KR20180119676A - 포도칼릭신 및 tra-관련된 항체, 생산 방법 및 항암 치료제로서의 용도 - Google Patents

포도칼릭신 및 tra-관련된 항체, 생산 방법 및 항암 치료제로서의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 각각 서열번호 1 내지 3의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 1 내지 3, 및 각각 서열번호 4 내지 6의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 1 내지 3을 갖는 중쇄 및 경쇄를 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 항암 치료제에 관한 것이다.

Description

포도칼릭신 및 TRA-관련된 항체, 생산 방법 및 항암 치료제로서의 용도
본원은 본원에 개시내용 전체가 참고로 포함된 미국 가출원 제62/307,690호(발명의 명칭: PODOCALYXIN AND TRA-RELATED ANTIBODY, METHODS FOR PREPARATION AND USES FOR TREATMENT OF AGGRESSIVE AND/OR METASTATIC CANCER; 출원일: 2016년 3월 14일)를 우선권 주장한다.
본 발명은 다능성- 및 배아 줄기 세포-특이적 항체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 포도칼릭신(podocalyxin) 단백질의 미발달 형태에 반응성이고 이에 대한 결합 활성을 갖는 항체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 암 세포를 퇴행시키고 감소시키고 제거하는 활성 성분으로서 항체 또는 이의 항체 단편을 포함하는 암 치료제에 관한 것이다.
정상 인간 배아 줄기 세포는 인간 신체를 구성하는 2백개의 상이한 유형의 세포로 분화하는 다능성 줄기 세포이다. 배아 암종은 인간 생식 세포 종양으로부터 유래된 인간 암 다능성 줄기 세포이고, 정상 배아 줄기 세포의 악성 등가물로서 공지되어 있다. 정상 배아 줄기 세포 및 배아 암종 모두는 이들의 원형질막의 표면 상의 다능성-관련된 항원을 발현한다. 다능성-관련된 항원 중 적어도 일부는 분화 동안 손실되고 정상 세포 및 조직에서 발현되지 않거나 적게 발현되는 것으로 공지되어 있다.
많은 인간 암이 배아 줄기 세포 유전자 시그니처를 갖고 정상 분화 세포에 존재하지 않거나 적게 존재하는 다능성 및 태아 항원을 재-발현하는 것으로 공지되어 있다. 암 기원의 세포 재프로그래밍 이론은, 암의 원인이 줄기 세포 특성을 갖는 초기 배아 세포-유사 암 세포로 퇴보하는 방향으로 향하는 탈분화를 재프로그래밍하고 수행하는 정상 세포에 기인한다고 한다. 이들 초기 배아 세포-유사 암 줄기 세포는 암의 기원이고 질병 진행의 추진자이고 질병 저항성(이는 종래의 치료법에 대해 거의 보편적으로 발생함)을 갖는 것으로 생각된다. 또한, 이들 초기 배아 세포-유사 암 줄기 세포를 표적화하고 제거하는 치료법이 의미있고 지속적인 암 치료를 초래할 것으로 생각된다.
포도칼릭신은 인간 배아 줄기 세포 및 다능성 암 줄기 세포 상에 고도로 발현되는 세포 표면 당단백질이다. 배아 및 다능성 세포 상에 발현된 포도칼릭신 단백질은 포도칼릭신 단백질에 부착된 추가적 탄수화물 기(TRA-1-60 및 TRA-1-81, 본원에서 TRA로도 지치됨)를 갖는다. TRA 탄수화물 기는 배아 및 다능성 특이적이고 체세포 및 분화 세포에 존재하지 않는다. 포도칼릭신의 다능성 및 배아 버전을 TRA-포도칼릭신으로 지칭한다. 배아 및 다능성 형태 TRA-포도칼릭신은 많은 유형의 암에서 재-발현되는 것으로 공지되어 있다.
단클론 항체는, 암 세포 및 정상 배아 세포의 표면 상에 발현되나 신체의 정상 분화 세포 상에는 발현되지 않는 다능성 항원에 특이적이고 반응성이도록 생산될 수 있다. 또한, 단클론 항체는, TRA-포도칼릭신에 반응성이고 이에 대한 특이적 결합 활성을 갖도록 생산될 수 있다. 이들 항체는 질병 발병 및 진행 동안 배아 및 다능성 항원, 예컨대 TRA-포도칼릭신을 재발현하는 암에 대한 항암 치료제로서 사용될 수 있다.
본 발명의 목적은 다능성- 및 배아 줄기 세포-특이적 항체를 개발하는 것이다. 또한, 본 발명의 목적은 TRA-포도칼릭신 특이적 항체를 개발하는 것이다. 또한, 목적은 활성 성분으로서 상기 항체 또는 이의 단편을 포함하는 치료제 또는 조성물을 개발하는 것이다. 또한, 목적은 치료제 또는 조성물을 암 환자에게 주입하거나 투여하여 상기 환자에서 암 세포를 퇴행시키거나 감소시키거나 제거하는 것이다.
본 발명에 따른 단클론 항체는 3개의 중쇄 상보성 결정 영역 및 3개의 경쇄 상보성 결정 영역을 갖는 6개의 특이적 아미노산 서열을 포함한다.
단클론 항체는 인간 배아 줄기 세포 및 악성 배아 암종 다능성 줄기 세포의 세포 표면 원형질막에 특이적이거나 반응성일 수 있다. 또한, 단클론 항체는 TRA-포도칼릭신에 특이적이거나 반응성일 수 있다.
단클론 항체는 구강암, 난소암, 전립선암, 유방암, 췌장암, 결장암, 위암 및 식도암으로 이루어진 군으로부터 선택된 다수의 인간 암에 대한 특이성 및 반응성을 가질 수 있다.
하나의 양상에서, 본 발명은 각각 서열번호 1 내지 3의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 1 내지 3, 및 각각 서열번호 4 내지 6의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 1 내지 3을 갖는 중쇄 및 경쇄를 포함하는 단클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
항체 또는 이의 단편은 재조합 항체일 수 있다. 재조합 항체는 인간 키메릭 항체, 인간화된 항체 및 인간 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, scFv, 다이아바디, dsFv, 및 CDR을 포함하는 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 각각 서열번호 1 내지 3의 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 서열 유사성을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 1 내지 3, 및 각각 서열번호 4 내지 6의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 1 내지 3을 갖는 중쇄 및 경쇄를 포함하는 단클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
또한, 경쇄 상보성 결정 영역 1 내지 3은 각각 서열번호 4 내지 6의 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 서열 유사성을 가질 수 있다.
항체 또는 이의 단편은 재조합 항체일 수 있다. 재조합 항체는 인간 키메릭 항체, 인간화된 항체 및 인간 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, scFv, 다이아바디, dsFv, 및 CDR을 포함하는 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 전술된 단클론 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 항암 치료제를 포함한다.
항암제는 약학적으로 허용되는 링커, 페이로드(payload) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 성분을 추가로 포함하는 조성물 형태일 수 있다. 항암제는 약물을 추가로 포함하여 항체-약물-접합체를 형성하는 조성물 형태일 수 있다. 항암제는 배아 줄기 세포로부터 유도된 분화 세포로부터 배아 줄기 세포를 표적화하고 선택하고 제거할 수 있다. 항암제는 위암 세포, 췌장암 세포, 식도암 세포, 결장암 세포, 유방암 세포 및 전립선암 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 암 세포를 표적화할 수 있다.
조성물은 네이키드(naked) 인간 키메릭 형태의 항체의 정맥내 전달에 의해 환자에게 투여되어 항종양 항체-의존성 세포 세포독성을 유도할 수 있다. 대안적으로, 조성물은 정맥내 전달에 의해 환자에게 투여될 수 있되, 조성물은 암 세포에 특이적으로 전달하기 위한 세포독성 약물을 추가로 포함한다.
서열목록
첨부된 서열목록에 열거된 아미노산 서열은 표준 문자 축약형을 사용하여 나타냈고, 서열목록은 본원에 참고로 포함된다.
본 발명은 다능성- 및 배아 줄기 세포-특이적 항체에 관한 것이다. 항체는 항종양 활성을 나타낸다. 항체는 정상 세포에 대해 미반응성이거나 저조하게 반응성이고, 다수의 암 세포에 고도로 특이적이고 반응성이다. 항체는 이의 항체-의존성 세포 세포독성 특성, 보체-의존성 세포독성 특성 및 항체-약물 접합체 때문에 항암치료제로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 독소와 접합된 항체는 암 세포에 대한 세포독성 활성을 갖는다. 항체는 비제한적으로 구강암, 난소암, 위암, 췌장암, 식도암, 결장암, 유방암 및 전립선암을 포함하는 매우 다양한 암에 대해 효과적이다.
본 발명의 항체는 단클론이고 본원에서 Bstrongomab-9A 또는 CM-918로서 지칭된다. 단클론 항체는 표준 하이브리도마 기술을 사용하여 생산된다. 단클론 항체 CM-918의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 DNA 및 아미노산 서열이 본원에 기재된다. 상보성 결정 영역(CDR)의 아미노산 서열은 VBASE2를 사용하여 정의되었다.
단클론 항체 CM-918은 하기와 같은 중쇄 상보성 결정 영역(hcCDR) 1 내지 3의 아미노산 서열을 포함한다:
- hcCDR #1 GFTFSDFY (서열번호 1)
- hcCDR #2 SRNKANDYTT (서열번호 2)
- hcCDR #3 ARDGWVEAMDY (서열번호 3)
단클론 항체 CM-918은 하기와 같은 경쇄 상보성 결정 영역(lcCDR) 1 내지 3의 아미노산 서열을 포함한다:
- lcCDR #1 QSLVHSNGNTY (서열번호 4)
- lcCDR #2 KVS (서열번호 5)
- lcCDR #3 SQSTHVPWT (서열번호 6)
단클론 항체 CM-918은 비-인간 및 인간 항체를 포함하는 재조합 항체일 수 있다. 교대하는 실시양태에서, 재조합 항체는 비-인간 동물-유래된 항체(예를 들어 마우스 또는 래트), 인간-유래된 항체, 인간 키메릭 항체 또는 인간화된 항체일 수 있다. 항체는 바람직하게 항-인간 항체이고, 이는 인간 세포, 예를 들어 다능성 및 배아 줄기 세포에 특이적으로 결합한다. 보다 특히, 항체는 포유동물-유래된 단클론 항체이고, 이는 하이브리도마에 의해 생산된 것을 포괄한다. 특정 실시양태에서, 항체는 종래의 하이브리도마 기술을 사용하여 마우스-유래된 것이다. 항체는 다양한 분자, 예컨대 비제한적으로 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 의해 변형될 수 있다. 또한, 항체는 화학치료제, 방사성 화학물질 등에 의해 변형되어 세포독성 활성을 가질 수 있다.
특정 실시양태에서, 단클론 항체 CM-918은 세포 부착 단백질 포도칼릭신(포도칼릭신-유사 단백질 1로도 공지됨) 상의 에피토프에 대한 반응성 및 선택적 결합을 갖는다. 포도칼릭신은 인간에서 PODXL 유전자에 의해 암호화되는 내재 막 단백질이다. 포도칼릭신은 일부 정상 세포에서 발현되는 지나치게 글리코실화된 유형-1 막관통 단백질이다. 포도칼릭신은 다양한 암에서 고도로 발현되고, 다양한 암에서 발현 수준이 종양 침입력에 연관성 있는 종양 마커이다. 포도칼릭신은 정상 세포에서 약 160 내지 164 kDa의 분자량을 갖는다. 또한, 포도칼릭신은 정상 배아 줄기 세포 및 악성 다능성 배아 암종 줄기 세포에서 지나치게 발현된다. 포도칼릭신은 배아 줄기 세포의 세포 표면 마커이다. 포도칼릭신은 모든 배아 및 다능성 줄기 세포에서 배아 또는 다능성-특이적 변이체 형태로 발현되고, 이는 비-다능성 및 배아 줄기 세포에 존재하지 않는 추가적 번역후 변형을 갖는다. 포도칼릭신의 하나의 공지된 배아 줄기 세포-특이적 번역후 변형은 TRA-1-60 및 TRA-1-81로도 공지된 포도칼릭신 단백질 주쇄(본원에서 TRA 에피토프로도 지칭됨)의 추가적 당화이다. 임의의 특정 이론에 구애됨 없이, TRA 에피토프는 다능성- 및 배아-특이적인 확장된 테트라사카라이드 뮤신 유형 O-글리칸 구조인 것으로 생각된다. 배아 줄기 세포 및 다능성 암 세포가 체세포로 분화할 때, TRA 에피토프는 포도칼릭신으로부터 손실된다. TRA는 정상 체세포 및 분화 세포 상에 발현되지 않는다. TRA 에피토프를 갖는 포도칼릭신의 배아 변이체(본원에서 TRA-포도칼릭신으로 지칭됨)의 겉보기 분자량은 약 200 내지 240 kDa이다. TRA-포도칼릭신은 구강암, 결장암, 췌장암, 위암, 유방암, 전립선암, 뇌암, 난소암 및 폐암을 포함하는 많은 유형의 암에서 발현되는 것으로 공지되어 있다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 단클론 항체 CM-918은 포도칼릭신의 배아 및 다능성 변이체, TRA-포도칼릭신 상에 존재하는 TRA 에피토프에 반응성이고 그에 대한 선택적 결합을 갖는다.
다른 실시양태에서, 단클론 항체 CM-918은 TRA-포도칼릭신 상의 공지되지 않은 에피토프에 대해 선택적 결합 및 반응성을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 단클론 항체 CM-918은 배아 줄기 세포 및 다능성 배아 암종 암 세포의 세포 원형질막 상에 발현되는 공지되지 않은 에피토프에 대한 선택적 결합 및 반응성을 갖는다. 중쇄 CDR 서열(서열번호 1 내지 3) 중 하나 이상에서 1, 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 대체된 CM-918 항체의 아미노산 서열 변이체가 존재함이 본 발명에 따라 이해되고 고려된다. 바람직하게, 이들 CM-918 변이체는 TRA-포도칼릭신에 대한 반응성 및 선택적 결합 또는 배아 줄기 세포의 세포 표면 원형질막에 대한 반응성 및 선택적 결합을 갖는다.
경쇄 CDR 서열(서열번호 4 내지 6) 중 하나 이상에서 1, 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 대체된 CM-918 항체의 아미노산 서열 변이체가 또한 본 발명에 따라 이해되고 고려된다. 바람직하게, 이들 CM-918 변이체는 TRA-포도칼릭신에 대한 반응성 및 선택적 결합 또는 배아 줄기 세포의 세포 표면 원형질막에 대한 반응성 및 선택적 결합을 갖는다.
특정 양상에서, 본 발명은 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 및 각각 서열번호 2 및 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열 CDR2 및 CDR3을 포함하는 항체를 제공한다. 또한, 항체는 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 및 각각 서열번호 5 및 서열번호 6에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 CDR3을 포함한다. 또한, 특정 양상에서, 본 발명은 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실, 첨가 및/또는 삽입에 의해 본원에 기재된 항체로부터 유래되고 기능적으로 동등한 항체를 포함한다. 특정 양상에서, 본 발명은 각각 서열번호 1 내지 3의 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 서열 유사성을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 1 내지 3, 및 각각 서열번호 4 내지 6의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 1 내지 3을 갖는 중쇄 및 경쇄를 포함하는 단클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 다른 특정 양상에서, 본 발명은 각각 서열번호 1 내지 3의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 1 내지 3, 및 각각 서열번호 4 내지 6의 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 서열 유사성을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 1 내지 3을 갖는 중쇄 및 경쇄를 포함하는 단클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 또 다른 특정 양상에서, 본 발명은 각각 서열번호 1 내지 3의 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 서열 유사성을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 1 내지 3, 및 각각 서열번호 4 내지 6의 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 서열 유사성을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 1 내지 3을 갖는 중쇄 및 경쇄를 포함하는 단클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다.
본 발명의 항체는 전항체 분자로 제한되지 않고, 항체가 세포 표면에 결합한다면 저분자 항체 또는 이의 변형된 형태일 수 있다. 저분자 항체는 전항체의 일부가 결핍된 항체 단편을 포괄한다. 항체 분자의 이러한 부분적 결핍은 생성된 항체 단편이 세포 표면에 결합할 수 있다면 허용가능하다. 항체 단편이 서열번호 1, 2 및 3에 제시된 중쇄(hc) CDR 및 서열번호 4, 5 및 6에 제시된 경쇄(lc) CDR을 함유하는 것이 바람직하다. 저분자 항체 및 항체 단편의 구체적 예는 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv(단일 쇄 Fv), dsFv 다이아바디, sc(Fv)2, 또는 CDR을 포함하는 펩티드를 포함할 수 있다.
다이아바디는 유전자 융합에 의해 구축된 이가 항체 단편을 나타낸다. 다이아바디는 2개의 폴리펩티드 쇄를 포함하는 이량체이다. scFv는 항체의 중쇄 및 경쇄 영역을 연결함으로써 수득된다. scFv에서, 중쇄 및 경쇄 영역은 링커, 예컨대 펩티드 링커를 통해 연결된다. 가변 영역을 연결하는 펩티드 링커는 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 약 3 내지 25개의 잔기의 임의의 단일 쇄 펩티드가 링커로서 사용될 수 있다. scFv-Fc는 scFv에 융합된 Fc 영역을 포함하는 저분자 항체이다. scFv-Fc에 사용된 scFv의 기원은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 IgM으로부터 유래된 scFv가 사용될 수 있다. 또한, Fc의 기원은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 인간 IgG(인간 IgG1 등)로부터 유래된 Fc가 사용될 수 있다. sc(Fv)2는 링커 등을 통해 연결된 중쇄 영역 및 경쇄 영역을 포함하는 단일 쇄를 갖는 저분자 항체이다. sc(Fv)2는 예를 들어 링커를 통해 scFv를 연결함으로써 생산될 수 있다.
항체의 단편은 당분야에 공지된 다양한 기술, 예컨대 비제한적으로 항체를 효소로 처리하여 이의 단편을 형성함에 의해 수득될 수 있다.
세포-증식성 질병, 예컨대 암의 치료를 위해, 항체가 이의 효과기 활성을 유지하는 것이 바람직하다. 구체적으로, 본 발명에 따른 항체는 세포 표면에 대한 결합 친화성 및 효과기 기능을 둘 다 가질 수 있다. 항체의 효과기 기능은 항체-의존성 세포-매개된 세포독성(ADCC) 활성 및 보체-의존성 세포독성(CDC) 활성을 포괄한다. 본 발명에 따른 치료 항체는 특히 효과기 기능으로서 ADCC를 보유할 수 있다. 치료 목적을 위해 사용된 본 발명의 항체는 세포독성 활성을 갖는 항체일 수 있다. 본 발명에 따른 세포독성 활성의 예는 ADCC 및 CDC 활성을 포함할 수 있다. 본 발명에서, ADCC 활성은 표적 세포의 세포 표면 항원에 특이적으로 부착된 항체의 Fc 도메인에 대한 Fcγ 수용체를 통한 Fcγ 수용체-함유 세포(면역 세포 등)의 결합을 통해 표적 세포를 손상시키는 활성을 의미한다. CDC 활성은 보체 시스템에 의해 매개된 세포독성 활성을 의미한다.
항체는 세포독성 물질과 접합될 수 있다. 적합한 세포독성 물질의 비제한적인 예는 화학치료제, 독성 펩티드, 방사성 화학물질 또는 다른 페이로드, 예컨대 약물을 포함한다. 이러한 변형된 항체(이후 항체 접합체로서 지칭함)는 수득된 항체를 화학적으로 변형시킴으로써 수득될 수 있다. 특정 실시양태에서, 변형된 항체는 약학적으로 허용되는 링커, 페이로드 또는 이들의 조합을 포함한다. 페이로드가 약물인 경우, 항체-약물-접합체가 형성된다. 항체 변형의 다양한 방법이 당분야에 공지되어 있고, 이들 방법은 본 발명에 따라 사용하기에 적합하다.
본 발명은 세포(예를 들어 다능성 및 배아 줄기 세포)의 표면에 결합하는 항체를 활성 성분으로서 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 약학 조성물은 치료 효과량의 항체를 포함한다. 용어 "치료 효과량"은 항체가 목적하는 치료 효과 또는 예방 효과를 행사할 수 있도록 하는 항체의 양을 나타낸다. 실시양태에서, 약학 조성물은 세포 성장 억제제, 특히 항암 치료제이다. 본 발명의 세포 성장 억제제 및 항암제는 암을 앓거나 아마 암을 앓는 개체에게 투여되고, 배아 줄기 세포로부터 유래된 분화된 세포로부터 배아 줄기 세포를 표적화하고 선택하고 제거하는 데 효과적일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 세포독성 물질-접합된 항체를 활성 성분으로서 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물에 의해 표적화되는 질병이 암인 경우, 표적화된 암은 특별히 제한되지 않고, 특히 구강암, 난소암, 위암, 췌장암, 식도암, 결장암, 유방암 또는 전립선암일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 환자에게 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 비경구 투여가 바람직할 수 있다. 이러한 투여 방법의 구체적 예는 주사 투여, 경비 투여, 폐 투여 및 경피 투여를 포함한다. 주사 투여의 예는 정맥내, 근육내, 복강내 및 피하 주사를 포함하고, 이를 통해 본 발명의 약학 조성물은 전신 또는 국소 투여될 수 있다. 또한, 투여 방법은 환자의 나이 또는 중상에 따라 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 투여량은 예를 들어 투여 당 1 kg 체중 당 0.0001 내지 1000 mg의 투여량 범위로부터 선택될 수 있다. 대안적으로, 투여량은 예를 들어 신체 당 0.001 내지 100000 mg 범위로부터 선택될 수 있다. 그러나, 본 발명의 약학 조성물은 이들 투여량에 제한되지 않는다. 본 발명의 약학 조성물은 당분야에 공지된 통상적인 표준 방법에 따라 제형화될 수 있고, 추가로 약학적으로 허용되는 담체 또는 첨가제를 함유할 수 있다. 이의 예는 비제한적으로 계면활성제, 부형제, 착섹제, 향미제, 보존제, 안정화제, 완충제, 현탁제, 긴장제, 결합제, 붕괴제, 활택제, 유동 촉진제 및 교정약을 포함한다. 일상적으로 사용되는 다른 담체가 적절하게 혼입될 수 있다. 암 세포와 접촉시, 본 발명의 항체는 암 세포를 손상시키거나 이의 성장을 억제할 수 있다. 항체가 결합하는 세포는 특별히 제한되지 않는다. 본 발명에서, 세포는 바람직하게 암 세포이다.
당업자는 본 발명의 광범위한 개념으로부터 벗어나지 않으면서 전술한 실시양태가 변할 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명은 개시된 특정 실시양태 및 수행된 하기 실시예에 제한되지 않고 본 발명의 사상 및 범위 내에 있는 변형을 포함하는 것으로 이해된다.
실시예
실시예 1 - 단클론 항체 CM-918의 생산
본 발명의 단클론 항체(Bstrongomab 또는 CM-918로 지칭됨)를 표준 마우스 하이브리도마 기술을 사용하여 생산하였다. 마우스를 멸균 PBS에 현탁된 갓 채취한 NCCIT 세포로 복강내로 주사하였다. 각각의 마우스는 주사 당 10e6개의 세포를 제공받았다. 2주 간격의 4회의 주사 후에, 면역화된 마우스의 혈청을 ELISA 및 웨스턴 블롯(Western Blot) 분석으로 시험하여 양성 역가를 갖는 마우스를 확인하였다. 이어서, 가장 높은 역가를 마우스는 비장으로부터 B 세포의 채취 또는 NS0 또는 P3X63Ag8.653 마우스 골수종 세포에 대한 융합 2 내지 7일 전에 융합전 부스트 면역화를 제공받았다.
하이브리도마를 96 웰 플레이트(융합 당 960 웰)에 플레이팅하고 14일 동안 20% 소 태아 혈청, 20% NCTC-109(깁코(Gibco)), 1% v/v 페니실린-스트렙토마이신, 2 mM L-글루타민, 0.4% v/v 하이브리도마 융합 및 클로닝 보충물(시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)), 1x 비필수 아미노산(깁코), 1x HAT-보충물(깁코), 20 mM HEPES, 및 L-글루타민을 함유하는 RPMI 1640 배지(mod.) 1x로 구성된 하이브리도마 융합 배지로 번식시켰다. 하이브리도마 상청액을 수집하고 NCCIT 용해물에 대해 웨스턴 블롯에 의해 스크리닝하여 TRA에 대한 IgG 항체 결합을 생성하는 하이브리도마를 확인하였다. 양성 클론을 스케일링하고 96 웰 플레이트에서 2회 이상의 라운드의 제한된 희석 서브클로닝을 수행하여 단클론 하이브리도마를 단리하였다. 서브클로닝 플레이트를 ELISA에 의해 스크리닝하고, 양성 단클론 하이브리도마를 10% 소 태아 혈청, 10% NCTC-109(깁코), 1% v/v 페니실린-스트렙토마이신, 2 mM L-글루타민, 0.4% v/v 하이브리도마 융합 및 클로닝 보충물(시그마-알드리치), 1x 비필수 아미노산(깁코), 1x HT-보충물(깁코), 20 mM HEPES, 및 L-글루타민을 함유하는 RPMI 1640 배지(mod.) 1x로 구성된 하이브리도마 배지에서 스케일링하였다. 웨스턴 블롯 분석에서 하이브리도마 활성을 확인한 후에, 단클론 하이브리도마를 10% DMSO로 보충된 하이브리도마 배지에서 극저온 냉동시켰다. CM-918 항체를 10% 초저 IgG FBS를 함유하는 하이브리도마 배지에서의 고갈을 위해 배양된 단클론 하이브리도마의 상청액으로부터 정제하였다. 상청액을 원심분리한 후에, 45 um 필터에 통과시켜 세포 및 세포 잔해를 제거하였다. IgG 항체를 지이 라이프사이언시즈(GE LifeSciences)의 하이트랩(HiTrap) 단백질 G HP 컬럼을 사용하여 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 정제된 mAb를 제바(Zeba) 회전 탈염 컬럼(써모사이언티픽(ThermoScientific))을 사용하여 탈염시켰다. 가변 영역의 중쇄 및 경쇄를 DNA 서열을 밝히고, 항체의 CDR 영역의 아미노산 서열을 VBASE2(인간 및 마우스의 면역글로불린 로커스로부터의 생식 계열 가변 유전자의 통합 데이터베이스)를 사용하여 정의하였다.
실시예 2 - CM-918 항체를 사용한 다능성 세포의 웨스턴 블롯 분석
CM-918 항체를 사용한 다능성 배아 암종 암 세포 NCCIT(ATCC # CRL2073) 및 인간 배아 줄기 세포(ESI-017)의 막 단백질 샘플의 웨스턴 블롯은 둘 다의 단백질 막 프렙에서 200 내지 240 kDa 분자량에서 단일 확산 밴드를 나타냈으나, 반응성은 TRA-포도칼릭신을 발현하지 않는 비-다능성 세포주 PC3(ATCC # CRL1435) 또는 A172(ATCC # CRL1620)에서 검출되지 않았다. 동일한 블롯 결과가 동일한 웨스턴 블롯에 대해 상업적으로 입수가능한 IgM 항체, 항-TRA-1-60(abcam 16288)을 사용하여 수득되었다. 결과는 CM-918 항체 및 항-TRA-1-60 항체가 유사한 에피토프에 결합함을 확인하였다. SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅을 표준 방법론에 의해 수행하였다. 인산 염 완충제 중의 1% 챕스(Chaps) 세제(시그마) 중의 세포 막 프렙을 8% 겔 상에서 수행하고 니트로셀룰로스에 옮겼다. 블롯을 CM-918 또는 항-TRA-1-60 항체와 함께 1:1000(1 ug/ml 농도)에서 항온처리한 후에, 1 내지 5000(0.2 ug/ml)에서(밀리포어(Millipore)) 이차 항-IGG-HRP 또는 항-IGM-HRP 항체의 항온처리가 뒤따랐고, 밴드를 ECL 검출(아머샴 바이오사이언시즈(Amersham Biosciences))에 의해 시각화하였다.
실시예 3 - 배아 줄기 세포 및 다능성 배아 암종 세포의 CM-918 항체 원형질막 염색
배아 줄기 세포(ESL-017) 및 다능성 NCCIT 배아 암종 세포를 알렉사(Alexa) 647(시그마)과 접합된 CM-918 항체(0.5 ug/ml), 및 항-TRA-1-60 항체(0.5 ug/ml) 및 항-IgM-알렉사 F488 항체(밀리포어)(0.5 ug/ml)로 염색시켰다. 적색 채널에 의한 형광 현미경 이미지는, CM-918 항체가 배아 줄기 세포 및 다능성 배아 암종 세포의 원형질막에 강하게 결합하나 TRA-포도칼릭신을 발현하지 않는 대조군 세포주 PC3(ATCC # CRL1435) 또는 A172(ATCC # CRL1620)에는 결합하지 않음을 나타냈다. 적색 및 녹색 채널로부터의 겹쳐 놓은 형광 이미지는, 줄기 세포의 표면 상에 동일한 에피토프에 대한 둘 다의 항체의 결합을 보여주는 CM-918 및 항-TRA-1-60 항체의 동일한 염색 오버랩을 나타냈다.
실시예 4 - 정상 인간 조직 및 인간 암에 대한 CM-918 항체의 면역조직화학(IHC) 염색
CM-918에 의한 정상 조직 및 암의 면역조직화학 염색을 하기에 기재된 바와 같이 수행하였다. 0 내지 3의 등급 매기기 시스템을 사용하였다: 0: 염색이 관찰되지 않음, 1: 국소 염색(< 5%); 2: 중간 염색(< 50%); 3: 강한 염색(> 50%). 염색된 조직 슬라이드를 병리학자가 점수 매겼다. 2 또는 3의 염색 점수가 하기 암 조직에서 관찰되었다: 췌장암: 38개의 샘플 중 22개; 전립선암: 41개의 샘플 중 19개; 유방암: 145개의 샘플 중 45개; 난소암: 30개의 샘플 중 18개; 위암: 8개의 샘플 중 8개; 결장암: 30개의 샘플 중 15개; 폐암: 66개의 샘플 중 32개. 정상 인간 조직에서의 발현은 0의 발현(골수를 포함한 거의 모든 정상 조직에서)에서 적은 국소 발현(췌장, 식도 및 결장의 일부 경우)으로 매우 제한적이었다. 신장은 세관에서 약 1%의 CM-918을 사용한 모든 샘플에서 양의 점수를 가졌다. 2의 점수를 갖는 유일한 정상 조직은 부갑상선이었고, 이는 9개의 샘플 중 2개가 2-염색 점수를 가졌다. 결과는 CM-918이 많은 다양한 암에서 막 염색을 수행하고 정상 조직에서 매우 제한된 염색을 수행함을 보여준다.
모든 조직을 10% 완충된 포르말린에서 24시간 동안 고정시키고 5 μm로 절단하고 양으로 하전된 슬라이드에 두었다. 염색 전에, 슬라이드를 60도에서 밤새 건조하였다. 자일렌(피셔 사이언티픽(Fisher Scientific), 카탈로그 번호 X3P-1GAL)에서 탈파라핀화시킨 후에, 섹션을 100% 에탄올(에키-켐(Eki-Chem), 카탈로그 번호 4085-1GL), 95% 에탄올 및 70% 에탄올(에키-켐, 카탈로그 번호 4089-1GL)을 통해 재수화시켰다. 이어서, 섹션을 1X 디바 디클로커(Diva Decloaker)(바이오케어 메디컬(Biocare Medical), 카탈로그 번호 DV2004LX)에 담그고, 디클로킹(Decloaking) 챔버(바이오케어 메디컬, 모델: NxGen)를 사용하여 쿠킹하였다. 이후, 섹션을 블록살(BLOXALL)(벡터 랩스(Vector labs), 카탈로그 번호 SP-6000) 및 파워비전 유니버셜(PowerVision Universal) IHC 블로킹/딜루션(레이카(Leica), 카탈로그 번호 BD09-15)에 의해 차단하였다. 일차 항체를 PBS에서 2 ug/ml로 각각의 슬라이드에 적용하고 실온에서 1시간 동안 방치하였다. PBS로 세척한 후에, 파워비전 포스트 블로킹(레이카, 카탈로그 번호 DPVO+15Post)을 20분 동안 실온에서 적용하였다. 이어서, 슬라이드를 파워비전 폴리-HRP 항-마우스/래빗 IgG(레이카, 카탈로그 번호 DPVO-15HRP)와 함께 30분 동안 실온에서 항온처리한 후에, DAB(벡터 랩스, 카탈로그 번호 SK4105) 정색 반응이 뒤따랐다. 슬라이드를 헤마톡실린(벡터 랩스, 카탈로그 번호 H-3404)으로 대비염색시켰다. 상이한 시약 또는 항체의 항온처리 사이에, 슬라이드를 PBS로 세척하였다. 배아 암종 섹션을 조직에서 표적 단백질 발현의 기술적 정확도를 보장하기 위해 염색에 포함시켰다. 음성 대조군 실험을 이소타입 대조군 항체(바이오레전드(Biolegend), 카탈로그 번호 401401)의 존재 하에 모든 분석과 유사하게 수행하였다.
실시예 5 - CM-918-항체-약물-접합체의 세포 생존능 투여량 반응 곡선
CM-919-vc-MMAE 항체 약물 접합체를 생산하였다: PBS 중의 CM-918의 용액을 37℃에서 TCEP로 처리하여 쇄간 다이설파이드 결합을 환원시켰다. MC-vc-PAB-MMAE의 용액(말레이미드도카프로일-발린-시트룰린-p-아미노벤질옥시카본일-모노메틸 아우리스타틴 E)을 반응 혼합물에 첨가하여 MC-vc-PAB-MMAE의 말레이미드 잔기를 CM-918에 연결시켰다. 생성된 항체 약물 접합체(ADC)를 세파덱스(Sephadex) G50 컬럼 상에서 탈염시켜 잔여 미반응 독소를 제거하고 PBS(pH 7.2)로 완충제 교환하였다. 약물 항체 비(DAR)를 248 및 280 nm에서의 UV 흡광도의 비로부터 결정하였다. HIC(소수성 상호작용 크로마토그래피) 및 SEC(크기 배제 크로마토그래피) 분석을 수행하여 DAR 종 분포를 결정하였다.
다능성 NCCIT 세포, 배아 줄기 세포(ESL-017) 및 TRA-포도칼릭신을 발현하지 않는 대조군 PCS 세포를 사용한 세포 생존능 분석을 수행하였다: 표적 세포를 96-웰 플레이트에 3x103 내지 1x104 세포/웰(90 ul)의 밀도로 시딩하고 5% CO2 항온처리기에서 24시간 동안 세포를 항온처리한다. 세포를 항체(웰 당 10 ul)로 하기와 같이 처리한다: 100 nM의 출발 농도 및 반 로그 희석을 사용함, 농도 당 6개의 반복 시험을 수행함, 항체 처리를 수행하지 않은 마지막 웰을 음성 대조군으로서 사용하였다. 세포를 5% CO2 항온처리기에서 24시간 내지 7일 동안 항온처리 한다. 사용 전에 셀티터-글로(CellTiter-Glo, 등록상표) 발광 세포 생존능 분석 시약(프로메가(Promega), 카탈로그 번호 7572)을 실온으로 평형화시킨다. 100 ul의 셀티터-글로(등록상표) 시약을 각각의 웰에 적용하고 내용물을 2분 동안 오비탈 쉐이커에서 혼합하여 세포 용해를 유도한다. 플레이트를 실온에서 10분 동안 항온처리하여 발광 신호를 안정화시킨다. 마이크로플레이트 판독기(필터맥스(Filtermax) F5, 미국 캘리포니아 서니베일 소재 몰레큘러 디바이시즈(Molecular Devices)) 상의 발광을 기록한다.
세포 생존능 분석 결과는 CM-918-vc-MMAE 항체 약물 접합체에 의한 세포의 IC50 사멸은 NCCIT 세포의 경우 2.7 nM이었고, 배아 줄기 세포의 경우 5.6 nM이었고, CM-918-vc MMAE의 100 nM 농도까지 대조군 PC3 세포에 대해 효과가 관찰되지 않았음을 보여주었다. MMAE와 동일하게 접합된 이소타입 대조군 항체는 100 nM 이하의 농도에서 모든 3개의 세포주에 대해 효과를 나타내지 않았다. 결과는, CM-918 항체 약물 접합체가 다능성 배아 암종 암 세포 및 인간 배아 줄기 세포 사멸에서 매우 효과적이나 TRA-포도칼릭신을 발현하지 않는 세포에서는 그렇지 않음을 보여준다.
실시예 6 - 접합된 CM-919 항체 약물로 처리된 다능성 NCCIT 암 세포 /마우스 이종이식 모델
15마리의 누드(nude) 마우스에게 2x106 NCCIT 다능성 암 줄기 세포를 피하 주사하고, 종양을 200 mm3의 크기로 발달시키고, 이 시점에 마우스를 5마리씩 3개의 군으로 나누었다: 5마리의 마우스를 4회의 염수 주사로 처리하였다; 5마리의 마우스를 3 mg/kg의 CM-vc-MMAE를 사용하여 Q4Dx4로 처리하였다; 마지막 5마리를 3 mg/kg의 이소타입 항체 대조군-vc-MMAE를 사용하여 Q4Dx4로 처리하였다. 결과는, 35일의 마지막에 염수 주사한 마우스 및 이소타입 대조군 주사한 마우스 둘 다가 1000 mm3의 평균 크기의 종양을 가졌음을 보여준다. 접합된 CM-918 항체 약물 처리된 마우스에서, 5마리의 마우스 중 4마리가 검출가능한 종양을 가지지 않았고, 1마리의 마우스는 약 25 mm3의 종양을 가졌다. CM-918과 같이 MMAE와 접합된 이소타입 대조군 항체는 1000 mm3의 평균 종양 크기를 갖는 염수 처리된 마우스와 유사한 결과를 나타냈다. 결과는, CM-919-vc-MMAE 항체 약물 접합체가 마우스에서 다능성 암 줄기 세포 종양을 치료하는 데 효과적이고 영향이 강함을 보여준다.
실시예 7 - CM-918 항체에 의한 항체 의존성 세포 세포독성 분석( ADCC )
CM-918 항체 및 다능성 암 NCCIT 세포를 사용한 ADCC 분석은 12 내지 15%의 세포독성 및 CM-918 ADCC 활성, 및 TRA-포도칼릭신을 발현하지 않는 대조군 세포가 2%의 세포독성을 가짐을 보여주었다. 대조군 IgG 항체는 NCCIT 세포의 사용시 2% 세포독성을 가졌다. 결과는, CM-918 항체가 TRA-포도칼릭신을 발현하는 다능성 암 세포를 사용시 ADCC 활성을 가짐을 보여준다.
인간 PBMC를 피콜(Ficoll) 구배를 사용하여 건강한 공여체로부터 정제하였다. 표적 세포를 96-웰 플레이트에 1 × 104/웰로 시딩하고 막 단리한 PBMC와 함께 25:1 또는 50:1의 E:T로 4시간 동안 7℃에서 항온처리하였다. 시험 항체 및 IgG-Fc 대조군 항체의 농도를 190 nM로 고정시켰다. 공동-항온처리 후에, 세포 세포독성을 LDH 분석에 의해 측정하였다. 표적 세포 세포독성의 백분율을 효과기 및 표적 세포(항체 없음) 대조군에 의한 흡광도 값을 감한 배경에 의해 계산하였고, 표적 세포 단독(자발적 용해)을 0%로, 용해된 표적 세포 단독(최대 용해)을 100%로 비율로 정했다.
실시예 8 - CM-918 항체에 의한 보체 의존성 세포독성 분석( CDC )
CDC 분석을 수행하였고, 이는 NCCIT 다능성 암 줄기 세포가 100 nM CM-918 항체의 사용시 18% 세포독성 및 10 nM CM-918 항체의 사용시 10% 세포독성을 가졌음을 나타냈다. 100 nM 대조군 항체를 사용한 CDC 분석에서 NCCIT 세포 세포독성의 결과는 1% 미만의 세포독성을 가졌다. 이들 결과는, CM-918 항체가 원형질막 세포 표면 상에 TRA-포도칼릭신을 발현하는 다능성 암 줄기 세포에 대해 CDC 활성을 유도할 수 있음을 보여준다.
인간 보체를 96-웰 포맷에서 1:4 부피 비로 104개의 표적 세포와 함께 항온처리하였다. 시험 항체를 190 nM에서 출발하는 10-포인트 반-로그 희석 시리즈로 적재하였다. IgG-Fc 대조군 항체만을 190 nM에서 첨가하였다. 항체를 표적 세포 및 보체와 함께 4시간 동안 37℃에서 공동-항온처리하였다. 공동-항온처리 후에, 세포 세포독성을 LDH 분석(로슈(Roche))에 의해 측정하였다. 표적 세포 세포독성 백분율을 보체 및 표적 세포(항체 없음) 대조군에 의한 흡광도 값을 감한 배경에 의해 계산하였고, 표적 세포 단독(자발적 용해)을 0%로, 용해된 표적 세포 단독(최대 용해)을 100%로 비율로 정했다.
SEQUENCE LISTING <110> CUREMETA THERAPEUTICS, LLC <120> PODOCALYXIN AND TRA-RELATED ANTIBODY, METHODS OF PREPARATION AND USES AS AN ANTI-CANCER THERAPEUTIC AGENT <130> 302977-00042-2 <140> PCT/US2017/022109 <141> 2017-03-13 <150> US 62/307,690 <151> 2016-03-14 <160> 6 <170> MICROSOFT WORD <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Gly Phe Thr Phe Ser Asp Phe Tyr 1 5 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Ser Arg Asn Lys Ala Asn Asp Tyr Thr Thr 1 5 10 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3 Ala Arg Asp Gly Trp Val Glu Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr 1 5 10 <210> 5 <211> 3 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5 Lys Val Ser 1 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr 1 5

Claims (14)

  1. 각각 서열번호 1 내지 3의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 1 내지 3, 및 각각 서열번호 4 내지 6의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 1 내지 3을 갖는 중쇄 및 경쇄를 포함하는 단클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  2. 제1항에 있어서,
    재조합 항체인 단클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  3. 제2항에 있어서,
    재조합 항체가 인간 키메릭 항체, 인간화된 항체 및 인간 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 단클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  4. 제1항에 있어서,
    단편이 Fab, Fab', F(ab')2, scFv, 다이아바디, dsFv, 및 CDR을 포함하는 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는, 단클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  5. 각각 서열번호 1 내지 3의 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 서열 유사성을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 1 내지 3, 및 각각 서열번호 4 내지 6의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 1 내지 3을 갖는 중쇄 및 경쇄를 포함하는 단클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  6. 제5항에 있어서,
    경쇄 상보성 결정 영역 1 내지 3이 각각 서열번호 4 내지 6의 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 서열 유사성을 갖는, 단클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  7. 제5항에 있어서,
    재조합 항체인 단클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  8. 제7항에 있어서,
    재조합 항체가 인간 키메릭 항체, 인간화된 항체 및 인간 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 단클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  9. 제5항에 있어서,
    단편이 Fab, Fab', F(ab')2, scFv, 다이아바디, dsFv, 및 CDR을 포함하는 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는, 단클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  10. 제1항의 단클론 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 항암 치료제.
  11. 제10항에 있어서,
    약학적으로 허용되는 링커, 페이로드 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 성분을 추가로 포함하는 조성물 형태인 항암 치료제.
  12. 제10항에 있어서,
    약물을 추가로 포함하여 항체-약물-접합체를 형성하는 조성물 형태인 항암 치료제.
  13. 제10항에 있어서,
    배아 줄기 세포로부터 유도된 분화 세포로부터 배아 줄기 세포를 표적화하고 선택하고 제거하는 항암 치료제.
  14. 제10항에 있어서,
    위암 세포, 췌장암 세포, 식도암 세포, 결장암 세포, 유방암 세포 및 전립선암 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 암 세포를 표적화하는 항암 치료제.
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