JP2002526108A - スキャフォルド・タンパク質のランダム・ペプチドライブラリィとの融合 - Google Patents

スキャフォルド・タンパク質のランダム・ペプチドライブラリィとの融合

Info

Publication number
JP2002526108A
JP2002526108A JP2000574670A JP2000574670A JP2002526108A JP 2002526108 A JP2002526108 A JP 2002526108A JP 2000574670 A JP2000574670 A JP 2000574670A JP 2000574670 A JP2000574670 A JP 2000574670A JP 2002526108 A JP2002526108 A JP 2002526108A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
protein
peptide
library
fusion
cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2000574670A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2002526108A5 (ja
Inventor
デイビッド・アンダーソン
ジェイコブ・マリア・ボーゲンバーガー
ボー・ロバート・ピール
Original Assignee
ライジェル・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ライジェル・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド filed Critical ライジェル・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド
Publication of JP2002526108A publication Critical patent/JP2002526108A/ja
Publication of JP2002526108A5 publication Critical patent/JP2002526108A5/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1044—Preparation or screening of libraries displayed on scaffold proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43595—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from coelenteratae, e.g. medusae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1086—Preparation or screening of expression libraries, e.g. reporter assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
    • C07K2319/42—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation containing a HA(hemagglutinin)-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/60—Fusion polypeptide containing spectroscopic/fluorescent detection, e.g. green fluorescent protein [GFP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ランダムおよび確定のペプチドおよびペプチドライブラリィとの融合構築体においてスキャフォルド・タンパク質、特にグリーン蛍光タンパク質を用いて、細胞中に発現されるランダム・ペプチドおよびペプチドライブラリィ・メンバーについて、細胞の発現レベルを増大し、細胞の異化作用を減少し、線状ペプチドに関し配座的安定性を増大し、安定状態の濃度を増大することに関する。その目的は、ペプチドの存在の検出およびランダム・ペプチドライブラリィのスクリーニングである。Ｎ末端、Ｃ末端、ＮおよびＣ両末端さらに１以上の内部での融合のすべてを意図している。配座的に安定な融合ドメインをつくるため自己結合ペプチドを利用する新規の融合も意図している。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 (発明の分野) 本発明は、ランダムおよび確定のペプチドおよびペプチドライブラリィとの融
合構築体においてスキャフォルド・タンパク質、特にグリーン蛍光タンパク質(
ＧＦＰ)、ルシフェラーゼ、β−ラクタマーゼなどの検出遺伝子を用いて、細胞
中に発現されるランダム・ペプチドおよびペプチドライブラリィ・メンバーにつ
いて、細胞の発現レベルを増大し、細胞の異化作用を減少し、線状ペプチドに関
し配座的安定性を増大し、安定状態の濃度を増大することに関する。その目的は
、ペプチドの存在の検出およびランダム・ペプチドライブラリィのスクリーニン
グである。Ｎ末端、Ｃ末端、ＮおよびＣ両末端さらに１以上の内部での融合のす
べてを意図している。配座的に安定な融合ドメインをつくるため自己結合ペプチ
ドを利用する新規の融合も意図している。
【０００２】 (発明の背景) 生物的および治療的に適切な化合物に関する生体分子スクリーニングの分野は
急速に成長している。適切な生体分子はこのようなスクリーニングの中心であり
、同定された標的分子の生物活性を阻害するまたは高める分子を検索するために
、化学ライブラリィ、核酸ライブラリィおよびペプチドライブラリィを含む。特
にペプチドライブラリィについて、標的のペプチド阻害物質を単離することおよ
び標的の正式な結合パートナーを同定することは、重要な焦点である。しかしな
がら、ペプチドライブラリィに関する一つの特有の問題は、ペプチドが生物的効
果を有するか測定する前に、いかなる特定のペプチドが発現されるか、およびど
のレベルで発現されるかを評価するのが難しいことである。
【０００３】 グリーン蛍光タンパク質(ＧＦＰ)は、２３８アミノ酸タンパク質である。タン
パク質およびいくつかの点変異の結晶構造が解明された(Ormo et al., Science
273, 1392-5, 1996; Yang et al., Nature Biotechnol. 14, 1246-51, 1996)。
蛍光団は修飾されたトリペプチドからなり、比較的堅いbeta-can構造内に埋もれ
ている。そのbeta-can構造内において、蛍光団は溶媒のアクセスからほぼ完全に
保護されている。このタンパク質の蛍光は、多くの点変異に対して感受性である
(Phillips, G.N., Curr. Opin. Struct. Biol. 7, 821-27, 1997)。蛍光団トリ
ペプチドへの溶媒のアクセスを可能にする構造の崩壊はいずれも蛍光を抑制する
ので、蛍光はタンパク質の天然構造の維持を敏感に示すようである。
【０００４】 Abedi et al (Nucleic Acids Res. 26, 623-30, 1998)は、いくつかのＧＦＰ
ループに含有される残基の間にペプチドを挿入した。１０の内部挿入部位におい
て、隣接する残基の間に短い配列ＬＥＥＦＧＳを挿入することが試みられた。こ
のうち、３つの部位、残基１５７−１５８、１７２−１７３および１９４−１９
５の間に挿入して、野生型ＧＦＰの蛍光の少なくとも１％を得た。単に残基１５
７−１５８および１７２−１７３の間に挿入すると、野生型ＧＦＰの少なくとも
１０％の蛍光を得た。−ＳＡＧ−ランダム２０量体−ＧＡＳ−ペプチド配列が異
なる内部部位でＧＦＰに挿入されたとき、２つの部位のみがバックグランド蛍光
の１０倍にあたるＧＦＰランダム・ペプチド配列の２％以上の平均蛍光強度を示
した。これらの部位は、残基１５７−１５８と１７２−１７３の間の挿入であっ
た。
【０００５】 本発明の目的は、例えばＧＦＰなどの検出タンパク質を含むスキャフォルド・
タンパク質を用いたペプチドの融合構築体の組成物およびペプチドライブラリィ
のスクリーニングにおけるこの構築体の使用方法を提供することである。
【０００６】 (発明の要約) 上記の目的に従って、本発明は、スキャフォルド・タンパク質および該スキャ
フォルド・タンパク質に融合されたランダム・ペプチドからなる融合タンパク質
および、その融合タンパク質をコードする核酸を提供する。さらなる態様におい
て、本発明は、ａ)融合タンパク質；ｂ)融合核酸；ｃ)融合核酸を含む発現ベク
ター；およびｄ)融合核酸を含む宿主細胞のライブラリィを提供する。本発明は
さらに、特定の表現型をもたらし得る生理活性ペプチドに関するスクリーニング
方法を包含する。
【０００７】 一つの態様において、融合タンパク質のライブラリィは、スキャフォルド・タ
ンパク質、スキャフォルド・タンパク質のＮ末端に融合したランダム・ペプチド
および配座的に制限された型でランダム・ペプチドを示す表現構造を含む。好ま
しい実施態様において、ライブラリィにおける各々のランダム・ペプチドは異な
る。
【０００８】 一つの態様において、融合タンパク質のライブラリィは、スキャフォルド・タ
ンパク質、スキャフォルド・タンパク質のＣ末端に融合したランダム・ペプチド
および配座的に制限された型でランダム・ペプチドを示す表現構造を含む。好ま
しい実施態様において、ライブラリィにおける各々のランダム・ペプチドは異な
る。
【０００９】 一つの態様において、融合タンパク質のライブラリィは、スキャフォルド・タ
ンパク質、スキャフォルド・タンパク質に挿入されたランダム・ペプチドおよび
少なくとも１つの融合パートナーを含む。好ましい実施態様において、ライブラ
リィにおける各々のランダム・ペプチドは異なる。別の好ましい実施態様におい
て、ランダム・ペプチドは、該スキャフォルド・タンパク質のループ構造に挿入
される。
【００１０】 本発明の一つの態様において、スキャフォルド・タンパク質はグリーン蛍光タ
ンパク質(ＧＦＰ)である。
【００１１】 本発明の一つの態様において、ＧＦＰはAequrea由来であり、ランダム・ペプ
チドは該ＧＦＰのアミノ酸１３０−１３５からなるループに挿入される。
【００１２】 本発明の別の態様において、ＧＦＰはAequrea由来であり、ランダム・ペプチ
ドは該ＧＦＰのアミノ酸１５４−１５９からなるループに挿入される。
【００１３】 本発明の別の態様において、ＧＦＰはAequrea由来であり、ランダム・ペプチ
ドは該ＧＦＰのアミノ酸１７２−１７５からなるループに挿入される。
【００１４】 本発明の別の態様において、ＧＦＰはAequrea由来であり、ランダム・ペプチ
ドは該ＧＦＰのアミノ酸１８８−１９３からなるループに挿入される。
【００１５】 本発明の別の態様において、ＧＦＰはAequrea由来であり、ランダム・ペプチ
ドは該ＧＦＰのアミノ酸２０８−２１６からなるループに挿入される。
【００１６】 本発明の一つの態様において、ＧＦＰはRenilla種由来である。
【００１７】 本発明の別の態様において、スキャフォルド・タンパク質はβ−ラクタマーゼ
である。
【００１８】 本発明の別の態様において、スキャフォルド・タンパク質はＤＨＦＲである。
【００１９】 本発明の別の態様において、スキャフォルド・タンパク質はβ−ガラクトシダ
ーゼである。
【００２０】 本発明の別の態様において、スキャフォルド・タンパク質はルシフェラーゼで
ある。
【００２１】 本発明の別の態様において、融合タンパク質のライブラリィが提供される。該
ライブラリィはランダム・ペプチドとスキャフォルド・タンパク質の間にリンカ
ーを含む。
【００２２】 本発明の別の態様において、融合タンパク質のライブラリィが提供される。該
ライブラリィはランダム・ペプチドのもう一方の端とスキャフォルド・タンパク
質の間に第２リンカーを含む。
【００２３】 本発明の別の態様において、融合タンパク質のライブラリィが提供される。該
ライブラリィは−(ｇｌｙ)ｎ−リンカー (式中、ｎ＞２)を含む。
【００２４】 本発明の別の態様において、融合タンパク質のライブラリィが提供される。該
ライブラリィはスキャフォルド・タンパク質およびランダム・ペプチドを含む。
該ライブラリィにおいて、ランダム・ペプチドは該スキャフォルド・タンパク質
の少なくとも一つのアミノ酸を置換する。好ましい実施態様において、ランダム
・ペプチドにより置換される該スキャフォルド・タンパク質のアミノ酸は、該ス
キャフォルド・タンパク質のループ構造内に位置する。
【００２５】 本発明の一つの態様において、融合タンパク質のライブラリィおよび核酸のラ
イブラリィは、少なくとも１０５の異なるメンバーからなる。
【００２６】 本発明はさらに、融合タンパク質をコードする融合核酸を提供する。好ましい
実施態様において、融合タンパク質をコードする核酸は、ランダム・ペプチドを
コードする核酸、スキャフォルド・タンパク質をコードする核酸および融合パー
トナーをコードする核酸からなる。別の好ましい実施態様において、ランダム・
ペプチドをコードする核酸は、スキャフォルド・タンパク質をコードする核酸に
内部挿入される。
【００２７】 本発明の別の態様において、発現ベクターが提供される。発現ベクターは、融
合タンパク質をコードする１以上の核酸を含む。該融合タンパク質は、核酸によ
り形質転換された宿主細胞により認識される制御配列に操作可能的に結合してい
る。好ましい実施態様において、発現ベクターはレトロウイルス・ベクターであ
る。本明細書に提供されるベクターと組換え核酸を含む宿主細胞がさらに、本明
細書に提供される。
【００２８】 さらなる態様において、本発明は、特定の表現型をもたらす生理活性ペプチド
に関するスクリーニング方法を提供する。該方法は、融合核酸を含有する細胞を
提供することを含み、該融合核酸は上記のようなスキャフォルド・タンパク質と
ランダム・ペプチドからなる融合タンパク質をコードする核酸を含む。細胞は、
融合タンパク質が発現する条件を必要とする。次いで、細胞は表現型についてア
ッセイされる。
【００２９】 本発明の他の態様は本発明の次の記載により当業者に明らかとなるであろう。
【００３０】 図面の簡単な説明 図１は、ループのいくつかを選択してランダム・ペプチドを内部挿入するため
に使用される温度因子を表示するＧＦＰの結晶構造を示す。 図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ、２Ｅおよび２Ｆは、実施例の結果を示す。図２Ａ
は、ループの位置を概略的に示す。図２Ｂ−２Ｆは、結果および平均の蛍光を示
す。 図３は、コイルドコイルのラセン円形図を示す。各ラセンについて、ａまたは
ａ'はＮ末端にあり、配列の残基はａｂｃｄｅｆｇまたはａ'ｂ'ｃ'ｄ'ｅ'ｆ'ｇ'
である。それらを反復して個々のラセンａｂｃｄｅｆｇ(ａｂｃｄｅｆｇ)ｎａｂ
ｃｄｅｆｇまたはａ'ｂ'ｃ'ｄ'ｅ'ｆ'ｇ'(ａ'ｂ'ｃ'ｄ'ｅ'ｆ'ｇ')ｎａ'ｂ'ｃ'
ｄ'ｅ'ｆ'ｇ'を得る。ラセンのコアは、ａ、ａ'、ｄおよびｄ'であり、それらは
ａｌａ／ｌｅｕまたはｖａｌ／ｌｅｕなどの疎水性の強いラセン形成残基の組み
合わせである。残基ｅおよびｅ'がｇｌｕとして固定している場合、および残基
ｇおよびｇ'がｌｙｓとして固定している場合、内部ラセン形塩橋はコイルドコ
イル構造をさらに安定化させる。 図４は、E.ColiからのβラクタマーゼＴＥＭ−１のアミノ酸配列を示す。アミ
ノ酸残基２６−２９０が示されている。 図５Ａおよび５Ｂは、E.coli β−ラクタマーゼの結晶構造を示す［PDB1BTL,
Jelsch et al., Proteins: Struct., Funct. Genet. 16:364 (19930］。図５Ａ
は、２つのラセンの正面図を示す。ランダム・ライブラリィが該ラセンに融合さ
れていることもある。図５Ｂは、２つのラセンの側面図を示す。２つのラセンは
このライブラリィにおいてランダム残基により伸長されるものであり、黄色(Ｃ
末端ラセン、残基２７１−２９０を含む；図４参照)および白(Ｎ末端ラセン、残
基２６−４０を含む；図４参照)で示されている。このタンパク質は除去された
残基１−２５を有する。同じ残基がライブラリィ・スキャフォルドにおいてさら
に除去されていることもある。活性部位ｓｅｒ７０は赤で示されている。両方の
ラセンは活性部位から離れているので、ランダム残基がＮ末端および／またはＣ
末端に付着しても、酵素の活性に影響しない。 図６は、結晶学的な温度因子により色づけられたβ−ラクタマーゼのモデルで
あり、最も不動性の領域は赤で、最も可動性の領域は黄色で示されている。Legr
ande et al. [Nature Biotechnology 17:67-72 (1999)]に記載されているループ
は青で示されている；活性部位ｓｅｒ７０は白で示され、ｇｌｕ１６６は青灰色
で示されている。 図７は、ＰＤＢファイル２Ｃｉ−２から取り出されたＣｉ−２の構造を示す。
反応性部位のループは、残基５４−６３により表されている；ループ構造を支持
する残基は５１、６５、６７、６９および８３である。これらの残基は異なる組
み合わせにおいて無作為化され得る。ループ挿入ライブラリィは、残基７２−７
３および／または４４−４５の間に挿入される。 図８はカナマイシン・ヌクレオチジル・トランスフェラーゼ二量体１ＫＮＹの
構造を示す。
【００３１】 [発明の詳細な記述] 治療関連の標的細胞に対する可能性ある薬剤についての組合せ的ライブラリィ
のスクリーニングは、急速に生長している重要な分野である。ペプチドライブラ
リィはこれらのライブラリィの重要なサブセットである。しかし、これらのペプ
チドライブラリィの細胞間スクリーニングを容易にするには、多数の障壁をのり
越えねばならない。細胞中の機能ペプチドを発現させ、次いでスクリーニングす
るには、ペプチドを十分な量で発現させて、タンパク質分解などの異化作用を克
服し、細胞質からエンドソームへ輸送を確保する必要がある。線状ペプチドにつ
いては配座的に安定にし、その細胞標的についての高度の結合親和性を必要とす
る。さらに、これらのペプチドの発現レベルを測定するのが難しいことがある。
例えば、具体的な細胞でペプチドの発現を追跡して、特定の細胞が多くのライブ
ラリィを発現しているかどうかを確かめることは難しい。これらの問題を解決す
るために、本発明はスキャフォルド・タンパク質（変異型を含む）とライブラリ
ィペプチドとの融合を目的とする。このランダム・ペプチドはスキャフォルドの
構造があまり影響を受けないで、ペプチドが代謝的に配座的に安定であるように
融合されるペプチドである。このことから、細胞中のペプチドの存在および量に
ついて容易にモニターされるペプチドライブラリィをつくることができる。この
ように、スキャフォルド・タンパク質中の、またはスキャフォルド・タンパク質
に融合したペプチドは、スキャフォルドの表面に表示され、もって、可能性ある
機能性標的との相互作用を得ることができる。
【００３２】 スキャフォルド・タンパク質には、２つの主なカテゴリーがある。すなわち、
レポータータンパク質および構造タンパク質である。レポータータンパク質は、
レポータータンパク質を含有する細胞と含有しない細胞との識別を可能とするタ
ンパク質である。特定のペプチドの発現を測定するのは難しいが、大きいタンパ
ク質の発現やそのタンパク質をコードする遺伝子の発現を測定することについて
は、多くの技術が知られている。例えば、遺伝子の発現の測定は、つくられたＲ
ＮＡのレベルを測定してなし得る。しかし、この解析は、直接的であるが、難し
く、常に感度がよくなく、労力を要する。さらに優れた方法がレポーター遺伝子
のの発現の測定で提供されている。レポーター遺伝子発現は一般にモニターする
のが容易である。多くの場合、細胞表現型が変わるからである。すなわち、検出
可能な変化の存在、例えば、蛍光タンパク質の存在（概記すると、検出可能遺伝
子自体との融合の使用または検出可能遺伝子構築体の使用であり、例えば、スキ
ャフォルドが転写因子であるときに、活性化されるべきスキャフォルド・タンパ
ク質の存在に基づくものである。）によるものであり、例えば、レポータータン
パク質により変えられた基質（例えば、ルシフェラーゼやβ−ガラクトシダーゼ
などのレポーター遺伝子についての色素産生基質（蛍光産生基質を含む））の添
加または薬剤耐性表現型の付与でおこなう。
【００３３】 レポータータンパク質は、いくつかのクラスの１つであって、検出遺伝子、間
接検出遺伝子、生存遺伝子などを含む。すなわち、タンパク質ライブラリィをＧ
ＦＰやルシフェラーゼなどの検出可能な遺伝子中に挿入すると、ペプチドライブ
ラリィの発現をモニターできる。同様に、抗生物質耐性遺伝子などの生存遺伝子
中に遺伝子を挿入すると、ライブラリィの発現の検出が可能となる。
【００３４】 ある実施態様において、ペプチドが別個の構造偏向を有することも望ましい。
別個のタンパク質または他の機能性標的が、表面または割れ目の結合部位とかた
く相互作用する別個の特異的構造のペプチドを必要とすることがあるからである
。すなわち、別個の構造偏向を各々有する別個のライブラリィを用いると、種々
の異なる標的について高度の親和性メンバーを有する機会を最大にし得る。例え
ば、下記に詳述するように、らせん偏向や伸長構造偏向を有するランダム・ペプ
チドライブラリィは、特定のスキャフォルド・タンパク質のＮ末端および／また
はＣ末端との融合によってつくることができる。同様にコイルドコイル偏向を有
するランダム・ペプチドライブラリィは、特定のスキャフォルド・タンパク質の
Ｎ末端および／またはＣ末端との融合によってつくることができる。ランダムラ
イブラリィの配座の伸長は、二量体化スキャフォルド・タンパク質間の挿入を用
いてなし得る。好ましい実施態様では、スキャフォルド・タンパク質におけるル
ープへの挿入によるループ形成を用いる。各ループ構造内のアミノ酸残基をラン
ダム・ペプチドライブラリィで置換でき、またはランダム・ペプチドライブラリ
ィをループ構造内に位置する２つのアミノ酸残基の間に挿入できる。
【００３５】 従って、本発明は、スキャフォルド・タンパク質とランダム・ペプチドと融合
タンパク質を提供する。「融合タンパク質」、「融合ポリペプチド」またはその
文法上の同義語は、タンパク質の元の状態では通常は結合しないが、ペプチド結
合によって各々のアミノおよびカルボキシル末端が結合して、単一の連続的ポリ
ペプチドを形成する複数のタンパク質構成成分からなるタンパク質を意味する。
本明細書において「タンパク質」は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドを含
む。本明細書において複数は、少なくとも２を意味し、好ましい実施態様は一般
的に２構成成分を用いる。望ましくは、タンパク質構成成分は、下記するように
、直接的またはペプチド・リンカー／スペーサーを介して結合できる。さらに、
下記するように、提示構造や標的配列を含む融合パートナーなどの追加の構成成
分を用い得る。
【００３６】 本発明は、スキャフォルド・タンパク質とランダム・ペプチドとの融合タンパ
ク質を提供する。「スキャフォルド・タンパク質」、「スキャフォルド・ポリペ
プチド」、「スキャフォルド」またはその文法上の同義語は、ランダム・ペプチ
ドなどのアミノ酸配列が融合し得るタンパク質を意味する。ペプチドはスキャフ
ォルドにとって外因性である。すなわち、このペプチドはタンパク質中に通常は
存在していない。融合に際して、スキャフォルド・タンパク質ランダム・ペプチ
ドの表示を可能にして、他の分子に到達し得るようになる。
【００３７】 スキャフォルド・タンパク質はいくつかのクラスがある。それにはレポーター
タンパク質（検出可能タンパク質、生存タンパク質、間接検出可能タンパク質な
ど）および構造タンパク質が含まれる。
【００３８】 好ましい実施態様において、スキャフォルド・タンパク質はレポータータンパ
ク質である。「レポータータンパク質」またはその文法的同義語は、細胞内また
は細胞中に存在することにより、または培養基中に分泌されたときに、その細胞
とレポータータンパク質を含有していない細胞とを識別できるタンパク質を意味
する。本明細書に記載のように、細胞は通常、レポータータンパク質をコードす
るレポーター遺伝子を含んでいる。
【００３９】 レポーター遺伝子はいくつかのクラスがある。上記したように、限定ではない
が、検出遺伝子、間接検出遺伝子、生存遺伝子が含まれる。
【００４０】 好ましい実施態様において、スキャフォルド・タンパク質は検出可能タンパク
質である。「検出可能タンパク質」または「検出タンパク質」（検出可能遺伝子
または検出遺伝子によりコードされる）は、直接ラベルとして使用できるタンパ
ク質である。すなわち、このタンパク質はさらなる操作や構造体なしに検出可能
（好ましくは、検出可能タンパク質を含む細胞が検出可能）である。本明細書に
概記するように、スクリーニングの好ましい実施態様では、細胞選別（例えば、
ＦＡＣＳによる）を用いてスキャフォルド（およびペプチドライブラリィ）発現
を検出する。つまり、この実施態様において、レポーター遺伝子自体のタンパク
質産物が、検出可能遺伝子を発現している細胞を識別するのに役立つ。この実施
態様において、適当な検出可能遺伝子は、自動蛍光タンパク質をコードする遺伝
子である。
【００４１】 本分野では種々の自動蛍光タンパク質が知られている。このものはAequoreaお
よびその変異型に由来するグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を基とする。それ
には、限定でないが、次のものがある。ＧＦＰ(Chalfie, et al.,“Green Fluor
escent Protein as a Marker for Gene Expression.”Science 263(5148):802-8
05994));、高揚ＧＦＰ（EGFP;Clontech-Genbank Accession Number U55762))、
ブルー蛍光タンパク質（BFP;Quantum Biotechnologies, Inc.1801 de Maisonneu
ve Bivd.West,8th Floor,Montreal(Quebec)Canada H3H 1J9; Stauber,R.H.Biote
chniques 24(3):462-471(1998); Heim,R.and Tsien,R.Y.Curr.Biol.6:178-182(1
996))、高揚イエロー蛍光タンパク質（EYFP;Clontech Laboratories,Inc.,1020
East Meadow Circle,Palo Alto,CA94303)。さらに、最近、Renilla種由来の自動
蛍光タンパク質が報告されている。参照、WO92/15673; WO95/07463; WO98/14605
; WO98/26277; WO99/49019; U.S.特許 5,292,658; U.S 特許 5,418,155; U.S.特
許 5,683,888; U.S.特許 5,741,668; U.S.特許 5,777,079;U.S.特許 5,804,387;
U.S.特許 5,874,304; U.S.特許 5,876,995; and U.S.特許 5,925,558;（出典明
示により本明細書の一部とする。）。
【００４２】 好ましい実施態様において、スキャフォルド・タンパク質は、Aequora蛍光タ
ンパク質またはその変異型の１つである。参照、Cody et al.,Biochemistry 32:
1212-1218(1993); and Inouye and Tsuji,FEBS Lett.341:277-280(1994)（出典
明示により本明細書の一部とする。）。
【００４３】 従って、本発明は、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）とランダム・ペプチド
との融合を提供する。「グリーン蛍光タンパク質」または「ＧＦＰ」は、ＧＦＰ
と少なくとも３０％配列同一性を有し、４９０から６００ｎｍで蛍光を示すタン
パク質を意味する。野生型ＧＦＰは、長さが２３８アミノ酸であって、溶媒およ
び溶媒急冷から蛍光団を保護する比較的剛性のβ−can構造中に存在する改変ト
リペプチド蛍光団を含有する。参照、Prasher et al.,Gene 111(2):229-233(199
2); Cody et al.,Biochem.32(5):1212-1218(1993); Ormo et al,Science 273:13
92-1395(1996); and Yang et al.,Nat.Biotech.14:1246-1251(1996)（出典明示
により本明細書の一部とする。）。
【００４４】 ＧＦＰの定義中に、アミノ酸の置換、挿入、欠失を有するＧＦＰの誘導体が含
まれる。参照、例えば、WO98/06737 and U.S.特許 No.5,777,079（出典明示によ
り本明細書の一部とする。）。従って、本発明で使用されるＧＦＰタンパク質は
、野生型配列よりも長いか短いことがある。このように、好ましい実施態様にお
いて、ＧＦＰの定義に野生型配列の部分や断片が含まれる。例えば、ＧＦＰ欠失
変異体をつくり得る。Ｎ末端において、タンパク質の最初のアミノ酸のみを欠失
しても蛍光が喪失しないことが知られている。Ｃ末端においては、蛍光の喪失な
しに７残基まで欠失できる。参照、Phillips et al.,Current Opin.Structura.
Biol.7:821(1997))。
【００４５】 一つの実施態様において、ＧＦＰタンパク質は誘導すなわち変異型ＧＦＰタン
パク質である。すなわち、下記に詳述するように、誘導ＧＦＰは、少なくとも１
つのアミノ酸の置換、欠失、挿入を含有し、特にアミノ酸の置換が好ましい。ア
ミノ酸の置換、欠失、挿入はＧＦＰタンパク質内のいかなる残基でも起こり得る
。この変異型を普通につくるには、ＧＦＰタンパク質をコードするＤＮＡ中のヌ
クレオチドの部位特異的変異形成による。当分野で知られているカセットまたは
ＰＣＲ変異形成などの技術を用いて、変異型をコードするＤＮＡをつくり、上記
したような組換え細胞培養におけるＤＮＡを発現さす。しかし、約１００〜１５
０までの残基を有する変異型ＧＦＰタンパク質断片は、既知の技術を用いるイン
ビトロ合成によってつくることができる。アミノ酸配列変異型は、変異型につい
て予め決定された性質、すなわちＧＦＰタンパク質アミノ配列について天然に生
じる対立遺伝子または種間の変異と区別する特徴を有する。変異型は典型的には
、天然に生じる類似体と同じ質的生物活性を発揮する。なお、下記に詳述するよ
うな修飾された特徴を有する変異型も選択し得る。すなわち、好ましい実施態様
において、非野生型ＧＦＰを使用するとき、誘導体は野生型蛍光の少なくとも１
％、好ましくは少なくとも１０％、特に好ましくは少なくとも５０〜６０％、特
別に好ましくは９５から９８％〜１００％を有する。一般的に、重要なのは、十
分な蛍光があって、例えば、蛍光活性細胞ソーター（ＧＡＣＳ）器を用いるバッ
クグランドで選別および／または検出が可能になることである。しかし、ある実
施態様において、融合タンパク質を非蛍光的に検出することが可能であり、例え
ば、エヒトープ、タグ（すなわち精製配列）またはＧＦＰ自体に対する抗体を用
いる。この場合、ＧＦＰスキャフォルドは蛍光を要しない。同様に、スキャフォ
ルドが正しくおよび／または再生的に折り畳まれているのを示すことができれば
、スキャフォルドが生物活性でなくてよい。
【００４６】 当業者が評価するように、いずれのスキャフォルド・タンパク質またはそれを
コードする遺伝子は野生型または変異型であり得る。これらの変異型は、３種類
、すなわち置換、挿入または欠失の１以上の変異型である。通常これらの変異型
は、スキャフォルド・タンパク質をコードするＤＮＡにおけるヌクレオチドの部
位特異的突然変異導入法により製造され、当業界で公知のカセットまたはＰＣＲ
突然変異誘発法または他の技術を用い、変異型をコードするＤＮＡを製造し、次
いで、上記で概説された組換え細胞培養物においてＤＮＡを発現させる。しかし
ながら、約１００−１５０以下の残基を有する変異型タンパク質断片は、確立さ
れた技術を用いるインビトロ合成により製造され得る。アミノ酸配列変異型は、
予め定められた変異の性質を特徴とし、すなわちスキャフォルド・タンパク質ア
ミノ酸配列の天然対立遺伝子または種間変異からそれらを区別する特徴である。
変異型は、典型的には天然類似体と同じ質的生物活性を呈するが、下記でより詳
細に説明されている通り修飾された特徴を有する変異型も選択され得る。
【００４７】 アミノ酸配列変異が導入される部位または領域が予め決定されても、変異自体
は予め決定される必要はない。例えば、所定の部位における変異誘発の性能を最
適化するため、ランダム変異誘発が標的のコドンまたは領域で誘導され、発現さ
れたスキャフォルド変異型は所望の活性の最適な組み合わせについてスクリーニ
ングされ得る。既知配列を有するＤＮＡにおいて予め決定された部位で置換変異
を誘発する技術はよく知られており、例えば、Ｍ１３プライマー突然変異誘発法
およびＰＣＲ突然変異誘発法がある。変異体のスクリーニングは、スキャフォル
ド・タンパク質活性の検定法を用いて行われる。
【００４８】 アミノ酸置換は典型的には単一残基によるものであり、挿入は通常約１−２０
アミノ酸程度で行われるが、かなり大規模な挿入も認容され得る。欠失は約１−
約２０残基の範囲であるが、場合によってはかなり大規模な欠失もあり得る。
【００４９】 置換、欠失、挿入またはそれらの組み合わせを用いることにより、最終誘導体
に到達し得る。一般に、これらの変化は、分子の改変を最小限にとどめるため数
個のアミノ酸に対して行われる。しかしながら、大規模な変化もある種の環境で
は認容され得る。ＧＦＰなどのスキャフォルド・タンパク質の特性の小規模な改
変が望まれる場合、置換は一般に下記チャートに従って行われる。 チャートＩ
【表１】
【表２】
【００５０】 機能または免疫学的同一性の実質的変化は、チャートＩに示されたものより同
類性が低い置換を選択することにより行われる。例えば、改変領域におけるポリ
ペプチドバックボーンの構造、例えば、αらせんまたはβシート構造、標的部位
における分子の荷電または疎水性、または側鎖のバルクに顕著な影響を及ぼす置
換が行われ得る。一般にポリペプチドの特性に最大の変化をもたらすことが予測
される置換は、（ａ）親水性残基、例えば、セリルまたはトレオニルが疎水性残
基、例えば、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリルまたはアラニ
ルの代わりに（または、により）置換されている場合、（ｂ）システインまたは
プロリンが他のいずれかの残基の代わりとして（または、により）置換されてい
る場合、（ｃ）電気陽性側鎖を有する残基、例えば、リシル、アルギニルまたは
ヒスチジルが、電気陰性残基、例えば、グルタミルまたはアスパルチルの代わり
として（または、により）置換されている場合、または（ｄ）巨大側鎖を有する
残基、例えば、フェニルアラニンが側鎖をもたない残基、例えば、グリシンの代
わりとして（または、により）置換されている場合である。
【００５１】 上記したように、変異型は典型的には同じ性質の生物活性（すなわち、蛍光）
を示すが、変異型も、必要とするようなスキャフォルド・タンパク質の特徴を修
飾するために選択される。
【００５２】 さらに、野生型より長いスキャフォルド・タンパク質をつくることができる。
例えば、エピトープまたは精製タグの付加、別の融合配列の付加による。詳しく
は下記する。 好ましい実施態様において、スキャフォルド・タンパク質は、蛍光が低いか、
蛍光を有さないが少なくとも約１０ｎＭの濃度で哺乳動物において発現される変
異型ＧＦＰである。この濃度は、好ましくは少なくとも約１０ｎＭ、さらに好ま
しくは少なくとも約１μＭ、一層好ましくは少なくとも約１０μＭ、最も好まし
くは少なくとも約１００μＭである。
【００５３】 ランダム・ペプチドはスキャフォルド・タンパク質に融合して、融合ポリペプ
チドを形成する。本明細書において「融合した」また「操作可能的に結合した」
は、下記に定義するようなランダム・ペプチドとＧＦＰを例とするようなスキャ
フォルド・タンパク質とが、スキャフォルド構造の安定性についての崩壊を最小
にするように（すなわち、生物活性を保持できる）、互に結合することを意味す
る。ＧＦＰの場合、スキャフォルドは蛍光能を好ましくは保持するか、少なくと
も４２℃のＴｍを維持する。下記するように、融合ポリペプチド（または融合ポ
リペプチドをコードする融合ポリヌクレオチド）は、さらに構成成分を含むこと
ができ、それには複数のループにおける複数のペプチド、融合パートナーなどが
ある。
【００５４】 融合ポリペプチドは、限定でないが、融合パートナーおよびリンカーを含む追
加の構成成分を好ましくは含んでいる。
【００５５】 好ましい実施態様において、ランダム・ペプチドはＧＦＰのＮ末端と融合する
。融合は直接的である。すなわちぺプチドのＣ末端とＧＦＰのＮ末端の間に追加
の残基がない。または、融合は間接的である。すなわち、介在するアミノ酸を用
い、例えば、リンカーを含む１以上の融合パートナーを用いる。この実施態様に
おいて、好ましくは提示構造を用いてペプチドになんらかの配座的安定性を与え
る。特に好ましい実施態様は二量化配列の使用である。
【００５６】 一つの実施態様において、ＧＦＰのＮ末端残基を検出する。すなわち、ＧＦＰ
の１以上のアミノ酸を検出し、ペプチドで置換できる。しかし、上記したように
、７を越えるアミノ酸の欠失はＧＦＰの蛍光を減じので、このような大きい欠失
は一般的に好ましくない。好ましい実施態様において、融合はＧＦＰの第１アミ
ノ酸に対して直接的である。
【００５７】 好ましい実施態様において、ランダム・ペプチドをＧＦＰのＣ末端に融合する
。Ｎ末端融合について上記したように、融合は直接または間接であり、Ｃ末端残
基を欠失できる。
【００５８】 好ましい実施態様において、ペプチドおよび融合パートナーをＧＦＰのＮおよ
びＣ両末端に付加する。ＧＦＰのＮおよびＣ末端は空間的に近接して（１８Å以
内）の同じ「表面」にあるので、本発明の構成成分を用いて非共有結合的「環状
」ＧＦＰタンパク質をつくることが可能である。例えば、二量化配列を用いると
非共有結合的環状タンパク質ができる。すなわち、第１二量化配列をＧＦＰのＮ
末端またはＣ末端のいずれかに接着し、ランダム・ペプチドおよび第２二量化配
列を他の末端に加えると、大きいコンパクト構造が形成される。
【００５９】 好ましい実施態様において、ランダム・ペプチドはＧＦＰの内部位置に融合さ
れる。すなわち、ペプチドをＧＦＰの内部位置に挿入する。ペプチドはいかなる
位置にも挿入できるが、好ましい挿入位置はＧＦＰ表面の「ループ」のチップそ
のものであって、ＧＦＰβ−ｃａｎタンパク質構造の崩壊が最小となる。好まし
い実施態様において、ループの選択は、実施例に述べるように、結晶構造におけ
る最高温度因子を有するように行う。
【００６０】 好ましい実施態様において、ランダム・ペプチドを、ＧＦＰ残基のなんらの欠
失もなしに挿入する。すなわち、挿入点がループにおける２つのアミノ酸の間に
あって、ペプチドの新しいアミノ酸およびリンカーなどの融合パートナーが加わ
る。一般的に、リンカーを用いるとき、リンカーはＧＦＰに直接的に、リンカー
およびペプチドに融合される追加の融合パートナーがあるときはそれとともに、
融合される。
【００６１】 好ましい実施態様において、ペプチドはＧＦＰ中に、１以上のＧＦＰ残基を欠
失して、挿入する。すなわち、ランダム・ペプチド（およびリンカーを含む融合
パートナー）が１以上の残基に置換する。一般的に、リンカーを用いたとき、リ
ンカーはＧＦＰに直接結合する。これは、一般的にループのティプでＧＦＰ残基
に置換するリンカー残基である。一般的に、残基が置換されるとき、ＧＦＰの１
〜５残基が欠失され、１から５のいずれのアミノ酸の欠失も可能である。特に好
ましい欠失は下記する。ＧＦＰ構造については、図１および２を参照。
【００６２】 ループ中の好ましい挿入点には、限定でないが、ループ１（アミノ酸154-159
）、ループ２（アミノ酸154-159）、ループ３（アミノ酸172-175）、ループ４（
アミノ酸188-193）、ループ５（アミノ酸208-216）がある。
【００６３】 特に好ましい実施態様は、ペプチドおよび関連構造のループ１、アミノ酸130-
135への挿入である。好ましい実施態様において、１以上のループ・アミノ酸が
欠失されており、asp133の欠失が好ましい。
【００６４】 好ましい実施態様において、ペプチド（存在すれば、および融合パートナー）
をループ２、アミノ酸154-159に挿入する。好ましい実施態様において、１以上
のループ・アミノ酸が欠失しており、lys156およびgln157両者の欠失が好ましい
。
【００６５】 好ましい実施態様において、ペプチド（存在すれば、および融合パートナー）
をループ３、アミノ酸172-175に挿入する。好ましい実施態様において、１以上
のループ・アミノ酸が欠失しており、asp173の欠失が好ましい。
【００６６】 好ましい実施態様において、ペプチド（存在すれば、および融合パートナー）
をループ４、アミノ酸188-193に挿入する。好ましい実施態様において、１以上
のループ・アミノ酸が欠失しており、gly189、asp190、gly191、pro192の同時欠
失が好ましい。
【００６７】 好ましい実施態様において、ペプチド（存在すれば、および融合パートナー）
をループ５、アミノ酸208-216に挿入する。好ましい実施態様において、１以上
のループ・アミノ酸が欠失されており、asn212、glu213、lys214の同時欠失が好
ましい。
【００６８】 好ましい実施態様において、ペプチド（適用できれば、融合パートナーを含む
）を一時にスキャフォルドの１以上のループに挿入する。例えば、ＧＦＰのルー
プ２および４の両方にペプチド付加すると、ライブラリィの複合性を増大し、タ
ンパク質の同じ表面にこれらのループを提出することができる。同様に、ペプチ
ドを１以上のループに加えること、および他の融合パートナーを標的配列などの
別のループに加えることも可能である。
【００６９】 このようにして、ＧＦＰおよびランダム・ペプチドを含む融合ポリペプチドが
提供される。さらに、ランダム・ペプチドのＧＦＰへの導入を容易にするために
、好ましい実施態様は、少なくとも１つのループ中に挿入された多部位クローニ
ング部位を有するＧＦＰタンパク質を提供する。
【００７０】 一つの実施態様において、例えば、リンカーなどの融合パートナーを使用する
とき、スキャフォルドはＧＦＰでなくてよい。
【００７１】 好ましい実施態様において、スキャフォルドはRenilla ＧＦＰである。 一つの実施態様において、スキャフォルドはAequorea ＧＦＰでない。 いくつかの実施態様において、スキャフォルドはＧＦＰでない。
【００７２】 好ましい実施態様において、スキャフォルド・タンパク質は間接的に検出可能
タンパク質である。レポータータンパク質として、間接的に検出可能タンパク質
を含有する細胞は、含有していない細胞と識別できる。しかし、これは２次的事
象の結果である。例えば、好ましい実施態様において、色素形成、特に蛍光形成
の基質に作用する酵素を含む「酵素的に検出可能」スキャフォルドを使用し、蛍
光をつくる。酵素は、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−ラクタマー
ゼなどである。あるいは、間接的に検出可能タンパク質は、スキャフォルドによ
り活性化され得る細胞中の組換え構造体を必要とする。例えば、自動蛍光タンパ
ク質に結合のプロモーターに結合するスキャフォルド転写因子またはインデュー
サーであって、自動蛍光タンパク質の転写が起きる。
【００７３】 好ましい実施態様において、スキャフォルドはβ−ラクタマーゼである。β−
ラクタマーゼは、一般に細菌の外質中に分泌され、抗生物質アンピシリンを含む
種々のペニシリン類やセファロスポリン類に対して耐性を提供する。β−ラクタ
マーゼスキャフォルドとペプチドライブラリィとの融合タンパク質を含む細胞の
抗生物質での選別は、ライブラリィ発現の測定を可能にする。これは異なるライ
ブラリィ挿入部位、融合部位、ライブラリィ偏向のスキャフォルド折り畳みに対
する作用の検討を可能にし、β−ラクタム抗生物質での選別後の生存率を調べる
ことでなされる。通常、真核細胞のβ−ラクタマーゼ・ライブラリィは、リーダ
ー配列を除去して、細胞からのその分泌を回避する。β−ラクタマーゼの検定は
、色素用試薬［Marshall et al., Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 22:353-5(1
995)］または生存哺乳動物においる蛍光用試薬［Zlokarnik et al., Science 27
9:84-88(1998)]を用いて容易なので、細胞分解物または生存細胞における酵素活
性から、ライブラリィメンバーを発現している細胞フラクションの決定ができ、
活性β−ラクタマーゼ・ライブラリィメンバーを発現する細胞は、色素用試薬ま
たは蛍光用試薬における変化を基にしてＦＡＣＳ選別ができる。これは、特異的
に細胞機能を変えるペプチドライブラリィメンバーについて容易に機能的にスク
リーニングする能力を高める。
【００７４】 本明細書の「β−ラクタマーゼ」は、種々の微生物が生産するβ−ラクタマー
ゼを含み、ＴＥＭ型伸長スペクトルβ−ラクタマーゼ（E.coli由来など、下記参
照）およびＡβ−ラクタマーゼなどがある。本発明の範囲のβ−ラクタマーゼは
、限定でないが、E.coli由来のＴＥＭ−１β−ラクタマーゼ、Pseudomonas aeru
ginosa由来のβ−ラクタマーゼ、Klebsiella oxytoca由来のＴＥＭ−２６Ｂβ−
ラクタマーゼ、Capnocytophaga ochracea由来のクラスＡβ−ラクタマーゼ、E.c
oli由来のＴＥＭ−６β−ラクタマーゼ（ＥＣ３．５．２．６）、E.coli由来の
ＴＥＭ−２８β−ラクタマーゼ、Morganella morganii由来の伸長スペクトルβ
−ラクタマーゼＴＥＭ−１０、Klebsiella pneumoniae由来のクラスＡβ−ラク
タマーゼ、Klebsiella pneumoniae由来の伸長スペクトルβ−ラクタマーゼＣＡ
Ｚ−７、Klebsiella pneumoniaeプラスミド由来のＴＥＭ−３β−ラクタマーゼ
（ＥＣ３．５．２．６）を含む。E.coli由来のＴＥＭ−１に高頻度の相同性を有
するβ−ラクタマーゼ、特にＮ末端およびＣ末端らせんまたは８４−８６ループ
におけるものも好ましい。
【００７５】 従って、下記するようにβ−ラクタマーゼおよびペプチドを含む融合タンパク
質を提供する。本発明に記載のようなＧＥＰおよびスキャフォルド・タンパク質
について、Ｎ末端、Ｃ末端、ＮおよびＣ両末端、１以上の内部での融合のすべて
について、個々にまたは組合せて、意図している。
【００７６】 好ましい実施態様において、内部での融合が好ましい。融合部位はいくつかの
β−ラクタマーゼの構造に基づいて決定する。β−ラクタマーゼの例として、Ba
cillus licheniformis 由来のβ−ラクタマーゼ（参照、Moews et al.,Proteins
7(2):156-71(1990);Knox and Moews,J.Mol.Biol.220(2):435-55(1991));、Stap
hylococcus aureus由来のβ−ラクタマーゼ（参照、Herzberg,J.Mol.Boil.217(4
):701-19(1991);and Chen et al.,Biochemistry 35(38):12251-8(1996))、ＴＥ
Ｍ−１β−ラクタマーゼ（参照、Swaren et al.,Biochemistry 38(30):9570-6(1
999);Jelsch et al.,Proteins 16(4):364-83(1993);and Maveyraud et al.,Bioc
hemistry 37(8):2622-8(1998))、クラスＡβ−ラクタマーゼ Toho−１（参照、I
buka et al.,J.Mol.Biol.285(5):2079-87(1999))、ジンクβ−ラクタマーゼ（参
照、Concha et al.,Structure 4(7):823-36(1996)）がある（出典明示により本
明細書の一部とする。）。
【００７７】 ある実施態様において、例えば、β−ラクタマーゼ酵素活性がライブラリィの
試験に用いた哺乳動物細胞や細菌において望ましくないとき、例えば、細胞に対
する毒性や特殊な機能検定での干渉あるいは別のスキャフォルドを提供する場合
などにおいては、部位特異的変異によって不活化したβ−ラクタマーゼを用いて
β−ラクタマーゼライブラリィをつくる。クラスＡβ−ラクタマーゼＰＥＲ−１
においては、例えば、ala164を argで置換するか、glu166をalaで置換する（参
照 Bouthers et al.,Biochem.J.330:1443-9(1998))。同様に、ＴＥＭ−１β−ラ
クタマーゼにおいては、活性部位ser70またはglu166をalaで置換する（Adachi e
t al.,J.Biol.Chem.266:316-91(1991))。B.Licheniformis由来のクラスＡβ−ラ
クタマーゼにおいては、glu166をalaで置換できる（Knox et al.,Protein Eng.6
:11-18(1993))。当業者は評価するように、β−ラクタマーゼを含む不活性折り
畳みスキャフォルド・タンパク質を使用し得る。
【００７８】 野生型酵素よりも安定なβ−ラクタマーゼ活性変異体もループ挿入ライブラリ
ィについてのライブラリィスキャフォルドとして好ましい。この変異体は、その
安定性が特に不安定なランダムライブラリィ配列を持つライブラリィメンバーの
折り畳みを高めるという利点を持つ。このような変異体の例には、Ｅ１０４およ
びＥ２４０Ｋがある（Raquet et al.,Proteins 23:63-72(1995))。あるいは変異
Ｍ１８２Ｔは、ミスセンス変異（Huang and Palzkill,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.
A.94:8801-6(1997))の大きいサプレッサーであって、スキャフォルド中に含まれ
て、折り畳みまたは安定性の欠損を抑制して、いくつかのライブラリィメンバー
をもたらす。さらに、このことはライブラリィのみに適用されるのでなく、本明
細書に開示したすべての他の酵素やタンパク質に適用される。
【００７９】 好ましい実施態様において、β−ラクタマーゼの誘導体をスキャフォルド・タ
ンパク質として用いる。すなわち、Ｎ末端ＢＡＬ−Ｃ末端が E.coli ＴＥＭ−
１β−ラクタマーゼの２６−２９０残基、Staphylococcus aureusなどのβ−ラ
クタマーゼの類似の残基を含む（参照、図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ）。
【００８０】 好ましい実施態様において、ランダム・ペプチドライブラリィの最適抑制のた
めに、挿入の主要部位は、酵素の活性部位に隣接していない関連可動ループにお
けるランダムアミノ酸（下記するようにリンカーおよび他の融合パートナーと操
作可能的に）の挿入がある。図６は、最大の不動および可動領域を表わすβ−ラ
クタマーゼのモデルを示す。
【００８１】 好ましい実施態様において、ペプチドライブラリィ挿入のための好ましいルー
プは、１８４−Ｄ８５−Ａ８６−Ｇ８７−Ｑ８８−Ｅ８９を含むループであって
、Ｎ末端でらせんおよびＣ末端で不規則領域に結合する。このループはNature B
iotechnology 17:67-72(1999)に記載のループとは相異する。彼らは、活性部位
に近くて、それに作用するループを具体的に選択して、酵素活性を調整した。こ
こでは、活性の減少を意図していないし、望ましくもない。
【００８２】 ＧＦＰについて述べたように、１以上のループ残基を置換するか、あるいは２
つの残基間に挿入できる一つの実施態様において、１８４、Ｄ８５、Ｅ８９は、
各側鎖がβ−ラクタマーゼ構造の残りと相互作用をするようなので、ライブラリ
ィ中に固定される。なお、これは必要ではない。Ｑ８８も最適に固定される。Ａ
８６およびＧ８７は、例えば、ランダム残基またはリンカー残基にはさまれたラ
ンダム残基で置換できる。
【００８３】 さらに下記するように、一方または両側のリンカーアミノ酸は、ランダムライ
ブラリィとタンパク質の残りとの間の可動的領域を提供するために、２、３、４
以上のグリシンを含み得る。しかし、当業者は分かるように、ループが十分可動
的であると、リンカーはグリシンを必要としない。多数のグリシンの存在は、ラ
イブラリィをタンパク質の残りから少なくとも部分的に配座的に分離し、ライブ
ラリィメンバーが活性β−ラクタマーゼを折り畳み創生する機会を多くする。
【００８４】 他の好ましい実施態様において、ランダム残査を代替のループ部位中に挿入す
る。さらに、リンカーなどの融合パートナーを適宜用い得る。好ましい実施態様
において、ランダム挿入のいずれかの側に少なくとも１つのグリシン・リンカー
を用いると、バックボーンおよびループのいくつかの側鎖の比較的な不動性によ
って、高率のβ−ラクタマーゼランダムが挿入され、活性酵素中に折り畳まれる
。
【００８５】 好ましい実施態様において、ループ残基をＤ２５４−Ｇ２５５−Ｋ２５６（β
−ラクタマーゼループ２）の部位中に置換または挿入できる。さらに適当なリン
カー、好ましくはグリシン残基などの融合パートナーとともに挿入できる。この
ループにおいて、３つの残基の置換が好ましい。
【００８６】 好ましい実施態様において、ループ残基をＡ２２７−Ｇ２２８（β−ラクタマ
ーゼループ３）の部位中に置換または挿入できる。さらに適当なリンカー好まし
くはグリシン残基などの融合パートナーとともに挿入できる。このループにおい
て、２つの残基の置換が好ましい。Bacillus lichenifirmis（ＰＤＢ構造４ＢＬ
Ｍ）タンパク質などのいくつかのバックボーンにおいて、Ｋ２５５−Ｇ２５６−
Ｄ２５７が選択ループである。
【００８７】 好ましい実施態様において、ループ残基をＮ５２−Ｓ５３（β−ラクタマーゼ
ループ３）の部位中に置換または挿入できる。さらに適当なリンカー好ましくは
グリシン残基などの融合パートナーとともに挿入できる。このループにおいて、
２つの残基の置換が好ましい。Bacillus lichenifirmis（ＰＤＢ構造４ＢＬＭ）
タンパク質などのいくつかのバックボーンにおいて、Ｇ５２−Ｔ５３−Ｎ５４が
選択ループである。
【００８８】 好ましい実施態様において、ランダム・ペプチドライブラリィをβ−ラクタマ
ーゼのＮ末端またはＣ末端に融合する。これは、スキャフォルドがランダム・ペ
プチドライブラリィの配列と独立的によく折り畳まれる機会を最適にする。α−
らせん偏向を有するこのようなライブラリィを、例えば、結合部位を持つタンパ
ク質に結合するのに用いる。好ましいα−らせんは、ロイシン・ジッパー・タン
パク質、コイルドコイル、らせん束である。これらのらせんは、上記構造の一つ
において、存在するらせんを置換することにより作用する。らせん構造のための
偏向をつくるために、ランダム・ペプチド配列（全２０天然Ｌアミノ酸から選択
）をらせんの終末に融合する。らせんはすでに有核化されており、すなわち、本
来の構造中で安定であり、少なくともいくつかのターンを有する。これには、選
択したβ−ラクタマーゼのＮ末端またはＣ末端に直接の融合をともなう。これら
の両末端が伸長α−らせんだからである。
【００８９】 他の好ましい実施態様において、ライブラリィはα−らせん構造に強く偏向し
ている。この場合、ランダム・ペプチド残基は比較的強いらせん形成のみによっ
てなり立つ。これはＭ，Ｋ，Ｅ，Ａ，Ｆ，Ｌ，Ｒ，Ｄ，Ｑ，Ｉ,Ｖ（例えば、参
照 Lyu et al.,Science 250(4981):669-673(1990);O'Neil and DeGrado Science
250(4981):646-651(1990)を含む。
【００９０】 他の好ましい実施態様において、用いられるβ−ラクタマーゼ変異体は、ＴＥ
Ｍ−１末端切除配列におけるＰ２７の、らせん形成アミノ酸による置換を含む。
アミノ酸にはＭ，Ｋ，Ｅ，Ａ，Ｆ，Ｌ，Ｒ，Ｄ，Ｑ，Ｉ，Ｖがある。
【００９１】 好ましい実施態様において、ランダム・ペプチドライブラリィをβ−ラクタマ
ーゼのＣ末端に融合する。得たライブラリィは次の模式構造を有す。「Ｎ末端−
ＢＬＡ−Ｃ末端−スペーサー残基−ランダム・ペプチドライブラリィ−（＋/−
最適Ｃ−cap残基）」。
【００９２】 他の好ましい実施態様において、ランダム・ペプチドライブラリィをβ−ラク
タマーゼのＮ末端に融合する。得たライブラリィは次の模式構造を有す。「（＋ /− 最適Ｎ−cap残基)−ランダム・ペプチドライブラリィ−スペーサー残基−Ｎ
末端−ＢＡＬ−Ｃ末端」。細胞発現のためには、第１残基は強いらせん形成体Ｍ
である。
【００９３】 好ましい実施態様において、１，２，３，４，５以上のスペーサー残基をβ−
ラクタマーゼ構造とランダム・ペプチドライブラリィとの間に挿入し得る。らせ
ん偏向ライブラリィの場合、スペーサーはＭ，Ｋ，Ｅ，Ａ，Ｆ，Ｌ，Ｒ，Ｄ，Ｑ
，Ｉ，Ｖなどの強いらせん形成体であり、組み合せや特定の配列において、Ｌお
よびＥは３−４残基が離れ、側鎖塩橋が可能となって、らせんをさらに安定にす
る。スペーサーは電荷をおびることができ、β−ラクタマーゼ構造の内部に挿入
されにくくなる。
【００９４】 好ましい実施態様において、スペーサー配列はＫＬＥＡＬＥＧであり、配列を
偏向して、α−らせんを形成し、平行コイルドコイルのように、標的タンパク質
のらせんと相互作用する［Monera et al.,j.Biol.Chem.268:19218(1993)］。
【００９５】 他の好ましい実施態様において、β−ラクタマーゼＣ末端らせん偏向ライブラ
リィのためのスペーサー配列はＥＥＡＡＫであり得る。E.coli ＴＥＭ−１β−
ラクタマーゼ由来のＣ末端野生型配列−ＫＨＷ２９０と組み合すと、これは−Ｋ
ＨＷ２９０Ｅ２９１Ｅ２９２Ａ２９３Ａ２９４Ｋ２９５Ａ２９６となる。Ｅ２９ １ はＫ２９５とｉ、ｉ＋４塩橋を形成する。Ｅ２９２はＫ２８８と類似の塩橋を
形成する。これはαらせんを安定にする。Ａ２９３Ａ２９４Ｋ２９５Ａ２９６は
ＡＸＸＡモチーフを形成して、この領域をコードするＤＮＡ中のＳｆｉ−１制限
部位の挿入を可能し、もって、ランダム・ペプチドライブラリィをβ−ラクタマ
ーゼのＣ末端上にクローニングする。
【００９６】 他の好ましい実施態様において、スペーサー配列は配列Ａ２９２Ｅ２９３Ｋ２ ９４ Ａ２９５Ｋ２９６Ａ２９７Ｅ２９８を含み、２つのｉ、ｉ＋４塩橋を可能に
する。
【００９７】 好ましい実施態様において、スキャフォルド・タンパク質はルシフェラーゼで
ある。ルシフェラーゼが触媒する生物発光反応は、ルシフェリン、ＡＴＰ、マグ
ネシウム、分子Ｏ２を要する。これらの成分を混合すると、収束に退化する光の
フラッシュが生じ、ルミノメーターなどで検出できる。
【００９８】 好ましい実施態様において、レポータータンパク質は蛍ルシフェラーゼである
［de Wet et al.,Mol.Cell.Biol.7:725-737(1987); Yang and Thomason,supra;
Bronstein et al.,supra］。蛍ルシフェラーゼは、血漿膜を通り得る溶性ルシフ
ェラーゼ基質を用いると、生存細胞で検出できる（Bronstein et al.,前掲）。
蛍ルシフェラーゼの使用が特に好ましいのは、哺乳動物細胞において最小の内因
性活性しかないからである。ルシフェラーゼは様々な種からクローンされており
、ヌクレオチド配列が利用可能である（例えば、参照、GenBank accession num
ber E08320,E05448,D25416,S61961,U51019,M15077,L39928,L39929,AF085332,U89
490,U31240,M10961,M65067,M62917,M25666,M63501,M55977,U03687,M26194）。
【００９９】 好ましい実施態様において、スキャフォルド・タンパク質はRenilla reniform
isルシフェラーゼである。Renillaルシフェラーゼ、Renillaルシフェラーゼをコ
ードするＤＮＡ、組換えルシフェラーゼをつくるためのRenilla reniformis Ｄ
ＮＡの使用、および他のコエレンテラーテ（coelenterate）からのルシフェラー
ゼをコードするＤＮＡは、当分野で既知であり、利用可能である［参照、例えば
、配列番号１、U.S.特許 5,418,155 および 5,292,658、Prasher et al.,Bioche
m.Biophys.Res.Commun.126:1259-1268(1985); Cormier,“Renilla and Aequorea
bioluminescence”in Bioluminescence and Chemiluminescence,pp.225-233(19
81); Charbonneau et al.,J.Biol.Chem.254:769-780(1979); Ward et al.,J.Bio
l.Chem.254:781-788(1979); Lorenz et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88:4438
-442(1981); Hori et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.74:4285-4287(1977); Hor
i et al.,Biochemistry 134:2371-2376(1975); Inouye et al.,Jap.Soc.Chem.Le
t.141-144(1975); Matthews et al.,Biochemistry 16:85-91(1979)］。
【０１００】 上記のように、ルシフェラーゼおよびペプチドライブラリィを含む融合タンパ
ク質をつくることができ、Ｎ末端、Ｃ末端、両末端、１以上の内部での融合を組
合せてまたは単独で使用できる。融合部位は、蛍ルシフェラーゼ［Franks et al
.,Biophys J.75(5):2205-11(1998); Conti et al.,Structure 4(3):287-98(1996
)]または細菌ルシフェラーゼ［Fisher et al.,Biochemistry34(20):6581-6(1995
); Fisher et al.,J.Biol.Chem.271(36):21956-68(1996); Tanner et al.,Bioch
emistry 36(4):665-72(1997); Thoden et al.,Protein Sci.6(1):13-23(1997)］
の構造に基づいて決定される。ルシフェラーゼ中のループ構造へのアミノ酸の挿
入が特に好ましい。
【０１０１】 好ましい実施態様において、スキャフォルド・タンパク質はβ−ガラクトシダ
ーゼである（Alam and Cook 前掲、Bronstein et al.,前掲）。β−ガラクトシ
ダーゼは、E.coli 由来のlacＺ遺伝子にコードされ、最も多能な遺伝子レポータ
ーであり、インヒドロとインビボの両方で適用できる。E.coli lacＺ遺伝子に加
えて、lacは様々な種からクローンされており、ヌクレオチド配列が利用できる
（例えば、参照、GenBank accession numberJ01636,AB025433,AF073995,U62625
,M57579）。この酵素は、いくつかのβ−ガラクトシドの加水分解を触媒する（
例えば、Young et al.,前掲）、この適用は、例えば、Ｏ−ニトロフェニル−β
−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）を用いる色素計量検定法、インドールの化学
ルミネッセンスに基づく化学ルミネッセンス検定法（Arakawa et al.,J.Niolumi
n.Chemilumin.13(6):349-54(1998)）、例えば、４−メチルウンベリフェリル−
β−ガラクトシド（ＭＵＧ）およびその誘導体である６，８−ジフルオロ−４−
メチルウンベリフェリル−β−ガラクトピラノシドなどを用いるフルオロ計量検
定法［DiFMUG; Gee et al.,Anal.Biochem.273(1):41-8(1999)]でなされる。さら
に、化学ルミネッセンス１，２−ジオキセタン基質の開発は、酵素活性の検出感
度を非常に改善した。ルミノ計量を用いて、化学ルミネッセンス信号を検出する
と、この検出法は色素計量検定法より５万倍も感度が高い。真核細胞β−ガラク
トシドによる内因性酵素活性を最小化する条件を用いると、感度をさらに上昇し
得る（Young et al.,前掲）。
【０１０２】 好ましい実施態様において、すべてのスキャフォルドについて、β−ガラクト
シダーゼはインビボ検定法で用いる。インビボ検定法は、原核および真核の細胞
、組織セクション、不活胚で行うことができ、沈殿基質Ｘ−galでの着色がある
（Alam and Cook、前掲）。さらに生存細胞における生物ルミネッセンス検定法
を、蛍光ｄｉ−β−Ｄ−ガラクスピラノシドを用いて行い得る（FDG; Bronstein
et al.,前掲）。酵素的に活性な型のβ−ガラクトシダーゼを発現する細胞を、
代謝された基質の蛍光体部分からの蛍光によって検出する。
【０１０３】 上記のように、Ｎ末端、Ｃ末端、Ｎ末端およびＣ両末端、１以上の内部での融
合を、個々にまたは組み合せて、すべて意図している。融合部位はβ−ガラクト
シダーゼの構造に基づき決定し得る。この構造はすでに決定されている［例えば
、参照、Pearl et al.,J.Mol.Biol.229(2):561-3(1993); Jacobson et al.,Natu
re 369(6483):761-6(1994); and Jacobson and Matthews,J.Mol.Biol.223(4):11
77-82(1992)］。β−ガラクトシダーゼ中のループ構造へのアミノ酸の挿入が特
に好ましい。
【０１０４】 好ましい実施態様において、レポータータンパク質は、クロラムフェニコール
・アセチルトランスフェラ−ゼである［CAT,Gorman et at.,Mol.Cell.Biol.,2:1
044-1051(1982)］。この酵素は、アセチルコエンチームＡからクロラムフェニコ
ールへのアセチル基の移行を触媒する。レポーターとしてＣＡＴを用いると次の
利点がある。（ｉ）哺乳動物細胞における最小の内因性活性、（ii）安定なタン
パク質発現、（iii）種々の検定法フォーマットが利用可能。ＣＡＴ遺伝子は様
々な種からクローンされており、ヌクレオチド配列が利用できる（例えば、参照
、GenBank accession numberAF031037,S48276,X74948,X02872, and M58472）。
【０１０５】 アミノ酸配列をクロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼに融合す
ることも本発明の目的である。Ｎ末端、Ｃ末端、ＮおよびＣ両末端、１以上の内
部での融合のすべてを意図する。融合部位は、クロラムフェニコール・アセチル
トランスフェラーゼの構造に基づいて決定し得る。この構造は決定されている［
例えば、参照、Leslie el al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85(12):4133-7(1988)
; Lewendon et al.,Biochemistry 27(19):7385-90(1988); and Leslie,J.Mol.Bi
ol.213(1):167-86(1990)］。クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラー
ゼ中のループ構造へのアミノ酸の挿入が特に好ましい。
【０１０６】 好ましい実施態様において、間接的検出可能タンパク質は、ＤＡＮ結合部位に
結合でき、操作可能的に連結したレポーター遺伝子の転写を活性化できるＤＮＡ
結合タンパク質である。このレポーター遺伝子は、グリーン蛍光タンパク質など
の検出可能遺伝子や生存遺伝子など、本明細書で記述したものである。ＤＮＡ結
合タンパク質が結合しているＤＮＡ結合部位は、基本的転写マシナリー（例えば
、ＲＮＡポリメラーゼII）による認識に必要とする配列を含有する基礎のプロモ
ーターに近接して位置する。プロモーターはレポーター遺伝子の発現を制御する
。このキメラ・レポーター構造体を導入すると、レポーター遺伝子産物が増加し
て、ＤＮＡ結合タンパク質がそのＤＮＡ結合部位に結合して、転写を活性化した
ことを示す。好ましくは、ＤＮＡ結合タンパク質の不存在でレポーター遺伝子産
物がつくられない。あるいは、レポーター遺伝子産物の低基礎レベルは、レポー
ター遺伝子産物における強い増加がＤＮＡ結合タンパク質またはこのタンパク質
をコードする遺伝子の付加で観察される場合には、問題がない。分析すべきＤＮ
Ａ結合タンパク質についてのＤＮＡ結合部位、プロモーター配列、レポーター遺
伝子を含むベクターは、よく知られている。
【０１０７】 好ましい実施態様において、ＤＮＡ結合タンパク質は、内因性タンパク質がま
ったく結合しないか少ししか結合しないプロモーター領域内で、核酸結合部位に
結合し得る細胞型特異的ＤＮＡ結合タンパク質である。この細胞型特異的ＤＮＡ
結合タンパク質はＯｃｔ−２［Mueller et al.,Nature 336(6199):544-51(1988)
］などの転写アクチベーターを含み、リンパ細胞で発現され、線維芽細胞で発現
されない。ＨｅＬａ細胞（このタンパク質を通常は発現しない）におけるこのＤ
ＮＡ結合タンパク質の発現は、Ｏｃｔ−２についてのＤＮＡ結合を含むβ細胞特
異的プロモーターの強力な転写活性化に十分である（Mueller et al.、前掲）。
【０１０８】 好ましい実施態様において、間接的検出可能タンパク質は、ＤＮＡ結合部位に
結合でき、操作可能的に結合したレポーター遺伝子の転写を活性化できるＤＮＡ
結合／転写アクチベーター融合タンパク質である。簡単に言うと、転写は、転写
アクチベータータンパク質の２つの機能的ドメインを用いて、活性化できる。す
なわち、核酸配列を認識し、それに結合するアミノ酸のドメインまたは配列、す
なわち、核酸結合ドメイン、および標的配列に近接したときに転写を活性化する
アミノ酸のドメインまたは配列である。このように転写活性化ドメインは転写に
要する他のタンパク質に接触すること、特に転写のマシナリーに持ちこまれるこ
とにより機能すると考えられる。これは、核酸結合ドメインによって標的遺伝子
に局在化されねばならない。このドメインは、標的遺伝子の転写複合体に転写活
性化ドメインを位置づけることによって機能すると推定される。
【０１０９】 ＤＮＡ結合ドメインおよび転写アクチベーター・ドメインは同じ転写アクチベ
ーター・タンパク質から、または相違のタンパク質からのいずれかに由来する（
参照、Mcknight et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:7061(1987); Ghosh et al
., J.Mol.Biol.234(3):610-619(1993); Curran et al., 55:395(1988)）。活性
ドメインおよびＤＮＡ結合ドメインを含む種々の転写アクチベータータンパク質
は既知である。
【０１１０】 好ましい実施態様において、ＤＮＡ融合／転写アクチベーター融合タンパク質
は、テトラサイクリン・リプレッサー・タンパク質（ＴｅｔＲ）−ＶＰ１６融合
タンパク質である。この共同融合タンパク質は、ＤＮＡ結合ドメイン（ＴｅｔＲ
）および転写活性化ドメイン（ＶＰ１６）からなる。ＴｅｔＲは高い特異性でも
ってテトラサイクリン・オペレーター配列（ｔｅｔＯ）と結合する。ＶＰ１６ド
メインは、機能的プロモーターに動員される限り、所望の遺伝子の遺伝子発現を
活性化し得る。テトラサイクリン・リプレッサータンパク質（ＴｅｔＲ）−ＶＰ
１６融合タンパク質を用いて、適切な真核細胞発現系がテトラサイクリンまたは
ドキシサイクリンの付加または除去によりきっちりと制御できる（Gossen and B
ujard, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89-5547-5551; Gossen et al., Science268:
1766-1769(1995)）。
【０１１１】 アミノ酸配列をＤＮＡ結合／転写アクチベータータンパク質および／またはＤ
ＮＡ結合／転写アクチベーター融合タンパク質に融合することも本発明の目的で
ある。Ｎ末端、Ｃ末端、ＮおよびＣ両末端、１以上の内部での融合についてのす
べてを意図する。融合はＤＮＡ結合／転写アクチベータータンパク質の構造に基
づいて決定できる。この構造は決定されている［例えば、TetR; 参照 Orth et a
l., J.Mol.Biol.285(2):455-61(1999); Orth et al., J.Mol.Biol.279(2):439-4
7(1998); Hinrichs et al., Science 264(5157):418-20(1994); Kisker et al.,
J.Mol.Biol.247(2):260-80(1995)］。ＤＮＡ結合／転写アクチベーター融合タ
ンパク質内のループ構造へのアミノ酸の挿入が特に好ましい。
【０１１２】 他の好ましい実施態様において、アミノ酸（＝ランダム・ペプチド）をＤＮＡ
結合ドメインと転写アクチベーター・ドメインとの融合部位で、またはその部位
の近くに挿入する。この実施態様において、両端スキャフォルド・タンパク質を
用いてランダム・ペプチドライブラリィを提供する。ランダム・ペプチドライブ
ラリィは、ＤＮＡ結合ドメインを提示するスキャフォルド・タンパク質と転写活
性化ドメインを提示するスキャフォルド・タンパク質とに挟まれている。ランダ
ム・ペプチドライブラリィは、ＤＮＡ結合ドメインのＣ末端および転写活性化ド
メインのＮ末端の間に、またはその逆の間に挿入する。ＤＮＡ結合ドメイン由来
および転写活性化ドメインからランダム・ペプチドを分離するリンカー配列が適
切である。タンパク質：タンパク質相互作用スクリーニング・プロトコールにお
けるＤＮＡ結合／転写アクチベーター融合タンパク質を用いると（例えば、参照
、Fields et al., Nature 340:245(1989); Vasavada et al., Proc.Natl.Acad.S
ci.U.S.A.88:10686(1991); Fearon et al., Prc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:7958(
1992); Dang et al., Mol.Cell.Biol.11:954(1991); Chien et al., Proc.Natl.
Acad.Sci.U.S.A.88:9578(1991); U.S.特許 5,283,173, 5,667,973, 5,468,614,
5,525,490, 5,637,463)、アミノ酸（例えば、試験ライブラリィの構成成分）の
ＤＮＡ結合ドメインへの挿入について、ＤＮＡ結合または転写活性化を混乱しな
いで、通常は顕著な自由度がある。
【０１１３】 好ましい実施態様において、本発明は下記を含む組成物を提供する。（ｉ）Ｄ
ＮＡ結合／転写アクチベーターおよび／またはＤＮＡ結合ドメイン／転写アクチ
ベーター融合タンパク質が結合できる核酸結合部分、該核酸結合部位はレポータ
ー遺伝子に操作可能的に結合している、（ii）レポーター遺伝子、（iii）核酸
によりコードされるＤＮＡ結合／転写アクチベーターおよび／またはＤＮＡ結合
ドメイン／転写アクチベーター融合タンパク質。
【０１１４】 好ましい実施態様において、スキャフォルド・タンパク質は生存タンパク質で
ある。本発明において「生存タンパク質」「選択タンパク質」、その文法上同義
語は、薬剤耐性遺伝子などのそのタンパク質なしでは細胞が生存できないタンパ
ク質を意味する。
【０１１５】 本明細書記載のように、細胞は通常、スキャフォルド・タンパク質として使用
される生存タンパク質の活性型を天然に含有していない。さらに本発明に記載す
るように、細胞は通常、生存タンパク質をコードする生存遺伝子を含んでいる。
【０１１６】 生存タンパク質の発現は、通常タンパク質活性の観点から定量されず、むしろ
各々の生存遺伝子または選択遺伝子を含む細胞上への特徴的表現型の付与により
認識する。このような生存遺伝子は、選択剤（即ち抗生物質）に耐性を提供し得
、各生存遺伝子を含み、発現する細胞のみを優先的に選択する。生存遺伝子の種
類はかなり多く、増え続けている（レビューのために、Kriegler, Gene Transfe
r and Expression: A Laboratory Manual, W.H. Freeman and Company, New Yor
k, 1990 参照）。典型的に、耐性付与表現型を含むＤＮＡを細胞にトランスフェ
クトし、続いて細胞を、トランスフェクトされてその際に医薬耐性である細胞の
選択的生存および拡大に適した濃度の医薬を含む培地で処理する。
【０１１７】 アンピシリン、カナマイシンおよびテトラサイクリンのような選択剤は、原核
生物における選択法に広く使用されている[例えば、Waxman and Strominger, An
nu. Rev. Biochem. 52:825-69(1983); Davies and Smith, Annu,. Rev. Microbi
ol. 32:469-518(1978); およびFranklin, Biochem J., 105(1):371-8(1967)参照
]。原核生物細胞の選択のための適当な選択剤は、ブラスチシジン[Izumi et al.
, Exp. Cell Res., 197(2):229-33(1991); Kimura et al., Biochim. Biophys.
Acta 1219(3):653-9(1984); Kimura et al., Mol. Gen. Genet. 242(2):121-9(1
994)]、ヒスチジノールＤ[Hartman and Mulligan; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S
.A., 85(21):8047-51(1988)]、ヒグロマイシン[Gritz and Davies, Gene 25(2-3
):179-88(1983); Sorensen et al., Gene 112(2):257-60(1992)]、ネオマイシン
[Davies and Jimenez, Am. J. Trop. Med. Hyg., 29(5 Suppl):1089-92(1980);
Southern and Berg, J. Mol. Appl. Genet., 1(4):327-41(1982)]、ピューロマ
イシン[de la Luna et al., Gene 62(1):121-6(1988)]およびブレオマイシン／
フレオマイシン／ゼオシン抗生物質[Mulsant et al., Somat Cell. Mol. Genet.
14(3):253-52(1988)]を含むが、これらに限定されない。
【０１１８】 このような医薬耐性表現型を媒介する酵素をコードする生存遺伝子およびその
使用のためのプロトコールは既知である（Kriegler、前掲 参照）。適当な生存
遺伝子は、チミジンキナーゼ[TK; Wigler et al., Cell 11:233(1977)]、アデニ
ンホスホリボシルトランスフェラーゼ[APRT; Lowry et al., Cell 22:817(1980)
; Murray et al., Gene 31:233(1984); Stambrook et al., Som. Cell. Mol. Ge
net. 4:359(1982)]、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラ
ーゼ[HGPRT; Jolly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:477(1983)]、
ジヒドロフォレートレダクターゼ[DHFR; Subramani et al., Mol. Cell. Biol.
1:854(1985); Kaufman and Sharp, J. Mol. Biol. 159:601(1982); Simonsen an
d Levinson, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:2495(1983)]、アスパルテート
トランスカルバミラーゼ[Ruiz and Wahl, Mol. Cell. Biol. 6:3050(1986)]、オ
ルニチンデカルボキシラーゼ[Chiang and McConlogue, Mol. Cell. Biol. 8:764
(1988)]、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ[Southern and Berg, Mol
. Appl. Gen. 1:327(1982); Davies and Jiminez, 前掲]、ヒグロマイシン−Ｂ
−ホスホトランスフェラーゼ[Gritz and Davies, 前掲; Sugden et al., Mol. C
ell. Biol. 5:410(1985); Palmer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:
1055(1987)]、キサンチン−グアミンホスホリボシルトランスフェラーゼ[Mullig
an and Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:2072(1981)]、トリプトファ
ンシンテターゼ[Hartman and Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:80
47(1988)]、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ[Hartman and Mulligan, 前掲]、
多剤耐性生化学マーカー[Kane et al., Mol. Cell. Biol. 8:3316(1988); Choi
et al., Cell 53:519(1988)]、ブラスチシジンＳデアミナーゼ[Izumi et al., E
xp. Cell. Res. 197(2):229-33(1991)]、ブレオマイシンヒドロラーゼ[Mulsant
et al., 前掲]およびピューロマイシン−Ｎ−アセチル−トランスフェラーゼ[La
calle et al., Gene 79(2):375-80(1989)]を含むが、これらに限定されない。
【０１１９】 好ましい態様において、生存タンパク質はチミジンキナーゼである[TK; Wigle
r et al., Cell 11:233(1977)]。ＴＫはＨＳＶまたはワクシニアウィルスｔｋ遺
伝子によりコードされる。ＴＫ−細胞に導入されたとき、これらの遺伝子は、ヒ
ポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを添加された培地であるＨＡＴ培
地に対する耐性を付与する。ＴＫは種々の種からクローン化されており、ヌクレ
オチド配列は入手可能である（例えば、GenBank accession numbers M29943、M2
9942、M29941およびK02611 参照）。
【０１２０】 チミジンキナーゼにアミノ酸配列を融合するのが、本願の目的である。Ｎ末端
、Ｃ末端、ＮおよびＣ両末端さらに１以上の内部での融合のすべてを意図してい
る。融合部位は、ＨＳＶチミジンキナーゼの構造に基づいて決定し得る。この構
造は決定されている[例えば、Bennett et al., FEBS Lett. 443(2):12-15(1999)
; Champness et al., Proteins 32(3):350-61(1998); およびBrown et al., Nat
. Struct. Biol. 2(10):876-81(1995)参照]。アミノ酸のチミジンキナーゼ内の
ループ構造への挿入が特に好ましい。
【０１２１】 他の好ましい態様において、生存タンパク質はアデニンホスホリボシルトラン
スフェラーゼである[APRT; Lowry et al., Cell 22:817(1980); Murray et al.,
Gene 31:233(1984); Stambrook et al., Som. Cell. Mol. Genet. 4:359(1982)
]。ＡＰＲＴ−細胞に導入されたとき、ＡＰＲＴをコードする遺伝子は、アザセ
リン、アデニンおよびアラノシンを添加された完全培地に対する耐性を付与する
。ＡＰＲＴ遺伝子はヒトを含む種々の種からクローン化されており、ヌクレオチ
ド配列は入手可能である（例えば、GenBank accession numbers L25411、AF0608
86、X58640、U16781、U22442、U28961、L06280、M16446、L04970およびM11310
参照）。
【０１２２】 アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼにアミノ酸配列を融合するのが、
本願の目的である。Ｎ末端、Ｃ末端、ＮおよびＣ両末端さらに１以上の内部での
融合のすべてを意図している。融合部位は、Leishmania donovaniのアデニンホ
スホリボシルトランスフェラーゼの構造に基づいて決定し得る。この構造は決定
されている[Phillips et al., EMBO J. 18(13):3533-45(1999)]。アミノ酸のア
デニンホスホリボシルトランスフェラーゼ内のループ構造への挿入が特に好まし
い。
【０１２３】 好ましい態様において、生存タンパク質はヒポキサンチン−グアニンホスホリ
ボシルトランスフェラーゼである[HGPRT; Jolly et al., Proc. Natl. Acad. Sc
i. U.S.A. 80:477(1983)]。ＨＧＰＲＴ−、ＡＰＲＴ−細胞に導入されたとき、
ＨＧＰＲＴをコードする遺伝子は、ＨＡＴ培地に対する耐性を付与する。ＨＧＰ
ＲＴ遺伝子はヒトを含む種々の種からクローン化されており、ヌクレオチド配列
は入手可能である（例えば、GenBank accession numbers AF170105、AF061748、
L07486、J00423、M86443、J00060およびM26434 参照）。
【０１２４】 ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼにアミノ酸配列
を融合するのが、本願の目的である。Ｎ末端、Ｃ末端、ＮおよびＣ両末端さらに
１以上の内部での融合のすべてを意図している。融合部位は、ヒトヒポキサンチ
ン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼの構造に基づいて決定し得る。
この構造は決定されている[Shi et al., Nat. Struct. Biol. 6(6):588-93; Ead
s et al., Cell 78(2):325-34(1994)]。アミノ酸のヒポキサンチン−グアニンホ
スホリボシルトランスフェラーゼ内のループ構造への挿入が特に好ましい。
【０１２５】 好ましい態様において、生存タンパク質はｄｈｆｒ遺伝子によりコードされる
ジヒドロフォレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）である[Subramani et al., Mol.
Cell. Biol. 1:854(1985); Kaufman and Sharp, J. Mol. Biol. 159:601(1982);
Simonsen and Levinson, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:2495(1983)]。Ｄ
ＨＦＲ−細胞に導入されたとき、ＤＨＦＲをコードする遺伝子は、メトトレキサ
ートを含む培地に対する耐性を付与する。ＤＨＦＲ遺伝子はヒトを含む種々の種
からクローン化されており、ヌクレオチド配列は入手可能である（例えば、GenB
ank accession numbers NM_000791、J01609、J00140、L26316およびM37124 参照
）。
【０１２６】 ジヒドロフォレートレダクターゼにアミノ酸配列を融合するのが、本願の目的
である。Ｎ末端、Ｃ末端、ＮおよびＣ両末端さらに１以上の内部での融合のすべ
てを意図している。融合部位は、ヒトおよびE. coliのジヒドロフォレートレダ
クターゼの構造に基づいて決定し得る。この構造は決定されている[Cody et al.
, Biochemistry 36(45):13897-903(1997); Chunduru et al., J. Biol. Chem. 2
69(13):9547-55(1994); Lewis et al., J. Biol. Chem. 270(10):5057-64(1995)
; Sawaya et al., Biochemistry 36(3):586-603(1997); Reyes et al., Biochem
istry 34(8):2710-23(1995)]。アミノ酸のジヒドロフォレートレダクターゼ内の
ループ構造への挿入が特に好ましい。
【０１２７】 好ましい態様において、生存タンパク質はアスパルテートトランスカルバミラ
ーゼである。アスパルテートトランスカルバミラーゼはｐｙｒＢ遺伝子によりコ
ードされる[Ruiz and Wahl, Mol. Cell. Biol. 6:3050(1986)]。ＣＨＯ Ｄ２Ｏ
（UrdA変異体；新たなウリジン生合成の最初の３つの酵素的活性を欠く；カルバ
ミルホスファターゼシンテターゼ、アスパルテートトランスカルバミラーゼ、お
よびジヒドロオルターゼ）に導入されたとき、このタンパク質をコードする遺伝
子は、Ｈａｍ Ｆ−１２培地（ウリジン無し）に対する耐性を付与する。アスパ
ルテートトランスカルバミラーゼ遺伝子はヒトを含む種々の種からクローン化さ
れており、ヌクレオチド配列は入手可能である（例えば、GenBank accession nu
mbers U61765、M38561、J04711、M60508およびM13128 参照）。
【０１２８】 アスパルテートトランスカルバミラーゼにアミノ酸配列を融合するのが、本願
の目的である。Ｎ末端、Ｃ末端、ＮおよびＣ両末端さらに１以上の内部での融合
のすべてを意図している。融合部位は、E. coliアスパルテートトランスカルバ
ミラーゼの構造に基づいて決定し得る。この構造は決定されている[Kantrowitz
and Lipscomb, Science 241(4866):669-74(1988)]。アミノ酸のアスパルテート
トランスカルバミラーゼ内のループ構造への挿入が特に好ましい。
【０１２９】 好ましい態様において、生存タンパク質はオルニチンデカルボキシラーゼであ
る。オルニチンデカルボキシラーゼはｏｄｃ遺伝子によりコードされる[Chiang
and McConlogue, Mol. Cell. Biol. 8:764(1988)]。ＣＨＯ Ｃ５５.７細胞（Ｏ
ＤＣ−）に導入されたとき、このタンパク質をコードする遺伝子は、プトレッシ
ンを欠く培地に対する耐性を付与する。ＯＤＣ遺伝子はヒトを含む種々の種から
クローン化されており、ヌクレオチド配列は入手可能である（例えば、GenBank
accession numbers U36394、AF016891、AF012551、U03059、J04792およびM34158
参照）。
【０１３０】 オルニチンデカルボキシラーゼにアミノ酸配列を融合するのが、本願の目的で
ある。Ｎ末端、Ｃ末端、ＮおよびＣ両末端さらに１以上の内部での融合のすべて
を意図している。
【０１３１】 好ましい態様において、生存タンパク質はａｐｈ遺伝子によりコードされるア
ミノグリコシドホスホトランスフェラーゼである[Southern and Berg, Mol. App
l. Gen. 1:327(1982); Davies and Jiminez, 前掲]。殆どの任意の細胞に導入さ
れたとき、この優勢選択可能遺伝子は、Ｇ４１８（ネオマイシン、ジェネテシン
）に対する耐性を付与する。アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼコード
遺伝子はクローン化されており、種々のベクターで選択可能マーカーとして広く
使用されている（例えば、GenBank accession numbers Z48231、M22126、U75992
、AF072538およびU04894 参照）。
【０１３２】 アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼにアミノ酸配列を融合するのが、
本願の目的である。Ｎ末端、Ｃ末端、ＮおよびＣ両末端さらに１以上の内部での
融合のすべてを意図している。
【０１３３】 好ましい態様において、生存タンパク質はｈｐｈ遺伝子によりコードされるヒ
グロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼである[Gritz and Davies, 前掲;
Sugden et al, Mol. Cell. Biol. 5:410(1985); Palmer et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A. 84:1055(1987)]。殆どの任意の細胞に導入されたとき、この
この優勢選択可能遺伝子は、ヒグロマイシン−Ｂに対する耐性を付与する。ヒグ
ロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼコード遺伝子はクローン化されてお
り、種々のベクターで選択可能マーカーとして広く使用されている（例えば、Ge
nBank accession numbers AF025747、L76273およびK01193 参照）。
【０１３４】 ヒグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼにアミノ酸配列を融合するの
が、本願の目的である。Ｎ末端、Ｃ末端、ＮおよびＣ両末端さらに１以上の内部
での融合のすべてを意図している。
【０１３５】 他の好ましい態様において、生存タンパク質はｇｐｔ遺伝子によりコードされ
るキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼである[Mulligan an
d Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:2072(1981)]。殆どの任意の細胞に
導入されたとき、この優勢選択可能遺伝子は、キサンチン、ヒポキサンチン、チ
ミジン、アミノプテリン、ミコフェノール酸およびＬ−グルタミンを含むＸＭＡ
Ｔ培地に対する耐性を付与する。キサンチン−グアニンホスホリボシルトランス
フェラーゼコード遺伝子はクローン化されており、ヌクレオチド配列は入手可能
である（例えば、GenBank accession numbers U28239およびM15035 参照）。
【０１３６】 キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼにアミノ酸配列を融
合するのが、本願の目的である。Ｎ末端、Ｃ末端、ＮおよびＣ両末端さらに１以
上の内部での融合のすべてを意図している。
【０１３７】 他の好ましい態様において、生存タンパク質はｔｒｐＢ遺伝子によりコードさ
れるトリプトファンシンテターゼである[Hartman and Mulligan, Proc. Natl. A
cad. Sci. U.S.A. 85:8047(1988)]。殆どの任意の細胞に導入されたとき、この
優勢選択可能遺伝子は、トリプトファン−マイナス培地に対する耐性を付与する
。トリプトファンシンテターゼコード遺伝子はクローン化されており、ヌクレオ
チド配列は入手可能である（例えば、GenBank accession numbers V00372、AF17
3835、V00365、M15826およびM32108 参照）。
【０１３８】 トリプトファンシンテターゼにアミノ酸配列を融合するのが、本願の目的であ
る。Ｎ末端、Ｃ末端、ＮおよびＣ両末端さらに１以上の内部での融合のすべてを
意図している。融合部位は、トリプトファンシンテターゼの構造に基づいて決定
し得る。この構造は決定されている[例えば、Rhee et al., Biochemistry 36(25
):7664-80(1997); Hyde et al., J. Biol. Chem. 263(33):17857-71(1988)]。ア
ミノ酸のトリプトファンシンテターゼ内のループ構造への挿入が特に好ましい。
【０１３９】 更に好ましい態様において、生存タンパク質はｈｉｓＤ遺伝子によりコードさ
れるヒスチジノールデヒドロゲナーゼである[Hartman and Mulligan, Proc. Nat
l. Acad. Sci. U.S.A. 85:8047(1988)]。殆どの任意の細胞に導入されたとき、
この優勢選択可能遺伝子は、ヒスチジノール含有培地に対する耐性を付与する。
ヒスチジノールデヒドロゲナーゼコード遺伝子はクローン化されており、ヌクレ
オチド配列は入手可能である（例えば、GenBank accession numbers AB013080、
U82227、J01804およびM60466 参照）。
【０１４０】 ヒスチジノールデヒドロゲナーゼにアミノ酸配列を融合するのが、本願の目的
である。Ｎ末端、Ｃ末端、ＮおよびＣ両末端さらに１以上の内部での融合のすべ
てを意図している。
【０１４１】 他の好ましい態様において、生存タンパク質はｍｄｒ１遺伝子によりコードさ
れる多剤耐性生化学マーカーである[Kane et al., Mol. Cell. Biol. 8:3316(19
88); Choi et al., Cell 53:519(1988)]。殆どの任意の細胞に導入されたとき、
この優勢選択可能遺伝子は、コルヒチン含有培地に対する耐性を付与する。ＭＤ
Ｒ１遺伝子はヒトを含む種々の種からクローン化されており、ヌクレオチド配列
は入手可能である（例えば、GenBank accession numbers U62928、U62930、AJ22
7752、U62931、AF016535およびJ03398 参照）。
【０１４２】 ＭＤＲ１にアミノ酸配列を融合するのが、本願の目的である。Ｎ末端、Ｃ末端
、ＮおよびＣ両末端さらに１以上の内部での融合のすべてを意図している。
【０１４３】 他の好ましい態様において、生存タンパク質はｂｓｒ遺伝子によりコードされ
るブラスチシジンＳデアミナーゼである[Izumi et al., Exp. Cell. Res. 197(2
):229-33(1991)]。殆どの任意の細胞に導入されたとき、この優勢選択可能遺伝
子は、抗生物質ブラスチシジンＳ含有培地に対する耐性を付与する。ブラスチシ
ジンＳデアミナーゼコード遺伝子はクローン化されている。それらは種々のベク
ターで選択可能マーカーとして使用されており、そのヌクレオチド配列は入手可
能である（例えば、GenBank accession numbers D83710、U75992およびU75991
参照）。
【０１４４】 ブラスチシジンＳデアミナーゼにアミノ酸配列を融合するのが、本願の目的で
ある。Ｎ末端、Ｃ末端、ＮおよびＣ両末端さらに１以上の内部での融合のすべて
を意図している。融合部位は、Aspergillus terreusブラスチシジンＳデアミナ
ーゼの構造に基づいて決定し得る。この構造は決定されている[Nakasako et al.
, Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 55(Pt2):547-8(1999)]。アミノ酸
のブラスチシジンＳデアミナーゼ内のループ構造への挿入が特に好ましい。
【０１４５】 他の好ましい態様において、生存タンパク質はｂｌｅ遺伝子によりコードされ
るブレオマイシンヒドロラーゼである[Mulsant et al., 前掲]。殆どの任意の細
胞に導入されたとき、この優勢選択可能遺伝子は、ブレオマイシン、フレオマイ
シンまたはゼオシンを含む培地に対する耐性を付与する。ブレオマイシンヒドロ
ラーゼコード遺伝子はクローン化されている。それらは種々のベクターで選択可
能マーカーとして使用されており、そのヌクレオチド配列は入手可能である（例
えば、GenBank accession numbers L26954、L37442およびL36849 参照）。
【０１４６】 ブレオマイシンヒドロラーゼにアミノ酸配列を融合するのが、本願の目的であ
る。Ｎ末端、Ｃ末端、ＮおよびＣ両末端さらに１以上の内部での融合のすべてを
意図している。融合部位は、酵母（Ｇａｌ６）およびヒトのブレオマイシンヒド
ロラーゼの構造に基づいて決定し得る。この構造は決定されている[Joshua-Tor
et al., Science 269(5226):945-50(1995); O'Farrell et al., Structure Fold
. Des. 7(6):619-27(1999)]。アミノ酸のブレオマイシンヒドロラーゼ内のルー
プ構造への挿入が特に好ましい。
【０１４７】 他の好ましい態様において、生存タンパク質はｐａｃ遺伝子によりコードされ
るピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼである[Lacalle et al.,
Gene 79(2):375-80(1989)]。殆どの任意の細胞に導入されたとき、この優勢選
択可能遺伝子は、ピューロマイシン含有培地に対する耐性を付与する。ピューロ
マイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼコード遺伝子はクローン化されてい
る。それらは種々のベクターで選択可能マーカーとして使用されており、そのヌ
クレオチド配列は入手可能である（例えば、GenBank accession numbers Z75185
およびM25346 参照）。
【０１４８】 ピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼにアミノ酸配列を融合す
るのが、本願の目的である。Ｎ末端、Ｃ末端、ＮおよびＣ両末端さらに１以上の
内部での融合のすべてを意図している。
【０１４９】 他の好ましい態様において、スキャフォルド・タンパク質が構造タンパク質で
ある。この態様において、スキャフォルド・タンパク質は直接検出可能ではない
が、一般に、小さな安定な非ジスルフィド結合含有タンパク質である。
【０１５０】 好ましい態様において、提示スキャフォルドは、提示ランダム・ペプチドを含
む。ペプチドは、立体配位的に前拘束されており、減少した数の低エネルギー適
合体を有し、したがって、標的結合対（タンパク質のような巨大分子、ＤＮＡ、
または他の細胞内または外に存在する機能的分子）と結合したとき、低いエント
ロピーを失う。このような拘束ペプチドは、したがって、非拘束ペプチドよりも
密接に標的分子と結合し得る。同様に、拘束ペプチドは、非拘束ペプチドよりも
、特にプロテアーゼによる細胞内異化作用の対象にならない可能性がある。異な
るスキャフォルドが、ランダム・ペプチドライブラリィの挿入部位に依存して、
ペプチドに異なる偏向を付与し得る。
【０１５１】 好ましい態様において、スキャフォルドは、大麦キモトリプシン阻害剤２（Ｃ
ｉ−２）およびエグリンＣのようなトリプシン阻害剤Ｉファミリーに属するプロ
テアーゼ阻害剤を含む。これらのタンパク質の両方は小さく（各々８３および６
４残基）、安定で、ジスルフィド結合を欠き、したがって、ジスルフィド結合形
成の複雑化なしに、哺乳類の細胞質での発現および折り畳みが可能である。ジス
ルフィド結合形成は、高レベルの還元グルタチオンおよび、チオレドキシンレダ
クターゼの存在のために、細胞質内では困難である。Ｃｉ−２の折り畳み機構は
詳細に研究されており、プロリン異性化である二つの相の速度限定段階を有する
２段階工程を含む[Jackson and Fersht, Biochemistry 30:10428-35(1991)]。２
０−５９および６０−８３残基からなる二つの別々の断片に開裂されたとき、天
然様構造の形成に関連する断片と共に、４２ｎＭのＫｄで再折り畳みすることが
示されている[de Prat Gay and Fersht, Biochemistry 33:7957-63(1994)]。Ｃ
ｉ−２は、２.９ｐＭの阻害定数でサブチリシンＢＰＮを遮断する[Longstaff et
al., Biochemistry 29:7339-47(1990)]。
【０１５２】 好ましい態様において、Ｃｉ−２および類似のプロテアーゼ阻害剤エグリン−
Ｃを、小タンパク質包埋ランダム・ペプチドライブラリのためのスキャフォルド
として使用する。異なる細胞内標的が、異なる構造の結合ペプチドを要求するた
め、既に上記に概説のように異なる偏向のペプチドライブラリィの構築が重要で
ある。Ｃｉ−２の結晶構造[図７およびMcPhalen and James, Biochemistry 26:2
61-269(1987)参照]は、付加的偏向の異なるペプチドライブラリィの構築を可能
にする：広域的２０Å拘束、両端がＣｉ−２スキャフォルドによりこの距離に固
定。有用な特性のライブラリィをもたらし得る少なくとも３つのランダム・ペプ
チドライブラリィ挿入部位がある。各挿入部位において、種々の数の挿入残基の
使用は、ペプチドライブラリィの立体偏向に作用し、したがって１組のライブラ
リィを作る。
【０１５３】 好ましい態様において、挿入部位はＣｉ−２阻害剤ループ残基Ｇ５４−Ｒ６２
を、９個以上のランダムアミノ酸に置換する。９個のＧ５４−Ｒ６２に存在する
残基を置換するために挿入されたランダム残基は、ライブラリィを、大まかにそ
の塩基で２０Åの広域的半円ループに偏向させる。より多い残基の挿入は、ライ
ブラリィを更に柔軟性のペプチドに偏向させる。この阻害剤ループ中の僅かに大
きい挿入部位への、同様により多い残基の挿入、例えば、５２と６４の間への１
３残基の挿入は、大きい約１８量体環状ペプチドのトップ約２／３に向かう偏向
のライブラリィを作る。この殆ど環状のループ（残基４９−６７）の全〜１９残
基を置換したライブラリィは、大きい１９残基環状ペプチドを事実上模倣し、し
たがって上記のライブラリィのいずれとも異なる。
【０１５４】 好ましい態様において、Ｇ５４−Ｒ６２を置換した上記ライブラリィは、ルー
プのトップを支持するように見えるこの阻害剤の塩基で、天然残基をランダム残
基に変えることにより、より柔軟性にする。この支持なしに、トップ残基は著し
くより柔軟性となる。支持残基は、Ｆ６９、Ｌ５１、Ｒ６７およびＲ６５を含む
と考えられる。Ｇ８３はまた結晶構造においてループの側面に近いため、ランダ
ム化する。
【０１５５】 他の好ましい態様において、ランダム・ペプチドライブラリィをＣｉ−２のＫ
７２−Ｌ７３の間に挿入する。
【０１５６】 他の好ましい態様において、ランダム・ペプチドライブラリィは、Ｃｉ−２の
残基Ｐ４４−Ｅ４５を置換する。
【０１５７】 残基Ｋ７２−Ｌ７２の間へのランダム・ペプチドライブラリィの挿入または残
基Ｐ４４−Ｅ４５の置換は異なるライブラリィを導き、大まかに、ループを閉じ
たまたは短い塩基であるが、例えば、ＧＦＰ（２７ｋＤａ）またはＤＨＦＲ（２
０ｋＤａ）よりもより小さなタンパク質スキャフォルド（９ｋＤａ）に偏向させ
る。したがって、これらの二つのライブラリィは、小ループ偏向ライブラリィと
して有用であり得る。
【０１５８】 好ましい態様において、残基Ｋ７２−Ｌ７３の間のランダム・ペプチドライブ
ラリィまたは残基Ｐ４４−Ｅ４５を置換するランダム・ペプチドライブラリィは
選択可能ライブラリィとして使用し得、適切に折り畳まれ、生体活性なライブラ
リィ・メンバーを発現しない細胞の、または非感染細胞の除去を可能にする。ラ
ンダム・ペプチドライブラリィを残基Ｋ７２−Ｌ７３の間に挿入したときまたは
残基Ｐ４４−Ｅ４５を置換したとき、約５４−６２の位置におけるまだ活性なプ
ロテアーゼ阻害剤残基の使用は、スブチリシンＢＰＮ'を阻害する、したがって
、適切に折り畳まれた阻害剤ライブラリィ・メンバーおよびスブチリシンＢＰＮ
'、Ｋｉ＝２.９ｐＭのような同族阻害可能プロテアーゼを共発現する細胞を選択
する能力を保持する（Longstaff, 前掲）。選択は、したがって、細胞をＣｉ−
２ライブラリィで感染またはトランスフェクションした後の適当な時点でのプロ
テアーゼ誘導細胞死に対する防御による。
【０１５９】 他の好ましい態様において、類似のライブラリィ挿入部位は、Ｃｉ−２と類似
の構造を有する、エグリン−Ｃまたは他のジスルフィド結合を欠くジャガイモト
リプシン阻害剤Ｉファミリーメンバーを使用して行い得る。
【０１６０】 好ましい態様において、融合タンパク質はスキャフォルド・タンパク質を含み
、ランダム・ペプチドライブラリィは生体活性であり、例えば、酵素活性を有す
る。しかし、本明細書で概説のように、融合タンパク質はこのような生体活性機
能を示す必要は無い。融合タンパク質の好ましい特性は、しかし、可能性のある
結合パートナーにランダム・ペプチド配列を提示することである。
【０１６１】 好ましい態様において、複数スキャフォルドを、伸張したペプチドに偏向を有
するペプチドライブラリィの細胞内（および細胞外）提示のために使用する。伸
張した配座は、非常に多くのプロテアーゼ、キナーゼおよびホスファターゼに結
合するペプチド基質（および阻害剤）を含む多くのペプチド−タンパク質複合体
[Siligardi and Drake, Biopolymers 38(4)281-92(1995)]、ＭＨＣクラスＩおよ
びIIタンパク質に結合するペプチド、シャペロンに結合するペプチド、ＤＮＡに
結合するペプチド、およびＢ細胞エピトープの分子認識に重要である。伸張結合
ペプチドの更なる例は、トロポニンＣに結合するトロポニン阻害ペプチド[Herna
nderz et al., Biochemistry 38:6911-17(1999)]およびＰＣＮＡに結合するｐ２
１−由来ペプチド[Gulbis et al., Cell 87:297-306(1996)]を含む。直鎖状ペプ
チドは独得な２次構造であり、したがって多くのペプチド−タンパク質結合相互
作用において重要であると考えられる。
【０１６２】 ペプチドの細胞内異化作用は、小ペプチドの明確な安定状態レベルを妨げ得る
一つの限定因子である。アミノペプチダーゼ[Lee and Goldberg, Biopolymers 3
7:281-92(1992)]のようなペプチダーゼおよびカルボキシペプチダーゼおよびプ
ロテアソームは、更に下に概説のように、細胞内ペプチドの分解に関与し得る。
このように、直鎖状または伸張ペプチドは、その細胞内発現後に容易に分解され
得る。
【０１６３】 好ましい態様において、遊離Ｎ末端（アミノペプチダーゼ媒介分解を可能にす
る）および遊離Ｃ末端（カルボキシペプチダーゼ媒介分解を可能にする）の両方
なしの直鎖状／伸張配置を有するための、１８−３０ランダム残基を含む、ラン
ダムライブラリィ・メンバーを可能にするライブラリィを構築する。この態様に
おいて、スキャフォルドは直鎖状／伸張構造偏向を有するを提示し（しかし、絶
対的必須要件ではない）、ある程度細胞内異化作用を限定しながら、著しいペプ
チド柔軟性を可能にする。タンパク質のライブラリィの両端への融合は、アミノ
−およびカルボキシ−ペプチダーゼからのランダム配列を保護すべきである。
【０１６４】 したがって、好ましい態様において、以下の構造の２重融合スキャフォルド融
合タンパク質が構築される：Ｎ末端−タンパク質１−リンカー１−ランダム・ペ
プチドライブラリィ−リンカー２−タンパク質２−Ｃ末端。
【０１６５】 好ましい態様において、タンパク質１とタンパク質２は同じタンパク質である
。あるいは、タンパク質１とタンパク質２は異なるタンパク質である。
【０１６６】 好ましい態様において、リンカー１とリンカー２は同じリンカーである。ある
いは、リンカー１とリンカー２は異なるリンカーである。
【０１６７】 好ましくは、タンパク質１およびタンパク質２は、互いに低親和性を有するタ
ンパク質のグループから選択される。
【０１６８】 他の好ましい態様において、タンパク質１およびタンパク質２は、哺乳類細胞
で、またはランダム・ペプチドライブラリィを試験した細胞において十分に発現
するタンパク質のグループから選択する。この態様には、ＣＡＴおよび当分野で
既知の他のもののような長い細胞内半減期を有するタンパク質が含まれる。
【０１６９】 他の態様において、タンパク質２はＤＨＦＲまたは他の、上記で概説のものま
たは当分野で既知の他のもののような、選択タンパク質である。この態様におい
て、哺乳類細胞またはライブラリィを試験した細胞における完全長ライブラリィ
・メンバーの選択を達成できる。選択法は上記に概説した。あるいは、タンパク
質１が選択タンパク質である。
【０１７０】 他の好ましい態様において、タンパク質２はＧＦＰまたは、上記で概説のよう
なまたは当分野で既知のような他の蛍光タンパク質、β−ラクタマーゼ、他の非
常に着色されたタンパク質のようなレポータータンパク質である。この態様にお
いて、哺乳類細胞またはライブラリィを試験した細胞における完全長ライブラリ
ィ・メンバーの細胞内検出および追跡を達成できる。レポーター−遺伝子生産物
分析は上に概説した。あるいは、タンパク質１がレポータータンパク質である。
【０１７１】 他の好ましい態様において、タンパク質１がレポータータンパク質およびタン
パク質２が選択タンパク質であり、細胞内追跡および完全長ライブラリ−メンバ
ーの選択の両方を可能にする。
【０１７２】 リンカー１およびリンカー２は高い自己親和性を有するべきでなく、またはタ
ンパク質１またはタンパク質２のいずれかに非共有結合的親和性を有するべきで
ない。
【０１７３】 好ましい態様において、リンカー１および／またはリンカー２は、１個以上の
グリシンを有する残基を含み、ランダムライブラリィからのタンパク質１および
タンパク質２から構造を切り離す。
【０１７４】 他の好ましい態様において、リンカー１およびまたはリンカー２は、伸張した
場合、ランダム残基とタンパク質１および２の間に０.５−１タンパク質直径空
間を提供する。これは、約１５−３０Åまたは５−１０残基に対応し、可能性の
ある標的に結合するペプチドライブラリィ・メンバーにおける立体的干渉を最小
にする。
【０１７５】 他の態様において、リンカー１および／またはリンカー２は十分な親水性残基
を含み、リンカーが完全融合タンパク質のまたはリンカー領域単独の溶解性また
は粘着性に不利に影響しない。
【０１７６】 他の好ましい態様において、相対的に固定された構造がリンカーから製造でき
、タンパク質１および２の表面からランダム残基を離れさせる。
【０１７７】 好ましい態様において、細胞性タンパク質ｐ２１は、結合パートナーに直鎖状
ペプチドを表示するために使用する。腫瘍抑制タンパク質ｐ２１は、そのＣ末端
２２残基を介して、このＣ末端ペプチドを伸張配置でＰＣＮＡに表示することに
よりＰＣＮＡに結合する（Gulbis et al, 前掲）。したがって、このスキャフォ
ルドはＣ末端２２残基のいくつかまたは全ての位置に伸張構造偏向を有するラン
ダム・ペプチドライブラリィの表示のために有用であり得、Ｃ末端残基は、ここ
でランダム化されている。ｐ２１スキャフォルドの構造は無秩序であるように見
え、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）に結合してそのＮ末端でより整う。全
体的表示構造は、このスキャフォルドが伸張（無秩序）ペプチドライブラリィの
表示に有用であることを示し得る。
【０１７８】 好ましい態様において、残基１４１と１５６の間に位置するｐ２１の核局在化
配列を欠失させ、ランダム残基で置換する。ランダム・ペプチドライブラリィは
、したがって、核局在化シグナルを置換するように挿入する。それにより、この
スキャフォルドは細胞質ペプチドライブラリィのスキャフォルドとして機能しな
ければならない。細胞質に残すことにより、ｐ２１スキャフォルドライブラリィ
・メンバーは核サイクリンおよびＣＤＫに結合せず、したがって細胞サイクルを
混乱させない。
【０１７９】 ＣＤＫのようなｐ２１機能の欠失を確実にするために、低レベルのペプチドラ
イブラリィ・メンバーが核に入った場合、当分野で既知のように、適当なドメイ
ンを部位特異的変異により不活性化できる。一つのこのような変異、Ｒ９４Ｗは
、ｐ２１がサイクリン依存性キナーゼの阻害をする能力を遮断する[Balbin et a
l., J. Biol. Chem. 271:15782-6(1996)]。またＣＤＫ結合を遮断するｐ２１
ＣＤＫ−構築物における第２の変異は、ｐ２１をプロテオソーム分解に対して安
定化することが示され[Cayrol and Ducommun, Oncogene 17:2437-44(1998)]、し
たがってスキャフォルドとして好ましい可能性がある。第３の変異、Ｎ５０Ｓは
またｐ２１によるＣＤＫ阻害を遮断する[Welcker et al., Cancer Res. 58:5053
-6(1998)]。あるいは、ｃｙ−１部位（残基１７−２４）を欠失し得、ｐ２１に
結合するサイクリン−およびサイクリン−ＣＤＫ複合体の両方を遮断し得る[Che
n et al., Mol. Cell. Biol. 16:4673-82(1996)]。残基１５２−１５８のｃｙ−
２サイクリン結合部位は、またランダムライブラリィが残基１４１−１６４の代
わりに挿入されたときに欠失し得る。
【０１８０】 他の好ましい態様において、スキャフォルド・タンパク質はカナマイシンヌク
レオチジルトランスフェラーゼである（図８ 参照）。カナマイシンヌクレオチ
ジルトランスフェラーゼは堅い二量体を形成する。この態様において、伸張−偏
向ランダム・ペプチドを第１二量体のＣ末端と第２二量体のＮ末端の間に、核タ
ンパク質とランダム残基の間のスペーサー残基と共に挿入する。ランダムライブ
ラリィ領域のいずれかの部位のスペーサー残基は、１個以上のグリシンを含み疎
水性残基を含まない、ランダム・ペプチドライブラリィのいずれかの側の少なく
とも５−１０残基を含む。
【０１８１】 本発明の融合タンパク質は、スキャフォルド・タンパク質とランダム・ペプチ
ドを含む。ペプチド（およびそれをコードする核酸）はランダム化され、完全ラ
ンダム化されているか、それらはそのランダム化が、例えば、全体的なまたは位
置当たりのヌクレオチド／残基頻度において偏向している。「ランダム化」また
はその文法的に同義語は、本明細書で、各核酸およびペプチドが、本質的に各々
ランダムヌクレオチドおよびアミノ酸からなることを意味する。下により詳細に
記載するように、ペプチドを発生させる核酸は化学的に合成され、したがって、
任意のヌクレオチドを任意の位置に挿入し得る。このように、核酸が発現し、ペ
プチドを作る場合、任意のアミノ酸残基が任意の位置に挿入され得る。合成法は
、ランダム化核酸を作るように設計でき、核酸の長さにわたり全てまたは殆どの
可能な組合わせの形成を、したがってランダム化核酸のライブラリィの形成を可
能にする。
【０１８２】 ライブラリィは、十分構造的に多用なランダム化発現生産物の集団を提供し、
蓋然論的に十分な範囲の細胞性応答を行い、所望の反応を提示する１個以上の細
胞を提供するべきである。したがって、相互作用ライブラリィは、少なくとも一
つのそのメンバーが、ある分子、タンパク質、またはその活性がシグナル伝達経
路に必要な他の因子へのその親和性を提供する構造を有するように、十分大きく
なければならない。相互作用ライブラリィの必要な絶対のサイズを測定すること
は困難であるが、性質が免疫応答と一緒にヒントを提供する：１０７−１０８の
異なる抗体の相違が、生物が面している最も可能性のある抗原と相互作用するの
に十分な親和性を有する少なくとも一つの組合わせを提供する。公開されたイン
ビトロ選択法はまた１０７から１０８のライブラリィサイズが、標的に親和性を
有する構造を発見するのに十分であることを示している。本明細書でレトロウイ
するにおける発現に関して提案しているような、７から２０アミノ酸長のペプチ
ドの全組合わせのライブラリィは、２０７（１０９）から２０２０のコードをす
る可能性を有する。したがって、例えば、１０７から１０８／レトロウイルス粒
子mlのライブラリィで、本方法は７個のアミノ酸のための理論的に完全な相互作
用の「作業」サブセットおよび２０２０ライブラリィの形のサブセットを可能に
する。このように、好ましい態様において、少なくとも１０５、好ましくは少な
くとも１０６、より好ましくは少なくとも１０７、より更に好ましくは少なくと
も１０８および最も好ましくは少なくとも１０９の異なるペプチドを、本明細書
に概説のように同時に分析し得る。
【０１８３】 このように、各融合タンパク質がスキャフォルド・タンパク質とペプチドを含
むものである融合タンパク質のライブラリィは、少なくとも１０５、好ましくは
少なくとも１０６、より好ましくは少なくとも１０７、より更に好ましくは少な
くとも１０８および最も好ましくは少なくとも１０９の異なるランダム・ペプチ
ドを含む。
【０１８４】 他の好ましい態様において、融合タンパク質の個々のメンバーは、本明細書に
概説のように分析する。あるいは、融合タンパク質のライブラリィの１個以上の
の独立したメンバーを、同時に分析し得る。
【０１８５】 オリゴヌクレオチド合成によりコードされる任意のライブラリィにおいて、ペ
プチド構造に最後に包含されるコドンを完全に抑制することができないことを理
解することは重要である。これは、コドンコード停止シグナルの場合に、特に当
て嵌まる（ＴＡＡ、ＴＧＡ、ＴＡＧ）。ランダム領域としてのＮＮＮでの合成に
おいて、３／６４、または４.６９％の、コドンが停止コドンであるチャンスが
ある。したがって、１０残基のペプチドにおいて、４６.７％のペプチドが早期
に停止する許容できない高い見こみがある。遊離ペプチド構造に関して、これは
恐らく問題ではない。しかし、本明細書で構想しているようなより大きな構造に
関して、このような停止は無効なペプチド発現を導く。これを解消するために、
ランダム残基をＮＮＫ（Ｋ＝ＴまたはＧ）としてコードする。これは、全ての可
能性のあるアミノ酸をコードすることが可能であるが（その相対的表示を僅かに
変える）、二つの停止コドン残基ＴＡＡおよびＴＧＡのコードを有力に防止する
。このように、１０アミノ酸ペプチドをコードするライブラリィは、１５.６％
の早期停止のチャンスを有する。しかし、本発明は、ＧＦＰが蛍光でなく、した
がってこれらのペプチドが分泌されないため、ループ中で停止ペプチドを含むラ
イブラリィのスクリーニングを可能にする。
【０１８６】 好ましい態様において、ペプチドライブラリィを、配列優勢なしに、または任
意の位置での不変なしに、十分ランダム化する。好ましい態様において、ライブ
ラリィは偏向している。すなわち、配列内のある位置が一定に保たれるか、また
は限られた数の可能性から選択される。例えば、好ましい態様において、例えば
、疎水性アミノ酸、親水性残基、立体的偏向（小または大）残基のヌクレオチド
またはアミノ酸残基は定義されたクラス内で、架橋のためのシステイン、ＳＨ−
３ドメインのためのプロリン、ホスホリル化部位のためのセリン、スレオニン、
チロシンまたはヒスチジン等の創造に向けて、またはプリンのために等、ランダ
ム化される。
【０１８７】 下に概説の構造の提示のコンセプトと同様に、例えば、個々の残基を構造的偏
向を創造するために、挿入したランダム・ペプチド配列中で固定し得る。好まし
い態様は、一般的構造−ｇｌｙ２−８−ａａ１−ａａ２−．．.ａａｎ−ｇｌｙ
２−８−（ランダム挿入配列はａａ１からａａｎである）の挿入を使用する。こ
の配列は、１個以上のｎ残基のプロリン（全ループの配座空間を有意に制限する
）、Ｗ、Ｒ、Ｋ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、ＦまたはＹのような嵩高いアミノ酸としてとして
の固定により、または一連のランダムアミノ酸をＥ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、
Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹのような嵩高いアミノ酸のみを含むように偏向して
、拘束できる。側さの大きいサイズのために、これらの残基はループとして利用
可能であるとして定義される小スペースへの圧縮の方法が少なく、したがって利
用可能なループ配座が殆どない。
【０１８８】 別の態様において、ランダムライブラリィを、特定の２次構造を好む適当な数
の残基（グリシンリンカーの他に）を包含させることにより、特定の２次構造に
偏向できる。例えば、アルファらせん偏向の創造のための全ループ挿入は−ｇｌ
ｙ２−８−らせん形成体４−８−ランダム残基−らせん形成体４−８−ｇｌｙ２ −８ −（ランダム化領域の各端の４−８らせん形成体は、アルファらせんに凝集
し、ランダム挿入がらせんである可能性を高める）であると考えられる；この更
なる偏向のために、ランダム化領域はｐｒｏおよびｇｌｙのような強いらせんブ
レーカーを欠くことができる；強いらせん形成残基の例は、Ｍ、Ａ、Ｋ、Ｌ、Ｄ
、Ｅ、Ｒ、Ｑ、Ｆ、ＩおよびＶを含む。
【０１８９】 好ましい態様において、この偏向は既知のクラスの分子と相互作用するペプチ
ドに向かう。例えば、多くの細胞内シグナル伝達が、小ペプチドドメインを通っ
て、他のポリペプチドと相互作用するポリペプチドの短領域を介して行われるこ
とは既知である。例えば、ＨＩＶ−１エンベロープ細胞質ドメイン由来の短領域
は、前に細胞内カルモジュリンの作用を遮断することが示されている。Ｗａｓｐ
ｓからのマストパラン毒素に相同性を示すＦａｓ細胞質ドメインを、死誘導アポ
トーシスまたはＧタンパク質誘導機能を有する短ペプチド領域に限定できる。Ｘ
ｅｎｏｐｕｓ由来の天然ペプチドであるマゲイニンは、強い抗腫瘍および抗微生
物活性を有する。プロテインキナーゼＣイソザイム（βＰＫＣ）の短ペプチド断
片は、刺激に続くＸｅｎｏｐｕｓ卵母細胞におけるβＰＫＣの核翻訳を遮断する
ことが示されている。そして、短ＳＨ−３標的ペプチドは、ＳＨ−３タンパク質
への特異的結合の偽基質として使用されている。これは、もちろん、生物活性を
有する利用可能なペプチドについての簡単な記述である。この分野には多数の文
献がある。このように、小ペプチドが細胞内シグナル伝達カスケードを有する可
能性に関して、多くの先行物がある。加えて、多くの分子のアゴニストおよびア
ンタゴニストを同様にペプチドの偏向ランダム化の基本として使用し得る。
【０１９０】 このように、多くの分子またはタンパク質ドメインが偏向ランダム化ペプチド
の産生のための出発点として適している。一般的機能、構造または親和性を付与
する多くの小分子ドメインが既知である。加えて、当分野で認められているよう
に、弱いアミノ酸相同性の領域は強い構造的相同性を有し得る。多くのこれらの
分子、ドメイン、および／または対応するコンセンサス配列が既知であり、ＳＨ
−２ドメイン、ＳＨ−３ドメイン、プレクストリン、死ドメイン、プロテアーゼ
開裂／認識部位、酵素阻害剤、酵素基質、Ｔｒａｆ等を含むがこれらに限定され
ない。同様に、本発明での使用に適したドメインを含む、多くの既知の核酸結合
タンパク質がある。例えば、ロイシンジッパーコンセンサス配列が既知である。
【０１９１】 一般に、少なくとも４、好ましくは少なくとも１０、より好ましくは少なくと
も１５のアミノ酸位がランダム化に必要である；また、ランダム化が完全でない
とき、より多いのが好ましい。
【０１９２】 好ましい態様において、ランダムライブラリィは、ロイシンまたはイソロイシ
ンジッパーモチーフに偏向させるために、７残基毎に固定されたロイシンまたは
イソロイシンを含み得る。
【０１９３】 好ましい態様において、らせん偏向ライブラリィの場合、任意のＣまたはＮキ
ャップ残基を固定し得、ランダムにせず、また強いらせん形成体である。より強
いらせん偏向のために、キャップ残基の少なくとも２−３ターンがあり、または
１１−１２アミノ酸までである。それらはまたＣまたはＮ末端にポリプロリンら
せんを提供するための（ｐｒｏ）ｎである。ＣまたはＮ末端が、アルファらせん
またはポリプロリンらせんのような安定な２次構造を作る時、それはタンパク質
分解に耐性であり、細胞内でのライブラリィの安定性に有利である。明らかなＣ
およびＮキャップらせん安定化配列または残基を、Ｎ末端およびＣ末端の両方に
各々包含できる[Betz and DeGrado, Biochem. 35:6955-62(1996); Doig et al.,
Prot. Sci. 6:147-155(1997); Doig and Baldwin, Prot. Sci. 4:1325-36(1995
); Richardson and Richardson, Science 240:1648-52(1998)。これらの配列を
出典明示により包含させる。]
【０１９４】 好ましい態様において、より伸張された構造偏向のライブラリィを構築し、弱
いらせん形成体をランダム領域の各端に融合するか、または１個以上のグリシン
をスペーサー領域およびＣまたはＮキャップ領域に包含させる。
【０１９５】 他の好ましい態様において、より伸張された構造偏向のライブラリィを、らせ
んＮまたはＣキャップ残基の削除により構築する。この態様において、ランダム
残基は全２０の天然Ｌ−アミノ酸から選択される。
【０１９６】 他の好ましい態様において、βラクタマーゼのＮおよびＣ末端の両方にペプチ
ドを融合することにより２重ライブラリィを構築し得、得られるライブラリィは
以下の概略的構造を有する：「（＋／−任意Ｎキャップ残基）−ランダム・ペプ
チドライブラリィ−スペーサー残基−Ｎ末端−ＢＬＡ−Ｃ末端−スペーサー残基
−ランダム・ペプチドライブラリィ−（＋／−任意Ｃキャップ残基）」。この場
合、β−ラクタマーゼＮおよびＣ末端らせんが隣接し、平行である（即ち、それ
らは同じ方向に延びる）ため、このようなライブラリィはコイルドコイル形態の
β−ラクタマーゼ構造から突出した二つの隣接らせんを有するように偏向する。
【０１９７】 好ましい態様において、この偏向は、ランダム・ペプチドライブラリィとβ−
ラクタマーゼのその間へのスペーサー配列ＫＬＥＡＬＥＧ（Monera et al., 前
掲）またはＶＳＳＬＥＳＫ[Graddis et al., Biochem. 32:12664-71(1993)]の包
含により、強調される。あるいは、スペーサー配列ＶＳＳＬＥＳＥを一つのラン
ダム・ペプチドライブラリィとβ−ラクタマーゼの間に包含させ、スペーサー配
列ＶＳＳＬＫＳＫを第２のランダム・ペプチドライブラリィ（例えば、合致を保
つために一定の数の介在アミノ酸の調製後）とβ−ラクタマーゼの他の端（Grad
dis et al, 前掲）の間に包含させる。これらの二つのらせん７アミノ酸繰り返
しは、二つの可能性のあるらせんが一緒に結合するのを助け得る。
【０１９８】 好ましい態様において、二つの隣接ランダム・ペプチドライブラリィのコイル
ドコイルへの偏向は、無作為残基が二つのらせんに挿入されるが、配列中の固定
残基が、平行のコイルドコイルの間の表面に存し得るように、配列内の位置の固
定により更に増加する。この融合タンパク質に関して、ランダム・ペプチドライ
ブラリィを含む二つのらせんを、１個以上のらせん形成残基を適当に挿入するこ
とにより、合わせた長さに配置し得る。図３は、平行コイルドコイルのらせんホ
イールの模式図を示す（Gradis et al., 前掲 参照）。ａ、ａ'、ｄおよびｄ'の
位置は、それらがコイルドコイル構造のコアにあるため、固定する。これらが唯
一の固定された残基であり、ｎ＝５（下記 参照）である場合、ライブラリィの
ランダム残基の全数は１８である。ライブラリィのサイズは、したがってｎによ
り制御される。位置ｃ、ｃ'、ｆ、ｆ'、ｂおよびｂ'の残基はランダム化し得、
標的への結合に利用可能ならせんの面を呈し得る。このように、各コイリドコイ
ルライブラリィにおいて、配列は概略的に：「ＢＬＡ−スペーサー残基−ａ−ｂ
−ｃ−ｄ−ｅ−ｆ−ｇ−（ａ−ｂ−ｃ−ｄ−ｅ−ｆ−ｇ−）ｎ−Ｃキャップ残基
および／またはＮキャップ残基−ａ'−ｂ'−ｃ'−ｄ'−ｅ'−ｆ'−ｇ'−（ａ'−
ｂ'−ｃ'−ｄ'−ｅ'−ｆ'−ｇ'−）ｎ−スペーサー残基−ＢＬＡ」として構築す
る。
【０１９９】 好ましい態様において、このスキームにおいて固定残基ａ、ａ'、ｄおよびｄ'
はａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕのような疎水性強らせん形成残基の組合わせであり、
ｇおよびｇ'はｌｙｓ、そしてｅおよびｅ'はｇｌｕ（あるいは、ｅおよびｅ'が
ｇｌｕである場合、ｌｙｓ）である。位置ｅ、ｅ'、ｇおよびｇ'は塩架橋により
コイルドコイルを更に安定化するために固定し得る。位置ｂ、ｂ'、ｃ、ｃ'、ｆ
およびｆ'はランダム残基であり得る。
【０２００】 他の好ましい態様において、らせんの表面上によりランダムな残基を有するら
せん偏向が小さいライブラリィを産生する。この態様において、位置ｇおよびｇ
'およびｅおよびｅ'は同様にランダム残基であり得る。上記の模式的に示したラ
イブラリィにおいて、ｎは１、２、３、４、５またはそれ以上である。
【０２０１】 他の好ましい態様において、固定残基の別のセットを使用して、平行コイリド
コイルに偏に対する偏向を産生する。二つのらせんをβ−ラクタマーゼ構造に配
置した（即ち、末端を合わせる）後、固定位置はａおよびａ'のａｌａ、ｄおよ
びｄ'のｌｅｕ、ｅおよびｅ'のｇｌｕ、ｇおよびｇ'のｌｙｓ、および残りの位
置のランダム残基を含む。この態様において、ｇおよびｇ'はまたランダム化し
得る。
【０２０２】 好ましい態様において、偏向ＳＨ−３ドメイン結合オリゴヌクレオチド／ペ内
ドを作る。ＳＨ−３ドメインは、標的ＳＨ−３ドメインに高い親和性の短ペプチ
ドとしてコードできる、直鎖状配列における約１０から１２残基の短標的モチー
フ（ＳＨ−３ドメイン結合ペプチド）を認識することが示されている。ＳＨ−３
ドメイン結合タンパク質のコンセンサス配列は提案されている。このように、好
ましい態様において、オリゴ／ペプチドは以下の偏向を有して作られる。
【０２０３】 １．ＸＸＸＰＰＸＰＸＸ（Ｘはランダム化残基）。 ２．（残基１１から−２の位置の範囲内で）：
【表３】
【０２０４】 本態様において、Ｎ末端フランキング領域が結合親和性に最大の効果を有する
ことが示され、したがって、完全にランダム化する。「ｈｙｄ」は疎水性残基、
即ち、−Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ａｒｇに向かった偏向を示
す。疎水性に偏向した残基をコードするために、「ｓｂｋ」コドン偏向構造を使
用する。遺伝コード内のコドンの例は、これが一般に疎水性残基をコードするこ
とを確実にする。ｓ＝ｇ、ｃ；ｂ＝ｔ、ｇ、ｃ；ｖ＝ａ、ｇ、ｃ；ｍ＝ａ、ｃ；
ｋ＝ｔ、ｇ；ｎ＝ａ、ｔ、ｇ、ｃ。
【０２０５】 一般に、ランダム・ペプチドは約４から約５０残基長の範囲であり、約５から
約３０が好ましく、約１０から約２０が特に好ましい。
【０２０６】 ランダム・ペプチドは、本明細書で更に十分概説するように、融合ポリペプチ
ドを形成するために、種々の位置でスキャフォルドに融合できる。
【０２０７】 好ましい態様において、スキャフォルド・タンパク質およびペプチドに加えて
、本発明の融合タンパク質は、好ましくは、リンカーを含む融合パートナーを含
むが、これらに限定されない更なる成分を含む。
【０２０８】 本明細書において「融合パートナー」とは、ランダム・ペプチドと会合し、そ
のクラスのライブラリィのすべてのメンバーに共通の機能または能力を付与する
配列を意味する。融合パートナーは異種（すなわち、宿主にとり天然でない）、
または合成のもの（いずれの細胞にとっても天然でない）であり得る。好適な融
合パートナーとしては、限定されるものではないが、ａ）ペプチドを立体配位上
制限されまたは安定な形で提供させる以下に定義の提示構造、ｂ）ペプチドを細
胞下または細胞外区画へ局在化させる、以下に定義される標的配列、ｃ）ペプチ
ドかまたはそれらをコードする核酸のいずれかの精製または単離を可能にする以
下に定義のレスキュー配列、ｄ）ペプチドまたはそれをコードする核酸に安定性
または分解からの保護、例えばタンパク質分解耐性を付与する安定配列、ｅ）ペ
プチドを、スキャフォルド折り畳みによる介在からペプチドを守る、スキャフォ
ルド自体からのランダム・ペプチド要素を立体配位的に切り離すリンカー配列、
あるいはｆ）ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）およびｅ）ならびに要すればリンカー配列
のいずれかの組合せが挙げられる。
【０２０９】 好ましい態様では、融合パートナーは提示構造である。本明細書みにおいて「
提示構造」または文法上の同義語は、ペプチドと融合した場合にペプチドに立体
配位的上制限された形をとらせる配列を意味する。タンパク質は立体配位上拘束
されたドメインを介して互いに強く相互作用する。当技術分野で公知のように、
自由に回転するアミノおよびカルボキシル末端を有する小さなペプチドは強い機
能を有していても、かかるペプチド構造の薬理活性剤への変換は、ペプチド模倣
合成に関する側鎖の位置を予測できないために困難である。従って、立体配位上
拘束された構造でのペプチドの提示は、その後のファルマコフォアモデルおよび
医薬の両方の製造にも有益であるし、またおそらくペプチドと標的タンパク質と
のより高い親和性の相互作用をもたらす。この事実は、細菌ファージ系において
生物学的に作製した短いペプチドを用いる組合せライブラリィ作製系において認
められている。何人かの研究者が、ランダム化されたペプチド構造を提示する小
ドメイン分子を構築している。
【０２１０】 従って合成提示構造、すなわち人工ポリペプチドはランダム化されたペプチド
を立体配位上制限されたドメインとして提示できる。一般に、かかる提示構造は
、ランダム化されたペプチドのＮ末端に結合した第１の部分と、そのペプチドの
Ｃ末端に結合した第２の部分とを含んでなり、すなわち該ペプチドは、以下に概
説されるように、変異体を作製できるが提示構造に挿入されており、提示構造中
の要素はランダム・ペプチド配列内に含まれる。ランダム化された発現産物の機
能的単離を高めるには、標的細胞において発現された場合に最小の生物活性しか
持たないように提示構造を選択または設計する。
【０２１１】 好ましい提示構造は、ループのような外側表面にそれを提示することにより、
ペプチドへの接近性が最大となり、またペプチド内の更なる立体配位的拘束をも
たらす。従って、好適な提示構造としては、限定されるものではないが、二量化
配列、ミニボディ構造、βターン上のループ、構造に重要でない残基がランダム
化されているコイルドコイル構造、ジンクフィンガードメイン、システイン結合
（ジスルフィド）構造、トランスグルタミナーゼ結合構造、環状ペプチド、Ｂル
ープ構造、らせんバレルまたはらせん束、ロイシンジッパーモチーフなどが挙げ
られる。
【０２１２】 好ましい態様では、該提示構造はコイルドコイル構造であり、外側のループで
ランダム化ペプチドの提示を可能にする。例えば、出典明示により本明細書の一
部とする、Myszka et al., Biochem. 33:2362-2373(1994)参照。この系を用いて
、研究者らは適当な標的と高い親和性の相互作用が可能なペプチドを単離してい
る。一般に、コイルドコイル構造は６ないし２０個の間のランダムな位置にある
。
【０２１３】 好ましいコイルドコイル提示構造は以下のとおりである。
【表４】 下線の領域はこれまでに定義されたコイルドコイルロイシンジッパー領域を示す
（出典明示により一部とする、Martin et al., ENBO J. 13(22):5303-5309(1994
) 参照）。太字のＧＲＧＤＭＰ領域は、ループ構造を示し、ランダム化されたペ
プチド（すなわち、本明細書では概して（Ｘ）ｎ（ここで、Ｘはアミノ酸残基で
あり、かつ、ｎは少なくとも５または６の整数である）で示されるペプチド）で
適当に置換された場合に可変の長さとなり得る。太字領域の置換は下線領域に制
限エンドヌクレアーゼ部位をコードすることによって促進されて、その位置での
ランダム化されたオリゴヌクレオチドの直接組み込みが可能となる。例えば、好
ましい態様は、二重下線のＬＥ部位にＸｈｏＩ部位を、また二重下線のＫＬ部位
にＨｉｎｄIII部位を作り出す。
【０２１４】 好ましい態様では、該提示構造はミニボディ構造である。「ミニボディ」は実
質的に最小の抗体相補性領域からなる。該ミニボディ提示構造は一般に折り畳ま
れたタンパク質において三次構造の単一面に沿って提示される２個のランダム化
領域を提供する。例えば、Bianchi et al., J. Mol. Biol. 236(2):649-59(1994
)およびそこで引用されている文献参照、なお、すべて出典明示により本明細書
の一部とする。研究者らはこの最小ドメインが溶液中で安定であることを示し、
組合せライブラリィにおいて相選択系を使用して炎症誘発性サイトカインＩＬ−
６にＫｄ＝１０−７といった高い親和性を示すペプチド領域を用いてミニボディ
を選択している。
【０２１５】 好ましいミニボディ提示構造は以下のとおりである。
【表５】 太字で下線の領域はランダム化され得る領域である。イタリック体のフェニルア
ラニンは第１のランダム化領域において不変でなくてはならない。完全なペプチ
ドがコイルドコイルの態様の３つのオリゴヌクレオチドからなる可変部分にクロ
ーン化され、従って２個の異なるランダム化領域の同時組み込みが可能となる。
この態様は末端の非パリンドロームＢｓｔＸＩ部位を利用する。
【０２１６】 好ましい態様では、該提示構造は一般に２個のシステイン残基を含む配列であ
り、その結果ジスルフィド結合が形成され、立体配位上拘束された配列が得られ
る。この態様は、例えば、分泌標的配列を用いる場合にはエキソビボで特に好ま
しい。当業者には理解されるであろうが、いずれの数のランダム配列でも、スペ
ーサーまたは連結配列を伴い伴わなくて、システイン残基で挟み得る。他の態様
では、効果的な提示構造はランダム領域自体によって作出され得る。例えば、ラ
ンダム領域は、システイン残基で「処理」するが、適当な酸化還元条件下では提
示構造に類似した高度に架橋した構造の立体配位をもたらし得る。同様に、ラン
ダム化領域は制御されてβシートまたはαらせん構造を与える一定数の残基を含
み得る。
【０２１７】 好ましい態様において、提示配列は金属イオンと結合する能力を付与する。し
たがって、例えば、Ｃ２Ｈ２ジンクフィンガー配列を使用する；Ｃ２Ｈ２配列は
、亜鉛イオンがキレート化されるように配置された二つのシステインと二つのヒ
スチジンを有する。ジンクフィンガードメインは独立して複数のジンクフィンガ
ーペプチドにおいて発生し、構造的に独立した、柔軟に連結するドメインを形成
することが知られている。J. Mol. Biol. 228:619(1992)参照。一般のコンセン
サス配列は（５アミノ酸）−Ｃ−（２から３アミノ酸）−Ｃ−（４から１２アミ
ノ酸）−Ｈ−（３アミノ酸）−Ｈ−（５アミノ酸）。好ましい例は、３から２０
アミノ酸−ＨＩＲＳＨＴＧ−の−ＦＱＣＥＥＣ−ランダム・ペプチドである。
【０２１８】 同様に、コンセンサス配列−Ｃ−（２アミノ酸）−Ｃ−（４から２０アミノ酸
）−Ｈ−（４アミノ酸）−Ｃ−（出典明示により本明細書の一部とするBavoso,
et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 242(2)385(1988) 参照）を有するＣＣ
ＨＣボックスを使用できる（Biochem. Biophys. Res. Comm. 242(2)385(1988)
参照）。好ましい例は、（１）−ＶＫＣＦＮＣ−４から２０ランダムアミノ酸−
ＨＴＡＲＮＣＲ−、ヌクレオカプシドタンパク質Ｐ２に基づく；（２）Ｌａｓｐ
−１ ＬＩＭドメインの天然に存在する亜鉛結合ペプチドのｔｅｈａｔから修飾
した配列（Hammarstrom et al, Biochem. 35:12723(1996)）；および（３）−Ｍ
ＮＰＮＣＡＲＣＧ−４から２０ランダムアミノ酸−ＨＫＡＣＦ−、ｎｍｒ構造ア
ンサンブル１ＺＦＰに基づく（Hammarstrom et al, Biochem. 35:12723(1996)）
を含む。
【０２１９】 好ましい態様において、提示構造は自己結合ペプチドを含む二量化配列である
。二量化配列は、同じでも異なってもよい二つのペプチド配列の、正常生理学的
条件下での会合を存続させるのに十分な親和性での非共有結合的会合を可能にす
る。これらの配列は多くの方法で使用し得る。好ましい態様において、ランダム
・ペプチドの一端を第１二量化配列に接続し、他端を第１二量化配列と同じでも
異なってもよい第２二量化配列に接続する。これは、二量体化配列の会合による
ループの形成を可能にする。あるいは、これらの配列の使用は、ランダム・ペプ
チドの小ライブラリィ（例えば、１０４）が大ライブラリィになり、細胞当たり
二つのペプチドが作出し、それが次いで二量体化した場合、１０８（１０４×１
０４）の有効なライブラリーを形成する。これは、必要な場合、より長いランダ
ム・ペプチド、またはより構造的に複雑なランダム・ペプチド分子の形成を可能
にする。二量体はホモまたはヘテロ二量体であり得る。
【０２２０】 二量化配列は、自己凝縮する一本鎖配列であるか、会合する二つの異なる配列
であり得る。すなわち、細胞内への挿入および核酸配列の発現により、二量化配
列１が二量化配列２と会合し、新規ランダム・ペプチド構造を形成するように、
二量化配列１を有する第１ランダム・ペプチド、および二量化配列２を有する第
２ランダム・ペプチドの両方をコードする核酸である。二量化配列の使用は、ラ
ンダムペプチドの「環化」を可能にする；すなわち、二量化配列をペプチドの各
端で使用する場合、得られる構造が「幹ループ」タイプ構造を形成できる。更に
、ＧＦＰのようなスキャフォルドのＮおよびＣ末端の両方に融合した二量化配列
の使用は、非共有結合的環化スキャフォルドランダム・ペプチドライブラリィを
形成する。
【０２２１】 適当な二量化配列は広範囲の配列を含む。任意の数のタンパク質−タンパク質
相互作用部位が既知である。加えて、二量化配列はまた、酵母二重ハイブリッド
システム、伝統的生化学的親和性結合実験のような標準方法を使用して、または
本方法を使用してさえ、解明される。出典明示により本明細書の一部とする、１
９９８年４月２日出願のU.S.S.N. 60/080,444参照。特に好ましい二量化配列は
、−ＥＦＬＩＶＫＳ−、−ＥＥＥＬＩＶＫＫＳ−、−ＦＥＳＩＫＬＶ−および−
ＶＳＩＫＦＥＬ−を含むが、これらに限定されない。
【０２２２】 好ましい態様では、該融合パートナーは標的配列である。当業者には理解され
るであろうが、細胞内でのタンパク質の局在化は有効濃度を高め、かつ機能を決
定するための簡単な方法である。例えば、ＲＡＦ１はミトコンドリア膜に局在し
た場合にＢＣＬ−２の抗アポトーシス作用を阻害し得る。同様に、膜に結合した
ＳｏｓはＴリンパ球においてＲａｓ媒介性のシグナル伝達を誘導する。これらの
機構はリガンドの探索領域を限定する原理によるものと考えられ、すなわち、タ
ンパク質の原形質膜への局在化はそのリガンドの探索を細胞質の三次元空間に対
して膜付近の二次元空間に限定することとなる。あるいはまた、タンパク質の濃
度も局在化という性質により簡単に高められる。核へタンパク質を往復させるこ
とによりそれらをより小さい空間に制限し、それにより濃度が高まる。最後に、
リガンドまたは標的は特定のコンパートメントに簡単に局在化され得るし、阻害
剤も適当に局在化するはずである。
【０２２３】 このように好適な標的配列としては、限定されるものではないが、発現産物の
生物活性を維持しつつ発現産物を、予じめ決定した分子または分子クラスと結合
させることができる結合配列（例えば、酵素阻害剤または基質配列を用いてある
関連する酵素クラスを標的化する）；それ自体またはともに結合しているタンパ
ク質の選択的分解のシグナルを伝達する配列；ならびに、ペプチドを、ａ）ゴル
ジ体、小胞体、核、仁、核膜、ミトコンドリア、葉緑体、分泌小胞、リソソーム
、および細胞膜などの細胞下の位置、およびｂ）分泌シグナルを介する細胞外の
位置を含む、細胞の所定の場所へ構成的に局在化させ得るシグナル配列が挙げら
れる。細胞下への局在化または分泌を介する細胞外への局在化のいずれかが特に
好ましい。
【０２２４】 好ましい態様では、標的化配列は核局在化シグナル（ＮＬＳ）である。ＮＬＳ
は一般に、ＮＬＳが生じる完全なタンパク質を細胞核へ向かわせるように働く、
正電荷を有する（塩基性）短いドメインである。ＳＶ４０（サルのウイルス）ラ
ージＴ抗原（
【表６】 ）、Kalderon(1984), et al., Cell, 39:499-509;ヒトレチノイン酸受容体−β
核局在化シグナル (
【表７】 )；ＮＦｋＢ ｐ５０（
【表８】 ；Ghosh et al., Cell 62:1019(1990)；ＮＦｋＢｐ６５（
【表９】 ；Nolan et al., Cell 64:961(1991)；およびその他（例えば出典明示により本
明細書の一部とするBoulikas, J. Cell. Biochem. 55(1):32-58(1994)参照）な
どの単一塩基性ＮＬ、ならびにツメガエル（アフリカツメガエル）タンパク質の
ヌクレオプラスミン（
【表１０】 ）、Dingwall, et al., Cell, 30:449-458 1982 and Dingwall et al., J. Cell
Biol., 107:841-849;1988）などの二塩基性ＮＬＳをはじめとする多数のＮＬＳ
アミノ酸配列が報告されている。多数の局在化研究では、合成ペプチドに組み込
まれたＮＬＳまたは通常は細胞核に向かわないレポータータンパク質につぎ足さ
れたＮＬＳは、これらのペプチドおよびリポータータンパク質を核内に集中させ
ることが証明されている。例えば、Dingwall, and Laskey, Ann. Rev. Cell Bio
l., 2:367-390, 1986; Bonnerot, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:67
95-6799, 1987; Galileo, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:458-462,
1990参照。
【０２２５】 好ましい態様では、該標的化配列は膜固定シグナル配列である。これが特に有
用なのは、多くの細胞内事象が原形質で起こるということの他、多くの寄生虫お
よび病原体が膜に結合するからである。このように、膜結合ペプチドライブラリ
ーは、これらの過程における重要な要素の同定、ならびに有効な阻害剤の発見の
双方に有用である。本発明は、ランダムな発現産物を細胞外または細胞質空間で
提示する方法を提供する。細胞外提示に関しては、ペプチド提示構造のカルボキ
シル末端に膜固定領域が提供される。ランダムな発現産物領域は細胞表面で発現
され、細胞外空間に提示され、他の表面分子（それらの機能に影響する）または
細胞外媒体中に存在する分子と結合できるようになる。かかる分子の結合により
、その分子と結合するペプチドを発現する細胞に機能を付与できる。細胞質領域
は、きわだった特徴がなくてもよいし、または細胞外のランダムな発現産物領域
が結合する場合、細胞に機能（キナーゼ、ホスファターゼの活性化、機能を遂行
するための他の細胞成分との結合）を付与するドメインを包含することもできる
。同様に、ランダムな発現産物を含む領域は、細胞質領域に包含されることが可
能で、かつ、貫通膜領域および細胞外領域は不変のままであるか、または明らか
な機能を有する。
【０２２６】 膜固定配列は、当技術分野で十分公知であり、哺乳類の貫通膜分子の遺伝的幾
何学に基づく。ペプチドは、シグナル配列（本明細書ではｓｓＴＭと表す）に基
づいて膜に挿入され、疎水性貫通膜ドメイン（本明細書ではＴＭ）を必要とする
。この貫通膜タンパク質は、貫通膜ドメインの５'側にコードされる領域は細胞
外に、３'部分をコードする領域は細胞内になるように膜に挿入する。もちろん
、これらの貫通膜ドメインは、可変領域の５'側に置かれた場合には、細胞内ド
メインとして領域を固定する働きをする。このことはいくつかの態様において望
ましい。ｓｓＴＭおよびＴＭは多様な膜結合タンパク質として公知であり、従っ
てこれらの配列は、特定のタンパク質由来の対として、または各成分を異なるタ
ンパク質から取って使用してもよく、あるいは該配列は人工送達ドメインとして
合成してもよく、また全体が共通配列に由来してもよい。
【０２２７】 当業者には理解されるであろうが、ｓｓＴＭおよびＴＭ双方を含む膜固定配列は
多様なタンパク質について公知であり、これらのうちのいずれを用いてもよい。
特に好ましい膜固定配列としては、限定されるものではないが、ＣＤ８、ＩＣＡ
Ｍ−２、ＩＬ−８Ｒ、ＣＤ４およびＬＦＡ−１が挙げられる。
【０２２８】 有用な配列としては、1）ＩＬ−２受容体β鎖（残基１−２６はシグナル配列
、２４１−２６５は貫通膜残基；Hatakeyama et al., Science 244:551(1989) a
nd von Heijne et al., Eur. J. Biochem. 174:871(1988)参照）およびインスリ
ン受容体β鎖（残基１−２７はシグナル配列、９５７−９５９は貫通膜ドメイン
、および９６０−１３８２は細胞質ドメイン；Hatakeyama, 前掲、Ebina et al.
, Cell 40:747(1983)参照）などのクラスＩ内在性膜タンパク質；２）中性エン
ドペプチダーゼ（残基２９−５１は貫通膜ドメイン、２−２８は細胞質ドメイン
；Malfroy et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 144:59(1987)参照）など
のクラスII内在性膜タンパク質；３）ヒトシトクロムＰ４５０ ＮＦ２５（Hatak
eyama, 前掲）などのタイプIIIタンパク質；ならびに４）ヒトＰ−糖タンパク質
（Hatakeyama, 前掲）などのタイプIVタンパク質由来の配列が挙げられる。特に
好ましいのはＣＤ８およびＩＣＡＭ−２である。例えば、ＣＤ８およびＩＣＡＭ
−２由来のシグナル配列は、転写物の最も５'末端に位置する。これらは、ＣＤ
−８の場合はアミノ酸１−３２（
【表１１】 ；Nakauchi et al., PNAS USA 82:5126(1985)を、ＩＣＡＭ−２の場合にはアミ
ノ酸１−２１（
【表１２】 ；Staunton et al., Nature(London) 339:61(1989)）からなる。これらのリーダ
ー配列は、構築体を膜へと送達する一方で、ランダムな候補領域の３'に位置す
る疎水性貫通膜ドメインは構築体を膜に固定させる。これらの貫通膜ドメインは
ＣＤ８由来のアミノ酸１４５−１９５（
【表１３】 ；Nakauchi, 前掲）およびＩＣＡＭ−２由来のアミノ酸２２４−２５６（
【表１４】 ；Staunton, 前掲）に包含される。
【０２２９】 あるいは、膜固定配列はＧＰＩアンカーを含み、その結果として例えばＤＡＦ
（
【表１５】 、アンカー部位に太字のセリンを有する、Homans et al., Nature 333(6170):26
9-72(1968),およびMoran et al., J. Biol. Chem. 266:1250(1991)参照）におい
ては、グリコシル−ホスファチジルイノシトール結合を介して該分子と脂質二重
層の間の共有結合を形成する。これを達成するには、Ｔｈｙ−１由来のＧＰＩ配
列を貫通膜配列の代わりに可変領域の３'にカセットとして挿入できる。
【０２３０】 同様に、ミリスチル化配列は膜固定配列として働き得る。ｃ−ｓｒｃのミリス
チル化によりこの配列は原形質膜に補充されることが知られている。該タンパク
質の最初の１４個のアミノ酸：
【表１６】 （Cross et al., Mol.Cell. Biol. 4(9):1834(1984); Spencer et al., Science
262:1019-1024(1993)参照、双方とも出典明示により本明細書の一部とする）が
単にこの機能のみを担うと仮定すると、これは膜局在化の単純かつ有効な方法で
ある。このモチーフはすでにリポーター遺伝子の局在化に有効であることが示さ
れており、ＴＣＲのゼータ鎖を固定するために使用できる。このモチーフは、該
構築体を原形質膜に局在化させるには可変領域の５'側に置かれる。パルミトイ
ル化のような他の修飾を用いて原形質膜に構築体を固定することもできる；例え
ば、Ｇタンパク質結合受容体キナーゼＧＰＫ６配列（
【表１７】 ；太字のシステインがパルミトイル化されている；Stoffel et al., J. Biol. C
hem 269:27791(1994)）由来；ロドプシン（
【表１８】 ；Barnstable et al., J. Mol. Neurosci. 5(3):207(1994)）由来；およびｐ２
１ Ｈ−ｒａｓ１タンパク質（
【表１９】 ；Capon et al., Nature 302:33(1983)）のパルミトイル化配列がある。
【０２３１】 好ましい態様では、該標的化配列は、例えばＬａｍｐ−２のようなリソソーム
分解配列（ＫＦＥＲＱ；Dice, Ann. N.Y. Acad. Sci. 674:58(1992)；またはＬ
ａｍｐ−１由来のリソソーム膜配列（
【表２０】 ；Uthayakumar et al., Cell. Mol. Biol. Res. 41:405(1995)）、またはＬａ
ｍｐ−２（
【表２１】 、Koneckl et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 205:1-5(1994)、双方ともイ
タリック体は貫通膜ドメイン、下線は細胞質標的シグナルを示す）をはじめとす
るリソソーム標的化配列である。
【０２３２】 あるいは、該標的化配列は、ミトコンドリア・マトリックス配列（例えば、酵
母アルコールデヒドロゲナーゼIII；
【表２２】 ；Schalz, Eur. J. Biochem. 165:1-5(1987)）；ミトコンドリア膜内配列（酵母
シトクロムｃオキシダーゼサブユニットIV；
【表２３】 Schalz, 前掲）；ミトコンドリア膜間空間配列（酵母シトクロムｃ１；
【表２４】 ；Schalz, 前掲）またはミトコンドリア膜外配列（酵母７０ｋＤ膜外タンパク質
；
【表２５】 ；Schalz, 前掲）をはじめとするミトコンドリア局在化配列であってもよい。
【０２３３】 該標的配列はまた、カルレチクリン由来配列（ＫＤＥＬ；Pelham, Royal Soci
etyLondon Transactions B; 1-10(1992)）またはアデノウイルスＥ３／１９Ｋタ
ンパク質由来の配列（
【表２６】 ；Jackson et al., EMBO J. 9:3153(1990)をはじめとする小胞体配列であっても
よい。
【０２３４】 さらに標的配列はまた、ペルオキシソーム配列（例えば、ルシフェラーゼ由来
のペルオキシソームマトリックス配列；ＳＫＬ；Ketler et al., PNAS USA 4:32
64(1987)）；ファルネシル化配列（例えば、Ｐ２１ Ｈ-ｒａｓ１；
【表２７】 太字のシステインがファルネシル化されている；Capon, 前掲）；ゲラニルゲラ
ニル化配列（例えば、タンパク質ｒａｂ−５Ａ；
【表２８】 太字のシステインがゲラニルゲラニル化されている；Farnsworth, PNAS USA 91:
11963(1994)）；または分解配列（サイクリンＢ１；
【表２９】 ；Klotzbucher et al., EMBO J. 1:3053(1996)）を含む。
【０２３５】 好ましい態様では、該標的化配列は該ペプチドの分泌に作用できる分泌シグナ
ル配列である。可変ペプチド領域の５'側に置かれた公知の分泌シグナル配列は
多数あり、ペプチド領域から切断されて細胞外空間への分泌を果たす。分泌シグ
ナル配列とそれらの関連のないタンパク質への転移能力は十分公知である。例え
ば、Sllhavy, et al., (1985) Microbiol. Rev. 49, 398-418。これは、宿主細
胞以外の、レトロウイルスに感染させた細胞、例えば該ペプチドを発現する細胞
のような標的細胞の表面に結合できる、またはその生理学に作用できるペプチド
を作製するのに特に有用である。好ましい試みにおいて、融合産物は一連の分泌
シグナルペプチド−提示構造−ランダムな発現産物領域−提示構造を含むように
配置する（図３参照）。この方法において、ペプチドライブラリーを発現した細
胞の近傍で増殖した標的細胞は、分泌したペプチドに浸される。標的細胞はペプ
チドの存在に応答して、例えば、ペプチドが表面受容体に結合するか、または取
り込まれて細胞内の標的に結合することにより生理学的変化を示し、種々の分泌
スキームのいずれかによって分泌細胞が局在化し、該ペプチドが所定の作用を引
き起こす。作用の例としては、デザイナーサイトカイン（すなわち、造血幹細胞
を分裂させ、それらの全能性を維持できる幹細胞因子）、癌細胞を自発的アポト
ーシスに導く因子、標的細胞の細胞表面に結合してそれらを特異的に標識する因
子など様々なものが挙げられる。
【０２３６】 ＩＬ−２（
【表３０】 ；Villinger et al., J. Immunol. 155:3948(1995)）、成長ホルモン（
【表３１】 ；Roskam et al., Nucleic Acids Res. 7:30(1979)）；プレプロインスリン（
【表３２】 ；Bell et al., Nature 284:26(1980)）およびインフルエンザＨＡタンパク質（
【表３３】 ；Sekiwawa et al., PNAS 80:3563）)由来のシグナルをはじめとする好適な分泌
配列が知られている。なおここで、非下線部と下線部の接点が切断される。特に
好ましい分泌シグナル配列は、分泌型サイトカインＩＬ−４由来のシグナルリー
ダー配列であり、これは以下に示すＩＬ−４の最初の２４個のアミノ酸を含む：
【表３４】
【０２３７】 好ましい態様では、該融合パートナーはレスキュー配列である。レスキュー配
列は、該ペプチドまたはそれをコードする核酸のいずれかを精製または単離する
ために使用できる配列である。このようにペプチドレスキュー配列としては、例
えば、Ｎｉ親和性カラムと併用するＨｉｓ６タグ、および検出、免疫沈降または
ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞分別）のためのエピトープ標識などの精製配列が挙げ
られる。好適なエピトープタグとしては、ｍｙｃ（市販の９Ｅ１０抗体と併用）
、細菌酵素ＢｉｒＡのＢＳＰビオチン化標的配列、ｆｌｕタグ、ｌａｃＺおよび
ＧＳＴ（ＳｔｒｅｐタグＩおよびおよびＩＩ）が挙げられる。
【０２３８】 あるいは、レスキュー配列は、ＰＣＲ、関連技術またはハイブリダイゼーショ
ンによるレトロウイルス構築体の迅速かつ容易な単離を可能にするプローブ標的
部位として働く特異なオリゴヌクレオチド配列であってもよい。
【０２３９】 好ましい態様では、該融合するパートナーは、ペプチドまたはそれをコードす
る核酸に安定性を付与する安定配列である。このように、例えば、Varahavskyの
Ｎ−Ｅｎｄ則に従い、ペプチドのユビキチン化を保護するため、開始メチオニン
（ＭＧまたはＭＧＧＯ）の後にグリシンを組み込むことによりペプチドは安定化
され、このようにして細胞質中での長い半減期が付与され得る。同様にＣ末端の
２個のプロリンは、ペプチドにカルボキシペプチダ−ゼの作用に対する強い耐性
を付与する。プロリンの前に２個のグリシンが存在すると、可変性が付与される
とともに、２個のプロリンで一連の事象が起こる構造候補ペプチド構造へ伝わる
のを防げる。このような好ましい安定配列を以下に示す：ＭＧ(Ｘ)ｎＧＧＰＰ、
ここでＸはいずれかのアミノ酸であり、ｎは少なくとも４の整数である。 即ち、「Ｎ−キャップ」、「Ｎ−キャップ残基」、「Ｎ−キャップ配列」なる用
語またはその文法上の同義語は、ペプチドのＮ末端もしくはスキャッフォルド・
タンパク質のＮ末端もしくは提示配列タンパク質のＮ末端と融合する場合に、安
定性を提供する配列、特にタンパク質分解安定性をいう。同様に、「Ｃ−キャッ
プ」、「Ｃ−キャップ残基」、「Ｃ−キャップ配列」なる用語またはその文法上
の同義語はペプチドのＮ末端もしくはスキャッフォルド・タンパク質のＮ末端も
しくは提示配列タンパク質のＮ末端と融合する場合に、安定性、特にタンパク質
分解安定性を提供する配列をいう。
【０２４０】 融合パートナーは生態と活性が許す限り、構造中のいずれの部分（すなわち、
Ｎ末端、Ｃ末端、内部）にあってもよい。さらに、融合ポリペプチドのペプチド
部分と融合パートナーと融合することを指向して論議されているが、融合ポリペ
プチドのスキャフォルド部分と１以上のこれら融合タンパク質を融合することも
可能である。即ち、例えば、該スキャフォルドは、ある位置で、標的配列（以下
のような、Ｎ末端の、Ｃ末端のもしくは内部のいずれも）を含んでもよく、もし
くは分子上の同じ場所もしくは異なる場所にレスキュー配列を含んでもよい。即
ち、融合パートナーおよびペプチドおよびスキャッフォルド・タンパク質の全て
の組合せを行ってよい。
【０２４１】 好ましい態様において、融合パートナーは、リンカーまたはつなぎ鎖配列を包
含する。様々な標的配列（例えば、膜標的配列）と構成成分の他の成分（例えば
、ランダムペプチド）の間にあるリンカー配列は、そのペプチドが妨害されてい
ない潜在的標的と相互作用させうるのが望ましい。例えば、有用なリンカーは、
グリシンポリマー（Ｇ）ｎ、グリシン−セリン・ポリマー[例えば、（ＧＳ）ｎ
、（ＧＳＧＧＳ）ｎおよび（ＧＧＧＳ）ｎを包含し、ｎは少なくとも１の整数で
ある]、グリシン−アラニン・ポリマー、アラニン−セリン・ポリマー、および
シェーカー型カリウムチャンネルのつなぎ鎖などの他の柔軟性リンカー、さらに
当業者が認める多様な他の柔軟性リンカーを包含する。グリシンおよびグリシン
−セリン・ポリマーは、このアミノ酸の両方が比較的非構造的であり、それ故に
成分間の中性的つなぎ鎖として働くことができるので、好適である。グリシン・
ポリマーは、グリシンがアラニンすら、よりphi-psi空間に著しく接近するので
最も好適であり、制限されることがより少ない、長い側鎖を有するtan残基であ
る。（参照：Shachrage, Rev. Computational Chem.III 73-142(1992)）。第二
に、セリンは親水性であり、そのため、球状のグリシン鎖であり得るものを可溶
化することが可能である。第三に、同様の鎖は、例えば、一本鎖抗体などの組換
えタンパク質のサブユニットを連接するのに有効であることが示されている。
【０２４２】 好ましい態様において、該ペプチドは、リンカーを介して該スッキャフォルド
と結合する。ある態様は、スッキャフォルドに対するペプチドのもしくはスキャ
ッフォルドに対するペプチドといずれかの融合パートナーとの直接結合を利用す
るが、好ましい態様は、ペプチドの一端または両端にリンカーを用いる。Ｎまた
はＣ末端のどちらかが結合する場合、１つのリンカーを利用してもよい。ペプチ
ドは、一般的に、以下記載するように、内部部分に挿入される場合、好ましい態
様では、少なくとも１つ、好ましくは２つのリンカーをペプチドの各末端で１つ
づつ利用する。一般的に、リンカーは、全ての挿入配列（即ち、ペプチド）をス
ッキャフォルド構造自身から配座的に分離すること、および折りたたみの中間部
分を不安定にし、またはＧＦＰ包埋トリペプチド蛍光団へ接近させ得るスッキャ
フォルド構造における局所的な歪みを最小にすることのために好ましい。歪みは
、外因性衝突蛍光クエンチャーに曝露することによりＧＦＰの蛍光を低下させる
（もしくは消失する）（参照：Philllips, Curr. Opin. Strructural Biology 7
:821 (1997)、出典明示により本明細書の一部とする）。
【０２４３】 従って、以下に記載したように、該ペプチドはスッキャフォルド内の内部部分
中に挿入する場合、好ましい態様はリンカーおよび好ましくは（ｇly）ｎリンカ
ー[ここで、ｎは１もしくは１以上であり、ｎは２、３、４、５および６である]
を利用するが、７−１０のアミノもしくはそれ以上のアミノ酸のリンカーも可能
である。この態様において一般的には、βカーボンを有するアミノ酸は、リンカ
ーでは使用されない。
【０２４４】 別の好ましい態様において、該リンカーはそのＧＱＧＧＧ配列を包含する。あ
るいは、該リンカーはＧＱＡＧＧＧＧ配列を包含する。本明細書中で記載したよ
うに、いずれかのリンカーが、ペプチドまたはスッキャフォルド・タンパク質の
Ｎ末端もしくはＣ末端どちらかに結合し得る。
【０２４５】 さらに、提示構造を含む融合パートナーは、修飾、ランダム化、および／また
は成熟化してランダム化発現産物の提示方向を変えることもできる。例えば、ル
ープ基部にある決定因子を修飾し、ランダム化アミノ酸配列を保持した内部ルー
プペプチドの三次構造を僅かに修飾することが可能である。
【０２４６】 好ましい態様においては、融合パートナーの組合わせを用いる。このように、
例えば、提示構造、標的配列、レスキュー配列および安定配列の多様な合わせを
リンカー配列の存在下または不存在下に使用することができる。当業者には理解
されるが、ランダムおよび／もしくは偏ったライブラリィーを得るためにクロー
ニング部位を含有する塩基ベクターを用いて、そのものを、ライブラリーの多様
な融合パートナー５’および３’中に挿入し得る。さらに、本明細書中に記載し
たように、１つの構造において１以上の変異性領域を持ち得る、もしくは新しい
表面を一緒に形成するか、２つの別の分子と共にもたらすことも可能である。同
様に、以下に充分記載したように、スッキャフォルドの２以上の異なったループ
にペプチドを挿入することができるが、スッキャフォルドと同じ「表面」上に存
在する必要はない。
【０２４７】 さらに、本発明は、本発明の融合ポリペプチドをコードする融合核酸を提供す
る。当業者には理解されるであろうが、遺伝子コードの縮重により、顕著に多い
核酸数を構築することができ、その全ての核酸は、本発明の融合タンパク質をコ
ードするもの全てを作り得る。即ち、特定のアミノ酸配列を同定すれば、１以上
のコドンを単に修飾することによって、当業者は多くの異なる核酸を作成し得る
。
【０２４８】 融合タンパク質をコードする本発明の核酸を用いると、様々な発現ベクターが
構築され。発現ベクターは、自己複製する染色体外ベクターまたは宿主ゲノムに
組み込まれるベクターであり得る。一般に、これらの発現ベクターは、融合タン
パク質をコードする核酸に機能し得るように結合された転写および翻訳調節核酸
を含む。「制御配列」の語は、特定の宿主生物体において操作可能的に結合され
たコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列を意味する。原核生物に適した制御配列
は、例えばプロモーター、所望によりオペレーター配列、およびリボソーム結合
部位含む。真核生物細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエン
ハンサーを利用することが知られている。
【０２４９】 核酸が別の核酸配列と機能的関係にある状況に置かれたとき、核酸は「操作可
能的に結合」されている。例えば、前駆配列または分泌リーダーに関するＤＮＡ
は、ポリペプチドの分泌に関与する前タンパク質として発現される場合に、ポリ
ペプチドに対するＤＮＡに機能しやすいように；プロモーターまたはエンハンサ
ーは配列の転写に影響する場合にコード配列に結合されている；リボソーム結合
部位は、翻訳を容易にするような位置にある場合に、コード配列に結合されてい
る。一般的に、「操作可能的に結合する」とは、該ＤＮＡ配列が、隣接している
こと、および、分泌リーダーの場合、隣接および読み取り段階であることを意味
する。しかし、エンハンサーは、隣接する必要はない。結合は、好都合な制限部
位での連結反応により達成される。上記部位が存在しない場合、合成オリゴヌク
レオチドアダプターまたはリンカーは、常法に従い使用される。転写および翻訳
調節核酸は、一般に融合タンパク質の発現に使用される宿主細胞に適合する；例
えば、バチルス（Bacillus）由来の転写および翻訳調節核酸配列は、好ましくは
バチルス（Bacillus）での融合タンパク質の発現に使用される。多様なタイプの
適当な発現ベクター、および適当な調節配列が、様々な宿主細胞に関する当技術
分野で知られている。
【０２５０】 一般に、転写および翻訳調節配列は、プロモーター配列、リボソーム結合部位
、転写開始および停止配列、翻訳開始および停止配列、およびエンハンサーまた
はアクチベーター配列を含み得るが、これらに限定はされない。好ましい態様に
おいて、調節配列は、プロモーターおよび転写開始および停止配列を含む。
【０２５１】 プロモーター配列は、構成的または誘導プロモーターをコードする。プロモー
ターは、天然プロモーターまたはハイブリッドプロモーターであってよい。１以
上のプロモーターの要素をあわせもつハイブリッドプロモーターは、当業界でも
知られており、本発明において有用である。好ましい態様において、該プロモー
ターは、特にＴet調節要素との組合せの際、細胞、特に哺乳類細胞において、Ｃ
ＭＶプロモーターのような強力なプロモーターである。
【０２５２】 さらに、発現ベクターは追加要素を含み得る。例えば、発現ベクターは２つの
複製系を有し得るため、２生物体、例えば発現用の哺乳類または昆虫細胞および
クローニングおよび増幅用の原核生物宿主において維持され得る。さらに、組込
み発現ベクターの場合、発現ベクターは、宿主細胞ゲノムに相同的に少なくとも
１つの配列、および好ましくは発現構築体の両端に接する２つの相同性配列を含
む。組込みベクターは、ベクターでの封入に適した相同性配列を選択することに
より宿主細胞における特異的座に指向され得る。組込みベクター用構築体は当業
界ではよく知られている。
【０２５３】 さらに、好ましい態様において、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の
選択を可能にする選択可能なマーカー遺伝子を含む。選択遺伝子は当業界ではよ
く知られており、使用される宿主細胞により異なる。
【０２５４】 好ましい発現ベクター系は、レトロウイルスベクター系、例えばＰＣＴ／ＵＳ
９７／０１０１９およびＰＣＴ／ＵＳ９７／０１０４８で全般的に記載されたも
のであり、これら両方を特に引用して説明の一部とする。
【０２５５】 候補核酸は、以下に説明するが、スクリーニング用の細胞に導入される。「導
入される」または本明細書中で文法上の同義語は、核酸の二次発現のために、核
酸が、適切な手法で細胞に導入されることを意味する。導入方法は、広く標的細
胞型を指し、以下に説明する。例示方法としては、ＣａＰＯ４沈殿、リポソーム
融合、lipofectin（登録商標）、電気穿孔法、ウイルス感染などを包含する。候
補核酸は、宿主細胞（例えば、以下に示すレトロウイルス導入）のゲノムに安定
に組み込むことができ、細胞質中で（即ち、従来プラスミドを使用すること、標
準的な調節配列、選択マーカーなどを利用することによって）一時的にまたは安
定に存在し得る。多くの医薬的に重要なスクリーニングは、ヒトまたはモデル哺
乳類細胞標的を必要とし、そのような標的をトランスフェクトし得るレトロウイ
ルスベクターが好ましい。
【０２５６】 この発明の融合タンパク質は、融合タンパク質発現の誘導または誘発に適した
条件下、融合タンパク質をコードする核酸を含有する発現ベクターで形質転換さ
れた宿主細胞を培養することによって産生される。融合タンパク質発現に適した
条件は、発現ベクターおよび宿主細胞の選択により変動し、通常の実験を通じて
当業者により容易に確認される。例えば、発現ベクターにおいて構成的プロモー
ターを使用する場合、宿主細胞の成長および増幅の最適化が必要とされ、誘導プ
ロモーターを使用する場合、誘導に適した成長条件が必要とされる。さらに、具
体例においては、採取のタイミングが重要である。例えば、昆虫細胞発現で使用
されるバクロウイルス系は溶菌ウイルスであり、そのため採取時間の選択が生成
物の収率にとって重大である。
【０２５７】 適当な宿主細胞には、酵母、細菌、古細菌、真菌および昆虫および哺乳類細胞
を含む動物細胞、特に興味深いのは、ドロソフィラ・メランガスター（Drosophi
la melangaster）細胞、サッカロマイシス・セレヴィシアエ（Saccharomyses ce
revisiae）および他の酵母、エシェリキア・コリ（ E.coli）、バチルス・スブ
チリス（枯草菌、Bacillus subtilis）、ＳＦ９細胞、Ｃ１２９細胞、２９３細
胞、ニューロスポラ（Neurospora）、ＢＨＫ、ＣＨＯ、ＣＯＳおよびヒーラ（He
La）細胞、線維芽細胞、Schwanoma 細胞系、不死化哺乳類骨髄様およびリンパ様
細胞系、ジャカット（Jurkat）細胞、マスト細胞および他の内分泌性細胞および
外分泌性細胞さらにニューロン細胞である。
【０２５８】 好ましい態様は、融合タンパク質は哺乳類細胞で発現される。哺乳類の発現系
もまた当分野では既知であり、レトロウイルス系を含む。哺乳類プロモーターは
、哺乳類ＲＮＡポリメラーゼに結合し、ｍＲＮＡへの融合タンパク質に関するコ
ード配列の下流（３'）転写を開始させ得るいかなるＤＮＡ配列でもよい。プロ
モーターは、通常コード配列の５'末端近位に位置する転写開始領域、および転
写開始部位上流に位置する２５−３０塩基対を用いたＴＡＴＡボックスを有する
。ＴＡＴＡボックスは、ＲＮＡポリメラーゼIIに指令し、正確な部位でのＲＮＡ
合成を開始させると考えられている。哺乳類プロモーターはまた、典型的にはＴ
ＡＴＡボックスの上流１００ないし２００塩基対内に位置する、上流プロモータ
ー要素（エンハンサー要素）を含む。上流プロモーター要素は、転写開始速度を
決定し、いずれかの配向で作用し得る。ウイルス遺伝子は高度発現されることが
多く広い宿主範囲を有するため、哺乳類プロモーターとして特に有用なのは哺乳
類ウイルス遺伝子由来のプロモーターである。例としては、ＳＶ４０初期プロモ
ーター、マウス乳癌ウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルス主要後期プロ
モーター、単純ヘルペスウイルスプロモーター、ＣＭＶプロモーターを含む。
【０２５９】 典型的には、哺乳類細胞により認識される転写終結およびポリアデニル化配列
は、転写停止コドンに対し３'に配置された調節領域であり、そのためプロモー
ター要素と共存してコード配列の両端に隣接する。成熟ｍＲＮＡの３'末端は、
部位特異的翻訳後開裂およびポリアデニル化により形成される。転写ターミネー
ターおよびポリアデニル化シグナルの例としては、ＳＶ４０から誘導されたもの
がある。
【０２６０】 外来核酸を哺乳類宿主ならびに他の宿主に導入する方法は、当業界ではよく知
られており、使用される宿主により変化する。技術として、デキストラン介在ト
ランスフェクション、燐酸カルシウム沈殿、ポリブレン介在トランスフェクショ
ン、プロトプラスト融合、電気穿孔法、ウイルス感染、リポソームにおけるポリ
ヌクレオチド（複数でもよい）封入、および核へのＤＮＡの直接顕微注入がある
。本発明中で説明する場合、特に好ましい方法は、出典明示により本明細書の一
部とするＰＣＴ／ＵＳ９９／０１０１９に記載のようなレトロウイルス感染を利
用するものである。
【０２６１】 当業者には理解されるであろうが、本発明において使用される哺乳類細胞の細
胞型は、広く変化し得る。基本的に、いずれの哺乳類細胞、マウス、ラット、霊
長類を使用してもよく、特にヒトの細胞が好ましいが、当業者には理解されるで
あろうが、偽型による該システムの修飾は、全て真核生物、好ましくは高等真核
生物に使用され得る。以下に充分記載するが、スクリーンは、該細胞が、生物的
に活性のあるペプチドの存在下で選択し得る表現型を示すことである。さらに以
下に記載するが、適当なスクリーンが細胞内ペプチドの存在によって変化した表
現型を示す細胞を選択させるように構築され得る限り、疾病条件の広範な変動に
影響を与える細胞は、特に有用である。
【０２６２】 従って、適当な細胞型は、限定されるものではないが、全ての種類（特に、黒
色腫様、骨髄性白血病、肺癌腫、胸癌腫、卵巣癌腫、大腸癌腫、腎臓癌腫、前立
腺癌腫、膵臓癌腫および精巣癌腫）の腫瘍細胞、心筋細胞、内皮細胞、上皮細胞
、リンパ細胞（Ｔ細胞およびＢ細胞）、マスト細胞、好酸球、血脈管内膜細胞、
神経系、皮膚、肺、腎臓、肝臓および筋軸細胞（分化および脱分化ファクターの
ためのスクリーニングで使用する）、破骨細胞、軟骨細胞および別の連結組織細
胞、ケラチノサイト、メラノサイト、肝臓細胞、腎臓細胞および含脂肪細胞を包
含する。また、適当な細胞は、既知の探査細胞、ジャカット（Jurkat）Ｔ細胞、
ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＨＯ、Ｃｏｓなどを包含する。ＡＴＣＣ細胞系カタログを
参照し、出典明示により本明細書の一部とするが、これを限定するものではない
。
【０２６３】 一態様では、該細胞はさらに遺伝子操作され得る、即ち融合核酸とは別の外来
核酸を含み得る。
【０２６４】 好ましい態様では、融合タンパク質は、細菌系で発現する。細菌発現系は、当
業者には公知である。
【０２６５】 適当な細菌性プロモーターとは、細菌性ＲＮＡポリメラーゼに結合し、ｍＲＮ
Ａへの融合タンパク質コード配列の下流（３'）転写を開始させ得る核酸配列で
あればよい。細菌性プロモーターは、通常コード配列の５'末端近位に配置され
た転写開始領域を有する。この転写開始領域は典型的にはＲＮＡポリメラーゼ結
合部位および転写開始部位を含む。代謝経路酵素をコードする配列からは、特に
有用なプロモーター配列が提供される。例としては、糖代謝性酵素、例えばガラ
クトース、ラクトースおよびマルトースから誘導されたプロモーター配列、およ
び生合成酵素、例えばトリプトファンから誘導された配列がある。バクテリオフ
ァージからのプロモーターもまた使用され得、当業界では公知である。さらに、
合成プロモーターおよびハイブリッドプロモーターもまた有用である。例えば、
tacプロモーターは、trpおよびlacプロモーター配列のハイブリッドである。さ
らに、細菌性プロモーターは、細菌性ＲＮＡポリメラーゼと結合し、転写を開始
させる能力を有する非細菌起源の天然プロモーターを含み得る。
【０２６６】 機能性プロモーター配列に加えて、有効なリボソーム結合部位が望ましい。エ
シェリキア・コリ（E.coli）の場合、リボソーム結合部位は、シャイン‐デルガ
ルノ（ＳＤ）配列と呼ばれ、開始コドンおよび開始コドン上流３‐１１ヌクレオ
チドに位置する配列３−９ヌクレオチド長を有する。
【０２６７】 発現ベクターもまた、細菌中で融合タンパク質の分泌を提供するシグナルペプ
チドを包含する。シグナル配列は、通常、当業者によく知られているように、該
細胞からのタンパク質分泌を指令する疎水性アミノ酸からなるシグナルペプチド
をコードする。蛋白質は、成長培地（グラム陽性菌）または細胞（グラム陰性菌
）の内膜および外膜間にある周辺腔に分泌される。
【０２６８】 細菌性発現ベクターはまた、形質転換された細菌株の選択を可能にする選択可
能マーカー遺伝子を含み得る。適当な選択遺伝子には、薬剤、例えばアンピシリ
ン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン、ネオマイシンお
よびテトラサイクリンに対する耐性を細菌に付与する遺伝子がある。選択可能マ
ーカーはまた、生合成遺伝子、例えばヒスチジン、トリプトファンおよびロイシ
ン生合成経路にあるものを含む。
【０２６９】 これらの成分は発現ベクターへと構築される。細菌に関する発現ベクターは当
業界ではよく知られており、そのなかで特に、バチルス・スチリス（枯草菌、Ba
cillus subtilis）、エシェリキア・コリ（E.coli）、ストレプトコッカス・ク
レモリス（Streptococcus cremoris）およびストレプトコッカス・リビダンス（
Streptococcus lividans）に関するベクターを含む。
【０２７０】 細菌性発現ベクターは、当業界でよく知られた技術、例えば塩化カルシウム処
理、電気穿孔法などを用いて細菌宿主細胞に形質転換される。
【０２７１】 一態様では、融合タンパク質は昆虫細胞で製造される。昆虫細胞の形質転換の
ための発現ベクターおよび特にバキュロウイルス由来の発現ベクターは、当業界
でもよく知られている。
【０２７２】 好ましい態様において、融合タンパク質は酵母細胞で製造される。酵母発現系
は当業界では周知であり、サッカロマイシイス・セレヴィシアエ（Saccharomyce
s cerevisiae）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）およびカンジダ
・マルトーサ（C. maltosa)、ハンセヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha
)、クルイヴェロマイシス・フラギリス（Kluyveromyces fragilis）およびクル
イヴェロマイシス・ラクティス（K. lactis）、ピキア・ギレリモンディ（Pichi
a guillerimondii）およびピキア・パストリス（P. Pastoris）、シゾサッカロ
マイシス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）およびヤロウィア・リポリテ
ィカ（Yarrowia lipolytica）に関する発現ベクターがある。酵母における発現
に好ましいプロモーターには、誘導性ＧＡＬ１,１０プロモーター、アルコール
デヒドロゲナーゼ、エノラーゼ、グルコキナーゼ、グルコース−６−燐酸イソメ
ラーゼ、グリセルアルデヒド−３−燐酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ホ
スホフルクトキナーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ
および酸性ホスファターゼ遺伝子由来のプロモーターがある。酵母選択可能マー
カーには、ＡＤＥ２、ＨＩＳ４、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１およびＡＬＧ７（これはツ
ニカマイシンに対する耐性を与える）、Ｇ４１８に対する耐性を付与するネオマ
イシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、および銅イオンの存在下で酵母を成長
させ得るＣＵＰ１遺伝子がある。
【０２７３】 本発明の融合ポリペプチドは、所望であれば、例えば発現を増加させるために
、別のタンパク質とさらに融合することも可能である。
【０２７４】 一態様において、発明のこの融合核酸、蛋白質および抗体は標識される。ここ
で「標識される」とは、化合物に少なくとも１つの成分、同位体または化学的化
合物を結合させて化合物の検出を可能にすることを意味する。一般に、標識は３
種類、すなわちａ）放射性または重同位体であり得る同位体標識、ｂ）抗体また
は抗原であり得る免疫標識、およびｃ）着色または蛍光染料に分類される。標識
は化合物のいずれかの位置に組込まれ得る。
【０２７５】 融合核酸は該細胞に導入され、細胞の表現型を変化させ得るペプチドがスクリ
ーニングされる。
【０２７６】 好ましい態様では、第一の多数細胞がスクリーニングされる。該融合核酸が導
入された該細胞は、変化した表現型に関してスクリーニングされる。従って、こ
の態様において、生物活性のあるペプチドの効果は、作製される同じ細胞で見ら
れる（即ち、オートクリン効果）。
【０２７７】 本明細書の“多数細胞”は、おおよそ約１０３細胞から１０８または１０９細
胞を意味し、１０６から１０８が好ましい。この多数細胞は、細胞性ライブラリ
ーを含み、その場合、ライブラリー内の各細胞には通常ペプチド分子ライブラリ
ーのメンバー、すなわち、種々のペプチド(またはペプチドをコードする核酸)を
含み、当業者が認識するように、ライブラリー内の幾つかの細胞はペプチドを含
まずともよく、数種以上のペプチドを含んでいてもよい。レトロウイルス感染以
外の方法を用い、候補核酸を多数細胞に導入するとき、細胞性ライブラリーの個
々細胞メンバー内の候補核酸の分布は広範囲に変化し得る。それは、エレクトロ
ポレーションなどの間に細胞に入れる多数の核酸を制御することが困難だからで
ある。
【０２７８】 好ましい実施態様では、融合核酸を第一の多数細胞に導入し、当該ペプチドの
効果により、第一の多数細胞とは異なる、すなわち通常異なる細胞型の、第二ま
たは第三の多数細胞中においてスクリーニングする。すなわち、生体活性ペプチ
ドの効果は、第二の細胞において細胞外効果、すなわち内分泌または傍分泌効果
に起因する。これは標準的な技術により行われる。第一の多数細胞は、１以上の
培地で増殖し得、当該培地によって第二の多数細胞と接触し、その効果を測定す
る。あるいは、細胞間で直接接触し得る。このように、“接触する”とは、機能
的な接触であり、直接的および間接的の両方を含む。この実施態様は、第一の多
数細胞をスクリーニングしてもよいし、スクリーニングせずともよい。
【０２７９】 必要ならば、当該細胞を処理し、ペプチドの発現に適当となるように条件付す
る(例えば、誘導プロモーターを用いる)。
【０２８０】 そのため、本発明の方法は、スキャフォルドに融合したランダム・ペプチドを
コードする融合核酸の分子ライブラリーを多数細胞、細胞性ライブラリーに導入
することを含む。各核酸は、ランダム・ペプチドを有するスキャフォルドをコー
ドする種々のヌクレオチド配列を含む。次いで、以下でより十分に概説するよう
に、多数細胞を、変化表現型を示す細胞としてスクリーニングする。変化表現型
は生体活性ペプチドの存在に起因する。
【０２８１】 本明細書の“変化表現型”もしくは“生理学的に変化した”または他の文法上
の同義語は、当該細胞の当該表現型が、幾つかの方法で、好ましくは検出可能お
よび／または測定可能な方法で変化することを意味する。。当業者が認識するよ
うに、本発明の長所は、本方法を用い試験され得る多様な細胞型および可能性あ
る表現型変化である。従って、観察され、検出されるか、または測定され得る表
現型変化は本明細書のスクリーニング方法に基づき得る。適当な表現型変化には
、以下に限らないが、細胞の形態学的変化、細胞増殖、細胞生存能力、基質また
は他の細胞への接着、および細胞性密度のような全体的な物理的変化；１以上の
ＲＮＡ、タンパク質、脂質、ホルモン、サイトカインまたは他の分子の発現の変
化；１以上のＲＮＡ、タンパク質、脂質、ホルモン、サイトカインまたは他の分
子の平衡状態(すなわち、半減期(half-life))の変化；１以上のＲＮＡ、タンパ
ク質、脂質、ホルモン、サイトカインまたは他の分子の局在化の変化；１以上の
ＲＮＡ、タンパク質、脂質、ホルモン、サイトカイン、レセプターまたは他の分
子の生存活性または特異活性の変化；イオン、サイトカイン、ホルモン、増殖因
子または他の分子の分泌の変化；細胞膜の可能性、極性、完全性または輸送性の
変化；伝染力、感染性、潜在性、接着性ならびにウイルスおよび細菌性病原体の
吸収の変化などが含まれる。本明細書の“表現型を変化させ得る”は、生体活性
ペプチドが、幾つかの検出可能および／または測定可能な方法で細胞の表現型を
変化し得ることを意味する。
【０２８２】 以下で十分に記載するように、変化表現型は、種々の方法で検出され得、一般
的に、変化されつつある表現型に依存しかつ相当する。一般に、変化表現型は、
例えば、細胞形態の顕微鏡分析；標準的な細胞生存能力検定法、この場合、増殖
細胞死および増殖細胞生存能力の両方が含まれ、例えばウイルス、細菌または細
菌もしくは合成毒性に耐性のある細胞；特定細胞または分子の存在またはレベル
のための蛍光インディケーター検定法のような標準的な標識検定法、この場合、
ＦＡＣＳまたは他の色素染色技術が含まれる；細胞の死滅後の標的化合物の発現
の生化学的検出などを用い検出される。ある場合には、本明細書で十分に記載し
たように、変化表現型は、融合核酸を導入した細胞で検出され、他の態様では、
その変化表現型は、第一の細胞由来の幾つかの分子シグナルに応答する第二の細
胞において検出される。
【０２８３】 細胞の変化表現型は、生体活性ペプチドの存在を示唆し、好ましくはトランス
ドミナントな方法に作用する。本明細書の“トランスドミナント”は、生体活性
ペプチドが、第二の分子上で作用し変化表現型を誘導することにより変化表現型
を間接的に生じることを意味する。すなわち、トランスドミナント発現産物は、
シス型ではない結果となり、すなわち遺伝学的用語または生化学的用語において
定義されるようにトランス事象となる。トランスドミナント効果は、幾つかの分
離し区別可能な標的に対する分子物(molecular entity)(すなわちコード化ペプ
チドまたはＲＮＡ)の区別可能効果である。すなわち、コードされた物(encoded
entity)自体に対する効果ではない。そのため、トランスドミナント効果は、細
胞または生理学的システムにおける標的分子または経路に対する薬理作用物によ
る多くの既知の効果を含む。例えば、β−ラクタム抗生物質は、タンパク質に結
合するペニシリンに結合しその機能を破壊することにより細菌性細胞のペプチド
グリカン合成にトランスドミナント効果を有する。ペプチドによる典型的なトラ
ンスドミナント効果は、機能に重要な領域でＩκＢ−αに結合することによるＮ
Ｆ−κＢ信号伝達の阻害能であり、そのため、有意な量のペプチド(または分子
物)の存在下、ＩκＢ−αのリン酸化および／または崩壊を通じてＮＦ−κＢの
活性化を通常生じる信号伝達経路は、ペプチドまたは分子物の結合によりＩκＢ
−αで作用し阻害される。他の例では、ＩｇＥの分泌を通常活性化する信号伝達
経路はペプチドの存在下阻害される。また、脂肪組織細胞、通常静止状態の信号
伝達経路が活性化され、脂肪が代謝される。また、ペプチド存在下、例えばＨＩ
Ｖ−ＩまたはHerpes viridaeファミリーメンバーまたはRespiratory Syncytia V
irusのような特定ウイルスの複製のための細胞内機構が阻害される。
【０２８４】 タンパク質または分子経路におけるトランスドミナント効果は、タンパク質ま
たは分子が既に明白となっている生化学的能力を促進するか減少する既知もしく
は未知機能のタンパク質もしくは分子内の配列のランダム化、変化、または変異
と、明確に区別される。例えば、酵素学的にβ−ラクタム抗生物質を切断するタ
ンパク質、β−ラクタマーゼは、β−ラクタム抗生物質に作用し切断する酵素の
能力を促進または減少する構造に対し内部となる配列を変異させることにより、
活性を促進するかまたは減少し得る。これはタンパク質に対しシス変異と呼ばれ
る。β−ラクタム抗生物質におけるこのタンパク質の効果は、タンパク質が既に
明白である活性を区別できる程度にまで活性化することである。同様に、このタ
ンパク質の細胞外空間(タンパク質がβ−ラクタム分子に容易に遭遇し得る)への
排出を促進するリーダー配列中における変異、または当該タンパク質の安定性を
促進する配列内の変異をタンパク質におけるシス変異と呼ぶ。比較として、この
タンパク質のトランスドミナントエフェクターは、β−ラクタマーゼとは独立し
た物質であって、β−ラクタマーゼに結合する利点によりβ−ラクタマーゼの機
能を促進または減少するの方法でβ−ラクタマーゼに結合する物質を含む。
【０２８５】 好ましい実施態様では、変化表現型を有する細胞を一旦検出し、融合タンパク
質の存在を確認すると、ペプチドが発現されたことおよび変化表現型がペプチド
の存在によることがわかる。当業者が認識し得るように、ペプチドの存在の証明
は、変化表現型のスクリーニングの前、間、または後の何れかで行い得る。これ
は様々な方法で行い得るが、好ましい方法は、ＦＡＣＳ技術を使用する。
【０２８６】 一旦、融合タンパク質の存在を確認すると、変化表現型を有する細胞は、変化
表現型を有さない多数のものから一般的に単離できる。これは、当分野に既知の
ように多数の方法で行い得、幾つかの例では検定法またはスクリーニングに依存
する。適当な単離技術には、以下に限らないが、ＦＡＣＳ、補体を用いるリシス
選択、細胞クローニング、Fluorimagerによるスキャンニング、蛍光を与え得る
か物理的単離のためにタグ化可能とする細胞表面タンパク質または他の分子の発
現を誘導する“生存”タンパク質の発現；非蛍光分子を蛍光分子に変化させる酵
素の発現；全く増殖しないか増殖の遅いバックグラウンドにおける過剰増殖；細
胞死およびＤＮＡの単離または他の細胞生存能力インディケーター色素などが含
まれる。
【０２８７】 好ましい実施態様では、融合核酸および／または生体活性ペプチド(すなわち
融合タンパク質)を陽性細胞から単離する。これは多くの方法で行い得る。好ま
しい実施態様では、上記定義したようなレトロウイルス構成にまたはレスキュー
配列のようなライブラリーの特定要素に共通のＤＮＡ領域に相補的なプライマー
を用い、特定のランダム配列を“レスキュー”する。他に、融合タンパク質をレ
スキュー配列を用い単離する。そのため、例えば、エピトープタグまたは精製配
列を含むレスキュー配列を用い、免疫沈降または親和性カラムを使用して融合タ
ンパク質を回収する。ある例では、以下に概説しているように、生体活性ペプチ
ドと標的分子の間に強力な結合相互作用が有意に存在するならば、第一標的分子
をも回収される。他に当該ペプチドはマススペクトロメトリーを用い検出され得
る。
【０２８８】 一旦、レスキューすると、生体活性ペプチドおよび／または融合核酸の配列が
決定される。次いで、この情報が多くの方法で使用し得る。
【０２８９】 好ましい実施態様では、生体活性ペプチドを再合成し、標的細胞に再導入し、
その効果を証明する。これは、レトロウイルス、または他にＨＩＶ−１Ｔａｔタ
ンパク質および類似および関連タンパク質に対する融合物を用いて行い、それに
よって、標的細胞中への非常に高い吸収が可能となる。例えば、Fawell et al.,
PNAS USA 91:664(1994);Frankel et al., Cell 55:1189(1988); Savion et al.
, J. Biol. Chem. 256: 1149 (1981); Derossi et al., J. Biol. Chem. 269: 1
0444 (1994);およびBaldin et al., EMBO J. 9: 1511(1990)参照(出典表示によ
り本明細書の一部とする)。
【０２９０】 好ましい実施態様では、生体活性ペプチドの配列を用い、より候補ペプチドを
作成する。例えば、生体活性ペプチドの配列は、第二ラウンドの(偏向化)ランダ
ム化に基づき、増加または変化する活性を有する生体活性ペプチドを開発し得る
。他に第二ラウンドのランダム化は、生体活性ペプチドの親和性を変化し得る。
さらに、生体活性ペプチドの同一ランダム領域を他の提示構造中に入れるか、提
示構造の定常領域の配列を変化させ、生体活性ペプチドの配置／形態を変化させ
ることが望ましい。結合ポケットの突然変異誘発と同様な方法で、リガンド領域
の一端を維持し、他の端をランダム化しペプチド周囲の結合を変化させることに
より、可能な結合部位周辺を“歩く”ことも望ましいかもしれない。
【０２９１】 好ましい実施態様では、生体活性ペプチドまたはそれをコードする生体活性核
酸の何れかを用い、標的分子、すなわち、生体活性ペプチドが相互作用する分子
を同定する。当業者が認識するように、生体活性ペプチドが結合するか直接作用
する第一標的分子が存在し得、生体活性ペプチドが影響するシグナル伝達経路の
一部である第二標的分子が存在し得、これらを“有効な標的”と呼ぶ。
【０２９２】 好ましい実施態様では、生体活性ペプチドを用い標的分子を回収する。例えば
、以下に概説したように、標的分子がタンパク質ならば、エピトープタグまたは
精製配列の使用により生化学的手段(共免疫沈降、アフィニティーカラムなど)を
介し第一標的分子を精製し得る。他に、ペプチドが細菌で発現され精製されると
き、当該ペプチドを、標的細胞型のｍＲＮＡから作成される細菌性ｃＤＮＡ発現
ライブラリーに対するプローブとして使用し得る。また、ペプチドを、酵母また
は哺乳類の２または３ハイブリッドシステムの何れかにおける“餌”として使用
し得る。その相互作用クローニングアプローチは、ＤＮＡ結合タンパク質および
他の相互作用タンパク質成分の単離に非常に有用である。当該ペプチドを薬理学
的アクチベーターと組合せて、該シグナルトランスダクション経路のエピスタシ
ス関係を研究し得る。標識ペプチドの合成的調製も可能であり、ペプチドに結合
するｃＤＮＡのためのバクテリオファージにおいて発現するｃＤＮＡライブラリ
ーのスクリーニングにも使用し得る。さらに、ペプチドにより導入される効果を
“相補”するレトロウイルスライブラリーを介してｃＤＮＡクローニングを使用
することも出来る。そのストラテジーでは、当該ペプチドは、特定信号伝達経路
に重要な幾つかの因子を離して系統的に力価測定するのに必要とされる。この分
子または活性が、ｃＤＮＡライブラリー内からｃＤＮＡの過剰発現により満たさ
れるならば、標的をクローニングすることができる。同様に、任意の上記酵母ま
たはバクテリオファージシステムによりクローニングされたｃＤＮＡを、ペプチ
ドが作用するシステムにおける相補機能に作用することを確認する方法で哺乳類
細胞に再導入することができる。
【０２９３】 一旦、第一標的分子を同定すると、第二標的分子も同様の方法で、餌として第
一標的を用い同定し得る。この方法では、信号伝達経路が解明され得る。同様に
、第二標的分子に特異的な生体活性ペプチドをも発見し得、組み合わせ治療など
のために多くの生体活性ペプチドが単一経路に作用し得るようになる。
【０２９４】 本発明のスクリーニング方法は、多様な条件下、多くの細胞型のスクリーニン
グに有用となり得る。通常、宿主細胞は、疾患状態を含む細胞であり、それらは
、細胞において通常望ましくない結果を生ずる条件下で試験またはスクリーニン
グされる。適当な生体活性ペプチドを発見したとき、望ましくない効果は減少す
るかまたは除かれ得る。他に、通常望ましい結果は、減少するか、または除かれ
得、疾患状態または信号伝達経路に関連する細胞性機構を解明する手段を伴う。
【０２９５】 好ましい実施態様では、本発明の方法は癌適用に有用となる。迅速かつ特異的
に腫瘍細胞を殺す能力は癌化学治療の基礎である。通常、本発明の方法を用い、
ランダムライブラリーを任意の腫瘍細胞に導入し得(第一および培養)、それら自
身により同定されるペプチドがアポトーシス、細胞死、細胞分裂の喪失または細
胞増殖の減少を誘導する。これは、改めて、または血管壁増殖を阻害するアンギ
オスタチンのような既知ペプチド物質に対するランダム化に基づき、行い得る。
他に、本発明の方法は、他の癌治療(例えば、薬剤または放射線)と組合せて、細
胞を感作することよって、第二物質にさらした後、急速で特殊なアポトーシス、
細胞死、細胞分裂の喪失または細胞増殖の減少を誘導する。同様に、本発明の方
法を既知癌治療と組合せて使用し、より効果的であるかまたはより毒性の少ない
治療をするアンタゴニストをスクリーニングし得る。これは、化学治療剤が、タ
キソールのように生産が非常に高価であるときに特に好ましい。
【０２９６】 ｖ−ＡｂＩ、ｖ−Ｓｒｃ、ｖ−Ｒａｓおよび他のもののような既知腫瘍遺伝子
は、特定細胞中にトランスフェクトするときに異常な細胞増殖生ずる形質転換表
現型を誘発する。これは、マイクロ−メタスターゼに伴う主な問題である。その
ため、好ましい実施態様では、非形質転換細胞をこれらの腫瘍遺伝子でトランス
フェクトし、次いでランダムライブラリーをこれらの細胞に導入し、形質転換状
態を逆転させるかまたは正す生体活性ペプチドを選択し得る。細胞の腫瘍遺伝子
形質転換のシグナル特徴の一つは、接触阻害および軟寒天における増殖能の喪失
である。形質転換ウイルスをｖ−ＡｂＩ、ｖ−Ｓｒｃ、またはｖ−Ｒａｓを含む
ようにＩＲＥＳ−ｐｕｒｏレトロウイルスベクター中に構成し、標的３Ｔ３細胞
に感染させ、プロマイシン選択すると、すべての３Ｔ３細胞が高形質転換し、プ
レートから分離する。当該細胞を新しい培地で洗浄することにより取り除き得る
。これは、生体活性ペプチドを発現する細胞がプレートに付着したままでありコ
ロニーを形成するため、スクリーニングの基礎としての役割をし得る。
【０２９７】 同様に、特定の腫瘍型の増殖および／または分散は、特定腫瘍の表面における
レセプターに結合する増殖因子およびサイトカイン(ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、Heregul
inおよび他のもの)からの刺激性応答により促進される。好ましい実施態様では
、本発明の方法を用い、腫瘍細胞を刺激する増殖因子またはサイトカインの能力
を阻止することができる生体活性ペプチドを発見することにより、腫瘍増殖およ
び／または分散を阻害または停止する。増殖因子またはサイトカインの付加を伴
う特定腫瘍細胞中へのランダムライブラリーの導入の後、当該増殖因子またはサ
イトカインへのこれら腫瘍細胞の、結合、信号伝達、表現型化および／または機
能性の応答を阻止する生体活性ペプチドを選択する。
【０２９８】 同様に、癌細胞の分散(侵入および転移)は癌治療の成功を制限する重要な問題
である。特定腫瘍細胞の侵入および／または転移の阻害能は、癌治療において重
要な進歩となろう。高い転移可能性を有することが知られている腫瘍細胞(例え
ば、黒色腫、肺細胞癌、乳癌および卵巣癌)は、それらに導入されたランダムラ
イブラリーを有し得、転移または侵入検定法において選択されるペプチドは、特
定腫瘍細胞の転移および／または侵入を阻害する。転移をより特異的に阻害し得
る、転移表現型を阻害する特定適用は、転移サプレッサー遺伝子ＮＭ２３を含み
、それはジヌクレオシドジホスフェートキナーゼをコードする。そのため、この
遺伝子の細胞内ペプチドアクチベーターが転移を阻止し得、そのアップレギュレ
ーション(レポーター遺伝子との融合により)のスクリーニングが目的である。多
くの腫瘍遺伝子もまた転移を促進する。突然変異ＲＡＳ腫瘍遺伝子、ｖ−ＭＯＳ
、ｖ−ＲＡＦ、Ａ−ＲＡＦ、ｖ−ＳＲＣ、ｖ−ＦＥＳおよびｖ−ＦＭＳを不活性
化するかまたは拮抗するペプチドは抗転移剤としても作用し得る。マトリクスメ
タロプロテアーゼやウロキナーゼなどの侵入を必要とするプロテアーゼの組合せ
の放出を阻止するように細胞内的に作用するペプチドは、有効な抗転移剤でもあ
り得る。
【０２９９】 好ましい実施態様では、本発明のランダムライブラリーを、腫瘍サプレッサー
遺伝子を不活性化するとして知られる腫瘍細胞中に導入する。ノックアウトの再
反応または補償の何れかによる逆転に成功したことは、通常の表現型の再生によ
りスクリーニングし得る。主な例は、ｐ５３不活性変異の逆転である。これは、
５０％またはそれ以上の癌に存在する。ｐ５３の作用は複雑であり、転写因子と
して作用を含むため、ペプチドから分離されるペプチドまたは小分子が変異を逆
転する多くの可能な方法が存在する。一つの例は、直ぐ下流のサイクリン−依存
キナーゼｐ２１ＣＩＰ１／ＷＡＦ１のアップレギュレーションである。有用であ
るためにその逆転は、多くの種々の既知ｐ５３変異で機能しなければならない。
これは、現在、遺伝子治療で使用されている；これをなす１以上の小分子が好ま
しい。
【０３００】 他の例は、ｂｒｃａ−１またはｂｒｃａ−２遺伝子、および細胞−細胞結合の
成分であるアデノーマポリポシス大腸菌遺伝子(ＡＰＣ)およびDrosophila discs
−巨大遺伝子(ＤＩｇ)のような乳癌において重要な他の腫瘍サプレッサー遺伝子
の構造性機能を回復する生体活性ペプチドのスクリーニングを含む。ｂｒｃａ−
１の変異は、遺伝的な卵巣癌および乳癌において重要であり、本発明の更なる適
用を構成する。
【０３０１】 好ましい実施態様では、本発明の方法を用い、患者の癌由来の新規細胞系を作
成する。プログラム化細胞死の最終的な通常経路を阻害するレトロウイルス性送
達の短いペプチドでは、確立された短−および可能ならば長−期間の細胞系が見
込まれる。インビトロ培養の条件およびヒト白血病細胞の感染が確立され得る。
生理学的および薬理学的研究が十分に見込まれる長さの培養における特定腫瘍細
胞を維持する方法を実質的に必要とする。現在、幾つかのヒト細胞系は、細胞の
実存の生理学を十分に変えるＥｂｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルスのような形質転
換物質の使用により確立されている。時折、細胞は培養において独立して増殖す
るが、これはランダムな事象である。プログラム化細胞死(アポトーシス)は細胞
の非炎症性破壊を誘発する細胞の特性変化を生ずる最終的な通常経路を最終的に
活性化する細胞内の複雑な信号伝達経路を通じて生ずる。腫瘍細胞は、インビボ
で高いアポトーシスの割合(index)またはアポトーシスとなる傾向を有すること
が十分知られている。細胞を培養中におくと、悪性の細胞増殖のインビボの刺激
が除かれ、細胞は容易にアポトーシス引き起こす。当該目的は、任意の多くの第
一腫瘍細胞、例えば第一ヒト白血病細胞由来の細胞系を確立する技術を、これら
細胞における信号伝達経路の天然の構成を変化させない再生産性の方法で、発展
させることである。アポトーシスを阻害するペプチドをコードする核酸を導入す
ることにより、インビトロの細胞生存率が増大し、それ故に、第一ヒト腫瘍細胞
における信号伝達トランスダクション経路を研究する機会が生ずる。加えて、こ
れらの方法は第一細胞、すなわち非腫瘍性細胞の培養に使用され得る。
【０３０２】 好ましい実施態様では、本発明は心臓血管適用に有用である。好ましい実施態
様では、心筋細胞は、通常の創傷条件下、以下に限らないが、例えばアドリアマ
イシン(adriamycin)で処置後の心臓機能不全；無酸素症、例えば冠状動脈閉塞；
活性化リンパ球様細胞の攻撃による自己免疫細胞性損傷(例えば後ウイルス性心
筋炎(post viral myocarditis)および狼瘡に見られるような)の防止のための毒
性薬剤(特に化学治療剤)の存在が含まれる条件下、細胞損傷または死の防止をス
クリーニングし得る。候補生体活性ペプチドを心筋細胞内に導入し、当該細胞を
傷害にさらし、生体活性ペプチドを、任意のまたはすべてのアポトーシス；膜脱
分極(すなわち、傷害の不整脈発生可能性の減少)；細胞肥大;または特定細胞内
イオンの浸出、第二メッセンジャーおよび活性化分子(例えば、アラキドン酸お
よび／またはリゾホスファチジン酸)を防止するように選択する。
【０３０３】 好ましい実施態様では、本発明を用い、心筋細胞中の不整脈を減少する可能性
についてスクリーニングする。当該スクリーニングには、候補生体活性ペプチド
をコードする候補核酸の導入、その後の不整脈発生性傷害の適用が含まれ、細胞
膜の特定分極化を阻止する生体活性ペプチドのスクリーニングを伴う。これは、
パッチクランプを用いるかまたは蛍光技術により検出され得る。同様に、心筋細
胞中のチャンネル活性(例えば、カリウムおよび塩化物チャンネル)は、収縮性を
促進し不整脈を防止または減少するために本発明の方法を用い調節され得る。
【０３０４】 好ましい実施態様では、本発明を用い、心筋細胞の促進収縮性でスクリーニン
グし、心臓機能不全の可能性を減少する。本発明のライブラリーの導入、その後
に蛍光技術を用いるミオシン重合化／脱重合化の変化率の測定を行うことができ
る。この現象の変化率を増大する生体活性ペプチドにより、ジギタリス製剤に見
られる効果と同様な、全心筋の収縮性応答が大きくなる。
【０３０５】 好ましい実施態様では、本発明は、不整脈を防止するために心筋細胞中におけ
る細胞内および筋繊維鞘カルシウムサイクリングを調節する物質の同定に有用で
ある。生体活性ペプチドを、ナトリウム−カルシウム交換、ナトリウムプロトン
ポンプ機能、およびカルシウムＡＴＰａｓｅ活性を調節するように選択する。
【０３０６】 好ましい実施態様では、本発明は、動脈およびストロークを誘発する小動脈(
および腎臓機能不全および四肢虚血を誘発する他の閉塞事象)における塞栓現象
を減少する薬剤の同定に有用であり、心筋梗塞に陥るアンギナを選択する。例え
ば、生体活性ペプチドは血小板および白血球の接着を減少させ、そのため閉塞事
象を減少する。このセッティングにおける接着は、本発明のライブラリーを内皮
細胞(静止細胞、またはサイトカインにより活性化される細胞、すなわち、ＩＬ
−１、および成長因子、すなわち、ＰＤＧＦ／ＥＧＦ)に挿入し、次いで、１)内
皮細胞の表面における接着分子発現をダウンレギュレート(結合検定法)し；２)
これらの細胞の表面における接着分子活性化を阻止(信号伝達検定法)し；または
３)接着細胞における同種レセプターに結合するレセプターを阻止するオートク
リン型ペプチドを放出する、これら何れかのペプチドをスクリーニングすること
により、阻害され得る。
【０３０７】 塞栓現象は、内皮細胞の細胞表面上のタンパク質分解性酵素を活性化し、それ
により血塊を消化し得る活性化酵素を放出することによっても位置付けられ得る
。そのため、本発明のライブラリーの内皮細胞への送達が行われ、その後に、既
知基質に対する細胞表面におけるタンパク質分解活性をモニターし得る標準的蛍
光発生性検定法を行い得る。次いで、生体活性ペプチドは、特定基質に対し特定
酵素を活性化するように選択され得る。
【０３０８】 好ましい実施態様では、脈管炎および後−梗塞のセッティングにおける動脈炎
症は、白血球および単核白血球の走化性応答を減少することにより調節し得る。
これは、走化性レセプターおよびこれら細胞におけるそれらの応答経路を阻止す
ることにより行い得る。候補生体活性ライブラリーをこれらの細胞中に挿入し、
ケモカインとは異なる走化性応答(例えば、ケモカインのＩＬ−８ファミリー、
ＲＡＮＴＥＳ)を細胞移動検定法で阻害し得る。
【０３０９】 好ましい実施態様では、冠状血管形成後の動脈再狭窄は、脈管内膜細胞、およ
び毛細管および／または動脈の内皮細胞の増殖を調節することにより制御され得
る。候補生体活性ペプチドライブラリーをこれら細胞型に導入し、特定刺激に対
する応答の増大をモニターし得る。一つの適用は、増殖を停止する平滑筋細胞に
おけるｃ−ｍｙｃおよび他の腫瘍遺伝子の発現または機能を阻止する細胞内ペプ
チドであり得る。第二の適用は、選択的にアポトーシスを誘発させる脈管平滑筋
細胞におけるライブラリーの発現を含み得る。これらペプチドから誘導される小
分子の適用は、標的薬剤送達を必要とし得、これは、ステント、ヒドロゲル被覆
および注入に基づくカテーテルシステムで可能である。エンドセリン−１Ａレセ
プターをダウンレギュレートするか、または可能性ある血管収縮神経薬および脈
管平滑筋細胞有糸分裂誘起物質エンドセリン−１の放出を阻止するペプチドをも
治療の候補となり得る。ペプチドは、これら細胞の増殖阻害するライブラリー、
または血小板(ＰＤＧＦ)および単核白血球のようなオートクリン増殖因子を放出
することが知られる循環における他の細胞の接着を防止するライブラリーから単
離され得る。
【０３１０】 毛細管および血管の増大の制御は、虚血領域(増殖)への血流増大を促進するか
または腫瘍の血液供給(脈管形成阻害)を遮るための重要な目標である。候補生体
活性ペプチドライブラリーを毛細管内皮細胞中に導入して増殖をモニターし得る
。低酸素圧力および種々の程度の脈管形成因子のような刺激が当該応答を調節し
得、そして適当な表現型を生ずるようにペプチドを単離し得る。脈管形成に重要
な脈管内皮細胞増殖因子のアンタゴニズムのスクリーニングも有用となり得る。
【０３１１】 好ましい実施態様では、本発明の方法は、ＬＤＬおよびＨＤＬ代謝を調節する
ペプチドを発見する機構を生ずるアテローム性動脈硬化の減少でスクリーニング
に有用である。候補ライブラリーは適当な細胞(肝細胞、単核白血球、内皮細胞
を含む)中に導入され得、ペプチドは、ＬＤＬの放出減少またはＬＤＬの合成減
少を誘発し、または逆に言えばＨＤＬの放出増加またはＨＤＬの合成増加を誘発
するように選択され得る。生体活性ペプチドはまた、酸化ＬＤＬの生産を減少す
る候補ライブラリー、それはアテローム性動脈硬化に含まれ、アテローム性動脈
硬化損傷から単離される候補ライブラリーから単離され得る。これは、その発現
の減少、減少システムもしくは酵素の活性化、またはマクロファージにおける１
５−リポキシゲナーゼのような酸化ＬＤＬの生産が含まれる酵素の活性化または
生産を阻止することにより生じ得る。
【０３１２】 好ましい実施態様では、本発明をスクリーニングで使用し、食物吸収機構の調
節または代謝を調節するレセプター信号伝達経路の応答の減少を調節する。ニュ
ーロペプチドＹ(ＮＰＹ)、コレシストキニンおよびガラニンレセプターの存在を
調節または阻害する生体活性ペプチドが特に望ましい。候補ライブラリーを細胞
に導入し、これらのレセプターをそれらにクローニングし、阻害ペプチドを、ガ
ラニンおよびＮＰＹへの信号伝達応答を阻止するオートクリン型において分泌す
るように選択する。同様に、レプチンレセプターを調節するペプチドを見つけ得
る。
【０３１３】 好ましい実施態様では、本発明は、神経生物学的適用に有用である。候補ライ
ブラリーは、ニューロン機能の保護およびニューロンの死を防止のための抗アポ
トーシスのスクリーニングに使用し得る。初期スクリーニングは細胞培養中で行
い得る。一つの適用には、アポトーシスにより、ストロークから生ずる大脳虚血
におけるニューロン死の防止を含み得る。アポトーシスは、ニューロンアポトー
シス阻害タンパク質(ＮＡＩＰ)により阻止されることが知られ、アップレギュレ
ーションをスクリーニングし、または効果的な任意の結合ステップは、ニューロ
ンのアポトーシスを選択的に阻止するペプチドを生じ得る。他の適用には、アル
ツハイマー病およびハンティングトン病のような神経組織変性を含む。
【０３１４】 好ましい実施態様では、本発明は、骨生物学的適用に有用である。破骨細胞は
、“古い”骨を破壊することによる骨の再合成において鍵の役割をすることが知
られており、そのため、骨芽細胞は“新しい”骨のもとにおかれる。骨粗鬆症で
は、この過程の平衡異常を有する。破骨細胞過剰活性は、これらの細胞に候補ラ
イブラリーを導入し、次いで、１)これら細胞により減少過程のコラーゲン、２)
骨片に形成する減少ピット形成；および３)骨断片からのカルシウム放出の減少
を生ずる生体活性ペプチドを探索することにより調節し得る。
【０３１５】 本発明の方法は、骨形態形成タンパク質、新規骨形成(例えば上皮小体ホルモ
ンおよびカルシトニンに類似する型で)を刺激、調節または促進するホルモン擬
似体のアゴニストのスクリーニングにも使用し得る。これらは骨粗鬆症において
不完全な骨折の治癒に使用され、新しい骨折の治癒率を加速する。更に、結合組
織源の細胞系を候補ライブラリーで処理し、標的骨芽細胞におけるその増殖、増
加、コラーゲン刺激活性および／またはプロリン導入能でスクリーニングし得る
。他に、候補ライブラリーは、骨芽細胞または軟骨細胞で直接発現し得、コラー
ゲンまたは骨の増加産物をスクリーニングし得る。
【０３１６】 好ましい実施態様では、本発明の方法は、皮膚生物学的適用に有用である。種
々の刺激に対するケラチン生成細胞応答は、乾癬、これらの細胞の増殖の変化を
生じ得る。候補ライブラリーは活性化乾癬プラークから取り除かれた細胞に導入
され得、生体活性ペプチドはこれら細胞の増殖率を減少するように単離され得る
。
【０３１７】 好ましい実施態様では、本発明の方法は、ケロイド形成(すなわち、過剰な傷
跡)の調節または阻害に有用である。候補ライブラリーを、この条件を伴う個体
から単離された皮膚結合組織細胞に導入し、生体活性ペプチドを増殖、コラーゲ
ン形成またはプロリン導入を減少するように単離した。これらの働きの結果、火
傷患者においても生じる過剰な傷跡の処置が拡大し得る。通常のペプチドモチー
フがケロイド作用の状況下で見られる場合、次いで、それは、火傷後の傷を少な
くする局所的方法において広く使用され得る。
【０３１８】 同様に、糖尿性潰瘍の傷の回復ならびに皮膚および四肢における他の慢性的“
回復機能不全”の症状は、皮膚および皮膚層におかれる細胞に追加増殖シグナル
を供することにより調節され得る。増殖因子擬似体は、実際にこの病状に非常に
有用と成り得る。候補ライブラリーは皮膚結合組織細胞に導入され得、生体活性
ペプチドは、低酸素圧、低ｐＨ、および炎症仲介体の存在のような“過酷な”条
件下でこれらの細胞の増殖が促進されるように単離される。
【０３１９】 本発明の薬用化粧品の適用は、皮膚のメラニン細胞におけるメラニン生成の制
御を含む。天然に生ずるペプチド、アルブチンはチロシンヒドロキシラーゼ阻害
剤、メラニン合成において鍵となる酵素である。候補ライブラリーをメラニン細
胞に導入し得、細胞に適用されるメラニンの合成を増加する刺激が知られている
。生体活性ペプチドは、これらの条件下のメラニン合成を阻害するように単離さ
れ得る。
【０３２０】 好ましい実施態様では、本発明は、内分泌学的適用に有用である。レトロウイ
ルスペプチドライブラリー技術は、信号伝達ペプチドまたはタンパク質を含む、
任意の内分泌、増殖因子、サイトカインまたはケモカインネットワークに広く適
用できる。その信号伝達ペプチドまたはタンパク質は、レセプターに結合するか
レセプターを二量体化する内分泌、傍分泌またはオートクリン型の何れかにおい
て作用し、そして既知の表現型的または機能的結果を生ずる信号伝達カスケード
を活性化し得る。当該方法は、望ましいホルモン(すなわち、インシュリン、レ
プチン、カルシトニン、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＥＰＯ、ＧＭＣＳＦ、ＩＬ１−１７
擬似体)を模倣するか、その作用を阻害するか何れかのペプチドを単離するため
に適用する。その作用阻害は、ホルモン放出の阻止、特定レセプターもしくは担
体タンパク質(例えばＣＲＦ結合タンパク質)への結合阻止、もしくは当該ホルモ
ンを特異的に標的とする細胞の細胞内応答阻害の何れかによる。ホルモンを正常
に生ずる細胞からのホルモンの発現または放出を増加するペプチドの選択は、ホ
ルモン欠損の病状に広く適用され得る。
【０３２１】 好ましい実施態様では、本発明の方法は感染疾患の適用に有用である。ウイル
ス潜在(ＣＭＶ、ＥＢＶ、ＨＢＶのようなヘルペスウイルスおよびＨＩＶのよう
な他のウイルス)およびその再発は、免疫抑制患者(ＡＩＤＳ患者および移植患者
)に特に重要な問題である。これらのウイルスの再発および分散の阻止能力が重
要な目的である。保有することが知られるかまたは潜在性のウイルス感染の疑い
のある細胞系は特定ウイルスに感染し得、刺激は、再発およびウイルス複製の誘
発が見られるこれらの細胞に適用される。これに続き、培地中のウイルス力価を
測定し、表現型変化について細胞を評価し得る。次いで、候補ライブラリーを上
記条件下でこれらの細胞に導入され得、ペプチドはウイルスの増殖および／また
は放出を阻止または減少するように単離し得る。化学治療の場合のように、これ
らの実験は、この結果に対し部分的に効果的であるのみである薬剤を用いても行
い得、そして生体活性ペプチドはこれらの薬剤の殺ウイルス剤効果を促進するよ
うに単離され得る。
【０３２２】 多くのうちの一つの例は、ＨＩＶ−１感染阻止能である。ＨＩＶ−１は、レセ
プターに連結する個々の７貫通膜Ｇ−タンパク質の一つとなり得るＣＤ４および
共レセプターを必要とする。マクロファージの感染の場合では、ＣＣＲ−５は共
レセプターを必要とし、ＣＣＲ−５における阻止がＨＩＶ−１感染に対し耐性と
なるという強力な証明がある。この陳述の証明には２つの系が存在する。第一に
、ＣＣＲ−５の天然リガンド、ＣＣケモカインＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ１ａおよび
ＭＩＰ１ｂはＨＩＶに対する耐性を仲介するＣＤ８＋に応答し得ることが知られ
ている。第２に、ＣＣＲ−５の変異対立遺伝子の個々の同型接合体は、完全にＨ
ＩＶ感染に耐性である。そのため、ＣＣＲ−５／ＨＩＶ相互作用の阻害剤は、生
物学者および臨床医の両方が多くの関心を寄せている。細胞外で固定される構成
は、その発見のための画期的なツールを提供する。貫通膜、エピトープタグ化、
グリシン−セリン連結構成中に、通常配列CNNNNNNNNNNCまたはC-(X)n-Cのランダ
ム環状化ペプチドライブラリーをおき得る。次いで、ライブラリーを含むレトロ
ウイルスでＣＣＲ−５を発現する細胞系を感染させる。ＣＣＲ−５に抗体を用い
、レセプターに対するこの抗体の結合に基づき望ましい細胞を分類するべくＦＡ
ＣＳを使用し得る。抗体に結合しないすべての細胞は、この抗体結合部位の阻害
剤を含むとみなされる。レトロウイルス構成におけるこれらの阻害剤は、ＨＩＶ
−１進入を阻害する能力を更に検定法し得る。
【０３２３】 ウイルスは、細胞に結合する特定レセプターを用い細胞に入り(例えば、ＨＩ
ＶはＣＤ４を使用し、コロナウイルスはＣＤ１３を使用し、マウス白血病ウイル
スは輸送タンパク質を使用し、はしかウイルスはＣＤ４４を使用する)、細胞と
融合することが知られている。候補ライブラリーは、これらのウイルスに許容さ
れることが知られる標的細胞中に導入され得、生体活性ペプチドはこれらのウイ
ルスの結合能を阻止し特定標的細胞と融合するように単離し得る。
【０３２４】 好ましい実施態様では、本発明は感染生体での使用が発見されている。マイコ
バクテリア、リステリア、サルモネラ、ニューモシスチス、エルシニア、リーシ
ュマニア、T. cruziのような細胞内生体は、細胞内で維持され複製され、免疫抑
制患者において活性化する。現在、市場における、開発中の薬剤が存在し、それ
らはこれらの生体に対し部分的に効果的か効果的でないのみの何れかである。候
補ライブラリーは、これらの生体(感染前または後)で感染した特定細胞中に導入
され得、生体活性ペプチドは、マゲイニンと同様の細胞内“抗生作用性ペプチド
”に類似の型のこれら生体の細胞内破壊を促進するように選択され得る。更に、
ペプチドは、ペプチド自身では効力が不十分である研究の基に既にある薬剤の致
死性を促進するが、候補ライブラリー由来の特定ペプチドと組合せる際に相乗的
機構を通じて劇的により効果的となるように選択され得る。最終的に、生体活性
ペプチドは、鍵となる生体事象の阻害による細胞内ライフサイクルを終えるよう
な方法で、これら細胞内生体の代謝を変えるように単離され得る。
【０３２５】 広く使用されている抗生作用薬剤は、特定用量依存、組織特異的毒性を有する
。例えば、腎毒性はゲンタマイシン、トブラマイシンおよびアンフォテリシンの
使用に見られ、肝細胞毒性はＩＮＨおよびリファンピンの使用に見られ、骨髄毒
性はクロラムフェニコールで見られ、血小板毒性はチカルシリンなどで見られる
。これらの毒性はその使用を制限する。候補ライブラリーは特定細胞型に導入さ
れ得、この場合、抗生物質による細胞性損傷またはアポトーシスを誘発する特定
変化を生じ、生体活性ペプチドは、これらの細胞をこれらの特定抗生物質で処理
する際に保護が供与されるように単離され得る。
【０３２６】 更に、本発明により、抗生物質輸送機構を阻止する生体活性ペプチドのスクリ
ーニングにおける使用が発見されている。特定抗生物質の血流からの急速な分泌
がその有用性を制限する。例えば、ペニシリンは、腎臓における特定輸送機構お
よび脳における脈絡叢により急速に分泌される。プロべネシッドは、この輸送を
阻止し、血清および組織レベルを増加することが知られている。候補物質は、腎
細胞から誘導された特定細胞および抗生物質用の活性化輸送機構を有することが
知られる脈絡叢の細胞中に導入し得る。次いで、生体活性ペプチドは、特定抗体
の活性化輸送を阻止し、それによるこれら薬剤の血清半減期を延長するように単
離され得る。
【０３２７】 好ましい実施態様では、本発明の方法は、薬剤毒性および薬剤耐性適用に有用
である。薬剤毒性は、重要な臨床上の問題である。これは、特定の組織または細
胞の損傷を示すことで明白となり、薬剤の効果が制限される。例には、高い用量
の癌化学治療における脊髄断裂、気道および消化管における上皮細胞の損傷、お
よび毛髪喪失が含まれる。特定の例には、アドリアマイシン誘導性心筋細胞死、
シスプラチニン誘導性腎毒性、ビンクリスチン誘導性消化管運動性疾患およびシ
クロスポリン誘導性腎損傷が含まれる。候補ライブラリーは、特徴的な薬剤誘導
性表現型または機能性応答を伴う特定細胞型に導入でき、薬剤の存在下で薬剤に
さらされる際の毒性変化に対し特定細胞型を逆転または保護する。これらの効果
は、目的の細胞のアポトーシスを誘導する薬剤を阻止することで明らかとなるの
で、初期スクリーニングは、組合せ化学治療で使用される高いレベルの薬剤また
は薬剤の組合せの存在下で、細胞の生存について行う。
【０３２８】 薬剤毒性は、特定細胞に非常に毒性のある肝臓または腎臓において生ずる特定
代謝物に起因し得るか、または投与薬剤の代謝を阻止または促進する肝臓におけ
る薬剤相互作用に起因し得る。候補ライブラリーは肝臓または腎臓細胞に導入さ
れ得、その後、毒性代謝物を生ずることが知られる当該薬剤にこれらの細胞をさ
らす。どのように肝臓または腎臓細胞が薬剤を代謝するかを変化する生体活性ペ
プチドを単離することができ、特定毒性代謝物の誘発を防止するような特定の物
質を同定できる。当該代謝物の発生の後にマススペクトロメトリーを行い、表現
型の変化を顕微鏡で評価し得る。そのスクリーニングは、毒性代謝物に特に感受
的なリードアウト細胞と共培養した培養肝細胞中でも行い得る。適用は、薬剤代
謝に含まれる酵素の可逆性(毒性に制限される)阻害剤を含む。
【０３２９】 多剤耐性、およびそれによる腫瘍細胞選択、副産物および再発は、癌患者に病
的状態および死亡をもたらす。候補ライブラリーは、特定または多剤耐性が示さ
れている腫瘍細胞系(第一および培養)に導入し得る。次いで、生体活性ペプチド
は、細胞が目的薬剤または組合せ化学治療で使用する薬剤にさらされる際に薬剤
感受性を供与するように同定し得る。当該リードアウトは、これら細胞のアポト
ーシス、膜浸透性変化、すなわち細胞内イオンおよび蛍光マーカーの放出を開始
し得る。多剤耐性が膜輸送を含む細胞を蛍光輸送基質でプレロードし得、選択は
、これらの細胞からの蛍光薬剤の通常流出を阻止するペプチドに実施し得る。候
補ライブラリーは、あまり特徴付けられていないか最近発見された、細胞内耐性
機構、またはＬＲＰ(肺耐性タンパク質)を含む機構のようなケモセンシタイザー
が現在わずかに存在するか全く存在しない機構を逆転するペプチドのスクリーニ
ングに特に適当である。このタンパク質は、卵巣癌、転移悪性黒色腫、および急
性骨髄白血病において多剤耐性を保有する。特に、関心が惹かれる例には、単一
細胞における１以上の重要な耐性機構を逆転する物質のスクリーニングが含まれ
、その細胞は、殆どの薬剤耐性細胞の部分集合中に生じ、重要な標的でもある。
適用には、転移黒色腫における耐性細胞の処置のため、急性骨髄白血病における
ｐ−グリコプロテインおよびＬＲＰの阻害剤のため、および全耐性細胞(pan-res
istant cell)を処理する３つすべての細胞の阻害(任意の機構により)のため、Ｍ
ＲＰ(多剤耐性関連タンパク質)およびＬＲＰ両方のペプチド阻害剤のスクリーニ
ングが含まれ得る。
【０３３０】 好ましい実施態様では、本発明の方法は、現存のまたは開発の薬剤の実施の改
善に有用である。経口投与薬剤の初回通過代謝は、経口生存能力を制限し、望ま
しい効果のため薬剤をさらに投与する効率および必要性を減少させ得る。初回通
過代謝に含まれる酵素の可逆性阻害剤は、これら薬剤の効率を促進する有用な添
加物となり得る。肝臓で初回通過代謝が生じ、そのため、相当する触媒性酵素の
阻害剤が同種薬剤の効果を促進し得る。可逆性阻害剤は、目的の薬剤と同時にま
たはわずかに前に送達され得る。特に疑問のあるアイソザイムの阻害剤(タンパ
ク質ダウンレギュレーションおよび活性の直接阻害のような任意の機構により)
のための肝細胞の候補ライブラリーのスクリーニングが目的となり得る。これら
には、シトクロムＰ４５０のＣＹＰ３Ａ４アイソザイムが含まれ、それには、抗
ＨＩＶ薬剤サキナビルおよびインジナビル(indinavir)の初回通過代謝が含まれ
る。他の適用には、薬剤に依存する、ＵＤＰ−グルクロニルトランスフェラーゼ
、スルホトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、エポキシドヒ
ドロラーゼ、およびグルタチオンＳ−トランスフェラーゼの可逆性阻害剤が含ま
れ得る。スクリーニングは、培養肝細胞または肝臓ミクロソーム中で行い得、代
謝物が非変形薬剤とは異なる生体活性を有する場合、肝臓または共培養リードア
ウト細胞において実施した特定修飾を認識する抗体を含み得る。スクリーニング
が薬剤の変化の欠失であったならば、当該薬剤を修飾する酵素を知る必要性はな
い。
【０３３１】 好ましい実施態様では、本発明の方法は、免疫生物学、炎症およびアレルギー
応答適用に有用である。Ｔリンパ球応答の選択調節は、特定方法における免疫仲
介疾患を修飾するのため、望ましい目標である。候補ライブラリーは、特定Ｔ細
胞部分集合(ＴＨ１、ＴＨ２、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋および他のもの)に導入され得
、その応答は、ライブラリーのメンバーにより修飾されたその部分集合(抗原に
対する応答におけるサイトカイン生成、細胞毒性、増殖が単核白血球および他の
ものによって見られる)を特徴付ける。物質は、既知Ｔ細胞部分集合生理学的応
答を増加または減少するように選択され得る。このアプローチは、多数の条件に
有用であり、１)耐性状態の誘発が要求される自己免疫疾患が(自己抗原発生細胞
の認識からＴ細胞部分集合を阻害するペプチドを選択する)；２)ＩｇＥ産生細胞
の刺激の減少が要求されるアレルギー疾患が(ＩｇＥ産生のスイッチを誘発する
特定Ｂ細胞刺激サイトカインのＴ細胞部分集合からの放出を阻止するペプチドを
選択する)；３)選択的免疫抑制の誘発が要求される移植患者に(外来抗原に対す
る宿主Ｔ細胞の増加応答を減少するペプチドを選択する)；４)化学治療および／
または放射線に特定Ｔ細胞腫瘍の増殖または感受性化を阻害が要求されるリンパ
組織増殖性状態に；５)Ｆａｓリガンド生成腫瘍細胞による細胞毒性Ｔ細胞の死
滅の阻害が要求される腫瘍サーベイランスに；５)疾患原因Ｔ細胞(選択的アポト
ーシスを促進する)の増殖阻害、その結果として生ずる標的組織の選択破壊(それ
ぞれ軟骨、結合組織、乏突起神経膠細胞、腸内皮細胞)が要求される、リュウマ
トイド炎症、結合組織疾患(ＳＬＥ)、多発性硬化症、および炎症性腸疾患のよう
なＴ細胞仲介炎症疾患に、含まれる。
【０３３２】 Ｂ細胞応答の調節は、特定Ｂ細胞部分集合により産生および分泌される免疫グ
ロブリンの型および量のより選択的な修飾を許容する。候補ライブラリーは、Ｂ
細胞に導入され得、生体活性ペプチドは、特定免疫グロブリンの放出および合成
を阻害するように選択され得る。これは、ＩｇＥのような自己抗体の過剰産生お
よびアレルギー原因抗体の産生により特徴付けられる自己免疫疾患に有用となり
得る。物質はまた、自己にとっては何れかの外来物である特定抗原に対する特定
免疫グロブリンサブクラスの結合を阻害または促進するように決定され得る。最
終的に、物質は、特定細胞型におけるレセプターに対する特定免疫グロブリンサ
ブクラスの結合を阻害するように選択され得る。
【０３３３】 同様に、サイトカイン産生に影響を与える物質は、２つの細胞システムを通常
用いて選択され得る。例えば、マクロファージ、単核白血球などから産生するサ
イトカインが上昇し得る。同様に、擬似サイトカイン、例えばエリトロポエチン
(erythropoetin)およびＩＬ１−１７が選択され得るか、またはＴＮＦ−αのよ
うなサイトカインに、それがレセプターに結合する前に、結合する物質が選択さ
れ得る。
【０３３４】 単核白血球(ＭＬ)により処理される抗原は、外来タンパク質を認識および除去
する免疫システム能の初期ステップに重要である。候補物質は、ＭＬ細胞系に導
入され得、物質は、クラスＩＩＭＨＣの関連における細胞表面上のＭＬによりＴ
細胞に提示される外来ペプチドの配列および外来ペプチドの細胞内処理を変化さ
せるように選択し得る。特にＴ細胞部分集合(例えば、ペプチドは実質的にワク
チンとして作用し得る)の免疫応答を促進するライブラリーのメンバーを探索し
得るか、またはより強固にＭＨＣに結合するライブラリーメンバーを探索し得る
。そのため、天然に発生するペプチドが置換されるが、それでも、当該物質は、
免疫原性は小さくなり得る(特定Ｔ細胞クローンに対する刺激も小さくなる)。こ
の物質は、実質的に免疫耐性を誘発し得、および／または外来タンパク質に対す
る免疫応答を減少し得る。このアプローチは、移植、自己免疫疾患、アレルギー
疾患に使用され得る。
【０３３５】 炎症仲介物(サイトカイン、ロイコトリエン、プロスタグランジン、血小板活
性化因子、ヒスタミン、ニューロペプチド、および他のペプチドおよび脂質仲介
物)の放出は、異所性免疫応答の維持および増幅において鍵となる要素である。
候補ライブラリーは、特定の炎症応答に関係するＭＬ、マスト細胞、エオシン好
性白血球、および他の細胞に導入され得、生体活性ペプチドは、これらの各型の
仲介物の同種レセプターの合成、放出および結合を阻害するように選択され得る
。
【０３３６】 好ましい実施態様では、本発明の方法は、バイオテクノロジーの適用に有用で
ある。哺乳類細胞における候補ライブラリー発現は、タンパク質発現、タンパク
質折畳みまたはタンパク質分泌の修飾のような医薬関連の他の適用も考えられ得
る。一つのその例は、ＣＨＯまたは他の細胞中のタンパク質医薬の商業的生産で
ある。増加の細胞増殖率(恐らく、増殖因子を擬似化するか、または増殖因子シ
グナルトランスダクション経路のアゴニストとして作用するペプチド)、病原体
耐性(前のセクション参照)、シアリル化またはグリコシル化の欠失(グリコトラ
ンスフェラーゼを阻止するか、または細胞内タンパク質を別ルートで送達するこ
とによる)、オートクレーブした培地における増殖、または血清フリー培地にお
ける増殖で選択する生体活性ペプチドを生ずる候補ライブラリーは、すべての生
産性を増加し、タンパク質医薬の生産コストを下げ得る。
【０３３７】 循環細胞の表面において置換されるランダムペプチドをツールとして使用し、
器官、組織および細胞特異的ペプチド標的化配列を同定し得る。細胞表面を標的
とするライブラリーを発現する動物の血流に導入する任意の細胞が、特定の器官
および組織標的化で選択され得る。同定された生体活性ペプチド配列を、抗体、
酵素、薬剤、イメージング剤または器官標的化が望ましい物質に結合させ得る。
【０３３８】 本発明を用いて選択され得る他の物質には、１)レポーター遺伝子を伴う細胞
系を用いる転写因子の活性を阻止する物質；２)通常の細胞性機能、検出用の哺
乳類２ハイブリッドシステムまたは蛍光応答エネルギー転移機構の欠如を用い、
細胞内の２つの既知タンパク質の相互作用を阻止する物質；および３)ランダム
ペプチドをタンパク質結合領域に連結し、目的の機能領域に対し効果を局在化す
る立体的に近接する分子と、すなわち信号伝達経路内で相互作用することにより
同定し得る物質が含まれる。
【実施例】
【０３３９】 実施例１ ループ挿入部位の選択 一つの実施例は、組成物リンカー−試験配列−リンカーの配列の、最も挿入を
許容するであろう改変されたＧＦＰループ内の特定された部位への挿入に関する
。これらのループは、ベータ−can構造のもっとも強固な部分の可動性を十分超
えるループまたはループの先端における可動性を有することに基づいて選択され
ている(Yang et al., Nature Biotechnology 14, 1246-9,1996; Ormo et al., S
cience 273, 1392-5, 1996)。最も関心のもたれるループは、ＧＦＰの残りのベ
ータ−can構造へ強固には結合されていないループである; この強固な結合の欠
如が、ライブラリー構築物におけるループ内への配列付加について最も許容性を
与え得る。ループを、結晶構造中における最も高い温度因子を有するループとし
て選択することができる。それには、ＧＦＰ単量体におけるループ130-135、154
-159、172-175、188-193および208-216がある。ループの温度因子を、リンカー
におけるグリシンなどの順応性のあるアミノ酸を含ませることにより、人工的に
増大させることができる(以下参照)。
【０３４０】 もっとも有望な挿入部位を、ループの末端における残基を除去することにより
選択した。ループの側鎖は溶液中に伸長し、ＧＦＰβ−canまたはループの他の
部分のいずれにも接触していなかった。側鎖がＧＦＰの他の部分に結合したルー
プ残基を置換しないままとし、ランダム配列とＧＦＰループの強固な配座的結合
の可能性を最小化した。このことは、正しく折り畳まれないタンパク質を導き、
および／またはループの塩基を変形させることおよび衝突クエンチャーの蛍光団
への接触を可能にすることにより蛍光ＧＦＰ融合ランダムペプチドの数を減少さ
せてしまうものである。
【０３４１】 ループ 挿入体位置 １ 挿入体でasp 133を置き換え; 他の残基側鎖にカルボキシレートが結合する
のでglu 132を除去することができず; これは非常に短いループである ２ gln 157およびlys 156を完全な挿入体で置き換え; lys 156およびgln 157側
鎖が溶液中に突出し; asp 155とのlys 158イオンペアがループを閉じるのに役立
ち、これらは概して保持され; 多くの点における主要なタンパク体にasn 159が
接触するので、その除去を回避する ３ asp 173がループの外側の末端にあるので、それを挿入体で置き換え; 側鎖
が折り畳まれた構造において他の側鎖と接触するので、glu 172の置換を回避す
る; gly 174も置き換え得る ４ 残基１８９−１９２(gly-asp-gly-pro)を挿入体と置き換え; これはループ
ではなく２の分離された鎖に結合している鎖であり; Ｐ１９２、Ｇ１９１、Ｄ１
９０およびＧ１８９はすべて溶液に突出し、主要なタンパク体と強固な接触を形
成しないようであり; それらは置換可能なようである ５ asn 212、glu 213およびlys 214を挿入体で置き換え; lys 214側鎖は溶液に
突出し; ループにおいてglu 213の側鎖が他の側鎖に結合するのでglu 213はター
ンを形成するのに役立ち、そしてその置換はもとのループの配座を保持する問題
を引き起こす; asn 212側鎖は溶液に突出する
【０３４２】 実施例２ 試験挿入配列の選択 蛍光ＧＦＰ構築体に適当に折り畳むためのＧＦＰにおいて異なるループの挿入
または置き換えの最大数を可能とするために、もとのＧＦＰ構造と挿入された配
列間の、ループに挿入された実際のライブラリーを構成するリンカー配列を注意
深く選択することは、重要である。ＧＦＰ折り畳みにおける問題を避けるための
一つの方法は、ＧＦＰ構造自身から任意の挿入配列を配座的に分離し、ＧＦＰ構
造における局部的変形を最小化する。この構造は、折り畳み仲介物を脱安定化す
ることができ、または外生衝突蛍光クエンチャーのＧＦＰ包埋トリペプチド蛍光
団への接触をもたらすことができる(Phillips、前掲)。これは、ＧＦＰとライブ
ラリーの間に複数の高度に順応性のあるアミノ酸残基を挿入することにより実施
することができ、ＧＦＰにおける最小の配座的拘束を可能とする。１以上のグリ
シンは、この目的のために理想的である。グリシンは、アラニンよりも非常によ
り多くのｐｈｉ−ｐｓｉ空間に接触し、長い側鎖を有する残基よりも制限されな
いからである(Scheraga, H. A., (1992), “Predicting Three-dimensional str
uctures of oligopeptides”in Reviews in Computational Chemstry III, p. 7
3-142)。ＧＦＰ構造に影響を与えないループ挿入体の機会を最適化するために、
-(gly)n-をこれら２の配列間にライブラリーを含む各ループにおいて挿入する。
最小はｎ＝１であり、より最適にはｎ＞２である。
【０３４３】 最初の２の試験挿入体は：１：−ＧＧＧＧＹＰＹＤＶＰＤＹＡＳＬＧＧＧＧ−
および２：−ＧＧＧＧ−ＹＰＹＤ−ＧＧＧＧ−であった。第一の配列は、埋め込
まれたインフルエンザ・ヘマグルチニン(ＨＡ)エピトープタグを有し、二量体−
折り畳みスキャフォルドへ挿入されたエピトープをマッチさすために各末端に付
加されたグリシンを有する、１９量体の挿入体(およそ意図されるライブラリー
サイズ)であり、エピトープに対する順応性を付与し、ポリクローナル抗血清へ
結合する配座が可能となった。これにより、異なる構築体の発現レベルのウェス
タンブロットによる評価が可能となった。第二の挿入体の末端を切除して、短い
ペプチドのＧＦＰ蛍光に対する作用を試験する。
【０３４４】 実施例３ E.coli.において発現された、ループ１−５における試験挿入体１および２を有
するＧＦＰの平均蛍光 使用されたＧＦＰはＥＧＦＰ(Clontech Inc., Palo Alto, CA)であった。そし
て、２の試験配列を実施例１に記載した部位に挿入した。単一コロニーのクロー
ンに相当するバクテリアの等しい数(２００００)を、MoFlo細胞ソーター(Cytoma
tion Inc., Ft. collins, CO)において蛍光−活性化細胞ソーティングによって
分析した。ＦＬ１の強度の平均も算出した。相対蛍光強度を、(ＷＴ蛍光−ルー
プ挿入体の蛍光)／(ＷＴ蛍光−ｂｋｄ)×１００％として計算した。ループ１お
よび５における挿入体１を有する構築体は、クローンニングの困難さのために発
現されなかった。各ループ挿入体からの細胞溶解物の等しい量を、１０％ＳＤＳ
ゲルに流し、ＰＶＤＦにブロッティングした。ＧＦＰを、抗ＧＦＰ抗体で検出し
、バンドを、化学発光検出を使用して観察した。各バンドの強度を、Sharp JX-3
30スキャニング・デンシトメーターおよびBiolmageソフトウェアーを使用して測
定した。特異的蛍光を、ウェスタンブロットバンドの相対強度に対する相対蛍光
の割合として計算した。
【０３４５】
【表３５】 表１の結果は、E.coliにおいて、定義されたループ２、３および４挿入部位が
、１２量体および１９量体の挿入体の双方についてのＧＦＰ折り畳みおよび蛍光
を支持すること示している。一方、部位１および５における挿入体は、１２量体
の挿入体について蛍光を伴わないＧＦＰの発現をもたらす。ゆえに、これらの部
位におけるライブラリーは、ＧＦＰ蛍光以外の陽性選択についての他の方法を使
用するスクリーニングにとって有用であり得る。挿入部位２、３および４につい
て、各末端において複数のグリシンを有する１２量体の挿入体についての蛍光は
、野生型ＧＦＰの蛍光の少なくとも１０％である。１２量体の挿入体についての
最も高い蛍光を、ループ３部位における挿入によって取得した。一方、ループ４
からの蛍光が最も低かった。このことは、各構築体についての異なる発現レベル
のためであると思われた。より大きな１９量体の挿入体について、最も高い蛍光
を、ループ３部位における挿入によって再び得た。一方、ループ２部位への挿入
からの蛍光が最も低かった。これもまた、ループ３挿入体ＧＦＰについてのより
高い明らかな発現レベルのためである。さらに、最も高い特異的蛍光を、ループ
４によって取得した。このことは、ループ４へ挿入されたライブラリーが、ＧＦ
Ｐ−ライブラリー・メンバーの発現されたレベルを高める強力なプロモーターを
伴って、これらのライブラリーならびにループ２および３ライブラリーのスクリ
ーニングを可能とするであろうことを示唆している。１９量体挿入配列に関して
、ループ２、３および４挿入体はすべて野生型の少なくとも１％の蛍光をもたら
す。ゆえに、すべてのこれらのループにおけるライブラリーのスクリーニングを
可能とする。
【０３４６】 ウェスタンブロットの結果によると、ループ１および５における短い挿入体は
、蛍光を欠くにもかかわらず、ループ２および４の挿入体と同じまたはより高い
ＧＦＰ発現をもたらす。ゆえに、これらのループに挿入されたランダム・ペプチ
ドライブラリーを、表現型の変化について細胞のスクリーンニングをするために
使用することができる。しかし、ライブラリー・メンバーの存在下でのスクリー
ニングは、細胞それ自身における表現型の変化を反映する読み出しのような、Ｇ
ＦＰ蛍光以外の他のある特性によらなければならないであろう。
【０３４７】 実施例４ JurkatＥ細胞において発現されたときの、ループ２−４における試験挿入体１お
よび２を有するＧＦＰの平均蛍光 JurkatＥ細胞において発現されたとき、前記実施例３において示した挿入配列
と同一の挿入配列をＧＦＰとともに使用した。ＧＦＰを、レトロウイルス発現ベ
クターのＬＴＲを使用して発現させた。そして、JurkatをPhoenix 293ヘルパー
細胞を使用して感染させた。感染の４８時間後、JurkatをBecton-Dickinson FAC
SCAN細胞ソーターを使用してＦＡＣＳ分析に付した。各挿入体について、１０４ 個の細胞を、フォワード−ｖｓ．サイド−スカター選択を使用してゲートし、生
存細胞を単離した。生存細胞を、プロピジウムヨウ化物蛍光を使用して第二ラウ
ンドにおいて選択した。そして、そのＧＦＰ蛍光の強度に基づき、ＦＬ１におい
てソーティングした。異なる構築体によるJurkat細胞の感染レベルは、30.1-44.
9％の範囲であった。平均では細胞あたり１つの挿入ペプチド構築体であった。
【０３４８】
【表３６】 これらの結果によると、挿入体が、テトラペプチドリンカーにおいて複数のグ
リシンによって側方に位置するとき、ループ２−４における指定された挿入部位
が、ＧＦＰ蛍光の高いレベルを保持する。ゆえに、１９残基の挿入体は、蛍光の
高レベルを保持する。このことは、すべての３のループは、ランダムペプチドラ
イブラリーの挿入およびそのスクリーニングを可能とするであろうこと示唆して
いる。そのようなスクリーニングは、バックグラウンドから識別できる蛍光のレ
ベルのみ、またはＦＬ１における１０以上の上昇を要する。
【０３４９】 ループ２挿入部位における両配列を有するＧＦＰにおいて、野生型のほとんど
１０％またはそれ以上の蛍光の成功された観察は、Abedi et al.(1998)によって
見出されなかった。そして、このことによると、挿入配列のいずれかの側におけ
るグリシンリンカーの包含が、ループの先端における残基の切除を伴って、この
ループをランダムライブラリー配列の挿入について特有であり有用な部位とし得
る。ループ２−４における挿入体１および２についての相対蛍光の高レベルは、
テトラグリシンリンカーがランダムペプチドライブラリーのこれらの特有な部位
への成功した挿入をもたらすであろうことを示唆しており; より短いライブラリ
ーが好ましい。
【０３５０】 実施例５ Phoenix 293細胞において発現されたときの、ループ２−４における試験挿入１
および２を有するＧＦＰの平均蛍光 Phoenix 293細胞において発現されたとき、前記実施例３において示した挿入
配列と同一の挿入配列を、ＧＦＰとともに使用した。ＧＦＰを、トランスフェク
トされたPhoenix 293細胞において、９６．７ ＣＭＶ−プロモーター駆動ＣＲ
Ｕ−５レトロウイルス発現ベクターを使用して発現させた。トランスフェクショ
ン効率は４０−４５％であった。トランスフェクションの４８時間後、Phoenix
293細胞をBecoN-Dickinson FACSCAN細胞ソーターを使用して、ＦＡＣＳ分析に付
した。各挿入体についておよそ104個の細胞をゲートし、フォワード− ｖｓ．サ
イド−スカター選択を使用して生存細胞を単離した。生存細胞を、第二ラウンド
においてプロピジウムヨウ化物蛍光を使用して選択し、そのＧＦＰの蛍光の強度
に基づき、ＦＬ１においてソーティングした。すべての構築体について、トラン
スフェクション効率は、２４−４２％であると報告された。平均では、1プラス
ミド／ＧＦＰ構築体を発現している細胞であった。
【０３５１】
【表３７】 ループ２、３、および４挿入体の相対蛍光についての数は、記載された挿入体を
有する１−２独立クローンについての平均値±標準偏差からのものである。特異
的蛍光は、相対的蛍光のウェスタンブロット相対強度に対する割合である。相対
蛍光の標準偏差を、[挿入体の蛍光／ＷＴの蛍光{(挿入体蛍光の標準偏差／挿入
体蛍光)２＋(ＷＴ蛍光の標準偏差／ＷＴ蛍光)２}]０．５(Bevington, P. 1969.
Data reduction and error analysis for the physical sciences. New York: M
cGraw Hill, p.61-2)として計算した。アステリスク＊を有するデータは、６０
−７０％トランスフェクションを有する細胞に由来し、そのため他のデータと質
的に比較されることができるのみである。
【０３５２】 ２９３個の細胞に関するこれらの結果によると、挿入体がテトラペプチドリン
カーにおいて複数のグリシンによって挟まれるときに、これらの細胞においてル
ープ２−４における意図された挿入部位が、ＧＦＰ蛍光の非常に高いレベルを保
持し、ある場合は野生型ＧＦＰ蛍光よりも高い。１９および１２残基の挿入体の
いずれも、蛍光の高レベルを保持している。このことは、すべての３ループがラ
ンダム・ペプチドライブラリーの挿入およびそのスクリーニングを可能とし、す
べての３ループにおけるライブラリーが、概ね等価であることを示唆している。
ループ３の相対蛍光の高レベルは、主にループ１および２における、挿入体を有
するＧＦＰ構築体より高い発現レベルのためであるようである。しかし、すべて
の３ループ−挿入体の発現レベルは、野生型ＧＦＰレベルの少なくとも１９％で
ある。ループ２および４の双方における挿入体の特異的蛍光が、ループ３におけ
る挿入体より高いので、発現のより高いレベルは、これらループ２および４挿入
体の蛍光の全体的により低いレベルを埋め合わせ得る。これらの構築体の発現は
、E. coliまたはJurkat細胞における発現よりも強力なプロモーターを伴ってい
るので、このことは、レトロウイルスＬＴＲまたはE.coliにおけるプロモーター
よりも強力なプロモーターの使用により、多くのループの挿入部位がスクリーニ
ングのために使用可能となることを示唆している。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、ループのいくつかを選択してランダム・ペプチドを内部
挿入するために使用される温度因子を表示するＧＦＰの結晶構造を示す。
【図２】 図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ、２Ｅおよび２Ｆは、実施例の結果を
示す。図２Ａは、ループの位置を概略的に示す。図２Ｂ−２Ｆは、結果および平
均の蛍光を示す。
【図３】 図３は、コイルドコイルのラセン円形図を示す。各ラセンについ
て、ａまたはａ'はＮ末端にあり、配列の残基はａｂｃｄｅｆｇまたはａ'ｂ'ｃ'
ｄ'ｅ'ｆ'ｇ'である。それらを反復して個々のラセンａｂｃｄｅｆｇ(ａｂｃｄ
ｅｆｇ)ｎａｂｃｄｅｆｇまたはａ'ｂ'ｃ'ｄ'ｅ'ｆ'ｇ'(ａ'ｂ'ｃ'ｄ'ｅ'ｆ'ｇ'
)ｎａ'ｂ'ｃ'ｄ'ｅ'ｆ'ｇ'を得る。ラセンのコアは、ａ、ａ'、ｄおよびｄ'であ
り、それらはａｌａ／ｌｅｕまたはｖａｌ／ｌｅｕなどの疎水性の強いラセン形
成残基の組み合わせである。残基ｅおよびｅ'がｇｌｕとして固定している場合
、および残基ｇおよびｇ'がｌｙｓとして固定している場合、内部ラセン形塩橋
はコイルドコイル構造をさらに安定化させる。
【図４】 図４は、E.ColiからのβラクタマーゼＴＥＭ−１のアミノ酸配列
を示す。アミノ酸残基２６−２９０が示されている。
【図５】 図５Ａおよび５Ｂは、E.coli β−ラクタマーゼの結晶構造を示
す［PDB1BTL, Jelsch et al., Proteins: Struct., Funct. Genet. 16:364 (199
30］。図５Ａは、２つのラセンの正面図を示す。ランダム・ライブラリィが該ラ
センに融合されていることもある。図５Ｂは、２つのラセンの側面図を示す。２
つのラセンはこのライブラリィにおいてランダム残基により伸長されるものであ
り、黄色(Ｃ末端ラセン、残基２７１−２９０を含む；図４参照)および白(Ｎ末
端ラセン、残基２６−４０を含む；図４参照)で示されている。このタンパク質
は除去された残基１−２５を有する。同じ残基がライブラリィ・スキャフォルド
においてさらに除去されていることもある。活性部位ｓｅｒ７０は赤で示されて
いる。両方のラセンは活性部位から離れているので、ランダム残基がＮ末端およ
び／またはＣ末端に付着しても、酵素の活性に影響しない。
【図６】 図６は、結晶学的な温度因子により色づけられたβ−ラクタマー
ゼのモデルであり、最も不動性の領域は赤で、最も可動性の領域は黄色で示され
ている。Legrande et al. [Nature Biotechnology 17:67-72 (1999)]に記載され
ているループは青で示されている；活性部位ｓｅｒ７０は白で示され、ｇｌｕ１
６６は青灰色で示されている。
【図７】 ＰＤＢファイル２Ｃｉ−２から取り出されたＣｉ−２の構造を示
す。反応性部位のループは、残基５４−６３により表されている；ループ構造を
支持する残基は５１、６５、６７、６９および８３である。これらの残基は異な
る組み合わせにおいて無作為化され得る。ループ挿入ライブラリィは、残基７２
−７３および／または４４−４５の間に挿入される。
【図８】 図８はカナマイシン・ヌクレオチジル・トランスフェラーゼ二量
体１ＫＮＹの構造を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 7/00 5/10 9/02 7/00 9/86 9/02 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 9/86 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡ Ｃ１２Ｑ 1/68 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｕ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ， ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，Ｌ Ｋ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ， ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，Ｔ Ｍ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ボー・ロバート・ピール アメリカ合衆国94131−1800カリフォルニ ア州サンフランシスコ、ダンカン・ストリ ート967番 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA20 BA80 CA07 DA20 HA01 HA12 4B050 CC05 GG06 LL03 4B063 QA01 QA18 QQ08 QR38 QS05 QS38 QX01 4B065 AA86Y AA97X AA97Y AB01 AC14 BA02 BA25 CA28 CA31 CA46 4H045 AA10 AA30 BA41 CA01 CA50 DA89 EA50

Claims (24)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 下記： ａ）スキャフォルド・タンパク質、 ｂ）スキャフォルド・タンパク質のＮ末端に融合したランダム・ペプチド（該各
    ランダム・ペプチドは夫々相違する）、 ｃ）該ペプチドを配座的に制限された形で提示する提示構造、 を含む各融合タンパク質のライブラリィ。
  2. 【請求項２】 下記： ａ）スキャフォルド・タンパク質、 ｂ）スキャフォルド・タンパク質のＣ末端に融合したランダム・ペプチド（該各
    ランダム・ペプチドは相違する）、 ｃ）該ペプチドを配座的に制限された形で提示する提示構造、 を含む融合タンパク質のライブラリィ。
  3. 【請求項３】 下記： ａ）スキャフォルド・タンパク質、 ｂ）スキャフォルド・タンパク質に挿入されたランダム・ペプチド（該各ランダ
    ム・ペプチドは夫々相違する）、 ｃ）少なくとも１つの融合パートナー、 を含む各融合タンパク質のライブラリィ。
  4. 【請求項４】 該融合パートナーが該ランダム・ペプチドと該スキャフォル
    ド・タンパク質とのリンカーである、請求項３の融合タンパク質のライブラリィ
    。
  5. 【請求項５】 該スキャフォルド・タンパク質がグリーン蛍光タンパク質（
    ＧＦＰ）である、請求項１、２、３、４の融合タンパク質ライブラリィ。
  6. 【請求項６】 該リンカーが−(ｇｌｙ)ｎ−（ｎ＞２）を含む、請求項４、
    ５、６の融合タンパク質ライブラリィ。
  7. 【請求項７】 該ランダム・ペプチドと該スキャフォルド・タンパク質との
    他の末端の第２リンカーをさらに含む、請求項４、５、６の融合タンパク質ライ
    ブラリィ。
  8. 【請求項８】 該融合パートナーが該ペプチドを配座的に制限された形で提
    示し得る提示構造である、請求項３、４、５、６の融合タンパク質ライブラリィ
    。
  9. 【請求項９】 該ランダム・ペプチドが該スキャフォルド・タンパク質の少
    なくとも１つのアミノ酸に置換わる、請求項１、２、３、４、５、６、７、８の
    融合タンパク質ライブラリィ。
  10. 【請求項１０】 該ＧＦＰがAequoreaに由来し、該ランダム・ペプチドが該
    ＧＦＰのアミノ酸１３０から１３５を含むループに挿入される、請求項５、６、
    ７、８、９の融合タンパク質ライブラリィ。
  11. 【請求項１１】 該ＧＦＰがAequoreaに由来し、該ランダム・ペプチドが該
    ＧＦＰのアミノ酸１５４から１５９を含むループに挿入される、請求項５、６、
    ７、８、９の融合タンパク質ライブラリィ。
  12. 【請求項１２】 該ＧＦＰがAequoreaに由来し、該ランダム・ペプチドが該
    ＧＦＰのアミノ酸１７２から１７５を含むループに挿入される、請求項５、６、
    ７、８、９の融合タンパク質ライブラリィ。
  13. 【請求項１３】 該ＧＦＰがAequoreaに由来し、該ランダム・ペプチドが該
    ＧＦＰのアミノ酸１８８から１９３を含むループに挿入される、請求項５、６、
    ７、８、９の融合タンパク質ライブラリィ。
  14. 【請求項１４】 該ＧＦＰがAequoreaに由来し、該ランダム・ペプチドが該
    ＧＦＰのアミノ酸２０８から２１６を含むループに挿入される、請求項５、６、
    ７、８、９の融合タンパク質ライブラリィ。
  15. 【請求項１５】 該スキャフォルドがβ−ラクタマーゼである、請求項１、
    ２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４の融合タンパ
    ク質ライブラリィ。
  16. 【請求項１６】 該スキャフォルドがＤＨＦＲである、請求項１、２、３、
    ４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４の融合タンパク質ライ
    ブラリィ。
  17. 【請求項１７】 該スキャフォルドがルシフェラーゼである、請求項１、２
    、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４の融合タンパク
    質ライブラリィ。
  18. 【請求項１８】 該スキャフォルドがRenilla種由来のＧＦＰである、請求
    項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４の融合
    タンパク質ライブラリィ。
  19. 【請求項１９】 下記： ａ）ランダム・ペプチドをコードする核酸、 ｂ）スキャフォルド・タンパク質をコードする核酸、 ｃ）融合パートナーをコードする核酸 （なお、該ランダム・ペプチドをコードする該核酸は該スキャフォルド・タンパ
    ク質をコードする該核酸に内部的に挿入される）を含む各融合核酸のライブラリ
    ィ。
  20. 【請求項２０】 請求項１９の融合核酸を含むレトロウイルスのライブラリ
    ィ。
  21. 【請求項２１】 請求項１９の融合核酸を含む宿主細胞のライブラリィ。
  22. 【請求項２２】 特定の表現型を付与する生物活性ペプチドをスクリーニン
    グする方法であって、下記： ａ）ランダム・ペプチドをコードする核酸、 ｂ）スキャフォルド・タンパク質をコードする核酸、 ｃ）融合パートナーをコードする核酸 （なお、該ランダム・ペプチドをコードする該核酸は該スキャフォルド・タンパ
    ク質をコードする該核酸に内部的に挿入される）を含む融合核酸含有の細胞を提
    供することを含む方法。
  23. 【請求項２３】 該提供が該融合核酸を含むレトロウイルスベクターで該細
    胞をトランスフェクトすることによりなされる、請求項２２の方法。
  24. 【請求項２４】 該スキャフォルドがＧＦＰである、請求項２４および２３
    の方法。
JP2000574670A 1998-10-08 1999-10-08 スキャフォルド・タンパク質のランダム・ペプチドライブラリィとの融合 Pending JP2002526108A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US09/169,015 1998-10-08
US09/169,015 US6180343B1 (en) 1998-10-08 1998-10-08 Green fluorescent protein fusions with random peptides
PCT/US1999/023715 WO2000020574A2 (en) 1998-10-08 1999-10-08 Fusions of scaffold proteins with random peptide libraries

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2002526108A true JP2002526108A (ja) 2002-08-20
JP2002526108A5 JP2002526108A5 (ja) 2006-11-30

Family

ID=22613927

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2000574670A Pending JP2002526108A (ja) 1998-10-08 1999-10-08 スキャフォルド・タンパク質のランダム・ペプチドライブラリィとの融合

Country Status (8)

Country Link
US (5) US6180343B1 (ja)
EP (1) EP1119617B1 (ja)
JP (1) JP2002526108A (ja)
AT (1) ATE362528T1 (ja)
AU (1) AU768126B2 (ja)
CA (1) CA2345215A1 (ja)
DE (1) DE69936103T2 (ja)
WO (1) WO2000020574A2 (ja)

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007197435A (ja) * 2005-12-28 2007-08-09 Canon Inc 金結合性タンパク質
JP2009545296A (ja) * 2006-05-22 2009-12-24 コリア リサーチ インスティテュート オブ スタンダーズ アンド サイエンス ドメインタンパク質を用いた医薬品候補の検索方法
JP2010515463A (ja) * 2007-01-12 2010-05-13 シー レーン バイオテクノロジーズ， エルエルシー 配座的に束縛されたポリペプチド配列のコンビナトリアルライブラリー
JP2013513382A (ja) * 2009-12-11 2013-04-22 グワンジュ・インスティテュート・オブ・サイエンス・アンド・テクノロジー 細胞内ターゲット結合用二座ペプチドバインダー
JP2013513601A (ja) * 2009-12-11 2013-04-22 グワンジュ・インスティテュート・オブ・サイエンス・アンド・テクノロジー Ｂｐｂベースのカーゴ運搬システム
WO2019026920A1 (ja) * 2017-07-31 2019-02-07 国立大学法人東京大学 環状ペプチドをタンパク質構造に提示させる超汎用法
WO2020027224A1 (ja) * 2018-07-31 2020-02-06 国立大学法人東京大学 新たな結合特異性を抗体に付与する超汎用法
JPWO2020027237A1 (ja) * 2018-08-01 2021-08-02 国立大学法人 鹿児島大学 ペプチド融合タンパク質

Families Citing this family (79)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6969584B2 (en) * 1997-06-12 2005-11-29 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Combinatorial enzymatic complexes
US6709814B1 (en) * 1998-04-02 2004-03-23 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Peptides causing formation of compact structures
US7090976B2 (en) 1999-11-10 2006-08-15 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions comprising Renilla GFP
US6936421B2 (en) * 1998-10-08 2005-08-30 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Structurally biased random peptide libraries based on different scaffolds
US6180343B1 (en) * 1998-10-08 2001-01-30 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Green fluorescent protein fusions with random peptides
US20030190740A1 (en) 1998-10-13 2003-10-09 The University Of Georgia Research Foundation, Inc Stabilized bioactive peptides and methods of identification, synthesis, and use
BR9914519A (pt) * 1998-10-13 2001-07-03 Univ Georgia Res Found Peptìdios bioativos estabilizados e métodos de identificação, sìntese e uso
DE60020366T2 (de) * 1999-06-14 2006-02-02 Genentech Inc., San Francisco Strukturiertes peptidgerüst zur ausstellung von drehung-bibliotheken auf phage
US6673554B1 (en) * 1999-06-14 2004-01-06 Trellie Bioinformatics, Inc. Protein localization assays for toxicity and antidotes thereto
US20030166003A1 (en) * 1999-06-14 2003-09-04 Cochran Andrea G. Structured peptide scaffold for displaying turn libraries on phage
WO2001009177A2 (en) * 1999-07-29 2001-02-08 Whitehead Institute For Biomedical Research Affinity fluorescent proteins and uses thereof
AU4183200A (en) * 1999-10-21 2001-04-30 Panorama Research, Inc. A general method for optimizing the expression of heterologous proteins
US7109315B2 (en) * 2000-03-15 2006-09-19 Bruce J. Bryan Renilla reniformis fluorescent proteins, nucleic acids encoding the fluorescent proteins and the use thereof in diagnostics, high throughput screening and novelty items
AU2001289284A1 (en) * 2000-04-04 2001-10-15 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Methods for identifying peptide aptamers capable of altering a cell phenotype
US7270821B2 (en) * 2000-04-07 2007-09-18 University Of Leeds Innovations Limited Hepatitis B core antigen fusion proteins
AU2001261499A1 (en) * 2000-05-12 2001-11-26 Yale University Methods of detecting interactions between proteins, peptides or libraries thereof using fusion proteins
US7083945B1 (en) * 2000-10-27 2006-08-01 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Isolation of binding proteins with high affinity to ligands
WO2002048189A2 (en) * 2000-12-13 2002-06-20 Borean Pharma A/S Combinatorial libraries of proteins having the scaffold structure of c-type lectin-like domains
US20040132094A1 (en) * 2000-12-13 2004-07-08 Michael Etzerodt Combinatorial libraries of proteins having the scaffold structure of c-type lectinlike domains
US20030036049A1 (en) * 2001-01-03 2003-02-20 Medis El Ltd. Optical method for testing sensitivity of cells
WO2002063035A2 (en) * 2001-02-08 2002-08-15 The Penn State Research Foundation Fluorescent assay for proteolysis
WO2003068907A2 (en) * 2001-02-09 2003-08-21 California Institute Of Technology Method for the generation of proteins with new enzymatic function
WO2002068630A1 (en) * 2001-02-22 2002-09-06 Praecis Pharmaceuticals Incorporated Methods for identifying peptides which modulate a biological process
US6914123B2 (en) 2001-04-17 2005-07-05 Genentech, Inc. Hairpin peptides with a novel structural motif and methods relating thereto
US7604955B2 (en) 2001-08-13 2009-10-20 Swey-Shen Alex Chen Immunoglobulin E vaccines and methods of use thereof
FR2830020B1 (fr) * 2001-09-25 2003-12-19 Univ Victor Segalen Bordeaux 2 Acide nucleique pour l'obtention d'un polynucleotide codant une proteine de detection et d'isolement d'un ligand "proie" et applications de cet acide nucleique
US20030134287A1 (en) * 2002-01-16 2003-07-17 Xianqiang Li Method for isolating and characterizing short-lived proteins
WO2003061570A2 (en) * 2002-01-16 2003-07-31 Zyomyx, Inc. Engineered binding proteins
US7056665B2 (en) * 2002-01-16 2006-06-06 Panomics, Inc. Screening methods involving the detection of short-lived proteins
WO2003062420A1 (en) 2002-01-23 2003-07-31 Gardner, Rebecca, Katherine Molecular libraries
US8492122B2 (en) 2002-03-11 2013-07-23 The Johns Hopkins University Molecular switches and methods for making and using the same
WO2003089464A1 (en) * 2002-04-19 2003-10-30 Bioimage A/S Two green fluorescent protein fragments and their use in a method for detecting protein - protein interactions
US20030219723A1 (en) * 2002-05-20 2003-11-27 Lu Henry H. Compositions and methods for screening and identifying anti-HCV agents
US20050182250A1 (en) * 2002-07-10 2005-08-18 Stratagene Humanized renilla reniformis green fluorescent protein as a scaffold
JP2005536228A (ja) 2002-08-21 2005-12-02 レビビコア， インコーポレイテッド 機能的α−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼのいかなる発現をも欠くブタ動物
US9453251B2 (en) 2002-10-08 2016-09-27 Pfenex Inc. Expression of mammalian proteins in Pseudomonas fluorescens
US7323303B2 (en) * 2003-03-31 2008-01-29 Hong Kong Polytechnic University Modified β-lactamases and uses thereof
US8394379B2 (en) * 2003-05-15 2013-03-12 Iogenetics, Llc Targeted cryptosporidium biocides
US20050014932A1 (en) * 2003-05-15 2005-01-20 Iogenetics, Llc Targeted biocides
US8703134B2 (en) 2003-05-15 2014-04-22 Iogenetics, Llc Targeted cryptosporidium biocides
US7566447B2 (en) 2003-05-15 2009-07-28 Iogenetics, Llc Biocides
JP4809767B2 (ja) * 2003-08-18 2011-11-09 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 発現ベクター、ポリペプチドディスプレイライブラリ、並びにそれらの作製及び使用方法
US7897384B2 (en) 2003-09-08 2011-03-01 Ethicon, Inc. Chondrocyte therapeutic delivery system
US8257963B2 (en) * 2007-06-01 2012-09-04 Depuy Mitek, Inc. Chondrocyte container and method of use
US7927599B2 (en) * 2003-09-08 2011-04-19 Ethicon, Inc. Chondrocyte therapeutic delivery system
WO2005072392A2 (en) 2004-01-28 2005-08-11 John Hopkins University Methods for making and using molecular switches involving circular permutation
WO2005087793A2 (en) * 2004-02-05 2005-09-22 The Arizona Board Of Regents, A Body Corporate Acting On Behalf Of Arizona State University Immunostimulatory compositions and uses thereof
US7745196B1 (en) 2004-03-25 2010-06-29 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for identifying peptide modulators of cell surface receptors
EP1749022A2 (en) * 2004-05-24 2007-02-07 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Methods for cyclizing synthetic polymers
CA2574953A1 (en) 2004-07-26 2006-02-09 Dow Global Technolgies Inc. Process for improved protein expression by strain engineering
US20080274095A1 (en) * 2004-10-20 2008-11-06 Jane Homan Biocides
EA018897B1 (ru) 2005-01-05 2013-11-29 Ф-Стар Биотехнологише Форшунгс- Унд Энтвиклунгсгез.М.Б.Х. Молекулы иммуноглобулина, содержащие модифицированные участки структурных петель, обладающие свойством связывания, и способ их получения
US8128952B2 (en) * 2005-01-12 2012-03-06 Clemson University Research Foundation Ligand-mediated controlled drug delivery
WO2007035213A2 (en) 2005-08-09 2007-03-29 Revivicor, Inc. Transgenic ungulates expressing ctla4-ig and uses thereof
CA2620886C (en) * 2005-08-31 2017-03-14 The Regents Of The University Of California Cellular libraries of peptide sequences (clips) and methods of using the same
CN100355950C (zh) * 2005-09-01 2007-12-19 南方医科大学 一种多肽随机文库及其构建方法和从该文库中筛选细胞穿透多肽的方法
AT503474A1 (de) * 2006-03-29 2007-10-15 Univ Wien Bodenkultur Peptidbibliothek
AT503889B1 (de) 2006-07-05 2011-12-15 Star Biotechnologische Forschungs Und Entwicklungsges M B H F Multivalente immunglobuline
AT503902B1 (de) 2006-07-05 2008-06-15 F Star Biotech Forsch & Entw Verfahren zur manipulation von immunglobulinen
US7798090B2 (en) * 2007-01-05 2010-09-21 Thomas Angell Hatfield Rescue and locational determination equipment
WO2008128144A2 (en) * 2007-04-15 2008-10-23 Shuang Zhang Monoclonal antibody selecting system, and making and using thereof
WO2008134461A2 (en) 2007-04-27 2008-11-06 Dow Global Technologies, Inc. Method for rapidly screening microbial hosts to identify certain strains with improved yield and/or quality in the expression of heterologous proteins
US9580719B2 (en) 2007-04-27 2017-02-28 Pfenex, Inc. Method for rapidly screening microbial hosts to identify certain strains with improved yield and/or quality in the expression of heterologous proteins
EP2000952B1 (en) 2007-05-31 2013-06-12 Industrial Technology Research Institute Smoke detecting method and device
WO2009000006A1 (en) 2007-06-26 2008-12-31 F-Star Biotechnologische Forschungs- Und Entwicklungsges.M.B.H. Display of binding agents
US8293685B2 (en) 2007-07-26 2012-10-23 The Regents Of The University Of California Methods for enhancing bacterial cell display of proteins and peptides
WO2009086132A2 (en) 2007-12-20 2009-07-09 University Of Southern California Design of spacers to increase the expression of recombinant fusion proteins
EP2113255A1 (en) 2008-05-02 2009-11-04 f-star Biotechnologische Forschungs- und Entwicklungsges.m.b.H. Cytotoxic immunoglobulin
EP2385955B1 (en) 2009-01-12 2020-08-12 CytomX Therapeutics, Inc. Modified antibody compositions, methods of making and using thereof
CN102481341B (zh) 2009-02-23 2017-05-17 希托马克斯医疗有限公司 蛋白原及其使用方法
WO2010129310A1 (en) * 2009-04-27 2010-11-11 Roswell Park Cancer Institute Reagents and methods for producing bioactive secreted peptides
US20120208291A1 (en) * 2009-05-01 2012-08-16 Univeristy Of Utah Research Foundation Methods and compositions for measuring high affinity interactions with kinetic imaging of single molecule interaction (kismi)
AU2011215685B2 (en) 2010-02-12 2015-08-20 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Methods for identifying and isolating cells expressing a polypeptide
KR101294982B1 (ko) * 2011-12-09 2013-08-08 경북대학교 산학협력단 단백질 골격모듈을 포함하는 융합 폴리펩타이드 및 이를 이용한 목적 단백질에 특이적인 펩타이드 라이브러리 스크리닝 방법
US9200291B2 (en) 2012-12-19 2015-12-01 Helge Zieler Compositions and methods for creating altered and improved cells and organisms
WO2015106097A1 (en) * 2014-01-09 2015-07-16 Helge Zieler Methods and compositions for creating altered and improved cells and organisms
BR102019017792A2 (pt) 2019-08-27 2021-11-16 Fundação Oswaldo Cruz Receptáculo proteico, método para produção do receptáculo, método de identificação de patógenos ou de diagnóstico de doenças, e, uso do receptáculo
CN114651003A (zh) 2019-09-10 2022-06-21 黑曜石疗法公司 用于可调调节的ca2-il15融合蛋白
CN117092084B (zh) * 2023-10-20 2024-01-12 浙江迪福润丝生物科技有限公司 Wnv蛋白酶抑制剂的筛选方法和抑制效果评价方法

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5223409A (en) * 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5635182A (en) 1994-06-16 1997-06-03 Genetics Institute, Inc. Method of detecting ligand interactions
ES2139329T3 (es) 1995-09-22 2000-02-01 Bioimage A S Nuevas variantes de la proteina fluorescente verde, gfp.
EP0912728A1 (en) 1996-05-31 1999-05-06 MediGene Aktiengesellschaft Novel synthetic protein structural templates for the generation, screening and evolution of functional molecular surfaces
US6025485A (en) 1997-02-14 2000-02-15 Arcaris, Inc. Methods and compositions for peptide libraries displayed on light-emitting scaffolds
US5955275A (en) 1997-02-14 1999-09-21 Arcaris, Inc. Methods for identifying nucleic acid sequences encoding agents that affect cellular phenotypes
US6623922B1 (en) 1997-02-14 2003-09-23 Deltagen Proteomics Methods for identifying, characterizing, and evolving cell-type specific CIS regulatory elements
ATE388224T1 (de) * 1998-03-27 2008-03-15 Prolume Ltd Luciferase, gfp fluoreszenzproteine, kodierende nukleinsaüre und ihre verwendung in der diagnose
US6180343B1 (en) * 1998-10-08 2001-01-30 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Green fluorescent protein fusions with random peptides

Cited By (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007197435A (ja) * 2005-12-28 2007-08-09 Canon Inc 金結合性タンパク質
JP2009545296A (ja) * 2006-05-22 2009-12-24 コリア リサーチ インスティテュート オブ スタンダーズ アンド サイエンス ドメインタンパク質を用いた医薬品候補の検索方法
JP2010515463A (ja) * 2007-01-12 2010-05-13 シー レーン バイオテクノロジーズ， エルエルシー 配座的に束縛されたポリペプチド配列のコンビナトリアルライブラリー
JP2013513382A (ja) * 2009-12-11 2013-04-22 グワンジュ・インスティテュート・オブ・サイエンス・アンド・テクノロジー 細胞内ターゲット結合用二座ペプチドバインダー
JP2013513601A (ja) * 2009-12-11 2013-04-22 グワンジュ・インスティテュート・オブ・サイエンス・アンド・テクノロジー Ｂｐｂベースのカーゴ運搬システム
JPWO2019026920A1 (ja) * 2017-07-31 2019-11-07 国立大学法人 東京大学 環状ペプチドをタンパク質構造に提示させる超汎用法
WO2019026920A1 (ja) * 2017-07-31 2019-02-07 国立大学法人東京大学 環状ペプチドをタンパク質構造に提示させる超汎用法
KR20200032184A (ko) * 2017-07-31 2020-03-25 도꾜 다이가꾸 환상 펩티드를 단백질 구조에 제시시키는 초범용법
KR102357604B1 (ko) * 2017-07-31 2022-02-08 도꾜 다이가꾸 환상 펩티드를 단백질 구조에 제시시키는 초범용법
WO2020027224A1 (ja) * 2018-07-31 2020-02-06 国立大学法人東京大学 新たな結合特異性を抗体に付与する超汎用法
JPWO2020027224A1 (ja) * 2018-07-31 2021-08-02 国立大学法人 東京大学 新たな結合特異性を抗体に付与する超汎用法
JP7303527B2 (ja) 2018-07-31 2023-07-05 国立大学法人 東京大学 新たな結合特異性を抗体に付与する超汎用法
JPWO2020027237A1 (ja) * 2018-08-01 2021-08-02 国立大学法人 鹿児島大学 ペプチド融合タンパク質
US11643474B2 (en) 2018-08-01 2023-05-09 Kagoshima University Peptide fusion protein

Also Published As

Publication number Publication date
US6180343B1 (en) 2001-01-30
US6548632B1 (en) 2003-04-15
AU768126B2 (en) 2003-12-04
ATE362528T1 (de) 2007-06-15
EP1119617B1 (en) 2007-05-16
US6548249B1 (en) 2003-04-15
CA2345215A1 (en) 2000-04-13
US6596485B2 (en) 2003-07-22
DE69936103D1 (de) 2007-06-28
EP1119617A2 (en) 2001-08-01
WO2000020574A9 (en) 2001-06-21
AU1516400A (en) 2000-04-26
WO2000020574A3 (en) 2000-09-21
US20010003650A1 (en) 2001-06-14
WO2000020574A2 (en) 2000-04-13
US6562617B1 (en) 2003-05-13
DE69936103T2 (de) 2008-05-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2002526108A (ja) スキャフォルド・タンパク質のランダム・ペプチドライブラリィとの融合
US9040462B2 (en) In vivo production of cyclic peptides for inhibiting protein-protein interaction
US7090976B2 (en) Methods and compositions comprising Renilla GFP
US7208571B2 (en) In vivo production of cyclic peptides
US6808906B2 (en) Directionally cloned random cDNA expression vector libraries, compositions and methods of use
US7252952B2 (en) In vivo production of cyclic peptides for inhibiting protein—protein interaction
US8492122B2 (en) Molecular switches and methods for making and using the same
CA2272823A1 (en) Method for identifying genes encoding novel secreted or membrane-associated proteins
US7297482B2 (en) Structurally biased random peptide libraries based on different scaffolds
US6936421B2 (en) Structurally biased random peptide libraries based on different scaffolds
EP1670940B1 (en) Method for identification of suitable fragmentation sites in a reporter protein
KR101104817B1 (ko) 융합 파트너로 이용해 리포터로 사용이 가능한 에스테라아제(ｅｓｔｌ120ｐ)와 이를 인디케이터로 이용한 클로닝 벡터의 제조방법

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20061006

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20061006

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20090728

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20091222