KR20230124037A - 종양 특이적 claudin 18.2 항체-약물 접합체 - Google Patents

종양 특이적 claudin 18.2 항체-약물 접합체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 CLDN18.2에 결합하는 항체에 기반한 ADC로서, 여기서 항체 또는 그의 단편은 CLDN18.2를 발현하는 건강한 조직에 비해 CLDN18.2를 발현하는 종양 조직에 대해 증가된 결합을 보이는 것인 ADC를 제공한다.

Description

종양 특이적 CLAUDIN 18.2 항체-약물 접합체
밀착 연접은 인접한 상피 또는 내피 세포를 연결하여 장벽을 형성하여 분자가 세포 사이를 통과하지 못하게 막고, 세포 및 조직의 극성을 유지하는 데 도움을 주는 다중단백질 복합체이다. 밀착 연접은 3개의 주요 막횡단 단백질 군: 클라우딘 및 오클루딘, 세포질 판 단백질, 및 신굴린으로 이루어진다. 이는 또한 세포골격 및 신호전달 단백질, 예컨대, 액틴, 미오신 II, 및 PKCζ도 함유한다. 이들 단백질은 밀착 연접 구조를 유지하기 위해 상호작용한다 (Yu and Turner 2008).
클라우딘은 23개의 단백질로 이루어진 패밀리를 형성한다 (Hewitt, Agarwal, and Morin 2006). Claudin 18은 CLDN18 유전자에 의해 코딩된 인간 단백질로, 이는 상피 세포에서 밀착 연접 가닥을 형성한다. 인간 CLDN18은 2개의 선택적 제1 엑손과 선택적으로 스플라이싱하여 2개의 단백질 이소폼, CLDN18.1 (또는 Claudin 18.1) 및 CLDN18.2 (또는 Claudin 18.2)를 생성할 수 있다. CLDN18.2는 WO2000/015659에서 Zsig28 단백질로 처음 공개되었다. 두 이소폼은 제1 세포외 루프를 포함하는 N-말단 69개 아미노산이 상이하다. 제1 세포외 도메인은 아미노산 28부터 아미노산 80까지 이어진다. 상기 스트레치 내에 CLDN18.1과 CLDN18.2 사이에 상이한 8개의 아미노산이 존재한다. 2개의 상이한 이소폼은 상이한 조직에서 발현되는데, CLDN18.1은 주로 폐 조직에서 발현되는 반면, CLDN18.2는 위 특이성을 나타낸다 (Niimi et al. 2001). 정상 위에서의 CLDN18.2 발현은 위 상피의 분화된 단명 세포로 제한된다. CLDN18.2 발현은 다양한 종양 조직에서도 추가로 확인되었다. 예를 들어, CLDN18.2는 췌장, 식도, 난소 및 폐 종양에서 발현되는 것으로 밝혀졌으며, 이는 별개의 조직학적 서브타입과 상관관계가 있다 (Sahin et al. 2008). 인간 CLDN18.2 단백질의 아미노산 서열은 NCBI 참조 서열: NP_001002026.1을 가진다. 서열은 또한 서열식별번호(SEQ ID NO:) 135로부터 유래된 것일 수 있다.
정상 조직에서의 그의 제한된 발현 패턴 및 인간 암에서의 그의 이소성 발현에 비춰 볼 때, CLDN18.2는 상피 종양의 항체 요법을 위한 매력적인 암 표적이다. 상기 항체 요법에 대한 많은 연구가 이루어지고 있다. WO2004/047863에서는 CLDN18의 스플라이스 변이체가 확인되었고, CLDN18.2로부터 유래된 상이한 펩티드: 글리코실화와 관계없이, CLDN18.2의 N-말단 세포외 펩티드 DQWSTQDLYN (서열식별번호 57); 주로 비글리코실화된 CLDN18.2의 N-말단 세포외 펩티드 NNPVTAVFNYQ (서열식별번호 58); 및 비글리코실화된 CLDN18.2의 N-말단 세포외 도메인 펩티드 STQDLYNNPVTAVF (서열식별번호 59)에 대한 항체가 스크리닝되었다. 또한 CLDN18.1 및 CLDN18.2 이소폼 둘 모두에 공통적인 C-말단 세포외 도메인 중의 범-CLDN18 펩티드 TNFWMSTANMYTG (서열식별번호 60)로 스크리닝된 폴리클로날 토끼 항체도 개시되었다. WO2005/113587에는 펩티드 서열: ALMIVGIVLGAIGLLV (서열식별번호 61) 및 RIGSMEDSAKANMTLTSGIMFIVS (서열식별번호 62)에 의해 정의된 CLDN18.2의 특이적인 에피토프에 대한 항체가 개시되어 있다. WO2007/059997에는 N- 및 C-말단 연장부와 함께 CLDN18.2의 제1 세포외 도메인을 포함하는 펩티드 METDTLLLWVLLLWVPGSTGDAAQPARRARRTKLGTELGSTPVWWNSADGRMDQWSTQDLYNNPVTAVFNYQGLWRSCVRESSGFTECRGYFTLLGLPAMLQAVRAAIQHSGGRSRRARTKTHLRRGSE (서열식별번호 63)에 의한 면역화에 의해 수득된, CLDN18.2 특이적인 모노클로날 항체가 개시되어 있다. 상기 면역화에 의해 수득된 항체는 보체 의존성 세포독성 (CDC) 및 항체 의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC)에 의한 세포 사멸을 매개한다. 클라우딕시맙(Claudiximab) 또는 졸베툭시맙(Zolbetuximab)으로도 알려진 항체 IMAB362는 WO2007/059997 및 WO2016/165762에 개시되어 있다. IMAB362는 뮤린 모노클로날 항체로부터 유래된 IgG1 항체이며, 임상 용도로 인간 IgG1 불변 영역을 나타내도록 키메라화되었다. WO2008/145338에는 또한 제1 세포외 도메인 (MDQWSTQDLYNNPVT (서열식별번호 64), LYNNPVTAVFNYQGL (서열식별번호 65), VFNYQGLWRSCVRES (서열식별번호 66), QGLWRSCVRESSGFT (서열식별번호 67), 및 RSCVRESSGFTECRG (서열식별번호 68)) 내의 중복 펩티드에 결합하는 항체가 개시되어 있다. 암 조직 절편의 세포에서의 CLDN18.2 발현을 검출하기 위한 진단 목적을 위해 CLDN18.2의 C-말단 부분을 표적화하는 항체를 제조하기 위한 노력의 일환으로, WO2013/167259에는 CLDN18.2의 C-말단 에피토프에 결합하는 항체가 개시되어 있다. 두 에피토프의 서열은 TEDEVQSYPSKHDYV (서열식별번호 69) 및 EVQSYPSKHDYV (서열식별번호 70)이다. WO2013/174509에는 γδ T 세포를 안정화시키는 작용제, 또는 CLDN18.2의 발현을 안정화 또는 증가시키는 작용제와 항-CLDN18.2 항체의 조합이 제시되어 있다. 항체는 예컨대, 세포독소, 약물 (예컨대, 면역억제제) 또는 방사성동위원소와 같은 치료 모이어티에 접합될 수 있다. WO2014/075788에는 CLDN18.2 및 CD3에 결합하는 이중특이적 항체를 사용하여 암 질환을 치료하는 방법이 개시되어 있다. WO2014/127906에는 CLDN18.2의 발현을 안정화 또는 증가시키는 조합 작용제가 개시되어 있다. WO2016/166122에는 CLDN18.2 결합시 매우 효율적으로 내재화될 수 있고, 따라서, 항체-약물 접합체 (ADC) 개발에 적합한 항-CLDN18.2 모노클로날 항체가 개시되어 있다. 추가로, 각각 절단가능한 SPDB 또는 발린-시트룰린 링커를 사용하여 이루어지는 상기 항체의 약물 DM4 및 MMAE에의 접합도 개시되어 있다. 그러나, 특허 출원에 개시된 모든 항체에도 불구하고, WO2007/059997 및 WO2016/165762에 개시된 키메라 IMAB362만이 현재 임상 시험에서 시험되고 있다. 이러한 항체 및 ADC 이외에도, WO2018/006882에는 항-CLDN18.2 모노클로날 항체를 기반으로 하는 키메라 항원 수용체 (CAR)가 개시되어 있다. WO2018/006882의 항체는 인간화되었으며, 그의 서열은 문헌 [Jiang et al. 2018 (Jiang et al. 2018)]과 연관된 보충 자료 섹션에 개시되어 있다. 인간화 항체를 기반으로 하는 CAR T 세포는 현재 진행성 위 선암종 및 췌장 선암종 환자에서의 I상 임상 시험 (ClinicalTrials.gov 식별자: NCT03159819)에서 시험되고 있다. CN109762067에는 CDC 및 ADCC에 의해 세포 사멸을 매개하는 다른 항-CLDN18.2 모노클로날 항체도 개시되어 있다. WO2019/173420에는 ADCC 활성을 갖는 항-CLDN18.2 인간화 모노클로날 항체가 개시되어 있다. WO2019/175617에는 IMAB362와 상이한 에피토프에 결합하는 항-CLDN18.2 모노클로날 항체가 개시되어 있다. WO2019/219089에는 CLDN18.2의 돌연변이체에 결합하는 모노클로날 항체가 개시되어 있다. CLDN18.2에 결합하는 다른 항체는 WO2019/242505, WO2020/038404, WO2020/043044, WO2020/063988, WO2020/082209, WO2020/018852, WO2020/023679, WO2020/135674, WO2020/135201, WO2020/139956, WO2020/025792, WO2020160560, CN111808194 및 WO2020200196에 개시되어 있다.
CLDN18.2는 다른 형태로 존재하는 것으로 설명되었으며, 잠재적인 세포외 N-글리코실화 부위를 포함하며 (WO2007/059997 3 페이지, 첫 번째 단락 참조), 이는 정상 세포와 종양 세포 사이에 잠재적으로 상이한 토폴로지/차등 글리코실화를 유도할 수 있다 (WO2007/059997 4 페이지, 두 번째 단락 참조). 그러나, 보고된 항체 중 어느 것도 종양 세포 상에 발현된 CLDN18.2를 우선적으로 표적화하지는 않고 있다. CLDN18.2는 종양 뿐만 아니라, 건강한 조직, 즉, 위 조직에서도 발현되기 때문에 (Sahin et al. 2008), 특히, IMAB362에 대해 보고된 바와 같은 (Sahin et al. 2018; Tureci et al. 2019), 치료 항체의 표적 효과와 매우 빈번하게 연관되는, 건강한 기관/조직에 대한 안전성 문제 및 부작용 (Hansel et al. 2010)을 피하기 위해서는 종양에서 발현되는 CLDN18.2만을 표적화하는 항체를 갖는 것이 분명히 유익할 것이다.
높은 친화도로 표적에 결합하는 것 이외에도 치료 항체는 개발, 생산, 보관 및 임상 적용 (생체내) 동안 그의 원하는 특성을 유지하여야 한다. 항체 안정성은 번역 후 변형 (PTM)에 의해 손상될 수 있다 (Lu et al. 2019; Gervais 2016). PTM이 비제어될 경우, 항체의 효능, 활성, 효력 또는 안정성은 원하는 것보다 낮아질 수 있는 바, 이에, 치료 항체를 개발하는 동안 가능한 최소한의 PTM을 항체를 디자인하는 것이 매우 중요하다. PTM은 또한 규제 승인, 기술 이전 또는 프로세스 및 바이오시밀러 개발에 지대한 영향을 미칠 수 있다. 주요 변형은 산화, 탈아미드화 및 이성질체화이다. 추가로, IMAB362는 여전히 확장된 마우스 서열을 갖는 키메라 항체이며, 이는 일부 환자에서 항약물 항체를 유도할 수 있고, 예컨대, 반복 적용시, 치료 효능을 감소시킬 수 있다.
상기에서 이미 언급된 바와 같이, IMAB362는 또한 항체가 MMAE 또는 DM4 약물에 접합된, (WO2016/165762에 개시된) 항체-약물 접합체 (ADC)로서 개발되었다. DM4 약물은 N-히드록시숙신이미드 (NHS) 에스테르를 통해 항체의 (리신 측쇄 또는 단백질의 N-말단에서 발견되는 것과 같은) 1급 아민과 반응하는 아미노 및 술프히드릴 반응성 이종이작용성 단백질 가교제인 SPBD (N-숙신이미딜-3-(2 피리딜디티오)부티레이트)를 통해 IMAB362에 커플링되었다. 발린-시트룰린-MMAE 약물은 티올화된 IMAB362에 커플링되었다. 상기 경우에서, IMAB362는 초기에 리신 잔기의 유리 아민과 반응하는 이종이작용성 링커 2-IT (2-이미노틸란)로 티올화되었다. 발린-시트룰린은 카텝신에 의해 절단가능한 링커이다. IMAB362와 관련하여 상기 열거된 모든 단서 조항은 동일한 항체를 기반으로 하는 ADC에도 적용된다.
따라서, 종양 환자 치료에 사용하기 위한 CLDN18.2에 특이적인 개선된 항체 및 ADC가 요구되고 있다.
정의
"면역글로불린" (Ig)으로도 명명되는 "항체들" 또는 "항체"는 일반적으로 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)인, 4개의 폴리펩티드 쇄를 포함하는 바, 다량체 단백질이거나, 또는 그의 등가 Ig 동족체 (예컨대, 중쇄만을 포함하는 카멜리드 항체, 단일-도메인 항체 (sdAb), 또는 중쇄 또는 경쇄로부터 유래될 수 있는 나노바디)를 포함한다. 용어 "항체"는 표적 결합 능력을 보유하는 변형된 항체 포맷인 항체 기반 결합 단백질을 포함한다. 용어 "항체"는 또한 Ig 분자의 필수 에피토프 결합 특징을 보유하는 그의 전장 기능성 돌연변이체, 변이체 또는 유도체 (제한하는 것은 아니지만, 뮤린, 키메라, 인간화 및 완전 인간 항체를 포함)를 포함하고, 이중 특이적, 이중특이적, 다중특이적 및 이중 가변 도메인 Ig를 포함한다. Ig 분자는 임의의 부류 (예컨대, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, 및 IgY) 또는 서브부류 (예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2)의 것 및 알로타입일 수 있다. Ig 분자는 또한 예컨대, Fcγ 수용체 또는 신생아 Fc 수용체 (FcRn)에 대한 친화성을 증가 또는 감소시키기 위해 돌연변이화될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "항체 단편"은 전장이 아니고, 표적 결합을 나타내는 항체로부터 유래된 적어도 하나의 펩티드 쇄를 포함하는 분자에 관한 것이다. 항체 단편은 그의 상응하는 전장 항체와 동일한 에피토프 또는 표적에 결합할 수 있다. 항체 단편은 (i) 가변 경쇄 (VL), 가변 중쇄 (VH), 불변 경쇄 (CL) 및 불변 중쇄 1 (CH1) 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 디술피드 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편 (F(ab')2 단편이 환원되면, 유리 술프히드릴 기를 포함하는 2개의 Fab' 단편이 생성된다); (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진, Fab (Fa) 단편의 중쇄부; (iv) 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진, 가변 단편 (Fv) 단편; (v) 단일 가변 도메인을 포함하는, 도메인 항체 (dAb) 단편; (vi) 단리된 상보성 결정 영역 (CDR); (vii) 단일 쇄 Fv 단편 (scFv); (viii) VH 및 VL 도메인이 단일 폴리펩티드 쇄에서 발현되지만, 동일한 쇄 상의 두 도메인 사이의 쌍형성을 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용하여 상기 도메인이 또 다른 쇄의 상보성 도메인과 쌍을 형성하고, 2개의 항원 결합 부위를 생성하게 하는, 2가 이중특이적 항체인 디아바디; (ix) 상보성 경쇄 폴리펩티드와 함께 한 쌍의 항원 결합 영역을 형성하는 한 쌍의 탠덤 Fv 세그먼트 (VH-CH1-VH-CH1)을 포함하는 선형 항체; (x) 이중 가변 도메인 면역글로불린; (xi) 면역글로불린 중쇄 및/또는 경쇄의 다른 비-전장 부분, 또는 그의 돌연변이체, 변이체 또는 유도체를 단독으로 또는 임의의 조합으로 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 바, "항체 기반 결합 단백질"은 다른 비-면역글로불린 또는 비-항체 유래 성분과 관련하여 적어도 하나의 항체 유래 VH, VL 또는 CH 면역글로불린 도메인을 함유하는 임의의 단백질을 나타낼 수 있다. 상기 항체 기반 단백질은 (i) 면역글로불린 CH 도메인의 전부 또는 그 일부를 포함하는 수용체 또는 수용체 성분을 포함하는 결합 단백질의 Fc-융합 단백질, (ii) VH 및 또는 VL 도메인이 대체 분자 스캐폴드에 커플링된 결합 단백질, 또는 (iii) 면역글로불린 VH, 및/또는 VL, 및/또는 CH 도메인이 보통 자연적으로 발생된 항체 또는 항체 단편에서는 발견되지 않는 방식으로 조합 및/또는 어셈블리된 분자를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 바, "변형된 항체 포맷"은 항체-약물-접합체 (ADC), 폴리알킬렌 옥시드-변형된 scFv, 모노바디, 디아바디, 카멜리드 항체, 도메인 항체, 이중 또는 삼중특이적 항체, IgA, 또는 J 쇄 및 분비 성분에 의해 연결된 2개의 IgG 구조, 샤크 항체, 신세계 영장류 프레임워크 및 비-신세계 영장류 CDR, 힌지 영역이 제거된 IgG4 항체, CH3 도메인으로 조작된 2개의 추가 결합 부위가 있는 IgG, Fc 감마 수용체에 대한 친화성이 증진 또는 감소되도록 Fc 영역이 변경된 항체, CH3, VL, 및 VH를 포함하는 이량체화된 구축물 등을 포함한다.
카바트 넘버링 체계(Kabat numbering scheme) (Martin and Allemn 2014)는 본 개시된 항체에 적용되었다.
용어 "항체-약물 접합체" 또는 "ADC"는 독소 (또는 약물)가 연결된 항체 또는 항체 단편을 지칭한다. ADC에서, 독소는 절단가능한 또는 비-절단가능한 링커에 의해 항체 또는 항체 단편에 접합된다. 절단가능한 링커는 종양 환경에서 세포외 방식으로 또는 세포질 내에서 세포내 방식으로 절단되도록 디자인될 수 있다. 절단가능한 링커는 표적 세포 외부 또는 내부에 존재할 수 있는 환원력 또는 효소 분해의 차등 조건을 이용한다. 비-절단가능한 링커는 ADC가 내재화되어야 하고, 항체-링커 성분은 독소가 방출되도록 리소솜 프로테아제에 의해 분해되어야 한다. 링커의 항체에의 접합도 다양할 수 있다. 접합은 접합 지점으로서 항체의 폴리펩티드 구조 내의 리신 및 시스테인 잔기의 존재에 의존할 수 있다. 링커 상의 반응성 기는 예컨대, 아미드 또는 아미딘 결합 형성을 통해 리신 잔기의 측쇄에 접합될 수 있다. 시스테인 잔기를 통한 접합을 위해서는 항체의 부분적 환원이 요구된다. 대안적으로, 부위 특이적 효소 접합이 사용될 수 있다. 이를 위해서는 항체와 반응하고, 부위- 또는 아미노산 서열-특이적 변형을 유도할 수 있는 효소가 요구된다. 상기 효소에 의해 인식되는 펩티드 서열은 접합되는 유전적으로 조작된 항체 또는 단편에 삽입되어야 할 수 있다. 상기 목적으로 사용된 효소는 소르타제, 트랜스글루타미나제, 갈락토실트랜스퍼라제, 시알릴트랜스퍼라제 및 튜불린-티로신 리가제이다. ADC 링커 접합 및 독소에 관한 개요는 문헌 [Ponziani et al., 2020 (Ponziani et al. 2020)]에서 살펴볼 수 있다. 독소의 항체 단편에의 접합체 관한 개요는 문헌 [Aguiar et al., 2018 (Aguiar et al. 2018)]에서 살펴볼 수 있다. 독소를 항체 또는 항체 단편을 접합시키는 데 사용되는 링커 타입 및 접합 방법이 약물-대-항체 비 (DAR)를 결정할 수 있다.
용어 "독소"는 합성, 식물, 진균 또는 박테리아 분자를 기반으로 할 수 있는 세포독성제 및/또는 세포증식억제제를 지칭한다. 세포독성 또는 세포증식억제는 세포, 특히, 악성 세포를 그의 증가된 턴오버에 기인하여 그의 성장을 억제시키고/거나, 그의 복제를 억제시키고/거나, 그를 사멸시키는 것을 의미한다. 바람직한 실시양태에서, 독소는 안트라사이클린 및 그의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 안트라사이클린은 세포독성 활성을 나타내고, 약물 분자의 세포의 DNA 내로의 인터칼레이션, 또는 DNA 절단 활성을 통해 DNA 의존적 핵산 합성을 억제시키는 것, 세포 거대분자와 반응하는 약물에 의해 자유 라디칼을 생성하여 세포 손상을 유발하는 것, DNA 알킬화 및/또는 약물 분자와 세포막의 상호작용을 비롯한, 상이한 기전에 의해 세포를 사멸시킬 수 있는 항생제 화합물이다. 안트라사이클린은 독소루비신, 에피루비신, 이다루비신, 다우노마이신, 네모루비신 및 그의 유도체를 포함한다. 널리 공지되고, 바람직한 안트라사이클린 유도체는 PNU-159682, 또는 간단히 말하면, PNU, CAS No. 202350-68-3이다. 뛰어난 세포독성을 가진 네모루비신의 매우 강력한 대사산물이다. 안트라사이클린 유도체는 특정 리간드에의 접합 결과로서 독소를 포함하는 것으로 이해되며, 여기서 사용된 접합 화학에 기인하여, 원래의 독소의 일부 원자가 누락될 수 있다 (Broggini 2008; Quintieri et al. 2005). 일부 경우에서, 용어 안트라사이클린 유도체는 링커의 단편이 안트라사이클린 분자에 부착된 상태 그대로 남아 있을 수 있는 리소솜 분해의 결과로 이해될 수 있다. 본원에서 사용되는 바, 용어 "안트라사이클린"은 안트라사이클린 및 안트라사이클린 유도체를 지칭한다.
본원에서 지칭되는 바, "CLDN18.2에 선택적으로 결합한다" 또는 "CLDN18.2에 선택적으로 결합하는"이라는 용어는 CLDN18.1에의 (특이적) 결합은 나타내지 않으면서, CLDN18.2에의 결합을 나타내는 항체를 지칭한다. 따라서, CLDN18.2에 선택적으로 결합하는 항체는 CLDN18.1에 대해 교차 반응성을 나타내지 않는다.
본 명세서 및 청구범위에서 "포함하는"이라는 용어가 사용되는 경우, 다른 요소를 배제하지 않는다. 본 발명의 목적을 위해, "~로 이루어진"이라는 용어는 "~로 구성된"이라는 용어의 바람직한 실시양태로 간주된다. 이하 한 군이 적어도 특정 개수의 실시양태를 포함하는 것으로 정의된다면, 이 또한 바람직하게는 이들 실시양태로만 이루어진 군을 개시하는 것으로 이해되어야 한다.
단수 명사를 언급할 때, 예컨대, "하나"와 같은 단수 형태가 사용되는 경우, 달리 구체적으로 명시되지 않는 한, 복수의 해당 명사를 포함한다.
기술 용어는 상식적으로 사용된다. 특정 용어에 특정한 의미가 전달되는 경우, 용어의 정의는 하기 해당 용어가 사용되는 맥락에서 제공될 것이다.
본 발명자들은 놀랍게도 CLDN18.2를 발현하는 건강한 위 세포와 비교하여 CLDN18.2를 발현하는 종양 세포에 대해 증가된 결합을 나타내고/거나, 개선된 안정성을 갖고/거나, 그의 개선된 특성은 보유하면서, 인간화된 것인, 본원에서 추가로 기술된 바와 같은 항-CLDN18.2 항체 및 독소를 포함하는 신규한 항체-약물 접합체 (ADC)를 확인하였다.
본 발명은 CLDN18.2에 결합하는 항체에 기반한 ADC로서, 여기서 항체 또는 그의 단편은 CLDN18.2를 발현하는 건강한 조직에 비해 CLDN18.2를 발현하는 종양 조직에 대해 증가된 결합을 보이는 것인 ADC를 제공한다. 한 실시양태에서, 비교에 사용된 건강한 세포 또는 조직은 건강한 위 세포 또는 건강한 위 조직이다.
본원에 제공된 항체 또는 그의 단편에 의한 종양 조직에 대해 증가된 결합은 각각 실시예 4 및 5에 제시된 바와 같이 예컨대, 유세포 분석법 (FC) 또는 면역조직화학법 (IHC)과 같은 생체분석 방법에 의해 제시될 수 있다. CLDN18.2를 발현하는 종양은 CLDN18.2-발현 A549 세포를 Balb/c 마우스에 피하로 주사함으로써 생성될 수 있다. CLDN18.2-발현 A549 세포는 실시예 4에 제시된 바와 같이 생성될 수 있고, 2019년 12월 6일 DSMZ-도이체 잠룽 폰 미크로오르가니즈멘 운트 젤쿨투렌 게엠베하(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH: 독일 38124 브라운슈바이크 인호펜슈트라쎄 7베)에 기탁된 수탁 번호 DSM ACC3360하에 이용가능하다. 건강한 조직 (예컨대, 건강한 위 조직) 또한 종양을 보유하는 마우스로부터 유래할 수 있다. 따라서, 건강한 조직에 비해 종양 조직에 대해 증가된 결합은 동일한 동물로부터 수득된 종양 조직 및 건강한 조직에서 제시될 수 있다.
종양 조직에서 발현된 CLDN18.2에 대해 증가된 결합은 건강한 조직에서 발현된 CLDN18.2와 비교할 때 CLDN18.2의 차등 글리코실화 또는 CLDN18.2의 미스폴딩과 같은 번역 후 변형에 기인하는 것일 수 있다.
유세포 분석법 (FC)은 항체 결합을 시험하기 위한 생체분석 방법으로서 사용될 수 있다. CLDN18.2-양성 세포의 비율(%)은 FC에 의해 예를 들어, 특이적인 항-CLDN18.2 항체에 대해 측정될 수 있다. 또 다른 가능한 결합 판독은 예를 들어, 종양 세포 샘플에서의 CLDN18.2-양성 세포의 비율(%) 대 예컨대, 건강한 위 조직과 같은 건강한 조직에서 수득된 세포 샘플에서의 CLDN18.2-양성 세포의 비율(%)의 비일 수 있다. 건강한 세포, 예컨대, 건강한 위 세포와 비교하여 CLDN18.2-발현 A549 세포로부터 생성된 CLDN18.2를 발현하는 종양 세포에의 항체의 결합 증가는 비가 > 2, > 5, ≥ 10, 바람직하게, ≥ 15, 더욱 바람직하게, ≥ 20인 것으로 제시될 수 있다.
건강한 세포, 예컨대, 건강한 위 세포와 비교하여 CLDN18.2-발현 A549 세포로부터 생성된 CLDN18.2를 발현하는 종양 세포에의 항체의 결합 증가는 또한 항체가 건강한 세포, 예컨대, 건강한 위 세포보다 종양 세포보다 적어도 2배 더 많이, 적어도 5배 더 많이, 적어도 10배 더 많이, 바람직하게, 적어도 15배 더 많이, 바람직하게, 적어도 20배 더 많이 결합한다는 것을 보여줌으로써 설명될 수 있다.
면역조직화학법 (IHC)은 항체 결합을 시험하기 위한 생체분석 방법으로서 사용될 수 있다. IHC에 사용되는 조직 샘플은 바람직하게는 절제 후 급속 냉동되어야 하고, 예컨대, 실시예 5에 제시된 바와 같이, 일단 해동되고 나면, 아세톤에서 고정되어야 한다. CLDN18.2는 건강한 조직에서 밀착 연접 단백질인 바, 양성 CLDN18.2 염색은 건강한 조직 및/또는 종양 조직의 세포-세포 계면에서 우세한 막 염색을 시각화하여야 한다. 따라서, 음성 CLDN18.2 염색 또는 약한 염색은 막 염색의 부재를 초래하여야 한다.
또 다른 실시양태에서, 항체 또는 그의 단편은 CLDN18.2를 과다발현하는 HEK293T 세포에 대한 유세포 분석법 (FC) 적정에 의해 측정되었을 때, 0.4 ㎍/ml 초과, 0.5 ㎍/ml 초과, 바람직하게, 0.6 ㎍/ml 초과이되, 단, 1 ㎍/ml는 초과하지 않는 최대 유효 농도의 절반 (EC50) 값으로 CLDN18.2에 결합한다. CLDN18.2를 과다발현하는 HEK293T 세포는 실시예 3에 기술된 바와 같이 생성될 수 있다. 항체의 EC50 값은 CLDN18.2를 과다발현하는 HEK293T 세포에 대한 유세포 분석법 (FC) 적정에 의해 측정되었을 때, 0.4 내지 1 ㎍/ml, 0.5 내지 1 ㎍/ml, 또는 바람직하게, 0.6 내지 1 ㎍/ml일 수 있다.
대안적으로, 항체의 EC50 값은 CLDN18.2를 과다발현하는 HEK293T 세포에 대한 유세포 분석법에 의해 측정되었을 때, IMAB362의 EC50 값과 비교될 수 있고, 여기서 항체의 EC50 값은 IMAB362의 EC50 값보다 적어도 1.1배 더 높고, 적어도 1.2배 더 높고, 바람직하게, 적어도 1.5배 더 높고, 더욱 바람직하게, 적어도 2배 더 높고, 더욱더 바람직하게, 적어도 2.5배 더 높지만, IMAB362의 EC50 값보다 5배 초과로 더 높지는 않다. 항체의 EC50 값은 CLDN18.2를 과다발현하는 HEK293T 세포에 대한 유세포 분석법에 의해 측정되었을 때, IMAB362의 EC50 값보다 1.1배 내지 2.5배 더 높거나, 1.2배 내지 2.5배 더 높거나, 바람직하게, 1.5배 내지 2.5배 더 높거나, 또는 더욱 바람직하게, 2배 내지 2.5배 더 높을 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 항체 또는 그의 단편은 PA-TU-8988S-고 세포에 대한 유세포 분석법 적정에 의해 측정되었을 때, 0.6 ㎍/ml 초과, 1 ㎍/ml 초과, 바람직하게, 1.5 ㎍/ml 초과, 더욱 바람직하게, 2 ㎍/ml 초과이되, 단, 3 ㎍/ml는 초과하지 않는 EC50 값으로 CLDN18.2에 결합한다. PA-TU-8988S-고 세포는 실시예 2에 기술된 바와 같이 생성될 수 있다. 항체의 EC50 값은 PA-TU-8988S-고 세포에 대한 유세포 분석법 적정에 의해 측정되었을 때, 0.6 내지 3 ㎍/ml, 1 내지 3 ㎍/ml, 바람직하게, 1.5 내지 3 ㎍/ml, 또는 더욱 바람직하게, 2 내지 3 ㎍/ml일 수 있다.
대안적으로, 항체의 EC50 값은 PA-TU-8988S-고 세포에 대한 유세포 분석법에 의해 측정되었을 때, IMAB362의 EC50 값과 비교될 수 있고, 여기서 항체의 EC50 값은 IMAB362의 EC50 값보다 적어도 1.5배 더 높고, 적어도 2배 더 높고, 바람직하게, 적어도 3배 더 높고, 더욱 바람직하게, 적어도 4배 더 높지만, 5배 초과로 더 높지는 않다. 항체의 EC50 값은 PA-TU-8988S-고 세포에 대한 유세포 분석법에 의해 측정되었을 때, IMAB362의 EC50 값보다 1.5배 내지 5배 더 높거나, 2배 내지 5배 더 높거나, 3배 내지 5배 더 높거나, 또는 4배 내지 5배 더 높을 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 항체 또는 그의 단편은 CLDN18.2를 과다발현하는 HEK293T 세포에 대한 유세포 분석법에 의해 측정되었을 때, IMAB362의 maxMFI 값의 +/- 40% 이내인 maxMFI 값으로 CLDN18.2에 결합한다. 항체 또는 그의 단편은 또한 PA-TU-8988S-고 세포에 대한 유세포 분석법에 의해 측정되었을 때, IMAB362의 maxMFI 값보다 2배 이상으로 더 높은 maxMFI 값으로 CLDN18.2에 결합할 수 있다.
CLDN18.2를 발현하는 건강한 조직과 비교하여 CLDN18.2를 발현하는 종양 조직에 대해 증가된 결합을 보이는 항체 또는 그의 기능성 단편은 CLDN18.2를 발현하는 종양 조직으로부터 CLDN18.2를 발현하는 건강한 조직을 구별할 수 없는 항체에 비해 치료적 이점을 가질 수 있다. 종양 특이적 항체는 안전성 문제 및 부작용을 일으키지 않을 수 있으며, 이는 종종 건강한 기관/조직에서 치료 항체의 표적 효과와 연관이 있다 (Hansel et al. 2010). 이러한 비바람직한 효과는 예컨대, IMAB362에 대해 보고된 바 있다 (Sahin et al. 2018; Tureci et al. 2019).
본 발명은 또한 각각 서열식별번호 21, 서열식별번호 22, 및 서열식별번호 23의 중쇄 상보성 결정 영역 (HCDR) HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호 24, 서열식별번호 25, 및 서열식별번호 26의 경쇄 CDR LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열을 포함하는, CLDN18.2에 결합하는 항체 또는 그의 단편, 및 독소를 포함하는 ADC를 제공한다. 한 실시양태에서, 독소는 안트라사이클린이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명자들은 놀랍게도 IMAB362에 기반한 유사한 ADC와 비교하여 종양 세포에 대해 더 우수한 세포독성 활성을 나타내는, 상기로부터의 신규한 항 CLDN18.2 항체에 기초하여 신규한 ADC를 조작하였다.
본 발명의 ADC는 일반 화학식 A - (L-T)n을 갖고, 상기 식에서,
a. A는 각각 서열식별번호 21, 서열식별번호 22, 및 서열식별번호 23의 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR) HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호 24, 서열식별번호 25, 및 서열식별번호 26의 경쇄 CDR LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열을 포함하는, CLDN18.2에 결합하는 항체 또는 그의 단편이고,
b. L은 링커이고,
c. T는 독소이고,
여기서 독소는 안트라사이클린이다.
한 실시양태에서, n은 정수 ≥ 1 내지 ≤10이다. 본 발명은 또한 ADC의 제약상 허용되는 염 또는 에스테르에 관한 것이다.
본 발명은 또한 서열식별번호 23의 중쇄 HCDR3 서열 및 서열식별번호 26의 경쇄 LCDR3 서열을 포함하는, CLDN18.2에 결합하는 항체를 포함하는 ADC를 제공한다.
각 컨센서스 서열은 표 1에서 살펴볼 수 있다. 컨센서스 서열로부터 유래된 CDR의 임의의 조합에 기초하고, CLDN18.2에 결합하는 항체 또는 그의 단편을 포함하는 임의의 ADC가 본 발명의 일부인 것으로 이해된다.
표 1: 단리된 항체 CDR 컨센서스 서열
Figure pct00001
한 실시양태에서, 본 발명의 ADC의 링커 L은 적어도 하나의 비-절단가능한 링커 요소를 포함한다. 비-절단가능한 링커 요소는 오직 리소솜 분해만이 수행되고, 특정 효소의 기질이 아니며, 혈장 및 세포질에서 안정한 링커 요소로 정의될 수 있다.
비-절단가능한 링커 요소는 하기로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고:
a. 에틸렌디아민 (EDA),
b. N-포르밀-N,N'-디메틸에틸렌디아민,
c. 디에틸아민 (DEA),
d. 하기 화학식의 피페라진-유래 화합물:
Figure pct00002
상기 식에서, 파선은 독소 및 또 다른 링커 요소에의 부착을 나타냄,
e. 하기 화학식의 화합물:
Figure pct00003
상기 식에서, 파선은 독소 및 또 다른 링커 요소에의 부착을 나타냄,
f. 하기 화학식의 화합물:
Figure pct00004
상기 식에서, 파선은 독소에의 부착을 나타내고, [Ab]는 항체 또는 그의 단편을 나타냄,
g. 하기 화학식의 말레이미도카프로일 화합물:
Figure pct00005
상기 식에서, 파선은 또 다른 링커 요소에의 부착을 나타내고, [Ab]는 항체 또는 그의 단편을 나타냄,
h. 하기 화학식의 화합물:
Figure pct00006
상기 식에서, 파선은 독소에의 부착을 나타내고, [Ab]는 항체 또는 그의 단편을 나타냄,
여기서 비-절단가능한 링커 요소가 아미드 결합 또는 에테르 결합에 의해 독소에 접합된다.
비-절단가능한 링커 요소는 항체에 직접 공유 부착될 수 있거나 (이로써, 링커를 형성할 수 있거나), 또는 예컨대, 올리고펩티드 링커 요소와 같은 다른 링커 요소를 통해 부착될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 절단가능한 링커 요소는 링커에 존재할 수 있다.
비-절단가능한 링커 요소는 예컨대, 리신의 ε-NH2 및 시스테인의 술프히드릴 SH 기와 같은 이용가능한 친핵성 기가 있는 측쇄를 갖는 항체 서열의 아미노산을 통해 항체에 연결될 수 있다. 말레이미드 화학은 시스테인 측쇄에의 연결을 허용하는 반면, 아실화 화학은 일반적으로 리신 측쇄에의 연결에 사용된다. 상기 연결에 대한 충분한 정보는 문헌 [Jain et al., 2015 (Jain et al. 2015)]에서 살펴볼 수 있다. 비-절단가능한 링커 요소의 올리고펩티드 링커 요소에의 연결은 카르보디이미드 가교 화학에 의해 수행될 수 있다. 상기 가교 화학에 대한 가이던스는 문헌 [Thermo Scientific Crosslinking Technical Handbook (2012) ("Crosslinking Technical Handbook" 2012)]에서 살펴볼 수 있다.
비-절단가능한 링커 요소는 또한 안트라사이클린에 직접 부착될 수 있다. 한 실시양태에서, 비-절단가능한 링커 요소는 C13에의 대한 아미드 결합 또는 C14에의 에테르 결합에 의해 하기 화학식 I의 안트라사이클린에 부착되고, 여기서 R1은 수소 원자, 히드록시 또는 메톡시 기이고, R2는 C1-C5 알콕시 기이다:
Figure pct00007
.
효소-절단가능한 링커 요소를 비롯한, 하나 이상의 링커 요소의 조합은 항체를 독소에 연결하기 위해 링커를 형성하는 데 사용될 수 있는 것으로 이해된다.
또 다른 요소에서, 링커는 올리고펩티드 링커 요소 및/또는 효소-절단가능한 링커 요소 및/또는 스페이서 요소를 추가로 포함한다.
올리고펩티드 링커 요소는 항체 또는 그의 단편을 형성하는 펩티드 쇄 외에 존재하는 올리고펩티드인 것으로 이해된다. 올리고펩티드 링커 요소는 항체, 또는 그의 단편을 형성하는 중쇄 및/또는 경쇄의 C-말단에 직접 부착될 수 있다. 한 실시양태에서, 올리고펩티드 링커 요소의 DNA 코딩 서열은 항체 또는 그의 단편을 형성하는 각각의 중쇄 및/또는 경쇄를 코딩하는 DNA의 일부일 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 올리고펩티드 링커 요소는 2개 이상의 올리고펩티드 링커 요소를 연결하기 위해 사용되는 펩티드 라이게이션의 결과일 수 있다. 라이게이션은 예컨대, 소르타제 (즉, 소르타제 A), 아스파라기닐 엔도프로테아제 (즉, 부텔라제 1), 트립신 관련 효소 (즉, 트립실리가제) 또는 서브틸리신-유래 변이체 (즉, 펩틸리가제)와 같은 펩티드 리가제에 의해 촉매화될 수 있다 (Nuijens et al. 2019). 따라서, 올리고펩티드 링커 요소는 펩티드 리가아제 인식 모티프를 포함할 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 용어 스페이서 요소는 입체 장애를 피하고, 항체 또는 그의 단편에의 독소의 적절한 접합을 허용하기 위해 링커에 부가된 스페이서로 이해되어야 한다.
한 실시양태에서, 올리고펩티드 링커 요소는 -LPXTGm-, -LPXAGm-, -LPXSGm-, -LAXTGm-, -LPXTGm-, -LPXTAm-, -NPQTGm- 또는 -NPQTNm- (여기서 Gm은 올리고글리신이고, 여기서 m은 정수 ≥1 내지 ≤21이고, Am은 올리고알라닌이고, 여기서 m은 정수 ≥1 내지 ≤21이고, Nm은 올리고아스파라긴이고, 여기서 m은 정수 ≥1 내지 ≤21이고, X는 임의의 가능한 아미노산이다)으로부터 선택되는 소르타제 인식 모티프 올리고펩티드를 포함한다. 바람직하게, m은 2 또는 3, 특히, 2이다. 바람직한 실시양태에서, 소르타제 인식 모티프 올리고펩티드는 -LPQTGG- 또는 -LPETGG-이다. 소르타제 인식 모티프 올리고펩티드는 항체 또는 그의 단편의 중쇄 및/또는 경쇄의 C-말단에, 바람직하게, 경쇄의 C-말단에 존재할 수 있다.
추가의 바람직한 실시양태에서, ADC의 올리고펩티드 링커 요소는 서열 서열식별번호 131을 포함한다. 한 실시양태에서, 서열 서열식별번호 131은 항체 중쇄의 C-말단에 존재하고, 또 다른 바람직한 실시양태에서, 항체 경쇄의 C-말단에 존재한다.
또 다른 실시양태에서, 효소-절단가능한 링커 요소는 링커에 존재한다. 효소-절단가능한 링커 요소는 하기 화학식의 화합물에 따른 val-cit-PAB 링커를 포함할 수 있다:
Figure pct00008
상기 식에서, 파선은 다른 링커 요소 또는 항체 또는 독소에의 부착을 나타낸다. 효소-절단가능한 링커 요소는 비-절단가능한 링커 요소에 대해 상기 기술된 바와 같이 공지된 가교제 화학에 의해 또 다른 링커 요소 또는 항체 또는 독소에 부착될 수 있다.
추가의 또 다른 실시양태에서, 링커는 스페이서 요소를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 스페이서 요소는 펩티드 가요성 올리고펩티드를 포함한다. 가요성 링커 요소는 연결된 성분이 어느 정도의 이동 또는 상호작용을 필요로 하는 경우에 적용될 수 있다. 가요성 올리고펩티드는 일반적으로 작은 비극성 (예컨대, G) 또는 극성 (예컨대, S 또는 T) 아미노산으로 구성된다. 상기 아미노산의 작은 크기는 가요성을 제공하고, 연결된 기능성 성분의 이동성을 허용한다. S 또는 T의 도입은 물 분자와 수소 결합을 형성함으로써 수용액에서 링커의 안정성을 유지시킬 수 있고, 따라서, 링커와 단백질 모이어티 사이의 불리한 상호작용을 감소시킬 수 있다. 펩티드 가요성 올리고펩티드에 대한 추가 가이던스는 문헌 [Chen et al., 2013 (Chen, Zaro, and Shen 2013)]에서 살펴볼 수 있다.
바람직하게 스페이서 요소는 G 및 S로 이루어진 펩티드 가요성 올리고펩티드를 포함하고, 더욱 바람직하게, 펩티드 가요성 올리고펩티드는 (GGGGS)o이고, 여기서 o는 1, 2, 3, 4 또는 5이다.
본 발명은 또한 하기 구조식의 ADC를 제공하고:
a. A - ([올리고펩티드 링커 요소 - 비-절단가능한 링커 요소] - T)n 및 바람직하게, 여기서 링커는
i. [LPXTGG]-[에틸렌디아민], 및
ii. [LPXTGG]-[
Figure pct00009
]로부터 선택됨; 또는
b. A - ([올리고펩티드 링커 요소 - 효소 절단가능한 링커 요소 - 비-절단가능한 링커 요소] - T)n 및 바람직하게, 여기서 링커는
i. [LPXTGG]-[vc-PAB]-[N-포르밀-N,N'-디메틸에틸렌디아민], 및
ii. [LPXTGG]-[vc-PAB]-[피페라진]으로부터 선택됨; 또는
c. A - ([스페이서 요소 - 올리고펩티드 링커 요소 - 비-절단가능한 링커 요소] - T)n 및 바람직하게, 여기서 링커는
i. [GGGGS]-[LPXTGG]-[에틸렌디아민], 및
ii. [GGGGS]-[LPXTGG]-[
Figure pct00010
]로부터 선택됨; 또는
d. A - ([스페이서 요소 - 올리고펩티드 링커 요소 - 효소 절단가능한 링커 요소 - 비-절단가능한 링커 요소] - T)n 및 바람직하게, 여기서 링커는
i. [GGGGS]-[LPXTGG]-[vc-PAB]-[N-포르밀-N,N'-디메틸에틸렌디아민], 및
ii. [GGGGS]-[LPXTGG]-[vc-PAB]-[피페라진]으로부터 선택됨,
여기서 A는 각각 서열식별번호 21, 서열식별번호 22, 및 서열식별번호 23의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호 24, 서열식별번호 25, 및 서열식별번호 26의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열을 포함하는, CLDN18.2에 결합하는 항체 또는 그의 단편이고, T는 안트라사이클린이다.
한 실시양태에서, n은 정수 ≥ 1 내지 ≤ 10이다. 본 발명은 또한 ADC의 제약상 허용되는 염 또는 에스테르에 관한 것이다.
독소는 항체 중쇄 및/또는 경쇄의 C-말단에, 또는 항체 단편의 C-말단에서 링커를 통해 접합될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 비-절단가능한 링커 요소는 에틸렌디아민이고, 올리고펩티드 링커 요소는 LPXTGG이고, 여기서 X는 Q 또는 E이고, 바람직하게, 여기서 X는 Q이다.
한 실시양태에서,
a. (L-T)는 항체의 두 경쇄 모두에 공유 연결되거나,
b. (L-T)는 항체의 두 중쇄 모두에 공유 연결되거나,
c. (L-T)는 항체의 두 경쇄 모두 및 두 중쇄 모두에 공유 연결된다.
한 실시양태에서, (L-T)는
a. 항체 경쇄 또는 항체 중쇄의 C-말단에 연결되거나, 또는
b. 항체 경쇄 또는 항체 중쇄의 아미노산 측쇄에 연결된다.
독소가 항체 경쇄 또는 항체 중쇄의 C-말단에 연결된 경우, 올리고펩티드 링커 요소 및 임의적 스페이서 요소는 항체가 상기 C-말단 태그와 재조합적으로 발현될 때, 항체 아미노산 서열의 일부일 수 있다. 독소가 항체 아미노산 서열의 아미노산 측쇄에 연결된 경우, 링커 요소는 선택한 아미노산 측쇄에 따라 말레이미드 화학 또는 아실화 화학에 의해 연결될 수 있다.
놀랍게도, 본 발명의 ADC는 독소가 올리고펩티드 펩티드 링커 요소 - 비-절단가능한 효소 링커 요소를 통해 오직 HC에서만, 스페이서 요소 - 올리고펩티드 펩티드 링커 요소 - 비-절단가능한 효소 링커 요소를 통해 오직 LC에서만, 접합되거나, 또는 HC 및 LC에서 상기 링커-독소 조합이 이루어진 경우, ADC 맥락에서도 또한 선행 기술의 항체에 비해 새로 확인된 항체의 우수성을 보이면서, IMAB362에 기반한 유사한 ADC보다 CLDN18.2를 발현하는 세포에서 더 높은 세포독성 활성을 가진다 (도 11 내지 19, 및 실시예 8 참조). 본 발명의 ADC는 또한 IMAB362에 기초하고, 앞서 WO2016/165762에 개시된 바와 같이 MC-vc-PAB 링커를 통해 MMAE에 접합된 ADC보다 더 높은 세포독성 활성을 가진다 (도 11 참조).
한 실시양태에서, 안트라사이클린은 하기 화학식 (I)을 갖고:
Figure pct00011
상기 식에서, R1은 수소 원자, 히드록시 또는 메톡시 기이고, 상기 식에서, R2는 C1-C5 알콕시 기이다. 한 실시양태에서, 안트라사이클린은 C13을 통해 링커에 부착되고, 그 결과로 C14 및 히드록실 기는 손실되거나, 또는 C14를 통해 링커에 부착되고, 그 결과로 히드록실 기는 손실된다.
(C13 또는 C14를 통해) 독소를 항체에 연결하는 것은 독소의 세포독성 활성에는 어떤 영향도 미치지 않을 것으로 이해된다.
PNU-159682의 합성 및 ADC에서 독소로서의 그의 용도에 대한 추가 정보는 문헌 [Holte D et al. 2020 (Holte et al. 2020)]에서 살펴볼 수 있다.
PNU-159682는 하기 제시된 바와 같이 비-절단가능한 링커 또는 효소-절단가능한 링커에 의해 항체에 연결될 수 있다.
링커는 말레이미드 아세탈 링커일 수 있다:
Figure pct00012
.
상기 링커는 하기 제시된 PNU-159682-말레이미드 아세탈-Ab ADC에서 사용되었다:
Figure pct00013
.
상기 PNU-159682 말레이미드 아세탈-Ab ADC는 US 10,435,471, 칼럼 90에 개시되었다. PNU-159682 말레이미드 아세탈 화합물은 WO2010/009124에서 화합물 51로 개시되었고, 동일 출원의 실시예 2 (단락 [0542] 내지 [0550])에서 제조된 화합물에 기초하여, 실시예 3d (단락 [0576] 내지 [0578])에 개시된 바와 같이 제조될 수 있다.
PNU-159682는 또한 하기 제시되는 바와 같이 val-cit-PAB 효소-절단가능한 링커에 의해 항체에 연결되어 PNU-159682-val-cit-PAB-Ab ADC를 형성할 수 있다:
Figure pct00014
.
상기 ADC는 US 10,435,471, 칼럼 91-92에 개시되었다. PNU-159682-val-cit-PAB 화합물은 WO2010/009124에 화합물 55로 개시되어 있고, 동일 출원의 실시예 3b (단락 [0567]-[0573] 및 도 7d)에 제시된 바와 같이 제조될 수 있다.
PNU-159682는 또한 하기 제시되는 바와 같이 효소 절단가능한 링커 val-cit-PAB 및 추가의 비-절단가능한 링커 요소를 통해 항체에 연결될 수 있다:
Figure pct00015
.
상기 ADC는 US 10,435,471, 칼럼 91-92 및 문헌 [Yu SF et Clin 암 Research 2015 (Yu et al. 2015)]에 개시되었다. PNU-159682-val-cit-PAB + 비-절단가능한 링커 화합물는 하기와 같이 제조될 수 있다:
Figure pct00016
여기서 MC-val-cit-PAB는 상업적으로 이용가능하고 (MedChemExpress 카탈로그 번호: HY-78738), Boc는 tert-부틸옥시카르보닐 보호기이다.
PNU-159682는 또한 하기 제시되는 바와 같이 비-절단가능한 말레이미드 링커를 통해 항체에 연결될 수 있다:
Figure pct00017
.
상기 ADC는 US 10,435,471, 칼럼 93에 개시되었다. PNU-159682-말레이미드 화합물은 WO2010/009124에 화합물 55로 개시되어 있고, 실시예 3a (동일 출원의 단락 [0564] 내지 [0566])에 그의 제조가 개시되어 있다.
비-절단가능한 링커 요소, 효소-절단가능한 링커 요소 및 올리고펩티드 링커 요소의 조합 또한 PNU-159682를 항체에 연결시키는 데 사용되었다. 상기 ADC는 하기에 제시되어 있다:
Figure pct00018
.
상기 화합물은 문헌 [Stefan et al. (Stefan et al. 2017)]에 개시되어 있다. 상기 ADC는 Fmoc-Gly3-Val-Cit-PAB (MedChemExpress로부터 상업적으로 이용가능, 카탈로그 번호: HY-136106)에 의해 MC-Val-Cit-PAB를 치환함으로써, PNU-159682-val-cit-PAB + 비-절단가능한 링커 ADC에 대해 상기 개시된 바와 같이 합성될 수 있고, 생성된 링커-독소 화합물은 WO2016/102679, 34 페이지, 2번째 단락에 개시된 바와 같이 항체에 접합될 수 있다.
PNU-159682는 또한 하기 제시되는 바와 같이 올리고펩티드 링커 요소 (-GGGGG-)와 조합된 비-절단가능한 EDA 링커 요소를 통해 항체에 연결될 수 있다:
Figure pct00019
.
상기 화합물은 WO2016/102679, 도 3A에 개시되어 있다. 이는 WO2016/102679의 도 3B의 개략도 및 33 페이지 마지막 단락부터 34 페이지 1번째 단락에 개시된 바와 같이 제조될 수 있고, 생성된 링커-독소 화합물은 WO2016/102679, 34 페이지 2번째 단락에 개시된 바와 같이 항체에 접합될 수 있다. 상기 사용된 올리고 펩티드 링커 요소는 또한 (-GGG-) 또는 바람직하게, (-GG-)일 수 있다.
항체 결합 또는 결합 친화도는 일반적으로 평형 회합 또는 해리 상수 (각각 Ka 또는 Kd)로 표시되며, 이는 차례로 해리 및 결합 속도 상수 (각각 k오프 및 k온)의 반비이다. 따라서, 속도 상수의 비가 동일하게 유지되는 한, 등가 친화도는 다른 속도 상수에 상응할 수 있다. 결합 친화도 및/또는 속도 상수는 예컨대, ELISA, 유세포 분석법 적정, 등온 적정 열량 측정 (ITC), 비어코어(Biacore) (SPR), 생물층 간섭법 또는 형광 편광과 같이 관련 기술분야에 널리 공지되어 있거나, 또는 본원에 설명된 기술을 사용하여 측정될 수 있다. 일부 경우에, 항원의 성질에 기인하여, 항체의 Ka 또는 Kd 측정이 어려울 수 있다. 이는 특히 Claudin과 같은 통합 막 단백질인 경우에 그러하다 (Hashimoto et al. 2018). 상기 경우에, 통합 막 단백질은 프로테오리포좀 또는 리포입자로 발현될 수 있다. 상기 리포입자는 플라스틱에 고정될 수 있으며, 고정화된 항원에 대한 항체의 결합 친화도를 측정하기 위해 ELISA 검정법에 사용될 수 있다. 따라서, Ka 또는 Kd 값 대신, 각각의 시험된 항체 또는 그의 기능성 단편에 대해 최대 유효 농도의 절반 (EC50) 값을 계산할 수 있으며, 이는 항원에 대한 그의 결합 친화도 (또는 결합 강도)를 반영할 수 있다. 하기 실시예 2 및 도 1은 표 1의 컨센서스 서열에 포함된 CDR을 갖는 항체의 ELISA 검정 결합 친화도 곡선을 예시한다. EC50 값 및 최대 결합 값은 항체의 CLDN18.2에의 결합을 정량화하기 위해 사용될 수 있다. 하기 실시예 3은 CLDN18.2를 발현하는 세포에 대한 유세포 분석법에 의한, 표 1의 컨센서스 서열에 포함된 CDR을 갖는 항체의 EC50 값 계산에 관한 것이다.
ADC의 세포독성 활성은 ADC 세포독성 검정법으로부터 검색된 EC50 값을 특징으로 할 수 있다. 하기 실시예 8 및 표 9는 CLDN18.2를 발현하는 세포를 이용하여 세포독성 검정법을 사용함으로써 본 발명의 ADC의 EC50 값을 계산하는 것에 관한 것이다.
비록 CLDN18.2를 과다발현하는 HEK293T 세포주 및 PA-TU-8988S-고 세포주에서 측정된 모든 hCl 항체의 항체 결합 EC50 (㎍/ml) 값은 동일한 세포주에서 참조 항체 IMAB362의 항체 결합 EC50 값보다 높지만 (표 4 및 실시예 2 참조), 즉, 본원에 제공된 hCl 항체는 IMAB362에 비해 더 낮은 친화도로 CLDN18.2에 결합하지만, 이제, 본 발명자들은 놀랍게도 CLDN18.2를 과다발현하는 HEK293T 및 A549 세포주 및 PA-TU-8988S-고 세포주에서 측정된 본 발명의 ADC의 ADC 세포독성 EC50 (ng/ml) 값은 동일한 세포주에서 IMAB362에 기반한 ADC의 세포독성 EC50 값보다 더 낮았다는 것을 보여주었다 (표 9 및 실시예 8 참조). 이는 항체가 IMAB362보다 표적에 대해 더 낮은 결합 친화도를 가짐에도 불구하고, 본 발명의 ADC가 IMAB362에 기반한 ADC보다 더 높은 세포독성 활성을 가진다는 것을 보여주는 것이다.
유사하게, 본 발명의 ADC는 IMAB362에 기반한 ADC보다 환자 유래 종양 이종이식편 모델에서 더 높은 생체내 효능을 보였다 (실시예 9 참조).
한 실시양태에서, 항체 또는 그의 단편은 CLDN18.2에 결합하고, 각각 서열식별번호 21, 서열식별번호 126, 및 서열식별번호 23의 중쇄 CDR HCDR1, HCDR2 및 HCR3 서열, 및 각각 서열식별번호 24, 서열식별번호 25, 및 서열식별번호 26의 경쇄 CDR LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 항체 또는 그의 단편은 CLDN18.2에 결합하고,
a. 각각 서열식별번호 1, 서열식별번호 15 및 서열식별번호 3의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호 4, 서열식별번호 5 및 서열식별번호 6의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열;
b. 각각 서열식별번호 1, 서열식별번호 16 및 서열식별번호 3의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호 4, 서열식별번호 5 및 서열식별번호 6의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열;
c. 각각 서열식별번호 1, 서열식별번호 16 및 서열식별번호 3의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호 17, 서열식별번호 14 및 서열식별번호 11의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열;
d. 각각 서열식별번호 1, 서열식별번호 16 및 서열식별번호 3의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호 18, 서열식별번호 19 및 서열식별번호 11의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열;
e. 각각 서열식별번호 12, 서열식별번호 15 및 서열식별번호 3의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호 4, 서열식별번호 5 및 서열식별번호 6의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열;
f. 각각 서열식별번호 1, 서열식별번호 20, 및 서열식별번호 3의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호 4, 서열식별번호 5 및 서열식별번호 6의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열;
g. 각각 서열식별번호 1, 서열식별번호 20 및 서열식별번호 3의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호 18, 서열식별번호 19 및 서열식별번호 11의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열;
h. 각각 서열식별번호 12, 서열식별번호 20 및 서열식별번호 8의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호 4, 서열식별번호 5 및 서열식별번호 6의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열; 또는
i. 각각 서열식별번호 12, 서열식별번호 20 및 서열식별번호 8의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호 17, 서열식별번호 14 및 서열식별번호 11의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열을 포함한다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 상기 항체에 기반한 ADC는 예를 들어, 세포독성 활성에 대한 EC50 값에 의해 제시된 바와 같이, IMAB362에 기반한 상응하는 ADC보다 CLDN18.2 발현 세포에 대하여 더 높은 세포독성 활성을 가진다.
추가의 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 그의 단편은 CLDN18.2에 결합하고,
a. 각각 서열식별번호 1, 서열식별번호 2 및 서열식별번호 3의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호 4, 서열식별번호 5 및 서열식별번호 6의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열;
b. 각각 서열식별번호 1, 서열식별번호 7 및 서열식별번호 8의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호 9, 서열식별번호 10 및 서열식별번호 11의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열; 또는
c. 각각 서열식별번호 12, 서열식별번호 2 및 서열식별번호 3의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호 13, 서열식별번호 14 및 서열식별번호 11의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열을 포함한다.
추가의 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 그의 단편은 CLDN18.2에 결합하고,
a. 서열식별번호 27의 VH 서열 및 서열식별번호 28의 VL 서열;
b. 서열식별번호 29의 VH 서열 및 서열식별번호 30의 VL 서열;
c. 서열식별번호 31의 VH 서열 및 서열식별번호 32의 VL 서열을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 항체 또는 그의 단편은 CLDN18.2에 결합하고,
a. 서열식별번호 33의 VH 서열;
b. 서열식별번호 34의 VH 서열;
c. 서열식별번호 35의 VH 서열;
d. 서열식별번호 36의 VH 서열; 또는
e.서열식별번호 37의 VH 서열;
및
f. 서열식별번호 38의 VL 서열;
g. 서열식별번호 39의 VL 서열;
h. 서열식별번호 40의 VL 서열; 또는
i.서열식별번호 41의 VL 서열을 포함한다.
추가 실시양태에서, 항체 또는 그의 단편은 CLDN18.2에 결합하고,
a. 서열식별번호 33의 VH 서열 및 서열식별번호 38의 VL 서열;
b. 서열식별번호 34의 VH 서열 및 서열식별번호 38의 VL 서열;
c. 서열식별번호 34의 VH 서열 및 서열식별번호 39의 VL 서열;
d. 서열식별번호 34의 VH 서열 및 서열식별번호 40의 VL 서열;
e. 서열식별번호 35의 VH 서열 및 서열식별번호 38의 VL 서열;
f. 서열식별번호 36의 VH 서열 및 서열식별번호 41의 VL 서열;
g. 서열식별번호 36의 VH 서열 및 서열식별번호 40의 VL 서열;
h. 서열식별번호 37의 VH 서열 및 서열식별번호 41의 VL 서열;
i. 서열식별번호 37의 VH 서열 및 서열식별번호 38의 VL 서열; 또는
j. 서열식별번호 37의 VH 서열 및 서열식별번호 39의 VL 서열을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 항체는 CLDN18.2에 결합하고,
a. 서열식별번호 46의 중쇄 서열 및 서열식별번호 51의 경쇄 서열;
b. 서열식별번호 47의 중쇄 서열 및 서열식별번호 51의 경쇄 서열;
c. 서열식별번호 47의 중쇄 서열 및 서열식별번호 52의 경쇄 서열;
d. 서열식별번호 47의 중쇄 서열 및 서열식별번호 53의 경쇄 서열;
e. 서열식별번호 48의 중쇄 서열 및 서열식별번호 51의 경쇄 서열;
f. 서열식별번호 47의 중쇄 서열 및 서열식별번호 54의 경쇄 서열;
g. 서열식별번호 49의 중쇄 서열 및 서열식별번호 53의 경쇄 서열;
h. 서열식별번호 50의 중쇄 서열 및 서열식별번호 54의 경쇄 서열;
i. 서열식별번호 50의 중쇄 서열 및 서열식별번호 51의 경쇄 서열; 또는
j. 서열식별번호 50의 중쇄 서열 및 서열식별번호 52의 경쇄 서열을 포함한다.
개시된 항체의 불변 경쇄 영역 CL 및 불변 중쇄 영역 CH1 및 Fc 영역은 각각 서열식별번호 127 및 서열식별번호 128의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
오직 경쇄에만 안트라사이클린이 접합된 본 발명의 ADC는 오직 경쇄에만 안트라사이클린 유도체가 접합된 IMAB362보다 CLDN18.2를 발현하는 세포에 대하여 더 높은 세포독성 활성을 가진다 (도 11 내지 19 참조). 중쇄 및 경쇄에, 또는 오직 중쇄에만 또는 오직 경쇄에만 안트라사이클린이 접합된 본 발명의 ADC 또한 이전에 WO2016/165762에 개시된 IMAB362-MC-vc-PAB-MMAE보다 더 높은 세포독성 활성을 가진다 (도 11 참조).
본 발명자들은 또한 본 발명의 ADC가 IMAB362에 기반한 동일한 ADC보다 환자 유래 위 종양 이종이식편 모델, 결장 종양 이종이식편 모델, 췌장 종양 이종이식편 모델 및 폐 종양 이종이식편 모델에 대하여 더 높은 생체내 세포독성 활성을 갖는다는 것을 보여주었다 (각각 도 21 내지 24, 및 실시예 9 참조). 바람직한 실시양태에서, 항체는 CLDN18.2에 결합하고, 서열식별번호 46의 중쇄 서열 및 서열식별번호 51의 경쇄 서열을 포함한다.
추가의 바람직한 실시양태에서, 항체는 CLDN18.2에 결합하고, 서열식별번호 46의 중쇄 서열 및 서열식별번호 51의 경쇄 서열로 이루어진다.
항체는 CLDN18.2를 발현하는 건강한 위 세포와 비교하여 CLDN18.2를 발현하는 종양 세포에 대해 증가된 결합을 나타내는, 본 발명의 항체의 아미노산 서열과 적어도 80%의 동일성, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
한 실시양태에서, 항체는 CLDN18.2에 결합하고,
a. 서열식별번호 27의 VH 서열 및 서열식별번호 28의 VL 서열;
b. 서열식별번호 29의 VH 서열 및 서열식별번호 30의 VL 서열;
c. 서열식별번호 31의 VH 서열 및 서열식별번호 32의 VL 서열을 포함하는 항체와 적어도 80%의 동일성, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가진다.
추가 실시양태에서, 항체는 CLDN18.2에 결합하고,
a. 서열식별번호 33의 VH 서열 및 서열식별번호 38의 VL 서열;
b. 서열식별번호 34의 VH 서열 및 서열식별번호 38의 VL 서열;
c. 서열식별번호 34의 VH 서열 및 서열식별번호 39의 VL 서열;
d. 서열식별번호 34의 VH 서열 및 서열식별번호 40의 VL 서열;
e. 서열식별번호 35의 VH 서열 및 서열식별번호 38의 VL 서열;
f. 서열식별번호 36의 VH 서열 및 서열식별번호 41의 VL 서열;
g. 서열식별번호 36의 VH 서열 및 서열식별번호 40의 VL 서열;
h. 서열식별번호 37의 VH 서열 및 서열식별번호 41의 VL 서열;
i. 서열식별번호 37의 VH 서열 및 서열식별번호 38의 VL 서열; 또는
j. 서열식별번호 37의 VH 서열 및 서열식별번호 39의 VL 서열을 포함하는 항체와 적어도 80%의 동일성, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가진다.
추가의 또 다른 실시양태에서, 항체는 CLDN18.2에 결합하고, 서열식별번호 46의 중쇄 서열 및 서열식별번호 51의 경쇄 서열로 이루어진 항체와 적어도 80%의 동일성, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가진다.
또 다른 실시양태에서, 항체 (또는 존재할 때, 항체 단편)의 Fc 도메인은 예컨대, 하기 표 2에 열거된 변형 또는 돌연변이와 같은, 변형 또는 돌연변이를 포함할 수 있다. 상기 변형 또는 돌연변이는 항체의 Fc 도메인의 이펙터 활성을 조정하기 위해 도입될 수 있다. 항체의 변형은 또한 항체 HC 및/또는 LC 쇄의 C-말단 단부에 부가된 펩티드 태그를 포함할 수 있다. 상기 태그는 예컨대, 단백질 정제 또는 단백질 접합을 위해 사용될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, CLDN18.2에 결합하는 항체 또는 그의 단편은 IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 합성 IgG, IgM, F(ab)2, Fv, scFv, IgGACH2, F(ab')2, scFvCH3, Fab, VL, VH, scFv4, scFv3, scFv2, dsFv, Fv, scFv-Fc, (scFv)2, 비-고갈성 IgG, 디아바디, 2가 항체 또는 그의 Fc-조작된 버전이다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 IgG1 타입의 항체이다. 면역글로불린의 Fc 영역은 다중 Fcγ 수용체 (FcγR) 및 보체 단백질 (예컨대, C1q)과 상호작용하고, 항체 의존성 세포 세포독성 (ADCC), 항체 의존성 세포 식세포작용 (ADCP) 또는 보체-의존성 세포독성 (CDC)을 통한 표적화된 세포 제거와 같은 면역 이펙터 기능을 매개한다. 치료 접근법을 위해, Fc 관련 이펙터 기능을 증진시키거나, 또는 침묵화시키는 것이 유익할 수 있다. 면역글로불린 (IgA, IgD, IgE, IgG, IgM) 타입은 Fc 도메인과 관련된 항체의 원하는 이펙터 기능에 따라 선택될 수 있다. 합성 면역글로불린, 예컨대, IgG2 아미노산 118 내지 260 및 IgG4 아미노산 261 내지 447를 포함하는 면역글로불린, 또는 IgG4로부터의 점 돌연변이를 포함하는 IgG2 변이체 (예컨대, H268Q/V309L/A30S/P331S) 또한 사용할 수 있다. 상기 합성 면역글로불린은 항체의 이펙터 기능을 감소킨다. Fc-조작된 면역글로불린은 또한 항체 이펙터 기능을 조정하는 데 사용될 수 있다. 표 2는 상기 Fc 조작의 예를 보여주는 것이다. 변경된 푸코실화를 갖는 생산 세포주에서의 발현은 또한 FcγR 결합에 영향을 줄 수 있다.
표 2: 항체 이펙터 기능을 조정하는 변형의 예. 달리 언급되지 않는 한, 돌연변이는 IgG1 서브부류에 있다 (Wang, Mathieu, and Brezski 2018).
Figure pct00020
Figure pct00021
항체의 생체내 반감기 또한 조정될 수 있다. Fc 도메인은 항체의 안정성 및 혈청 반감기에서 중심적인 역할을 한다. 치료 접근법을 위해, 항체 반감기는 Fc 도메인이 누락된 항체 단편, 또는 말단절단된 Fc 도메인을 포함하는 항체 단편, 예컨대, F(ab)2, Fv, scFv, IgGACH2, F(ab')2, scFvCH3, Fab, VL, VH, scFv4, scFv3, scFv2, dsFv, Fv, scFv-Fc 또는 (scFv)2를 사용하여 감소될 수 있다. 항체는 또한 디아바디 또는 2가 항체 형태일 수 있다. 디아바디 또는 2가 항체를 사용하여 표적에 대한 친화도를 증가시켜 더 낮은 투여량을 허용할 수 있다. Fc 도메인이 누락되거나, 또는 말단절단된 Fc 도메인을 포함하는 기능성 단편 또한 예컨대, 키메라 항원 수용체 T 세포 (CAR T 세포) 또는 이중특이적 T 세포 인게이저 (BiTE)와 같은 다른 치료 접근법의 개발에도 사용될 수 있다. CAR 구축물에서, 하나의 VH 및 하나의 VL 도메인은 전형적으로 짧은 펩티드 링커에 의해 연결되어 단일 쇄 가변 단편 (scFv)을 형성하고, scFv 단편은 추가로 막횡단 도메인 및 세포질내 T 세포 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프 (예컨대, CD3ζ로부터의 것) 및 공동 자극 분자의 추가 도메인 (예컨대, CD28, 4-1BB(CD127) 또는 OX40으로부터의 것)에 연결된다 (Chang and Chen 2017). scFv 단편에 사용된 VH 및 VL 도메인은 표 3에 열거된 항체 중 하나일 수 있다. BiTE는 전형적으로 2개의 상이한 항체의 두 scFv의 융합으로 이루어진다. 하나의 scFv 도메인은 표 3에 열거된 CLDN18.2에 결합하는 단리된 항체의 것일 수 있는 반면, 다른 scFv 도메인은 예컨대, CD3, CD16, NKG2D, NKp46, CD2, CD28 또는 CD25에 결합하는 항체로부터의 것이다. BiTE 항체 포맷 및 T 세포 재유도에 사용되는 다른 이중특이적 항체 포맷에 대한 충분한 가이던스는 문헌 [Diego Ellerman (2019)]에 의한 리뷰에서 살펴볼 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 항체 또는 그의 단편은 CLDN18.2에 결합하고, 상기 항체는 서열식별번호 127의 불변 경쇄 영역 (CL) 및 바람직하게, 서열식별번호 129의 불변 중쇄 영역 CH1 및 Fc 영역을 갖고, 불변 중쇄 영역 CH2 중에 L234A/L235A 돌연변이를 가지며, 감소된 FcγR 결합을 보인다. 더욱 바람직하게, 항체는 불변 중쇄 영역 CH1 및 Fc 영역에 L234A/L235A/P329G 돌연변이를 가진 서열식별번호 130의 불변 중쇄 영역 CH1 및 Fc 영역을 갖고, 더 추가로 감소된 FcγR 결합을 보인다.
이제, 본 발명자들은 놀랍게도 불변 중쇄 영역 CH2 중에 L234A/L235A 돌연변이를 갖는 항체에 기반한 본 발명의 ADC가 IMAB362에 기반한 동일한 ADC보다 환자 유래 종양 이종이식편 모델에 대하여 더 높은 생체내 세포독성 활성을 갖는다는 것을 것을 보여주었다 (도 21C 및 23B, 및 실시예 9 참조).
또 다른 바람직한 실시양태에서, 항체 또는 그의 단편은 CLDN18.2에 결합하고, 서열식별번호 33의 VH 서열, 서열식별번호 38의 VL 서열, 서열식별번호 127의 불변 경쇄 영역 (CL) 및 L234A/L235A를 포함하는, 서열식별번호 129의 불변 중쇄 영역 CH1 및 Fc 영역을 포함한다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 항체 또는 그의 단편은 CLDN18.2에 결합하고, 서열식별번호 33의 VH 서열, 서열식별번호 38의 VL 서열, 서열식별번호 127의 불변 경쇄 영역 (CL) 및 L234A/L235A를 포함하는, 서열식별번호 129의 불변 중쇄 영역 CH1 및 Fc 영역으로 이루어진다.
또 다른 실시양태에서, 항체 또는 그의 단편은 CLDN18.2에 결합하고, 여기서 항체 또는 그의 단편은 인간화된 것이다. 모노클로날 항체의 인간화는 잘 확립되어 있다. 문헌 [The Handbook of Therapeutic Antibodies, Second Edition]은 모노클로날 항체의 인간화 (Saldanha 2014), 상기 항체 분석을 위한 생물정보학 도구 (Martin and Allemn 2014) 또는 치료 항체의 개발 및 제조 (Jacobi et al. 2014)에 대한 충분한 정보를 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 항체 또는 그의 단편은 CLDN18.2에 결합하는 단리된 항체 또는 단리된 단편이다.
추가 실시양태에서, 항체 또는 그의 단편은 CLDN18.2에 결합하고, 여기서 항체 또는 그의 단편은 CLDN18.1에는 결합하지 않는다. 따라서, 항체는 CLDN18.1에 대한 교차 반응성, 또는 그에의 교차 결합을 나타내지 않는다. 항체의 표적 단백질에의 결합은 표적 단백질을 발현하는 세포에서의 유세포 분석법에 의해 시험될 수 있다. 시험된 항체의 그의 표적 단백질에의 특이적 결합은 히스토그램 플롯에서 시각화될 수 있다. 상기 플롯은 항체가 발현된 표적 단백질에 특이적으로 결합할 때 높은 형광 신호를 갖는 피크를 생성하고, 항체가 발현된 표적 단백질에 결합하지 않거나, 매우 약하게만 결합할 때에는 낮은 형광 신호를 갖는 피크를 생성한다. 결합 정도는 또한 유세포 분석법에 의해 측정된 최대 평균 형광 강도 (maxMFI)를 보여주는 막대 그래프로 표시될 수도 있으며, 높은 maxMFI는 강한 결합을 반영하고, 낮은/없는 maxMFI는 비결합 또는 매우 약한 결합을 반영한다. 동일한 실험 세트에서 상이한 항체에 대한 maxMFI 값을 비교하는 것은 표적에 대한 항체의 친화도를 나타낼 수도 있으며, maxMFI가 더 높다는 것은 오프 속도가 더 낮고, 친화도가 더 높다는 것을 나타내는 것일 수 있다. 상기 결합 검정법의 예는 실시예 3과 도 4 및 5에서 살펴볼 수 있다.
또 다른 실시양태에서, ADC는 또 다른 모이어티에 결합된다. 항체 또는 그의 단편의 또 다른 모이어티에의 결합은 공유 또는 비공유일 수 있다. 모이어티는 방사성동위원소, 형광 태그, 조직학적 마커, 세포독소 또는 시토카인을 포함할 수 있다. 모이어티의 항체에의 결합은 관련 기술분야에 공지된 링커에 의해 촉진될 수 있다.
추가의 또 다른 실시양태에서, 특이적 항체 또는 그의 단편은 CLDN18.2에 결합하고, 여기서 항체는 IMAB362보다 번역 후 탈아미드화에 덜 감수성이다. 추가 실시양태에서, 종양 특이적 항체 또는 그의 단편은 CLDN18.2에 결합하고, 여기서 항체는 번역 후 탈아미드화되지 않는다. 번역 후 변형 (PTM)은 항체 개발 및 항체 생산 및 보관, 둘 모두에서 중요한 관심사이다. 비제한된 PTM은 효능, 활성, 효력, 또는 안정성이 더 낮은 항체를 유도할 수 있다. PTM은 N-글리코실화, 리신 당화 및 바이오프로세싱 동안 세포 배양 배지로부터의 다른 시스테인, 글루타티온 또는 다른 술프히드릴 함유 화합물로 캡핑된 시스테인, 또는 공유 디술피드 브릿지에 의해 연결된 시스테인에 기인하는 이량체 및 고급 올리고머의 형성일 수 있다. PTM 중에서, 아스파라긴 (Asn, N) 잔기의 탈아미드화,아스파르테이트 (아스파르트산, Asp, D) 잔기의 이성질체화 및 숙신이미드 중간체의 형성은 생산, 보관 동안 또는 투여 후 생체내에서의 치료 항체에 대한 가장 빈번한 변형 반응이다. Asn의 탈아미드화 및 Asp의 이성질체화는 서열 안정성, 구조적 환경 및 보관 조건, 특히, 용액 pH 및 보관 온도에 의존한다. 이러한 변형은 특히 영향을 받는 잔기가 표적 결합에 관여하는 경우, 기능 또는 생물학적 활성의 감소 또는 심지어는 손실을 초래할 수 있다. Asn 및 Asp 잔기는 특히 상기 잔기가 예컨대, CDR 루프와 같은 구조상 가요성인 영역에 위치할 때, 및 특정 다른 구조적 전제 조건이 충족되는 경우, 변형 위험이 있는 반면, 프레임워크 영역은 변형에 비교적 내성이 있는 것으로 관찰되었다. Asn 및 Asp 잔기의 구조적 위치 외에도, Asn 탈아미드화의 정규 모티프 및 Asp 이성질체화의 정규 모티프 또한 확인되었다. 이러한 정규 모티프는 각각 NG, NS, NN, NT, NH, 및 DG, DS, DD, DT 및 DH이다 (Lu et al. 2019). 인-실리코 분석 시, 개시된 항체는 VL 도메인의 CDR2의 마지막 아미노산에 및 HC의 CH2 및 CH3 영역에 (VL-CDR2 (위치 62에), CH2 (위치 282에), CH3 (위치 403에)) DG Asp-이성질체화 모티프를 제공한다.
Asp의 이성질체화는 항체를 2주 동안 낮은 pH (즉, pH 5.5) 및 열 (즉, 40℃)에 적용하여 시험할 수 있는 반면, 항체의 Asn 탈아미드화는 생산 및 보관 조건을 모방하면서, 항체를 1주 동안 높은 pH (즉, pH 8.0) 및 열 (즉, 40℃)에 적용하여 시험할 수 있다.
이제, 본 발명자들은 비록 그의 CDR에 Asn 및 Asp를 함유하고, Asp-Gly (DG) Asp-이성질체화 모티프를 보유함에도 불구하고, 상기 열악한 조건하에서도 놀랍게도 개시된 항체에서는 Asn 탈아미드화 (표 6 참조) 및 Asp 이성질체화 (표 7 참조)가 이루어지지 않았고, 그의 CLDN18.2에의 결합 친화도는 어떤 영향도 받지 않았다고 밝혔다. 반면, IMAB362는 상기 조건하에서 Asn 탈아미드화를 보였으며, 이는 (표 6 및 도 10에 제시된 바와 같이) 결합 친화도 손실을 유도하였다. 따라서, 본 발명은 CLDN18.2에 결합하고, 생산, 보관 및 임상 적용 (생체내) 동안 IMAB362보다 PTM 경향이 더 작고, 생산, 보관 및 임상 적용 (생체내) 동안 CLDN18.2에 대한 결합 친화도 유지를 보증하는 단리된 항체 또는 그의 단편을 제공한다.
한 실시양태에서, 항체는 서열식별번호 46의 중쇄 서열 및 서열식별번호 51의 경쇄 서열을 포함하는 항체와 동일한 에피토프에 결합한다.
본 발명은 본원에 기술된 항체와 결합에 대하여 경쟁하는 항체를 추가로 제공한다. 한 실시양태에서, 항체는 서열식별번호 46의 중쇄 서열 및 서열식별번호 51의 경쇄 서열을 포함하는 항체와 결합에 대하여 경쟁한다.
본 발명은 본원에 기술된 항체의 Claudin 18.2에의 결합을 경쟁적으로 억제시키는 항체를 추가로 제공한다. 한 실시양태에서, 항체는 서열식별번호 46의 중쇄 서열 및 서열식별번호 51의 경쇄 서열을 포함하는 항체의 Claudin 18.2에의 결합을 경쟁적으로 억제시킨다.
항체의 동일한 항원에의 결합을 검출하는 적합한 방법으로는 항원-항체 상호작용을 맵핑하는 접근법을 포함한다. 상기 접근법은 문헌 [Abbott 2014 (Abbott, Damschroder, and Lowe 2014)]에 기술되었다. 경쟁을 검출하는 적합한 방법은 문헌 [Abdiche 2009 (Abdiche et al. 2009)]에 기술된 바와 같이, 에피토프 비닝에 의한 경쟁 검정법을 포함한다. 경쟁적 억제를 검출하는 데 적합한 방법으로는 ELISA 검정법을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 ADC를 제조하는 방법에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 본 방법은 하기 단계:
a. 하나 이상의 링커 요소를 갖는 A인 항체 또는 그의 단편을 제공하는 단계,
b. 하나 이상의 링커 요소를 갖는 하나 이상의 독소 T를 제공하는 단계, 및
c. 항체 및 독소를 접합시켜 항체-약물 접합체를 생성하는 단계를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 방법은 하기 단계:
d. 바람직하게는 그의 C-말단에, 임의적으로, 항체 경쇄 및/또는 중쇄에서 스페이서 요소에 이어 올리고펩티드 링커 요소를 갖는 A인 항체 또는 그의 단편을 제공하는 단계,
e. 임의적으로 올리고펩티드 링커 요소 앞에 비-절단가능한 링커 요소를 갖는 하나 이상의 독소 T를 제공하는 단계, 및
f. 항체 및 독소를 접합시켜 항체-약물 접합체를 생성하는 단계를 포함한다.
본원에 개시된 임의의 항체 A에 본원에 개시된 임의의 올리고펩티드 링커 요소 및 임의적 스페이서 요소가 제공될 수 있는 것으로 이해된다. 유사하게, 임의의 안트라사이클린 독소 T는 본원에 개시된 임의의 비-절단가능한 링커 요소로 연결될 수 있다. 접합 타입은 링커 요소 및/또는 ADC를 제조하는 방법에 따라 달라질 수 있다. 상기 방법에 의해 제조된 ADC의 대표도는 도 25에서 살펴볼 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 ADC는
· 서열식별번호 46에 따른 아미노산 서열의 두 중쇄, 및 서열식별번호 51에 따른 아미노산 서열의 두 경쇄로 이루어진 항체로서, 여기서 항체는 CLDN18.2에 결합하는 것인 항체,
· 경쇄의 C-말단의 링커 [GGGGS]-[LPQTGG]-[에틸렌디아민], 및
· C13에서 링커의 에틸렌디아민에 공유 연결되어, C14 및 히드록실 기가 손실되는, 안트라사이클린-기반 소분자 독소 3'-데아미노-3",4'-안히드로-[2"(S)-메톡시-3"(R)-옥시-4"-모르폴리닐]독소루비신 (PNU-159682)으로 이루어진다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 ADC는
· 서열식별번호 133에 따른 아미노산 서열의 두 중쇄, 및 서열식별번호 51에 따른 아미노산 서열의 두 경쇄로 이루어진 항체로서, 여기서 항체는 CLDN18.2에 결합하는 것인 항체,
· 경쇄의 C-말단의 링커 [GGGGS]-[LPQTGG]-[에틸렌디아민], 및
· C13에서 링커의 에틸렌디아민에 공유 연결되어, C14 및 히드록실 기가 손실되는, 안트라사이클린-기반 소분자 독소 3'-데아미노-3",4'-안히드로-[2"(S)-메톡시-3"(R)-옥시-4"-모르폴리닐]독소루비신 (PNU-159682)으로 이루어진다.
추가의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 ADC는
· 서열식별번호 134에 따른 아미노산 서열의 두 중쇄, 및 서열식별번호 51에 따른 아미노산 서열의 두 경쇄로 이루어진 항체로서, 여기서 항체는 CLDN18.2에 결합하는 것인 항체,
· 경쇄의 C-말단의 링커 [GGGGS]-[LPQTGG]-[에틸렌디아민], 및
· C13에서 링커의 에틸렌디아민에 공유 연결되어, C14 및 히드록실 기가 손실되는, 안트라사이클린-기반 소분자 독소 3'-데아미노-3",4'-안히드로-[2"(S)-메톡시-3"(R)-옥시-4"-모르폴리닐]독소루비신 (PNU-159682)으로 이루어진다.
본 발명은 또한 개시된 ADC 및 부형제를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
ADC 제조에서의 그의 사용을 위한, CLDN18.2에 결합하는 단리된 종양 특이적 항체 또는 그의 기능성 단편을 코딩하는 핵산 서열 또한 제공한다. 핵산 서열은 CDR 단독, VH 및 VL 영역, 또는 항체의 전체 중쇄 및 경쇄를 코딩할 수 있다. 이들 핵산 서열은 표 3에서 살펴볼 수 있다. 핵산 서열은 또한 F(ab)2, Fv, scFv, IgGACH2, F(ab')2, scFvCH3, Fab, VL, VH, scFv4, scFv3, scFv2, dsFv, Fv, scFv-Fc, (scFv)2, 비-고갈성 IgG, 디아바디, 2가 항체 또는 그의 Fc-조작된 버전을 코딩할 수 있다. 코딩된 면역글로불린은 IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IdG2, IgG3, IgG4, 합성 IgG, IgM 또는 그의 돌연변이화 및 Fc-조작된 버전일 수 있다. 핵산은 항체 중쇄 및 항체 경쇄의 C-말단에 직접 융합된 올리고펩티드 링커 요소에 대한 코딩 서열을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 핵산, 또는 코돈 축퇴성의 결과로서의 축퇴성 핵산을 포함하는 발현 벡터 또한 제공한다. 발현 벡터는 포유동물 세포, 박테리아, 진균 또는 곤충 세포에서의 단백질 발현을 위한 발현 벡터일 수 있고, 항체 또는 그의 기능성 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터를 보유하는 숙주 세포의 타입에 대해 선택될 수 있다. 상기 벡터의 구축에 대한 충분한 가이던스는 문헌 [Green and Sambrook (Green and Sambrook 2012)]에서 살펴볼 수 있다. 포유동물 세포, 특히, CHO 세포를 위한 발현 벡터가 바람직하다.
본 발명의 핵산 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포 또한 제공한다. 숙주 세포는 포유동물 세포 또는 세포주, 박테리아 세포, 진균 세포 또는 곤충 세포일 수 있다. 포유동물 세포, 특히, CHO 세포가 바람직하다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 치료용의 CLDN18.2에 결합하는 본 발명의 ADC에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 암/신생물성 질환을 앓는 대상체의 치료에서 사용하기 위한 본 발명의 ADC에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 신생물성 질환이 발생할 위험이 있는 대상체의 치료에서 사용하기 위한, 및/또는 신생물성 질환 진단을 받은 대상체의 치료에서 사용하기 위한, ADC에 관한 것이다.
개시된 ADC는 단일 요법으로서 사용될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 개시된 ADC는 신생물성 질환의 확립된 치료 표준과 함께 조합하여 사용된다.
신생물성 질환은 췌장암, 위암, 식도암, 난소암 및 폐암으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 질환일 수 있다. 치료하고자 하는 신생물성 질환은 CLDN18.2를 발현하는 것으로 이해된다.
한 실시양태에서, 대상체는 포유동물이다. 바람직한 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 신생물성 질환 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 본원에 제공된 바와 같은 ADC를 투여하는 단계를 포함하는, 본원에 제공된 바와 같은 ADC를 이용하여, 췌장암, 위암, 식도암, 난소암 또는 폐암을 비롯한 신생물성 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 본 치료 방법은 단일 요법 또는 바람직하게는 신생물성 질환의 확립된 치료 표준과의 조합 요법일 수 있다.
인간 CLDN18.2 단백질의 아미노산 서열은 NCBI 참조 서열: NP_001002026.1을 가진다. 서열은 또한 서열식별번호 135부터 유래된 것일 수 있다.
도 1: 명시된 바와 같이 선택된 키메라 및 인간화 항-CLDN18.2 항체의 CLDN18.2를 함유하는 리포입자 또는 널-리포입자에의 결합에 대한 ELISA에 의한 평가. A. 키메라 항체 cCl1-1, cCl1-2, cCl1-3, IMAB362 및 2차 항체 단독; B. 인간화 항체 hCl1a 내지 hCl1j, 키메라 cCl1-1, IMAB362 및 2차 항체 단독. 새로 생성된 항체 모두 리포솜 CLDN18.2에 결합한다.
도 2: CLDN18.2의 발현 수준에 대한 PA-TU-8988S 세포의 분류. A: IMAB362로 염색된 PA-TU-9888S의 FC 프로파일. B: CLDN18.2의 고발현에 대해 FACS에 의해 분류된 PA-TU-8988S 세포의 FC 프로파일.
도 3: huCLDN18.2를 과다발현하는 HEK293T 세포 생성. 내인적으로 CLDN18.2를 발현하지 않는 HEK293T 세포를, CLDN18.2를 안정적으로 발현하기 위해 huCLDN18.2를 코딩하는 플라스미드로, 또는 CLDN18.1을 안정적으로 발현하기 위해 huCLDN18.1을 코딩하는 플라스미드로 형질감염시켰다. IMAB362 및 범CLDN18.1 항체 또는 항-인간 IgG 2차 항체 단독으로 염색한 후 FC에 의해 발현을 분석하였다. A. 형질감염되지 않은 HEK293T 세포의 FC 프로파일. B. CLDN18.1을 안정적으로 발현하는 형질감염된 HEK293T 세포의 FC 프로파일. C. CLDN18.2를 안정적으로 발현하는 형질감염된 HEK293T 세포의 FC 프로파일.
도 4: CLDN18.1 또는 CLDN18.2를 과다발현하는 프리-B 세포 L11 세포에의 키메라 cCl1-1, cCl1-2 및 cCl1-3 항체의 유세포 분석 결합 검정법. 키메라 항체는 CLDN18.2에는 결합하지만, CLDN18.1에는 결합하지 않는다. IMAB362를 양성 결합 대조군으로서 사용하였다.
도 5: CLDN18.1 또는 CLDN18.2를 과다발현하는 HEK293T 세포에의 인간화 hCl1a 내지 hCl1j 항체의 유세포 분석 결합 검정법. 인간화 항체는 CLDN18.2에는 결합하지만, CLDN18.1에는 결합하지 않는다. IMAB362 및 cCL1-1을 양성 결합 대조군으로서 사용하였다.
도 6: CLDN18.2를 과다발현하는 A549 세포의 FACS 발현 프로파일. 내인성 CLDN18.2를 발현하지 않는 A549 세포를 CLDN18.2를 코딩하는 플라스미드로 안정적으로 형질감염시키고, CLDN18.2의 발현을 IMAB362를 사용하여 FACS에 의해 분석하였다.
도 7: 생-세포 염색에 의한 유세포 분석법. 그래프는 CLDN18.2 항체 (cCl1-1, hCl1a, hCl1b, hCl1c, hCl1f 및 IMAB362)에 의해 결합된 단리된 단일 세포의 비율(%)을 나타낸다. CLDN18.2를 과다발현하는 주사된 A549 세포로부터 발생하는 CLDN18.2를 발현하는 마우스 종양 (실선 막대) 또는 CLDN18.2를 발현하는 마우스 건강한 위 (개방형 막대)로부터 단일 세포를 단리시켰다.
도 8: 냉동된 위 조직 염색. CLDN18.2를 발현하는 마우스 건강한 위 조직의 냉동된 조직 슬라이드를 hCl1a (A), hCl1b (B), hCl1c (C), hCl1f (D) 또는 IMAB362 (E) 항체로 염색하였다. 사진은 대표적인 IHC 이미지이다.
도 9: CLDN18.2를 과다발현하는 주사맞은 A549 세포로부터 발생하는 냉동된 종양 조직 염색. CLDN18.2를 발현하는 마우스 종양의 냉동된 조직 슬라이드를 hCl1a (A), hCl1f (B), IMAB362 (C) 또는 압캠(Abcam) 34H14L15 범-CLDN18 항체로 염색하였다. 사진은 대표적인 IHC 이미지이다.
도 10: 탈아미드화가 IMAB362의 결합 활성에 미치는 효과. CLDN18.2에의 IMAB362의 친화도는 탈아미드화 후, 감소한다.
도 11: PNU가 키메라 항체 cCl1-1 (A), cCl1-2 (B) 또는 cCl1-3 (C)의 HC, 또는 LC, 또는 HC 및 LC에 접합된 ADC의 HEK-293T-CLDN18.2 세포에 대한 시험관내 세포독성 검정법. ADC의 세포독성 활성을 동일한 방식으로 PNU에 접합된 IMAB362 또는 이소타입 대조군 Ac10에 기반한 ADC, 또는 제시되었을 때, 독소 MMAE가 MC-vc-PAB 효소-절단가능한 링커를 통해 항체에 접합된 IMAB362에 기반한 ADC의 세포독성 활성과 비교한다. 도 범례: ADC는, PNU가 항체의 중쇄 및 경쇄에 접합되었을 때, HC-LC-PNU로 표지되고, PNU가 오직 중쇄에만 접합되었을 때, HC-PNU로 표지되며, PNU가 오직 경쇄에만 접합되었을 때, LC-PNU로 표지된다. PNU와 접합된 모든 ADC는 -LPQTGG- 올리고펩티드 링커 및 에틸렌디아민 링커를 가진다. PNU가 경쇄에 접합될 때, 가요성 올리고펩티드 -GGGGS- 또한 존재한다. 표지에 존재할 때, G2는 올리고펩티드 링커 중 2개의 글리신을 나타낸다.
도 12: PNU가 키메라 항체 cCl1-1 (A), cCl1-2 (B) 또는 cCl1-3 (C)의 HC, 또는 LC, 또는 HC 및 LC에 접합된 ADC의 HEK-293T-CLDN18.1 세포에 대한 시험관내 세포독성 검정법. ADC의 세포독성 활성을 동일한 방식으로 PNU에 접합된 IMAB362 또는 이소타입 대조군 Ac10의 세포독성 활성과 비교한다. 도 범례: ADC는, PNU가 항체의 중쇄 및 경쇄에 접합되었을 때, HC-LC-PNU로 표지되고, PNU가 오직 중쇄에만 접합되었을 때, HC-PNU로 표지되며, PNU가 오직 경쇄에만 접합되었을 때, LC-PNU로 표지된다. PNU와 접합된 모든 ADC는 -LPQTGG- 올리고펩티드 링커 및 에틸렌디아민 링커를 가진다. PNU가 경쇄에 접합될 때, 가요성 올리고펩티드 -GGGGS- 또한 존재한다. 표지에 존재할 때, G2는 올리고펩티드 링커 중 2개의 글리신을 나타낸다.
도 13: PNU가 키메라 항체 cCl1-1 (A), cCl1-2 (B) 또는 cCl1-3 (C)의 HC, 또는 LC, 또는 HC 및 LC에 접합된 ADC의 BxPC-3-CLDN18.2 세포에 대한 시험관내 세포독성 검정법. ADC의 세포독성 활성을 동일한 방식으로 PNU에 접합된 IMAB362 또는 이소타입 대조군 Ac10의 세포독성 활성과 비교한다. 도 범례: ADC는, PNU가 항체의 중쇄 및 경쇄에 접합되었을 때, HC-LC-PNU로 표지되고, PNU가 오직 중쇄에만 접합되었을 때, HC-PNU로 표지되며, PNU가 오직 경쇄에만 접합되었을 때, LC-PNU로 표지된다. PNU와 접합된 모든 ADC는 -LPQTGG- 올리고펩티드 링커 및 에틸렌디아민 링커를 가진다. PNU가 경쇄에 접합될 때, 가요성 올리고펩티드 -GGGGS- 또한 존재한다. 표지에 존재할 때, G2는 올리고펩티드 링커 중 2개의 글리신을 나타낸다.
도 14: PNU가 키메라 항체 cCl1-1 (A), cCl1-2 (B) 또는 cCl1-3 (C)의 HC, 또는 LC, 또는 HC 및 LC에 접합된 ADC의 A549-CLDN18.2 세포에 대한 시험관내 세포독성 검정법. ADC의 세포독성 활성을 동일한 방식으로 PNU에 접합된 IMAB362 또는 이소타입 대조군 Ac10, 또는 독소 MMAE가 MC-vc-PAB 효소-절단가능한 링커를 통해 항체에 접합된 IMAB362에 기반한 ADC의 세포독성 활성과 비교한다. 도 범례: ADC는, PNU가 항체의 중쇄 및 경쇄에 접합되었을 때, HC-LC-PNU로 표지되고, PNU가 오직 중쇄에만 접합되었을 때, HC-PNU로 표지되며, PNU가 오직 경쇄에만 접합되었을 때, LC-PNU로 표지된다. PNU와 접합된 모든 ADC는 -LPQTGG- 올리고펩티드 링커 및 에틸렌디아민 링커를 가진다. PNU가 경쇄에 접합될 때, 가요성 올리고펩티드 -GGGGS- 또한 존재한다. 표지에 존재할 때, G2는 올리고펩티드 링커 중 2개의 글리신을 나타낸다.
도 15: PNU가 키메라 항체 cCl1-1 (A), cCl1-2 (B) 또는 cCl1-3 (C)의 HC, 또는 LC, 또는 HC 및 LC에 접합된 ADC의 A549-CLDN18.1 세포에 대한 시험관내 세포독성 검정법. ADC의 세포독성 활성을 동일한 방식으로 PNU에 접합된 IMAB362 또는 이소타입 대조군 Ac10, 또는 독소 MMAE가 MC-vc-PAB 효소-절단가능한 링커를 통해 항체에 접합된 IMAB362에 기반한 ADC의 세포독성 활성과 비교한다. 도 범례: ADC는, PNU가 항체의 중쇄 및 경쇄에 접합되었을 때, HC-LC-PNU로 표지되고, PNU가 오직 중쇄에만 접합되었을 때, HC-PNU로 표지되며, PNU가 오직 경쇄에만 접합되었을 때, LC-PNU로 표지된다. PNU와 접합된 모든 ADC는 -LPQTGG- 올리고펩티드 링커 및 에틸렌디아민 링커를 가진다. PNU가 경쇄에 접합될 때, 가요성 올리고펩티드 -GGGGS- 또한 존재한다. 표지에 존재할 때, G2는 올리고펩티드 링커 중 2개의 글리신을 나타낸다.
도 16: PNU가 키메라 항체 cCl1-1 (A), cCl1-2 (B) 또는 cCl1-3 (C)의 HC, 또는 LC, 또는 HC 및 LC에 접합된 ADC의 PATU-8988-S-고 세포에 대한 시험관내 세포독성 검정법. ADC의 세포독성 활성을 동일한 방식으로 PNU에 접합된 IMAB362 또는 이소타입 대조군 Ac10의 세포독성 활성과 비교한다. 도 범례: ADC는, PNU가 항체의 중쇄 및 경쇄에 접합되었을 때, HC-LC-PNU로 표지되고, PNU가 오직 중쇄에만 접합되었을 때, HC-PNU로 표지되며, PNU가 오직 경쇄에만 접합되었을 때, LC-PNU로 표지된다. PNU와 접합된 모든 ADC는 -LPQTGG- 올리고펩티드 링커 및 에틸렌디아민 링커를 가진다. PNU가 경쇄에 접합될 때, 가요성 올리고펩티드 -GGGGS- 또한 존재한다. 표지에 존재할 때, G2는 올리고펩티드 링커 중 2개의 글리신을 나타낸다.
도 17: PNU가 인간화 항체 hCl1a 내지 hCl1c (A), hCl1d 내지 hCl1f (B), hCl1g 내지 hCl11 (C) 및 hCl1j (D)의 LC에 접합된 ADC의 A549-CLDN18.2 세포에 대한 시험관내 세포독성 검정법. ADC의 세포독성 활성을 PNU가 키메라 cCl1-1 항체 또는 IMAB362의 LC에 접합된 ADC의 세포독성 활성과 비교한다. 도 범례: LC-PNU로 표지된 ADC는 [GGGGS]-[LPQTGG]-[에틸렌디아민] 링커를 통해 오직 경쇄에만 접합된 PNU를 가진다. 표지에 존재할 때, G2는 올리고펩티드 링커 중 2개의 글리신을 나타낸다.
도 18: PNU가 인간화 항체 hCl1a 내지 hCl1c (A), hCl1d 내지 hCl1f (B), hCl1g 내지 hCl11 (C) 및 hCl1j (D)의 LC에 접합된 ADC의 HEK-293T-CLDN18.2 세포에 대한 시험관내 세포독성 검정법. ADC의 세포독성 활성을 PNU가 키메라 cCl1-1 항체 또는 IMAB362의 LC에 접합된 ADC의 세포독성 활성과 비교한다. 도 범례: LC-PNU로 표지된 ADC는 [GGGGS]-[LPQTGG]-[에틸렌디아민] 링커를 통해 오직 경쇄에만 접합된 PNU를 가진다. 표지에 존재할 때, G2는 올리고펩티드 링커 중 2개의 글리신을 나타낸다.
도 19: PNU가 인간화 항체 hCl1a 내지 hCl1c (A), hCl1d 내지 hCl1f (B), hCl1g 내지 hCl11 (C) 및 hCl1j (D)의 LC에 접합된 ADC의 HEK-293T-CLDN18.1 세포에 대한 시험관내 세포독성 검정법. ADC의 세포독성 활성을 PNU가 키메라 cCl1-1 항체 또는 IMAB362의 LC에 접합된 ADC의 세포독성 활성과 비교한다. 도 범례: LC-PNU로 표지된 ADC는 [GGGGS]-[LPQTGG]-[에틸렌디아민] 링커를 통해 오직 경쇄에만 접합된 PNU를 가진다. 표지에 존재할 때, G2는 올리고펩티드 링커 중 2개의 글리신을 나타낸다.
도 20: PNU가 인간화 항체 hCl1a 내지 hCl1c (A), hCl1d 내지 hCl1f (B), hCl1g 내지 hCl11 (C) 및 hCl1j (D)의 LC에 접합된 ADC의 PATU-8988-S-고 세포에 대한 시험관내 세포독성 검정법. ADC의 세포독성 활성을 PNU가 키메라 cCl1-1 항체 또는 IMAB362의 LC에 접합된 ADC의 세포독성 활성과 비교한다. 도 범례: LC-PNU로 표지된 ADC는 [GGGGS]-[LPQTGG]-[에틸렌디아민] 링커를 통해 오직 경쇄에만 접합된 PNU를 가진다. 표지에 존재할 때, G2는 올리고펩티드 링커 중 2개의 글리신을 나타낸다.
도 21: ADC IMAB362-LC-G2-PNU와 비교된, 위 환자 유래 종양 이종이식편 모델 GXA 3037에서의 ADC hCl1a-LC-G2-PNU (A), hCl1f-LC-G2-PNU (B) 및 hCl1a(LALA)-LC-G2-PNU (C)의 생체내 효능. 각 ADC를 0.2 mg/kg/일, 0.6 mg/kg/일 또는 2 mg/kg/일로 시험한다. 도 범례: 모든 ADC는 [GGGGS]-[LPQTGG]-[에틸렌디아민] 링커를 통해 오직 경쇄에만 접합된 PNU를 가진다.
도 22: 이소타입 대조군 ADC Ac10-LC-G2-PNU와 비교된, 결장암 환자 유래 종양 이종이식편 모델 CXF 742에서의 ADC hCl1a-LC-G2-PNU의 생체내 효능. 각 ADC를 2 mg/kg/일로 시험한다. 도 범례: 모든 ADC는 [GGGGS]-[LPQTGG]-[에틸렌디아민] 링커를 통해 오직 경쇄에만 접합된 PNU를 가진다.
도 23: ADC IMAB362-LC-G2-PNU와 비교된, 췌장암 환자 유래 종양 이종이식편 모델 PAXF 2175에서의 ADC hCl1a-LC-G2-PNU (A) 및 hCl1a(LALA)-LC-G2-PNU (B)의 생체내 효능. 각 ADC를 0.2 mg/kg/일 또는 0.6 mg/kg/일로 시험한다. 도 범례: 모든 ADC는 [GGGGS]-[LPQTGG]-[에틸렌디아민] 링커를 통해 오직 경쇄에만 접합된 PNU를 가진다.
도 24: 이소타입 대조군 ADC Ac10-LC-G2-PNU와 비교된, 폐암 환자 유래 종양 이종이식편 모델 LIXFC 2050에서의 ADC hCl1a-LC-G2-PNU의 생체내 효능. 각 ADC를 2 mg/kg/일로 시험한다. 도 범례: 모든 ADC는 [GGGGS]-[LPQTGG]-[에틸렌디아민] 링커를 통해 오직 경쇄에만 접합된 PNU를 가진다.
도 25: PNU가 스페이서 요소 -GGGGS-, 올리고펩티드 링커 요소 -LPQTGG- 및 PNU의 C13에 연결된 비-절단가능한 링커 요소 EDA를 통해 항체 LC에 접합된 ADC의 그래프로 나타낸 대표도. 도 범례: 모든 ADC는 [GGGGS]-[LPQTGG]-[에틸렌디아민] 링커를 통해 오직 경쇄에만 접합된 PNU를 가진다.
실시예
실시예 1: 키메라 및 인간화 항체의 생성
모노클로날 항체를 생성하는 기술은 잘 확립되어 있다. 문헌 [The Handbook of Therapeutic Antibodies, Second Edition (2014)]은 상기 기술, 예컨대, 마우스 또는 래트의 면역화에 의한 모노클로날 항체 생산 (Moldenhauer 2014), 모노클로날 항체의 인간화 (Saldanha 2014), 항체 분석을 위한 생물정보학 도구 (Martin and Allemn 2014) 또는 치료 항체의 개발 및 제조 (Jacobi et al. 2014)에 대한 충분한 정보를 제공한다. 간략하면, CLDN18.2에 대한 모노클로날 항체는 인간 CLDN18.2 cDNA (huCLDN18.2) (NCBI 참조 서열: NM_001002026.3)를 코딩하는 플라스미드로 래트를 DNA 면역화하여 생성하였다. huCLDN18.2에 대한 래트 면역 혈청의 특이적 반응성을 유세포 분석법 (FC 분석) 및 ELISA에 의해 분석하였다. 이어서, 키메라 항체를 수득하기 위해, 면역화된 래트로부터 단리된 림프구로부터 하이브리도마 클론을 생성하였다. 3개의 클론이 CLDN18.2-특이적인 것으로 확인되었고, 그 결과로 유사한 CDR을 갖는 cCl1-1, cCl1-2 및 cCl1-3으로 명명되는 키메라 항체를 수득하였다 (표 3 참조). 이어서, cCl1-1 cCl1-2 및 cCl1-3을 인간화하여, hCl1a, hCl1b, hCl1c, hCl1d, hCl1e, hCl1f, hCl1g, hCl1h, hCl1i 및 hCl1j 항체로 명명되는 10개의 인간화 클론을 수득하였다 (표 3 참조). 상기 항체를 ADC를 생성하는 데에도 또한 사용하였다.
대조군으로서, WO2013/174509에 공개된 바와 같고, 2006년 10월 26일 DSMZ-도이체 잠룽 폰 미크로오르가니즈멘 운트 젤쿨투렌 게엠베하 (독일 38124 브라운슈바이크 인호펜슈트라쎄 7베)에 기탁된 모노클로날 항체 182-D1106-362, 수탁 번호 DSM ACC2810으로 명명되는, 중쇄 (서열식별번호 55) 및 경쇄 (서열식별번호 56)의 서열을 사용하여 IMAB362 항체를 합성하였다.
표 3: 항체 핵산 및 아미노산 서열
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HC의 C-말단 단부에 LPQTGG 태그 (서열식별번호 131) 및/또는 LC의 C-말단 단부에 GGGGSLPQTGG 태그 (서열식별번호 132)를 함유하도록 추가 실시예 2 내지 5에 기술된 항체를 변형시켰다. 이 경우, HC 상의 C-말단 리신 (K)을 태그의 Arg (R)로 대체하였다. 태그 부가는 항체의 CLDN18.2에 대한 친화도 및 특이성을 변경시키지 않았다.
실시예 2: 키메라 및 인간화 항체 변이체의 CLDN18 .2에의 결합을 확인하기 위한 ELISA 검정법 및 FC 적정
항원 공급원으로서 CLDN18.2를 보유하는 리포입자를 사용하여 ELISA 검정법에서 키메라 및 인간화 항체 (hCl)의 CLDN18.2에의 결합 친화성을 시험하였다. CLDN18.2-리포입자 및 널-리포입자 (음성 대조군으로서 결합된 항원 부재)를 사용하여 10 U/ml의 최종 농도로 96-웰 플레이트를 코팅하였다. PBS/0.05% 트윈(Tween)-20 (PBS-T)으로의 세척 및 37℃에서 적어도 1 h 동안 PBS-T/3% BSA로의 차단시, 2 ㎍/ml의 출발 농도로 시험된 항체의 1:3 연속 희석액을 코팅된 웰에 첨가하고, 37℃에서 적어도 1 h 동안 인큐베이션시켰다. HRP-염소 항-인간 2차 항체의 결합, 퍼옥시다제 기질로서 SIGMAFAST™ OPD를 이용한 발색을 통해 결합된 항체의 존재를 밝혀냈고, 반응은 2 M H2SO4를 첨가하여 정지시킨 후, ELISA 플레이트 판독기 상에서 490 nm에서 OD를 판독하였다. 대표적인 결합 곡선은 도 1에 제시되어 있다. 본 발명의 시험된 항체 모두 리포입자를 함유하는 CLDN18.2에 특이적으로 결합한다. 흥미롭게도, 키메라 항체의 인간화는 모체 키메라 cCl1-1 항체와 비교하여 예상할 수 있는 바와 같이 친화도를 감소시키지 못했고, 심지어 10개의 항체 중 6개는 그의 친화도를 증가시켰다.
CLDN18.2를 과다발현하는 PA-TU-8988S 세포 (크리에이티브 바이오어레이(Creative Bioarray), 카탈로그 번호 CSC-C0326) 및 HEK293T (ATCC, CRL-3216™) 세포를 사용한 FC 적정에 의해 시험하여 CLDN18.2에 대한 키메라 및 인간화 항체의 결합 또한 시험하였다. FC 적정을 통해 시험된 항체의 최대 유효 농도의 절반 (EC50)을 측정할 수 있다. 고수준으로 CLDN18.2를 발현하는 PA-TU-8988S 세포를 FACS에 의해 선택하였다. 본원에서, 상기 세포를 PA-TU-8988S-고 세포로 명명하였다. IMAB362를 이용한 FACS 염색에 기초하여, PA-TU-8988S 세포 집단은 높은 발현 수준 및 중간 발현 수준으로 상이한 수준의 CLDN18.2를 발현한다 (도 2A 참조). 더욱 균질한 세포 집단을 갖기 위해, FACS에 의해 세포를 분류하여 더 높은 CLDN18.2 발현을 보이는 세포만을 선택하였다. 간략하면, FACS 완충제 (PBS, 2% FCS) 중에 현탁된 PA-TU-8988S 세포를 2 ㎍/ml로 IMAB362와 함께 얼음 상에서 30 min 동안 인큐베이션시켰다. FACS 완충제 중에서 세척한 후, 세포를 PE-표지된 Fcγ 특이적 IgG 염소 항-인간 2차 항체 (e바이오사이언스)와 함께 얼음 상에서 30 min 동안 인큐베이션시켰다. 세척 후, 염색된 세포를 FACS 완충제 중에 재현탁시키고, FACSAria™ 기기로 분석하고, 분류하여 중간 발현 세포를 고발현 세포 (도 2B)로부터 분리하였다. 분류 후, 수집된 PA-TU-8988S-고 세포를 성장 배지 중에 재현탁시키고, 성장 배지 중에서 확장시키고, 냉동된 분취물을 액체 N2 중에서 보존시켰다. CLDN18.2 또는 CLDN18.1을 과다발현하는 HEK293T 세포를 실시예 3에 기술된 바와 같이 생성하고, CLDN18.2의 발현을 유세포 분석법에 의해 분석하였다 (도 3).
CLDN18.2에의 항체의 결합을 정량화하기 위해, CLDN18.2를 과다발현하는 HEK293T 세포, 또는 PA-TU-8988-고 세포를 250 x 103개의 세포/웰로 FC 완충제 (PBS/2% FBS) 중 96-웰 플레이트에 시딩하고, 원심분리에 의해 침전시켰다. IMAB362 및 시험하고자 하는 hCl 항체를 20 ㎍/ml로 희석시킨 후, 1:4로 연속 희석하고, 플레이팅된 세포와 함께 4℃에서 30 min 동안 인큐베이션시켰다. FC 완충제로 세척한 후, PE-커플링된 2차 항-인간 IgG 항체를 4℃에서 추가로 30 min 동안 세포에 첨가하고, 이어서, FC 완충제로 추가로 세척하였다. 이어서, 세포를 100 ㎕ FC 완충제 중에 재현탁시키고, FACSCalibur™ 세포 분석기 (BD 바이오사이언시스(BD Biosciences: 미국))로 측정하였다. FC 분석 (도 5 및 표 4 참조)은, 비록 maxMFI 값은 IMAB362와 동일 범위지만, hCl 항체가 IMAB362보다 더 높은 EC50 값을 갖는다는 것을 보여준다. maxMFI 값이 유사하다는 것은 IMAB362 및 hCl 항체에 대한 온/오프 속도가 유사하다는 것을 시사하는 것일 수 있다.
표 4: CLDN18 .2를 과다발현하는 HEK293T 세포주에서 및 PA-TU-8988S-고 세포주에서 모든 hCl 및 IMAB362 항체에 대해 측정된 최대 MFI 및 EC50 (㎍/ml).
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실시예 3: hCLDN18 .1 및 hCLDN18 .2를 안정적으로 발현하는 프리 -B 세포 L11 세포, BxPC -3 및 HEK293 T 세포의 생성; 키메라 및 인간화 항체의 결합 특이성 시험.
프리-B 세포 L11 세포주 (Waldmeier et al. 2016), BxPC-3 (ATCC CRL-1687™) 세포주 및 HEK293T (ATCC CRL-3216™) 및 A549 (ATCC CCL-185™) 세포주는 CLDN18.1 또는 CLDN18.2를 내인적으로 발현하지 않는다. 따라서, 항체 결합을 시험하기 위해, HEK293T 및 A549 세포주에서 CLDN18.1 또는 CLDN18.2를 재조합적으로 과다발현시켰다. 트랜스포사제 발현 구축물 (pcDNA3.1-hy-mPB), 퓨로마이신 내성 카세트와 함께 전이성 전장 huCLDN18.1 (pPB-Puro-huCLDN18.1) 또는 huCLDN18.2 (pPB-Puro-huCLDN18.2)를 보유하는 구축물, 및 형질감염 대조군으로서 EGFP를 보유하는 구축물 (pEGFP-N3) (Waldmeier et al. 2016)로 전기천공에 의해 세포를 공동 형질감염시켰다. 전기천공시, 세포를 L11 세포의 경우, 7.5% CO2 대기하에 및 HEK293T 세포 및 A549 세포의 경우, 5% CO2 대기하에 가습 인큐베이터에서 37℃하에 성장 배지 중에서 2일 동안 회복시켰다. EGFP 발현의 FC 분석에 의해 형질감염을 확인하였다. 이어서, 1 ㎍/ml로 배양물에 퓨로마이신을 첨가하여 CLDN18.1 또는 CLDN18.2를 발현하는 세포를 선택하고, 10% DMSO를 포함하는 FCS에서 냉동 스톡을 생성할 수 있도록 추가로 확장시켰다. 형질감염된 세포에서 CLDN18.1 및 CLDN18.2의 발현을 FC에 의해 분석하였다 (도 3 참조). 요약하면, 현탁액 중에서 성장시킨, 트립신 처리된 HEK293T 및 A549 세포, 및 L11세포를 원심분리에 의해 수집하고, PBS/2% FCS에 재현탁시키고, 얼음 상에서 30 min 동안 2 ㎍/ml로 1차 항체로서 IMAB362를 사용하여 CLDN18.2에 대해 염색하고, PBS/2% FCS에서의 세척시, 얼음 상에서 30 min 동안 2차 항체로서 항-인간 IgG (Fc 감마-특이적) PE 염소 항체 (e바이오사이언스)로 염색하였다. 추가 세척시, FACSCalibur™ 기기를 사용하여 빙냉 FC 완충제 중 재현탁된 염색된 세포를 분석하였다 (도 4 및 도 5 참조). CLDN18.2를 발현하지 않는, 형질감염되지 않은 모체 세포를 음성 대조군으로 사용하였다. CLDN18.1 및 CLDN18.2를 인식하는 독점 범-CLDN18 항체를 사용하여 CLDN18.1의 발현을 유사한 방식으로 분석하였다 (도 3 참조). 예컨대, 오리진 테크놀러지즈(OriGene Technologies)에 의해 제공받은 항체 항클라우딘-18/CLDN18 (C-term) (카탈로그 번호 AP50944PU-N), 마이바이오소스(MyBioSource)로부터의 CLDN18 (C-Term) 토끼 pAb (카탈로그 번호 MBS8555451) 또는 ProSci로부터의 CLDN18 항체 (카탈로그 번호 63-847)와 같이, 유세포 분석법 측정에 사용가능한 임의의 범-CLDN18 항체 또한 적합할 것이다.
결과적으로, huCLDN18.1 및 huCLDN18.2를 안정적으로 발현하는 L11 및 HEK293T 세포를 사용하여 키메라 항체 cCl1-1, cCl1-2, cCl1-3 및 인간화 항체의 CLDN18.1이 아닌, CLDN18.2에의 결합 특이성을 시험하였다. 세포를 2 ㎍/ml의 항체를 사용하여 얼음 상에서 30 min 동안 염색하고, PBS/2% FCS 중에서의 세척시, 얼음 상에서 30 min 동안 2차 항체로서 항-인간 IgG (Fc 감마-특이적) PE 염소 항체 (e바이오사이언스)로 염색하였다. 3개의 키메라 항체 (도 4) 및 인간화 항체 (도 5), 모두 L11 또는 HEK293T 세포에 의해 발현된 huCLDN18.2에는 결합하지만, huCLDN18.1에는 결합하지 않는다. 추가로, 인간화 항체는 IMAB362와 유사한 친화도로, 및 적어도 cCl1-1만큼 우수한 친화도로 huCLDN18.2에 결합한다 (도 5).
실시예 4: 생 종양 조직 및 생 위 조직에 대한 유세포 분석법에 의한 인간화 CLDN18.2 항체 결합 활성 시험
A549 (ATCC CCL-185™) 세포주는 CLDN18.1 또는 CLDN18.2를 내인적으로 발현하지 않는다. CLDN18.2에의 항체 결합을 시험하기 위해, A549 세포에서 CLDN18.2를 발현시켰다. 트랜스포사제 발현 구축물 (pcDNA3.1-hy-mPB) (Klose et al. 2017), 퓨로마이신 발현 카세트와 함께 전이성 전장 huCldn18.2 (pPB-Puro-huCldn18.1)를 보유하는 구축물, 및 형질감염 대조군으로서 EGFP를 보유하는 구축물 (pEGFP-N3) (Waldmeier et al. 2016)로 전기천공에 의해 A549 세포를 공동 형질감염시켰다. 전기천공시, 세포를 5% CO2 대기하에 가습 인큐베이터에서 37℃하에 성장 배지 중에서 2일 동안 회복시켰다. EGFP 발현의 FC 분석에 의해 형질감염을 확인하였다. 이어서, 1 ㎍/ml로 배양물에 퓨로마이신을 첨가하여 CLDN18.1 또는 CLDN18.2를 발현하는 세포를 선택하고, 10% DMSO를 포함하는 FCS에서 냉동 스톡을 생성할 수 있도록 추가로 확장시켰다. 형질감염된 세포에서 CLDN18.2의 발현을 FC에 의해 분석하였다. 요약하면, 트립신 처리된 A549 세포를 원심분리에 의해 수집하고, PBS/2% FCS에 재현탁시키고, 얼음 상에서 30 min 동안 2 ㎍/ml로 1차 항체로서 IMAB362를 사용하여 CLDN18.2에 대해 염색하고, PBS/2% FCS에서의 세척시, 얼음 상에서 30 min 동안 2차 항체로서 항-인간 IgG (Fc 감마-특이적) PE 염소 항체 2.5 ㎍/ml (e바이오사이언스)로 염색하였다. 추가 세척시, FACSCalibur™ 기기를 사용하여 빙냉 FC 완충제 중 재현탁된 염색된 세포를 분석하였다 (도 6 참조). CLDN18.2를 발현하지 않는, 형질감염되지 않은 모체 세포를 음성 대조군으로 사용하였다. 상기 세포는 2019년 12월 6일 DSMZ-도이체 잠룽 폰 미크로오르가니즈멘 운트 젤쿨투렌 게엠베하 (독일 38124 브라운슈바이크 인호펜슈트라쎄 7베)에 기탁되었고, 이는 수탁 번호 DSM ACC3360하에 이용가능하다.
100 ㎕의 50% 마트리겔(Matrigel) 중 1x106개의, CLDN18.2를 발현하는 A549 세포를 Balb/c 마우스 2마리에 피하로 이식하고, 종양이 원하는 크기 150-450 ㎣에 도달할 때까지 몇 주에 걸쳐 종양 성장을 모니터링하였다. 건강한 위 조직과 종양 조직을 FC 분석을 위해 수집하였다. 수집된 조직을 작은 조각으로 절단하고, 밀테니이(Miltenyi) 종양 해리 키트 (MACS 밀테니이 바이오테크(MACS Miltenyi Biotec: 독일))로 분해시켰다. 조직 조각을 영구적으로 온화하게 흔들어 주면서 37℃에서 30 min 동안 6 웰 플레이트에서 (제조사 설명서에 따라 제조된) 해리 완충제와 함께 인큐베이션시켰다. 샘플을 재현탁시키고, 70 ㎛ 세포 스트레이너 (코닝(Corning: 미국))를 통해 스트레이닝한 후, 이어서, 20 ml FC 완충제 (PBS + 2% FBS)로 세척하였다. 세포 현탁액을 원심분리하고 (4℃에서 400 g로 5 min 동안), 상청액을 폐기하였다. 필요한 경우, 세포 현탁액을 스트레이너에 통과시키고, 반복하여 원심분리하고, 펠릿을 5 ml의 적혈구 용해 완충제 (바이오레전드(Biolegend: 미국))에 재현탁시키고, 얼음 상에서 4 min 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, 25 ml의 PBS를 첨가하고, 현탁액을 다시 원심분리하였다 (4℃에서 400 g로 5 min 동안). 펠릿을 FC 완충제 (펠릿 기준으로 0.5 - 3 ml)에 재현탁시켰다. 동일한 개수의 세포를 96 웰 플레이트로 옮기고, FC 분석을 위해 추가로 프로세싱하였다. 플레이트 중의 세포를 PBS로 세척하고, 원심분리하였다 (4℃에서 400 g로 2 min 동안). 펠릿을 50 ㎕/웰의, PBS 중 희석된 선택된 항체 (cCl1-1, hCl1a, hCl1b, hCl1c 및 hCl1f (4 ㎍/ml); IMAB364 (2 ㎍/ml)) 및 AF488-표지된 AE1/AE3 범-시토케라틴 항체 (써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific: 미국))로 이루어진 염색 믹스에 재현탁시키고, 얼음 상에서 25 min 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, 세포를 PBS 중에서 2회 세척하고, 원심분리하였다 (4℃에서 400 g로 2 min 동안). 펠릿을 50 ㎕/웰의 2차 염색 혼합물 ((PBS + PE-표지된 항-인간 항체) (써모 피셔 사이언티픽: 미국)에 재현탁시키고, 얼음 상에서 25 min 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, 세포를 다시 PBS 중에서 2회 세척하였다. 펠릿을 DAPI를 함유하는 PBS 100 ㎕ 중에 재현탁시켰다. 플레이트는 FC 분석시까지 얼음 상에서 보관하였다. FC 분석을 위해, 전방 산란 및 DAPI 염색에 의해 생 세포를 죽은 세포로부터 분리하였다. 이어서, 생 세포를 시토케라틴 (AF888 양성) 및 결합된 CLDN18.2 항체 (PE 양성 세포) 존재에 대하여 게이팅하였다. FC 분석 결과는 도 7 및 표 5에서 볼 수 있다. 결과는 마우스 2마리로부터 얻은 데이터의 평균이다.
시험된 항체 (cCl1-1, hCl1a, hCl1b, hCl1c, hCl1f 및 IMAB364) 모두 대략 20% 내지 30%의 유사한 비율로 CLDN18.2 보유 종양 세포에 결합하였다. 그러나, 놀랍게도, 오직 IMAB362만이 CLDN18.2를 보유하는 건강한 위 세포에 결합하였지만, 건강한 위 세포에 1% 미만으로 결합하는 바, cCl1-1, hCl1a, hCl1b, hCl1c 및 hCl1f의 결합은 거의 검출할 수 없었다. CLDN18.2를 발현하는 주사된 A549 세포에서 유래한 CLDN18.2 발현 종양 세포와 건강한 위 세포 사이의 결합 능력의 차이는 또한 양성 종양 세포의 비율(%)을 양성 위 세포의 비율(%)로 나눈 비로 표시하였다 (표 5 마지막 열 참조). 상기 비는 IMAB362의 경우, 5 미만이고 평균적으로 1에 가까웠고, 시험된 cCl1-1의 인간화 클론 (hCl1a, hCl1b, hCl1c 및 hCl1f)의 경우, 15 초과, 평균적으로 30 초과였다.
표 5: 건강한 위 세포 및 종양 세포에의 선택된 항체의 FC 결합 데이터 및 결합 비.
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그러므로, cCl1-1 및 시험된 cCl1-1의 인간화 클론 (hCl1a, hCl1b, hCl1c 및 hCl1f)은 건강한 위 세포 대비 종양 세포에 대해 증가된 결합을 나타내며, 따라서, 이는 종양 특이적 CLDN18.2 항체이다. 그에 반해, IMAB362는 CLDN18.2를 보유하는 종양 세포를 CLDN18.2를 보유하는 건강한 위 세포와 구별하지 못한다.
실시예 5: 냉동된 조직 샘플에 대한 면역조직화학법 (IHC)에 의한 인간화 CLDN18.2 항체의 시험
CLDN18.2를 발현하는 1x106개의 A549 세포를 피하로 이식받은 Balb/c 마우스로부터 수득된 CLDN18.2를 발현하는 신선한 위 및 종양 조직 샘플을 적합한 조직 몰드에서 OCT 중에서 급냉시켰다. 5-15 ㎛ 두께의 조직 절편을 -20℃에서 냉동조직절단기로 절단하고, 실온 (RT)에서 현미경 슬라이드로 옮긴 후, 이어서, IHC 염색시까지 냉동 상태로 유지시켰다. 염색 전, 슬라이드를 RT로 복귀시키고, 미리 냉각된 아세톤 (-20℃)에서 10 min 동안 고정시켰다. RT에서 아세톤 증발 후, 슬라이드를 TBS 중에서 세정하고, 프로세싱하여 비특이적 염색 부위를 차단하고: 슬라이드를 RT에서 15 min 동안 0.3% H2O2 중에서 인큐베이션시킨 후, 이어서, TBS 세척하고, 퍼옥시다제 차단 용액 (애질런트(Agilent: 미국))에서 RT에서 60 min 동안 인큐베이션시켰다. 차단 후, 슬라이드는 항체 염색을 위해 프로세싱하였고: 슬라이드를 RT에서 120 min 동안 1차 항체 (hCL1a, hCl1b, hCl1c, hCl1f, IMAB362 및 34H14L15 범-CLDN18 항체 (압캠: 미국))와 함께 인큐베이션시킨 후, TBS 중에서 세척한 후, 이어서, RT에서 30 min 동안 HRP-접합된 항-인간 항체 (또는 범-CLDN18 항체의 경우, 항-토끼 항체)와 함께 인큐베이션시켰다. 제조업체의 지침에 따라 DAB+ 기질 크로모겐(Chromogen) 시스템 (애질런트: 미국)으로 슬라이드를 처리함으로써 조직 절편 상의 CLDN18.2 또는 범-CLDN18에 결합하는 항체를 밝혀냈다. 후속 TBS 세척 후, 슬라이드를 헤마톡실린으로 대조염색하고, 15 min 동안 dH2O로 세정하고, 순차적으로 95% 및 100% 에탄올로 세척하여 탈수시킨 후, 이어서, 추가로, 크실렌 중에서 슬라이드를 추가로 세정하였다. 마지막으로, 글리세롤 마운팅 매질 (애질런트: 미국) 중에서 슬라이드에 커버슬립을 마운팅하였다. 건강한 마우스 위 조직 및 마우스 종양 조직의 염색의 대표적인 현미경 이미지는 각각 도 8 및 도 9에서 살펴볼 수 있다.
도 8은 건강한 위 조직의 대표적인 염색을 보여주는 것이다. hCL1a, hCl1b, hCl1c 및 hCl1f (각각 패널 A, B, C 및 D)로 공동 염색된 조직에서는 핵의 헤마톡실린 염색만 볼 수 있으며, IMAB362로 공동 염색으로 염색된 조직 (패널 E)은 막성 CLDN18.2 DAB 염색을 보여주는 것이다. 따라서, 시험된 cCl1-1의 인간화 클론 (hCL1a, hCl1b, hCl1c 및 hCl1f)은 CLDN18.2를 발현하는 건강한 위 조직에 결합하는 IMAB362와 달리 CLDN18.2를 발현하는 건강한 위 조직에 결합하지 않는다. 추가로, 도 9는 종양 조직의 대표적인 염색을 보여주는 것이고, 패널 A, B, C 및 D는 각각 hCl1a, hCl1f, IMAB362 및 압캠 34H14L15 범-CLDN18 항체로 염색된 종양 조직의 대표적인 이미지이다. 시험된 항체로 염색된 종양 모두 강한 막성 CLDN18.2 DAB 염색을 나타낸다. 시험된 cCl1-1의 인간화 클론 (hCL1a 및 hCl1f)은 IMAB362 또는 범-CLDN18 항체와 유사하게 CLDN18.2를 발현하는 마우스 종양 조직에 결합하였다. 따라서, cCl1-1의 인간화 클론은 CLDN18.2를 발현하는 건강한 위 조직과 비교하여 CLDN18.2를 발현하는 종양 조직에 대하여 증가된 결합을 나타낸다.
실시예 6: 인간화 항체 ( hCl ) 변이체 및 IMAB362의 Asn - 탈아미드화 및 Asp-이성질체화 가능성 분석
Asn (N) 잔기의 탈아미드화 및 Asp (D) 잔기의 이성질체화는 생물의약품 제조, 보관 또는 임상 적용 (생체내) 중에 발생할 수 있다. 탈아미드화 및 이성질체화는 단백질 구조, 기능, 활성, 안정성 및 면역원성에 잠재적인 변화를 일으킬 수 있다. 따라서, 특히 규제 상황에서 최소화되고, 제어되어야 한다. Asn 탈아미드화 및 Asp 이성질체화 모티프의 존재는 인-실리코로 분석될 수 있다. 가장 일반적인 Asn 탈아미드화 모티프는 NG 모티프이고, 가장 일반적인 Asp-이성질체화 모티프는 DG 모티프에 있다.
상기 인-실리코 분석 결과, 모든 hCl 항체가 VL의 제2 CDR에 잠재적인 DG Asp-이성질체화 모티프를 갖고, hCl 항체 또는 IMAB362 중 어느 것도 그들의 CDR에 잠재적인 NG 탈아미드화 모티프를 갖지 않는 것으로 나타났다. 인-실리코 예측을 검증하기 위해, hCl 항체 및 IMAB362는 높은 pH 또는 낮은 pH 및 열에서 스트레스 받았고, 이로써, 제조 프로세스 및 장기 보관 동안 발생할 수 있는 변형을 가속화시켰다. 간략하면, 항체 샘플을 아미콘(Amicon) 원심분리 필터를 사용하는 Asn-탈아미드화 스트레스 시험의 경우, 20 mM 인산나트륨 완충제, pH 8.0으로, 또는 Asp-이성질체화 스트레스 시험의 경우, 20 mM 시트레이트 완충제, pH 5.5로 완충제 교환하고, 샘플을 3.0 mg/ml 최종 농도로 희석시켰다. 30 ㎕의 샘플을 가열된 응축 방지 뚜껑이 있는 열 블록에서 40℃하에 1주 (Asn-탈아미드화) 또는 2주 (Asp-이성질체화) 동안 인큐베이션시켰다. 스트레스 받은 샘플 및 스트레스 받지 않은 샘플을 -80℃에서 보관하였다. 샘플의 Asn-탈아미드화 및 Asp-이성질체화는 강한 양이온 교환 (SCX) 크로마토그래피에 의해 분석하였다. Asn의 탈아미드화는 SCX 크로마토그램에서 주요 피크 전 (bM)의 피크 면적 증가로 이어지는 반면, Asp-이성질체화는 SCX 크로마토그래프에서 주요 피크 후 (aM)의 피크 면적 증가로 이어진다 (Du et al. 2012). pH 4.0의 완충제 A 및 pH 11.0의 완충제 B를 사용하여 MAbPac SCX-10 칼럼 (써모피셔 사이언티픽(ThermoFisher Scientific: 스위스 바젤))에서 SCX 크로마토그래피를 수행하였다. 유속은 0.5 ml/min이고, pH 구배는 30-80% 완충제 B였다. 20 ㎕의 완충제 A 중 10 ㎍의 샘플을 칼럼에 주입하였다. 샘플 검출은 280 nm에서 단백질 흡광도에 의해 수행하였다. hCl 항체는 약 27.9-32.2%의 bM 증가만을 보였고 (표 6 참조), 이는 중요한 것으로 평가되지 않았다. 그러나, IMAB362는 이 항체가 가변 도메인에 NG 모티프를 갖지 않음에도 불구하고 40.9%의 현저한 bM 증가를 나타내었다 (표 6 참조). 본 발명의 항-CLDN18.2 모노클로날 항체와 대조적으로, IMAB362는 위치 HC CDR3 (aa 103-104)(서열식별번호 55) 및 LC CDR 1 (aa 31-32) (서열식별번호 56)에 2개의 NS 모티프를 갖는다. NS 모티프는 탈아미드화에 대한 가능성이 두 번째로 높은 모티프이다.
표 6: mAB의 탈아미드화 스트레스 시험, 강한 양이온 교환 (SCX) 크로마토그래피
Figure pct00037
항원 공급원으로서 CLDN18.2를 보유하는 리포입자를 사용하여 ELISA 검정법에서 hCl1a, hCl1i 및 IMAB362의 CLDN18.2에 대한 결합 친화도에 대해 Asn-탈아미드화 스트레스 시험이 미치는 영향을 시험하였다. CLDN18.2-리포입자 및 널-리포입자 (항원 부재)를 사용하여 100 mM 탄산나트륨 (pH 9.6) 중 10 U/ml의 최종 농도로 96 웰 플레이트를 코팅하였다. PBS/0.05% 트윈-20(PBS-T)으로의 세척 및 37℃에서 적어도 1 h 동안 PBS-T/3% BSA로의 차단시, 2 ㎍/ml의 출발 농도로 hCl 항체의 1:3 연속 희석액을 첨가하고, 37℃에서 적어도 1 h 동안 인큐베이션시켰다. HRP-염소 항-인간 2차 항체의 결합, 퍼옥시다제 기질로서 시그마-패스트(Sigma-Fast) OPD를 이용한 발색을 통해 결합된 항체의 존재를 밝혀냈고, 반응은 2 M H2SO4를 첨가하여 정지시킨 후, ELISA 플레이트 판독기 상에서 OD-490에서 판독을 수행하였다. IMAB362 EC50 값은 탈아미드화 스트레스 시험 후 1.8배 더 높았다 (스트레스 받지 않은 참조: EC50 51.5 ng/ml, 스트레스 받은 경우: EC50 95.09 ng/ml) (도 10 참조). 이는 탈아미드화 스트레스 시험 후 SCX에서 40.9%의 bM 증가와 관련이 있을 수 있다 (표 6 참조). SCX Asn-탈아미드화 결과를 확인한 결과, hCl1a 및 hCl1i에 대한 탈아미드화 스트레스 시험 후 항원 결합에 어떤 유의적인 차이도 관찰되지 않았다 (표 6 참조). 따라서, 탈아미드화 스트레스 시험은 hCl 항체가 IMAB362보다 탈아미드화 및 잠재적으로 표적 결합이 감소하는 경향이 더 적고, 예상대로 제조, 보관 및 임상 적용 (생체내) 동안 더 안정적이며, 그 결과로, 더욱 균일하고, 활성이 큰 항체/생성물을 생성한다는 것을 보여준다.
비록 모든 hCl 항체는 VL의 제2 CDR 및 HC의 CH2 및 CH3 도메인 (VL-CDR2 (위치 62), CH2 (위치 282), CH3 (위치 403))에 잠재적인 DG Asp-이성질체화 모티프를 갖지만, Asp-이성질체화 스트레스 시험는 듀 등(Du et al.)(Du et al. 2012)으로부터 예측할 수 있었던 것과 달리 Asp-이성질체화를 밝혀내지 못했다 (표 7 참조). 스트레스 받지 않은 샘플 (IMAB362 제외)의 aM 값은 이미 눈에 띄게 높았다. 이는 중쇄의 리신 클리핑 변이체 때문일 수 있다. IMAB362는 스트레스 받지 않은 샘플에서 높은 aM이 없는 유일한 항체였다. IMAB362는 C-말단 Lys가 없는 유일의 시험된 항-CLDN18.2 항체이며, 이는 hCl 항체의 경우, C-말단 Lys 클리핑이 스트레스 받지 않은 샘플 및 스트레스 받은 샘플에서 aM 증가에 대해 가능성이 가장 높은 이유임을 시사한다.
표 7: mAb의 Asp-이성질체화 스트레스 시험, 강한 양이온 교환 (SCX) 크로마토그래피
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실시예 7: 소르타제 매개 접합을 사용하여 ADC를 형성하기 위한 글리신 변형 독소와 mAb의 접합.
소르타제 A 효소: W02014140317A1에 개시된 바와 같이 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로부터의 재조합 및 친화성 정제된 소르타제 A 효소를 이. 콜라이(E. coli)에서 생산하였다.
글리신-변형 독소의 생성: 비글리신-변형 EDA-안트라사이클린 유도체 GG-EDA-PNU-159682 (도 25 또한 참조)는 레베나 바이오파마(Levena Biopharma: 미국 샌디에이고)에서 제조되었다. 여기서 독소 PNU-159682는 비-절단가능한 링커 EDA 및 올리고펩티드 링커 GG를 이미 포함하도록 합성하였다. 글리신-변형 독소의 아이덴티티 및 순도는 질량분석법 및 HPLC로 확인하였다. 글리신-변형된 독소는 HPLC 크로마토그래피에 의해 측정된 바, > 95%의 순도를 나타내었다.
소르타제-매개 항체 접합: 상기 언급된 독소를 표 3에 따른 중쇄 및 경쇄, 또는 경쇄 단독의 LPQTG-태그부착된 항-CLDN18.2 항체 및 비교 항체 (IMAB362, CD30-특이적 항체 AC10)에 접합시켰다. 대안적으로, 독소를 오직 항체의 경쇄에만 접합시켰다. 중쇄 및 경쇄, 또는 경쇄 단독의 LPQTG-태그부착된 mAb를 20 μM로 100 μM의 글리신-변형된 독소 및 4 μM의 소르타제 A와 함께 접합 완충제 (50 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 10% 글리세롤)의 존재하에 3.5h 동안 25℃에서, 또는 밤새도록 4℃에서 인큐베이션시킴으로써 항체를 독소에 접합시켰다. r프로테인 A 그래비트랩(rProtein A GraviTrap) 칼럼 (GE 헬쓰케어(GE Healthcare))을 통해 통과시켜 반응을 정지시켰다. 칼럼을 36 칼럼 부피의 세척 완충제 (25 mM HEPES (pH 7.5), 150 mM NaCl, 10% (v/v) 글리세롤)로 세척하였다. 결합된 접합체를 5 칼럼 부피의 용출 완충제 (0.1 M 글리신 (pH 2.7), 50 mM NaCl, 10% (v/v) 글리세롤)로 용출시키고, 여기서 0.5 칼럼 부피 분획을 1 M HEPES (pH 8)를 함유하는 튜브 내로 수집하여 산을 중화시켰다. 단백질 함유 분획을 풀링하고, 제바 스핀(Zeba Spin) (써모 피셔) 탈염 칼럼을 이용하여 히스티딘 완충제 (15 mM 히스티딘 (pH 6.5), 175 mM 수크로스, 0.02% 트윈 20)에서 제제화하였다. 피어스 고용량 내독소 제거 수지(Pierce High Capacity Endotoxin Removal Resin) (써모 피셔)를 이용하여 내독소를 제거하고, 0.22 ㎛ 필터를 통해 멸균 여과하였다. ADC의 최종 농도를 UV-가시광선 분광법으로 측정하였다.
ADC IMAB362-MC-vc-PAB-MMAE는 WO2016/166122 (실시예 1, 섹션 3, 페이지 75-76)에 개시된 바와 같이 생성하였다.
ADC 분석: 60℃에서 9분 선형 구배 (25-40%), 이어서, 0.1% TFA/3% CH3CN/H2O 내지 0.1% TFA/CH3CN의 4분 선형 구배 (40-75%)로 0.7 ml/min로 전개된 PLRP-S, 300 Å, 2.1 x 150 mm, 3 ㎛ 칼럼 (애질런트)에서 수행된 역상 크로마토그래피에 의해 DAR을 평가하였다. 샘플을 먼저 10% v/v 0.5 M DTT (pH 8.0)와 함께 37℃에서 15분 동안 인큐베이션시켜 환원시켰다. 생성된 모든 ADC는 DAR LC = 2 또는 DAR HC-LC = 4였다.
실시예 8: CLDN18 .2 발현 세포에 대한 항- CLDN18 .2 항체 기반 ADC의 시험관 내 세포독성 검정법 [NBET'2483으로부터의 데이터]
실시예 8 및 하기 실시예 9에서, 화학식 [항체]-HC-LC-PNU의 ADC는 항체가 중쇄 및 경쇄에서 독소 PNU-159682와 접합되고, DAR = 4인 ADC이고; 화학식 [항체]-HC-PNU 또는 [항체]-LC-PNU의 ADC는 각각 중쇄 또는 경쇄에서 독소 PNU-159682와 접합되고, DAR = 2인 것이다. 상기 ADC는 또한 -LPQTGG- 올리고펩티드 링커 및 에틸렌디아민 비-절단가능한 링커를 가진다. 화학식 [항체]-LC-PNU의 ADC의 구조식은 도 25에서 볼 수 있다.
A549 세포 또는 HEK293T 세포 또는 hCLDN18.2를 과다발현하도록 조작된 BxPC-3 (실시예 3 및 4 참조) 또는 hCLDN18.2를 내인적으로 발현하는 PA-TU-8988S-고 세포 (실시예 2 참조)를 이용하여 항-CLDN18.2 ADC의 세포독성을 조사하고, IMAB362-HC-G2-PNU, IMAB362-LC-G2-PNU, IMAB362-HC-LC-G2-PNU 또는 IMAB362-MC-vc-PAB-MMAE아 비교하였다. hCLDN18.1을 과다발현하도록 조작된 HEK293T 및 A549 세포 (실시예 3 참조)를 사용하여 CLDN18.1이 아닌, CLDN18.2에의 특이성을 보여주었다.
요약하면, 1000개의 세포/웰의 A549 세포 또는 HEK293T 세포, 5000개의 세포/웰의 BxPC-3 세포 또는 10000개의 세포/웰의 PA-TU-8988S-고 세포를 75 ㎕ DMEM 고 글루코스, 10% FCS, 100 IU/ml Pen/Step/훈기존(Fungizone), 2 mM L-글루타민 중 흰색 투명 바닥 96-웰 플레이트 (그라이너(Greiner)) (가장자리에 있는 웰은 배제, 이는 물을 함유)에 플레이팅하고, 7.5% CO2 대기하에 가습 인큐베이터에서 37℃하에 성장시켰다. 1일 인큐베이션 후, 각 ADC를 완전 성장 배지 중 25 ㎕의 4배 연속 희석액 양으로 각 웰에 첨가하여 A549 세포의 경우, 5000 내지 0.076 ng/ml, HEK293-T 세포의 경우, 1000 내지 0.015 ng/ml, BxPC-3 세포의 경우, 20000 내지 0.25 ng/ml, 및 PA-TU-8988S 세포의 경우, 20000 내지 0.31 ng/ml의 농도를 생성하였다. 추가로 4일 후, 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고, 실온으로 평형화시켰다. 대략 30 min 후, 50 ㎕의 셀타이터-글로® 2.0 발광 용액(CellTiter-Glo® 2.0 Luminescent Solution) (프로메가(Promega))을 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 450 rpm으로 5 min 동안 진탕시킨 후, 이어서, 진탕시키지 않으면서 10 min 동안 인큐베이션시킨 후, 250 ms/웰의 적분 시간으로 테칸 스파크 10M(Tecan Spark 10M) 플레이트 판독기에서 발광을 측정하였다. 그래프패드 프리즘 소프트웨어(Graphpad Prism Software)을 이용하여 발광 대 ADC 농도 (ng/ml)의 곡선을 피팅하였다 (도 11 내지 19 참조).
시험관내 세포독성 검정법에서 오직 HC에서만, 오직 LC에서만, 또는 HC 및 LC, 둘 모두에서 접합된 cCl1-1, cCl1-2 및 cCl1-3은 유사하게 접합된 IMAB362 및 IMAB362-MC-vc-PAB-MMAE보다 CLDN18.2를 과다발현하는 HEK293T 세포 (도 11 참조), CLDN18.2를 과다발현하는 BxPC-3 세포 (도 13 참조), CLDN18.2를 과다발현하는 A549 세포 (도 14 참조), 또는 PA-TU-8988S-고 세포 (도 16 참조)에 대해 더 우수한 세포독성 활성을 보인 반면, CLDN18.1을 과다발현하는 HEK293T 세포 (도 12 참조), 또는 CLDN18.1을 과다발현하는 A549 세포 (도 15 참조)에서는 매우 높은 농도의 ADC에서만 세포독성 활성이 관찰된 것으로 나타났다. CLDN18.1을 과다발현하는 세포에 대한 임의의 세포독성 활성은 적어도 1000 x 더 높은 농도의 독소에 기인하였고, 이는 DAR4 접합 (독소는 항체 중쇄 및 경쇄에 접합)에 대해서만 관찰되었다. 유사하게, CLDN18.2를 표적화하지 않는 Ac10 항체에 기반한 대조군 ADC는 매우 높은 농도의 ADC에서만 유익한 세포독성 활성을 보였다 (도 14, 15 참조).
시험관내 세포독성 검정법에서는 또한 독소가 오직 LC에만 접합된 (DAR 2 생성) 항체 hCl1a 내지 hCl1j에 기반한 ADC가 유사하게 독소가 LC에서 접합된 IMAB362에 기반한 ADC보다 CLDN18.2를 과다발현하는 A549 세포 (도 17 참조), CLDN18.2를 과다발현하는 HEK293T 세포 (도 18 참조), 또는 PA-TU-8988S 세포 (도 20 참조)에 대해 우수한 세포독성 활성을 보인 것으로 나타났다. 항체 hCl1a 내지 hCl1j에 기반한 ADC의 세포독성 활성은 CLDN18.2를 과다발현하는 세포에 대해 선택적이었고, CLDN18.1을 과다발현하는 HEK293T 세포에 대해서는 어떤 세포독성 활성도 없었다 (도 19 참조).
프리즘 소프트웨어의 내장된 "log(억제제) 대 반응 - 변수 기울기(4 파라미터)" EC50 결정 함수를 사용하여 결정된, 그의 LC에 접합된 인간화 항체에 대한 EC50 값은 표 9에 보고되어 있다.
표 9: 시험관내 세포독성 검정법에 기반한 시험된 ADC에 대한 EC50 (ng/ml) 값
Figure pct00039
전반적으로, 본 발명의 것은 모두 IMAB362-LC-G2-PNU보다 더 높은 세포독성 활성과 함께 높은 시험관내 세포독성 잠재력을 가진다.
실시예 9: 환자 유래 종양 이종이식편 모델에서의 ADC hCl1a -LC-G2-PNU 및 hCl1f-LC-G2-PNU의 생체내 효능 분석
하기 연구는 찰스 리버 게엠베하(Charles River GmbH) (독일 프라이부르크)에서 수행되었다.
표 10: 항- CLDN18 .2 ADC hCl1a -LC-G2-PNU 및 hCl1f -LC-G2-PNU의 평가를 위해 사용된 환자 유래된 종양 이종이식편 모델
Figure pct00040
항-CLDN18.2 ADC hCl1a-LC-G2-PNU, hCl1a(LALA)-LC-G2 및 hCl1f-LC-G2-PNU를 하기 연구 프로토콜에 따라 환자 유래 종양 이종이식편 (PDX) 모델에서 조사하였다:
표 11: PDX 모델에서 항-CLDN18.2 hCl1a-LC-G2-PNU, hCl1a(LALA)-LC-G2 및 hCl1f-LC-G2-PNU ADC를 평가하는 데 사용된 프로토콜
Figure pct00041
PDX 물질을 마우스에 편측으로 피하 이식하였다. 종양이 무작위화 처리 기준에 도달하였을 때, 마우스를 군으로 할당하였고, 표 11에 명시된 바와 같은 ADC 또는 비히클로 총 3회 처리하였다. 종양 부피는 캘리퍼 측정으로 측정하였고, 체중은 주 2회 기록하였다. 종양 부하가 2000 ㎣에 도달하였거나, 체중이 현저히 감소하였을 때 (전체적으로 30% 초과, 또는 2일 후 20% 초과), 마우스를 안락사시켰다
도 20 내지 23은 상이한 PDX 모델에서의 연구에 대한 상대적인 종양 부피 진화를 보여주는 것이다. CLDN18.2 발현을 보인 환자 유래 종양 물질로 확립된 종양 이종이식편은 본 발명의 ADC를 사용한 처리에 대해 유의적으로 반응하였다. 더 낮은 용량 (0.2 mg/kg 또는 0.6 mg/kg)으로 투여되었을 때 본 발명의 ADC에 의한 반응 (종양 성장 지연 또는 종양 수축)은 동일한 용량으로 투여된 항-CLDN18.2 항체 IMAB362에 기반한 유사한 ADC보다 우수하였고, 2 mg/kg의 더 높은 용량으로 투여되었을 때, 비교적 우수하였다.
실시양태
1. 일반 화학식 A - (L-T)n을 갖는 항체-약물 접합체로서, 상기 식에서,
a. A는 각각 서열식별번호 21, 서열식별번호 22, 및 서열식별번호 23의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호 24, 서열식별번호 25 및 서열식별번호 26의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열을 포함하는, CLDN18.2에 결합하는 항체 또는 그의 단편이고,
b. L은 링커이고,
c. T는 독소이고,
여기서 독소는 안트라사이클린이고,
여기서 n은 정수 ≥ 1 내지 ≤10인 항체-약물 접합체, 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 에스테르.
2. 실시양태 1에 있어서, 링커 L이 적어도 하나의 비-절단가능한 링커 요소를 포함하는 것인 항체-약물 접합체.
3. 실시양태 2에 있어서, 비-절단가능한 링커 요소가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되고:
i. 에틸렌디아민 (EDA),
j. N-포르밀-N,N'-디메틸에틸렌디아민,
k. 디에틸아민 (DEA),
l. 하기 화학식의 피페라진-유래 화합물:
Figure pct00042
상기 식에서, 파선은 독소 및 또 다른 링커 요소에의 부착을 나타냄,
m. 하기 화학식의 화합물:
Figure pct00043
상기 식에서, 파선은 독소 및 또 다른 링커 요소에의 부착을 나타냄,
n. 하기 화학식의 화합물:
Figure pct00044
상기 식에서, 파선은 독소에의 부착을 나타내고, [Ab]는 항체 또는 그의 단편을 나타냄,
o. 하기 화학식의 말레이미도카프로일 화합물:
Figure pct00045
상기 식에서, 파선은 또 다른 링커 요소에의 부착을 나타내고, [Ab]는 항체 또는 그의 단편을 나타냄,
p. 하기 화학식의 화합물:
Figure pct00046
상기 식에서, 파선은 독소에의 부착을 나타내고, [Ab]는 항체 또는 그의 단편을 나타냄,
여기서 비-절단가능한 링커 요소가 아미드 결합 또는 에테르 결합에 의해 독소에 접합되는 것인 항체-약물 접합체.
4. 실시양태 2 또는 실시양태 3에 있어서, 링커가 올리고펩티드 링커 요소 및/또는 효소-절단가능한 링커 요소 및/또는 스페이서 요소를 추가로 포함하는 것인 항체-약물 접합체.
5. 실시양태 4에 있어서, 하나의 올리고펩티드 링커 요소가 - LPXTGm-, -LPXAGm-, -LPXSGm-, -LAXTGm-, -LPXTGm-, -LPXTAm-, -NPQTGm- 또는 -NPQTNm-으로부터 선택되는 소르타제 인식 모티프 올리고펩티드를 포함하고, 여기서 Gm은 올리고글리신이고, 여기서 m은 정수 ≥1 내지 ≤21이고, Am은 올리고알라닌이고, 여기서 m은 정수 ≥1 내지 ≤21이고, Nm은 올리고아스파라긴이고, 여기서 m은 정수 ≥1 내지 ≤21이고, X는 임의의 가능한 아미노산이고, 바람직하게, 소르타제 인식 모티프 올리고펩티드는 -LPQTGG- 또는 -LPETGG-인 항체-약물 접합체.
6. 실시양태 5에 있어서, 올리고펩티드 링커 요소가
a. 서열 서열식별번호 131, 또는
b. 서열 서열식별번호 132를 포함하는 것인 항체-약물 접합체.
7. 실시양태 4 내지 6 중 어느 한 실시양태에 있어서, 효소-절단가능한 링커 요소가 하기 화학식의 화합물에 따른 val-cit-PAB 링커를 포함하고:
Figure pct00047
상기 식에서, 파선은 다른 링커 요소에의 부착을 나타내는 것인 항체-약물 접합체.
8. 실시양태 4 내지 7 중 어느 한 실시양태에 있어서, 스페이서 요소가 펩티드 가요성 올리고펩티드를 포함하고, 바람직하게, 여기서 펩티드 가요성 올리고펩티드가 G 및 S로 이루어지고, 더욱 바람직하게, 여기서 펩티드 가요성 올리고펩티드가 (GGGGS)o이고, 여기서 o가 1, 2, 3, 4 또는 5인 항체-약물 접합체.
9. 실시양태 1 내지 8 중 어느 한 실시양태에 있어서, 항체 약물 접합체가 하기 구조식을 갖는 것인 항체-약물 접합체:
a. A - ([올리고펩티드 링커 요소 - 비-절단가능한 링커 요소] - T)n 및 바람직하게, 여기서 링커는
i. [LPXTGG]-[에틸렌디아민], 및
ii. [LPXTGG]-[
Figure pct00048
]로부터 선택됨;
b. A - ([올리고펩티드 링커 요소 - 효소 절단가능한 링커 요소 - 비-절단가능한 링커 요소] - T)n 및 바람직하게, 여기서 링커는
i. [LPXTGG]-[vc-PAB]-[N-포르밀-N,N'-디메틸에틸렌디아민], 및
ii. [LPXTGG]-[vc-PAB]-[피페라진]으로부터 선택됨;
c. A - ([스페이서 요소 - 올리고펩티드 링커 요소 - 비-절단가능한 링커 요소] - T)n 및 바람직하게, 여기서 링커는
i. [GGGGS]-[LPXTGG]-[에틸렌디아민], 및
ii. [GGGGS]-[LPXTGG]-[
Figure pct00049
]로부터 선택됨; 또는
d. A - ([스페이서 요소 - 올리고펩티드 링커 요소 - 효소 절단가능한 링커 요소 - 비-절단가능한 요소] - T)n 및 바람직하게, 여기서 링커는
i. [GGGGS]-[LPXTGG]-[vc-PAB]-[N-포르밀-N,N'-디메틸에틸렌디아민], 및
ii. [GGGGS]-[LPXTGG]-[vc-PAB]-[피페라진]으로부터 선택됨.
10. 실시양태 9에 있어서, 비-절단가능한 링커 요소가 에틸렌디아민이고, 여기서 올리고펩티드 링커 요소가 LPXTGG이고, 여기서 X가 Q 또는 E이고, 바람직하게, 여기서 X가 Q인 항체-약물 접합체.
11. 실시양태 1 내지 10 중 어느 한 실시양태에 있어서,
a. (L-T)가 항체의 두 경쇄 모두에 공유 연결되거나,
b. (L-T)가 항체의 두 중쇄 모두에 공유 연결되거나,
c. (L-T)가 항체의 두 경쇄 모두 및 두 중쇄 모두에 공유 연결된 것인 항체-약물 접합체.
12. 실시양태 1 내지 11 중 어느 한 실시양태에 있어서, (L-T)가
a. 항체 경쇄 또는 항체 중쇄의 C-말단에 연결되거나, 또는
b. 항체 경쇄 또는 항체 중쇄의 아미노산 측쇄에 연결된 것인 항체-약물 접합체.
13. 실시양태 1 내지 12 중 어느 한 실시양태에 있어서, 안트라사이클린 유도체가 하기 화학식 (I)을 갖고, C13에 의해 비-절단가능한 링커 요소에 공유 연결되고, 그 결과로 C14 및 히드록실 기는 손실되거나, 또는 C14 상의 히드록실 기에 의해 비-절단가능한 링커 요소에 공유 연결되고:
Figure pct00050
상기 식에서, R1이 수소 원자, 히드록시 또는 메톡시 기이고,
상기 식에서, R2가 C1-C5 알콕시 기인 항체-약물 접합체.
14. 실시양태 1 내지 13 중 어느 한 실시양태에 있어서, 안트라사이클린 유도체가 3'-데아미노-3",4'-안히드로-[2"(S)-메톡시-3"(R)-옥시-4"-모르폴리닐]독소루비신 (PNU-159682)의 유도체인 항체-약물 접합체.
15. 실시양태 1 내지 14 중 어느 한 실시양태에 있어서, A인 항체 또는 그의 단편이
a. 각각 서열식별번호 1, 서열식별번호 15 및 서열식별번호 3의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호 4, 서열식별번호 5 및 서열식별번호 6의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열;
b. 각각 서열식별번호 1, 서열식별번호 16 및 서열식별번호 3의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호 4, 서열식별번호 5 및 서열식별번호 6의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열;
c. 각각 서열식별번호 1, 서열식별번호 16 및 서열식별번호 3의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호 17, 서열식별번호 14 및 서열식별번호 11의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열;
d. 각각 서열식별번호 1, 서열식별번호 16 및 서열식별번호 3의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호 18, 서열식별번호 19 및 서열식별번호 11의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열;
e. 각각 서열식별번호 12, 서열식별번호 15 및 서열식별번호 3의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호 4, 서열식별번호 5 및 서열식별번호 6의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열;
f. 각각 서열식별번호 1, 서열식별번호 20, 및 서열식별번호 3의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호 4, 서열식별번호 5 및 서열식별번호 6의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열;
g. 각각 서열식별번호 1, 서열식별번호 20 및 서열식별번호 3의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호 18, 서열식별번호 19 및 서열식별번호 11의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열;
h. 각각 서열식별번호 12, 서열식별번호 20 및 서열식별번호 8의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호 4, 서열식별번호 5 및 서열식별번호 6의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열; 또는
i. 각각 서열식별번호 12, 서열식별번호 20 및 서열식별번호 8의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호 17, 서열식별번호 14 및 서열식별번호 11의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열을 포함하는 것인 항체-약물 접합체.
16. 실시양태 1 내지 14 중 어느 한 실시양태에 있어서, A인 항체 또는 그의 단편이
a. 각각 서열식별번호 1, 서열식별번호 2 및 서열식별번호 3의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호 4, 서열식별번호 5 및 서열식별번호 6의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열;
b. 각각 서열식별번호 1, 서열식별번호 7 및 서열식별번호 8의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호 9, 서열식별번호 10 및 서열식별번호 11의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열; 또는
c. 각각 서열식별번호 12, 서열식별번호 2 및 서열식별번호 3의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호 13, 서열식별번호 14 및 서열식별번호 11의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열을 포함하는 것인 항체-약물 접합체.
17. 실시양태 1 내지 15 중 어느 한 실시양태에 있어서, A인 항체 또는 그의 단편이
a. 서열식별번호 33의 VH 서열 및 서열식별번호 38의 VL 서열;
b. 서열식별번호 34의 VH 서열 및 서열식별번호 38의 VL 서열;
c. 서열식별번호 34의 VH 서열 및 서열식별번호 39의 VL 서열;
d. 서열식별번호 34의 VH 서열 및 서열식별번호 40의 VL 서열;
e. 서열식별번호 35의 VH 서열 및 서열식별번호 38의 VL 서열;
f. 서열식별번호 36의 VH 서열 및 서열식별번호 41의 VL 서열;
g. 서열식별번호 36의 VH 서열 및 서열식별번호 40의 VL 서열;
h. 서열식별번호 37의 VH 서열 및 서열식별번호 41의 VL 서열;
i. 서열식별번호 37의 VH 서열 및 서열식별번호 38의 VL 서열; 또는
j. 서열식별번호 37의 VH 서열 및 서열식별번호 39의 VL 서열을 포함하는 것인 항체-약물 접합체.
18. 실시양태 1 내지 14 또는 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, A인 항체 또는 그의 단편이
a. 서열식별번호 27의 VH 서열 및 서열식별번호 28의 VL 서열;
b. 서열식별번호 29의 VH 서열 및 서열식별번호 30의 VL 서열; 또는
c. 서열식별번호 31의 VH 서열 및 서열식별번호 32의 VL 서열을 포함하는 것인 항체-약물 접합체.
19. 실시양태 1 내지 15 또는 17 중 어느 한 실시양태에 있어서, A인 항체 또는 그의 단편이 하기를 포함하는 것인 항체-약물 접합체:
a. 서열식별번호 46의 중쇄 서열 및 서열식별번호 51의 경쇄 서열;
b. 서열식별번호 47의 중쇄 서열 및 서열식별번호 51의 경쇄 서열;
c. 서열식별번호 47의 중쇄 서열 및 서열식별번호 52의 경쇄 서열;
d. 서열식별번호 47의 중쇄 서열 및 서열식별번호 53의 경쇄 서열;
e. 서열식별번호 48의 중쇄 서열 및 서열식별번호 51의 경쇄 서열;
f. 서열식별번호 47의 중쇄 서열 및 서열식별번호 54의 경쇄 서열;
g. 서열식별번호 49의 중쇄 서열 및 서열식별번호 53의 경쇄 서열;
h. 서열식별번호 50의 중쇄 서열 및 서열식별번호 54의 경쇄 서열;
i. 서열식별번호 50의 중쇄 서열 및 서열식별번호 51의 경쇄 서열; 또는
j. 서열식별번호 50의 중쇄 서열 및 서열식별번호 52의 경쇄 서열
또는 조작된 Fc 도메인을 갖는 그의 버전.
20. 하기 단계:
g. 바람직하게는 그의 C-말단에, 임의적으로, 항체 경쇄 및/또는 중쇄에서 스페이서 요소에 이어 올리고펩티드 링커 요소를 갖는 A인 항체 또는 그의 단편을 제공하는 단계,
h. 비-절단가능한 링커 요소를 갖는 하나 이상의 독소 T를 제공하는 단계, 및
i. 항체 및 독소를 접합시켜 항체-약물 접합체를 생성하는 단계를 포함하는, 실시양태 1 내지 19 중 어느 한 실시양태에 따른 항체-약물 접합체를 제조하는 방법.
21. · 서열식별번호 46에 따른 아미노산 서열의 두 중쇄, 및 서열식별번호 51에 따른 아미노산 서열의 두 경쇄로 이루어진 항체로서, 여기서 항체는 CLDN18.2에 결합하는 것인 항체,
· 경쇄의 C-말단의 링커 [GGGGS]-[LPQTGG]-[에틸렌디아민], 및
· C13에서 링커의 에틸렌디아민에 공유 연결되어, C14 및 히드록실 기가 손실되는, 안트라사이클린-기반 소분자 독소 3'-데아미노-3",4'-안히드로-[2"(S)-메톡시-3"(R)-옥시-4"-모르폴리닐]독소루비신 (PNU-159682)으로 이루어진 항체-약물 접합체.
22. · 서열식별번호 133에 따른 아미노산 서열의 두 중쇄, 및 서열식별번호 51에 따른 아미노산 서열의 두 경쇄로 이루어진 항체로서, 여기서 항체는 CLDN18.2에 결합하는 것인 항체,
· 경쇄의 C-말단의 링커 [GGGGS]-[LPQTGG]-[에틸렌디아민], 및
· C13에서 링커의 에틸렌디아민에 공유 연결되어, C14 및 히드록실 기가 손실되는, 안트라사이클린-기반 소분자 독소 3'-데아미노-3",4'-안히드로-[2"(S)-메톡시-3"(R)-옥시-4"-모르폴리닐]독소루비신 (PNU-159682)으로 이루어진 항체-약물 접합체.
23. · 서열식별번호 134에 따른 아미노산 서열의 두 중쇄, 및 서열식별번호 51에 따른 아미노산 서열의 두 경쇄로 이루어진 항체로서, 여기서 항체는 CLDN18.2에 결합하는 것인 항체,
· 경쇄의 C-말단의 링커 [GGGGS]-[LPQXTGG]-[에틸렌디아민], 및
· C13에서 링커의 에틸렌디아민에 공유 연결되어, C14 및 히드록실 기가 손실되는, 안트라사이클린-기반 소분자 독소 3'-데아미노-3",4'-안히드로-[2"(S)-메톡시-3"(R)-옥시-4"-모르폴리닐]독소루비신 (PNU-159682)으로 이루어진 항체-약물 접합체.
24. 실시양태 1 내지 23 중 어느 한 실시양태의 항체-약물 접합체, 및 및 부형제를 포함하는 제약 조성물.
25. 실시양태 1 내지 23 중 어느 한 실시양태에 있어서, 치료에서 사용하기 위한, 항체-약물 접합체.
26. 실시양태 1 내지 23 중 어느 한 실시양태에 있어서, 암 치료에서 사용하기 위한, 항체-약물 접합체.
27. 실시양태 24에 있어서, 암이 췌장암, 위암, 식도암, 난소암 및 폐암으로부터 선택되는 것인 항체-약물 접합체.
서열
Figure pct00051
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참고문헌
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DSMZ DSMACC3360 20191206
SEQUENCE LISTING <110> SOTIO BIOTECH a.s. <120> Tumor-specific Claudin 18.2 antibody-drug conjugates <130> S12607WO / ADC Claudin antibody <150> EP20216800.1 <151> 2020-12-23 <160> 148 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cCl1-1, cCl1-2, hCl1a, hCl1b, hCl1c, hCl1d, hCl1f, hCl1g HCDR1 <400> 1 Asp Tyr Ala Met His 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cCl1-1, cCl1-3 HCDR2 <400> 2 Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Lys Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cCl1-1, cCl1-3 , hCl1a, hCl1b, hCl1c, hCl1d, hCl1e, hCl1f, hCl1g HCDR3 <400> 3 Ala Val Phe Tyr Gly Tyr Thr Met Asp Ala 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cCl1-1, hCl1a, hCl1b, hCl1e, hCl1f, hCl1h, hCl1i LCDR1 <400> 4 Arg Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Asn Leu Ala 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cCl1-1, hCl1a, hCl1b, 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His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Xaa 435 440 445 <210> 56 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IMAB362 LC full <400> 56 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 115 120 125 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 130 135 140 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 145 150 155 160 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 165 170 175 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 180 185 190 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 195 200 205 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 220 <210> 57 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N-terminal extracellular of CLDN18.2, independent of glycosylation <400> 57 Asp Gln Trp Ser Thr Gln Asp Leu Tyr Asn 1 5 10 <210> 58 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N-terminal extracellular of CLDN18.2, mainly unglycosylated <400> 58 Asn Asn Pro Val Thr Ala Val Phe Asn Tyr Gln 1 5 10 <210> 59 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N-terminal extracellular domain of CLDN18.2, unglycosylated <400> 59 Ser Thr Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ala Val Phe 1 5 10 <210> 60 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> pan-CLDN18 peptide in the C-terminal extracellular domain common to both CLDN18.1 and CLDN18.2 isoforms <400> 60 Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly 1 5 10 <210> 61 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Specific epitope of CLDN18.2 as disclosed by WO2005/113587 <400> 61 Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val 1 5 10 15 <210> 62 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Specific epitope of CLDN18.2 as disclosed by WO2005/113587 <400> 62 Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr 1 5 10 15 Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser 20 <210> 63 <211> 129 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> First extracellular domain of CLDN18.2 with N- and C-terminal extensions <400> 63 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Asp Ala Ala Gln Pro Ala Arg Arg Ala Arg Arg Thr 20 25 30 Lys Leu Gly Thr Glu Leu Gly Ser Thr Pro Val Trp Trp Asn Ser Ala 35 40 45 Asp Gly Arg Met Asp Gln Trp Ser Thr Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro 50 55 60 Val Thr Ala Val Phe Asn Tyr Gln Gly Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg 65 70 75 80 Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly 85 90 95 Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg Ala Ala Ile Gln His Ser Gly 100 105 110 Gly Arg Ser Arg Arg Ala Arg Thr Lys Thr His Leu Arg Arg Gly Ser 115 120 125 Glu <210> 64 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Overlapping peptide within the first extracellular domain as disclosed by WO2008/145338 <400> 64 Met Asp Gln Trp Ser Thr Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr 1 5 10 15 <210> 65 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Overlapping peptide within the first extracellular domain as disclosed by WO2008/145338 <400> 65 Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ala Val Phe Asn Tyr Gln Gly Leu 1 5 10 15 <210> 66 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Overlapping peptide within the first extracellular domain as disclosed by WO2008/145338 <400> 66 Val Phe Asn Tyr Gln Gly Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser 1 5 10 15 <210> 67 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Overlapping peptide within the first extracellular domain as disclosed by WO2008/145338 <400> 67 Gln Gly Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr 1 5 10 15 <210> 68 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Overlapping peptide within the first extracellular domain as disclosed by WO2008/145338 <400> 68 Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg Gly 1 5 10 15 <210> 69 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminal epitope of CLDN18.2 as disclosed by WO2013/167259 <400> 69 Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser Lys His Asp Tyr Val 1 5 10 15 <210> 70 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminal epitope of CLDN18.2 as disclosed by WO2013/167259 <400> 70 Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser Lys His Asp Tyr Val 1 5 10 <210> 71 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cCl1-1, cCl1-2, hCl1a HCDR1 <400> 71 gactacgcga tgcac 15 <210> 72 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cCl1-1 HCDR2 <400> 72 tggatcaaca cgtacacggg gaagccgaca tacgcggacg acttcaaggg g 51 <210> 73 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cCl1-1, cCl1-3 HCDR3 <400> 73 gccgtcttct acggatatac gatggacgcg 30 <210> 74 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cCl1-1 VH <400> 74 cagatccagc tcgtccagag cgggccggag ctgaagaagc cgggggagag cgtgaagatc 60 tcgtgcaagg cgagcggata tacgttcacg gactacgcga tgcactgggt caagcaagcg 120 ccggggaaag ggctgaagtg gatggggtgg atcaacacgt acacggggaa gccgacatac 180 gcggacgact tcaaggggcg attcgtgttc tcgctggagg cgagcgcgag cacggcgaac 240 ctgcaaatct cgaacctgaa gaacgaggac acggcgacgt acttctgcgc gcgggccgtc 300 ttctacggat atacgatgga cgcgtggggg cagggtacca gcgtgacggt ctcgagc 357 <210> 75 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cCl1-1 LCDR1 <400> 75 cgggcgagcg aggacatcta ctcgaacctg gcg 33 <210> 76 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cCl1-1 LCDR2 <400> 76 tccgtcaagc ggctgcaaga c 21 <210> 77 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cCl1-1 LCDR3 <400> 77 ctgcaaggga gcaacttccc gctgacg 27 <210> 78 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cCl1-1 VL <400> 78 gacatccaga tgacgcagag cccggcgtcg ctgagcgcga gcctggggga gacgatctcg 60 atcgcgtgcc gggcgagcga ggacatctac tcgaacctgg cgtggtatca acagaagagc 120 gggaagagcc cgcagctgct gatcttctcc gtcaagcggc tgcaagacgg cgtcccgagc 180 cgattctcgg ggagcgggag cgggacgcag tactcgctga agatctcggg gatgcagccg 240 gaggacgagg gggactactt ctgcctgcaa gggagcaact tcccgctgac gttcgggtcg 300 ggtaccaaac tcgagatcaa a 321 <210> 79 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cCl1-2 HCDR2 <400> 79 tggatcaacg cgtacacggg gaagccgacc tacgcggacg acttcaaggg g 51 <210> 80 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cCl1-2 HCDR3 <400> 80 gccgtctact acggatatac gatggac 27 <210> 81 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cCl1-2 VH <400> 81 cagatccagc tcgtccagag cgggccggag ctgaagaagc cgggggagag cgtgaagatc 60 tcgtgcaaga cgagcggata tacgttcacg gactacgcga tgcactgggt caagcagggg 120 ccagggaaag ggatgaagtg gatggggtgg atcaacgcgt acacggggaa gccgacctac 180 gcggacgact tcaaggggcg attcgtgctg agcctggagg cgagcgcctc gacggcgaac 240 ctgcaaatct cgaacctgaa gaacgaggac acggcgacgt acttctgcgc gcgggccgtc 300 tactacggat atacgatgga cgcgtggggg cagggtacca gcgtgatcgt ctcgagc 357 <210> 82 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cCl1-2 LCDR1 <400> 82 cggacgagcg aggacatcta ctcgaacttc gcg 33 <210> 83 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cCl1-2 LCDR2 <400> 83 tcagtcaacc ggctgcaaga c 21 <210> 84 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cCl1-2, cCl1-3, hCl1d, hCl1g LCDR3 <400> 84 ctgcaaggga gcaagttccc gctgacg 27 <210> 85 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cCl1-1 VL <400> 85 gacatccaga tgacgcagag cccggcgagc ctgagcgcga gcctggggga gacgatctcg 60 atcgagtgcc ggacgagcga ggacatctac tcgaacttcg cgtggttcca gcagaagagc 120 gggaagagcc cgcagctgct gatctactca gtcaaccggc tgcaagacgg cgtcccgagc 180 cgattctcgg ggagcgggag cgggacgcag tactcgctga agatctcggg gatgcagccg 240 gaggacgagg gggactactt ctgcctgcaa gggagcaagt tcccgctgac gttcgggagc 300 ggtaccaaac tcgagatcaa a 321 <210> 86 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cCl1-3 HCDR1 <400> 86 gactacgcga tgtac 15 <210> 87 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cCl1-3 HCDR2 <400> 87 tggatcaaca cgtacacggg gaagccgacc tacgcggacg acttcaaggg g 51 <210> 88 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cCl1-3 VH <400> 88 cagatccagc tcgtccagag cgggccggag ctgaagaagc cgggggagag cgtgaagatc 60 tcgtgcaagg cgagcggata tacgttcacg gactacgcga tgtactgggt caagcaagtg 120 ccggggaaag ggctgcgatg gatggggtgg atcaacacgt acacggggaa gccgacctac 180 gcggacgact tcaaggggcg attcgtgttc tcgctggagg cgagcgcgag cacggcgaac 240 ctgcaaatct cgaacctgaa gaacgaggac acggcgacgt acttctgcgc gcgggccgtc 300 ttctacggat atacgatgga cgcgtggggg cagggtacca gcgtgacggt ctcgagc 357 <210> 89 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cCl1-3 LCDR1 <400> 89 cggacgagcg aggacatcta ctcgaacctg gcg 33 <210> 90 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cCl1-3 LCDR2 <400> 90 gcgatcaagc ggctgcaaga c 21 <210> 91 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cCl1-3 VL <400> 91 gacatccaga tgacgcagag cccggcgagc ctgagcgcga gcctggggga gacgatctcg 60 atcgcgtgcc ggacgagcga ggacatctac tcgaacctgg cgtggtatca acagaagagc 120 gggaagagcc cgcagctgct gatcttcgcg atcaagcggc tgcaagacgg cgtcccgagc 180 cgattctcgg ggagcgggag cgggacgcag tactcgctga agatctcggg gatgcagccg 240 gaggacgagg gggactactt ctgcctgcaa gggagcaagt tcccgctgac gttcgggtcg 300 ggtaccaaac tcgagatcaa a 321 <210> 92 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCl1a HCDR2 <400> 92 tggatcaata catacacggg gaagccgact tatgcgcaaa aattccaagg a 51 <210> 93 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCl1a HCDR3 <400> 93 gcggtcttct acggatatac gatggatgcc 30 <210> 94 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cCl1a VH <400> 94 caggtccaac tagtccaaag cggggcggaa gtcaagaagc ccggagcatc cgtcaaagtc 60 agctgcaagg cgagcggata tacatttacg gactacgcga tgcactgggt caggcaagcc 120 cctgggcaaa ggctcgaatg gatgggatgg atcaatacat acacggggaa gccgacttat 180 gcgcaaaaat tccaaggaag agtcacaatt acgcgggata catccgcatc taccgcctac 240 atggagctaa gctcgctgcg gagcgaggat acggcggtct actattgcgc ccgagcggtc 300 ttctacggat atacgatgga tgcctggggg cagggtaccc tggtcacggt ctcgagc 357 <210> 95 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCl1a, hCl1b, hCl1e, hCl1i LCDR1 <400> 95 agggcctccg aagacatcta ctccaacctg gca 33 <210> 96 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCl1a, hCl1b, hCl1e, hCl1i LCDR2 <400> 96 agcgtcaaaa gactacaaga t 21 <210> 97 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCl1a, hCl1b, hCl1e, hCl1i LCDR3 <400> 97 ttgcaaggaa gcaatttccc cttgact 27 <210> 98 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cCl1a, hCl1b, hCl1e, hCl1i VL <400> 98 gacattcaaa tgacgcaaag cccatcatcg ctgagcgcat cggtcgggga tagagtcacc 60 ataacatgca gggcctccga agacatctac tccaacctgg catggtatca acaaaaaccg 120 gggaaggctc cgaagctgct gatatttagc gtcaaaagac tacaagatgg agtaccgagc 180 cgattttcgg gaagcgggag cgggacggat ttcacgctga ccatatcaag tttgcaaccg 240 gaggattttg cgacatacta ttgcttgcaa ggaagcaatt tccccttgac tttcgggcaa 300 ggtaccaagg tcgagatcaa a 321 <210> 99 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCl1b, hCl1c, hCl1d HCDR1 <400> 99 gattatgcaa tgcac 15 <210> 100 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCl1b, hCl1c, hCl1d HCDR2 <400> 100 tggattaaca cctacacggg caagcccaca tactcccaaa aattccaagg a 51 <210> 101 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCl1b, hCl1c, hCl1d HCDR3 <400> 101 gctgtattct atggatatac aatggatgcc 30 <210> 102 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCl1b, hCl1c, hCl1d VH <400> 102 caggtccaat tagtccaaag cggggcggaa gtcaagaagc cgggggcgag cgtcaaagtc 60 tcatgcaaag cgagcggata cacatttacg gattatgcaa tgcactgggt caggcaagca 120 cccggacaaa ggctggaatg gatgggatgg attaacacct acacgggcaa gcccacatac 180 tcccaaaaat tccaaggaag ggtcacgata acgagagaca cgagcgcgag caccggaatg 240 gatgggatgg attaacacct acacgggcaa gcccacatac tcccaaaaat tccaaggaag 300 ggtcacgata acgagagaca cgagcgcgag caccgtaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 103 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCl1c, hCl1j LCDR1 <400> 103 cgaacgagcg aggacatata ctcaaacctt gca 33 <210> 104 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCl1c, hCl1j LCDR2 <400> 104 gcgataaaga ggctgcaaga c 21 <210> 105 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCl1c, hCl1j LCDR3 <400> 105 ttgcaaggct ccaaatttcc cctgaca 27 <210> 106 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCl1c, hCl1j VL <400> 106 gacatccaaa tgactcaaag cccatcatcg ctatcggcat cggtcgggga tagagtcacg 60 ataacatgcc gaacgagcga ggacatatac tcaaaccttg catggtatca acaaaagccg 120 gggaaggccc cgaagctact gatattcgcg ataaagaggc tgcaagacgg agttccatca 180 cgattttcgg gatctggctc ggggaccgat tttacgctga ctatatcatc gctgcaaccg 240 gaagattttg caacatacta ctgcttgcaa ggctccaaat ttcccctgac attcggacaa 300 ggtaccaagg tcgagatcaa a 321 <210> 107 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCl1d, hCl1g LCDR1 <400> 107 cggacgagcg aggatattta ttcgaacttt gca 33 <210> 108 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCl1d, hCl1g LCDR2 <400> 108 cagtcaatcg gctacaagat 20 <210> 109 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCl1d, hCl1g VL <400> 109 gacatccaaa tgacgcaatc accgagctcg ctgagcgcat ctgtcgggga ccgtgtcaca 60 atcacatgcc ggacgagcga ggatatttat tcgaactttg catggtatca acaaaaaccg 120 ggcaaggctc cgaaactttt gatttattca gtcaatcggc tacaagatgg cgtcccgagc 180 cgatttagcg ggagcggatc gggaaccgac tttacgctga cgatatcatc gctacaaccg 240 gaggacttcg cgacttatta ctgcctacaa gggagcaaat tcccgctgac attcggacaa 300 ggtaccaagg tcgagatcaa a 321 <210> 110 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCl1e HCDR1 <400> 110 gattacgcaa tgtac 15 <210> 111 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCl1e HCDR2 <400> 111 tggataaata cctatacggg aaagccaaca tacgcccaaa aattccaagg c 51 <210> 112 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCl1e HCDR3 <400> 112 gccgtctttt atggatatac gatggacgca 30 <210> 113 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCl1e VH <400> 113 caggtccaac tggtccaatc gggggctgaa gtcaaaaagc cgggggcgag cgtcaaagtc 60 agctgcaaag catcgggata cacatttacg gattacgcaa tgtactgggt caggcaagca 120 cccggccaac gactggaatg gatgggctgg ataaatacct atacgggaaa gccaacatac 180 gcccaaaaat tccaaggccg cgtcacaata acgcgggaca cgagcgcatc gacggcttat 240 atggaactat catcgctgcg atcggaagac acggcggtct attattgcgc acgcgccgtc 300 ttttatggat atacgatgga cgcatggggg cagggtaccc tggtcacggt ctcgagc 357 <210> 114 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCl1f, hCl1g HCDR1 <400> 114 gactacgcaa tgcac 15 <210> 115 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCl1f, hCl1g HCDR2 <400> 115 tggattaatg cctacacggg gaagccgacc tacgcacaaa aattccaagg a 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Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Xaa <210> 135 <211> 261 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 135 Met Ala Val Thr Ala Cys Gln Gly Leu Gly Phe Val Val Ser Leu Ile 1 5 10 15 Gly Ile Ala Gly Ile Ile Ala Ala Thr Cys Met Asp Gln Trp Ser Thr 20 25 30 Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ala Val Phe Asn Tyr Gln Gly 35 40 45 Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg 50 55 60 Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg 65 70 75 80 Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val 85 90 95 Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser 100 105 110 Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser 115 120 125 Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val 130 135 140 Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly 145 150 155 160 Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe 165 170 175 Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met 180 185 190 Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala 195 200 205 Val Ser Tyr His Ala Ser Gly His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly 210 215 220 Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile 225 230 235 240 Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser 245 250 255 Lys His Asp Tyr Val 260 <210> 136 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sortase tag <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> X is any of the 20 natural amino acids <220> <221> REPEAT <222> (5)..(5) <223> oligoglycine may comprise 1-21 repeats <400> 136 Leu Pro Xaa Thr Gly 1 5 <210> 137 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sortase tag <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> X is any of the 20 natural amino acids <220> <221> REPEAT <222> (5)..(5) <223> oligoglycine may comprise 1-21 repeats <400> 137 Leu Pro Xaa Ala Gly 1 5 <210> 138 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sortase tag <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> X is any of the 20 natural amino acids <220> <221> REPEAT <222> (5)..(5) <223> oligoglycine may comprise 1-21 repeats <400> 138 Leu Pro Xaa Ser Gly 1 5 <210> 139 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sortase tag <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> X is any of the 20 natural amino acids <220> <221> REPEAT <222> (5)..(5) <223> oligoglycine may comprise 1-21 repeats <400> 139 Leu Ala Xaa Thr Gly 1 5 <210> 140 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sortase tag <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> X is any of the 20 natural amino acids <220> <221> REPEAT <222> (5)..(5) <223> oligoalanine may comprise 1-21 repeats <400> 140 Leu Pro Xaa Thr Ala 1 5 <210> 141 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sortase tag <220> <221> REPEAT <222> (5)..(5) <223> oligoglycine may comprise 1-21 repeats <400> 141 Asn Pro Gln Thr Gly 1 5 <210> 142 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sortase tag <220> <221> REPEAT <222> (5)..(5) <223> oligoasparagine may comprise 1-21 repeats <400> 142 Asn Pro Gln Thr Asn 1 5 <210> 143 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sortase tag <400> 143 Leu Pro Glu Thr Gly Gly 1 5 <210> 144 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligopeptide <220> <221> REPEAT <222> (1)..(5) <223> oligopeptide may comprise 1-5 repeats <400> 144 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 145 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sortase tag <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> X is any of the 20 natural amino acids <400> 145 Leu Pro Xaa Thr Gly Gly 1 5 <210> 146 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sortase tag <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> X is any of the 20 natural amino acids <400> 146 Gly Gly Gly Gly Ser Leu Pro Xaa Thr Gly Gly 1 5 10 <210> 147 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligopeptide <400> 147 Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 148 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sortase tag <400> 148 Leu Pro Gln Thr Gly 1 5

Claims (18)

  1. 일반 화학식 A - (L-T)n을 갖는 항체-약물 접합체로서, 상기 식에서,
    a. A는 각각 서열식별번호 21, 서열식별번호 22, 및 서열식별번호 23의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호 24, 서열식별번호 25 및 서열식별번호 26의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열을 포함하는, CLDN18.2에 결합하는 항체 또는 그의 단편이고,
    b. L은 링커이고,
    c. T는 독소이고,
    여기서 독소는 안트라사이클린이고,
    여기서 n은 정수 ≥ 1 내지 ≤10인 항체-약물 접합체, 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 에스테르.
  2. 제1항에 있어서, 링커 L이 적어도 하나의 비-절단가능한 링커 요소를 포함하고, 바람직하게, 여기서 비-절단가능한 링커 요소가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되고:
    a. 에틸렌디아민 (EDA),
    b. N-포르밀-N,N'-디메틸에틸렌디아민,
    c. 디에틸아민 (DEA),
    d. 하기 화학식의 피페라진-유래 화합물:
    Figure pct00068

    상기 식에서, 파선은 독소 및 또 다른 링커 요소에의 부착을 나타냄,
    e. 하기 화학식의 화합물:
    Figure pct00069

    상기 식에서, 파선은 독소 및 또 다른 링커 요소에의 부착을 나타냄,
    f. 하기 화학식의 화합물:
    Figure pct00070

    상기 식에서, 파선은 독소에의 부착을 나타내고, [Ab]는 항체 또는 그의 단편을 나타냄,
    g. 하기 화학식의 말레이미도카프로일 화합물:
    Figure pct00071

    상기 식에서, 파선은 또 다른 링커 요소에의 부착을 나타내고, [Ab]는 항체 또는 그의 단편을 나타냄,
    h. 하기 화학식의 화합물:
    Figure pct00072

    상기 식에서, 파선은 독소에의 부착을 나타내고, [Ab]는 항체 또는 그의 단편을 나타냄,
    여기서 비-절단가능한 링커 요소가 아미드 결합 또는 에테르 결합에 의해 독소에 접합되는 것인 항체-약물 접합체.
  3. 제2항에 있어서, 링커가 올리고펩티드 링커 요소 및/또는 효소-절단가능한 링커 요소 및/또는 스페이서 요소를 추가로 포함하는 것인 항체-약물 접합체.
  4. 제3항에 있어서, 하나의 올리고펩티드 링커 요소가 -LPXTGm-, -LPXAGm-, -LPXSGm-, -LAXTGm-, -LPXTGm-, -LPXTAm-, -NPQTGm- 또는 -NPQTNm-으로부터 선택되는 소르타제 인식 모티프 올리고펩티드를 포함하고, 여기서 Gm은 올리고글리신이고, 여기서 m은 정수 ≥1 내지 ≤21이고, Am은 올리고알라닌이고, 여기서 m은 정수 ≥1 내지 ≤21이고, Nm은 올리고아스파라긴이고, 여기서 m은 정수 ≥1 내지 ≤21이고, X는 임의의 가능한 아미노산이고, 바람직하게, 소르타제 인식 모티프 올리고펩티드는 -LPQTGG- 또는 -LPETGG-이고, 바람직하게, 여기서 올리고펩티드 링커 요소는
    a. 서열 서열식별번호 131, 또는
    b. 서열 서열식별번호 132를 포함하는 것인 항체-약물 접합체.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 효소-절단가능한 링커 요소가 하기 화학식의 화합물에 따른 val-cit-PAB 링커를 포함하고:
    Figure pct00073

    상기 식에서, 파선은 다른 링커 요소에의 부착을 나타내는 것인 항체-약물 접합체.
  6. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 스페이서 요소가 펩티드 가요성 올리고펩티드를 포함하고, 바람직하게, 여기서 펩티드 가요성 올리고펩티드가 G 및 S로 이루어지고, 더욱 바람직하게, 여기서 펩티드 가요성 올리고펩티드가 (GGGGS)o이고, 여기서 o가 1, 2, 3, 4 또는 5인 항체-약물 접합체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 구조식을 갖는 항체-약물 접합체:
    a. A - ([올리고펩티드 링커 요소 - 비-절단가능한 링커 요소] - T)n 및 바람직하게, 여기서 링커는
    i. [LPXTGG]-[에틸렌디아민], 및
    ii. [LPXTGG]-[
    Figure pct00074
    ]로부터 선택됨;
    b. A - ([올리고펩티드 링커 요소 - 효소 절단가능한 링커 요소 - 비-절단가능한 링커 요소] - T)n 및 바람직하게, 여기서 링커는
    i. [LPXTGG]-[vc-PAB]-[N-포르밀-N,N'-디메틸에틸렌디아민], 및
    ii. [LPXTGG]-[vc-PAB]-[피페라진]으로부터 선택됨;
    c. A - ([스페이서 요소 - 올리고펩티드 링커 요소 - 비-절단가능한 링커 요소] - T)n 및 바람직하게, 여기서 링커는
    i. [GGGGS]-[LPXTGG]-[에틸렌디아민], 및
    ii. [GGGGS]-[LPXTGG]-[
    Figure pct00075
    ]로부터 선택됨; 또는
    d. A - ([스페이서 요소 - 올리고펩티드 링커 요소 - 효소 절단가능한 링커 요소 - 비-절단가능한 요소] - T)n 및 바람직하게, 여기서 링커는
    i. [GGGGS]-[LPXTGG]-[vc-PAB]-[N-포르밀-N,N'-디메틸에틸렌디아민], 및
    ii. [GGGGS]-[LPXTGG]-[vc-PAB]-[피페라진]으로부터 선택됨.
  8. 제7항에 있어서, 비-절단가능한 링커 요소가 에틸렌디아민이고, 여기서 올리고펩티드 링커 요소가 LPXTGG이고, 여기서 X가 Q 또는 E이고, 바람직하게, 여기서 X가 Q인 항체-약물 접합체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    a. (L-T)가 항체의 두 경쇄 모두에 공유 연결되거나,
    b. (L-T)가 항체의 두 중쇄 모두에 공유 연결되거나, 또는
    c. (L-T)가 항체의 두 경쇄 모두 및 두 중쇄 모두에 공유 연결된 것인 항체-약물 접합체.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 안트라사이클린 유도체가 하기 화학식 (I)을 갖고, C13에 의해 비-절단가능한 링커 요소에 공유 연결되고, 그 결과로 C14 및 히드록실 기는 손실되거나, 또는 C14 상의 히드록실 기에 의해 비-절단가능한 링커 요소에 공유 연결되고:
    Figure pct00076

    상기 식에서, R1이 수소 원자, 히드록시 또는 메톡시 기이고,
    상기 식에서, R2가 C1-C5 알콕시 기이고, 바람직하게, 여기서 안트라사이클린 유도체가 3'-데아미노-3",4'-안히드로-[2"(S)-메톡시-3"(R)-옥시-4"-모르폴리닐]독소루비신 (PNU-159682)의 유도체인 항체-약물 접합체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, A인 항체 또는 그의 단편이
    a. 각각 서열식별번호 1, 서열식별번호 15 및 서열식별번호 3의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호 4, 서열식별번호 5 및 서열식별번호 6의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열;
    b. 각각 서열식별번호 1, 서열식별번호 16 및 서열식별번호 3의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호 4, 서열식별번호 5 및 서열식별번호 6의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열;
    c. 각각 서열식별번호 1, 서열식별번호 16 및 서열식별번호 3의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호 17, 서열식별번호 14 및 서열식별번호 11의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열;
    d. 각각 서열식별번호 1, 서열식별번호 16 및 서열식별번호 3의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호 18, 서열식별번호 19 및 서열식별번호 11의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열;
    e. 각각 서열식별번호 12, 서열식별번호 15 및 서열식별번호 3의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호 4, 서열식별번호 5 및 서열식별번호 6의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열;
    f. 각각 서열식별번호 1, 서열식별번호 20, 및 서열식별번호 3의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호 4, 서열식별번호 5 및 서열식별번호 6의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열;
    g. 각각 서열식별번호 1, 서열식별번호 20 및 서열식별번호 3의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호 18, 서열식별번호 19 및 서열식별번호 11의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열;
    h. 각각 서열식별번호 12, 서열식별번호 20 및 서열식별번호 8의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호 4, 서열식별번호 5 및 서열식별번호 6의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열; 또는
    i. 각각 서열식별번호 12, 서열식별번호 20 및 서열식별번호 8의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호 17, 서열식별번호 14 및 서열식별번호 11의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열을 포함하는 것인 항체-약물 접합체.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, A인 항체 또는 그의 단편이
    a. 각각 서열식별번호 1, 서열식별번호 2 및 서열식별번호 3의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호 4, 서열식별번호 5 및 서열식별번호 6의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열;
    b. 각각 서열식별번호 1, 서열식별번호 7 및 서열식별번호 8의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호 9, 서열식별번호 10 및 서열식별번호 11의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열; 또는
    c. 각각 서열식별번호 12, 서열식별번호 2 및 서열식별번호 3의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열, 및 각각 서열식별번호 13, 서열식별번호 14 및 서열식별번호 11의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열을 포함하고,
    바람직하게, 여기서 A인 항체 또는 그의 단편이
    a. 서열식별번호 27의 VH 서열 및 서열식별번호 28의 VL 서열;
    b. 서열식별번호 29의 VH 서열 및 서열식별번호 30의 VL 서열; 또는
    서열식별번호 31의 VH 서열 및 서열식별번호 32의 VL 서열을 포함하는 것인 항체-약물 접합체.
  13. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, A인 항체 또는 그의 단편이 하기를 포함하고:
    a. 서열식별번호 33의 VH 서열 및 서열식별번호 38의 VL 서열;
    b. 서열식별번호 34의 VH 서열 및 서열식별번호 38의 VL 서열;
    c. 서열식별번호 34의 VH 서열 및 서열식별번호 39의 VL 서열;
    d. 서열식별번호 34의 VH 서열 및 서열식별번호 40의 VL 서열;
    e. 서열식별번호 35의 VH 서열 및 서열식별번호 38의 VL 서열;
    f. 서열식별번호 36의 VH 서열 및 서열식별번호 41의 VL 서열;
    g. 서열식별번호 36의 VH 서열 및 서열식별번호 40의 VL 서열;
    h. 서열식별번호 37의 VH 서열 및 서열식별번호 41의 VL 서열;
    i. 서열식별번호 37의 VH 서열 및 서열식별번호 38의 VL 서열; 또는
    j. 서열식별번호 37의 VH 서열 및 서열식별번호 39의 VL 서열,
    바람직하게, 여기서 A인 항체 또는 그의 단편이 하기를 포함하는 것인 항체-약물 접합체:
    a. 서열식별번호 46의 중쇄 서열 및 서열식별번호 51의 경쇄 서열;
    b. 서열식별번호 47의 중쇄 서열 및 서열식별번호 51의 경쇄 서열;
    c. 서열식별번호 47의 중쇄 서열 및 서열식별번호 52의 경쇄 서열;
    d. 서열식별번호 47의 중쇄 서열 및 서열식별번호 53의 경쇄 서열;
    e. 서열식별번호 48의 중쇄 서열 및 서열식별번호 51의 경쇄 서열;
    f. 서열식별번호 47의 중쇄 서열 및 서열식별번호 54의 경쇄 서열;
    g. 서열식별번호 49의 중쇄 서열 및 서열식별번호 53의 경쇄 서열;
    h. 서열식별번호 50의 중쇄 서열 및 서열식별번호 54의 경쇄 서열;
    i. 서열식별번호 50의 중쇄 서열 및 서열식별번호 51의 경쇄 서열; 또는
    j. 서열식별번호 50의 중쇄 서열 및 서열식별번호 52의 경쇄 서열
    또는 조작된 Fc 도메인을 갖는 그의 버전.
  14. 하기 단계:
    a. 바람직하게는 그의 C-말단에, 임의적으로, 항체 경쇄 및/또는 중쇄에서 스페이서 요소에 이어 올리고펩티드 링커 요소를 갖는 A인 항체 또는 그의 단편을 제공하는 단계,
    b. 비-절단가능한 링커 요소를 갖는 하나 이상의 독소 T를 제공하는 단계, 및
    c. 항체 및 독소를 접합시켜 항체-약물 접합체를 생성하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 항체-약물 접합체를 제조하는 방법.
  15. · 서열식별번호 46에 따른 아미노산 서열의 두 중쇄, 및 서열식별번호 51에 따른 아미노산 서열의 두 경쇄로 이루어진 항체로서, 여기서 항체는 CLDN18.2에 결합하는 것인 항체,
    · 경쇄의 C-말단의 링커 [GGGGS]-[LPQTGG]-[에틸렌디아민], 및
    · C13에서 링커의 에틸렌디아민에 공유 연결되어, C14 및 히드록실 기가 손실되는, 안트라사이클린-기반 소분자 독소 3'-데아미노-3",4'-안히드로-[2"(S)-메톡시-3"(R)-옥시-4"-모르폴리닐]독소루비신 (PNU-159682); 또는
    · 서열식별번호 133에 따른 아미노산 서열의 두 중쇄, 및 서열식별번호 51에 따른 아미노산 서열의 두 경쇄로 이루어진 항체로서, 여기서 항체는 CLDN18.2에 결합하는 것인 항체,
    · 경쇄의 C-말단의 링커 [GGGGS]-[LPQTGG]-[에틸렌디아민], 및
    · C13에서 링커의 에틸렌디아민에 공유 연결되어, C14 및 히드록실 기가 손실되는, 안트라사이클린-기반 소분자 독소 3'-데아미노-3",4'-안히드로-[2"(S)-메톡시-3"(R)-옥시-4"-모르폴리닐]독소루비신 (PNU-159682); 또는
    · 서열식별번호 134에 따른 아미노산 서열의 두 중쇄, 및 서열식별번호 51에 따른 아미노산 서열의 두 경쇄로 이루어진 항체로서, 여기서 항체는 CLDN18.2에 결합하는 것인 항체,
    · 경쇄의 C-말단의 링커 [GGGGS]-[LPQXTGG]-[에틸렌디아민], 및
    · C13에서 링커의 에틸렌디아민에 공유 연결되어, C14 및 히드록실 기가 손실되는, 안트라사이클린-기반 소분자 독소 3'-데아미노-3",4'-안히드로-[2"(S)-메톡시-3"(R)-옥시-4"-모르폴리닐]독소루비신 (PNU-159682)
    으로 이루어진 항체-약물 접합체.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 항체-약물 접합체, 및 부형제를 포함하는 제약 조성물.
  17. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 치료에서 사용하기 위한 항체-약물 접합체.
  18. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 암 치료에서 사용하기 위한 항체-약물 접합체로서, 바람직하게, 여기서 암이 췌장암, 위암, 식도암, 난소암 및 폐암으로부터 선택되는 것인 항체-약물 접합체.
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