WO2023145860A1 - Ｓｃｆ受容体結合ペプチド - Google Patents

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WO2023145860A1
WO2023145860A1 PCT/JP2023/002590 JP2023002590W WO2023145860A1 WO 2023145860 A1 WO2023145860 A1 WO 2023145860A1 JP 2023002590 W JP2023002590 W JP 2023002590W WO 2023145860 A1 WO2023145860 A1 WO 2023145860A1
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seq
amino acid
peptide
formula
acid sequence
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PCT/JP2023/002590
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匡平 宮入
健一郎 伊藤
友博 藤井
吉彦 松田
峯 亜矢子 藤原
Original Assignee
味の素株式会社
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Publication date
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/12—Cyclic peptides, e.g. bacitracins; Polymyxins; Gramicidins S, C; Tyrocidins A, B or C
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
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    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
    • C40B40/10—Libraries containing peptides or polypeptides, or derivatives thereof

Definitions

  • the present invention relates to peptides capable of binding to SCF receptors, peptides having agonistic activity to SCF receptors, and the like.
  • SCF Stem cell growth factor
  • Patent Document 1 International Publication No. 2009/135198 Patent Document 2: US Patent No. 6084066 Patent Document 3: International Publication No. 92/03459
  • One aspect of the present invention aims to provide novel peptides capable of binding to the SCF receptor (also known as "c-Kit”). Another object of the present invention is to provide a peptide having agonistic activity to the SCF receptor (c-Kit).
  • a peptide having a cyclic structure or a loop structure which is capable of binding to the SCF receptor, and a peptide having agonistic activity to the SCF receptor.
  • the present invention may include, for example, the following aspects.
  • WX 4-7 (S/T)X ⁇ Formula (1) In the formula, ⁇ represents an amino acid residue selected from W, F, Y, L, V, I and M; Each X independently represents an arbitrary amino acid residue.
  • WX 5 (S/T) ⁇ formula (3) (Wherein, ⁇ and X are each as defined in formula (1) described in [1] above, and ⁇ represents an amino acid residue selected from L, V, I and M.) [4] The peptide according to [3] above, wherein the amino acid residue represented by ⁇ is selected from L, V and I. [5] The [1 ] The peptide according to .
  • WSHRGSSMI (SEQ ID NO: 1) WESGYSMV (SEQ ID NO: 2) WVSGHNSWV (SEQ ID NO: 3) WEPIDFTYV (SEQ ID NO: 4) WTHIGKSLI (SEQ ID NO: 5) WVFFPQTKTMV (SEQ ID NO: 6) WHPANFSML (SEQ ID NO: 7) WKHVRYTML (SEQ ID NO: 8) WMQKGFSMI (SEQ ID NO: 9) WRARGYSMV (SEQ ID NO: 10) WHHRGASMI (SEQ ID NO: 11) WEARNWSVI (SEQ ID NO: 12) WHDEGYQMTWY (SEQ ID NO: 13) WVEWPTMW (SEQ ID NO: 14) WESLGYSYV (SEQ ID NO: 15) [6] The peptide of [5] above, wherein the amino acid sequence represented by formula (1) is selected from the amino acid sequences represented by SEQ ID NOS: 1-15.
  • a peptide having a cyclic structure comprising an amino acid sequence represented by formula (1) according to [1] above, and selected from amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 16 to 30 below
  • the peptide according to [1] above which is formed from an amino acid sequence having a sequence identity of 75% or more with any one of the amino acid sequences described in [1].
  • CFWHSRGSSMIQHC (SEQ ID NO: 16) CWWWESGYSMVQEC (SEQ ID NO: 17) CWVSGHNSWVKINC (SEQ ID NO: 18) CVWEPIDFTYVQHC (SEQ ID NO: 19) CTWTHIGKSLIIQC (SEQ ID NO: 20) CEWVFFPQTKTMVC (SEQ ID NO: 21) CWHPANFSMLYQC (SEQ ID NO: 22) CWKHVRYTMLQIPC (SEQ ID NO: 23) CKWMQKGFSMIQMC (SEQ ID NO: 24) CVWRARGYSMVQMC (SEQ ID NO: 25) CFWHHRGASMIRMC (SEQ ID NO: 26) CWWEARNWSVIQHC (SEQ ID NO: 27) CWHDEGYQMTWYC (SEQ ID NO: 28) CLWVEWPTMWELRC (SEQ ID NO: 29) CWESLGYSYVIVPC (SEQ ID NO: 30) [8]
  • the partial sequence WX 4-7 (S/T) in the amino acid sequence represented by formula (1) has an amino acid sequence represented by the following formula (4), and has agonistic activity to the SCF receptor.
  • WX 1-3 (G/P) X 1-3 (S/T) Formula (4) (Wherein, X is as defined in formula (1) described in [1] above, provided that the total number of X in formula (4) is at least three.) [10]
  • the above-described [9], wherein the amino acid sequence consisting of the amino acid sequence represented by formula (1) and one amino acid residue on the C-terminal side thereof is an amino acid sequence represented by the following formula (5): peptide.
  • WSHRGSS (SEQ ID NO: 31) WESGYS (SEQ ID NO: 32) WVSGHNS (SEQ ID NO: 33) WEPIDFT (SEQ ID NO: 34) WTHIGKS (SEQ ID NO: 35) WVFFPQTKT (SEQ ID NO: 36) WMQKGFS (SEQ ID NO: 37) WESLGYS (SEQ ID NO: 38) WRARGYS (SEQ ID NO: 39)
  • WSHRGSSMIQ (SEQ ID NO: 40) WESGYSMVQ (SEQ ID NO: 41) WVSGHNSWVK (SEQ ID NO: 42) WEPIDFTYVQ (SEQ ID NO: 43) WMQKGFSMIQ (SEQ ID NO: 44) WRARGYSMVQ (SEQ ID NO: 45) [18]
  • a peptide having a cyclic structure wherein the cyclic structure is an amino acid sequence represented by formula (4) according to [9] above or an amino acid sequence represented by formula (5) according to above [10] and formed from an amino acid sequence having a sequence identity of 75% or more with any one amino acid sequence selected from the amino acid sequences shown in SEQ ID NOS: 16 to 21, 24, 25 and 30 below, The peptide of [9] or [10].
  • CFWHSRGSSMIQHC (SEQ ID NO: 16) CWWWESGYSMVQEC (SEQ ID NO: 17) CWVSGHNSWVKINC (SEQ ID NO: 18) CVWEPIDFTYVQHC (SEQ ID NO: 19) CTWTHIGKSLIIQC (SEQ ID NO: 20) CEWVFFPQTKTMVC (SEQ ID NO: 21) CKWMQKGFSMIQMC (SEQ ID NO: 24) CVWRARGYSMVQMC (SEQ ID NO: 25) CWESLGYSYVIVPC (SEQ ID NO: 30) [20] The peptide of [19] above, wherein the cyclic structure is formed from any one of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOS: 16-21, 24, 25 and 30.
  • a peptide homodimer comprising two molecules of the peptide according to any one of [1] to [20].
  • a pharmaceutical composition comprising the peptide, peptide dimer or peptide homodimer of any one of [1] to [22].
  • a cell culture medium containing the peptide, peptide dimer or peptide homodimer of any one of [1] to [22].
  • a cell culture additive comprising the peptide, peptide dimer or peptide homodimer of any one of [1] to [22].
  • a cell differentiation inducer comprising the peptide, peptide dimer or peptide homodimer of any one of [1] to [22] above.
  • a cell culture method comprising contacting the peptide, peptide dimer or peptide homodimer of any one of [1] to [22] with a cell.
  • a method of inducing cell differentiation which comprises contacting a cell with the peptide, peptide dimer or peptide homodimer of any one of [1] to [22] above.
  • novel peptides capable of binding to the SCF receptor can be provided.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing the cyclic peptide library site in Example 2.
  • FIG. 2 is a graph showing the enrichment of peptides that bind to the SCF receptor (c-Kit) by the selection performed in Example 2.
  • FIG. The E/I ratio on the vertical axis represents the Elute/Input ratio.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing an outline of an experiment to evaluate peptide binding to SCF receptor (c-Kit) performed in Example 3.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of evaluation of peptide binding to SCF receptor (c-Kit) performed in Example 3.
  • FIG. The vertical axis represents the relative absorbance to His-Neg.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of evaluation of SCF-like activity of SCF receptor (c-Kit)-binding peptides performed in Example 5.
  • FIG. The vertical axis represents the relative luminescence intensity considering the difference between the sample addition group and the non-addition group.
  • the values of 10, 30, 90, 270, 810 and 2430 refer to the final dilution ratio of each peptide solution to the medium.
  • 2 is a graph showing the results of evaluation of SCF-like activity of SCF receptor (c-Kit)-binding peptides performed in Example 5.
  • FIG. The vertical axis represents the relative luminescence intensity considering the difference between the sample addition group and the non-addition group.
  • FIG. 10 is a graph showing the results of evaluation of SCF-like activity of SCF receptor (c-Kit)-binding peptides performed in Example 7.
  • the vertical axis represents the relative luminescence intensity considering the difference between the sample addition group and the non-addition group.
  • the values of 110, 330 and 990 represent the final dilution ratio of each peptide solution to the medium.
  • FIG. 10 is a graph showing the results of evaluation of SCF-like activity of SCF receptor (c-Kit)-binding peptides performed in Example 7.
  • FIG. 10 is a graph showing the results of evaluation of SCF-like activity of SCF receptor (c-Kit)-binding peptides performed in Example 7.
  • FIG. 10 is a graph showing the results of evaluation of SCF-like activity of Fc-peptide conjugates conducted in Example 9.
  • FIG. 10 represents the relative luminescence intensity considering the difference between the sample addition group and the non-addition group.
  • the horizontal axis represents the concentration of each peptide solution relative to the medium.
  • FIG. 10 shows the results of receptor tyrosine kinase (RTK) specificity evaluation of Fc-peptide conjugates conducted in Example 10.
  • FIG. FIG. 11 is a graph showing quantified intensity of the spots represented in FIG. 10; FIG. FIG.
  • FIG. 3 shows each array of the Proteome Profiler Human Phospho-RTK Array Kit (R&D Systems).
  • FIG. 10 is a graph showing the results of evaluation of SCF-like activity of Fc-peptide conjugates conducted in Example 11.
  • FIG. The vertical axis represents the relative luminescence intensity considering the difference between the sample addition group and the non-addition group.
  • the horizontal axis represents the concentration of each peptide solution relative to the medium.
  • One embodiment described herein is a peptide having a cyclic structure or loop structure, wherein the amino acid sequence of the cyclic structure or the loop structure comprises an amino acid sequence represented by formula (1) described below. , relates to peptides capable of binding to SCF receptors.
  • One embodiment described herein is a peptide having a cyclic structure or a loop structure, wherein the amino acid sequence of the cyclic structure or the loop structure comprises an amino acid sequence represented by formula (4) described below. , relates to peptides with agonistic activity towards the SCF receptor.
  • each amino acid may be either an L-amino acid or a D-amino acid, and any amino acid may be a natural type or a non-natural type. It may be, for example, an ⁇ -, ⁇ - or ⁇ -amino acid, preferably an ⁇ -amino acid.
  • the one-letter or three-letter amino acid designations shown in Table 1 are used herein.
  • cyclic structure means a structure cyclized by a covalent bond.
  • covalently cyclized include being cyclized with a disulfide bond, a thioether bond, or an amide bond. It is not particularly limited whether it is (cyclized).
  • loop structure means a loop-shaped folded structure formed by non-covalent interactions such as electrostatic interactions, hydrophobic interactions, and hydrogen bonds. .
  • a method of presenting a cyclic peptide (biologically active portion of a cyclic peptide) on a protein while retaining the structure and activity of the cyclic peptide using a protein having a loop structure as a scaffold is described in International Publication No. 2019/026920. WO 2020/027224, and Mihara, et al., Nature Communications, 12, Article number: 1543 (2021) (the contents of these documents are hereby incorporated by reference). ), and according to these methods, it is possible to insert a cyclic structural portion for exhibiting physiological activity into the loop structure of a protein while maintaining the physiological activity. Also in the peptides described herein, a cyclic structural portion for exhibiting physiological activity can be inserted into a desired loop structure while maintaining the physiological activity based on the above method.
  • a peptide capable of binding to an SCF receptor includes those having agonistic activity to SCF receptors, those having antagonistic activity to SCF receptors, those that bind to SCF receptors but mostly or Those that show no activity at all may be included.
  • expressions such as “a peptide capable of binding to an SCF receptor” and "a peptide having an agonistic activity to an SCF receptor” mean that the peptide is in a completely unmodified form or in a completely free form. not intend.
  • a peptide capable of binding to an SCF receptor and "a peptide having an agonistic activity to an SCF receptor” include the property of being able to bind to an SCF receptor or side chains of amino acid residues are modified, for example, protected and glycosylated, and salt forms known as biologically or pharmaceutically acceptable salts can be included.
  • the ability to bind to SCF receptors can be assessed by methods well known to those skilled in the art. For example, a plate on which the peptide to be tested is immobilized or a plate on which the SCF receptor protein is immobilized is prepared, and the ability of the peptide to be tested to bind to the SCF receptor is evaluated by ELISA. be able to.
  • Such assessment of binding ability to SCF receptors can be performed using commercially available products and reagents.
  • agonistic activity towards SCF receptors can be assessed by methods well known to those skilled in the art.
  • agonist activity to SCF receptors can be evaluated using commercially available products that can be used for screening SCF receptor agonists using chemiluminescence or bioluminescence.
  • X% or more sequence identity means that up to (100-X)% amino acid substitutions can be tolerated.
  • Amino acid substitution means replacement of an amino acid residue in a reference amino acid sequence with a known amino acid residue different from the amino acid residue in question.
  • One aspect of amino acid substitution includes, but is not limited to, conservative amino acid substitution.
  • a "conservative amino acid substitution” is one in which an amino acid residue is replaced by another amino acid residue having a side chain R group with similar chemical properties (eg, charge or hydrophobicity).
  • amino acid groups having side chains with similar chemical properties include glycine, alanine, valine, leucine, and isoleucine with aliphatic side chains, serine and threonine with aliphatic hydroxyl side chains, amide-containing side chains. phenylalanine, tyrosine, and tryptophan with aromatic side chains; lysine, arginine, and histidine with basic side chains; and aspartic acid and glutamic acid with acidic side chains.
  • Each amino acid to be introduced by substitution may be an L-amino acid or a D-amino acid, and may be a natural amino acid or a non-natural amino acid. is an amino acid that constitutes
  • the amino acid sequence represented by formula (1) is as follows.
  • WX 4-7 (S/T)X ⁇ Formula (1) (In the formula, ⁇ represents an amino acid residue selected from W, F, Y, L, V, I and M; Each X independently represents an arbitrary amino acid residue. )
  • the notation "(S/T)” means either S or T.
  • the notation “X 4-7 ” means that 4 to 7 consecutive Xs (that is, any amino acid residue) are present.
  • Each X is independently selected and each X can be the same or different.
  • X is not particularly limited, it may be, for example, an amino acid residue listed in Table 1 above.
  • X1 S, E, V, T, H, K, M
  • R X2 H, S, P, F, Q, A, D
  • E X3 R, G, I, F, A, V, K, E, W, L
  • X4 G, Y, H, D, P, N
  • R X5 S, N, F, K, Q, Y, A, W X6: T, Q X7: K, M X present on the C-terminal side of "(S/T)" is not particularly limited, but may be, for example, an amino acid residue listed in Table 1 above.
  • the amino acid sequence represented by formula (1) is the amino acid sequence represented by the following formula (2).
  • WX 4-7 (S/T) ⁇ formula (2) (Wherein, ⁇ and X are each as defined in formula (1), and ⁇ is independently selected.)
  • the notation “X 4-7 ” and the notation “(S/T)” have the same meanings as those described in formula (1), and the contents described in formula (1) can be applied.
  • Each ⁇ in the amino acid sequence represented by formula (2) may be the same or different.
  • the amino acid sequence represented by formula (2) is the amino acid sequence represented by the following formula (2-1).
  • WX 4-7 (S/T) ⁇ Formula (2-1) (Wherein, ⁇ and X are each as defined in Formula (1), and ⁇ represents an amino acid residue selected from L, V, I and M.)
  • the notation “X 4-7 ” and the notation “(S/T)” have the same meanings as those described in formula (1), and the contents described in formula (1) can be applied.
  • ⁇ represents an amino acid residue selected from L, V and I in one embodiment.
  • the amino acid sequence represented by formula (2) is the amino acid sequence represented by the following formula (2-2).
  • WX 5 (S/T) ⁇ formula (2-2) (Wherein, ⁇ and X are each as defined in formula (1), and ⁇ is independently selected.)
  • the notation “X 5 ” means that 5 consecutive Xs (that is, arbitrary amino acid residues) are present. Each X is independently selected and each X may be the same or different.
  • the notation “(S/T)” has the same meaning as described in formula (1), and the content described in formula (1) can be applied.
  • Each ⁇ in the amino acid sequence represented by formula (2-2) may be the same or different.
  • the amino acid sequence represented by formula (2) is the amino acid sequence represented by formula (3) below.
  • WX 5 (S/T) ⁇ formula (3) (Wherein, ⁇ and X are each as defined in Formula (1), and ⁇ represents an amino acid residue selected from L, V, I and M.)
  • the notation “X 5 ” means that 5 consecutive Xs (that is, arbitrary amino acid residues) are present. Each X is independently selected and each X may be the same or different.
  • the notation “(S/T)” has the same meaning as described in formula (1), and the content described in formula (1) can be applied.
  • ⁇ represents an amino acid residue selected from L, V and I in one embodiment.
  • the amino acid sequence represented by formula (1) has 75% or more sequence identity with any one amino acid sequence selected from the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 15 below.
  • WSHRGSSMI SEQ ID NO: 1 WESGYSMV (SEQ ID NO: 2) WVSGHNSWV (SEQ ID NO: 3) WEPIDFTYV (SEQ ID NO: 4) WTHIGKSLI (SEQ ID NO: 5) WVFFPQTKTMV (SEQ ID NO: 6) WHPANFSML (SEQ ID NO: 7) WKHVRYTML (SEQ ID NO: 8) WMQKGFSMI (SEQ ID NO: 9) WRARGYSMV (SEQ ID NO: 10) WHHRGASMI (SEQ ID NO: 11) WEARNWSVI (SEQ ID NO: 12) WHDEGYQMTWY (SEQ ID NO: 13) WVEWPTMW (SEQ ID NO: 14) WESLGYSYV (SEQ ID NO: 15)
  • the amino acid sequence represented by formula (1) has 80% or more or 90% or more sequence identity with any one amino acid sequence selected from the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 15. In one aspect, the amino acid sequence represented by formula (1) is selected from the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1-15.
  • the peptide capable of binding to an SCF receptor has a cyclic structure, the cyclic structure comprising the amino acid sequence represented by formula (1) and represented by SEQ ID NOs: 16 to 30 below. It is formed from an amino acid sequence having a sequence identity of 75% or more with any one amino acid sequence selected from the amino acid sequences listed.
  • CFWHSRGSSMIQHC (SEQ ID NO: 16) CWWWESGYSMVQEC (SEQ ID NO: 17) CWVSGHNSWVKINC (SEQ ID NO: 18) CVWEPIDFTYVQHC (SEQ ID NO: 19) CTWTHIGKSLIIQC (SEQ ID NO: 20) CEWVFFPQTKTMVC (SEQ ID NO: 21) CWHPANFSMLYQC (SEQ ID NO: 22) CWKHVRYTMLQIPC (SEQ ID NO: 23) CKWMQKGFSMIQMC (SEQ ID NO: 24) CVWRARGYSMVQMC (SEQ ID NO: 25) CFWHHRGASMIRMC (SEQ ID NO: 26) CWWEARNWSVIQHC (SEQ ID NO: 27) CWHDEGYQMTWYC (SEQ ID NO: 28) CLWVEWPTMWELRC (SEQ ID NO: 29) CWESLGYSYVIVPC (SEQ ID NO: 30)
  • the peptide capable of binding to the SCF receptor has a cyclic structure, the cyclic structure comprising the amino acid sequence represented by formula (1) and represented by SEQ ID NOS: 16-30. It is formed from an amino acid sequence having a sequence identity of 80% or more, 85% or more, or 90% or more with any one amino acid sequence selected from the amino acid sequences.
  • the peptide capable of binding to the SCF receptor has a cyclic structure, and the cyclic structure is formed from any one of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOS: 16-30.
  • WX 4-7 (S/T) of the amino acid sequence represented by the following formula (4) relates to a peptide having an agonistic activity to the SCF receptor.
  • WX 1-3 (G/P) X 1-3 (S/T) Formula (4) (Wherein, each X independently represents any amino acid residue as defined in formula (1), provided that the total number of Xs in formula (4) is at least three.)
  • the notation "(G/P)" means either G or P.
  • the notation "(S/T)” means either S or T.
  • X 1-3 means that X (ie, any amino acid residue) is 1 or 2 to 3 consecutively present. Each X is independently selected and each X can be the same or different. Although X is not particularly limited, it may be, for example, an amino acid residue listed in Table 1 above.
  • Each X in “X 1-3 " present on the N-terminal side of "(G/P)” can correspond to X1, X2, and X3 described with respect to formula (1).
  • Each X in “X 1-3 ” present on the C-terminal side of “(G/P)” is X3, X4, and X5; X4, X5, and X6; or X5, X6 and X7. For these exemplary X's, what has been explained in equation (1) is applicable.
  • an amino acid sequence consisting of the amino acid sequence represented by formula (1) and one amino acid residue on the C-terminal side thereof is an amino acid sequence represented by the following formula (5).
  • WX 1-3 (G/P)X 1-3 (S/T)X(I/V)(Q/K/R) Formula (5) (Wherein, each X independently represents any amino acid residue as defined in formula (1), provided that the total number of Xs in formula (5) is at least three.)
  • the notation "(G/P)” means either G or P.
  • the notation "(S/T)” means either S or T.
  • the notation "(I/V)” means either I or V.
  • the notation "(Q/K/R)” means Q, K, or R.
  • the notation of “X 1-3 ” is as explained in formula (4).
  • the amino acid sequence represented by formula (5) is the amino acid sequence represented by formula (6) below.
  • WX 1-3 (G/P)X 1-3 (S/T) ⁇ (I/V)(Q/K/R) Formula (6) (Wherein, ⁇ and X are each as defined in formula (1), ⁇ represents an amino acid residue selected from W, F, Y, L, V, I and M, and X is , each independently represents any amino acid residue, provided that the total number of Xs in formula (6) is at least three.) "(G/P)" notation, “(S/T)” notation, "(I/V)” notation, "(Q/K/R)” notation, and "X 1 " ⁇ 3 ” is as described in formula (4) or (5), respectively. In one embodiment, the total number of X's in the amino acid sequence represented by formula (6) is four.
  • the amino acid sequence represented by formula (6) is the amino acid sequence represented by formula (7) below.
  • WX3GXS (L/M)(I/V)(Q/R) Equation (7) (Wherein, each X independently represents any amino acid residue as defined in formula (1).)
  • the notation "(L/M)” means either L or M.
  • the notation "(I/V)” means either I or V.
  • the notation “(Q/R)” means either Q or R.
  • the notation “X 3 ” means that three consecutive Xs (that is, arbitrary amino acid residues) are present. Each X is independently selected and each X can be the same or different.
  • Each X in “X 3 ” can correspond to, but is not limited to, X1, X2, and X3 described with respect to formula (1).
  • X present between G and S in the amino acid sequence represented by formula (7) is not particularly limited, but can correspond to X5 described in relation to formula (1), and has the content described in formula (1) is applicable.
  • the amino acid sequence represented by formula (7) is the amino acid sequence represented by formula (8) below.
  • WX 3 GXSM(I/V)(Q/R) Equation (8) (Wherein, each X independently represents any amino acid residue as defined in formula (1).)
  • the notation “(I/V)”, the notation “(Q/R)”, and the notation “X 3 ” have the same meanings as those described in formula (7), and formula (7 ) can be applied.
  • X present between G and S in the amino acid sequence represented by formula (8) is not particularly limited, but can correspond to X5 described in relation to formula (1), and has the content described in formula (1) is applicable.
  • the amino acid sequence represented by formula (4) has 75% or more sequence identity with any one amino acid sequence selected from the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 31 to 39 below.
  • WSHRGSS (SEQ ID NO: 31) WESGYS (SEQ ID NO: 32) WVSGHNS (SEQ ID NO: 33) WEPIDFT (SEQ ID NO: 34) WTHIGKS (SEQ ID NO: 35) WVFFPQTKT (SEQ ID NO: 36) WMQKGFS (SEQ ID NO: 37) WESLGYS (SEQ ID NO: 38) WRARGYS (SEQ ID NO: 39)
  • the amino acid sequence represented by formula (4) has 85% or more sequence identity with any one amino acid sequence selected from the amino acid sequences represented by SEQ ID NOS:31-39. In one aspect, the amino acid sequence represented by formula (4) is selected from the amino acid sequences represented by SEQ ID NOS:31-39.
  • the amino acid sequence represented by formula (5) has 75% or more sequence identity with any one amino acid sequence selected from the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 40 to 45 below.
  • WSHRGSSMIQ (SEQ ID NO: 40) WESGYSMVQ (SEQ ID NO: 41) WVSGHNSWVK (SEQ ID NO: 42) WEPIDFTYVQ (SEQ ID NO: 43) WMQKGFSMIQ (SEQ ID NO: 44) WRARGYSMVQ (SEQ ID NO: 45)
  • the amino acid sequence represented by formula (5) is any one amino acid sequence selected from the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 40 to 45 and 80% or more, 85% or more, or 90% or more of the sequence have identity. In one aspect, the amino acid sequence represented by formula (5) is selected from the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs:40-45.
  • the peptide having agonistic activity against the SCF receptor has a cyclic structure, wherein the cyclic structure comprises an amino acid sequence represented by formula (4) or an amino acid sequence represented by formula (5), It is formed from an amino acid sequence having 75% or more sequence identity with any one amino acid sequence selected from the amino acid sequences shown in SEQ ID NOS: 16-21, 24, 25 and 30 below.
  • CFWHSRGSSMIQHC (SEQ ID NO: 16) CWWWESGYSMVQEC (SEQ ID NO: 17) CWVSGHNSWVKINC (SEQ ID NO: 18) CVWEPIDFTYVQHC (SEQ ID NO: 19) CTWTHIGKSLIIQC (SEQ ID NO: 20) CEWVFFPQTKTMVC (SEQ ID NO: 21) CKWMQKGFSMIQMC (SEQ ID NO: 24) CVWRARGYSMVQMC (SEQ ID NO: 25) CWESLGYSYVIVPC (SEQ ID NO: 30)
  • the peptide having agonistic activity to the SCF receptor has a cyclic structure, wherein the cyclic structure comprises an amino acid sequence represented by formula (4) or an amino acid sequence represented by formula (5), Formed from an amino acid sequence having 80% or more, 85% or more, or 90% or more sequence identity with any one amino acid sequence selected from the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 16 to 21, 24, 25 and 30 It is in one aspect, the peptide having agonistic activity to the SCF receptor has a cyclic structure, and the cyclic structure is composed of any one of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOS: 16-21, 24, 25 and 30. formed.
  • the cyclic structure in the peptides described herein is not particularly limited. It may consist of 25 or fewer, 20 or fewer, or 15 or fewer amino acid residues.
  • the loop structure in the peptides described herein is not particularly limited. For example, it may consist of 2 or more, 3 or more, 4 or more, or 5 or more amino acid residues, It may consist of 23 or fewer, 18 or fewer, or 13 or fewer amino acid residues.
  • the loop structure is not particularly limited.
  • IgV-like domain, anti-GFP single domain antibody, Fc region such as IgG antibody, human growth hormone, serum albumin, retinol binding protein, placental alkaline phosphatase, or VP3 capsid protein sequence from adeno-associated virus serotype 2, or their It can contain subsequences.
  • the peptides described herein can be made based on well-known peptide synthesis methods, for example, chemical synthesis techniques or biological techniques can be used to prepare the peptides described herein.
  • the peptides described herein may form peptide dimers with two molecules.
  • Peptide dimers may be heterodimers or homodimers.
  • One embodiment described herein relates to a peptide dimer comprising two molecules of the peptides described herein.
  • the peptide dimer is a homodimer.
  • the peptide dimer has a structure that connects two peptide chains with a short linker.
  • Peptide dimers include, but are not limited to, WO2021/112249, Chen, et al., Adv Drug Deliv Rev., 2013 October 15; 65(10): 1357-1369, Tan, et al., Nature Communications, 2019; 10: 439; Troup, et al., Explor Target Antitumor Ther., 2020; ) can be exemplified by a peptide dimer having a linker as described in .
  • Peptide dimers can be prepared by applying known techniques. For example, peptide dimers can be prepared by the methods described in the above documents such as International Publication No. 2021/112249.
  • the peptide dimer has a linker site consisting of 49 or less amino acid residues, and at least 90%, at least 95%, or 100% of the amino acid sequence of the linker site is selected from A, P and S. comprising or consisting of amino acid residues
  • the peptide dimer has a linker site comprising or consisting of a sequence consisting of G and S (e.g., a sequence comprising repeating amino acid sequences selected from the group consisting of GGGGS, GGGS, GGS, and GS).
  • the peptide dimer has a linker site comprising or consisting of repeats of the amino acid sequence shown by EAAAK.
  • the above-mentioned peptide dimer can be obtained by linking two peptide molecules described herein with a linker, but the peptides described herein are not limited to peptides, and are desired drugs (e.g., anticancer drugs). or a photosensitizer, or a labeling compound), or a desired functional sequence (e.g., a tag sequence, an enzyme recognition sequence, a target binding sequence, or a sequence useful for enhancing peptide expression, stability, or water solubility); , may be linked via a linker.
  • the linker that connects the peptide described herein and the desired drug or functional sequence is not particularly limited.
  • linker comprising or consisting of amino acid residues selected from A, P and S, a sequence consisting of G and S (e.g., selected from the group consisting of GGGGS, GGGS, GGS, and GS A linker containing or consisting of repeats of the amino acid sequence represented by EAAAK, or a linker containing or consisting of repeats of the amino acid sequence shown by EAAAK.
  • linkers that connect the peptides described herein and the desired drug or functional sequence are described in Tsuchikama and An, Protein & Cell, 2018; 9: 33-46, Poreba, The FEBS Journal, 2020; 287: 1936. -1969, Bargh, Chem. Soc. Rev., 2019; 48(16): 4361-4374, the contents of which are hereby incorporated by reference as being incorporated herein by reference. ).
  • sequences for enhancing the stability or water solubility of peptides include JP-T-2013-531480 (herein, the contents of this document are cited by reference as constituting a part of the present specification). and a random coil polypeptide containing an amino acid sequence consisting of at least 50 proline and alanine amino acid residues as described in JP-T-2010-531139 (herein, as a part of this specification, the document (the content of which is incorporated by reference)), but are not limited thereto.
  • Sequences for enhancing peptide stability include, for example, the Fc protein.
  • Fc proteins are also useful as scaffolds for dimerizing peptides, and the peptides described herein may form peptide dimers using Fc proteins as scaffolds.
  • Fc protein and the formation of peptide dimers using Fc protein as a scaffold are described in WO 2017/191817, WO 2019/240287, WO 2022/154116, WO 2022/154127, etc. (The contents of these documents are cited here by reference as constituting a part of the present specification.).
  • Specific examples of enzyme identification sequences include, but are not limited to, SortaseA identification signals, Butelase identification signals, Transglutaminase identification signals, and the like.
  • tag sequences include, but are not limited to, FLAG tags, PA tags, histidine tags, and the like.
  • target-binding sequences include, but are not limited to, low-molecular-weight antibodies such as VHH and scFv.
  • the functional sequence can consist of, for example, 3 or more, 6 or more, 10 or more, or 12 or more amino acid residues, 1000 or less, 500 or less, 300 or less, or It can consist of 150 or fewer amino acid residues.
  • the peptides described herein may comprise a dimerization domain comprising a cysteine residue and a leucine zipper region and may form peptide dimers via this dimerization domain.
  • the dimerization domain is preferably present in a chain-like portion other than the cyclic structure or loop structure.
  • the dimerization domain may bind to the peptides described herein via the same linkers described above as linkers capable of connecting two molecules of the peptides described herein.
  • the leucine zipper region in the dimerization domain is a region that forms an ⁇ -helix and has a leucine residue every seven residues.
  • the leucine zipper region is not particularly limited, but can consist of, for example, 60 or less, 45 or less, 35 or less, or 25 or less amino acid residues.
  • the leucine zipper region in the dimerization domain is not particularly limited as long as it forms a dimer. Jun ⁇ hep (M. D. Ballinger et al., Nat. Biotechnol. 17, 1199-1204 (1999), incorporated herein by reference), deficient in heparin-binding ability by replacing the positively charged amino acids in the domain with glutamine.
  • the content of the document is cited as a reference.) and the like.
  • Specific examples of the leucine zipper region include, but are not limited to, those containing the following amino acid sequences and those consisting of the following amino acid sequences.
  • the leucine zipper region in the dimerization domain may have its heparin binding ability removed.
  • the pharmaceutical composition is a pharmaceutical composition for treating cancer.
  • the pharmaceutical composition is a cancer angiogenesis inhibitor.
  • cancer include, but are not limited to, leukemia and KIT (CD117)-positive tumors (KIT (CD117)-positive gastrointestinal stromal tumors, etc.).
  • KIT CD117-positive tumors
  • the above-mentioned pharmaceutical composition related to cancer therapy and angiogenesis inhibition may contain a peptide having antagonistic activity to the SCF receptor.
  • treatment means curing a subject's disease, ameliorating a subject's symptoms, inhibiting disease progression in a subject, or inhibiting exacerbation of symptoms in a subject.
  • a "subject” is not particularly limited, but can be, for example, a vertebrate or a mammal. Examples of mammals include humans, cows, horses, goats, sheep, dogs and cats, and in one aspect, humans.
  • the pharmaceutical composition comprises a peptide as described herein conjugated to a desired agent via a linker.
  • the pharmaceutical composition can be used in applications depending on the drug attached via the linker to the peptides described herein.
  • the pharmaceutical composition can be used for cancer treatment.
  • the agent attached to the peptides described herein via a linker is a photosensitizer, the pharmaceutical composition is used for treating cancer by photodynamic therapy. be able to.
  • the pharmaceutical composition is used for the diagnosis of diseases associated with SCF receptor expression. can do.
  • a labeling compound is a compound that can be detected using physical and/or chemical properties, and examples thereof include enzymes, fluorescent substances, luminescent substances, and radioactive isotopes.
  • the peptide described herein, which is bound to the desired drug via a linker has antagonistic activity against the SCF receptor, it exerts or enhances the cancer therapeutic effect.
  • the peptide portion may be for conferring targeting.
  • Anticipated targets for conferring target directivity include, but are not limited to, SCF receptor-expressing cells (T cells, etc.), SCF receptor-bearing proteosomes, and the like.
  • the pharmaceutical composition contains pharmaceutically acceptable carriers, solvents, diluents, excipients, stabilizers, buffers, binders, disintegrants, surfactants, colorants, flavoring agents, and the like. It may contain additives that can be used in medicine. As these additives, those known to those skilled in the art can be used.
  • the administration route of the pharmaceutical composition is not particularly limited as long as it is a route that is generally adopted, and specific examples include oral, sublingual, nasal, pulmonary, transgastrointestinal, transdermal, and intravenous. Examples include intramuscular injection, subcutaneous injection, and intramuscular injection.
  • a therapeutically effective amount or a diagnostically effective amount of a peptide, peptide dimer or peptide homodimer described herein can be administered to a subject by administering the pharmaceutical composition to the subject.
  • a “therapeutically effective amount” means an amount that exhibits a therapeutic effect depending on the disease, symptom, and/or administration route, and is determined on a case-by-case basis.
  • a “diagnostically effective amount” means an amount required for diagnosis depending on the disease and/or administration route, and is determined individually and specifically.
  • a subject in need of treatment for a disease comprises administering a therapeutically effective amount of a peptide, peptide dimer or peptide homodimer described herein, or treatment Methods of treating such diseases are provided comprising administering an effective amount of a pharmaceutical composition comprising a peptide, peptide dimer or peptide homodimer as described herein.
  • a pharmaceutical composition comprising a peptide, peptide dimer or peptide homodimer as described herein.
  • a subject in need of diagnosis of a disease is administered a diagnostically effective amount of a peptide, peptide dimer or peptide homodimer described herein. or administering a pharmaceutical composition comprising a diagnostically effective amount of a peptide, peptide dimer or peptide homodimer described herein. Any of the matters described above with respect to such diagnostic methods may be applied.
  • a peptide, peptide dimer or peptide homodimer as described herein for use in treating disease (eg cancer).
  • Cells to be cultured include, but are not limited to, stem cells.
  • Stem cells include, but are not limited to, induced pluripotent stem cells (iPS cells), embryonic stem cells (ES cells), mesenchymal stem cells (e.g., adipose tissue-derived stem cells, bone marrow-derived stem cells, cord blood-derived stem cells, placenta-derived stem cells).
  • stem cells hematopoietic stem cells, neural stem cells, and the like.
  • One embodiment described herein relates to a cell culture additive comprising a peptide, peptide dimer or peptide homodimer as described herein.
  • Additives for cell culture may be added directly to cells, may be added to a medium containing cells, may contain components other than the peptides, peptide dimers or peptide homodimers described herein good.
  • the medium to which cell culture additives are added those well known to those skilled in the art can be applied, and the medium may contain additives well known to those skilled in the art as appropriate.
  • the cells to be cultured can be as described above.
  • One embodiment described herein relates to a cell culture method comprising contacting a cell with a peptide, peptide dimer or peptide homodimer described herein.
  • the step of contacting the peptide, peptide dimer or peptide homodimer described herein with the cell may be performed by directly adding the peptide, peptide dimer or peptide homodimer described herein to the cell or by adding the peptides, peptide dimers or peptide homodimers described herein to a medium containing As the medium, those well known to those skilled in the art can be applied, and the medium may appropriately contain additives well known to those skilled in the art.
  • the cells to be cultured can be as described above.
  • a peptide, peptide dimer or peptide homodimer as described herein in the manufacture of a cell culture medium.
  • Cells and media may be as described above.
  • One embodiment described herein relates to a cell differentiation inducer comprising a peptide, peptide dimer or peptide homodimer described herein.
  • the cell differentiation inducer may be added directly to the cells, or may be added to the medium containing the cells, and may contain components other than the peptides, peptide dimers, or peptide homodimers described herein. good.
  • the medium to which the cell differentiation inducer is added those well known to those skilled in the art can be applied, and the medium may appropriately contain additives well known to those skilled in the art.
  • Cells to be differentiated include, but are not limited to, stem cells.
  • Stem cells include, but are not limited to, induced pluripotent stem cells (iPS cells), embryonic stem cells (ES cells), mesenchymal stem cells (e.g., adipose tissue-derived stem cells, bone marrow-derived stem cells, cord blood-derived stem cells, placenta-derived stem cells). stem cells), hematopoietic stem cells, neural stem cells, and the like.
  • Cells to induce differentiation are not particularly limited, but examples include bone marrow progenitor cells, megakaryocyte/erythroblast progenitor cells, monocytes, neutrophils, basophils, mast cells, platelet-producing cells, megakaryocytes, erythrocytes, and the like. can.
  • One embodiment described herein relates to a method of inducing cell differentiation comprising contacting a cell with a peptide, peptide dimer or peptide homodimer described herein.
  • the step of contacting the peptide, peptide dimer or peptide homodimer described herein with the cell may be performed by directly adding the peptide, peptide dimer or peptide homodimer described herein to the cell or by adding the peptides, peptide dimers or peptide homodimers described herein to a medium containing As the medium, those well known to those skilled in the art can be applied, and the medium may appropriately contain additives well known to those skilled in the art.
  • Cells that are induced to differentiate can be as described above.
  • a peptide, peptide dimer or peptide homodimer as described herein for use in inducing cell differentiation may be as described above.
  • use of the peptide, peptide dimer or peptide homodimer described herein in the manufacture of a cell differentiation inducer may be as described above.
  • Example 1 Immobilization of c-Kit-Fc and Fc Proteins on Magnetic Beads Dispense 3 ⁇ L slurry of Dynabeads Protein G (Thermo Fisher Scientific) into tubes and add ice-cold 1x TBS-T (pH 7.6, TBS -T tablet (TaKaRa) was dissolved in Milli-Q water) and washed 3 times with 100 ⁇ L.
  • Dynabeads Protein G Thermo Fisher Scientific
  • Example 2 Selection of c-Kit-binding cyclic peptides by cDNA display is a method described in Biochemical and Biophysical Research Communications, Volume 503, Issue 3, Pages 2054-2060, 2018. was carried out according to The cyclic peptide library site used a mixture of peptides in which random sequences of 9 to 12 amino acids were cyclized by disulfide bonds between two cysteine side chains, as shown in FIG.
  • Library mRNA was prepared by transcribing four types of mixed library cDNA.
  • a peptide cDNA display library was prepared using 15 pmol of library mRNA per target.
  • Peptide cDNA display libraries were prepared by ligation of puromycin linkers to mRNA libraries, cell-free translation using Rabbit Reticulocyte Lysate, ligation of puromycin to the C-terminus, purification on StreptAvidin beads from a cell-free translation system, and on-bead , recovery from beads using RNaseT1, purification of peptide-linked cDNA (cDNA display molecule) using Ni-NTA beads, and buffer exchange to TBS-T. Quantitative PCR confirmed that the peptide cDNA display library contained more than 10 11 molecules per target. From round 2 onward, rhFc-immobilized Protein G beads were added to 500 nM in terms of rhFc, and subtraction was performed once in each round.
  • Example 3 Evaluation of binding activity of c-Kit-binding peptide candidate to c-Kit (Example 3-1) Preparation of c-Kit-binding peptide containing His tag From the amino acid sequence of the peptide obtained in Example 2, peptide We extracted the following two motifs that were conserved between the two.
  • c-Kit binding motif 1 WX 4-7 (S/T)X ⁇ (Wherein, each symbol is as defined in the above formula (1).
  • a more specific motif is the above formula (2), (2-1), (2-2) or (3) (indicated by c-Kit binding motif 2: HGN(I/V) Peptides containing each motif were evaluated by Enzyme-linked immunoSorbent assay (ELISA) to see if they could actually bind to c-Kit.
  • ELISA Enzyme-linked immunoSorbent assay
  • the following sequences (1) to (16) were designed as c-Kit-linked cyclic peptides having an affinity tag His-tag at the N-terminus.
  • His-CAP0208, His-CAP0164, His-CAP0005, His-CAP0378, His-CAP0148, His-CAP0020, His-CAP0325, His-CAP0040, His-CAP0001, His-CAP2006, His-CAP1248, His-CAP0115, His- CAP0242 and His-CAP0008 each contain c-Kit binding motif 1, and His-CAP0083 and His-CAP0140c-Kit each contain binding motif 2.
  • His-Neg peptide sequence which is a peptide sequence that does not bind to c-Kit, was designed.
  • the peptides designed as above were synthesized by cell-free expression.
  • Primer 1 (F25), Primer 2 (UTR) and primer 3 (R23) were synthesized by Eurofins Genomics Japan. These nucleotide sequences are shown in Tables 2 and 3 below.
  • the following His-Neg-DNA sequence was synthesized by Eurofins Genomics Japan Co., Ltd. as a DNA for His-Neg expression.
  • DNA for cell-free expression was prepared by PCR.
  • KOD-plus-ver.2 Toyobo was used for PCR.
  • a PCR premix solution was prepared according to the KOD-plus-ver.2 product protocol.
  • 50 ⁇ L of PCR premix solution 1 ⁇ L of template DNA solution prepared in advance from the His-peptide nucleotide sequence, 100 ⁇ M Primer 1 0.5 ⁇ L, 50 ⁇ M Primer 1 containing the region encoding each c-Kit binding cyclic peptide sequence ⁇ L was added and amplified by PCR.
  • Example 3-2 Evaluation of c-Kit binding of cyclic peptides by ELISA Evaluation of binding of cyclic peptides to c-Kit was performed using ELISA. An outline of the experiment is shown in FIG. Add a mixture of 1 ⁇ L of cell-free synthesis solution of each peptide and 100 ⁇ L of PBS (Nacalai Tesque) to a copper-coated plate (Thermo Fisher Scientific), incubate at 4°C for 30 minutes, and add Peptides were immobilized. The plate was washed 5 times with 200 ⁇ L of TBS-T (Takara Bio Inc.).
  • the reaction was stopped by adding 100 ⁇ L of 0.1 M sulfuric acid, and the coloration of the TMB substrate was quantified by measuring the absorbance at 450 nm with a plate reader.
  • the relative absorbance to His-Neg was calculated and the results are shown in FIG.
  • the wells on which the peptide containing the c-Kit binding motif 1 was immobilized exhibited high absorbance, indicating binding to c-Kit.
  • the wells in which the peptide containing the c-Kit binding motif 2 was immobilized showed low absorbance, indicating that it does not bind to c-Kit.
  • Example 4 Preparation of template DNA for peptide candidates retaining SCF-like activity , 1 type of sequence (CAP_0400) containing c-Kit binding motif 1 was designed, and a total of 9 types of peptides were selected.
  • CAP_0400 1 type of sequence
  • 9 types of peptides were selected as peptides having a His-tag, which is an affinity tag at the N-terminus, and a self-dimerization domain between the His-tag and the c-Kit-bound cyclic peptide are shown below.
  • 'His-Zipped-peptide' sequences (a) to (i) were designed. Template DNAs for these His-Zipped-peptide constructs were prepared by PCR. KOD-plus-ver.2 (Toyobo) was used for PCR.
  • a PCR premix solution was prepared according to the KOD-plus-ver.2 product protocol. For 20 ⁇ L of PCR premix solution, add 5 ⁇ L of pre-prepared DNA sequence (His-Zipped), 0.15 ⁇ L of 100 ⁇ M primer 1, and 0.3 ⁇ L of primer containing region encoding 50 ⁇ M of each c-Kit binding cyclic peptide sequence. In addition, it was amplified by PCR. Next, the PCR product, 0.15 ⁇ L of 100 ⁇ M primer 1 and 0.15 ⁇ L of 100 ⁇ M primer 2 were added to 20 ⁇ L of PCR premix solution and amplified by PCR.
  • PCR product 0.15 ⁇ L of 100 ⁇ M primer 1 and 0.15 ⁇ L of 100 ⁇ M primer 3 were added to 20 ⁇ L of PCR premix solution, and amplified by PCR to prepare full-length template DNA.
  • the thus-prepared PCR product containing the full-length template DNA was diluted 5-fold with MilliQ water, and an in vitro cell-free translation reaction was performed using PUREfrex 2.0 (Gene Frontier) to obtain each peptide solution.
  • Example 5 Evaluation of SCF-like Activity of c-Kit-Binding Peptide and Identification of Activity Motif SCF-like activity was evaluated by eXpress c-KIT Functional Assay.
  • the frozen cells were quickly thawed, resuspended in the Cell Plating Reagent provided with the product, seeded in a 384-well plate, and cultured for 20 hours or longer.
  • CAP_2006 peptide solution was added to the culture medium so that the final dilution ratio was 110 times, 220 times, 440 times, 880 times or 1760 times, and cultured at room temperature for 3 hours. These were used as a sample addition group.
  • a non-addition group was prepared by culturing at room temperature for 3 hours without adding the peptide solution. A premix was prepared with Cell Assay buffer, Substrate reagent 1, and Substrate reagent 2 attached to the product, and the required amount was added to each of the sample addition group and non-addition group. After further incubation for 1 hour at room temperature in a light-shielded environment, luminescence intensity was measured.
  • Example 6 Preparation of Template DNA for Cyclic Homodimeric Peptide Retaining SCF-like Activity
  • CAP_0001, CAP_0005, CAP_0148, and CAP_2006 Four types of peptides (CAP_0001, CAP_0005, CAP_0148, and CAP_2006) were selected from the sequences whose binding activity was confirmed in Example 3.
  • the "STaMPtide" sequences (j) to (o) containing a peptide sequence connecting two of these sequences (the same ones) with a peptide linker mainly composed of alanine and proline residues.
  • CAP_S_0001-DNA, CAP_S_0005-DNA, CAP_S_0148-DNA, CAP_S_2006_PA 8-DNA, CAP_S_2006_PA22-DNA, CAP_S_2006_PAS49-DNA was obtained by total gene synthesis at Eurofins Genomics Japan.
  • a template DNA required for cell-free translation was prepared from each STaMPtide construct obtained by PCR.
  • Example 7 Evaluation of SCF-like activity of c-Kit-binding peptides and identification of activity motifs
  • a total of six STaMPtide expression products prepared in Example 6 were evaluated for SCF-like activity by PathHunter (registered trademark) eXpress c-KIT Functional Assay. evaluated.
  • the frozen cells were quickly thawed, resuspended in the Cell Plating Reagent provided with the product, seeded in a 384-well plate, and cultured for 20 hours or longer.
  • a peptide solution prepared in advance in a dilution series was added in an appropriate amount to the medium so that the final dilution ratio was 110-fold, 330-fold, or 990-fold, and cultured at room temperature for 3 hours.
  • the final dilution ratio of the peptide solution prepared in advance against the medium is 110 times, 220 times, 440 times, 880 times, 1760 times, 3520 times, 7040 times, 14080 times, and 28160 times. , or 56320-fold, and cultured at room temperature for 3 hours.
  • a suitable amount of the cell-free translation solution to which no template DNA was added was added so as to achieve the above final dilution ratio, and the cells were cultured at room temperature for 3 hours to form a non-addition group.
  • a premix was prepared with Cell Assay buffer, Substrate reagent 1, and Substrate reagent 2 attached to the product, and the required amount was added to each of the sample addition group and non-addition group. After further incubation for 1 hour at room temperature in a light-shielded environment, luminescence intensity was measured. The difference between the value of the sample addition group and the non-addition group was calculated, and the activity intensity was evaluated as the relative luminescence intensity.
  • FIGS. 7 and 8. The results are shown in FIGS. 7 and 8.
  • Activity was observed for CAP_S_2006_PA8 and CAP_S_2006_PA22 at 110-fold, 220-fold and 440-fold dilution ratios.
  • CAP_S_2006_PAS49 was found to have higher activity than CAP_S_2006_PA8 and CAP_S_2006_PA22.
  • Example 8 Synthesis of Fc protein (Fc)-peptide conjugate having a lysine residue at the N-terminus [Example 8-1] Synthesis of peptide (P-1)
  • Example 8-1-1 Solid phase synthesis of peptide 4-azidobenzoic acid-Gly-Ser-Cys-Val-Trp-Arg-Ala-Arg-Gly-Tyr-Ser-Met-Val-Gln-Met-
  • a peptide designated Cys-NH 2 (SEQ ID NO: 111) was synthesized by the Fmoc solid-phase synthesis method.
  • Liberty Blue (CEM) was used as a peptide synthesizer.
  • C-terminally amidated and N-terminally capped with 4-azidobenzoic acid (TCI) were prepared by solid-phase peptide synthesis.
  • Example 8-1-2 Formation of intramolecular disulfide bond at Cys of peptide
  • the peptide synthesized in Example 8-1-1 was dissolved in DMSO, and 0.1 M Tris-HCl solution (pH 8.0) was added. . Glutathione oxidized form was added to this solution and stirred at room temperature for 20 hours.
  • a 2M trifluoroacetic acid aqueous solution was added to the reaction solution to terminate the reaction, which was then dissolved in a 0.05% trifluoroacetic acid aqueous solution and subjected to reversed-phase high-performance liquid chromatography using octadodecyl-bonded silica gel as a packing material.
  • Fc protein having a lysine residue at the N-terminus An Fc protein (Fc) represented by SEQ ID NO: 112 was synthesized according to the method described in WO 2017/191817.
  • SEQ ID NO: 112 Lys-Thr-His-Thr-Cys-Pro-Pro-Cys-Pro-Ala-Pro-Glu-Leu-Leu-Gly-Gly-Pro-Ser-Val-Phe-Leu-Phe-Pro-Pro-Lys- Pro-Lys-Asp-Thr-Leu-Met-Ile-Ser-Arg-Thr-Pro-Glu-Val-Thr-Cys-Val-Val-Val-Asp-Val-Ser-His-Glu-Asp-Pro- Glu-Val-Lys-Phe-Asn-Trp-Tyr-Val-Asp-Gly-Val-Glu-Val-His-Asn-Ala-Lys-Thr
  • Example 8-3 Synthesis of an Fc protein having a lysine residue at the N-terminus having two DBCO groups (Example 8-3-1) Lysine residue at the N-terminus having two thiol groups at Lys27 Synthesis of Fc protein with For the Fc prepared in Example 8-2, using the peptide reagent (P-2) described in the previous report (International Publication No. 2019/240287), according to the method described in the document, from the N-terminus of the Fc protein A thiol group was introduced to the 27th lysine residue (Lys27).
  • P-2 is obtained by modifying the side chain amino group of the eighth lysine residue from the N-terminus of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:113.
  • Example 8-3-2 Synthesis of Fc protein having two thiol groups at Lys67 and having a lysine residue at the N-terminus
  • Fc prepared in Example 8-2, using the peptide reagent (P-3) described in the previous report (International Publication No. 2022/154116), according to the method described in the document, from the N-terminus of the Fc protein A thiol group was introduced to the 67th lysine residue (Lys67).
  • ESI-TOFMS analysis was performed according to a previous report (International Publication No. 2019/240287), and peaks were observed at 56346 and 56508, confirming the introduction of two molecules of thiol groups.
  • P-3 is obtained by modifying the side chain amino group of the 31st lysine residue from the N-terminus of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:114.
  • Example 8-3-3-3 Synthesis of Fc (F-1) having two dibenzocyclooctyne (DBCO) groups
  • a DBCO group was introduced according to the description in the literature using the Fc into which the thiol group was introduced prepared in Example 8-3-1 and the reagent (P-4) described in the previous report (International Publication No. 2022/154127).
  • ESI-TOFMS analysis was performed according to the previous report (International Publication No. 2019/240287), peaks were observed at 57187 and 57349, and it was confirmed that two molecules of DBCO groups were introduced.
  • Example 8-3-6 Synthesis of Fc (F-4) having two molecules of DBCO groups
  • Fc introduced with a thiol group prepared in Example 8-3-2 was used instead of the Fc introduced with a thiol group prepared in Example 8-3-1.
  • Fc (F-4) introduced with a PEG12-DBCO group was obtained.
  • ESI-TOFMS analysis was performed according to the previous report (International Publication No. 2019/240287), peaks were observed at 58400 and 58561, and it was confirmed that two molecules of DBCO groups were introduced.
  • Example 8-4 Synthesis of Fc protein (Fc)-peptide conjugate having a lysine residue at the N-terminus (Example 8-4-1) Fc protein (Fc)-peptide having a lysine residue at the N-terminus Synthesis of conjugate (C-1)
  • P-1 The cyclic peptide synthesized in Example 8-1 (P-1 ) (6 equivalents to Fc, dimethylformamide (DMF) (8% v/v) solution) was added, and the mixture was shaken at room temperature for 20 hours.
  • the reaction solution was purified using a NAP-25 desalting column (manufactured by Cytiva) to obtain Fc (C-1) into which two molecules of peptide reagents had been introduced.
  • ESI-TOFMS analysis was performed according to the previous report (International Publication No. 2019/240287), peaks were observed at 61137 and 61299, and it was confirmed that two molecules of P-1 were introduced.
  • Example 8-4-2 Synthesis of Fc protein (Fc)-peptide conjugate (C-2) having a lysine residue at the N-terminus
  • the reaction and purification were carried out in the same manner as in Example 8-4-1, except that Fc (F-2) having a DBCO group prepared in Example 8-3-4 was used instead of F-1.
  • a molecular peptide reagent (P-1) introduced Fc (C-2) was obtained.
  • ESI-TOFMS analysis was performed according to the previous report (International Publication No. 2019/240287), peaks were observed at 61646 and 61808, and it was confirmed that two molecules of P-1 were introduced.
  • Example 8-4-3 Synthesis of Fc protein (Fc)-peptide conjugate (C-3) having a lysine residue at the N-terminus
  • the reaction and purification were carried out in the same manner as in Example 8-4-1, except that Fc (F-3) into which a DBCO group was introduced prepared in Example 8-3-5 was used instead of F-1.
  • a molecular peptide reagent (P-1) introduced Fc (C-3) was obtained.
  • ESI-TOFMS analysis was performed according to a previous report (International Publication No. 2019/240287), and peaks were observed at 62350 and 62512, confirming the introduction of two molecules of P-1.
  • Example 8-4-4 Synthesis of Fc protein (Fc)-peptide conjugate (C-4) having a lysine residue at the N-terminus
  • the reaction and purification were carried out in the same manner as in Example 8-4-1, except that Fc (F-4) into which a DBCO group was introduced prepared in Example 8-3-6 was used instead of F-1.
  • a molecular peptide reagent (P-1) introduced Fc (C-4) was obtained.
  • ESI-TOFMS analysis was performed according to a previous report (International Publication No. 2019/240287), peaks were observed at 62350 and 62512, and it was confirmed that two molecules of P-1 were introduced.
  • Example 9 Evaluation of SCF-like activity of Fc-peptide conjugate
  • the Fc-peptide conjugate (C-3) synthesized in Example 8 was evaluated for SCF-like activity by PathHunter (registered trademark) eXpress c-KIT Functional Assay. .
  • the frozen cells were quickly thawed, resuspended in the Cell Plating Reagent provided with the product, seeded in a 384-well plate, and cultured for 20 hours or longer.
  • Fc-peptide conjugate solution was added to the cells at final concentrations of 405.0, 202.5, 101.2, 50.6, 25.3, 12.7, 6.3, 3.2, 1.6, 0.8, 0.4 ⁇ g/mL and incubated at room temperature for 3 hours.
  • a non-addition group was prepared by adding only the Cell Plating Reagent and culturing at room temperature for 3 hours. A premix was prepared with Cell Assay buffer, Substrate reagent 1, and Substrate reagent 2 attached to the product, and the required amount was added to each of the sample addition group and non-addition group. After further incubation for 1 hour at room temperature in a light-shielded environment, luminescence intensity was measured. The difference between the value of the sample addition group and the non-addition group was calculated, and the activity intensity was evaluated as the relative luminescence intensity. The results are shown in FIG.
  • Example 10 Evaluation of specificity of Fc-peptide conjugate Receptor tyrosine kinase (RTK) specificity of Fc-peptide conjugate (C-3) was evaluated using Proteome Profiler Human Phospho-RTK Array Kit (R&D Systems) bottom.
  • Confluent HEL cells were placed in a 10 cm cell culture dish in RPMI-Gluta Max (Thermo Fisher Scientific) medium containing 0.5% FBS (Thermo Fisher Scientific) and penicillin-streptomycin (Nacalai Tesque). The cells were starved by culturing for 24 hours. Starved HEL cells were stimulated with RPMI-Gluta Max medium containing 1000 ng/mL C-3 at 37° C. for 15 minutes.
  • FIG. 10 shows the results of quantifying the spot intensity using ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/). The extent of c-Kit phosphorylation by C-3 was higher after stimulation with 10 ng/mL SCF and lower than after stimulation with 100 ng/mL. These results revealed that C-3 performs c-Kit-specific activation.
  • FIG. 12 shows each array of Proteome Profiler Human Phospho-RTK Array Kit (R&D Systems).
  • Example 11 Evaluation of SCF-Like Activity of Fc-Peptide Conjugates The Fc-peptide conjugates synthesized in Example 8 (C-1, C-2, C-3, and C-4) SCF-like activity was evaluated by eXpress c-KIT Functional Assay. The frozen cells were quickly thawed, resuspended in the Cell Plating Reagent provided with the product, seeded in a 384-well plate, and cultured for 20 hours or longer. Each of the C-1, C-2, C-3, and C-4 solutions was added to the cells in an 11-point 2-fold dilution series, and cultured at room temperature for 3 hours to form a sample addition group.
  • a non-addition group was prepared by adding only the Cell Plating Reagent and culturing at room temperature for 3 hours.
  • a premix was prepared with Cell Assay buffer, Substrate reagent 1, and Substrate reagent 2 attached to the product, and the required amount was added to each of the sample addition group and non-addition group.
  • luminescence intensity was measured. The difference between the value of the sample addition group and the non-addition group was calculated, and the activity intensity was evaluated as the relative luminescence intensity. The results are shown in FIG.

Abstract

SCF受容体（c-Kit）に結合することのできる新規なペプチドを提供する。例えば、新規なペプチドは、環状構造又はループ構造を有するペプチドであって、前記環状構造又は前記ループ構造のアミノ酸配列が下式（１）で示されるアミノ酸配列を含み、SCF受容体に結合することのできるペプチドである。　WX4-7(S/T)XΦ　式（１） （式中、Φは、W、F、Y、L、V、I及びMから選択されるアミノ酸残基を表し、Xは、それぞれ独立に、任意のアミノ酸残基を表す。）

Description

ＳＣＦ受容体結合ペプチド
　本発明は、SCF受容体に結合することのできるペプチド及びSCF受容体に対するアゴニスト活性を有するペプチド等に関する。
　細胞分化に重要な生体分子である成長因子には、二量体となって生物活性を発揮するもの又は生物活性が増強されるものが多くみられる。そのような成長因子の一つとして、幹細胞増殖因子（SCF）が知られており、医薬等、医療分野での利用が研究されている。
　しかしながら、SCF等の二量体となって生物活性を発揮する成長因子の生産には、コストや保存安定性等、様々な困難性がある。そのため、SCF代替分子の開発が求められ、いくつかの技術が検討されてきた。そのような技術としては、核酸分子（アプタマー）に関する技術（特許文献１）や天然の配列を含むSCF代替分子に関する技術（特許文献２及び３）が知られているが、これらの技術に基づくSCF代替分子では、これまで満足な成果は得られていない。従って、新規なSCF代替分子の開発が求められている。
　一方で、近年、新しい医薬のモダリティとして、中分子、特にペプチドが着目されている。中でも、環状ペプチド等の特殊な形状のペプチド（特殊ペプチド）が複数開発されており、医薬等、医療分野での応用が期待されるところである。
　環状ペプチドは、直鎖ペプチドと比べて優れた結合親和性、標的選択性、分解耐性等を有し得る。そのため、医薬等の分野での環状ペプチドの利用が有望視されている。
特許文献１：国際公開第2009/135198号
特許文献２：米国特許第6084066号明細書
特許文献３：国際公開第92/03459号
　本発明の一態様では、SCF受容体（「c-Kit」としても知られている。）に結合することのできる新規なペプチドを提供することを目的とする。
　また、本発明の別の態様では、SCF受容体（c-Kit）に対するアゴニスト活性を有するペプチドを提供することを目的とする。
　本発明者らは、鋭意検討した結果、環状構造又はループ構造を有するペプチドであって、SCF受容体に結合することのできるペプチド及びSCF受容体に対するアゴニスト活性を有するペプチドを新たに見出した。
　本発明は、例えば、以下の態様を含み得る。
〔１〕環状構造又はループ構造を有するペプチドであって、前記環状構造又は前記ループ構造のアミノ酸配列が下式（１）で示されるアミノ酸配列を含み、SCF受容体に結合することのできるペプチド。
　WX4-7(S/T)XΦ　　　式（１）
（式中、
　Φは、W、F、Y、L、V、I及びMから選択されるアミノ酸残基を表し、
　Xは、それぞれ独立に、任意のアミノ酸残基を表す。）
〔２〕前記式（１）で示されるアミノ酸配列が、下式（２）で示されるアミノ酸配列である、前記〔１〕に記載のペプチド。
　WX4-7(S/T)ΦΦ　　　式（２）
（式中、Φ及びXは、それぞれ前記〔１〕に記載の式（１）で定義されるとおりであり、Φはそれぞれ独立に選択される。）
〔３〕前記式（２）で示されるアミノ酸配列が、下式（３）で示されるアミノ酸配列である、前記〔２〕に記載のペプチド。
　WX5(S/T)ΦΨ　　　式（３）
（式中、Φ及びXは、それぞれ前記〔１〕に記載の式（１）で定義されるとおりであり、Ψは、L、V、I及びMから選択されるアミノ酸残基を表す。）
〔４〕Ψで表されるアミノ酸残基が、L、V及びIから選択される、前記〔３〕に記載のペプチド。
〔５〕前記式（１）で示されるアミノ酸配列が、下記配列番号１～１５で示されるアミノ酸配列から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列と75％以上の配列同一性を有する、前記〔１〕に記載のペプチド。
　WSHRGSSMI（配列番号：１）
　WESGYSMV（配列番号：２）
　WVSGHNSWV（配列番号：３）
　WEPIDFTYV（配列番号：４）
　WTHIGKSLI（配列番号：５）
　WVFFPQTKTMV（配列番号：６）
　WHPANFSML（配列番号：７）
　WKHVRYTML（配列番号：８）
　WMQKGFSMI（配列番号：９）
　WRARGYSMV（配列番号：１０）
　WHHRGASMI（配列番号：１１）
　WEARNWSVI（配列番号：１２）
　WHDEGYQMTWY（配列番号：１３）
　WVEWPTMW（配列番号：１４）
　WESLGYSYV（配列番号：１５）
〔６〕前記式（１）で示されるアミノ酸配列が、配列番号１～１５で示されるアミノ酸配列から選択される、前記〔５〕に記載のペプチド。
〔７〕環状構造を有するペプチドであって、前記環状構造が、前記〔１〕に記載の式（１）で示されるアミノ酸配列を含み、かつ下記配列番号１６～３０で示されるアミノ酸配列から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列と75％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列から形成されている、前記〔１〕に記載のペプチド。
　CFWSHRGSSMIQHC（配列番号：１６）
　CWWWESGYSMVQEC（配列番号：１７）
　CWVSGHNSWVKINC（配列番号：１８）
　CVWEPIDFTYVQHC（配列番号：１９）
　CTWTHIGKSLIIQC（配列番号：２０）
　CEWVFFPQTKTMVC（配列番号：２１）
　CWHPANFSMLYQC（配列番号：２２）
　CWKHVRYTMLQIPC（配列番号：２３）
　CKWMQKGFSMIQMC（配列番号：２４）
　CVWRARGYSMVQMC（配列番号：２５）
　CFWHHRGASMIRMC（配列番号：２６）
　CWWEARNWSVIQHC（配列番号：２７）
　CWHDEGYQMTWYC（配列番号：２８）
　CLWVEWPTMWELRC（配列番号：２９）
　CWESLGYSYVIVPC（配列番号：３０）
〔８〕前記環状構造が、配列番号１６～３０で示されるアミノ酸配列のいずれか１つから形成されている、前記〔７〕に記載のペプチド。
〔９〕式（１）で示されるアミノ酸配列中の部分配列：WX4-7(S/T)が、下式（４）で示されるアミノ酸配列である、SCF受容体に対するアゴニスト活性を有する前記〔１〕に記載のペプチド。
　WX1-3(G/P)X1-3(S/T)　　　式（４）
（式中、Xは、前記〔１〕に記載の式（１）で定義されるとおりであり、但し、式（４）においてXの総数は少なくとも３つである。）
〔１０〕式（１）で示されるアミノ酸配列と、そのC末側の１アミノ酸残基とからなるアミノ酸配列が、下式（５）で示されるアミノ酸配列である、前記〔９〕に記載のペプチド。
　WX1-3(G/P)X1-3(S/T)X(I/V)(Q/K/R)　　　式（５）
（式中、Xは、前記〔１〕に記載の式（１）で定義されるとおりであり、但し、式（５）においてXの総数は少なくとも３つである。）
〔１１〕式（５）で示される前記アミノ酸配列が、下式（６）で示されるアミノ酸配列である、前記〔１０〕に記載のペプチド。
　WX1-3(G/P)X1-3(S/T)Φ(I/V)(Q/K/R)　　　式（６）
（式中、Φ及びXは、それぞれ前記〔１〕に記載の式（１）で定義されるとおりであり、但し、式（６）においてXの総数は少なくとも３つである。）
〔１２〕式（６）で示される前記アミノ酸配列において、Xの総数が４つである、前記〔１１〕に記載のペプチド。
〔１３〕式（６）で示される前記アミノ酸配列が、下式（７）で示されるアミノ酸配列である、前記〔１２〕に記載のペプチド。
　WX3GXS(L/M)(I/V)(Q/R)　　　式（７）
（式中、Xは、前記〔１〕に記載の式（１）で定義されるとおりである。）
〔１４〕式（７）で示される前記アミノ酸配列が、下式（８）で示されるアミノ酸配列である、前記〔１３〕に記載のペプチド。
　WX3GXSM(I/V)(Q/R)　　　式（８）
（式中、Xは、前記〔１〕に記載の式（１）で定義されるとおりである。）
〔１５〕式（４）で示される前記アミノ酸配列が、下記配列番号３１～３９で示されるアミノ酸配列から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列と75％以上の配列同一性を有する、前記〔９〕に記載のペプチド。
　WSHRGSS（配列番号：３１）
　WESGYS（配列番号：３２）
　WVSGHNS（配列番号：３３）
　WEPIDFT（配列番号：３４）
　WTHIGKS（配列番号：３５）
　WVFFPQTKT（配列番号：３６）
　WMQKGFS（配列番号：３７）
　WESLGYS（配列番号：３８）
　WRARGYS（配列番号：３９）
〔１６〕式（４）で示される前記アミノ酸配列が、配列番号３１～３９で示されるアミノ酸配列から選択される、前記〔１５〕に記載のペプチド。
〔１７〕式（５）で示される前記アミノ酸配列が、下記配列番号４０～４５で示されるアミノ酸配列から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列と75％以上の配列同一性を有する、前記〔１０〕に記載のペプチド。
　WSHRGSSMIQ（配列番号：４０）
　WESGYSMVQ（配列番号：４１）
　WVSGHNSWVK（配列番号：４２）
　WEPIDFTYVQ（配列番号：４３）
　WMQKGFSMIQ（配列番号：４４）
　WRARGYSMVQ（配列番号：４５）
〔１８〕式（５）で示される前記アミノ酸配列が、配列番号４０～４５で示されるアミノ酸配列から選択される、前記〔１７〕に記載のペプチド。
〔１９〕環状構造を有するペプチドであって、前記環状構造が、前記〔９〕に記載の式（４）で示されるアミノ酸配列又は前記〔１０〕に記載の式（５）で示されるアミノ酸配列を含み、かつ下記配列番号１６～２１、２４、２５及び３０で示されるアミノ酸配列から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列と75％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列から形成されている、前記〔９〕又は〔１０〕に記載のペプチド。
　CFWSHRGSSMIQHC（配列番号：１６）
　CWWWESGYSMVQEC（配列番号：１７）
　CWVSGHNSWVKINC（配列番号：１８）
　CVWEPIDFTYVQHC（配列番号：１９）
　CTWTHIGKSLIIQC（配列番号：２０）
　CEWVFFPQTKTMVC（配列番号：２１）
　CKWMQKGFSMIQMC（配列番号：２４）
　CVWRARGYSMVQMC（配列番号：２５）
　CWESLGYSYVIVPC（配列番号：３０）
〔２０〕前記環状構造が、配列番号１６～２１、２４、２５及び３０で示されるアミノ酸配列のいずれか１つから形成されている、前記〔１９〕に記載のペプチド。
〔２１〕前記〔１〕～〔２０〕のいずれか１項に記載のペプチドを２分子含むペプチドダイマー。
〔２２〕前記〔１〕～〔２０〕のいずれか１項に記載のペプチドを２分子含むペプチドホモダイマー。
〔２３〕前記〔１〕～〔２２〕のいずれか１項に記載のペプチド、ペプチドダイマーまたはペプチドホモダイマーを含む医薬組成物。
〔２４〕前記〔１〕～〔２２〕のいずれか１項に記載のペプチド、ペプチドダイマーまたはペプチドホモダイマーを含む細胞培養用培地。
〔２５〕前記〔１〕～〔２２〕のいずれか１項に記載のペプチド、ペプチドダイマーまたはペプチドホモダイマーを含む細胞培養用添加剤。
〔２６〕前記〔１〕～〔２２〕のいずれか１項に記載のペプチド、ペプチドダイマーまたはペプチドホモダイマーを含む、細胞の分化誘導剤。
〔２７〕前記〔１〕～〔２２〕のいずれか１項に記載のペプチド、ペプチドダイマーまたはペプチドホモダイマーを細胞と接触させることを含む、細胞培養方法。
〔２８〕前記〔１〕～〔２２〕のいずれか１項に記載のペプチド、ペプチドダイマーまたはペプチドホモダイマーを細胞と接触させることを含む、細胞の分化を誘導する方法。
　本発明の一実施態様によれば、SCF受容体（c-Kit）に結合することのできる新規なペプチドを提供することができる。
　本発明の別の一実施態様によれば、SCF受容体（c-Kit）に対するアゴニスト活性を有するペプチドを提供することができる。
実施例２における環状ペプチドライブラリ部位を示す模式図である。 実施例２で行ったセレクションによる、SCF受容体（c-Kit）に結合するペプチドの濃縮を示すグラフである。縦軸のE/I比は、Elute/Input比を表す。 実施例３で行ったSCF受容体（c-Kit）に対するペプチドの結合評価の実験概要を示す模式図である。 実施例３で行ったSCF受容体（c-Kit）に対するペプチドの結合評価の結果を示すグラフである。縦軸は、His-Negに対する相対吸光度を表す。 実施例５で行ったSCF受容体（c-Kit）結合ペプチドのSCF様活性評価の結果を示すグラフである。縦軸は、サンプル添加群と無添加群における差分を考慮した相対発光強度で示したものである。10、30、90、270、810及び2430という値は、各ペプチド溶液の培地に対する終希釈倍率を意味する。 実施例５で行ったSCF受容体（c-Kit）結合ペプチドのSCF様活性評価の結果を示すグラフである。縦軸は、サンプル添加群と無添加群における差分を考慮した相対発光強度で示したものである。110、220、440、880及び1760という値は、各ペプチド溶液の培地に対する終希釈倍率を意味する。 実施例７で行ったSCF受容体（c-Kit）結合ペプチドのSCF様活性評価の結果を示すグラフである。縦軸は、サンプル添加群と無添加群における差分を考慮した相対発光強度で示したものである。110、330及び990という値は、各ペプチド溶液の培地に対する終希釈倍率を意味する。 実施例７で行ったSCF受容体（c-Kit）結合ペプチドのSCF様活性評価の結果を示すグラフである。縦軸は、サンプル添加群と無添加群における差分を考慮した相対発光強度で示したものである。横軸は、培地に対する各ペプチド溶液の濃度を表す。 実施例９で行ったFc－ペプチドコンジュゲートのSCF様活性評価の結果を示すグラフである。縦軸は、サンプル添加群と無添加群における差分を考慮した相対発光強度で示したものである。横軸は、培地に対する各ペプチド溶液の濃度を表す。 実施例１０で行ったFc－ペプチドコンジュゲートの受容体チロシンキナーゼ（RTK）特異性評価の結果を示す図である。 図１０で表されるスポットの強度を定量化して示すグラフである。 Proteome Profiler Human Phospho-RTK Array Kit（R&D Systems）の各アレイを示す図である。 実施例１１で行ったFc－ペプチドコンジュゲートのSCF様活性評価の結果を示すグラフである。縦軸は、サンプル添加群と無添加群における差分を考慮した相対発光強度で示したものである。横軸は、培地に対する各ペプチド溶液の濃度を表す。
　本明細書に記載の一実施態様は、環状構造又はループ構造を有するペプチドであって、前記環状構造又は前記ループ構造のアミノ酸配列が下記に説明される式（１）で示されるアミノ酸配列を含み、SCF受容体に結合することのできるペプチドに関する。
　本明細書に記載の一実施態様は、環状構造又はループ構造を有するペプチドであって、前記環状構造又は前記ループ構造のアミノ酸配列が下記に説明される式（４）で示されるアミノ酸配列を含み、SCF受容体に対するアゴニスト活性を有するペプチドに関する。
　本明細書において、「環状構造又はループ構造を有するペプチド」とは、その全体が環状構造又はループ構造であるペプチドに限定されるものでなく、環状構造又はループ構造と、それ以外の鎖状部分との両方を有するペプチドも包含される。なお、本明細書に記載のペプチドにおいて、各アミノ酸は、L-アミノ酸であってもD-アミノ酸であってもよく、任意のアミノ酸とされるものは、天然型であっても非天然型であってもよく、例えばα－、β－又はγ－アミノ酸であり、好ましくはα－アミノ酸である。
　本明細書においては、表１に示される１文字表記又は三文字表記のアミノ酸の表記が用いられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　本明細書において、「環状構造」とは、共有結合で環化されている構造を意味する。「共有結合で環化されている」ことの具体的な例としては、ジスルフィド結合、チオエーテル結合、又はアミド結合で環化されていることが挙げられるが、どのような結合様式で環状構造となっている（環化されている）かは特に限定されない。
　本明細書において、「ループ構造」とは、静電的相互作用、疎水的相互作用、水素結合等の非共有結合的な相互作用によって形成されている、ループ状に折り曲がった構造を意味する。特に限定されるものでないが、ループ構造と、ループ構造でない鎖状構造との境に位置する（言い換えれば、ループ構造の開始地点に位置する）ループ構造内の２つアミノ酸残基のＣα原子間距離は、例えば、４～７Åの範囲内にある。
　なお、ループ構造を有するタンパク質を足場として、環状ペプチドが有する構造と活性を保持させた状態で、環状ペプチド（環状ペプチドの生理活性部分）をタンパク質上に提示する方法が、国際公開第2019/026920号、国際公開第2020/027224号、及びMihara, et al., Nature Communications, 12, Article number: 1543 (2021)（ここに本明細書の一部を構成するものとしてこれらの文献の内容を参照により引用する。）に開示されており、これらの方法によれば、生理活性を示すための環状構造部分を、当該生理活性を保持したままタンパク質のループ構造中に挿入することが可能である。本明細書に記載のペプチドにおいても、上記方法に基づき、生理活性を示すための環状構造部分を、当該生理活性を保持したまま所望のループ構造中に挿入し得る。
　本明細書において、「SCF受容体に結合することのできるペプチド」には、SCF受容体に対するアゴニスト活性を有するもの、SCF受容体に対するアンタゴニスト活性を有するもの、SCF受容体に結合はするがほとんど又は全く活性を示さないものが含まれ得る。ここで、「SCF受容体に結合することのできるペプチド」及び「SCF受容体に対するアゴニスト活性を有するペプチド」等の表現は、ペプチドが完全に未修飾の形態又は完全に遊離の形態であるものを意図するのではない。「SCF受容体に結合することのできるペプチド」及び「SCF受容体に対するアゴニスト活性を有するペプチド」等の表現には、SCF受容体に結合することができるという性質又はSCF受容体に対するアゴニスト活性を有するという性質を有する限り、アミノ酸残基の側鎖が修飾されたもの、例えば保護されたもの及び糖鎖修飾されたものや、生物学的に又は医薬的に許容される塩として周知の塩の形態となっているものが含まれ得る。
　本明細書に記載のペプチドに関し、SCF受容体への結合能は、当業者に周知の方法により評価することができる。例えば、プレート上に試験対象のペプチドを固定化したもの、又はプレート上にSCF受容体タンパク質を固定化したものを準備し、ELISA法により試験対象のペプチドのSCF受容体への結合能を評価することができる。このようなSCF受容体への結合能の評価は、市販の製品及び試薬を用いて行うことができる。
　本明細書に記載のペプチドに関し、SCF受容体に対するアゴニスト活性は、当業者に周知の方法により評価することができる。例えば、化学的発光又は生物学的発光を利用したSCF受容体アゴニストのスクリーニングに使用可能な市販品を用いて、SCF受容体に対するアゴニスト活性を評価することができる。
　本明細書において、「Ｘ％以上の配列同一性」とは、（１００－Ｘ）％までのアミノ酸置換を許容できることを意味する。アミノ酸置換とは、基準となるアミノ酸配列におけるアミノ酸残基の、当該アミノ酸残基とは別の公知のアミノ酸残基への置換を意味する。アミノ酸置換の一態様としては保存的アミノ酸置換が挙げられるが、これに限定されるものではない。
　「保存的アミノ酸置換」は、類似した化学的性質（例えば、電荷又は疎水性）を伴う側鎖Ｒ基を有する別のアミノ酸残基によって、アミノ酸残基が置換された置換である。類似した化学的性質を伴う側鎖を有するアミノ酸基の例には、脂肪族側鎖を有するグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシン、脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するセリン及びスレオニン、アミド含有側鎖を有するアスパラギン及びグルタミン、芳香族側鎖を有するフェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン、塩基性側鎖を有するリシン、アルギニン、及びヒスチジン、並びに酸性側鎖を有するアスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれる。置換により導入される各アミノ酸は、L-アミノ酸であってもD-アミノ酸であってもよく、天然型アミノ酸であっても非天然型であってもよいが、好ましくは、ヒトや動物においてタンパク質を構成するアミノ酸である。
　式（１）で示されるアミノ酸配列は、以下のとおりである。
　WX4-7(S/T)XΦ　　　式（１）
（式中、
　Φは、W、F、Y、L、V、I及びMから選択されるアミノ酸残基を表し、
　Xは、それぞれ独立に、任意のアミノ酸残基を表す。）
　「(S/T)」との表記は、Sであるか、又はTであることを意味する。
　「X4-7」との表記は、X（即ち、任意のアミノ酸残基）が４～７個連続して存在することを意味する。Xはそれぞれ独立して選択され、各Xは同じであっても異なっていてもよい。
　Xについては特に限定されないが、例えば、上記表１に記載のアミノ酸残基であり得る。「X4-7」をN末端側からX1、X2、X3、X4、X5、X6及びX7とした場合、それぞれ以下のアミノ酸残基を例示することができるが、これらに限定されるものではない。
X1：S、E、V、T、H、K、M、R、D、L、I
X2：H、S、P、F、Q、A、D、E、K、R、T、Y、W、N、G
X3：R、G、I、F、A、V、K、E、W、L、H、Y、D、P
X4：G、Y、H、D、P、N、R、A、K、F、W、E、Q
X5：S、N、F、K、Q、Y、A、W、T、R、H、G
X6：T、Q、S、N
X7：K、M、R、H
　一態様において、X1、X2、X3、X4、X5、X6及びX7は、以下のアミノ酸残基から選択される。
X1：S、E、V、T、H、K、M、R
X2：H、S、P、F、Q、A、D、E
X3：R、G、I、F、A、V、K、E、W、L
X4：G、Y、H、D、P、N、R
X5：S、N、F、K、Q、Y、A、W
X6：T、Q
X7：K、M
　「(S/T)」のC末端側に存在するXは、特に限定されないが、例えば、上記表１に記載のアミノ酸残基であり得る。
　一態様において、式（１）で示されるアミノ酸配列は、下式（２）で示されるアミノ酸配列である。
　WX4-7(S/T)ΦΦ　　　式（２）
（式中、Φ及びXは、それぞれ式（１）で定義されるとおりであり、Φはそれぞれ独立に選択される。）
　「X4-7」との表記及び「(S/T)」との表記は、それぞれ式（１）において説明したものと同じ意味であり、式（１）において説明した内容が適用できる。
　式（２）で示されるアミノ酸配列中、各Φは同じであっても異なっていてもよい。
　一態様において、式（２）で示されるアミノ酸配列は、下式（２－１）で示されるアミノ酸配列である。
　WX4-7(S/T)ΦΨ　　　式（２－１）
（式中、Φ及びXは、それぞれ式（１）で定義されるとおりであり、Ψは、L、V、I及びMから選択されるアミノ酸残基を表す。）
　「X4-7」との表記及び「(S/T)」との表記は、それぞれ式（１）において説明したものと同じ意味であり、式（１）において説明した内容が適用できる。
　式（２－１）で示されるアミノ酸配列において、Ψは、ある態様では、L、V及びIから選択されるアミノ酸残基を表す。
　一態様において、式（２）で示されるアミノ酸配列は、下式（２－２）で示されるアミノ酸配列である。
　WX5(S/T)ΦΦ　　　式（２－２）
（式中、Φ及びXは、それぞれ式（１）で定義されるとおりであり、Φはそれぞれ独立に選択される。）
　「X5」との表記は、X（即ち、任意のアミノ酸残基）が５個連続して存在することを意味する。Xは、それぞれ独立して選択され、各Xは同じであっても異なっていてもよい。
　「(S/T)」との表記は、式（１）において説明したものと同じ意味であり、式（１）において説明した内容が適用できる。
　式（２－２）で示されるアミノ酸配列中、各Φは同じであっても異なっていてもよい。
　一態様において、式（２）で示されるアミノ酸配列は、下式（３）で示されるアミノ酸配列である。
　WX5(S/T)ΦΨ　　　式（３）
（式中、Φ及びXは、それぞれ式（１）で定義されるとおりであり、Ψは、L、V、I及びMから選択されるアミノ酸残基を表す。）
　「X5」との表記は、X（即ち、任意のアミノ酸残基）が５個連続して存在することを意味する。Xは、それぞれ独立して選択され、各Xは同じであっても異なっていてもよい。
　「(S/T)」との表記は、式（１）において説明したものと同じ意味であり、式（１）において説明した内容が適用できる。
　式（３）で示されるアミノ酸配列において、ある態様では、Ψは、L、V及びIから選択されるアミノ酸残基を表す。
　一態様において、式（１）で示されるアミノ酸配列は、下記配列番号１～１５で示されるアミノ酸配列から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列と75％以上の配列同一性を有する。
　WSHRGSSMI（配列番号：１）
　WESGYSMV（配列番号：２）
　WVSGHNSWV（配列番号：３）
　WEPIDFTYV（配列番号：４）
　WTHIGKSLI（配列番号：５）
　WVFFPQTKTMV（配列番号：６）
　WHPANFSML（配列番号：７）
　WKHVRYTML（配列番号：８）
　WMQKGFSMI（配列番号：９）
　WRARGYSMV（配列番号：１０）
　WHHRGASMI（配列番号：１１）
　WEARNWSVI（配列番号：１２）
　WHDEGYQMTWY（配列番号：１３）
　WVEWPTMW（配列番号：１４）
　WESLGYSYV（配列番号：１５）
　一態様において、式（１）で示されるアミノ酸配列は、配列番号１～１５で示されるアミノ酸配列から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列と80％以上又は90％以上の配列同一性を有する。
　一態様において、式（１）で示されるアミノ酸配列は、配列番号１～１５で示されるアミノ酸配列から選択される。
　一態様において、SCF受容体に結合することのできるペプチドは、環状構造を有するものであり、前記環状構造が、式（１）で示されるアミノ酸配列を含み、かつ下記配列番号１６～３０で示されるアミノ酸配列から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列と75％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列から形成されている。
　CFWSHRGSSMIQHC（配列番号：１６）
　CWWWESGYSMVQEC（配列番号：１７）
　CWVSGHNSWVKINC（配列番号：１８）
　CVWEPIDFTYVQHC（配列番号：１９）
　CTWTHIGKSLIIQC（配列番号：２０）
　CEWVFFPQTKTMVC（配列番号：２１）
　CWHPANFSMLYQC（配列番号：２２）
　CWKHVRYTMLQIPC（配列番号：２３）
　CKWMQKGFSMIQMC（配列番号：２４）
　CVWRARGYSMVQMC（配列番号：２５）
　CFWHHRGASMIRMC（配列番号：２６）
　CWWEARNWSVIQHC（配列番号：２７）
　CWHDEGYQMTWYC（配列番号：２８）
　CLWVEWPTMWELRC（配列番号：２９）
　CWESLGYSYVIVPC（配列番号：３０）
　一態様において、SCF受容体に結合することのできるペプチドは、環状構造を有するものであり、前記環状構造が、式（１）で示されるアミノ酸配列を含み、かつ配列番号１６～３０で示されるアミノ酸配列から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列と80％以上、85％以上、又は90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列から形成されている。
　一態様において、SCF受容体に結合することのできるペプチドは、環状構造を有するものであり、前記環状構造が、配列番号１６～３０で示されるアミノ酸配列のいずれか１つから形成されている。
　本明細書に記載の一実施態様は、環状構造又はループ構造を有するペプチドであって、前記環状構造又は前記ループ構造のアミノ酸配列が式（１）で示されるアミノ酸配列を含み、かつ式（１）で示されるアミノ酸配列中の部分配列：WX4-7(S/T)が、下式（４）で示されるアミノ酸配列である、SCF受容体に対するアゴニスト活性を有するペプチドに関する。
　WX1-3(G/P)X1-3(S/T)　　　式（４）
（式中、Xは、式（１）で定義されるとおり、それぞれ独立に、任意のアミノ酸残基を表し、但し、式（４）においてXの総数は少なくとも３つである。）
　「(G/P)」との表記は、Gであるか、又はPであることを意味する。
　「(S/T)」との表記は、Sであるか、又はTであることを意味する。
　「X1-3」との表記は、X（即ち、任意のアミノ酸残基）が１個であるか又は２～３個連続して存在することを意味する。Xはそれぞれ独立して選択され、各Xは同じであっても異なっていてもよい。
　Xについては特に限定されないが、例えば、上記表１に記載のアミノ酸残基であり得る。「(G/P)」のN末端側に存在する「X1-3」における各Xは、式（１）に関して記載したX1、X2、及びX3に対応し得る。「(G/P)」のC末端側に存在する「X1-3」における各Xは、式（１）に関して記載したX3、X4、及びX5；X4、X5、及びX6；又はX5、X6及びX7に対応し得る。これらの例示的なXについて、式（１）において説明した内容が適用できる。
　一態様において、式（１）で示されるアミノ酸配列と、そのC末側の１アミノ酸残基とからなるアミノ酸配列は、下式（５）で示されるアミノ酸配列である。
　WX1-3(G/P)X1-3(S/T)X(I/V)(Q/K/R)　　　式（５）
（式中、Xは、式（１）で定義されるとおり、それぞれ独立に、任意のアミノ酸残基を表し、但し、式（５）においてXの総数は少なくとも３つである。）
　「(G/P)」との表記は、Gであるか、又はPであることを意味する。
　「(S/T)」との表記は、Sであるか、又はTであることを意味する。
　「(I/V)」との表記は、Iであるか、又はVであることを意味する。
　「(Q/K/R)」との表記は、Qであるか、Kであるか、又はRであることを意味する。
　「X1-3」との表記は、式（４）において説明したとおりである。
　一態様において、式（５）で示されるアミノ酸配列は、下式（６）で示されるアミノ酸配列である。
　WX1-3(G/P)X1-3(S/T)Φ(I/V)(Q/K/R)　　　式（６）
（式中、Φ及びXは、それぞれ式（１）で定義されるとおりであり、Φは、W、F、Y、L、V、I及びMから選択されるアミノ酸残基を表し、Xは、それぞれ独立に、任意のアミノ酸残基を表し、但し、式（６）においてXの総数は少なくとも３つである。）
　「(G/P)」との表記、「(S/T)」との表記、「(I/V)」との表記、「(Q/K/R)」との表記、及び「X1-3」との表記は、それぞれ式（４）又は（５）において説明したとおりである。
　一態様において、式（６）で示されるアミノ酸配列において、Xの総数は４つである。
　一態様において、式（６）で示される前記アミノ酸配列は、下式（７）で示されるアミノ酸配列である。
　WX3GXS(L/M)(I/V)(Q/R)　　　式（７）
（式中、Xは、式（１）で定義されるとおり、それぞれ独立に、任意のアミノ酸残基を表す。）
　「(L/M)」との表記は、Lであるか、又はMであることを意味する。
　「(I/V)」との表記は、Iであるか、又はVであることを意味する。
　「(Q/R)」との表記は、Qであるか、又はRであることを意味する。
　「X3」との表記は、X（即ち、任意のアミノ酸残基）が３個連続して存在することを意味する。Xはそれぞれ独立して選択され、各Xは同じであっても異なっていてもよい。「X3」における各Xは、特に限定されないが、式（１）に関して記載したX1、X2、及びX3に対応し得る。これらの例示的なXについて、式（１）において説明した内容が適用できる。
　式（７）で示されるアミノ酸配列におけるGとSの間に存在するXは、特に限定されないが、式（１）に関して記載したX5に対応し得るものであり、式（１）において説明した内容が適用できる。
　一態様において、式（７）で示される前記アミノ酸配列は、下式（８）で示されるアミノ酸配列である。
　WX3GXSM(I/V)(Q/R)　　　式（８）
（式中、Xは、式（１）で定義されるとおり、それぞれ独立に、任意のアミノ酸残基を表す。）
　「(I/V)」との表記、「(Q/R)」との表記、及び「X3」との表記は、それぞれ式（７）において説明したものと同じ意味であり、式（７）において説明した内容が適用できる。
　式（８）で示されるアミノ酸配列におけるGとSの間に存在するXは、特に限定されないが、式（１）に関して記載したX5に対応し得るものであり、式（１）において説明した内容が適用できる。
　一態様において、式（４）で示されるアミノ酸配列が、下記配列番号３１～３９で示されるアミノ酸配列から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列と75％以上の配列同一性を有する。
　WSHRGSS（配列番号：３１）
　WESGYS（配列番号：３２）
　WVSGHNS（配列番号：３３）
　WEPIDFT（配列番号：３４）
　WTHIGKS（配列番号：３５）
　WVFFPQTKT（配列番号：３６）
　WMQKGFS（配列番号：３７）
　WESLGYS（配列番号：３８）
　WRARGYS（配列番号：３９）
　一態様において、式（４）で示されるアミノ酸配列は、配列番号３１～３９で示されるアミノ酸配列から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列と85％以上の配列同一性を有する。
　一態様において、式（４）で示されるアミノ酸配列は、配列番号３１～３９で示されるアミノ酸配列から選択される。
　一態様において、式（５）で示されるアミノ酸配列は、下記配列番号４０～４５で示されるアミノ酸配列から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列と75％以上の配列同一性を有する。
　WSHRGSSMIQ（配列番号：４０）
　WESGYSMVQ（配列番号：４１）
　WVSGHNSWVK（配列番号：４２）
　WEPIDFTYVQ（配列番号：４３）
　WMQKGFSMIQ（配列番号：４４）
　WRARGYSMVQ（配列番号：４５）
　一態様において、式（５）で示されるアミノ酸配列は、配列番号４０～４５で示されるアミノ酸配列から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列と80％以上、85％以上、又は90％以上の配列同一性を有する。
　一態様において、式（５）で示されるアミノ酸配列は、配列番号４０～４５で示されるアミノ酸配列から選択される。
　一態様において、SCF受容体に対するアゴニスト活性を有するペプチドは、環状構造を有するものであり、前記環状構造が、式（４）で示されるアミノ酸配列又は式（５）で示されるアミノ酸配列を含み、かつ下記配列番号１６～２１、２４、２５及び３０で示されるアミノ酸配列から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列と75％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列から形成されている。
　CFWSHRGSSMIQHC（配列番号：１６）
　CWWWESGYSMVQEC（配列番号：１７）
　CWVSGHNSWVKINC（配列番号：１８）
　CVWEPIDFTYVQHC（配列番号：１９）
　CTWTHIGKSLIIQC（配列番号：２０）
　CEWVFFPQTKTMVC（配列番号：２１）
　CKWMQKGFSMIQMC（配列番号：２４）
　CVWRARGYSMVQMC（配列番号：２５）
　CWESLGYSYVIVPC（配列番号：３０）
　一態様において、SCF受容体に対するアゴニスト活性を有するペプチドは、環状構造を有するものであり、前記環状構造が、式（４）で示されるアミノ酸配列又は式（５）で示されるアミノ酸配列を含み、かつ配列番号１６～２１、２４、２５及び３０で示されるアミノ酸配列から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列と80％以上、85％以上、又は90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列から形成されている。
　一態様において、SCF受容体に対するアゴニスト活性を有するペプチドは、環状構造を有するものであり、前記環状構造が、配列番号１６～２１、２４、２５及び３０で示されるアミノ酸配列のいずれか１つから形成されている。
　本明細書に記載のペプチドにおける環状構造は、特に限定されないが、例えば、４個以上、５個以上、６個以上、又は７個以上のアミノ酸残基からなるものであり得、３０個以下、２５個以下、２０個以下、又は１５個以下のアミノ酸残基からなるものであり得る。
　本明細書に記載のペプチドにおけるループ構造は、特に限定されないが、例えば、２個以上、３個以上、４個以上、又は５個以上のアミノ酸残基からなるものであり得、２８個以下、２３個以下、１８個以下、又は１３個以下のアミノ酸残基からなるものであり得る。
　ループ構造は特に限定されないが、例えば、ループ構造を構成するアミノ酸配列は、フィブロネクチン（第１０ヒトフィブロネクチン）III型ドメイン、ヒト癌胎児性抗原の第１IgV様ドメイン、シグナル調節タンパク質α（SIRPα）の第１IgV様ドメイン、抗GFPシングルドメイン抗体、IgG抗体等のFc領域、ヒト成長ホルモン、血清アルブミン、レチノール結合タンパク質、胎盤性アルカリホスファターゼ、もしくはアデノ随伴ウイルスセロタイプ２由来のVP3カプシドタンパク質の配列、又はそれらの部分配列を含み得る。
　本明細書に記載のペプチドは、周知のペプチド合成方法に基づき作成することができ、例えば、化学合成手法又は生物学的手法を用いて本明細書に記載のペプチドを調製することができる。
　本明細書に記載のペプチドは、２分子でペプチドダイマーを形成してもよい。ペプチドダイマーはヘテロダイマーであってもホモダイマーであってもよい。
　本明細書に記載の一実施態様は、本明細書に記載のペプチドを２分子含むペプチドダイマーに関する。一態様において、ペプチドダイマーはホモダイマーである。一態様において、ペプチドダイマーは、２つのペプチド鎖を短鎖リンカーで連結する構造を有する。
　ペプチドダイマーとしては、特に限定されないが、国際公開第2021/112249号、Chen, et al., Adv Drug Deliv Rev., 2013 October 15; 65(10): 1357-1369、 Tan, et al., Nature Communications, 2019; 10: 439、 Troup, et al., Explor Target Antitumor Ther., 2020; 1: 273-312（ここに本明細書の一部を構成するものとしてこれらの文献の内容を参照により引用する。）に記載されるようなリンカーを有するペプチドダイマー等を例示できる。ペプチドダイマーは、公知の技術を応用して調製することが可能であり、例えば、国際公開第2021/112249号等上記文献に記載される方法でペプチドダイマーを調製することができる。
　一態様において、ペプチドダイマーは、４９個以下のアミノ酸残基からなるリンカー部位を有し、当該リンカー部位のアミノ酸配列の少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％が、A、P及びSから選択されるアミノ酸残基を含む又はからなる。
　一態様において、ペプチドダイマーは、GとSから構成される配列（例えば、GGGGS、GGGS、GGS、及びGSからなる群から選択されるアミノ酸配列を繰り返し含む配列）を含む又はからなるリンカー部位を有する。
　一態様において、ペプチドダイマーは、EAAAKで示されるアミノ酸配列を繰り返し含む又はその繰り返しからなるリンカー部位を有する。
　上述のペプチドダイマーは、本明細書に記載のペプチド２分子をリンカーで連結したものであり得るが、本明細書に記載のペプチドは、ペプチドに限らず、所望の薬剤（例えば、抗悪性腫瘍薬や光感受性物質、又は標識性化合物）、又は所望の機能性配列（例えば、タグ配列、酵素識別配列、標的結合配列、又はペプチドの発現、安定性もしくは水溶性を高めるために有用な配列）と、リンカーを介して結合していてもよい。
　本明細書に記載のペプチドと所望の薬剤又は機能性配列を結合するリンカーは、特に限定されないが、例えば、４９個以下のアミノ酸残基からなり、当該リンカーのアミノ酸配列の少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％が、A、P及びSから選択されるアミノ酸残基を含む又はからなるリンカー、GとSから構成される配列（例えば、GGGGS、GGGS、GGS、及びGSからなる群から選択されるアミノ酸配列を繰り返し含む配列）を含む又はからなるリンカー、EAAAKで示されるアミノ酸配列を繰り返し含む又はその繰り返しからなるリンカーであり得る。また、本明細書に記載のペプチドと所望の薬剤又は機能性配列を結合するリンカーは、Tsuchikama and An, Protein & Cell, 2018; 9: 33-46、Poreba, The FEBS Journal, 2020; 287: 1936-1969、Bargh, Chem. Soc. Rev., 2019; 48(16): 4361-4374 等の文献（ここに本明細書の一部を構成するものとしてこれらの文献の内容を参照により引用する。）に記載のものであり得る。
　ペプチドの安定性又は水溶性を高めるために有用な配列の具体例としては、特表2013-531480（ここに本明細書の一部を構成するものとして当該文献の内容を参照により引用する。）に記載されるような少なくとも５０個のプロリン及びアラニンのアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含むランダムコイルポリペプチドや、特表2010-531139（ここに本明細書の一部を構成するものとして当該文献の内容を参照により引用する。）に記載されるようなプロリン、アラニン及びセリンのアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含むランダムコイルポリペプチド等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
　また、ペプチドの安定性を高めるための配列としては、例えばFcタンパク質が挙げられる。Fcタンパク質は、ペプチドをダイマー化するための足場としても有用であり、本明細書に記載のペプチドは、Fcタンパク質を足場としてペプチドダイマーを形成してもよい。Fcタンパク質や、Fcタンパク質を足場とするペプチドダイマーの形成は、国際公開第2017/191817号、国際公開第2019/240287号、国際公開第2022/154116号、国際公開第2022/154127号等の文献（ここに本明細書の一部を構成するものとしてこれらの文献の内容を参照により引用する。）に記載の化合物等を用いて行い得る。
　酵素識別配列の具体例としては、SortaseA識別シグナル、Butelase識別シグナル、Transglutaminase識別シグナル等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
　タグ配列の具体例としては、FLAGタグ、PAタグ、ヒスチジンタグ等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
　標的結合配列の具体例としては、VHHやscFvといった低分子抗体等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
　一態様において、機能性配列は、例えば、３個以上、６個以上、１０個以上、又は１２個以上のアミノ酸残基からなることができ、１０００個以下、５００個以下、３００個以下、又は１５０個以下のアミノ酸残基からなることができる。
　本明細書に記載のペプチドは、システイン残基及びロイシンジッパー領域を含む二量体化ドメインを含んでもよく、この二量体化ドメインを介してペプチドダイマーを形成してもよい。本明細書に記載のペプチドが当該二量体化ドメインを含む場合、当該二量体化ドメインは、環状構造又はループ構造以外の鎖状部分に存在することが好ましい。当該二量体化ドメインは、本明細書に記載のペプチド２分子を連結し得るリンカーとして上述したものと同じリンカーを介して、本明細書に記載のペプチドと結合し得る。
　当該二量体化ドメイン中のロイシンジッパー領域とは、αヘリックスを形成し、７残基ごとにロイシン残基を有する領域のことである。当該ロイシンジッパー領域は、特に限定されないが、例えば、６０個以下、４５個以下、３５個以下、又は２５個以下のアミノ酸残基からなることができる。
　当該二量体化ドメイン中のロイシンジッパー領域としては、ダイマーを形成するものであれば特に限定されないが、例えば、c-Junタンパク質、GCN4タンパク質又はCEBPαタンパク質のロイシンジッパードメイン、及びc-Junロイシンジッパードメインの正電荷アミノ酸をグルタミンに置換することでヘパリン結合能を欠損させたJunΔhep（M. D. Ballinger et al., Nat. Biotechnol. 17, 1199-1204 (1999)、ここに本明細書の一部を構成するものとして当該文献の内容を参照により引用する。）等が挙げられる。当該ロイシンジッパー領域の具体例としては、以下のアミノ酸配列を含むものや、以下のアミノ酸配列からなるものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。RIARLEEKVKTLKAQNSELASTANMLREQVAQLKQKVMN（配列番号：４６）、QIAQLEEKVQTLQAQNSELASTANMLREQVAQLKQKVMN（配列番号：４７）、RMKQLEDKVEELLSKNYHLENEVARLKKLVGER（配列番号：４８）、RNVETQQKVLELTSDNDRLRKRVEQLSRELDTLRGIFRQ（配列番号：４９）。
　一態様において、当該二量体化ドメイン中のロイシンジッパー領域は、ヘパリン結合能を除去したものであってもよい。
　本明細書に記載の一実施態様は、本明細書に記載のペプチド、ペプチドダイマー又はペプチドホモダイマーを含む医薬組成物に関する。
　一態様において、医薬組成物は、がん治療用の医薬組成物である。また、一態様において、医薬組成物は、がんの血管新生阻害剤である。がんとしては、例えば、白血病、KIT（CD117）陽性腫瘍（KIT（CD117）陽性消化管間質腫瘍等）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
　がんの治療や血管新生阻害に関連する上記医薬組成物は、SCF受容体に対するアンタゴニスト活性を有するペプチドを含み得る。
　本明細書において、「治療」とは、対象の疾患が治癒すること、対象の症状が改善されること、対象における疾患の進行が抑制されること、又は対象における症状の増悪が抑制されることを意味する。「対象」は、特に限定されないが、例えば脊椎動物であり、哺乳動物であり得る。哺乳動物の例としては、ヒト、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、イヌ及びネコ等が挙げられ、一態様では、ヒトである。
　一態様において、医薬組成物は、リンカーを介して所望の薬剤と結合している本明細書に記載のペプチドを含む。この場合、医薬組成物は、リンカーを介して本明細書に記載のペプチドに結合している薬剤に応じた用途で使用し得る。例えば、リンカーを介して本明細書に記載のペプチドに結合している薬剤が抗悪性腫瘍薬であれば、医薬組成物はがんの治療のために使用することができる。また、別の例では、リンカーを介して本明細書に記載のペプチドに結合している薬剤が光感受性物質であれば、医薬組成物は光線力学的療法によるがんの治療のために使用することができる。更に別の例では、リンカーを介して本明細書に記載のペプチドに結合している薬剤が標識性化合物であれば、医薬組成物はSCF受容体の発現が関連する疾患の診断のために使用することができる。標識性化合物とは、物理的及び／又は化学的特性を利用した検出が可能な化合物であり、例えば、酵素、蛍光物質、発光物質、放射性同位元素等が挙げられる。
　このような医薬組成物において、リンカーを介して所望の薬剤と結合している本明細書に記載のペプチドが、SCF受容体に対するアンタゴニスト活性を有するものであれば、がん治療効果の発揮又は増強のためのものであり得、また、リンカーを介して所望の薬剤と結合している本明細書に記載のペプチドが、SCF受容体に結合はするがほとんど又は全く活性を示さないものである場合は、当該ペプチド部分は、標的指向性を付与するためのものであり得る。標的指向性を付与する場合の想定される標的としては、SCF受容体を発現している細胞（T細胞等）やSCF受容体を有するプロテオソーム等が挙げられるが、これらに限定されるものでない。
　一態様において、医薬組成物は、医薬的に許容され得る担体、溶媒、希釈剤、賦形剤、安定化剤、緩衝化剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、着色料、香料等の医薬に使用し得る添加物を含み得る。これらの添加物としては、当業者に周知のものを使用することができる。
　医薬組成物の投与経路は、一般的に採用されている経路であれば、特に限定はされないが、具体例としては、経口、舌下、経鼻、経肺、経消化管、経皮、静脈内注射、皮下注射、筋肉内注射等が挙げられる。
　医薬組成物を対象に投与することにより、治療上有効な量又は診断上有効な量で本明細書に記載のペプチド、ペプチドダイマー又はペプチドホモダイマーを対象に投与することができる。「治療上有効な量」とは、疾患、症状、及び／又は投与経路に応じて治療効果を奏する量を意味し、個別具体的に適宜決定されるものである。「診断上有効な量」とは、疾患及び／又は投与経路に応じて診断のために要する量を意味し、個別具体的に適宜決定されるものである。
　更なる一態様では、疾患（例えば、がん）の治療を必要とする対象に、治療上有効な量の本明細書に記載のペプチド、ペプチドダイマー又はペプチドホモダイマーを投与することを含む、又は治療上有効な量の本明細書に記載のペプチド、ペプチドダイマー又はペプチドホモダイマーを含む医薬組成物を投与することを含む、当該疾患の治療方法が提供される。ここで、この治療方法では、本明細書に記載のペプチドがリンカーを介して所望の薬剤と結合している場合に、当該薬剤による治療効果が期待できる疾患にも適用し得ることは、医薬組成物に関し前述したとおりである。このような治療方法に関し、上述した事項のいずれが適用されてもよい。
　更なる一態様では、疾患（例えば、SCF受容体の発現が関連する疾患）の診断を必要とする対象に、診断上有効な量の本明細書に記載のペプチド、ペプチドダイマー又はペプチドホモダイマーを投与することを含む、又は診断上有効な量の本明細書に記載のペプチド、ペプチドダイマー又はペプチドホモダイマーを含む医薬組成物を投与することを含む、当該疾患の診断方法が提供される。このような診断方法に関し、上述した事項のいずれが適用されてもよい。
　更なる一態様では、疾患（例えば、がん）の治療に使用されるための、本明細書に記載のペプチド、ペプチドダイマー又はペプチドホモダイマーが提供される。
　更なる一態様では、疾患（例えば、がん）の治療用医薬の製造における、本明細書に記載のペプチド、ペプチドダイマー又はペプチドホモダイマーの使用が提供される。
　更なる一態様では、疾患（例えば、SCF受容体の発現が関連する疾患）の診断に使用されるための、本明細書に記載のペプチド、ペプチドダイマー又はペプチドホモダイマーが提供される。
　更なる一態様では、疾患（例えば、SCF受容体の発現が関連する疾患）の診断用医薬の製造における、本明細書に記載のペプチド、ペプチドダイマー又はペプチドホモダイマーの使用が提供される。
　これらの態様に関し、上述した事項のいずれが適用されてもよい。
　本明細書に記載の一実施態様は、本明細書に記載のペプチド、ペプチドダイマー又はペプチドホモダイマーを含む細胞培養用培地に関する。培地としては、当業者に周知のものが適用でき、適宜、当業者に周知の添加剤を更に含んでもよい。培養される細胞としては、特に限定されないが、幹細胞が挙げられる。幹細胞としては、特に限定されないが、人工多能性幹細胞（iPS細胞）、胚性幹細胞（ES細胞）、間葉系幹細胞（例えば、脂肪組織由来幹細胞、骨髄由来幹細胞、臍帯血由来幹細胞、胎盤由来幹細胞）、造血幹細胞、神経幹細胞等が例示できる。
　本明細書に記載の一実施態様は、本明細書に記載のペプチド、ペプチドダイマー又はペプチドホモダイマーを含む細胞培養用添加剤に関する。細胞培養用添加剤は、細胞に直接添加されてもよいし、細胞を含む培地中に添加されてもよく、本明細書に記載のペプチド、ペプチドダイマー又はペプチドホモダイマー以外の成分を含んでいてもよい。細胞培養用添加剤が添加される培地としては、当業者に周知のものが適用でき、培地には、適宜、当業者に周知の添加剤が含まれていてもよい。培養される細胞は、前記のとおりであり得る。
　本明細書に記載の一実施態様は、本明細書に記載のペプチド、ペプチドダイマー又はペプチドホモダイマーを細胞と接触させることを含む、細胞培養方法に関する。本明細書に記載のペプチド、ペプチドダイマー又はペプチドホモダイマーを細胞と接触させるという工程は、本明細書に記載のペプチド、ペプチドダイマー又はペプチドホモダイマーを細胞に直接添加することにより行ってもよいし、細胞を含む培地中に本明細書に記載のペプチド、ペプチドダイマー又はペプチドホモダイマーを添加することにより行ってもよい。培地としては、当業者に周知のものが適用でき、培地には、適宜、当業者に周知の添加剤が含まれていてもよい。培養される細胞は、前記のとおりであり得る。
　更なる一態様では、細胞の培養に使用されるための、本明細書に記載のペプチド、ペプチドダイマー又はペプチドホモダイマーが提供される。細胞や培地に関しては上述のとおりであり得る。
　更なる一態様では、細胞培養用培地の製造における、本明細書に記載のペプチド、ペプチドダイマー又はペプチドホモダイマーの使用が提供される。細胞や培地に関しては上述のとおりであり得る。
　更なる一態様では、細胞培養用添加剤の製造における、本明細書に記載のペプチド、ペプチドダイマー又はペプチドホモダイマーの使用が提供される。細胞や培地に関しては上述のとおりであり得る。
　本明細書に記載の一実施態様は、本明細書に記載のペプチド、ペプチドダイマー又はペプチドホモダイマーを含む、細胞の分化誘導剤に関する。細胞の分化誘導剤は、細胞に直接添加されてもよいし、細胞を含む培地中に添加されてもよく、本明細書に記載のペプチド、ペプチドダイマー又はペプチドホモダイマー以外の成分を含んでいてもよい。細胞の分化誘導剤が添加される培地としては、当業者に周知のものが適用でき、培地には、適宜、当業者に周知の添加剤が含まれていてもよい。
　分化誘導される細胞としては、特に限定されないが、幹細胞が挙げられる。幹細胞としては、特に限定されないが、人工多能性幹細胞（iPS細胞）、胚性幹細胞（ES細胞）、間葉系幹細胞（例えば、脂肪組織由来幹細胞、骨髄由来幹細胞、臍帯血由来幹細胞、胎盤由来幹細胞）、造血幹細胞、神経幹細胞等が例示できる。分化誘導する細胞としては、特に限定されないが、骨髄前駆細胞、巨核球・赤芽球前駆細胞、単球、好中球、好塩基球、マスト細胞、血小板産生細胞、巨核球、赤血球等が例示できる。
　本明細書に記載の一実施態様は、本明細書に記載のペプチド、ペプチドダイマー又はペプチドホモダイマーを細胞と接触させることを含む、細胞の分化を誘導する方法に関する。本明細書に記載のペプチド、ペプチドダイマー又はペプチドホモダイマーを細胞と接触させるという工程は、本明細書に記載のペプチド、ペプチドダイマー又はペプチドホモダイマーを細胞に直接添加することにより行ってもよいし、細胞を含む培地中に本明細書に記載のペプチド、ペプチドダイマー又はペプチドホモダイマーを添加することにより行ってもよい。培地としては、当業者に周知のものが適用でき、培地には、適宜、当業者に周知の添加剤が含まれていてもよい。分化誘導される細胞は、前記のとおりであり得る。
　更なる一態様では、細胞の分化誘導に使用されるための、本明細書に記載のペプチド、ペプチドダイマー又はペプチドホモダイマーが提供される。細胞や培地に関しては上述のとおりであり得る。
　更なる一態様では、細胞の分化誘導剤の製造における、本明細書に記載のペプチド、ペプチドダイマー又はペプチドホモダイマーの使用が提供される。細胞や培地に関しては上述のとおりであり得る。
　以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
実施例１：c-Kit-FcおよびFcタンパク質の磁気ビーズへの固定化
　3 μL slurry のDynabeads Protein G（Thermo Fisher Scientific）をチューブに分注し、氷冷した1x TBS-T （pH 7.6、TBS-T tablet (TaKaRa) をMilli-Q水で溶解）100 μLで3回洗浄した。当該チューブ内に、0.25 μg/μLに調製したrecombinant human c-Kit-Fc (rh c-Kit-Fc, ACRO Biosystems) またはrecombinant human Fc (rh Fc, R&D Systems) 溶液を適量加え、その後溶液量が合計10 μLとなるまで1x TBS-Tを加えた。4 ℃で30分間穏やかに混和させ、その後速やかに上清を回収した。チューブ内に残った磁気ビーズを氷冷1x TBS-T 100 μLで3回洗浄することで、各タンパク質を固定化した磁気ビーズを得た。
実施例２：cDNAディスプレイによるc-Kit結合環状ペプチドのセレクション
　cDNAディスプレイによるc-Kit結合環状ペプチドのセレクションは、Biochemical and Biophysical Research Communications, Volume 503, Issue 3, Pages 2054-2060, 2018に記載の方法に従い実施した。環状ペプチドライブラリ部位は、図１に示すように、9～12アミノ酸のランダム配列が2つのシステイン側鎖間のジスルフィド結合により環状化されたペプチドの混合物を用いた。
　4種混合ライブラリcDNAを転写しライブラリmRNAを調製した。1標的あたり、ライブラリmRNA 15 pmolを使用し、ペプチドcDNAディスプレイ・ライブラリを調製した。ペプチドcDNAディスプレイ・ライブラリは、mRNAライブラリへのピューロマイシン・リンカーのライゲーション、Rabbit Reticulocyte Lysateを用いた無細胞翻訳、C末端へのピューロマイシンの連結、無細胞翻訳系からのStreptAvidinビーズによる精製、ビーズ上での逆転写反応、RNaseT1によるビーズ上からの回収、Ni-NTAビーズによるペプチド連結cDNA (cDNAディスプレイ分子) の精製、TBS-Tへのバッファー交換を経て調製した。定量PCRにより、1標的あたり1011分子以上のペプチドcDNAディスプレイ・ライブラリとなっていることを確認した。
　ラウンド2以降では、rh Fcを固定化したProteinGビーズをrh Fc換算で500 nMとなるよう添加し、各ラウンドでサブトラクション1回を実施した。ペプチドcDNAディスプレイライブラリに、rh c-Kit-Fc固定化ProteinGビーズをrh c-Kit-Fc換算で1000 nM (ラウンド1)、500 nM (ラウンド2)、200 nM（ラウンド3以降）混合し、チューブブロックローテーターを使用して混和させた。未結合のペプチドcDNAディスプレイをTBS-T (pH 7.6) でウォッシュアウトした。1x PCRバッファー (KOD Fx, Toyobo) を投入し、熱(95 ℃, 5 min) を加えることで、rh Fc固定化ビーズおよびrh c-Kit-Fc固定化ビーズに結合しているペプチドcDNAディスプレイを溶出した。ラウンド1のみ1x PCRバッファー溶出後、0.1% SDS含有TBS-Tでさら熱変性 (80 ℃, 5 min) を行い、上清を回収した。溶出液100 μLの内1 μLを分取し、定量PCRにより定量し、Elute/Input比 (E/I) を確認した。溶出液に他のPCRコンポーネントを添加のうえPCRを実施し、次ラウンド用のライブラリDNAを調製した。
　上記セレクションを5ラウンド実施したところ、図２に示すように、rh c-Kit-Fc結合ビーズに対するE/I比の顕著な上昇が認められ、c-Kit結合ペプチドがライブラリ中で濃縮されたことが示唆された。
実施例３：c-Kit結合ペプチド候補のc-Kitに対する結合活性評価
（実施例３－１）Hisタグを含むc-Kit結合ペプチドの調製
　実施例２で得られたペプチドのアミノ酸配列より、ペプチド間で保存された以下のモチーフ2種を抽出した。
　c-Kit結合モチーフ１：　WX4-7(S/T)XΦ
　（式中、各記号は、それぞれ上記式（１）で定義されるとおりである。より具体的なモチーフは、上記式（２）、（２－１）、（２－２）又は（３）で示される。）
　c-Kit結合モチーフ２：　HGN(I/V)
　それぞれのモチーフを含むペプチドについて、実際にc-Kitに結合することが可能であるかについて、Enzyme-linked immunoSorbent assay (ELISA) 法により評価を行った。N末端にアフィニティタグであるHis-tagを有するc-Kit結合環状ペプチドとして、以下の配列(1)～(16)を設計した。
(1) His-CAP0208
MKDHLIHNHHKHEHAHAEHLGGGGSDYKDDDDKAAPAAPAPACFWSHRGSSMIQHCGSG（配列番号：５０）
(2) His-CAP0164
MKDHLIHNHHKHEHAHAEHLGGGGSDYKDDDDKAAPAAPAPACWWWESGYSMVQECGSG（配列番号：５１）
(3) His-CAP0005
MKDHLIHNHHKHEHAHAEHLGGGGSDYKDDDDKAAPAAPAPACWVSGHNSWVKINCGSG（配列番号：５２）
(4) His-CAP0378
MKDHLIHNHHKHEHAHAEHLGGGGSDYKDDDDKAAPAAPAPACVWEPIDFTYVQHCGSG（配列番号：５３）
(5) His-CAP0148
MKDHLIHNHHKHEHAHAEHLGGGGSDYKDDDDKAAPAAPAPACTWTHIGKSLIIQCGSG（配列番号：５４）
(6) His-CAP0020
MKDHLIHNHHKHEHAHAEHLGGGGSDYKDDDDKAAPAAPAPACEWVFFPQTKTMVCGSG（配列番号：５５）
(7) His-CAP0325
MKDHLIHNHHKHEHAHAEHLGGGGSDYKDDDDKAAPAAPAPACWHPANFSMLYQCGSG（配列番号：５６）
(8) His-CAP0040
MKDHLIHNHHKHEHAHAEHLGGGGSDYKDDDDKAAPAAPAPACWKHVRYTMLQIPCGSG（配列番号：５７）
(9) His-CAP0001
MKDHLIHNHHKHEHAHAEHLGGGGSDYKDDDDKAAPAAPAPACKWMQKGFSMIQMCGSG（配列番号：５８）
(10) His-CAP2006
MKDHLIHNHHKHEHAHAEHLGGGGSDYKDDDDKAAPAAPAPACVWRARGYSMVQMCGSG（配列番号：５９）
(11) His-CAP1248
MKDHLIHNHHKHEHAHAEHLGGGGSDYKDDDDKAAPAAPAPACFWHHRGASMIRMCGSG（配列番号：６０）
(12) His-CAP0083
MKDHLIHNHHKHEHAHAEHLGGGGSDYKDDDDKAAPAAPAPACMHVHGNIVYPMSCGSG（配列番号：６１）
(13) His-CAP0008
MKDHLIHNHHKHEHAHAEHLGGGGSDYKDDDDKAAPAAPAPACWWEARNWSVIQHCGSG（配列番号：６２）
(14) His-CAP0242
MKDHLIHNHHKHEHAHAEHLGGGGSDYKDDDDKAAPAAPAPACWHDEGYQMTWYCGSG（配列番号：６３）
(15) His-CAP0140
MKDHLIHNHHKHEHAHAEHLGGGGSDYKDDDDKAAPAAPAPACGGWQHWHGNIVYCGSG（配列番号：６４）
(16) His-CAP0115
MKDHLIHNHHKHEHAHAEHLGGGGSDYKDDDDKAAPAAPAPACLWVEWPTMWELRCGSG（配列番号：６５）
　His-CAP0208、His-CAP0164、His-CAP0005、His-CAP0378、His-CAP0148、His-CAP0020、His-CAP0325、His-CAP0040、His-CAP0001、His-CAP2006、His-CAP1248、His-CAP0115、His-CAP0242、及びHis-CAP0008には、それぞれc-Kit結合モチーフ１が含まれ、His-CAP0083及びHis-CAP0140c-Kitには、それぞれ結合モチーフ２が含まれる。
　また、ネガティブコントロールとしては、c-Kitに結合しないペプチド配列である以下のHis-Negペプチド配列を設計した。
His-Neg
MKDHLIHNHHKHEHAHAEHLAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPAPCDDYYYGFGCNKFCRPR（配列番号：６６）
　上記のとおり設計したペプチドは無細胞発現にて合成を行った。まず、His-tagを含む環状ペプチドを無細胞合成するための遺伝子として、下記His-peptide塩基配列をユーロフィンジェノミクスジャパン株式会社で全合成することで得た。また、c-Kit結合環状ペプチド配列をコードする領域を含むプライマーとしてPrimer-CAP0208、Primer-CAP0164、Primer-CAP0005、Primer-CAP0378、Primer-CAP0148、Primer-CAP0020、Primer-CAP0325、Primer-CAP0040、Primer-CAP0001、Primer-CAP2006、Primer-CAP1248、Primer-CAP0083、Primer-CAP0140、Primer-CAP0115、Primer-CAP0242、及びPrimer-CAP0008を、無細胞合成鋳型DNAの調製用プライマーとしてプライマー１（F25）、プライマー２（UTR）及びプライマー３（R23）を、ユーロフィンジェノミクスジャパン株式会社で合成した。これらの塩基配列は下記表２及び表３に示す。また、His-Neg発現用DNAとして、下記His-Neg-DNA配列をユーロフィンジェノミクスジャパン株式会社で合成した。
His-peptide塩基配列
5’- GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCAATGAAAGATCATCTCATCCACAATCATCACAAACATGAGCACGCTCATGCCGAACACCTGGGCGGTGGCGGATCGGACTACAAGGACGACGATGACAAAGCAGCCCCCGCAGCACCAGCTCCAGCATGTCGTCAGTTTAACCGTCGTACGCACGAAGTTTGGAATCTGGACTGTTAGTGAATAACTAATCC -3’（配列番号：６７）
His-Neg-DNA配列
5’- GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCAATGAAAGATCATCTCATCCACAATCATCACAAACATGAGCACGCTCATGCCGAACACCTGGGCGCAGCCCCCGCAGCACCAGCTCCAGCAGCACCCGCAGCTCCAGCACCAGCAGCCCCTGCAGCCCCAGGCTGCGATGACTACTATTATGGCTTTGGTTGCAACAAATTCTGTCGTCCGCGCTAGTGAATAACTAATCC -3’（配列番号：６８）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　無細胞発現用のDNAはPCRで調製した。PCRにはKOD -plus- ver.2（東洋紡）を用いた。まずKOD -plus- ver.2製品プロトコルに従って、PCRプレミックス溶液を作成した。PCRプレミックス溶液50 μL に対し、予めHis-peptide塩基配列より調製した鋳型DNA溶液1 μL、100 μM プライマー１ 0.5 μL, 50 μM の各c-Kit結合環状ペプチド配列をコードする領域を含むプライマー 1 μLを加え、PCRで増幅した。次に、そのPCR産物 1 μL、100 μM プライマー１ 0.5 μL、100 μM プライマー２ 0.5 μLをPCRプレミックス溶液50 μLに加え、PCRで増幅した。His-Neg発現用DNAは、PCRプレミックス溶液20 μL に対し、予め調製したプラスミドベクター 5 μL、100 μM プライマー１ 0.15 μL、100 μM プライマー３ 0.15 μLを加え、PCRで増幅した。
　このように調製した全長鋳型DNAを含むPCR産物をMilliQ水で5倍希釈し、PUREfrex 2.0 (ジーンフロンティア)を用いて試験管内無細胞翻訳反応を実施した。
（実施例３－２）ELISAによる環状ペプチドのc-Kit結合評価
　環状ペプチドのc-Kitに対する結合評価は、ELISAを用いて行った。実験概要を図３に示す。
　Copper-coated plate（Thermo Fisher Scientific社）に、各ペプチドの無細胞合成液1 μLをPBS （ナカライテスク社）100 μLに混合したものを添加して、4 ℃で30分インキュベートさせ、プレート底面にペプチドを固定した。プレートは200 μLのTBS-T（タカラバイオ社）で5回洗浄した。ペプチドを固定したプレートに対し、0.1 μg/mLのc-Kit-Fcタンパク質を100 μL添加し、4 ℃で30分インキュベートした後、プレートを200 μLのTBS-Tで5回洗浄した。そのプレートに、20,000倍希釈したGoat anti-Human IgG-Fc Fragment Antibody HRP Conjugated（Bethyl Laboratories）を100 μLを添加し、4 ℃で30分インキュベートした。そのプレートを200 μLのTBS-Tで5回洗浄した。その後、プレートにTMB substrate（Cell Signaling Technology社）を100 μL添加し、10分程度室温でインキュベートすることで試薬の呈色反応を実施した。0.1 Mの硫酸を100 μL 添加することで反応を停止し、TMB substrateの呈色をプレートリーダーで450 nmの吸光度を測定することで定量した。His-Negに対する相対吸光度を計算し結果を図４に示す。
　c-Kit結合モチーフ１を含むペプチドを固定化したウェルでは高い吸光度を示し、c-Kitに結合することが明らかとなった。c-Kit結合モチーフ２を含むペプチドを固定化したウェルでは吸光度が低く、c-Kitに結合しないことが示された。この結果より、c-Kit結合モチーフ１はc-Kit結合モチーフであり、c-Kit結合モチーフ２はc-Kitに弱く結合するもしくは結合しないモチーフであることが明らかになった。
実施例４：SCF様活性を保持するペプチド候補の鋳型DNA調製
　実施例３で結合活性を確認した配列のうちの8種類（CAP_0208、CAP_0164、CAP_0005、CAP_0378、CAP_0148、CAP_0020、CAP_0040、CAP_2006）に加え、c-Kit結合モチーフ１を含む配列1種類（CAP_0400）を設計し、計9種類のペプチドを選定した。N末端にアフィニティタグであるHis-tagを有し、さらにHis-tagとc-Kit結合環状ペプチドの間に自己二量体化ドメインを有するペプチドとして、選定した9種類のペプチドについてそれぞれ以下に示す「His-Zipped-peptide」配列(a)～(i)を設計した。
　これらのHis-Zipped-peptideコンストラクトの鋳型DNAをPCRにより作製した。PCRにはKOD -plus- ver.2（東洋紡）を用いた。まずKOD -plus- ver.2製品プロトコルに従って、PCRプレミックス溶液を作成した。PCRプレミックス溶液20 μL に対し、予め調製したDNA配列（His-Zipped）5 μL、100 μM プライマー１ 0.15 μL、50 μMの各c-Kit結合環状ペプチド配列をコードする領域を含むプライマー 0.3 μLを加え、PCRで増幅した。次に、そのPCR産物と100 μM プライマー１ 0.15 μL、100 μM プライマー２ 0.15 μLをPCRプレミックス溶液20 μLに加え、PCRで増幅した。更にそのPCR産物と100 μM プライマー１ 0.15 μL、100 μM プライマー３ 0.15 μLをPCRプレミックス溶液20 μLに加え、PCRで増幅し全長鋳型DNAを調製した。
　このように調製した全長鋳型DNAを含むPCR産物をMilliQ水で5倍希釈し、PUREfrex 2.0 (ジーンフロンティア)を用いて試験管内無細胞翻訳反応を実施して、各ペプチド溶液を得た。
(a) Zipped-CAP0208
MKDHLIHNHHKHEHAHAEHLGGCGGRMKQLEDKVEELLSKNYHLENEVARLKKLVGERAAPAAPAPACFWSHRGSSMIQHCGSG（配列番号：８８）
(b) Zipped-CAP0164
MKDHLIHNHHKHEHAHAEHLGGCGGRMKQLEDKVEELLSKNYHLENEVARLKKLVGERAAPAAPAPACWWWESGYSMVQECGSG（配列番号：８９）
(c) Zipped-CAP0005
MKDHLIHNHHKHEHAHAEHLGGCGGRMKQLEDKVEELLSKNYHLENEVARLKKLVGERAAPAAPAPACWVSGHNSWVKINCGSG（配列番号：９０）
(d) Zipped-CAP0378
MKDHLIHNHHKHEHAHAEHLGGCGGRMKQLEDKVEELLSKNYHLENEVARLKKLVGERAAPAAPAPACVWEPIDFTYVQHCGSG（配列番号：９１）
(e) Zipped-CAP0148
MKDHLIHNHHKHEHAHAEHLGGCGGRMKQLEDKVEELLSKNYHLENEVARLKKLVGERAAPAAPAPACTWTHIGKSLIIQCGSG（配列番号：９２）
(f) Zipped-CAP0020
MKDHLIHNHHKHEHAHAEHLGGCGGRMKQLEDKVEELLSKNYHLENEVARLKKLVGERAAPAAPAPACEWVFFPQTKTMVCGSG（配列番号：９３）
(g) Zipped-CAP0400
MKDHLIHNHHKHEHAHAEHLGGCGGRMKQLEDKVEELLSKNYHLENEVARLKKLVGERAAPAAPAPACWESLGYSYVIVPCGSG（配列番号：９４）
(h) Zipped-CAP0040
MKDHLIHNHHKHEHAHAEHLGGCGGRMKQLEDKVEELLSKNYHLENEVARLKKLVGERAAPAAPAPACWKHVRYTMLQIPCGSG（配列番号：９５）
(i) Zipped-CAP2006
MKDHLIHNHHKHEHAHAEHLGGCGGRMKQLEDKVEELLSKNYHLENEVARLKKLVGERAAPAAPAPACVWRARGYSMVQMCGSG（配列番号：９６）
His-Zipped
5’- GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCAATGAAAGATCATCTCATCCACAATCATCACAAACATGAGCACGCTCATGCCGAACACCTGGGTGGTTGCGGTGGTCGCATGAAACAGTTGGAGGATAAAGTCGAAGAGCTTCTGAGCAAGAACTATCACCTCGAAAACGAAGTTGCTCGTCTGAAGAAACTCGTTGGAGAACGTGCAGCACCAGCAGCTCCGGCCCCTGCTTGT -3’（配列番号：９７）
（及びその相補鎖）
CAP_0400をコードする領域を含むプライマー
ACTACCCGCTGCCACACGGCACAATCACATAGCTATAGCCCAGGCTTTCCCAACATGCTGGAGCTGGTGC（配列番号：９８）
実施例５：c-Kit結合ペプチドのSCF様活性評価と活性モチーフの同定
　実施例４で調製した計9種類の発現産物に対し、Hisタグ精製・濃縮プロセスを実施した後、PathHunter（登録商標） eXpress c-KIT Functional AssayでSCF様活性を評価した。凍結された細胞を素早く融解し、製品付属のCell Plating Reagentで再懸濁し384-well plateに播種し20時間以上培養した。
　CAP_2006以外のペプチド溶液については予め希釈系列を調製し、培地に対して終希釈倍率が10倍、30倍、90倍、270倍、810倍、又は2430倍となるよう適量添加し、3時間室温で培養した。また、CAP_2006のペプチド溶液は培地に対して終希釈倍率が110倍、220倍、440倍、880倍、又は1760倍となるよう適量添加し、3時間室温で培養した。これらをサンプル添加群とした。
　一方、ペプチド溶液を添加せずに3時間室温で培養したものを無添加群とした。
　製品付属のCell Assay buffer、Substrate reagent 1、Substrate reagent 2でpremixを調製し、サンプル添加群及び無添加群それぞれに必要量添加した。更に1時間室温・遮光環境下で培養した後、発光強度測定を実施した。サンプル添加群の値と無添加群の平均値との差分を計算し、それを相対発光強度として活性強度を評価した。結果を図５及び図６に示す。
　この結果から、CAP_0208、CAP_0164、CAP_0005、CAP_0378、CAP_0148、CAP_0020、CAP_2006について、濃度依存的な活性が認められた。CAP_0400について10倍希釈での活性が認められた。CAP_0040については、活性が確認できなかった。以上の結果をもとに、WX1-3(G/P)X1-3(S/T)（式中、各記号は、それぞれ式（４）で定義されるとおりである。より具体的なモチーフは、上記式（５）、（６）、（７）又は（８）で示される。）をSCF様活性モチーフとして抽出した。
実施例６：SCF様活性を保持する環状ホモダイマーペプチドの鋳型DNA調製
　実施例３で結合活性を確認した配列のうちの4種類（CAP_0001、CAP_0005、CAP_0148、CAP_2006）のペプチドを選定した。選定した4種類のペプチドについてそれぞれ、これらの配列2つ（同じもの同士）を、主にアラニン及びプロリン残基からなるペプチドリンカーでつないだペプチド配列を含む「STaMPtide」配列(j)～(o)を設計（CAP_S_0001、CAP_S_0005、CAP_S_0148、CAP_S_2006_PA8、CAP_S_2006_PA22、CAP_S_2006_PAS49）し、対応する鋳型DNA配列（CAP_S_0001-DNA、CAP_S_0005-DNA、CAP_S_0148-DNA、CAP_S_2006_PA8-DNA、CAP_S_2006_PA22-DNA、CAP_S_2006_PAS49-DNA）を含むプラスミドをユーロフィンジェノミクスジャパン株式会社で遺伝子全合成することで得た。
　得られた各STaMPtideコンストラクトから無細胞翻訳に必要な鋳型DNAをPCRにより調製した。KOD -plus- ver.2製品プロトコルに従い、PCRプレミックス溶液50 μL に対し、100 ng/μLに調製した各遺伝子溶液 0.5 μL、100 μM プライマー１ 0.5 μL, 100 μMプライマー３ 0.5 μLを加え、PCRで増幅した。
　このように調製した全長鋳型DNAを含むPCR産物をMilliQ水で5倍希釈し、PUREfrex 2.0 (ジーンフロンティア)を用いて試験管内無細胞翻訳反応を実施して、各ペプチド溶液を得た。別途、鋳型DNAを含むPCR産物の代わりにMilliQ水を使用して同様に試験管内無細胞翻訳反応を実施し、鋳型DNA非添加の無細胞翻訳溶液を得た。
(j) CAP_S_0001
MACKWMQKGFSMIQMCGAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPGMACKWMQKGFSMIQMC（配列番号：９９）
(k) CAP_S_0005
MACWVSGHNSWVKINCGAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPGMACWVSGHNSWVKINC（配列番号：１００）
(l) CAP_S_0148
MACTWTHIGKSLIIQCGAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPGMACTWTHIGKSLIIQC（配列番号：１０１）
(m) CAP_S_2006_PA8
MACVWRARGYSMVQMCGAAPAAPAPGCVWRARGYSMVQMC（配列番号：１０２）
(n) CAP_S_2006_PA22
MACVWRARGYSMVQMCGAAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAPGCVWRARGYSMVQMC（配列番号：１０３）
(o) CAP_S_2006_PAS49
MACVWRARGYSMVQMCGSAPSPSSAPASASAPASPASASASASPASSPASASSASPAASSASPASSGCVWRARGYSMVQMC（配列番号：１０４）
CAP_S_0001-DNA
5’- GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCAATGGCGTGTAAATGGATGCAGAAAGGCTTTAGCATGATTCAAATGTGCGGCGCAGCCCCCGCAGCACCAGCTCCAGCAGCACCCGCAGCTCCAGCACCAGCAGCCCCTGCAGCCCCAGGCATGGCCTGCAAATGGATGCAGAAGGGTTTCTCTATGATCCAAATGTGTTAGTGAATAACTAATCC -3’（配列番号：１０５）
（及びその相補鎖）
CAP_S_0005-DNA
5’- GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCAATGGCGTGTTGGGTTAGCGGCCATAATTCGTGGGTGAAAATTAACTGCGGCGCAGCCCCCGCAGCACCAGCTCCAGCAGCACCCGCAGCTCCAGCACCAGCAGCCCCTGCAGCCCCAGGCATGGCCTGCTGGGTTTCTGGTCATAACTCGTGGGTGAAAATCAATTGTTAGTGAATAACTAATCC -3’（配列番号：１０６）
（及びその相補鎖）
CAP_S_0148-DNA
5’- GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCAATGGCGTGTACCTGGACGCATATTGGCAAAAGCCTGATCATTCAGTGCGGCGCAGCCCCCGCAGCACCAGCTCCAGCAGCACCCGCAGCTCCAGCACCAGCAGCCCCTGCAGCCCCAGGCATGGCCTGCACATGGACGCACATTGGTAAATCTCTGATTATCCAGTGTTAGTGAATAACTAATCC -3’（配列番号：１０７）
（及びその相補鎖）
CAP_S_2006_PA8-DNA 
5’- GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCAATGGCGTGTGTTTGGCGTGCGCGCGGCTATAGCATGGTGCAGATGTGCGGCGCAGCACCCGCAGCTCCAGCACCAGGCTGCGTTTGGCGTGCACGTGGTTATTCTATGGTGCAGATGTGTTAGTGAATAACTAATCC -3’（配列番号：１０８）
（及びその相補鎖）
CAP_S_2006_PA22-DNA 
5’- GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCAATGGCGTGTGTTTGGCGTGCGCGCGGCTATAGCATGGTGCAGATGTGCGGCGCAGCCCCCGCAGCACCAGCTCCAGCAGCACCCGCAGCTCCAGCACCAGCAGCCCCTGCAGCCCCAGGCTGCGTTTGGCGTGCACGTGGTTATTCTATGGTGCAGATGTGTTAGTGAATAACTAATCC -3’（配列番号：１０９）
（及びその相補鎖）
CAP_S_2006_PAS49-DNA
5’- GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCAATGGCGTGTGTTTGGCGTGCGCGCGGCTATAGCATGGTGCAGATGTGCGGCTCTGCTCCATCACCTTCTTCCGCACCAGCATCAGCTTCTGCACCAGCGTCGCCTGCTTCTGCATCTGCGTCTGCTTCACCAGCATCCTCACCTGCATCAGCATCGTCTGCTTCTCCAGCAGCTTCCTCAGCTTCACCTGCTTCGTCTGGTTGCGTTTGGCGTGCACGTGGTTATTCTATGGTGCAGATGTGTTAGTGAATAACTAATCC -3’（配列番号：１１０）
（及びその相補鎖）
実施例７：c-Kit結合ペプチドのSCF様活性評価と活性モチーフの同定
　実施例６で調製した計6種類のSTaMPtide発現産物について、PathHunter（登録商標） eXpress c-KIT Functional AssayでSCF様活性を評価した。凍結された細胞を素早く融解し、製品付属のCell Plating Reagentで再懸濁し384-well plateに播種し20時間以上培養した。
　CAP_S_0001、CAP_S_0005、CAP_S_0148について、予め希釈系列を調製したペプチド溶液を培地に対して終希釈倍率が110倍、330倍、又は990倍となるよう適量添加し、3時間室温で培養した。CAP_S_2006_PA8、CAP_S_2006_PA22、CAP_S_2006_PAS49について、予め希釈系列を調製したペプチド溶液を培地に対して終希釈倍率が110倍、220倍、440倍、880倍、1760倍、3520倍、7040倍、14080倍、28160倍、又は56320倍となるよう適量添加し、3時間室温で培養した。これらをサンプル添加群とした。
　一方、鋳型DNAを添加しなかった無細胞翻訳溶液を上記の終希釈倍率となるよう適量添加し、3時間室温で培養したものを無添加群とした。
　製品付属のCell Assay buffer、Substrate reagent 1、Substrate reagent 2でpremixを調製し、サンプル添加群及び無添加群それぞれに必要量添加した。更に1時間室温・遮光環境下で培養した後、発光強度測定を実施した。サンプル添加群の値と無添加群との差分を計算し、それを相対発光強度として活性強度を評価した。結果を図７及び図８に示す。
　この結果から、CAP_S_0001、CAP_S_0005、CAP_S_0148いずれについても、110倍及び330倍の希釈倍率にて活性が認められた。また、CAP_S_2006_PAS49について、110倍、220倍、440倍、880倍及び1760倍の希釈倍率にて活性が認められた。CAP_S_2006_PA8、CAP_S_2006_PA22について110倍、220倍及び440倍の希釈倍率にて活性が認められた。また、CAP_S_2006_PAS49について、CAP_S_2006_PA8、CAP_S_2006_PA22と比して高い活性が認められた。
実施例８：Ｎ末端にリジン残基を有するFcタンパク質（Fc）－ペプチドコンジュゲートの合成
［実施例８－１］ペプチド（Ｐ－１）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
（実施例８－１－１）ペプチドの固相合成
　４－アジド安息香酸－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｖａｌ－Ｔｒｐ－Ａｒｇ－Ａｌａ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｔｙｒ－Ｓｅｒ－Ｍｅｔ－Ｖａｌ－Ｇｌｎ－Ｍｅｔ－Ｃｙｓ－ＮＨ2（配列番号１１１）で示されるペプチドをＦｍｏｃ固相合成法により合成した。ペプチド合成装置はLiberty Blue（CEM社）を使用した。用いたペプチド固相合成によって、Ｃ末端をアミド化し、Ｎ末端を４－アジド安息香酸（TCI社）でキャッピングしたものを調製した。20％HFIP／ジクロロメタンの溶液にて終夜撹拌することで、アミノ酸側鎖を脱保護し樹脂からの切り出しを行った。樹脂をフィルトレーションにより除去し、溶液を濃縮後、これを分取ＨＰＬＣにて精製し、生成物であるペプチドを得た。
（実施例８－１－２）ペプチドのＣｙｓでの分子内ジスルフィド結合の形成
　実施例８－１－１で合成したペプチドをDMSOに溶解し、0.1M Tris-HCl溶液（pH 8.0）を加えた。この溶液にグルタチオン酸化型を加えて室温で20時間攪拌した。反応溶液に2Mトリフルオロ酢酸水溶液を加え反応を停止し、これを0.05％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、オクタドデシル基化学結合型シリカゲルを充填剤とする逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、トリフルオロ酢酸0.05％を含有する水とアセトニトリルの混合溶液で溶出し、各フラクションをLC-MSにより確認した。生成物が含まれるフラクションを回収し、減圧下濃縮することによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥を行い、目的物（Ｐ－１）を得た。
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｚ＝１　１９７６．３［Ｍ＋Ｈ］
［実施例８－２］Ｎ末端にリジン残基を有するFcタンパク質の調製
　国際公開第2017/191817号に記載の方法に則り、配列番号１１２で示されるFcタンパク質（Fc）を合成した。
配列番号１１２
Ｌｙｓ－Ｔｈｒ－Ｈｉｓ－Ｔｈｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｖａｌ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－Ａｓｐ－Ｔｈｒ－Ｌｅｕ－Ｍｅｔ－Ｉｌｅ－Ｓｅｒ－Ａｒｇ－Ｔｈｒ－Ｐｒｏ－Ｇｌｕ－Ｖａｌ－Ｔｈｒ－Ｃｙｓ－Ｖａｌ－Ｖａｌ－Ｖａｌ－Ａｓｐ－Ｖａｌ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｇｌｕ－Ａｓｐ－Ｐｒｏ－Ｇｌｕ－Ｖａｌ－Ｌｙｓ－Ｐｈｅ－Ａｓｎ－Ｔｒｐ－Ｔｙｒ－Ｖａｌ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ｖａｌ－Ｈｉｓ－Ａｓｎ－Ａｌａ－Ｌｙｓ－Ｔｈｒ－Ｌｙｓ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ｇｌｎ－Ｔｙｒ－Ａｓｎ－Ｓｅｒ－Ｔｈｒ－Ｔｙｒ－Ａｒｇ－Ｖａｌ－Ｖａｌ－Ｓｅｒ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｔｈｒ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｈｉｓ－Ｇｌｎ－Ａｓｐ－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ａｓｎ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ－Ｇｌｕ－Ｔｙｒ－Ｌｙｓ－Ｃｙｓ－Ｌｙｓ－Ｖａｌ－Ｓｅｒ－Ａｓｎ－Ｌｙｓ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｉｌｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ－Ｔｈｒ－Ｉｌｅ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ａｌａ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｎ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－Ｇｌｕ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｖａｌ－Ｔｙｒ－Ｔｈｒ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ａｒｇ－Ａｓｐ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－Ｔｈｒ－Ｌｙｓ－Ａｓｎ－Ｇｌｎ－Ｖａｌ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ－Ｔｈｒ－Ｃｙｓ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｔｙｒ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｉｌｅ－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ｔｒｐ－Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ａｓｎ－Ｇｌｙ－Ｇｌｎ－Ｐｒｏ－Ｇｌｕ－Ａｓｎ－Ａｓｎ－Ｔｙｒ－Ｌｙｓ－Ｔｈｒ－Ｔｈｒ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｌｅｕ－Ｔｈｒ－Ｖａｌ－Ａｓｐ－Ｌｙｓ－Ｓｅｒ－Ａｒｇ－Ｔｒｐ－Ｇｌｎ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－Ａｓｎ－Ｖａｌ－Ｐｈｅ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｓｅｒ－Ｖａｌ－Ｍｅｔ－Ｈｉｓ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｈｉｓ－Ａｓｎ－Ｈｉｓ－Ｔｙｒ－Ｔｈｒ－Ｇｌｎ－Ｌｙｓ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ
［実施例８－３］２分子のDBCO基を有するＮ末端にリジン残基を有するFcタンパク質の合成
（実施例８－３－１）Ｌｙｓ２７に２分子のチオール基を有するＮ末端にリジン残基を有するFcタンパク質の合成
　実施例８－２で調製したFcに対して、既報（国際公開第2019/240287号）記載のペプチド試薬（Ｐ－２）を用いて、当該文献に記載の手法に従い、Fcタンパク質のＮ末端から２７番目のリジン残基（Ｌｙｓ２７）にチオール基を導入した。当該文献の記載に従いESI-TOFMS分析を行い、56346と56508にピークが観測され、２分子のチオール基が導入されたことを確認した。
　なお、Ｐ－２は、配列番号１１３で示されるアミノ酸配列に対し、Ｎ末端から８番目のリジン残基の側鎖アミノ基を修飾したものである。
（実施例８－３－２）Ｌｙｓ６７に２分子のチオール基を有するＮ末端にリジン残基を有するFcタンパク質の合成
　実施例８－２で調製したFcに対して、既報（国際公開第2022/154116号）記載のペプチド試薬（Ｐ－３）を用いて、当該文献に記載の手法に従い、Fcタンパク質のＮ末端から６７番目のリジン残基（Ｌｙｓ６７）にチオール基を導入した。既報（国際公開第2019/240287号）に従いESI-TOFMS分析を行い、56346と56508にピークが観測され、２分子のチオール基が導入されたことを確認した。
　なお、Ｐ－３は、配列番号１１４で示されるアミノ酸配列に対し、Ｎ末端から３１番目のリジン残基の側鎖アミノ基を修飾したものである。
（実施例８－３－３）２分子のジベンゾシクロオクチン（DBCO）基を有するFc（Ｆ－１）の合成
　実施例８－３－１で調製したチオール基を導入したFcと既報（国際公開第2022/154127号）記載の試薬（Ｐ－４）を用いて、当該文献の記載に従いDBCO基を導入した。既報（国際公開第2019/240287号）に従いESI-TOFMS分析を行い、57187と57349にピークが観測され、２分子のDBCO基が導入されたことを確認した。
（実施例８－３－４）２分子のDBCO基を有するFc（Ｆ－２）の合成
　実施例８－３－１で調製したチオール基を導入したFcのPBSE緩衝液（10mMのPhosphate Buffered Saline (PBS)、10mMのEDTA、pH7.4）溶液に市販のDBCO-PEG4-Maleimide（BroadPharma社）のジメチルホルムアミド溶液（Fcに対して５当量、ジメチルホルムアミド（DMF）（8％v/v）溶液）を加え、室温にて１時間振盪した。反応溶液をNAP-25脱塩カラム（Cytiva社製）を用いて精製し、PEG4-DBCO基を導入したFc（Ｆ－２）を取得した。既報（国際公開第2019/240287号）に従いESI-TOFMS分析を行い、57696と57858にピークが観測され、２分子のDBCO基が導入されたことを確認した。
（実施例８－３－５）２分子のDBCO基を有するFc（Ｆ－３）の合成
　実施例８－３－１で調製したチオール基を導入したFcのPBSE緩衝液（10mMのPhosphate Buffered Saline (PBS)、10mMのEDTA、pH7.4）溶液に市販のDBCO-PEG12-Maleimide（BroadPharma社）のジメチルホルムアミド溶液（Fcに対して５当量、ジメチルホルムアミド（DMF）（8％v/v）溶液）を加え、室温にて１時間振盪した。反応溶液をNAP-25脱塩カラム（Cytiva社製）を用いて精製し、PEG12-DBCO基を導入したFc（Ｆ－３）を取得した。既報（国際公開第2019/240287号）に従いESI-TOFMS分析を行い、58400と58562にピークが観測され、２分子のDBCO基が導入されたことを確認した。
（実施例８－３－６）２分子のDBCO基を有するFc（Ｆ－４）の合成
　実施例８－３－１で調製したチオール基を導入したFcに代えて実施例８－３－２で調製したチオール基を導入したFcを用いた以外は実施例８－３－５と同じように反応及び精製を行い、PEG12-DBCO基を導入したFc（Ｆ－４）を取得した。既報（国際公開第2019/240287号）に従いESI-TOFMS分析を行い、58400と58561にピークが観測され、２分子のDBCO基が導入されたことを確認した。
［実施例８－４］Ｎ末端にリジン残基を有するFcタンパク質（Ｆｃ）－ペプチドコンジュゲートの合成
（実施例８－４－１）Ｎ末端にリジン残基を有するFcタンパク質（Ｆｃ）－ペプチドコンジュゲート（Ｃ－１）の合成
　実施例８－３－３で調製したDBCO基を導入したFc（Ｆ－１）の酢酸緩衝液（50mM Sodium acetate、pH5.5）溶液に実施例８－１で合成した環状ペプチド（Ｐ－１）のジメチルホルムアミド溶液（Fcに対して６当量、ジメチルホルムアミド（DMF）（8％v/v）溶液）を加え、室温にて２０時間振盪した。反応溶液をNAP-25脱塩カラム（Cytiva社製）を用いて精製し、２分子のペプチド試薬が導入されたFc（Ｃ－１）を取得した。既報（国際公開第2019/240287号）に従いESI-TOFMS分析を行い、61137と61299にピークが観測され、２分子のＰ－１が導入されたことを確認した。
（実施例８－４－２）Ｎ末端にリジン残基を有するFcタンパク質（Fc）－ペプチドコンジュゲート（Ｃ－２）の合成
　Ｆ－１に代えて実施例８－３－４で調製したDBCO基を導入したFc（Ｆ－２）を用いた以外は実施例８－４－１と同じように反応及び精製を行い、２分子のペプチド試薬（Ｐ－１）が導入されたFc（Ｃ－２）を取得した。既報（国際公開第2019/240287号）に従いESI-TOFMS分析を行い、61646と61808にピークが観測され、２分子のＰ－１が導入されたことを確認した。
（実施例８－４－３）Ｎ末端にリジン残基を有するFcタンパク質（Fc）－ペプチドコンジュゲート（Ｃ－３）の合成
　Ｆ－１に代えて実施例８－３－５で調製したDBCO基を導入したFc（Ｆ－３）を用いた以外は実施例８－４－１と同じように反応及び精製を行い、２分子のペプチド試薬（Ｐ－１）が導入されたFc（Ｃ－３）を取得した。既報（国際公開第2019/240287号）に従いESI-TOFMS分析を行い、62350と62512にピークが観測され、２分子のＰ－１が導入されたことを確認した。
（実施例８－４－４）Ｎ末端にリジン残基を有するFcタンパク質（Fc）－ペプチドコンジュゲート（Ｃ－４）の合成
　Ｆ－１に代えて実施例８－３－６で調製したDBCO基を導入したFc（Ｆ－４）を用いた以外は実施例８－４－１と同じように反応及び精製を行い、２分子のペプチド試薬（Ｐ－１）が導入されたFc（Ｃ－４）を取得した。既報（国際公開第2019/240287号）に従いESI-TOFMS分析を行い、62350と62512にピークが観測され、２分子のＰ－１が導入されたことを確認した。
実施例９：Fc－ペプチドコンジュゲートのSCF様活性評価
　実施例８で合成したFc－ペプチドコンジュゲート（Ｃ－３）について、PathHunter（登録商標） eXpress c-KIT Functional AssayでSCF様活性を評価した。凍結された細胞を素早く融解し、製品付属のCell Plating Reagentで再懸濁し384-well plateに播種し20時間以上培養した。細胞に対し、Fc－ペプチドコンジュゲート溶液を終濃度が405.0, 202.5, 101.2, 50.6, 25.3, 12.7, 6.3, 3.2, 1.6, 0.8, 0.4 μg/mLとなるよう添加し、3時間室温で培養し、これをサンプル添加群とした。サンプルサイズは各濃度N=3で実施した。一方、Cell Plating Reagentのみを添加し、3時間室温で培養したものを無添加群とした。
　製品付属のCell Assay buffer、Substrate reagent 1、Substrate reagent 2でpremixを調製し、サンプル添加群及び無添加群それぞれに必要量添加した。更に1時間室温・遮光環境下で培養した後、発光強度測定を実施した。サンプル添加群の値と無添加群との差分を計算し、それを相対発光強度として活性強度を評価した。結果を図９に示す。
実施例１０：Fc－ペプチドコンジュゲートの特異性評価
　Fc－ペプチドコンジュゲート（Ｃ－３）の受容体チロシンキナーゼ（RTK）特異性をProteome Profiler Human Phospho-RTK Array Kit（R&D Systems）を用いて評価した。
　10 cm細胞培養ディッシュにコンフルエントの状態になったHEL細胞を、0.5％ FBS（Thermo Fisher Scientific社）およびペニシリン－ストレプトマイシン（ナカライテスク社）を含む－RPMI－Gluta Max（Thermo Fisher Scientific社）培地中で24時間培養することで飢餓状態にした。飢餓状態としたHEL細胞を、1000 ng/mLのＣ－３を含むRPMI－Gluta Max培地で37℃15分間刺激した。陽対照１，２としては、それぞれ10, 100 ng/mLのSCFで同様に37℃15分間刺激を行った。陰対照としてはRPMI－Gluta Maxを加えて37℃15分間刺激を行った（Mock群）。培地を除去し、PBSで一度細胞を洗浄した後、Protease inhibitor cocktail（ナカライテスク社）を添加したLysis buffer 17を1 mL加えることで細胞を溶解した。溶解液を14,000 Gで5分間遠心し、上清をライセートとして得た。
　ライセートをProteome Profiler Human Phospho-RTK Array Kitを用いて解析した。化学発光の検出にはAmersham Imager 600（Cytiva社）を用いた。図１０に示す通り、RPMI－Gluta Maxのみで刺激を行った細胞（Mock群）はいずれのRTKも脱リン酸化状態であることが確認された。また、SCFで刺激を行うと、c-Kitが特異的にリン酸化されることが確認された。Ｃ－３で刺激を加えると、SCFと同様、c-Kitが特異的にリン酸化された（図１０）。
　加えて、スポットの強度をImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) を用いて定量した結果を図１１に示す。Ｃ－３によるc-Kitリン酸化の程度は、SCF 10 ng/mLで刺激した場合より高く、100 ng/mLで刺激した場合より低かった。この結果から、Ｃ－３はc-Kit特異的な活性化を行うことが明らかになった。なお、図１２は、Proteome Profiler Human Phospho-RTK Array Kit（R&D Systems）の各アレイを示している。
実施例１１：Fc－ペプチドコンジュゲートのSCF様活性評価
　実施例８で合成したFc－ペプチドコンジュゲート（Ｃ－１、Ｃ－２、Ｃ－３、およびＣ－４）について、PathHunter（登録商標） eXpress c-KIT Functional AssayでSCF様活性を評価した。凍結された細胞を素早く融解し、製品付属のCell Plating Reagentで再懸濁し384-well plateに播種し20時間以上培養した。細胞に対し、Ｃ－１、Ｃ－２、Ｃ－３、およびＣ－４溶液をそれぞれ11点の2倍希釈系列で添加して3時間室温で培養し、これをサンプル添加群とした。一方、Cell Plating Reagentのみを添加し、3時間室温で培養したものを無添加群とした。
　製品付属のCell Assay buffer、Substrate reagent 1、Substrate reagent 2でpremixを調製し、サンプル添加群及び無添加群それぞれに必要量添加した。更に1時間室温・遮光環境下で培養した後、発光強度測定を実施した。サンプル添加群の値と無添加群との差分を計算し、それを相対発光強度として活性強度を評価した。結果を図１３に示す。

Claims (28)

  1. 　環状構造又はループ構造を有するペプチドであって、前記環状構造又は前記ループ構造のアミノ酸配列が下式（１）で示されるアミノ酸配列を含み、SCF受容体に結合することのできるペプチド。
    　WX4-7(S/T)XΦ　　　式（１）
    （式中、
    　Φは、W、F、Y、L、V、I及びMから選択されるアミノ酸残基を表し、
    　Xは、それぞれ独立に、任意のアミノ酸残基を表す。）
  2. 　前記式（１）で示されるアミノ酸配列が、下式（２）で示されるアミノ酸配列である、請求項１に記載のペプチド。
    　WX4-7(S/T)ΦΦ　　　式（２）
    （式中、Φ及びXは、それぞれ請求項１に記載の式（１）で定義されるとおりであり、Φはそれぞれ独立に選択される。）
  3. 　前記式（２）で示されるアミノ酸配列が、下式（３）で示されるアミノ酸配列である、請求項２に記載のペプチド。
    　WX5(S/T)ΦΨ　　　式（３）
    （式中、Φ及びXは、それぞれ請求項１に記載の式（１）で定義されるとおりであり、Ψは、L、V、I及びMから選択されるアミノ酸残基を表す。）
  4. 　Ψで表されるアミノ酸残基が、L、V及びIから選択される、請求項３に記載のペプチド。
  5. 　前記式（１）で示されるアミノ酸配列が、下記配列番号１～１５で示されるアミノ酸配列から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列と75％以上の配列同一性を有する、請求項１に記載のペプチド。
    　WSHRGSSMI（配列番号：１）
    　WESGYSMV（配列番号：２）
    　WVSGHNSWV（配列番号：３）
    　WEPIDFTYV（配列番号：４）
    　WTHIGKSLI（配列番号：５）
    　WVFFPQTKTMV（配列番号：６）
    　WHPANFSML（配列番号：７）
    　WKHVRYTML（配列番号：８）
    　WMQKGFSMI（配列番号：９）
    　WRARGYSMV（配列番号：１０）
    　WHHRGASMI（配列番号：１１）
    　WEARNWSVI（配列番号：１２）
    　WHDEGYQMTWY（配列番号：１３）
    　WVEWPTMW（配列番号：１４）
    　WESLGYSYV（配列番号：１５）
  6. 　前記式（１）で示されるアミノ酸配列が、配列番号１～１５で示されるアミノ酸配列から選択される、請求項５に記載のペプチド。
  7. 　環状構造を有するペプチドであって、前記環状構造が、請求項１に記載の式（１）で示されるアミノ酸配列を含み、かつ下記配列番号１６～３０で示されるアミノ酸配列から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列と75％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列から形成されている、請求項１に記載のペプチド。
    　CFWSHRGSSMIQHC（配列番号：１６）
    　CWWWESGYSMVQEC（配列番号：１７）
    　CWVSGHNSWVKINC（配列番号：１８）
    　CVWEPIDFTYVQHC（配列番号：１９）
    　CTWTHIGKSLIIQC（配列番号：２０）
    　CEWVFFPQTKTMVC（配列番号：２１）
    　CWHPANFSMLYQC（配列番号：２２）
    　CWKHVRYTMLQIPC（配列番号：２３）
    　CKWMQKGFSMIQMC（配列番号：２４）
    　CVWRARGYSMVQMC（配列番号：２５）
    　CFWHHRGASMIRMC（配列番号：２６）
    　CWWEARNWSVIQHC（配列番号：２７）
    　CWHDEGYQMTWYC（配列番号：２８）
    　CLWVEWPTMWELRC（配列番号：２９）
    　CWESLGYSYVIVPC（配列番号：３０）
  8. 　前記環状構造が、配列番号１６～３０で示されるアミノ酸配列のいずれか１つから形成されている、請求項７に記載のペプチド。
  9. 　式（１）で示されるアミノ酸配列中の部分配列：WX4-7(S/T)が、下式（４）で示されるアミノ酸配列である、SCF受容体に対するアゴニスト活性を有する請求項１に記載のペプチド。
    　WX1-3(G/P)X1-3(S/T)　　　式（４）
    （式中、Xは、請求項１に記載の式（１）で定義されるとおりであり、但し、式（４）においてXの総数は少なくとも３つである。）
  10. 　式（１）で示されるアミノ酸配列と、そのC末側の１アミノ酸残基とからなるアミノ酸配列が、下式（５）で示されるアミノ酸配列である、請求項９に記載のペプチド。
    　WX1-3(G/P)X1-3(S/T)X(I/V)(Q/K/R)　　　式（５）
    （式中、Xは、請求項１に記載の式（１）で定義されるとおりであり、但し、式（５）においてXの総数は少なくとも３つである。）
  11. 　式（５）で示される前記アミノ酸配列が、下式（６）で示されるアミノ酸配列である、請求項１０に記載のペプチド。
    　WX1-3(G/P)X1-3(S/T)Φ(I/V)(Q/K/R)　　　式（６）
    （式中、Φ及びXは、それぞれ請求項１に記載の式（１）で定義されるとおりであり、但し、式（６）においてXの総数は少なくとも３つである。）
  12. 　式（６）で示される前記アミノ酸配列において、Xの総数が４つである、請求項１１に記載のペプチド。
  13. 　式（６）で示される前記アミノ酸配列が、下式（７）で示されるアミノ酸配列である、請求項１２に記載のペプチド。
    　WX3GXS(L/M)(I/V)(Q/R)　　　式（７）
    （式中、Xは、請求項１に記載の式（１）で定義されるとおりである。）
  14. 　式（７）で示される前記アミノ酸配列が、下式（８）で示されるアミノ酸配列である、請求項１３に記載のペプチド。
    　WX3GXSM(I/V)(Q/R)　　　式（８）
    （式中、Xは、請求項１に記載の式（１）で定義されるとおりである。）
  15. 　式（４）で示される前記アミノ酸配列が、下記配列番号３１～３９で示されるアミノ酸配列から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列と75％以上の配列同一性を有する、請求項９に記載のペプチド。
    　WSHRGSS（配列番号：３１）
    　WESGYS（配列番号：３２）
    　WVSGHNS（配列番号：３３）
    　WEPIDFT（配列番号：３４）
    　WTHIGKS（配列番号：３５）
    　WVFFPQTKT（配列番号：３６）
    　WMQKGFS（配列番号：３７）
    　WESLGYS（配列番号：３８）
    　WRARGYS（配列番号：３９）
  16. 　式（４）で示される前記アミノ酸配列が、配列番号３１～３９で示されるアミノ酸配列から選択される、請求項１５に記載のペプチド。
  17. 　式（５）で示される前記アミノ酸配列が、下記配列番号４０～４５で示されるアミノ酸配列から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列と75％以上の配列同一性を有する、請求項１０に記載のペプチド。
    　WSHRGSSMIQ（配列番号：４０）
    　WESGYSMVQ（配列番号：４１）
    　WVSGHNSWVK（配列番号：４２）
    　WEPIDFTYVQ（配列番号：４３）
    　WMQKGFSMIQ（配列番号：４４）
    　WRARGYSMVQ（配列番号：４５）
  18. 　式（５）で示される前記アミノ酸配列が、配列番号４０～４５で示されるアミノ酸配列から選択される、請求項１７に記載のペプチド。
  19. 　環状構造を有するペプチドであって、前記環状構造が、請求項９に記載の式（４）で示されるアミノ酸配列又は請求項１０に記載の式（５）で示されるアミノ酸配列を含み、かつ下記配列番号１６～２１、２４、２５及び３０で示されるアミノ酸配列から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列と75％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列から形成されている、請求項９又は１０に記載のペプチド。
    　CFWSHRGSSMIQHC（配列番号：１６）
    　CWWWESGYSMVQEC（配列番号：１７）
    　CWVSGHNSWVKINC（配列番号：１８）
    　CVWEPIDFTYVQHC（配列番号：１９）
    　CTWTHIGKSLIIQC（配列番号：２０）
    　CEWVFFPQTKTMVC（配列番号：２１）
    　CKWMQKGFSMIQMC（配列番号：２４）
    　CVWRARGYSMVQMC（配列番号：２５）
    　CWESLGYSYVIVPC（配列番号：３０）
  20. 　前記環状構造が、配列番号１６～２１、２４、２５及び３０で示されるアミノ酸配列のいずれか１つから形成されている、請求項１９に記載のペプチド。
  21. 　請求項１～２０のいずれか１項に記載のペプチドを２分子含むペプチドダイマー。
  22. 　請求項１～２０のいずれか１項に記載のペプチドを２分子含むペプチドホモダイマー。
  23. 　請求項１～２２のいずれか１項に記載のペプチド、ペプチドダイマーまたはペプチドホモダイマーを含む医薬組成物。
  24. 　請求項１～２２のいずれか１項に記載のペプチド、ペプチドダイマーまたはペプチドホモダイマーを含む細胞培養用培地。
  25. 　請求項１～２２のいずれか１項に記載のペプチド、ペプチドダイマーまたはペプチドホモダイマーを含む細胞培養用添加剤。
  26. 　請求項１～２２のいずれか１項に記載のペプチド、ペプチドダイマーまたはペプチドホモダイマーを含む、細胞の分化誘導剤。
  27. 　請求項１～２２のいずれか１項に記載のペプチド、ペプチドダイマーまたはペプチドホモダイマーを細胞と接触させることを含む、細胞培養方法。
  28. 　請求項１～２２のいずれか１項に記載のペプチド、ペプチドダイマーまたはペプチドホモダイマーを細胞と接触させることを含む、細胞の分化を誘導する方法。
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