JP7384415B2 - 抗体の抗原結合領域を含み、生理活性ペプチドを融合する人工タンパク質 - Google Patents
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Description
MsAbは、一つの抗体が二つ以上の標的分子に同時に結合するので、がん細胞とリンパ球のような異種細胞同士を架橋して抗がん作用を発揮する医薬として利用できる。また、抗体固有の第一の結合特異性を有する抗体に、第二の結合特異性を付与することで、MsAbを望みの組織や細胞に集積させることも可能である。したがって、単一の標的に対する結合能・阻害能を有するのみである通常のモノクローナル抗体を用いた医薬に対して、MsAbはより複雑な作用機序を介しての病態制御が可能であり、次世代の抗体医薬の主役として重要視されている。
しかしながら、IgG型のBsAbでは、いずれも高度な工学的改変を要し、IgG型の高分子(分子量15万)であることからも、開発や生産において困難が多い。さらに、このようなIgG型のBsAbでは付与できる新たな結合特異性は一般に一つである。よって、第三、第四の結合特異性付与を実現した例はない。
一方、元々の抗体分子の一部であるFabはVH、VL、CH1、CLという4つのドメインから構成され、IgGをパパインなどのプロテアーゼで処理することにより得られる安定な抗原結合蛋白質として古くから使われている。Fabの抗原結合部位(complementarity determining region;CDRと呼ばれる)は、VHとVLの先端部にそれぞれが提示する3つのループ領域、合計6つのループによって構成されるので、この先端部以外の領域は工学的改変の余地がある。すなわち、CDR以外の領域のアミノ酸配列を改変して新たな生理活性部位を創出できれば、既存の抗体に、第2の標的結合性のような新規の機能を賦与することが可能になる。しかしながら、それらループ領域のアミノ酸をランダム化して新たな生理活性を付与しようとしても、通常、構造的安定性において大きな犠牲を払うため、前述のFcabやtaFvよりもさらに創出が困難である。このため、これまでにFab領域に新たな活性を賦与した例は、軽鎖のC末端に生理活性ペプチドや小タンパク質を融合したものが知られているに過ぎない(特許文献2)。
(1)
少なくとも抗体の抗原結合領域を有するタンパク質における抗原結合活性を担う構造領域内の二次構造の折り返し部分に存在し、かつタンパク質の表面に露出している部位に、生理活性ペプチドを融合する、人工タンパク質。
(2)
抗体由来の抗原結合活性を保持し、かつ生理活性ペプチドに由来する機能が付与された、(1)に記載の人工タンパク質。
(3)
生理活性ペプチドが、環状ペプチド又は直鎖ペプチドである、(1)又は(2)に記載の人工タンパク質。
(4)
少なくとも抗体の抗原結合領域を有するタンパク質が、Fv、Fab、scFv、IgG、Diabody又はtaFvである、(1)~(3)のいずれかに記載の人工タンパク質。
(5)
抗原結合活性を担う構造領域における二次構造の折り返し部分に存在し、かつタンパク質の表面に露出している部位が、抗体Fab断片(Fab)におけるループ領域又はエルボウ領域に存在する、(1)~(4)のいずれかに記載の人工タンパク質。
抗体Fab断片におけるループ領域としては、ABループ(CH1)、CDループ(CH1)、EFループ(CH1)、ABループ(VH)、C”Dループ(VH)、EFループ(VH)、DEループ(CH1)、FGループ(CH1)又はCC’ループ(VH)、ABループ(CL)、CDループ(CL)、EFループ(CL)、ABループ(VL)、C”Dループ(VL)、EFループ(VL)、DEループ(CL)、FGループ(CL)又はCC’ループ(VL)であることが好ましく、エルボウ領域としては、GAループ(VH-CH1)又はGAループ(VL-CL)であることが好ましい。
抗体Fab断片におけるループ領域としては、Chothiaの番号に準じて、H鎖については、112-119位、125-134位、155-162位、186-194位、13-17位、61-66位、82b-87位、172-174位、201-203位又は40-44位に存在するループ領域であることが好ましく、L鎖については、105-113位、119-128位、151-158位、182-190位、13-18位、57-61位、76-83位、165-174位、198-203位又は39-44位に存在するループ領域であることが好ましい。
(5-1)
抗体におけるループ領域中の挿入部位が、図7及び図8に例示される軽鎖(L鎖)におけるB1、B2、B2―2、B3、M1、M2、M2―2、M3、M3―2、M4、M5、M5-2又はM6サイトであるか、図14及び図15に例示される重鎖(H鎖)におけるB1、B2、B2―2、B3、M1、M2、M2-2、M3、M3―2、M4、M5又はM6サイトである、(5)に記載の人工タンパク質。
(5-2)
抗体におけるエルボウ領域中の挿入部位が、図7に例示されるL鎖におけるエルボウサイトであるか、図14に例示されるH鎖におけるエルボウサイトである、(5)に記載の人工タンパク質。
(6)
多重特異性を有する、(1)~(5-2)のいずれかに記載の人工タンパク質。
(7)
少なくとも抗体の抗原結合領域を有するタンパク質に、生理活性ペプチドを提示する方法であって、当該タンパク質における抗原結合活性を担う構造領域における二次構造の折り返し部分に存在し、かつタンパク質の表面に露出している部位に、当該生理活性ペプチドを融合することで、タンパク質に生理活性ペプチドを提示する方法。
(8)
抗体由来の抗原結合活性を保持し、かつ生理活性ペプチドに由来する機能を付与させる、(7)に記載のタンパク質に生理活性ペプチドを提示する方法。
(9)
生理活性ペプチドが、環状ペプチド又は直鎖ペプチドである、(7)又は(8)に記載のタンパク質に生理活性ペプチドを提示する方法。
(10)
少なくとも抗体の抗原結合領域を有するタンパク質が、Fv、Fab、scFv、IgG、Diabody又はtaFvである、(7)~(9)のいずれかに記載のタンパク質に生理活性ペプチドを提示する方法。
(11)
抗原結合活性を担う構造領域における二次構造の折り返し部分に存在し、かつタンパク質の表面に露出している部位が、抗体Fab断片(Fab)におけるループ領域又はエルボウ領域に存在する、(7)~(10)のいずれかに記載のタンパク質に生理活性ペプチドを提示する方法。
抗体Fab断片におけるループ領域としては、ABループ(CH1)、CDループ(CH1)、EFループ(CH1)、ABループ(VH)、C”Dループ(VH)、EFループ(VH)、DEループ(CH1)、FGループ(CH1)又はCC’ループ(VH)、ABループ(CL)、CDループ(CL)、EFループ(CL)、ABループ(VL)、C”Dループ(VL)、EFループ(VL)、DEループ(CL)、FGループ(CL)又はCC’ループ(VL)であることが好ましく、エルボウ領域としては、GAループ(VH-CH1)又はGAループ(VL-CL)であることが好ましい。
抗体Fab断片におけるループ領域としては、Chothiaの番号に準じて、H鎖については、112-119位、125-134位、155-162位、186-194位、13-17位、61-66位、82b-87位、172-174位、201-203位又は40-44位に存在するループ領域であることが好ましく、L鎖については、105-113位、119-128位、151-158位、182-190位、13-18位、57-61位、76-83位、165-174位、198-203位又は39-44位に存在するループ領域であることが好ましい。
(11-1)
抗体におけるループ領域中の挿入部位が、図7及び図8に例示されるL鎖におけるB1、B2、B2―2、B3、M1、M2、M2―2、M3、M3―2、M4、M5、M5-2又はM6サイトであるか、図14及び図15に例示されるH鎖におけるB1、B2、B2―2、B3、M1、M2、M2-2、M3、M3―2、M4、M5又はM6サイトである、(11)に記載のタンパク質に生理活性ペプチドを提示する方法。
(11-2)
抗体におけるエルボウ領域中の挿入部位が、図7に例示されるL鎖におけるエルボウサイトであるか、図14に例示されるH鎖におけるエルボウサイトである、(11)に記載のタンパク質に生理活性ペプチドを提示する方法。
本発明の人工タンパク質は、少なくとも抗体の抗原結合領域を有するタンパク質における抗原結合活性を担う構造領域内の二次構造の折り返し部分に存在し、かつタンパク質の表面に露出している部位に、生理活性ペプチドが融合されている。
本発明の人工タンパク質は、抗体の抗原結合領域を有する。また、本発明の人工タンパク質は、人工タンパク質が抗原結合領域を有していることにより、当該抗原結合領域に基づいて、人工タンパク質の構造として、抗原結合活性を担う構造を保持していることになる。
本発明の人工タンパク質の抗原結合活性を担う構造領域内には、二次構造の折り返し部分が存在しており、当該折り返し部分には、タンパク質における立体構造として、タンパク質の表面に露出している部位が存在する。
本発明においては、当該タンパク質の表面に露出している部位に、生理活性ペプチドが融合されている。
二次構造の折り返し部分のすべてがタンパク質の表面に露出していてもよく、二次構造の折り返し部分の一部がタンパク質の表面に露出していてもよい。
かかる先端部を有するタンパク質としては、抗体が挙げられ、抗体としては、特に限定されるものではないが、IgG、IgM、IgA、IgD、IgEの5種類に分類される。
本発明において、少なくとも抗体の抗原結合領域を有するタンパク質が抗体である場合には、抗体としては、IgG、IgM、IgA、IgD、IgEのいずれであってもよいが、IgGが好適である。IgGのサブクラスとして、多数のサブクラスが知られており、それらの中から選択されてもよい。
また、抗体としては、その由来は特に限定されず、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ウマ抗体、イヌ抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体であってよい。
なお、少なくとも抗体の抗原結合領域を有するタンパク質として、図2~5に記載される構造であってもよい。
Fv、Fab、scFv、Diabody又はtaFvについては、当業界において既に知られている構造として理解される抗体断片といえる。
本明細書において、抗原結合活性を人工タンパク質が保持しているとは、生理活性ペプチドが、人工タンパク質に融合された後においても、当該人工タンパク質がインタクトなタンパク質であった場合の抗原結合活性を保持していることを意味する。その場合に、抗原結合活性の程度は、生理活性ペプチドを融合させた前後で、異なる結合活性を示してもよい。
本発明において、抗原結合活性は、抗体の抗原結合領域を有するタンパク質を抗体と見立てた場合における抗体の抗原結合活性であることが好ましい。
本発明の人工タンパク質は、抗原結合活性を保持し、かつ融合された生理活性ペプチドに由来する機能が付与されていることが好ましい。抗原結合活性を保持し、かつ融合された生理活性ペプチドに由来する機能が付与されている場合には、本発明の人工タンパク質が、多重特異性を有する人工タンパク質であるといえる。
本発明の好適な態様として、Fv領域の周辺部に、第二の結合特異性を融合される生理活性ペプチドを介して賦与するという、authenticな抗体そのもののエンジニアリング技術を提供することができる。
ここで、Fv領域とは、H鎖のVHドメインとL鎖のVLドメインから構成される独立した構造領域を意味する。
したがって、本発明の人工タンパク質は、抗体が本来有する抗原結合性を示し、さらに、融合されている生理活性ペプチドに由来する新たな機能を示す場合には、少なくとも二重特異性を有する人工タンパク質である。
好ましくは、本発明の人工タンパク質は、抗体由来の抗原結合活性を保持し、かつ融合された生理活性ペプチドに由来する機能が付与された、多重特異性を有するが、本発明の人工タンパク質は、抗体が本来有する抗原結合性についてDUALであり得、及び/又は、複数の生理活性ペプチドを融合されことにより、異なる生理活性ペプチドでは異なる2以上の生理活性が示されるので、本発明の人工タンパク質は、多重特異性を有し得る。
本発明においては、好適には、生理活性ペプチドを、抗原結合活性を担う構造領域内の二次構造の折り返し部分に存在し、かつタンパク質の表面に露出している部位に融合することで、従来技術における手法を採用することなく、タンパク質に生理活性ペプチドを融合することができるという利点を有する。
本発明の人工タンパク質においては、好適には、抗原結合活性を担う構造領域内の二次構造の折り返し部分に存在し、かつタンパク質の表面に露出している部位に融合されている構造は、生理活性ペプチドに由来するアミノ酸構造のみであり得る。
人工タンパク質に融合される生理活性ペプチドは、特に限定されるものではないが、環状ペプチド又は直鎖ペプチドであることが好適である。
生理活性ペプチドとは、何らかの生理学的な活性を有しているペプチドであることを意味し、生理学的な活性に関しては、特に限定されない。
生理活性ペプチドの生理学的な活性は、好ましくは、所望の分子への結合活性であり、より好ましくは、所望の標的分子への結合活性であり、結合活性は、分子へ結合することにより分子の活性を活性化するものであってもよく、分子の活性を阻害するものであってもよく、分子の活性を調節するものであってもよい。
生理活性ペプチドは、阻害剤であっても、活性化剤であってもよく、アンタゴニスト、アゴニストに分類されるペプチドであってもよい。生理活性ペプチドとは、生理活性ペプチド単独で、ある特定の標的分子に結合する活性を示すペプチドと言うこともできる。
標的分子としては、特に限定されないが、医薬における標的となる分子であることが好ましく、その例示として、受容体や酵素等が挙げられる。
生理活性の強さとしては、Kd値あるいはEC50値で表示したときにpMオーダーの活性でも、nMオーダーの活性でも、μMオーダーの活性でも、mMオーダーの活性でもよいが、nM以下のオーダーで活性を有することが好ましい。
生理活性は、生理活性ペプチドの有する活性が、人工タンパク質に融合されることにより、増強されていても、減弱されていてもよい。
生理活性ペプチドは本発明の人工タンパク質に融合されている状態として、生理活性を有することが知られたアミノ酸配列の全長が、人工タンパク質に融合されていてもよく、その部分配列が融合されていてもよい。
生理活性ペプチドの部分配列が融合される場合には、生理活性ペプチドの有する生理活性を保持するように部分配列が好ましくは選択される。
生理活性ペプチドが部分配列として融合される場合には、人工タンパク質の表面に提示されることにより、生理活性を保持するように融合されていてもよい。すなわち、部分配列を有するペプチドである場合には、全長の生理活性ペプチドに比して生理活性を減弱させていても、人工タンパク質に融合されることにより生理活性ペプチドが本来有する生理活性を保持するような場合も本発明における好ましい態様である。
環状ペプチドにおける特定の結合の切断部位は、切断部位をタンパク質に融合させた後において、生理活性を保持するような部位であることが好ましい。
環状ペプチドの全長を鎖状のペプチドで表現した場合のアミノ酸配列の全長が人工タンパク質に融合されていてもよく、当該アミノ酸配列の部分配列が人工タンパク質に融合されていてもよい。
すなわち、所望の分子に結合活性を有する生理活性ペプチドを所望の分子に対する結合活性を保持したまま生理活性ペプチドが融合されていることが好ましい。
リンカーは、生理活性ペプチドと元の少なくとも抗体の抗原結合領域を有するタンパク質とを連結することができれば特に限定されないが、生理学的に不活性なアミノ酸配列を有することが好ましい。
リンカーとしては、グリシンやセリンといったアミノ酸が1つの又は2以上連結した配列を有することが好ましい。
生理活性ペプチドは、特に限定されないが、例えば、5~20のアミノ酸を有するペプチドである。
1又は複数とは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10であってもよく、1~10の範囲内であってもよく、1~9、1~8、1~7、1~6、1~5、1~4、1~3、1又は2、1であってもよい。
生理活性ペプチドが、その変異体として融合される場合には、元の生理活性ペプチドの有するアミノ酸配列と、生理活性が消失しない限り、70%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上の配列相同性を有するアミノ酸配列として融合されていてもよい。
環状ペプチドは、分子内環状構造を形成するための化学架橋構造として、例えば、チオエーテル結合又はジスルフィド結合を含む。
通常、RaPID法やTRAP法のようなmRNAディスプレイ法やファージディスプレイ法により選択される環状ペプチドは、チオエーテル結合又はジスルフィド結合といった分子内環状構造を形成するための化学架橋構造以外の構造が、生理活性を有する活性点であることが多い。
そうすると、環状ペプチドのチオエーテル結合又はジスルフィド結合を、切断して見かけ上直鎖状のペプチドを想定し、当該直鎖状のペプチドが、人工タンパク質に融合されていることが好ましい。この場合、通常、RaPID法やTRAP法のようなmRNAディスプレイ法やファ-ジディスプレイ法により得られる環状ペプチドの高い特異性と親和性を、所望の人工タンパク質の所望の構造内に賦与することができる。また。特に限定されるものではないが、チオエーテル結合又はジスルフィド結合を分子内環状構造として有する環状ペプチドを融合することにより、RaPID法やTRAP法のようなmRNAディスプレイ法やファ-ジディスプレイ法により得られる環状ペプチドを汎用性をもって融合させることができる。
天然型の環状ペプチドを人工タンパク質上に融合する場合には、アミノ酸残基同士を結合するいずれの結合も、分子内環状構造を形成するための化学架橋構造といえるため、いずれの結合を採用することもできるが、環状ペプチドにおける活性部位と考えられる領域以外のアミノ酸残基同士の結合を、人工タンパク質と融合させるための化学架橋構造とすることが好ましい。
2つのアミノ酸残基が2アミノ酸以上離れていることは、2つのアミノ酸残基の間に少なくとも2つのアミノ酸残基が存在していることと同義であり、2つのアミノ酸残基は、その間に2つ以上のアミノ酸を介して結合することとなる。
本発明の人工タンパク質においては、抗原結合活性を保持していることが好ましいため、抗原結合活性を担う構造領域に対して、抗原結合活性が失われてしまうまでに生理活性ペプチドが融合されることは望まれない。
生理活性ペプチドのアミノ酸数としては、下限は特に限定されないものの、4以上であってよく、上限は特に限定されないものの、30以下であってよく、25以下であってよく、20以下であってよい。
また、本発明の人工タンパク質においては、生理活性ペプチドを融合する前後において、アミノ酸数が増加していてもよく、減少していてもよい。
本発明の人工タンパク質においては、少なくとも抗体の抗原結合領域を有するタンパク質に対して、生理活性ペプチドが挿入されている融合タンパク質であるともいえるが、少なくとも抗体の抗原結合領域を有するタンパク質は、代表的には、図2~図5に示されるタンパク質を例示することができ、Fv、Fab、scFv、IgG、Diabody又はtaFvが好ましく、Fab、scFv又はIgGがより好ましい。
したがって、抗体の抗原結合領域に基づく抗原結合活性は、生理活性ぺプチドが融合される前の、例えば、Fv、Fab、scFv、IgG、Diabody又はtaFvといった構造における抗体又はその誘導体における抗原結合活性であることが好ましい。
また、図3~5には、抗体の抗原結合領域が異なる二重(多重)特異性抗体が例示されているが、これらの二重(多重)特異性抗体も、本発明における少なくとも抗体の抗原結合領域を有するタンパク質として例示できる。すなわち、少なくとも抗体の抗原結合領域を有するタンパク質としては、抗体様分子であってもよい。
図3~5には、抗体の抗原結合領域が異なるタンパク質として記載されているが、本発明の少なくとも抗体の抗原結合領域を有するタンパク質においては、図3~5に示されるタンパク質において、抗体の抗原結合部位が同一であるタンパク質であってもよい。
本発明の人工タンパク質においては、生理活性ペプチドは、少なくとも抗体の抗原結合領域を有するタンパク質に融合されており、具体的には、当該タンパク質において、抗原結合活性を担う構造領域における二次構造の折り返し部分に存在し、かつタンパク質の表面に露出している部位に融合されている。
抗原結合活性を担う構造領域における二次構造の折り返し部分に相当するアミノ酸配列において、生理活性ペプチドを融合する部位としては、隣接するアミノ酸の間であってもよい。また、抗原結合活性を担う構造領域における二次構造の折り返し部分に相当するアミノ酸配列において、生理活性ペプチドを融合する部位としては、当該アミノ酸配列において離れたアミノ酸の間であってもよい。離れたアミノ酸の間に生理活性ぺプチドが融合される場合、生理活性ペプチドと結合するために選択される抗原結合活性を担う構造領域における二次構造の折り返し部分に相当するアミノ酸配内のアミノ酸間に存在する1又は複数のアミノ酸については、人工タンパク質においては欠失していてよい。
抗原結合活性を担う構造領域における二次構造の折り返し部分に存在し、かつタンパク質の表面に露出している部位は、好ましくは、抗体Fab断片(Fab)におけるループ領域又はエルボウ領域に存在する部位である。
抗体Fab断片におけるループ領域又はエルボウ領域内から生理活性ぺプチドが融合される部位は任意に選択してもよい。
抗体やその誘導体におけるループ領域としては、H鎖においては、GAループ(VH-CH1)、ABループ(CH1)、CDループ(CH1)、EFループ(CH1)、ABループ(VH)、C”Dループ(VH)、EFループ(VH)、DEループ(CH1)、FGループ(CH1)及びCC’ループ(VH)が挙げられ、L鎖においては、GAループ(VL-CL)、ABループ(CL)、CDループ(CL)、EFループ(CL)、ABループ(VL) 、C”Dループ(VL)、EFループ(VL)、DEループ(CL)、FGループ(CL)及びCC’ループ(VL)が挙げられる。
なお、好適なループ領域は、少なくとも抗体の抗原結合領域を有するタンパク質に応じて適宜選択し得る。少なくとも抗体の抗原結合領域を有するタンパク質が、抗体やFabである場合には、上述のループ領域から選択してよい。すなわち、少なくとも抗体の抗原結合領域を有するタンパク質が有する構造に存在するループ領域を選択すればよい。
GAループ(VH-CH1) 112-119位
ABループ(CH1) 125-134位
CDループ(CH1) 155-162位
EFループ(CH1) 186-194位
ABループ(VH) 13-17位
C”Dループ(VH) 61-66位
EFループver1(VH) 82b-87位
DEループ(CH1) 172-174位
FGループ(CH1) 201-203位
CC’ループ(VH) 40-44位
であることが好ましく、L鎖については、
GAループ(VL-CL) 105-113位
ABループ(CL) 119-128位
CDループ(CL) 151-158位
EFループ(CL) 182-190位
ABループ(VL) 13-18位
C”Dループ(VL) 57-61位
EFループ(VL) 76-83位
DEループ(CL) 165-174位
FGループ(CL) 198-203位
CC’ループ(VL) 39-44位
であることが好ましい。
本発明においては、抗原結合活性を担う構造領域内の二次構造の折り返し部分が、上記Chothiaの番号で特定可能なループ構造であることが好ましく、抗原結合活性を担う構造領域内の二次構造の折り返し部分に存在し、かつタンパク質の表面に露出している部位は、当該ループ構造全体であってもよく、当該ループ構造の一部分であってもよい。
すなわち、抗原結合活性を担う構造領域内の二次構造の折り返し部分に存在し、かつタンパク質の表面に露出している部位は、好適には、Chothiaの番号で特定可能なループ構造内の部位であってよい。
選択される任意の位置として、Chothiaのナンバリングに基づくアミノ酸番号の小さい方の位置で生理活性ペプチドのN末端側が結合していてよく、、Chothiaのナンバリングに基づくアミノ酸番号の大きい方の位置で生理活性ペプチドのC末端側が結合していてもよい。
また、GAループ(VH-CH1)は、Chothiaの番号として112-119位のアミノ酸として規定されるが、タンパク質の表面に露出している部位であれば、112位よりもN末端側の位置から選択されてもよく、同様に、119位よりもC末端側の位置から選択されてもよい。
図6に従うと以下のとおりである(N1_mP6-9_M6L)。
...YQQKP40-(GWRPYIERWTGRLIVGG)-G41KAPK... 図13に従うと以下のとおりである(N1_mP6-9_M6H)。
...VRQAP41-(GWRPYIERWTGRLIVGG)-G42KGLE... エルボウ領域中の生理活性ペプチドの挿入部位が、図7に例示されるL鎖におけるエルボウサイト内であるか、図14に例示されるH鎖におけるエルボウサイト内であることが好ましい。
図7、図8、図14及び図15においては、抗体(1HZH)の構造を参考にして各挿入部位を例示しているが、他の抗体の場合には、抗体(1HZH)におけるサイトに相当する他の抗体におけるサイトを挿入部位とすることができる。
生理活性ペプチドの挿入部位の例示として、図6及び図13が挙げられる。
GAループ(VH-CH1)中におけるEサイトとして、113-114位
ABループ(CH1)中におけるB1サイトとして、132-133位
CDループ(CH1)中におけるB2サイトとして、156-157位、B2-2サイトとして、160-161位
EFループ(CH1)中におけるB3サイトとして、190-191位
ABループ(VH)中におけるM1サイトとして、14-15位
C”Dループ(VH)中におけるM2サイトとして、61-62位、M2-2サイトとして、65-66位
EFループ(VH)中におけるM3サイトとして、82a-82b、M3-2サイトとして、83-84位
DEループ(CH1)中におけるM4サイトとして、172-173位
FGループ(CH1)中におけるM5サイトとして、203-204位
CC’ループ(VH)中におけるM6サイトとして、41-42位
であることが好ましく、L鎖については、
GAループ(VL-CL)中におけるEサイトとして、108-109位
ABループ(CL)中におけるB1サイトとして、127-128位
CDループ(CL)中におけるB2サイトとして、151-152位、B2-2サイトとして、156-157位
EFループ(CL)中におけるB3サイトとして、188-189位
ABループ(VL)中におけるM1サイトとして、15-16位
C”Dループ(VL)中におけるM2サイトとして、56-57位、M2-2位サイトとして、60-61位
EFループ(VL)中におけるM3サイトとして、76-77位、M3-2サイトとして、80-81位
DEループ(CL)中におけるM4サイトとして、169-170位
FGループ(CL)中におけるM5サイトとして、202-203位、M502サイトとして、199-200位
CC’ループ(VL)中におけるM6サイトとして、40-41位
であることが好ましい。
なお、図6や図13では、H鎖又はL鎖であることを示すため、下付き文字によりH又はLを付して記載している。
本発明においては、少なくとも抗体の抗原結合領域を有するタンパク質が抗体やFab等である場合には、いわゆるボトムサイトとなる、H鎖であれば、B1サイト、B2サイト、B3サイトであることが好ましく、L鎖であれば、B1サイト、B2サイト、B2-2サイト、B3サイトであることが好ましい。
本発明においては、抗原結合領域近傍にも生理活性ペプチドを融合できるため、いわゆるボトムサイト以外の挿入部位も好適に利用可能である。
H鎖であれば、B1サイト、B2サイト、B3サイトが属するループ領域が好ましく、L鎖であれば、B1サイト、B2サイト、B2-2サイト、B3サイトが属するループ領域が好ましい。
本発明は、少なくとも抗体の抗原結合領域を有するタンパク質における抗原結合活性を担う構造領域内の二次構造の折り返し部分に存在し、かつタンパク質の表面に露出している部位に、生理活性ペプチドが融合されている、人工タンパク質の製造方法は特に限定されず、本発明の人工タンパク質は、実施例に記載の方法を援用して製造することが可能である。また、その際に、従来公知の遺伝子工学に係る手法又はその変法を採用することが可能である。
本発明における、少なくとも抗体の抗原結合領域を有するタンパク質における抗原結合活性を担う構造領域内の二次構造の折り返し部分に存在し、かつタンパク質の表面に露出している部位に、生理活性ペプチドが融合されている、人工タンパク質の製造方法は、
生理活性ペプチドのアミノ酸配列から、タンパク質上に融合する全部又は部分アミノ酸配列を選択し、該アミノ酸配列に相当する塩基配列を選択し、
少なくとも抗体の抗原結合領域を有するタンパク質における抗原結合活性を担う構造領域内の二次構造の折り返し部分に存在し、かつタンパク質の表面に露出している部位を選択し、
生理活性ペプチドを融合する当該部位を構成する2つのアミノ酸残基に相当する塩基配列を選択し、該選択された塩基配列間に存在する塩基を必要に応じて削除し、選択された生理活性ペプチド由来のアミノ酸配列に相当する塩基配列を挿入して組み込んだ塩基配列を有する核酸を準備し、
該核酸を翻訳する、人工タンパク質の製造方法である。
本発明における、少なくとも抗体の抗原結合領域を有するタンパク質における抗原結合活性を担う構造領域内の二次構造の折り返し部分に存在し、かつタンパク質の表面に露出している部位に、生理活性ペプチドが融合されている、人工タンパク質においては、「少なくとも抗体の抗原結合領域を有するタンパク質」の「抗原結合活性を担う構造領域内の二次構造の折り返し部分に存在し、かつタンパク質の表面に露出している部位」に、「生理活性ペプチド」が融合されているため、本発明の人工タンパク質について説明したところと同様に、タンパク質に生理活性ペプチドを提示する方法が提供され得る。
「少なくとも抗体の抗原結合領域を有するタンパク質に、生理活性ペプチドを提示する方法」が、当該タンパク質の抗原結合活性を担う構造領域における二次構造の折り返し部分に存在し、かつタンパク質の表面に露出している部位に、当該生理活性ペプチドを融合することで、「少なくとも抗体の抗原結合領域を有するタンパク質に、生理活性ペプチドを融合させて、当該タンパク質に多重特異性を付与する方法」と、本発明を理解することも可能である。
すなわち、好適には、抗体由来の抗原結合活性を保持し、かつ融合された生理活性ペプチドに由来する機能を付与させることにより少なくとも抗体の抗原結合領域を有するタンパク質は多重特異性を有する。
生理活性ペプチドを、IgG全長タンパク質(以下、「IgG」と呼ぶ)の抗原結合部位であるFab領域に挿入してペプチド融合タンパク質を、以下のとおり調製した。
抗体(1HZH)の構造を例示として図1に示す。図7、図8、図14及び図15に、図1で示した抗体の構造を参考に、生理活性ペプチドの挿入サイトを示す。
1.ペプチド融合タンパク質の調製
ニューロピリン1に対するヒトIgG1モノクローナル抗体(N1抗体、クローン名YW64.3)のH鎖のうちFab領域をコードするDNAとHisx6タグをコードするDNAを発現ベクターpcDNA3.1(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)に組み込んだ(抗体H鎖Fab領域発現ベクター)。
このベクターから生産されるN1抗体H鎖Fab領域のアミノ酸配列(配列番号2)を図48に示す。なお、N1抗体H鎖のアミノ酸配列(配列番号1)を図47として示す。
N1抗体のLκ鎖全長領域をコードするDNAを発現ベクターpcDNA3.1に組み込んだ(抗体Lκ鎖発現ベクター)。ただしこちらはタグなしで組み込んだ。このベクターから生産されるN1抗体Lκ鎖のアミノ酸配列(配列番号3)を図49に示す。
生理活性ペプチドとして、ヒトプレキシンB1に対して結合する活性を有するmP6-9を選択した。mP6-9は、D-Trp Arg Pro Tyr Ile Glu Arg Trp Thr Gly Arg Leu Ile Val Cysのアミノ酸配列(配列番号4)を有する環状ペプチドであって、クロロアセチル化されたD-TrpがCysと環状構造を形成している。Fab領域の各サイトに挿入されたmP6-9のアミノ酸配列(配列番号5)は、Trp Arg Pro Tyr Ile Glu Arg Trp Thr Gly Arg Leu Ile Valである。
なお、図6及び図13に示すとおり、挿入したアミノ酸配列のN末及びC末には、リンカーとしてGlyを用いた(配列番号6~32)。
抗体H鎖-ペプチド融合ベクターは、上記抗体H鎖Fab領域発現ベクターを元に、そのFab領域のエルボウ(E)サイト、ループ領域として、B1、B2、B2―2、B3、M1、M2、M2-2、M3、M3―2、M4、M5、M6サイトを選び、そこにmP6-9配列に相当するDNA配列を挿入することにより作製した。例えばH鎖のエルボウ(E)サイト挿入は以下に示す様に113位のセリン(S)と114位のアラニン(A)(アミノ酸残基番号はChothiaのナンバリングを使用)の間に括弧内のmP6-9配列を含むアミノ酸配列をコードするDNA配列を挿入した(配列番号20)。
...VTVSS113-(GWRPYIERWTGRLIVG)-A114STKG...
同様にH鎖の各サイトの挿入位置を図13に示す。
ペプチド融合型抗体H鎖を含むFabタンパク質は、抗体H鎖-ペプチド融合ベクターと、未融合の抗体Lκ鎖発現ベクターを共発現することにより構成し、それぞれN1_Fab_mP6-9_M1HのようにN1_Fab_ペプチド名_サイト名と命名した(図16~図18)。
抗体L鎖-ペプチド融合ベクターは、上記抗体Lκ鎖発現ベクターを元に、その領域のエルボウ(E)サイト、ループ領域として、B1、B2、B2―2、B3、M1、M2、M2-2、M3、M3―2、M4、M5、M5-2、M6サイトを選び、そこにmP6-9配列に相当するDNA配列を挿入することにより作製した。例えばL鎖のエルボウ(E)サイト挿入は以下に示す様に108位のアルギニン(R)と109位のトレオニン(T)(アミノ酸残基番号はChothiaのナンバリングを使用)の間に括弧内のmP6-9配列を含むアミノ酸配列をコードするDNA配列を挿入した(配列番号6)。
...VEIKR108-(GWRPYIERWTGRLIVG)-T109VAAP...
同様にL鎖の各サイトの挿入位置を図6に示す。
ペプチド融合型抗体L鎖を含むFabタンパク質は、抗体L鎖-ペプチド融合ベクターと、未融合の抗体H鎖Fab領域発現ベクターを共発現することにより構成し、それぞれN1_Fab_mP6-9_M1LのようにN1_Fab_ペプチド名_サイト名と命名した(図9~図12)。
なお、ペプチド融合型抗体H鎖及びペプチド融合型L鎖であることを、サイト名において下付文字のH及びLを用いて示した。
ペプチド融合型抗体H鎖又はペプチド融合型抗体L鎖を含むペプチド融合型Fabタンパク質(Fabbody)は、抗体H鎖-ペプチド融合ベクターと未融合の抗体Lκ鎖発現ベクター、もしくは抗体L鎖-ペプチド融合ベクターと未融合の抗体H鎖Fab領域発現ベクターを、Expi293F細胞(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)を用いて共発現させることにより、その培養上清中に分泌させることで調製した。細胞の培養やトランスフェクションはサーモフィッシャーサイエンティフィック社の標準プロトコールに従っておこなった。
回収した培養上清0.25mLにNi-NTAセファロース(キアゲン社製)を40μL加え、2時間回転混和した。遠心分離によってセファロースを沈殿させて上清を除き、1mLのTris-buffered saline(TBS,20mM Tris-HCl,150mM NaCl,pH7.5)で2回セファロースを洗浄し、TBSに500mM Imidazole pH8.0を12.5μL加え溶出し、さらにSDSサンプルバッファー12.5μLを加えて95℃で2分間加熱して試料を得た。溶出した試料の5μLを非還元条件下で電気泳動に供し、クマシーブリリアントブルーで染色した。結果を図9及び図16に示す。
様々なサイトにmP6-9ペプチドを融合したN1_Fab(mP6-9ペプチド融合型N1_Fab)について、融合前のN1抗体が有していたニューロピリン1に対する結合能及び融合前のmP6-9ペプチドが有していたヒトプレキシンB1に対する結合能をそれぞれ保持しているかどうかを調べるため、プルダウン型の結合試験を行った。Protein Exp. Purification,2014;95:240-247に記載された方法に準じて、ヒトプレキシンB1の細胞外領域のC末端にPAタグ(和光純薬工業社製)が付加された融合タンパク質をコードするコンストラクト、及びマウスニューロピリン1の細胞外領域のC末端にPAタグが付加された融合タンパク質をコードするコンストラクトをそれぞれ作成し、これを発現ベクターpcDNA3.1(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)に組み込んだ。このベクターを用いて前述の方法によりExpi293F細胞で一過性発現させ、可溶性受容体断片であるプレキシンB1-PA及びニューロピリン1-PAを含む培養上清を調製した。
前述の様にmP6-9ペプチド融合型N1_FabをNi-NTAセファロースにキャプチャーした後、上記の方法で別に調製したプレキシンB1-PA又はニューロピリン1-PAを含む培養上清を反応させた。セファロースを洗浄し、前述のように結合蛋白質を溶出した後、非還元条件下で電気泳動に供し、クマシーブリリアントブルーで染色した。結果を、図10及び図11並びに図17及び図18に示す。
これらのデータは、mP6-9ペプチド融合型N1_Fabが、ニューロピリン1とヒトプレキシンB1に対する結合能をそれぞれ有することを示唆する実験結果を示している。
マウスニューロピリン1の細胞外領域のC末端にDYKDDDDKタグ(配列番号33)が付加された融合タンパク質をコードするコンストラクトを作成し、これを発現ベクターpcDNA3.1(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)に組み込んだ。このベクターを用いて前述の方法によりExpi293F細胞で一過性発現させ、可溶性受容体断片であるニューロピリン1-DYKDDDDKを含む培養上清を調製した。ニューロピリン1-DYKDDDDKを含む培養上清0.25mLをAnti DYKDDDDK tag Antibody Beadsセファロース(和光純薬工業社製)40μLにキャプチャーした。遠心分離によってセファロースを沈殿させて上清を除き、1mLのTris-buffered saline(TBS,20mM Tris-HCl,150mM NaCl,pH7.5)で1回セファロースを洗浄した後、mP6-9ペプチド融合Fabを含む培養上清0.25mLを加え、さらに1時間回転混和して反応させた。再び遠心分離によってセファロースを沈殿させ、1mLのTBSで1回セファロースを洗浄し、続いてヒトプレキシンB1-PAを含む培養上清0.25mLを加え、さらに1時間回転混和して反応させた。その後1mLのTBSで2回セファロースを洗浄し、TBS12.5μLとSDSサンプルバッファー12.5μLを加えて溶出を行い、95℃で2分間加熱して試料を得た。溶出した試料の10μLを非還元条件下で電気泳動に供し、クマシーブリリアントブルーで染色した。結果を、図12及び図19に示す。
これらのデータは、mP6-9ペプチド融合型N1_Fabが、ニューロピリン1とヒトプレキシンB1に対して同時に結合能を有することを示唆する実験結果を示している。
3-1.サンドイッチ型分子間架橋試験の原理と標的抗原の調製
mP6-9ペプチド融合型N1_Fabが2種の標的分子に同時に結合できることを示すため、サンドイッチELISAタイプのアッセイ系を構築した。原理を図20Aに示す。まずProtein Exp. Purification,2014;95:240-247に記載された方法に準じて、第2標的分子としてのヒトプレキシンB1の細胞外領域のC末端にPAタグ(和光純薬工業社製)が付加された融合タンパク質をコードするコンストラクトを作成し、これを発現ベクターpcDNA3.1(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)に組み込んだ。このベクターを用いて上記「2.」と同様の方法によりExpi293F細胞で一過性発現させ、可溶性受容体断片であるプレキシンB1-PAを含む培養上清を調製し、それらを抗PAタグ抗体ビーズ(和光純薬工業社製)を用いて精製した。第1抗原側は、AP融合発現ベクターであるpAPtag-5(GenHunter社)を用いてAPのN末端(ニューロピリン1)にその細胞外領域の配列を融合し、上記「2.」と同様の方法によりExpi293F細胞で一過性発現させ、可溶性受容体―AP融合物であるNrp1ec-APをそれぞれ含む培養上清を調製した。
mP6-9ペプチド融合型N1_Fabによる2種の標的分子間の架橋は、図20Aに示す原理に基づき、以下のプロトコールに従って評価した。
(1)10μg/mLに希釈した精製第2標的抗原溶液50μLを96wellプレートに加え室温で、3時間静置した。
(2)精製第2標的抗原溶液を除去し、TBSにて10倍希釈したBlocking One(ナカライテスク社製)(TBS;20mM Tris-HCl,150mM NaCl,pH7.5)を200μL/well加えて4℃で一晩静置した。
(3)200μL/wellのTBSで1回洗浄した。
(3)mP6-9ペプチド融合型N1_Fab発現上清を50μL加えて室温で2.5時間静置した。
(4)200μL/wellのTBSで3回洗浄した。
(5)AP融合第1標的抗原を発現する上清を50μL加えて室温で2時間静置した。
(6)200μL/wellのTBSで4回洗浄し、最後に100μL/wellのTBSを加えた。
(7)発色基質(Phosphatase substrate、シグマアルドリッチ社製)を100μL/wellでさらに加え、37℃で30分静置後、各well中の溶液の405nmの吸光度を測定した。結果を図20Bに示す。
mP6-9ペプチド融合型N1_Fabは、それぞれの第2標的抗原を固定化したプレートにキャプチャーされ、後から加えた第1標的抗原-AP融合タンパク質を結合して基質を発色させた。一方、ペプチド挿入をしていないN1_Fabは陽性シグナルを与えなかった。このことは、ペプチド融合型Fabタンパク質であるFabbodyが第1及び第2標的に対して個別にでは無く、同時に結合できることを示している。
1.ペプチド融合タンパク質の調製
ペプチド融合型抗体H鎖又はペプチド融合型抗体L鎖を含むペプチド融合型IgGタンパク質は、抗体H鎖-ペプチド融合ベクターと未融合の抗体Lκ鎖発現ベクター、もしくは抗体L鎖-ペプチド融合ベクターと未融合の抗体H鎖IgG領域発現ベクターを、Expi293F細胞(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)を用いて共発現させることにより、その培養上清中に分泌させることで調製した。
回収した培養上清0.25mLにProteinAセファロース(GEヘルスケア社製)を40μL加え、1時間回転混和した。遠心分離によってセファロースを沈殿させて上清を除き、1mLのTris-buffered saline(TBS,20mM Tris-HCl,150mM NaCl,pH7.5)で2回セファロースを洗浄し、TBSを12.5μLとSDSサンプルバッファー12.5μLを加えて溶出し、さらに95℃で2分間加熱して試料を得た。溶出した試料の5μLを還元条件下で電気泳動に供し、クマシーブリリアントブルーで染色した。結果を図21に示す。
様々なサイトにmP6-9ペプチドを融合したN1_IgG(mP6-9ペプチド融合型N1_IgG)について、融合前のN1抗体が有していたニューロピリン1に対する結合能及び融合前のmP6-9ペプチドが有していたヒトプレキシンB1に対する結合能をそれぞれ保持しているかどうかを調べるため、プルダウン型の結合試験を行った。
mP6-9ペプチド融合型N1_IgGをProteinAセファロースにキャプチャーした後、実施例1と同様の方法で別に調製したプレキシンB1-PA又はニューロピリン1-PAを含む培養上清を反応させた。セファロースを洗浄し、前述のように結合蛋白質を溶出した後、還元条件下で電気泳動に供し、クマシーブリリアントブルーで染色した。結果を図22及び図23に示す。
これらのデータは、mP6-9ペプチド融合IgGが、ニューロピリン1とヒトプレキシンB1に対する結合能をそれぞれ有することを示唆する実験結果を示している。
生理活性ペプチドとして、ヒトプレキシンB1に対して結合する活性を有するmP6-9に代えて、ヒトMet受容体(Met)に対して結合する活性を有するaMD4を用いて、実施例1と同様に行った。
aMD4は、D-Tyr Arg Gln Phe Asn Arg Arg Thr His Glu Val Trp Asn Leu Asp Cysのアミノ酸配列(配列番号34)を有する環状ペプチドであって、クロロアセチル化されたD-TyrがCysと環状構造を形成している。Fab領域の各サイトに挿入されたaMD4のアミノ酸配列(配列番号35)は、Tyr Arg Gln Phe Asn Arg Arg Thr His Glu Val Trp Asn Leu Aspである。
なお、図24及び図28に示すとおり、挿入したアミノ酸配列のN末及びC末には、リンカーとしてGlyを用いた(配列番号36~51)。
結果を図25~図27及び図29~図32に示す。
1.ペプチド融合タンパク質の調製
Fabタンパク質として、N1抗体に代えて、抗CD3抗体(OKT3抗体)のFabを用いて、実施例1と同様に行った。
抗体H鎖-ペプチド融合ベクターは、OKT3抗体H鎖Fab領域発現ベクターを元に、ループ領域として、B1、B2、B2-2、B3サイトを選び、そこに実施例3で用いたaMD4配列又はaMD5配列に相当するDNA配列を挿入することにより作製した。抗体L鎖-ペプチド融合ベクターは、OKT3抗体Lκ鎖発現ベクターを元に、ループ領域として、B1、B2、B2―2、B3サイトを選び、そこにaMD4配列又はaMD5配列に相当するDNA配列を挿入することにより作製した。H鎖又はL鎖における生理活性ペプチドの挿入部位は図24及び図28に示す挿入部位とChothiaのアミノ酸残基番号に基づいたナンバリングにより、OKT3抗体のFabにおいて対応する部位である。
aMD4については、実施例3と同様である。
aMD5は、D-Tyr Trp Tyr Tyr Ala Trp Asp Gln Thr Tyr Lys Ala Phe Pro Cysのアミノ酸配列(配列番号52)を有する環状ペプチドであって、クロロアセチル化されたD-TyrがCysと環状構造を形成している。Fab領域の各サイトに挿入されたaMD5のアミノ酸配列(配列番号53)は、Tyr Trp Tyr Tyr Ala Trp Asp Gln Thr Tyr Lys Ala Phe Proである。 挿入したアミノ酸配列のN末及びC末には、リンカーとしてGlyを用いた。
実施例1と同様の方法でExpi293F細胞(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)を用いて共発現させ、その培養上清中をNi-NTAセファロースにキャプチャーし、洗浄・溶出後に電気泳動することにより得られた結果を図33に示す。
融合前のaMD4又はaMD5ペプチドが有していたヒトMet受容体(Met)に対する結合能を、それぞれ保持しているかどうかを調べるため、プルダウン型の結合試験を行った。Expi293F細胞で一過性発現させた可溶性受容体断片であるMet-PAを含む培養上清1.0mLを抗PAタグ抗体ビーズ(和光純薬工業社製)でキャプチャーし、遠心分離によってセファロースを沈殿させて上清を除き、1mLのTris-buffered saline(TBS,20mM Tris-HCl,150mM NaCl,pH7.5)で1回セファロースを洗浄した後、製造したペプチド融合Fab含む培養上清0.8mLを加え、さらに1時間回転混和して反応させた。再び遠心分離によってセファロースを沈殿させ、1mLのTBSで2回セファロースを洗浄し、TBSを12.5μLとSDSサンプルバッファー12.5μLを加えて溶出し、さらに95℃で2分間加熱して試料を得た。溶出した試料の12μLを非還元条件下で電気泳動に供し、クマシーブリリアントブルーで染色した。結果を図34に示す。
様々な位置にaMD4ペプチドを挿入したaMD4ペプチド融合型OKT3_Fabについて、ヒトMet受容体(Met)に対する結合能を保持しているかどうかを調べるため、フローサイトメトリーによる結合試験を行った。OKT3_Fab及び6種類のaMD4ペプチド融合型OKT3_Fabの発現上清を、CD3を発現するヒトTリンパ球性白血病由来Jurkat細胞あるいはヒトMet受容体安定発現CHO細胞と反応させ、結合したFabをAlexaFluor488標識ヤギ抗ヒトIgG二次抗体(ThermoFisher社製)で染色し、EC800型フローサイトメーター(SONY社製)で分析した。結果を図35に示す。
上段ではCD3を細胞表面上に発現するJurkat細胞に対してplain-Fab(OKT3-Fab)及びaMD4ペプチド融合型OKT3_Fabが結合するかを確認しており、no-Fabの灰色の領域に対して水色で示した領域は右にシフトしており、結合が確認できる。このことからaMD4ペプチド融合型OKT3_Fabにおいても本来のCD3抗原への結合能は失われていない。下段では、aMD4ペプチド挿入によって付加されたMetへの結合能を調べており、Met-CHO(細胞表面上に Metを発現)に対し、aMD4ペプチド融合型OKT3_Fabではシフトしており結合が確認できる。一方、plain-Fab(OKT3-Fab)では、シフトは見られない。このことから、aMD4ペプチド融合型OKT3_Fabにおいて、aMD4ペプチドを融合したことにより、新たにMet特異的結合能が付加されていることが確認できる。
Fabタンパク質として、N1抗体に代えて、抗CD3抗体(UCHT1抗体)のFabを用いて、実施例4と同様に行った。結果を図36~図38に示す。
aMD4ペプチドを融合したことにより、aMD4ペプチド融合型UCHT1_Fabにおいても、新たにMet特異的結合能が付加されていることが確認できる。
1.ペプチド融合タンパク質の調製
Fabタンパク質として、N1抗体に代えて、抗CD16抗体(3G8抗体)のFabを用いて、実施例4と同様に行った。結果を図39に示す。
融合前の3G8抗体が有していたCD16に対する結合能を保持しているかどうかを調べるため、プルダウン型の結合試験を行った。Expi293F細胞で一過性発現させた可溶性受容体断片であるCD16-PAを含む培養上清0.5mLを抗PAタグ抗体ビーズ(和光純薬工業社製)でキャプチャーし、遠心分離によってセファロースを沈殿させて上清を除き、1mLのTris-buffered saline(TBS,20mM Tris-HCl,150mM NaCl,pH7.5)で1回セファロースを洗浄した後、製造したペプチド融合Fab含む培養上清0.25mLを加え、さらに1時間回転混和して反応させた。再び遠心分離によってセファロースを沈殿させ、1mLのTBSで2回セファロースを洗浄し、TBSを12.5μLとSDSサンプルバッファー12.5μLを加えて溶出し、さらに95℃で2分間加熱して試料を得た。溶出した試料の20μLを非還元条件下で電気泳動に供し、クマシーブリリアントブルーで染色した。結果を図40に示す。
1.ペプチド融合タンパク質(三重特異性)の調製
抗体H鎖-mP6-9ペプチド融合ベクターは、実施例1に記載の抗体H鎖Fab領域発現ベクターを元に、そのFab領域のエルボウ(E)サイト、ループ領域として、B1、B2―2、M4、サイトを選び、そこにmP6-9配列に相当するDNA配列を組み込むことにより作製した。
抗体L鎖-mP6-9ペプチド融合ベクターは、実施例1に記載の抗体Lκ鎖発現ベクターを元に、そのFab領域のエルボウ(E)サイト、ループ領域として、B1、M1、M2-2サイトを選び、そこにmP6-9配列に相当するDNA配列を組み込むことにより作製した。
抗体H鎖-aMD4ペプチド融合ベクターは、実施例1に記載の抗体H鎖Fab領域発現ベクターを元に、そのFab領域のエルボウ(E)サイト、ループ領域として、B1、B2、M4、M5、サイトを選び、そこにaMD4配列に相当するDNA配列を組み込むことにより作製した。
抗体L鎖-aMD4ペプチド融合ベクターは、実施例1に記載の抗体Lκ鎖発現ベクターを元に、そのFab領域のエルボウ(E)サイト、ループ領域として、B2-2、M2、M2-2サイトを選び、そこにaMD4配列に相当するDNA配列を組み込むことにより作製した。
H鎖又はL鎖における生理活性ペプチドの挿入部位は図6及び図13に示す挿入部位である。
三重特異性ペプチド融合型Fabタンパク質は、抗体H鎖-mP6-9ペプチド融合ベクターと抗体L鎖-aMD4ペプチド融合ベクター、もしくは抗体H鎖-aMD4ペプチド融合ベクターと抗体L鎖-mP6-9ペプチド融合ベクターを、Expi293F細胞(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)を用いて共発現させることにより、その培養上清中に分泌させることで調製した。細胞の培養やトランスフェクションはサーモフィッシャーサイエンティフィック社の標準プロトコールに従っておこなった。
回収した培養上清0.25mLにNi-NTAセファロース(キアゲン社製)を40μL加え、1時間回転混和した。遠心分離によってセファロースを沈殿させて上清を除き、1mLのTris-buffered saline(TBS,20mM Tris-HCl,150mM NaCl,pH7.5)で2回セファロースを洗浄し、TBSに500mM Imidazole pH8.0を12.5μL加え溶出し、さらにSDSサンプルバッファー12.5μLを加えて95℃で2分間加熱して試料を得た。溶出した試料の5μLを非還元条件下で電気泳動に供し、クマシーブリリアントブルーで染色した。結果を図42に示す。
三重特異性ペプチド融合型Fabタンパク質について、それぞれニューロピリン1に対する結合能、融合前のmP6-9ペプチドが有していたヒトプレキシンB1に対する結合能、融合前のaMD4ペプチドが有していたヒトMet受容体(Met)に対して結合能を、それぞれ保持しているかどうかを調べるため、プルダウン型の結合試験を行った。Protein Exp. Purification,2014;95:240-247に記載された方法に準じて、ヒトプレキシンB1の細胞外領域のC末端にPAタグ(和光純薬工業社製)が付加された融合タンパク質をコードするコンストラクト、ヒトMet受容体の細胞外領域のC末端にPAタグ(和光純薬工業社製)が付加された融合タンパク質をコードするコンストラクト、及びマウスニューロピリン1の細胞外領域のC末端にPAタグが付加された融合タンパク質をコードするコンストラクトをそれぞれ作成し、これを発現ベクターpcDNA3.1(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)に組み込んだ。このベクターを用いて前述の方法によりExpi293F細胞で一過性発現させ、可溶性受容体断片であるプレキシンB1-PA、Met-PA及びニューロピリン1-PAを含む培養上清を調製した。
Expi293F細胞で一過性発現させた可溶性受容体断片であるプレキシンB1-PA、Met-PAもしくはニューロピリン1-PAのいずれかを含む培養上清1.0mLを抗PAタグ抗体ビーズ(和光純薬工業社製)でキャプチャーし、遠心分離によってセファロースを沈殿させて上清を除き、1mLのTris-buffered saline(TBS,20mM Tris-HCl,150mM NaCl,pH7.5)で1回セファロースを洗浄した後、製造したペプチド融合Fab含む培養上清1.0mLを加え、さらに1時間回転混和して反応させた。再び遠心分離によってセファロースを沈殿させ、1mLのTBSで2回セファロースを洗浄し、TBSを12.5μLとSDSサンプルバッファー12.5μLを加えて溶出し、さらに95℃で2分間加熱して試料を得た。溶出した試料の5μLを非還元条件下で電気泳動に供し、クマシーブリリアントブルーで染色した。ニューロピリン1-PAとの結果を図43に、プレキシンB1-PAとの結果を図44に、Met-PAとの結果を図45Nに示す。
図43~図45の結果から、三重特異性ペプチド融合型Fabが、ニューロピリン1に対する結合能、融合前のmP6-9ペプチドが有していたヒトプレキシンB1に対する結合能、融合前のaMD4ペプチドが有していたヒトMet受容体に対して結合能を、それぞれ保持していることが確認できる。
3-1.サンドイッチ型分子間架橋試験の原理と標的抗原の調製
三重特異性ペプチド融合型Fabが2種の標的分子に同時に結合できることを示すため、サンドイッチELISAタイプのアッセイ系を構築した。原理を図46Aに示す。まずProtein Exp. Purification, 2014, 95, 240-247に記載された方法に準じて、第2標的分子としてのヒトプレキシンB1又はヒトMet受容体の細胞外領域のC末端にPAタグ(和光純薬工業社製)が付加された融合タンパク質をコードするコンストラクトを作成し、これを発現ベクターpcDNA3.1(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)に組み込んだ。このベクターを用いて実施例1と同様の方法によりExpi293F細胞で一過性発現させ、可溶性受容体断片であるプレキシンB1-PA及びMet-PAをそれぞれ含む培養上清を調製し、それらを抗PAタグ抗体ビーズ(和光純薬工業社製)で精製した。第1抗原側は、AP融合発現ベクターであるpAPtag-5(GenHunter社)を用いてAPのN末端(ニューロピリン1)にその細胞外領域の配列を融合し、実施例1と同様の方法によりExpi293F細胞で一過性発現させ、可溶性受容体―AP融合物であるNrp1ec-APをそれぞれ含む培養上清を調製した。
三重特異性ペプチド融合型Fab(三重特異性のFabbody)による標的分子間の架橋は、図20Aに示す原理に基づき、以下のプロトコールに従って評価した。
(1)10μg/mLに希釈した精製第2標的抗原溶液50μLを96wellプレートに加え室温で、3時間静置した。
(2)精製第2標的抗原溶液を除去し、TBSにて10倍希釈したBlocking One(ナカライテスク社製)(TBS;20mM Tris-HCl,150mM NaCl,pH7.5)を200μL/well加えて4℃で一晩静置した。
(3)200μL/wellのTBSで1回洗浄した。
(3)三重特異性ペプチド融合型Fab発現上清を50μL加えて室温で2.5時間静置した。
(4)200μL/wellのTBSで3回洗浄した。
(5)AP融合第1標的抗原を発現する上清を50μL加えて室温で2時間静置した。
(6)200μL/wellのTBSで4回洗浄し、最後に100μL/wellのTBSを加えた。
(7)発色基質(Phosphatase substrate、シグマアルドリッチ社製)を100μL/wellで加え、37℃で30分静置後、各well中の溶液の405nmの吸光度を測定した。結果を図46Bに示す。
三重特異性ペプチド融合型Fabはそれぞれの第2標的抗原を固定化したプレートにキャプチャーされ、後から加えた第1標的抗原-AP融合タンパク質を結合して基質を発色させた。一方、ペプチド挿入をしていないN1_Fabは陽性シグナルを与えなかった。このことは、三重特異性ペプチド融合型FabであるFabbodyがプレキシンB1とニューロピリン、もしくはMetとニューロピリンに同時に結合できることを示している。すなわち、本実験結果は、製造されたFabbodyが三重特異性を有することを示唆している。
IgGの抗原結合部位であるFab領域を有するタンパク質として、Fabを用いた場合には、二重特異性Fabを簡便に構築することができた。本明細書において、二重特異性Fabは、Fabbodyの一種である。
Fabはヘテロダイマーで存在するのでH鎖及びL鎖へそれぞれ異なる生理活性ペプチド由来のアミノ酸配列を挿入することが可能である。したがって、三重特異性Fabや、四重特異性以上のFab等の、多重特異性Fabの開発に繋げることが可能である。実際、三重特異性Fabについては、Fab領域における本来の抗原結合部位を活かしつつ、融合された2種の生理活性ペプチドの生理活性に基づく新たな結合能をペプチド融合タンパク質に付加することができたことを確認している。
また、IgGやFabだけではなく、図3~5に示すような抗原決定部位の異なるBispecificな抗体又はその小型断片や誘導体に対して生理活性ペプチド由来のアミノ酸配列を挿入して、多重特異性抗体として開発することも可能である。
生理活性ペプチドが、アゴニスト活性を有する場合には、生理活性由来ペプチドのアゴニスト活性を有するFabの開発に繋がる。また、生理活性ペプチドがアゴニスト活性を有していない場合であっても、生理活性ペプチドを融合した本発明の人工タンパク質とすることで、人工タンパク質としてアゴニスト活性を有することも可能である。
FabのFv領域においてもL鎖及びH鎖共に、生理活性ペプチド由来のアミノ酸配列の挿入及び活性の維持が可能なことが確かめられているため、scFv、Diabody、taFv等のFv領域を少なくとも有するフラグメントに対しても生理活性ペプチドを挿入することが可能である。
Claims (9)
- 少なくとも抗体の抗原結合領域を有するタンパク質における抗原結合部位が提示するループ領域以外のループ領域又はエルボウ領域に存在し、かつタンパク質の表面に露出している部位に、生理活性ペプチドを融合し、
生理活性ペプチドが環状ペプチドの部分配列である、抗原が特異的に結合する人工タンパク質。 - 抗体由来の抗原結合活性を保持し、かつ生理活性ペプチドに由来する機能が付与された、請求項1に記載の人工タンパク質。
- 少なくとも抗体の抗原結合領域を有するタンパク質が、Fv、Fab、scFv、IgG、Diabody又はtaFvである、請求項1又は2に記載の人工タンパク質。
- 抗原結合部位が提示するループ領域以外のループ領域又はエルボウ領域に存在し、かつタンパク質の表面に露出している部位が、抗体Fab断片における抗原結合部位が提示するループ領域以外のループ領域又はエルボウ領域に存在する、請求項1~3のいずれか1項に記載の人工タンパク質。
- 多重特異性を有する、請求項1~4のいずれか1項に記載の人工タンパク質。
- 少なくとも抗体の抗原結合領域を有するタンパク質に、生理活性ペプチドを提示する方法であって、当該タンパク質における抗原結合部位が提示するループ領域以外のループ領域又はエルボウ領域に存在し、かつタンパク質の表面に露出している部位に、環状ペプチドの部分配列である生理活性ペプチドを融合することで、抗原が特異的に結合するタンパク質に生理活性ペプチドを提示する方法。
- 抗体由来の抗原結合活性を保持し、かつ生理活性ペプチドに由来する機能を付与させる、請求項6に記載のタンパク質に生理活性ペプチドを提示する方法。
- 少なくとも抗体の抗原結合領域を有するタンパク質が、Fv、Fab、scFv、IgG、Diabody又はtaFvである、請求項6又は7に記載のタンパク質に生理活性ペプチドを提示する方法。
- 抗原結合部位が提示するループ領域以外のループ領域又はエルボウ領域に存在し、かつタンパク質の表面に露出している部位が、抗体Fab断片における抗原結合部位が提示するループ領域以外のループ領域又はエルボウ領域に存在する、請求項6~8のいずれか1項に記載のタンパク質に生理活性ペプチドを提示する方法。
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