KR20230131183A - Gucy2c 결합 분자 및 이의 용도 - Google Patents

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KR20230131183A
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링 히
린 왕
웨이 왕
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파라솔 바이오테크 엘티디.
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Abstract

본 개시내용은 GUCY2C에 결합하는 단일 도메인 항체 및 이를 포함하는 키메라 항원 수용체를 제공한다. 키메라 항원 수용체를 포함하는 조작된 면역 효과기 세포(예컨대, T 세포)가 추가로 제공된다. 질환 또는 장애를 치료하기 위한 약제학적 조성물, 키트 및 방법이 또한 제공된다.

Description

GUCY2C 결합 분자 및 이의 용도
본 출원은 2020년 12월 17일자로 출원된 국제 출원 제PCT/CN2020/137164호의 우선권을 주장하며, 이는 모든 목적을 위해 전체가 참조에 의해 본 명세서에 원용된다.
기술 분야
본 개시내용은 항-GUCY2C 단일 도메인 항체, 키메라 항원 수용체, 조작된 면역 효과기 세포 및 이의 사용 방법에 관한 것이다. 본 개시내용은 또한 특히 키메라 항원 수용체-기반 T 세포 면역요법에 대한 치료적 용도를 위한 세포의 활성화 및 확장에 관한 것이다.
결장직장암은 전 세계적으로 가장 흔한 유형의 암 중 하나이며, 모든 종양 사례의 약 10% 및 모든 암 사망의 8.5%를 차지한다. 결장직장암의 발병은 점차 어려지는 경향이 있으며, 40세 미만의 환자의 수가 모든 결장직장암 환자의 2% 내지 8%를 차지한다. 현재, 결장직장암의 치료는 수술, 방사선요법 및 화학요법의 조합에 기초하고 있다. 대부분의 초기 환자는 전통적인 요법으로 치료 후 예후가 좋지만, 전이가 있는 결장직장암 환자의 경우 예후는 좋지 않으며 5-년 생존율이 매우 낮다. 현재의 치료법은 잠복 잔류 종양 세포를 제거하거나 또는 전이의 성장을 저해할 수 없다. 키메라 항원 수용체 T(Chimeric antigen receptor T: CAR-T) 세포 요법은 떠오르고 있는 유망한 암 면역요법이다.
장 종양의 생성을 촉진하는 결장 상피 세포의 항상성 불균형은 구아닐레이트 사이클레이스 C(Guanylate cyclase C: GUCY2C; GCC) 리간드의 결여로 인해 야기된다(Waldman, S.A. and M. Camilleri, Gut, 67(8): 1543-1552 (2018)). GUCY2C는 N-연결 당단백질의 구아닐레이트 사이클레이스 수용체 패밀리의 구성원이며, 장 조직-특이적 폴리펩타이드이다. 이는 소장에서 직장까지의 장 점막에 위치한 상피 세포에서 발현되지만, 정상적인 위 및 식도 조직에서는 발현되지 않는다. GUCY2C 수용체는 환식 구아닌 포스페이트(cyclic guanine phosphate: cGMP)-의존적 메커니즘을 통해 소장 점막 상피 세포의 증식 및 분화를 조절할 수 있다. GUCY2C는 원발성 결장직장암 세포에서 안정적으로 발현되며, 전이성 결장직장암 세포에서 GUCY2C의 발현은 정상 장 상피 세포보다 약 2배 내지 10배 더 커서(Carrithers et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, 93(25): 14827-14832 (1996)), GUCY2C가 결장직장암 치료를 위한 잠재적 표적이 되게 하는 것으로 나타났다. 예를 들어, 보다 효과적이거나 또는 효율적인 CAR-T 요법에 사용하기 위한 당업계에서 개선된 GUCY2C-결합 분자 및 조작된 GUCY2C-표적화 세포가 필요하다.
일 양태에서, (i) X1YGMX2의 아미노산 서열(여기서, X1은 A, I 또는 V이고, X2는 D 또는 G임)을 포함하는 CDR1(서열번호 64); (ii) X3IX4LSGRX5X6YX7DAVX8G의 아미노산 서열(여기서, X3은 A, S 또는 T이고; X4는 F, W 또는 Y이고; X5는 S 또는 T이고; X6은 E, N 또는 T이고; X7은 A, S 또는 T이고; X8은 K 또는 Q임)을 포함하는 CDR2(서열번호 65); 및 (iii) GX9X10TAX11SX12RQY의 아미노산 서열(여기서, X9는 A, E 또는 P이고; X10은 P 또는 T이고; X11은 S 또는 T이고; X12는 G 또는 V임)을 포함하는 CDR3(서열번호 66)을 포함하는 항-GUCY2C 단일 도메인 항체(single domain antibody: sdAb)가 본 명세서에 제공된다.
일부 실시형태에서, CDR1은 서열번호 19 내지 26으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고; CDR2는 서열번호 27 내지 34로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고; 및 CDR3은 서열번호 35 내지 42로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항-GUCY2C sdAb는 (i) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (ii) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (iii) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (iv) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (v) 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (vi) 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (vii) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 (viii) 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3를 포함한다.
일부 실시형태에서, (i) 각각 서열번호 3에 제시된 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3; (ii) 각각 서열번호 4에 제시된 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3; (iii) 각각 서열번호 5에 제시된 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3; (iv) 각각 서열번호 6에 제시된 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3; (v) 각각 서열번호 7에 제시된 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3; (vi) 각각 서열번호 8에 제시된 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3; (vii) 각각 서열번호 9에 제시된 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3; 또는 (viii) 각각 서열번호 10에 제시된 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 항-GUCY2C 단일 도메인 항체(sdAb)가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, CDR1, CDR2 또는 CDR3은 Kabat 넘버링 체계, IMGT 넘버링 체계, AbM 넘버링 체계, Chothia 넘버링 체계, Contact 넘버링 체계 또는 이들의 조합에 따라 결정된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 sdAb는 서열번호 3 내지 10 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 하나 이상의 FR 영역을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항-GUCY2C sdAb는 서열번호 3 내지 10 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항-GUCY2C sdAb는 서열번호 3 내지 10 중 어느 하나의 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 항-GUCY2C sdAb는 낙타과 sdAb이다. 다른 실시형태에서, 항-GUCY2C sdAb는 인간화된 sdAb이다.
일부 실시형태에서, 항-GUCY2C sdAb는 작용제에 유전적으로 융합되거나 또는 화학적으로 접합된다.
또 다른 양태에서, (a) 본 명세서에 제공된 항-GUCY2C sdAb를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인, (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)가 본 명세서에 제공된다.
일부 실시형태에서, 세포외 항원 결합 도메인은 하나 이상의 추가적인 항원 결합 도메인(들)을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 막관통 도메인은 CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 및 PD1로 이루어진 군으로부터 선택된 분자로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 막관통 도메인은 CD8α로부터 유래된다.
일부 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 면역 효과기 세포의 1차 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 1차 세포내 신호전달 도메인은 CD3ξ로부터 유래된다.
다른 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 공동 자극성 신호전달 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 공동 자극성 신호전달 도메인은 CD27, CD28, CD137(4-1BB), OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83의 리간드 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 공동 자극성 분자로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 공동 자극성 신호전달 도메인은 CD137로부터 유래된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 CAR은 세포외 항원 결합 도메인의 C-말단과 막관통 도메인의 N-말단 사이에 위치한 힌지 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 도메인은 CD8α로부터 유래된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 CAR은 폴리펩타이드의 N-말단에 위치한 신호 펩타이드를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 신호 펩타이드는 CD8α로부터 유래된다.
일부 실시형태에서, (i) 서열번호 48 내지 55로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열; 또는 (ii) 서열번호 48 내지 55 중 어느 하나의 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)가 본 명세서에 제공된다.
또 다른 양태에서, 본 명세서에 제공된 항-GUCY2C sdAb를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산이 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 단리된 핵산은 서열번호 11 내지 18의 핵산 서열을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 명세서에 제공된 단일 도메인 항체를 암호화하는 단리된 핵산을 포함하는 벡터가 본 명세서에 제공된다.
또 다른 양태에서, 본 명세서에 제공된 CAR을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산이 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 단리된 핵산은 서열번호 56 내지 63의 핵산 서열을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 명세서에 제공된 CAR을 암호화하는 단리된 핵산을 포함하는 벡터가 본 명세서에 제공된다.
또 다른 양태에서, 본 명세서에 제공된 CAR, 단리된 핵산 또는 벡터를 포함하는 조작된 면역 효과기 세포가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 면역 효과기 세포는 T 세포이다.
또 다른 양태에서, 본 명세서에 제공된 항-GUCY2C sdAb, 조작된 면역 효과기 세포 또는 벡터 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물이 본 명세서에 제공된다.
또 다른 양태에서, 유효량의 본 명세서에 제공된 항-GUCY2C sdAb, 조작된 면역 효과기 세포 또는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법이 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 질환 또는 장애는 GUCY2C 관련 질환 또는 장애이다. 일부 실시형태에서, 질환 또는 장애는 암이다. 일부 실시형태에서, 질환 또는 장애는 결장직장암, 위암 또는 식도암이다.
도 1은 파지 항체 라이브러리 콜로니의 전기영동 다이어그램을 보여준다. 첫 번째 레인은 DL2000 DNA 마커이고, 마지막 레인은 플라스미드 pComb3XSS의 음성 대조군이며, 1 내지 23은 파지 항체 라이브러리 단일클론이다. 23개의 단일클론이 선택되었고, 이들 중 22개의 단일클론이 양성 클론이었으며, 삽입률은 96%였다.
도 2는 항체 스크리닝 동안 VHH 클론의 OD450 값을 보여준다.
도 3은 본 명세서에 제공된 예시적인 VHH 도메인의 정렬을 보여준다.
도 4a는 형질전환된 벡터 pLVX-WT-G1의 개략도를 보여준다. pLVX-Puro의 CMV 프로모터는 EF-1a 프로모터로 대체되었고, CD8 힌지, CD8 막관통 도메인, 4-1BB 및 CD3z가 EF-1a 프로모터 다음에 추가되었다.
도 4b는 항-알파카 IgG, VHH 도메인 2차 항체로 염색된 CAR-T 세포의 양성 비율에 대한 유세포 분석을 보여준다.
도 5는 GFP 및 2:1의 효과기:표적 세포 비로 24시간 동안 공동 배양된 다양한 항-GUCY2C CAR-T 세포로 형질감염된 T84의 형광 사진을 보여준다. 공동 배양된 다양한 CAR-T 세포주는 (A) 클론 C08, (B) 클론 C12, (C) 클론 C13, (D) 클론 C15, (E) 클론 C21, (F) 클론 C27, (G) 클론 C30, (H) 클론 C31, (I) T 세포, (J) T84 세포 단독 및 (J) 세포 용해제와 T84 세포였다.
도 6은 다양한 항-GUCY2C CAR T 세포의 특이적 세포용해 활성을 나타내는 히스토그램을 보여준다. CAR-T 세포 및 T 세포는 2:1의 효과기:표적 세포 비로 T84 세포와 함께 공동 배양되었다. T84 세포의 특이적 세포 용해 백분율은 공동 배양의 종료 시에 계산되었다.
도 7a는 T84 종양 NCG 마우스 모델에서 항-GUCY2C CAR-T 처리 후 종양 성장을 보여준다. 면역결핍성 NCG 마우스는 피하 주사를 통해 5×106개의 루시퍼레이스 발현 T84 결장직장암 세포가 주입되고, 제14일에 꼬리 정맥 주사에 의해 3×106개의 T 세포 또는 클론 C08 CAR-T 세포로 처리되었다. 실선: 주입된 T 세포, 파선: 주입된 클론 C08 CAR-T 세포. 도 7b는 T84 종양 NCG 마우스 모델에서 항-GUCY2C CAR-T 처리 후 종양 성장을 보여준다. 면역결핍성 NCG 마우스는 피하 주사를 통해 5×106개의 루시퍼레이스 발현 T84 결장직장암 세포가 주입되고, 제14일에 꼬리 정맥 주사에 의해 3×106개의 T 세포, 클론 C12 CAR-T 세포 또는 클론 C13 CAR-T 세포로 처리되었다. 실선: 주입된 T 세포, 점선: 주입된 클론 C12 CAR-T 세포, 파선: 주입된 클론 C13 CAR-T 세포. 도 7c는 T84 종양 NCG 마우스 모델에서 항-GUCY2C CAR-T 처리 후 종양 성장을 보여준다. 면역결핍성 NCG 마우스는 피하 주사를 통해 5×106개의 루시퍼레이스 발현 T84 결장직장암 세포가 주입되고, 제14일에 꼬리 정맥 주사에 의해 3×106개의 T 세포, 클론 C15 CAR-T 세포 또는 클론 C21 CAR-T 세포로 처리되었다. 실선: 주입된 T 세포, 점선: 주입된 클론 C15 CAR-T 세포, 파선: 주입된 클론 C21 CAR-T 세포.
본 개시내용은 부분적으로 GUCY2C에 결합하는 신규한 단일 도메인 항체(예를 들어, VHH 도메인), 키메라 항원 수용체 또는 이를 포함하는 조작된 세포 및 이들의 개선된 특성에 기초한다.
5.1. 정의
본 명세서에 기재되거나 또는 참조되는 기법 및 절차는, 예를 들어, 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3d ed. 2001); Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al. eds., 2003); Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic (An ed. 2009); Monoclonal Antibodies: Methods and Protocols (Albitar ed. 2010); 및 Antibody Engineering Vols 1 and 2 (Kontermann and eds., 2d ed. 2010)]에 기술되어 있는 널리 이용되는 방법론과 같은 당업자에 의해 일반적으로 잘 이해되고/되거나 종래의 방법론을 사용하여 일반적으로 사용되는 것들을 포함한다. 본 명세서에서 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 기술 및 과학 용어는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다. 본 명세서를 해석하기 위해, 용어에 대한 다음 설명이 적용될 것이며 적절할 때마다 단수형으로 사용된 용어는 복수형도 포함하며 그 반대도 마찬가지이다. 제시된 용어에 대한 임의의 설명이 본 명세서에 참조에 의해 원용된 문서와 충돌하는 경우, 아래 제시된 용어에 대한 설명이 우선한다.
용어 "항체", "면역 글로불린" 또는 "Ig"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되고, 가장 넓은 의미로 사용되며, 구체적으로, 예를 들어, 단일클론 항체(효능제, 길항제, 중화 항체, 전장 또는 온전한 단일클론 항체 포함), 다중에피토프 또는 단일에피토프 특이성을 갖는 항체 조성물, 다중클론 또는 1가 항체, 다가 항체, 적어도 2개의 온전한 항체로부터 형성된 다중특이성 항체(예를 들어, 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한 이중특이성 항체), 단일쇄 항체 및 아래 기재된 바와 같은 이들의 단편(예를 들어, 도메인 항체)을 포괄한다. 항체는 인간, 인간화된, 키메라 및/또는 성숙된 친화도뿐만 아니라, 예를 들어, 마우스, 토끼, 라마 등으로부터의 항체일 수 있다. 용어 "항체"는 특정 분자 항원에 결합할 수 있고 2개의 동일한 쌍의 폴리펩타이드 사슬로 구성되는 폴리펩타이드의 면역 글로불린 클래스 내 B 세포의 폴리펩타이드 산물을 포함하는 것으로 의도되며, 각 쌍은 하나의 중쇄(약 50kDa 내지 70kDa) 및 하나의 경쇄(약 25kDa)를 갖고, 각 사슬의 각 아미노-말단 부분은 약 100개 내지 약 130개 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함하고, 각 사슬의 각 카복시-말단 부분은 불변 영역을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Antibody Engineering (Borrebaeck ed., 2d ed. 1995); 및 Kuby, Immunology (3d ed. 1997)]을 참조한다. 항체는 또한 합성 항체, 재조합적으로 생산된 항체, 낙타과 종(예를 들어, 라마 또는 알파카) 또는 이의 인간화된 변이체를 포함하는 단일 도메인 항체, 인트라바디, 항-이디오타입(항-Id) 항체, 및 단편이 유래되는 항체의 결합 활성의 일부 또는 전부를 유지하는 항체 중쇄 또는 경쇄 폴리펩타이드의 일부를 지칭하는 위의 임의의 기능적 단편(예를 들어, 항원-결합 단편)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 기능적 단편(예를 들어, 항원-결합 단편)의 비제한적인 예는 단일쇄 Fv(scFv)(예를 들어, 단일특이성, 이중특이성 등 포함), Fab 단편, F(ab') 단편, F(ab)2 단편, F(ab')2 단편, 이황화-연결 Fv(dsFv), Fd 단편, Fv 단편, 다이어바디, 트라이어바디, 테트라바디 및 미니바디를 포함한다. 특히, 본 명세서에 제공된 항체는 면역 글로불린 분자 및 면역 글로불린 분자의 면역학적으로 활성인 부분, 예를 들어, 항원에 결합하는 항원-결합 부위를 포함하는 항원-결합 도메인 또는 분자(예를 들어, 항체의 하나 이상의 CDR)를 포함한다. 이러한 항체 단편은, 예를 들어, 문헌[Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (1989); Mol. Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference (Myers ed., 1995); Huston et al., 1993, Cell Biophysics 22:189-224; and Skerra, 1989, Meth. Enzymol. 178:497-515; 및 Day, Advanced Immunochemistry (2d ed. 1990)]에서 찾을 수 있다. 본 명세서에 제공된 항체는 면역 글로불린 분자의 임의의 클래스(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD 및 IgA) 또는 임의의 하위클래스(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2)일 수 있다. 항체는 작용 항체(agonistic antibody) 또는 길항 항체(antagonistic antibody)일 수 있다. 항체는 작용성도 길항성도 아닐 수 있다.
"항원"은 항체가 선택적으로 결합할 수 있는 구조이다. 표적 항원은 폴리펩타이드, 탄수화물, 핵산, 지질, 합텐 또는 다른 자연 발생적 또는 합성 화합물일 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적 항원은 폴리펩타이드이다. 소정의 실시형태에서, 항원은 세포와 회합되며, 예를 들어, 세포 상에 또는 세포에 존재한다.
"온전한" 항체는 항원-결합 부위뿐만 아니라 CL 및 적어도 중쇄 불변 영역, CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 항체이다. 불변 영역은 인간 불변 영역 또는 이의 아미노산 서열 변이체를 포함할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 온전한 항체는 하나 이상의 효과기 기능을 갖는다.
"sFv" 또는 "scFv"로도 약칭되는 "단일쇄 Fv"는 단일 폴리펩타이드 사슬로 연결된 VH 및 VL 항체 도메인을 포함하는 항체 단편이다. 바람직하게는, sFv 폴리펩타이드는 sFv가 항원 결합을 위해 목적하는 구조를 형성할 수 있게 하는 VH와 VL 도메인 사이의 폴리펩타이드 링커를 추가로 포함한다. sFv의 검토를 위해, 문헌[Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]을 참조한다.
용어 "중쇄-단독 항체" 또는 "HCAb"는 중쇄를 포함하지만 4-쇄 항체에서 일반적으로 발견되는 경쇄가 결여된 기능성 항체를 지칭한다. 낙타과 동물(예컨대, 낙타, 라마 또는 알파카)이 HCAb를 생산하는 것으로 알려져 있다.
본 명세서에서 사용되는 "단일 도메인 항체" 또는 "sdAb"는 항원 결합이 가능한 단일 단량체성 가변 항체 도메인(예를 들어, GUCY2C에 결합하는 단일 도메인 항체)을 지칭한다. 단일 도메인 항체는 본 명세서에 기재된 바와 같은 VHH 도메인을 포함한다. 단일 도메인 항체의 예는 낙타과 종(예를 들어, 라마)으로부터의 것과 같은 경쇄가 자연적으로 결여된 항체, 통상적인 4-쇄 항체로부터 유래되는 단일 도메인 항체, 조작된 항체 및 항체로부터 유래되는 스캐폴드 이외의 단일 도메인 스캐폴드를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 단일 도메인 항체는 마우스, 인간, 낙타, 라마, 염소, 토끼 및 소를 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 종으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 단일 도메인 항체는 본 명세서에 기재된 바와 같이 낙타과 종, 예를 들어, 라마, 단봉낙타, 알파카 및 구아나코에서 생성된 항체로부터 유래될 수 있다. 낙타과 이외의 다른 종은 경쇄가 자연적으로 결여된 중쇄 항체를 생산할 수 있으며; 이러한 다른 종으로부터 유래된 VHH는 본 개시내용의 범위 내에 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 단일 도메인 항체(예를 들어, VHH)는 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4의 구조를 갖는다. 단일 도메인 항체는 본 명세서에 기재된 바와 같이 또 다른 분자(예를 들어, 작용제)에 유전적으로 융합되거나 또는 화학적으로 접합될 수 있다. 단일 도메인 항체는 더 큰 결합 분자(예를 들어, 다중특이성 항체 또는 키메라 항원 수용체)의 일부일 수 있다.
용어 "결합하다" 또는 "결합하는"은, 예를 들어, 복합체를 형성하는 것을 포함하는 분자 사이의 상호작용을 지칭한다. 상호작용은, 예를 들어, 수소 결합, 이온 결합, 소수성 상호작용 및/또는 반데르 발스 상호작용을 포함하는 비공유적 상호작용일 수 있다. 복합체는 또한 공유 또는 비공유 결합, 상호작용 또는 힘에 의해 함께 유지되는 2개 이상의 분자의 결합을 포함할 수 있다. 항체의 단일 항원-결합 부위와 항체와 같은 표적 분자의 단일 에피토프 사이의 전체 비공유적 상호작용의 강도는 해당 에피토프에 대한 항체 또는 기능적 단편의 친화도이다. 1가 항원에 대한 결합 분자(예를 들어, 항체)의 해리 속도(koff) 대 결합 속도(kon)의 비(koff/kon)는 해리 상수 KD이며, 이는 친화도와 반비례한다. KD 값이 낮을수록, 항체의 친화도가 높다. KD의 값은 항체 및 항원의 상이한 복합체에 따라 다르며, kon 및 koff에 따라 다르다. 본 명세서에 제공된 항체에 대한 해리 상수 KD는 본 명세서에 제공된 임의의 방법 또는 당업자에게 잘 알려진 임의의 다른 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 하나의 결합 부위에서의 친화도가 항상 항체와 항원 사이의 진정한 상호작용의 강도를 반영하는 것은 아니다. 다가 항원과 같이 여러 개의 반복되는 항원 결정기를 포함하는 복합 항원이 여러 개의 결합 부위를 포함하는 항체와 접촉할 때, 하나의 부위에서의 항체와 항원의 상호작용은 두 번째 부위에서 반응의 확률을 증가시킬 것이다. 다가 항체와 항원 간의 이러한 다중 상호작용의 강도는 결합력(avidity)이라고 한다.
본 명세서에 기재된 결합 분자와 관련하여, "~에 결합하는", "~에 특이적으로 결합하는"과 같은 용어 및 유사한 용어가 또한 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되며, 폴리펩타이드와 같은 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인의 결합 분자를 지칭한다. 항원에 결합하거나 또는 특이적으로 결합하는 결합 분자 또는 항원 결합 도메인은, 예를 들어, 면역검정, Octet®, Biacore® 또는 당업자에게 공지된 다른 기법에 의해 확인될 수 있다. 일부 실시형태에서, 결합 분자 또는 항원 결합 도메인은 방사면역검정(RIA) 및 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA)과 같은 실험 기법을 사용하여 결정된 임의의 교차 반응성 항원보다 더 높은 친화도로 항원에 결합할 때 항원에 결합하거나 또는 특이적으로 결합한다. 전형적으로, 특이적 또는 선택적 반응은 배경 신호 또는 잡음의 적어도 두 배일 것이며, 배경의 10배 이상일 수 있다. 예를 들어, 결합 특이성에 관한 논의에 대해 문헌[Fundamental Immunology 332-36 (Paul ed., 2d ed. 1989)]을 참조한다. 소정의 실시형태에서, "비표적" 단백질에 대한 결합 분자 또는 항원 결합 도메인의 결합 정도는, 예를 들어, 형광 활성화 세포 분류(FACS) 분석 또는 RIA에 의해 결정된 바와 같이 특정 표적 항원에 대한 결합 분자 또는 항원 결합 도메인의 결합의 약 10% 미만이다. 항원에 결합하는 결합 분자 또는 항원 결합 도메인은 결합 분자가, 예를 들어, 항원을 표적화하는 데 치료제 및/또는 진단제로서 유용하도록 충분한 친화도로 항원에 결합할 수 있는 것을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 항원에 결합하는 결합 분자 또는 항원 결합 도메인은 1μM, 800nM, 600nM, 550nM, 500nM, 300nM, 250nM, 100nM, 50nM, 10nM, 5nM, 4nM, 3nM, 2nM, 1nM, 0.9nM, 0.8nM, 0.7nM, 0.6nM, 0.5nM, 0.4nM, 0.3nM, 0.2nM 또는 0.1nM 이하의 해리 상수(KD)를 갖는다. 소정의 실시형태에서, 결합 분자 또는 항원 결합 도메인은 상이한 종으로부터의 항원 사이에 보존된 항원의 에피토프에 결합한다.
소정의 실시형태에서, 결합 분자 또는 항원 결합 도메인은 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래되거나 또는 특정 항체 클래스 또는 하위클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 또는 상동인 "키메라" 서열을 포함할 수 있는 반면, 사슬(들)의 나머지 부분은 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한 또 다른 종으로부터 유래되거나 또는 또 다른 항체 클래스 또는 하위클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열뿐만 아니라 이러한 항체의 단편과 동일하거나 또는 상동이다(미국 특허 제4,816,567호; 및 문헌[Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-55] 참조). 키메라 서열은 인간화된 서열을 포함할 수 있다.
소정의 실시형태에서, 결합 분자 또는 항원 결합 도메인은 천연 CDR 잔기가 목적하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 낙타, 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류와 같은 비인간 종(예를 들어, 공여 항체)의 상응하는 CDR로부터의 잔기로 대체된 인간 면역 글로불린(예를 들어, 수용(recipient) 항체)으로부터의 서열을 포함하는 비인간(예를 들어, 낙타, 뮤린, 비인간 영장류) 항체의 "인간화된" 형태의 일부를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 인간 면역 글로불린 서열의 하나 이상의 FR 영역 잔기는 상응하는 비인간 잔기로 대체된다. 또한, 인간화된 항체는 수용 항체 또는 공여 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 더욱 개선하기 위해 이루어진다. 인간화된 항체 중쇄 또는 경쇄는 적어도 하나 이상의 가변 영역을 실질적으로 모두 포함할 수 있으며, 모든 또는 실질적으로 모든 CDR은 비인간 면역 글로불린의 CDR에 해당하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 면역 글로불린 서열의 FR에 해당한다. 소정의 실시형태에서, 인간화된 항체는 면역 글로불린 불변 영역(Fc), 전형적으로 인간 면역 글로불린의 면역 글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부를 포함할 것이다. 추가의 자세한 내용은 문헌[Jones et al., Nature 321:522-25 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-29 (1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-96 (1992); Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285-89 (1992)]; 미국 특허 제6,800,738호; 제6,719,971호; 제6,639,055호; 제6,407,213호; 및 제6,054,297호를 참조한다.
소정의 실시형태에서, 결합 분자 또는 항원 결합 도메인은 "완전 인간 항체" 또는 "인간 항체"의 일부를 포함할 수 있되, 용어는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되며 인간 가변 영역 및, 예를 들어, 인간 불변 영역을 포함하는 항체를 지칭한다. 결합 분자는 단일 도메인 항체 서열을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 용어는 인간 기원의 가변 영역 및 불변 영역을 포함하는 항체를 지칭한다. 소정의 실시형태에서, "완전 인간" 항체는 또한 폴리펩타이드에 결합하고 인간 생식세포계열 면역 글로불린 핵산 서열의 자연 발생적 체세포 변이체인 핵산 서열에 의해 암호화되는 항체를 포함할 수 있다. 용어 "완전 인간 항체"는 Kabat 등(문헌[Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242] 참조)에 의해 기술된 바와 같은 인간 생식세포계열 면역 글로불린 서열에 상응하는 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함한다. "인간 항체"는 인간에 의해 생산되고/되거나 인간 항체를 만들기 위한 임의의 기법을 사용하여 만들어진 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 항체이다. 인간 항체의 이러한 정의는 특히 비인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화된 항체를 제외한다. 인간 항체는 파지-디스플레이 라이브러리(Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol. 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581 (1991)) 및 효모 디스플레이 라이브러리(Chao et al., Nature Protocols 1: 755-68 (2006))를 포함하는 당업계에 공지된 다양한 기법을 사용하여 생산될 수 있다. 또한, 인간 단일클론 항체의 제조에 이용 가능한 것은 문헌[Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol. 147(1):86-95 (1991); 및 van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001)]에 기술되어 있는 방법이다. 인간 항체는 항원 시험투여에 대한 반응으로 이러한 항체를 생산하도록 변형되었지만 이의 내인성 유전자좌가 비활성화된 트랜스제닉 동물, 예를 들어, 마우스에 항원을 투여함으로써 제조될 수 있다(예를 들어, XENOMOUSE™ 기술에 관해 문헌[Jakobovits, Curr. Opin. Biotechnol. 6(5):561-66 (1995); and Taussing, Curr. Opin. Biotechnol. 8(4):455-58 (1997)]; 및 미국 특허 제6,075,181호 및 제6,150,584호 참조). 또한, 예를 들어, 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통해 생성된 인간 항체에 관해 문헌[Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:3557-62 (2006)]을 참조한다.
소정의 실시형태에서, 결합 분자 또는 항원 결합 도메인은 "재조합 인간 항체"의 일부를 포함할 수 있되, 어구는 숙주 세포에 형질감염된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 항체와 같은 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 인간 항체, 재조합, 조합 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 인간 면역 글로불린 유전자에 대해 트랜스제닉 및/또는 트랜스염색체인 동물(예를 들어, 마우스 또는 소)로부터 단리된 항체(예를 들어, 문헌[Taylor, L. D. et al., Nucl. Acids Res. 20:6287-6295 (1992)] 참조) 또는 인간 면역 글로불린 유전자 서열을 다른 DNA 서열로 스플라이싱하는 것을 포함하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체를 포함한다. 이러한 재조합 인간 항체는 인간 생식세포계열 면역 글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 가질 수 있다(문헌[Kabat, E. A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242] 참조). 그러나, 소정의 실시형태에서, 이러한 재조합 인간 항체는 시험관내 돌연변이유발(또는, 인간 Ig 서열에 대한 트랜스제닉 동물 트랜스제닉이 사용되는 경우, 생체내 체세포 돌연변이유발)을 거치므로, 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은 인간 생식세포계열 VH 및 VL 서열로부터 유래되고 이와 관련이 있지만, 생체내 인간 항체 생식세포계열 레퍼토리 내에 자연적으로 존재하지 않을 수 있는 서열이다.
소정의 실시형태에서, 결합 분자 또는 항원 결합 도메인은 "단일클론 항체"의 일부를 포함할 수 있되, 본 명세서에서 사용되는 용어는 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 얻은 항체를 지칭하며, 예를 들어, 집단을 구성하는 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생적 돌연변이 또는 아미노산 이성질체화 또는 탈아마이드화, 메티오닌 산화 또는 아스파라긴 또는 글루타민 탈아마이드화와 같은 잘 알려진 번역 후 변형을 제외하고는 동일하며, 각각의 단일클론 항체는 전형적으로 항원의 단일 에피토프를 인식할 것이다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에서 사용되는 "단일클론 항체"는 단일 하이브리도마 또는 다른 세포에 의해 생산된 항체이다. 용어 "단일클론"은 항체를 제조하기 위한 임의의 특정 방법에 제한되지 않는다. 예를 들어, 본 개시내용에 유용한 단일클론 항체는 문헌[Kohler et al., Nature 256:495 (1975)]에 의해 처음 기술된 하이브리도마 방법론에 의해 제조될 수 있거나 또는 세균 또는 진핵생물 동물 또는 식물 세포에서 재조합 DNA 방법을 사용하여 제조될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호 참조). "단일클론 항체"는, 예를 들어, 문헌[Clackson et al., Nature 352:624-28 (1991) 및 Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-97 (1991)]에 기술되어 있는 기법을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 클론 세포주 및 이에 의해 발현된 단일클론 항체의 제조를 위한 다른 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Short Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al. eds., 5th ed. 2002)]을 참조한다.
전형적인 4-쇄 항체 유닛은 2개의 동일한 경쇄(L) 사슬 및 2개의 동일한 중쇄(H)로 구성된 이종4량체 당단백질이다. IgG의 경우, 4-쇄 유닛은 일반적으로 약 150,000달톤이다. 각각의 L 사슬은 하나의 공유 이황화 결합에 의해 H 사슬에 연결되는 반면, 2개의 H 사슬은 H 사슬 아이소타입에 따라 하나 이상의 이황화 결합에 의해 서로 연결된다. 각각의 H 및 L 사슬은 또한 규칙적으로 간격을 둔 사슬내 이황화 브리지를 갖는다. 각각의 H 사슬은 N-말단에 α 및 γ 사슬 각각에 대한 3개의 불변 도메인(CH) 및 μ 및 ε 아이소타입에 대한 4개의 CH 도메인이 뒤따르는 가변 도메인(VH)을 갖는다. 각각의 L 사슬은 N-말단에 가변 도메인(VL)과 다른 말단에 불변 도메인(CL)이 있다. VL은 VH와 정렬되고, CL은 중쇄(CH1)의 첫 번째 불변 도메인과 정렬된다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄와 중쇄 가변 도메인 사이의 경계면을 형성하는 것으로 여겨진다. VH 및 VL은 함께 페어링하여 단일 항원-결합 부위를 형성한다. 상이한 클래스의 항체의 구조 및 특성에 대해, 예를 들어, 문헌[Basic and Clinical Immunology 71 (Stites et al. eds., 8th ed. 1994); 및 Immunobiology (Janeway et al. eds., 5th ed. 2001)]을 참조한다.
용어 "Fab" 또는 "Fab 영역"은 항원에 결합하는 항체 영역을 지칭한다. 종래의 IgG는 일반적으로 각각 Y-형 IgG 구조의 2개의 암(arm) 중 하나에 상주하는 2개의 Fab 영역을 포함한다. 각 Fab 영역은 전형적으로 각각의 중쇄 및 경쇄의 하나의 가변 영역 및 하나의 불변 영역으로 구성된다. 보다 구체적으로, Fab 영역에서 중쇄의 가변 영역 및 불변 영역은 VH 및 CH1 영역이고, Fab 영역에서 경쇄의 가변 영역 및 불변 영역은 VL 및 CL 영역이다. Fab 영역에서 VH, CH1, VL 및 CL은 본 개시내용에 따라 항원 결합 능력을 부여하기 위해 다양한 방식으로 배열될 수 있다. 예를 들어, VH 및 CH1 영역은 하나의 폴리펩타이드 상에 있을 수 있고, VL 및 CL 영역은 종래의 IgG의 Fab 영역과 유사하게 별도의 폴리펩타이드 상에 있을 수 있다. 대안적으로, VH, CH1, VL 및 CL 영역은 모두 동일한 폴리펩타이드 상에 있을 수 있으며, 아래 부문에서 더 자세히 설명되는 바와 같이 상이한 순서로 배향된다.
용어 "가변 영역", "가변 도메인", "V 영역" 또는 "V 도메인"은 일반적으로 경쇄 또는 중쇄의 아미노-말단에 위치하고, 중쇄에서 약 120개 내지 130개의 아미노산 길이 및 경쇄에서 약 100개 내지 110개의 아미노산 길이를 가지며, 특정 항원에 대한 각 특정 항체의 결합 및 특이성에 사용되는 항체의 경쇄 또는 중쇄의 일부를 지칭한다. 중쇄의 가변 영역은 "VH"로 지칭될 수 있다. 경쇄의 가변 영역은 "VL"로 지칭될 수 있다. 용어 "가변"은 가변 영역의 소정의 분절이 항체 사이에서 서열이 광범위하게 다르다는 사실을 지칭한다. V 영역은 항원 결합을 매개하며 특정 항원에 대한 특정 항체의 특이성을 정의한다. 그러나, 가변성은 가변 영역의 110개의 아미노산 범위에 고르게 분포되지 않는다. 대신, V 영역은 각각 약 9개 내지 12개의 아미노산 길이인 "초가변 영역"이라고 하는 더 큰 가변성(예를 들어, 극한의 가변성)의 더 짧은 영역으로 분리된 약 15개 내지 30개의 아미노산의 프레임워크 영역(framework region: FR)이라고 하는 덜 가변적인(예를 들어, 상대적으로 불변) 신장부로 구성된다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 각각 4개의 FR을 포함하고, 주로 β 시트 구성을 채택하고, 3개의 초가변 영역에 의해 연결되며, 루프 연결을 형성하고, 경우에 따라 β 시트 구조의 일부를 형성한다. 각 사슬의 초가변 영역은 FR에 매우 근접하게 함께 유지되며, 다른 사슬의 초가변 영역과 함께 항체의 항원-결합 부위 형성에 기여한다(예를 들어, 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (5th ed. 1991)] 참조). 불변 영역은 항체가 항원에 결합하는 데 직접 관여하지 않지만, 항체 의존성 세포독성(antibody dependent cellular cytotoxicity: ADCC) 및 보체 의존성 세포독성(complement dependent cytotoxicity: CDC)에서의 항체의 참여와 같은 다양한 효과기 기능을 나타낸다. 가변 영역은 상이한 항체 사이에서 서열이 광범위하게 상이하다. 특정 실시형태에서, 가변 영역은 인간 가변 영역이다.
용어 "Kabat에 따른 가변 영역 잔기 넘버링" 또는 "Kabat에서와 같은 아미노산 위치 넘버링" 및 이의 변형어는 상기 Kabat 등에서 항체 편집의 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역에 사용되는 넘버링 시스템을 지칭한다. 이 넘버링 시스템을 사용하여, 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 CDR의 단축 또는 삽입에 해당하는 더 적거나 또는 추가적인 아미노산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 가변 도메인은 잔기 52 뒤에 단일 아미노산 삽입체(insert)(Kabat에 따른 잔기 52a) 및 잔기 82 뒤에 3개의 삽입된 잔기(예를 들어, Kabat에 따른 잔기 82a, 82b 및 82c 등)를 포함할 수 있다. 잔기의 Kabat 넘버링은 "표준" Kabat 넘버링된 서열과 함께 항체 서열의 상동성 영역에서의 정렬에 의해 주어진 항체에 대해 결정될 수 있다. Kabat 넘버링 시스템은 일반적으로 가변 도메인 내의 잔기(대략 경쇄의 1번 내지 107번 잔기 및 중쇄의 1번 내지 113번 잔기)(예를 들어, 상기 Kabat 등)를 언급할 때 사용된다. "EU 넘버링 시스템" 또는 "EU 지수"는 일반적으로 면역 글로불린 중쇄 불변 영역의 잔기를 언급할 때 사용된다(예를 들어, 상기 Kabat 등에 보고된 EU 지수). "Kabat에서와 같은 EU 지수"는 인간 IgG 1 EU 항체의 잔기 넘버링을 지칭한다. 예를 들어, AbM, Chothia, Contact, IMGT 및 AHon에 의해 다른 넘버링 시스템이 기술되어 있다.
항체와 관련하여 사용될 때 용어 "중쇄"는 아미노-말단 부분이 약 120개 내지 130개 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함하고 카복시-말단 부분이 불변 영역을 포함하는 약 50kDa 내지 70kDa의 폴리펩타이드 사슬을 지칭한다. 불변 영역은 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열에 기초하여 알파(α), 델타(δ), 엡실론(ε), 감마(γ) 및 뮤(μ)로 지칭되는 5개의 별개의 유형(예를 들어, 아이소타입) 중 하나일 수 있다. 별개의 중쇄는 크기가 다르다: α, δ 및 γ는 대략 450개의 아미노산을 포함하는 반면, μ 및 ε는 대략 550개의 아미노산을 포함한다. 경쇄와 조합될 때, 이러한 별개의 유형의 중쇄는 IgG의 4가지 하위클래스, 즉, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하여 각각 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 5가지 잘 알려진 항체 클래스(예를 들어, 아이소타입)를 생성한다.
항체와 관련하여 사용될 때 용어 "경쇄"는 아미노-말단 부분이 약 100개 내지 약 110개 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함하고 카복시-말단 부분이 불변 영역을 포함하는 약 25kDa의 폴리펩타이드 사슬을 지칭한다. 경쇄의 대략적인 길이는 211개 내지 217개의 아미노산이다. 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여 카파(κ) 또는 람다(λ)로 지칭되는 2가지 별개의 유형이 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "초가변 영역", "HVR", "상보성 결정 영역" 및 "CDR"은 상호교환적으로 사용된다. "CDR"은 면역 글로불린(Ig 또는 항체) VH β-시트 프레임워크의 비프레임워크 영역 내의 3개의 초가변 영역(H1, H2 또는 H3) 중 하나 또는 항체 VL β-시트 프레임워크의 비프레임워크 영역 내의 3개의 초가변 영역(L1, L2 또는 L3) 중 하나를 지칭한다. 따라서, CDR은 프레임워크 영역 서열 내에 산재된 가변 영역 서열이다.
CDR 영역은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 잘 알려진 넘버링 시스템에 의해 정의되었다. 예를 들어, Kabat 상보성 결정 영역(CDR)은 서열 가변성을 기반으로 하며 가장 일반적으로 사용된다(예를 들어, 상기 Kabat 등 참조). 대신, Chothia는 구조적 루프의 위치를 지칭한다(예를 들어, 문헌[Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-17 (1987)] 참조). Kabat 넘버링 형식을 사용하여 넘버링될 때 Chothia CDR-H1 루프의 끝은 루프의 길이에 따라 H32와 H34 사이에서 다르다(이는 Kabat 넘버링 체계가 H35A와 H35B에 삽입을 배치하기 때문이며; 35A도 35B도 존재하지 않는 경우 루프는 32에서 끝나고; 35A만 존재하는 경우 루프는 33에서 끝나고; 35A와 35B가 모두 존재하는 경우 루프는 34에서 끝남). AbM 초가변 영역은 Kabat CDR과 Chothia 구조적 루프 사이의 절충(compromise)을 나타내며, 옥스포드 몰리큘러(Oxford Molecular)의 AbM 항체 모델링 소프트웨어에서 사용된다(예를 들어, 문헌[Antibody Engineering Vol. 2 (Kontermann and eds., 2d ed. 2010)] 참조). "접촉" 초가변 영역은 이용 가능한 복잡한 결정 구조의 분석을 기반으로 한다. 개발되어 널리 채택된 또 다른 범용 넘버링 시스템은 ImMunoGeneTics(IMGT) Information System®(Lafranc et al., Dev. Comp. Immunol. 27(1):55-77 (2003))이다. IMGT는 인간 및 다른 척추동물의 면역 글로불린(IG), T-세포 수용체(TCR) 및 주요 조직적합성 복합체(MHC)를 전문으로 하는 통합 정보 시스템이다. 본 명세서에서 CDR은 경쇄 또는 중쇄 내의 아미노산 서열 및 위치 모두의 관점에서 언급된다. 면역 글로불린 가변 도메인의 구조 내에서 CDR의 "위치"는 구조적 특징에 따라 가변 도메인 서열을 정렬하는 넘버링 시스템을 사용함으로써 종 간에 보존되고 루프라고 하는 구조에 존재하므로, CDR 및 프레임워크 잔기는 쉽게 식별된다. 이 정보는 한 종의 면역 글로불린으로부터의 CDR 잔기를 전형적으로 인간 항체로부터의 수용자(acceptor) 프레임워크로 이식 및 교체하는 데 사용될 수 있다. 추가적인 넘버링 시스템(AHon)이 문헌[Honegger and , J. Mol. Biol. 309: 657-70 (2001)]에 의해 개발되었다. 예를 들어, Kabat 넘버링과 IMGT 고유 넘버링 시스템을 포함하는 넘버링 시스템 간의 관련성은 당업자에게 잘 알려져 있다(예를 들어, 상기 Kabat; 상기 Chothia 및 Lesk; 상기 Martin; 상기 Lefranc 등 참조). 이러한 초가변 영역 또는 CDR 각각으로부터의 잔기는 아래 표 6에 예시되어 있다.
주어진 CDR의 경계는 식별에 사용되는 체계에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 달리 명시되지 않는 한, 가변 영역과 같은 주어진 항체 또는 이의 영역의 "CDR" 및 "상보성 결정 영역"이라는 용어뿐만 아니라 항체 또는 이의 영역의 개별 CDR(예를 들어, CDR-H1, CDR-H2)은 상기 본 명세서에 기재된 임의의 공지된 체계에 의해 정의된 바와 같은 상보성 결정 영역을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 일부 예에서, IMGT, Kabat, Chothia 또는 접촉 방법에 의해 정의된 바와 같은 CDR과 같이 특정 CDR 또는 CDR의 식별을 위한 체계가 명시된다. 다른 경우에, CDR의 특정 아미노산 서열이 주어진다. CDR 영역은 또한 다양한 넘버링 시스템의 조합, 예를 들어, Kabat과 Chothia 넘버링 시스템의 조합 또는 Kabat과 IMGT 넘버링 시스템의 조합에 의해 정의될 수 있음에 유의하여야 한다. 따라서, "특정 VH 또는 VHH로 제시된 CDR"과 같은 용어는 위에 기재된 예시적인 CDR 넘버링 시스템에 의해 정의된 임의의 CDR1을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일단 가변 영역(예를 들어, VHH, VH 또는 VL)이 주어지면, 당업자는 영역 내의 CDR이 상이한 넘버링 시스템 또는 이들의 조합에 의해 정의될 수 있음을 이해할 것이다.
초가변 영역은 다음과 같은 "확장된 초가변 영역"을 포함할 수 있다: VL에서 24-36 또는 24-34(L1), 46-56 또는 50-56(L2) 및 89-97 또는 89-96(L3) 및 VH에서 26-35 또는 26-35A(H1), 50-65 또는 49-65(H2) 및 93-102, 94-102 또는 95-102(H3).
용어 "불변 영역" 또는 "불변 도메인"은 항원에 대한 항체의 결합에 직접 관여하지 않지만 Fc 수용체와의 상호작용과 같은 다양한 효과기 기능을 나타내는 경쇄 및 중쇄의 카복시 말단 부분을 지칭한다. 용어는 항원 결합 부위를 포함하는 가변 영역인 면역 글로불린의 다른 부분에 비해 더 보존된 아미노산 서열을 갖는 면역 글로불린 분자의 부분을 지칭한다. 불변 영역은 중쇄의 CH1, CH2 및 CH3 영역 및 경쇄의 CL 영역을 포함할 수 있다.
용어 "프레임워크" 또는 "FR"은 CDR의 측면에 있는 가변 영역 잔기를 지칭한다. FR 잔기는, 예를 들어, 키메라, 인간화된, 인간, 도메인 항체(예를 들어, 단일 도메인 항체), 다이어바디, 선형 항체 및 이중특이성 항체에 존재한다. FR 잔기는 초가변 영역 잔기 또는 CDR 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다.
용어 "Fc 영역"은 본 명세서에서, 예를 들어, 천연 서열 Fc 영역, 재조합 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함하는 면역 글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하기 위해 사용된다. 면역 글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계는 다양할 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 종종 위치 Cys226 또는 Pro230의 위치의 아미노산 잔기에서 이의 카복실-말단까지 신장되는 것으로 정의된다. Fc 영역의 C-말단 라이신(EU 넘버링 시스템에 따른 447번 잔기)은, 예를 들어, 항체의 생산 또는 정제 동안 또는 항체의 중쇄를 암호화하는 핵산을 재조합적으로 조작함으로써 제거될 수 있다. 따라서, 온전한 항체의 조성물은 모두 K447번 잔기가 제거된 항체 집단, K447 잔기가 제거되지 않은 항체 집단 및 K447 잔기가 있거나 없는 항체의 혼합물을 갖는 항체 집단을 포함할 수 있다. "기능적 Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역의 "효과기 기능"을 보유한다. 예시적인 "효과기 기능"은 C1q 결합; CDC; Fc 수용체 결합; ADCC; 식세포 작용; 세포 표면 수용체(예를 들어, B 세포 수용체)의 하향조절 등을 포함한다. 이러한 효과기 기능은 일반적으로 Fc 영역이 결합 영역 또는 결합 도메인(예를 들어, 항체 가변 영역 또는 도메인)과 결합될 것을 필요로 하며, 당업자에게 공지된 다양한 검정을 사용하여 평가될 수 있다. "변이체 Fc 영역"은 적어도 하나의 아미노산 변형(예를 들어, 치환, 부가 또는 결실)에 의해 천연 서열 Fc 영역의 것과 상이한 아미노산 서열을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩타이드의 Fc 영역과 비교하여 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩타이드의 Fc 영역에 적어도 하나의 아미노산 치환, 예를 들어, 약 1개 내지 약 10개의 아미노산 치환 또는 약 1개 내지 약 5개의 아미노산 치환을 갖는다. 본 명세서에서 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 및/또는 모 폴리펩타이드의 Fc 영역과 적어도 약 80%의 상동성 또는 이들과 적어도 약 90%의 상동성, 예를 들어, 이들과 적어도 약 95%의 상동성을 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "에피토프"는 당업계의 용어이며, 결합 분자(예를 들어, 단일 도메인 항체 서열을 포함하는 항체)가 특이적으로 결합할 수 있는 항원의 국부화된 영역을 지칭한다. 에피토프는 선형 에피토프 또는 구조적, 비선형 또는 비연속적 에피토프일 수 있다. 폴리펩타이드 항원의 경우, 예를 들어, 에피토프는 폴리펩타이드의 연속 아미노산일 수 있거나("선형" 에피토프) 또는 에피토프는 폴리펩타이드의 2개 이상의 비연속 영역으로부터의 아미노산을 포함할 수 있다("구조적", "비선형" 또는 "비연속적" 에피토프). 당업자라면 일반적으로 선형 에피토프는 2차, 3차 또는 4차 구조에 의존하거나 또는 의존하지 않을 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 결합 분자는 천연 3차원 단백질 구조로 접혀 있는지 여부에 관계없이 아미노산 그룹에 결합한다. 다른 실시형태에서, 결합 분자는 에피토프를 인식하고 이에 결합하기 위해 특정 형태(예를 들어, 구부림, 뒤틀림, 회전 또는 접힘)를 나타내도록 에피토프를 구성하는 아미노산 잔기를 필요로 한다.
"차단" 항체 또는 "길항제" 항체는 그것이 결합하는 항원의 생물학적 활성을 저해하거나 또는 감소시키는 항체이다. 일부 실시형태에서, 차단 항체 또는 길항제 항체는 항원의 생물학적 활성을 실질적으로 또는 완전히 저해한다.
"효능제" 또는 활성화 항체는 그것이 결합하는 항원에 의한 신호전달을 향상시키거나 또는 개시하는 항체이다. 일부 실시형태에서, 효능제 항체는 천연 리간드의 부재하에 신호전달을 유발하거나 또는 활성화한다.
펩타이드, 폴리펩타이드 또는 항체 서열에 대한 "아미노산 서열 동일성의 퍼센트(%)" 및 "상동성"은, 필요한 경우, 서열 동일성의 최대 퍼센트를 달성하기 위해 서열을 정렬하고, 갭을 도입한 후 특정 펩타이드 또는 폴리펩타이드 서열의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열의 아미노산 잔기의 백분율로 정의되며, 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 치환은 고려하지 않는다. 아미노산 서열 동일성의 퍼센트를 결정하기 위한 정렬은, 예를 들어, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 MEGALIGN™(디엔에이스타(DNASTAR)) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 당업계의 기술 내에 있는 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여 정렬을 측정하기 위한 적절한 매개변수를 결정할 수 있다.
용어 "특이성"은 항원의 특정 에피토프에 대한 항원 결합 단백질(예컨대, CAR 또는 sdAb)의 선택적 인식을 지칭한다. 예를 들어, 천연 항체는 단일특이적이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "다중특이성"은 항원 결합 단백질(예컨대, CAR 또는 sdAb)이 적어도 2개의 상이한 항원에 결합하는 2개 이상의 항원-결합 부위를 가짐을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 "이중특이성"은 항원 결합 단백질(예컨대, aCAR 또는 sdAb)이 2개의 상이한 항원-결합 특이성을 가짐을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "단일특이성" CAR은 항원 결합 단백질(예컨대, CAR 또는 sdAb)이 각각 동일한 항원에 결합하는 하나 이상의 결합 부위를 가짐을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "가(valent)"는 항원 결합 단백질(예컨대, CAR 또는 sdAb)에서 특정 수의 결합 부위의 존재를 나타낸다. 예를 들어, 천연 항체 또는 전장 항체는 2개의 결합 부위를 가지며, 2가이다. 이와 같이, 용어 "3가", 4가", "5가" 및 "6가"는 항원 결합 단백질(예컨대, CAR 또는 sdAb) 내에 각각 2개의 결합 부위, 3개의 결합 부위, 4개의 결합 부위, 5개의 결합 부위 및 6개의 결합 부위의 존재를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 "키메라 항원 수용체" 또는 "CAR"은 T 세포와 같은 면역 효과기 세포에 하나 이상의 항원 특이성을 이식하는 데 사용될 수 있는 유전적으로 조작된 수용체를 지칭한다. 일부 CAR은 "인공 T-세포 수용체", "키메라 T 세포 수용체" 또는 "키메라 면역 수용체"로도 알려져 있다. 일부 실시형태에서, CAR은 하나 이상의 항원(예컨대, 종양 항원)에 특이적인 세포외 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 T 세포 및/또는 다른 수용체의 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. "CAR-T 세포"는 CAR을 발현하는 T 세포를 지칭한다.
용어 "폴리펩타이드" 및 "펩타이드" 및 "단백질"은 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되며, 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭한다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 이는 변형된 아미노산을 포함할 수 있으며, 이는 비아미노산에 의해 중단될 수 있다. 용어는 또한 자연적으로 또는 중재; 예를 들어, 이황화 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화 또는 임의의 다른 조작 또는 변형에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포함한다. 또한, 예를 들어, 비천연 아미노산뿐만 아니라 당업계에 공지된 다른 변형을 포함하지만 이에 제한되지 않는 아미노산의 하나 이상의 유사체를 포함하는 폴리펩타이드가 정의 내에 포함된다. 본 개시내용의 폴리펩타이드는 항체 또는 면역 글로불린 슈퍼패밀리의 다른 구성원에 기초할 수 있기 때문에, 소정의 실시형태에서 "폴리펩타이드"는 단일 사슬 또는 2개 이상의 회합된 사슬로서 발생할 수 있는 것으로 이해된다.
본 명세서에서 상호교환적으로 사용되는 "폴리뉴클레오타이드" 또는 "핵산"은 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체를 지칭하며, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오타이드는 데옥시리보뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드, 변형된 뉴클레오타이드 또는 염기, 및/또는 이의 유사체 또는 DNA 또는 RNA 폴리머레이스에 의해 또는 합성 반응에 의해 중합체에 혼입될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 메틸화된 뉴클레오타이드 및 이들의 유사체와 같은 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "올리고뉴클레오타이드"는 일반적으로 길이가 약 200개 미만인 뉴클레오타이드이지만 반드시 그런 것은 아닌 짧은 일반적으로 단일-가닥의 합성 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 용어 "올리고뉴클레오타이드" 및 "폴리뉴클레오타이드"는 상호 배타적이지 않다. 폴리뉴클레오타이드에 대한 위의 설명은 올리고뉴클레오타이드에 동등하고 완전하게 적용 가능하다. 본 개시내용의 결합 분자를 생산하는 세포는 모 하이브리도마 세포뿐만 아니라 항체를 암호화하는 핵산이 도입된 세균 및 진핵생물 숙주 세포를 포함할 수 있다. 달리 명시되지 않는 한, 본 명세서에 개시된 임의의 단일-가닥 폴리뉴클레오타이드 서열의 좌측 말단은 5' 말단이고; 이중-가닥 폴리뉴클레오타이드 서열의 좌측 방향은 5' 방향으로 지칭된다. 초기(nascent) RNA 전사체의 5'에서 3'로의 추가 방향은 전사 방향으로 지칭되고; RNA 전사체의 5' 말단에 대해 5'인 RNA 전사체와 동일한 서열을 갖는 DNA 가닥 상의 서열 영역은 "상류 서열"로 지칭되며; RNA 전사체의 3' 말단에 대해 3'인 RNA 전사체와 동일한 서열을 갖는 DNA 가닥 상의 서열 영역은 "하류 서열"로 지칭된다.
"단리된 핵산"은 핵산, 예를 들어, RNA, DNA 또는 혼합 핵산으로서, 천연 서열에 자연적으로 수반되는 리보솜 및 폴리머레이스와 같은 단백질 또는 복합체뿐만 아니라 다른 게놈 DNA 서열로부터 실질적으로 분리된다. "단리된" 핵산 분자는 핵산 분자의 천연 공급원에 존재하는 다른 핵산 분자로부터 분리된 것이다. 더욱이, cDNA 분자와 같은 "단리된" 핵산 분자는 재조합 기법에 의해 생산될 때 다른 세포 물질 또는 배양 배지가 실질적으로 없거나 또는 화학적으로 합성될 때 화학적 전구체 또는 기타 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 단일 도메인 항체 또는 항체를 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자가 단리되거나 또는 정제된다. 용어는 이들의 자연 발생적 환경으로부터 제거된 핵산 서열을 포함하며, 재조합 또는 클로닝된 DNA 단리물 및 화학적으로 합성된 유사체 또는 이종 시스템에 의해 생물학적으로 합성된 유사체를 포함한다. 실질적으로 순수한 분자는 단리된 형태의 분자를 포함할 수 있다. 구체적으로, 본 명세서에 기재된 CAR 또는 sdAb를 암호화하는 "단리된" 핵산 분자는 이것이 생산되었던 환경에서 이것이 통상적으로 회합되는 적어도 하나의 오염물 핵산 분자로부터 확인되고 분리된 핵산 분자이다.
용어 "제어 서열"은 특정 숙주 유기체에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 DNA 서열을 지칭한다. 원핵생물에 적합한 제어 서열은, 예를 들어, 프로모터, 선택적으로 작동자 서열 및 리보솜 결합 부위를 포함한다. 진핵생물 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호 및 인핸서를 이용하는 것으로 알려져 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "작동 가능하게 연결된" 및 유사한 어구(예를 들어, 유전적으로 융합된)는 핵산 또는 아미노산과 관련하여 사용될 때 각각 서로 기능적 관계에 있는 핵산 서열 또는 아미노산 서열의 작동적 연결을 지칭한다. 예를 들어, 작동 가능하게 연결된 프로모터, 인핸서 요소, 오픈 리딩 프레임, 5' 및 3' UTR 및 종결자 서열은 핵산 분자(예를 들어, RNA)의 정확한 생산을 초래한다. 일부 실시형태에서, 작동 가능하게 연결된 핵산 요소는 오픈 리딩 프레임의 전사 및 궁극적으로 폴리펩타이드의 생산(즉, 오픈 리딩 프레임의 발현)을 초래한다. 또 다른 예로서, 작동 가능하게 연결된 펩타이드는 기능적 도메인이 각 도메인의 의도된 기능을 부여하기 위해 서로로부터 적절한 거리를 두고 배치된 것이다.
용어 "벡터"는 핵산 서열을 숙주 세포에 도입하기 위해, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 결합 분자(예를 들어, 항체)를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 서열을 운반하거나 또는 포함하는 데 사용되는 물질을 지칭한다. 사용하기 위해 적용 가능한 벡터는, 예를 들어, 숙주 세포의 염색체로의 안정적인 통합을 위해 작동할 수 있는 선택 서열 또는 마커를 포함할 수 있는, 발현 벡터, 플라스미드, 파지 벡터, 바이러스 벡터, 에피솜 및 인공 염색체를 포함한다. 추가적으로, 벡터는 하나 이상의 선별 마커 유전자 및 적절한 발현 제어 서열을 포함할 수 있다. 포함될 수 있는 선별 마커 유전자는, 예를 들어, 항생제 또는 독소에 대한 저항성을 제공하거나, 영양요구성 결핍을 보완하거나 또는 배양 배지에 없는 중요한 영양소를 공급한다. 발현 제어 서열은 구성적 및 유도성 프로모터, 전사 인핸서, 전사 종결자 등을 포함할 수 있으며, 이들은 당업계에 잘 알려져 있다. 2개 이상의 핵산 분자(예를 들어, 항체 중쇄 및 경쇄 또는 항체 VH 및 VL 둘 다)가 공동 발현되어야 하는 경우, 두 핵산 분자는, 예를 들어, 단일 발현 벡터 또는 별도의 발현 벡터에 삽입될 수 있다. 단일 벡터 발현을 위해, 암호화 핵산은 하나의 공통 발현 제어 서열에 작동 가능하게 연결되거나 또는 하나의 유도성 프로모터 및 하나의 구성적 프로모터와 같은 상이한 발현 제어 서열에 연결될 수 있다. 핵산 분자의 숙주 세포로의 도입은 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 확인될 수 있다. 이러한 방법은, 예를 들어, mRNA의 노던 블롯 또는 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭과 같은 핵산 분석, 유전자 산물의 발현에 대한 면역블로팅 또는 도입된 핵산 서열 또는 이의 상응하는 유전자 산물의 발현을 테스트하기 위한 다른 적합한 분석적 방법을 포함한다. 핵산 분자가 목적하는 산물을 생산하기에 충분한 양으로 발현된다는 것이 당업자에 의해 이해되며, 발현 수준이 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 충분한 발현을 얻기 위해 최적화될 수 있음이 추가로 이해된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "숙주"는 포유동물(예를 들어, 인간)과 같은 동물을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "숙주 세포"는 핵산 분자로 형질감염될 수 있는 특정 대상 세포 및 자손 또는 이러한 세포의 자손 또는 잠재적인 자손을 지칭한다. 이러한 세포의 자손은 다음 세대에서 발생할 수 있는 돌연변이 또는 환경적 영향 또는 숙주 세포 게놈으로의 핵산 분자의 통합으로 인해 핵산 분자로 형질감염된 모 세포와 동일하지 않을 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "자가"는 나중에 개체에게 다시 도입될 동일한 개체로부터 유래된 임의의 물질을 의미한다.
"동종이계"는 동일한 종의 상이한 개체로부터 유래된 이식편을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "형질감염된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된"은 외인성 핵산이 숙주 세포에 전달되거나 또는 도입되는 과정을 지칭한다. "형질감염된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된" 세포는 외인성 핵산으로 형질감염되거나, 형질전환되거나 또는 형질도입된 세포이다. 세포는 1차 대상 세포 및 이의 자손을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "약제학적으로 허용 가능한"은 동물, 특히 인간에게 사용하기 위해 연방 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 또는 미국 약전, 유럽 약전 또는 기타 일반적으로 인정되는 약전에 등재된 것을 의미한다.
"부형제"는 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 용매 또는 캡슐화 물질과 같은 약제학적으로 허용 가능한 물질, 조성물 또는 비히클을 의미한다. 부형제는, 예를 들어, 캡슐화 물질 또는 첨가제, 예컨대, 흡수 촉진제, 항산화제, 결합제, 완충액, 담체, 코팅제, 착색제, 희석제, 붕해제, 유화제, 증량제, 충전제, 향미제, 보습제, 윤활제, 향료, 방부제, 추진제, 이형제, 살균제, 감미제, 가용화제, 습윤제 및 이들의 혼합물을 포함한다. 용어 "부형제"는 또한 희석제, 보조제(예를 들어, 프로인트 보조제(완전 또는 불완전) 또는 비히클을 지칭할 수 있다.
일부 실시형태에서, 부형제는 약제학적으로 허용 가능한 부형제이다. 약제학적으로 허용 가능한 부형제의 예는 완충액, 예컨대, 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산; 아스코르브산을 포함하는 항산화제; 저분자량(예를 들어, 약 10개 미만의 아미노산 잔기) 폴리펩타이드; 단백질, 예컨대, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역 글로불린; 친수성 중합체, 예컨대, 폴리바이닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물; 킬레이트제, 예컨대, EDTA; 당 알코올, 예컨대, 만니톨 또는 소르비톨; 염-형성 반대 이온, 예컨대, 소듐; 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대, TWEEN™, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 PLURONICS™를 포함한다. 약제학적으로 허용 가능한 부형제의 다른 예는 문헌[Remington and Gennaro, Remington's Pharmaceutical Sciences (18th ed. 1990)]에 기술되어 있다.
일 실시형태에서, 각 성분은 약제학적 제형의 다른 성분과 상용성이라는 의미에서 "약제학적으로 허용 가능"하고, 합리적인 이익/위험 비에 부합하는 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 면역원성 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 인간 및 동물의 조직 또는 기관과 접촉하여 사용하기에 적합하다. 예를 들어, 문헌[Lippincott Williams & Wilkins: Philadelphia, PA, 2005; Handbook of Pharmaceutical Excipients, 6th ed.; Rowe et al., Eds.; The Pharmaceutical Press and the American Pharmaceutical Association: 2009; Handbook of Pharmaceutical Additives, 3rd ed.; Ash and Ash Eds.; Gower Publishing Company: 2007; Pharmaceutical Preformulation and Formulation, 2nd ed.; Gibson Ed.; CRC Press LLC: Boca Raton, FL, 2009]을 참조한다. 일부 실시형태에서, 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 사용된 투여량 및 농도에 노출되는 세포 또는 포유동물에 비독성이다. 일부 실시형태에서, 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 수성 pH 완충 용액이다.
일부 실시형태에서, 부형제는 석유, 동물성, 식물성 또는 합성 기원의 것, 예컨대, 땅콩유, 대두유, 광유, 참깨유 등을 포함하는 물 및 오일과 같은 멸균 액체이다. 물은 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물)이 정맥내로 투여될 때 예시적인 부형제이다. 염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액은 또한 특히 주사용 용액을 위한 액체 부형제로서 사용될 수 있다. 부형제는 또한 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 초크, 실리카 겔, 소듐 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 소듐 클로라이드, 건조 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함할 수 있다. 조성물은 또한, 원하는 경우, 소량의 습윤제 또는 유화제 또는 pH 완충제를 포함할 수 있다. 조성물은 용액, 현탁액, 에멀션, 정제, 알약, 캡슐, 분말, 지속 방출 제형 등의 형태를 취할 수 있다. 제형을 포함하는 경구 조성물은 약제학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 사카린, 셀룰로스, 마그네슘 카보네이트 등과 같은 표준 부형제를 포함할 수 있다.
약제학적 화합물을 포함하는 조성물은 적합한 양의 부형제와 함께, 예를 들어, 단리된 또는 정제된 형태의 결합 분자(예를 들어, 항체)를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "유효량" 또는 "치료학적 유효량"은 목적하는 결과를 초래하기에 충분한 단일 도메인 항체 또는 작용제 및 본 명세서에 제공된 단일 도메인 항체 또는 약제학적 조성물을 포함하는 치료 분자의 양을 지칭한다.
용어 "대상체" 및 "환자"는 상호교환적으로 사용될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 소정의 실시형태에서, 대상체는 비영장류 또는 영장류(예를 들어, 인간)와 같은 포유동물이다. 특정 실시형태에서, 대상체는 인간이다. 일 실시형태에서, 대상체는 포유동물, 예를 들어, 질환 또는 장애가 있는 것으로 진단된 인간이다. 또 다른 실시형태에서, 대상체는 질환 또는 장애가 발생할 위험이 있는 포유동물, 예를 들어, 인간이다.
"투여하다" 또는 "투여"는 점막, 피내, 정맥내, 근육내 전달 및/또는 본 명세서에 기재되거나 또는 당업계에 공지된 임의의 기타 물리적 전달 방법에 의해서와 같이 신체 외부에 존재하는 물질을 환자에게 주사하거나 또는 그렇지 않으면 물리적으로 전달하는 행위를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "치료하다", "치료" 및 "치료하는"은 하나 이상의 요법의 투여로 인한 질환 또는 병태의 진행, 중증도 및/또는 지속 기간의 감소 또는 개선을 지칭한다. 치료는 환자가 여전히 기저 장애를 앓고 있을 수 있음에도 불구하고 환자에게서 개선이 관찰되도록 기저 장애와 관련된 하나 이상의 증상의 감소, 완화 및/또는 경감이 있었는지 여부를 판단함으로써 결정될 수 있다. 용어 "치료하는"은 질환을 관리하고 개선하는 것을 모두 포함한다. 용어 "관리하다", "관리하는" 및 "관리"는 반드시 질환의 치유를 초래하는 것은 아닌 요법으로부터 대상체가 얻는 유익한 효과를 지칭한다.
용어 "예방하다", "예방하는" 및 "예방"은 질환, 장애, 병태 또는 관련 증상(들)(예를 들어, 당뇨병 또는 암)의 발병(또는 재발) 가능성을 감소시키는 것을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 암의 발달을 "지연시키는" 것은 질환의 발생을 미루고, 방해하고, 지연시키고, 지체시키고, 안정화하고/하거나 연기하는 것을 의미한다. 이러한 지연은 치료 중인 질환 및/또는 개체의 병력에 따라 다양한 시간이 될 수 있다. 당업자에게 자명한 바와 같이, 충분한 또는 현저한 지연은 개체에서 질환이 발생하지 않는다는 점에서 사실상 예방을 포함할 수 있다. 암의 발달을 "지연시키는" 방법은 해당 방법을 사용하지 않는 것과 비교할 때, 주어진 기간 내에 질환 발생의 확률을 감소시키고/시키거나 주어진 기간 내에 질환의 정도를 감소시키는 방법이다. 이러한 비교는 전형적으로 통계적으로 유의미한 수의 개체를 사용하는 임상 연구를 기반으로 한다. 암의 발생은 컴퓨터 단층 촬영(CAT 스캔), 자기 공명 영상(MRI), 복부 초음파, 응고 테스트, 동맥 조영술 또는 생검을 포함하지만 이에 제한되지 않는 표준 방법을 사용하여 검출할 수 있다. 발생은 또한 처음에는 검출 불가능할 수 있는 발생, 재발 및 발병을 포함하는 암 진행을 지칭할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "GUCY2C 관련 질환 또는 장애"는 GUCY2C가 발현되는 세포 또는 조직을 포함하는 질환 또는 장애를 지칭한다. 일부 실시형태에서, GUCY2C 관련 질환 또는 장애는 GUCY2C가 비정상적으로 발현되는 세포를 포함한다. 다른 실시형태에서, GUCY2C 관련 질환 또는 장애는 GUCY2C가 결핍된 세포를 포함한다.
용어 "약" 및 "대략"은 주어진 값 또는 범위의 20% 이내, 15% 이내, 10% 이내, 9% 이내, 8% 이내, 7% 이내, 6% 이내, 5% 이내, 4% 이내, 3% 이내, 2% 이내, 1% 이내 또는 그 이하를 의미한다.
본 개시내용 및 청구범위에서 사용되는 바와 같이, "단수형"은 문맥상 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수형을 포함한다.
실시형태가 "포함하는"이라는 용어와 함께 본 명세서에 기재된 경우에는 "~로 이루어지는" 및/또는 "~로 본질적으로 이루어지는"이라는 용어로 기재된 유사한 실시형태가 또한 제공되는 것으로 이해된다. 또한, 실시형태가 "~로 본질적으로 이루어지는"이라는 어구와 함께 본 명세서에 기재되는 경우 "~로 이루어지는"이라는 용어로 기재된 유사한 실시형태가 또한 제공되는 것으로 이해된다.
"A와 B 사이" 또는 "A 내지 B 사이"와 같은 어구에서 사용되는 용어 "사이"는 A와 B를 모두 포함하는 범위를 지칭한다.
본 명세서에서 "A 및/또는 B"와 같은 어구에서 사용되는 용어 "및/또는"은 A 및 B 둘 다; A 또는 B; A(단독); 및 B(단독)를 포함하는 것으로 의도된다. 마찬가지로, "A, B 및/또는 C"와 같은 어구에서 사용되는 용어 "및/또는"은 다음 실시형태 각각을 포함하는 것으로 의도된다: A, B 및 C; A, B 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A(단독); B(단독); 및 C(단독).
5.2. 단일 도메인 항체
5.2.1. GUCY2C에 결합하는 단일 도메인 항체
일 양태에서, GUCY2C에 결합할 수 있는 단일 도메인 항체(예를 들어, VHH 도메인)가 본 명세서에 제공된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 단일 도메인 항체(예를 들어, VHH 도메인)는 인간 GUCY2C에 결합한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항-GUCY2C 단일 도메인 항체는 하나 이상의 GUCY2C 활성을 조절한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항-GUCY2C 단일 도메인 항체는 길항제 항체이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항-GUCY2C 단일 도메인 항체는 1μM 이하, 100nM 이하, 10nM 이하, 1nM 이하, 0.1nM 이하, 0.01nM 이하 또는 0.001nM 이하(예를 들어, 10-8 M 이하, 예를 들어, 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어, 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수(KD)로 GUCY2C(예를 들어, 인간 GUCY2C)에 결합한다. 결합 친화도를 측정하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 관심 항체 및 이의 항원의 Fab 버전으로 수행되는 RIA(Chen et al., 1999, J. Mol Biol 293:865-81); 예를 들어, Octet®Red96 시스템을 사용하는 Octet® 또는, 예를 들어, Biacore®TM-2000 또는 Biacore®TM-3000을 사용하는 Biacore®에 의한 생물층 간섭 측정(biolayer interferometry: BLI) 또는 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance: SPR) 검정에 의한 것을 포함하는 이들 중 임의의 것이 본 개시내용의 목적을 위해 사용될 수 있다. "결합 속도"("on-rate" 또는 "rate of association" 또는 "association rate") 또는 "kon"은 또한, 예를 들어, Octet®Red96, Biacore®TM-2000 또는 Biacore®TM-3000 시스템을 사용하여 위에 기재된 것과 동일한 생물층 간섭 측정(BLI) 또는 표면 플라스몬 공명(SPR) 기법으로 결정될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항-GUCY2C 단일 도메인 항체는 VHH 도메인이다. 본 명세서에 제공된 예시적인 VHH 도메인은 아래 부문 6에 기재된 바와 같이 생성되며, 이들 VHH 도메인은 또한 아래 표 7에 나타낸 바와 같이 C8, C12, C13, C15, C21, C27, C30 및 C31로 지칭된다.
따라서, 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 단일 도메인 항체는 C8, C12, C13, C15, C21, C27, C30 및/또는 C31 중 어느 하나의 하나 이상의 CDR 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 다음 구조: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4를 포함하는 GUCY2C에 결합하는 단일 도메인 항체가 본 명세서에 제공되되, CDR 서열은 C8, C12, C13, C15, C21, C27, C30 및/또는 C31의 것으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항-GUCY2C sdAb는 X1YGMX2의 아미노산 서열(여기서, X1은 A, I 또는 V이고, X2는 D 또는 G임)을 포함하는 CDR1(서열번호 64)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항-GUCY2C sdAb는 X3IX4LSGRX5X6YX7DAVX8G의 아미노산 서열(여기서, X3은 A, S 또는 T이고; X4는 F, W 또는 Y이고; X5는 S 또는 T이고; X6는 E, N 또는 T이고; X7은 A, S 또는 T이고; X8은 K 또는 Q임)을 포함하는 CDR2(서열번호 65)를 포함한다. 다른 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항-GUCY2C sdAb는 GX9X10TAX11SX12RQY의 아미노산 서열(여기서, X9는 A, E 또는 P이고; X10은 P 또는 T이고; X11은 S 또는 T이고; X12는 G 또는 V임)을 포함하는 CDR3(서열번호 66)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항-GUCY2C sdAb는 X1YGMX2의 아미노산 서열(여기서, X1은 A, I 또는 V이고, X2는 D 또는 G임)을 포함하는 CDR1(서열번호 64); X3IX4LSGRX5X6YX7DAVX8G의 아미노산 서열(여기서, X3은 A, S 또는 T이고; X4는 F, W 또는 Y이고; X5는 S 또는 T이고; X6은 E, N 또는 T이고; X7은 A, S 또는 T이고; X8은 K 또는 Q임)을 포함하는 CDR2(서열번호 65); 및 GX9X10TAX11SX12RQY의 아미노산 서열(여기서, X9는 A, E 또는 P이고; X10은 P 또는 T이고; X11은 S 또는 T이고; X12는 G 또는 V임)을 포함하는 CDR3(서열번호 66)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 서열번호 3의 아미노산 서열의 1개, 2개 또는 3개의 CDR을 모두 포함하는 항-GUCY2C 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 4의 아미노산 서열의 1개, 2개 또는 3개의 CDR을 모두 포함하는 항-GUCY2C 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 5의 아미노산 서열의 1개, 2개 또는 3개의 CDR을 모두 포함하는 항-GUCY2C 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 6의 아미노산 서열의 1개, 2개 또는 3개의 CDR을 모두 포함하는 항-GUCY2C 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 7의 아미노산 서열의 1개, 2개 또는 3개의 CDR을 모두 포함하는 항-GUCY2C 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 8의 아미노산 서열의 1개, 2개 또는 3개의 CDR을 모두 포함하는 항-GUCY2C 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 9의 아미노산 서열의 1개, 2개 또는 3개의 CDR을 모두 포함하는 항-GUCY2C 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 10의 아미노산 서열의 1개, 2개 또는 3개의 CDR을 모두 포함하는 항-GUCY2C 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 항-GUCY2C 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-GUCY2C 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-GUCY2C 단일 도메인 항체는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역 글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 CDR1의 아미노산 서열을 갖는 서열번호 3에 제시된 바와 같은 CDR1을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 3에 제시된 바와 같은 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 CDR2를 갖는다. 다른 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 3에 제시된 바와 같은 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 3에 제시된 바와 같은 CDR1 및 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR2를 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 3에 제시된 바와 같은 CDR1 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 3에 제시된 바와 같은 CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 3에 제시된 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 갖는다. CDR 서열은 잘 알려진 넘버링 시스템에 따라 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, CDR은 IMGT 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 Kabat 넘버링을 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 AbM 넘버링을 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Chothia 넘버링을 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Contact 넘버링을 따른다. 일부 실시형태에서, 항-GUCY2C 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-GUCY2C 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-GUCY2C 단일 도메인 항체는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역 글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 4에 제시된 바와 같은 CDR1의 아미노산 서열을 갖는 CDR1을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 4에 제시된 바와 같은 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 CDR2를 갖는다. 다른 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 4에 제시된 바와 같은 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 4에 제시된 바와 같은 CDR1 및 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR2를 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 4에 제시된 바와 같은 CDR1 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 4에 제시된 바와 같은 CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 4에 제시된 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 갖는다. CDR 서열은 잘 알려진 넘버링 시스템에 따라 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, CDR은 IMGT 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 Kabat 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 AbM 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Chothia 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Contact 넘버링을 따른다. 일부 실시형태에서, 항-GUCY2C 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-GUCY2C 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-GUCY2C 단일 도메인 항체는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역 글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 5에 제시된 바와 같은 CDR1의 아미노산 서열을 갖는 CDR1을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 5에 제시된 바와 같은 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 CDR2를 갖는다. 다른 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 5에 제시된 바와 같은 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 5에 제시된 바와 같은 CDR1 및 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR2를 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 5에 제시된 바와 같은 CDR1 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 5에 제시된 바와 같은 CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 5에 제시된 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 갖는다. CDR 서열은 잘 알려진 넘버링 시스템에 따라 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, CDR은 IMGT 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 Kabat 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 AbM 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Chothia 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Contact 넘버링을 따른다. 일부 실시형태에서, 항-GUCY2C 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-GUCY2C 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-GUCY2C 단일 도메인 항체는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역 글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 6에 제시된 바와 같은 CDR1의 아미노산 서열을 갖는 CDR1을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 6에 제시된 바와 같은 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 CDR2를 갖는다. 다른 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 6에 제시된 바와 같은 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 6에 제시된 바와 같은 CDR1 및 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR2를 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 6에 제시된 바와 같은 CDR1 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 6에 제시된 바와 같은 CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 6에 제시된 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 갖는다. CDR 서열은 잘 알려진 넘버링 시스템에 따라 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, CDR은 IMGT 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 Kabat 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 AbM 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Chothia 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Contact 넘버링을 따른다. 일부 실시형태에서, 항-GUCY2C 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-GUCY2C 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-GUCY2C 단일 도메인 항체는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역 글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 7에 제시된 바와 같은 CDR1의 아미노산 서열을 갖는 CDR1을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 7에 제시된 바와 같은 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 CDR2를 갖는다. 다른 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 7에 제시된 바와 같은 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 7에 제시된 바와 같은 CDR1 및 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR2를 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 7에 제시된 바와 같은 CDR1 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 7에 제시된 바와 같은 CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 7에 제시된 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 갖는다. CDR 서열은 잘 알려진 넘버링 시스템에 따라 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, CDR은 IMGT 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 Kabat 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 AbM 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Chothia 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Contact 넘버링을 따른다. 일부 실시형태에서, 항-GUCY2C 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-GUCY2C 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-GUCY2C 단일 도메인 항체는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역 글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 8에 제시된 바와 같은 CDR1의 아미노산 서열을 갖는 CDR1을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 8에 제시된 바와 같은 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 CDR2를 갖는다. 다른 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 8에 제시된 바와 같은 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 8에 제시된 바와 같은 CDR1 및 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR2를 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 8에 제시된 바와 같은 CDR1 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 8에 제시된 바와 같은 CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 8에 제시된 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 갖는다. CDR 서열은 잘 알려진 넘버링 시스템에 따라 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, CDR은 IMGT 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 Kabat 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 AbM 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Chothia 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Contact 넘버링을 따른다. 일부 실시형태에서, 항-GUCY2C 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-GUCY2C 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-GUCY2C 단일 도메인 항체는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역 글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 9에 제시된 바와 같은 CDR1의 아미노산 서열을 갖는 CDR1을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 9에 제시된 바와 같은 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 CDR2를 갖는다. 다른 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 9에 제시된 바와 같은 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 9에 제시된 바와 같은 CDR1 및 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR2를 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 9에 제시된 바와 같은 CDR1 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 9에 제시된 바와 같은 CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 9에 제시된 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 갖는다. CDR 서열은 잘 알려진 넘버링 시스템에 따라 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, CDR은 IMGT 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 Kabat 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 AbM 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Chothia 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Contact 넘버링을 따른다. 일부 실시형태에서, 항-GUCY2C 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-GUCY2C 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-GUCY2C 단일 도메인 항체는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역 글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 10에 제시된 바와 같은 CDR1의 아미노산 서열을 갖는 CDR1을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 10에 제시된 바와 같은 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 CDR2를 갖는다. 다른 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 10(예를 들어, 서열번호 3 또는 6)에 제시된 바와 같은 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 10에 제시된 바와 같은 CDR1 및 CDR2의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR2를 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 10에 제시된 바와 같은 CDR1 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 10에 제시된 바와 같은 CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 CDR3을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 10에 제시된 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 갖는다. CDR 서열은 잘 알려진 넘버링 시스템에 따라 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, CDR은 IMGT 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 Kabat 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, CDR은 AbM 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Chothia 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, CDR은 Contact 넘버링을 따른다. 일부 실시형태에서, 항-GUCY2C 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-GUCY2C 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-GUCY2C 단일 도메인 항체는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역 글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 다음 구조: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4를 포함하는 GUCY2C에 결합하는 단일 도메인 항체가 본 명세서에 제공되되, (i) CDR1은 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24 또는 서열번호 25, 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하고; (ii) CDR2는 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33 또는 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하고; 그리고/또는 (iii) CDR3은 서열번호 35, 서열번호 36, 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41 또는 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-GUCY2C 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-GUCY2C 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-GUCY2C 단일 도메인 항체는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역 글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크를 포함한다.
다른 실시형태에서, 다음 구조: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4를 포함하는 GUCY2C에 결합하는 단일 도메인 항체가 본 명세서에 제공되되, (i) CDR1은 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24 또는 서열번호 25, 서열번호 26과 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; (ii) CDR2는 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33 또는 서열번호 34와 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 그리고/또는 (iii) CDR3은 서열번호 35, 서열번호 36, 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41 또는 서열번호 42와 적어도 75%,80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-GUCY2C 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-GUCY2C 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-GUCY2C 단일 도메인 항체는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역 글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항-GUCY2C 단일 도메인 항체(sdAb)가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 항-GUCY2C 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-GUCY2C 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-GUCY2C 단일 도메인 항체는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역 글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항-GUCY2C 단일 도메인 항체(sdAb)가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 항-GUCY2C 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-GUCY2C 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-GUCY2C 단일 도메인 항체는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역 글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항-GUCY2C 단일 도메인 항체(sdAb)가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 항-GUCY2C 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-GUCY2C 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-GUCY2C 단일 도메인 항체는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역 글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항-GUCY2C 단일 도메인 항체(sdAb)가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 항-GUCY2C 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-GUCY2C 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-GUCY2C 단일 도메인 항체는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역 글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항-GUCY2C 단일 도메인 항체(sdAb)가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 항-GUCY2C 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-GUCY2C 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-GUCY2C 단일 도메인 항체는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역 글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항-GUCY2C 단일 도메인 항체(sdAb)가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 항-GUCY2C 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-GUCY2C 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-GUCY2C 단일 도메인 항체는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역 글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항-GUCY2C 단일 도메인 항체(sdAb)가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 항-GUCY2C 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-GUCY2C 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-GUCY2C 단일 도메인 항체는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역 글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항-GUCY2C 단일 도메인 항체(sdAb)가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 항-GUCY2C 단일 도메인 항체는 낙타과이다. 일부 실시형태에서, 항-GUCY2C 단일 도메인 항체는 인간화된다. 일부 실시형태에서, 항-GUCY2C 단일 도메인 항체는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역 글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크를 포함한다.
일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 C8, C12, C13, C15, C21, C27, C30 및/또는 C31의 하나 이상의 프레임워크 영역(들)을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 3의 서열을 포함하는 VHH 도메인으로부터 유래되는 하나 이상의 프레임워크(들)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 4의 서열을 포함하는 VHH 도메인으로부터 유래되는 하나 이상의 프레임워크(들)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 5의 서열을 포함하는 VHH 도메인으로부터 유래되는 하나 이상의 프레임워크(들)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 6의 서열을 포함하는 VHH 도메인으로부터 유래되는 하나 이상의 프레임워크(들)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 7의 서열을 포함하는 VHH 도메인으로부터 유래되는 하나 이상의 프레임워크(들)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 8의 서열을 포함하는 VHH 도메인으로부터 유래되는 하나 이상의 프레임워크(들)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 9의 서열을 포함하는 VHH 도메인으로부터 유래되는 하나 이상의 프레임워크(들)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 서열번호 10의 서열을 포함하는 VHH 도메인으로부터 유래되는 하나 이상의 프레임워크(들)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 단일 도메인 항체는 인간화된 단일 도메인 항체이다.
본 명세서에 기재된 프레임워크 영역은 CDR 넘버링 시스템의 경계에 기초하여 결정된다. 즉, CDR이, 예를 들어, Kabat, IMGT 또는 Chothia에 의해 결정되면, 프레임워크 영역은 N-말단에서 C-말단까지의 형식으로 가변 영역의 CDR을 둘러싸는 아미노산 잔기이다: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. 예를 들어, FR1은, 예를 들어, Kabat 넘버링 시스템, IMGT 넘버링 시스템 또는 Chothia 넘버링 시스템에 의해 정의된 바와 같이 CDR1 아미노산 잔기에 대한 N-말단의 아미노산 잔기로 정의되고, FR2는, 예를 들어, Kabat 넘버링 시스템, IMGT 넘버링 시스템 또는 Chothia 넘버링 시스템에 의해 정의된 바와 같이 CDR1과 CDR2 아미노산 잔기 사이의 아미노산 잔기로 정의되고, FR3은, 예를 들어, Kabat 넘버링 시스템, IMGT 넘버링 시스템 또는 Chothia 넘버링 시스템에 의해 정의된 바와 같이 CDR2와 CDR3 아미노산 잔기 사이의 아미노산 잔기로 정의되고, FR4는, 예를 들어, Kabat 넘버링 시스템, IMGT 넘버링 시스템 또는 Chothia 넘버링 시스템에 의해 정의된 바와 같이 CDR3 아미노산 잔기에 대한 C-말단의 아미노산 잔기로 정의된다.
일부 실시형태에서, 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 VHH 도메인을 포함하는 단리된 항-GUCY2C 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 제공된다.
일부 실시형태에서, 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 VHH 도메인을 포함하는 단리된 항-GUCY2C 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 제공된다.
일부 실시형태에서, 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 VHH 도메인을 포함하는 단리된 항-GUCY2C 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 제공된다.
일부 실시형태에서, 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 VHH 도메인을 포함하는 단리된 항-GUCY2C 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 제공된다.
일부 실시형태에서, 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 VHH 도메인을 포함하는 단리된 항-GUCY2C 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 제공된다.
일부 실시형태에서, 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 VHH 도메인을 포함하는 단리된 항-GUCY2C 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 제공된다.
일부 실시형태에서, 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 VHH 도메인을 포함하는 단리된 항-GUCY2C 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 제공된다.
일부 실시형태에서, 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 VHH 도메인을 포함하는 단리된 항-GUCY2C 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 제공된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항-GUCY2C 단일 도메인 항체 중 어느 하나와 경쟁적으로 GUCY2C에 특이적으로 결합하는 항-GUCY2C 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 경쟁적 결합은 ELISA 검정을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 항-GUCY2C 단일 도메인 항체와 경쟁적으로 GUCY2C에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 항-GUCY2C 단일 도메인 항체와 경쟁적으로 GUCY2C에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 항-GUCY2C 단일 도메인 항체와 경쟁적으로 GUCY2C에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 항-GUCY2C 단일 도메인 항체와 경쟁적으로 GUCY2C에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 항-GUCY2C 단일 도메인 항체와 경쟁적으로 GUCY2C에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 항-GUCY2C 단일 도메인 항체와 경쟁적으로 GUCY2C에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 항-GUCY2C 단일 도메인 항체와 경쟁적으로 GUCY2C에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 항-GUCY2C 단일 도메인 항체와 경쟁적으로 GUCY2C에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다.
일부 실시형태에서, 기능적 에피토프는 본 명세서에 제공된 항-GUCY2C 단일 도메인 항체와의 상호작용에 필요한 GUCY2C 단백질 내의 아미노산을 확인하기 위해, 예를 들어, 조합 알라닌 스캐닝(combinatorial alanine scanning)에 의해 매핑될 수 있다. 일부 실시형태에서, GUCY2C에 결합된 항-GUCY2C 단일 도메인 항체의 형태 및 결정 구조는 에피토프를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 제공된 임의의 항-GUCY2C 단일 도메인 항체와 동일한 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 일부 실시형태에서, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 항-GUCY2C 단일 도메인 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 항-GUCY2C 단일 도메인 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 항-GUCY2C 단일 도메인 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 항-GUCY2C 단일 도메인 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 항-GUCY2C 단일 도메인 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 항-GUCY2C 단일 도메인 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 항-GUCY2C 단일 도메인 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 항-GUCY2C 단일 도메인 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 항체 C8, C12, C13, C15, C21, C27, C30 및 C31 중 어느 하나에 대해 소정의 동일성 퍼센트를 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
2개의 서열(예를 들어, 아미노산 서열 또는 핵산 서열) 간의 동일성 퍼센트의 결정은 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다. 2개의 서열의 비교를 위해 사용되는 수학적 알고리즘의 비제한적인 예는 문헌[Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873 5877 (1993)]에서와 같이 수정된 문헌[Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:2264 2268 (1990)]의 알고리즘이다. 이러한 알고리즘은 문헌[Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403 (1990)]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램에 통합된다. BLAST 뉴클레오타이드 검색은 본 명세서에 기재된 핵산 분자와 상동성인 뉴클레오타이드 서열을 얻기 위해 NBLAST 뉴클레오타이드 프로그램 매개변수 세트, 예를 들어, 점수=100, 단어 길이=12로 수행될 수 있다. BLAST 단백질 검색은 본 명세서에 기재된 단백질 분자에 상동성인 아미노산 서열을 얻기 위해 XBLAST 프로그램 매개변수 세트, 예를 들어, 점수 50, 단어 길이=3으로 수행될 수 있다. 비교 목적을 위한 캐핑된 정렬을 얻기 위해, 문헌[Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389 3402 (1997)]에 기술되어 있는 바와 같은 캐핑된 BLAST가 사용될 수 있다. 대안적으로, PSI BLAST는 분자 사이의 원거리 관계를 검출하는 반복 검색을 수행하기 위해 사용될 수 있다(Id.). BLAST를 사용할 때, 캐핑된 BLAST 및 PSI Blast 프로그램, 각 프로그램(예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)의 기본 매개변수가 사용될 수 있다(예를 들어, 월드와이드 웹 ncbi.nlm.nih.gov의 미국 국립생물공학정보센터(National Center for Biotechnology Information: NCBI) 참조). 서열의 비교를 위해 사용되는 수학적 알고리즘의 또 다른 비제한적인 예는 문헌[Myers and Miller, CABIOS 4:11-17 (1998)]의 알고리즘이다. 이러한 알고리즘은 GCG 서열 정렬 소프트웨어 패키지의 일부인 ALIGN 프로그램(버전 2.0)에 통합되어 있다. 아미노산 서열을 비교하기 위해 ALIGN 프로그램을 이용하는 경우, PAM120 가중 잔차(weight residue) 표, 12의 갭 길이 페널티 및 4의 갭 페널티가 사용될 수 있다. 2개의 서열 사이의 동일성 퍼센트는 갭을 허용하거나 또는 허용하지 않고 위에 기재된 것과 유사한 기법을 사용하여 결정될 수 있다. 동일성 퍼센트를 계산하는 데 있어서, 전형적으로 정확히 일치하는 것만 계산된다.
일부 실시형태에서, 서열번호 3 내지 10으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성 중 어느 하나를 갖는 VHH 도메인을 포함하는 항-GUCY2C 단일 도메인 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 적어도 약 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성 중 어느 하나를 갖는 VHH 서열은 참조 서열에 비해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하지만, 해당 서열을 포함하는 항-GUCY2C 단일 도메인 항체는 GUCY2C에 결합하는 능력을 유지한다. 일부 실시형태에서, 서열번호 3 내지 10으로부터 선택된 아미노산 서열에서 총 1개 내지 10개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실되어 있다. 일부 실시형태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 CDR의 외부 영역(즉, FR)에서 발생한다. 선택적으로, 항-GUCY2C 단일 도메인 항체는 해당 서열의 번역 후 변형을 포함하는 서열번호 3 내지 10으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 단일 도메인 항체는 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 VHH 도메인을 포함하되, 단일 도메인 항체는 GUCY2C에 결합한다.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 단일 도메인 항체는 서열번호 4의 아미노산 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 VHH 도메인을 포함하되, 단일 도메인 항체는 GUCY2C에 결합한다.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 단일 도메인 항체는 서열번호 5의 아미노산 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 VHH 도메인을 포함하되, 단일 도메인 항체는 GUCY2C에 결합한다.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 단일 도메인 항체는 서열번호 6의 아미노산 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 VHH 도메인을 포함하되, 단일 도메인 항체는 GUCY2C에 결합한다.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 단일 도메인 항체는 서열번호 7의 아미노산 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 VHH 도메인을 포함하되, 단일 도메인 항체는 GUCY2C에 결합한다.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 단일 도메인 항체는 서열번호 8의 아미노산 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 VHH 도메인을 포함하되, 단일 도메인 항체는 GUCY2C에 결합한다.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 단일 도메인 항체는 서열번호 9의 아미노산 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 VHH 도메인을 포함하되, 단일 도메인 항체는 GUCY2C에 결합한다.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 단일 도메인 항체는 서열번호 10의 아미노산 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 VHH 도메인을 포함하되, 단일 도메인 항체는 GUCY2C에 결합한다.
일부 실시형태에서, 위에 기재된 항-GUCY2C 단일 도메인 항체 중 어느 하나를 포함하는 GUCY2C 결합 단백질이 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, GUCY2C 결합 단백질은 낙타, 키메라, 인간화된 또는 인간 항체를 포함하는 단일클론 항체이다. 일부 실시형태에서, 항-GUCY2C 항체는 항체 단편, 예를 들어, VHH 단편이다. 일부 실시형태에서, 항-GUCY2C 항체는 IgG1 또는 IgG4와 같은 임의의 항체 클래스 또는 아이소타입의 Fc 영역을 포함하는 전장 중쇄 단독 항체이다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 감소된 또는 최소화된 효과기 기능을 갖는다. 일부 실시형태에서, GUCY2C 결합 단백질은 본 명세서에 제공된 항-GUCY2C 단일 도메인 항체를 포함하는 융합 단백질이다. 다른 실시형태에서, GUCY2C 결합 단백질은 본 명세서에 제공된 항-GUCY2C 단일 도메인 항체를 포함하는 다중특이성 항체이다. 다른 예시적인 GUCY2C 결합 분자는 다음 부문에서 더 상세히 기술된다.
일부 실시형태에서, 임의의 위의 실시형태에 따른 항-GUCY2C 항체(예컨대, 항-GUCY2C 단일 도메인 항체) 또는 항원 결합 단백질은 아래 부문 5.2.2 내지 5.2.7에 기재된 바와 같이 임의의 특징을 단독으로 또는 조합하여 포함할 수 있다.
5.2.2. 단일 도메인 항체 변이체
본 명세서에 기재된 GUCY2C에 결합하는 단일 도메인 항체에 더하여, 본 명세서에 기재된 GUCY2C에 결합하는 단일 도메인 항체의 변이체가 제조될 수 있음이 상정된다. 예를 들어, 단일 도메인 항체 변이체는 암호화 DNA에 적절한 뉴클레오타이드 변화를 도입하고/하거나 목적하는 항체 또는 폴리펩타이드의 합성에 의해 제조될 수 있다. 당업자라면 아미노산 변화가 단일 도메인 항체의 번역 후 과정을 변경할 수 있음을 인식한다.
변이는 원래의 항체 또는 폴리펩타이드와 비교하여 아미노산 서열의 변화를 초래하는 단일 도메인 항체 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 하나 이상의 코돈의 치환, 결실 또는 삽입일 수 있다. 치환형 돌연변이유발을 위한 관심 부위는 CDR 및 FR을 포함한다.
아미노산 치환은 류신의 세린으로의 대체와 같은 하나의 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 특성을 갖는 또 다른 아미노산으로 대체하는 것, 예를 들어, 보존적 아미노산 대체의 결과일 수 있다. 예를 들어, 아미노산 치환을 초래하는 부위 지정 돌연변이유발 및 PCR-매개성 돌연변이유발을 포함하는 당업자에게 공지된 표준 기법이 본 명세서에 제공된 분자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 돌연변이를 도입하기 위해 사용될 수 있다. 삽입 또는 결실은 선택적으로 약 1개 내지 5개의 아미노산 범위일 수 있다. 소정의 실시형태에서, 치환, 결실 또는 삽입은 원래 분자에 비해 25개 미만의 아미노산 치환, 20개 미만의 아미노산 치환, 15개 미만의 아미노산 치환, 10개 미만의 아미노산 치환, 5개 미만의 아미노산 치환, 4개 미만의 아미노산 치환, 3개 미만의 아미노산 치환 또는 2개 미만의 아미노산 치환을 포함한다. 특정 실시형태에서, 치환은 하나 이상의 예측된 비필수 아미노산 잔기에서 이루어진 보존적 아미노산 치환이다. 허용되는 변이는 서열에서 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환을 체계적으로 수행하고, 모 항체에 의해 나타나는 활성에 대해 생성된 변이체를 테스트함으로써 결정될 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 1개의 잔기로부터 여러 잔기를 포함하는 폴리펩타이드에 이르는 길이 범위의 아미노-말단 및/또는 카복실-말단 융합뿐만 아니라 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다.
보존적 아미노산 치환에 의해 생성된 단일 도메인 항체는 본 개시내용에 포함된다. 보존적 아미노산 치환에서, 아미노산 잔기는 유사한 전하를 갖는 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체된다. 위에 기재된 바와 같이, 유사한 전하를 갖는 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 당업계에 정의되어 있다. 이러한 패밀리는 염기성 측쇄(예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전된 극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 타이로신, 시스테인), 비극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지형 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 아이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들어, 타이로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산을 포함한다. 대안적으로, 돌연변이는 포화 돌연변이유발에 의해서와 같이 코딩 서열의 전부 또는 일부와 함께 무작위로 도입될 수 있고, 및 생성된 돌연변이체는 활성을 유지하는 돌연변이체를 확인하기 위해 생물학적 활성에 대해 스크리닝될 수 있다. 돌연변이유발 후, 암호화된 단백질이 발현될 수 있고, 단백질의 활성이 결정될 수 있다. 특성을 유지하거나 또는 크게 변경하지 않기 위하여, 보존적(예를 들어, 유사한 특성 및/또는 측쇄를 갖는 아미노산 그룹 내에서) 치환이 이루어질 수 있다. 예시적인 치환이 아래 표에 나타나 있다.
아미노산은 이들의 측쇄 특성의 유사성에 따라 그룹화될 수 있다(예를 들어, 문헌[Lehninger, Biochemistry 73-75 (2d ed. 1975)] 참조): (1) 비극성: Ala(A), Val(V), Leu(L), Ile(I), Pro(P), Phe(F), Trp(W), Met(M); (2) 비하전된 극성: Gly(G), Ser(S), Thr(T), Cys(C), Tyr(Y), Asn(N), Gln(Q); (3) 산성: Asp(D), Glu(E); 및 (4) 염기성: Lys(K), Arg(R), His(H). 대안적으로, 자연 발생적 잔기는 일반적인 측쇄 특성에 기초하여 다음 그룹으로 나눌 수 있다: (1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) 산성: Asp, Glu; (4) 염기성: His, Lys, Arg; (5) 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro; 및 (6) 방향족: Trp, Tyr, Phe. 예를 들어, 단일 도메인 항체의 적절한 형태를 유지하는 데 관여하지 않는 임의의 시스테인 잔기는 또한 분자의 산화적 안정성을 개선하고 비정상적인 가교를 방지하기 위해, 예를 들어, 알라닌 또는 세린과 같은 또 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 비보존적 치환은 이러한 클래스 중 하나의 구성원을 또 다른 클래스로 교환하는 것을 수반할 것이다.
한 유형의 치환 변이체는 모 항체(예를 들어, 인간화된 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가변 영역 잔기를 치환하는 것을 수반한다. 일반적으로, 추가 연구를 위해 선택된 생성된 변이체(들)는 모 항체에 비해 소정의 생물학적 특성(예를 들어, 증가된 친화도, 감소된 면역원성)에 변형(예를 들어, 개선)을 가질 것이고/것이거나 모 항체의 소정의 생물학적 특성을 실질적으로 유지할 것이다. 예시적인 치환 변이체는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 것과 같은 파지 디스플레이-기반 친화도 성숙 기법을 사용하여 편리하게 생성될 수 있는 친화도 성숙 항체이다. 간략하게는, 하나 이상의 CDR 잔기가 돌연변이되고, 변이체 항체가 파지에 디스플레이되며, 특정 생물학적 활성(예를 들어, 결합 친화도)에 대해 스크리닝된다.
예를 들어, 항체 친화성을 개선하기 위해 CDR에서 변경(예를 들어, 치환)이 이루어질 수 있다. 이러한 변경은 CDR "핫스팟(hotspot)", 즉, 체세포 성숙 과정 동안 높은 빈도로 돌연변이를 겪는 코돈에 의해 암호화된 잔기(예를 들어, 문헌[Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)] 참조) 및/또는 SDR(a-CDR)에서 이루어질 수 있으며, 생성된 변이체 항체 또는 이의 단편은 결합 친화도에 대해 테스트된다. 2차 라이브러리를 구성하고 재선택하는 것에 의한 친화도 성숙은, 예를 들어, 문헌[Hoogenboom et al. Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001))]에 기술되어 있다. 친화도 성숙의 일부 실시형태에서, 임의의 다양한 방법(예를 들어, 오류-유발 PCR, 사슬 셔플링 또는 올리고뉴클레오타이드-지정 돌연변이유발)에 의해 성숙을 위해 선택된 가변 유전자에 다양성이 도입된다. 그런 다음, 2차 라이브러리가 생성된다. 라이브러리는 이어서 목적하는 친화도를 갖는 임의의 항체 변이체를 확인하기 위해 스크리닝된다. 다양성을 도입하는 또 다른 방법은 여러 CDR 잔기(예를 들어, 한 번에 4개 내지 6개의 잔기)를 무작위로 지정하는 CDR-지정 접근법을 포함한다. 항원 결합에 관련된 CDR 잔기는, 예를 들어, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 또는 모델링을 사용하여 구체적으로 확인될 수 있다. 친화도 성숙에 대한 더 자세한 설명은 아래 부문에서 제공된다.
일부 실시형태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 이러한 변경이 항원에 결합하는 항체의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한 하나 이상의 CDR 내에서 발생할 수 있다. 예를 들어, 결합 친화도를 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경(예를 들어, 본 명세서에 제공된 바와 같은 보존적 치환)이 CDR에서 이루어질 수 있다. 본 명세서에 제공된 변이체 VHH 서열의 일부 실시형태에서, 각각의 CDR은 변경되지 않거나 또는 1개, 2개 또는 3개 이하의 아미노산 치환을 포함한다.
돌연변이유발에 대해 표적화될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역을 확인하는 유용한 방법은 문헌[Cunningham and Wells, Science, 244:1081-1085 (1989)]에 의해 기술된 바와 같이 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"이라고 한다. 이 방법에서, 항원과 항체의 상호작용이 영향을 받는지 여부를 결정하기 위해 잔기 또는 표적 잔기의 그룹(예를 들어, Arg, Asp, His, Lys 및 Glu와 같은 하전된 잔기)이 확인되고, 중성 또는 음으로 하전된 아미노산(예를 들어, 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체된다. 추가 치환이 초기 치환에 대한 기능적 민감성을 나타내는 아미노산 위치에 도입될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 항체와 항원 사이의 접점을 확인하기 위한 항원-항체 복합체의 결정 구조. 이러한 접촉 잔기 및 인접 잔기는 치환을 위한 후보로서 표적화되거나 또는 제거될 수 있다. 변이체는 목적하는 특성을 포함하는지 여부를 결정하기 위해 스크리닝될 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 1개의 잔기로부터 100개 이상의 잔기를 포함하는 폴리펩타이드에 이르는 길이 범위의 아미노-말단 및/또는 카복실-말단 융합뿐만 아니라 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 효소(예를 들어, ADEPT용) 또는 폴리펩타이드에 대한 항체의 N-말단 또는 C-말단에 대한 융합을 포함한다.
변이는 올리고뉴클레오타이드-매개성(부위 지정) 돌연변이유발, 알라닌 스캐닝 및 PCR 돌연변이유발과 같은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 이루어질 수 있다. 단일 도메인 항체 변이체 DNA를 생산하기 위해, 부위 지정 돌연변이유발(예를 들어, 문헌[Carter, Biochem J. 237:1-7 (1986); 및 Zoller et al., Nucl. Acids Res. 10:6487-500 (1982)] 참조), 카세트 돌연변이유발(예를 들어, 문헌[Wells et al., Gene 34:315-23 (1985)] 참조) 또는 다른 공지된 기법이 클로닝된 DNA에서 수행될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 단일 도메인 항체는, 예를 들어, 단일 도메인 항체에 대한 임의의 유형의 분자의 공유 부착에 의해 화학적으로 변형된다. 항체 유도체는, 예를 들어, 글리코실화, 아세틸화, 페길화, 인산화, 아마이드화, 공지된 보호기/차단기에 의한 유도체화, 단백질 가수분해 절단, 세포 리간드 또는 다른 단백질에 대한 연결 또는 하나 이상의 면역 글로불린 도메인(예를 들어, Fc 또는 Fc의 일부)에 대한 접합에 의해 화학적으로 변형된 항체를 포함할 수 있다. 임의의 수많은 화학적 변형이 특정 화학적 절단, 아세틸화, 제형화, 투니카마이신의 대사성 합성 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 공지된 기법에 의해 수행될 수 있다. 추가적으로, 항체는 하나 이상의 비고전적 아미노산을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 항체가 글리코실화된 정도를 증가시키거나 또는 감소시키도록 변경된다. 항체에 대한 글리코실화 부위의 추가 또는 결실은 하나 이상의 글리코실화 부위가 생성되거나 또는 제거되도록 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 달성될 수 있다.
본 명세서에 제공된 단일 도메인 항체가 Fc 영역에 융합될 때, 이에 부착된 탄수화물은 변경될 수 있다. 포유동물 세포에 의해 생산된 천연 항체는 전형적으로 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 N-연결에 의해 부착된 분지형 바이안테나형(biantennary) 올리고당을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997)]을 참조한다. 올리고당은 다양한 탄수화물, 예를 들어, 만노스, N-아세틸 글루코사민(GlcNAc), 갈락토스 및 시알산뿐만 아니라 바이안테나형 올리고당 구조의 "스템(stem)"에서 GlcNAc에 부착된 푸코스를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 소정의 개선된 특성을 갖는 변이체를 생성하기 위해, 본 명세서에 제공된 결합 분자에서 올리고당의 변형이 이루어질 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 단일 도메인 항체가 Fc 영역에 융합될 때, 본 명세서에 제공된 항체 변이체는 상기 Fc 영역에 (직접 또는 간접적으로) 부착된 푸코스가 결여된 탄수화물 구조를 가질 수 있다. 예를 들어, 이러한 항체에서 푸코스의 양은 1% 내지 80%, 1% 내지 65%, 5% 내지 65% 또는 20% 내지 40%일 수 있다. 푸코스의 양은, 예를 들어, WO 2008/077546에 기술되어 있는 것과 같은 MALDI-TOF 질량 분석법에 의해 측정된 바와 같이 Asn 297에 부착된 모든 글리코구조(예를 들어, 복합체, 하이브리드 및 고 만노스 구조)의 합과 비교하여 Asn297에서 당 사슬 내의 푸코스의 평균 양을 계산함으로써 결정된다. Asn297은 Fc 영역에서 대략 297번 위치(Fc 영역 잔기의 EU 넘버링)에 위치한 아스파라긴 잔기를 지칭하지만; Asn297은 또한 항체의 사소한 서열 변이로 인해 297번 위치의 약 ±3의 아미노산 상류 또는 하류, 즉, 294번과 300번 위치 사이에 위치할 수 있다. 이러한 푸코실화 변이체는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 예를 들어, 미국 공개 제US 2003/0157108호 및 제US 2004/0093621호를 참조한다. "탈푸코실화된" 또는 "푸코스-결핍" 항체 변이체와 관련된 간행물의 예는 다음을 포함한다: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; 문헌[Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)]. 탈푸코실화된 항체를 생산할 수 있는 세포주의 예는 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec13 CHO 세포(문헌[Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)]; 미국 특허 제US 2003/0157108호; 및 WO 2004/056312, 특히 실시예 11) 및 넉아웃 세포주, 예컨대, 알파-1,6-푸코실트랜스퍼레이스 유전자 FUT8, 넉아웃 CHO 세포(예를 들어, 문헌[Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)]; 및 WO2003/085107 참조)를 포함한다.
본 명세서에 제공된 단일 도메인 항체를 포함하는 결합 분자는 이등분된 올리고당, 예를 들어, Fc 영역에 부착된 바이안테나형 올리고당이 GlcNAc에 의해 이등분된 것과 함께 추가로 제공된다. 이러한 변이체는 감소된 푸코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 이러한 변이체의 예는, 예를 들어, WO 2003/011878(Jean-Mairet et al.); 미국 특허 제6,602,684호(Umana et al.); 및 US 2005/0123546(Umana et al.)에 기술되어 있다. Fc 영역에 부착된 올리고당에 적어도 하나의 갈락토스 잔기를 갖는 변이체도 제공된다. 이러한 변이체는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 이러한 변이체는, 예를 들어, WO 1997/30087; WO 1998/58964; 및 WO 1999/22764에 기술되어 있다.
본 발명의 단일 도메인 항체 및 Fc 영역을 포함하는 분자에서, 하나 이상의 아미노산 변형이 Fc 영역으로 도입되어 Fc 영역 변이체를 생성할 수 있다. Fc 영역 변이체는 하나 이상의 아미노산 위치에 아미노산 변형(예를 들어, 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열(예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 출원은 생체내 결합 분자의 반감기가 중요하지만 소정의 효과기 기능(예컨대, 보체 및 ADCC)이 불필요하거나 또는 유해한, 적용을 위한 바람직한 후보가 되게 하는 효과기 기능의 전부는 아니지만 일부를 보유하는 변이체를 상정한다. CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인하기 위해 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 검정이 수행될 수 있다. 예를 들어, 결합 분자가 FcγR 결합이 결여되어(이에 의해 ADCC 활성이 결여될 가능성이 있음) 있지만 FcRn 결합 능력은 유지하는지 확인하기 위해 Fc 수용체(FcR) 결합 검정이 수행될 수 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 검정의 비제한적인 예는 미국 특허 제5,500,362호(예를 들어, 문헌[Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)) 및 Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985)] 참조); 제5,821,337호(문헌[Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)] 참조)에 기술되어 있다. 대안적으로, 비방사성 검정 방법이 사용될 수 있다(예를 들어, 유세포 분석을 위한 ACTI™ 비방사성 세포독성 검정(셀테크놀로지, 인크.(CellTechnology, Inc.), 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재); 및 CytoTox 96® 비방사성 세포독성 검정(프로메가(Promega), 위스콘신주 매디슨 소재) 참조). 이러한 검정에 유용한 효과기 세포는 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC) 및 자연 살해(NK) 세포를 포함한다. 대안적으로 또는 추가적으로, 관심 분자의 ADCC 활성은 생체내, 예를 들어, 문헌[Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)]에 개시된 바와 같은 동물 모델에서 평가될 수 있다. 항체가 C1q에 결합할 수 없어 CDC 활성이 결여되어 있음을 확인하기 위해 C1q 결합 검정이 또한 수행될 수 있다. 예를 들어, WO 2006/029879 및 WO 2005/100402의 C1q 및 C3c 결합 ELISA를 참조한다. 보체 활성화를 평가하기 위해, CDC 검정이 수행될 수 있다(예를 들어, 문헌[Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003); 및 Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)] 참조). FcRn 결합 및 생체내 제거율/반감기 결정이 또한 당업계에 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다(예를 들어, 문헌[Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)] 참조).
감소된 효과기 기능을 갖는 결합 분자는 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상의 치환을 갖는 것을 포함한다(미국 특허 제6,737,056호). 이러한 Fc 돌연변이체는 265번 및 297번 잔기가 알라닌으로 치환된 소위 "DANA" Fc 돌연변이체를 포함하여 265번, 269번, 270번, 297번 및 327번 아미노산 위치 중 2개 이상에 치환을 갖는 Fc 돌연변이체를 포함한다(미국 특허 제7,332,581).
FcR에 대한 결합이 개선되거나 또는 감소된 소정의 변이체가 기재된다(예를 들어, 미국 특허 제6,737,056호; WO 2004/056312 및 문헌[Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)] 참조).
일부 실시형태에서, 변이체는 ADCC를 개선하는 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들어, Fc 영역의 298번, 333번 및/또는 334번 위치에 치환(잔기의 EU 넘버링)을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 미국 특허 제6,194,551호, WO 99/51642 및 문헌[Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)]에 기술되어 있는 바와 같이 C1q 결합 및/또는 보체 의존성 세포독성(CDC)을 변경하는(즉, 개선하거나 또는 감소시키는) Fc 영역에서 변경이 이루어진다.
모체 IgG를 태아로 전달하는 역할을 하는(Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) 및 Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)) 반감기가 증가되고 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 결합이 개선된 결합 분자가 US2005/0014934A1(Hinton et al.)에 기술되어 있다. 이들 분자는 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합을 개선하는 하나 이상의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 이러한 Fc 변이체는 Fc 영역 잔기: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434 중 하나 이상의 치환, 예를 들어, 434번 Fc 영역 잔기의 치환을 갖는 것들을 포함한다(미국 특허 제7,371,826호). 또한, 문헌[Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988)]; 미국 특허 제5,648,260호; 미국 특허 제5,624,821호; 및 Fc 영역 변이체의 다른 예에 관한 WO 94/29351을 참조한다.
일부 실시형태에서, 항체의 하나 이상의 잔기가 시스테인 잔기로 치환된 시스테인 조작된 항체를 생성하는 것이 바람직할 수 있다. 일부 실시형태에서, 치환된 잔기는 항체의 접근 가능한 부위에서 발생한다. 이러한 잔기를 시스테인으로 치환함으로써, 반응성 티올기는 항체의 접근 가능한 부위에 위치하게 되며, 항체를 약물 모이어티 또는 링커-약물 모이어티와 같은 다른 모이어티에 접합시켜 본 명세서에서 추가로 기재되는 바와 같은 면역접합체를 생성하는 데 사용될 수 있다.
5.2.3. 시험관내 친화도 성숙
일부 실시형태에서, 모 항체와 비교하여 친화도, 안정성 또는 발현 수준과 같은 개선된 특성을 갖는 항체 변이체는 시험관내 친화도 성숙에 의해 제조될 수 있다. 천연 프로토타입과 마찬가지로, 시험관내 친화도 성숙은 돌연변이와 선택의 원리를 기반으로 한다. 항체의 라이브러리는 유기체(예를 들어, 파지, 세균, 효모 또는 포유동물 세포)의 표면에 디스플레이되거나 또는 이들의 암호화 mRNA 또는 DNA와의 회합(예를 들어, 공유 또는 비공유적)으로 디스플레이된다. 디스플레이된 항체의 친화도 선택은 항체를 암호화하는 유전 정보를 전달하는 유기체 또는 복합체를 단리할 수 있게 한다. 파지 디스플레이와 같은 디스플레이 방법을 사용한 2라운드 또는 3라운드의 돌연변이 및 선택은 일반적으로 낮은 나노몰 범위의 친화도를 갖는 항체 단편을 생성한다. 친화도 성숙 항체는 표적 항원에 대해 나노몰 또는 심지어 피코몰의 친화도를 가질 수 있다.
파지 디스플레이는 항체의 디스플레이 및 선택을 위한 광범위한 방법이다. 항체는 박테리오파지 외피 단백질에 대한 융합으로서 Fd 또는 M13 박테리오파지의 표면에 디스플레이된다. 선택은 항원에 노출되어 파지-디스플레이된 항체가 이들의 표적에 결합할 수 있도록 하는 "패닝(panning)"으로 지칭되는 과정을 포함한다. 항원에 결합된 파지는 회수되어 세균을 감염시켜 추가 라운드의 선택을 위한 파지를 생산하는 데 사용된다. 검토를 위해, 예를 들어, 문헌[Hoogenboom, Methods. Mol. Biol. 178:1-37 (2002); 및 Bradbury and Marks, J. Immunol. Methods 290:29-49 (2004)]을 참조한다.
효모 디스플레이 시스템(예를 들어, 문헌[Boder et al., Nat. Biotech. 15:553-57 (1997); 및 Chao et al., Nat. Protocols 1:755-68 (2006)] 참조)에서, 항체는 Aga1p에 대한 이황화 결합을 통해 효모 세포벽에 부착되는 효모 응집소 단백질 Aga2p의 부착 서브유닛에 융합될 수 있다. Aga2p를 통한 단백질의 디스플레이는 단백질을 세포 표면에서 멀리 투사하여 효모 세포벽의 다른 분자와의 잠재적인 상호작용을 최소화한다. 개선된 친화도 또는 안정성을 갖는 항체를 선택하기 위해 라이브러리를 스크리닝하기 위해 자성 분리 및 유세포 분석이 사용된다. 관심 가용성 항원에 대한 결합은 바이오티닐화된 항원 및 형광단에 접합된 스트렙타비딘과 같은 2차 시약으로 효모를 표지함으로써 결정된다. 항체의 표면 발현의 변화는 단일쇄 항체(예를 들어, scFv)의 측면에 있는 헤마글루티닌 또는 c-Myc 에피토프 태그의 면역형광 표지를 통해 측정될 수 있다. 발현은 디스플레이된 단백질의 안정성과 상관관계가 있는 것으로 나타났으며, 따라서 항체는 개선된 안정성뿐만 아니라 친화도에 대해 선택될 수 있다(예를 들어, 문헌[Shusta et al., J. Mol. Biol. 292:949-56 (1999)] 참조). 효모 디스플레이의 추가적인 이점은 디스플레이된 단백질이 소포체 샤페론 및 품질-관리 기구(quality-control machinery)를 이용하여 진핵생물 효모 세포의 소포체에 접혀 있다는 것이다. 성숙이 완료되면, 항체 친화도는 효모의 표면에 디스플레이되는 동안 편리하게 "적정"될 수 있어 각 클론의 발현 및 정제가 필요하지 않다. 효모 표면 디스플레이의 이론적 한계는 다른 디스플레이 방법보다 기능적 라이브러리 크기가 잠재적으로 더 작다는 것이지만; 최근의 접근법은 효모 세포의 짝짓기 시스템을 사용하여 크기가 1014으로 추정되는 조합 다양성을 생성한다(예를 들어, 미국 공개 2003/0186374; 및 문헌[Blaise et al., Gene 342:211-18 (2004)] 참조).
리보솜 디스플레이에서, 항체-리보솜-mRNA(ARM) 복합체는 무세포 시스템에서 선택을 위해 생성된다. 특정 항체 라이브러리를 코딩하는 DNA 라이브러리는 종결 코돈이 결여된 스페이서 서열에 유전적으로 융합된다. 이 스페이서 서열은 번역될 때 여전히 펩티딜 tRNA에 부착되어 리보솜 터널을 차지하므로, 관심 단백질이 리보솜의 바깥으로 돌출되어 접힐 수 있게 한다. 생성된 mRNA, 리보솜 및 단백질의 복합체는 표면-결합 리간드에 결합할 수 있어 리간드와의 친화성 포획을 통해 항체 및 이의 암호화 mRNA를 동시에 단리할 수 있다. 그런 다음, 리보솜-결합 mRNA는 cDNA로 역전사된 다음 돌연변이유발을 거쳐 다음 라운드 선택에 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌[Fukuda et al., Nucleic Acids Res. 34:e127 (2006)] 참조). mRNA 디스플레이에서, 항체와 mRNA 사이의 공유 결합은 퓨로마이신을 어댑터 분자로 사용하여 확립된다(Wilson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:3750-55 (2001)).
이들 방법은 완전히 시험관내에서 수행되기 때문에, 다른 선택 기술에 비해 두 가지 주요 이점을 제공한다. 첫째, 라이브러리의 다양성은 세균 세포의 형질전환 효율에 의해 제한되는 것이 아니라 테스트 튜브에 존재하는 리보솜 및 상이한 mRNA 분자의 수에 의해서만 제한된다. 둘째, 무작위 돌연변이는, 예를 들어, 비-교정 폴리머레이스에 의해 각 선택 라운드 후에 쉽게 도입될 수 있으며, 이는 라이브러리가 임의의 다양화 단계 후 형질전환되지 않아야 하기 때문이다.
일부 실시형태에서, 포유동물 디스플레이 시스템이 사용될 수 있다.
다양성은 또한 표적화된 방식으로 또는 무작위 도입을 통해 항체 라이브러리의 CDR에 도입될 수 있다. 전자의 접근법은 높거나 또는 낮은 수준의 돌연변이유발을 통해 항체의 모든 CDR을 순차적으로 표적화하거나, 또는 실험적 기반 또는 구조적 이유로 친화도에 영향을 미치는 것으로 의심되는 체세포 초돌연변이(예를 들어, 문헌[Ho et al., J. Biol. Chem. 280:607-17 (2005)] 참조) 또는 잔기의 고립된 핫스팟을 표적화하는 것을 포함한다. 다양성은 또한 DNA 셔플링 또는 유사한 기법을 통해 자연적으로 다양한 영역을 대체함으로써 도입될 수 있다(예를 들어, 문헌[Lu et al., J. Biol. Chem. 278:43496-507 (2003)]; 미국 특허 제5,565,332호 및 제6,989,250호 참조). 프레임워크-영역 잔기로 확장되는 초가변 루프를 표적으로 하는 대안적 기법(예를 들어, 문헌[Bond et al., J. Mol. Biol. 348:699-709 (2005)] 참조)은 루프 결실 및 CDR의 삽입을 사용하거나 또는 혼성화-기반 다양화를 사용한다(예를 들어, 미국 공개 제2004/0005709호 참조). CDR에서 다양성을 생성하는 추가적인 방법은, 예를 들어, 미국 특허 제7,985,840호에 개시되어 있다. 항체 라이브러리 및/또는 항체 친화도 성숙을 생성하는 데 사용될 수 있는 추가 방법은, 예를 들어, 각각 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있는 미국 특허 제8,685,897호 및 제8,603,930호 및 미국 공개 제2014/0170705호, 제2014/0094392호, 제2012/0028301호, 제2011/0183855호 및 제2009/0075378호에 개시되어 있다.
라이브러리의 스크리닝은 당업계에 공지된 다양한 기법에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 단일 도메인 항체는 고체 지지체, 칼럼, 핀 또는 셀룰로스/폴리(바이닐리덴 플루오라이드) 멤브레인/기타 필터에 고정되고, 흡착 플레이트에 부착된 숙주 세포에서 발현되거나, 또는 세포 분류에 사용되거나, 또는 스트렙타비딘-코팅된 비드로 포획하기 위한 바이오틴에 접합되거나, 또는 디스플레이 라이브러리를 패닝하기 위한 임의의 다른 방법에 사용될 수 있다.
시험관내 친화도 성숙 방법의 검토를 위해, 예를 들어, 문헌[Hoogenboom, Nature Biotechnology 23:1105-16 (2005); Quiroz and Sinclair, Revista Ingeneria Biomedia 4:39-51 (2010)]; 및 그 안의 참고문헌을 참조한다.
5.2.4. 단일 도메인 항체의 변형
단일 도메인 항체의 공유 변형은 본 개시내용의 범위 내에 포함된다. 공유 변형은 단일 도메인 항체의 표적화된 아미노산 잔기를 단일 도메인 항체의 선택된 측쇄 또는 N-말단 또는 C-말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제와 반응시키는 것을 포함한다. 다른 변형은 각각 상응하는 글루타밀 및 아스파틸 잔기로의 글루타민일 및 아스파라긴일 잔기의 탈아마이드화, 프롤린 및 라이신의 하이드록실화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 하이드록실기의 인산화, 라이신, 아르기닌 및 히스티딘 측쇄의 α-아미노기의 메틸화(예를 들어, 문헌[Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties 79-86 (1983)] 참조), N-말단 아민의 아세틸화 및 임의의 C-말단 카복실기의 아마이드화를 포함한다.
본 개시내용의 범위에 포함되는 단일 도메인 항체의 다른 유형의 공유 변형은 위에 기재된 바와 같은 항체 또는 폴리펩타이드의 천연 글리코실화 패턴을 변경하고(예를 들어, 문헌[Beck et al., Curr. Pharm. Biotechnol. 9:482-501 (2008); 및 Walsh, Drug Discov. Today 15:773-80 (2010)] 참조), 항체를 다양한 비단백질성 중합체 중 하나, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리옥시알킬렌에, 예를 들어, 미국 특허 제4,640,835호; 제4,496,689호; 제4,301,144호; 제4,670,417호; 제4,791,192호; 또는 제4,179,337호에 제시된 방식으로 연결시키는 것을 포함한다. 본 개시내용의 GUCY2C에 결합하는 단일 도메인 항체는 또한 반감기를 연장하고/하거나 공지된 Fc-매개성 효과기 기능을 부여하기 위해 하나 이상의 면역 글로불린 불변 영역 또는 이의 부분(예를 들어, Fc)에 유전적으로 융합되거나 또는 접합될 수 있다.
본 개시내용의 GUCY2C에 결합하는 단일쇄 항체는 또한 또 다른 이종 폴리펩타이드 또는 아미노산 서열, 예를 들어, 에피토프 태그(예를 들어, 문헌[Terpe, Appl. Microbiol. Biotechnol. 60:523-33 (2003)] 참조) 또는 IgG 분자의 Fc 영역(예를 들어, 문헌[Aruffo, Antibody Fusion Proteins 221-42 (Chamow and Ashkenazi eds., 1999)] 참조)에 융합된 GUCY2C에 결합하는 단일쇄 항체를 포함하는 키메라 분자를 형성하도록 변형될 수 있다. GUCY2C에 결합하는 단일쇄 항체는 또한 아래에 더 상세히 기재되는 바와 같이 GUCY2C 결합 키메라 항원 수용체(CAR)를 생성하는 데 사용될 수 있다.
또한, 본 개시내용의 GUCY2C에 결합하는 단일쇄 항체 및 이종 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질이 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 항체가 유전적으로 융합되거나 또는 화학적으로 접합된 이종 폴리펩타이드는 세포 표면-발현된 GUCY2C를 갖는 세포에 대한 항체를 표적화하는 데 유용하다.
또한, GUCY2C 항원에 결합하는 항체의 패널이 본 명세서에 제공된다. 특정 실시형태에서, 항체의 패널은 GUCY2C 항원에 대한 상이한 결합 속도, 상이한 해리 속도, 상이한 친화도 및/또는 GUCY2C 항원에 대한 상이한 특이성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 패널은 약 10개 내지 약 1000개 이상의 항체를 포함하거나 또는 이로 구성된다. 항체의 패널은 ELISA와 같은 검정을 위해, 예를 들어, 96-웰 또는 384-웰 플레이트에서 사용될 수 있다.
5.2.5. 인간화된 단일 도메인 항체
본 명세서에 기재된 단일 도메인 항체는 인간화된 단일 도메인 항체를 포함한다. 낙타과 종으로부터의 단일 도메인 항체를 인간화하기 위한 일반적인 전략이 기술되어 있으며(예를 들어, 문헌[Vincke et al., J. Biol. Chem., 284(5):3273-3284 (2009)] 참조), 이는 본 명세서에 개시된 바와 같은 인간화된 VHH 도메인을 생산하는 데 유용할 수 있다. 낙타과 종으로부터의 인간화된 단일 도메인 항체의 설계는 11번, 37번, 44번, 45번 및 47번 잔기(Kabat에 따른 잔기 넘버링)와 같은 VHH의 특징적 잔기를 포함할 수 있다(Muyldermans, Reviews Mol Biotech 74:277-302 (2001)).
본 명세서에 개시된 인간화된 단일 도메인 항체와 같은 인간화된 항체는 또한 CDR-그라프팅(유럽 특허 제EP 239,400호; 국제 공개 제WO 91/09967호; 및 미국 특허 제5,225,539호, 제5,530,101호 및 제5,585,089호), 베니어링(veneering) 또는 리서피싱(resurfacing)(유럽 특허 제EP 592,106호 및 제EP 519,596호; 문헌[Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); 및 Roguska et al., PNAS 91:969-973 (1994)]), 사슬 셔플링(미국 특허 제5,565,332호)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 당업계에 공지된 다양한 기법 및, 예를 들어, 미국 특허 제6,407,213호, 미국 특허 제5,766,886호, WO 9317105, 문헌[Tan et al., J. Immunol. 169:1119 25 (2002), Caldas et al., Protein Eng. 13(5):353-60 (2000), Morea et al., Methods 20(3):267 79 (2000), Baca et al., J. Biol. Chem. 272(16):10678-84 (1997), Roguska et al., Protein Eng. 9(10):895 904 (1996), Couto et al., Cancer Res. 55 (23 Supp):5973s - 5977s (1995), Couto et al., Cancer Res. 55(8):1717-22 (1995), Sandhu JS, Gene 150(2):409-10 (1994), 및 Pedersen et al., J. Mol. Biol. 235(3):959-73 (1994)]에 개시되어 있는 기법을 사용하여 생산될 수 있다. 또한, 전체가 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있는 미국 공개 제US 2005/0042664 A1호(2005년 2월 24일)를 참조한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 단일 도메인 항체는 인간 GUCY2C를 포함하는 GUCY2C에 결합하는 인간화된 단일 도메인 항체일 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 인간화된 단일쇄 항체는 서열번호 3 내지 10에 제시된 하나 이상의 CDR을 포함할 수 있다. 비인간 항체를 인간화하기 위한 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 인간화된 항체는 비인간 공급원으로부터 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 이러한 비인간 아미노산 잔기는 종종 "유입(import)" 잔기로 지칭되며, 이는 전형적으로 "유입" 가변 도메인으로부터 취해진다. 인간화는, 예를 들어, 문헌[Jones et al., Nature 321:522-25 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-27 (1988); 및 Verhoeyen et al., Science 239:1534-36 (1988)]의 방법에 따라 인간 항체의 상응하는 서열을 초가변 영역 서열로 치환함으로써 수행될 수 있다.
일부 경우에, 인간화된 항체는 모 비인간 항체의 CDR의 아미노산 서열이 인간 항체 프레임워크에 이식되는 CDR 그라프팅에 의해 구성된다. 예를 들어, Padlan 등은 CDR에 있는 잔기의 약 1/3만이 실제로 항원과 접촉하는 것으로 결정하였으며, 이를 "특이성 결정 잔기" 또는 SDR로 명명하였다(Padlan et al., FASEB J. 9:133-39(1995)). SDR 그라프팅 기법에서, SDR 잔기만 인간 항체 프레임워크에 이식된다(예를 들어, 문헌[Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005)] 참조).
인간화된 항체를 제조하는 데 사용되는 인간 가변 도메인의 선택은 항원성을 감소시키는 데 중요할 수 있다. 예를 들어, 소위 "최적-적합(best-fit)" 방법에 따르면, 비인간 항체의 가변 도메인의 서열은 공지된 인간 가변-도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝된다. 비인간 항체의 서열과 가장 가까운 인간 서열이 인간화된 항체를 위한 인간 프레임워크로 선택될 수 있다(Sims et al., J. Immunol. 151:2296-308(1993); 및 Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-17(1987)). 또 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 하위그룹의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 특정 프레임워크를 사용한다. 여러 상이한 인간화된 항체에 대해 동일한 프레임워크가 사용될 수 있다(Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285-89(1992); 및 Presta et al., J. Immunol. 151:2623-32(1993)). 일부 경우에, 프레임워크는 가장 풍부한 인간 하위클래스인 VL6 하위그룹 I(VL6I) 및 VH 하위그룹 III(VHIII)의 컨센서스 서열로부터 유래된다. 또 다른 방법에서, 인간 생식세포계열 유전자가 프레임워크 영역의 공급원로서 사용된다.
초인간화라고 불리는 CDR의 비교에 기초한 대안적 패러다임에서, FR 상동성은 부적절하다. 방법은 기능적 인간 생식세포계열 유전자 레퍼토리와 비인간 서열의 비교로 구성된다. 그런 다음, 뮤린 서열과 동일하거나 또는 밀접하게 관련된 표준(canonical) 구조를 암호화하는 유전자가 선택된다. 다음으로, 비인간 항체와 표준 구조를 공유하는 유전자 내에서, CDR 내에서 가장 높은 상동성을 갖는 것들이 FR 공여자로 선택된다. 마지막으로, 비인간 CDR이 이러한 FR에 이식된다(예를 들어, 문헌[Tan et al., J. Immunol. 169:1119-25 (2002)] 참조).
추가로, 항체가 항원에 대한 친화도 및 다른 유리한 생물학적 특성을 유지하면서 인간화되는 것이 일반적으로 바람직하다. 이러한 목표를 달성하기 위해, 한 방법에 따르면, 인간화된 항체는 모 서열 및 인간화된 서열의 3차원 모델을 사용한 모 서열 및 다양한 개념적 인간화 생성물의 분석 과정에 의해 제조된다. 3차원 면역 글로불린 모델은 일반적으로 이용 가능하며, 당업자에게 친숙하다. 선택된 후보 면역 글로불린 서열의 가능한 3차원 형태 구조를 설명하고 표시하는 컴퓨터 프로그램이 이용 가능하다. 이들은, 예를 들어, WAM(Whitelegg and Rees, Protein Eng. 13:819-24 (2002)), Modeller(Sali and Blundell, J. Mol. Biol. 234:779-815 (1993)) 및 Swiss PDB Viewer(Guex and Peitsch, Electrophoresis 18:2714-23 (1997))를 포함한다. 이들 디스플레이의 검사는 후보 면역 글로불린 서열의 기능에서의 잔기의 역할의 분석, 예를 들어, 이의 항원에 결합하는 후보 면역 글로불린의 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석을 가능하게 한다. 이러한 방식으로, 표적 항원(들)에 대한 증가된 친화도와 같은 목적하는 항체 특성이 달성되도록 FR 잔기가 수용체 및 유입 서열로부터 선택되고 조합될 수 있다. 일반적으로, 초가변 영역 잔기는 항원 결합에 영향을 미치는 데 직접적으로 그리고 가장 실질적으로 관여한다.
항체 인간화를 위한 또 다른 방법은 인간 스트링 함량(Human String Content: HSC)이라고 하는 항체 인간성의 척도를 기반으로 한다. 이 방법은 마우스 서열을 인간 생식세포계열 유전자의 레퍼토리와 비교하고, 그 차이를 HSC로 점수를 매긴다. 그런 다음, 표적 서열은 여러 다양한 인간화된 변이체를 생성하기 위해 포괄적인(전체적) 동일성 척도를 사용하는 대신 HSC를 최대화시킴으로써 인간화된다(Lazar et al., Mol. Immunol. 44:1986-98(2007)).
위에 기재된 방법에 더하여, 인간화된 항체를 생성하고 선택하기 위해 경험적 방법이 사용될 수 있다. 이러한 방법은 인간화된 변이체의 대규모 라이브러리의 생성 및 농축 기술 또는 고속 대량 스크리닝 기법을 사용한 최상의 클론의 선택을 기반으로 하는 방법을 포함한다. 항체 변이체는 파지, 리보솜 및 효모 디스플레이 라이브러리로부터 뿐만 아니라 세균 콜로니 스크리닝에 의해 단리될 수 있다(예를 들어, 문헌[Hoogenboom, Nat. Biotechnol. 23:1105-16 (2005); Dufner et al., Trends Biotechnol. 24:523-29 (2006); Feldhaus et al., Nat. Biotechnol. 21:163-70 (2003); 및 Schlapschy et al., Protein Eng. Des. Sel. 17:847-60 (2004)] 참조).
FR 라이브러리 접근법에서, 이식된 CDR을 가장 잘 지원하는 FR을 선택하기 위해 수집된 잔기 변이체가 FR의 특정 위치에 도입된 후 라이브러리가 스크리닝된다. 치환될 잔기는 잠재적으로 CDR 구조(예를 들어, 문헌[Foote and Winter, J. Mol. Biol. 224:487-99 (1992)])에 기여하는 것으로 확인된 "버니어(Vernier)" 잔기의 일부 또는 전부, 또는 문헌[Baca et al. J. Biol. Chem. 272:10678-84 (1997)]에 의해 확인된 보다 제한된 표적 잔기의 세트로부터의 것을 포함할 수 있다.
FR 셔플링에서, 전체 FR은 선택된 잔기 변이체의 조합 라이브러리를 생성하는 대신 비인간 CDR과 결합된다(예를 들어, 문헌[Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005)] 참조). 1-단계 FR 셔플링 과정이 사용될 수 있다. 이러한 과정은 효율적인 것으로 나타났으며, 이는 생성된 항체가 향상된 발현, 증가된 친화도 및 열 안정성을 포함하여 개선된 생화학적 및 물리화학적 특성을 나타내었기 때문이다(예를 들어, 문헌[Damschroder et al., Mol. Immunol. 44:3049-60 (2007)] 참조).
"휴머니어링(humaneering)" 방법은 필수 최소 특이성 결정인자(minimum specificity determinant: MSD)의 실험적 확인을 기반으로 하며, 인간 FR 라이브러리로의 비인간 단편의 순차적 교체 및 결합의 평가를 기반으로 한다. 이 방법론은 전형적으로 별개의 인간 V-분절 CDR이 있는 여러 하위클래스로부터의 항체를 식별하고 에피토프를 유지하는 결과를 가져온다.
"인간 공학" 방법은 원래 비인간 항체의 바람직한 결합 특성을 유지하는 인간에서 감소된 면역원성을 갖는 변형된 항체를 생산하기 위해 항체의 아미노산 서열에 특정 변화를 가함으로써 비인간 항체 또는 항체 단편을 변경하는 것을 포함한다. 일반적으로, 기법은 비인간 항체의 아미노산 잔기를 "저위험", "중간 위험" 또는 "고위험" 잔기로 분류하는 것을 포함한다. 분류는 치환이 생성된 항체의 접힘에 영향을 미칠 위험에 대해 (예를 들어, 인간의 면역원성에 대한) 특정 치환을 만들 때 예측되는 이점을 평가하는 전체적 위험/보상 계산을 사용하여 수행된다. 비인간 항체 서열의 주어진 위치(예를 들어, 저위험 또는 중간 위험)에서 치환될 특정 인간 아미노산 잔기는 비인간 항체의 가변 영역으로부터의 아미노산 서열을 특정 또는 컨센서스 인간 항체 서열의 상응하는 영역과 정렬시킴으로써 선택될 수 있다. 비인간 서열에서 저위험 또는 중간 위험 위치에 있는 아미노산 잔기는 정렬에 따라 인간 항체 서열에서 상응하는 잔기로 치환될 수 있다. 인간 공학 단백질을 제조하는 기법은 문헌[Studnicka et al., Protein Engineering 7:805-14 (1994)]; 미국 특허 제5,766,886호; 제5,770,196호; 제5,821,123호; 및 제5,869,619호; 및 PCT 공개 WO 93/11794에 더 상세히 기술되어 있다.
복합 인간 항체는, 예를 들어, Composite Human Antibody™ 기술(안티토프 엘티디.(Antitope Ltd.), 영국 캠브리지 소재)을 사용하여 생성될 수 있다. 복합 인간 항체를 생성하기 위해, 가변 영역 서열은 T 세포 에피토프를 피하는 방식으로 다중 인간 항체 가변 영역 서열의 단편으로부터 설계되어 생성된 항체의 면역원성을 최소화한다.
탈면역화된 항체는 T-세포 에피토프가 제거된 항체이다. 탈면역화된 항체를 제조하는 방법이 기술되어 있다. 예를 들어, 문헌[Jones et al., Methods Mol Biol. 525:405-23 (2009), xiv, 및 De Groot et al., Cell. Immunol. 244:148-153(2006)]을 참조한다. 탈면역화된 항체는 T-세포 에피토프-고갈 가변 영역 및 인간 불변 영역을 포함한다. 간략하게는, 항체의 가변 영역이 클로닝되고, T-세포 에피토프는 T 세포 증식 검정에서 항체의 가변 영역으로부터 유래된 중첩 펩타이드를 테스트함으로써 차후에 확인된다. T 세포 에피토프는 인간 MHC 클래스 II에 결합하는 펩타이드를 확인하기 위해 인 실리코(in silico) 방법을 통해 확인된다. 인간 MHC 클래스 II에 대한 결합을 없애기 위해 가변 영역에 돌연변이가 도입된다. 그런 다음, 돌연변이된 가변 영역은 탈면역화된 항체를 생성하기 위해 사용된다.
5.2.6. 단일 도메인 항체의 제조
본 명세서에 제공된 단일 도메인 항체(예컨대, VHH)는 낙타과 종(예컨대, 낙타 또는 라마)을 면역화하고, 이로부터 하이브리도마를 얻거나 또는 당업계에 공지된 분자 생물학 기법을 사용하여 단일 도메인 항체의 라이브러리를 클로닝한 후에, 선택되지 않은 라이브러리의 개별 클론을 사용하여 ELISA에 의해 또는 파지 디스플레이를 사용하여 선택하는 것과 같은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 얻을 수 있다. 예를 들어, 단일 도메인 항체를 제조하는 방법은, 예를 들어, 문헌[Els Pardon et al, Nature Protocol, 9(3): 674 (2014)]에 기술되어 있다.
본 명세서에 제공된 단일 도메인 항체는 단일 도메인 항체-암호화 핵산을 포함하는 벡터로 형질전환되거나 또는 형질감염된 세포를 배양함으로써 생산될 수 있다. 본 개시내용의 항체의 폴리펩타이드 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 표준 재조합 기법을 사용하여 얻을 수 있다. 목적하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 하이브리도마 세포 또는 B 세포와 같은 항체 생산 세포로부터 단리되고 시퀀싱될 수 있다. 대안적으로, 폴리뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 합성기 또는 PCR 기법을 사용하여 합성될 수 있다. 일단 얻어지면, 폴리펩타이드를 암호화하는 서열은 숙주 세포에서 이종 폴리뉴클레오타이드를 복제 및 발현할 수 있는 재조합 벡터에 삽입된다. 당업계에서 이용 가능하고 공지되어 있는 많은 벡터가 본 개시내용의 목적을 위해 사용될 수 있다. 적절한 벡터의 선택은 주로 벡터에 삽입될 핵산의 크기 및 벡터로 형질전환될 특정 숙주 세포에 따라 달라질 것이다. 본 개시내용의 항체를 발현하기에 적합한 숙주 세포는 그람-음성 또는 그람-양성 유기체를 포함하는 고세균(Archaebacteria) 및 진정세균(Eubacteria)과 같은 원핵생물, 사상균 또는 효모와 같은 진핵 미생물, 곤충 또는 식물 세포와 같은 무척추 세포 및 포유동물 숙주 세포주와 같은 척추 세포를 포함한다. 숙주 세포는 전술한 발현 벡터로 형질전환되고, 프로모터를 유도하고, 형질전환체를 선택하거나 또는 목적하는 서열을 암호화하는 유전자를 증폭시키는 데 적합하도록 변형된 종래의 영양 배지에서 배양된다. 숙주 세포에 의해 생산된 항체는 당업계에 공지된 바와 같은 표준 단백질 정제 방법을 사용하여 정제된다.
벡터 작제, 발현 및 정제를 포함하는 항체 생산 방법은 문헌[ et al., Antibody Engineering: Producing antibodies in Escherichia coli: From PCR to fermentation 203-52 (McCafferty et al. eds., 1996); Kwong and Rader, E. coli Expression and Purification of Fab Antibody Fragments, Current Protocols in Protein Science (2009); Tachibana and Takekoshi, Production of Antibody Fab Fragments in Escherichia coli, Antibody Expression and Production (Al-Rubeai ed., 2011); 및 Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic (An ed., 2009)]에 추가로 기술되어 있다.
물론, 항-GUCY2C 단일 도메인 항체를 제조하기 위해 당업계에 잘 알려진 대안적 방법이 사용될 수 있음이 상정된다. 예를 들어, 적절한 아미노산 서열 또는 이의 일부는 고체상 기법을 사용하여 직접 펩타이드 합성에 의해 생산될 수 있다(예를 들어, 문헌[Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis (1969); 및 Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-54 (1963)] 참조). 시험관내 단백질 합성은 수동 기법을 사용하거나 또는 자동화에 의해 수행될 수 있다. 항-GUCY2C 항체의 다양한 부분은 목적하는 항-GUCY2C 항체를 생산하기 위해 화학적 또는 효소적 방법을 사용하여 개별적으로 화학적으로 합성되고 조합될 수 있다. 대안적으로, 항체는, 예를 들어, 미국 특허 제5,545,807호 및 제5,827,690호에 개시된 바와 같이 항체를 발현하도록 조작된 트랜스제닉 동물의 세포 또는 우유와 같은 체액으로부터 정제될 수 있다.
구체적으로, 단일 도메인 항체 또는 본 명세서에 제공된 다른 GUCY2C 결합체는 라마를 면역화하고, 단일 B-세포 분류를 수행하고, V-유전자 추출을 수행하고, VHH-Fc 융합과 같은 GUCY2C 결합체를 클로닝한 다음, 소규모 발현 및 정제를 수행함으로써 생성될 수 있다. ELISA-양성, BLI-양성 및 100nM 미만의 KD에 대한 선택 중 하나 이상을 포함하는 단일 도메인 항체 및 GUCY2C에 결합하는 다른 분자의 추가적인 스크리닝이 수행될 수 있다. 이러한 선택 기준은 아래 부문 6에 기재된 바와 같이 조합될 수 있다. 추가적으로, 개별 VHH 결합체(및 GUCY2C에 결합하는 다른 분자)는 GUCY2C를 발현하는 세포에 결합하는 능력에 대해 검정될 수 있다. 이러한 검정은 GUCY2C를 발현하는 세포를 사용한 FACS 분석을 사용하고 형광-표지된 VHH 분자의 평균 형광 강도(mean fluorescence intensity: MFI)를 측정하여 수행될 수 있다. 위에 언급된 다양한 양태가 아래에 더 상세히 기술된다.
다중클론 항체는 일반적으로 관련 항원 및 보조제의 다중 피하(sc) 또는 복강내(ip) 주사에 의해 동물에서 생성된다. 이는 이작용성 작용제 또는 유도체화제, 예를 들어, 말레이미도벤조일 설포석신이미드 에스터(시스테인 잔기를 통한 접합), N-하이드록시석신이미드(라이신 잔기를 통해), 글루타르알데하이드, 석신산 무수물, SOCl2 또는 R1N=C=NR(여기서, R 및 R1은 독립적으로 저급 알킬기)을 사용하여 관련 항원을 면역화될 종에서 면역원성인 단백질, 예를 들어, 키홀-림펫 헤모사이아닌(keyhole limpet hemocyanin: KLH), 혈청 알부민, 소 티로글로불린 또는 대두 트립신 저해제에 접합시키는 데 유용할 수 있다. 사용될 수 있는 보조제의 예는 프로인트 완전 보조제 및 MPL-TDM 보조제(모노포스포릴 지질 A, 합성 트레할로스 다이코리노마이콜레이트)를 포함한다. 면역화 프로토콜은 과도한 실험 없이 당업자에 의해 선택될 수 있다.
예를 들어, 동물은 3부피의 프로인트 완전 보조제와, 예를 들어, 100㎍ 또는 5㎍의 단백질 또는 접합체(각각 토끼 또는 마우스용)를 배합하고, 용액을 여러 부위에 피내로 주사함으로써 항원, 면역원성 접합체 또는 유도체에 대해 면역화된다. 1개월 후, 동물은 여러 부위에 피하 주사하여 프로인트 완전 보조제 중 펩타이드 또는 접합체의 원래 양의 1/5 내지 1/10로 부스팅된다. 7일 내지 14일 후, 동물은 채혈되며, 혈청은 항체 역가에 대해 검정된다. 동물은 역가 안정기에 도달할 때까지 부스팅된다. 또한, 접합체는 재조합 세포 배양에서 단백질 융합체로 만들어질 수 있다. 또한, 명반과 같은 응집제가 면역 반응을 향상시키는 데 적합하다.
단일클론 항체는 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 얻어지며, 즉, 집단을 구성하는 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생적 돌연변이 및/또는 번역 후 변형(예를 들어, 이성질체화, 아마이드화)을 제외하고는 동일하다. 따라서, "단일클론"이라는 수식어는 개별 항체의 혼합물이 아닌 항체의 특성을 나타낸다. 예를 들어, 단일클론 항체는 문헌[Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 의해 처음 기술된 하이브리도마 방법을 사용하여 만들 수 있거나 또는 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,567호)에 의해 만들 수 있다.
하이브리도마 방법에서, 적절한 숙주 동물은 면역화에 사용되는 단백질에 특이적으로 결합할 항체를 생산하거나 또는 생산할 수 있는 림프구를 유도하도록 면역화된다. 대안적으로, 림프구는 시험관내에서 면역화될 수 있다. 그런 다음, 림프구는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적합한 융합제를 사용하여 골수종 세포와 융합되어 하이브리도마 세포를 형성한다(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)).
면역화제는 전형적으로 항원 단백질 또는 이의 융합 변이체를 포함할 것이다(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press (1986), pp. 59-103). 불멸화된 세포주는 일반적으로 형질전환된 포유동물 세포이다. 이렇게 제조된 하이브리도마 세포는 바람직하게는 비융합된 모 골수종 세포의 성장 또는 생존을 저해하는 하나 이상의 물질을 포함하는 적합한 배양 배지에 시딩되고 성장된다. 바람직한 불멸화된 골수종 세포는 효율적으로 융합하고, 선택된 항체-생산 세포에 의한 안정적인 고수준의 항체 생산을 지원하는 세포이며, HAT 배지와 같은 배지에 민감하다.
하이브리도마 세포가 성장하고 있는 배양 배지는 항원에 대한 단일클론 항체의 생산에 대해 검정된다. 하이브리도마 세포가 배양되는 배양 배지는 목적하는 항원에 대한 단일클론 항체의 존재에 대해 검정될 수 있다. 이러한 기법 및 검정은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 결합 친화도는 문헌[Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980)]의 Scatchard 분석에 의해 결정될 수 있다.
목적하는 특이성, 친화도 및/또는 활성의 항체를 생산하는 하이브리도마 세포가 확인된 후, 클론은 제한 희석 절차에 의해 서브클로닝되고, 표준 방법(상기 Goding)에 의해 성장될 수 있다. 이러한 목적에 적합한 배양 배지는, 예를 들어, D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또한, 하이브리도마 세포는 포유동물에서 종양으로서 생체내에서 성장될 수 있다.
서브클론에 의해 분비된 단일클론 항체는, 예를 들어, 단백질 A-세파로스, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화성 크로마토그래피와 같은 종래의 면역 글로불린 정제 절차에 의해 배양 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 적절하게 분리된다.
단일클론 항체는 또한 미국 특허 제4,816,567호에 기술되어 있으며 위에 기재된 바와 같은 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있다. 단일클론 항체를 암호화하는 DNA는 종래의 절차를 사용하여(예를 들어, 뮤린 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용함으로써) 쉽게 단리되고 시퀀싱된다. 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 바람직한 공급원 역할을 한다. 일단 단리되면, DNA는 이러한 재조합 숙주 세포에서 단일클론 항체를 합성하기 위해 발현 벡터에 배치된 다음, 대장균 세포, 유인원 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소(Chinese hamster ovary: CHO) 세포 또는 달리 면역 글로불린 단백질을 생산하지 않는 골수종 세포와 같은 숙주 세포에 형질감염될 수 있다. 항체를 암호화하는 DNA의 세균에서의 재조합 발현에 대한 리뷰 논문은 문헌[Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993) 및 Pliickthun, Immunol. Revs. 130:151-188 (1992)]을 포함한다.
추가 실시형태에서, 항체는 문헌[McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990). Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) 및 Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)]에 기술되어 있는 기법을 사용하여 생성된 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 후속 간행물은 사슬 셔플링에 의한 고친화성(nM 범위) 인간 항체의 생산(Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992))뿐만 아니라 매우 큰 파지 라이브러리를 구성하기 위한 전략으로서 조합 감염 및 생체내 재조합(Waterhouse et al., Nucl. Acids Res., 21:2265-2266 (1993))을 기술하고 있다. 따라서, 이러한 기법은 단일클론 항체의 단리를 위한 전통적인 단일클론 항체 하이브리도마 기법에 대한 실행 가능한 대안이다.
DNA는 또한, 예를 들어, 코딩 서열을 치환함으로써(미국 특허 제4,816,567호; 문헌[Morrison, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)]) 또는 비면역 글로불린 폴리펩타이드에 대한 코딩 서열의 전부 또는 일부를 코딩 서열에 공유적으로 연결함으로써 변형될 수 있다. 이러한 비면역 글로불린 폴리펩타이드는 항원에 대해 특이성을 갖는 하나의 항원-결합 부위 및 상이한 항원에 대해 특이성을 갖는 또 다른 항원-결합 부위를 포함하는 키메라 2가 항체를 생성하도록 치환될 수 있다.
키메라 또는 하이브리드 항체는 또한 가교제를 포함하는 합성 단백질 화학의 공지된 방법을 사용하여 시험관내에서 제조될 수 있다. 예를 들어, 면역독소는 이황화-교환 반응을 사용하거나 또는 티오에터 결합을 형성함으로써 작제될 수 있다. 이러한 목적에 적합한 시약의 예는 이미노티올레이트 및 메틸-4-머캅토뷰티르이미데이트를 포함한다.
진핵생물 발현의 경우, 벡터 성분은 일반적으로 다음 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자 및 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열 중 하나 이상을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
진핵생물 숙주에 사용하기 위한 벡터는 또한 성숙 단백질 또는 폴리펩타이드의 N-말단에 특정 절단 부위를 갖는 신호 서열 또는 다른 폴리펩타이드를 암호화하는 삽입체일 수 있다. 선택된 이종 신호 서열은 바람직하게는 숙주 세포에 의해 인식되고 처리되는(즉, 신호 펩티데이스에 의해 절단되는) 것이다. 포유동물 세포 발현에서, 포유동물 신호 서열뿐만 아니라 바이러스 분비 리더, 예를 들어, 단순 헤르페스 gD 신호가 이용 가능하다. 이러한 전구체 영역에 대한 DNA는 본 출원의 항체를 암호화하는 DNA에 리딩 프레임으로 결찰될 수 있다.
일반적으로, 복제 기점 구성요소는 포유동물 발현 벡터에 필요하지 않다(SV40 기원은 전형적으로 초기 프로모터를 포함하기 때문에 사용될 수 있다).
발현 및 클로닝 벡터는 선별 마커라고도 하는 선별 유전자를 포함할 수 있다. 선별 유전자는 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어, 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라사이클린에 대한 저항성을 부여하는 단백질을 암호화하거나; 영양요구성 결핍을 보완하거나; 또는 복합 배지로부터 이용할 수 없는 중요 영양소를 공급할 수 있다.
선별 계획의 한 예는 숙주 세포의 성장을 정지시키기 위해 약물을 사용하는 것이다. 이종 유전자로 성공적으로 형질전환된 이러한 세포는 약물 저항성을 부여하는 단백질을 생산하므로 선택 양생법에서 생존한다. 이러한 우세한 선택의 예는 약물 네오마이신, 마이코페놀산 및 하이그로마이신을 사용하는 것이다.
포유동물 세포에 적합한 선별 마커의 또 다른 예는 본 출원의 항체를 암호화하는 핵산을 취할 수 있는 세포의 식별을 가능하게 하는 것들이다. 예를 들어, DHFR 선별 유전자로 형질전환된 세포는 먼저 모든 형질전환체를 DHFR의 경쟁적 길항제인 메토트렉세이트(Mtx)를 포함하는 배양 배지에서 배양함으로써 확인된다. 야생형 DHFR이 사용되는 경우 예시적인 적절한 숙주 세포는 DHFR 활성이 결핍된 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포주이다. 대안적으로, 폴리펩타이드 암호화-DNA 서열, 야생형 DHFR 단백질 및 아미노글리코시드 3' 포스포트랜스퍼레이스(APH)와 같은 또 다른 선별 마커로 형질전환되거나 또는 공동 형질전환된 숙주 세포(특히 내인성 DHFR을 포함하는 야생형 숙주)는 아미노글리코시드 항생제와 같은 선별 마커에 대한 선별제를 포함하는 배지에서의 세포 성장에 의해 선택될 수 있다.
발현 및 클로닝 벡터는 일반적으로 숙주 유기체에 의해 인식되고 목적하는 폴리펩타이드 서열을 암호화하는 핵산에 작동 가능하게 연결되는 프로모터를 포함한다. 진핵생물 유전자는 전사가 시작되는 부위로부터 대략 25개 내지 30개 염기 상류에 위치한 AT-풍부 영역을 갖는다. 많은 유전자의 전사 시작으로부터 70개 내지 80개 염기 상류에서 발견되는 또 다른 서열이 포함될 수 있다. 대부분의 진핵생물의 3' 말단은 코딩 서열의 3' 말단에 폴리 A 꼬리를 추가하기 위한 신호일 수 있다. 이들 서열 모두는 진핵생물 발현 벡터에 삽입될 수 있다.
포유동물 숙주 세포에서 벡터로부터의 폴리펩타이드 전사는, 예를 들어, 폴리오마 바이러스, 포울폭스 바이러스, 아데노바이러스(예컨대, 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 유인원 바이러스 40(SV40)와 같은 바이러스의 게놈으로부터 얻어진 프로모터, 이종 포유동물 프로모터, 예를 들어, 액틴 프로모터 또는 면역 글로불린 프로모터, 열-충격 프로모터에 의해 제어될 수 있으며, 제공되는 이러한 프로모터는 숙주 세포 시스템과 상용성이다.
고등 진핵생물에 의한 본 개시내용의 항체를 암호화하는 DNA의 전사는 종종 인핸서 서열을 벡터에 삽입함으로써 증가된다. 현재 포유동물 유전자(글로빈, 엘라스테이스, 알부민, α-태아단백질 및 인슐린)로부터의 많은 인핸서 서열이 알려져 있다. 예는 복제 기점의 후반에 있는 SV40 인핸서(bp 100 내지 270), 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기점의 후반에 있는 폴리오마 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다. 또한, 진핵생물 프로모터의 활성화를 위한 요소 강화에 대한 문헌[Yaniv, Nature 297:17-18 (1982)]을 참조한다. 인핸서는 폴리펩타이드 암호화 서열에 대해 5' 또는 3' 위치에서 벡터에 스플라이싱될 수 있지만, 바람직하게는 프로모터로부터 5' 부위에 위치한다.
진핵생물 숙주 세포(효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간 또는 다른 다세포 유기체로부터의 유핵 세포)에 사용되는 발현 벡터는 또한 전사의 종결 및 mRNA 안정화에 필요한 서열을 포함한다. 이러한 서열은 일반적으로 진핵생물 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5' 및 때때로 3' 비번역 영역에서 이용 가능하다. 이들 영역은 폴리펩타이드-암호화 mRNA의 비번역 부분에서 폴리아데닐화된 단편으로 전사된 뉴클레오타이드 분절을 포함한다. 유용한 전사 종결 성분 중 하나는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 영역이다.
본 명세서의 벡터에서 DNA를 클로닝하거나 발현시키기에 적합한 숙주 세포는 척추 숙주 세포를 포함하는 본 명세서에 기재된 고등 진핵생물 세포를 포함한다. 배양(조직 배양)에서 척추 세포의 증식은 일상적인 절차가 되었다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 SV40으로 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주(COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포주(현탁 배양에서 성장을 위해 서브클로닝된 293 또는 293 세포, 문헌[Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)]); 베이비 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL 10); 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR(CHO, 문헌[Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)]); 마우스 세르톨리 세포(TM4, 문헌[Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)]); 원숭이 신장 세포(CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부 암종 세포(HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포(MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포(W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포(Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양(MMT 060562, ATCC CCL51); TR1 세포(Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68(1982)); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간종양 세포주(Hep G2)이다.
숙주 세포는 항체 생산을 위한 전술한 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환되고, 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선택하거나 또는 목적하는 서열을 암호화하는 유전자를 증폭시키기에 적절하게 변형된 종래의 영양 배지에서 배양될 수 있다.
본 출원의 항체를 생산하는 데 사용되는 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 햄 F10(시그마(Sigma)), 최소 필수 배지((Minimal Essential Medium: MEM), (시그마), RPMI-1640(시그마) 및 둘베코 변형된 이글 배지((Dulbecco's Modified Eagle's Medium: DMEM), 시그마)와 같은 상업적으로 이용 가능한 배지가 숙주 세포를 배양하는 데 적합하다. 또한, 문헌[Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980)], 미국 특허 제4,767,704호; 제4,657,866호; 제4,927,762호; 제4,560,655호; 또는 제5,122,469호; WO 90/03430; WO 87/00195; 또는 미국 재발행 특허 30,985에 기술되어 있는 임의의 배지가 숙주 세포를 위한 배양 배지로 사용될 수 있다. 임의의 이러한 배지는 필요에 따라 호르몬 및/또는 다른 성장 인자(예컨대, 인슐린, 트랜스페린 또는 상피 성장 인자), 염(예컨대, 소듐 클로라이드, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 완충액(예컨대, HEPES), 뉴클레오타이드(예컨대, 아데노신 및 티미딘), 항생제(예컨대, GENTAMYCIN™ 약물), 미량원소(일반적으로 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로 정의됨) 및 글루코스 또는 동등한 에너지 공급원이 보충될 수 있다. 임의의 다른 필요한 보충물이 또한 당업자에게 공지된 적절한 농도로 포함될 수 있다. 온도, pH 등과 같은 배양 조건은 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 이전에 사용된 것이며 당업자에게 명백할 것이다.
재조합 기법을 사용할 때, 항체는 주변세포질 공간에서 세포내로 생산되거나 또는 배지로 직접 분비될 수 있다. 항체가 세포내로 생산되는 경우, 첫 번째 단계로, 숙주 세포 또는 용해된 단편인 미립자 파편이, 예를 들어, 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거된다. 항체가 배지로 분비되는 경우, 이러한 발현 시스템으로부터의 상청액은 일반적으로 상업적으로 이용 가능한 단백질 농도 필터, 예를 들어, Amicon 또는 Millipore Pellicon 한외여과 장치를 사용하여 먼저 농축된다. PMSF와 같은 프로테이스 저해제가 단백질 가수분해를 저해하기 위해 임의의 전술한 단계에 포함될 수 있고, 항생제가 우발적 오염물의 증가를 방지하기 위해 포함될 수 있다.
세포로부터 제조된 단백질 조성물은, 예를 들어, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 및 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제될 수 있으며, 친화성 크로마토그래피가 바람직한 정제 기법이다. 친화성 리간드가 부착된 매트릭스는 대부분 아가로스이지만, 다른 매트릭스도 이용 가능하다. 조절된 공극 유리 또는 폴리(스타이렌-다이바이닐) 벤젠과 같은 기계적으로 안정적인 매트릭스는 아가로스로 달성할 수 있는 것보다 더 빠른 유속 및 더 짧은 처리 시간을 가능하게 한다. 이온-교환 칼럼에서의 분별, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지에서의 크로마토그래피(예컨대, 폴리아스파르트산 칼럼), 헤파린 SEPHAROSE™ 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE 및 암모늄 설페이트 침전과 같은 다른 기법이 또한 회수될 항체에 따라서 이용 가능하다. 임의의 예비 정제 단계(들) 후에, 관심 항체 및 오염물을 포함하는 혼합물은 낮은 pH 소수성 상호작용 크로마토그래피에 적용될 수 있다.
본 개시내용의 항체를 암호화하는 폴리핵산 서열은 표준 재조합 기법을 사용하여 얻을 수 있다. 목적하는 폴리핵산 서열은 하이브리도마 세포와 같은 항체 생산 세포로부터 단리되고 시퀀싱될 수 있다. 대안적으로, 폴리뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 합성기 또는 PCR 기법을 사용하여 합성될 수 있다. 일단 얻어지면, 폴리펩타이드를 암호화하는 서열은 원핵생물 숙주에서 이종 폴리뉴클레오타이드를 복제하고 발현할 수 있는 재조합 벡터에 삽입된다. 당업계에서 이용 가능하고 공지된 많은 벡터가 본 개시내용의 목적을 위해 사용될 수 있다. 적절한 벡터의 선택은 벡터에 삽입될 핵산의 크기 및 벡터로 형질전환될 특정 숙주 세포에 따라 달라질 것이다. 각 벡터는 이의 기능(이종 폴리뉴클레오타이드의 증폭 또는 발현 또는 둘 다) 및 그것이 상주하는 특정 숙주 세포와의 상용성에 따라 다양한 성분을 포함한다. 벡터 성분은 일반적으로 복제 기점, 선택 마커 유전자, 프로모터, 리보솜 결합 부위(ribosome binding site: RBS), 신호 서열, 이종 핵산 삽입체 및 전사 종결 서열을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일반적으로, 숙주 세포와 양립할 수 있는 종으로부터 유래된 레플리콘 및 제어 서열을 포함하는 플라스미드 벡터가 이들 숙주와 관련하여 사용된다. 벡터는 일반적으로 복제 부위뿐만 아니라 형질전환된 세포에서 표현형 선택을 제공할 수 있는 표식(marking) 서열을 운반한다. 예를 들어, 대장균은 전형적으로 대장균 종으로부터 유래된 플라스미드인 pBR322를 사용하여 형질전환된다. 특정 항체의 발현에 사용되는 pBR322 유도체의 예는 Carter 등의 미국 특허 제5,648,237호에 상세히 기술되어 있다.
또한, 숙주 미생물과 양립할 수 있는 레플리콘 및 제어 서열을 포함하는 파지 벡터는 이들 숙주와 관련하여 형질전환 벡터로 사용될 수 있다. 예를 들어, GEM™-11과 같은 박테리오파지가 대장균 LE392와 같은 감수성 숙주 세포를 형질전환시키는 데 사용될 수 있는 재조합 벡터를 만드는 데 사용될 수 있다.
본 출원의 발현 벡터는 각각의 폴리펩타이드 성분을 암호화하는 2개 이상의 프로모터-시스트론 쌍을 포함할 수 있다. 프로모터는 발현을 조절하는 시스트론의 상류(5')에 위치한 비번역 조절 서열이다. 원핵생물 프로모터는 전형적으로 유도성 및 구성적의 두 클래스로 나뉜다. 유도성 프로모터는 배양 조건의 변화, 예를 들어, 영양소의 유무 또는 온도의 변화에 반응하여 제어하에 시스트론의 증가된 수준의 전사를 개시하는 프로모터이다.
다양한 잠재적인 숙주 세포에 의해 인식되는 다수의 프로모터가 잘 알려져 있다. 선택된 프로모터는 제한 효소 소화를 통해 공급원 DNA로부터 프로모터를 제거하고 단리된 프로모터 서열을 본 출원의 벡터에 삽입함으로써 본 발명의 항체를 암호화하는 시스트론 DNA에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 천연 프로모터 서열 및 많은 이종 프로모터는 둘 다 표적 유전자의 증폭 및/또는 발현을 지시하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이종 프로모터는 일반적으로 천연 표적 폴리펩타이드 프로모터와 비교하여 발현된 표적 유전자의 더 큰 전사 및 더 높은 수율을 허용하기 때문에 사용된다.
원핵생물 숙주와 함께 사용하기에 적합한 프로모터는 PhoA 프로모터, -갈락타메이스 및 락토스 프로모터 시스템, 트립토판(trp) 프로모터 시스템 및 하이브리드 프로모터, 예컨대, tac 또는 trc 프로모터를 포함한다. 그러나, 세균(예컨대, 다른 공지된 세균 또는 파지 프로모터)에서 기능하는 다른 프로모터도 적합하다. 이들의 핵산 서열은 공개되어 있으므로, 숙련된 작업자가 임의의 필요한 제한 부위를 제공하기 위해 링커 또는 어댑터를 사용하여 표적 펩타이드를 암호화하는 시스트론에 작동 가능하게 결찰(Siebenlist et al. Cell 20: 269 (1980))할 수 있다.
일 양태에서, 재조합 벡터 내의 각각의 시스트론은 발현된 폴리펩타이드의 막을 가로지르는 전위를 지시하는 분비 신호 서열 성분을 포함한다. 일반적으로, 신호 서열은 벡터의 성분일 수 있거나 또는 벡터에 삽입되는 표적 폴리펩타이드 DNA의 일부일 수 있다. 본 발명의 목적을 위해 선택된 신호 서열은 숙주 세포에 의해 인식되고 처리되는(즉, 신호 펩티데이스에 의해 절단되는) 것이어야 한다. 이종 폴리펩타이드 고유의 신호 서열을 인식하고 처리하지 않는 원핵생물 숙주 세포의 경우, 신호 서열은, 예를 들어, 알칼리 포스파테이스, 페니실리네이스, Ipp 또는 열-안정적 장독소 II(STII) 리더, LamB, PhoE, PelB, OmpA 및 MBP로 이루어진 군으로부터 선택된 원핵생물 신호 서열로 치환될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 항체의 생산은 숙주 세포의 세포질에서 발생할 수 있으므로, 각 시스트론 내의 분비 신호 서열의 존재를 필요로 하지 않는다. 소정의 숙주 균주(예를 들어, 대장균 trxB- 균주)는 이황화 결합 형성에 유리한 세포질 조건을 제공함으로써 발현된 단백질 서브유닛의 적절한 접힘 및 조립을 허용한다.
본 개시내용의 항체를 발현시키는 데 적합한 원핵생물 숙주 세포는 고세균 및 진정세균, 예컨대, 그람-음성 또는 그람-양성 유기체를 포함한다. 유용한 세균의 예는 에스케리키아(Escherichia)(예를 들어, 대장균(E. coli)), 바실리(Bacilli)(예를 들어, B. 서브틸리스(B. subtilis)), 엔테로박테리아(Enterobacteria), 슈도모나스 종(예를 들어, P. 아에루기노사(P. aeruginosa)), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아 마르세센스(Serratia marcescans), 클레브시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 시겔라(Shigella), 리조비아(Rhizobia), 비트레오스실라(Vitreoscilla) 또는 파라코커스(Paracoccus)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 그람-음성 세포가 사용된다. 일 실시형태에서, 대장균 세포는 숙주로 사용된다. 대장균 균주의 예는 유전자형 W3110 AfhuA(AtonA) ptr3 lac Iq lacL8 AompT A(nmpc-fepE) degP41 kanR(미국 특허 제5,639,635호)을 갖는 균주 33D3을 포함하여 균주 W3110(Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), pp. 1190-1219; ATCC 기탁 번호 27,325) 및 이의 유도체를 포함한다. 대장균 294(ATCC 31,446), 대장균 B, 대장균 1776(ATCC 31,537) 및 대장균 RV308(ATCC 31,608)과 같은 다른 균주 및 이의 유도체가 또한 적합하다. 이들 예는 제한적이기보다는 예시적이다. 규정된 유전자형을 갖는 임의의 위에 언급된 세균의 유도체를 작제하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌[Bass et al., Proteins, 8:309-314 (1990)]에 기술되어 있다. 일반적으로, 세균의 세포에서 레플리콘의 복제성을 고려하여 적절한 세균을 선택할 필요가 있다. 예를 들어, pBR322, pBR325, pACYC177 또는 pKN410과 같은 잘 알려진 플라스미드가 레플리콘을 공급하기 위해 사용되는 경우, 대장균, 세라티아 또는 살모넬라 종이 숙주로서 적합하게 사용될 수 있다.
전형적으로, 숙주 세포는 최소량의 단백질 가수분해 효소를 분비하여야 하며, 추가적인 프로테이스 저해제가 바람직하게는 세포 배양에 포함될 수 있다.
숙주 세포는 전술한 발현 벡터로 형질전환되고, 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선택하거나 또는 목적하는 서열을 암호화하는 유전자를 증폭시키는 데 적절하게 변형된 종래의 영양 배지에서 배양된다. 형질전환은 DNA가 염색체외 요소로서 또는 염색체 통합체에 의해 복제 가능하도록 DNA를 원핵생물 숙주에 도입하는 것을 의미한다. 사용된 숙주 세포에 따라, 이러한 세포에 적절한 표준 기법을 사용하여 형질전환이 수행된다. 칼슘 클로라이드를 사용하는 칼슘 처리는 일반적으로 상당한 세포벽 장벽을 포함하는 세균 세포에 사용된다. 형질전환을 위한 또 다른 방법은 폴리에틸렌 글리콜/DMSO를 사용한다. 사용되는 또 다른 기법은 전기천공법이다.
본 출원의 항체를 생산하는 데 사용되는 원핵생물 세포는 당업계에 공지되고 선택된 숙주 세포의 배양에 적합한 배지에서 성장된다. 적합한 배지의 예는 루리아 브로스(luria broth: LB)와 필수 영양소 보충제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 배지는 또한 발현 벡터를 포함하는 원핵생물 세포의 성장을 선택적으로 허용하기 위해 발현 벡터의 구성에 기초하여 선택된 선별제를 포함한다. 예를 들어, 암피실린 저항성 유전자를 발현하는 세포의 성장을 위해 배지에 암피실린이 첨가된다.
탄소, 질소 및 무기 인산 공급원 외에, 단독으로 또는 복합 질소 공급원과 같은 또 다른 보충제 또는 배지와의 혼합물로 도입되는 임의의 필수 보충제가 또한 적절한 농도로 포함될 수 있다. 선택적으로, 배양 배지는 글루타티온, 시스테인, 시스타민, 티오글리콜레이트, 다이티오에리트리톨 및 다이티오트레이톨로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 환원제를 포함할 수 있다. 원핵생물 숙주 세포는 적합한 온도 및 pH에서 배양된다.
유도성 프로모터가 본 출원의 발현 벡터에 사용되는 경우, 프로모터의 활성화에 적합한 조건하에 단백질 발현이 유도된다. 본 출원의 일 양태에서, PhoA 프로모터는 폴리펩타이드의 전사를 제어하기 위해 사용된다. 따라서, 형질전환된 숙주 세포는 유도를 위해 포스페이트-제한 배지에서 배양된다. 바람직하게는, 포스페이트-제한 배지는 C.R.A.P 배지이다(예를 들어, 문헌[Simmons et al., J. Immunol. Methods 263:133-147 (2002)] 참조). 당업계에 공지된 바와 같이 사용되는 벡터 작제물에 따라 다양한 다른 유도제가 사용될 수 있다.
본 개시내용의 발현된 항체는 숙주 세포의 주변 세포질로 분비되고 이로부터 회수된다. 단백질 회수는 전형적으로 삼투 충격, 초음파 처리 또는 용해와 같은 수단에 의해 일반적으로 미생물을 파괴하는 것을 포함한다. 세포가 파괴되면, 세포 파편 또는 전체 세포는 원심분리 또는 여과에 의해 제거될 수 있다. 단백질은, 예를 들어, 친화성 수지 크로마토그래피에 의해 추가로 정제될 수 있다. 대안적으로, 단백질은 배양 배지로 옮겨지고 그 안에서 단리될 수 있다. 세포는 배양물로부터 제거될 수 있고, 배양 상청액은 여과되어 생산된 단백질의 추가 정제를 위해 농축된다. 발현된 폴리펩타이드는 추가로 단리되고, 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(polyacrylamide gel electrophoresis: PAGE) 및 웨스턴 블롯 검정과 같은 일반적으로 공지된 방법을 사용하여 확인될 수 있다.
대안적으로, 단백질 생산은 발효 과정에 의해 대량으로 수행된다. 다양한 대규모 공급-배취 발효 절차가 재조합 단백질의 생산을 위해 사용 가능하다. 본 개시내용의 항체의 생산 수율 및 품질을 개선하기 위해, 다양한 발효 조건이 변형될 수 있다. 예를 들어, 샤페론 단백질은 세균 숙주 세포에서 생산된 이종 단백질의 적절한 접힘 및 용해도를 촉진하는 것으로 입증되었다(문헌[Chen et al. J Bio Chem 274:19601-19605 (1999)]; 미국 특허 제6,083,715호; 미국 특허 제6,027,888호; 문헌[Bothmann and Pluckthun, J. Biol. Chem. 275:17100-17105 (2000); Ramm and Pluckthun, J. Biol. Chem. 275:17106-17113 (2000); Arie et al., Mol. Microbiol. 39:199-210 (2001)]).
발현된 이종 단백질(특히 단백질 가수분해에 민감한 단백질)의 단백질 가수분해를 최소화하기 위해, 예를 들어, 미국 특허 제5,264,365호; 미국 특허 제5,508,192호; 문헌[Hara et al., Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996)]에 기술되어 있는 바와 같이 단백질 가수분해 효소가 결핍된 소정의 숙주 균주가 본 발명에 사용될 수 있다. 단백질 가수분해 효소가 결핍되고 하나 이상의 샤페론 단백질을 과발현하는 플라스미드로 형질전환된 대장균 균주가 본 출원의 항체를 암호화하는 발현 시스템에서 숙주 세포로 사용될 수 있다.
본 명세서에서 생산된 항체는 추가 검정 및 사용을 위해 실질적으로 균질한 제조물을 얻기 위해 추가로 정제될 수 있다. 당업계에 공지된 표준 단백질 정제 방법이 사용될 수 있다. 다음 절차는 적합한 정제 절차의 예이다: 면역친화성 또는 이온-교환 칼럼에서의 분별, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 또는 DEAE와 같은 양이온-교환 수지에서의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 암모늄 설페이트 침전 및, 예를 들어, 일부 실시형태에서 본 개시내용의 결합 분자의 면역친화성 정제를 위해 사용될 수 있는, 예를 들어, 고체상에 고정된 Sephadex G-75.단백질 A를 사용하는 겔 여과. 단백질 A가 고정되는 고체상은 바람직하게는 유리 또는 실리카 표면을 포함하는 칼럼, 보다 바람직하게는 조절 공극유리 칼럼 또는 규산 칼럼이다. 일부 실시형태에서, 칼럼은 오염물의 비특이적 부착을 방지하기 위해 글리세롤과 같은 시약으로 코팅되었다. 그런 다음, 고체상은 고체상에 비특이적으로 결합된 오염물을 제거하기 위해 세척된다. 마지막으로, 관심 항체가 용리에 의해 고체상으로부터 회수된다.
5.2.7. 단일 도메인 항체를 포함하는 결합 분자
또 다른 양태에서, 본 명세서에 제공된 단일 도메인 항체(예를 들어, GUCY2C에 대한 VHH 도메인)를 포함하는 결합 분자가 본 명세서에 제공된다. 아래 부문 5.3에 기재된 바와 같은 본 명세서에 제공된 키메라 항원 수용체(CAR)에 더하여, 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 GUCY2C에 대한 단일 도메인 항체는 다른 결합 분자의 일부이다. 융합 단백질 및 면역접합체와 같은 본 개시내용의 예시적인 결합 분자가 본 명세서에 기재된다.
다양한 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 단일 도메인 항체는 또 다른 작용제, 예를 들어, 단백질-기반 실체(entity)에 유전적으로 융합되거나 또는 화학적으로 접합될 수 있다. 단일 도메인 항체는 작용제에 화학적으로 접합될 수 있거나 또는 그렇지 않으면 작용제에 비공유적으로 접합될 수 있다. 작용제는 펩타이드 또는 항체(또는 이의 단편)일 수 있다.
따라서, 일부 실시형태에서, 융합 단백질을 생성하기 위해 이종 단백질 또는 폴리펩타이드(또는 이의 단편, 예를 들어, 약 10개, 약 20개, 약 30개, 약 40개, 약 50개, 약 60개, 약 70개, 약 80개, 약 90개, 약 100개, 약 150개, 약 200개, 약 250개, 약 300개, 약 350개, 약 400개, 약 450개 또는 약 500개의 아미노산 또는 500개 이상의 아미노산의 폴리펩타이드)에 재조합적으로 융합되거나 또는 화학적으로 접합(공유 또는 비공유적 접합)된 단일 도메인 항체(예를 들어, VHH 도메인)뿐만 아니라 이의 용도가 본 명세서에 제공된다. 특히, 본 명세서에 제공된 단일 도메인 항체의 항원-결합 단편(예를 들어, CDR1, CDR2 및/또는 CDR3) 및 이종 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 포함하는 융합 단백질이 본 명세서에 제공된다.
더욱이, 본 명세서에 제공된 항체는 정제를 용이하게 하기 위해 펩타이드와 같은 마커 또는 "태그" 서열에 융합될 수 있다. 특정 실시형태에서, 마커 또는 태그 아미노산 서열은 헥사-히스티딘 펩타이드, 헤마글루티닌("HA") 태그 및 "FLAG" 태그이다.
항체에 모이어티(폴리펩타이드 포함)를 융합 또는 접합시키는 방법은 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Arnon et al., Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy 243-56 (Reisfeld et al. eds., 1985); Hellstrom et al., Antibodies for Drug Delivery, in Controlled Drug Delivery 623-53 (Robinson et al. eds., 2d ed. 1987); Thorpe, Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy: A Review, in Monoclonal Antibodies: Biological and Clinical Applications 475-506 (Pinchera et al. eds., 1985); Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy, in Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy 303-16 (Baldwin et al. eds., 1985); Thorpe et al., Immunol. Rev. 62:119-58 (1982)]; 미국 특허 제5,336,603호; 제5,622,929호; 제5,359,046호; 제5,349,053호; 제5,447,851호; 제5,723,125호; 제5,783,181호; 제5,908,626호; 제5,844,095호; 및 제5,112,946호; EP 307,434; EP 367,166; EP 394,827; PCT 공개 WO 91/06570, WO 96/04388, WO 96/22024, WO 97/34631 및 WO 99/04813; 문헌[Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 10535-39 (1991); Traunecker et al., Nature, 331:84-86 (1988); Zheng et al., J. Immunol. 154:5590-600 (1995); 및 Vil et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11337-41 (1992)] 참조).
융합 단백질은, 예를 들어, 유전자-셔플링, 모티프-셔플링, 엑손-셔플링 및/또는 코돈-셔플링(통칭하여 "DNA 셔플링"으로 지칭됨)의 기법을 통해 생성될 수 있다. DNA 셔플링은, 예를 들어, 더 높은 친화도 및 더 낮은 해리 속도를 갖는 항체를 포함하는 본 명세서에 제공된 바와 같은 단일 도메인 항체의 활성을 변경하기 위해 사용될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,605,793호; 제5,811,238호; 제5,830,721호; 제5,834,252호; 및 제5,837,458호; 문헌[Patten et al., Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33 (1997); Harayama, Trends Biotechnol. 16(2):76-82 (1998); Hansson et al., J. Mol. Biol. 287:265-76 (1999); 및 Lorenzo and Blasco, Biotechniques 24(2):308-13 (1998)] 참조). 항체 또는 암호화된 항체는 재조합 전에 오류-유발 PCR, 무작위 뉴클레오타이드 삽입 또는 기타 방법에 의한 무작위 돌연변이유발을 거침으로써 변경될 수 있다. 본 명세서에 제공된 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 이종 분자의 하나 이상의 성분, 모티프, 절편, 일부, 도메인, 단편 등과 재조합될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 단일 도메인 항체(예를 들어, VHH 도메인)는 항체 이종접합체를 형성하기 위해 제2 항체에 접합된다.
다양한 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 작용제에 유전적으로 융합된다. 유전적 융합은 단일 도메인 항체와 작용제 사이에 링커(예를 들어, 폴리펩타이드)를 배치함으로써 달성될 수 있다. 링커는 가요성 링커일 수 있다.
다양한 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 단일 도메인 항체를 치료 분자에 연결하는 힌지 영역과 함께 치료 분자에 유전적으로 접합된다.
또한, 본 명세서에 제공된 다양한 융합 단백질을 제조하는 방법이 본 명세서에 제공된다. 위의 부문 5.2.6에 기재된 다양한 방법이 또한 본 명세서에 제공된 융합 단백질을 제조하기 위해 사용될 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 융합 단백질은 재조합적으로 발현된다. 본 명세서에 제공된 융합 단백질의 재조합 발현은 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터의 작제를 필요로 한다. 본 명세서에 제공된 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 수득되면, 분자의 생산을 위한 벡터는 당업계에 잘 알려진 기법을 사용하여 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 수 있다. 따라서, 암호화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 발현시킴으로써 단백질을 제조하는 방법이 본 명세서에 기재된다. 당업자에게 잘 알려져 있는 방법이 코딩 서열 및 적절한 전사 및 번역 제어 신호를 포함하는 발현 벡터를 작제하는 데 사용될 수 있다. 이러한 방법은, 예를 들어, 시험관내 재조합 DNA 기법, 합성 기법 및 생체내 유전적 재조합을 포함한다. 또한, 본 명세서에 제공된 융합 단백질, 또는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 이의 단편 또는 CDR을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 복제 가능한 벡터가 제공된다.
발현 벡터는 종래의 기법에 의해 숙주 세포에 전달될 수 있고, 형질감염된 세포는 이후 종래의 기법에 의해 배양되어 본 명세서에 제공된 융합 단백질을 생산한다. 따라서, 본 명세서에 제공된 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 이종 프로모터에 작동 가능하게 연결된 이의 단편을 포함하는 숙주 세포가 또한 본 명세서에 제공된다.
다양한 숙주-발현 벡터 시스템이 본 명세서에 제공된 융합 단백질을 발현하는 데 사용될 수 있다. 이러한 숙주-발현 시스템은 관심 코딩 서열이 생성되고 후속적으로 정제될 수 있는 비히클을 나타내지만, 또한 적절한 뉴클레오타이드 코딩 서열로 형질전환되거나 또는 형질감염될 때 제자리에서(in situ) 본 명세서에 제공된 융합 단백질을 발현할 수 있는 세포를 나타낸다. 이들은 코딩 서열을 포함하는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 세균(예를 들어, 대장균 및 B. 서브틸리스)과 같은 미생물; 코딩 서열을 포함하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모(예를 들어, 사카로마이세스 피키아(Saccharomyces Pichia)); 코딩 서열을 포함하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 바큘로바이러스)에 감염된 곤충 세포 시스템; 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 콜리플라워 모자이크 바이러스, CaMV, 담배 모자이크 바이러스, TMV)에 감염되거나 또는 코딩 서열을 포함하는 재조합 플라스미드 발현 벡터(예를 들어, Ti 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포 시스템; 또는 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터(예를 들어, 메탈로티오네인 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터; 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터)를 포함하는 재조합 발현 작제물을 보유하는 포유동물 세포 시스템(예를 들어, COS, CHO, BHK, 293, NS0 및 3T3 세포)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특히 전체 재조합 항체 분자의 발현을 위한 대장균과 같은 세균 세포 또는 진핵생물 세포는 재조합 융합 단백질의 발현을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 인간 사이토메갈로바이러스로부터의 주요 중간 초기 유전자 프로모터 요소와 같은 벡터와 함께 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO)와 같은 포유동물 세포는 항체 또는 이의 변이체를 위한 효과적인 발현 시스템이다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 발현은 구성적 프로모터, 유도성 프로모터 또는 조직 특이적 프로모터에 의해 조절된다.
세균 시스템에서, 발현되는 융합 단백질에 대해 의도된 용도에 따라 다수의 발현 벡터가 유리하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 융합 단백질의 약제학적 조성물의 생성을 위해 이러한 융합 단백질을 다량으로 생산해야 하는 경우, 쉽게 정제되는 높은 수준의 융합 단백질 생성물의 발현을 지시하는 벡터가 바람직할 수 있다. 이러한 벡터는 대장균 발현 벡터 pUR278(Ruther et al., EMBO 12:1791(1983))(여기서, 코딩 서열은 lac Z 코딩 영역과 함께 프레임내 벡터에 개별적으로 결찰되어 융합 단백질이 생산될 수 있음); pIN 벡터(Inouye & Inouye, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109 (1985); Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 24:5503-5509 (1989)) 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. pGEX 벡터가 또한 글루타티온 5-트랜스퍼레이스(GST)와의 융합 단백질로서 외래 폴리펩타이드를 발현시키는 데 사용될 수 있다. 일반적으로, 이러한 융합 단백질은 가용성이며, 매트릭스 글루타티온 아가로스 비드에 흡착 및 결합한 후 유리 글루타티온의 존재하에 용리에 의해 용해된 세포로부터 쉽게 정제될 수 있다. pGEX 벡터는 클로닝된 표적 유전자 산물이 GST 모이어티로부터 방출될 수 있도록 트롬빈 또는 인자 Xa 프로테이스 절단 부위를 포함하도록 설계된다.
포유동물 숙주 세포에서, 다수의 바이러스-기반 발현 시스템이 사용될 수 있다. 아데노바이러스가 발현 벡터로 사용되는 경우, 관심 코딩 서열은 아데노바이러스 전사/번역 제어 복합체, 예를 들어, 후기 프로모터 및 삼부(tripartite) 리더 서열에 결찰될 수 있다. 그런 다음, 이 키메라 유전자는 시험관내 또는 생체내 재조합에 의해 아데노바이러스 게놈에 삽입될 수 있다. 바이러스 게놈의 비필수 영역(예를 들어, 영역 El 또는 E3)으로의 삽입은 감염된 숙주에서 생존 가능하고 융합 단백질을 발현할 수 있는 재조합 바이러스를 생성할 것이다(예를 들어, 문헌[Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8 1:355-359 (1984)] 참조). 삽입된 코딩 서열의 효율적인 번역을 위해 특정 개시 신호가 또한 필요할 수 있다. 이러한 신호는 ATG 개시 코돈 및 인접 서열을 포함한다. 또한, 개시 코돈은 전체 삽입체의 번역을 보장하기 위해 목적하는 코딩 서열의 리딩 프레임과 위상이 같아야(in phase with) 한다. 이러한 외인성 번역 제어 신호 및 개시 코돈은 천연 및 합성 모두에서 다양한 기원을 가질 수 있다. 발현의 효율은 적절한 전사 인핸서 요소, 전사 종결자 등을 포함시킴으로써 향상될 수 있다(예를 들어, 문헌[Bittner et al., Methods in Enzymol. 153:51-544 (1987)] 참조).
또한, 삽입된 서열의 발현을 조절하거나 또는 목적하는 특정 방식으로 유전자 산물을 변형 및 처리하는 숙주 세포 균주가 선택될 수 있다. 단백질 산물의 이러한 변형(예를 들어, 글리코실화) 및 처리(예를 들어, 절단)는 단백질의 기능에 중요할 수 있다. 상이한 숙주 세포는 번역 후 처리 및 단백질 및 유전자 산물의 변형을 위한 특징적이고 특정한 메커니즘을 갖고 있다. 발현된 외래 단백질의 올바른 변형 및 처리를 보장하기 위해 적절한 세포주 또는 숙주 시스템이 선택될 수 있다. 이를 위해, 유전자 산물의 1차 전사체, 글리코실화 및 인산화의 적절한 처리를 위한 세포 기구를 갖는 진핵생물 숙주 세포가 사용될 수 있다. 이러한 포유동물 숙주 세포는 CHO, VERY, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT2O 및 T47D, NS0(임의의 면역 글로불린 사슬을 내인성으로 생산하지 않는 뮤린 골수종 세포주), CRL7O3O 및 HsS78Bst 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
재조합 단백질의 장기간, 고수율 생산을 위해, 안정적인 발현이 사용될 수 있다. 예를 들어, 융합 단백질을 안정적으로 발현하는 세포주가 조작될 수 있다. 바이러스 복제 기점을 포함하는 발현 벡터를 사용하는 대신, 숙주 세포는 적절한 발현 제어 요소(예를 들어, 프로모터, 인핸서, 서열, 전사 종결자, 폴리아데닐화 부위 등) 및 선별 마커에 의해 제어되는 DNA로 형질전환될 수 있다. 외래 DNA의 도입 후, 조작된 세포는 농축 배지에서 1일 내지 2일 동안 성장시킨 다음, 선택 배지로 전환될 수 있다. 재조합 플라스미드 내 선별 마커는 선택에 대한 저항성을 부여하고, 세포가 플라스미드를 이들의 염색체에 안정적으로 통합시키고 성장시켜 세포주로 클로닝 및 확장될 수 있는 초점(foci)을 형성할 수 있게 한다. 이 방법은 융합 단백질을 발현하는 세포주를 조작하는 데 유리하게 사용될 수 있다. 이러한 조작된 세포주는 결합 분자와 직접 또는 간접적으로 상호작용하는 조성물의 스크리닝 및 평가에 특히 유용할 수 있다.
단순 헤르페스 바이러스 티미딘 카이네이스(Wigler et al., Cell 11:223 (1977)), 하이포잔틴구아닌 포스포리보실트랜스퍼레이스(Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202 (1992)) 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼레이스(Lowy et al., Cell 22:8-17 (1980)) 유전자가 각각 tk-, hgprt- 또는 aprt-세포에서 사용될 수 있는 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다수의 선택 시스템이 사용될 수 있다. 또한, 항대사물질 저항성은 다음 유전자에 대한 선택의 기초로 사용될 수 있다: 메토트렉세이트에 대한 저항성을 부여하는 dhfr(Wigler et al., Natl. Acad. Sci. USA 77:357 (1980); O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527 (1981)); 마이코페놀산에 대한 저항성을 부여하는 gpt(Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072 (1981)); 아미노글리코시드 G-418에 대한 저항성을 부여하는 neo(Wu and Wu, Biotherapy 3:87-95 (1991); Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596 (1993); Mulligan, Science 260:926-932 (1993); 및 Morgan and Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217 (1993); May, TIB TECH 11(5):l55-2 15 (1993)); 및 하이그로마이신에 대한 저항성을 부여하는 hygro(Santerre et al., Gene 30:147 (1984)). 재조합 DNA 기술 분야에서 일반적으로 알려진 방법이 목적하는 재조합 클론을 선택하기 위해 일상적으로 적용될 수 있으며, 이러한 방법은, 예를 들어, 전체가 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있는 문헌[Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); 및 Chapters 12 and 13, Dracopoli et al. (eds.), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150:1 (1981)]에 기술되어 있다.
융합 단백질의 발현 수준은 벡터 증폭에 의해 증가될 수 있다(검토를 위해, 문헌[Bebbington and Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol. 3 (Academic Press, New York, 1987)] 참조). 융합 단백질을 발현하는 벡터 시스템의 마커가 증폭 가능한 경우, 숙주 세포의 배양물에 존재하는 저해제 수준의 증가는 마커 유전자의 카피 수를 증가시킬 것이다. 증폭된 영역은 융합 단백질 유전자와 연관되어 있기 때문에, 융합 단백질의 생산도 증가할 것이다(Crouse et al., Mol. Cell. Biol. 3:257 (1983)).
숙주 세포는 본 명세서에 제공된 다수의 발현 벡터로 공동 형질감염될 수 있다. 벡터는 각각의 암호화 폴리펩타이드의 동등한 발현을 가능하게 하는 동일한 선별 마커를 포함할 수 있다. 대안적으로, 다수의 폴리펩타이드를 암호화하고 발현할 수 있는 단일 벡터가 사용될 수 있다. 코딩 서열은 cDNA 또는 게놈 DNA를 포함할 수 있다.
본 명세서에 제공된 융합 단백질이 재조합 발현에 의해 생산되면, 이는 폴리펩타이드(예를 들어, 면역 글로불린 분자)의 정제를 위한 임의의 당업계에 공지된 방법에 의해, 예를 들어, 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환, 친화도, 특히 단백질 A 후 특정 항원에 대한 친화도, 크기별 칼럼 크로마토그래피 및 카파 선택 친화성 크로마토그래피), 원심분리, 차등 용해도에 의해 또는 단백질의 정제를 위한 임의의 다른 표준 기법에 의해 정제될 수 있다. 또한, 본 명세서에 제공된 융합 단백질 분자는 정제를 용이하게 하기 위해 본 명세서에 기재되거나 또는 그렇지 않으면 당업계에 공지된 이종 폴리펩타이드 서열에 융합될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 또한 화학치료제 또는 약물, 성장 저해제, 독소(예를 들어, 단백질 독소, 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소 또는 이들의 단편) 또는 방사성 동위원소와 같은 하나 이상의 세포독성제에 접합된 본 명세서에 기재된 임의의 항체(예컨대, 항-GUCY2C 단일 도메인 항체)를 포함하는 면역접합체를 제공한다.
일부 실시형태에서, 면역접합체는 항체가 메이탄시노이드(미국 특허 제5,208,020호, 제5,416,064호 및 유럽 특허 EP 0 425 235 B1 참조); 아우리스타틴, 예컨대, 모노메틸아우리스타틴 약물 모이어티 DE 및 DF(MMAE 및 MMAF)(미국 특허 제5,635,483호 및 제5,780,588호 및 제7,498,298호 참조); 돌라스타틴; 칼리케아미신 또는 이의 유도체(미국 특허 제5,712,374호, 제5,714,586호, 제5,739,116호, 제5,767,285호, 제5,770,701호, 제5,770,710호, 제5,773,001호 및 제5,877,296호; 문헌[Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993); 및 Lode et al., Cancer Res. 58:2925-2928 (1998)] 참조); 안트라사이클린, 예컨대, 다우노마이신 또는 독소루비신(문헌[Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002); King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002)]; 및 미국 특허 제6,630,579호 참조); 메토트렉세이트; 빈데신; 탁세인, 예컨대, 도세탁셀, 파클리탁셀, 라로탁셀, 테세탁셀 및 오르타탁셀; 트라이코테센; 및 CC1065를 포함하지만 이에 제한되지 않는 하나 이상의 약물에 접합된 항체-약물 접합체(ADC)이다.
일부 실시형태에서, 면역접합체는 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 사슬(슈도모나스 아에루기노사 유래), 리신(ricin) A 사슬, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이(Aleurites fordii) 단백질, 다이안틴 단백질, 피토라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질(PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 저해제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 저해제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트라이코테센을 포함하지만 이에 제한되지 않는 효소적으로 활성인 독소 또는 이의 단편에 접합된 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체를 포함한다.
일부 실시형태에서, 면역접합체는 방사성접합체를 형성하기 위해 방사성 원자에 접합된 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체를 포함한다. 다양한 방사성 동위원소가 방사성접합체의 생산에 이용 가능하다. 예는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소를 포함한다. 방사성접합체가 검출에 사용되는 경우, 이는 섬광계 연구를 위한 방사성 원자, 예를 들어, tc99m 또는 I123, 또는 아이오다인-123, 아이오다인-131, 인듐-111, 플루오린-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망가니즈 또는 철과 같은 핵 자기 공명(NMR) 영상(자기 공명 영상, mri로도 알려져 있음)을 위한 스핀 표지를 포함할 수 있다.
항체와 세포독성제의 접합체는 다양한 이작용성 단백질 커플링제, 예컨대, N-석신이미딜-3-(2-피리딜다이티오) 프로피오네이트(SPDP), 석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥세인-1-카복실레이트(SMCC), 이미노티올레인(IT), 이미도에스터의 이작용성 유도체(예컨대, 다이메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스터(예컨대, 다이석신이미딜 수베레이트), 알데하이드(예컨대, 글루타르알데하이드), 비스-아지도 화합물(예컨대, 비스(p-아지도벤조일) 헥세인다이아민), 비스-다이아조늄 유도체(예컨대, 비스-(p-다이아조늄벤조일)-에틸렌다이아민), 다이아이소사이아네이트(예컨대, 톨루엔 2,6-다이아이소사이아네이트) 및 비스-활성 플루오린 화합물(예컨대, 1,5-다이플루오로-2,4-다이나이트로벤젠)을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소는 문헌[Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)]에 기술되어 있는 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14-표지된 1-아이소티오사이아나토벤질-3-메틸다이에틸렌 트라이아민펜타아세트산(MX-DTPA)이 방사성뉴클레오타이드를 항체에 접합시키기 위한 예시적인 킬레이트제이다. WO94/11026을 참조한다.
링커는 세포에서 접합된 작용제의 방출을 용이하게 하는 "절단성 링커"일 수 있지만, 비절단성 링커도 본 명세서에서 상정된다. 본 개시내용의 접합체에 사용하기 위한 링커는 제한 없이 산 불안정 링커(예를 들어, 하이드라존 링커), 이황화-함유 링커, 펩티데이스-민감성 링커(예를 들어, 아미노산, 예를 들어, 발린 및/또는 시트룰린-발린 또는 페닐알라닌-라이신과 같은 시트룰린을 포함하는 펩타이드 링커), 광불안정 링커, 다이메틸 링커, 티오에터 링커 또는 다약제 수송체-매개성 저항성을 회피하도록 설계된 친수성 링커를 포함한다.
본 명세서에서 면역접합체 또는 ADC는 상업적으로 이용 가능한(예를 들어, 피어스 바이오테크놀로지, 인크.(Pierce Biotechnology, Inc.), 미국, 일리노이주 록퍼드 소재) BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 설포-EMCS, 설포-GMBS, 설포-KMUS, 설포-MBS, 설포-SIAB, 설포-SMCC 및 설포-SMPB 및 SVSB(석신이미딜-(4-바이닐설폰)벤조에이트)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 가교제 시약으로 제조된 이러한 접합체를 상정하지만 이에 제한되지 않는다.
다른 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는, 예를 들어, 진단 분자에 접합되거나 또는 재조합적으로 융합된다. 이러한 진단 및 검출은, 예를 들어, 서양고추냉이 퍼옥시데이스, 알칼리 포스파테이스, 베타-갈락토시데이스 또는 아세틸콜린에스터레이스와 같으나 이에 제한되지 않는 다양한 효소; 스트렙타비딘/바이오틴 또는 아비딘/바이오틴과 같으나 이에 제한되지 않는 보결 분자단(prosthetic groups); 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 아이소티오사이아네이트, 로다민, 다이클로로트라이아진일아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린과 같으나 이에 제한되지 않는 형광 물질; 루미놀과 같으나 이에 제한되지 않는 발광 물질; 루시퍼레이스, 루시페린 또는 에쿼린과 같으나 이에 제한되지 않는 생물발광 물질; 225Acγ-방출, 오오거-방출, β-방출, 알파-방출 또는 양전자-방출 방사성 동위원소와 같은 화학발광 물질을 포함하지만 이에 제한되지 않는 검출 가능한 물질에 항체를 커플링함으로써 달성될 수 있다.
5.3. 키메라 항원 수용체
또 다른 양태에서, GUCY2C에 결합하는 본 명세서에 제공된 적어도 하나의 단일 도메인 항체(예를 들어, VHH)를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)가 본 명세서에 제공된다. 본 발명의 VHH 도메인(즉, VHH-기반 CAR)을 포함하는 예시적인 CAR이 예시되며, 이들의 우수한 효과는 아래 부문 6에 기재된 바와 같이 입증된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 키메라 항원 수용체(CAR)는 (a) 본 명세서에 제공된 바와 같은 GUCY2C에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 단일 도메인 항체(sdAb) 및 선택적으로 하나 이상의 추가적인 결합 도메인(들)을 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 각 성분 및 추가적인 영역은 아래에서 더 자세히 설명된다.
5.3.1. 세포외 항원 결합 도메인
본 명세서에 기재된 CAR의 세포외 항원 결합 도메인은 하나 이상(예컨대, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 이상 중 어느 하나)의 단일 도메인 항체를 포함한다. 단일 도메인 항체는 펩타이드 결합 또는 펩타이드 링커를 통해 서로 직접 융합될 수 있다.
단일 도메인 항체
본 개시내용의 CAR은 하나 이상의 단일 도메인 항체를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인을 포함한다. sdAb는 동일하거나 또는 상이한 기원일 수 있고, 동일하거나 또는 상이한 크기일 수 있다. 예시적인 sdAb는 중쇄 단독 항체로부터의 중쇄 가변 도메인(예를 들어, VHH 또는 VNAR), 자연적으로 경쇄가 없는 결합 분자, 통상적인 4-쇄 항체로부터 유래된 단일 도메인(예컨대, VH 또는 VL), 인간화된 중쇄 단독 항체, 인간 중쇄 분절을 발현하는 트랜스제닉 마우스 또는 래트에 의해 생산된 인간 단일 도메인 항체 및 항체에서 유래된 것 이외의 조작된 도메인 및 단일 도메인 스캐폴드를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본 개시내용에서 위에 기재된 단일 도메인 항체를 포함하는 당업계에 공지되거나 또는 본 개시내용에 의해 개발된 임의의 sdAb는 본 명세서에 기재된 CAR을 작제하기 위해 사용될 수 있다. sdAb는 마우스, 래트, 인간, 낙타, 라마, 칠성장어, 물고기, 상어, 염소, 토끼 및 소를 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 종으로부터 유래될 수 있다. 본 명세서에서 상정되는 단일 도메인 항체는 또한 낙타과 및 상어 이외의 종으로부터의 자연 발생적 단일 도메인 항체 분자를 포함한다.
일부 실시형태에서, sdAb는 경쇄가 없는 중쇄 항체(본 명세서에서 "중쇄 단독 항체"로도 지칭됨)로 알려진 자연 발생적 단일 도메인 항원 결합 분자로부터 유래된다. 이러한 단일 도메인 분자는, 예를 들어, WO 94/04678 및 문헌[Hamers-Casterman, C. et al., Nature 363:446-448 (1993)]에 개시되어 있다. 명확성을 위해, 자연적으로 경쇄가 없는 중쇄 분자로부터 유래된 가변 도메인은 본 명세서에서 4쇄 면역 글로불린의 종래의 VH와 구별하기 위해 VHH로 알려져 있다. 이러한 VHH 분자는 낙타과 종, 예를 들어, 낙타, 라마, 비쿠나, 단봉낙타, 알파카 및 구아나코에서 생성된 항체로부터 유래될 수 있다. 낙타과 이외의 다른 종은 자연적으로 경쇄가 없는 중쇄 분자를 생성할 수 있으며, 이러한 VHH는 본 개시내용의 범위 내에 있다. 또한, VHH의 인간화된 버전뿐만 아니라 다른 변형체 및 변이체도 상정되며, 본 개시내용의 범위 내에 있다.
낙타류로부터의 VHH 분자는 IgG 분자보다 약 10배 더 작다. 이들은 단일 폴리펩타이드이며, 극한의 pH 및 온도 조건에 저항하여 매우 안정적일 수 있다. 더욱이, 이들은 통상적인 4-쇄 항체의 경우가 아닌 프로테이스의 작용에 저항성일 수 있다. 또한, VHH의 시험관내 발현은 높은 수율의 적절하게 접힌 기능적 VHH를 생성한다. 또한, 낙타류에서 생성된 항체는 항체 라이브러리의 사용을 통해 또는 낙타류 외의 포유동물의 면역화를 통해 시험관내에서 생성된 항체에 의해 인식되는 것 이외의 에피토프를 인식할 수 있다(예를 들어, WO9749805 참조). 이와 같이, 하나 이상의 VHH 도메인을 포함하는 다중특이성 또는 다가 CAR은 통상적인 4-쇄 항체로부터 유래된 항원 결합 단편을 포함하는 다중특이성 또는 다가 CAR보다 표적과 더 효율적으로 상호작용할 수 있다. VHH는 공동 또는 홈과 같은 "특이한" 에피토프에 결합하는 것으로 알려져 있기 때문에, 이러한 VHH를 포함하는 CAR의 친화성은 종래의 다중특이성 폴리펩타이드보다 치료적 치료에 더 적합할 수 있다.
일부 실시형태에서, sdAb는 연골 어류에서 발견되는 면역 글로불린의 가변 영역으로부터 유래된다. 예를 들어, sdAb는 상어의 혈청에서 발견되는 신규한 항원 수용체(Novel Antigen Receptor: NAR)로 알려져 있는 면역 글로불린 아이소타입으로부터 유래될 수 있다. NAR("IgNAR")의 가변 영역으로부터 유래되는 단일 도메인 분자를 생산하는 방법은 WO 03/014161 및 문헌[Streltsov, Protein Sci. 14:2901-2909 (2005)]에 기술되어 있다.
일부 실시형태에서, sdAb는 재조합, CDR-이식된, 인간화된, 낙타화된, 탈면역화된 및/또는 시험관내 생성된(예를 들어, 파지 디스플레이에 의해 선택된) 것이다. 일부 실시형태에서, 프레임워크 영역의 아미노산 서열은 프레임워크 영역에서 특정 아미노산 잔기의 "낙타화"에 의해 변경될 수 있다. 낙타화는 통상적인 4-쇄 항체로부터의 (자연 발생적) VH 도메인의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기를 중쇄 항체의 VHH 도메인에서 상응하는 위치(들)에서 발생하는 하나 이상의 아미노산 잔기로 대체 또는 치환하는 것을 지칭한다. 이는 당업계에 공지된 방식으로 수행될 수 있으며, 이는 당업자에게 명백할 것이다. 이러한 "낙타화" 치환은 본 명세서에 정의된 바와 같이 바람직하게는 VH-VL 계면 및/또는 소위 낙타과 특징 잔기를 형성하고/하거나 이에 존재하는 아미노산 위치에 삽입된다(예를 들어, WO 94/04678, 문헌[Davies and Riechmann FEBS Letters 339: 285-290 (1994); Davies and Riechmann, Protein Engineering 9 (6): 531-537 (1996); Riechmann, J. Mol. Biol. 259: 957-969 (1996); 및 Riechmann and Muyldermans, J. Immunol. Meth. 231: 25-38 (1999)] 참조).
일부 실시형태에서, sdAb는 인간 중쇄 분절을 발현하는 트랜스제닉 마우스 또는 래트에 의해 생산된 인간 단일 도메인 항체이다. 예를 들어, US20090307787, 미국 특허 제8,754,287호, US20150289489, US20100122358 및 WO2004049794를 참조한다. 일부 실시형태에서, sdAb는 성숙된 친화도이다.
일부 실시형태에서, 특정 항원 또는 표적에 대한 자연 발생적 VHH 도메인은 낙타과 VHH서열의 (미경험 또는 면역) 라이브러리로부터 얻을 수 있다. 이러한 방법은 당업계에 공지된 하나 이상의 스크리닝 기법을 사용하여 이러한 라이브러리를 상기 항원 또는 표적, 또는 이의 적어도 하나의 부분, 단편, 항원 결정기 또는 에피토프를 사용하여 스크리닝하는 것을 포함하거나 또는 포함할 수 있다. 대안적으로, 무작위 돌연변이유발 및/또는 CDR 셔플링과 같은 기법에 의해 (미경험 또는 면역) VHH 라이브러리로부터 얻은 VHH 라이브러리와 같이 (미경험 또는 면역) VHH 라이브러리로부터 유래된 개선된 합성 또는 반-합성 라이브러리가 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 통상적인 4-쇄 항체로부터 생성된다. 예를 들어, EP 0 368 684; 문헌[Ward et al., Nature, 341 (6242): 544-6 (1989); Holt et al., Trends Biotechnol., 21(11):484-490 (2003)]; WO 06/030220; 및 WO 06/003388을 참조한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 세포외 항원 결합 도메인은 적어도 하나의 결합 도메인을 포함하고, 적어도 하나의 결합 도메인은 본 명세서에 제공된 바와 같은 GUCY2C에 결합하는 단일 도메인 항체, 예를 들어, 위의 부문 5.2에 기재된 항-GUCY2C 단일 도메인 항체를 포함한다.
일부 실시형태에서, (a) 항-GUCY2C sdAb를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인으로서, 항-GUCY2C sdAb는, 예를 들어, 표 7의 VHH 도메인 및 표 7의 VHH 도메인 중 임의의 것에서 1개, 2개 또는 3개의 CDR을 모두 갖는 것들을 포함하는 위의 부문 5.2에 기재된 것과 같은 항-GUCY2C sdAb인, 상기 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 CAR이 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 항-GUCY2C sdAb는 낙타, 키메라, 인간 또는 인간화된 것이다.
일부 실시형태에서, (a) 항-GUCY2C sdAb를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인으로서, 항-GUCY2C sdAb는 서열번호 3의 아미노산 서열, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 또는 서열번호 10을 포함하는, 상기 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 CAR이 본 명세서에 제공된다. 다른 실시형태에서, (a) 항-GUCY2C sdAb를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인으로서, 항-GUCY2C sdAb는 서열번호 3의 아미노산 서열, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 또는 서열번호 10과 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 상기 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 CAR이 본 명세서에 제공된다.
다른 실시형태에서, 세포외 항원 결합 도메인은 2개 이상의 항원 결합 도메인을 포함하다. 이들 2개 이상의 항원 결합 도메인 중에서, 적어도 하나는 본 명세서에 제공된 바와 같은 GUCY2C에 결합하는 VHH이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 추가적인 결합 도메인(들)은 또한 GUCY2C에 결합하는 VHH(들)이다. 다른 실시형태에서, 하나 이상의 추가적인 결합 도메인(들)은 하나 이상의 추가적인 상이한 항원(들), 예를 들어, 하나 이상의 추가적인 상이한 항원(들)을 표적화하는 1개, 2개, 3개, 4개 이상의 추가적인 단일 도메인 항체 결합 영역(sdAb)에 결합한다.
일부 실시형태에서, (a) GUCY2C에 특이적으로 결합하는 2개 이상의 단일 도메인 항체(sdAb)를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 다가(예컨대, 2가 및 3가) CAR이 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 세포외 항원 결합 도메인은 본 명세서에 제공된 GUCY2C에 특이적으로 결합하는 2개의 단일 도메인 항체(sdAb)를 포함한다. 다른 실시형태에서, 세포외 항원 결합 도메인은 본 명세서에 제공된 GUCY2C에 특이적으로 결합하는 3개의 단일 도메인 항체(sdAb)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 항-GUCY2C sdAb는, 예를 들어, 표 7의 VHH 도메인 및 표 7의 VHH 도메인 중 임의의 것에서 1개, 2개 또는 3개의 CDR을 모두 갖는 것들을 포함하는 위의 부문 5.2에 기재된 항-GUCY2C sdAb로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 항-GUCY2C sdAb는 낙타, 키메라, 인간 또는 인간화된 것이다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 항-GUCY2C sdAb는 각각 독립적으로 서열번호 3의 아미노산 서열, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 또는 서열번호 10과 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 항-GUCY2C sdAb로부터 선택된다.
다른 실시형태에서, (a) GUCY2C에 특이적으로 결합하는 제1 단일 도메인 항체(sdAb)를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 다중특이성(예컨대, 이중특이성 및 삼중특이성) CAR이 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, CAR은 제2 항원(예컨대, 제2 종양 항원)에 특이적으로 결합하는 제2 단일 도메인 항체(sdAb)를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR은 제2 항원(예컨대, 제2 종양 항원)에 특이적으로 결합하는 제2 단일 도메인 항체(sdAb); 및 제3 항원(예컨대, 제3 종양 항원)에 특이적으로 결합하는 제3 단일 도메인 항체(sdAb)를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 CAR에 의해 표적화되는 추가적인 항원(들)은 세포 표면 분자이다. 단일 도메인 항체는 특정 질환 상태와 관련된 표적 세포에서 세포 표면 마커로 작용하는 항원을 인식하도록 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원은 종양 항원이다. 종양은 면역 반응, 특히 T 세포 매개성 면역 반응에 대한 표적 항원으로서 작용할 수 있는 많은 단백질을 발현한다. CAR에 의해 표적화되는 항원은 병에 걸린 단일 세포에 대한 항원 또는 질환에 각각 기여하는 상이한 세포에서 발현되는 항원일 수 있다. CAR에 의해 표적화되는 항원은 질환에 직접 또는 간접적으로 관여할 수 있다. 일부 실시형태에서, 종양 항원은 악성 종양과 관련된 하나 이상의 항원성 암 에피토프를 포함한다. 일부 실시형태에서, 종양 항원은 종양-특이적 항원(TSA) 또는 종양-관련 항원(TAA)이다. TSA는 종양 세포에 고유하며, 신체의 다른 세포에서는 발생하지 않는다. TAA 관련 항원은 종양 세포에 고유하지 않으며, 대신 항원에 대한 면역 관용 상태를 유도하지 못하는 조건하에서 정상 세포에서도 발현된다. 종양에 대한 항원의 발현은 면역계가 항원에 반응할 수 있는 조건하에서 발생할 수 있다. TAA는 면역계가 미성숙하여 반응할 수 없는 태아 발달 동안 정상 세포에서 발현되는 항원 또는 정상 세포에서는 극히 낮은 수준으로 정상적으로 존재하지만 종양 세포에서는 훨씬 더 높은 수준으로 발현되는 항원일 수 있다.
본 명세서에 제공된 하나 이상의 항원 결합 도메인(들)에 더하여, 본 명세서에 제공된 CAR은 다음 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다: 링커(예를 들어, 펩타이드 링커), 막관통 도메인, 힌지 영역, 신호 펩타이드, 세포내 신호전달 도메인, 공동 자극성 신호전달 도메인, 이들 각각은 아래에서 보다 상세히 설명된다.
예를 들어, 일부 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 면역 효과기 세포(예컨대, T 세포)의 1차 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 1차 세포내 신호전달 도메인은 CD3ξ로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 공동 자극성 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 공동 자극성 신호전달 도메인은 CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83의 리간드 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 공동 자극성 분자로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 공동 자극성 신호전달 도메인은 CD137로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, GUCY2C CAR은 세포외 항원 결합 도메인의 C-말단과 막관통 도메인의 N-말단 사이에 위치한 힌지 도메인(예컨대, CD8α 힌지 도메인)을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, GUCY2C CAR은 폴리펩타이드의 N-말단에 위치한 신호 펩타이드(예컨대, CD8α 신호 펩타이드)를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는, N-말단에서 C-말단으로, CD8α 신호 펩타이드, 세포외 항원-결합 도메인, CD8α 힌지 도메인, CD8α 막관통 도메인, CD137(4-1BB)로부터 유래된 공동 자극성 신호전달 도메인 및 CD3ξ로부터 유래된 1차 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 특정 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 CAR은, N-말단에서 C-말단으로, 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 CD8 신호 펩타이드, 본 명세서에 제공된 하나 이상의 sdAb(들)를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인, 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 CD8 힌지, 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 CD8 막관통 영역, 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 4-1BB 공동 자극성 신호전달 도메인 및 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 CD3z 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, GUCY2C CAR은 단일특이성이다. 일부 실시형태에서, GUCY2C CAR은 1가이다. 다른 실시형태에서, GUCY2C CAR은 다가이다.
5.3.2. 신호 펩타이드
본 개시내용의 CAR은 폴리펩타이드의 N-말단에 신호 펩타이드(신호 서열로도 알려져 있음)를 포함할 수 있다. 일반적으로, 신호 펩타이드는 폴리펩타이드를 세포의 목적하는 부위로 표적화하는 펩타이드 서열이다. 일부 실시형태에서, 신호 펩타이드는 효과기 분자를 세포의 분비 경로로 표적화하고, 효과기 분자가 지질 이중층으로 통합 및 고정되도록 할 것이다. 본 명세서에 기재된 CAR을 사용하기에 적합한 자연 발생적 단백질 또는 합성 신호 서열, 비자연 발생적 신호 서열을 포함하는 신호 펩타이드는 당업자에게 명백할 것이다. 일부 실시형태에서, 신호 펩타이드는 CD8α, GM-CSF 수용체 α 및 IgG1 중쇄로 이루어진 군으로부터 선택된 분자로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 신호 펩타이드 CD8α로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, CD8α의 신호 펩타이드는 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함한다.
5.3.3. 힌지 영역
본 개시내용의 CAR은 세포외 항원 결합 도메인과 막관통 도메인 사이에 위치하는 힌지 도메인을 포함할 수 있다. 힌지 도메인은 일반적으로 단백질의 두 도메인 사이에서 발견되는 아미노산 분절이며, 단백질의 유연성 및 도메인 중 하나 또는 둘 다의 서로에 대한 이동을 허용할 수 있다. 효과기 분자의 막관통 도메인에 대해 세포외 항원 결합 도메인의 이러한 유연성 및 이동을 제공하는 임의의 아미노산 서열이 사용될 수 있다.
힌지 도메인은 약 10개 내지 100개의 아미노산, 예를 들어, 약 15개 내지 75개의 아미노산, 20개 내지 50개의 아미노산 또는 30개 내지 60개의 아미노산 중 어느 하나를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 힌지 도메인은 적어도 약 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개 또는 75개의 아미노산 길이 중 어느 하나일 수 있다.
일부 실시형태에서, 힌지 도메인은 자연 발생적 단백질의 힌지 도메인이다. 힌지 도메인을 포함하는 것으로 당업계에 공지된 임의의 단백질의 힌지 도메인은 본 명세서에 기재된 키메라 수용체에 사용하기에 적합하다. 일부 실시형태에서, 힌지 도메인은 자연 발생적 단백질의 힌지 도메인의 적어도 일부이며, 키메라 수용체에 대해 유연성을 부여한다. 일부 실시형태에서, 힌지 도메인은 CD8α로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 힌지 도메인은 CD8α의 힌지 도메인의 일부, 예를 들어, CD8α의 힌지 도메인의 적어도 15개(예를 들어, 20개, 25개, 30개, 35개 또는 40개)의 연속 아미노산을 포함하는 단편이다. 일부 실시형태에서, CD8α의 힌지 도메인은 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함한다.
IgG, IgA, IgM, IgE 또는 IgD 항체와 같은 항체의 힌지 도메인이 또한 본 명세서에 기재된 pH-의존적 키메라 수용체 시스템에서 사용하기에 적합하다. 일부 실시형태에서, 힌지 도메인은 항체의 불변 도메인 CH1 및 CH2를 연결하는 힌지 도메인이다. 일부 실시형태에서, 힌지 도메인은 항체의 것이며, 항체의 힌지 도메인 및 항체의 하나 이상의 불변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 도메인은 항체의 힌지 도메인 및 항체의 CH3 불변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 도메인은 항체의 힌지 도메인 및 항체의 CH2 및 CH3 불변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 IgG, IgA, IgM, IgE 또는 IgD 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 IgG 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 항체이다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역은 IgG1 항체의 힌지 영역 및 CH2 및 CH3 불변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 영역은 IgG1 항체의 힌지 영역 및 CH3 불변 영역을 포함한다.
비자연 발생적 펩타이드는 또한 본 명세서에 기재된 키메라 수용체에 대한 힌지 도메인으로서 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, Fc 수용체의 세포외 리간드-결합 도메인의 C-말단과 막관통 도메인의 N-말단 사이의 힌지 도메인은 (GxS)n 링커와 같은 펩타이드 링커이되, 여기서 x 및 n은 독립적으로 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 이상을 포함하는 3 내지 12 사이의 정수일 수 있다.
5.3.4. 막관통 도메인
본 개시내용의 CAR은 세포외 항원 결합 도메인에 직접 또는 간접적으로 융합될 수 있는 막관통 도메인을 포함한다. 막관통 도메인은 천연 또는 합성 공급원으로부터 유래될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "막관통 도메인"은 세포막, 바람직하게는 진핵생물 세포막에서 열역학적으로 안정적인 임의의 단백질 구조를 지칭한다. 본 명세서에 기재된 CAR에 사용하기에 적합한 막관통 도메인은 자연 발생적 단백질로부터 얻을 수 있다. 대안적으로, 이는 합성, 비자연 발생적 단백질 분절, 예를 들어, 세포막에서 열역학적으로 안정적인 소수성 단백질 분절일 수 있다.
막관통 도메인은 막관통 도메인의 3차원 구조에 기초하여 분류된다. 예를 들어, 막관통 도메인은 알파 나선, 하나 초과의 알파 나선의 복합체, 베타-배럴 또는 세포의 인지질 이중층에 걸쳐있을 수 있는 임의의 다른 안정적인 구조를 형성할 수 있다. 또한, 막관통 도메인은 또한 또는 대안적으로 막관통 도메인이 막을 통과하는 통과의 수 및 단백질의 배양을 포함하는 막관통 도메인 토폴로지(topology)에 기초하여 분류될 수 있다. 예를 들어, 단일-통과 막 단백질은 세포막을 한 번 통과하고, 다중-통과 막 단백질은 세포막을 적어도 두 번(예를 들어, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회 이상) 통과한다. 막 단백질은 세포의 내부 및 외부에 대한 이들의 말단 및 막-통과 분절(들)의 토폴로지에 따라 유형 I, 유형 II 또는 유형 III으로 정의될 수 있다. 유형 I 막 단백질은 단일 막-스패닝 영역을 가지며, 단백질의 N-말단이 세포의 지질 이중층의 세포외 쪽에 존재하고 단백질의 C-말단이 세포질 쪽에 존재하도록 배향된다. 유형 II 막 단백질도 단일 막-스패닝 영역을 갖지만, 단백질의 C-말단이 세포의 지질 이중층의 세포외 쪽에 존재하고 단백질의 N-말단이 세포질 쪽에 존재하도록 배향된다. 유형 III 막 단백질은 다중 막-스패닝 분절을 가지며, 막관통 분절의 수 및 N-말단 및 C-말단의 위치에 기초하여 추가로 하위 분류될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 CAR의 막관통 도메인은 유형 I 단일-통과 막 단백질로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 다중-통과 막 단백질로부터의 막관통 도메인은 또한 본 명세서에 기재된 CAR에 사용하기에 적합하다. 다중-통과 막 단백질은 복잡한 (적어도 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 이상의) 알파 나선 또는 베타 시트 구조를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 다중-통과 막 단백질의 N-말단 및 C-말단은 지질 이중층의 반대쪽에 존재하며, 예를 들어, 단백질의 N-말단은 지질 이중층의 세포질 쪽에 존재하고, 단백질의 C-말단은 세포외 쪽에 존재한다.
일부 실시형태에서, CAR의 막관통 도메인은 T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 사슬, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1(CD1 la, CD18), ICOS(CD278), 4-1BB(CD137), GITR, CD40, BAFFR, HVEM(LIGHTR), SLAMF7, NKp80(KLRFl), CD160, CD19, IL-2R 베타, IL-2R 감마, IL-7R a, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD1 ld, ITGAE, CD103, ITGAL, CD1 la, LFA-1, ITGAM, CD1 lb, ITGAX, CD1 lc, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAM1(CD226), SLAMF4(CD244, 2B4), CD84, CD96(Tactile), CEACAM1, CRT AM, Ly9(CD229), CD160(BY55), PSGL1, CDIOO(SEMA4D), SLAMF6(NTB-A, Lyl08), SLAM(SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME(SLAMF8), SELPLG(CD162), LTBR, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D 및/또는 NKG2C의 막관통 도메인으로부터 선택된 막관통 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 막관통 도메인은 CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 및 PD1로 이루어진 군으로부터 선택된 분자로부터 유래된다.
일부 특정 실시형태에서, 막관통 도메인은 CD8α로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 막관통 도메인은 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 CD8α의 막관통 도메인이다.
본 명세서에 기재된 CAR에 사용하기 위한 막관통 도메인은 또한 합성, 비자연 발생적 단백질 분절의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 막관통 도메인은 합성, 비자연 발생적 알파 나선 또는 베타 시트이다. 일부 실시형태에서, 단백질 분절은 적어도 대략 20개의 아미노산, 예를 들어, 적어도 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개 이상의 아미노산이다. 합성 막관통 도메인의 예는 당업계, 예를 들어, 관련 개시내용이 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있는 미국 특허 제7,052,906호 및 PCT 공개 제WO 2000/032776호에 공지되어 있다.
본 명세서에 제공된 막관통 도메인은 막관통 영역 및 막관통 도메인의 C-말단 쪽에 위치한 세포질 영역을 포함할 수 있다. 막관통 도메인의 세포질 영역은 3개 이상의 아미노산을 포함할 수 있고, 일부 실시형태에서, 지질 이중층에서 막관통 도메인의 배향을 돕는다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 시스테인 잔기는 막관통 도메인의 막관통 영역에 존재한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 시스테인 잔기는 막관통 도메인의 세포질 영역에 존재한다. 일부 실시형태에서, 막관통 도메인의 세포질 영역은 양으로 하전된 아미노산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 막관통 도메인의 세포질 영역은 아미노산 아르기닌, 세린 및 라이신을 포함한다.
일부 실시형태에서, 막관통 도메인의 막관통 영역은 소수성 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 CAR의 막관통 도메인은 인공 소수성 서열을 포함한다. 예를 들어, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 삼중체(triplet)는 막관통 도메인의 C 말단에 존재할 수 있다. 일부 실시형태에서, 막관통 영역은 알라닌, 류신, 아이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판 또는 발린과 같은 대부분 소수성 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 실시형태에서, 막관통 영역은 소수성이다. 일부 실시형태에서, 막관통 영역은 폴리-류신-알라닌 서열을 포함한다. 단백질 또는 단백질 분절의 소수성(hydropathy 또는 hydrophobic) 또는 친수성 특성은 임의의 당업계에 공지된 방법, 예를 들어, Kyte 및 Doolittle 소수성 분석에 의해 평가될 수 있다.
5.3.5. 세포내 신호전달 도메인
본 개시내용의 CAR은 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 세포내 신호전달 도메인은 CAR을 발현하는 면역 효과기 세포의 정상적인 효과기 기능 중 적어도 하나의 활성화를 담당한다. 용어 "효과기 기능"은 세포의 특화된 기능을 지칭한다. T 세포의 효과기 기능은, 예를 들어, 사이토카인의 분비를 포함하는 세포용해 활성 또는 헬퍼 활성일 수 있다. 따라서, 용어 "세포질 신호전달 도메인"은 효과기 기능 신호를 전달하고 세포가 특화된 기능을 수행하도록 지시하는 단백질의 부분을 지칭한다. 일반적으로 전체 세포질 신호전달 도메인이 사용될 수 있지만, 많은 경우에 전체 사슬을 사용할 필요는 없다. 세포질 신호전달 도메인의 절단된 부분이 사용되는 한, 이러한 절단된 부분은 효과기 기능 신호를 전달하는 한 온전한 사슬 대신에 사용될 수 있다. 따라서, 용어 세포질 신호전달 도메인은 효과기 기능 신호를 전달하기에 충분한 세포질 신호전달 도메인의 임의의 절단된 부분을 포함하는 것을 의미한다.
일부 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 면역 효과기 세포의 1차 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR은 면역 효과기 세포의 1차 세포내 신호전달 도메인으로 본질적으로 이루어진 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. "1차 세포내 신호전달 도메인"은 자극성 방식으로 작용하여 면역 효과기 기능을 유도하는 세포질 신호전달 서열을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 1차 세포내 신호전달 도메인은 면역수용체 타이로신-기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로 알려진 신호전달 모티프를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 "ITAM(immunoreceptor tyrosine-based activation motif)"은 많은 면역 세포에서 발현되는 신호전달 분자의 꼬리 부분에 일반적으로 존재하는 보존된 단백질 모티프이다. 모티프는 6개 내지 8개의 아미노산에 의해 분리된 아미노산 서열 YxxL/I의 2개의 반복을 포함할 수 있되, 각 x는 보존된 모티프 YxxL/Ix(6-8)YxxL/I를 생성하는 독립적으로 임의의 아미노산이다. 신호전달 분자 내의 ITAM은 세포 내의 신호 전달에 중요하며, 이는 신호전달 분자의 활성화 후 ITAM에서 타이로신 잔기의 인산화에 의해 적어도 부분적으로 매개된다. ITAM은 신호전달 경로와 관련된 다른 단백질의 도킹 부위(docking site)로 기능할 수 있다. 예시적인 ITAM-함유 1차 세포질 신호전달 서열은 CD3ξ, FcR 감마(FCER1G), FcR 베타(Fc 엡실론 Rib), CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d로부터 유래되는 것들을 포함한다.
일부 실시형태에서, 1차 세포내 신호전달 도메인은 CD3ξ로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3ξ의 세포질 신호전달 도메인으로 구성된다. 일부 실시형태에서, 1차 세포내 신호전달 도메인은 야생형 CD3ξ의 세포질 신호전달 도메인이다. 일부 실시형태에서, CD3ξ의 1차 세포내 신호전달 도메인은 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 1차 세포내 신호전달 도메인은 야생형 CD3ξ의 것이다. 일부 실시형태에서, 1차 세포내 신호전달 도메인은 Q65K와 같은 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 CD3ξ의 세포질 신호전달 도메인의 기능적 돌연변이체이다.
5.3.6. 공동 자극성 신호전달 도메인
많은 면역 효과기 세포는 세포 증식, 분화 및 생존을 촉진할 뿐만 아니라 세포의 효과기 기능을 활성화하기 위해 항원-특이적 신호의 자극에 더하여 공동 자극을 필요로 한다. 일부 실시형태에서, CAR은 적어도 하나의 공동 자극성 신호전달 도메인을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "공동 자극성 신호전달 도메인"은 효과기 기능과 같은 면역 반응을 유도하기 위해 세포 내에서 신호 전달을 매개하는 단백질의 적어도 일부를 지칭한다. 본 명세서에 기재된 키메라 수용체의 공동 자극성 신호전달 도메인은 신호를 전달하고 T 세포, NK 세포, 대식세포, 호중구 또는 호산구와 같은 면역 세포에 의해 매개되는 반응을 조절하는 공동 자극성 단백질로부터의 세포질 신호전달 도메인일 수 있다. "공동 자극성 신호전달 도메인"은 공동 자극성 분자의 세포질 부분일 수 있다. 용어 "공동 자극성 분자"는 공동 자극성 리간드와 특이적으로 결합함으로써 증식 및 생존과 같으나 이에 제한되지 않는 면역 세포에 의한 공동 자극성 반응을 매개하는 면역 세포(예컨대, T 세포) 상의 동족 결합 파트너를 지칭한다.
일부 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 단일 공동 자극성 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 2개 이상(예컨대, 약 2개, 3개, 4개 이상 중 하나)의 공동 자극성 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 2개 이상의 동일한 공동 자극성 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 본 명세서에 기재된 임의의 2개 이상의 공동 자극성 단백질과 같은 상이한 공동 자극성 단백질로부터의 2개 이상의 공동 자극성 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 1차 세포내 신호전달 도메인(예컨대, CD3ξ의 세포질 신호전달 도메인) 및 하나 이상의 공동 자극성 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 공동 자극성 신호전달 도메인 및 1차 세포내 신호전달 도메인(예컨대, CD3ξ의 세포질 신호전달 도메인)은 선택적 펩타이드 링커를 통해 서로 융합된다. 1차 세포내 신호전달 도메인 및 하나 이상의 공동 자극성 신호전달 도메인은 임의의 적합한 순서로 배열될 수 있다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 공동 자극성 신호전달 도메인은 막관통 도메인과 1차 세포내 신호전달 도메인(예컨대, CD3ξ의 세포질 신호전달 도메인) 사이에 위치한다. 다중 공동 자극성 신호전달 도메인은 상가적 또는 상승적 자극 효과를 제공할 수 있다.
숙주 세포(예를 들어, 면역 세포)에서 공동 자극성 신호전달 도메인의 활성화는 세포가 사이토카인의 생산 및 분비, 식세포 특성, 증식, 분화, 생존 및/또는 세포독성을 증가시키거나 또는 감소시키도록 유도할 수 있다. 임의의 공동 자극성 분자의 공동 자극성 신호전달 도메인은 본 명세서에 기재된 CAR에 사용하기에 적합할 수 있다. 공동 자극성 신호전달 도메인의 유형(들)은 효과기 분자가 발현될 면역 효과기 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포, 대식세포, 호중구 또는 호산구)의 유형 및 목적하는 면역 효과기 기능(예를 들어, ADCC 효과)과 같은 인자에 기초하여 선택된다. CAR에 사용하기 위한 공동 자극성 신호전달 도메인의 예는 제한 없이 B7/CD28 패밀리의 구성원(예를 들어, B7-1/CD80, B7-2/CD86, B7-H1/PD-L1, B7-H2, B7-H3, B7-H4, B7-H6, B7-H7, BTLA/CD272, CD28, CTLA-4, Gi24/VISTA/B7-H5, ICOS/CD278, PD- 1, PD-L2/B7-DC 및 PDCD6); TNF 슈퍼패밀리의 구성원(예를 들어, 4- 1BB/TNFSF9/CD137, 4-1BB 리간드/TNFSF9, BAFF/BLyS/TNFSF13B, BAFF R/TNFRSF13C, CD27/TNFRSF7, CD27 리간드/TNFSF7, CD30/TNFRSF8, CD30 리간드/TNFSF8, CD40/TNFRSF5, CD40/TNFSF5, CD40 리간드/TNFSF5, DR3/TNFRSF25, GITR/TNFRSF18, GITR 리간드/TNFSF18, HVEM/TNFRSF14, LIGHT/TNFSF14, 림포톡신-알파/TNF-베타, OX40/TNFRSF4, OX40 리간드/TNFSF4, RELT/TNFRSF19L, TACI/TNFRSF13B, TL1A/TNFSF15, TNF-알파 및 TNF RII/TNFRSF1B); SLAM 패밀리의 구성원(예를 들어, 2B4/CD244/SLAMF4, BLAME/SLAMF8, CD2, CD2F-10/SLAMF9, CD48/SLAMF2, CD58/LFA-3, CD84/SLAMF5, CD229/SLAMF3, CRACC/SLAMF7, NTB-A/SLAMF6 및 SLAM/CD150); 및 임의의 기타 공동 자극성 분자, 예컨대, CD2, CD7, CD53, CD82/Kai-1, CD90/Thy1, CD96, CD160, GUCY2C0, CD300a/LMIR1, HLA 클래스 I, HLA- DR, 이카로스, 인테그린 알파 4/CD49d, 인테그린 알파 4 베타 1, 인테그린 알파 4 베타 7/LPAM-1, LAG-3, TCL1A, TCL1B, CRTAM, DAP12, Dectin-1/CLEC7A, DPPIV/CD26, EphB6, TIM-1/KIM-1/HAVCR, TIM-4, TSLP, TSLP R, 림프구 기능 관련 항원-1(LFA-1) 및 NKG2C를 포함하는 공동 자극성 단백질의 세포질 신호전달 도메인일 수 있다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 공동 자극성 신호전달 도메인은 CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, 림프구 기능-관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 및 CD83에 특이적으로 결합하는 리간드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 CAR에서 세포내 신호전달 도메인은 CD137로부터 유래된 공동 자극성 신호전달 도메인(즉, 4-1BB)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3ξ의 세포질 신호전달 도메인 및 CD137의 공동 자극성 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 CD137의 공동 자극성 신호전달 도메인을 포함한다.
또한, 공동 자극성 신호전달 도메인이 면역 세포의 면역 반응을 조절할 수 있도록 하는 본 명세서에 기재된 임의의 공동 자극성 신호전달 도메인의 변이체가 본 개시내용의 범위 내에 있다. 일부 실시형태에서, 공동 자극성 신호전달 도메인은 야생형 대응물과 비교하여 최대 10개(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 8개)의 아미노산 잔기 변이를 포함한다. 하나 이상의 아미노산 변이를 포함하는 이러한 공동 자극성 신호전달 도메인은 변이체로 지칭될 수 있다. 공동 자극성 신호전달 도메인의 아미노산 잔기의 돌연변이는 돌연변이를 포함하지 않는 공동 자극성 신호전달 도메인에 비해 신호전달 전달 및 면역 반응의 향상된 자극을 초래할 수 있다. 공동 자극성 신호전달 도메인의 아미노산 잔기의 돌연변이는 돌연변이를 포함하지 않는 공동 자극성 신호전달 도메인에 비해 신호전달 전달 및 면역 반응의 감소된 자극을 초래할 수 있다.
5.3.7. 펩타이드 링커
본 명세서에 기재된 다중특이성 또는 다가 CAR의 다양한 단일 도메인 항체는 펩타이드 링커를 통해 서로 융합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 임의의 펩타이드 링커 없이 서로 직접 융합된다. 상이한 단일 도메인 항체(예를 들어, VHH)를 연결하는 펩타이드 링커는 동일하거나 또는 상이할 수 있다. CAR의 상이한 도메인도 펩타이드 링커를 통해 서로 융합될 수 있다.
CAR의 각각의 펩타이드 링커는 단일 도메인 항체 및/또는 다양한 도메인의 구조적 및/또는 기능적 특징에 따라 동일하거나 또는 상이한 길이 및/또는 서열을 가질 수 있다. 각각의 펩타이드 링커는 독립적으로 선택되고 최적화될 수 있다. CAR에 사용된 펩타이드 링커(들)의 길이, 유연성의 정도 및/또는 기타 특성은 하나 이상의 특정 항원 또는 에피토프에 대한 친화성, 특이성 또는 결합력을 포함하지만 이에 제한되지 않는 특성에 일부 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 더 긴 펩타이드 링커는 2개의 인접한 도메인이 서로 입체적으로 간섭하지 않도록 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 짧은 펩타이드 링커는 막관통 도메인과 및 CAR의 세포내 신호전달 도메인 사이에 배치될 수 있다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 링커는 인접한 도메인이 서로에 대해 자유롭게 이동할 수 있도록 가요성 잔기(예컨대, 글리신 및 세린)를 포함한다. 예를 들어, 글리신-세린 이중체(doublet)는 적합한 펩타이드 링커일 수 있다.
펩타이드 링커는 임의의 적합한 길이일 수 있다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 링커는 적어도 약 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 50개, 75개, 100개 이상의 아미노산 길이 중 하나이다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 링커는 약 100개, 75개, 50개, 40개, 35개, 30개, 25개, 20개, 19개, 18개, 17개, 16개, 15개, 14개, 13개, 12개, 11개, 10개, 9개, 8개, 7개, 6개, 5개 이하의 아미노산 길이 중 하나이다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 링커의 길이는 약 1개의 아미노산 내지 약 10개의 아미노산, 약 1개의 아미노산 내지 약 20개의 아미노산, 약 1개의 아미노산 내지 약 30개의 아미노산, 약 5개의 아미노산 내지 약 15개의 아미노산, 약 10개의 아미노산 내지 약 25개의 아미노산, 약 5개의 아미노산 내지 약 30개의 아미노산, 약 10개의 아미노산 내지 약 30개의 아미노산 길이, 약 30개의 아미노산 내지 약 50개의 아미노산, 약 50개의 아미노산 내지 약 100개의 아미노산 또는 약 1개의 아미노산 내지 약 100개의 아미노산 중 어느 하나이다.
펩타이드 링커는 자연 발생적 서열 또는 비자연 발생적 서열을 가질 수 있다. 예를 들어, 중쇄 단독 항체의 힌지 영역으로부터 유래된 서열은 링커로 사용될 수 있다. 예를 들어, WO1996/34103을 참조한다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 링커는 가요성 링커이다. 예시적인 가요성 링커는 글리신 중합체, 글리신-세린 중합체, 글리신-알라닌 중합체, 알라닌-세린 중합체 및 당업계에 공지된 기타 가요성 링커를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
예를 들어, 각 개시내용이 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있는 WO2016014789, WO2015158671, WO2016102965, US20150299317, WO2018067992, US7741465, 문헌[Colcher et al., J. Nat. Cancer Inst. 82:1191-1197 (1990) 및 Bird et al., Science 242:423-426 (1988)]에 기술되어 있는 바와 같은 당업계에 공지된 다른 링커도 본 명세서에 제공된 CAR에 포함될 수 있다.
5.3.8. 예시적인 CAR
C8-CAR, C12-CAR, C13-CAR, C15-CAR, C21-CAR, C27-CAR, C30-CAR 및 C31-CAR과 같은 예시적인 1가 CAR은 아래 부문 6에 나타낸 바와 같이 생성된다.
일부 실시형태에서, 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진 CAR이 본 명세서에 제공된다.
일부 실시형태에서, 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진 CAR이 본 명세서에 제공된다.
일부 실시형태에서, 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진 CAR이 본 명세서에 제공된다.
일부 실시형태에서, 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진 CAR이 본 명세서에 제공된다.
일부 실시형태에서, 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진 CAR이 본 명세서에 제공된다.
일부 실시형태에서, 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진 CAR이 본 명세서에 제공된다.
일부 실시형태에서, 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진 CAR이 본 명세서에 제공된다.
일부 실시형태에서, 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진 CAR이 본 명세서에 제공된다.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 CAR은 아래 부문 6에 예시된 CAR 중 어느 하나에 대해 소정의 동일성 퍼센트를 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 서열번호 48의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 GUCY2C CAR이 본 명세서에 제공된다.
일부 실시형태에서, 서열번호 49의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 GUCY2C CAR이 본 명세서에 제공된다.
일부 실시형태에서, 서열번호 50의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 GUCY2C CAR이 본 명세서에 제공된다.
일부 실시형태에서, 서열번호 51의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 GUCY2C CAR이 본 명세서에 제공된다.
일부 실시형태에서, 서열번호 52의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 GUCY2C CAR이 본 명세서에 제공된다.
일부 실시형태에서, 서열번호 53의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 GUCY2C CAR이 본 명세서에 제공된다.
일부 실시형태에서, 서열번호 54의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 GUCY2C CAR이 본 명세서에 제공된다.
일부 실시형태에서, 서열번호 55의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 GUCY2C CAR이 본 명세서에 제공된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 임의의 GUCY2C CAR을 암호화하는 단리된 핵산이 본 명세서에 제공된다. 핵산 서열 및 벡터에 관한 보다 상세한 설명이 아래에 제공된다.
5.4. 조작된 면역 효과기 세포
또 다른 양태에서, 본 명세서에 기재된 CAR 중 어느 하나를 포함하는 숙주 세포(예컨대, 면역 효과기 세포)가 본 명세서에 제공된다.
따라서, 일부 실시형태에서, (a) 하나 이상의 항-GUCY2C sdAb(들)를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 CAR을 포함하는 조작된 면역 효과기 세포(예컨대, T 세포)가 본 명세서에 제공되되, 항-GUCY2C sdAb는, 예를 들어, 표 7의 VHH 도메인 및 표 7의 VHH 도메인 중 임의의 것에서 1개, 2개 또는 3개의 CDR을 모두 갖는 것들을 포함하는 위의 부문 5.2에 기재된 것과 같은 항-GUCY2C sdAb이다. 구체적으로, 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 조작된 면역 효과기 세포의 CAR에서 항-GUCY2C sdAb는 (i) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (ii) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (iii) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (iv) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (v) 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (vi) 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (vii) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 (viii) 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-GUCY2C sdAb는 낙타, 키메라, 인간 또는 인간화된 것이다. 일부 실시형태에서, 막관통 도메인은 CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 및 PD1로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 면역 효과기 세포(예컨대, T 세포)의 1차 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 1차 세포내 신호전달 도메인은 CD3ξ로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 공동 자극성 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 공동 자극성 신호전달 도메인은 CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83의 리간드 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 공동 자극성 분자로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, CAR은 세포외 항원 결합 도메인의 C-말단과 막관통 도메인의 N-말단 사이에 위치한 힌지 도메인(예컨대, CD8α 힌지 도메인)을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR은 폴리펩타이드의 N-말단에 위치한 신호 펩타이드(예컨대, CD8α 신호 펩타이드)를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는, N-말단에서 C-말단으로, CD8α 신호 펩타이드, 세포외 항원 결합 도메인, CD8α 힌지 도메인, CD8α 막관통 도메인, CD137로부터 유래된 공동 자극성 신호전달 도메인 및 CD3ξ로부터 유래된 1차 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, (a) 하나 이상의 항-GUCY2C sdAb(들)를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 CAR을 포함하는 조작된 면역 효과기 세포(예컨대, T 세포)가 본 명세서에 제공되되, 항-GUCY2C sdAb는 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 또는 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, (a) 하나 이상의 항-GUCY2C sdAb(들)를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 CAR을 포함하는 조작된 면역 효과기 세포(예컨대, T 세포)가 본 명세서에 제공되되, 항-GUCY2C sdAb는 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 또는 서열번호 10의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 막관통 도메인은 CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 및 PD1로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 면역 효과기 세포(예컨대, T 세포)의 1차 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 1차 세포내 신호전달 도메인은 CD3ξ로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 공동 자극성 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 공동 자극성 신호전달 도메인은 CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83의 리간드 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 공동 자극성 분자로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, CAR은 세포외 항원 결합 도메인의 C-말단과 막관통 도메인의 N-말단 사이에 위치한 힌지 도메인(예컨대, CD8α 힌지 도메인)을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR은 폴리펩타이드의 N-말단에 위치한 신호 펩타이드(예컨대, CD8α 신호 펩타이드)를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는, N-말단에서 C-말단으로, CD8α 신호 펩타이드, 세포외 항원 결합 도메인, CD8α 힌지 도메인, CD8α 막관통 도메인, CD137로부터 유래된 공동 자극성 신호전달 도메인 및 CD3ξ로부터 유래된 1차 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51, 서열번호 52, 서열번호 53, 서열번호 54 및 서열번호 55로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CAR을 포함하는 조작된 면역 효과기 세포(예컨대, T 세포)가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51, 서열번호 52, 서열번호 53, 서열번호 54 및 서열번호 55로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 CAR을 포함하는 조작된 면역 효과기 세포(예컨대, T 세포)가 본 명세서에 제공된다.
다른 실시형태에서, (a) GUCY2C에 특이적으로 결합하는 제1 단일 도메인 항체(sdAb) 및 하나 이상의 추가적인 항원 결합 도메인(들)을 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 다중특이성(예컨대, 이중특이성 또는 삼중특이성) 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 조작된 면역 효과기 세포(예컨대, T 세포)가 제공된다. 일부 실시형태에서, 제1 sdAb 및/또는 추가적인 sdAb는 낙타, 키메라, 인간 또는 인간화된 것이다. 일부 실시형태에서, 제1 단일 도메인 항체 및 추가적인 단일 도메인 항체는 펩타이드 결합 또는 펩타이드 링커를 통해 서로 융합된다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 링커는 약 50개 이하(예컨대, 약 35개, 25개, 20개, 15개, 10개 또는 5개 중 하나 이하)의 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 막관통 도메인은 CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 및 PD1로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 면역 효과기 세포(예컨대, T 세포)의 1차 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 1차 세포내 신호전달 도메인은 CD3ξ로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 공동 자극성 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 공동 자극성 신호전달 도메인은 CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83의 리간드 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 공동 자극성 분자로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 다중특이성 CAR은 세포외 항원 결합 도메인의 C-말단과 막관통 도메인의 N-말단 사이에 위치한 힌지 도메인(예컨대, CD8α 힌지 도메인)을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 다중특이성 CAR은 폴리펩타이드의 N-말단에 위치한 신호 펩타이드(예컨대, CD8α 신호 펩타이드)를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는, N-말단에서 C-말단으로, CD8α 신호 펩타이드, 세포외 항원 결합 도메인, CD8α 힌지 도메인, CD8α 막관통 도메인, CD137로부터 유래된 공동 자극성 신호전달 도메인 및 CD3ξ로부터 유래된 1차 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 조작된 면역 효과기 세포는 T 세포, NK 세포, 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC), 조혈 줄기 세포, 다능성 줄기 세포 또는 배아 줄기 세포이다. 일부 실시형태에서, 조작된 면역 효과기 세포는 자가 세포이다. 일부 실시형태에서, 조작된 면역 효과기 세포는 동종 세포이다.
또한, 2개 이상의 상이한 CAR을 포함(또는 발현하는) 조작된 면역 효과기 세포가 제공된다. 본 명세서에 기재된 임의의 2개 이상의 CAR은 조합하여 발현될 수 있다. CAR은 표적 상이한 항원을 표적으로 할 수 있으므로, 상승적 또는 상가적 효과를 제공할 수 있다. 2개 이상의 CAR이 동일한 벡터 또는 상이한 벡터 상에 암호화될 수 있다.
조작된 면역 효과기 세포는 하나 이상의 치료 단백질 및/또는 면역 관문 저해제와 같은 면역조절제를 추가로 발현할 수 있다. 예를 들어, 전체가 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있는 국제 특허 제PCT/CN2016/073489 및 PCT/CN2016/087855호를 참조한다.
5.4.1. 벡터
본 개시내용은 본 명세서에 기재된 CAR 중 어느 하나를 클로닝하고 발현시키기 위한 벡터를 제공한다. 일부 실시형태에서, 벡터는 포유동물 세포와 같은 진핵생물 세포에서의 복제 및 통합에 적합하다. 일부 실시형태에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 바이러스 벡터의 예는 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 백시니아 벡터, 단순 헤르페스 바이러스 벡터 및 이들의 유도체를 포함하지만 이에 제한되지 않는. 바이러스 벡터 기술은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 문헌[Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)] 및 다른 바이러스학 및 분자 생물학 매뉴얼에 기술되어 있다.
포유동물 세포로의 유전자 전달을 위해 다수의 바이러스 기반 시스템이 개발되었다. 예를 들어, 레트로바이러스는 유전자 전달 시스템을 위한 편리한 플랫폼을 제공한다. 이종 핵산은 벡터에 삽입되고, 당업계에 공지된 기법을 사용하여 레트로바이러스 입자에 패키징될 수 있다. 그런 다음, 재조합 바이러스는 단리되고, 시험관내 또는 생체외에서 조작된 포유동물 세포로 전달될 수 있다. 다수의 레트로바이러스 시스템이 당업계에 공지되어 있다. 일부 실시형태에서, 아데노바이러스 벡터가 사용된다. 다수의 아데노바이러스 벡터가 당업계에 공지되어 있다. 일부 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터가 사용된다. 일부 실시형태에서, 자가-불활성화 렌티바이러스 벡터가 사용된다. 예를 들어, 면역조절제(예컨대, 면역 관문 저해제) 코딩 서열을 운반하는 자가-불활성화 렌티바이러스 벡터 및/또는 키메라 항원 수용체를 운반하는 자가-불활성화 렌티바이러스 벡터는 당업계에 공지된 프로토콜로 패키징될 수 있다. 생성된 렌티바이러스 벡터는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 포유동물 세포(예컨대, 1차 인간 T 세포)를 전달하기 위해 사용될 수 있다. 렌티바이러스와 같은 레트로바이러스로부터 유래된 벡터는 이식유전자의 장기적이고 안정적인 통합 및 자손 세포에서의 이의 전파를 가능하게 하기 때문에 장기 유전자 전달을 달성하는 데 적합한 도구이다. 렌티바이러스 벡터는 또한 낮은 면역원성을 가지며, 비증식 세포를 형질도입시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 벡터는 본 명세서에 기재된 CAR을 암호화하는 핵산 중 어느 하나를 포함한다. 핵산은, 예를 들어, 제한 엔도뉴클레이스 부위 및 하나 이상의 선별 마커를 사용하는 것을 포함하는 당업계에 공지된 임의의 분자 클로닝 방법을 사용하여 벡터에 클로닝될 수 있다. 일부 실시형태에서, 핵산은 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 포유동물 세포에서의 유전자의 발현을 위해 다양한 프로모터가 연구되었고, 당업계에 공지된 임의의 프로모터가 본 개시내용에 사용될 수 있다. 프로모터는 대략 구성적 프로모터 또는 유도성 프로모터와 같은 조절형 프로모터로 분류될 수 있다.
일부 실시형태에서, CAR을 암호화하는 핵산은 구성적 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 구성적 프로모터는 이종 유전자(이식유전자로도 지칭됨)가 숙주 세포에서 구성적으로 발현되도록 한다. 본 명세서에서 상정되는 예시적인 구성적 프로모터는 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 인간 신장 인자-1 알파(hEF1α), 유비퀴틴 C 프로모터(UbiC), 포스포글리세로카이네이스 프로모터(PGK), 유인원 바이러스 40 초기 프로모터(SV40) 및 CMV 초기 인핸서와 결합된 닭 β-액틴 프로모터(CAGG)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이식유전자 발현의 유도에 대한 이러한 구성적 프로모터의 효율성은 수많은 연구에서 광범위하게 비교되었다. 예를 들어, Michael C. Milone 등은 1차 인간 T 세포에서 키메라 항원 수용체 발현을 유도하기 위한 CMV, hEF1α, UbiC 및 PGK의 효율성을 비교하였으며, hEF1α 프로모터가 최고 수준의 이식유전자 발현을 유도할 뿐만 아니라 CD4 및 CD8 인간 T 세포에서 최적으로 유지된다는 결론을 내렸다(Molecular Therapy, 17(8): 1453-1464 (2009)). 일부 실시형태에서, CAR을 암호화하는 핵산은 hEF1α 프로모터에 작동 가능하게 연결된다.
일부 실시형태에서, CAR을 암호화하는 핵산은 유도성 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 유도성 프로모터는 조절형 프로모터의 범주에 속한다. 유도성 프로모터는 물리적 조건, 조작된 면역 효과기 세포의 미세환경 또는 조작된 면역 효과기 세포의 생리학적 상태, 유도인자(즉, 유도제) 또는 이들의 조합과 같은 하나 이상의 조건에 의해 유도될 수 있다.
일부 실시형태에서, 유도 조건은 조작된 포유동물 세포 및/또는 약제학적 조성물을 투여받는 대상체에서 내인성 유전자의 발현을 유도하지 않는다. 일부 실시형태에서, 유도 조건은 유도인자, 조사(예컨대, 전리 방사선, 빛), 온도(예컨대, 열), 산화환원 상태, 종양 환경 및 조작된 포유동물 세포의 활성화 상태로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 벡터는 또한 렌티바이러스 벡터를 통해 형질감염된 숙주 세포의 집단으로부터 CAR을 발현하는 세포를 선택하기 위한 선별 마커 유전자 또는 리포터 유전자를 포함한다. 선별 마커 및 리포터 유전자는 모두 숙주 세포에서의 발현을 가능하게 하는 적절한 조절 서열 옆에 있을 수 있다. 예를 들어, 벡터는 핵산 서열의 발현 조절에 유용한 전사 및 번역 종결자, 개시 서열 및 프로모터를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 벡터는 하나 초과의 CAR을 암호화하는 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 벡터는 제1 CAR을 암호화하는 제1 핵산 서열 및 제2 CAR을 암호화하는 제2 핵산 서열을 포함하는 핵산을 포함하되, 제1 핵산은 자가-절단 펩타이드를 암호화하는 제3 핵산 서열을 통해 제2 핵산에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시형태에서, 자가-절단 펩타이드는 T2A, P2A 및 F2A로 이루어진 군으로부터 선택된다.
5.4.2. 면역 효과기 세포
"면역 효과기 세포"는 면역 효과기 기능을 수행할 수 있는 면역 세포이다. 일부 실시형태에서, 면역 효과기 세포는 적어도 FcγRIII을 발현하고, ADCC 효과기 기능을 수행한다. ADCC를 매개하는 면역 효과기 세포의 예는 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC), 자연 살해(NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포, 호중구 및 호산구를 포함한다.
일부 실시형태에서, 면역 효과기 세포는 T 세포이다. 일부 실시형태에서, T 세포는 CD4+/CD8-, CD4-/CD8+, CD4+/CD8+, CD4-/CD8- 또는 이들의 조합이다. 일부 실시형태에서, T 세포는 CAR을 발현하고 GUCY2C+ 종양 세포와 같은 표적 세포에 결합할 때 IL-2, TFN 및/또는 TNF를 생산한다. 일부 실시형태에서, CD8+ T 세포는 CAR을 발현하고 표적 세포에 결합할 때 항원-특이적 표적 세포를 용해시킨다.
일부 실시형태에서, 면역 효과기 세포는 NK 세포이다. 다른 실시형태에서, 면역 효과기 세포는 확립된 세포주, 예를 들어, NK-92 세포일 수 있다.
일부 실시형태에서, 면역 효과기 세포는 조혈 줄기 세포, 다능성 줄기 세포, iPS 또는 배아 줄기 세포와 같은 줄기 세포로부터 분화된다.
조작된 면역 효과기 세포는 CAR을 T 세포와 같은 면역 효과기 세포에 도입함으로써 제조된다. 일부 실시형태에서, CAR은 단리된 핵산 중 어느 하나 또는 위에 기재된 벡터 중 어느 하나를 형질감염시킴으로써 면역 효과기 세포에 도입된다. 일부 실시형태에서, CAR은 CELL SQUEEZE®와 같은 미세유체 시스템을 통해 세포를 통과시키면서 단백질을 세포막에 삽입함으로써 면역 효과기 세포에 도입된다(예를 들어, 미국 공개 제20140287509호 참조).
벡터 또는 단리된 핵산을 포유동물 세포에 도입시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 기재된 벡터는 물리적, 화학적 또는 생물학적 방법에 의해 면역 효과기 세포에 전달될 수 있다.
벡터를 면역 효과기 세포에 도입시키기 위한 물리적 방법은 칼슘 포스페이트 침전, 리포펙션, 입자 충격, 미세주사, 전기천공법 등을 포함한다. 벡터 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 세포를 생산하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York]을 참조한다. 일부 실시형태에서, 벡터는 전기천공법에 의해 세포에 도입된다.
벡터를 면역 효과기 세포에 도입시키기 위한 생물학적 방법은 DNA 및 RNA 벡터의 사용을 포함한다. 바이러스 벡터는 유전자를 포유동물, 예를 들어, 인간 세포에 삽입하기 위해 가장 널리 사용되는 방법이 되었다.
벡터를 면역 효과기 세포에 도입시키기 위한 화학적 수단은 거대분자 복합체, 나노캡슐, 마이크로스피어, 비드 및 수중유 에멀션을 포함하는 지질-기반 시스템, 마이셀, 혼합된 마이셀 및 리포솜과 같은 콜로이드성 분산 시스템을 포함한다. 시험관내에서 전달 비히클로 사용하기 위한 예시적인 콜로이드성 시스템은 리포솜(예를 들어, 인공 막 소포)이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 임의의 CAR을 암호화하는 RNA 분자는 종래의 방법(예를 들어, 시험관내 전사)에 의해 제조된 다음, mRNA 전기천공법과 같은 공지된 방법을 통해 면역 효과기 세포에 도입될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Rabinovich et al., Human Gene Therapy 17:1027-1035 (2006)]을 참조한다.
일부 실시형태에서, 형질도입되거나 또는 형질감염된 면역 효과기 세포는 벡터 또는 단리된 핵산의 도입 후 생체외에서 증식된다. 일부 실시형태에서, 형질도입되거나 또는 형질감염된 면역 효과기 세포는 적어도 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 10일, 12일 또는 14일 중 임의의 기간 동안 증식되도록 배양된다. 일부 실시형태에서, 형질도입되거나 또는 형질감염된 면역 효과기 세포는 조작된 포유동물 세포를 선택하기 위해 추가로 평가되거나 또는 스크리닝된다.
리포터 유전자는 잠재적으로 형질감염된 세포를 확인하고 조절 서열의 기능을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 일반적으로, 리포터 유전자는 수용체 유기체 또는 조직에 존재하거나 또는 발현되지 않으며, 발현이 쉽게 검출될 수 있는 일부 특성, 예를 들어, 효소적 활성에 의해 나타나는 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자이다. 리포터 유전자의 발현은 DNA가 수용체 세포에 도입된 후 적절한 시간에 검정된다. 적합한 리포터 유전자는 루시퍼레이스, 베타-갈락토시데이스, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼레이스, 분비된 알칼리 포스파테이스 또는 녹색 형광 단백질 유전자를 암호화하는 유전자를 포함할 수 있다(예를 들어, 문헌[Ui-Tei et al. FEBS Letters 479: 79-82 (2000)]). 적합한 발현 시스템은 잘 알려져 있으며, 공지된 기법을 사용하여 제조되거나 또는 상업적으로 입수될 수 있다.
조작된 면역 효과기 세포에서 CAR을 암호화하는 핵산의 존재를 확인하기 위한 다른 방법은, 예를 들어, 서던 및 노던 블로팅, RT-PCR 및 PCR과 같은 당업자에게 잘 알려진 분자 생물학적 검정; 예를 들어, 면역학적 방법(예컨대, ELISA 및 웨스턴 블롯)에 의해 특정 펩타이드의 존재 여부를 검출하는 것과 같은 생화학적 검정을 포함한다.
5.4.3. T 세포의 공급원
일부 실시형태에서, T 세포의 확장 및 유전적 변형 전에, T 세포의 공급원은 대상체로부터 얻는다. T 세포는 말초 혈액 단핵구 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위로부터의 조직, 복수, 흉막 삼출액, 비장 조직 및 종양을 비롯한 여러 공급원으로부터 얻을 수 있다. 일부 실시형태에서, 당업계에서 이용 가능한 임의의 수의 T 세포주가 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, T 세포는 Ficoll™ 분리와 같은 당업자에게 공지된 임의의 수의 기법을 사용하여 대상체로부터 수집된 혈액 단위로부터 얻을 수 있다. 일부 실시형태에서, 개체의 순환 혈액으로부터의 세포는 성분채집에 의해 얻어진다. 성분채집 산물은 전형적으로 T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포, 다른 유핵 백혈구, 적혈구 및 혈소판을 포함하는 림프구를 포함한다. 일부 실시형태에서, 성분채집에 의해 수집된 세포는 혈장 분획을 제거하고 후속 처리 단계를 위해 적절한 완충액 또는 배지에 세포를 배치하기 위해 세척될 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포는 인산 완충 식염수(PBS)로 세척된다. 일부 실시형태에서, 세척 용액은 칼슘이 부족하고, 마그네슘이 부족할 수 있거나 또는 2가 양이온이 전부는 아니더라도 많이 부족할 수 있다. 칼슘의 부재하에 초기 활성화 단계는 확대된 활성화로 이어질 수 있다. 당업자라면 제조업체의 지침에 따라 반-자동화된 "병류(flow-through)" 원심분리(예를 들어, Cobe 2991 세포 처리장치, Baxter CytoMate 또는 Haemonetics Cell Saver 5)를 사용하는 것과 같이 세척 단계가 당업계에 공지된 방법에 의해 달성될 수 있음을 쉽게 이해할 수 있을 것이다. 세척 후, 세포는, 예를 들어, Ca2+-무함유, Mg2+-무함유 PBS, PlasmaLyte A 또는 완충액을 포함하거나 또는 포함하지 않는 다른 염수 용액과 같은 다양한 생체적합성 완충액에 재현탁될 수 있다. 대안적으로, 성분채집 샘플의 바람직하지 않은 성분은 제거될 수 있고, 세포는 배양 배지에 직접 재현탁될 수 있다.
일부 실시형태에서, T 세포는, 예를 들어, PERCOLL™ 구배를 통한 원심분리 또는 역류 원심분리 용출에 의해 적혈구를 용해시키고 단핵구를 고갈시킴으로써 말초 혈액 림프구로부터 단리된다. CD3+, CD28+, CD4+, CD8+, CD45RA+ 및 CD45RO+T 세포와 같은 T 세포의 특정 하위집단은 양성 또는 음성 선택 기법에 의해 추가로 단리될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, T 세포는 목적하는 T 세포의 양성 선택에 충분한 시간 동안 DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T와 같은 항-CD3/항-CD28(즉, 3×28)-접합된 비드와 함께 인큐베이션함으로써 단리된다. 일부 실시형태에서, 시간은 약 30분이다. 추가 실시형태에서, 시간은 30분 내지 36시간 또는 그 이상의 범위 및 그 사이의 모든 정수 값이다. 추가 실시형태에서, 시간은 적어도 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간 또는 6시간이다. 일부 실시형태에서, 시간은 10시간 내지 24시간이다. 일부 실시형태에서, 인큐베이션 시간은 24시간이다. 백혈병 환자로부터 T 세포를 단리하기 위해, 24시간과 같이 더 긴 인큐베이션 시간을 사용하면 세포 수율을 높일 수 있다. 더 긴 인큐베이션 시간은 종양 조직 또는 면역이 손상된 개체로부터 종양 침윤 림프구(tumor infiltrating lymphocyte: TIL)를 단리하는 것과 같이 다른 세포 유형과 비교하여 T 세포가 거의 없는 임의의 상황에서 T 세포를 단리하는 데 사용될 수 있다. 또한, 더 긴 인큐베이션 시간을 사용하면 CD8+ T 세포의 포획 효율을 높일 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, T 세포가 CD3/CD28 비드에 결합할 수 있게 하는 시간을 단순히 단축시키거나 또는 연장함으로써 및/또는 비드 대 T 세포의 비를 증가 또는 감소시킴으로써, T 세포의 하위집단은 배양 개시 또는 과정 동안 다른 시점에 대해 우선적으로 선택될 수 있다. 추가적으로, 비드 또는 다른 표면 상의 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체의 비를 증가 또는 감소시킴으로써, T 세포의 하위집단은 배양 개시 또는 다른 목적하는 시점에서 우선적으로 선택될 수 있다. 당업자는 다수의 선택 라운드가 사용될 수 있음을 인지할 것이다. 일부 실시형태에서, 선택 절차를 수행하고, 활성화 및 확장 과정에서 "선택되지 않은" 세포를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. "선택되지 않은" 세포는 또한 추가의 선택 라운드를 거칠 수 있다.
음성 선택에 의한 T 세포 집단의 농축은 음성 선택된 세포에 고유한 표면 마커에 대한 항체의 조합으로 달성될 수 있다. 한 가지 방법은 세포 음성 선택된 세포에 존재하는 세포 표면 마커에 대한 단일클론 항체의 칵테일을 사용하는 음성 자성 면역부착 또는 유세포 분석을 통한 세포 분류 및/또는 선택이다. 예를 들어, 음성 선택에 의해 CD4+ 세포를 농축시키기 위해, 단일클론 항체 칵테일은 전형적으로 CD14, GUCY2C, CD11b, CD16, HLA-DR 및 CD8에 대한 항체를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 이는 전형적으로 CD4+, CD25+, CD62Lhi, GITR+ 및 FoxP3+를 발현하는 조절 T 세포를 농축시키거나 양성 선택하는 것이 바람직할 수 있다. 대안적으로, 소정의 실시형태에서, T 조절 세포는 항-C25 접합된 비드 또는 기타 유사한 선택 방법에 의해 고갈된다.
양성 또는 음성 선택에 의해 세포의 목적하는 집단을 단리하기 위해, 세포 및 표면(예를 들어, 비드와 같은 입자)의 농도는 달라질 수 있다. 소정의 실시형태에서, 세포 및 비드의 최대 접촉을 보장하기 위해 비드와 세포가 함께 혼합되는 부피를 상당히 줄이는 것(즉, 세포의 농도를 증가시키는 것)이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 20억개 세포/㎖의 농도가 사용된다. 일 실시형태에서, 10억개 세포/㎖의 농도가 사용된다. 추가 실시형태에서, 1억개 이상의 세포/㎖이 사용된다. 추가 실시형태에서, 1000만, 1500만, 2000만, 2500만, 3000만, 3500만, 4000만, 4500만 또는 5000만개 세포/㎖의 세포 농도가 사용된다. 또 다른 실시형태에서, 7500만, 8000만, 8500만, 9000만, 9500만 또는 1억개 세포/㎖의 세포 농도가 사용된다. 추가 실시형태에서, 1억 2500만 또는 1억 5000만개 세포/㎖의 농도가 사용될 수 있다. 고농도를 사용하면 세포 수율, 세포 활성화 및 세포 확장을 증가시킬 수 있다. 또한, 높은 세포 농도를 사용하면 CD28-음성 T 세포와 같은 관심 표적 항원을 약하게 발현할 수 있는 세포 또는 많은 종양 세포가 존재하는 샘플(즉, 백혈병 혈액, 종양 조직 등)에서 보다 효율적인 포획이 가능하다. 이러한 세포 집단은 치료적 가치를 가질 수 있으며, 이를 얻는 것이 바람직할 것이다. 일부 실시형태에서, 고농도의 세포를 사용하면 일반적으로 CD28 발현이 약한 CD8+ T 세포를 보다 효율적으로 선택할 수 있다.
일부 실시형태에서, 더 낮은 농도의 세포를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. T 세포와 표면(예를 들어, 비드와 같은 입자)의 혼합물을 상당히 희석함으로써, 입자와 세포 간의 상호작용은 최소화된다. 이는 입자에 결합될 목적하는 항원을 다량으로 발현하는 세포를 선택한다. 예를 들어, CD4+ T 세포는 더 높은 수준의 CD28을 발현하고, 희석 농도에서 CD8+ T 세포보다 더 효율적으로 포획된다. 일부 실시형태에서, 사용되는 세포의 농도는 5×106/㎖이다. 일부 실시형태에서, 사용되는 농도는 약 1×105/㎖ 내지 1×106/㎖ 및 이들 사이의 임의의 정수일 수 있다.
일부 실시형태에서, 세포는 2℃ 내지 10℃ 또는 실온에서 다양한 속도로 다양한 시간 동안 회전 장치에서 인큐베이션될 수 있다.
자극을 위한 T 세포는 또한 세척 단계 후에 동결될 수 있다. 이론에 얽매이지 않고, 동결 및 후속 해동 단계는 세포 집단에서 과립구 및 어느 정도의 단핵구를 제거함으로써 보다 균일한 생성물을 제공할 수 있다. 혈장 및 혈소판을 제거하는 세척 단계 후, 세포는 동결 용액에 현탁될 수 있다. 많은 동결 용액 및 매개변수가 당업계에 공지되어 있으며 이러한 맥락에서 유용할 것이지만, 한 가지 방법은 20% DMSO 및 8% 인간 혈청 알부민을 포함하는 PBS, 또는 10% 덱스트란 40 및 5% 덱스트로스, 20% 인간 혈청 알부민 및 7.5% DMSO 또는 31.25% plasmalyte-A, 31.25% 덱스트로스 5%, 0.45% NaCl, 10% 덱스트란 40 및 5% 덱스트로스, 20% 인간 혈청 알부민 및 7.5% DMSO를 포함하는 배양 배지 또는, 예를 들어, Hespan 및 PlasmaLyte A를 포함하는 다른 적합한 세포 동결 배지를 사용하는 것을 포함한다. 그런 다음, 세포는 -80℃에서 분당 1°의 속도로 동결되고, 액체 질소 보관 탱크의 증기 상태로 보관된다. -20℃ 또는 액체 질소에서 즉시 제어되지 않은 동결뿐만 아니라 다른 제어된 동결 방법도 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 동결보존된 세포는 본 명세서에 기재된 바와 같이 해동되고 세척되며, 활성화 전 실온에서 1시간 동안 방치되었다.
또한, 본 명세서에 기재된 바와 같은 확장된 세포가 필요할 수 있는 시기 이전의 기간에 대상체로부터 혈액 샘플 또는 성분채집 산물을 수집하는 것이 본 개시내용에서 상정된다. 이와 같이, 확장될 세포의 공급원은 필요한 임의의 시점에서 수집될 수 있으며, T 세포와 같은 목적하는 세포는 본 명세서에 기재된 것과 같은 T 세포 요법으로부터 이익을 얻을 수 있는 임의의 수의 질환 또는 병태에 대한 T 세포 요법에서 나중에 사용하기 위해 단리되고 동결된다. 일 실시형태에서, 혈액 샘플 또는 성분채집은 일반적으로 건강한 대상체로부터 채취된다. 소정의 실시형태에서, 혈액 샘플 또는 성분채집은 일반적으로 질환의 발생할 위험이 있지만 아직 질환이 발생하지 않은 건강한 대상체로부터 채취되며, 관심 세포는 나중에 사용하기 위해 단리되고 동결된다. 소정의 실시형태에서, T 세포는 나중에 사용하기 위해 확장되고 동결될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 샘플은 본 명세서에 기재된 바와 같이 특정 질환의 진단 직후 그러나 임의의 치료 이전에 환자로부터 수집된다. 추가 실시형태에서, 세포는 작용제, 예컨대, 나탈리주맙, 에팔리주맙, 항바이러스제, 화학요법, 방사선, 면역억제제, 예컨대, 사이클로스포린, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 미코페놀레이트 및 FK506, 항체 또는 다른 면역제거제, 예컨대, CAMPATH, 항-CD3 항체, 사이톡산, 플루다라빈, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 마이코페놀산, 스테로이드, FR901228 및 조사를 사용한 치료를 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 수의 관련 치료 양식 전에 대상체로부터의 혈액 샘플 또는 성분채집으로부터 단리된다. 이러한 약물은 칼슘 의존성 포스파테이스 칼시뉴린(사이클로스포린 및 FK506)을 저해하거나 또는 성장 인자 유도성 신호전달(라파마이신)에 중요한 p70S6 카이네이스를 저해한다(Liu et al., Cell 66:807-815 (1991); Henderson et al., Immun 73:316-321 (1991); Bierer et al., Curr. Opin. Immun. 5:763-773 (1993)). 추가 실시형태에서, 세포는 환자를 위해 단리되고, 나중에 골수 또는 줄기 세포 이식, 플루다라빈, 외부-빔 방사선 요법(external-beam radiation therapy: XRT), 사이클로포스파마이드와 같은 화학요법제, 또는 OKT3 또는 CAMPATH와 같은 항체를 사용하는 T 세포 제거 요법과 함께(예를 들어, 이전에, 동시에 또는 이후에) 사용하기 위해 동결된다. 또 다른 실시형태에서, 세포는 이전에 단리되고, GUCY2C, 예를 들어, 리툭산(Rituxan)과 반응하는 작용제와 같은 B-세포 제거 요법 후 치료를 위해 나중에 사용하기 위해 동결될 수 있다.
일부 실시형태에서, T 세포는 치료 직후 직접 환자로부터 얻어진다. 이와 관련하여, 소정의 암 치료, 특히 면역계를 손상시키는 약물 치료 후, 환자가 일반적으로 치료로부터 회복되는 기간 동안 치료 직후에 얻어진 T 세포의 품질이 생체외 확장 능력에 대해 최적이거나 또는 개선될 수 있음이 관찰되었다. 마찬가지로, 본 명세서에 기재된 방법을 사용한 생체외 조작 후, 이들 세포는 향상된 생착 및 생체내 확장을 위해 바람직한 상태에 있을 수 있다. 따라서, 이 회복 단계 동안 T 세포, 수지상 세포 또는 조혈 계통의 다른 세포를 포함하는 혈액 세포를 수집하는 것이 본 개시내용의 맥락 내에서 상정된다. 또한, 소정의 실시형태에서, 동원(예를 들어, GM-CSF를 사용한 동원) 및 조건화 양생법은 특히 요법 후 정의된 시간 범위(window) 동안 대상체에서 특정 세포 유형의 재증식, 재순환, 재생 및/또는 확장이 선호되는 조건을 생성하는 데 사용될 수 있다. 예시적인 세포 유형은 T 세포, B 세포, 수지상 세포 및 면역계의 다른 세포를 포함한다.
5.4.4. T 세포의 활성화 및 확장
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 CAR을 사용한 T 세포의 유전적 변형 전 또는 후에, T 세포는 일반적으로, 예를 들어, 미국 특허 제6,352,694호; 제6,534,055호; 제6,905,680호; 제6,692,964호; 제5,858,358호; 제6,887,466호; 제6,905,681호; 제7,144,575호; 제7,067,318호; 제7,172,869호; 제7,232,566호; 제7,175,843호; 제5,883,223호; 제6,905,874호; 제6,797,514호; 제6,867,041호; 및 미국 공개 제20060121005호에 기술되어 있는 바와 같은 방법을 사용하여 활성화되고 확장될 수 있다.
일반적으로, T 세포는 CD3/TCR 복합체 관련 신호를 자극하는 작용제 및 T 세포의 표면 상의 공동 자극성 분자를 자극하는 리간드가 부착된 표면과의 접촉에 의해 확장될 수 있다. 특히, T 세포 집단은 표면에 고정화된 항-CD3 항체, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항-CD2 항체와의 접촉에 의해 또는 칼슘 이온 운반체와 함께 단백질 카이네이스 C 활성화제(예를 들어, 브리오스타틴)와의 접촉에 의해서와 같이 본 명세서에 기재된 바와 같이 자극될 수 있다. T 세포 표면 상의 보조 분자의 공동 자극을 위해, 보조 분자에 결합하는 리간드가 사용된다. 예를 들어, T 세포의 집단은 T 세포의 증식을 자극하기에 적절한 조건하에 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체와 접촉될 수 있다. CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포의 증식을 자극하기 위한, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체. 항-CD3 항체의 예는 UCHT1, OKT3, HIT3a(바이오레전드(BioLegend), 미국 샌디에고 소재)를 포함하며, 당업계에 일반적으로 공지된 다른 방법이 사용될 수 있다(Graves J, et al., J.Immunol. 146:2102 (1991); Li B, et al., Immunology 116:487 (2005); Rivollier A, et al., Blood 104:4029 (2004)). 항-CD28 항체의 예는 9.3, B-T3, XR-CD28(다이아클론(Diaclone), 프랑스 브장송 소재)을 포함하며, 당업계에 일반적으로 공지된 다른 방법이 사용될 수 있다(Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977 (1998); Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9):13191328 (1999); Garland et al., J. Immunol Meth. 227(1-2):53-63 (1999)).
일부 실시형태에서, T 세포에 대한 1차 자극성 신호 및 공동 자극성 신호는 상이한 프로토콜에 의해 제공될 수 있다. 예를 들어, 각 신호를 제공하는 작용제는 용액 중에 있거나 또는 표면에 커플링될 수 있다. 표면에 커플링될 때, 작용제는 동일한 표면(즉, "시스(cis)" 형성)에 또는 별도의 표면(즉, "트랜스(trans)" 형성)에 커플링될 수 있다. 대안적으로, 하나의 작용제는 표면에 커플링되고, 다른 작용제는 용액 중에 있을 수 있다. 일 실시형태에서, 공동 자극성 신호를 제공하는 작용제는 세포 표면에 결합되고, 1차 활성화 신호를 제공하는 작용제는 용액 중에 있거나 또는 표면에 커플링된다. 소정의 실시형태에서, 두 작용제는 모두 용액 중에 있을 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 작용제는 가용성 형태일 수 있고, 이어서 Fc 수용체 또는 항체를 발현하는 세포 또는 작용제에 결합할 다른 결합제와 같은 표면에 가교된다. 이와 관련하여, 예를 들어, 본 개시내용의 소정의 실시형태에서 T 세포를 활성화하고 확장시키는 데 사용하기 위해 상정되는 인공 항원 제시 세포(artificial antigen presenting cell: aAPC)에 대해 미국 공개 제20040101519호 및 제20060034810호를 참조한다.
일부 실시형태에서, T 세포는 작용제-코팅된 비드와 결합되고, 비드 및 세포는 이후에 분리된 다음, 세포는 배양된다. 대안적 실시형태에서, 배양 전, 작용제-코팅된 비드 및 세포는 분리되지 않지만 함께 배양된다. 추가 실시형태에서, 비드 및 세포는 자력(magnetic force)과 같은 힘을 가하여 먼저 농축되어 세포 표면 마커의 결찰이 증가하고, 이에 의해 세포 자극을 유도한다.
예로서, 세포 표면 단백질은 항-CD3 및 항-CD28이 부착된 상자성 비드(3×28 비드)가 T 세포와 접촉하도록 함으로써 결찰될 수 있다. 일 실시형태에서, 세포(예를 들어, 104 내지 4×108개의 T 세포) 및 비드(예를 들어, 1:100의 권장 역가의 항-CD3/CD28 MACSiBead 입자)는 완충액, 바람직하게는 PBS(칼슘 및 마그네슘과 같은 2가 양이온을 포함하지 않음)에서 조합된다. 당업자는 임의의 세포 농도가 사용될 수 있음을 쉽게 이해할 수 있다. 예를 들어, 표적 세포는 샘플에서 매우 드물 수 있고, 샘플의 0.01%만을 포함할 수 있거나 또는 전체 샘플(즉, 100%)은 표적 관심 세포를 포함할 수 있다. 따라서, 임의의 세포 수는 본 개시내용의 맥락 내에 있다. 소정의 실시형태에서, 세포 및 입자의 최대 접촉을 보장하기 위해 입자 및 세포가 함께 혼합되는 부피를 상당히 줄이는 것(즉, 세포의 농도를 증가시키는 것)이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 약 20억개 세포/㎖의 농도가 사용된다. 또 다른 실시형태에서, 1억개 이상의 세포/㎖이 사용된다. 추가 실시형태에서, 1000만, 1500만, 2000만, 2500만, 3000만, 3500만, 4000만, 4500만 또는 5000만개 세포/㎖의 세포 농도가 사용된다. 또 다른 실시형태에서, 7500만, 8000만, 8500만, 9000만, 9500만 또는 1억개 세포/㎖의 세포 농도가 사용된다. 추가 실시형태에서, 1억 2500만 또는 1억 5000만개 세포/㎖의 농도가 사용될 수 있다. 고농도를 사용하면 세포 수율, 세포 활성화 및 세포 확장을 증가시킬 수 있다. 또한, 높은 세포 농도를 사용하면 CD28-음성 T 세포와 같은 관심 표적 항원을 약하게 발현할 수 있는 세포를 보다 효율적으로 포획할 수 있다. 이러한 세포 집단은 치료적 가치를 가질 수 있으며, 소정의 실시형태에서 이를 얻는 것이 바람직할 것이다. 일부 실시형태에서, 고농도의 세포를 사용하면 일반적으로 CD28 발현이 약한 CD8+ T 세포를 보다 효율적으로 선택할 수 있다.
일부 실시형태에서, 혼합물은 수 시간(약 3시간) 내지 약 14일 도안 또는 그 사이의 임의의 시간당 정수 값 동안 배양될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 혼합물은 21일 동안 배양될 수 있다. 일 실시형태에서, 비드 및 T 세포는 약 8일 동안 함께 배양된다. 또 다른 실시형태에서, 비드 및 T 세포는 2일 내지 3일 동안 함께 배양된다. T 세포의 배양 시간이 60일 이상이 되도록 여러 주기의 자극이 또한 바람직할 수 있다. T 세포 배양에 적절한 조건은 혈청(예를 들어, 소태아 또는 인간 혈청), 인터류킨-2(IL-2), 인슐린, IFN-γ, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-12, IL-15, TGFβ 및 TNF-α 또는 당업자에게 공지된 성장을 위한 임의의 다른 첨가제를 포함하는 증식 및 생존력에 필요한 인자를 포함할 수 있는 적절한 배지(예를 들어, 최소 필수 배지 또는 RPMI 배지 1640 또는 X-vivo 15(론자(Lonza)))를 포함한다. 세포의 성장을 위한 다른 첨가제는 계면활성제, 플라스미네이트 및 환원제, 예컨대, N-아세틸-시스테인 및 2-머캅토에탄올을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 배지는 아미노산, 소듐 피루베이트 및 바이타민이 첨가되거나, 무혈청이거나, 또는 적절한 양의 혈청(또는 혈장) 또는 정의된 일련의 호르몬 및/또는 T 세포의 성장 및 확장에 충분한 사이토카인(들)의 양이 보충된 RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, α-MEM, F-12, X-Vivo 15 및 X-Vivo 20, 옵티마이저(optimizer)를 포함할 수 있다. 항생제, 예를 들어, 페니실린 및 스트렙토마이신은 대상체에게 주입될 때 세포 배양이 아닌 실험 배양에만 포함된다. 표적 세포는 성장을 지원하는 데 필요한 조건, 예를 들어, 적절한 온도(예를 들어, 37℃) 및 분위기(예를 들어, 공기+5% CO2)하에 유지된다. 다양한 자극 시간에 노출된 T 세포는 상이한 특성을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 전형적인 혈액 또는 성분채집된 말초 혈액 단핵구 세포 생성물은 세포독성 또는 억제 T 세포 집단(TC, CD8)보다 더 많은 헬퍼 T 세포 집단(TH, CD4+)을 갖는다. CD3 및 CD28 수용체를 자극하는 것에 의한 T 세포의 생체외 확장은 약 8일 내지 9일 전에 주로 TH 세포로 구성된 T 세포 집단을 생성하는 반면, 약 8일 내지 9일 후 T 세포 집단은 점점 더 큰 TC 세포 집단으로 구성된다. 따라서, 치료 목적에 따라, 주로 TH 세포를 포함하는 T 세포 집단을 대상체에게 주입하는 것이 유리할 수 있다. 유사하게는, TC 세포의 항원-특이적 서브세트가 단리된 경우, 이 서브세트를 더 큰 정도로 확장시키는 것이 유익할 수 있다.
또한, CD4 및 CD8 마커 외에도, 다른 표현형 마커는 크게 다르지만, 대부분 세포 확장 과정 중에 재현 가능하다. 따라서, 이러한 재현성은 특정 목적을 위해 활성화된 T 세포 생성물을 맞춤화하는 능력을 가능하게 한다.
5.5. 폴리뉴클레오타이드
소정의 실시형태에서, 개시내용은 GUCY2C에 결합하는 단일 도메인 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 본 명세서에 기재된 GUCY2C에 결합하는 단일 도메인 항체를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 본 개시내용의 폴리뉴클레오타이드는 RNA의 형태 또는 DNA의 형태일 수 있다. DNA는 cDNA, 게놈 DNA 및 합성 DNA를 포함하며; 이중-가닥 또는 단일-가닥일 수 있고, 단일 가닥인 경우 코딩 가닥 또는 논코딩(안티-센스) 가닥일 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 cDNA의 형태이다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 합성 폴리뉴클레오타이드이다.
예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 11을 갖는 핵산과 같은 서열번호 3의 서열을 갖는 단일 도메인 항체를 암호화하는 서열을 포함한다.
예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 12를 갖는 핵산과 같은 서열번호 4의 서열을 갖는 단일 도메인 항체를 암호화하는 서열을 포함한다.
예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 13을 갖는 핵산과 같은 서열번호 5의 서열을 갖는 단일 도메인 항체를 암호화하는 서열을 포함한다.
예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 14를 갖는 핵산과 같은 서열번호 6의 서열을 갖는 단일 도메인 항체 암호화하는 서열을 포함한다.
예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 15를 갖는 핵산과 같은 서열번호 7의 서열을 갖는 단일 도메인 항체 암호화하는 서열을 포함한다.
예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 16을 갖는 핵산과 같은 서열번호 8의 서열을 갖는 단일 도메인 항체 암호화하는 서열을 포함한다.
예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 17을 갖는 핵산과 같은 서열번호 9의 서열을 갖는 단일 도메인 항체 암호화하는 서열을 포함한다.
예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 18을 갖는 핵산과 같은 서열번호 10의 서열을 갖는 단일 도메인 항체 암호화하는 서열을 포함한다.
소정의 실시형태에서, 개시내용은 본 명세서에 제공된 GUCY2C CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 본 개시내용의 폴리뉴클레오타이드는 RNA의 형태 또는 DNA의 형태일 수 있다. DNA는 cDNA, 게놈 DNA 및 합성 DNA를 포함하며; 이중-가닥 또는 단일-가닥일 수 있고, 단일 가닥인 경우 코딩 가닥 또는 논코딩(안티-센스) 가닥일 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 cDNA의 형태이다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 합성 폴리뉴클레오타이드이다.
예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 56을 갖는 핵산과 같은 서열번호 48의 서열을 갖는 CAR을 암호화하는 서열을 포함한다.
예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 57을 갖는 핵산과 같은 서열번호 49의 서열을 갖는 CAR을 암호화하는 서열을 포함한다.
예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 58을 갖는 핵산과 같은 서열번호 50의 서열을 갖는 CAR을 암호화하는 서열을 포함한다.
예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 59를 갖는 핵산과 같은 서열번호 51의 서열을 갖는 CAR을 암호화하는 서열을 포함한다.
예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 60을 갖는 핵산과 같은 서열번호 52의 서열을 갖는 CAR을 암호화하는 서열을 포함한다.
예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 61을 갖는 핵산과 같은 서열번호 53의 서열을 갖는 CAR을 암호화하는 서열을 포함한다.
예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 62를 갖는 핵산과 같은 서열번호 54의 서열을 갖는 CAR을 암호화하는 서열을 포함한다.
예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열번호 63을 갖는 핵산과 같은 서열번호 55의 서열을 갖는 CAR을 암호화하는 서열을 포함한다.
본 개시내용은 추가로 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드의 변이체에 관한 것이되, 변이체는, 예를 들어, 본 개시내용의 GUCY2C에 결합하는 단일 도메인 항체 또는 CAR의 단편, 유사체 및/또는 유도체를 암호화한다. 소정의 실시형태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 GUCY2C에 결합하는 단일 도메인 항체 또는 CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드와 적어도 약 75% 동일한, 적어도 약 80% 동일한, 적어도 약 85% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 적어도 약 95% 동일한, 일부 실시형태에서, 적어도 약 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 어구 "적어도, 예를 들어, 참조 뉴클레오타이드 서열과 95% "동일한" 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드"는 폴리뉴클레오타이드 서열이 참조 뉴클레오타이드 서열의 각각의 100개의 뉴클레오타이드당 최대 5개의 점 돌연변이를 포함할 수 있다는 점을 제외하고는 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열이 참조 서열과 동일함을 의미하는 것으로 의도된다. 즉, 참조 뉴클레오타이드 서열과 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리펩타이드를 얻기 위해, 참조 서열의 뉴클레오타이드의 최대 5%가 결실되거나 또는 또 다른 뉴클레오타이드로 치환될 수 있거나, 또는 참조 서열의 전체 뉴클레오타이드의 최대 5%까지의 뉴클레오타이드 수가 참조 서열에 삽입될 수 있다. 참조 서열의 이러한 돌연변이는 참조 뉴클레오타이드 서열의 5' 또는 3' 말단 위치에서 또는 이러한 말단 위치 사이의 어디에서나 발생할 수 있으며, 참조 서열의 뉴클레오타이드 사이에 개별적으로 또는 참조 서열 내의 하나 이상의 연속 그룹에 산재되어 있다.
폴리뉴클레오타이드 변이체는 코딩 영역, 논코딩 영역 또는 둘 다에 변경을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 변이체는 침묵 치환, 첨가 또는 결실을 생성하는 변경을 포함하지만, 암호화된 폴리펩타이드의 특성 또는 활성을 변경하지는 않는다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 변이체는 (유전적 코드의 축퇴로 인해) 폴리펩타이드의 아미노산 서열에 변화를 일으키지 않는 침묵 치환을 포함한다. 폴리뉴클레오타이드 변이체는, 예를 들어, 특정 숙주에 대한 코돈 발현을 최적화(즉, 인간 mRNA의 코돈을 대장균과 같은 세균 숙주가 선호하는 코돈으로 변경)하기 위해 다양한 이유로 생산될 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 변이체는 서열의 논코딩 또는 코딩 영역에 적어도 하나의 침묵 돌연변이를 포함한다.
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 변이체는 암호화된 폴리펩타이드의 발현(또는 발현 수준)을 조절 또는 변경하기 위해 생산된다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 변이체는 암호화된 폴리펩타이드의 발현을 증가시키기 위해 생산된다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 변이체는 암호화된 폴리펩타이드의 발현을 감소시키기 위해 생산된다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 변이체는 모 폴리뉴클레오타이드 서열과 비교하여 암호화된 폴리펩타이드의 증가된 발현을 갖는다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 변이체는 모 폴리뉴클레오타이드 서열과 비교하여 암호화된 폴리펩타이드의 감소된 발현을 갖는다.
또한, 본 명세서에 기재된 핵산 분자를 포함하는 벡터가 제공된다. 실시형태에서, 핵산 분자는 재조합 발현 벡터에 혼입될 수 있다. 본 개시내용은 본 개시내용의 임의의 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "재조합 발현 벡터"는 작제물이 mRNA, 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 때 숙주 세포에 의한 mRNA, 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 발현을 허용하는 유전적으로-변형된 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 작제물을 의미하되, 벡터는 mRNA, 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드가 세포 내에서 발현되기에 충분한 조건하에서 세포와 접촉된다. 본 명세서에 기재된 벡터는 전체적으로 자연 발생적인 것은 아니지만; 벡터의 일부는 자연 발생적일 수 있다. 기재된 재조합 발현 벡터는 단일-가닥 또는 이중-가닥, 합성되거나 또는 천연 공급원으로부터 부분적으로 얻어질 수 있고, 천연, 비천연 또는 변경된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있는 DNA 및 RNA를 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 유형의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 재조합 발현 벡터는 자연 발생적 또는 비자연 발생적 뉴클레오타이드간 연결 또는 두 유형의 연결을 포함할 수 있다. 비자연 발생적 또는 변경된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드간 연결은 벡터의 전사 또는 복제를 방해하지 않는다.
실시형태에서, 본 개시내용의 재조합 발현 벡터는 임의의 적합한 재조합 발현 벡터일 수 있으며, 임의의 적합한 숙주를 형질전환시키거나 또는 형질감염시키는 데 사용될 수 있다. 적합한 벡터는 플라스미드 및 바이러스와 같이 증식 및 확장 또는 발현 또는 둘 다를 위해 설계된 것들을 포함한다. 벡터는 pUC 시리즈(퍼멘타스 라이프 사이언시즈(Fermentas Life Sciences), 메릴랜드주 글렌 버니 소재), pBluescript 시리즈(스트라타진(Stratagene), 캘리포니아주 라호이아 소재), pET 시리즈(노바젠(Novagen), 위스콘신주 매디슨 소재), pGEX 시리즈(파마시아 바이오텍(Pharmacia Biotech), 스웨덴 웁살라 소재) 및 pEX 시리즈(클론텍(Clontech), 캘리포니아주 팔로알토 소재)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. λGT10, λGT11, λEMBL4 및 λNM1149, λZapII(스트라타진)와 같은 박테리오파지 벡터가 사용될 수 있다. 식물 발현 벡터의 예는 pBI01, pBI01.2, pBI121, pBI101.3 및 pBIN19(클론텍)를 포함한다. 동물 발현 벡터의 예는 pEUK-Cl, pMAM 및 pMAMneo(클론텍)를 포함한다. 재조합 발현 벡터는 바이러스 벡터, 예를 들어, 레트로바이러스 벡터, 예를 들어, 감마 레트로바이러스 벡터일 수 있다.
실시형태에서, 재조합 발현 벡터는, 예를 들어, 상기 Sambrook 등 및 상기 Ausubel 등에 기술되어 있는 표준 재조합 DNA 기법을 사용하여 제조된다. 원형 또는 선형인 발현 벡터의 작제물은 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포에서 기능하는 복제 시스템을 포함하도록 제조될 수 있다. 복제 시스템은, 예를 들어, ColE1, SV40, 2μ 플라스미드, λ, 소 유두종 바이러스 등으로부터 유래될 수 있다.
재조합 발현 벡터는 벡터가 도입될 유형의 숙주(예를 들어, 세균, 식물, 진균 또는 동물)에 특이적이며 적절하다면 벡터가 DNA-기반 또는 RNA-기반인지를 고려하여 전사 및 번역 개시 및 종결 코돈과 같은 조절 서열을 포함할 수 있다.
재조합 발현 벡터는 형질전환되거나 또는 형질감염된 숙주의 선택을 가능하게 하는 하나 이상의 마커 유전자를 포함할 수 있다. 마커 유전자는 살생제 저항성, 예를 들어, 항생제, 중금속 등에 대한 저항성, 원시영양성(prototrophy) 등을 제공하기 위한 영양요구성 숙주에서의 보완성을 포함한다. 기재된 발현 벡터에 적합한 마커 유전자는, 예를 들어, 네오마이신/G418 저항성 유전자, 히스티딘올 x 저항성 유전자, 히스티딘올 저항성 유전자, 테트라사이클린 저항성 유전자 및 암피실린 저항성 유전자를 포함한다.
재조합 발현 벡터는 본 개시내용의 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된 천연 또는 표준 프로모터를 포함할 수 있다. 예를 들어, 강한, 약한, 조직-특이적, 유도성 및 발달-특이적인 프로모터의 선택은 통상적인 기술 내에 있다. 유사하게는, 뉴클레오타이드 서열과 프로모터를 조합하는 것은 또한 통상적인 기술 내에 있다. 프로모터는 비바이러스 프로모터 또는 바이러스 프로모터, 예를 들어, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, RSV 프로모터, SV40 프로모터 또는 뮤린 줄기 세포 바이러스의 긴-말단 반복부에서 발견되는 프로모터일 수 있다.
재조합 발현 벡터는 일시적인 발현, 안정적인 발현 또는 둘 다를 위해 설계될 수 있다. 또한, 재조합 발현 벡터는 구성적 발현 또는 유도성 발현을 위해 제조될 수 있다.
또한, 재조합 발현 벡터는 자살 유전자를 포함하도록 제조될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "자살 유전자"는 자살 유전자를 발현하는 세포를 사멸시키는 유전자를 지칭한다. 자살 유전자는 유전자가 발현되는 세포에 작용제, 예를 들어, 약물에 대한 민감성을 부여하고 세포가 작용제와 접촉하거나 또는 이에 노출될 때 세포를 사멸시키는 유전자일 수 있다. 자살 유전자는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 단순 헤르페스 바이러스(HSV) 티미딘 카이네이스(TK) 유전자, 사이토신 데아미네이스, 퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴레이스 및 나이트로리덕테이스를 포함한다.
소정의 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 단리된다. 소정의 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 실질적으로 순수하다.
또한, 본 명세서에 기재된 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 숙주 세포는 이종 핵산을 포함하는 임의의 세포일 수 있다. 이종 핵산은 벡터(예를 들어, 발현 벡터)일 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포는 세포에 의한 물질의 생산, 예를 들어, 세포에 의한 유전자, DNA 또는 RNA 서열, 단백질 또는 효소의 발현을 위해 임의의 방식으로 선택, 변형, 형질전환, 성장, 사용 또는 조작된 임의의 유기체로부터의 세포일 수 있다. 적절한 숙주가 결정될 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포는 벡터 백본 및 목적하는 결과에 기초하여 선택될 수 있다. 예로서, 여러 유형의 벡터의 복제를 위해 플라스미드 또는 코스미드가 원핵생물 숙주 세포에 도입될 수 있다. DH5α, JM109 및 KCB, SURE® 컴피턴트 세포 및 SOLOPACK Gold 세포와 같으나 이에 제한되지 않는 세균 세포가 벡터 복제 및/또는 발현을 위한 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 추가적으로, 대장균 LE392와 같은 세균 세포는 파지 바이러스에 대한 숙주 세포로 사용될 수 있다. 숙주 세포로 사용될 수 있는 진핵생물 세포는 효모(예를 들어, YPH499, YPH500 및 YPH501), 곤충 및 포유동물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 벡터의 복제 및/또는 발현을 위한 포유동물 진핵생물 숙주 세포의 예는 HeLa, NIH3T3, Jurkat, 293, COS, Saos, PC12, SP2/0(미국 타입 컬처 컬렉션(American Type Culture Collection: ATCC), 버지니아주 머내서스 소재, CRL-1581), NS0(세포 배양의 유럽 컬렉션(European Collection of Cell Cultures: ECACC), 영국, 월트셔주 솔즈베리 소재, ECACC 번호 85110503), FO(ATCC CRL-1646) 및 Ag653(ATCC CRL-1580) 뮤린 세포주를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예시적인 인간 골수종 세포주는 U266(ATCC CRL-TIB-196)이다. 다른 유용한 세포주는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, 예컨대, CHO-K1SV(론자 바이오로직스(Lonza Biologics), 메릴렌드주 워커스빌 소재), CHO-K1(ATCC CRL-61) 또는 DG44로부터 유래된 것들을 포함한다.
5.6. 약제학적 조성물
일 양태에서, 본 개시내용은 단일 도메인 항체, 단일 도메인 항체를 포함하는 결합 분자 또는 치료 분자, 또는 본 개시내용의 조작된 면역 효과기 세포를 포함하는 약제학적 조성물을 추가로 제공한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 치료학적 유효량의 단일 도메인 항체, 단일 도메인 항체를 포함하는 결합 분자 또는 치료 분자, 또는 본 개시내용의 조작된 면역 효과기 세포 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함한다.
일부 실시형태에서, 치료학적 유효량의 본 명세서에 제공된 단일 도메인 항체 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물이 본 명세서에 제공된다.
일부 실시형태에서, 치료학적 유효량의 본 명세서에 제공된 단일 도메인 항체를 포함하는 치료 분자(예컨대, 융합 단백질, 면역접합체 및 다중특이성 결합 분자) 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물이 본 명세서에 제공된다.
다른 실시형태에서, 치료학적 유효량의 본 명세서에 제공된 단일 도메인 항체를 포함하는 CAR 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물이 본 명세서에 제공된다.
다른 실시형태에서, 치료학적 유효량의 본 명세서에 제공된 조작된 면역 효과기 세포 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물이 본 명세서에 제공된다.
다른 실시형태에서, 예를 들어, 벡터에 치료학적 유효량의 본 명세서에 제공된 핵산 및, 예를 들어, 유전자 요법에 적합한 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물이 본 명세서에 제공된다.
특정 실시형태에서, 용어 "부형제"는 또한 희석제, 보조제(예를 들어, 프로인트 보조제(완전 또는 불완전), 담체 또는 비히클을 지칭할 수 있다. 약제학적 부형제는 석유, 동물성, 식물성 또는 합성 기원, 예컨대, 땅콩유, 대두유, 광유, 참깨유 등을 포함하는 물 및 오일과 같은 멸균 액체일 수 있다. 염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액이 또한 액체 부형제로서 사용될 수 있다. 적합한 약제학적 부형제는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 초크, 실리카 겔, 소듐 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 소듐 클로라이드, 건조 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 원하는 경우, 조성물은 또한 소량의 습윤제 또는 유화제 또는 pH 완충제를 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 용액, 현탁액, 에멀션, 정제, 알약, 캡슐, 분말, 지속 방출 제형 등의 형태를 취할 수 있다. 적합한 약제학적 부형제의 예는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA]에 기술되어 있다. 이러한 조성물은 환자로의 적절한 투여를 위한 형태를 제공하기 위해 적합한 양의 부형제와 함께 정제된 형태와 같은 본 명세서에 제공된 예방학적 또는 치료학적 유효량의 활성 성분을 포함할 것이다. 제형은 투여 방식에 적합하여야 한다.
일부 실시형태에서, 부형제의 선택은 부분적으로 특정 세포, 결합 분자 및/또는 항체 및/또는 투여 방법에 의해 결정된다. 따라서, 다양한 적합한 제형이 있다.
전형적으로, 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 무독성이며, 완충액, 아스코르브산, 메티오닌, 바이타민 E, 소듐 메타바이설파이트를 포함하는 항산화제; 방부제, 등장화제, 안정화제, 금속 복합체(예를 들어, Zn-단백질 복합체); 킬레이트제, 예컨대, EDTA 및/또는 비이온성 계면활성제를 포함한다.
특히 안정성이 pH 의존적인 경우, 완충액은 치료적 효과를 최적화하는 범위에서 pH를 제어하기 위해 사용될 수 있다. 본 개시내용과 함께 사용하기에 적합한 완충제는 유기산 및 무기산 모두 및 이들의 염을 포함한다. 예를 들어, 시트레이트, 포스페이트, 석시네이트, 타트레이트, 퓨마레이트, 글루코네이트, 옥살레이트, 락테이트, 아세테이트. 추가적으로, 완충액은 히스티딘 및 트라이메틸아민 염, 예컨대, Tris를 포함할 수 있다.
방부제는 미생물 성장을 지연시키기 위해 첨가될 수 있다. 본 개시내용과 함께 사용하기에 적합한 방부제는 옥타데실다이메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤잘코늄 할라이드(예를 들어, 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드), 벤제토늄 클로라이드; 티메로살, 페놀, 뷰틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥산올, 3-펜탄올 및 m-크레졸을 포함한다.
종종 "안정화제"로 알려져 있는 등장화제는 조성물에서 액체의 등장성을 조정하거나 또는 유지시키기 위해 존재할 수 있다. 단백질 및 항체와 같은 크고 하전된 생체분자와 함께 사용될 때, 이들은 아미노산 측쇄의 하전된 기와 상호작용할 수 있어 분자간 및 분자내 상호작용의 가능성을 줄일 수 있기 때문에 이들은 종종 "안정화제"라고 한다. 예시적인 등장화제는 글리세린, 에리트리톨, 아라비톨, 자일리톨, 소르비톨 및 만니톨과 같은 다가 당 알코올, 3가 이상의 당 알코올을 포함한다.
추가적인 예시적인 부형제는 (1) 증량제, (2) 용해도 향상제, (3) 안정화제 및 (4) 용기 벽의 변성 또는 부착을 방지하는 작용제를 포함한다. 이러한 부형제는 다가 당 알코올(위에 열거됨); 아미노산, 예컨대, 알라닌, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 라이신, 오르니틴, 류신, 2-페닐알라닌, 글루탐산, 트레오닌 등.; 유기 당 또는 당 알코올, 예컨대, 수크로스, 락토스, 락티톨, 트레할로스, 스타키오스, 만노스, 소르보스, 자일로스, 리보스, 리비톨, 미오이니시토스, 미오이니시톨, 갈락토스, 갈락티톨, 글리세롤, 사이클리톨(예를 들어, 이노시톨), 폴리에틸렌 글리콜; 항 함유 환원제, 예컨대, 우레아, 글루타티온, 티옥트산, 소듐 티오글리콜레이트, 티오글리세롤, α-모노티오글리세롤 및 소듐 티오 설페이트; 저분자량 단백질, 예컨대, 인간 혈청 알부민, 소 혈청 알부민, 젤라틴 또는 기타 면역 글로불린; 친수성 중합체, 예컨대, 폴리바이닐피롤리돈; 단당류(예를 들어, 자일로스, 만노스, 프럭토스, 글루코스; 이당류(예를 들어, 락토스, 말토스, 수크로스); 삼당류, 예컨대, 라피노스; 및 다당류, 예컨대, 덱스트린 또는 덱스트란을 포함한다.
비이온성 계면활성제 또는 세제("습윤제"로도 알려져 있음)는 치료제를 가용화하는 데 도움을 줄 뿐만 아니라 교반-유도성 응집에 대해 치료 단백질을 보호하기 위해 존재할 수 있으며, 이는 또한 활성 치료 단백질 또는 항체의 변성을 유발하지 않고 제형이 전단 표면 응력에 노출되도록 한다. 적합한 비이온성 계면활성제는, 예를 들어, 폴리소르베이트(20, 40, 60, 65, 80 등), 폴록사머(184, 188 등), PLURONIC® 폴리올, TRITON®, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노에터(TWEEN®-20, TWEEN®-80 등), 라우로마크로골 400, 폴리옥실 40 스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유 10, 50 및 60, 글리세롤 모노스테아레이트, 수크로스 지방산 에스터, 메틸 셀룰로스 및 카복시메틸 셀룰로스를 포함한다. 사용될 수 있는 음이온성 세제는 소듐 라우릴 설페이트, 다이옥틸 소듐 설포석시네이트 및 다이옥틸 소듐 설포네이트를 포함한다. 양이온성 세제는 벤잘코늄 클로라이드 또는 벤제토늄 클로라이드를 포함한다.
약제학적 조성물이 생체내 투여에 사용되기 위해, 이들은 바람직하게는 멸균이다. 약제학적 조성물은 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 멸균될 수 있다. 본 명세서에서 약제학적 조성물은 일반적으로 멸균 접근 포트를 갖는 용기, 예를 들어, 정맥내 용액 백 또는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개가 있는 바이알에 배치될 수 있다.
투여 경로는 단일 또는 다중 볼루스 또는 적합한 방식으로 장기간에 걸친 주입, 예를 들어, 피하, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 병변내 또는 관절내 경로에 의한 주사 또는 주입에 의해, 국소 투여, 흡입 또는 지속 방출 또는 확장-방출 수단에 의해서와 같은 공지되고 허용되는 방법에 따른다.
또 다른 실시형태에서, 약제학적 조성물은 제어 방출 또는 지속 방출 시스템으로 제공될 수 있다. 일 실시형태에서, 제어 또는 지속 방출을 달성하기 위해 펌프가 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌[Sefton, Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201-40 (1987); Buchwald et al., Surgery 88:507-16 (1980); 및 Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321:569-74 (1989)] 참조). 또 다른 실시형태에서, 예방제 또는 치료제의 제어 또는 지속 방출을 달성하기 위해 중합체 물질(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 융합 단백질) 또는 본 명세서에 제공된 조성물(예를 들어, 문헌[Medical Applications of Controlled Release (Langer and Wise eds., 1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance (Smolen and Ball eds., 1984); Ranger and Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61-126 (1983); Levy et al., Science 228:190-92 (1985); During et al., Ann. Neurol. 25:351-56 (1989); Howard et al., J. Neurosurg. 71:105-12 (1989)]; 미국 특허 제5,679,377호; 제5,916,597호; 제5,912,015호; 제5,989,463호; 및 제5,128,326호; PCT 공개 제WO 99/15154호 및 제WO 99/20253호 참조)이 사용될 수 있다. 지속 방출 제형에 사용되는 중합체의 예는 폴리(2-하이드록시 에틸 메타크릴레이트), 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(아크릴산), 폴리(에틸렌-코-바이닐 아세테이트), 폴리(메타크릴산), 폴리글리콜라이드(PLG), 폴리무수물, 폴리(N-바이닐 피롤리돈), 폴리(바이닐 알코올), 폴리아크릴아마이드, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리락타이드(PLA), 폴리(락타이드-코-글리콜라이드)(PLGA) 및 폴리오쏘에스터를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일 실시형태에서, 지속 방출 제형에 사용되는 중합체는 불활성이고, 침출성 불순물이 없으며, 보관 시 안정적이고, 멸균 및 생분해성이다. 또 다른 실시형태에서, 제어 또는 지속 방출 시스템은 특정 표적 조직, 예를 들어, 비강 또는 폐에 근접하여 배치될 수 있으므로, 전신 용량의 일부만을 필요로 한다(예를 들어, 문헌[Goodson, Medical Applications of Controlled Release Vol. 2, 115-38 (1984)] 참조). 제어 방출 시스템은, 예를 들어, 문헌[Langer, Science 249:1527-33 (1990)]에 논의되어 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 1종 이상의 작용제를 포함하는 지속 방출 제형을 생산하기 위해 당업자에게 공지된 임의의 기법이 사용될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제4,526,938호, PCT 공개 제WO 91/05548호 및 제WO 96/20698호, 문헌[Ning et al., Radiotherapy & Oncology 39:179-89 (1996); Song et al., PDA J. of Pharma. Sci. & Tech. 50:372-97 (1995); Cleek et al., Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-54 (1997); 및 Lam et al., Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-60 (1997)] 참조).
본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 또한 치료 중인 특정 적응증에 필요한 1종 초과의 활성 화합물 또는 작용제를 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 조성물은 세포독성제, 화학치료제, 사이토카인, 면역억제제 또는 성장 저해제를 포함할 수 있다. 이러한 분자는 의도된 목적에 효과적인 양으로 적절하게 조합되어 존재한다.
활성 성분은 또한, 예를 들어, 코아세르베이션(coascervation) 기법 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어, 각각 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀션, 나노-입자 및 나노캡슐) 또는 매크로에멀션에서 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에 포획될 수 있다. 이러한 기법은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 18th edition]에 개시되어 있다.
리포솜, 마이크로입자, 마이크로캡슐, 본 명세서에 제공된 단일 도메인 항체 또는 치료 분자를 발현할 수 있는 재조합 세포, 레트로바이러스 또는 다른 벡터 등의 일부로서 핵산의 구성물의 캡슐화를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 조성물 및 전달 시스템이 공지되어 있으며, 본 명세서에 제공된 치료제와 함께 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 약제학적 조성물은 결합 분자 및/또는 세포를 치료학적 유효량 또는 예방학적 유효량과 같은 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하는 데 효과적인 양으로 포함한다. 일부 실시형태에서, 치료적 또는 예방적 효능은 치료 대상체의 주기적인 평가에 의해 모니터링된다. 수일 이상에 걸쳐 반복 투여되는 경우, 병태에 따라, 치료는 목적하는 질환 증상의 억제가 발생할 때까지 반복된다. 그러나, 다른 투여량 양생법이 유용할 수 있으며 결정될 수 있다.
5.7. 방법 및 용도
또 다른 양태에서, 항-GUCY2C VHH, 키메라 항원 수용체(CAR) 및/또는 재조합 수용체를 발현하는 조작된 세포를 포함하는 본 명세서에 제공된 GUCY2C 결합 분자의 사용 방법 및 용도가 본 명세서에 제공된다.
5.7.1. 치료적 방법 및 용도
이러한 방법 및 용도, 예를 들어, 분자, 세포 또는 이를 포함하는 조성물을 GUCY2C를 발현하거나 또는 GUCY2C 발현과 관련되고/되거나 세포 또는 조직이 GUCY2C를 발현하는 질환, 병태 또는 장애가 있는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 치료적 방법 및 용도를 포함한다. 일부 실시형태에서, 분자, 세포 및/또는 조성물은 질환 또는 장애를 치료하는 데 효과적인 유효량으로 투여된다. 용도는 이러한 방법 및 치료에서 그리고 이러한 치료적 방법을 수행하기 위한 약제의 제조에서의 항체 및 세포의 용도를 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 항체 또는 세포 또는 이를 포함하는 조성물을 질환 또는 병태를 갖거나 또는 이를 갖는 것으로 의심되는 대상체에게 투여함으로써 수행된다. 일부 실시형태에서, 이에 의해 방법은 대상체에서 질환 또는 장애를 치료한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 치료는 질환 또는 장애 또는 증상, 이와 관련된 부작용 또는 결과 또는 표현형의 완전하거나 또는 부분적인 개선 또는 감소를 야기한다. 치료의 바람직한 효과는 질환의 발생 또는 재발의 방지, 증상의 완화, 질환의 임의의 직접 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 전이의 예방, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 개선 또는 완화 및 관해 또는 개선된 예후를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 용어는 질환의 완전한 치유 또는 모든 증상 또는 결과에 대한 임의의 증상 또는 영향(들)의 완전한 제거를 포함하지만 이를 의미하지는 않는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 치료는 질환 또는 장애의 발생을 지연, 예를 들어, 질환(예컨대, 암)의 발생을 지연, 방해, 둔화, 지체, 안정화, 억제 및/또는 연기한다. 이러한 지연은 질환 및/또는 치료 중인 개체의 병력에 따라 다양한 시간이 될 수 있다. 당업자에게 자명한 바와 같이, 충분한 또는 상당한 지연은 개체가 질환 또는 장애를 발생시키지 않는다는 점에서 사실상 예방을 포함할 수 있다. 예를 들어, 전이의 발생과 같은 말기 암이 지연될 수 있다. 다른 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 방법 또는 용도는 질환 또는 장애를 예방한다.
일부 실시형태에서, 질환 또는 장애는 GUCY2C 관련 질환 또는 장애이다. 일부 실시형태에서, 질환 또는 장애는 암이다. 일부 실시형태에서, 암은 결장직장암, 위암 또는 식도암이다.
일부 실시형태에서, 방법은 제공된 GUCY2C-표적화된 CAR을 발현하는 유전적으로 조작된 세포가 대상체에게 투여되는 입양 세포 요법을 포함한다. 이러한 투여는 질환 또는 장애의 세포가 파괴의 표적이 되도록 GUCY2C-표적화된 방식으로 세포의 활성화(예를 들어, T 세포 활성화)를 촉진할 수 있다.
일부 실시형태에서, 방법은 세포 또는 세포를 포함하는 조성물을 질환 또는 장애를 갖거나, 이를 가질 위험이 있거나 또는 이를 가질 것으로 의심되는 바와 같은 대상체, 조직 또는 세포에 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포, 집단 및 조성물은, 예를 들어, 입양 T 세포 요법과 같은 입양 세포 요법을 통해 치료될 특정 질환 또는 장애를 갖는 대상체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 세포 또는 조성물은 질환 또는 장애를 갖거나 또는 이를 가질 위험이 있는 대상체와 같은 대상체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 이에 따라 방법은 GUCY2C-발현 암에서 종양 부담을 줄임으로써 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상을 치료, 예를 들어, 개선한다.
입양 세포 요법을 위한 세포의 투여 방법은, 예를 들어, 미국 공개 제2003/0170238호; 미국 특허 제4,690,915호; 문헌[Rosenberg, Nat Rev Clin Oncol. 8 (10):577-85 (2011); Themeli et al., Nat Biotechnol. 31(10): 928-933 (2013); Tsukahara et al., Biochem Biophys Res Commun 438(1): 84-9 (2013); 및 Davila et al., PLoS ONE 8(4): e61338 (2013)]에 기술되어 있는 바와 같이 공지되어 있다. 이들 방법은 물 본 명세서에 제공된 방법 및 조성물과 관련하여 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 세포 요법(예를 들어, 입양 T 세포 요법)은 자가 전달에 의해 수행되며, 여기서 세포는 세포 요법을 받는 대상체 또는 이러한 대상체로부터 유래된 샘플로부터 단리되고/되거나 그렇지 않으면 제조된다. 따라서, 일부 양태에서, 세포는 치료를 필요로 하는 대상체로부터 유래되고, 세포는 단리 및 처리 후 동일한 대상체에게 투여된다. 다른 실시형태에서, 세포 요법(예를 들어, 입양 T 세포 요법)은 동종이계 전달에 의해 수행되며, 여기서 세포는 세포 요법을 받을 대상체 또는 궁극적으로 받는 대상체 이외의 대상체, 예를 들어, 제1 대상체로부터 단리되고/되거나 그렇지 않으면 제조된다. 그런 다음, 이러한 실시형태에서, 세포는 상이한 대상체, 예를 들어, 동일한 종의 제2 대상체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 대상체는 유전적으로 동일하다. 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 대상체는 유전적으로 유사하다. 일부 실시형태에서, 제2 대상체는 제1 대상체와 동일한 HLA 클래스 또는 슈퍼유형을 발현한다.
일부 실시형태에서, 세포, 세포 집단 또는 조성물이 투여되는 대상체는 영장류, 예컨대, 인간과 같은 영장류이다. 대상체는 남성 또는 여성일 수 있고, 유아, 아동, 청소년, 성인 및 노인 대상체를 포함하는 임의의 적합한 연령일 수 있다. 일부 예에서, 대상체는 질환, 입양 세포 요법 및/또는 독성 평가 결과를 위한 검증된 동물 모델이다.
VHH 및 VHH를 포함하는 키메라 수용체와 같은 GUCY2C-결합 분자 및 이를 발현하는 세포는, 예를 들어, 주사, 예를 들어, 정맥내 또는 피하 주사, 안구내 주사, 눈주위 주사, 망막하 주사, 유리체내 주사, 경비중격 주사, 공막하 주사, 맥락막내 주사, 전안방내 주사, 결막하(subconjectval 또는 subconjuntival) 주사, 후테논낭하(sub-Tenon) 주사, 안구후부 주사, 안구주위 주사 또는 후방 공막옆 전달에 의한 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이들은 비경구, 폐내 및 비강내로 투여되고, 국부 치료가 요망되는 경우, 병변내 투여로 투여된다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다.
질환 또는 병태의 예방 및/또는 치료에 효과적일 본 명세서에 제공된 예방제 또는 치료제의 양은 표준 임상 기법에 의해 결정될 수 있다. 유효 용량은 시험관내 또는 동물 모델 테스트 시스템으로부터 파생된 용량-반응 곡선으로부터 외삽될 수 있다. 질환의 예방 또는 치료를 위해, 결합 분자 또는 세포의 적절한 투여량은 치료될 질환 또는 장애의 유형, 결합 분자의 유형, 질환 또는 장애의 중증도 및 과정, 치료제가 예방적 또는 치료적 목적으로 투여되는지 여부, 이전 요법, 환자의 임상 병력, 작용제에 대한 반응 및 주치의의 재량에 따라 달라질 수 있다. 조성물, 분자 및 세포는 일부 실시형태에서 한 번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적절하게 투여된다.
예를 들어, 질환이 유형 및 중증도에 따라, 항체의 투여량은 약 10 ㎍/㎏ 내지 100 ㎎/㎏ 이상을 포함할 수 있다. 다회 용량이 간헐적으로 투여될 수 있다. 초기에 더 높은 로딩 용량을 투여한 후 하나 이상의 더 낮은 용량이 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 본 명세서에 기재된 단일 도메인 항체 중 어느 하나를 포함하고, 약제학적 조성물은 투여 경로에 따라 일일당 개체 체중의 약 10 ng/㎏ 최대 약 100 ㎎/㎏, 예를 들어, 약 1 ㎎/㎏/일 내지 10 ㎎/㎏/일의 투여량으로 투여된다. 특정 투여량 및 전달 방법에 대한 지침은 문헌에 제공되어 있다(예를 들어, 미국 특허 제4,657,760호; 제5,206,344호; 및 제5,225,212호 참조).
결합 분자를 포함하는 유전적으로 조작된 세포의 맥락에서, 일부 실시형태에서, 대상체에게 약 100만 내지 약 1000억개 세포의 범위 및/또는 체중 킬로그램당 세포의 양이 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 본 명세서에 기재된 조작된 면역 세포 중 어느 하나를 포함하고, 약제학적 조성물은 개체 체중의 약 104 내지 109개 세포/㎏의 투여량으로 투여된다. 투여량은 질환 또는 장애 및/또는 환자 및/또는 다른 치료에 대한 특정한 특성에 따라 달라질 수 있다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 1회 투여된다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 수회(예컨대, 임의의 2회, 3회, 4회, 5회, 6회 이상) 투여된다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 투여 주기 동안 1회 또는 수회 투여된다. 투여 주기는, 예를 들어, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주(들) 이상 또는 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월(들) 이상일 수 있다. 특정 환자에 대한 최적의 투여량 및 치료 양생법은 질환의 징후에 대해 환자를 모니터링하고 이에 따라 치료를 조정함으로써 의학 분야의 당업자에 의해 결정될 수 있다.
일부 실시형태에서, 세포 또는 항체는 임의의 순서로, 또 다른 항체 또는 조작된 세포 또는 수용체 또는 작용제, 예컨대, 세포독성제 또는 치료제와 같은 또 다른 치료적 중재와 동시에 또는 순차적으로 조합 치료의 일부로서 투여된다.
일부 실시형태에서, 세포 또는 항체는 임의의 순서로 동시에 또는 순차적으로 1종 이상의 추가적인 치료제와 함께 또는 또 다른 치료적 중재와 관련하여 공동 투여된다. 일부 상황에서, 세포는 세포 집단이 1종 이상의 추가적인 치료제의 효과를 향상시키거나 또는 그 반대가 되도록 시간적으로 충분히 가깝게 또 다른 요법과 공동 투여된다. 일부 실시형태에서, 세포 또는 항체는 1종 이상의 추가적인 치료제 전에 투여된다. 일부 실시형태에서, 세포 또는 항체는 1종 이상의 추가적인 치료제 후에 투여된다.
소정의 실시형태에서, 세포가 포유동물(예를 들어, 인간)에게 투여되면, 조작된 세포 집단 및/또는 항체의 생물학적 활성은 임의의 수의 공지된 방법에 의해 측정된다. 평가하기 위한 매개변수는, 예를 들어, 영상화에 의해 생체내에서 또는, 예를 들어, ELISA 또는 유세포 분석에 의해 생체외에서 항원에 대한 조작된 또는 천연 T 세포 또는 다른 면역 세포의 특이적 결합을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 표적 세포를 파괴하는 조작된 세포의 능력은, 예를 들어, 문헌[Kochenderfer et al., J. Immunotherapy, 32(7): 689-702 (2009) 및 Herman et al. J. Immunological Methods, 285(1): 25-40 (2004)]에 기술되어 있는 세포독성 검정과 같은 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 세포의 생물학적 활성은 또한 CD107a, IFNγ, IL-2 및 TNF와 같은 소정의 사이토카인의 발현 및/또는 분비를 검정함으로써 측정될 수 있다. 일부 양태에서, 생물학적 활성은 종양 부담 또는 부하의 감소와 같은 임상 결과를 평가함으로써 측정된다.
일부 특정 실시형태에서, 예를 들어, 표 7의 CDR을 갖는 것들을 포함하여 위의 부문 5.2에 기재된 것과 같은 GUCY2C에 결합하는 단일 도메인 항체를 포함하는 결합 분자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법이 본 명세서에 제공되며, 예컨대, 항-GUCY2C sdAb는 (i) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (ii) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (iii) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (iv) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (v) 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (vi) 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (vii) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 (viii) 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다. 일부 실시형태에서, sdAb는 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 또는 서열번호 10의 아미노산 서열, 또는 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 또는 서열번호 10과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 질환 또는 장애는 GUCY2C 관련 질환 또는 장애이다. 일부 실시형태에서, 질환 또는 장애는 암이다. 일부 실시형태에서, 암은 결장직장암, 위암 또는 식도암이다.
다른 실시형태에서, 예를 들어, 부문 5.3에 제공된 CAR을 포함하는 세포를 포함하는 부문 5.4에 제공된 것과 같은 조작된 면역 효과기 세포(예컨대, T 세포)를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 질환 또는 장애를 치료하는 방법이 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 대상체에게 투여되는 조작된 면역 세포는 (a) 하나 이상의 항-GUCY2C sdAb(들)를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 CAR을 포함하되, 항-GUCY2C sdAb는, 예를 들어, 표 7의 CDR을 갖는 것들을 포함하여 위의 부문 5.2에 기재된 것과 같고, 예컨대, 항-GUCY2C sdAb는 (i) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (ii) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (iii) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (iv) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (v) 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (vi) 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (vii) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 (viii) 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다. 본 발명의 조작된 세포의 CAR 내의 sdAb는 또한 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10의 아미노산 서열, 및 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것을 포함하는 것들을 포함한다. 일부 실시형태에서, 대상체에게 투여되는 조작된 면역 세포는 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51, 서열번호 52, 서열번호 53, 서열번호 54 및 서열번호 55로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51, 서열번호 52, 서열번호 53, 서열번호 54 및 서열번호 55로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 CAR을 포함한다. 일부 실시형태에서, 질환 또는 장애는 GUCY2C 관련 질환 또는 장애이다. 일부 실시형태에서, 질환 또는 장애는 암이다. 일부 실시형태에서, 암은 결장직장암, 위암 또는 식도암이다.
5.7.2. 진단 및 검출 방법 및 용도
또 다른 양태에서, 검출, 예후, 진단, 병기 결정, 하나 이상의 조직 또는 세포 유형에 대한 특정 치료의 결합을 결정하고/하거나 GUCY2C 및/또는 항체에 의해 인식되는 이의 에피토프의 존재의 검출에 의한 것과 같이 대상체에서의 치료 결정을 알리기 위한, 본 명세서에 제공된 결합 분자, 예를 들어, GUCY2C에 결합하는 이러한 VHH를 포함하는 VHH 및 분자(예컨대, 접합체 및 복합체)의 사용을 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
일부 실시형태에서, 진단 또는 검출 방법에 사용하기 위한 항-GUCY2C 항체(예컨대, 본 명세서에 기재된 항-GUCY2C 단일 도메인 항체 중 어느 하나)가 제공된다. 추가 양태에서, 생물학적 샘플에서 GUCY2C의 존재를 검출하는 방법이 제공된다. 소정의 실시형태에서, 방법은 생물학적 샘플에서 GUCY2C 단백질의 존재를 검출하는 단계를 포함한다. 소정의 실시형태에서, GUCY2C는 인간 GUCY2C이다. 일부 실시형태에서, 방법은 GUCY2C-발현 질환 또는 장애와 관련된 진단적 및/또는 예후적 방법이다. 일부 실시형태에서, 방법은 생물학적 샘플을 항체와 함께 인큐베이션 및/또는 프로빙하고/하거나 항체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 생물학적 샘플은 종양 또는 암 조직 또는 생검 또는 이의 절편과 같은 세포 또는 조직 또는 이들의 일부를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 접촉은 샘플에 존재하는 GUCY2C에 대한 항-GUCY2C 항체의 결합을 허용하는 조건하에 있다. 일부 실시형태에서, 방법은 이러한 결합의 존재 또는 부재 또는 수준을 검출하는 것과 같이, 샘플에서 항-GUCY2C 항체와 GUCY2C 사이에 복합체가 형성되는지 여부를 검출하는 단계를 더 포함한다. 이러한 방법은 시험관내 또는 생체내 방법일 수 있다. 일 실시형태에서, 항-GUCY2C 항체는, 예를 들어, GUCY2C가 환자의 선택을 위한 바이오마커인 경우 항-GUCY2C 항체 또는 조작된 항원 수용체를 사용한 요법에 적격인 대상체를 선택하는 데 사용된다.
일부 실시형태에서, 세포, 조직 샘플, 용해물, 조성물 또는 이로부터 유래된 다른 샘플과 같은 샘플은 항-GUCY2C 항체와 접촉되고, 항체와 샘플(예를 들어, 샘플의 GUCY2C) 사이의 복합체의 결합 또는 형성이 결정되거나 또는 검출된다. 동일한 조직 유형의 참조 세포와 비교하여 테스트 샘플의 결합이 입증되거나 또는 검출되는 경우, 이는 관련 질환 또는 장애의 존재를 나타낼 수 있고/있거나 항체를 포함하는 치료제가 조직 또는 세포 또는 샘플이 유래되는 다른 생물학적 물질과 동일하거나 또는 동일한 유형인 조직 또는 세포에 특이적으로 결합할 것임을 나타낼 수 있다. 일부 실시형태에서, 샘플은 인간 조직으로부터 유래하며, 예를 들어, 치료될 질환 또는 장애를 갖는 대상체 및/또는 이러한 대상체와 동일한 종의 대상체로부터 유래하지만 치료될 질환 또는 장애를 갖지 않는 대상체로부터의 병에 걸린 조직 및/또는 정상 조직일 수 있다. 일부 경우에, 정상 조직 또는 세포는 치료될 질환 또는 장애를 갖는 대상체로부터 유래하지만 주어진 대상체에 존재하는 암과 동일하거나 또는 상이한 기관으로부터의 정상 조직과 같이 그 자체가 병에 걸린 세포 또는 조직은 아니다.
특정 항체-항원 결합을 검출하기 위해 당업계에 공지된 다양한 방법이 사용될 수 있다. 예시적인 면역검정은 형광 편광 면역검정(fluorescence polarization immunoassay: FPIA), 형광 면역검정(fluorescence immunoassay: FIA), 효소 면역검정(enzyme immunoassay: EIA), 혼탁 저해 면역검정(nephelometric inhibition immunoassay: NIA), 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA) 및 방사면역검정(RIA)을 포함한다. 지시인자 모이어티 또는 표지 그룹은 종종 검정 장비 및 양립 가능한 면역검정 절차의 이용 가능성에 관한 방법의 다양한 용도의 요구를 충족시키기 위해 사용될 수 있다. 예시적인 표지는 방사성핵종(예를 들어, 125I, 131I, 35S, 3H 또는 32P 및/또는 크로뮴(51Cr), 코발트(57Co), 플루오린(18F), 가돌리늄(153Gd, 159Gd), 저마늄(68Ge), 홀뮴(166Ho), 인듐(115In, 113In, 112In, 111In), 아이오다인(125I, 123I, 121I), 란타늄(140La), 루테튬(177Lu), 망가니즈(54Mn), 몰리브데넘(99Mo), 팔라듐(103Pd), 인(32P), 프라세오디뮴(142Pr), 프로메튬(149Pm), 레늄(186Re, 188Re), 로듐(105Rh), 류테늄(97Ru), 사마륨(153Sm), 스칸듐(47Sc), 셀레늄(75Se), (85Sr), 황(35S), 테크네튬(99Tc), 탈륨(201Ti), 주석(113Sn, 117Sn), 트리튬(3H), 제논(133Xe), 이테르븀(169Yb, 175Yb), 이트륨(90Y),), 효소(예를 들어, 알칼리 포스파테이스, 서양고추냉이 퍼옥시데이스, 루시퍼레이스 또는 β-갈락토시데이스), 형광 모이어티 또는 단백질(예를 들어, 플루오레세인, 로다민, 피코에리트린, GFP 또는 BFP) 또는 발광 모이어티(예를 들어, 퀀텀 도트 코포레이션(Quantum Dot Corporation)(캘리포니아주 팔로알토 소재)에 의해 공급되는 Qdot™ 나노입자)를 포함한다. 위에 언급된 다양한 면역검정을 수행하는 데 사용되는 다양한 일반적인 기법이 공지되어 있다.
소정의 실시형태에서, 표지된 항체(예컨대, 항-GUCY2C 단일 도메인 항체)가 제공된다. 표지는 직접적으로 검출되는 표지 또는 모이어티(예컨대, 형광, 발색단, 전자 밀도, 화학발광 및 방사성 표지)뿐만 아니라, 예를 들어, through 효소적 반응 또는 분자 상호작용을 통해 간접적으로 검출되는 효소 또는 리간드와 같은 모이어티를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 다른 실시형태에서, 항체는 표지되지 않으며, 이의 존재는 임의의 항체에 결합하는 표지된 항체를 사용하여 검출될 수 있다.
5.8. 키트 및 제조품
본 명세서에 기재된 임의의 단일 도메인 항체, 키메라 항원 수용체 또는 조작된 면역 효과기 세포를 포함하는 키트, 단위 투여량 및 제조품이 추가로 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물 중 어느 하나를 포함하고, 바람직하게는 이의 사용 지침을 제공하는 키트가 제공된다.
본 출원의 키트는 적합한 패키징에 있다. 적합한 패키징은 바이알, 보틀, 병, 가요성 패키징(예를 들어, 밀봉된 마일러(Mylar) 또는 플라스틱 백) 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 키트는 선택적으로 완충액과 같은 추가적인 성분 및 설명적인 정보를 제공할 수 있다. 따라서, 본 출원은 또한 바이알(예컨대, 밀봉된 바이알), 보틀, 병, 가요성 패키징 등을 포함하는 제조품을 제공한다.
제조품은 용기 및 용기 상에 또는 용기와 관련된 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함할 수 있다. 적합한 용기는, 예를 들어, 보틀, 바이알, 주사기 등을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로 형성될 수 있다. 일반적으로, 용기는 본 명세서에 기재된 질환 또는 장애(예컨대, 암)를 치료하는 데 효과적인 조성물을 보유하며, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다(예를 들어, 용기는 정맥내 용액 백 또는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개가 있는 바이알일 수 있음). 라벨 또는 패키지 삽입물은 조성물이 개체의 특정 병태를 치료하기 위해 사용됨을 나타낸다. 라벨 또는 패키지 삽입물은 조성물을 개체에게 투여하기 위한 지침을 추가로 포함할 것이다. 라벨에는 재구성 및/또는 사용을 위한 지침이 표시되어 있을 수 있다. 약제학적 조성물이 담긴 용기는 재구성된 제형의 반복 투여(예를 들어, 2회 내지 6회 투여)를 가능하게 하는 다중-사용 바이알일 수 있다. 패키지 삽입물은 이러한 치료 제품의 사용에 관한 적응증, 용법, 투여량, 투여, 금기사항 및/또는 경고에 대한 정보를 포함하는 치료 제품의 상업용 패키지에 관례적으로 포함된 지침을 지칭한다. 추가적으로, 제조품은 주사용 정균수(bacteriostatic water for injection: BWFI), 인산 완충 식염수, 링거 용액 및 덱스트로스 용액과 같은 약제학적으로 허용 가능한 완충액을 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이는
다른 완충액, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 포함하여 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
키트 또는 제조품은 약국, 예를 들어, 병원 약국 및 조제 약국에서 보관 및 사용하기에 충분한 양으로 패키징된 약제학적 조성물 및 지침의 다중 단위 용량을 포함할 수 있다.
간결함을 위해, 소정의 약어가 본 명세서에 사용된다. 한 가지 예는 단일 아미노산 잔기를 나타내는 단일 문자 약어이다. 아미노산 및 이들의 상응하는 세 글자 및 단일 글자 약어는 다음과 같다:
본 개시내용은 일반적으로 다수의 실시형태를 설명하기 위해 적극적인(affirmative) 언어를 사용하여 본 명세서에 개시된다. 본 개시내용은 또한 구체적으로 물질 또는 재료, 방법 단계 및 조건, 프로토콜, 절차, 검정 또는 분석과 같은 특정 주제가 전체적으로 또는 부분적으로 배제된 실시예를 포함한다. 따라서, 본 개시내용이 포함하지 않는 것과 관련하여 본 개시내용이 일반적으로 본 명세서에 표현되지 않더라도, 본 개시내용에 명시적으로 포함되지 않는 양태들은 그럼에도 불구하고 본 명세서에 개시된다.
본 개시내용의 다수의 실시형태가 설명되었다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 다양한 수정이 이루어질 수 있음이 이해될 것이다. 따라서, 하기 실시예는 청구범위에 기술된 개시의 범위를 예시하기 위한 것이지 제한하려는 것이 아니다.
6. 실시예
다음은 연구에 사용된 다양한 방법 및 물질에 대한 설명이고, 본 개시내용을 만들고 사용하는 방법에 대한 완전한 개시 및 설명을 당업자에게 제공하기 위해 제시되며, 본 발명자들이 이들의 개시내용으로 간주하는 것의 범위를 제한하려는 것이 아니며, 하기 실험이 수행되었고 수행될 수 있는 모든 실험임을 나타내는 것으로 의도되지 않는다. 현재 시제로 기술된 예시적인 설명이 반드시 수행된 것은 아니며, 오히려 본 개시내용의 교시와 관련된 데이터 등을 생성하기 위해 설명이 수행될 수 있음을 이해하여야 한다. 사용된 숫자(예를 들어, 양, 백분율 등)와 관련하여 정확성을 보장하기 위해 노력하였지만, 일부 실험 오류 및 편차를 고려하여야 한다.
6.1. 실시예 1 - 항-GUCY2C VHH의 제조
알파카의 면역화
알파카를 면역화하기 위해 인위적으로 합성된 GUCY2C 단백질의 세포외 영역을 난징 젠스크립트 바이오테크놀로지 주식회사(Nanjing GenScript Biotechnology Co., Ltd.)(서열 UniProtKB: P25092, Ser24-Gln430)에서 합성하였다. 이는 서열번호 1의 핵산 서열 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함한다(표 1 참조). 매번 100㎍의 GUCY2C 단백질을 보조제와 동일한 부피로 혼합하였다. 프로인트 완전 보조제는 1차 면역화에만 사용하였으며, 그 외에는 프로인트 불완전 보조제를 사용하였다. 항원-특이적 나노바디를 발현하도록 B 세포를 자극하기 위해 알파카를 매주 7회 면역화하였다. 면역화 기간 동안, 소량의 알파카 말초 혈액을 채취하여 항체 역가를 테스트하였다. 면역화 후, 200㎖의 알파카 말초 혈액을 채취하고, Trizol로 총 RNA를 추출하였다.
나노바디 파지 라이브러리의 구축
추출된 총 RNA를 사용하여 역전사 키트 PrimeScript II 첫 번째 가닥 cDNA 합성 키트(타카라(Takara))에 의해 cDNA를 합성하고, VHH 사슬을 2-단계 PCR에 의해 증폭시켰다. 1차 PCR에 의해 중쇄 항체 유전자를 얻었다. cDNA를 PCR 주형으로 사용하여, 면역 글로불린 IgG를 포함하는 상류 및 하류 프라이머를 PCR 시스템에 첨가하여 다양한 하위유형의 IgG를 증폭시킨 다음, IgG2 및 IgG3 유전자를 TaKaRa MiniBEST 아가로스 겔 DNA 추출 키트에 의해 회수하였다. 2차 PCR에 의해 제한 부위를 갖는 VHH 유전자를 얻었다. 1차 PCR에 의해 회수된 유전자 단편을 주형으로 사용하였다. Sac1 및 Spe1 제한 부위를 갖는 IgG2 및 IgG3 중쇄 영역의 VHH 서열을 포함하는 프라이머를 PCR 시스템에 첨가하여 파지 라이브러리용 VHH의 DNA를 다량으로 증폭시켰다. 마지막으로, PCR 산물을 DNA 정제 키트로 정제하였다.
VHH 유전자 및 pComb3XSS의 제한 소화, 결찰, 전기형질전환 및 파지 라이브러리 식별
2차 PCR에서 VHH 유전자 서열을 얻고, 파스미드 pComb3XSS(애드진(addgene))를 제한 효소 Sac1(NEB) 및 Spe1(NEB)로 소화시키고, 37℃ 수조에서 4시간 동안 두었다. 정제 및 회수 후, 샘플을 T4 DNA 라이게이스와 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 그런 다음, 200㎍의 재조합 플라스미드를 TG1 대장균 컴피턴트 세포에 첨가하고, 전기천공기로 전기천공하였다. 그런 다음, SOC 배지를 첨가하고, 혼합물을 37℃ 인큐베이터에서 1시간 동안 회전시켰다. 200㎕의 세균 용액을 10배 구배 희석으로 취하여 2ХYT 고체 플레이트를 긁어내고, 세균을 37℃ 인큐베이터에서 밤새 배양하였다. 다음날, 라이브러리의 용량은 플레이트의 콜로니 수를 기준으로 1×108 CFU로 계산되었다. 23개의 클론을 무작위로 선택하고, pComb3XSS용으로 설계된 상류 및 하류 프라이머를 콜로니 PCR 반응을 위한 PCR 반응 시스템에 첨가하였다. 파지 라이브러리의 삽입률은 95% 이상인 것으로 결정되었다(도 1). 무작위로 100개의 클론을 선택하고, 시퀀싱을 위해 안휘 제너럴바이오 주식회사(Anhui Generalbio Co., Ltd.)로 보냈다. 유효 삽입률이 90% 이상으로, 라이브러리가 성공적으로 구축되었음을 보여주었다.
GUCY2C 단백질에 대한 나노바디 스크리닝
단백질 GUCY2C를 0.1mM pH7.2 PBS에 용해시키고, 5㎍의 단백질을 고친화도 ELISA 플레이트에 코팅하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 코팅 단백질을 다음날 제거하고, 5% BSA를 첨가하여 ELISA 플레이트를 실온에서 2시간 동안 밀봉하였다. 차단 용액을 제거한 다음, 1×1011 CFU 파지를 ELISA 플레이트에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 비결합된 파지를 PBST(PBS+0.05% Tween20)로 8회 세척하였다. 결합된 파지를 0.1M pH2.0 글리신으로 8분 동안 용리시키고, 2M Tris를 첨가하여 반응을 중지시켰다. 용출 파지를 대수증식기에서 TG1 세균으로 감염시키고, 파지를 증폭시키고, 다음 라운드의 스크리닝을 위해 TG1 세균으로부터 정제하였다. 동일한 스크리닝 방법을 3회 반복하고, Elisa에 의해 양성 클론을 검출하기 위해 연속 스크리닝 파지를 이용하였다.
3 라운드 스크리닝의 파지를 HB2151 세균으로 형질감염시키고, 2ХYT-AG 고체 배양 접시의 표면을 긁어내어 100㎕의 감염된 HB2151 세균을 취하였다. 96개의 단일 클론을 선택하여 2×YT 배지에 첨가한 다음, 96 딥-웰 플레이트에서 배양하였다. 세균이 대수기로 성장하였을 때 배지에 0.8mM IPTG를 첨가하고, 25℃에서 밤새 배양하였다. 배지의 상청액을 2개의 대조군 웰이 포함되어 있는 1 ㎍/㎖의 GUCY2C가 코팅된 ELISA 플레이트에 첨가하였다. 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 PBST로 3회 세척하였다. 퍼옥시데이스 AffiniPure 염소 항-알파카 IgG, VHH 도메인(잭슨 이뮤노 리서치(Jackson Immumo Research))을 Elisa 플레이트에 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고, PBST로 3회 세척하였다. TMB 용액을 20분 동안 첨가한 다음, 2M 황산으로 반응을 중지시켰다. 450㎚ 파장에서의 흡광도 값을 마이크로플레이트 판독기에서 판독하였다(도 2). 음성 대조군보다 2.1배 더 높은 흡광도 값을 갖는 클론을 양성 클론으로 간주하고, 시퀀싱을 보냈다.
예시적인 VHH 도메인의 아미노산 및 핵산 서열은 표 2에 나타나 있으며, 이러한 예시적인 VHH 도메인의 예시적인 CDR 서열(Kabat 넘버링 시스템에 따름)은 아래 표 3에 나타나 있다. 이러한 예시적인 VHH 도메인의 정렬은 도 3에 도시되어 있으며, 이는 이러한 전체 서열뿐만 아니라 CDR 영역 사이에서 공유된 아미노산의 높은 비율을 보여준다. CDR1은 X1YGMX2의 컨센서스 서열을 갖되, X1은 A, I 또는 V이고, X2는 D 또는 G이다(서열번호 64). CDR2는 X3IX4LSGRX5X6YX7DAVX8G의 컨센서스 서열을 갖되, X3은 A, S 또는 T이고; X4는 F, W 또는 Y이고; X5는 S 또는 T이고; X6은 E, N 또는 T이고; X7은 A, S 또는 T이고; X8은 K 또는 Q이다(서열번호 65). CDR3은 GX9X10TAX11SX12RQY의 컨센서스 서열이되, X9는 A, E 또는 P이고; X10은 P 또는 T이고; X11은 S 또는 T이고; X12는 G 또는 V이다(서열번호 66).
6.2. 실시예 2 - 키메라 항원 수용체의 구축
pLVX-Puro 벡터를 주형으로 사용하여 벡터 pLVX-WT-G1을 변형시켰으며, 여기서 pLVX-Puro 벡터의 CMV 프로모터는 EF1a 프로모터로 형질전환시켰고, 키메라 항원 수용체의 부분 서열은 프로모터 다음에 EF1a에 삽입하였다. 서열은 CD8 힌지, CD8 막관통 영역, 4-1BB 및 CD3z로 구성되며, 이들 아미노산 서열은 각각 아래 표 4에 나타난 바와 같이 서열번호 43, 서열번호 44, 서열번호 45 및 서열번호 46이다. 형질전환된 벡터는 도 3A에 도시되어 있다. CD8 신호 펩타이드 및 항-GUCY2C VHH를 포함하는 최적화된 서열을 결찰에 의해 pLVX-WT-G1 벡터의 CD8 힌지 다음에 삽입하여 항-GUCY2C VHH 기반 키메라 항원 수용체 벡터 pLVX-WT-G1-VHH-CAR을 구축하였다. CD8 신호 펩타이드는 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함한다(표 4 참조).
예시적인 구축된 키메라 항원 수용체의 아미노산 및 핵산 서열은 표 5에 나타나 있다.
렌티바이러스 패키징
배지로서 DMEM/10% FBS를 사용하여 293T 세포를 회수하고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 바이러스를 패키징하기 전날, 세포를 소화시키고, 25㎠ 플라스크에서 50% 컨플루언스로 배양하였다. 세포를 감염시킬 때, 벡터 pLVX-WT-G1-VHH-CAR을 헬퍼 벡터 VSVG 및 GAG-pol과 일정 비율로 혼합하고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 감염 시약 PEI MAX 및 플라스미드 혼합물을 혼합하고, 실온에서 20분 동안 인큐베이션하여 293T 세포 배양 배지에 첨가되는 DNA-감염 시약 화합물을 형성하였다. 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 6시간 인큐베이션한 후, 상청액을 완전 배지로 교체하고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 인큐베이션하였다. 48시간 및 72시간 후, 바이러스를 한 번 수거하였다. 그런 다음, 바이러스를 원심분리에 의해 농축시키고, 바이러스 역가를 테스트하는 데 사용하였다.
CAR-T 세포 준비
Ficoll 시약을 사용하여 인간 말초 혈액으로부터 단핵구 세포를 추출하고, EasySep™ 인간 T 세포 단리 키트(스템셀(stemcell))로 CD3+ 세포를 분류하였다. 세포를 최대 5×107개 세포/㎖, 0.5㎖/튜브로 조정하고, 25㎕ RapidSphere를 각 튜브에 첨가하였다. 실온에서 혼합한 후, 샘플을 자성 랙에 넣고, 실온에서 3분 동안 인큐베이션하였다. 유출물을 수집하고 원심분리하여 CD3+ 세포를 얻었다. 분류된 CD3+ 세포를 x-vivo 15 배지로 재현탁시킨 후 인큐베이션하였다. 세포를 24-웰 플레이트에서 0.5 내지 1×106개 세포/웰로 배양하고, x-vivo15 배지를 최대 0.5㎖ 첨가하였다. CD3/CD28 비드 1:1의 비로 분류 세포에 첨가하고, IL2를 100 IU/㎖의 최종 농도로 보충한 다음, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 밤새 인큐베이션하였다.
그런 다음, 새로운 배지를 사용하고, 1×106개의 T 세포를 96-웰 플레이트에서 밤새 배양하였다. 다음날, 농축된 VHH-CAR 바이러스를 T 세포에 첨가하고, 6시간 동안 공동 배양하였다. 원심 분리 후 새로운 x-vivo15 배지로 교체하고, IL2를 100 IU/㎖의 최종 농도로 보충한 다음, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양을 계속하였다. 여러 계대배양 후, 유세포 분석을 사용하여 CAR-T 세포의 양성률을 검출하였다.
CAR-T 세포의 양성 검출률
수집 및 계수 후 다양한 CAR-T 세포를 PBS에 재현탁시켰다. PBS로 2회 세척 후, 1:1000으로 희석된 VHH 도메인(잭슨 이뮤노리서치(Jackson ImmumoResearch)) 2차 항체인 Alexa Fluor 647-접합된 AffiniPure 염소 항-알파카 IgG를 반응 시스템에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고, PBS로 2회 세척한 다음, 유세포 분석으로 검출하였다(도 4b). 나타낸 바와 같이, C08, C12, C13, C15, C21, C27, C30 및 C31의 양성률은 각각 91.86%, 20.32%, 23.62%, 46.41%, 30.61%, 90.28%, 86.89% 및 67.78%였다.
T84-Luci-eGFP 세포 준비
1×105개 세포/100㎕의 T84 세포를 24-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 다음날, 100㎕의 pLVX-Luci-eGFP 바이러스(바이러스 역가: 0.5 내지 1×108 TU/㎖)를 세포가 각 웰에서 60% 내지 70%로 성장할 때 T84 세포에 넣었다. 그런 다음 300㎕의 완전 배지를 첨가하고, 37℃ 5% CO2 인큐베이터에서 성장시켰다. 세포 밀도를 매일 관찰하고, 세포 밀도가 80% 내지 90%에 도달하였을 때 세포를 계대배양하였다. 양성률이 95% 이상일 때, T84 세포를 세포독성 검정 및 동물 실험에 사용하였다.
6.3. 실시예 3 - CAR-T 세포독성 검정
1×105개/㎖의 표적 세포를 96-웰 플레이트에 플레이팅하고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 밤새 성장시켰다. T 세포(음성 대조군) 및 다양한 CAR-T 세포를 E:T(효과기 세포:표적 세포) = 2:1로 표적 세포와 혼합하였다. 세포 배양 배지의 부피를 최대 200㎕/웰로 만든 다음, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 세포 배양 배지를 버리고, 세포를 PBS로 1회 세척하였다. 100㎕의 Bright-Glo 루시퍼레이스 기질을 각 웰에 첨가하고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 흰색 플레이트로 옮긴 100㎕의 상청액을 마이크로플레이트 판독기로 검출하였다(도 5 및 도 6 참조). 결과는 C8-CAR, C12-CAR, C13-CAR, C15-CAR, C21-CAR, C27-CAR, C30-CAR 및 C31-CAR을 발현하는 테스트된 모든 CAR-T 세포에 대한 세포독성을 보여주었다.
6.4. 실시예 4 - CAR-T 세포의 생체내 활성
결장암을 제거하는 항-GUCY2C CAR-T 세포의 능력을 NCG 마우스 모델을 사용하여 생체내에서 테스트하였다. 성장 상태가 양호한 T84-Luci-eGFP 세포를 1×108개 세포/㎖의 농도로 준비하여 NCG 암컷 마우스의 오른쪽 앞다리의 겨드랑이에 피하로 주사하였다. 각 마우스에 5×106개의 세포를 주사하였으며, 주사 부피는 0.05㎖이었다. 세포 주사 약 2주 후, 종양 부피는 약 100㎣ 내지 150㎣이었다. 각 마우스에 꼬리 정맥을 통해 3×106개의 CAR-T 세포를 주사하였다. 2일 내지 3일마다 캘리퍼로 종양 크기를 측정하였다. 마우스의 생체내 형광 영상화를 주 1회 수행하였다. 0.1 ㎖의 루시페린 기질을 마우스 복부의 피하부에 주사하고, 8분 후에 마우스를 마취시켰다. 촬영 검출을 위해 마취된 마우스를 PerkinElmer 소동물 생체내 광학 영상 시스템(IVIS Lumina LT)에 넣었다. CAR-T 세포 주사 후, 매주 100㎕의 마우스 혈액을 채취하고, 마우스에 남아있는 CAR-T 세포를 유세포 분석 및 qPCR로 모니터링하였다. 결과는 C8-CAR, C12-CAR, C13-CAR, C15-CAR 및 C21-CAR을 발현하는 본 명세서에 제공된 테스트된 예시적인 CAR-T 세포가 우수한 생체내 항암 활성을 보인 바와 같이 도 7a 내지 도 7c에 나타나 있다.
본 명세서에 인용된 모든 특허, 공개된 출원 및 참고 문헌의 교시 내용은 그 전체가 참조에 의해 원용된다. 예시적인 실시예가 특히 도시되고 설명되었지만, 당업자라면 첨부된 청구범위에 포함된 실시형태의 범위를 벗어나지 않고 형태 및 세부 사항의 다양한 변경이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다.
전술한 것으로부터, 예시의 목적으로 특정 실시형태가 본 명세서에 기술되었지만, 본 명세서에 제공된 것의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 다양한 수정이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 상기 언급된 모든 참조문헌은 그 전체가 참조에 의해 본 명세서에 원용된다.
SEQUENCE LISTING <110> PARASOL BIOTECH LTD. <120> GUCY2C BINDING MOLECULES AND USES THEREOF <130> 14687-002-999 <140> <141> <150> PCT/CN2021/138845 <151> 2021-12-16 <150> PCT/CN2020/137164 <151> 2020-12-17 <160> 66 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1221 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GUCY2C protein peptide (Ser24-Gln430) (Nucleic acid) <400> 1 tctcaagtgt cccagaactg ccacaacggc agctacgaga tcagcgtgct gatgatgggc 60 aacagcgcct ttgccgagcc tctgaagaac ctggaagatg ccgtgaacga aggcctggaa 120 atcgtgcgag gcagactgca gaatgccggc ctgaacgtga ccgtgaacgc cacctttatg 180 tacagcgacg gcctgatcca caacagcggc gactgtagaa gcagcacctg tgaaggactg 240 gacctgctgc ggaagatcag caacgcccag agaatgggct gtgtgctgat cggccctagc 300 tgcacctaca gcaccttcca gatgtacctg gacaccgagc tgagctaccc catgatcagc 360 gccggatctt tcggcctgag ctgcgactac aaagagacac tgacccggct gatgagcccc 420 gccagaaagc tgatgtactt cctggtcaac ttctggaaaa cgaacgacct gcctttcaag 480 acctacagct ggtccaccag ctacgtgtac aagaacggca ccgagacaga ggactgcttc 540 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gtaccgccag 120 gctccaggga agcagcgcga aatagtcgcg actatctatc ttagtggtcg cacaacgtat 180 agtgacgccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagga cacggtgtat 240 ctgcaaatga acagcctgaa acctgaggac acggccgtct attactgtaa tgcaggtgaa 300 cctacggcaa gttccgtccg tcagtactgg ggccagggga cccaggtcac cgtctcctca 360 gaacccaaga caccaaaacc a 381 <210> 16 <211> 381 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary VHH Domain - C27 (nucleic acid) <400> 16 atggaggtgc agctggtgga gtctggggga ggtttggtgc aacctggggg gtctctgaga 60 ctctcctgta caagctcttc aaacatcttc aaaatctatg gcatggactg gtaccgccag 120 gctccaggga aacagcgcga aatagtcgcg actatctatc ttagtggtcg cacaacgtat 180 agtgacgccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacggtgtat 240 ctgcaaatga acaccctgaa acctgaggac acggccgtct attactgtaa tgcaggtgaa 300 actacggcaa gttccgtccg tcaatactgg ggccagggga cccaggtcac cgtctcctca 360 gaacccaaga caccaaaacc a 381 <210> 17 <211> 381 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary VHH Domain - C30 (nucleic acid) 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gaacccaaga caccaaaacc a 381 <210> 19 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR Amino Acid Sequence of Exemplary VHH Domain - C08-CDR1 <400> 19 Ala Tyr Gly Met Gly 1 5 <210> 20 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR Amino Acid Sequence of Exemplary VHH Domain - C12-CDR1 <400> 20 Ala Tyr Gly Met Asp 1 5 <210> 21 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR Amino Acid Sequence of Exemplary VHH Domain - C13-CDR1 <400> 21 Ala Tyr Gly Met Asp 1 5 <210> 22 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR Amino Acid Sequence of Exemplary VHH Domain - C15-CDR1 <400> 22 Ala Tyr Gly Met Asp 1 5 <210> 23 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR Amino Acid Sequence of Exemplary VHH Domain - C21-CDR1 <400> 23 Ile Tyr Gly Met Asp 1 5 <210> 24 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR Amino Acid Sequence of Exemplary VHH Domain - C27-CDR1 <400> 24 Ile Tyr Gly Met Asp 1 5 <210> 25 <211> 5 <212> PRT 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of Exemplary VHH Domain - C15-CDR2 <400> 30 Thr Ile Trp Leu Ser Gly Arg Ser Thr Tyr Thr Asp Ala Val Gln Gly 1 5 10 15 <210> 31 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR Amino Acid Sequence of Exemplary VHH Domain - C21-CDR2 <400> 31 Thr Ile Tyr Leu Ser Gly Arg Thr Thr Tyr Ser Asp Ala Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 32 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR Amino Acid Sequence of Exemplary VHH Domain - C27-CDR2 <400> 32 Thr Ile Tyr Leu Ser Gly Arg Thr Thr Tyr Ser Asp Ala Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 33 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR Amino Acid Sequence of Exemplary VHH Domain - C30-CDR2 <400> 33 Ser Ile Phe Leu Ser Gly Arg Thr Asn Tyr Ala Asp Ala Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 34 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR Amino Acid Sequence of Exemplary VHH Domain - C31-CDR2 <400> 34 Ser Ile Trp Leu Ser Gly Arg Thr Asn Tyr Ala Asp Ala Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 35 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR Amino Acid Sequence of Exemplary VHH Domain - C08-CDR3 <400> 35 Gly Pro Pro Thr Ala Thr Ser Val Arg Gln Tyr 1 5 10 <210> 36 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR Amino Acid Sequence of Exemplary VHH Domain - C12-CDR3 <400> 36 Gly Pro Thr Thr Ala Ser Ser Val Arg Gln Tyr 1 5 10 <210> 37 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR Amino Acid Sequence of Exemplary VHH Domain - C13-CDR3 <400> 37 Gly Ala Pro Thr Ala Ser Ser Gly Arg Gln Tyr 1 5 10 <210> 38 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR Amino Acid Sequence of Exemplary VHH Domain - C15-CDR3 <400> 38 Gly Pro Thr Thr Ala Ser Ser Val Arg Gln Tyr 1 5 10 <210> 39 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR Amino Acid Sequence of Exemplary VHH Domain - C21-CDR3 <400> 39 Gly Glu Pro Thr Ala Ser Ser Val Arg Gln Tyr 1 5 10 <210> 40 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR Amino Acid Sequence of Exemplary VHH Domain - 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Artificial Sequence <220> <223> C27-CAR (nucleic acid) <400> 61 atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60 ccggaggtgc agctggtgga gtctggggga ggtttggtgc aacctggggg gtctctgaga 120 ctctcctgta caagctcttc aaacatcttc aaaatctatg gcatggactg gtaccgccag 180 gctccaggga aacagcgcga aatagtcgcg actatctatc ttagtggtcg cacaacgtat 240 agtgacgccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacggtgtat 300 ctgcaaatga acaccctgaa acctgaggac acggccgtct attactgtaa tgcaggtgaa 360 actacggcaa gttccgtccg tcaatactgg ggccagggga cccaggtcac cgtctcctca 420 gaacccaaga caccaaaacc aactagtacc acgacgccag cgccgcgacc accaacaccg 480 gcgcccacca tcgcgtcgca gcccctgtcc ctgcgcccag aggcgtgccg gccagcggcg 540 gggggcgcag tgcacacgag ggggctggac ttcgcctgtg atatctacat ctgggcgccc 600 ttggccggga cttgtggggt ccttctcctg tcactggtta tcacccttta ctgcaaacgg 660 ggcagaaaga aactcctgta tatattcaaa caaccattta tgagaccagt acaaactact 720 caagaggaag atggctgtag ctgccgattt ccagaagaag aagaaggagg atgtgaactg 780 agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 840 tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 900 cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaagaagg cctgtacaat 960 gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 1020 cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 1080 tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgctaa 1119 <210> 62 <211> 1119 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C30-CAR (nucleic acid) <400> 62 atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60 ccgcaggtgc agctggtgga gtctggggga ggcttggtgc agcctggggg gtctctgaga 120 ctctcctgtg cagcctctgg aagcatcttc agagtctatg gcatggactg gtaccgccag 180 gctccaggga agcagcgcga gttggtcgcg tctatttttc ttagtggtag gacaaactat 240 gcagacgccg tgaagggccg attcacgctc tccagagata acgccaagaa tactatgtat 300 ctgcaaatga acagcctgaa acctgaggac acggccgtct attattgtaa tgcaggtgaa 360 actacggcaa gttccgtccg tcaatactgg ggccagggga cccaggtcac cgtctcctca 420 gaacccaaga caccaaaacc aactagtacc acgacgccag cgccgcgacc accaacaccg 480 gcgcccacca tcgcgtcgca gcccctgtcc ctgcgcccag aggcgtgccg gccagcggcg 540 gggggcgcag tgcacacgag ggggctggac ttcgcctgtg atatctacat ctgggcgccc 600 ttggccggga cttgtggggt ccttctcctg tcactggtta tcacccttta ctgcaaacgg 660 ggcagaaaga aactcctgta tatattcaaa caaccattta tgagaccagt acaaactact 720 caagaggaag atggctgtag ctgccgattt ccagaagaag aagaaggagg atgtgaactg 780 agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 840 tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 900 cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaagaagg cctgtacaat 960 gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 1020 cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 1080 tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgctaa 1119 <210> 63 <211> 1119 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C31-CAR (nucleic acid) <400> 63 atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60 ccggcggtgc agctggtgga gtctggggga ggcttggtgc agcctggggg gtctctgaga 120 ctctcctgtg cagcctctgg aagcatcttc agagtctatg gcatggactg gtaccgccag 180 gctccaggga agcagcgcga gttggtcgcg tctatttggc ttagtggtag gacaaactat 240 gcagacgccg tgaagggccg attcacgctc tccagagata acgccaagaa tacgatgtat 300 ctgcaaatga acagcctgaa acctgaggac acggccgtct attattgtaa tgcaggtgaa 360 actacggcaa gttccgtccg tcaatactgg ggccagggga cccaggtcac catctcctcg 420 gaacccaaga caccaaaacc aactagtacc acgacgccag cgccgcgacc accaacaccg 480 gcgcccacca tcgcgtcgca gcccctgtcc ctgcgcccag aggcgtgccg gccagcggcg 540 gggggcgcag tgcacacgag ggggctggac ttcgcctgtg atatctacat ctgggcgccc 600 ttggccggga cttgtggggt ccttctcctg tcactggtta tcacccttta ctgcaaacgg 660 ggcagaaaga aactcctgta tatattcaaa caaccattta tgagaccagt acaaactact 720 caagaggaag atggctgtag ctgccgattt ccagaagaag aagaaggagg atgtgaactg 780 agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 840 tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 900 cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaagaagg cctgtacaat 960 gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 1020 cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 1080 tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgctaa 1119 <210> 64 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-GUCY2C single domain antibody (sdAb) - CDR1 <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> X is A, I or V <220> <221> VARIANT <222> (5)..(5) <223> X is D or G <400> 64 Xaa Tyr Gly Met Xaa 1 5 <210> 65 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-GUCY2C single domain antibody (sdAb) - CDR2 <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> X is A, S or T <220> <221> VARIANT <222> (3)..(3) <223> X is F, W or Y <220> <221> VARIANT <222> (8)..(8) <223> X is S or T <220> <221> VARIANT <222> (9)..(9) <223> X is E, N or T <220> <221> VARIANT <222> (11)..(11) <223> X is A, S or T <220> <221> VARIANT <222> (15)..(15) <223> X is K or Q <400> 65 Xaa Ile Xaa Leu Ser Gly Arg Xaa Xaa Tyr Xaa Asp Ala Val Xaa Gly 1 5 10 15 <210> 66 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-GUCY2C single domain antibody (sdAb) - CDR3 <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> X is A, E or P <220> <221> VARIANT <222> (3)..(3) <223> X is P or T <220> <221> VARIANT <222> (6)..(6) <223> X is S or T <220> <221> VARIANT <222> (8)..(8) <223> X is G or V <400> 66 Gly Xaa Xaa Thr Ala Xaa Ser Xaa Arg Gln Tyr 1 5 10

Claims (40)

  1. 항-GUCY2C 단일 도메인 항체(single domain antibody: sdAb)로서,
    (i) X1YGMX2의 아미노산 서열(여기서, X1은 A, I 또는 V이고, X2는 D 또는 G임)을 포함하는 CDR1(서열번호 64);
    (ii) X3IX4LSGRX5X6YX7DAVX8G의 아미노산 서열(여기서, X3은 A, S 또는 T이고; X4는 F, W 또는 Y이고; X5는 S 또는 T이고; X6은 E, N 또는 T이고; X7은 A, S 또는 T이고; X8은 K 또는 Q임)을 포함하는 CDR2(서열번호 65); 및
    (iii) GX9X10TAX11SX12RQY의 아미노산 서열(여기서, X9는 A, E 또는 P이고; X10은 P 또는 T이고; X11은 S 또는 T이고; 및 X12는 G 또는 V임)을 포함하는 CDR3(서열번호 66)
    을 포함하는, 항-GUCY2C sdAb.
  2. 제1항에 있어서, 상기 CDR1은 서열번호 19 내지 26으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고; CDR2는 서열번호 27 내지 34로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하며; CDR3은 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 항-GUCY2C sdAb.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    (i) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3;
    (ii) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3;
    (iii) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3;
    (iv) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3;
    (v) 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3;
    (vi) 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3;
    (vii) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는
    (viii) 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3
    을 포함하는, 항-GUCY2C sdAb.
  4. 항-GUCY2C 단일 도메인 항체(sdAb)로서,
    (i) 각각 서열번호 3에 제시된 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    (ii) 각각 서열번호 4에 제시된 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    (iii) 각각 서열번호 5에 제시된 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    (iv) 각각 서열번호 6에 제시된 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    (v) 각각 서열번호 7에 제시된 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    (vi) 각각 서열번호 8에 제시된 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    (vii) 각각 서열번호 9에 제시된 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3; 또는
    (viii) 각각 서열번호 10에 제시된 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3
    을 포함하는, 항-GUCY2C sdAb.
  5. 제4항에 있어서, 상기 CDR1, CDR2 또는 CDR3은 Kabat 넘버링 체계, IMGT 넘버링 체계, AbM 넘버링 체계, Chothia 넘버링 체계, Contact 넘버링 체계 또는 이들의 조합에 따라 결정된, 항-GUCY2C sdAb.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10 어느 하나에 제시된 바와 같은 하나 이상의 FR 영역을 추가로 포함하는, 항-GUCY2C sdAb.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는, 항-GUCY2C sdAb.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-GUCY2C sdAb는 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10 중 어느 하나의 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된, 항-GUCY2C sdAb.
  9. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-GUCY2C sdAb는 낙타과 sdAb인, 항-GUCY2C sdAb.
  10. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-GUCY2C sdAb는 인간화된 sdAb인, 항-GUCY2C sdAb.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-GUCY2C sdAb는 작용제에 유전적으로 융합되거나 또는 화학적으로 접합된, 항-GUCY2C sdAb.
  12. 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor: CAR)로서,
    (a) 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 항-GUCY2C sdAb를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인;
    (b) 막관통 도메인; 및
    (c) 세포내 신호전달 도메인
    을 포함하는, CAR.
  13. 제12항에 있어서, 상기 세포외 항원 결합 도메인은 하나 이상의 추가적인 항원 결합 도메인(들)을 추가로 포함하는, CAR.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 막관통 도메인은 CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 및 PD1로 이루어진 군으로부터 선택된 분자로부터 유래된, CAR.
  15. 제14항에 있어서, 상기 막관통 도메인은 CD8α로부터 유래된, CAR.
  16. 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 면역 효과기 세포의 1차 세포내 신호전달 도메인을 포함하는, CAR.
  17. 제16항에 있어서, 상기 1차 세포내 신호전달 도메인은 CD3ξ로부터 유래된, CAR.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 공동 자극성 신호전달 도메인을 추가로 포함하는, CAR.
  19. 제18항에 있어서, 상기 공동 자극성 신호전달 도메인은 CD27, CD28, CD137(4-1BB), OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83의 리간드 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 공동 자극성 분자로부터 유래된, CAR.
  20. 제20항에 있어서, 상기 공동 자극성 신호전달 도메인은 CD137로부터 유래된, CAR.
  21. 제12항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포외 항원 결합 도메인의 C-말단과 상기 막관통 도메인의 N-말단 사이에 위치한 힌지 도메인을 추가로 포함하는, CAR.
  22. 제21항에 있어서, 상기 힌지 도메인은 CD8α로부터 유래된, CAR.
  23. 제12항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드의 N-말단에 위치한 신호 펩타이드를 추가로 포함하는, CAR.
  24. 제23항에 있어서, 상기 신호 펩타이드는 CD8α로부터 유래된, CAR.
  25. 키메라 항원 수용체(CAR)로서, (i) 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51, 서열번호 52, 서열번호 53, 서열번호 54 및 서열번호 55로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열; 또는 (ii) 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51, 서열번호 52, 서열번호 53, 서열번호 54 및 서열번호 55 중 어느 하나의 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, CAR.
  26. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 항-GUCY2C sdAb를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산.
  27. 제26항에 있어서, 상기 단리된 핵산은 서열번호 11 내지 18의 핵산 서열을 포함하는, 단리된 핵산.
  28. 제27항의 단리된 핵산을 포함하는 벡터.
  29. 제14항 내지 제25항 중 어느 하나의 키메라 항원 수용체를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산.
  30. 제29항에 있어서, 상기 단리된 핵산은 서열번호 56 내지 63의 핵산 서열을 포함하는, 단리된 핵산.
  31. 제30항의 단리된 핵산을 포함하는 벡터.
  32. 제14항 내지 제25항 중 어느 하나의 CAR, 제29항 또는 제30항의 단리된 핵산 또는 제31항의 벡터를 포함하는 조작된 면역 효과기 세포.
  33. 제32항에 있어서, 상기 면역 효과기 세포는 T 세포인, 조작된 면역 효과기 세포.
  34. 약제학적 조성물로서, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 항-GUCY2C sdAb, 제32항 또는 제33항의 조작된 면역 효과기 세포 또는 제28항 또는 제31항의 벡터 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는, 약제학적 조성물.
  35. 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법으로서, 유효량의 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 항-GUCY2C sdAb, 제32항 또는 제33항의 조작된 면역 효과기 세포 또는 제34항의 약제학적 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 질환 또는 장애는 GUCY2C 관련 질환 또는 장애인, 방법.
  37. 제35항에 있어서, 상기 질환 또는 장애는 암인, 방법.
  38. 제36항에 있어서, 상기 질환 또는 장애는 결장직장암인, 방법.
  39. 제36항에 있어서, 상기 질환 또는 장애는 위암인, 방법.
  40. 제36항에 있어서, 상기 질환 또는 장애는 식도암인, 방법.
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