JP2013513601A - Bpbベースのカーゴ運搬システム - Google Patents
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Classifications
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
Abstract
を含むBPBベースのカーゴ運搬システム(Cargo Delivery System)に関し、本発明のBPBベースのカーゴ運搬システムは、BPBのターゲット結合性及び特異性に基づいて多用な物質を細胞表面または細胞内に運搬できる。二坐ペプチドバインダーは、非常に低い水準(例えば、nM水準)のKD値(解離定数)を示し、ターゲットに非常に高い親和度を示す。本発明のBPBベースのカーゴ運搬システムは、医薬、インビボ分子イメージング、インビトロ細胞イメージング及び薬物伝達用ターゲッティングをする際に利用でき、エスコート分子としても非常に有用に利用できる。
【選択図】図15b
Description
[一般式I]
X1-Trp(X2)X3-X4-X5(X'2)X6-X7
[一般式II]
X1-Trp-X2-Tyr-X3-Phe-Thr-Val-X4
[一般式II’]
X1-Trp-Thr-Tyr-X2-Phe-Thr-Val-X3
[一般式III]
X1-X2-X3-Trp-X4-X5-Thr-X6-X7
[一般式IV]
X1-X2-X3-Trp-X4
(i)本発明は、BPBベースのカーゴ運搬システムを提供する。
(ii)本発明の二座ペプチドバインダーにおいて、構造安定性部位の両末端に結合されている離隔された(distal)二つのターゲット結合部位は、互いに協同的に(cooperatively)、シナージック(synergetically)にターゲットに結合する。
(iii)このため、本発明の二座ペプチドバインダーは、非常に低い水準(例えば、nM水準)のKD値(解離定数)を示し、ターゲットに非常に高い親和度を示す。
(iv)本発明のBPBベースのカーゴ運搬システムは、BPBのターゲット結合性及び特異性に基づいて、多様な物質を細胞表面または細胞内に運搬することができる。
実施例1:ライブラリーの製作
二座ペプチドバインダー遺伝子の製作及びファージミドベクターへの挿入
二つのオリゴヌクレオチドBeta-F1(5'-TTCTATGCGGCCCAGCTGGCC (NNK)6GGATCTTGGACATGGGAAAACGGAAAA-3')及びBeta-B1 (5'-AACAGTTTCTGCGGCCGCTCCTCC TCC(MNN)6TCCCTTCCATGTCCATTTTCCGTT-3')(Nは、A, T, GまたはC; Kは、GまたはT; Mは、CまたはA)を合成した。二重鎖を作るために、Beta-F1 4μM, Beta-B1 4μM, 2.5mM dNTP混合液4μl、ExTaq DNA重合酵素1μl(Takara, Seoul, Korea)及び10×PCRバッファ5μlを混合して、総50μlになるように蒸留水を添加した混合液を25個作った。この混合液をPCR反応(94℃で5分、60サイクル: 30℃で30秒、72℃で30秒及び72℃で7分間)をして、二重鎖を作った後、PCR精製キット(GeneAll, Seoul, Korea)を利用して精製し、二座ペプチドバインダー遺伝子を得た。二座ペプチドバインダーに挿入させる遺伝子をpIGT2ファージミドベクター(Ig therapy, Chuncheon, Korea)に連結するために、インサート遺伝子とpIGT2ファージミドベクターに制限酵素を処理した。約11μgのインサートDNAをSfiI(New England Biolabs(NEB, Ipswich)及びNotI(NEB, Ipswich)でそれぞれ4時間ずつ反応した後、PCR精製キットを利用して精製した。また、約40μgのpIGT2ファージミドベクターをSfiI及びNotIでそれぞれ4時間ずつ反応した後、CIAP(Calf Intestinal Alkaline Phosphatase)(NEB, Ipswich)を入れて1時間反応した後、PCR精製キットを利用して精製した。これらをUV-可視光線分光器(Ultrospec 2100pro, Amersham Bioscience)で定量し、2.9μgのインサート遺伝子を、T4 DNAリガーゼ(Bioneer, Daejeon, Korea)を利用してpIGT2ファージミドベクター12μgと18℃で15時間連結した後、エタノールで沈殿させてTEバッファ100μlでDNAを溶解させた。
E.coli XL1-BLUE細胞(American Type Culture Collection, Manassas, USA)をLB寒天プレートに線状塗抹した。寒天プレート培地で育った群落を5mlのLB培地に接種した後、37℃で200rpmの速度で混合しながら一日間培養した。培養された10mlの細胞を2lのLB培地に接種して、同じ方式で600nmの波長で吸光度が0.3-0.4になるまで培養した。培養されたフラスコを30分間氷に放置した後、4℃で4,000×gで20分間遠心分離し、沈殿した細胞を除いた上澄み液を全て除去し、1lの冷却された滅菌蒸留水で懸濁させた。これを再び同じ方法で遠心分離して、上澄み液を除去した後、1lの冷却された滅菌蒸留水で再懸濁させて、同じ方式で10%グリセロール溶液40mlで洗浄を繰り返して遠心分離した後、最後に10%グリセロール溶液4mlで懸濁させた後、200μlずつ分株して液体窒素に冷凍させた後、-80℃に保管した。
ファージミドベクター12μgと二座ペプチドバインダーにインサートDNA 2.9μgを連結反応させた100μlを25個に分株して、電気穿孔を行った。コンピテンス細胞を氷の上で溶かして、200mlのコンピテンス細胞を連結反応した溶液4μlと混合した後、冷却して用意した0.2cmのキュベットに入れた後、1分間氷の上に放置した。電気穿孔機(BioRad, Hercules, CA)を200Ωで25μF及び2.5kVの条件にプログラムして、用意したキュベットの水気を除去して電気穿孔機に位置させた後、パルスを与えた(時間常数は、4.5〜5msec)。その後、直に37℃に用意した20mMのグルコースの含まれた1mlのLB液体培地に入れて、得られた25mlの細胞を100ml試験管に移した。一時間37℃で200rpmの速度で混合しながら培養した後、ライブラリーの数を測定するために、10μlを稀釈してアンピシリン寒天培地に塗抹した。残りの細胞を、1lのLBに20mMグルコース及び50μg/mlのアンピシリンを入れて、30℃で一日間培養した。4℃で4,000×gで20分間遠心分離し、沈殿した細胞を除いた上澄み液を全て除去し、40mlのLBで再懸濁させた後、グリセロールを最終濃度20%以上入れて、-80℃に保管した。
-80℃に貯蔵された二座ペプチドバインダーライブラリーで組み換えファージを生産した。500mlフラスコに100mlのLB液体培地にアンピシリン(50μg/ml)及び20mMのグルコースを入れた後、-80℃に保管されたライブラリー1mlを追加して、一時間37℃で150rpmの速度で混合しながら培養した。これに1×1011pfuのExヘルパーファージ(Ig therapy, Chuncheon, Korea)を入れて、再び一時間同じ条件で培養した。1,000×gで10分間遠心分離して上澄み液を除去し、これにアンピシリン(50μg/ml)及びカナマイシン(25μg/ml)が含まれたLB液体培地100mlを入れて、一日間培養し、組み換えファージを生産した。培養液を3,000×gで10分間遠心分離し、得られた上澄み液100mlにPEG/NaCl 25mlを混合して、氷に1時間放置させた後、4℃で20分間10,000×gで遠心分離して、上澄み液は注意して除去し、2mlのPBS(pH 7.4)でペレットを再懸濁させた。
実施例に利用するフィブロネクチン(フィブロネクチン) ED-B, VEGF(vascular endothelial growth factor), VCAM1(vascular cell adhesion molecule-1), nAchR(Nicotinic acetylcholine receptor), HSA(Human serum albumin)及びMyD88を下記のように用意した。
韓国生命工学研究院から部分的なヒトのフィブロネクチンED-B(ID=KU017225)遺伝子を供給してもらった。プライマーEDB_F1(5'-TTCATAACATATGCCAGAGGTGCCCCAA-3')及びEDB_B1(5'-ATTGGATCCTTACGTTTGTTGTGTCAGTGTAGTAGGGGCACTCTCGCCGCCATTAATGAGAGTGATAACGCTGATATCATAGTCAATGCCCGGCTCCAGCCCTGTG-3')を合成して、EDB-F1 20 pmol, EDB-B1 20 pmol, 2.5 mM dNTP混合液4μl, ExTaq DNA重合酵素1μl(10 U)及び10×PCRバッファ5μlを混合して、50μlになるように蒸留水を添加した混合液を製造した。この混合液をPCR反応(94℃で5分, 30サイクル: 55℃で30秒, 72℃で1分及び94℃で30秒)をしてEDBインサートにした後、PCR精製キットを利用して精製した。EDBインサート遺伝子をpET28bベクター(Novagen)に連結するために、EDBインサート遺伝子及びpET28bベクターに制限酵素を処理した。約2μgのインサートDNAをBamHI(NEB, Ipswich)及びNdeI(NEB, Ipswich)で4時間ずつ反応した後、PCR精製キットを利用して精製した。また、約2μgのpIGT2ファージミドベクターをBamHI及びNdeIで3時間ずつ反応した後、CIAPを入れて1時間反応した後、PCR精製キットを利用して精製した。これらをベクターとインサートが約1:3のモル比率になるように添加して、T4 DNAリガーゼ(Bioneer, Daejeon, Korea)を利用して18℃で10時間連結させて、XL-1コンピテント細胞に形質転換をした後、カナマイシンの含まれた寒天培地に塗抹した。寒天プレート培地で育った群落を5mlのLB培地に接種した後、37℃で200rpmの速度で混合しながら一日間培養した後、プラスミドフラップキット(GeneAll, Seoul, Korea)を利用してプラスミドを精製し、シーケンシングをして、クローニングが成功したかどうかを確認した。
サイトカイン銀行(Jeonju, Korea)から部分的なヒトのVEGF(ID=G157)遺伝子を供給してもらった。プライマーVEGF_F1(5'-ATAGAATTCGCACCCATGGCAGAA-3')及びVEGF_B1(5'-ATTAAGCTTTCACCGCCTCGGCTTGTCACAATTTTCTTGTCTTGC-3')を合成して、VEGF-F1 20 pmol, VEGF-B1 20 pmol, 2.5 mM dNTP混合液4μl、ExTaq DNA重合酵素1μl(10 U)及び10×PCRバッファ5μlを混合して、50μlになるように蒸留水を添加した混合液を製造した。この混合液をPCR反応(94℃で5分, 30サイクル: 55℃で30秒, 72℃で1分及び94℃で30秒)をしてVEGFインサートにした後、PCR精製キットを利用して精製した。VEGFインサート遺伝子をpET32aベクター(Novagen)に連結するために、VEGFインサート遺伝子及びpET32aベクターに制限酵素を処理した。約2μgのインサートDNAをEcoRI(NEB, Ipswich)及びHindIII(NEB, Ipswich)で4時間ずつ反応した後、PCR精製キットを利用して精製した。これらをベクターとインサートが約1:3のモル比率になるように添加して、T4 DNAリガーゼ(Bioneer, Daejeon, Korea)を利用して18℃で10時間連結させて、XL-1コンピテント細胞に形質転換をした後、アンピシリンの含まれた寒天培地に塗抹した。寒天プレート培地で育った群落を5mlのLB培地に接種した後、37℃で200rpmの速度で混合しながら一日間培養した後、プラスミドフラップキット(GeneAll, Seoul, Korea)を利用してプラスミドを精製し、シーケンシングをして、クローニングが成功したかどうかを確認した。
韓国生命工学研究院からヒトのVCAM1遺伝子を供給してもらった。VCAM1インサート遺伝子をpET32aベクターに連結するために、VCAM1インサート遺伝子及びpET32aベクターに制限酵素を処理した。これらをベクターとインサートが約1:3のモル比率になるように添加して、T4 DNAリガーゼ(Bioneer, Daejeon, Korea)を利用して18℃で10時間連結させて、XL-1コンピテント細胞に形質転換をした後、アンピシリンの含まれた寒天培地に塗抹した。寒天プレート培地で育った群落を5mlのLB培地に接種した後、37℃で200rpmの速度で混合しながら一日間培養した後、プラスミドフラップキット(GeneAll, Seoul, Korea)を利用してプラスミドを精製し、シーケンシングをして、クローニングが成功したかどうかを確認した。
フィブロネクチンED-BをクローニングしたpET28bベクターをBL21細胞に形質転換した後、カナマイシンの含まれた寒天培地に塗抹した。寒天プレート培地で育った群落をカナマイシン(25μg/ml)の含まれた5mlのLB培地に接種した後、37℃で200rpmの速度で混合しながら一日間培養した後、カナマイシン(25μg/ml)の含まれた50mlのLB培地に移して3時間培養した。培養したE. coliをカナマイシン(25μg/ml)の含まれた2lのLBに接種して、OD=0.6-0.8まで培養した。その後、1mMイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)を入れて、37℃で200rpmの速度で混合しながら8時間培養した。4,000×gで20分間遠心分離して、沈殿された細胞を除いた上澄み液を全て除去し、ライシスバッファ(50mMリン酸ナトリウム(pH 8.0), 300mM NaCl及び5mMイミダゾール)で懸濁させた。-80℃に一日間保管した後、ソニケーターを利用してE. coliを溶解させた後、15,000×gで1時間遠心分離して、上澄み液をNi-NTA親和性レジン(Elpisbio, Daejeon, Korea)に結合させる。ライシスバッファでレジンを洗浄した後、イリュージョンバッファ(50mMリン酸ナトリウム(pH 8.0), 300mM NaCl及び300mMイミダゾール)を利用して、N-末端His-tag ED-B蛋白質を溶出させて獲得した。このように獲得した蛋白質をSuperdex75カラム(GE Healthcare, United Kingdom)及びPBS(pH 7.4)バッファを利用して、ゲルろ過法(gel filtration)で純度の高いED-B蛋白質を得た。バイオパニングのためにED-B蛋白質にビオチンを連結した。6mgのスルホ-NHS-SS-ビオチン(PIERCE, Illinois, USA)及び1.5mgのED-B蛋白質を常温で0.1Mホウ酸ナトリウム(pH 9.0)下で2時間反応し、反応しなかったスルホ-NHS-SS-ビオチンを除去するために、蛋白質をSuperdex75カラム及びPBS(pH 7.4)バッファを利用してゲルろ過法(gel filtration)でビオチン-EDB蛋白質を精製した。
VEGF121とVCAM1をクローニングしたpET32aベクターをそれぞれAD494細胞に形質転換した後、アンピシリンの含まれた寒天培地に塗抹した。寒天プレート培地で育った群落をアンピシリン(25μg/ml)の含まれた5mlのLB培地に接種した後、37℃で200rpmの速度で混合しながら一日間培養した後、アンピシリン(25μg/ml)の含まれた50mlのLB培地に移して3時間培養した。培養したE. coliをアンピシリン(25μg/ml)の含まれた2lのLBに接種して、OD=0.6-0.8まで培養した。その後、1mMイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)を入れて、37℃で200rpmの速度で混合しながら8時間培養した。4,000×gで20分間遠心分離して、沈殿された細胞を除いた上澄み液を全て除去し、ライシスバッファ(50mMリン酸ナトリウム(pH 8.0), 300mM NaCl及び5mMイミダゾール)で懸濁させた。-80℃に一日間保管した後、ソニケーターを利用してE. coliを溶解させた後、15,000×gで1時間遠心分離して、上澄み液をNi-NTA親和性レジン(Elpisbio, Daejeon, Korea)に結合させる。ライシスバッファでレジンを洗浄した後、イリュージョンバッファ(50mMリン酸ナトリウム(pH 8.0), 300mM NaCl及び300mMイミダゾール)を利用して、Trx-VEGF121蛋白質を溶出させて獲得した。このように獲得した蛋白質をSuperdex75カラム(GE Healthcare, United Kingdom)及びPBS(pH 7.4)バッファを利用して、ゲルろ過法(gel filtration)で純度の高いVEGF-TrxとVCAM1-Trx蛋白質を得た。純粋なVEGFを得るために、トロンビンでVEGFとTrx間を切断し、VEGF121を得た。
BiotinフィブロネクチンED-B蛋白質とBiotin-nAchRペプチドのバイオパニング方法
2mlのストレプトアビジン(10μg/ml)を96ウェルELISAプレート(Corning)の40個のウェルに50μlずつ入れた後、4℃で一晩中放置し、翌日20個のウェルにのみ0.1%のPBST(tween-20)で3回洗浄した後、ビオチンED-BとビオチンnAchR(10μg/ml)をそれぞれ入れて、常温で1時間放置した。その後、40個のウェルの全てを0.1%PBSTで3回洗浄して、PBSで稀釈した2%BSAを使用して常温で2時間ブロッキングした後、溶液を全て捨てて、0.1%PBSTで3回洗浄した。これに二座ペプチドバインダー組み換えファージ含有溶液800μl及び10%BSA 200μlを混合し、ストレプトアビジン及びBSAに結合するファージを除去するために、ストレプトアビジンにBSAコーティングした20個のウェルに入れて1時間27℃に放置した。上澄み液を回収してED-BとnAchRが結合した20個のウェルに移して、27℃で45分間放置した。20個のウェルの溶液を全て除去して、0.5%PBSTで15回洗浄した後、0.2Mグリシン/HCl(pH2.2)1mlを各ウェル当たり50μlずつ入れて20分間ファージを溶離させて、1mlをチューブに集めて、これに2M Tris-base(pH 9.0)150μlを入れて溶液を中和させた。各バイオパニング毎にインプットファージ及びアウトプットファージの数を測定するために、OD=0.7のXL-1 BLUE細胞に混ぜて、アンピシリンの含まれた寒天培地に塗抹した。パニングを繰り返すために10mlのE. coli XL1-BLUE細胞と混ぜて、37℃で1時間200rpmの速度で混合しながら培養した。アンピシリン(50μg/ml)及び20mMグルコースを混合した後、2×1010 pfuのExヘルパーファージを添加して、37℃で1時間200rpmの速度で混合しながら培養した。培養液を1,000×gで10分間遠心分離した後、上澄み液は全て除去し、沈殿された細胞をアンピシリン(50μg/ml)及びカナマイシン(25μg/ml)の含まれた40ml LB液体培地で再懸濁して、30℃で200 rpmの速度で混合しながら一日間培養した。培養液を4,000×g、20分間及び4℃の条件で遠心分離した。上澄み液に8mlの5x PEG/NaCl[20% PEG(w/v)及び15% NaCl(w/v)]を添加した後、4℃で1時間静置させた。遠心分離後、PEG溶液を完全に除去して、1mlのPBS溶液でファージペプチドペレットを溶かした後、2次バイオパニングに使用した。各パニング段階毎に上記と同一な方法を使用したが、洗浄過程は、段階別にそれぞれ25回及び35回(0.5% PBST)増加させた。
VEGFとVCAM1-trxとHSAとMyD 88(5μg/ml)を96ウェルELISAプレート(Corning)の10個のウェルに50μlずつ入れた後、4℃で一晩中放置し、翌日2%BSAを使用して常温で2時間ブロッキングした後、溶液を全て捨てて、0.1%PBSTで3回洗浄した。これに二座ペプチドバインダー組み換えファージ含有溶液800μl及び10%BSA 200μlを混合し、VEGFとVCAM1-TrxとHSAが結合した10個のウェルに移して常温で1時間放置した。10個のウェルの溶液を全て除去して、0.1%PBSTで10回洗浄した後、0.2Mグリシン/HCl(pH2.2)1mlを各ウェル当たり50μlずつ入れて20分間ファージを溶離させて、1mlをチューブに集め、これに2M Tris-base(pH 9.0)150μlを入れて溶液を中和させた。各バイオパニング毎にインプットファージ及びアウトプットファージの数を測定するために、OD=0.7のXL-1 BLUE細胞に混ぜて、アンピシリンの含まれた寒天培地に塗抹した。パニングを繰り返すために10mlのE. coli XL1-BLUE細胞と混ぜて、37℃で1時間200rpmの速度で混合しながら培養した。アンピシリン(50μg/ml)及び20mMグルコースを混合した後、2×1010 pfuのExヘルパーファージを添加して、37℃で1時間200rpmの速度で混合しながら培養した。培養液を1,000×gで10分間遠心分離した後、上澄み液は除去し、沈殿された細胞をアンピシリン(50μg/ml)及びカナマイシン(25μg/ml)の含まれた40ml LB液体培地で再懸濁して、30℃で200 rpmの速度で混合しながら一日間培養した。培養液を4,000×g、20分間及び4℃の条件で遠心分離した。上澄み液に8mlの5x PEG/NaCl[20% PEG(w/v)及び15% NaCl(w/v)]を添加した後、4℃で1時間静置させた。遠心分離後、PEG溶液を完全に除去して、1mlのPBS溶液でファージペプチドペレットを溶かした後、2次バイオパニングに使用した。各パニング段階毎に上記と同一な方法を使用したが、洗浄過程は、段階別にそれぞれ20回及び30回(0.1% PBST)増加させた。
二座ペプチドバインダーライブラリーの各インプットファージのELISAを、ストレプトアビジン、BSA及びED-Bに対して行った。96ウェルELISAプレートに10μg/mlストレプトアビジンを各ウェル当たり50μlずつ18個のウェルに入れて、10μg/ml BSAを各ウェル当たり50μlずつ9個のウェルに入れて、4℃で一晩中放置した。翌日、ストレプトアビジンのある18個のウェルの中、9個のウェルのみを0.1% PBST(tween-20)で3回洗浄し、ビオチンED-B(10μg/ml)を入れて常温で1時間放置した。その後、全てのウェルを0.1% PBSTで3回洗浄し、PBSで稀釈した2% BSAを使用して常温で2時間ブロッキングした後、溶液を全て捨てて0.1% PBSTで3回洗浄した。これに二座ペプチドバインダー組み換えファージである一番目、二番目及び三番目のインプットファージ800μl及び10% BSA 200μlを混合して、100μlずつED-B, ストレプトアビジン及びBSAウェルにそれぞれ3ウェルずつ分株して、27℃で1時間30分間静置した。0.1% PBST溶液で10回洗浄した後、HRP-コンジュゲート抗-M13抗体(GE Healthcare)を1:1,000に稀釈して、27℃で1時間反応した。0.1% PBSTで5回洗浄した後、ペロキシダーゼの基質であるテトラメチルベンジジン(TMB)(BD Science)溶液100μlを分株して、発色反応を誘導した後、100μlの1 M HClを添加して反応を中止した。その後、450nmで吸光度を測定した。
アウトプットファージ/インプットファージ比率が最も高いバイオパニング段階で回収したファージをXL1-BLUE細胞に感染させた後、プラークがプレート当たり100-200個程度になるように塗抹した。滅菌されたチップを利用し、プラーク60個を2mlのLB-アンピシリン(50μg/ml)培養液に接種した後、37℃で5時間振とう培養し、OD=0.8-1で5×109pfuのExヘルパーファージを添加して、37℃で1時間200 rpmの速度で混合しながら培養した。培養液を1,000×gで10分間遠心分離した後、上澄み液は全て除去し、沈殿された細胞をアンピシリン(50μg/ml)及びカナマイシン(25μg/ml)の含まれた1ml LB液体培地で再懸濁して、30℃で200 rpmの速度で混合しながら一日間培養した。培養液を10,000×g, 20分間及び4℃の条件で遠心分離して上澄み液を回収した後、2%の脱脂牛乳を入れて、これをファージペプチド検索に使用した。96ウェルELISAプレートに5μg/mlのフィブロネクチン ED-B, VEGF, VCAM1, Nicotinic acetylcholine receptor(nAchR), Human serum albumin, MyD88を各ウェル当たり50μlずつ30個のウェルに入れて、また、10μg/mlのBSAを各ウェル当たり50μlずつ30個のウェルに入れて4℃で一日間放置した。翌日、全てのウェルを0.1% PBSTで3回洗浄し、PBSで稀釈した2%脱脂牛乳を使用して常温で2時間ブロッキングした後、溶液を全て捨てて0.1% PBSTで3回洗浄した。各クローン別に増幅されたファージペプチド溶液100μlずつを全てのウェルに分株して、27℃で1時間30分間静置した。0.1% PBST溶液で5回洗浄した後、HRP-コンジュゲート抗-M13抗体(GE Healthcare)を1:1,000に稀釈して、27℃で1時間反応した。0.1% PBSTで5回洗浄した後、TMB溶液100μlを分株して発色反応を誘導した後、100μlの1 M HClを添加して反応を中止した。450 nmで吸光度を測定し、BSAに比べて吸光度の高いクーロンを選択した。これらのファージをXL1細胞に感染させた後、プラークがプレート当たり100-200個程度になるように塗抹した。滅菌されたチップを利用し、プラークを4mlのLB-アンピシリン(50μg/ml)培養液に接種した後、37℃で一日間振とう培養して、プラスミドフラップキットを利用してプラスミドを精製し、シーケンシングを依頼した(Genotech, Daejeon, Korea)。シーケンシングプライマーは、ベクターシーケンスである5'-GATTACGCCAAGCTTTGGAGC-3'を使用した。
DNAシーケンシングで重複して出たED-B, VEGF, nAchRに特異的な二座ペプチドバインダーペプチドを合成(Anygen,韓国)した。親和度の測定は、BIAcore X(Biacore AB, Uppsala, Sweden)を利用して行った。ED-BとnAchRは、ストレプトアビジンSAチップ(Biacore)にビオチン-EDBを2,000 RUだけ流して固定させた。VEGFは、EDC/NHSを利用してCM5チップ(Biacore)に固定した。ランニングバッファとしてはPBS(pH 7.4)を使用して、フローは、分当たり30μl流しながら、多様な濃度で動力学を測定した後、BIAevaluationソフトウェア(Biacore AB, Uppsala, Sweden)で親和度を計算した。
癌にたくさん分布するフィブロネクチンED-Bをターゲットする二座ペプチドバインダー(ペプチド2)にCy5.5-NHS蛍光ダイ(flurorescence dye)(Amersham Pharmacia, Piscataway)を50 mMホウ酸ナトリウム緩衝液(pH 9.7)で12時間常温反応した。反応後にSephadex G25(Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)でCy5.5と二座ペプチドバインダー-Cy5.5を分離した。Balb/cヌードマウスにHuman U87MG(ATCC) 2 x 106 cellを皮下に入れて癌を10日間育てた後、0.5nmolの二座ペプチドバインダー-Cy5.5を静脈注射で入れて、IVIS(Caliper Life Sience, Hopkinton)で蛍光を測定した。この実験は、癌バイオマーカーであるフィブロネクチンED-Bに特異的な二座ペプチドバインダーが、インビボ動物において癌に蓄積されることを証明する結果であって、実際、癌診断剤としての応用性を示す(図11)。
MyD88は、細胞内に存在する蛋白質であるため、二座ペプチドバインダーのloopのリジン(lysine)残基を利用し、細胞透過ペプチド(cell penetrating peptide)である9個のアルギニン(arginine)(Anygen, 韓国)を、EDC/NHS(Sigma)を利用して二座ペプチドバインダーに共有結合させて、細胞透過を可能にした。MyD88の活性が活性化されるとMMP-13の量が増加するため、MMP-13の量を測定すれば、MyD88の活性が抑制されるかどうか判別できる。MyD88の活性を活性化させるIL-1beta(10 ng/ml)(R&D systems, Minneapolis MN)を軟骨細胞に処理した。その後、MyD88に特異的な二座ペプチドバインダー(表3fのペプチド1)を軟骨細胞に10μM処理して、12時間後にmRNAを分離した後、MMP-13とGAPDHに対してRT-PCRを進行した。また、軟骨細胞を破壊して細胞内蛋白質を得た後、Anti-MMP 13抗体(Abcam, ab3208, Cambridge)とセミドライtransfer機械(Amersham Bioscience, Piscataway)を利用しウェスタンブロッティングを行って、MMP-13の量を測定した。
実施例9:二座ペプチドバインダーライブラリーの製作
二座ペプチドバインダーの構造安定化部位としては、安定したβ-ヘアピンモチーフを使用した。特に、トリプトファン-トリプトファンアミノ酸の相互作用によりβ-ヘアピンモチーフ構造を安定にできるトリプトファンジッパー(Andrea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 98:5578-5583(2001))を利用した。骨格であるトリプトファンジッパーのN-及びC-末端部分にそれぞれ6個のアミノ酸を無作為に配列することにより、二つの部分に可変的部位を生成した(図1a)。これを二座ペプチドバインダーと命名し、両側の可変的部位を有しているため、抗原に共同作用で付くことができ、高い親和力及び特異性を有することができる。また、二座ペプチドバインダーの構造安定化部位は、図1b乃至図1eのように様々に構成できる。
二座ペプチドバインダーライブラリーをフィブロネクチンED-B, VEGF, VCAM1, nAchR, HSA蛋白質に対して3〜5回にかけてバイオパニングを行って、各パニング段階で回収したファージペプチドのアウトプットファージ/インプットファージの比率を決定した(表1a)。
二座ペプチドバインダーのライブラリーの各インプットファージをED-B、ストレプトアビジン及びBSAに対してELISAを行った。一番目のインプットファージの反応性は、ED-B、ストレプトアビジン及びBSAのいずれも吸光度がほぼ等しいが、二番目のインプットファージからED-B吸光度が、ストレプトアビジンに比べ5.1倍、BSAに比べ3.4倍高かった。最後に三番目のインプットファージでは、ED-B吸光度が、ストレプトアビジンに比べ22倍、BSAに比べ15倍高い反応性を示し、ED-Bに対して成功的にバイオパニングがなされることが分かる(図3及び表2)。
各ライブラリーのパニング段階の中、アウトプット/インプットの比率が最も高い段階で回収したファージをプラーク形態として確保した。各プラークから60個のファージを増幅させた後、BSAに対してELISAを行った(図4)。BSAに比べて吸光度の高いクローンを選択し、DNAシーケンシングを依頼した。これから重複したそれぞれの蛋白質に特異的なペプチドシーケンスを得た(表3)。
フィブロネクチンED-B, VEGF, VCAM1, nAchR及びHSAに対する前記ペプチドを合成し、SPR Biacore system(Biacore AB, Uppsala, Sweden)を利用して親和度を測定した。フィブロネクチンED-Bに対する親和度を測定した結果、ペプチド1は、620nMを示して、ペプチド2は、75nMを示し、ペプチド3は、2.5μMを示した(図5a)。VEGFに対する親和度を測定した結果、ペプチド1は、60nM、ペプチド2は、326nMを示した(図5b)。VCAM1の断片ペプチドに対する親和度を測定した結果、ペプチド1は、318nMを示した(図5c)。nAchRの断片ペプチドに対する親和度を測定した結果、ペプチド1は、73nMを示した(図5d)。HSAの断片ペプチドに対する親和度を測定した結果、ペプチド1は、115nMを示した(図5e)。
それぞれの蛋白質に特異的に結合する組み換えファージを、種々の蛋白質に対して特異性検査をELISAを利用して行った。96ウェルELISAプレートにそれぞれの蛋白質5μg/mlを50μlずつウェルに入れて、翌日0.1% PBST(tween-20)で3回洗浄し、2%BSAを使用して常温で2時間ブロッキングした後、溶液を全て捨てて0.1% PBSTで3回洗浄した。これに本発明のペプチドを有する組み換えファージを2%BSAとよく混合し、100μlずつ10個の蛋白質が結合されているウェルに分株し、27℃で2時間静置した。0.1% PBST溶液で5回洗浄した後、HRP-コンジュゲーション抗-M13抗体(GE Healthcare)を1:1,000に稀釈して、27℃で1時間反応した。0.1% PBSTで5回洗浄した後、TMB溶液100μlを分株して発色反応を誘導した後、100μlの1 M HClを添加して反応を中止した後、450 nmで吸光度を測定した。図6aから分かるように、二座ペプチドバインダーで見つけたED-Bに特異的な表3aのペプチド2は、他の蛋白質の吸光度と比較すると、30倍以上の差を示し、これは、ペプチド2シーケンスがED-Bに対して特異的であることを示す結果である。図6b〜6fから分かるように、表3b〜3fのそれぞれのペプチド1に対する特異性分析結果、これらのそれぞれのペプチドは、VEGF, VCAM1, nAchR, HSA及びMyD88に対して特異性を有するということが分かる。
二座ペプチドバインダーの抗原に対する共同作用効果を証明するために、親和力が最もよい表3aのED-Bに対するペプチド2のN-及びC-末端の一側部位のみをそれぞれ除去したペプチドを合成し、親和力を測定した。N-末端部分は、592μMを有して、C-末端部分は、12.8μMを示した(図7)。二座ペプチドバインダーにおいて二座(bipodal)を有していることから表す共同作用効果は、43nMの親和力であることを証明した(図5a)。
トリプトファンジッパーの外に、異なるβ-ヘアピン骨格であるGB1m3及びHP7に、ED-Bに特異的に結合するペプチド2のN-末端シーケンス(HCSSAV)とC-末端シーケンス(IIRLEQ)を有するようにペプチドを合成した(Anygen, 韓国)。即ち、トリプトファンジッパーを含む二座ペプチドバインダーのシーケンスは、HCSSAVGSWTWENGKWTWKGIIRLEQであり、GB1m3を含む二座ペプチドバインダーは、HCSSAVGKKWTYNPATGKFTVQEGIIRLEQであって、HP7を含む二座ペプチドバインダーは、HCSSAVGKTWNPATGKWTEGIIRLEQである。各ペプチドの親和度は、BIAcore X(Biacore AB, Uppsala, Sweden)を使用して測定した。ストレプトアビジンSAチップ(Biacore AB, Uppsala, Sweden)にビオチン-EDBを2,000 RUだけ流して固定した。ランニングバッファとしてはPBS(pH 7.4)を使用して、フローは、分当たり30μl流しながら、多様な濃度で動力学を測定した後、BIAevaluationで親和度を計算した。 親和度を測定した結果、GB1m3が70nM、HP7が84nMであって、トリプトファンジッパー(43nM)と等しい親和力を有することを確認した(図8)。これは、全ての安定したβ-ヘアピンモチーフが構造安定化部位として機能することを証明する結果である。
β-ヘアピン骨格の代わりに、構造安定化部位としてロイシンジッパーに、ED-Bに特異的に結合するペプチド2のN-末端シーケンス(HCSSAV)とC-末端シーケンス(IIRLEQ)を有するようにCSSPIQGGSMKQLEDKVEELLSKNYHLENEVARLKKLVGER及びIIRLEQGGSMKQLEDKVEELLSKNYHLENEVARLKKLVGERペプチドを合成した(Anygen, 韓国)。二つのペプチドをダイマーにした後、BIAcore X(Biacore AB, Uppsala, Sweden)を使用して親和度を測定した。親和度を測定した結果、ロイシンジッパーは、5μMの親和度を示して、これは、トリプトファンジッパー(43nM)の親和度に劣る親和度ではあるが、ロイシンジッパーも二座ペプチドバインダーの構造安定化部位として機能することができることが分かる(図9)。
癌にたくさん分布するフィブロネクチンED-Bをターゲッティングする二座ペプチドバインダーにCy5.5蛍光ダイを付着した後、Human U87MG癌が存在するマウスに静脈注射で投与して、IVIS機会を利用し、二座ペプチドバインダーが癌にターゲットするかどうか蛍光を確認した(図10)。実験結果、癌バイオマーカーであるフィブロネクチンED-Bに特異的な二座ペプチドバインダーは、癌組織に蓄積されることが観察されて、これは、本発明の二座ペプチドバインダーがインビボイメージングに利用できることを示す結果である。
1.GST-BPB遺伝子の製作
Glutathione S-transferase(GST)遺伝子の含まれたpGEX4T-1ベクター(GE Healthcare)にフィブロネクチン EDBを認識するBPB遺伝子シーケンスをクローニングした。二つのオリゴヌクレオチドGST-F1(5’-ACCGGATCCCATTGTTCTAGT-3’)とGST-B1(5'-ATTCTCGAGTTACGCTCCTCCTCC-3')を利用して、EDBタンパク質に付くファージから得たphagemid vectorをtemplate(実施例1及び3)でPCRして、フィブロネクチンEDBに付くBPBペプチド遺伝子を得た。このBPBペプチドのペプチド配列は、HCSSAVGSWTWENGKWTWKGIIRLEQである。GST-F1 20pmol, GST-B1 20pmol, 鋳型選別したphagemid template 1ul, 2.5mM dNTP mixture 4μl, Ex Taq DNA polymerase 1μl (10 U), 10 x PCR buffer 5μlを混ぜて、総50μlになるように蒸留水を追加した混合液を作った。この混合液をPCR反応(94℃で5分, 30cycle: 55℃で30秒と72℃で1分, 94℃で30秒)して、BPB Insertにした後、PCR purification kit(GeneAll, Seoul, Korea)を利用して精製した。BPB Insert遺伝子をpGEX4T-1 ベクターに連結するために、BPB Insert遺伝子とpGEX4T-1ベクターに制限酵素処理を行った。約2μgのInsert DNAをBamHI (NEB)とXhoI (NEB)で4時間ずつ反応させた後、PCR purification kitを利用して精製した。これらをmolar ratio vector:Insert=1:3でT4 DNA ligase(Bioneer)を利用して18℃、10時間連結した後、E. coli XL-1 competent cell(Stratagene)にtransformationをした後、Ampicillin agar培地に塗抹した。寒天平板培地で育った集落を5mlのLB培地に接種した後、37℃で200rpmの速度で混ぜながら、一日中培養した後、plasmid preparation kit(GeneAll, Seoul, Korea)を利用してplasmidを精製し、シーケンシングをして、クローニングが成功したかどうかを確認した。
GST-BPBをクローニングしたベクターをE. coli BL21にtransformationした後、2L LBにアンピシリン(25ug/ml)を入れて、OD=0.6-0.8まで育てた。その後、1mM isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside(IPTG)を入れて、37℃で200rpmの速度で混ぜながら、8時間育てた。4,000gで20分間遠心分離して、沈んだ細胞を除いた上澄み液を全て除去して、lysis buffer (50 mM sodium phosphate (pH 8.0), 300mM NaClと5mM imidazole)で再浮遊させた。-80℃で一日間保管した後、Sonicatorを利用してE. coli溶解させた後、15,000gで1時間遠心分離して、上澄み液をGST affinity resin(Peptron)に結合させた。PBS bufferでresinを洗浄した後、Elution buffer(20mM GSH in 10mM Tris-HCl, pH 8)を利用して、GST-BPBタンパク質を分離して収集した。このように集めたタンパク質をSuperdex75 column(Amersham)とPBS(pH7.4) bufferを利用してgel filtrationをして、純度高いGST-BPBタンパク質を収集した。
精製されたGST-BPBを、フィブロネクチンEDBにbindingするかをSPR機械を利用して確認した。Affinity測定は、BIAcore Xを利用して行った。Streptavidin SA chip(Biacore)にbiotin-EDBを2000RUだけ流して固定させた。Running bufferとしてはPBS(pH7.4)を使用して、流速は30ul/minとして流しながら、様々な濃度でkineticsを測定した後、BIAevaluationでaffinityを計算した。
(1) GST-BPBの製作
フィブロネクチンED-Bを特異的に認識するBPBをGST fusion vectorにクローニングした後、GST-BPBを大腸菌で発現して精製した(図11a)。
GST-BPBをSPR biacore systemを利用してフィブロネクチンフィブロネクチン EDBに対するaffinityを測定した。Affinityを測定した結果、284nMのaffinityを有して、GSTがあるにもかかわらず、十分フィブロネクチンEDBを認識できることを示した(図11b)。
1.TNFα-BPB遺伝子の製作
pET28b vector(Novagen)にhuman TNFα(tumor necrosis factor α)とフィブロネクチンEDBを認識するBPB遺伝子シーケンスをクローニングした。二つのオリゴヌクレオチドTNF-F1(AATAAAACATATG TCTCGAACCCCGA)とTNF-B1(ATGGATCCCAGGGCAATGATC)を利用して、human TNFαがクローニングされているベクターGh75(Cytokine Bank, Korea)でTNFα遺伝子を増幅して、これをpET28bにクローニングした。そして二つのオリゴヌクレオチドBPB-F1(AAT GAATTC TCTTCCTCATCGGGTTCTTCCTCATCGGGTTGTAGTTCTCCTATTC)とBPB-B1(AAT AAGCTT TCA TTGCTCCAACCTAAT)を利用し、EDBタンパク質に付くファージで得たphagemid vector(実施例1及び3)をtemplateでPCRして、フィブロネクチンEDBに付くBPBペプチド遺伝子を得た。このBPBペプチドのペプチド配列は、CSSPIQGSWTWENGKWTWKGIIRLEQである。
TNFα-BPBをクローニングしたpET28bベクターをBL21 cellにtransformationした後、kanamycine agar培地に塗抹した。2L LBにカナマイシン(25ug/ml)を入れて、OD=0.6-0.8まで育てた後、1mM isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside(IPTG)を入れて、37℃で200rpmの速度で混ぜながら、8時間育てた。4,000gで20分間遠心分離して、沈んだ細胞を除いた上澄み液を全て除去して、lysis buffer (50 mM sodium phosphate (pH 8.0), 300mM NaClと5mM imidazole)で再浮遊させた。-80℃で一日間保管した後、Sonicatorを利用してE. coli溶解させた後、15,000gで1時間遠心分離して、上澄み液をNi-NTA affinity resin(ELPIS biotech.)に結合させた。Lysis bufferでresinを洗浄した後、Elution buffer(50mM sodium phosphate (pH 8.0), 300 mM NaCl and 300 mM imidazole)を利用して、TNFα-BPBタンパク質を分離して収集した。このように集めたタンパク質をSuperdex75 columnとPBS(pH7.4) bufferを利用してgel filtrationをして、純度高いTNFα-BPBタンパク質を収集した。
精製されたTNFα-BPBを、フィブロネクチンEDBにbindingするかをSPR機械を利用して確認した。Affinity測定は、BIAcore Xを利用して行った。Streptavidin SA chip(Biacore)にbiotin-EDBを2000RUだけ流して固定させた。Running bufferとしてはPBS(pH7.4)を使用して、流速は30ul/minとして流しながら、様々な濃度でkineticsを測定した後、BIAevaluationでaffinityを計算した。
L-M mouse fibroblastsを利用して、TNFα-BPBとTNFαのcytotoxicitiyをMTT分析で測定した。まずL-M mouse fibroblastを96well microplateに5000個を敷いた後、18時間後にTNFαとTNFα-BPBを濃度別に入れて、30時間後にMTTを行って、cytotoxicitiyを測定した。
(1)TNFα-BPB製作
フィブロネクチンED-Bを特異的に認識するBPBをTNFαにクローニングした後、 TNFα-BPBを大腸菌で発現して精製した(図12a)。
TNFα-BPBを、SPR biacore systemを利用してフィブロネクチン EDBに対するaffinityを測定した。Affinityを測定した結果、80nMのaffinityを有して、TNFαがあるにもかかわらず、十分フィブロネクチンEDBを認識できることを示した(図12b).
L-M mouse fibroblast cellでTNFnとTNFn-BPBのcytotoxicityをMTTで測定した。TNFα-BPBがTNFαより5倍程度cytotoxicityが高い(図12c)。
1. Conjugation of BPBcssto Mal-PEG2000-DSPE
Mal-PEG2000-DSPEを利用し、BPBEDB(CSSPIQGSWTWENGK(Cys, lysine残基にcysを連結)WTWKGIIRLEQ)のシステイン残基にコンジュゲーションさせた。簡単には、Mal-PEG2000-DSPEの1.1 fold molar excessをchloroform/DMSO(1:1 v/v)でBPBEDBと混合した。12時間常温で攪拌して、反応を進行した。
9R peptide及びVEGF-C siRNA(sense 5' CAG AUG GAU UCC AUG ACA dTdT, anti-sense 5' AUG UCA UGG AAU CCA UGU G dTdT)をHEPES-buffered 5% glucose (pH 7.4)で希釈して、最終容量250μlになるようにして、室温で10分間インキュベーションした。前記溶液を混合してボルテキシングして、500μl 9R/siRNA complexes at a +/- charge ratio of 1:6を得た。同時にBPB-DSPEが内包されたリポソームを作るためのPOPC/Chol/POPG/PEG2000-DSPE/BPB-DSPE (4:3:3:1:0.5)mixtureと対照群リポソームのためのPOPC/Chol/POPG/PEG2000-DSPE (4:3:3:1)mixtureを利用してlipid filmを作る。これに500ul Hepes buffer glucose 5% (HBG 5%)を入れた後、lipid filmに500ul 9R/siRNA complexを入れた。この混合物を簡単にソニケーションした後、hand-held extruder (Avanti Polar Lipid, AL, USA)を利用して二つのpolycarbonate membranes (100 nm pore size)のスタックを通じて11回押出した。9R/siRNA-loaded BPB-リポソームs(BPBcss-LS)と対照群である9R/siRNA-loaded-リポソームsをsize-exclusion chromatography (CL-4B column)で精製した。Sepharose CL4B column eluentの分画をOliGreen (Invitrogen)で分析してsiRNA含量を分析した。
9R/siRNAがローディングされたBPBcss-LSをHBS(Hepes Buffer Saline)で希釈し、最適のscattering intensityを得た。Hydrodynamic diameter及びzeta potentialを、ELS 8000装置(Otsuka Electronics Korea, Seoul, South Korea)を利用してelectrophoretic light scattering方法で測定した。
細胞をcover glass coated with 2% gelatin上で一晩中培養した。24時間後、細胞に200ugのBPB-リポソーム(0.3% rhodomaime含み)と対照群の200ugのリポソーム(0.3% rhodamine)をそれぞれ処理した。37℃で1時間処理後、細胞を3回洗浄し、4%パラホルムアルデヒドparaformaldehydeで固定化した後、共焦点顕微鏡で観察した。
BPBcss-LSにencapsulatされたsiRNAのMCF-7 cell内へのtransfection効率を評価するために、MCF-7 cellを50nM VEGF-C siRNA in lipofectamine(positive control), 50 nM BPBcss-LS及び100 nM BPBcss-LSで形質転換させた。4時間経過後、細胞を24時間さらにインキュベーションして、次いでRNA分離、cDNA合成及び実時間RT-PCRを行った。
(1) BPB-リポソーム大きさ及びゼータ電位
BPBcss-LSの測定された大きさ及びゼータ電位は、下記表のようである。
図13aから分かるように、BPB-リポソーム(CSS-LS)にsiRNAを内包したものとfree siRNAを除去するために、size exculsion CL-4Bカラムを利用して分離した。大きさの大きいsiRNA/BPB-リポソームが先に出て、その後free siRNAが出ることを観察することができる。この方法でsiRNAの内包された、精製されたBPB-リポソームを得ることができる。
ターゲットタンパク質であるEDBが過発現されるU87MG, MCF-7, MCF-7/ADR細胞株を利用して、BPB-リポソームがよく認識するかを確認した。0.3%ロダミンの含まれたBPB-リポソームと対照群のリポソームを三つの細胞に一時間処理した後、洗浄して、顕微鏡で観察した。図13bから分かるように、BPB-リポソーム(CSS-LS)は、全ての細胞によく付着することを確認した。しかし、対照群であるBPBのないリポソーム(LS)は、EDB過発現細胞株に付着しなかった。これは、BPB-リポソームが EDBを細胞内で特異的に認識できることを示す結果である。
図13dから分かるように、VEGF-C siRNAを内包したBPB-LSが細胞内でVEGF-CのmRNAを抑制できるかをMCF-7細胞で確認した。50nMと100nM VEGF-C siRNAを内包したBPB-LSを細胞に処理した時、一般によく使用されるリポフェクタミンとほぼ等しくVEGF-C mRNAを抑制できることを示した。
1. Oleic SPION-BPBの製造
500ug/100ul(CHCl3) DSPE-PEG2000-Mal(Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL, USA)(1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine-N-[Maleimide(Polyethylene Glycol)2000])とBPB(SSS) peptide(SSSPIQGSWTWENGK(Cys)WTWKGIIRLEQ) 250ug/100ul(DMSO)をCHCl3/DMSO co-solvent下で一晩中反応した。反応後、MALDI-TOF-MS(SHIMADZU Axima-CFR,SHIMADZE, Japen)を利用して反応を確認した。DSPE-PEG2000polymerとBPB conjugated DSPE-PEG2000 及びRhodamine-DSPEを(5:94:1)の比率でD.W.に入れた後、Oleic SPION(superparamagnetic iron oxide nanoparticle, 熱分解法で合成)をHexaneに溶かした後、上記のpolymer solutionに入れて、probeタイプのsonicatorを利用してsonicationした後、stirring方法とcentrifuge、そしてmagnetを利用して精製した。そして、BPBのないグループも上記の同様な方法で合成した。
electrophoretic light scattering(ELS 8000 instrument of Otsuka Electronics, Otsuka Electronics Korea, Seoul, South Korea)を利用してHydrodynamic sizeを測定し、BPB conjugate有無のサイズ変化を測定して、また、一定時間D.W.における安定性を確認し、transmission electron microscopy(Philips TECNAI F20 instrument (Philips ElectronicInstruments Corp., Mahwah, NJ))を利用してナノ粒子のaggregation程度を確認した。
BPB conjugated DSPE-PEG2000 coated oleic SPIONとDSPE-PEG2000 coated oleic SPIONをそれぞれ濃度別にe-tubeに入れて3T MRI scanner (Magnetom Avanto, Siemens, Germany)を利用してT2 Timeを測定し、r2値を計算した。
6 well plateにU87MG細胞を37℃ CO2 インキュベーターで培養密度90-100%に培養後、同じ濃度のBPB conjugated DSGPE-PEG2000 coated SPIONとDSGPE-PEG2000coated SPIONを培地に混ぜて30分間培養した後、細胞を集めて、3T MRI scanner (Magnetom Avanto, Siemens, Germany)を通じて信号強度の差を確認した。また、confocal microscope (Olympus, FV1000)を利用し、細胞におけるロダミン信号の差を確認した。
96ウェルプレートにU87MG細胞を37℃ CO2 インキュベーターで培養密度50%に培養後、同じ濃度のBPB conjugated DSPE-PEG2000 coated oleic SPIONとDSPE-PEG2000coated oleic SPIONを培地に混ぜて12時間培養した後、MTT assayを通じて細胞毒性有無を確認した。
Balb/c nude(female) 6 weeks miceの後ろ右足の上部にU87MG細胞5 x 106 個の細胞を移植し、2週間程度育てた後、癌の大きさが約100-150mm3 になった時、BPB conjugated DSPE-PEG2000coated oleic SPIONとDSPE-PEG2000 coated oleic SPIONを20mg Fe/kgずつ尻尾静脈に投与後、3T MRIを利用して癌部位の信号強度を時間別にモニターした。
(1) SPION-BPBの製作
DSPE-PEG2000-MalとBPB(SSS)ペプチドのコンジュゲーションを、MALDIを利用して確認した(図14a)。
DSPE-PEG2000 coated oleic SPION及びBPB conjugated DSPE-PEG2000 coated oleic SPIONのいずれも、r2値は120 mM-1S-1であって、MRI T2造影剤として使用可能であることを確認した(図14d)。
細胞実験でBPBのあるグループとないグループ間のMRイメージ及び信号強度の差を確認した(図14e)。BPB conjugated DSPE-PEG2000 coated SPIONが細胞にさらに多くuptakeされて、MRイメージでさらに黒く表れて、またMR信号比較(ROI信号比較)においても、DSPE-PEG2000 coated SPIONよりさらに低い値を示した。
MTT実験を通じて、DSPE-PEG2000 coated SPIONとBPB conjugated DSPE-PEG2000 coated SPIONの細胞毒性実験を行った結果、両グループとも低い細胞毒性を示した(図14g)。
脳癌動物モデルにおいて、BPB conjugated DSPE-PEG2000coated SPIONグループがinjection 1時間後、癌部位が黒く表れることを確認した(図14h)。それに対し、BPB conjugateされなかったDSPE-PEG2000 coated SPIONグループでは、injectionの前と後において大きい変化が現れなかった。
1. Pegylated Gold nanoparticleの製造
金イオンを、還元剤を使用し、約5nm大きさを有する金ナノ粒子を合成した。5 nm金ナノ粒子が生体内における安定性、即ちRES(reticuloendothelial system)などへのuptakeを減らして、目標細胞への伝達効率を増加させるために、金ナノ粒子表面を生体的合成高分子のPEGでコーティングが必要である。したがって、PEGにチオールグループを導入するために、ジチオールグループとカルボキシルグループが含まれたlipoic acidと反応させた。Lipoic acidにPEGを結合するために、まず、lipoic acidのカルボキシルグループをDCC(dicyclohexylcarbodiimide)とNHS (N-hydroxylsucciniimide)で活性化させた後、100ugのNH2-PEG-OCH3と反応させることによりlipoic-PEGを合成した。金ナノ粒子にPEGがコーティングされることを、1M NaClを添加してaggregationされるかを測定して、PEGが完璧にコーティングされることを測定した。
合成されたlipoic-PEG-maleimdeとチオールグループが露出されたBPB(CSSpペプチド, CSSPIQGSWTWENGK(cys)WTWKGIIRLEQ)をCHCl3/DMSO(3:1) co-solvent下で一晩中反応した後、lipoic-PEG-maleimde-BPB利用してgold nanoparticleをコーティングした。
BPB-金ナノ粒子がフィブロネクチンED-Bを認識するかどうか、フィブロネクチン ED-BがoverexpressionされるU87MG glioblastomaを利用して、癌細胞認識を確認した。Human U87MG glioblastoma cellを90-100% confluencyでcover slipに育てた後、BPB-金ナノ粒子を1時間37℃でcellとインキュベーションした。その後、PBSで3回洗浄した後、細胞をトリプシンで分離した後、細胞を集めてInductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS)を利用し、細胞内Auの量を測定した。
金ナノ粒子は、既存の造影剤が有している短所(短い映像時間、腎臓毒性)を克服することができるが、金ナノ粒子も同様に大きさなどの問題によって、体外に排出されない問題点を有している。このような問題点を克服するために、PEGの代わりに、PEGのような役割をしながらもナノ粒子のhydrodynamicサイズを大きく増加させない両性イオンを金ナノ粒子にコーティングさせることにより、最終金ナノ粒子のhydrodynamic大きさを8nm以下に減らして、体外に排出できるようにナノ粒子をデザインした。また、本研究陳で使用した両性イオンは、金ナノ粒子と結合できる部分として、モノチオール(mono-thiol)グループではなく、環状ジチオール(cyclic dithiol)グループを導入することにより、血液内で金ナノ粒子と両性イオン間の安定性(stability)を増加させた。両性イオンの構造は、下記のようである。
金ナノ粒子とBPB間の結合力、即ち、血液内での安定性を増加させるために、BPBでも同様に環状ジチオール(cyclic dithiol)グループを導入した。即ち、lipoic acidをDCC(N,N`-Dicyclohexylcarbodiimide)/NHS(N-hydroxl succinimides)とTHF(tetrahydrofuran)で72時間反応し、lipoic-NHS形態を作って、トルエンによる再結晶方法で精製した。精製したlipoic-NHSは、N-末端基がアセチル化(acetylation)されたBPBのリジン(lysine)残基のアミン(NH2)グループとDMSO(Dimethyl sulfoxide)で2時間反応し、BPBに環状ジチオールグループを導入することができた。
(1) Gold Nanoparticle-BPBの製作
金ナノ粒子は、現在広く使用されているヨードベースのCT造影剤の短所である腎臓毒性、短い映像化時間などを克服できるだけではなく、肝癌造影が可能な生体適合性高分子でコーティングした金ナノ粒子を次世代CT造影剤として開発することができる。ここでは、癌標的BPBを付着することにより、CTで癌をイメージングできる金ナノ粒子を開発した。5nmの金ナノ粒子にフィブロネクチンEDBを認識するBPBをコンジュゲーションした。TEMイメージを通じて、ナノ粒子が、BPBがコンジュゲートされた後にもよく分散されているかを確認した(図15a)。
U87MG細胞を利用して、BPB conjugated金ナノ粒子を同一な濃度として入れた後、ICP-MSを利用して細胞内のAuの量の差を測定した。BPBのあるグループが、BPBのないグループより細胞内Auの量が多いことが確認された。したがって、BPB conjugated金ナノ粒子の方がEDBによる細胞表面吸着と細胞内伝達にさらに優れていることを確認した(図15b)。また、BPBがコンジュゲーションされなかった金ナノ粒子よりBPBのコンジュゲーションされた金ナノ粒子の方が選択的にU87MG細胞に吸着することを、silver enhancement方法を利用して顕微鏡観察によっても確認することができた(図15c)。
BPBを金ナノ粒子に付着した時、選択的に癌細胞に吸着されることを確認した後、金ナノ粒子が生体内に注入された時、血液内で安定するように、金ナノ粒子表面を両性イオンでコーティングした。金ナノ粒子と両性イオン間の比率が1:10000以上である時、金ナノ粒子の表面プラズモン共鳴最大ピークが、血清及び1M NaClを添加して24時間が経っても変化がないことから、血清及び1M NaClの環境においても金ナノ粒子が安定したことを確認することができた。
BPBに環状ジチオールグループを導入したLipoic-BPBをHPLCで分離し、MALDI-TOFを通じて合成物を確認することができた。
1. Docetaxel(DTX)-NHSの製造及び確認
DTXのヒドロキシル基をsuccinic anhydrideと常温で12時間反応し、DTX succinic acidを製造した。BPBのlysineが有しているfree amineにDTX succinic acidをコンジュゲーションさせるために、まずアミンに反応するNHSグループをDTX succinic acidに結合させた。反応条件は、DTX succinic acidをMC(methylene choloride)溶液に溶かして、EDC/NHSを加えて常温で12時間反応した。この際、モル比は、DTX succinic acide : EDC : NHS = 1 : 1.2 : 1.5として行った。反応後、移動相溶媒をEA(ethyl acetate)としてTLC(thin liquid chromatography)分析を行った。
DTX-NHSをコンジュゲーション反応直前にDMFに溶かして、BPBを追加して溶かした。完全に溶けない場合、DMSOを少しずつ添加した。これにBPBのfree amine形成を助けるbase DIEA(di-isoethyl amine)を添加して、常温で12時間反応した。DIEAは、BPBの2当量以上入れた。BPB配列は、N-terminal acetylated BPBであって、配列は、SSSPIQGSWTWENGKWTWRGIIRLEQである。
DTX-NHSとBPBコンジュゲーション反応液を真空乾燥機で乾燥させた後、50% ACNに溶かしてHPLCで分析し、DTX-BPBコンジュゲートに該当するHPLCピークサンプルを、質量分析(MALD TOF)を行ってDTX-BPBコンジュゲート形成を確認した。
Claims (19)
- (a)(i)鎖間(interstrand)非共有結合が形成されたパラレル(parallel)、アンチパラレル(antiparallel)、またはパラレル(parallel)とアンチパラレル(antiparallel)アミノ酸鎖を含む構造安定化部位(structure stabilizing region)と、(ii)前記構造安定化部位の両末端に結合されており、無作為的に選択されたそれぞれn及びm個のアミノ酸を含むターゲット結合部位I(target binding region I)及びターゲット結合部位II(target binding region II)と、を含む二座ペプチドバインダー(Bipodal Peptide Binder:BPB)と、
(b)前記二座ペプチドバインダーに結合されたカーゴと、
を含む、BPBベースのカーゴ運搬システム(Cargo Delivery System)。 - 前記構造安定化部位に形成された鎖間非共有結合は、水素結合、静電気的相互作用、疎水性相互作用、ファンデルワールス相互作用、パイ−パイ相互作用、陽イオン−パイ相互作用、またはこれらの組み合わせであることを特徴とする、請求項1に記載の運搬システム。
- 前記構造安定化部位のアミノ酸鎖は、リンカーで連結されたことを特徴とする、請求項1に記載の運搬システム。
- 前記構造安定化部位は、β−ヘアピン、リンカーで連結されたβ−シート、ロイシンジッパーまたはリンカーで連結されたロイシンジッパー、ロイシンリッチモチーフであることを特徴とする、請求項1に記載の運搬システム。
- 前記構造安定化部位は、β−ヘアピンであることを特徴とする、請求項1に記載の運搬システム。
- 前記β−ヘアピンは、配列番号1乃至19からなる群から選択されることを特徴とする、請求項5に記載の運搬システム。
- 前記β−ヘアピンは、配列番号2、14、または18から選択されることを特徴とする、請求項6に記載の運搬システム。
- 前記β−ヘアピンは、下記一般式Iで表されることを特徴とする、請求項5に記載の運搬システム。
[一般式I]
X1-Trp(X2)X3-X4-X5(X'2)X6-X7
X1は、SerまたはGly-Gluであり、X2及びX'2は、それぞれ独立してThr、His、Val、Ile、PheまたはTyrであり、X3は、TrpまたはTyrであり、X4は、タイプI、タイプI'、タイプII、タイプII'またはタイプIIIまたはタイプIII'ターン配列であり、X5は、TrpまたはPheであり、X6は、TrpまたはValであって、X7は、LysまたはThr-Gluである。 - 前記β−ヘアピンは、下記一般式IIで表されることを特徴とする、請求項5に記載の運搬システム。
[一般式II]
X1-Trp-X2-Tyr-X3-Phe-Thr-Val-X4
X1は、Arg、Gly-GluまたはLys-Lysであり、X2は、GlnまたはThrであり、X3は、タイプI、タイプI'、タイプII、タイプII'またはタイプIIIまたはタイプIII'ターン配列であって、X4は、Gln、Thr-GluまたはGln-Gluである。 - 前記β−ヘアピンは、下記一般式IIIで表されることを特徴とする、請求項5に記載の運搬システム。
[一般式III]
X1-X2-X3-Trp-X4-X5-Thr-X6-X7
X1は、LysまたはLys-Lysであり、X2は、TrpまたはTyrであり、X3は、ValまたはThrであり、X4は、タイプI、タイプI'、タイプII、タイプII'またはタイプIIIまたはタイプIII'ターン配列であり、X5は、TrpまたはAlaであり、X6は、TrpまたはValであって、X7は、GluまたはGln-Gluである。 - 前記β−ヘアピンは、下記一般式IVで表されることを特徴とする、請求項5に記載の運搬システム。
[一般式IV]
X1-X2-X3-Trp-X4
X1は、Lys-ThrまたはGlyであり、X2は、TrpまたはTyrであり、X3は、タイプI、タイプI'、タイプII、タイプII'またはタイプIIIまたはタイプIII'ターン配列であって、X4は、Thr-GluまたはGlyである。 - 前記β−ヘアピンは、前記一般式Iにおいて、X1は、SerまたはGly-Gluであり、X2及びX'2は、それぞれ独立してThr、HisまたはValであり、X3は、TrpまたはTyrであり、X4は、タイプI、タイプI'、タイプIIまたはタイプII'配列であり、X5は、TrpまたはPheであり、X6は、TrpまたはValであって、X7は、LysまたはThr-Gluであることを特徴とする、請求項8に記載の運搬システム。
- 前記ターゲット結合部位Iのアミノ酸の数nは、2〜20であることを特徴とする、請求項1に記載の運搬システム。
- 前記ターゲット結合部位IIのアミノ酸の数mは、2〜20であることを特徴とする、請求項1に記載の運搬システム。
- 前記ターゲット結合部位I及びターゲット結合部位IIは、ターゲットに共同に作用して結合することを特徴とする、請求項1に記載の運搬システム。
- 前記構造安定化部位、ターゲット結合部位Iまたはターゲット結合部位IIに、他の追加的な機能性分子が結合されていることを特徴とする、請求項1に記載の運搬システム。
- 前記機能性分子は、細胞膜透過ペプチド(CPP)であることを特徴とする、請求項16に記載の運搬システム。
- 前記ターゲットは、生化学物質、ペプチド、ポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質、細胞、組織、化合物、金属または非金属物質であることを特徴とする、請求項1に記載の運搬システム。
- 前記カーゴは、化合物、化学薬物、バイオ薬物、無機粒子、ナノ粒子、タンパク質、ペプチド、核酸分子、脂質、炭水化物、リポソームまたは検出可能な信号を発生させるラベル分子であることを特徴とする、請求項1に記載の運搬システム。
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