WO2015156644A1 - 환형의 β-헤어핀 기반 펩타이드 바인더 및 이의 제조방법 - Google Patents

환형의 β-헤어핀 기반 펩타이드 바인더 및 이의 제조방법 Download PDF

Info

Publication number
WO2015156644A1
WO2015156644A1 PCT/KR2015/003632 KR2015003632W WO2015156644A1 WO 2015156644 A1 WO2015156644 A1 WO 2015156644A1 KR 2015003632 W KR2015003632 W KR 2015003632W WO 2015156644 A1 WO2015156644 A1 WO 2015156644A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
hairpin
cyclic
target
based peptide
peptide binder
Prior art date
Application number
PCT/KR2015/003632
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
전상용
전형수
김대진
Original Assignee
한국과학기술원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국과학기술원 filed Critical 한국과학기술원
Publication of WO2015156644A1 publication Critical patent/WO2015156644A1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/64—Cyclic peptides containing only normal peptide links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/02—Peptides of undefined number of amino acids; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/001—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids

Definitions

  • the present invention relates to a cyclic ⁇ -hairpin-based peptide binder (Cyclic beta-Rippin based peptide de bider, CPB), a nucleic acid molecule encoding the same and a recombinant vector comprising the nucleic acid molecule, and a method for producing the CPB. It is about. [Background technology]
  • Antibodies are immunoglobulin proteins, a type of plasma protein produced by B cells, that specifically inactivate and inactivate antigens by specifically recognizing and binding to specific sites of antigens from outside. By applying the specificity and high affinity of the antigen-antibody reaction and the diversity of antibodies that can distinguish tens of millions of antigens, many kinds of antibody products including diagnostics and therapeutics have emerged today.
  • the reason why the development of new drugs using antibodies is active is that the development period of the drug is short and the investment cost is high; This is because the side effects are easy to predict.
  • the antibody is a herbal drug, the human body is hardly affected, and the half-life in the body is overwhelmingly long compared to low-molecular weight drugs, which is friendly to patients.
  • Antibody-replacement protein is a recombinant protein made to have constant and variable regions like antibodies, and the library is made by replacing a small portion of stable protein with amino acid of random sequence and screening for the target material, You can find a substance with good specificity. For example, it has been reported that avimer and affibody among antibody replacement proteins have an affinity of pi comol e for a target substance.
  • the present invention has focused on peptide-based antibody replacement proteins that are different from antibody replacement proteins using proteins up to now.
  • Peptides have adequate pharmacokinetics, mass productivity, and low levels compared to antibodies. Due to toxicity, antigenic inhibition and low production cost, it has been widely used in place of antibody therapeutics.
  • the advantages of peptides as therapeutic drugs are low production costs, high safety and responsiveness, relatively low patent royalties, and less exposure to unwanted immune systems, which can inhibit the production of antibodies to the peptides themselves. Deformation through is easy and accurate.
  • the present inventors have studied to develop a peptide substance capable of binding to a target molecule with a very high affinity (af f ini ty) while maintaining a stable structure. I tried.
  • a peptide is randomly bound to both ends thereof using ⁇ -hairpin as a rigid peptide backbone
  • the two peptides covalently bind to a target molecule, thereby greatly increasing binding capacity and specificity.
  • the ⁇ -hairpin, the peptide backbone is implemented in a cyclic form, the structure of the ⁇ -hairpin is prevented from being released by a peptide randomly connected to both ends thereof, thereby reducing the overall structure of the peptide molecule.
  • Another object of the present invention is to provide a nucleic acid molecule encoding the cyclic ⁇ -hairpin-based peptide binder.
  • Still another object of the present invention is to provide a transformant comprising the recombinant vector.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for preparing the cyclic ⁇ -hairpin based peptide binder.
  • the present invention (a) has a ⁇ -hairpin structure in which interstrand non-covalent bonds are formed, and covalent bonds between amino acid residues located at both ends of the ⁇ -hairpin structure Cyclic ⁇ -hairpins having a cyclic structure formed through them; And (b) a target binding site I comprising n amino acids bound to one end of the cyclic ⁇ -haffin and exhibiting binding affinity to a target, and the other of the cyclic ⁇ -haffin.
  • a target binding site comprising m amino acids bound to the terminal and exhibiting binding affinity for the target
  • a cyclic ⁇ -hairpin based peptide binder that specifically binds a target comprising ⁇ .
  • the present invention provides a method for preparing a cyclic ⁇ -hairpin-based peptide binder that specifically binds to a target comprising the following steps:
  • (a) ( ⁇ ) has a ⁇ -hairpin structure in which non-covalent bonds are formed between strands, and a cyclic structure is formed through covalent bonds between amino acid residues located at both ends of the ⁇ -hafferin structure. Cyclic ⁇ -hairpin formed; And ( ⁇ ) a target binding site I comprising ⁇ amino acids bonded to one end of the cyclic ⁇ -hairpin, and a target binding site ⁇ comprising m amino acids bound to the other end of the cyclic ⁇ -hairpin.
  • the cyclic structure is formed by direct or indirect covalent bonds (via covalent bonds, such as chemical linkers) between amino acid residues located at both ends thereof, having a ⁇ -haepin structure.
  • covalent bonds such as chemical linkers
  • the formed cyclic ⁇ _hairpin as a rigid peptide backbone, a peptide having a binding affinity for a target is linked to both ends thereof.
  • the cyclic ⁇ -hairpin not only acts to stabilize the overall structure of the peptide binder, but also enhances the binding force of the target binding sites I and ⁇ to the target molecule.
  • the cyclic ⁇ -hairpin based peptide binder of the present invention can maintain the ⁇ -hairpin structure continuously, and can bind with a high affinity to the target based on such structural stability.
  • the cyclic ⁇ -hairpin has non-covalent bonds formed between amino acid strands. Noncovalent bonds between these strands contribute to the robustness of the cyclic ⁇ -hairpin structure and can affect the binding affinity of the target binding site.
  • Example 2 is a peptide binder ( ⁇ ) comprising a simple cyclic peptide in which the target affinity of a peptide binder (CPB) containing a cyclic ⁇ -hairpin having a ⁇ -hairpin structure is substituted with glycine at an amino acid of ⁇ -hairpin. Better than that (see FIGS. 6 and 7).
  • CPB peptide binder
  • the non-covalent bond may be hydrogen bonding, electrostatic interaction, hydrophobic interaction, van der Waals interaction, pi-pi interaction, cation-pi interaction, or a combination thereof.
  • the ⁇ -hairpin structure of the cyclic ⁇ -hairpin means the simplest protein motif including two ⁇ strands, and the two ⁇ ' strands exhibit antiparallel alignment with each other, and are generally connected by turn sequences. do.
  • the turn sequence applied to the ⁇ -hairpin structure is type 1 (eg Asp-Asp—A la-Thr-Lys—Thr) type I ′ (eg Glu-Asn-Gly- Lys), type ⁇ (eg X-Pro-Gly—Glu-Val, Ala— X-Gly-Glu-Val; X is selected from 20 amino acids), type ⁇ ′ (eg Glu-Gly-Asn-Lys , Glu-D-Pro-Asn-Lys), type ⁇ , or type ⁇ turn sequence.
  • type 1 eg Asp-Asp—A la-Thr-Lys—Thr
  • type I ′ eg Glu-Asn-Gly- Lys
  • the covalent bond that forms a cyclic form in the cyclic ⁇ -hairpin may be a covalent bond by direct bond between amino acid residues located at both ends of the ⁇ -hairpin structure, or a covalent bond by indirect bond.
  • Examples of the covalent bonds include disulfide bonds, ester bonds, ether bonds, phosphoester bonds, amide bonds, carbon-phosphorus bonds, carbon-sulfur bonds and imide bonds such as thioethers.
  • the cyclic ⁇ -hairpin forms a cyclic structure through disulfide bonds between amino acid residues located at both ends of the ⁇ -hairpin structure.
  • the cyclic ⁇ -hairpin is a cyclic structure formed through covalent linkage between amino acid residues located at both ends of the ⁇ -hairpin structure.
  • ⁇ - mediates covalent bonds of amino acid residues located at both ends of the ⁇ _hairpin structure.
  • Various compounds which can make the structure of the hairpin into a ring can be used as the linker.
  • linkers examples include oPDM (, A ⁇ l, 4-phenylenedi maleimide), pPDM ( ⁇ , ⁇ -1, 2-pheny 1 ened i ma 1 em i de, DSP (Di thiobis (succinimi dyl propionate)), Di succinimidyl suberate (DSS), DMACDimethyl adipimidate dihydrochloride (DMS), and dimethyl suber imidate di hydrochloride (DMS).
  • oPDM A ⁇ l, 4-phenylenedi maleimide
  • pPDM ⁇ , ⁇ -1, 2-pheny 1 ened i ma 1 em i de
  • DSP Di thiobis (succinimi dyl propionate)
  • DSS Di succinimidyl suberate
  • DMS dimethyl suber imidate di hydrochloride
  • the cyclic ⁇ -hairpin may be prepared using a ⁇ -hairpin structure known in the art.
  • a ⁇ -hairpin structure known in the art it is possible to prepare a cyclic ⁇ -hafepin by covalently binding amino acid residues located at both ends thereof.
  • the disulfide bond between the two can be substituted by replacing cysteines with amino acids located at both ends for covalent bonding.
  • Peptides having such ⁇ -hairpin conformation are well known in the art. See, eg, US Pat. No. 6,914,123 and Andrea G. Cochran et al. , PNAS, tryptophan zipper disclosed in 98 (10): 5578-5583, template-fixed ⁇ -hairpin mimetic disclosed in WO 2005/047503, ⁇ -hairpin variant disclosed in US Pat. No. 5,807,979.
  • peptides having a ⁇ -hairpin structure include Smith & Regan (1995) Science 270: 980-982; Chou & Fassman (1978) Annu. Rev. Biochem. 47: 251-276; Kim & Berg (1993).
  • a tryptophan zipper a peptide derived from the B1 domain of protein G (ie GB1 peptide) or HP peptide may be used as the ⁇ -hairpin structure of the cyclic ⁇ -hair fragment.
  • the cyclic ⁇ -hairpin may have the following amino acid sequence:
  • the random amino acid sequence above forms the target binding site I and the target binding site ⁇ .
  • One of the characteristics of the present invention is to prepare a peptide binder in a bipodal manner by connecting target binding sites I and ⁇ including a certain number of amino acids having a binding affinity for a target to both ends of the cyclic ⁇ -hairpin will be.
  • the target binding site " I " and the target binding site [pi] are cooperatively bound to the target, thereby greatly increasing the affinity for the target.
  • the number of amino acids n and m of the target binding site I and the target binding site ⁇ is not particularly limited.
  • n and m may each be an integer of 2-100.
  • n and m are each an integer of 2-50, in a more specific embodiment an integer of 2-40, in a more specific embodiment an integer of 2-30, even more
  • it is an integer of 2-20, in a more specific embodiment it is an integer of 2-15, and in a more specific embodiment it is an integer of 2-10.
  • n and . m is an integer of 3-50 each, an integer of 3-40 in a more specific embodiment, an integer of 3-30 in a more specific embodiment, and a-integer of 3-20 in a more specific embodiment.
  • the integer is 3-15, and in a more specific embodiment, the integer is 3-10.
  • the target binding site I and the target binding site ⁇ may each contain different or the same number of amino acid residues.
  • the target binding site I and the target binding site ⁇ may include different or identical amino acid sequences from each other.
  • the amino acid sequence included in the target binding site I and / or target binding site ⁇ may be a linear amino acid sequence or a cyclic amino acid sequence.
  • at least one amino acid residue among the amino acid sequences included in the target binding site I and / or the target binding site ⁇ may be an acetyl group, polorerenyl methoxy carbonyl group, formyl group, or palmi. It may be modified into a toyl group, myristyl group, stearyl group or polyethylene glycol (PEG).
  • the target binding site I and the target binding site ⁇ are peptides having an amino acid sequence identified through phage display-, yeast display or ribosomal display-based screening of ⁇ -hairpin-based peptide binders. to be.
  • the target binding site I and the target binding site ⁇ may include any one amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 17 to 20 sequences and 38 to 70 sequences.
  • the target binding sites I and I I may bind to fibronectin ED-B (SEQ ID NO: 17 to 20) or human angiopoietin-2 (SEQ ID NO: 38 to 70).
  • the cyclic ⁇ -hairpin based peptide binders of the present invention bound to biological target molecules can be used to regulate in vivo physiological reactions, to detect substances in vivo, to target in vivo cell imaging and drug delivery. It can be used as an escort molecule.
  • a functional molecule may be additionally bound to the cyclic ⁇ -hairpin, target binding site I or target binding site ⁇ . Examples of such functional molecules include, but are not limited to, labels, chemicals, biopharmaceuticals, cell membrane penetrating peptides (CPPs) or nanoparticles that generate detectable signals.
  • Labels that generate the detectable signal include T1 contrast material (eg Gd chelate compound), T2 contrast material [eg, superparamagnetic material (eg magnetite, Fe 3 0 4l y-Fe 2 03, manganese ferrite, cobalt ferrite and Nickel ferrite)], radioactive isotopes (eg, U C, 15 0, 13 N, P 32 , S 35 , Sc, 45 Ti, 118 1, 136 La, 198 T1, 200 ⁇ 1, 205 ⁇ and 206 Bi), Fluorescent materials [fluoresceines phycoerythrin, rhodamine, lysamine (1 i ssamine) and Cy3 and Cy5], chemiluminescent groups, magnetic particles, mass labels or electron-dense particles; It is not limited to this.
  • T1 contrast material eg Gd chelate compound
  • T2 contrast material eg, superparamagnetic material (eg magnetite, Fe 3 0 4l y-Fe 2
  • the chemicals include, for example, anti-inflammatory drugs, analgesics, anti-arthritis agents, antispasmodics, anti-inflammatory drugs, antipsychotics, neurostabilizers, anti-anxiety drugs, antiantagonists, anti-Parkin's disease drugs, cholinergic agonists, anticancer agents, anti-angiogenic agents, immunity.
  • Inhibitors eg, anti-wrinkle agents, anti-aging agents and skin lightening agents.
  • the biopharmaceuticals include insulin, IGF-K insulin-like growth factor 1), growth hormone erythropoietin, G-CSFs (granulocyte-colony stimulating factors), GM-CSFs (granulocyte / macrophage— colony stimulating factors), Interferon alpha, interferon bettysov, interferon gamma, interleukin-1 alpha and beta, interleukin-3, interleukin-4, interleukin-6, interleukin-2, epidermal growth factors (EGFs), calcitonin, ACTH (adrenocorticotropic hormone) ), Tumor necrosis factor (TNF), atobisban, buserel in, cetrorelix, deslorel in desmopressin, dinonorphine Dynorphin A, elcatonin, eleidosin, epitif ibatide, GHRH-I I (growth hormone releasing hormone- 11), gonadorel in, goserelin,
  • the target binding site I and / or target binding site ⁇ may comprise an amino acid sequence that binds to various targets.
  • Targeted by the cyclic ⁇ -seaweed based peptide binder of the present invention may include biological targets, compounds, metals or nonmetallic materials such as biochemicals, peptides, polypeptides, nucleic acids, carbohydrates, lipids, cells and tissues. do.
  • Bio targets to which the target binding site binds are, for example, biochemicals, peptides, polypeptides, glycoproteins, nucleic acids, carbohydrates, proteoglycans, lipids or glycolipids.
  • biochemicals to which the target binding site binds include various in vivo metabolites (eg, ATP, NADH, NADPH, carbohydrate metabolites, lipid metabolites and amino acid metabolites).
  • in vivo metabolites eg, ATP, NADH, NADPH, carbohydrate metabolites, lipid metabolites and amino acid metabolites.
  • Exemplary peptides or polypeptides to which the target binding site binds include enzymes, ligands, receptors, biomarkers, hormones, transcription factors, growth factors, cotton globulins, signaling proteins, binding proteins, ion channels, antigens, adhesion proteins, Structural proteins, regulatory proteins, toxin proteins, cytokines and hematological factors.
  • the target of the cyclic ⁇ -hairpin-based peptide binder is Fibronectin extra domain B (ED-B), vascular endothelial growth factor (VEGF), vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR), VCAM1 (vascular cell adhesion molecule-1), Nicot inic acetylcholine receptor (nAchR), human serum albumin (HSA), MyD88, Epi dermal Growth Factor Receptor (EGFR), HER2 / neu, CD20, CD33, CD52, Epithelial Cell Adhesion Molecule), TNF- (Tumor Necrosis.Factor—a), IgE (I ⁇ unoglobul in E), CD11A (a -chain of l mphocyte funct ion-associated antigen 1), CD3, CD25 Glycoprotein Ilb / IIIa, Integrin, AF (Alpha-f etoprotein), ⁇ 2M (Beta2- microglobul in), BTA (Bla
  • nucleic acid molecules to which the target binding site binds include, but are not limited to, gDNA, mRNA, cDNA, rRNACribosomal RNA (rDNA), r ibosomal DNA (rDNA), and tRNA.
  • Exemplary carbohydrates to which the target binding site binds include, but are not limited to, monosaccharides, disaccharides, trisaccharides and polysaccharides as in vivo carbohydrates.
  • Exemplary lipids to which the target binding site binds include, but are not limited to, fatty acids, triacylglycerols, sphingolipids, gangliosides, and cholesterol.
  • the cyclic ⁇ -hairpin based peptide binder of the present invention may bind to a biomolecule (eg, a protein) exposed to the cell surface, but may bind to a biomolecule (eg, a protein) in a cell and modulate the activity of the biomolecule.
  • a biomolecule eg, a protein
  • the peptide binder may further include a cell membrane penetrating peptide (CPP).
  • CPP cell membrane penetrating peptide
  • the CPP includes various CPPs known in the art and include, for example, HIV-1 Tat protein, Tat peptide analog (eg oligoarginine), ANTP peptide, HSV VP22 transcriptional regulator protein, MTS peptide derived from vFGF, Including but not limited to Penetratin, Transport an or Pep-1 peptide It is not.
  • Tat peptide analog eg oligoarginine
  • ANTP peptide HSV VP22 transcriptional regulator protein
  • MTS peptide derived from vFGF Including but not limited to Penetratin, Transport an or Pep-1 peptide It is not.
  • the CPP is covalently bonded to the lysine residue of the cyclic ⁇ -hairpin moiety.
  • Example 3 shows a specific example of targeting for intracellular protein (fibronectin ED-B) of the cyclic ⁇ -hairpin based peptide binder.
  • the cyclic ⁇ -hairpin based peptide binder of the present invention is typically a "N-terminal-target binding site I-a strand of cyclic ⁇ -hairpin-a linker (e.g., turn sequence)-a cyclic ⁇ -hairpin On the other strand of the target binding site ⁇ ⁇ C terminus' construct.
  • a structure influence inhibiting region can be included that blocks the cross-structural effects between the target binding site and the cyclic ⁇ -hairpins.
  • amino acids eg glycine, alanine, serine
  • 1-10 ⁇ preferably 1-8 ⁇ Preferably 1-3 amino acid residues may be located.
  • the cyclic ⁇ -hairpin based peptide binder will have a random sequence, which is an amino acid that has no sequence preference or is designated (or immobilized) at any position of target binding site I and / or target binding site ⁇ . It means no residue.
  • a library of cyclic ⁇ -hairpin based peptide binders may be used for the spite-synthesis method (Lam et al. (1991) Nature 354: 82; WO 92) carried out on a solid support (eg, polystyrene or polyacrylamide resin). / 00091).
  • the library of cyclic ⁇ _hairpin-based peptide binder can be constructed in a cell surface display (eg phage display, bacterial display, yeast display).
  • the library of the cyclic ⁇ -hairpin-based peptide binder can be prepared through a display method based on polamide, bacteriophage, phagemid, yeast, bacteria, mRNA or ribosomes.
  • Phage display is a technique for displaying various polypeptides in the form of proteins fused to coat proteins on the surface of the phage (Scott, JK and Smith, GP (1990) Science 249: 386; Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed.Cold Spring Harbor Press (2001); Clackson and Lowman, Phage Display, Oxford University Press (2004).
  • a random peptide is displayed by fusing the gene ffl of the filamentous phage (eg M13) or the gene to be expressed in the gene.
  • Phageimide may be used for the fiji display.
  • Phageimide is a plasmid vector with one copy of the bacterial origin of replication (eg, ColEl) and the intergenic site of the bacteriophage. DNA fragments cloned in this phagemid are propagated like plasmids.
  • an embodiment of the present invention may include the following steps:
  • a fusion gene in which a gene encoding a phage coat protein (eg, gene m of a filamentous phage such as M13 or gene ⁇ coat protein) and a gene encoding a circular ⁇ -hairpin-based peptide binder are fused; And the above .
  • a gene encoding a phage coat protein eg, gene m of a filamentous phage such as M13 or gene ⁇ coat protein
  • a gene encoding a circular ⁇ -hairpin-based peptide binder are fused
  • Peptide libraries are constructed using phage display, and methods for screening these libraries are described in US Pat. Nos. 5, 723,286, 5,432, 018, 5, 580, 717, 5, 427, 908, 5, 498,530, 5,770,434, 5,734,018, 5,698,426, G. 15,763,192 and G. 15,723,323.
  • the method for preparing an expression vector comprising the gene of the cyclic ⁇ -hairpin-based peptide binder may be performed according to methods known in the art.
  • known phagemids or phage vectors eg, pIGT2, fUSE5, fAFFl, fd-CATl, m663, fdtetDOG, pHENl, P Comb3, P Comb8, pCANTAB 5E
  • LamdaSurfZa can be used to insert an cyclic ⁇ -hairpin based peptide binder-coding gene to produce expression vectors.
  • phage display methods are carried out using filamentous phage, but lambda phage display (W0 95/34683; US Pat. No. 5,627,024), ⁇ 4 phage display (Ren et al. (1998) Gene 215: 439;
  • the method of introducing the vector library into a suitable host cell can be carried out according to various transformation methods, for example by the electroporation method (see US Patent No. 5,186,800, 5,422,272, 5,750,373).
  • Suitable host cells for the present invention are Gram-negative bacterial cells such as E. coli, and suitable E. coli hosts include JM101, E. coli K12 strain 294, E. coli strain W3110 and E. coli XL-LBlue (Stratagene). One, limited to It is not. It is recommended that host cells be prepared with competence cells prior to transformation (Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual 3rd ed. Cold Spring Harbor Press (2001)).
  • Selection of transformed cells is generally carried out by culturing in a medium containing antibiotics (eg tetracycline and ampicillin). Selected transformed cells are further cultured in the presence of helper phage to generate recombinant phage or phagemid virus particles.
  • Suitable helper phage phages include, but are not limited to, Ex helper phages, M13-K07, M13-VCS, and R408.
  • the cyclic ⁇ -hairpin based peptide binder of the present invention comprises:
  • a cyclic ⁇ -hairpin comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 or an amino acid sequence of which some of the amino acids except cysteinol at both ends of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 are substituted with lysine (e.g., sequence List 15 or 16);
  • the cyclic ⁇ -hairpin based peptide binder of the present invention is described in SEQ ID NO: 8, 9, and 21-37.
  • the present invention provides a nucleic acid molecule encoding the cyclic ⁇ -hairpin-based peptide binder.
  • the present invention provides a recombinant vector comprising the nucleic acid molecule. According to another aspect of the present invention, the present invention provides a transformant comprising the recombinant vector.
  • nucleic acid molecule has the meaning of encompassing DNA (gDNA and cDNA) and RNA molecules inclusively, and the nucleotides that are the basic structural units in nucleic acid molecules are not only natural nucleotides, but also sugar or base sites. Modified analogues (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York (1980); Uhlman and Peyman, Chemical Reviews, 90: 543-584 (1990)).
  • the vector of the present invention is a powerful promoter capable of promoting transcription in addition to a nucleic acid molecule encoding a cyclic ⁇ -hairpin based peptide binder (eg, tac promoter, lac promoter, / ⁇ 3dJV5 promoter, 1 PP promoter, promoter, ⁇ ⁇ ⁇ promoter, ra & promoter, amp promoter, reck promoter, SP6 promoter, trp promoter and T7 promoter, etc.), ribosome binding site and transcription / detox termination sequence for initiation of translation.
  • a cyclic ⁇ -hairpin based peptide binder eg, tac promoter, lac promoter, / ⁇ 3dJV5 promoter, 1 PP promoter, promoter, ⁇ ⁇ ⁇ promoter, ra & promoter, amp promoter, reck promoter, SP6 promoter, trp promoter and T7 promoter, etc.
  • the vector of the present invention may further comprise a signal sequence (eg, pelB) on the 5'-direction of the nucleic acid molecule encoding a circular ⁇ -hairpin based peptide binder.
  • the vector of the present invention may further include a tagging sequence (eg, myc tag) for confirming that the cyclic ⁇ -hairpin based peptide binder is well expressed on the surface of the phage.
  • the vector of the invention may comprise a gene encoding a phage coat protein, eg, gene m of filamentous phage such as M13 or gene VI coat protein.
  • the vector of the present invention may include a replication origin of bacteria (eg, ColEl) and / or a replication origin of bacteriophage.
  • the vector of the present invention may include antibiotic resistance genes commonly used in the art as a selection marker, for example, ampicillin gentamicin, carbenicillin, chloramphenicol, streptomycin, kanamycin, geneticin neomycin and Resistance genes for tetracycline.
  • Transformants of the invention are, for example, Gram-negative bacterial cells such as E. coli, and suitable E. coli hosts are JM101, E. coli K12 strain 294, E. coli strain W3110 and E. coli XL-lBlue. (Stratagene), including but not limited to.
  • the method of carrying the vector of the present invention into a host cell may be carried out by the CaCl 2 method (Cohen, SN et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9: 2110-2114 (1973)), one method (Cohen, SN et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9: 2110-2114 (1973); and Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166: 557-580 (1983)) and electroporation methods (US Pat. Nos. 5,186,800, 5,422,272, 5,750,373) and the like.
  • the present invention provides a cyclic ⁇ -hairpin based peptide binder having a novel construct.
  • the peptide binder of the present invention adopts a cyclic ⁇ -hairpin structure, and the cyclic structure prevents the ⁇ -hairpin structure from being released by target binding sites bonded to both ends of the ⁇ -harpin. Do it.
  • peptide binder of the present invention In the peptide binder of the present invention, two separate target binding sites bound to both ends of the cyclic ⁇ -hairpin are cooperatively and synergistically with the target.
  • the peptide binder of the present invention thus exhibits very low levels (eg, nM levels) of KD values (dissociation constants) and thus has a very high affinity to the target.
  • the cyclic ⁇ -haepin-based peptide binder of the present invention not only has a use as a medicament, but also can be used for the detection of substances in vivo, in vivo molecular imaging, in vitro cell imaging and drug delivery, It can also be used as an escort molecule.
  • Figure 1 shows the structure of beta-hairpin, CPBCCyclic beta-hairpin based Peptide Binder (MPB) and Mutant Cyclic Peptide Binder (MPB).
  • MPB CPBCCyclic beta-hairpin based Peptide Binder
  • MPB Mutant Cyclic Peptide Binder
  • Figure 2 schematically shows the phageimide vector used in the production of CPB and MPB libraries and the transformation of E. coli using the same.
  • FIG. 4A-4C show the biopanning results of the CPB library for fibronectin ED-B. 4A and 4B, the left bar is the result for ED-B and the right bar is the result for streptavidin.
  • FIG. 4C the results for ED-B, streptavidin, mTNFa m2% BSA from left bar.
  • FIG. 5a-5c show the bio panning results of the library for the MPB fibronectin ED-B. 5A and 5B, the left bar is the result for ED—B and the right bar is the result for streptavidin.
  • Figure 5c from the left bar is the result for ED-B, streptavidin, bFGF, BSA, Trap.
  • FIG. 6 shows the fibronectin ED-B binding assay results of selected fibronectin ED-B specific CPBs.
  • FIG. 11 and 12 show the results of phage peptide selection 1 specific for human angiopoietin-2.
  • the left bar from the experimental results for angiopoietin-2, BSA, mTNFa.
  • FIG. 12 the left bar is the result for angiopoietin 2 and the right bar is the result for BSA.
  • Figure 13 shows specific binding of human angiopoietin-2 of selected CPBs.
  • angiopoietin-2, bFGF, hFC, strap avidin, BSA, ED-B, mTNFa is the experimental results.
  • 14 shows the results of phage peptide selection 2 specific for human angiopoietin-2.
  • the left bar is the result for angiopoietin-2 and the right bar is the result for BSA.
  • 16 shows human angiopoietin-2 binding assay results of selected CPBs.
  • NNK 6 TGCT ATGATCCGGAAACTGGT-3 ', SEQ ID NO: 1
  • CPB-B1 5'- AACAG1TTCTGCGGCCGCACCACCACCACC (MNN) 6 GCACCAGGTACCAGTTTC-3', SEQ ID NO: 2, where N is A, T, G Or C; K represents G or T; M represents C or A).
  • N is A, T, G Or C; K represents G or T; M represents C or A
  • To make double-chain DNA mix 100 ⁇ M CPB-F1 and CPB-B1 1.5, 10 mM dNTP 4 ⁇ l, DNA tag polymerase 1 ⁇ (BIMS bio, Korea) and 10X polymerase buffer 5 to a total of 50 ⁇ . Four mixtures were prepared with the addition of tertiary sterile distilled water.
  • Is a common hapaek PCR banung After creating a double-stranded DNA to the (5 minutes at 94 ° C, 60 cycles 30 ° 30 sec at C, at 72 ° C for 30 seconds and 72 ° C 7 bun) PCR purification kit ( Macrogen, Seoul, Korea) to obtain a CPB library gene. This gene was transferred to PIGT2 phagemid vector (Ig therapy, Chuncheon, Korea). For ligation, the CPB library gene and the pIGT2 vector were treated with restriction enzymes.
  • E. col i ER2738 cells (Department of Biochemistry and Molecular Biology & Cancer Research Institute, Seoul National University College of Medicine) were plated on LB (Luria broth) agar-plates. The colonies grown on agar plate medium were inoculated in 5 m £ SB (super broth) medium, and then incubated for 16 hours while mixing at 37 ° C. at a speed of 200 rpm. The cultured 5 ⁇ cells were inoculated into 5 conical flasks containing SB medium of ⁇ , and mixed with 20% glucose solution 10 1 and 1 M MgCl 2 5 M: at 37 ° C at 250 rpm.
  • the absorbance was incubated at a wavelength of 600 kHz until the absorbance became 0.3-0.4
  • Electroporation was performed using pIGT2 phagemid vector 50 (20 yg) into which the CPB library was inserted. Dissolve the competent cells on ice, After mixing with 300 ⁇ of competent vector 50, it was placed in a cooled 0.1 cm cuvette and placed on ice for 1 minute. The electroporator (BioRad, Hercules, CA) was programmed at 200 ⁇ at 25 uF and 2.5 kV, drained the prepared cuvettes, placed in the electroporator and pulsed (time constant is 4.5-5 msec).
  • MPB-F1 Two oligonucleotide MPB-F1 (5'-TTCTATGCGGCCCAGCTGGCC NNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKTGCGGTGGCGGAGGGGGTGGCGGA -3 1, SEQ ID NO 3 to SEQ ID NO:) and MPB-B1 (5 1 -MCAGmCTGCGGCCGCACCACCACC ⁇ NM ⁇ N ⁇ NNM ⁇ GCACCCTCCGCCA ⁇ CCCT-3 1, SEQ ID No. 4) (where N represents A, T, G or C; K represents G or T; M represents C or A). The rest of the process was performed in the same manner as the CPB library manufacturing process described above. Recombinant Phage Production and PEG Precipitation in a Library
  • Recombinant phage was produced in CPB and MPB libraries stored at -80 ° C. 60 nrf, and SB are added to the library 1.5 m kept on -80 ° C to the flask containing 500 was incubated with heunhap for one hour at 37 ° C at a rate of 200 rpm of.
  • Ex helper phage Ig therapy, Chuncheon, Korea
  • Ampicillin 50 / ig /
  • Recombinant phage were produced by culturing under the same conditions for one day. Centrifuge the culture at 3,580xg for 15 minutes to 60 m £ of supernatant.
  • glycine which is both ends of a beta-hairpin structure consisting of 10 sequences (a of FIG. 1), is substituted with cysteine to form an intercysteine disulfide bond.
  • a total of 10 motifs were used to form cyclic beta-hairpins.
  • a variable site target binding site
  • CPB cyclic beta-hairpin based Peptide Binder
  • the EDB insert gene and the pET28b vector were subjected to restriction enzymes to link the EDB insert gene to the pET28b vector (Novagen).
  • About 2 insert DNAs were reacted with BamHI (NEB, Ipswich) and NdeKNEB, Ipswich for 4 hours and purified using a PCR purification kit.
  • BamHI NEB, Ipswich
  • NdeKNEB NdeKNEB
  • Ipswich purified using a PCR purification kit.
  • CIAP was added and reacted for 1 hour, and then purified using a PCR purification kit.
  • the pET28b vector cloned from the fibronectin ED-B was transformed into BL21 cells, and then plated in agar medium containing kanamycin.
  • Kanamycin (25) Inoculated in the included 20 LB medium and incubated for one day while mixing at a speed of 200 rpm at 37 ° C.
  • Cultured E. co // kanamycin 25 Inoculated into LB of 2 included and incubated to 0DO.6-0.8. Then 1 mM IPTG was added and incubated for one day while mixing at 18 ° C at a speed of 200 rpm.
  • Straptavidin (10 // g / u) was added to 50 wells in 20 wells of a 96-well ELISA plate (Corning) and left overnight at 4 ° C. The next day, 0.1% PBST (tween-20) After washing three times), the biotin 50 ⁇ ED-B (10 / g /) was put, and left at room temperature for 30 minutes. Then, all 20 wells were washed three times with 0.1% PBST and blocked for 2 hours at room temperature using 2% BSA diluted with PBS, then discarded the solution and washed three times with 0.1% PBST.
  • ELISA of each input phage of the CPB library was performed on straptavidin, BSA and ED-B.
  • BSA was placed in 8 wells with 50 ⁇ for each well and left at 4 ° C. for 1 day. The following day, only 8 wells of 16 wells with straptavidin were washed three times with 0.13 ⁇ 4> PBST (tween-20), and biotin ED ⁇ B (10 / g /) was added for 30 minutes at room temperature.
  • TMB tetramethylbenzidine
  • Phages recovered at the biopanning stage with the highest output phage / input phage ratio were infected with E. coli ER2738 cells and plated to approximately 100-200 plaques per plate. Using a sterile tip, 60 plaques were removed for each 1 m of SB-ampicillin (50 After inoculation in Ex helper phage cultures were incubated at 37 ° C for one day. After centrifugation at 16,800 ⁇ g for 10 minutes, the supernatant was recovered and then 2% skim milk was added and used for phage peptide search.
  • a 96-well ELISA plate 10 / g / ⁇ fibronectin ED-B is placed in 60 wells at 50 ⁇ for each well, and 10 / g / m £ BSA is added to 60 wells at 50 for each well at 4 °. Leave at C for one day. The following day all wells were washed three times with 0.1% PBST, blocked for 2 hours at room temperature using 2% skim milk diluted with PBS, then discarded all the solutions and washed three times with 1% PBST. 200 ⁇ amplified phage peptide solution for each clone was mixed in 200% 2% skim milk, dispensed into 100 wells and left at 37 ° C. for 1 hour.
  • the plasmid was purified using a plasmid flap kit and commissioned for sequencing (Macrogen, Seoul, Korea).
  • the sequencing primer used the vector sequence 5'-GATTACGCCMGCTTTG-3 '(SEQ ID NO: 7).
  • CPB peptide specific for ED-B from DNA sequence [4: ATPFRICYDPETGT ICKQPR (SEQ ID NO: 8); 27: AQSFRICYDPETGTW CKCPKLQ (SEQ ID NO: 9)], CPB specific for ED-B substituted with lysine [CPB4-l: ATPFRICYDPETKTWCICKQPR (SEQ ID NO: 12), CPB4-2: ATPFRICYDPEKGTWCICKQPR (SEQ ID NO: 13) And MPB peptide (25: CAYSWSCGGGGGGGRCRW I DQN, SEQ ID NO: 11) were synthesized (Anygen, Korea).
  • Each input phage of the CPB and MPB libraries was subjected to ELISA for ED-B and straptavidin.
  • the absorbances of ED-B and straptavidin were similar in absorbance, but in the fourth input phage, ED-B absorbance was 10 times higher than that of straptavidin.
  • the second and third input phage reactivity of the MPB library was similar in absorbance to ED-B and straptavidin, but from the fourth input phage, ED-B uptake was twice as high as straptavidin.
  • MPB libraries were also screened for candidates showing high responsiveness to ED-B (Nos. 4, 9 and 25) through phage ELISA using fifth input phage. As a result of sequencing the selected three clones, it was confirmed that No. 4 and No. 9 were the same peptide sequences. ) It was confirmed that the phage showed a high absorbance and selectivity in ED-B compared to the control (Fig. 5). Fibronectin ED-B Binding Assay
  • CPB4-2 peptide targeting fibronectin ED-B substituted with lysine at the 12th amino acid was dissolved in DMSO at 20 ⁇ to a concentration of 2 mM, and 2.2 mM Cy5.5— mono NHS ester dissolved in DMS0 as well. (GE healthcare UK) 40 and 70 mM TEA 2 ⁇ were mixed and reacted at room temperature for one day. After reaction, Cy5.5 and CPB4-2-Cy5.5 were separated by Eclipse Plus C18, and only CPB4-2—Cy5.5 was lyophilized.
  • CPB4-1 peptide In addition, in order to confirm whether the alteration of the amino acid sequence of the structural stabilization site affects the secondary structure, circular dichroism (Ci rcul ar di chroims, CD) analysis of CPB4-1 peptide was performed. As a result, as shown in Figure 9, CPB4-1 peptide of 1 mg / i concentration dissolved in 20 ⁇ sodium phosphate buffer of pH 7.0 showed a strong negative peak at 200 nm wavelength, strong positive at 230 nm wavelength Pick was shown. These results show that the CPB4-1 peptide also forms a typical beta-hairpin secondary structure (FIG. 9). Cancer Cell Targeting Ability of CPB
  • Human angiopoietin-2 (5 g /) and 23 ⁇ 4 BSA were added to 25 wells of 10 in 20 wells of 96 half wall EL ISA plates (Corning) and then allowed to stand at 4 ° C. overnight. All 20 wells were washed three times with 0.1% PBST and blocked for 2 hours at room temperature using 2% BSA diluted with PBS, then the solution was discarded and washed three times with 0.1% PBST.
  • 500 ⁇ 500 of a solution containing CPB recombinant phage and 2% BSA 500 were mixed and placed in 10 wells coated with BSA to remove phages that bind to BSA, and placed at room temperature for 1 hour.
  • the supernatant was collected, transferred to 10 wells bound with human angiopoietin-2, and left for 1 hour at silver. Remove all 10 wells, wash three times with 0.1% PBST, and elute the phage for 20 minutes with 25 ⁇ 0.2 M glycine / HCKpH 2.2) per well, collect in tube and return to 2 M Tris-base (pH 9.0) 50 ⁇ was added to neutralize the solution.
  • coli ER2738 cells were mixed and incubated at 37 ° C for 25 minutes at a speed of 200 rpm. 5 ⁇ Ampicillin (50 /) was added and mixed in the same manner, and then cultured by mixing at a speed of 200 rpm for 1 hour at 37 ° C by adding Ex helper phage of 1 X 10 u cfu. Ampicillin (50 ⁇ / ⁇ ) at 35 ⁇ . And transferred to a 200 ml Erlenmeyer pulley containing 30 mi SB liquid medium containing kanamycin (25 / g / in £) and incubated for one day at 37 ° C. at 200 rpm.
  • ELISA of each input phage of the CPB library was performed on human angiopoietin-2 ′ BSA and mouse TNFa (niTNFa). In a 96 half well ELISA plate, 5 human angiopoietin-2, BSA and mTNF ⁇ were added to each well.
  • the output phage ELISA the output phage recovered from the step immediately preceding the biopanning step, where the ratio of human angiopoietin-2 protein to the control group is the highest, was infected with E. coli ER2738 cells, followed by a polar plate per agar plate containing ampicillin. The plate was smeared with about 100-200 pieces. Sterile tips were used to collect 30 Polaks from each 1 SB-ampicillin (50 , Inoculated in Ex helper phage culture and then incubated at 37 ° C. for one day.
  • Phage peptide selection specific to human angiopoietin-2 Specific to human angiopoietin-2.
  • phage ELISA was performed using a 384 well ELISA pl.
  • Human angiopoietin-2 protein compared to control in input phage ELI SA.
  • plaques were inoculated into 70 ⁇ SB-ampicillin (50 ug / mi), Ex helper phage culture per well of 384 well ELISA pl, and incubated at 37 ° C. at 150 rpm for 1 day. The next day, after centrifugation at 209xg for 15 minutes, the supernatant was collected and 2% skim milk was added and used for phage peptide detection.
  • Angiopoietin-2 was placed in 192 wells at 15 ⁇ for each well, and 2 ⁇ g / m BSA was added to 192 wells at 15 ⁇ for each well and left at 4 ° C. for one day.
  • Human angiopoietin-2 specific CPB peptides (1-1: AYPMFLCYDPETGTWCHRWTNT, SEQ ID NO: 21; 1-12: AYPMFLCYDPETGTWCQRQTNT, SEQ ID NO: 23) from DNA sequencing were synthesized. Affinity measurements were performed using BIAcore X (Biacore AB, Uppsala, Sweden). Human angiopoietin-2 was immobilized by pouring 2,700 RU into CM5 chips (Biacore).
  • Human Angiopoietin-2 Specific CPB Screening ELISA was performed on human angiopoietin-2, BSA and mTNFa with each input phage of the CPB library.
  • the second and third input phage reactivity of the CPB library showed similar absorbance for both human angiopoietin-2 BSA and mTNFa, but the absorbance of human angiopoietin-2 from fourth input phage was comparable to that of BSA and mTNFa. High reactivity was shown to be about 2 times higher, and it was confirmed that the response difference in the fifth input phage increased up to 6 times, confirming successful biopanning (FIG. 11).
  • the output phage of the fourth stage was obtained in the form of plaques.
  • phage ELISA was performed using a 384 well ELISA plate in order to secure a sufficient amount of CPB candidates specific for human angiopoiet in_2. As a result, a total of 22 CPBs were selected (FIG. 15 and Table 3).

Abstract

본 발명은 신규한 컨스트럭트를 갖는 환형의 β-헤어핀 기반 펩타이드 바인더를 제공한다. 본 발명의 환형의 β-헤어핀 기반 펩타이드 바인더는 의약으로서의 용도를 가질 뿐만 아니라, 생체 내 물질의 검출, 인 비보 분자 이미징, 인 비트로 세포 이미징 및 약물전달을 하는 데 이용될 수 있으며, 에스코트 분자로도 이용될 수 있다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
환형의 β -헤어핀 기반 펩타이드 바인더 및 이의 제조방법 【기술 분야】
본 발명은 환형의 β—헤어핀 기반 펩타이드 바인더 (Cyc l i c beta- hai rpin based pept i de bi nder , CPB) , 이를 코딩하는 핵산 분자와 이 핵산분자를 포함하는 재조합 백터， 및 상기 CPB의 제조방법에 관한 것이다. 【배경 기술】
항체는 B 세포가 생산하는 혈장단백질의 일종인 면역글로불린 단백질로서 외부에서 들어온 항원의 특정부위를 특이적으로 인식하여 결합함으로써 항원을 비활성화하거나 무력화시킨다. 이러한 항원 -항체 반응의 특이성과 고도의 친화도 및 수천만 종류의 항원올 구별할 수 있는 항체의 다양성을 응용하여 오늘날 진단제와 치료제 등을 포함하는 많은 종류의 항체 제품이 출현하게 되었다.
항체를 이용한 신약개발이 활발해지는 이유는 약품의 개발기간이 짧으며, 투자비용이; 적고 부작용을 쉽게 예측할 수 있기 때문이다. 또한， 항체는 생약이어서 인체가 거의 영향을 받지 않으며, 체내에서의 반감기가 저분자량 약품에 비하여 압도적으로 길어 환자에게 친화적이다.
이러한 유용성에도 불구하고 인간에서 단일클론항체는 외래 항원으로 인식하여 심한 알레르기 반웅 또는 과민반응올 일으키기도 한다. 또한， 이러한 항암 기능의 단일클론항체를 임상적으로 사용할 경우 생산 단가가 높기 때문에 치료제로서의 가격이 급격히 상승한다는 단점이 있으며， 항체를 배양하는 방법 및 정제 방법 등 광범위한 분야의 기술들이 각종 지적소유권에 의해 보호받고 있기 때문에 비싼 라이센싱비를 지불해야 한다. 이러한 문제를 해결하기 위하여 미국을 중심으로 유럽연합에서 항체 대체 단백질 개발이 태동기에 있다. 항체 대체 단백질은 항체와 같이 불변영역과 가변영역을 가질 수 있도록 만든 재조합 단백질로서 크기가 작고， 안정한 단백질의 일정부분을 무작위 서열의 아미노산으로 바꾸어 라이브러리를 만들고 이를 표적물질에 대해 스크리닝을 하여 높은 친화력과 좋은 특이성을 가진 물질을 찾을 수 있다. 예를 들어， 항체 대체 단백질 중 아비머 (avimer )와 아피바디 (af f ibody)는 표적물질에 대해 피코몰 (pi comol e) 정도의 친화력을 가진다는 보고가 있었다.
이런 항체 대체 단백질은 크기가 작고 안정해서 암세포에 깊이 침투 가능하며， 일반적으로 면역반응을 적게 일으킨다고 보고되어 있다. 그리고 무엇보다도 광범위한 항체 특허 문제에서 벗어 날 수 있으며， 박테리아에서 쉽게 대량정제 할 수 있기 때문에 생산단가가 낮아 경제적으로 항체보다 큰 장점을 가진다.
본 발명은 지금까지의 단백질을 이용한 항체 대체 단백질과는 다른 펩타이드 기반 항체 대체 단백질에 초점을 맞추었다. 펩타이드는 항체에 비해 적절한 약물동력학， 대량생산성， 낮은. 독성， 항원성 억제 및 낮은 생산 단가 등으로 인해 현재 항체 치료제를 대체하여 다양하게 활용되고 있다. 치료용 약으로서의 펩타이드의 장점은 생산 단가가 낮고， 안전성 및 반웅성이 높으며， 특허 로얄티가 상대적으로 저렴하고 , 원하지 않는 면역시스템에 덜 노출되어 펩타이드 자체에 대한 항체 생산을 억제 할 수 있으며， 합성을 통한 변형이 쉽고 정확하다는 것이다.
그러나, 대부분의 펩타이드는 항체에 비해 특정 단백질 타켓에 대해 낮은 친화력 및 특이성을 보이기 때문에 여러 응용분야에서 사용되지 못하는 단점이 있다. 따라서， 이러한 펩타이드의 단점을 극복할 수 있는 새로운 펩타이드 기반 항체 대체 단백질 개발에 대한 요구가 당업계에 대두되고 있다. 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
【발명의 내용】
【해결하려는 과제】
본 발명자들은 안정적인 구조를 유지하면서 타겟 분자에 매우 높은 친화도 (af f ini ty)로 결합할 수 있는 펩타이드 물질을 개발하기 위하여 연구 노력하였다. 그 결과， 리지드 (rigid)한 펩타이드 골격으로서 β-헤어핀을 이용하여 이의 양 말단에 무작위적 (randomly)으로 펩타이드를 결합시키는 경우， 이 두 펩타이드가 공동으로 타겟 분자에 결합함으로써 크게 증가된 결합능 및 특이성을 나타낼 수 있으며, 이때 상기 펩타이드 골격인 β- 헤어핀을 환형 (cyclic)으로 구현하는 경우， 이의 양 말단에 무작위적으로 연결된 펩타이드에 의해서 β-헤어핀의 구조가 풀리는 것이 방지되어 펩타이드 분자의 전체적인 구조가 안정적으로 유지될 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서， 본 발명의 목적은 환형의 β-헤어핀 기반 펩타이드 바인더를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 환형의 β-헤어핀 기반 펩타이드 바인더를 코딩하는 핵산 분자를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 백터를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 백터를 포함하는 형질전환체를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 환형의 β-헤어핀 기반 펩타이드 바인더의 제조방법올 제공하는 데 있다. 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
【과제의 해결 수단】
본 발명의 일 양태에 따르면， 본 발명은 (a) 가닥 간 (interstrand) 비공유결합이 형성되어 있는 β-헤어핀 구조를 가지되, 상기 β-헤어핀 구조의 양 말단에 위치한 아미노산 잔기 사이의 공유결합을 통하여 환형 (cyclic) 구조를 형성한 환형의 β-헤어핀 (cyclic β -hairpin); 및 (b) 상기 환형의 β-해어핀의 일 말단에 결합되어 타겟에 대한 결합 친화도 (binding affinity)를 나타내는 n 개의 아미노산을 포함하는 타켓 결합 부위 I 과， 상기 환형의 β-해어핀의 타 말단에 결합되어 상기 타겟에 대한 결합 친화도를 나타내는 m 개의 아미노산을 포함하는 타겟 결합 부위 Π를 포함하는 타켓에 특이적으로 결합하는 환형의 β—헤어핀 기반 펩타이드 바인더를 제공한다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면， 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 타겟에 특이적으로 결합하는 환형의 β-헤어핀 기반 펩타이드 바인더의 제조방법을 제공한다:
(a) (ί) 가닥 간 (interstrand) 비공유결합이 형성되어 있는 β- 헤어핀 구조를 가지되， 상기 βᅳ해어핀 구조의 양 말단에 위치한 아미노산 잔기 사이의 공유결합을 통하여 환형 (cyclic) 구조를 형성한 환형의 β- 헤어핀 (cyclic β -hairpin); 및 (Π) 상기 환형의 β-헤어핀의 일 말단에 결합된 η 개의 아미노산을 포함하는 타겟 결합 부위 I 과， 상기 환형의 β- 헤어핀의 타 말단에 결합된 m 개의 아미노산을 포함하는 타켓 결합 부위 Π를 포함하는 환형의 β-헤어핀 기반 펩타이드 바인더의 라이브러리를 제공하는 단계 ;
(b) 상기 라이브러리에 타겟을 접촉시키는 단계; 및
(c) 상기 타겟에 결합된 환형의 β-헤어핀 기반 펩타이드 바인더를 선택하는 단계.
본 발명의 특징 중 하나는， β-해어핀 구조를 갖되， 이의 양 말단에 위치한 아미노산 잔기 사이의 직접 혹은 간접적인 (화학 링커와 같이 공유결합을 매개하는 분자를 통한) 공유결합을 통하여 환형 구조를 형성한 환형의 β_헤어핀을 리지드한 펩타이드 골격으로 이용하여 , 이의 양 말단에 타켓에 대한 결합 친화도를 갖는 펩타이드를 연결하는 것이다. 이 경우， 환형의 β-헤어핀은 펩타이드 바인더의 전체적인 구조를 안정화시키는 작용올 할 뿐만 아니라, 타겟 결합 부위 I 및 Π의 타겟 분자에 대한 결합력을 강화시킨다.
또한， β-헤어핀 구조의 양 말단에 위치한 아미노산 잔기들의 공유결합은 , β-헤어핀의 구조를 환형으로 만들어줌으로써 이의 양 말단에 무작위적으로 연결된 아미노산 서열 (타겟 결합 부위 I 및 Π)에 의해서 β-헤어핀의 구조가 풀리는 것을 방지하는 역할을 한다. 따라서， 본 발명의 환형의 β-해어핀 기반 펩타이드 바인더는 β-헤어핀 구조를 계속하여 유지할 수 있고， 이러한 구조적 안정성을 기반으로 하여 타겟에 높은 친화력으로 결합할 수 있다. 상기 환형의 β-헤어핀은 아미노산 가닥 간에 비공유결합이 형성되어 있다. 이 가닥 간 비공유결합은 환형의 β-헤어핀 구조의 견고성에 기여하며, 타겟 결합 부위의 결합 친화도에 영향을 미칠 수 있다. 하기 실시예 2 는 β-헤어핀 구조를 갖는 환형의 β-헤어핀을 포함하는 펩타이드 바인더 (CPB)의 타켓 친화도가 β-헤어핀의 아미노산이 글리신으로 치환된 단순한 환형 펩타이드를 포함하는 펩타이드 바인더 (ΜΡΒ)에 비하여 더 우수함을 보여준다 (도 6 및 7 참조).
본 발명의 일구현예에 따르면， 상기 비공유결합은 수소결합, 정전기적 상호작용， 소수성상호작용, 반데르발스 상호작용, 파이 -파이 상호작용， 양이온 -파이 상호작용 또는 이들의 조합일 수 있다.
상기 환형의 β-헤어핀이 갖는 β-헤어핀 구조는 두 개의 β 가닥을 포함하는 가장 간단한 단백질 모티프를 의미하며， 이 두 개의 β' 가닥은 서로 안티패러럴 한 정렬을 나타내며， 일반적으로 턴 서열에 의해 연결된다. 본 발명의 일구현예에 따르면， 상기 β-헤어핀 구조에 적용되는 턴 서열은 타입 1(예컨대， Asp-Asp— A la-Thr-Lys—Thr) 타입 I' (예컨대， Glu- Asn-Gly-Lys), 타입 Π(예컨대， X-Pro-Gly—Glu-Val， Ala— X-Gly-Glu-Val； X는 20 개의 아미노산으로부터 선택됨), 타입 Π' (예컨대, Glu-Gly-Asn-Lys, Glu-D-Pro-Asn-Lys), 타입 ΙΠ, 또는 타입 ΠΓ 턴 서열일 수 있다.
상기 환형의 β-헤어핀에서 환형 구조 (cyclic form)를 형성하는 공유결합은， β-헤어핀 구조의 양 말단에 위치한 아미노산 잔기 사이의 직접적 결합에 의한 공유결합이거나, 혹은 간접적 결합에 의한 공유결합일 수 있다. 상기 공유결합의 예로는, 이황화 결합， 에스테르 결합, 에테르 결합， 포스포에스테르 결합， 아미드 결합， 탄소-인 결합， 티오에테르와 같은 탄소-황 결합 및 이미드 결합을 들 수 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 환형의 β-헤어핀은 β-헤어핀 구조의 양 말단에 위치한 아미노산 잔기 사이의 이황화 결합을 통하여 환형 구조를 형성한 것이다.
본 발명의 다른 일구현예에 따르면， 상기 환형의 β_헤어핀은 β- 헤어핀 구조의 양 말단에 위치한 아미노산 잔기 사이의 링커를 통한 공유결합을 통하여 환형 구조를 형성한 것이다. 일예로， 본 발명에서는 β_ 헤어핀 구조의 양 말단에 위치한 아미노산 잔기의 공유결합을 매개하여 β- 헤어핀의 구조를 환형으로 만들 수 있는 다양한 화합물올 링커로서 사용할 수 있다. 이러한 링커의 예로는， oPDM( ,A^l,4-phenylenedi maleimide), pPDM (Ν,Ν-1, 2-pheny 1 ened i ma 1 em i de , DSP(Di thiobis(succinimi dyl propionate)) , DSS(Di succinimidyl suberate) , DMACDimethyl adipimidate dihydrochlor ide) , 및 DMS(Dimethyl suber imidate di hydrochloride) 등이 있다. ,
상기 환형의 β-헤어핀은 당업계에 알려진 β-헤어핀 구조를 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들어， 당업계에 알려진 β-헤어핀 구조를 채택하고， 이의 양 말단에 위치한 아미노산 잔기를 공유결합 시켜 환형의 β-해어핀을 제조할 수 있다. 이때， 공유결합을 위하여 양 말단에 위치한 아미노산을 시스테인으로 치환하여 이 둘 사이의 이황화 결합을 시킬 수 있다.
이러한 β-헤어핀 구조 (conformation)를 갖는 펩타이드는 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어， 미국 특허 제 6,914,123 호 및 Andrea G. Cochran et al . , PNAS, 98(10) :5578-5583)에 개시되어 있는 트립토판 지퍼 , W0 2005/047503 에 개시되어 있는 주형-고정된 β-헤어핀 미메틱， 미국 특허 제 5,807,979 호에 개시되어 있는 β—헤어핀 변형체들이 잘 알려져 있다. 이외에도， β-헤어핀 구조를 갖는 펩타이드는 Smith & Regan (1995) Science 270 :980-982； Chou & Fassman (1978) Annu. Rev. Biochem. 47:251- 276； Kim & Berg (1993). Nature 362:267-270； Minor & Kim (1994) Nature 367:660-663； Minor & Kim (1993) Nature 371:264-267; Smith et al . Biochemistry (1994) 33:5510-5517; Searle et al . (1995) Nat. Struct. Biol. 2:999-1006； Haque & Gellman (1997) J. Am. Chew. Soc. 119:2303- 2304； Blanco et al. (1993) J. Am. Chem. Soc. 115:588그 5888; de Alba et al. (1996) Fold. Des. 1： 133-144； de Alba et al . (1997) Protein Sci. 6:2548-2560; Ramirez-Alvarado et al. (1996) Nat. Struct. Biol. 3:604- 612； St anger & Gellman (1998) J. Am. Chem. Soc. 120:4236-4237； Maynard & Searle (1997) Chew. Commun. 1297-1298； Griffiths-Jones et al. (1998) Chem. Comnmn. 789-790； Maynard et al . (1998) J. Am. Chem. Soc. 120:1996-2007; 및 Blanco et al . (1994) Nat. Struct. Biol. 1： 584-590 에 개시되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 본 발명의 일구현예에 따르면， 상기 환형의 β-헤어편의 β-해어핀 구조로서 트립토판 지퍼, 단백질 G 의 B1 도메인으로부터 유래된 펩타이드 (즉， GB1 펩타이드) 또는 HP 펩타이드를 이용할 수 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면， 상기 환형의 β-헤어핀은 하기의 아미노산 서열을 가질 수 있다:
(i) 서열목록 제 14서열의 아미노산 서열 ; 또는
(ii) 서열목록 제 14서열의 아미노산 서열에서 양 말단의 시스테인올 제외한 아미노산 중 일부 아미노산이 라이신으로 치환된 아미노산 서열. 상기 (ii)에서의 라이신은 아민 커플링 반웅을 통하여 카고 (cargo) 물질을 환형의 β—헤어핀에 결합 (conjugation) 시키기 위한 용도로 사용할 수 있다. 하기 실시예 3 은 환형의 -헤어핀 중 일부 아미노산을 라이신으로 치환하는 경우에도 환형의 β-헤어핀 구조 및 타겟에 대한 결합 친화도가 유지됨을 보여준다 (도 8 내지 10 참조). 상기 (Π)에 따른 아미노산 서열의 예로는， 서열목록 제 15서열 및 제 16서열을 들 수 있다. 상기 환형의 β—헤어핀의 양 말단에는 무작위 아미노산 서열이 결합된다. 상기 · 무작위 아미노산 서열이 타겟 결합 부위 I 및 타켓 결합 부위 Π를 형성한다. 본 발명의 특징 중 하나는， 환형의 β-헤어핀의 양쪽 말단에 타겟에 대한 결합 친화도를 갖는 일정 개수의 아미노산을 포함하는 타겟 결합 부위 I 및 Π를 연결하여 바이포달 방식으로 펩타이드 바인더를 제작하는 것이다.
본 발명의 일구현예에 따르면， 상기 타겟 결합 부위 "I 및 타겟 결합 부위 Π는 서로 협동적으로 (cooperatively) 타겟에 결합함으로써 타겟에 대한 친화도가 크게 증가된다.
상기 타겟 결합 부위 I 및 타겟 결합 부위 Π의 아미노산 개수 n 및 m은 특별하게 제한되지 않는다.
본 발명의 일구현예에 따르면， 상기 n 및 m 은 각각 2-100 의 정수일 수 있다. 보다 구체적인 일구현예에서， 상기 n 및 m 은 각각 2-50 의 정수이며， 보다 더 구체적인 일구현예에서는 2-40 의 정수이고， 보다 더 구체적인 일구현예에서는 2-30 의 정수이며, 보다 더 구체적인 일구현예에서는 2-20 의 정수이고， 보다 더 구체적인 일구현예에서는 2- 15 의 정수이며， 보다 더 구체적인 일구현예에서는 2-10 의 정수이다. 보다 구체적인 다른 일구현예에서， 상기 n 및. m 은 각각 3-50 의 정수이며 보다 더 구체적인 일구현예에서는 3-40 의 정수이고， 보다 더 구체적인 일구현예에서는 3-30 의 정수이며， 보다 더 구체적인 일구현예에서는 3- 20 의 -정수이고， 보다 더 구체적인 일구현예에서는 3-15 의 정수이며, 보다 더 구체적인 일구현예에서는 3-10의 정수이다.
상기 타겟 결합 부위 I 및 타켓 결합 부위 Π에는 서로 각각 다른 또는 동일한 개수의 아미노산 잔기가 포함될 수 있다. 또한， 상기 타겟 결합 부위 I 및 타겟 결합 부위 Π에는 서로 각각 다른 또는 동일한 아미노산 서열이 포함될 수 있다.
상기 타겟 결합 부위 I 및 /또는 타겟 결합 부위 π에 포함되는 아미노산 서열은 선형의 아미노산 서열 또는 환형의 아미노산 서열일 수 있다. 타겟 결합 부위의 펩타이드 서열의 안정성을 증가시키기 위하여, 타겟 결합 부위 I 및 /또는 타겟 결합 부위 Π에 포함되는 아미노산 서열 중에서 적어도 하나의 아미노산 잔기는 아세틸기， 폴루오레닐 메록시 카르보닐기， 포르밀기， 팔미토일기， 미리스틸기， 스테아릴기 또는 폴리에틸렌글리콜 (PEG)로 변형될 수 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면， 상기 타겟 결합 부위 I 과 타겟 결합 부위 Π는 β -헤어핀 기반 펩타이드 바인더의 파지 디스플레이-， 효모 디스플레이 또는 라이보좀 디스플레이-기반의 스크리닝을 통하여 확인된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드이다.
본 발명의 일구현예에 따르면， 상기 타겟 결합 부위 I 과 타겟 결합 부위 Π는 서열목록 제 17 서열 내지 제 20 서열 및 제 38 서열 내지 제 70 서열 중에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 타겟 결합 부위 I 및 I I 는 피브로넥틴 ED-B (서열목록 제 17서열 내지 제 20 서열) 또는 인간 안지오포이에틴 -2(서열목록 제 38 서열 내지 제 70서열)에 결합할 수 있다.
생물학적 타겟 분자에 결합되는 본 발명의 환형의 β -헤어핀 기반 펩타이드 바인더는 생체 내 생리학적 반웅의 조절， 생체 내 물질의 검출， 인 비보 분자 이미징 인 비트로 세포 이미징 및 약물전달용 타겟팅을 하는 데 이용될 수 있으며， 에스코트 분자로도 이용될 수 있다. 본 발명의 일구현예에 따르면， 상기 환형의 β-헤어핀， 타겟 결합 부위 I 또는 타겟 결합 부위 Π에는 추가적으로 기능성 분자가 결합될 수 있다. 상기 기능성 분자의 예로는, 검출 가능한 신호를 발생시키는 레이블, 화학약물, 바이오약물， 세포막 투과 펩타이드 (CPP) 또는 나노입자를 포함하나， 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 검출 가능한 신호를 발생시키는 레이블은 T1 조영물질 (예컨대， Gd 킬레이트 화합물)， T2 조영물질 [예컨대 , 초상자성 물질 (예： 마그네타이트, Fe304l y-Fe203, 망간 페라이트, 코발트 페라이트 및 니켈 페라이트)]， 방사성 동위 원소 (예컨대 , UC, 150, 13N, P32, S35, Sc, 45Ti, 1181， 136La, 198T1 , 200Τ1 , 205Βί 및 206Bi), 형광물질 [플루오리신 (fluorescein)ᅳ 피코에리트린 (phycoerythrin), 로다민， 리사민 ( 1 i ssamine)， 그리고 Cy3 와 Cy5], 화학발광단， 자기입자， 매스 표지 또는 전자밀집입자를 포함하나， 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 화학약물은 예를 들어 항염증제， 진통제, 항관절염제， 진경제， 항우을증제， 항정신병약물， 신경안정제， 항불안제, 마약길항제， 항파킨스질환 약물， 콜린성 아고니스트， 항암제， 항혈관신생억제제， 면역억제제， 항바이러스제, 항생제， 식욕억제제， 진통제， 항콜린제, 항히스타민제, 항편두통제， 호르몬제 관상혈관， 뇌혈관 또는 말초혈관 확장제， 피임약， 항혈전제， 이뇨제, 항고혈압제， 심혈관질환 치료제， 미용성분 (예컨대, 주름개선제， 피부노화 억제제 및 피부미백제) 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 바이오약물은 인술린， IGF-K insulin-like growth factor 1)， 성장호르몬 에리쓰로포이에틴, G-CSFs(granulocyte-colony stimulating factors) , GM-CSFs (granulocyte/macrophage— colony stimulating factors) , 인터페론 알파, 인터페론 베티ᅳ， 인터페론 감마， 인터루킨 -1 알파 및 베타， 인터루킨 -3， 인터투킨 -4, 인터루킨 -6, 인터루킨 -2, EGFs( epidermal growth factors) , 칼시토닌 (calcitonin)， ACTH (adrenocorticotropic hormone) , TNF( tumor necrosis factor) , 아토비스반 (atobi sban)， 부세레린 (buserel in) , 세트로렉릭스 (cetrorelix), 데스로레린 (deslorel in) 데스모프레신 (desmopressin) , 디노르핀 A(dynorphin A), 엘카토닌 (elcatonin) , 엘레이도신 (eleidosin), 엡티피바타이드 (eptif ibatide), GHRH-I I (growth hormone releasing hormone- 11 ) , 고나도레린 (gonadorel in) , 고세레린 (goserelin), 히스트레린 (hi strel in)， 류프로레린 ( leuprorel in) , 라이프레신 (lypressin), 옥트레오타이드 (octreotide)， 옥시토신 (oxytocin) , 피트레신 (pitressin), 세크레틴 (secret in)ᅳ 신칼라이드 (sincalide) , 테르리프레신 (terlipressin), 티모펜틴 (thymopent in)， 티모신 (thymosine) α 1, 트리프토레린 (triptorelin), 바이발리루딘 (bival i rudin) , 카르베토신 (carbetocin), 사이클로스포린， 엑센딘 (exedine) , 란레오타이드 ( lanreot ide) , LHRH( luteini zing hormonere leasing hormone) , 나파레린 (nafarelin), 부갑상선 호르몬, 프람린타이드 (pramlint ide) , T- 20(enfuvirtide), 타이말파신 (thymal f asin)， 지코노타이드， RNA, DNA, cDNA 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 siRNA 가 될 수 있으나， 이에 한정되지는 않는다.
상기 타겟 결합 부위 I 및 /또는 타겟 결합 부위 Π는 다양한 타겟에 결합하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 환형의 β-해어편 기반 펩타이드 바인더에 의해 타켓팅될 수 있는 것은， 생화학물질, 펩타이드， 폴리펩타이드, 핵산， 탄수화물， 지질， 세포 및 조직과 같은 생물학적 타겟, 화합물, 금속 또는 비금속 물질을 포함한다.
상기 타겟 결합 부위가 결합하는 생물학적 타겟은， 예를 들어 생화학물질， 펩타이드， 폴리펩타이드， 당단백질， 핵산， 탄수화물， 프로테오글리칸， 지질 또는 당지질이다.
예를 들어, 타겟 결합 부위가 결합하는 생화학 물질은 다양한 생체 내 대사산물 (예컨대， ATP, NADH, NADPH, 탄수화물 대사산물， 지질 대사산물 및 아미노산 대사산물)을 포함한다.
상기 타겟 결합 부위가 결합하는 예시적인 펩타이드 또는 폴리펩타이드는， 효소， 리간드， 수용체， 바이오마커, 호르몬, 전사인자, 성장인자, 면 글로블린， 신호전달단백질， 결합단백질， 이온 채널， 항원， 부착단백질, 구조단백질， 조절단백질, 독소단백질， 사이토카인 및 혈액 웅고 인자를 포함하나， 이에 한정되지 않는다. 보다 상세하게는， 상기 환형의 β—헤어핀 기반 펩타이드 바인더의 타겟은, Fibronectin extra domain B(ED-B) , VEGF(vascular endothelial growth factor) , VEGFR(vascular endothelial growth factor receptor) , VCAM1 (vascular cell adhesion molecule-1) , nAchR(Nicot inic acetylcholine receptor) , HSA( Human serum albumin) , MyD88 , EGFR(Epi dermal Growth Factor Receptor), HER2/neu, CD20, CD33, CD52, EpCAM(Epi thel ial Cell Adhesion Molecule) , TNF- (Tumor Necrosis. Factor— a), IgE(I議 unoglobul in E) , CD11A( a -chain of l mphocyte funct ion-associated antigen 1)， CD3, CD25 Glycoprotein Ilb/IIIa, 인테그린， AF?(Alpha-f etoprotein)， ^2M(Beta2- microglobul in) , BTA (Bladder Tumor Antigens), NMP22, Cancer Antigen 125 Cancer Antigen 15-3, 칼시토닌， Carcinoembryonic Antigen, Chromogranin A, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, Human Chorionic Gonadotropin, Neuron-Speci f i c Enolase, PSA(Prostate-Speci f ic Ant i gen) , PAPCProstatic Acid Phosphatase) 및 Thyroglobul in 을 포함하나， 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 타겟 결합 부위가 결합하는 예시적인 핵산 분자는， gDNA, mRNA, cDNA, rRNACribosomal RNA) , rDNA(r ibosomal DNA) 및 tRNA 를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 타켓 결합 부위가 결합하는 예시적인 탄수화물은， 생체 내 탄수화물로서， 단당류， 이당류, 삼당류 및 다당류를 포함하나， 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 타겟 결합 부위가 결합하는 예시적인 지질은， 지방산， 트리아실글라이세롤， 스핑고지질， 강글리오사이드 및 콜레스테를를 포함하나， 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 환형의 β-헤어핀 기반 펩타이드 바인더는 세포 표면에 노출된 생체 분자 (예컨대, 단백질)에 결합할 수도 있지만, 세포 내 생체 분자 (예컨대, 단백질)에도 결합하여 생체 분자의 활성을 조절할 수 있다. 상기 환형의 β-헤어핀 기반 펩타이드 바인더가 세포 내 단백질을 타겟팅 하는 경우, 상기 펩타이드 바인더는 추가적으로 세포막 투과 펩타이드 (CPP)를 포함할 수 있다.
상기 CPP 는 당업계에 공지된 다양한 CPP 를 포함하며， 예를 들어 HIV-1 Tat 단백질, Tat 펩타이드 유사체 (예컨대， 올리고알지닌)， ANTP 펩타이드， HSV VP22 전사조절단백질, vFGF 에서 유래된 MTS 펩타이드, Penetratin, Transport an 또는 Pep-1 펩타이드를 포함하나， 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 CPP 를 환형의 β—헤어핀 기반 펩타이드 바인더에 결합시키는 방법은 다양한 방법이 있으며， 예를 들어 환형의 β-헤어핀 부분의 라이신 잔기와 CPP를 공유결합 시킨다.
세포 내에는 생리 활성에 중요한 역할을 하는 많은 타켓 단백질이 있으며， CPP가 결합된 환형의 β-헤어핀 기반 펩타이드 바인더는 세포 내로 유입되어 이 타켓 단백질에 결합하여 활성을 조절 (예컨대， 억제)한다. 하기 실시예 3 은 환형의 β-헤어핀 기반 펩타이드 바인더의 세포 내 단백질 (피브로넥틴 ED-B)에 대한 타겟팅의 구체적인 예를 보여준다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 환형의 β-헤어핀 기반 펩타이드 바인더는 전형적으로 "Ν 말단 - 타겟 결합 부위 I - 환형의 β-헤어핀의 한 가닥 - 링커 (예컨대， 턴 서열) - 환형의 β-헤어핀의 다른 한 가닥 - 타켓 결합 부위 Π ᅳ C 말단' '의 컨스트럭트를 갖는다.
본 발명의 일구현예에 따르면， 본 발명의 환형의 β-헤어핀 기반 펩타이드 바인더에서 타겟 결합 부위 I 과 환형의 β-헤어핀의 한 가닥 사이 및 /또는 환형의 β-헤어핀의 다른 한 가닥과 타겟 결합 부위 Π 사이에는, 타겟 결합 부위와 환형의 β-헤어핀 간의 상호 구조적 영향을 차단하는 구조영향 억제부위 (structure influence inhibiting region)를 포함할 수 있다. 회전 부위에는 펩타이드 분자에서 Φ와 Ψ의 회전이 비교적 자유로운 아미노산 (예컨대， 글리신， 알라닌， 세린)이 위치할 수 있으며， 구조영향 억제부위에는 1-10 개 ᅳ 바람직하게는 1-8 개 ᅳ 보다 바람직하게는 1-3 개의 아미노산 잔기가 위치할 수 있다.
상술한 컨스트럭트를 갖는 본 발명의 환형의 -헤어핀 기반 펩타이드 바인더의 라이브러리는 당업계에 공지된 다양한 방법으로 얻을 수 있다. 이 라이브러리에서 환형의 β-헤어핀 기반 펩타이드 바인더는 무작위 서열올 갖게 되며, 이는 타겟 결합 부위 I 및 /또는 타켓 결합 부위 Π의 어떤 위치에서도 서열 선호도 (sequence preference)가 없거나 또는 지정 (또는 고정)된 아미노산 잔기가 없다는 것을 의미한다.
예를 들어, 환형의 β-헤어핀 기반 펩타이드 바인더의 라이브러리는 고상지지체 (예컨대, 폴리스틸렌 또는 폴리아크릴아미드 수지) 상에서 실시되는 스폴리트 -합성 방법 (Lam et al. (1991) Nature 354:82; WO 92/00091)에 따라 구축될 수 있다. 본 발명의 일구현예에 따르면 , 상기 환형의 β_헤어핀 기반 펩타이드 바인더의 라이브러리는 세포 표면 전시 (cell surface display) 방식 (예컨대 파아지 디스플레이， 박테리아 디스폴레이， 이스트 디스플레이)으로 구축될 수 있다. 또한， 상기 환형의 β-헤어핀 기반 펩타이드 바인더의 라이브러리는 폴라스미드， 박테리오파아지， 파아지미드, 이스트, 박테리아, mRNA 또는 라이보좀을 기반으로 하는 디스플레이 방법을 통하여 제작될 수 있다.
파아지 디스플레이는 파아지의 표면 상의 코트 단백질에 융합된 단백질 형태로 다양한 폴리펩타이드를 디스플레이하는 기술이다 (Scott, J. K. and Smith, G. P. (1990) Science 249： 386； Sambrook, J. et al . , Molecular Cloning. A Laboratory Manual , 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)； Clackson and Lowman , Phage Display, Oxford University Press(2004)). 필라멘트성 파아지 (예컨대， M13)의 유전자 ffl 또는 유전자 에 발현하고자 하는 유전자를 융합시켜 무작위 펩타이드를 디스플레이한다.
파이지 디스플레이에는 파아지미드가 이용될 수 있다. 파아지미드는 박테리아의 복제원점 (예컨대， ColEl) 및 박테리오파아지의 인터제닉 (intergenic) 부위의 한 카피를 갖는 플라스미드 백터이다. 이 파아지미드에 클로닝된 DNA 단편은 플라스미드처럼 증식된다.
상기 환형의 β-헤어핀 기반 펩타이드 바인더의 라이브러리를 파아지 디스플레이 방식으로 구축하는 경우， 본 발명의 일구현예는 다음의 단계를 포함할 수 있다:
(i) 파아지 코트 단백질 (예컨대, M13 과 같은 필라멘트성 파아지의 유전자 m 또는 유전자 νιπ 코트 단백질)을 코딩하는 유전자와 환형의 β- 헤어핀 기반 펩타이드 바인더를 코딩하는 유전자가 융합된 융합 유전자; 및 상기 .융합 유전자에 작동적으로 결합된 전사 조절 서열 (예컨대, lac 프로모터)을 포함하는 발현 백터의 라이브러리를 제작하는 단계;
(ii) 상기 발현 백터 라이브러리를 적합한 숙주 세포에 도입시키는 단계; (iii) 상기 숙주세포를 배양하여 재조합 파아지 또는 파아지미드 바이러스 파티클을 형성시켜 융합 단백질이 표면에 디스플레이 되도록 하는 단계;
(iv) 생물학적 타겟 분자와 상기 바이러스 파티클을 접촉시켜 파티클을 타겟 분자에 결합시키는 단계; 및
(V) 타켓 분자에' 결합하지 않은 파티클을 분리하는 단계.
파아지 디스플레이를 이용하여 펩타이드 라이브러리를 구축하고， 이들 라이브러리를 스크리닝 하는 방법은 미국 특허 게 5, 723,286호， 제 5,432, 018호, 제 5, 580, 717호, 제 5，427，908호 제 5，498，530호， 제 5，770，434호， 제 5，734，018호， 제 5，698，426호, 거 15,763,192호 및 거 15 ,723,323호에 개시되어 있다.
상기 환형의 β-헤어핀 기반 펩타이드 바인더의 유전자를 포함하는 발현 백터를 제작하는 방법은 당업계에 공지된 방법에 따라 실시될 수 있다. 예를 들어， 공지의 파아지미드 또는 파아지 백터 (예컨대， pIGT2, fUSE5, fAFFl, fd-CATl, m663, fdtetDOG, pHENl, PComb3, PComb8, pCANTAB 5E
(Pharmacia), LamdaSurfZa , pIF4, PM48, PM52, PM54, fdH 및 p8V5)에 환형의 β-헤어핀 기반 펩타이드 바인더 -코딩 유전자를 삽입시켜 발현 백터를 제작할 수 있다.
대부분의 파아지 디스플레이 방법이 필라맨트성 파아지를 이용하여 실시되지만, 람다 파아지 디스플레이 (W0 95/34683； 미국 특허 제 5,627,024 호)， Τ4 파아지 디스플레이 (Ren et al. (1998) Gene 215： 439；
Zhu (1997) CAN 33：534) 및 T7 파아지 디스폴레이 (미국 특허 제 5,766,905호)도 환형의 β-헤어핀 기반 펩타이드 바인더의 라이브러리를 구축하는 데 이용될 수 있다.
백터 라이브러리를 적합한 숙주 세포에 도입시키는 방법은 다양한 형질전환 방법에 따라 실시될 수 있으며 , 예를 들어 전기천공 (electroporation) 방법에 따라 실시될 수 있다 (참조: 미국 특허 제 5，186，800호， 제 5，422，272호， 제 5，750,373호).
본 발명에 적합한 숙주 세포는 E. coli 와 같은 그람 음성 박테리아 세포이며， 적합한 E. coli 숙주는 JM101, E. coli K12 strain 294， E. coli strain W3110 및 E. coli XL-lBlue(Stratagene)을 포함하나， 이에 한정되는 것은 아니다. 숙주세포는 형질전환 전에 컴피턴스 세포로 준비하는 것이 tij "람직히다 (Sambrook, J. et al. , Molecular Cloning. A Laboratory Manual 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)) .
형질전환 된 세포의 선별은 일반적으로 항생제 (예컨대， 테트라사이클린 및 암피실린)를 포함하는 배지에서 배양하여 실시된다. 선별된 형질전환 세포를 헬퍼 파아지의 존재 하에서 추가적으로 배양하여 재조합 파아지 또는 파아지미드 바이러스 파티클을 생성시킨다. 상기 헬퍼 파아지 파아지로 적합한 것은, Ex 헬퍼 파아지， M13-K07, M13-VCS 및 R408을 포함하나， 이에 한정되는 것은 아니다.
생물학적 타겟 분자와 결합하는 바이러스 파티클의 선별은 통상적으로 바이오패닝 과정을 통하여 실시될 수 있다 (Sambrook, J. et al . Molecular Cloning. A Laboratory Manual , 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)； Clackson and Lowman , Phage Display, Oxford University Press(2004)).
본 발명의 · 일구현예에 따르면， 본 발명의 환형의 β-헤어핀 기반 펩타이드 바인더는 다음을 포함한다:
( i ) 환형의 β-헤어핀으로서， 서열목록 제 14서열의 아미노산 서열, 또는 서열목록 제 14 서열의 아미노산 서열에서 양 말단의 시스테인올 제외한 아미노산 중 일부 아미노산이 라이신으로 치환된 아미노산 서열 (예컨대， 서열목록 제 15서열 또는 제 16서열); 및
(ii) 타겟 결합 부위 I 및 Π로서, 서열목록 제 17 서열 내지 제 20 서열 및 제 38 서열 내지 제 70 서열의 아미노산 서열 중에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열.
보다 구체적인 일구현예에 따르면， 본 발명의 환형의 β-헤어핀 기반 펩타이드 바인더는 서열목록 제 8 서열， 제 9 서열 및 제 21 서열 내지 제 37서열에 기재되어 있다. 본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면， 본 발명은 상기 환형의 β- 헤어핀 기반 펩타이드 바인더를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면， 본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 백터를 제공한다. 본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 재조합 백터를 포함하는 형질전환체를 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어， "핵산 분자 "는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며， 핵산 분자에서 기본 구성단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라， 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다 (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980)； Uhlman 및 Peyman , Chemical Reviews , 90： 543-584 ( 1990 ) ) .
본 발명의 일구현예에 따르면， 본 발명의 백터는 환형의 β-헤어핀 기반 펩타이드 바인더를 코딩하는 핵산 분자 이외에 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대， tac 프로모터， lac 프로모터， /<3dJV5 프로모터 , 1PP 프로모터， 프로모터， ρκ λ 프로모터， ra& 프로모터， amp 프로모터 , reck 프로모터， SP6 프로모터， trp프로모터 및 T7 프로모터 등)， 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사 /해독 종결 서열을 포함할 수 있다..
본 발명의 일구현예에 따르면， 본 발명의 백터는 환형의 β-헤어핀 기반 펩타이드 바인더를 코딩하는 핵산 분자의 5'-방향쪽에 시그널 서열 (예컨대, pelB)을 추가적으로 포함할 수 있다. 또한， 본 발명의 백터는 환형의 β-헤어핀 기반 펩타이드 바인더가 파아지의 표면에 잘 발현되었는지를 확인하기 위한 태깅 서열 (예컨대, myc tag)을 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 백터는 파아지 코트 단백질， 예컨대 M13 과 같은 필라멘트성 파아지의 유전자 m 또는 유전자 VI 코트 단백질을 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다. 또한， 본 발명의 백터는 박테리아의 복제원점 (예컨대， ColEl) 및 /또는 박테리오파아지의 복제원점을 포함할 수 있다. 한편， 본 발명의 백터는 선택표지로서 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린 겐타마이신， 카베니실린， 클로람페니콜， 스트렙토마이신， 카나마이신， 게네티신 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자를 포함할 수 있다. 본 발명의 형질전환체는， 예를 들어， E. coli 와 같은 그람 음성 박테리아 세포이며， 적합한 E. coli 숙주는 JM101, E. coli K12 strain 294, E. coli strain W3110 및 E. coli XL-lBlue(Stratagene)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 백터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은， CaCl2 방법 (Cohen, S.N. et al . , Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110- 2114(1973))， 하나한 방법 (Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)； 및 Hanahan, D.， J. Mol . Biol. , 166:557- 580(1983)) 및 전기 천공 방법 (미국 특허 제 5,186,800호, 제 5，422，272호， 제 5,750,373호) 등에 의해 실시될 수 있다.
【발명의 효과】
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(i) 본 발명은 신규한 컨스트럭트를 갖는 환형의 β-헤어핀 기반 펩타이드 바인더를 제공한다.
(ii) 본 발명의 펩타이드 바인더는 환형의 β-헤어핀 구조를 채택하고 있으며, 이러한 환형 구조는 β-해어핀의 양 말단에 결합된 타켓 결합 부위에 의하여 β-헤어핀의 구조가 풀리는 것을 막아주는 역할을 한다.
(Hi) 본 발명의 펩타이드 바인더에서 환형의 β-헤어핀의 양 말단에 결합되어 있는 이격된 (distal) 두 개의 타겟 결합 부위는 서로 협동적으로 (cooperatively), 시너직 (synerget ical ly)하게 타겟에 결합하며, 이에 따라 본 발명의 펩타이드 바인더는 매우 낮은 수준 (예컨대， nM 수준)의 KD 값 (해리상수)을 나타내어， 타겟에 매우 높은 친화도를 갖는다.
(IV) 본 발명의 환형의 β-해어핀 기반 펩타이드 바인더는 의약으로서의 용도를 가질 뿐만 아니라， 생체 내 물질의 검출， 인 비보 분자 이미징， 인 비트로 세포 이미징 및 약물전달을 하는 데 이용될 수 있으며, 에스코트 분자로도 이용될 수 있다.
【도면의 간단한 설명】 도 1 은 베타-헤어핀, CPBCCyclic beta-hairpin based Peptide Binder) 및 MPB(Mutant cyclic Peptide Binder)의 구조를 보여준다. (a) 예시적인 베타-헤어핀의 구조ᅳ (b) 예시적인 CPB의 구조， (c) MPB의 구조. 도 2 는 CPB 및 MPB 라이브러리 제작에 사용된 파아지미드 백터 및 이를 이용한 대장균의 형진전환을 개략적으로 보여준다.
도 3은 바이오패닝 과정을 개략적으로 보여준다.
도 4a-4c 는 피브로넥틴 ED-B 에 대한 CPB 라이브러리의 바이오패닝 결과를 보여준다. 도 4a 및 4b 에서, 왼쪽 막대는 ED-B 에 대한 결과이고， 오른쪽 막대는 스트렙트아비딘에 대한 결과이다. 도 4c 에서， 왼쪽 막대부터 ED-B, 스트렙트아비딘， mTNFaᅳ 2% BSA에 대한 결과이다. ' 도 5a-5c 는 피브로넥틴 ED-B 에 대한 MPB 라이브러리의 바이오패닝 결과를 보여준다. 도 5a 및 5b 에서， 왼쪽 막대는 ED— B 에 대한 결과이고， 오른쪽 막대는 스트렙트아비딘에 대한 결과이다. 도 5c 에서， 왼쪽 막대부터 ED-B, 스트렙트아비딘, bFGF, BSA, Trap에 대한 결과이다.
도 6 은 선별된 피브로넥틴 ED-B 특이적 CPB 의 피브로넥틴 ED-B 바인딩 어세이 결과를 보여준다ᅳ
도 7 은 선별된 MPB 의 피브로넥틴 ED-B 바인딩 어세이 결과를 보여준다.
도 8 은 CPB4-1 및 CPB4-2 펩타이드의 피브로넥틴 ED-B 에 대한 친화도를 보여준다.
도 9 는 CPB4-1 펩타이드의 이차구조를 보여주는 원평광 이색성 (Circular dichroism) 분석 결과를 보여준다.
도 10은 CPB의 암세포 표적화능을 보여준다.
도 11 및 12 는 인간 안지오포이에틴 -2 에 특이적인 파아지 펩타이드 선별 ①의 결과를 보여준다. 도 11 에서， 왼쪽 막대부터 안지오포이에틴 -2, BSA, mTNFa에 대한 실험결과이다. 도 12 에서， 왼쪽 막대는 안지오포이에틴ᅳ 2에 대한 결과이고, 오른쪽 막대는 BSA에 대한 결과이다. 도 13 은 선별된 CPB 의 인간 안지오포이에틴 -2 에 대한 특이적 결합을 보여준다. 도 13에서， 왼쪽 막대부터 안지오포이에틴— 2， bFGF, hFC, 스트랩트아비딘, BSA, ED-B, mTNFa에 대한 실험결과이다. 도 14 는 인간 안지오포이에틴 -2 에 특이적인 파아지 펩타이드 선별 ② 의 결과를 보여준다. 왼쪽 막대는 안지오포이에틴 -2 에 대한 결과이고， 오른쪽 막대는 BSA에 대한 결과이다.
도 15 는 인간 안지오포이에틴 -2 에 특이적인 파아지 펩타이드 선별 ③의 결과를 보여준다.
도 16은 선별된 CPB의 인간 안지오포이에틴 -2 바인딩 어세이 결과를 보여준다.
【발명올 실시하기 위한 구체적인 내용】
이하， 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서， 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다. 실시예
실시예 1. CPB(Cycl ic beta-hairpin based Peptide Binder) 라이브러리 제작
1-1. 실험방법
CPB 라이브러리 유전자 제작 및 pIGT2 파아지미드 백터로의 연결 두 개의 올리고뉴클레오티드 CPB-FK5'— TTCTATGCGGCCCAGCTGGCC
(NNK)6TGCT ATGATCCGGAAACTGGT-3 ' , 서열목록 게 1서열) 및 CPB-B1(5'- AACAG1TTCTGCGGCCGCACCACCACC ( MNN ) 6GCACCAGGTACCAGTTTC-3 '， 서열목록 제 2서 열) (여기서 N은 A, T, G 또는 C; K는 G 또는 T; M은 C 또는 A를 지시한다)을 합성하였다. 이중사슬 DNA를 만들기 위하여 100 pM CPB-F1 및 CPB-B1 1.5 씩， 10 mM dNTP 4 μΐ, DNA tag 중합효소 1 ^(BIMS bio, Korea) 및 10X 중합효소 버퍼 5 를 흔합하여 총 50 ^가 되도록 3차 멸균증류수를 첨가한 흔합액을 총 4개 만들었다. 이 흔합액을 PCR 반웅 (94°C에서 5분， 60 사이클: 30°C에서 30초, 72°C에서 30초 및 72°C에서 7분)을 하여 이중사슬 DNA로 만든 후 PCR 정제 키트 (Macrogen, Seoul, Korea)를 이용하여 정제하여， CPB 라이브러리 유전자를 얻었다. 이 유전자를 PIGT2 파아지미드 백터 (Ig therapy, Chuncheon, Korea)에 연결하기 위해 CPB 라이브러리 유전자와 pIGT2 백터에 제한효소를 처리하였다. 약 15 의 CPB 라이브러리 유전자와 60 의 pIGT2 백터를 SfiKNew England Biolabs(NEB) , Ipswich)을 넣고 16시간 반응, N0TKNEB, Ipswich)을 넣고 6시간 반웅시킨 후， pIGT2 백터에만 CIAP(Calf Intestinal Alkaline Phosphatase; NEB, Ipswich)를 넣고 1시간 더 반웅시키고， PCR 정제 키트를 이용하여 정제하였다. 정제된 CPB 라이브러리 유전자와 pIGT2 백터를 1:10의 몰 비율로 (pIGT2 백터 20 tig 기준) 흔합하고， T4 DNA 리가아제 (NEB, Ipswich)와 버퍼 및 3차 멸균증류수를 넣고 18°C에서 16시간 동안 반응시켜 연결한 후， 플라스미드 DNA 정제 키트 (Macrogenᅳ Seoul , Korea)를 이용하여 50 ^의 3차 멸균증류수에 용해시켰다. 컴피턴트 세포 준비
E. col i ER2738 세포 (Department of Biochemistry and Molecular Biology & Cancer research Institute, Seoul National University College of Medicine)를 LB(Luria broth) 아가 -플레이트에 선상 도말하였다. 한천 평판 배지에서 자란 군락을 5 m£의 SB( super broth) 배지에 접종한 후， 37°C에서 200 rprn의 속도로 흔합하면서 16시간 동안 배양하였다. 배양된 5 ^의 세포들을 5(ΧΓ 의 SB 배지가 들어있는 2 삼각플라스크에 접종하고， 20% 글루코오스 용액 10 1 와 1 M MgCl2 5 M: 첨가하여 37°C에서 250 rpm의 속도로 흔합하면서 600 薦의 파장에서 흡광도가 0.3-0.4가 될 때까지 배양하였다. 배양된 플라스크를 30분 동안 얼음에 방치한 후, 4°C에서 5,000xg로 10분 동안 원심 분리하여 가라앉은 세포들을 제외한 상층액을 모두 제거하고, 200 ^의 10% 글리세를 용액으로 현탁시켰다. 이것올 다시 같은 방법으로 7분간 원심분리하고, 상층액올 제거하는 과정을 2번 반복한 후， 마지막으로 30 ^의 10% 글리세를 용액으로 현탁시키고, 5분간 3,580xg로 원심분리하여 700 ^의 10% 글리세를 용액으로 현탁시킨 것을 300 ^씩 분주하고 액체질소에 넁동시킨 뒤 -80°C에 보관하였다. 전기천공법 및 라이브러리 보관
CPB 라이브러리가 삽입된 pIGT2 파아지미드 백터 50 (20 yg)를 이용하여 전기천공을 수행하였다. 컴피턴트 세포를 얼음 위에서 녹이고， 300 ^의 컴피턴트 백터 50 와 흔합한 후, 냉각하여 준비된 0.1 cm의 큐벳에 넣은 뒤 1분 동안 얼음 위에 두었다. 전기천공기 (BioRad, Hercules, CA)를 200 Ω에서 25 uF 및 2.5 kV의 조건으로 프로그램하고， 준비된 큐벳의 물기를 제거하고 전기 천공기에 위치시킨 후 펄스를 주었다 (시간 상수는 4.5-5 msec). 이후， 즉시 37°C로 준비한 5 ^의 SB 액체배지가 들어있는 50 mi 튜브에 넣고， 한 시간 동안 37°C에서 250 rpm의 속도로 흔합하며 배양한 후， 라이브러리의 개수를 측정하기 위해 10 의 SB 액체배지를 더 채우고 흔합한 뒤 1 ^를 희석해서 암피실린 아가 배지에 도말하였다. 남은 세포에 50 / / ^의 암피실린 15 1000X)를 넣고, 한 시간 동안 37°C에서 250 rpm의 속도로 흔합하면서 배양한 뒤， 500 m 의 SB가 들어있는 1 삼각플라스크에 옮겨 담고 50 /g/m«의 암피실린 500 /i(lOOOX)를 첨가하여 37°C에서 250 rptn의 속도로 흔합하면서 하루 동안 배양하였다. 4°C에서 5,000xg로 20분 동안 원심 분리하여 침전된 세포들을 제외한 상층액을 모두 제거하고， 20 의 SB 액체배지로 재현탁시킨 후, 글리세를을 최종 농도 20% 이상 넣고 혼합하여 -80°C에 보관하였다.
MPB (Mutant cyclic Peptide Binder) 라이브러리 제작
두 개의 올리고뉴클레오티드 MPB-F1(5'-TTCTATGCGGCCCAGCTGGCC NNKNNKNNKNNKNNKNNKTGCGGTGGCGGAGGGGGTGGCGGA-31 , 서열목록 게 3서열) 및 MPB-B1 ( 51 -MCAGmCTGCGGCCGCACCACCACC顺 NM匪 N画匪 NNM顺 GCACCCTCCGCCA^ CCCT-31 , 서열목록 제 4서열) (여기서 N은 A, T, G 또는 C; K는 G 또는 T; M은 C 또는 A를 나타낸다)을 합성하였다. 나머지 과정은 상기에서 서술한 CPB 라이브러리 제작 과정과 동일하게 진행하였다. 라이브러리에서 재조합 파아지 생산과 PEG 침전
-80°C에 저장된 CPB 및 MPB 라이브러리에서 재조합 파아지를 생산하였다. 60 nrf,의 SB가 담긴 500 플라스크에 -80°C에 보관된 라이브러리 1.5 m을 추가하여 한 시간 동안 37°C에서 200 rpm의 속도로 흔합하면서 배양하였다. 여기에 1 X 1011 cfu의 Ex 헬퍼 파아지 (Ig therapy, Chuncheon, Korea)와 60 ^의 암피실린 (50 /ig/ )을 넣고, 다시 한 시간 동안 같은 조건으로 배양하였다. 여기에 60 ^의 카나마이신 (25 /g/ )을 넣고， 하루 동안 같은 조건으로 배양하여 재조합 파아지를 생산하였다. 배양액을 3,580xg로 15분 동안 원심 분리하여 얻은 상층액 60 m£에
PEG/NaCl 10 ^을 흔합하고 얼음에 1시간 동안 방치시킨 후， 4°C에서 20분 동안 16,800xg로 원심 분리하여 상층액을 조심스럽게 제거하고， 1 m£의 PBS(pH 7.4)로 펠렛을 재현탁 시켰다.
1- 2. 실험결과
도 1의 (b)에 도시된 바와 같이, CPB의 구조 안정화 부위로는, 10개 서열로 구성된 베타-헤어핀 구조 (도 1의 a)의 양 말단인 글리신을 시스테인으로 치환하여 시스테인간 이황화 결합을 통해 사이클릭 베타- 헤어핀을 형성하는 총 10개로 구성된 모티브를 사용하였다. 구조 안정화 부위의 N-및 C-말단 부분에 각각 6개 아미노산을 무작위로 배열함으로써 두 부분에 가변작인 부위 (타겟 결합 부위 )를 생성하였다. 이를 사이클릭 베타- 헤어핀 기반 펩타이드 바인더 (Cyclic beta-hairpin based Peptide Binder, CPB)라고 명명하였으며， 양쪽의 가변적 부위를 통해 타겟에 협동적으로 붙을 수 있어 높은 친화력 및 특이성을 가질 수 있다 (도 1의 b).
또한， CPB의 사이클릭 베타-헤어핀 구조의 안정화가 가변적 부위 (타겟 결합 부위 )의 타겟에 대한 친화력 및 특이성에 도움을 주는지 확인하기 위하여, 도 1의 (c)에 도시된 바와 같은 CPB의 구조 안정화 부위를 글리신으로 치환한 MPB(Mutant cyclic Peptide Binder)흩 만들었다 (도 1의 c).
합성한 2개의 무작위 서열 을리고뉴클레오티드를 PCR 반웅을 통해 이중사슬로 만든 후， 제한효소인 Sfil 및 Notl로 자른 후, pIGT2 파아지미드 백터에 클로닝을 하여 5 X 108개 이상의 CPB 및 MPB 라이브러리를 구축하였다 (도 2). 실시예 2. 피브로넥틴 (Fibronectin) ED-B특이적 CBP선별
2- 1. 실험방법
2-1-1. 피브로넥틴 ED— B단백질 준비
피브로넥틴 ED-B 유전자 제작 및 발현 백터로의 삽입
한국생명공학 연구원에서 부분적인 인간의 피브로넥틴 ED- B(ID=KU017225) 유전자를 공급받았다. 프라이머 EDB_F1(5'- TTCATMCATATGCCAGAGGTGCCCCAA-3 ' , 서열목록 제 5서열) 및 EDB— B1 ( 51 -
CTGATATCATAGTCAATGCCCGGCTCCAGCCCTGTG-3 ' , 서열목록 제 6서열)을 합성하여， EDB-F1 20 pmol , EDB-B1 20 pmol, 2.5 mM dNTP 흔합액 4 ≠, ExTaq DNA 중합효소 1 (10 U) 및 10XPCR 버퍼 5 μί를 흔합하여 총 50 가 되도록 증류수를 첨가한 흔합액을 만들었다. 이 흔합액을 PCR 반응 (94°C에서 5분, 30 사이클: 55°C에서 30초， 72°C에서 1분 및 94°C에서 30초)을 하여 EDB 인서트로 만든 후， PCR 정제 키트를 이용하여 정제하였다. EDB 인서트 유전자를 pET28b 백터 (Novagen)에 연결하기 위해 EDB 인서트 유전자 및 pET28b 백터에 제한효소를 처리하였다. 약 2 의 인서트 DNA를 BamHI(NEB, Ipswich) 및 NdeKNEB, Ipswich)로 4시간씩 반웅시킨 후 PCR 정제 키트를 이용하여 정제하였다. 또한， 약 2 / 의 pIGT2 파아지미드 백터를 BamHI 및 Ndel로 3시간씩 반응시킨 후, CIAP를 넣고 1시간 동안 반웅시킨 다음 PCR 정제 키트를 이용하여 정제하였다. 이들을 백터와 인서트가 약 1:3의 몰 비율이 되도록 첨가하고, T4 DNA 리가아제 (Bioneer, Dae j eon, Korea)를 이용하여 18°C에서 10시간 동안 연결시키고, XL-1 컴피턴트 세포에 형질전환을 한 후, 카나마이신이 포함된 아가 배지에 도말하였다. 한천 평판 배지에서 자란 군락을 5 m의 LB 배지에 접종한 뒤 37°C에서 200 rpm의 속도로 흔합하면서 하루 동안 배양한 후， 플라스미드 프랩 키트 (GeneAU, Seoul, Korea)를 이용하여 플라스미드를 정제하고, 시뭔싱을 하여 클로닝이 성공했는지 여부를 확인하였다. 피브로넥틴 ED-B의 발현 및 정제
피브로넥린 ED-B를 클로닝 한 pET28b 백터를 BL21 세포에 형질전환한 후， 카나마이신이 포함된 아가 배지에 도말하였다. 한천 평판 배지에서 자란 군락을 카나마이신 (25
Figure imgf000025_0001
포함된 20 의 LB 배지에 접종한 뒤 37°C에서 200 rpm의 속도로 흔합하면서 하루 동안 배양하였다. 배양한 E. co//를 카나마이신 (25
Figure imgf000025_0002
포함된 2 의 LB에 접종하고 0DO.6- 0.8까지 배양하였다. 이후 1 mM IPTG를 넣어주어 18°C에서 200 rpm의 속도로 흔합하면서 하루 동안 배양하였다. 5,000xg로 20분 동안 원심 분리하여 침전된 세포들을 제외한 상층액을 모두 제거하고， 용해 버페 50 ηιΜ 소듐 포스페이트 (pH 8.0), 300 mM NaCl 및 10 mM 이미다졸]로 현탁시켰다. -80°C에 하루 동안 보관한 후 소니케이터를 이용하여 E. coli를 용해시킨 후에 20，000 로 1시간 동안 원심 분리하여 상층액을 Ni- NTA 친화성 레진 (Elpisbio, Dae j eon, Korea)에 결합시켰다. 세척 버페 50 ηιΜ 소듐 포스페이트 (pH 8.0), 300 mM NaCl 및 20 mM 이미다졸]로 레진을 세척한 후， 용출 버페 50 mM 소듐 포스페이트 (pH 8.0), 300 mM NaCl 및 300 mM 이미다졸]를 이용하여 N-말단 His-tag ED-B 단백질을 용출시켜 획득하였다. 이렇게 획득한 단백질을 Superdex75 컬럼 (GE Healthcare, United Kingdom) 및 PBS(pH 7.4) 버퍼를 이용하여 겔 여과법 (gel filtration)으로 순도 높은 ED-B 단백질을 얻었다. 바이오패닝을 위해 ED-B 단백질에 바이오틴을 연결하였다. 6 rag의 설포 -NHS-SS-바이오린 (PIERCE, Illinois, USA) 및 1.5 mg의 ED-B 단백질을 상온에서 0.1 M 소듬 보레이트 (pH 9.0) 하에 2시간 동안 반웅시키고， 반응이 되지 않은 설포- NHS-SS-바이오틴을 제거하기 위해 단백질을 Superdex75 컬럼 및 PBS(pH 7.4) 버퍼를 이용하여 겔 여과법 (gel filtration)으로 바이오틴 -EDB 단백질을 정제하였다.
2-1-2. 바이오패닝
바이오틴 피브로넥틴 ED-B 단백질의 바이오패닝
스트랩타비딘 (10 //g/u )을 96웰 ELISA 플레이트 (Corning)의 20개의 웰에 50 씩 넣은 후 4°C에서 하룻밤 동안 방치하였고， 다음날 10개의 웰에만 0.1%의 PBST(tween-20)로 3회 세척한 후， 바이오틴 50 ^의 ED-B(10/g/ )를 넣고， 상온에서 30분 동안 방치하였다. 이후， 20개의 웰 모두를 0.1% PBST로 3회 세척하고 PBS로 희석한 2% BSA를 사용하여 상온에서 2시간 동안 블로킹한 후, 용액을 모두 버리고 0.1% PBST로 3회 세척하였다. 여기에 CPB 재조합 파아지 포함 용액 500 βί 및 2% BSA 500 를 흔합하고， 스트랩타비딘 및 BSA에 결합하는 파아지들을 제거하기 위해 스트랩타비딘에 BSA 코팅했던 10개의 웰에 넣어 1시간 동안 상은에 두었다. 상층액을 회수하여 ED-B가 결합한 10개의 웰에 옮겨 상온에서 1시간 동안 방치하였다. 10개 웰의 용액을 모두 제거하고， 0.1% PBST로 3회 세척한 뒤 0.2 M 글리신 /HCKpH 2.2)을 각 웰 당 50 씩 넣어 20분간 파아지를 용리시키고， 다시 튜브에 모아 여기에 2M Tris-base(pH 9.0) 100 를 넣어 용액을 중화시켰다. 각 바이오패닝 마다 인풋 파아지 및 일루트 (아웃풋) 파아지와 수를 측정하기 위해 OD=0.7인 E. co// ER2738'세포에 섞어 주어 암피실린이 포함된 아가 배지에 도말하였다.
패닝을 반복하기 위해 5 ^의 E. col/ ER2738 세포와 섞어 37°C에서 25분 동안 200 rpm의 속도로 흔합하며 배양하였다. 5 ^의 암피실린 (50 /g/ )올 넣고, 같은 방법으로 흔합 후 2 X 1010 cfu의 Ex 헬퍼 파아지를 첨가하여 37°C에서 1시간 동안 200 rpm의 속도로 흔합하면서 배양하였다. 35 의 암피실린 (50
Figure imgf000027_0001
SB 액체 배지가 들어있는 200 mi 삼각플라스크에 옮겨 담고, 37°C에서 200 rpm의 속도로 혼합하면서 하루 동안 배양하였다. 배양액을 3,580xg, 20분 및 4°C의 조건으로 원심 분리하였다. 상층액에 5 1 의 PEG/NaCl[20% PEG(w/v) 및 15% NaCKw/v)]을 첨가한 후 아이스에서 1시간 동안 방치시켰다. 4°C에서 20분 동안 16,800xg로 원심분리한 후 PEG 용액올 완전히 제거하고， 1 m£의 PBS 용액으로 파아지 펩타이드 펠렛을 녹인 다음 2차 바이오패닝에 사용하였다. 각 패닝 단계마다 상기와 동일한 방법을 사용했으며， 세척과정만 단계별로 각각 5회 , 7회 및 10회 (0.1% PBST)로 증가시켰다. 도 3은 바이오패닝의 모식도를 보여준다. 피브로넥틴 ED-B의 인풋 파아지의 ELISA
CPB 라이브러리의 각 인풋 파아지의 ELISA를 스트랩타비딘, BSA 및 ED-B에 대하여 실시하였다. 96웰 ELISA 폴레이트에 10 //g/ 스트랩타비딘을 각 웰 당 50 ,씩 16개의 웰에 넣고， 10
Figure imgf000027_0002
BSA를 각 웰 당 50 ^씩 8개의 웰에 넣고 4°C에서 하루 동안 방치하였다. 다음날 스트랩타비딘이 있는 16개의 웰 중 8개의 웰만 0.1¾> PBST(tween-20)로 3회 세척하고， 바이오틴 EDᅳ B(10 /g/ )를 넣고 상온에서 30분 동안 두었다. 이후， 모든 웰을 0.1% PBST로 3회 세척하고， PBS로 희석한 2%의 탈지 우유를 사용하여 상온에서 2시간 동안 블로킹한 후, 용액을 모두 버리고 0.1% PBST로 3회 세척하였다. 여기에 CPB 재조합 파아지인 두 번째， 세 번째, 네 번째 및 다섯 번째 인풋 파아지 10 및 2%의 탈지 우유 500 ^를 흔합하여 100 ^씩 ED-B, 스트랩타비딘 및 BSA 웰에 각각 2웰씩 분주하고， 상온에서 1시간 동안 방치하였다. 0.1% PBST 용액으로 10회 세척한 다음 HRP-컨쥬게이트 항 -M13 항체 (GE Healthcare)를 1:1, 000으로 희석하여 상온에서 1시간 동안 반웅시켰다. 0.1% PBST로 6회 세척한 후 퍼옥시다아제의 기질인 테트라메틸벤지딘 (TMB; BD Science) 용액 100 ^를 분주하여 발색반응을 유도한 다음， 100 의 1 M HC1을 첨가하여 반응을 중지시켰다. 이후， 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 피브로넥틴 ED-B 단백질에 특이적인 파아지 펩타이드 검색 (파아지 ELISA, 웃풋 ELISA)
아웃풋 파아지 /인풋 파아지 비율이 가장 높은 바이오패닝 단계에서 회수한 파아지를 E. coli ER2738 세포에 감염시킨 후ᅳ 플라크가 플레이트 당 100— 200개 정도가 되도록 도말하였다. 멸균된 팁을 이용하여 플라크 60개를 각 1 m 의 SB-암피실린 (50
Figure imgf000028_0001
Ex 헬퍼 파아지 배양액에 접종한 후 37°C에서 하루 동안 배양하였다. 16,800xg로 10분 동안 원심 분리한 후, 상층액을 회수한 다음 2%의 탈지 우유를 넣고ᅳ 이를 파아지 펩타이드 검색에 사용하였다. 96웰 ELISA 플레이트에 10 /g/ ^의 피브로넥틴 ED-B를 각 웰 당 50 ^씩 60개의 웰에 넣고， 또한 10 /g/m£의 BSA을 각 웰 당 50 씩 60개의 웰에 넣어 4°C에서 하루 동안 방치하였다. 다음날 모든 웰을 0.1% PBST로 3회 세척하고， PBS로 희석한 2% 탈지 우유를 사용하여 상온에서 2시간 동안 블로킹한 뒤, 용액을 모두 버리고 으 1% PBST로 3회 세척하였다. 각 클론별로 증폭된 파아지 펩타이드 용액 200 ≠를 200 ^의 2% 탈지 우유에 혼합하고， 100 씩 모든 웰에 분주하고 37°C에서 1시간 동안 방치하였다. 0.1% PBST 용액으로 6회 세척한 다음 HRP—컨쥬게이트 항- M13 항체 (GE Healthcare)를 1:1,000으로 희석하여 37°C에서 1시간 동안 반응시켰다ᅳ 0.1% PBST로 6회 세척한 후 TMB용액 100 ^를 분주하여 발색반웅을 유도한 다음 100 ^의 1 M HC1을 첨가하여 반웅을 중지시켰다. 450 nm에서 흡광도를 측정하여 BSA에 비해 흡광도가 3배 이상 높은 클론들을 선택하였다. 이들의 파아지를 E. coli ER2738 세포에 감염시킨 후， 플라크가 플레이트 당 10으 200개 정도가 되도록 도말하였다. 멸균된 팁을 이용하여 플라크를 4 의 SB-암피실린 (50 ^gl i) 배양액에 접종한 후 37°C에서 하루 동안 진탕 배양하여 플라스미드 프랩 키트를 이용하여 플라스미드를 정제하여 시뭔싱을 의뢰하였다 (Macrogen, Seoul, Korea). 시퀀싱 프라이머는 백터 시퀀스인 5'-GATTACGCCMGCTTTG-3' (서열목록 제 7서열)을 사용하였다.
2-1-3. 피브로넥틴 ED— B에 대한 친화도 측정
DNA 시¾성에서 나온 ED-B에 특이적인 CPB 펩타이드 [4: ATPFRICYDPETGT ICKQPR (서열목록 게 8서열) ; 27： AQSFRICYDPETGTW CKCPKLQ (서열목록 제 9서열)]， 라이신으로 치환된 ED-B에 특이적인 CPB[CPB4-l: ATPFRICYDPETKTWCICKQPR (서열목록 제 12서열)， CPB4-2: ATPFRICYDPEKGTWCICKQPR (서열목톡 제 13서열)] 및 MPB 펩타이드 (25: CAYSWSCGGGGGGGRCRW I DQN , 서열목록 제 11서열)를 합성 (Anygen, Korea)하였다. 친화도 측정은 BIAcore X(Biacore AB, Uppsala, Sweden)를 이용하여 수행하였다. 스트랩타비딘 SA 칩 (Biacore)에 바이오틴 -EDB을 1,000 RU 만큼 홀려주어 ED-B를 고정시켰다. 러닝 버퍼로는 PBS(pH 7.4)을 사용하였고, 플로우는 분당 30 로 흘리면서 여러 농도로 동력학을 측정한 후， BIAevaluation 소프트웨어 (Biacore AB, Uppsala, Sweden)로 친화도를 계산하였다. 2-2. 실험결과
피브로넥틴 ED-B 특이적 CPB 선별
CPB 및 MPB 라이브러리의 각 인풋 파아지를 ED-B 및 스트랩타비딘에 대해 ELISA를 수행하였다. 먼저 CPB 라이브러리의 첫 번째부터 세 번째까지 인풋 파아지의 반응성은 ED-B와 스트랩타비딘 모두 흡광도가 비슷하였으나， 마지막 네 번째 인풋 파지에서는 ED-B 흡광도가 스트랩타비딘에 비해 10배 이상 높은 반응성을 보였다 (도 4). MPB 라이브러리의 두 번째부터 세 번째까지 인풋 파아지의 반응성은 ED-B와 스트랩타비딘 모두 흡광도가 비슷하였으나， 네 번째 인풋 파아지부터 ED-B 흡관도가 스트랩타비딘에 비해 2배 높았으며， 마지막 다섯 번째 인풋 파아지에서는 EI)-B의 흡광도가 스트램타비딘에 비해 5배 높은 반웅성을 보여 각 라이브러리를 이용하여 ED-B에 대해 성공적인 바이오패닝을 수행하였다 (도 5). 라이브러리의 패닝 단계 중 아웃풋 /인풋의 비율이 가장 높은 단계에서 회수한 파아지를 플라크 형태로 확보하였다. CPB 라이브러리 플라스크로부터 30개의 파아지를 증폭시킨 후， 네 번째 인풋 파아지를 이용한 파아지 ELISA를 통하여 2개의 ED-B에 높은 반응성을 보이는 후보 (4번 및 27번)를 선별하였으며， 이들이 E으 B에 높은 반웅성뿐만 아니라 선택성을 갖는지 확인하기 위하여, 스트랩타비딘， BSA 및 niTNF 단백질을 대조군으로 삼아 특이성 ELISA를 수행하였다. 그 결과， 도 4에 나타난 바와 같이， 4번 및 27번 파아지 모두 ED-B에 대한 흡광도가 대조군에 비하여 최소 5배 이상 차이를 보였으며, 이러한 결과는 상기 파아지가 ED-B에 선택성을 갖고 있음을 보여준다 (도 4) . 선별된 2개의 클론을 DNA 서열 분석하여 ED-B 특이적인 펩타이드 서열 [4번: ATPFRICYDPETGTW CICKQPR (서열목록 '게 8서열)， 27번： AQSFRICYDPETGTWCKCPKLQ (서열목록 제 9서열) ]을 얻었다 (도 4) .
또한， MPB 라이브러리도 같은 방법으로 다섯 번째 인풋파아지를 이용한 파아지 ELISA를 통하여 ED-B에 높은 반응성을 보이는 후보 (4 , 9 및 25번)를 선별하였다. 선별된 3개의 클론을 서열 분석한 결과, 4번과 9번이 같은 펩타이드 서열임을 확인하였으며, 특이성 ELISA를 통하여 4번 (WSQMIVCGGGGGGGGCTGRIAT , 서열목록 제 10서열) 및 25번 (CAYSWSCGGGGGGGGCRWIDQN , 서열목록 제 11서열) 파아지가 대조군에 비하여 ED-B에 높은 흡광도를 보이며 선택성을 갖는 것을 확인하였다 (도 5) . 피브로넥틴 ED-B 바인딩 어세이
피브로넥틴 ED-B에 대한 펩타이드를 합성하여 SPR Bi acore system(Bi acore ABᅳ Uppsa l a , Sweden)을 이용하여 친화도를 측정하였다. 피브로넥틴 ED-B에 대한 친화도를 측정한 결과， 도 6에 나타난 바와 같이 본 발명의 CPB-4 펩타이드는 45.6 nM올 나타내었고， CPB-27 펩타이드는 175 nM을 나타내었다 (도 6) . 반면, MPB-25 펩타이드의 경우에는 64 y M의 친화도를 나타내었으며 (도 7)， 이는 CPB 펩타이드의 친화도보다 365-1290배 가량 낮은 것으로， CPB의 환형의 베타-해어핀 구조가 타겟에 대한 친화도를 높이는데 큰 영향을 주고 있음을 보여준다 (도 6 및 7) . 실시예 3. 암 바이오마커인 피브로넥틴 ED-B에 특이적인 CPB의 암세포 표적화능
3-1. 실험방법
12번째 아미노산이 라이신으로 치환된 피브로넥틴 ED-B를 타겟하는 CPB4-2 펩타이드를 DMSO에 20 ^에 용해시켜 2 mM의 농도가 되도록 만들고, 마찬가지로 DMS0에 용해시킨 2.2 mM의 Cy5.5— mono NHS ester(GE healthcare UK) 40 와 70 mM의 TEA 2 ^를 흔합시켜 상온에서 하루 동안 섞어주며 반응시켰다. 반웅 후에 Eclipse Plus C18로 Cy5.5와 CPB4-2-Cy5.5를 분리하고， CPB4-2— Cy5.5만을 동결 건조하였다. ED-B 양성 세포인 Mouse LLC(American Type Culture Collection, USA)와 ED-B 음성 세포인 인간 PC3 (American Type Culture Collection, USA) I X 105개를 18 隱 2 커버글라스가 들어있는 12웰에 10% FBS와 1% 페니실린 스트렙토마이신이 포함된 1 ^의 RPM 11640 (Wei gene, Korea) 배양액과 함께 37°C, 5% C02 조건에서 하루 동안 배양하였다. 동결 건조된 CPB4-2-Cy5.5를 PBS에 용해시키고, opti-MEM 600 에 희석하여 전날 배양한 세포 배양액과 교체해주고 4°C에서 1시간 동안 방치시켰다. 배양액을 제거하고 4% 포름알데하이드 (4¾PFA) 1 11 을 처뫼하고 15분 동안 상온에서 방치하였다. PFA를 제거하고 PBS 1 로 세척하는 과정을 2번 반복하였다. 슬라이드 글라스에 Fluorescence Mounting Medium(Dako, Korea) 한 방울 떨어뜨리고, 12웰 안에 있는 커버글라스를 세포가 있는 면이 Fluorescence Mounting Medium이 있는 방향으로 향하게 하여 덮어주고 새어나오는 액체들을 최대한 제거한 뒤 30분 동안 건조시켰다. 건조 후， 공초점 현광현미경 (LSM510, Zeiss)에서 633 nm 레이저, LP650 필터， 확대배율은 63배 렌즈를 사용하여 샘플의 형광 이미지를 촬영하였다.
3-2. 실험결과
변형된 CPB-4 펩타이드의 피브로넥틴 ED-B에 대한 친화도 측정 및 이차구조 분석
피브로넥틴 ED— B에 특이적인 2개의 CPB 펩타이드 중 친화도가 더 좋은 CPB-4를 이용하여 암세포 표적화 실험을 수행하였다. CPB— 4의 구조안정화 부분에 속하는 12번째와 13번째 아미노산을 각각 라이신으로 치환한 펩타이드인， CPB4-1 및 CPB4-2 펩타이드의 피브로넥틴 ED-B에 대한 친화도가 유지되고 있는지를 확인하기 위하여， SPR Bi acore syst em(Bi acore AB , Uppsal a , Sweden)을 이용하여 친화도를 측정하였다. 그 결과， 도 8에 나타난 바와 같이， CPB4-1 펩타이드의 친화도는 35.7 nM이었고, CPB4-2 펩타이드의 친화도는 38.6 nM을 나타내었으며， 이는 CPB-4펩타이드의 친화도 (49 .6 nM)와 비슷한 수치였다 (도 8) .
또한， 구조안정화 부위의 아미노산 서열의 변경이 2차 구조에 영향을 주는지 확인하기 위하여， CPB4— 1 펩타이드의 원평광 이색성 (Ci rcul ar di chro i sm , CD) 분석을 수행하였다. 그 결과， 도 9에 나타난 바와 같이, pH 7.0의 20 ιιιΜ 인산나트륨 버퍼에 용해된 1 mg/i 농도의 CPB4-1 펩타이드는 200 nm 파장에서 강한 마이너스픽을 나타내었으며， 230 nm 파장에서는 강한 파지티브픽을 나타내었다. 이러한 결과를 통하여 CPB4-1 펩타이드 역시 전형적인 베타-헤어핀 이차구조를 이루고 있음을 보여준다 (도 9) . CPB의 암세포표적화능
CPB-4 펩타이드가 암세포에 많이 분포하는 피브로넥틴 ED-B에 특이적으로 바인딩 하는지 확인하기 위하예 CPB4-2에 형광시약 (Cy5.5)을 컨쥬게이션 하여 세포 이미징에 사용하였다. 피브로넥틴 ED-B를 과발현하는 LLC 암세포와 거의 발현하지 않는 PC3 암세포 각각에 190 nM의 CPB4-2- Cy5.5를 처리하고, 4°C에서 한 시간 동안 방치시킨 뒤 샘플링 하여 공초점 현광현미경 (LSM510 , Zei ss )으로 관찰하였다. 아무것도 처리하지 않은 그룹에서는 붉은색의 형광신호가 보이지 않은 것으로 보아 세포 자체적인 형광신호가 없는 것임을 확인하였다.
실험 결과, 도 10에 나타난 바와 같이， CPB4-2-Cy5.5를 처리한 그룹에서는 피브로넥틴 ED-B를 과발현 하는 LLC 세포 주위로 붉은색의 Cy5.5 신호가 강하게 존재하는 반면, 피브로넥틴 ED— B를 거의 발현하지 않는 PC3 세포 주위로는 Cy5.5 신호가 거의 존재하지 않았다 (도 10) . 이러한 결과는， CPB가 세포 내에서도 피브로넥틴 ED-B에 특이적으로 결합할 수 있음을 보여주며, 나아가 이러한 특성을 이용하여 CPB를 세포 이미징 도구 및 약물전달 시스템에 적용할 수 있음을 보여준다. 실시예 4: 인간 안지오포이에틴 -2(Human angiopoietin-2) 특이적 CPB 선별
4-1, 실험방법
인간 안지오포이에틴 -2 단백질의 바이오패닝
인간 안지오포이에틴 -2(5 g/ )와 2¾ BSA를 96 half wall EL ISA 플레이트 (Corning)의 20개의 웰에 10개씩 나누어 25 ^씩 넣은 후， 4°C에서 하룻밤 동안 방치하였다ᅳ 이후, 20개의 웰 모두를 0.1% PBST로 3회 세척하고 PBS로 희석한 2% BSA를 사용하여 상온에서 2시간 동안 블로킹한 후， 용액을 모두 버리고 0.1% PBST로 3회 세척하였다. 여기에 CPB 재조합 파아지 포함 용액 500 μϊ 및 2% BSA 500 을 흔합하여 BSA에 결합하는 파아지들을 제거하기 위해 BSA를 코팅했던 10개의 웰에 넣어 1시간 동안 상온에 두었다. 상층액을 회수하여 인간 안지오포이에틴 -2가 결합한 10개의 웰에 옮겨 상은에서 1시간 동안 방치하였다. 10개 웰의 용액을 모두 제거하고, 0.1% PBST로 3회 세척한 뒤 0.2 M 글리신 /HCKpH 2.2)을 각 웰 당 25 ^씩 넣어 20분간 파아지를 용리시키고， 다시 튜브에 모으고 2 M Tris-base(pH 9.0) 50 ^를 넣어 용액을 중화시켰다. 각 바이오패닝 마다 인풋 파아지 및 일루트 (아웃풋) 파아지의 수를 측정하기 위해 0D=0.7인 E. coli ER2738 세포에 섞어주어 암피실린이 포함된 아가 배지에 도말하였다. 패닝을 반복하기 위해 5 m 의 E. coli ER2738 세포와 섞어 37°C에서 25분 동안 200 rpm의 속도로 흔합하며 배양하였다. 5 ^의 암피실린 (50 / )을 넣고， 같은 방법으로 흔합한 후 1 X 10u cfu의 Ex 헬퍼 파아지를 첨가하여 37°C에서 1시간 동안 200 rpm의 속도로 혼합하며 배양하였다. 35 ^의 암피실린 (50 μξ/ηί) ..및 카나마이신 (25 /g/in£)이 포함된 30 mi SB 액체 배지가 들어있는 200 ml 삼각풀라스크에 옮겨 담고， 37°C에서 200 rpm의 속도로 흔합하며 하루 동안 배양하였다. 배양액을 3,580xg, 20분 및 4°C의 조건으로 원심 분리하였다. 상층액에 5 m의 PEG/NaCl[20% PEG(w/v) 및 15% NaCl(w/v)]을 첨가한 후 아이스에서 1시간 동안 방치시켰다. 4°C에 20분 동안 16,800xg로 원심분리 후 PEG 용액을 완전히 제거하고， 1 ι 의 PBS 용액으로 파아지 펩타이드 펠렛을 녹인 다음 2차 바이오패닝에 사용하였다. 각 패닝 단계마다 상기와 동일한 방법을 사용했으며， 세척과정만 단계별로 각각 5회， 7회 및 10회 (0.1% PBST)씩 증가시켰다. 인간 안지오포이에틴— 2의 인풋 파아지의 ELISA
CPB 라이브러리의 각 인풋 파아지의 ELISA를 인간 안지오포이에틴 -2ᅳ BSA 및 마우스 TNFa(niTNFa)에 대해 수행하였다. 96 half well ELISA 플레이트에 5 의 인간 안지오포이에틴 -2， BSA 및 mTNF α을 각 웰 당
25 ^씩 총 24개의 웰에 8개 웰로 나누어 넣고， 4°C에서 하루 동안 방치하였다. 다음날 모든 웰을 0.1% PBST로 3회 세척하고 PBS로 희석한 2%의 탈지 우유를 사용하여 상온에서 2시간 동안 블로킹한 후， 용액올 모두 버리고 0.1% PBST로 3회 세척하였다. 여기에 CPB 재조합 파아지인 두 번째, 세 번째， 네 번째 및 다섯 번째 인 파아지 10 및 2%의 탈지 우유 500 ,를 흔합하여 100 ^씩 인간 안지오포이에틴 -2， BSA 및 mTNF α 웰에 각각 2웰씩 분주하고， 상온에서 1시간 동안 방치하였다. 0.1% PBST 용액으로 10회 세척한 다음 HRP-컨쥬게이트 항 -M13 항체 (GE Healthcare)를 1:1,000으로 희석하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 0.1% PBST로 6회 세척한 후 퍼옥시다아제의 기질인 테트라메틸벤지딘 (TMB; BD Science) 용액 50 ^를 분주하여 발색반응을 유도한 다음， 50 ^의 1 M HC1을 첨가하여 반응을 중지시켰다. 이후， 450 nrn에서 흡광도를 측정하였다. 인간 안지오포이에틴 -2에 특이적인 파아지 펩타이드 선별 φ
인풋 파아지 ELISA에서 대조군 대비 인간 안지오포이에틴 -2 단백질에 붙는 비율이 가장 높은 바이오패닝 단계의 직전 단계에서 회수한 아웃풋 파아지를 E. coli ER2738 세포에 감염시킨 후， 암피실린이 포함된 아가 플레이트당 폴라크가 100-200개 정도되도록 도말하였다. 멸균된 팁을 이용하여 폴라크 30개를 각 1 의 SB-암피실린 (50
Figure imgf000034_0001
, Ex 헬퍼 파아지 배양액에 접종한 후 37°C에서 .하루 동안 배양하였다. 16,800xg로 10분 동안 원심분리한 후， 상층액을 회수한 다음 2%의 탈지 우유를 넣고， 이를 파아지 펩타이드 검색에 사용하였다. 96웰 ELISA 플레이트에 5 ^g/ 의 인간 안지오포이에틴 -2를 각 웰당 25 ^씩 30개의 웰에 넣고， 또한 5 /ig/m,의 BSA을 각 웰당 25 ^씩 30개의 웰에 넣어 4°C에서 하루 동안 방치하였다. 다음날 모든 웰을 0.1% PBST로 3회 세척하고， PBS로 희석한 탈지 우유를 사용하여 상온에서 2시간 동안 블로킹한 뒤， 용액을 모두 버리고 0.1% PBST로 3회 세척하였다. 각 클론별로 증폭된 파아지 펩타이드 용액 200 ≠를 200 의 2% 탈지 우유에 흔합하고 100 씩 모든 웰에 분주하고 37 °C에서 1시간 동안 방치하였다. 0. 1% PBST 용액으로 6회 세척한 다음 HRP-컨쥬게이트 항— M13 항체 (GE Hea l thcare)를 1 : 1，000으로 희석하여 37 °C에서 1시간 동안 반응시켰다. 0. 1% PBST로 6회 세척한 후 TMB 용액 50 분주하여 발색반웅을 유도한 다음 50 의 1 M HC1를 첨가하여 반웅을 중지시켰다. 450 nm에서 흡광도를 측정하여 BSA에 비해 흡광도가 3배 이상 높은 클론들올 선택하였다. 이들의 파아지를 E. coli ER2738 세포에 감염시킨 후 암피실린이 포함된 아가 플레이트에 도말하였다. 멸균된 팁을 이용하여 플라크를 4 ^의 SB-암피실린 (50 /ig/mO 배양액에 접종한 후 37 °C에서 하루 동안 진탕 배양하여 플라스미드 프램 키트를 이용하여 플라스미드를 정제하여 시뭔싱을 의뢰하였다 (Macrogen , Seoul , Korea) . 시퀀싱 프라이머는 백터 시퀀스인 5 '— GATTACGCCMGCnTG-3 ' (서열목록 게 7서열)을 사용하였다. 인간 안지오포이에틴 -2에 특이적인 파아지 펩타이드 선별 ② 인간 안지오포이에틴 -2에 특이적인 CPB 후보물질을 층분하게 확보하기 위하여， 상술한 방법으로 60개의 폴라크를 검색하였다. 인간 안지오포이에틴 -2에 특이적인 파아지 펩타이드 선별 ③ 인간 안지오포이에틴 -2에 특이적인 CPB 후보물질을 충분하게 확보 하기 위해 384웰 ELISA p l ate를 이용하여 파아지 ELISA를 수행하였다. 인풋 파아지 ELI SA에서 대조군 대비 인간 안지오포이에틴 -2 단백질에 붙는 비율이 가장 높은 바이오패닝 단계의 직전 단계에서 회수한 아웃풋 파아지를 E. coli ER2738 세포에 감염시킨 후 플라크가 암피실린이 포함된 아가 플레이트당 100-200개 정도가 되도록 도말하였다. 멸균된 팁을 이용하여 플라크 192개를 384웰 ELISA p l ate 각 웰당 70 ^의 SB- 암피실린 (50 ug/mi) , Ex 헬퍼 파아지 배양액에 접종한 후 37°C에서 150 rpm 속도로 회전하며 하루 동안 배양하였다. 다음날 209xg로 15분 동안 원심분리한 후 상층액을 회수하여 2%의 탈지 우유를 넣고 이를 파아지 펩타이드 검색에 사용하였다. 384웰 ELISA 플레이트에 2 / 의 인간 안지오포이에틴 -2를 각 웰당 15 ^씩 192개의 웰에 넣고， 또한 2 ^g/m의 BSA을 각 웰당 15 ^씩 192개의 웰에 넣어 4°C에서 하루 동안 방치하였다. 다음날 모든 웰을 0.1% PBST로 3회 세척하고 PBS로 희석한 2% 탈지 우유를 사용하여 상온에서 2시간 동안 블로킹한 뒤, 용액을 모두 버리고 0.1% PBST로 3회 세척하였다. 각 클론별로 증폭된 파아지 펩타이드 용액 20 ^를 20 의 2% 탈지 우유에 흔합하고 30 씩 모든 웰에 분주하고 37°C에서 1시간 동안 방치하였다. 0.1% PBST 용액으로 6회 세척한 다음 HRP- 컨쥬게이트 항 -M13 항체 (GE Healthcare)를 1:3， 000으로 희석하여 37°C에서 1시간 동안 반응시켰다. 0. PBST로 6회 세척한 후 TMB 용액 30 ^를 분주하여 발색반응을 유도한 다음 육안으로 발색반응을 확인하고， BSA에 비해 푸른색 발색이 높은 클론들 (도 15의 파란색 선으로 표시된 부분)을 선택하여， 이들의 파아지를 E. col/ ER2738 세포에 감염시킨 후 암피실린이 포함된 아가 플레이트에 도말하였다. 멸균된 팁을 이용하여 플라크를 4 ιπ의 SB-암피실린 (50 g/m« 배양액에 접종한 후 37°C에서 하루 동안 진탕 배양하여 플라스미드 프램 키트를 이용하여 플라스미드를 정제하여 시퀀싱을 의뢰하였다 (Macrogen, Seoul , Korea). 시퀀싱 프라이머는 백터 시퀀스인 5'-GATTACGCCMGCnTG-3' (서열목록 제 7서열)을 사용하였다. 인간 안지오포이에틴ᅳ 2에 대한 친화도 측정
DNA 시퀀싱에서 나온 인간 안지오포이에틴 -2에 특이적인 CPB 펩타이드 (1-1: AYPMFLCYDPETGTWCHRWTNT , 서열목록 제 21서열; 1-12: AYPMFLCYDPETGTWCQRQTNT , 서열목록 제 23서열)들을 합성 (Anygenᅳ Korea)하였다. 친화도 측정은 BIAcore X(Biacore AB, Uppsala, Sweden)를 이용하여 수행하였다. 인간 안지오포이에틴 -2를 CM5 칩 (Biacore)에 2,700 RU 만큼 흘려주어 고정시켰다. 러닝 버퍼로는 PBS(pH 7.4)을 사용하였고， 플로우는 분당 30 로 홀리면서 여러 농도로 동력학을 측정한 후 BIAevaluation 소프트웨어 (Biacore AB, Uppsala, Sweden)로 친화도를 계산하였다. 4-2. 실험결과
인간 안지오포이에틴 -2 특이적 CPB 선별 CPB 라이브러리의 각 인풋 파아지로 인간 안지오포이에틴 -2， BSA 및 mTNFa에 대해 ELISA를 수행하였다. CPB 라이브러리의 두 번째부터 세 번째까지 인풋 파아지의 반응성은 인간 안지오포이에틴 -2 BSA 및 mTNFa 모두 흡광도가 비슷했으나, 네 번째 인풋 파아지에서부터 인간 안지오포이에틴 -2의 흡광도가 BSA 및 mTNFa에 비해 2배 가량 높아 높은 반응성을 보였으며， 다섯 번째 인풋 파아지에서의 반웅성 차이가 6배까지 증가하였음을 확인하여, 성공적인 바이오패닝을 확인하였다 (도 11).
4번째 단계의 아웃풋 파아지를 플라크 형태로 확보하였다. CPB 라이브러리 폴라스크로부터 30개의 파아지를 증폭시킨 후, 네 번째 아웃풋 파아지를 이용한 파아지 ELISA를 통하여 6개의 인간 안지오포이에틴 -2에 높은 반웅성을 보이는 후보 (1번， 4번， 12번， 16번, 25번ᅳ 26번)를 선별하였다 (도 12).
이후， 선별한 후보 파아지들이 인간 안지오포이에틴 -2에 높은 반응성뿐만 아니라, 선택성을 갖는지 확인하기 위하여 인간 FC 단편 (hFC), 스트랩트아비딘 (streptavidin), BSA, ED— B 및 mTNFa 단백질을 대조군으로 삼아 특이성 ELISA를 수행하였다. 그 결과, 6종류의 파아지 모두 인간 안지오포이에틴 -2에 대한 흡광도가 대조군에 비하여 최소 15배 이상 차이를 보였으며, 이를 통하여 인간 안지오포이에틴ᅳ 2에 선택성을 갖고 있음을 확인하였다 (도 13).
선별된 6개의 클론에 대하여 DNA 서열 분석을 실시하여， 인간 안지오포이에틴 -2 특이적 CPB의 서열을 확인하였다 (표 1).
【표 1】
Figure imgf000037_0001
나아가， 인간 안지오포이에틴 -2에 특이적인 CPB 후보물질을 충분하게 확보하기 위하여， "인간 안지오포이에틴— 2 단백질에 특이적인 파아지 펩타이드 검색 ①" 과 동일한 방법으로 60개의 플라크를 검색하여， 총 8개의 CPB를 선별하였다 (도 14 및 표 2 ) .
【표 2】
Figure imgf000039_0001
또한， Human angiopoiet in_2에 특이적인 CPB 후보물질을 층분하게 확보하기 위하여， 384웰 ELISA 플레이트를 이용하여 파아지 ELISA를 수행하였다. 그 결과， 총 22개의 CPB를 선별하였다 (도 15 및 표 3).
【표 3]
Figure imgf000040_0001
이상과 같은 3차례의 인간 안지오포이에틴 -2 특이적 펩타이드 검색 결과를 종합하여, 중복되는 서열들을 제외한 최종 17개의 CPB 서열을 표 4에 나타내었다. 【표 4】
Figure imgf000041_0001
인간 안지오포이에틴 -2에 대한 친화도
인간 안지오포이에틴 -2에 대한 펩타이드를 합성하여 SPR Biacore system(Biacore AB, Uppsala, Sweden)을 이용하여 친화도를 측정하였다. 그 결과， CPB-1-1은 530 nM올 나타내었고， CPB-1-12는 987 nM을 나타내었다 (도 16). 이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바， 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며， 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다

Claims

【특허청구범위】
【청구항 1】
(a) 가닥 간 (interstrand) 비공유결합이 형성되어 있는 β—헤어핀 구조를 가지되, 상기 β-헤어핀 구조의 양 말단에 위치한 아미노산 잔기 사이의 공유결합을 통하여 환형 (cyclic) 구조를 형성한 환형의 βᅳ 헤어핀 (eye lie β -hairpin); 및
(b) 상기 환형의 -헤어핀의 일 말단에 결합되어 타겟에 대한 결합 친화도 (binding affinity)를 나타내는 n개의 아미노산을 포함하는 타겟 결합 부위 I과, 상기 환형의 β-해어핀의 타 말단에 결합되어 상기 타겟에 대한 결합 친화도를 나타내는 «1개의 아미노산을 포함하는 타겟 결합 부위 Π를 포함하는 타겟에 특이적으로 결합하는 환형의 β-헤어핀 기반 펩타이드 바인더.
【청구항 2】
제 1 항에 있어서， 상기 가닥 간 비공유결합은 수소결합， 정전기적 상호작용, 소수성상호작용， 반데르발스 상호작용, 파이 -파이 상호작용， 양이온 -파이 상호작용 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는 환형의 β- 헤어핀 기반 펩타이드 바인더.
【청구항 3】
제 1 항에 있어서, 상기 환형의 β-헤어핀은 상기 β-헤어핀 구조의 양 말단에 위치한 아미노산 잔기 사이의 이황화 결합을 통하여 환형 구조를 형성한 것을 특징으로 하는 환형의 β-헤어핀 기반 펩타이드 바인더.
【청구항 4】
제 1 항에 있어서， 상기 환형의 β_헤어핀은 상기 β-헤어핀 구조의 양 말단에 위치한 아미노산 잔기 사이의 링커를 통한 공유결합을 통하여 환형 구조를 형성한 것을 특징으로 하는 환형의 β-헤어핀 기반 펩타이드 바인더.
【청구항 5】
제 1 항에 있어서, 상기 환형의 β -헤어핀은 서열목록 제 14서열의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 환형의 β -헤어핀 기반 펩타이드 바인더 .
【청구항 6】
제 1 항에 있어서， 상기 환형의 β -헤어핀은 서열목록 제 14서열의 아미노산 서열에서 양 말단의 시스테인을 제외한 아미노산 중 일부 아미노산이 라이신으로 치환된 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 환형의 β -헤어핀 기반 펩타이드 바인더.
【청구항 7]
제 1 항에 있어서, 상기 타겟 결합 부위의 아미노산 개수 η 및 m은 각각 2-50의 정수인 것을 특징으로 하는 환형의 β -헤어핀 기반 펩타이드 바인더.
【청구항 8】
제 1 항에 있어서, 상기 타겟 결합 부위 I 및 타겟 결합 부위 Π는 공동으로 작용하여 타겟에 결합하는 것을 특징으로 하는 환형의 β -헤어핀 기반 펩타이드 바인더 .
【청구항 9】
제 1 항에 있어서, 상기 환형의 β—헤어핀 또는 타겟 결합 부위에는 추가적으로 기능성 분자가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 환형의 β - 헤어핀 기반 펩타이드 바인더.
【청구항 10】
제 9 항에 있어서， 상기 기능성 분자는 검출 가능한 신호를 발생시키는 레이블， 화학약물， 바이오약물， 세포막 투과 펩타이드 (CPP) 또는 나노입자인 것을 특징으로 하는 환형의 β -헤어핀 기반 펩타이드 바인더.
【청구항 11】
제 1 항에 있어서, 상기 타겟은 생화학물질, 펩타이드 폴리펩타이드 핵산， 탄수화물， 지질， 세포, 조직, 화합물， 금속 또는 비금속 물질인 것을 특징으로 하는 환형의 β-헤어핀 기반 펩타이드 바인더 .
【청구항 12]
제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항의 환형의 β-헤어핀 기반 펩타이드 바인더를 코딩하는 핵산 분자.
【청구항 13】
제 12 항의 핵산 분자를 포함하는 재조합 백터 .
【청구항 14]
다음의 단계를 포함하는 타켓에 특이적으로 결합하는 환형의 β- 헤어핀 기반 펩타이드 바인더의 제조방법:
(a) (i) 가닥 간 (interstrand) 비공유결합이 형성되어 있는 β- 헤어핀 구조를 가지되， 상기 β-헤어핀 구조의 양 말단에 위치한 아미노산 잔기 사이의 공유결합을 통하여 환형 (cyclic) 구조를 형성한 환형의 β- 헤어핀 (cyclic -hairpin); 및 (ii) 상기 환형의 β—헤어핀의 일 말단에 결합된 η개의 아미노산을 포함하는 타겟 결합 부위 I과， 상기 환형의 β- 헤어핀의 타 말단에 결합된 m개의 아미노산을 포함하는 타겟 결합 부위 Π를 포함하는 환형의 β-헤어핀 기반 펩타이드 바인더의 라이브러리를 제공하는 단계 ;
(b) 상기 라이브러리에 타겟을 접촉시키는 단계; 및
(C) 상기 타겟에 결합된 환형의 β-헤어핀 기반 펩타이드 바인더를 선택하는 단계.
PCT/KR2015/003632 2014-04-11 2015-04-10 환형의 β-헤어핀 기반 펩타이드 바인더 및 이의 제조방법 WO2015156644A1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020140043633A KR20150118252A (ko) 2014-04-11 2014-04-11 환형의 β-헤어핀 기반 펩타이드 바인더 및 이의 제조방법
KR10-2014-0043633 2014-04-11

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2015156644A1 true WO2015156644A1 (ko) 2015-10-15

Family

ID=54288133

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2015/003632 WO2015156644A1 (ko) 2014-04-11 2015-04-10 환형의 β-헤어핀 기반 펩타이드 바인더 및 이의 제조방법

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR20150118252A (ko)
WO (1) WO2015156644A1 (ko)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20160118166A (ko) 2016-09-21 2016-10-11 이우성 국제사회 상거래용 자유무역 유통의 위조방지 조절화폐 및 상기 화폐를 제조하는 금형
KR102043248B1 (ko) 2018-02-20 2019-11-12 한국과학기술원 세포투과성 물질이 융합된 앱타이드가 포집된 지질 나노 입자 복합체 및 이의 용도

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5856456A (en) * 1992-11-20 1999-01-05 Enzon, Inc. Linker for linked fusion polypeptides
KR20100044128A (ko) * 2008-10-20 2010-04-29 광주과학기술원 바이포달 펩타이드 바인더
KR20120125455A (ko) * 2009-12-11 2012-11-15 광주과학기술원 세포내 타겟 결합용 바이포달 펩타이드 바인더

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5856456A (en) * 1992-11-20 1999-01-05 Enzon, Inc. Linker for linked fusion polypeptides
KR20100044128A (ko) * 2008-10-20 2010-04-29 광주과학기술원 바이포달 펩타이드 바인더
KR20120125455A (ko) * 2009-12-11 2012-11-15 광주과학기술원 세포내 타겟 결합용 바이포달 펩타이드 바인더

Also Published As

Publication number Publication date
KR20150118252A (ko) 2015-10-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101216008B1 (ko) 바이포달 펩타이드 바인더
JP5726299B2 (ja) 細胞透過性ペプチドおよびその使用
JP5677454B2 (ja) 細胞内ターゲット結合用二座ペプチドバインダー
JP5677453B2 (ja) Ｂｐｂベースのカーゴ運搬システム
KR101695792B1 (ko) 신규 세포막 투과 펩티드 및 생리활성 물질 전달체로서의 그의 용도
WO2015156644A1 (ko) 환형의 β-헤어핀 기반 펩타이드 바인더 및 이의 제조방법
CN107903307B (zh) 一种高亲和力edb-fn蛋白靶向肽及其应用
TW201309720A (zh) 胜肽庫
KR101323846B1 (ko) 타겟 친화도가 유지되고 안정성이 개선된 ｄ－앱타이드
Peyrassol et al. Development by genetic immunization of monovalent antibodies against human vasoactive intestinal peptide receptor 1 (VPAC1), new innovative, and versatile tools to study VPAC1 receptor function
AU2019403533A1 (en) Transmembrane domain derived from human LRRC24 protein
JP2021530230A (ja) アプタマーベースの可逆的細胞選択に関連する組成物および方法
WO2023145860A1 (ja) Ｓｃｆ受容体結合ペプチド
WO2011132940A2 (ko) Rtk에 특이적으로 결합하는 rtk-bpb
WO2011132941A2 (ko) 전사인자에 특이적으로 결합하는 tf-bpb
WO2011132938A2 (ko) Gpcr에 특이적으로 결합하는 gpcr-bpb
KR101443839B1 (ko) 펩타이드의 타겟 친화도 개선방법
CN113557246A (zh) 靶向αvβ3整联蛋白的单域抗体
KR20110116930A (ko) 이온채널에 특이적으로 결합하는 이온채널―ｂｐｂ
WO2011132939A2 (ko) Rtk에 특이적으로 결합하는 rtk-bpb
KR20120105273A (ko) 바이오핀

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 15777325

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 15777325

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1