CN113286634A

CN113286634A - 对gucy2c特异性的抗体及其用途

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Publication number: CN113286634A
Application number: CN201980049389.XA
Authority: CN
Inventors: C·S·常; G·冈塔斯; M·卡特拉加达; D·马图尔; A·R·鲁特; L·莫斯亚克; E·R·拉瓦尔列
Original assignee: Pfizer Inc
Current assignee: Pfizer Inc
Priority date: 2018-05-23
Filing date: 2019-05-21
Publication date: 2021-08-20
Also published as: TW202308693A; TW202003041A; JP2022106751A; EP3796983A2; IL278924A; SG11202010934SA; KR20230146098A; KR20210013165A; TWI803637B; PE20210488A1; US20230340151A1; PH12020500671A1; ZA202006859B; TWI816396B; US11525010B2; WO2019224716A3; MX2020012607A; JP2021525080A; CA3100829A1; CO2020014345A2

Abstract

本发明提供了特异性结合GUCY2c的新抗体及其在治疗癌症中的用途。本发明进一步提供了包含这种抗体的新双特异性抗体及其在治疗癌症中的用途。

Description

对GUCY2C特异性的抗体及其用途

序列表

所述申请是通过EFS-Web电子提交的，并包括.txt格式的电子提交的序列表。.txt文件含有于2019年5月14日创建且具有738 KB的大小的命名为“PC72377-PRV2_Sequence_Listing_ST25_05142019.txt”的序列表。所述.txt文件中含有的序列表是说明书的一部分，且整体引入本文作为参考。

技术领域

本发明涉及特异性结合GUCY2c（鸟苷酸环化酶C）和/或CD3（分化簇（Cluster ofDifferentiation）3）的抗体，例如，全长抗体或其抗原结合片段。本发明进一步涉及特异性结合CD3和肿瘤细胞抗原的双特异性抗体（例如，特异性结合CD3和GUCY2c的双特异性抗体）。本发明还涉及相关分子，例如，编码这种抗体或双特异性抗体的核酸，组合物，以及相关方法，例如，产生和纯化这种抗体和双特异性抗体的方法，及其在诊断学和治疗学中的用途。

背景技术

癌症是全球主要的死亡原因，是造成每年超过700万死亡的原因。癌症死亡率几乎普遍地与形成转移并最终导致死亡的原发肿瘤向远距离的部位扩散有关。这对于包括食道、胃、结肠和直肠的腺癌的胃肠癌来说是特别正确的。结肠直肠癌（CRC）仍然是美国第四最多诊断的癌症，以及癌症死亡的第二大主要原因（Siegel RL, Miller KD, Jemal A.Cancer statistics, 2016. CA Cancer J Clin., 66:7–30, 2016）。在世界范围内，结肠直肠癌每年引起多达120万新病例和600,000死亡（Brenner H, Kloor M, Pox CP.Colorectal cancer. Lancet, 383:1490–502, 2014）。

鸟苷酸环化酶C（GUCY2c）（也称为STAR、ST受体、GUC2C、GUCY2C、GC-C和GCC）是跨膜细胞表面受体，其在维持肠液、电解质稳态和细胞增殖中起作用（Carrithers等人, ProcNatl Acad Sci USA 100: 3018-3020, 2003；Mann等人, Biochem Biophys Res Commun239: 463-466, 1997；Pitari等人, Proc Natl Acad Sci USA 100: 2695-2699, 2003）；GenBank检索号NM.sub.-004963和GenPept检索号NP-004954）。所述功能通过鸟苷肽（Wiegand等人. FEBS Lett. 311:150-154, 1992）和尿鸟苷素（uroguanylin）（Hamra等人.Proc Natl Acad Sci USA 9(22):10464-10468, 1993）的结合介导。GUCY2c还是热稳定的肠毒素（ST）的受体，所述肠毒素是由大肠杆菌（E. coli）和其他感染性生物产生的肽（Rao,M. C. Ciba Found. Symp. 112:74-93, 1985；Knoop F. C.和Owens, M. J. Pharmacol.Toxicol. Methods 28:67-72, 1992）。ST与GUCY2c的结合激活了信号级联，其导致肠病，例如，腹泻。

GUCY2c已被表征为与癌症有关的蛋白，包括结肠直肠癌、胰癌、胃癌、肝癌和食道癌（Carrithers等人, Dis Colon Rectum 39:171-181, 1996；Buc等人. Eur J Cancer41: 1618-1627, 2005；Carrithers等人, Gastroenterology 107: 1653-1661, 1994；Urbanski等人, Biochem Biophys Acta 1245: 29-36, 1995）。

作为细胞表面蛋白，GUCY2c可以充当受体结合蛋白例如抗体或配体的治疗用靶。GUCY2c在小肠、大肠和直肠的黏膜内衬的上皮细胞的顶面上表达（Carrithers等人, DisColon Rectum 39: 171-181, 1996）。GUCY2c的表达在肠上皮细胞的致瘤性转化时维持，包括在所有原发性和转移性结肠直肠肿瘤中的表达（Carrithers等人, 1996；Buc等人；Carrithers等人, 1994）。在被诊断为巴雷特食管、食道癌和胃癌的食道细胞中也已检测到了GUCY2c的表达。

仍然需要可以特异性靶向并特异性结合转移的结肠直肠癌细胞的分子和/或组合物。需要治疗怀疑患有结肠直肠癌的个体的改进的方法，尤其是怀疑患有结肠直肠癌细胞转移的个体。

已经开发了各种策略以产生能够进行T细胞募集以介导肿瘤细胞杀伤的双特异性抗体。这种双特异性抗体可以在肿瘤细胞和人免疫系统的效应细胞（NK细胞、T细胞、单核细胞、巨噬细胞或粒细胞）之间架起桥梁，从而允许肿瘤细胞的特异性杀伤。尽管已证明这种双特异性抗体对于治疗应用是有利的，例如，对于用于治疗肿瘤的治疗概念，但是仍需要以高度有效且特异性的方式靶向GUCY2c阳性肿瘤细胞的双特异性抗体。这种分子作为治疗剂在GI恶性肿瘤的病例中、在癌症的治疗中以及在细胞上GUCY2c的检测中将是有用的。

发明内容

本发明提供了抗体，包括双特异性抗体，其中所述抗体特异性结合GUCY2c。本发明进一步提供了能够结合GUCY2c和CD3的双特异性抗体。

在一个方面，本发明提供了特异性结合鸟苷酸环化酶C（GUCY2c）的抗体，其中所述抗体包含：（a）重链可变（VH）区，其包含SEQ ID NO: 11、19、26、33、41、48、52、57、60、62、64、65、67、69、71或73中所示的VH序列的VH互补性决定区1（VH CDR1）、VH互补性决定区2（VHCDR2）和VH互补性决定区3（VH CDR3）；和/或（b）轻链可变（VL）区，其包含SEQ ID NO: 92、100、104、106、112、119、125、129、134、136、137、138、140、143、145、147、150、152、156、158、160、162、166、170、171、172、173、174或175中所示的VL序列的VL互补性决定区1（VL CDR1）、VL互补性决定区2（VL CDR2）和VL互补性决定区3（VL CDR3）。

在一个实施方案中，本发明提供了特异性结合GUCY2c的抗体，其中所述抗体包含：（a）VH区，其包含（i）包含SEQ ID NO: 12、20、27、34、42、74、257、258、259、260或261的序列的VH CDR1；（ii）包含SEQ ID NO: 13、21、28、35、43、53、66、68、70、72、75、262、263、264、265、266或267的序列的VH CDR2；和（iii）包含SEQ ID NO: 14、22、29、36或44的序列的VHCDR3；和/或（b）VL区，其包含（i）包含SEQ ID NO: 93、101、105、107、113、120、148、153、163或167的序列的VL CDR1；（ii）包含SEQ ID NO: 78、94、102、108、114、141、144、146、149、151、157、159、161、164或168的序列的VL CDR2；和（iii）包含SEQ ID NO: 95、109、115、121、142、154、165或169的序列的VL CDR3。

在一个实施方案中，本发明提供了抗体，其中：（a）VH区包含（i）包含SEQ ID NO：74的序列的VH CDR1；（ii）包含SEQ ID NO：75的序列的VH CDR2；和iii）包含SEQ ID NO：29的序列的VH CDR3；和/或（b）VL区包含（i）包含SEQ ID NO：148的序列的VL CDR1；（ii）包含SEQID NO：149的序列的VL CDR2；和（iii）包含SEQ ID NO：142的序列的VL CDR3。

在另一个实施方案中，本发明提供了抗体，其中：（a）VH区包含SEQ ID NO: 11、19、26、33、41、48、52、57、60、62、64、65、67、69、71或73；和/或（b）VL区包含SEQ ID NO: 92、100、104、106、112、119、125、129、134、136、137、138、140、143、145、147、150、152、156、158、160、162、166、170、171、172、173、174或175。

在再另一个实施方案中，本发明提供了抗体，其中VH区包含SEQ ID NO：73的序列；且其中VL区包含SEQ ID NO：147的序列。

在一个实施方案中，本发明提供了抗体，其中VH区包含SEQ ID NO：73的序列或其变体，所述变体具有不在VH区内的残基中的一个或几个保守氨基酸取代；和/或其中VL区包含SEQ ID NO：147的序列或其变体，所述变体具有不在VL区内的氨基酸中的一个或几个保守氨基酸取代。

在一个实施方案中，本发明提供了结合GUCY2c的抗体，其包含：包含具有序列RASESV-X_L1.30-X_L1.30a-YG-X_L1.30d-SLLQ的氨基酸的GUCY2c VL CDR1；包含具有SEQ ID NO：149中所示序列的氨基酸的GUCY2c VL CDR2；包含具有SEQ ID NO：142中所示序列的氨基酸的GUCY2c VL CDR3；包含具有序列GFTFS-X_H1.31-X_H1.32-WMH的氨基酸的GUCY2c VH CDR1；包含具有序列EIK- X_H2.52A-X_H2.53-X_H2.54-X_H2.55-X_H2.56-X_H2.57-NVHEKFKD的氨基酸的GUCY2c VHCDR2；和包含具有序列T-X_H3.96-X_H3.97-X_H3.98-X_H3.99-X_H3.100-G-X_H3.100B-WF-X_H3.100E-X_H3.101-V的氨基酸的GUCY2c VH CDR3，其中X_L1.30、X_L1.30a、X_L1.30d、X_H1.31、X_H1.32、X_H2.52A、X_H2.53、X_H2.54、X_H2.55、X_H2.56、X_H2.57、X_H3.96、X_H3.97、X_H3.98、X_H3.99、X_H3.100、X_H3.100B、X_H3.100E和X_H3.101的每一个独立地是根据表42A和42B的列4和5的氨基酸残基。

在一个方面，X_L1.30是D、N或S；X_L1.30a是Y、W或I；X_L1.30d是T、S或H；X_H1.31是S、R、W、Y、A、H、P、Y、T、N、K、D、G或V；X_H1.32是Y、R、L、T、K、P、I、N、M、V或S；X_H2.52A是P、T或V；X_H2.53是S、A、L或R；X_H2.54是N、T、R、H、K、M、S、A、Y、T或I；X_H2.55是E、R、K、N、Y、G、L、A、M、S、H、D或Q；X_H2.56是L、W、Y、F、V、I、N或H；X_H2.57是T、M、S、L、N、Q或V；X_H3.96是I、F或K；X_H3.97是T、V、L、I、M、F、Y或A；X_H3.98是T、N、R、G、L或I；X_H3.99是T、K、L、W、A、S、M、P、N或R；X_H3.100是E、G、A、H、S、D、T、R、Q、K、Y、L或M；X_H3.100B是Y或H；X_H3.100E是F或L；且X_H3.101是D、Y、E或S。

在一个实施方案中，本发明提供了抗体，其中所述抗体选自Fab片段、Fab'片段、F（ab'）₂片段、Fd片段、Fv片段、单链Fv（scFv）片段、二硫键稳定的Fv（dsFv）片段、单结构域抗体（dAb）片段、单克隆抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、三特异性抗体、多特异性抗体、双特异性异二聚体双抗体、双特异性异二聚体IgG、多克隆抗体、标记的抗体、人源化抗体、人抗体及其片段。

在另一个实施方案中，本发明的抗体进一步包含人或人源化的VH构架和人或人源化的VL构架。在一些实施方案中，VH构架包含SEQ ID NO: 5、6、7、8、15、16、17、18、23、24、25、30、31、32、37、38、39、40、45、46、47、49、50、51、54、55、56、58、59、61或63的序列；和/或VL构架包含SEQ ID NO: 80、81、82、83、86、87、88、89、96、97、98、99、103、110、111、116、117、118、122、123、124、126、127、128、130、131、132、133、135、139或155的序列。

在另一个实施方案中，本发明提供了与GUCY2c胞外域上的表位结合的分离的人单克隆抗体，其中所述表位包含选自SEQ ID NO：406的氨基酸残基R73、S74、S75、T76、E78、G79、L80、L82、L83、R84或I86的至少一个氨基酸残基。

在一个方面，表位包含选自SEQ ID NO：406的氨基酸残基R73、S74、S75、T76、E78、G79、L80、L82、L83、R84或I86的至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少十个氨基酸残基。在另一个方面，表位包含SEQ ID NO：406的氨基酸残基R73、S74、S75、T76、E78、G79、L80、L82、L83、R84或I86。在进一步的方面，表位包含具有如SEQ ID NO：406中所示的序列的氨基酸。在进一步的方面，表位是功能性表位。

在另一个方面，如通过晶体学所测定的，分离的人抗体和GUCY2c表位氨基酸接触在3.8埃内。如本文所用的，“在3.8埃内”意指接触小于或等于3.8埃。

在一个方面，本发明的抗体是双特异性抗体。在另一个方面，本发明提供了特异性结合GUCY2c和CD3的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体包含第一多肽链和第二多肽链。

在一个实施方案中，（a）第一多肽链在N-末端至C-末端方向包含：（i）结构域1，其包含GUCY2c抗体的VL（GUCY2c VL）和CD3抗体的VH （CD3 VH），和（ii）第一异二聚体促进结构域；和（b）第二多肽链在N-末端至C-末端方向包含：（i）结构域2，其包含CD3抗体的VL（CD3VL）和GUCY2c抗体的VH（GUCY2c VH），和（ii）第二异二聚体促进结构域；其中GUCY2c VL和GUCY2c VH形成与GUCY2c特异性结合的结构域；且CD3 VL和CD3 VH形成与CD3特异性结合的结构域。

在另一个实施方案中，（a）第一多肽链在N-末端至C-末端方向包含：（i）结构域1，其包含CD3 VL和GUCY2c VH，和（ii）第一异二聚体促进结构域；和（b）第二多肽链在N-末端至C-末端方向包含：（i）结构域2，其包含GUCY2c VL和CD3 VH，和（ii）第二异二聚体促进结构域；其中GUCY2c VL和GUCY2c VH形成与GUCY2c特异性结合的结构域；且CD3 VL和CD3 VH形成与CD3特异性结合的结构域。

在另一个实施方案中，（a）第一多肽链在N-末端至C-末端方向包含：（i）结构域1，其包含GUCY2c VH和CD3 VL，和（ii）第一异二聚体促进结构域；和（b）第二多肽链在N-末端至C-末端方向包含：（i）结构域2，其包含CD3 VH和GUCY2c VL，和（ii）第二异二聚体促进结构域；其中GUCY2c VH和GUCY2c VL形成与GUCY2c特异性结合的结构域；且CD3 VH和CD3 VL形成与CD3特异性结合的结构域。

在进一步的实施方案中，（a）第一多肽链在N-末端至C-末端方向包含：（i）结构域1，其包含CD3 VH和GUCY2c VL，和（ii）第一异二聚体促进结构域；和（b）第二多肽链在N-末端至C-末端方向包含：（i）结构域2，其包含GUCY2c VH和CD3 VL，和（ii）第二异二聚体促进结构域；其中GUCY2c VL和GUCY2c VH形成与GUCY2c特异性结合的结构域；且CD3 VL和CD3VH形成与CD3特异性结合的结构域。

在上述每一种的一些实施方案中，所述第一异二聚体促进结构域和所述第二异二聚体促进结构域各自包含CH2结构域和CH3结构域，其中所述CH2结构域和/或所述CH3结构域各自的氨基酸序列将被进行修饰以驱动异二聚化和/或稳定双特异性抗体。

在一些这种实施方案中，CH2结构域和/或CH3结构域的氨基酸序列包含至少一个氨基酸修饰，其中：（a）第一异二聚体促进结构域的CH3结构域形成杵（knob）；和（b）第二异二聚体促进结构域的CH3结构域形成臼（hole）。

在另一个这种实施方案中，第一异二聚体促进结构域的CH3结构域包含突变Y349C和/或T366W；且第二异二聚体促进结构域的CH3结构域包含突变S354C、T366S、L368A和/或Y407V（根据EU索引（EU index）编号）。

在上述每一种的特定实施方案中，所述第一异二聚体促进结构域包含SEQ ID NO：188的序列；其中所述第二异二聚体促进结构域包含SEQ ID NO：189的序列。

在另外的实施方案中，GUCY2c VL和CD3 VH通过甘氨酸-丝氨酸接头连接；且CD3VL和GUCY2c VH通过甘氨酸-丝氨酸接头连接。在一些这种实施方案中，甘氨酸-丝氨酸接头是包含SEQ ID NO：190的序列的接头1。在其他实施方案中，甘氨酸-丝氨酸接头是包含SEQID NO：191的序列的接头2。

在上述每一种的进一步的实施方案中，结构域1通过半胱氨酸接头共价结合至第一异二聚体促进结构域；且结构域2通过半胱氨酸接头共价结合至第二异二聚体促进结构域；其中所述半胱氨酸接头包含至少五个氨基酸。在一些这种实施方案中，半胱氨酸接头是包含SEQ ID NO：192的序列的接头3。

在一些实施方案中，第一多肽链通过至少一个二硫键共价结合至第二多肽链。在一些这种实施方案中，在第一多肽链的接头3和第二多肽链的接头3之间形成至少一个二硫键。在另一个这种实施方案中，在第一异二聚体促进结构域和第二异二聚体促进结构域之间形成至少一个二硫键。在特定的实施方案中，每个二硫键通过连接两个半胱氨酸残基形成。

在上述任一种的进一步的实施方案中，本发明的双特异性抗体包含（a）包含SEQID NO: 12、20、27、34、42、74、257、258、259、260或261的序列的GUCY2c VH CDR1；（b）包含SEQ ID NO: 13、21、28、35、43、53、66、68、70、72、75、262、263、264、265、266或267的序列的GUCY2c VH CDR2；（c）包含SEQ ID NO: 14、22、29、36或44的序列的GUCY2c VH CDR3；（d）包含SEQ ID NO: 93、101、105、107、113、120、148、153、163或167的序列的GUCY2c VL CDR1；（e）包含SEQ ID NO: 78、94、102、108、114、141、144、146、149、151、157、159、161、164或168的序列的GUCY2c VL CDR2；和（f）包含SEQ ID NO: 95、109、115、121、142、154、165或169的序列的GUCY2c VL CDR3。

在特定的实施方案中，本发明的双特异性抗体包含（a）包含SEQ ID NO：74或259的序列的GUCY2c VH CDR1；（b）包含SEQ ID NO：75或267的序列的GUCY2c VH CDR2；（c）包含SEQ ID NO：29的序列的GUCY2c VH CDR3；（d）包含SEQ ID NO：148的序列的GUCY2c VLCDR1；（e）包含SEQ ID NO：149的序列的GUCY2c VL CDR2；和（f）包含SEQ ID NO：142的序列的GUCY2c VL CDR3。

在特定的实施方案中，双特异性抗体包含：（a）包含SEQ ID NO：73的序列的GUCY2cVH区；和（b）包含SEQ ID NO：147中所示的序列的GUCY2c VL区。

在另外的实施方案中，本发明提供了双特异性抗体，其包含：（a）包含SEQ ID NO：2、268或277的序列的CD3 VH CDR1；（b）包含SEQ ID NO：3、10、269或270的序列的CD3 VHCDR2；（c）包含SEQ ID NO：4的序列的CD3 VH CDR3；（d）包含SEQ ID NO: 77、85、91、278、279或280的序列的CD3 VL CDR1；（e）包含SEQ ID NO：78或281的CD3 VL CDR2；和（f）包含SEQID NO：79的序列的CD3 VL CDR3。

在特定的实施方案中，本发明提供了双特异性抗体，其包含：（a）包含SEQ ID NO：2或268的序列的CD3 VH CDR1；（b）包含SEQ ID NO：10或270的序列的CD3 VH CDR2；（c）包含SEQ ID NO：4的序列的CD3 VH CDR3；（d）包含SEQ ID NO：91的序列的CD3 VL CDR1；（e）包含SEQ ID NO：78的序列的CD3 VL CDR2；和（f）包含SEQ ID NO：79的序列的CD3 VL CDR3。

在一个实施方案中，本发明提供了双特异性抗体，其包含：（a）包含SEQ ID NO：1、9或273的序列的CD3 VH区；和（b）包含SEQ ID NO: 76、84、90、274、275或276的序列的CD3 VL区。在特定的实施方案中，本发明的双特异性抗体包含：（a）包含SEQ ID NO：9的序列的CD3VH区；和（b）包含SEQ ID NO：90的序列的CD3 VL区。

在一个实施方案中，本发明提供了双特异性抗体，其包含：包含具有序列RASESV-X_L1.30-X_L1.30a-YG-X_L1.30d-SLLQ的氨基酸的GUCY2c VL CDR1；包含具有SEQ ID NO：149中所示序列的氨基酸的GUCY2c VL CDR2；包含具有SEQ ID NO：142中所示序列的氨基酸的GUCY2cVL CDR3；包含具有序列GFTFS-X_H1.31-X_H1.32-WMH的氨基酸的GUCY2c VH CDR1；包含具有序列EIK- X_H2.52A-X_H2.53-X_H2.54-X_H2.55-X_H2.56-X_H2.57-NVHEKFKD的氨基酸的GUCY2c VH CDR2；和包含具有序列T-X_H3.96-X_H3.97-X_H3.98-X_H3.99-X_H3.100-G-X_H3.100B-WF-X_H3.100E-X_H3.101-V的氨基酸的GUCY2c VH CDR3，其中X_L1.30、X_L1.30a、X_L1.30d、X_H1.31、X_H1.32、X_H2.52A、X_H2.53、X_H2.54、X_H2.55、X_H2.56、X_H2.57、X_H3.96、X_H3.97、X_H3.98、X_H3.99、X_H3.100、X_H3.100B、X_H3.100E和X_H3.101的每一个独立地是根据表42A和42B的列4和5的氨基酸残基。

在另一个实施方案中，本发明提供了与GUCY2c胞外域上的表位结合的双特异性抗体，其中所述表位包含选自SEQ ID NO：406的氨基酸残基R73、S74、S75、T76、E78、G79、L80、L82、L83、R84或I86的至少一个氨基酸残基。

在另一个方面，如通过晶体学所测定的，分离的人抗体和GUCY2c表位氨基酸接触在3.8埃内。

在一个方面，本发明提供了双特异性抗体，其与GUCY2c特异性结合并与如本文所公开的双特异性抗体竞争结合。

在一个方面，本发明提供了特异性结合GUCY2c和CD3的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体包括第一多肽链和第二多肽链，并且其中：（a）第一多肽链以N-末端至C-末端方向以下述顺序包含下述区域：GUCY2c抗体的VL（GUCY2c VL）（SEQ ID NO：147）-接头1（SEQID NO：190）-CD3抗体的VH（CD3 VH）（SEQ ID NO：9）-接头3（SEQ ID NO：192）-第一异二聚体促进结构域（SEQ ID NO：188）；和（b）第二多肽链以N-末端至C-末端方向以下述顺序包含下述区域：CD3抗体的VL（CD3 VL）（SEQ ID NO：90）-接头2（SEQ ID NO：191）-GUCY2c抗体的VH（GUCY2c VH）（SEQ ID NO：73）-接头3（SEQ ID NO：192）-第二异二聚体促进结构域（SEQ IDNO：189）；其中GUCY2c VL和GUCY2c VH形成与GUCY2c特异性结合的结构域；且CD3 VL和CD3VH形成与CD3特异性结合的结构域；其中第一多肽链的接头3和第二多肽链的接头3通过两个二硫键彼此共价结合；其中第一异二聚体促进结构域和第二异二聚体促进结构域各自包含CH2结构域和CH3结构域；其中所述第一异二聚体促进结构域的CH3结构域形成杵，且所述第二异二聚体促进结构域的CH3结构域形成臼；其中在第一异二聚体促进结构域的CH3结构域与第二异二聚体促进结构域的CH3结构域之间形成至少一个二硫键。

在一些实施方案中，本发明提供了双特异性抗体，其进一步包含人或人源化的VH构架和人或人源化的VL构架。在一些这种实施方案中，双特异性抗体是人源化抗体。在特定的实施方案中，VH构架包含SEQ ID NO: 5、6、7、8、15、16、17、18、23、24、25、30、31、32、37、38、39、40、45、46、47、49、50、51、54、55、56、58、59、61或63的序列；和/或VL构架包含SEQ IDNO: 80、81、82、83、86、87、88、89、96、97、98、99、103、110、111、116、117、118、122、123、124、126、127、128、130、131、132、133、135、139或155的序列。

在一个方面，本发明的双特异性抗体与GUCY2c和CD3特异性结合，其中双特异性抗体包含第一多肽链和第二多肽链；其中第一多肽链由具有ATCC检索号PTA-124944的表达载体产生；且第二多肽链由具有ATCC检索号PTA-124943的表达载体产生。

在特定的实施方案中，本发明的抗体或双特异性抗体（a）结合人GUCY2c的胞外域；（b）显示30分钟至100天的延长的血清和肿瘤半衰期；和/或（c）在有增加的GUCY2c表达水平或增加的受体密度水平的情况下，显示0.0001 nM至100 nM的较低EC₅₀值。

本发明进一步提供了药物组合物，其包含治疗有效量的本文公开的抗体或双特异性抗体，以及药学上可接受的载体。

在另一个方面，本发明提供了治疗有此需要的患者中的GUCY2c有关病症的方法，其包括向所述患者施用本发明的GUCY2c抗体。本发明还提供了治疗有此需要的患者中的GUCY2c有关病症的方法，其包括向所述患者施用本发明的双特异性抗体。本发明进一步提供治疗有此需要的患者中的GUCY2c有关病症的方法，其包括向所述患者施用包含本文公开的GUCY2c抗体或双特异性抗体的药物组合物。在一些这种实施方案中，GUCY2c有关病症是癌症。在特定的实施方案中，所述癌症是选自食道、胃、小肠、结肠、直肠、肛门、肝、胆囊、阑尾、胆管和胰的消化系统的癌症。

本发明进一步提供了治疗有此需要的患者中的GUCY2c有关病症的方法，其包括向所述患者施用如本文所公开的双特异性抗体或包含如本文所公开的双特异性抗体的药物组合物，其中溶细胞性T细胞应答被激活。

在一个方面，本发明提供了供疗法之用的了如本文所公开的抗体、双特异性抗体或药物组合物。本发明进一步提供了供制备药物之用的如本文所公开的抗体或双特异性抗体，所述药物供疗法之用。在一些实施方案中，所述疗法是GUCY2c有关病症的治疗。在具体的实施方案中，GUCY2c有关病症是癌症。在一些实施方案中，所述癌症是选自食道、胃、小肠、结肠、直肠、肛门、肝、胆囊、阑尾、胆管和胰的消化系统的癌症。在特定的实施方案中，所述疗法激活溶细胞性T细胞应答。

在一个方面，本发明提供了编码如本文所公开的抗体或双特异性抗体的多核苷酸。在另一个实施方案中，本发明提供了包含如本文所公开的多核苷酸的载体。在再另一个实施方案中，本发明提供了包含如本文所公开的载体的宿主细胞。在一些这种实施方案中，宿主细胞重组产生如本文所公开的抗体或双特异性抗体。在特定的实施方案中，宿主细胞选自细菌细胞系、哺乳动物细胞系、昆虫细胞系和酵母细胞系。在特定的实施方案中，哺乳动物细胞系是CHO细胞系。在一个实施方案中，使用体外无细胞蛋白合成系统产生抗体或双特异性抗体。

在一个方面，本发明提供了产生如本文所公开的GUCY2c抗体或双特异性抗体的方法，包括在导致产生如本文所公开的GUCY2c抗体或双特异性抗体的条件下培养宿主细胞，并从培养物上清液纯化所述抗体或双特异性抗体。

在另一个方面，本发明提供了如本文所公开的GUCY2c抗体、双特异性抗体、药物组合物、多核苷酸、载体或宿主细胞在制备用于治疗GUCY2c有关病症的药物中的用途。

在另一个实施方案中，本发明提供了包含本发明的双特异性抗体和第二治疗剂的组合物。

在另一个实施方案中，本发明提供了包含本发明的双特异性抗体和止泻剂的组合物。

在一个方面，该止泻药包括，但不限于，碱式没食子酸铋、嗜酸乳杆菌（lactobacillus acidophilus）、布拉氏糖酵母（saccharomyces boulardii）、洛哌丁胺/西甲硅油（simethicone）、阿托品/地芬诺酯、阿托品/地芬诺辛（difenoxin）、布拉氏糖酵母冻干形式（saccharomyces boulardii lyo）、嗜酸乳杆菌、洛哌丁胺、碱式水杨酸铋、嗜酸乳杆菌/保加利亚乳杆菌（lactobacillus bulgaricus）、鼠李糖乳杆菌（lactobacillusrhamnosus）、凹凸棒石（attapulgite）、crofelemer、氟喹诺酮（fluoroquinolone）、抗生素或善得定。

在另一个方面，本发明提供了如本文所公开的包含GUCY2c双特异性抗体和止泻剂的组合物在制备用于治疗GUCY2c有关病症的药物中的用途。

根据对详述的研究，其他实施方案将变得显而易见。在根据马库什组或其他备择方案的分组描述本发明的方面或实施方案的场合，本发明不仅包括整个地列举的完整的组，而且还包括个别地所述组的每个成员以及主要组的所有可能的亚组，并且还包括在没有一种或多种组成员的情况下的主要组。本发明还设想在请求保护的发明中明确排除任一种组成员中的一种或多种。

附图说明

图1A、1B、1C和1D描绘了CD3-GUCY2c双特异性抗体的四种备择表示法的示意图，所述CD3-GUCY2c双特异性抗体具有包含Fc链的第一异二聚体促进结构域和第二异二聚体促进结构域，所述Fc链被最优化以通过“杵臼（knob-in-hole）”结合进行结合。

图2描绘了使用基于流式细胞术的测定的（A）GUCY2C-0247和（B）GUCY2C-1608双特异性抗体与T84肿瘤细胞的结合。

图3描绘了基于流式细胞术的测定，以测定（A）GUCY2C-0247和（B）GUCY2C-1608双特异性抗体与幼稚人T细胞的结合。

图4A描绘了GUCY2C-1608和GUCY2C-0247募集幼稚人T细胞以诱导T84肿瘤细胞中的细胞杀伤。图4B描绘了在表达GUCY2c的肿瘤细胞系LS1034中看到的GUCY2C-1608介导的细胞毒性T细胞活性。图4C描绘了在表达GUCY2c的肿瘤细胞系LS174T中看到的GUCY2C-1608介导的细胞毒性T细胞活性。图4D描绘了在GUCY2c-阴性细胞系中用GUCY2C-1608未观察到活性。

图5A至5F描绘了在GUCY2C-1608介导的幼稚人T细胞募集到表达GUCY2c的T84细胞时诱导的细胞因子释放的体外分析。基于Luminex的测定显示人IFN-γ（图5A）、IL10（图5B）、IL2（图5C）、IL4（图5D）、IL6（图5E）和TNF-α（图5F）的上调。

图6描绘了在过继转移模型中，在T84结肠直肠癌细胞系异种移植肿瘤中通过GUCY2C-0247的剂量依赖性肿瘤生长抑制。

图7描绘了在过继转移模型中，在HT55结肠直肠癌细胞系异种移植肿瘤中通过GUCY2C-0247的剂量依赖性肿瘤生长抑制。

图8描绘了在过继转移模型中，在HT55结肠直肠癌细胞系异种移植肿瘤中通过GUCY2C-1608的剂量依赖性肿瘤生长抑制。

图9描绘了在过继转移模型中，在结肠直肠癌LS1034细胞系异种移植-肿瘤中，通过GUCY2c双特异性抗体GUCY2C-0247和GUCY2C-1608的剂量依赖性肿瘤生长抑制。

图10描绘了在过继转移模型中，在结肠直肠癌LS1034细胞系异种移植-肿瘤中，通过GUCY2c双特异性抗体GUCY2C-0074、GUCY2C-0098和GUCY2C-0105的肿瘤生长抑制在过继转移模型中，在结肠直肠癌LS1034细胞系异种移植-肿瘤中，通过GUCY2c双特异性抗体GUCY2C-0074、GUCY2C-0098和GUCY2C-0105的肿瘤生长抑制。

图11描绘了在过继转移模型中，在PDX-CRX-11201结肠直肠癌患者来源的异种移植肿瘤中通过GUCY2C-0098的剂量依赖性肿瘤生长抑制。

图12描绘了在过继转移模型中，在PDX-CRX-11201结肠直肠癌患者来源的异种移植肿瘤中通过GUCY2C-1608的剂量依赖性肿瘤生长抑制。

图13描绘了在过继转移模型中，在PDX-CRX-11201结肠直肠癌患者来源的异种移植肿瘤中通过GUCY2C-0240的肿瘤生长抑制。

图14描绘了在过继转移模型中，在PDX-CRX-12213结肠直肠癌患者来源的异种移植肿瘤中通过GUCY2C-0098肿瘤生长抑制的肿瘤生长抑制。

图15描绘了在过继转移模型中，在PDX-CRX-24225结肠直肠癌患者来源的异种移植肿瘤中通过GUCY2C-0247的肿瘤生长抑制。

图16描绘了T84细胞中GUCY2c-CD3双特异性抗体（bispecific）的cGMP诱导和中和能力的表征。

图17描绘了纯化后GUCY2C-1608的LC/MS分析。

图18描绘了具有抗-CD3变体的抗-GUCY2C双特异性T细胞介导的细胞毒性。具有不同CD3变体的抗-GUCY2c双特异性抗体（bispecifics）募集幼稚人T细胞，以诱导T84肿瘤细胞中的细胞杀伤。

图19描绘了GUCY2c ECD肽竞争DELFIA ELISA。

图20描绘了利用抗体MS20的竞争DELFIA ELISA。

图21描绘了通过晶体学的GUCY2c肽和GUCY2C-1608 scFv肽的结合界面的细节。

图22描绘了GUCY2c CD3双特异性抗体上的两个抗原结合部位的晶体结构，其显示它们间隔约70 Å并且位于分子的相对侧上，直接在彼此对面。

图23描绘了与抗-VEGF和阿昔替尼（axitinib）的组合研究的结果，其显示了与GUCY2c CD3双特异性抗体组合的加性肿瘤生长抑制。

图24描绘了与抗-PD1的组合研究的结果，其显示了与GUCY2c CD3双特异性抗体组合的加性肿瘤生长抑制。

图25描绘了与抗-PD-L1的组合研究的结果，其显示了与GUCY2c CD3双特异性抗体组合的加性肿瘤生长抑制。

具体实施方式

本文公开的发明提供了特异性结合GUCY2c（例如，人GUCY2c、小鼠GUCY2c、大鼠GUCY2c、食蟹猴GUCY2c）的抗体。进一步地，本文公开的发明提供了特异性结合CD3（例如，人CD3）和肿瘤抗原（例如，GUCY2c）的双特异性抗体。本发明还提供了编码这些抗体的多核苷酸、包含这些抗体的组合物以及制备和使用这些抗体的方法。本发明进一步提供了使用抗体（例如，GUCY2、CD3或双特异性抗体）治疗主体中与GUCY2c表达有关的状况例如癌症的方法，如本文所述的。

一般技术

除非另外指出，否则本发明的实践将采用分子生物学（包括重组技术）、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，其在本领域的技术内。这种技术在文献中充分解释，所述文献例如Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第二版（Sambrook等人,1989） Cold Spring Harbor Press；Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, 编,1984)；Methods in Molecular Biology, Humana Press；Cell Biology: A LaboratoryNotebook (J.E. Cellis, 编, 1998) Academic Press；Animal Cell Culture (R.I.Freshney, 编, 1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather和P.E. Roberts, 1998) Plenum Press；Cell and Tissue Culture: LaboratoryProcedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, 和D.G. Newell, 编, 1993-1998) J. Wileyand Sons；Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.)；Handbook ofExperimental Immunology (D.M. Weir和C.C. Blackwell, 编)；Gene Transfer Vectorsfor Mammalian Cells (J.M. Miller和M.P. Calos, 编, 1987)；Current Protocols inMolecular Biology (F.M. Ausubel等人, 编, 1987)；PCR: The Polymerase ChainReaction, (Mullis等人, 编, 1994)；Current Protocols in Immunology (J.E.Coligan等人, 编, 1991)；Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons,1999)；Immunobiology (C.A. Janeway和P. Travers, 1997)；Antibodies (P. Finch,1997)；Antibodies: a practical approach (D. Catty., 编, IRL Press, 1988-1989)；Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd和C. Dean, 编, OxfordUniversity Press, 2000)；Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow和D.Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)；The Antibodies (M. Zanetti和J.D. Capra, 编, Harwood Academic Publishers, 1995)。在一些情况下，为了清楚和/或易于参考，本文定义了具有通常理解的含义的术语，并且本文中包括这种定义不应必定解释为代表比起本领域通常理解的那种来显著的区别。

现在将以参考的方式使用以下定义和实例来详细描述本发明。本文提及的所有专利和公开（包括这种专利和公开中公开的所有序列）均明确地引入作为参考。

定义

通常，除非另有定义，否则本文所用的所有本领域术语、符号和其它科学术语或术语学均意图具有本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。例如，如在本文的短语如“A和/或B”中所用的术语“和/或”意图包括A和B两者；A或B；A（单独）；和B（单独）。同样，如在短语如“A、B和/或C”中所用的术语“和/或”意图包括以下实施方案中的每一种：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A（单独）；B（单独）；和C（单独）。

如本文所用的，除非上下文另外明确指示，否则单数形式“一个/种（a）”、“一个/种（an）”和“该（the）”包括其相应复数参考。

如本文所用的，数值范围包括定义所述范围的数字。

术语“约”、“近似”等当在数值或范围的列表之前时独立地指所述列表或范围中的每一个别值，如同所述列表或范围中的每一个别值紧接在所述术语之后一样。所述术语意指所述术语所提及的值与其丝毫不差、接近或类似。例如，在一些实施方案中，约或近似特定值可指示所述值的99%、95%或90%的值。作为实例，“约100”的表述包括99和101和其之间的所有值（例如，99.1、99.2、99.3、99.4、99.5等）。作为另一实例，在温度为70℃的场合，“约”或“近似”70℃可等于69℃、66℃或63℃。应理解，这些仅为实例。

如本文所用的，“在3.8埃内”意指如通过晶体学所测定的接触小于或等于3.8埃。

如本文所用的，分别地，核酸从左至右以5'至3'方向书写；氨基酸序列从左至右以氨基至羧基取向书写。对于本领域的定义和术语，专业人员特别被指向Sambrook等人，1989和Ausubel FM等人，1993。应理解，本发明不限于所述的特定方法、规程和试剂，这是因为这些可变化。

术语“多肽”、“寡肽”、“肽”和“蛋白”在本文可互换使用，以指任何长度的氨基酸链，优选地相对短（例如，10-100个氨基酸）。所述链可以是线性或分支的，其可以包含修饰的氨基酸，和/或可以被非氨基酸断开。所述术语还包括已天然地或通过干预修饰的氨基酸链；例如，二硫键形成、糖基化、脂质化（lipidation）、乙酰化、磷酸化或者任何其它操作或修饰，例如与标记组分缀合。所述定义内还包括的是例如含有一种或多种氨基酸的类似物（包括，例如，非天然氨基酸等）以及本领域已知的其他修饰的多肽。应理解，多肽可以作为单链或缔合的链存在。优选地，使用哺乳动物多肽（最初衍生自哺乳动物生物的多肽），更优选地直接分泌到培养基中的那些多肽。

“抗体”是免疫球蛋白分子，其能够通过位于免疫球蛋白分子的可变区中的至少一个抗原识别位点，与靶例如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等特异性结合。如本文所使用的，所述术语包括多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、双重-特异性抗体、双功能抗体、三特异性抗体、多特异性抗体、双特异性异二聚体双抗体、双特异性异二聚体IgG、标记的抗体、人源化抗体、人抗体、及其片段（例如Fab、Fab'、F(ab')₂、Fv）、单链（ScFv）和结构域抗体（包括，例如，鲨鱼和骆驼科动物（camelid）抗体）、包含抗体的融合蛋白、以及包含抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其它修饰的构型。抗体包括任何类别的抗体，例如IgG、IgA或IgM（或其亚类），并且抗体无需是任何特定类别。取决于其重链恒定区的抗体氨基酸序列，免疫球蛋白可以分配到不同类别。存在免疫球蛋白的五种主要类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的几种可以进一步分为亚类（同种型），例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的。本发明还包括一种或多种“抗体类似物”，其它基于非抗体分子蛋白的支架，例如，使用CDRs以提供特异性抗原结合的融合蛋白和/或免疫缀合物。本发明的抗体可衍生自任何物种，包括，但不限于小鼠、人、骆驼、美洲驼、鱼、鲨鱼、山羊、兔、鸡和牛。

术语“抗体”进一步包括包含由二硫键互连的四条多肽链（两条重（H）链和两条轻（L）链）的免疫球蛋白分子，以及其多聚体（例如，IgM）。每一重链包含重链可变区（在本文中缩写为HC VR或VH）和重链恒定区。抗体的“可变区”是指单独或组合的抗体轻链的可变区或抗体重链的可变区。重链恒定区包含三个结构域，CH1、CH2和CH3。CH1和CH2结构域由铰链区连接。每一轻链包含轻链可变区（在本文中缩写为LC VR或VL）和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域（CL1）。VH和VL区可进一步细分成高变性（hypervariability）区域，称为互补性决定区（CDRs），其散置有更保守的区域，称为构架区（FR）。每一VH和VL由从氨基末端至羧基末端按以下顺序排列的三个CDRs和四个FRs构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本发明的不同实施方案中，CD3抗体（或其抗原结合部分）的FRs可以与人种系序列相同，或者可以是天然或人工修饰的。氨基酸共有序列可以基于两个或更多个CDRs的并排分析来定义。每条链中的CDRs通过FRs紧靠着保持在一起，并且与来自另一链的CDRs一起，有助于抗体的抗原结合部位的形成。

如本文所用的术语“抗原结合片段”或“抗体片段”或“抗原结合部分”是指抗体的保留特异性结合抗原的能力的一个或多个片段。包括在术语抗体的“抗原结合片段”内的结合片段的实例包括（i）抗体重链可变结构域（VH）和/或抗体轻链可变结构域（VL），或衍生自全长抗体或抗体片段的VH/VL对，例如VH结构域和/或VL结构域；（ii）Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；（iii）Fab’片段，其基本上是具有铰链区的一部分的Fab（例如，Fundamental Immunology，Paul编，第3版，1993；（iv）F(ab')₂片段，包含在铰链区处通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；（v）由VH和CH1结构域组成的Fd片段；（vi）由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；（vii）单链Fv片段（scFv），其中VL和VH区配对以形成单价分子的单一蛋白链（例如，Bird等人，(1988) Science 242:423-426；和Huston等人，(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883）；（viii）二硫键稳定的Fv片段（dsFv），具有使VH-VL对稳定的人工改造的分子间二硫键的Fv；（ix）单可变结构域抗体（sdAb或dAb）片段（例如，Ward等人, (1989) Nature 341:544-546），其由重链的可变结构域组成且无轻链；（x）互补性决定区（CDR）；和其任何衍生物。

如本文所用的，抗体的“抗原结合片段”可以包含至少一个可变结构域。可变结构域可以具有任何大小或氨基酸组成，且通常将包含至少一个与一个或多个构架序列邻近或与其符合读框的CDR。如本文所用的，“抗体的抗原结合片段”可以包含下文所列的彼此非共价缔合和/或与一个或多个单体VH或VL区非共价缔合（例如，通过一个或多个二硫键）的任一可变区和恒定结构域构型的同二聚体或异二聚体（或其它多聚体）。例如，可变区可以是二聚体的且含有VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚体。可以在本发明的抗体的抗原结合片段内发现的可变和恒定结构域的构型包括：VH-CH1；VH-CH2；VH-CH3；VH-CH1-CH2；VH-CH1-CH2-CH3；VH-CH2-CH3；VH-VL-CL、VH-VL-CH1、VH-VL-CH2；VH-CL；VL-CH1；VL-CH2；VL-CH3；VL-CH1-CH2；VL-CH1-CH2-CH3；VL-CH2-CH3；和VL-CL。可变区和恒定结构域可以彼此直接连接或可以通过完整或部分铰链或接头区连接。铰链区可以由至少2个（例如，5个、10个、15个、20个、40个、60个或更多个）氨基酸组成，其结果产生单一多肽分子中的邻近可变区和/或恒定结构域之间的柔性或半柔性键。

如本文所用的，“结合结构域”包含多肽（例如，抗体）的负责选择性结合感兴趣的分子（例如抗原、配体、受体、底物或抑制剂）的任何区域。示例性结合结构域包括抗体可变区、受体结合结构域、配体结合结构域和酶促结构域。

如本文所用的，术语“人接纳体构架”是包含衍生自人免疫球蛋白构架或人共有构架的轻链可变（VL）构架或重链可变（VH）构架的氨基酸序列的构架，如下文所定义的。“衍生自”人免疫球蛋白构架或人共有构架的人接纳体构架可以包含其相同氨基酸序列，或其可以含有氨基酸序列修饰。在一些实施方案中，氨基酸修饰的数目为10或更少、9或更少、8或更少、7或更少、6或更少、5或更少、4或更少、3或更少或2或更少。在一些实施方案中，VL人接纳体构架的序列与VL人免疫球蛋白构架序列或人共有构架序列相同。

如本文所用的，“亲和力成熟的”抗体是指与不具有修饰的亲本抗体相比在一个或多个可变区（其包括CDRs和FRs中具有一种或多种修饰的抗体，且其中这种修饰导致所述抗体对抗原的亲和力提高。

如本文所用的，术语“Fc区”、“Fc结构域”、“Fc链”或类似术语用于定义IgG重链的C-末端区。IgG的Fc区包含两个恒定结构域，CH2和CH3。人IgG Fc区的CH2结构域通常根据EU索引的编号系统从氨基酸231延伸至氨基酸340，或根据Kabat的编号系统从氨基酸244延伸至氨基酸360。人IgG Fc区的CH3结构域通常根据EU索引的编号系统从氨基酸341延伸至447，或根据Kabat的编号系统从氨基酸361延伸至氨基酸478。人IgG Fc区的CH2结构域（也称为“Cγ2”结构域）由于其不与另一结构域紧密配对而是独特的。相反，两条N联分支碳水化合物链插入在完整天然IgG的两个CH2结构域之间。Fc区可以包含天然或变体Fc序列。尽管免疫球蛋白重链的Fc序列的边界可能改变，但人IgG重链Fc序列通常定义为从在约位置Cys226或约位置Pro230处的氨基酸残基至所述Fc序列的羧基末端的序列段。除非在本文中另外指定，否则Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号根据也称为EU索引的EU编号系统，如Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版，PublicHealth Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991中所述的。

在某些实施方案中，Fc链在恰好木瓜蛋白酶切割位点上游的铰链区中开始并在抗体的C-末端处结束。因此，完整Fc链至少包含铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域。在某些实施方案中，Fc链包含以下中的至少一种：铰链（例如，上部、中部和/或下部铰链区）结构域、CH2结构域、CH3结构域、CH4结构域或其变体、部分或片段。在某些实施方案中，Fc结构域包含完整Fc链（即，铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域）。在某些实施方案中，Fc链包含融合至CH3结构域（或其部分）的铰链结构域（或其部分）。在某些实施方案中，Fc链包含融合至CH3结构域（或其部分）的CH2结构域（或其部分）。在某些实施方案中，Fc链由CH3结构域或其部分组成。在某些实施方案中，Fc链由铰链结构域（或其部分）和CH3结构域（或其部分）组成。在某些实施方案中，Fc链由CH2结构域（或其部分）和CH3结构域组成。在某些实施方案中，Fc链由铰链结构域（或其部分）和CH2结构域（或其部分）组成。在某些实施方案中，Fc链缺乏CH2结构域的至少一部分（例如，CH2结构域的全部或一部分）。本文中的Fc链通常是指包含免疫球蛋白重链的Fc链的全部或一部分的多肽。这包括，但不限于，包含整个CHI、铰链、CH2和/或CH3结构域的多肽以及仅包含例如铰链、CH2和CH3结构域的这种肽的片段。Fc链可衍生自任何物种的免疫球蛋白和/或任何亚型，包括，但不限于，人IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE或IgM抗体。Fc结构域包括天然Fc和Fc变体分子。与Fc变体和天然Fc一样，术语Fc链包括呈单体或多聚体形式的分子，无论其从全抗体消化还是通过其它方式产生。在一些实施方案中，Fc链包含通过二硫键保持在一起的两条重链的羧基末端部分。在某些实施方案中，Fc链由CH2结构域和CH3结构域组成。

如本领域所使用的，“Fc受体”和“FcR”描述了与抗体的Fc区结合的受体。优选的FcR是天然序列人FcR。此外，优选的FcR是这样的FcR，其结合IgG抗体（γ受体），并且包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位基因变体和可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA（“活化受体”）和FcγRIIB（“抑制受体”），其具有主要在其胞质结构域方面有差别的相似的氨基酸序列。FcR在以下中综述：Ravetch和Kinet, Ann. Rev.Immunol., 9:457-92, 1991；Capel等人, Immunomethods, 4:25-34, 1994；和de Haas等人, J. Lab. Clin. Med., 126:330-41, 1995。“FcR”还包括新生儿受体FcRn，其负责母体IgGs至胎儿的转移（Guyer等人, J. Immunol., 117:587, 1976；和Kim等人, J.Immunol., 24:249, 1994）。

“天然序列Fc区”或“野生型Fc区”包含与自然界中发现的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。所谓“野生型”人IgG Fc指的是在人群体内天然存在的氨基酸的序列。当然，正如Fc序列可在个体之间略有不同一样，可对野生型序列作出一种或多种改变且仍保持在本发明的范围内。例如，Fc区可含有与本发明不相关的额外改变，例如在糖基化位点中的突变、包括非天然氨基酸或“杵臼（knobs-in-holes）”突变。

“变体Fc区”或“变体Fc链”包含这样的氨基酸序列，其凭借至少一个氨基酸修饰而不同于天然序列Fc区的氨基酸序列，然而保留天然序列Fc区的至少一种效应子功能。在一些实施方案中，与天然序列Fc链或亲本多肽的Fc区相比，变体Fc链具有至少一个氨基酸取代，例如，天然序列Fc链或亲本多肽的Fc链中的约1至约10个氨基酸取代，且优选约1至约5个氨基酸取代。本文的变体Fc链将优选与天然序列Fc链和/或亲本多肽的Fc链具有至少约80%的序列同一性，且最优选与其具有至少约90%的序列同一性，更优选与其具有至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%的序列同一性。

如本文所用的，术语“效应子功能”是指归因于抗体的Fc链（天然序列Fc链或氨基酸序列变体Fc链）的那些生物活性，且随抗体同种型而变化。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和依赖补体的细胞毒性；Fc受体结合；依赖抗体的细胞毒性（ADCC）；吞噬作用；细胞表面受体（例如，B细胞受体）的下调；和B细胞活化。这种效应子功能一般需要将Fc链与结合结构域（例如，抗体可变区）组合，并且可以使用本领域已知的用于评价这种抗体效应子功能的各种测定来评估。效应子功能的示例性测量是通过Fcγ3和/或C1q结合。

抗体的效应子功能由Fc链中的序列决定；所述链也是由某些类型的细胞上发现的Fc受体（FcR）识别的部分。

在一些实施方案中，Fc多肽包含野生型铰链序列的一部分或全部（通常在其N-末端）。在一些实施方案中，Fc多肽不包含功能性或野生型铰链序列。

如本文所用的“铰链区”、“铰链序列”及其变化形式包括本领域已知的含义，其在例如Janeway等人, ImmunoBiology: the immune system in health and disease,Elsevier Science Ltd., NY (第4版, 1999)；Bloom等人, Protein Science, 6:407-415, 1997；和Humphreys等人, J. Immunol. Methods, 209:193-202, 1997中举例说明。

如本文所用的“免疫球蛋白样铰链区”、“免疫球蛋白样铰链序列”及其变化形式是指免疫球蛋白样或抗体样分子（例如，免疫黏附素）的铰链区和铰链序列。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白样铰链区可以来自或衍生自任何IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型，或者IgA、IgE、IgD或IgM，包括其嵌合形式，例如，嵌合IgG1/2铰链区。

在一些实施方案中，所述铰链区可以来自根据EU索引的编号系统从氨基酸216延伸至氨基酸230或根据Kabat的编号系统从氨基酸226延伸至氨基酸243的人IgG1亚型。在一些实施方案中，序列可以是EPKSCDKTHTCPPCP（SEQ ID NO: 186）。本领域技术人员在对应于IgG分子的各个结构域的确切氨基酸的理解方面可以有不同。因此，上文概述的结构域的N-末端或C-末端可以延伸或缩短1、2、3、4、5、6、7、8、9或甚至10个氨基酸。

在一些实施方案中，铰链区可以突变一个或多个氨基酸。在一些实施方案中，铰链区可以被截短且仅含有全铰链区的一部分。在一些实施方案中，铰链区可以仅含有铰链区的最后5个氨基酸。

如本文所用的，术语“连接的”、“融合的”、“融合”、“共价结合的”、“共价偶联的”和“基因融合的”可互换使用。这些术语是指通过包括化学缀合或重组方式在内的无论什么方式将两个更多个元件或组分连接在一起。如本文所用的，术语“共价结合的”意指指定部分彼此直接共价键合，要不然就通过一种或多种间插部分如连接肽或部分彼此间接共价连接。在优选实施方案中，部分是共价融合的。一种类型的共价键合是肽键。化学缀合的方法（例如，使用异双功能交联剂）是本领域已知的。融合部分也可以是基因融合的。如本文所用的，术语“基因融合的”、“基因连接的”或“遗传融合的”是指通过编码两种或更多种蛋白、多肽或片段的单一多核苷酸分子的基因表达，那些蛋白、多肽或其片段经由其个别肽主链的共线性、共价键合或附着。这种遗传融合导致单一邻接基因序列的表达。优选的遗传融合是符合读框的，即，两个或更多个可读框（ORFs）以维持原始ORFs的正确读框的方式融合以形成连续的更长ORF。因此，所得到的重组融合蛋白是含有两个或更多个对应于由原始ORFｓ编码的多肽的蛋白区段（所述区段天然通常不如此连接）的单一多肽。在所述情况中，所述单一多肽在处理期间被切割以产生包含两条多肽链的二聚体分子。

如本文所用的，术语“修饰”是指多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失，与蛋白化学连接的部分的改变或对蛋白（例如抗体）的功能的修饰。例如，修饰可以是改变的抗体功能或改变的与蛋白附着的碳水化合物结构。如本文所用的，“氨基酸修饰”是指抗体中的一个或多个氨基酸残基的突变（取代）、插入（添加）或缺失。术语“氨基酸突变”表示至少一个现有氨基酸残基被另一不同氨基酸残基（例如置换氨基酸残基）取代。术语“氨基酸缺失”表示在氨基酸序列中的预定位置处去除至少一个氨基酸残基。例如，突变L234A表示，在抗体Fc-区中的位置234处的氨基酸残基赖氨酸被氨基酸残基丙氨酸取代（用丙氨酸取代赖氨酸），（根据EU索引编号系统编号）。“天然存在的氨基酸残基”表示来自由以下组成的组的氨基酸残基：丙氨酸（三字母代码：Ala，单字母代码：A）、精氨酸（Arg，R）、天冬酰胺（Asn，N）、天冬氨酸（Asp，D）、半胱氨酸（Cys，C）、谷氨酰胺（Gin，Q）、谷氨酸（Glu，E）、甘氨酸（Gly，G）、组氨酸（His，H）、异亮氨酸（Ile，I）、亮氨酸（Leu，L）、赖氨酸（Lys，K）、甲硫氨酸（Met，M）、苯丙氨酸（Phe，F）、脯氨酸（Pro，P）、丝氨酸（Ser，S）、苏氨酸（Thr，T）、色氨酸（Trp，W）、酪氨酸（Tyr，Y）和缬氨酸（Val，V）。

如本文所用的，“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基用具有类似侧链的氨基酸残基置换的取代。本领域中已定义了具有类似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链（例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸）、酸性侧链（例如，天冬氨酸、谷氨酸）、非荷电的极性侧链（例如，天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸）、非极性侧链（例如，甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸）、β-分支的侧链（例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸）和芳族侧链（例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸）的氨基酸。

如本文所用的，“非必需”氨基酸残基是可在不消除或不基本上改变生物活性的情况下与结合剂（例如抗体）的野生型序列不同的残基，而“必需”氨基酸残基则导致这种变化。在抗体中，必需氨基酸残基可以是特异性决定残基（SDR）。

术语“试剂”在本文中用于表示生物大分子、从生物材料制得的提取物、生物大分子的混合物、化合物、化合物的混合物和/或化合物和生物大分子的混合物。术语“治疗剂”是指具有生物活性的试剂。

如本文所用的，“单克隆抗体”是指从基本上均质的抗体群体获得的抗体，即，除了可以以少量存在的可能天然存在的突变之外，构成群体的各个抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，从而针对单个抗原位点。此外，与一般包括针对不同决定簇（表位）的不同抗体的多克隆抗体制剂形成对照，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。修饰语“单克隆的”表示如从基本上均质的抗体群体获得的抗体的特征，并且不应解释为要求通过任何特定方法的抗体生产。例如，待根据本发明使用的单克隆抗体可以通过首先由Kohler和Milstein, Nature 256:495, 1975描述的杂交瘤方法来制备，或者可以通过诸如美国专利No. 4,816,567中所述的重组DNA方法来制备。单克隆抗体也可以从噬菌体文库中分离，所述噬菌体文库使用例如McCafferty等人 Nature 348:552-554, 1990中描述的技术产生。

本发明的抗体可以是“人源化抗体”。如本文所用的，“人源化”抗体是指非人（例如，小鼠、大鼠、兔、非人灵长类动物或其它哺乳动物）抗体的形式，其是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段（例如Fv、Fab、Fab'、F(ab')₂或抗体的其它抗原结合子序列（subsequences）），其含有从非人的来源引入其中的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基经常被称为“输入”残基，其一般取自“输入”可变结构域。输入残基、序列或抗体具有所期望的亲和力和/或特异性或如本文所讨论的其它期望的抗体生物活性。

优选地，人源化抗体是人免疫球蛋白（受体抗体），其中来自受体的互补性决定区（CDR）的残基被置换为具有期望的特异性、亲和力和能力的来自非人物种（供体抗体）如小鼠、大鼠或兔的CDR的残基。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv构架区（FR）残基被置换为相应的非人残基。此外，人源化抗体可以包含这样的残基，其在受体抗体和输入的CDR或构架序列中均未发现，但被包括以进一步改善且最优化抗体性能。通常，人源化抗体将包含至少一个，且一般为两个可变区的基本上全部，其中CDR区的全部或基本上全部对应于非人免疫球蛋白的那些，并且FR区的全部或基本上全部是人免疫球蛋白共有序列的那些。人源化抗体最佳地还将包含免疫球蛋白恒定区或结构域（Fc）的至少一部分，一般为人免疫球蛋白的那种。优选的是具有如WO 99/58572中所述修饰的Fc链的抗体。其它形式的人源化抗体具有一个或多个CDRs（CDR L1、CDR L2、CDR L3、CDR H1、CDR H2或CDR H3），其相对于原始抗体改变，也被称为“衍生自”来自原始抗体的一个或多个CDRs的一个或多个CDRs。如本文所用的人源化意图包括去免疫化的（de-immunized）抗体。

如本文所用的，“人抗体”意指这样的抗体，其具有对应于由人产生的抗体的氨基酸序列的氨基酸序列，和/或其已使用本领域技术人员已知或本文公开的用于制备人抗体的任何技术进行制备。因此，如本文所用的术语“人抗体”意图包括具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人抗体可以包括并非由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基（例如，通过体外随机诱变或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变），例如在CDRs且特别在CDR3中。人抗体的这个定义包括包含至少一个人重链多肽或至少一个人轻链多肽的抗体。一个这种实例是包含鼠轻链和人重链多肽的抗体。可以使用本领域已知的各种技术来产生人抗体。在一个实施方案中，人抗体选自噬菌体文库，其中所述噬菌体文库表达人抗体（Vaughan等人, Nature Biotechnology, 14:309-314,1996；Sheets等人, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:6157-6162, 1998；Hoogenboom和Winter, J. Mol. Biol., 227:381, 1991；Marks等人, J. Mol. Biol., 222:581,1991）。人抗体也可以通过动物的免疫来制备，人免疫球蛋白基因座已被转基因引入所述动物内代替内源基因座，例如其中内源免疫球蛋白基因已被部分或完全灭活的小鼠。所述方法描述于美国专利号Nos. 5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；和5,661,016。另一方面，可以通过使人B淋巴细胞无限增殖化来制备人抗体，所述人B淋巴细胞产生针对靶抗原的抗体（这种B淋巴细胞可以从个体或cDNA的单细胞克隆回收，或者可以已在体外进行免疫）。参见，例如，Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R. Liss, p. 77, 1985；Boerner等人, J. Immunol., 147(1):86-95, 1991；和美国专利No. 5,750,373。

本发明的人抗体可以以与铰链异质性有关的至少两种形式存在。例如，免疫球蛋白分子包含近似150-160 kDa的稳定四链构建体，其中二聚体通过链间重链二硫键保持在一起。另一方面，二聚体不经由链间二硫键连接，且形成由共价偶联的轻链和重链组成的约75-80 kDa的分子（半抗体（half-antibody））。

如本文所用的，术语“重组人抗体”意图包括通过重组方式制备、表达、产生或分离的所有人抗体，例如使用转染至宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体（下文进一步描述）、从重组组合人抗体文库分离的抗体（下文进一步描述）、从对于人免疫球蛋白基因转基因的动物（例如，小鼠）分离的抗体（参见，例如，Taylor等人，(1992) Nucl. Acids Res.20:6287-6295）或通过包括将人免疫球蛋白基因序列剪接至其它DNA序列的任何其它方式制备、表达、产生或分离的抗体。这种重组人抗体具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。然而，在某些实施方案中，使这种重组人抗体经受体外诱变（或，当使用对于人Ig序列转基因的动物时，经受体内体细胞诱变），且因此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是这样的序列，其尽管衍生自人种系VH和VL序列且与其相关，但可以不天然存在于人体内抗体种系谱（repertoire）内。

本发明的抗体可以是“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而一条或多条链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及这种抗体的片段，只要它们表现出期望的生物活性（美国专利4,816,567；和Morrison等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 :6851 -6855, 1984）。本文的感兴趣的嵌合抗体包括灵长类动物源化（primatized）抗体，其包含衍生自非人灵长类动物（例如，旧大陆猴、猿等）的可变区抗原结合序列和人恒定区序列。

“单价抗体”包含一个抗原结合部位/分子（例如，IgG或Fab）。在一些情况下，单价抗体可以具有不止一个抗原结合部位，但结合部位来自不同的抗原。

“单特异性抗体”是指抗体或抗体制剂，其包含两个相同的抗原结合部位/分子（例如，IgG），从而使得两个结合部位结合抗原上的相同表位。因此，它们在结合一个抗原分子时彼此竞争。所述术语包括“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”。自然界中发现的大多数抗体都是单特异性的。在一些情况下，单特异性抗体也可以是单价抗体（例如，Fab）。

“二价抗体”每个分子包含两个抗原结合部位（例如，IgG）。在一些情况下，两个结合部位具有相同的抗原特异性。然而，二价抗体可能是双特异性的。

如本文所用的，“双特异性抗体”、“双重-特异性抗体”、“双功能抗体”、“异源多聚体”、“异源多聚体复合体”、“双特异性异二聚体双抗体”或“异源多聚体多肽”是包含至少第一多肽和第二多肽的分子，其中第二多肽与第一多肽在氨基酸序列方面相差至少一个氨基酸残基。在一些情况下，双特异性抗体是具有两个不同重链区和轻链区的人工杂合抗体。优选地，双特异性抗体对至少两种不同配体、抗原或结合部位具有结合特异性。因此，双特异性抗体可以同时结合两种不同抗原。双特异性抗体的两个抗原结合部位结合可存在于相同或不同蛋白靶（例如，肿瘤靶）上的两个不同表位。

如本文所用的“靶抗原”、“靶细胞抗原”、“肿瘤抗原”或“肿瘤特异性抗原”是指在靶细胞（例如肿瘤中的细胞如癌细胞或肿瘤基质的细胞）的表面上存在的抗原决定簇。

术语“突变负荷（mutation load）”、“突变负荷（mutational load）”、“突变负荷（mutation burden）”或“突变负荷（mutational burden）”在本文中可互换使用。肿瘤突变负荷是肿瘤基因组内突变数目的量度，其定义为肿瘤基因组的每一编码区的总突变数目。肿瘤类型内的突变负荷存在大的变异性，从仅几个一直到数千个突变（Alexandrov LB等人, Nature 2013;500(7463):415-421；Lawrence MS等人, Nature 2013;499:214–218；Vogelstein B等人, Science, 2013;339:1546–1558。

如本文所用的，“双特异性抗体”的第一多肽链和第二多肽链包含至少一个抗体VL和一个抗体VH区或其片段，其中两个抗体结合结构域均包含在单一多肽链内且其中每一多肽链中的VL和VH区来自不同抗体。

双特异性抗体、双重-特异性抗体、双功能抗体、异源多聚体、异源多聚体复合体、双特异性异二聚体双抗体或异源多聚体多肽可形成高级三级结构，其中除第一和第二多肽以外还存在其他多肽。异源多聚体的多肽可以通过非肽的共价键（例如，二硫键）和/或非共价的相互作用（例如，氢键、离子键、范德瓦尔斯力和/或疏水作用）彼此相互作用。

双特异性抗体、双重-特异性抗体、双功能抗体、异源多聚体、异源多聚体复合体、双特异性异二聚体双抗体或异源多聚体多肽可通过构建在VH和VL区之间具有短接头（例如，约3-10个残基）的sFv片段来制备，从而使得实现了V区的链间配对而不是链内配对，从而结果产生了二价片段，即，具有两个抗原结合部位的片段。双特异性抗体可衍生自全长抗体或抗体片段（例如F(ab')₂双特异性抗体）。双抗体更充分地描述于例如EP404,097；WO93/11161；和Hollinger等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448, 1993中。双特异性抗体是两个“交换”sFv片段的异二聚体，其中两种抗体的VH和VL区存在于不同多肽链上。

如本文所用的，“分离的抗体”意指已经自其天然环境的至少一种组分鉴定和分离和/或回收的抗体。例如，对本发明来说，已经自生物的至少一种组分或自天然存在或天然产生抗体的组织或细胞分离或取出的抗体是“分离的抗体”。分离的抗体还包括重组细胞内的原位抗体。分离的抗体是已经经受了至少一个纯化或分离步骤的抗体。根据某些实施方案，分离的抗体可以基本上不含其他细胞材料和/或化学制剂。

如本文所用的，术语“连接（linked）”或“连接（links）”是指第一和第二氨基酸序列之间的直接肽键键合，或包括第三氨基酸序列的键合，所述第三氨基酸序列是键合至第一和第二氨基酸序列并键合在第一和第二氨基酸序列之间的肽。例如，接头肽键合至一个氨基酸序列的C-末端和另一个氨基酸序列的N-末端。

如本文所用的，术语“接头”是指长度为两个或更多个氨基酸的氨基酸序列。接头可由中性极性或非极性氨基酸组成。接头的长度可以是例如 2至100个氨基酸，例如长度在2和50个氨基酸之间，例如长度为3个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个或50个氨基酸。接头可以是“可切割”的，例如，通过自切割（auto-cleavage）、或酶促或化学切割。氨基酸序列中的切割位点以及在这种位点处切割的酶和化学制剂是本领域众所周知的且也描述于本文中。

如本文所用的，术语“二硫键”或“半胱氨酸-半胱氨酸二硫键”是指两个半胱氨酸之间的共价相互作用，其中所述半胱氨酸的硫原子被氧化以形成二硫键。与氢键的1-2kcal/mol相比，二硫键的平均键能为约60 kcal/mol。在本发明的背景中，形成二硫键的半胱氨酸在单链抗体的构架区内并用于稳定抗体的构象。可例如通过位点定向诱变引入半胱氨酸残基，从而使得可在分子内产生稳定二硫键。

“杵臼名称”类似于“突起和腔”名称，且可互换使用。

“突起”或“杵”是指至少一种这样的氨基酸侧链，其从第一多肽的界面伸出，且因此可定位于邻近界面（即，第二多肽的界面）中的补偿性腔中以便稳定异二聚体，且由此例如比起同二聚体形成来有助于异二聚体形成。突起可存在于原始界面中或可以合成地引入（例如，通过改变编码界面的核酸）。通常，编码第一多肽的界面的核酸被改变以编码突起。为了实现这一点，用编码至少一种输入氨基酸残基的核酸置换编码第一多肽的界面中的至少一种原始氨基酸残基的核酸，所述输入氨基酸残基具有比原始氨基酸残基大的侧链体积。置换的原始残基数目的上限是第一多肽的界面中的残基的总数目。用于形成突起的某些输入残基通常是天然存在的氨基酸残基且优选选自精氨酸（R）、苯丙氨酸（F）、酪氨酸（Y）和色氨酸（W）。

突起或杵“可定位”于腔或臼中，这意指分别在第一多肽和第二多肽的界面上的突起和腔的空间位置和突起和腔的大小是这样的，从而使得突起可在不显著扰乱第一多肽和第二多肽在界面处的正常缔合的情况下位于腔中。由于突起如苯丙氨酸（F）、酪氨酸（Y）和色氨酸（W）一般不从界面的轴垂直延伸，所以突起与相应腔的对准依赖于基于三维结构（如通过X射线结晶学或核磁共振（NMR）获得的那些）对突起/腔对建模。这可使用本领域广泛认可的技术来实现。

“腔”或“臼”是指至少一种这样的氨基酸侧链，其从第二多肽的界面凹进，且因此容纳第一多肽的邻近界面上的相应突起。腔可存在于原始界面中或可以合成地引入（例如，通过改变编码界面的核酸）。通常，编码第二多肽的界面的核酸被改变以编码腔。为了实现这一点，用编码至少一种“输入”氨基酸残基的DNA置换编码第二多肽的界面中的至少一种原始氨基酸残基的核酸，所述“输入”氨基酸残基具有比原始氨基酸残基小的侧链体积。置换的原始残基数目的上限是第二多肽的界面中的残基的总数目。用于形成腔的某些输入残基通常是天然存在的氨基酸残基且优选选自丙氨酸（A）、丝氨酸（S）、苏氨酸（T）和缬氨酸（V）。

如本文所用的术语“界面”、“界面残基”、“界面氨基酸”、“接触残基”或“接触氨基酸”一般是指存在于可与第一多肽和第二多肽接触有关的结构域中的任何氨基酸残基。

“原始氨基酸”残基是由可具有比原始残基更小或更大的侧链体积的“输入氨基酸”残基置换的残基。输入氨基酸残基可以是天然存在或非天然存在的氨基酸残基，但优选为前者。“天然存在的”氨基酸残基是由遗传密码编码的那些残基。所谓“非天然存在的”氨基酸残基指的是并非由遗传密码编码的残基，但其能够共价结合多肽链中的一种或多种邻近氨基酸残基。非天然存在的氨基酸残基的实例是正亮氨酸、鸟氨酸、正缬氨酸、高丝氨酸和其它氨基酸残基类似物，例如描述于例如Ellman等人, Meth. Enzym. 202:301-336（1991）中的那些。在一些实施方案中，本发明的方法可包括置换至少一个原始氨基酸残基，但可置换不止一个原始残基。通常，不多于第一或第二多肽界面中的总残基可以包含被置换的原始氨基酸残基。

如本文关于抗体所使用的术语“竞争”意指第一抗体或其抗原结合片段（或部分）以与第二抗体或其抗原结合部分的结合足够相似的方式结合表位，从而使得与在没有第二抗体的情况下的第一抗体的结合相比，在有第二抗体的情况下第一抗体与其关联表位的结合结果可检测地降低。其中在有第一抗体的情况下第二抗体与其表位的结合也可检测地降低的备择方案可以但不需要是这样的。也就是说，第一抗体可以在第二抗体不抑制第一抗体与其相应表位结合的情况下抑制第二抗体与其表位的结合。然而，在每种抗体可检测地抑制另一种抗体与其关联表位或配体的结合的场合，无论是相同、更大还是更小程度，所述抗体都被说成彼此“交叉竞争”结合其一种或多种相应的表位。竞争抗体和交叉竞争抗体两者均被本发明包括。不管这种竞争或交叉竞争通过其发生的机制（例如，空间位阻，构象变化，或者与共同表位或其一部分的结合），基于本文提供的教导，技术人员将理解，这种竞争和/或交叉竞争抗体被包括并且可以用于本文公开的方法中。

如本文所用的，“依赖抗体的细胞毒性”或“ADCC”是指细胞介导的反应，其中表达Fc受体（FcRs）的非特异性细胞毒性细胞（例如，天然杀伤（NK）细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞）识别在靶细胞上的结合的抗体，并且接着引起靶细胞的裂解。可以使用体外ADCC测定，例如美国专利5,500,362或5,821,337中所述的那种，来评估感兴趣的分子的ADCC活性。用于这种测定的有用的效应细胞包括外周血单核细胞（PBMC）和NK细胞。另一方面或另外地，可以例如在动物模型中在体内评估感兴趣的分子的ADCC活性，例如在Clynes等人, PNAS(USA), 95:652-656, 1998中公开的那种。

如本文所用的，“依赖补体的细胞毒性”或“CDC”是指在有补体的情况下的靶的裂解。补体活化途径通过补体系统的第一组分（C1q）与和关联抗原复合的分子（例如，抗体）的结合来起始。为了评估补体活化，可以进行例如如Gazzano-Santoro等人, J. Immunol.Methods, 202: 163, 1996中所述的CDC测定。

如本文所用的，术语“免疫特异性结合”、“免疫特异性识别”、“特异性结合”、“特异性识别”和类似术语是指特异性结合抗原（例如，表位或免疫复合体）且不特异性结合另一分子的分子，例如，结合结构域。特异性结合抗原的分子可以以更低的亲和力结合其它肽或多肽，如通过本领域已知的测定所测定的，例如，免疫测定、BIACORE™或其它测定。优选地，特异性结合抗原的分子不与其它蛋白交叉反应。

合适的“中等严格条件”包括在5 X SSC、0.5% SDS、1.0 mM EDTA（pH 8.0）的溶液中的预洗涤；在50℃-65℃、5 X SSC下杂交过夜；继之以于65℃用含有0.1% SDS的2X、0.5X和0.2X SSC的每一种洗涤两次，各20分钟。

如本文所用的，“高度严格条件”或“高严格性条件”是这样的条件，其：（1）采用低离子强度和高温度用于洗涤，例如于50℃的0.015 M氯化钠/0.0015 M柠檬酸钠/0.1%十二烷基硫酸钠；（2）在杂交过程中采用变性剂，例如甲酰胺，例如于42℃的具有0.1%牛血清清蛋白的50%（v/v）甲酰胺/0.1%菲克（Ficoll）/0.1%聚乙烯吡咯烷酮/具有750 mM氯化钠、75mM柠檬酸钠的50 mM磷酸钠缓冲液pH 6.5；或（3）于42℃采用50%甲酰胺、5 x SSC（0.75 MNaCl、0.075 M柠檬酸钠）、50 mM磷酸钠（pH 6.8）、0.1%焦磷酸钠、5 x Denhardt杂交溶液、超声处理的鲑精DNA（50 µg/ml）、0.1% SDS和10%硫酸葡聚糖，以及于42℃在0.2 x SSC（氯化钠/柠檬酸钠）中和于55℃的50%甲酰胺中的洗涤，继之以于55℃由含有EDTA的0.1 x SSC组成的高严格性洗涤。技术人员将认识到如何根据需要调节温度、离子强度等，以适应诸如探针长度等的因素。

所述结合蛋白、结合结构域、CDRs或抗体（如本文所广泛定义的）可以根据Kabat、Chothia、Kabat和Chothia两者的累积、AbM、接触、North的定义和/或构象定义、或本领域众所周知的CDR测定的任何方法鉴定。参见，例如，Kabat等人，1991, Sequences of Proteinsof Immunological Interest，第5版（超变区）；Chothia等人，Nature 342:877-883, 1989（结构环结构）。特定抗体中构成CDR的氨基酸残基的特性可使用本领域所众所周知的方法来确定。CDRs的AbM定义是Kabat和Chothia之间的折衷并使用Oxford Molecular's AbM抗体建模软件（Accelrys®）。CDRs的“接触”定义基于观察到的抗原接触，在MacCallum等人，J. Mol. Biol.，262:732-745，1996中阐述。CDRs的“构象”定义基于对抗原结合具有焓贡献的残基（参见，例如，Makabe等人, J. Biol. Chem., 283:1156-1166, 2008）。North已使用不同的优选CDR定义集鉴定了规范CDR构象（North等人，J. Mol. Biol. 406: 228-256,2011）。在本文中称为CDRs的“构象定义”的另一种方法中，CDRs的位置可以被鉴定为对抗原结合具有焓贡献的残基（Makabe等人, J. Biol. Chem., 283:1156-1166, 2008）。再其它的CDR边界定义可能并不严格遵循上述方法之一，但仍将与Kabat CDRs的至少一部分重叠，尽管根据特定的残基或残基组或甚至整个CDRs不显著影响抗原结合的预测或实验发现，它们可以缩短或延长。如本文所用的，CDR可以是指通过本领域已知的任何方法，包括方法的组合定义的CDRs。本文使用的方法可以利用根据这些方法中的任一种定义的CDRs。对于含有不止一个CDR的任何给定实施方案，可以根据Kabat、Chothia、延伸的（Kabat和Chothia的组合）、North、延伸的、AbM、接触和/或构象定义中的任一种来定义CDRs（或抗体的其它残基）。

可变结构域中的残基根据Kabat进行编号，所述Kabat是用于抗体编码的重链可变区或轻链可变区的编号系统。参见，Kabat等人, Sequences of Proteins ofImmunological Interest, 第5版. Public Health Service, National Institutes ofHealth, Bethesda, MD, 1991。使用所述编号系统，实际的线性氨基酸序列可以含有对应于可变区的FR或CDR的缩短或插入的较少或额外的氨基酸。例如，重链可变区可包括在H2的残基52之后的单氨基酸插入片段（根据Kabat的残基52a）和在重链FR残基82后的插入的残基（例如，根据Kabat的残基82a、82b和82c）。可以通过抗体的序列与“标准”Kabat编号的序列在同源性区域的比对来确定给定抗体的残基的Kabat编号。各种用于分配Kabat编号的算法是可获得的。本文使用在Abysis的版本2.3.3发布（www.abysis.org）中执行的算法，以将Kabat编号分配给可变区VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3、VH CDR2和VH CDR3。AbM定义用于VHCDR1。抗体中的具体氨基酸残基位置也可根据Kabat来编号。

如本文所用的，术语“噬菌体展示文库”是指噬菌体群体，其各自含有符合读框地重组融合至表面蛋白的外源cDNA。噬菌体在其表面上展示由cDNA编码的外源蛋白。在细菌宿主（一般为大肠杆菌）中复制后，通过外源蛋白在噬菌体表面上的表达选择含有感兴趣的外源cDNA的噬菌体。

术语“表位”是指分子的能够在称为互补位的抗体的抗原结合区的一个或多个处由抗体识别、与抗体接触和/或由抗体结合的部分。单一抗原可具有不止一个表位。因此，不同抗体可结合抗原上的不同区域且可具有不同生物效应。表位经常由分子的化学活性表面定群如氨基酸或糖侧链组成，且具有特定三维结构特征以及特定电荷特征。如本文所用的，表位可以是构象的或线性的。通过来自线性多肽链的不同区段的空间并列的氨基酸产生构象表位。线性表位是由多肽链中的邻近氨基酸残基产生的表位。在某些实施方案中，表位可包括抗原上的糖、磷酰基或磺酰基的部分。

如本文所用的术语“抗原性表位”定义为抗体可特异性结合的多肽的一部分，如通过本领域众所周知的任一方法所测定的，例如通过常规免疫测定。“非线性表位”或“构象表位”包含抗原性蛋白内的非邻接多肽（或氨基酸），对所述表位特异性的抗体与其结合。一旦确定抗原上的期望表位，就可能例如使用本文所述的技术产生针对所述表位的抗体。

在关于抗体和蛋白或肽的相互作用使用时，术语“特异性结合”或“特异性地结合”是指依赖于蛋白上的特定结构（即，抗原决定簇或表位）的存在的相互作用；换言之，抗体识别且结合特定蛋白结构而非一般说来的蛋白。例如，如果抗体对表位“A”是特异性的，则在含有标记的“A”和抗体的反应中存在含有表位A的蛋白（或游离的未标记的A）将减少与抗体结合的标记的A的量。

在某些实施方案中，“特异性地结合”意指例如抗体以约0.1 nM或更小、但更通常小于约1 μM的K_D结合蛋白。在某些实施方案中，“特异性地结合”意指抗体有时以至少约0.1μM或更小、在其它时间以至少约0.01 μM或更小并在其它时间以至少约1 nM或更小的K_D结合靶。由于不同物种中的同源蛋白之间的序列同一性，特异性结合可包括识别不止一个物种中的蛋白（例如，人GUCY2c和小鼠GUCY2c）的抗体。同样，由于不同蛋白的多肽序列的某些区域内的同源性，特异性结合可包括识别不止一种蛋白的抗体。应理解，在某些实施方案中，特异性结合第一靶的抗体或结合部分可特异性结合或可不特异性结合第二靶。因此，“特异性结合”不必定需要（尽管其可包括）排他性结合，即结合单一靶。因此，在一些实施方案中，抗体可特异性结合不止一种靶。在某些实施方案中，抗体上的相同抗原结合部位可结合多种靶。例如，在某些情况中，抗体可包含两个相同的抗原结合部位，其各自特异性结合两种或更多种蛋白上的相同表位。在某些备择实施方案中，抗体可以是多特异性的且包含至少两个具有不同特异性的抗原结合部位。通过非限制性实例的方式，双特异性抗体可包含一个识别一种蛋白（例如，人CD3）上的表位的抗原结合部位且进一步包含识别第二蛋白上的不同表位的第二不同抗原结合部位。通常但不必定地，对结合的提及意指特异性结合。

特异性结合抗原的抗体可以以更低的亲和力结合其它肽或多肽，如通过本领域已知的测定所测定的，例如免疫测定、BIACORE™或其它测定。优选地，特异性结合抗原的抗体不与其它蛋白交叉反应。

在关于抗体和蛋白或肽的相互作用使用时，术语“非特异性结合”或“背景结合”是指不依赖于特定结构的存在的相互作用（即，抗体结合一般说来的蛋白而非特定结构例如表位）。

如本文所用的术语“k_on”或“k_a”是指关于抗体与抗原的缔合的速率常数。具体地，使用全抗体（即，二价的）和单体GUCY2c蛋白测量速率常数（k_on/k_a和k_off/k_d）和平衡解离常数。

如本文所用的术语“k_off”或“k_d”是指关于抗体从抗体/抗原复合体解离的速率常数。

如本文所用的术语“K_D”是指抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。

如本文所用的，术语“结合亲和力”通常是指分子（例如，抗体）的单一结合部位和其结合配偶体（例如，抗原）之间的非共价相互作用的总计强度。除非另外指示，否则如本文所用的，“结合亲和力”是指反映结合对的成员（例如，抗体和抗原）之间的1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可由解离常数（K_D）表示。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可由解离常数（Kd）表示。例如，Kd可以是约200 nM、150 nM、100 nM、60 nM、50 nM、40 nM、30 nM、20 nM、10 nM、8 nM、6 nM、4 nM、2 nM、1 nM或更强。亲和力可通过本领域已知的常用方法（包括本文所述的那些）来测量。低亲和力抗体通常缓慢地结合抗原且倾向于易于解离，而高亲和力抗体通常较快结合抗原且倾向于较长时间保持结合。多种测量结合亲和力的方法是本领域已知的，对本发明来说可以使用其任一种。特别地，术语“结合亲和力”意图指特定抗原-抗体相互作用的解离速率。K_D是解离速率（rate ofdissociation）（也称为“解离速率（off-rate）（k_off）”）与结合速率（rate of association）或“结合速率（on-rate）（k_on）”的比率。因此，K_D等于k_off/k_on且表示为摩尔浓度（M）。因此，K_D越小，则结合亲和力越强。因此，与1 nM的K_D相比，1 μM的K_D指示弱结合亲和力。可使用本领域充分确立的方法测定抗体的K_D值。一种测定抗体的K_D的方法是通过使用表面等离振子共振（SPR），一般使用生物传感器系统，例如BIACORE™系统。BIACORE™动力学分析包括分析抗原从在其表面上具有固定的分子（例如，包含表位结合结构域的分子）的芯片的结合和解离。测定抗体的K_D的另一种方法是通过使用一般使用OCTET^®技术（Octet QK^e系统，ForteBio）的生物层（Bio-Layer）干涉量度学。

除另有指定之外，否则关于本发明的双特异性抗体（例如抗体、片段或其衍生物）的“生物活性的”、“生物活性”和“生物特征”意指具有结合生物分子的能力。

如本文所用的，术语“核酸”和“核苷酸序列”包括DNA分子（例如，cDNA或基因组DNA）、RNA分子（例如，mRNA）、DNA和RNA分子的组合或杂合DNA/RNA分子和DNA或RNA分子的类似物。这种类似物可使用例如核苷酸类似物来产生，所述核苷酸类似物包括，但不限于，肌苷或三苯甲基化碱基。这种类似物也可以包含DNA或RNA分子，其包含为所述分子提供有益属性（如例如核酸酶抗性或增加的穿过细胞膜的能力）的修饰的主链。核酸或核苷酸序列可以是单链的、双链的，可以含有单链和双链的部分两者，且可以含有三链部分，但优选为双链的DNA。

本发明还包括编码本发明的抗体（包括抗体的多肽和结合区）的多核苷酸。通过本领域已知的任一方法，可获得编码本发明的分子的多核苷酸，且确定多核苷酸的核苷酸序列。

编码本发明的抗体的多核苷酸可包括以下：仅变体的编码序列，变体的编码序列和额外编码序列，例如功能性多肽，或信号或分泌序列或蛋白原（pro-protein）序列；抗体的编码序列和非编码序列，例如内含子或抗体的编码序列5’和/或3’的非编码序列。术语“编码抗体的多核苷酸”涵盖包括变体的额外编码序列的多核苷酸，且还涵盖包括额外编码和/或非编码序列的多核苷酸。本领域已知，可以从期望的蛋白的氨基酸序列容易获得对于特定宿主细胞/表达系统最优化的多核苷酸序列（参见GENEART^® AG, Regensburg, 德国）。

本发明的抗体及其抗原结合片段可具有对多肽功能不具显著效应的额外的保守或非必需氨基酸取代。可如Bowie, JU等人，Science 247: 1306-1310,1990或Padlan等人，FASEB J. 9: 133-139, 1995中所述来确定特定取代是否将被耐受，即，将不有害地影响期望的生物性质，例如结合活性。

如本文所用的，术语“分离的”是指从其原始环境（例如，如果其为天然存在的则为天然环境）取出的材料。例如，活的动物中存在的天然存在的多核苷酸或多肽不是分离的，但自天然系统中的一些或所有共存材料分离的相同多核苷酸或多肽是分离的。这种多核苷酸可以是载体的一部分，和/或这种多核苷酸或多肽可以是组合物（例如，混合物、溶液或悬浮液）的一部分或构成包含所述多核苷酸或多肽的分离的细胞或培养的细胞，且由于所述载体或组合物不是其天然环境的一部分而仍为分离的。

如本文所用的，术语“复制子”是指在细胞内起自主多核苷酸复制单位作用的任何遗传元件，例如质粒、染色体或病毒。

如本文所用的，术语“可操作地连接的”是指其中所述组分处于允许其以预期方式起作用的关系的情况。例如，“可操作地连接”至编码序列的控制序列以这样的方式连接，从而使得在合适或与所述控制序列相容的条件下实现所述编码序列的表达。通常，“可操作地连接的”意指所连接的DNA序列是邻接的，并在分泌前导序列的情况下是邻接的且处于读相（reading phase）中。然而，增强子不必须邻接。连接通过在方便的限制位点处连接来完成。如果不存在这种位点，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。

如本文所用的，“载体”意指能够在宿主细胞中递送，并且优选表达一种或多种感兴趣的基因或序列的构建体。载体的实例包括，但不限于，病毒载体，裸DNA或RNA表达载体，质粒，黏粒或噬菌体载体，与阳离子缩合剂缔合的DNA或RNA表达载体，包囊在脂质体中的DNA或RNA表达载体，以及某些真核细胞，例如生产细胞（producer cells）。

如本文所用的，术语“表达控制序列”或“控制序列”是指实现其所连接的编码序列的表达所必需的多核苷酸序列。这种控制序列的特性取决于宿主生物而不同。例如，在原核生物中，这种控制序列通常包括启动子、核糖体结合位点和终止子以及在一些情况下的增强子。因此，术语“控制序列”意图最少地包括其存在对于表达必需的所有组分，且也可包括其存在有利的额外组分，例如前导序列。

“宿主细胞”包括可以是或已经是一种或多种载体的受体的个别细胞或细胞培养物，所述载体用于并入多核苷酸插入片段。宿主细胞包括单一宿主细胞的子代，且子代可以由于天然、偶然或故意突变而不必定与原始亲本细胞完全相同（在形态上或在基因组DNA套（complement）上）。宿主细胞包括在体内用一种或多种本发明的多核苷酸转染的细胞。

如本文所用的，“哺乳动物细胞”包括对衍生自哺乳动物的细胞的提及，所述哺乳动物包括人、大鼠、小鼠、豚鼠、黑猩猩或猕猴。所述细胞可在体内或体外培养。

如本文所用的，术语“纯化的产物”是指已与产物通常所缔合的细胞成分分离和/或自可存在于感兴趣的样品中的其他类型的细胞分离的产物制剂。

如本文所用的，“基本上纯的”是指至少50%纯（即，不含污染物），更优选至少90%纯，更优选至少95%纯，又更优选至少98%纯，且最优选至少99%纯的材料。

如本文所用的，术语“癌症”或“癌性”是指或描述哺乳动物中的生理状况，其一般特征在于不受调节的细胞生长，由细胞的异常不受控制的生长引起的赘生物或肿瘤。在一些方面，癌症是指没有转移的情况下的恶性原发性肿瘤，其仍然为局部化的。在其它方面，癌症是指恶性肿瘤，其已侵袭且破坏相邻身体结构且扩散至远距离的部位。在一些方面，癌症与特定癌症抗原相关。癌症的例子包括，但不限于，口腔和咽、消化系统（例如，食道、胃、小肠、结肠、直肠、肛门、肝、胆囊、阑尾、胆管和胰）或内分泌系统的癌症。在某些实施方案中，消化系统的癌症是食道、胃、小肠、结肠、直肠、肛门、肝、胆囊、阑尾、胆管和胰的癌症。

如本文所用的，术语“食道癌”意图包括充分认可的医学定义，其将食道癌定义为特征在于食道细胞的癌症的医学状况。食道癌的例子包括腺癌、鳞状细胞癌、绒毛膜癌、淋巴瘤、肉瘤和小细胞癌。

“胃肠”（GI）癌是影响消化系统的一组癌症的术语。如本文所用的，术语“胃癌（stomach cancer）”或“胃癌（gastric cancer）”意图包括充分认可的医学定义，其将胃癌定义为特征在于胃细胞的癌症的医学状况。特别地，胃癌或胃癌是在胃内壁（lining）中形成恶性细胞的疾病。胃癌或胃癌可在胃的任何部分发展，并可能扩散到整个胃和其他器官；特别是食道、肺和肝。

如本文所用的，术语“结肠直肠癌”或“肠癌”意图包括充分认可的医学定义，其将结肠直肠癌定义为特征在于在小肠以下的肠道（即，大肠（结肠），包括盲肠、升结肠、横结肠、降结肠和乙状结肠和直肠）细胞的癌症的医学状况。另外，如本文所用的，术语“结肠直肠癌”意图进一步包括特征在于十二指肠和小肠（空肠和回肠）细胞的癌症的医学状况。本文所用的结肠直肠癌的定义比普通医学定义更广泛，但由于十二指肠和小肠的细胞也含有GUCY2c而因此提供所述定义。

如本文所用的，术语“恶性细胞”或“恶性肿瘤”是指侵入性和/或能够进行转移的肿瘤或肿瘤细胞，即，癌性细胞。

如本文所用的，术语“治疗（treat）”、“治疗（treating）”或“治疗（treatment）”是用于获得有益或期望的临床结果的方法。对本发明来说，治疗定义为向主体（例如，患者）施用GUCY2c抗体分子（例如，GUCY2c单克隆抗体或GUCY2c双特异性或多特异性抗体）。这种施用可以是例如通过直接施用于主体，或通过向来自主体的分离的组织或细胞应用，所述分离的组织或细胞返回至所述主体。GUCY2c抗体分子可单独或与一种或多种试剂组合施用。治疗可以治愈、愈合、缓和、减轻、改变、补救、改善、暂时减轻、改进或影响病症、病症的症状或对所述病症（例如，癌症）的易感性。在一些实施方案中，所述治疗可用于以下任何一种或多种：（a）治疗、预防或改善主体中与表达GUCY2c的恶性细胞有关的状况（例如，胃肠相关癌症，例如结肠直肠癌（CRC））的一种或多种症状；（b）抑制具有表达GUCY2c的恶性肿瘤的主体中的肿瘤生长或进展；（c）抑制具有一种或多种表达GUCY2c的恶性细胞的主体中表达GUCY2c的癌（恶性）细胞的转移；（d）诱导表达GUCY2c的肿瘤的消退（例如，长期消退）；（e）在表达GUCY2c的恶性细胞中发挥细胞毒活性；（f）增加患有GUCY2c有关病症的主体的无进展存活；（g）增加患有GUCY2c有关病症的主体的总存活；（h）减少患有GUCY2c有关病症的主体中额外的化疗剂或细胞毒剂的使用；（i）减少患有GUCY2c有关病症的主体的肿瘤负荷（tumor burden）；或（j）阻断GUCY2c与其他尚待鉴定的因子相互作用。尽管不希望受到理论的束缚，但认为治疗在体外或体内引起细胞的抑制、除去或杀伤，或以其他方式降低细胞（包括异常细胞）介导病症的能力，例如，如本文所述的病症，例如癌症。

如本文所用的“止泻药”意指终止或放慢腹泻的药物。除了可能包括输液（fluidadministration）以及终止乳糖、酒精、高渗透产物的支持性医护外，这些止泻药还可以共施用或与GUCY2c双特异性抗体联合。止泻药包括，但不限于，碱式没食子酸铋、嗜酸乳杆菌、布拉氏糖酵母、洛哌丁胺/西甲硅油（simethicone）、阿托品/地芬诺酯、阿托品/地芬诺辛（difenoxin）、布拉氏糖酵母冻干形式、嗜酸乳杆菌、洛哌丁胺、碱式水杨酸铋、嗜酸乳杆菌/保加利亚乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、凹凸棒石（attapulgite）、crofelemer、氟喹诺酮（fluoroquinolone）、抗生素或善得定。参见Bensen等人，Recommended Guidelines forthe Treatment of Cancer Treatment-Induced Diarrhea. Journal of ClinicalOncology 14: 2918-2926, 2004。

如本文所用的，术语“主体”意图包括任何动物（例如，哺乳动物），包括，但不限于，人、非人灵长类动物、啮齿类动物等，其为特定治疗的受体。例如，主体可以是具有癌症的患者（例如，人患者或兽医患者）。一般，术语“主体（subject）”、“个体（individual）”和“患者”关于人主体在本文中可互换使用。

除非另外指出，否则本发明的术语“非人动物”包括所有非人脊椎动物，例如，非人哺乳动物和非哺乳动物，例如非人灵长类动物、绵羊、狗、牛、鸡、两栖类、爬行类、小鼠、大鼠、兔或山羊等。

如本文所用的，术语“药学上可接受的”是指由联邦政府或州政府管理机构批准（或可批准）或列于美国药典（U.S. Pharmacopeia）或其它公认药典中以用于动物（包括人）中的产物或化合物。

如本文所用的，术语“药学上可接受的赋形剂、载体或佐剂”或“可接受的药物载体”是指可与本公开内容的至少一种抗体一起施用于主体且不破坏抗体的活性的赋形剂、载体或佐剂。在以足以递送治疗效应的剂量与抗体施用时，赋形剂、载体或佐剂应当是无毒性的。

如本文所用的，术语“改善”意指与不施用本发明的抗体分子相比，一种或多种症状的减轻或改善。“改善”还包括症状的持续时间的缩短或减少。

如本文所用的，术语“预防（prevent）”、“预防（preventing）”和“预防（prevention）”是指由于施用预防剂或治疗剂的结果而预防主体中的病症的一种或多种症状的复发或发作。

如本文所用的，“有效量”、“治疗有效量”、“治疗足够量”或“有效剂量”是指治疗剂在单剂或多剂施用于主体时超出没有这种治疗的情况下所预期的在预防、愈合、改善、治疗或管理疾病、病症或副作用，或降低疾病或病症的进展速率，或延长治愈、缓和、减轻或改善具有如本文所述的病症的主体的状况中有效或足够的任何量。所述术语在其范围内还包括有效增强正常生理功能的量。有效量可以在施用一种或多种治疗剂的背景下考虑，并且如果与一种或多种其它试剂一起可以达到或达到了期望的结果，则单一试剂可以被认为以有效量给予。

如本文所用的，“抑制”肿瘤或癌症“的生长”是指减缓、中断、延滞或终止其生长和/或转移，并且不必定表示完全消除肿瘤生长。

功效是治疗剂的活性的量度，其按照产生给定强度的效应所需的量表示。与在低浓度下引起较小应答的较低功效的试剂相比，高度有效的试剂在低浓度引起更大的应答。功效随亲和力和效力而变化。效力是指治疗剂在结合靶配体时产生生物应答的能力和所述应答的定量量级。如本文所用的，术语“半最大有效浓度（EC₅₀）”是指治疗剂在指定暴露时间后引起在基线和最大值之间的一半的应答的浓度。治疗剂可以引起抑制或刺激。通常使用并在本文中使用EC₅₀值作为功效的量度。

如本文所用的，“联合治疗”或“与……组合”施用是指使用不止一种预防剂和/或治疗剂。术语“联合治疗”或“与……组合”的使用不限制将预防剂和/或治疗剂施用于具有病症的主体的顺序。换言之，联合治疗可以通过单独地、序贯地或同时用治疗剂治疗来进行。在“序贯施用”的情况下，第一施用的试剂可以在第二试剂施用或在主体中变得具有活性时对主体发挥一些生理效应。

如本文关于预防剂和/或治疗剂的施用所使用的术语“同时施用”是指施用试剂，从而使得各个试剂同时存在于主体内。同时施用可通过配制于单一组合物中或于在相同时间或类似时间施用的分开的组合物中的分子来实现。序贯施用可以为如所需要的任何顺序。

如本文所用的，“GUCY2c”是指哺乳动物鸟苷酸环化酶C（GUCY2c），优选人GUCY2c蛋白。术语“GUCY2c”可以与术语“GUCY2C”互换使用。人GUCY2c的核苷酸序列公开为GenBank检索号：NM.sub.-004963，其引入本文作为参考。人GUCY2c的氨基酸序列公开为GenBank检索号NP.sub.-004954，其引入本文作为参考。

一般，天然存在的等位基因变体具有与GenBank检索号NP.sub.-004954中描述的蛋白至少95％、97％或99％相同的氨基酸序列。GUCY2c蛋白被表征为跨膜细胞表面受体蛋白，且据信在维持肠液、电解质稳态和细胞增殖中起关键作用。

如本文所用的，“结合GUCY2c的抗体”、“识别GUCY2c的抗体”、“抗-GUCY2c抗体”、“抗-GUCY2c抗体分子”或“GUCY2c抗体”包括将抗体（如本文所定义的）的至少一个结合结构域与抗-GUCY2c抗体（如本申请中所定义的）的至少一个结合结构域组合的分子。本发明的GUCY2c抗体分子包括与GUCY2c（例如，人GUCY2c、小鼠GUCY2c、大鼠GUCY2c、食蟹猴GUCY2c）相互作用或识别例如结合（例如，特异性结合）GUCY2c（例如，人GUCY2c、小鼠GUCY2c、大鼠GUCY2c、食蟹猴GUCY2c）的抗体及其抗原结合片段。

术语“分化簇（Cluster of differentiation）3”或“CD3”是指多聚体蛋白复合体（历史上称为T3复合体），且由以下四条不同多肽链组成；作为三对二聚体（εγ、εδ、ζζ）装配且起作用的艾普西隆（ε）、伽玛（γ）、得尔塔（δ）和泽塔（ζ）。CD3复合体充当T细胞共同受体，其与T细胞受体（TCR）非共价缔合（Smith-Garvin等人2009）并在T淋巴细胞中产生活化信号。CD3蛋白复合体是T细胞谱系的定义特征，因此CD3抗体可有效地用作T细胞标记标记（Chetty和Gatter, Journal of Pathology, Vol 172, 4, 303-301（1994））。众所周知，CD3抗体通过活化内源淋巴因子产生来引出细胞毒性T细胞的产生，且能够选择性地杀伤肿瘤靶（Yun等人，Cancer Research, 49: 4770-4774 （1989））。

更具体地，T细胞表达能够诱导抗原特异性免疫应答的TCR复合体（Smith-Garvin等人，Annula Review of Immunology, 27: 1, 591-619（2009））。抗原是由能够刺激免疫应答的肿瘤细胞和病毒感染的细胞表达的肽。细胞内表达的抗原结合I类主要组织相容性（I类MHC）分子且转运至表面，在那里其暴露于T细胞。如果TCR与和抗原复合的I类MHC的结合亲和力是足够的，则将起始免疫突触的形成。通过免疫突触的信号传导通过形成εδ、δγ和ζζ二聚体的CD3共同受体介导。这些二聚体与TCR缔合并在T淋巴细胞中产生活化信号。所述信号传导级联放大指导表达抗原的细胞的T细胞介导的杀伤。细胞毒性通过粒酶B和穿孔蛋白从T细胞释放且转移至靶细胞来介导。

如本文所用的，“结合CD3的抗体”、“识别CD3的抗体”、“抗-CD3抗体”、“CD3抗体分子”或“CD3抗体”包括特异性识别单一CD3亚基（例如，ε、δ、γ或ζ）的抗体及其抗原结合片段，以及特异性识别两个CD3亚基的二聚体复合体（例如，γ/ε、δ/ε和ζ/ζ CD3二聚体）的抗体及其抗原结合片段。人CD3ε在Genbank检索号NM_000733中指出。本发明的抗体及抗原结合片段可结合可溶性CD3和/或细胞表面表达的CD3。可溶性CD3包括天然CD3蛋白以及缺乏跨膜结构域或以其它方式不与细胞膜缔合的重组CD3蛋白变体，如例如，单体和二聚体CD3构建体。

针对CD3的抗体能够在T淋巴细胞中产生活化信号。也可使用其它T细胞活化配体，包括但不限于 CD28、CD134、CD137和CD27。

CD3双特异性抗体回避了对于MHC-肽/TCR接合的需要，而代之以募集T细胞至表达细胞表面抗原的靶细胞。双特异性抗体的一个臂与肿瘤相关的细胞表面抗原结合，且另一个臂与CD3蛋白结合，后者是T细胞上TCR复合体的一部分。T3细胞上CD3和肿瘤细胞上的靶抗原通过双特异性抗体的共同接合（Co-engagement）导致细胞毒性应答。因此，在不受理论束缚的情况下，据信本发明的双特异性抗体可以允许T细胞回避对于TCR和与抗原复合的I类MHC相互作用的需要，而代之以通过在T细胞上表达的CD3（例如CD3ε）和在肿瘤上表达的GUCY2c的直接共同接合将T细胞改方向至靶细胞。

如本文所用的，术语“CD3-GUCY2c双特异性抗体”是指一种分子，所述分子被进行设计以通过靶向表达所期望的分子的肿瘤细胞来利用主体的T细胞去杀伤癌细胞。在某些实施方案中，所期望的分子是人GUCY2c。在一些实施方案中，CD3-GUCY2c双特异性抗体包含两个Fv结构域。在一些实施方案中，CD3-GUCY2c双特异性抗体包含针对GUCY2c的第一Fv结构域和针对CD3的第二Fv结构域。Fv结构域可以是scFv结构域。

如本文所用的，“第一多肽”是将与第二多肽缔合的任何多肽。第一多肽和第二多肽在界面处相遇。除了界面之外，第一多肽可以包含一个或多个额外的结构域，例如“结合结构域”（例如，抗体可变结构域、受体结合结构域、配体结合结构域或酶促结构域）或抗体恒定结构域（或其部分），包括CH2、CH1和CL结构域。通常，第一多肽将包含至少一个衍生自抗体的结构域。所述结构域方便地是恒定结构域，例如抗体的CH3结构域，并且可以形成第一多肽的界面。示例性的第一多肽包括抗体重链多肽，将抗体恒定结构域与异源多肽的结合结构域组合的嵌合体，受体多肽，配体多肽，和抗体可变结构域多肽（例如，双特异性抗体）。

除界面之外，第二多肽可包含额外的结构域，例如“结合结构域”（例如，抗体可变结构域、受体结合结构域、配体结合结构域或酶促结构域），或抗体恒定结构域（或其部分），包括CH2、CH1和CL结构域。通常，第二多肽将包含至少一个衍生自抗体的结构域。所述结构域方便地是恒定区，例如抗体的CH3结构域，并且可以形成第二多肽的界面。示例性的第二多肽包括抗体重链多肽，将抗体恒定结构域与异源多肽的结合结构域组合的嵌合体，和抗体可变结构域多肽（例如，双特异性抗体）。

如本文所用的，术语“复合体”或“复合的”是指彼此通过不是肽键的键和/或力（例如，范德瓦尔斯力、疏水力、亲水力）相互作用的两个或更多个分子的缔合。在一个实施方案中，复合体是异源多聚体的。应理解，如本文所用的术语“蛋白复合体”或“多肽复合体”包括具有与蛋白复合体中的蛋白缀合的非蛋白实体（例如，包括，但不限于，化学分子，例如毒素或检测剂）的复合体。

尽管可在本发明的实践或测试或测试中使用与本文所述的那些类似或等同的任何材料和方法，但现在描述优选的材料和方法。

材料和方法

已描述了用于产生抗体的各种技术，其包括用于制备单克隆抗体的传统杂交瘤方法、用于制备抗体（包括嵌合抗体，例如，人源化抗体）的重组技术、在转基因动物中的抗体产生和最近描述的用于制备“全人”抗体的噬菌体展示技术。下文简要描述这些技术。

针对感兴趣的抗原的多克隆抗体通常可在动物中通过多次皮下（sc）或腹膜内（ip）注射抗原和佐剂来产生。使用双功能试剂或衍生化剂，例如，马来酰亚胺基苯甲酰基磺基琥珀酰亚胺酯（通过半胱氨酸残基缀合）或N-羟基琥珀酰亚胺（通过赖氨酸残基），抗原（或含有靶氨基酸序列的片段）可以与在待免疫的物种中是免疫原性的蛋白（例如，血清清蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂）缀合。针对免疫原性缀合物或衍生物免疫动物，且几周后通过在多个部位皮下注射对动物进行加强。7至14天后，抽取动物血液且测定血清的抗体滴度。对动物进行加强，直到滴度平台为止。优选地，用相同抗原但缀合至不同蛋白和/或通过不同交联试剂的缀合物对动物进行加强。缀合物也可在重组细胞培养物中作为蛋白融合物制备。同样，使用聚集剂例如明矾来增强免疫应答。

单克隆抗体可使用首先由Kohler和Milstein，Nature 256:495, 1975描述的杂交瘤方法从基本上均质的抗体群体获得或可通过重组DNA方法（Cabilly等人，美国专利No.4,816,567）来制备。在杂交瘤方法中，如上文所述对小鼠或其它适当的宿主动物进行免疫以引出产生或能够产生将特异性地结合用于免疫的蛋白的抗体的淋巴细胞。另一方面，可在体外对淋巴细胞进行免疫。然后使用合适的融合剂例如聚乙二醇使淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles andPractice，第59-103页（Academic Press, 1986）。将因此制备的杂交瘤细胞接种并生长于优选含有一种或多种抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞的生长或存活的物质的合适培养基中。另外，杂交瘤细胞可在体内作为动物中的腹水肿瘤生长。通过常规免疫球蛋白纯化程序，如例如A蛋白-琼脂糖凝胶（Sepharose）、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析，将由亚克隆分泌的单克隆抗体与培养基、腹水或血清合适地分离。

抗体、抗体的抗原结合片段或任一抗体构建体的表达可在适当的原核或真核宿主细胞如CHO细胞、NSO细胞、SP2/0细胞、HEK293细胞、COS细胞、PER.C6细胞、酵母或大肠杆菌细胞中进行，且从所述细胞（细胞培养物上清液、调节的细胞培养物上清液、细胞裂解物或澄清的批量物（bulk））回收和收获分泌的抗体。用于产生抗体的一般方法是现有技术众所周知的且描述于例如以下综述文章中：Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17:183-202, 1999；Geisse, S.等人, Protein Expr. Purif. 8:271-282, 1986；Kaufman, R.J.,MoI. Biotechnol. 16:151-160, 2000；Werner, R.G., Drug Res. 48:870-880, 1998。在具体实施方案中，细胞培养物是哺乳动物细胞培养物，例如中国仓鼠卵巢（CHO）细胞培养物。

在各种实施方案中，分离或回收的抗体可通过使用本领域中已知的常规层析方法经受额外的纯化步骤。特别地，预期纯化方法包括，但不限于，亲和层析（例如，A蛋白亲和层析）、离子交换层析（例如，阴离子交换层析或阳离子交换层析）、疏水作用层析、羟基磷灰石层析、凝胶过滤层析和/或透析。在那些中，优选的纯化方法是使用A蛋白层析。亲和配体附着的基质最经常为琼脂糖，但其他基质是可用的。

本领域中也已知用于抗体纯化的其他技术，例如离子交换柱上的分级分离、乙醇沉淀、反相高压层析、乙醇沉淀、反相HPLC、硅石上的层析、肝素Sepharose™上的层析、阴离子或阳离子交换树脂（诸如多聚天冬氨酸柱）上的层析、层析聚焦、使用SDS-PAGE的电泳和硫酸铵沉淀。以上纯化方法列表在性质上仅为示例性的，且不意图为限制性列举。

另一方面，可能产生转基因动物（例如，小鼠），所述转基因动物在免疫时能够在没有内源性免疫球蛋白产生的情况下产生完整人抗体谱。例如，已描述了在嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区（J.sub.H）基因的纯合缺失导致内源性抗体产生的完全抑制。将人种系免疫球蛋白基因阵列转移入这种种系突变小鼠中将在抗原攻击时导致人抗体的产生。参见，例如，Jakobovits等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551-255;1993 和Jakobovits等人, Nature 362:255-258, 1993）。

在一些实施方案中，本发明的抗体可在保留对于抗原的高亲和力和其他有利生物性质的情况下被人源化。用于使非人抗体人源化的方法是本领域众所周知的。人源化可基本上遵循Winter和合作者的方法（Jones等人, Nature 321:522-525, 1986；Riechmann等人, Nature 332:323-327, 1988；Verhoeyen等人, Science 239:1534-1536, 1988），通过用啮齿类动物CDRs或CDR序列取代人抗体的相应序列来进行。因此，这种人源化抗体是嵌合抗体（Cabilly，上文），其中基本上少于完整人可变结构域已由来自非人类物种的相应序列取代。实际上，人源化抗体一般为人抗体，其中一些CDR残基和可能一些FR残基由来自啮齿类动物抗体中类似位点的残基取代。重要的是，抗体在保留对于抗原的高亲和力和其他有利生物性质的情况下被人源化。为实现所述目标，根据优选方法，通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念上的人源化产物的方法来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型是本领域技术人员熟悉的。计算机程序是可用的，所述计算机程序举例说明且展示所选择的候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构。对这些展示的检查允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能发挥中的可能作用，即，分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，可以从共有和输入序列选择且组合FR残基，从而使得实现期望的抗体特征，例如对一种或多种靶抗原增加的亲和力。关于进一步细节，参见1992年12月23日公开的WO92/22653。

也可使用本领域中已知的各种噬菌体展示方法来产生本发明的抗体。在噬菌体展示方法中，功能性抗体结构域展示于携带编码其的多核苷酸序列的噬菌体颗粒的表面上。在特定方面，可利用这种噬菌体以展示从谱或组合抗体文库（例如，人或鼠）表达的抗原结合结构域，例如Fab和Fv或二硫键稳定的Fv。可用抗原（例如，使用标记的抗原或结合或捕获至固体表面或珠的抗原）选择或鉴定表达结合感兴趣的抗原的抗原结合结构域的噬菌体。这些方法中使用的噬菌体一般是丝状噬菌体，包括fd和M13。抗原结合结构域表达为与噬菌体基因III或基因VIII蛋白重组融合的蛋白。可用于制备本发明的免疫球蛋白或其片段的噬菌体展示方法的实例包括Brinkmann等人，"Phage Display Of Disulfide-StabilizedFv Fragments," J. Immunol. Methods, 182:41-50, 1995中所公开的那些。

多种IgG同种型和其结构域的功能特征是本领域众所周知的。IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的氨基酸序列是本领域已知的。用于本发明的方法中的来自特定IgG同种型的两个或更多个结构域的选择和/或组合可基于亲本同种型的任何已知参数，包括对FcγR的亲和力。例如，使用来自表现出对FcγRIIB有限结合或无结合的IgG同种型（例如，IgG2或IgG4）的区域或结构域可在其中期望人工改造双特异性抗体以将与活化受体的结合达到最大且将与抑制性受体的结合减至最小的场合特别有用。类似地，使用来自已知优先结合C1q或FcγRIIIA的IgG同种型（例如，IgG3）的Fc链或结构域可与本领域中已知增强依赖抗体的细胞毒性（ADCC）和/或依赖补体的细胞毒性（CDC）的Fc氨基酸修饰组合以人工改造双特异性抗体，从而使得将效应子功能活性（例如，补体活化或ADCC）达到最大。以类似方式，可在IgG同种型的Fc链或结构域中进行突变，其将Fc链的效应子功能减至最小或将其消除。

在发现过程期间，抗体的产生和表征可阐明关于期望的表位的信息。根据所述信息，然后可能对抗体进行与相同表位结合的竞争筛选。实现这一点的方法是进行竞争和交叉竞争研究以寻找彼此竞争或交叉竞争的抗体，例如竞争结合抗原的抗体。一种方法是鉴定抗体结合的表位，或“表位作图”。存在本领域已知用于作图且表征蛋白上的表位的位置的许多方法，包括解决抗体-抗原复合体的晶体结构、竞争测定、基因片段表达测定和基于合成肽的测定，如例如在Harlow和Lane，Using Antibodies, a Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1999的第11章中所述的。在额外的实例中，表位作图可以用于测定抗体结合的序列。表位作图可从各种来源商购可得，例如，Pepscan Systems（Edelhertweg 15, 8219 PH Lelystad，荷兰）。在额外的实例中，可以进行抗原结合结构域的诱变、结构域交换实验和丙氨酸分区诱变法，以鉴定对于表位结合需要、足够和/或必需的残基。结合亲和力和抗原结合结构域相互作用的解离速率可通过竞争性结合测定来测定。竞争性结合测定的一个实例是放射免疫测定，其包括标记的抗原的温育和与标记的抗原结合的分子的检测。本发明的分子对抗原的亲和力和结合解离速率可通过Scatchard分析从饱和数据确定。

本发明的抗体对抗原的亲和力和结合性质可最初使用本领域中已知用于抗原结合结构域的体外测定（基于生物化学或免疫学的测定）来测定，包括但不限于酶联免疫吸附测定（ELISA）测定、表面等离振子共振（SPR）测定、生物层干涉量度学或免疫沉淀测定。本发明的分子在体内模型（例如本文所述和公开的那些）中可具有与基于体外的测定中的那些类似的结合性质。然而，本发明并不排除在基于体外的测定中不表现出期望的表型但在体内表现出期望的表型的本发明的分子。

任选的双特异性抗体形式是基于共价连接的双特异性异二聚体双抗体结构的Fv-衍生的策略，也称为双重亲和力重新靶向（DART^®）蛋白，其描述于例如美国专利公开Nos.2007/0004909、2009/0060910和2010/0174053）。

一旦已获得了编码本发明的分子（即，结合结构域）的核酸序列，就可使用本领域众所周知的技术通过重组DNA技术来产生用于产生所述分子的载体。

编码本发明的抗体（例如，GUCY2c抗体或CD3-GUCY2c双特异性抗体）结合结构域的多核苷酸可包括可操作地连接至抗体编码序列的表达控制多核苷酸序列，包括本领域已知的天然结合的或异源启动子区。表达控制序列可以是能够转化或转染真核宿主细胞的载体中的真核启动子系统，但也可使用用于原核宿主的控制序列。一旦载体已并入适当的宿主细胞系中，就使宿主细胞在适于表达核苷酸序列且如所需要的适合于收集且纯化抗体的条件下繁殖。真核细胞系包括CHO细胞系、各种COS细胞系、HeLa细胞、骨髓瘤细胞系、转化的B-细胞或人胚肾细胞系。

在一些实施方案中，编码本发明的抗体的DNA使用常规程序（例如，通过使用能够特异性结合编码鼠抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针）分离且测序。本发明的杂交瘤细胞充当这种DNA的优选来源。一旦分离，就可以将DNA放置于表达载体中，然后将所述表达载体转染至否则不产生免疫球蛋白蛋白的宿主细胞中，例如猿猴COS细胞、CHO细胞或骨髓瘤细胞，以获得在重组宿主细胞中的单克隆抗体合成。还可以例如通过用人重链和轻链恒定结构域的编码序列取代同源鼠序列来修饰DNA，Morrison等人，Proc. Nat. Acad.Sci. 81:6851，1984。以这种方式，制备具有本文的抗抗原单克隆抗体的结合特异性的嵌合抗体。

作为细胞表面蛋白，GUCY2c可以充当受体结合蛋白例如抗体或配体的治疗靶。在正常的肠组织中，GUCY2c在上皮细胞紧密连接的顶面上表达，所述上皮细胞紧密连接形成在腔环境与血管区室之间的屏障（Almenoff等人, Mol Microbiol 8: 865-873, 1993；和Guarino等人, Dig Dis Sci 32: 1017-1026, 1987）。因此，GUCY2c-结合蛋白治疗剂的全身静脉内施用将对存在于正常细胞上的肠GUCY2c受体具有最小的影响，同时可以接触胃肠系统的赘生性细胞，包括恶性或转移结肠癌细胞、肠外或转移结肠肿瘤、食道肿瘤或胃肿瘤或胃食道交界处（gastroesophageal junction）的腺癌。另外，GUCY2c在配体结合时通过受体介导的胞吞作用内在化（Buc等人，Eur J Cancer 41: 1618-1627, 2005；Urbanski等人,Biochem Biophys Acta 1245: 29-36, 1995）。

可以利用GUCY2c的组织特异性表达和与例如胃肠起源的癌症（例如，结肠癌、胃癌或食道癌）的联系，以允许将GUCY2c用作所述疾病的诊断标记（Carrithers等人, DisColon Rectum 39:171-181, 1996；Buc等人，Eur J Cancer 41: 1618-1627, 2005）。

本发明提供了与GUCY2c（例如，人GUCY2c（例如，SEQ ID NO：224，其是检索号：NP_004954.2的衍生物））结合并且可用于以下中的任何一种或多种的抗体：（a）治疗、预防或改善主体中与表达GUCY2c的恶性细胞有关的状况（例如，胃肠相关癌症，例如结肠直肠癌（CRC））的一种或多种症状；（b）抑制具有表达GUCY2c的恶性肿瘤的主体中的肿瘤生长或进展；（c）抑制具有一种或多种表达GUCY2c的恶性细胞的主体中表达GUCY2c的癌（恶性）细胞的转移；（d）诱导表达GUCY2c的肿瘤的消退（例如，长期消退）；（e）在表达GUCY2c的恶性细胞中发挥细胞毒活性；（f）增加患有GUCY2c有关病症的主体的无进展存活；（g）增加患有GUCY2c有关病症的主体的总存活；（h）减少患有GUCY2c有关病症的主体中额外的化疗剂或细胞毒剂的使用；（i）减少患有GUCY2c有关病症的主体的肿瘤负荷（tumor burden）；或（j）阻断GUCY2c与其他尚待鉴定的因子相互作用。

在一个方面，提供了一种抗体，其包含（a）包含SEQ ID NO: 11、19、26、33、41、48、52、57、60、62、64、65、67、69、71或73中所示的VH序列的VH互补性决定区1（VH CDR1）、VH互补性决定区2（VH CDR2）和VH互补性决定区3（VH CDR3）的重链可变（VH）区；和/或（b）包含SEQID NO: 92、100、104、106、112、119、125、129、134、136、137、138、140、143、145、147、150、152、156、158、160、162、166、170、171、172、173、174或175中所示的VL序列的VL互补性决定区1（VL CDR1）、VL互补性决定区2（VL CDR2）和VL互补性决定区3（VL CDR3）的轻链可变（VL）区。

在另一个方面，提供了具有如表1中所列举的部分重链序列的任一种和/或部分轻链序列的任一种的抗体。在一个实施方案中，本发明提供了包含VH区和/或VL区的抗体，其中：（a）VH区包含SEQ ID NO: 11、19、26、33、41、48、52、57、60、62、64、65、67、69、71或73；和/或（b）VL区包含SEQ ID NO: 92、100、104、106、112、119、125、129、134、136、137、138、140、143、145、147、150、152、156、158、160、162、166、170、171、172、173、174或175。

表1

在表1中，加下划线的序列是根据Kabat的CDR序列，且粗体根据Chothia。AbM定义用于VH CDR1。

本发明还提供了针对GUCY2c的抗体的CDR部分。CDR接触区是使抗体具有对于抗原的特异性的抗体区域。通常，CDR接触区包括在CDRs和Vernier区中的残基位置，其受约束以便维持正确的环结构用于抗体结合特异性抗原。参见，例如，Makabe等人，J. Biol. Chem.,283:1156-1166, 2007。CDR区的测定完全在本领域的技术内。除了VH CDR1之外，本文使用在Abysis的版本2.3.3发布（www.abysis.org）中执行的算法，以将Kabat编号分配给可变区VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3、VH CDR2和VH CDR3。AbM定义用于VH CDR1。

在一个方面，提供了具有如表2中列举的VH CDR序列的任一种和/或VL CDR序列的任一种的抗体。在一个方面，本发明提供了特异性结合鸟苷酸环化酶C（GUCY2c）的抗体，其中所述抗体包含：（a）重链可变（VH）区，其包含（i）包含SEQ ID NO: 12、20、27、34、42、74、257、258、259、260或261的VH互补性决定区1（VH CDR1）；（ii）包含SEQ ID NO: 13、21、28、35、43、53、66、68、70、72、75、262、263、264、265、266或267的VH互补性决定区2（VH CDR2）；和（iii）包含SEQ ID NO: 14、22、29、36或44的VH互补性决定区3（VH CDR3）；和/或（b）轻链可变（VL）区，其包含（i）包含SEQ ID NO: 93、101、105、107、113、120、148、153、163或167的VL互补性决定区1（VL CDR1）；（ii）包含SEQ ID NO: 78、94、102、108、114、141、144、146、149、151、157、159、161、164或168的VL互补性决定区2（VL CDR2）；和（iii）包含SEQ ID NO: 95、109、115、121、142、154、165或169的VH互补性决定区3（VL CDR3）。

在具体的实施方案中，本发明提供了抗体，其中：（a）VH区包含（i）包含SEQ ID NO：74或259的序列的VH CDR1；（ii）包含SEQ ID NO：75或267的序列的VH CDR2；和iii）包含SEQID NO：29的序列的VH CDR3；和/或（b）VL区包含（i）包含SEQ ID NO：148的序列的VL CDR1；（ii）包含SEQ ID NO：149的序列的VL CDR2；和（iii）包含SEQ ID NO：142的序列的VL CDR3。

表2

在一个方面，提供了具有如表3中列举的部分轻链序列的任一种和/或部分重链序列的任一种的抗体。在一个实施方案中，提供了分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合CD3，其中所述抗体包含：VH区，其包含SEQ ID NO：1、9或273中所示的VH序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；和/或VL区，其包含SEQ ID NO: 76、84、90、274、275或276中所示的VL序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。

表3

在表3中，加下划线的序列是根据Kabat的CDR序列，且粗体根据Chothia显示。AbM定义用于VH CDR1。

表4提供了用于本文提供的CD3抗体的CDR序列的实例。

表4

在一个实施方案中，本发明提供了双特异性抗体，其中：（a）GUCY2c VL CDR1包含SEQ ID NO: 93、101、105、107、113、120、148、153、163或167的序列；GUCY2c VL CDR2包含SEQ ID NO: 78、94、102、108、114、141、144、146、149、151、157、159、161、164或168的序列；且GUCY2c VL CDR3包含SEQ ID NO: 95、109、115、121、142、154、165或169的序列；（b）CD3VH CDR1包含SEQ ID NO：2、268或277的序列；CD3 VH CDR2包含SEQ ID NO: 3、10、269或270的序列；且CD3 VH CDR3包含SEQ ID NO：4的序列；（c）CD3 VL CDR1包含SEQ ID NO: 77、85、91、278、279或280的序列；CD3 VL CDR2包含SEQ ID NO：78或281的序列；且CD3 VL CDR3包含SEQ ID NO：79的序列；和（d）GUCY2c VH CDR1包含SEQ ID NO: 12、20、27、34、42、74、257、258、259、260或261的序列；GUCY2c VH CDR2包含SEQ ID NO: 13、21、28、35、43、53、66、68、70、72、75、262、263、264、265、266或267的序列；且GUCY2c VH CDR3包含SEQ ID NO: 14、22、29、36或44的序列。

在一些这种实施方案中，本发明提供了双特异性抗体，其中：（a）GUCY2c VH CDR1包含SEQ ID NO：74或259的序列；（b）GUCY2c VH CDR2包含SEQ ID NO：75或267的序列；（c）GUCY2c VH CDR3包含SEQ ID NO：29的序列；（d）GUCY2c VL CDR1包含SEQ ID NO：148的序列；（e）GUCY2c VL CDR2包含SEQ ID NO：149的序列；且（f）GUCY2c VL CDR3包含SEQ ID NO：142的序列。

在上述每一种的进一步的实施方案中，本发明提供了双特异性抗体，其中：（a）CD3VH CDR1包含SEQ ID NO：2、268或277的序列；（b）CD3 VH CDR2包含SEQ ID NO：10或270的序列；（c）CD3 VH CDR3包含SEQ ID NO：4的序列；（d）CD3 VL CDR1包含SEQ ID NO: 91、278、279或280的序列; （e）CD3 VL CDR2包含SEQ ID NO：78或281的序列；且（f）CD3 VL CDR3包含SEQ ID NO：79的序列。

在特定的实施方案中，本发明提供了多核苷酸，其包含编码如本文以及表5、表37A和表37B中所述的抗体的重链和/或轻链可变区的核苷酸序列，包括：CD3-0001、CD3-0004、CD3-0006、GUCY2C-0074、GUCY2C-0077、GUCY2C-0078、GUCY2C-0098、GUCY2C-0104、GUCY2C-0105、GUCY2C-0240、GUCY2C-0315、GUCY2C-0179、GUCY2C-0193、GUCY2C-0210、GUCY2C-0212、GUCY2C-0241、GUCY2C-0247、GUCY2C-1186、GUCY2C-1467、GUCY2C-1478、GUCY2C-1481、GUCY2C-1512、GUCY2C-1518、GUCY2C-1526、GUCY2C-1527、GUCY2C-1538、GUCY2C-1554、GUCY2C-1555、GUCY2C-1556、GUCY2C-1557、GUCY2C-1590、GUCY2C-1591、GUCY2C-1592、GUCY2C-1608、huIGHV3-7、huIGKV1-39、GUCY2C-0405、GUCY2C-0486、GUCY2C-1640、GUCY2C-0250、GUCY2C-1678、GUCY2C-1679或GUCY2C-1680。

本文详述的序列描述了GUCY2c抗体、CD3抗体和CD3-GUCY2c双特异性抗体。在一些实施方案中，这些抗体通过其克隆ID（例如，GUCY2C-0098）来表示。这些克隆IDs可用于指成熟抗体（例如，IgG或CD3双特异性抗体）。克隆ID也可以指在所述抗体中发现的独特的VH或VL区。对于代表CD3-GUCY2c双特异性抗体的克隆IDs（例如，GUCY2C-0098），在成熟蛋白中可能还并入了独特的抗-CD3抗体区域（例如，VL和/或VH区）。表5显示了在所述成熟蛋白中存在的抗体和抗-CD3区域（如果有的话）的形式。表37A和37B进一步显示了这些成熟的GUCY2c抗体、抗-CD3 IgGs和CD3-GUCY2c双特异性抗体的组成序列。

表5

某些本文提供的CD3抗体可以用不止一种名称来提及。例如，CD3-0001可以称为2B5v1或h2B5v1；CD3-0004可称为2B4或h2B4；且CD3-0006可以称为2B5v6或h2B5v6。

某些本文提供的CD3抗体包括，但不限于，CD3-0006（也称为2B5v6或h2B5v6）的变体。例如，CD3-0006的变体包括，但不限于，2B5-1038、2B5-1039和2B5-1040。

如本文所述的抗体与GUCY2c（例如人GUCY2c（例如，（SEQ ID NO：224、230或232）或与CD3（SEQ ID NO：242）的结合亲和力（K_D）可以为约0.001 nM-约6500 nM。在一些实施方案中，结合亲和力为约6500 nM、6000 nM、5500 nM、4500 nM、4000 nM、3500 nM、3000 nM、2500nM、2000 nM、1500 nM、1000 nM、750 nM、500 nM、400 nM、300 nM、250 nM、200 nM、150 nM、100 nM、75 nM、50 nM、45 nM、40 nM、35 nM、30 nM、25 nM、20 nM、19 nM、17 nM、16 nM、15nM、10 nM、8 nM、7.5 nM、7 nM、6.5 nM、6 nM、5.5 nM、5 nM、4 nM、3 nM、2 nM、1 nM、0.5 nM、0.3 nM、0.1 nM、0.01 nM、0.002 nM或0.001 nM的任何一种。在一些实施方案中，结合亲和力小于约6500 nM、6000 nM、5500 nM、5000 nM、4000 nM、3000 nM、2000 nM、1000 nM、900nM、800 nM、500 nM、250 nM、200 nM、100 nM、50 nM、30 nM、20 nM、10 nM、7.5 nM、7 nM、6.5nM、6 nM、5 nM、4.5 nM、4 nM、3.5 nM、3 nM、2.5 nM、2 nM、1.5 nM、1 nM、0.5 nM、0.1 nM、0.05 nM、0.01 nM或更低nM的任何一种。在某些实施方案中，抗体具有约80至约200 pM，优选约100至约150 pM的K_D。

在一些实施方案中，本发明提供了抗体，其结合GUCY2c和/或CD3并与如本文所述的抗体竞争，包括：CD3-0001、CD3-0004、CD3-0006、GUCY2C-0074、GUCY2C-0077、GUCY2C-0078、GUCY2C-0098、GUCY2C-0104、GUCY2C-0105、GUCY2C-0240、GUCY2C-0315、GUCY2C-0179、GUCY2C-0193、GUCY2C-0210、GUCY2C-0212、GUCY2C-0241、GUCY2C-0247、GUCY2C-1186、GUCY2C-1467、GUCY2C-1478、GUCY2C-1481、GUCY2C-1512、GUCY2C-1518、GUCY2C-1526、GUCY2C-1527、GUCY2C-1538、GUCY2C-1554、GUCY2C-1555、GUCY2C-1556、GUCY2C-1557、GUCY2C-1590、GUCY2C-1591、GUCY2C-1592、GUCY2C-1608、huIGHV3-7、huIGKV1-39、GUCY2C-0405、GUCY2C-0486、GUCY2C-1640、GUCY2C-0250、GUCY2C-1678、GUCY2C-1679和GUCY2C-1680（表5）。

在一个方面，提供了具有如表6中列举的构架区序列的任一种的抗体。在一些实施方案中，本发明提供了如本文所述的抗体，其进一步包含人或人源化的VH构架和人或人源化的VL构架。在一些这这种实施方案中，VH构架包含SEQ ID NO: 5、6、7、8、15、16、17、18、23、24、25、30、31、32、37、38、39、40、45、46、47、49、50、51、54、55、56、58、59、61或63的序列；和/或VL构架包含SEQ ID NO: 80、81、82、83、86、87、88、89、96、97、98、99、103、110、111、116、117、118、122、123、124、126、127、128、130、131、132、133、135、139或155的序列。

表6

在一个实施方案中，本发明提供了抗体，其中VH区包含SEQ ID NO：73的序列或其变体，所述变体具有不在CDR区内的残基中的一个或几个保守氨基酸取代；和/或其中VL区包含SEQ ID NO：147的序列或其变体，所述变体具有不在CDR区内的氨基酸中的一个或几个保守氨基酸取代。

在一个方面，本发明提供了特异性结合GUCY2c和CD3的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体包含第一多肽链和第二多肽链。在一个实施方案中，第一多肽链包含如在SEQID NOs：216和220的一个或多个中所示的氨基酸序列。在另一个实施方案中，第二多肽链包含如在SEQ ID NOs：216和220的一个或多个中所示的氨基酸序列。在优选的实施方案中，第一多肽链包含SEQ ID NO：216的氨基酸序列；且第二多肽链包含SEQ ID NO：220的氨基酸序列。在一些这种实施方案中，能够与GUCY2c的表位和CD3的表位特异性结合的双特异性抗体包含第一多肽链和第二多肽链，其中所述第一多肽链包含SEQ ID NO：216的序列且所述第二多肽链包含SEQ ID NO：220的序列。在一个实施方案中，第二多肽链是将通过界面与第一多肽链缔合的任何多肽。

在一个这种实施方案中，本发明提供了双特异性抗体，其中：（a）第一多肽链在N-末端至C-末端方向包含：（i）结构域1，其包含GUCY2c抗体的VL（GUCY2c VL）和CD3抗体的VH（CD3 VH），和（ii）第一异二聚体促进结构域；和（b）第二多肽链在N-末端至C-末端方向包含：（i）结构域2，其包含抗-CD3抗体的VL（CD3 VL）和GUCY2c抗体的VH（GUCY2c VH），和（ii）第二异二聚体促进结构域；其中GUCY2c VL和GUCY2c VH形成与GUCY2c特异性结合的结构域；且CD3 VL和CD3 VH形成与CD3特异性结合的结构域。

在另一个这种实施方案中，（a）第一多肽链在N-末端至C-末端方向包含：（i）结构域1，其包含CD3 VL和GUCY2c VH，和（ii）第一异二聚体促进结构域；和（b）第二多肽链在N-末端至C-末端方向包含：（i）结构域2，其包含GUCY2c VL和CD3 VH，和（ii）第二异二聚体促进结构域；其中GUCY2c VL和GUCY2c VH形成与GUCY2c特异性结合的结构域；且CD3 VL和CD3VH形成与CD3特异性结合的结构域。

在再另一个这种实施方案中，（a）第一多肽链在N-末端至C-末端方向包含：（i）结构域1，其包含GUCY2c VH和CD3 VL，和（ii）第一异二聚体促进结构域；和（b）第二多肽链在N-末端至C-末端方向包含：（i）结构域2，其包含CD3 VH和GUCY2c VL，和（ii）第二异二聚体促进结构域；其中GUCY2c VH和GUCY2c VL形成与GUCY2c特异性结合的结构域；且CD3 VH和CD3 VL形成与CD3特异性结合的结构域。

本发明还提供了编码本发明抗体的分离的多核苷酸，以及包含所述多核苷酸的载体和宿主细胞。在一个方面，多核苷酸包含编码重链可变区、轻链可变区、CDR区、构架区、杵和臼Fc链、第一多肽链和第二多肽链的核苷酸序列，如在表1-7和38中所列举的。在某些实施方案中，多核苷酸包含编码抗体CD3-0001、CD3-0004、CD3-0006、GUCY2C-0074、GUCY2C-0077、GUCY2C-0078、GUCY2C-0098、GUCY2C-0104、GUCY2C-0105、GUCY2C-0240、GUCY2C-0315、GUCY2C-0179、GUCY2C-0193、GUCY2C-0210、GUCY2C-0212、GUCY2C-0241、GUCY2C-0247、GUCY2C-1186、GUCY2C-1467、GUCY2C-1478、GUCY2C-1481、GUCY2C-1512、GUCY2C-1518、GUCY2C-1526、GUCY2C-1527、GUCY2C-1538、GUCY2C-1554、GUCY2C-1555、GUCY2C-1556、GUCY2C-1557、GUCY2C-1590、GUCY2C-1591、GUCY2C-1592、GUCY2C-1608、huIGHV3-7、huIGKV1-39、GUCY2C-0405、GUCY2C-0486、GUCY2C-1640、GUCY2C-0250、GUCY2C-1678、GUCY2C-1679或GUCY2C-1680的任一种的序列。

可以将编码感兴趣的抗体的序列维持在宿主细胞中的载体中，且然后可以将所述宿主细胞扩充并冷冻用于将来使用。载体（包括表达载体）和宿主细胞在本文中进一步描述。

本发明还包括包含一种或多种来自本发明抗体的片段或区域的融合蛋白。在一个实施方案中，提供了融合多肽，其包含SEQ ID NO: 76、84、90、92、100、104、106、112、119、125、129、134、136、137、138、140、143、145、147、150、152、156、158、160、162、166、170、171、172、173、174、175、274、275或276中所示的可变轻链区的至少10个邻接氨基酸；和/或SEQID NO: 1、9、11、19、26、33、41、48、52、57、60、62、64、65、67、69、71、73或273中所示的可变重链区的至少10个邻接氨基酸。在其他实施方案中，提供了融合多肽，其包含可变轻链区的至少约10个、至少约15个、至少约20个、至少约25个或至少约30个邻接氨基酸和/或可变重链区的至少约10个、至少约15个、至少约20个、至少约25个或至少约30个邻接氨基酸。在另一个实施方案中，融合多肽包含轻链可变区和/或重链可变区，如选自SEQ ID NOs：73和147；69和147；60和138；48和125；或26和106的序列对的任何一种中所示的。在另一个实施方案中，融合多肽包含一个或多个CDR。在又其他实施方案中，融合多肽包含CDR H3（VH CDR3）和/或CDR L3（VL CDR3）。对本发明来说，融合蛋白含有一种或多种抗体和其在天然分子中未附着的另一种氨基酸序列，例如，来自另一区域的异源序列或同源序列。示例性异源序列包括，但不限于，诸如FLAG标签或6His标签的标签。标签是本领域中众所周知的。融合多肽可以通过本领域中已知的方法产生，例如，合成地或重组地。一般，本发明的融合蛋白通过使用本文所述的重组方法制备并表达编码其的多核苷酸来制备，尽管它们也可以通过本领域中已知的其他方法来制备，包括，例如，化学合成。

本发明还包括本发明的抗体的scFv。单链可变区片段通过由使用短的连接肽连接轻链和/或重链可变区来制备（Bird等人, Science 242:423-426, 1988）。连接肽的实例是GGGGSGGGGSGGGGSG（SEQ ID NO: 193），其桥接一个可变区的羧基末端和另一可变区的氨基末端之间的近似3.5 nm。已设计并使用了其它序列的接头（Bird等人, Science 242:423-426, 1988）。接头应当是短的、柔性多肽且优选包含少于约20个氨基酸残基。接头本身又可针对额外的功能来进行修饰，例如附着药物或附着至固相支持体。单链变体可以重组地或合成地产生。对于合成产生scFv，可使用自动合成仪。对于重组产生scFv，可将含有编码scFv的多核苷酸的合适质粒引入合适宿主细胞中，所述宿主细胞为真核的，例如酵母、植物、昆虫或哺乳动物细胞，或原核的，例如大肠杆菌。可通过多核苷酸的常规操纵例如连接来制备编码感兴趣的scFv的多核苷酸。可使用本领域已知的标准蛋白纯化技术来分离作为结果所得到的scFv。

也包括其他形式的单链抗体，例如双抗体或小抗体（minibodies）。双抗体是二价双特异性抗体，其中重链可变（VH）区和轻链可变（VL）区在单条多肽链上表达，但使用太短以致于不能允许在相同链上的两个结构域之间配对的接头，从而迫使所述结构域与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合部位（参见例如，Holliger, P.等人, Proc.Natl. Acad Sci. USA 90: 6444-6448, 1993；Poljak, R. J.等人, Structure 2:1121-1123, 1994）。小抗体包括与免疫球蛋白分子的铰链区和CH3结构域融合的天然抗体的VL和VH区。参见，例如，美国专利5,837,821。

在一个方面，本发明提供了包含本发明的多核苷酸的任一种的组合物（例如药物组合物）。在一些实施方案中，组合物包含表达载体，所述表达载体包含编码本文所述的任何抗体的多核苷酸。在又其他的实施方案中，组合物包含SEQ ID NO：246（编码GUCY2C-1608第一多肽链）和SEQ ID NO：247（编码GUCY2C-1608第二多肽链）中所示的多核苷酸中的任何一种或两种。本文进一步描述了表达载体和多核苷酸组合物的施用。

本发明也包括与任何这种序列互补的多核苷酸。多核苷酸可以是单链的（编码或反义）或双链的，并且可以是DNA（基因组、cDNA或合成的）或RNA分子。RNA分子包括成熟和未成熟mRNAs，例如前体mRNAs（前-mRNA）或核内异质mRNAs（hnRNA）和成熟mRNAs。额外的编码序列或非编码序列可以但不需要存在于本发明的多核苷酸内，并且多核苷酸可以但不需要与其它分子和/或支持材料连接。

多核苷酸可以包含天然序列（即，编码抗体或其一部分的内源序列），或可以包含这种序列的变体。多核苷酸变体含有一个或多个取代、添加、缺失和/或插入，从而使得相对于天然免疫反应性分子，编码的多肽的免疫反应性不减小。通常可以如本文所述评估对编码的多肽的免疫反应性的作用。变体优选表现出与编码天然抗体或其一部分的多核苷酸序列至少约70%的同一性，更优选至少约80%的同一性，又更优选至少约90%的同一性，且最优选至少约95%的同一性。

如果当如下所述对于最大对应进行比对时，两个序列中的核苷酸或氨基酸序列是相同的，则两个多核苷酸或多肽序列被说成是“相同的”。一般通过在比较窗（comparisonwindow）上比较序列以鉴定且比较序列相似性的局部区域，来进行两个序列之间的比较。如本文所用的“比较窗”是指至少约20个邻接位置的区段，通常为30至约75个或40至约50个，其中在两个序列进行最佳比对后，可以将序列与具有相同数目的邻接位置的参考序列进行比较。

使用缺省参数，使用Lasergene生物信息学软件套件（suite）（DNASTAR, Inc.,Madison, WI）中的Megalign程序，可以进行用于比较的序列的最佳比对。优选地，通过在至少20个位置的比较窗上比较两个最佳比对的序列来确定“序列同一性的百分比”，其中比较窗中的多核苷酸或多肽序列的部分可以包含与参考序列（其不包含添加或缺失）相比20%或更少，通常为5至15%，或10至12%的添加或缺失（即，缺口），以用于两个序列的最佳比对。百分比通过以下进行计算：测定在其处相同的核酸碱基或氨基酸残基在两个序列中都出现的位置的数目，以得到匹配的位置数目，将匹配的位置数目除以参考序列中的位置总数目（即，窗口大小），并且将结果乘以100，以得到序列同一性的百分比。

变体也可以或另一方面与天然基因或者其一部分或互补体（complement）基本上同源。这种多核苷酸变体能够在中等严格条件下与编码天然抗体的天然存在的DNA序列（或互补序列）杂交。

本领域普通技术人员将理解，由于遗传密码的简并性的结果，存在编码如本文所述的多肽的许多核苷酸序列。这些多核苷酸中的一些与任何天然基因的核苷酸序列具有最小限度的同源性。然而，本发明特别预期了由于密码子使用中的差异而变化的多核苷酸。进一步地，包含本文提供的多核苷酸序列的基因的等位基因在本发明的范围内。等位基因是由于一种或多种突变（例如核苷酸的缺失、添加和/或取代）的结果而改变的内源基因。所得到的mRNA和蛋白可以但不需要具有改变的结构或功能。可以使用标准技术（例如杂交、扩增和/或数据库序列比较）鉴定等位基因。

在一个方面，本发明提供了制备本文所述的任一种多核苷酸的方法。例如，可以使用化学合成、重组方法或PCR获得本发明的多核苷酸。化学多核苷酸合成的方法是本领域众所周知的，并且无需在本文中详细描述。本领域技术人员可以使用本文提供的序列和商业DNA合成仪，以产生期望的DNA序列。

对于使用重组方法制备多核苷酸，可以将包含期望的序列的多核苷酸插入合适的载体内，并且所述载体本身又可以被引入合适的宿主细胞内用于复制和扩增，如本文进一步讨论的。可以通过本领域已知的任何方法，将多核苷酸插入宿主细胞内。通过直接摄取、胞吞作用、转染、F-接合或电穿孔，通过引入外源多核苷酸来转化细胞。一旦引入，外源多核苷酸就可以作为非整合的载体（例如质粒）维持在细胞内或整合到宿主细胞基因组内。如此扩增的多核苷酸可以通过本领域内众所周知的方法从宿主细胞中分离（例如，Sambrook等人，1989）。

另一方面，PCR允许DNA序列的复制。PCR技术是本领域众所周知的，并且在美国专利Nos. 4,683,195、4,800,159、4,754,065和4,683,202，以及PCR: The Polymerase ChainReaction, Mullis等人编, Birkauswer Press, Boston, 1994中描述。

通过使用在适当载体中的分离的DNA，并且将其插入合适的宿主细胞内，可以获得RNA。当细胞复制并且DNA被转录成RNA时，然后可以使用本领域技术人员众所周知的方法分离RNA，如例如Sambrook等人，1989，上文中所述的。

合适的克隆载体可以根据标准技术构建，或者可以选自本领域中可获得的大量克隆载体。尽管选择的克隆载体可以根据意图使用的宿主细胞而变化，但有用的克隆载体将通常具有自我复制的能力，可能具有用于特定限制性内切核酸酶的单一靶，和/或可能携带对于可以用于选择含有该载体的克隆中的标记的基因。合适的实例包括质粒和细菌病毒，例如，pUC18、pUC19、Bluescript（例如，pBS SK+）及其衍生物、mp18、mp19、pBR322、pMB9、ColE1、pCR1、RP4、噬菌体DNAs以及穿梭载体如pSA3和pAT28。这些和许多其它克隆载体可从商业供应商如BioRad、Strategene和Invitrogen获得。

表达载体通常是可复制的多核苷酸构建体，其含有根据本发明的多核苷酸。暗示表达载体必须可作为附加体或作为染色体DNA的整合部分在宿主细胞中复制。合适的表达载体包括但不限于质粒，病毒载体，包括腺病毒，腺伴随病毒，反转录病毒，黏粒，和PCT公开No. WO87/04462中公开的一种或多种表达载体。载体组分通常可以包括，但不限于，下述中的一种或多种：信号序列；复制起点；一种或多种标记基因；合适的转录控制元件（例如启动子、增强子和终止子）。对于表达（即，翻译），通常还需要一种或多种翻译控制元件，例如核糖体结合位点、翻译起始位点和终止密码子。

含有感兴趣的多核苷酸的载体可以通过许多适当方法中的任一种引入宿主细胞内，所述方法包括电穿孔，采用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、DEAE-葡聚糖或其它物质的转染；微粒轰击；脂转染；以及感染（例如，在载体是传染性病原体例如痘苗病毒的场合）。引入载体或多核苷酸的选择将经常取决于宿主细胞的特征。

能够超表达异源DNAs的任何宿主细胞都可以用于分离编码感兴趣的抗体、多肽或蛋白的基因的目的。哺乳动物宿主细胞的非限制性实例包括但不限于COS、HeLa和CHO细胞。还参见PCT公开号No. WO87/04462。合适的非哺乳动物宿主细胞包括原核生物（例如大肠杆菌或枯草芽孢杆菌（B. subtillis））和酵母（例如啤酒糖酵母（S. cerevisae）、粟酒裂殖糖酵母（S. pombe）或乳克鲁维氏酵母（K. lactis））。优选地，宿主细胞以相应的内源抗体或蛋白GUCY2c的约5倍，更优选地10倍，甚至更优选地20倍的水平表达cDNAs，或通过免疫测定或FACS产生GUCY2c结构域（例如，结构域1-4）。可以鉴定超表达感兴趣的抗体或蛋白的细胞。

在一个方面，GUCY2c抗体分子将具有对于GUCY2c的亲和力，例如，如通过直接结合或竞争结合测定在皮摩尔至微摩尔亲和力范围内、优选地在皮摩尔至低纳摩尔范围内所测量的。

可以使用本文公开的抗体制备双特异性抗体。用于制备双特异性抗体的方法是本领域已知的（参见，例如，Suresh等人，Methods in Enzymology 121:210，1986）。传统上，双特异性抗体的重组产生基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，而两条重链具有不同的特异性（Millstein和Cuello，Nature 305, 537-539, 1983）。

在另一个实施方案中，如本文所述的双特异性抗体包含全长人抗体，其中异二聚体蛋白的抗体可变区能够通过特异性结合位于人免疫效应细胞上的效应抗原（例如，CD3抗原）而募集人免疫效应细胞的活性，且其中异二聚体蛋白的第二抗体可变区能够特异性结合靶抗原。在一些实施方案中，人抗体具有IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。在一些实施方案中，异二聚体蛋白包含免疫学惰性的Fc链。

人免疫效应细胞可以是本领域已知的多种免疫效应细胞的任一种。例如，免疫效应细胞可以是人淋巴样细胞谱系的成员，包括，但不限于，T细胞（例如，细胞毒性T细胞）、B细胞和天然杀伤（NK）细胞。免疫效应细胞还可以是例如但不限于人髓样谱系的成员，包括，但不限于，单核细胞、嗜中性粒细胞和树突细胞。这种免疫效应细胞可以在通过结合效应抗原而活化时对靶细胞具有细胞毒性或凋亡作用或者具有其它期望的作用。

效应抗原是在人免疫效应细胞上表达的抗原（例如，蛋白或多肽）。可以被异二聚体蛋白（例如，异二聚体抗体或双特异性抗体）结合的效应抗原的实例包括，但不限于，人CD3（或CD3（分化簇）复合体）、CD16、NKG2D、NKp46、CD2、CD28、CD25、CD64和CD89。

靶细胞可以是对于人天然的或外源的细胞。在天然靶细胞中，细胞可能已被转化为恶性细胞或病理修饰（例如，被病毒、变形体或细菌感染的天然靶细胞）。在外源的靶细胞中，细胞是侵入病原体，例如细菌、变形体或病毒。

靶抗原在患病状况（例如，炎性疾病、增生性疾病（例如，癌症）、免疫性病症、神经疾病、神经变性疾病、自身免疫病、传染病（例如，病毒感染或寄生物感染）、变态反应、移植物抗宿主疾病或宿主抗移植物疾病）的靶细胞上表达。靶抗原不是效应抗原。靶抗原的实例包括，但不限于，GUCY2c、BCMA、EpCAM（上皮细胞黏附分子）、CCR5（5型趋化因子受体）、CD19、HER（人表皮生长因子受体）-2/neu、HER-3、HER-4、EGFR（表皮生长因子受体）、PSMA、CEA、MUC-1（黏蛋白）、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5AC、MUC5B、MUC7、CIhCG、Lewis-Y、CD20、CD33、CD30、神经节苷脂GD3、9-O-乙酰-GD3、GM2、Globo H、岩藻糖基GM1、Poly SA、GD2、碳酸酐酶IX（MN/CA IX）、CD44v6、Shh（Sonic Hedgehog）、Wue-1、浆细胞抗原、（膜-结合的）IgE、MCSP（黑素瘤硫酸软骨素蛋白聚糖）、CCR8、TNF-α前体、STEAP、间皮素（mesothelin）、A33抗原、PSCA（前列腺干细胞抗原）、Ly-6；桥粒芯蛋白4、E-钙黏着蛋白新表位（neoepitope）、胎儿乙酰胆碱受体、CD25、CA19-9标记、CA-125标记和MIS（缪氏抑制物质）受体II型、sTn（唾液酸化Tn抗原；TAG-72）、FAP（成纤维细胞活化抗原）、内皮唾液酸蛋白、EGFRvIII、LG、SAS和CD63。

在一个实施方案中，本发明提供了双特异性抗体，其中：（a）包含SEQ ID NO: 92、100、104、106、112、119、125、129、134、136、137、138、140、143、145、147、150、152、156、158、160、162、166、170、171、172、173、174或175中所示的序列的GUCY2c VL的GUCY2c VL CDR1、GUCY2c VL CDR2和GUCY2c VL CDR3；（b）包含SEQ ID NOS：1、9或273中所示的序列的CD3 VH的CD3 VH CDR1、CD3 VH CDR2和CD3 VH CDR3；（c）包含SEQ ID NO: 76、84、90或274、275或276中所示的序列的CD3 VL的CD3 VL CDR1、CD3 VL CDR2和CD3 VL CDR3；和/或（d）包含SEQID NO: 11、19、26、33、41、48、52、57、60、62、64、65、67、69、71或73中所示的序列的GUCY2cVH的GUCY2c VH CDR1、GUCY2c VH CDR2和GUCY2c VH CDR3。

在特定的实施方案中，本发明提供了双特异性抗体，其中：（a）GUCY2c VH区包含SEQ ID NO：73的序列；且（b）GUCY2c VL区包含SEQ ID NO：147的序列。

在一些实施方案中，本发明提供了双特异性抗体，其中：（a）GUCY2c VL CDR1包含SEQ ID NO: 93、101、105、107、113、120、148、153、163或167的序列；GUCY2c VL CDR2包含SEQ ID NO: 78、94、102、108、114、141、144、146、149、151、157、159、161、164或168的序列；且GUCY2c VL CDR3包含SEQ ID NO: 95、109、115、121、142、154、165或169的序列；（b）CD3VH CDR1包含SEQ ID NO: 2、268或277的序列；CD3 VH CDR2包含SEQ ID NO: 3、10、269或270的序列；且CD3 VH CDR3包含SEQ ID NO：4的序列；（c）CD3 VL CDR1包含SEQ ID NO: 77、85、91、278、279或280的序列；CD3 VL CDR2包含SEQ ID NO：78或281的序列；且CD3 VL CDR3包含SEQ ID NO：79的序列；且（d）GUCY2c VH CDR1包含SEQ ID NO: 12、20、27、34、42、74、257、258、259、260或261的序列；GUCY2c VH CDR2包含SEQ ID NO: 13、21、28、35、43、53、66、68、70、72、75、262、263、264、265、266或267的序列；且GUCY2c VH CDR3包含SEQ ID NO: 14、22、29、36或44的序列。

在一些实施方案中，可用于本发明的抗体是单克隆抗体，多克隆抗体，抗体片段（例如，Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、Fc等），嵌合抗体，双特异性抗体，异源缀合物（heteroconjugate）抗体，单链（ScFv），其突变体，包含抗体部分（例如，结构域抗体）的融合蛋白，人源化抗体，以及免疫球蛋白分子的任何其他修饰的构型，其包含具有所需特异性的抗原识别位点，包括抗体的糖基化变体、抗体的氨基酸序列变体和共价修饰的抗体。抗体可以是鼠、大鼠、人或任何其他起源的（包括嵌合或人源化抗体）。

在一些实施方案中，如本文所述的GUCY2c或CD3抗体是单克隆抗体。例如，GUCY2c或CD3抗体是人源化单克隆抗体或嵌合单克隆抗体。

本发明包括包含Fc链或结构域或其部分的双特异性抗体。在一些实施方案中，Fc链或一种或多种其部分包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc链的一个或多个恒定结构域（例如，CH2或CH3结构域）。在另一个实施方案中，本发明包括包含Fc链或其部分的分子，其中所述Fc链或其部分包含相对于可比较的野生型Fc链或其部分的至少一种氨基酸修饰（例如取代）。变体Fc区是本领域众所周知的，且主要用于改变包含变体Fc区的抗体的表型，如在本领域众所周知的任一种结合活性或效应子功能测定（例如，ELISA、SPR分析或ADCC）中所测定的。这种变体Fc链或其部分可延长本发明的包含Fc链或其部分的双特异性抗体表现出的血浆半衰期和稳定性。在另一个实施方案中，本发明包括本领域已知的任一Fc变体的用途。

在一个实施方案中，对Fc链的氨基酸进行一种或多种修饰以降低Fc链以及因此本发明的双特异性抗体分子对一种或多种FcγR受体的亲和力和亲合力。在具体实施方案中，本发明包括包含变体Fc链或其部分的双特异性抗体，其中相对于野生型Fc链，所述变体Fc链包含至少一种氨基酸修饰，所述变体Fc区仅结合一种FcγR，其中所述FcγR是FcγRIIIA。在另一个具体实施方案中，本发明包括包含变体Fc链或其部分的双特异性抗体，其中相对于野生型Fc链，所述变体Fc链包含至少一种氨基酸修饰，所述变体Fc区仅结合一种FcγR，其中所述FcγR是FcγRIIA。在另一个具体实施方案中，本发明包括包含变体Fc链或其部分的双特异性抗体，其中相对于野生型Fc链，所述变体Fc链包含至少一种氨基酸修饰，所述变体Fc链仅结合一种FcγR，其中所述FcγR是FcγRIIB。在另一个实施方案中，本发明包括包含变体Fc链的分子，其中相对于不包含Fc链或包含野生型Fc链的分子，所述变体赋予或介导降低的ADCC活性（或其它效应子功能）和/或增加的与FcγRIIB （CD32B）的结合，如使用本领域技术人员已知且本文所述的方法所测量的。

本发明还包括包含来自两种或更多种IgG同种型的结构域或区域的Fc区的用途。如本领域已知的，Fc区的氨基酸修饰可深深地影响Fc-介导的效应子功能和/或结合活性。然而，当在所选择的IgG同种型的背景下实现时，可进一步改进和/或操纵功能特征的这些改变。类似地，通过一种或多种氨基酸修饰可操纵同种型Fc的天然特征。多种IgG同种型（即，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4）由于其铰链和/或Fc区的氨基酸序列中的差异而表现出不同的物理和功能性质，包括血清半衰期、补体结合、FcγR结合亲和力和效应子功能活性（例如ADCC、CDC）。

在一个实施方案中，氨基酸修饰和IgG Fc区基于其相应单独的结合和/或效应子功能活性独立地选择，以人工改造具有期望的特征的双特异性抗体。在特定的实施方案中，已如本文所述或本领域在IgG1的背景下已知的分开地测定氨基酸修饰和IgG铰链/Fc区的结合和/或效应子功能活性。在一个实施方案中，氨基酸修饰和IgG铰链/Fc区展示类似的功能性，例如，在双特异性抗体或其它含Fc的分子（例如，和免疫球蛋白）的背景中降低的ADCC活性（或其它效应子功能）和/或增加的与FcγRIIB的结合。在另一个实施方案中，本发明包括变体Fc区，其包含本领域已知的氨基酸修饰和表现出新性质的所选择的IgG区的组合，在如本文所述独立地测定修饰和/或区域时，所述性质不可检测。

在一些实施方案中，第一异二聚体促进结构域和第二异二聚体促进结构域各自包含包含CH2结构域和CH3结构域的Fc区，其中CH2结构域和/或CH3的每一种的氨基酸序列与野生型Fc区相比包含至少一种氨基酸修饰，以形成杵或臼。

在一些实施方案中，第一异二聚体促进结构域和第二异二聚体促进结构域各自包含CH2结构域和CH3结构域，其中CH2结构域的每一种和/或CH3结构域的每一种的氨基酸序列被修饰以驱动异二聚化和/或稳定双特异性抗体。

在一些这种实施方案中，本发明的双特异性抗体包含第一多肽链上的第一异二聚体促进结构域和第二多肽链上的第二异二聚体促进结构域。合起来看，第一和第二异二聚体促进结构域驱动异二聚化和/或稳定双特异性抗体（例如，通过互补的异二聚体促进结构域上的杵和臼的相互作用）和/或用来稳定双特异性抗体。

在一些实施方案中，第一异二聚体促进结构域和第二异二聚体促进结构域并非两个都是杵或臼；和/或其中所述第一异二聚体促进结构域和所述第二异二聚体促进结构域形成IgG免疫球蛋白Fc区。

在一些实施方案中，第一异二聚体促进结构域可包含Fc链，其具有经修饰以包含杵（突起）或臼（腔）的CH2和/或CH3结构域。在一些这种实施方案中，CH2结构域和/或CH3结构域的氨基酸序列包含至少一种氨基酸修饰，其中：（a）第一异二聚体促进结构域的CH3结构域形成杵；且（b）第二异二聚体促进结构域的CH3结构域形成臼。在另一个这种实施方案中，第一异二聚体促进结构域的CH3结构域包含突变Y349C和/或T366W，以形成杵；且第二异二聚体促进结构域的CH3结构域包含突变S354C、T366S、L368A和/或Y407V，以形成臼，（根据EU索引编号）。在一些具体实施方案中，突变导致降低的效应子功能。

在一些实施方案中，如果第二异二聚体促进结构域包含被修饰以包含臼（腔）的CH2和/或CH3结构域，则第一异二聚体促进结构域可包含包含SEQ ID NO：188的序列的被修饰以包含杵（突起）的CH2和/或CH3结构域。在另一个实施方案中，如果第二异二聚体促进结构域包含被修饰以包含杵（突起）的CH2和/或CH3结构域，则第一异二聚体促进结构域可包含臼（腔）。在上述每一种的特定实施方案中，第一异二聚体促进结构域包含SEQ ID NO：188的序列以形成杵；且其中第二异二聚体促进结构域包含SEQ ID NO：189的序列以形成臼。表7提供了具有本文所述的各种GUCY2c和CD3抗体的GUCY2c双特异性抗体的杵和臼Fc链以及第一多肽链和第二多肽链的氨基酸序列（SEQ ID NOs: 196、197、199、200、202、203、205、206、210、211、216、217、219、220、248、249、282、283、284、285、286 and 287）。

表7

测定抗体与GUCY2c或CD3的结合亲和力的一种方法是通过测量所述抗体的单功能Fab片段的结合亲和力。为了获得单功能性Fab片段，抗体（例如，IgG）可以用木瓜蛋白酶切割或重组表达。抗体的GUCY2c Fab片段的亲和力可以通过表面等离振子共振（BIACORE™3000™表面等离振子共振（SPR）系统，BIACORE™, INC, Piscataway NJ）进行测定，所述表面等离振子共振装备有预固定的（pre-immobilized）链霉抗生物素蛋白传感器芯片（SA）或抗小鼠Fc或抗人Fc，其使用HBS-EP运行缓冲液（0.01M HEPES，pH 7.4，0.15 M NaCl，3 mMEDTA，0.005% v/v表面活性剂P20）。生物素化的或Fc融合人GUCY2c可以稀释到HBS-EP缓冲液中至小于0.5 μg/mL的浓度，并且使用可变的接触时间穿过各个芯片通道注射，以实现两个范围的抗原密度：用于详细的动力学研究的50-200个应答单位（RU）或用于筛选测定的800-1,000 RU。再生研究已显示，在25% v/v乙醇中的25 mM NaOH有效地去除结合的Fab，同时对于超过200次注射保持芯片上的GUCY2c的活性。一般，将纯化的Fab样品的连续稀释物（跨越0.1-10x估计的K_D的浓度）以100 µL/分钟注射1分钟，并且允许最多到2小时的解离时间。使用已知浓度的Fab （如通过氨基酸分析所测定的）作为标准物通过ELISA和/或SDS-PAGE电泳来测定Fab蛋白的浓度。通过使用BIAevaluation程序，将数据总地拟合至1:1郎格缪尔结合模型（Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B., MethodsEnzymology 6. 99-110, 1994），同时获得动力学结合速率（k_on）和解离速率（k_off）。平衡解离常数（K_D）值计算为k_off/k_on。所述规程适合用于测定抗体与任何GUCY2c的结合亲和力，所述GUCY2c包括人GUCY2c、另一种哺乳动物的GUCY2c（例如小鼠GUCY2c、大鼠GUCY2c或灵长类动物GUCY2c）以及不同形式的GUCY2c（例如，糖基化的GUCY2c）。抗体的结合亲和力通常于25℃进行测量，但也可以于37℃进行测量。

如本文所述的抗体可以通过本领域已知的任何方法来制备。对于杂交瘤细胞系的产生，宿主动物的免疫途径和时间表通常与对于抗体刺激和产生确立的和常规的技术一致，如本文进一步所述的。用于产生人和小鼠抗体的一般技术是本领域已知的和/或在本文中描述。

预期可以操纵任何哺乳动物主体，包括人或来自其的抗体产生细胞，以充当用于产生哺乳动物包括人和杂交瘤细胞系的基础。一般，用一定量的免疫原，包括如本文所述的，对宿主动物进行腹膜内、肌内、经口、皮下、足底内（intraplantar）和/或皮内接种。

使用Kohler, B.和Milstein, C., Nature 256:495-497, 1975或如由Buck, D.W.等人, In Vitro, 18:377-381, 1982改进的一般体细胞杂交技术，可以从淋巴细胞和无限增殖化的骨髓瘤细胞制备杂交瘤。可用的骨髓瘤系，包括但不限于X63-Ag8.653和来自Salk Institute, Cell Distribution Center, San Diego, Calif., 美国的那些，可以用于杂交中。通常，所述技术包括使用融合剂例如聚乙二醇，或通过本领域技术人员众所周知的电方法，使骨髓瘤细胞和淋巴样细胞融合。融合后，将细胞与融合介质分离，并且在选择性生长培养基（例如次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷（HAT）培养基）中生长，以消除未杂交的亲本细胞。本文所述的补加或未补加血清的任何培养基都可以用于培养分泌单克隆抗体的杂交瘤。作为细胞融合技术的另一种备择方案，EBV无限增殖化的B细胞可以用于产生本发明的单克隆抗体。如果期望，则将杂交瘤扩充并亚克隆，并且通过常规免疫测定程序（例如，放射免疫测定、酶免疫测定或荧光免疫测定）测定上清液的抗免疫原活性。

可以用作抗体来源的杂交瘤包括产生对GUCY2c、CD3或其部分特异性的单克隆抗体的亲本杂交瘤的所有衍生物，子代细胞。

产生这种抗体的杂交瘤可以使用已知程序在体外或体内生长。如果期望，则可以通过常规的免疫球蛋白纯化程序，例如硫酸铵沉淀、凝胶电泳、透析、层析和超滤，从培养基或体液分离单克隆抗体。例如，通过使制剂在由附着至固相的免疫原制成的吸附剂上运行，并且从免疫原洗脱或释放期望的抗体，可以去除不期望的活性（如果存在的话）。使用双功能试剂或衍生化剂，例如，马来酰亚胺基苯甲酰基磺基琥珀酰亚胺酯（通过半胱氨酸残基缀合）、N-羟基琥珀酰亚胺（通过赖氨酸残基）、戊二醛、琥珀酐、SOCl₂或R¹N=C=NR（其中R和R¹是不同的烷基基团），用与在待免疫的物种中是免疫原性的蛋白（例如，钥孔䗩血蓝蛋白、血清清蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂）缀合的人GUCY2c或CD3或含有靶氨基酸序列的片段免疫宿主动物，可以产生抗体（例如，单克隆抗体）的群体。

如果期望，则可以对感兴趣的抗体（单克隆或多克隆）进行测序，且然后可以将多核苷酸序列克隆到载体内用于表达或繁殖。可以将编码感兴趣的抗体的序列维持在宿主细胞中的载体中，且然后可以将所述宿主细胞扩充且冷冻用于将来的使用。细胞培养中的重组单克隆抗体的产生可以通过本领域已知的方法通过从B细胞克隆抗体基因来进行。参见，例如，Tiller等人, J. Immunol. Methods, 329, 112, 2008；美国专利No. 7,314,622。

在备择方案中，多核苷酸序列可以用于遗传操作，以人源化抗体或改善抗体的亲和力或其它特征。例如，如果抗体用于人的临床试验和治疗中，则恒定区可以被人工改造以更接近地类似人恒定区，以避免免疫应答。可能期望遗传操纵抗体序列，以获得对GUCY2c或CD3的更大亲和力和抑制GUCY2c中的更大功效。

存在使单克隆抗体人源化的四个一般步骤。这些步骤是：（1）测定起始抗体轻和重可变区的核苷酸和预测的氨基酸序列，（2）设计人源化抗体，即，决定在人源化过程期间使用哪种抗体构架区，（3）实际人源化方法/技术，以及（4）人源化抗体的转染和表达。参见，例如，美国专利Nos. 4,816,567；5,807,715；5,866,692；6,331,415；5,530,101；5,693,761；5,693,762；5,585,089；和6,180,370。

已描述了包含衍生自非人免疫球蛋白的抗原结合部位的许多人源化抗体分子，包括具有与人恒定区融合的啮齿类动物或修饰的啮齿类动物V区及其相关CDRs的嵌合抗体。参见，例如，Winter等人，Nature 349:293-299, 1991、Lobuglio等人，Proc. Nat. Acad.Sci. USA 86:4220-4224, 1989、Shaw等人，J Immunol. 138:4534-4538, 1987和Brown等人，Cancer Res. 47:3577-3583, 1987。其它参考文献描述了在与适当的人抗体恒定区融合之前，将啮齿类动物CDRs嫁接到人支持构架区（FR）内。参见，例如，Riechmann等人，Nature 332:323-327, 1988、Verhoeyen等人，Science 239:1534-1536, 1988和Jones等人，Nature 321:522-525, 1986。另一参考文献描述了由重组人工改造的啮齿类动物构架区支持的啮齿类动物CDRs。参见，例如，欧洲公开No. EP0519596。这些“人源化”分子被进行设计以使针对啮齿类动物抗人抗体分子的不需要的免疫应答减至最小，其限制了那些部分在人受体中的治疗应用的持续时间和有效性。例如，可以对抗体恒定区进行人工改造，从而使得其是免疫学惰性的（例如，不触发补体裂解）。参见，例如，PCT申请No. PCT/GB99/01441；英国申请No. 9809951.8。也可以利用的人源化抗体的其它方法由Daugherty等人，Nucl. Acids Res. 19:2471-2476，1991，以及在美国专利Nos. 6,180,377；6,054,297；5,997,867；5,866,692；6,210,671；和6,350,861；以及PCT公开No. WO01/27160中公开。

上文讨论的与人源化抗体相关的一般原理也适用于定制抗体，例如供狗、猫、灵长类动物、马科动物和牛科动物中使用。进一步地，可以组合本文所述的人源化抗体的一个或多个方面，例如，CDR嫁接、构架突变和CDR突变。

在一种变型中，可以通过使用商购可得的小鼠获得全人抗体，所述小鼠已被人工改造以表达特定人免疫球蛋白蛋白。进行设计以产生更期望的（例如，全人抗体）或更稳健的免疫应答的转基因动物也可以用于产生人源化或人抗体。这种技术的实例是来自Abgenix, Inc. （Fremont, CA）的Xenomouse™ 和来自Medarex, Inc.（Princeton, NJ）的HuMAb-Mouse®和TC Mouse™。

在备择方案中，抗体可以使用本领域已知的任何方法来重组制备且表达。在另一个备择方案中，抗体可以通过噬菌体展示技术来重组制备。参见，例如，美国专利Nos. 5,565,332；5,580,717；5,733,743；和6,265,150；以及Winter等人，Annu. Rev. Immunol.12:433-455，1994。另一方面，噬菌体展示技术（McCafferty等人，Nature 348:552-553，1990）可以用于从来自未免疫的供体的免疫球蛋白可变（V）结构域基因谱，在体外产生人抗体和抗体片段。根据所述技术，将抗体V结构域基因符合读框地克隆到丝状噬菌体例如M13或fd的主要或次要外壳蛋白基因内，并且作为功能性抗体片段展示在噬菌体颗粒的表面上。因为丝状颗粒含有噬菌体基因组的单链DNA拷贝，所以基于抗体的功能性质的选择还导致选择编码表现出那些性质的抗体的基因。因此，噬菌体模拟B细胞的一些性质。噬菌体展示可以以多种形式进行；关于综述，参见，例如，Johnson, Kevin S.和Chiswell, DavidJ., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571, 1993。V基因区段的几种来源可以用于噬菌体展示。Clackson等人，Nature 352:624-628，1991，从衍生自免疫的小鼠的脾的V基因的小型随机组合文库分离广泛多样的抗

唑酮抗体。基本上遵循由Mark等人，J.Mol. Biol. 222:581-597，1991或Griffith等人，EMBO J. 12:725-734，1993所述的技术，可以构建来自未免疫的人供体的V基因谱，并且可以分离针对广泛多样的抗原（包括自身抗原）的抗体。在天然免疫应答中，抗体基因以高速率累积突变（体细胞高变）。引入的一些变化将赋予更高的亲和力，并且展示高亲和力表面免疫球蛋白的B细胞在后来的抗原攻击期间被优先复制且分化。所述天然过程可以通过采用称为“链改组”的技术来模拟（Marks等人，Bio/Technol. 10:779-783，1992）。在所述方法中，通过用从未免疫的供体获得的V结构域基因的天然存在的变体谱（谱）序贯地置换重链和轻链V区基因，可以改善通过噬菌体展示获得的“初级”人抗体的亲和力。所述技术允许产生亲和力在pM-nM范围内的抗体和抗体片段。用于制备非常大的噬菌体抗体谱（也称为“最大文库（the mother-of-alllibraries）”）的策略已由Waterhouse等人，Nucl. Acids Res. 21:2265-2266，1993描述。基因改组还可以用于从啮齿类动物抗体衍生人抗体，其中所述人抗体具有与起始啮齿类动物抗体相似的亲和力和特异性。根据也称为“表位印迹”的所述方法，将通过噬菌体展示技术获得的啮齿类动物抗体的重链或轻链V结构域基因置换为人V结构域基因谱，从而产生啮齿类动物-人嵌合体。在抗原上的选择导致分离能够恢复功能性抗原结合部位的人可变区，即，表位支配（印迹）配偶体的选择。当重复该过程以置换剩余的啮齿类动物V结构域时，获得了人抗体（参见PCT公开No. WO93/06213）。与啮齿类动物抗体通过CDR嫁接的传统人源化不同，所述技术提供了完全人抗体，其没有啮齿类动物起源的构架或CDR残基。

抗体可以通过以下进行重组制备：首先从宿主动物分离抗体和抗体产生细胞，获得基因序列，并且使用基因序列以在宿主细胞（例如，CHO细胞）中重组表达抗体。可以采用的另一种方法是在植物（例如，烟草）或转基因乳中表达抗体序列。已公开了用于在植物或乳中重组表达抗体的方法。参见，例如，Peeters等人，Vaccine 19:2756, 2001；Lonberg,N.和D. Huszar Int. Rev. Immunol 13:65, 1995；和Pollock等人, J Immunol Methods231:147, 1999。用于制备抗体的衍生物例如人源化的、单链等的方法是本领域已知的。

免疫测定和流式细胞术分选技术，例如荧光活化细胞分选术（FACS），也可以用于分离对于GUCY2c、CD3或感兴趣的抗原特异性的抗体。

如本文所述的抗体可以与许多不同的固相支持体或载体结合。这种支持体可以是活性的和/或惰性的。众所周知的支持体包括聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、玻璃、天然和改性纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖和磁体。对本发明来说，支持体的特性可以是可溶的或不溶的。本领域技术人员将知道用于结合抗体的其它合适的支持体，或将能够使用常规实验来确定这些。在一些实施方案中，所述支持体包括靶向心肌的部分。

编码单克隆抗体的DNA使用常规程序（例如，通过使用能够特异性结合编码单克隆抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针）容易地分离且测序。杂交瘤细胞充当这种DNA的优选来源。一旦分离，就可以将DNA放置于表达载体（例如PCT公开No. WO87/04462中公开的表达载体）内，然后将所述表达载体转染到否则不产生免疫球蛋白蛋白的宿主细胞（例如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、CHO细胞或骨髓瘤细胞）内，以获得在重组宿主细胞中的单克隆抗体的合成。参见，例如，PCT公开No. WO87/04462。还可以例如通过用人重链和轻链恒定区的编码序列取代同源鼠序列（Morrison等人，Proc. Nat. Acad. Sci. 81:6851，1984），或通过将免疫球蛋白编码序列与非免疫球蛋白多肽的编码序列的全部或部分共价连接，来修饰DNA。以所述方式，制备了具有本文的单克隆抗体的结合特异性的“嵌合”或“杂合”抗体。

可以使用本领域已知的方法来鉴定或表征如本文所述的GUCY2c、CD3或其它抗原抗体，由此检测和/或测量GUCY2c、CD3或其他抗原表达水平的减少。在一些实施方案中，通过使候选剂与GUCY2c一起温育，并且监控结合和/或GUCY2c表达水平的伴随减少，来鉴定GUCY2c抗体。结合测定可以用一种或多种纯化的GUCY2c多肽，或者天然表达或经转染以表达一种或多种GUCY2c多肽的细胞进行。在一个实施方案中，结合测定是竞争性结合测定，其中评价候选抗体与已知的GUCY2c抗体竞争GUCY2c结合的能力。所述测定可以以各种形式，包括ELISA形式进行。

在最初鉴定后，候选GUCY2c、CD3或其它抗原抗体的活性可以通过已知用于测试靶向的生物活性的生物测定进一步确认且改进。另一方面，生物测定可以用于直接筛选候选物。实施例中详细描述了用于鉴定且表征抗体的一些方法。

可以使用本领域众所周知的方法表征GUCY2c、CD3或其它抗原抗体。例如，一种方法是鉴定它与之结合的表位或“表位作图”。本领域中存在已知用于作图且表征蛋白上的表位的位置的许多方法，包括解决抗体-抗原复合体的晶体结构、竞争测定、基因片段表达测定和基于合成肽的测定，如例如Harlow和Lane, Using Antibodies, a LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York,1999的第11章中所述的。在额外的实例中，表位作图可以用于测定抗体结合的序列。表位作图从各种来源商购可得，例如，Pepscan系统（Edelhertweg 15, 8219 PH Lelystad，荷兰）。表位可以是线性表位，即，包含在单个氨基酸序列段中，或由氨基酸的三维相互作用形成的构象表位，所述氨基酸可以不必定包含在单个序列段中。可以分离或合成（例如，重组地）不同长度（例如，至少4-6个氨基酸长）的肽，并且用于与GUCY2c、CD3或其它抗原抗体的结合测定。在另一个实例中，通过使用衍生自GUCY2c、CD3或其它抗原序列的重叠肽，并且测定通过GUCY2c、CD3或其它抗原抗体的结合，可以在系统筛选中测定GUCY2c、CD3或其它抗原抗体与之结合的表位。根据基因片段表达测定，编码GUCY2c、CD3或其它抗原的可读框被随机地或通过特定的遗传构建片段化，并且测定表达的GUCY2c、CD3或其它抗原的片段与待测试的抗体的反应性。基因片段可以例如通过PCR产生，且然后在有放射性氨基酸的情况下，在体外转录并翻译成蛋白。然后通过免疫沉淀和凝胶电泳测定抗体与放射性标记的GUCY2c、CD3或其它抗原片段的结合。某些表位也可以通过使用在噬菌体颗粒的表面上展示的随机肽序列的大型文库（噬菌体文库）来鉴定。另一方面，可以在简单的结合测定中测试确定的重叠肽片段文库与测试抗体的结合。在额外的实例中，可以进行抗原结合结构域的诱变、结构域交换实验和丙氨酸分区诱变，以鉴定对于表位结合需要、足够和/或必需的残基。例如，可以使用突变GUCY2c、CD3或其它抗原进行结构域交换实验，其中GUCY2c、CD3或其它抗原蛋白的各种片段已被置换（交换）为来自另一个物种（例如，小鼠）的GUCY2c的序列、或紧密相关但抗原性不同的蛋白（例如，Trop-1）。通过评估抗体与突变GUCY2c、CD3或其它抗原的结合，可以评估特定GUCY2c、CD3或其它抗原片段对抗体结合的重要性。

可以用于表征GUCY2c、CD3或其它抗原抗体的又另一种方法是使用与其它抗体的竞争测定，所述其它抗体已知结合相同抗原，即，GUCY2c、CD3或其它抗原上的各种片段，以测定GUCY2c、CD3或其它抗原抗体是否分别结合与其它抗体相同的表位。竞争测定是本领域技术人员众所周知的。

表达载体可以用于指导GUCY2c、CD3或其它抗原抗体的表达。本领域技术人员熟悉表达载体的施用，以获得外源蛋白在体内的表达。参见，例如，美国专利号6,436,908；6,413,942；和6,376,471。表达载体的施用包括局部或全身施用，包括注射、经口施用、粒子枪或插入导管的施用，以及局部施用。在另一个实施方案中，将表达载体直接施用于交感干或神经节，或施用到冠状动脉、心房、心室或心包膜内。

也可以使用含有表达载体或亚基因组多核苷酸的治疗组合物的靶向递送。受体介导的DNA递送技术在例如以下中描述：Findeis等人, Trends Biotechnol., 11:202,1993；Chiou等人, Gene Therapeutics: Methods And Applications Of Direct GeneTransfer, J.A. Wolff, 编, 1994；Wu等人, J. Biol. Chem., 263:621, 1988；Wu等人,J. Biol. Chem., 269:542, 1994；Zenke等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:3655,1990；和Wu等人, J. Biol. Chem., 266:338, 1991。含有多核苷酸的治疗组合物以约100ng至约200 mg DNA的范围施用，用于基因治疗规程中的局部施用。约500 ng至约50 mg、约1μg至约2 mg、约5 μg至约500 μg以及约20 µg至约100 µg DNA的浓度范围也可以在基因治疗规程期间使用。可以使用基因递送媒介物来递送治疗用多核苷酸和多肽。基因递送媒介物可以具有病毒或非病毒起源（通常参见，Jolly, Cancer Gene Therapy,1:51, 1994；Kimura, Human Gene Therapy, 5:845, 1994；Connelly, Human Gene Therapy, 1:185,1995；和Kaplitt, Nature Genetics, 6:148, 1994）。可以使用内源哺乳动物或异源启动子来诱导这种编码序列的表达。编码序列的表达可以是组成型的或调节的。

用于递送期望的多核苷酸和在期望的细胞中表达的基于病毒的载体是本领域众所周知的。示例性的基于病毒的媒介物包括，但不限于，重组反转录病毒（参见，例如，PCT公开Nos. WO90/07936；WO94/03622；WO93/25698；WO93/25234；WO93/11230；WO93/10218；WO91/02805；美国专利Nos. 5,219,740和4,777,127；GB专利No. 2,200,651；和EP专利No.EP0 345 242）、基于甲病毒的载体（例如，辛德比斯病毒载体、塞姆利基森林病毒（ATCC VR-67；ATCC VR-1247）、罗斯河病毒（Ross River virus）（ATCC VR-373；ATCC VR-1246）和委内瑞拉马脑炎病毒（ATCC VR-923；ATCC VR-1250；ATCC VR 1249；ATCC VR-532））以及腺伴随病毒（AAV）载体（参见，例如，PCT公开Nos. WO94/12649、WO93/03769；WO93/19191；WO94/28938；WO95/11984和WO95/00655）。也可以采用如Curiel, Hum. Gene Ther., 3:147,1992中所述的，与杀伤的腺病毒连接的DNA的施用。

也可以采用非病毒递送媒介物和方法，包括，但不限于，与单独的杀伤的腺病毒连接或未连接的聚阳离子浓缩DNA（参见，例如，Curiel, Hum. Gene Ther., 3:147, 1992）；配体连接的DNA（参见，例如，Wu, J. Biol. Chem., 264:16985, 1989）；真核细胞递送媒介物细胞（参见，例如，美国专利No. 5,814,482；PCT公开Nos. WO95/07994；WO96/17072；WO95/30763；和WO97/42338）和核电荷中和（nucleic charge neutralization）或与细胞膜融合。也可以采用裸DNA。示例性的裸DNA引入方法在PCT公开No. WO90/11092和美国专利No. 5,580,859中描述。可以充当基因递送媒介物的脂质体在美国专利No. 5,422,120；PCT公开Nos. WO95/13796；WO94/23697；WO91/14445；和欧洲公开EP 0524968中描述。额外的方法在Philip, Mol. Cell Biol., 14:2411, 1994和Woffendin, Proc. Natl. Acad.Sci., 91:1581, 1994中描述。

在一些实施方案中，本发明包括组合物，包括这样的药物组合物，其包含如本文所述或通过所述方法制备且具有本文所述的特征的本发明的抗体。如本文所用的，药物组合物可以包含结合GUCY2c的一种或多种抗体、结合CD3和GUCY2c肿瘤抗原的一种或多种双特异性抗体和/或包含编码一种或多种这些抗体的序列的一种或多种多核苷酸。这些组合物可以进一步包含合适的赋形剂，例如药学上可接受的赋形剂，包括缓冲剂，其是本领域众所周知的。

本发明还提供了制备这些抗体的任一种的方法。本发明的抗体可以通过本领域已知的程序制备。可以通过抗体的蛋白水解或其他降解、通过如上文所述的重组方法（即，单一或融合多肽）或通过化学合成来产生多肽。抗体的多肽，尤其是最多到约50个氨基酸的较短的多肽，可以通过化学合成方便地制备。化学合成方法是本领域已知的并且可商购获得。例如，抗体可以通过采用固相方法的自动多肽合成仪产生。也参见，美国专利Nos. 5,807,715；4,816,567；和6,331,415。

包含两种共价连接的抗体的异源缀合物抗体也在本发明的范围内。这种抗体已经用于将免疫系统细胞靶向不需要的细胞（美国专利No. 4,676,980），以及用于治疗HIV感染（PCT公开Nos. WO91/00360和WO92/200373；和欧洲专利公开EP03089）。异源缀合物抗体可以使用任何方便的交联方法来制备。合适的交联剂和技术是本领域众所周知的，并在美国专利No. 4,676,980中描述。

嵌合或杂合抗体也可以使用合成蛋白化学的已知方法在体外制备，所述方法包括涉及交联剂的那些。例如，可以使用二硫键交换反应（disulfide exchange reaction）或通过形成硫醚键来构建免疫毒素。用于所述目的的合适试剂的实例包括亚氨基硫醇盐（iminothiolate）和 4-巯基丁亚氨酸甲酯（methyl-4-mercaptobutyrimidate）。

在重组人源化抗体中，可以修饰Fcγ部分以避免与Fcγ受体以及补体和免疫系统的相互作用。制备这种抗体的技术在PCT公开WO99/58572中描述。例如，如果抗体用于人中的临床试验和治疗，则恒定区可以被人工改造以更类似于人恒定区以避免免疫应答。参见，例如，美国专利Nos. 5,997,867和5,866,692。

与抗体从中衍生的相应的种系序列相比，如本文所公开的GUCY2c抗体和CD3-GUCY2c双特异性抗体可在重链和轻链可变结构域的构架和/或CDR区域中包含一个或多个氨基酸取代、插入和/或缺失。通过将本文公开的氨基酸序列与可从例如公共抗体序列数据库获得的种系序列进行比较，可以容易地确定这种突变。本发明包括衍生自本文公开的氨基酸序列的任一种的抗体及其抗原结合片段，其中一个或多个构架和/或CDR区域内的一个或多个氨基酸被突变为抗体从中衍生的种系序列的一种或多种相应的残基，或另一种人种系序列的一种或多种相应的残基，或一种或多种相应的种系残基的保守氨基酸取代（这种序列改变在本文中统称为“种系突变”）。从本文公开的重链和轻链可变区序列开始，本领域普通技术人员可以容易地产生包含一种或多种个别种系突变或其组合的多种抗体和抗原结合片段。在某些实施方案中，VH和/或VL结构域内的所有构架和/或CDR残基均突变回抗体从中衍生的原始种系序列中发现的残基。在其他实施方案中，仅某些残基突变回原始种系序列，例如，仅在FR1的最初8个氨基酸内或在FR4的最后8个氨基酸内发现的突变的残基，或仅在CDR1、CDR2或CDR3内发现的突变的残基。在其他实施方案中，一个或多个构架和/或CDR残基被突变为不同种系序列（即，不同于抗体最初从中衍生的种系序列的种系序列）的一种或多种相应的残基。

此外，本发明的抗体可以在构架和/或CDR区域内含有两个或更多个种系突变的任何组合，例如，其中某些个别残基突变为特定种系序列的相应残基，而某些其他不同于原始种系序列的残基被维持或将突变为不同种系序列的相应残基。一旦获得，就可容易地测试含有一种或多种种系突变的抗体和抗原结合片段的一种或多种所期望的性质，例如，提高的结合特异性、增加的结合亲和力、改善的或增强的拮抗性或激动性生物性质（视情况而定）、降低的免疫原性等。以这种一般方式获得的抗体和抗原结合片段包括在本发明内。

本发明还包括GUCY2c抗体和CD3-GUCY2c双特异性抗体，其包含具有一个或多个保守取代的本文公开的HC VR、LC VR和/或CDR氨基酸序列中任一种的变体。例如，本发明包括GUCY2c抗体和CD3-GUCY2c双特异性抗体，其具有相对于HC VR、LC VR和/或CDR氨基酸序列的任一种具有例如10个或更少、8个或更少、6个或更少、4个或更少等的保守氨基酸取代的HC VR、LC VR和/或CDR氨基酸序列，如本文所公开的。

因此，本发明包括对本发明的抗体和多肽的修饰，如本文所述的变体，包括不显著影响其性质的功能上等价的抗体，以及具有增强或降低的活性和/或亲和力的变体。例如，可以使氨基酸序列突变，以获得对GUCY2c和/或CD3具有所期望的结合亲和力的抗体。多肽的修饰是本领域中的常规实践，且无需在本文中详细描述。修饰的多肽的实例包括具有氨基酸残基的保守取代，不显著地有害地改变功能活性或成熟（增强）多肽对于其配体的亲和力的氨基酸的一种或多种缺失或添加，或化学类似物的使用的多肽。

氨基酸序列插入包括长度从一个残基一直到含有一百个或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合，以及单个或多重氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N-末端甲硫氨酰残基的抗体或与附加表位融合的抗体。抗体分子的其它插入变体包括酶或增加抗体在血液循环中的半衰期的多肽与抗体的N-或C-末端的融合。

取代变体使抗体分子中的至少一个氨基酸残基被去除，并且使不同的残基在其位置插入。对于取代诱变最感兴趣的位点包括高变区，但也预期了FR改变。保守取代显示在表8中的“保守取代”标题下。如果这种取代导致生物活性中的改变，则可以引入在表8中命名为“示例性取代”、或如下文关于氨基酸类别进一步描述的更显著改变，并且筛选产物。

表8

抗体的生物性质中的显著修饰通过选择取代来完成，所述取代在其维持下述的作用中显著不同：(a)取代区域中的多肽主链结构，例如，作为片层或螺旋构象，(b)分子在靶位点处的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。天然存在的氨基酸残基基于共同的侧链性质分成组：

(1)非极性的：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；

(2)无电荷的极性的：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；

(3)酸性的(带阴电的)：Asp、Glu；

(4)碱性的(带正阳的)：Lys、Arg；

(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；和

(6)芳族的：Trp、Tyr、Phe、His。

通过将这些类别之一的成员换成另一个类别来制备非保守取代。

一般还可以用丝氨酸取代不与维持抗体的正确构象有关的任何半胱氨酸残基，以改善分子的氧化稳定性并防止异常的交联。相反，可以将一个或多个半胱氨酸键添加到抗体中，以改善其稳定性，特别是当抗体是抗体片段如Fv片段时。

氨基酸修饰可以从改变或修饰一个或多个氨基酸一直到区域（例如可变区）的完全重新设计。可变区中的变化可以改变结合亲和力和/或特异性。在一些实施方案中，在CDR结构域内进行不多于一到五个保守氨基酸取代。在其他实施方案中，在CDR结构域内进行不多于一到三个保守氨基酸取代。在又其他的实施方案中，CDR结构域是VH CDR3和/或VLCDR3。

修饰还包括糖基化和非糖基化的多肽，以及具有其它翻译后修饰的多肽，如例如，用不同糖的糖基化、乙酰化和磷酸化。抗体在其恒定区中的保守位置处被糖基化（Jefferis和Lund, Chem. Immunol. 65:111-128, 1997；Wright和Morrison, TibTECH 15:26-32,1997）。免疫球蛋白的寡糖侧链影响蛋白的功能（Boyd等人, Mol. Immunol. 32:1311-1318, 1996；Wittwe和Howard, Biochem. 29:4175-4180, 1990），以及糖蛋白的部分之间的分子内相互作用，其可以影响构象并呈现糖蛋白的三维表面（Jefferis和Lund, 上文；Wyss和Wagner, Current Opin. Biotech. 7:409-416, 1996）。寡糖还可以用来基于特定的识别结构将给定的糖蛋白靶向某些分子。还已报道抗体的糖基化影响抗体依赖性细胞毒作用（ADCC）。特别地，报道具有四环素调节的β(1,4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III（GnTIII）（催化等分GlcNAc的形成的糖基转移酶）表达的CHO细胞具有改善的ADCC活性（Umana等人,Mature Biotech. 17:176-180, 1999）。

抗体的糖基化一般是N联或O联的。N联是指碳水化合物部分附着至天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸、天冬酰胺-X-苏氨酸和天冬酰胺-X-半胱氨酸（其中X是除了脯氨酸以外的任何氨基酸）是用于碳水化合物部分酶促附着至天冬酰胺侧链的识别序列。因此，多肽中的这些三肽序列中任一种的存在产生潜在的糖基化位点。O联糖基化是指糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一与羟基氨基酸的附着，所述羟基氨基酸最通常为丝氨酸或苏氨酸，尽管也可以使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。

通过改变氨基酸序列，从而使得其含有上述三肽序列中的一种或多种（对于N联糖基化位点），方便地完成糖基化位点至抗体的添加。也可以通过向原始抗体的序列中添加或取代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来进行改变（对于O联糖基化位点）。

也可以在不改变作为基础的核苷酸序列的情况下改变抗体的糖基化模式。糖基化主要取决于用于表达抗体的宿主细胞。由于用于表达作为潜在治疗剂的重组糖蛋白例如抗体的细胞类型很少是天然细胞，所以可以预期抗体的糖基化模式中的变化（参见，例如，Hse等人, J. Biol. Chem. 272:9062-9070, 1997）。

除宿主细胞的选择之外，在抗体的重组生产过程中影响糖基化的因素还包括生长模式、培养基配方、培养密度、氧合、pH、纯化方案等等。已提出了各种方法以改变在特定宿主生物中实现的糖基化模式，包括引入或超表达与寡糖生产有关的某些酶（美国专利Nos.5,047,335；5,510,261和5,278,299）。例如，使用内切糖苷酶H（Endo H）、N-糖苷酶F、内切糖苷酶F1、内切糖苷酶F2、内切糖苷酶F3，可以从糖蛋白中酶促去除糖基化或某些类型的糖基化。另外，重组宿主细胞可以被基因工程改造，以在加工某些类型的多糖中是缺陷的。这些技术和类似技术是本领域众所周知的。

其他修饰方法包括使用本领域已知的偶联技术，包括，但不限于，酶促手段、氧化取代和螯合。修饰可以用于例如标记的附着用于免疫测定。修饰的多肽使用本领域已确立的程序制备，并且可以使用本领域已知的标准测定进行筛选，其中一些在下文和实施例中进行描述。

在本发明的一些实施方案中，抗体包含修饰的恒定区，例如这样的恒定区，其对人Fcγ受体具有增加的亲和力，是免疫学惰性或部分惰性的，例如，不触发补体介导的裂解，不刺激依赖抗体的细胞毒性（ADCC），或不激活巨噬细胞；或在以下任何一种或多种中具有降低的活性（与未修饰的抗体相比）：触发补体介导的裂解、刺激依赖抗体的细胞毒性（ADCC）或激活小胶质细胞。恒定区的不同修饰可用于实现效应子功能的最佳水平和/或组合。参见，例如，Morgan等人, Immunology 86:319-324, 1995；Lund等人, J. Immunology157:4963-9 157:4963-4969, 1996；Idusogie等人, J. Immunology 164:4178-4184,2000；Tao等人, J. Immunology 143: 2595-2601, 1989；和Jefferis等人,Immunological Reviews 163:59-76, 1998。在一些实施方案中，恒定区如Eur. J.Immunol., 29:2613-2624, 1999；PCT申请No. PCT/GB99/01441；和/或英国申请No.9809951.8中所述进行修饰。在又其他的实施方案中，恒定区被脱糖基化（aglycosylated）以用于N联糖基化。在一些实施方案中，通过突变恒定区中作为N-糖基化识别序列的一部分的糖基化的氨基酸残基或侧翼残基，将恒定区脱糖基化以用于N联糖基化。例如，N-糖基化位点N297可以突变为A、Q、K或H。参见，Tao等人, J. Immunology 143: 2595-2601, 1989；和Jefferis等人, Immunological Reviews 163:59-76, 1998。在一些实施方案中，恒定区被脱糖基化以用于N联糖基化。恒定区可被酶促地（例如通过酶肽-N糖苷酶（PNGase）去除碳水化合物），或通过在糖基化缺陷的宿主细胞中表达来脱糖基化以用于N联糖基化。

其他抗体修饰包括已如PCT公开No. WO99/58572中所述进行修饰的抗体。除针对靶分子的结合结构域以外，这些抗体还包含效应子结构域，其具有与人免疫球蛋白重链的恒定区的全部或部分基本上同源的氨基酸序列。这些抗体能够在不触发显著的补体依赖性裂解或细胞介导的靶破坏的情况下结合靶分子。在一些实施方案中，效应子结构域能够特异性结合FcRn和/或FcγRIIb。这些一般基于衍生自两种或更多种人免疫球蛋白重链CH2结构域的嵌合结构域。以所述方式修饰的抗体特别适合用于长期抗体疗法中，以避免炎症及对常规抗体疗法的其他不利反应。

本发明包括亲和力成熟的实施方案。例如，亲和力成熟的抗体可以通过本领域已知的程序产生（Marks等人, Bio/Technology, 10:779-783, 1992；Barbas等人, ProcNat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813, 1994；Schier等人, Gene, 169:147-155, 1995；Yelton等人, J. Immunol., 155:1994-2004, 1995；Jackson等人, J. Immunol., 154(7):3310-9, 1995，Hawkins等人, J. Mol. Biol., 226:889-896, 1992；和PCT公开No.WO04/058184）。

下述方法可以用于调节抗体的亲和力和表征CDR。表征抗体的CDR和/或改变（例如改善）多肽例如抗体的结合亲和力的一种方式称为“文库扫描诱变”。通常，文库扫描诱变如下所述运行。使用本领域公认的方法，用两种或更多种（例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种）氨基酸置换CDR中的一个或多个氨基酸位置。这产生小的克隆文库(在一些实施方案中，对于所分析的每个氨基酸位置一个克隆)，所述克隆各自具有两个或更多个成员的复杂度(如果在每个位置处取代两种或更多种氨基酸的话)。通常，文库还包括包含天然(未取代的)氨基酸的克隆。对来自每个文库的少量克隆，例如，约20-80个克隆(取决于文库的复杂度)，进行与靶多肽(或其它结合靶)的结合亲和力的筛选，并且鉴定具有增加的结合、相同的结合、降低的结合或无结合的候选物。用于测定结合亲和力的方法是本领域众所周知的。可以使用BIACORE™表面等离振子共振分析来测定结合亲和力，所述分析检测结合亲和力中约2倍或更大的差异。当起始抗体已经以相对高的亲和力(例如约10 nM或更低的K_D)结合时，BIACORE™是特别有用的。在本文的实施例中描述了使用BIACORE™表面等离振子共振的筛选。

结合亲和力可以使用Kinexa Biocensor、闪烁亲近测定、ELISA、ORIGEN免疫测定(IGEN)、荧光猝灭、荧光转移和/或酵母展示来测定。结合亲和力也可以使用合适的生物测定进行筛选。

在一些实施方案中，使用本领域公认的诱变方法(其中的一些在本文中描述)，用所有20种天然氨基酸置换(在一些实施方案中，一次一个)CDR中的每个氨基酸位置。这产生了小的克隆文库(在一些实施方案中，对于所分析的每个氨基酸位置一个克隆)，所述克隆各自具有20个成员的复杂度(如果在每个位置处取代所有20种氨基酸的话)。

在一些实施方案中，待筛选的文库包含在两个或更多个位置中的取代，所述位置可以在相同的CDR中或者在两个或更多个CDRs中。因此，文库可以包含在一个CDR中的两个或更多个位置处的取代。文库可以包含在两个或更多个CDRs中的两个或更多个位置处的取代。文库可以包含在3、4、5个或更多个位置中的取代，所述位置在两个、三个、四个、五个或六个CDRs中发现。可以使用低冗余密码子来制备取代。参见，例如，Balint等人, Gene 137(1):109-18, 1993的表2。

可以对具有改善结合的候选物进行测序，从而鉴定导致改善的亲和力的CDR取代突变体(也称为“改善的”取代)。还可以对结合的候选物进行测序，从而鉴定保持结合的CDR取代。

可以进行多轮筛选。例如，具有改善结合的候选物(所述候选物各自包含在一个或多个CDR的一个或多个位置处的氨基酸取代)也可用于设计第二文库，所述第二文库至少含有在每个改善的CDR位置(即，CDR中的氨基酸位置，在所述位置处取代突变体显示改善的结合)处的原始和取代的氨基酸。所述文库的制备和筛选或选择在下文进一步讨论。

由于具有改善的结合、相同的结合、降低的结合或无结合的克隆的频率还提供了与每个氨基酸位置对于抗体-抗原复合体的稳定性的重要性有关的信息，文库扫描诱变还提供了用于表征CDR的手段。例如，如果在改变为所有20种氨基酸时CDR的位置保持结合，则所述位置被鉴定为不太可能是抗原结合所需要的。相反，如果CDR的位置仅在小百分比的取代中保持结合，则所述位置被鉴定为对CDR功能重要的位置。因此，文库扫描诱变方法产生了关于CDRs中可以被改变为许多不同氨基酸(包括所有20种氨基酸)的位置，以及CDR中不能被改变或只能被改变为几个氨基酸的位置的信息。

具有改善的亲和力的候选物可以组合在第二文库中，所述第二文库包括改善的氨基酸、在所述位置处的原始氨基酸，并且可以进一步包括在所述位置处的额外取代，取决于所期望的或者使用所期望的筛选或选择方法允许的文库的复杂度。另外，如果需要，则可以将相邻氨基酸位置随机化为至少两种或更多种氨基酸。相邻氨基酸的随机化可以允许突变CDR中的额外的构象灵活度，其本身又可以允许或促进大量改善突变的引入。文库还可以包含在第一轮筛选中未显示出改善的亲和力的位置处的取代。

使用本领域已知的任何方法，对第二文库进行具有改善的和/或改变的结合亲和力的文库成员的筛选或选择，包括使用BIACORE™表面等离振子共振分析的筛选，以及使用本领域已知的用于选择的任何方法的选择，所述方法包括噬菌体展示、酵母展示和核糖体展示。

本发明还提供了包含缀合（例如连接）至促进与固相支持体（例如生物素或抗生物素蛋白）的偶联的试剂的抗体的组合物。为了简单起见，通常将参考抗体，条件是这些方法适用于本文所述的GUCY2c抗体实施方案的任一种。缀合一般是指连接如本文所述的这些组分。可以以多种方式来实现连接（其一般将这些组分以至少用于施用的贴近结合固定在一起）。例如，当试剂和抗体各自具有能够彼此反应的取代基时，在试剂和抗体之间的直接反应是可能的。例如，在一个上的亲核基团，例如氨基或巯基，可能能够与另一个上的含羰基基团例如酐或酰基卤，或者含有良好离去基团（例如，卤化物）的烷基基团反应。

在某些实施方案中，作为第一个步骤，选择第一和第二多肽（以及形成双特异性抗体的任何额外的多肽）。通常，如本文所定义的，编码这些多肽的核酸需要被分离，以便可以对其进行改变以编码杵或臼，或两者。然而，可以使用合成手段来引入突变，例如，通过使用肽合成仪。同样，在取代的残基是非天然残基的情况下，Noren等人，上文的方法是制备具有这种取代的多肽可以采用的。另外，双特异性抗体的一部分适当地在细胞培养物中重组制备，且分子的一个或多个其他部分通过上述那些技术制备。

用于分离抗体和制备双特异性抗体的技术如下。然而，将理解的是，双特异性抗体可以使用本领域已知的技术由其他多肽形成或并入其他多肽。例如，可以从由被认为具有多肽mRNA并以可检测的水平表达其的组织制备的cDNA文库分离编码感兴趣的多肽（例如，配体、受体或酶）的核酸。用进行设计以鉴定感兴趣的基因或由其编码的蛋白的探针（例如抗体或约20-80个碱基的寡核苷酸）筛选文库。可以使用如Sambrook等人, MolecularCloning: A Laboratory Manual（New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989）的第10-12章中所述的标准程序，进行用选择的探针对cDNA或基因组文库的筛选。

如以前所述的，双特异性抗体是指两条或更多条多肽链的复合体，每条多肽链包含至少一个抗体VL区和一个抗体VH区或其片段，其中每条多肽链中的VL和VH区均来自不同的抗体。在特定方面，双特异性抗体包括含有VL和VH区两者的多肽链的二聚体或四聚体。构成多聚体蛋白的各条多肽链可以通过链间二硫键与多聚体的至少一个其他肽共价连接。

本发明的双特异性抗体同时靶向T细胞（CD3）和肿瘤细胞（GUCY2c），并成功地指导和激活对于表达GUCY2c的肿瘤细胞的T细胞细胞毒性。

双特异性抗体的每条多肽链包含VL区和VH区，其可以通过接头共价连接，其中所述接头是包含甘氨酸和丝氨酸残基的甘氨酸-丝氨酸接头，从而使得抗体结合结构域被约束免于自组装。在特定的实施方案中，甘氨酸-丝氨酸接头是包含SEQ ID NO：190的序列的接头1。此外，每条多肽链都包含异二聚化结构域，其促进多条多肽链的异二聚化和/或稳定化并降低不同多肽链的同二聚化的可能性。异二聚化结构域可以位于多肽链的N-末端或C-末端。异二聚化结构域可以包含长度为1、2、3、4、5、6或更多个氨基酸残基的半胱氨酸接头（接头2）。两条多肽链的相互作用可产生两个VL/VH配对，从而形成两个表位结合结构域，即，二价分子。VH或VL区既不约束在多肽链内的任何位置，即，被限制在氨基末端或羧基末端，也不以它们彼此的相对位置限制所述区域，即，VL区可以在VH区N-末端，且反之亦然。唯一的限制是可获得互补的多肽链以形成功能性双特异性抗体。在VL和VH区衍生自对不同抗原特异的抗体的场合，功能性双特异性抗体的形成需要两条不同多肽链的相互作用，即，异二聚体的形成。相反，在两条不同的多肽链自由相互作用的场合，例如，在重组表达系统中，一条包含VLA和VHB（A为第一表位，且B为第二表位），且另一条包含VLB和VHA，可以形成两个不同的结合部位：VLA-VHA和VLB-VHB。对于所有双特异性抗体多肽链对，两条链的错排或错结合是一种可能性，例如，VL-VL或VH-VH区的相互作用。然而，使用本领域已知的或本文例示的任何基于亲和力的方法，例如，亲和层析，基于正确二聚化的结合位点的免疫特异性，可以容易地处理功能性双特异性抗体的纯化。

在一个实施方案中，双特异性抗体的多肽链可包含各种接头和肽。接头和肽可以为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9个或更多个氨基酸。在一些实施方案中，GUCY2c VL和CD3 VH通过接头1或接头2链接；且CD3 VL和GUCY2c VH通过接头1或接头2链接。在一些这种实施方案中，接头1包含SEQ ID NO：190的序列。在其他实施方案中，接头2包含SEQ ID NO：191的序列。

在一些实施方案中，结构域1通过半胱氨酸接头共价结合至第一异二聚体促进结构域，并且结构域2通过半胱氨酸接头共价结合至第二异二聚体促进结构域。半胱氨酸接头各自包括至少一个半胱氨酸残基，以允许分子内二硫键键合。在前述每一种的进一步的实施方案中，半胱氨酸接头包含至少五个氨基酸。在一些这种实施方案中，半胱氨酸接头是包含SEQ ID NO：192的序列的接头3。

在一些实施方案中，第一多肽链通过至少一个二硫键共价结合至第二多肽链。在一些这种实施方案中，在第一多肽链的接头3和第二多肽链的接头3之间形成至少一个二硫键。在另一个这种实施方案中，在第一异二聚体促进结构域和第二异二聚体促进结构域之间形成至少一个二硫键。在特定的实施方案中，每个二硫键都通过连接两个半胱氨酸残基形成。

本发明的双特异性抗体可以同时结合两个单独且不同的表位。在某些实施方案中，至少一个表位结合部位对于在免疫效应细胞上表达的例如在T淋巴细胞上表达的CD3决定簇是特异性的。在一个实施方案中，双特异性抗体分子结合效应细胞决定簇并且还激活效应细胞。

在特定的实施方案中，本发明的双特异性抗体（a）结合人GUCY2c的胞外域；（b）显示30分钟至100天的延长的血清和肿瘤半衰期；和/或（c）在有增加的GUCY2c表达水平或增加的受体密度水平的情况下，显示0.0001 nM至100 nM的较低EC₅₀值。

在一个实施方案中，表位结合结构域能够结合GUCY2c肿瘤相关抗原，其与乳腺癌、卵巢癌、甲状腺癌、前列腺癌、宫颈癌、肺癌（包括但不限于非小细胞肺癌和小细胞肺癌）、膀胱癌、子宫内膜癌、头和颈癌、睾丸癌和成胶质细胞瘤癌相关。在某些实施方案中，所述癌症是选自食道、胃、小肠、结肠、直肠、肛门、肝、胆囊、阑尾、胆管和胰的消化系统的癌症。在特定的实施方案中，疗法激活溶细胞性T细胞应答。

本发明的双特异性抗体包含通常衍生自免疫球蛋白或抗体的抗原结合结构域。衍生出用于本发明方法中的结合结构域的抗体可以来自任何动物起源，包括鸟类和哺乳动物（例如，人、非人灵长类动物、鼠、驴、绵羊、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马或鸡）。优选地，抗体是人或人源化单克隆抗体。

本发明的双特异性抗体可以以多种方式表征。特别地，可以测定本发明的分子免疫特异性结合抗原的能力。然后，可以对已鉴定为与抗原免疫特异性结合的分子进行它们对于抗原的特异性和亲和力的测定。

可以使用本领域众所周知的多种方法来产生本发明的双特异性抗体，包括从头蛋白合成和编码结合蛋白的核酸的重组表达。所期望的核酸序列可以通过重组方法（例如，所期望的多核苷酸的较早制备的变体的PCR诱变）或通过固相DNA合成来产生。通常使用重组表达方法。在一个方面，本发明提供了包含编码CD3 VH和/或VL的序列的多核苷酸；在另一个方面，本发明提供了包含编码GUCY2c VH和/或VL的序列的多核苷酸。由于遗传密码的简并性，多种核酸序列编码每种免疫球蛋白氨基酸序列，并且本发明包括编码本文所述结合蛋白的所有核酸。

本发明的双特异性抗体可以包含两个结合靶抗原和CD3的scFv结构域，其融合到IgG的Fc结构域。在本发明的一个实施方案中，双特异性抗体包含两个结合GUCY2c和CD3ε的scFv结构域，其融合到IgG1的Fc结构域。特别地，图1A、1B、1C和1D显示了CD3-GUCY2c双特异性抗体的四种备择表示法。双特异性抗体包含第一异二聚体促进和第二异二聚体促进结构域。每个第一异二聚体促进和第二异二聚体促进结构域都可包含免疫球蛋白Fc区的CH2结构域和/或CH3结构域，其中所述CH2结构域和/或CH3结构域已被改变以包含杵（突起）或臼（腔）。双特异性抗体的Fc部分的修饰在下文描述。

在本发明的方面，如图1A、1B、1C和1D中所示的，双特异性抗体包含第一多肽链和第二多肽链。

在一个方面，本发明提供了如本文进一步描述的双特异性抗体，其中：（a）第一多肽链在N-末端至C-末端方向包含：（i）结构域1，其包含GUCY2c抗体的VL（GUCY2c VL）和CD3抗体的VH （CD3 VH），和（ii）第一异二聚体促进结构域；和（b）第二多肽链在N-末端至C-末端方向包含：（i）结构域2，其包含CD3抗体的VL（CD3 VL）和GUCY2c抗体的VH（GUCY2c VH），和（ii）第二异二聚体促进结构域。

在另一个方面，本发明提供了如本文描述的双特异性抗体，其中：（a）第一多肽链在N-末端至C-末端方向包含：（i）结构域1，其包含CD3 VL和GUCY2c VH，和（ii）第一异二聚体促进结构域；和（b）第二多肽链在N-末端至C-末端方向包含：（i）结构域2，其包含GUCY2cVL和CD3 VH，和（ii）第二异二聚体促进结构域。

在又另一个方面，本发明提供了如本文描述的双特异性抗体，其中：（a）第一多肽链在N-末端至C-末端方向包含：（i）结构域1，其包含GUCY2c VH和CD3 VL，和（ii）第一异二聚体促进结构域；和（b）第二多肽链在N-末端至C-末端方向包含：（i）结构域2，其包含CD3VH和GUCY2c VL，和（ii）第二异二聚体促进结构域。

在另一个方面，本发明提供了如本文描述的双特异性抗体，其中：（a）第一多肽链在N-末端至C-末端方向包含：（i）结构域1，其包含CD3 VH和GUCY2c VL，和（ii）第一异二聚体促进结构域；和（b）第二多肽链在N-末端至C-末端方向包含：（i）结构域2，其包含GUCY2cVH和CD3 VL，和（ii）第二异二聚体促进结构域。

在上述的一些实施方案中，GUCY2c VL和GUCY2c VH形成与GUCY2c特异性结合的结构域；且CD3 VL和CD3 VH形成与CD3特异性结合的结构域。

在特定的实施方案中，本发明的双特异性抗体包含（a）包含SEQ ID NO：74的序列的GUCY2c VH CDR1；（b）包含SEQ ID NO：75的序列的GUCY2c VH CDR2；（c）包含SEQ ID NO：29的序列的GUCY2c VH CDR3；（d）包含SEQ ID NO：148的序列的GUCY2c VL CDR1；（e）包含SEQ ID NO：149的序列的GUCY2c VL CDR2；和（f）包含SEQ ID NO：142的序列的GUCY2c VLCDR3。

在另外的实施方案中，本发明提供了双特异性抗体，其包含：（a）包含SEQ ID NO：2的序列的CD3 VH CDR1；（b）包含SEQ ID NO：3或10的序列的CD3 VH CDR2；（c）包含SEQ IDNO：4的序列的CD3 VH CDR3；（d）包含SEQ ID NO: 77、85或91的序列的CD3 VL CDR1；（e）包含SEQ ID NO：78的CD3 VL CDR2；和（f）包含SEQ ID NO：79的序列的CD3 VL CDR3。

在特定的实施方案中，本发明提供了双特异性抗体，其包含：（a）包含SEQ ID NO：2的序列的CD3 VH CDR1；（b）包含SEQ ID NO：10的序列的CD3 VH CDR2；（c）包含SEQ ID NO：4的序列的CD3 VH CDR3；（d）包含SEQ ID NO：91的序列的CD3 VL CDR1；（e）包含SEQ ID NO：78的序列的CD3 VL CDR2；和（f）包含SEQ ID NO：79的序列的CD3 VL CDR3。

在本发明的另一个方面，接头3可以包含在至少一个甘氨酸残基位于下铰链区之前的情况下的具有序列GCPPCP（SEQ ID NO: 192）的截短的人IgG1下铰链区。

在一个方面，第一异二聚体促进结构域可以包含具有CH2和/或CH3结构域的Fc链，所述CH2和/或CH3结构域被改变以包含包含SEQ ID NO: 188、196、199、202、205、210、216或248、282、284或286的序列的杵Fc链（突起）；或包含SEQ ID NO: 189、197、200、203、206、211、217、220、249、283、285或287的序列的臼Fc链（腔）。在另一个方面，第二异二聚体促进结构域可以包含具有CH2和/或CH3结构域的Fc链，所述CH2和/或CH3结构域被改变以包含包含SEQ ID NO: 188、196、199、202、205、210、216或248、282、284或286的序列的杵Fc链（突起），如果这种第一异二聚体区域包含臼Fc链（腔）的话，或包含SEQ ID NO: 189、197、200、203、206、211、217、220、249、283、285或287的序列的臼Fc链（腔），如果这种第一异二聚体区域包含杵Fc链（突起）的话（表7）。

表9提供了具有本文所述的各种GUCY2c和CD3抗体的双特异性抗体的第一多肽链和第二多肽链的核酸序列。SEQ ID NOs：246和247提供了如本文所用的相应核苷酸序列。

表9

人IgG1 CH2-CH3中的效应子无效突变

使用标准引物指导的PCR诱变，修饰人IgG1的Fc链以引入突变L234A、L235A和G237A（SEQ ID NO：187，根据EU索引编号），以消除（oblate）归因于与FcγRIII结合的效应子功能，从而提供了效应子功能无效表型（Canfield等人, J. Exp. Med (1991) 173:1483-1491；Shields等人, J. Biol. Chem. (2001) 276:6591-604）。

人IgG1 CH2-CH3中的杵臼突变

杵臼是本领域中已知的用于人工改造抗体重链同二聚体以用于异二聚化的有效设计策略。在所述方法中，通过在IgG1的Fc链的一条链中用较大的氨基酸置换小的氨基酸，例如，Y349C和T366W（根据EU索引编号），获得了‘杵’变体。对‘杵’进行设计以插入通过用较小的残基置换大的残基例如S354C、T366S、L368A和Y407V（根据EU索引编号）产生的Fc链互补链的CH3结构域的‘臼’中。

在一些实施方案中，引入互补突变以得到作为结果而产生的Fc链的异二聚体化，从而使得每条Fc链将携带一组突变，对于杵（或突起）Fc链的Y349C和T366W（SEQ ID NO：188），或对于臼（或腔）Fc链的S354C、T366S、L368A和Y407V（SEQ ID NO：189），如表10中所提供的。当共转染到合适的哺乳动物宿主中时，编码氨基酸序列的DNA例如SEQ ID NOs：246和247产生Fc结构域，其以具有与一条臼（或腔）Fc结构域结合的一条杵（或突起）Fc链的双特异性抗体为主。

表10

本发明的CD3-GUCY2c双特异性抗体是在热稳定性研究中针对聚集稳定的，且是靶向人CD3和GUCY2c两者的有效的双特异性抗体-Fc融合物。杵臼Fc结构域允许在CHO细胞中改善的表达和改善的纯化，从而导致所期望的异二聚体的高纯度。Fc结构域内人工改造的突变取消了FcγR结合，因此潜在地避免了ADCC介导的T细胞排除。进一步地，如差示扫描量热法（DSC）所示的，将Fc结构域并入双特异性抗体中增强了分子的稳定性。

可以将双特异性抗体人工改造以包含至少一个半胱氨酸残基，其可以与本发明的另一条多肽链上的对应物半胱氨酸残基相互作用以形成链间二硫键。链间二硫键可用于稳定双特异性抗体，从而改善在重组系统中的表达和回收，从而结果产生稳定和一致的制剂，以及改善分离和/或纯化的产物在体内的稳定性。一个或多个半胱氨酸残基可以作为单个氨基酸或作为较大氨基酸序列例如铰链区的一部分引入多肽链的任何部分中。在具体方面，至少一个半胱氨酸残基被人工改造以出现在多肽链的C-末端。

在一个方面，本发明提供了双特异性抗体，其与GUCY2c特异性结合并与如本文所公开的双特异性抗体竞争结合。在一些这种实施方案中，双特异性抗体特异性结合GUCY2c的表位。

在一个方面，本发明提供了特异性结合GUCY2c和CD3的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体包括第一多肽链和第二多肽链，并且其中：（a）第一多肽链以N-末端至C-末端方向以下述顺序包含下述区域：抗-GUCY2c抗体的VL（GUCY2c VL）（SEQ ID NO：147）-接头1（SEQ ID NO：190）-抗-CD3抗体的VH（CD3 VH）（SEQ ID NO：9）-接头3（SEQ ID NO：192）-第一异二聚体促进结构域（SEQ ID NO：188）；和（b）第二多肽链以N-末端至C-末端方向以下述顺序包含下述区域：抗-CD3抗体的VL（CD3 VL）（SEQ ID NO：90）-接头2（SEQ ID NO：191）-抗-GUCY2c抗体的VH（GUCY2c VH）（SEQ ID NO：73）-接头3（SEQ ID NO：192）-第二异二聚体促进结构域（SEQ ID NO：189）。

在另一个方面，本发明提供了特异性结合GUCY2c和CD3的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体包括第一多肽链和第二多肽链，并且其中：（a）第一多肽链以N-末端至C-末端方向以下述顺序包含下述区域：抗-GUCY2c抗体的VL（GUCY2c VL）（SEQ ID NO：147）-接头1（SEQ ID NO：190）-抗-CD3抗体的VH（CD3 VH）（SEQ ID NO：9）-接头3（SEQ ID NO：192）-第一异二聚体促进结构域（SEQ ID NO：188）；和（b）第二多肽链以N-末端至C-末端方向以下述顺序包含下述区域：抗-CD3抗体的VL（CD3 VL）（SEQ ID NO：90）-接头2（SEQ ID NO：191）-抗-GUCY2c抗体的VH（GUCY2c VH）（SEQ ID NO：73）-接头3（SEQ ID NO：192）-第二异二聚体促进结构域（SEQ ID NO：189）；其中GUCY2c VL和GUCY2c VH形成与GUCY2c特异性结合的结构域；且CD3 VL和CD3 VH形成与CD3特异性结合的结构域；其中第一多肽链的接头3和第二多肽链的接头3通过两个二硫键彼此共价结合；其中第一异二聚体促进结构域和第二异二聚体促进结构域各自包含CH2结构域和CH3结构域；其中所述第一异二聚体促进结构域的CH3结构域形成杵，且所述第二异二聚体促进结构域的CH3结构域形成臼；其中在第一异二聚体促进结构域的CH3结构域与第二异二聚体促进结构域的CH3结构域之间形成至少一个二硫键。

在一些这种实施方案中，本发明提供了双特异性抗体，其与GUCY2c的表位和CD3的表位特异性结合。

在一个方面，本发明提供了能够与GUCY2c和CD3特异性结合的双特异性抗体，其包含第一多肽链和第二多肽链，其中所述第一多肽链包含SEQ ID NO：216的序列，并且所述第二多肽链包含SEQ ID NO：220的序列。

在一些这种实施方案中，本发明提供了双特异性抗体，其中第一和第二多肽链通过至少一个二硫键彼此共价键合。

本发明包括用于治疗、预防或管理主体中的癌症的方法和组合物，包括向所述主体施用治疗有效量的根据本发明人工改造的抗体或双特异性抗体，所述分子进一步结合癌症抗原。本发明的分子对于预防、抑制、减少原发肿瘤的生长和/或消退以及癌细胞的转移特别有用。尽管不意图受特定作用机制的约束，但是本发明的分子可以介导效应子功能，其可以导致肿瘤清除、肿瘤减少或其组合。

本发明的抗体（例如，GUCY2c或CD3-GUCY2c双特异性抗体）可用于各种应用中，包括，但不限于治疗性治疗方法和诊断性治疗方法。

在一个方面，本发明提供了用于治疗主体中与GUCY2c表达有关的状况的方法。在一些实施方案中，治疗主体中与GUCY2c表达有关的状况的方法包括向有此需要的主体施用有效量的包含如本文所述的GUCY2c抗体或GUCY2c双特异性抗体的组合物（例如，药物组合物）。与GUCY2c表达有关的状况包括，但不限于，异常GUCY2c表达、改变的或异常的GUCY2c表达、表达GUCY2c的恶性细胞和增生性疾病（例如，癌症）。

因此，本发明提供了通过人工改造双特异性抗体以免疫特异性识别GUCY2c抗原和T细胞上的CD3抗原来治疗特征在于GUCY2c抗原的癌症的方法。已经根据本发明人工改造的双特异性抗体可用于预防或治疗癌症，这是因为它们凭借抗CD3诱导的活化杀伤T细胞具有细胞毒活性。

在特定的实施方案中，本发明提供了治疗有此需要的患者中的GUCY2c有关病症的方法，其包括向所述患者施用如本文所公开的GUCY2c抗体。本发明还提供了治疗有此需要的患者中的GUCY2c有关病症的方法，其包括向所述患者施用本发明的双特异性抗体。

本发明进一步提供治疗有此需要的患者中的GUCY2c有关病症的方法，其包括向所述患者施用包含本文公开的GUCY2c抗体或双特异性抗体的药物组合物。在一些这种实施方案中，GUCY2c有关病症是癌症。在特定的实施方案中，癌症是乳腺癌、卵巢癌、甲状腺癌、前列腺癌、宫颈癌、肺癌（包括但不限于非小细胞肺癌和小细胞肺癌）、膀胱癌、子宫内膜癌、头和颈癌、睾丸癌或成胶质细胞瘤癌。在某些实施方案中，癌症是选自食道、胃、小肠、结肠、直肠、肛门、肝、胆囊、阑尾、胆管和胰的消化系统的癌症。在特定的实施方案中，所述疗法激活溶细胞性T细胞应答。

在一个方面，本发明提供了供疗法之用的如本文所公开的抗体、双特异性抗体或药物组合物。在特定实施方案中，本发明还提供了供本文定义的治疗癌症的方法之用的GUCY2c抗体或CD3-GUCY2c双特异性抗体。

本发明进一步提供了供制备药物之用的如本文所公开的抗体或双特异性抗体，所述药物供疗法之用。在一些实施方案中，所述疗法是GUCY2c有关病症的治疗。在具体的实施方案中，GUCY2c有关病症是癌症。在一些实施方案中，癌症选自乳腺癌、卵巢癌、甲状腺癌、前列腺癌、宫颈癌、肺癌（包括但不限于非小细胞肺癌和小细胞肺癌）、膀胱癌、子宫内膜癌、头和颈癌、睾丸癌和成胶质细胞瘤癌。在某些实施方案中，癌症是选自食道、胃、小肠、结肠、直肠、肛门、肝、胆囊、阑尾、胆管和胰的消化系统的癌症。在特定的实施方案中，所述疗法激活溶细胞性T细胞应答。

在一个方面，本发明提供了编码如本文所公开的抗体或双特异性抗体的多核苷酸。在另一个实施方案中，本发明提供了包含如本文所公开的多核苷酸的载体。在再另一个实施方案中，本发明提供了用如本文所公开的载体转化或转染的宿主细胞。在一些这种实施方案中，宿主细胞重组产生如本文所公开的抗体或双特异性抗体。在特定的实施方案中，宿主细胞选自细菌细胞系、哺乳动物细胞系、昆虫细胞系和酵母细胞系。在特定的实施方案中，哺乳动物细胞系是CHO细胞系。在一个实施方案中，使用体外无细胞蛋白合成系统产生抗体或双特异性抗体。

在一个方面，提供了治疗有此需要的主体中的癌症的方法，包括：a）提供如本文所述的双特异性抗体，和b）向所述患者施用所述双特异性抗体。在一些实施方案中，提供了治疗主体中与表达肿瘤抗原的恶性细胞有关的状况的方法，包括a）提供如本文所述的抗体，和b）向有此需要的主体施用有效量的包含如本文所述的抗体的药物组合物。待治疗的癌症的实例包括，但不限于，食道癌、胃癌、小肠癌、结肠癌、直肠癌、肛门癌、肝癌、胆囊癌、阑尾癌、胆管癌和胰癌。因此，本文所述的组合物和方法可用于针对上文列举的原发性和转移性癌症进行治疗、成像、检测和接种。

在一些实施方案中，提供了抑制具有表达GUCY2c的恶性细胞的主体中的肿瘤生长或进展的方法，包括向有此需要的主体施用有效量的包含如本文所述的GUCY2c抗体或CD3-GUCY2c双特异性抗体的组合物。在其他实施方案中，提供了抑制主体中的表达GUCY2c的转移细胞的方法，包括向有此需要的主体施用有效量的包含如本文所述的GUCY2c抗体或CD3-GUCY2c双特异性抗体的组合物。在其他实施方案中，提供了诱导主体中的恶性细胞中肿瘤消退的方法，包括向有此需要的主体施用有效量的包含如本文所述的GUCY2c抗体或CD3-GUCY2c双特异性抗体的组合物。

在具体的方面，相对于在没有本发明的抗体或双特异性抗体的情况下的癌细胞的生长，本发明的GUCY2c抗体或CD3-GUCY2c双特异性抗体将癌细胞的生长抑制或降低至少99%、至少95%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少60%、至少50%、至少45%、至少40%、至少45%、至少35%、至少30%、至少25%、至少20%或至少10%。

在具体的方面，GUCY2c抗体或CD3-GUCY2c双特异性抗体杀伤细胞或抑制或减少癌细胞的生长比在没有本发明的抗体或双特异性抗体的情况下好至少5%、至少10%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少100%。

在一个实施方案中，提供了治疗主体中的自身免疫性疾病的方法，包括向有此需要的主体施用有效量的包含如本文所述的GUCY2c抗体或CD3-GUCY2c双特异性抗体的组合物。

如本文所用的，自身免疫性疾病包括，但不限于，炎性肠病、全身性红斑狼疮、糖尿病（I型）、乳糜泻、无丙球蛋白血症、自身免疫性肠病、自身免疫性肝炎、克罗恩病、胃肠类天疱疮、多肌炎、横贯性脊髓炎、溃疡性结肠炎和脉管炎。

在一个方面，本发明提供了用于治疗有此需要的主体中与GUCY2c表达有关的状况（例如，癌症）的有效量的包含如本文所述的抗体（例如，GUCY2c抗体或CD3-GUCY2c双特异性抗体）的组合物（例如，药物组合物）。在一个实施方案中，提供了用于抑制具有表达GUCY2c的恶性细胞的主体中的肿瘤生长或进展的有效量的包含如本文所述的抗体（例如，GUCY2c抗体或CD3-GUCY2c双特异性抗体）的组合物（例如，药物组合物）。在一些实施方案中，提供了用于抑制有此需要的主体中表达GUCY2c的恶性细胞的转移的有效量的包含如本文所述的抗体（例如，GUCY2c抗体或CD3-GUCY2c双特异性抗体）的组合物（例如，药物组合物）。在一些实施方案中，提供了有效量的包含如本文所述的抗体（例如，GUCY2c抗体或CD3-GUCY2c双特异性抗体）的组合物（例如，药物组合物）。

在另一个方面，本发明提供了供治疗有此需要的主体中与GUCY2c表达有关的状况（例如，癌症）之用的如本文所述的抗体（例如，GUCY2c抗体或CD3-GUCY2c）。在一些实施方案中，提供了用于抑制具有表达GUCY2c的恶性细胞的主体中的肿瘤生长或进展的如本文所述的抗体（例如，GUCY2c抗体或CD3-GUCY2c双特异性抗体）。在一些实施方案中，提供了用于抑制有此需要的主体中表达GUCY2c的恶性细胞的转移的如本文所述的抗体（例如，GUCY2c抗体或CD3-GUCY2c双特异性抗体）。在一些实施方案中，提供了用于诱导具有表达GUCY2c的恶性细胞的主体中的肿瘤消退的如本文所述的抗体（例如，GUCY2c抗体或CD3-GUCY2c双特异性抗体）。

在另一个方面，本发明提供了如本文所述的抗体（例如，GUCY2c抗体或CD3-GUCY2c双特异性抗体）在制备用于治疗与GUCY2c表达有关的状况（例如，癌症）的药物中的用途。在一些实施方案中，提供了如本文所述的抗体（例如，GUCY2c抗体或CD3-GUCY2c双特异性抗体）在制备用于抑制肿瘤生长或进展的药物中的用途。在一些实施方案中，提供了如本文所述的抗体（例如，GUCY2c抗体或CD3-GUCY2c双特异性抗体）在制备用于抑制表达GUCY2c的恶性细胞的转移的药物中的用途。在一些实施方案中，提供了如本文所述的抗体（例如，GUCY2c抗体或CD3-GUCY2c双特异性抗体）在制备用于诱导肿瘤消退的药物中的用途。

在另一个方面，提供了检测、诊断和/或监控与GUCY2c表达有关的状况的方法。例如，如本文所述的抗体（例如，GUCY2c抗体或CD3-GUCY2c双特异性抗体）可以用可检测的部分如成像剂和酶-底物标记进行标记。如本文所述的抗体也可以用于体内诊断测定，例如体内成像（例如，PET或SPECT）或染色试剂。

因此，除了将T细胞改方向至肿瘤特异性抗原以外，本发明的CD3-GUCY2c双特异性抗体还可用于将其他诊断或治疗剂携带至在其表面表达肿瘤的细胞。因此，双特异性抗体可以直接或间接（例如经由接头）附着至药物，从而使得其将被直接递送至带有肿瘤的细胞。治疗剂包括，但不限于，核酸、蛋白、肽、氨基酸或衍生物、糖蛋白、放射性同位素、脂质、碳水化合物或重组病毒。核酸诊断剂或治疗剂包括，但不限于，反义核酸，用于与单或双链体DNA共价交联的衍生寡核苷酸，以及形成三链体的寡核苷酸。

另一方面，与本发明的双特异性抗体连接的诊断或治疗剂可以是包囊作用系统，例如含有治疗剂例如药物、核酸（例如反义核酸）或优选被免于直接暴露于循环系统的另一种治疗剂的脂质体或微团。制备与抗体附着的脂质体的方法是本领域技术人员众所周知的。参见，例如，美国专利No. 4,957,735；和Connor等人, Pharm. Ther. 28:341-365(1985)。

在一些实施方案中，本文所述的方法进一步包括用另外的形式的疗法治疗主体的步骤。在一些实施方案中，另外的形式的疗法是另外的抗癌疗法，包括，但不限于，化学疗法、辐射、外科手术、激素疗法和/或另外的免疫治疗。

本发明进一步包括将本发明的分子与本领域技术人员已知的用于治疗或预防癌症的其他疗法组合施用，所述其他疗法包括但不限于，当前的标准和实验化学疗法、生物疗法、免疫治疗、放射疗法或外科手术。在一些方面，本发明的分子可以与治疗或预防有效量的一种或多种本领域技术人员已知用于治疗和/或预防癌症的试剂、治疗用抗体或其他试剂组合施用。

因此，用于治疗癌症的方法包括向有此需要的主体施用与化疗剂组合的有效量的本发明的抗体或双特异性抗体。这种组合治疗可以单独地、序贯地或同时施用。合适的化疗剂包括，但不限于，至少一种另外的试剂，例如贝伐单抗（bevacizumab）、西妥昔单抗（cetuximb）、西罗莫司、帕尼单抗（panitumumab）、5-氟尿嘧啶（5-FU）、卡培他滨、替沃扎尼（tivozanib）、伊立替康、奥沙利铂、顺铂、三氟尿苷、替吡嘧啶（tipiracil）、甲酰四氢叶酸（leucovori）、吉西他滨和/或盐酸厄洛替尼（erlotinib hydrochloride）。

本文提供的剂量的量和施用频率由术语治疗有效和预防有效包括。取决于所施用的具体治疗剂或预防剂，癌症的严重性和类型，施用途径以及患者的年龄、体重、反应和过去的医疗史，剂量和频率进一步可以根据特异于每个患者的因素而不同。本领域技术人员通过考虑这种因素并通过遵循例如文献中报道的以及Physician's Desk Reference（第56版, 2002）中推荐的剂量可以选择合适的方案。

本发明的抗体或双特异性抗体可以是用于施用的药物组合物的形式，其被进行配制以适合于所选择的施用模式，以及药学上可接受的稀释剂或赋形剂，例如缓冲剂、表面活性剂、防腐剂、增溶剂、等渗剂、稳定剂、载体等。Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co., Easton Pa., 第18版, 1995提供了专业人员通常已知的配制技术纲要。

这些药物组合物可以通过本领域已知的实现治疗癌症的一般预期目的的任何方式来施用。施用途径可以是肠胃外的，在本文中被定义为是指施用模式，包括但不限于经食道（transesophageal）、瘤内、经结肠镜（transcolonoscopically）、经皮肤、静脉内、肌内、腹膜内、皮下和关节内注射和输注。根据本发明的分子（例如，GUCY2c抗体、CD3-GUCY2c双特异性抗体、药物组合物）的施用方式和给药取决于所要斗争的疾病的类型，在适当的场合的其病期，所要控制的抗原，并存的治疗的种类（如果有的话），治疗的频率，所期望的效果的特性，以及还有患者的体重、年龄、健康状况膳食和性别。因此，实际采用的剂量方案可以大不相同，且因此可以偏离本文陈述的剂量方案。

本发明的抗体（例如，GUCY2c抗体或CD3-GUCY2c双特异性抗体）的各种制剂可以用于施用。在一些实施方案中，抗体（例如，GUCY2c抗体或CD3-GUCY2c双特异性抗体）可以纯净地施用。在一些实施方案中，抗体（例如，GUCY2c抗体或CD3-GUCY2c双特异性抗体）和药学上可接受的赋形剂可以处于各种制剂中。药学上可接受的赋形剂是本领域中已知的，并且是相对惰性的物质，其便于药理学上有效的物质的施用。例如，赋形剂可以赋予形状或稠度，或充当稀释剂。合适的赋形剂包括但不限于稳定剂、润湿剂和乳化剂、用于改变摩尔渗透压浓度的盐、包囊剂、缓冲剂和皮肤穿透增强剂。赋形剂以及用于肠胃外和非肠胃外药物递送的制剂在Remington, The Science and Practice of Pharmacy 第21版. MackPublishing, 2005中陈述。

在一些实施方案中，将这些试剂配制用于通过注射施用（例如，腹膜内、静脉内、皮下、肌内等）。因此，这些试剂可以与药学上可接受的媒介物组合，例如盐水、林格液、葡萄糖溶液等。特定的剂量方案，即，剂量、时间控制和重复，将取决于特定的个体以及所述个体的医疗史。

如本文所述的抗体（例如，GUCY2c抗体或CD3-GUCY2c双特异性抗体）可以使用任何合适的方法来施用，包括通过注射（例如，腹膜内、静脉内、皮下、肌内等）来施用。如本文所述的，抗体例如单克隆抗体或双特异性抗体也可通过吸入施用。通常，对于本发明的抗体（例如，GUCY2c抗体或CD3-GUCY2c双特异性抗体）的施用，剂量取决于所治疗的宿主和特定的施用模式。在一个实施方案中，本发明的抗体的剂量范围将为约0.001 µg/kg体重至约20,000 µg/kg体重。当正治疗患者时，术语“体重”可适用。当正处理分离的细胞时，如本文所用的“体重”是指“总细胞体重”。术语“总体重”可以用于适用于分离的细胞和患者治疗两者。在本申请中，所有浓度和治疗水平均表示为“体重”或简称为“kg”，也被认为包括类似的“总细胞体重”和“总体重”浓度。然而，本领域普通技术人员将认识到多种剂量范围的实用性，例如，0.01 µg/kg体重至20,000 µg/kg体重、0.02 µg/kg体重至15,000 µg/kg体重、0.03 µg/kg体重至10,000 µg/kg体重、0.04 µg/kg体重至5,000 µg/kg体重、0.05 µg/kg体重至2,500 µg/kg体重、0.06 µg/kg体重至1,000 µg/kg体重、0.07 µg/kg体重至500 µg/kg体重、0.08 µg/kg体重至400 µg/kg体重、0.09 µg/kg体重至200 µg/kg体重或0.1 µg/kg体重至100 µg/kg体重。进一步地，本领域技术人员将认识到多种不同剂量水平将是有用的，例如，0.0001 µg/kg、0.0002 µg/kg、0.0003 µg/kg、0.0004 µg/kg、0.005 µg/kg、0.0007 µg/kg、0.001 µg/kg、0.1 µg/kg、1.0 µg/kg、1.5 µg/kg、2.0 µg/kg、5.0 µg/kg、10.0 µg/kg、15.0 µg/kg、30.0 µg/kg、50 µg/kg、75 µg/kg、80 µg/kg、90 µg/kg、100 µg/kg、120 µg/kg、140 µg/kg、150 µg/kg、160 µg/kg、180 µg/kg、200 µg/kg、225 µg/kg、250 µg/kg、275 µg/kg、300 µg/kg、325 µg/kg、350 µg/kg、375 µg/kg、400 µg/kg、450 µg/kg、500 µg/kg、550 µg/kg、600 µg/kg、700 µg/kg、750 µg/kg、800 µg/kg、900 µg/kg、1 µg/kg、5 µg/kg、10 µg/kg、12 µg/kg、15 mg/kg、20 mg/kg和/或30 mg/kg。所有这些剂量都是示例性的，并且这些点中间的任何剂量也预期在本发明中是有用的。以上剂量范围或剂量水平的任一种均可用于本发明的抗体。对于几天或更长期间的重复施用，取决于状况，持续治疗直到出现所期望的症状抑制为止或直到实现足够的治疗水平为止，例如，以抑制或延迟肿瘤生长/进展或癌细胞的转移。

取决于专业人员希望实现的药物代谢动力学衰减的模式，其他剂量方案也可能是有用的。在一个实施方案中，本发明的抗体以初始致敏剂量继之以更高和/或连续的、基本上恒定的剂量施用。在一些实施方案中，预期每周一次至四次给药。在其他实施方案中，预期每月一次或每隔一个月或每三个月一次给药。通过常规技术和测定容易监控所述疗法的进展。给药方案（包括抗体（例如，GUCY2c抗体或CD3-GUCY2c双特异性抗体）可以随着时间的过去变化。

对本发明来说，抗体（例如，GUCY2c抗体或CD3-GUCY2c双特异性抗体）的适当剂量将取决于所使用的抗体（例如，GUCY2c抗体或CD3-GUCY2c双特异性抗体）或其组合物，待治疗的症状的类型和严重性，试剂是否是为了治疗目的施用的，以前的疗法，患者的临床史和对试剂的反应，患者对施用的试剂的清除率以及主治医生的判断。一般，医生将施用抗体（例如，GUCY2c抗体或CD3-GUCY2c双特异性抗体），直到达到实现期望的结果的剂量为止。剂量和/或频率可在治疗过程期间变化。诸如半衰期的经验考虑通常将有助于剂量的确定。例如，可以使用与人免疫系统相容的抗体，例如人源化抗体或全人抗体，以延长抗体的半衰期并防止抗体被宿主免疫系统攻击。施用的频率可以在疗法过程期间确定和调节，并且通常但不必定基于症状的治疗和/或抑制和/或改善和/或延迟，例如，肿瘤生长抑制或延迟等。另一方面，抗体（例如，GUCY2c抗体或CD3-GUCY2c双特异性抗体）的持续连续释放制剂可能是合适的。用于实现持续释放的各种制剂和设备是本领域已知的。

在一个实施方案中，可以在已经给予抗体（例如，GUCY2c抗体或CD3-GUCY2c双特异性抗体）的一次或多次施用的个体中根据经验地确定抗体（例如，GUCY2c抗体或CD3-GUCY2c双特异性抗体）的剂量。向个体给予递增剂量的抗体（例如，GUCY2c抗体或CD3-GUCY2c双特异性抗体）。为了评估疗效，可以跟踪所述疾病的指示物。

在某些实施方案中，抗体（例如，GUCY2c抗体或CD3-GUCY2c双特异性抗体）的施用导致选自以下的至少一种作用：肿瘤生长的抑制，肿瘤消退，肿瘤大小的减小，肿瘤细胞数目的减小，肿瘤生长的延迟，远位效应（abscopal effect），肿瘤转移的抑制，随着时间的过去转移病灶的减少，减少的化疗剂或细胞毒剂的使用，肿瘤负荷（tumor burden）的减少，无进展存活的增加，总存活的增加，完全应答，部分应答和稳定的疾病。

取决于例如接受者的生理状况，施用的目的是治疗性的还是预防性的，以及熟练的专业人员已知的其他因素，根据本发明方法的抗体（例如，GUCY2c抗体或CD3-GUCY2c双特异性抗体）的施用可以是连续的或间歇的。抗体（例如，GUCY2c抗体或CD3-GUCY2c双特异性抗体）的施用可以在预选的时间段内是基本上连续的，或者可以是一系列彼此隔开的剂量。

在一些实施方案中，可以存在不止一种抗体（例如，GUCY2c抗体或CD3-GUCY2c双特异性抗体）。可以存在至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种不同或更多种抗体（例如，GUCY2c抗体或CD3-GUCY2c双特异性抗体）。通常，那些（例如，GUCY2c抗体或CD3-GUCY2c双特异性抗体）可以具有不有害地相互影响的互补的活性。例如，可以使用一种或多种以下抗体：针对GUCY2c或CD3上的一个表位的第一GUCY2c或CD3抗体和针对GUCY2c或CD3上的不同表位的第二GUCY2c或CD3抗体。

通过将具有所期望的纯度的抗体与任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂（Remington, The Science and Practice of Pharmacy 第21版. Mack Publishing,2005）混合，以冻干制剂或水溶液的形式来制备根据本发明使用的抗体（例如，GUCY2c抗体或CD3-GUCY2c双特异性抗体）的治疗制剂用于贮藏。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所使用的剂量和浓度对接受者无毒，且可以包括缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；盐，例如氯化钠；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂（例如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双铵；苯扎氯铵，苄索氯铵；酚，丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇和间甲酚）；低分子量（小于约10个残基）多肽；蛋白，例如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐平衡离子，例如钠；金属络合物（例如，Zn-蛋白络合物）；和/或非离子型表面活性剂，例如TWEEN^TM、PLURONICS^TM或聚乙二醇（PEG）。

含有抗体（例如，GUCY2c抗体或CD3-GUCY2c双特异性抗体）的脂质体通过本领域已知的方法制备，例如在Epstein等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688, 1985；Hwang等人, Proc. Natl Acad. Sci. USA 77:4030, 1980；和美国专利Nos. 4,485,045和4,544,545中所述的。具有增长的循环时间的脂质体在美国专利No. 5,013,556中公开。特别有用的脂质体可以通过反相蒸发方法用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG-衍生的磷脂酰乙醇胺（PEG-PE）的脂质组合物产生。脂质体通过具有确定的孔径大小的过滤器挤出以产生具有所期望的直径的脂质体。

活性成分也可以被包载在例如通过团聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊（例如，分别为羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊）中，胶体药物递送系统（例如，脂质体、清蛋白小球体、微乳状液、纳米颗粒和纳米胶囊（nanocapsules））或粗滴乳状液中。这种技术在Remington, The Science and Practice of Pharmacy 第21版.Mack Publishing, 2005中公开。

可以制备缓释制剂。缓释制剂的合适实例包括含有抗体的固体疏水聚合物的半透性基质，所述基质为定型物品的形式，例如，膜或微胶囊。缓释基质的实例包括聚酯，水凝胶（例如，聚(甲基丙烯酸-2-羟乙酯)或聚(乙烯醇)），聚交酯（美国专利No. 3,773,919），L-谷氨酸和L-谷氨酸7-乙酯的共聚物，非降解性乙烯乙酸乙烯酯，可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，例如LUPRON DEPOT^TM（由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射小球体），蔗糖醋酸异丁酸酯和聚-D-(-)-3-羟丁酸。

用于体内施用的制剂必须是无菌的。这容易通过例如通过过滤除菌膜的过滤来达到。通常将治疗用抗体（例如，GUCY2c抗体或CD3-GUCY2c双特异性抗体）组合物放置入具有无菌出入口的容器中，例如，具有可通过皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶。

根据本发明的组合物可以是单位剂量形式，例如片剂，丸剂，胶囊，粉末，颗粒，溶液或悬浮液，或栓剂，用于口服、肠胃外或直肠施用，或通过吸入或吹入法施用。

为了制备固体组合物例如片剂，将主要活性成分与药学载体混合，例如，常规的制片成分例如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨糖醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸二钙或树胶，和其他药学稀释剂，例如，水，以形成含有本发明的化合物或其无毒性的药学上可接受的盐的均匀混合物的固体处方设计（preformulation）组合物。当将这些处方设计组合物称为均匀的时，其意指将活性成分均匀地分散在整个组合物中，从而使得可以容易地将组合物细分为同等有效的单位剂量形式，例如片剂、丸剂和胶囊。然后将所述固体处方设计组合物细分为含有0.1至约500 mg的本发明的活性成分的上述类型的单位剂量形式。可以将新组合物的片剂或丸剂包衣或以其他方式复合以提供给予延长的作用的优点的剂量形式。例如，片剂或丸剂可包含内部剂量和外部剂量组分，后者为在前者上面的外皮的形式。这两种组分可以被肠溶层（enteric layer）分开，所述肠溶层用来抵抗胃中的分解并允许内部组分完整地进入十二指肠或延迟释放。多种材料可用于这种肠溶层或包衣，这种材料包括许多聚合酸（polymeric acid）以及聚合酸与诸如紫胶、鲸蜡醇和乙酸纤维素的材料的混合物。

合适的表面活性剂特别地包括非离子型试剂，例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇（例如，Tween^TM 20、40、60、80或85）和其他脱水山梨糖醇（例如，Span^TM 20、40、60、80或85）。具有表面活性剂的组合物将方便地包含0.05至5％的表面活性剂，并且可以为0.1至2.5％。将理解的是，必要时，可以添加其他成分，例如甘露糖醇或其他药学上可接受的媒介物。

合适的乳剂可以使用可商购获得的脂肪乳剂来制备，例如Intralipid^TM、Liposyn^TM、Infonutrol^TM、Lipofundin^TM和Lipiphysan^TM。活性成分可以溶解在预混合的乳剂组合物中，或者另一方面其可以溶解在油（例如，大豆油、红花油、棉籽油、芝麻油、玉米油或杏仁油）和与磷脂（例如，卵磷脂、大豆磷脂或大豆卵磷脂）和水混合时形成的乳剂中。将理解的是，可以添加其他成分，例如甘油或葡萄糖，以调节乳剂的涨度。合适的乳剂将一般含有最多到20％的油，例如，5至20％。脂肪乳剂可以包含0.1至1.0μm，特别是0.1至0.5μm的脂肪液滴，并且具有5.5至8.0的pH。

乳剂组合物可以是通过将抗体（例如，GUCY2c抗体或CD3-GUCY2c双特异性抗体）与Intralipid^TM或其组分（大豆油、卵磷脂、甘油和水）混合而制备的那些。

用于吸入或吹入法的组合物包括在药学上可接受的含水或有机溶剂中的溶液和悬浮液，或其混合物，以及粉末。液体或固体组合物可以含有如上所述的合适的药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，通过口或鼻呼吸途径施用组合物以用于局部或全身作用。可以通过使用气体雾化在优选无菌的药学上可接受的溶剂中的组合物。雾化的溶液可以直接从雾化设备中呼吸，或者雾化设备可以附着到面具、面罩吸入器（tent）或间歇正压呼吸机上。溶液、悬浮液或粉末组合物可以从以适当方式递送制剂的设备优选口服或鼻施用。

本发明范围内的组合物包括其中抗体（GUCY2c抗体或CD3-GUCY2c双特异性抗体）以有效实现用于治疗癌症所期望的医学效果的量存在的所有组合物。尽管从一个患者到另一个患者的个体需要可能不同，但是所有组分有效量的最佳范围的确定在具有普通技术的临床医师的能力范围内。

这种组合物的实例以及如何配制也在较早的部分和下文中进行了描述。在一些实施方案中，组合物包含一种或多种抗体（例如，GUCY2c抗体或CD3-GUCY2c双特异性抗体）。在一些实施方案中，GUCY2c抗体或CD3-GUCY2c双特异性抗体是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。在一些实施方案中，GUCY2c抗体或CD3-GUCY2c双特异性抗体包含能够触发所期望的免疫应答的恒定区，例如抗体介导的裂解或ADCC。在其他实施方案中，GUCY2c抗体或CD3-GUCY2c双特异性抗体包含不触发不需要的或不期望的免疫应答的恒定区，例如抗体介导的裂解或ADCC。

据理解组合物可以包含不止一种抗体（例如，GUCY2c抗体或CD3-GUCY2c双特异性抗体），例如识别GUCY2c或CD3和GUCY2c的不同表位的GUCY2c抗体或CD3-GUCY2c双特异性抗体的混合物。其他示例性组合物包含不止一种GUCY2c抗体或CD3-GUCY2c双特异性抗体，其识别一种或多种相同的表位，或不同种类的GUCY2c抗体，CD3-GUCY2c双特异性抗体，或结合至GUCY2c（例如，人GUCY2cA）或CD3和GUCY2c（人CD3和GUCY2c）的不同表位。

在一些实施方案中，GUCY2c抗体或CD3-GUCY2c双特异性抗体可以与一种或多种额外治疗剂的施用组合施用。这些包括，但不限于，生物治疗剂和/或化疗剂的施用，例如但不限于，疫苗，基于CAR-T细胞的疗法，放射治疗，细胞因子治疗，CD3双特异性抗体，其他免疫抑制途径的抑制剂，血管发生的抑制剂，T细胞激活剂，代谢途径的抑制剂，mTOR抑制剂，腺苷途径的抑制剂，酪氨酸激酶抑制剂，包括但不限于Inlyta，ALK抑制剂和舒尼替尼（sunitinib），BRAF抑制剂，外遗传修饰因子，IDO1抑制剂，JAK抑制剂，STAT抑制剂，细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂，生物治疗剂（包括但不限于对于VEGF、VEGFR、EGFR、Her2/neu、其他生长因子受体、CD40、CD-40L、CTLA-4、OX-40、4-1BB、TIGIT和ICOS的抗体），免疫原性剂（例如，减毒癌性细胞，肿瘤抗原，抗原呈递细胞例如用肿瘤衍生的抗原或核酸冲击的树突细胞，免疫刺激性细胞因子（例如，IL-2、IFNα2、GM-CSF），以及用编码免疫刺激细胞因子例如但不限于GM-CSF的基因转染的细胞）。

生物治疗剂的实例包括治疗用抗体、免疫调谐剂和治疗用免疫细胞。

治疗用抗体可能具有针对多种不同的抗原的特异性。例如，治疗用抗体可以针对肿瘤相关抗原，从而使得抗体与抗原的结合促进表达所述抗原的细胞的死亡。在其他实例中，治疗用抗体可以针对免疫细胞上的抗原（例如，PD-1），从而使得所述抗体的结合防止表达所述抗原的细胞的活性的下调（且从而促进表达所述抗原的细胞的活性）。在一些情况下，治疗用抗体可能通过多种不同的机制起作用（例如，其在与表达抗原的细胞接触时既可以i）促进表达抗原的细胞死亡，又可以ii）防止抗原引起免疫细胞活性的下调）。

治疗用抗体可以针对例如如下列举的抗原。对于一些抗原，下面还包括针对所述抗原的示例性抗体（在抗原后的括号/括弧中）。如下的抗原在本文中也可称为“靶抗原”等。本文中用于治疗用抗体的靶抗原包括，例如：4-1BB（例如，乌托鲁单抗（utomilumab））；5T4；A33；α-叶酸受体1（例如，mirvetuximab soravtansine）；Alk-1；BCMA [例如PF-06863135（参见US9969809）]；BTN1A1（例如，参见WO2018222689）；CA-125（例如阿巴伏单抗（abagovomab））；碳酸酐酶（Carboanhydrase）IX；CCR2；CCR4（例如莫加珠单抗（mogamulizumab））；CCR5（例如乐利单抗（leronlimab））；CCR8；CD3 [例如博纳吐单抗（blinatumomab）（CD3/CD19双特异性），PF-06671008（CD3/P-钙黏着蛋白双特异性），PF-06863135（CD3/BCMA双特异性），CD19（例如博纳吐单抗，MOR208）；CD20（例如替伊莫单抗（ibritumomab tiuxetan）、阿托珠单抗（obinutuzumab）、奥法木单抗（ofatumumab）、利妥昔单抗（rituximab）、乌妥昔单抗（ublituximab））；CD22（奥英妥珠单抗（inotuzumabozogamicin）、帕舒托-莫塞妥莫单抗（moxetumomab pasudotox））；CD25；CD28；CD30（例如维布妥昔单抗（brentuximab vedotin））；CD33（例如吉妥珠单抗奥唑米星（gemtuzumabozogamicin））；CD38（例如达雷木单抗（daratumumab）、伊沙妥昔单抗（isatuximab）），CD40；CD-40L；CD44v6；CD47；CD52（例如阿伦单抗（alemtuzumab））；CD63；CD79（例如泊洛妥珠单抗（polatuzumab vedotin））；CD80；CD123；CD276/B7-H3（例如omburtamab）；CDH17；CEA；ClhCG；CTLA-4（例如伊匹单抗（ipilimumab）、替西木单抗（tremelimumab）），CXCR4；桥粒芯蛋白4；DLL3（例如rovalpituzumab tesirine）；DLL4；E-钙黏着蛋白；EDA；EDB；EFNA4；EGFR（例如西妥昔单抗（cetuximab）、玛汀-迪妥昔珠单抗（depatuxizumab mafodotin）、耐昔妥珠单抗（necitumumab）、帕尼单抗（panitumumab））；EGFRvIII；内皮唾液酸蛋白；EpCAM（例如莫度奥妥珠单抗（oportuzumab monatox））；FAP；胎儿乙酰胆碱受体；FLT3（例如，参见WO2018/220584）；GD2（例如地努图希单抗（dinutuximab），3F8）；GD3；GITR；GloboH；GM1；GM2；GUCY2C（例如PF-07062119）；HER2/neu [例如margetuximab、帕妥珠单抗（pertuzumab）、曲妥珠单抗（trastuzumab）；恩美曲妥珠单抗（ado-trastuzumabemtansine）、曲妥珠单抗duocarmazine（trastuzumab duocarmazine）、PF-06804103（参见US8828401）]；HER3；HER4；ICOS；IL-10；ITG-AvB6；LAG-3（例如瑞拉利单抗（relatlimab））；Lewis-Y；LG；Ly-6；M-CSF [例如PD-0360324（参见US7326414）]；MCSP；间皮素（mesothelin）；MUC1；MUC2；MUC3；MUC4；MUC5AC；MUC5B；MUC7；MUC16；刻缺蛋白（Notch）1；刻缺蛋白3；柄蛋白（Nectin）-4（例如维汀-恩弗妥单抗（enfortumab vedotin））；OX40 [例如PF-04518600（参见US7960515）]；P-钙黏着蛋白（P-Cadherein）[例如PF-06671008（参见WO2016/001810）]；PCDHB2；PD-1 [例如BCD-100、卡瑞利珠单抗（camrelizumab）、西米普利单抗（cemiplimab）、杰诺单抗（genolimzumab）（CBT-501）、MEDI0680、纳武单抗（nivolumab）、派姆单抗（pembrolizumab）、RN888（参见WO2016/092419）、信迪利单抗（sintilimab）、斯巴达珠单抗（spartalizumab）、STI-A1110、替雷利珠单抗（tislelizumab）、TSR-042]；PD-L1（例如阿特朱单抗（atezolizumab）、德瓦鲁单抗（durvalumab）、BMS-936559（MDX-1105）或LY3300054）；PDGFRA（例如奥拉单抗（olaratumab））；浆细胞抗原；PolySA；PSCA；PSMA；PTK7 [例如PF-06647020（参见US9409995）]；Ror1；SAS；SCRx6；SLAMF7（例如埃罗妥珠单抗（elotuzumab））；SHH；SIRPa（例如ED9、Effi-DEM）；STEAP；TGF-β；TIGIT；TIM-3；TMPRSS3；TNF-α前体；TROP-2（例如戈维替康-沙西妥珠单抗（sacituzumab govitecan））；TSPAN8；VEGF（例如贝伐珠单抗（bevacizumab）、溴珠单抗（brolucizumab））；VEGFR1（例如雷珠单抗（ranibizumab））；VEGFR2（例如雷莫芦单抗（ramucirumab）、雷珠单抗））；Wue-1。

治疗用抗体可以具有任何合适的形式。例如，治疗用抗体可以具有本文别处所述的任何形式。在一些实施方案中，治疗用抗体可以是裸抗体。在一些实施方案中，治疗用抗体可以与药物/试剂连接（也称为“抗体-药物缀合物”（ADC））。在一些实施方案中，可以将针对特定抗原的治疗用抗体并入多特异性抗体（例如双特异性抗体）中。

在一些实施方案中，针对抗原的抗体可以与药物/试剂缀合。连接的抗体-药物分子也称为“抗体-药物缀合物”（ADCs）。药物/试剂可以直接地或通过接头间接地与抗体连接。最常见的是，有毒药物与抗体相连，从而使得ADC与相应抗原的结合促进表达所述抗原的细胞的杀伤。例如，与有毒药物连接的ADCs对于靶向肿瘤相关抗原特别有用，以促进表达肿瘤相关抗原的肿瘤细胞的杀伤。在其他实施方案中，可以与抗体连接的试剂可以是例如免疫调谐剂（例如，以调节在ADC附近的免疫细胞的活性）、显像剂（例如，以促进主体或来自主体的生物样品中的ADC的成像）或增加抗体血清半衰期或生物活性的试剂。

在各种出版物中已经描述了将细胞毒剂或其他治疗剂与抗体缀合的方法。例如，可以通过赖氨酸侧链胺或通过由还原链间二硫键活化的半胱氨酸巯基对抗体进行化学修饰以用于使缀合反应发生。参见，例如，Tanaka等人, FEBS Letters 579:2092-2096, 2005和Gentle等人, Bioconjugate Chem. 15:658-663, 2004。还已经描述了用于具有确定的化学计量的特定药物缀合的在抗体的特定位点人工改造的反应性半胱氨酸残基。参见，例如，Junutula等人, Nature Biotechnology, 26:925-932, 2008。在国际申请WO2012/059882和WO2015015448中也描述了在有转谷氨酰胺酶和胺（例如，包含或附着至活性胺的细胞毒剂）的情况下使用酰基供体含谷氨酰胺的标签或通过多肽人工改造而使其处于活性状态（即，作为酰基供体形成共价键的能力）的内源性谷氨酰胺的偶联。在一些实施方案中，ADC可以具有在出于所有目的特此引入作为参考的WO2016166629中提供的ADCs的任何特点或特征。

可以以ADC形式与抗体连接的药物/试剂可以包括例如细胞毒剂、免疫调谐剂、显像剂、治疗用蛋白、生物聚合物或寡核苷酸。

可以并入ADC的示例性细胞毒剂包括蒽环类、澳瑞他汀（auristatin）、多拉司他汀（dolastatin）、康普瑞汀（combretastatin）、倍癌霉素（duocarmycin）、吡咯并苯并二氮杂

二聚体、吲哚啉-苯并二氮杂

二聚体、烯二炔（enediyne）、格尔德霉素、美登素、嘌呤霉素、紫杉烷、长春花生物碱、喜树碱、tubulysin、哈米特林（hemiasterlin）、spliceostatin、pladienolide及其立体异构体、等构物、类似物或衍生物。

可以并入ADC的示例性免疫调谐剂包括更昔洛韦（gancyclovier）、依那西普（etanercept）、他克莫司（tacrolimus）、西罗莫司、voclosporin、环孢菌素、雷帕霉素、环磷酰胺、硫唑嘌呤（azathioprine）、霉酚酸酯（mycophenolgate mofetil）、氨甲蝶呤（methotrextrate）、糖皮质激素及其类似物、细胞因子、干细胞生长因子、淋巴毒素、肿瘤坏死因子（TNF）、造血因子、白细胞介素（例如，白细胞介素-1（IL-1）、IL-2、IL-3、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18和IL-21）、集落刺激因子（例如，粒细胞集落刺激因子（G-CSF）和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF））、干扰素（例如，干扰素-α、-β和-γ）、称为“S 1因子”的干细胞生长因子、促红细胞生成素和血小板生成素或其组合。

ADC中可包括的示例性显像剂包括荧光素、罗丹明、镧系元素磷光体及其衍生物，或与螯合剂结合的放射性同位素。荧光团的实例包括，但不限于，异硫氰酸荧光素（FITC）（例如，5-FITC）、荧光素亚磷酰胺（FAM）（例如5-FAM）、伊红、羧基荧光素、赤藓红、AlexaFluor.RTM.（例如，Alexa 350、405、430、488、500、514、532、546、555、568、594、610、633、647、660、680、700或750）、羧基四甲基罗丹明（TAMRA）（例如，5,-TAMRA）、四甲基罗丹明（TMR）和磺基罗丹明（SR）（例如，SR101）。螯合剂的实例包括，但不限于，1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N,N',N'',N'''-四乙酸（DOTA）、1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸（NOTA）、1,4,7-三氮杂环壬烷、1-戊二酸-4,7-乙酸（去铁胺）、二亚乙基三胺五乙酸（DTPA）和1,2-双(邻氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸）（BAPTA）。

ADC中可包括的示例性治疗用蛋白包括毒素、激素、酶和生长因子。

可并入ADC中的示例性生物相容性聚合物包括水溶性聚合物，例如聚乙二醇（PEG）或其衍生物，和含兼性离子的生物相容性聚合物（例如，含磷酸胆碱的聚合物）。

可并入ADC中的示例性生物相容性聚合物包括反义寡核苷酸。

在一些实施方案中，可以将本文提供的针对抗原的抗体并入双特异性抗体分子中。双特异性抗体是对至少两种不同抗原具有结合特异性的单克隆抗体。

免疫调谐剂包括可以刺激主体中的免疫应答的多种不同分子类型，例如图式识别受体（PRR）激动剂、免疫刺激细胞因子和癌症疫苗。

图式识别受体（PRRs）是由免疫系统的细胞表达的且识别与病原体和/或细胞损伤或死亡相关的多种分子的受体。PRRs与先天免疫应答和适应性免疫免疫应答两者都有关。PRR激动剂可用于刺激主体中的免疫应答。存在多种类别的PRR分子，包括toll-样受体（TLRs）、RIG-I-样受体（RLRs），核苷酸结合寡聚化结构域（NOD）-样受体（NLRs）、C-型凝集素受体（CLRs）以及干扰素基因刺激物（STING）蛋白。

术语“TLR”和“toll-样受体”是指任何toll-样受体。toll-样受体是与激活免疫应答有关的受体。TLRs识别例如在微生物中表达的病原体相关性分子图式（PAMPs），以及从死亡或垂死细胞释放的内源损伤相关性分子图式（DAMPs）。

激活TLRs（且从而激活免疫应答）的分子在本文中被称为“TLR激动剂”。TLR激动剂可包括例如小分子（例如具有低于约1000道尔顿的分子量的有机分子）以及大分子（例如寡核苷酸和蛋白）。一些TLR激动剂是对单个类型的TLR（例如 TLR3或TLR9）特异性的，而一些TLR激动剂则激活两种或更多种类型的TLR（例如TLR7和TLR8两者）。

本文提供的示例性TLR激动剂包括TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8和TLR9的激动剂。

示例性小分子TLR激动剂包括在例如美国专利Nos. 4,689,338；4,929,624；5,266,575；5,268,376；5,346,905；5,352,784；5,389,640；5,446,153；5,482,936；5,756,747；6,110,929；6,194,425；6,331,539；6,376,669；6,451,810；6,525,064；6,541,485；6,545,016；6,545,017；6,573,273；6,656,938；6,660,735；6,660,747；6,664,260；6,664,264；6,664,265；6,667,312；6,670,372；6,677,347；6,677,348；6,677,349；6,683,088；6,756,382；6,797,718；6,818,650；和7,7091,214；美国专利公开Nos. 2004/0091491、2004/0176367和2006/0100229；和国际公开Nos. WO 2005/18551、WO 2005/18556、WO 2005/20999、WO 2005/032484、WO 2005/048933、WO 2005/048945、WO 2005/051317、WO 2005/051324、WO 2005/066169、WO 2005/066170、WO 2005/066172、WO 2005/076783、WO 2005/079195、WO 2005/094531、WO 2005/123079、WO 2005/123080、WO 2006/009826、WO 2006/009832、WO 2006/026760、WO 2006/028451、WO 2006/028545、WO 2006/028962、WO 2006/029115、WO 2006/038923、WO 2006/065280、WO 2006/074003、WO 2006/083440、WO 2006/086449、WO 2006/091394、WO 2006/086633、WO 2006/086634、WO 2006/091567、WO 2006/091568、WO 2006/091647、WO 2006/093514和WO 2006/098852中公开的那些。

小分子TLR激动剂的额外例子包括某些嘌呤衍生物（例如美国专利Nos. 6,376,501和6,028,076中描述的那些）、某些咪唑并喹啉酰胺（imidazoquinoline amide）衍生物（例如美国专利No. 6,069,149中描述的那些）、某些咪唑并吡啶衍生物（例如美国专利No.6,518,265中描述的那些）、某些苯并咪唑衍生物（例如美国专利No. 6,387,938中描述的那些）、与五元含氮杂环稠合的4-氨基嘧啶的某些衍生物（例如美国专利Nos. 6,376,501；6,028,076和6,329,381；以及WO 02/08905中描述的腺嘌呤衍生物）和某些3-β-D-呋喃核糖基噻唑并[4,5-d]嘧啶衍生物（例如在美国公开No. 2003/0199461中描述的那些）以及某些小分子免疫强化剂化合物，例如在美国专利公开No. 2005/0136065中描述的那些。

示例性的大分子TLR激动剂包括寡核苷酸序列。一些TLR激动剂寡核苷酸序列含有胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸（CpG），并描述于例如美国专利Nos. 6,194,388；6,207,646；6,239,116；6,339,068；和6,406,705中。一些含CpG的寡核苷酸可包括合成的免疫调谐结构基序，如例如在美国专利Nos. 6,426,334和6,476,000中描述的那些。其他TLR激动剂核苷酸序列缺乏CpG序列，并且例如在国际专利公开No. WO 00/75304中描述。更其他的TLR激动剂核苷酸序列包括富含鸟苷和尿苷的单链RNA（ssRNA），如例如在Heil等人, Science, vol.303, pp. 1526-1529, 2004年3月5日中描述的那些。

其他TLR激动剂包括生物分子，例如氨烷基氨基葡糖苷磷酸（AGPs），并且在例如美国专利Nos. 6,113,918；6,303,347；6,525,028；和6,649,172中描述。

TLR激动剂还包括灭活的病原体或其级分，其可以激活多种不同类型的TLR受体。示例性的病原体衍生的TLR激动剂包括BCG、奥布分枝杆菌（mycobacterium obuense）提取物、Talimogene laherparepvec（T-Vec）（衍生自HSV-1）和Pexa-Vec（衍生自痘苗病毒）。

在一些实施方案中，TLR激动剂可以是与TLR特异性结合的激动剂抗体。

下面提供了各种TLRs以及TLR激动剂的简要说明。在下面对于特定TLR的TLR激动剂的列表不应解释为表示给定的TLR激动剂必定仅激活所述TLR（例如，某些分子可以激活多种类型的TLR，或甚至多种类别的PRR）。例如，下面作为示例性TLR4激动剂提供的一些分子也可以是TLR5激动剂。

术语“TLR1”和“toll-样受体1”是指任何形式的TLR1受体，以及保留至少一部分TLR1活性的变体、同工型和物种同源物。除非有不同的说明，例如通过具体参考人TLR1，否则TLR1包括所有哺乳动物物种的天然序列TLR1，例如，人、猴和小鼠。在UniProt条目No.Q15399下提供了一种示例性人TLR1。

如本文所用的“TLR1激动剂”意指与TLR1结合时（1）刺激或激活TLR1，（2）增强、增加、促进、诱导或延长TLR1的活性、功能或存在，或（3）增强、增加、促进或诱导TLR1的表达的任何分子。在本发明的治疗方法、药物和用途的任何一种中有用的TLR1激动剂包括，例如，结合TLR1的细菌脂蛋白及其衍生物。

在本发明的治疗方法、药物和用途中有用的TLR1激动剂的例子包括例如细菌脂蛋白及其衍生物，例如SPM-105（衍生自高压灭菌的分枝杆菌）、OM-174（脂质A衍生物）、OmpS1（来自伤寒沙门氏菌（Salmonella typhi）的孔蛋白）、OmpS1（来自伤寒沙门氏菌的孔蛋白）、OspA（来自布氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi））、MALP-2（支原体巨噬细胞活化脂肽-2kD）、STF（可溶性结核因子）、CU-T12-9、Diprovocim和衍生自细胞壁组分的脂肽，例如PAM2CSK4、PAM3CSK4和PAM3Cys。

TLR1可以与TLR2形成异二聚体，且因此，许多TLR1激动剂也是TLR2激动剂。

术语“TLR2”和“toll-样受体2”是指任何形式的TLR2受体，以及保留至少一部分TLR2活性的变体、同工型和物种同源物。除非有不同的说明，例如通过具体参考人TLR2，否则TLR2包括所有哺乳动物物种的天然序列TLR2，例如，人、猴和小鼠。在UniProt条目No.O60603下提供了一种示例性人TLR2。

如本文所用的“TLR2激动剂”意指与TLR2结合时（1）刺激或激活TLR2，（2）增强、增加、促进、诱导或延长TLR2的活性、功能或存在，或（3）增强、增加、促进或诱导TLR2的表达的任何分子。在本发明的治疗方法、药物和用途的任何一种中有用的TLR2激动剂包括，例如，结合TLR2的细菌脂蛋白及其衍生物。

在本发明的治疗方法、药物和用途中有用的TLR2激动剂的例子包括例如细菌脂蛋白（例如二酰化脂蛋白）及其衍生物，例如SPM-105（衍生自高压灭菌的分枝杆菌）、OM-174（脂质A衍生物）、OmpS1（来自伤寒沙门氏菌的孔蛋白）、OmpS1（来自伤寒沙门氏菌的孔蛋白）、OspA（来自布氏疏螺旋体）、MALP-2（支原体巨噬细胞活化脂肽-2kD）、STF（可溶性结核因子）、CU-T12-9、Diprovocim、Amplivant和衍生自细胞壁组分的脂肽，例如PAM2CSK4、PAM3CSK4和PAM3Cys。

TLR2可以与TLR1或TLR6形成异二聚体，且因此，许多TLR2激动剂也是TLR1或TLR6激动剂。

术语“TLR3”和“toll-样受体3”是指任何形式的TLR3受体，以及保留至少一部分TLR3活性的变体、同工型和物种同源物。除非有不同的说明，例如通过具体参考人TLR3，否则TLR3包括所有哺乳动物物种的天然序列TLR3，例如，人、猴和小鼠。在UniProt条目No.O15455下提供了一种示例性人TLR3。

如本文所用的“TLR3激动剂”意指与TLR3结合时（1）刺激或激活TLR3，（2）增强、增加、促进、诱导或延长TLR3的活性、功能或存在，或（3）增强、增加、促进或诱导TLR3的表达的任何分子。在本发明的治疗方法、药物和用途的任何一种中有用的TLR3激动剂包括，例如，结合TLR3的核酸配体。

在本发明的治疗方法、药物和用途中有用的TLR3激动剂的例子包括TLR3配体，例如合成的dsRNA、聚肌胞苷酸[“poly(I:C)”]（可从例如InvivoGen以高分子量（HMW）和低分子量（LMW）制剂获得）、聚腺尿苷酸（polyadenylic-polyuridylic acid）[“poly(A:U)”]（可从例如InvivoGen获得）、polyICLC（参见Levy等人, Journal of Infectious Diseases,vol. 132, no. 4, pp. 434-439, 1975）、安普利近（Ampligen）（参见Jasani等人,Vaccine, vol. 27, no. 25-26, pp. 3401-3404, 2009）、Hiltonol、Rintatolimod和RGC100（参见Naumann等人, Clinical and Developmental Immunology, vol. 2013, 文章ID 283649）。

术语“TLR4”和“toll-样受体4”是指任何形式的TLR4受体，以及保留至少一部分TLR4活性的变体、同工型和物种同源物。除非有不同的说明，例如通过具体参考人TLR4，否则TLR4包括所有哺乳动物物种的天然序列TLR4，例如，人、猴和小鼠。在UniProt条目No.O00206下提供了一种示例性人TLR4。

如本文所用的“TLR4激动剂”意指与TLR4结合时（1）刺激或激活TLR4，（2）增强、增加、促进、诱导或延长TLR4的活性、功能或存在，或（3）增强、增加、促进或诱导TLR4的表达的任何分子。在本发明的治疗方法、药物和用途的任何一种中有用的TLR4激动剂包括，例如，结合TLR4的细菌脂多糖（LPS）及其衍生物。

在本发明的治疗方法、药物和用途中有用的TLR4激动剂的例子包括，例如，细菌脂多糖（LPS）及其衍生物，例如B:0111（Sigma）、单磷酰脂质A（MPLA）、3DMPL（3-O-脱酰MPL）、GLA-AQ、G100、AS15、ASO2、GSK1572932A（GlaxoSmithKline，英国）。

术语“TLR5”和“toll-样受体5”是指任何形式的TLR5受体，以及保留至少一部分TLR5活性的变体、同工型和物种同源物。除非有不同的说明，例如通过具体参考人TLR5，否则TLR5包括所有哺乳动物物种的天然序列TLR5，例如，人、猴和小鼠。在UniProt条目No.O60602下提供了一种示例性人TLR5。

如本文所用的“TLR5激动剂”意指与TLR5结合时（1）刺激或激活TLR5，（2）增强、增加、促进、诱导或延长TLR5的活性、功能或存在，或（3）增强、增加、促进或诱导TLR5的表达的任何分子。在本发明的治疗方法、药物和用途的任何一种中有用的TLR5激动剂包括，例如，结合TLR5的细菌鞭毛蛋白及其衍生物。

在本发明的治疗方法、药物和用途中有用的TLR5激动剂的例子包括，例如，从枯草芽孢杆菌（B. subtilis）纯化的细菌鞭毛蛋白、从铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）纯化的鞭毛蛋白、从鼠伤寒沙门氏菌（S. typhimurium）纯化的鞭毛蛋白和重组鞭毛蛋白（全部可从InvivoGen获得）、entolimod（CBLB502；药理学最优化的鞭毛蛋白衍生物）。

术语“TLR6”和“toll-样受体6”是指任何形式的TLR6受体，以及保留至少一部分TLR6活性的变体、同工型和物种同源物。除非有不同的说明，例如通过具体参考人TLR6，否则TLR6包括所有哺乳动物物种的天然序列TLR6，例如，人、猴和小鼠。在UniProt条目No.Q9Y2C9下提供了一种示例性人TLR6。

如本文所用的“TLR6激动剂”意指与TLR6结合时（1）刺激或激活TLR6，（2）增强、增加、促进、诱导或延长TLR6的活性、功能或存在，或（3）增强、增加、促进或诱导TLR6的表达的任何分子。在本发明的治疗方法、药物和用途的任何一种中有用的TLR6激动剂包括，例如，结合TLR6的细菌脂肽及其衍生物。

在本发明的治疗方法、药物和用途中有用的TLR6激动剂的例子包括，例如，上文提供的许多TLR2激动剂，这是因为TLR2和TLR6可以形成异二聚体。TLR6也可以与TLR4形成异二聚体，并且TLR6激动剂可以包括上文提供的各种TLR4激动剂。

术语“TLR7”和“toll-样受体7”是指任何形式的TLR7受体，以及保留至少一部分TLR7活性的变体、同工型和物种同源物。除非有不同的说明，例如通过具体参考人TLR7，否则TLR7包括所有哺乳动物物种的天然序列TLR7，例如，人、猴和小鼠。在UniProt条目No.Q9NYK1下提供了一种示例性人TLR7。

如本文所用的“TLR7激动剂”意指与TLR7结合时（1）刺激或激活TLR7，（2）增强、增加、促进、诱导或延长TLR7的活性、功能或存在，或（3）增强、增加、促进或诱导TLR7的表达的任何分子。在本发明的治疗方法、药物和用途的任何一种中有用的TLR7激动剂包括，例如，结合TLR7的核酸配体。

在本发明的治疗方法、药物和用途中有用的TLR7激动剂的例子包括重组单链（“ss”）RNA，咪唑并喹啉化合物如咪喹莫特（R837），嘎德莫特（gardiquimod）和瑞喹莫德（resiquimod）（R848）；罗唑利宾（7-烯丙基-7,8-二氢-8-氧代鸟苷）和相关化合物；7-硫杂-8-氧代鸟苷，7-脱氮鸟苷和相关的鸟苷类似物；ANA975（Anadys Pharmaceuticals）和相关化合物；SM-360320（Sumimoto）；3M-01，3M-03，3M-852和3M-S-34240（3MPharmaceuticals）；GSK2245035（GlaxoSmithKline；8-氧腺嘌呤分子），AZD8848（AstraZeneca；8-氧腺嘌呤分子），MEDI9197（Medimmune；以前是3M-052），ssRNA40，和腺苷类似物，例如UC-1V150（Jin等人, Bioorganic Medicinal Chem Lett (2006) 16:4559-4563，化合物4）。许多TLR7激动剂也是TLR8激动剂。

术语“TLR8”和“toll-样受体8”是指任何形式的TLR8受体，以及保留至少一部分TLR8活性的变体、同工型和物种同源物。除非有不同的说明，例如通过具体参考人TLR8，否则TLR8包括所有哺乳动物物种的天然序列TLR8，例如，人、猴和小鼠。在UniProt条目No.Q9NR97下提供了一种示例性人TLR8。

如本文所用的“TLR8激动剂”意指与TLR8结合时（1）刺激或激活TLR8，（2）增强、增加、促进、诱导或延长TLR8的活性、功能或存在，或（3）增强、增加、促进或诱导TLR8的表达的任何分子。在本发明的治疗方法、药物和用途的任何一种中有用的TLR8激动剂包括，例如，结合TLR8的核酸配体。

在本发明的治疗方法、药物和用途中有用的TLR8激动剂的例子包括重组单链ssRNA，咪喹莫特（R837），嘎德莫特，瑞喹莫德（R848），3M-01，3M-03，3M-852和3M-S-34240（3M Pharmaceuticals）；GSK2245035（GlaxoSmithKline；8-氧腺嘌呤分子），AZD8848（AstraZeneca；8-氧腺嘌呤分子），MEDI9197（Medimmune；以前是3M-052），Poly-G10，Motolimod和上文提供的各种TLR7激动剂（如以前所指出的，许多TLR7激动剂也是TLR8激动剂）。

术语“TLR9”和“toll-样受体9”是指任何形式的TLR9受体，以及保留至少一部分TLR9活性的变体、同工型和物种同源物。除非有不同的说明，例如通过具体参考人TLR9，否则TLR9包括所有哺乳动物物种的天然序列TLR9，例如，人、猴和小鼠。在UniProt条目No.Q9NR96下提供了一种示例性人TLR9。

如本文所用的“TLR9激动剂”意指与TLR9结合时（1）刺激或激活TLR9，（2）增强、增加、促进、诱导或延长TLR9的活性、功能或存在，或（3）增强、增加、促进或诱导TLR9的表达的任何分子。在本发明的治疗方法、药物和用途的任何一种中有用的TLR9激动剂包括，例如，结合TLR9的核酸配体。

在本发明的治疗方法、药物和用途中有用的TLR9激动剂的例子包括未甲基化的含CpG的DNA，免疫刺激寡脱氧核苷酸（ODN），例如含CpG的ODN，例如CpG24555、CpG10103、CpG7909（PF-3512676/阿托莫德（agatolimod））、CpG1018、AZD1419、ODN2216、MGN1703、SD-101、1018ISS和CMP-001。TLR9激动剂还包括含有合成的胞嘧啶-磷酸-2'-脱氧-7-脱氮鸟苷二核苷酸（CpR）的核苷酸序列（Hybridon, Inc.）、dSLIM-30L1和免疫球蛋白-DNA复合体。示例性的TLR9激动剂公开于WO2003/015711、WO2004/016805、WO2009/022215、PCT/US95/01570、PCT/US97/19791和美国专利Nos. 8552165、6194388和6239116中，其出于所有目的特此引入作为参考。

RLRs包括检测例如dsRNAs的各种胞质PRRs。RLRs的实例包括，例如，视黄酸诱导型基因I（RIG-I）、黑素瘤分化相关基因5（MDA-5）和遗传学与生理学实验室2（Laboratory ofGenetics and Physiology 2）（LGP2）。

如本文所用的“RLR激动剂”意指与RLR结合时（1）刺激或激活RLR，（2）增强、增加、促进、诱导或延长RLR的活性、功能或存在，或（3）增强、增加、促进或诱导RLR的表达的任何分子。在本发明的治疗方法、药物和用途的任何一种中有用的RLR激动剂包括，例如，结合RLRs的核酸及其衍生物和特异性结合RLRs的激动剂性（agonistic）单克隆抗体（mAb）。

在本发明的治疗方法、药物和用途中有用的RLRs激动剂的例子包括，例如，具有未加帽的5'三磷酸的短双链RNA（RIG-I激动剂）；poly I:C（MDA-5激动剂）和BO-112（MDA-A激动剂）。

NLRs包括检测例如损伤相关性分子图式（DAMP）分子的各种PRRs。NLRs包括亚家族NLRA-A、NLRB-B、NLRC-C和NLRP-P。NLRs的实例包括例如NOD1、NOD2、NAIP、NLRC4和NLRP3。

如本文所用的“NLR激动剂”意指与NLR结合时（1）刺激或激活NLR，（2）增强、增加、促进、诱导或延长NLR的活性、功能或存在，或（3）增强、增加、促进或诱导NLR的表达的任何分子。在本发明的治疗方法、药物和用途的任何一种中有用的NLR激动剂包括，例如，结合NLRs的DAMPs及其衍生物和特异性结合NLRs的激动剂性单克隆抗体（mAb）。

在本发明的治疗方法、药物和用途中有用的NLR激动剂的例子包括，例如，脂质体胞壁酰三肽/米伐木肽（mifamurtide）（NOD2激动剂）。

CLRs包含检测例如碳水化合物和糖蛋白的各种PRRs。CLRs包括跨膜CLRs和分泌型CLRs两者。CLRs的实例包括例如DEC-205/CD205、巨噬细胞甘露糖受体（MMR）、Dectin-1、Dectin-2、mincle、DC-SIGN、DNGR-1和甘露糖结合凝集素（MBL）。

如本文所用的“CLR激动剂”意指与CLR结合时（1）刺激或激活CLR，（2）增强、增加、促进、诱导或延长CLR的活性、功能或存在，或（3）增强、增加、促进或诱导CLR的表达的任何分子。在本发明的治疗方法、药物和用途的任何一种中有用的CLR激动剂包括，例如，结合CLRs的碳水化合物及其衍生物和特异性结合CLRs的激动剂性单克隆抗体（mAb）。

在本发明的治疗方法、药物和用途中有用的CLR激动剂的例子包括，例如，MD-级分（来自叶状奇果菌（Grifola frondosa）的纯化的可溶性β-葡聚糖提取物）和imprime PGG（衍生自酵母的β1,3/1,6-葡聚糖PAMP）。

STING蛋白在1型干扰素信号传导中既作为胞质DNA传感物又作为衔接蛋白起作用。术语“STING”和“干扰素基因的刺激物”是指任何形式的STING蛋白，以及保留至少一部分STING活性的变体、同工型和物种同源物。除非有不同的说明，例如通过具体参考人STING，否则STING包括所有哺乳动物物种的天然序列STING，例如，人、猴和小鼠。在UniProt条目No. Q86WV6下提供了一种示例性人TLR9。STING也称为TMEM173。

如本文所用的“STING激动剂”意指与TLR9结合时（1）刺激或激活STING，（2）增强、增加、促进、诱导或延长STING的活性、功能或存在，或（3）增强、增加、促进或诱导STING的表达的任何分子。在本发明的治疗方法、药物和用途的任何一种中有用的STING激动剂包括，例如，结合STING的核酸配体。

在本发明的治疗方法、药物和用途中有用的STING激动剂的例子包括各种免疫刺激核酸，例如合成的双链DNA，环二-GMP，环GMP-AMP（cGAMP），合成的环二核苷酸（CDN），例如MK-1454和ADU-S100（MIW815），以及小分子，例如P0-424。

其他PRRs包括，例如，依赖于DNA的IFN-调节因子激活剂（DNA-dependentActivator of IFN-regulatory factors）（DAI）和黑素瘤缺乏因子2（Absent in Melanoma2）（AIM2）。

免疫刺激细胞因子包括各种刺激免疫应答的信号传导蛋白，例如干扰素、白细胞介素和造血生长因子。

示例性的免疫刺激细胞因子包括GM-CSF、G-CSF、IFN-α、IFN-γ；IL-2（例如地尼白介素（denileukin difitox））、IL-6、IL-7、IL-11、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和TNF-α。

免疫刺激细胞因子可以具有任何合适的形式。在一些实施方案中，免疫刺激细胞因子可以是野生型细胞因子的重组形式。在一些实施方案中，免疫刺激细胞因子可以是与相应的野生型细胞因子相比具有一个或多个氨基酸改变的突变蛋白。在一些实施方案中，可以将免疫刺激细胞因子并入含有细胞因子和至少一种其他功能蛋白（例如抗体）的嵌合蛋白中。在一些实施方案中，免疫刺激细胞因子可以共价连接至药物/试剂（例如，如本文别处作为可能的ADC组分所述的任何药物/试剂）。

癌症疫苗包括含有肿瘤相关抗原（或可用于在主体中产生肿瘤相关抗原）且因此可用于在主体中引起将针对含有肿瘤相关抗原的肿瘤细胞的免疫应答的各种组合物。

可以包括在癌症疫苗中的实例材料包括减毒癌性细胞，肿瘤抗原，抗原呈递细胞例如用肿瘤衍生的抗原或编码肿瘤相关抗原的核酸冲击的树突细胞。在一些实施方案中，可以用患者自己的癌细胞制备癌症疫苗。在一些实施方案中，癌症疫苗可以用不来自患者自身癌细胞的生物材料制备。

癌症疫苗包括，例如，西普鲁塞-T（sipuleucel-T）和talimogene laherparepvec（T-VEC）。

免疫细胞治疗包括用能够靶向癌细胞的免疫细胞治疗患者。免疫细胞治疗包括，例如，肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）和嵌合抗原受体T细胞（CAR-T细胞）。

化疗剂的实例包括烷化剂，例如噻替哌和环磷酰胺；烷基磺酸盐，例如白消安、二丙胺磺酯和哌泊舒凡；氮丙啶，例如苯佐替派（benzodopa）、卡波醌、美妥替哌（meturedopa）和乌瑞替哌（uredopa）；乙烯亚胺和甲基蜜胺（methylamelamines），包括六甲密胺、曲他胺、三乙撑磷酰胺（trietylenephosphoramide）、乙胺硫磷和三羟甲密胺（trimethylolomelamine）；多聚乙酰（acetogenins）（尤其是布拉它辛（bullatacin）和布拉它辛酮（bullatacinone））；喜树碱（包括合成类似物拓扑替康）；苔藓虫素；卡利他汀（callystatin）；CC-1065（包括其阿多来新、卡折来新（carzelesin）和比折来新（bizelesin）合成类似物）；cryptophycins（特别是cryptophycin 1和cryptophycin 8）；多拉司他汀（dolastatin）；倍癌霉素（包括合成类似物，KW-2189和CBI-TMI）；软珊瑚醇（eleutherobin）；水鬼蕉碱（pancratistatin）；匍枝珊瑚醇（sarcodictyin）；海绵抑制素（spongistatin）；氮芥，如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺（cholophosphamide）、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥（mechlorethamine）、盐酸氧化氮芥（mechlorethamine oxidehydrochloride）、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇、松龙苯芥、三芥环磷酰胺、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲（nitrosureas），如卡莫司汀、氯脲菌素、福泰氮芥、洛莫氮芥、尼莫司汀、雷诺氮芥；抗生素，如烯二炔（enediyne）抗生素（例如，加利车霉素，尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素phiI1，参见，例如，Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33:183-186（1994）；达内霉素（dynemicin），包括达内霉素A；双膦酸盐（bisphosphonates），如骨膦；埃斯波霉素；以及新制癌菌素发色团和相关的色蛋白烯二炔抗生素发色团（chromomophores））、阿克拉霉素、放线菌素、安曲霉素（authramycin）、偶氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C（cactinomycin）、卡拉比星（carabicin）、卡米诺霉素（caminomycin）、嗜癌霉素、色霉素、更生霉素、柔红霉素、二乙氧醋酰阿霉素、6-重氮基-5-氧-L-正亮氨酸、阿霉素（包括吗啉代-阿霉素、氰基吗啉代-阿霉素、2-吡咯啉基-阿霉素（2-pyrrolino-doxorubicin）和脱氧阿霉素）、聚乙二醇化脂质体阿霉素、表柔比星、去羟阿霉素、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素如丝裂霉素C、霉酚酸、诺加拉霉素、橄榄霉素、培来霉素、泼非霉素（potfiromycin）、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星（rodorubicin）、链黑霉素、链脲霉素、杀结核菌素、羟氨苯丁酰亮氨酸、新制癌菌素、佐柔比星；抗代谢物，如氨甲蝶呤和5-氟尿嘧啶（5-FU）；叶酸类似物，如二甲叶酸、氨甲蝶呤、蝶酰三谷氨酸、曲美沙特；嘌呤类似物，如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫唑鸟嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，如环胞苷、氮杂胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、多西氟尿啶、依诺他宾、氟尿苷；雄激素，如卡鲁睾酮、羟甲雄酮丙酸酯、环硫雄醇、甲环硫甾烷、睾内酯；抗肾上腺素药（anti-adrenals），如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂，如亚叶酸（frolinic acid）；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷（aldophosphamide glycoside）；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶（eniluracil）；安吖啶；阿莫司汀（bestrabucil）；必桑郡；依达曲沙（edatraxate）；地磷酰胺（defofamine）；地美可辛；地吖醌；依氟鸟氨酸（elformithine）；醋酸羟哔咔唑；埃博霉素；环氧甘醚；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；美登木素生物碱，如美登素和美坦西醇；丙米腙；米托蒽醌；蒙匹胺醇；二胺硝吖啶；喷司他丁；苯来美特；吡柔比星；洛索蒽醌（losoxantrone）；鬼臼酸；2-乙酰肼（2-ethylhydrazide）；甲基苄肼；丙亚胺；根霉素；西索菲兰；螺锗；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2',2''-三氯三乙胺；单端孢菌毒素（尤其是T-2毒素、verracurin A、杆孢菌素A和蛇形菌素（anguidine））；乌来糖；长春地辛；达卡巴嗪；甘露氮芥；二溴甘露醇；二溴去羟卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿糖胞苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替哌；紫杉烷类（taxoids），例如，紫杉醇和多西他赛（doxetaxel）；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；氨甲蝶呤；铂类似物，如顺铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷（VP-16）；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春烯碱；能减瘤；替尼泊苷；依达曲沙；柔红霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊本膦酸钠；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸（DMFO）；类视黄醇（retinoids ），如视黄酸；卡培他滨；和上述任何一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。还包括用于调节或抑制对肿瘤的激素作用的抗激素剂，例如抗雌激素和选择性雌激素受体调节剂（SERMs），包括，例如，他莫昔芬、雷洛昔芬、屈洛西芬、4-羟基他莫昔芬、曲奥昔芬、那洛西芬、LY117018、奥那斯酮和托瑞米芬（Fareston）；抑制酶芳化酶的芳化酶抑制剂，其调节肾上腺中的雌激素生产，如例如，4(5)-咪唑、氨鲁米特、醋酸甲地孕酮、依西美坦、福美坦、法倔唑、伏罗唑、来曲唑和阿那曲唑；和抗雄激素物质，如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、利普安和性瑞林；KRAS抑制剂；MCT4抑制剂；MAT2a抑制剂；酪氨酸激酶抑制剂，例如舒尼替尼（sunitinib）、阿昔替尼（axitinib）；alk/c-Met/ROS抑制剂，例如克唑替尼（crizotinib）、劳拉替尼（lorlatinib）；mTOR抑制剂，例如替西罗莫司（temsirolimus）、gedatolisib；src/abl抑制剂，例如博舒替尼（bosutinib）；细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）抑制剂，例如帕博西尼（palbociclib）、PF-06873600；erb抑制剂，例如达克替尼（dacomitinib）；PARP抑制剂，例如他拉唑帕尼（talazoparib）；SMO抑制剂，例如格拉吉布（glasdegib）、PF-5274857；EGFR T790M抑制剂，例如PF-06747775；EZH2抑制剂，例如PF-06821497；PRMT5抑制剂，例如PF-06939999；TGFRβr1抑制剂，例如PF-06952229；和上述任何一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。在特定的实施方案中，这种额外的治疗剂是贝伐单抗、西妥昔单抗（cetuximab）、西罗莫司、帕尼单抗、5-氟尿嘧啶（5-FU）、卡培他滨、替沃扎尼、伊立替康、奥沙利铂、顺铂、三氟尿苷、替吡嘧啶、甲酰四氢叶酸、吉西他滨、瑞戈非尼（regorafinib）或盐酸厄洛替尼。

在一些实施方案中，GUCY2c抗体或CD3-GUCY2c双特异性抗体与一种或多种靶向免疫限制点调节剂或共刺激剂的其他治疗剂一起使用，如例如但不限于，靶向CTLA-4、LAG-3、B7-H3、B7-H4、B7-DC (PD-L2)、B7-H5、B7-H6、B7-H8、B7-H2、B7-1、B7-2、ICOS、ICOS-L、TIGIT、CD2、CD47、CD80、CD86、CD48、CD58、CD226、CD155、CD112、LAIR1、2B4、BTLA、CD160、TIM1、TIM-3、TIM4、VISTA (PD-H1)、OX40、OX40L、GITR、GITRL、CD70、CD27、4-1BB、4-BBL、DR3、TL1A、CD40、CD40L、CD30、CD30L、LIGHT、HVEM、SLAM (SLAMF1、CD150)、SLAMF2 (CD48)、SLAMF3 (CD229)、SLAMF4 (2B4、CD244)、SLAMF5 (CD84)、SLAMF6 (NTB-A)、SLAMCF7 (CS1)、SLAMF8 (BLAME)、SLAMF9 (CD2F)、CD28、CEACAM1 (CD66a)、CEACAM3、CEACAM4、CEACAM5、CEACAM6、CEACAM7、CEACAM8、CEACAM1-3AS CEACAM3C2、CEACAM1-15、PSG1-11、CEACAM1-4C1、CEACAM1-4S、CEACAM1-4L、IDO、TDO、CCR2、CD39–CD73–腺苷途径（A2AR）、BTKs、TIKs、CXCR2、CXCR4、CCR4、CCR8、CCR5、CSF-1或先天免疫应答调节剂的试剂。

在一些实施方案中，GUCY2c抗体或CD3-GUCY2c双特异性抗体与例如下述一起使用：抗-CTLA-4拮抗剂抗体，如例如伊匹单抗；抗-LAG-3拮抗剂抗体，例如BMS-986016和IMP701；抗-TIM-3拮抗剂抗体；抗-B7-H3拮抗剂抗体，如例如MGA271；抗-VISTA拮抗剂抗体；抗-TIGIT拮抗剂抗体；抗体；抗-CD80抗体；抗-CD86抗体；抗-B7-H4拮抗剂抗体；抗-ICOS激动剂抗体；抗-CD28激动剂抗体；先天免疫应答调节剂（例如TLRs、KIR、NKG2A）和IDO抑制剂。

在一些实施方案中，GUCY2c抗体或CD3-GUCY2c双特异性抗体与OX40激动剂如例如抗- OX-40激动剂抗体一起使用。在一些实施方案中，GUCY2c抗体或CD3-GUCY2c双特异性抗体与GITR激动剂如例如抗-GITR激动剂抗体如例如但不限于TRX518一起使用。在一些实施方案中，GUCY2c抗体或CD3-GUCY2c双特异性抗体与IDO抑制剂一起使用。在一些实施方案中，GUCY2c抗体或CD3-GUCY2c双特异性抗体与细胞因子治疗一起使用，如例如但不限于IL-15、CSF-1、MCSF-1等。

在一些实施方案中，GUCY2c抗体或CD3-GUCY2c双特异性抗体与一种或多种其他治疗用抗体一起使用，如例如但不限于靶向CD19、CD22、CD40、CD52或CCR4的抗体。

在某些实施方案中，GUCY2c抗体或CD3-GUCY2c双特异性抗体组合物包含至少一种额外的试剂，例如贝伐单抗、西妥昔单抗（cetuximb）、西罗莫司、帕尼单抗、5-氟尿嘧啶（5-FU）、卡培他滨、替沃扎尼、伊立替康、奥沙利铂、顺铂、三氟尿苷、替吡嘧啶、甲酰四氢叶酸（leucovori）、吉西他滨和盐酸厄洛替尼。

在一些实施方案中，GUCY2c抗体或CD3-GUCY2c双特异性抗体疗法可以与其他试剂治疗共同施用或在其他试剂治疗之前或之后按从数分钟一直到数周的间隔序贯地施用。在其他试剂和/或蛋白或多核苷酸单独施用的实施方案中，人们将通常确保相当长的时间段不在每次递送之间期满，从而使得所述试剂和本发明的组合物将仍然能够对主体发生有利的联合作用。在这种情况下，预期人们可以在彼此约12-24小时内，并且更优选在彼此约6-12小时内施用两种用药程式。然而，在一些情况下，可能期望将用于施用的时间段显著延长，在这方面几天（2、3、4、5、6或7）至几周（1、2、3、4、5、6、7或8）在各次施用之间过去。

在一些实施方案中，将GUCY2c抗体或CD3-GUCY2c双特异性抗体组合物与进一步包括选自下述的传统疗法的治疗方案组合：外科手术、放射疗法、化学疗法、定向治疗、免疫治疗、激素疗法、血管发生抑制和姑息护理（palliative care）。

本发明中使用的组合物可以以冻干制剂或水溶液的形式进一步包含药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂（Remington: The Science and practice of Pharmacy 第21版, 2005, Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover）。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所述剂量和浓度对接受者无毒，且可以包括缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂（例如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双铵；苯扎氯铵，苄索氯铵；酚，丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇和间甲酚）；低分子量（小于约10个残基）多肽；蛋白，例如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或葡聚糖；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐平衡离子，例如钠；金属络合物（例如，Zn-蛋白络合物）；和/或非离子型表面活性剂，例如TWEEN™、PLURONICS™或聚乙二醇（PEG）。本文进一步描述了药学上可接受的赋形剂。

在一个方面，本发明提供了生产如本文所公开的抗-GUCY2c抗体或双特异性抗体的方法，包括在导致产生如本文所公开的抗-GUCY2c抗体或双特异性抗体的条件下培养宿主细胞，并从培养物中纯化所述抗体或双特异性抗体。

在另一各方面，本发明提供了如本文所公开的抗-GUCY2c抗体、双特异性抗体、药物组合物、多核苷酸、上清液、载体或宿主细胞在制备用于检测、诊断和/或治疗GUCY2c有关病症的药物中的用途。

本发明的另一个方面是试剂盒，其包括如上文所公开的GUCY2c抗体或CD3-GUCY2c双特异性抗体和用于根据本文所述的本发明的任何方法进行使用的说明书。通常，这些说明书包括对用于上述治疗性治疗的GUCY2c抗体或CD3-GUCY2c双特异性抗体的施用的描述。所述试剂盒包括本文公开的任何药物组合物。药物组合物和其他试剂可以以任何方便的形式存在于试剂盒中，如例如以溶液或粉末形式。

在另一个方面，试剂盒在一个或多个容器中进一步包括一种或多种可用于治疗癌症的其他预防或治疗剂。在一个实施方案中，所述其他预防或治疗剂是化疗剂。在其他方面，所述预防或治疗剂是生物或激素治疗剂（therapeutic）。

本发明的药物组合物、预防剂或治疗剂的几个方面在人中使用前优选在体外、在细胞培养系统和在动物模型生物（例如啮齿类动物模型系统）中进行所期望的治疗活性的测试。

本发明的预防和/或治疗规程的毒性和功效可以通过在细胞培养物或实验动物中的标准药学程序来确定，例如，用于确定LD₅₀（对50％的群体致死的剂量）和ED₅₀（在50％的其群体中治疗有效的剂量）。毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指数，并且可以表示为比值LD₅₀/ED₅₀。表现出大的治疗指数的预防剂和/或治疗剂是优选的。

进一步地，本领域技术人员已知的任何测定都可用于评价本文公开的用于治疗或预防癌症的疗法或组合疗法的预防和/或治疗效用。

与如本文所述的GUCY2c抗体或CD3-GUCY2c双特异性抗体的用途相关的说明书通常包括关于用于预期的治疗的剂量、给药方案和施用途径的信息。容器可以是单位剂量、大批包装（bulk package）（例如，多剂包装）或亚单位剂量。本发明的试剂盒中供应的说明书一般是在标签或包装插页（例如，试剂盒中包括的纸张）上的书面说明书，但机器可读的说明书（例如，磁性或光学存储盘上携带的说明书）也是可接受的。

本发明的试剂盒在合适的包装中。合适的包装包括，但不限于，用于每种药物组合物和用于向主体施用药物组合物的其他包括的试剂（例如，缓冲剂、平衡盐溶液等）的小瓶、安瓿、管、瓶、大口瓶、软包装（例如，密封的聚酯薄膜或塑料袋）等。还预期的是用于与特定设备例如吸入器、鼻施用设备（例如喷雾器）或输注设备例如微泵组合使用的包装。试剂盒可以具有无菌出入口（例如，容器可以是具有可通过皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶）。容器也可以具有无菌出入口（例如，容器可以是具有可通过皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶）。组合物中的至少一种活性剂是GUCY2c抗体或CD3-GUCY2c双特异性抗体。容器可以进一步包括第二药学活性剂。

通常，试剂盒包括容器和在容器上或与容器有关的标签或一份或多份包装插页。

生物保藏

本发明的代表性材料于2018年2月14日保藏于美国典型培养物保藏中心（American Type Culture Collection），10801 University Boulevard, Manassas, Va.20110-2209，美国。具有ATCC检索No. PTA-124943的载体GUCY2C-1608链A（VH-臼SEQ IDNO: 220）包含编码双特异性抗体GUCY2C-1608的VH-臼链的DNA插入片段（SEQ ID NO：247），且具有ATCC检索No. PTA-124944的载体GUCY2C-1608链B（VL-杵SEQ ID NO: 216）包含编码双特异性抗体GUCY2C-1608的VL-杵链的DNA插入片段（SEQ ID NO：246）。

保藏根据国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约（Budapest Treatyon the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for thePurpose of Patent Procedure）及其实施细则（布达佩斯条约（Budapest Treaty））的规定进行。这确保保藏物的活培养物从保藏日起维持30年。保藏物将根据布达佩斯条约条款通过ATCC可获得，并且受辉瑞公司（Pfizer Inc.）和ATCC之间的协议的支配，所述协议确保在相关的美国专利颁布时或者在向公众公开任何美国或外国专利申请时（以先到者为准），保藏物培养物的子代对公众的永久且不受限制的可用性，并且确保子代对由美国专利商标局局长（U.S. Commissioner of Patents and Trademarks）根据35 U.S.C.第122条和根据其的局长细则（Commissioner’s rules）（包括特别关于886 OG 638的37 C.F.R.第1.14条）确定有资格的人的可用性。

本申请的受让人已同意，如果在合适的条件下培养时，保藏的材料的培养物将会死亡或丧失或破坏，则将在通知时迅速将所述材料替换为相同的另一份。保藏的材料的可用性不应解释为违反任何政府当局根据其专利法授予的权利来实践发明的许可。

用于实施本发明的具体方面的下述实施例仅为了举例说明起见而提供，且不意图以任何方式限制本发明的范围。

实施例

实施例1：小鼠GUCY2c抗体的免疫和杂交瘤产生

将重组人GUCY2c蛋白免疫原或在表面上超表达人GUCY2c（SEQ ID NO：224）的细胞注射到Balb/c小鼠中用于产生杂交瘤。用可溶性huGUCY2c-mIgG2a蛋白或表达人GUCY2c（SEQ ID 224/225）的300.19细胞系免疫八周龄的雌性Balb/c小鼠。对于用huGUCY2c重组蛋白免疫的小鼠，根据RIMMS规程对动物进行给药（Kilpatrick等人. Hybridoma. 1997. 16:381-389）。简而言之，在两周的过程中通过皮下注射用六次重组人GUCY2c-小鼠IgG2a Fc-融合蛋白（SEQ ID NO：230）免疫小鼠。所用的佐剂是完全和不完全弗氏佐剂。对于基于细胞的免疫，Balb/c小鼠在没有佐剂的情况下通过腹膜内（i.p.）注射每周两次用超表达人GUCY2c的5x10⁶个300.19细胞免疫达一个月。为了测定小鼠GUCY2c抗体滴度，从免疫的动物收集测试出血，并通过关于重组人GUCY2c mIgG2a-Fc（SEQ ID NO：230）和食蟹猴GUCY2c-mIgG2a-Fc（SEQ ID NO：234）的酶联免疫吸附测定（ELISA）检查GUCY2c特异性滴度。选择具有最高GUCY2c滴度的动物用于杂交瘤生产。对于可溶性重组蛋白免疫的小鼠，将LN淋巴细胞和脾细胞用于融合，而对于用300.19/hGUCY2c免疫的小鼠，仅脾细胞用于融合。对于杂交瘤生产，使用PEG将脾细胞和/或淋巴结淋巴细胞与P3X骨髓瘤以1:1的比例融合。在有HAT的情况下选择融合的细胞达7天，然后在筛选之前将杂交瘤维持在含HT的培养基中。为了鉴定抗-huGUCY2c特异性杂交瘤，通过ELISA对杂交瘤上清液进行IgG抗-huGUCY2c反应性的筛选。然后合并潜在的抗-GUCY2c杂交瘤，并分析其对转染的表达GUCY2c的300.19细胞系和原发性肿瘤系上的细胞表面人和食蟹猴（cyno）GUCY2c的反应性。简而言之，在第1天以4 x10⁴个细胞/孔将表达各种GUCY2c蛋白（SEQ ID NOs：224、226和228）的300.19细胞系接种在无菌的96-孔组织培养平板（Becton Dickinson）中，并于37℃/5％CO₂温育1-2天，直到观察到汇合的单层为止。将细胞用PBS + Ca²⁺和Mg²⁺洗涤4次，并于室温用3％牛奶/1％BSA/PBS+ Ca²⁺和Mg²⁺封闭1小时。将连续稀释的样品（在封闭缓冲液中1:3）应用到平板上。在用PBS+ Ca²⁺和Mg²⁺洗涤之前，将平板于室温温育2小时。然后应用在封闭缓冲液中稀释（1:4,000）的HRP-缀合的第二抗体，山羊抗小鼠IgG Fc（Thermo Scientific），并与细胞一起温育1小时。将平板用PBS + Ca²⁺和Mg²⁺洗涤，然后TMB底物溶液显影10分钟，然后0.18M H₂SO₄以终止反应。测量在O.D. 450 nM处的吸光度，并使用Microsoft Excel和Graphpad-Prism软件将数据绘图和分析。鉴定了特异性结合人和食蟹猴GUCY2c的杂交瘤。

实施例2：流式细胞术和免疫组织化学测定中抗-GUCY2c杂交瘤抗体的结合

通过流式细胞术对抗-GUCY2c杂交瘤抗体进行与T84和HT55肿瘤细胞上人GUCY2c的细胞表面结合的筛选。HT29细胞用作阴性对照。将细胞用细胞解离缓冲液（Sigma）解离，并在冰上用PBS + 3％BSA封闭。将细胞在冰上用第一抗体染色1小时，且然后用冷PBS洗涤。在冰上添加10 µg/ml的第二抗体（PE缀合的抗小鼠第二抗体，Jackson Immunoresearch）达小时。将细胞再次用冷PBS洗涤，并重悬浮于PBS中，并用DAPI染色用于活/死区分，并在BDLSRII Fortessa上分析GUCY2c结合。鉴定出几个克隆以显示与表达GUCY2c的细胞系（T84和HT55）的特异性结合，且不与GUCY2c-阴性细胞（HT29）结合。

测试了来自针对GUCY2c免疫的BALB/c小鼠的杂交瘤在福尔马林固定的石蜡包埋的细胞沉淀中的免疫反应性。对于所述筛选产生的细胞沉淀由300.19亲本细胞，超表达小鼠、食蟹猴猕猴或人GUCY2c的300.19细胞，一种表达高内源水平的GUCY2c的人结肠直肠癌细胞系（T84）和一种对于GUCY2c表达呈阴性的人结肠直肠癌细胞系（HT29）组成。将细胞系在10％中性缓冲的福尔马林（Thermo Scientific）中固定24小时，并于300 x g离心4分钟（m）以沉淀。去除福尔马林，并用预热的50℃ Histogel（Thermo Scientific）将细胞沉淀温和地重悬浮。将包埋在Histogel中的细胞沉淀于4℃冷却1-2小时，然后在VIP自动组织处理机（Tissue-Tek）中处理过夜。将处理的细胞沉淀包埋在石蜡中。切割五微米的细胞微阵列切片，转移至水浴中，并放置于Superfrost Excell显微镜载玻片（Fisher）上。使载玻片干燥过夜。在组织切片脱蜡和再水化后，在Borg Decloaker缓冲液pH 9.5（Biocare Medical）或pH 6.0柠檬酸盐缓冲液（Thermo Scientific）中在Retriever 2100高压锅（ElectronMicroscopy Sciences）中进行热诱导的表位提取，继之以冷却至室温（RT）。内源过氧化物酶活性用Peroxidazed 1（Biocare Medical）灭活10 m。非特异性蛋白相互作用被Background Punisher（Biocare Medical）阻断10 m。在两种热诱导的表位提取条件下，将每种杂交瘤在不稀释的情况下温育1小时。在TBS中漂洗切片，并用Envision+ 小鼠HRP（DAKO）检测杂交瘤结合30 m。将载玻片在TBS中漂洗，并用Betazoid DAB色原试剂盒（Biocare Medical）显影免疫反应性5 m，继之以在蒸馏水中漂洗。免疫染色的切片用CAT苏木精（Biocare Medical）短暂复染，在自来水中洗涤，在分级醇中脱水，在二甲苯中透明化，并用Permount封固介质（FisherChemicals）盖片。载玻片由兽医病理学家评价以评估免疫反应性。在所述筛选中鉴定出具有对人、食蟹猴和小鼠GUCY2c的免疫反应性的克隆。

表11中显示了通过流式细胞术和免疫组织化学（IHC）的抗-GUCY2c杂交瘤抗体结合的结果。

表11

实施例3：细胞系上GUCY2c表达水平的定量

使用与藻红蛋白（Thermo Scientific）以1:1的比例缀合的GUCY2C-9H3克隆测量细胞系中的GUCY2c受体密度。将1x105的细胞用10 ug/ml的PE标记的抗-GUCY2c mAb染色用于饱和结合。将细胞洗涤并重悬浮于具有DAPI的FACS缓冲液中，并使用具有FACS Diva软件的BD LSRII Fortessa进行获取。在相同的获取PE电压设置中使用QuantiBRITE PE标记的珠（BD），以基于PE几何平均荧光强度计算每个细胞的PE标记的抗体数目（ABC）。表12中显示了人肿瘤细胞系中的GUCY2c受体密度测量结果。在所述测定中表征了具有对于GUCY2c的受体密度的细胞系，并将其用于后来的测定（例如，细胞毒性测定）以评价CD3-GUCY2c双特异性抗体的功能活性。

表12

实施例4：抗-GUCY2c杂交瘤抗体的克隆和测序

将具有证实的细胞表面结合活性的杂交瘤上清液亚克隆为小鼠IgG1形式。提取RNA，并通过反转录聚合酶链反应（RT-PCR）克隆获得来自表达的抗体的可变（V）区DNA序列，如下文所述的。

使用QIAGEN RNAeasy Mini试剂盒将一到五百万个亚克隆的杂交瘤细胞匀浆用于总RNA分离。然后使用SuperScript III RT试剂盒（Invitrogen）产生第一链cDNA。接着产生抗-GUCY2c IgGs可变区的双链cDNAs，并使用来自小鼠IgG重链（IgG1、IgG2a、IgG2b）和轻链（κ或λ）恒定区的引物通过PCR进行扩增，如下文所述的。PCR循环条件为于95C 1分钟的1个循环；于95C 1分钟、63C 1分钟和72C 1分钟的25个循环。将所得到的RT-PCR产物克隆到TOPO-Blunt克隆载体（Invitrogen）中并测序。

可变结构域中的残基根据Kabat进行编号，所述Kabat是用于抗体编码的重链可变结构域或轻链可变结构域的编号系统（Kabat等人, 1991, Sequences of Proteins ofImmunological Interest, 第5版. Public Health Service, National Institutes ofHealth, Bethesda, MD）。使用所述编号系统，实际的线性氨基酸序列可以含有对应于可变结构域的FR或CDR的缩短或插入的较少或额外的氨基酸。例如，重链可变结构域可包括在H2的残基52之后的单氨基酸插入片段（根据Kabat的残基52a）和在重链构架（FR）残基82后的插入的残基（例如，根据Kabat的残基82a、82b和82c）。可以通过抗体的序列与“标准”Kabat编号的序列在同源性区域的比对来确定给定抗体的残基的Kabat编号。各种用于分配Kabat编号的算法是可获得的。本文使用在Abysis的版本2.3.3发布（www.abysis.org）中执行的算法，以将Kabat编号分配给可变区VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3、VH CDR2和VH CDR3。AbM定义用于VH CDR1。FR残基是除CDR残基以外的抗体可变结构域残基。VH或VL结构域构架包含以下述结构用CDRs点缀的四个构架亚区，FR1、FR2、FR3和FR4：FR1 – CDR1 – FR2 – CDR2 –FR3 – CDR3 – FR4。

具有小鼠V区和修饰的人IgG恒定（hIgG1）区的嵌合T细胞双特异性蛋白如下产生：将来自亲本小鼠TOPO载体的V区cDNAs亚克隆到哺乳动物表达载体中，所述哺乳动物表达载体包含各自具有半胱氨酸接头（接头3）例如GCPPCP（SEQ ID NO：192）和“杵”Fc链（SEQ IDNO：188）或“臼”Fc链（SEQ ID NO：189）的第一和第二异二聚体促进结构域。在所述情况下，将小鼠抗-GUCY2c可变重（VH）区（SEQ ID NOs: 11、19、26、33和41）与人抗-CD3可变轻（VL）区（SEQ ID NO: 84）符合读框地融合，由接头GGGSGGGG（SEQ ID NO: 190）隔开，且后面是连接至“臼”Fc链（SEQ ID NO：189）的另一个接头GCPPCP（SEQ ID NO: 192）。将小鼠抗-GUCY2cVL区（SEQ ID NOs: 92、100、104、106、112和119）与接头，GGGSGGGG（SEQ ID NO: 190），人抗-CD3 VH区（SEQ ID NO：1），后面是接头，GCPPCP（SEQ ID NO: 192）和“杵”Fc链（SEQ IDNO：188）符合读框地融合。通过标准PCR用并入了15-25个核苷酸突出端的引物扩增片段，所述突出端与用于等温装配（ITA）克隆的目的载体共享同源性。使用Infusion ITA克隆试剂盒（Clontech）将片段重组入上述线性化的载体中。

然后将连接物（ligations）转化到感受态大肠杆菌DH5α（Life Technologies）中，并于37C在含有100 µg/mL羧苄青霉素的琼脂糖平板上生长过夜。将菌落计数、挑取并在YT-液体培养基+ 100 µg/mL羧苄青霉素中生长过夜，并使用标准方法分离DNA。然后使用常规测序方法，在哺乳动物细胞表达之前，将所有DNA构建体在两条链上测序。

实施例5：嵌合CD3-GUCY2c双特异性抗体的表达和纯化

使用ExpiFectamine™ 293转染试剂盒（Life Technologies）将互补的构建体对（每条链12.5 µg）共转染到25 mL对数期培养物中，所述培养物含有1百万个细胞/ml HEK293细胞。转染后24小时，添加ExpiFectamine转染增强剂（ExpiFectamine TransfectionEnhancer），且使细胞在收获前生长另外4-5天。然后收集用过的培养物，离心以除去细胞碎片，然后通过20 µm过滤器。

然后使用A蛋白亲和层析纯化含有CD3-GUCY2c双特异性抗体的澄清的条件培养基。使用液体输送装置（Tecan）将样品加样到预装有MabSelect SuRe™ A蛋白树脂（GEHealthcare）的0.45 mL微柱（Repligen）上。将结合的蛋白用PBS pH7.2洗涤，然后用20 mM柠檬酸，150 mM氯化钠pH 3.5洗脱，并用2M tris，pH 8.0中和。然后根据制造商的方法，使用G25 Sephadex滴注柱（drip columns）（GE Healthcare）将样品脱盐至PBS pH 7.2中。遵循制造商的规程，在Aglient 1200 HPLC上使用具有Mab HTP柱的分析型大小排阻层析（Tosoh Bioscience）分析纯化的蛋白的纯度。通过使用显微分光光度计（Trinean）于OD280nm处测量来测定浓度。

实施例6：重组蛋白结合分析

通过ELISA对蛋白进行与重组人、食蟹猴和小鼠蛋白的结合的筛选。将纯化的人、食蟹猴、鼠GUCY2c ECD或人CD3 ε-δ蛋白于4C在PBS-CMF（无钙和镁）中以20 µl中1 µg/ml包被在Nunc-Maxisorb 384-孔ELISA平板上。将平板用PBS + 0.05％吐温20洗涤3x，并用PBS+ 3％牛奶封闭1小时，于室温摇动。去除封闭溶液，并添加整批（in block）连续稀释的样品，且温育1小时于室温摇动。如前所述，将平板洗涤3x，并添加第二抗体（山羊抗-hu IgGFc-HRP - Southern Biotech L2047-05，1:5000；山羊抗-小鼠IgG Fc-HRP - ThermoScientific，1:4,000稀释；或小鼠抗-五-HIS-HRP，Qiagen，1:1000），继之以于室温摇动1小时。如前所述洗涤平板，并使用TMB显影信号，用H2SO4终止反应，并在Envision平板读出器（Perkin Elmer）上于450 nm读取吸光度。还定期使用备择的检测方法代替TMB/H2SO4。在添加和洗涤第一抗体后，添加每孔20 µl的在DELFIA测定缓冲液（Perkin Elmer 1244-330）中1:1000稀释的抗人IgG铕缀合物（Perkin Elmer EU-N1），并于室温温育1小时。然后将平板用1x DELFIA洗涤溶液（Perkin Elmer 1244-114）洗涤3次，并添加每孔20 µl的增强溶液（Enhancement solution）（Perkin Elmer 1244-105）且温育30分钟。然后遵循制造商的方法，使用EnVision®平板读出器（EnVision®多标记平板读出器（Multilabel PlateReader），Perkin Elmer）在320和615 nm处测量时间分辨荧光。

为了测试与GUCY2c和CD3两者的双特异性结合，进行了夹心ELISA。将人CD3ε-δ（SEQ ID NO：242）于4℃在PBS-CMF（无钙和镁）中以20 µl中1 µg/ml包被在Nunc-Maxisorb384-孔ELISA平板上。将平板用PBS + 0.05％吐温20洗涤3x，并用PBS + 3％牛奶封闭1小时，于室温摇动。去除封闭溶液，并添加整批（in block）连续稀释的样品，且温育1小时于室温摇动。如前所述，将平板洗涤3x，并将纯化的人、食蟹猴或鼠GUCY2c ECD-小鼠IgG2a Fc融合蛋白以1 µg/ml添加到平板，并于室温温育，摇动1小时。如前所述，将平板洗涤3x，并添加第二抗体（山羊抗-小鼠IgG Fc-HRP - Thermo Scientific，1:4,000稀释），继之以于室温摇动1小时。如前所述洗涤平板，并使用TMB显影信号，用H2SO4终止反应，并在Envision®平板读出器（Perkin Elmer）上于450 nm读取吸光度。还定期使用备择的检测方法代替TMB/H2SO4。在添加和洗涤纯化的人、食蟹猴或鼠GUCY2c ECD-小鼠IgG2a Fc融合蛋白后，添加每孔20 µl的在DELFIA测定缓冲液（Perkin Elmer 1244-330）中1:1000稀释的抗mu-IgG铕缀合物（Perkin Elmer EU-N1），并于室温温育1小时。将平板用DELFIA洗涤缓冲液洗涤3x，并与20 µl的增强溶液（Perkin Elmer 1244-105）温育30分钟。然后遵循制造商的方法，使用EnVision®平板读出器（Perkin Elmer）在3240和615 nm处测量时间分辨荧光。通过ELISA对嵌合的CD3-GUCY2c双特异性抗体进行针对重组人GUCY2c和人CD3ε的结合活性的筛选。最前面6个命中显示了低或亚nM的双重结合活性（表13）。

表13

实施例7：双特异性抗体介导的T细胞活性

使用Histopaque-177（Sigma）从健康的供体血液分离人PBMCs。使用来自StemCell Technologies的T细胞富集试剂盒从PBMCs分离幼稚T细胞（T细胞的负选择）。将用萤光素酶表达构建体转染的表达GUCY2c的T84人肿瘤细胞重悬浮于R10培养基（RPMI，10%FBS，1%青霉素/链霉素（Penn/Strep），3 ml 45%葡萄糖）中。也将T细胞重悬浮于R10培养基中，并以10:1或5:1的效应物-靶比值（E:T比值）添加到T84细胞。用GUCY2c双特异性抗体或阴性对照CD3双特异性抗体的连续稀释物处理细胞，并于37℃温育48小时，继之以使用Victor（Perkin Elmer）使用neolite试剂（Perkin Elmer）测量萤光素酶信号。使用四参数非线性回归分析在Graphpad PRISM中计算EC₅₀值。靶阴性的HCT116或HT29细胞未显示任何GUCY2c双特异性抗体介导的细胞毒性。表14中显示了使用嵌合CD3-GUCY2c双特异性抗体（E:T比值=10:1）的细胞杀伤测定的结果。所有CD3-GUCY2c双特异性抗体均显示出GUCY2c阳性细胞的特异性和有效的T细胞依赖性细胞杀伤。

表14

表15中显示了使用人源化CD3-GUCY2c双特异性抗体（E:T比值=5:1）的细胞杀伤测定的结果。所有双特异性抗体在GUCY2c阳性细胞中均显示T细胞依赖性细胞毒性。

表15

实施例8：通过Octet的表位分箱（epitope binning）

用OctetRED 384（ForteBio）使用串联分箱测定，评价双特异性蛋白GUCY2C-0074、-0077、-0104、-0105和-0098针对人GUCY2c（SEQ ID NO：224）的竞争性和非竞争性结合。于室温进行Octet测定。将生物素化的人GUCY2c在无钙和镁的磷酸缓冲盐水（PBS）中稀释至10 µg/ml，并根据制造商的说明书在链霉抗生物素蛋白（SA）生物传感器（18-5020，ForteBio）上捕获。将双特异性蛋白在PBS中稀释至300 nM。将GUCY2c包被的生物传感器浸入第一双特异性蛋白达300秒，然后浸入第二双特异性蛋白达300秒。以这种成对组合方式测试每种双特异性抗体。将竞争人GUCY2c上相同结合区的双特异性抗体分组到单个箱中。通过嵌合CD3-GUCY2c双特异性抗体的Octet的表位分箱显示了被抗-GUCY2c结合结构域识别的独特表位组（表16）。+符号表示竞争性表位；+/-符号表示部分重叠的表位；-符号表示非竞争性表位；且NT表示未测试比较分析。

表16

实施例9：小鼠GUCY2c抗体结合结构域的人源化

使用CDR-嫁接策略进行小鼠GUCY2c可变区的人源化。在含有人IgG1-3m恒定区或人轻链κ的载体中合成具有抗-GUCY2c互补性决定区（CDR）供体序列的含有人接纳体构架，重链的VH3-7（SEQ ID NO：176）和轻链的VK1-39（SEQ ID NO：180）的互补DNAs（cDNAs）。重链载体包含CH1区（SEQ ID NO：185）、铰链区（SEQ ID NO：186）和包括效应子功能突变L234A、L235A和G237A的CH2-CH3区（SEQ ID NO：187；根据EU索引编号）。轻链载体包含κCL结构域（SEQ ID NO：184）。引入VH和VL区两者的构架区中到小鼠序列的回复突变，并评估结合活性的完全恢复。人接纳体构架、亲本小鼠克隆和完全活性的人源化变体的VH和VL区的比对显示在对于克隆GUCY2C-0098的下表17A、17B、18A和18B中。

引入VH和VL区两者的构架区中到小鼠序列的回复突变，并评估结合活性的完全恢复。人接纳体构架、亲本小鼠克隆和完全活性的人源化变体GUCY2C-0241的VH和VL区的比对显示在对于克隆GUCY2C-0098的下表17A和17B中。

表17A

表17B

人接纳体构架、亲本小鼠克隆和完全人源化的变体的VL区的比对显示在对于克隆GUCY2C-0098的下表18A和18B中。基于Kabat编号的CDRs是加下划线的。粗体代表存在于完全人源化克隆中的原始非人种系氨基酸。

表18A

表18B

表19显示作为人IgG1人源化的抗-GUCY2c结合结构域通过ELISA显示保留的与重组GUCY2c蛋白的结合。

表19

表20显示作为CD3双特异性抗体人源化的GUCY2c结合结构域显示保留的同时与重组人GUCY2c和人CD3蛋白的结合。GUCY2C-0240是GUCY2C-0166 IgG的人源化CD3双特异性抗体形式。GUCY2C-0247和GUCY2C-0250是具有不同抗-CD3可变区的GUCY2C-0241的人源化CD3双特异性抗体。

表20

实施例10：使用噬菌体展示的GUCY2C结合结构域的进一步人源化和最优化

在某些实施方案中，取代是人种系取代，其中CDR残基被相应的人种系残基置换，以增加人氨基酸含量并降低抗体的潜在免疫原性。例如，如果使用人种系VH3-7构架以及示例性抗体GUCY2C-0241，则GUCY2C-0241抗体的VH CDR1（SEQ ID NO：27）和人种系VH3-7的比对如下表21（使用具有VH CDR1的AbM定义的Kabat编号系统）：

表21

对于位置26、28、29、31、32、33和34，人种系残基和相应的GUCY2C-0241残基相同，且种系取代是不可能的。对于位置27、30和35（粗体且加下划线），人种系残基和相应的GUCY2C-0241残基不同。在这些位置上的GUCY2C-0241残基可以被相应的人种系VH3-7残基置换，以进一步增加人残基含量。

抗体或其抗原结合片段可以包含包含人种系VH构架序列的VH构架。VH构架序列可以来自人VH3种系、VH1种系、VH5种系或VH4种系。优选的人种系重链构架是衍生自VH1、VH3或VH5种系的构架。例如，可以使用来自以下种系的VH构架：IGHV3-23、IGHV3-7或IGHV1-69（种系名称基于IMGT种系定义）。优选的人种系轻链构架是衍生自VΚ或Vλ种系的构架。例如，可以使用来自以下种系的VL构架：IGKV1-39或IGKV3-20（种系名称基于IMGT种系定义）。另一方面或此外，构架序列可以是人种系共有构架序列，例如人Vλ1共有序列、VΚ1共有序列、VΚ2共有序列、VΚ3共有序列、VH3种系共有序列、VH1种系共有序列、VH5种系共有序列或VH4种系共有序列的构架。人种系构架的序列可从各种公共数据库获得，例如V-base、IMGT、NCBI或Abysis。

抗体或其抗原结合片段可以包含包含人种系VL构架序列的VL构架。VL构架可包含一个或多个氨基酸取代、添加或缺失，同时仍保持与其从中衍生的种系的功能和结构相似性。在一些方面，VL构架与人种系VL构架序列至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同。在一些方面，所述抗体或其抗原结合片段包含VL构架，所述VL构架包含相对于人种系VL构架序列的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个氨基酸取代、添加或缺失。

人种系VL构架可以是DPK9的构架（IMGT名称：IGKV1-39）。人种系VL构架可以是DPK12的构架（IMGT名称：IGKV2D-29）。人种系VL构架可以是DPK18的构架（IMGT名称：IGKV2-30）。人种系VL构架可以是DPK24的构架（IMGT名称：IGKV4-1）。人种系VL构架可以是HK102_V1的构架（IMGT名称：IGKV1-5）。人种系VL构架可以是DPK1的构架（IMGT名称：IGKV1-33）。人种系VL构架可以是DPK8的构架（IMGT名称：IGKV1-9）。人种系VL构架可以是DPK3的构架（IMGT名称：IGKV1-6）。人种系VL构架可以是DPK21的构架（IMGT名称：IGKV3-15）。人种系VL构架可以是Vg_38K的构架（IMGT名称：IGKV3-11）。人种系VL构架可以是DPK22的构架（IMGT名称：IGKV3-20）。人种系VL构架可以是DPK15的构架（IMGT名称：IGKV2-28）。人种系VL构架可以是DPL16的构架（IMGT名称：IGLV3-19）。人种系VL构架可以是DPL8的构架（IMGT名称：IGLV1-40）。人种系VL构架可以是V1-22的构架（IMGT名称：IGLV6-57）。人种系VL构架可以是人Vλ共有序列的构架。人种系VL构架可以是人Vλ1共有序列的构架。人种系VL构架可以是人Vλ3共有序列的构架。人种系VL构架可以是人VΚ共有序列的构架。人种系VL构架可以是人VΚ1共有序列的构架。人种系VL构架可以是人VΚ2共有序列的构架。人种系VL构架可以是人VΚ3共有序列的构架。

通过增强的双取代（augmented binary substitution）的GUCY2c抗体的互补位确定

已经描述了用于确定关键CDR残基的方法，通过所述方法可以从在除CDR-H3之外的每个CDR位置含有人种系残基或相应的啮齿类动物残基的文库选择功能性抗体变体（Townsend等人, 2015, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112(50):15354-15359）。构建噬菌体scFv文库，其中将不同于人种系（VH3-7/VK1-39）的除GUCY2C-0241的VH CDR3以外的所有CDR位置随机化，从而使得约50％的克隆编码小鼠GUCY2C-0241氨基酸和约50％在所述位置编码人种系氨基酸（表17A、17B、18A和18B）。如下所述制备文库并在人GUCY2c（SEQ IDNO：232）上经历3-4轮选择。回收保持与GUCY2c的结合的克隆并测定其序列。

按照所述实验，在少于约20％的结合克隆中观察到人序列的位置被定义为必需的小鼠残基。小鼠残基优先在25个位置保持（根据Kabat编号系统的重链残基H35、E50、P52a、S53、N54、G55、L56、T57、N58、I60、E61、K62、F63和N65；轻链残基E27、V29、D30、L32、M33、Q34、N53、E55、T91、R92和K93，且AbM定义用于VH CDR1；Chothia编号系统用于VL CDR1），从而表明这些残基被人种系残基置换是强烈不利的。发现在重链残基27（F/Y）和30（S/T）以及轻链残基54（L/V）和94（A/V；根据kabat编号系统；AbM定义用于VH CDR1）小鼠和人残基具有相似的频率（定义为大于20％的人含量），从而表明这些位置的小鼠序列不是关键的。

此外，在增强的双取代策略中包括以前需要到小鼠氨基酸的回复突变的构架（FW）残基（根据Kabat编号系统的重链位置I48和G49）。在噬菌体选择和筛选后，约10％的时间观察到重链构架位置48的人氨基酸序列，从而提示回复突变是优选的。重链位置49于100％的时间含有小鼠氨基酸残基，从而提示所回复突变是必需的。表22中显示了增强的双取代后CDR或FW位置的小鼠或人氨基酸序列的频率。表22显示了通过增强的双取代测试的人氨基酸在GUCY2C-0098 CDR位置的并入频率（使用Kabat编号系统，且AbM定义用于VH CDR1；Chothia编号系统用于VL CDR1）。

表22

抗-GUCY2c结合结构域的进一步最优化

通过以下程序分离了具有改善的稳定性的抗-GUCY2c的变体。将人源化克隆GUCY2C-0241的VH和VL区（SEQ ID NOs：60和137）作为在含有C-末端His6和c-myc标签的噬菌体表达载体中的单链可变区片段（scFv）合成（Blue Heron）。通过使用（以前在美国专利9,884,921中描述的方法）的NNK软性随机化（NNK soft randomization）将随机突变引入VH和VL CDR结构域。在供应商（IDT）合成了被进行设计以一次选择性突变一个CDR残基的寡核苷酸（Oligos），且然后用于使用以前描述的方法在核酸模板中引入变化（Townsend等人,2015, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112(50):15354-15359）。还在寡核苷酸设计中并入进行设计以消除潜在的翻译后修饰位点的突变（重链G55E），其去除潜在的NG天冬酰胺脱酰胺作用位点（Chelius等人, Anal. Chem. 77(18):6004-6011, 2005）。挑取突变的克隆并送去测序以评估突变频率。然后将含有诱变的GUCY2C-0241的VH和VL CDR变体（SEQ IDNOs：60和137）的这些噬菌体表达载体合并到用于噬菌体展示的小的子文库中。

在选择和后来的筛选步骤过程中使用重组人、食蟹猴和鼠GUCY2c蛋白（SEQ IDNOs: 230、232、234、236、238和240）。对于涉及生物素化的蛋白的选择，将上述噬菌体库的等分部分和磁性链霉抗生物素蛋白珠（Dynabeads M-280链霉抗生物素蛋白）分别于室温、60℃或65℃在旋转混合器（20 rpm）中在3％牛奶/PBS中封闭1小时。于不同温度温育后，将封闭的噬菌体库以4000 RPM离心10分钟，将上清液转移至新鲜的管中，并与6％封闭缓冲液混合。将封闭的噬菌体与过量摩尔浓度的去选择试剂（de-selection reagents）（即，不含靶的链霉抗生物素蛋白珠，双链sDNA，胰岛素和/或膜提取试剂）温育，于室温于旋转振荡器（20 rpm）上温育1小时，与封闭的链霉抗生物素蛋白磁珠混合，且再温育一小时。通过使用磁分离器将珠沉淀来收集去选择的文库。使用Kingfisher磁纯化仪器（ThermoFisher，Springfield NJ，美国），将生物素化的选择抗原（于如表23所示的各种浓度）与去选择的噬菌体文库在96-深孔平板中在定期混合的情况下于室温温育1小时。将珠使用Kingfisher仪器上的磁分离器分离，并在单独的96-深孔平板中用PBS/0.1％吐温20洗涤4次，并用PBS洗涤3次。通过在新鲜的96-孔平板中与100 mM三乙胺（TEA）温育8分钟继之以与磁珠分离来洗脱结合的噬菌体。用2 M Tris-HCl pH 7.5中和洗脱的噬菌体。表23中显示了用于抗-GUCY2c结合结构域最优化的噬菌体选择条件的实例。表23还显示了用于噬菌体展示的选择条件。Dslxn代表使用的去选择条件。SA =链霉抗生物素蛋白；D = DNA；I =胰岛素；M =膜提取蛋白。Therm代表在与靶温育之前进行的热温育。

表23

洗脱的噬菌体用于感染10 ml已生长至对数中期（对应于〜0.5的OD₆₀₀）的大肠杆菌ER2738培养物。细菌于37℃在以150 rpm摇动的情况下用噬菌体感染1小时，离心步骤后浓缩，且铺平板在含有2％葡萄糖和100 µg/ml氨苄青霉素的2X YT琼脂生物测定平板（2XYTAG）上。将用输入或输出噬菌体感染的大肠杆菌培养物的各种稀释物也铺平板在2X YTAG琼脂上，以测定噬菌体滴度。于30℃过夜生长后，将10 ml的2X YTAG培养基添加到每个生物测定平板，并通过刮擦菌苔将细胞重悬浮。将甘油添加到所述细胞悬浮液中，以给出17％的终浓度，并以等分部分贮藏于-80℃直到进一步使用为止。为了拯救噬菌体用于下一轮选择，将100 µl的所述细胞悬浮液用于接种20 ml 2X YTAG培养基，其于37℃（300 rpm）生长至0.3-0.5的OD₆₀₀。然后将细胞用3.3 µl的MK13K07辅助噬菌体超感染，并于37℃（150 rpm）温育1小时。然后将细胞离心，并将沉淀重悬浮于含有卡那霉素/非葡萄糖的培养基（具有50µg/ml卡那霉素和100 µg/ml氨苄青霉素的2X YT）中。所述培养物于30℃（300 rpm）生长过夜。离心后在上清液中收集噬菌体，并准备好用于如上所述的下一轮选择。

供ELISAs之用的的粗周质材料的制备

取决于所用的生长条件，ScFv可以在噬菌体颗粒的表面上或细菌周质间隙的溶液中表达。为了诱导scFv释放到周质中，使用QPix菌落挑取器（QPix Colony picker）（Molecular Devices）从解冻的甘油原液接种含有具有0.1％葡萄糖/100 µg/ml氨苄青霉素的2X YT培养基的96-深孔平板（每孔一个克隆），并于37℃（999rpm）生长〜4小时。用终浓度为0.02 mM的IPTG诱导培养，并于30℃（999 rpm）生长过夜。细菌周质的内容物（周质制备物（peripreps））通过渗透压休克释放。简而言之，将平板离心并将沉淀重悬浮于150 µlTES周质缓冲液（50 mM Tris，1 mM EDTA，20％蔗糖，pH7.4）中，继之以添加150 µl 1:5TES:水，并在冰上温育30分钟。将平板于4000 RPM离心20分钟，并收获含scFv的上清液。

竞争ELISA

将ELISA平板（NUNC-Maxisorb 460372）用在PBS缓冲液中的1 µg/mL感兴趣的抗原于4℃包被过夜。弃去包被溶液，且然后于室温用每孔70 µL PBS-3％BSA封闭平板2小时。弃去封闭溶液，且20 µL第一抗体，其为所期望的浓度（一般于EC₅₀– EC₈₀）的作为周质制备物或纯化的蛋白的未知样品（于预定稀度，一般1:5）和纯亲本抗体的混合物。通过缓慢摇动于室温将平板温育2小时。将平板用每孔100 µL的洗涤缓冲液（Perkin Elmer 1244-114）洗涤5次，并与对于链霉抗生物素蛋白-Eu或抗人IgG在Delfia测定缓冲液（Perkin Elmer 1244-111）中1:1000稀释，对于抗小鼠IgG 1:500稀释的20 µL的第二抗体铕缀合物温育1小时。如前所述将平板洗涤5次，并与20 µL的增强溶液（Perkin Elmer 1244-105）温育30分钟。然后遵循制造商的方法，使用EnVision®平板读出器（EnVision®多标记平板读出器，PerkinElmer）在320和615 nm处测量时间分辨荧光。

ScFv转化为scFv-Fc、IgG和双特异性抗体

选择显示出期望的行为的ScFv用于亚克隆到scFv-Fc中，其中人IgG1的Fc结构域附着到scFv的3'端。简而言之，通过利用引物用于5'扩增的BssHII和用于3'扩增的BclI的标准聚合酶链反应（PCR）扩增片段。根据制造商的说明书，用相应的限制酶切割片段（NewEngland Biolabs）。将抗GUCY2c scFv-Fc扩增子进行凝胶纯化（Qiagen凝胶纯化试剂盒），并连接到辉瑞公司（Pfizer）有专利权的含有人IgG1 Fc结构域的预切割（pre-cut）的哺乳动物表达载体中。将ScFv-Fc构建体转化到大肠杆菌中并如前所述测序。如以前所述的，然后将序列验证的表达载体用于HEK 293细胞中的瞬时哺乳动物表达。如以前所述的，使用A蛋白亲和捕获继之以缓冲液更换到PBS中纯化样品。然后对纯化的样品进行重组GUCY2c蛋白结合活性和稳定性的筛选。scFv-Fc序列的例子是GUCY2C-0405（SEQ ID NO：213）。所述形式由以VH-VL取向由接头4连接的scFv组成，所述接头4是甘氨酸-丝氨酸接头（SEQ ID NO：193）。使用两个接头序列，接头5（SEQ ID NO：194）和接头6（SEQ ID NO：195），将VH-VL连接至修饰的人IgG 1 Fc结构域（SEQ ID NO：187）。

如以前所述的，还将最优化的scFv亚克隆到人IgG1和T细胞双特异性形式中。如前所述，可变区基因特异性引物被设计用于ITA克隆。

实施例11：最优化的GUCY2c抗体的表面等离振子共振

使用BIACORE™ 8K仪器（GE Healthcare）通过表面等离振子共振评估了最优化的GUCY2c抗体的结合。遵循制造商的规程，使用CM5传感器芯片，抗人Fc（GE BR-1008-39）首先被包被。将人抗-GUCY2c IgG在Hank氏缓冲盐水（HBS）-EP+ pH = 7.4中以0.5ug/mL，10uL/分钟从芯片上流过达30秒。紧接着，通过从芯片上以50uL/分钟流过达54秒，使浓度为450nM、150nM和50nM的人GUCY2c蛋白（SEQ ID NO：224）缔合，然后解离300秒。芯片在每次流动之间于5 BIACORE™）用3X 3M MgCl2再生30秒，表24中显示了人IgG1形式中最优化的抗-GUCY2c结合结构域的与人GUCY2c重组蛋白的结合亲和力（nM K_D）。与亲本的非最优化的结合结构域（GUCY2C-0241）相比，几个最优化的GUCY2c结合结构域例如GUCY2C-0486（SEQ IDNos：214和215）显示出改善的结合亲和力。

表24

实施例12：热攻击（thermal challenge）结合测定

为了评估最优化的变体的改善的热稳定性，在PCR块中于升高的温度热攻击后评估了最优化的噬菌体克隆的周质制备物（如上所述）或纯化的蛋白的结合活性。将Greinerbio-one 384-孔白色ELISA平板（781074）于4℃在包被缓冲液（25mM Na2CO3，75mM NaHCO3pH 9.6）中用1 µg/ml靶蛋白包被过夜（O/N）。将平板用PBS + 0.05％吐温20洗涤3次，且然后于室温摇动用封闭缓冲液（PBS + 3％牛奶）封闭1小时。单独地，以在封闭缓冲液中于室温1:10的周质制备物或1 µg/ml（EC80）的重组蛋白结合制备周质制备物或纯化的蛋白的稀释平板，并将100 µl转移至96-孔PCR平板。然后将含有100 µl稀释的样品的PCR平板于所期望的温度（通常在55℃和75℃之间）加热30分钟。使平板于室温冷却15分钟，且然后以4000rpm离心10分钟。排空封闭的ELISA平板，且每孔添加20 µl热攻击的蛋白上清液，然后温育1小时，于室温摇动。如前所述，将平板洗涤3次，并每孔添加20 µl的在DELFIA测定缓冲液（Perkin Elmer 1244-330）中1:1000稀释的抗-6xHIS-铕试剂（Perkin Elmer EU-N1）或抗人IgG-铕缀合物试剂蛋白（Perkin Elmer EU-N1），并于室温在摇动的情况下温育1小时。将平板用1x DELFIA洗涤溶液（Perkin Elmer 1244-114）洗涤3次，并向每个孔添加20 µl增强溶液（Perkin Elmer 1244-105），并温育30分钟。遵循制造商的方法，首先在OD320，然后在OD615，在Envision平板读出器上读取平板的时间分辨荧光。保持50％活性的温度被报告为T50。与非最优化的亲本克隆GUCY2C-0241（此处作为scFv-Fc形式的GUCY2C-0295）相比，于升高的温度温育后，作为scFv-Fc的稳定性最优化的GUCY2c结合结构域的热结合测定显示出改善的热稳定性（表25A和25B）。

表25A和25B显示了于逐渐增加的温度最优化的GUCY2c结合结构域（作为scFv-Fc蛋白）的时间分辨荧光（TRF）。T50值代表克隆保持50％结合活性的温度。

表25A

表25B

将显示出改善的热稳定性的GUCY2c抗体克隆的氨基酸序列针对亲本克隆GUCY2C-0241（VH SEQ ID NO：60和VL SEQ ID NO：137）进行比较。表26A中显示了导致改善的稳定性的VH CDRs中氨基酸含量的变化。位置59、60、61和62中的变化看来似乎对稳定性具有最大的影响，从而与稳定性的最大变化相关（根据Kabat的编号系统，使用VH CDR1的AbM定义）。

表26A

表26B中显示了导致改善的稳定性的VL CDRs中氨基酸含量的变化（Chothia的编号系统用于VL CDR1，且Kabat的编号系统用于VL CDR2和CDR3。VL CDR2中的位置53、54、55和VL CDR3中的位置93和94的变化看来似乎对稳定性具有最大的影响，从而与稳定性的最大变化相关。

表26B

实施例13：最优化的CD3-GUCY2c双特异性抗体的重组蛋白结合

使用以前描述的DELFIA方法，于室温和60℃以双特异性形式评价了最优化的抗-GUCY2c结合结构域与人GUCY2c（SEQ ID NO：224）和人CD3（SEQ ID NO：242）的同时重组蛋白结合。还使用以前描述的DELFIA方法于室温和60℃评价了最优化的双特异性抗体与人GUCY2c（SEQ ID NO：232）和食蟹猴GUCY2c（SEQ ID NO：236）的直接结合。表27中显示了最优化的GUCY2c双特异性抗体与人GUCY2c和人CD3的双重结合。最优化的CD3-GUCY2c双特异性抗体例如GUCY2C-1478于室温和60℃两者均显示出强的结合。

表27

表28中显示了最优化的GUCY2c双特异性抗体与人和食蟹猴GUCY2c直接结合的结果。最优化的CD3-GUCY2C双特异性抗体例如GUCY2C-1478显示于室温与人和食蟹猴GUCY2c两者均强的结合，但于60℃温育后显示出一些结合信号的丧失。

表28

实施例14：通过流式细胞术的CD3-GUCY2c双特异性抗体的细胞结合

使用以前描述的流式细胞术方法，对于与T84细胞上的GUCY2c和从新鲜人外周血单核细胞（PBMCs）纯化的幼稚人T细胞上的人CD3的细胞表面结合对最优化的CD3双特异性抗体进行滴定。人源化和最优化的GUCY2c克隆GUCY2C-0247和GUCY2C-1608显示出对表达人GUCY2c的T84细胞的低/亚nM结合亲和力（图2A和2B）。还通过流式细胞术评估了人源化和最优化的GUCY2c双特异性抗体的CD3细胞表面结合（图3A和3B），并显示了与幼稚人T细胞的低-中nM结合亲和力。

实施例15：GUCY2c双特异性抗体的免疫原性去风险化（De-risking）

当将一些治疗用蛋白施用于患者时，不需要的免疫应答，例如抗药物抗体（ADA）的产生，已影响了药物功效并引起患者安全性问题（Yin L.等人, Cell Immunol. Jun; 295(2):118-26, 2015）。取决于它们是否抑制治疗用蛋白的药理活性，ADAs可以分为两组：中和ADA（NAb）或非中和ADA（非-NAb）（Yin L.等人, Cell Immunol. Jun; 295(2):118-26,2015）。存在两种NAb和非-NAb可通过其促使降低的药物功效的可能的机制。首先，NAb直接阻断治疗用蛋白与其靶向分子的结合，因此降低其治疗功效（Yin L.等人, Cell Immunol.Jun; 295(2):118-26, 2015）。其次，NAb和非-NAb可促使增加的清除率，从而影响TPP的药物代谢动力学（PK），因此损害药物功效（Yin L.等人, Cell Immunol. Jun; 295(2):118-26, 2015）。可以在依赖于T细胞和不依赖于T细胞的途径两者中产生针对治疗用蛋白的免疫原性。在依赖于T细胞的途径中，通过识别由抗原呈递细胞中主要组织相容性复合体II类分子（MHC II）呈递的治疗用蛋白衍生的抗原性肽来激活T细胞。然后激活的T细胞刺激B细胞以产生治疗用蛋白特异性ADA（Yin L.等人, Cell Immunol. Jun; 295(2):118-26,2015）。为了将通过依赖于T细胞的应答引起的免疫原性的潜力减至最小，使用如下所述的计算机方法，进行努力以降低CD3-GUCY2c双特异性抗体序列的抗原性潜力。

使用两种规程（下文详述的）分析序列以鉴定潜在的T细胞表位。由本文对于任一规程所述的规则标记的任何序列均被认为是表位。本说明书主要在氨基酸9-聚体水平上检查序列。

方法1：将序列交付在ISPRI软件包中的EpiMatrix分析（ISPRI v 1.8.0, EpiVaxInc., Providence, RI (2017)；Schafer JRA, Jesdale BM, George JA, Kouttab NM,De Groot AS. Prediction of well-conserved HIV-1 ligands using a matrix-basedalgorithm, EpiMatrix. Vaccine 16(19), 1880-84, 1998）。原始结果提供了每种9-聚体氨基酸片段针对8种不同HLA类型的结合的可能性的等级。因此，对于每种9-聚体有8种预测（“观察结果”）。从序列的每个单独的线性编号位置开始产生9-聚体（因此，相同的9-聚体在相同的序列中可能出现不止一次）。如果任何4种观察结果表明9-聚体位于结合剂（binder）的最前面5％中（从而意味着对于至少4种HLA类型，预测其位于结合剂的最前面5％中），则将所述9-聚体认为是预测的表位（“表位”）。另一方面，如果8种预测中的任何1种表明9-聚体位于结合剂的最前面1％中，则所述9-聚体也被认为是预测的表位。

方法2：将序列交付使用MHC-II结合一致方法（Consensus method）的分析（WangP, Sidney J, Kim Y, Sette A, Lund O, Nielsen M, Peters B. Peptide bindingpredictions for HLA DR, DP and DQ molecules. BMC Bioinformatics 11:568, 2010；Wang P, Sidney J, Dow C, Mothé B, Sette A, Peters B. A systematic assessmentof MHC class II peptide binding predictions and evaluation of a consensusapproach. PLoS Comput Biol. 4(4),e1000048, 2008，在IEDB中（Vita R, Overton JA,Greenbaum JA, Ponomarenko J, Clark JD, Cantrell JR, Wheeler DK, Gabbard JL,Hix D, Sette A, Peters B. The immune epitope database (IEDB) 3.0. NucleicAcids Res. 1月28日 (43), D405-12, 2015；IEDB MHC-II结合预测（BindingPredictions）, http://www.iedb.org）。

所述软件的输出按15-聚体排列结果。对于15-聚体和HLA类型的每种组合提供了一致得分和百分位等级。但是，得出每种15-聚体的一致的各个得分是在15-聚体中发现的某些9-聚体的等级：用于所述一致的每种方法都报告了15-聚体内9-聚体的百分位等级，且取作总体15-聚体的值的一致是对于具有中位数得分的9-聚体的预测。如果（a）选择9-聚体作为15-聚体的一致代表，并且（b）对于正被考虑的HLA类型具有结合剂的最前面10％中的百分位等级，并且如果对于相同9-聚体对于三种或更多种不同的HLA类型发生标准（a）和（b）（即，三个观察结果），我们就将所述9-聚体分类为表位。所考虑的HLA类型为DRB1*01、1*03、1*04、1*07、1*08、1*11、1*13和1*15，它们是标准ISPRI/EpiMatrix报告中的相同HLA类型。因此，尽管所述方法的主要输出是15-聚体的等级，但为了便于与方法1进行比较，我们重新解释了数据，以获得预测的9-聚体表位的表。

我们将每种表位分类为种系或非种系表位。对于抗体，我们进一步基于每种表位在抗体中的位置（CDR或非CDR）对其进行分类。我们过滤了从IMGT（www.imgt.org）获得的人V结构域的序列，以去除注释为假基因或可读框（ORFs）的种系。在剩余的序列中发现的任何预测的9-聚体表位均被认为是种系表位。在J或C区（包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4）或这些区域之间的连接中发现的表位也被分类为种系表位。否则，表位被分类为非种系表位。CDR定义基于Kabat的编号系统（Kabat EA, Wu TT, Perry HM, Gottesman KS, Foeller C.Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health andHuman Services, NIH Publication No. 91-3242, 1991），其中CDRs被定义为包括以下残基：VH CDR1（H26-H35，包括插入，例如H35A，最多到但不包括H36）、VH CDR2（H50-H65（连端点在内））、VH CDR3（H95-H102（连端点在内））VL CDR1（L24-L34（连端点在内））、VL CDR2（L54-L56（连端点在内））、VL CDR3（L89-L97（连端点在内））。如果预测的9-聚体表位的氨基酸的任何一个是CDR区的一部分，则所述预测的9-聚体表位是CDR表位。请注意，我们对于VHCDR1选择起始位置（H26）与那些其他使用Kabat注释的出版物不同。

对于个别链，或对于抗体VH和VL结构域的配对，总得分可以通过如下所述对每个组成9-聚体求和来计算。检查9-聚体和HLA类型的所有个别组合（“观察结果”），而不管所述9-聚体是否为表位。如果特定观察结果表明所述肽对于给定HLA类型在结合剂的最前面5％中，则将所述观察结果的EpiMatrix Z-得分添加到与整个蛋白序列有关的流水式总计（running total）。还记录了检查的观察结果的总数。唯一的例外是，假定所有对于被ISPRI鉴定为“调节T细胞表位（T-regitopes）”的9-聚体的观察结果均具有0的EpiMatrix得分。在流水式总计中，从每个观察结果（包括调节T细胞表位）中减去0.05 * 2.2248的基线得分。如下所述计算最终得分：

T-reg调整的得分=（流水式总计）* 1000 /（观察结果数目）

较低的得分表示较低的预测的免疫原性潜力。

所述得分仅包括来自ISPRI/EpiMatrix的预测，且不包括来自IEDB的信息。因此，由IEDB但不是ISPRI预测的任何强的HLA结合剂都不对得分产生影响。在理论上，如果EpiMatrix也不将相同的序列预测为很可能的结合剂，则序列可能含有许多IEDB-预测的HLA结合剂，并且仍具有良好的T-reg调整的得分。

非最优化和最优化的GUCY2c VH和VL区与种系的比对。以粗体显示的残基代表如使用上述计算机方法确定的T细胞表位热点。在某些实施方案中，取代是人种系取代，其中CDR残基被相应的人种系残基置换，以增加人氨基酸含量并降低抗体的潜在免疫原性（如以前所描述的）。在其他实施方案中，取代是另一种氨基酸，其降低抗体的免疫原性的潜力，并且其不破坏抗体的结合性质。

例如，如果人种系VH3-7构架与示例性抗体GUCY2C-0241一起使用，则GUCY2C-0241的VH CDR2（SEQ ID NO：28）与人种系VH3-7（SEQ ID NO：178）的比对如下在下表29中所示（使用Kabat编号系统）：

表29

对于位置51、52、59和64，人种系残基和相应的GUCY2C-0241残基是相同的，并且种系取代是不可能的。对于位置50、52A、53、54、55、56、57、58、60、61、62、63和65（粗体），人种系残基和相应的GUCY2C-0241残基不同。当对于GUCY2C-0241序列运行计算机T细胞表位评估时，鉴定了潜在的肽序列（加下划线的）。然后进一步分析这些的非人种系含量，并靶定具有>10的T细胞表位得分且为非人种系两者的残基用于进行诱变（上面以粗体和加下划线显示的）。使用软性随机化诱变（以前在美国专利9,884,921中描述的方法），将这些残基突变并测试其保留的结合活性和保留的稳定性。

实施例16：最优化的CD3-GUCY2c双特异性抗体的T细胞介导的细胞杀伤活性

如以前所述的，评价最优化的CD3-GUCY2c双特异性抗体的肿瘤细胞的T细胞介导的细胞毒性。最优化的GUCY2c双特异性抗体显示了改善的T84肿瘤细胞的T细胞有效的T细胞介导的杀伤。表30和图4A至4D中显示了使用人源化的CD3-GUCY2c双特异性抗体的细胞杀伤测定的结果（E:T比值=5:1）。

表30

实施例17：差示扫描量热法（DSC）分析

将蛋白以400 µl的体积在磷酸缓冲盐水（PBS）溶液中稀释至0.6 mg/ml。PBS用作参考测定池中的缓冲液空白。PBS含有137 mM NaCl、2.7 mM KCl、8.1 mM Na2HPO4和1.47mM KH2PO4，pH 7.2。使用自动进样器（Malvern Instruments Ltd, Malvern, 英国）将样品分配到MicroCal VP-Capillary DSC的样品盘中。将样品于10℃平衡5分钟，且然后以每小时100℃的速度扫描最多到110℃。选择了16秒的过滤时间段。将原始数据进行基线校正，并将蛋白浓度进行归一化。使用Origin软件7.0（OriginLab Corporation, Northampton,MA）以用适当的转换数将数据拟合到MN2-状态模型（MN2-State Model）。表31中显示了scFv-Fc形式的最优化的抗-GUCY2c结合结构域的差示扫描量热法的结果。与亲本非最优化的克隆GUCY2C-0247（此处作为scFv-Fc形式的GUCY2C-0295）相比，最优化的克隆显示出改善的解折叠温度（Tm1）。

表31

实施例18：CD3-GUCY2c双特异性抗体的表面等离振子共振（SPR）分析

使用BIACORE™ T200仪器（GE Healthcare）于25℃和37℃以10 Hz的收集速率确定CD3-GUCY2c双特异性抗体与人GUCY2c（SEQ ID NO：224）、食蟹猴GUCY2c（SEQ ID NO：236）和鼠GUCY2C（SEQ ID NO：240）的结合亲和力。根据制造商的规程，使用胺偶联试剂盒（BR100050, GE Healthcare），将人GUCY2c、食蟹猴GUCY2c和小鼠GUCY2c直接固定在CM5传感器芯片（BR100530, GE Healthcare）表面的三个不同流动池（flow cell）上。人、食蟹猴和鼠GUCY2c的最终固定水平分别为142共振单位（RU）、61 RU和201 RU。流动池1用作参考流动池。将具有从450 nM一直到5.56 nM的浓度的CD3-GUCY2c双特异性抗体的三倍稀释系列以50 µl/分钟的流速在传感器表面上注射52秒。监控解离400秒，并用10 mM甘氨酸pH 2.1再生表面。运行和样品缓冲液为10 mM HEPES pH 7.4、0.15 M NaCl、3mM EDTA、0.05% P-20（HBS-EP+）。数据被双重参考（double referenced）。通过将所得到的传感图数据拟合到BIACORE™ T200评价软件3.0版（GE Healthcare）中的1:1朗格缪尔（Langmuir）模型中，确定结合亲和力和速率常数。使用BIACORE™ T200仪器（GE Healthcare）于25℃和37℃以10Hz的收集速率确定GUCY2c双特异性抗体与人CD3（SEQ ID NO：242）和食蟹猴CD3（SEQ IDNO：244）的结合亲和力。根据制造商的规程，使用His捕获试剂盒（28995056, GEHealthcare），将人CD3和食蟹猴捕获在CM5传感器芯片（BR100050, GE Healthcare）表面的三个不同流动池上。人CD3（SEQ ID NO：242）的捕获水平分别为在流动池2和3上的8共振单位（RU）和16 RU，而10 RUs的食蟹猴CD3捕获在流动池4上。流动池1用作参考。将具有从100nM一直到3.7 nM的浓度的GUCY2c双特异性蛋白的三倍稀释系列以50 µl/分钟的流速在传感器表面上注射55秒。监控解离300秒，并用10 mM甘氨酸pH 1.5再生表面。运行和样品缓冲液为10 mM HEPES pH 7.4、0.15 M NaCl、3 mM EDTA、0.05% P-20（HBS-EP+）。数据被双重参考。通过将所得到的传感图数据拟合到BIACORE™ T200评价软件3.0版（GE Healthcare）中的1:1朗格缪尔模型中，确定结合亲和力和速率常数。表32A至32J中显示了在不同条件包括测定取向和温度的CD3-GUCY2c双特异性抗体与人、食蟹猴和小鼠GUCY2c的BIACORE™结合分析的结果。人源化和最优化的GUCY2C结合结构域显示了作为双特异性抗体保留或改善的与GUCY2C和CD3的结合。在一些情况下，升高的温度（37C），观察到结合亲和力的降低。

表32A显示了CD3-GUCY2c双特异性抗体与人GUCY2c的结合动力学。使用的捕获方法是于25℃的抗人IgG捕获。

表32A

表32B显示了CD3-GUCY2c双特异性抗体与人GUCY2c的结合动力学。使用的捕获方法是于25℃的直接固定。

表32B

表32C显示了CD3-GUCY2c双特异性抗体与人GUCY2c的结合动力学。使用的捕获方法是于37℃的直接固定。

表32C

表32D显示了CD3-GUCY2c双特异性抗体与食蟹猴GUCY2c的结合动力学。使用的捕获方法是于25℃的抗人IgG捕获。

表32D

表32E显示了CD3-GUCY2c双特异性抗体与食蟹猴GUCY2c的结合动力学。使用的捕获方法是于25℃的直接固定。

表32E

表32F显示了CD3-GUCY2c双特异性抗体与食蟹猴GUCY2c的结合动力学。使用的捕获方法是于37℃的直接固定。

表32F

表32H显示了CD3-GUCY2c双特异性抗体与鼠GUCY2c的结合动力学。使用的捕获方法是于25℃的抗人IgG捕获。

表32H

表32I显示了CD3-GUCY2c双特异性抗体与鼠GUCY2c的结合动力学。使用的捕获方法是于25℃的直接固定。

表32I

表32J显示了CD3-GUCY2c双特异性抗体与鼠GUCY2c的结合动力学。使用的捕获方法是于37℃的直接固定。

表32J

表33A至33F显示了在不同条件包括测定取向和温度的CD3-GUCY2c双特异性抗体与人和食蟹猴CD3的BIACORE™结合分析。

表33A显示了CD3-GUCY2c双特异性抗体与人CD3蛋白的结合动力学。使用的捕获方法是于25℃的抗人IgG捕获。

表33A

表33B显示了CD3-GUCY2c双特异性抗体与人CD3的结合动力学。使用的捕获方法是于25℃的抗-His。

表33B

表33C显示了CD3-GUCY2c双特异性抗体与人CD3的结合动力学。使用的捕获方法是于25℃的抗-His。

表33C

表33D显示了CD3-GUCY2c双特异性抗体与食蟹猴CD3的结合动力学。使用的捕获方法是于25℃的抗-His。

表33D

表33E显示了CD3-GUCY2c双特异性抗体与食蟹猴CD3的结合动力学。使用的捕获方法是于25℃的抗-His。

表33E

表33F显示了CD3-GUCY2c双特异性抗体与食蟹猴CD3的结合动力学。使用的捕获方法是于25℃的抗-His。

表33F

实施例19：CD3-GUCY2c双特异性抗体的体外细胞因子释放测量

用不同剂量的T细胞（E:T比值为5:1）和GUCY2C-1608处理T84细胞。在不同的时间点（24小时、48小时、96小时）收集上清液，并根据制造商的指南使用多重Lumninex测定进行分析，并在具有xPONENT软件的Luminex 200上进行读取。测量的细胞因子是人IFN-γ、IL10、IL2、IL4、IL6、TNF-α。图5A-5F举例说明了GUCY2C-1608的细胞因子释放概况。在有T细胞的情况下，由T84细胞的GUCY2C-1608处理上调这些细胞因子，从而支持了表达GUCY2c的细胞中T-细胞介导的CD3-GUCY2c双特异性抗体活性的机制。

实施例20：CD3-GUCY2c双特异性抗体介导的活性的体内评价

将人PBMCs以约500万个细胞/ml解冻到培养基（X-VIVO 15 (Lonza). 5％人血清清蛋白（Gemini #100-318），1％青霉素/链霉素，0.01 mM 2-巯基乙醇）中。将细胞离心（spin down）并以5000万个细胞/ml的浓度重悬浮于Robosep缓冲液（Stem CellTechnologies）中。使用EasySep人T细胞富集试剂盒（Stem cell technologies，分离T细胞。使用人T细胞激活/扩充试剂盒（Miltenyi）激活和扩充T细胞。在第2天，将T细胞转移到G-Rex细胞培养设备中用于扩充，并将IL-2（Stem Cell Technologies）添加到培养基中，并在2天后补充。激活/扩充后1周收获T细胞。在收获时，用磁体去除珠，并将细胞以1x107个细胞/mL重悬浮于DPBS中用于体内接种。

对于异种移植研究，将NSG小鼠在协腹中皮下用结肠直肠肿瘤细胞系（T84、H55、LS1034）或患者来源的异种移植（PDX-CRX-11201、PDX-CRX-12213、PDX-CRX-24225）片段接种。

使用数字游标卡尺收集肿瘤测量结果，并使用修正的椭球公式½×长度×宽度2计算体积。将小鼠随机化，并于150-200 mm³的肿瘤大小分期。在第0天向动物施用初始剂量的GUCY2c双特异性抗体、阴性对照双特异性抗体或媒介物，并在第二天接种200万培养的T-细胞。每周以0.2 mL弹丸注射对小鼠给药最多到5次，并且通过每只动物的侧尾静脉静脉内施用所有化合物和T-细胞。与连续监控移植物抗宿主应答的病征一道每周两次收集肿瘤测量结果（图6-15）。所有CD3-GUCY2c双特异性抗体在细胞系异种移植和患者来源的异种移植模型两者中均显示出剂量依赖性T-细胞介导的抗肿瘤活性。

实施例21：环鸟苷酸（cGMP）测定以表征GUCY2c-CD3双特异性抗体的潜在的GUCY2c途径调节活性

为了测试T84细胞响应于GUCY2c途径刺激的环鸟苷酸（cGMP）产生，将2 x10⁶T84细胞铺平板于24孔平板中过夜。用含有50mM HEPES的DMEM洗涤细胞，并用含有50 mM HEPES和1mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）的DMEM处理15分钟。然后用从0.1一直到99 µM的浓度的GUCY2C-1608或阴性对照双特异性抗体处理细胞。作为阳性对照，添加GUCY2c激动剂肠毒素STp（BACHEM）（0.02至51 µM）达45分钟。通过离心去除颗粒，并根据制造商的指南，使用cGMP参数测定试剂盒（R&D Systems），将200 µl的上清液用于测定cGMP产生。为了评估GUCY2C-1608的潜在中和活性，将0.2 µM的STp添加到上述相同范围的GUCY2C-1608或阴性对照双特异性抗体中达45分钟，并类似地分析上清液的cGMP水平。

通过测量cGMP产生来评估T84细胞中的GUCY2c途径活性。虽然GUCY2c途径激动剂细菌肠毒素STp以剂量依赖性方式增加cGMP，但通过逐渐增加浓度的GUCY2C-1608的添加不增强cGMP的产生。此外，GUCY2C-1608不影响由0.2 µM STp诱导的cGMP产生（图16）。这些发现表明GUCY2C-1608不是GUCY2c途径激动剂，并且在有配体的情况下不中和GUCY2c途径功能。

实施例22：DNA和胰岛素多特异性ELISA

已提出抗体与除其靶以外的分子的非特异性结合是体内快速清除率的机制（Hötzel等人, 2010, MAbs 4(6):753-760）。这种多反应性（polyreactive）非靶结合的证据可以通过测量与膜制剂（Xu等人, Protein Eng. Des. Select. 26(10):663-70, 2013），杆状病毒颗粒（Hötzel等人, mAbs 4, 753-760,（2012）或带阴电的底物，例如DNA，胰岛素和肝素（Tiller等人, J. Immunol. Methods 329(1-2):112-124, 2008）的结合来获得。DNA和胰岛素的ELISA使用了一种低严格性规程，所述规程最初开发用于检测来自狼疮患者的低亲和力自身抗体（Tiller等人, J. Immunol. Methods 329, 112, 2008；美国专利No.7,314,622）。

将384-孔ELISA平板（Nunc Maxisorp）于4℃用在PBS pH 7.5中的DNA（10µg/ml）和胰岛素（5µg/ml）包被过夜。在PerkinElmer Janus液体处理机器人上执行从Tiller等人,J. Immunol. Methods 329, 112, 2008；美国专利No. 7,314,622中描述的测定修改的ELISA。将孔用水洗涤，于室温用50 µl的多反应性ELISA缓冲液（PEB；含0.5％吐温-20的PBS，1 mM EDTA）封闭1小时，并用水漂洗3次。将在25 µl中连续稀释的mAbs一式四份添加到孔中，并于室温温育1小时。将平板用水洗涤3次，并向每个孔添加25 µl的10ng/ml与辣根过氧化物酶（Jackson ImmunoResearch）缀合的山羊抗人IgG（Fcγ片段特异性）。将平板于室温温育1小时，用80 µl的水洗涤3次，并向每个孔添加25 µl的TMB底物（Sigma Aldrich）。在6分钟50秒后，通过向每个孔添加25 µl的0.18M正磷酸终止反应，并在450nm处读取吸光度。DNA和胰岛素结合得分计算为于10 µg/ml的抗体的ELISA信号与含缓冲液的孔的信号的比值。表34显示了使用DNA和胰岛素结合ELISA对CD3-GUCY2c双特异性抗体的多特异性分析。最优化的双特异性抗体显示出对于非特异性结合的低潜力。

表34

实施例23：亲和捕获自身相互作用纳米颗粒光谱学（AC-SINS）

抗体和抗体样蛋白具有与其自身相互作用的潜力，特别是在增加的浓度。这种自身相互作用可导致与药物开发过程中的制剂有关的黏度挑战以及增加的清除率风险（Avery等人, mAbs, 2018, Vol. 0, N0. 0, 1–12）。亲和捕获自身相互作用纳米颗粒光谱学测定测量自身相互作用，并用于帮助预测高黏度和不良药物代谢动力学性质的潜力。

AC-SINS测定在Perkin-Elmer Janus液体处理机器人上以384-孔形式标准化。用被缓冲液更换到20 mM乙酸钠pH 4.3中并稀释至0.4 mg/ml的80％山羊抗人Fc（JacksonImmunoResearch Laboratories, Inc. # 109-005-098）和20％非特异性山羊多克隆抗体（Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. # 005-000-003）的混合物包被20 nm金纳米颗粒（Ted Pella, Inc., #15705）。于室温温育一小时后，用硫醇化的聚乙二醇（2 kD）封闭金纳米颗粒上未被占的位点。然后使用针筒式滤器将包被的纳米颗粒浓缩10倍，并将10 µl添加到100 µl的在PBS pH 7.2中的0.05 mg/ml的mAb中。将包被的纳米颗粒与感兴趣的抗体在96-孔聚丙烯平板中温育2小时，且然后转移至384-孔聚苯乙烯平板，并在TecanM1000分光光度计上读取。以2 nm的增量从450-650读取吸光度，并使用Microsoft Excel宏（macro）以鉴定最大吸光度、平滑数据并使用二阶多项式拟合数据。从抗体样品的平滑的最大吸光度减去平均空白（仅PBS缓冲液）的平滑的最大吸光度，以确定抗体AC-SINS得分。表35显示了对于最优化的CD3-GUCY2c双特异性抗体的AC-SINS非特异性测定显示出低的自身相互作用和非特异性的潜力。

表35

实施例24：GUCY2c-1608双特异性抗体的稳定的细胞系的产生、表达和纯化

将编码GUCY2C-1608双特异性抗体的两条链克隆到含有双重启动子和用于单点整合（SSI）（Zhang, L.等人. Biotechnology Progress., 31: 1645-1656, 2015）到CHO细胞基因组中的重组位点的哺乳动物表达载体pRY19-GA-Q中。SSI依靠使用因高度稳定基因表达而众所周知的在已知染色体位置的基于重组酶的盒式交换（recombinase-basedcassette exchange）插入感兴趣的基因。将GUCY2C-1608-臼和GUCY2C-1608-杵构建体分别克隆到盒一和二中的我们的表达载体中。在pRY19载体含有感兴趣的基因的情况下经由电穿孔将所得到的GUCY2C-1608质粒转染到CHO-K1 SV 10E9细胞中，后面是使用潮霉素-B和更昔洛韦的正和负选择压力。这些CHO库经历了3周的恢复期。当观察到的生存力超过90％时，产生了用于将来工作的细胞库。然后，使确立的CHO-库在CD-CHO培养基（ThermoFisherScientific, Waltham, MA）中经受12-天的补料分批平台表达过程。在12-天的过程结束时，将细胞以3000 x g离心10分钟，继之以使用0.2 um PES瓶顶过滤器（bottle topfilter）（Corning, Oneonta, NY）对条件培养基的无菌过滤。另外，将稳定的CHO库对于10L受控摇动生物反应器（Finesse, Santa Clara, CA）改变比例。CHO库在辉瑞公司有专利权的培养基中以12-天补料分批生长，其包括化学成分确知的进料以维持培养物的生存力。当完成时，使用由20” 5um Pall Profile II继之以10” 0.2um Pall Supor（PallCorporation, Port Washington, NY）组成的过滤器系列（train）对培养物进行深度过滤。使用A蛋白亲和层析评价滴度。然后利用本领域已知的技术进行蛋白纯化，包括A蛋白层析、疏水作用层析和离子交换层析。表36中显示了来自稳定转染的CHO细胞库的GUCY2C-1608的蛋白表达滴度。GUCY2C-1608克隆库的表达滴度显示0.48-0.84克/升的表达水平。

表36

实施例25：GUCY2C-1608双特异性抗体的质谱分析

进行了LC/MS分析以证实正确配对的GUCY2C-1608纯化的双特异性抗体的产生。双特异性分子的分子量由其独特的氨基酸序列限定，且准确的分子量测定提供了存在正确配对的GUCY2c双特异性分子的证据。简而言之，通过在与Bruker maXis II Q-ToF质谱仪偶联的Waters Acquity H-Class HPLC上的LC/MS分析，分析了CD3-GUCY2c双特异性样品。将分析物加样到SMT SAM C2柱（2.1 mm X 100 mm，维持于80oC）上，并使用缓冲液B（80％1-丙醇，20％乙腈，具有0.05％三氟乙酸）和缓冲液C（具有0.05％三氟乙酸的100％乙腈）的三级梯度（tertiary gradient）以300 µl/分钟的流速洗脱（5分钟斜升至19％B和4％C，20分钟斜升至22％B和16％C，10分钟斜升至0％B和98％C。质谱检测在毛细管电压（capillaryvoltage）设置为3.5 kV的情况下以正模式进行。在Compass DataAnalysis v4.2中使用MaxEnt 1去褶合进行数据分析。图17显示了在最终纯化的GUCY2C-1608双特异性抗体的预测的分子量的高纯度。

实施例26：序列

表37A和37B提供了如本文所讨论的抗体或抗体片段SEQ ID NOs的概括说明。表37A对VH CDR1s序列使用ABM编号系统。表37A对所有其他序列（包括VH CDR2s）使用Kabat编号系统。

表37A

表37B

表38提供了本文涉及的序列。

表38

本发明的抗体序列使用Abysis AbM编号。Abysis AbM编号系统分配Kabat编号，并根据Kabat规则确定每个CDR的开始和结束，除了CDR H1除外。CDR H1是根据AbM定义确定的。

实施例27：三种抗-CD3变体在GUCY2C-CD3双特异性抗体中显示出改善的亲和力和细胞毒性

使用上文所述的标准克隆、表达和纯化技术，将衍生自2B5v6的三种抗-CD3变体2B5-1038（SEQ ID NOs：273和274）、2B5-1039（SEQ ID NOs：273和275）和2B5-1040（SEQ IDNOs：273和276）以图1中所示的构型之一重新形成与抗肿瘤GUCY2c抗体序列配对的双特异性双抗体-Fc分子。使用T-细胞重新靶向（retargeting）测定测试表39中所示的所得到的双特异性抗体的体外细胞毒性，且使用表面等离振子共振（SPR）测定测试结合亲和力，且通过AC-SINs测试非特异性。通过用于潜在的T-细胞表位的计算机预测的Epivax工具（Tool）评价了免疫原性风险。完整的质谱学数据表明，所有双特异性抗体均具有正确的配对，并且均为100％异二聚体。表39证明，所有三种双特异性抗体（1）与和抗-CD3 2B5v6配对的对照双特异性GUCY2C-1608相比，在体外细胞毒性测定中的效力为约2-倍（图18）；（2）具有通过SPR的对重组人CD3的结合亲和力，其与细胞毒性活性一致；（3）具有比起对照来提高的免疫原性评分；和（4）AC-SINs得分维持与对照双特异性GUCY2C-1608相同。

表39

实施例28：抗-GUCY2c抗体结合结构域的亲和力成熟

为了增加抗-GUCY2c抗体结合结构域对GUCY2c的亲和力，采用噬菌体展示方法。使用以前陈述的方法设计和生产了四种噬菌体展示文库。通过将突变引入抗-GUCY2C-1608（SEQ ID 221）的CDRs H1、H2和H3以及CDR L1中来产生文库。如以前所述的拯救噬菌体文库，并使用表40中概述的竞争性选择策略进行选择。对于第1轮，将噬菌体与和生物素化的人GUCY2c（5nM；SEQ ID NO.232）复合的链霉抗生物素蛋白珠温育。3次洗涤后，将100倍过量的未生物素化的抗原（500 nM）添加到反应中，并将混合物于4℃旋转过夜。第二天洗涤珠以除去从珠解离的噬菌体，并用TEA洗脱剩余的结合的噬菌体。对于第2轮，在没有任何竞争的情况下针对0.5 nM抗原如上所述重复选择。如以前所述的，挑取菌落并产生周质制备物。使用以前描述的竞争ELISA对克隆进行改善的结合活性的筛选。选择与亲本相比显示出改善的结合的克隆用于进一步分析。筛选后，如以前所述的对最前面的克隆进行DNA测序，以鉴定有助于改善的GUCY2c结合活性的突变。

最初的亲和力成熟文库选择后，将来自最前面的命中的CDR区组合到新的文库中，并在表41中概述的进行了额外的噬菌体展示选择。除使用0.5 nM生物素化的抗原之外，如上文对于最初的亲和力文库选择所述进行第1轮选择。对于每个文库，有两个第2轮选择分支，其中选择前的噬菌体用65℃温育进行攻击或不进行攻击。噬菌体选择后，如以前所述挑取菌落并产生周质制备物。通过以前描述的竞争ELISA筛选克隆。筛选后，对最前面的克隆进行DNA测序，以鉴定有助于改善的GUCY2c结合活性的突变。表40和41显示了用于亲和力成熟文库的噬菌体展示选择策略（C =文库；R =轮次；Dslxn =去选择条件；Therm =热条件；SA=链霉抗生物素蛋白；D = DNA；I =胰岛素；M =膜提取物）。

表40

表41

将通过周质制备物竞争ELISA显示出改善的亲和力的GUCY2c抗体克隆的氨基酸序列与亲本克隆GUCY2C-1608（VH SEQ ID NO：73和VL SEQ ID NO：147）进行比较。表42A中显示了导致改善的稳定性的VH CDRs中氨基酸含量的变化。位置54、55、56、97和99中的变化看来似乎对亲和力具有最大的影响，从而与时间分辨荧光的最大变化相关（根据Kabat的编号系统，对于VH CDR1使用AbM定义）。

表42A

表42B中显示了导致通过周质制备物竞争ELISA的改善的亲和力的VL CDRs中氨基酸含量的变化（Chothia的编号系统用于VL CDR1。VL CDR1中位置30、30a和30d中的变化看来似乎对亲和力具有最大的影响，从而与时间分辨荧光的最大变化相关。

表42B

在作为周质制备物以scFv形式筛选后，将来自最前面的克隆的VH和VL序列克隆到全人IgG1/κ形式中。使用以前描述的分子生物学技术，将VH和VL基因从噬菌体载体中扩增出来，并亚克隆到人IgGI和人κ载体中。然后使用也以前描述的方法瞬时表达和纯化这些最前面的亲和力成熟的克隆的人IgG1形式。然后如前所述通过表面等离振子共振针对人GUCY2c重组蛋白（SEQ ID NO. 232）分析纯化的蛋白。表43显示了与IgG形式的亲本GUCY2C-1608（GUCY2c-1640；SEQ ID NOs. 214和223）相比，亲和力成熟的克隆的结合速率（ka）、解离速率（kd）和平衡常数（K_D）。与亲本抗体相比，几种变体显示出多达3.4-倍的改善的亲和力。表44显示了这些亲和力成熟的形式的GUCY2C-1608的全VH和VL氨基酸序列。

表43. 亲和力成熟的抗-GUCY2c IgG针对人GUCY2c胞外域蛋白（ECD）的表面等离振子共振。

表44. 亲和力成熟的VH和VL区的氨基酸序列

实施例29：通过GUCY2C胞外域的肽作图的表位确定

进行肽作图以确定领先的GUCY2c抗体结合的GUCY2c胞外域（ECD）上的表位。对于这种方法，产生了具有15 aa重叠的20-聚体肽，从而覆盖了由氨基酸1-440组成的GUCY2c的整个胞外域到跨膜结构域中（表45）。合成肽并以冻干形式作为阵列提供（New EnglandPeptide, Gardner MA）。用乙腈将阵列重构至100 µg/ml，且然后进一步用碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液稀释至20 µg/ml。然后使用以前讨论的Delfia ELISA方法通过Delfia ELISA测试纯化的抗体或GUCY2c-CD3双特异性抗体与不同肽的结合，而将稀释的肽用作靶抗原。如通过时间分辨荧光（TRF）测量的，GUCY2C-1608显示出与肽19和20（SEQ ID NOs：334和335）的强结合。表45中显示了GUCY2C-1608针对所有肽的TRF结合数据。这些肽跨越了序列NSGDCRSSTCEGLDLLRKISNAQRM（SEQ ID NO：405）。肽之间的重叠区域是RSSTCEGLDLLRKIS（SEQ ID NO：406），从而指示了所述区域内的表位。

表45

然后使用以前描述的方法，在竞争DELFIA ELISA中将GUCY2c肽19（SEQ ID NO：334）与全胞外域竞争，并显示出与全胞外域有效竞争（图19）。这提示肽19（SEQ ID NO 334）含有在全GUCY2c胞外域上GUCY2C-1608结合的特异性表位。

GUCY2C-1608结合与抗体MS20不同的GUCY2c ECD表位

还将与GUCY2c胞外域结合的GUCY2C-1608与已知的抗-GUCY2c抗体进行了比较。US2013/315923中公开的抗体MS20不具有报道的表位。为了将所述抗体与GUCY2C-1608进行比较，使用以前描述的Delfia竞争ELISA的改良方法进行了竞争Delfia ELISA。在这里，如前所述将人GUCY2c蛋白（SEQ ID NO. 232）包被在平板上。将GUCY2C-1640（GUCY2C-1608的IgG形式；SEQ ID NOs. 214和223）或MS20抗体从20 µg/ml开始连续稀释，然后与250 ng/ml（EC50值单独确定）的GUCY2C-0098的兔嵌合IgG形式（SEQ ID NOs. 440和441，其由与兔恒定结构域融合的SEQ ID NOs：26和106组成）组合。如前所述洗涤平板，并添加1:1000稀释的第二抗兔铕抗体（Perkin Elmer）用于检测。如前所述检测TRF信号。TRF信号的降低表明竞争性结合，这是因为GUCY2C-0098的兔嵌合形式已被从与人GUCY2c的结合移走。如所预期的，GUCY2C-1640取代了GUCY2C-0098的兔嵌合形式，而MS20没有取代（图20）。因此，GUCY2C-1608结合与MS20抗体不同的GUCY2c ECD表位。

实施例30：GUCY2c-1608结合与抗体5F9不同的GUCY2c ECD表位

如下文所述的，US2011/0110936中描述的抗体被报道结合来自肽19（SEQ ID NO334）的GUCY2c ECD上的不同表位序列。

在96-孔平板中每孔添加表达人、大鼠和鸡GUCY2c（分别为CID1814、1815和1818）、点突变体CID1941-1950、“补片（patch）”突变体CID1868-1873（补片突变体由2-5个被来自鸡GUCY2c中相同位置的氨基酸残基置换的人GUCY2c氨基酸残基组成）或人-鸡GUCY2c嵌合体CID1874-1881（被鸡GUCY2c残基取代的>5个人GUCY2c氨基酸）或确证性反向嵌合体CID1939 & 1940（被人GUCY2c残基取代的>5个鸡GUCY2c氨基酸）或阴性对照CID1431（不含GUCY2s序列但具有与酵母表面上表达的其他构建体相同的附加表位的阴性对照构建体）的3x10e6个细胞。将细胞与抗-V5（Abcam 27671）抗体、单价或二价抗-GUCY2c抗体、抗体GUCY2C-1608或抗体5F9抗体（US2011/0110936中所述的Millennium抗体）于室温温育1小时。然后将细胞用PBS + 0.5％BSA缓冲液洗涤3次。然后将细胞与PE-缀合的抗小鼠IgG或PE-缀合的抗人IgG或PE-缀合的抗-HA抗体（Miltenyi Biotec 130-092-257）于4℃在黑暗处温育30分钟。用PBS + 0.5％BSA缓冲液洗涤细胞3次，且然后在流式细胞仪上分析。

将结合至细胞的抗-GUCY2c抗体的MFI（中位数荧光强度（median fluorescenceintensity））相对于抗标签抗体的通过MFI测量的细胞表面上的表达归一化。所有细胞在细胞表面上都表达V5和HA以用于表达归一化。表46显示了抗-GUCY2c抗体与每种GUCY2c构建体的归一化的相对结合。不与抗-GUCY2c Ab结合的嵌合体（除CID1939和CID1940之外）、点突变体和补片突变体表明，那些构建体中改变的GUCY2c残基对结合抗体是重要的。GUCY2C-1608且不是抗体5F9与反向嵌合体CID1939和CID1940的结合的恢复证实了抗体GUCY2C-1608结合了GUCY2c（SEQ ID NO：224）上的残基68至87，并且表明抗体5F9的结合位点不与抗体GUCY2C-1608的重叠。

表46

实施例31：抗-GUCY2C-1608 scFv加GUCY2c-肽复合体的结晶和结构确定

对于结晶试验，以1:1.2的摩尔比形成GUCY2C-1608 scFv（SEQ ID NO 409）和GUCY2c-ECD肽编号19 ⁶⁸NSGDCRSSTCEGLDLLRKIS⁸⁷（SEQ ID NO 334）之间的复合体，并在含有pH 7.5的TBS的蛋白溶液中浓缩至8.8 mg/ml。通过悬滴蒸汽扩散（vapor-diffusion）法从含有20％PEG 3350，200 mM硫酸锂，2-[双(2-羟乙基)氨基]-2-羟甲基-丙烷-1,3-二醇（bis-tris）pH 5.5的条件获得晶体。杆状晶体具有与具有晶胞参数a=70.68 Å；b=80.57 Å；c=90.7 Å的单斜空间群= P2₁2₁2₁且与在晶体学不对称单元中的两个拷贝的GUCY2C-1608scFv-肽复合体一致的对称性。将晶体使用含有20％乙二醇的储存液（reservoirsolution）进行低温保护，并在液氮中瞬间冻结。在Argonne National Laboratory（APS）的IMCA beamline 17-ID从单个冷冻晶体收集了调整到1.6 Å分辨率的数据。使用autoPROC处理和调节数据，且最终数据集是71.4％完备的。

结构通过从获得自抗-GUCY2c CD3双特异性抗体的结构的单链Fv片段开始用PHASER进行分子置换来解决（图22）。通过搜索GUCY2C-1608 scFv的两个拷贝获得解决方案。用两个拷贝的GUCY2C-1608 scFv作为模型计算的所得到的电子密度图清楚地显示了两个肽的额外电子密度，每个肽都与相应的GUCY2C-1608 scFv的拷贝结合。

使用COOT的几个重复轮次的手动调整和模型重建以及使用autoBUSTER的晶体学精修产生了具有晶体学19.7 %的R_work和21.7%的R_free的GUCY2C-1608 scFv +肽的最终模型，其中R_work= ||F_obs| - |F_calc|| / |F_obs|，且R_free等同于R_work，但是对于从精修过程中忽略的反射的随机选择的5％进行计算。

A. GUCY2C-1608 scFv-肽结构的描述

17-残基长的GUCY2c-肽在结合到GUCY2C-1608 scFv的CDR-区时大部分采用α-螺旋确认（图21）。α-螺旋被二硫键SS-键约束到肽的N-末端。相互作用下掩盖的总结合界面面积为~1,320 Å²，其对于仅仅17个氨基酸残基长的片段而言是令人惊讶地大的。结合界面主要是疏水的，而在其中心有一些特定的极性接触，且在其周边具有氢键接触（图21）。

与GUCY2C-1608 scFv在3.8 Å之内的结合表位接触是由肽序列中加下划线的残基定义的：⁶⁸NSGDCRSSTCEGLDLLRKIS⁸⁷且在表47中列出。以粗体突出了将>75％的其表面积贡献给结合界面的氨基酸。GUCY2C-1608 scFv的结合互补位由5个CDR-区域定义：CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1和CDR-L3。表48中列举了与在3.8 Å之内的接触有关的GUCY2C-1608scFv（互补位）和GUCY2c-肽（表位）的氨基酸。

表47. GUCY2c表位残基

表48. 定义互补位（链H + L）和表位（链C）的氨基酸

B. 抗-GUCY2c CD3双特异性抗体的结晶和结构确定

对于结晶试验，用在每个VL-VH亚基链的C-末端的His6标签或FLAG标签产生了GUCY2C-1608的修饰的形式，以帮助纯化。使用序列GUCY2C-1637 VH（SEQ ID NO. 407）和GUCY2C-1637 VL（SEQ ID NO. 408）产生用于晶体学的GUCY2c CD3双特异性抗体。如上所述，将构建体瞬时转染到FreeStyle™ 293 HEK细胞中。收获条件培养基后，在轨道式混合器上于4℃使在TBS中预平衡的2.5 mL Ni-NTA树脂与蛋白分批结合（batch-bind）1小时。然后收集树脂并将其放置于Applied Biosystems柱（Life Technologies, Grand Island,NY, 美国）中。首先用缓冲液A（50 mM磷酸钠，300 mM氯化钠pH 8.0），然后用5个CVs的补加有20 mM咪唑的缓冲液A洗涤树脂至基线，且最后用缓冲液A + 250 mM咪唑洗脱。合并具有最高纯度的级分，并使用具有10kD MWCO的30 ml盒于4℃在2小时内透析入PBS中。然后通过抗-FLAG层析进一步纯化透析的蛋白。将40 mL抗-FLAG M2树脂（Sigma, St. Louis, MO,美国）在TBS中预平衡，并使其于4℃在1.4 L条件培养基中分批结合过夜。然后收集树脂并将其填充入用于抗-FLAG M2层析的柱中，用TBS（20 CVs）洗涤至基线，并最初用0.1 M FLAG肽缓冲液洗脱，且最后用0.1 M甘氨酸pH 3.0洗脱。立即用10％1.0 M Tris pH 8.0中和洗脱的蛋白。然后将具有最高纯度的级分合并，并使用Superdex200柱（GE Healthcare,Piscataway, NJ, 美国）通过大小排阻层析进一步纯化，并贮藏在TBS中。

对于结晶试验，将纯化的His/FLAG形式的GUCY2C-1608在含有TBS pH 7.5的蛋白溶液中浓缩至12 mg/ml。通过悬滴蒸汽扩散法从含有1M丙二酸钠pH 6、2％乙烯亚胺聚合物的条件获得晶体。晶体具有与具有晶胞参数a=b=119.55 Å和c=121.85 Å的六方空间群=P3₂2₁且与在晶体学不对称单元中的一个拷贝的双抗体一致的对称性。将晶体使用含有2.8M丙二酸钠pH 6的储存液进行低温保护，并在液氮中瞬间冻结。在Argonne NationalLaboratory（APS）的IMCA beamline 17-ID从单个冷冻晶体收集了调整到2.03 Å分辨率的数据。使用autoPROC处理和调节数据，且最终数据集是49.3％完备的。

结构通过从由Brookhaven PDB条目1moe制备的单链Fv片段模型开始用PHASER进行分子置换来解决。通过分别搜索双抗体分子的四个亚基中的每一个获得解决方案。使用COOT的几个重复轮次的手动调整和模型重建以及使用autoBUSTER的晶体学精修产生了具有晶体学19.1 %的R_work和20.8%的R_free的双抗体的最终模型，其中R_work= ||F_obs| - |F_calc||/ |F_obs|，且R_free等同于R_work，但是对于从精修过程中忽略的反射的随机选择的5％进行计算。

C. 抗-GUCY2C-CD3双抗体结构的描述

GUCY2c CD3双特异性抗体上的两个抗原结合部位间隔约70 Å并且位于分子的相对侧上，直接在彼此对面（图22）。抗-CD3 CDR和抗-GUCY2c CDR区域两者均远离亚基界面定位。

实施例32：与抗-VEGF-A mAb和阿昔替尼的GUCY2c CD3双特异性抗体组合的体内评价

将人PBMCs以约500万个细胞/ml解冻到培养基（X-VIVO 15 (Lonza). 5％人血清清蛋白（Gemini #100-318），1％青霉素/链霉素，0.01 mM 2-巯基乙醇）中。将细胞离心（spin down）并以5000万个细胞/ml的浓度重悬浮于Robosep缓冲液（Stem CellTechnologies）中。使用EasySep人T细胞富集试剂盒（Stem cell technologies，分离T细胞。使用人T细胞激活/扩充试剂盒（Miltenyi）激活和扩充T细胞。在第2天，将T细胞转移到G-Rex细胞培养设备中用于扩充，并将IL-2（Stem Cell Technologies）添加到培养基中，并在2天后补充。激活/扩充后1周收获T细胞。在收获时，用磁体去除珠，并将细胞以1x10⁷个细胞/mL重悬浮于DPBS中用于体内接种。

将NSG小鼠在协腹中皮下用结肠直肠患者来源的异种移植PDX-CRX-11201片段接种。使用数字游标卡尺收集肿瘤测量结果，并使用修正的椭球公式½×长度×宽度2计算体积。将小鼠随机化，并于150-200 mm³的肿瘤大小分期。在第0天向动物施用初始剂量的GUCY2c双特异性抗体（GUCY2C-1608）、阴性对照双特异性抗体或媒介物，并在第二天接种200万培养的T-细胞。每周以0.2 mL弹丸注射对小鼠给药最多到3次，并且通过每只动物的尾静脉静脉内施用所有化合物和T-细胞。从第0天开始施用组合剂。每3天通过尾静脉静脉内施用抗-VEGF mAb（G6-31）最多到4次。阿昔替尼经由口服管饲法（oral gavage）每天两次施用，最多到14天。与连续监控移植物抗宿主应答的病征一道每周两次收集肿瘤测量结果。

在PDX-11201过继转移模型中，以0.05 mg/kg施用的GUCY2c CD3双特异性抗体具有部分抗肿瘤应答。当分别以5 mg/kg和15 mg/kg单独施用时，抗-VEGF mAb和阿昔替尼在所述模型中也具有部分抗肿瘤应答。GUCY2c CD3双特异性抗体与抗-VEGF mAb或与阿昔替尼的组合导致加性的抗肿瘤应答，从而显示出完全的肿瘤抑制。

GUCY2C-1608在具有过继T细胞转移的PDX-CRX-11201结肠直肠癌患者来源的异种移植模型中，与抗-VEGF mAb以及阿昔替尼组合显示出增强的肿瘤生长抑制。

实施例33：与抗-PD1的GUCY2c CD3双特异性抗体组合的体内评价

将人PBMCs以约500万个细胞/ml解冻到培养基（X-VIVO 15 (Lonza). 5％人血清清蛋白（Gemini #100-318），1％青霉素/链霉素，0.01 mM 2-巯基乙醇）中。将细胞离心并以5000万个细胞/ml的浓度重悬浮于Robosep缓冲液（Stem Cell Technologies）中。使用EasySep人T细胞富集试剂盒（Stem cell technologies，分离T细胞。使用人T细胞激活/扩充试剂盒（Miltenyi）激活和扩充T细胞。在第2天，将T细胞转移到G-Rex细胞培养设备中用于扩充，并将IL-2（Stem Cell Technologies）添加到培养基中，并在2天后补充。激活/扩充后1周收获T细胞。在收获时，用磁体去除珠，并将细胞以1x10⁷个细胞/mL重悬浮于DPBS中用于体内接种。

将NSG小鼠在协腹中皮下用结肠直肠癌细胞系LS1034细胞接种。使用数字游标卡尺收集肿瘤测量结果，并使用修正的椭球公式½×长度×宽度2计算体积。将小鼠随机化，并于150-200 mm³的肿瘤大小分期。在第0天向动物施用初始剂量的0.03 mg/kg的GUCY2c双特异性抗体（GUCY2C-1608）、0.1 mg/kg的阴性对照双特异性抗体、5 mg/kg的抗-PD1（派姆单抗（pembrolizumab）生物类似药（biosimilar）D265A hIgG1a Fc效应子功能突变体）或媒介物，并在第二天接种200万培养的T-细胞。每周以0.2 mL弹丸注射对小鼠给药最多到3次，并且通过每只动物的侧尾静脉静脉内施用所有化合物和T-细胞。与连续监控移植物抗宿主应答的病征一道每周两次收集肿瘤测量结果。

在LS1034过继转移模型中，以0.03 mg/kg施用的GUCY2c CD3双特异性抗体具有部分抗肿瘤应答。当以10 mg/kg施用时，抗-PD-1在所述模型中没有抗肿瘤应答。GUCY2c CD3双特异性抗体与抗-PD-1的组合导致加性的抗肿瘤应答（图24）。

GUCY2C-1608在具有过继T细胞转移的LS1034结肠直肠癌细胞系来源的异种移植模型中，与抗-PD1 mAb组合显示出增强的肿瘤生长抑制。

实施例34：与抗-PDL1的GUCY2c CD3双特异性抗体组合的体内评价

将NSG小鼠在协腹中皮下用结肠直肠癌细胞系LS1034细胞接种。使用数字游标卡尺收集肿瘤测量结果，并使用修正的椭球公式½×长度×宽度2计算体积。将小鼠随机化，并于150-200 mm³的肿瘤大小分期。在第0天向动物施用初始剂量的0.03 mg/kg的GUCY2c双特异性抗体（GUCY2C-1608）或0.1 mg/kg的阴性对照双特异性抗体或媒介物，并在第二天接种200万培养的T-细胞。每周以0.2 mL弹丸注射对小鼠给药最多到3次，并且通过每只动物的侧尾静脉静脉内施用所有化合物和T-细胞。从第0天开始每3天静脉内施用抗-PDL1，最多到6次。与连续监控移植物抗宿主应答的病征一道每周两次收集肿瘤测量结果。

在LS1034过继转移模型中，以0.03 mg/kg施用的GUCY2c CD3双特异性抗体具有部分抗肿瘤应答。当以10 mg/kg施用时，抗-PD-L1在所述模型中没有抗肿瘤应答。GUCY2c CD3双特异性抗体与抗-PD-L1的组合导致加性的抗肿瘤应答（图25）。

GUCY2C-1608在具有过继T细胞转移的LS1034结肠直肠癌细胞系来源的异种移植模型中，与抗-PD-L1 mAb组合显示出增强的肿瘤生长抑制。

实施例35：评价GUCY2c-1608双特异性抗体在患有晚期胃肠肿瘤的患者中的安全性、耐受性、药物代谢动力学、药物动力学和抗肿瘤活性的1期剂量逐步上升（escalation）和扩大研究

所述实施例陈述了GUCY2c-1608双特异性抗体的1期、开放标签（open-label）、多中心、多剂量、安全性、PK和PD研究。所述研究含有两个部分，单一试剂的剂量逐步上升和在组合中（抗-PD-1或抗-VEGF）的剂量确定（分别为第1A和1B部分），继之以剂量扩大（第2部分）。在研究的第1A部分中，患有晚期/转移性胃肠肿瘤包括结肠直肠、胃和食道腺癌的患者的序贯群组（其不是已知提供临床益处的方案的候选人）将接受逐步上升剂量的GUCY2c-1608双特异性抗体。在第1B部分中，在患有晚期/转移性结肠直肠、胃和食道腺癌的患者中将发生GUCY2c-1608双特异性抗体在组合中（抗-PD-1或抗-VEGF）的剂量确定评价。第2部分（剂量扩大阶段）将评价在具有以前治疗的结肠直肠腺癌的患者中作为单一疗法或组合（抗-PD-1或抗-VEGF）从第1部分（剂量逐步上升阶段）中选择的推荐的2期剂量（RP2D）。当接近最大耐受剂量（MTD）或在RP2D/MTD时在第1A和1B部分中并且在第2部分中的剂量扩大臂的亚群中发生在这些患者中需要成对肿瘤活组织检查的生物标志群组。

GUCY2c-1608的逐步上升剂量将在21-天的周期内作为每周一次皮下（SC）注射施用。建议的起始SC剂量为0.6 µg/kg。

确定作为单一疗法的GUCY2c-1608 RP2D/MTD时，将开始第1B部分剂量群组，以探索在组合中（抗-PD-1或抗-VEGF）所述剂量水平的安全性、耐受性和初步抗肿瘤活性。剂量扩大阶段（第2部分）将评价在患有晚期/转移性结肠直肠腺癌的患者中作为单一疗法和与组合剂（抗-PD-1或抗-VEGF）的GUCY2c-1608的RP2D。

对在新剂量水平登记参加的每个初始患者（即，有助于初始剂量限制性毒性（DoseLimiting Toxicity）（DLT）评价的患者）的第一次给药之间也将有最少72-小时的间隔。在第1部分的第1周期第1天（C1D1）首次SC给药后，将对所有患者住院观察至少48小时或更长时间。

用GUCY2c-1608的治疗将继续，直到发生疾病进展、患者拒绝或不能接受的毒性为止（以最早者为准），除非研究人员和医学监护仪（medical monitor）基于个体利益/风险评估同意超出疾病进展的治疗。

利用静脉内（IV）剂量施用的备择给药方案

基于来自利用SC施用的剂量逐步上升群组的可获得的新出现的临床数据（包括安全性/耐受性，PK，PD等），可以评价静脉内（IV）施用。

可以在所述研究中设立致敏剂量以允许后来更高水平剂量施用的评价。

剂量逐步上升的标准

对于施用群组，表49中提供了初始剂量水平；可以基于临床发现评价中间剂量。对于SC施用群组，在初始剂量逐步上升水平期间，最大剂量增加将最多到250％，但在观察到DLT后将被调整为不多于100％。

表49

*中间剂量可基于临床发现进行评价

当如本领域技术人员所确定的符合终止标准时，将终止剂量逐步上升。

所述研究的第1A部分目的在于确定SC剂量方案的MTD，然而如果将给药方案转变为IV，则将确定IV剂量施用的MTD。如果对于IV需要引入致敏剂量（dose prime），那么将确定具有致敏剂量方案的IV的MTD。

第1B部分将目的在于确定具有组合剂（抗-PD-1或抗-VEGF）的GUCY2c-1608的MTD。

RP2D是基于1期研究结果选择用于进一步研究的剂量。

患者选择

对于剂量逐步上升（第1A和1B部分）：对标准疗法有抗性或没有可用的标准疗法的晚期/转移性结肠直肠、胃或食道腺癌的组织学或细胞学诊断。

对于剂量扩大（第2部分）：对标准疗法有抗性或没有可用的标准疗法的的以前治疗的结肠直肠腺癌的组织学或细胞学诊断，其具有至少一个可测量的病灶，未以前照射，如RECIST 1.1版所定义的，对标准疗法有抗性或没有可用的标准疗法。

细胞因子释放综合征管理

细胞因子释放综合征（CRS）管理和修订的CRS分级系统改编自D.W.Lee等人:Current Concepts in the Diagnosis and Management of Cytokine ReleaseSyndrome. Blood 124 (2014) 188-195。

抗-IL6施用：考虑在1小时内4 mg/kg，且如果在24至48小时内没有临床改善，则施用第二剂。

本文引用的每个专利、专利申请和出版物的公开内容都整体引入本文作为参考。

等同方案

尽管已经参考特定实施方案公开了本发明，但是显然，本领域的其他技术人员可以在不背离本发明的真实精神和范围的情况下设计本发明的其他实施方案和变化形式。本发明的主题包括所有那些其他实施方案和变化形式，包括本文公开的各种要素、特征、功能和/或性质的组合和子组合（subcombinations）。下述权利要求特别指出了被认为具备新颖性且非显而易见的某些组合和子组合。在本申请中、在要求本申请优先权的申请中或在相关申请中，可以请求保护体现在特征、功能、要素和/或性质的其他组合和子组合里的发明。这种权利要求，无论是涉及不同的发明还是相同的发明，且无论与原始权利要求相比在范围中更宽、更窄、相等还是不同，也都被认为包括在本公开内容的发明的主题内。

Claims

1.特异性结合鸟苷酸环化酶C（GUCY2c）的抗体，其中所述抗体包含：

a. 重链可变（VH）区，其包含SEQ ID NO: 11、19、26、33、41、48、52、57、60、62、64、65、67、69、71或73中所示的VH序列的VH互补性决定区1（VH CDR1）、VH互补性决定区2（VH CDR2）和VH互补性决定区3（VH CDR3）；和/或

b. 轻链可变（VL）区，其包含SEQ ID NO: 92、100、104、106、112、119、125、129、134、136、137、138、140、143、145、147、150、152、156、158、160、162、166、170、171、172、173、174或175中所示的VL序列的VL互补性决定区1（VL CDR1）、VL互补性决定区2（VL CDR2）和VL互补性决定区3（VL CDR3）。

2.权利要求1的抗体，其中：

c. 所述VH区包含（i）包含SEQ ID NO: 12、20、27、34、42、74、257、258、259、260或261的序列的VH CDR1；（ii）包含SEQ ID NO: 13、21、28、35、43、53、66、68、70、72、75、262、263、264、265、266或267的序列的VH CDR2；和（iii）包含SEQ ID NO: 14、22、29、36或44的序列的VH CDR3；和/或

d. 所述VL区包含（i）包含SEQ ID NO: 93、101、105、107、113、120、148、153、163或167的序列的VL CDR1；（ii）包含SEQ ID NO: 78、94、102、108、114、141、144、146、149、151、157、159、161、164或168的序列的VL CDR2；和（iii）包含SEQ ID NO: 95、109、115、121、142、154、165或169的序列的VL CDR3。

3.权利要求2的抗体，其中：

a. 所述VH区包含（i）包含SEQ ID NO：74或259的序列的VH CDR1；（ii）包含SEQ ID NO：75或267的序列的VH CDR2；和iii）包含SEQ ID NO：29的序列的VH CDR3；和/或

b. 所述VL区包含（i）包含SEQ ID NO：148的序列的VL CDR1；（ii）包含SEQ ID NO：149的序列的VL CDR2；和（iii）包含SEQ ID NO：142的序列的VL CDR3。

4.权利要求1或2的抗体，其中：

e. 所述VH区包含SEQ ID NO: 11、19、26、33、41、48、52、57、60、62、64、65、67、69、71或73的序列；和/或

f. 所述VL区包含SEQ ID NO: 92、100、104、106、112、119、125、129、134、136、137、138、140、143、145、147、150、152、156、158、160、162、166、170、171、172、173、174或175的序列。

5.权利要求1-4任一项的抗体，其中所述VH区包含SEQ ID NO：73的序列；且其中所述VL区包含SEQ ID NO：147的序列。

6.权利要求1-5任一项的抗体，其中所述VH区包含SEQ ID NO：73的序列或其变体，所述变体具有不在CDR区内的残基中的一个或几个保守氨基酸取代；和/或其中所述VL区包含SEQ ID NO：147的序列或其变体，所述变体具有不在CDR区内的氨基酸中的一个或几个保守氨基酸取代。

7.结合GUCY2c的抗体，其包含：

a. 包含具有序列RASESV-X_L1.30-X_L1.30a-YG-X_L1.30d-SLLQ的氨基酸的GUCY2c VL CDR1；

b. 包含具有SEQ ID NO：149中所示序列的氨基酸的GUCY2c VL CDR2；

c. 包含具有SEQ ID NO：142中所示序列的氨基酸的GUCY2c VL CDR3；

d. 包含具有序列GFTFS-X_H1.31-X_H1.32-WMH的氨基酸的GUCY2c VH CDR1；

e. 包含具有序列EIK- X_H2.52A-X_H2.53-X_H2.54-X_H2.55-X_H2.56-X_H2.57-NVHEKFKD的氨基酸的GUCY2c VH CDR2；和

f. 包含具有序列T-X_H3.96-X_H3.97-X_H3.98-X_H3.99-X_H3.100-G-X_H3.100B-WF-X_H3.100E-X_H3.101-V的氨基酸的GUCY2c VH CDR3。

8.权利要求7的抗体，其中：

a. X_L1.30是D、N或S；

b. X_L1.30a是Y、W或I；

c. X_L1.30d是T、S或H；

d. X_H1.31是S、R、W、Y、A、H、P、Y、T、N、K、D、G或V；

e. X_H1.32是Y、R、L、T、K、P、I、N、M、V或S；

f. X_H2.52A是P、T或V；

g. X_H2.53是S、A、L或R；

h. X_H2.54是N、T、R、H、K、M、S、A、Y、T或I；

i. X_H2.55是E、R、K、N、Y、G、L、A、M、S、H、D或Q；

j. X_H2.56是L、W、Y、F、V、I、N或H；

k. X_H2.57是T、M、S、L、N、Q或V；

l. X_H3.96是I、F或K；

m. X_H3.97是T、V、L、I、M、F、Y或A；

n. X_H3.98是T、N、R、G、L或I；

o. X_H3.99是T、K、L、W、A、S、M、P、N或R；

p. X_H3.100是E、G、A、H、S、D、T、R、Q、K、Y、L或M；

q. X_H3.100B是Y或H；

r. X_H3.100E是F或L；且

s. X_H3.101是D、Y、E或S。

9.权利要求1-8任一项的抗体，其中所述抗体选自Fab片段、Fab'片段、F（ab'）₂片段、Fd片段、Fv片段、单链Fv片段（scFv）、二硫键稳定的Fv（dsFv）片段、单结构域抗体（dAb）片段、单克隆抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、三特异性抗体、多特异性抗体、双特异性异二聚体双抗体、双特异性异二聚体IgG、多克隆抗体、标记的抗体、人源化抗体、人抗体及其片段。

10.权利要求1-9任一项的抗体，其进一步包含人或人源化的VH构架和人或人源化的VL构架。

11.权利要求10的抗体，其中所述VH构架包含SEQ ID NO: 5、6、7、8、15、16、17、18、23、24、25、30、31、32、37、38、39、40、45、46、47、49、50、51、54、55、56、58、59、61或63的序列；和/或所述VL构架包含SEQ ID NO: 80、81、82、83、86、87、88、89、96、97、98、99、103、110、111、116、117、118、122、123、124、126、127、128、130、131、132、133、135、139或155的序列。

12.与GUCY2c胞外域上的表位结合的分离的人单克隆抗体，其中所述表位包含选自SEQID NO：406的氨基酸残基R73、S74、S75、T76、E78、G79、L80、L82、L83、R84或I86的至少一个氨基酸残基。

13.权利要求12的分离的人单克隆抗体，其中所述表位包含选自SEQ ID NO：406的氨基酸残基R73、S74、S75、T76、E78、G79、L80、L82、L83、R84或I86的至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少十个氨基酸残基。

14.权利要求12的分离的人单克隆抗体，其中所述表位包含SEQ ID NO：406的氨基酸残基R73、S74、S75、T76、E78、G79、L80、L82、L83、R84或I86。

15.权利要求12的分离的人单克隆抗体，其中所述表位包含具有如SEQ ID NO：406中所示的序列的氨基酸。

16.权利要求12的分离的人单克隆抗体，其中所述表位是功能性表位。

17.权利要求12的分离的人单克隆抗体，其中如通过晶体学所测定的，所述分离的人抗体和GUCY2c表位氨基酸接触在3.8埃内。

18.权利要求1-17任一项的抗体，其中所述抗体是双特异性抗体。

19.特异性结合GUCY2c和CD3的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体包含第一多肽链和第二多肽链。

20.权利要求19的双特异性抗体，其中：

a. 所述第一多肽链在N-末端至C-末端方向包含：

i. 结构域1，其包含GUCY2c抗体的VL区（GUCY2c VL）和CD3抗体的VH区（CD3 VH），和

ii. 第一异二聚体促进结构域；和

b. 所述第二多肽链在N-末端至C-末端方向包含：

i. 结构域2，其包含CD3抗体的VL区（CD3 VL）和GUCY2c抗体的VH区（GUCY2c VH），和

ii. 第二异二聚体促进结构域；

其中所述GUCY2c VL和GUCY2c VH形成与GUCY2c特异性结合的结构域；且所述CD3 VL和CD3 VH形成与CD3特异性结合的结构域。

21.权利要求19的双特异性抗体，其中：

a. 所述第一多肽链在N-末端至C-末端方向包含：

i. 结构域1，其包含CD3 VL和GUCY2c VH，和

ii. 第一异二聚体促进结构域；和

b. 所述第二多肽链在N-末端至C-末端方向包含：

i. 结构域2，其包含GUCY2c VL和CD3 VH，和

ii. 第二异二聚体促进结构域；

22.权利要求19的双特异性抗体，其中：

a. 所述第一多肽链在N-末端至C-末端方向包含：

i. 结构域1，其包含GUCY2c VH和CD3 VL，和

ii. 第一异二聚体促进结构域；和

b. 所述第二多肽链在N-末端至C-末端方向包含：

i. 结构域2，其包含CD3 VH和GUCY2c VL，和

ii. 第二异二聚体促进结构域；

23.权利要求19的双特异性抗体，其中：

a. 所述第一多肽链在N-末端至C-末端方向包含：

i. 结构域1，其包含CD3 VH和GUCY2c VL，和

ii. 第一异二聚体促进结构域；和

b. 所述第二多肽链在N-末端至C-末端方向包含：

i. 结构域2，其包含GUCY2c VH和CD3 VL，和

ii. 第二异二聚体促进结构域；

24.权利要求20-23任一项的双特异性抗体，其中所述第一异二聚体促进结构域和所述第二异二聚体促进结构域各自包含Fc区，所述Fc区包含CH2结构域和CH3结构域，其中所述CH2结构域和/或所述CH3各自的氨基酸序列与野生型Fc区相比包含至少一种氨基酸修饰以形成杵或臼。

25.权利要求24的双特异性抗体，其中所述第一异二聚体促进结构域和所述第二异二聚体促进结构域并非两个都是杵或臼；和/或其中所述第一异二聚体促进结构域和所述第二异二聚体促进结构域形成IgG免疫球蛋白Fc区。

26.权利要求25的双特异性抗体，其中所述第一异二聚体促进结构域的CH3结构域包含突变Y349C和/或T366W，以形成杵；且所述第二异二聚体促进结构域的CH3结构域包含突变S354C、T366S、L368A和/或Y407V，以形成臼，（根据EU索引编号）。

27.权利要求26的双特异性抗体，其中所述第一异二聚体促进结构域的CH2结构域和所述第二异二聚体促进结构域的CH2结构域各自包含突变L234A、L235A和/或G237A，（根据EU索引编号）。

28.权利要求27的双特异性抗体，其中所述第一异二聚体促进结构域包含SEQ ID NO：188的序列，以形成杵；且其中所述第二异二聚体促进结构域包含SEQ ID NO：189的序列，以形成臼。

29.权利要求20-28任一项的双特异性抗体，其中所述GUCY2c VL和CD3 VH通过甘氨酸-丝氨酸接头连接；且所述CD3 VL和GUCY2c VH通过甘氨酸-丝氨酸接头连接。

30.权利要求29的双特异性抗体，其中所述甘氨酸-丝氨酸接头是包含SEQ ID NO：190的序列的接头1。

31.权利要求29的双特异性抗体，其中所述甘氨酸-丝氨酸接头是包含SEQ ID NO：191的序列的接头2。

32.权利要求20-31任一项的双特异性抗体，其中所述结构域1通过半胱氨酸接头共价结合至第一异二聚体促进结构域；且所述结构域2通过半胱氨酸接头共价结合至第二异二聚体促进结构域；其中所述半胱氨酸接头包含至少五个氨基酸。

33.权利要求32的双特异性抗体，其中所述半胱氨酸接头是包含SEQ ID NO：192的序列的接头3。

34.权利要求19-33任一项的双特异性抗体，其中所述第一多肽链通过至少一个二硫键共价结合至所述第二多肽链。

35.权利要求34的双特异性抗体，其中在所述第一多肽链的接头3和所述第二多肽链的接头3之间形成至少一个二硫键。

36.权利要求34或35的双特异性抗体，其中在所述第一异二聚体促进结构域和所述第二异二聚体促进结构域之间形成至少一个二硫键。

37.权利要求35或36的双特异性抗体，其中每个二硫键通过连接两个半胱氨酸残基形成。

38.权利要求18-37任一项的双特异性抗体，其中：

a. 包含SEQ ID NO: 92、100、104、106、112、119、125、129、134、136、137、138、140、143、145、147、150、152、156、158、160、162、166、170、171、172、173、174或175中所示的序列的GUCY2c VL的GUCY2c VL CDR1、GUCY2c VL CDR2和GUCY2c VL CDR3；

b. 包含SEQ ID NOS: 1、9或273中所示的序列的CD3 VH的CD3 VH CDR1、CD3 VH CDR2和CD3 VH CDR3；

c. 包含SEQ ID NO: 76、84、90、274、275或276中所示的序列的CD3 VL的CD3 VL CDR1、CD3 VL CDR2和CD3 VL CDR3；和/或

d. 包含SEQ ID NO: 11、19、26、33、41、48、52、57、60、62、64、65、67、69、71或73中所示的序列的GUCY2c VH的GUCY2c VH CDR1、GUCY2c VH CDR2和GUCY2c VH CDR3。

39.权利要求38的双特异性抗体，其中：

a. GUCY2c VL CDR1包含SEQ ID NO: 93、101、105、107、113、120、148、153、163或167的序列；GUCY2c VL CDR2包含SEQ ID NO: 78、94、102、108、114、141、144、146、149、151、157、159、161、164或168的序列；且GUCY2c VL CDR3包含SEQ ID NO: 95、109、115、121、142、154、165或169的序列；

b. CD3 VH CDR1包含SEQ ID NO：2、268或277的序列；CD3 VH CDR2包含SEQ ID NO: 3、10、269或270的序列；且CD3 VH CDR3包含SEQ ID NO：4的序列；

c. CD3 VL CDR1包含SEQ ID NO: 77、85、91、278、279或280的序列；CD3 VL CDR2包含SEQ ID NO：78或281的序列；且CD3 VL CDR3包含SEQ ID NO：79的序列；和

d. GUCY2c VH CDR1包含SEQ ID NO: 12、20、27、34、42、74、257、258、259、260或261的序列；GUCY2c VH CDR2包含SEQ ID NO: 13、21、28、35、43、53、66、68、70、72、75、262、263、264、265、266或267的序列；且GUCY2c VH CDR3包含SEQ ID NO: 14、22、29、36或44的序列。

40.权利要求39的双特异性抗体，其中：

a. GUCY2c VH CDR1包含SEQ ID NO：74或259的序列；

b. GUCY2c VH CDR2包含SEQ ID NO：75或267的序列；

c. GUCY2c VH CDR3包含SEQ ID NO：29的序列；

d. GUCY2c VL CDR1包含SEQ ID NO：148的序列；

e. GUCY2c VL CDR2包含SEQ ID NO：149的序列；且

f. GUCY2c VL CDR3包含SEQ ID NO：142的序列。

41.权利要求39或40的双特异性抗体，其中：

a. CD3 VH CDR1包含SEQ ID NO：2或268的序列；

b. CD3 VH CDR2包含SEQ ID NO：10或270的序列；

c. CD3 VH CDR3包含SEQ ID NO：4的序列；

d. CD3 VL CDR1包含SEQ ID NO: 91的序列;

e. CD3 VL CDR2包含SEQ ID NO：78的序列；且

f. CD3 VL CDR3包含SEQ ID NO：79的序列。

42.权利要求19-41任一项的双特异性抗体，其中：

a. GUCY2c VL包含SEQ ID NO: 92、100、104、106、112、119、125、129、134、136、137、138、140、143、145、147、150、152、156、158、160、162、166、170、171、172、173、174或175中所示的序列；

b. CD3 VH包含SEQ ID NOS: 1或9中所示的序列；

c. CD3 VL包含SEQ ID NO: 76、84或90中所示的序列；和/或

d. GUCY2c包含SEQ ID NO: 11、19、26、33、41、48、52、57、60、62、64、65、67、69、71或73中所示的序列。

43.权利要求42的双特异性抗体，其中：

a. GUCY2c VH区包含SEQ ID NO: 73的序列；且

b. GUCY2c VL区包含SEQ ID NO: 147的序列。

44.权利要求42的双特异性抗体，其中：

a. CD3 VH区包含SEQ ID NO: 9中所示的序列；

b. CD3 VL区包含SEQ ID NO: 90的序列。

45.权利要求18-37任一项的双特异性抗体，其包含：

a. 包含具有序列RASESV-X_L1.30-X_L1.30a-YG-X_L1.30d-SLLQ的氨基酸的GUCY2c VL CDR1，

b. 包含具有SEQ ID NO：149中所示序列的氨基酸的GUCY2c VL CDR2，

c. 包含具有SEQ ID NO：142中所示序列的氨基酸的GUCY2c VL CDR3，

d. 包含具有序列GFTFS-X_H1.31-X_H1.32-WMH的氨基酸的GUCY2c VH CDR1，

e. 包含具有序列EIK- X_H2.52A-X_H2.53-X_H2.54-X_H2.55-X_H2.56-X_H2.57-NVHEKFKD的氨基酸的GUCY2c VH CDR2，和

46.权利要求45的双特异性抗体，其中：

a. X_L1.30是D、N或S，

b. X_L1.30a是Y、W或I，

c. X_L1.30d是T、S或H，

d. X_H1.31是S、R、W、Y、A、H、P、Y、T、N、K、D、G或V，

e. X_H1.32是Y、R、L、T、K、P、I、N、M、V或S，

f. X_H2.52A是P、T或V，

g. X_H2.53是S、A、L或R，

h. X_H2.54是N、T、R、H、K、M、S、A、Y、T或I，

i. X_H2.55是E、R、K、N、Y、G、L、A、M、S、H、D或Q，

j. X_H2.56是L、W、Y、F、V、I、N或H，

k. X_H2.57是T、M、S、L、N、Q或V，

l. X_H3.96是I、F或K，

m. X_H3.97是T、V、L、I、M、F、Y或A，

n. X_H3.98是T、N、R、G、L或I，

o. X_H3.99是T、K、L、W、A、S、M、P、N或R，

p. X_H3.100是E、G、A、H、S、D、T、R、Q、K、Y、L或M，

q. X_H3.100B是Y或H，

r. X_H3.100E是F或L，且

s. X_H3.101是D、Y、E或S。

47.权利要求18-37、45或46任一项的双特异性抗体，其中所述抗体与GUCY2c胞外域上的表位结合，其中所述表位包含选自SEQ ID NO：406的氨基酸残基R73、S74、S75、T76、E78、G79、L80、L82、L83、R84或I86的至少一个氨基酸残基。

48.权利要求47的分离的人单克隆抗体，其中所述表位包含选自SEQ ID NO：406的氨基酸残基R73、S74、S75、T76、E78、G79、L80、L82、L83、R84或I86的至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少十个氨基酸残基。

49.权利要求47的分离的人单克隆抗体，其中所述表位包含SEQ ID NO：406的氨基酸残基R73、S74、S75、T76、E78、G79、L80、L82、L83、R84或I86。

50.权利要求47的分离的人单克隆抗体，其中所述表位包含具有如SEQ ID NO：406中所示的序列的氨基酸。

51.权利要求47的分离的人单克隆抗体，其中所述表位是功能性表位。

52.权利要求47的分离的人单克隆抗体，其中如通过晶体学所测定的，所述分离的人抗体和GUCY2c表位氨基酸接触在3.8埃内。

53.双特异性抗体，其与GUCY2c特异性结合并与权利要求18-52任一项的双特异性抗体竞争结合。

54.特异性结合GUCY2c和CD3的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体包括第一多肽链和第二多肽链，并且其中：

a. 第一多肽链以N-末端至C-末端方向以下述顺序包含下述区域：

GUCY2c抗体的VL（GUCY2c VL）（SEQ ID NO：147）-接头1（SEQ ID NO：190）-CD3抗体的VH（CD3 VH）（SEQ ID NO：9）-接头3（SEQ ID NO：192）-第一异二聚体促进结构域（SEQ ID NO：188）；和

b. 第二多肽链以N-末端至C-末端方向以下述顺序包含下述区域：

CD3抗体的VL（CD3 VL）（SEQ ID NO：90）-接头2（SEQ ID NO：191）-GUCY2c抗体的VH（GUCY2c VH）（SEQ ID NO：73）-接头3（SEQ ID NO：192）-第二异二聚体促进结构域（SEQ IDNO：189）。

55.权利要求54的双特异性抗体，其中GUCY2c VL和GUCY2c VH形成与GUCY2c特异性结合的结构域；且CD3 VL和CD3 VH形成与CD3特异性结合的结构域；其中第一多肽链的接头3和第二多肽链的接头3通过两个二硫键彼此共价结合；其中第一异二聚体促进结构域和第二异二聚体促进结构域各自包含CH2结构域和CH3结构域；其中所述第一异二聚体促进结构域的CH3结构域形成杵，且所述第二异二聚体促进结构域的CH3结构域形成臼；且其中在第一异二聚体促进结构域的CH3结构域与第二异二聚体促进结构域的CH3结构域之间形成至少一个二硫键。

56.权利要求1-17任一项的抗体或权利要求18-55任一项的双特异性抗体，其进一步包含人或人源化的VH构架和人或人源化的VL构架。

57.权利要求1-17任一项的抗体或权利要求18-55任一项的双特异性抗体，其中所述抗体或所述双特异性抗体是人源化抗体。

58.权利要求55-57任一项的抗体，其中所述VH构架包含SEQ ID NO: 5、6、7、8、15、16、17、18、23、24、25、30、31、32、37、38、39、40、45、46、47、49、50、51、54、55、56、58、59、61或63的序列；和/或所述VL构架包含SEQ ID NO: 80、81、82、83、86、87、88、89、96、97、98、99、103、110、111、116、117、118、122、123、124、126、127、128、130、131、132、133、135、139或155的序列。

59.与GUCY2c和CD3特异性结合的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体包含第一多肽链和第二多肽链；其中所述第一多肽链由具有ATCC检索号PTA-124944的表达载体产生；且所述第二多肽链由具有ATCC检索号PTA-124943的表达载体产生。

60.能够与GUCY2c和CD3特异性结合的双特异性抗体，其包含第一多肽链和第二多肽链，其中所述第一多肽链包含SEQ ID NO：216的序列，并且所述第二多肽链包含SEQ ID NO：220的序列。

61.权利要求19-60任一项的双特异性抗体，其中所述第一和第二多肽链通过至少一个二硫键彼此共价键合。

62.权利要求1-17任一项的抗体或权利要求18-61任一项的双特异性抗体，其中所述抗体或双特异性抗体：

a. 结合人GUCY2c的胞外域；

b. 显示30分钟至100天的延长的血清和肿瘤半衰期；和/或

c. 在有增加的GUCY2c表达水平或增加的受体密度水平的情况下，显示0.0001 nM至100 nM的较低EC₅₀值。

63.药物组合物，其包含治疗有效量的权利要求1-17任一项的抗体或权利要求18-62任一项的双特异性抗体，以及药学上可接受的载体。

64.治疗有此需要的患者中的GUCY2c有关病症的方法，其包括向所述患者施用权利要求1-17任一项的抗体、权利要求18-62任一项的双特异性抗体或权利要求63的药物组合物。

65.权利要求64的方法，其中所述GUCY2c有关病症是癌症。

66.权利要求65的方法，其中所述癌症是选自食道、胃、小肠、结肠、直肠、肛门、肝、胆囊、阑尾、胆管和胰的消化系统的癌症。

67.治疗有此需要的患者中的GUCY2c有关病症的方法，其包括向所述患者施用权利要求18-62任一项双特异性抗体或权利要求63的药物组合物，其中溶细胞性T细胞应答被激活。

68.供疗法之用的权利要求1-17任一项的抗体、权利要求18-62任一项的双特异性抗体或权利要求63的药物组合物。

69.在制备供疗法之用的药物中的权利要求1-17任一项的抗体或权利要求18-62任一项的双特异性抗体。

70.权利要求69的抗体或双特异性抗体，其中所述疗法是GUCY2c有关病症的治疗。

71.权利要求70的抗体或双特异性抗体，其中所述GUCY2c有关病症是癌症。

72.权利要求71的抗体或双特异性抗体，其中所述癌症是选自食道、胃、小肠、结肠、直肠、肛门、肝、胆囊、阑尾、胆管和胰的消化系统的癌症。

73.权利要求68-72任一项的双特异性抗体，其中所述疗法激活溶细胞性T细胞应答。

74.多核苷酸，其包含编码权利要求1-17任一项的抗体或权利要求18-62任一项的双特异性抗体的核苷酸序列。

75.包含权利要求74的多核苷酸的载体。

76.包含权利要求75的载体的宿主细胞。

77.权利要求76的宿主细胞，其重组产生权利要求1-17任一项的抗体或权利要求18-62任一项的双特异性抗体。

78.权利要求76或77的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自细菌细胞系、哺乳动物细胞系、昆虫细胞系和酵母细胞系。

79.权利要求78的宿主细胞，其中所述哺乳动物细胞系是CHO细胞系。

80.产生抗体或双特异性抗体的方法，包括在导致产生权利要求1-17任一项的抗体或权利要求18-62任一项的双特异性抗体的条件下培权利要求76-79任一项的养宿主细胞，并从培养物上清液纯化所述抗体或双特异性抗体。

81.权利要求1-17任一项的抗体、权利要求18-62任一项的双特异性抗体、权利要求63的药物组合物、权利要求74的多核苷酸、权利要求75的载体或权利要求76-79任一项的宿主细胞在制备用于治疗GUCY2c有关病症的药物中的用途。

82.权利要求1-17任一项的抗体、权利要求18-62任一项的双特异性抗体或权利要求63的药物组合物，其供在治疗GUCY2c有关病症中使用。

83.根据权利要求82的供使用的抗体、双特异性抗体或药物组合物，其中所述GUCY2c有关病症是癌症，任选地其中所述癌症是选自食道、胃、小肠、结肠、直肠、肛门、肝、胆囊、阑尾、胆管和胰的消化系统的癌症。

84.根据权利要求82或83的供使用的抗体、双特异性抗体或药物组合物，其中所述治疗激活溶细胞性T细胞应答。

85.权利要求1-17任一项的抗体、权利要求18-62任一项的双特异性抗体、权利要求63的药物组合物、权利要求74的多核苷酸、权利要求75的载体或权利要求76-79任一项的宿主细胞，其供治疗GUCY2c有关病症之用。

86.包含权利要求18-62任一项的双特异性抗体和第二治疗剂的组合物。

87.治疗主体中的癌症的方法，包括向所述主体施用包含权利要求86的组合物的联合治疗。

88.包含权利要求18-62任一项的双特异性抗体和止泻剂的组合物。

89.治疗主体中的癌症的方法，包括向所述主体施用包含权利要求88的组合物的联合治疗。

90.权利要求86或88的组合物在制备用于治疗GUCY2c有关病症的药物中的用途。

91.权利要求86或88的组合物，其供在治疗GUCY2c有关病症中使用。

92.根据权利要求90或91的供使用的组合物，其中所述GUCY2c有关病症是癌症，任选地其中所述癌症是选自食道、胃、小肠、结肠、直肠、肛门、肝、胆囊、阑尾、胆管和胰的消化系统的癌症。