JP2023554467A - Ｇｕｃｙ２ｃ結合分子及びその使用 - Google Patents

Ｇｕｃｙ２ｃ結合分子及びその使用 Download PDF

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Abstract

本開示は、ＧＵＣＹ２Ｃに結合する単一ドメイン抗体、及びそれを含むキメラ抗原受容体を提供する。更に、キメラ抗原受容体を含む操作された免疫エフェクター細胞（Ｔ細胞など）が提供される。医薬組成物、キット及び疾患または障害を治療する方法も提供される。【選択図】なし

Description

本出願は、２０２０年１２月１７日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＣＮ２０２０／１３７１６４号の優先権の利益を主張するものであり、その全体は、全ての目的のために参照により本明細書に援用される。
１．分野
本開示は、抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体、キメラ抗原受容体、操作された免疫エフェクター細胞、及びその使用方法に関する。本開示は、治療用途の細胞の活性化及び増殖、特に、キメラ抗原受容体によるＴ細胞免疫療法に更に関する。
２．背景
大腸癌は、世界的に最も多いがん種の１つであり、全腫瘍症例の約１０％、全がん死亡の８．５％をしめる。大腸癌の発病は、次第に若年化する傾向にあり、全大腸癌患者の２％～８％を４０歳未満の患者が占めている。現在、大腸癌の治療は、手術、放射線療法及び化学療法の組み合わせが基本となっている。早期患者の多くは、従来の療法後、良好な予後を有しているが、転移のある大腸癌患者は、予後が不良であり、５年生存率も非常に低い。現在の治療は、潜在的に残存している腫瘍細胞を排除したり、転移部の成長を阻害することができない。キメラ抗原受容体Ｔ（ＣＡＲ－Ｔ）細胞療法は、新しく現れた有望ながん免疫療法である。
腸の腫瘍の発生を促進する腸上皮細胞の恒常性の不均衡は、グアニル酸シクラーゼＣ（ＧＵＣＹ２Ｃ；ＧＣＣ）リガンドの欠如によって生じる（Ｗａｌｄｍａｎ，Ｓ．Ａ．ａｎｄ Ｍ．Ｃａｍｉｌｌｅｒｉ，Ｇｕｔ，６７（８）：１５４３－１５５２（２０１８））。ＧＵＣＹ２Ｃは、Ｎ－結合糖タンパク質のグアニル酸シクラーゼ受容体ファミリーの１つであり、腸組織に特異的なポリペプチドである。ＧＵＣＹ２Ｃは、小腸から直腸の腸粘膜に存在する上皮細胞に発現するが、正常な胃及び食道の組織には発現しない。ＧＵＣＹ２Ｃ受容体は、環状グアニンリン酸（ｃＧＭＰ）依存性機序により、小腸の粘膜上皮細胞の増殖及び分化を制御し得る。ＧＵＣＹ２Ｃは、原発性大腸癌細胞に安定発現し、転移性大腸癌細胞におけるＧＵＣＹ２Ｃの発現は、正常な腸上皮細胞の２～１０倍であることが示されており（Ｃａｒｒｉｔｈｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，９３（２５）：１４８２７－１４８３２（１９９６））、ＧＵＣＹ２Ｃは、大腸癌の治療に対して潜在的な標的となっている。当該技術分野において、例えば、より効果的または効率的なＣＡＲ－Ｔ療法において使用するために、改善されたＧＵＣＹ２Ｃ結合分子及び操作されたＧＵＣＹ２Ｃ標的化細胞が必要とされている。
３．要約
一態様において、本明細書で提供されるのは、（ｉ）Ｘ１ＹＧＭＸ２のアミノ酸配列（ここで、Ｘ１は、Ａ、ＩまたはＶであり、Ｘ２は、ＤまたはＧである）（配列番号６４）を含むＣＤＲ１と、（ｉｉ）Ｘ３ＩＸ４ＬＳＧＲＸ５Ｘ６ＹＸ７ＤＡＶＸ８Ｇのアミノ酸配列（ここで、Ｘ３は、Ａ、ＳまたはＴであり、Ｘ４は、Ｆ、ＷまたはＹであり、Ｘ５は、ＳまたはＴであり、Ｘ６は、Ｅ、ＮまたはＴであり、Ｘ７は、Ａ、ＳまたはＴであり、Ｘ８は、ＫまたはＱである）（配列番号６５）を含むＣＤＲ２と、（ｉｉｉ）ＧＸ９Ｘ１０ＴＡＸ１１ＳＸ１２ＲＱＹのアミノ酸配列（Ｘ９は、Ａ、ＥまたはＰであり、Ｘ１０は、ＰまたはＴであり、Ｘ１１は、ＳまたはＴであり、Ｘ１２は、ＧまたはＶである）（配列番号６６）を含むＣＤＲ３とを含む、抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）である。
いくつかの実施形態において、ＣＤＲ１は、配列番号１９～２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号２７～３４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３は、配列番号３５～４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される抗ＧＵＣＹ２Ｃ ｓｄＡｂは、（ｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；（ｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；（ｉｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；（ｉｖ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；（ｖ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；（ｖｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；（ｖｉｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または（ｖｉｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、（ｉ）配列番号３に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；（ｉｉ）配列番号４に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；（ｉｉｉ）配列番号５に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；（ｉｖ）配列番号６に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；（ｖ）配列番号７に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；（ｖｉ）配列番号８に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；（ｖｉｉ）配列番号９に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；または（ｖｉｉｉ）配列番号１０に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む、抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）である。いくつかの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３は、Ｋａｂａｔナンバリングスキーム、ＩＭＧＴナンバリングスキーム、ＡｂＭナンバリングスキーム、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングスキーム、Ｃｏｎｔａｃｔナンバリングスキーム、またはこれらの組み合わせに従って決定される。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるｓｄＡｂは、配列番号３～１０のいずれか１つに記載される１つ以上のＦＲ領域を更に含む。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される抗ＧＵＣＹ２Ｃ ｓｄＡｂは、配列番号３～１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される抗ＧＵＣＹ２Ｃ ｓｄＡｂは、配列番号３～１０のいずれか１つの配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなる。
いくつかの実施形態において、抗ＧＵＣＹ２Ｃ ｓｄＡｂは、ラクダｓｄＡｂである。他の実施形態において、抗ＧＵＣＹ２Ｃ ｓｄＡｂは、ヒト化ｓｄＡｂである。
いくつかの実施形態において、抗ＧＵＣＹ２Ｃ ｓｄＡｂは、薬剤に、遺伝子的に融合されるか、または化学的にコンジュゲートされる。
更に別の態様において、本明細書で提供されるのは、（ａ）本明細書で提供される抗ＧＵＣＹ２Ｃ ｓｄＡｂを含む細胞外抗原結合ドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインとを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。
いくつかの実施形態において、細胞外抗原結合ドメインは、１つ以上の追加の抗原結合ドメイン（複数可）を更に含む。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１５２、及びＰＤ１からなる群から選択される分子に由来する。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、ＣＤ８αに由来する。
いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫エフェクター細胞の一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζに由来する。
他の実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインを更に含む。いくつかの実施形態において、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ３、ＬＦＡ－１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３のリガンド及びこれらの組み合わせからなる群から選択される共刺激分子に由来する。いくつかの実施形態において、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ１３７に由来する。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインのＣ末端と膜貫通ドメインのＮ末端との間に位置するヒンジドメインを更に含む。いくつかの実施形態において、ヒンジドメインは、ＣＤ８αに由来する。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるＣＡＲは、ポリペプチドのＮ末端に位置するシグナルペプチドを更に含む。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、ＣＤ８αに由来する。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、（ｉ）配列番号４８～５５からなる群から選択されるアミノ酸配列、または（ｉｉ）配列番号４８～５５のいずれか１つの配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。
別の態様において、本明細書で提供されるのは、本明細書で提供される抗ＧＵＣＹ２Ｃ ｓｄＡｂをコードする核酸配列を含む、単離された核酸である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される単離された核酸は、配列番号１１～１８の核酸配列を含む。
更に別の態様において、本明細書で提供されるのは、本明細書で提供される単一ドメイン抗体をコードする単離された核酸を含む、ベクターである。
更に別の態様において、本明細書で提供されるのは、本明細書で提供されるＣＡＲをコードする核酸配列を含む、単離された核酸である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される単離された核酸は、配列番号５６～６３の核酸配列を含む。
更に別の態様において、本明細書で提供されるのは、本明細書で提供されるＣＡＲをコードする単離された核酸を含む、ベクターである。
更に別の態様において、本明細書で提供されるのは、本明細書で提供されるＣＡＲ、単離された核酸、またはベクターを含む、操作された免疫エフェクター細胞である。いくつかの実施形態において、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞である。
更に別の態様において、本明細書で提供されるのは、本明細書で提供される抗ＧＵＣＹ２Ｃ ｓｄＡｂ、操作された免疫エフェクター細胞、またはベクターと、薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物である。
更に別の態様において、本明細書で提供されるのは、対象における疾患または障害を治療する方法であって、当該対象に、有効量の、本明細書で提供される抗ＧＵＣＹ２Ｃ ｓｄＡｂ、操作された免疫エフェクター細胞、または医薬組成物を投与することを含む、方法である。いくつかの実施形態において、疾患または障害は、ＧＵＣＹ２Ｃ関連疾患または障害である。いくつかの実施形態において、疾患または障害は、がんである。いくつかの実施形態において、疾患または障害は、大腸癌、胃癌または食道癌である。
４．図面の簡単な説明
ファージ抗体ライブラリーコロニーの電気泳動図を示す。最初のレーンはＤＬ２０００ ＤＮＡマーカーであり、最後のレーンはプラスミドｐＣｏｍｂ３ＸＳＳの陰性対照であり、１～２３はファージ抗体ライブラリーモノクローナルである。２３のモノクローンを選択し、そのうちの２２のモノクローンが陽性クローンであり、挿入率は９６％であった。
抗体スクリーニング中のＶＨＨクローンのＯＤ４５０の値である。
本明細書で提供される例示的なＶＨＨドメインのアラインメントを示す。
変換したベクターｐＬＶＸ－ＷＴ－Ｇ１の模式図を示す。ｐＬＶＸ－ＰｕｒｏのＣＭＶプロモーターをＥＦ－１ａプロモーターに置き換え、ＥＦ－１ａプロモーターに続いて、ＣＤ８ヒンジ、ＣＤ８膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ及びＣＤ３ｚを加えた。
抗Ａｌｐａｃａ ＩｇＧのＶＨＨドメイン二次抗体で染色されたＣＡＲ－Ｔ細胞の陽性率に関するフローサイトメトリー解析を示す。
ＧＦＰをトランスフェクトしたＴ８４と様々な抗ＧＵＣＹ２Ｃ ＣＡＲ－Ｔ細胞を２：１のエフェクター：標的細胞比で２４時間共培養した蛍光写真を示す。共培養した様々なＣＡＲ－Ｔ細胞株は、（Ａ）クローンＣ０８、（Ｂ）クローンＣ１２、（Ｃ）クローンＣ１３、（Ｄ）クローンＣ１５、（Ｅ）クローンＣ２１、（Ｆ）クローンＣ２７、（Ｇ）クローンＣ３０、（Ｈ）クローンＣ３１、（Ｉ）Ｔ細胞、（Ｊ）Ｔ８４細胞のみ、及び（Ｊ）細胞溶解剤を含むＴ８４細胞であった。
様々な抗ＧＵＣＹ２Ｃ ＣＡＲ Ｔ細胞の特異的な細胞溶解活性を示すヒストグラムを示す。ＣＡＲ－Ｔ細胞及びＴ細胞をＴ８４細胞と２：１のエフェクター：標的細胞比で共培養した。Ｔ８４細胞の特異的な細胞溶解率を共培養の終了時に算出した。
Ｔ８４腫瘍ＮＣＧマウスモデルにおける抗ＧＵＣＹ２Ｃ ＣＡＲ－Ｔ治療後の腫瘍成長を示す。免疫不全ＮＣＧマウスに５×１０６個のルシフェラーゼ発現Ｔ８４大腸癌細胞を皮下注射により注射し、１４日目に、３×１０６個のＴ細胞またはクローンＣ０８ ＣＡＲ－Ｔ細胞の尾静脈注射により治療した。実線：Ｔ細胞注射、破線：クローンＣ０８ ＣＡＲ－Ｔ細胞注射。 Ｔ８４腫瘍ＮＣＧマウスモデルにおける抗ＧＵＣＹ２Ｃ ＣＡＲ－Ｔ治療後の腫瘍成長を示す。免疫不全ＮＣＧマウスに５×１０６個のルシフェラーゼ発現Ｔ８４大腸癌細胞を皮下注射により注射し、１４日目に、３×１０６個のＴ細胞、クローンＣ１２ ＣＡＲ－Ｔ細胞またはクローンＣ１３ ＣＡＲ－Ｔ細胞の尾静脈注射により治療した。実線：Ｔ細胞注射、点線：クローンＣ１２ ＣＡＲ－Ｔ細胞注射、破線：クローンＣ１３ ＣＡＲ－Ｔ細胞注射。 Ｔ８４腫瘍ＮＣＧマウスモデルにおける抗ＧＵＣＹ２Ｃ ＣＡＲ－Ｔ治療後の腫瘍成長を示す。免疫不全ＮＣＧマウスに５×１０６個のルシフェラーゼ発現Ｔ８４大腸癌細胞を皮下注射により注射し、１４日目に、３×１０６個のＴ細胞、クローンＣ１５ ＣＡＲ－Ｔ細胞またはクローンＣ２１ ＣＡＲ－Ｔ細胞の尾静脈注射により治療した。実線：Ｔ細胞注射、点線：クローンＣ１５ ＣＡＲ－Ｔ細胞注射、破線：クローンＣ２１ ＣＡＲ－Ｔ細胞注射。
５．発明の詳細な説明
本開示は、部分的には、ＧＵＣＹ２Ｃに結合する新規の単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨＨドメイン）、それを含むキメラ抗原受容体または操作された細胞、及びその改善された特性に基づく。
５．１．定義
本明細書に記載されるまたは参照される技術及び手順には、当業者によって一般に十分に理解され、及び／または従来の方法論、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｄ ｅｄ．２００１）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，２００３）；Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｆｒｏｍ Ｂｅｎｃｈ ｔｏ Ｃｌｉｎｉｃ（Ａｎ ｅｄ．２００９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ａｌｂｉｔａｒ ｅｄ．２０１０）；及びＡｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｖｏｌｓ １ ａｎｄ ２（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｕｂｅｌ ｅｄｓ．，２ｄ ｅｄ．２０１０）に記載されている広く利用されている方法論などの使用により、一般に採用されているものが含まれる。本明細書で特に定義しない限り、本明細書で使用される技術科学用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。本明細書の解釈のために、以下の用語の説明が適用され、適切な場合には、単数形で使用される用語は、複数形を含み、その逆もまた同様である。記載される用語のいずれかの説明が、参照により本明細書に援用される文書と矛盾する場合は、以下に記載される用語の説明が優先されるものとする。
「抗体」、「免疫グロブリン」、または「Ｉｇ」という用語は、本明細書中で区別なく使用され、最も広い意味で使用され、具体的には、以下に記載されるように、例えば、モノクローナル抗体（アゴニスト、アンタゴニスト、中和抗体、全長またはインタクトモノクローナル抗体を含む）、ポリエピトープまたはモノエピトープ特異性を有する抗体組成物、ポリクローナルまたは一価抗体、多価抗体、少なくとも２つのインタクト抗体から形成される多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体、所望の生物学的活性を呈する場合に限る）、一本鎖抗体、及びその断片（例えば、ドメイン抗体）を包含する。抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体及び／または親和性成熟抗体、ならびに他の種、例えば、マウス、ウサギ、ラマなどに由来する抗体であり得る。「抗体」という用語は、特定の分子抗原に結合することが可能であり、２つの同一のポリペプチド鎖のペアで構成され、各ペアは、１つの重鎖（約５０～７０ｋＤａ）及び１つの軽鎖（約２５ｋＤａ）を有し、各鎖のそれぞれのアミノ末端部分は、約１００～約１３０以上のアミノ酸の可変領域を含み、各鎖のそれぞれのカルボキシ末端部分は、定常領域を含む、免疫グロブリンクラスのポリペプチドのうち、Ｂ細胞のポリペプチド産物を含むことが意図される。例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ ｅｄ．，２ｄ ｅｄ．１９９５）；及びＫｕｂｙ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（３ｄ ｅｄ．１９９７）を参照されたい。抗体はまた、限定するものではないが、合成抗体、組み換え産生抗体、ラクダ科の種（例えば、ラマまたはアルパカ）由来のものを含む単一ドメイン抗体またはそのヒト化バリアント、イントラボディ、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、及び上記のいずれかの機能性断片（例えば、抗原結合断片）を含み、当該断片は、その断片の由来となる抗体の結合活性の一部または全部を保持する抗体重鎖または軽鎖ポリペプチドの部分を指す。機能性断片（例えば、抗原結合断片）の非限定的な例としては、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）（例えば、単一特異性、二重特異性などを含む）、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆ（ａｂ）２断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｄｓＦｖ）、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、及びミニボディが挙げられる。特に、本明細書で提供される抗体は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、例えば、抗原に結合する抗原結合部位（例えば、抗体の１つ以上のＣＤＲ）を含有する抗原結合ドメインまたは分子を含む。そのような抗体断片は、例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８９）；Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（Ｍｙｅｒｓ ｅｄ．，１９９５）；Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ ２２：１８９－２２４；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ａｎｄ Ｓｋｅｒｒａ，１９８９，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１７８：４９７－５１５；及びＤａｙ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２ｄ ｅｄ．１９９０）に見出すことができる。本明細書で提供される抗体は、免疫グロブリン分子の任意のクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＡ）または任意のサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）のものであり得る。抗体は、アゴニスト抗体またはアンタゴニスト抗体であり得る。抗体は、アゴニストでもアンタゴニストでもなくてもよい。
「抗原」とは、抗体が選択的に結合することができる構造である。標的抗原は、ポリペプチド、炭水化物、核酸、脂質、ハプテン、または他の天然に存在するもしくは合成の化合物であり得る。いくつかの実施形態において、標的抗原は、ポリペプチドである。ある特定の実施形態において、抗原は、細胞と関連しており、例えば、細胞上または細胞内に存在する。
「インタクト」抗体は、抗原結合部位に加えて、ＣＬと、少なくとも重鎖定常領域であるＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含むものである。定常領域は、ヒト定常領域またはそのアミノ酸配列バリアントを含み得る。ある特定の実施形態において、インタクト抗体は、１つ以上のエフェクター機能を有する。
「ｓＦｖ」または「ｓｃＦｖ」とも略される「一本鎖Ｆｖ」は、単一のポリペプチド鎖に接続されたＶＨ及びＶＬ抗体ドメインを含む、抗体断片である。好ましくは、ｓＦｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーを更に含み、これにより、ｓＦｖは、抗原結合に対して所望の構造を形成する。ｓＦｖの概説については，Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）を参照されたい。
「重鎖のみ抗体」または「ＨＣＡｂ」という用語は、重鎖を含むが、４鎖抗体に通常見られる軽鎖を欠く、機能性抗体を指す。ラクダ科動物（ラクダ、ラマ、またはアルパカなど）は、ＨＣＡｂを産生することが知られている。
本明細書で使用される「単一ドメイン抗体」または「ｓｄＡｂ」は、単一の単量体可変抗体ドメインを指し、抗原に結合することが可能である（例えば、ＧＵＣＹ２Ｃに結合する単一ドメイン抗体）。単一ドメイン抗体は、本明細書に記載されるＶＨＨドメインを含む。単一ドメイン抗体の例としては、ラクダ科の種（例えば、ラマ）に由来するものなどの軽鎖を天然に欠いている抗体、従来の４鎖抗体に由来する単一ドメイン抗体、操作された抗体、及び抗体に由来するもの以外の単一ドメイン足場が挙げられるが、これらに限定されない。単一ドメイン抗体は、限定するものではないが、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、ヤギ、ウサギ、及びウシを含む任意の種に由来し得る。例えば、単一ドメイン抗体は、本明細書に記載されるように、ラクダ科の種、例えば、ラクダ、ラマ、ヒトコブラクダ、アルパカ、及びグアナコにおいて産生される抗体に由来し得る。ラクダ科動物以外の他の種も軽鎖を天然に欠く重鎖抗体を産生する場合があり、そのような他の種に由来するＶＨＨも本開示の範囲内である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨＨ）は、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４の構造を有する。単一ドメイン抗体は、本明細書に記載されるように、別の分子（例えば、薬剤）に遺伝子的に融合されるか、または化学的にコンジュゲートされてもよい。単一ドメイン抗体は、より大きな結合分子（例えば、多重特異性抗体またはキメラ抗原受容体）の一部であってもよい。
「結合する」または「結合」という用語は、例えば、複合体を形成することを含む、分子間の相互作用を指す。相互作用は、例えば、水素結合、イオン結合、疎水性相互作用、及び／またはファン・デル・ワールス相互作用を含む、非共有結合性の相互作用であり得る。複合体はまた、共有結合もしくは非共有結合、相互作用、または力によって一緒に保持される２つ以上の分子の結合を含み得る。抗体上の１つの抗原結合部位と、抗原などの標的分子の１つのエピトープとの間の全体的な非共有結合性の相互作用の強さは、そのエピトープに対する抗体または機能性断片の親和性である。結合分子（例えば、抗体）の一価抗原に対する解離速度（ｋｏｆｆ）と会合速度（ｋｏｎ）の比（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）は、解離定数ＫＤであり、これは、親和性と逆相関の関係にある。ＫＤ値が低いほど、抗体の親和性が高くなる。ＫＤの値は、抗体と抗原の様々な複合体によって異なり、ｋｏｎ及びｋｏｆｆの両方に依存する。本明細書で提供される抗体の解離定数ＫＤは、本明細書で提供される任意の方法または当業者によく知られている任意の他の方法を使用して決定することができる。１つの結合部位における親和性は、抗体と抗原との間の相互作用の真の強さを必ずしも反映するものではない。多価抗原のように複数の反復する抗原決定基を含有する複合抗原が、複数の結合部位を含有する抗体と接触する場合、１つの部位で抗体と抗原が相互作用することにより、第２の部位における反応の確率が高くなる。そのような多価抗体と抗原との間の複数の相互作用の強さは、アビディティと呼ばれる。
本明細書に記載される結合分子に関連して、「結合する」、「特異的に結合する」などの用語、及び類似の用語もまた本明細書中で区別なく使用され、ポリペプチドなどの、抗原に特異的に結合する抗原結合ドメインの結合分子を指す。抗原に結合するまたは特異的に結合する結合分子または抗原結合ドメインは、例えば、イムノアッセイ、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）、または当業者に知られた他の技術によって特定することができる。いくつかの実施形態において、結合分子または抗原結合ドメインは、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）及び酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などの実験技術を使用して決定される任意の交差反応性抗原に対する親和性よりも高い親和性で抗原に結合する場合、抗原に結合するまたは特異的に結合する。典型的に、特異的または選択的な反応は、バックグラウンドシグナルまたはノイズの少なくとも２倍であり、バックグラウンドの１０倍を超えることもある。結合特異性に関する考察については、例えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３３２－３６（Ｐａｕｌ ｅｄ．，２ｄ ｅｄ．１９８９）を参照されたい。ある特定の実施形態において、「非標的」タンパク質に対する結合分子または抗原結合ドメインの結合の程度は、例えば、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）分析またはＲＩＡによって決定される場合、その特定の標的抗原に対する結合分子または抗原結合ドメインの結合の約１０％未満である。抗原に結合する結合分子または抗原結合ドメインには、例えば、当該結合分子が、抗原を標的とする治療薬剤及び／または診断薬剤として有用であるのに十分な親和性でその抗原に結合することが可能なものが含まれる。ある特定の実施形態において、抗原に結合する結合分子または抗原結合ドメインは、１μＭ、８００ｎＭ、６００ｎＭ、５５０ｎＭ、５００ｎＭ、３００ｎＭ、２５０ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、０．９ｎＭ、０．８ｎＭ、０．７ｎＭ、０．６ｎＭ、０．５ｎＭ、０．４ｎＭ、０．３ｎＭ、０．２ｎＭ、または０．１ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）を有する。ある特定の実施形態において、結合分子または抗原結合ドメインは、異なる種に由来する抗原間で保存されている抗原のエピトープに結合する。
ある特定の実施形態において、結合分子または抗原結合ドメインには、重鎖及び／または軽鎖の一部が、特定の種に由来する抗体または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同であり、鎖（複数可）の残りが、別の種に由来する抗体または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同である「キメラ」配列、ならびに所望の生物学的活性を示す限りそのような抗体の断片が含まれ得る（米国特許第 ４，８１６，５６７号；及びＭｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１－５５）。キメラ配列は、ヒト化された配列を含み得る。
ある特定の実施形態において、結合分子または抗原結合ドメインは、ヒト免疫グロブリン（例えば、レシピエント抗体）に由来する配列を含み、その天然ＣＤＲ残基が、所望の特異性、親和性、及び能力を有するラクダ科動物、マウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類などの非ヒト種（例えば、ドナー抗体）の対応するＣＤＲに由来する残基で置き換えられている、非ヒト（例えば、ラクダ科、ネズミ科、非ヒト霊長類）抗体の「ヒト化された」形態の部分を含み得る。いくつかの場合において、ヒト免疫グロブリン配列の１つ以上のＦＲ領域残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体に見られない残基を含むことができる。これらの改変は、抗体性能を更に改良するためになされる。ヒト化抗体重鎖または軽鎖は、少なくとも１つ以上の可変領域の実質的に全てを含み得、ＣＤＲの全てまたは実質的に全ては、非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲに対応し、ＦＲの全てまたは実質的に全ては、ヒト免疫グロブリン配列のＦＲである。ある特定の実施形態において、ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的には、ヒト免疫グロブリンのＦｃの少なくとも一部を含む。更なる詳細については、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２－２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－２９（１９８８）；Ｐｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３－９６（１９９２）；Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：４２８５－８９（１９９２）；米国特許第６，８００，７３８号；同第６，７１９，９７１号；同第６，６３９，０５５号；同第６，４０７，２１３号；及び同第６，０５４，２９７号を参照されたい。
ある特定の実施形態において、結合分子または抗原結合ドメインは、「完全ヒト抗体」または「ヒト抗体」の部分を含み得、この場合、当該用語は、本明細書中で区別なく使用され、ヒト可変領域と、例えば、ヒト定常領域とを含む、抗体を指す。結合分子は、単一ドメイン抗体配列を含み得る。具体的な実施形態において、この用語は、ヒト起源の可変領域及び定常領域を含む抗体を指す。「完全ヒト」抗体は、ある特定の実施形態において、ポリペプチドに結合し、天然に存在するヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン核酸配列の体細胞バリアントである核酸配列によってコードされる抗体も包含し得る。「完全ヒト抗体」という用語は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．によって記載されるヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列に対応する可変領域及び定常領域を有する抗体を含む（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２参照）。「ヒト抗体」は、ヒトによって産生される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有し、及び／またはヒト抗体の作製技術のいずれかを使用して作製された抗体である。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を具体的に除外する。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリー（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１（１９９１））及び酵母ディスプレイライブラリー（Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ １：７５５－６８（２００６））を含む、当該技術分野において知られている様々な技術を使用して産生することができる。ヒトモノクローナル抗体の調製には、Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ７７（１９８５）；Ｂｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（１）：８６－９５（１９９１）；及びｖａｎ Ｄｉｊｋ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５：３６８－７４（２００１）に記載される方法も利用可能である。ヒト抗体は、抗原刺激に応答してヒト抗体を産生するように改変され、その内因性遺伝子座が無効化されているトランスジェニック動物（例えば、マウス）に抗原を投与することによって調製することができる（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６（５）：５６１－６６（１９９５）；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ａｎｄ Ｔａｕｓｓｉｎｇ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８（４）：４５５－５８（１９９７）；ならびにＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術に関する米国特許第６，０７５，１８１号及び同第６，１５０，５８４号参照）。例えば、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術により産生されるヒト抗体については、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０３：３５５７－６２（２００６）も参照されたい。
ある特定の実施形態において、結合分子または抗原結合ドメインは、「組み換えヒト抗体」の部分を含み得、この場合、当該語句は、組み換え手段によって調製、発現、作製、もしくは単離されたヒト抗体、例えば、宿主細胞にトランスフェクトされた組み換え発現ベクターを使用して発現された抗体、組み換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体、ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニック及び／またはトランスクロモソームである動物（例えば、マウスまたはウシ）から単離された抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒ，Ｌ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：６２８７－６２９５（１９９２））、またはヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを伴う任意の他の手段によって調製、発現、作製、もしくは単離された抗体を含み得る。そのような組み換えヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有し得る（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２参照）。ただし、ある特定の実施形態において、そのような組み換え抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ変異導入（あるいは、ヒトＩｇ配列についてトランスジェニックである動物が使用される場合、ｉｎ ｖｉｖｏ体細胞変異導入）に供せられ、そのため、この組み換え抗体のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列のＶＨ及びＶＬ配列に由来し、それに関連しているが、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるヒト抗体生殖細胞系列レパートリーには天然に存在し得ない配列となる。
ある特定の実施形態において、結合分子または抗原結合ドメインは、「モノクローナル抗体」の部分を含み得、この場合、本明細書で使用されるこの用語は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、例えば、その集団に含まれる個々の抗体は、微量で存在し得る可能性のある自然発生の変異、またはアミノ酸の異性化もしくは脱アミド、メチオニン酸化もしくはアスパラギンもしくはグルタミンの脱アミドなどのよく知られた翻訳後修飾を除いて同一であり、各モノクローナル抗体は、典型的に抗原上の単一エピトープを認識する。具体的な実施形態において、本明細書で使用される「モノクローナル抗体」は、単一のハイブリドーマまたは他の細胞によって産生される抗体である。「モノクローナル」という用語は、任意の特定の抗体作製方法に限定されない。例えば、本開示において有用なモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって調製されてもよいし、細菌細胞または真核生物の動物細胞または植物細胞における組み換えＤＮＡ法を使用して作製されてもよい。（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号参照）。「モノクローナル抗体」は、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－２８（１９９１）及びＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１－９７（１９９１）に記載されている技術を使用して、ファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。クローン細胞株及びそれによって発現されるモノクローナル抗体の他の調製方法は、当該技術分野においてよく知られている。例えば、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，５ｔｈ ｅｄ．２００２）を参照されたい。
典型的な４鎖の抗体単位は、２つの同一の軽（Ｌ）鎖と、２つの同一の重（Ｈ）鎖から構成される、ヘテロ四量体糖タンパク質である。ＩｇＧの場合、４鎖単位は、一般に、１５０，０００ダルトンである。各Ｌ鎖は、１つのジスルフィド共有結合によってＨ鎖に連結されているが、２本のＨ鎖は、Ｈ鎖アイソタイプに応じて１つ以上のジスルフィド結合によって互いに連結されている。各Ｈ鎖及びＬ鎖は、規則的な間隔で鎖内ジスルフィド架橋も有する。各Ｈ鎖は、Ｎ末端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、続いて、α鎖及びγ鎖のそれぞれについては３つの定常ドメイン（ＣＨ）、μ及びεのアイソタイプについては４つのＣＨドメインを有する。各Ｌ鎖は、Ｎ末端に可変ドメイン（ＶＬ）を有し、続いて、その他方の末端に定常ドメイン（ＣＬ）を有する。ＶＬはＶＨと整列し、ＣＬは重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）と整列する。特定のアミノ酸残基が軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間の界面を形成すると考えられている。ＶＨとＶＬとが一緒に対合することにより、単一の抗原結合部位を形成する。異なるクラスの抗体の構造及び特性については、例えば、Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ７１（Ｓｔｉｔｅｓ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，８ｔｈ ｅｄ．１９９４）；及びＩｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，５ｔｈ ｅｄ．２００１）を参照されたい。
「Ｆａｂ」または「Ｆａｂ領域」という用語は、抗原に結合する抗体領域を指す。従来のＩｇＧは、通常、２つのＦａｂ領域を含み、それぞれＹ字型のＩｇＧ構造の２つのアームの１つに存在する。各Ｆａｂ領域は、典型的に、重鎖及び軽鎖それぞれの１つの可変領域及び１つの定常領域を含む。より具体的には、Ｆａｂ領域における重鎖の可変領域及び定常領域は、ＶＨ及びＣＨ１領域であり、Ｆａｂ領域における軽鎖の可変領域及び定常領域は、ＶＬ及びＣＬ領域である。Ｆａｂ領域のＶＨ、ＣＨ１、ＶＬ、及びＣＬは、本開示に従って、抗原結合能力を付与するように様々に配置することができる。例えば、従来のＩｇＧのＦａｂ領域のように、ＶＨ及びＣＨ１領域が１つのポリペプチド上にあり、ＶＬ及びＣＬ領域が別のポリペプチド上にあってもよい。あるいは、以下のセクションでより詳細に記載するように、ＶＨ、ＣＨ１、ＶＬ及びＣＬ領域が全て同じポリペプチド上にあり、異なる順序で配向することもできる。
「可変領域」、「可変ドメイン」、「Ｖ領域」、または「Ｖドメイン」という用語は、一般に軽鎖または重鎖のアミノ末端に位置し、重鎖が約１２０～１３０アミノ酸及び軽鎖が約１００～１１０アミノ酸の長さを有する、抗体の軽鎖または重鎖の部分を指し、特定の抗体それぞれの特定の抗原に対する結合及び特異性に使用される。重鎖の可変領域は、「ＶＨ」と称され得る。軽鎖の可変領域は、「ＶＬ」と称され得る。「可変」という用語は、可変領域のある特定のセグメントの配列が抗体間で大きく異なるという事実を指す。Ｖ領域は、抗原結合を媒介し、特定の抗原に対する特定の抗体の特異性を定義する。しかしながら、可変性は、可変領域の１１０アミノ酸範囲全体に均一に分散しているわけではない。むしろ、Ｖ領域は、それぞれが約９～１２アミノ酸長である「超可変領域」と呼ばれる可変性のより大きい（例えば、極端に可変性の）短い領域によって隔てられた、約１５～３０アミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる可変性の低い（例えば、比較的不変である）ストレッチからなる。重鎖及び軽鎖の可変領域はそれぞれ、４つのＦＲを含み、これらのＦＲは、βシート立体配置を主に採用し、３つの超可変領域によって接続され、これらの超可変領域は、βシート構造を接続するループを形成し、場合により、βシート構造の一部を形成する。各鎖中の超可変領域は、ＦＲによって極めて近接して一緒に保持され、他方の鎖の超可変領域とともに抗体の抗原結合部位の形成に寄与している（例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（５ｔｈ ｅｄ．１９９１）参照）。定常領域は、抗体の抗原への結合に直接関与しないが、抗体の抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）への関与などの様々なエフェクター機能を呈する。可変領域は、異なる抗体間で配列が大きく異なる。具体的な実施形態において、可変領域は、ヒト可変領域である。
「Ｋａｂａｔによる可変領域残基ナンバリング」または「Ｋａｂａｔにおけるアミノ酸位置ナンバリング」という用語、及びその変化形は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（上掲）における抗体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域の編成に使用されるナンバリングシステムを指す。このナンバリングシステムを使用する場合、実際の直鎖状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲまたはＣＤＲの短縮に応じてアミノ酸がより少ないこともあれば、ＦＲまたはＣＤＲへの挿入に応じて追加のアミノ酸を含有することもある。例えば、重鎖可変ドメインは、残基５２の後に１つのアミノ酸挿入（Ｋａｂａｔに従うと残基５２ａ）を含み得、残基８２の後に挿入された３つの残基（例えば、Ｋａｂａｔに従うと残基８２ａ、８２ｂ及び８２ｃなど）を含み得る。所与の抗体に対する残基のＫａｂａｔナンバリングは、抗体の配列と「標準的な」Ｋａｂａｔナンバリング配列との相同領域でのアラインメントによって決定され得る。Ｋａｂａｔナンバリングシステムは、一般に、可変ドメイン中の残基（概ね、軽鎖の残基１～１０７及び重鎖の残基１～１１３）について言及する際に使用される（例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（上掲））。「ＥＵナンバリングシステム」または「ＥＵインデックス」は、一般に、免疫グロブリン重鎖定常領域中の残基について言及する際に使用される（例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（上掲）で報告されるＥＵインデックス）。「ＫａｂａｔにおけるＥＵインデックス」は、ヒトＩｇＧ１ ＥＵ抗体の残基ナンバリングを指す。他のナンバリングシステムは、例えば、ＡｂＭ、Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｃｏｎｔａｃｔ、ＩＭＧＴ、及びＡＨｏｎによって記載されている。
「重鎖」という用語は、抗体に関して使用される場合、約５０～７０ｋＤａのポリペプチド鎖を指し、アミノ末端部分は、約１２０～１３０以上のアミノ酸の可変領域を含み、カルボキシ末端部分は、定常領域を含む。定常領域は、重鎖定常領域のアミノ酸配列に基づいて、アルファ（α）、デルタ（δ）、イプシロン（ε）、ガンマ（γ）、及びミュー（μ）と呼ばれる５つの異なるタイプ（例えば、アイソタイプ）のうちの１つであり得る。個々の重鎖は、大きさが異なり、α、δ、及びγは、およそ４５０アミノ酸を含有し、μ及びεは、およそ５５０アミノ酸を含有する。これらの異なるタイプの重鎖は、軽鎖と組み合わせると、それぞれ５つのよく知られた抗体のクラス（例えば、アイソタイプ）であるＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭになり、ＩｇＧは、４つのサブクラス、すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含む。
「軽鎖」という用語は、抗体に関して使用される場合、約２５ｋＤａのポリペプチド鎖を指し、アミノ末端部分は、約１００～約１１０以上のアミノ酸の可変領域を含み、カルボキシ末端部分は、定常領域を含む。軽鎖のおおよその長さは、２１１～２１７アミノ酸である。軽鎖には、２つの異なるタイプがあり、定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）またはラムダ（λ）と呼ばれる。
本明細書で使用される場合、「超可変領域」、「ＨＶＲ」、「相補性決定領域」、及び「ＣＤＲ」という用語は、区別なく使用される。「ＣＤＲ」は、免疫グロブリン（Ｉｇまたは抗体）ＶＨ βシートフレームワークの非フレームワーク領域内の３つの超可変領域（Ｈ１、Ｈ２またはＨ３）のうちの１つ、または抗体ＶＬ βシートフレームワークの非フレームワーク領域内の３つの超可変領域（Ｌ１、Ｌ２またはＬ３）のうちの１つを指す。したがって、ＣＤＲは、フレームワーク領域の配列内に挟まれた可変領域配列である。
ＣＤＲ領域は、当業者によく知られており、よく知られたナンバリングシステムによって定義されている。例えば、Ｋａｂａｔ相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列可変性に基づくものであり、最も一般的に使用されている（例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（上掲））。Ｃｈｏｔｈｉａは、構造ループの位置を指す（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－１７（１９８７）参照）。Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲ－Ｈ１ループの末端は、Ｋａｂａｔナンバリング規則を使用してナンバリングした場合、ループの長さに応じてＨ３２からＨ３４の間で変化する（これは、ＫａｂａｔナンバリングスキームがＨ３５Ａ及びＨ３５Ｂに挿入を置くからであり、３５Ａも３５Ｂも存在しない場合、ループは３２で終了し、３５Ａのみが存在する場合、ループは３３で終了し、３５Ａと３５Ｂの両方が存在する場合、ループは３４で終了する）。ＡｂＭ超可変領域は、Ｋａｂａｔ ＣＤＲとＣｈｏｔｈｉａ構造ループとの間の妥協案を示すものであり、Ｏｘｆｏｒｄ ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアで使用されている（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｖｏｌ．２（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｕｂｅｌ ｅｄｓ．，２ｄ ｅｄ．２０１０）参照）。「Ｃｏｎｔａｃｔ」の超可変領域は、利用可能な複合体結晶構造の分析に基づくものである。開発され、広く採用されている別のユニバーサルナンバリングシステムは、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）である（Ｌａｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７（１）：５５－７７（２００３））。ＩＭＧＴは、ヒト及び他の脊椎動物の免疫グロブリン（ＩＧ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、及び主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）に特化した総合情報システムである。本明細書において、ＣＤＲは、アミノ酸配列と軽鎖または重鎖内での位置の両方について参照される。免疫グロブリン可変ドメインの構造内のＣＤＲの「位置」は、種間で保存されており、ループと呼ばれる構造で存在していることから、構造的な特徴に従って可変ドメイン配列を整列させるナンバリングシステムを使用することによって、ＣＤＲ及びフレームワーク残基は、容易に特定される。この情報は、ある種の免疫グロブリンに由来するＣＤＲ残基を、典型的にはヒト抗体に由来するアクセプターフレームワークにグラフト化及び置換する際に使用することができる。更なるナンバリングシステム（ＡＨｏｎ）がＨｏｎｅｇｇｅｒ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０９：６５７－７０（２００１）によって開発されている。例えば、Ｋａｂａｔナンバリング及びＩＭＧＴ独自ナンバリングシステムを含む、ナンバリングシステム間の対応関係は、当業者によく知られている（例えば、Ｋａｂａｔ（上掲）；Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ（上掲）；Ｍａｒｔｉｎ（上掲）；Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．（上掲）参照）。これらの超可変領域またはＣＤＲのそれぞれに由来する残基は、以下の表６に例示される。
Figure 2023554467000001
所与のＣＤＲの境界は、特定に使用されるスキームに応じて変わり得る。したがって、特に指定のない限り、所与の抗体または可変領域などのその領域の「ＣＤＲ」及び「相補性決定領域」という用語、ならびに抗体またはその領域の個々のＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２）は、本明細書で上載される既知のスキームのいずれかによって定義される相補性決定領域を包含することを理解されたい。いくつかの場合、特定の１つまたは複数のＣＤＲを特定するためのスキームは、ＩＭＧＴ、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、またはＣｏｎｔａｃｔ法によって定義されるＣＤＲなどのように指定される。他の場合、ＣＤＲの具体的なアミノ酸配列が示される。また、ＣＤＲ領域は、様々なナンバリングシステムの組み合わせ、例えば、ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａナンバリングシステムの組み合わせ、またはＫａｂａｔとＩＭＧＴナンバリングシステムの組み合わせによって定義され得ることにも留意されたい。したがって、「特定のＶＨまたはＶＨＨに示されるＣＤＲ」などの用語は、上記の例示的なＣＤＲナンバリングシステムによって定義される任意のＣＤＲ１を含むが、それによって限定されない。当業者であれば、可変領域（例えば、ＶＨＨ、ＶＨまたはＶＬ）が示されれば、領域内のＣＤＲが異なるナンバリングシステムまたはこれらの組み合わせによって定義され得ることを理解するであろう。
超可変領域は、次の「伸長超可変領域」を含み得る：ＶＬでは２４～３６または２４～３４（Ｌ１）、４６～５６または５０～５６（Ｌ２）、及び８９～９７または８９～９６（Ｌ３）、ならびにＶＨでは２６～３５または２６～３５Ａ（Ｈ１）、５０～６５または４９～６５（Ｈ２）、及び９３～１０２、９４～１０２、または９５～１０２（Ｈ３）。
「定常領域」または「定常ドメイン」という用語は、抗体の抗原への結合に直接関与しないが、Ｆｃ受容体との相互作用などの様々なエフェクター機能を呈する、軽鎖及び重鎖のカルボキシ末端部分を指す。この用語は、免疫グロブリンの他の部分、すなわち、抗原結合部位を含有する可変領域と比較して、より保存されたアミノ酸配列を有する免疫グロブリン分子の部分を指す。定常領域は、重鎖のＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３領域、ならびに軽鎖のＣＬ領域を含有し得る。
「フレームワーク」または「ＦＲ」という用語は、ＣＤＲを挟む可変領域の残基を指す。ＦＲ残基は、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、ドメイン抗体（例えば、単一ドメイン抗体）、ダイアボディ、直鎖抗体、及び二重特異性抗体に存在する。ＦＲ残基は、超可変領域の残基またはＣＤＲ残基以外の可変ドメイン残基である。
本明細書における「Ｆｃ領域」という用語は、例えば、天然配列Ｆｃ領域、組み換えＦｃ領域、及びバリアントＦｃ領域を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は様々であり得るが、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域は、多くの場合、位置Ｃｙｓ２２６またはＰｒｏ２３０のアミノ酸残基からそのカルボキシル末端までに及ぶ範囲であると定義される。Ｆｃ領域のＣ末端リシン（ＥＵナンバリングシステムによると残基４４７）は、例えば、抗体の産生もしくは精製の間に、または抗体の重鎖をコードする核酸を組み換え操作することによって、除去されてもよい。したがって、インタクト抗体の組成物は、全てのＫ４４７残基が除去された抗体集団、Ｋ４４７残基が除去されていない抗体集団、及びＫ４４７残基を有する抗体と有しない抗体との混合物を有する抗体集団を含み得る。「機能性Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域の「エフェクター機能」を有する。例示的な「エフェクター機能」には、Ｃ１ｑ結合、ＣＤＣ、Ｆｃ受容体結合、ＡＤＣＣ、食作用、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御などが含まれる。そのようなエフェクター機能は、一般に、Ｆｃ領域が結合領域または結合ドメイン（例えば、抗体可変領域またはドメイン）と結合することが必要であり、当業者に知られている様々なアッセイを使用して評価することができる。「バリアントＦｃ領域」は、少なくとも１つのアミノ酸修飾（例えば、置換、付加、または欠失）によって、天然配列Ｆｃ領域のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、バリアントＦｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域と比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換、例えば、約１～約１０個のアミノ酸置換、または約１～約５個のアミノ酸置換を、天然配列Ｆｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域に有する。本明細書におけるバリアントＦｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域及び／または親ポリペプチドのＦｃ領域と少なくとも約８０％の相同性、または少なくとも約９０％の相同性、例えば、少なくとも約９５％の相同性を有し得る。
本明細書で使用される場合、「エピトープ」は、当該技術分野における用語であり、結合分子（例えば、単一ドメイン抗体配列を含む抗体）が特異的に結合することができる抗原の局在領域を指す。エピトープは、線状エピトープまたは高次構造、非線状、もしくは不連続エピトープであり得る。ポリペプチド抗原の場合、例えば、エピトープは、ポリペプチドの連続したアミノ酸であるか（「線状」エピトープ）、あるいは、エピトープは、ポリペプチドの２つ以上の非連続領域のアミノ酸を含み得る（「高次構造」、「非線状」または「不連続」エピトープ）。一般に、線状エピトープは、二次、三次、または四次構造に依存する場合もあれば、しない場合もあることが当業者には理解されるであろう。例えば、いくつかの実施形態において、結合分子は、天然の三次元タンパク質構造に折り畳まれるかどうかに関係なく、アミノ酸の群に結合する。他の実施形態において、結合分子は、エピトープを認識し結合するために、エピトープを構成するアミノ酸残基が特定の高次構造（例えば、屈曲、ねじれ、回転または折り畳み）を示すことを必要とする。
「遮断」抗体または「アンタゴニスト」抗体は、それが結合する抗原の生物学的活性を阻害または低減するものである。いくつかの実施形態において、遮断抗体またはアンタゴニスト抗体は、抗原の生物学的活性を実質的にまたは完全に阻害する。
「アゴニスト」または活性化抗体は、それが結合する抗原によるシグナル伝達を増強または開始するものである。いくつかの実施形態において、アゴニスト抗体は、天然のリガンドが存在しなくても、シグナル伝達をもたらすか、または活性化させる。
ペプチド、ポリペプチドまたは抗体配列に関する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」及び「アミノ酸配列相同性パーセント（％）」は、配列を整列させ、必要に応じて最大配列同一性パーセントを達成するためにギャップを導入した後の、いかなる保存的置換も配列同一性の一部として考慮しない、指定のペプチドまたはポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である、候補配列中のアミノ酸残基の百分率として定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアライメントは、当該技術分野における技術範囲内である様々な方法、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、またはＭＥＧＡＬＩＧＮ（商標）（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの一般に利用可能なコンピューターソフトウェアを使用して達成することができる。当業者であれば、比較される配列の全長にわたって最大のアライメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アライメントを評価するのに適切なパラメーターを決定することができる。
「特異性」という用語は、抗原の特定のエピトープに対する抗原結合タンパク質（ＣＡＲまたはｓｄＡｂなど）の選択的認識を指す。天然抗体は、例えば、単一特異性である。本明細書で使用される「多重特異性」という用語は、抗原結合タンパク質（ＣＡＲまたはｓｄＡｂなど）が２つ以上の抗原結合部位を有し、そのうちの少なくとも２つが異なる抗原に結合することを示す。本明細書で使用される「二重特異性」は、抗原結合タンパク質（ＣＡＲまたはｓｄＡｂなど）が２つの異なる抗原結合特異性を有することを示す。本明細書で使用される「単一特異性」ＣＡＲは、１つ以上の結合部位を有し、そのそれぞれが同じ抗原に結合する抗原結合タンパク質（ＣＡＲまたはｓｄＡｂなど）を示す。
本明細書で使用される「価」という用語は、抗原結合タンパク質（ＣＡＲまたはｓｄＡｂなど）に特定の数の結合部位が存在することを示す。例えば、天然抗体または全長抗体は、２つの結合部位を有し、二価である。したがって、「三価」、「四価」、「五価」及び「六価」という用語は、抗原結合タンパク質（ＣＡＲまたはｓｄＡｂなど）にそれぞれ２つの結合部位、３つの結合部位、４つの結合部位、５つの結合部位、及び６つの結合部位が存在することを示す。
本明細書で使用される「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」は、１つ以上の抗原特異性をＴ細胞などの免疫エフェクター細胞上にグラフトするために使用することができる、遺伝子操作された受容体を指す。いくつかのＣＡＲは、「人工Ｔ細胞受容体」、「キメラＴ細胞受容体」、または「キメラ免疫受容体」としても知られる。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、１つ以上の抗原（腫瘍抗原など）に特異的な細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、ならびにＴ細胞及び／または他の受容体の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。「ＣＡＲ－Ｔ細胞」は、ＣＡＲを発現するＴ細胞を指す。
「ポリペプチド」及び「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は、本明細書中で区別なく使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。ポリマーは、直鎖状であっても分岐状であってもよく、修飾アミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸によって中断されていてもよい。これらの用語はまた、天然にまたは介入によって、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、もしくは任意の他の操作もしくは修飾により修飾されたアミノ酸ポリマーを包含する。また、定義内には、例えば、限定するものではないが、非天然アミノ酸を含む１つ以上のアミノ酸の類似体、及び当該技術分野において知られている他の修飾を含有するポリペプチドも含まれる。本開示のポリペプチドは、抗体または免疫グロブリンスーパーファミリーの他のメンバーに基づき得るので、ある特定の実施形態において、「ポリペプチド」は、単鎖として、または２つ以上の関連鎖として生じ得ることが理解される。
「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、本明細書中で区別なく使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドもしくは塩基、及び／またはそれらの類似体、またはＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼによって、もしくは合成反応によってポリマーに組み込むことができる任意の基質であり得る。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びその類似体などの修飾ヌクレオチドを含み得る。「オリゴヌクレオチド」は、本明細書で使用される場合、必ずしもそうではないが、概して長さが約２００ヌクレオチド未満である、一般に一本鎖の短い合成ポリヌクレオチドを指す。「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、相互排他的ではない。ポリヌクレオチドに関する上記の説明は、等しくかつ完全にオリゴヌクレオチドに適用可能である。本開示の結合分子抗体を産生する細胞は、親ハイブリドーマ細胞、ならびに抗体をコードする核酸が導入されている細菌及び真核生物の宿主細胞を含み得る。特に指示がない限り、本明細書で開示される任意の一本鎖ポリヌクレオチド配列の左側の末端が５’末端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左側方向が５’方向と呼ばれる。新生ＲＮＡ転写物の５’から３’への付加方向は、転写方向と呼ばれ、ＲＮＡ転写物の５’末端に対して５’側に存在する、ＲＮＡ転写物の配列と同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域は、「上流配列」と呼ばれ、ＲＮＡ転写物の３’末端に対して３’側に存在する、ＲＮＡ転写物の配列と同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域は、「下流配列」と呼ばれる。
「単離された核酸」は、他のゲノムＤＮＡ配列ならびに天然配列に自然に付随しているリボソーム及びポリメラーゼなどのタンパク質または複合体から実質的に分離された核酸、例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、または混合核酸である。「単離された」核酸分子は、核酸分子の天然源に存在する他の核酸分子から分離されている分子である。更に、ｃＤＮＡ分子などの「単離された」核酸分子は、組み換え技術によって産生される場合は他の細胞物質または培地を実質的に含まないか、または、化学合成される場合は化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まないものであり得る。具体的な一実施形態において、本明細書に記載される単一ドメイン抗体または抗体をコードする１つ以上の核酸分子は、単離または精製される。この用語は、その天然に存在する環境から取り出された核酸配列を包含し、組み換えまたはクローニングしたＤＮＡ単離物及び化学的に合成された類似体または異種系によって生物学的に合成された類似体を含む。実質的に純粋な分子は、単離された形態の分子を含み得る。具体的には、本明細書に記載のＣＡＲまたはｓｄＡｂをコードする「単離された」核酸分子は、それが産生された環境において通常会合している少なくとも１つの混入核酸分子から特定及び分離される核酸分子である。
「制御配列」という用語は、特定の宿主生物における、操作可能に連結されたコーディング配列の発現に必要なＤＮＡ配列を指す。原核生物に好適な制御配列は、例えば、プロモーター、任意選択により、オペレーター配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、及びエンハンサーを利用することが知られている。
本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」という用語、及び類似の語句（例えば、遺伝子的に融合された）は、核酸またはアミノ酸に関して使用される場合、それぞれ、互いに機能的な関係に置かれた核酸配列またはアミノ酸配列の作動可能な連結を指す。例えば、作動可能に連結されたプロモーター、エンハンサー要素、オープンリーディングフレーム、５’及び３’ＵＴＲ、ならびにターミネーター配列は、核酸分子（例えば、ＲＮＡ）の正確な産生をもたらす。いくつかの実施形態において、作動可能に連結された核酸要素は、オープンリーディングフレームの転写及び最終的なポリペプチドの産生（すなわち、オープンリーディングフレームの発現）をもたらす。別の例として、作動可能に連結されたペプチドは、機能性ドメインが、意図された各ドメインの機能を付与するように、互いに適切な距離をおいて配置されたものである。
「ベクター」という用語は、核酸配列を宿主細胞に導入するために、例えば、本明細書に記載される結合分子（例えば、抗体）をコードする核酸配列を含む、核酸配列を運搬または含むために使用される物質を指す。使用に適用可能なベクターとしては、例えば、発現ベクター、プラスミド、ファージベクター、ウイルスベクター、エピソーム、及び人工染色体が挙げられ、宿主細胞の染色体に安定的に組み込むための選択配列または選択マーカーを含み得る。更に、ベクターは、１つ以上の選択マーカー遺伝子及び適切な発現制御配列を含み得る。含めることができる選択マーカー遺伝子は、例えば、抗生物質もしくは毒素に対する耐性を付与し、栄養要求性欠損を補完し、または培地中にはない重要な栄養素を供給する。発現制御配列は、当該技術分野においてよく知られている構成的及び誘導性プロモーター、転写エンハンサー、転写ターミネーターなどを含み得る。２つ以上の核酸分子（例えば、抗体重鎖と軽鎖または抗体ＶＨとＶＬの両方）が共発現される場合、両方の核酸分子は、例えば、単一の発現ベクターまたは別個の発現ベクターに挿入され得る。単一のベクター発現の場合、コード核酸は、１つの共通する発現制御配列に機能的に連結されるか、または１つの誘導性プロモーター及び１つの構成的プロモーターなどの異なる発現制御配列に連結され得る。核酸分子の宿主細胞への導入は、当該技術分野においてよく知られている方法を使用して確認することができる。そのような方法には、例えば、ｍＲＮＡのノーザンブロットもしくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅などの核酸分析、遺伝子産物の発現に関する免疫ブロット法、または導入された核酸配列もしくはその対応する遺伝子産物の発現を試験するのに好適な他の分析方法が含まれる。当業者は、核酸分子が所望の産物を産生するのに十分な量で発現されることを理解し、更に、当該技術分野においてよく知られている方法を使用して十分な発現が得られるように発現レベルを最適化することができることも理解している。
本明細書で使用される「宿主」という用語は、動物、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト）を指す。
本明細書で使用される「宿主細胞」という用語は、核酸分子がトランスフェクトされ得る特定の対象細胞、及びそのような細胞の子孫または潜在的な子孫を指す。そのような細胞の子孫は、次世代で発生し得る変異もしくは環境の影響、または核酸分子の宿主細胞ゲノムへの組み込みに起因して、核酸分子がトランスフェクトされた親細胞と同一でない場合もある。
本明細書で使用される場合、「自己由来」という用語は、任意の物質であって、それが後に再導入される個体と同一の個体に由来する物質を指すことが意図される。
「同種」とは、同じ種の異なる個体に由来する移植片を指す。
本明細書で使用される「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」という用語は、外因性核酸が宿主細胞に移入または導入されるプロセスを指す。「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」細胞は、外因性核酸によってトランスフェクト、形質転換、または形質導入された細胞である。この細胞は、初代対象細胞及びその子孫を含む。
本明細書で使用される「薬学的に許容される」という用語は、動物における使用、より具体的にはヒトにおける使用について、連邦政府もしくは州政府の規制機関によって承認されているか、または米国薬局方、欧州薬局方、もしくは他の一般に認知されている薬局方に収載されていることを意味する。
「賦形剤」は、薬学的に許容される材料、組成物、またはビヒクル、例えば、液体もしくは固体の充填剤、希釈剤、溶媒、またはカプセル化材料を意味する。賦形剤としては、例えば、カプセル化材料または添加剤、例えば、吸収促進剤、抗酸化剤、結合剤、緩衝液、担体、コーティング剤、着色剤、希釈剤、崩壊剤、乳化剤、増量剤、充填剤、矯味剤、加湿剤、滑沢剤、香料、保存剤、噴射剤、放出剤、滅菌剤、甘味料、可溶化剤、湿潤剤及びこれらの混合物が挙げられる。「賦形剤」という用語は、希釈剤、アジュバント（例えば、フロイントアジュバント（完全または不完全）またはビヒクルも指し得る。
いくつかの実施形態において、賦形剤は、薬学的に許容される賦形剤である。薬学的に許容される賦形剤の例としては、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量（例えば、約１０アミノ酸残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、もしくはリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む単糖、二糖、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトールもしくはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；及び／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。薬学的に許容される賦形剤の他の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１８ｔｈ ｅｄ．１９９０）に記載されている。
一実施形態において、各成分は、医薬製剤の他の成分と適合性があり、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、免疫原性、または他の問題もしくは合併症を伴わずにヒト及び動物の組織または器官と接触させて使用するのに適し、妥当な利益／リスク比に見合うという意味で、「薬学的に許容される」。例えば、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，２００５；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，６ｔｈ ｅｄ．；Ｒｏｗｅ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．；Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ：２００９；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｄｄｉｔｉｖｅｓ，３ｒｄ ｅｄ．；Ａｓｈ ａｎｄ Ａｓｈ Ｅｄｓ．；Ｇｏｗｅｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ：２００７；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，２ｎｄ ｅｄ．；Ｇｉｂｓｏｎ Ｅｄ．；ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ ＬＬＣ：Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，２００９を参照されたい。いくつかの実施形態において、薬学的に許容される賦形剤は、採用される用量及び濃度で賦形剤に曝露される細胞または哺乳動物に対して無毒である。いくつかの実施形態において、薬学的に許容される賦形剤は、ｐＨ緩衝水溶液である。
いくつかの実施形態において、賦形剤は、滅菌された水及び油などの液体であり、石油、動物、植物、または合成起源のもの、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、ミネラルオイル、ゴマ油などを含む。水は、組成物（例えば、医薬組成物）が静脈内投与される場合の例示的な賦形剤である。生理食塩水ならびにデキストロース水溶液及びグリセロール水溶液もまた、液体賦形剤として、特に注射用溶液として用いることができる。賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなども含まれる。組成物はまた、所望により、微量の湿潤剤または乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含有し得る。組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、徐放性製剤などの形態を取り得る。経口組成物は、製剤を含め、医薬品等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的な賦形剤を含むことができる。
組成物は、医薬化合物を含め、結合分子（例えば、抗体）を、例えば、単離または精製された形態で、好適な量の賦形剤とともに含有し得る。
本明細書で使用される「有効量」または「治療上有効な量」という用語は、所望の転帰をもたらすのに十分である、本明細書で提供される単一ドメイン抗体または薬剤及び単一ドメイン抗体を含む治療分子または医薬組成物の量を指す。
「対象」及び「患者」という用語は、区別なく使用され得る。本明細書で使用される場合、ある特定の実施形態において、対象は、非霊長類または霊長類（例えば、ヒト）などの哺乳動物である。具体的な実施形態において、対象は、ヒトである。一実施形態において、対象は、疾患または障害と診断された哺乳動物、例えば、ヒトである。別の実施形態において、対象は、疾患または障害を発生するリスクがある哺乳動物、例えば、ヒトである。
「投与する」または「投与」は、粘膜、皮内、静脈内、筋肉内送達、及び／または本明細書に記載されるもしくは当該技術分野において知られている任意の他の物理的送達方法などによって、体外に存在する物質を患者に注射するか、または別の方法で物理的に送達する行為を指す。
本明細書で使用される場合、「治療する」、「治療」及び「治療すること」という用語は、１つ以上の療法の実施から生じる、疾患または状態の進行、重症度、及び／または持続期間の低減または改善を指す。治療することは、基礎疾患に関連する１つ以上の症状の減少、軽減及び／または緩和があったかどうかを評価することによって決定され得、そのため、患者は依然として基礎疾患に罹患しているが、患者には改善が観察される。「治療すること」という用語は、疾患を管理すること及び疾患を改善することの両方を含む。「管理する」、「管理すること」、及び「管理」という用語は、必ずしも疾患の治癒をもたらすとは限らない、療法から対象が得る有益な効果を指す。
「予防する」、「予防すること」、及び「予防」という用語は、疾患、障害、状態、または関連症状（複数可）（例えば、疾患または癌）の発症（または再発）の可能性を低減することを指す。
本明細書で使用される場合、がんの発生を「遅延させること」は、疾患の発生を先に延ばす、阻止する、緩徐化する、遅らせる、安定化させる、及び／または延期させることを意味する。この遅延は、病歴及び／または治療される個体に応じて、様々な時間の長さになり得る。当業者には明らかであるように、十分なまたは大きな遅延は、事実上、個体が疾患を発生しないという点で予防も包含し得る。がんの発生を「遅延させる」方法は、当該方法を使用しない場合と比較して、所定の時間枠内における疾患の発生可能性を低減させる及び／または所定の時間枠内における疾患の程度を低減させる方法である。そのような比較は、典型的には、統計的に有意な数の個体を使用した臨床試験に基づく。がんの発生は、限定するものではないが、コンピュータ軸断層撮影（ＣＡＴスキャン）、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）、腹部超音波検査、凝固検査、動脈造影法、または生検を含む、標準的な方法を使用して検出することができる。発生はまた、初期に検出不可能であり得るがん進行を指し、発生、再発、及び発症を含む。
本明細書で使用される「ＧＵＣＹ２Ｃ関連疾患または障害」は、ＧＵＣＹ２Ｃを発現している細胞または組織を含む、疾患または障害を指す。いくつかの実施形態において、ＧＵＣＹ２Ｃ関連疾患または障害は、ＧＵＣＹ２Ｃが異常発現している細胞を含む。他の実施形態において、ＧＵＣＹ２Ｃ関連疾患または障害は、ＧＵＣＹ２Ｃが細胞中または細胞上で欠損している細胞を含む。
「約」及び「およそ」という用語は、所与の値または範囲の２０％以内、１５％以内、１０％以内、９％以内、８％以内、７％以内、６％以内、５％以内、４％以内、３％以内、２％以内、１％以内、またはそれ未満を意味する。
本開示及び特許請求の範囲で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈上、特に明確な指示のない限り、複数形を含む。
実施形態が「～を含む」という用語を用いて本明細書に記載される場合、「～からなる」及び／または「～から本質的になる」の用語で記載される類似の実施形態もまた提供されることが理解される。実施形態が「～から本質的になる」という語句を用いて本明細書に記載される場合、「～からなる」の用語で記載される類似の実施形態もまた提供されることが理解される。
「ＡとＢとの間」または「Ａ－Ｂ間」などの語句で使用される「間」という用語は、ＡとＢの両方を含む範囲を指す。
本明細書で「Ａ及び／またはＢ」などの語句で使用される「及び／または」という用語は、ＡとＢの両方；ＡまたはＢ；Ａ（単独）；及びＢ（単独）を含むことが意図される。同様に、「Ａ、Ｂ、及び／またはＣ」などの語句で使用される「及び／または」という用語は、次の実施形態のいずれをも包含することが意図される：Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；ならびにＣ（単独）。
５．２．単一ドメイン抗体
５．２．１．ＧＵＣＹ２Ｃに結合する単一ドメイン抗体
一態様において、本明細書で提供されるのは、ＧＵＣＹ２Ｃに結合することが可能な単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨＨドメイン）である。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨＨドメイン）は、ヒトＧＵＣＹ２Ｃに結合する。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体は、１つ以上のＧＵＣＹ２Ｃ活性を調節する。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体は、アンタゴニスト抗体．である。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、または≦０．００１ｎＭ（例えば、１０－８Ｍ以下、例えば、１０－８Ｍ～１０－１３Ｍ、例えば、１０－９Ｍ～１０－１３Ｍ）の解離定数（ＫＤ）でＧＵＣＹ２Ｃ（例えば、ヒトＧＵＣＹ２Ｃ）に結合する。結合親和性を測定する方法は、様々なものが当該技術分野において知られており、例えば、目的の抗体のＦａｂバージョン及びその抗原を用いて実施されるＲＩＡ（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９３：８６５－８１）；バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）または表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイ、例えば、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）Ｒｅｄ９６システムを使用するＯｃｔｅｔ（登録商標）、または例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）ＴＭ－２０００もしくはＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）ＴＭ－３０００を使用するＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）によるものがあり、そのいずれも本開示の目的のために使用することができる。「オンレート」または「会合の速度」または「会合速度」または「ｋｏｎ」もまた、例えば、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）Ｒｅｄ９６、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）ＴＭ－２０００、またはＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）ＴＭ－３０００システムを使用する、上記と同じバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）または表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術により決定され得る。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体は、ＶＨＨドメインである。本明細書で提供される例示的なＶＨＨドメインは、以下のセクション６に記載されるように生成され、これらのＶＨＨドメインは、以下の表７に示されるとおり、Ｃ８、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１５、Ｃ２１、Ｃ２７、Ｃ３０及びＣ３１と呼ばれる。
したがって、いくつかの実施形態において、本明細書で提供される単一ドメイン抗体は、Ｃ８、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１５、Ｃ２１、Ｃ２７、Ｃ３０及び／またはＣ３１のいずれか１つの１つ以上のＣＤＲ配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、以下の構造：ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４を含む、ＧＵＣＹ２Ｃに結合する単一ドメイン抗体であり、ここで、ＣＤＲ配列は、Ｃ８、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１５、Ｃ２１、Ｃ２７、Ｃ３０及び／またはＣ３１のものから選択される。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される抗ＧＵＣＹ２Ｃ ｓｄＡｂは、Ｘ１ＹＧＭＸ２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１を含み、ここで、Ｘ１は、Ａ、ＩまたはＶであり、Ｘ２は、ＤまたはＧである（配列番号６４）。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される抗ＧＵＣＹ２Ｃ ｓｄＡｂは、Ｘ３ＩＸ４ＬＳＧＲＸ５Ｘ６ＹＸ７ＤＡＶＸ８Ｇのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２を含み、ここで、Ｘ３は、Ａ、ＳまたはＴであり、Ｘ４は、Ｆ、ＷまたはＹであり、Ｘ５は、ＳまたはＴであり、Ｘ６は、Ｅ、ＮまたはＴであり、Ｘ７は、Ａ、ＳまたはＴであり、Ｘ８は、ＫまたはＱである（配列番号６５）。他の実施形態において、本明細書で提供される抗ＧＵＣＹ２Ｃ ｓｄＡｂは、ＧＸ９Ｘ１０ＴＡＸ１１ＳＸ１２ＲＱＹのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含み、ここで、Ｘ９は、Ａ、ＥまたはＰであり、Ｘ１０は、ＰまたはＴであり、Ｘ１１は、ＳまたはＴであり、Ｘ１２は、ＧまたはＶである（配列番号６６）。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される抗ＧＵＣＹ２Ｃ ｓｄＡｂは、Ｘ１ＹＧＭＸ２のアミノ酸配列（ここで、Ｘ１は、Ａ、ＩまたはＶであり、Ｘ２は、ＤまたはＧである）（配列番号６４）を含むＣＤＲ１と、Ｘ３ＩＸ４ＬＳＧＲＸ５Ｘ６ＹＸ７ＤＡＶＸ８Ｇのアミノ酸配列（ここで、Ｘ３は、Ａ、ＳまたはＴであり、Ｘ４は、Ｆ、ＷまたはＹであり、Ｘ５は、ＳまたはＴであり、Ｘ６は、Ｅ、ＮまたはＴであり、Ｘ７は、Ａ、ＳまたはＴであり、Ｘ８は、ＫまたはＱである）（配列番号６５）を含むＣＤＲ２と、ＧＸ９Ｘ１０ＴＡＸ１１ＳＸ１２ＲＱＹのアミノ酸配列（ここで、Ｘ９は、Ａ、ＥまたはＰであり、Ｘ１０は、ＰまたはＴであり、Ｘ１１は、ＳまたはＴであり、Ｘ１２は、ＧまたはＶである）（配列番号６６）を含むＣＤＲ３とを含む。
Figure 2023554467000002
いくつかの実施形態において、配列番号３のアミノ酸配列の１つ、２つ、または３つ全てのＣＤＲを含む、抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態において、配列番号４のアミノ酸配列の１つ、２つ、または３つ全てのＣＤＲを含む、抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態において、配列番号５のアミノ酸配列の１つ、２つ、または３つ全てのＣＤＲを含む、抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態において、配列番号６のアミノ酸配列の１つ、２つ、または３つ全てのＣＤＲを含む、抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態において、配列番号７のアミノ酸配列の１つ、２つ、または３つ全てのＣＤＲを含む、抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態において、配列番号８のアミノ酸配列の１つ、２つ、または３つ全てのＣＤＲを含む、抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態において、配列番号９のアミノ酸配列の１つ、２つ、または３つ全てのＣＤＲを含む、抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態において、配列番号１０のアミノ酸配列の１つ、２つ、または３つ全てのＣＤＲを含む、抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態において、抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体は、ラクダ科抗体である。いくつかの実施形態において、抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体は、ヒト化抗体である。いくつかの実施形態において、抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、配列番号３に記載されるＣＤＲ１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１を有する。いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、配列番号３に記載されるＣＤＲ２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２を有する。他の実施形態において、単一ドメイン抗体は、配列番号３に記載されるＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を有する。いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、配列番号３に記載されるＣＤＲ１及びＣＤＲ２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１及びＣＤＲ２を有する。いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、配列番号３に記載されるＣＤＲ１及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１及びＣＤＲ３を有する。いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、配列番号３に記載されるＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及びＣＤＲ３を有する。いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、配列番号３に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を有する。ＣＤＲ配列は、周知のナンバリングシステムによって決定することができる。いくつかの実施形態において、ＣＤＲは、ＩＭＧＴナンバリングに従う。いくつかの実施形態において、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔナンバリングに従う。いくつかの実施形態において、ＣＤＲは、ＡｂＭナンバリングに従う。他の実施形態において、ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングに従う。他の実施形態において、ＣＤＲは、Ｃｏｎｔａｃｔナンバリングに従う。いくつかの実施形態において、抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体は、ラクダ科抗体である。いくつかの実施形態において、抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体は、ヒト化抗体である。いくつかの実施形態において、抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、配列番号４に記載されるＣＤＲ１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１を有する。いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、配列番号４に記載されるＣＤＲ２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２を有する。他の実施形態において、単一ドメイン抗体は、配列番号４に記載されるＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を有する。いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、配列番号４に記載されるＣＤＲ１及びＣＤＲ２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１及びＣＤＲ２を有する。いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、配列番号４に記載されるＣＤＲ１及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１及びＣＤＲ３を有する。いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、配列番号４に記載されるＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及びＣＤＲ３を有する。いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、配列番号４に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を有する。ＣＤＲ配列は、周知のナンバリングシステムによって決定することができる。いくつかの実施形態において、ＣＤＲは、ＩＭＧＴナンバリングに従う。いくつかの実施形態において、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔナンバリングに従う。いくつかの実施形態において、ＣＤＲは、ＡｂＭナンバリングに従う。他の実施形態において、ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングに従う。他の実施形態において、ＣＤＲは、Ｃｏｎｔａｃｔナンバリングに従う。いくつかの実施形態において、抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体は、ラクダ科抗体である。いくつかの実施形態において、抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体は、ヒト化抗体である。いくつかの実施形態において、抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、配列番号５に記載されるＣＤＲ１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１を有する。いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、配列番号５に記載されるＣＤＲ２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２を有する。他の実施形態において、単一ドメイン抗体は、配列番号５に記載されるＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を有する。いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、配列番号５に記載されるＣＤＲ１及びＣＤＲ２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１及びＣＤＲ２を有する。いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、配列番号５に記載されるＣＤＲ１及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１及びＣＤＲ３を有する。いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、配列番号５に記載されるＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及びＣＤＲ３を有する。いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、配列番号５に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を有する。ＣＤＲ配列は、周知のナンバリングシステムによって決定することができる。いくつかの実施形態において、ＣＤＲは、ＩＭＧＴナンバリングに従う。いくつかの実施形態において、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔナンバリングに従う。いくつかの実施形態において、ＣＤＲは、ＡｂＭナンバリングに従う。他の実施形態において、ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングに従う。他の実施形態において、ＣＤＲは、Ｃｏｎｔａｃｔナンバリングに従う。いくつかの実施形態において、抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体は、ラクダ科抗体である。いくつかの実施形態において、抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体は、ヒト化抗体である。いくつかの実施形態において、抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、配列番号６に記載されるＣＤＲ１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１を有する。いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、配列番号６に記載されるＣＤＲ２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２を有する。他の実施形態において、単一ドメイン抗体は、配列番号６に記載されるＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を有する。いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、配列番号６に記載されるＣＤＲ１及びＣＤＲ２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１及びＣＤＲ２を有する。いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、配列番号６に記載されるＣＤＲ１及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１及びＣＤＲ３を有する。いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、配列番号６に記載されるＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及びＣＤＲ３を有する。いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、配列番号６に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を有する。ＣＤＲ配列は、周知のナンバリングシステムによって決定することができる。いくつかの実施形態において、ＣＤＲは、ＩＭＧＴナンバリングに従う。いくつかの実施形態において、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔナンバリングに従う。いくつかの実施形態において、ＣＤＲは、ＡｂＭナンバリングに従う。他の実施形態において、ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングに従う。他の実施形態において、ＣＤＲは、Ｃｏｎｔａｃｔナンバリングに従う。いくつかの実施形態において、抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体は、ラクダ科抗体である。いくつかの実施形態において、抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体は、ヒト化抗体である。いくつかの実施形態において、抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、配列番号７に記載されるＣＤＲ１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１を有する。いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、配列番号７に記載されるＣＤＲ２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２を有する。他の実施形態において、単一ドメイン抗体は、配列番号７に記載されるＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を有する。いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、配列番号７に記載されるＣＤＲ１及びＣＤＲ２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１及びＣＤＲ２を有する。いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、配列番号７に記載されるＣＤＲ１及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１及びＣＤＲ３を有する。いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、配列番号７に記載されるＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及びＣＤＲ３を有する。いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、配列番号７に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を有する。ＣＤＲ配列は、周知のナンバリングシステムによって決定することができる。いくつかの実施形態において、ＣＤＲは、ＩＭＧＴナンバリングに従う。いくつかの実施形態において、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔナンバリングに従う。いくつかの実施形態において、ＣＤＲは、ＡｂＭナンバリングに従う。他の実施形態において、ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングに従う。他の実施形態において、ＣＤＲは、Ｃｏｎｔａｃｔナンバリングに従う。いくつかの実施形態において、抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体は、ラクダ科抗体である。いくつかの実施形態において、抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体は、ヒト化抗体である。いくつかの実施形態において、抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、配列番号８に記載されるＣＤＲ１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１を有する。いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、配列番号８に記載されるＣＤＲ２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２を有する。他の実施形態において、単一ドメイン抗体は、配列番号８に記載されるＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を有する。いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、配列番号８に記載されるＣＤＲ１及びＣＤＲ２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１及びＣＤＲ２を有する。いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、配列番号８に記載されるＣＤＲ１及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１及びＣＤＲ３を有する。いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、配列番号８に記載されるＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及びＣＤＲ３を有する。いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、配列番号８に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を有する。ＣＤＲ配列は、周知のナンバリングシステムによって決定することができる。いくつかの実施形態において、ＣＤＲは、ＩＭＧＴナンバリングに従う。いくつかの実施形態において、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔナンバリングに従う。いくつかの実施形態において、ＣＤＲは、ＡｂＭナンバリングに従う。他の実施形態において、ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングに従う。他の実施形態において、ＣＤＲは、Ｃｏｎｔａｃｔナンバリングに従う。いくつかの実施形態において、抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体は、ラクダ科抗体である。いくつかの実施形態において、抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体は、ヒト化抗体である。いくつかの実施形態において、抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、配列番号９に記載されるＣＤＲ１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１を有する。いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、配列番号９に記載されるＣＤＲ２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２を有する。他の実施形態において、単一ドメイン抗体は、配列番号９に記載されるＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を有する。いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、配列番号９に記載されるＣＤＲ１及びＣＤＲ２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１及びＣＤＲ２を有する。いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、配列番号９に記載されるＣＤＲ１及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１及びＣＤＲ３を有する。いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、配列番号９に記載されるＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及びＣＤＲ３を有する。いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、配列番号９に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を有する。ＣＤＲ配列は、周知のナンバリングシステムによって決定することができる。いくつかの実施形態において、ＣＤＲは、ＩＭＧＴナンバリングに従う。いくつかの実施形態において、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔナンバリングに従う。いくつかの実施形態において、ＣＤＲは、ＡｂＭナンバリングに従う。他の実施形態において、ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングに従う。他の実施形態において、ＣＤＲは、Ｃｏｎｔａｃｔナンバリングに従う。いくつかの実施形態において、抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体は、ラクダ科抗体である。いくつかの実施形態において、抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体は、ヒト化抗体である。いくつかの実施形態において、抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、配列番号１０に記載されるＣＤＲ１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１を有する。いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、配列番号１０に記載されるＣＤＲ２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２を有する。他の実施形態において、単一ドメイン抗体は、配列番号１０（例えば、配列番号３または６）に記載されるＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を有する。いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、配列番号１０に記載されるＣＤＲ１及びＣＤＲ２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１及びＣＤＲ２を有する。いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、配列番号１０に記載されるＣＤＲ１及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１及びＣＤＲ３を有する。いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、配列番号１０に記載されるＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及びＣＤＲ３を有する。いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、配列番号１０に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を有する。ＣＤＲ配列は、周知のナンバリングシステムによって決定することができる。いくつかの実施形態において、ＣＤＲは、ＩＭＧＴナンバリングに従う。いくつかの実施形態において、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔナンバリングに従う。いくつかの実施形態において、ＣＤＲは、ＡｂＭナンバリングに従う。他の実施形態において、ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングに従う。他の実施形態において、ＣＤＲは、Ｃｏｎｔａｃｔナンバリングに従う。いくつかの実施形態において、抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体は、ラクダ科抗体である。いくつかの実施形態において、抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体は、ヒト化抗体である。いくつかの実施形態において、抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、以下の構造：ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４を含む、ＧＵＣＹ２Ｃに結合する単一ドメイン抗体であり、ここで、（ｉ）ＣＤＲ１は、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、もしくは配列番号２５、配列番号２６のアミノ酸配列を含み、（ｉｉ）ＣＤＲ２は、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、もしくは配列番号３４のアミノ酸配列を含み、及び／または（ｉｉｉ）ＣＤＲ３は、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、もしくは配列番号４２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体は、ラクダ科抗体である。いくつかの実施形態において、抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体は、ヒト化抗体である。いくつかの実施形態において、抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
他の実施形態において、本明細書で提供されるのは、以下の構造：ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４を含む、ＧＵＣＹ２Ｃに結合する単一ドメイン抗体であり、ここで、（ｉ）ＣＤＲ１は、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、もしくは配列番号２５、配列番号２６に対して、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、（ｉｉ）ＣＤＲ２は、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、もしくは配列番号３４に対して、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及び／または（ｉｉｉ）ＣＤＲ３は、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、もしくは配列番号４２に対して、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体は、ラクダ科抗体である。いくつかの実施形態において、抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体は、ヒト化抗体である。いくつかの実施形態において、抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）である。いくつかの実施形態において、抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体は、ラクダ科抗体である。いくつかの実施形態において、抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体は、ヒト化抗体である。いくつかの実施形態において、抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）である。いくつかの実施形態において、抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体は、ラクダ科抗体である。いくつかの実施形態において、抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体は、ヒト化抗体である。いくつかの実施形態において、抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）である。いくつかの実施形態において、抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体は、ラクダ科抗体である。いくつかの実施形態において、抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体は、ヒト化抗体である。いくつかの実施形態において、抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）である。いくつかの実施形態において、抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体は、ラクダ科抗体である。いくつかの実施形態において、抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体は、ヒト化抗体である。いくつかの実施形態において、抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）である。いくつかの実施形態において、抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体は、ラクダ科抗体である。いくつかの実施形態において、抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体は、ヒト化抗体である。いくつかの実施形態において、抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）である。いくつかの実施形態において、抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体は、ラクダ科抗体である。いくつかの実施形態において、抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体は、ヒト化抗体である。いくつかの実施形態において、抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）である。いくつかの実施形態において、抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体は、ラクダ科抗体である。いくつかの実施形態において、抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体は、ヒト化抗体である。いくつかの実施形態において、抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）である。いくつかの実施形態において、抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体は、ラクダ科抗体である。いくつかの実施形態において、抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体は、ヒト化抗体である。いくつかの実施形態において、抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、Ｃ８、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１５、Ｃ２１、Ｃ２７、Ｃ３０及び／またはＣ３１の１つ以上のフレームワーク領域（複数可）を更に含む。いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、配列番号３の配列を含むＶＨＨドメインに由来する１つ以上のフレームワーク（複数可）を含む。いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、配列番号４の配列を含むＶＨＨドメインに由来する１つ以上のフレームワーク（複数可）を含む。いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、配列番号５の配列を含むＶＨＨドメインに由来する１つ以上のフレームワーク（複数可）を含む。いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、配列番号６の配列を含むＶＨＨドメインに由来する１つ以上のフレームワーク（複数可）を含む。いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、配列番号７の配列を含むＶＨＨドメインに由来する１つ以上のフレームワーク（複数可）を含む。いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、配列番号８の配列を含むＶＨＨドメインに由来する１つ以上のフレームワーク（複数可）を含む。いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、配列番号９の配列を含むＶＨＨドメインに由来する１つ以上のフレームワーク（複数可）を含む。いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、配列番号１０の配列を含むＶＨＨドメインに由来する１つ以上のフレームワーク（複数可）を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される単一ドメイン抗体は、ヒト化された単一ドメイン抗体である。
本明細書に記載されるフレームワーク領域は、ＣＤＲナンバリングシステムの境界に基づいて決定される。言い換えれば、ＣＤＲが、例えば、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴ、またはＣｈｏｔｈｉａによって決定される場合、フレームワーク領域は、可変領域のＣＤＲをＮ末端からＣ末端に向かってＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４のフォーマットで取り囲むアミノ酸残基である。例えば、ＦＲ１は、例えば、Ｋａｂａｔナンバリングシステム、ＩＭＧＴナンバリングシステム、またはＣｈｏｔｈｉａナンバリングシステムによって定義される、ＣＤＲ１アミノ酸残基に対してＮ末端にあるアミノ酸残基として定義され、ＦＲ２は、例えば、Ｋａｂａｔナンバリングシステム、ＩＭＧＴナンバリングシステム、またはＣｈｏｔｈｉａナンバリングシステムによって定義される、ＣＤＲ１とＣＤＲ２のアミノ酸残基の間のアミノ酸残基として定義され、ＦＲ３は、例えば、Ｋａｂａｔナンバリングシステム、ＩＭＧＴナンバリングシステム、またはＣｈｏｔｈｉａナンバリングシステムによって定義される、ＣＤＲ２とＣＤＲ３のアミノ酸残基の間のアミノ酸残基として定義され、ＦＲ４は、例えば、Ｋａｂａｔナンバリングシステム、ＩＭＧＴナンバリングシステム、またはＣｈｏｔｈｉａナンバリングシステムによって定義される、ＣＤＲ３アミノ酸残基に対してＣ末端にあるアミノ酸残基として定義される。
いくつかの実施形態において、配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＨＨドメインを含む、単離された抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態において、配列番号３のアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。
いくつかの実施形態において、配列番号４のアミノ酸配列を有するＶＨＨドメインを含む、単離された抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態において、配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。
いくつかの実施形態において、配列番号５のアミノ酸配列を有するＶＨＨドメインを含む、単離された抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態において、配列番号５のアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。
いくつかの実施形態において、配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＨＨドメインを含む、単離された抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態において、配列番号６のアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。
いくつかの実施形態において、配列番号７のアミノ酸配列を有するＶＨＨドメインを含む、単離された抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態において、配列番号７のアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。
いくつかの実施形態において、配列番号８のアミノ酸配列を有するＶＨＨドメインを含む、単離された抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態において、配列番号８のアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。
いくつかの実施形態において、配列番号９のアミノ酸配列を有するＶＨＨドメインを含む、単離された抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態において、配列番号９のアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。
いくつかの実施形態において、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＶＨＨドメインを含む、単離された抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態において、配列番号１０のアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載される抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体のいずれか１つと競合的にＧＵＣＹ２Ｃに特異的に結合する、抗ＧＵＣＹ２Ｃ抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態において、競合的結合は、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して決定され得る。例えば、いくつかの実施形態において、配列番号３のアミノ酸配列を含む抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体と競合的にＧＵＣＹ２Ｃに特異的に結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態において、配列番号４のアミノ酸配列を含む抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体と競合的にＧＵＣＹ２Ｃに特異的に結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態において、配列番号５のアミノ酸配列を含む抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体と競合的にＧＵＣＹ２Ｃに特異的に結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態において、配列番号６のアミノ酸配列を含む抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体と競合的にＧＵＣＹ２Ｃに特異的に結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態において、配列番号７のアミノ酸配列を含む抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体と競合的にＧＵＣＹ２Ｃに特異的に結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態において、配列番号８のアミノ酸配列を含む抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体と競合的にＧＵＣＹ２Ｃに特異的に結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態において、配列番号９のアミノ酸配列を含む抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体と競合的にＧＵＣＹ２Ｃに特異的に結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態において、配列番号１０のアミノ酸配列を含む抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体と競合的にＧＵＣＹ２Ｃに特異的に結合する抗体が提供される。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体との相互作用に必要なＧＵＣＹ２Ｃタンパク質中のアミノ酸を特定するために、例えば、コンビナトリアルアラニンスキャニングによって、機能性エピトープをマッピングすることができる。いくつかの実施形態において、ＧＵＣＹ２Ｃに結合した抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体の高次構造及び結晶構造を採用してエピトープを特定してもよい。いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書で提供される抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体のいずれかと同じエピトープに特異的に結合する抗体を提供する。いくつかの実施形態において、配列番号３のアミノ酸配列を含む抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態において、配列番号４のアミノ酸配列を含む抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態において、配列番号５のアミノ酸配列を含む抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態において、配列番号６のアミノ酸配列を含む抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態において、配列番号７のアミノ酸配列を含む抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態において、配列番号８のアミノ酸配列を含む抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態において、配列番号９のアミノ酸配列を含む抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態において、配列番号１０のアミノ酸配列を含む抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。
ある特定の実施形態において、本明細書に記載される抗体またはその抗原結合断片は、抗体Ｃ８、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１５、Ｃ２１、Ｃ２７、Ｃ３０及びＣ３１のいずれか１つに対して、特定の同一性パーセントを有するアミノ酸配列を含む。
２つの配列（例えば、アミノ酸配列または核酸配列）の間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。２つの配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの非限定的な例は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：５８７３ ５８７７（１９９３）で修正されたＫａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：２２６４ ２２６８（１９９０）のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３（１９９０）のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、例えば、スコア＝１００、ワード長＝１２に設定されたＮＢＬＡＳＴヌクレオチドプログラムパラメーターを用いて実施して、本明細書に記載される核酸分子に対して相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、例えば、スコア５０、ワード長＝３に設定されたＸＢＬＡＳＴプログラムパラメーターを用いて実施して、本明細書に記載されるタンパク質分子に対して相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的のためにギャップを含めたアライメントを得るには、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９ ３４０２（１９９７）に記載されるように、ギャップ付きＢＬＡＳＴを利用することができる。あるいは、ＰＳＩ ＢＬＡＳＴを使用して、分子間の遠縁関係を検出する反復検索を行うこともできる（同上）。ＢＬＡＳＴ、ギャップ付きＢＬＡＳＴ、及びＰＳＩ Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合、各プログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトのパラメーターを使用することができる（例えば、ワールドワイドウェブｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖのＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）参照）。配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの別の非限定的な例は、Ｍｙｅｒｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ，ＣＡＢＩＯＳ ４：１１－１７（１９９８）のアルゴリズムである。かかるアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０重み付け残基表、ギャップ長ペナルティ１２、及びギャップペナルティ４を使用することができる。２つの配列間の同一性パーセントは、ギャップを許容するかしないかにかかわらず、上記に記載のものと同様の技術を使用して決定することができる。同一性パーセントの算出には、典型的に、完全一致のみがカウントされる。
いくつかの実施形態において、配列番号３～１０から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも約７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のいずれか１つを有するＶＨＨドメインを含む、抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体が提供される。いくつかの実施形態において、少なくとも約７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性のいずれか１つを有するＶＨＨ配列は、参照配列に対して、置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含有するが、当該配列を含む抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体は、ＧＵＣＹ２Ｃに結合する能力を保持している。いくつかの実施形態において、配列番号３～１０から選択されるアミノ酸配列は、合計１～１０アミノ酸が置換、挿入及び／または欠失している。いくつかの実施形態において、置換、挿入、または欠失は、ＣＤＲ外の領域（すなわち、ＦＲ）に生じる。任意選択により、抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体は、当該配列の翻訳後修飾を含む、配列番号３～１０から選択されるアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態において、本明細書に記載される単一ドメイン抗体は、配列番号３のアミノ酸配列に対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＨＨドメインを含み、ここで、単一ドメイン抗体は、ＧＵＣＹ２Ｃに結合する。
ある特定の実施形態において、本明細書に記載される単一ドメイン抗体は、配列番号４のアミノ酸配列に対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＨＨドメインを含み、ここで、単一ドメイン抗体は、ＧＵＣＹ２Ｃに結合する。
ある特定の実施形態において、本明細書に記載される単一ドメイン抗体は、配列番号５のアミノ酸配列に対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＨＨドメインを含み、ここで、単一ドメイン抗体は、ＧＵＣＹ２Ｃに結合する。
ある特定の実施形態において、本明細書に記載される単一ドメイン抗体は、配列番号６のアミノ酸配列に対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＨＨドメインを含み、ここで、単一ドメイン抗体は、ＧＵＣＹ２Ｃに結合する。
ある特定の実施形態において、本明細書に記載される単一ドメイン抗体は、配列番号７のアミノ酸配列に対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＨＨドメインを含み、ここで、単一ドメイン抗体は、ＧＵＣＹ２Ｃに結合する。
ある特定の実施形態において、本明細書に記載される単一ドメイン抗体は、配列番号８のアミノ酸配列に対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＨＨドメインを含み、ここで、単一ドメイン抗体は、ＧＵＣＹ２Ｃに結合する。
ある特定の実施形態において、本明細書に記載される単一ドメイン抗体は、配列番号９のアミノ酸配列に対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＨＨドメインを含み、ここで、単一ドメイン抗体は、ＧＵＣＹ２Ｃに結合する。
ある特定の実施形態において、本明細書に記載される単一ドメイン抗体は、配列番号１０のアミノ酸配列に対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＨＨドメインを含み、ここで、単一ドメイン抗体は、ＧＵＣＹ２Ｃに結合する。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、上に記載される抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体のいずれか１つを含む、ＧＵＣＹ２Ｃ結合タンパク質である。いくつかの実施形態において、ＧＵＣＹ２Ｃ結合タンパク質は、ラクダ科、キメラ、ヒト化またはヒト抗体を含む、モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態において、抗ＧＵＣＹ２Ｃ抗体は、抗体断片、例えば、ＶＨＨ断片である。いくつかの実施形態において、抗ＧＵＣＹ２Ｃ抗体は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４などの任意の抗体クラスまたはアイソタイプのＦｃ領域を含む、全長重鎖のみの抗体である。いくつかの実施形態において、Ｆｃ領域は、低減されたまたは最小化されたエフェクター機能を有する。いくつかの実施形態において、ＧＵＣＹ２Ｃ結合タンパク質は、本明細書で提供される抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体を含む、融合タンパク質である。他の実施形態において、ＧＵＣＹ２Ｃ結合タンパク質は、本明細書で提供される抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体を含む、多重特異性抗体である。他の例示的なＧＵＣＹ２Ｃ結合分子は、以下のセクションにおいて更に詳述される。
いくつかの実施形態において、上記の実施形態のいずれかによる抗ＧＵＣＹ２Ｃ抗体（抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体など）または抗原結合タンパク質は、以下のセクション５．２．２～５．２．７に記載される特徴のいずれかを単独でまたは組み合わせて組み込むことができる。
５．２．２．単一ドメイン抗体バリアント
本明細書に記載されるＧＵＣＹ２Ｃに結合する単一ドメイン抗体に加えて、本明細書に記載されるＧＵＣＹ２Ｃに結合する単一ドメイン抗体のバリアントを調製することができることも企図される。例えば、単一ドメイン抗体バリアントは、適切なヌクレオチド変化をコードＤＮＡに導入することによって、及び／または所望の抗体またはポリペプチドの合成によって、調製することができる。当業者であれば、アミノ酸の変更により、単一ドメイン抗体の翻訳後プロセスを変えることができることを理解している。
変異は、単一ドメイン抗体またはポリペプチドをコードする１つ以上のコドンの置換、欠失、または挿入であり得、元の抗体またはポリペプチドと比較して、アミノ酸配列に変化をもたらすものである。置換による変異導入の対象となる部位には、ＣＤＲ及びＦＲが含まれる。
アミノ酸置換は、あるアミノ酸を類似の構造及び／または化学的特性を有する別のアミノ酸で置き換えた結果であり得、ロイシンのセリンによる置換、例えば、保存的アミノ酸置換などである。本明細書で提供される分子をコードするヌクレオチド配列に変異を導入するために、例えば、アミノ酸置換をもたらす部位特異的変異導入及びＰＣＲによる変異導入を含む、当業者に知られた標準的な技術を使用することができる。挿入または欠失は、任意選択により、約１～５アミノ酸の範囲であり得る。ある特定の実施形態において、置換、欠失、または挿入は、元の分子に対して、２５個未満のアミノ酸置換、２０個未満のアミノ酸置換、１５個未満のアミノ酸置換、１０個未満のアミノ酸置換、５個未満のアミノ酸置換、４個未満のアミノ酸置換、３個未満のアミノ酸置換、または２個未満のアミノ酸置換を含む。具体的な一実施形態において、置換は、１つ以上の予測された非必須アミノ酸残基でなされる保存的アミノ酸置換である。許容される変異は、配列中にアミノ酸の挿入、欠失、または置換を体系的に行い、それにより得られたバリアントを親抗体によって示される活性について試験することによって決定され得る。
アミノ酸配列の挿入には、１残基から複数の残基を含有するポリペプチドまでの長さに及ぶアミノ末端及び／またはカルボキシル末端の融合、ならびに１つまたは複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が挙げられる。
保存的アミノ酸置換によって生成される単一ドメイン抗体は、本開示に含まれる。保存的アミノ酸置換において、アミノ酸残基は、類似の電荷を持つ側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられる。上記のように、類似の電荷を持つ側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を持つアミノ酸が含まれる。あるいは、変異は、飽和変異導入などによって、コーディング配列の全てまたは一部に沿ってランダムに導入することができ、結果として生じた変異体は、生物学的活性についてスクリーニングすることで、活性を保持する変異体を特定することができる。変異導入後、コード化タンパク質を発現させ、タンパク質の活性を決定することができる。保存的（例えば、類似の特性及び／または側鎖を有するアミノ酸基内での）置換は、特性を維持するように、または特性を著しく変化させないようになされ得る。例示的な置換は、以下の表に示される。
Figure 2023554467000003
アミノ酸は、その側鎖の特性の類似性に従ってグループ分けされ得る（例えば、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ７３－７５（２ｄ ｅｄ．１９７５）参照）：（１）非極性：Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）；（２）無電荷極性：Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）；（３）酸性：Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）；及び（４）塩基性：Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｈｉｓ（Ｈ）。あるいは、天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいたグループに分類され得る：（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；（５）鎖の方向性に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；及び（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。例えば、単一ドメイン抗体の適切な高次構造の維持に関与しない任意のシステイン残基もまた、分子の酸化安定性を改善し、異常な架橋を防ぐために、例えば、アラニンまたはセリンなどの別のアミノ酸で置換され得る。非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスに交換することを伴う。
置換型バリアントのあるタイプは、親抗体（例えば、ヒト化抗体またはヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基を置換することを伴う。一般に、得られたバリアント（複数可）のうち、親抗体と比べて特定の生物学的特性が変更（例えば、改善）され（例えば、親和性の増加、免疫原性の低下）、及び／または親抗体の特定の生物学的特性が実質的保持されているバリアントが更なる研究のために選択される。例示的な置換バリアントは、親和性成熟抗体であり、例えば、本明細書に記載されるようなファージディスプレイベースの親和性成熟技術を使用して、簡便に生成され得る。簡潔に述べると、１つ以上のＣＤＲ残基を変異させ、バリアント抗体をファージ上に提示させ、特定の生物活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングする。
改変（例えば、置換）は、例えば、抗体親和性を改善するために、ＣＤＲ中になされ得る。そのような改変は、ＣＤＲの「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟プロセス中に高頻度で変異を受けるコドンによってコードされる残基（例えば、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０７：１７９－１９６（２００８）参照）、及び／またはＳＤＲ（ａ－ＣＤＲ）になされ得、それにより得られたバリアント抗体またはその断片を結合親和性について試験する。二次ライブラリーを構築し、二次ライブラリーから再選択することによる親和性成熟は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７８：１－３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，（２００１））に記載されている。親和性成熟のいくつかの実施形態において、様々な方法（例えば、エラープローンＰＣＲ、鎖シャッフリング、またはオリゴヌクレオチド指向性変異導入）のいずれかによって、成熟について選択された可変遺伝子に多様性が導入される。次いで、二次ライブラリーが作製される。次いで、このライブラリーをスクリーニングして、所望の親和性を有する任意の抗体バリアントを特定する。多様性を導入する別の方法は、いくつかのＣＤＲ残基（例えば、一度に４～６個の残基）を無作為に割り付けるＣＤＲ指向性アプローチを伴う。抗原結合に関与するＣＤＲ残基は、例えば、アラニンスキャニング変異導入法またはモデリングを使用して、特異的に特定され得る。親和性成熟に関するより詳細な説明は、以下のセクションに提供される。
いくつかの実施形態において、置換、挿入、または欠失は、そのような改変が抗体の抗原結合能力を実質的に低減させない限り、１つ以上のＣＤＲ内に生じ得る。例えば、結合親和性を実質的に低減させない保存的改変（例えば、本明細書で提供される保存的置換）がＣＤＲ中になされ得る。本明細書で提供されるバリアントＶＨＨ配列のいくつかの実施形態において、各ＣＤＲは、改変されていないか、または１つ、２つもしくは３つのアミノ酸置換を含有し得る。
変異導入の標的となり得る抗体の残基または領域の特定に有用な方法は、「アラニンスキャニング変異導入法」と呼ばれ、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１－１０８５（１９８９）によって記載されている。この方法では、標的残基のうちのある残基または基（例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、及びＧｌｕなどの荷電残基）を特定し、これを中性または負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニンまたはポリアラニン）で置き換え、抗体と抗原の相互作用に影響があるかどうかを決定する。最初の置換に対して機能感受性を示すアミノ酸位置に更なる置換が導入され得る。代替的にまたは追加的に、抗原－抗体複合体の結晶構造から、抗体と抗原との間の接触点を特定する。そのような接触残基及び隣接残基は、置換の候補として、標的にされるか、または排除され得る。バリアントは、スクリーニングにより、所望の特性を含有するかどうか決定され得る。
アミノ酸配列の挿入には、１残基から１００以上の残基を含有するポリペプチドまでの長さに及ぶアミノ末端及び／またはカルボキシル末端の融合、ならびに１つまたは複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入バリアントには、酵素（例えば、ＡＤＥＰＴの場合）または抗体の血清中半減期を増加させるポリペプチドを抗体のＮ末端またはＣ末端に融合したものが含まれる。
オリゴヌクレオチド媒介（部位特異的）変異導入、アラニンスキャニング、及びＰＣＲ変異導入などの当該技術分野において知られている方法を使用して、変異を行うことができる。部位特異的変異導入（例えば、Ｃａｒｔｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．２３７：１－７（１９８６）；及びＺｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０：６４８７－５００（１９８２）参照）、カセット変異導入（例えば、Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ３４：３１５－２３（１９８５）参照）、または他の既知の技術をクローンＤＮＡに対して行い、単一ドメイン抗体バリアントＤＮＡを生成することができる。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される単一ドメイン抗体は、例えば、任意のタイプの分子を単一ドメイン抗体に共有結合することによって、化学修飾される。抗体誘導体は、例えば、グリコシル化、アセチル化、ＰＥＧ化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解による切断、細胞リガンドもしくは他のタンパク質への連結、または１つ以上の免疫グロブリンドメイン（例えば、ＦｃまたはＦｃの一部）へのコンジュゲーションなどによって化学修飾されている抗体を含み得る。多数の化学修飾のいずれかは、限定するものではないが、特定の化学的切断、アセチル化、製剤化、ツニカマイシンの代謝合成などを含む、既知の技術によって実施され得る。更に、抗体は、１つ以上の非典型的アミノ酸を含有し得る。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される抗体は、抗体のグリコシル化の程度が増加または減少するように改変される。抗体に対するグリコシル化部位の付加または除去は、１つ以上のグリコシル化部位が創出または除去されるようにアミノ酸配列を変更することによって、簡便に達成され得る。
本明細書で提供される単一ドメイン抗体がＦｃ領域に融合される場合、それに結合している炭水化物が改変され得る。哺乳動物細胞によって産生される天然抗体は、典型的には、一般にＦｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７にＮ－結合により結合している、分岐した二分岐型オリゴ糖を含む。例えば、Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．ＴＩＢＴＥＣＨ １５：２６－３２（１９９７）を参照されたい。オリゴ糖は、様々な炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース及びシアル酸、ならびに二分岐型オリゴ糖構造の「幹」中のＧｌｃＮＡｃに結合したフコースを含み得る。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される結合分子中のオリゴ糖の修飾は、ある特定の特性が改善したバリアントを作製するために行われ得る。
他の実施形態において、本明細書で提供される単一ドメイン抗体がＦｃ領域に融合される場合、本明細書で提供される抗体バリアントは、当該Ｆｃ領域に（直接または間接的に）結合したフコースを欠く炭水化物構造を有し得る。例えば、そのような抗体のフコースの量は、１％～８０％、１％～６５％、５％～６５％または２０％～４０％であり得る。フコースの量は、例えば、ＷＯ２００８／０７７５４６に記載されているようなＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析によって測定されるように、Ａｓｎ２９７に結合している全ての糖構造の合計（例えば、複合型、混合型及び高マンノース型構造）に対する、Ａｓｎ２９７の糖鎖内にあるフコースの平均量を算出することによって決定され得る。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域内の位置２９７付近（ＥＵナンバリングのＦｃ領域残基）に位置するアスパラギン残基を指すが、Ａｓｎ２９７は、抗体の軽微な配列変化に起因して、位置２９７から上流または下流の約±３アミノ酸、すなわち、位置２９４～３００の間に位置する場合もある。そのようなフコシル化バリアントは、改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。例えば、米国特許公開第ＵＳ２００３／０１５７１０８号及び同第ＵＳ２００４／００９３６２１号を参照されたい。「脱フコシル化」または「フコース欠損」抗体バリアントに関する公開物の例としては、ＵＳ２００３／０１５７１０８；ＷＯ２０００／６１７３９；ＷＯ２００１／２９２４６；ＵＳ２００３／０１１５６１４；ＵＳ２００２／０１６４３２８；ＵＳ２００４／００９３６２１；ＵＳ２００４／０１３２１４０；ＵＳ２００４／０１１０７０４；ＵＳ２００４／０１１０２８２；ＵＳ２００４／０１０９８６５；ＷＯ２００３／０８５１１９；ＷＯ２００３／０８４５７０；ＷＯ２００５／０３５５８６；ＷＯ２００５／０３５７７８；ＷＯ２００５／０５３７４２；ＷＯ２００２／０３１１４０；Ｏｋａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３６：１２３９－１２４９（２００４）；Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）が挙げられる。脱フコシル化抗体を産生することが可能な細胞株の例としては、タンパク質のフコシル化が欠損しているＬｅｃ１３ ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａ ｅｔ ａｌ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４９：５３３－５４５（１９８６）；米国特許出願第ＵＳ２００３／０１５７１０８号；及びＷＯ ２００４／０５６３１２、特に実施例１１）、及びアルファ－１，６－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞などのノックアウト細胞株（例えば、Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）；Ｋａｎｄａ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９４（４）：６８０－６８８（２００６）；及びＷＯ２００３／０８５１０７参照）が挙げられる。
本明細書で提供される単一ドメイン抗体を含む結合分子は、二分されたオリゴ糖を含むものも更に提供され、これは、例えば、Ｆｃ領域に結合した二分岐型オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分されている。そのようなバリアントは、フコシル化の減少及び／または改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。そのようなバリアントの例は、例えば、ＷＯ２００３／０１１８７８（Ｊｅａｎ－Ｍａｉｒｅｔ ｅｔ ａｌ．）；米国特許第６，６０２，６８４号（Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．）；及びＵＳ２００５／０１２３５４６（Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．）に記載されている。Ｆｃ領域に結合しているオリゴ糖内に少なくとも１つのガラクトース残基を含むバリアントも提供される。そのようなバリアントは、改善されたＣＤＣ機能を有し得る。そのようなバリアントは、例えば、ＷＯ１９９７／３００８７；ＷＯ１９９８／５８９６４；及びＷＯ１９９９／２２７６４に記載されている。
本発明の単一ドメイン抗体及びＦｃ領域を含む分子において、１つ以上のアミノ酸修飾がＦｃ領域に導入され、それにより、Ｆｃ領域バリアントを生成することができる。Ｆｃ領域バリアントは、アミノ酸修飾（例えば、置換）を１つ以上のアミノ酸位置に含む、ヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４ Ｆｃ領域）を含み得る。
いくつかの実施形態において、本出願は、全てではないがいくつかのエフェクター機能を有するバリアントを企図するものであり、これにより、結合分子のｉｎ ｖｉｖｏ半減期は重要であるが、特定のエフェクター機能（補体及びＡＤＣＣなど）は不要または有害である用途に対して、望ましい候補となる。ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／またはｉｎ ｖｉｖｏ細胞傷害アッセイを実施して、ＣＤＣ活性及び／またはＡＤＣＣ活性の低下／枯渇を確認することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを実施して、結合分子がＦｃγＲ結合を欠く（したがって、ＡＤＣＣ活性を欠く可能性が高い）が、ＦｃＲｎ結合能力を保持していることを確実にすることができる。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの非限定的な例としては、米国特許第５，５００，３６２号（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：７０５９－７０６３（１９８６）参照）及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：１４９９－１５０２（１９８５）；５，８２１，３３７（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１３５１－１３６１（１９８７）参照）に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ法が採用され得る（例えば、フローサイトメトリーのためのＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞傷害アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ；及びＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞傷害アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）参照。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。代替的にまたは追加的に、目的分子のＡＤＣＣ活性は、ｉｎ ｖｉｖｏで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：６５２－６５６（１９９８）に開示されているような動物モデルで評価され得る。また、Ｃ１ｑ結合アッセイを実施して、抗体がＣ１ｑに結合することができず、それにより、ＣＤＣ活性を欠くことを確認することもできる。例えば、ＷＯ２００６／０２９８７９及びＷＯ２００５／１００４０２におけるＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイが実施され得る（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２：１６３（１９９６）；Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １０１：１０４５－１０５２（２００３）；及びＣｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ａｎｄ Ｍ．Ｊ．Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｂｌｏｏｄ １０３：２７３８－２７４３（２００４）参照）。ＦｃＲｎ結合及びｉｎ ｖｉｖｏクリアランス／半減期の決定は、当該技術分野において知られている方法を使用して実施することもできる（例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｂ． ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（１２）：１７５９－１７６９（２００６）参照）。
エフェクター機能が低減された結合分子には、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９のうちの１つ以上の置換を有するものが含まれる（米国特許第６，７３７，０５６号）。そのようなＦｃ変異体には、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７のうちの２つ以上に置換を含むＦｃ変異体、例えば、残基２６５及び２９７をアラニンに置換したいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体（米国特許第７，３３２，５８１号）が含まれる。
ＦｃＲへの結合が改善されたまたは低減した特定のバリアントについても記載されている（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号；ＷＯ２００４／０５６３１２、及びＳｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１－６６０４（２００１）参照）。
いくつかの実施形態において、バリアントは、ＡＤＣＣを改善する１つ以上のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の位置２９８、３３３、及び／または３３４（残基はＥＵナンバリング）における置換を含むＦｃ領域を含む。いくつかの実施形態において、例えば、米国特許第６，１９４，５５１号、ＷＯ９９／５１６４２、及びＩｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８－４１８４（２０００）に記載されているように、Ｃ１ｑ結合及び／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）に変更（すなわち、改善または減少のいずれか）をもたらす改変がＦｃ領域になされる。
半減期が増加され、母胎ＩｇＧの胎児への輸送を担う胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合が改善された結合分子（Ｇｕｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）及びＫｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））については、ＵＳ２００５／００１４９３４Ａ１（Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．））に記載されている。これらの分子は、Ｆｃ領域のＦｃＲｎへの結合を改善する１つ以上の置換を含むＦｃ領域を含む。そのようなＦｃバリアントは、Ｆｃ領域残基：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４または４３４のうちの１つ以上に置換を含むもの、例えば、Ｆｃ領域の残基４３４に置換を含むもの（米国特許第７，３７１，８２６号）を含む。Ｆｃ領域バリアントの他の例に関しては、Ｄｕｎｃａｎ ＆ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３２２：７３８－４０（１９８８）；米国特許第５，６４８，２６０号；米国特許第５，６２４，８２１号；及びＷＯ９４／２９３５１も参照されたい。
いくつかの実施形態において、抗体の１つ以上の残基がシステイン残基で置換された、システイン操作抗体を作製することが望ましい場合がある。いくつかの実施形態において、置換残基は、抗体のアクセス可能な部位に生じる。これらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基が抗体のアクセス可能な部位に配置され、本明細書で更に記載されるように、これを使用して、抗体を薬物部分またはリンカー－薬物部分などの他の部分にコンジュゲートしてイムノコンジュゲートを作製することができる。
５．２．３．ｉｎ ｖｉｔｒｏ親和性成熟
いくつかの実施形態において、親抗体と比較して、親和性、安定性、または発現レベルなどの特性が改善された抗体バリアントは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ親和性成熟によって調製され得る。天然のプロトタイプと同様に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ親和性成熟は、変異及び選択の原理に基づく。抗体のライブラリーは、生物（例えば、ファージ、細菌、酵母、または哺乳動物細胞）の表面上に、またはコードｍＲＮＡもしくはＤＮＡとの会合で（例えば、共有結合的または非共有結合的に）提示される。提示された抗体の親和性選択により、抗体をコードする遺伝子情報を保有する生物または複合体の単離が可能になる。ファージディスプレイなどのディスプレイ方法を使用する２または３ラウンドの変異及び選択により、通常、低ナノモル範囲の親和性を有する抗体断片が得られる。親和性成熟抗体は、標的抗原に対して、ナノモルまたは更にはピコモルの親和性を有し得る。
ファージディスプレイは、抗体の提示及び選択について広く使用されている方法である。抗体は、バクテリオファージコートタンパク質との融合体として、ＦｄまたはＭ１３バクテリオファージの表面上に提示される。選択は、ファージディスプレイ抗体をその標的に結合させるようにする抗原への曝露を伴い、このプロセスは、「パニング」と呼ばれる。抗原に結合したファージを回収し、これを使用して細菌に感染させて、更なる選択ラウンドのためのファージを産生させる。概説については、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７８：１－３７（２００２）；及びＢｒａｄｂｕｒｙ ａｎｄ Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２９０：２９－４９（２００４）を参照されたい。
酵母ディスプレイシステム（例えば、Ｂｏｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：５５３－５７（１９９７）；及びＣｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ １：７５５－６８（２００６）参照）では、抗体は、酵母のアグルチニンタンパク質Ａｇａ２ｐの接着サブユニットに融合され、Ａｇａ１ｐへのジスルフィド結合を介して酵母細胞壁に付着している。Ａｇａ２ｐを介したタンパク質の提示により、タンパク質が細胞表面から離れて突き出されることから、酵母細胞壁上の他の分子との相互作用の可能性は最小限である。親和性または安定性が改善された抗体を選択するために、磁気分離及びフローサイトメトリーを使用してライブラリーをスクリーニングする。目的の可溶性抗原への結合は、ビオチン化抗原で酵母を標識すること、及びフルオロフォアにコンジュゲートされたストレプトアビジンなどの第２の試薬によって決定される。抗体の表面発現における変異は、一本鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）に隣接するヘマグルチニンまたはｃ－Ｍｙｃエピトープタグのいずれかの免疫蛍光標識から測定することができる。発現は、提示されたタンパク質の安定性と相関することが示されていることから、親和性だけでなく安定性の改善についても抗体を選択することができる（例えば、Ｓｈｕｓｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９２：９４９－５６（１９９９）参照）。酵母ディスプレイの更なる利点は、提示されたタンパク質が、真核酵母細胞の小胞体内で折り畳まれることで、小胞体のシャペロン及び品質管理機構を利用できることである。成熟完了後、酵母の表面上に提示されたまま、簡便に抗体親和性を「タイトレーション」することができことから、各クローンの発現及び精製の必要性が不要となる。酵母表面ディスプレイの理論的限界は、他のディスプレイ方法よりも機能的なライブラリーのサイズが小さくなる可能性があることであるが、最近のアプローチでは、酵母細胞の交配系を使用して、サイズが１０１４と推定されるコンビナトリアル多様性が創出されている（例えば、米国特許公開第２００３／０１８６３７４号；及びＢｌａｉｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ３４２：２１１－１８（２００４）参照）。
リボソームディスプレイでは、無細胞系での選択のために抗体－リボソーム－ｍＲＮＡ（ＡＲＭ）複合体が生成される。抗体の特定のライブラリーをコードするＤＮＡライブラリーが、終止コドンを欠くスペーサー配列と遺伝的に融合される。このスペーサー配列は、翻訳されると、ペプチジルｔＲＮＡに結合したままでリボソームトンネルを占有することから、目的のタンパク質がリボソームから突出し、折り畳みが可能になる。結果として得られるｍＲＮＡ、リボソーム、及びタンパク質の複合体は、表面結合リガンドに結合することができることから、リガンドでの親和性捕捉により、抗体及びそのコードｍＲＮＡの同時単離が可能である。次いで、リボソーム結合ｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、次いで、変異導入を行い、それを次の選択ラウンドに使用することができる（例えば、Ｆｕｋｕｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３４：ｅ１２７（２００６）参照）。ｍＲＮＡディスプレイでは、抗体とｍＲＮＡとの間の共有結合は、ピューロマイシンをアダプター分子として使用して確立される（Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：３７５０－５５（２００１））。
これらの方法は、完全にｉｎ ｖｉｔｒｏで実施されるので、他の選択技術よりも２つの重要な利点を提供する。第１に、ライブラリーの多様性が、細菌細胞の形質転換効率ではなく、試験管内に存在するリボソーム及び様々なｍＲＮＡ分子の数によってのみ限定されることである。第２に、各選択ラウンドの後に、例えば、非プルーフリーディングポリメラーゼによってランダム変異を容易に導入することができ、多様化ステップの後に、ライブラリーを形質転換する必要がないことである。
いくつかの実施形態において、哺乳動物ディスプレイシステムが使用され得る。
多様性はまた、標的化した方法またはランダム導入を介して、抗体ライブラリーのＣＤＲに導入され得る。前者のアプローチには、高レベルもしくは低レベルの変異導入を介して抗体のＣＤＲを全て逐次的に標的にすること、または体細胞超変異の孤立したホットスポット（例えば、Ｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：６０７－１７（２００５）参照）もしくは実験に基づいてもしくは構造的な理由で親和性に影響すると疑われる残基を標的にすることが含まれる。多様性はまた、ＤＮＡシャッフリングまたは類似の技術を介して、天然に多様である領域を置換することによっても導入され得る（例えば、Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：４３４９６－５０７（２００３）；米国特許第５，５６５，３３２号及び同第６，９８９，２５０号参照）。代替的な技術では、フレームワーク領域残基に及ぶ超可変ループを標的とするか（例えば、Ｂｏｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４８：６９９－７０９（２００５）参照）、ＣＤＲ中のループ欠失及び挿入を採用するか、ハイブリダイゼーションによる多様化を使用する（例えば、米国特許公開第２００４／０００５７０９号参照）。ＣＤＲに多様性をもたらす追加の方法は、例えば、米国特許第７，９８５，８４０号に開示されている。抗体ライブラリー及び／または抗体親和性成熟を行うために使用することができる更なる方法は、例えば、米国特許第８，６８５，８９７号及び同第８，６０３，９３０号、ならびに米国特許公開第２０１４／０１７０７０５号、同第２０１４／００９４３９２号、同第２０１２／００２８３０１号、同第２０１１／０１８３８５５号、及び同第２００９／００７５３７８号に開示されており、そのそれぞれが参照により本明細書に援用される。
ライブラリーのスクリーニングは、当該技術分野において知られている様々な技術によって達成することができる。例えば、単一ドメイン抗体は、固体支持体、カラム、ピン、もしくはセルロース／ポリ（フッ化ビニリデン）メンブレン／他のフィルター上に固定化したり、吸着プレートに付着させた宿主細胞上に発現させたり、またはセルソーティングで使用したり、またはストレプトアビジンをコーティングしたビーズで捕捉するためのビオチンにコンジュゲートしたり、またはディスプレイライブラリーをパニングするための任意の他の方法で使用したりすることができる。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ親和性成熟法の概説については、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３：１１０５－１６（２００５）；Ｑｕｉｒｏｚ ａｎｄ Ｓｉｎｃｌａｉｒ，Ｒｅｖｉｓｔａ Ｉｎｇｅｎｅｒｉａ Ｂｉｏｍｅｄｉａ ４：３９－５１（２０１０）；及びその中の参考文献を参照されたい。
５．２．４．単一ドメイン抗体の修飾
単一ドメイン抗体の共有結合修飾は、本開示の範囲内に含まれる。共有結合修飾には、単一ドメイン抗体の標的アミノ酸残基を、単一ドメイン抗体の選択された側鎖またはＮ末端もしくはＣ末端残基と反応することが可能な有機誘導体化剤と反応させることが含まれる。他の修飾には、グルタミニル残基及びアスパラギニル残基の対応するグルタミル残基及びアスパルチル残基それぞれへの脱アミド化、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル残基またはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα－アミノ基メチル化（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ７９－８６（１９８３）参照）、Ｎ末端アミンのアセチル化、ならびに任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化が含まれる。
本開示の範囲内に含まれる単一ドメイン抗体の共有結合修飾の他のタイプには、上に記載される抗体またはポリペプチドの天然グリコシル化パターンを改変すること（例えば、Ｂｅｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９：４８２－５０１（２００８）；及びＷａｌｓｈ，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ １５：７７３－８０（２０１０）参照）、ならびに例えば、米国特許第４，６４０，８３５号；同第４，４９６，６８９号；同第４，３０１，１４４号；同第４，６７０，４１７号；同第４，７９１，１９２号；または同第４，１７９，３３７号に記載されているように、抗体を様々な非タンパク質性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンのうちの１つに連結させることが含まれる。本開示のＧＵＣＹ２Ｃに結合する単一ドメイン抗体はまた、半減期を延長させ、及び／または既知のＦｃ媒介性エフェクター機能を付与するために、１つ以上の免疫グロブリン定常領域またはその一部（例えば、Ｆｃ）に遺伝的に融合またはコンジュゲートされ得る。
本開示のＧＵＣＹ２Ｃに結合する一本鎖抗体はまた、ＧＵＣＹ２Ｃに結合する一本鎖抗体を含み、別の異種ポリペプチドまたはアミノ酸配列、例えば、エピトープタグ（例えば、Ｔｅｒｐｅ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６０：５２３－３３（２００３）参照）またはＩｇＧ分子のＦｃ領域（例えば、Ａｒｕｆｆｏ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ２２１－４２（Ｃｈａｍｏｗ ａｎｄ Ａｓｈｋｅｎａｚｉ ｅｄｓ．，１９９９）参照）に融合させたキメラ分子を形成するように修飾され得る。ＧＵＣＹ２Ｃに結合する一本鎖抗体はまた、以下により詳細に記載されるように、ＧＵＣＹ２Ｃ結合キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を生成するために使用され得る。
また、本明細書で提供されるのは、本開示のＧＵＣＹ２Ｃに結合する一本鎖抗体及び異種ポリペプチドを含む、融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、抗体が遺伝的に融合されるまたは化学的にコンジュゲートされる異種ポリペプチドは、細胞表面に発現されるＧＵＣＹ２Ｃを有する細胞へ抗体を標的化するのに有用である。
また、本明細書で提供されるのは、ＧＵＣＹ２Ｃ抗原に結合する抗体のパネルである。具体的な実施形態において、抗体のパネルは、ＧＵＣＹ２Ｃ抗原に対して異なる会合速度、異なる解離速度、異なる親和性、及び／またはＧＵＣＹ２Ｃ抗原に対して異なる特異性を有する。いくつかの実施形態において、パネルは、約１０～約１０００個以上の抗体を含むか、またはそれらからなる。抗体のパネルは、ＥＬＩＳＡなどのアッセイのために、例えば、９６ウェルまたは３８４ウェルプレートで使用することができる。
５．２．５．ヒト化された単一ドメイン抗体
本明細書に記載される単一ドメイン抗体は、ヒト化された単一ドメイン抗体を含む。ラクダ科の種に由来する単一ドメイン抗体をヒト化する一般的な戦略は記載されており（例えば、Ｖｉｎｃｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８４（５）：３２７３－３２８４（２００９）参照）、本明細書で開示されるヒト化ＶＨＨドメインの産生に有用であり得る。ラクダ科の種に由来するヒト化された単一ドメイン抗体の設計には、残基１１、３７、４４、４５及び４７（Ｋａｂａｔに従う残基ナンバリング）などのＶＨＨ中の特徴的な残基が含まれ得る（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ ７４：２７７－３０２（２００１）。
本明細書で開示されるヒト化された単一ドメイン抗体などのヒト化抗体はまた、当該技術分野において知られている様々な技術、例えば、限定するものではないが、ＣＤＲグラフト化（欧州特許第ＥＰ２３９，４００号；国際公開第ＷＯ９１／０９９６７号；ならびに米国特許第５，２２５，５３９号、同第５，５３０，１０１号、及び同第５，５８５，０８９号）、ベニアリングまたはリサーフェーシング（欧州特許第ＥＰ５９２，１０６号及び同第ＥＰ５１９，５９６号；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２８（４／５）：４８９－４９８（１９９１）；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７（６）：８０５－８１４（１９９４）；ならびにＲｏｇｕｓｋａ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９１：９６９－９７３（１９９４））、鎖シャフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）、ならびに例えば、米国特許第６，４０７，２１３号、米国特許第５，７６６，８８６号、ＷＯ９３１７１０５、Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：１１１９ ２５（２００２）、Ｃａｌｄａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１３（５）：３５３－６０（２０００）、Ｍｏｒｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０（３）：２６７ ７９（２０００）、Ｂａｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１６）：１０６７８－８４（１９９７）、Ｒｏｇｕｓｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．９（１０）：８９５ ９０４（１９９６）、Ｃｏｕｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５（２３ Ｓｕｐｐ）：５９７３ｓ－ ５９７７ｓ（１９９５）、Ｃｏｕｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５（８）：１７１７－２２（１９９５）、Ｓａｎｄｈｕ ＪＳ，Ｇｅｎｅ １５０（２）：４０９－１０（１９９４）、及びＰｅｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３５（３）：９５９－７３（１９９４）に開示されている技術を使用して産生することができる。米国特許公開第ＵＳ２００５／００４２６６４Ａ１号（２００５年２月２４日）も参照されたい。そのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に援用される。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される単一ドメイン抗体は、ヒトＧＵＣＹ２Ｃを含むＧＵＣＹ２Ｃに結合するヒト化された単一ドメイン抗体であり得る。例えば、本開示のヒト化一本鎖抗体は、配列番号３～１０に記載される１つ以上のＣＤＲを含み得る。非ヒト抗体をヒト化するための方法は、様々なものが当該技術分野において知られている。例えば、ヒト化抗体は、非ヒトの供給源から導入された１つ以上のアミノ酸残基を有し得る。これらの非ヒトアミノ酸残基は、多くの場合、「移入」残基と呼ばれ、典型的には「移入」可変ドメインから得られる。ヒト化は、例えば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２－２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－２７（１９８８）；及びＶｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４－３６（１９８８））の方法に従って、超可変領域配列をヒト抗体の対応する配列に置き換えることによって、実施され得る。
いくつかの場合において、ヒト化抗体は、親非ヒト抗体のＣＤＲのアミノ酸配列がヒト抗体フレームワーク上にグラフトされる、ＣＤＲグラフト化によって構築される。例えば、Ｐａｄｌａｎ ｅｔ ａｌ．は、抗原に実際に接触しているのはＣＤＲ中の残基の約３分の１のみであることを実証し、これらを「特異性決定残基」またはＳＤＲと名付けた（Ｐａｄｌａｎ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．９：１３３－３９（１９９５））。ＳＤＲグラフト化の技術では、ＳＤＲ残基のみがヒト抗体フレームワークにグラフトされる（例えば、Ｋａｓｈｍｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：２５－３４（２００５）参照）。
ヒト化抗体の作製に使用されるヒト可変ドメインの選択は、抗原性を減少させることが重要であり得る。例えば、いわゆる「ベストフィット」法では、非ヒト抗体の可変ドメインの配列を、既知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリーに対してスクリーニングする。非ヒト抗体の配列に最も近いヒト配列をヒト化抗体のためのヒトフレームワークとして選択することができる（Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６－３０８（１９９３）；及びＣｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－１７（１９８７））。別の方法は、軽鎖または重鎖の特定のサブグループの全てのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に使用することができる（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：４２８５－８９（１９９２）；及びＰｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３－３２（１９９３））。いくつかの場合において、フレームワークは、最も豊富なヒトサブクラスであるＶＬ６サブグループＩ（ＶＬ６Ｉ）及びＶＨサブグループＩＩＩ（ＶＨＩＩＩ）のコンセンサス配列に由来する。別の方法において、ヒト生殖細胞系列遺伝子がフレームワーク領域の供給源として使用される。
超ヒト化と呼ばれるＣＤＲの比較に基づく代替パラダイムでは、ＦＲの相同性は関係しない。この方法は、非ヒト配列と機能的なヒト生殖細胞系列遺伝子レパートリーとの比較からなる。次いで、マウス配列と同じまたは密接に関係する標準的な構造をコードする遺伝子を選択する。次に、非ヒト抗体と標準的な構造を共有する遺伝子のうち、ＣＤＲと最も相同性の高い遺伝子をＦＲドナーとして選択する。最後に、これらのＦＲ上に非ヒトＣＤＲをグラフトする（例えば、Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：１１１９－２５（２００２）参照）。
更に、抗体は、抗原に対する親和性及び他の好ましい生物学的特性を維持したままヒト化されることが一般に望ましい。この目的を達成するために、ある方法では、親配列及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列と種々の概念上のヒト化産物について分析するプロセスによって、ヒト化抗体が調製される。三次元免疫グロブリンモデルが一般に利用可能であり、当業者にはよく知られている。選択された免疫グロブリン候補配列から推定される三次元高次構造を例示及び表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらには、例えば、ＷＡＭ（Ｗｈｉｔｅｌｅｇｇ ａｎｄ Ｒｅｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１３：８１９－２４（２００２））、Ｍｏｄｅｌｌｅｒ（Ｓａｌｉ ａｎｄ Ｂｌｕｎｄｅｌｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３４：７７９－８１５（１９９３））、及びＳｗｉｓｓ ＰＤＢ Ｖｉｅｗｅｒ（Ｇｕｅｘ ａｎｄ Ｐｅｉｔｓｃｈ，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １８：２７１４－２３（１９９７））が挙げられる。これらの表示を検討することにより、免疫グロブリン候補配列の機能において、その残基が果たすと思われる役割の分析、例えば、免疫グロブリン候補の抗原に結合する能力に影響を与える残基を分析することが可能となる。このように、ＦＲ残基は、標的抗原（複数可）に対する親和性の増加などの所望の抗体特性が達成されるように、レシピエント配列及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般に、超可変領域残基は、抗原結合への影響に直接的かつ最も実質的に関与している。
抗体ヒト化の別の方法には、ヒトストリング含有量（ＨＳＣ）と呼ばれる抗体ヒト化の尺度に基づくものがある。この方法は、マウス配列をヒト生殖細胞系列遺伝子のレパートリーと比較し、差異をＨＳＣとしてスコア化する。次いで、全体的な同一性指標を使用するのではなく、そのＨＳＣを最大化することによって標的配列をヒト化して、複数の多様なヒト化バリアントが生成される（Ｌａｚａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４４：１９８６－９８（２００７））。
上記の方法に加えて、経験的方法を使用して、ヒト化抗体を生成及び選択することができる。これらの方法には、ヒト化バリアントの大規模なライブラリー生成、及び濃縮技術またはハイスループットスクリーニング技術を使用した最良クローンの選択に基づくものが含まれる。抗体バリアントは、ファージ、リボソーム、及び酵母ディスプレイライブラリーから、ならびに細菌コロニースクリーニングによって単離され得る（例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：１１０５－１６（２００５）；Ｄｕｆｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４：５２３－２９（２００６）；Ｆｅｌｄｈａｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：１６３－７０（２００３）；及びＳｃｈｌａｐｓｃｈｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．１７：８４７－６０（２００４）参照）。
ＦＲライブラリーアプローチでは、残基バリアントのコレクションをＦＲの特定の位置に導入し、続いて、ライブラリーをスクリーニングして、グラフトされたＣＤＲを最も良く支えるＦＲが選択される。置換される残基は、ＣＤＲ構造に寄与する可能性があると特定された「Ｖｅｒｎｉｅｒ」残基のいくつかもしくは全てを含み得（例えば、Ｆｏｏｔｅ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：４８７－９９（１９９２）参照）、またはＢａｃａ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１０６７８－８４（１９９７）によって特定されたより限定された標的残基セットから含み得る。
ＦＲシャッフリングでは、選択された残基バリアントのコンビナトリアルライブラリーを作製するのではなく、ＦＲ全体を非ヒトＣＤＲと組み合わせる（例えば、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：４３－６０（２００５）参照）。ワンステップのＦＲシャッフリングプロセスが使用されてもよい。そのようなプロセスは、得られる抗体が、発現の増大、親和性の増加、及び熱安定性を含む、生化学的及び物理化学的特性の改善を示すことから、効率的であることが示されている（例えば、Ｄａｍｓｃｈｒｏｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４４：３０４９－６０（２００７）参照）。
「ヒューマニアリング」法は、必須最小特異性決定基（ＭＳＤ）の実験的な特定に基づくものであり、ヒトＦＲのライブラリーへの非ヒト断片の逐次的置換及び結合の評価に基づく。この方法により、典型的には、エピトープが保持され、ヒトＶセグメントＣＤＲが異なる複数のサブクラスの抗体が特定される。
「ヒトエンジニアリング」法は、ヒトにおける免疫原性が減少しているが、それでもなお元の非ヒト抗体の所望の結合特性を保持している改変抗体を生成するように、抗体のアミノ酸配列に特定の変化をもたらすことによって、非ヒト抗体または抗体断片を改変することを伴う。一般に、この技術は、非ヒト抗体のアミノ酸残基を「低リスク」、「中リスク」、または「高リスク」残基として分類することを伴う。分類は、特定の置換を行うことにより、結果として得られる抗体の折り畳みにその置換が影響を及ぼすリスクに対して予想される利益（例えば、ヒトにおける免疫原性）を評価する、全体的なリスク／リワードの算出を使用して実施される。非ヒト抗体配列の所与の位置（例えば、低または中リスク）で置換される特定のヒトアミノ酸残基は、非ヒト抗体の可変領域に由来するアミノ酸配列を特定のヒト抗体配列またはコンセンサスヒト抗体配列の対応する領域と整列させることによって選択することができる。非ヒト配列中の低または中リスク位置にあるアミノ酸残基は、アライメントに従って、ヒト抗体配列中の対応する残基に置き換えることができる。ヒトエンジニアリングタンパク質を作製するための技術は、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７：８０５－１４（１９９４）；米国特許第５，７６６，８８６号；同第５，７７０，１９６号；同第５，８２１，１２３号；及び同第５，８６９，６１９号；ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ９３／１１７９４号に更に詳細に記載されている。
複合ヒト抗体は、例えば、Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（商標）技術（Ａｎｔｉｔｏｐｅ Ｌｔｄ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）を使用して生成することができる。複合ヒト抗体を生成するには、可変領域配列を、複数のヒト抗体可変領域配列の断片からＴ細胞エピトープを回避するように設計することから、得られる抗体の免疫原性が最小限になる。
脱免疫化抗体は、Ｔ細胞エピトープが除去された抗体である。脱免疫化抗体を作製するための方法は、記載されている。例えば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．５２５：４０５－２３（２００９），ｘｉｖ，ａｎｄ Ｄｅ Ｇｒｏｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４４：１４８－１５３（２００６））を参照されたい。脱免疫化抗体は、Ｔ細胞エピトープを除去した可変領域及びヒト定常領域を含む。簡潔に述べると、抗体の可変領域をクローニングし、その後、Ｔ細胞増殖アッセイで抗体の可変領域に由来する重複ペプチドを試験することによって、Ｔ細胞エピトープを特定する。Ｔ細胞エピトープは、ヒトＭＨＣクラスＩＩに結合するペプチドを特定するｉｎ ｓｉｌｉｃｏ法により特定される。可変領域に変異を導入して、ヒトＭＨＣクラスＩＩへの結合を無効にする。次いで、変異させた可変領域を利用して脱免疫化抗体を生成する。
５．２．６．単一ドメイン抗体の調製
本明細書で提供される単一ドメイン抗体（ＶＨＨなど）は、当該技術分野において知られている方法を使用して、例えば、ラクダ科の種（ラクダまたはラマなど）を免疫化してそこからハイブリドーマを得ることによって、または当該技術分野において知られている分子生物学技術を使用して単一ドメイン抗体のライブラリーをクローニングした後に未選択ライブラリーの個々のクローンを用いたＥＬＩＳＡによって選択することによって、またはファージディスプレイを使用して得ることができる。例えば、単一ドメイン抗体を調製する方法は、例えば、Ｅｌｓ Ｐａｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ，９（３）：６７４（２０１４）に記載されている。
本明細書で提供される単一ドメイン抗体は、単一ドメイン抗体をコードする核酸を含有するベクターで形質転換またはトランスフェクトした細胞を培養することによって産生され得る。本開示の抗体のポリペプチド成分をコードするポリヌクレオチド配列は、標準的な組み換え技術を使用して得ることができる。所望のポリヌクレオチド配列は、ハイブリドーマ細胞またはＢ細胞などの抗体産生細胞から単離され、配列決定され得る。あるいは、ポリヌクレオチドは、ヌクレオチドシンセサイザーまたはＰＣＲ技術を使用して合成することができる。ポリペプチドをコードする配列が得られたら、宿主細胞中で異種ポリヌクレオチドを複製及び発現することが可能な組み換えベクターに挿入する。当該技術分野において利用可能であり、かつ知られている多くのベクターを本開示の目的に使用することができる。適切なベクターの選択は、主に、ベクターに挿入される核酸の大きさ、及びベクターで形質転換される特定の宿主細胞に依存する。本開示の抗体の発現に好適な宿主細胞には、グラム陰性もしくはグラム陽性生物を含むＡｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ及びＥｕｂａｃｔｅｒｉａなどの原核生物、糸状菌もしくは酵母菌などの真核微生物、昆虫などの無脊椎動物細胞、または植物細胞、及び哺乳動物の宿主細胞株などの脊椎動物細胞が含まれる。宿主細胞を上記の発現ベクターで形質転換し、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、または所望の配列をコードする遺伝子の増幅のために適宜改変された従来の栄養培地中で培養する。宿主細胞によって産生される抗体は、当該技術分野において知られている標準的なタンパク質精製方法を使用して精製される。
ベクターの構築、発現、及び精製を含む抗体産生のための方法は、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ：Ｆｒｏｍ ＰＣＲ ｔｏ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ２０３－５２（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，１９９６）；Ｋｗｏｎｇ ａｎｄ Ｒａｄｅｒ，Ｅ．ｃｏｌｉ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆａｂ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ，ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００９）；Ｔａｃｈｉｂａｎａ ａｎｄ Ｔａｋｅｋｏｓｈｉ，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆａｂ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，ｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ（Ａｌ－Ｒｕｂｅａｉ ｅｄ．，２０１１）；及びＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｆｒｏｍ Ｂｅｎｃｈ ｔｏ Ｃｌｉｎｉｃ（Ａｎ ｅｄ．，２００９）に更に記載されている。
当然のことながら、当該技術分野においてよく知られている代替的な方法を採用して抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体が調製され得ることも企図される。例えば、固相技術を使用する直接ペプチド合成によって、適切なアミノ酸配列またはその部分が生成されてもよい（例えば、Ｓｔｅｗａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｏｌｉｄ－Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（１９６９）；及びＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９－５４（１９６３）参照）。ｉｎ ｖｉｔｒｏタンパク質合成を手動技術または自動化によって実施してもよい。抗ＧＵＣＹ２Ｃ抗体の様々な部分を個別に化学合成し、化学的または酵素的な方法を使用して結合することで、所望の抗ＧＵＣＹ２Ｃ抗体を生成することもできる。あるいは、例えば、米国特許第５，５４５，８０７号及び同第５，８２７，６９０号に開示されるように、抗体を発現するように遺伝子操作されたトランスジェニック動物の細胞または乳などの体液から抗体を精製してもよい。
具体的には、本明細書で提供される単一ドメイン抗体または他のＧＵＣＹ２Ｃ結合剤は、ラマを免疫化し、単一Ｂ細胞選別を実施し、Ｖ遺伝子抽出を行い、ＶＨＨ－Ｆｃ融合体などのＧＵＣＹ２Ｃ結合剤をクローニングし、次いで、小規模の発現及び精製を実施することによって生成することができる。単一ドメイン抗体及びＧＵＣＹ２Ｃに結合する他の分子の追加のスクリーニングを実施することもでき、例えば、ＥＬＩＳＡ陽性、ＢＬＩ陽性、及び１００ｎＭ未満のＫＤの選択のうちの１つ以上を含む。これらの選択基準は、以下のセクション６に記載されるように組み合わせることができる。更に、個々のＶＨＨ結合剤（及びＧＵＣＹ２Ｃに結合する他の分子）は、ＧＵＣＹ２Ｃを発現する細胞に結合する能力についてアッセイすることができる。そのようなアッセイは、ＧＵＣＹ２Ｃを発現する細胞を用いたＦＡＣＳ解析を使用し、蛍光標識したＶＨＨ分子の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を測定することによって行うことができる。上述の様々な態様が、以下により詳細に記載される。
ポリクローナル抗体は、一般に、関連抗原及びアジュバントの皮下（ｓｃ）注射または腹腔内（ｉｐ）注射を複数回行うことによって、動物内で産生される。関連抗原の、免疫化する種において免疫原性であるタンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、血清アルブミン、ウシサイログロブリンまたはダイズトリプシン阻害剤へのコンジュゲートは、二官能性または誘導体化剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介したコンジュゲーション）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を介する）、グルタルアルデヒド、コハク酸無水物、ＳＯＣｌ２、またはＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（式中、Ｒ及びＲ１は独立して低級アルキル基である）を使用して行うことが有用であり得る。採用され得るアジュバントの例としては、フロイント完全アジュバント及びＭＰＬ－ＴＤＭアジュバント（モノホスホリルリピドＡ、合成トレハロースジコリノミコール酸エステル）が挙げられる。当業者であれば、過度な実験をすることなく、免疫化プロトコルを選択することができる。
例えば、抗原、免疫原性コンジュゲート、または誘導体に対する動物の免疫化は、例えば、１００μｇまたは５μｇのタンパク質またはコンジュゲート（それぞれ、ウサギまたはマウスの場合）を３倍量のフロイント完全アジュバントと合わせ、この溶液を複数部位に皮内注射することによってなされる。１ヶ月後、フロイント完全アジュバント中のペプチドまたはコンジュゲートの元の量の１／５～１／１０を複数部位に皮下注射することによって動物に追加免疫を行う。７～１４日後、動物から採血し、血清の抗体力価をアッセイする。力価が安定状態に達するまで、動物に追加免疫が行われる。コンジュゲートはまた、組み換え細胞培養でタンパク質融合体として作製することもできる。また、ミョウバンなどの凝集剤も免疫応答を高めるのに好適である。
モノクローナル抗体は、実質的に均質な抗体集団から得られるものであり、すなわち、その集団に含まれる個々の抗体は、微量で存在し得る可能性のある天然変異及び／または翻訳後修飾（例えば、異性化、アミド化）を除き、同一である。したがって、「モノクローナル」という修飾語は、異なる抗体の混合物ではない抗体の特徴を示す。例えば、モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）に最初に記載されたハイブリドーマ法を使用して作製されてもよいし、組み換えＤＮＡ法（米国特許第４，８１６，５６７号）によって作製されてもよい。
ハイブリドーマ法では、適切な宿主動物を免疫化することで、免疫化に使用されたタンパク質に特異的に結合する抗体を産生するまたは産生することが可能なリンパ球が誘発される。あるいは、リンパ球は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫化されてもよい。リンパ球は、次いで、ポリエチレングリコールなどの好適な融合剤を使用してミエローマ細胞と融合され、ハイブリドーマ細胞が形成される（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９－１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８６）。
免疫剤は、典型的に、抗原性タンパク質またはその融合バリアントを含む。Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８６），ｐｐ．５９－１０３。不死化細胞株は、通常、形質転換された哺乳動物細胞である。このように調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親骨髄腫細胞の成長または生存を阻害する１つ以上の物質を好ましくは含有する好適な培養培地に播種し、成長させる。好ましい不死化骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による安定した高レベルの抗体産生を支援し、ＨＡＴ培地などの培地に感受性を示すものである。
ハイブリドーマ細胞が成長している培地を、抗原に指向するモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。ハイブリドーマ細胞を培養している培養培地は、所望の抗原に対するモノクローナル抗体の存在についてアッセイすることができる。そのような技術及びアッセイは、当該技術分野において知られている。例えば、結合親和性は、Ｍｕｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０）のスキャッチャード分析によって決定され得る。
所望の特異性、親和性及び／または活性を有する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を特定した後、クローンを限界希釈法によってサブクローニングし、標準的な方法によって成長させることができる（Ｇｏｄｉｎｇ、上掲）。この目的に好適な培養培地としては、例えば、Ｄ－ＭＥＭまたはＲＰＭＩ－１６４０培地が挙げられる。加えて、ハイブリドーマ細胞は、哺乳動物の腫瘍としてｉｎ ｖｉｖｏで成長させてもよい。
サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、従来の免疫グロブリン精製手順、例えば、プロテインＡ－セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーによって、培養培地、腹水または血清から好適に分離される。
モノクローナル抗体はまた、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されるもの及び上に記載されるものなどの組み換えＤＮＡ法によって作製され得る。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することが可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用して）、容易に単離され配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい供給源として機能する。ＤＮＡが単離されたら、そのＤＮＡを発現ベクターに配置し、次いで、これを、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または免疫グロブリンタンパク質を別様に産生しない骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトして、このような組み換え宿主細胞中でモノクローナル抗体を合成することができる。抗体をコードするＤＮＡの細菌中での組み換え発現についての概説記事は、Ｓｋｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５：２５６－２６２（１９９３）及びＰｌｉｉｃｋｔｈｕｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖｓ．１３０：１５１－１８８（１９９２）に含まれている。
更なる実施形態において、抗体は、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２－５５４（１９９０）、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４－６２８（１９９１）及びＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１－５９７（１９９１）に記載される技術を使用して生成される抗体ファージライブラリーから単離することができる。後続の刊行物は、鎖シャフリングによる高親和性（ｎＭ範囲）のヒト抗体の産生（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９－７８３（１９９２））、ならびに非常に大きいファージライブラリーを構築するための戦略としてのコンビナトリアル感染及びｉｎ ｖｉｖｏ組み換え（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２１：２２６５－２２６６（１９９３））について記載している。したがって、これらの技法は、モノクローナル抗体を単離するための従来のモノクローナル抗体ハイブリドーマ技法の実行可能な代替案である。
ＤＮＡはまた、例えば、コーディング配列を置換することによって（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１（１９８４））、または非免疫グロブリンポリペプチドのコーディング配列の全てもしくは一部をコーディング配列に共有結合させることによって、改変することができる。そのような非免疫グロブリンポリペプチドは、ある抗原に対して特異性を有する１つの抗原結合部位と、異なる抗原に対して特異性を有する別の抗原結合部位とを含むキメラ二価抗体を作製するように置換され得る。
キメラまたはハイブリッド抗体もまた、架橋剤を必要とするものを含め、合成タンパク質化学において知られている方法を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで調製されてもよい。例えば、ジスルフィド交換反応を使用して、またはチオエーテル結合を形成することによって、免疫毒素を構築してもよい。この目的に好適な試薬の例としては、イミノチオレート及びメチル－４－メルカプトブチルイミデートが挙げられる。
真核生物での発現の場合、ベクター成分には、一般に、次のもの：シグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、及び転写終結配列のうちの１つ以上が含まれるが、これらに限定されない。
真核生物の宿主で使用するためのベクターには、成熟タンパク質もしくはポリペプチドのＮ末端に特異的な切断部位を有するシグナル配列または他のポリペプチドをコードするインサートも含まれ得る。選択される異種シグナル配列は、好ましくは、宿主細胞によって認識され、プロセシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものであり得る。哺乳動物細胞の発現では、哺乳動物のシグナル配列及びウイルス分泌リーダー、例えば、単純ヘルペスｇＤシグナルが利用可能である。そのような前駆体領域のＤＮＡは、リーディングフレーム内で、本出願の抗体をコードするＤＮＡにライゲーションすることができる。
一般に、哺乳動物発現ベクターには、複製起点成分は必要ない（ＳＶ４０起点は、典型的に、初期プロモーターを含有するという理由でのみ、使用され得る）。
発現及びクローニングベクターは、選択マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含有し得る。選択遺伝子は、抗生物質もしくは他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサートもしくはテトラサイクリンに対する耐性を付与するタンパク質、栄養要求性欠損を補うタンパク質、または複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
選択スキームの一例は、宿主細胞の成長を停止するための薬物を利用する。異種遺伝子での形質転換に成功した細胞は、薬剤耐性を付与するタンパク質を産生するため、選択レジメンを生き延びる。そのような優性選択の例は、ネオマイシン、ミコフェノール酸及びハイグロマイシンの薬物を使用する。
哺乳動物細胞に好適な選択マーカーの別の例は、本出願の抗体をコードする核酸を取り込む能力のある細胞を特定可能にするものである。例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子で形質転換された細胞は、まず、その全ての形質転換体を、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニストであるメトトレキサート（Ｍｔｘ）を含有する培養培地中で培養することによって特定される。野生型ＤＨＦＲが採用される場合、例示的な適切な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性が欠損したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株である。あるいは、ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、野生型ＤＨＦＲタンパク質、及びアミノグリコシド３’－ホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）などの別の選択マーカーを用いて形質転換または同時形質転換された宿主細胞（特に、内因性ＤＨＦＲを含有する野生型宿主）は、アミノグリコシド系抗生物質などの選択マーカーに適した選択剤を含有する培地中で細胞を成長させることによって選択することができる。
発現ベクター及びクローニングベクターは、通常、宿主生物によって認識され、所望のポリペプチド配列をコードする核酸に操作可能に連結されたプロモーターを含有する。真核細胞遺伝子は、転写が開始される部位からおよそ２５～３０塩基上流に位置するＡＴリッチ領域を有する。多くの遺伝子の転写開始点から７０～８０塩基上流に見られる別の配列が含まれもよい。ほとんどの真核細胞の３’末端は、コーディング配列の３’末端にポリＡテールを付加するためのシグナルであり得る。これらの配列は全て、真核生物の発現ベクター中に挿入され得る。
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからのポリペプチド転写は、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２など）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、及びシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから得られるプロモーター、異種哺乳動物のプロモーター、例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーターから得られるプロモーター、ヒートショックプロモーターから得られるプロモーターによって制御することができるが、そのようなプロモーターが宿主細胞系に適合することを条件とする。
高等真核細胞による、本開示の抗体をコードするＤＮＡの転写は、多くの場合、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増加する。現在、哺乳動物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α－フェトプロテイン及びインスリン）に由来する多くのエンハンサー配列が知られている。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００～２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。真核生物プロモーターを活性化するための要素の増大については、Ｙａｎｉｖ，Ｎａｔｕｒｅ ２９７：１７－１８（１９８２）も参照されたい。エンハンサーは、ポリペプチドコード配列に対して５’側または３’側の位置でベクターにスプライスされ得るが、好ましくは、プロモーターから５’側の位置に置かれる。
真核生物の宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒトまたは他の多細胞生物に由来する有核細胞）に使用される発現ベクターは、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含有する。そのような配列は、真核生物またはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’非翻訳領域、場合により３’非翻訳領域から一般に入手可能である。これらの領域は、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化フラグメントとして転写されるヌクレオチドセグメントを含有する。１つの有用な転写終結成分は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。
本明細書のベクター中のＤＮＡのクローニングまたは発現に好適な宿主細胞は、脊椎動物宿主細胞を含む、本明細書に記載される高等真核細胞を含む。脊椎動物細胞の培養（組織培養）における増殖は、常法の手順となっている。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０により形質転換したサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胎児腎細胞株（２９３細胞または浮遊培養での成長のためにサブクローニングされた２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））；ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／－ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３－２５１（１９８０））；サル腎細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲ１ 細胞（Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４－６８（１９８２））；ＭＲＣ ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒトヘパトーマ株（Ｈｅｐ Ｇ２）である。
宿主細胞は、抗体産生のための上記の発現ベクターまたはクローニングベクターで形質転換され、プロモーターの誘導、形質転換体の選択または所望の配列をコードする遺伝子の増幅に適切に改変された従来の栄養培地中で培養される。
本出願の抗体の産生に使用される宿主細胞は、様々な培地中で培養することができる。Ｈａｍ’ｓ Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ－１６４０（Ｓｉｇｍａ）、及びダルベッコ改変イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）などの市販の培地が、宿主細胞の培養に好適である。加えて、Ｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９）、Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０）、米国特許第４，７６７，７０４号；同第４，６５７，８６６号；同第４，９２７，７６２号；同第４，５６０，６５５号；もしくは同第５，１２２，４６９号；ＷＯ９０／０３４３０；ＷＯ８７／００１９５；または米国再発行特許第３０，９８５号に記載されている培地のいずれかを宿主細胞の培養培地として使用してもよい。これらの培地のいずれも、必要に応じて、ホルモン及び／または他の成長因子（インスリン、トランスフェリンまたは上皮成長因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩など）、緩衝剤（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシン及びチミジンなど）、抗生物質（ゲンタマイシン（商標）剤など）、微量元素（マイクロモル範囲の最終濃度で通常存在する無機化合物として定義される）ならびにグルコースまたは同等のエネルギー源が添加され得る。任意の他の必要な添加物も、当業者に知られているであろう適切な濃度で含めることができる。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞で以前から使用されているものであり、当業者に明らかであろう。
組み換え技術を使用する場合、抗体は、ペリプラズム中に細胞内産生され得るか、または培地中に直接分泌され得る。抗体が細胞内で産生される場合、第１ステップとして、宿主細胞または溶解断片のいずれかである粒子状デブリを、例えば、遠心分離または限外濾過によって除去する。抗体が培地中に分泌される場合、一般に、かかる発現系の上清を、まず、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを使用して濃縮する。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を前述のステップのいずれかで含めてタンパク質分解を阻害してもよく、抗生物質を含めて偶発的な汚染物質の成長を防いでもよい。
細胞から調製されたタンパク質組成物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及び親和性クロマトグラフィーを使用して精製することができ、親和性クロマトグラフィーが典型的に好ましい精製技術である。親和性リガンドが結合するマトリックスは、アガロースであることが多いが、他のマトリックスも利用可能である。制御された多孔質ガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定したマトリックスでは、アガロースで達成できる場合よりも、流速を速くし、かつ処理時間を短くすることができる。タンパク質精製のための他の技術、例えば、イオン交換カラム上での分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上でのクロマトグラフィー、ヘパリン上でのクロマトグラフィー陰イオンまたは陽イオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラムなど）上でのＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）クロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿もまた、回収される抗体に応じて利用可能である。任意の予備的な精製ステップ（複数可）の後、目的の抗体及び汚染物質を含む混合物を、低ｐＨの疎水性相互作用クロマトグラフィーに供してもよい。
本開示の抗体をコードするポリ核酸配列は、標準的な組み換え技術を使用して得ることができる。所望のポリ核酸配列は、ハイブリドーマ細胞などの抗体産生細胞から単離され、配列決定され得る。あるいは、ポリヌクレオチドは、ヌクレオチドシンセサイザーまたはＰＣＲ技術を使用して合成することができる。ポリペプチドをコードする配列が得られたら、原核生物宿主中で異種ポリヌクレオチドを複製及び発現することが可能な組み換えベクターに挿入する。当該技術分野において利用可能であり、かつ知られている多くのベクターを本開示の目的に使用することができる。適切なベクターの選択は、主に、ベクターに挿入される核酸の大きさ、及びベクターで形質転換される特定の宿主細胞に依存する。各ベクターは、その機能（異種ポリヌクレオチドの増幅もしくは発現、またはその両方）及びベクターが内在する特定の宿主細胞との適合性に応じて、様々な成分を含有する。ベクター成分は、一般に、複製起点、選択マーカー遺伝子、プロモーター、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、シグナル配列、異種核酸インサート及び転写終結配列が含まれるが、これらに限定されない。
一般に、宿主細胞と適合する種に由来するレプリコン及び制御配列を含有するプラスミドベクターがこれらの宿主に関連して使用される。ベクターは、通常、複製部位と、形質転換細胞において表現型選択をもたらすことが可能なマーキング配列を持つ。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉは、典型的に、Ｅ．ｃｏｌｉ種に由来するプラスミドであるｐＢＲ３２２を使用して形質転換される。特定の抗体の発現に使用されるｐＢＲ３２２誘導体の例は、Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．の米国特許第５，６４８，２３７号に詳述されている。
加えて、宿主微生物と適合するレプリコン及び制御配列を含有するファージベクターがこれらの宿主に関連して形質転換ベクターとして使用される。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＬＥ３９２などの感受性宿主細胞を形質転換するのに使用することができる組み換えベクターを作製するには、ＧＥＭ（商標）－１１などのバクテリオファージが利用され得る。
本出願の発現ベクターは、各ポリペプチド成分をコードする、２つ以上のプロモーター－シストロンペアを含み得る。プロモーターは、シストロンの上流（５′）に位置する非翻訳制御配列であり、シストロン発現を調節する。原核生物プロモーターは、典型的に、誘導性と構成的の２つのクラスに分類される。誘導性プロモーターは、培養条件の変化、例えば、栄養素の有無または温度変化に応答して、その制御下で、増加したレベルのシストロン転写を開始するプロモーターである。
候補となる様々な宿主細胞によって認識されるプロモーターは、多数知られている。選択されたプロモーターは、元となるＤＮＡから制限酵素消化によりプロモーターを除去し、単離されたプロモーター配列を本出願のベクターに挿入することによって、本抗体をコードするシストロンＤＮＡに操作可能に連結することができる。標的遺伝子の増幅及び／または発現をもたらすには、天然プロモーター配列及び多くの異種プロモーターのどちらを使用してもよい。いくつかの実施形態において、一般に、天然の標的ポリペプチドプロモーターと比較して、発現される標的遺伝子のより大きな転写及びより高い収率が可能となることから、異種プロモーターが利用される。
原核生物宿主との使用に好適なプロモーターには、ＰｈｏＡプロモーター、－ガラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、ならびにｔａｃまたはｔｒｃプロモーターなどのハイブリッドプロモーターが含まれる。しかしながら、細菌において機能する他のプロモーター（他の既知の細菌またはファージプロモーターなど）も同様に好適である。これらの核酸配列は公開されているので、当業者であれば、任意の必要な制限部位を供給するリンカーまたはアダプターを使用して、標的ペプチドをコードするシストロンに当該配列を操作可能にライゲートすることが可能である（Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ２０：２６９（１９８０））。
一態様において、組み換えベクター内の各シストロンは、発現されたポリペプチドが膜を通過して輸送されることを指示する分泌シグナル配列成分を含む。一般に、シグナル配列は、ベクターの成分であってもよいし、ベクターに挿入される標的ポリペプチドＤＮＡの一部であってもよい。本発明の目的のために選択されるシグナル配列は、宿主細胞によって認識され、プロセシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものである必要がある。異種ポリペプチドに天然に存在するシグナル配列を認識し、プロセシングしない原核生物宿主細胞の場合、当該シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ｉｐｐ、または熱安定性エンテロトキシンＩＩ（ＳＴＩＩ）リーダー、ＬａｍＢ、ＰｈｏＥ、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡ及びＭＢＰからなる群から選択される原核生物シグナル配列に置き換えることができる。
いくつかの実施形態において、本開示による抗体の産生は、宿主細胞の細胞質内で起こり得るため、各シストロン内に分泌シグナル配列が存在する必要はない。ある特定の宿主株（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ｔｒｘＢ－株）は、ジスルフィド結合形成に有利な細胞質条件を提供することから、発現されるタンパク質サブユニットの適切な折り畳み及び組み立てが可能となる。
本開示の抗体の発現に好適な原核生物宿主細胞には、グラム陰性またはグラム陽性生物などのＡｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ及びＥｕｂａｃｔｅｒｉａが含まれる。有用な細菌の例としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｂａｃｉｌｌｉ（例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種（例えば、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｒｈｉｚｏｂｉａ、Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ、またはＰａｒａｃｏｃｃｕｓが挙げられる。いくつかの実施形態において、グラム陰性細胞が使用される。一実施形態において、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞が宿主として使用される。Ｅ．ｃｏｌｉ株の例としては、Ｗ３１１０株（Ｂａｃｈｍａｎｎ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９８７），ｐｐ．１１９０－１２１９；ＡＴＣＣ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｎｏ．２７，３２５）及びその誘導体、例えば、遺伝子型Ｗ３１１０ ＡｆｈｕＡ（ＡｔｏｎＡ）ｐｔｒ３ ｌａｃ Ｉｑ ｌａｃＬ８ ＡｏｍｐＴ Ａ（ｎｍｐｃ－ｆｅｐＥ）ｄｅｇＰ４１ ｋａｎＲを有する３３Ｄ３株（米国特許第５，６３９，６３５号）が挙げられる。Ｅ．ｃｏｌｉ ２９４（ＡＴＣＣ ３１，４４６）、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ １７７６（ＡＴＣＣ ３１，５３７）及びＥ．ｃｏｌｉ ＲＶ３０８（ＡＴＣＣ ３１，６０８）などの他の株及びその誘導体も好適である。これらの例は、限定的なものではなく、例示的なものである。定義された遺伝子型を有する上述の細菌のいずれかの誘導体を構築するための方法は、当該技術分野において知られており、例えば、Ｂａｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，８：３０９－３１４（１９９０）に記載されている。一般に、細菌の細胞内におけるレプリコンの複製性を考慮して、適切な細菌を選択する必要がある。例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１７７、またはｐＫＮ４１０などのよく知られているプラスミドを使用してレプリコンを供給する場合、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、またはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ種を宿主として好適に使用することができる。
典型的に、宿主細胞は、最小量のタンパク質分解酵素を分泌するはずであるが、追加のプロテアーゼ阻害剤を望ましくは細胞培養に組み込むことができる。
宿主細胞を上記の発現ベクターで形質転換し、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、または所望の配列をコードする遺伝子の増幅のために適宜改変された従来の栄養培地中で培養する。形質転換とは、ＤＮＡを原核生物宿主に組み込むことを意味し、これにより、染色体外要素として、または染色体組み込み体によって、ＤＮＡが複製可能となる。形質転換は、使用される宿主細胞に応じて、かかる細胞に適した標準的な技術を使用して行われる。塩化カルシウムを採用するカルシウム処理は、一般に、強固な細胞壁バリアを含有する細菌細胞に使用される。形質転換の別の方法は、ポリエチレングリコール／ＤＭＳＯを採用する。使用される更に別の技術は、エレクトロポレーションである。
本出願の抗体の産生に使用される原核細胞は、当該技術分野において知られている、選択された宿主細胞の培養に好適な培地中で成長させる。好適な培地の例は、必要な栄養添加物を加えたルリアブロス（ＬＢ）である。いくつかの実施形態において、培地はまた、発現ベクターを含有する原核細胞の成長を選択的に可能にするために、発現ベクターの構築に基づいて選択される選択剤も含有する。例えば、アンピシリン耐性遺伝子を発現する細胞の成長には、アンピシリンが培地に追加される。
炭素、窒素、及び無機リン酸の供給源以外の任意の必要な添加物もまた、単独で、または複合窒素源などの別の添加物もしくは培地とともに導入され、適切な濃度で含まれ得る。任意選択により、培養培地は、グルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコール酸、ジチオエリトリトール及びジチオスレイトールからなる群から選択される１つ以上の還元剤を含有し得る。原核生物宿主細胞は、好適な温度及びｐＨで培養される。
誘導性プロモーターが本出願の発現ベクターに使用される場合、タンパク質発現は、プロモーターの活性化に好適な条件下で誘導される。本出願の一態様において、ポリペプチドの転写を制御するために、ＰｈｏＡプロモーターが使用される。したがって、形質転換された宿主細胞は、誘導のためにリン酸制限培地で培養される。好ましくは、リン酸制限培地は、Ｃ．Ｒ．Ａ．Ｐ培地である（例えば、Ｓｉｍｍｏｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２６３：１３３－１４７（２００２）参照）。当該技術分野において知られているように、採用されるベクターコンストラクトに従って、他の様々な誘導物質が使用され得る。
本開示の発現抗体は、宿主細胞のペリプラズムに分泌され、そこから回収される。タンパク質の回収は、典型的には、一般に、浸透圧ショック、超音波処理または溶解などの手段によって、微生物を破壊することを伴う。細胞が破壊されたら、遠心分離または濾過によって、細胞デブリまたは全細胞を除去する。タンパク質は、例えば、親和性樹脂クロマトグラフィーによって、更に精製される。あるいは、タンパク質を培養培地に移し、そこで単離してもよい。培地から細胞を取り出し、産生されたタンパク質の更なる精製のために、培養上清を濾過し、濃縮することができる。発現されたポリペプチドは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）及びウェスタンブロットアッセイなどの一般に知られている方法を使用して、更に単離し、特定することができる。
あるいは、タンパク質産生は、発酵プロセスによって大量に行われる。組み換えタンパク質の産生には、様々な大規模流加発酵手順が利用可能である。本開示の抗体の産生収率及び品質を向上させるために、様々な発酵条件を変更することができる。例えば、シャペロンタンパク質は、細菌宿主細胞で産生される異種タンパク質の適切な折り畳み及び可溶性を促進することが示されている。Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏ Ｃｈｅｍ ２７４：１９６０１－１９６０５（１９９９）；米国特許第６，０８３，７１５号；米国特許第６，０２７，８８８号；Ｂｏｔｈｍａｎｎ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１７１００－１７１０５（２０００）；Ｒａｍｍ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１７１０６－１７１１３（２０００）；Ａｒｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３９：１９９－２１０（２００１）。
発現された異種タンパク質（特にタンパク質分解感受性であるもの）のタンパク質分解を最小限に抑えるために、例えば、米国特許第５，２６４，３６５号；米国特許第５，５０８，１９２号；Ｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，２：６３－７２（１９９６）に記載されているように、タンパク質分解酵素が欠損した特定の宿主株を本発明に使用することができる。本出願の抗体をコードする発現系において、タンパク質分解酵素が欠損し、１つ以上のシャペロンタンパク質を過剰発現するプラスミドで形質転換したＥ．ｃｏｌｉ株が、宿主細胞として使用され得る。
本明細書で産生される抗体は、更なるアッセイ及び使用のために、更に精製して、実質的に均質である調製物を得ることができる。当該技術分野において知られている標準的なタンパク質精製法を採用することができる。以下の手順は、好適な精製手順の例示である：免疫親和性またはイオン交換カラム上での分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上またはＤＥＡＥなどの陽イオン交換樹脂上でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈殿、及びゲル濾過、例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－７５を使用するもの。例えば、いくつかの実施形態において、固相上に固定化したプロテインＡを本開示の結合分子の免疫親和性精製に使用することができる。プロテインＡが固定化される固相は、好ましくは、ガラスまたはシリカ表面を含むカラムであり、より好ましくは、制御細孔ガラスカラムまたはケイ酸カラムである。いくつかの実施形態において、カラムは、汚染物質の非特異的な付着を防止するために、グリセロールなどの試薬でコーティングされている。次いで、固相は、固相に非特異的に結合した汚染物質を除去するために洗浄される。最後に、溶出により、目的の抗体を固相から回収する。
５．２．７．単一ドメイン抗体を含む結合分子
別の態様において、本明細書で提供されるのは、本明細書で提供される単一ドメイン抗体（例えば、ＧＵＣＹ２Ｃに対するＶＨＨドメイン）を含む、結合分子である。以下のセクション５．３に記載されるように、本明細書で提供されるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に加えて、いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＧＵＣＹ２Ｃに対する単一ドメイン抗体は、他の結合分子の一部である。融合タンパク質及びイムノコンジュゲートなどの本開示の例示的な結合分子が本明細書に記載される。
種々の実施形態において、本明細書で提供される単一ドメイン抗体は、別の薬剤、例えば、タンパク質ベースの実体に遺伝子的に融合されるか、または化学的にコンジュゲートされ得る。単一ドメイン抗体は、薬剤に化学的にコンジュゲートされるか、または別様に薬剤に非共有結合的にコンジュゲートされ得る。薬剤は、ペプチドまたは抗体（またはその断片）であり得る。
したがって、いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、異種由来のタンパク質またはポリペプチド（またはその断片、例えば、約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１５０、約２００、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０もしくは約５００アミノ酸、または５００アミノ酸を超えるポリペプチド）に、融合タンパク質を生成するように組み換え的に融合されたまたは化学的にコンジュゲートされた（共有結合的または非共有結合的コンジュゲーション）単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨＨドメイン）、及びその使用である。特に、本明細書で提供されるのは、本明細書で提供される単一ドメイン抗体の抗原結合断片（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／またはＣＤＲ３）と、異種由来のタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドとを含む、融合タンパク質である。
更に、本明細書で提供される抗体は、精製を容易にするために、ペプチドなどのマーカーまたは「タグ」配列に融合することができる。具体的な実施形態において、マーカーまたはタグアミノ酸配列は、ヘキサヒスチジンペプチド、ヘマグルチニン（「ＨＡ」）タグ、及び「ＦＬＡＧ」タグである。
抗体に部分（ポリペプチドを含む）を融合またはコンジュゲートするための方法は、知られている（例えば、Ａｒｎｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２４３－５６（Ｒｅｉｓｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｉｎ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ６２３－５３（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，２ｄ ｅｄ．１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ，ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ４７５－５０６（Ｐｉｎｃｈｅｒａ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，１９８５）；Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ ３０３－１６（Ｂａｌｄｗｉｎ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，１９８５）；Ｔｈｏｒｐｅ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９－５８（１９８２）；米国特許第５，３３６，６０３号；同第５，６２２，９２９号；同第５，３５９，０４６号；同第５，３４９，０５３号；同第５，４４７，８５１号；同第５，７２３，１２５号；同第５，７８３，１８１号；同第５，９０８，６２６号；同第５，８４４，０９５号；及び同第５，１１２，９４６号；ＥＰ３０７，４３４；ＥＰ３６７，１６６；ＥＰ３９４，８２７；ＰＣＴ公開ＷＯ９１／０６５７０、ＷＯ９６／０４３８８、ＷＯ９６／２２０２４、ＷＯ９７／３４６３１、及びＷＯ９９／０４８１３；Ａｓｈｋｅｎａｚｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：１０５３５－３９（１９９１）；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３１：８４－８６（１９８８）；Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５５９０－６００（１９９５）；ならびにＶｉｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１１３３７－４１（１９９２）参照）。
融合タンパク質は、例えば、遺伝子シャッフリング、モチーフシャッフリング、エクソンシャッフリング、及び／またはコドンシャッフリング（「ＤＮＡシャッフリング」と総称される）の技術により生成され得る。ＤＮＡシャッフリングは、例えば、より高い親和性及びより低い解離速度の抗体を含む、本明細書で提供される単一ドメイン抗体の活性を改変するために採用され得る（例えば、米国特許第５，６０５，７９３号；同第５，８１１，２３８号；同第５，８３０，７２１号；同第５，８３４，２５２号；及び同第５，８３７，４５８号；Ｐａｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：７２４－３３（１９９７）；Ｈａｒａｙａｍａ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（２）：７６－８２（１９９８）；Ｈａｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８７：２６５－７６（１９９９）；ならびにＬｏｒｅｎｚｏ ａｎｄ Ｂｌａｓｃｏ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４（２）：３０８－１３（１９９８）参照）。抗体、またはコードされた抗体は、組み換え前に、エラープローンＰＣＲ、ランダムヌクレオチド挿入、または他の方法によるランダム変異導入を行うことによって、改変され得る。本明細書で提供される抗体をコードするポリヌクレオチドは、１つ以上の異種分子の１つ以上の成分、モチーフ、セクション、部分、ドメイン、断片などと組み換えられてもよい。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨＨドメイン）は、第２の抗体にコンジュゲートされて、抗体ヘテロコンジュゲートを形成する。
種々の実施形態において、単一ドメイン抗体は、薬剤に遺伝的に融合される。遺伝子融合は、単一ドメイン抗体と薬剤との間にリンカー（例えば、ポリペプチド）を配置することによって達成され得る。リンカーは、フレキシブルリンカーであり得る。
様々な実施形態において、単一ドメイン抗体は、治療分子に遺伝的にコンジュゲートされ、ヒンジ領域が単一ドメイン抗体を治療分子に連結している。
また、本明細書で提供されるのは、本明細書で提供される様々な融合タンパク質を作製するための方法である。上のセクション５．２．６に記載される様々な方法もまた、本明細書で提供される融合タンパク質を作製するために利用され得る。
具体的な一実施形態において、本明細書で提供される融合タンパク質は、組み換え発現される。本明細書で提供される融合タンパク質の組み換え発現は、タンパク質またはその断片をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築を必要とし得る。本明細書で提供されるタンパク質またはその断片をコードするポリヌクレオチドが得られたら、当該技術分野においてよく知られている技術を使用する組み換えＤＮＡ技術によって、分子を生産するベクターを生成することができる。したがって、ヌクレオチドコード配列を含有するポリヌクレオチドを発現させることによってタンパク質を調製するための方法が本明細書に記載される。当業者によく知られている方法を使用して、コーディング配列ならびに適切な転写及び翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組み換えＤＮＡ技術、合成技術、及びｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子組み換えが含まれる。また、プロモーターに操作可能に連結された、本明細書で提供される融合タンパク質、もしくはその断片、またはＣＤＲをコードするヌクレオチド配列を含む、複製可能ベクターも提供される。
発現ベクターは、従来の技術によって宿主細胞に移入することができ、次いで、トランスフェクトした細胞を従来の技術によって培養することで、本明細書で提供される融合タンパク質が生成される。したがって、異種プロモーターに操作可能に連結された、本明細書で提供される融合タンパク質またはその断片をコードするポリヌクレオチドを含有する宿主細胞もまた本明細書で提供される。
本明細書で提供される融合タンパク質を発現させるには、様々な宿主発現ベクター系を利用することができる。そのような宿主発現系は、目的のコーディング配列が生成され、その後、精製され得る担体を表すが、適切なヌクレオチドコード配列で形質転換またはトランスフェクトしたときに、本明細書で提供される融合タンパク質がｉｎ ｓｉｔｕで発現され得る細胞も表す。これらとしては、限定するものではないが、微生物、例えば、コーディング配列を含有する、組み換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、もしくはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ及びＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）；コーディング配列を含有する組み換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ Ｐｉｃｈｉａ）；コーディング配列を含有する組み換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；コーディング配列を含有する、組み換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ、タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染したもしくは組み換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系；または哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーター（例えばメタロチオネインプロモーター）もしくは哺乳動物ウイルス由来のプロモーター（例えばアデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含有する組み換え発現コンストラクトを保有する哺乳動物細胞系（例えばＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、ＮＳ０、及び３Ｔ３細胞）が挙げられる。組み換え融合タンパク質の発現には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉなどの細菌細胞、または特に組み換え抗体分子全体の発現には、真核細胞を使用することができる。例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）などの哺乳動物細胞は、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要中間初期遺伝子プロモーター要素などのベクターとあわせて、抗体またはそのバリアントに効果的な発現系である。具体的な一実施形態において、本明細書で提供される融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現は、構成的プロモーター、誘導性プロモーターまたは組織特異的プロモーターによって制御される。
細菌系では、発現される融合タンパク質の意図された用途に応じて、いくつかの発現ベクターが有利に選択され得る。例えば、融合タンパク質の医薬組成物を生成するために、そのような融合タンパク質を大量に産生する場合、容易に精製される融合タンパク質産物を高レベルに発現することを誘導するベクターが望ましい場合がある。そのようなベクターには、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ １２：１７９１（１９８３））（融合タンパク質が産生されるように、コーディング配列をｌａｃ Ｚコーディング領域とともにインフレームでベクターに個々にライゲートすることができる）；ｐＩＮ ベクター（Ｉｎｏｕｙｅ ＆ Ｉｎｏｕｙｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：３１０１－３１０９（１９８５）；Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ ＆ Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：５５０３－５５０９（１９８９））などが含まれるが、これらに限定されない。ｐＧＥＸベクターもまた、グルタチオン５－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として、外来ポリペプチドを発現するために使用され得る。一般に、そのような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオンアガロースビーズのマトリックスに吸着及び結合させ、続いて、遊離グルタチオンの存在下で溶出することによって、溶解細胞から容易に精製することができる。ｐＧＥＸベクターは、トロンビンまたは第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計され、それにより、クローニングされた標的遺伝子産物がＧＳＴ部分から放出され得る。
哺乳動物宿主細胞では、いくつかのウイルスベースの発現系が利用され得る。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合、目的のコーディング配列は、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば、後期プロモーター及び三成分リーダー配列にライゲートされ得る。次いで、このキメラ遺伝子をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ組み換えによって、アデノウイルスゲノムに挿入することができる。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、領域ＥｌまたはＥ３）に挿入すると、感染宿主内で生存し、融合タンパク質を発現することが可能な組み換えウイルスが得られる（例えば、Ｌｏｇａｎ ＆ Ｓｈｅｎｋ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８ １：３５５－３５９（１９８４）参照）。挿入したコーディング配列の効率的な翻訳には、特定の開始シグナルも必要な場合がある。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドン及び隣接配列を含む。更に、この開始コドンは、インサート全体の翻訳を確実にするために、所望のコーディング配列のリーディングフレームと同相でなければならない。これらの外因性翻訳制御シグナル及び開始コドンは、天然と合成の両方の様々な起源のものであり得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサー要素、転写ターミネーターなどを含めることによって高めることができる（例えば、Ｂｉｔｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１－５４４（１９８７）参照）。
加えて、挿入された配列の発現を調節するか、または所望の特定の様式で遺伝子産物を修飾及びプロセシングする宿主細胞株を選択することができる。そのようなタンパク質産物の修飾（例えば、グリコシル化）及びプロセシング（例えば、切断）は、タンパク質の機能にとって重要であり得る。異なる宿主細胞は、タンパク質及び遺伝子産物の翻訳後プロセシング及び修飾のための特徴的かつ特異的な機構を有する。発現された外来タンパク質の正しい修飾及びプロセシングを確実にするために、適切な細胞株または宿主系を選択することができる。この目的のために、一次転写産物の適切なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化及びリン酸化のための細胞機構を有する真核生物宿主細胞が使用され得る。そのような哺乳動物宿主細胞には、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、Ｗ１３８、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２Ｏ及びＴ４７Ｄ、ＮＳ０（いかなる免疫グロブリン鎖も内因的に産生しないマウス骨髄腫細胞）、ＣＲＬ７Ｏ３Ｏ及びＨｓＳ７８Ｂｓｔ細胞が含まれるが、これらに限定されない。
組み換えタンパク質を長期的に高収率で産生するために、安定発現を利用することができる。例えば、融合タンパク質を安定的に発現する細胞株を作製することができる。宿主細胞は、ウイルス複製起点を含有する発現ベクターを使用するのではなく、適切な発現制御要素（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写終結、ポリアデニル化部位など）、及び選択マーカーによって制御されたＤＮＡで形質転換され得る。外来ＤＮＡの導入後、操作された細胞は、濃縮培地で１～２日間成長させ、次いで、選択培地に交換され得る。組み換えプラスミド中の選択マーカーは、選択に対する耐性を付与し、細胞がプラスミドを染色体に安定的に組み込み、成長して凝集体を形成することを可能にし、その後、それがクローン化され、細胞株に拡大し得る。この方法は、融合タンパク質を発現する細胞株を作製するために有利に使用され得る。そのような操作された細胞株は、結合分子と直接または間接的に相互作用する組成物のスクリーニング及び評価に特に有用であり得る。
いくつかの選択システムを使用することができ、例えば、限定するものではないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １１：２２３（１９７７））、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ ＆ Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ４８：２０２（１９９２））、及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ２２：８－１７（１９８０））遺伝子をそれぞれｔｋ細胞、ｈｇｐｒｔ細胞またはａｐｒｔ細胞に採用することができる。また、次の遺伝子選択の基準としては、代謝拮抗物質耐性を使用することができる：メトトレキサートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：３５７（１９８０）；Ｏ’Ｈａｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：１５２７（１９８１））；ミコフェノール酸に対する耐性を付与するｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ ＆ Ｂｅｒｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：２０７２（１９８１））；アミノグリコシドＧ－４１８に対する耐性を付与するｎｅｏ（Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３：８７－９５（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３－５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６－９３２（１９９３）；及びＭｏｒｇａｎ ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１－２１７（１９９３）；Ｍａｙ，ＴＩＢ ＴＥＣＨ １１（５）：ｌ５５－２ １５（１９９３））；及びハイグロマイシンに対する耐性を付与するｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ３０：１４７（１９８４））。所望の組み換えクローンを選択するには、組み換えＤＮＡ技術分野において一般に知られている方法を常法的に適用することができ、そのような方法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９０）；及びＣｈａｐｔｅｒｓ １２ ａｎｄ １３，Ｄｒａｃｏｐｏｌｉ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９４）；Ｃｏｌｂｅｒｒｅ－Ｇａｒａｐｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１（１９８１）に記載されており、その全体が参照により本明細書に援用される。
融合タンパク質の発現レベルは、ベクターの増幅によって上げることができる（概説については、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ ａｎｄ Ｈｅｎｔｓｃｈｅｌ，Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｖｅｃｔｏｒｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌ．３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７）参照）。融合タンパク質を発現するベクター系のマーカーが増幅可能である場合、宿主細胞の培養中に存在する阻害剤のレベルが増加すると、マーカー遺伝子のコピー数が増加し得る。増幅領域が融合タンパク質遺伝子と関連しているので、融合タンパク質の産生も増加し得る（Ｃｒｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２５７（１９８３））。
宿主細胞は、本明細書で提供される複数の発現ベクターで共トランスフェクトされてもよい。ベクターは、コードするそれぞれのポリペプチドの等しい発現を可能にする同一の選択マーカーを含有し得る。あるいは、複数のポリペプチドをコードし、それらを発現することが可能な単一ベクターを使用してもよい。コーディング配列は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含み得る。
本明細書で提供される融合タンパク質が組み換え発現によって産生されたら、ポリペプチド（例えば、免疫グロブリン分子）の精製について当該技術分野において知られている任意の方法によって、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、特にプロテインＡ後の特異的抗原に対する親和性によるもの、サイズカラムクロマトグラフィー、及びカッパ選択アフィニティークロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度の差、またはタンパク質精製の任意の他の標準的な技術によって精製され得る。更に、本明細書で提供される融合タンパク質分子は、精製を容易にするために、本明細書に記載されるまたは当該技術分野において別途知られている異種ポリペプチド配列に融合され得る。
いくつかの実施形態において、本開示はまた、１つ以上の細胞傷害性薬剤、例えば、化学療法剤もしくは化学療法薬、成長阻害剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の酵素的に活性な毒素、またはその断片）、または放射性同位体にコンジュゲートされた、本明細書に記載される抗体（抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体など）のいずれかを含む、イムノコンジュゲートを提供する。
いくつかの実施形態において、イムノコンジュゲートは、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）であり、ここで、抗体は、１つ以上の薬物、例えば、限定するものではないが、メイタンシノイド（米国特許第５，２０８，０２０号、同第５，４１６，０６４号及び欧州特許第ＥＰ０４２５２３５Ｂ１号参照）；モノメチルアウリスタチン薬物部分ＤＥ及びＤＦ（ＭＭＡＥ及びＭＭＡＦ）などのアウリスタチン（米国特許第５，６３５，４８３号及び同第５，７８０，５８８号及び同第７，４９８，２９８号参照）；ドラスタチン；カリケアミシンまたはその誘導体（米国特許第５，７１２，３７４号、同第５，７１４，５８６号、同第５，７３９，１１６号、同第５，７６７，２８５号、同第５，７７０，７０１号、同第５，７７０，７１０号、同第５，７７３，００１号及び同第５，８７７，２９６号；Ｈｉｎｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：３３３６－３３４２（１９９３）；ならびにＬｏｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８：２９２５－２９２８（１９９８）参照）；ダウノマイシンまたはドキソルビシンなどのアントラサイクリン（Ｋｒａｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１３：４７７－５２３（２００６）；Ｊｅｆｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ １６：３５８－３６２（２００６）；Ｔｏｒｇｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１６：７１７－７２１（２００５）；Ｎａｇｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：８２９－８３４（２０００）；Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．＆ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ １２：１５２９－１５３２（２００２）；Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４５：４３３６－４３４３（２００２）；及び米国特許第６，６３０，５７９号参照）；メトトレキサート；ビンデシン；ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル、及びオルタタキセルなどのタキサン；トリコテセン；ならびにＣＣ１０６５にコンジュゲートされる。
いくつかの実施形態において、イムノコンジュゲートは、酵素的に活性な毒素またはその断片、例えば、限定するものではないが、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ－サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンチンタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ－Ｓ）、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ阻害剤、クルシン、クロチン、ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、及びトリコテセンにコンジュゲートされた本明細書に記載される抗体を含む。
いくつかの実施形態において、イムノコンジュゲートは、放射性コンジュゲートを形成するように放射性原子にコンジュゲートされた本明細書に記載される抗体を含む。放射性コンジュゲートの産生には、様々な放射性同位体が利用可能である。例としては、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体が挙げられる。放射性コンジュゲートが検出に使用される場合、シンチグラム検査のための放射性原子、例えば、ｔｃ９９ｍもしくはＩ１２３、または核磁気共鳴（ＮＭＲ）映像法（磁気共鳴映像法、ｍｒｉとしても知られる）のためのスピン標識、例えば、再びヨウ素－１２３、ヨウ素－１３１、インジウム－１１１、フッ素－１９、炭素－１３、窒素－１５、酸素－１７、ガドリニウム、マンガンもしくは鉄が含まれ得る。
抗体と細胞傷害性剤のコンジュゲートは、様々な二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシラート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（アジプイミド酸ジメチルＨＣｌなど）、活性エステル（スベリン酸ジスクシンイミジルなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビスアジド化合物（ビス（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビスジアゾニウム誘導体（ビス－（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）－エチレンジアミンなど）、ジイソシアナート（トルエン２，６－ジイソシアナートなど）、及び二活性フッ素化合物（１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼンなど）を使用して作製することができる。例えば、リシンイムノトキシンは、Ｖｉｔｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１０９８（１９８７）に記載されるとおりに調製することができる。炭素－１４で標識された１－イソチオシアナトベンジル－３－メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ－ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドを抗体にコンジュゲーションする際の例示的なキレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照されたい。
リンカーは、コンジュゲートされた薬剤が細胞内で放出されるのを容易にする「切断可能リンカー」であり得るが、切断可能ではないリンカーも本明細書で企図される。本開示のコンジュゲートで使用するためのリンカーには、限定するものではないが、酸不安定性リンカー（例えば、ヒドラゾンリンカー）、ジスルフィド含有リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー（例えば、アミノ酸、例えば、バリン及び／またはシトルリンを含むペプチドリンカー、例えば、シトルリン－バリンまたはフェニルアラニン－リシン）、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー、チオエーテルリンカー、または多剤トランスポーター媒介性耐性を回避するように設計された親水性リンカーが含まれる。
本明細書のイムノコンジュゲートまたはＡＤＣは、限定するものではないが、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ－ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ－ＥＭＣＳ、スルホ－ＧＭＢＳ、スルホ－ＫＭＵＳ、スルホ－ＭＢＳ、スルホ－ＳＩＡＢ、スルホ－ＳＭＣＣ、及びスルホ－ＳＭＰＢ、及びＳＶＳＢ（スクシンイミジル－（４－ビニルスルホン）ベンゾアート）を含む、市販されている（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ．，Ｕ．Ｓ．Ａ）架橋試薬で調製されたコンジュゲートを企図するが、これらに限定されない。
他の実施形態において、本明細書で提供される抗体は、例えば、診断分子にコンジュゲートまたは組み換え的に融合される。そのような診断及び検出は、例えば、抗体を検出可能な物質にカップリングすることによって、達成することができ、そのような物質には、限定するものではないが、様々な酵素、例えば、限定するものではないが、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼ；補欠分子団、例えば、限定するものではないが、ストレプトアビジン／ビオチンまたはアビジン／ビオチンなど；蛍光材料、例えば、限定するものではないが、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、またはフィコエリトリン；発光材料、例えば、限定するものではないが、ルミノール；生物発光材料、例えば、限定するものではないが、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、またはエクオリン；化学発光材料、例えば、２２５Ａｃγ放出、Ａｕｇｅｒ放出、β放出、アルファ放出またはポジトロン放出放射性同位体が含まれる。
５．３．キメラ抗原受容体
別の態様において、本明細書で提供されるのは、ＧＵＣＹ２Ｃに結合する本明細書で提供される少なくとも１つの単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨＨ）を含む、細胞外抗原結合ドメインを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。本発明のＶＨＨドメインを含む例示的なＣＡＲ（すなわち、ＶＨＨベースのＣＡＲ）が例示され、以下のセクション６に記載されるように、優れた効果を示す。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、（ａ）本明細書で提供されるＧＵＣＹ２Ｃに特異的に結合する少なくとも１つの単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）及び任意選択による１つ以上の追加の結合ドメイン（複数可）を含む細胞外抗原結合ドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインとを含む、ポリペプチドを含む。各成分及び追加の領域は、以下でより詳細に記載される。
５．３．１．細胞外抗原結合ドメイン
本明細書に記載されるＣＡＲの細胞外抗原結合ドメインは、１つ以上（１、２、３、４、５、６またはそれ以上のいずれか１つなど）の単一ドメイン抗体を含む。単一ドメイン抗体は、ペプチド結合またはペプチドリンカーを介して互いに直接融合され得る。
単一ドメイン抗体
本開示のＣＡＲは、１つ以上の単一ドメイン抗体を含む、細胞外抗原結合ドメインを含む。ｓｄＡｂは、同じまたは異なる起源のものであり得、同じまたは異なるサイズのものであり得る。例示的なｓｄＡｂとしては、重鎖のみ抗体（例えば、ＶＨＨまたはＶＮＡＲ）に由来する重鎖可変ドメイン、軽鎖を天然に欠いている結合分子、従来の４鎖抗体に由来する単一ドメイン（ＶＨまたはＶＬなど）、ヒト化重鎖のみ抗体、ヒト重鎖セグメントを発現するトランスジェニックマウスまたはラットによって産生されたヒト単一ドメイン抗体、ならびに抗体に由来するもの以外の操作されたドメイン及び単一ドメイン足場が挙げられるが、これらに限定されない。当該技術分野において知られているまたは本開示によって開発された任意のｓｄＡｂが、本開示で上に記載される単一ドメイン抗体を含め、本明細書に記載されるＣＡＲを構築するために使用され得る。ｓｄＡｂは、マウス、ラット、ヒト、ラクダ、ラマ、ヤツメウナギ、魚類、サメ、ヤギ、ウサギ、及びウシを含むがこれらに限定されない任意の種に由来するものであってもよい。本明細書で企図される単一ドメイン抗体はまた、ラクダ科動物及びサメ以外の種に由来する、天然に存在する単一ドメイン抗体分子も含む。
いくつかの実施形態において、ｓｄＡｂは、軽鎖を欠いている重鎖抗体として知られる（本明細書では「重鎖のみ抗体」とも呼ばれる）、天然に存在する単一ドメイン抗原結合分子に由来する。そのような単一ドメイン分子は、例えば、ＷＯ９４／０４６７８及びＨａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６３：４４６－４４８（１９９３）に開示されている。明確にするために、軽鎖を天然に欠いている重鎖分子に由来する可変ドメインは、本明細書においてＶＨＨとし、４鎖免疫グロブリンの従来のＶＨと区別する。そのようなＶＨＨ分子は、ラクダ科動物の種、例えば、ラクダ、ラマ、ビクーナ、ヒトコブラクダ、アルパカ及びグアナコで生じた抗体に由来し得る。ラクダ科動物以外の他の種も軽鎖を天然に欠く重鎖分子を産生する場合があり、そのようなＶＨＨは本出願の範囲内である。加えて、ＶＨＨのヒト化バージョンならびに他の修飾体及びバリアントもまた企図され、本開示の範囲内である。
ラクダ科動物由来のＶＨＨ分子は、ＩｇＧ分子の約１／１０の小ささである。これらは、単一ポリペプチドであり、非常に安定しており、極端なｐＨ及び温度条件にも耐えることができる。更に、従来の４鎖抗体にはないプロテアーゼ作用に対する耐性があり得る。更に、ＶＨＨのｉｎ ｖｉｔｒｏ発現は、高収率で適切に折り畳まれた機能性ＶＨＨをもたらす。加えて、ラクダ科動物で生成された抗体は、抗体ライブラリーの使用によりｉｎ ｖｉｔｒｏで、またはラクダ科動物以外の哺乳動物の免疫化により生成された抗体によって認識されるエピトープ以外のエピトープを認識することができる（例えば、ＷＯ９７４９８０５参照）。したがって、１つ以上のＶＨＨドメインを含む多重特異性または多価ＣＡＲは、従来の４鎖抗体に由来する抗原結合断片を含む多重特異性または多価ＣＡＲよりも効率的に標的と相互作用し得る。ＶＨＨは、空洞または溝などの「特殊な」エピトープに結合することが知られているので、そのようなＶＨＨを含むＣＡＲの親和性は、従来の多重特異性ポリペプチドよりも治療的処置により好適であり得る。
いくつかの実施形態において、ｓｄＡｂは、軟骨魚に見られる免疫グロブリンの可変領域に由来する。例えば、ｓｄＡｂは、サメの血清中に見られる新規抗原受容体（ＮＡＲ）として知られる免疫グロブリンアイソタイプに由来し得る。ＮＡＲの可変領域（「ＩｇＮＡＲ」）に由来する単一ドメイン分子を産生する方法は、ＷＯ０３／０１４１６１及びＳｔｒｅｌｔｓｏｖ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．１４：２９０１－２９０９（２００５）に記載されている。
いくつかの実施形態において、ｓｄＡｂは、組み換え、ＣＤＲグラフト、ヒト化、ラクダ化、脱免疫化及び／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ生成された（例えば、ファージディスプレイによって選択された）ものである。いくつかの実施形態において、フレームワーク領域のアミノ酸配列は、フレームワーク領域内の特定のアミノ酸残基の「ラクダ化」によって改変され得る。ラクダ化は、従来の４鎖抗体に由来する（天然に存在する）ＶＨドメインのアミノ酸配列内の１つ以上のアミノ酸残基を、重鎖抗体のＶＨＨドメイン中の対応する位置（複数可）に存在する１つ以上のアミノ酸残基で置き換えることまたは置換することを指す。これは、当該分野で知られている方法で実施することができ、当業者には明らかであろう。そのような「ラクダ化」置換は、好ましくは、ＶＨ－ＶＬ界面を形成する及び／または当該界面に存在するアミノ酸位置に、及び／または本明細書に定義されるいわゆるラクダ動物の特徴的な残基に挿入される（例えば、ＷＯ９４／０４６７８、Ｄａｖｉｅｓ ａｎｄ Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３３９：２８５－２９０ （１９９４）；Ｄａｖｉｅｓ ａｎｄ Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ９ （６）：５３１－５３７ （１９９６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５９：９５７－９６９ （１９９６）；及びＲｉｅｃｈｍａｎｎ ａｎｄ Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２３１：２５－３８（１９９９）参照）。
いくつかの実施形態において、ｓｄＡｂは、ヒト重鎖セグメントを発現するトランスジェニックマウスまたはラットによって産生されたヒト単一ドメイン抗体である。例えば、ＵＳ２００９０３０７７８７、米国特許第８，７５４，２８７号、ＵＳ２０１５０２８９４８９、ＵＳ２０１００１２２３５８、及びＷＯ２００４０４９７９４を参照されたい。いくつかの実施形態において、ｓｄＡｂは、親和性成熟される。
いくつかの実施形態において、特定の抗原または標的に対する天然に存在するＶＨＨドメインは、ラクダ科動物ＶＨＨ配列の（天然または免疫）ライブラリーから得ることができる。そのような方法は、当該分野で知られている１つ以上のスクリーニング技術を使用して、かかるライブラリーを、当該抗原もしくは標的、または少なくとも１つの部分、断片、抗原決定基もしくはそのエピトープを使用してスクリーニングすることを伴うか、または伴わない場合もある。あるいは、ランダム変異導入及び／またはＣＤＲシャッフリングなどの技術による（天然または免疫）ＶＨＨライブラリーから得られたＶＨＨライブラリーなどの（天然または免疫）ＶＨＨライブラリーに由来する改善された合成または半合成ライブラリーを使用してもよい。
いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、従来の４鎖抗体から生成される。例えば、ＥＰ ０ ３６８ ６８４；Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４１（６２４２）：５４４－６（１９８９）；Ｈｏｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２１（１１）：４８４－４９０（２００３）；ＷＯ ０６／０３０２２０；及びＷＯ０６／００３３８８を参照されたい。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される細胞外抗原結合ドメインは、少なくとも１つの結合ドメインを含み、少なくとも１つの結合ドメインは、本明細書で提供されるＧＵＣＹ２Ｃに結合する単一ドメイン抗体、例えば、上のセクション５．２に記載される抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、（ａ）抗ＧＵＣＹ２Ｃ ｓｄＡｂを含む細胞外抗原結合ドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインとを含む、ポリペプチドを含むＣＡＲであり、ここで、抗ＧＵＣＹ２Ｃ ｓｄＡｂは、例えば、表７のＶＨＨドメイン及び表７のこれらのＶＨＨドメインのいずれかの１つ、２つまたは３つ全てのＣＤＲを有するものを含む、上のセクション５．２に記載される抗ＧＵＣＹ２Ｃ ｓｄＡｂである。いくつかの実施形態において、抗ＧＵＣＹ２Ｃ ｓｄＡｂは、ラクダ科抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、またはヒト化抗体である。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、（ａ）抗ＧＵＣＹ２Ｃ ｓｄＡｂを含む細胞外抗原結合ドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインとを含む、ポリペプチドを含むＣＡＲであり、ここで、抗ＧＵＣＹ２Ｃ ｓｄＡｂは、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０のアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、本明細書で提供されるのは、（ａ）抗ＧＵＣＹ２Ｃ ｓｄＡｂを含む細胞外抗原結合ドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインとを含む、ポリペプチドを含むＣＡＲであり、ここで、抗ＧＵＣＹ２Ｃ ｓｄＡｂは、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０のアミノ酸配列に対して、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
他の実施形態において、細胞外抗原結合ドメインは、２つ以上の抗原結合ドメインを含む。これらの２つ以上の抗原結合ドメインのうち、少なくとも１つは、本明細書で提供されるＧＵＣＹ２Ｃに結合するＶＨＨである。いくつかの実施形態において、１つ以上の追加の結合ドメイン（複数可）もまた、ＧＵＣＹ２Ｃに結合するＶＨＨ（複数可）である。他の実施形態において、１つ以上の追加の結合ドメイン（複数可）は、１つ以上の追加の異なる抗原（複数可）に結合し、例えば、１、２、３、４またはそれ以上の追加の単一ドメイン抗体結合領域（ｓｄＡｂ）は、１つ以上の追加の異なる抗原（複数可）を標的とする。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、（ａ）ＧＵＣＹ２Ｃに特異的に結合する２つ以上の単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を含む、細胞外抗原結合ドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインとを含む、ポリペプチドを含む多価（二価及び三価など）のＣＡＲである。いくつかの実施形態において、細胞外抗原結合ドメインは、本明細書で提供されるＧＵＣＹ２Ｃに特異的に結合する２つの単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を含む。他の実施形態において、細胞外抗原結合ドメインは、本明細書で提供されるＧＵＣＹ２Ｃに特異的に結合する３つの単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を含む。いくつかの実施形態において、２つ以上の抗ＧＵＣＹ２Ｃ ｓｄＡｂは、例えば、表７のＶＨＨドメイン及び表７のこれらのＶＨＨドメインのいずれかの１つ、２つまたは３つ全てのＣＤＲを有するものを含む、上のセクション５．２に記載されるこれらの抗ＧＵＣＹ２Ｃ ｓｄＡｂから選択される。いくつかの実施形態において、抗ＧＵＣＹ２ＣｓｄＡｂは、ラクダ科抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、またはヒト化抗体である。いくつかの実施形態において、２つ以上の抗ＧＵＣＹ２Ｃ ｓｄＡｂは、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０のアミノ酸配列に対して、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、抗ＧＵＣＹ２Ｃ ｓｄＡｂからそれぞれ独立して選択される。
他の実施形態において、本明細書で提供されるのは、（ａ）ＧＵＣＹ２Ｃに特異的に結合する第１の単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を含む細胞外抗原結合ドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインとを含む、ポリペプチドを含む、多価（二価及び三価など）のＣＡＲである。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、第２の抗原（第２の腫瘍抗原など）に特異的に結合する第２の単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を更に含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、第２の抗原（第２の腫瘍抗原など）に特異的に結合する第２の単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）及び第３の抗原（第３の腫瘍抗原など）に特異的に結合する第３の単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を更に含む。
いくつかの実施形態において、本開示のＣＡＲが標的とする追加の抗原（複数可）は、細胞表面分子である。単一ドメイン抗体は、特定の疾患状態に関連する標的細胞上の細胞表面マーカーとして機能する抗原を認識するように選択されてもよい。いくつかの実施形態において、抗原は、腫瘍抗原である。腫瘍は、免疫応答、特に、Ｔ細胞媒介性免疫応答に対する標的抗原として機能することができるいくつかのタンパク質を発現する。ＣＡＲが標的とする抗原は、単一の疾患細胞上の抗原であってもよいし、それぞれが疾患に関与する異なる細胞上に発現している抗原であってもよい。ＣＡＲが標的とする抗原は、疾患に直接的または間接的に関与し得る。いくつかの実施形態において、腫瘍抗原は、悪性腫瘍に関連する１つ以上の抗原がんエピトープを含む。いくつかの実施形態において、腫瘍抗原は、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）または腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である。ＴＳＡは、腫瘍細胞に特有であり、体内の他の細胞には生じない。ＴＡＡ関連抗原は、腫瘍細胞に特有なものではなく、抗原に対する免疫寛容の状態を誘導することができない条件下では、正常細胞にも発現する。腫瘍上の抗原の発現は、免疫系が抗原に応答することを可能にする条件下で生じ得る。ＴＡＡは、免疫系が未熟で応答できない胎児の発達中に正常細胞で発現する抗原であり得るか、または正常細胞では通常、非常に低レベルで存在するが、腫瘍細胞上では遥かに高いレベルで発現する抗原であり得る。
本明細書で提供される１つ以上の抗原結合ドメイン（複数可）に加えて、本明細書で提供されるＣＡＲは、次のもの：リンカー（例えば、ペプチドリンカー）、膜貫通ドメイン、ヒンジ領域、シグナルペプチド、細胞内シグナル伝達ドメイン、共刺激シグナル伝達ドメインのうちの１つ以上を含み得、そのそれぞれは、以下でより詳細に記載される。
例えば、いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫エフェクター細胞（Ｔ細胞など）の一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζに由来する。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ３、ＬＦＡ－１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３のリガンド及びこれらの組み合わせからなる群から選択される共刺激分子に由来する。いくつかの実施形態において、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ１３７に由来する。いくつかの実施形態において、ＧＵＣＹ２Ｃ ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインのＣ末端と膜貫通ドメインのＮ末端との間に位置するヒンジドメイン（ＣＤ８αヒンジドメインなど）を更に含む。いくつかの実施形態において、ＧＵＣＹ２Ｃ ＣＡＲは、ポリペプチドのＮ末端に位置するシグナルペプチド（ＣＤ８αシグナルペプチドなど）を更に含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＣＤ８αシグナルペプチド、細胞外抗原結合ドメイン、ＣＤ８αヒンジドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）由来の共刺激シグナル伝達ドメイン、及びＣＤ３ζ由来の一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの具体的な実施形態において、本明細書で提供されるＣＡＲは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、配列番号４７のアミノ酸配列を含むＣＤ８シグナルペプチド、本明細書で提供される１つ以上のｓｄＡｂ（複数可）を含む細胞外抗原結合ドメイン、配列番号４３のアミノ酸配列を含むＣＤ８ヒンジ、配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤ８膜貫通領域、配列番号４４のアミノ酸配列を含む４－１ＢＢ共刺激シグナル伝達ドメイン、及び配列番号４６のアミノ酸配列を含むＣＤ３ｚ細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＧＵＣＹ２Ｃ ＣＡＲは、単一特異性である。いくつかの実施形態において、ＧＵＣＹ２Ｃ ＣＡＲは、一価である。他の実施形態において、ＧＵＣＹ２Ｃ ＣＡＲは、多価である。
５．３．２．シグナルペプチド
本開示のＣＡＲは、ポリペプチドのＮ末端にシグナルペプチド（シグナル配列としても知られる）を含み得る。一般に、シグナルペプチドは、ポリペプチドを細胞内の所望の部位に標的指向化させるペプチド配列である。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、エフェクター分子を細胞の分泌経路へ標的指向化させ、エフェクター分子の脂質二重層への組み込みと係留を可能にする。本明細書に記載されるＣＡＲでの使用に適合する天然に存在するタンパク質のシグナル配列または天然に存在しない合成のシグナル配列を含むシグナルペプチドは、当業者に明らかであろう。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、ＣＤ８α、ＧＭ－ＣＳＦ受容体α、及びＩｇＧ１重鎖からなる群から選択される分子に由来する。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、ＣＤ８αに由来する。いくつかの実施形態において、ＣＤ８αのシグナルペプチドは、配列番号４７のアミノ酸配列を含む。
５．３．３．ヒンジ領域
本出願のＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインと膜貫通ドメインとの間に位置するヒンジドメインを含み得る。ヒンジドメインは、一般に、タンパク質の２つのドメイン間に見られるアミノ酸セグメントであり、タンパク質の柔軟性及びドメインの一方または両方の相対的な動きを可能にし得る。そのようなエフェクター分子の膜貫通ドメインに対する細胞外抗原結合ドメインの柔軟性及び動きを提供する任意のアミノ酸配列が使用され得る。
ヒンジドメインは、約１０～１００アミノ酸、例えば、約１５～７５アミノ酸、２０～５０アミノ酸、または３０～６０アミノ酸のいずれか１つを含有し得る。いくつかの実施形態において、ヒンジドメインは、少なくとも約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、または７５アミノ酸長のいずれか１つであり得る。
いくつかの実施形態において、ヒンジドメインは、天然に存在するタンパク質のヒンジドメインである。ヒンジドメインを含むことが当該技術分野において知られている任意のタンパク質のヒンジドメインは、本明細書に記載されるキメラ受容体の使用に適合する。いくつかの実施形態において、ヒンジドメインは、少なくとも天然に存在するタンパク質のヒンジドメインの少なくとも一部であり、キメラ受容体に柔軟性を付与する。いくつかの実施形態において、ヒンジドメインは、ＣＤ８αに由来する。いくつかの実施形態において、ヒンジドメインは、ＣＤ８αのヒンジドメインの一部、例えば、ＣＤ８αのヒンジドメインの少なくとも１５（例えば、２０、２５、３０、３５、または４０）連続アミノ酸を含有する断片である。いくつかの実施形態において、ＣＤ８αのヒンジドメインは、配列番号４３のアミノ酸配列を含む。
ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、またはＩｇＤ抗体などの抗体のヒンジドメインもまた、本明細書に記載されるｐＨ依存性キメラ受容体システムでの使用に適合する。いくつかの実施形態において、ヒンジドメインは、抗体の定常ドメインＣＨ１とＣＨ２を接続するヒンジドメインである。いくつかの実施形態において、ヒンジドメインは、抗体のものであり、抗体のヒンジドメイン及び抗体の１つ以上の定常領域を含む。いくつかの実施形態において、ヒンジドメインは、抗体のヒンジドメイン及び抗体のＣＨ３定常領域を含む。いくつかの実施形態において、ヒンジドメインは、抗体のヒンジドメインならびに抗体のＣＨ２及びＣＨ３定常領域を含む。いくつかの実施形態において、抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、またはＩｇＤ抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、ＩｇＧ抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体である。いくつかの実施形態において、ヒンジ領域は、ＩｇＧ１抗体のヒンジ領域ならびにＣＨ２及びＣＨ３定常領域を含む。いくつかの実施形態において、ヒンジ領域は、ＩｇＧ１抗体のヒンジ領域及びＣＨ３定常領域を含む。
天然に存在しないペプチドもまた、本明細書に記載されるキメラ受容体のヒンジドメインとして使用され得る。いくつかの実施形態において、Ｆｃ受容体の細胞外リガンド結合ドメインのＣ末端と膜貫通ドメインのＮ末端との間のヒンジドメインは、（ＧｘＳ）ｎリンカーなどのペプチドリンカーであり、ここで、ｘ及びｎは、独立して、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれ以上を含む、３～１２の整数であり得る。
５．３．４．膜貫通ドメイン
本出願のＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインに直接または間接的に融合され得る膜貫通ドメインを含む。膜貫通ドメインは、天然源または合成源のいずれかに由来し得る。本明細書で使用される場合、「膜貫通ドメイン」は、細胞膜、好ましくは、真核細胞の細胞膜で熱力学的に安定な任意のタンパク質構造を指す。本明細書に記載されるＣＡＲの使用に適合する膜貫通ドメインは、天然に存在するタンパク質から得ることができる。あるいは、天然に存在しない合成タンパク質セグメント、例えば、細胞膜で熱力学的に安定な疎水性タンパク質セグメントであり得る。
膜貫通ドメインは、膜貫通ドメインの三次元構造に基づいて分類される。例えば、膜貫通ドメインは、アルファヘリックス、２つ以上のアルファヘリックスの複合体、ベータ－バレル、または細胞のリン脂質二重層にまたがることが可能な任意の他の安定した構造を形成し得る。更に、膜貫通ドメインは、加えてまたは代替的に、膜貫通ドメインが膜を通過する回数及びタンパク質の配向を含む、膜貫通ドメインのトポロジーに基づいて分類され得る。例えば、単回通過膜タンパク質は、細胞膜を１回通過し、複数回通過膜タンパク質は、細胞膜を少なくとも２回（例えば、２、３、４、５、６、７またはそれ以上の回数）通過する。膜タンパク質は、その末端及び膜通過セグメント（複数可）の細胞の内外に対するトポロジーに応じて、Ｉ型、ＩＩ型またはＩＩＩ型と定義され得る。Ｉ型膜タンパク質は、単一の膜通過領域を有し、タンパク質のＮ末端が細胞の脂質二重層の細胞外側に存在し、タンパク質のＣ末端が細胞質側に存在するように配向している。ＩＩ型膜タンパク質もまた、単一の膜通過領域を有するが、タンパク質のＣ末端が細胞の脂質二重層の細胞外側に存在し、タンパク質のＮ末端が細胞質側に存在するように配向している。ＩＩＩ型膜タンパク質は、複数の膜通過セグメントを有し、膜貫通セグメントの数及びＮ末端とＣ末端の位置に基づいて更に細かく分類され得る。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＣＡＲの膜貫通ドメインは、Ｉ型単回通過膜タンパク質に由来する。いくつかの実施形態において、複数回通過膜タンパク質に由来する膜貫通ドメインもまた本明細書に記載されるＣＡＲでの使用に適合し得る。複数回通過膜タンパク質は、複合（少なくとも２、３、４、５、６、７またはそれ以上の）アルファヘリックスまたはベータシート構造を含み得る。いくつかの実施形態において、複数回通過膜タンパク質のＮ末端及びＣ末端は、脂質二重層の反対側に存在し、例えば、タンパク質のＮ末端は、脂質二重層の細胞質側に存在し、タンパク質のＣ末端は、細胞外側に存在する。
いくつかの実施形態において、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータもしくはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＫＩＲＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ－１（ＣＤｌ ｌａ、ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦｌ）、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ－２Ｒベータ、ＩＬ－２Ｒガンマ、ＩＬ－７Ｒ ａ、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤｌ ｌｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤｌ ｌａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤｌ ｌｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤｌ ｌｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴ ＡＭ、Ｌｙ９ （ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０ （ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤＩＯＯ（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙｌ０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、及び／またはＮＫＧ２Ｃの膜貫通ドメインから選択される膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１５２及びＰＤ１からなる群から選択される分子に由来する。
いくつかの具体的な実施形態において、膜貫通ドメインは、ＣＤ８αに由来する。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤ８αの膜貫通ドメインである。
本明細書に記載されるＣＡＲに使用するための膜貫通ドメインは、天然に存在しない合成タンパク質セグメントの少なくとも一部を含み得る。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、天然に存在しない合成アルファヘリックスまたはベータシートである。いくつかの実施形態において、タンパク質セグメントは、少なくともおよそ２０アミノ酸、例えば、少なくとも１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、またはそれ以上のアミノ酸である。合成膜貫通ドメインの例は、当該技術分野において知られており、例えば、米国特許第７，０５２，９０６号及びＰＣＴ公開第ＷＯ２０００／０３２７７６号があり、これらの関連開示は、参照により本明細書に援用される。
本明細書で提供される膜貫通ドメインは、膜貫通領域と、膜貫通ドメインのＣ末端側に位置する細胞質領域とを含み得る。膜貫通ドメインの細胞質領域は、３つ以上のアミノ酸を含み得、いくつかの実施形態において、脂質二重層内で膜貫通ドメインを配向させる助けとなる。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインの膜貫通領域に、１つ以上のシステイン残基が存在する。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインの細胞質領域に、１つ以上のシステイン残基が存在する。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインの細胞質領域は、正電荷のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインの細胞質領域は、アルギニン、セリン、及びリシンのアミノ酸を含む。
いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインの膜貫通領域は、疎水性アミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるＣＡＲの膜貫通ドメインは、人工の疎水性配列を含む。例えば、フェニルアラニン、トリプトファン及びバリンのトリプレットが膜貫通ドメインのＣ末端に存在し得る。いくつかの実施形態において、膜貫通領域は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、またはバリンなどの主に疎水性のアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態において、膜貫通領域は、疎水性である。いくつかの実施形態において、膜貫通領域は、ポリ－ロイシン－アラニン配列を含む。タンパク質またはタンパク質セグメントのハイドロパシー、すなわち、疎水性または親水性の特徴は、当該技術分野において知られている任意の方法、例えば、Ｋｙｔｅ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅハイドロパシー分析によって評価することができる。
５．３．５．細胞内シグナル伝達ドメイン
本出願のＣＡＲは、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞の正常なエフェクター機能のうちの少なくとも１つの活性化に関与する。「エフェクター機能」という用語は、細胞の特殊な機能を指す。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、細胞溶解活性またはサイトカインの分泌を含むヘルパー活性であり得る。したがって、「細胞質シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクター機能のシグナルを伝達し、その細胞に特殊な機能を発揮させるようにするタンパク質の部分を指す。通常、細胞質シグナル伝達ドメイン全体が採用され得るが、多くの場合、全鎖を使用する必要はない。細胞質シグナル伝達ドメインの切断部分が使用される場合、そのような切断部分は、エフェクター機能のシグナルを伝達する限り、インタクト鎖の代わりに使用され得る。したがって、細胞質シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクター機能のシグナルを伝達するのに十分な細胞質シグナル伝達ドメインの任意の切断部分を含むことを意味する。
いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫エフェクター細胞の一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、免疫エフェクター細胞の一次細胞内シグナル伝達から本質的になる細胞内シグナル伝達ドメインを含む。「一次細胞内シグナル伝達ドメイン」とは、免疫エフェクター機能を誘導するように刺激を与えるように作用する細胞質シグナル伝達配列を指す。いくつかの実施形態において、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシン活性化モチーフ、またはＩＴＡＭとして知られているシグナル伝達モチーフを含有する。「ＩＴＡＭ」は、本明細書で使用される場合、多くの免疫細胞で発現されるシグナル伝達分子の尾部に一般に存在する、保存されたタンパク質モチーフである。このモチーフは、６～８アミノ酸によって分離されたアミノ酸配列ＹｘｘＬ／Ｉの２つのリピートを含み得、ここで、各ｘは、独立して、保存されたモチーフであるＹｘｘＬ／Ｉｘ（６～８）ＹｘｘＬ／Ｉをもたらす任意のアミノ酸である。シグナル伝達分子内のＩＴＡＭは、細胞内のシグナル伝達に重要であり、少なくとも部分的には、シグナル伝達分子の活性化に続く、ＩＴＡＭ中のチロシン残基のリン酸化により媒介される。ＩＴＡＭはまた、シグナル伝達経路に関与する他のタンパク質のドッキング部位としても機能し得る。例示的なＩＴＡＭ含有一次細胞質シグナル伝達配列としては、ＣＤ３ζ、ＦｃＲガンマ（ＦＣＥＲ１Ｇ）、ＦｃＲベータ（ＦｃイプシロンＲｉｂ）、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄに由来するものが挙げられる。
いくつかの実施形態において、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζに由来する。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの細胞質シグナル伝達ドメインからなる。いくつかの実施形態において、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、野生型ＣＤ３ζの細胞質シグナル伝達ドメインである。いくつかの実施形態において、ＣＤ３ζの一次細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号４６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、野生型ＣＤ３ζの一次細胞内シグナル伝達ドメイン。いくつかの実施形態において、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｑ６５Ｋなどの１つ以上の変異を含有する、ＣＤ３ζの細胞質シグナル伝達ドメインの機能的変異体である。
５．３．６．共刺激シグナル伝達ドメイン
多くの免疫エフェクター細胞は、細胞の増殖、分化及び生存を促進するために、また細胞のエフェクター機能を活性化するために、抗原特異的シグナルの刺激に加えて、共刺激を必要とする。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメインを含む。「共刺激シグナル伝達ドメイン」という用語は、本明細書で使用される場合、細胞内でシグナル伝達を媒介してエフェクター機能などの免疫応答を誘導するタンパク質の少なくとも一部を指す。本明細書に記載されるキメラ受容体の共刺激シグナル伝達ドメインは、シグナルを伝達し、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、好中球、または好酸球など免疫細胞によって媒介される応答を調節する、共刺激タンパク質に由来する細胞質シグナル伝達ドメインであり得る。「共刺激シグナル伝達ドメイン」は、共刺激分子の細胞質部分であり得る。「共刺激分子」という用語は、共刺激リガンドと特異的に結合し、これにより、限定するものではないが、増殖及び生存などの免疫細胞による共刺激応答を媒介する、免疫細胞（Ｔ細胞など）上の同族結合パートナーを指す。
いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、１つの共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、２つ以上（約２、３、４、またはそれ以上のいずれかなど）の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、２つ以上の同じ共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、本明細書に記載される任意の２つ以上の共刺激タンパク質などの異なる共刺激タンパク質に由来する２つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次細胞内シグナル伝達ドメイン（ＣＤ３ζの細胞質シグナル伝達ドメインなど）及び１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメイン及び一次細胞内シグナル伝達ドメイン（ＣＤ３ζの細胞質シグナル伝達ドメインなど）は、任意選択のペプチドリンカーを介して互いに融合される。一次細胞内シグナル伝達ドメイン及び１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインは、任意の好適な順序で配置され得る。いくつかの実施形態において、１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインは、膜貫通ドメインと一次細胞内シグナル伝達ドメイン（ＣＤ３ζの細胞質シグナル伝達ドメインなど）との間に位置する。複数の共刺激シグナル伝達ドメインは、相加的または相乗的な刺激作用を提供し得る。
宿主細胞（例えば、免疫細胞）の共刺激シグナル伝達ドメイン活性化は、細胞に対して、サイトカインの生産及び分泌、食作用特性、増殖、分化、生存、及び／または細胞毒性の増加または低減を誘導し得る。任意の共刺激分子の共刺激シグナル伝達ドメインは、本明細書に記載されるＣＡＲでの使用に適合し得る。共刺激シグナル伝達ドメインのタイプ（複数可）は、エフェクター分子が発現される免疫エフェクター細胞のタイプ（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、好中球、または好酸球）、及び所望の免疫エフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣ作用）などの因子に基づいて選択される。ＣＡＲで使用するための共刺激シグナル伝達ドメインの例は、限定するものではないが、Ｂ７／ＣＤ２８ファミリーのメンバー（例えば、Ｂ７－１／ＣＤ８０、Ｂ７－２／ＣＤ８６、Ｂ７－Ｈ１／ＰＤ－Ｌ１、Ｂ７－Ｈ２、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ６、Ｂ７－Ｈ７、ＢＴＬＡ／ＣＤ２７２、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ－４、Ｇｉ２４／ＶＩＳＴＡ／Ｂ７－Ｈ５、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ２／Ｂ７－ＤＣ、及びＰＤＣＤ６）；ＴＮＦスーパーファミリーのメンバー（例えば、４－１ＢＢ／ＴＮＦＳＦ９／ＣＤ１３７、４－１ＢＢリガンド／ＴＮＦＳＦ９、ＢＡＦＦ／ＢＬｙＳ／ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＢＡＦＦ Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ、ＣＤ２７／ＴＮＦＲＳＦ７、ＣＤ２７リガンド／ＴＮＦＳＦ７、ＣＤ３０／ＴＮＦＲＳＦ８、ＣＤ３０リガンド／ＴＮＦＳＦ８、ＣＤ４０／ＴＮＦＲＳＦ５、ＣＤ４０／ＴＮＦＳＦ５、ＣＤ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ５、ＤＲ３／ＴＮＦＲＳＦ２５、ＧＩＴＲ／ＴＮＦＲＳＦ１８、ＧＩＴＲリガンド／ＴＮＦＳＦ１８、ＨＶＥＭ／ＴＮＦＲＳＦ１４、ＬＩＧＨＴ／ＴＮＦＳＦ１４、リンホトキシン－アルファ／ＴＮＦ－ベータ、ＯＸ４０／ＴＮＦＲＳＦ４、ＯＸ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ４、ＲＥＬＴ／ＴＮＦＲＳＦ１９Ｌ、ＴＡＣＩ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＴＬ１Ａ／ＴＮＦＳＦ１５、ＴＮＦ－アルファ、及びＴＮＦ ＲＩＩ／ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ）；ＳＬＡＭファミリーのメンバー（例えば、２Ｂ４／ＣＤ２４４／ＳＬＡＭＦ４、ＢＬＡＭＥ／ＳＬＡＭＦ８、ＣＤ２、ＣＤ２Ｆ－１０／ＳＬＡＭＦ９、ＣＤ４８／ＳＬＡＭＦ２、ＣＤ５８／ＬＦＡ－３、ＣＤ８４／ＳＬＡＭＦ５、ＣＤ２２９／ＳＬＡＭＦ３、ＣＲＡＣＣ／ＳＬＡＭＦ７、ＮＴＢ－Ａ／ＳＬＡＭＦ６、及びＳＬＡＭ／ＣＤ１５０）；ならびにＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ５３、ＣＤ８２／Ｋａｉ－１、ＣＤ９０／Ｔｈｙ１、ＣＤ９６、ＣＤ１６０、ＧＵＣＹ２Ｃ０、ＣＤ３００ａ／ＬＭＩＲ１、ＨＬＡクラスＩ、ＨＬＡ－ＤＲ、Ｉｋａｒｏｓ、インテグリンアルファ４／ＣＤ４９ｄ、インテグリンアルファ４ベータ１、インテグリンアルファ４ベータ７／ＬＰＡＭ－１、ＬＡＧ－３、ＴＣＬ１Ａ、ＴＣＬ１Ｂ、ＣＲＴＡＭ、ＤＡＰ１２、デクチン－１／ＣＬＥＣ７Ａ、ＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６、ＥｐｈＢ６、ＴＩＭ－１／ＫＩＭ－１／ＨＡＶＣＲ、ＴＩＭ－４、ＴＳＬＰ、ＴＳＬＰ Ｒ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、及びＮＫＧ２Ｃなどの任意の他の共刺激分子を含む、共刺激タンパク質の細胞質シグナル伝達ドメインを挙げることができる。
いくつかの実施形態において、１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ３、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３及びＣＤ８３に特異的に結合するリガンドからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、本出願のＣＡＲにおける細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ１３７（すなわち、４－１ＢＢ）に由来する共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの細胞質シグナル伝達ドメイン及びＣＤ１３７の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号４５のアミノ酸配列を含むＣＤ１３７の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。
共刺激シグナル伝達ドメインが免疫細胞の免疫応答を調節することができる、本明細書に記載される共刺激シグナル伝達ドメインのいずれかのバリアントもまた、本開示の範囲内である。いくつかの実施形態において、共刺激シグナル伝達ドメインは、野生型対応物と比較して、最大１０個のアミノ酸残基の変異（例えば、１、２、３、４、５、または８個）を含む。１つ以上のアミノ酸変異を含むそのような共刺激シグナル伝達ドメインは、バリアントとも呼ばれる。共刺激シグナル伝達ドメインのアミノ酸残基の変異は、変異を含まない共刺激シグナル伝達ドメインと比べて、シグナル伝達の増加及び免疫応答の刺激の増大をもたらし得る。共刺激シグナル伝達ドメインのアミノ酸残基の変異は、変異を含まない共刺激シグナル伝達ドメインと比べて、シグナル伝達の減少及び免疫応答の刺激の低減をもたらし得る。
５．３．７．ペプチドリンカー
本明細書に記載される多重特異性または多価ＣＡＲ中の様々な単一ドメイン抗体は、ペプチドリンカーを介して互いに融合され得る。いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、任意のペプチドリンカーなしで、互いに直接融合される。異なる単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨＨ）を接続するペプチドリンカーは、同じであっても異なっていてもよい。ＣＡＲの異なるドメインは、ペプチドリンカーを介して互いに融合され得る。
ＣＡＲ中の各ペプチドリンカーは、単一ドメイン抗体及び／または様々なドメインの構造的及び／または機能的特徴に応じて、同じまたは異なる長さ及び／または配列を有し得る。各ペプチドリンカーは、独立して、選択され、最適化され得る。ＣＡＲに使用されるペプチドリンカー（複数可）の長さ、柔軟性の程度及び／または他の特性は、限定するものではないが、１つ以上の特定の抗原またはエピトープに対する親和性、特異性またはアビディティを含む特性に何らかの影響を与え得る。例えば、２つの隣接するドメインが互いに立体的に干渉しないことを確実にするには、より長いペプチドリンカーが選択され得る。いくつかの実施形態において、ＣＡＲの膜貫通ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとの間に、短いペプチドリンカーが配置され得る。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーは、フレキシブル残基（グリシン及びセリンなど）を含み、隣接するドメインが互いに自由に動けるようになっている。例えば、グリシン－セリンダブレットは、好適なペプチドリンカーであり得る。
ペプチドリンカーは、任意の好適な長さであり得る。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００またはそれ以上のいずれかのアミノ酸長である。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーは、約１００、７５、５０、４０、３５、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５またはそれ未満のいずれかを超えないアミノ酸長である。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーの長さは、約１アミノ酸～約１０アミノ酸、約１アミノ酸～約２０アミノ酸、約１アミノ酸～約３０アミノ酸、約５アミノ酸～約１５アミノ酸、約１０アミノ酸～約２５アミノ酸、約５アミノ酸～約３０アミノ酸、約１０アミノ酸～約３０アミノ酸長、約３０アミノ酸～約５０アミノ酸、約５０アミノ酸～約１００アミノ酸、または約１アミノ酸～約１００アミノ酸のいずれかである。
ペプチドリンカーは、天然に存在する配列、または天然に存在しない配列を有し得る。例えば、重鎖のみの抗体のヒンジ領域に由来する配列がリンカーとして使用され得る。例えば、ＷＯ１９９６／３４１０３を参照されたい。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーは、フレキシブルリンカーである。例示的なフレキシブルリンカーとしては、グリシンポリマー、グリシン－セリンポリマー、グリシン－アラニンポリマー、アラニン－セリンポリマー、及び当該技術分野において知られている他のフレキシブルリンカーが挙げられるが、これらに限定されない。
当該技術分野において知られている他のリンカー、例えば、ＷＯ２０１６０１４７８９、ＷＯ２０１５１５８６７１、ＷＯ２０１６１０２９６５、ＵＳ２０１５０２９９３１７、ＷＯ２０１８０６７９９２、ＵＳ７７４１４６５、Ｃｏｌｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８２：１１９１－１１９７（１９９０）、及びＢｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６（１９８８）に記載されるものもまた、本明細書で提供されるＣＡＲに含めることができ、そのそれぞれの開示は、参照により本明細書に援用される。
５．３．８．例示的なＣＡＲ
Ｃ８－ＣＡＲ、Ｃ１２－ＣＡＲ、Ｃ１３－ＣＡＲ、Ｃ１５－ＣＡＲ、Ｃ２１－ＣＡＲ、Ｃ２７－ＣＡＲ、Ｃ３０－ＣＡＲ及びＣ３１－ＣＡＲなどの例示的な一価ＣＡＲは、以下のセクション６に示されるように生成される。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、配列番号４８のアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなる、ＣＡＲである。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、配列番号４９のアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなる、ＣＡＲである。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、配列番号５０のアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなる、ＣＡＲである。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、配列番号５１のアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなる、ＣＡＲである。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、配列番号５２のアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなる、ＣＡＲである。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、配列番号５３のアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなる、ＣＡＲである。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、配列番号５４のアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなる、ＣＡＲである。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、配列番号５５のアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなる、ＣＡＲである。
ある特定の実施形態において、本明細書で提供されるＣＡＲは、以下のセクション６に例示されるＣＡＲのいずれか１つに対して、特定の同一性パーセントを有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、配列番号４８のアミノ酸配列に対して、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、ＧＵＣＹ２Ｃ ＣＡＲである。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、配列番号４９のアミノ酸配列に対して、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、ＧＵＣＹ２Ｃ ＣＡＲである。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、配列番号５０のアミノ酸配列に対して、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、ＧＵＣＹ２Ｃ ＣＡＲである。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、配列番号５１のアミノ酸配列に対して、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、ＧＵＣＹ２Ｃ ＣＡＲである。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、配列番号５２のアミノ酸配列に対して、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、ＧＵＣＹ２Ｃ ＣＡＲである。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、配列番号５３のアミノ酸配列に対して、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、ＧＵＣＹ２Ｃ ＣＡＲである。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、配列番号５４のアミノ酸配列に対して、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、ＧＵＣＹ２Ｃ ＣＡＲである。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、配列番号５５のアミノ酸配列に対して、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、ＧＵＣＹ２Ｃ ＣＡＲである。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、本明細書で提供されるＧＵＣＹ２Ｃ ＣＡＲのいずれかをコードする単離された核酸である。核酸配列及びベクターに関するより詳細な説明は、以下に提供される。
５．４．操作された免疫エフェクター細胞
更に別の態様において、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載されるＣＡＲのいずれか１つを含む、宿主細胞（免疫エフェクター細胞など）である。
したがって、いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、（ａ）１つ以上の抗ＧＵＣＹ２Ｃ ｓｄＡｂ（複数可）を含む細胞外抗原結合ドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインとを含む、ポリペプチドを含むＣＡＲを含む操作された免疫エフェクター細胞（Ｔ細胞など）であり、ここで、抗ＧＵＣＹ２Ｃ ｓｄＡｂは、例えば、表７のＶＨＨドメイン及び表７のこれらのＶＨＨドメインのいずれかの１つ、２つまたは３つ全てのＣＤＲを有するものを含む、上のセクション５．２に記載される抗ＧＵＣＹ２Ｃ ｓｄＡｂである。具体的には、いくつかの実施形態において、本明細書に記載される操作された免疫エフェクター細胞のＣＡＲ中の抗ＧＵＣＹ２Ｃ ｓｄＡｂは、（ｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；（ｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；（ｉｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；（ｉｖ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；（ｖ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；（ｖｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；（ｖｉｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または（ｖｉｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態において、抗ＧＵＣＹ２Ｃ ｓｄＡｂは、ラクダ科、キメラ、ヒト、またはヒト科抗体である。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１５２及びＰＤ１からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫エフェクター細胞（Ｔ細胞など）の一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζに由来する。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ３、ＬＦＡ－１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３のリガンド及びこれらの組み合わせからなる群から選択される共刺激分子に由来する。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインのＣ末端と膜貫通ドメインのＮ末端との間に位置するヒンジドメイン（ＣＤ８αヒンジドメインなど）を更に含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、ポリペプチドのＮ末端に位置するシグナルペプチド（ＣＤ８αシグナルペプチドなど）を更に含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＣＤ８αシグナルペプチド、細胞外抗原結合ドメイン、ＣＤ８αヒンジドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ１３７由来の共刺激シグナル伝達ドメイン、及びＣＤ３ζ由来の一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、（ａ）１つ以上の抗ＧＵＣＹ２Ｃ ｓｄＡｂ（複数可）を含む細胞外抗原結合ドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインとを含む、ポリペプチドを含むＣＡＲを含む、操作された免疫エフェクター細胞（Ｔ細胞など）であり、ここで、抗ＧＵＣＹ２Ｃ ｓｄＡｂは、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、（ａ）１つ以上の抗ＧＵＣＹ２Ｃ ｓｄＡｂ（複数可）を含む細胞外抗原結合ドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインとを含む、ポリペプチドを含むＣＡＲを含む、操作された免疫エフェクター細胞（Ｔ細胞など）であり、ここで、抗ＧＵＣＹ２Ｃ ｓｄＡｂは、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０のアミノ酸配列に対して、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１５２及びＰＤ１からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫エフェクター細胞（Ｔ細胞など）の一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζに由来する。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ３、ＬＦＡ－１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３のリガンド及びこれらの組み合わせからなる群から選択される共刺激分子に由来する。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインのＣ末端と膜貫通ドメインのＮ末端との間に位置するヒンジドメイン（ＣＤ８αヒンジドメインなど）を更に含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、ポリペプチドのＮ末端に位置するシグナルペプチド（ＣＤ８αシグナルペプチドなど）を更に含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＣＤ８αシグナルペプチド、細胞外抗原結合ドメイン、ＣＤ８αヒンジドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ１３７由来の共刺激シグナル伝達ドメイン、及びＣＤ３ζ由来の一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、及び配列番号５５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＡＲを含む、操作された免疫エフェクター細胞（Ｔ細胞など）である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、及び配列番号５５からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含むＣＡＲを含む、操作された免疫エフェクター細胞（Ｔ細胞など）である。
他の実施形態において、（ａ）ＧＵＣＹ２Ｃに特異的に結合する第１の単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）及び１つ以上の追加の抗原結合ドメイン（複数可）を含む細胞外抗原結合ドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインとを含む、ポリペプチドを含む多重特異性（二重特異性または三重特異性など）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む、操作された免疫エフェクター細胞（Ｔ細胞など）が提供される。いくつかの実施形態において、第１のｓｄＡｂ及び／または追加のｓｄＡｂは、ラクダ科、キメラ、ヒト、またはヒト化である。いくつかの実施形態において、第１の単一ドメイン抗体及び追加の単一ドメイン抗体は、ペプチド結合またはペプチドリンカーを介して互いに融合される。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーは、約５０を超えない（３５、２５、２０、１５、１０、または５のいずれか１つを超えない）アミノ酸長である。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１５２及びＰＤ１からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫エフェクター細胞（Ｔ細胞など）の一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζに由来する。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ３、ＬＦＡ－１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３のリガンド及びこれらの組み合わせからなる群から選択される共刺激分子に由来する。いくつかの実施形態において、多重特異性ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインのＣ末端と膜貫通ドメインのＮ末端との間に位置するヒンジドメイン（ＣＤ８αヒンジドメインなど）を更に含む。いくつかの実施形態において、多重特異性ＣＡＲは、ポリペプチドのＮ末端に位置するシグナルペプチド（ＣＤ８αシグナルペプチドなど）を更に含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＣＤ８αシグナルペプチド、細胞外抗原結合ドメイン、ＣＤ８αヒンジドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ１３７由来の共刺激シグナル伝達ドメイン、及びＣＤ３ζ由来の一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、操作された免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、造血幹細胞、多能性幹細胞、または胚幹細胞である。いくつかの実施形態において、操作された免疫エフェクター細胞は、自己由来である。いくつかの実施形態において、操作された免疫エフェクター細胞は、同種である。
また、２つ以上の異なるＣＡＲを含む（または発現する）、操作された免疫エフェクター細胞も提供される。本明細書に記載されるＣＡＲのいずれか２つ以上が組み合わせて発現されてもよい。ＣＡＲは、異なる抗原を標的としてもよく、それにより、相乗的または相加的効果が得られる。２つ以上のＣＡＲは、同じベクターまたは異なるベクター上にコードされ得る。
操作された免疫エフェクター細胞は、免疫チェックポイント阻害剤などの１つ以上の治療タンパク質及び／または免疫調節剤を更に発現してもよい。例えば、国際特許出願番号 ＰＣＴ／ＣＮ２０１６／０７３４８９及びＰＣＴ／ＣＮ２０１６／０８７８５５を参照されたく、その全体が参照により本明細書に援用される。
５．４．１．ベクター
本開示は、本明細書に記載されるＣＡＲのいずれか１つをクローニング及び発現するためのベクターを提供する。いくつかの実施形態において、ベクターは、哺乳動物細胞などの真核細胞における複製及び組み込みに好適である。いくつかの実施形態において、ベクターは、ウイルスベクターである。ウイルスベクターの例としては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ワクシニアベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、及びその誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。ウイルスベクター技術は、当該技術分野においてよく知られており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、ならびに他のウイルス学及び分子生物学マニュアルに記載されている。
哺乳動物細胞への遺伝子移入には、いくつかのウイルスベースの系が開発されている。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達系に好都合なプラットフォームを提供する。当該技術分野において知られている技術を使用して、異種核酸をベクターに挿入し、レトロウイルス粒子にパッケージ化することができる。次いで、組み換えウイルスを単離し、操作された哺乳動物細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで送達することができる。いくつかのレトロウイルスシステムが当該技術分野において知られている。いくつかの実施形態において、アデノウイルスベクターが使用される。いくつかのアデノウイルスベクターが当該技術分野において知られている。いくつかの実施形態において、レンチウイルスベクターが使用される。いくつかの実施形態において、自己不活性化レンチウイルスベクターが使用される。例えば、免疫調節剤（免疫チェックポイント阻害剤など）コーディング配列を有する自己不活性化レンチウイルスベクター及び／またはキメラ抗原受容体を有する自己不活性化レンチウイルスベクターは、当該技術分野において知られているプロトコルでパッケージ化することができる。結果として得られるレンチウイルスベクターは、当該技術分野において知られている方法を使用して、哺乳動物細胞（初代ヒトＴ細胞など）を形質導入するために使用することができる。レンチウイルスなどのレトロウイルスに由来するベクターは、導入遺伝子の長期間の安定した組み込み及び子孫細胞におけるその伝播を可能にするので、長期間の遺伝子移入を達成するのに好適なツールである。レンチウイルスベクターはまた、免疫原性が低く、非増殖細胞を形質導入することができる。
いくつかの実施形態において、ベクターは、本明細書に記載されるＣＡＲをコードする核酸のいずれか１つを含む。核酸は、例えば、制限エンドヌクレアーゼ部位及び１つ以上の選択マーカーを使用することを含む、当該技術分野において知られている任意の分子クローニング法を使用して、ベクターにクローニングすることができる。いくつかの実施形態において、核酸は、プロモーターに操作可能に連結される。哺乳動物細胞における遺伝子発現については、様々なプロモーターが探索されており、当該技術分野において知られているプロモーターのいずれも、本開示において使用され得る。プロモーターは、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターなどの制御性プロモーターに大まかに分類され得る。
いくつかの実施形態において、ＣＡＲをコードする核酸は、構成的プロモーターに操作可能に連結される。構成的プロモーターは、異種遺伝子（導入遺伝子とも呼ばれる）を宿主細胞内で構成的に発現させる。本明細書で企図される例示的な構成的プロモーターとしては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ヒト伸長因子－１アルファ（ｈＥＦ１α）、ユビキチンＣプロモーター（ＵｂｉＣ）、ホスホグリセロキナーゼプロモーター（ＰＧＫ）、シミアンウイルス４０初期プロモーター（ＳＶ４０）、及びＣＭＶ初期エンハンサーと結合されたニワトリβ－アクチンプロモーター（ＣＡＧＧ）が挙げられるが、これらに限定されない。そのような構成的プロモーターが導入遺伝子の発現を駆動する効率は、膨大な研究で広く比較されている。例えば、Ｍｉｃｈａｅｌ Ｃ．Ｍｉｌｏｎｅ ｅｔ ａｌは、初代ヒトＴ細胞において、ＣＭＶ、ｈＥＦ１α、ＵｂｉＣ及びＰＧＫがキメラ抗原受容体発現を駆動する効率を比較し、ｈＥＦ１αプロモーターが最高レベルの導入遺伝子発現を誘導するだけでなく、ＣＤ４及びＣＤ８ヒトＴ細胞で最適に維持されるという結論を出した（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，１７（８）：１４５３－１４６４（２００９））。いくつかの実施形態において、ＣＡＲをコードする核酸は、ｈＥＦ１αプロモーターに操作可能に連結される。
いくつかの実施形態において、ＣＡＲをコードする核酸は、誘導性プロモーターに操作可能に連結される。誘導性プロモーターは、制御性プロモーターの分類に属する。誘導性プロモーターは、物理的状態、操作された免疫エフェクター細胞の微小環境、もしくは操作された免疫エフェクター細胞の生理学的状態などの１つ以上の条件、誘導因子（すなわち、誘導剤）、またはこれらの組み合わせによって誘導することができる。
いくつかの実施形態において、誘導条件は、操作された哺乳動物細胞、及び／または医薬組成物を摂取する対象において、内因性遺伝子の発現を誘導しない。いくつかの実施形態において、誘導条件は、誘導因子、照射（電離放射線、光など）、温度（熱など）、酸化還元状態、腫瘍環境、及び操作された哺乳動物細胞の活性化状態からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、ベクターはまた、レンチウイルスベクターによりトランスフェクトされた宿主細胞の集団からＣＡＲを発現する細胞を選択するための選択マーカー遺伝子またはレポーター遺伝子も含有する。選択マーカー及びレポーター遺伝子はいずれも、宿主細胞中での発現を可能にする、適切な制御配列に隣接し得る。例えば、ベクターは、転写及び翻訳ターミネーター、開始配列、及び核酸配列の発現制御に有用なプロモーターを含有し得る。
いくつかの実施形態において、ベクターは、ＣＡＲをコードする２つ以上の核酸を含む。いくつかの実施形態において、ベクターは、第１のＣＡＲをコードする第１の核酸配列及び第２のＣＡＲをコードする第２の核酸配列を含む核酸を含み、ここで、第１の核酸は、自己切断ペプチドをコードする第３の核酸配列を介して、第２の核酸に操作可能に連結される。いくつかの実施形態において、自己切断ペプチドは、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ及びＦ２Ａからなる群から選択される。
５．４．２．免疫エフェクター細胞
「免疫エフェクター細胞」は、免疫エフェクター機能を果たすことができる免疫細胞である。いくつかの実施形態において、免疫エフェクター細胞は、少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を果たす。ＡＤＣＣを媒介する免疫エフェクター細胞の例としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞、好中球、及び好酸球が挙げられる。
いくつかの実施形態において、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋／ＣＤ８－、ＣＤ４－／ＣＤ８＋、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋、ＣＤ４－／ＣＤ８－、またはこれらの組み合わせである。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＡＲを発現し、ＧＵＣＹ２Ｃ＋腫瘍細胞などの標的細胞と結合すると、ＩＬ－２、ＴＦＮ、及び／またはＴＮＦを産生する。いくつかの実施形態において、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＡＲを発現し、標的細胞に結合すると、抗原特異的標的細胞を溶解する。
いくつかの実施形態において、免疫エフェクター細胞は、ＮＫ細胞である。他の実施形態において、免疫エフェクター細胞は、確立された細胞株、例えば、ＮＫ－９２細胞であり得る。
いくつかの実施形態において、免疫エフェクター細胞は、造血幹細胞、多能性幹細胞、ｉＰＳ、または胚幹細胞などの幹細胞から分化される。
操作された免疫エフェクター細胞は、ＣＡＲをＴ細胞などの免疫エフェクター細胞に導入することによって調製される。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、単離された核酸のいずれか１つまたは上に記載されるベクターのいずれか１つをトランスフェクトすることによって、免疫エフェクター細胞に導入される。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、細胞をＣＥＬＬ ＳＱＵＥＥＺＥ（登録商標）などのマイクロ流体システムに通しながら、細胞膜にタンパク質を挿入することによって、免疫エフェクター細胞に導入される（例えば、米国特許出願公開第２０１４０２８７５０９号参照）。
ベクターまたは単離された核酸を哺乳動物細胞に導入する方法は、当該技術分野において知られている。記載のベクターは、物理的、化学的、または生物学的方法によって、免疫エフェクター細胞に移入することができる。
免疫エフェクター細胞にベクターを導入するための物理的方法には、リン酸カルシウム沈殿法、リポフェクション、微粒子銃法、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどが含まれる。ベクター及び／または外因性核酸を含む細胞を作製するための方法は、当該技術分野においてよく知られている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。いくつかの実施形態において、ベクターは、エレクトロポレーションによって細胞に導入される。
免疫エフェクター細胞にベクターを導入するための生物学的方法は、ＤＮＡベクター及びＲＮＡベクターの使用を含む。ウイルスベクターは、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞に遺伝子を挿入するために最も広く使用されている方法である。
免疫エフェクター細胞にベクターを導入するための化学的手段には、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズなどのコロイド分散系、ならびに水中油型エマルション、ミセル、混合ミセル及びリポソームを含む脂質系が含まれる。ｉｎ ｖｉｔｒｏで送達担体として使用するための例示的なコロイド系は、リポソーム（例えば、人工膜小胞）である。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＣＡＲのいずれかをコードするＲＮＡ分子は、従来の方法（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写）によって調製され、次いで、ｍＲＮＡエレクトロポレーションなどの既知の方法を介して免疫エフェクター細胞に導入され得る。例えば、Ｒａｂｉｎｏｖｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １７：１０２７－１０３５（２００６）を参照されたい。
いくつかの実施形態において、形質導入またはトランスフェクトされた免疫エフェクター細胞は、ベクターまたは単離された核酸の導入後、ｅｘ ｖｉｖｏで増殖させる。いくつかの実施形態において、形質導入またはトランスフェクトされた免疫エフェクター細胞は、少なくとも約１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、１０日間、１２日間、または１４日間のいずれかにわたって増殖するように培養される。いくつかの実施形態において、形質導入またはトランスフェクトされた免疫エフェクター細胞は、操作された哺乳動物細胞を選択するために、更に評価またはスクリーニングされる。
トランスフェクトされたと思われる細胞の特定するために、及び制御配列の機能を評価するために、レポーター遺伝子が使用され得る。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエントの有機体もしくは組織中に存在しないか、または発現されていない遺伝子であり、その発現がある程度簡単に検出できる特性、例えば、酵素活性によって顕在化されるポリペプチドをコードする遺伝子である。レポーター遺伝子の発現は、そのＤＮＡがレシピエント細胞に導入された後の好適な時点でアッセイされる。好適なレポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼをコードする遺伝子、または緑色蛍光タンパク質遺伝子を挙げることができる（例えば、Ｕｉ－Ｔｅｉ ｅｔ ａｌ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４７９：７９－８２（２０００））。好適な発現系はよく知られており、既知の技術を使用して調製してもよいし、商業的に入手してもよい。操作された免疫エフェクター細胞中のＣＡＲをコードする核酸の存在を確認する他の方法は、例えば、当業者によく知られた、サザン及びノーザンブロッティング、ＲＴ－ＰＣＲ及びＰＣＲなどの分子生物学的アッセイ；特定のペプチドの有無を検出することなどによる生化学的アッセイ、例えば、免疫学的方法（ＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロットなど）を含む。
５．４．３．Ｔ細胞源
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞の拡大及び遺伝子改変に先立って、対象からＴ細胞源が取得される。Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位由来の組織、腹水、胸水、脾臓組織及び腫瘍を含む、いくつかの供給源から得ることができる。いくつかの実施形態において、当該技術分野において入手可能な様々なＴ細胞株が使用され得る。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ（商標）分離などの当業者に知られている様々な技術を使用して、対象から採取した血液単位から得ることができる。いくつかの実施形態において、個体の循環血に由来する細胞は、アフェレーシスによって得られる。アフェレーシス産物は、典型的に、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球及び血小板を含むリンパ球を含有する。いくつかの実施形態において、アフェレーシスによって採取された細胞は、血漿分画を除去し、後続の処理ステップに適切な緩衝液または培地中に細胞を置くために、洗浄され得る。いくつかの実施形態において、細胞は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄される。いくつかの実施形態において、洗浄液は、カルシウムを欠いており、かつマグネシウムを欠いてもよく、または全てではないにしても多くの二価カチオンを含み得ない。カルシウム不存在下での最初の活性化ステップは、活性化の拡大につながり得る。当業者であれば容易に理解するように、洗浄ステップは、当業者に知られている方法、例えば、半自動化「フロースルー」遠心分離器（例えば、Ｃｏｂｅ ２９９１細胞処理装置、Ｂａｘｔｅｒ ＣｙｔｏＭａｔｅ、またはＨａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｅｌｌ Ｓａｖｅｒ５）を製造元の説明書に従って使用することによって、達成することができる。洗浄後、細胞は、様々な生体適合性緩衝液、例えば、Ｃａ２＋不含Ｍｇ２＋不含ＰＢＳであるＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａ、または緩衝剤含有もしくは不含の他の食塩水などに再懸濁され得る。あるいは、アフェレーシス試料の望ましくない成分を除去し、細胞を培養培地に直接再懸濁してもよい。
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、赤血球を溶解し、単球を枯渇させることによって、例えば、Ｐｅｒｃｏｌｌ（商標）密度勾配による遠心分離または対向流遠心溶出によって、末梢血リンパ球から単離される。Ｔ細胞の特定のサブ集団、例えば、ＣＤ３＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、及びＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞を、ポジティブまたはネガティブ選択技術によって、更に単離することができる。例えば、いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、所望のＴ細胞のポジティブ選択に十分な時間にわたるＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ－４５０ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔなどの抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８（すなわち、３×２８）結合ビーズとのインキュベーションによって単離される。いくつかの実施形態において、時間は、約３０分である。更なる実施形態において、時間は、３０分～３６時間の範囲またはそれより長い時間及びその間の全ての整数値である。更なる実施形態において、時間は、少なくとも１、２、３、４、５、または６時間である。いくつかの実施形態において、時間は、１０～２４時間である。いくつかの実施形態において、インキュベーション時間は、２４時間である。白血病患者からＴ細胞を単離する場合、２４時間などのより長いインキュベーションを使用すると、細胞収率を上げることができる。腫瘍組織または免疫不全の個体から腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を単離する場合などの、他の細胞型と比較してＴ細胞がわずかである任意の状況では、より長いインキュベーション時間を用いてＴ細胞を単離してもよい。更に、より長いインキュベーション時間を用いることで、ＣＤ８＋Ｔ細胞の捕捉効率を高めることができる。したがって、いくつかの実施形態において、Ｔ細胞をＣＤ３／ＣＤ２８ビーズに結合させる時間を単に短縮もしくは延長することによって、及び／またはビーズとＴ細胞の比率を増加もしくは減少させることによって、培養開始時またはプロセス中の他の時点で、Ｔ細胞のサブ集団を優先的に選択または反選択することができる。更に、ビーズまたは他の表面上の抗ＣＤ３及び／または抗ＣＤ２８抗体の比率を増加または減少させることによって、培養開始時または他の所望の時点で、Ｔ細胞のサブ集団を優先的に選択または反選択することができる。当業者であれば、複数ラウンドの選択も使用され得ることを認識するであろう。いくつかの実施形態において、選択手順を実施し、「選択されていない」細胞を活性化及び拡大プロセスに使用することが望ましい場合がある。「選択されていない」細胞はまた、更なるラウンドの選択にかけることもできる。
ネガティブ選択によるＴ細胞集団の濃縮は、ネガティブ選択された細胞に固有の表面マーカーに対する抗体の組み合わせにより達成することができる。１つの方法は、ネガティブ選択された細胞に存在する細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体のカクテルを使用するネガティブ磁気免疫付着またはフローサイトメトリーを介したセルソーティング及び／または細胞選択である。例えば、ネガティブ選択によってＣＤ４＋細胞を濃縮する場合、モノクローナル抗体カクテルは、典型的に、ＣＤ１４、ＧＵＣＹ２Ｃ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ－ＤＲ、及びＣＤ８に対する抗体を含む。ある特定の実施形態において、典型的に、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ６２Ｌｈｉ、ＧＩＴＲ＋、及びＦｏｘＰ３＋を発現する制御性Ｔ細胞を濃縮するか、またはポジティブ選択することが望ましい場合がある。あるいは、ある特定の実施形態において、抗Ｃ２５結合ビーズまたは他の類似の選択方法によって制御性Ｔ細胞が除去される。
ポジティブまたはネガティブ選択によって所望の細胞集団を単離するために、細胞と表面（例えば、ビーズなどの粒子）の濃度を変えることができる。ある特定の実施形態において、細胞とビーズの最大接触を確実にするために、ビーズと細胞の混合体積を大幅に減少させる（すなわち、細胞の濃度を上げる）ことが望ましい場合がある。例えば、一実施形態において、２０億細胞／ｍｌの濃度が使用される。一実施形態において、１０億細胞／ｍｌの濃度が使用される。更なる実施形態において、＞１億細胞／ｍｌが使用される。更なる実施形態において、１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５００万、または５０００万細胞／ｍｌの細胞濃度が使用される。更に別の実施形態において、７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万、または１億細胞／ｍｌからの細胞濃度が使用される。更なる実施形態において、１億２５００万または１億５０００万細胞／ｍｌの濃度が使用される。高濃度の使用は、細胞収率、細胞活性化、及び細胞拡大の増加をもたらし得る。更に、高い細胞濃度を使用すると、ＣＤ２８ネガティブＴ細胞などの目的の標的抗原の発現が弱い細胞をより効率的に捕捉することができ、または多数の腫瘍細胞が存在する試料（すなわち、白血球血液、腫瘍組織など）から細胞をより効率的に捕捉することができる。そのような細胞集団は、治療上の価値を有し得、これを得ることが望ましいであろう。いくつかの実施形態において、高い細胞濃度を使用すると、通常、ＣＤ２８の発現が弱いＣＤ８＋Ｔ細胞のより効率的な選択が可能となる。
いくつかの実施形態において、より低い細胞濃度を使用することが望ましい場合がある。Ｔ細胞と表面（例えば、ビーズなどの粒子）の混合物を大幅に希釈することによって、粒子と細胞との間の相互作用が最小限に抑えられる。これにより、粒子に結合する所望の抗原を豊富に発現する細胞が選択される。例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ２８をより高いレベルで発現し、希釈濃度でＣＤ８＋Ｔ細胞よりも効率的に捕捉される。いくつかの実施形態において、使用される細胞の濃度は、５×１０６／ｍｌである。いくつかの実施形態において、使用される濃度は、約１×１０５／ｍｌ～１×１０６／ｍｌ、及びその間の任意の整数値であり得る。
いくつかの実施形態において、細胞は、回転装置上で、様々な長さの時間、２～１０℃または室温のいずれかで、様々な速度でインキュベートされ得る。
刺激のためのＴ細胞は、洗浄ステップ後に凍結することもできる。理論に束縛されることを望むものではないが、凍結及び後続の解凍ステップは、細胞集団中の顆粒球及びある程度の単球を除去することによって、より均一な産物を提供し得る。血漿及び血小板を除去する洗浄ステップの後、細胞を凍結溶液中に懸濁することができる。多くの凍結溶液及びパラメーターが当該技術分野において知られ、本文脈で有用であるが、１つの方法は、２０％ＤＭＳＯ及び８％ヒト血清アルブミンを含有するＰＢＳ、または１０％デキストラン４０及び５％ブドウ糖、２０％ヒト血清アルブミン及び７．５％ＤＭＳＯ、もしくは３１．２５％Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ－Ａ、３１．２５％ブドウ糖５％、０．４５％ＮａＣｌ、１０％デキストラン４０及び５％ブドウ糖、２０％ヒト血清アルブミンならびに７．５％ＤＭＳＯを含有する培地、または他の好適な細胞凍結培地、例えば、Ｈｅｓｐａｎ及びＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａを含有するものを使用することを伴う。次いで、細胞を－８０℃まで１°／分の速度で凍結し、液体窒素貯蔵タンクの気相中で保存する。他の制御凍結法及び－２０℃または液体窒素中での制御されていない即時凍結も使用され得る。
いくつかの実施形態において、凍結保存細胞は、本明細書に記載されるように解凍及び洗浄され、活性化の前に室温で１時間静置される。
また、本明細書に記載される増殖した細胞が必要とされ得る時点よりも前の時点における、対象からの血液試料またはアフェレーシス産物の採取も本開示で企図される。したがって、増殖される細胞源は、任意の必要な時点で採取することができ、Ｔ細胞などの所望の細胞が単離され、本明細書に記載されるものなどのＴ細胞療法から恩恵を受け得る様々な疾患または状態に対するＴ細胞療法での後の使用のために凍結され得る。一実施形態において、血液試料またはアフェレーシスは、全般的に健康な対象から採取される。ある特定の実施形態において、血液試料またはアフェレーシスは、疾患を発生するリスクがあるが、疾患がまだ発生していない全般的に健康な対象から採取され、目的の細胞が単離され、後の使用のために凍結される。ある特定の実施形態において、Ｔ細胞は、増殖され、凍結され、その後、使用され得る。ある特定の実施形態において、試料は、本明細書に記載される特定の疾患の診断の直後に、任意の治療の前に、患者から採取される。更なる実施形態において、細胞は、薬剤、例えば、ナタリズマブ、エファリズマブ、抗ウイルス剤、化学療法、放射線、免疫抑制剤、例えば、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸エステル及びＦＫ５０６、抗体または他の免疫消失薬、例えば、ＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体、シトキサン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８ならびに放射線照射による治療を含むが、これらに限定されない、様々な関連療法の前に対象から得た血液試料またはアフェレーシスから単離される。これらの薬物は、カルシウム依存性ホスファターゼカルシニューリンを阻害する（シクロスポリン及びＦＫ５０６）か、または成長因子誘導シグナル伝達に重要であるｐ７０Ｓ６キナーゼを阻害する（ラパマイシン）かのいずれかである（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ６６：８０７－８１５（１９９１）；Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎ ７３：３１６－３２１（１９９１）；Ｂｉｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎ．５：７６３－７７３（１９９３））。更なる実施形態において、細胞は、患者のために単離され、骨髄もしくは幹細胞移植、フルダラビンなどのいずれかの化学療法剤を使用するＴ細胞除去療法、体外放射線療法（ＸＲＴ）、シクロホスファミド、またはＯＫＴ３もしくはＣＡＭＰＡＴＨなどの抗体との併用（例えば、その前、それと同時に、またはその後）における、後の使用のために凍結される。別の実施形態において、細胞は、ＧＵＣＹ２Ｃと反応する薬剤、例えば、リツキサンなどのＢ細胞除去療法の前に単離され、Ｂ細胞除去療法に続く治療に対する後の使用のために凍結され得る。
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、治療後の患者から直接得られる。この点について、ある特定のがん治療、特に、免疫系に損傷を与える薬物による治療後、通常であれば患者が治療から回復している期間中の治療直後に得られるＴ細胞の質が最適であるか、またはｅｘ ｖｉｖｏでの増殖能力が改善され得ることが観察されている。同様に、これらの細胞は、本明細書に記載される方法を使用したｅｘ ｖｉｖｏ操作の後、生着及びｉｎ ｖｉｖｏ拡大の向上に好ましい状態にあり得る。したがって、この回復期中に、Ｔ細胞、樹状細胞または他の造血系細胞を含む血液細胞を採取することは、本開示の範囲内であることが意図される。更に、ある特定の実施形態において、動員（例えば、ＧＭ－ＣＳＦによる動員）及び移植前処置を使用して、対象において、特に、治療法後の所定の時間内に、特定の細胞型の再増殖、再循環、再生及び／または拡大が促進される状態を作り上げることができる。例示的な細胞型としては、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、及び免疫系の他の細胞が挙げられる。
５．４．４．Ｔ細胞の活性化及び拡大
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、本明細書に記載されるＣＡＲを用いたＴ細胞の遺伝子改変の前または後に、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号；同第６，５３４，０５５号；同第６，９０５，６８０号；同第６，６９２，９６４号；同第５，８５８，３５８号；同第６，８８７，４６６号；同第６，９０５，６８１号；同第７，１４４，５７５号；同第７，０６７，３１８号；同第７，１７２，８６９号；同第７，２３２，５６６号；同第７，１７５，８４３号；同第５，８８３，２２３号；同第６，９０５，８７４号；同第６，７９７，５１４号；同第６，８６７，０４１号；及び米国特許出願公開第２００６０１２１００５号に記載される方法を一般に使用して、活性化及び増殖することができる。
一般に、Ｔ細胞は、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体に関連するシグナルを刺激する薬剤及びＴ細胞の表面上の共刺激分子を刺激するリガンドを結合させた表面との接触によって、増殖され得る。特に、Ｔ細胞集団は、本明細書に記載されるように、例えば、抗ＣＤ３抗体もしくはその抗原結合断片、もしくは表面上に固定化された抗ＣＤ２抗体との接触によって、またはカルシウムイオノフォアと組み合わせたプロテインキナーゼＣ活性化剤（例えば、ブリオスタチン）との接触によって、刺激することができる。Ｔ細胞表面上のアクセサリー分子の共刺激については、アクセサリー分子に結合するリガンドが使用される。例えば、Ｔ細胞集団は、Ｔ細胞の増殖を刺激するために適切な条件下で、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体と接触され得る。ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞のいずれかの増殖を刺激するためには、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体。抗ＣＤ３抗体の例としては、ＵＣＨＴ１、ＯＫＴ３、ＨＩＴ３ａ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＵＳ）が挙げられ、当該技術分野において知られている他の方法も同様に使用することができる（Ｇｒａｖｅｓ Ｊ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：２１０２（１９９１）；Ｌｉ Ｂ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １１６：４８７（２００５）；Ｒｉｖｏｌｌｉｅｒ Ａ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １０４：４０２９（２００４））。抗ＣＤ２８抗体の例としては、９．３、Ｂ－Ｔ３、ＸＲ－ＣＤ２８（Ｄｉａｃｌｏｎｅ，Ｂｅｓａｎｃｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）が挙げられ、当該技術分野において一般に知られている他の方法も同様に使用することができる（Ｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｐｒｏｃ．３０（８）：３９７５－３９７７（１９９８）；Ｈａａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９０（９）：１３１９１３２８（１９９９）；Ｇａｒｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ．２２７（１－２）：５３－６３（１９９９））。
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞の一次刺激シグナル及び共刺激シグナルは、異なるプロトコルによって提供されてもよい。例えば、各シグナルをもたらす薬剤は、溶液中に存在し得るか、または表面にカップリングされ得る。表面にカップリングされる場合、薬剤は、同じ表面にカップリングされてもよいし（すなわち、「シス」形成）、別の表面にカップリングされてもよい（すなわち、「トランス」形成）。あるいは、一方の薬剤が表面にカップリングされ、他方の薬剤が溶液中にあってもよい。一実施形態において、共刺激シグナルをもたらす薬剤は、細胞表面に結合しており、一次活性化シグナルをもたらす薬剤は、溶液中に存在するか、または表面にカップリングされる。ある特定の実施形態において、両方の薬剤が、溶液中に存在し得る。別の実施形態において、薬剤は、可溶形態であり得、次いで、Ｆｃ受容体もしくは抗体を発現する細胞または薬剤に結合する他の結合剤の表面に架橋されてもよい。この点については、例えば、本開示のある特定の実施形態において、Ｔ細胞を活性化及び増殖するために使用することが企図される人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）に関して、米国特許出願公開第２００４０１０１５１９号及び同第２００６００３４８１０号を参照されたい。
いくつかの実施形態において、薬剤をコーティングしたビーズとＴ細胞を合わせ、その後、ビーズ及び細胞を分離し、次いで、細胞を培養する。代替的実施形態において、培養前に、薬剤をコーティングしたビーズ及び細胞を分離せず、一緒に培養する。更なる実施形態において、ビーズ及び細胞は、まず、磁力などの力を加えることによって濃縮し、細胞表面マーカーのライゲーションを増加させることにより、細胞刺激を誘導する。
例として、細胞表面タンパク質のライゲーションは、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８が結合した常磁性ビーズ（３×２８ビーズ）をＴ細胞に接触させることによって行うことができる。一実施形態において、細胞（例えば、１０４～４×１０８個のＴ細胞）及びビーズ（例えば、推奨力価１：１００の抗ＣＤ３／ＣＤ２８ ＭＡＣＳｉＢｅａｄ粒子）を、緩衝液、好ましくは、ＰＢＳ（カルシウム及びマグネシウムなどの二価カチオンを含まない）中で混合する。当業者であれば、いかなる細胞濃度も使用され得ることを容易に理解することができるであろう。例えば、標的細胞は、試料中に極めて少なく、試料の０．０１％しか含まれない場合もあれば、試料全体（すなわち、１００％）が目的の標的細胞で構成されることもある。したがって、あらゆる細胞数が本開示の文脈に含まれる。ある特定の実施形態において、細胞と粒子の最大接触を確実にするために、粒子と細胞の混合体積を大幅に減少させる（すなわち、細胞の濃度を上げる）ことが望ましい場合がある。例えば、一実施形態において、約２０億細胞／ｍＬの濃度が使用される。別の実施形態において、＞１億細胞／ｍＬが使用される。更なる実施形態において、１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５００万、または５０００万細胞／ｍＬの細胞濃度が使用される。更に別の実施形態において、７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万、または１億細胞／ｍＬからの細胞濃度が使用される。更なる実施形態において、１億２５００万または１億５０００万細胞／ｍＬの濃度が使用される。高濃度の使用は、細胞収率、細胞活性化、及び細胞拡大の増加をもたらし得る。更に、高い細胞濃度を使用すると、ＣＤ２８ネガティブＴ細胞などの目的の標的抗原の発現が弱い細胞をより効率的に捕捉することができる。そのような細胞集団は、ある特定の実施形態において、治療上の価値を有し得、これを得ることが望ましいであろう。例えば、高い細胞濃度を使用すると、通常、ＣＤ２８の発現が弱いＣＤ８＋Ｔ細胞の効率的な選択が可能となる。
いくつかの実施形態において、混合物は、数時間（約３時間）～約１４日間またはその間の任意の時間単位の整数値の間、培養され得る。別の実施形態において、混合物は、２１日間培養され得る。一実施形態において、ビーズ及びＴ細胞は、一緒に、約８日間培養される。別の実施形態において、ビーズ及びＴ細胞は、一緒に、２～３日間培養される。Ｔ細胞の培養時間が６０日以上になり得るように、数サイクルの刺激が望ましい場合もある。Ｔ細胞培養に適切な条件は、血清（例えば、ウシまたはヒト胎児血清）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インスリン、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＴＧＦβ、及びＴＮＦ－αを含む増殖及び生存に必要な因子、または当業者に知られている細胞成長のための任意の他の添加物を含有し得る、適切な培地（例えば、最小必須培地もしくはＲＰＭＩ培地１６４０またはＸ－ｖｉｖｏ１５、（Ｌｏｎｚａ））を含む。細胞成長のための他の添加物には、界面活性剤、ピアスマネート、ならびにＮ－アセチル－システイン及び２－メルカプトエタノールなどの還元剤が含まれるが、これらに限定されない。培地は、ＲＰＭＩ１６４０、ＡＩＭ－Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、α－ＭＥＭ、Ｆ－１２、Ｘ－Ｖｉｖｏ１５、及びＸ－Ｖｉｖｏ２０、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒを含み得、これには、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、及びビタミンが追加され、無血清であるか、または適量の血清（または血漿）もしくは定義された一連のホルモン、及び／またはＴ細胞の成長及び拡大に十分な量のサイトカイン（複数可）が添加される。抗生物質、例えば、ペニシリン及びストレプトマイシンは、実験培地中にのみ含まれ、対象に注入される細胞の培養物中には含まれない。標的細胞は、成長を支持するのに必要な条件下、例えば、適切な温度（例えば、３７℃）及び雰囲気（例えば、大気圧＋５％ＣＯ２）に維持される。刺激への曝露時間が異なるＴ細胞は、異なる特徴を呈し得る。例えば、典型的な血液またはアフェレーシスで得られた末梢血の単核細胞産物は、細胞傷害性または抑制性Ｔ細胞集団（ＴＣ、ＣＤ８）よりも大きいヘルパーＴ細胞集団（ＴＨ、ＣＤ４＋）を有する。ＣＤ３及びＣＤ２８受容体を刺激することによるＴ細胞のｅｘ ｖｉｖｏ拡大は、約８～９日目以前には、主にＴＨ細胞からなるＴ細胞集団をもたらすが、約８～９日目以降には、Ｔ細胞集団は、次第に増加するＴＣ細胞集団を含む。したがって、治療目的に応じて、主にＴＨ細胞を含むＴ細胞集団を対象に注入することが有利な場合がある。同様に、ＴＣ細胞の抗原特異的サブセットが単離された場合、このサブセットを更に多く増殖させることが有益であり得る。
更に、ＣＤ４及びＣＤ８マーカーに加えて、他の表現型マーカーも細胞拡大プロセス中に大きく変化するが、大部分は再現可能である。したがって、このような再現性により、活性化Ｔ細胞産物を特定の目的に合わせて調整することが可能になる。
５．５．ポリヌクレオチド
ある特定の実施形態において、本開示は、ＧＵＣＹ２Ｃに結合する単一ドメイン抗体及び本明細書に記載されるＧＵＣＹ２Ｃに結合する単一ドメイン抗体を含む融合タンパク質をコードする、ポリヌクレオチド提供する。本開示のポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形態またはＤＮＡの形態であり得る。ＤＮＡは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡを含み、二本鎖または一本鎖であり得、一本鎖の場合、コーディング鎖でも非コーディング（アンチセンス鎖）鎖でもよい。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡの形態である。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、合成ポリヌクレオチドである。
例示的な実施形態において、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号３の配列を有する単一ドメイン抗体をコードする配列、例えば、配列番号１１を有する核酸を含む。
例示的な実施形態において、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号４の配列を有する単一ドメイン抗体をコードする配列、例えば、配列番号１２を有する核酸を含む。
例示的な実施形態において、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号５の配列を有する単一ドメイン抗体をコードする配列、例えば、配列番号１３を有する核酸を含む。
例示的な実施形態において、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号６の配列を有する単一ドメイン抗体をコードする配列、例えば、配列番号１４を有する核酸を含む。
例示的な実施形態において、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号７の配列を有する単一ドメイン抗体をコードする配列、例えば、配列番号１５を有する核酸を含む。
例示的な実施形態において、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号８の配列を有する単一ドメイン抗体をコードする配列、例えば、配列番号１６を有する核酸を含む。
例示的な実施形態において、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号９の配列を有する単一ドメイン抗体をコードする配列、例えば、配列番号１７を有する核酸を含む。
例示的な実施形態において、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号１０の配列を有する単一ドメイン抗体をコードする配列、例えば、配列番号１８を有する核酸を含む。
ある特定の実施形態において、本開示は、本明細書で提供されるＧＵＣＹ２Ｃ ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを提供する。本開示のポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形態またはＤＮＡの形態であり得る。ＤＮＡは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡを含み、二本鎖または一本鎖であり得、一本鎖の場合、コーディング鎖でも非コーディング（アンチセンス鎖）鎖でもよい。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡの形態である。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、合成ポリヌクレオチドである。
例示的な実施形態において、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号４８の配列を有するＣＡＲをコードする配列、例えば、配列番号５６を有する核酸を含む。
例示的な実施形態において、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号４９の配列を有するＣＡＲをコードする配列、例えば、配列番号５７を有する核酸を含む。
例示的な実施形態において、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号５０の配列を有するＣＡＲをコードする配列、例えば、配列番号５８を有する核酸を含む。
例示的な実施形態において、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号５１の配列を有するＣＡＲをコードする配列、例えば、配列番号５９を有する核酸を含む。
例示的な実施形態において、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号５２の配列を有するＣＡＲをコードする配列、例えば、配列番号６０を有する核酸を含む。
例示的な実施形態において、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号５３の配列を有するＣＡＲをコードする配列、例えば、配列番号６１を有する核酸を含む。
例示的な実施形態において、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号５４の配列を有するＣＡＲをコードする配列、例えば、配列番号６２を有する核酸を含む。
例示的な実施形態において、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号５５の配列を有するＣＡＲをコードする配列、例えば、配列番号６３を有する核酸を含む。
本開示は、本明細書に記載されるポリヌクレオチドのバリアントに更に関し、ここで、バリアントは、例えば、本開示のＧＵＣＹ２Ｃに結合する単一ドメイン抗体またはＣＡＲの断片、類似体、及び／または誘導体をコードする。ある特定の実施形態において、本開示は、本開示のＧＵＣＹ２Ｃに結合する単一ドメイン抗体またはＣＡＲをコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも約７５％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、いくつかの実施形態において、少なくとも約９６％、９７％、９８％または９９％の同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチドを提供する。本明細書で使用される場合、「参照ヌクレオチド配列に対して、少なくとも、例えば、９５％「同一である」ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド」という文言は、ポリヌクレオチド配列が参照ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチドあたり最大５個の点変異を含み得ることを除き、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列と同一であることを意味することが意図される。言い換えれば、参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列のヌクレオチドの最大５％を欠失させるか、別のヌクレオチドで置換することができ、または参照配列の全ヌクレオチドの最大５％の数のヌクレオチドを参照配列に挿入することができる。参照配列のこれらの変異は、参照ヌクレオチド配列の５′もしくは３′末端位置またはこれらの末端位置の間の任意の場所に存在し得、参照配列中のヌクレオチド間に個々に散在するか、または参照配列内の１つ以上の連続したグループのいずれかである。
ポリヌクレオチドバリアントは、コーディング領域、非コーディング領域、またはその両方に改変を含有し得る。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドバリアントは、サイレント置換、付加、または欠失をもたらす改変を含有するが、コードされるポリペプチドの特性または活性は、変わらない。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドバリアントは、ポリペプチドのアミノ酸配列に変化をもたらさないサイレント置換を含む（遺伝コードの縮重による）。ポリヌクレオチドバリアントは、様々な理由で、例えば、特定の宿主に対してコドン発現を最適化するために作製することができる（すなわち、ヒトｍＲＮＡ中のコドンをＥ．ｃｏｌｉなどの細菌宿主によって好まれるものに変更する）。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドバリアントは、配列の非コーディング領域またはコーディング領域に少なくとも１つのサイレント変異を含む。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドバリアントは、コードされるポリペプチドの発現（または発現レベル）を調節または改変するために作製される。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドバリアントは、コードされるポリペプチドの発現を増加させるために作製される。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドバリアントは、コードされるポリペプチドの発現を減少させるために作製される。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドバリアントは、親ポリヌクレオチド配列と比較して、コードされるポリペプチドの発現が増加する。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドバリアントは、親ポリヌクレオチド配列と比較して、コードされるポリペプチドの発現が減少する。
本明細書に記載される核酸分子を含むベクターも提供される。一実施形態において、核酸分子は、組み換え発現ベクターに組み込むことができる。本開示は、本開示の核酸のいずれかを含む、組み換え発現ベクターを提供する。本明細書で使用される場合、「組み換え発現ベクター」という用語は、宿主細胞によるｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドの発現を可能にする遺伝子改変されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのコンストラクトを意味し、ここで、コンストラクトは、ｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ベクターは、当該ｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドが細胞内で発現されるのに十分な条件下で細胞と接触させる。本明細書に記載されるベクターは、全体として天然に存在するものではないが、ベクターの一部は、天然に存在し得る。記載される組み換え発現ベクターは、限定するものではないが、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む、任意のタイプのヌクレオチドを含み得、一本鎖または二本鎖であっても、合成されたものであっても、一部が天然源から得られたものでもよく、天然、非天然または改変ヌクレオチドを含有し得る。組み換え発現ベクターは、天然に存在するもしくは天然に存在しないヌクレオチド間連結を含み得、または両方のタイプの連結を含んでもよい。天然に存在しないもしくは改変されたヌクレオチドまたはヌクレオチド間連結は、ベクターの転写または複製を阻害しない。
一実施形態において、本開示の組み換え発現ベクターは、任意の好適な組み換え発現ベクターであり得、任意の好適な宿主の形質転換またはトランスフェクトに使用することができる。好適なベクターは、プラスミド及びウイルスなど、増殖及び拡大もしくは発現またはその両方のために設計されたものを含む。ベクターは、ｐＵＣシリーズ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｌｅｎ Ｂｕｒｎｉｅ，Ｍｄ．）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔシリーズ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）、ｐＥＴシリーズ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、ｐＧＥＸシリーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、及びｐＥＸシリーズ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）からなる群から選択することができる。λＧＴ１０、λＧＴ１１、λＥＭＢＬ４、及びλＮＭ１１４９、λＺａｐＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）などのバクテリオファージベクターも使用することができる。植物発現ベクターの例としては、ｐＢＩ０１、ｐＢＩ０１．２、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ１０１．３、及びｐＢＩＮ１９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が挙げられる。動物発現ベクターの例としては、ｐＥＵＫ－Ｃｌ、ｐＭＡＭ、及びｐＭＡＭｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が挙げられる。組み換え発現ベクターは、ウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクター、例えば、ガンマレトロウイルスベクターであり得る。
一実施形態において、組み換え発現ベクターは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（上掲）、及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（上掲）に記載される標準的な組み換えＤＮＡ技術を使用して調製される。発現ベクターのコンストラクトは、環状または線状であり、原核または真核生物の宿主細胞で機能する複製系を含有するように調製することができる。複製系は、例えば、ＣｏｌＥ１、ＳＶ４０、２μプラスミド、λ、ウシパピローマウイルスなどに由来し得る。
組み換え発現ベクターは、ベクターがＤＮＡまたはＲＮＡベースであるかどうかを適宜考慮しつつ、ベクターが導入される宿主タイプ（例えば、細菌、植物、真菌、または動物）に特異的な転写及び翻訳の開始及び終結コドンなどの制御配列を含み得る。
組み換え発現ベクターは、形質転換またはトランスフェクトされた宿主の選択を可能にする１つ以上のマーカー遺伝子を含み得る。マーカー遺伝子は、バイオサイド耐性、例えば、抗生物質、重金属などへの耐性、栄養要求性宿主において原栄養性を与える補償などを含む。記載される発現ベクターに好適なマーカー遺伝子には、例えば、ネオマイシン／Ｇ４１８耐性遺伝子、ヒスチジノールｘ耐性遺伝子、ヒスチジノール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、及びアンピシリン耐性遺伝子が含まれる。
組み換え発現ベクターは、本開示のヌクレオチド配列に操作可能に連結された天然または通常のプロモーターを含み得る。プロモーターの選択、例えば、強い、弱い、組織特異的、誘導性及び発生特異的などの選択は、当業者の通常の技術の範囲内である。同様に、ヌクレオチド配列とプロモーターの組み合わせも当業者の通常の技術の範囲内である。プロモーターは、非ウイルスプロモーターまたはウイルスプロモーター、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、またはマウス幹細胞ウイルスの長末端反復に見られるプロモーターであり得る。
組み換え発現ベクターは、一過性発現、安定発現、またはその両方のいずれかの設計が可能である。また、組み換え発現ベクターは、構成的発現用または誘導性発現用として作製することができる。
更に、組み換え発現ベクターは、自殺遺伝子を含むように作製することができる。本明細書で使用される場合、「自殺遺伝子」という用語は、自殺遺伝子を発現する細胞を死滅される遺伝子を指す。自殺遺伝子は、当該遺伝子を発現する細胞に、薬剤、例えば、薬物に対する感受性を付与し、細胞がその薬剤と接触するか、またはその薬剤に曝露したときに細胞を死滅させる遺伝子であり得る。自殺遺伝子は、当該技術分野において知られており、例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、シトシンデアミナーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、及びニトロレダクターゼを含む。
ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、単離される。ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、実質的に純粋である。
本明細書に記載される核酸分子を含む宿主細胞もまた提供される。宿主細胞は、異種核酸を含有する任意の細胞であり得る。異種核酸は、ベクター（例えば、発現ベクター）であり得る。例えば、宿主細胞は、細胞による物質の産生、例えば、細胞による遺伝子、ＤＮＡもしくはＲＮＡ配列、タンパク質または酵素の発現のために、任意の方法で、選択、改変、形質転換、成長、使用、または操作される任意の生物に由来する細胞であり得る。適切な宿主が決定され得る。例えば、宿主細胞は、ベクター骨格及び所望の結果に基づいて選択され得る。例として、数種類のベクターの複製のために、プラスミドまたはコスミドを原核生物宿主細胞に導入することができる。ベクター複製及び／または発現のために、細菌細胞、例えば、限定するものではないが、ＤＨ５α、ＪＭ１０９、及びＫＣＢ、ＳＵＲＥ（登録商標）コンピテント細胞、及びＳＯＬＯＰＡＣＫ Ｇｏｌｄ細胞を宿主細胞として使用することができる。更に、Ｅ．ｃｏｌｉ ＬＥ３９２などの細菌細胞をファージウイルスのための宿主細胞として使用することもできる。宿主細胞として使用することができる真核細胞には、酵母（例えば、ＹＰＨ４９９、ＹＰＨ５００及びＹＰＨ５０１）、昆虫及び哺乳動物が含まれるが、これらに限定されない。ベクターの複製及び／または発現のための哺乳動物の真核生物宿主細胞の例としては、ＨｅＬａ、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｊｕｒｋａｔ、２９３、ＣＯＳ、Ｓａｏｓ、ＰＣ１２、ＳＰ２／０（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ、ＣＲＬ－１５８１）、ＮＳ０（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ，ＵＫ、ＥＣＡＣＣ Ｎｏ．８５１１０５０３）、ＦＯ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６４６）及びＡｇ６５３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８０）マウス細胞株が挙げられるが、これらに限定されない。例示的なヒト骨髄腫細胞株は、Ｕ２６６（ＡＴＣＣＣＲＬ－ＴＩＢ－１９６）である。他の有用な細胞株には、ＣＨＯ－Ｋ１ＳＶ（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、ＣＨＯ－Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－６１）またはＤＧ４４などのチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に由来するものが含まれる。
５．６．医薬組成物
一態様において、本開示は、本開示の単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体を含む結合分子もしくは治療分子、または操作された免疫エフェクター細胞を含む、医薬組成物を更に提供する。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、治療上有効な量の、本開示の単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体を含む結合分子もしくは治療分子、または操作された免疫エフェクター細胞と、薬学的に許容される賦形剤とを含む。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、治療上有効な量の本明細書で提供される単一ドメイン抗体と、薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物である。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、治療上有効な量の本明細書で提供される単一ドメイン抗体を含む治療分子（融合タンパク質、イムノコンジュゲート、及び多重特異性結合分子など）と、薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物である。
他の実施形態において、本明細書で提供されるのは、治療上有効な量の本明細書で提供される単一ドメイン抗体を含むＣＡＲと、薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物である。
他の実施形態において、本明細書で提供されるのは、治療上有効な量の本明細書で提供される操作された免疫エフェクター細胞と、薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物である。
他の実施形態において、本明細書で提供されるのは、例えば、遺伝子療法に好適である、治療上有効な量の本明細書で提供される核酸（例えば、ベクター中）と、薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物である。
具体的な一実施形態において、「賦形剤」という用語は、希釈剤、アジュバント（例えば、フロイントアジュバント（完全または不完全）、担体またはビヒクルも指し得る。薬学的賦形剤は、滅菌された水及び油などの液体であり得、石油、動物、植物、または合成起源のもの、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、ミネラルオイル、ゴマ油などを含む。生理食塩水ならびにデキストロース水溶液及びグリセロール水溶液もまた、液体賦形剤として用いることができる。好適な薬学的賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなども含まれる。組成物はまた、所望により、微量の湿潤剤または乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含有し得る。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、徐放性製剤などの形態を取り得る。好適な薬学的賦形剤の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９０）Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ．に記載されている。そのような組成物は、予防上または治療上有効な量の本明細書で提供される有効成分を、精製された形態などで、患者に適切な投与形態を提供するように好適な量の賦形剤とともに含有するであろう。製剤は、投与様式に適したものである必要がある。
いくつかの実施形態において、賦形剤の選択は、部分的には、特定の細胞、結合分子、及び／または抗体によって、及び／または投与方法によって決定される。したがって、様々な好適な製剤が存在する。
典型的に、許容される担体、賦形剤、または安定剤は、採用される投薬量及び濃度でレシピエントに対して無毒であり、緩衝液、アスコルビン酸、メチオニン、ビタミンＥ、二亜硫酸ナトリウムを含む抗酸化剤；防腐剤、等張化剤、安定剤、金属複合体（例えば、Ｚｎ－タンパク質複合体）；ＥＤＴＡなどのキレート剤及び／または非イオン性界面活性剤を含む。
緩衝液は、特に、安定性がｐＨ依存性である場合、治療効果を最適化する範囲にｐＨを制御するために使用され得る。本開示とともに使用するための好適な緩衝剤は、有機酸及び無機酸の両方ならびにそれらの塩を含む。例えば、クエン酸塩、リン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、酢酸塩。更に、緩衝液は、ヒスチジン及びトリメチルアミン塩、例えば、トリスを含み得る。
防腐剤は、微生物の成長を遅延させるために添加され得る。本開示との使用に好適な防腐剤には、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；ベンザルコニウムハロゲン化物（例えば、塩化物、臭化物、ヨウ化物）、塩化ベンゼトニウム；チメロサール、フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール、３－ペンタノール、及びｍ－クレゾールが含まれる。
等張化剤は、ときに「安定剤」としても知られ、組成物中の液体の等張性を調整または維持するために存在し得る。等張化剤は、タンパク質及び抗体などの大きい荷電生体分子と併用される場合、アミノ酸側鎖の荷電基と相互作用することにより、分子内及び分子間相互作用の可能性を減少させることができるので、「安定剤」と呼ばれることが多い。例示的な等張化剤には、多価糖アルコール、三価以上の糖アルコール、例えば、グリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール及びマンニトールが挙げられる。
追加の例示的な賦形剤としては、（１）増量剤、（２）溶解促進剤、（３）安定剤及び（４）変性または容器の壁への付着を防止する薬剤が挙げられる。そのような賦形剤には、多価糖アルコール（上に列挙されるもの）；アラニン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、リシン、オルニチン、ロイシン、２－フェニルアラニン、グルタミン酸、トレオニンなどのアミノ酸；スクロース、ラクトース、ラクチトール、トレハロース、スタキオース、マンノース、ソルボース、キシロース、リボース、リビトール、ミオイニシトース、ミオイニシトール、ガラクトース、ガラクチトール、グリセロール、シクリトール（例えば、イノシトール）、ポリエチレングリコールなどの有機糖または糖アルコール；尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、α－モノチオグリセロール及びチオ硫酸ナトリウムなどの硫黄含有還元剤；ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチンまたは他の免疫グロブリンなどの低分子量タンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；単糖（例えば、キシロース、マンノース、フルクトース、グルコース；二糖（例えば、ラクトース、マルトース、スクロース）；ラフィノースなどの三糖；及びデキストリンまたはデキストランなどの多糖が含まれる。
非イオン性界面活性剤または洗剤（「湿潤剤」としても知られる）は、治療薬剤の溶解を助けるだけでなく、攪拌による凝集から治療タンパク質を保護するために存在し得、これはまた、活性治療タンパク質または抗体の変性を引き起こすことなく、剪断表面応力に製剤を曝すことも可能にする。好適な非イオン性界面活性剤には、例えば、ポリソルベート（２０、４０、６０、６５、８０、など）、ポリオキサマー（１８４、１８８、など）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）ポリオール、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル（ＴＷＥＥＮ（登録商標）－２０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）－８０、など）、ラウロマクロゴール４００、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油１０、５０及び６０、モノステアリン酸グリセロール、スクロース脂肪酸エステル、メチルセルロース、ならびにカルボキシメチルセルロースが含まれる。使用することができるアニオン性洗剤には、ラウリル硫酸ナトリウム、スルホコハク酸ジオクチルナトリウム及びスルホン酸ジオクチルナトリウムが含まれる。カチオン性洗剤には、塩化ベンザルコニウムまたは塩化ベンゼトニウムが含まれる。
ｉｎ ｖｉｖｏ投与に使用される医薬組成物は、好ましくは、無菌である。医薬組成物は、無菌濾過膜を通す濾過によって、無菌化され得る。本明細書の医薬組成物は、一般に、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針で貫通可能な栓を有する静脈内注射用溶液バッグまたはバイアル中に入れることができる。
投与経路は、好適な様式、例えば、皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、病巣内もしくは関節内経路による注射もしくは注入、局所投与、吸入での単回もしくは複数回のボーラスまたは長期間の注入、または持続放出性もしくは長期放出手段による、既知の許容される方法に従う。
別の実施形態において、医薬組成物は、制御放出または持続放出性系として提供することができる。一実施形態において、ポンプを使用して制御放出または持続放出を達成してもよい（例えば、Ｓｅｆｔｏｎ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１－４０（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｕｒｇｅｒｙ ８８：５０７－１６（１９８０）；及びＳａｕｄｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５６９－７４（１９８９）参照）。別の実施形態において、ポリマー材料を使用して、予防薬もしくは治療薬（例えば、本明細書に記載される融合タンパク質）または本明細書で提供される組成物の制御放出または持続放出性を達成することができる（例えば、Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ（Ｌａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｗｉｓｅ ｅｄｓ．，１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（Ｓｍｏｌｅｎ ａｎｄ Ｂａｌｌ ｅｄｓ．，１９８４）；Ｒａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｐｅｐｐａｓ，Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１－１２６（１９８３）；Ｌｅｖｙ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１９０－９２（１９８５）；Ｄｕｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１－５６（１９８９）；Ｈｏｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５－１２（１９８９）；米国特許第５，６７９，３７７号；同第５，９１６，５９７号；同第５，９１２，０１５号；同第５，９８９，４６３号；ならびに同第５，１２８，３２６号；ＰＣＴ公開第ＷＯ９９／１５１５４号及び第ＷＯ９９／２０２５３号参照）。持続放出性製剤に使用されるポリマーの例としては、ポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン－ｃｏ－ビニルアセテート）、ポリ（メタクリル酸）、ポリグリコリド（ＰＬＧ）、ポリ無水物、ポリ（Ｎ－ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）（ＰＬＧＡ）、及びポリオルトエステルが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、持続放出性製剤に使用されるポリマーは、不活性であり、浸出性不純物を含まず、保管時に安定であり、無菌であり、生分解性である。更に別の実施形態において、制御放出または持続放出性系は、特定の標的組織、例えば、鼻腔または肺の近くに配置することができるので、全身用量の一部しか必要としない（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｖｏｌ．２，１１５－３８（１９８４）参照）。制御放出系は、例えば、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７－３３（１９９０）によって考察されている。当業者に知られている任意の技術を使用して、本明細書に記載される１つ以上の薬剤を含む持続放出性製剤を生産することができる（例えば、米国特許第４，５２６，９３８号、ＰＣＴ公開第ＷＯ９１／０５５４８号及び同第ＷＯ９６／２０６９８号、Ｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ ＆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ３９：１７９－８９（１９９６）；Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＰＤＡ Ｊ．ｏｆ Ｐｈａｒｍａ．Ｓｃｉ．＆ Ｔｅｃｈ．５０：３７２－９７（１９９５）；Ｃｌｅｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏ．Ｉｎｔ’ｌ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．２４：８５３－５４（１９９７）；ならびにＬａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ’ｌ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．２４：７５９－６０（１９９７）参照）。
本明細書に記載される医薬組成物はまた、治療される特定の適応に必要であれば、２つ以上の活性化合物または薬剤を含有し得る。代替的または付加的に、組成物は、細胞傷害性剤、化学療法剤、サイトカイン、免疫抑制剤、または成長阻害剤を含み得る。そのような分子は、好適には、意図された目的に対して有効な量で組み合わせて存在する。
活性成分はまた、例えば、コアセルベーション技術もしくは界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチンのマイクロカプセル及びポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中、コロイド状薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）中、またはマクロエマルション中に封入され得る。そのような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １８ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎに記載されている。
様々な組成物及び送達システムが知られており、本明細書で提供される治療薬剤とともに使用することができ、限定するものではないが、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル中へのカプセル化、本明細書で提供される単一ドメイン抗体または治療分子を発現することが可能な組み換え細胞、レトロウイルスまたは他のベクターの一部としての核酸の構築などが含まれる。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される医薬組成物は、結合分子及び／または細胞を、疾患または障害を治療または予防するのに有効な量、例えば、治療上有効な量または予防上有効な量で含有する。いくつかの実施形態における治療有効性または予防有効性は、治療対象の定期的な評価によってモニターされる。数日間以上にわたる反復投与の場合、治療は、状態に応じて、疾患症状の所望の抑制が生じるまで繰り返される。しかしながら、他の投薬レジメンも有用であり得、決定することができる。
５．７．方法及び使用
別の態様において、本明細書で提供されるのは、抗ＧＵＣＹ２Ｃ ＶＨＨ、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、及び／または組み換え受容体を発現する操作された細胞を含む、本明細書で提供されるＧＵＣＹ２Ｃ結合分子を使用するための方法及び使用である。
５．７．１．治療法及び使用
そのような方法及び使用には、例えば、ＧＵＣＹ２Ｃを発現するもしくはＧＵＣＹ２Ｃ発現に関連する疾患、状態、もしくは障害を有する対象、及び／または細胞または組織がＧＵＣＹ２Ｃを発現する対象に、当該分子、細胞、またはそれらを含有する組成物を投与することを伴う、治療法及び使用が含まれる。いくつかの実施形態において、分子、細胞、及び／または組成物は、疾患または障害の治療をもたらすのに有効な量で投与される。使用には、そのような方法及び治療における抗体及び細胞の使用、ならびにそのような治療法を実施するための医薬品の調製におけるそれらの使用が含まれる。いくつかの実施形態において、方法は、疾患もしくは障害を有する対象またはその疑いのある対象に、抗体もしくは細胞、またはそれらを含む組成物を投与することによって実施される。いくつかの実施形態において、方法は、それにより、対象における疾患または障害を治療する。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される治療は、疾患もしくは障害、またはそれに関連する症状、有害作用もしくは転帰、または表現型の完全もしくは部分的な改善もしくは低減をもたらす。治療の望ましい効果には、疾患の発生もしくは再発の予防、症状の緩和、疾患の任意の直接的もしくは間接的な病理学的結果の軽減、転移の予防、疾患進行の速度の低下、疾患状態の改善もしくは緩和、ならびに寛解または予後の改善が含まれるが、これらに限定されない。これらの用語には、疾患の完全な治癒、またはすべての症状もしくは転帰に対する任意の症状もしくは作用（複数可）の完全な排除が含まれるが、これを含意するものではない。
本明細書で使用される場合、いくつかの実施形態において、本明細書で提供される治療は、疾患または障害の発生を遅延させる。例えば、疾患（がんなど）の発生を延期させ、阻止し、緩徐化し、遅らせ、安定化させ、抑制し、及び／または先延ばしする。この遅延は、病歴及び／または治療される個体に応じて、様々な時間の長さになり得る。当業者には明らかであるように、十分なまたは大きな遅延は、事実上、個体が疾患または障害を発生しないという点で予防も包含し得る。例えば、転移の発生などの末期がんが遅延され得る。他の実施形態において、本明細書で提供される方法または使用は、疾患または障害を予防する。
いくつかの実施形態において、疾患または障害は、ＧＵＣＹ２Ｃ関連疾患または障害である。いくつかの実施形態において、疾患または障害は、がんである。いくつかの実施形態において、がんは、大腸癌、胃癌または食道癌である。
いくつかの実施形態において、方法は、養子細胞療法を含み、これにより、提供されるＧＵＣＹ２Ｃ標的化ＣＡＲを発現する遺伝子操作された細胞が対象に投与される。そのような投与は、疾患または障害の細胞が破壊の対象となるように、ＧＵＣＹ２Ｃを標的とする方法で、細胞の活性化（例えば、Ｔ細胞活性化）を促進することができる。
いくつかの実施形態において、方法は、疾患もしくは障害を有するか、そのリスクがあるか、またはそれを有することが疑われるものなどの対象、組織、または細胞に、細胞または細胞を含有する組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態において、細胞、集団、及び組成物は、治療される特定の疾患または障害を有する対象に、例えば、養子Ｔ細胞療法などの養子細胞療法により、投与される。いくつかの実施形態において、細胞または組成物は、対象、例えば、疾患もしくは障害を有するか、またはそのリスクがある対象に投与される。いくつかの実施形態において、方法は、それにより、ＧＵＣＹ２Ｃ発現癌における腫瘍組織量を減らすことなどにより、疾患または障害の１つ以上の症状を治療する（例えば、改善する）。
養子細胞療法に関する細胞投与の方法は、例えば、米国特許出願公開第２００３／０１７０２３８号；米国特許第４，６９０，９１５号；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．８（１０）：５７７－８５（２０１１）；Ｔｈｅｍｅｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１（１０）：９２８－９３３（２０１３）；Ｔｓｕｋａｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ４３８（１）：８４－９（２０１３）；及びＤａｖｉｌａ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ ＯＮＥ ８（４）：ｅ６１３３８（２０１３）に記載されているように、知られている。これらの方法は、本明細書で提供される方法及び組成物に関連して使用され得る。
いくつかの実施形態において、細胞療法（例えば、養子Ｔ細胞療法）は、自己移植によって行われ、この場合、細胞は、細胞療法を受ける対象またはかかる対象に由来する試料から単離及び／または別様に調製される。したがって、いくつかの態様において、細胞は、治療を必要とする対象に由来し、細胞は、単離及び処理の後に、同じ対象に投与される。他の実施形態において、細胞療法（例えば、養子Ｔ細胞療法）は、同種移植によって行われ、この場合、細胞は、細胞療法を受けるまたは最終的に受ける対象以外の対象、例えば、第１の対象から単離及び／または別様に調製される。このような実施形態において、次いで、細胞は、同じ種の異なる対象、例えば、第２の対象に投与される。いくつかの実施形態において、第１及び第２の対象は、遺伝的に同一である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の対象は、遺伝的に類似している。いくつかの実施形態において、第２の対象は、第１の対象と同じＨＬＡクラスまたはサブタイプを発現する。
いくつかの実施形態において、細胞、細胞集団、または組成物が投与される対象は、ヒトなどの霊長類である。対象は、男性または女性であり得、乳幼児、若年、青年、成人、及び老年対象を含む、任意の好適な年齢であり得る。いくつかの例において、対象は、疾患、養子細胞療法、及び／または毒性転帰を評価するための検証済み動物モデルである。
ＧＵＣＹ２Ｃ結合分子、例えば、ＶＨＨ及びＶＨＨを含有するキメラ受容体及びそれを発現する細胞は、任意の好適な手段、例えば、注射、例えば、静脈内または皮下注射、眼内注射、眼周囲注射、網膜下注射、硝子体内注射、経隔壁注射、強膜下注射、脈絡膜内注射、前房内注射、結膜下注射、結膜下注射、テノン嚢下注射、球後注射、球周囲注射、または後強膜近傍送達によって、投与することができる。いくつかの実施形態において、非経口、肺内、及び鼻腔内、ならびに局所治療が望ましい場合には病巣内投与によって投与される。非経口注入は、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、または皮下投与を含む。
疾患または状態の予防及び／または治療に有効である、本明細書で提供される予防または治療薬剤の量は、標準的な臨床技術によって決定することができる。有効用量は、インビトロまたは動物モデル試験系から導出される用量反応曲線から推定することができる。疾患の予防または治療の場合、結合分子または細胞の適切な投薬量は、治療される疾患または障害の種類、結合分子の種類、疾患または障害の重症度及び経過、治療薬剤の投与が予防目的または治療目的であるか、以前の治療法、患者の臨床病歴及び薬剤に対する応答、ならびに主治医の裁量に依存し得る。組成物、分子及び細胞は、いくつかの実施形態において、一度にまたは一連の治療にわたって、患者に好適に投与される。
例えば、抗体の投薬量は、疾患の種類及び重症度に応じて、約１０ｕｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ以上を含み得る。複数回用量が断続的に投与されてもよい。最初に高負荷量を投与し、続いて、１回以上の低用量を投与することもできる。医薬組成物が本明細書に記載される単一ドメイン抗体のいずれか１つを含むいくつかの実施形態において、医薬組成物は、投与経路に応じて、１日あたり個体の体重１ｋｇあたり約１０ｎｇ～約１００ｍｇ以下、またはそれ以上、例えば、約１ｍｇ／ｋｇ／日～１０ｍｇ／ｋｇ／日の投薬量で投与される。具体的な投薬量及び送達方法に関する指針は、文献で提供されている（例えば、米国特許第４，６５７，７６０号；同第５，２０６，３４４号；及び同第５，２２５，２１２号参照）。
結合分子を含有する遺伝子操作された細胞との関係において、いくつかの実施形態において、対象は、約１００万～約１０００億個の範囲の細胞及び／または体重１ｋｇあたり当該量の細胞を投与され得る。医薬組成物が本明細書に記載される操作された免疫細胞のいずれか１つを含むいくつかの実施形態において、医薬組成物は、個体の体重１ｋｇあたり約１０４～１０９細胞の投薬量で投与される。投薬量は、疾患もしくは障害及び／または患者及び／または他の治療に特有の属性に応じて変わり得る。
いくつかの実施形態において、医薬組成物は、１回投与される。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、複数回（２、３、４、５、６、またはそれ以上の回数のいずれかなど）投与される。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、投薬サイクル中に１回またか複数回投与される。投薬サイクルは、例えば、１、２、３、４、５週もしくはそれ以上、または１、２、３、４、５ヶ月もしくはそれ以上であり得る。特定の患者に対する最適な投薬量及び治療計画は、医学分野の当業者が、疾患の兆候について患者を観察し、適宜治療を調整することによって、決定され得る。
いくつかの実施形態において、細胞または抗体は、併用治療の一部として投与され、同時または逐次的に、任意の順序で、別の治療介入、例えば、別の抗体または操作された細胞または受容体または薬剤、例えば、細胞傷害性剤または治療薬剤とともに投与される。
いくつかの実施形態において、細胞または抗体は、１つ以上の追加の治療薬剤とともに、または別の治療介入に関連して、同時または任意の順序で逐次的に、共投与される。いくつかの状況において、細胞は、細胞集団が１つ以上の追加の治療薬剤の効果を高めるように、またはその逆になるように、十分に近接した時間で、別の療法と共投与される。いくつかの実施形態において、細胞または抗体は、１つ以上の追加の治療薬剤の前に投与される。いくつかの実施形態において、細胞または抗体は、１つ以上の追加の治療薬剤の後に投与される。
ある特定の実施形態において、細胞が哺乳動物（例えば、ヒト）に投与されたら、いくつかの既知の方法のいずれかによって、操作された細胞集団及び／または抗体の生物学的活性が測定される。評価するパラメーターには、例えば、イメージングによってｉｎ ｖｉｖｏで、または例えば、ＥＬＩＳＡまたはフローサイトメトリーによってｅｘ ｖｉｖｏで、操作されたＴ細胞もしくは天然Ｔ細胞または他の免疫細胞の抗原に対する特異的結合が含まれる。ある特定の実施形態において、操作された細胞が標的細胞を破壊する能力は、例えば、Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，３２（７）：６８９－７０２（２００９）、及びＨｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２８５（１）：２５－４０（２００４）に説明される細胞傷害アッセイなどの当該技術分野で知られている任意の好適な方法を使用して測定することができる。ある特定の実施形態において、細胞の生物学的活性はまた、ＣＤ１０７ａ、ＩＦＮγ、ＩＬ－２、及びＴＮＦなどのある特定のサイトカインの発現及び／または分泌をアッセイすることによって測定することができる。いくつかの態様において、生物学的活性は、腫瘍組織量または腫瘍量の低減などの臨床転帰を評価することによって測定される。
いくつかの具体的な実施形態において、本明細書で提供されるのは、対象における疾患または障害を治療する方法であって、対象に、例えば、表７のＣＤＲを含むものを含む、上のセクション５．２に記載されるＧＵＣＹ２Ｃに結合する単一ドメイン抗体を含む結合分子を投与することを含む、方法であり、例えば、抗ＧＵＣＹ２Ｃ ｓｄＡｂは、（ｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；（ｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；（ｉｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；（ｉｖ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；（ｖ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；（ｖｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；（ｖｉｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または（ｖｉｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態において、ａｄＡｂは、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、もしくは配列番号１０のアミノ酸配列、または配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、もしくは配列番号１０に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％配列の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、疾患または障害は、ＧＵＣＹ２Ｃ関連疾患または障害である。いくつかの実施形態において、疾患または障害は、がんである。いくつかの実施形態において、がんは、大腸癌、胃癌または食道癌である。
他の実施形態において、本明細書で提供されるのは、疾患または障害を治療する方法であって、対象に、例えば、セクション５．３に提供されるＣＡＲを含む細胞を含む、セクション５．４，に提供される操作された免疫エフェクター細胞（Ｔ細胞など）を投与することを含む、方法である。いくつかの実施形態において、対象に投与される操作された免疫細胞は、（ａ）１つ以上の抗ＧＵＣＹ２Ｃ ｓｄＡｂ（複数可）を含む細胞外抗原結合ドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインとを含む、ポリペプチドを含むＣＡＲを含み、ここで、抗ＧＵＣＹ２Ｃ ｓｄＡｂは、例えば、表７のＣＤＲを含むものを含む、上のセクション５．２に記載されるとおりであり、例えば、抗ＧＵＣＹ２Ｃ ｓｄＡｂは、（ｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；（ｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；（ｉｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；（ｉｖ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；（ｖ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；（ｖｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；（ｖｉｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または（ｖｉｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。本発明の操作された細胞のＣＡＲ中のｓｄＡｂはまた、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０のアミノ酸配列を含むもの、ならびに配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％配列の同一性を有するアミノ酸配列を含むものも含む。いくつかの実施形態において、対象に投与される操作された免疫細胞は、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、及び配列番号５５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、及び配列番号５５からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、ＣＡＲを含む。いくつかの実施形態において、疾患または障害は、ＧＵＣＹ２Ｃ関連疾患または障害である。いくつかの実施形態において、疾患または障害は、がんである。いくつかの実施形態において、がんは、大腸癌、胃癌または食道癌である。
５．７．２．診断法及び検出法ならびに使用
別の態様において、本明細書で提供されるのは、本明細書で提供される結合分子、例えば、ＧＵＣＹ２Ｃに結合するＶＨＨ及びかかるＶＨＨを含有する分子（コンジュゲート及び複合体など）を、ＧＵＣＹ２Ｃの検出及び／または抗体によって認識されるそのエピトープの存在などにより、対象における検出、予後、診断、病期分類、１つ以上の組織もしくは細胞型に対する特定の治療剤の結合の決定、及び／または治療決定の情報提供のために使用することを伴う方法である。
いくつかの実施形態において、診断または検出に使用するための抗ＧＵＣＹ２Ｃ抗体（本明細書に記載される抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体のいずれか１つなど）が提供される。更なる態様において、生物学的試料中のＧＵＣＹ２Ｃの存在を検出する方法が提供される。ある特定の実施形態において、方法は、生物学的試料中のＧＵＣＹ２Ｃタンパク質の存在を検出することを含む。ある特定の実施形態において、ＧＵＣＹ２Ｃは、ヒトＧＵＣＹ２Ｃである。いくつかの実施形態において、方法は、ＧＵＣＹ２Ｃを発現する疾患または障害と関連した診断法及び／または予後法である。いくつかの実施形態における方法は、抗体と生物学的試料をインキュベート及び／またはプロービングすること、及び／または対象に抗体を投与することを含む。ある特定の実施形態において、生物学的試料は、細胞もしくは組織またはその一部、例えば、腫瘍もしくはがん組織またはその生検もしくは切片を含む。ある特定の実施形態において、接触は、試料中に存在するＧＵＣＹ２Ｃへの抗ＧＵＣＹ２Ｃ抗体の結合を許容する条件下である。いくつかの実施形態において、方法は、抗ＧＵＣＹ２Ｃ抗体と試料中のＧＵＣＹ２Ｃとの間で複合体が形成されるかどうかを検出すること、例えば、そのような結合の有無またはレベルを検出することを更に含む。そのような方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ法であっても、ｉｎ ｖｉｖｏ法であってもよい。一実施形態において、抗ＧＵＣＹ２Ｃ抗体は、抗ＧＵＣＹ２Ｃ抗体または操作された抗原受容体による治療法に適格な対象を選択するために使用され、例えば、ＧＵＣＹ２Ｃは、患者を選択するためのバイオマーカーである。
いくつかの実施形態において、細胞、組織試料、溶解物、組成物、またはそれらに由来する他の試料などの試料を抗ＧＵＣＹ２Ｃ抗体と接触させ、抗体と試料（例えば、試料中のＧＵＣＹ２Ｃ）との間の結合または複合体の形成が決定または検出される。試験試料中の結合が、同じ組織型の参照細胞と比較して実証または検出された場合、関連疾患もしくは障害が存在すること、及び／または抗体を含有する治療剤が、試料由来の組織もしくは細胞もしくは他の生物学的材料と同じであるか、もしくは同じ型である組織もしくは細胞に特異的に結合するであろうことを示し得る。いくつかの実施形態において、試料は、ヒト組織に由来し、疾患組織及び／または正常組織に由来し得、例えば、治療される疾患もしくは障害を有する対象に由来してもよいし、及び／または当該対象と同じ種であるが、治療される疾患もしくは障害を有していない対象に由来してもよい。いくつかの場合において、正常な組織または細胞は、治療される疾患または障害を有する対象に由来するものであるが、それ自体は疾患細胞または組織ではなく、所与の対象に存在するがんと同じ器官または異なる器官に由来する正常組織である。
特異的抗体抗原結合を検出するには、当該技術分野において知られている様々な方法を使用することができる。例示的なイムノアッセイとしては、蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、比濁阻害イムノアッセイ（ＮＩＡ）、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、及びラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）が挙げられる。指示部分、または標識基は、多くの場合、アッセイ装置及び適合するイムノアッセイ手順の利用可能性によって示される、方法の様々な用途のニーズを満たすように使用することができる。例示的な標識としては、放射性核種（例えば、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、３Ｈ、もしくは３２Ｐ及び／またはクロム（５１Ｃｒ）、コバルト（５７Ｃｏ）、フッ素（１８Ｆ）、ガドリニウム（１５３Ｇｄ、１５９Ｇｄ）、ゲルマニウム（６８Ｇｅ）、ホルミウム（１６６Ｈｏ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ）、ヨウ素（１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ）、ランタン（１４０Ｌａ）、ルテチウム（１７７Ｌｕ）、マンガン（５４Ｍｎ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、リン（３２Ｐ）、プラセオジム（１４２Ｐｒ）、プロメチウム（１４９Ｐｍ）、レニウム（１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ）、ロジウム（１０５Ｒｈ）、ルテニウム（９７Ｒｕ）、サマリウム（１５３Ｓｍ）、スカンジウム（４７Ｓｃ）、セレン（７５Ｓｅ）、（８５Ｓｒ）、硫黄（３５Ｓ）、テクネチウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、スズ（１１３Ｓｎ、１１７Ｓｎ）、トリチウム（３Ｈ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、イッテルビウム（１６９Ｙｂ、１７５Ｙｂ）、イットリウム（９０Ｙ））、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、またはβ－ガラクトシダーゼ）、蛍光部分もしくはタンパク質（例えば、フルオロセイン、ローダミン、フィコエリトリン、ＧＦＰ、またはＢＦＰ）、または発光部分（例えば、Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．によって供給されるＱｄｏｔ（商標））が挙げられる。上述の様々なイムノアッセイを実施する際に使用される様々な一般的技術が知られている。
ある特定の実施形態において、標識抗体（抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体など）が提供される。標識には、直接検出される標識または部分（蛍光、発色団、電子密度、化学発光、及び放射性標識）だけでなく、例えば、酵素反応または分子相互作用を介して間接的に検出される酵素またはリガンドなどの部分が含まれるが、これらに限定されない。他の実施形態において、抗体は、標識されず、その存在は、抗体のいずれかに結合する標識抗体を使用して検出することができる。
５．８．キット及び製品
本明細書に記載される単一ドメイン抗体、キメラ抗原受容体、または操作された免疫エフェクター細胞のいずれかを含む、キット、単位剤形、及び製品が更に提供される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される医薬組成物のいずれか１つを含有し、好ましくは、その使用説明書を提供する、キットが提供される。
本出願のキットは、好適な包装がなされる。好適な包装には、バイアル、ボトル、ジャー、軟包装（例えば、密封マイラーバッグまたはプラスチック袋）などが含まれるが、これらに限定されない。キットは、任意選択により、緩衝剤及び説明的情報などの追加の構成要素を備えてもよい。したがって、本出願は、バイアル（密封したバイアルなど）、ボトル、ジャー、軟包装などを含む製品も提供する。
製品は、容器と、容器上または容器に付随するラベルまたは添付文書とを含み得る。好適な容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジなどが含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。一般に、容器は、本明細書に記載される疾患または障害（がんなど）を治療するのに有効な組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、皮下注射針で貫通可能な栓を有する静脈内注射用溶液バッグまたはバイアルであり得る）。ラベルまたは添付文書は、組成物が個体の特定の状態を治療するのに使用されることを示す。ラベルまたは添付文書は、組成物を個体に投与するための説明を更に含む。ラベルは、再構築及び／または使用のための指示を示し得る。医薬組成物を保持する容器は、再構成製剤の反復投与（例えば、２～６回の投与）を可能にするマルチユースバイアルであり得る。添付文書は、かかる治療製品の適応症、用途、投薬量、投与、禁忌及び／またはその使用に関する警告についての情報を含む、治療製品の商業包装に通例含まれる説明を指す。更に、製品は、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル溶液及びブドウ糖液などの薬学的に許容される緩衝液を含む第２の容器を更に備え得る。他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業的観点及び使用者の観点から望ましい他の材料を更に含み得る。
キットまたは製品は、薬局、例えば、院内薬局及び調剤薬局での保管及び使用に十分な量で包装された、複数単位用量の医薬組成物及び使用説明書を含み得る。
簡潔のために、ある特定の略号が本明細書で使用される。一例は、アミノ酸残基を表すための一文字の略号である。アミノ酸及びそれに対応する三文字及び一文字の略号は、以下のとおりである。
Figure 2023554467000004
本開示は、概して、多数の実施形態を記載するために肯定的な言葉を使用して本明細書に開示されている。本開示はまた、物質または材料、方法のステップ及び条件、プロトコル、手順、アッセイ、または分析などの特定の主題が完全にまたは部分的に排除された実施形態も具体的に含むものである。したがって、本開示は、本開示が含まないものに関して本明細書中では概ね表現されていないが、それにもかかわらず、本開示に明示的に含まれない態様が本明細書で開示されている。
本開示のいくつかの実施形態が説明されてきた。しかしながら、本開示の趣旨及び範囲を逸脱することなく、様々な変形がなされてもよいことが理解される。したがって、以下の実施例は、特許請求の範囲に記載される開示の範囲を例示するものであり、限定するものではない。
６．実施例
以下は、試験で使用される様々な方法及び材料の説明であり、本開示の実施法及び使用法に関する完全な開示及び説明を当業者に提供するために記載されるものであり、発明者らが開示とみなすものの範囲を限定することを意図するものでも、以下の実験が実施され、実施され得る実験の全てであることを表すことを意図するものでもない。現在の時制で書かれた例示的な説明は、必ずしも実施されたものではなく、むしろ、その説明は、本開示の教示に関連するデータ及び同等物を得るために実施され得ることを理解されたい。使用される数（例えば、量、百分率など）に関しては、正確さを確保するよう努めたが、ある程度の実験誤差及び偏差を考慮されたい。
６．１．実施例１－抗ＧＵＣＹ２Ｃ ＶＨＨの調製
アルパカの免疫化
人工合成したＧＵＣＹ２Ｃタンパク質の細胞外領域を、アルパカの免疫化のために、Ｎａｎｊｉｎｇ ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．（配列はＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ２５０９２、Ｓｅｒ２４－Ｇｌｎ４３０）により合成した。これは、配列番号１の核酸配列及び配列番号２のアミノ酸配列（表１参照）を含む。毎回、１００ｕｇのＧＵＣＹ２Ｃタンパク質を等量のアジュバントと混合した。初回免疫にのみフロイント完全アジュバントを使用し、他はフロイント不完全アジュバントを使用した。Ｂ細胞を刺激して抗原特異的ナノボディを発現するように、アルパカを週７回免疫化した。免疫期間中、抗体価を試験するために、アルパカの末梢血を少量採取した。免疫後、アルパカの末梢血を２００ｍｌ採取し、ＴｒｉｚｏｌでトータルＲＮＡを抽出した。
Figure 2023554467000005
Figure 2023554467000006
ナノボディファージライブラリーの構築
抽出したトータルＲＮＡを使用して、逆転写キットＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＩＩ １ｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）によりｃＤＮＡを合成し、２ステップＰＣＲによってＶＨＨ鎖を増幅した。重鎖抗体遺伝子を１回目のＰＣＲによって得た。ｃＤＮＡをＰＣＲ鋳型として使用し、免疫グロブリンＩｇＧをカバーする上流及び下流プライマーをＰＣＲシステムに加えて、ＩｇＧの異なるサブタイプを増幅し、次いで、ＩｇＧ２及びＩｇＧ３遺伝子をＴａＫａＲａ ＭｉｎｉＢＥＳＴ Ａｇａｒｏｓｅ Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔによって回収した。制限部位を含むＶＨＨ遺伝子を２回目のＰＣＲによって得た。１回目のＰＣＲで回収した遺伝子断片を鋳型として使用した。Ｓａｃ１及びＳｐｅ１制限部位を含むＩｇＧ２及びＩｇＧ３重鎖領域のＶＨＨ配列をカバーするプライマーをＰＣＲシステムに加えて、ＶＨＨのＤＮＡをファージライブラリー用に大量に増幅した。最後に、ＰＣＲ産物をＤＮＡ精製キットで精製した。
ＶＨＨ遺伝子及びｐＣｏｍｂ３ＸＳＳの制限消化、ライゲーション、電気形質転換及びファージライブラリー特定
２回目のＰＣＲで得られたＶＨＨ遺伝子配列及びプラスミドｐＣｏｍｂ３ＸＳＳ（Ａｄｄｇｅｎｅ）を制限酵素Ｓａｃ１（ＮＥＢ）及びＳｐｅ１（ＮＥＢ）で消化し、３７℃の水浴に４時間置いた。精製及び回収後、試料をＴ４ ＤＮＡリガーゼとともに４℃で一晩インキュベートした。次いで、２００ｕｇの組み換えプラスミドをＴＧ１ Ｅ．ｃｏｌｉコンピテント細胞に加え、エレクトロポレーターでエレクトロポレーションを行った。次いで、ＳＯＣ培地を加え、混合物を３７℃のインキュベーターで１時間回転させた。２００μＬの細菌溶液を１０倍に勾配希釈して２×ＹＴソリッドプレートに掻き取り、細菌を３７℃のインキュベーターで一晩培養した。翌日、プレート上のコロニー数に基づいてライブラリーの容量を算出すると、１×１０８ＣＦＵであった。２３個のクローンをランダムに選択し、コロニーＰＣＲ反応のために、ｐＣｏｍｂ３ＸＳＳ用に設計した上流及び下流プライマーをＰＣＲ反応システムに加えた。ファージライブラリーの挿入率は、９５％を超えることがわかった（図１）。１００個のクローンをランダムに選択し、配列決定のために、Ａｎｈｕｉ Ｇｅｎｅｒａｌｂｉｏ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．に送った。有効挿入率は９０％を超え、ライブラリーの構築が成功したことが証明された。
ＧＵＣＹ２Ｃタンパク質のナノボディスクリーニング
タンパク質ＧＵＣＹ２Ｃを０．１ｍＭ ｐＨ７．２ ＰＢＳ中に溶解し、５ｕｇのタンパク質を高親和性ＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。翌日、コーティングタンパク質を除去し、５％ＢＳＡを加えて、ＥＬＩＳＡプレートを室温で２時間密閉した。ブロッキング溶液を除去し、次いで、１×１０１１ＣＦＵのファージをＥＬＩＳＡプレートに加え、室温で１時間インキュベートした。結合していないファージをＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で８回洗浄した。結合したファージを０．１Ｍ ｐＨ２．０ Ｇｌｙｃｉｎｅで８分間かけて溶出し、反応を停止するために、２Ｍ Ｔｒｉｓを加えた。溶出したファージを対数増殖期のＴＧ１細菌に感染させ、次のスクリーニングラウンドのために、ファージを増幅させ、ＴＧ１細菌から精製した。同じスクリーニング法を３回繰り返し、連続的にスクリーニングしたファージを利用して陽性クローンをＥｌｉｓａによって検出した。
３回スクリーニングしたファージをＨＢ２１５１細菌にトランスフェクトし、１００ｕｌの感染ＨＢ２１５１細菌を２×ＹＴ－ＡＧソリッド培養皿の表面上に掻き取った。９６個の単一クローンを取り出し、２×ＹＴ培地に加え、次いで、９６ディープウェルプレートで培養した。細菌が対数期まで成長したら、０．８ｍＭ ＩＰＴＧを培地に加え、２５℃で一晩培養した。培地の上清を、１ｕｇ／ｍｌのＧＵＣＹ２ＣをコーティングしたＥＬＩＳＡプレートに加えた。このプレートは、２つの対照ウェルを含んだ。３７℃で２時間インキュベートした後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－Ａｌｐａｃａ ＩｇＧ，ＶＨＨ Ｄｏｍａｉｎ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）をＥｌｉｓａプレートに加え、３７℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴで３回洗浄した。ＴＭＢ溶液を２０分間加え、次いで、反応を２Ｍ硫酸で停止した。波長４５０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った（図２）。吸光度が陰性対照よりも２．１倍高いクローンを陽性クローンとみなし、配列決定に回した。
例示的なＶＨＨドメインのアミノ酸及び核酸配列を表２に示し、これらの例示的なＶＨＨドメインの例示的なＣＤＲ配列（Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従う）を以下の表３に示す。これらの例示的なＶＨＨドメインのアラインメントを図３に示すが、共有されているアミノ酸の割合が、ＣＤＲ領域だけでなく、全配列間でも高いことが示されている。ＣＤＲ１は、Ｘ１ＹＧＭＸ２のコンセンサス配列を有し、ここで、Ｘ１は、Ａ、ＩまたはＶであり、Ｘ２は、ＤまたはＧである（配列番号６４）。ＣＤＲ２は、Ｘ３ＩＸ４ＬＳＧＲＸ５Ｘ６ＹＸ７ＤＡＶＸ８Ｇのコンセンサス配列を有し、ここで、Ｘ３は、Ａ、ＳまたはＴであり、Ｘ４は、Ｆ、ＷまたはＹであり、Ｘ５は、ＳまたはＴであり、Ｘ６は、Ｅ、ＮまたはＴであり、Ｘ７は、Ａ、ＳまたはＴであり、Ｘ８は、ＫまたはＱである（配列番号６５）。ＣＤＲ３は、ＧＸ９Ｘ１０ＴＡＸ１１ＳＸ１２ＲＱＹのコンセンサス配列を有し、ここで、Ｘ９は、Ａ、ＥまたはＰであり、Ｘ１０は、ＰまたはＴであり、Ｘ１１は、ＳまたはＴであり、Ｘ１２は、ＧまたはＶである（配列番号６６）。
Figure 2023554467000007
Figure 2023554467000008
Figure 2023554467000009
Figure 2023554467000010
Figure 2023554467000011
６．２．実施例２－キメラ抗原受容体の構築
ｐＬＶＸ－Ｐｕｒｏベクターを鋳型に使用して、ベクターｐＬＶＸ－ＷＴ－Ｇ１を改変した。ｐＬＶＸ－ＰｕｒｏベクターのＣＭＶプロモーターをＥＦ１ａプロモーターに変更し、プロモーターに続いて、キメラ抗原受容体の部分配列をＥＦ１ａに挿入した。この配列は、ＣＤ８ヒンジ、ＣＤ８膜貫通領域、４－１ＢＢ及びＣＤ３ｚから構成され、アミノ酸配列は、以下の表４に示されるように、それぞれ配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５及び配列番号４６である。変換したベクターを図３Ａに示す。ＣＤ８シグナルペプチド及び抗ＧＵＣＹ２Ｃ ＶＨＨを含む最適化配列は、ｐＬＶＸ－ＷＴ－Ｇ１ベクターのＣＤ８ヒンジの後にライゲーションによって挿入し、抗ＧＵＣＹ２Ｃ ＶＨＨベースのキメラ抗原受容体ベクターｐＬＶＸ－ＷＴ－Ｇ１－ＶＨＨ－ＣＡＲを構築した。ＣＤ８シグナルペプチドは、配列番号４７のアミノ酸配列を含む（表４参照）。
例示的に構築されたキメラ抗原受容体のアミノ酸及び核酸配列を表５に示す。
Figure 2023554467000012
Figure 2023554467000013
Figure 2023554467000014
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レンチウイルスのパッケージング
２９３Ｔ細胞を培地のＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳで回収し、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで培養した。ウイルスをパッケージする前日に、細胞を消化し、２５ｃｍ２フラスコで５０％コンフルエントに培養した。細胞に感染させる際に、ベクターｐＬＶＸ－ＷＴ－Ｇ１－ＶＨＨ－ＣＡＲをヘルパーベクターＶＳＶＧ及びＧＡＧ－ｐｏｌと一定割合で混合し、室温で５分間インキュベートした。感染試薬ＰＥＩ ＭＡＸ及びプラスミド混合物を混合し、室温で２０分間インキュベートして、ＤＮＡ感染試薬化合物を得、これを２９３Ｔ細胞培養培地に加えた。３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで６時間インキュベートした後、上清を完全培地に交換し、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターでインキュベートした。４８時間後及び７２時間後に、ウイルスを１回採取した。次いで、ウイルスを遠心分離により濃縮し、ウイルス力価の試験に使用した。
ＣＡＲ－Ｔ細胞の調製
Ｆｉｃｏｌｌ試薬を使用してヒト末梢血から単核細胞を抽出し、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）Ｈｕｍａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ）でＣＤ３＋細胞を選別した。細胞を最大５×１０７細胞／ｍｌ、０．５ｍｌ／チューブに調整し、２５ｕｌのＲａｐｉｄＳｐｈｅｒｅｓを各チューブに加えた。室温で混合した後、試料をマグネットラックに入れ、室温で３分間インキュベートした。溶出液を回収し、遠心分離にかけて、ＣＤ３＋細胞を得た。選別されたＣＤ３＋細胞を、ｘ－ｖｉｖｏ１５培地で再懸濁した後、インキュベートした。細胞を２４ウェルプレートで０．５～１×１０６細胞／ウェルで培養し、ｘ－ｖｉｖｏ１５培地を最大０．５ｍｌまで加えた。ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを選別細胞に１：１の比で加え、ＩＬ２を最終濃度が１００ＩＵ／ｍｌになるまで添加し、次いで、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで一晩インキュベートした。
次いで、新しい培地を使用して１×１０６個のＴ細胞を９６ウェルプレートで一晩培養した。翌日、濃縮したＶＨＨ－ＣＡＲウイルスをＴ細胞に加え、６時間共培養した。遠心分離後、新しいｘ－ｖｉｖｏ１５培地に置き換え、ＩＬ２を最終濃度が１００ＩＵ／ｍｌになるまで添加し、次いで、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで培養を続けた。数回の継代培養した後、フローサイトメトリーを使用して、ＣＡＲ－Ｔ細胞の陽性率を検出した。
ＣＡＲ－Ｔ細胞の陽性検出率
回収及び計数した後の様々なＣＡＲ－Ｔ細胞をＰＢＳ中に再懸濁した。ＰＢＳで２回洗浄した後、１：１０００に希釈したＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－Ａｌｐａｃａ ＩｇＧ，ＶＨＨ Ｄｏｍａｉｎ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｍｏＲｅｓｅａｒｃｈ）二次抗体を反応系に加え、室温で１時間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄し、次いで、フローサイトメトリーで検出した（図４Ｂ参照）。示されるように、Ｃ０８、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１５、Ｃ２１、Ｃ２７、Ｃ３０及びＣ３１の陽性率は、それぞれ９１．８６％、２０．３２％、２３．６２％、４６．４１％、３０．６１％、９０．２８％、８６．８９％及び６７．７８％であった。
Ｔ８４－Ｌｕｃｉ－ｅＧＦＰ細胞の調製
１×１０５細胞／１００μｌのＴ８４細胞を２４ウェルプレートにプレーティングした。翌日、１００ｕｌのｐＬＶＸ－Ｌｕｃｉ－ｅＧＦＰウイルス（ウイルス価：０．５～１×１０８ＴＵ／ｍｌ）を、Ｔ８４細胞に、各ウェルで細胞が６０％～７０％に成長した時点で入れた。次いで、３００ｕｌの完全培地を加え、細胞を３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで成長させた。細胞密度を毎日観察し、細胞密度が８０％～９０％に到達した時点で継代培養した。陽性率が９５％超に到達したら、Ｔ８４細胞を細胞傷害アッセイ及び動物実験に使用した。
６．３．実施例３－ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞毒性アッセイ
１×１０５／ｍｌの標的細胞を９６ウェルプレートにプレーティングし、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで成長させた。Ｔ細胞（陰性対照）及び様々なＣＡＲ－Ｔ細胞を標的細胞とＥ：Ｔ（エフェクター細胞：標的細胞）＝２：１で混合した。細胞培養培地の容量を２００μｌ／ウェル以下にし、次いで、３７°Ｃ、５％ＣＯ２のインキュベーターで２４時間インキュベートした。細胞培養培地を捨て、細胞をＰＢＳで１回洗浄した。１００μｌのＢｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ基質を各ウェルに加え、室温で５分間インキュベートした。白色プレートに移した１００ｕｌの上清をマイクロプレートリーダーで検出した（図５及び図６参照）。その結果、Ｃ８－ＣＡＲ、Ｃ１２－ＣＡＲ、Ｃ１３－ＣＡＲ、Ｃ１５－ＣＡＲ、Ｃ２１－ＣＡＲ，Ｃ２７－ＣＡＲ、Ｃ３０－ＣＡＲ及びＣ３１－ＣＡＲを発現する試験した全てのＣＡＲ－Ｔ細胞が細胞傷害を示した。
６．４．実施例４－ＣＡＲ－Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ活性
抗ＧＵＣＹ２Ｃ ＣＡＲ－Ｔ細胞が結腸癌を除去する能力を、ＮＣＧマウスモデルを使用してｉｎ ｖｉｖｏで試験した。成長状態が良好なＴ８４－Ｌｕｃｉ－ｅＧＦＰ細胞を１×１０８細胞／ｍｌの濃度に調製し、ＮＣＧ雌マウスの右前肢の腋窩に皮下注射した。各マウスに５×１０６細胞を注射し、注射量は０．０５ ｍｌであった。細胞の注射から約２週間後の腫瘍体積は、約１００～１５０ｍｍ３であった。各マウスに３×１０６個のＣＡＲ－Ｔ細胞を尾静脈から注射した。腫瘍サイズを２～３日ごとにノギスで測定した。マウスのｉｎｖｉｖｏ蛍光イメージングを週１回実施した。０．１ｍｌのＬｕｃｉｆｅｒｉｎ基質をマウスの腹部皮下に注射し、８分後、マウスに麻酔をかけた。撮影検出のために、麻酔をかけたマウスをＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒの小動物用ｉｎ ｖｉｖｏ光学イメージングシステム（ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ ＬＴ）に入れた。ＣＡＲ－Ｔ細胞の注射後、マウスの血液を毎週１００ｕｌ採取し、マウスに残存しているＣＡＲ－Ｔ細胞をフローサイトメトリー及びｑＰＣＲによってモニタリングした。結果を図７Ａ～７Ｃに示す。示されるように、Ｃ８－ＣＡＲ、Ｃ１２－ＣＡＲ、Ｃ１３－ＣＡＲ、Ｃ１５－ＣＡＲ及びＣ２１－ＣＡＲを発現する、試験した例示的な本明細書で提供されるＣＡＲ－Ｔ細胞は、優れたｉｎ ｖｉｖｏ抗がん活性を示した。
本明細書で引用される全ての特許、公開出願、及び参考文献の教示は、その全体が参照により援用される。例示的な実施形態が具体的に示され、記載されているが、当業者であれば、添付の特許請求の範囲によって包含される実施形態の範囲を逸脱することなく、形態及び詳細の様々な変更がなされ得ることを理解するであろう。
以上、例示の目的で特定の実施形態を本明細書に記載したが、本明細書で提供されるものの趣旨及び範囲を逸脱することなく、様々な変形がなされ得ることを理解されたい。上で参照された参考文献の全ては、その全体が参照により本明細書に援用される。

Claims (40)

  1. 抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）であって、
    （ｉ）Ｘ１ＹＧＭＸ２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１（ここで、Ｘ１は、Ａ、ＩまたはＶであり、Ｘ２は、ＤまたはＧである）（配列番号６４）と、
    （ｉｉ）Ｘ３ＩＸ４ＬＳＧＲＸ５Ｘ６ＹＸ７ＤＡＶＸ８Ｇのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２（ここで、Ｘ３は、Ａ、ＳまたはＴであり、Ｘ４は、Ｆ、ＷまたはＹであり、Ｘ５は、ＳまたはＴであり、Ｘ６は、Ｅ、ＮまたはＴであり、Ｘ７は、Ａ、ＳまたはＴであり、Ｘ８は、ＫまたはＱである）（配列番号６５）と、
    （ｉｉｉ）ＧＸ９Ｘ１０ＴＡＸ１１ＳＸ１２ＲＱＹのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３（ここで、Ｘ９は、Ａ、ＥまたはＰであり、Ｘ１０は、ＰまたはＴであり、Ｘ１１は、ＳまたはＴであり、Ｘ１２は、ＧまたはＶである）（配列番号６６）と
    を含む、前記抗ＧＵＣＹ２Ｃ ｓｄＡｂ。
  2. 前記ＣＤＲ１が、配列番号１９～２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ＣＤＲ２が、配列番号２７～３４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ＣＤＲ３が、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗ＧＵＣＹ２Ｃ ｓｄＡｂ。
  3. （ｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
    （ｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
    （ｉｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
    （ｉｖ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
    （ｖ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
    （ｖｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
    （ｖｉｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または
    （ｖｉｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３
    を含む、請求項１または請求項２に記載の抗ＧＵＣＹ２Ｃ ｓｄＡｂ。
  4. 抗ＧＵＣＹ２Ｃ単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）であって、
    （ｉ）配列番号３に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；
    （ｉｉ）配列番号４に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；
    （ｉｉｉ）配列番号５に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；
    （ｉｖ）配列番号６に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；
    （ｖ）配列番号７に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；
    （ｖｉ）配列番号８に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；
    （ｖｉｉ）配列番号９に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；または
    （ｖｉｉｉ）配列番号１０に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３
    を含む、前記抗ＧＵＣＹ２Ｃ ｓｄＡｂ。
  5. 前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３が、Ｋａｂａｔナンバリングスキーム、ＩＭＧＴナンバリングスキーム、ＡｂＭナンバリングスキーム、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングスキーム、Ｃｏｎｔａｃｔナンバリングスキーム、またはこれらの組み合わせに従って決定される、請求項４に記載の抗ＧＵＣＹ２Ｃ ｓｄＡｂ。
  6. 配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０のいずれか１つに記載される１つ以上のＦＲ領域を更に含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の抗ＧＵＣＹ２Ｃ ｓｄＡｂ。
  7. 配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の抗ＧＵＣＹ２Ｃ ｓｄＡｂ。
  8. 前記抗ＧＵＣＹ２Ｃ ｓｄＡｂが、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０のいずれか１つの配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなる、請求項１～６のいずれか１項に記載の抗ＧＵＣＹ２Ｃ ｓｄＡｂ。
  9. 前記抗ＧＵＣＹ２Ｃ ｓｄＡｂが、ラクダ科ｓｄＡｂである、請求項１～５のいずれか１項に記載の抗ＧＵＣＹ２Ｃ ｓｄＡｂ。
  10. 前記抗ＧＵＣＹ２Ｃ ｓｄＡｂが、ヒト化ｓｄＡｂである、請求項１～５のいずれか１項に記載の抗ＧＵＣＹ２Ｃ ｓｄＡｂ。
  11. 前記抗ＧＵＣＹ２Ｃ ｓｄＡｂが、薬剤に遺伝子的に融合されるか、または化学的にコンジュゲートされる、請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗ＧＵＣＹ２Ｃ ｓｄＡｂ。
  12. キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、
    （ａ）請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗ＧＵＣＹ２Ｃ ｓｄＡｂを含む細胞外抗原結合ドメインと、
    （ｂ）膜貫通ドメインと、
    （ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインと
    を含む、前記ＣＡＲ。
  13. 前記細胞外抗原結合ドメインが、１つ以上の追加の抗原結合ドメイン（複数可）を更に含む、請求項１２に記載のＣＡＲ。
  14. 前記膜貫通ドメインが、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１５２、及びＰＤ１からなる群から選択される分子に由来する、請求項１２または請求項１３に記載のＣＡＲ。
  15. 前記膜貫通ドメインが、ＣＤ８αに由来する、請求項１４に記載のＣＡＲ。
  16. 前記細胞内シグナル伝達ドメインが、免疫エフェクター細胞の一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項１２～１５のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
  17. 前記一次細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ζに由来する、請求項１６に記載のＣＡＲ。
  18. 前記細胞内シグナル伝達ドメインが、共刺激シグナル伝達ドメインを更に含む、請求項１６または請求項１７に記載のＣＡＲ。
  19. 前記共刺激シグナル伝達ドメインが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ３、ＬＦＡ－１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３のリガンド及びこれらの組み合わせからなる群から選択される共刺激分子に由来する、請求項１８に記載のＣＡＲ。
  20. 前記共刺激シグナル伝達ドメインが、ＣＤ１３７に由来する、請求項２０に記載のＣＡＲ。
  21. 前記細胞外抗原結合ドメインのＣ末端と前記膜貫通ドメインのＮ末端との間に位置するヒンジドメインを更に含む、請求項１２～２０のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
  22. 前記ヒンジドメインが、ＣＤ８αに由来する、請求項２１に記載のＣＡＲ。
  23. 前記ポリペプチドのＮ末端に位置するシグナルペプチドを更に含む、請求項１２～２２のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
  24. 前記シグナルペプチドが、ＣＤ８αに由来する、請求項２３に記載のＣＡＲ。
  25. （ｉ）配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、及び配列番号５５からなる群から選択されるアミノ酸配列、または（ｉｉ）配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、及び配列番号５５のいずれか１つの配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
  26. 請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗ＧＵＣＹ２Ｃ ｓｄＡｂをコードする核酸配列を含む、単離された核酸。
  27. 前記単離された核酸が、配列番号１１～１８の核酸配列を含む、請求項２６に記載の単離された核酸。
  28. 請求項２７に記載の単離された核酸を含む、ベクター。
  29. 請求項１４～２５のいずれか１項に記載のＣＡＲをコードする核酸配列を含む、単離された核酸。
  30. 前記単離された核酸が、配列番号５６～６３の核酸配列を含む、請求項２９に記載の単離された核酸。
  31. 請求項３０に記載の単離された核酸を含む、ベクター。
  32. 請求項１４～２５のいずれか１項に記載のＣＡＲ、請求項２９もしくは請求項３０に記載の単離された核酸、または請求項３１に記載のベクターを含む、操作された免疫エフェクター細胞。
  33. 前記免疫エフェクター細胞が、Ｔ細胞である、請求項３２に記載の操作された免疫エフェクター細胞。
  34. 請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗ＧＵＣＹ２Ｃ ｓｄＡｂ、請求項３２もしくは請求項３３に記載の操作された免疫エフェクター細胞、または請求項２８もしくは請求項３１に記載のベクターと、薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物。
  35. 対象における疾患または障害を治療する方法であって、前記対象に、有効量の、請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗ＧＵＣＹ２Ｃ ｓｄＡｂ、請求項３２もしくは請求項３３に記載の操作された免疫エフェクター細胞、または請求項３４に記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
  36. 前記疾患または障害が、ＧＵＣＹ２Ｃ関連疾患または障害である、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記疾患または障害が、がんである、請求項３５に記載の方法。
  38. 前記疾患または障害が、大腸癌である、請求項３６に記載の方法。
  39. 前記疾患または障害が、胃癌である、請求項３６に記載の方法。
  40. 前記疾患または障害が、食道癌である、請求項３６に記載の方法。
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