CN117751139A

CN117751139A - 抗Nectin-4抗体依喜替康缀合物

Info

Publication number: CN117751139A
Application number: CN202280025792.0A
Authority: CN
Inventors: J·埃兰兹; F·洛斯派斯; X·普雷维尔; D·奥利夫; M·洛佩兹
Original assignee: Jean Pauli And Eileen Kalmet Institute; Emerging Pharmaceutical Co ltd; Aix Marseille Universite; Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Jean Pauli And Eileen Kalmet Institute; Emerging Pharmaceutical Co ltd; Aix Marseille Universite; Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 2021-03-31
Filing date: 2022-03-31
Publication date: 2024-03-22
Also published as: CN117440970A

Abstract

本发明涉及一种包含单克隆抗体或其抗原结合片段的抗体‑药物缀合物，其中所述单克隆抗体或其抗原结合片段与Nectin‑4结合和其中所述药物为拓扑异构酶I抑制剂、特别是依喜替康。

Description

抗Nectin-4抗体依喜替康缀合物

技术领域

本发明涉及含有单克隆抗体或其抗原结合片段的抗体-药物缀合物，其中所述单克隆抗体或其抗原结合片段与Nectin-4结合，其中所述药物是拓扑异构酶I抑制剂、特别是依喜替康(exatecan)或德鲁替康(deruxtecan)。

背景技术

Nectins是帮助组织上皮和内皮连接的黏附分子，并且作为单纯疱疹病毒、麻疹病毒和骨髓灰质炎病毒的用于进入的受体。

它们属于免疫球蛋白超家族并且是骨髓灰质炎病毒受体(PVR/CD155)的同源物，为此，也称为骨髓灰质炎病毒受体结合蛋白(PRR)。迄今为止，已描述了5名成员PVR/CD155、Nectin-1/PRR1/CD111、Nectin-2/PRR2/CD112、Nectin-3/PRR3和Nectin-4/PRR4。它们的胞外域由三个免疫球蛋白样(Ig)V、C、C型结构域构成，所述结构域在其氨基酸序列中共享30％至55％同一性。

Nectin/PRR分子通常在组织中广泛表达，所述组织包括造血细胞、神经元细胞、内皮细胞和上皮细胞，但Nectin-3和Nectin-4除外，它们表现更为受限的表达谱。

Nectin-4是特别令人感兴趣的靶标。它在胎儿发育过程中表达，但与Nectin家族的其它成员相比，它在成人组织中的表达减少并且非常受限。Nectin-4在83％的膀胱癌、78％的乳腺癌(主要为三阴性和ERBB2+)、71％的胰腺癌、55％的肺癌、57％的卵巢癌、59％的头颈癌和55％的食管癌中是肿瘤相关抗原。

这些病理中的Nectin-4的表达与不良预后相关，可能是由于Nectin-4的能力为体外赋予肿瘤细胞较高的迁移、增殖和转移形成能力的结果。在正常组织中，仅在皮肤、唾液腺、尿膀胱和食管中检测到Nectin-4。目前卫生机构批准维汀-恩弗妥单抗(Enfortumabvedotin)用于晚期泌尿道上皮癌的二线治疗验证了Nectin-4作为癌症治疗的靶标。

发明内容

本发明的第一方面是含有单克隆抗体或其抗原结合片段的抗体-药物缀合物，其中所述单克隆抗体或其抗原结合片段与Nectin-4结合，其中所述药物是拓扑异构酶I抑制剂、特别是依喜替康或德鲁替康。

本发明的其它方面是一种药物组合物，其包含活性剂和药学上可接受的载体和/或赋形剂，所述活性剂是含有单克隆抗体或其抗原结合片段的抗体-药物缀合物，其中所述单克隆抗体或其抗原结合片段与Nectin-4结合，其中所述药物是拓扑异构酶I抑制剂、特别是依喜替康。

本发明的其它方面是如上所述的抗体-药物缀合物或药物组合物在医学(medicine)、特别是在人类医学中的用途。

本发明的其它方面是如上所述的抗体-药物缀合物或药物组合物在用于预防和/或治疗Nectin-4相关病症、特别是用于预防和/或治疗Nectin-4阳性癌症的方法中的用途。

本发明的其它方面是如上所述的抗体-药物缀合物或药物组合物在用于预防和/或治疗选自以下的癌症的方法中的用途：膀胱癌、泌尿道上皮癌、子宫内膜癌、宫颈癌、结肠直肠癌、肝癌、甲状腺癌、乳腺癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、头颈癌和/或食管癌。

本发明的其它方面是用于预防和/或治疗Nectin-4相关病症、特别是用于预防和/或治疗Nectin-4阳性癌症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的如上所述的抗体-药物缀合物或药物组合物。

本发明的其它方面是用于预防和/或治疗癌症、特别是用于预防和/或治疗选自膀胱癌、泌尿道上皮癌、子宫内膜癌、宫颈癌、结肠直肠癌、肝癌、甲状腺癌、乳腺癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、头颈癌和/或食管癌的癌症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的如上所述的抗体-药物缀合物或药物组合物。

具体实施方式

本发明人发现，与作为抗Nectin-4抗体和一甲基澳瑞他汀E(monomethylauristatin E，MMAE)的缀合物的市售抗体维汀-恩弗妥单抗(Enfortumab vedotin)相比，抗Nectin-4抗体与例如依喜替康等拓扑异构酶I抑制剂的缀合物显示出提高的抗癌症活性。因此，本发明的抗Nectin-4抗体缀合物允许例如Nectin-4阳性癌症等Nectin-4相关病症的改进的治疗。

在具体实施方案中，本发明的抗体-药物缀合物包含新的抗Nectin-4抗体，所述抗体以与由人角质细胞例如体外分化型表达Nectin-4的角质细胞表达的Nectin-4相比较高的亲和力与由肿瘤表达的Nectin-4结合。优选实例为单克隆抗体(mAb)15A7.5、9A2.7、3A1.4和/或8F06。

具体优选的实例是单克隆抗体(mAb)15A7.5或由其衍生的抗体。在体外，在同样的测定中，与肿瘤细胞相比并参照HA22 mAb(恩弗妥单抗(Enfortumab))的活性，该选择性为mAb 15A7.5提供了对角质细胞具有较低的结合亲和力、内化和/或细胞毒活性。

具体地，本发明的缀合物包含衍生自单克隆抗Nectin-4抗体15A7.5 mAb的人源化抗体。

在体内，由于在皮肤中较低的吸收率，这种与角质细胞的低结合能力赋予了mAb15A7.5较长的半衰期。

在异种移植小鼠模型中，用缀合有依喜替康的mAb的4mg/kg的单剂量I.V.治疗已形成的肿瘤引起快速且长期的消退。

更具体地，本发明人阐明，在这样的配置中，抗体-依喜替康缀合物比维汀-恩弗妥单抗的替代物更有效，所述替代物即第三方使用非GMP方法制备的与市售维汀-恩弗妥单抗别无二致的维汀-恩弗妥单抗产品。

抗体

本发明的缀合物的抗体是表征为特定氨基酸序列的单克隆抗体(mAb)或单克隆抗体片段。如果没有不同的指示，术语“单克隆”是指单一种，即，抗体或抗体片段的单一氨基酸组合物。

本文提供的抗体优选显示出与Nectin-4的特异性结合，并且与人Nectin家族的其它蛋白质、特别是Nectin-1和/或啮齿动物Nectin-4如来自大鼠和/或小鼠的Nectin-4没有基本的(essential)或没有交叉反应性。

本发明的抗体的抗原结合位点包含重链可变结构域/区(VH)和/或抗体轻链可变结构域/区(VL)、或VH/VL对。

术语“抗原结合位点”表示抗体分子的、配体(例如抗原，即Nectin-4，或其抗原片段)实际与之结合且衍生自抗体的区域(一个或多个)。

可变结构域/区表示轻链和重链对的每一者，其直接参与抗体与抗原的结合，重链的可变结构域缩写为“VH”，轻链的可变结构域缩写为“VL”。

根据本发明的抗体的抗原结合位点可以包含六个互补决定区(CDR)，在不同程度上有助于结合位点对抗原的亲和力。存在三个重链可变结构域CDR(CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)和三个轻链可变结构域CDR(CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3)。本发明的范围内还包括由较少个CDR构成的功能性抗原结合位点(即，其中结合特异性由三个、四个或五个CDR决定)。例如，少于完整集合的6个CDR可足以进行结合。在一些情况中，VH或VL结构域将是足够的。

根据本发明，VH区或其CDR可以单独地构成完整的抗原结合位点。在某些实施方案中，抗体包含单独的如本文定义的VH区或其CDR。在其它实施方案中，抗体一起包含如本文定义的VH区或其CDR以及VL区或其CDR、特别是如本文定义的VL区或其CDR。

CDR在VH或VL区中的位置可以根据Kabat等,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版.Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD(1991)或者IMGT编号系统来定义，这二者均是本领域技术人员已知的。IMGT编号已限定为比较可变结构域，无论抗原受体、链类型、或物种如何(Lefranc M.-P.,"Unique database numbering system for immunogenetic analysis"ImmunologyToday,18,509(1997)；Lefranc M.-P.,"The IMGT unique numbering forImmunoglobulins,T cell receptors and Ig-like domains"The Immunologist,7,132-136(1999))。如果没有另外指出，本文使用Kabat系统。

如本文所用，术语“结合”和“特异性结合”是指本发明的抗体或其片段与Nectin-4抗原的表位的结合。抗体的结合强度的度量称为亲和力。本领域技术人员已知使用体外试验测定这样的结合和/或亲和力的方法。根据本发明，描述了用流式细胞术、免疫组织化学和/或荧光进行检测，并且在本文是特别优选的。

抗体与抗原结合的亲和力由术语Ka(来自抗体/抗原复合物的抗体的结合速率常数)、KD(解离常数)和K_dis(kD/ka)进行定义。

在某些实施方案中，本发明的缀合物的抗体可以是嵌合抗体、多特异性抗体、特别是双特异性抗体、人抗体、人源化抗体或其抗原结合片段。

根据本发明，“嵌合”抗体是指其中重链和/或轻链的一部分衍生自特定来源或物种、而重链和/或轻链的其余部分衍生自不同来源或物种的抗体。

“多特异性抗体”结合两个或更多个不同的表位。表位可以在相同或不同的抗原上。多特异性抗体的优选实例是结合两个不同表位的“双特异性抗体”。

在优选实施方案中，本发明的抗体是人源化抗体。

术语“人源化抗体”或“抗体的人源化形式”是指由于抗体工程化而使重链和轻链二者都被人源化的抗体。人源化链通常是其中V区氨基酸序列已被改变以使得作为整体分析其与人种系序列的同源性比原始物种的种系序列的同源性更接近的链。例如，可以将鼠CDR移植至人抗体的框架区以制备“人源化抗体”。参见，例如，Riechmann,L.,等,Nature332(1988)323-327；和Neuberger,M.S.,等,Nature 314(1985)268-270。本发明所包括的其它形式的人源化抗体是其中已由原始抗体的恒定区额外地修饰或改变以产生根据本发明所述的性质的那些。人源化评价是基于所得氨基酸序列而不是基于方法本身。

另一优选实施方案是指包含人抗体的缀合物。

如本文所用的术语“人抗体”旨在包括具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。人抗体是现有技术中众所周知的(van Dijk,M.A.,和van de Winkel,J.G.,Curr.Opin.Chem.Biol.5(2001)368-374)。人抗体也可以在转基因动物(例如小鼠)中产生，这些动物在免疫的情况下、能够在不存在内源性免疫球蛋白生产的情况下产生人抗体的完整的库或选择物。

本发明的缀合物的抗体可以是任何合适的类。术语“类”是指其重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。如本文所用，“恒定结构域”或“恒定区”表示除了可变区以外的抗体的结构域的总和。恒定区不直接参与抗原的结合，但表现各种效应子功能。抗体可以是5种主要抗体类、特别是5种主要人抗体类中的任一种：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，或其任何亚类(亚型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为a、δ、ε、γ和μ。根据本发明，IgG、IgA或IgM类抗体、特别是人IgG、IgA或IgM类抗体或其片段是特别适合的。

根据优选实施方案，本发明的缀合物的抗体选自IgG类、特别是人IgG类，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚类的抗体，或IgM类抗体，IgA类抗体，或其抗原结合片段。

在某些实施方案中，抗体包含恒定区，特别是重链恒定结构域，更特别是IgG的重链恒定结构域，特别是人IgG类的重链恒定结构域，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚类的重链恒定结构域，IgM类的重链恒定结构域，IgA类的重链恒定结构域，与相同亚类的野生型序列相比具有降低的效应子功能，例如具有降低的与Fc受体的结合。具有降低的效应子功能的重链恒定结构域的实例可以包含人IgG、例如IgG1或IgG4序列的突变D265C、L234A、L235A、P331S、L234Q和L235F的至少一种。

抗体的“抗原结合片段”是指包含完整抗体的一部分的分子，其与完整抗体所结合的抗原结合。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2；双体(diabodies)；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。所述术语还包括融合蛋白，例如与非免疫球蛋白肽或多肽的融合蛋白，和与非蛋白质结构如标签或毒素的缀合物。术语“抗体的(其)抗原结合片段”和“抗体的(其)片段”在本文可交换使用。

抗体或抗原结合片段可以是单价抗体或多价的，即其可以包括单个抗原结合位点或多个抗原结合位点。例如，Fab片段具有单个抗原结合位点，IgG类抗体或Fv或scFv片段具有两个抗原结合位点，IgM类抗体具有5个抗原结合位点。术语“抗体”还包括异源特异性抗体，例如异源双特异性抗体，其具有不同的抗原结合位点，特别是针对抗原上的两个不同的表位的抗体。如本文所用，“表位”是抗原的被抗体结合的区域。术语“表位”包括能够与抗体特异性结合的任何多肽决定簇(determinant)。

肿瘤选择性抗NECTIN-4抗体

在具体实施方案中，缀合物的抗体是肿瘤选择性抗Nectin-4抗体，其以与由人角质细胞例如体外分化型表达Nectin-4的角质细胞表达的Nectin-4相比较高的亲和力与由肿瘤表达的Nectin-4结合，例如衍生自单克隆抗体(mAb)15A7.5、9A2.7、3A1.4和/或8F06的抗体。特别优选mAb 15A7.5。

为了比较，结合亲和力可以通过流式细胞术、免疫组织化学和/或荧光来检测。尤其，这样的特异性结合允许基于本发明的抗体的治疗期间较少的副作用。

因此，包含抗体15A7.5、9A2.7、3A1.4和/或8F06和特别是衍生自其的人源化变体代表了一种通过较低相关皮肤毒性和较高抗肿瘤选择性及功效来提高Nectin-4阳性癌症治疗的治疗指数的新的方法。

肿瘤选择性抗Nectin-4抗体及其抗原结合片段优选显示出至少40、优选至少45、更优选至少50和最优选至少55(nM)的解离常数KD。

除了较低的结合亲和力以外，本文提供的肿瘤选择性抗体及片段还优选显示出与肿瘤细胞相比对角质细胞较低的内化和/或细胞毒活性。

根据特别优选的实施方案，肿瘤选择性抗体及片段显示出与肿瘤细胞相比对角质细胞较低的结合亲和力、较低的内化和较低的细胞毒活性。

当然，与由肿瘤表达的Nectin-4的特异性结合是优选的。

根据其它方面，本发明还涉及一种含有单克隆抗体或其抗原结合片段的抗体-药物缀合物，所述单克隆抗体或其抗原结合片段的特征在于以与由人角质细胞表达的Nectin-4相比较高的亲和力与由肿瘤表达的Nectin-4结合。为了比较，结合亲和力可以通过流式细胞术、免疫组织化学和/或荧光来检测。

在某些实施方案中，肿瘤选择性单克隆抗Nectin-4抗体或其抗原结合片段包含：

(a)可变重链(VH)区，其包含互补决定区(CDR)CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中

(i)CDR-H1包含根据SEQ ID NO:1、7、88、96或104所述的氨基酸序列，

或包含取代或插入、特别是至少一个氨基酸如1或2个氨基酸的保守取代和/或组氨酸插入的氨基酸序列，

(ii)CDR-H2包含根据SEQ ID NO:2、8、89、97或105所述的氨基酸序列，

(iii)CDR-H3包含根据SEQ ID NO:3、9、90、98或106所述的氨基酸序列，

或包含取代或插入、特别是至少一个氨基酸如1或2个氨基酸的保守取代和/或组氨酸插入的氨基酸序列，和任选地

(b)可变轻链(VL)区、特别是包含互补决定区(CDR)CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的VL区，其中

(i)CDR-L1包含根据SEQ ID NO:4、10、92、100或108所述的氨基酸序列，

(ii)CDR-L2包含根据SEQ ID NO:5、11、93、101或109所述的氨基酸序列，

(iii)CDR-L3包含根据SEQ ID NO:6、12、94、102或110所述的氨基酸序列，

或包含取代或插入、特别是至少一个氨基酸如1或2个氨基酸的保守取代和/或组氨酸插入的氨基酸序列。

SEQ ID NO:1-6限定了根据IMGT编号系统的本发明的亲本抗体15A7.5的六个CDR序列。SEQ ID NO:7-12限定了根据Kabat的本发明的亲本抗体的六个CDR序列。

在所附序列表中提供了本文使用的SEQ ID NO:的特定氨基酸序列。

SEQ ID NO:s 88-95表征了mAb 9A2.7。

SEQ ID NO:s 96-103表征了mAb 3A1.4。

SEQ ID NO:s 104-111表征了mAb 8F06。

根据本发明，这些CDR序列中的至少一个氨基酸、例如1或2个氨基酸的取代或插入是可行的。在具体实施方案中，保守氨基酸取代是优选的，即一氨基酸被具有类似生化性质的另一氨基酸取代，例如脂肪族氨基酸如Gly、Ala、Val、Leu或Ile取代另一脂肪族氨基酸，碱性氨基酸如His、Lys或Arg取代另一碱性氨基酸，酸性氨基酸或其酰胺如Asp、Glu、Asn或Gln取代另一酸性氨基酸或其酰胺，芳香族氨基酸如Phe、Tyr或Trp取代另一芳香族氨基酸，或含羟基或硫的氨基酸如Ser、Thr、Met或Cys取代另一含羟基或硫的氨基酸。在其它具体实施方案中，至少一个氨基酸、例如1或2个组氨酸残基被插入至重链或轻链的一个或多个CDR序列，例如CDR1、CDR2或CDR3。这可导致相对于例如pH 7.0至7.5等中性pH，在例如5.5至6.5之间的pH等低pH下的优先结合。

根据其它优选实施方案，根据IMGT编码系统，抗体或其抗原结合片段包含：

(i)VH区，其包含SEQ ID NO:1的CDR-H1、SEQ ID NO:2的CDR-H2和SEQ ID NO:3的CDR-H3，

和任选地

(ii)VL区，其包含SEQ ID NO:4的CDR-L1、SEQ ID NO:5的CDR-L2和SEQ ID NO:6的CDR-L3。

根据另一优选实施方案，抗体或其抗原结合片段包含根据Kabat的：

(i)VH区，其包含SEQ ID NO:7的CDR-H1、SEQ ID NO:8的CDR-H2和SEQ ID NO:9的CDR-H3，

和任选地

(ii)VL区，其包含SEQ ID NO:10的CDR-L1、SEQ ID NO:11的CDR-L2和SEQ ID NO:12的CDR-L3。

根据另一优选实施方案，抗体或其抗原结合片段包含：

(i)VH区，其包含SEQ ID NO:88的CDR-H1、SEQ ID NO:89的CDR-和SEQ ID NO:90的CDR-H3，

和任选地

(ii)VL区，其包含SEQ ID NO:92的CDR-L1、SEQ ID NO:93的CDR-L2和SEQ ID NO:94的CDR-L3。

根据另一优选实施方案，抗体或其抗原结合片段包含：

(i)VH区，其包含SEQ ID NO:96的CDR-H1、SEQ ID NO:97的CDR-和SEQ ID NO:98的CDR-H3，

和任选地

(ii)VL区，其包含SEQ ID NO:100的CDR-L1、SEQ ID NO:101的CDR-L2和SEQ IDNO:102的CDR-L3。

根据另一优选实施方案，抗体或其抗原结合片段包含：

(i)VH区，其包含SEQ ID NO:104的CDR-H1、SEQ ID NO:105的CDR-H2和SEQ ID NO:106的CDR-H3，

和任选地

(ii)VL区，其包含SEQ ID NO:108的CDR-L1、SEQ ID NO:109的CDR-L2和SEQ IDNO:110的CDR-L3。

更具体地，抗体或其抗原结合片段可以包含：

(a)VH区，其包含根据SEQ ID NO:13、91、99或107所述的氨基酸序列或相对于序列的全长具有至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的同一性的氨基酸序列，

和任选地

(b)VL区，特别是包含根据SEQ ID NO:14、95、103或111所述的氨基酸序列或相对于序列的全长具有至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的同一性的氨基酸序列的VL区。

根据优选实施方案，抗体或其抗原结合片段可以包含：

(a)VH区，其包含根据SEQ ID NO:13所述的氨基酸序列或相对于序列的全长具有至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的同一性的氨基酸序列，

和任选地

(b)VL区，特别是包含根据SEQ ID NO:14所述的氨基酸序列或相对于序列的全长具有至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的同一性的氨基酸序列的VL区。

根据优选实施方案，抗体或其抗原结合片段可以包含：

(a)VH区，其包含根据SEQ ID NO:91所述的氨基酸序列或相对于序列的全长具有至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的同一性的氨基酸序列，

和任选地

(b)VL区，特别是包含根据SEQ ID NO:95所述的氨基酸序列或相对于序列的全长具有至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的同一性的氨基酸序列的VL区。

根据优选实施方案，抗体或其抗原结合片段可以包含：

(a)VH区，其包含根据SEQ ID NO:99所述的氨基酸序列或相对于序列的全长具有至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的同一性的氨基酸序列，

和任选地

(b)VL区，特别是包含根据SEQ ID NO:103所述的氨基酸序列或相对于序列的全长具有至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的同一性的氨基酸序列的VL区。

根据优选实施方案，抗体或其抗原结合片段可以包含：

(a)VH区，其包含根据SEQ ID NO:107所述的氨基酸序列或相对于序列的全长具有至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的同一性的氨基酸序列，

和任选地

(b)VL区，特别是包含根据SEQ ID NO:111所述的氨基酸序列或相对于序列的全长具有至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的同一性的氨基酸序列的VL区。

关于肽或多肽序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”，定义为在比对序列并根据需要引入空位以实现最大序列同一性百分比后，候选序列中的与特定肽或多肽序列中的氨基酸残基为相同的氨基酸残基的百分比。为了确定氨基酸序列同一性百分比的目的的比对可以以本领域技术范围内的各种方法来实现，例如使用公众可获得的计算机软件如BLAST。

在具体实施方案中，本发明的人源化或人抗体定义为至少3个、优选6个互补决定区(CDR)的组合，即涉及包含以下的抗体或其抗原结合片段：

(i)CDR-H1包含根据SEQ ID NO:21、35、49或63所述的氨基酸序列，或包含取代或插入、特别是至少一个氨基酸如1或2个氨基酸的保守取代和/或组氨酸插入的氨基酸序列，

(ii)CDR-H2包含根据SEQ ID NO:22、36、50或64所述的氨基酸序列，

(iii)CDR-H3包含根据SEQ ID NO:23、37、51或65所述的氨基酸序列，

(i)CDR-L1包含根据SEQ ID NO:24、38、52或66所述的氨基酸序列，或包含取代或插入、特别是至少一个氨基酸如1或2个氨基酸的保守取代和/或组氨酸插入的氨基酸序列，

(ii)CDR-L2包含根据SEQ ID NO:25、39、53或67所述的氨基酸序列，

(iii)CDR-L3包含根据SEQ ID NO:26、40、54或68所述的氨基酸序列，

根据本发明的特定人源化或人抗体可以包含：

(a)(i)VH区，其包含SEQ ID NO:21的CDR-H1、SEQ ID NO:22的CDR-H2和SEQ IDNO:23的CDR-H3，

和任选地

(ii)VL区，其包含SEQ ID NO:24的CDR-L1、SEQ ID NO:25的CDR-L2和SEQ ID NO:26的CDR-L3，

或

(b)(i)VH区，其包含SEQ ID NO:35的CDR-H1、SEQ ID NO:36的CDR-H2和SEQ IDNO:37的CDR-H3，

和任选地

(ii)VL区，其包含SEQ ID NO:38的CDR-L1、SEQ ID NO:39的CDR-L2和SEQ ID NO:40的CDR-L3，

或

(c)(i)VH区，其包含SEQ ID NO:49的CDR-H1、SEQ ID NO:50的CDR-H2和SEQ IDNO:51的CDR-H3，

和任选地

(ii)VL区，其包含SEQ ID NO:52的CDR-L1、SEQ ID NO:53的CDR-L2和SEQ ID NO:54的CDR-L3，

或

(d)(i)VH区，其包含SEQ ID NO:63的CDR-H1、SEQ ID NO:64的CDR-H2和SEQ IDNO:65的CDR-H3，

和任选地

(ii)VL区，其包含SEQ ID NO:66的CDR-L1、SEQ ID NO:67的CDR-L2和SEQ ID NO:68的CDR-L3，

或

(e)(i)VH区，其包含SEQ ID NO:21的CDR-H1、SEQ ID NO:22的CDR-H2和SEQ IDNO:23的CDR-H3，

和任选地

或

(f)(i)VH区，其包含SEQ ID NO:21的CDR-H1、SEQ ID NO:22的CDR-H2和SEQ IDNO:23的CDR-H3，

和任选地

(ii)VL区，其包含SEQ ID NO:52的CDR-L1、SEQ ID NO:5的CDR-L2和SEQ ID NO:54的CDR-L3，

或

(g)(i)VH区，其包含SEQ ID NO:21的CDR-H1、SEQ ID NO:22的CDR-H2和SEQ IDNO:23的CDR-H3，

和任选地

或

(h)(i)VH区，其包含SEQ ID NO:35的CDR-H1、SEQ ID NO:36的CDR-H2和SEQ IDNO:37的CDR-H3，

和任选地

或(j)(i)VH区，其包含SEQ ID NO:35的CDR-H1、SEQ ID NO:36的CDR-H2和SEQ IDNO:37的CDR-H3，

和任选地

或(k)(i)VH区，其包含SEQ ID NO:35的CDR-H1、SEQ ID NO:36的CDR-H2和SEQ IDNO:37的CDR-H3，

和任选地

或

(l)(i)VH区，其包含SEQ ID NO:49的CDR-H1、SEQ ID NO:50的CDR-H2和SEQ IDNO:51的CDR-H3，

和任选地

或

(m)(i)VH区，其包含SEQ ID NO:49的CDR-H1、SEQ ID NO:50的CDR-H2和SEQ IDNO:51的CDR-H3，

和任选地

或

(n)(i)VH区，其包含SEQ ID NO:49的CDR-H1、SEQ ID NO:50的CDR-H2和SEQ IDNO:51的CDR-H3，

和任选地

或

(o)(i)VH区，其包含SEQ ID NO:63的CDR-H1、SEQ ID NO:64的CDR-H2和SEQ IDNO:65的CDR-H3，

和任选地

或

(p)(i)VH区，其包含SEQ ID NO:63的CDR-H1、SEQ ID NO:64的CDR-H2和SEQ IDNO:65的CDR-H3，

和任选地

或

(q)(i)VH区，其包含SEQ ID NO:63的CDR-H1、SEQ ID NO:64的CDR-H2和SEQ IDNO:65的CDR-H3，

和任选地

(ii)VL区，其包含SEQ ID NO:52的CDR-L1、SEQ ID NO:53的CDR-L2和SEQ ID NO:54的CDR-L3。

特别优选的是如上定义的人源化抗体(a)、(b)、(c)、(d)、(j)、(k)、(n)和(q)。

(ii)CDR-H2包含根据SEQ ID NO:22、36、50或64所述的氨基酸序列，

(iii)CDR-H3包含根据SEQ ID NO:23、37、51或65所述的氨基酸序列，

(ii)CDR-L2包含根据SEQ ID NO:25、39、53或67所述的氨基酸序列，

(iii)CDR-L3包含根据SEQ ID NO:26、40、54或68所述的氨基酸序列，

根据本发明的特定人源化或人抗体可以包含：

和任选地

或

和任选地

或

和任选地

或

和任选地

或

和任选地

或

和任选地

或

和任选地

或

和任选地

或

(j)(i)VH区，其包含SEQ ID NO:35的CDR-H1、SEQ ID NO:36的CDR-H2和SEQ IDNO:37的CDR-H3，

和任选地

或

(k)(i)VH区，其包含SEQ ID NO:35的CDR-H1、SEQ ID NO:36的CDR-H2和SEQ IDNO:37的CDR-H3，

和任选地

或

和任选地

或

和任选地

或

和任选地

或

和任选地

或

和任选地

或

和任选地

当然，根据本发明的人源化或人抗体也可以由其VH和/或VL区定义。

这样的抗体可以包含：

(i)VH区，其包含选自SEQ ID NO:27、41、55或69的氨基酸序列或与其具有至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的同一性的氨基酸序列，

和任选地

(ii)VL区，特别是包含选自SEQ ID NO:28、42、56、70或71的氨基酸序列或与其具有至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的同一性的氨基酸序列的VL区。

根据本发明的特定人源化或人抗体也可以由其VH和/或VL区定义，其中这样的抗体包含：

(a)(i)VH区，其包含根据SEQ ID NO:27所述的氨基酸序列或与其具有至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的同一性的氨基酸序列，和任选地

(ii)VL区，特别是包含根据SEQ ID NO:28所述的氨基酸序列或与其具有至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的同一性的氨基酸序列的VL区，

或

(b)(i)VH区，其包含根据SEQ ID NO:41所述的氨基酸序列或与其具有至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的同一性的氨基酸序列，和任选地

(ii)VL区，特别是包含根据SEQ ID NO:42所述的氨基酸序列或与其具有至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的同一性的氨基酸序列的VL区，

或

(c)(i)VH区，其包含根据SEQ ID NO:55所述的氨基酸序列或与其具有至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的同一性的氨基酸序列，和任选地

(ii)VL区，特别是包含根据SEQ ID NO:56所述的氨基酸序列或与其具有至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的同一性的氨基酸序列的VL区，

或

(d)(i)VH区，其包含根据SEQ ID NO:69所述的氨基酸序列或与其具有至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的同一性的氨基酸序列，和任选地

(ii)VL区，特别是包含根据SEQ ID NO:70或71所述的氨基酸序列或与其具有至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的同一性的氨基酸序列的VL区，

或

(e)(i)VH区，其包含根据SEQ ID NO:27所述的氨基酸序列或与其具有至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的同一性的氨基酸序列，和任选地

或

(f)(i)VH区，其包含根据SEQ ID NO:27所述的氨基酸序列或与其具有至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的同一性的氨基酸序列，和任选地

或

(g)(i)VH区，其包含根据SEQ ID NO:27所述的氨基酸序列或与其具有至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的同一性的氨基酸序列，和任选地

或

(h)(i)VH区，其包含根据SEQ ID NO:41所述的氨基酸序列或与其具有至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的同一性的氨基酸序列，和任选地

或

(j)(i)VH区，其包含根据SEQ ID NO:41所述的氨基酸序列或与其具有至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的同一性的氨基酸序列，和任选地

或

(k)(i)VH区，其包含根据SEQ ID NO:41所述的氨基酸序列或与其具有至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的同一性的氨基酸序列，和任选地

或

(l)(i)VH区，其包含根据SEQ ID NO:55所述的氨基酸序列或与其具有至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的同一性的氨基酸序列，和任选地

或

(m)(i)VH区，其包含根据SEQ ID NO:55所述的氨基酸序列或与其具有至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的同一性的氨基酸序列，和任选地

或

(n)(i)VH区，其包含根据SEQ ID NO:55所述的氨基酸序列或与其具有至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的同一性的氨基酸序列，和任选地

或

(o)(i)VH区，其包含根据SEQ ID NO:69所述的氨基酸序列或与其具有至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的同一性的氨基酸序列，和任选地

或

(p)(i)VH区，其包含根据SEQ ID NO:69所述的氨基酸序列或与其具有至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的同一性的氨基酸序列，和任选地

或

(q)(i)VH区，其包含根据SEQ ID NO:69所述的氨基酸序列或与其具有至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的同一性的氨基酸序列，和任选地

(ii)VL区，特别是包含根据SEQ ID NO:56所述的氨基酸序列或与其具有至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的同一性的氨基酸序列的VL区。

其它抗Nectin-4抗体

在其它实施方案中，本发明的缀合物的抗体是抗体5A12.2或其抗原结合片段。

SEQ ID NO:s 80-87表征了mAb 5A12.2。

根据优选实施方案，5A12.2抗体或其抗原结合片段包含：

(i)VH区，其包含SEQ ID NO:80的CDR-H1、SEQ ID NO:81的CDR-和SEQ ID NO:82的CDR-H3，

和任选地

(ii)VL区，其包含SEQ ID NO:84的CDR-L1、SEQ ID NO:85的CDR-L2和SEQ ID NO:86的CDR-L3。

根据另一优选实施方案，5A12.2抗体或其抗原结合片段包含：

(a)VH区，其包含根据SEQ ID NO:83所述的氨基酸序列或相对于序列的全长具有至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的同一性的氨基酸序列，

和任选地

(b)VL区，特别是包含根据SEQ ID NO:87所述的氨基酸序列或相对于序列的全长具有至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的同一性的氨基酸序列的VL区。

在其它实施方案中，本发明的缀合物的抗体是作为市售抗体-药物缀合物维汀-恩弗妥单抗的抗体的抗体HA22、或HA22-衍生的抗体。

HA22是WO2012/047724中描述的人单克隆抗Nectin-4抗体，前述文献通过引用并入本文。HA22抗体或HA22-衍生的抗体特别是指包含重链G1m17或G1m3单倍型序列和κ轻链序列的IgG1抗体，所述重链G1m17或G1m3单倍型序列任选地有具有如上所述的降低的效应子功能的恒定区，例如TM突变：P331S、L234Q和L235F，或LALA突变：L234A和L235A。特别地，HA22 VH序列及其人IgG1恒定区示于WO 2012/047724的图3A，HA22 VL序列及其人κ恒定区示于WO 2012/047724的图3B。

在某些实施方案中，HA22-衍生的单克隆抗Nectin-4抗体或其抗原结合片段由其CDR序列定义并且包含：

(i)CDR-H1，其包含根据SEQ ID NO:72所述的氨基酸序列，

(ii)CDR-H2，其包含根据SEQ ID NO:73所述的氨基酸序列，

(iii)CDR-H3，其包含根据SEQ ID NO:74所述的氨基酸序列，

(i)CDR-L1，其包含根据SEQ ID NO:75所述的氨基酸序列，

(ii)CDR-L2，其包含根据SEQ ID NO:76所述的氨基酸序列，

(iii)CDR-L3，其包含根据SEQ ID NO:77所述的氨基酸序列，

SEQ ID NO:72-77限定了根据IMGT编号系统的亲本抗体HA22的六个CDR序列。

在具体实施方案中，HA22衍生的抗体可以由其VH和/或VL区定义，其中这样的抗体包含：

(a)(i)VH区，其包含根据SEQ ID NO:78所述的氨基酸序列或与其具有至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的同一性的氨基酸序列，

和任选地

(ii)VL区，特别是包含根据SEQ ID NO:79所述的氨基酸序列或与其具有至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的同一性的氨基酸序列的VL区。

在甚至更具体的实施方案中，HA22衍生的抗体包含：

(a)(i)VH区，其包含根据SEQ ID NO:78所述的氨基酸序列，

和

(ii)VL区，其包含根据SEQ ID NO:79所述的氨基酸序列。

拓扑异构酶I抑制剂

本发明的抗体缀合物的药物是拓扑异构酶I抑制剂。拓扑异构酶I抑制剂是能够与拓扑异构酶I和DNA形成三元复合物，从而在细胞基因组中防止DNA再连接并引入DNA链断裂的化合物。拓扑异构酶I抑制剂可以例如选自喜树碱(camptothecin)或其类似物、茚并异喹啉(indenoisoquinoline)和吲哚并咔唑(indolocarbazole)。

在具体实施方案中，拓扑异构酶I抑制剂是喜树碱或其类似物，即包含喜树碱的五环基础结构和任选导致存在其它环的修饰取代基的化合物。具体实例为喜树碱、拓扑替康(topotecan)、伊立替康(irinotecan)、SN-38、贝洛替康(belotecan)、依喜替康，包括其衍生物，例如德鲁替康、勒托替康(lurtotecan)或atiratecan。

在具体实施方案中，拓扑异构酶I抑制剂是依喜替康：

依喜替康经由其NH₂基团典型地缀合至抗体。

缀合

拓扑异构酶I抑制剂、特别是依喜替康共价缀合至抗体或其抗原结合片段。

理论上，拓扑异构酶I抑制剂，例如依喜替康，可以缀合至单克隆抗体或其抗原结合片段的任何合适的位置，特别是缀合至不消除抗体与Nectin-4的结合的任何位置。例如，拓扑异构酶I抑制剂，例如依喜替康，可以缀合至抗体上的反应性氨基酸残基如具有含有氨基、羟基或硫醇基的侧链的氨基酸残基，或者抗体聚糖结构中的反应性基团。在具体实施方案中，拓扑异构酶I抑制剂，例如依喜替康，缀合至抗体上的可接近的(accessible)半胱氨酸残基的侧链中的反应性硫醇基。

在某些实施方案中，抗体药物缀合物包括大于1的药物-抗体/抗体片段摩尔比(DAR)，即多于一个药物分子连接至抗体/抗体片段。典型地，缀合物的DAR为约2:1至约16:1，特别为约4:1至约10:1，更特别为约6:1至约8:1。DAR可根据已知的方法从统计分布计算。

在某些实施方案中，拓扑异构酶I抑制剂经由连接子缀合至抗体或抗原结合片段。在某些实施方案中，连接子是可切割连接子，即在生理条件下是可切割的、例如通过生理酶可切割的连接子。可切割连接子的特定实例为基于肽的连接子，其可通过蛋白酶而经历切割，或基于糖苷的连接子，其可通过糖苷酶而经历切割。

在某些实施方案中，连接子是亲水性聚肌氨酸连接子，例如如Conilh等.“Exatecan antibody drug conjugates based on a hydrophilic polysarcosine drug-linker platform”(Pharmaceuticals 14(2021),247)所述。其它优选连接子包括含有至少一个乙二醇单元如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个乙二醇单元的连接子，例如抗体-药物缀合物MEDI7247的连接子，来自的mcc-三唑间隔子-PEG7-x-Lys-PABC二醇连接子，其它优选的连接子包括寡肽、特别是二肽至十肽，例如四肽序列如来自/>的甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸。其它优选连接子包括高极性间隔子如酰基、氨基甲酰基、和/或磺酰胺基团(sulfamide group)添加至至少一个乙二醇单元如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个乙二醇单元，例如称为Hydraspace^TM的连接子技术。

在具体实施方案中，连接子是亲水性聚肌氨酸连接子，其包含例如多至15个肌氨酸单元和至少一个乙二醇单元如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个乙二醇单元，其中所述连接子通过糖苷酶而经历切割、特别地通过葡糖醛酸糖苷酶(glucuronidase)而经历切割。

在具体实施方案中，连接子是亲水性聚肌氨酸连接子，其包含例如8-12个肌氨酸单元和至少一个乙二醇单元，例如多至10个乙二醇单元，其中所述连接子通过糖苷酶而经历切割、特别地通过葡糖醛酸糖苷酶而经历切割。

在具体实施方案中，连接子是亲水性聚肌氨酸连接子，其包含10个肌氨酸单元和2个乙二醇单元，其中所述连接子通过葡糖醛酸糖苷酶而经历切割。

本发明的抗体药物缀合物可通过已知的方法来制备。

抗体或其抗原结合片段可以在合适的宿主细胞中产生，所述宿主细胞包含编码抗体VH区或抗体VL区、或编码完整抗体或抗体片段的核酸分子，例如DNA分子，或载体或载体系统，即多个载体，包含优选与表达控制序列、特别地与异源表达控制序列可操作地连接的所述核酸分子(一个以上)。宿主细胞可以是用于产生抗体或抗体片段的任何已知的宿主细胞，例如原核细胞如大肠杆菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、或哺乳动物细胞，例如CHO细胞或杂交瘤细胞。

抗体或其抗原结合片段可与连接子-药物缀合物反应以获得抗体-药物缀合物。连接子-药物缀合物包括药物分子，例如具有连接至其的合适的连接子，其中所述连接子包括能够与抗体或其抗原结合片段上期望的连接位置反应的反应性基团。为了连接至半胱氨酸残基，连接子-药物缀合物包含硫醇-反应性基团，例如马来酰亚胺基团。

本发明的其它方面涉及连接子-药物缀合物，其包含：

(i)亲水性聚肌氨酸连接子，其包含例如约8-12个肌氨酸单元和至少一个乙二醇单元如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个乙二醇单元，其中所述连接子通过糖苷酶而经历切割，并且特别地通过葡糖醛酸糖苷酶而经历切割，其中所述连接子包含能够与抗体或其抗原结合片段上的半胱氨酸残基反应的硫醇-反应性基团，例如马来酰亚胺基团，和

(ii)拓扑异构酶I抑制剂、特别是依喜替康，其共价连接至连接子。

在具体实施方案中，连接子-药物缀合物包含：

(i)亲水性聚肌氨酸连接子，其包含例如10个肌氨酸单元和2个乙二醇单元，其中所述连接子通过糖苷酶而经历切割，并且特别地通过葡糖醛酸糖苷酶而经历切割，其中所述连接子包含能够与抗体或其抗原结合片段上的半胱氨酸残基反应的马来酰亚胺基团，和

(ii)依喜替康，其共价连接至连接子。

连接子-药物缀合物特别适合于连接至如本文所述的抗Nectin-4抗体。然而，需要注意的是，连接子-药物缀合物也适合于连接至任何抗体或其抗原结合片段，例如与肿瘤抗原结合的抗体或其抗原结合片段。

药物组合物

本发明的其它方面是一种药物组合物，其包含活性剂和药学上可接受的载体和/或赋形剂，所述活性剂是抗体-药物缀合物，所述抗体-药物缀合物包含单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体或其抗原结合片段与Nectin-4结合，其中所述药物是拓扑异构酶I抑制剂、特别是依喜替康。

用于配制抗体药物缀合物的合适的载体和赋形剂的实例包括盐水和水性缓冲液，并且是本领域众所周知的。典型地，药物组合物用于肠胃外施用，例如用于皮下、肌内、或静脉内注射或通过输注。在其它实施方案中，药物组合物适用于局部施用，例如用于膀胱内滴注至膀胱中。

取决于病症的阶段和严重程度，药物组合物可以以治疗有效剂量向有需要的受试者、特别是向人受试者施用一次或几次。例如，可以在合适的时间段内，例如至少一周、或至少一个月，每天、每两天、每周两次或每周施用一次或几次。

医学应用

根据本发明的其它方面，如上所述的抗体-药物缀合物或药物组合物用于医学，包括人类和兽医学、特别是人类医学。

在具体实施方案中，如上所述的抗体-药物缀合物或药物组合物用于预防和/或治疗Nectin-4相关病症、特别是用于预防和/或治疗Nectin-4阳性癌症、更特别地是用于预防和/或治疗与Nectin-4过表达相关的癌症的方法。

要预防和/或治疗的癌症可以是任何种类的癌症，其中术语“癌症”在本文中用于指增殖性疾病。根据本发明的要预防和/或治疗的癌症优选选自由以下组成的组：膀胱癌、泌尿道上皮癌、子宫内膜癌、宫颈癌、结肠直肠癌、肝癌、甲状腺癌、乳腺癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、头颈癌和/或食管癌。

在治疗应用中，将活性剂以有效量向有需要的受试者、特别是人受试者施用。剂量将取决于药剂的具体类型、例如抗体或抗体片段的类型、疾病的类型、施用模式，例如局部地或全身地。

在癌症的预防和/或治疗中，抗体药物缀合物的治疗剂量典型地为约0.3mg/kg至约10mg/kg。

抗体药物缀合物可以单独地或与其它活性剂组合施用，所述其它活性剂可选自化学治疗剂，例如抗代谢药、烷基化剂、嵌入剂(intercalating agent)、或抗有丝分裂剂)，特定激酶的抑制剂，例如酪氨酸激酶抑制剂、丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂或磷酸肌醇激酶抑制剂，免疫治疗化合物，例如免疫检查点抑制剂、CAR-T细胞、治疗性疫苗或溶瘤病毒(oncolytic virus)。

此外，通过以下表格、附图和实施例，更详细地解释本发明。

附图

图1：Ch-15A7.5和Ch-5A12.2识别人Nectin-4。通过流式细胞术检测。

使用剂量范围(0.3ng/mL–5μg/mL)的Ch-15A7.5和Ch-5A12.2抗体，用Nectin-4的N-末端Flag标记的表位转染的MDA-MB231的流式细胞术分析。包括亲本MDA-MB231细胞作为对照。用藻红蛋白缀合的山羊抗人Fc抗体染色细胞。显示出归一化的平均荧光强度。插图：由抗Nectin-1、-2和-3mAb(5μg/mL)染色亲本MDA-MB231细胞。显示出平均荧光强度。

图2：Ch-15A7.5识别人Nectin-4的IgV样结构域。通过ELISA检测。

如所示，在4℃用以下包被96孔板过夜：5μg/mL Nectin-1胞外结构域Fc融合重组蛋白(Nec1-VCC)、或Nectin-4 IgV样结构域Fc融合重组蛋白(Nec4-V)、或Nectin-4胞外结构域Fc融合重组蛋白(Nec4-VCC)。Ch15A7.5识别Nectin-4胞外结构域，更准确地说是Nectin-4 IgV样结构域而不是Nectin-1胞外结构域。

图3：Ch-15A7.5表位的特征。通过ELISA进行竞争测定。

在4℃下用5μg/mL的Nectin-4胞外结构域Fc融合重组蛋白(Nec4-VCC)包被96孔板过夜。在存在增加浓度(2.75ng/mL-6μg/mL)的利妥昔单抗、Ch-15A7 mAb、恩弗妥单抗(HA22)、Ch-N41 mAb和Ch-14A5 mAb的情况下，测量过氧化物酶缀合的Ch-15A7.5 mAb(5μg/mL)的结合。HA22、Ch-N41和CH-14A5识别Nectin-4的IgV结构域。

图4：Ch-15A7.5和5A12.2 mAb与Nectin-1竞争Nectin-4结合。通过流式细胞术评价竞争。

96孔板接种有用人Nectin-4cDNA转染的50,000个CHO细胞。用增加浓度的同型对照(isotypic control)、Ch-15A7.5或Ch-5A12.2 mAb(8ng/mL–5μg/mL)培养细胞45分钟。在洗涤后，用20μg/mL的Nectin-1胞外结构域Fc融合重组蛋白(Nec1-VCC)培养板。在用与藻红蛋白偶联的山羊抗人Fc抗体培养后，显示出Nectin-1结合。

图5：与来自食蟹猴(cynomolgus monkey)、大鼠和小鼠的Nectin-4的交叉反应性。通过流式细胞术检测。

使用剂量范围的Ch-15A7(A)、Ch-3A1.4(B)、Ch-5A12.2(C),Ch-9A2.7(D)或恩弗妥单抗(HA22,B)抗体(0.05ng/mL–5μg/mL)，用食蟹猴、大鼠或小鼠Nectin-4转染的CHO细胞的流式细胞术分析。然后用藻红蛋白缀合的山羊抗人Fc抗体染色细胞。显示出归一化的平均荧光强度。表格报告了通过GraphPad Prism 9软件、使用非线性曲线拟合(4个参数)确定的估计EC₅₀值。～符号表示报告值是由于不良拟合而不明确的。

图6：与由肿瘤细胞系和正常分化型人角质细胞表达的Nectin-4的差异结合。通过流式细胞术检测。

使用剂量范围(1.2ng/mL–5μg/mL))的恩弗妥单抗(HA22，正方形)、Ch-15A7.5(圆形)、Ch-3A1.4(三角形)和Ch-9A2.7(菱形)，TNBC细胞系(SUM190，实心符号)和正常分化型(0.1mM CaCl₂)人角质细胞(NHEK，空心符号)的流式细胞术分析。然后用藻红蛋白缀合的山羊抗人Fc抗体染色细胞。显示出归一化的平均荧光强度。用GraphPad Prism 9软件进行非线性曲线拟合(4个参数)。水平线放置在针对SUM190细胞的用HA22抗体获得的最大染色强度的50％处。

图7：与由肿瘤细胞系和正常分化型人角质细胞表达的Nectin-4的差异结合。通过流式细胞术检测。使用5μg/mL的HA22(恩弗妥单抗)、Ch-5A12.2、Ch-15A7.5和Ch-8F06，TNBC细胞系(SUM190，A)和正常分化型(0.1mM CaCl₂)人角质细胞(NHEK，B)的流式细胞术分析。然后用藻红蛋白缀合的山羊抗人Fc抗体染色细胞。显示出归一化的平均荧光强度。

图8：与由肿瘤细胞系和人角质细胞表达的Nectin-4的差异结合。通过免疫组织化学检测。

对高表达水平Nectin-4肿瘤细胞系(SUM190)、低表达水平Nectin-4肿瘤细胞系(SUM149)、人和猴皮肤的冷冻保存的OCT包埋块进行处理以用15A7.5 mAb(A)和9A2.7 mAb(B)染色。显示了对各mAb报告的快速评分(Quick score)(A,B)。C，SUM190相对于人皮肤的快速评分的比。

图9：肿瘤细胞系和人角质细胞中的差异内化。通过荧光检测。

将恩弗妥单抗(HA22)、Ch-15A7.5和同型对照mAb与pHAB硫醇活性染料偶联以达到所包含的染料抗体比在4.58和5.55之间。用SUM190PT Nectin-4表达细胞系(A)正常人分化型(0.1mM CaCl₂)角质细胞(B)一式两份地培养剂量范围的这些抗体染料缀合物的每一种(1.6ng/mL–5μg/mL)。在24小时后，用荧光微孔板读数仪(ClarioStar)记录细胞内荧光。报告了荧光强度与染料抗体缀合物浓度的函数。

图10：对肿瘤细胞和正常分化型人角质细胞的差异体外细胞毒活性。通过MTT测定法测定细胞活力。

将恩弗妥单抗(HA22，菱形)、Ch-15A7.5(三角形)和Ch-9A2.7(正方形)mAb与α-鹅膏蕈碱偶联以产生抗体药物缀合物，对SUM190PT Nectin-4表达细胞系(A,D)或正常人分化型(0.1mM CaCl₂)角质细胞(B,E)比较地评价剂量范围(7.7pg/mL–15μg/mL)的抗体药物缀合物的细胞毒活性。报告了5天培养期后的存活率(MTT测定法)。通过GraphPad Prism 9软件、使用非线性曲线拟合(4个参数)确定了EC₅₀值。对于各个情况，计算并报告了Ch-15A7.5ADC(C)或Ch-9A2.7 ADC(F)的EC₅₀相对于HA22-ADC的EC₅₀的比。显示的数据是2种不同的Nectin-4表达肿瘤细胞系(SUM190PT和MDA-MB468)和3个独立供体的人角质细胞的代表。

图11：用Ch-15A7.5-MA-PS-βGlu-依喜替康ADC治疗SUM190移植的NSG小鼠诱导持久的肿瘤消退期。

将NSG小鼠(n＝5只/组)在两侧原位异种移植包埋在Matrigel中的SUM190PT细胞。试验了3种不同的ADC：同型对照ICT-和Ch-15A7.5-MA-PS-βGlu-依喜替康、和维汀-恩弗妥单抗替代物HA22-MC-vc-PABC-MMAE。当肿瘤达到约150mm³时，开始小鼠的治疗(单次静脉注射)。以2个剂量(4或8mg/kg)评价Ch-15A7.5-MA-PS-βGlu-依喜替康(Ch-15A7.5-Ex)和Ch-5A12.2-MA-PS-βGlu-依喜替康(Ch-5A12.2-Ex)，以8mg/kg给予ICT-MA-PS-βGlu-依喜替康(ICT-Ex)，并以4mg/kg给予维汀-恩弗妥单抗(EV)替代物。其后，每周两次用卡尺监测肿瘤大小(n＝10只/组)并由下式(L×l×h×Pi/6)报告大小。

图12：人源化变体对肿瘤细胞的表观亲和力。通过流式细胞术进行检测。

对表达Nectin-4的T47D人肿瘤细胞进行编号并用剂量范围(169pg/mL–30μg/mL)的Ch-15A7.5或指定的人源化变体进行培养。与H和L相关的编号是指引入的回复突变(backmutation)数。然后用藻红蛋白缀合的山羊抗人Fc抗体染色细胞并通过流式细胞术进行分析。报告了平均荧光强度。GraphPad Prism 9软件用于非线性曲线拟合(4个参数)。

图13：用HA22-MA-PS-βGlu-依喜替康ADC治疗SUM190移植的NSG小鼠诱导持久的肿瘤消退期。

将NSG小鼠(n＝5只/组)在两侧原位异种移植包埋在Matrigel中的SUM190PT细胞。试验了3种不同的ADC：同型对照ICT-和HA22-MA-PS-βGlu-依喜替康、和维汀-恩弗妥单抗替代物HA22-MC-vc-PABC-MMAE。当肿瘤达到约150mm³时，开始小鼠的治疗(单次静脉注射)。以2个剂量(4或8mg/kg)评价HA22MA-PS-βGlu-依喜替康(HA22-Ex)，以8mg/kg给予ICT-MA-PS-βGlu-依喜替康(ICT-Ex)，并以4mg/kg给予维汀-恩弗妥单抗(EV)替代物。其后，每周两次用卡尺监测肿瘤大小(n＝10只/组)并由下式(L×l×h×Pi/6)报告大小。

图14:：用HA22-MA-PS-βGlu-依喜替康和HA22-MC-GGFG-DX8951ADC治疗SUM190移植的NSG小鼠诱导持久的肿瘤消退期。

将NSG小鼠(n＝5只/组)在两侧原位异种移植包埋在Matrigel中的SUM190PT细胞。试验了5种不同的ADC：同型对照，与MA-PS-βGlu-依喜替康偶联的ICT-和HA22(ICT-Ex和HA22-Ex)或与MC-GGFG-DX8951偶联的ICT-和HA22(ICT-和HA22-Dxd)，和维汀-恩弗妥单抗替代物HA22-MC-vc-PABC-MMAE(EV)。当肿瘤达到约150mm³时，开始小鼠的治疗(单次静脉注射)。以2个剂量(4或8mg/kg)评价HA22-Ex和HA22-Dxd，以8mg/kg给予ICT-EX和ICT-Dxd，并以4mg/kg给予维汀-恩弗妥单抗(EV)替代物。其后，每周两次用卡尺监测肿瘤大小(n＝10只/组)并由下式(L×l×h×Pi/6)报告大小。

图15：Ch-15A7.5及其人源化变体与由肿瘤细胞系和正常分化型人角质细胞表达的Nectin-4的差异结合。通过流式细胞术检测。

使用剂量范围(8pM–33nM)的Ch-5A12.2、Ch-15A7.5及其人源化变体15A7.5-H1L2、-H1L3、-H2L2、-H2L3、-H3L0、-H3L2、-H3L3，TNBC细胞系(SUM190，上图)和正常分化型(0.1mM CaCl₂)人角质细胞(NHEK，下图)的流式细胞术分析。然后，用藻红蛋白缀合的山羊抗人Fc抗体染色细胞。显示出归一化的平均荧光强度。用GraphPad Prism 9软件进行非线性曲线拟合(4个参数)。注意到Ch-15A7.5及其人源化变体对角质细胞的表观EC₅₀与Ch-5A12.2相比低得多(下图)。

图16：亲本抗体克隆5A12.2的可变重链(VH)和可变轻链(VK)的氨基酸序列。对根据IMTG命名法的H-CDR和L-CDR序列加下划线。

图17：9A2.7的人源化变体的可变重链(VH)和可变轻链(VK)的氨基酸序列。对根据IMTG命名法的H-CDR和L-CDR序列加下划线。

图18：3A1.4的人源化变体的可变重链(VH)和可变轻链(VK)的氨基酸序列。对根据IMTG命名法的H-CDR和L-CDR序列加下划线。

图19：8F06的人源化变体的可变重链(VH)和可变轻链(VK)的氨基酸序列。对根据IMTG命名法的H-CDR和L-CDR序列加下划线。

图20：15A7.5的人源化变体的可变重链(VH)和可变轻链(VL)的氨基酸序列。对根据IMTG命名法的H-CDR和L-CDR序列加灰色阴影。

图21：人源化15A7.5变体的亲和力值。

图22：亲本抗体克隆15A7.5可变重链(VH)和可变轻链(VK)的氨基酸序列。对根据IMTG命名法的H-CDR和L-CDR序列加灰色阴影。

图23：抗体HA22的可变重链(VH)和可变轻κ链(VK)的氨基酸序列。对根据IMTG命名法的H-CDR和L-CDR序列加灰色阴影。

实施例

材料和方法

细胞系：

在补充有10％胎牛血清、50IU/mL青霉素、50μg/mL链霉素和2mM谷氨酰胺的DMEM中培养人乳腺癌细胞系MDA-MB231(ATCC,Manassas,VA)。用含有PVRL4 cDNA的表达载体p3XFLR4.C1转染所述细胞。在具有5％胎牛血清、1％非必需氨基酸、1％ Hepes、1％胰岛素、1μg/mL氢化可的松、6.8ng/mL三碘L-酪氨酸、100IU/mL青霉素、100μg/mL链霉素和2mM谷氨酰胺的Ham'sF12培养基中培养人三阴性乳腺癌细胞系SUM190PT(BioIVT,Westbury,NY)。在补充有10％胎牛血清、100IU/mL青霉素、100μg/mL链霉素和2mM谷氨酰胺的DMEM中培养中国仓鼠卵巢CHO细胞系。在补充有10％胎牛血清、100IU/mL青霉素、100μg/mL链霉素的RPMI中培养人乳腺癌MDA-MB-468细胞系和T47D细胞系。

ELISA：

三明治酶联免疫吸附测定用于控制Ch-15A7.5抗体的特异性并用于进行不同mAb之间的竞争测定。在+4℃用10nM的Nectin-4-VCC-Fc、Nectin-1-VCC-Fc(完整细胞外部分)或Nectin-4-V-Fc(仅包含IgV结构域)包被96孔板过夜。在用PBS1％ BSA洗涤并饱和后，在25℃用10nM的过氧化物酶缀合的Ch-15A7.5 mAb培养细胞2小时。在竞争的情况下，在存在不同浓度(0.018nM至40nM)的“冷”mAb的情况下，测定0.5nM的过氧化物酶缀合的Ch-15A7.5mAb的结合。添加100μL的过氧化物酶底物(One Step ABST,Pierce)，在405nm处读取OD。

流式细胞术:

用剂量范围的指定抗体培养(天然或转染地)表达Nectin-4的细胞或细胞系(10,000–50,000)。在洗涤后，用藻红蛋白缀合的山羊抗人抗体(5μg/mL)Jackson ImmunoResearch)染色细胞。在流式细胞术进行前，用活力染料(viability dye)(e780,Invitrogen)染色细胞。

免疫组织化学：

将在-80℃下保存的冷冻样本保持在干冰上并以允许最大化后续切片数量的方式置于塑料冷冻切片包埋模具(cryomold)中，并且包埋在最佳切割温度(OCT)介质中。将OCT的冷冻块安装在具有OCT的盘上，在-20℃下在NX70低温恒温器(Thermo Scientificial)上进行冷冻切片。将冷冻切片(7μm)安装在superfrost+玻片(VWR)上。仅制备各系列试验所需数量的玻片并保存在-80℃直至使用。将剩余的块保存在-80℃直至进一步使用。将切片排列在玻片上并在丙酮中在-20℃固定10分钟。作为Roche DAB试剂盒方案的一部分，通过将玻片浸渍在过氧化氢(H₂O₂)中来抑制内源性过氧化物酶。对每种mAb的几个稀释进行了试验以优化噪声对信号比，确定0.5μg/mL的小鼠15A7.5 mAb和10μg/mL的小鼠9A2.7 mAb是最佳的。为了减轻二抗与小鼠组织的非特异性结合，在一抗培养后，添加兔抗小鼠IgG(4μg/mL,Abcam)。然后，根据制造商的说明(Ventana automat)，omni-map抗兔HRP(Roche)用于进行DAB染色。对染色强度和染色细胞的比例进行评价。两名受过训练的技术人员独立且顺序地观察同一显微镜视野。对每个视野评价了染色细胞比例和染色强度。对于每个染色，在允许组织的最佳可视化的放大率下，随机选择10个视野。评分过程如下：(i)对于每个视野，估计阳性染色细胞的比例并分配0至4的评分(0＝0-5％；1＝5-25％；2＝25-50％；3＝50-75％；和4＝75-100％)；和(ii)染色强度评分为0、1、2或3，分别对应于存在阴性、弱、中、和强棕色染色。每个视野和每个观察者的最终评分为两个值的乘积(0＝组织中无染色；12＝组织包含强染色细胞)。对于每种组织类型，在每组玻片的5个玻片的每一者上，对10个独立的观察视野平行评分染色强度和标记细胞的百分比二者。技术人员同时观察给定视野(虚拟玻片，在计算机屏幕上)并独立地评分，不知道其它观察者的结果。对于每个玻片，对每名技术人员的10次评分进行平均以设定每名观察员的最终评分。对两名观察员的最终评分进行平均，得到给定玻片的组织评分。对于人皮肤，仅示出来自第一组重复的结果。

内化测定

将1万个SUM190PT或人分化型角质细胞(0.1mM CaCl₂)接种在96孔板中，然后在37℃、用剂量范围(1.6ng/mL–1μg/mL)的缀合有pHAB硫醇活性染料的抗Nectin-4mAb和同型对照培养24小时。在内化和内体-溶酶体(endo-lysosomal)加工的情况下，酸性环境使得染料发荧光。在读板机上监测荧光强度，激发波长为532nm，发射波长为560nm。

体外细胞毒性测定

为了分析ADC的体外细胞毒活性，使用制造商(Biosource,CA,USA)推荐的AlamarBlue染色方案评价细胞活力。试验包括荧光氧化-还原指示剂。荧光强度与细胞代谢减少成比例。在第0天、在96孔板中，通过用连续稀释的ADC一式三份地培养3000个细胞/孔(SUM190PT或分化的NHEK)来进行实验。在第5天，通过在37℃培养1/10体积的alamarBlue溶液2小时并在595nm(FLUOstar Optima,BMG Labtech)读数来测量AlamarBlue。

小鼠实验

NOD/SCID(非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷)/gc null小鼠(NSG)获得自查尔斯河实验室(Charles River Laboratory)(Margate,UK)。将6至7周龄雌性(n＝5只/组)在两侧原位异种移植包埋在Matrigel中的SUM190PT(0.5×10⁶)细胞。如在各个试验中所提及，用ADC进行治疗。其后，每周两次用卡尺监测肿瘤大小(n＝10只/组)并由下式(L×l×h×PiL×l×h×Pi/6)报告大小。

杂交瘤测序

对于杂交瘤测序，首先从杂交瘤细胞沉淀物(pellet)提取RNA。通过逆转录产生cDNA，并通过聚合酶链反应、使用Prime STARMax DNA聚合酶(Takara)扩增VH和VL结构域。随后将PCR产物克隆至专用的重链和轻链表达载体，然后测序。

嵌合抗体的产生、生产、纯化和控制

轻链表达载体编码Vκ链。取决于所使用的负载(payload)，使用两种不同的重链表达载体，一种编码具有D265C(ThiomAb)L234A和L235A突变的Fc片段，一种编码具有P331S、L234Q和L235F突变的Fc片段。两种Fc片段均为“Fc沉默的”。在同一载体中还克隆了抗Nectin-4恩弗妥单抗(HA22)的序列。

在以1.2/1比接种的HEK293中转染轻链和重链载体。在6天的生产后，根据制造商的说明，使用MabSelect PrismA树脂(GE Healthcare)澄清培养上清液并纯化mAb。0.5M甘氨酸、3M NaCl pH8.9用作结合缓冲液，0.1M柠檬酸盐pH 3用于洗脱。用10％(V/V)1M Tris-HCl pH 9进行瞬时中和(instant neutralization)。针对PBS1X pH 7.4对单克隆嵌合抗体进行透析(Mini透析装置，2mL-10k,Thermo Scientific)，然后在0.22μm过滤器(MilelexGV亲水性PVDF,Millipore)上进行过滤。用Nanodrop 2000分光光度计(ThermoScientific)根据每个单克隆抗体的特定消光系数(E^1％ _280nm)来确定浓度。通过UPLC-SEC、使用Acquity UPLC-HClass Bio(Waters)、使用在补充有10％异丙醇的0.2MNaPO₄、0.3M NaClpH 6.9中平衡的Protein-BEH 200A柱，来确定纯度。在Xevo G2-S Q-Tof质量分光光度计(Waters)中、使用反相柱(PLRP-S 4000A,Agilent technologies)确定抗体的质量。根据制造商的说明，在37℃下用PNGase F糖苷酶去糖基化后，对所有样品进行分析。通过SDS-PAGE评价最终材料的片段化和/或聚集。使用显色LAL动态测定(Charles River Endosafe)，确定内毒素负载。

抗体缀合

根据制造商的说明，使用马来酰亚胺化学方法，将硫醇反应性染料pHAB(Promega)缀合至所选抗Nectin-4 ThiomAb(D265C、L234A、L235A)的半胱氨酸。简言之，针对0.1M磷酸盐缓冲液pH 7.0对抗体进行透析，然后在室温下、在轻微搅动下用2.5mM还原1小时。其后，通过在Zeba旋转脱盐柱(7MWCO)上洗涤/离心两次来去除DTT。将1.2L的pHdye试剂(10μg/mLDMSO)添加至100μg的抗体并在室温下避光培养1小时。在用Zeba脱盐柱去除过量的染料后，计算染料抗体比以验证不同抗体之间的等效缀合(equivalent conjugation)。

将半胱氨酸反应性接头-依喜替康化合物马来酰亚胺-Gly-PSAR10-葡萄糖苷酸-依喜替康(MabLink)缀合至所选抗Nectin-4mAbs(P331S、L234Q和L235F)的半胱氨酸残基。简言之，在37℃、用14摩尔当量的TCEP还原PBS1X,1mM EDTA中的mAb 2小时，其后将缓冲液变更(Amicon ultra 30kDa)为100mM KPO4,1mM EDTA pH 7.4。12摩尔当量的半胱氨酸反应性接头-依喜替康化合物用于在室温下与反应性半胱氨酸缀合35分钟。然后将缓冲液变更为100mM KPO₄ pH 8.0，接着在不存在氧的情况下、在37℃下培养24小时以允许马来酰亚胺自水解。在20mM His pH 6.0中进行最终交换缓冲液，然后用0.22μM过滤器过滤。根据LC-MS分析的药物-抗体比(DAR)包括在7.77和7.82个毒素/缀合的mAb之间。如通过SEC-HPLC来确定的，小于8％的材料聚集。

序列表

<110> 涌现制药股份公司(Emergence Therapeutics AG)

<120> 抗Nectin-4抗体依喜替康缀合物

<130> 72919P WO

<160> 111

<170> PatentIn 版本 3.5

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR1 VH_15A7.5 IMGT

<400> 1

Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Gly

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR2 VH_15A7.5 IMGT

<400> 2

Ile Ser Asn Leu Ala Tyr Gly Ile

1 5

<210> 3

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR3 VH_15A7.5 IMGT

<400> 3

Ala Arg Gly Ala Arg Ala Thr Gly Trp Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 4

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR1 VK_15A7.5 IMGT

<400> 4

Gln Asn Val Asp Thr His

1 5

<210> 5

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR2 VK_15A7.5 IMGT

<400> 5

Ser Ala Ser

1

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR3 VK_15A7.5 IMGT

<400> 6

Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Thr

1 5

<210> 7

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR1 VH_15A7.5 Kabat

<400> 7

Asn Tyr Gly Met Ala

1 5

<210> 8

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR2 VH_15A7.5 Kabat

<400> 8

Phe Ile Ser Asn Leu Ala Tyr Gly Ile Asn Tyr Ala Asp Thr Val Thr

1 5 10 15

Gly

<210> 9

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR3 VH_15A7.5 Kabat

<400> 9

Gly Ala Arg Ala Thr Gly Trp Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 10

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR1 VK_15A7.5 Kabat

<400> 10

Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr His Val Ala

1 5 10

<210> 11

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR2 VK_15A7.5 Kabat

<400> 11

Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser

1 5

<210> 12

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR3 VK_15A7.5 Kabat

<400> 12

Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Thr

1 5

<210> 13

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH_15A7.5

<400> 13

Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val

35 40 45

Ala Phe Ile Ser Asn Leu Ala Tyr Gly Ile Asn Tyr Ala Asp Thr Val

50 55 60

Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Met Arg Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Ala Arg Ala Thr Gly Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 14

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VK_15A7.5

<400> 14

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Ile Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr His

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 15

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR1 H0_15A7.5 IMGT

<400> 15

Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Gly Met

1 5

<210> 16

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR2 H0_15A7.5 IMGT

<400> 16

Ile Ser Asn Leu Ala Tyr Gly Ile

1 5

<210> 17

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR3 H0_15A7.5 IMGT

<400> 17

Ala Arg Gly Ala Arg Ala Thr Gly Trp Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 18

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR1 L0_15A7.5 IMGT

<400> 18

Gln Asn Val Asp Thr His

1 5

<210> 19

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR2 L0_15A7.5 IMGT

<400> 19

Ser Ala Ser

1

<210> 20

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR3 L0_15A7.5 IMGT

<400> 20

Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Thr

1 5

<210> 21

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR1 H0_15A7.5 Kabat

<400> 21

Asn Tyr Gly Met Asn

1 5

<210> 22

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR2 H0_15A7.5 Kabat

<400> 22

Phe Ile Ser Asn Leu Ala Tyr Gly Ile Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 23

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR3 H0_15A7.5 Kabat

<400> 23

Gly Ala Arg Ala Thr Gly Trp Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 24

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR1 L0_15A7.5 Kabat

<400> 24

Arg Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr His Val Ala

1 5 10

<210> 25

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR2 L0_15A7.5 Kabat

<400> 25

Ser Ala Ser Tyr Leu Gln Ser

1 5

<210> 26

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR3 L0_15A7.5 Kabat

<400> 26

Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Thr

1 5

<210> 27

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> H0_15A7.5

<400> 27

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Phe Ile Ser Asn Leu Ala Tyr Gly Ile Asn Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Ala Arg Ala Thr Gly Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 28

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> L0_15A7.5

<400> 28

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr His

20 25 30

Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 29

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR1 H1_15A7.5 IMGT

<400> 29

Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Gly

1 5

<210> 30

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR2 H1_15A7.5 IMGT

<400> 30

Ile Ser Asn Leu Ala Tyr Gly Ile

1 5

<210> 31

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR3 H1_15A7.5 IMGT

<400> 31

Ala Arg Gly Ala Arg Ala Thr Gly Trp Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 32

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR1 L1_15A7.5 IMGT

<400> 32

Gln Asn Val Asp Thr His

1 5

<210> 33

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR2 L1_15A7.5 IMGT

<400> 33

Ser Ala Ser

1

<210> 34

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR3 L1_15A7.5 IMGT

<400> 34

Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Thr

1 5

<210> 35

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR1 H1_15A7.5 Kabat

<400> 35

Asn Tyr Gly Met Ala

1 5

<210> 36

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR2 H1_15A7.5 Kabat

<400> 36

Phe Ile Ser Asn Leu Ala Tyr Gly Ile Asn Tyr Ala Asp Thr Val Thr

1 5 10 15

Gly

<210> 37

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR3 H1_15A7.5 Kabat

<400> 37

Gly Ala Arg Ala Thr Gly Trp Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 38

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR1 L1_15A7.5 Kabat

<400> 38

Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr His Val Ala

1 5 10

<210> 39

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR2 L1_15A7.5 Kabat

<400> 39

Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser

1 5

<210> 40

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR3 L1_15A7.5 Kabat

<400> 40

Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Thr

1 5

<210> 41

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> H1_15A7.5

<400> 41

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Phe Ile Ser Asn Leu Ala Tyr Gly Ile Asn Tyr Ala Asp Thr Val

50 55 60

Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Ala Arg Ala Thr Gly Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 42

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> L1_15A7.5

<400> 42

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr

20 25 30

His Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu

35 40 45

Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro

85 90 95

Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 43

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR1 H2_15A7.5 IMGT

<400> 43

Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Gly

1 5

<210> 44

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR2 H2_15A7.5 IMGT

<400> 44

Ile Ser Asn Leu Ala Tyr Gly Ile

1 5

<210> 45

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR3 H2_15A7.5 IMGT

<400> 45

Ala Arg Gly Ala Arg Ala Thr Gly Trp Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 46

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR1 L2_15A7.5 IMGT

<400> 46

Gln Asn Val Asp Thr His

1 5

<210> 47

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR2 L2_15A7.5 IMGT

<400> 47

Ser Ala Ser

1

<210> 48

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR3 L2_15A7.5 IMGT

<400> 48

Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Thr

1 5

<210> 49

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR1 H2_15A7.5 Kabat

<400> 49

Asn Tyr Gly Met Ala

1 5

<210> 50

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR2 H2_15A7.5 Kabat

<400> 50

Phe Ile Ser Asn Leu Ala Tyr Gly Ile Asn Tyr Ala Asp Thr Val Thr

1 5 10 15

Gly

<210> 51

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR3 H2_15A7.5 Kabat

<400> 51

Gly Ala Arg Ala Thr Gly Trp Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 52

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR1 L2_15A7.5 Kabat

<400> 52

Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr His Val Ala

1 5 10

<210> 53

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR2 L2_15A7.5 Kabat

<400> 53

Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser

1 5

<210> 54

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR3 L2_15A7.5 Kabat

<400> 54

Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Thr

1 5

<210> 55

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> H2_15A7.5

<400> 55

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Phe Ile Ser Asn Leu Ala Tyr Gly Ile Asn Tyr Ala Asp Thr Val

50 55 60

Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Ala Arg Ala Thr Gly Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 56

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> L2_15A7.5

<400> 56

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr His

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 57

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR1 H3_15A7.5 IMGT

<400> 57

Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Gly

1 5

<210> 58

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR2 H3_15A7.5 IMGT

<400> 58

Ile Ser Asn Leu Ala Tyr Gly Ile

1 5

<210> 59

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR3 H3_15A7.5 IMGT

<400> 59

Ala Arg Gly Ala Arg Ala Thr Gly Trp Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 60

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR1 L3_15A7.5 IMGT

<400> 60

Gln Asn Val Asp Thr His

1 5

<210> 61

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR2 L3_15A7.5 IMGT

<400> 61

Ser Ala Ser

1

<210> 62

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR3 L3_15A7.5 IMGT

<400> 62

Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Thr

1 5

<210> 63

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR1 H3_15A7.5 Kabat

<400> 63

Asn Tyr Gly Met Ala

1 5

<210> 64

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR2 H3_15A7.5 Kabat

<400> 64

Phe Ile Ser Asn Leu Ala Tyr Gly Ile Asn Tyr Ala Asp Thr Val Thr

1 5 10 15

Gly

<210> 65

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR3 H3_15A7.5 Kabat

<400> 65

Gly Ala Arg Ala Thr Gly Trp Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 66

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR1 L3_15A7.5 Kabat

<400> 66

Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr His Val Ala

1 5 10

<210> 67

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR2 L3_15A7.5 Kabat

<400> 67

Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser

1 5

<210> 68

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR3 L3_15A7.5 Kabat

<400> 68

Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Thr

1 5

<210> 69

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> H3_15A7.5

<400> 69

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val

35 40 45

Ala Phe Ile Ser Asn Leu Ala Tyr Gly Ile Asn Tyr Ala Asp Thr Val

50 55 60

Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Ala Arg Ala Thr Gly Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 70

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> L3_15A7.5

<400> 70

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr His

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Ala Leu

35 40 45

Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro

85 90 95

Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 71

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> L3_15A7.5_mod

<400> 71

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr His

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Ala Leu

35 40 45

Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 72

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR1 VH_HA22

<400> 72

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Asn

1 5

<210> 73

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR2 VH_HA22

<400> 73

Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile

1 5

<210> 74

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR3 VH_HA22

<400> 74

Ala Arg Ala Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val

1 5 10

<210> 75

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR1 VK_HA22

<400> 75

Gln Gly Ile Ser Gly Trp

1 5

<210> 76

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR2 VK_HA22

<400> 76

Ala Ala Ser

1

<210> 77

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR3 VK_HA22

<400> 77

Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Pro Thr

1 5

<210> 78

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH_HA22

<400> 78

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Asn Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Ser

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ala Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 79

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VK_HA22

<400> 79

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Gly Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Phe Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 80

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR1 VH_5A12.2

<400> 80

Gly Phe Thr Phe Asn Ser Met Tyr

1 5

<210> 81

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR2 VH_5A12.2

<400> 81

Ile Tyr Ala Gly Thr Gly Gly Thr

1 5

<210> 82

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR3 VH_5A12.2

<400> 82

Ala Ile Arg Ser Gly Phe Val Pro Met Asp Tyr Trp Gly

1 5 10

<210> 83

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH_5A12.2

<400> 83

Gln Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Thr Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Met

20 25 30

Tyr Ile Ser Trp Leu Lys Gln Lys Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Ala Trp Ile Tyr Ala Gly Thr Gly Gly Thr Arg Phe Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Thr Gly Lys Val Gln Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Phe Ser Ser Leu Thr Thr Asp Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ile Arg Ser Gly Phe Val Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Ser Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 84

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR1 VK_5A12.2

<400> 84

Gln Ser Val Ser Asn Asp

1 5

<210> 85

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR2 VK_5A12.2

<400> 85

Tyr Ala Ser

1

<210> 86

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR3 VK_5A12.2

<400> 86

Gln Gln Asp Tyr Ser Ser

1 5

<210> 87

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VK_5A12.2

<400> 87

Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Thr Val Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 88

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR1 VH_9A2.7

<400> 88

Gly Tyr Asn Phe Thr Thr Phe Trp

1 5

<210> 89

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR2 VH_9A2.7

<400> 89

Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Ala

1 5

<210> 90

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR3 VH_9A2.7

<400> 90

Thr Arg Pro Ser Tyr Phe Gly Arg Asn Ser Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 91

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH_9A2.7

<400> 91

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asn Phe Thr Thr Phe

20 25 30

Trp Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Ala Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Pro Ser Tyr Phe Gly Arg Asn Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

115 120

<210> 92

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR1 VK_9A2.7

<400> 92

Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Val Asn His Lys Asn Tyr

1 5 10

<210> 93

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR2 VK_9A2.7

<400> 93

Trp Ala Ser

1

<210> 94

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR3 VK_9A2.7

<400> 94

His Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu Thr

1 5

<210> 95

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VK_9A2.7

<400> 95

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Val Val Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser

20 25 30

Val Asn His Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln

85 90 95

Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu

100 105 110

Lys

<210> 96

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR1 VH_3A1.4

<400> 96

Gly Asp Ser Ile Thr Ser Gly Tyr

1 5

<210> 97

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR2 VH_3A1.4

<400> 97

Ile Ser Asn Ser Gly Ile Thr

1 5

<210> 98

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR3 VH_3A1.4

<400> 98

Thr Arg Phe Gly Ser Thr Met Ile Leu Tyr Tyr Thr Met Asp Tyr

1 5 10 15

<210> 99

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH_3A1.4

<400> 99

Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Asp Ser Ile Thr Ser Gly

20 25 30

Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Tyr Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Ser Asn Ser Gly Ile Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Phe Leu

65 70 75 80

Gln Leu Asn Ser Val Thr Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Thr

85 90 95

Arg Phe Gly Ser Thr Met Ile Leu Tyr Tyr Thr Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 100

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR1 VK_3A1.4

<400> 100

Gln Ser Ile Ser Asp Tyr

1 5

<210> 101

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR2 VK_3A1.4

<400> 101

Tyr Ala Ser

1

<210> 102

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR3 VK_3A1.4

<400> 102

Gln Asn Gly His Ser Phe Pro Leu Thr

1 5

<210> 103

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VK_3A1.4

<400> 103

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Val Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asp Tyr

20 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gln Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Lys Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ser Asn Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Gly His Ser Phe Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 104

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR1 VH_8F06

<400> 104

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Val

1 5

<210> 105

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR2 VH_8F06

<400> 105

Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr

1 5

<210> 106

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR3 VH_8F06

<400> 106

Val Thr Leu Phe Ala Tyr

1 5

<210> 107

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH_8F06

<400> 107

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Thr Leu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

100 105 110

Ala

<210> 108

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR1 VK_8F06

<400> 108

Ser Ser Ile Ser Tyr

1 5

<210> 109

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR2 VK_8F06

<400> 109

Asp Thr Ser

1

<210> 110

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR3 VK_8F06

<400> 110

His Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Phe Thr

1 5

<210> 111

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VK_8F06

<400> 111

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Phe Thr

85 90 95

Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

Claims

1.一种抗体-药物缀合物，其包含单克隆抗体或其抗原结合片段和药物，其中所述单克隆抗体或其抗原结合片段与Nectin-4结合，所述药物为拓扑异构酶I抑制剂。

2.根据权利要求1所述的抗体-药物缀合物，其包含选自嵌合抗体、多特异性抗体、特别是双特异性抗体、人抗体、人源化抗体的抗体，或其抗原结合片段。

3.根据权利要求1或2所述的抗体-药物缀合物，其包含选自以下的抗体：IgG类抗体如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚类的抗体、IgM类抗体、IgA类抗体或其抗原结合片段、或单链抗体、或抗体Fv片段，其中所述抗体任选地有具有降低的效应子功能的重链恒定结构域，例如具有降低的与Fc受体的结合。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的抗体-药物缀合物，其包含抗体或其抗原结合片段，所述抗体以与由人分化型角质细胞表达的Nectin-4相比较高的亲和力与由肿瘤表达的Nectin-4特异性结合。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的抗体-药物缀合物，其包含抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：

(i)CDR-H1包含根据SEQ ID NO:1或7、88、96或104所述的氨基酸序列，

(ii)CDR-H2包含根据SEQ ID NO:2或8、89、97或105所述的氨基酸序列，

(iii)CDR-H3包含根据SEQ ID NO:3或9、90、98或106所述的氨基酸序列，

(i)CDR-L1包含根据SEQ ID NO:4或10、92、100或108所述的氨基酸序列，

(ii)CDR-L2包含根据SEQ ID NO:5或11、93、101或109所述的氨基酸序列，

(iii)CDR-L3包含根据SEQ ID NO:6或12、94、102或110所述的氨基酸序列，

6.根据权利要求1-5中任一项所述的抗体-药物缀合物，其包含抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：

(a)(i)VH区，其包含SEQ ID NO:1的CDR-H1、SEQ ID NO:2的CDR-H2和SEQ ID NO:3的CDR-H3，和任选地

(ii)VL区，其包含SEQ ID NO:4的CDR-L1、SEQ ID NO:5的CDR-L2和SEQ ID NO:6的CDR-L3，

或

(b)(i)VH区，其包含SEQ ID NO:7的CDR-H1、SEQ ID NO:8的CDR-H2和SEQ ID NO:9的CDR-H3，和任选地

(ii)VL区，其包含SEQ ID NO:10的CDR-L1、SEQ ID NO:11的CDR-L2和SEQ ID NO:12的CDR-L3，

或

(c)(i)VH区，其包含SEQ ID NO:88的CDR-H1、SEQ ID NO:89的CDR-H2和SEQ ID NO:90的CDR-H3，和任选地

(ii)VL区，其包含SEQ ID NO:92的CDR-L1、SEQ ID NO:93的CDR-L2和SEQ ID NO:94的CDR-L3，

或

(d)(i)VH区，其包含SEQ ID NO:96的CDR-H1、SEQ ID NO:97的CDR-H2和SEQ ID NO:98的CDR-H3，和任选地

(ii)VL区，其包含SEQ ID NO:100的CDR-L1、SEQ ID NO:101的CDR-L2和SEQ ID NO:102的CDR-L3，

或

(e)(i)VH区，其包含SEQ ID NO:104的CDR-H1、SEQ ID NO:105的CDR-H2和SEQ ID NO:106的CDR-H3，和任选地

(ii)VL区，其包含SEQ ID NO:108的CDR-L1、SEQ ID NO:109的CDR-L2和SEQ ID NO:110的CDR-L3。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的抗体-药物缀合物，其包含抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：

(a)VH区，其包含根据SEQ ID NO:13、91、99或107所述的氨基酸序列或与其具有至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的同一性的氨基酸序列，

和任选地

(b)VL区，特别是包含根据SEQ ID NO:14、95、103或111所述的氨基酸序列或与其具有至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的同一性的氨基酸序列的VL区。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的抗体-药物缀合物，其包含抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：

(a)(i)VH区，其包含根据SEQ ID NO:13所述的氨基酸序列或与其具有至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的同一性的氨基酸序列，和任选地

(ii)VL区，特别是包含根据SEQ ID NO:14所述的氨基酸序列或与其具有至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的同一性的氨基酸序列的VL区，

或

(b)(i)VH区，其包含根据SEQ ID NO:91所述的氨基酸序列或与其具有至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的同一性的氨基酸序列，和任选地

(ii)VL区，特别是包含根据SEQ ID NO:95所述的氨基酸序列或与其具有至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的同一性的氨基酸序列的VL区，

或

(c)(i)VH区，其包含根据SEQ ID NO:99所述的氨基酸序列或与其具有至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的同一性的氨基酸序列，和任选地

(ii)VL区，特别是包含根据SEQ ID NO:103所述的氨基酸序列或与其具有至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的同一性的氨基酸序列的VL区，

或

(d)(i)VH区，其包含根据SEQ ID NO:107所述的氨基酸序列或与其具有至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的同一性的氨基酸序列，

和任选地

(ii)VL区，特别是包含根据SEQ ID NO:111所述的氨基酸序列或与其具有至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的同一性的氨基酸序列的VL区。

9.根据前述权利要求中任一项所述的抗体-药物缀合物，其包含：

衍生的抗体或其抗原结合片段，其包含：

(ii)CDR-H2包含根据SEQ ID NO:22、36、50或64所述的氨基酸序列，

(iii)CDR-H3包含根据SEQ ID NO:23、37、51或65所述的氨基酸序列，

(ii)CDR-L2包含根据SEQ ID NO:25、39、53或67所述的氨基酸序列，

(iii)CDR-L3包含根据SEQ ID NO:26、40、54或68所述的氨基酸序列，

10.根据权利要求1-3中任一项所述的抗体-药物缀合物，其包含衍生的抗体或其抗原结合片段，所述衍生的抗体或其抗原结合片段包含：

(i)CDR-H1包含根据SEQ ID NO:72或80所述的氨基酸序列，

(ii)CDR-H2包含根据SEQ ID NO:73或81所述的氨基酸序列，

(iii)CDR-H3包含根据SEQ ID NO:74或82所述的氨基酸序列，

(i)CDR-L1包含根据SEQ ID NO:75或84所述的氨基酸序列，

(ii)CDR-L2包含根据SEQ ID NO:76或85所述的氨基酸序列，

(iii)CDR-L3包含根据SEQ ID NO:77或86所述的氨基酸序列，

11.根据权利要求1-10中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述拓扑异构酶I抑制剂是喜树碱或其类似物，其中所述拓扑异构酶I抑制剂特别是依喜替康或德鲁替康。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的抗体-药物缀合物，其药物-抗体/抗体片段摩尔比(DAR)为约2:1至约16:1，特别为约4:1至约10:1，更特别为约6:1至约8:1。

13.根据权利要求1-12中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述药物缀合至所述抗体上的反应性氨基酸残基如具有含有氨基、羟基或硫醇基的侧链的氨基酸残基，或者抗体聚糖结构中的反应性基团，和

其中所述药物特别缀合至所述抗体或其抗原结合片段上的半胱氨酸残基的侧链中的反应性硫醇基。

14.根据权利要求1-13中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述药物经由连接子缀合至所述抗体或其抗原结合片段，特别地其中所述连接子特别是可切割连接子、和/或其中所述连接子特别是亲水性聚肌氨酸连接子、含有至少一个乙二醇单元的亲水性连接子、含有高极性间隔子的连接子、或寡肽连接子。

15.根据权利要求14所述的抗体-药物缀合物，其中所述连接子是亲水性聚肌氨酸连接子和至少一个乙二醇单元，其中所述连接子通过糖苷酶而经历切割，特别是通过葡糖醛酸糖苷酶而经历切割。

16.根据权利要求14或15所述的抗体-药物缀合物，其中所述连接子是含有例如约8-12个肌氨酸单元和至少一个乙二醇单元如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个乙二醇单元的亲水性聚肌氨酸连接子，其中所述连接子通过糖苷酶而经历切割，特别是通过葡糖醛酸糖苷酶而经历切割。

17.根据权利要求14-16中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述连接子是含有10个肌氨酸单元和2个乙二醇单元的亲水性聚肌氨酸连接子。

18.根据权利要求14-17中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述连接子通过葡糖醛酸糖苷酶而经历切割。

19.根据权利要求14-18中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述连接子经由硫醇-反应性基团、特别是马来酰亚胺基团连接至抗体或其抗原结合片段上的半胱氨酸残基。

20.一种药物组合物，其包含活性剂和药学上可接受的载体和/或赋形剂，所述活性剂是含有单克隆抗体或其抗原结合片段的抗体-药物缀合物，其中所述单克隆抗体或其抗原结合片段与Nectin-4结合，其中所述药物是拓扑异构酶I抑制剂。

21.根据权利要求1-19中任一项所述的抗体-药物缀合物或根据权利要求19所述的药物组合物在医学、特别是在人类医学中的用途。

22.根据权利要求1-19中任一项所述的抗体-药物缀合物或根据权利要求19所述的药物组合物在用于预防和/或治疗Nectin-4相关病症、特别是用于预防和/或治疗Nectin-4阳性癌症、特别是用于预防和/或治疗选自以下的癌症的方法中的用途：膀胱癌、泌尿道上皮癌、子宫内膜癌、宫颈癌、结肠直肠癌、肝癌、甲状腺癌、乳腺癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、头颈癌和/或食管癌。