 안정화 부위 또는 상기 타겟 결합 부위에 결합된 세포막투과 펩타이드(CPP)를 포함하는 세포내 타겟분자에 특이적으로 결합하는 세포내 타겟팅(intracellular targeting) 바이포달 펩타이드 바인더, 그리고 그의 제조방법에 관한 것으로서, 본 발명의 세포 내 타겟분자에 결합하여, 의약으로서의 용도, 인 비보 분자 이미징, 인 비트로 세포 이미징 및 약물전달용 타겟팅을 하는 데 이용될 수 있으며, 에스코트 분자로도 매우 유용하게 이용될 수 있다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
세포내 타겟 결합용 바이포달 펩타이드 바인더
【기술분야】
본 발명은 세포내 타겟 결합용 바이포달 펩타이드 바인더 및 그의 제조방법에 관한 것이다.
【배경기술】
항체는 B 세포가 생산하는 혈장단백질의 일종인 면역글로불린 단백질로써 외부에서 들어온 항원의 특정부위를 특이적으로 인식하여 결합함으로써 항원을 비활성화하거나 무력화시킨다. 이러한 항원 -항체 반웅의 특이성과 고도의 친화도 및 수천만 종류의 항원을 구별할 수 있는 항체의 다양성을 웅용하여 오늘날 진단제와 치료제 등을 포함하는 많은 종류의 항체 제품이 출현하게 되었다. 현재 FDA 에서는 21 개의 단일클론항체를 승인하였으며. 리턱시맵 (Rituximab) 및 헤르셉틴 (Herceptin)과 같은 항체는 다른 치료에서 전혀 반응을 보이지 않던 환자들의 50% 이상에서 효과를 보인바 있으며 실질적으로 여러 연구에서 단일클론항체를 이용하여 림프종， 대장암 또는 유방암 등에 성공적인 임상치료를 보여주고 있다. 치료용 항체의 전체 시장 규모는 2004 년 100 억 달러 규모에서 2010 년에는 300 억 달러로 연평균 20%의 성장률을 보일 것으로 추정하고 있으며, 그 시장 규모는 기하급수적으로 증가할 것으로 추정되고 있다. 항체흩 이용한 신약개발이 활발해지는 이유는 약품의 개발기간이 짧으며 투자비용이 작고 부작용을 쉽게 예측할 수 있기 때문이다. 또한 항체는 생약이어서 인체가 거의 영향을 받지 않으며 체내에서의 반감기가 저 분자량 약품에 비하여 압도적으로 길어서 환자에게 친화적이다. 이러한 유용성에도 불구하고 인간에서 단일클론항체는 외래 항원으로 인식하여 심한 알레르기 반웅 또는 과민반응을 일으키기도 한다. 또한， 이러한 항암 기능의 ：클론 항체를— ¾상적으로 산^할 경우 생산 단가가 높기 때문에 치료제로서의 가격이 급격히 상승한다는 단점이 있으며， 항체를 배양하는 방법 및 정제 방법 등 광범위한 분야의 기술들이 각종 지적 소유권에 의해 보호받고 있기 때문에 비싼 라이센싱비를 지불해야 한다.
따라서 이 문제를 해결하기 위해서 미국을 중심으로 유럽연합에서 항체 대체 단백질 개발이 태동기에 있다. 항체 대체 단백질은 항체와 같이 불변영역과 가변영역을 가질 수 있도록 만든 재조합 단백질로 크기가 작고 안정한 단백질의 일정부분을 무작위 서열의 아미노산으로 바꾸어 라이브러리를 만들고 이를 표적물질에 대해 스크리닝을 하여 높은 친화력과 좋은 특이성을 가진 물질을 찾을 수 있다. 예를 들어 항체 대체 단백질중 아비머 (avimer)와 아피바디 (af f ibody)는 표적물질에 대해 피코몰 (picomole) 정도의 친화력을 가진 예시가 보고되어 있다. 이런 항체 대체 단백질은 크기가 작고 안정해서 암세포에 깊이 침투 가능하며 일반적으로 면역반응을 적게 일으킨다고 보고되어 있다. 그리고 무엇보다도 광범위한 항체 특허 문제에서 벗어 날 수 있으며 박테리아에서 쉽게 대량정제 할 수 있기 때문에 생산단가가 낮아 경제적으로 항체보다 큰 장점을 가진다. 현재 개발된 항체 대체 단백질은 40 개가 있으나 이 중 벤처 회사나 다국적 제약회사에서 상용화를 시도하고 있는 항체 대체 단백질은 피브로넥틴 타입 m 도메인, 리포칼린, LDLR-A 도메인， 크리스탈린， 프로테인 A, 안키린 리피트 (Ankyrin repeat), BPTI 라는 단백질을 이용하고 있으며 타겟에 대한 피코몰에서 수 나노몰정도의 높은 친화력을 가지고 있다. 그 중 애드넥틴 (Adnectin), 아비머, 쿠니츠 (Kunitz) 도메인은 현재 FDA 임상 실험이 진행 중이다.
본 발명은 지금까지의 단백질을 이용한 항체대체 단백질과는 다른 펩타이드 기반 항체대체 단백질에 초점을 맞추었다. 펩타이드는 항체에 비해 적절한 약물동력학， 대량생산성， 낮은 독성， 항원성 억제 및 낮은 생산 단가 등으로 인해 현재 항체 치료제를 대체하여 다양하게 활용되고 있다. 치료용 약으로서의 펩타이드의 장점은 생산 단가가 낮고, 안전성 및 반응성이 높으며 , 특허 로얄티가 상대적으로 저렴하고， 원하지 않는 면역시스템에 덜 노출되어 펩타이드 자체에 대한 항체 생산을 억제 할 수 있으며， 합성을 통한 변형이 쉽고 정확하다는 것이다, 그러나 대부분의 펩타이드는 항체에 비해 특정 단백질 타¾에 대해 낮은 친화력 및 특이성을 보이기 때문에 여러 웅용분야에 사용되지 못하는 단점이 있다. 따라서， 펩타이드의 단점을 극복할 수 있는 새로운 펩타이드 기반 항체 대체 단백질 개발에 대한 요구가 당업계에 대두되고 있다. 이에 본 발명자들은 생물학적 타겟 분자에 높은 친화성으로 특이적 결합이 가능한 펩타이드 물질을 개발하고자 노력하였다. 이는 현재 매우 많은 타겟에 대해 보고된 낮은 친화력를 가진 펩타이드를 이용하여 빠른 시간안에 높은 친화성 및 특이성을 가진 신약후보를 만들 수 있는 기술이 될 것으로 기대된다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】
본 발명자들은 인 비트로， 액스 비보 포는 인 료에서 세포에 처리하는 경우 세포 내 타겟 분자에 효율적으로 타겟팅할 수 있는 펩타이드 물질을 개발하고자 노력하였다. 그 결과， 비교적 리지드 (rigid)한 펩타이드 골격을 가지는 구조안정화 부위의 양 말단에 무작위적 (random)으로 펩타이드를 결합시키고， 이 펩타이드에 세포막 투과 펩타이드 (CPP)를 결합시키는 경우에는 세포내 타겟 분자를 효과적으로 타겟팅 할 수 있는 바이포달 템타이드 바인더를 얻을 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 세포내 타겟분자에 특이적으로 결합하는 세포내 타겟팅 (intracellular targeting) 바이포달 펩타이드 바인더 (bipodal-peptide binder)의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 세포내 타겟분자에 특이적으로 결합하는 세포내 타겟팅 (intracellular targeting) 바이포달 펩타이드 바인더를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 세포내 타겟분자에 특이적으로 결합하는 세포내 타겟팅 (intracellular targeting) 바이포달 펩타이드 바인더를 코딩하는 핵산 분자를 제공하는 데 있다. 본 발명의 다른 목적은 세포내 타겟분자에 특이적으로 결합하는 세포내 타겟팅 (intracellular targeting) 바이포달 펩타이드 바인더의 발현용 백터를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 세포내 타겟분자에 특이적으로 결합하는 세포내 타겟팅 (intracellular targeting) 바이포달 펩타이드 바인더의 발현용 백터를 포함하는 형질전환체를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명， 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
【기술적 해결방법】
본 발명의 일 양태에 따르면， 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 세포내 타겟분자에 특이적으로 결합하는 세포내 타겟팅 (intracellular targeting) 바이포달 펩타이드 바인더 (bipodal peptide binder)의 제조방법을 제공한다:
(a) (i) 가닥간 (interstrand) 비공유결합이 형성되는 패러럴 (paral lei )， 안티패러럴 (antiparallel) 또는 패러럴 (paral lei)과 안티패러럴 (antiparallel) 아미노산 가닥들을 포함하는 구조 안정화 부위 (structure stabilizing region); (ii) 상기 구조 안정화 부위의 양 말단에 결합되어 있고 무작위적으로 선택된 각각 n 및 m 개의 아미노산을 포함하는 타겟 결합 부위 Ktarget binding region I) 및 타겟 결합 부위 Π (target binding region Π)를 포함하는 바이포달 펩타이드 바인더의 라이브러리를 제공하는 단계;
(b) 상기 라이브러리와 타겟을 접촉시키는 단계 ;
(c) 상기 타겟과 결합된 바이포달 펩타이드 바인더를 선택하는 단계; 및
(d) 상기 선택된 바이포달 펩타이드 바인더에 세포막투과 펩타이드 (CPP)를 결합시키는 단계.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 가닥간 (inter st rand) 비공유결합이 형성된 패러럴 (parallel), 안티패러럴 (antiparallel) 또는 패러럴 (parallel)과 안티패러럴 (antiparallel) 아미노산 가닥들을 포함하는 구조 안정화 부위 (structure stabilizing region); (b) 상기 구조 안정화 부위의 양 말단에 결합되어 있고 무작위적으로 선택된 각각 η 및 m 개의 아미노산을 포함하는 타겟 결합 부위 I (target binding region I) 및 타겟 결합 부위 Π (target binding region Π); 및 (c) 상기 구조 안정화 부위 또는 상기 타겟 결합 부위에 결합된 세포막투과 펩타이드 (CPP)를 포함하는 세포내 타겟분자에 특이적으로 결합하는 세포내 타겟팅 (intracellular targeting) 바이포달 펩타이드 바인더를 제공한다.
본 발명자들은 인 비트로， 액스 비보 포는 인 트^에서 세포에 처리하는 경우 세포 내 타겟 분자에 효율적으로 타겟팅할 수 있는 펩타이드 물질을 개발하고자 노력하였다. 그 결과， 비교적 리지드 (rigid)한 펩타이드 골격을 가지는 구조안정화 부위의 양 말단에 무작위적 (random)으로 펩타이드를 결합시키고， 이 펩타이드에 세포막 투과 펩타이드 (CPP)를 결합시키는 경우에는 세포내 타겟 분자를 효과적으로 타겟팅 할 수 있는 바이포달 템타이드 바인더를 얻을 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 기본적인 전략은 리지드한 펩타이드 골격의 양 말단에 타겟에 결합되는 펩타이드를 연결하는 것이다. 이 경우 리지드한 펩타이드 골격은 바이포달 펩타이드 바이더의 전체적인 구조를 안정화시키는 작용을 하며， 타겟 결합 부위 I 및 타겟 결합부위 Π가 타겟 분자에 결합되는 것을 강화시킨다.
본 발명에서 이용 가능한 구조안정화 부위는 패러럴， 안티패러럴 또는 패러럴과 안티패러럴 아미노산 가닥들을 포함하며， 가닥간 (interstrand) 수소결합, 정전기적 상호작용， 소수성상호작용， 반데르 발스 상호작용， 파이 -파이 상호작용, 양이온 -파이 상호작용 또는 이들의 조합에 의한 비공유결합이 형성되는 단백질 구조 모티프들을 포함한다ᅳ 가닥간 수소결합， 정전기적 상호작용, 소수성상호작용， 반데르 발스 상호작용， 파이 -파이 상호작용, 양이온 -파이 상호작용 또는 이들의 조합에 의한 형성되는 비공유결합은 구조안정화 부위의 견고성 (rigidity)에 기여한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 구조안정화 부위에서의 가닥간 (interstrand) 비공유결합은 수소결합， 소수성상호작용， 반떼르 발스 상호작용， 파이 -파이 상호작용 또는 이들의 조합을 포함한다 ^
선택적으로， 구조화안정화 부위에 공유결합이 있을 수 있다. 예를 들어， 구조화안정화 부위에 이황화결합을 형성시켜 구조안정화 부위의 견고성을 더 증가시킬 수 있다. 이러한 공유결합에 의한 견고성 증가는 바이포달 펩타이드 바인더의 타겟에 대한 특이도 및 친화도를 고려하여 부여한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 구조 안정화 부위의 아미노산 가닥들은 링커로 연결되어 있다. 본 명세서에서 가닥을 언급하면서 사용되는 용어 "링커" 는 가닥과 가닥을 연결시켜 주는 물질을 의미한다. 예컨대， 구조안정화 부위로서 β-헤어핀이 이용되는 경우에는 β-헤어핀에 있는 턴 서열이 링커의 역할을 하며， 루이신 지퍼가 이용되는 경우에는 루이신 지퍼의 두 C-말단을 연결하는 물질 (예컨대, 펩타이드 링커)이 링커의 역할을 한다.
링커는 패러럴, 안티패러럴 또는 패러럴과 안티패러럴 아미노산 가닥들을 연결한다. 예컨대， 패러럴 방식으로 정렬된 최소 2개의 가닥 (바람직하게는 2개의 가닥)， 안티패러럴 방식으로 정렬된 최소 2개의 가닥 (바람직하게는 2개의 가닥)， 패러럴 및 안티패러럴 방식으로 정렬된 최소 3 개의 가닥 (바람직하게는 3 개의 가닥)을 링커가 연결하게 된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 링커는 턴 서열 또는 펩타이드 링커이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면ᅳ 상기 턴 서열은 β-턴， γ—턴， α- 턴， π-턴 또는 ω— loop 이다 (Venkatachalam CM (1968), Biopolymers, 6， 1425- 1436； Nemethy G and Print z MP. (1972)， Macromolecules, 5， 755-758； Lewis PN et al. , (1973), Biochim. Biophys. Acta, 303， 211-229； Toniolo C. (1980) CRC Crit. Rev. Biochem. , 9, 1-44； Richardson JS. (1981), Adv. Protein Chem. , 34， 167-339； Rose GD et al . , (1985)， Adv. Protein Chem., 37, 1-109； Mi lner— White EJ and Poet R. (1987), TIBS, 12， 189-192； Wilmot CM and Thornton JM. (1988), J. Mo J. Biol., 203, 221-232； Milner-White EJ. (1990), J. Mol . Biol. , 216， 385-397； Pavone V et al . (1996)， Biopolymers, 38, 705-721； Rajashankar KR and Ramakumar S. (1996), Protein Sci. , 5, 932-946). 가장 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 턴 서열은 β-턴아다.
턴 서열로서 β-턴이 이용되는 경우， 바람직하게는 타입 I， 타입 , 타입 Π， 타입 Π', 타입 m 또는 타입 ΠΓ 턴 서열이고， 보다 바람직하게는 타입 I， 타입 1'， 타입 Π， 타입 Π ' 턴 서열이고， 보다 더 바람직하게는 타입 Γ 또는 타입 Π ' 턴 서열이며, 가장 바람직하게는 타입 Γ 턴 서열이다 (B. L. Sibanda et al., J. Mo J. Biol. , 1989, 206, 4, 759-777； B. L. Sibanda et al . , Methods Enzymol. , 1991, 202， 59—82).
본 발명의 다른 바람직한 구현예에 따르면， 본 발명에서 턴 서열로서 이용될 수 있는 것은 H. Jane Dyson et al . , Eur. J. Biochem. 255:462- 471(1998)에 개시되어 있으며， 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 턴 서열로 이용될 수 있는 것은 다음의 아미노산 서열을 포함한다: X— Pro-Gly-Glu- Val; Ala-X-Gly-Glu-Val (X는 20개의 아미노산으로부터 선택된다).
본 발명의 일 구현예에 따라, 구조안정화 부위로서 β-쉬트 또는 루이신 지퍼가 이용되는 경우, 패러럴 방식으로 정렬된 2 개의 가닥 또는 안티패러럴 방식으로 정렬된 2개의 가닥을 펩타이드 링커가 연결하는 것이 바람직하다.
펩타이드 링커는 당업계에 공지된 어떠한 것도 이용 가능하다. 적합한 펩타이드 링커의 서열은 다음과 같은 요소를 고려하여 선택될 수 있다: (a) 유연한 연장된 컨포메이션 (flexible extended conformation)에 적용될 수 있는 능력; (b) 생물학적 타겟 분자와 상호작용 하는 이차구조를 생성하지 않는 능력; 및 (c) 생물학적 타겟 분자와 상호작용하는 소수성 잔기 또는 전하를 갖는 잔기의 부재. 바람직한 펩타이드 링커는 Gly, Asn 및 Ser 잔기를 포함한다. Thr 및 Ala 과 같은 다른 중성 아미노산들도 링커 서열에 포함될 수 있다. 링커에 적합한 아미노산 서열은 Maratea et al., Gene 40： 39-46 ( 1985)； Murphy et al . , Proc. Natl. Acad Sci. USA 83:8258-8562(1986)； 미국 특허 제 4，935，233 호, 제 4,751,180호 및 제 5,990,275호에 개시되어 있다. 펩타이드 링커 서열은 1-50 아미노산 잔기로 구성될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 구조안정화 부위는 헤어핀， β- 헤어핀， 베타 -턴, 링커로 연결된 β-쉬트 또는 링커로 연결된 루이신 지퍼이고, 보다 바람직하게.는 구조안정화 부위는 β—헤어핀 또는 링커로 연결된 β-쉬트이며， 가장 바람직하게는 β-헤어핀이다.
본 명세서에서 용어 "β-헤어핀" 은 두 개의 β
Figure imgf000009_0001
포함한는 간 _ 간단한 단백질 모티프를 의미하며, 이 두 개의 β 가닥은 서로 안티패러럴한 정렬을 나타낸다. 이 β-헤어핀에서 두 개의 β 가닥은 일반적으로 턴 서열에 의해 연결된다.
바람직하게는， β-헤어핀에 적용되는 턴 서열은 타입 I， 타입 Γ, 타입 Π， 타입 Π'， 타입 ΙΠ 또는 타입 ΠΓ 턴 서열이고， 보다 바람직하게는 타입 I, 타입 I', 타입 Π, 타입 Π' 턴 서열이고， 보다 더 바람직하게는 타입 Γ 또는 타입 Π' 턴 서열이며, 가장 바람직하게는 타입 Γ 턴 서열이다. 또한, X-Pro- Gly-Glu-Val; 또는 Ala—X-Gly-Glu—Val (X 는 20 개의 아미노산으로부터 선택된다)으로 표시되는 턴 서열도 β-헤어핀에 이용될 수 있다.
본 발명의 예시적인 실시예에 따르면， 타입 I 턴 서열은 Asp-Asp-Ala- Thr-Lys-Thr 이고, 타입 Γ 턴 서열은 Glu— Asn-Gly-Lys 이며, 타입 Π 턴 서열은 X-Pro-Gly-Glu-Val； 또는 Ala-X-Gly-Glu-Val (X 는 20 개의 아미노산으로부터 선택된다)이고， 타입 Π' 턴 서열은 Glu-Gly-Asn-Lys 또는 Glu-D-Pro-Asn- Lys이다.
β-헤어핀 콘포메이션을 갖는 펩타이드는 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어， 미국 특허 제 6,914,123 호 및 Andrea G. Cochran et al., PNAS, 98(10) :5578-5583)에 개시되어 있는 트립토판 지퍼, W0 2005/047503 에 개시되어 있는 주형-고정된 β-헤어핀 미멕틱， 미국 특허 제 5,807,979 호에 개시되어 있는 β-헤어핀 변형체들이 잘 알려져 있다. 이외에도, β-헤어핀 콘포메이션을 갖는 펩타이드는 Smith & Regan (1995) Science 270： 980-982； Chou & Fassman (1978) Annu. Rev. Biochem. 47:251-276; Kim & Berg (1993) Nature 362:267-270; Minor & Kim (1994) Nature 367:660-663; Minor & Kim (1993) Nature 371:264-267； Smith et al. Biochemistry (1994) 33:5510-5517； Searle et al. (1995) Nat. Struct. Biol. 2:999-1006； Haque & Gellman (1997) J. Am. Chem. Soc. 119:2303- 2304； Blanco et al. (1993) J. Am. Chem. Soc. 115:5887-5888; de Alba et al. (1996) Fold. Des. 1: 133-144； de Alba et al. (1997) Protein Sci . 6:2548- 2560； Ramirez-Alvarado et al. (1996) Nat. Struct. Biol. 3:604—612; St anger & Gellman (1998) J. Am. Chem. Soc. 120:4236-4237; Maynard & Searle (1997) Chem. Commun. 1297-1298； Griffiths-Jones et al . (1998) Chem. Commun. 789-790； Maynard et al. (1998) J. Am. Chem. Soc. 120:1996—2007; 및 Blanco et al . (1994) Nat. Struct. Biol. 1： 584-590 에 개시되어 있으며， 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
β_헤어핀 콘포메이션을 갖는 펩타이드를 구조안정화 부위로 이용하는 경우, 가장 바람직하게는 트립토판 지퍼를 이용한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 본 발명에서 미용되는 트립토판 지퍼는 다음 일반식 I로 표시된다:
일반식 I
¾— Trp(X2 )¾- — ¾(Χ ' 2)¾-Χ7
Xi은 Ser 또는 Gly-Glu 이고， X2 및 X'2는 서로 독립적으로 Thr, His, Val, He, Phe 또는 Tyr 이며， X3는 Trp 또는 Tyr 이고， 는 타입 I， 타입 Γ, 타입 Π, 타입 Π' 또는 타입 m 또는 타입 ΠΓ 턴 서열이고 ¾ 는 Trp 또는 Phe이며， ¾는 Trp또는 Val이고， X7는 Lys 또는 Thr— Glu이다.
보다 바람직하게는， 상기 일반식 I 에서 ¾은 ser 또는 Gly-Glu 이고， X2 및 X'2는 서로 독립적으로 Thr, His또는 Val이며， ¾는 Trp또는 Tyr이고， X4는 타입 I， 타입 1'， 타입 Π 또는 타입 Π' 턴 서열이고， ¾는 Trp또는 Phe 이며， ¾는 Trp또는 Val이고， X7는 Lys또는 Thr-Glu이다.
보다 더 바람직하게는， 일반식 I에서 ¾은 Ser 또는 Gly-Glu이고， ¾ 및 X'2는 서로 독립적으로 Thr, His 또는 Val 이며， ¾는 Trp 이고, X4는 타입 I， 타입 1'， 타입 Π 또는 타입 Π' 턴 서열이고， ¾는 Trp 이며， ¾는 Trp 이고， X7는 Lys 또는 Thr-Glu이다.
보다 더욱 더 바람직하게는， 일반식 I 에서 ¾은 Ser 이고， ¾ 및 X'2는
Thr 이며， ¾ 는 Trp 이고， 는 타입 Γ 또는 타입 Π' 턴 서열이고， ¾ 는 Trp이며 , ¾는 Trp이고， X7는 Lys이다.
가장 바람직하게는， 일반식 I에서 ¾은 Ser이고， ¾ 및 X'2는 Thr이며， ¾는 Trp 이고, 는 타입 Γ 턴 서열 (ENGK) 또는 타입 Π ' 턴 서열 (EGNK)이고, ¾는 Trp이며 , ¾는 Trp이고， X7는 Lys이다.
본 발명에 적합한 트립토판 지퍼의 예시적인 아미노산 서열은 서열목록 제 1서열 내지 제 3서열 및 제 5서열 내지 제 10서열에 기재되어 있다. 본 발명에서 구조안정화 부위로서 이용가능한 β-헤어핀 펩타이드는 단백질 G의 B1도멘인으로부터 유래된 펩타이드 즉 GB1 펩타이드이다.
본 발명에서 GB1 펩타이드가 이용되는 경우, 바람직하게는 구조안정화 부위는 다음 일반식 Π로 표시된다:
일반식 Π
Xi-Trp-X2-Tyr-X3-Phe-Thr-Va 1 -
Xi은 Arg, Gly-Glu 또는 Lys-Lys 이고, ¾는 Gin 또는 Thr 이며， ¾는 타입 I， 타입 r， 타입 π， 타입 π' 또는 타입 m또는 타입 nr 턴 서열이고, 는 Gin, Thr-Glu또는 Gln-Glu이다.
보다 바람직하게는， 일반식 π의 구조안정화 부위는 다음 일반식 π'으로 표시된다:
일반식 Π
Xi-Trp-Thr— Tyr— X2-Phe_Thr-Va 1 _¾
Xi은 Gly-Glu또는 Lys-Lys 이고, X2는 타입 I， 타입 Γ, 타입 Π, 타입 Π' 또는 타입 m또는 타입 ΠΓ 턴 서열이고， ¾는 Thr-Glu또는 Gln-Glu이다.
본 발명에 적합한 GB1 β-헤어핀의 예시적인 아미노산 서열은 서열목록 제 4서열 및 제 14서열 내지 제 15서열에 기재되어 있다.
본 발명에서 구조안정화 부위로서 이용 가능한 β-헤어핀 펩타이드는 HP 펩타이드이다. 본 발명에서 HP 펩타이드가 이용되는 경우， 바람직하게는 구조안정화 부위는 다음 일반식 m으로 표시된다:
일반식 m
Xi-X2-X3- r -X4-X5-Thr-X6-X7
Xi은 Lys 또는 Lys-Lys 이고， X2는 Trp 또는 Tyr 이고， ¾는 Val 또는 Thr 이며， ¾는 타입 I, 타입 Γ, 타입 Π, 타입 Π' 또는 타입 ΠΙ 또는 타입 ΠΓ 턴 서열이고， ¾는 Trp 또는 Ala 이며， ¾는 Trp 또는 Val 이고, X7은 Glu또는 Gln-Glu이다.
본 발명에서 구조안정화 부위로선 이용 가능한 또 다른 β-헤어핀 펩타이드는 다음 일반식 IV로 표시된다:
일반식 IV
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¾은 Lys-Thr 또는 Gly이고， X2는 Trp 또는 Tyr이고， X3는 타입 Iᅳ타입 1'， 타입 Π， 타입 Π' 또는 타입 m 또는 타입 ΠΓ 턴 서열이고， 는 Thr-Glu 또는 Gly이다.
일반식 III 및 IV 의 β-헤어핀의 예시적인 아미노산 서열은 서열목록 제 11서열 내지 제 12서열, 제 15서열 및 제 16서열 내지 제 19서열에 기재되어 있다.
본 발명에 따르면， 구조안정화 부위로서 헤어핀 (알파-헤어핀， 베타- 헤어핀， 감마-헤어핀， Ρ-헤어핀 등)이 이용될 수 있다. 또한， 본 발명에 따르면, 구조안정화 부위로서 베타 -턴이 이용될 수 있다.
본 발명에 따르면， 구조안정화 부위로서 링커로 연결된 β-쉬트를 이용할 수 있다. β-쉬트 구조에서 패러럴 또는 안티패러럴한, 바람직하게는 안티패러럴한 두 개의 아미노산 가닥이 뻗은 구조 (extended form)로 되어 있으며， 아미노산 가닥사이에 수소 결합이 형성된다.
β-쉬트 구조에서 두 개의 아미노산 가닥의 인접한 두 말단은 링커에 의해 연결된다. 링커로서는 상술한 다양한 턴 -서열 또는 펩타이드 링커가 이용될 수 있다. 턴-서열이 링커로 이용되는 경우, -턴 서열이 가장 바람직하다..
본 발명의 다른 변형예에 따르면, 구조안정화 부위로서 루이신 지퍼 또는 링커로 연결된 루이신 지퍼가 이용될 수 있다. 루이신 지퍼는 패러럴한 2 개의 α-사슬의 다이머화를 야기하는 보존성 펩타이드 도메인이며， 일반적으로 유전자 발현에 관여하는 단백질에 발견되는 다이머화 도메인이다 ("Leucine scissors". Glossary of Biochemistry and Molecular Biology (Revised) . (1997) . Ed. David M. Gl ick. London： Portland Press; Landschulz WH, et al . (1988) Science 240:1759-1764). 루이신 지퍼는 일반적으로 헵태드 (heptad) 반복 서열을 포함하며， 루이신 잔기가 4 번째 또는 5 번째에 위치해 있다. 예를 들어， 본 발명에 이용될 수 있는 루이신 지퍼는 LEALKEK, LKALEKE, LKKLVGE, LED VEE, LENEVAR 또는 LLSKNYH 의 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명에서 이용 1_는_ 루이신 지 ¾의 구체적인 예를 서열목록 제 39 서열에 기재되어 있다. 루이신 지퍼의 각각의 반은 짧은 α-사슬로 이루어져 있으며, α-사슬간의 직접적인 루이신 접촉이 있다. 전사인자에 있는 루이신 지퍼는 일반적으로 소수성 루이신 지퍼 부위 및 염기성 부위 (DNA 분자의 주 그루브와 상호작용하는 부위 )로 이루어져 있다. 본 발명에서 루이신 지퍼가 이용되는 경우에는 염기성 부위는 반드시 필요로 하지 않는다. 루이신 지퍼 구조에서 두 개의 아미노산 가닥 (즉， 두 개의 α-사슬)의 인접한 두 말단은 링커에 의해 연결될 수 있다. 링커로서는 상술한 다양한 턴 -서열 또는 펩타이드 링커가 이용될 수 있으며， 바람직하게는 루이신 지퍼의 구조에 영향을 미치지 않는 펩타이드 링커가 이용된다.
상술한 구조안정화 부위의 양 말단에는 무작위 아미노산서열이 결합된다. 상기 무작위 아미노산 서열이 타켓 결합 부위 I 및 타겟 결합 부위 Π를 형성한다. 본 발명의 가장 큰 특징 중 하나는, 구조안정화 부위의 양쪽 말단에 타겟 결합 부위 I 및 타겟 결합 부위 π를 연결하여 바이포달 방식으로 펩타이드 바인더를 제작하는 것이다. 타겟 결합 부위 I 및 타겟 결합 부위 Π는 서로 협동적으로 (cooperatively) 타겟에 결합함으로써, 타겟에 대한 친화도를 크게 증가시킨다.
타겟 결합 부위 I 의 아미노산 개수 n 은 특별하게 제한되지 않으며， 바람직하게는 2-100 의 정수， 보다 바람직하게는 2-50 의 정수， 보다 더욱 더 바람직하게는 2-20의 정수, 가장 바람직하게는 3-10의 정수이다.
타겟 결합 부위 Π의 아미노산 개수 m 은 특별하게 제한되지 않으며， 바람직하게는 2-100 의 정수, 보다 바람직하게는 2-50 의 정수， 보다 더욱 더 바람직하게는 2-20의 정수， 가장 바람직하게는 3-10의 정수이다.
타겟 결합부위 I 및 타겟 결합부위 Π에는 서로 각각 다른 또는 동일한 개수의 아미노산 잔기가 포함될 수 있다. 타겟 결합 부위 I 및 타겟 결합 부위 Π에는 서로 각각 다른 또는 동일한 아미노산 서열이 포함될 수 있으며, 바람직하게는 서로 각각 다른 아미노산서열이 포함된다.
타켓 결합 부위 I 및 /또는 타겟 결합 부위 Π에 포함되는 아미노산 서열은 선형의 아미노산 서열 또는 환형의 아미노산 서열이다. 타겟 결합 부위의 펩타이드 서열의 안정성을 증가시키기 위하여, 타겟 결합 부위 I 및 /또는 결합 부위 Π에 포함되는 아미노산 서열 중에서 적어도 하나의 아미노산 잔기는 아세틸기， 플루오레닐 메록시 카르보닐기， 포르밀기， 팔미토일기 미리스틸기， 스테아릴기 또는 폴리에틸렌글리콜 (PEG)로 변형될 수 있다.
생물학적 타겟 분자에 결합되는 본 발명의 바이포달 펩타이드 바인더는 생체 내 생리학적 반응의 조절， 생체 내 물질의 검출， 인 비보 분자 이미징, 인 비트로 세포 이미징 및 약물전달용 타겟팅을 하는 데 이용될 수 있으며， 에스코트 분자로도 이용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 구조 안정화부위， 타겟 결합 부위 I 또는 타겟 결합 부위 Π(보다 바람직하게는, 구조안정화 부위， 보다 더 바람직하게는 구조안정화 부위의 링커)에 추가적으로 기능성 분자가 결합되어 있다. 상기 기능성 분자의 예는 검출가능한 신호를 발생시키는 레이블， 화학약물, 바이오약물, 세포막투과 펩타이드 (CPP) 또는 나노입자를 포함하나， 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 검출가능한 신호를 발생시키는 레이블은 T1 조영물질 (예컨대， Gd 킬레이트 화합물), T2 조영물질 (예컨대， 초상자성 물질 (예: 마그네타이트， Fe304, Y-Fe203) 망간 페라이트， 코발트 페라이트 및 니켈 페라이트))， 방사성 동위 원소 (예컨대， ， 150, 13N, P32, S35, 44Sc, 45Ti, 118I, 136La, 198T1 , 200T1， 205Bi 및 206Bi), 형광물질 (플루오리신 (fluorescein), 피코에리트린 (phycoerythrin), 로다민， 리사민 (lissamine), 그리고 Cy3 와 Cy5), 화학발광단， 자기입자， 매스 표지 또는 전자밀집입자를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 화학약물은 예를 들어， 항염증제, 진통제, 항관절염제， 진경제， 항우울증제， 항정신병약물， 신경안정제， 항불안제， 마약길항제, 항파킨스질환 약물， 콜린성 아고니스트, 항암제， 항혈관신생억제제, 면역억제제， 항바이러스제， 항생제， 식욕억제제， 진통제， 항콜린제， 항히스타민제, 항편두통제, 호르몬제， 관상혈관, 뇌혈관 또는 말초혈관 확장제， 피임약， 항혈전제, 이뇨제, 항고혈압제, 심혈관질환 치료제， 미용성분 (예컨대, 주름개선제， 피부노화 억제제 및 피부미백제) 등을 포함하나， 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 바이오약물은 인슐린, IGF-K insulin-like growth factor 1)， 성장호르몬, 에리쓰로포이에틴, G-CSFs (granulocyte-colony stimulating factors) , GM-CSFs (granulocyte/macrophage— colony stimulating factors) , 인터페론 알파， 인터페론 베타， 인터페론 감마， 인터루킨 -1 알파 및 베타， 인터루킨 -3， 인터루킨 -4， 인터루킨 -6, 인터루킨 -2， EGFs (epidermal growth factors) , 칼시토닌 (calcitonin) , ACTH (adrenocorticotropic hormone) , TNF (tumor necrosis factor) , 아토비스반 (atobisban)， 부세레린 (buserelin)， 세트로렉릭스 (cetrorelix), 데스로레린 (deslorelin)， 데스모프레신 (desmopressin) , 디노르핀 A (dynorphin A) (1-13)， 엘카토닌 (elcatonin) , 엘레이도신 (eleidosin) , 엡티피바타이드 (eptif ibatide)， GHRH— 11 (growth hormone releasing hormone一 II), 고나도레린 (gonadorelin), 고세레린 (goserelin), 히스트레린 (histrelin), 류프로레린 (leuprorelin), 라이프레신 ( lypressin)， 옥트레오타이드 (octreotide)， 옥시토신 (oxytocin), 피트레신 (pitressin)， 세크레틴 (secret in) , 신칼라이드 (sincalide), 테르리프레신 (terl ipressin) , 티모펜틴 (thymopentin)， 티모신 (thymosine) αΐ, 트리프토레린 (triptorelin), 바이발리루딘 (bivalirudin)， 카르베토신 (carbetocin), 사이클로스포린， 액세딘 (exedine) , 란레오타이드 (lanreotide)， LHRH (luteinizing hormone—releasing hormone) , 나파레린 (nafarelin), 부갑상선 호르몬， 프람린타이드 (pramlintide), T-20 (enfuvirtide), 타이말파신 (thymalfasin) , 지코노타이드, RNA, DNA, cDNA, 안티센스 을리고뉴클레오티드 및 siRNA 가 될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
타겟 결합 부위 I 및 /또는 타겟 결합 부위 Π는 다양한 타겟에 결합하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 바이포달 펩타이드 바인더에 의해 타겟팅 될 수 있는 것은, 생화학물질， 펩타이드， 폴리펩타이드， 핵산， 탄수화물， 지질, 세포 및 조직과 같은 생물학적 타겟， 화합물， 금속 또는 비금속 물질을 포함하며， 바람직하게는 생물학적 타겟이다.
타겟 결합 부위가 결합하는 생물학적 타겟은， 바람직하게는 생화학물질, 펩타이드， 플리펩타이드， 당단백질,핵산， 탄수화물， 프로테오글리칸, 지질 또는 당지질이다.
예를 들어， 타겟 결합 부위가 결합하는 생화학물질은 다양한 생체 내 대사산물 (예컨대, AT^ NADH， NADPH , 탄수화물 대사산물，—짓질 대사산 '및 아미노산 대사산물)을 포함한다. 타겟 결합 부위가 결합하는 예시적인 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 효소， 리간드 , 수용체 , 바이오마커 , 호르몬 , 전사인자， 성장인자 , 면역글로블린 , 신호전달단백질， 결합단백질， 이온 채널， 항원， 부착단백질， 구조단백질, 조절단백질, 독소단백질, 사이토카인 및 혈액 웅고 인자를 포함하나 , 이에 한정되지 않는다. 보다 상세하게는， 바이포달 펩타이드 바인더의 타겟은
Fibronectin extra domain B(ED-B) , VEGFCvascular endothel ial growth factor) , VEGFR( vascular endothel ial growth factor receptor) , VCAMK vascular cell adhesion molecule— 1), nAchR(Nicotinic acetylcholine receptor) , HSA( Human serum albumin) , MyD88 , EGFR(Epi dermal Growth Factor Receptor) , HER2/neu, CD20, CD33, CD52, EpCAM (Epithelial Cell Adhesion Molecule), TNF- a (Tumor Necrosis Factor— a), IgE (Immunoglobulin E) , CD11A ( a -chain of lymphocyte funct ionᅳ associated antigen 1), CD3, CD25, Glycoprotein Ilb/IIIa, 인테그린， AFP(Alpha-fetoprotein) , (Beta2-microglobul in) , BTA(B ladder Tumor
Antigens), NMP22, Cancer Antigen 125, Cancer Antigen 15-3, 칼시토닌， Carcinoembryonic Antigen, Chromogranin A, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체， Human Chorionic Gonadotropin, Neuron-Specific Enolase, PSA(Prostate- Specif ic Antigen) , PAP(Prostat ic Acid Phosphatase) 및 Thyroglobul in 을 포함하나， 이에 한정되는 것은 아니다.
타겟 결합 부위가 결합하는 예시적인 핵산 분자는 gDNA, mRNA, cDNA, rRNA(ribosomal RNA), rDNA(ribosomal DNA) 및 tRNA 를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 타겟 결합 부위가 결합하는 예시적인 탄수화물은 세포 내 탄수화물로서, 단당류, 이당류, 삼당류 및 다당류를 포함하나， 이에 한정되는 것은 아니다. 타겟 결합 부위가 결합하는 예시적인 지질은， 지방산， 트리아실글라이세를, 스핑고지질， 강글리오사이드 및 콜레스테롤를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 바이포달 펩타이드 세포 내 생체 분자 (예컨대, 단백질)에 결합하여 생체 분자의 활성을 조절할 수 있다.
바람직하게는， 상기 세포막투과 펩타이드 (CPP)는 구조 안정화 부위에— 결합되어 있다. 상기 CPP 는 당업계에 공지된 다양한 CPP를 포함하며， 예를 들어 HIV-1 Tat 단백질， 을리고알지닌, ANTP 펩타이드, HSV VP22 전사조절단백질， vFGF 에서 유래된 MTS 펩타이드, Penetratin, Transport an, Pep-1 펩타이드， Pep-7 펩타이드， Buforin II， MAP(model amphiphatic peptide), k-FGF, Ku 70, pVEC, SynBl 또는 HN-1 를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 CPP를 바이포달 펩타이드에 결합시키는 방법은 다양한 방법이 있으며， 예를 들어 바이포달 펩타이드의 구조 안정화부위에 있는 루프 부분의 라이신 잔기와 CPP를 공유결합 시킨다.
세포 내에는 생리 활성에 중요한 역할을 하는 많은 타겟 단백질이 있으며， CPP가 결합된 바이포달 펩타이드 바인더는 세포 내로 유입되어 이 타겟 단백질에 결합하여 활성을 조절 (예컨대, 억제)한다. 하기 실시예 19 는 바이포달 펩타이드 바인더의 세포 내 단백질에 대한 타겟팅의 구체적인 예를 보여준다. MyD88 은 TLR 4， 인터루킨 1 수용체， RACl, IRAK2 및 IRAKI 와 상호작용하는 세포 내 단백질로 잘 알려져 있다. MyD88 에 결합 특이성이 있는 CPP-바이포달 펩타이드 바인더는 세포 내로 들어가서 MyD88 의 기능을 억제함으로써， MMP-13 의 발현을 효과적으로 차단하고 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 상기 세포내 타겟분자는 세포막 단백질의 세포질 영역， 세포질 단백질， 소기관 (organelled) 단백질， 핵 단백질 또는 세포 내 핵산분자 또는 세포 내 화학물질이고， 보다 바람직하게는 상기 세포내 타겟분자는 암발생 관련 단백질ᅳ 아픕토시스 관련 단백질， 수용체의 세포질 영역， G- protein coupled receptor 의 세포질 영역， 호르몬， 호르몬 수용체， 효소, Histone deacetylase (HDAC) , 면역관련 단백질， Toll-like receptors 의 시그널링에 관여하는 세포내 단백질, 혈액응고 관련 단백질， ERCendoplasmic reticulum)에 있는 단백질， 마이토콘드리아에 있는 단백질 또는 핵 단백질이다.
상술한 바와 같이， 본 발명의 바이포달 펩타이드 바인더는 전형적으로 타겟 결합 부위 I-구조안정화 부위의 한 가닥 -링커 -구조안정화 부위의 다른 가닥 -타겟 결합부위 Π-C"의 컨스트럭트를 갖는다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 본 발명의 바이포달 펩타이드 바인더에서 타겟 결합 부위 I 과 구조안정화 부위의 한 가닥 사이 및 /또는 구조안정화 부위의 다른 가닥 -타겟 결합 부위 Π 사이에는， 타겟 결합 부위와 구조안정화 부위 간의 상호 구조적 영향을 차단하는 구조영향 억제부위 (structure influence inhibiting region)를 포함한다. 회전 부위에는 펩타이드 분자에서 ¬와 ^의 회전이 비교적 자유로운 아미노산이 위치한다. 바람직하게는， ^와
^의 회전이 비교적 자유로운 아미노산은 글라이신, 알라닌 및 세린이다.
구조영향 억제부위에는 1-10 개， 바람직하게는 1-8 개， 보다 바람직하게는 1- 3개의 아미노산 잔기가 위치할 수 있다.
상술한 컨스트럭트를 갖는 본 발명의 바이포달 펩타이드 바인더의 라이브러리는 당업계에 공지된 다양한 방법으로 얻을 수 있다. 이 라이브러리에서 바이포달 펩타이드 바인더는 무작위 서열을 갖게 되며， 이는 타겟 결합 부위 I 및 /또는 타겟 결합 부위 Π의 어떤 위치에서도 서열 선호도 (sequence preference)가 없거나 또는 지정 (또는 고정)된 아미노산 잔기가 없다는 것을 의미한다.
예를 들어， 바이포달 펩타이드 바인더의 라이브러리는 고상지지체 (예컨대， 폴리스틸렌 또는 폴리아크릴아미드 수지) 상에서 실시되는 스플리트 -합성 방법 (Lam et al . (1991) Nature 354： 82； WO 92/00091)에 따라 구축될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 바이포달 펩타이드 바인더의 라이브러리는 세포 표면 전시 (cell surface display)방식 (예컨대， 파아지 디스플레이， 박테리아 디스플레이 또는 이스트 디스플레이)으로 구축된다.
바람직하게는， 바이포달 펩타이드 바인더의 라이브러리는 플라스미드， 박테리오파아지， 파아지미드， 이스트, 박테리아, mRNA 또는 라이보좀을 기반으로 하는 디스플레이방법을 통하여 제작될 수 있다.
파아지 디스플레이는 파아지의 표면 상의 코트 단백질에 융합된 단백질 형태로 다양한 폴리펩타이드를 디스플레이하는 기술이다 (Scott, J. K. and Smith,
G. P. (1990) Science 249： 386； Sambrook, J. et al . , Molecular Cloning. A
Laboratory Manual , 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)； Clackson and
Lowman , Phage Display, Oxford University Press(2004)) ᅳ 멘론성 파아지 (예컨대, M13)의 유전자 m 또는 유전자 vm에 발현하고자 하는 유전자를 융합시켜 무작위 펩타이드를 디스플레이한다. 파이지 디스플레이에는 파아지미드가 이용될 수 있다. 파아지미드는 박테리아의 복제원점 (예컨대， ColEl) 및 박테리오파아지의 인터제닉 (intergenic) 부위의 한 카피를 갖는 플라스미드 백터이다. 이 파아지미드에 클로닝된 DNA 단편은 폴라스미드처럼 증식된다.
바이포달 펩타이드 바인더의 라이브러리를 파아지 디스플레이 방식으로 구축하는 경우， 본 발명의 바람직한 구현예는 다음의 단계를 포함한다: (i) 파아지 코트 단백질 (예컨대, M13 과 같은 필라멘트성 파아지의 유전자 ΠΙ 또는 유전자 珊 코트 단백질)을 코딩하는 유전자와 바이포달 펩타이드 바인더를 코딩하는 유전자가 융합된 융합 유전자; 및 상기 융합 유전자에 작동적으로 결합된 전사 조절 서열 (예컨대, lac 프로모터)을 포함하는 발현 백터의 라이브러리를 제작하는 단계; (Π) 상기 발현 백터 라이브러리를 적합한 숙주 세포에 도입시키는 단계; (iii) 상기 숙주세포를 배양하여 재조합 파아지 또는 파아지미드 바이러스 파티클을 형성시켜 융합 단백질이 표면에 디스플레이 되도록 하는 단계; (iv) 생물학적 타겟 분자와 상기 바이러스 파티클을 접촉시켜 파티클을 타겟 분자에 결합시키는 단계; 및 (V) 타겟 분자에 결합하지 않은 파티클을 분리하는 단계 .
파아지 디스플레이를 이용하여 펩타이드 라이브러리를 구축하고 이들 라이브러리를 스크리닝 하는 방법은 미국 특허 제 5,723,286호, 제 5，432，018호， 제 5,580,717 호， 제 5,427,908 호， 제 5,498,530 호, 제 5,770,434 호, 제 5,734,018호, 제 5,698,426호， 제 5,763,192호 및 제 5,723,323호에 개시되어 있다.
바이포달 펩타이드 바인더를 유전자를 포함하는 발현 백터를 제작하는 방법은 당업계에 공지된 방법에 따라 실시될 수 있다. 예를 들어， 공지의 파아지미드 또는 파아지 백터 (예컨대， pIGT2, fUSE5, fAFFl, fd-CATl, m663, fdtetDOG, pHENl, pComb3, pComb8, pCANTAB 5E (Pharmacia), LamdaSur f Zap , pIF4, PM48, PM52, PM54, fdH 및 p8V5)에 바이포달 펩타이드 바인더를 유전자를 삽입시켜 발현 백터를 제작할수 있다.
대부분의 파아지 디스플레이 방법이 필라멘트성 파아지를 이용하여 실시되지만, 람다 파아지 디스플레이 (W095/34683； 미국 특허 제 5,627,024 호)， T4 파아지 디스플레이 (Ren et al . (1998) Gene 215： 439； Zhu (1997) CAN 33:534) 및 T7 파아지 디스플레이 (미국 특허 제 5，766，905 호)도 바이포달 펩타이드 바인더의 라이브러리를 구축하는 데 이용될 수 있다.
벡터 라이브러리를 적합한 숙주 세포에 도입시키는 방법은 다양한 형질전환 방법에 따라 실시될 수 있으며, 가장 바람직하게는 전기천공 (electroporation) 방법에 따라 실시된다 (참조: 미국 특허 제 5，186，800 호， 제 5,422,272 호， 제 5,750,373 호). 본 발명에 적합한 숙주는 세포는 E. coli 와 같은 그람 음성 박테리아 세포이며， 적합한 E. coli 숙주는 JM101, E. coli K12 strain 294, E. coli strain W3110 및 E. coli XL-lBlue (Stratagene)을 포함하나， 이에 한정되는 것은 아니다. 숙주세포는 형질전환 전에 컴피턴스 세포로 준비하는 것이 바람직하다 (Sambrook, J. et al. , Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)) . 형질전환된 세포의 선별은 일반적으로 항생제 (예컨대， 테트라사이클린 및 암피실린)를 포함하는 배지에서 배양하여 실시된다. 선별된 형질전환 세포를 헬퍼 파아지의 존재 하에서 추가적으로 배양하여 재조합 파아지 또는 파아지미드 바이러스 파티클을 생성시킨다. 상기 헬퍼 파아지 파아지로 적합한 것은， Ex 헬퍼 파아지， M13-K07, M13-VCS 및 R408을 포함하나， 이에 한정되는 것은 아니다.
생물학적 타겟 분자와 결합하는 바이러스 파티클의 선별은 통상적으로 바이오패닝 과정을 통하여 실시될 수 있다 (Sambrook, J. et al. , Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)； Clackson and Lowman , Phage Display, Oxford University Press(2004)) .
본 발명의 바이포달 펩타이드 바인더의 구체적인 예는 서열목록 제 20서열-제 38서열 및 제 40서열-제 41서열에 기재되어 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면， 본 발명은 상술한 세포내 타겟팅 바이포달 펩타이드 바인더를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면， 본 발명은 세포내 타겟팅 바이포달 펩타이드 바인더를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 바이포달 펩타이드 바인더의 발현용 백터를 제공한다. 본 발명의 다른 양태에 따르면， 본 발명은 세포내 타겟팅 바이포달 펩타이드 바인더의 발현용 백터를 포함하는 형질전환체를 제공한다.
본 명세서에서 용어 "핵산 분자" 는 DNA (gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며， 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라， 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다 (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 본 발명의 백터는 바이포달 펩타이드 바인더를 코딩하는 핵산 분자 이외에 상기 핵산 분자에， 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, tac프로모터， lac프로모터, /adJV5 프로모터， Ipp 프로모터， pL x프로모터， p /프로모터， ra(S 프로모터, amp 프로모터， recA 프로모터, SP6 프로머터， trp 프로모터 및 T7 프로모터 등)， 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사 /해독 종결 서열을 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 본 발명의 백터는 바이포달 펩타이드 바인더를 코딩하는 핵산 분자의 5 '-방향쪽에 시그널 서열 (예컨대， pelB)를 추가적으로 포함할 수 있다. 또한， 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 본 발명의 백터는 바이포달 펩타이드 바인더가 파아지의 표면에 잘 발현되었는지를 확인하기 위한 태깅 서열 (예컨대, myc tag)을 추가적으로 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 본 발명의 백터는 파아지 코트 단백질， 바람직하게는 M13 과 같은 필라멘트성 파아지의 유전자 m 또는 유전자 vm 코트 단백질을 코딩하는 유전자를 포함한다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 본 발명의 백터는 박테리아의 복제원점 (예컨대， ColEl) 및 /또는 박테리오파아지의 복제원점을 포함한다. 한편, 본 발명의 백터는 선택표지로서 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린， 겐타마이신， 카베니실린， 클로람페니콜, 스트렙토마이신， 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대 내성 유전자를 포함할수 있다. 본 발명의 형질전환체는 바람직하게는 E. coli 와 같은 그람 음성 박테리아 세포이며, 적합한 E. coli 숙주는 JM101, E. coli K12 strain 294, E. coli strain W3110 및 E. coli XL-lBlue (Stratagene)을 포함하나， 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 백터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은, CaCl2 방법 (Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법 (Cohen, S.N. et al . , Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973); 및 Hanahan, D.， J. Mol. Biol. , 166：557-580(1983)) 및 전기 천공 방법 (미국 특허 제 5，186，800호， 제 5,422,272호， 제 5,750,373호) 등에 의해 실시될 수 있다.
본 발명의 바이포달 펩타이드 바인더는 매우 낮은 수준 (예컨대, nM 수준)의 값 (해리상수)을 나타내어， 생물학적 타겟 분자에 매우 높은 친화도를 나타내는 펩타이드를 제공한다. 하기 실시예에 기재된 바와 같이， 모노포달 방식으로 제작된 바인더와 비교하여 바이포달 펩타이드 바인더는 약 102-105 배 (바람직하게는， 약 103-104배) 높은 친화도를 나타낸다.
본 발명의 바이포달 펩타이드 바인더는 의약으로서의 용도를 가질 뿐만 아니라， 세포 내 물질의 검출， 인 비보 분자 이미징， 인 비트로 세포 이미징 및 약물전달용 타겟팅을 하는 데 이용될 수 있으며， 에스코트 분자로도 이용될 수 있다.
【유리한 효과】
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
( i ) 본 발명은 신규한 컨스트럭트를 갖는 세포내 타겟팅 바이포달 펩타이드 바인더를 제공한다.
(ii) 본 발명의 세포내 타겟팅 바이포달 펩타이드 바인더에서 구조안정성 부위의 양 말단에 결합되어 있는 이격된 (distal) 두 개의 타겟 결합 부위는 서로 협동적으로 (cooperatively), 시너직 (synergetical ly)하게 타겟에 결합한다.
(iii) 이에， 본 발명의 세포내 타겟팅 바이포달 펩타이드 바인더는 매우 낮은 수준 (예컨대, nM 수준)의 KD 값 (해리상수)을 나타내어， 타겟에 _매우 높은 친화도를 나타낸다. (iv) 본 발명의 세포내 타겟팅 바이포달 펩타이드 바인더는 의약으로서의 용도를 가질 뿐만 아니라， 세포 내 물질의 검출， 인 비보 분자이미징， 인 비트로 세포 이미징 및 약물전달용 타겟팅을 하는 데 이용될 수 있으며， 에스코트 분자로도 이용될 수 있다。
【도면의 간단한 설명】
도 la 는 구조안정화 부위로서 β-헤어핀 (hairpin)을 포함하는 바이포달 펩타이드 바인더 (bipodal-peptide binder)의 모식도를 나타낸다.
도 lb 는 구조안정화 부위로서 링커로 연결된 β-쉬트를 포함하는 바이포달 펩타이드 바인더 (bipodal-peptide binder)의 모식도를 나타낸다.
도 lc 는 구조안정화 부위로서 링커로 연결된 루이신 지퍼를 포함하는 바이포달 펩타이드 바인더 (bipodal peptide binder)의 모식도를 나타낸다.
도 Id 는 구조안정화 부위로서 링커로 연결된 루이신 -리치 모티프 (leucine-rich motif)를 포함하는 바이포달 펩타이드 바인더 (bipodal- peptide binder)의 모식도를 나타낸다.
도 2 는 바이포달 펩타이드 바인더 라이브러리를 클로닝하기 위한 전략올 나타낸다. pIGT2 파이지미드 백터 맵에서， pelB 시그널서열， myc tag 은 목적 유전자가 파아지의 표면에 잘 발현되었는지를 확인하기 위한 태깅 서열이다. 프로모터로서 lac 프로모터가 이용되었다.
도 3 은 피르로넥틴 ED-B 바이오패닝 과정 중 인풋 파아지에 대한 ED-B, 스트랩타비딘 및 BSA의 바이오패닝 결과를 나타낸다.
도 4 는 피르로넥틴 ED-B 바이오패닝 과정 중 바이포달 펩타이드 바인더 라이브러리의 바이오패닝의 3 차 단계에서 회수한 60 개의 재조합 파아지의 ED-B 및 BSA에 대한 ELISA 결과이다.
도 5a 는 피르로넥틴 ED-B 단백질에 결합하는 특정 바이포달 펩타이드 바인더의 친화력을 측정한 결과이다.
도 5b 는 VEGF 에 결합하는 특정 바이포달 펩타이드 바인더의 친화력을 측정한 결과이다. 도 5c 는 VCAMl 에 결합하는 특정 바이포달 펩타이드 바인더의 친화력을 측정한 결과이다.
도 5d 는 nAchR(Nicotinic acetylcholine receptor 결합하는 특정 바이포달 펩타이드 바인더의 친화력을 측정한 결과이다.
도 5e 는 HSAOluman Serum Albumin)에 결합하는 특정 바이포달 펩타이드 바인더의 친화력을 측정한 결과이다.
도 6a 은 피르로넥틴 ED-B 에 대해 특이성 검사를 하기 위해 바이포달 펩타이드 바인더를 가지고 있는 재조합 파아지를 여러 단백질에 대해 ELISA 를 수행하여 흡광도를 측정한 결과이다. 왼쪽 막대부터 스트랩타비딘, ED-B, 아세틸콜린 al, BSA, VCAM, TNF- α， 트롬빈， 미오글로불린， 리소자임 및 비스파틴에 대한 결과이다.
도 6b 은 VEGF 에 대해 특이성 검사를 하기 위해 바이포달 펩타이드 바인더를 가지고 있는 재조합 파아지를 여러 단백질에 대해 ELISA 를 수행하여 흡광도를 측정한 결과이다. '
도 6c 은 VCAM1 에 대해 특이성 검사를 하기 위해 바이포달 펩타이드 바인더를 가지고 있는 재조합 파아지를 여러 단백질에 대해 ELISA 를 수행하여 흡광도를 측정한 결과이다.
도 6d은 nAchR단편 펩타이드에 대해 특이성 검사를 하기 위해 바이포달 펩타이드 바인더를 가지고 있는 재조합 파아지를 여러 단백질에 대해 ELISA 를 수행하여 흡광도를 측정한 결과이다.
도 6e 은 HSA 에 대해 특이성 검사를 하기 위해 바이포달 펩타이드 바인더를 가지고 있는 재조합 파아지를 여러 단백질에 대해 ELISA 를 수행하여 홉광도를 측정한 결과이다.
도 6f 은 MyD88 에 대해 특이성 검사를 하기 위해 바이포달 펩타이드 바인더를 가지고 있는 재조합 파아지를 여러 단백질에 대해 ELISA 를 수행하여 흡광도를 측정한 결과이다.
도 7 은 바이포달 템타이드 바인더의 공동 작용 효과의 증명을 위한 친화력을 측정한 결과이다. 도 8 은 바이포달 펩타이드 바인더에서 구조 안정화 부위를 트립토판 지퍼 대신 여러 β-헤어핀 모티프로 바꾸어 바이포달 펩타이드 바인더의 친화력을 측정한 결과이다.
도 9 은 바이포달 펩타이드 바인더에서 구조 안정화 부위를 트립토판 지퍼 대신 루이신 지퍼로 바꾸어 바이포달 펩타이드 바인더의 친화력을 측정한 결과이다.
도 10 은 암 바이오마커인 피브로넥틴 ED-B 에 특이적인 바이포달 펩타이드 바인더의 암 표적화 결과이다. 시간에 경과함에 따라서 암에 바이포달 펩타이드 바인더가 축적됨이 보인다. 각각의 장기를 분리해서 형광을 측정했을 때도 암에 상당부분 축적됨이 보인다.
도 11 은 세포 내에 존재하는 MyD88 의 활성을 억제하는 세포내 타겟팅 바이포달 펩타이드 바인더의 효과를 증명한 결과이다.
도 12a 는 AR-DBD 에 대해 특이성 검사를 하기 위해 바이포달 펩타이드 바인더를 가지고 있는 재조합 파아지를 여러 단백질에 대해 ELISA 를 수행하여 흡광도를 측정한 결과이다.
도 12b 는 Androgen receptor DNA binding domain( AR-DBD) 바이오패닝 과정 중 바이포달 펩타이드 바인더 라이브러리의 바이오패닝에서 회수한 재조합 파아지의 AR-DBD에 대한 ELISA 결과이다.
도 12c 는 바이포달 펩타이드 바인더가 AR-DBD 와 결합하는지 여부를 EMSA( (Electrophoretic Mobility Shift Assay)로 분석한 결과이다.
도 13a 는 STAT3 바이오패닝 과정 중 바이포달 펩타이드 바인더 라이브러리의 바이오패닝에서 회수한 재조합 파아지의 STAT3 에 대한 ELISA 결과이다.
도 13b 및 도 13c 는 STAT3 에 대해 특이성 검사를 하기 위해 바이포달 펩타이드 바인더를 가지고 있는 재조합 파아지를 여러 단백질에 대해 ELISA 를 수행하여 흡광도를 측정한 결과이다. 도 13b 는 Peptide KQAYYIP GSWTWENGKWTWKG LWGPEF)에 대한 실험결과이고, 도 13c 는 Peptide2(HGFQWP GSWTWENGKWTWKG AYQFLK)에 대한 실험 결과이다, 도 13d는 STAT3 에 결합하는 특정 바이포달 펩타이드 바인더의 친화력을 측정한 결과이다.
도 13e 는 01igo-9 R peptide 가 루프에 결합된 바이포달 펩타이드 바인더의 STAT3에 특이작인 세포 전달 능력을 보여주는 이미지이다.
도 13f 는 01igo-9 R peptide 가 C-말단에 결합된 바이포달 펩타이드 바인더의 STAT3에 특이적인 세포 전달 능력을 보여주는 이미지이다.
도 13g 는 세포 내에 존재하는 STAT3 에 특이적인 바이포달 펩타이더 바인더의 활성 억제 능력을 보여주는 실험 결과이다.
도 14 는 OIigo-9 R peptide 가 루프에 결합된 바이포달 펩타이드 바인더의 AR-DBD에 특이적인 세포 전달 능력을 보여주는 이미지이다.
【발명의 실시를 위한 형태】
이하, 실시예를 통하여 본 발명올 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실험 재료 및 실험 방법 1
실시예 1: 라이브러리의 제작
바이포달펩타이드 바인더 유전자제작및파아지미드 백터에의삽입
두 개의 을리고뉴클레오티드 Beta-Fl ( 5 ' -TOTATGCGGCCCAGCTGGCC (NNK)6GGATCTTGGACATGGGAAAACGGAAM-3' ) 및 Beta-Bl (5'-
AACAG1TTCTGCGGCCGCTCCTCC TCC(MNN)6TCCOTCCATGTCCATTTTCCG^3 * ) (N 은 A, T, G 또는 C; K는 G또는 T; M은 C 또는 A)를 합성하였다. 이중사슬을 만들기 위해서 Beta-Fl 4 μΜ, Beta-Bl 4 yM, 2.5 mM dNTP 흔합액 4 ≠, ExTaq DNA 중합효소 1 /^(Takara, Seoul, Korea) 및 lOxPCR 버퍼 5 μί를 흔합하여 총 50 ^가 되도록 증류수를 첨가한 흔합액을 총 25 개 만들었다. 이 흔합액을 PCR 반웅 (94°C에서 5분， 60 싸이클: 30°C에서 30초， 72°C에서 30초 및 72°C에서 7분)을 하여 이중 사슬로 만든 후 PCR 정제 키트 (GeneAll, Seoul , Korea) 를 이용하여 정제하여， 바이포달 펩타이드 바인더 유전자를 얻었다. 바이포달 펩타이드 바인더에 삽입시킬 유전자를 PIGT2 파아지미드 백터 (Ig therapy, Chuncheon, Korea) 에 연결하기 위해 인서트 유전자와 pIGT2 파아지미드 백터에 제한효소를 처리하였다. 약 11 //g의 인서트 DNA 를 5/7/(New England Bio labs (NEB, Ipswich) 및 ? /(ΝΕΒ, Ipswich)으로 각각 4 시간 씩 반웅시킨 후 PCR 정제 키트를 이용하여 정제하였다. 또한， 약 40 의 pIGT2 파아지미드 백터를 5/7/ 및 Notl으로 각각 4 시간 씩 반응시킨 후 CIAP(Calf Intestinal Alkaline Phosphatase) (NEB, Ipswich)를 넣고 1 시간 동안 반웅시킨 후, PCR 정제 키트를 이용하여 정제하였다. 이들을 UV- 가시광선 분광기 (Ultrospec 2100pro, Amersham Bioscience)로 정량하여 2.9 //g의 인서트 유전자를 T4 DNA 리가아제 (Bioneer, Dae j eon, Korea)를 이용하여 pIGT2 파아지미드 백터 12 과 18°C에서 15 시간 동안 연결한 후， 에탄올로 침전시켜 TE 버퍼 100 i 로 DNA를 용해시켰다.
컴피턴트 세포의 준비
E.col i XL1— BLUE 세포 (American Type Culture Collection, Manassas , USA)를 LB 아가 -플레이트에 선상 도말하였다. 한천 평판 배지에서 자란 군락을 5 의 LB 배지에 접종한 후 37°C에서 200 rpm 의 속도로 흔합하면서 하루 동안 배양하였다. 배양된 10 의 세포들을 2 의 LB 배지에 접종하고 같은 방식으로 600 nm 의 파장에서 흡광도가 0.3—0.4 가 될 때까지 배양하였다. 배양된 플라스크를 30분 동안 얼음에 방치한후， 4°C 에서 4,000X g로 20분 동안 원심 분리하여 가라앉은 세포들을 제외한 상층액을 모두 제거하고, 1 의 냉각된 멸균 증류수로 현탁시켰다. 이것을 다시 같은 방법으로 원심분리하고 상층액을 제거한 후, 1 의 냉각된 멸균 증류수로 재현탁시키고 같은 방식으로 10¾> 글리세를 용액 40 ^로 세척을 반복하여 원심 분리한 후, 마지막으로 10% 글리세를 용액 4 으로 현탁시킨 후， 200 ^씩 분주하여 액체 질소에 냉동시킨 뒤 -80°C에 보관하였다.
전기천공법
파아지미드 백터 12 /g과 바이포달 펩타이드 바인더에 인서트 DNA 2.9 /g을 연결 반응시킨 100 ^를 25 개로 분주하여 전기 천공을 수행하였다. 컴피턴트 세포를 얼음 위에서 녹이고， 200 ^의 컴피턴트 세포를 연결 반웅시킨 용액 4 ^와 흔합한 후, 냉각하여 준비된 0.2 cm 의 큐벳에 넣은 뒤 1 분 동안 얼음 위에 두었다. 전기 천공기 (BioRad, Hercules, CA)를 200 Ω에서 25 uF 및 2.5 kV 의 조건으로 프로그램하고 준비된 큐벳의 물기를 제거하고 전기 천공기에 위치시킨 후 필스를 주었다 (시간 상수는 4.5-5 msec). 이후 즉시 37°C로 준비한 20 mM 의 글루코오스가 포함된 1 i 의 LB 액체배지에 넣고 얻어진 총 25 ^의 세포를 100 ra^ 시험관에 옮겼다. 한 시간 동안 37°C에서 200 rpm 의 속도로 흔합하며 배양한 후 라이브러리의 개수를 측정하기 위해 10 ^를 회석해서 암피실린 아가 배지에 도말하였다. 남은 세포를 1 의 LB 에 20 mM 글루코오스 및 50 ^g/mi의 0ᄆ피실린을 넣고 30°C에서 하루 동안 배양하였다. 4°C 에서 4,000Xg 로 20 분 동안 원심 분리하여 침전된 세포들을 제외한 상층액을 모두 제거하고, 40 ^의 LB 로 재현탁시킨 후 글리세를을 최종 농도 20¾> 이상 넣고 - 80°C에 보관하였다.
라이브러리에서재조합파아지 생산과 PEG침전
-80°C에 저장된 바이포달 펩타이드 바인더 라이브러리에서 재조합 파아지를 생산하였다. 500 플라스크에 100 의 LB 액체배지에 암피실린 (50 및 20 mM 의 글루코오스를 넣은 후， -80 °C 에 보관된 라이브러리 1 ^을 추가하여 한 시간 동안 37°C에서 150 rpm 의 속도로 흔합하며 배양하였다. 껴기에 1 1011 pfu 의 Ex 헬퍼 파아지 (Ig therapy, Chuncheon, Korea)를 넣고 다시 한 시간 동안 같은 조건으로 배양하였다. l,000Xg 로 10 분 동안 원심 분리하여 상층액을 제거하고 여기에 암피실린 (50 ig/mi) 및 카나마이신 (25 /g/m«이 포함된 LB 액체배지 100 을 넣고 하루 동안 배양하여 재조합 파아지를 생산하였다. 배양액을 3,000Xg 로 10 분 동안 원심 분리하여 얻은 상층액 100 ^에 PEG/NaCl 25 을 흔합하고 얼음에 1 시간 동안 방치시킨 후, 4°C에서 20 분 동안 10s000Xg 로 원심 분리하여 상층액은 조심스럽게 제거하고 2 의 PBS(pH 7.4)로 펠렛을 재현탁시켰다.
실시예 2: 단백질의 준비
실시예에 이용할 피르로텍틴 (Fibronectin) ED-B, VEGF( vascular endothelial growth factor) , VCAM1 (vascular cell adhes i on molecule一 1)， nAchR(Nicotinic acetylcholine receptor) , HSA( Human serum albumin) 및
MyD88를 다음과 같이 준비하였다.
피브로넥틴 ED—B유전자 제작 및 발현 백터에의 삽입
한국생명공학 연구원에서 부분적인 인간의 피브로넥틴 ED-B(ID=KU017225) 유전자를 공급받았다. 프라이머 EDB_Fl(5'-TTCATMCATATGCCAGAGGTGCCCCAA-3') 및 EDB_B1(5'-
TCATAGTCMTGCCCGGCTCCAGCCCTGTG-3')을 합성하여, EDB-F1 20 pmol, EDB-B1 20 pmol, 2.5 mM dNTP 흔합액 4 μΐ, ExTaq DNA 중합효소 1 ^(10 U) 및 10XPCR 버퍼 5 ^를 흔합하여 총 50 ^가 되도록 증류수를 첨가한 흔합액을 만들었다. 이 흔합액을 PCR 반응 (94°C에서 5 분， 30싸이클: 55°C에서 30 초， 72°C에서 1 분 및 94°C에서 30 초)을 하여 EDB 인서트로 만든 후 PCR 정제 키트를 이용하여 정제하였다. EDB 인서트 유전자를 pET28b 백터 (Novagen)에 연결하기 위해 EDB 인서트 유전자 및 pET28b 백터에 제한효소를 처리하였다. 약 2 /g의 인서트 DNA 를 Ba HKWB, Ipswich) 및 y½fe/(NEB, Ipswich)로 4 시간씩 반응시킨 후 PCR 정제 키트를 이용하여 정제하였다. 또한, 약 2 ； 의 pIGT2 파아지미드 백터를 BamHI및 Ndel로 3 시간씩 반웅시킨 후 CIAP 를 넣고 1 시간 동안 반응시킨 후, PCR 정제 키트를 이용하여 정제하였다. 이들을 백터와 인서트가 약 1:3 의 몰 비율이 되도록 첨가하고， T4 DNA 리가아제 (Bioneer, Dae j eon, Korea)를 이용하여 18°C에서 10 시간 동안 연결시키고， XL-1 컴피턴트 세포에 형질전환을 한 후, 카나마이신이 포함된 아가 배지에 도말하였다. 한천 평판 배지에서 자란 군락을 5 의 LB 배지에 접종한 뒤 37°C에서 200 rpm 의 속도로 흔합하면서 하루 동안 배양한 후， 플라스미드 프랩 키트 (GeneAll, Seoul , Korea)를 이용하여 플라스미드를 정제하고， 시퀀싱올 하여 클로닝이 성공했는지 여부를 확인하였다. VEGF121 유전자 제작 및 발현 백터에의 삽입
싸이토카인 은행 (Jeonju, Korea)에서 부분적인 인간의 VEGF(ID=G157) 유전자를 공급받았다. 프라이머 VEGF_Fl(5'-ATAGMTTCGCACCCATGGCAGAA-3') 및 VEGF_B1( 5 ' -ΑπΜ( ;^0ΑΟΟΟ€0ΤΟ(^πθΤ0ΑΟΜΤΤΤΤ0 θΤ0πα€-3 ' )을 합성하여 , VEGF-F1 20 pmol, VEGF-B1 20 pmol, 2.5 mM dNTP 흔합액 4 μΐ, ExTaq DNA 중합효소 1 ^(10 U) 및 10XPCR 버퍼 5 를 흔합하여 총 50 ^가 되도록 증류수를 첨가한 흔합액을 만들었다. 이 흔합액을 PCR 반응 (94°C에서 5 분, 30 싸이클: 55°C에서 30초, 72°C에서 1분 및 94°C에서 30초)을 하여 VEGF 인서트로 만든 후 PCR 정제 키트를 이용하여 정제하였다. VEGF 인서트 유전자를 pET32a 백터 (Novagen)에 연결하기 위해 VEGF 인서트 유전자 및 pET32a 백터에 제한효소를 처리하였다. 약 2 /g의 인서트 DNA 를 ^σ?/(ΝΕΒ, Ipswich) 및 HindIlKW&, Ipswich)로 4 시간씩 반웅시킨 후 PCR 정제 키트를 이용하여 정제하였다 이들을 백터와 인서트가 약 1:3 의 몰 비율이 되도록 첨가하고, T4 DNA 리가아제 (Bioneer Dae j eon, Korea)를 이용하여 18°C에서 10 시간 동안 연결시키고, XL-1 컴피턴트 세포에 형질전환을 한 후, 암피실린이 포함된 아가 배지에 도말하였다. 한천 평판 배지에서 자란 군락을 5 의 LB 배지에 접종한 뒤 37°C에서 200 rpm 의 속도로 흔합하면서 하루 동안 배양한 후, 플라스미드 프랩 키트 (GeneAll, Seoul , Korea)를 이용하여 플라스미드를 정제하고， 시퀀싱을 하여 클로닝이 성공했는지 여부를 확인하였다.
VCAM1 유전자 제작 및 발현 백터에의 삽입
한국생명공학 연구원에서 인간의 VCAM1 유전자를 공급받았다. VCAM1 인서트 유전자를 pET32a 백터에 연결하기 위해 VCAM1 인서트 유전자 및 pET32a 백터에 제한효소를 처리하였다. 이들을 백터와 인서트가 약 1:3 의 몰 비율이 되도록 첨가하고， T4 DNA 리가아제 (Bioneer, Dae j eon, Korea)를 이용하여 18°C에서 10 시간 동안 연결시키고， XL-1 컴피턴트 세포에 형질전환을 한 후, 암피실린이 포함된 아가 배지에 도말하였다. 한천 평판 배지에서 자란 군락을 5 ^의 LB 배지에 접종한 뒤 37°C에서 200 rpm 의 속도로 흔합하면서 하루 동안 배양한 후， 플라스미드 프랩 키트 (GeneAll, Seoul , Korea)를 이용하여 플라스미드를 정제하고， 시뭔싱을 하여 클로닝이 성공했는지 여부를 확인하였다. 피브로넥틴 ED—B의 발현 및 정제
피브로넥틴 ED-B를 클로닝한 pET28b 백터를 BL21 세포에 형질 전환한후 카나마이신이 포함된 아가 배지에 도말하였다. 한천 평판 배지에서ᅵ 자란 군락을 카나마이신 (25 /zg/mO이 포함된 5 ι 의 LB 배지에 접종한 뒤 37°C에서 200 rpm 의 속도로 흔합하면서 하루 동안 배양한 후， 카나마이신 (25 이 포함된 50 의 LB 배지에 옮겨 3 시간 배양하였다. 배양한 E. col/ 를 카나마이신 (25 //g/ )이 포함된 2 의 LB 에 접종하고 0D=0.6-0.8 까지 배양하였다. 이후 1 mM 이소프로필 -β-D-키오갈락토피라노사이드 (IPTG)를 넣어주어 37°C에서 200 rpm 의 속도로 흔합하면서 8 시간 동안 배양하였다. 4,000Xg 로 20 분 동안 원심 분리하여 침전된 세포들을 제외한 상층액을 모두 제거하고， 라이시스 버퍼 (50 mM 소듐 포스페이트 (pH 8.0), 300 mM NaCl 및 5 mM 이미다졸)로 현탁시켰다. _80°C에 하루 동안 보관한 후 소니케이터를 이용하여 E. coli 를 용해시킨 후에 15,000Xg 로 1 시간 동안 원심 분리하여 상층액을 Ni-NTA 친화성 레진 (Elpisbio, Dae j eon, Korea)에 결합시킨다. 라이시스 버퍼로 레진을 세척한 후 일루션 버퍼 (50 mM 소듐 포스페이트 (pH 8.0)， 300 mM NaCl 및 300 mM 이미다졸)을 이용하여 N-말단 His-tag ED-B 단백질을 용출시켜 획득하였다. 이렇게 획득한 단백질을 Superdex75 컬럼 (GE Healthcare, United Kingdom) 및 PBS(pH 7.4) 버퍼를 이용하여 겔 여과법 (gel filtration)으로 순도 높은 ED-B 단백질을 얻었다. 바이오패닝을 위해 ED-B 단백질에 바이오틴을 연결하였다. 6 mg의 설포 -NHS-SS- 바이오틴 (PIERCE, Illinois, USA) 및 1.5 rag의 ED-B 단백질을 상온에서 0.1 M 소듐 보레이트 (pH 9.0) 하에 2 시간 동안 반응시키고， 반웅이 되지 않은 설포- NHS-SS_바이오틴을 제거하기 위해 단백질을 Superdex75 컬럼 및 PBS(pH 7.4) 버퍼를 이용하여 겔 여과법 (gel filtration)으로 바이오틴 -EDB 단백질을 정제하였다ᅳ
VEGF121와 VCAMl-Trx의 발현 및정제
VEGF121 와 VCAM1 를 클로닝한 pET32a 백터를 각각 AD494 세포에 형질 전환한 후 암피실린이 포함된 아가 배지에 도말하였다. 한천 평판 배지에서 자란 군락을 암피실린 (25
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포함된 5 ^의 LB 배지에 접종한 뒤 37°C에서 200 rpm 의 속도로 흔합하면서 하루 동안 배양한 후， 암피실린 (25 /g/ )이 포함된 50 의 LB 배지에 옮겨 3시간 배양하였다. 배양한 E. coli를 암피실린 (25 g/m£)이 포함된 2 £의 LB 에 접종하고 0D=0.6-0.8 까지 배양하였다. 이후 1 mM 이소프로필 -β-D-키오갈락토피라노사이드 (IPTG)를 넣어주어 37°C에서 200 rpm 의 속도로 흔합하면서 8 시간 동안 배양하였다. 4,000Xg 로 20 분 동안 원심 분리하여 침전된 세포들을 제외한 상층액을 모두 제거하고， 라이시스 버퍼 (50 mM 소듐 포스페이트 (pH 8.0), 300 mM NaCl 및 5 mM 이미다졸)로 현탁시켰다. -80°C에 하루 동안 보관한 후 소니케이터를 이용하여 E. coli 를 용해시킨 후에 15,000Xg 로 1 시간 동안 원심 분리하여 상층액을 Ni-NTA 친화성 레진 (Elpisbio, Dae j eon, Korea)에 결합시킨다. 라이시스 버퍼로 레진을 세척한 후 일루션 버퍼 (50 mM 소듐 포스페이트 (pH 8.0)， 300 mM NaCl 및 300 mM 이미다졸)을 이용하여 Trx-VEGF121 단백질을 용출시켜 획득하였다. 이렇게 획득한 단백질을 Superdex75 컬럼 (GE Healthcare, United Kingdom) 및 PBS(pH 7.4) 버퍼를 이용하여 겔 여과법 (gel filtration)으로 순도 높은 VEGF-Trx 와 VCAMl-Trx 단백질을 얻었다. 순수한 VEGF 을 얻기 위하여 트롬빈으로 VEGF 와 Trx 사이를 잘라 VEGF121을 얻었다.
한편， HSA 는 Genetex 회사 (Irvine)에서 구매하여 이용하였다. nAchR(Nicotinic acetylcholine receptor)≤l 단편 펩타이드인 biotin— SGEWVIKEARG丽 WVFYSCCFTPYLDITYH (32 mer)는 애니젠 (Korea, Kwangju)에서 합성하였다. Human MyD88 은 Santa Cruz Biotechnology(sc-4540 WBXCalifornia)에서 구매하였다.
실시예 3： 바이오 패닝 방법
Biotin 피르로넥틴 ED~B 단백질과 Biotin-nAchR펩타이드의 바이오 패닝 방법
2 ^의 스트랩타비딘 (10 //g/ )을 96 웰 ELISA 플레이트 (Corning)의 40 개의 웰에 50 ^씩 넣은 후, 4°C에서 하룻밤 동안 방치하였고， 다음날 20 개의 웰에만 0„1%의 PBST(tween— 20)로 3 회 세척한 후， 바이오틴 ED-B 와 바이오틴 nAchR (10 g/ )를 각각 넣고 상온에서 1시간 동안 방치하였다. 이후 40개의 웰 모두를 0.1% PBST 로 3 회 세척하고 PBS 로 희석한 2% BSA 를 사용하여 상온에서 2 시간 동안 블로킹한 후， 용액을 모두 버리고 0.1% PBST 로 3 회 세척하였다. 여기에 바이포달 펩타이드 바인더 재조합 파아지 포함용액 800 ≠ 및 10% BSA 200 !Λ을 흔합하여 스트랩타비딘 및 BSA 에 결합하는 파아지들을 제거하기 위해 스트랩타비딘에 BSA 코팅했던 20 개의 웰에 넣어 1 시간 동안 27°C에 두었다. 상층액을 회수하여 ED-B 와 nAchR 가 결합한 20 개의 웰에 옮겨 27°C에서 45 분 동안 방치하였다. 20개 웰의 용액을 모두 제거하고 0.5% PBST로 15회 세척한 뒤 0.2 M 글리신 /HCKpH 2.2) 1 ^을 각 웰당 50 ^씩 넣어 20 분간 파아지를 용리시키고 1 ^을 튜브에 모아 여기에 2M Tris-base(pH 9.0) 150 ^를 넣어 용액을 중화시켰다. 각 바이오패닝마다 인풋 파아지 및 일루트 파아지의 수를 측정하기 위해 0D=0.7 인 XL-1 BLUE 세포에 섞어 주어 암피실린이 포함된 아가 배지에 도말하였다. 패닝을 반복하기 위해 10 의 E. coli XL1-BLUE 세포와 섞어 37°C에서 1 시간 동안 200 rpm 의 속도로 흔합하며 배양하였다. 암피실린 (50 g/m ) 및 20 mM 글루코오스를 흔합한 후， 2X1010 pfu 의 Ex 헬퍼 파아지를 첨가하여 37°C에서 1시간 동안 200 rpm의 속도로 흔합하며 배양하였다. 배양액을 l.OOOXg 로 10 분 동안 원심 분리한 후 상층액은 제거하고 침전된 세포들을 암피실린 (50 g/ l) 및 카나마이신 (25 g/mi ^] 포함된 40 ra^ LB 액체 배지로 재현탁하여 30°C에서 200 rpm 의 속도로 흔합하며 하루 동안 배양하였다. 배양액을 4,000Xg, 20 분 및 4°C의 조건으로 원심 분리하였다. 상층액에 8 ^의 5x PEG/NaCl[20% PEG(w/v) 및 15% NaCKw/v)]을 첨가한 후 4°C에서 1 시간 동안 정치시켰다. 원심분리 후 PEG 용액을 완전히 제거하고 1 의 PBS 용액으로 파아지 펩타이드 펠렛을 녹인 다음 2 차 바이오패닝에 사용하였다. 각 패닝 단계마다 상기와 동일한 방법을 사용했으며， 세척과정만 단계별로 각각 25 회 및 35회 (0.5% PBST) 증가시켰다.
VEGF와 VCAMl-Trx와 Human serum albimin(HSA) , MyD88의 바이오 패닝 방법
VEGF 와 VCAMl-trx 와 HSA 와 MyD 88(5 /g/ )을 96 웰 ELISA 플레이트 (Corning)의 10 개의 웰에 50 ^씩 넣은 후， 4°C에서 하룻밤 동안 방치하였고, 다음날 2% BSA 를 사용하여 상온에서 2 시간 동안 블로킹한 후， 용액을 모두 버리고 0.1% PBST 로 3 회 세척하였다. 여기에 바이포달 펩타이드 바인더 재조합 파아지 포함용액 800 id 및 10% BSA 200 ^을 흔합하여 VEGF 와 VCAMl-Trx와 HSA 가 결합한 10개의 웰에 옮겨 상온에서 1시간 동안 방치하였다. 10 개 웰의 용액을 모두 제거하고 0.1% PBST 로 10 회 세척한 뒤 0.2 M 글리신 /HCKpH 2.2) 1 m£을 각 웰당 50 ^씩 넣어 20 분간 파아지를 용리시키고 1 ^을 튜브에 모아 여기에 2M Tris-base(pH 9.0) 150 峰 넣어 용액을 중화시켰다. 각 바이오패닝마다 인풋 파아지 및 일루트 파아지의 수를 측정하기 위해 0D=0.7 인 XL-1 BLUE 세포에 섞어 주어 암피실린이 포함된 아가 배지에 도말하였다ᅳ 패닝을 반복하기 위해 10 의 E. coli XL1-BLUE 세포와 섞어 37°C에서 1 시간 동안 200 rpm 의 속도로 흔합하며 배양하였다. 암피실린 (50 fig/ mi) 및 20 mM 글루코오스를 흔합한 후， 2X1010 pfu 의 Ex 헬퍼 파아지를 첨가하여 37°C에서 1시간 동안 200 rpm의 속도로 흔합하며 배양하였다. 배양액을 l,000Xg 로 10 분 동안 원심 분리한 후 상층액은 제거하고 침전된 세포들을 암피실린 (50 g/mi) 및 카나마이신 (25 ug/ i)o] 포함된 40 LB 액체 배지로 재현탁하여 30°C에서 200 rpm 의 속도로 흔합하며 하루 동안 배양하였다.
배양액을 4,000Xg, 20 분 및 4°C의 조건으로 원심 분리하였다. 상층액에 8 의 5x PEG/NaCl [20% PEG(w/v) 및 15% NaCl(w/v)]을 첨가한 후 4°C에서 1 시간 동안 정치시켰다. 원심분리 후 PEG 용액을 완전히 제거하고 1 ！ 의 PBS 용액으로 파아지 펩타이드 펠렛을 녹인 다음 2 차 바이오패닝에 사용하였다. 각 패닝 단계마다 상기와 동일한 방법을 사용했으며， 세척과정만 단계별로 각각 20 회 및 30회 (0 · 1% PBST) 증가시찼다 .
실시예 4: 피르로넥틴 ED"B의 인풋 파아지의 ELISA
바이포달 펩타이드 바인더 라이브러리의 각 인풋 파아지의 ELISA 를 스트랩타비딘， BSA 및 ED-B에 대해 수행하였다. 96웰 ELISA플레이트에 10
스트랩타비딘을 각 웰당 50 ^씩 18 개의 웰에 넣고 10 g/ J> BSA 를 각 웰당 50 ¬씩 9 개의 웰에 넣고 4°C에서 하루 동안 방치하였다. 다음날 스트램타비딘이 있는 18 개의 웰 중 9 개의 웰만 0.1¾ PBST(tween-20)로 3 회 세척하고, 바이오틴 ED-BC10 «g/m£)를 넣고 상온에서 1 시간 동안 두었다. 이후 모든 웰을 0.1% PBST 로 3 회 세척하고 PBS 로 희석한 1% BSA 를 사용하여 상온에서 2 시간 동안 블로킹한 후， 용액을 모두 버리고 0.1% PBST로 3회 세척하였다. 여기에 바이포달 펩타이드 바인더 재조합 파아지인 첫 번째， 두 번째 및 세 번째 인풋 파아지 800 ≠ 및 10% BSA 200 (iH 흔합하여 100 ^씩 ED-B, 스트랩타비딘 및 BSA 웰에 각각 3 웰 씩 분주하고 27°C에서 1 시간 30 분 동안 정치하였다. 0.1% PBST 용액으로 10 회 세척한 다음 HRP-컨쥬게이트 항 -M13 항체 (GE Healthcare)를 1:1,000 으로 회석하여 27°C에서 1 시간 동안 반응시켰다. 0.1% PBST 로 5 회 세척한 후 퍼옥시다아제의 기질인 테트라메틸벤지딘 (TMBKBD Science) 용액 100 ...fdi 분주하여 발색반응을 유도한 다음 100 ^의 1 M HC1 을 첨가하여 반웅을 중지시켰다. 이후 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 실시예 5: 피브로넥틴 ED— B, VEGF, VCAM1, nAchR, HSA, MyD88 단백질에 특이적인 파아지 펩타이드 검색 (파아지 ELISA)
아웃풋 파아지 /인풋 파아지 비율이 가장 높은 바이오패닝 단계에서 회수한 파아지를 XL1-BLUE 세포에 감염시킨 후 플라크가 플레이트당 100-200 개 정도가 되도록 도말하였다. 멸균된 팁을 이용하여 플라크 60 개를 2 의 LB- 암피실린 (50 배양액에 접종한 후 37°C에서 5 시간 동안 진탕 배양하여
0D=0.8-1에서 5xi09pfu의 Ex헬퍼 파아지를 첨가하여 37°C에서 1시간 동안 200 rpm 의 속도로 흔합하며 배양하였다. 배양액을 l,000Xg 로 10 분 동안 원심 분리한 후 상층액은 제거하고 침전된 세포들을 암피실린 (50 β /ηί) 및 카나마이신 (25 이 포함된 1 의 LB 액체배지로 재현탁하여 30°C에서 200 rpm 의 속도로 흔합하며 하루 동안 배양하였다. 배양액을 10,000Xg, 20 분 및 4°C의 조건으로 원심 분리하여 상층액을 회수한 후 2%의 탈지 우유를 넣고 이를 파아지 펩타이드 검색에 사용하였다. 96 웰 ELISA 플레이트에 5 ； 의 Fibronectin ED—B, VEGF, VCAM1, Nicotinic acetylcholine receptor (nAchR) , Human serum albumin, MyD88 을 각 웰당 50 ^씩 30 개의 웰에 넣고， 또한 10 ； Mg/m£의 BSA을 각 웰당 50 ^씩 30개의 웰에 넣어 4°C에서 하루 동안 방치하였다. 다음날 모든 웰을 0.1% PBST 로 3 회 세척하고 PBS 로 희석한 2% 탈지 우유를 사용하여 상온에서 2 시간 동안 블로킹한 뒤， 용액을 모두 버리고 0.1% PBST 로 3 회 세척하였다. 각 클론별로 증폭된 파아지 펩타이드 용액 100 ^씩을 모든 웰에 분주하고 27°C에서 1 시간 30분 동안 정치하였다. 0.1% PBST용액으로 5회 세척한 다음 HRP-컨쥬게이트 항 -M13 항체 (GE Healthcare)를 1:1,000 으로 희석하여 27°C에서 1시간동안 반웅시켰다. 0.1% PBST로 5회 세척한 후 TMB용액 100峰 분주하여 발색반응을 유도한 다음 100 ^의 1 M HC1 를 첨가하여 반웅을 중지시켰다. 450 nm에서 흡광도를 측정하여 BSA에 비해 흡광도가 높은 클론들을 선택하였다. 이들의 파아지를 XL1 세포에 감염시킨 후 플라크가 플레이트당 100- 200 개 정도가 되도록 도말하였다. 멸균된 팁을 이용하여 플라크를 4 의 LB- 암피실린 (50 μ /Άΐ) 배양액에 접종한 후 37°C에서 하루 동안 진탕 배양하여 플라스미드 프랩 키트을 이용하여 플라스미드를 정제하여 시퀀싱을 의뢰하였다 (Genotech, Dae j eon, Korea). 시뭔싱 프라이머는 백터 시뭔스인 5'-
GATTACGCCAAGCTTGGAGC-3 '을 사용하였다 .
실시예 6: 피르로넥틴 ED~B, VEGF, nAchR바인딩 어세이
DNA 시뭔성에서 중복되어 나온 ED-B, VEGF, nAchR 에 특이적인 바이포달 펩타이드 바인더 펩타이드를 합성 (애니젠， 한국)을 하였다. 친화도의 측정은 BIAcore X(Biacore AB, Uppsala, Sweden)를 이용하여 수행하였다. ED-B 와 nAchR은 스트랩타비딘 SA칩 (Biacore)에 바이오틴 -EDB을 2,000 RU만큼 홀려주어 고정시켰다. VEGF 는 EDC/NHS 을 이용하여 CM5 칩 (Biacore)에 고정하였다. 러닝 버퍼로는 PBS(pH 7.4)을 사용하였고, 플로우는 분당 30 ^로 홀리면서 여러 농도로 동력학을 측정한 후 BIAevaluation 소프트웨어 (Biacore AB, Uppsala, Sweden)로 친화도를 계산하였다.
실시예 7: 암 바이오마커인 피르보넥틴 ED— B 에 특이적인 바이포달 펩타이드 바인더의 암 표적화
암에 많이 분포하는 피르로넥틴 ED-B 를 타겟하는 바이포달 펩타이드 바인더 (펩타이드 2)에 Cy5.5-NHS 형광다이 (f lurorescence dye) (Amer sham Pharmacia, Piscataway)을 50 mM 소듐 보레이트 완층액 (pH 9.7)에서 12 시간동안 상온 반웅 시켰다. 반응 후에 Sephadex G25(Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)로 Cy5.5 와 바이포달 펩타이드 바인더 -Cy5.5를 분리하였다. Balb/c 누드 마우스에 Human U87MG(ATCC) 2 x 106 cell 을 피하에 넣어 암을 10 일 동안 키운 후에 0.5 nmol 의 바이포달 펩타이드 바인더 _Cy5.5 을 정맥주사로 넣은 다음 IVISCCaliper Life Sience, Hopkinton)로 형광을 측정하였다. 이 실험은 암 바이오마커인 피브로넥틴 E[)-B 에 특이적인 바이포달 펩타이드 바인더가 인 비보 동물에서 암에 축적이 됨을 증명하는 결과이며 실제 암 진단제로서의 응용성을 보여준다 (도 11).
실시예 8: 세포내에 존재하는 MyD88 에 특이적인 바이포달 펩타이드 바인더의 활성 억제 실험
MyD88 은 세포내에 존재하는 단백질이기 때문에 바이포달 펩타。—ᅵ—드 바인더의 loop 의 라이신 (lysine) 잔기를 이용하여 세포투과펩타이드 (eel 1 penetrating peptide)인 9 개의 아지닌 (arginine) (애니젠， 한국)을 EDC/NHS(Sigma)를 이용하여 바이포달 펩타이드 바인더에 공유결합시켜 세포 투과를 가능하게 만들었다. MyD88 의 활성이 활성화되면 MMP-13 의 양의 증가하기 때문에 MMP-13 의 양을 측정하면 MyD88 의 활성이 억제되는지 판별할 수 있다. MyD88 의 활성을 활성화 시키는 IL-lbeta(10 ng/ml)(R&D systems, Minneapolis 丽)를 연골세포에 처리하였다. 그 다음 MyD88 에 특이적인 바이포달 펩타이드 바인더 (표 3f 의 펩타이드 1)를 연골세포에 10 μΜ 처리하고 12시간후에 mRNA을 분리한 다음 MMP— 13 과 GAPDH 에 대해 RT-PCR 을 진행하였다. 또한 연골세포를 파괴하여 세포 내 단백질을 얻은 다음 Anti-MMP 13 항체 (Abeam, ab3208, Cambridge)와 세미 드라이 transfer 기계 (Amersham Bioscience, Pi scat away )¾· 이용하여 웨스턴 블롯팅을 실시하여 MMP-13의 양을 측정하였다.
실험 결과
실시예 9: 바이포달 펩타이드 바인더 라이브러리의 제작
바이포달 펩타이드 바인더의 구조 안정화 부위로는 안정한 베타-헤어핀 모티프를 사용하였다. 특히 트립토판-트립토판 아미노산의 상호 작용에 의해 베타-헤어핀 모티프 구조를 안정하게 이루어 주는 트립토판 지퍼 (Andrea et al . , Proc. Natl. Acad. Sci. 98 :5578-5583(2001))을 이용하였다. 뼈대인 트립토판 지퍼의 N- 및 C-말단 부분에 각각 6 개 아미노산을 무작위로 배열함으로써 두 부분에 가변적 부위를 생성하였다 (도 la). 이를 바이포달 펩타이드 바인더라고 명명하였으며 양쪽의 가변적 부위를 가지고 있어 항원에 공동작용으로 붙을 수 있어 높은 친화력 및 특이성을 가질 수 있다. 또한, 바이포달 펩타이드 바인더의 구조 안정화 부위는 도 lb 내지 도 le와 같이 여러 가지로 구성될 수 있다.
합성한 2 개의 무작위 서열 올리고뉴클레오티드를 PCR 반웅을 통해 이중 사슬로 만든 후 제한효소인 S 및 Not\ 으로 자른 후 pIGT2 파아지미드 백터에 클로닝을 하여 8X108이상의 라이브러리를 구축하였다 (도 2).
실시예 10: 바이오 패닝 결과
바이포달 펩타이드 바인더 라이브러리를 피브로넥틴 ED-B, VEGF, VCAM1, nAchR, HSA 단백질에 대해 3-5 차에 걸쳐 바이오 패닝을 실시하고 각 패닝 단계에서 회수한 파아지 펩타이드들의 아웃풋 파아지 /인풋 파아지의 비율을 결정하였다 (표 la). 【표 la]
피브로넥틴 ED-B 단백질에 대한 바이오 패닝 결과
Figure imgf000039_0001
【표 lb]
VEGF 단백질에 대한 바이오 패닝 결과
Figure imgf000039_0002
【표 lc]
VCAMl 단백질쎄 대한 바이오 패닝 결과
Figure imgf000039_0003
【표 ldl - nAchR 단백질에 대한 바이오 패닝 결과
Figure imgf000039_0004
단계 파아지 (pfu) 파아지 (pfu)
1회 2.6 1012 9.9X107 3.1X10"5
2회 7.9X1011 4.6X107 5.8X10"5
3회 2 X 1012 5.6X108 28.3X10"5
4회 3.3X1012 3.2X109 97.6X10"5
5회 3.3X1011 6.7X108 202X10—5
【표 le]
HSA 단백질에 대한 바이오 패닝 결과
Figure imgf000040_0001
【표 if]
MyD88 단백질에 대한 바이오 패닝 결과
Figure imgf000040_0002
실시예 11: 피브로넥틴 ED-B의 인풋 파아지의 파아지 ELISA결과
바이포달 펩타이드 바인더의 라이브러리의 각 인풋 파아지를 ED-B, 스트랩타비딘 및 BSA 에 대해 ELISA 를 수행하였다. 첫 번째 인풋 파아지의 반웅성은 ED— B, 스트랩타비딘 및 BSA 모두 흡광도가 비슷하나， 두 번째 인풋 파아지부터 ED-B 흡광도가 스트랩타비딘에 비해 5.1 배， BSA 에 비해 3.4 배 높았다. 마지막 세 번째 인풋 파아지에서는 ED-B 흡광도가 스트랩타비딘에 비해 22 배， BSA 에 비해 15 배 높은 반웅성을 보여 ED-B 에 대해 성공적으로 바이오 패닝이 이루어짐을 알수 있다 (도 3 및 표 2).
【표 2】
Figure imgf000041_0001
실시예 12: 피브로넥틴 ED-B, VEGF, VCAM1, nAchR, HSA 및 MyD88에 대해 특이적^ 파아지 펩타이드 검색 (파아지 ELISA) 및 시¾싱
각 라이브러리의 패닝 단계중 아웃풋 /인풋의 비율이 가장 높은 단계에서 회수한 파아지를 플라크 형태로 확보하였다. 각 플라크로부터 60 개의 파아지를 증폭시킨 후 BSA 에 대해 ELISA를 수행하였다 (도 4). BSA 에 비해 흡광도가 높은 클론들을 선택하여 DNA 시뭔싱을 의뢰하였다. 이로부터 중복된 각각의 단백질에 특이적인 펩타이드 시뭔스를 얻었다 (표 3).
【표 3a]
Figure imgf000041_0002
펩타이드 4 YGAYPWGSWTWENG WTW GWRVSRD 펩타이드 5 AAPTSFGSWTWENG WTW GWQMWHR
【표 3c]
조 Ξ
"ο"ΤΓ VCAM1에 대한 특이적인 펩타이드 시퀀스 펩타이드 1 QARDCTGSWTWENG WTW GPSICPI
【표 3d】
조 S
"Sᄀ τ nAchR에 대한 특이적인 펩타이드 시퀀스 펩타이드 1 EASFWLGSWTWENGKWTW GKGTLNR 펩타이드 2 YAYPLLGSWTWENGKWTW GWYQ I 펩타이드 3 ASLPAWGSWTWENG WTW GWSTRTA
【표 3d
조 Ξ
"Ο·ΤΓ HSA에 대한 특이적인 펩타이드 시퀀스
펩타이드 1 AASPYKGSWTWENGKWTWKGGWRMKM
펩타이드 2 SANSLYGSWTWENG WTWKGTSRQRW
펩타이드 3 YAHVYYGSWTWENG WTW GHRV QT
펩타이드 4 YGAYPWGSWTWENGKWTWKGWRVSRD
펩타이드 5 YAHFGWGSWTWENGKWTW GTTDSQS
【표 3f]
조方 e
ΤΓ MyD88에 대한 특이적인 펩타이드 시퀀스 펩타이드 1 HSHAFYGSWTWENG WTWKGNPGWWT
펩타이드 2 ASTINFGSWTWENGKWTW GYTERWN
실시예 13: 피브로넥틴 ED-B, VEGF, VCAM1, nAchR 및 HSA의 친화도의 측정
피브로넥틴 ED— B, VEGF, VCAM1, nAchR 및 HSA 에 대한 상기 펩타이드를 합성하여 SPR Biacore system(Biacore AB, Uppsala, Sweden)을 이용하여 친화도를 측정하였다. 피브로넥틴 ED-B 에 대한 친화도를 측정한 결과 펩타이드 1 은 620 nM 를 나타내었고, 펩타이드 2 는 75 nM 를 나타내었으며， 펩타이드 3 은 2.5 μΜ을 나타내었다 (도 5a). VEGF 에 대한 친화도를 측정한 결과 펩타이드 1 은 60 nM, 펩타이드 2 는 326 nM 을 나타냈다 (도 5b). VCAM1 의 단편 펩타이드에 대한 친화도를 측정한 결과 펩타이드 1 은 318 nM 을 보였다 (도 5c). nAchR 의 단편 펩타이드에 대한 친화도를 측정한 결과 펩타이드 1 은 73 nM 을 보였다 (도 5d), HSA 의 단편 펩타이드에 대한 친화도를 측정한 결과 펩타이드 1 은 115 nM 을 보였다 (도 5e).
실시예 14: 피브로넥틴 ED-B, VEGF, VCAM1, nAchR, HSA 및 MyD88 에 대한 특이성 분석
각각의 단백질에 특이적으로 결합하는 재조합 파아지를 여러 단백질에 대해서 특이성 검사를 ELISA 을 이용하여 시행하였다. 96-웰 ELISA 플레이트에 각각의 단백질을 5 을 50 ^씩 웰에 넣고 다음날 0.1% PBST(Tween-20)로
3 회 세척하고 2% BSA 를 사용하여 상온에서 2 시간 동안 블로킹을 한 후， 용액을 모두 버리고 0.1% PBST 로 3 회 세척하였다. 여기에 본 발명의 펩타이드를 가지는 재조합 파아지를 2% BSA와 잘 흔합하여 100 씩 10개의 단백질이 결합되어 있는 웰에 분주하고 27°C에서 2시간 동안 정치하였다. 0.1% PBST 용액으로 5회 세척한 다음 HRP—컨쥬게이션 항 -M13 항체 (GE Healthcare)를 1:1,000 으로 희석하여 27°C에서 1 시간 반응시켰다. 0.1% PBST 로 5 회 세척한 후 TMB 용액 100 ^를 분주하여 발색반응을 유도한 다음 1M HC1 100 ^을 첨가하여 반웅올 중지시킨 다음 450 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 도 6a 에서 볼 수 있듯이， 바이포달 펩타이드 바인더에서 찾은 ED-B 에 특이적인 표 3a 의 펩타이드 2 는 다른 단백질의 흡광도와 비교할 때 30 배 이상의 차이를 나타내었으며 이는 펩타이드 2 시퀀스가 E으 B 에 대해서 특이적임을 나타내는 결과이다. 도 6b-6f 에서 볼 수 있듯이， 표 3b-3f 각각의 펩타이드 1 에 대한 특이성 분석 결과， 이들 각각의 펩타이드는 VEGF, VCAM1, nAchR, HSA 및 MyD88 에 대하여 특이성을 갖는다는 것을 알 수 있다.
실시예 15: SPR(Surface Plasmon Resonance)의 공동 작용 효과 확인
바이포달 펩타이드 바인더의 항원에 대한 공동 작용 효과를 증명하기 위해서 친화력이 가장 좋은 표 3a 의 ED-B 에 대한 펩타이드 2 의 N- 및 C-말단 한쪽 부위만 각각 제거한 펩타이드를 합성하여 친화력을 측정하였다. N-말단 부분은 592 μΜ을 가지며 C-말단 부분은 12.8 μΜ을 나타내었다 (도 7). 바이포달 펩타이드 바인더에서 양발 (bipodal)을 가지고 있음으로써 나타내는 공동 작용 효과는 43 nM의 친화력임을 증명하였다 (도 5a).
실시예 16: 다른 β-헤어핀에 대한 바인딩 어세이
트립토판 지퍼 이외에 다른 β-헤어핀 골격인 GBlm3 및 HP7 에 ED-B 에 특이적으로 결합하는 Peptide2 의 N-말단 시퀀스 (HCSSAV)와 C-말단 시퀀스 (IIRLEQ)를 가지도록 펩타이드를 합성하였다 (애니젠， 한국). 즉, 트립토판 지퍼를 포함한 바이포달 펩타이드 바인더의 시퀀스는 HCSSAVGSWTWENGKWTWKGIIRLEQ 이며 GBlm3 을 포함한 바이포달 펩타이드 바인더는 HCSSAVGKKWTYNPAIXiKFTVQEGI IRLEQ이고, HP7을 포함한 바이포달 펩타이드 바인더는 HCSSAVGKTWNPATGKWTEG IIRLEQ이다. 각 펩타이드의 친화도는 BIAcore X(Biacore AB, Uppsala, Sweden)를 사용하여 측정하였다. 스트랩타비딘 SA 칩 (Biacore AB, Uppsala, Sweden)에 비오틴 -EDB 를 2,000 RU 만큼 홀려주어 고정시켰다. 러닝 버퍼로는 PBS(pH 7.4)를 사용하였고 플로우는 분당 30 ≠로 홀리면서 여러 농도로 동력학을 측정한 후 BIAevaluation 으로 친화도를 계산하였다. 친화도를 측정한 결과 GBlm3 가 70 nM, HP7 이 84 nM 로 트립토판 지퍼 (43 nM)와 비슷한 친화력을 가짐을 확인하였다 (도 8). 이는 모든 안정한 β—헤어핀 모티프가 구조 안정화 부위로서 가능함을 증명하는 결과이다.
실시예 17: 구조안정화 부위로서 루이신 지퍼를 포함하는 바이포달 펩타이드 바인더에 대한 바인딩 어세이
β-헤어핀 골격 대신 구조안정화 부위로서 루이신 지퍼에 ED-B 에 특이적으로 결합하는 펩타이드 2 의 Ν-말단 시뭔스 (HCSSAV)와 C-말단 시퀀스 (IIRLEQ)를 가지도록 CSSPIQGGSMKQLEDKVEELLSKNYHLENEVARLKKLVGER 및 11 RLEQGGSMKQLED VEELLSKNYHLENEVARLKKLVGER 펩타이드를 합성하였다 (애니젠, 한국). 두 펩타이드를 다이머로 만든 다음 BIAcore X(Biacore AB, Uppsala, Sweden)를 사용하여 친화도를 측정하였다. 친화도를 측정한 결과, 루이신 지퍼는 5 μΜ 의 친화도를 나타내었고 이는 트립토판 지퍼 (43 nM)의 비슷한 친화도보다 떨어지는 친화도이기는 하지만 루이신 지퍼도 바이포달 펩타이드 바인더의 구조 안정화 부위로서 기능할 수 있음을 알수 있다 (도 9).
실시예 18: 암 바이오마커인 피브로넥틴 ED-B 에 특이적인 바이포달 펩타이드 바인더의 암 표적화
암에 많미 분포하는 피브로넥틴 ED-B 를 타겟팅 하는 바이포달 펩타이드 바인더 (CSSPIQGSWTWENGKWTWKGIIRLEQ)에 Cy5.5 형광다이를 붙인 다음 Human U87MG 암이 있는 쥐에 정맥주사로 투여하여 IVIS 기계를 이용하여 바이포달 펩타이드 바인더가 암에 타겟하는 지 형광을 확인하였다 (도 10). 실험 결과, 암 바이오마커인 피브로넥틴 ED-B 에 특이적인 바이포달 펩타이드 바인더는 암 조직에 축적되는 것이 관찰되었으며, 이는 본 발명의 바이포달 펩타이드 바인더가 인 비보 이미징에 이용될 수 있음을 보여주는 것이다.
실시예 19: 세포내에 존재하는 MyD88 에 특이적인 바이포달 펩타이드 바인더의 활성 억제
세포 내에 존재하는 MyD88 의 활성을 억제하는 특이적인 바이포달 펩타이드 바인더의 효과를 증명한 결과이다 (도 11). 바이포달 펩타이드 바인더에 세포투과 펩타이드 (cell penetrating peptide) (9 개의 Arg 잔기)를 붙이면 세포 안으로 들어 갈 수 있다. 이를 ILᅳ lbeta 를 처리한 연골세포 (chondrocytes)에 10 μΜ 의 MyD88 특이적인 바이포달 펩타이드 바인더을 처리하였을 때 MyD88 의 활성이 억제됨을 丽 P-13 의 mRNA 와 단백질이 감소되는 것으로 확인하였다. 이는 바이포달 펩타이드 바인더를 이용하여 세포 내 타겟의 활성을 억제할 수 있음을 보여준 결과이다.
실시예 20: 세포내 타겟팅 (Intracellular targeting) - MyD88
1. MyD88바이오패닝
MyD 88(5 g/ )을 96 웰 ELISA 플레이트 (Corning)의 10 개의 웰에 50 ^씩 넣은 후， 4°C에서 하룻밤 동안 방치하였고， 다음날 2% BSA 를 사용하여 상온에서 2 시간 동안 블로킹한 후, 용액을 모두 버리고 0.1% PBST 로 3 회 세척하였다. 여기에 바이포달 펩타이드 바인더 재조합 파아지 포함용액 800≠및 10% BSA 200 ^을 흔합하여 Myd88 이 결합한 10 개의 웰에 옮겨 상온에서 1 시간 동안 방치하였다. 10 개 웰의 용액을 모두 제거하고 0.1% PBST 로 10 회 세척한 뒤 0.2 M 글리신 /HCKpH 2.2) 1 을 각 웰당 50 ^씩 넣어 20 분간 파아지를 용리시키고 1 을 류브에 모아 여기에 2M Tris-base(pH 9.0) 150 ^를 넣어 용액을 중화시켰다. 각 바이오패닝마다 인풋 파아지 및 일루트 파아지의 수를 측정하기 위해 0D=0.7 인 XL-1 BLUE 세포에 섞어 주어 암피실린이 포함된 아가 배지에 도말하였다. 패닝을 반복하기 위해 10 1 의 E. coli XL1-BLUE 세포와 섞어 37°C에서 1 시간 동안 200 rpm 의 속도로 흔합하며 배양하였다. 암피실린 (50 및 20 ηιΜ 글루코오스를 흔합한 후， 2X1010 pfu 의 Ex 헬퍼 파아지를 첨가하여 37°C에서 1시간 동안 200 rpm의 속도로 흔합하며 배양하였다. 배양액을 l,000Xg 로 10 분 동안 원심 분리한 후 상층액은 제거하고 침전된 세포들올 암피실린 (50 및 카나마이신 (25 g/m«이 포함된 40 mi LB 액체 배지로 재현탁하여 30°C에서 200 rpm 의 속도로 흔합하며 하루 동안 배양하였다. 배양액을 4,000Xg, 20 분 및 4°C의 조건으로 원심 분리하였다. 상층액에 8 의 5x PEG/NaCl[20% PEG(w/v) 및 15% NaCl(w/v)]을 첨가한 후 4°C에서 1 시간 동안 정치시켰다. 원심분리 후 PEG 용액을 완전히 제거하고 1 11 의 PBS 용액으로 파아지 펩타이드 펠렛을 녹인 다음 2 차 바이오패닝에 사용하였다. 각 패닝 단계마다 상기와 동일한 방법을 사용했으며， 세척과정만 단계별로 각각 20 회 및 30회 (0.1% PBST) 증가시켰다.
2. MyD88단백질에 특이적인 Phage peptide검색 (Phage ELISA)
Output phage/ Input phage ratio 가 가장 높은 다섯번째 biopanning 단계에서 회수한 파아지를 XL1-BLUE 세포에 감염시킨 후 plaque 가 plate 당 100- 200 개 정도되도록 plating 하였다. 멸균된 Tip 을 이용하여 plaque 60 개를 2 ml 의 LB-Ampiciinn(50ug/ml) 배양액에 접종한 후 37°C에서 5 시간동안 진탕 배양하여 0D=0.8-1 에서 5X109 pfu 의 Ex helper 파아지를 추가하여 37 °C 에서 1시간 동안 200 rpm의 속도로 섞어주며 배양하였다. 배양액을 1,000 g로 10분간 원심 분리한 뒤 상청액은 제거하고 가라앉은 세포들을 LB 에 Ampcillin(50ug/ml)과 Kanamycine(25ug/ml )을 넣어준 lml 액체배지로 재부유하여 30oC에서 200 rpm의 속도로 섞어주며 하룻밤 배양하였다. 배양액을 10000g, 20분 4°C 조건으로 원심분리하여 상청액을 회수한 후 2% skim milk 을 넣고 이를 phage peptide 검색에 사용하였다. 96-well ELISA plate 에 10 ug/ml myd88 을 50 ul/each well 씩 30 well 에 넣고 lOug/ml BSA 을 50 ul/each well 씩 30well 에 넣고 40C 에서 하룻밤 방치하였고, 다음날 모든 wells 을 0.1% PBST 로 3 회 세척하고 PBS 로 희석한 2% Skim milk 를 사용하여 상온에서 2 시간 동안 blocking 한 뒤， 용액을 모두 버리고 0. PBST로 3 회 세척하였다. 각 클론별로 증폭된 phage peptide 용액 100 μ 1 씩을 ED-B 단백질이 부착된 well 과 BSA 단백질이 부착된 well 에 분주하고 27°C에서 1시간 30 분 정치하였다. 0.1% PBST 용액으로 10 번 세척한 다음 HRP-conjugated anti— M13 항체 (GE Healthcare)를 1:1,000으로 회석하여 270C에서 1시간 반응시켰다. 0.1% PBST로 5번 세척한 후 TMB 용액 100 μ 1 를 분주하여 발색반웅을 유도한 다음 lOOul 의 1M HC1 를 첨가하여 반웅을 중지시켰다. 450 nm 에서 흡광도를 측정하여 BSA 에 비해 AR- DBD 의 흡광도가 20 배 이상 높은 클론들을 선택하였다. 이들의 파아지를 XL1 세포에 감염시킨 후 plaque 가 plate 당 100-200 개 정도되도록 plating 하였다. 멸균된 Tip 을 이용하여 plaque 를 4 ml 의 LB-Ampici 11 in(50ug/ml ) 배양액에 접종한 후 37°C에서 하루동안 진탕 배양하여 plasmid preparation kit 을 이용하여 plasmid 들을 정제하여 sequencing 을 의뢰했다. sequencing primer 는 vector sequence인 5 - GAT TAC GCC AAG CTT TGG AGC -3'을 사용하였다.
3. 세포내에 존재하는 MyD88 에 특이적인 바이포달 펩타이드 바인더의 활성 억제 실험
MyD88 은 세포내에 존재하는 단백질이기 때문에 바이포달 펩타이드 바인더의 loop 의 라이신 (lysine) 잔기를 이용하여 세포투과펩타이드 (eel 1 penetrating peptide)인 9 개의 아지닌 (arginine) (애니젠， 한국)을 EDC/NHS(Sigma)를 이용하여 바이포달 펩타이드 바인더에 공유결합시켜 세포 투과를 가능하게 만들었다. MyD88 의 활성이 활성화되면 MMP-13 의 양의 증가하기 때문에 匪 P-13 의 양을 측정하면 MyD88 의 활성이 억제되는지 판별할 수 있다. MyD88 의 활성을 활성화 시키는 IL-lbeta(10 ng/ml)(R&D systems, Minneapolis MN)를 연골세포에 처리하였다. 그 다음 세포 투과 펩타이드 인 9R 이 결합된 MyD88 에 특이적인 바이포달 펩타이드 바인더 (표 3f 의 펩타이드 1)를 연골세포에 10 μΜ 처리하고 12 시간 후에 niRNA 을 분리한 다음 MMP-13 과 GAPDH 에 대해 RT- PCR을 진행하였다. 또한 연골세포를 파괴하여 세포 내 단백질을 얻은 다음 Anti- 醒 P 13 항체 (Abeam, ab3208, Cambridge)와 세미 드라이 transfer 기계 (Amersham Bioscience, Piscataway)를 이용하여 웨스턴 블롯팅을 실시하여 MMP-13 의 양을 측정하였다.
4. 실험 결과
(1) Biopanning of MyD88
Bipodal -peptide binder library 를 myd88 단백질에 대해 5 차에 걸쳐 biopanning 을 실시하고 각 panning 단계에서 회수한 phage peptide 들의 output phage/ input phage 비 (ratio)를 결정하였다 (표 4a).
【표 4a]
Input Elute
Round Yield phage(pfu) phage(pfu)
First 2*10" 2.8*107 14*10—5
Second 1.3*10" 1*107 7.7*10"5
Third 1.1*1010 1.8*107 163*10"5
Four 4*1012 3.3*108 8.2*10"5
Five 7*1010 1.8*108 257*10"5
(2) EL ISA of 40 each recombinant phage selected from fifth biopanning and DNA sequencing against MyD88
각 플라크로부터 60 개의 파아지를 증폭시킨 후 BSA 에 대해 ELISA 를 수행하였다. BSA 에 비해 흡광도가 높은 클론들을 선택하여 DNA 시뭔싱을 의뢰하였다. 이로부터 중복된 각각의 단백질에 특이적인 펩타이드 시퀀스를 얻었다.
Pept i del： HSHAFYGSWTWENGKWTWKGNPGWWT
Peptide 2： ASTINFGSWTWENGKWTWKGYTRRWN
(3) Myd88 바이포달 펩타이드 바인더의 특이성 테스트
다른 단백질과 비교하였을 때 바이포달 펩타이드 바인더가 Myd88 과 특이성이 있는지 ELISA 테스트를 하였고， 특이성이 있는 결과가 나왔다 (참조: 도 6f).
(4) 세포내에 존재하는 MyD88 에 특이적인 바이포달 펩타이드 바인더의 활성 억제 세포 내에 존재하는 MyD88 의 활성을 억제하는 특이적인 바이포달 펩타이드 바인더의 효과를 증명한 결과이다 (도 11). 바이포달 펩타이드 바인더에 세포투과 펩타이드 (cell penetrating peptide)를 붙이면 세포 안으로 들어 갈 수 있다. 이를 IL-lbeta 를 처리한 연골세포 (chondrocytes)에 10 μΜ 의 MyD88 특이적인 9R-바이포달 펩타이드 바인더을 처리하였을 때 MyD88 의 활성이 억제됨을匪 P-13의 mRNA와 단백질이 감소되는 것으로 확인하였다. 이는 바이포달 펩타이드 바인더를 이용하여 세포 내 타겟의 활성을 억제할 수 있음을 보여준 결과이다.
실시예 21: 세포내 타켓팅 (Intracellular targeting) - Androgen receptor
1. Androgen receptor DNA binding domain(DBD) 유전자 제작과 Expression vector에 삽입
Prostate cancer cell line 인 LNCaP cell 에서 total mRNA를 추출한 뒤 oligo dT 를 이용하여 cDNA 를 만들었다.두 개의 primer 인 5'- GAC TAT TAC ΊΤΤ CCA CCC CA-3' (AR_F1) 와 5'- TAG TTT CAG ATT ACC AAG TTT C— 3' (ARᅳ Bl)을 합성하여 AR-F1 20 pmol, AR-Bl 20 pmol , 2.5mM dNTP mixture 4y 1, Ex Taq DNA polymerase 1μ 1 (10 U), 10 x PCR buffer 5μ 1 를 섞고 총 50 μΐ 가 되도록 증류수를 추가한 혼합액을 만들었다. 이 흔합액을 PCR반웅 (94 5분， 30 cycle: 57 °C 30 초와 720C 1 분， 940C 30 초)을 하여 AR DBD Insert 로 만든 후 PCR purification kit을 이용하여 정제하였다. 그 후 Enzyme site를 넣어주기 위해서 다시 두 개의 primer 인 5'- TAT GGA TCC GAC TAT TAC TTT CCA CC— 3' (AR_F1- BamHl) 와 5'- ATA CTC GAG TCA TAG TTT CAG ATT ACC AAG-3' (AR_Bl-Xhol) 을 합성하여 AR-F1 20 pmol, AR-Bl 20 pmol, 2.5mM dNTP mixture 4μ 1, Ex Taq DNA polymerase 1μ 1 (10 U), 10 x PCR buffer 5μ 1 를 섞고 총 50μ1 가 되도록 증류수를 추가한 흔합액을 만들었다. 이 흔합액을 PCR반웅 (940C 5분, 30 cycle: 57 °C 30 초와 720C 1 분， 940C 30 초)을 하여 AR DBD Insert 로 만든 후 PCR purification kit 을 이용하여 정제하였다. AR DBD insert 유전자를 pGEX-4T-l 백터 (Amersham)에 연결하기 위해 AR-DBD insert 유전자와 pGEX-4T-l 백터에 제한효소 처리를 시행하였다. 약 2yg 의 Insert DNA 를 B HI (NEB)와 i /(NEB)로 4시간씩 반웅시킨 후 PCR purification kit을 이용하여 정제하였다. 그리고 약 2ug의 pGEXᅳ 4T-1 백터를 BamHI (NEB)와 ¾/(NEB)로 3시간씩 반웅시킨 후 Calf Intestinal Alkaline Phosphatase(CIP)를 1 시간 반웅한 후 PCR purification kit 을 이용하여 정제하였다. 이들을 molar ratio vector: Insert=l:3 으로 T4 DNA 1 igase(Bioneer )를 이용하여 180C, 10 시간 동안 연결한 후 DH5a competent cell 에 trans format ion 을 한 후 ampici 11 in agar 배지에 도말하였다. 한천 평판 배지에서 자란 집락을 5 ml 의 LB 배지에 접종한 뒤 370C 에서 200 rpm 의 속도로 섞어주면서 하룻동안 배양한 후 plasmid preparation kit 을 이용하여 plasmid 을 정제하여 sequencing 을 하여 클로닝이 성공했는지 확인하였다.
2. androgen receptor DBD 발현 및 정제
Androgen receptor DBD 를 클로닝한 pGEX_4T_l vector 를 BL21 cell 에 transformation 한 후 ampici 11 in agar 배지에 도말하였다. 한천 평판 배지에서 자란 집락을 ampicillin (25ug/ml)을 넣어준 5ml LB 배지에 접종한 뒤 370C 에서 200 rpm 의 속도로 섞어주면서 하룻동안 배양한 후 50ml ampici 11 in (25ug/ml) LB 배지에 옮겨 3 시간 키웠다. 이렇게 키운 E.coli 을 2L LB 에 ampicillin (25ug/ml)을 넣고 50ml 키운 E.coli를 넣고 OD=0.6-0.8까지 키웠다. 그 다음 ImM isopropyl-p-D-thiogalactopyranosidedPTG)를 넣어주어 37 °C 에서 200rpm 의 속도로 섞어주면서 8 시간 키웠다. 4,000 g 로 20 분간 원심 분리하여 가라앉은 세포들을 제외한 상청액을 모두 제거하고， PBS buffer로 재부유시켰다. -80 °C에 하루동안 보관한 후 Sonicator 를 이용하여 E.coli 용해시킨 후에 15ᅳ 000 g 로 1 시간 동안 원심 분리하여 상청액을 GST affinity resin 에 붙인다. PBS 로 resin 을 씻어 준 후 Elution buffer (25 mM glutathione, 50 mM Tris pH 8.8, 200 mM NaCl)을 이용하여 N-terminal GST-AR DBD 단백질을 떨어뜨려 모은다. 이렇게 모은 단백질을 superdex75 column 와 PBS(pH7.4) buffer 을 이용하여 gel filtration을 하여 순도 높은 GST-AR DBD 단백질을 모은다.
3. counter-select ion을 위한 GST단백질 정제
pGEX-4T-l vector 자체를 BL21 cell 에 transformation 한후 ampicillin agar 배지에 도말하였다. 한천 평판 배지에서 자란 집락을 ampicillin (25ug/ml)을 넣어준 5ml LB 배지에 접종한 뒤 37 °C 에서 200 rpm 의 속도로 섞어주면서 하룻동안 배양한 후 50ml ampicillin (25ug/ml) LB 배지에 옮겨 3 시간 키웠다. 이렇게 키운 E.coli 을 2L LB 에 ampicillin (25ug/ml)을 넣고 50ml 키운 E.coli 를 넣고 0DO.6-0.8 까지 키웠다. 그 다음 ImM isopropyl-β -D- thiogalactopyranoside(IPTG)를 넣어주어 370C 에서 200rpm 의 속도로 섞어주면서 8 시간 키웠다. 4,000 g 로 20 분간 원심 분리하여 가라앉은 세포들을 제외한 상청액을 모두 제거하고， PBS buffer로 재부유시켰다. -80 °C에 하루동안 보관한 후 Sonicator 를 이용하여 E.coli 용해시킨 후에 15,000 g 로 1 시간 등안 원심 분리하여 상청액을 GST affinity resin 에 붙인다. PBS 로 resin 을 씻어 준 후 Elution buffer (25 mM glutathione, 50 ιηΜ Tris pH 8.8， 200 mM NaCl)을 이용하여 N-terminal GST 단백질을 떨어뜨려 수집하였다.이렇게 모은 단백질을 Superdex75 col围 n(Amersham)와 PBS(pH7.4) buffer을 이용하여 gel filtration을 하여 순도 높은 GST 단백질을 수집하였다.
4. Electrophoretic mobility shift assay
정제한 AR-DBD 가 DNA 와 결합하는지 알아보기 위해 EMSA 를 수행하였다. AR DBD 가 결합하는 DNA 시퀀스인 5' -CCA GAA CAT C GAA CAC-3' 5' -GTG TTC TTG ATG TTC TGG-3' 을 합성하였다.그 다음 shift buffer (4 mMTris-HCl (pH7.5), 80 mMNaCl , 0.5 mM ZnC12, 2.5 mM MgS04, 1 mM EDTA, 0.5 mM DTT, 1 lg polyCdl- dC), 4% glycerol) 에 정제한 AR DBD 와 DNA 를 넣고 인큐베이션 한다. 그리고 아가로즈 젤에서 전기영동을 통해 리타데이션을 확인하였다.
5. Affinity selection (Biopanning)
GST-AR DBD(10ug/ml) lml 을 96 well EL ISA plate(Corning)에 20wells 에 50ul 씩 넣고 4 0C 에서 하룻밤 방치하였고， GST(10ug/ml) lml 을 96 well EL ISA plate(Corning)에 20wells 에 50ul 씩 넣고 4 °C 에서 하룻밤 방치하였다. 다음날 40 wells 모두를 0.1% PBST 로 3 회 세척하고 PBS 로 회석한 2% BSA 를 사용하여 상온에서 2 시간 동안 blocking 한 뒤, 용액을 모두 버리고 0.1% PBST 로 3 회 세척하였다. 여기에 Bipodal-peptide binder 재조합 파아지 포함용액 800ul 과 10% BSA 200ul 을 잘 흔합하여 streptavidin 과 BSA 에 붙는 파지들을쎄거하기 위해서 GST 에 BSA coating 했던 20wells 에 넣어 1 시간 동안 270C 에 두었다. 상청액을 회수하여 GST-AR-DBD 가 붙어있는 20wells 에 옮겨 270C 에서 45 분간 정치하였다. 20 wells의 용액을 모두 제거하고 0.5% PBST로 15회 세척한 뒤 0.2 M glycine/HCl (pH2.2) 1 ml을 50ul/each well 넣어 20분간 파아지를 용리시키고 lml 을 E-tube 에 모아 여기에 2M Tris-base(pH9.0) 150 μ 1 를 넣어 용액을 중화시켰다. 각 biopanning 마다 Input phage 와 Elute phage 의 수를 측정하기 위해 OD=0.7인 XL-1 BLUE cell 에 섞어 주어 ampicillin 한천 배지에 도말하였다. panning 을 반복하기 위해 10 ml 의 E.coli XL1-BLUE 세포와 섞어 37 0C 에서 1 시간 동안 200 rpm 의 속도로 섞어주며 배양하였다. ampicillin (50ug/ml)과 20mMglucose를 흔합한 뒤 , 여기에 2X1010 pfu의 Ex helper 파아지를 추가하여 37 0C에서 1시간 동안 200 r i의 속도로 섞어주며 배양하였다. 배양액을 1,000 g로 10 분간 원심 분리한 뒤 상청액은 제거하고 가라앉은 세포들을 LB 에 Ampcillin(50ug/ml)과 Kanamycine(25ug/ml )을 넣어준 40ml 액체배지로 재부유하여 30oC에서 200 rpm의 속도로 섞어주며 하룻밤 배양하였다. 배양액을 4000g, 20분, 4°C 조건으로 원심 분리하였다. 상청액에 8ml 의 5xPEG/NaCI [20%PEG (w/v) , 15% NaCl (w/v)]을 첨가한 후 4°C에서 1 시간 정치시켰다. 원심분리 후 PEG 용액을 완전히 제거하고 1 ml 의 PBS 용액으로 phage peptide pellet 을 녹인 다음 2 차 biopanning 에 사용하였다. 각 panning 단계마다 위와 같은 똑같은 방법을 사용했으며， 세척과정만 0.5% PBST 25, 35회로 단계별로 증가시켰다.
6. ELISA of Input phage
Bipodal -peptide binder 의 라이브러리의 각 Input phage 을 GST, BSA, GST-AR-DBD에 대해 ELISA를 시행하였다. 96well ELISA plate에 lOug/ml GST-AR- DBD 를 50ul/ each well 씩 lOwell 에 넣고 lOug/ml GST 를 50ul/ each well씩 lOwell에 넣고 BSA을 50ul/each well씩 lOwell 에 넣고 4 °C에서 하룻밤 방치하였다, 다음날 모든 wells 을 0.1% PBST로 3 회 세척하고 PBS 로 희석한 2% BSA 를 사용하여 상온에서 2 시간 동안 blocking 한 뒤， 용액을 모두 버리고 0.1% PBST로 3회 세척하였다. 여기에 Bipodal -peptide binder 재조합 파아지인 첫번째 두번째， 세번째 네번째, 다섯번째 Input phage 800ul 과 10% BSA 200ul 을 잘 흔합하여 lOOul 씩 GST-AR-DBD, GST, BSA wells 에 각각 2 wells 씩 분주하고 27 °C 에서 1 시간 30 분 정치하였다. 0.1% PBST 용액으로 10 번 세척한 다음 HRP- conjugated ant i -M13 항체 (GE Healthcare)를 1: 1,000 으로 회석하여 27°C 에서 1 시간 반웅시켰다. 0.1% PBST 로 5 번 세척한 후 TMB 용액 100 μΐ 를 분주하여 발색반응을 유도한 다음 lOOul 의 1M HC1 를 첨가하여 반웅을 중지시켰다. 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
7.AR-DBD 단백질에 특이적인 Phage peptide 검색 (Phage ELISA)
Output phage/ Input phage ratio 가 가장 높은 다섯번째 biopanning 단계에서 회수한 파아지를 XL1-BLUE 세포에 감염시킨 후 plaque 가 plate 당 100- 200 개 정도되도록 plating 하였다. 멸균된 Tip 을 이용하여 plaque 60 개를 2 ml 의 LB-Ampicillin(50ug/ml) 배양액에 접종한 후 37°C에서 5 시간동안 진탕 배양하여 0D=0.8-1 에서 5X109 pfu 의 Ex helper 파아지를 추가하여 37 °C 에서 1시간 동안 200 rpm의 속도로 섞어주며 배양하였다. 배양액을 1，000 g로 10분간 원심 분리한 뒤 상청액은 제거하고 가라앉은 세포들을 LB 에 Ampcillin(50ug/ml)과 Kanamycine(25ug/ml)을 넣어준 lml 액체배지로 재부유하여 30°C에서 200 rpm의 속도로 섞어주며 하룻밤 배양하였다. 배양액을 10000g, 20분 4°C 조건으로 원심분리하여 상청액을 회수한 후 2% skim milk을 넣고 이를 phage peptide 검색에 사용하였다. 96well ELISA plate에 10ug/ml AR-DBD를 50ul/ each well 씩 30well 에 넣고 lOug/ml BSA 을 50ul/each well 씩 30well 에 넣고 4 °C 에서 하룻밤 방치하였고， 다음날 모든 wells 을 0.1% PBST 로 3 회 세척하고 PBS 로 희석한 2% Skim milk 를 사용하여 상온에서 2 시간 동안 blocking 한 뒤， 용액을 모두 버리고 0.1% PBST 로 3 회 세척하였다. 각 클론별로 증폭된 phage peptide 용액 100 μ 1 씩을 ED-B 단백질이 부착된 well 과 BSA 단백질이 부착된 well 에 분주하고 2Ί 에서 1 시간 30 분 정치하였다. 0.1% PBST용액으로 10 번 세척한 다음 HRP-conjugated anti— M13 항체 (GE Healthcare)를 1:1,000 으로 희석하여 27°C에서 1시간 반웅시켰다. 0.1% PBST로 5번 세척한후 TMB용액 100 μΐ 를 분주하여 발색반웅을 유도한 다음 lOOul 의 1M HC1 를 첨가하여 반웅을 중지시켰다. 450 nm에서 흡광도를 측정하여 BSA에 비해 AR-DBD의 흡광도가 20배 이상 높은 클론들을 선택하였다. 이들의 파아지를 XL1 세포에 감염시킨 후 plaque 가 plate 당 100—200 개 정도되도록 plating 하였다. 멸균된 Tip 을 이용하여 plaque를 4 ml 의 LB-Ampici 11 in(50ug/ml ) 배양액에 접종한 후 37°C에서 하루동안 진탕 배양하여 plasmid preparation kit 을 이용하여 plasmid 들을 정제하여 sequencing을 의뢰했다. sequencing primer 는 vector sequence 인 5一 GAT TAC GCC AAG CTT TGG AGC -3'을 사용하였다.
8. Inhibition assaysᅳ EMSA
합성한 Bipodal -peptide binder 가 AR-DBD 와 DNA 와의 결합을 억제하는 지 알아보기 위해 EMSA를 수행하였다. AR DBD가 결합하는 DNA시뭔스인 5' -CCA GAA CAT CM GAA CAC-3' 5' -GTG TTC TTG ATG TTC TGG-3' 을 합성하였다.그 다음 shift buffer(4 mMTris-HCl (pH7.5), 80 mMNaCl, 0.5 mM ZnC12, 2.5 mM MgS04, 1 mM EDTA, 0.5 mM DTT, 1 lg polyCdl -dC) , 4% glycerol) 에 AR DBD 와 DNA 그리고 Bipodal -peptide binder 를 넣고 인큐베이션 한다. 그리고 아가로즈 젤에서 전기영동을 통해 리타데이션을 확인한다.
9. AR DBD에 특이적인 BPB의 세포전달 실험
AR DBD BPB의 N-term에 FITC를 콘쥬게이션 하였고， BPB의 loop부분의 라이신 잔기에 세포투과펩타이드인 oligo 9R 펩타이드를 콘쥬게이션 하였다, 그리고 FITC-BPB-9R, FITC-BPB 를 0.5yg 을 PC3 cell 에 1 시간 처리하였다. 세 번의 washing 과정을 거치고 세포를 고정시킨 후 confocal 현미경을 통해 BPB 가 세포 안으로 들어갔는지 확인 하였다.
9. 실험 결과
(1) Biopanning of AR-DBD
Bipodal -peptide binder library 를 AR-DBD 단백질에 대해 5 차에 걸쳐 biopanning 을 실시하고 각 panning 단계에서 회수한 phage peptide 들의 output phage/ input phage 비 (ratio)를 결정하였다 (표 4b).
【표 4b]
Inp니 t Elute
Round Yield phage(pf니) phage(pfu)
First 2.8*1011 1.1*107 4*10_5
Second 1.6*1011 1.0*107 5.1*10-5
Third 1.6*1011 1. 108 65*1으5
Four 3.2*10" 4.4*108 130*10"5
Five 3.2*1011 4.3*108 128*10~5 (2) Phage ELISA of Input phage against AR-DBD
Bipodal -peptide binder의 라이브러리의 각 Input phage을 AR-DBD, GST, BSA에 대해 ELISA를 시행하였다. 첫번째 두번째 Input phage의 반웅성은 AR-DBD, GST, BSA모두 흡광도가 비슷하나 세번째 Input phage부터 ED-B흡광도가 GST에 비해 5.1 배， BSA 에 비해 3.4 배 높았다. 네번째, 다섯번째 Input 에서는 ED-B 흡광도가 GST 와 BSA 보다 높은 반웅성을 보여 AR-DBD 에 대해 성공적으로 Biopanning이 이루어짐을 알 수 있다 (도 12a).
(3) ELISA of 40 each recombinant phage selected from third biopanning and DNA sequencing against AR-DBD
각 library 의 panning 단계증 0/1 ratio 가 가장 높은 5 차 단계에서 회수한 phage 를 plaque 형태로 확보하였다. 각 plaque 로부터 60 개의 phage 을 증폭시킨 후 AR-DBD 와 BSA 에 대해 ELISA 를 시행하였다. 대부분 AR-DBD 가 BSA보다 흡광도가 높았고 BSA보다 5배 이상 흡광도를 보이는 clones 20개를 DNA sequencing을 해 보았다. 총 2개의 중복된 펩타이드 시뭔스를 얻었다 (도 12b). Peptide 1: YGFAPFGSWTWENGKWTWKGYSTQKP( 14/20 clones)
Peptide 2： GGHNIQGSWTWENGKWTWKGWQHIWG(6/20 clones)
(4) Inhibition assays -EMSA
Bipodal peptide binder 가 AR-DBD 와 결합하는지 EMSA 수행하였다. 수행결과 BPB 처리 농도가 증가 할수록 점점 AR-DBD 가 DNA 와의 결합능력을 상실하였다. 이것은 AR 이 DNA 와의 결합할 수 있는 능력을 막을 수 있다는 것을 의미한다 (도 12c).
(5) AR DBD에 특이적인 바이포달 펩타이더의 세포 전달 테스트
AR DBD 에 특이적인 바이포달 펩타이드 바인더의 루프에 세포투과 펩타이드 (cell penetrating peptide)와 FITC를 붙여 세포 안으로 들어 가는 것을 confocal 현미경을 통해 확인 하였다. 세포 투과 펩타이드인 01igo-9 R peptide 를 붙인 것과 붙이지 않은 것을 비교한 결과 뚜렷하게 세포 투과 펩타이드를 붙인 것이 효과적으로 세포 안으로 들어가는 것을 확인 하였다 (도 14), 실시예 22: 세포내 타겟팅 (Intracellular targeting) - STAT3
1. STAT3 biopnning STAT3(10 을 96 웰 ELISA 플레이트 (Corning)의 10 개의 웰에 50
^씩 넣은 후, 4°C에서 하룻밤 동안 고정하였고， 다음날 2% BSA 를사용하여 상온에서 2 시간 동안 블로킹한 후， 용액을 모두 버리고 0.1¾> PBST 로 3 회 세척하였다. 여기에 바이포달 펩타이드 바인더 재조합 파아지 포함용액 500 ^및 10% BSA 500 을 흔합하여 STAT3 가 고정된 10 개의 웰에 옮겨 상온에서 1 시간 동안 방치하였다. 10개 웰의 용액을 모두 제거하고 0.1% PBST로 10회 세척한 뒤 0.2 M 글리신 /HCKpH 2.2) 500 峰 각 웰당 50 ^씩 넣어 20 분간 파아지를 용리시키고 500 ^를 튜브에 모아 여기에 2M Tris-base(pH 9.0) 100 μ 넣어 용액을 중화시켰다. 각바이오패닝마다 인풋 파아지 및 일루트 파아지의 수를 측정하기 위해 0D=0.7 인 XL-1 BLUE 세포에 섞어 주어 암피실린이 포함된 아가 배지에 도말하였다. 패닝을 반복하기 위해 10 의 E. coli XL1-BLUE세포와 섞어 37°C에서 1시간 동안 200 rpn의속도로 흔합하며 배양하였다. 암피실린 (50 i /ml) 및 20 iiiM 글루코오스를 흔합한 후， 2X1010 pfu 의 Ex 헬퍼 파아지를 첨가하여 37°C에서 1 시간 동안 200 rpm 의속도로 흔합하며 배양하였다. 배양액을 l.OOOXg 로 10 분 동안 원심 분리한 후 상층액은 제거하고 침전된 세포들을 암피실린 (50 ； ag/iiO 및 카나마이신 (25 g/iiO이 포함된 40 LB 액체 배지로 재현탁하여 30°C에서 200 rpm 의속도로 혼합하며 하루 동안 배양하였다. 배양액을 4,000Xg, 20 분 및 4°C의조건으로 원심 분리하였다. 상층액에 8 의 5x PEG/NaCl[20% PEG(w/v) 및 15% NaCl(w/v)]을 첨가한 후 4°C에서 1 시간 동안 정치시켰다. 원심분리 후 PEG 용액을 완전히 제거하고 1 의 PBS 용액으로 파아지 펩타이드 펠렛을 녹인 다음 2 차 바이오패닝에 사용하였다. 각패닝 단계마다 상기와 동일한 방법을 사용했으며， 세척과정만 단계별로 각각 20 회 및 30회 (0.1% PBST) 증가시켰다 .
2. STAT3단백질에 특이적인 Phage peptide검색 (Phage ELISA)
Output phage/ Input phage ratio 가 가장 높은 네번째 biopanning 단계에서 회수한 파아지를 XL1-BLUE세포에 감염시킨 후 plaque 가 plate 당 100- 200 개 정도되도록 도말하였다. 멸균된 Tip 을 이용하여 plaque 30 개를 2 ml 의 LB-Ampicillin(50ug/ml) 배양액에 접종한 후 371：에서 5 시간동안 진탕 배양하여 OD=0.8-1 에서 5X109 pfu의 Exhelper 파아지를 추가하여 37 °C 에서 1 시간 동안 200 rpm의속도로 섞어주며 배양하였다. 배양액을 1,000 g로 10분간 원심 분리한 뒤 상청액은 제거하고 가라앉은 세포들을 LB 에
Anipcillin(50ug/ml)과 Kanamycine(25ug/ml )을 넣어준 lml 액체배지로 재부유하여 30oC에서 200 rpm의 속도로 섞어주며 하룻밤 배양하였다. 배양액을 lOOOOg, 20분， 4°C 조건으로 원심분리하여 상청액을 회수한 후 2% skim milk 을 넣고 이를 phage peptide 검색에 사용하였다. 96well EL ISA plate 에 lOug/ml STAT3 를 50ul/each well씩 30well에 넣고 lOug/ml streptavidin을 50ul/each well씩 30well에 넣고 4 °C 에서 하룻밤 동안 고정하였고， 다음날 모든 wells 을 0.1% PBST 로 3 회 세척하고 PBS 로희석한 2% Skim milk 를 사용하여 상온에서 2 시간 동안 blocking 한 뒤， 용액을 모두 버리고 0.1% PBST로 3 희 세척하였다. 각 클론별로 증폭된 phage peptide 용액 100 μ 1 씩을 STAT3 단백질이 부착된 well 과 Streptavidin 단백질이 부착된 well 에 분주하고 27 °C 에서 1 시간 30 분 정치하였다. 0.1% PBST 용액으로 10 번 세척한 다음 HRP-conjugated anti-M13 항체 (GE Healthcare)를 1:1,000 으로 회석하여 27 0C 에서 1 시간 반웅시켰다. 0.1% PBST 로 5 번 세척한 후 TMB 용액 100 μ 1 를 분주하여 발색반웅을 유도한 다음 lOOul 의 1M HC1 를 첨가하여 반웅을 중지시켰다. 450 nm 에서 홉광도를 측정하여 streptavidin 에 비해 AR-DBD 의 흡광도가 20 배 이상 높은 클론들을 선택하였다. 이들의 파아지를 XL1 세포에 감염시킨 후 plaque 가 plate 당 100- 200개 정도되도록 plating하였다. 멸균된 Tip을 이용하여 plaque를 4 ml의 LB- Ampicillin(50ug/ml) 배양액에 접종한 후 37°C에서 하루동안 진탕 배양하여 plasmid preparation kit 을 이용하여 plasmid 들을 정제하여 sequencing 을 의뢰했다. sequencing primer 는 vector sequence 인 5 -GAT TAC GCC AAG CTT TGG AGC -31을 사용하였다.
3. STAT3에 특이적인 바이포달 펩타이드 바인더의 친화력 측정
DNA 시퀀싱을 통해서 peptide 서열을 확인 하였고, 두개의 BPB 를 펩타이드 합성 의뢰하였다. (BPBl: QAYYIP GSWTWENGKWTWKG LWGPEF, BPB2: HGFQWP GSWTWENGKWTWKG AYQFLK) 이 중 BPB1 친화력을 측정하였다. Biacore X 를 이용해서 친화력을 측정하였다. CM5 chip에 STAT3 단백질을 pH5.5 buffer에서 4000RU까지 고정하였다. 그리고 펩타이드 농도 ¾Μ, 5μΜ, 7.5μΜ로 친화력을 측정하였다. 4. STAT3에 특이적인 바이포달 펩타이드 바인더의 세포전달 실험
(1) STAT3 BPB1 peptide(QAYYIP GSWTWENGKWTWKG LWGPEF)의 N-term 에 FITC 를 콘쥬게이션 하였고， BPB 의 loop 부분의 라이신 잔기에 세포투과펩타이드인 oligo 9R 펩타이드를 콘쥬게이션 하였다. 그리고 FITC-BPB-9R, FITC-BPB 를 0.5Ug 을 PC3 cell 에 1 시간 처리하였다. 세 번의 washing 과정을 거치고 세포를 고정시킨 후 confocal 현미경을 통해 BPB 가 세포 안으로 들어갔는지 확인 하였다.
(2) STAT3 BPB1 pept ide(QAYYIP GSWTWENGKWTWKG LWGPEF)의 C— term 에 세포투과펩타이드인 oligo 9R 을 퓨전시키고 N-term 말단에 FITC 를 콘쥬게이션 하였다. 그리고 FITC-BPB-9R, FITC-BPB를 0.5pg을 PC3 cell에 1시간 처리하였다. 세 번의 washing 과정을 거치고 세포를 고정시킨 후 confocal 현미경을 통해 BPB가 세포 안으로 들어갔는지 확인 하였다.
5. 세포내에 존재하는 STAT3 에 특이적인 바이포달 펩타이드 바인더의 활성 억제 실험
STAT3 는 세포내에 존재하는 단백질이기 때문에 바이포달 펩타이드 바인더의 loop 의 라이신 (lysine) 잔기를 이용하여 세포투과펩타이드 (eel 1 penetrating peptide)인 9 개의 아지닌 (arginine) (애니젠, 한국)을 EDC/NHS(Sigma)를 이용하여 바이포달 펩타이드 바인더에 공유결합시켜 세포 투과를 가능하게 만들었다. STAT3 의 활성이 활성화되면 HIF-a와 VEGF 의 발현이 증가하게 된다. 그러므로 이들의 양을 측정하면 STAT3 의 활성이 억제되는지 판별할 수 있다. Prostate cancer cell 인 DU145 에 BPB 를 20 μΜ 처리한 뒤 12시간후에 western blotting을 통해서 HIF-a와 VEGF의 발현 양을 측정하였다. 그리고 EMSA방법을 통해서 STAT3와 DNA의 결합이 억제되는지 확인하였다.
6. 실험결과
(1) Biopanning of STAT3
Bipodal -peptide binder library 를 Stat3 단백질에 대해 4 차에 걸쳐 biopanning 을 실시하고 각 panning 단계에서 회수한 phage peptide 들의 Output phage/ input phage 비 (ratio)를 결정하였다 (표 4c) ·
【표 4c] Biopanning against STAT3
Input Elute
Round Yield phage(pfu) phage(pfu)
First 4*10" 2*107 0.5*10"4
Second 6*1011 4·1*108 6.8*10"4
Third 9*1010 8.4*107 9.6*10"4
Four 2.1*10" 6*108 30* 10"4
(2) ELISA of 30 each recombinant phage selected from fourth biopanning and DNA sequencing against STAT3
각 library 의 panning 단계중 0/1 ratio 가 가장 높은 4 차 단계에서 회수한 phage 를 plaque 형태로 확보하였다. 각 plaque 로부터 30 개의 phage 을 증폭시킨 후 STAT3 와 streptaividin 에 대해 ELISA 를 시행하였다 (도 13a). Streptavidin 보다 2 배 이상 흡광도를 보이는 clones 6 개를 DNA sequencing 을 해 본 결과 두개의 시퀀스를 보였다: Peptidel: QAYYIP GSWTWENGKWTWKG LWGPEF; Peptides HGFQWP GSWTWENGKWTWKG AYQFLK
(3) STAT3 바이포달 펩타이드 바인더의 특이성 테스트
다른 단백질과 비교하였을 때 바이포달 펩타이드 바인더가 STAT3 과 특이성이 있는지 ELISA 테스트를 하였고， 특이성이 있는 결과가 나왔다 (도 13b 및 13c). 도 13b 는 Peptide 1 (QAYYIP GSWTWENGKWTWKG LWGPEF)에 대한 실험결과이고, 도 13c는 Peptide2 (HGFQWP GSWTWENGKWTWKG AYQFLK)에 대한 실험 결과이다.
(4) STAT3에 특이적인 바이포달 펩타이더 바인더의 친화력 측정
SPRCBiacore X)를 이용하여 바이포달 펩타이더 바인더의 친화력을 측정하였다. (BPBl: QAYYIP GSWTWENGKWTWKG LWGPEF) CM5 chip 에 STAT3 단백질을 약 4000RU 고정시킨 뒤 펩타이드 농도 2μΜ, 5μΜ, 7.5μΜ 로 측정하였다. 친화력은 약 1.7μΜ로 측정되었다 (도 13d).
(5) STAT3에 특이적인 바이포달 펩타이더의 세포 전달 테스트
바이포달 펩타이드 바인더의 루프에 세포투과 펩타이드 (cell penetrating peptide)와 FITC 를 붙여 세포 안으로 들어 가는 것을 confocal 현미경을 통해 확인 하였다. 세포 투과 펩타이드인 OHgo-9 R peptide를 붙인 것과 붙이지 않은 것을 비교한 결과 뚜렷하게 세포 투과 펩타이드를 붙인 것이 효과적으로 세포 안으로 들어가는 것을 확인 하였다 (도 13e).
바이포달 펩타이드 바인더의 c-말단에 세포투과 펩타이드 (cell penetrating peptide)인 oligo-9R 을 퓨전시키고 N 말단에 FITC 를 붙여 세포 안으로 들어 가는 것을 confocal 현미경을 통해 확인 하였다. 세포 투과 펩타이드인 0Hgo-9 peptide 가 퓨전 된 것과 퓨전 되지 않은 것을 비교한 결과 뚜렷하게 세포 투과 펩타이드를 붙인 것이 효과적으로 세포 안으로 들어가는 것을 확인 하였다 (도 13f).
(6) 세포 내에 존재하는 STAT3에 특이적인 바이포달 펩타이더에 의한 활성 억제
DU145 cell 에 STAT3 에 특이적인 BPB(Pept ide 1； QAYYIP GSWTWENG WTWKG LWGPEF)를 처리한 결과， STAT3 와 DNA 와의 결합이 억제되는 것을 EMSA 를 통해 확인 할 수 있고， 그 결과 HIF-la 와 VEGF 의 발현이 억제되는 것을 확인 하였다 (도 13g).
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며， 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서， 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

【청구의 범위】
【청구항 1]
다음의 단계를 포함하는 세포내 타겟분자에 특이적으로 결합하는 세포내 타겟팅 (intracellular targeting) 바이포달 펩타이드 바인더 (bipodal peptide binder)의 제조방법:
(a) (i) 가닥간 (interstrand) 비공유결합이 형성되는 패러럴 (parallel), 안티패러럴 (antiparallel) 또는 패러럴 (paral lei )과 안티패러럴 (ant iparal lei ) 아미노산 가닥들을 포함하는 구조 안정화 부위 (structure stabilizing region); (ii) 상기 구조 안정화 부위의 양 말단에 결합되어 있고 무작위적으로 선택된 각각 n 및 m 개의 아미노산을 포함하는 타켓 결합 부위 I (target binding region I) 및 타겟 결합 부위 Π (target binding region Π)를 포함하는 바이포달 펩타이드 바인더의 라이브러리를 제공하는 단계 ;
(b) 상기 라이브러리와 타겟을 접촉시키는 단계 ;
(c) 상기 타겟과 결합된 바이포달 펩타이드 바인더를 선택하는 단계; 및
(d) 상기 선택된 바이포달 펩타이드 바인더에 세포막투과 펩타이드 (CPP)를 결합시키는 단계.
【청구항 2】
제 1 항에 있어서， 상기 구조 안정화 부위에 형성되는 가닥간 비공유결합은 수소결합, 정전기적 상호작용， 소수성상호작용， 반데르 발스 상호작용， 파이 -파이 상호작용, 양이온 -파이 상호작용 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 3]
제 1 항에 있어서， 상기 구조 안정화 부위의 아미노산 가닥들은 링커로 연결된 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 4]
제 1 항에 있어서, 상기 구조 안정화 부위는 헤어핀, β-헤어핀， 베타 -턴, 링커로 연결된 β-쉬트， 루이신 지퍼, 링커로 연결된 루이신 지퍼, 루이신 리치 모티프 또는 링커로 연결된 루이신 리치 모티프인 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 5】
제 4 항에 있어서， 상기 구조 안정화 부위는 β-헤어핀인 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 6】
제 5 항에 있어서， 상기 β_헤어핀은 서열목록 제 1 서열 내지 제 19 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 7】
제 6항에 있어서， 상기 β-헤어핀은 서열목록 제 2서열， 제 14서열 또는 제 18서열로부터 선택되는 아미노산서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 8]
제 5 항에 있어서， 상기 β-헤어핀은 다음 일반식 I 로 표시되는 것을 특징으로 하는 방법 :
일반식 I
X1-Trp(X2)X3-X4-X5(X'2)X6-X7
Xi은 Ser 또는 Gly-Glu 이고， X2 및 X'2는 서로 독립적으로 Thr, His, Val, He, Phe 또는 Tyr 이며 , X3는 Trp 또는 Tyr 이고, 는 타입 I, 타입 Γ, 타입 Π， 타입 Π' 또는 타입 m 또는 타입 ΠΓ 턴 서열이고, ¾ 는 Trp 또는 Phe이며， ¾는 Trp또는 Val이고， X7는 Lys또는 Thr-Glu이다.
【청구항 9】
제 5 항에 있어서， 상기 β—헤어핀은 다음 일반식 Π로 표시되는 것을 특징으로 하는 방법 :
일반식 Π
Xi-Trp-X2-Tyr-X3-Phe-Thr-Va 1 -X4
Xi은 Arg, Gly-Glu 또는 Lys-Lys 이고， X2는 Gin 또는 Thr 이며， X3는 타입 I, 타입 Γᅳ 타입 Π， 타입 Π' 또는 타입 ΙΠ 또는 타입 ΠΓ 턴 서열이고, 는 Gin, Thr-Glu또는 Gln-Glu이다.
【청구항 10] 제 5 항에 있어서， 상기 -헤어핀은 다음 일반식 m으로 표시되는 것을 특징으로 하는 방법 :
일반식 m
Xi-X2-X3-Trp-X4-X5-Thr-X6-X7
¾은 Lys 또는 Lys-Lys 이고， ¾는 Trp 또는 Tyr 이고， ¾는 Val 또는 Thr 이며， 는 타입 I， 타입 Γ， 타입 Π， 타입 Π' 또는 타입 ΠΙ 또는 타입 ΠΓ 턴 서열이고， ¾는 Trp 또는 Ala 이며 , ¾는 Trp 또는 Val 이고, X7은 Glu또는 Gln-Glu이다.
【청구항 111
제 5 항에 있어서， 상기 β-헤어핀은 다음 일반식 IV로 표시되는 것을 특징으로 하는 방법 :
일반식 IV
X1-X2-X3-Trp-X4
¾은 Lys-Thr 또는 Gly이고, ¾는 Trp또는 Tyr이고， ¾는 타입 I, 타입 1'， 타입 Π， 타입 Π' 또는 타입 m 또는 타입 ΠΓ 턴 서열이고， 는 Thr-Glu 또는 Gly이다.
【청구항 12】
제 8 항에 있어서， 상기 β-헤어핀은 상기 일반식 I 에서 ¾은 Ser 또는 Gly— Glu 이고， X2 및 X'2는 서로 득립적으로 Thr, His 또는 Val 이며， ¾는 Trp 또는 Tyr 이고， X4는 타입 I， 타입 1'， 타입 Π 또는 타입 Π' 서열이고， ¾는 Trp또는 Phe이며， ¾는 Trp또는 Val이고， X7는 Lys 또는 Thr-Glu이다.
【청구항 13]
제 1 항에 있어서， 상기 타겟 결합부위 I의 아미노산 개수 n은 2-20인 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 14】
제 1항에 있어서， 상기 타켓 결합 부위 Π의 아미노산 개수 m은 2-20인 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 15] 제 1 항에 있어서， 상기 라이브러리는 플라스미드， 박테리오파아지， 파아지미드로， 이스트 또는 박테리아로부터 제작된 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 16]
제 1 항에 있어서， 상기 타겟 결합 부위 I 및 타겟 결합 부위 Π는 타겟에 공동으로 작용하여 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 17】
제 1 항에 있어서, 상기 세포막투과 펩타이드 (CPP)는 구조 안정화 부위， 타겟 결합 부위 I (target binding region I) 또는 타겟 결합 부위 Π (target binding region Π)에 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 18】
제 1 항에 있어서， 상기 세포막투과 펩타이드 (CPP)는 HIV-1 Tat 단백질, 을리고알지닌, ANTP 펩타이드， HSV VP22 전사조절단백질， vFGF 에서 유래된 MTS 펩타이드， Penetratin, Transport an, Pep— 1 펩타이드， Pep_7 펩타이드, Buforin II， MAP (model amphiphatic peptide), k-FGF, Ku 70， pVEC, SynBl 또는 HN-1 인 것올 특징으로 하는 방법 .
【청구항 19]
제 1 항에 있어서, 상기 세포내 타겟분자는 세포막 단백질의 세포질 영역, 세포질 단백질， 소기관 (organelled) 단백질， 핵 단백질， 세포 내 핵산분자 또는 세포 내 화학물질인 것올 특징으로 하는 방법.
【청구항 20】
제 19 항에 있어서, 상기 세포내 타겟분자는 암발생 관련 단백질， 아픕토시스 관련 단백질， 수용체의 세포질 영역， G- protein coupled receptor 의 세포질 영역, 호르몬， 호르몬 수용체, 효소， Histone deacetylase (HDAC) , 면역관련 단백질, Toll-like receptors 의 시그널링에 관여하는 세포내 단백질， 혈액응고 관련 단백질， ER( endoplasmic reticulum)에 있는 단백질, 마이토콘드리아에 있는 단백질 또는 핵 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 21】 (a) 가닥간 (interstrand) 비공유결합이 형성된 패러럴 (paral lei ) , 안티패러럴 (antiparallel) 또는 패러럴 (paral lei )과 안티패러럴 (antiparallel) 아미노산 가닥들을 포함하는 구조 안정화 부위 (structure stabilizing region);
(b) 상기 구조 안정화 부위의 양 말단에 결합되어 있고 무작위적으로 선택된 각각 n 및 m 개의 아미노산을 포함하는 타겟 결합 부위 Ktarget binding region I) 및 타겟 결합 부위 Π (target binding region Π); 및
(c) 상기 구조 안정화 부위 또는 상기 타겟 결합 부위에 결합된 세포막투과 펩타이드 (CPP)를 포함하는 세포내 타겟분자에 특이적으로 결합하는 세포내 타겟팅 (intracellular targeting) 바이포달 펩타이드 바인더 .
【청구항 22]
제 21 항에 있어서， 상기 구조 안정화 부위에 형성된 가닥간 비공유결합은 수소결합, 정전기적 상호작용， 소수성상호작용， 반데르 발스 상호작용, 파이 -파이 상호작용， 양이온—파이 상호작용 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는 바이포달 펩타이드 바인더.
【청구항 23]
제 21 항에 있어서， 상기 구조 안정화 부위의 아미노산 가닥들은 링커로 연결된 것을 특징으로 하는 바이포달 펩타이드 바인더.
【청구항 24】
제 21 항에 있어서， 상기 구조 안정화 부위는 헤어핀， β-헤어핀， 베타- 턴， 링커로 연결된 β-쉬트， 루이신 지퍼 또는 링커로 연결된 루이신 지퍼, 루이신 리치 모티프인 것을 특징으로 하는 바이포달 펩타이드 바인더.
【청구항 25]
제 21 항에 있어서， 상기 구조 안정화 부위는 β-헤어핀인 것을 특징으로 하는 바이포달 펩타이드 바인더.
【청구항 26】
제 25 항에 있어서， 상기 β-헤어핀은 서열목록 제 1 서열 내지 제 19 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 바이포달 펩타이드 바인더 .
【청구항 27】 제 26 항에 있어서， 상기 β-헤어핀은 서열목록 제 2 서열， 제 14 서열 또는 제 18서열로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 바이포달 펩타이드 바인더 .
【청구항 28】
제 25 항에 있어서， 상기 β-헤어핀은 다음 일반식 I 로 표시되는 것을 특징으로 하는 바이포달 펩타이드 바인더:
일반식 I
X1-Trp(X2)X3-X4-X5(X,2)X6-X7
Xi은 Ser 또는 Gly-Glu 이고， ¾ 및 X'2는 서로 독립적으로 Thr, His, Val, lie, Phe 또는 Tyr 이며， ¾는 Trp 또는 Tyr 이고， 는 타입 I, 타입 Γ, 타입 Π， 타입 Π' 또는 타입 m 또는 타입 ΠΓ 턴 서열이고, ¾ 는 Trp 또는 Phe이며， ¾는 Trp또는 Val이고， X7는 Lys 또는 Thr-Glu이다.
【청구항 29】
제 25 항에 있어서， 상기 β-헤어핀은 다음 일반식 Π로 표시되는 것을 특징으로 하는 바이포달 펩타이드 바인더:
일반식 Π
X!-Trp-X2-Tyr-X3-Phe-Thr-Va 1ᅳ¾
Xi은 Arg, Gly-Glu 또는 Lys-Lys 이고， ¾는 Gin 또는 Thr 이며 , ¾는 타입 I， 타입 Γ, 타입 π, 타입 π' 또는 타입 m또는 타입 nr 턴 서열이고，
¾는 Gin, Thr-Glu또는 Gln-Glu이다.
【청구항 30】 '
제 25항에 있어세 상기 β-헤어핀은 다음 일반식 m으로 표시되는 것을 특징으로 하는 바이포달 펩타이드 바인더:
일반식 m
X厂 X2-X3-Trp-X4-X5-Thr-X6-X7
Xi은 Lys 또는 Lys-Lys 이고， ¾는 Trp 또는 Tyr 이고, ¾는 Val 또는 Thr 이며， X4는 타입 I, 타입 Γ， 타입 Π， 타입 π' 또는 타입 m또는 타입 m' 턴 서열이고, ¾는 Trp 또는 Ala 이며， ¾는 Trp 또는 Val 이고， X7은 Glu또는 Gln-Glu이다.
【청구항 31】 제 25 항에 있어서, 상기 β-헤어핀은 다음 일반식 IV로 표시되는 것을 특징으로 하는 바이포달 펩타이드 바인더:
일반식 IV
Figure imgf000067_0001
¾은 Lys— Thr 또는 Gly이고, ¾는 Trp또는 Tyr이고， ¾는 타입 I， 타입 Γ， 타입 Π, 타입 Π' 또는 타입 ΠΙ 또는 타입 ΠΓ 턴 서열이고， 는 Thr-Glu 또는 Gly이다.
【청구항 32]
제 26항에 있어서， 상기 β-헤어핀은 상기 일반식 I 에서 ¾은 Ser 또는 Gly-Glu 이고， X2 및 X'2는 서로 독립적으로 Thr, His 또는 Val 이며， ¾는 Trp 또는 Tyr 이고, ¾는 타입 I， 타입 Γ, 타입 Π 또는 타입 Π' 서열이고， Χ5는 Trp또는 Phe이며 , ¾는 Trp또는 Val이고， X7는 Lys또는 Thr-Glu이다,
【청구항 33]
제 21 항에 있어서, 상기 타겟 결합 부위 I 의 아미노산 개수 n 은 2- 20인 것을 특징으로 하는 바이포달 펩타이드 바인더 .
【청구항 34]
제 21 항에 있어서， 상기 타켓 결합 부위 Π의 아미노산 개수 m 은 2- 20인 것을 특징으로 하는 바이포달 펩타이드 바인더.
【청구항 35]
제 21 항에 있어서， 상기 타겟 결합 부위 I 및 타겟 결합 부위 Π는 타겟에 공동으로 작용하여 결합하는 것을 특징으로 하는 바이포달 템타이드 바인더ᅳ
【청구항 36]
제 21항에 있어서， 상기 세포막투과 펩타이드 (CPP)는 구조 안정화 부위， 타겟 결합 부위 Ktarget binding region I) 또는 타겟 결합 부위 Π (target binding region Π)에 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 바이포달 펩타이드 바인더.
【청구항 37] 제 21 항에 있어서 상기 세포막투과 펩타이드 (CPP)는 HIV-1 Tat 단백질， 올리고알지닌 ANTP 펩타이드, HSV VP22 전사조절단백질， vFGF 에서 유래된 MTS 펩타이드， Penetratin, Transport an, Pep-1 펩타이드, Pep-7 펩타이드， Buforin II， MAP (model amphiphatic peptide), k-FGF, Ku 70， pVEC, SynBl 또는 HN-1 인 것을 특징으로 하는 바이포달 펩타이드 바인더 .
【청구항 38】
제 21 항에 있어서， 상기 세포내 타겟분자는 세포막 단백질의 세포질 영역， 세포질 단백질， 소기관 (organelled) 단백질 또는 핵 단백질， 세포 내 핵산분자 또는 세포 내 화학물질인 것을 특징으로 하는 바이포달 펩타이드 바인더.
【청구항 39]
제 38 항에 있어서, 상기 세포내 타켓분자는 암발생 관련 단백질, 아품토시스 관련 단백질， 수용체의 세포질 영역, G- protein coupled receptor 의 세포질 영역， 호르몬 호르몬 수용체， 효소， Hi stone deacetylase (HDAC) , 면역관련 단백질， Toll-like receptors 의 시그널링에 관여하는 세포내 단백질, 혈액응고 관련 단백질， ER( endoplasmic reticulum)에 있는 단백질， 마이토콘드리아에 있는 단백질 또는 핵 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 40]
상기 제 21 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항의 바이포달 펩타이드 바인더를 코딩하는 핵산 분자.
【청구항 41】
상기 제 40 항의 핵산 분자를 포함하는 바이포달 펩타이드 바인더의 발현용 백터.
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