CN112062854B

CN112062854B - 用于治疗肠癌的双特异性融合蛋白抗体及其应用

Info

Publication number: CN112062854B
Application number: CN202010831202.6A
Authority: CN
Inventors: 方维佳; 涂晓璇; 姚航平
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2020-08-18
Filing date: 2020-08-18
Publication date: 2022-03-22
Anticipated expiration: 2040-08-18
Also published as: CN112062854A

Abstract

本发明公开了用于治疗肠癌的双特异性融合蛋白抗体及其应用。本发明双特异性融合蛋白抗体一条链为肠癌特异性抗原GUCY2C抗体，可与肠癌细胞特异性结合，其另一条链是ULBP2(NKG2D配体)，可与NKs表面NKG2D活化受体结合。本发明的有益效果主要体现在：本发明对于肠癌双特异性抗体的研发，将极大的丰富晚期难治性肠癌的内科治疗手段，并可能极大的降低药物副反应和治疗的精准性；本发明双特异性融合蛋白抗体，可将NK活化并定位至肿瘤细胞，使得NK的肿瘤杀伤效率极大的提高，丰富了难治性肠癌的治疗手段。

Description

用于治疗肠癌的双特异性融合蛋白抗体及其应用

(一)技术领域

本发明涉及用于治疗肠癌的双特异性融合蛋白抗体及其应用。

(二)背景技术

自然杀伤细胞(Natural Killer Cells，NK细胞)作为血液中的单个核细胞中的一种，是人体先天免疫的核心组成部分，分布于外周各淋巴器官及血液循环系统，其主要功能是参与机体先天性免疫应答；同时在免疫调节中也发挥重要的作用，它无需抗原的刺激与活化即可发挥细胞毒效应；NK细胞的靶细胞主要包括：肿瘤细胞、病毒感染细胞、某些自身组织衰老细胞和细菌、寄生虫等，因此，NK细胞是机体抗肿瘤、抗感染的重要免疫因素；此外，NK细胞还参与第Ⅱ型超敏反应和抑制物抗宿主反应。

目前对NK细胞功能成熟和细胞毒活性的研究主要从它对NK细胞表面功能性受体的改变和NK细胞分泌效应因子的能力等方面来观察；IL-21可以明显地刺激NK细胞表面或滑行受体NKG2D分子的表达上调，从而激活NK细胞，协同低剂量IL-2显著地增强细胞增殖速率及毒活性。

4-1BB(CD137)是神经生长因子受体/肿瘤坏死因子受体家族成员之一，通过胞浆末尾区的聚集，与肿瘤坏死因子受体相关因子2(TRAF2)交流，依次活化ASK-1、JNK/SAPK或p38 MAP，启动级联放大效应，促进NK等免疫细胞活化、增殖、分化，调高杀伤肿瘤的活性。

双特异抗体是含有两种或多种特异性抗原结合位点的人工抗体，能在靶细胞和功能分子或细胞之间架起桥梁，激发具有导向性的免疫反应，在肿瘤等疾病治疗中表现出潜在价值。美国安进公司的新型靶向CD19和CD3的双特异性抗体Blincyto的上市，是对双特异性抗体产业的一个极大的鼓舞，该药被批准用于费城染色体阴性的复发或耐药急性淋巴母细胞性白血病的二线治疗，技术上归属于系列合成单抗，即T细胞双特异性单抗家族(BiTEs)。

双特异IgG抗体产生中的主要挑战就是轻、重链的正确连接，而以往最原始的方式是轻、重链随机合成非对称的异源二聚体IgG抗体，容易产生多种不需要的副产品；Knobs-into-holes(KiH)方法的使用解决了重链异二聚体的正确连结，但双抗轻链的正确连结仍未得到有效解决；此时，CrossMAb技术应运而生了！该技术基于双特异IgG抗体Fab臂功能域的交换而达成目的，解决了轻链连接的问题，而重链的正确结可利用KiH、静电转向技术达成。

实践证明CrossMAb已经成了具有广泛用途的抗体工程技术之一，可用于多种形式双特异抗体的构建，多项临床研究成功验证了该方法的可靠性，有4种独特设计的双特异抗体已经进入了I/II期临床试验，其中CEA TCB就是运用靶向肠癌特异性CEA抗原以及连接CD3抗体，来吸引更多淋巴毒T细胞靶向肠癌进行针对性的杀伤，临床试验已提示该双抗与PDL1单抗联合使用可显著提高难治性肠癌的疗效。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种可将NK活化并定位至肿瘤细胞，使得NK的肿瘤杀伤效率极大的提高的双特异性融合蛋白抗体，及其在制备治疗肠癌的药物中的应用。

本发明采用的技术方案是：

一种用于治疗肠癌的双特异性融合蛋白抗体，其一条链为肠癌特异性抗原GUCY2C抗体，另一条链为ULBP2。

本发明双特异性融合蛋白抗体一条链为肠癌特异性抗原GUCY2C抗体，可与肠癌细胞特异性结合，其另一条链是ULBP2(NKG2D配体)，可与NKs表面NKG2D活化受体结合。前期研究显示NKG2D受体激活后可“越过”MHC抑制效应对靶细胞进行杀伤，通过双特异性融合蛋白抗体，可将NK活化并定位至肿瘤细胞，使得NK的肿瘤杀伤效率极大的提高。本发明双抗起到的是桥梁的作用，形成免疫突触，同时可介导抗体依赖细胞介导的细胞毒性(ADCC)等生物效应，对NK细胞杀伤肿瘤有增益效果。

所述的双特异性融合蛋白抗体，由如下方法制得：

(1)将ULBP2-Ig Kappa轻链、重链及肠癌特异性蛋白GUCY2C相关抗体的可变区，分别连接到真核表达载体pATX2，以1:1:1:1配比与人悬浮胚胎肾细胞293F共转染，在293F表达系统中的表达，依靠CROSS MAB 技术，表达的氨基酸片段通过功能域的交换自动拼合成GUCY2C-NKG2D双特异性抗体。

(2)利用细胞工厂小批量转染293F细胞的方式表达双特异性抗体通过凝胶过滤、亲和层析、离子交换层析方式进行纯化，得到所述双特异性融合蛋白抗体。

所述ULBP2-Ig Kappa轻链核苷酸序列如SEQ ID No.4所示(编码SEQ ID No.5所示氨基酸)，所述重链核苷酸序列如SEQ ID No.2所示(编码SEQ ID No.6 所示氨基酸)，所述肠癌特异性抗原GUCY2C抗体的可变区核苷酸序列如SEQ ID No.3(编码SEQ ID No.7所示氨基酸)和SEQ ID No.1(编码SEQ ID No.8所示氨基酸)所示。

SEQ ID No.1序列如下：

>VL-MS7-CH1-725bp

GAATTCGCCGCCACCATGGAGACCGATACCCTGCTGCTGTGGGTGCT GCTGCTGTGGGTCCCTGGCAGCACCGGCGACGACATCCTGATGACACAGA GCCCTAGCAGCATGTACGCCTCCCTGGGCGAGAGGGTGACAATCACCTGC AAGGCCAGCCACGACATCAAGTCCTACCTGAGCTGGTACCAGCAGAAGC CTTGGAGGTCCCCTAAGACACTGATCTACTACACCACCGCCCTGGCCGAT GGCGTGCCCTCTAGATTCAGCGGCAGCGGCTCCGGCCAGGACTACAGCCT GACAATCTCCAGCCTGGAGAGCGATGATACCGCCACATACTACTGTCTGC AGCACGGCGAGAGCCCCTACACCTTTGGCGGCGGCACCAAGCTGGAGAT CAAGAGCAGCGCCAGCACAAAGGGCCCTTCCGTGTTCCCCCTGGCCCCCT CTTCCAAGTCCACAAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGATGTCTGGTGAAG GATTACTTCCCCGAGCCTGTGACCGTGAGCTGGAATAGCGGCGCCCTGAC AAGCGGCGTGCACACATTTCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACA GCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCTCCAGCCTGGGCACCCAGACA TACATCTGCAATGTGAACCACAAGCCCAGCAATACAAAGGTGGATAAGA AGGTGGAGCCTAAGTCCTGTTGAGCGGCCGC

SEQ ID No.2序列如下：

>VH-KYK2.0-CH1-hinge-CH2-CH3(S354C-T366W)-1436bp

GAATTCGCCGCCACCATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTCCTGGTG GCCACCGCCACCGGCGTGCACTCTCAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGCG GCGGACTGGTGAAGCCTGGCGGATCCCTGAGACTGTCCTGCGCCGCCAGC GGCTTTACCTTTAGCAGCTACGGCATGCACTGGGTGAGGCAGGCCCCCGG AAAGGGCCTGGAGTGGGTGGCTTTCATCAGATACGACGGCAGCAACAAG TACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACAATCAGCAGAGACAATT CCAAGAACACAAAGTACCTGCAGATGAATAGCCTGAGAGCCGAGGACAC AGCCGTGTACTACTGCGCCAAGGACAGAGGCCTGGGCGACGGCACCTAC TTTGACTACTGGGGCCAGGGCACCACAGTGACAGTGAGCAGCGCCTCCAC CAAGGGCCCTAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCTCTTCCAAGAGCACCAGCG GCGGCACAGCCGCCCTGGGATGTCTGGTGAAGGATTACTTTCCCGAGCCT GTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGCGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACATT CCCTGCCGTGCTGCAGAGCTCCGGCCTGTACTCCCTGTCCAGCGTGGTGA CCGTGCCTTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAAT CACAAGCCTAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGGGTGGAGCCCAAGAGCT GCGATAAGACCCACACATGTCCCCCTTGCCCCGCCCCTGAGCTGCTGGGA GGACCTTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGAT CTCCAGAACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGG ACCCTGAGGTGAAGTTTAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAA CGCCAAGACAAAGCCCAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGAGTG GTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGT ACAAGTGCAAGGTGAGCAATAAGGCCCTGCCCGCCCCCATCGAGAAGAC CATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAGCCTCAGGTGTACACCCTG CCTCCTTGTAGAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGTGGTGTCT GGTGAAAGGCTTCTACCCCAGCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAATG GCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACAACCCCTCCCGTGCTGGACAGCGA CGGCTCCTTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACAGTGGATAAGAGCAGATGGC AGCAGGGCAATGTGTTCTCCTGTTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAAC CACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGAGCCCCGGCAAGTGAGCGGCCG C

SEQ ID No.3序列如下：

>VH-MS7-CK-hinge-CH2-CH3 Y349C-T366S-L368A-Y407V-1448bp

GAATTCGCCGCCACCATGGGCTGGAGCTGCATCATCCTGTTCCTGGT GGCCACAGCCACCGGCGTGCACAGCGAGGTCATGCTGGTGGAGAGCGGC GGCGGCCTGGTGAAGCCAGGAGGATCCCTGAAGCTGAGCTGTGCCGCCA GCGGCTTCACATTCAGCACATACGCCATGAGCTGGGTGAGGCAGACCCCT GAGAAGAGACTGGAGTGGGTGGCCACCATCACAAGCGGCGGCTCCTACA CATACTACCCCGATTCCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGAGATAAC GCCAAGAATATCCTGTACCTGCAGATGTCCTCCCTGAGATCCGAGGATAC CGCCATGTACTACTGTACCAGGCTGAGACAGATCGGCCTGAGGGGCTTCA GCGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCCTGACAGTGTCCTCCGCCAGCGTG GCCGCCCCTTCTGTGTTCATCTTCCCTCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAG CGGCACCGCCTCCGTGGTGTGCCTGCTGAATAATTTCTACCCCAGAGAGG CCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCA GGAGTCCGTGACAGAGCAGGACTCCAAGGACAGCACATACAGCCTGAGC TCCACCCTGACCCTGTCCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGC CTGCGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCTGTGACCAAGTCCTTCA ATAGAGGCGAGTGCGACAAGACACACACCTGCCCCCCTTGCCCTGCCCCT GAGCTGCTGGGAGGCCCTTCCGTGTTCCTGTTTCCTCCCAAGCCCAAGGA CACCCTGATGATCTCCAGGACACCCGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGACG TGTCCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTG GAGGTGCACAACGCCAAGACAAAGCCTAGAGAGGAGCAGTACAATTCCA CCTACAGAGTGGTGAGCGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAAC GGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGAGCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCCA TCGAGAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAGCCTCAGGT GTGTACACTGCCTCCCAGCAGGGAGGAGATGACAAAGAATCAGGTGTCC CTGAGCTGTGCTGTGAAGGGCTTCTACCCTAGCGACATCGCCGTGGAGTG GGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAATAACTACAAGACCACCCCTCCCGTG CTGGACTCCGACGGCAGCTTTTTCCTGGTGAGCAAGCTGACCGTGGATAA GTCCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGG CCCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTGTCCCTGTCCCCTGGCAAG TGAGCGGCCGC

SEQ ID No.4序列如下：

>VL-KYK2.0-CK-737bp

GAATTCGCCGCCACCATGGAGACCGATACCCTGCTGCTGTGGGTGCT GCTGCTGTGGGTCCCTGGCTCCACAGGCGACCAGAGCGCCCTGACACAGC CCGCTTCCGTGTCCGGCTCCCCCGGACAATCCATCACCATCTCCTGCTCCG GCTCCTCCAGCAATATCGGCAACAATGCCGTGAATTGGTACCAGCAGCTG CCTGGCAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTACTACGACGATCTGCTGCCTTC CGGCGTGAGCGACAGGTTCTCCGGCTCCAAGAGCGGCACCAGCGCCTTTC TGGCCATCAGCGGCCTGCAGTCCGAGGATGAGGCCGACTACTACTGCGCC GCCTGGGACGATAGCCTGAACGGCCCTGTGTTCGGCGGCGGCACAAAGCT GACCGTGCTGGGCCAGCCTAAGGCCGCCCCTAGCGTGACACTGTTCCCCC CTTCCAGCGAGGAGCTGCAGGCCAATAAGGCCACACTGGTGTGCCTGGTG TCCGACTTCTACCCTGGCGCCGTGACCGTGGCCTGGAAGGCTGATGGCTC CCCTGTGAAGGTGGGCGTGGAGACCACAAAGCCTTCCAAGCAGAGCAAT AATAAGTACGCCGCCTCCTCCTACCTGAGCCTGACACCTGAGCAGTGGAA GTCCCACAGGTCCTACAGCTGCAGGGTGACACACGAGGGCAGCACCGTG GAGAAGACAGTGGCCCCCGCCGAGTGTTCCTGAGCGGCCGC

SEQ ID No.5序列如下：

>VL-KYK2.0-CK(237AAs；24.94kDa)

METDTLLLWVLLLWVPGSTGDQSALTQPASVSGSPGQSITISCSGSSSNI GNNAVNWYQQLPGKAPKLLIYYDDLLPSGVSDRFSGSKSGTSAFLAISGLQS EDEADYYCAAWDDSLNGPVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQAN KATLVCLVSDFYPGAVTVAWKADGSPVKVGVETTKPSKQSNNKYAASSYLS LTPEQWKSHRSYSCRVTHEGSTVEKTVAPAECS

Features:SIP[1:21]

SEQ ID No.6序列如下：

>VH-KYK2.0-CH1-hinge-CH2-CH3(S354C-T366W)(470Aas；51.47kDa)

MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFS SYGMHWVRQAPGKGLEWVAFIRYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTKY LQMNSLRAEDTAVYYCAKDRGLGDGTYFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVF PLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPA PELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEK TISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGK

Features:SIP[1:19]

SEQ ID No.7序列如下：

>VH-MS7-CK-hinge-CH2-CH3 Y349C-T366S-L368A-Y407V(474AAs； 52.34kDa)

MGWSCIILFLVATATGVHSEVMLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFS TYAMSWVRQTPEKRLEWVATITSGGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNILYLQ MSSLRSEDTAMYYCTRLRQIGLRGFSDYWGQGTTLTVSSASVAAPSVFIFPPS DEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDST YSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECDKTHTCPPCP APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGV EVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE KTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHY TQKSLSLSPGK

Features:SIP[1:19]

SEQ ID No.8序列如下：

>VL-MS7-CH1(233AAs；24.85kDa)

METDTLLLWVLLLWVPGSTGDDILMTQSPSSMYASLGERVTITCKASHD IKSYLSWYQQKPWRSPKTLIYYTTALADGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLESD DTATYYCLQHGESPYTFGGGTKLEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC

Features:SIP[1:21]

本发明还涉及所述双特异性融合蛋白抗体在制备治疗肠癌的药物中的应用。

具体的，本发明双特异性融合蛋白抗体可与NK细胞联用。异体T细胞与人类白细胞抗原(HLA)复合物相互作用可能导致致命的移植物抗宿主病，但是NK细胞与HLA的互作要小得多，因此双抗联合NK细胞疗法不会产生严重的副反应。

本发明的有益效果主要体现在：

(1)本发明对于肠癌双特异性抗体的研发，将极大的丰富晚期难治性肠癌的内科治疗手段，并可能极大的降低药物副反应和治疗的精准性；

(2)本发明双特异性融合蛋白抗体，可将NK活化并定位至肿瘤细胞，使得 NK的肿瘤杀伤效率极大的提高，丰富了难治性肠癌的治疗手段。

(四)附图说明

图1为抗GCC/NKG2D双抗在人悬浮胚胎肾细胞293细胞中的表达 SDS-PAGE分析图；说明：MW为分子量参照物，

为阴性对照。

图2为抗GCC/NKG2D双抗100ml量级的表达纯化效果SDS-PAGE分析图；说明：MW为分子量参照物，IN为输入液，FT为滤液，W为冲洗液，E2 至E11为进行缓冲液交换和浓缩后的产品

图3为最终抗GCC/NKG2D双抗质控图；说明：Non-reduced为未变性蛋白， Reduced为变性蛋白。

图4为抗GCC/NKG2D双抗检测人NK细胞NKG2D抗原蛋白表达流式峰图；说明：L1空白对照；L2同型对照；L3Alexa Fluor 488标记的荧光二抗(双抗2.5ug/ml)；L4 Alexa Fluor488标记的荧光二抗(双抗5ug/ml)。

图5为抗GCC/NKG2D双抗对Caco-2癌细胞增殖活性的影响。

图6为抗GCC/NKG2D双抗在小鼠体内MTD毒性试验结果。

(五)具体实施方式

为了加深对本发明的理解，下面将结合具体实施例对本发明做进一步详细描述，该实施例仅用于解释本发明，并不对本发明的保护范围构成限定。

实施例1：

1、抗GCC/NKG2D双抗表达载体的构建及抗体蛋白的表达纯化

1.1抗GCC/NKG2D双抗表达载体的构建及验证

将ULBP2-Ig Kappa轻链>VL-KYK2.0-CK-737bp、重链 VH-KYK2.0-CH1-hinge-CH2-CH3-1436bp及肠癌特异性蛋白GUCY2C相关抗体的可变区>VH-MS7-CK-hinge-CH2-CH3Y349C-T366S-L368A-Y407V-1448bp 和>VL-MS7-CH1-725bp，分别连接到真核表达载体pATX2，然后人悬浮胚胎肾细胞293F表达系统中的表达和纯化。具体为将H-KYK2.0-CH1-hinge-CH2-CH3-pATX2，VL-KYK2.0-CK-pATX2， VH-MS7-CK-hinge-CH2-CH3-pATX2和VL-MS7-CH1-pATX2以1:1:1:1配比与 293F细胞共转染.然后收获细胞与培养基。依靠CROSSMAB技术，表达的氨基酸片段将通过功能域的交换自动拼合成GUCY2C-NKG2D双特异性抗体。因此通过小量转染293F细胞对构建表达的NKG2DL(ULBP2)-GUCY2C进行验证。采用聚丙烯凝胶电泳联合检测分析双特异性抗体的表达情况。

结果见图1，显示双抗在人悬浮胚胎肾细胞293细胞中稳定表达。

1.2抗GCC/NKG2D双抗的表达纯化

利用细胞工厂转染100ml 293F细胞的方式表达一批双特异性抗体，通过 ProteinG resin凝胶层析柱亲和层析，ph＝5的TBS洗涤后，用0.1M Glycine pH 3.0 洗脱，用1MTris-HCl，pH 8.5缓冲液进行中和纯化，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳方式分析抗体的表达量及纯化效果。

结果见图2，显示双抗100ml量级的表达纯化效果仍佳。同时验证纯化后的双特异性抗体与肠癌细胞的结合情况及对于NK细胞刺激效果。通过筛选稳定细胞株的方式，获得高效表达双特异性抗体的稳转细胞株，为后续抗体的大量生产做准备。

1.3抗GCC/NKG2D双抗的质量控制

将得到的2ug双抗和变性后的2ug双抗进行丙烯凝胶电泳，结果见图3，结果说明得到的双抗与构建的分子量一致，其轻链及重链也与原先NKG2DL (ULBP2)、GUCY2C分子量一致，最终抗GCC/NKG2D双抗有良好的质量控制。

2、抗GCC/NKG2D双抗亲和力的鉴定

采用生物传感器测定双特异性抗体对于NK细胞特异性蛋白NKG2D及肠癌细胞特异性抗原GUCY2C的亲和力，并且分析其对于两种蛋白的亲和力差异。根据亲和力的差异指导抗体在结合NK细胞时的抗体用量。流式细胞检测峰图显示，Caco-2肠癌细胞株与双抗作用后结合效应明显，并且2.5ug/ml的双抗浓度可达到与5.0ug/ml相同的结合效应，故后续双抗推荐使用浓度为2.0～2.5ug/ml。同样的，流式峰图显示本发明合成的双抗能与人外周血分离纯化的NK细胞具有良好的反应性。

实施例2：

2.1使用抗GCC/NKG2D双抗检测人NK细胞NKG2D抗原蛋白表达

人外周血分离纯化的NK细胞，用PBS调准细胞浓度2×10⁶/ml。取0.1ml 细胞，加入抗GCC-NKG2D双抗(人源化)，终浓度分别为2.5ug/ml和5ug/ml，室温反应1小时。用PBS(含5％FCS和0.1％NaN₃)细胞3次后，加入100μL Goat anti-Human IgG(H+L)Cross-AdsorbedSecondary Antibody,Alexa Fluor 488(1:400,5ug/ml)(Molecular Probes,Cat#A-11013)荧光标记的二抗，荧光二抗终浓度5ug/mL，避光反应30min。用PBS(含5％FCS和0.1％NaN3) 洗细胞3次后，流式细胞仪(BD Canto II)检测。

结果见图4，显示双抗能与人外周血分离纯化的NK细胞具有良好的反应性。

2.2双抗抗结肠癌细胞的生物功能鉴定

(1)癌细胞增殖活性检测：

癌细胞系：Caco-2(GCC-Positive)

人NK细胞：临床分离纯化

试剂盒：CCK8

方法：取5000个癌细胞铺在96孔板中，培养2小时待细胞粘壁后，加不同效靶比例的NK细胞(NK:cancer cell分别为1:1，2:1，5:1，10:1，20:1)，同时加入双抗体终浓度为1、2μg/ml。同时设有正常人IgG对照组(2μg/ml)，共培养24、48、72小时后，分别用CCK8检测细胞活力。

双抗对Caco-2癌细胞增殖活性的影响参见图5，结果显示，加用双抗的 Caco-2在双抗和NK细胞的共同作用下，随着时间的推移，出现了增殖活性的最大抑制，提示本发明获得的双特异性抗体可特异性结合靶向肿瘤细胞和NK 细胞，并获得更好的抑制肿瘤效应，在相同的效应细胞(NK细胞)：靶细胞比例下，加入双抗抗体对肿瘤细胞杀伤有增效效果。

2.3双抗在小鼠体内的毒性测定

评价药物双抗在Balb/c小鼠上的MTD的研究。

方法：

1.实验动物：Bal b/c小鼠，雌性，6～8周龄，体重约18～20g，6只。

2.实验分组：按照小鼠体重进行分组(每组3只)，A组按小鼠体重给予 6.25mg/kg双抗腹腔注射，每周2次。B组按小鼠体重给予12.5mg/kg双抗腹腔注射，每周2次。

3.实验观察：实验动物在治疗后，每天进行观察，记录其发病和死亡等。对所有的实验动物进行行为、进食、摄水、体重改变、毛发光泽和其他一些异常情况的监测。所有小鼠每天测量体重。同时计算给药后小鼠体重增长变化率：体重变化用公式RCBW％＝(BWi–BW0)/BW0×100％，BWi是小鼠当前体重， BW0是分组当日的小鼠体重；

4.实验终止：当小鼠体重下降超过20％，将进行安乐死处理。

双抗在小鼠体内的毒性测定见图6，结果显示，双抗在6.25mg/kg和12.5 mg/kg剂量下均无明显毒性，能够被机体耐受，安全性高。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 用于治疗肠癌的双特异性融合蛋白抗体及其应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 725

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

gaattcgccg ccaccatgga gaccgatacc ctgctgctgt gggtgctgct gctgtgggtc 60

cctggcagca ccggcgacga catcctgatg acacagagcc ctagcagcat gtacgcctcc 120

ctgggcgaga gggtgacaat cacctgcaag gccagccacg acatcaagtc ctacctgagc 180

tggtaccagc agaagccttg gaggtcccct aagacactga tctactacac caccgccctg 240

gccgatggcg tgccctctag attcagcggc agcggctccg gccaggacta cagcctgaca 300

atctccagcc tggagagcga tgataccgcc acatactact gtctgcagca cggcgagagc 360

ccctacacct ttggcggcgg caccaagctg gagatcaaga gcagcgccag cacaaagggc 420

ccttccgtgt tccccctggc cccctcttcc aagtccacaa gcggcggcac agccgccctg 480

ggatgtctgg tgaaggatta cttccccgag cctgtgaccg tgagctggaa tagcggcgcc 540

ctgacaagcg gcgtgcacac atttcccgcc gtgctgcaga gcagcggcct gtacagcctg 600

agcagcgtgg tgaccgtgcc cagctccagc ctgggcaccc agacatacat ctgcaatgtg 660

aaccacaagc ccagcaatac aaaggtggat aagaaggtgg agcctaagtc ctgttgagcg 720

gccgc 725

<210> 2

<211> 1436

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

gaattcgccg ccaccatggg ctggtcctgc atcatcctgt tcctggtggc caccgccacc 60

ggcgtgcact ctcaggtgca gctggtggag agcggcggcg gactggtgaa gcctggcgga 120

tccctgagac tgtcctgcgc cgccagcggc tttaccttta gcagctacgg catgcactgg 180

gtgaggcagg cccccggaaa gggcctggag tgggtggctt tcatcagata cgacggcagc 240

aacaagtact acgccgacag cgtgaagggc aggttcacaa tcagcagaga caattccaag 300

aacacaaagt acctgcagat gaatagcctg agagccgagg acacagccgt gtactactgc 360

gccaaggaca gaggcctggg cgacggcacc tactttgact actggggcca gggcaccaca 420

gtgacagtga gcagcgcctc caccaagggc cctagcgtgt tccccctggc cccctcttcc 480

aagagcacca gcggcggcac agccgccctg ggatgtctgg tgaaggatta ctttcccgag 540

cctgtgaccg tgtcctggaa cagcggcgcc ctgacctccg gcgtgcacac attccctgcc 600

gtgctgcaga gctccggcct gtactccctg tccagcgtgg tgaccgtgcc ttccagcagc 660

ctgggcaccc agacctacat ctgtaacgtg aatcacaagc ctagcaacac caaggtggac 720

aagagggtgg agcccaagag ctgcgataag acccacacat gtcccccttg ccccgcccct 780

gagctgctgg gaggaccttc cgtgttcctg ttccccccca agcccaagga caccctgatg 840

atctccagaa cccccgaggt gacctgcgtg gtggtggacg tgtcccacga ggaccctgag 900

gtgaagttta actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcaca acgccaagac aaagcccaga 960

gaggagcagt acaacagcac ctacagagtg gtgagcgtgc tgaccgtgct gcaccaggac 1020

tggctgaacg gcaaggagta caagtgcaag gtgagcaata aggccctgcc cgcccccatc 1080

gagaagacca tcagcaaggc caagggccag cccagggagc ctcaggtgta caccctgcct 1140

ccttgtagag aggagatgac caagaaccag gtgtccctgt ggtgtctggt gaaaggcttc 1200

taccccagcg atatcgccgt ggagtgggag tccaatggcc agcctgagaa caactacaag 1260

acaacccctc ccgtgctgga cagcgacggc tccttcttcc tgtactccaa gctgacagtg 1320

gataagagca gatggcagca gggcaatgtg ttctcctgtt ccgtgatgca cgaggccctg 1380

cacaaccact acacccagaa gtccctgagc ctgagccccg gcaagtgagc ggccgc 1436

<210> 3

<211> 1448

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 3

gaattcgccg ccaccatggg ctggagctgc atcatcctgt tcctggtggc cacagccacc 60

ggcgtgcaca gcgaggtcat gctggtggag agcggcggcg gcctggtgaa gccaggagga 120

tccctgaagc tgagctgtgc cgccagcggc ttcacattca gcacatacgc catgagctgg 180

gtgaggcaga cccctgagaa gagactggag tgggtggcca ccatcacaag cggcggctcc 240

tacacatact accccgattc cgtgaagggc aggttcacca tcagcagaga taacgccaag 300

aatatcctgt acctgcagat gtcctccctg agatccgagg ataccgccat gtactactgt 360

accaggctga gacagatcgg cctgaggggc ttcagcgact actggggcca gggcaccacc 420

ctgacagtgt cctccgccag cgtggccgcc ccttctgtgt tcatcttccc tcccagcgat 480

gagcagctga agagcggcac cgcctccgtg gtgtgcctgc tgaataattt ctaccccaga 540

gaggccaagg tgcagtggaa ggtggacaac gccctgcaga gcggcaacag ccaggagtcc 600

gtgacagagc aggactccaa ggacagcaca tacagcctga gctccaccct gaccctgtcc 660

aaggccgact acgagaagca caaggtgtac gcctgcgagg tgacccacca gggcctgtcc 720

agccctgtga ccaagtcctt caatagaggc gagtgcgaca agacacacac ctgcccccct 780

tgccctgccc ctgagctgct gggaggccct tccgtgttcc tgtttcctcc caagcccaag 840

gacaccctga tgatctccag gacacccgag gtgacatgcg tggtggtgga cgtgtcccac 900

gaggaccctg aggtgaagtt caactggtac gtggacggcg tggaggtgca caacgccaag 960

acaaagccta gagaggagca gtacaattcc acctacagag tggtgagcgt gctgacagtg 1020

ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag tacaagtgta aggtgagcaa caaggccctg 1080

cctgccccca tcgagaagac catctccaag gccaagggcc agcccaggga gcctcaggtg 1140

tgtacactgc ctcccagcag ggaggagatg acaaagaatc aggtgtccct gagctgtgct 1200

gtgaagggct tctaccctag cgacatcgcc gtggagtggg agagcaacgg ccagcccgag 1260

aataactaca agaccacccc tcccgtgctg gactccgacg gcagcttttt cctggtgagc 1320

aagctgaccg tggataagtc cagatggcag cagggcaacg tgttcagctg ctccgtgatg 1380

cacgaggccc tgcacaacca ctacacacag aagagcctgt ccctgtcccc tggcaagtga 1440

gcggccgc 1448

<210> 4

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<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

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gaattcgccg ccaccatgga gaccgatacc ctgctgctgt gggtgctgct gctgtgggtc 60

cctggctcca caggcgacca gagcgccctg acacagcccg cttccgtgtc cggctccccc 120

ggacaatcca tcaccatctc ctgctccggc tcctccagca atatcggcaa caatgccgtg 180

aattggtacc agcagctgcc tggcaaggcc cctaagctgc tgatctacta cgacgatctg 240

ctgccttccg gcgtgagcga caggttctcc ggctccaaga gcggcaccag cgcctttctg 300

gccatcagcg gcctgcagtc cgaggatgag gccgactact actgcgccgc ctgggacgat 360

agcctgaacg gccctgtgtt cggcggcggc acaaagctga ccgtgctggg ccagcctaag 420

gccgccccta gcgtgacact gttcccccct tccagcgagg agctgcaggc caataaggcc 480

acactggtgt gcctggtgtc cgacttctac cctggcgccg tgaccgtggc ctggaaggct 540

gatggctccc ctgtgaaggt gggcgtggag accacaaagc cttccaagca gagcaataat 600

aagtacgccg cctcctccta cctgagcctg acacctgagc agtggaagtc ccacaggtcc 660

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tgttcctgag cggccgc 737

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<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

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Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser

20 25 30

Gly Ser Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser

35 40 45

Asn Ile Gly Asn Asn Ala Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Lys

50 55 60

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Asp Asp Leu Leu Pro Ser Gly Val

65 70 75 80

Ser Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Phe Leu Ala

85 90 95

Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala

100 105 110

Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu

115 120 125

Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro

130 135 140

Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu

145 150 155 160

Val Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp

165 170 175

Gly Ser Pro Val Lys Val Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln

180 185 190

Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu

195 200 205

Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Arg Val Thr His Glu Gly

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Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser

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<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 6

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys

20 25 30

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

35 40 45

Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Val Ala Phe Ile Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala

65 70 75 80

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn

85 90 95

Thr Lys Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Arg Gly Leu Gly Asp Gly Thr Tyr Phe Asp

115 120 125

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys

130 135 140

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly

145 150 155 160

Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

165 170 175

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

180 185 190

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

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Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn

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Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro

225 230 235 240

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

245 250 255

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

260 265 270

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

275 280 285

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

290 295 300

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

305 310 315 320

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

325 330 335

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

340 345 350

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

355 360 365

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

370 375 380

Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

385 390 395 400

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

405 410 415

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

420 425 430

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

435 440 445

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

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Ser Leu Ser Pro Gly Lys

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<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 7

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1 5 10 15

Val His Ser Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys

20 25 30

Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

35 40 45

Ser Thr Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu

50 55 60

Glu Trp Val Ala Thr Ile Thr Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro

65 70 75 80

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn

85 90 95

Ile Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met

100 105 110

Tyr Tyr Cys Thr Arg Leu Arg Gln Ile Gly Leu Arg Gly Phe Ser Asp

115 120 125

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala

130 135 140

Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser

145 150 155 160

Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu

165 170 175

Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser

180 185 190

Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

195 200 205

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val

210 215 220

Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

225 230 235 240

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

245 250 255

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

260 265 270

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

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Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

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Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

325 330 335

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

340 345 350

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

355 360 365

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

370 375 380

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr

385 390 395 400

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

405 410 415

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

420 425 430

Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

435 440 445

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

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<210> 8

<211> 233

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 8

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Asp Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met

20 25 30

Tyr Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser His

35 40 45

Asp Ile Lys Ser Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Trp Arg Ser

50 55 60

Pro Lys Thr Leu Ile Tyr Tyr Thr Thr Ala Leu Ala Asp Gly Val Pro

65 70 75 80

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile

85 90 95

Ser Ser Leu Glu Ser Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His

100 105 110

Gly Glu Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

115 120 125

Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser

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Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys

145 150 155 160

Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu

165 170 175

Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu

180 185 190

Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr

195 200 205

Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val

210 215 220

Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

225 230

Claims

1.一种用于治疗肠癌的双特异性融合蛋白抗体，其一条链为肠癌特异性抗原GUCY2C抗体，另一条链为ULBP2，由如下方法制得：

（1）将核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的ULBP2-Ig Kappa轻链、核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示的ULBP2-Ig重链及核苷酸序列分别如SEQ ID No.3和SEQ ID No.1所示的肠癌特异性抗原GUCY2C抗体的重链和轻链可变区，分别连接到真核表达载体pATX2，以1:1:1:1配比与人悬浮胚胎肾细胞293F共转染，在293F表达系统中的表达，依靠CROSS MAB技术，表达的氨基酸片段通过功能域的交换自动拼合成GUCY2C-ULBP2双特异性融合蛋白抗体；

（2）利用细胞工厂小批量转染293F细胞的方式表达双特异性融合蛋白抗体，通过凝胶过滤、亲和层析、离子交换层析方式进行纯化，得到所述双特异性融合蛋白抗体。

2.权利要求1所述双特异性融合蛋白抗体在制备治疗肠癌的药物中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述双特异性融合蛋白抗体与NK细胞联用。