KR20200032184A - 환상 펩티드를 단백질 구조에 제시시키는 초범용법 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 환상 펩티드를, 루프 구조를 갖는 단백질 상에 제시하는 방법으로서, 환상 펩티드는, 분자 내 환상 구조를 형성하기 위한 화학 가교 구조를 갖고, 환상 펩티드의 화학 가교 구조를, 루프 구조를 구성하는 2개의 아미노산 잔기로 치환함으로써, 환상 펩티드를, 루프 구조를 갖는 단백질에 융합시키는 것을 포함하는, 방법을 제공한다.

Description

환상 펩티드를 단백질 구조에 제시시키는 초범용법

본 발명은 환상 펩티드를, 루프 구조를 갖는 단백질 상에 제시하는 방법 등에 관한 것이다.

단백질의 활성을 향상시킬 것을 목적으로 하여, 단백질의 아미노산 잔기를 개변하거나, 단백질에 다른 펩티드 구조를 도입하는 기술이 알려져 있다.

특허문헌 1에는, 생물 활성을 상승시킨, 생물 활성 이종 펩티드 서열을 내부에 삽입해서 갖는 혈청 알부민 단백질을 포함해서 이루어지는 키메라 폴리펩티드가 개시되어 있다.

특허문헌 2에는, FnIII 베이스 폴리펩티드의 적어도 하나의 루프 영역의 개변에 더하여, FnIII 폴리펩티드의 β 시트의 개변이, FnIII 베이스 결합 분자와 타깃 분자의 결합 능력을 개선하는 것이 개시되어 있다.

또한, 특허문헌 3에는, 1개 이상의 생물 활성 펩티드를 항체 단백질의 Fc 도메인에 혼입한 분자가 개시되어 있지만, 구체적으로는, Fc 도메인의 루프 영역에 있어서의 인접한 아미노산 잔기에 대하여 생물 활성 펩티드가 삽입되어 있다.

특허문헌 4에는, 특허문헌 3과 마찬가지로, 수식된 Fc 분자가 기재되어 있지만, 포합 부위의 아미노산 잔기의 측쇄를 통해서 공유 결합된 부가 기능 부분을 갖는 Fc 분자가 개시되고, 구체적으로는, 포합 부위의 아미노산 잔기가 시스테인 잔기인 것이 개시되어 있다.

이에 더하여, 특허문헌 5 및 6에는, 면역 글로불린의 구조 루프를 1군데 이상 개변해서 새로운 결합능을 면역 글로불린에 부여하는 기술이 개시되어 있다.

특허문헌 2에 있어서는, FnIII의 루프 구조 부분에 랜덤화한 펩티드 서열을 삽입한 라이브러리로부터 표적에 대한 결합 활성종을 획득하고 있다.

또한, 특허문헌 5 및 6에 있어서도, 기득의 펩티드를 삽입하는 것은 아니고, 랜덤화한 펩티드 서열을 면역 글로불린의 특정한 구조 루프의 1군데에 삽입하고, 그 라이브러리로부터 표적에 대한 결합 활성을 갖는 활성종을 스크리닝하고 있다.

즉, 이들 종래 기술에 있어서는, 단순히 랜덤화된 펩티드가 삽입된 라이브러리를 얻고 있는 것에 지나지 않으며, 라이브러리의 스크리닝에 의해, 삽입된 것이 동정된 펩티드 부분에 대해서, 그들 펩티드 단독으로 표적에 대한 결합 활성을 유지할 수 있을지 불분명하다. 바꿔 말하면, 삽입된 펩티드는, 라이브러리화하기 위해서 삽입되어 있는 서열로서, 애당초 결합 활성을 갖는 것이 기대되지 않았다. 또한, 단백질의 호환성, 예를 들어 면역 글로불린에서 제시되어 있는 펩티드를 FnIII에 재삽입해도 원래의 활성을 유지할 수 있을지 불분명하다.

일본특허공표 제2005-505243호 공보 일본특허공표 제2013-539362호 공보 일본특허공표 제2008-514201호 공보 일본특허공표 제2009-504164호 공보 일본특허공표 제2009-541361호 공보 일본특허공표 제2009-540837호 공보

본 발명이 해결하고자 하는 과제는, 루프 구조를 갖는 단백질을 스캐폴드로해서, 환상 펩티드가 갖는 구조와 활성을 유지시킨 상태에서, 환상 펩티드를, 단백질 상에 제시하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은, 이하와 같다.

(1)

환상 펩티드를, 루프 구조를 갖는 단백질 상에 제시하는 방법으로서,

환상 펩티드는, 분자 내 환상 구조를 형성하기 위한 화학 가교 구조를 갖고,

환상 펩티드의 화학 가교 구조를, 루프 구조를 구성하는 2개의 아미노산 잔기로 치환함으로써, 환상 펩티드를, 루프 구조를 갖는 단백질에 융합시키는 것을 포함하는, 방법.

(2)

루프 구조를 구성하는 2개의 아미노산 잔기의 Cα 원자간 거리가, 4 내지 7Å의 범위 내에 있는, (1)에 기재된 방법.

(3)

루프 구조를 갖는 단백질이, 루프 구조를 구성하는 2개의 아미노산 잔기 사이에 1 내지 15 아미노산 잔기를 갖는, (1) 또는 (2)에 기재된 방법.

(4)

환상 펩티드가, 단백질성 아미노산 및/또는 비단백질성 아미노산을 포함하는, (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재된 방법.

(5)

화학 가교 구조가, 티오에테르 결합 또는 디술피드 결합을 포함하는, (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 방법.

(6)

2 이상의 환상 펩티드가, 복수의 루프 구조를 갖는 단백질의 다른 루프 구조에 각각 융합하는, (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 기재된 방법.

(7)

2 이상의 환상 펩티드가, 동일한 아미노산 서열을 갖는, (6)에 기재된 방법.

(8)

2 이상의 환상 펩티드가, 다른 아미노산 서열을 갖는, (6)에 기재된 방법.

(9)

환상 펩티드의 화학 가교 구조를, 루프 구조를 구성하는 2개의 아미노산 잔기로 치환할 때, 링커 서열을 통해서 환상 펩티드의 화학 가교 구조가, 루프 구조를 구성하는 2개의 아미노산 잔기로 치환되는, (1) 내지 (8) 중 어느 하나에 기재된 방법.

(10)

루프 구조를 구성하는 2개의 아미노산 이외의 루프 구조를 구성하는 아미노산 서열을 포함하고, 환상 펩티드의 화학 가교 구조가, 루프 구조를 구성하는 2개의 아미노산 잔기로 치환되는, (1) 내지 (9) 중 어느 하나에 기재된 방법.

(11)

환상 펩티드를, 루프 구조를 갖는 단백질에 융합시켜서 환상 펩티드를 단백질 상에 제시시킨 개변 단백질의 제조 방법으로서,

환상 펩티드는, 분자 내 환상 구조를 형성하기 위한 화학 가교 구조를 갖고,

환상 펩티드의 아미노산 서열로부터, 단백질 상에 제시시키는 부분 아미노산 서열을 선택하고, 해당 부분 아미노산 서열에 상당하는 염기 서열을 선택하고,

루프 구조를 갖는 단백질의 루프 구조를 구성하는 2개의 아미노산 잔기에 상당하는 염기 서열을 선택하고, 해당 선택된 염기 서열간에 존재하는 염기를 필요에 따라서 삭제하고, 선택된 환상 펩티드의 부분 아미노산 서열에 상당하는 염기 서열을 삽입해서 혼입한 염기 서열을 갖는 핵산을 준비하고,

해당 핵산을 번역하는, 개변 단백질의 제조 방법.

(12)

루프 구조를 구성하는 2개의 아미노산 잔기의 Cα 원자간 거리가, 4 내지 7Å의 범위 내에 있는, (11)에 기재된 방법.

(13)

루프 구조를 갖는 단백질이, 루프 구조를 구성하는 2개의 아미노산 잔기 사이에 1 내지 15 아미노산 잔기를 갖는, (11) 또는 (12)에 기재된 방법.

(14)

환상 펩티드가, 단백질성 아미노산 및/또는 비단백질성 아미노산을 포함하는, (11) 내지 (13) 중 어느 하나에 기재된 방법.

(15)

화학 가교 구조가, 티오에테르 결합 또는 디술피드 결합을 포함하는, (11) 내지 (14) 중 어느 하나에 기재된 방법.

(16)

2 이상의 환상 펩티드가, 복수의 루프 구조를 갖는 단백질의 다른 루프 구조에 각각 융합하는, (11) 내지 (15) 중 어느 하나에 기재된 방법.

(17)

2 이상의 환상 펩티드가, 동일한 아미노산 서열을 갖는, (16)에 기재된 방법.

(18)

2 이상의 환상 펩티드가, 다른 아미노산 서열을 갖는, (16)에 기재된 방법.

(19)

환상 펩티드의 화학 가교 구조를, 루프 구조를 구성하는 2개의 아미노산 잔기로 치환할 때, 링커 서열을 통해서 환상 펩티드의 화학 가교 구조가, 루프 구조를 구성하는 2개의 아미노산 잔기로 치환되는, (11) 내지 (18) 중 어느 하나에 기재된 방법.

(20)

루프 구조를 구성하는 2개의 아미노산 이외의 루프 구조를 구성하는 아미노산 서열을 포함하고, 환상 펩티드의 화학 가교 구조가, 루프 구조를 구성하는 2개의 아미노산 잔기로 치환되는, (11) 내지 (19) 중 어느 하나에 기재된 방법.

(21)

(11) 내지 (20) 중 어느 하나에 기재된 제조 방법에 의해 얻어지는 개변 단백질.

본 발명에 따르면, 루프 구조를 갖는 단백질을 스캐폴드로 해서, 환상 펩티드가 갖는 구조와 활성을 유지시킨 상태에서, 환상 펩티드를, 단백질 상에 제시하는 방법을 제공할 수 있다.

도 1은 실시예에서 사용한 환상 펩티드의 구조를 나타낸다. 환상 펩티드를 나타내는 일반식에 있어서, S는 Cys의 티올기에서 유래하는 황 원자를 의미한다. Xaa는 임의의 아미노산을 나타내고, s는 임의의 0 이상의 정수이다. 가변 영역(Variable region)은, 한 글자 표기에 의해, 환상 펩티드의 내부 구조를 구성하는 아미노산 서열을 나타내고, 소문자로 나타낸 아미노산(w, y 등)은 각각, D체의 아미노산(D-Trp, D-Tyr)을 나타낸다.
도 2는 스캐폴드 단백질로서 사용한 피브로넥틴의 제10형 III 반복 도메인의 입체 구조를 나타낸다. 제10형 III 반복 도메인에 있어서의 루프 구조는, Val1490을 B_N이라 하고, Ser1499를 B_C라 하여, 그 사이의 8 아미노산 잔기의 루프 영역을 포함한다.
도 3은 스캐폴드 단백질로서, 인간 피브로넥틴의 제10형 III 반복 도메인을 사용한 경우의 융합 단백질에 있어서의 부분 구조인, 환상 펩티드 융합 후의 루프 부분의 아미노산 서열을 나타낸다. Val1490(B_N)과 Ser1499(B_C) 사이의 서열이 삽입 서열을 나타낸다. 삽입 서열 중, TGR과 SPA는, 인간 피브로넥틴의 제10형 III 반복 도메인에서 유래하는 아미노산 서열을 나타내고, 밑줄 부분은 환상 펩티드에서 유래하는 아미노산 서열을 나타내고, 회색 문자는 링커 서열을 나타낸다.
도 4는 Expi293F 세포로부터 발현·분비시킨 Fn10-Fc 및 그의 환상 펩티드 융합 단백질의 SDS-PAGE를 나타낸다.
도 5는 환상 펩티드 융합 단백질(Fn10-Fc 변이체)과 결합 분자의 상호 작용 결과를 나타낸다.
도 6은 스캐폴드 단백질로서 사용한 인간 IgG 유래 Fc 영역의 입체 구조를 나타낸다. 인간 IgG 유래 Fc 영역에 있어서의 루프 구조는, 각각 L1 사이트 내지 L8 사이트로서 나타내는 바와 같이, 각 사이트에 있어서, B_N으로서 나타나는 아미노산 잔기와, B_C로서 나타나는 아미노산 잔기와, 그 사이에 각각 존재하는 1 내지 3 아미노산 잔기의 루프 영역을 포함한다.
도 7은 스캐폴드 단백질로서, 인간 IgG 유래 Fc 영역을 사용한 경우의 융합 단백질에 있어서의 부분 구조인, 환상 펩티드 융합 후의 루프 부분의 아미노산 서열을 나타낸다. Fc 영역의 힌지 영역에 가까운 「상부」의 L1 내지 L3 사이트에 있어서의 환상 펩티드가 융합한 융합 단백질을 각각 L1 내지 L3 사이트 변이체로서 나타낸다. 밑줄 부분은 환상 펩티드에서 유래하는 아미노산 서열을 나타내고, 회색 문자는 링커 서열을 나타낸다.
도 8은 스캐폴드 단백질로서, 인간 IgG 유래 Fc 영역을 사용한 경우의 융합 단백질에 있어서의 부분 구조인, 환상 펩티드 융합 후의 루프 부분의 아미노산 서열을 나타낸다. Fc 영역의 「저부」의 L4 내지 L6 사이트에 있어서의 환상 펩티드가 융합한 융합 단백질을 각각 L4 내지 L6 사이트 변이체로서 나타낸다. 밑줄 부분은 환상 펩티드에서 유래하는 아미노산 서열을 나타내고, 회색 문자는 링커 서열을 나타낸다.
도 9는 스캐폴드 단백질로서, 인간 IgG 유래 Fc 영역을 사용한 경우의 융합 단백질에 있어서의 부분 구조인, 환상 펩티드 융합 후의 루프 부분의 아미노산 서열을 나타낸다. Fc 영역의 「측면부」의 L7 내지 L8 사이트에 있어서의 환상 펩티드가 융합한 융합 단백질을 각각 L7 내지 L8 사이트 변이체로서 나타낸다. 밑줄 부분은 환상 펩티드에서 유래하는 아미노산 서열을 나타내고, 회색 문자는 링커 서열을 나타낸다.
도 10은 Expi293F 세포로부터 발현·분비시킨 Fc 및 그의 환상 펩티드 융합 단백질의 SDS-PAGE를 나타낸다.
도 11은 환상 펩티드 융합 단백질(Fc 변이체)과 결합 분자의 상호 작용 결과를 나타낸다.
도 12는 스캐폴드 단백질로서 사용한 인간 IgG 전체의 입체 구조를 나타낸다. 융합에 사용하는 Fc 영역에 있어서의 루프 구조는 도 6 내지 도 9에 도시한 L1 사이트 내지 L8 사이트이지만, 여기에서는 각각의 위치를, 도 6에 있어서 B_N, B_C로서 나타낸 아미노산 잔기의 중간점으로서 표현했다.
도 13의 A는 Expi293F 세포로부터 발현·분비시킨 IgG 및 그의 환상 펩티드 융합 단백질의 SDS-PAGE를 나타낸다. 도 13의 B는 환상 펩티드 융합 단백질(IgG 변이체)과 결합 분자의 상호 작용 결과를 나타낸다.
도 14는 스캐폴드 단백질로서 사용한 인간 혈청 알부민의 입체 구조를 나타낸다. 인간 혈청 알부민에 있어서의 루프 구조는, 각각 L1 내지 L4 사이트로서 나타내는 바와 같이, 각 사이트에 있어서, B_N으로서 나타나는 아미노산 잔기와, B_C로서 나타나는 아미노산 잔기와, 그 사이에 각각 존재하는 2 또는 4 아미노산 잔기의 루프 영역을 포함한다.
도 15는 스캐폴드 단백질로서, 인간 혈청 알부민을 사용한 경우의 융합 단백질에 있어서의 부분 구조인, 환상 펩티드 융합 후의 루프 부분의 아미노산 서열을 나타낸다. L1 내지 L4 사이트에 있어서의 환상 펩티드가 융합한 융합 단백질을 각각 L1 내지 L4 사이트 변이체로서 나타낸다. 밑줄 부분은 환상 펩티드에서 유래하는 아미노산 서열을 나타내고, 회색 문자는 링커 서열을 나타낸다.
도 16은 Expi293F 세포로부터 발현·분비시킨 HSA 및 그의 환상 펩티드 융합 단백질의 SDS-PAGE를 나타낸다.
도 17은 환상 펩티드 융합 단백질(HSA 변이체)과 결합 분자의 상호 작용 결과를 나타낸다.
도 18은 스캐폴드 단백질로서 사용한 인간 성장 호르몬의 입체 구조를 나타낸다. 인간 성장 호르몬에 있어서의 루프 구조는, 각각 L1 내지 L2 사이트로서 나타내는 바와 같이, 각 사이트에 있어서, B_N으로서 나타나는 아미노산 잔기와, B_C로서 나타나는 아미노산 잔기와, 그 사이에 각각 존재하는 1 아미노산 잔기의 루프 영역을 포함한다.
도 19는 스캐폴드 단백질로서, 인간 성장 호르몬을 사용한 경우의 융합 단백질에 있어서의 부분 구조인, 환상 펩티드 융합 후의 루프 부분의 아미노산 서열을 나타낸다. L1 내지 L2 사이트에 있어서의 환상 펩티드가 융합한 융합 단백질을 각각 L1 내지 L2 사이트 변이체로서 나타낸다. 밑줄 부분은 환상 펩티드에서 유래하는 아미노산 서열을 나타내고, 회색 문자는 링커 서열을 나타낸다.
도 20의 A는 Expi293F 세포로부터 발현·분비시킨 hGH 및 그의 환상 펩티드 융합 단백질의 SDS-PAGE를 나타낸다. 도 20의 B는, 환상 펩티드 융합 단백질(hGH 변이체)과 결합 분자의 상호 작용 결과를 나타낸다.
도 21은 스캐폴드 단백질로서 사용한 인간 혈청 레티놀 결합 단백질의 입체 구조를 나타낸다. 인간 혈청 레티놀 결합 단백질에 있어서의 루프 구조는, 각각 L1 내지 L2 사이트로서 나타내는 바와 같이, 각 사이트에 있어서, B_N으로서 나타나는 아미노산 잔기와, B_C로서 나타나는 아미노산 잔기와, 그 사이에 각각 존재하는 2 아미노산 잔기의 루프 영역을 포함한다.
도 22는 스캐폴드 단백질로서, 인간 혈청 레티놀 결합 단백질을 사용한 경우의 융합 단백질에 있어서의 부분 구조인, 환상 펩티드 융합 후의 루프 부분의 아미노산 서열을 나타낸다. L1 내지 L2 사이트에 있어서의 환상 펩티드가 융합한 융합 단백질을 각각 L1 내지 L2 사이트 변이체로서 나타낸다. 밑줄 부분은 환상 펩티드에서 유래하는 아미노산 서열을 나타내고, 회색 문자는 링커 서열을 나타낸다.
도 23의 A는 Expi293F 세포로부터 발현·분비시킨 인간 혈청 레티놀 결합 단백질(RBP) 및 그의 환상 펩티드 융합 단백질의 SDS-PAGE를 나타낸다. 도 23의 B는 환상 펩티드 융합 단백질(RBP 변이체)과 결합 분자의 상호 작용 결과를 나타낸다.
도 24는 스캐폴드 단백질로서 사용한 인간 태반 알칼리 포스파타아제의 입체 구조를 나타낸다. 인간 태반 알칼리 포스파타아제에 있어서의 루프 구조는, 각 사이트에 있어서, Lys402를 B_N이라 하고, Gly404를 B_C라 하여, 그 사이의 1 아미노산 잔기의 루프 영역을 포함한다.
도 25는 스캐폴드 단백질로서, 인간 태반 알칼리 포스파타아제를 사용한 경우의 융합 단백질에 있어서의 부분 구조인, 환상 펩티드 융합 후의 루프 부분의 아미노산 서열을 나타낸다. 밑줄 부분은 환상 펩티드에서 유래하는 아미노산 서열을 나타내고, 회색 문자는 링커 서열을 나타낸다.
도 26은 Expi293F 세포로부터 발현·분비시킨 인간 태반 알칼리 포스파타아제(PLAP) 및 그의 환상 펩티드 융합 단백질의 SDS-PAGE를 나타낸다.
도 27은 환상 펩티드 융합 단백질(PLAP 변이체)과 결합 분자의 상호 작용 결과를 나타낸다.
도 28은 mP6-9 펩티드 융합 단백질(Fc 변이체)에 의한 플렉신 B1 시그널 전달의 저해 효과를 나타낸다.

본 발명을, 발명을 실시하기 위한 형태에 의해 구체적으로 설명하겠지만, 본 발명은, 이하의 발명을 실시하기 위한 형태로 한정되는 것은 아니고, 다양하게 변형시켜서 실시할 수 있다.

본 발명은, 환상 펩티드를, 루프 구조를 갖는 단백질 상에 제시하는 방법으로서,

환상 펩티드는 분자 내 환상 구조를 형성하기 위한 화학 가교 구조를 갖고,

환상 펩티드의 화학 가교 구조를, 루프 구조를 구성하는 2개의 아미노산 잔기로 치환함으로써, 환상 펩티드를, 루프 구조를 갖는 단백질에 융합시키는 것을 포함하는, 방법이다.

본 발명에 따르면, 루프 구조를 갖는 단백질을 스캐폴드로 해서, 환상 펩티드가 갖는 구조와 활성을 유지시킨 상태에서, 환상 펩티드를, 단백질 상에 제시할 수 있다. 또한, 환상 펩티드를, 단백질 상에 제시함으로써, 환상 펩티드는, 단백질을 스캐폴드로 함으로써, 생체 적합성이 증가하고, 또한 단백질이 갖는 기능을 환상 펩티드에 부여할 수 있다고 하는 이점이 있다.

본 발명에 있어서는, 환상 펩티드는, 그의 부분 구조가 단백질의 루프 구조와 치환되는 형식으로, 단백질 상에 제시된다. 또한, 적합하게는, 환상 펩티드의 루프 구조와 치환되는 부분 구조가, 활성, 보다 구체적으로는, 생리 활성을 나타내기 위한 구조이다. 또한, 구조면에서는, 적합하게는, 환상 펩티드의 루프 구조와 치환되는 부분 구조가, 환상 펩티드의 분자 내 환상 구조를 구성하고 있는 아미노산 서열에서 선택된다.

본 발명에 의해, 환상 펩티드와, 단백질에 한정을 가하지 않고, 환상 펩티드를 단백질 구조로, 즉 단백질 상에 제시시키는 초범용법을 제공할 수 있다.

환상 펩티드는, 분자 내 환상 구조를 형성하기 위한 화학 가교 구조를 갖고 있는 바와 같이, 화학 가교 구조에 의해 환상 구조를 갖는 펩티드이지만, 화학 가교 구조를, 단백질의 루프 구조로 대체함으로써, 즉 펩티드를 환상화함에 있어서 지금까지 사용해 온 화학 가교 구조를 대신하여, 자못 1분자라 인식한 단백질을 사용한다고 하는 기술 사상을 갖는 점에, 본 발명은 특징을 갖는다.

그렇다 하더라도, 환상 펩티드와 루프 구조를 갖는 단백질을 융합시킨 개변 단백질에 있어서의 아미노산 서열의 1차 구조 자체는 환상화하고 있는 것은 아니다. 그리고, 개변 단백질에 있어서의 환상 펩티드에서 유래하는 구조가, 외관 상, 원래 존재하고 있던 환상 펩티드에 있어서의 환상 구조와는 전체에서 보면 다른 형상이면서, 국소적으로는 펩티드의 3차원 구조는 유지되고, 또한 환상 펩티드의 활성을 유지할 수 있는 것이다.

본 발명의 효과로서, 환상 펩티드를, 루프 구조를 갖는 단백질 상에 환상 펩티드의 구조를 유지시킨 상태에서 제시하는 것은, 간접적으로, 루프 구조를 갖는 단백질 상에 환상 펩티드를 융합시킨 개변 단백질에 있어서의 환상 펩티드가 원래 갖는 활성을 유지하고 있는 것에 의해 확인할 수 있다. 즉, 본 발명에 있어서는, 환상 펩티드가 갖는 활성이, 개변 단백질에 있어서도 발휘됨으로써, 루프 구조를 갖는 단백질 상에, 환상 단백질은, 그의 구조를 유지시킨 상태에서 제시되고 있다고 생각할 수 있다. 부언하면, 본 발명에 있어서는, 환상 펩티드가 구조를 유지하고 있는 것을, 개변 단백질의 구조 정보를 취득하는 것에 의해 확인해도 된다.

루프 구조를 갖는 단백질로서는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 이하의 단백질로서 예시할 수 있다. 이하, 이들을 「스캐폴드 단백질」이라고 하는 경우가 있다.

스캐폴드 단백질로서는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어 이뮤노글로불린, 피브로넥틴, 알부민, 인간 성장 호르몬, 알칼리 포스파타아제, 레티놀 결합 단백질, 유테로글로빈, 피브리노겐, 혈액 응고 인자, 트란스페린, Cas9를 포함하는 게놈 편집 효소, G 단백질 공액형 수용체, 사이토카인 수용체, 성장 인자 수용체, 인테그린, 카드헤린, 트란스페린 수용체, 면역 수용체, 바이러스 엔벨로프 단백질 및 바이러스 캡시드 단백질 등을 들 수 있다.

스캐폴드 단백질로서는, 부분 단편 단백질이어도 되고, 상기 예시하고 있는 단백질의 부분 단편 단백질이 예시된다.

스캐폴드 단백질은, 루프 구조를 갖는 것이면, 전장 단백질에 있어서의 일부분의 구조로서, 루프 구조를 포함하는 부분 단편을 사용해도 된다.

또한, 스캐폴드 단백질로서는, 루프 구조를 갖는 단백질 또는 그 루프 구조를 갖는 부분 단편 단백질에, 또 다른 단백질이 융합하고 있어도 된다.

상기 예시한 스캐폴드 단백질은, 그의 2차 구조에 있어서, 루프 구조를 갖는다.

루프 구조로서는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, α 헬릭스 및/또는 β 시트를 연결하는 폴리펩티드 쇄 영역이며, 절곡 구조를 갖는 구조를 의미한다.

본 발명에 있어서는, 상기 예시한 각 스캐폴드 단백질에 존재하는 루프 구조를 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서는, 스캐폴드 단백질의 루프 구조 내에, 환상 펩티드를 삽입하여, 환상 펩티드와 스캐폴드 단백질을 융합시키지만, 당해 융합은, 공유 결합에 의한 융합인 것이 바람직하다.

환상 펩티드와 공유 결합시키는 루프 구조로서는, 특별히 한정되는 것은 아니며, 상기 예시한 스캐폴드 단백질에 존재하는 루프 구조이면 된다.

루프 구조 중, 어느 부위에 환상 펩티드를 삽입할지는, 특별히 한정되는 것은 아니며, 범용성을 가지고 루프 구조 중 임의의 부위에 환상 펩티드를 삽입해도 된다.

루프 구조에 있어서의 임의의 부위란, 환상 펩티드를 삽입하기 위한 2개의 아미노산 잔기가, 루프 구조 내에서 선택되는 부위인 것을 의미한다.

루프 구조 내의 2개의 아미노산 잔기는, 루프 구조에 있어서, 2개의 아미노산 잔기의 Cα 원자간 거리가 4 내지 7Å로 존재하고, 게다가 어느 쪽도 적어도 부분적으로는 단백질 표면에 노출되어 있는 2개의 아미노산 잔기인 것이 바람직하다.

2개의 아미노산 잔기의 Cα 원자간 거리가 4 내지 7Å에 있음으로써, 스캐폴드 단백질에 융합된 환상 펩티드는, 원래의 환상 펩티드에 있어서의 구조를 개변 펩티드에 있어서도 유지하기 쉬운 것이 된다.

2개의 아미노산 잔기의 Cα 원자간 거리는, 입체 구조가 명확한 스캐폴드 단백질의 구조 데이터로부터 확인할 수 있다. 스캐폴드 단백질의 입체 구조가 분명하지 않은 경우에도, 그의 상사 단백질(상동체)의 구조 정보로부터 구축한 모델 구조가 있으면, 상기 2 아미노산 잔기간의 거리는 어림잡을 수 있다.

루프 구조 내에 있어서 환상 펩티드와 융합하기 위해서 선택되는 2개의 아미노산 잔기는, 루프 구조 내에 존재하는 인접하는 아미노산 잔기여도 되지만, 2개의 아미노산 잔기가 인접하지 않는 아미노산 잔기끼리인 것이 바람직하다. 2개의 아미노산 잔기가 인접하지 않는다는 것은, 2개의 아미노산 잔기가, 단백질의 루프 구조에 있어서의 아미노산 1차 서열에 있어서, 불연속의 아미노산 잔기인 것과 동일한 의미이다.

예를 들어, 단백질의 결정 구조에 있어서, 2개의 아미노산 잔기의 Cα 원자간 거리가 4 내지 7Å인 배치의 2개의 아미노산 잔기를 선택하는 경우, 스캐폴드 단백질에 있어서, 루프 구조를 구성하는 2개의 아미노산 잔기 사이에 1 내지 15 아미노산 잔기 존재하고 있어도 된다. 2개의 아미노산 잔기 사이에 1 내지 15 아미노산 잔기 존재하고 있다란, 2개의 아미노산 잔기가, 단백질의 루프 구조에 있어서의 아미노산 1차 서열에 있어서, 1 내지 15 아미노산 잔기를 통해서 존재하고 있는 것과 동일한 의미이다.

2개의 아미노산 잔기 사이의 1 내지 15 아미노산 잔기 부분은, 루프 구조를 형성하는 아미노산 잔기인 것이 바람직하다.

본 발명의 환상 펩티드를 루프 구조를 갖는 단백질 상에 제시하는 방법에 있어서는, 환상 펩티드는, 루프 구조를 갖는 단백질을 스캐폴드로 해서, 해당 스캐폴드 단백질 상에 제시되지만, 적합하게는, 루프 구조가 환상 펩티드로 치환됨으로써, 단백질의 구조 및 환상 펩티드의 구조가 유지된다.

루프 구조로부터, 2개의 아미노산 잔기의 Cα 원자간 거리가 4 내지 7Å가 되도록 환상 펩티드와 결합시키는 2개의 아미노산 잔기를 선택함으로써, 단백질의 원래 갖는 구조를 유지할 수 있음과 함께, 환상 펩티드의 활성을 유지할 수 있다.

본 발명에 있어서, 환상 펩티드가, 그의 활성을 유지하고 있다는 것은, 루프 구조를 갖는 단백질에 융합시키는 환상 펩티드는, 어떠한 생리 활성을 갖는 화합물로서 알려져 있는 것이 바람직하고, 환상 펩티드로서 갖는 생리 활성이, 환상 펩티드를 단백질에 융합시킨 후에도, 당해 생리 활성을 유지하고 있는 것을 의미한다.

또한, 그 경우에, 생리 활성의 정도는, 단백질에 융합시킨 전후에서, 다른 활성값/저해값을 나타내도 된다.

본 발명에 있어서, 「환상 펩티드의 화학 가교 구조를, 루프 구조를 구성하는 2개의 아미노산 잔기로 치환한다」는 것은 이하의 의미로 사용한다.

루프 구조를 구성하는 2개의 아미노산 잔기로 치환한다는 것은, 루프 구조를 구성하는 2개의 아미노산 잔기에 있어서, 환상 펩티드의 화학 가교 구조 이외의 구조가 결합하고 있어도 되고, 환상 펩티드의 화학 가교 구조를 제외하고, 추가로 환상 펩티드의 환상 구조를 구성하는 1개 또는 복수의 아미노산을 제외한 부분 아미노산 서열이 결합하고 있어도 된다.

즉, 부분 아미노산 서열이 결합하고 있다는 것은, 환상 펩티드에 있어서의 활성, 보다 구체적으로는, 생리 활성을 나타내기 위한 구조를 포함하는 부분 구조가 결합하고 있으면 된다.

또한, 환상 펩티드를 구성하는 아미노산은, 이하에 나타내는 바와 같이, 단백질성 아미노산 및/또는 비단백질성 아미노산일 수 있고, 일부에 비단백질성 아미노산을 포함하는 환상 펩티드인 것이 적합하지만, 환상 펩티드가 비단백질성 아미노산을 포함하는 경우, 환상 펩티드가 융합된 개변 단백질에 있어서는, 환상 펩티드에서 유래하는 비단백질성 아미노산은, 단백질성 아미노산으로 치환되어 있는 것이 바람직하다.

환상 펩티드를 구성하는 단백질성 아미노산은, 스캐폴드 단백질과 융합시킬 때, 그대로의 아미노산으로서 융합시키는 것이 바람직하지만, 다른 단백질성 아미노산으로 치환해서 융합해도 된다.

또한, 융합시키는 환상 펩티드의 아미노산 서열은, 원래의 환상 펩티드의 아미노산 서열과 동일해도 되고, 1개 또는 복수의 아미노산을 치환, 결실 또는 삽입한 서열이어도 된다.

본 발명에 있어서, 1개 또는 복수의 아미노산이라고 하는 경우, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 혹은 10개의 아미노산이어도 되고, 1 내지 10, 1 내지 9, 1 내지 8, 1 내지 7, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 1 내지 3, 1 내지 2 혹은 1개의 아미노산이면 된다.

본 발명에 있어서, 「환상 펩티드의 화학 가교 구조를, 루프 구조를 구성하는 2개의 아미노산 잔기로 치환한다」 일 때, 환상 펩티드의 화학 가교 구조가, 링커 서열을 통해서 루프 구조를 구성하는 2개의 아미노산 잔기로 치환되어 있어도 된다.

링커 서열을 통해서 치환되는 경우, 환상 펩티드가 융합된 개변 단백질에 있어서는, N 말단측에 있어서는, 루프 구조에서 유래하는 아미노산 서열, 링커 서열, 환상 펩티드에서 유래하는 아미노산 서열이라고 하는 순서로 융합하고, C 말단측에 있어서는, 환상 펩티드에서 유래하는 아미노산 서열, 링커 서열, 루프 구조에서 유래하는 아미노산 서열이라고 하는 순서로 융합하고 있다.

N 말단측, C 말단측 양쪽에서 링커 서열을 갖고 있어도 되고, N 말단측 및 C 말단측의 한쪽에서 링커 서열을 갖고 있어도 된다.

링커 서열로서는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 1개 또는 복수의 Ser, Gly 및 Cys를 포함하는 서열을 들 수 있고, 1 내지 5, 1 내지 4, 1 내지 3, 1 내지 2 혹은 1개의 Ser, Gly 및 Cys를 포함하는 서열을 들 수 있다. 링커 서열로서는, Ser 및/또는 Gly를 포함하는 서열이 바람직하게 사용된다.

본 발명에 있어서, 「환상 펩티드의 화학 가교 구조를, 루프 구조를 구성하는 2개의 아미노산 잔기로 치환한다」일 때, 루프 구조를 구성하는 2개의 아미노산 이외의 루프 구조를 구성하는 아미노산 서열을 포함하고, 환상 펩티드의 화학 가교 구조가, 루프 구조를 구성하는 2개의 아미노산 잔기로 치환되어 있어도 된다.

루프 구조를 구성하는 2개의 아미노산 이외의 루프 구조를 구성하는 아미노산 서열을 포함해서 치환되는 경우, 환상 펩티드가 융합된 개변 단백질에 있어서는, N 말단측에 있어서는, 루프 구조를 구성하는 2개의 아미노산의 N 말단측의 한쪽의 아미노산, 루프 구조에서 유래하는 아미노산 서열, 소망에 따라 링커 서열, 환상 펩티드에서 유래하는 아미노산 서열이라고 하는 순서로 융합하고, C 말단측에 있어서는, 환상 펩티드에서 유래하는 아미노산 서열, 소망에 따라 링커 서열, 루프 구조에서 유래하는 아미노산 서열, 루프 구조를 구성하는 2개의 아미노산의 C 말단측의 다른 쪽의 아미노산이라고 하는 순서로 융합하고 있다.

N 말단측, C 말단측 양쪽에서 루프 구조를 구성하는 2개의 아미노산 이외의 루프 구조를 구성하는 아미노산 서열을 포함하고 있어도 되고, N 말단측 및 C 말단측의 한쪽에서 루프 구조를 구성하는 2개의 아미노산 이외의 루프 구조를 구성하는 아미노산 서열을 포함하고 있어도 된다.

루프 구조를 구성하는 2개의 아미노산 이외의 루프 구조를 구성하는 아미노산 서열이란, 루프 구조를 구성하는 2개의 아미노산 사이에 끼워진 루프 구조에서 유래하는 아미노산 서열이며, 각각, 루프 구조를 구성하는 2개의 아미노산에 인접해서 결합하는 아미노산 서열인 것이 바람직하다.

보다 구체적으로 설명한다.

본 발명에 있어서, 환상 펩티드의 화학 가교 구조를 치환하는 스캐폴드 단백질에 존재하는 2개의 아미노산 잔기 중, 루프 구조를 구성하는 아미노산 잔기이며, N 말단측에 위치하는 아미노산 잔기를 B_N, C 말단측의 아미노산 잔기를 B_C라 하는 경우, 환상 펩티드의 루프 구조는, -B_N-(Xaa1)_m-B_C-로 표현되는 구조를 포함한다(루프 구조를 형성하고 있는 한, Xaa1은 각각 독립적으로, 임의의 아미노산 잔기이며, m은 0 이상의 임의의 정수이고, 1 내지 15의 정수인 것이 적합하다.).

「환상 펩티드의 화학 가교 구조를, 루프 구조를 구성하는 2개의 아미노산 잔기로 치환한다」일 때, 환상 펩티드에서 유래하는 아미노산은, B_N과 결합하고 있어도 되고, B_N과 링커 서열을 통해서 결합하고 있어도 되고, B_N으로부터 임의의 수로 표현되는 번째의 Xaa1과, 소망에 따라 링커 서열을 통해서 결합하고 있어도 된다.

또한, 「환상 펩티드의 화학 가교 구조를, 루프 구조를 구성하는 2개의 아미노산 잔기로 치환한다」일 때, 환상 펩티드에서 유래하는 아미노산은, B_C와 결합하고 있어도 되고, B_C와 링커 서열을 통해서 결합하고 있어도 되고, B_C로부터 임의의 수로 표현되는 번째의 Xaa1과, 소망에 따라 링커 서열을 통해서 결합하고 있어도 된다.

B_N으로부터 임의의 수로 표현되는 번째의 Xaa1과, 소망에 따라 링커 서열을 통해서 결합하고 있는 경우, 혹은 B_C로부터 임의의 수로 표현되는 번째의 Xaa1과, 소망에 따라 링커 서열을 통해서 결합하고 있는 경우, 환상 펩티드를 융합한 개변 단백질은, 루프 구조를 구성하는 2개의 아미노산 이외의 루프 구조를 구성하는 아미노산 서열을 포함하게 된다.

한편, 환상 펩티드는 분자 내 환상 구조를 형성하기 위한 화학 가교 구조를 형성하는 2개의 아미노산 잔기 중, N 말단측에 위치하는 아미노산 잔기를 C_N, C 말단측의 아미노산 잔기를 C_C라 하는 경우, 환상 펩티드는, C_N-(Xaa2)_n-C_C로 표현되는 1차 서열을 적어도 갖는다(환상 펩티드를 형성할 수 있는 한, Xaa2는 각각 독립적으로, 임의의 아미노산 잔기이며, n은 2 이상의 임의의 정수이다.). 환상 펩티드는, 분자 내 환상 구조 이외에도 환상 구조로부터의 쇄상의 분지쇄를 갖고 있어도 된다. 또한, 환상 펩티드에 있어서는, 2개의 아미노산 잔기인 C_N과 C_C가, 분자 내 환상 구조를 형성하기 위한 화학 가교 구조를 형성해서 환상 펩티드가 된다.

「환상 펩티드의 화학 가교 구조를, 루프 구조를 구성하는 2개의 아미노산 잔기로 치환한다」일 때, 루프 구조를 구성하는 2개의 아미노산, 혹은 루프 구조를 구성하는 2개의 아미노산 이외의 루프 구조를 구성하는 아미노산은, 소망에 따라 링커 서열을 통해서, C_N 및/또는 C_C와 결합하고 있어도 된다.

C_N 및/또는 C_C가, 비단백질성 아미노산인 경우에는, 단백질성 아미노산으로 치환되어 있는 것이 바람직하고, C_N 및/또는 C_C가 Cys인 경우에는, C_N 및/또는 C_C를 결실시켜도 되고, C_C가 Cys인 경우에는, C_N은 Cys로 치환하고, 환상 펩티드가 융합되어 있어도 된다.

「환상 펩티드의 화학 가교 구조를, 루프 구조를 구성하는 2개의 아미노산 잔기로 치환한다」일 때, 환상 펩티드에서 유래하는 아미노산은, C_N에서 결합하고 있어도 되고, C_N에서 링커 서열을 통해서 결합하고 있어도 되고, C_N으로부터 임의의 수로 표현되는 번째의 Xaa2에서, 소망에 따라 링커 서열을 통해서 결합하고 있어도 된다. 그 중에서도, C_N이 비단백질성 아미노산인 경우에는, C_N을 단백질성 아미노산으로 치환하고, 소망에 따라 링커 서열을 통해서 결합하고 있어도 된다.

또한, 「환상 펩티드의 화학 가교 구조를, 루프 구조를 구성하는 2개의 아미노산 잔기로 치환한다」일 때, 환상 펩티드에서 유래하는 아미노산은, C_C에서 결합하고 있어도 되고, C_C에서 링커 서열을 통해서 결합하고 있어도 되고, C_C로부터 임의의 수로 표현되는 번째의 Xaa2에서, 소망에 따라 링커 서열을 통해서 결합하고 있어도 된다. 그 중에서도, C_C를 결실시키고, C_C로부터 세어서 1번째의 Xaa2에서, 즉 C_C와 결합하는 Xaa2에서, 소망에 따라 링커 서열을 통해서 결합하고 있어도 된다.

C_N으로부터 임의의 수로 표현되는 번째의 Xaa2와, 소망에 따라 링커 서열을 통해서 결합하고 있는 경우, 혹은 C_C로부터 임의의 수로 표현되는 번째의 Xaa2와, 소망에 따라 링커 서열을 통해서 결합하고 있는 경우, 환상 펩티드를 융합한 개변 단백질은, 환상 펩티드의 부분 서열을 포함하게 된다.

환상 펩티드가, 루프 구조를 갖는 단백질에 융합된다는 것은, 루프 구조 -B_N-(Xaa1)_m-B_C-의 -(Xaa1)_m-에 있어서의 전부 또는 일부의 -(Xaa1)_p- 대신에, 환상 펩티드에 있어서, 분자 내 환상 구조를 구성하는 C_N-(Xaa2)_n-C_C의 전부 또는 일부가 치환되는 것을 의미한다.

구조로서는, -B_N-(Xaa1)_q-[C_N-(Xaa2)_n-C_C]-(Xaa1)_r-B_C-로 표현되는 구조가 된다. 부언하면, 해당 구조에 있어서는, 링커 서열을 포함하지 않은 경우로서 기재하고 있지만(p는 m 이하의 정수이고, p+q+r은 m이 된다. q와 r은 0 이상의 정수이지만, 0 내지 10의 정수인 것이 적합하다.), 링커 서열을 포함하는 경우에는, (Xaa1)_q-[C_N-(Xaa2)_n-C_C]의 결합, [C_N-(Xaa2)_n-C_C]-(Xaa1)_r의 결합간에, 링커 서열이 존재하게 된다.

부언하면, [C_N-(Xaa2)_n-C_C]은, 당해 서열에 있어서의 전부 또는 일부의 아미노산 서열이 융합하고 있는 것을 의미한다. 적합하게는, 부분 서열로서, C_N-(Xaa2)_n이 융합된다. 또한, C_N 및/또는 C_C가, 비단백질성 아미노산인 경우에는, 각각 단백질성 아미노산으로서 융합하고 있는 것을 의미해도 된다.

여기서, B_N과 B_C로 표현되는 아미노산 잔기는, 루프 구조에 있어서의 아미노산 잔기를 그대로 사용해도 되지만, 다른 아미노산 잔기로 치환해도 된다. 또한, C_N과 C_C로 표현되는 아미노산 잔기는, 환상 펩티드에 있어서의 아미노산 잔기를 그대로 사용해도 되지만, 다른 아미노산 잔기로 치환해도 되고, 결실시켜도 된다. 적합하게는, C_N은 단백질성 아미노산으로 치환되고, C_C는 결실시킨다.

환상 펩티드를 융합시킨 개변 단백질에 있어서는, 환상 펩티드 유래의 아미노산 서열에 있어서의 N 말단 아미노산과 그 N 말단측에서 융합하고 있는 B_N이라 한 루프 구조를 구성하는 2개의 아미노산 잔기까지의 사이의 아미노산수와, 환상 펩티드 유래의 아미노산 서열에 있어서의 C 말단 아미노산과 그 C 말단측에서 융합하고 있는 B_C라 한 루프 구조를 구성하는 2개의 아미노산 잔기까지의 사이의 아미노산수는, 동일하거나 상이해도 된다.

환상 펩티드 유래의 아미노산 서열에 있어서의 N 말단 아미노산과 그 N 말단측에서 융합하고 있는 B_N이라 한 루프 구조를 구성하는 2개의 아미노산 잔기까지의 사이의 아미노산수는, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 혹은 10개여도 되고, 0 내지 10, 0 내지 9, 0 내지 8, 0 내지 7, 0 내지 6, 0 내지 5, 0 내지 4, 0 내지 3, 0 내지 2, 0 내지 1 혹은 0개의 아미노산이면 된다.

환상 펩티드 유래의 아미노산 서열에 있어서의 C 말단 아미노산과 그 C 말단측에서 융합하고 있는 B_C라 한 루프 구조를 구성하는 2개의 아미노산 잔기까지의 사이의 아미노산수에 대해서도 마찬가지로, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 혹은 10개여도 되고, 0 내지 10, 0 내지 9, 0 내지 8, 0 내지 7, 0 내지 6, 0 내지 5, 0 내지 4, 0 내지 3, 0 내지 2, 0 내지 1 혹은 0개의 아미노산이면 된다.

환상 펩티드는, 일반적인 mRNA 디스플레이법에 의해 제조되는 펩티드여도 되고, TRAP법이나 RaPID법으로 제조되는 펩티드여도 되고, 또한 파지 디스플레이법에 의해 제조되는 펩티드여도 된다. 또한, 이들의 변법에 있어 제조되는 펩티드여도 된다.

환상 펩티드는, 분자 내 환상 구조를 형성하기 위한 화학 가교 구조로서, 예를 들어 티오에테르 결합 또는 디술피드 결합을 포함한다.

통상, RaPID법이나 TRAP법과 같은 mRNA 디스플레이법이나 파지 디스플레이법에 의해 선택되는 환상 펩티드는, 티오에테르 결합 또는 디술피드 결합과 같은 분자 내 환상 구조를 형성하기 위한 화학 가교 구조 이외의 구조가, 생리 활성을 갖는 활성점인 경우가 많다.

그렇게 하면, 환상 펩티드의 티오에테르 결합 또는 디술피드 결합을, 루프 구조를 갖는 단백질과의 결합으로 치환함으로써, 통상, RaPID법이나 TRAP법과 같은 mRNA 디스플레이법이나 파지 디스플레이법에 의해 얻어지는 환상 펩티드의 높은 특이성과 친화성을, 원하는 단백질의 원하는 루프 구조 내에 부여할 수 있다. 또한. 특별히 한정되는 것은 아니지만, 티오에테르 결합 또는 디술피드 결합을 분자 내 환상 구조로서 갖는 환상 펩티드를 융합함으로써, 환상 펩티드를 범용성을 가지고 융합시킬 수 있다.

환상 펩티드로서는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 천연형의 환상 펩티드를 사용해도 되고, 비천연형의 환상 펩티드를 사용해도 된다.

천연형의 환상 펩티드를 단백질 상에 제시하는 경우에는, 아미노산 잔기끼리를 결합하는 어느 결합도, 분자 내 환상 구조를 형성하기 위한 화학 가교 구조라 할 수 있기 때문에, 어느 결합을 채용할 수도 있지만, 천연형의 환상 펩티드에 있어서의 활성 부위라 생각되는 영역 이외의 아미노산 잔기끼리의 결합을, 단백질과 융합시키기 위한 화학 가교 구조로 하는 것이 바람직하다.

환상 펩티드는, 4 이상의 아미노산 잔기에 의해 형성되는 환상 구조를 분자 내에 적어도 갖는 펩티드이다. 4 이상의 아미노산 잔기에 의해 형성되는 환상 펩티드에 있어서의 환상 구조는, 직쇄상 펩티드에 있어서, 2 아미노산 이상 이격된 2개의 아미노산 잔기가 직접, 또는 링커 등을 통해서 결합함으로써 분자 내에 형성되는 폐환 구조이다.

2개의 아미노산 잔기가 2 아미노산 이상 이격되어 있는 것은, 2개의 아미노산 잔기 사이에 적어도 2개의 아미노산 잔기가 존재하고 있는 것과 동일한 의미이며, 2개의 아미노산 잔기는, 그 사이에 2개 이상의 아미노산을 통해서 결합하게 된다.

환상 구조에 있어서의 폐환 구조는, 특별히 한정되지 않지만, 2개의 아미노산이, 공유 결합함으로써 형성된다.

2개의 아미노산간의 공유 결합으로서는, 예를 들어 디술피드 결합, 펩티드 결합, 알킬 결합, 알케닐 결합, 에스테르 결합, 티오에스테르 결합, 에테르 결합, 티오에테르 결합, 포스포네이트에테르 결합, 아조 결합, C-S-C 결합, C-N-C 결합, C=N-C 결합, 아미드 결합, 락탐 가교, 카르바모일 결합, 요소 결합, 티오 요소 결합, 아민 결합 및 티오아미드 결합 등을 들 수 있다.

2개의 아미노산이 아미노산의 주쇄에 있어서 결합하면, 펩티드 결합에 의해 폐환 구조가 형성되지만, 2개의 아미노산의 측쇄끼리, 측쇄와 주쇄의 결합 등에 의해, 2개의 아미노산간의 공유 결합은 형성되어도 된다.

환상 구조는, 직쇄상 펩티드의 N 말단과 C 말단의 아미노산 결합에 한정되지 않고, 말단의 아미노산과 말단 이외의 아미노산의 결합, 또는 말단 이외의 아미노산끼리의 결합에 의해 형성되어도 된다. 환상 구조를 형성하기 위해서 결합하는 2개의 아미노산의 한쪽이 말단 아미노산이고, 다른 쪽이 비말단 아미노산인 경우, 환상 펩티드는, 환상 구조로부터의 쇄상의 분지쇄로서, 환상 구조에 직쇄의 펩티드가 꼬리와 같이 붙은 구조를 갖는다.

환상 구조를 형성하는 아미노산으로서는, 단백질성 아미노산에 더하여, 인공의 아미노산 변이체나 유도체를 포함하고, 예를 들어 단백질성 L-아미노산, 아미노산의 특징인 당업계에서 공지된 특성을 갖는 화학적으로 합성된 화합물 등을 들 수 있다.

단백질성 아미노산(proteinogenic amino acids)은, 당업계에 주지된 3문자 표기에 의해 나타내면, Arg, His, Lys, Asp, Glu, Ser, Thr, Asn, Gln, Cys, Gly, Pro, Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Trp, Tyr 및 Val이다.

비단백질성 아미노산(non-proteinogenic amino acids)으로서는, 단백질성 아미노산 이외의 천연 또는 비천연의 아미노산을 의미한다.

비천연 아미노산으로서는, 예를 들어 주쇄의 구조가 천연형과 다른, α,α-이치환 아미노산(α-메틸알라닌 등), N-알킬-α-아미노산, D-아미노산, β-아미노산, α-히드록시산이나, 측쇄의 구조가 천연형과 다른 아미노산(노르류신, 호모히스티딘 등), 측쇄에 여분의 메틸렌을 갖는 아미노산(「호모」아미노산, 호모페닐알라닌, 호모히스티딘 등) 및 측쇄 중의 카르복실산 관능기가 술폰산기로 치환되는 아미노산(시스테인산 등) 등을 들 수 있다. 비천연 아미노산의 구체예로서는, 국제공개 제2015/030014호에 기재된 아미노산을 들 수 있다.

환상 구조를 형성하는 아미노산의 수는 4 이상이면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 5 이상, 8 이상, 10 이상이어도 되고, 30 이하, 25 이하, 20 이하, 15 이하여도 된다.

환상 구조를 형성하는 아미노산의 수로서는, 4 이상 30 이하인 것이 바람직하고, 4 이상 30 이하의 범위 내에서, 환상 구조를 형성하는 아미노산의 수를 5 이상, 8 이상, 10 이상으로 해도 되고, 30 이하, 25 이하, 20 이하, 15 이하로 해도 된다.

환상 구조를 형성하는 아미노산의 수는, 8 이상 20 이하로 해도 되고, 10 이상 20 이하로 해도 되고, 10 이상 15 이하로 해도 된다.

본 발명에 있어서 사용되는 환상 펩티드는, 공지된 펩티드 합성 기술을 사용해서 제조할 수 있는 환상 펩티드이다.

환상 펩티드의 제조 방법으로서는, 예를 들어, 액상법, 고상법, 액상법과 고상법을 조합한 하이브리드법 등의 화학 합성법, 유전자 조작법, 무세포 번역계에 의한 번역 합성법 등을 들 수 있다.

환상 펩티드는, RaPID법이나 TRAP법과 같은 mRNA 디스플레이법이나 파지 디스플레이법에 의해 적합하게 제조할 수 있는 펩티드를 사용하는 것이 바람직하다.

RaPID법에 있어서는, 예를 들어 하기 표 1에 나타내는 관능기 1을 갖는 아미노산과, 대응하는 관능기 2를 갖는 아미노산이 환상화한 환상 펩티드로 할 수 있다.

관능기 1과 2는 어느 쪽이 N 말단측에 와도 되고, N 말단과 C 말단에 배치 해도 되고, 한쪽을 말단 아미노산, 다른 쪽을 비말단 아미노산으로 해도 되고, 양쪽을 비말단 아미노산으로 해도 된다.

관능기 1과 관능기 2에 의해 형성되는 결합이, 환상 펩티드에 있어서의 분자 환상 구조를 형성하기 위한 화학 가교 구조라 할 수 있다.

식 중, X₁은 탈리기이고, 탈리기로서는, 예를 들어 Cl, Br 및 I 등의 할로겐 원자를 들 수 있고, Ar은 치환기를 갖고 있어도 되는 방향환이다.

파지 디스플레이법에 있어서는, Cys끼리가 결합해서 환상화한 환상 펩티드로 할 수 있기 때문에, 관능기 1로서의 -SH와 관능기 2로서의 HS-에 의한 디술피드 결합을 갖는 환상 펩티드로 할 수 있다.

(A-1)의 관능기를 갖는 아미노산으로서는, 예를 들어 클로로아세틸화한 아미노산을 사용할 수 있다. 클로로아세틸화 아미노산으로서는, N-클로로아세틸-L-알라닌, N-클로로아세틸-L-페닐알라닌, N-클로로아세틸-L-티로신, N-클로로아세틸-L-트립토판, N-3-(2-클로로아세트아미도)벤조일-L-페닐알라닌, N-3-(2-클로로아세트아미도)벤조일-L-티로신, N-3-(2-클로로아세트아미도)벤조일-L-트립토판, β-N-클로로아세틸-L-디아미노프로판산, γ-N-클로로아세틸-L-디아미노부티르산, σ-N-클로로아세틸-L-오르니틴, ε-N-클로로아세틸-L-리신 및 이들에 대응하는 D-아미노산 유도체 등을 들 수 있다.

(A-1)의 관능기를 갖는 아미노산으로서는, N-클로로아세틸-L-트립토판 및 N-클로로아세틸-L-티로신이 적합하게 사용되고, D체인 것이 보다 적합하다.

부언하면, 본 명세서에 있어서, L체인 것을 명시해서 기재하는 경우가 있지만, L체여도 되고, D체여도 되는 것을 의미하고, 또한 L체와 D체의 임의의 비율로의 혼합물이어도 된다. L체 및 D체인 것을 명시해서 기재하지 않은 경우에 대해서도, L체여도 되고, D체여도 되는 것을 의미하고, 또한 L체와 D체의 임의의 비율로의 혼합물이어도 된다.

(A-2)의 관능기를 갖는 아미노산으로서는, 예를 들어 시스테인, 호모시스테인, 머캅토노르발린, 머캅토노르류신, 2-아미노-7-머캅토헵탄산 및 2-아미노-8-머캅토옥탄산 등을 들 수 있다.

(A-1)의 관능기를 갖는 아미노산으로서는, 시스테인이 적합하게 사용된다.

(A-1)의 관능기를 갖는 아미노산과 (A-2)의 관능기를 갖는 아미노산에 의한 환상화 방법은, 예를 들어 Kawakami, T. et al., Nature Chemical Biology 5, 888-890(2009); Yamagishi, Y. et al., ChemBioChem 10, 1469-1472(2009); Sako, Y. et al., Journal of American Chemical Society 130, 7932-7934(2008); Goto, Y. et al., ACS Chemical Biology 3, 120-129(2008); Kawakami T. et al, Chemistry & Biology 15, 32-42(2008) 및 국제공개 제2008/117833호 등에 기재된 방법을 들 수 있다.

(B-1)의 관능기를 갖는 아미노산으로서는, 예를 들어 프로파르길글리신, 호모프로파르길글리신, 2-아미노-6-헵틴산, 2-아미노-7-옥틴산 및 2-아미노-8-노닌산 등을 들 수 있다.

4-펜티노일화나 5-헥시노일화한 아미노산을 사용해도 된다.

4-펜티노일화 아미노산으로서는, 예를 들어 N-(4-펜테노일)-L-알라닌, N-(4-펜테노일)-L-페닐알라닌, N-(4-펜테노일)-L-티로신, N-(4-펜테노일)-L-트립토판, N-3-(4-펜티노일아미도)벤조일-L-페닐알라닌, N-3-(4-펜티노일아미도)벤조일-L-티로신, N-3-(4-펜티노일아미도)벤조일-L-트립토판, β-N-(4-펜테노일)-L-디아미노프로판산, γ-N-(4-펜테노일)-L-디아미노부티르산, σ-N-(4-펜테노일)-L-오르니틴, ε-N-(4-펜테노일)-L-리신 및 이들에 대응하는 D-아미노산 유도체 등을 들 수 있다.

5-헥시노일화 아미노산으로서는, 4-펜티노일화 아미노산으로서 예시한 화합물에 있어서, 4-펜티노일기가, 5-헥시노일기로 치환된 아미노산을 들 수 있다.

(B-2)의 관능기를 갖는 아미노산으로서는, 예를 들어 아지도알라닌, 2-아미노-4-아지도부탄산, 아지돕토노르발린, 아지도노르류신, 2-아미노-7-아지도헵탄산 및 2-아미노-8-아지도옥탄산 등을 들 수 있다.

아지도아세틸화나 3-아지도펜타노일화한 아미노산을 사용할 수도 있다.

아지도아세틸화 아미노산으로서는, 예를 들어 N-아지도아세틸-L-알라닌, N-아지도아세틸-L-페닐알라닌, N-아지도아세틸-L-티로신, N-아지도아세틸-L-트립토판, N-3-(4-펜티노일아미도)벤조일-L-페닐알라닌, N-3-(4-펜티노일아미도)벤조일-L-티로신, N-3-(4-펜티노일아미도)벤조일-L-트립토판, β-N-아지도아세틸-L-디아미노프로판산, γ-N-아지도아세틸-L-디아미노부티르산, σ-N-아지도아세틸-L-오르니틴, ε-N-아지도아세틸-L-리신 및 이들에 대응하는 D-아미노산 유도체 등을 들 수 있다.

3-아지도펜타노일화 아미노산으로서는, 아지도아세틸화 아미노산으로서 예시한 화합물에 있어서, 아지도아세틸기가, 3-아지도펜타노일기로 치환된 아미노산을 들 수 있다.

(B-1)의 관능기를 갖는 아미노산과 (B-2)의 관능기를 갖는 아미노산에 의한 환상화 방법은, 예를 들어 Sako, Y. et al., Journal of American Chemical Society 130, 7932-7934(2008) 및 국제공개 제2008/117833호 등에 기재된 방법을 들 수 있다.

(C-1)의 관능기를 갖는 아미노산으로서는, 예를 들어 N-(4-아미노메틸-벤조일)-페닐알라닌(AMBF) 및 3-아미노메틸티로신 등을 들 수 있다.

(C-2)의 관능기를 갖는 아미노산으로서는, 예를 들어 5-히드록시트립토판(WOH) 등을 들 수 있다.

(C-1)의 관능기를 갖는 아미노산과 (C-2)의 관능기를 갖는 아미노산에 의한 환상화 방법은, 예를 들어 Yamagishi, Y. et al., ChemBioChem 10, 1469-1472(2009) 및 국제공개 제2008/117833호에 기재된 방법 등을 들 수 있다.

(D-1)의 관능기를 갖는 아미노산으로서는, 예를 들어 2-아미노-6-클로로-헥신산, 2-아미노-7-클로로-헵틴산 및 2-아미노-8-클로로-옥틴산 등을 들 수 있다.

(D-2)의 관능기를 갖는 아미노산으로서는, 예를 들어 시스테인, 호모시스테인, 머캅토노르발린, 머캅토노르류신, 2-아미노-7-머캅토헵탄산 및 2-아미노-8-머캅토옥탄산 등을 들 수 있다.

(D-1)의 관능기를 갖는 아미노산과 (D-2)의 관능기를 갖는 아미노산에 의한 환상화 방법은, 예를 들어 국제공개 제2012/074129호에 기재된 방법 등을 들 수 있다.

(E-1)의 아미노산으로서는, 예를 들어 N-3-클로로메틸벤조일-L-페닐알라닌, N-3-클로로메틸벤조일-L-티로신, N-3-클로로메틸벤조일-L-트립토판 및 이들에 대응하는 D-아미노산 유도체 등을 들 수 있다.

(E-2)의 아미노산으로서는, 예를 들어 시스테인, 호모시스테인, 머캅토노르발린, 머캅토노르류신, 2-아미노-7-머캅토헵탄산 및 2-아미노-8-머캅토옥탄산 등을 들 수 있다.

(E-1)의 관능기를 갖는 아미노산과 (E-2)의 관능기를 갖는 아미노산에 의한 환상화 방법은, 예를 들어 (A-1)과 (A-2)의 환상화 방법이나 (D-1)과 (D-2)의 환상화 방법을 참고로 해서 행할 수 있다.

환 형성 아미노산으로서는, (A-1)의 관능기를 갖는 아미노산과 (A-2)의 관능기를 갖는 아미노산의 조합이 바람직하고, 탈리기에서 H가 치환된 N-아세틸트립토판과 시스테인의 조합이 보다 바람직하고, N-할로아세틸-D-티로신 또는 N-할로아세틸-D-트립토판, 적합하게는 N-클로로아세틸-D-티로신 또는 N-클로로아세틸-D-트립토판과 시스테인(Cys)의 조합이 더욱 바람직하다.

본 발명에 있어서는, RaPID법이나 TRAP법과 같은 mRNA 디스플레이법이나 파지 디스플레이법에 의해 제조되는 환상 펩티드이며, 원하는 결합 분자에 대하여 생리 활성을 갖는 환상 펩티드를 사용하는 것이 바람직하다.

RaPID법이나 TRAP법과 같은 mRNA 디스플레이법이나 파지 디스플레이법에 의해 적합하게 제조할 수 있는 펩티드에 있어서의 관능기 1 및 관능기 2에 의해 형성되는 결합을 분자 내 환상 구조를 형성하기 위한 화학 가교 구조로서, 루프 구조를 갖는 단백질과 융합시키는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서 사용되는 환상 펩티드에 대해서, RaPID법에 의해 제조되는 환상 펩티드를 예로, 이하 설명한다.

본 발명에 있어서, RaPID법에 의해 제조되는 환상 펩티드로서는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 이하의 일반식으로 표시되는 환상 펩티드를 들 수 있다.

상기 일반식으로 표시되는 환상 펩티드는, 예시가 되지만, 표 1에 기재된 관능기 1 및 관능기 2로서, (A)인 경우의 구조를 갖는다.

여기서, 일반식에 있어서, S는 Cys의 티올기에서 유래하는 황 원자를 의미한다. Xaa는 임의의 아미노산을 나타내고, s는 임의의 0 이상의 정수이다. 가변 영역(Variable region)은, 환상 아미노산을 구성하는 Cys 이외의 아미노산 서열을 나타낸다. 가변 영역(Variable region)의 N 말단의 아미노산은, 상기 (A-1)의 관능기를 갖는 아미노산인 것이 바람직하다.

가변 영역(Variable region)의 아미노산 서열은, RaPID법에 의해 제조되는 환상 펩티드에 있어서의 부분 아미노산 서열이며, 환상 펩티드를 구성하는 한, 임의의 아미노산 서열일 수 있다.

환상 펩티드로서, 상기 일반식으로 표시되는 펩티드가 사용되는 경우에는, 가변 영역의 N 말단의 아미노산 잔기가 C_N이고, Cys가 C_C이다.

C_N이, 예를 들어 비단백질성 아미노산인 N-할로아세틸-D-트립토판인 경우에는, 단백질성 아미노산인 L-트립토판으로 치환해서, 예를 들어 비단백질성 아미노산인 N-클로로아세틸-D-티로신인 경우에는, 단백질성 아미노산인 L-티로신으로 치환해서 환상 펩티드가 융합되는 것이 적합하다. 또한, C_N을 단백질성 아미노산인 Cys로 치환해도 된다. C_C가, 예를 들어 Cys인 경우에는, C_C를 결실시켜서 환상 펩티드가 융합되는 것이 적합하고, 또한 C_C가 Cys인 경우에, C_C인 Cys도 융합시키는 경우에는, C_N을 Cys로 치환해서 융합하는 것도 바람직하다. 일반식으로 표시되는 환상 펩티드가 융합되는 경우, 소망에 따라, D-아미노산은, L-아미노산으로 치환되기는 하지만, 환상 펩티드의 환상 구조를 구성하는 아미노산 서열의 부분 아미노산 서열로서, 가변 영역(Variable region)의 아미노산 서열이, 환상 펩티드가 융합된 개변 단백질에 융합되는 것이 바람직하다. 본 발명에 있어서는, 가변 영역(Variable region)의 아미노산 서열의 일부가, 예를 들어 C_N이 비단백질성 아미노산인 경우에, 단백질성 아미노산으로 치환되어 있는 경우도, 가변 영역(Variable region)의 아미노산 서열이, 환상 펩티드가 융합된 개변 단백질에 융합되어 있다고 이해된다. 가변 영역(Variable region)과 C_C인 Cys가 함께, 융합되어 있어도 된다.

RaPID법이나 TRAP법과 같은 mRNA 디스플레이법이나 파지 디스플레이법에 의해 적합하게 제조할 수 있는 환상 펩티드를 루프 구조를 갖는 단백질과 융합시키는 경우에는, 구체적으로는, 이하와 같은 개변을 행하는 것도 적합하다.

(1) RaPID법이나 TRAP법과 같은 mRNA 디스플레이법이나 파지 디스플레이법에 있어서의 분자 내 환상 구조를 형성하기 위한 화학 가교 구조에 관여하는 아미노산 잔기를 각각 치환 또는 삭제하고, 환상 펩티드 유래의 아미노산 잔기와, 루프 구조 유래의 아미노산 잔기를 융합시켜도 된다.

구체적으로는, RaPID법에 의한 환상 펩티드에 있어서는, 관능기 1을 갖는 아미노산 잔기를 단백질성 아미노산으로 치환하고, 관능기 2를 갖는 아미노산 잔기를 각각 결실하여, 루프 구조와 융합한다. 관능기 1을 갖는 아미노산 잔기로서, D-아미노산 등의 비단백질성 아미노산이 사용되는 경우가 있다.

파지 디스플레이법에 의한 환상 펩티드에 있어서는, 화학 가교 구조인 S-S 결합을 구성하는 Cys 잔기를 삭제하고, 루프 구조와 융합해도 된다.

보다 구체적으로는, RaPID법에 있어서, 관능기 1로서 (A-1)의 구조가 채용 되어 있는 경우, 일반적으로, (A-1)의 구조를 갖는 아미노산으로서는, ClAc-D-Trp나 ClAc-D-Tyr이 사용되고 있는 경우가 많지만, 개변 단백질에 있어서는, 해당 아미노산 잔기를 L-Trp나 L-Tyr로 치환하는 것이 바람직하다. 또한, ClAc-D-Trp나 ClAc-D-Tyr을 결실시켜도 된다.

또한, (A-2)의 구조를 갖는 아미노산으로서는, Cys가 사용되고 있는 경우가 많지만, 개변 단백질에 있어서는, 해당 Cys 잔기를 결실시켜도 된다.

(2) (1)에 있어서, 환상 펩티드는 갖지 않지만, Ser, Gly 및 Cys와 같은 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 환상 펩티드와 루프 구조와의 링커 서열로서 사용하여, 환상 펩티드 유래의 아미노산 잔기와, 루프 구조 유래의 아미노산 잔기와의 사이에 삽입하여, 융합시켜도 된다.

(3) 분자 내 환상 구조를 형성하기 위한 화학 가교 구조에 관여하는 아미노산 잔기를 L-Cys로 변환하고, 환상 펩티드를 루프 구조와 융합시킨 개변 단백질에 있어서, 디술피드 결합에 의해 가교 구조를 형성시킴과 함께, Ser 및 Gly와 같은 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 환상 펩티드와 루프 구조와의 링커 서열로서 사용하여, 환상 펩티드 유래의 아미노산 잔기와, 루프 구조 유래의 아미노산 잔기와의 사이에 삽입하여, 융합시켜도 된다.

링커 서열을 구성하는 아미노산 잔기의 수는, 1 이상의 아미노산 잔기이면 되고, 아미노산 잔기의 수는, 특별히 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서는, 환상 펩티드를, 루프 구조를 갖는 단백질 상에 제시하는 방법에 있어서 환상 펩티드를 루프 구조를 갖는 단백질에 융합시키는 것을 포함하지만, 환상 펩티드를 루프 구조를 갖는 단백질에 융합시키기 위해서는, 통상의 유전자 공학 기술을 사용해서 행할 수 있다.

구체적으로는, 본 발명은, 환상 펩티드를 단백질에 융합시키는 방법으로서, 환상 펩티드를, 루프 구조를 갖는 단백질에 융합시켜서 환상 펩티드를 단백질 상에 제시시킨 개변 단백질의 제조 방법도 제공한다.

본 발명에 있어서의, 환상 펩티드를, 루프 구조를 갖는 단백질에 융합시켜서 환상 펩티드를 단백질 상에서 제시시킨 개변 단백질의 제조 방법은,

환상 펩티드는, 분자 내 환상 구조를 형성하기 위한 화학 가교 구조를 갖고,

환상 펩티드의 아미노산 서열로부터, 단백질 상에서 제시시키는 부분 아미노산 서열을 선택하고, 해당 부분 아미노산 서열에 상당하는 염기 서열을 선택하고,

루프 구조를 갖는 단백질의 루프 구조를 구성하는 2개의 아미노산 잔기에 상당하는 염기 서열을 선택하고, 해당 선택된 염기 서열간에 존재하는 염기를 필요에 따라서 삭제하고, 선택된 환상 펩티드의 부분 아미노산 서열에 상당하는 염기 서열을 삽입해서 혼입한 염기 서열을 갖는 핵산을 준비하고,

해당 핵산을 번역하는, 개변 단백질의 제조 방법이다.

환상 펩티드로서는, RaPID법이나 TRAP법과 같은 mRNA 디스플레이법 또는 파지 디스플레이법에 의해 선택되는 환상 펩티드를 사용하는 것이 바람직하고, mRNA 디스플레이법에 의한 것이 보다 바람직하고, mRNA 디스플레이법 등에 의하면, 환상 펩티드 중, 삽입해야 할 부분 아미노산 서열의 염기 서열은 용이하게 이해할 수 있다.

루프 구조를 갖는 단백질의 루프 구조를 구성하는 2개의 아미노산 잔기에 상당하는 염기 서열을 선택하고, 해당 선택된 염기 서열간에 존재하는 염기를 필요에 따라서 삭제하는 방법이나, 선택된 환상 펩티드의 부분 아미노산 서열에 상당하는 염기 서열을 삽입해서 혼입한 염기 서열을 갖는 핵산을 준비하는 방법은, 특별히 한정되는 것이 아니고, 종래 공지된 방법을 원용해서 실시할 수 있다.

또한, 준비된 핵산의 번역 방법은, 본 발명이 속하는 기술 분야에 있어서, 이미 주지의 사항이므로, 그들 주지의 방법을 적절히 적용하여, 핵산의 번역을 행하면 된다.

루프 구조를 갖는 단백질의 루프 구조를 구성하는 2개의 아미노산 잔기에 상당하는 염기 서열을 선택함에 있어서는, 루프 구조를 갖는 단백질의 아미노 서열에 있어서(부분 단편 단백질의 아미노산 서열이어도 되고, 융합 단백질의 아미노산 서열이어도 된다.), 루프 구조를 구성하는 아미노산 서열 중에서 환상 펩티드를 융합시키는 스캐폴드가 되는 2개의 아미노산 잔기가 선택된다.

2개의 아미노산 잔기는, 스캐폴드 단백질의 구조 데이터를 사용하거나, 스캐폴드 단백질의 입체 구조가 분명하지 않은 경우에도, 그의 상사 단백질(상동체)의 구조 정보로부터 구축한 모델 구조를 사용함으로써, 선택할 수 있다.

2개의 아미노산 잔기를 선택함에 있어서는, 복수의 루프 구조를 갖는 스캐폴드 단백질을 선택하고 있는 경우에는, 환상 펩티드를 융합시키는 루프 구조를 선택하고, 당해 루프 구조 내에서 Cα 원자간 거리가 4 내지 7Å에 있는 2개의 아미노산 잔기를 선택하는 것이 바람직하다.

2개의 아미노산 잔기를 선택할 때에는, 1 내지 15 아미노산 잔기 이격된 2개의 아미노산 잔기를 선택하는 것이 바람직하고, Cα 원자간 거리가 4 내지 7Å에 있고, 또한 1 내지 15 아미노산 잔기 이격된 2개의 아미노산 잔기를 선택하는 것이 보다 바람직하다.

여기서, 스캐폴드 단백질로부터 선택한 2개의 아미노산 잔기 중, 원래의 스캐폴드 단백질에 있어서, N 말단측에 있는 아미노산 잔기를 B_N이라 하고, C 말단측에 있는 아미노산 잔기를 B_C라 한다.

B_N에 결합하는 C 말단측의 아미노산 서열을 환상 펩티드와의 결합에 사용해도 되고, 또한 B_C에 결합하는 N 말단측의 아미노산 서열을 환상 펩티드와의 결합에 사용해도 된다.

환상 펩티드와 결합시키는 아미노산 잔기를 선택한 후, 링커 서열의 부가를 선택할 수도 있다.

스캐폴드 단백질에 융합시키는 환상 펩티드의 선택에 있어서는, 어떠한 생리 활성을 갖는 것이 알려져 있거나, 혹은 생리 활성을 갖는 것을 확인한 환상 펩티드를 선택하는 것이 바람직하다. 또한, 환상 펩티드의 아미노산 서열은, 통상의 방법에 의해, 적절히 확인해도 된다.

환상 펩티드의 화학 가교 구조가 되는 결합을 특정하고, 당해 결합을 절단함으로써 얻어지는 1차 아미노산 서열 정보에 기초하여, 융합시키는 환상 펩티드에 있어서의 아미노산 서열을 선택한다.

선택된 아미노산 서열에 기초하여, 단백질에 필요한 번역에 필요해지는 염기 서열을 결정하고, 번역하는 것에 의해 소정의 개변 단백질을 제조할 수 있다.

본 발명의 방법에 의해 얻어지는 루프 구조를 갖는 단백질을 스캐폴드로 해서, 환상 펩티드를 단백질 상에 제시시킨 개변 단백질은, 환상 펩티드의 구조와 활성을 유지시킨 상태에서 환상 펩티드를 제시하므로, 환상 펩티드의 활성에 기초한 시약, 의약 등으로서 사용할 수 있다.

또한, 환상 펩티드가 융합된 개변 단백질은, 단백질 자체가 갖고 있는 활성에 더하여, 환상 펩티드가 갖는 활성을 나타내기 때문에, 2종의 다른 또는 동종의 활성을 갖는 개변 단백질로서 사용하는 것도 가능하다.

본 발명에 있어서는, 1의 환상 펩티드가, 1 또는 2 이상의 루프 구조를 갖는 단백질의 1 또는 2 이상의 루프 구조에 각각 융합하고 있어도 되고, 2 이상의 환상 펩티드가, 복수의 루프 구조를 갖는 단백질의 다른 루프 구조에 각각 융합하고 있어도 된다.

2 이상의 환상 펩티드가 융합하는 경우, 동일한 아미노산 서열을 갖는 환상 펩티드여도 되고, 2 이상의 환상 펩티드가 다른 아미노산 서열을 갖는 환상 펩티드여도 된다.

실시예

이하, 실시예를 나타내어 구체적으로 본 발명을 설명하지만, 본 발명은 이하의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

결합 분자로 한 인간 플렉신 B1, 인간 Met 수용체, 인간 EGF 수용체 및 인간 TrkB 수용체에 대하여, 국제공개 제2011/049157호 및 일본특허공개 제2013-46637호 공보 등에 기초하여 RaPID 시스템을 실시하고, 각각에 특이적으로 결합하는 환상 펩티드를 1 내지 3종류씩 얻었다. 환상 펩티드의 구조를 도 1에 도시한다.

도 1에 있어서, 가변 영역의 아미노산 서열의 N 말단 아미노산 및 정상부의 Cys(일반식 중에 도시)가 각각 뒤에 연결에 사용하는 아미노산 잔기 C_N 및 C_C에 대응한다. 부언하면, 환상 펩티드의 N 말단 아미노산으로서 w 및 y로 소문자로 나타나는 D-아미노산은, 각각 L-아미노산으로 치환하거나, 혹은 결실시켜서 융합 단백질에 도입했다.

도 1에 기재된 환상 펩티드 중, P6 및 P7은 Cell Chem. Biol, 2016, 23, 1341-1350에 기재된 환상 펩티드이며, 모두 인간 플렉신 B1에 대하여 결합하는 활성을 갖고 있다. mP6-9는 P6의 아미노산 서열의 일부를 개변한 것으로, P6에 동일하게 인간 플렉신 B1에 대한 결합성을 갖고 있다. 또한, P6 및 mP6-9는 인간 플렉신 B1에 결합함으로써 인간 플렉신 B1에 대한 세마포린 4D의 결합을 알로스테릭 저해하고, 결과로서 세포에 있어서 세마포린 4D 자극에 의한 형태 변화를 억제하는 활성을 갖는다(Cell Chem. Biol, 2016, 23, 1341-1350).

aMD4, aMD5 및 aML5는, Nature Co㎜un, 2015, 6, 6373에 기재된 환상 펩티드이며, 모두 인간 Met 수용체에 대하여 결합하는 활성을 갖고 있다. 또한, 이들 펩티드는 단독으로는 인간 Met 수용체를 활성화하지 않지만, 가교에 의해 이량체화하면 인간 Met 수용체의 활성화를 야기하여, 아고니스트 활성을 갖는 것을 알 수 있다.

A6-2f 및 trkD5는 각각 대응하는 인간 EGF 수용체 및 인간 TrkB 수용체에 나노몰 레벨의 친화성으로 결합한다.

[실시예 1] 피브로넥틴의 제10번째 형 III 반복 도메인과 환상 펩티드의 융합

1. 환상 펩티드 융합 단백질의 디자인

상기 8종류의 생리 활성 환상 펩티드의 화학 가교 구조로 치환하기 위해서, 스캐폴드 단백질이 되는 루프 구조를 갖는 단백질로서 인간 피브로넥틴의 제10번째 형 III 반복 도메인(이하, 「Fn10」이라고 칭한다)을 선택하고, 그의 입체 구조 상에서 6번째와 7번째의 β스트랜드 사이에 끼워진 루프 부분으로부터 Cα 원자간 거리가 4.1Å인 Val1490(B_N에 상당)과 Ser1499(B_C에 상당)의 2 아미노산 잔기를 연결 잔기로서 선정했다. 이 부분의 입체 구조를 도 2에 도시한다.

Fn10에 있어서 선정한 B_N과 B_C의 2 아미노산 잔기에 의해 사이에 끼워지는 8 아미노산 잔기의 일부를, 도 1에서 도시한 환상 펩티드의 가변 영역의 아미노산 서열의 양측에 적절히 임의의 링커 아미노산을 추가한 것으로 치환한 융합 단백질을 디자인했다(부언하면, 환상 펩티드의 가변 영역의 w 또는 y로 표현되는 비단백질성 아미노산은, 단백질성 아미노산인 W 또는 Y로 치환하여, 융합된 환상 펩티드의 가변 영역의 아미노산 서열이 디자인되어 있다. 이하, 마찬가지이다. 또한, P7을 융합시키는 경우에만, P7의 가변 영역에 있어서의 N 말단의 아미노산 잔기인 w를 Cys로 치환하고, C_C에 상당하는 Cys와 함께 디자인했다.). 디자인한 융합 단백질에 있어서의, 환상 펩티드 융합 후의 루프 부분의 아미노산 서열을 도 3에 도시한다.

2. 환상 펩티드 융합 단백질의 제조

인간 프롤락틴의 시그널 서열을 코딩하는 DNA, 인간 피브로넥틴의 아미노산 잔기 번호 1418 내지 1509의 영역을 코딩하는 DNA, 그리고 인간 IgG1의 Fc 영역을 코딩하는 DNA를 연결하여, Fn10-Fc 융합 단백질의 컨스트럭트를 작성하고, 이것을 발현 벡터 pcDNA3.1(서모 피셔 사이언티픽사제)에 혼입했다.

Fn10-Fc 발현 벡터를 바탕으로, 피브로넥틴 영역 내의 Val1490과 Ser1499 사이에 끼워지는 루프 영역의 8 아미노산 잔기를, 도 3에 도시하는 삽입 서열로 교체한 발현 벡터를 제작했다. 삽입 서열 부분은 익스텐션(extension) PCR법을 사용해서 증폭하고, 목적으로 하는 각종 환상 펩티드 융합 단백질의 컨스트럭트를 얻었다. 환상 펩티드 융합 단백질은 각각 Fn10(P6)-Fc와 같이 Fn10(환상 펩티드명)-Fc라 명명했다.

Expi293F 세포(서모 피셔 사이언티픽사제)를 3mL의 Expi293 발현 배지(Expression Medium)(서모 피셔 사이언티픽사제)를 사용하여, 세포가 3x10⁶cells/mL가 되도록 파종했다. 그 후, 통상법에 따라, ExpiFectamine 293 Reagent(서모 피셔 사이언티픽사제)를 사용하여, 3㎍의 Fn10-Fc(혹은 그의 변이체) 발현용 벡터를, Expi293F 세포에 유전자 도입했다. 유전자 도입 후, 37℃, 8% CO₂ 조건 하, 125rpm으로 세포를 18시간 진탕 배양했다. 그 후, ExpiFectamime 293 형질감염 인핸서(Transfection Enhancer) 1 및 ExpiFectamime 293 형질감염 인핸서 2(서모 피셔 사이언티픽사제)를 각각 15μL, 150μL 첨가하여, 37℃, 8% CO₂ 조건 하, 125rpm으로 3일간 진탕 배양하고, 배양 상청을 회수했다.

회수한 배양 상청 0.3mL에 단백질 A-세파로스(서모 피셔 사이언티픽사제)를 30μL 첨가하고, 2시간 회전 혼화했다. 원심 분리에 의해 세파로스를 침전시켜서 상청을 제거하고, 1mL의 Tris-완충 염수(buffered saline)(TBS, 20mM Tris-HCl, 150mM NaCl, pH7.5)로 3회 세파로스를 세정하고, SDS 샘플 버퍼 20μL를 첨가해서 95℃에서 2분간 가열해서 시료를 용출했다. 용출한 시료의 5μL를 환원 조건 하에서 전기 영동에 제공하고, 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색했다.

전기 영동의 결과를 도 4에 도시한다. 도 4에 있어서, 샘플 번호는, 둥근 숫자로 나타낸다. Fn10-Fc(샘플 번호 1)은 예상되는 분자량(37.5kDa)의 위치에 밴드가 보이고, 모든 환상 펩티드 융합 단백질(샘플 번호 2 내지 9)은 그보다 약간 높은 분자량을 나타내고, 전체 아미노산 길이로서 12 내지 20잔기 긴 것에 호응하고 있었다. 모두 펩티드 삽입이 없는 Fn10-Fc와 손색없는 양의 환상 펩티드 융합 단백질이 Expi293F 세포로부터 발현·분비되고 있는 것이 확인되었다.

3. 환상 펩티드 융합 단백질의 결합 분자에 대한 결합

다양하게 환상 펩티드를 융합한 Fn10-Fc에 대해서, 융합 전의 환상 펩티드가 갖고 있었던 결합 분자에 대한 결합능을 유지하고 있는지의 여부를 조사하기 위해서, 풀 다운형의 결합 시험을 행하였다. Protein Exp. Purification, 2014, 95, 240-247에 기재된 방법에 준하여, 4종류의 결합 분자(모두 1회 막 관통형의 수용체)의 세포 외 영역의 C 말단에 PA 태그(와코 쥰야꾸 고교사제)가 부가된 융합 단백질을 코딩하는 컨스트럭트를 작성하고, 이것을 발현 벡터 pcDNA3.1(서모 피셔 사이언티픽사제)에 혼입했다. 이 벡터를 사용해서 전술한 방법에 의해 Expi293F 세포로 일과성 발현시키고, 가용성 수용체 단편인 플렉신 B1-PA, Met-PA, EGFR-PA 및 TrkB-PA를 각각 포함하는 배양 상청을 조제했다.

PA 태그를 부가한 수용체 세포외 영역을 포함하는 배양 상청 0.5mL에 항 PA 태그 항체인 NZ-1을 고정화한 세파로스(와코 쥰야꾸 고교사제)를 30μL 첨가하고, 2시간 회전 혼화함으로써 결합 분자를 세파로스에 캡쳐했다. 원심 분리에 의해 세파로스를 침전시켜서 제거한 후, 별도로 조제한 각종 환상 펩티드 융합 단백질(Fn10-Fc 변이체)을 포함하는 배양 상청을 0.5mL 첨가하고, 추가로 2시간 회전 혼화해서 반응시켰다. 다시 원심 분리에 의해 세파로스를 침전시켜서, 1mL의 TBS로 3회 세파로스를 세정하고, SDS 샘플 버퍼 20μL를 첨가해서 95℃에서 2분간 가열해서 시료를 용출했다. 용출한 시료의 5μL를 환원 조건 하에서 전기 영동에 제공하고, 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색했다.

전기 영동의 결과를 도 5에 도시한다. 플렉신 결합제인 P6, mP6-9 및 P7의 아미노산 서열을 혼입한 융합 단백질(샘플 번호 2 내지 4)은 플렉신 B1-PA와, Met 결합제인 aMD4, aMD5 및 aML5의 아미노산 서열을 혼입한 융합 단백질(샘플 번호 5 내지 7)은 Met-PA와, EGF 수용체 결합제인 A6-2f의 아미노산 서열을 혼입한 융합 단백질(샘플 번호 8)은 EGFR-PA와, TrkB 결합제인 trkD5의 아미노산 서열을 혼입한 융합 단백질(샘플 번호 9)은 TrkB-PA와, 각각 특이적으로 결합하는 것이, 풀 다운의 결과로부터 밝혀졌다.

컨트롤로서 사용한 Fn10-Fc(샘플 번호 1)는 어느 수용체 단백질에 대해서도 결합성을 나타내지 않았다. 이상의 점에서, 8종류의 환상 펩티드는, 모두 Fn10의 루프 구조 상에 제시함으로써 오리지널의 환상 펩티드의 결합능을 유지한 융합 단백질로 변환할 수 있는 것이 확인되었다.

[실시예 2] 항체의 Fc 영역과 환상 펩티드의 융합

1. 환상 펩티드 융합 단백질의 디자인

생리 활성 환상 펩티드의 화학 가교 구조로 치환하기 위해서, 스캐폴드 단백질이 되는 루프 구조를 갖는 단백질로서 인간 IgG 유래 Fc 영역(이하, 「Fc」라고 칭한다)을 선택하고, 그의 입체 구조 상에서 β스트랜드 사이에 끼워진 루프 부분으로부터 Cα 원자간 거리가 4 내지 7Å 사이에 있는 2 아미노산 잔기를 탐색했다. 그 결과, Fc의 힌지 영역에 가까운 「상부」로부터 3군데, Fc의 「저부」로부터 3군데, Fc의 「측면부」로부터 2군데의 총8군데를 선정했다. 융합에 사용하는 부위의 명칭으로서는, 「상부」로부터는 Ser267(B_N에 상당)과 Pro271(B_C에 상당)의 2 아미노산 잔기를 연결 잔기로 하는 경우를 L1 사이트, Tyr296(B_N에 상당)과 Ser298(B_C에 상당)의 2 아미노산 잔기를 연결 잔기로 하는 경우를 L2 사이트, Leu328(B_N에 상당)과 Pro331(B_C에 상당)의 2 아미노산 잔기를 연결 잔기로 하는 경우를 L3 사이트라 칭한다. 「저부」로부터는 Lys360(B_N에 상당)과 Gln362(B_C에 상당)의 2 아미노산 잔기를 연결 잔기로 하는 경우를 L4 사이트, Ser383(B_N에 상당)과 Gln386(B_C에 상당)의 2 아미노산 잔기를 연결 잔기로 하는 경우를 L5 사이트, Gln419(B_N에 상당)와 Asn421(B_C에 상당)의 2 아미노산 잔기를 연결 잔기로 하는 경우를 L6 사이트라 칭한다. 「측면부」로부터는 Gly341(B_N에 상당)과 Pro343(B_C에 상당)의 2 아미노산 잔기를 연결 잔기로 하는 경우를 L7 사이트, Ser400(B_N에 상당)과 Gly402(B_C에 상당)의 2 아미노산 잔기를 연결 잔기로 하는 경우를 L8 사이트라 칭한다. 이들 부분의 입체 구조를 도 6에 도시한다.

Fc의 상부, 저부, 측면부에 있어서 선정한 B_N과 B_C의 2 아미노산 잔기에 의해 사이에 끼워지는 영역의 일부를, 환상 펩티드 mP6-9, aMD4, 혹은 aMD5의 가변 영역의 아미노산 서열 양측에 적절히 임의의 링커 아미노산을 추가한 것으로 치환한 융합 단백질을 디자인했다. 디자인한 융합 단백질에 있어서의, 환상 펩티드의 융합 후의 루프 부분의 아미노산 서열을 도 7 내지 도 9에 도시한다.

2. 환상 펩티드 융합 단백질의 제조

인간 프롤락틴의 시그널 서열을 코딩하는 DNA, Hisx8 태그를 코딩하는 DNA, Myc 태그를 코딩하는 DNA, 그리고 인간 IgG1의 Fc 영역을 코딩하는 DNA를 연결해서 Fc 융합 단백질의 컨스트럭트를 작성하고, 이것을 발현 벡터 pcDNA3.1(서모 피셔 사이언티픽사제)에 혼입했다.

Fc 발현 벡터를 바탕으로, L1 내지 L8 사이트의 루프 영역의 아미노산 서열을, 도 7 내지 도 9에 도시하는 삽입 서열로 교체한 발현 벡터를 제작했다. 삽입 서열 부분은 익스텐션 PCR법을 사용해서 증폭하고, 목적으로 하는 각종 환상 펩티드 융합 단백질의 컨스트럭트를 얻었다. 환상 펩티드 융합 단백질은 각각 Fc(mP6-9_L1)와 같이 Fc(환상 펩티드명_사이트명)라고 명명했다.

Fc 및 그의 환상 펩티드 융합 단백질 20종(3종류의 펩티드와 8군데의 삽입 부위 베리에이션)에 대해서, 실시예 1에 있어서 전술한 방법에 의해 Expi293F 세포를 사용한 일과성 발현을 행하여, 배양 상청으로부터 단백질 A 세파로스에 의해 침강시켜서 SDS-PAGE 분석을 행하였다.

전기 영동의 결과를 도 10에 도시한다. Fc(샘플 번호 1)는 예상되는 분자량(30.6kDa)의 위치에 밴드가 보이고, 모든 환상 펩티드 융합 단백질(샘플 번호 2 내지 21)은 30 내지 37kDa의 분자량에 상당하는 이동도를 나타내는 밴드로서 나타났다.

3. 환상 펩티드 융합 단백질의 결합 분자에 대한 결합

얻어진 환상 펩티드 융합 단백질(Fc 변이체)에 대해서, 실시예 1에 있어서 전술한 방법에 의해 가용성 수용체 단편인 플렉신 B1-PA 및 Met-PA를 캡쳐한 NZ-1 세파로스에 대한 결합을 풀 다운법에 의해 조사했다.

전기 영동의 결과를 도 11에 도시한다. 플렉신 결합제인 mP6-9의 아미노산 서열을 혼입한 8종의 융합 단백질(샘플 번호 2 내지 9) 모두가 플렉신 B1-PA와 결합하고, Met 결합제인 aMD4 및 aMD5의 아미노산 서열을 혼입한 12종의 융합 단백질 중 11종(샘플 번호 10 내지 13, 15 내지 21)이 Met-PA와 특이적으로 결합하는 것이, 풀 다운의 결과로부터 밝혀졌다(또한, Fc(aMD5_L2, 샘플 번호 14)에 대해서도 특이적인 결합은 확인할 수 있었다.). 즉 Fn10-Fc일 때와 마찬가지로, IgG의 Fc 영역의 루프 구조 상에 직접 삽입함으로써도, 환상 펩티드는 그의 결합 분자에 대한 결합 활성을 유지한 채 융합 단백질로 변환할 수 있는 것이 확인되었다.

[실시예 3] IgG 항체와 환상 펩티드의 융합

1. 환상 펩티드 융합 단백질의 디자인

생리 활성 환상 펩티드의 화학 가교 구조로 치환하기 위해서, 스캐폴드 단백질이 되는 루프 구조를 갖는 단백질로서 인간 IgG 전장 단백질(이하, 「IgG」라고 칭한다)을 선택했다. IgG는 그의 구조의 일부로서 실시예 2에 있어서 사용한 스캐폴드 단백질인 Fc 그 자체를 포함하기 때문에, 융합에 사용하는 부위로서는 실시예 2에 나타낸 L1 내지 L8 사이트를 그대로 이용했다. IgG와 그의 Fc 영역(환상 펩티드의 융합 부위를 포함한다) 및 2개의 항원 결합 부위인 Fab 영역의 입체 구조를 도 12에 도시한다.

2. 환상 펩티드 융합 단백질의 제조

뉴로필린 1에 대한 인간 IgG1 모노클로날 항체의 H쇄 전장 영역을 코딩하는 DNA를 발현 벡터 p3xFLAG-CMV-14(시그마-알드리치사제)에 혼입했다. 동 항체의 Lκ쇄 전장 영역을 코딩하는 DNA도 마찬가지로 p3xFLAG-CMV-14 벡터에 혼입했다.

상기 IgG1 H쇄 발현 벡터를 바탕으로, 그의 Fc 영역의 L1 내지 L8 사이트의 루프 영역의 아미노산 서열을, 도 7 내지 도 9에 도시하는 삽입 서열로 교체한 H쇄 발현 벡터를 제작했다. 삽입 서열 부분은 익스텐션 PCR법을 사용해서 증폭하고, 목적으로 하는 각종 환상 펩티드 융합 H쇄의 컨스트럭트를 얻었다. 환상 펩티드 융합 단백질은 각각 IgG(mP6-9_L1)와 같이 IgG(환상 펩티드명_사이트명)라 명명했다.

H쇄 및 그의 플렉신 B1 결합성 환상 펩티드(mP6-9) 융합 변이체 발현 벡터를, 대응하는 Lκ쇄 발현 벡터와 1:1의 비율로 혼합하고, 실시예 2와 동일한 방법에 의해 Expi293F 세포에 유전자 도입해서 일과성 발현을 행하고, 출현 분비되는 IgG 단백질을 배양 상청으로부터 단백질 A 세파로스에 의해 침강시켜서 SDS-PAGE 분석을 행하였다.

전기 영동의 결과를 도 13의 A에 도시한다. 융합하지 않은 IgG(샘플 번호 1)는 예상되는 분자량(H쇄 47kDa, L쇄 25kDa)의 위치에 밴드가 보이고, 모든 환상 펩티드 융합 단백질(샘플 번호 2 내지 9)은 H쇄만 47kDa보다 조금 고분자량에 상당하는 이동도를 나타내는 밴드, L쇄는 융합 전의 IgG와 같은 25kDa의 밴드로서 드러났다.

3. 환상 펩티드 융합 단백질의 결합 분자에 대한 결합

얻어진 환상 펩티드 융합 단백질(IgG 변이체)에 대해서, 실시예 2에 있어서 전술한 방법에 의해 가용성 수용체 단편인 플렉신 B1-PA를 캡쳐한 NZ-1 세파로스에 대한 결합을 풀 다운법에 의해 조사했다.

전기 영동의 결과를 도 13의 B에 도시한다. 플렉신 결합제인 mP6-9의 아미노산 서열을 혼입한 6종의 융합 단백질(샘플 번호 2 내지 9) 모두가 플렉신 B1-PA와 결합하는 것이, 풀 다운의 결과로부터 밝혀졌다. 즉 Fc 단독일 때와 마찬가지로, IgG 중의 Fc 영역의 루프 구조 상에 직접 삽입함으로써도, 환상 펩티드는 그의 결합 분자에 대한 결합 활성을 유지한 채 융합 단백질로 변환할 수 있는 것이 확인되었다.

[실시예 4] 인간 혈청 알부민과 환상 펩티드의 융합

1. 환상 펩티드 융합 단백질의 디자인

생리 활성 환상 펩티드의 화학 가교 구조로 치환하기 위해서, 스캐폴드 단백질이 되는 루프 구조를 갖는 단백질로서 인간 혈청 알부민(이하, 「HSA」라고 칭한다)을 선택하고, 그의 입체 구조 상에서 α 헬릭스 사이에 끼워진 루프 부분으로부터 Cα 원자간 거리가 4 내지 7Å 사이에 있는 2 아미노산 잔기를 탐색했다. 그 결과, HSA의 분자상에서 용매 노출도가 높은 4군데를 선정했다. 융합에 사용하는 부위의 명칭으로서는, Asp56(B_N에 상당)과 Ala59(B_C에 상당)의 2 아미노산 잔기를 연결 잔기로 하는 경우를 L1 사이트, Cys169(B_N에 상당)와 Lys174(B_C에 상당)의 2 아미노산 잔기를 연결 잔기로 하는 경우를 L2 사이트, Ala363(B_N에 상당)과 Pro366(B_C에 상당)의 2 아미노산 잔기를 연결 잔기로 하는 경우를 L3 사이트, Ala561(B_N에 상당)과 Lys564(B_C에 상당)의 2 아미노산 잔기를 연결 잔기로 하는 경우를 L4 사이트라 칭한다. 이들 부분의 입체 구조를 도 14에 도시한다.

HSA에 있어서 선정한 B_N과 B_C의 2 아미노산 잔기에 의해 사이에 끼워지는 영역의 일부를, 환상 펩티드 mP6-9 및 aMD4의 가변 영역의 아미노산 서열 양측에 적절히 임의의 링커 아미노산을 추가한 것으로 치환한 융합 단백질을 디자인했다. 디자인한 융합 단백질에 있어서의, 환상 펩티드의 융합 후의 루프 부분의 아미노산 서열을 도 15에 도시한다.

2. 환상 펩티드 융합 단백질의 제조

인간 혈청 알부민 전장을 코딩하는 DNA, Hisx8 태그를 코딩하는 DNA, Myc 태그를 코딩하는 DNA를 연결해서 HSA 융합 단백질의 컨스트럭트를 작성하고, 이것을 발현 벡터 pcDNA3.1(서모 피셔 사이언티픽사제)에 혼입했다.

HSA 발현 벡터를 바탕으로, L1 내지 L4 사이트의 루프 영역의 아미노산 서열을, 도 12에 도시하는 삽입 서열로 교체한 발현 벡터를 제작했다. 삽입 서열 부분은 익스텐션 PCR법을 사용해서 증폭하고, 목적으로 하는 각종 환상 펩티드 융합 단백질의 컨스트럭트를 얻었다. 환상 펩티드 융합 단백질은 각각 HSA(mP6-9_L1)와 같이 HSA(환상 펩티드명_사이트명)라고 명명했다.

HSA 및 그의 환상 펩티드 융합 단백질 8종(2종류의 펩티드×4군데의 삽입 부위 베리에이션)에 대해서, 실시예 1에 있어서 전술한 방법에 의해 Expi293F 세포를 사용한 일과성 발현을 행하고, C 말단에 His 태그가 부가되고 있는 것을 이용해서 배양 상청으로부터 Ni-NTA 아가로오스에 의해 침강시켜서 SDS-PAGE 분석을 행하였다.

전기 영동의 결과를 도 16에 도시한다. HSA(샘플 번호 1)는 예상되는 분자량(67kDa)의 위치에 밴드가 보이고, 모든 환상 펩티드 융합 단백질(샘플 번호 2 내지 9)은 그보다 조금 고분자량에 상당하는 이동도를 나타내는 밴드로서 나타났다.

3. 환상 펩티드 융합 단백질의 결합 분자에 대한 결합

얻어진 환상 펩티드 융합 단백질(HSA 변이체)에 대해서, 실시예 1에 있어서 전술한 방법에 의해 플렉신 B1 및 Met의 가용성 수용체 단편과의 결합을 확인했다. 단, mP6-9 펩티드 융합 단백질에 있어서는, 결합 분자로서 플렉신 B1-PA가 아니고 플렉신 B1-Fc 단백질을 사용하고, 풀 다운의 비즈도 NZ-1-세파로오스가 아니고 단백질 A-세파로오스를 사용했다.

전기 영동의 결과를 도 17에 도시한다. 플렉신 결합제인 mP6-9의 아미노산 서열을 혼입한 4종의 융합 단백질 모두(샘플 번호 2 내지 5)가 플렉신 B1-Fc와 결합하고, Met 결합제인 aMD4의 아미노산 서열을 혼입한 4종의 융합 단백질(샘플 번호 6 내지 9)에 대해서도 4종 모두가 Met-PA와 특이적으로 결합하는 것이, 풀 다운의 결과로부터 밝혀졌다. 환상 펩티드를 융합하지 않은 HSA(샘플 번호 1)에서는 HSA 단백질을 전혀 포함하지 않는 컨트롤 배양 상청(샘플 번호 10)에서도 보이는 비특이적 밴드 만이 함께 침강하고, 결합하지 않은 것이 확인되었다. 즉 Fn10-Fc, Fc일 때와 마찬가지로, HSA의 α 헬릭스 사이에 끼워진 루프에 직접 삽입함으로써도, 환상 펩티드는 그의 결합 분자에 대한 결합 활성을 유지한 채 융합 단백질로 변환할 수 있는 것이 확인되었다.

[실시예 5] 인간 성장 호르몬과 환상 펩티드의 융합

1. 환상 펩티드 융합 단백질의 디자인

생리 활성 환상 펩티드의 화학 가교 구조로 치환하기 위해서, 루프 구조를 갖는 단백질로서 인간 성장 호르몬(이하, 「hGH」라고 칭한다)을 선택하고, 그의 입체 구조 상에서 α 헬릭스 사이에 끼워진 루프 부분으로부터 Cα 원자간 거리가 4 내지 7Å 사이에 있는 2 아미노산 잔기를 탐색했다. 그 결과, hGH의 분자 구조상, 장축의 선단에 상당하는 2군데를 선정했다. 융합에 사용하는 부위의 명칭으로서는, Asp130(B_N에 상당)과 Ser132(B_C에 상당)의 2 아미노산 잔기를 연결 잔기로 하는 경우를 L1 사이트, Asn152(B_N에 상당)와 Asp154(B_C에 상당)의 2 아미노산 잔기를 연결 잔기로 하는 경우를 L2 사이트라 칭한다. 이들 부분의 입체 구조를 도 18에 도시한다.

hGH에 있어서 선정한 B_N과 B_C의 2 아미노산 잔기에 의해 사이에 끼워지는 영역의 일부를, 환상 펩티드 mP6-9의 가변 영역의 아미노산 서열 양측에 적절히 임의의 링커 아미노산을 추가한 것으로 치환한 융합 단백질을 디자인했다. 디자인한 융합 단백질에 있어서의, 환상 펩티드의 융합 후의 루프 부분의 아미노산 서열을 도 19에 도시한다.

2. 환상 펩티드 융합 단백질의 제조

인간 성장 호르몬 발현 벡터는 hGH 전장의 C 말단에 Hisx8 태그와 TEV프로테아제 인식 서열을 부가한 pSGHV0(Protein Expr. Purif., 2000, 20(3), 500-506에 기재)을 사용했다. 이 벡터를 바탕으로, L1 내지 L2 사이트의 루프 영역의 아미노산 서열을, 도 19에 도시하는 삽입 서열로 교체한 발현 벡터를 제작했다. 삽입 서열 부분은 익스텐션 PCR법을 사용해서 증폭하고, 목적으로 하는 각종 환상 펩티드 융합 단백질의 컨스트럭트를 얻었다. 환상 펩티드 융합 단백질은 각각 hGH(mP6-9_L1)와 같이 hGH(환상 펩티드명_사이트명)라고 명명했다.

hGH 및 그의 환상 펩티드 융합 단백질 2종(1종류의 펩티드×2군데의 삽입 부위 베리에이션)에 대해서, 실시예 1에 있어서 전술한 방법에 의해 Expi293F 세포를 사용한 일과성 발현을 행하고, 배양 상청으로부터 Ni-NTA 아가로오스에 의해 침강시켜서 SDS-PAGE 분석을 행하였다.

전기 영동의 결과를 도 20의 A에 도시한다. hGH(샘플 번호 1)는 예상되는 분자량(26kDa)의 위치에 밴드가 보이고, 2개의 환상 펩티드 융합체(샘플 번호 2 및 3)는 그보다 조금 고분자량에 상당하는 이동도를 나타내는 밴드로서 나타났다.

3. 환상 펩티드 융합 단백질의 결합 분자에 대한 결합

얻어진 환상 펩티드 융합 단백질(hGH 변이체)에 대해서, 실시예 1에 있어서 전술한 방법에 의해 가용성 수용체 단편인 플렉신 B1-PA를 캡쳐한 NZ-1 세파로스에 대한 결합을 풀 다운법에 의해 조사했다.

전기 영동의 결과를 도 20의 B에 도시한다. 야생형의 hGH(샘플 번호 1)는 플렉신 B1-PA와 결합하지 않지만, 플렉신 결합제인 mP6-9의 서열을 혼입한 2종의 융합 단백질(샘플 번호 2 및 3)은 특이적으로 결합하는 것이, 풀 다운의 결과로부터 밝혀졌다. 즉 Fn10-Fc, Fc, HSA일 때와 마찬가지로, 분비 호르몬인 hGH의 루프에 직접 삽입함으로써도, 환상 펩티드는 그의 결합 분자에 대한 결합 활성을 유지한 채 융합 단백질로 변환할 수 있는 것이 확인되었다.

[실시예 6] 인간 혈청 레티놀 결합 단백질과 환상 펩티드의 융합

1. 환상 펩티드 융합 단백질의 디자인

생리 활성 환상 펩티드의 화학 가교 구조로 치환하기 위해서, 스캐폴드 단백질이 되는 루프 구조를 갖는 지질 결합 단백질로서 인간 혈청 레티놀 결합 단백질(이하, 「RBP」라고 칭한다)을 선택하고, 그의 입체 구조 상에서 β스트랜드 사이에 끼워진 루프 부분으로부터 Cα 원자간 거리가 4 내지 7Å 사이에 있는 2 아미노산 잔기를 탐색했다. 그 결과, RBP의 β배럴 구조로부터 돌출되는 헤어핀 루프 2군데를 선정했다. 융합에 사용하는 부위의 명칭으로서는, Leu64(B_N에 상당)과 Trp67(B_C에 상당)의 2 아미노산 잔기를 연결 잔기로 하는 경우를 L1 사이트, Ala94(B_N에 상당)와 Leu97(B_C에 상당)의 2 아미노산 잔기를 연결 잔기로 하는 경우를 L2 사이트라 칭한다. 이들 부분의 입체 구조를 도 21에 도시한다.

RBP에 있어서 선정한 B_N과 B_C의 2 아미노산 잔기에 의해 사이에 끼워지는 영역의 일부를, 환상 펩티드 mP6-9의 가변 영역의 아미노산 서열 양측에 적절히 임의의 링커 아미노산을 추가한 것으로 치환한 융합 단백질을 디자인했다. 디자인한 융합 단백질에 있어서의, 환상 펩티드의 융합 후의 루프 부분의 아미노산 서열을 도 22에 도시한다.

2. 환상 펩티드 융합 단백질의 제조

인간 RBP 발현 벡터는, RBP 전장을 코딩하는 DNA와 PA 태그를 코딩하는 DNA를 연결해서 작성하고, 이것을 발현 벡터 pcDNA3.1(서모 피셔 사이언티픽사제)에 혼입했다. 이 벡터를 바탕으로, L1 내지 L2 사이트의 루프 영역의 아미노산 서열을, 도 22에 도시하는 삽입 서열로 교체한 발현 벡터를 제작했다. 삽입 서열 부분은 익스텐션 PCR법을 사용해서 증폭하고, 목적으로 하는 각종 환상 펩티드 융합 단백질의 컨스트럭트를 얻었다. 환상 펩티드 융합 단백질은 각각 RBP(mP6-9_L1)과 같이 RBP(환상 펩티드명_사이트명)라고 명명했다.

RBP 및 그의 환상 펩티드 융합 단백질 2종(1종류의 펩티드×2군데의 삽입 부위 베리에이션)에 대해서, 실시예 1에 있어서 전술한 방법에 의해 Expi293F 세포를 사용한 일과성 발현을 행하여, 배양 상청으로부터 PA 태그에 대한 항체인 NZ-1을 고정화한 세파로스(와코 쥰야꾸 고교사제)에 의해 침강시켜서 SDS-PAGE 분석을 행하였다.

전기 영동의 결과를 도 23의 A에 도시한다. RBP(샘플 번호 1)는 예상되는 분자량(25kDa)의 위치에 밴드가 보이고, 2개의 환상 펩티드 융합체(샘플 번호 2 및 3)는 그보다 조금 고분자량에 상당하는 이동도를 나타내는 밴드로서 나타났다.

3. 환상 펩티드 융합 단백질의 제조와 결합 분자에 대한 결합

얻어진 환상 펩티드 융합 단백질(RBP 변이체)에 대해서, 전술과 마찬가지 방법에 의해 가용성 수용체 단편인 플렉신 B1-Fc를 캡쳐한 단백질 A 세파로스에 대한 결합을 풀 다운법에 의해 조사했다.

전기 영동의 결과를 도 23의 B에 도시한다. 야생형의 RBP(샘플 번호 1)은 플렉신 B1-Fc와 결합하지 않지만, 플렉신 결합제인 mP6-9의 서열을 혼입한 2종의 융합 단백질(샘플 번호 2 및 3)은 특이적으로 결합하는 것이, 풀 다운의 결과로부터 밝혀졌다. 즉 Fn10-Fc, Fc, HSA, hGH일 때와 마찬가지로, 지질 결합성 분비 단백질인 RBP의 루프에 직접 삽입함으로써도, 환상 펩티드는 그의 결합 분자에 대한 결합 활성을 유지한 채 융합 단백질로 변환할 수 있는 것이 확인되었다.

[실시예 7] 인간 태반형 알칼리 포스파타아제와 환상 펩티드의 융합

1. 환상 펩티드 융합 단백질의 디자인

생리 활성 환상 펩티드의 화학 가교 구조로 치환하기 때문에, 스캐폴드 단백질이 되는 루프 구조를 갖는 효소 단백질로서 인간 태반형 알칼리 포스파타아제(이하, 「PLAP」라고 칭한다)를 선택하고, 그의 입체 구조 상에서 효소 활성 부위로부터 이격된 루프 부분으로부터 Cα 원자간 거리가 5.5Å인 Lys404(B_N에 상당)와 Gly406(B_C에 상당)의 2 아미노산 잔기를 연결 잔기로서 선정했다. 이 부분의 입체 구조를 도 24에 도시한다.

PLAP에 있어서 선정한 B_N과 B_C의 2 아미노산 잔기에 의해 사이에 끼워지는 영역의 일부를, 환상 펩티드 mP6-9 및 aMD4의 가변 영역의 아미노산 서열 양측에 적절히 임의의 링커 아미노산을 추가한 것으로 치환한 융합 단백질을 디자인했다. 디자인한 융합 단백질에 있어서의, 환상 펩티드의 융합 후의 루프 부분의 아미노산 서열을 도 25에 도시한다.

2. 환상 펩티드 융합 단백질의 제조

인간 태반형 알칼리 포스파타아제 발현 벡터는 PLAP 전장의 C 말단에 Myc 태그와 Hisx6 태그를 부가한 pAPtag-5 벡터(Methods Enzymol. 2000, 327, 19-35에 기재)를 사용했다. 이 벡터를 바탕으로, 루프 부분을 도 25에 도시하는 삽입 서열로 교체한 발현 벡터를 제작했다. 삽입 서열 부분은 익스텐션 PCR법을 사용해서 증폭하고, 목적으로 하는 각종 환상 펩티드 융합 단백질의 컨스트럭트를 얻었다. 환상 펩티드 융합 단백질은 각각 PLAP(mP6-9)와 같이 PLAP(환상 펩티드명)라 명명했다.

PLAP 및 그의 환상 펩티드 융합 단백질 2종(2종류의 펩티드×1군데의 삽입 부위)에 대해서, 실시예 1에 있어서 전술한 방법에 의해 Expi293F 세포를 사용한 일과성 발현을 행하고, 배양 상청으로부터 Ni-NTA 아가로오스에 의해 침강시켜서 SDS-PAGE 분석을 행하였다.

전기 영동의 결과를 도 26에 도시한다. PLAP(샘플 번호 1)는 예상되는 분자량(74kDa)의 위치에 밴드가 보이고, 2개의 환상 펩티드 융합 단백질(샘플 번호 2 및 3)은 그보다 조금 고분자량에 상당하는 이동도를 나타내는 밴드로서 나타났다.

3. 환상 펩티드 융합 단백질의 결합 분자에 대한 결합

얻어진 환상 펩티드 융합 단백질(PLAP 변이체)에 대해서, 실시예 1에 있어서 전술한 방법에 의해 가용성 수용체 단편인 플렉신 B1-Fc 및 Met-Fc를 캡쳐한 단백질 A 세파로스에 대한 결합을 풀 다운법에 의해 조사했다.

전기 영동의 결과를 도 27에 도시한다. 야생형의 PLAP(샘플 번호 1)는 플렉신 B1-Fc나 Met-Fc와 결합하지 않지만, 플렉신 결합제인 mP6-9의 서열을 혼입한 융합 단백질(샘플 번호 2)은 플렉신 B1-Fc와, aMD4의 서열을 혼입한 융합 단백질(샘플 번호 3)은 Met-Fc와, 각각 특이적으로 결합하는 것이 풀 다운의 결과로부터 밝혀졌다. 즉 Fn10-Fc, Fc, HSA, hGH, RBP일 때와 마찬가지로, 효소 단백질인 PLAP의 루프에 직접 삽입함으로써도, 환상 펩티드는 그의 결합 분자에 대한 결합 활성을 유지한 채 융합 단백질로 변환할 수 있는 것이 확인되었다.

[실시예 8] 환상 단백질 융합 펩티드의 생리 활성

플렉신 B1 결합제 펩티드인 P6 및 그의 유사체인 mP6-9는, 세포 상에 발현한 플렉신 B1에 결합해서 그의 시그널 전달을 저해한다. 이 저해 활성이 단백질에 융합한 상태에서도 발휘될지의 여부를 조사하기 위해서, 세마포린 4D(Sema4D) 자극 시의 플렉신 B1 발현 세포의 형태 변화에 끼치는 영향을 평가했다.

세포의 형태 변화는 xCELLigence RTCA DP 장치(ACEA Biosciences사제)를 사용한 임피던스법에 의해 측정했다. 플렉신 B1 안정 발현 세포(Cell Chem. Biol, 2016, 23, 1341-1350에 기재)를 6,000cells/well의 농도로 E-PlateView16PET 플레이트(ACEA Biosciences사제)에 파종하고, 37℃에서 20시간 배양했다. 다음에 배지중에, 실시예 2에 기재한 mP6-9 펩티드 융합 단백질을 1nM 내지 1μM의 범위에서 첨가하고 추가로 30분간 보온한 다음, 자극제로서 Sema4D-Fc 단백질(R&D Systems사제)을 최종 농도 1nM으로 첨가하고, 셀의 임피던스를 모니터했다.

결과를 도 28에 도시한다. Sema4D-Fc의 첨가 후 바로 임피던스의 급속한 저하가 일어나고, 세포의 형태 변화가 일어나서 접착 면적이 퇴축하는 것을 알 수 있다. 한편, 6종류의 융합 단백질로 전처리한 세포에서는, 첨가한 융합 단백질의 농도에 의존해서 세포의 형태 변화가 억제되며, 모든 융합 단백질이 100nM 이상에 있어서 거의 완전히 플렉신 B1의 활성화를 차단하는 것이 밝혀졌다. 즉, 환상 펩티드의 상태에서 mP6-9가 갖고 있었던 플렉신 B1 시그널 저해제로서의 효력이, 융합 단백질로 변환된 후에도 유지되고 있는 것이 밝혀졌다.

SEQUENCE LISTING <110> The University of Tokyo Osaka University <120> A highly versatile method for presenting cyclic peptides on protein scaffolds <130> T0529AJP0001 <160> 68 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variable region of cyclic peptide P6 <400> 1 Arg Pro Arg Val Ala Arg Trp Thr Gly Gln Ile Ile Tyr 1 5 10 <210> 2 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variable region of cyclic peptide mP6-9 <400> 2 Arg Pro Tyr Ile Glu Arg Trp Thr Gly Arg Leu Ile Val 1 5 10 <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variable region of cyclic peptide P7 <400> 3 Asn Ser Asn Val Leu Ser Trp Gln Thr Tyr Ser Trp Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variable region of cyclic peptide aMD4 <400> 4 Arg Gln Phe Asn Arg Arg Thr His Glu Val Trp Asn Leu Asp 1 5 10 <210> 5 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variable region of cyclic peptide aMD5 <400> 5 Trp Tyr Tyr Ala Trp Asp Gln Thr Tyr Lys Ala Phe Pro 1 5 10 <210> 6 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variable region of cyclic peptide aML5 <400> 6 Tyr Ile Ser Trp Asn Glu Phe Asn Ser Pro Asn Trp Arg Phe Ile Thr 1 5 10 15 <210> 7 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variable region of cyclic peptide A6-2f <400> 7 Ala Ser Phe Pro Glu Glu Leu Asp Glu Trp Tyr Val Ala Tyr Gly 1 5 10 15 <210> 8 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variable region of cyclic peptide trkD5 <400> 8 Arg Gln Ala Ser Pro Lys Phe Thr Phe Trp Ser 1 5 10 <210> 9 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys 1 5 10 15 Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg 20 <210> 10 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> partial structure of Fn10(P6)-Fc <400> 10 Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg Trp Arg Pro Arg Val Ala Arg Trp 1 5 10 15 Thr Gly Gln Ile Ile Tyr Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile 20 25 30 Asn Tyr Arg 35 <210> 11 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> partial structure of Fn10(mP6-9)-Fc <400> 11 Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg Trp Arg Pro Tyr Ile Glu Arg Trp 1 5 10 15 Thr Gly Arg Leu Ile Val Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile 20 25 30 Asn Tyr Arg 35 <210> 12 <211> 43 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> partial structure of Fn10(P7)-Fc <400> 12 Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg Gly Gly Ser Gly Cys Asn Ser Asn 1 5 10 15 Val Leu Ser Trp Gln Thr Tyr Ser Trp Tyr Cys Gly Gly Ser Ser Pro 20 25 30 Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg 35 40 <210> 13 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> partial structure of Fn10(aMD4)-Fc <400> 13 Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg Gly Gly Tyr Arg Gln Phe Asn Arg 1 5 10 15 Arg Thr His Glu Val Trp Asn Leu Asp Gly Ser Pro Ala Ser Ser Lys 20 25 30 Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg 35 <210> 14 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> partial structure of Fn10(aMD5)-Fc <400> 14 Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg Gly Ser Tyr Trp Tyr Tyr Ala Trp 1 5 10 15 Asp Gln Thr Tyr Lys Ala Phe Pro Gly Ser Ser Pro Ala Ser Ser Lys 20 25 30 Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg 35 <210> 15 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> partial structure of Fn10(aML5)-Fc <400> 15 Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg Gly Gly Tyr Ile Ser Trp Asn Glu 1 5 10 15 Phe Asn Ser Pro Asn Trp Arg Phe Ile Thr Gly Ser Pro Ala Ser Ser 20 25 30 Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg 35 40 <210> 16 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> partial structure of Fn10(A6-2f)-Fc <400> 16 Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg Gly Gly Ser Tyr Ala Ser Phe Pro 1 5 10 15 Glu Glu Leu Asp Glu Trp Tyr Val Ala Tyr Gly Gly Ser Pro Ala Ser 20 25 30 Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg 35 40 <210> 17 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> partial structure of Fn10(trkD5)-Fc <400> 17 Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg Gly Gly Ser Tyr Arg Gln Ala Ser 1 5 10 15 Pro Lys Phe Thr Phe Trp Ser Gly Gly Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro 20 25 30 Ile Ser Ile Asn Tyr Arg 35 <210> 18 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 1 5 10 <210> 19 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> partial structure of Fc(mP6-9_L1) <400> 19 Val Val Asp Val Ser His Gly Trp Arg Pro Tyr Ile Glu Arg Trp Thr 1 5 10 15 Gly Arg Leu Ile Val Gly Gly Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 20 25 30 <210> 20 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> partial structure of Fc(aMD4_L1) <400> 20 Val Val Asp Val Ser His Gly Gly Tyr Arg Gln Phe Asn Arg Arg Thr 1 5 10 15 His Glu Val Trp Asn Leu Asp Gly Gly Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 20 25 30 <210> 21 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> partial structure of Fc(aMD5_L1) <400> 21 Val Val Asp Val Ser His Gly Ser Tyr Trp Tyr Tyr Ala Trp Asp Gln 1 5 10 15 Thr Tyr Lys Ala Phe Pro Gly Ser Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 20 25 30 <210> 22 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 1 5 10 <210> 23 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> partial structure of Fc(mP6-9_L2) <400> 23 Arg Glu Glu Gln Tyr Gly Trp Arg Pro Tyr Ile Glu Arg Trp Thr Gly 1 5 10 15 Arg Leu Ile Val Gly Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 20 25 <210> 24 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> partial structure of Fc(aMD4_L2) <400> 24 Arg Glu Glu Gln Tyr Gly Gly Tyr Arg Gln Phe Asn Arg Arg Thr His 1 5 10 15 Glu Val Trp Asn Leu Asp Gly Ser Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 20 25 30 <210> 25 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> partial structure of Fc(aMD5_L2) <400> 25 Arg Glu Glu Gln Tyr Gly Ser Tyr Trp Tyr Tyr Ala Trp Asp Gln Thr 1 5 10 15 Tyr Lys Ala Phe Pro Gly Ser Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 20 25 30 <210> 26 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 1 5 10 <210> 27 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> partial structure of Fc(mP6-9_L3) <400> 27 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Gly Trp Arg Pro Tyr Ile Glu Arg Trp Thr 1 5 10 15 Gly Arg Leu Ile Val Gly Pro Ile Glu Lys Thr Ile 20 25 <210> 28 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> partial structure of Fc(aMD4_L3) <400> 28 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Gly Gly Tyr Arg Gln Phe Asn Arg Arg Thr 1 5 10 15 His Glu Val Trp Asn Leu Asp Gly Ser Pro Ile Glu Lys Thr Ile 20 25 30 <210> 29 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> partial structure of Fc(aMD5_L3) <400> 29 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Gly Ser Tyr Trp Tyr Tyr Ala Trp Asp Gln 1 5 10 15 Thr Tyr Lys Ala Phe Pro Gly Ser Pro Ile Glu Lys Thr Ile 20 25 30 <210> 30 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 1 5 10 <210> 31 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> partial structure of Fc(mP6-9_L4) <400> 31 Asp Glu Leu Thr Lys Gly Trp Arg Pro Tyr Ile Glu Arg Trp Thr Gly 1 5 10 15 Arg Leu Ile Val Gly Gly Gln Val Ser Leu Thr Cys 20 25 <210> 32 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> partial structure of Fc(aMD4_L4) <400> 32 Asp Glu Leu Thr Lys Gly Gly Tyr Arg Gln Phe Asn Arg Arg Thr His 1 5 10 15 Glu Val Trp Asn Leu Asp Gly Gly Gln Val Ser Leu Thr Cys 20 25 30 <210> 33 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> partial structure of Fc(aMD5_L4) <400> 33 Asp Glu Leu Thr Lys Ser Gly Gly Tyr Trp Tyr Tyr Ala Trp Asp Gln 1 5 10 15 Thr Tyr Lys Ala Phe Pro Gly Gly Ser Gln Val Ser Leu Thr Cys 20 25 30 <210> 34 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 1 5 10 <210> 35 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> partial structure of Fc(mP6-9_L5) <400> 35 Val Glu Trp Glu Ser Gly Trp Arg Pro Tyr Ile Glu Arg Trp Thr Gly 1 5 10 15 Arg Leu Ile Val Gly Gly Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 20 25 <210> 36 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> partial structure of Fc(aMD4_L5) <400> 36 Val Glu Trp Glu Ser Gly Gly Tyr Arg Gln Phe Asn Arg Arg Thr His 1 5 10 15 Glu Val Trp Asn Leu Asp Gly Gly Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 20 25 30 <210> 37 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> partial structure of Fc(aMD5_L5) <400> 37 Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gly Tyr Trp Tyr Tyr Ala Trp Asp Gln 1 5 10 15 Thr Tyr Lys Ala Phe Pro Gly Gly Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 20 25 30 <210> 38 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 1 5 10 <210> 39 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> partial structure of Fc(mP6-9_L6) <400> 39 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Trp Arg Pro Tyr Ile Glu Arg Trp Thr Gly 1 5 10 15 Arg Leu Ile Val Gly Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 20 25 <210> 40 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> partial structure of Fc(aMD4_L6) <400> 40 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Gly Tyr Arg Gln Phe Asn Arg Arg Thr His 1 5 10 15 Glu Val Trp Asn Leu Asp Gly Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 20 25 30 <210> 41 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> partial structure of Fc(aMD5_L6) <400> 41 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Ser Gly Tyr Trp Tyr Tyr Ala Trp Asp Gln 1 5 10 15 Thr Tyr Lys Ala Phe Pro Gly Ser Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 20 25 30 <210> 42 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42 Ser Lys Ser Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 1 5 10 <210> 43 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> partial structure of Fc(mP6-9_L7) <400> 43 Ser Lys Ser Lys Gly Trp Arg Pro Tyr Ile Glu Arg Trp Thr Gly Arg 1 5 10 15 Leu Ile Val Gly Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 20 25 <210> 44 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 1 5 10 <210> 45 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> partial structure of Fc(mP6-9_L8) <400> 45 Pro Val Leu Asp Ser Gly Trp Arg Pro Tyr Ile Glu Arg Trp Thr Gly 1 5 10 15 Arg Leu Ile Val Gly Gly Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 20 25 <210> 46 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46 Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys 1 5 10 <210> 47 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> partial structure of HSA(mP6-9_L1) <400> 47 Thr Cys Val Ala Asp Glu Gly Trp Arg Pro Tyr Ile Glu Arg Trp Thr 1 5 10 15 Gly Arg Leu Ile Val Gly Gly Ala Glu Asn Cys Asp Lys 20 25 <210> 48 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> partial structure of HSA(aMD4_L1) <400> 48 Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Gly Tyr Arg Gln Phe Asn Arg Arg Thr 1 5 10 15 His Glu Val Trp Asn Leu Asp Gly Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys 20 25 30 <210> 49 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49 Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu 1 5 10 15 <210> 50 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> partial structure of HSA(mP6-9_L2) <400> 50 Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Gly Trp Arg Pro Tyr Ile Glu Arg Trp 1 5 10 15 Thr Gly Arg Leu Ile Val Gly Gly Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu 20 25 30 <210> 51 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> partial structure of HSA(aMD4_L2) <400> 51 Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Gly Tyr Arg Gln Phe Asn Arg Arg 1 5 10 15 Thr His Glu Val Trp Asn Leu Asp Gly Ser Asp Lys Ala Ala Cys Leu 20 25 30 Leu <210> 52 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 52 Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala 1 5 10 <210> 53 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> partial structure of HSA(mP6-9_L3) <400> 53 Glu Lys Cys Cys Ala Ala Gly Trp Arg Pro Tyr Ile Glu Arg Trp Thr 1 5 10 15 Gly Arg Leu Ile Val Gly Gly Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala 20 25 30 <210> 54 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> partial structure of HSA(aMD4_L3) <400> 54 Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Gly Tyr Arg Gln Phe Asn Arg Arg Thr 1 5 10 15 His Glu Val Trp Asn Leu Asp Gly Ser Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala 20 25 30 <210> 55 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 55 Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala 1 5 10 <210> 56 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> partial structure of HSA(mP6-9_L4) <400> 56 Lys Cys Cys Lys Ala Gly Trp Arg Pro Tyr Ile Glu Arg Trp Thr Gly 1 5 10 15 Arg Leu Ile Val Gly Gly Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala 20 25 <210> 57 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> partial structure of HSA(aMD4_L4) <400> 57 Lys Cys Cys Lys Ala Gly Gly Tyr Arg Gln Phe Asn Arg Arg Thr His 1 5 10 15 Glu Val Trp Asn Leu Asp Gly Gly Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala 20 25 30 <210> 58 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 58 Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gln Ala 1 5 10 <210> 59 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> partial structure of hGH(mP6-9_L1) <400> 59 Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Trp Arg Pro Tyr Ile Glu Arg Trp Thr 1 5 10 15 Gly Arg Leu Ile Val Gly Ser Pro Arg Thr Gln Ala 20 25 <210> 60 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 60 Asp Ala Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr 1 5 10 <210> 61 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> partial structure of hGH(mP6-9_L2) <400> 61 Asp Ala Asn Ser His Asn Gly Trp Arg Pro Tyr Ile Glu Arg Trp Thr 1 5 10 15 Gly Arg Leu Ile Val Gly Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr 20 25 <210> 62 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 62 Gly Arg Val Arg Leu Leu Asn Asn Trp Asp Val Cys Ala Asp 1 5 10 <210> 63 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> partial structure of RBP(mP6-9_L1) <400> 63 Gly Arg Val Arg Leu Leu Gly Trp Arg Pro Tyr Ile Glu Arg Trp Thr 1 5 10 15 Gly Arg Leu Ile Val Gly Asn Asn Trp Asp Val Cys Ala Asp 20 25 30 <210> 64 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 64 Lys Tyr Trp Gly Val Ala Ser Phe Leu Gln Lys Gly Asn Asp Asp 1 5 10 15 <210> 65 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> partial structure of RBP(mP6-9_L2) <400> 65 Lys Tyr Trp Gly Val Ala Gly Trp Arg Pro Tyr Ile Glu Arg Trp Thr 1 5 10 15 Gly Arg Leu Ile Val Gly Ser Phe Leu Gln Lys Gly Asn Asp Asp 20 25 30 <210> 66 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 66 Pro Gly Tyr Val Leu Lys Asp Gly Ala Arg Pro Asp Val Thr 1 5 10 <210> 67 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> partial structure of PLAP(mP6-9) <400> 67 Pro Gly Tyr Val Leu Lys Gly Gly Trp Arg Pro Tyr Ile Glu Arg Trp 1 5 10 15 Thr Gly Arg Leu Ile Val Gly Gly Asp Gly Ala Arg Pro Asp Val Thr 20 25 30 <210> 68 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> partial structure of PLAP(aMD4) <400> 68 Pro Gly Tyr Val Leu Lys Gly Gly Tyr Arg Gln Phe Asn Arg Arg Thr 1 5 10 15 His Glu Val Trp Asn Leu Asp Gly Gly Asp Gly Ala Arg Pro Asp Val 20 25 30 Thr

Claims (12)

1. 환상 펩티드를, 루프 구조를 갖는 단백질 상에 제시하는 방법으로서,
   환상 펩티드는, 분자 내 환상 구조를 형성하기 위한 화학 가교 구조를 갖고,
   환상 펩티드의 화학 가교 구조를, 루프 구조를 구성하는 2개의 아미노산 잔기로 치환함으로써, 환상 펩티드를, 루프 구조를 갖는 단백질에 융합시키는 것을 포함하는, 방법.
2. 제1항에 있어서, 루프 구조를 구성하는 2개의 아미노산 잔기의 Cα 원자간 거리가, 4 내지 7Å의 범위 내에 있는, 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 루프 구조를 갖는 단백질이, 루프 구조를 구성하는 2개의 아미노산 잔기 사이에 1 내지 15 아미노산 잔기를 갖는, 방법.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 환상 펩티드가, 단백질성 아미노산 및/또는 비단백질성 아미노산을 포함하는, 방법.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 화학 가교 구조가, 티오에테르 결합 또는 디술피드 결합을 포함하는, 방법.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 2 이상의 환상 펩티드가, 복수의 루프 구조를 갖는 단백질의 다른 루프 구조에 각각 융합하는, 방법.
7. 제6항에 있어서, 2 이상의 환상 펩티드가, 동일한 아미노산 서열을 갖는, 방법.
8. 제6항에 있어서, 2 이상의 환상 펩티드가, 다른 아미노산 서열을 갖는, 방법.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 환상 펩티드의 화학 가교 구조를, 루프 구조를 구성하는 2개의 아미노산 잔기로 치환할 때, 링커 서열을 통해서 환상 펩티드의 화학 가교 구조가, 루프 구조를 구성하는 2개의 아미노산 잔기로 치환되는, 방법.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 루프 구조를 구성하는 2개의 아미노산 이외의 루프 구조를 구성하는 아미노산 서열을 포함하고, 환상 펩티드의 화학 가교 구조가, 루프 구조를 구성하는 2개의 아미노산 잔기로 치환되는, 방법.
11. 환상 펩티드를, 루프 구조를 갖는 단백질에 융합시켜서 환상 펩티드를 단백질 상에 제시시킨 개변 단백질의 제조 방법으로서,
    환상 펩티드는, 분자 내 환상 구조를 형성하기 위한 화학 가교 구조를 갖고,
    환상 펩티드의 아미노산 서열로부터, 단백질 상에 제시시키는 부분 아미노산 서열을 선택하고, 해당 부분 아미노산 서열에 상당하는 염기 서열을 선택하고,
    루프 구조를 갖는 단백질의 루프 구조를 구성하는 2개의 아미노산 잔기에 상당하는 염기 서열을 선택하고, 해당 선택된 염기 서열간에 존재하는 염기를 필요에 따라서 삭제하고, 선택된 환상 펩티드의 부분 아미노산 서열에 상당하는 염기 서열을 삽입해서 혼입한 염기 서열을 갖는 핵산을 준비하고,
    해당 핵산을 번역하는, 개변 단백질의 제조 방법.
12. 제11항에 기재된 제조 방법에 의해 얻어지는, 개변 단백질.

Images