KR20230129441A - 이기능성 항-pd1/il-7 분자 - Google Patents

이기능성 항-pd1/il-7 분자 Download PDF

Info

Publication number
KR20230129441A
KR20230129441A KR1020237023523A KR20237023523A KR20230129441A KR 20230129441 A KR20230129441 A KR 20230129441A KR 1020237023523 A KR1020237023523 A KR 1020237023523A KR 20237023523 A KR20237023523 A KR 20237023523A KR 20230129441 A KR20230129441 A KR 20230129441A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
seq
cells
bifunctional molecule
chain
bifunctional
Prior art date
Application number
KR1020237023523A
Other languages
English (en)
Inventor
니콜라스 포이리에
캐롤라인 메리
오로르 모렐로
마르고 세이트
Original Assignee
오제 이뮈노테라프틱스
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from PCT/EP2020/086600 external-priority patent/WO2021122866A1/en
Application filed by 오제 이뮈노테라프틱스 filed Critical 오제 이뮈노테라프틱스
Publication of KR20230129441A publication Critical patent/KR20230129441A/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5418—IL-7
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/35—Valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/74—Inducing cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Transition And Organic Metals Composition Catalysts For Addition Polymerization (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 IL-7 변이체를 포함하고 특정 스캐폴드를 갖는 이기능성 분자 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

이기능성 항-PD1/IL-7 분자
본 발명은, 면역요법 분야에 관한 것이다. 본 발명은 IL-7 변이체를 포함하는 이기능성 분자에 대한 신규한 스캐폴드를 제공한다.
인터루킨-7은 IL-2 슈퍼패밀리의 면역자극성 사이토카인 구성원이며, 면역 반응을 촉진함으로써 적응 면역계에서 중요한 역할을 한다. 이 사이토카인은 T 세포와 B 세포의 생존과 분화, 림프구 세포의 생존, 자연살해(NK: natural killer) 세포의 활성 자극을 통해 면역 기능을 활성화시킨다. IL-7은 또한 림프 조직 유도기(LTi: lymphoid tissue inducer) 세포를 통해 림프절의 발달을 조절하고, 나이브 T 세포 또는 기억 T 세포의 생존 및 분열을 촉진한다. 또한, IL-7은 IL-2 및 인터페론-γ의 분비를 촉진하여 인간의 면역 반응을 향상시킨다. IL-7의 수용체는 이종이량체이며, IL-7Rα(CD127)와 공통 γ 사슬(CD132)로 구성된다. γ 사슬은 모든 조혈 세포 유형에서 발현되는 반면, IL-7Rα는 주로 B 및 T 림프구 전구체를 포함하는 림프구, 나이브 T 세포 및 기억 T 세포에 의해 발현된다. IL-7Rα의 낮은 발현은 더 높은 수준을 발현하는 이펙터/나이브 T 세포와 비교하여 조절 T 세포에서 관찰된다. 따라서, CD127은 이 두 집단을 구별하기 위한 표면 마커로 사용된다. IL-7Rα는 또한 NK 및 gut-관련 림프구 조직(GALT: gut-associated lymphoid tissue)-유래 T 세포로서 선천성 림프구 세포에서 발현된다. IL-7Rα(CD127) 사슬은 TSLP(종양 기질 림프포이에틴)와 공유되고, CD132(γ 사슬)는 IL-2, IL-4, IL-9, IL-15 및 인터루킨-21과 공유된다. 두 가지 주요 신호전달 경로는 CD127/CD132를 통해 유래된다: (1) Janus 키나제/STAT 경로(즉, Jak-Stat-3 및 5) 및 (2) 포스파티딜-이노시톨-3키나제 경로(즉, PI3K-Akt). IL-7 투여는 환자에게 잘 용인되며, CD8 및 CD4 세포 확장 및 CD4+ T 조절 세포의 상대적 감소를 초래한다. 재조합 네이키드 IL-7 또는 항체 Fc의 N 말단 도메인에 융합된 IL-7은 Fc 도메인의 융합을 통해 IL-7 반감기를 증가시키고 치료의 오래 지속되는 효율성을 향상시키는 근거로 임상에서 테스트되었다.
재조합 IL-7 사이토카인은 약동학적 프로파일이 좋지 않아 임상에서의 사용이 제한된다. 주사 후, 재조합 IL-7은 빠르게 분포되고 제거되어, 인간(6.8 내지 9.5시간 범위)(문헌[Sportes et al., Clin Cancer Res. 2010 Jan 15;16(2):727-35]) 또는 마우스(2.5시간)(문헌[Hyo Jung Nam et al., Eur. J. Immunol. 2010. 40:351-358])에서 IL-7의 불량한 반감기를 초래한다. IgG가 신생 Fc 수용체(FcRn)에 결합하고 분자의 트랜스사이토시스 및 엔도솜 재활용에 관여할 수 있기 때문에 IL-7에 대한 IgG Fc 도메인의 융합은 그의 반감기를 연장한다. IL-7에 대한 Fc 융합 분자(t1/2=13h)는 마우스에 투여 후 최대 8일까지 검출 가능한 수준(200 pg/mL)으로 유지되는 연장된 순환 반감기가 관찰된다(문헌[Hyo Jung Nam et al., Eur. J. Immunol. 2010. 40:351-358]). Fc 도메인에 융합된 IL-7 사이토카인은 반감기가 증가하지만, 생물학적 효과를 나타내기 위해서는 분자에 생체 내 주사를 자주 해야 했다. 면역사이토카인 분자의 맥락에서, 사이토카인은 항체(예를 들어, 표적화 암 항원, 면역 체크포인트 차단, 공동자극 분자…)에 융합되어 표적화된 항원-발현 세포에 사이토카인을 우선적으로 집중시킨다. 그러나, CD127/CD132 수용체에 대한 IL-7 사이토카인의 친화도(나노몰에서 피코몰 범위)는 표적에 대한 항체의 친화도보다 높을 수 있다. 따라서, 사이토카인은 표적-매개 약물 배치(TMDD: target-mediated drug disposition) 메커니즘으로 인해 생체 내에서 사용 가능한 약물의 빠른 고갈로 이어지는 생성물의 약동학을 유도할 것이다. 이 빠른 제거는 IL-2 또는 IL-15와 같은 면역사이토카인에 대해 설명되었으며, 이는 융합 단백질의 약동학적 특성이 약물 성능에 직접적인 영향을 미칠 수 있음을 보여준다(문헌[List et Neri Clin Pharmacol. 2013; 5(Suppl 1): 29-45]).
따라서, IL-7 생성물, 특히 IL-7을 포함하는 이기능성 분자의 분포를 개선하고 제거를 감소시킬 수 있는 새롭고 개선된 IL-7 변이체에 대한 당업계의 상당한 요구가 남아 있다. 본 발명자들은 본원에 개시된 발명과 함께 상당한 진전을 이루었다.
이기능성 분자는 현재 면역학, 특히 종양학 분야에서 발전의 대상이다. 실제로, 그들은 두 표적의 공동 참여를 통해 새로운 약리학적 특성을 가져오고, 종양으로의 표적화된 재배치 덕분에 두 개의 별개 분자의 조합에 비해 안전성 프로파일을 증가시킬 수 있으며 잠재적으로 단일 약물 제품과 관련된 개발 및 제조 비용을 줄일 수 있다. 그러나, 이러한 분자는 유리하지만 몇 가지 불편함을 나타낼 수 있다. 이기능성 분자의 설계는 결합 친화도 및 특이성, 폴딩 안정성, 용해도, 약동학, 이펙터 기능, 추가 도메인 부착과의 호환성 및 임상 개발과 호환되는 생산 수율 및 비용과 같은 몇 가지 주요 속성을 암시해야 한다. 예를 들어, PD-1을 표적화하고 IL-7 변이체를 포함하는 이기능성 분자가 국제특허공개 WO2020/127377호에 기술되어 있다.
그러나, 이기능성 분자를 위한 개선된 스캐폴드에 대한 남아있고 강력한 요구가 여전히 존재한다.
본 발명자들은 생체 내에서 향상된 생물학적 효과를 위해 이기능성 분자의 분포 및 제거를 개선하기 위한 IL-7 돌연변이 및 최적화된 스캐폴드를 제공한다. 본 발명자들은 IL-7 돌연변이를 최적화된 스캐폴드와 조합하여 사용하면 이기능성 분자의 분포가 더 양호해지고, 생체 내 반감기가 더 길어진다는 것을 확인하였다.
본원에 제공된 이기능성 분자는 특히 IL-7 야생형을 포함하는 이기능성 분자와 비교하여 생체 내에서 우수한 약동학 및 약력학을 입증한다. 또한, 하기 및 실시예에서 상세히 설명된 바와 같이 유리하고 예상치 못한 특성이 이러한 새로운 분자와 연관되어 있다.
본 발명은 특정 스캐폴드를 갖고 PD-1에 결합하는 결합 모이어티에 접합된 인터루킨 7(IL-7) 변이체(IL-7m)를 포함하는 이기능성 분자에 관한 것으로, 여기서 이러한 스캐폴드는 이량체 Fc 도메인, Fc 도메인의 하나의 단량체의 N 말단 단부에서 PD-1에 결합하는 단일 1가 항원 결합 도메인 및 i) Fc 도메인의 동일한 단량체의 C 말단 단부에 연결된 단일 IL-7m 또는 ii) 가변 중쇄 및 가변 경쇄를 포함하고 단일 IL-7m이 항원 결합 도메인의 경쇄의 C 말단 단부에 연결된 단일 1가 항원 결합 도메인으로 본질적으로 이루어진다.
이러한 특정 스캐폴드는 개선된 약동학적 프로파일과 관련이 있다. IL-7m이 없으면 이러한 스캐폴드에서 관찰이 되지 않기 때문에 개선된 약동학적 프로파일은 놀랍다.
이러한 특정 스캐폴드를 가진 이기능성 분자는 동일한 세포 상에서 두 표적의 시스-표적화에 유리하여 IL-7m을 표적화된 세포로 선택적으로 전달할 수 있다.
또한, IL-7을 갖는 이기능성 분자의 맥락에서, 이러한 분자는 상승적 활성화 및 보다 우수한 생체 내 항-종양 효능을 유도할 수 있다. 마지막으로, 놀랍게도, 특정 스캐폴드를 갖는 이기능성 분자는 더 나은 생산성을 가지며 산업적 규모 및 안전성에서 생산에 주요 이점인 사슬 미스페어링(mispairing)으로 인한 부산물을 방지한다.
게다가, 개선된 약동학적 프로파일 및 더 나은 생산성 외에도, 면역 활성 측면에서 강한 관심을 보이는 종양-반응성 종양-내 T 세포의 하위 집합인 T 세포와 같은 이펙터 기억 줄기의 활성을 향상시키는 새롭고 유리한 생물학적 효율성이 확인되었다.
본 개시내용의 특정 양태에서, 이기능성 분자는 하나의 IL7 변이체, 특히 W142H IL7 변이체, 및 특정 스캐폴드를 갖는 PD-1에 특이적인 하나의 항원 결합 도메인, 즉, 항-PD-1*1 IL7 W142H*1로 지칭되는 분자를 포함한다. 이러한 이기능성 분자는 PD-1에 대해 높은 친화도를 갖고 한쪽 면에는 길항 활성을 갖고 다른 한쪽에는 IL7 수용체(IL7R)에 대한 낮은 친화도를 갖는 하나의 IL7 변이체를 갖는 1가 항원 결합 도메인을 특징으로 한다.
놀랍게도, 이러한 이기능성 분자(항-PD-1*1 IL7 W142H*1)는 야생형 IL7을 가진 동일한 분자보다 종양-특이적 T 세포(cis-표적화)를 더 잘 우선적으로 표적화한다(58배 대비 315배, 도 11c 참조). 또한, 이러한 분자는 Treg의 억제 활성을 차단하고 야생형 IL7을 갖는 동일한 분자보다 Treg-유도된 억제의 제거(abrogation)에 대해 더 나은 결과를 생성한다(도 19 참조). 이러한 이기능성 분자(항-PD-1*1 IL7 W142H*1)가 Treg 제거와 동시에 강력한 T 세포 증식에 영향을 미치며 이중 효과인 반면, 이러한 분자에서 선택된 IL7 변이체는 IL7 수용체에 대해 낮은 친화도를 나타내는 것은 예상치 못한 일이었다.
당업자에게 공지된 바와 같이, 많은 암에서 관찰되는 T 세포 고갈(exhaustion)이라는 현상으로 인해 종양 세포가 T 세포에 의해 충분히 제거되지 않을 수 있다. 예를 들어 문헌[Jiang, Y., Li, Y. and Zhu, B (Cell Death Dis 6, e1792 (2015))]에 의해 기술된 바와 같이, 종양 미세환경에서 고갈된 T 세포는 억제 수용체의 과발현, 이펙터 사이토카인 생산 및 세포용해 활성의 감소를 야기할 수 있으며, 이는 암 제거의 실패 및 일반적으로 암 면역 회피로 이어질 수 있다. 이어서 고갈된 T 세포를 복원하는 것은 암 치료를 위해 계획된 임상 전략이다.
고갈된 T 세포가 IL7R 발현이 감소하고 분자의 IL7 변이체가 IL7R에 대한 친화도가 낮더라도, 이러한 이기능성 분자(항-PD-1*1 IL7 W142H*1)는 만성적으로 자극된 T 세포의 증식을 회복시킬 뿐만 아니라 고갈된 T 세포의 생존율을 재조합 IL7과 동일한 수준으로 유지한다. 놀랍게도, 이러한 이기능성 분자(항-PD-1*1 IL7 W142H*1)는 T 림프구를 아폽토시스(apoptosis)로부터 보호할 수 있다. 이와 같이 IL7R 발현이 감소하고 IL7R에 대한 친화력이 낮아지는 맥락에서, 이러한 효과는 현저하고 예측할 수 없다.
놀랍게도, 이러한 이기능성 분자(항-PD-1*1 IL7 W142H*1)는 줄기-유사 TCF1+ CD8 T 세포(Ki67+ TCF1+ CD8+ T 세포)(도 24)의 증식을 rIL7과 동일한 수준(데이터는 표시되지 않음)으로 유도할 수 있다.
최근에 문헌[Caushi et al (2021, Nature, 596, 126-132)]은 항 PD-1 치료에 반응하지 않는 환자의 맥락에서 돌연변이-관련 신생항원(MANA)-특이적 CD8 T 세포를 연구했으며 이들 종양 특이적 TIL(종양 침윤 림프구)에서 낮은 수준의 IL7R을 관찰하였다. 유리하게도, IL7R에 대한 보다 낮은 친화도 및 고갈된 T 세포에서의 감소된 IL7R 발현에도 불구하고, 이기능성 분자(항-PD-1*1 IL7 W142H*1)는 증식을 회복시킬 뿐만 아니라 만성적으로 자극된 T 세포의 생존도 유지한다.
추가 치료 검증을 위해 4개의 다른 전임상 생체 내 모델을 사용하였다: 2개의 다른 면역적격 모델(PD1 민감성 모델(AK7 동소위(orthotopic)); 및 PD1 내성(Hepa1.6 동소위)(도 20 및 21); 및 2개의 상이한 인간화 모델(TNBC) 이소성(ectopic) 모델 및 이소성 폐암종). 이러한 생체 내 전임상 모델에서, 이기능성 분자(항-PD-1*1 IL7 W142H*1)는 생존을 증가시키고 종양 성장을 감소시키거나 완전히 억제한다. 놀랍게도, 야생형 IL7 또는 항-PD-1 항체를 갖는 동일한 분자와 비교하여 개선된 치료 효능이 관찰되었다.
특히, PD1 내성 Hepa1.6 모델은 종양으로부터 종양 T 세포 배제로 인해 특히 관심을 끈다(문헌[Gauttier et al, 2020, Clin Invest, 130, 6109-6123]). 항-PD1이 어떠한 효능도 없는 것으로 예상되는 이러한 모델에서, 이기능성 분자(항-PD-1*1 IL7 W142H*1)는 60%에서 완전한 종양 반응을 달성하여, 야생형 IL7(47%)의 동일한 분자보다 분명히 우수하다(도 21). 또한, 이러한 분자는 줄기-유사 기억 CD8+ TIL의 선택적 확장을 촉진할 수 있다(도 22). 이는 종양 T 세포 배제를 제시하는 이러한 모델의 맥락에서 특히 중요하다. 이러한 내성 모델에서 종양으로부터 T 세포 배제에도 불구하고 CD8 TIL 조성은 이기능성 분자(항-PD-1*1 IL7 W142H*1)로 처리한 후 크게 증가하고 T 세포 하위 집합은 극적으로 변형된다. 매우 낮은 Treg, 높은 CD8+ T 세포 및 높은 증식 및 줄기 유사 기억 T 세포 하위 집합이 관찰되었다(도 23 및 24). 반대로, 이러한 분자는 항-PD-1 처리에 비해 고갈된 T 세포가 현저히 더 낮다. 특히 TILS에서 이러한 강력한 이점은 이러한 이기능성 분자에 의한 줄기-유사 기억 CD8 T 세포 하위집단(TCF1+Tox- 세포)의 종양 내 증식을 보여주는 상세한 예에서 설명된다. 이러한 증식으로 인해 줄기-유사 기억 T 세포의 활성 풀을 수득할 수 있다. 이들 줄기 T 세포는 i) 종양 항원 특이적이지 않거나 종양 세포에 대한 항-PD1 약물의 존재 하에 다수인 나이브 T 세포(상기 나이브 T 세포는 PD1 음성임)와 ii) 충분히 많지 않거나 너무 많이 자극되어 더 이상 항-PD1 처리에 반응하지 않는 성숙한 고갈된 T 세포(특히 이미 완전히 고갈된 T 세포) 사이에서 분화의 중간 단계를 나타낸다. 이러한 고갈된 T 세포는 스트레스를 받은 세포이며, 유전적 프로파일에서 알 수 있듯이 아폽토시스를 유발하는 반면, 줄기-유사 기억 T 세포 풀(TCF1+)은 다수의 T 세포에서 증식 및 분화할 수 있어 더 높은 항-종양 반응과 함께 장기 지속성을 허용한다.
광범위한 기억 항-종양 반응은 동일한 종양 유형으로 치유된 마우스에 대한 종양 재도전으로 나타난 바와 같이 이기능성 분자(항-PD-1*1 IL7 W142H*1)로 수득하였다(3개 종양 모델 시험. (PD1 민감성 모델(AK7 동소위); PD1 부분적 민감성 모델(MC38 이소성) 및 PD1 내성(Hepa1.6 동소위)). 임의의 새로운 처리 없이 이러한 전처리된 동물은 임의의 새로운 종양이 발달하지 않아, 기억 T 세포 하위 집합 활성화를 통해 장기 보호를 부여하는 이기능성 분자(항-PD-1*1 IL7 W142H*1)의 능력을 확립한다(도 20b).
TNBC 인간화 마우스 모델에서, 인간화 조건에서 이기능성 분자(항-PD-1*1 IL7 W142H*1)의 활성을 평가하기 위해 4명의 상이한 인간 공여자로부터의 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 실행하였다. 종양 성장에 대한 이기능성 분자(항-PD-1*1 IL7 W142H*1)의 효과는 항-PD-1 항체에 비해 명백히 우수하여, 종양 성장을 강력하게 감소시켰다(도 25). 동일한 우수한 효과가 또 다른 인간화 마우스 모델(폐암)에서 관찰되었으며, 특히 혈청에서 IFN감마 분비가 증가하여, 유도된 반응의 직접적인 효과가 나타났다(도 26).
요약하면, IL7R에 대한 친화도가 더 낮고 표적 세포에서 IL7R의 발현이 감소함에도 불구하고, 이기능성 분자(항-PD-1*1 IL7 W142H*1)는 TCR 신호전달에 대한 상승적 효과에 의해, Treg을 억제하면서 T 이펙터 확장을 촉진함으로써, 점막 T 세포 이동을 촉진함으로써 그리고 마지막으로 고갈된 T 세포를 재활성화함으로써 암 면역 주기를 되살릴 수 있다. 놀랍게도, 이러한 효과는 재조합 IL7 또는 동일한 분자이지만 야생형 IL7의 효과보다 우수하거나 동일하였다.
본 발명은 단일 항원 결합 도메인 및 단일 IL-7 변이체를 포함하는 이기능성 분자에 관한 것으로서,
- 상기 이기능성 분자는, 선택적으로 펩티드 링커를 통해, C-말단 단부를 통해 제1 Fc 사슬의 N-말단 단부에 공유적으로 연결된 항원-결합 도메인을 포함하는 제1 단량체, 및 항원-결합 도메인 및 IL-7 변이체가 없는 상보적인 제2 Fc 사슬을 포함하는 제2 단량체를 포함하고;
- i) 상기 IL-7 변이체는, 선택적으로 펩티드 링커를 통해, 상기 제1 Fc 사슬의 C-말단 단부에 공유적으로 연결되거나; ii) 상기 단일 항원 결합 도메인은 가변 중쇄 및 가변 경쇄를 포함하고 IL-7 변이체는 경쇄의 C-말단 단부에 공유적으로 연결되고;
- 상기 항원 결합 도메인은 PD-1에 결합하고;
- 상기 IL-7 변이체는 SEQ ID NO: 1로 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 야생형 인간 IL-7(wth-IL-7)과 적어도 75% 동일성으로 존재하고, IL-7 변이체는 i) IL-7R에 대한 wth-IL-7의 친화도와 비교하여 IL-7 수용체(IL-7R)에 대한 IL-7 변이체의 친화도를 감소시키고, ii) wth-IL-7를 포함하는 이기능성 분자와 비교하여 IL-7 변이체를 포함하는 이기능성 분자의 약동학을 개선한다.
특히, IL-7 변이체는 (i) W142G, W142A, W142V, W142C, W142L, W142I, W142M, W142H, W142Y 및 W142F, 바람직하게는 W142H, W142F 또는 W142Y, (ii) C2S-C141S 및 C47S-C92S, C2S-C141S 및 C34S-C129S, 또는 C47S-C92S 및 C34S-C129S, (iii) D74E, D74Q 또는 D74N, iv) Q11E, Y12F, M17L, Q22E 및/또는 K81R로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산 돌연변이; 또는 이들의 임의의 조합을 포함하고, 아미노산 넘버링은 SEQ ID NO: 1에 제시된 바와 같다.
바람직하게는, IL-7 변이체는 W142H, W142F 및 W142Y로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 치환을 포함하며, 아미노산 넘버링은 SEQ ID NO: 1에 제시된 바와 같다. 보다 바람직하게는, IL-7 변이체는 아미노산 치환 W142H를 포함한다. 보다 더 바람직하게는, IL-7 변이체는 SEQ ID NO: 2 내지 15로 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 가장 바람직하게는, IL-7 변이체는 SEQ ID NO: 5로 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
특정 양태에서, IL-7 변이체는, 바람직하게는 이의 N-말단 단부에 의해 제1 Fc 사슬의 C-말단 단부에서 연결된다.
또 다른 양태에서, 이기능성 분자는, T250Q/M428L; M252Y/S254T/T256E + H433K/N434F; E233P/L234V/L235A/G236A + A327G/A330S/P331S; E333A; S239D/A330L/I332E; P257I/Q311; K326W/E333S; S239D/I332E/G236A; N297A; L234A/L235A; N297A + M252Y/S254T/T256E (YTE); N297A+N298A+ M252Y/S254T/T256E+ K444A, K322A, K444A, K444E, K444D, K444G, K444S, P329GL234A/L235A/P329G, M428L, L309D, Q311H, N434S, M428L + N434S(LS) 및 L309D + Q311H + N434S(DHS)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 바람직하게는 선택적으로 M252Y/S254T/T256E와 조합하여 N297A, 및 L234A/L235A 또는 L234A/L235A/P329G로 이루어진 군으로부터 선택되는 치환 또는 치환의 조합이 있는, 인간 IgG1의 중쇄 불변 도메인, 바람직하게는 Fc 도메인을 포함한다. 바람직하게는, 치환 또는 치환의 조합은 T250Q/M428L; M252Y/S254T/T256E + H433K/N434F; E233P/L234V/L235A/G236A + A327G/A330S/P331S; E333A; S239D/A330L/I332E; P257I/Q311; K326W/E333S; S239D/I332E/G236A; N297A; L234A/L235A; N297A + M252Y/S254T/T256E; K322A 및 K444A로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 선택적으로 M252Y/S254T/T256E와 조합하여 N297A 및 L234A/L235A로 이루어진 군으로부터 선택된다.
대안적으로, 이기능성 분자는, 선택적으로 S228P; L234A/L235A, S228P + M252Y/S254T/T256E+ K444A, K444E, K444D, K444G, K444S, P329G 및 L234A/L235A/P329G로 이루어진 군으로부터 선택되는 치환 또는 치환의 조합이 있는, 인간 IgG4의 중쇄 불변 도메인, 바람직하게는 Fc 도메인을 포함한다. 바람직하게는, 치환 또는 치환의 조합은 S228P; L234A/L235A, S228P + M252Y/S254T/T256E 및 K444A로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 양태에서, 본 발명에 따른 이기능성 분자는 돌연변이 LALA(L234A/L352A) 또는 LALA PG(L234A/L235A/P329G)를 포함하는 IgG1 또는 IgG4로부터 유도되는 Fc 도메인을 포함한다.
이러한 양태에서, 제1 Fc 사슬과 제2 Fc 사슬은 이종이량체 Fc 도메인, 특히 노브-인투-홀(knob-into-hole) 이종이량체 Fc 도메인을 형성한다. 특히, 제1 Fc 사슬은 홀 또는 H 사슬이고 치환 T366S/L368A/Y407V/Y349C 및 선택적으로 N297A를 포함하고 제2 Fc 사슬은 노브 또는 K 사슬이고 치환 T366W/S354C 및 선택적으로 N297A를 포함한다. 바람직하게는, 제1 Fc 사슬은 홀 또는 H 사슬이고 치환 T366S/L368A/Y407V/Y349C 및 N297A를 포함하고 제2 Fc 사슬은 노브 또는 K 사슬이고 치환 T366W/S354C 및 N297A를 포함한다. 보다 구체적으로, 제2 Fc 사슬은 SEQ ID NO: 75를 포함하거나 이로 이루어지고/지거나 제1 Fc 사슬은 SEQ ID NO: 77을 포함하거나 이로 이루어진다.
매우 특정한 양태에서, 본 발명에 따른 이기능성 분자는, 선택적으로 펩티드 링커를 통해 제1 이종이량체 Fc 사슬의 N-말단 단부에 C-말단 단부를 통해 공유적으로 연결된 항원-결합 도메인을 포함하는 제1 단량체로서, 상기 제1 이종이량체 Fc 사슬은, 선택적으로 펩티드 링커를 통해 IL-7 변이체의 N-말단 단부에 C-말단 단부에 의해 공유적으로 연결된 것, 및 항원-결합 도메인이 없는 상보적인 제2 이종이량체 Fc 사슬을 포함하는 제2 단량체를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본원에 개시된 이기능성 분자에서, IL-7 변이체는 GGGGS(SEQ ID NO: 68), GGGGSGGGS(SEQ ID NO: 67), GGGGSGGGGS(SEQ ID NO: 69) 및 GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO: 70)로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 (GGGGS)3인 펩티드 링커에 의해 항원 결합 도메인 또는 Fc 도메인에 융합된다. 바람직하게는, IL-7 변이체는 SEQ ID 70의 펩티드 링커에 의해 항원 결합 도메인 또는 Fc 도메인에 융합된다.
이러한 양태에서, 본 발명에 따른 이기능성 분자에서, 항원-결합 도메인은 Fab 도메인, Fab', 단일-사슬 가변 단편(scFV) 또는 단일 도메인 항체(sdAb)이다. 바람직하게는, 항원-결합 도메인은 Fab 도메인 또는 Fab'이다.
특히, 항원 결합 도메인은 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 세미플리맙, 캄렐리주맙, AUNP12, AMP-224, AGEN-2034, BGB-A317, 스파르탈리주맙, MK-3477, SCH-900475, PF-06801591, JNJ-63723283, 제놀림주맙, LZM-009, BCD-100, SHR-1201, BAT-1306, AK-103, MEDI-0680, MEDI0608, JS001, BI-754091, CBT-501, INCSHR1210, TSR-042, GLS-010, AM-0001, STI-1110, AGEN2034, MGA012, 또는 IBI308, 5C4, 17D8, 2D3, 4H1, 4A11, 7D3, 및 5F4로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체로부터 유래된다. 바람직하게는, 항원 결합 도메인은 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 세미플리맙, 캄렐리주맙, 스파르탈리주맙 및 제놀림주맙으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체로부터 유래된다. 보다 더 바람직하게는, 항원 결합 도메인은 펨브롤리주맙 또는 니볼루맙으로부터 유래된다.
매우 특정한 양태에서, 본 발명에 따른 이기능성 분자의 항원 결합 도메인은 (i) SEQ ID NO: 51의 CDR1, SEQ ID NO: 53의 CDR2 및 SEQ ID NO: 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 또는 62의 CDR3을 포함하는 중쇄; 및 (ii) SEQ ID NO: 64, 65, 89의 CDR1, SEQ ID NO: 66의 CDR2 및 SEQ ID NO: 16, 또는 90의 CDR3을 포함하는 경쇄를 포함하거나 이로 본질적으로 이루어진다. 바람직하게는, 항원 결합 도메인은 (i) SEQ ID NO: 51의 CDR1, SEQ ID NO: 53의 CDR2 및 SEQ ID NO: 61의 CDR3을 포함하는 중쇄; 및 (ii) SEQ ID NO: 65의 CDR1, SEQ ID NO: 66의 CDR2 및 SEQ ID NO: 16의 CDR3을 포함하는 경쇄를 포함하거나 이로 본질적으로 이루어진다.
보다 바람직하게는, 항원-결합 도메인은 (a) SEQ ID NO: 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 영역(VH); (b) SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID 88 또는 SEQ ID NO 99의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하거나 이로 본질적으로 이루어진다. 보다 더 바람직하게는, 항원-결합 도메인은 SEQ ID NO: 24의 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 28의 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하거나 이로 본질적으로 이루어진다.
매우 특정한 양태에서, 본 발명에 따른 이기능성 분자는 SEQ ID NO: 24의 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 28의 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하거나 이로 본질적으로 이루어진 항원-결합 도메인 및 아미노산 치환 W142H를 포함하는 IL-7 변이체를 포함하며, 아미노산 넘버링은 SEQ ID NO: 1에 제시된 바와 같고, 바람직하게는 IL-7 변이체는 SEQ ID : 5를 포함하거나 이로 본질적으로 이루어진다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 이기능성 분자에서:
(i) 항원-결합 도메인은 NO: 24의 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 28의 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하거나 이로 본질적으로 이루어지고,
(ii) IL-7 변이체는 SEQ ID: 5로 정의된 서열을 포함하거나 이로 본질적으로 이루어지고,
(iii) 제2 Fc 사슬은 SEQ ID NO: 75를 포함하거나 이로 본질적으로 이루어지고/지거나 제1 Fc 사슬은 SEQ ID NO: 77을 포함하거나 이로 이루어진다.
바람직하게는, 이러한 이기능성 분자는 SEQ ID NO: 70의 펩티드 링커를 추가로 포함한다.
매우 특정한 양태에서, 본 발명에 따른 이기능성 분자는 SEQ ID NO: 83의 제1 단량체, SEQ ID NO: 75의 제2 단량체, 및 SEQ ID NO: 37, 38 또는 80, 바람직하게는 SEQ ID NO: 38 또는 80의 제3 단량체를 포함한다. 바람직하게는, 이기능성 분자는 SEQ ID No:83을 포함하거나 이로 이루어진 제1 단량체, SEQ ID 75를 포함하거나 이로 이루어진 제2 단량체 및 SEQ ID No:80을 포함하거나 이로 이루어진 제3 단량체를 포함한다.
본 발명은 또한 본 개시내용에 따른 이기능성 분자를 코딩하는 단리된 핵산 서열 또는 단리된 핵산 분자의 군에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 개시내용에 따른 이기능성 분자를 코딩하는 단리된 핵산 서열 또는 단리된 핵산 분자의 군을 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 개시내용에 따른 이기능성 분자, 핵산 또는 숙주 세포를, 선택적으로 약학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
마지막으로, 본 발명은 약제로서 사용하기 위한, 특히 암 또는 감염 질환의 치료에서 사용하기 위한 본 개시내용에 따른 이기능성 분자, 핵산, 숙주 세포 또는 약학 조성물; 약제의 제조를 위한, 특히 암 또는 감염 질환의 치료에서 사용하기 위한 본 개시내용에 따른 이기능성 분자, 핵산, 숙주 세포 또는 약학 조성물의 용도; 및 치료 유효량의 본 개시내용에 따른 이기능성 분자, 핵산, 숙주 세포 또는 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환, 특히 암 또는 감염 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.
선택적으로, 본 발명은 이펙터 기억 줄기 유사 T 세포를 자극함으로써 암 또는 바이러스 감염의 치료에서 사용하기 위한 본 개시내용에 따른 이기능성 분자, 핵산, 숙주 세포 또는 약학 조성물; 약제의 제조를 위한, 특히 이펙터 기억 줄기 유사 T 세포를 자극함으로써 암 또는 바이러스 감염의 치료에서 사용하기 위한 본 개시내용에 따른 이기능성 분자, 핵산, 숙주 세포 또는 약학 조성물의 용도; 치료 유효량의 본 개시내용에 따른 이기능성 분자, 핵산, 숙주 세포 또는 약학 조성물을 투여함으로써 이펙터 기억 줄기 유사 T 세포를 자극하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암 또는 바이러스 감염을 치료하는 방법에 관한 것이다.
특히, 암은 조혈암, 고형암, 암종, 자궁경부암, 결장직장암, 식도암, 위암, 위장관암, 두경부암, 신장암, 간암, 폐암, 림프종, 신경교종, 중피종, 흑색종, 위암, 요도암 환경적으로 유발된 암 및 상기 암의 임의의 조합, 전이성 또는 비 전이성, 흑색종, 악성 중피종, 비-소세포 폐암, 신세포 암종, 호지킨 림프종, 두경부암, 요로상피 암종, 결장직장암, 간세포 암종, 소세포 폐암 전이성 메르켈 세포 암종, 위암 또는 위식도암, 자궁경부암, 혈액림프양 신생물, 혈관면역모세포 T 세포 림프종, 골수이형성 증후군, 급성 골수성 백혈병, 카포시 육종; 인간 유두종 바이러스와 관련된 자궁경부암, 항문암, 음경암 및 외음부 편평 세포 암 및 구강인두암; 미만성 거대 B-세포 림프종을 비롯한 B 세포 비-호지킨 림프종(NHL), 버킷 림프종, 형질모구 림프종, 원발성 중추 신경계 림프종, HHV-8 원발성 삼출성 림프종, 고전적 호지킨 림프종, 및 엡스타인-바 바이러스(EBV) 및/또는 카포시 육종 헤르페스 바이러스와 관련된 림프증식성 장애; B형 간염 및/또는 C형 간염 바이러스와 관련된 간세포 암종; 메르켈 세포 폴리오마 바이러스(MPV)와 관련된 메르켈 세포 암종; 및 인간 면역결핍 바이러스 감염(HIV) 감염과 관련된 암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특히, 바이러스 감염은 HIV, 간염 바이러스 예컨대 A형, B형, 또는 C형 간염, 헤르페스 바이러스 예컨대 VZV, HSV-1, HAV-6, HSV-II, CMV 및 엡스타인 바 바이러스, 아데노바이러스, 인플루엔자 바이러스, 플라비바이러스, 에코바이러스, 리노바이러스, 콕사키 바이러스, 코로나바이러스, 호흡기 융합 바이러스, 멈프스 바이러스, 로타바이러스, 홍역 바이러스, 풍진 바이러스, 파보바이러스, 백시니아 바이러스, HTLV 바이러스, 뎅기열 바이러스, 유두종바이러스, 몰루스컴 바이러스, 폴리오바이러스, 광견병 바이러스, JC 바이러스 및 아르보바이러스 뇌염 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스에 의한 것이다.
마지막으로, 본 발명은 화학요법, 방사선 요법, 표적화요법, 항혈관형성제, 저메틸화제, 암 백신, 종양 항원의 에피토프 또는 네오에피토프, 골수 체크포인트 억제제, 면역요법제, 및 HDAC 억제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 치료제 또는 요법과 병용하여 사용하기 위한 이기능성 분자, 핵산, 숙주 세포 또는 약학 조성물에 관한 것이다. 특히, 치료제는 항-CTLA4, 항-CD2, 항-CD28, 항-CD40, 항-HVEM, 항-BTLA, 항-CD160, 항-TIGIT, 항-TIM-1/3, 항-LAG-3, 항-2B4, 및 항-OX40, 항-CD40 작용제, CD40-L, TLR 작용제, 항-ICOS, ICOS-L 및 B-세포 수용체 작용제로 이루어진 군으로부터 선택되는 적응 면역 세포(T 및 B 림프구)의 면역 체크포인트 차단제 또는 활성화제이다. 이러한 병용은 특히 본원에 개시된 것과 같은 암 또는 바이러스 감염의 치료를 위해 사용될 수 있다.
도 1: 실시예 1 및 2에서 사용된 상이한 분자의 개략적인 표현.
도 2: 항 PD-1 IL7 W142H 돌연변이는 PD-1에 대한 높은 결합 효율을 보여주고 PDL1 결합을 길항한다. a. PD-1 결합 ELISA 분석. 인간 재조합 PD-1(rPD1) 단백질을 고정화하고, 항체를 상이한 농도로 첨가하였다. 퍼옥시다제에 결합된 항-인간 Fc 항체로 밝혀냈다. 비색법을 TMB 기질을 사용하여 450 nm에서 결정하였다. 1개(항 PD-1*1 ▲ 회색) 또는 2개의 항 PD-1 암(항 PD-1*2 ◆)을 갖는 항 PD-1을 대조군으로서 시험하였다. IL7 변이체(항 PD-1*2 IL7 W142H*2 ● 흑색), (항 PD-1*2 IL7 W142H*1 ■ 흑색), (항 PD-1*1 IL7 W142H*2 ● 회색), (항 PD-1*1 IL7 W142H*1 ▼ 회색)을 포함하는 이기능성 분자도 시험하였다. b. ELISA에 의해 측정된 PD-1/PD-L1을 차단하는 길항 능력. PD-L1을 고정화하고, 복합 항체 + 비오티닐화된 재조합 인간 PD-1을 첨가하였다. 이러한 복합체는 고정 농도의 PD1(0.6 μg/mL) 및 서로 다른 농도의 항-PD1*2 IL7 W142H*1(■ 일반선), 항-PD1*2 IL7 W142H*2(○ 점선), 항 PD-1*1(회색▲ 회색 점선), 항-PD1*1 IL7 W142H*2(회색 ● 일반 회색선) 또는 항 PD1*1 IL7 W142H*1(회색▼ 일반 회색선)로 생성하였다. 시험한 모든 작제물은 Fc와 IL-7 도메인 사이의 GGGGSGGGGSGGGGS 링커를 포함한다.
도 3: 항 PD-1의 1개 또는 2개의 원자가와 1개의 IL-7 W142H 사이토카인으로 작제된 항 PD-1 IL7 분자는 높은 효율로 pSTAT5를 활성화한다. a. 항 PD-1 IL-7 W142H 이기능성 분자의 PD-1/CD127 결합. PD-1 재조합 단백질을 고정시킨 다음, 상이한 농도의 이기능성 분자 및 고정량의 CD127 재조합 단백질(히스티딘 태그됨, Sino ref 10975-H08H)을 첨가하였다. 비오틴에 결합된 항-히스티딘 항체와 퍼옥시다제에 결합된 스트렙타비딘의 혼합물로 밝혀냈다. 비색법을 TMB 기질을 사용하여 450 nm에서 결정하였다. 항 PD1*2 IL7 W142H1*1(■) 또는 항 PD1*2 IL7 W142H*2(● 회색)를 시험하였다. b. IL-7 W142*1 사이토카인에 융합된 항 PD-1*2 백본을 사용한 pSTAT5 신호전달 분석. 건강한 지원자의 말초 혈액에서 단리된 인간 PBMC를 항-PD1*2 IL7 WT*2(▼) 또는 항-PD1*2 IL7 W142H*1(■ 점선)과 함께 15분 동안 인큐베이션하였다. 이어서 세포를 고정하고, 투과성화하고, 항 CD3-BV421 및 항-pSTAT5 AF647(클론 47/Stat5(pY694))로 염색하였다. MFI %pSTAT5 + 세포를 CD3+ 집단으로 계산하여 데이터를 얻었다. c. 항 PD-1*1 IL7 W142H*1(●) 항 PD-1*2 IL7WT*2(■) 또는 항 PD1*2 IL7 W142H*1(▲) 처리 후 pSTAT5 신호전달 분석. 시험한 모든 W142H 작제물은 Fc와 IL-7 도메인 사이에 IgG1m 및 GGGGSGGGGSGGGGS 링커를 포함한다.
도 4: 1개 또는 2개의 원자가로 작제된 항 PD-1 IL7 분자는 생체 내 에서 T 세포 증식을 유의하게 촉진한다. 마우스에 1회 용량(34 nM/kg)의 항 PD-1 IL-7 W142H 분자(항 PD-1*2 IL7 W142H*1, 항 PD-1*1 IL7 W142H*1, 항 PD-1 *1 IL7 W142H*2) 또는 이소형 대조군을 복강 내로 주입하였다. 4일차에 혈액을 채취하고 T 세포를 항 CD3, 항 CD8, 항 CD4 및 ki67 증식 마커로 염색하였다. KI67 백분율을 CD3 CD4+ 및 CD3 CD8+ 집단에서 정량화하였다. 통계적 유의성(*p<0,05)을 2개의 독립적인 실험 군 당 n=2 내지 8마리의 대조군 마우스와의 다중 비교를 위한 일원 ANOVA 검정으로 계산하였다.
도 5: 항 PD-1*2 IL7*1, 항 PD-1*1 IL7*1, 항 PD-1*1 IL7*2는 상승적으로 TCR 신호를 활성화한다. Promega PD-1/PD-L1 생물분석: (1) 이펙터 T 세포(PD-1을 안정적으로 발현하는 Jurkat, NFAT-유도된 루시퍼라제) 및 (2) 활성화 표적 세포(항원-독립적인 방식으로 동족 TCR을 활성화하도록 설계된 표면 단백질 및 PDL1을 안정적으로 발현하는 CHO K1 세포)를 공동 배양하였다. BioGloTM 루시페린을 첨가한 후, 발광을 정량화하고 T 세포 활성화를 반영한다. a. 항-PD1*2(●흑색), 항 PD-1*2 IL7 W142H*1(○ 백색)을 일련의 농도로 첨가하였다. 이소형 항체를 활성화의 음성 대조군(■)으로 사용하였다. b. 항-PD1*1 + 이소형 IL7 W142H*2 대조군(○ 백색 점선), 항 PD-1*1 IL7 W142H *2(● 회색), 항 PD-1*1 IL7 W142H*1(○ 회색)의 조합을 일련의 농도로 첨가하였다. 시험된 모든 W142H 작제물은 Fc와 IL-7 도메인 사이의 IgG1m 및 GGGGSGGGGSGGGGS 링커를 포함한다.
도 6: 항 PD-1*2 IL7*1, 항 PD-1*1 IL7*1, 항 PD-1*1 IL7*2　W142H 돌연변이체는 PD-1-CD127+ 세포 보다는 PD-1+ CD127+ 세포에 우선적으로 결합하여 PD-1+ CD127+ 세포 내로의 pSTAT5 신호전달을 활성화한다. CD127+을 발현하거나 CD127+ 및 PD-1+ 세포를 동시 발현하는 U937 세포를 세포 증식 염료(CPDe450 또는 CPDe670)로 염색하고 다양한 농도의 항 PD-1 IL-7 이기능성 분자와 인큐베이션하기 전에 1:1의 비율로 공동-배양하였다. 항-인간 IgG PE 및 pSTAT5 활성화로의 염색을 유세포 분석에 의해 인큐베이션 후에 정량화하였다. a. 각 세포 유형 및 각 작제물에 대해 EC50 결합(nM)을 계산하였다. b. 각 세포 유형 및 각 작제물에 대해 EC50 pSTAT5(nM)를 계산하였다. 이기능성 분자로 처리한 후, 세포를 고정, 투과화하고 AF647 표지된 항-pSTAT5(클론 47/Stat5(pY694)로 염색하였다. pSTAT5 활성화. 각 작제물 및 각 세포 유형 PD-1+ CD127+(백색 히스토그램) 및 U937 PD-1- CD127+(흑색 히스토그램)에 대해 EC50(nM)을 계산하였다. n=2개의 독립적인 실험. 이 분석에서, 항 PD-1*2 IL7 W142*1, 항 PD-1*1 IL7 W142*1 및 항 PD-1*1 IL7 W142*2를 시험하였으며 이들은 Fc와 IL-7 도메인 사이에 IgG1m 이소형 및 GGGGSGGGGSGGGGS 링커를 포함한다.
도 7: 복강내 주입 후 항 PD-1*2 IL7*1, 항 PD-1*1 IL7*1, 항 PD-1*1 IL7*2　W142H 돌연변이체 분자의 약동학. 1회 용량(34 nM/kg)의 항 PD-1*2 IL7 IL7*2 IgG4m(△), 항 PD-1*2 IL7 W142H*1 IgG1m(▼), 항 PD-1*1 IL7 W142H*1 IgG1m(● 회색), 또는 항 PD-1*1 IL7 W142H*2 IgG1m(○ 회색)을 인간화 PD1 마우스에 복강 내로 주입하였다. 주입 후 72시간 까지 혈청 중의 약물 농도를 ELISA로 평가하였다.
도 8: 포유류 세포에서 항 PD-1/IL7 이기능성 항체의 생산성. 비율(1:3:3; 사슬 A: 사슬 B: VL)로 항 PD-1*2/IL7*1 또는 항 PD-1*1/IL7*1 분자를 코딩하는 DNA를 사용하여 CHO-S 세포를 일시적으로 형질감염시켰다. 단백질 A 크로마토그래피를 사용하여 항체를 함유하는 상등액을 정제하였다. 정제 후 수득된 이기능성 항체의 양을 UV 분광광도계(DO 280nm)로 정량화하고 생성물의 부피에 대해 정규화하였다. 작제물의 생산성 원시 데이터.
도 9: 항 PD-1*1/IL-7wt*1(a) 및 항 PD-1*1/IL-7v*1(b)의 크기 배제 크로마토그래피. 정제된 항체를 SuperDex 200(10/300GL)을 사용하는 겔 여과 크로마토그래피를 사용하여 크기별로 분리하였다. 응집체, 이종이량체 항체 및 Fc 동종이량체에 해당하는 피크는 계산된 화합물의 %로 그래픽에 표시하였다.
도 10: 항 PD-1*/IL7*1 분자는 높은 효율로 pSTAT5를 활성화시킨다. 도 10a. 항 PD-1*1 /IL-21*1, 항 PD-1*1 /IL-15*1, 항 PD-1*1 /IL-7wt*1, 항 PD-1*1 /IL-7v*1로 처리한 인간 1차 T 세포의 pSTAT5 신호전달 분석. 건강한 지원자의 말초 혈액으로부터 단리한 인간 PBMC를 분자와 함께 15분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 고정하고, 투과화하고 항 CD3-BV421 및 항-pSTAT5 AF647(클론 47/Stat5(pY694))로 염색하였다. 데이터는 CD3+ 집단 내로의 pSTAT5 + 세포%에 해당한다. 도 10b. 항 PD-1*2 IL7v*2(▼) 또는 항 PD-1*1 IL7v1*1(△) 분자로 처리한 후 인간 CD127+ CD132+ U937 세포주 내로의 pSTAT5 신호전달. 왼쪽 그래프는 pSTAT5 + 세포의 %에 해당하고 오른쪽 그래프는 pSTAT5 활성화의 50%에 도달하는 데 필요한 농도를 참조하여 계산된 EC50(nM)에 해당한다. 데이터는 3개의 독립적인 실험의 평균 +/- SD를 나타낸다.
도 11: 항 PD-1*1/IL7*1 분자는 PD-1-세포에 비해 PD-1+ 세포에 높은 효율로 우선적으로 결합한다. 도 11a. PD-1+ CD127+ U937 세포(일반선) 대 PD-1- CD127+ U937 세포주(점선)에 대한 항 PD-1*1/IL-7wt*1 분자의 결합. 도 11b. PD-1+ CD127+ U937 세포(일반선) 대 PD-1- CD127+ U937 세포주(점선)에 대한 항 PD-1*1/IL-7v*1 분자의 결합. 도 11c. PD-1+ CD127+ 세포 대 PD-1- 세포 CD127+ 세포 내로의 pSTAT5 활성화 비교. PD-1+ CD127+(백색 히스토그램) 대 PD-1- CD127+ 세포(흑색 히스토그램)에 대한 pSTAT5 활성화의 EC50nM 비율을 계산하여 그래프에 보고하였다. N= 3개의 독립적인 실험.
도 12: 항 PD-1*1 IL7*1은 TCR 신호전달을 상승적으로 활성화한다. Promega PD-1/PD-L1 생물분석: (1) 이펙터 T 세포(PD-1을 안정적으로 발현하는 Jurkat, NFAT-유도된 루시퍼라제) 및 (2) 활성화 표적 세포(항원-독립적인 방식으로 동족 TCR을 활성화하도록 설계된 표면 단백질 및 PD-L1을 안정적으로 발현하는 CHO K1 세포)를 공동 배양하였다. BioGloTM 루시페린을 첨가한 후, 발광을 정량화하고 T 세포 활성화를 반영한다. 도 12a. 항-PD1*1(■ 흑색), 별도의 화합물로서 항 PD-1*1 + 이소형*1 IL-7wt*1(▽), 항 PD-1*1 IL7wt*1(▲ 흑색)을 일련의 농도로 첨가하였다. 오른쪽 그래프 EC50(nM)은 각 작제물에 대해 계산하였다. 도 12b. 항-PD1*1(■ 흑색), 별도의 화합물로서 항 PD-1*1 + 이소형*1 IL-7v*1(▽), 항 PD-1*1 IL7v*1(▲ 흑색)을 일련의 농도로 첨가하였다. 오른쪽 그래프 EC50(nM)은 각 작제물에 대해 계산하였다. 데이터는 적어도 3개의 독립적인 실험을 나타낸다.
도 13: 항 PD1*2/IL7v*1 또는 항 PD-1*2/IL7v*2 분자에 비해 항 PD-1*1/IL7v*1은 생체 내 에서 더 높은 약동학을 나타낸다. C57BL/6 마우스에 이중기능성 항 PD-1/IL-7v 분자의 1회 용량(34 nmol/kg)을 정맥 내로(도 13a) 또는 복강 내로(도 13b) 주입하였다. 항-인간 Fc 특이적 ELISA를 사용하여 여러 시점에서 혈청 내 항체 농도를 정량화하였다. 왼쪽 그래프, 데이터는 나노몰 농도로 표시된다. 오른쪽 그래프, 생체 내 약물 노출을 정의하기 위해 각 작제물에 대해 곡선 아래 면적을 계산하였다. 데이터는 군 당 2 내지 4 마리 마우스의 평균 +/- SEM이다.
도 14: 개별 항 PD1*2/IL7*1 분자의 약동학 연구. 데이터는 항 PD-1*1 또는 항 PD-1*2 백본 및 1 또는 2개의 융합된 IL7로 작제된 항 PD-1/IL-7 분자의 개별 작제물의 약동학 및 AUC를 나타낸다. 데이터는 개별적인 실험의 군 당 1 내지 4 마리 마우스의 평균 +/- SEM을 의미한다.
도 15: 항 PD-1 단독(항 PD-1*1 및 항 PD-1*2)의 단일 주입 후 마우스에서의 약동학 연구. C57 BL6 마우스에 1개의 항 PD-1 원자가(항 PD-1*1 ■, 점선) 또는 2개의 항 PD-1 원자가(항 PD-1*2 ●, 일반선)로 작제된 항 PD-1 항체의 1회 용량(34 nmol/kg)을 주입하였다. (도 15a) 정맥 내 주입 및 (도 15b) 복강 내 주입. 항-인간 Fc 특이적 ELISA를 사용하여 여러 시점에서 혈청 내 항체 농도를 정량화하였다. 데이터는 nM 농도로 표시된다.
도 16: 항 PD-1*1 IL7v*1 분자는 생체 내 에서 T 세포 증식을 유의하게 촉진한다. 1회 용량(34 nM/kg)의 항 PD-1 IL-7v 분자(항 PD-1*2 IL7v*1, 항 PD-1*1 IL7v*1, 항 PD-1*1 IL7v*2, 항 PD-1*2 IL7wt*1, 항 PD-1*1 또는 항 PD-*2)를 마우스에 복강 내로 주입하였다. 4일 차에, 종양 및 혈액을 수집하고, 다양한 T 세포 하위집단에서 T 세포를 ki67 증식 마커로 염색하였다. 혈액 중의 CD3 CD4+ 및 CD3 CD8+ 집단-에서(도 16a) 및 종양 내 TCF1+ 줄기-유사 CD8 T 세포 (CD45/CD3/CD8/CD44/TCF1+/TOX-)에서(도 16b) KI67 백분율을 정량화하였다. 통계적 유의성(*p<0,05)은 군 당 n=3 내지 8마리의 대조군 마우스와의 다중 비교를 위한 일원 ANOVA 검정으로 계산하였다.
도 17: 항 PD-1*1 IL7*1 분자는 항 PD-1 내성 간암종 동소위 모델에서 유의한 효능을 입증하였다. 인간화 PD-1 KI 면역적격 마우스를 실험에 사용하였다. Hepa1.6 간암종 세포를 간문맥을 통해 동소위적으로 주입하였다. 4일 차에, 마우스를 3회 용량의 PBS(음성 대조군), 항 PD-1*2, 및 항 PD-1*1 IL7*1로 처리하였다. 2개의 독립적인 실험을 수행하였다. 도 17a. 항 PD-1*1IL7v*1 대 항 PD-1*2 및 PBS 처리로 처리한 마우스의 생존. 도 17b. 항 PD-1*1IL7wt*1 대 항 PD-1*2 및 PBS 처리로 처리한 마우스의 생존.
도 18: 항 PD-1*1 IL7v*1 분자는 중피종 동소위 모델에서 높은 효능을 입증하였다. 인간화 PD-1 KI 면역적격 마우스를 실험에 사용하였다. AK7 중피종 세포를 복강 내로 주입하였다. 4일 차에, 마우스를 3회 용량의 PBS(음성 대조군), 항 PD-1*2, 항 PD-1*1 IL7v*1로 처리하였다. 도 18a. 생물발광으로 측정한 종양 부담. AK7 세포는 루시퍼라제를 안정적으로 발현하여 생물발광의 생체 내 정량화를 가능하게 한다. 도 18b. 처리 후 마우스의 생존.
도 19: 항 PD-1*1 IL7v*1 분자는 IL-7 사이토카인 단독 및 항 PD-1*1 IL7wt*1에 비해 더 높은 정도로 Treg의 억제 기능을 제거한다. CD8+ 이펙터 T 세포 및 자가 CD4+ CD25high CD127low Treg을 건강한 공여자의 말초 혈액으로부터 단리하고, 세포 증식 염료(CD8+ T 세포의 경우 CPDe670)로 염색하였다. 이어서 rIL-7, 항 PD-1*2, 재조합 IL-7 사이토카인, 항 PD-1*1 IL7WT*1 또는 항 PD-1*1 IL7v*1 (항 PD-1*1 IL7W142H*)(0.12nM)의 존재 또는 부재 하에 OKT3 코팅된 플레이트(2 μg/mL)에서 1:1 비율로 Treg/CD8+Teff를 5일 동안 공동 배양하였다. 이펙터 T 세포의 증식을 CPD 마커의 손실에 기초한 세포형광측정법으로 분석하였다. 데이터는 공식 100-((Treg와 공동배양된 Teff%/ Teff 증식 단독%)*100을 사용하여 분석된 Treg 억제 활성%을 나타낸다. 독립적인 실험의 n=4 공여자의 +/- SEM 데이터. 통계적 유의성은 다중 비교를 위해 Dunnett 검정을 사용하는 일원 ANOVA였다.
도 20: 항 PD-1 민감성 동소위 모델 AK7 동소위 모델에서 항 PD-1*1 IL7v*1 분자의 유의한 장기 단독요법 효능. AK7 중피종 세포를 hPD-1KI 마우스에 복강 내로 주입하고 PBS(n=8 마우스), 항 PD-1*2 (n=8 마우스), 항 PD-1*1 IL7v*1(W142H*1)(n=14), 항 PD-1*1 IL7WT *1로 처리하였다. (a) 처리 후 전체적인 생존. 통계적 유의성을 log-rank 검정(*p<0,05)으로 계산하였다. (b) 종양 재도전 후 항 PD-1*1 IL7v*1은 장기 기억 반응을 유도한다. 항 PD-1*1 IL7v*1 처리로 치유된 마우스(n=7)를 복강 내 주입(3e6 세포)을 통해 AK7 중피종 세포로 재도전시켰다. 대조군으로서, 나이브 마우스의 군(n=3)에 또한 주입하여 종양 부담 및 성장을 검증하였다. 그래프는 D-루시페린(150 mg/kg 및 바이오이미저를 사용한 분석)의 복강 내 주입 후 생물발광에 의해 정량화된 루시퍼라제 형질도입된 AK7 종양 세포 성장을 나타낸다(평균 +/- SEM).
도 21: 간암종 동소위 모델에서 항 PD-1*1 IL7v*1 분자의 전임상 효능. Hepa 1.6 종양 접종 후, 4/6 및 8일차에 마우스를 PBS, 항 PD-1, 항 PD-1*1 IL7v*1(항 PD-1*1 IL7W142H*1) 또는 항 PD-1*1 IL7wt*1로 처리하였다. 3개의 독립적인 실험에 대해 수득한 전체적인 생존 및 설명을 위해 합침. PBS(n=23); 항 PD-1*2(n=26), 이소형-IL-7(n=14), 항 PD-1*1 IL7v*1(n=20) 및 항 PD-1*1IL7wt*1(n=19). 통계적 유의성 p<0.05을 Log Rank 검정으로 계산하였다.
도 22: 종양 미세환경에서 줄기-유사 기억 CD8 T 세포 하위 집합의 증가를 나타내는 생체 내 에서 항 PD-1*1 IL7v*1 분자를 처리한 후 유전자 서명. Hepa 1.6 종양 접종 후, 4/6 및 8일차에 마우스를 PBS, 항 PD-1(34.3 nmol/kg) 또는 항 PD-1*1 IL7v*1 또는 항 PD-1*1 IL7wt *1(34.3 nmol/kg)(군 당 n=4)로 처리하였다. 10일차에, 종양을 수집하고, Nanostring Pancancer 면역 패널로 유전자 발현을 분석하였다 (a) 항 PD-1와 BICKI IL7v 처리 사이의 일반적인 상향조절된 유전자의 STRING 단백질-단백질 네트워크 분석을 통해 PBS, 항 PD-1 및 항 PD-1*1IL7v*1군 사이에서 차별적으로 발현된(DEG) 유전자의 히트맵 표현;. (b 및 c) 초기 활성화된 T 세포 대 고갈된 T 세포의 유전자 서명 풍부. 고갈된 T 세포의 유전자 서명 및 나이브 유사/줄기 유사 기억 T 세포 서명을 Andreatta 등(문헌[Nature comm 2021, 12, 2965])에 대해 맞추었다 나이브-유사/줄기-유사 기억 T 세포(TCF7, CCR7, SELL, IL7R) 및 고갈된 CD8 T 세포 점수(LAG3, PRF1, CD8A, HAVRC2, GZMB, CD8B1, KLRD1, TNFRSF9, TIGIT, CTSW, CCL4, CD63, IFNG, CXCR6, FASL, CSF1).
도 23: 항 PD-1*1 IL7v*1 분자는 종양 미세환경 내로 줄기-유사 기억 CD8 T 세포(TCF1+) 하위 집합의 증식을 유도한다. (a, b 및 c) Hepa 1.6 종양 접종 후, 4/6 및 8일차에 마우스를 PBS, 항 PD-1(34.3 nmol/kg) 또는 항 PD-1*1 IL7v*1 또는 항 PD-1*1 IL7wt *1(34.3 nmol/kg)(군 당 n=4)로 처리하였다. 10일차에, 종양을 수집하고, T 세포를 CD3/CD8/CD44 마커 및 TCF1/TOX 인자의 발현에 대한 유세포 분석을 위해 염색하였다. (a) 종양 미세환경 내로의 CD4, CD8, 및 Treg 하위집단의 백분율 (b) TCF1+/-TOX 마커를 발현하는 CD44+ CD8+ 활성화된 T 세포의 백분율 (c) MC38 피하 모델에서 Hepa1.6 모델(D)에서의 KI67 마커의 %로 측정된 TCF1+/-TOX 마커를 발현하는 CD44+ CD8+ 활성화 T 세포의 증식, TCF1+/-TOX 마커를 발현하는 CD44+ CD8+ 활성화 T 세포의 증식을 처리(항 PD-1*2 항 PD-1*1 IL7v*1 (W142H*1)) 후 KI67 마커의 %로 측정하였다
도 24: 항 PD-1*1 IL7v*1은 만성적으로 자극된 T 세포의 생존(a) 및 시험관 내에서 줄기-유사 T 세포의 유도된 증식(b)을 유지한다. 2명의 건강한 지원자의 말초 혈액으로부터 단리된 인간 PBMC는 3일마다 항-CD3 및 항-CD28 작용제 항체로 만성적으로 자극하였다. 각 자극 동안 T 세포를 항-PD-1, 인간 IL-7 및 항-PD-1*1 IL7v*1로 처리하였다. 5차 자극 1일 후, T 세포를 생존 염료, 항-CD3, 항-CD8, 항-TCF1 및 항-ki67 증식 마커로 염색하였다. (a) 전체 세포에서 생존력을 정량화하였다. (b) KI67 백분율은 CD3+ CD8+ TCF1-/+ 집단에서 정량화하였다. 데이터는 평균 +/- SD 군 당 N=2 공여자.
도 25: 유방암 세포 인간화 마우스 모델에서 항 PD-1*1 IL7v*1 분자의 단독요법 효능. NXG 면역결핍 마우스에 MDA-MB231 유방암 세포 암종 세포(3e6 세포)를 피하 주사하고, 8일째에(3e6 세포) 인간 PBMC로 복강 내로 인간화한 다음, 종양 접종 후 12일, 15일 및 18일에 PBS, 항 PD-1*2 또는 항 PD-1*1 IL7v*1로 복강내로 처리하였다. 데이터는 평균 +/- SEM 군 당 및 공여자 당 N=3 내지 4마리
도 26: 폐암 A549 인간화 마우스 모드에서 항 PD-1*1 IL7v*1 분자의 단독요법 효능. NXG 면역결핍 마우스에 A549 폐 암종 세포를 피하 주사하고, 인간 PBMC로 21일째에 복강내로 인간화(10e6 세포)한 다음, 종양 접종 후 25일, 28일, 31일 및 34째일에 PBS, 항 PD-1*2 또는 항 PD-1*1 IL7v*1로 복강 내로 처리하였다. (a) A549 종양 성장 군 당 n=5마리 마우스, 평균 +/- SEM. 통계적 유의성 **p<0.05는 항 PD-1*1 IL7v*1 대 항 PD-1*2 군을 비교함으로써 Dunnett의 다중 비교 검정을 사용하여 계산되었다. (b) 35일째에 수집된 마우스의 혈청에서 ELISA에 의해 정량화된 인간 IFNg 분비(군 당 n= 2내지 5마리 마우스).
도 27. 항 PD-1*1 IL7v*1은 항 PD-1*1 IL7wt*1 분자와 비교하여 더 우수한 약동학 프로파일을 입증했으며 생체 내 에서 CD8 T 세포의 증식을 유도했다. 동물에게 0.8 mg/kg(n=1 cyno), 4.01 mg/kg(n=1 cyno), 25 mg/kg(n=1 cyno)의 1회 용량의 항 PD-1*1 IL-7v*1(항 PD-1*1 IL7 W142H*1) 또는 항 PD-1*1 IL7wt*1을 정맥 내로 주입하였다. (a) 동물 혈청 중의 약물 농도를 MSD 면역분석으로 정량화하였다. (b) CD8 T 세포 증식 측정을 상이한 용량의 항 PD-1*1 IL7v*1 항체의 주입 후 말초 혈액 T 세포에서 유세포 분석으로 평가하였다(용량 당 n=1 cyno).
도 28. IgG1 N297A 이소형 또는 IgG1 N297A LALA PG 이소형으로 작제한 항 PD-1*1 IL7v*1은 pSTAT5 활성화에 대한 유사한 효능을 나타냈다. 자극된 인간 PBMC를 상이한 용량에서 IgG1 N297A 이소형 또는 IgG1 LALA P329G 돌연변이로 작제된 항 PD-1*1 IL7v*1로 처리하였다. IL-7R 신호전달 활성화를 CD4 및 CD8 T 세포에 대한 세포 내 pSTAT5 염색으로 측정하고 유세포 분석으로 분석하였다.
도 29: 항 PD-1 IL7 W142H 돌연변이체는 PD-1에 대한 높은 결합 효율을 입증하였다. PD-1 결합 ELISA 분석. 인간 재조합 PD-1(rPD1) 단백질을 고정하고, 항체를 상이한 농도로 첨가하였다. 퍼옥시다제에 커플링된 항-인간 Fc 항체로 밝혀냈다. TMB 기질을 사용하여 450 nm에서 비색법을 측정하였다. 1개의 항 PD-1 아암(◆)을 갖는 IL7 W142H N297A 변이체를 포함하는 이기능성 분자를 대조군으로서 시험하였다. 1개의 항 PD-1 아암(IL7 W142H N297A DHS ■), (IL7 W142H N297A LS ▲), (IL7 W142H N297A YTE X), (IL7 W142H N297A VL CNDOwt ), (IL7 W142H N297A VL vAv3-11 ●)을 가진 IL7 변이체를 포함하는 이기능성 분자도 시험하였다.
도 30: 항 PD-1의 하나의 원자가 및 하나의 IL-7 W142H 돌연변이체 사이토카인으로 작제된 항 PD-1 IL7 분자는 높은 효율로 pSTAT5를 활성화한다. IL-7 W142H*1 사이토카인 돌연변이체에 융합된 항 PD-1*1 백본으로 pSTAT5 신호전달을 분석하였다. 건강한 지원자의 말초 혈액으로부터 단리한 인간 T 림프구를 이기능성 분자와 함께 15분 동안 인큐베이션하였다. 이어서 세포를 고정하고, 투과성화하고 항 CD3-BV421 및 항-pSTAT5 AF647(클론 47/Stat5(pY694))로 염색하였다. CD3+ 집단 내로의 MFI %pSTAT5 + 세포를 계산하여 데이터를 수득하였다. 1 항 PD-1 아암(흑색 ◆) 및 야생형 IL7(▽)이 있는 IL7 W142H N297A 변이체를 포함하는 이기능성 분자, 및 하나의 원자가의 항 PD-1(◇)으로 작제된 항 PD-1 분자를 대조군으로서 시험하였다. 1개의 항 PD-1 아암(IL7 W142H N297A DHS (회색 ■)), (IL7 W142H N297A LS (흑색 ▲)), (IL7 W142H N297A YTE (흑색 X)), (IL7 W142H N297A VL CNDOwt 흑색 *), (IL7 W142H N297A VL vAv3-11 흑색 ●)을 가진 IL7 변이체를 포함하는 이기능성 분자도 또한 시험하였다.
도입
본 발명은 특정 스캐폴드를 갖고 면역 세포 표면에서 특이적으로 발현되는 표적, 특히 PD-1, 및 단일 면역-자극 사이토카인, 특히 IL-7에 결합하는 단일 1가 항원 결합 도메인을 포함하는 이기능성 분자에 관한 것이다. 이러한 스캐폴드는 본질적으로 Fc 도메인의 하나의 단량체의 N 말단 단부에 연결된 단일 1가 항-PD-1 항원 결합 도메인 및 Fc 도메인 단량체 또는 항원 결합 도메인이 가변 중쇄 및 가변 경쇄를 포함하는 경우 경쇄의 C 말단 단부에 연결된 단일 면역-자극 사이토카인, 특히 IL-7인 이량체 Fc 도메인으로 본질적으로 이루어진다. 이러한 신규한 이기능성 분자는, 무엇보다도 개선된 약동학적 프로파일 및 더 나은 생산성을 제공한다.
본 발명자들은 놀랍게도 2개의 IL7 변이체를 포함하는 작제물과 비교하여 단일 IL-7 변이체를 포함하는 작제물의 개선된 특성을 활성 및 약동학 모두에서 보여주었다.
정의
본 발명을 보다 쉽게 이해할 수 있도록 이하에 특정 용어가 정의된다. 추가 정의는 상세한 설명 전반에 걸쳐 설명된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 용어, 표기법 및 기타 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는 것으로 의도된다. 일부 경우에, 일반적으로 이해되는 의미를 갖는 용어는 명료함 및/또는 용이한 참조를 위해 본원에 정의되며, 본원에 이러한 정의를 포함하는 것이 반드시 당업계에서 일반적으로 이해되는 것과의 차이를 나타내는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 명세서에 기술되거나 참조된 기술 및 절차는 일반적으로 잘 이해되고 당업자에 의해 통상적인 방법론을 사용하여 일반적으로 사용된다.
본원에 사용된 용어 "야생형 인터루킨-7", "wt-IL-7" 및 "wt-IL7"은 예를 들어 IL-7 수용체 결합 친화도의 표준 생물검정 또는 검정에서 야생형 기능성 포유류 IL-7에 대한 실질적인 아미노산 서열 동일성 및 실질적으로 동등한 생물학적 활성을 갖는 포유류 내인성 분비 당단백질, 특히 IL-7 폴리펩티드, 그의 유도체 및 유사체를 지칭한다. 예를 들어, wt-IL-7은 i) 천연 또는 자연-발생 IL-7 폴리펩티드, ii) IL-7 폴리펩티드의 생물학적 활성 단편, iii) IL-7 폴리펩티드의 생물학적 활성 폴리펩티드 유사체, 또는 iv) 생물학적 활성 IL-7 폴리펩티드의 아미노산 서열을 갖는 재조합 또는 비-재조합 폴리펩티드의 아미노산 서열을 지칭한다. IL-7은 펩티드 신호를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 이 분자에 대한 대체 명칭은 "pre-B 세포 성장 인자" 및 "림포포이에틴-1"이다. 바람직하게는, 용어 "wt-IL-7"은 인간 IL-7(wth-IL7)을 지칭한다. 예를 들어, 인간 wt-IL-7 아미노산 서열은 약 152개 아미노산(신호 펩티드 부재)이고 Genbank 수탁 번호 NP_000871.1을 가지며, 유전자는 염색체 8q12-13에 위치한다. 인간 IL-7은 예를 들어 UniProtKB - P13232에 기재되어 있다. 본원에서 사용된 용어 "예정된 사멸 1(Programmed Death 1)", "예정된 세포 사멸 1(Programmed Cell Death 1)", "PD1", "PD-1", "PDCD1", "PD-1 항원", "인간 PD-1", "hPD-1" 및 "hPD1"은 상호교환적으로 사용되며 CD279로도 공지된 예정된 사멸-1 수용체(Programmed Death-1 receptor)를 지칭하고, 인간 PD-1의 변이체 및 이소형, 및 PD-1과 적어도 하나의 공통 에피토프를 가진 유사체를 포함한다. PD-1은 면역 반응의 역치 및 말초 면역 관용의 주요 조절자이다. 이는 활성화된 T 세포, B 세포, 단핵구, 및 수지상 세포 상에서 발현되고 이의 리간드 PD-L1 및 PD-L2에 결합한다. 인간 PD-1은 PDCD1 유전자에 의해 코딩된다. 예로서, 인간 PD-1의 아미노산 서열이 GenBank 접근 번호 NP_005009로 개시되어 있다. PD1은 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC: Peripheral blood mononuclear cell) 상에 발현된 4개의 스플라이스 변이체를 갖는다. 따라서, PD-1 단백질은 전장 PD-1뿐만 아니라, PD-1의 대안적인 스플라이스 변이체, 예컨대 PD-1Aex2, PD-1Aex3, PD-1Aex2,3 및 PD-1Aex2,3,4를 포함한다. 달리 명시되지 않는 한, 상기 용어는 임의의 변이체 및, PBMC에 의해 자연적으로 발현된, 또는 PD-1 유전자로 형질감염된 세포에 의해 발현된 인간 PD-1의 이소형을 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "항체"는 면역글로불린 분자의 유형을 기술하며 이의 최광의로 사용된다. 특히, 항체는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적으로 활성인 단편, 즉, 항원 결합 부위를 함유하는 분자를 포함한다. 면역글로불린 분자는 임의의 유형(예컨대, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 부류(예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 하위부류일 수 있다. 상이한 부류의 면역글로불린에 해당하는 중쇄 불변 도메인은 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤로 지칭된다. 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 상기 용어 "항체"는 온전한(intact) 면역글로불린 및 "항체 단편" 또는 "항원 결합 단편"(예컨대 Fab, Fab', F(ab')2, Fv), 단일 사슬(scFv), 이의 돌연변이체, 항체 부분을 포함하는 분자, 디아바디, 선형 항체, 단일 사슬 항체, 및 항체의 글리코실화 변이체, 항체의 아미노산 서열 변이체를 포함하여, 요구되는 특이성의 항원 인식 부위를 포함하는 면역글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 구성(configuration)을 포함한다. 바람직하게는, 상기 용어 항체는 인간화 항체를 지칭한다.
본원에서 사용된 "항체 중쇄"는 항체 입체형태(conformation)에 존재하는 2가지 유형의 폴리펩티드 사슬 중 더 큰 것을 지칭한다. 항체 중쇄의 CDR은 전형적으로 "HCDR1", "HCDR2" 및 "HCDR3"으로 지칭된다. 항체 중쇄의 프레임워크 영역은 전형적으로 "HFR1", "HFR2", "HFR3" 및 "HFR4"로 지칭된다.
본원에서 사용된 "항체 경쇄"는 항체 입체형태에 존재하는 2가지 유형의 폴리펩티드 사슬 중 더 작은 것을 지칭하고, κ 및 λ 경쇄는 2개의 주요 항체 경쇄 이소형을 지칭한다. 항체 경쇄의 CDR은 일반적으로 "LCDR1", "LCDR2" 및 "LCDR3"으로 지칭된다. 항체 경쇄의 프레임워크 영역은 일반적으로 "LFR1", "LFR2", "LFR3" 및 "LFR4"로 지칭된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 항체의 "항원-결합 단편" 또는 "항원-결합 도메인"은 항체의 일부, 즉, 가능하게는 천연 형태의 특정 항원에 대한 항원-결합능을 나타내는 본 발명의 항체 구조의 일부에 상응하는 분자를 의미하며; 이러한 단편은 특히 상응하는 4-사슬 항체의 항원-결합 특이성과 비교하여 상기 항원에 대해 동일하거나 실질적으로 동일한 항원-결합 특이성을 나타낸다. 유리하게는, 항원-결합 단편은 상응하는 4-사슬 항체와 유사한 결합 친화도를 갖는다. 그러나, 상응하는 4-사슬 항체에 대해 감소된 항원-결합 친화도를 가진 항원-결합 단편이 또한 본 발명 내에 포함된다. 항원-결합능은 항체와 표적 단편 사이의 친화도를 측정하여 결정될 수 있다. 이러한 항원-결합 단편은 또한 항체의 "기능성 단편"으로도 지정될 수 있다. 항체의 항원-결합 단편은 CDR(상보성 결정 영역(Complementary Determining Region) 또는 이들의 일부로 지정된 이들의 초가변 도메인을 포함하는 단편이다.
본원에서 사용된 용어 "인간화 항체"는 마우스와 같은 또 다른 포유류 종의 생식세포(germline)로부터 유도된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열에 이식된(grafted) 항체(예컨대, 비-인간 항체로부터 유도된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체)를 지칭하는 것으로 의도된다. 항체, 예컨대, 비-인간 항체의 "인간화 형태"는 또한 인간화를 거친 항체를 지칭한다. 인간화 항체는 일반적으로 하나 이상의 CDR 유래의 잔기가 비-인간 항체(공여자 항체)의 적어도 하나의 CDR 유래 잔기로 대체되는 동시에 본래 항체의 원하는 특이성, 친화도 및 능력(capacity)을 유지하는 인간 면역글로불린(수여자 항체)이다. 추가의 프레임워크 영역 변형이 인간 프레임워크 서열 내에서 이루어질 수 있다. 바람직하게는 인간화 항체는 80%, 85% 또는 90% 초과의 T20 인간성 점수를 갖는다. 항체의 "인간성"은 예를 들어 문헌[Gao SH, Huang K, Tu H, Adler A S. BMC Biotechnology. 2013: 13:55]에 기재된 바와 같이 항체의 가변 영역의 인간성을 정량화하기 위해 T20 스코어 분석기를 사용하여, 또는 T20 Cutoff Human Databases: http://abAnalyzer.lakepharma.com을 사용하여 항체 서열의 T20 점수를 계산하기 위해 웹 기반 도구를 통해 측정될 수 있다.
"키메라 항체"는 비인간 공급원, 바람직하게는 예컨대 마우스로부터의 유전 물질을 인간의 유전 물질과 조합함으로써 제조된 항체를 의미한다. 이러한 항체는 키메라 영역에 의해 연결된 인간 및 비-인간 항체 모두에서 유래한다. 키메라 항체는 일반적으로 인간으로부터의 불변 도메인과 다른 포유류 종으로부터의 가변 도메인을 포함하여, 치유적 치료에 사용될 때 비인간 동물로부터의 외래 항체에 대한 반응 위험을 줄인다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "결정화 가능한 단편 영역" "Fc 영역" 또는 "Fc 도메인"은 상호교환가능하고 Fc 수용체라고 하는 세포 표면 수용체와 상호작용하는 항체의 꼬리 영역을 지칭한다. Fc 영역 또는 도메인은 전형적으로 항체의 두 중쇄(즉, CH2 및 CH3 도메인)의 제2 및 제3 불변 도메인에서 유래된, 선택적으로 동일한, 2개의 도메인으로 구성된다. Fc 도메인의 일부는 CH2 또는 CH3 도메인을 지칭한다. 선택적으로, Fc 영역 또는 도메인은 CH1과 CH2 사이의 힌지 영역의 전부 또는 일부를 선택적으로 포함할 수 있다. 따라서, Fc 도메인은 힌지, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함할 수 있다. 선택적으로, Fc 도메인은 선택적으로 IgG1 힌지-CH2-CH3 및 IgG4 힌지-CH2-CH3을 갖는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4로부터의 것이다.
IgG 항체의 맥락에서, IgG 이소형은 각각 3개의 CH 영역을 갖는다. 따라서, IgG의 맥락에서 "CH" 도메인은 다음과 같다: "CH1"은 Kabat에서와 같이 EU 인덱스에 따른 위치 118-215를 나타낸다. "힌지"는 Kabat에서와 같이 EU 인덱스에 따른 위치 216-230을 나타낸다. "CH2"는 Kabat에서와 같이 EU 인덱스에 따른 위치 231-340을 나타내고, "CH3"은 Kabat에서와 같이 EU 인덱스에 따른 위치 341-447을 나타낸다.
"아미노산 변화" 또는 "아미노산 변형"은 본원에서 폴리펩티드의 아미노산 서열의 변화를 의미한다. "아미노산 변형"은 폴리펩티드 서열에서의 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함한다. 본원에서 "아미노산 치환" 또는 "치환"은 모 폴리펩티드 서열의 특정 위치에 있는 아미노산을 다른 아미노산으로 대체하는 것을 의미한다. "아미노산 삽입" 또는 "삽입"은 모 폴리펩티드 서열의 특정 위치에 아미노산을 추가하는 것을 의미한다. "아미노산 결실" 또는 "결실"은 모 폴리펩티드 서열의 특정 위치에서 아미노산의 제거를 의미한다. 아미노산 치환은 보존적일 수 있다. 보존적 치환은 주어진 아미노산 잔기를 유사한 화학적 특성(예를 들어, 전하, 벌크 및/또는 소수성)을 갖는 측쇄("R-기")를 갖는 다른 잔기로 대체하는 것이다. 본원에 사용된 바와 같이, "아미노산 위치" 또는 "아미노산 위치 번호"는 상호교환적으로 사용되며, 일반적으로 아미노산에 대한 한 문자 코드로 특정되는, 아미노산 서열에서 특정 아미노산의 위치를 지칭한다. 아미노산 서열에서의 첫 번째 아미노산(즉, N 말단에서 시작)은 위치 1을 갖는 것으로 간주되어야 한다.
보존적 치환은 주어진 아미노산 잔기를 유사한 화학적 특성(예를 들어, 전하, 벌크 및/또는 소수성)을 갖는 측쇄("R-기")를 갖는 다른 잔기로 대체하는 것이다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환은 단백질의 기능적 특성을 실질적으로 변화시키지 않을 것이다. 보존적 치환 및 해당 규칙은 최신 기술에 잘 설명되어 있다. 예를 들어, 보존적 치환은 하기 표에 반영된 아미노산 기 내의 치환으로 정의될 수 있다.
[표 A]
[표 B]
[표 C]
본원에 사용된 바와 같이, 2개의 서열 사이의 "서열 동일성"은 "서열 동일성", "서열 유사성" 또는 "서열 상동성" 매개변수에 의해 기술된다. 본 발명의 목적을 위해, 2개의 서열 (A)와 (B) 사이의 "백분율 동일성"은 비교 창을 통해 최적 방식으로 정렬된 2개의 서열을 비교함으로써 결정된다. 서열의 상기 정렬은 예를 들어 Needleman-Wunsch의 전체 정렬을 위한 알고리즘을 사용하여 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 수행될 수 있다. 단백질 분석 소프트웨어는 보존적 아미노산 치환을 포함하여 다양한 치환, 결실 및 기타 변형에 할당된 유사성 측정을 사용하여 유사한 서열을 매칭시킨다. 전체 정렬이 얻어지면, 정렬된 동일한 아미노산 잔기의 전체 수를 서열 (A)와 (B) 사이의 가장 긴 서열에 포함된 잔기의 전체 수로 나누어 동일성 백분율이 얻어질 수 있다. 서열 동일성은 전형적으로 서열 분석 소프트웨어를 사용하여 결정된다. 2개의 아미노산 서열을 비교하기 위해, 예를 들어 기본 설정: (I) Matrix: BLOSUM62, (ii) 갭 오픈(Gap open): 10, (iii) 갭 확장: 0.5, (iv) 출력 형식: 쌍, (v) 단부 간격 패널티: 실패, (vi) 단부 간격 오픈: 10, (vii) 단부 간격 확장: 0.5를 사용하여, 예를 들어 EMBL-EBI에서 제공하고 www.ebi.ac.uk/Tools/services/web/toolform.ebi?tool=emboss_needle&context=protein에서 입수가능한 단백질의 쌍별 서열 정렬을 위한 도구 "엠보스 바늘(Emboss needle)"을 사용할 수 있다.
대안적으로, 서열 동일성은 HHalign 알고리즘과 그의 기본 설정을 그의 핵심 정렬 엔진으로 사용하는 서열 분석 소프트웨어 Clustal Omega를 사용하여 전형적으로 결정될 수도 있다. 알고리즘은 문헌[Soding, J. (2005) 'Protein homology detection by HMM-HMM comparison'. Bioinformatics 21, 951-960]에 기본 설정과 함께 기재되어 있다.
본원에 사용된 용어 "~로부터 유래" 및 "~로부터 유래된"은 모 화합물 또는 단백질의 구조로부터 유도된 구조를 갖고 구조가 본원에 개시된 것과 충분히 유사하고 그 유사성에 기초하여 청구된 화합물과 동일하거나 유사한 특성, 활성 및 유용성을 나타내는 것으로 당업자에 의해 예상되는 화합물을 지칭한다.
본원에 사용된 "약학 조성물"은 생리학적으로 적합한 담체 및 부형제와 같은 임의의 다른 화학 성분과 함께 본 발명에 따른 이기능성 분자를 포함하는 것과 같은 활성제 중 하나 이상의 제제를 지칭한다. 약학 조성물의 목적은 유기체에 대한 활성제의 투여를 용이하게 하는 것이다. 본 발명의 조성물은 임의의 통상적인 투여 또는 사용 경로에 적합한 형태일 수 있다. 한 양태에서, "조성물"은 전형적으로 활성제, 예를 들어, 화합물 또는 조성물과, 자연-발생 또는 비-자연-발생 담체, 비활성(예를 들어, 검출가능한 제제 또는 표지) 또는 활성제의 조합, 예컨대 보조제, 희석제, 결합제, 안정화제, 완충제, 염, 친유성 용매, 방부제, 보조제 등을 의도하고, 약학으로 허용가능한 담체를 포함한다. 본원에 언급된 "허용가능한 비히클" 또는 "허용가능한 담체"는 약학 조성물을 제형화하는데 유용한 것으로 당업자에게 공지된 임의의 공지된 화합물 또는 화합물의 조합이다.
본원에 사용된 "유효량" 또는 "치료적 유효량"은 단독으로 또는 하나 이상의 다른 활성제와 조합하여 대상체에게 치료 효과를 부여하는 데 필요한 활성제의 양, 예를 들어 표적 질환 또는 장애를 치료하거나, 원하는 효과를 내는 데 필요한 활성제의 양을 지칭한다. "유효량"은 작용제, 질환 및 그 중증도, 연령, 신체 상태, 체격, 성별 및 체중을 포함한 치료 대상체의 특성, 치료 기간, 동시 요법(있는 경우)의 성질, 특정 투여 경로 및 의료 종사자의 지식 및 전문 지식 내에서 유사한 요인에 따라 다르다. 이러한 요인은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 일상적인 실험만으로도 해결할 수 있다. 일반적으로 개별 성분 또는 이들의 조합의 최대 용량, 즉 건전한 의학적 판단에 따른 최고 안전 용량을 사용하는 것이 바람직하다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "의약"은 장애 또는 질환에 대한 치유 또는 예방 특성을 갖는 임의의 물질 또는 조성물을 지칭한다.
용어 "치료"는 질환 또는 질환의 증상을 치료, 방지, 예방 및 지연시키는 등 환자의 건강상태를 개선하기 위한 행위를 지칭한다. 질환의 치유적 치료 및/또는 예방적 치료를 모두 나타낸다. 치유적 치료는 직접적 또는 간접적으로 유발하는 질환 또는 질환의 증상 또는 고통을 경감, 개선 및/또는 제거, 감소 및/또는 안정화하는 치유 또는 치료를 초래하는 치료로 정의된다. 예방적 치료는 질환의 예방을 초래하는 치료 및 질환의 진행 및/또는 발병 또는 이의 발병 위험을 감소 및/또는 지연시키는 치료 둘 다를 포함한다. 특정 양태에서, 이러한 용어는 질환, 장애, 감염 또는 이와 관련된 증상의 개선 또는 근절을 지칭한다. 다른 양태에서, 이 용어는 암의 확산 또는 악화를 최소화하는 것을 지칭한다. 본 발명에 따른 치료는 반드시 100% 또는 완전한 치료를 의미하지는 않는다. 오히려, 당업자가 잠재적인 이점 또는 치료 효과를 갖는 것으로 인식하는 다양한 정도의 치료가 존재한다. 바람직하게는, 용어 "치료"는 장애/질환이 있는 대상체에 대한 하나 이상의 활성제를 포함하는 조성물의 적용 또는 투여를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "장애" 또는 "질환"은 유전적 또는 발달적 오류, 감염, 독극물, 영양 결핍 또는 불균형, 독성, 또는 불리한 환경 요인의 영향으로 인해 신체의 기관, 부분, 구조 또는 시스템이 잘못 기능하는 것을 지칭한다. 바람직하게는, 이러한 용어는 건강 장애 또는 질환, 예를 들어, 정상적인 신체적 또는 정신적 기능을 방해하는 질환을 지칭한다. 보다 바람직하게는, 장애라는 용어는 암과 같이 동물 및/또는 인간에 영향을 미치는 면역 및/또는 염증성 질환을 지칭한다.
본원에 사용된 "면역 세포"는 골수에서 생성된 조혈 줄기 세포(HSC), 림프구(T 세포, B 세포, 자연 살해(NK) 세포 및 자연 살해 T 세포(NKT) 및 골수 유래 세포(호중구, 호산구, 호염기구, 단핵구, 대식세포, 수지상 세포)에서 유래된 백혈구 세포(백혈구)와 같은 선천성 및 후천성 면역에 관여하는 세포를 지칭한다. 특히, 면역 세포는 B 세포, T 세포, 특히 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포, NK 세포, NKT 세포, APC 세포, 수지상 세포 및 단핵구를 포함하는 비제한적 목록에서 선택될 수 있다. 본원에서 사용되는 "T 세포"는 예를 들어 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, T 헬퍼 1형 T 세포, T 헬퍼 2형 T 세포, T 헬퍼 17형 T 세포 및 억제성 T 세포를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "T 이펙터 세포", "T eff" 또는 "이펙터 세포"는 공동-자극과 같은 자극에 능동적으로 반응하는 여러 T 세포 유형을 포함하는 면역 세포의 그룹을 설명한다. 이것은 특히 (예를 들어, 다른 세포의 활성화를 조절하는 사이토카인을 생성하거나 세포독성 활성에 의해) 항원을 제거하는 기능을 하는 T 세포를 포함한다. 여기에는 특히 CD4+, CD8+, 세포독성 T 세포 및 헬퍼 T 세포(Th1 및 Th2)가 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "조절 T 세포", Treg 세포" 또는 "T reg"는 면역계를 조절하고, 자가-항원에 대한 내성을 유지하고, 자가면역 질환을 예방하는 T 세포의 하위집단을 지칭한다. Treg는 면역억제제이며, 일반적으로 이펙터 T 세포의 유도 및 증식을 억제하거나 하향조절한다. Treg는 바이오마커 CD4, FOXP3 및 CD25를 발현하며, 나이브 CD4 세포와 동일한 계통에서 유래된 것으로 생각된다.
용어 "고갈된 T 세포"는 기능장애(즉, "고갈") 상태에 있는 T 세포의 집단을 지칭한다. T 세포 고갈은 기능의 점진적인 상실, 전사 프로파일의 변화 및 억제 수용체의 지속적인 발현을 특징으로 한다. 고갈된 T 세포는 그들의 사이토카인 생산 능력, 높은 증식 능력 및 세포독성 잠재력을 상실하여, 결국 결실을 초래한다. 고갈된 T 세포는 전형적으로 CD62L 및 CD127의 낮은 발현과 결합된 CD43, CD69 및 억제 수용체의 높은 수준을 나타낸다.
용어 "이펙터 기억 줄기 유사 T 세포"는 체크포인트 단백질 PD-1 및 전사 인자 Tcf1의 발현을 포함하여, 고갈된 세포 및 중앙 기억 세포의 특징을 지닌 종양 반응성 종양 내 T 세포의 하위 집합을 지칭한다. 이러한 세포는 Tcf1+PD-1+CD8+ T 세포라고 지칭될 수 있다. 이러한 세포는 종양 미세환경에 상주하며 면역요법에 의해 촉진되는 암의 면역 조절에 중요하다. 그들은 만성 바이러스 감염 및 암 동안 T 세포 반응을 유지하는 데 중요하며 PD-1 면역요법 후 나타나는 증식 폭발을 제공한다. 이 세포는 느린 자가 재생을 거치며 또한 보다 최종적으로 분화되고 고갈된 CD8 T 세포를 생성한다. 이들 세포 및 이들의 특성은 하기 기사에서 추가로 정의되며, 그의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다: 문헌[Siddiqui et al, 2019, Immunity, 50, 195-211]; 및 문헌[Jadhav et al, 2019, PNAS, 116, 14113-14118)].
용어 "면역 반응"은 예를 들어 림프구, 항원 제시 세포, 식세포, 과립구 및 상기 세포 또는 간에서 생성된 가용성 거대분자(항체, 사이토카인 및 보체 포함)의 작용을 지칭하며, 이는 침입하는 병원체, 병원체에 감염된 세포 또는 조직, 암 세포, 또는 자가면역 또는 병리학적 염증의 경우 정상 인간 세포 또는 조직에 대한 선택적 손상, 파괴 또는 인체로부터의 제거를 초래한다.
본원에 사용된 용어 "길항제"는 다른 물질의 활성 또는 기능을 차단하거나 감소시키는 물질을 지칭한다. 특히, 이 용어는 참조 물질(예를 들어, PD-L1 및/또는 PD-L2)로서 세포 수용체(예를 들어, PD-1)에 결합하여 일반적인 생물학적 효과(예를 들어, 면역 억제 미세환경의 생성)의 전체 또는 일부를 생성하는 것을 방지하는 항체를 지칭한다. 본 발명에 따른 인간화 항체의 길항제 활성은 경쟁적 ELISA에 의해 평가될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "작용제"는 활성화 수용체의 기능을 활성화시키는 물질을 지칭한다. 특히, 본 용어는 세포 활성화 수용체에 참조 물질로서 결합하고, 생물학적 천연 리간드와 적어도 부분적으로 동일한 효과(예를 들어, 수용체의 활성화 효과 유도)를 갖는 항체를 지칭한다.
약동학(PK)은 신체를 통한 약물의 이동을 지칭하는 반면, 약력학(PD)은 약물에 대한 신체의 생물학적 반응을 지칭한다. PK는 시간의 함수로서 흡수, 분포, 생체이용률, 대사 및 배설을 특성화하여 약물의 노출을 설명한다. PD는 생화학적 또는 분자적 상호작용의 관점에서 약물 반응을 설명한다. PK 및 PD 분석은 약물 노출을 특성화하고, 투여량의 변화를 예측 및 평가하고, 제거율 및 흡수율을 추정하고, 제형의 상대적 생체이용률/생물학적 동등성을 평가하고, 대상체 내 및 대상체 간 변동성을 특성화하고, 농도-효과 관계를 이해하고, 안전 마진 및 효능 특성을 설정하는 데 사용된다. "PK 개선"은 예를 들어, 분자의 증가된 반감기, 특히 대상체에게 주사될 때 분자의 더 긴 혈청 반감기와 같은 상기 특성 중 하나가 개선됨을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "약동학" 및 "PK"는 상호교환적으로 사용되며 살아있는 유기체에 투여되는 화합물, 물질 또는 약물의 운명을 지칭한다. 약동학은 특히 해방(Liberation)(즉, 조성물로부터 물질의 방출), 흡수(Absorption)(즉, 혈액 순환에서 물질의 유입), 분포(Distribution)(즉, 신체를 통한 물질의 분산 또는 전파), 대사(Metabolism)(즉, 물질의 변형 또는 분해) 및 배설(Excretion)(즉, 유기체로부터 물질의 제거 또는 청소(clearance))를 나타내는, ADME 또는 LADME 체계를 포함한다. 대사와 배설의 두 단계는 또한 제거라는 제목으로 함께 그룹화될 수 있다. 특히 제거 반감기, 제거 일정 속도, 청소율(즉, 단위 시간 당 약물이 제거된 혈장의 부피), Cmax(최대 혈청 농도) 및 약물 노출(곡선 아래 면적에 의해 결정됨, 문헌[Scheff et al, Pharm Res. 2011 May;28(5):1081-9] 참조)과 같은 상이한 약동학 매개변수가 당업자에 의해 모니터링될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "단리된"은 인용된 물질(예를 들어, 항체, 폴리펩티드, 핵산 등)이 자연에서 발생하는 다른 물질로부터 실질적으로 분리되거나 이에 상대적으로 풍부함을 나타낸다. 특히, "단리된" 항체는 자연 환경의 구성요소로부터 확인 및 분리 및/또는 회수된 항체이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "및/또는"은 다른 것과 함께 또는 다른 것 없이 2개의 특정된 특징 또는 구성요소 각각의 특정 개시로 간주되어야 한다. 예를 들어, "A 및/또는 B"는 각각이 개별적으로 설정된 것처럼 (i) A, (ii) B 및 (iii) A 및 B 각각의 특정 개시로 간주된다.
단수 표현("a" 또는 "an")은 문맥상 요소 중 하나 또는 둘 이상이 문맥상 명확하지 않거나, 둘 이상의 요소가 설명되는 한 변형되는 요소 중 하나 또는 복수를 나타낼 수 있다(예를 들어, "시약"은 하나 이상의 시약을 의미할 수 있음).
임의의 및 모든 값(수치 범위의 하한 및 상한 포함)과 관련하여 본원에 사용된 용어 "약"은 최대 +/- 10%(예를 들어, +/- 0.5%, +/- 1 %, +/- 1.5%, +/- 2%, +/- 2.5%, +/- 3%, +/- 3.5%, +/- 4%, +/- 4.5%, +/- 5%, +/- 5.5%, +/- 6%, +/- 6.5%, +/- 7%, +/- 7.5%, +/- 8%, +/- 8.5%, +/- 9%, +/- 9.5%)의 허용 가능한 편차 범위를 갖는 임의의 값을 의미한다. 값 문자열의 시작 부분에 "약"이라는 용어를 사용하면 각 값이 수정된다(즉, "약 1, 2 및 3"은 약 1, 약 2 및 약 3을 나타냄). 또한, 값 목록이 본원에 설명되어 있는 경우(예를 들어, 약 50%, 60%, 70%, 80%, 85% 또는 86%), 목록에는 이의 모든 중간 값 및 분수 값(예를 들어, 54%, 85.4%)이 포함된다.
임의의 주어진 생물학적 서열과 관련하여 본원에서 사용되는 "본질적으로"라는 용어는 상기 생물학적 서열이 생물학적 서열 길이의 10%까지 서열 목록에 포함된 참조 서열과는 다르다는 것을 의미한다. 특히, "본질적으로 이루어진"은 생물학적 서열이 그 서열로 이루어지는 것을 의도하지만, 이는 또한 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 치환, 부가, 결실 또는 이들의 혼합, 바람직하게는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 치환, 부가, 결실 또는 이들의 혼합을 포함할 수 있으며, 단, 상기 생물학적 서열은 생물학적 서열 길이의 10%까지 서열 목록에 포함된 참조 서열과는 다르다.
이기능성 분자
본 발명은 개선된 특성과 관련된 스캐폴드를 갖는 이기능성 분자에 관한 것이다.
보다 특히, 본 발명은 특정 스캐폴드를 갖고 PD-1 및 단일 IL-7m에 결합하는 단일 1가 항원 결합 도메인을 포함하는 이기능성 분자에 관한 것이다. 이 스캐폴드는 본질적으로 이량체 Fc 도메인인, Fc 도메인의 하나의 단량체의 N 말단 단부에 연결된 PD-1에 결합하는 단일 1가 항원 결합 도메인 및 i) Fc 도메인의 동일한 단량체의 C 말단 단부에 연결된 단일 IL-7m, 및 선택적으로 펩티드 링커, 또는 ii) 단일 1가 항원 결합 도메인이 가변 중쇄 및 가변 경쇄를 포함하고 단일 IL-7m이 상기 항원 결합 도메인의 경쇄의 C 말단 단부에 연결되는 것 중 하나로 이루어진다.
특정 양태에서, 이기능성 분자는 선택적으로 펩티드 링커를 통해 제1 Fc 사슬에 공유적으로 연결된 항-PD-1 항원-결합 도메인을 포함하는 제1 단량체로서, 상기 제1 Fc 사슬은 선택적으로 펩티드 링커를 통해 IL-7m에 공유적으로 연결되는 것, 및 항원-결합 도메인 및 IL-7m이 없는, 상보적인 제2 Fc 사슬을 포함하는 제2 단량체를 포함하며, 상기 제1 및 제2 Fc 사슬은 이량체 Fc 도메인을 형성한다.
대안적인 양태에서, 이기능성 분자는 선택적으로 펩티드 링커를 통해 제1 Fc 사슬에 공유적으로 연결된 항-PD-1 항원-결합 도메인을 포함하는 제1 단량체, 및 항원-결합 도메인 및 IL-7m이 없는, 상보적인 제2 Fc 사슬을 포함하는 제2 단량체를 포함하며, 상기 제1 및 제2 Fc 사슬은 이량체 Fc 도메인을 형성하고, 단일 1가 항원 결합 도메인은 가변 중쇄 및 가변 경쇄를 포함하고 단일 IL-7m은 상기 항원 결합 도메인의 경쇄의 C 말단 단부에 연결된다.
따라서, 2개의 단량체는 각각 하나의 Fc 사슬을 포함하고, Fc 사슬은 이량체 Fc 도메인을 형성할 수 있다. 일 양태에서, 이량체 Fc 융합 단백질은 동종이량체 Fc 도메인이다. 또 다른 양태에서, 이량체 Fc 융합 단백질은 이종이량체 Fc 도메인이다.
보다 특히, 이량체 Fc 도메인이 이종이량체 Fc 도메인인 경우, 이기능성 분자는 선택적으로 펩티드 링커를 통해 제1 이종이량체 Fc 사슬의 N-말단 단부에 공유적으로 연결된 항원-결합 도메인을 포함하는 제1 단량체로서, 상기 제1 이종이량체 Fc 사슬은, 선택적으로 펩티드 링커를 통해 IL-7m에 이의 C-말단 단부에 공유적으로 연결되는 것, 및 항원-결합 도메인 및 IL-7m이 없는 상보적인 제2 이종이량체 Fc 사슬을 포함하는 제2 단량체를 포함한다. 선택적으로, 상보적인 제2 이종이량체 Fc 사슬을 포함하는 상기 제2 단량체는 임의의 다른 기능성 모이어티, 특히 다른 항원 결합 도메인 또는 임의의 사이토카인이 없다. 보다 더 특히, 이기능성 분자는 선택적으로 펩티드 링커를 통해 제1 이종이량체 Fc 사슬의 N-말단 단부에 C-말단 단부를 통해 공유적으로 연결된 항원-결합 도메인을 포함하는 제1 단량체로서, 상기 제1 이종이량체 Fc 사슬은, 선택적으로 펩티드 링커를 통해 IL-7m의 N-말단 단부에 이의 C-말단 단부를 통해 공유적으로 연결된 것, 및 항원-결합 도메인 및 IL-7m이 없는, 바람직하게는 임의의 다른 기능성 모이어티가 없는, 특히 다른 항원 결합 도메인 또는 임의의 사이토카인이 없는 상보적인 제2 이종이량체 Fc 사슬을 포함하는 제2 단량체를 포함한다. 이러한 이기능성 분자는 예를 들어 도 1에서 IL-7m의 예시로서 IL-7 W142H와 함께, "작제물 3"으로 예시되어 있다.
선택적으로, 단일 항원-결합 도메인은 a Fab, a Fab', scFV 및 sdAb로 이루어진 군으로부터 선택된다.
따라서, 일 양태에서, 본 발명에 따른 이기능성 분자는 하기를 포함하거나 이로 이루어진다:
(a) 제1 Fc 사슬이 있는 하나의 중쇄, 및 (ii) 하나의 경쇄를 포함하는, 항-PD1 항원-결합 도메인,
(b) IL-7m, 및
(c) 상보적인 제2 Fc 사슬,
상기 IL-7m은, 제1 Fc 사슬의 C-말단 단부에, 바람직하게는 이의 N-말단 단부에 의해, 선택적으로 펩티드 링커를 통해 공유적으로 연결된다. 제1 Fc 사슬 및 제2 Fc 사슬은 함께 이량체 Fc 도메인을 형성한다.
특정 양태에서, 이기능성 분자는 하기를 포함한다:
- 이의 C-말단 단부에서 IL-7m에 연결된 VH-CH1-힌지-CH2-CH3을 포함하는 하나의 항체 중쇄,
- 특히 면역 세포 표면에서 발현되는, PD-1에 결합하는 항원 결합 도메인을 함께 형성하는 VL-CL(불변 경쇄), VH-CH1 모이어티 및 VL-CL 모이어티를 포함하는 하나의 항체 경쇄, 및
- 항체 중쇄의 CH2-CH3와 이량체 Fc 도메인을 형성하는, CH2-CH3, 선택적으로 힌지-CH2-CH3을 포함하는 하나의 Fc 사슬.
대안적 양태에 따르면, 이량체 Fc 도메인이 이종이량체 Fc 도메인인 경우, 이기능성 분자는 선택적으로 펩티드 링커를 통해 제1 이종이량체 Fc 사슬의 N-말단 단부에 공유적으로 연결된 항원-결합 도메인을 포함하는 제1 단량체, 및 항원-결합 도메인 및 IL-7m이 없는 상보적인 제2 이종이량체 Fc 사슬을 포함하는 제2 단량체를 포함하며, 상기 항원-결합 도메인은 가변 중쇄 및 가변 경쇄를 포함하고, IL-7m은 상기 항원-결합 도메인의 경쇄의 C 말단 단부에서, 선택적으로 펩티드 링커를 통해 연결된다. 선택적으로, 상기 IL-7m은, 이의 N 말단 단부에 의해 상기 항원-결합 도메인의 경쇄의 C 말단 단부에서, 선택적으로 펩티드 링커를 통해 연결된다.
따라서, 이러한 양태에서, 본 발명에 따른 이기능성 분자는 하기를 포함하거나 이로 이루어진다:
(a) 제1 Fc 사슬이 있는 하나의 중쇄, 및 (ii) 하나의 경쇄를 포함하는, 항-PD1 항원-결합 도메인,
(b) IL-7m, 및
(c) 상보적인 제2 Fc 사슬,
상기 IL-7m은 경쇄의 C-말단 단부에, 바람직하게는 이의 N-말단 단부에 의해, 선택적으로 펩티드 링커를 통해 공유적으로 연결된다. 제1 Fc 사슬 및 제2 Fc 사슬은 함께 이량체 Fc 도메인을 형성한다.
특정 양태에서, 이기능성 분자는 하기를 포함한다:
- VH-CH1-힌지-CH2-CH3을 포함하는 하나의 항체 중쇄,
- 특히 면역 세포 표면에서 발현되는, PD-1에 결합하는 항-PD-1 항원 결합 도메인을 함께 형성하는, IL-7m에 이의 C-말단 단부에서 연결된 VL-CL(불변 경쇄), VH-CH1 모이어티 및 VL-CL 모이어티를 포함하는 하나의 항체 경쇄, 및
- 항체 중쇄의 CH2-CH3와 이량체 Fc 도메인을 형성하는, CH2-CH3, 선택적으로 힌지-CH2-CH3을 포함하는 하나의 Fc 사슬.
IL-7m, 항-PD1 항원 결합 도메인, Fc 도메인 및 선택적인 링커는 임의의 양태에서 아래에 추가로 정의된 바와 같다.
IL-7 및 IL-7 변이체
IL-7m은 면역 세포를 자극하거나 활성화할 수 있다. 면역 세포는 B 세포, T 세포, 특히 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포, NK 세포, NKT 세포, APC 세포, 수지상 세포 및 단핵구를 포함하는 비제한적인 목록에서 선택될 수 있다. 바람직한 양태에서, 면역 세포는 T 세포, 보다 구체적으로 CD8+ T 세포, 이펙터 T 세포 또는 고갈된 T 세포이다. 특히 바람직한 양태에서, 면역 세포는 이펙터 기억 줄기 유사 T 세포이다.
특히, IL-7m은 10 kDa 내지 50 kDa 사이의 크기를 갖는다. 바람직하게는 IL-7m은 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질이다. 한 양태에서, IL-7m은 비항체 실체 또는 부분이다.
IL-7m은 생물학적 활성이 변경되도록, 예를 들어 생물학적 활성이 증가, 감소 또는 완전히 억제되도록 돌연변이 또는 변경될 수 있다.
매우 구체적인 양태에서, IL-7m은 야생형 사이토카인과 적어도 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 갖거나 부가, 결실, 치환 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 내지 10개 변형을 갖는 IL-7 또는 이의 변이체이다.
특정 양태에서, IL-7 변이체 또는 이의 돌연변이체는 SEQ ID NO: 1 또는 이와 적어도 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 갖는 서열 또는 SEQ ID NO: 1의 서열에 대해 부가, 결실, 치환 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 내지 10개 변형을 갖는 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
용어 "인터루킨-7 돌연변이체", "돌연변이된 IL-7", "IL-7 돌연변이체", "IL-7 변이체", "IL-7m" 또는 IL-7v"는 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. IL-7 단백질의 "변이체" 또는 "돌연변이체"는 하나 이상의 아미노산에 의해 변경된 아미노산 서열로 정의된다. 변이체는 "보존적" 변형 또는 "비보존적" 변형을 가질 수 있다. 이러한 변형은 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 변형은 치환, 특히 보존적 치환이다. 본 발명에 포함된 변이체 IL-7 단백질은 특히 야생형 IL-7과 비교하여 실질적으로 동등한 생물학적 특성(예를 들어, 활성, 결합 능력 및/또는 구조)을 보유하지 않는 IL-7 단백질에 관한 것이다. IL-7 돌연변이체 또는 변이체는 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 특히, 적어도 하나의 돌연변이는 IL-7m의 IL-7R에 대한 친화도를 감소시키지만, IL-7R의 인식 상실로 이어지지는 않는다. 따라서, IL-7 돌연변이체 또는 변이체는 예를 들어 문헌[Bitar et al., Front. Immunol., 2019, volume 10)]에 개시된 바와 같은 pSat5 신호로 측정된 바와 같이 IL-7R을 활성화시키는 능력을 보유한다. IL-7 단백질의 생물학적 활성은 시험관 내 세포 증식 분석을 사용하거나, ELISA 또는 FACS에 의해 T 세포로의 P-Stat5를 측정함으로써 측정될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 IL-7 변이체는 야생형 IL-7, 바람직하게는 wth-IL7과 비교하여 적어도 인자 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 250, 500, 750, 1000, 2500, 5000, 또는 8000만큼 감소된 생물학적 특성(예를 들어, 활성, 결합 능력 및/또는 구조)을 갖는다. 더 바람직하게는, IL-7 변이체는 IL-7 수용체에 대한 감소된 결합을 갖지만 IL-7R을 활성화하는 능력은 유지한다. 예를 들어, IL-7 수용체에 대한 결합은 야생형 IL-7과 비교하여 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% 감소될 수 있으며, IL-7R을 활성화하는 능력은 야생형 IL-7과 비교하여 적어도 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30% 또는 20% 유지한다. 바람직하게는, IL-7m은 예를 들어 SEQ ID NO: 1에 기재된 것과 같은 인간 야생형 IL-7의 변이체이다.
한 양태에서, 본 발명에 따른 IL-7 변이체는 야생형 인간 IL-7과 비교하여 생물학적 활성을 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 바람직하게는 야생형 IL-7과 비교하여 적어도 80%, 90%, 95% 및 훨씬 더 바람직하게는 99% 유지한다.
한 양태에서, IL-7 변이체 또는 돌연변이체는 i) IL-7R에 대한 wt-IL-7의 친화도와 비교하여 IL-7 수용체(IL-7R)에 대한 IL-7 변이체의 친화도를 감소시키고, ii) wt-IL7과 비교하여 IL7 변이체의 약동학을 개선시키는 적어도 하나의 아미노산 돌연변이에 의해 wt-IL-7과 상이하다. 보다 특히, IL-7 변이체 또는 돌연변이체는 특히 pStat5 신호전달을 통해 IL-7R을 활성화하는 능력을 추가로 보유한다.
또 다른 양태에서, IL-7 변이체 또는 돌연변이체를 포함하는 이기능성 분자는 i) wt-IL-7을 포함하는 이기능성 분자의 IL-7R에 대한 친화도와 비교하여 IL-7 수용체(IL-7R)에 대한 이기능성 분자의 친화도를 감소시키고, ii) wt-IL-7을 포함하는 이기능성 분자와 비교하여 IL-7 변이체 또는 돌연변이체를 포함하는 이기능성 분자의 약동학을 개선시키는 적어도 하나의 아미노산 돌연변이에 의해 wt-IL-7과 상이하다. 보다 특히, IL-7 변이체 또는 돌연변이체를 포함하는 이기능성 분자는 특히 pStat5 신호전달을 통해 IL-7R을 활성화하는 능력을 추가로 보유한다. 예를 들어, IL-7 수용체에 대한 IL-7 변이체 또는 돌연변이체를 포함하는 결합 이기능성 분자는 야생형 IL-7을 포함하는 이기능성 분자와 비교하여 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% 감소될 수 있으며, 야생형 IL-7을 포함하는 이기능성 분자와 비교하여 적어도 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30% 또는 20% IL-7R을 활성화시키는 능력을 보유한다.
본 발명에 따르면, IL-7m은 IL-7R에 대한 wth-IL-7의 친화도와 비교하여 IL-7 수용체(IL-7R)에 대한 감소된 친화도를 나타낸다. 특히, IL-7m은 각각 CD127 및/또는 CD132에 대한 wth-IL-7의 친화도와 비교하여 CD127 및/또는 CD132에 대한 감소된 친화도를 나타낸다. 바람직하게는, IL-7m은 CD127에 대한 wth-IL-7의 친화도와 비교하여 CD127에 대한 감소된 친화도를 나타낸다.
바람직하게는, 적어도 하나의 아미노산 돌연변이는 IL-7R, 특히 CD132 또는 CD127에 대한 IL-7m의 친화도를 IL-7R에 대한 wt-IL-7의 친화도와 비교하여 적어도 인자 10, 100, 1000, 10,000 또는 100,000만큼 감소시킨다. 이러한 친화도 비교는 ELISA 또는 Biacore와 같은 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다.
바람직하게는, 적어도 하나의 아미노산 돌연변이는 IL-7R에 대한 IL-7m의 친화도를 감소시키지만, 특히 pStat5 신호에 의해 측정될 때 IL-7 wt와 비교하여 IL-7m의 생물학적 활성을 감소시키지는 않는다.
대안적으로, 적어도 하나의 아미노산 돌연변이는 IL-7R에 대한 IL-7m의 친화도를 감소시키지만, 특히 pStat5 신호에 의해 측정된 바와 같이, IL-7 wt와 비교하여 IL-7m의 생물학적 활성을 유의하게 감소시키지는 않는다.
추가로 또는 대안적으로, IL-7m은 야생형 IL-7 또는 야생형 IL-7을 포함하는 이기능성 분자와 각각 비교하여 IL-7 변이체 또는 돌연변이체 또는 IL-7 변이체를 포함하는 이기능성 분자의 약동학을 개선시킨다. 특히, 본 발명에 따른 IL-7m은 wth-IL-7과 비교하여 적어도 인자 10, 100 또는 1000만큼 IL-7 변이체의 약동학을 개선시킨다. 특히, 본 발명에 따른 IL-7m은 wth-IL-7을 포함하는 이기능성 분자와 비교하여 IL-7 변이체 또는 돌연변이체를 포함하는 이기능성 분자의 약동학을 적어도 인자 10, 100 또는 1000만큼 개선시킨다. 약동학적 프로파일 비교는 예를 들어 실시예 2에 나타낸 바와 같이 다중 시점에서의 혈청 내 약물의 생체 내 주사 및 약물의 투여량 ELISA와 같은 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "약동학" 및 "PK"는 상호교환적으로 사용되며 살아있는 유기체에 투여되는 화합물, 물질 또는 약물의 운명을 지칭한다. 약동학은 특히 해방(Liberation)(즉, 조성물로부터 물질의 방출), 흡수(Absorption)(즉, 혈액 순환에서 물질의 유입), 분포(Distribution)(즉, 신체를 통한 물질의 분산 또는 전파), 대사(Metabolism)(즉, 물질의 변형 또는 분해) 및 배설(Excretion)(즉, 유기체로부터 물질의 제거 또는 청소(clearance))를 나타내는, ADME 또는 LADME 체계를 포함한다. 대사와 배설의 두 단계는 또한 제거라는 제목으로 함께 그룹화될 수 있다. 특히 제거 반감기, 제거 일정 속도, 청소율(즉, 단위 시간 당 약물이 제거된 혈장의 부피), Cmax(최대 혈청 농도) 및 약물 노출(곡선 아래 면적에 의해 결정됨, 문헌[Scheff et al, Pharm Res. 2011 May;28(5):1081-9] 참조)과 같은 상이한 약동학 매개변수가 당업자에 의해 모니터링될 수 있다.
그런 다음, 특히 이기능성 분자에서 IL-7m의 사용에 의한 약동학의 개선은 상기 언급된 매개변수 중 적어도 하나의 개선을 의미한다. 바람직하게는, 이는 이기능성 분자의 제거 반감기의 개선, 즉 반감기 지속시간 또는 Cmax의 증가를 의미한다.
특정 양태에서, IL-7m의 적어도 하나의 돌연변이는 IL-7 wt를 포함하는 이기능성 분자와 비교하여 IL-7m을 포함하는 이기능성 분자의 제거 반감기를 개선시킨다.
한 양태에서, IL-7m은 예를 들어 서열번호 1에 개시된 바와 같은 152개 아미노산의 야생형 인간 IL-7(wth-IL-7) 단백질과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 나타낸다. 바람직하게는, IL-7m은 SEQ ID No: 1과의 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 나타낸다.
특히, 적어도 하나의 돌연변이는 IL-7의 아미노산 위치 74 및/또는 142에서 발생한다. 추가로 또는 대안적으로, 적어도 하나의 돌연변이는 아미노산 위치 2 및 141, 34 및 129, 및/또는 47 및 92에서 발생한다. 이러한 위치는 SEQ ID NO: 1에 제시된 아미노산의 위치를 나타낸다.
특히, 적어도 하나의 돌연변이는 아미노산 치환이거나, 또는 아미노산 치환 기는 C2S-C141S 및 C47S-C92S, C2S-C141S 및 C34S-C129S, C47S-C92S 및 C34S-C129S, W142H, W142F, W142Y, Q11E, Y12F, M17L, Q22E, K81R, D74E, D74Q 및 D74N 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이러한 돌연변이는 SEQ ID NO: 1에 제시된 아미노산의 위치를 나타낸다. 그런 다음, 예를 들어 돌연변이 W142H는 wth-IL7의 트립토판을 히스티딘으로 치환하여 아미노산 위치 142에 히스티딘을 갖는 IL-7m을 얻는 것을 의미한다. 이러한 돌연변이체는 예를 들어 SEQ ID NO: 5에 기재되어 있다.
특정 양태에서, IL-7 변이체는 P를 제외한 임의의 아미노산에 의해 SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 142에서의 치환을 포함한다. 이러한 치환은 국제특허공개 WO2019144945A1호에서 연구되었고, 이의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다. 예를 들어, 위치 142에서의 W는 G, A, V, C, L, I, M, H, Y 또는 F로 치환될 수 있다. 선택적으로, 치환은 W142G, W142A, W142V, W142C, W142L, W142I, W142M, W142H, W142Y 및 W142F로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직한 양태에서, 치환은 W142H, W142Y 및 W142F, 보다 특히 W142H로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 양태에서, IL-7m은 C2와 C141, C47과 C92, 및 C34-C129 사이의 이황화 결합을 파괴하기 위한 치환 세트를 포함한다. 특히, IL-7m은 C2와 C141, 및 C47과 C92; C2와 C141, 및 C34-C129; 또는 C47과 C92, 및 C34-C129 사이의 이황화 결합을 파괴하기 위해 두 세트의 치환을 포함한다. 예를 들어, 시스테인 잔기는 이황화 결합 형성을 방지하기 위해 세린으로 치환될 수 있다. 따라서, 아미노산 치환은 C2S-C141S 및 C47S-C92S("SS2"로 지칭), C2S-C141S 및 C34S-C129S("SS1"로 지칭), 및 C47S-C92S 및 C34S-C129S("SS3"으로 지칭)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 이러한 돌연변이는 SEQ ID NO: 1에 제시된 아미노산의 위치를 나타낸다. 이러한 IL-7m은 특히 SEQ ID No: 2 내지 4(각각 SS1, SS2 및 SS3)에 제시된 서열 하에 기재되어 있다. 바람직하게는, IL-7m은 아미노산 치환 C2S~C141S 및 C47S~C92S를 포함한다. 훨씬 더 바람직하게는, IL-7m은 SEQ ID NO: 3에 제시된 서열을 나타낸다.
또 다른 양태에서, IL-7m은 W142H, W142F, 및 W142Y로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 이러한 IL-7m은 각각 SEQ ID NO: 5 내지 7에 제시된 서열로 구체적으로 기재되어 있다. 바람직하게는, IL-7m은 돌연변이 W142H를 포함한다. 훨씬 더 바람직하게는, IL-7m은 SEQ ID NO: 5에 제시된 서열을 나타낸다.
또 다른 양태에서, IL-7m은 D74E, D74Q 및 D74N, 바람직하게는 D74E 및 D74Q로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 이러한 IL-7m은 각각 SEQ ID NO: 12 내지 14에 제시된 서열로 구체적으로 기재되어 있다. 바람직하게는, IL-7m은 돌연변이 D74E를 포함한다. 훨씬 더 바람직하게는, IL-7m은 SEQ ID NO: 12에 제시된 서열을 나타낸다.
또 다른 양태에서, IL-7m은 Q11E, Y12F, M17L, Q22E 및/또는 K81R로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 이러한 돌연변이는 SEQ ID NO: 1에 제시된 아미노산의 위치를 나타낸다. 이러한 IL-7m은 각각 SEQ ID NO: 8, 9, 10, 11 및 15에 제시된 서열로 구체적으로 기재되어 있다.
일 양태에서, IL-7m은 i) W142H, W142F 또는 W142Y 및/또는 ii) D74E, D74Q 또는 D74N, 바람직하게는 D74E 또는 D74Q 및/또는 iii) C2S-C141S 및 C47S-C92S, C2S-C141S 및 C34S-C129S, 또는 C47S-C92S 및 C34S-C129S로 이루어진 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.
일 양태에서, IL-7m은 W142H 치환 및 i) D74E, D74Q 또는 D74N, 바람직하게는 D74E 또는 D74Q 및/또는 ii) C2S-C141S 및 C47S-C92S, C2S-C141S 및 C34S-C129S 또는 C47S-C92S 및 C34S-C129S로 이루어진 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.
일 양태에서, IL-7m은 D74E 치환 및 i) W142H, W142F 또는 W142Y 및/또는 ii) C2S-C141S 및 C47S-C92S, C2S-C141S 및 C34S-C129S, 또는 C47S- C92S 및 C34S-C129S로 이루어진 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.
일 양태에서, IL-7m은 돌연변이 C2S-C141S 및 C47S-C92S, 및 i) W142H, W142F 또는 W142Y 및/또는 ii) D74E, D74Q 또는 D74N, 바람직하게는 D74E 또는 D74Q로 이루어진 적어도 하나의 치환을 포함한다.
일 양태에서, IL-7m은 i) D74E 및 W142H 치환 및 ii) 돌연변이 C2S-C141S 및 C47S-C92S, C2S-C141S 및 C34S-C129S, 또는 C47S-C92S 및 C34S-C129S를 포함한다.
IL-7m 단백질은 펩티드 신호를 포함하거나 없을 수 있다. IL-7의 변이체는 또한 IL-7의 변경된 폴리펩티드 서열(예를 들어, 산화, 환원, 탈아미노화 또는 절단된 형태)을 포함할 수 있다.
일 양태에서, 본 발명에서 사용되는 IL-7 변이체 또는 돌연변이체는 재조합 IL-7이다. 본원에 사용된 용어 "재조합"은 폴리펩티드가 재조합 발현 시스템으로부터, 즉 숙주 세포(예를 들어, 미생물 또는 곤충 또는 식물 또는 포유동물)의 배양물로부터 또는 IL-7m 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 함유하도록 조작된 트랜스제닉 식물 또는 동물로부터 수득되거나 유래됨을 의미한다. 바람직하게는, 재조합 IL-7은 인간 재조합 IL-7m(예를 들어, 재조합 발현 시스템에서 생산된 인간 IL-7m)이다.
한 양태에서, IL-7m은 SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15에 제시된 서열을 나타낸다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 이기능성 분자는 SEQ ID NO: 2 내지 15에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진된 IL-7 변이체를 포함한다. 훨씬 더 바람직하게는, 본 발명에 따른 이기능성 분자는 SEQ ID NO: 2-에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 IL-7 변이체를 포함한다.
보다 더 바람직하게는, 본 발명에 따른 이기능성 분자는 SEQ ID NO 3, 5 또는 12에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 IL-7 변이체를 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 특히 면역 반응에 자극할 수 있는 IL-7 내의 T-세포 에피토프를 제거함으로써 야생형 IL-7 단백질과 비교하여 감소된 면역원성을 갖는 IL-7 변이체를 포함하는 이기능성 분자를 제공한다. 이러한 IL-7의 예는 국제특허공개 WO 2006061219호에 기재되어 있다.
본 발명은 또한 본원에 개시된 바와 같은 IL-7 변이체 또는 돌연변이체를 포함하는 임의의 융합 단백질에 관한 것이다. IL-7 변이체 또는 돌연변이체는 그들의 N-말단 단부 또는 그들의 C-말단 단부에 의해 융합될 수 있다.
본 발명은 특히 IL-7m, 항-PD-1 결합 도메인, 및 Fc 단편, 및 선택적으로 펩티드 링커를 포함하는 이기능성 분자를 제공한다.
특히, Fc 도메인은, 바람직하게는 본원의 하기에 개시된 바와 같은 펩티드 링커에 의해, IL-7에 공유적으로 접합된다(예를 들어, 유전자 융합 또는 화학적 커플링을 통해).
특히, IL-7m의 Fc 도메인로의 접합은 공유적이거나, 직접적이든 아니든(즉, 링커를 통해), 및/또는 화학적, 효소적 또는 유전적이다. 접합은 당업계에 공지된 임의의 허용가능한 결합 수단에 의해 수행될 수 있다. 이와 관련하여, 커플링은 따라서 생리학적 매질에서 또는 세포 내에서 절단가능하거나 절단 불가능한 하나 이상의 공유, 이온, 수소, 소수성 또는 반 데르 발스 결합에 의해 수행될 수 있다.
특히, 화학적 접합은 노출된 설프히드릴기(Cys), Fc 도메인 또는 IL7-m에 대한 친화성 태그(예를 들어, 6 히스티딘, 플래그 태그(Flag Tag), 스트렙 태그(Strep Tag), SpyCatcher 등)의 부착 또는 클릭 화학 접합을 위한 비천연 아미노산 또는 화합물의 통합을 통해 수행될 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 접합은 유전적 융합(즉, 유전적 융합으로서 Fc 도메인 및 IL-7을 코딩하는 핵산 작제물의 적합한 시스템에서의 발현에 의해)에 의해 얻어진다. 한 양태에서, 본 발명은 면역글로불린(Ig) 사슬, 특히 Fc 도메인을 포함하는 제1 부분 및 인터루킨-7(IL-7)을 포함하는 제2 부분을 포함하는 융합 단백질을 특징으로 한다.
IL-7 돌연변이체의 획득은 특히 본원에 인용되어 포함된 국제특허공개 WO 2020/12377호에 기술되어 있다.
면역 세포 상의 PD-1을 표적화하는 항원 결합 도메인
본 발명에 따르면, 항원 결합 도메인은, 특히 면역 세포 표면 상에 발현된 PD-1에 특이적으로 결합한다. 특히, 항원 결합 도메인은 종양 세포에서 발현되는 표적을 향하지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 표현 "항원 결합 도메인"은 PD-1에 결합하는 능력을 갖는 임의의 모이어티, 예컨대 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 융합 단백질 및 항체에 관한 것이다. 특히, 이러한 용어는 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 항체 모방체 또는 모사체를 포함한다.
일 실시형태에서, "항원 결합 도메인"은 항체 또는 그의 단편, 및 항체 모방체 또는 모사체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 생화학 분야의 당업자는, 문헌[Gebauer and Skerra, 2009, Curr Opin Chem Biol 13(3): 245-255]에 논의된 바와 같이, 항체 모방체 또는 모사체에 익숙하다. 항체 모방체의 예로는 아피바디(Affibodies)(트리넥틴이라고도 함; 문헌[Nygren, 2008, FEBS J, 275, 2668-2676]); CTLD(테트라넥틴이라고도 함; 문헌[Innovations Pharmac. Technol. (2006), 27-30]); 애드넥틴(단일체라고도 함; 문헌[Meth. Mol. Biol., 352(2007), 95-109]); 안티칼린(문헌[Drug Discovery Today(2005), 10, 23-33]); DARPin(안키린; 문헌[Nat. Biotechnol. (2004), 22, 575-582]); 아비머(문헌[Nat. Biotechnol. (2005), 23, 1556-1561]); 마이크로바디(문헌[FEBS J, (2007), 274, 86-95]); 앱타머(문헌[Expert. Opin. Biol. Ther. (2005), 5, 783-797]); Kunitz 도메인(문헌[J. Pharmacol. Exp. Ther. (2006) 318, 803-809]); 아필린(문헌[Trends. Biotechnol. (2005), 23, 514-522]); 아피틴(문헌[Krehenbrink et al, 2008, J. Mol. Biol. 383(5): 1058-68]), 알파바디(문헌[Desmet, J.; et al, 2014, Nature Communications. 5: 5237]), 파이노머(fynomer)(문헌[Grabulovski D; et al. al, 2007, J Biol Chem. 282(5): 3196-3204]) 및 아피머(affimer)(문헌[Avacta Life Sciences, Wetherby, UK])가 포함된다.
바람직하게는, 항원 결합 도메인은 항체 단편이다. 보다 더 바람직하게는, 항원 결합 도메인은 인간, 인간화 또는 키메라 항원 결합 단편이다.
항원 결합 도메인의 "결합" 능력과 관련하여, 용어 "결합" 또는 "결합하는"은 또 다른 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 또는 분자, 특히 PD-1을 인식하고 접촉하는 항체 단편 및 항체 유도체를 포함하는 항체를 지칭한다. 특정 표적에 대해, "특이적 결합", "특이적으로 결합한다", "~에 대해 특이적", "선택적으로 결합한다" 및 "선택적인"이라는 용어는 항원 결합 도메인이 특정 표적을 인식하고 결합하지만, 샘플 내 다른 분자를 실질적으로 인식하거나 결합하지 않는다는 것을 의미한다. 예를 들어, 항원에 특이적으로(또는 우선적으로) 결합하는 항체 또는 항원 결합 도메인은 예를 들어 다른 분자에 결합하는 것보다 더 큰 친화도, 결합력, 더 쉽게 및/또는 더 긴 지속 시간으로 항원에 결합하는 항체 또는 항원 결합 도메인이다. 바람직하게는, 용어 "특이적 결합"은 10-7 M 이하의 결합 친화도로 항체 또는 항원 결합 도메인과 항원 사이의 접촉을 의미한다. 특정 양태에서, 항체 또는 항원 결합 도메인은 10-8 M, 10-9 M 또는 10-10 M 이하의 친화도로 결합한다.
선택적으로, 항원-결합 도메인은 Fab 도메인, Fab', 단일-사슬 가변 단편(scFV) 또는 단일 도메인 항체(sdAb)일 수 있다. 항원-결합 도메인 바람직하게는 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
항원-결합 도메인이 Fab 또는 Fab'인 경우, 이기능성 분자는 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 불변 도메인(즉, CH 및 CL)을 포함하고, 중쇄는 이의 C-말단 단부에서 IL-7m에 연결된다.
일 양태에서, PD-1은 건강한 대상체 또는 특히 암과 같은 질병을 앓고 있는 대상체의 면역 세포에 의해 특이적으로 발현된다. 이는 PD-1이 다른 세포보다 면역세포에서 발현 수준이 더 높거나, 전체 면역세포에서 PD-1을 발현하는 면역세포의 비율이 나머지 전체 세포에서 PD-1을 발현하는 다른 세포의 비율보다 높다는 것을 의미한다. 바람직하게는 발현 수준 또는 비율은 인자 2, 5, 10, 20, 50 또는 100만큼 더 높다. 보다 구체적으로, 특정 유형의 면역 세포, 예를 들어 T 세포, 보다 구체적으로 CD8+ T 세포, 이펙터 T 세포 또는 고갈된 T 세포, 또는 특정 맥락에서 예를 들어 암 또는 감염과 같은 질병을 앓고 있는 대상체에 대해 결정될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이,"면역 세포"는 선천성 및 후천성 면역에 관여하는 세포, 예를 들어 골수에서 생성된 조혈 줄기 세포(HSC)에서 유래된 백혈구 세포(백혈구), 림프구(T 세포, B 세포, 자연 살해(NK) 세포 및 자연 살해 T 세포(NKT)) 및 골수-유래 세포(호중구, 호산구, 호염기구, 단핵구, 대식세포, 수지상 세포)를 지칭한다. 특히, 면역 세포는 B 세포, T 세포, 특히 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포, NK 세포, NKT 세포, APC 세포, 대식세포, 수지상 세포 및 단핵구를 포함하는 비제한적 목록에서 선택될 수 있다.
바람직하게는, 항원 결합 도메인은 B-세포, T-세포, 자연 살해, 수지상 세포, 단핵구 및 선천성 림프구 세포(ILC)로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역 세포에 의해 발현된 PD-1에 특이적으로 결합한다.
보다 더 바람직하게는, 면역 세포는 T 세포이다. 본원에 사용된 “T 세포” 또는 “T 림프구”는 예를 들어 CD4 + T 세포, CD8 + T 세포, T 헬퍼 1형 T 세포, T 헬퍼 2형 T 세포, T 조절자, T 헬퍼 17형 T 세포 및 억제 T 세포를 포함한다. 매우 특정한 양태에서, 면역 세포는 고갈된 T 세포이다.
특정 양태에서, 면역 세포는 이펙터 기억 줄기 유사 T 세포이다.
특정 양태에서, 면역 세포는 고갈된 T 세포 또는 이펙터 기억 줄기 유사 T 세포이이고 PD-1은 고갈된 T 세포 또는 이펙터 기억 줄기 유사 T 세포의 표면 상에 발현된다. T 세포 고갈은 T 세포의 기능, 증식 능력 및 세포독성 가능성이 점진적으로 상실되어 결국에는 결실을 초래하는 상태이다. T 세포 고갈은 PD-1을 포함한 지속적인 항원 노출 또는 억제 수용체와 같은 여러 요인에 의해 유발될 수 있다.
바람직한 양태에서, 항원 결합 도메인은 PD-1에 대해 길항제 활성을 갖는다.
PD-1에 대한 수많은 항체가 이미 당업계에 기술되어 있다. 당업자는 이의 서열에 기초하여 공지된 항체로부터 단일 항원 결합 도메인을 생성하는 방법을 알고 있다.
몇몇 항-PD-1이 이미 임상적으로 승인되었고, 나머지는 아직 임상 개발 중이다. 예를 들어, 항-PD1 항체는 펨브롤리주맙(키트루다 람브롤리주맙, MK-3475로도 알려짐), 니볼루맙(옵디보, MDX-1106, BMS-936558, ONO-4538), 피딜리주맙(CT-011), 세미플리맙(리브타요), 캄렐리주맙, AUNP12, AMP-224, AGEN-2034, BGB-A317(티슬레이주맙), PDR001(스파르탈리주맙), MK-3477, SCH-900475, PF-06801591, JNJ-63723283, 게놀림주맙(CBT-501), LZM-009, BCD-100, SHR-1201, BAT-1306, AK-103(HX-008), MEDI-0680(AMP-514로도 알려짐) MEDI0608, JS001(문헌[Si-Yang Liu et al., J. Hematol. Oncol.10:136 (2017)] 참조), BI-754091, CBT-501, INCSHR1210(SHR-1210로도 알려짐), TSR-042(ANB011로도 알려짐), GLS-010(WBP3055로도 알려짐), AM-0001(Armo), STI-1110(국제특허공개 WO 2014/194302호 참조), AGEN2034(WO 2017/040790 참조), MGA012(WO 2017/19846 참조), 또는 IBI308(국제특허공개 WO 2017/024465호, 국제특허공개 WO 2017/025016호, 국제특허공개 WO 2017/132825호, 및 국제특허공개 WO 2017/133540호 참조), 국제특허공개 WO 2006/121168호에 기재된 단일클론 항체 5C4, 17D8, 2D3, 4H1, 4A11, 7D3, 및 5F4로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. PD-1을 표적으로 하는 이기능성 또는 이중특이성 분자는 또한 RG7769(Roche), XmAb20717(Xencor), MEDI5752(AstraZeneca), FS118(F-star), SL-279252(Takeda) 및 XmAb23104(Xencor)와 같이 알려져 있다. 특히, PD-1을 표적화하는 항원-결합 도메인은 이러한 목록에서 선택된 항-PD1 항체의 6개의 CDR 또는 VH 및 VL을 포함한다. 이러한 항원-결합 도메인은 특히 이러한 항체로부터 유도된 Fab 또는 svFc 도메인일 수 있다. 바람직한 양태에서, PD-1을 표적화하는 항원-결합 도메인은 펨브롤리주맙(키트루다 람브롤리주맙, MK-3475로도 알려짐) 또는 니볼루맙(옵디보, MDX-1106, BMS-936558, ONO-4538)으로부터 선택되는 항-PD1 항체의 6개의 CDR 또는 VH 및 VL을 포함하며, 예를 들어 Fab 또는 scFc 도메인일 수 있다.
특정 양태에서, 항원 결합 도메인이 유도되는 항-PD1 항체는 펨브롤리주맙(키트루다 람브롤리주맙, MK-3475로도 알려짐) 또는 니볼루맙(옵디보, MDX-1106, BMS-936558, ONO-4538)일 수 있다.
특히, 표적은 PD-1이고 이기능성 분자의 항원 결합 도메인은 항체, 이의 단편 또는 유도체 또는 PD-1에 특이적인 항체 모방체이다. 이어서, 특정 양태에서, 본 발명에 따른 이기능성 분자에 포함된 항원 결합 도메인은 항-PD1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 바람직하게는 인간, 인간화 또는 키메라 항-PD1 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로부터 유래된다. 바람직하게는, 항원 결합 도메인은 PD-1의 길항제이다. 따라서, 이기능성 분자는 IL-7 수용체에 대한 IL-7 변이체 또는 돌연변이체의 효과와 PD-1의 억제 효과 차단을 결합하고, T 세포, 특히 고갈된 T 세포의 활성화, 보다 특히 TCR 신호전달에 대해 상승적인 효과를 가질 수 있다. 바람직하게는, 항원 결합 도메인은 PD-1의 길항제이다.
본 개시내용의 매우 구체적인 양태에서, 항원 결합 도메인은 PD-1을 표적으로 하고 국제특허공개 WO2020/127366호에 개시된 항체로부터 유래되며, 이의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다.
이어서, 항원-결합 도메인은 하기를 포함한다:
(i) HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 및
(ii) LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 도메인,
여기서:
- 중쇄 CDR1(HCDR1)은 SEQ ID NO: 51의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 선택적으로, SEQ ID NO: 51의 위치 3을 제외한 임의의 위치에 치환, 부가, 결실 및 이들의 조합으로부터 선택되는 1, 2, 또는 3개의 변형이 있다;
- 중쇄 CDR2(HCDR2)는 SEQ ID NO: 53의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 선택적으로, SEQ ID NO: 53의 위치 13, 14 및 16을 제외한 임의의 위치에 치환, 부가, 결실 및 이들의 조합으로부터 선택되는 1, 2, 또는 3개의 변형이 있다;
- 중쇄 CDR3(HCDR3)은 SEQ ID NO: 54의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 여기서 X1은 D 또는 E이고 X2는 T, H, A, Y, N, E 및 S로 이루어진 군, 바람직하게는 H, A, Y, N, E 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고; 선택적으로, SEQ ID NO: 54의 위치 2, 3, 7 및 8을 제외한 임의의 위치에 치환, 부가, 결실 및 이들의 조합으로부터 선택되는 1, 2, 또는 3개의 변형이 있다;
- 경쇄 CDR1(LCDR1)은 SEQ ID NO: 63의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 여기서 X는 G 또는 T이고, 선택적으로, SEQ ID NO: 63의 위치 5, 6, 10, 11 및 16을 제외한 임의의 위치에 치환, 부가, 결실 및 이들의 조합으로부터 선택되는 1, 2, 또는 3개의 변형이 있다;
- 경쇄 CDR2(LCDR2)는 SEQ ID NO: 66의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 선택적으로, 치환, 부가, 결실 및 이들의 조합으로부터 선택되는 1, 2, 또는 3개의 변형이 있다;
- 경쇄 CDR3(LCDR3)은 SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 선택적으로, SEQ ID NO: 16의 위치 1, 4 및 6을 제외한 임의의 위치에 치환, 부가, 결실 및 이들의 조합으로부터 선택되는 1, 2, 또는 3개의 변형이 있다.
일 양태에서, 항원-결합 도메인은 하기를 포함한다:
(i) HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 및
(ii) LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 도메인,
여기서:
- 중쇄 CDR1(HCDR1)은 SEQ ID NO: 51의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 선택적으로, SEQ ID NO: 51의 위치 3을 제외한 임의의 위치에 치환, 부가, 결실 및 이들의 조합으로부터 선택되는 1, 2, 또는 3개의 변형이 있다;
- 중쇄 CDR2(HCDR2)는 SEQ ID NO: 53의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 선택적으로, SEQ ID NO: 53의 위치 13, 14 및 16을 제외한 임의의 위치에 치환, 부가, 결실 및 이들의 조합으로부터 선택되는 1, 2, 또는 3개의 변형이 있다;
- 중쇄 CDR3(HCDR3)은 SEQ ID NO: 54의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 여기서 X1은 D이고 X2는 T, H, A, Y, N, E 및 S로 이루어진 군, 바람직하게는 H, A, Y, N, E로 이루어진 군으로부터 선택되거나; X1은 E이고 X2는 T, H, A, Y, N, E 및 S로 이루어진 군, 바람직하게는 H, A, Y, N, E로 이루어진 군으로부터 선택되고; 선택적으로, SEQ ID NO: 54의 위치 2, 3, 7 및 8을 제외한 임의의 위치에 치환, 부가, 결실 및 이들의 조합으로부터 선택되는 1, 2, 또는 3개의 변형이 있다;
- 경쇄 CDR1(LCDR1)은 SEQ ID NO: 63의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 여기서 X1은 G 또는 T이고, 선택적으로, SEQ ID NO: 63의 위치 5, 6, 10, 11 및 16을 제외한 임의의 위치에 치환, 부가, 결실 및 이들의 조합으로부터 선택되는 1, 2, 또는 3개의 변형이 있다;
- 경쇄 CDR2(LCDR2)는 SEQ ID NO: 66의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 선택적으로, 치환, 부가, 결실 및 이들의 조합으로부터 선택되는 1, 2, 또는 3개의 변형이 있다;
- 경쇄 CDR3(LCDR3)은 SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 선택적으로, SEQ ID NO: 16의 위치 1, 4 및 6을 제외한 임의의 위치에 치환, 부가, 결실 및 이들의 조합으로부터 선택되는 1, 2, 또는 3개의 변형이 있다.
또 다른 실시형태에서, 항원-결합 도메인은 하기를 포함하거나 이로 본질적으로 이루어진다: (i) SEQ ID NO: 51의 CDR1, SEQ ID NO: 53의 CDR2 및 SEQ ID NO: 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 또는 62의 CDR3을 포함하는 중쇄; 및 (ii) SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65 또는 SEQ ID NO: 89의 CDR1, SEQ ID NO: 66의 CDR2 및 SEQ ID NO: 16 또는 SEQ ID No: 90의 CDR3을 포함하는 경쇄.
또 다른 실시형태에서, 항원-결합 도메인은 하기를 포함하거나 이로 본질적으로 이루어진다: (i) SEQ ID NO: 51의 CDR1, SEQ ID NO: 53의 CDR2 및 SEQ ID NO: 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 또는 62의 CDR3을 포함하는 중쇄; 및 (ii) SEQ ID NO: 64 또는 SEQ ID NO: 65의 CDR1, SEQ ID NO: 66의 CDR2 및 SEQ ID NO: 16의 CDR3을 포함하는 경쇄.
또 다른 양태에서, 항원-결합 도메인은 하기를 포함하거나 이로 본질적으로 이루어진다:
(i) SEQ ID NO: 51의 CDR1, SEQ ID NO: 53의 CDR2 및 SEQ ID NO: 55의 CDR3을 포함하는 중쇄; 및 (ii) SEQ ID NO: 64의 CDR1, SEQ ID NO: 66의 CDR2 및 SEQ ID NO: 16의 CDR3을 포함하는 경쇄; 또는
(i) SEQ ID NO: 51의 CDR1, SEQ ID NO: 53의 CDR2 및 SEQ ID NO: 56의 CDR3을 포함하는 중쇄; 및 (ii) SEQ ID NO: 64의 CDR1, SEQ ID NO: 66의 CDR2 및 SEQ ID NO: 16의 CDR3을 포함하는 경쇄; 또는
(i) SEQ ID NO: 51의 CDR1, SEQ ID NO: 53의 CDR2 및 SEQ ID NO: 57의 CDR3을 포함하는 중쇄; 및 (ii) SEQ ID NO: 64의 CDR1, SEQ ID NO: 66의 CDR2 및 SEQ ID NO: 16의 CDR3을 포함하는 경쇄; 또는
(i) SEQ ID NO: 51의 CDR1, SEQ ID NO: 53의 CDR2 및 SEQ ID NO: 58의 CDR3을 포함하는 중쇄; 및 (ii) SEQ ID NO: 64의 CDR1, SEQ ID NO: 66의 CDR2 및 SEQ ID NO: 16의 CDR3을 포함하는 경쇄; 또는
(i) SEQ ID NO: 51의 CDR1, SEQ ID NO: 53의 CDR2 및 SEQ ID NO: 59의 CDR3을 포함하는 중쇄; 및 (ii) SEQ ID NO: 64의 CDR1, SEQ ID NO: 66의 CDR2 및 SEQ ID NO: 16의 CDR3을 포함하는 경쇄; 또는
(i) SEQ ID NO: 51의 CDR1, SEQ ID NO: 53의 CDR2 및 SEQ ID NO: 60의 CDR3을 포함하는 중쇄; 및 (ii) SEQ ID NO: 64의 CDR1, SEQ ID NO: 66의 CDR2 및 SEQ ID NO: 16의 CDR3을 포함하는 경쇄; 또는
(i) SEQ ID NO: 51의 CDR1, SEQ ID NO: 53의 CDR2 및 SEQ ID NO: 61의 CDR3을 포함하는 중쇄; 및 (ii) SEQ ID NO: 64의 CDR1, SEQ ID NO: 66의 CDR2 및 SEQ ID NO: 16의 CDR3을 포함하는 경쇄; 또는
(i) SEQ ID NO: 51의 CDR1, SEQ ID NO: 53의 CDR2 및 SEQ ID NO: 62의 CDR3을 포함하는 중쇄; 및 (ii) SEQ ID NO: 64의 CDR1, SEQ ID NO: 66의 CDR2 및 SEQ ID NO: 16의 CDR3을 포함하는 경쇄; 또는
(i) SEQ ID NO: 51의 CDR1, SEQ ID NO: 53의 CDR2 및 SEQ ID NO: 55의 CDR3을 포함하는 중쇄; 및 (ii) SEQ ID NO: 65의 CDR1, SEQ ID NO: 66의 CDR2 및 SEQ ID NO: 16의 CDR3을 포함하는 경쇄; 또는
(i) SEQ ID NO: 51의 CDR1, SEQ ID NO: 53의 CDR2 및 SEQ ID NO: 56의 CDR3을 포함하는 중쇄; 및 (ii) SEQ ID NO: 65의 CDR1, SEQ ID NO: 66의 CDR2 및 SEQ ID NO: 16의 CDR3을 포함하는 경쇄; 또는
(i) SEQ ID NO: 51의 CDR1, SEQ ID NO: 53의 CDR2 및 SEQ ID NO: 57의 CDR3을 포함하는 중쇄; 및 (ii) SEQ ID NO: 65의 CDR1, SEQ ID NO: 66의 CDR2 및 SEQ ID NO: 16의 CDR3을 포함하는 경쇄; 또는
(i) SEQ ID NO: 51의 CDR1, SEQ ID NO: 53의 CDR2 및 SEQ ID NO: 58의 CDR3을 포함하는 중쇄; 및 (ii) SEQ ID NO: 65의 CDR1, SEQ ID NO: 66의 CDR2 및 SEQ ID NO: 16의 CDR3을 포함하는 경쇄; 또는
(i) SEQ ID NO: 51의 CDR1, SEQ ID NO: 53의 CDR2 및 SEQ ID NO: 59의 CDR3을 포함하는 중쇄; 및 (ii) SEQ ID NO: 65의 CDR1, SEQ ID NO: 66의 CDR2 및 SEQ ID NO: 16의 CDR3을 포함하는 경쇄; 또는
(i) SEQ ID NO: 51의 CDR1, SEQ ID NO: 53의 CDR2 및 SEQ ID NO: 60의 CDR3을 포함하는 중쇄; 및 (ii) SEQ ID NO: 65의 CDR1, SEQ ID NO: 66의 CDR2 및 SEQ ID NO: 16의 CDR3을 포함하는 경쇄; 또는
(i) SEQ ID NO: 51의 CDR1, SEQ ID NO: 53의 CDR2 및 SEQ ID NO: 61의 CDR3을 포함하는 중쇄; 및 (ii) SEQ ID NO: 65의 CDR1, SEQ ID NO: 66의 CDR2 및 SEQ ID NO: 16의 CDR3을 포함하는 경쇄; 또는
(i) SEQ ID NO: 51의 CDR1, SEQ ID NO: 53의 CDR2 및 SEQ ID NO: 62의 CDR3을 포함하는 중쇄; 및 (ii) SEQ ID NO: 65의 CDR1, SEQ ID NO: 66의 CDR2 및 SEQ ID NO: 16의 CDR3을 포함하는 경쇄.
또 다른 양태에서, 항원-결합 도메인은 하기를 포함하거나 이로 본질적으로 이루어진다:
(i) SEQ ID NO: 51의 CDR1, SEQ ID NO: 53의 CDR2 및 SEQ ID NO: 55의 CDR3을 포함하는 중쇄; 및 (ii) SEQ ID NO: 89의 CDR1, SEQ ID NO: 66의 CDR2 및 SEQ ID NO: 90의 CDR3을 포함하는 경쇄; 또는
(i) SEQ ID NO: 51의 CDR1, SEQ ID NO: 53의 CDR2 및 SEQ ID NO: 56의 CDR3을 포함하는 중쇄; 및 (ii) SEQ ID NO: 89의 CDR1, SEQ ID NO: 66의 CDR2 및 SEQ ID NO: 90의 CDR3을 포함하는 경쇄; 또는
(i) SEQ ID NO: 51의 CDR1, SEQ ID NO: 53의 CDR2 및 SEQ ID NO: 57의 CDR3을 포함하는 중쇄; 및 (ii) SEQ ID NO: 89의 CDR1, SEQ ID NO: 66의 CDR2 및 SEQ ID NO: 90의 CDR3을 포함하는 경쇄; 또는
(i) SEQ ID NO: 51의 CDR1, SEQ ID NO: 53의 CDR2 및 SEQ ID NO: 58의 CDR3을 포함하는 중쇄; 및 (ii) SEQ ID NO: 89의 CDR1, SEQ ID NO: 66의 CDR2 및 SEQ ID NO: 90의 CDR3을 포함하는 경쇄; 또는
(i) SEQ ID NO: 51의 CDR1, SEQ ID NO: 53의 CDR2 및 SEQ ID NO: 59의 CDR3을 포함하는 중쇄; 및 (ii) SEQ ID NO: 89의 CDR1, SEQ ID NO: 66의 CDR2 및 SEQ ID NO: 90의 CDR3을 포함하는 경쇄; 또는
(i) SEQ ID NO: 51의 CDR1, SEQ ID NO: 53의 CDR2 및 SEQ ID NO: 60의 CDR3을 포함하는 중쇄; 및 (ii) SEQ ID NO: 89의 CDR1, SEQ ID NO: 66의 CDR2 및 SEQ ID NO: 90의 CDR3을 포함하는 경쇄.
일 양태에서, 본 발명에 따른 항-PD1 항원 결합 단편은 프레임워크 영역, 특히 중쇄 가변 영역 프레임워크 영역(HFR) HFR1, HFR2, HFR3 및 HFR4 및 경쇄 가변 영역 프레임워크 영역(LFR) LFR1, LFR2, LFR3 및 LFR4를 포함한다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 항-PD1 항원 결합 단편은 인간 또는 인간화 프레임워크 영역을 포함한다. 본원에서의 목적을 위해 "인간 수용체 프레임워크"는, 아래에 정의된 대로, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크로부터 유래된 경쇄 가변 도메인(VL) 프레임워크 또는 중쇄 가변 도메인(VH) 프레임워크의 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크이다. 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크로부터 유래된 인간 수용체 프레임워크는 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 아미노산 서열 변화를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 아미노산 변화의 수는 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 또는 2개 이하이다. 일부 실시형태에서, VL 수용체 인간 프레임워크는 VL 인간 면역글로불린 프레임워크 서열 또는 인간 컨센서스 프레임워크 서열과 서열이 동일하다. "인간 컨센서스 프레임워크"는 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선택에서 가장 일반적으로 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다.
특히, 항-PD1 항원 결합 단편은 선택적으로, HFR3, 즉 SEQ ID NO: 43의 위치 27, 29 및 32를 제외한 임의의 위치에서의 치환, 부가, 결실 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 변형을 갖는, 각각 SEQ ID NO: 41, 42, 43 및 44의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 프레임워크 영역(HFR) HFR1, HFR2, HFR3 및 HFR4를 포함한다. 바람직하게는, 항-PD1 항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 41의 HFR1, SEQ ID NO: 42의 HFR2, SEQ ID NO: 43의 HFR3 및 SEQ ID NO: 44의 HFR4를 포함한다.
특정한 실시형태에서, 항-PD1 항원 결합 단편은 각각 SEQ ID NOs: i) 45, 46, 47 및 48, ii) 91, 92, 93, 및 94 또는 iii) 95, 96, 97, 및 98의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 프레임워크 영역(LFR) LFR1, LFR2, LFR3 및 LFR4를 포함하며, 선택적으로, 치환, 부가, 결실 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 변형이 있다. 바람직하게는, 인간화 항-PD1 항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 45, 91 또는 95의 LFR1, SEQ ID NO: 46, 92 또는 96의 LFR2, SEQ ID NO: 47, 93 또는 97의 LFR3 및 SEQ ID NO: 48, 94 또는 98의 LFR4를 포함한다.
대안적으로 또는 추가로, 항-PD1 항원 결합 단편은 각각 SEQ ID NO: 45, 46, 47 및 48의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 프레임워크 영역(LFR) LFR1, LFR2, LFR3 및 LFR4를 포함하며, 선택적으로 치환, 부가, 결실 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 변형이 있다. 바람직하게는, 인간화 항-PD1 항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 45의 LFR1, SEQ ID NO: 46의 LFR2, SEQ ID NO: 47의 LFR3 및 SEQ ID NO: 48의 LFR4를 포함한다.
대안적으로 또는 추가로, 항-PD1 항원 결합 단편은 각각 SEQ ID NO: 91, 92, 93 및 94의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 프레임워크 영역(LFR) LFR1, LFR2, LFR3 및 LFR4를 포함하며, 선택적으로 치환, 부가, 결실 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 변형이 있다. 바람직하게는, 인간화 항-PD1 항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 91의 LFR1, SEQ ID NO: 92의 LFR2, SEQ ID NO: 93의 LFR3 및 SEQ ID NO: 94의 LFR4를 포함한다. 바람직하게는, 이러한 프레임워크는 SEQ ID NO: 89의 CDR1, SEQ ID NO: 66의 CDR2, SEQ ID NO: 90의 CDR3과 연관되어 있으며 선택적으로, 각각 치환, 부가, 결실 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 변형이 있다.
대안적으로 또는 추가로, 항-PD1 항원 결합 단편은 각각 SEQ ID NO: 95, 96, 97 및 98의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 프레임워크 영역(LFR) LFR1, LFR2, LFR3 및 LFR4를 포함하며, 선택적으로 치환, 부가, 결실 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 변형이 있다. 바람직하게는, 인간화 항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 95의 LFR1, SEQ ID NO: 96의 LFR2, SEQ ID NO: 97의 LFR3 및 SEQ ID NO: 98의 LFR4를 포함하며, 선택적으로 각각 치환, 부가, 결실 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 변형이 있다.
본 발명에 따른 이기능성 분자에 포함된 항원 결합 도메인의 VL 및 VH 도메인은 바람직하게는 하기 순서로 작동가능하게 연결된 3개의 상보적 결정 영역에 의해 중단된 4개의 프레임워크 영역을 포함할 수 있다: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4(아미노 말단에서 카복시 말단까지).
이러한 양태에서, 항원-결합 도메인은 하기를 포함하거나 이로 본질적으로 이루어진다:
(a) SEQ ID NO: 17의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 영역(VH), 여기서 X1은 D 또는 E이고 X2는 T, H, A, Y, N, E 및 S로 이루어진 군, 바람직하게는 H, A, Y, N, E로 이루어진 군으로부터 선택되고; 선택적으로 SEQ ID NO: 17의 위치 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112를 제외한 임의의 위치에서 치환, 부가, 결실 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 변형이 있다;
(b) SEQ ID NO: 26의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 영역(VL), 여기서 X는 G 또는 T이고, 선택적으로 SEQ ID NO: 26의 위치 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105를 제외한 임의의 위치에서 치환, 부가, 결실 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 변형이 있다.
또 다른 양태에서, 항원-결합 도메인 하기를 포함하거나 이로 본질적으로 이루어진다:
(a) SEQ ID NO: 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 영역(VH), 선택적으로 각각 SEQ ID NO: 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25의 위치 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112를 제외한 임의의 위치에서 치환, 부가, 결실 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 변형이 있다;
(b) SEQ ID NO: 27 또는 SEQ ID NO: 28의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 영역(VL), 선택적으로 SEQ ID NO: 27 또는 SEQ ID NO: 28의 위치 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105를 제외한 임의의 위치에서 치환, 부가, 결실 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 변형이 있다.
또 다른 양태에서, 항원-결합 도메인 하기를 포함하거나 이로 본질적으로 이루어진다:
(a) SEQ ID NO: 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 영역(VH);
(b) SEQ ID NO: 27 또는 SEQ ID NO: 28의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 영역(VL).
일 양태에서, 이기능성 분자는 프레임워크 영역, 특히 중쇄 가변 영역 프레임워크 영역(HFR) HFR1, HFR2, HFR3 및 HFR4 및 경쇄 가변 영역 프레임워크 영역(LFR) LFR1, LFR2, LFR3 및 LFR4를 포함하고, 특히 HFR1, HFR2, HFR3 및 HFR4는 각각 SEQ ID NO: 41, 42, 43 및 44의 아미노산 서열을 포함하고, 선택적으로 HFR3, 즉 SEQ ID NO: 43의 위치 27, 29 및 32를 제외한 임의의 위치에서 치환, 부가, 결실 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 변형이 있다. 바람직하게는, 이기능성 분자는 SEQ ID NO: 41의 HFR1, SEQ ID NO: 42의 HFR2, SEQ ID NO: 43의 HFR3 및 SEQ ID NO: 44의 HFR4를 포함한다. 또한, 이기능성 분자는 각각 SEQ ID NO: 45, 46, 47 및 48의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 프레임워크 영역(LFR) LFR1, LFR2, LFR3 및 LFR4를 포함할 수 있으며, 선택적으로 치환, 부가, 결실 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 변형이 있다. 바람직하게는, 이기능성 분자는 SEQ ID NO: 45의 LFR1, SEQ ID NO: 46의 LFR2, SEQ ID NO: 47의 LFR3 및 SEQ ID NO: 48의 LFR4를 포함한다. 대안적으로, 이기능성 분자는 각각 SEQ ID NO: 91, 92, 93 및 94의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 프레임워크 영역(LFR) LFR1, LFR2, LFR3 및 LFR4를 포함할 수 있으며, 선택적으로 치환, 부가, 결실 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 변형이 있다. 바람직하게는, 이기능성 분자는 SEQ ID NO: 91의 LFR1, SEQ ID NO: 92의 LFR2, SEQ ID NO: 93의 LFR3 및 SEQ ID NO: 94의 LFR4를 포함한다. 대안적으로, 이기능성 분자는 각각 SEQ ID NO: 95, 96, 97 및 98의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 프레임워크 영역(LFR) LFR1, LFR2, LFR3 및 LFR4를 포함할 수 있으며, 선택적으로 치환, 부가, 결실 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 변형이 있다. 바람직하게는, 이기능성 분자는 SEQ ID NO: 95의 LFR1, SEQ ID NO: 96의 LFR2, SEQ ID NO: 97의 LFR3 및 SEQ ID NO: 98의 LFR4를 포함한다.
또 다른 양태에서, 항원-결합 도메인은 표 D 및 E에 기술된 VH 및 VL의 임의의 조합을 포함하거나 이로 본질적으로 이루어진다.
또 다른 양태에서, 항원-결합 도메인은 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)의 하기 하기의 조합을 포함하거나 이로 본질적으로 이루어진다.
[표 D]
매우 특정한 양태에서, 항원-결합 도메인은 SEQ ID NO: 24의 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 28의 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하거나 이로 본질적으로 이루어진다. 또 다른 양태에서, 항원-결합 도메인은 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)의 하기 임의의 조합을 포함하거나 이로 본질적으로 이루어진다.
[표 E]
펩티드 링커
특정 양태에서, 본 발명에 따른 이기능성 분자는 항원 결합 도메인과 IL-7m을 Fc 사슬에 연결하는 펩티드 링커를 추가로 포함한다. 펩티드 링커는 일반적으로 IL-7m과 그 사이에 링커와 연결된 항원 결합 도메인이 그의 기능을 발휘하기에 충분한 공간적 자유를 갖도록 하기에 충분한 길이와 유연성을 갖는다.
본 개시내용의 양태에서, IL-7m은 바람직하게는 펩티드 링커를 통해 Fc 사슬에 연결된다. 본 개시내용의 이러한 양태에서, 항원 결합 도메인은 VH 도메인, 특히 CH1 도메인을 Fc 사슬의 CH2 도메인에 연결하기 위한 중쇄에서 자연적으로 발견되는 힌지에 의해 Fc 사슬에 연결될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "링커"는 적어도 하나의 아미노산의 서열을 지칭한다. 이러한 링커는 입체 장애를 방지하는 데 유용할 수 있다. 링커는 일반적으로 길이가 3 내지 44개의 아미노산 잔기이다. 바람직하게는, 링커는 3 내지 30개의 아미노산 잔기를 갖는다. 일부 양태에서, 링커는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 아미노산 잔기를 갖는다.
링커 서열은 자연 발생 서열 또는 비-자연 발생 서열일 수 있다. 치료 목적으로 사용되는 경우, 링커는 바람직하게는 이기능성 분자가 투여되는 대상체에서 비-면역원성이다. 링커 서열의 하나의 유용한 군은 국제특허공개 WO 96/34103호 및 국제특허공개 WO 94/04678 에 기재된 바와 같은 중쇄 항체의 힌지 영역으로부터 유래된 링커이다. 다른 예는 폴리-알라닌 링커 서열이다. 링커 서열의 추가의 바람직한 예는 (Gly4Ser)4, (Gly4Ser)3, (Gly4Ser)2, Gly4Ser, Gly3Ser, Gly3, Gly2ser 및 (Gly3Ser2)3, 특히 (Gly4Ser)3을 포함하는 상이한 길이의 Gly/Ser 링커이다. 바람직하게는, 링커는 (Gly4Ser)4, (Gly4Ser)3, 및 (Gly3Ser2)3으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 훨씬 더 바람직하게는 링커는 (GGGGS)3이다.
일 양태에서, 이기능성 분자에 포함된 링커는 (Gly4Ser)4, (Gly4Ser)3, (Gly4Ser)2, Gly4Ser, Gly3Ser, Gly3, Gly2ser 및 (Gly3Ser2)3으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 (Gly4Ser)3이다. 바람직하게는, 링커는 (Gly4Ser)4, (Gly4Ser)3, 및 (Gly3Ser2)3으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
Fc 도메인
이기능성 분자의 Fc 도메인은 항원 결합 도메인의 부분, 특히 IgG 면역글로불린의 중쇄일 수 있다. 실제로, 항원 결합 도메인이 Fab인 경우, 이기능성 분자는 가변 중쇄(VH), CH1, 힌지, CH2 및 CH3 도메인을 포함하여, 하나의 중쇄를 포함할 수 있다. 그러나, 이기능성 분자는 또한 scFv, 또는 디아바디와 같은 다른 구조를 가질 수 있다. 예를 들어, 이는 항원 결합 도메인에 연결된 Fc 도메인을 포함할 수 있다.
Fc 도메인은 인간 면역글로불린 중쇄, 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 또는 다른 부류로부터 유래될 수 있다. 바람직하게는, 이기능성 분자는 IgG1 또는 IgG4 중쇄 불변 도메인을 포함한다.
바람직하게는, Fc 도메인은 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다. 선택적으로, 이는 힌지 영역, CH2 도메인 및/또는 CH3 도메인의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, CH2 및/또는 CH3 도메인은 인간 IgG4 또는 IgG1 중쇄로부터 유래될 수 있다. 바람직하게는, Fc 도메인은 힌지 영역의 전부 또는 일부를 포함한다. 힌지 영역은 면역글로불린 중쇄, 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 또는 다른 부류로부터 유래될 수 있다. 바람직하게는, 힌지 영역은 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4로부터 유래된다. 보다 바람직하게는, 힌지 영역은 인간 또는 인간화 IgG1 또는 IgG4 중쇄로부터 유래된다.
IgG1 힌지 영역에는 3개의 시스테인이 있으며, 그 중 2개는 면역글로불린의 두 중쇄 사이의 이황화 결합에 관여한다. 이러한 동일한 시스테인은 Fc 부분 사이에 효율적이고 일관된 이황화 결합 형성을 허용한다. 따라서, 본 발명의 바람직한 힌지 영역은 IgG1, 보다 바람직하게는 인간 IgG1에서 유래된다. 일부 양태에서, 인간 IgG1 힌지 영역 내의 제1 시스테인은 다른 아미노산, 바람직하게는 세린으로 돌연변이된다.
IgG4의 힌지 영역은 사슬간 이황화 결합을 비효율적으로 형성하는 것으로 알려져 있다. 그러나, 본 발명에 적합한 힌지 영역은 바람직하게는 중쇄-유래 모이어티 사이의 이황화 결합의 정확한 형성을 향상시키는 돌연변이를 함유하는 IgG4 힌지 영역으로부터 유래될 수 있다(문헌[Angal S, et al. (1993) Mol. Immunol., 30:105-8). 보다 바람직하게는 힌지 영역은 인간 IgG4 중쇄로부터 유래된다.
이기능성 분자는 이량체 Fc 도메인을 포함한다. 따라서, 2개의 단량체는 각각 하나의 Fc 사슬을 포함하며, Fc 사슬은 이량체 Fc 도메인을 형성할 수 있다. 이량체 Fc 도메인은 동종이량체일 수 있으며, 각각의 Fc 단량체는 동일하거나 본질적으로 동일하다. 대안적으로, 이량체 Fc 도메인은 이종이량체일 수 있으며, 각각의 Fc 단량체는 상이하고 이종이량체 Fc 도메인의 형성을 촉진하기 위해 상보적이다.
보다 구체적으로, Fc 도메인은 이종이량체 Fc 도메인이다. 이종이량체 Fc 도메인은 각각의 단량체의 아미노산 서열의 변경에 의해 이루어진다. 이종이량체 Fc 도메인은 이종이량체 형성을 촉진하고/하거나 동종이량체에 비해 이종이량체의 용이한 정제를 허용하기 위해 각 사슬에서 상이한 불변 영역의 아미노산 변이체에 의존한다. 본 발명의 이종이량체를 생성하기 위해 사용될 수 있는 다수의 메카니즘이 있다. 또한, 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 이러한 메카니즘은 높은 이종이량체화를 보장하기 위해 조합될 수 있다. 따라서, 이종이량체의 생성을 유도하는 아미노산 변이체는 "이종이량체화 변이체"로 지칭된다. 이종이량체화 변이체는 입체 변이체(예를 들어, 아래에 설명된 "노브 및 홀" 또는 "스큐" 변이체 및 아래에 설명된 "전하 쌍" 변이체) 및 이종이량체로부터 동종이량체의 정제를 허용하는 "pi 변이체"를 포함할 수 있다. 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함되는, 국제특허공개 WO 2014/145806호는 "노브 및 홀", "정전기 스티어링" 또는 "전하 쌍", pi 변이체, 및 일반적인 추가 Fc 변이체를 포함하는 이종이량체화를 위한 유용한 메카니즘을 개시하고 있다. 또한, 문헌[Ridgway et al., Protein Engineering 9(7):617 (1996)]; 문헌[Atwell et al., J. Mol. Biol. 1997 270:26]; 미국 특허 제 8,216,805 호, 문헌[Merchant et al., Nature Biotech. 16:677 (1998)]를 참고하며, 이들 모두는 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다. "정전기 스티어링"에 대해서는 문헌[Gunasekaran et al., J. Biol. Chem. 285(25): 19637 (2010)]을 참고하며, 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다. pi 변이체에 대해서는, 미국 특허 US 2012/0149876 호를 참고하며, 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다.
그 다음, 바람직한 양태에서, 이종이량체 Fc 도메인은 "노브 및 홀" 기술을 기반으로 하는 제1 Fc 사슬 및 상보적 제2 Fc 사슬을 포함한다. 예를 들어, 제1 Fc 사슬은 노브 사슬을 특징짓는 치환을 포함하는 것을 의미하는, "노브(knob)" 또는 K 사슬이며, 제2 Fc 사슬은 홀 사슬을 특징짓는 치환을 포함하는 것을 의미하는, "홀(hole)" 또는 H 사슬이다. 그리고 그 역으로, 제1 Fc 사슬은 홀 사슬을 특징짓는 치환을 포함하는 것을 의미하는, "홀" 또는 H 사슬이고, 제2 Fc 사슬은 노브 사슬을 특징짓는 치환을 포함하는 것을 의미하는, "노브" 또는 K 사슬이다. 바람직한 양태에서, 제1 Fc 사슬은 "홀" 또는 H 사슬이고, 제2 Fc 사슬은 "노브" 또는 K 사슬이다.
선택적으로, 이종이량체 Fc 도메인은 하기 표 F에 나타낸 바와 같은 치환을 포함하는 하나의 이종이량체 Fc 사슬 및 하기 표 F에 나타낸 바와 같은 치환을 포함하는 다른 이종이량체 Fc 사슬을 포함할 수 있다.
[표 F]
바람직한 양태에서, 제1 Fc 사슬은 "홀" 또는 H 사슬이고, 치환 T366S/L368A/Y407V/Y349C를 포함하고, 제2 Fc 사슬은 "노브" 또는 K 사슬이고, 치환 T366W/S354C를 포함한다.
선택적으로, Fc 사슬은 추가 치환을 추가로 포함할 수 있다.
특히, 세포-표면 분자, 특히 면역 세포 상의 것들을 표적화하는 이기능성 분자의 경우, 이펙터 기능을 제거하는 것이 요구될 수 있다. 조작된 Fc 영역이 또한 이기능성 분자의 이펙터 기능을 감소시키거나 증가시키기 위해 바람직할 수 있다.
특정 양태에서, 아미노산 변형은 Fc 영역 변이체를 생성하기 위해 Fc 영역 내로 도입될 수 있다. 특정 양태에서, Fc 영역 변이체는 전부는 아니지만 일부의 이펙터 기능을 보유한다. 이러한 이기능성 분자는, 예를 들어 생체 내 항체의 반감기가 중요하지만 특정 이펙터 기능이 불필요하거나 유해한 적용에서 유용할 수 있다. 변경된 이펙터 기능을 갖는 수많은 치환 또는 치환들 또는 결실이 당업계에 공지되어 있다.
일 양태에서, Fc 도메인의 불변 영역은 Fc 수용체에 대한 친화도를 감소시키거나 Fc 이펙터 기능을 감소시키는 돌연변이를 함유한다. 예를 들어, 불변 영역은 IgG 중쇄의 불변 영역 내의 글리코실화 부위를 제거하는 돌연변이를 함유할 수 있다. 바람직하게는, CH2 도메인은 CH2 도메인 내의 글리코실화 부위를 제거하는 돌연변이를 함유한다.
특정 양태에서, Fc 도메인은 FcRn에 대한 결합을 증가시키도록 변형되어, 이기능성 분자의 반감기를 증가시킨다. 다른 양태 또는 추가 양태에서, Fc 도메인은 FcγR에 대한 결합을 감소시켜, ADCC 또는 CDC를 감소시키거나 FcγR에 대한 결합을 증가시켜 ADCC 또는 CDC를 증가시키도록 변형된다.
Fc 부분과 비-Fc 부분의 접합부 근처에 있는 아미노산의 변경은 국제특허공개 WO 01/58957호에 나타난 바와 같이 Fc 융합 단백질의 혈청 반감기를 극적으로 증가시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 단백질 또는 폴리펩티드의 접합 영역은 면역글로불린 중쇄 및 에리트로포이에틴의 자연-발생 서열에 비해 바람직하게는 접합점의 약 10개 아미노산 내에 있는 변경을 함유할 수 있다. 이러한 아미노산 변화는 소수성을 증가시킬 수 있다. 한 실시형태에서, 불변 영역은 C-말단 라이신 잔기가 대체된 IgG 서열로부터 유래된다. 바람직하게는, IgG 서열의 C-말단 라이신은 혈청 반감기를 추가로 증가시키기 위해 알라닌 또는 류신과 같은 비-라이신 아미노산으로 대체된다.
일 실시형태에서, Fc 도메인의 불변 영역은 하기 표 G에 기재된 돌연변이 중 하나, 또는 이들의 임의의 조합을 갖는다.
[표 G]
특정 양태에서, 이기능성 분자는 인간 IgG1 중쇄 불변 도메인 또는 IgG1 Fc 도메인을 포함하며, 선택적으로 T250Q/M428L; M252Y/S254T/T256E + H433K/N434F; E233P/L234V/L235A/G236A + A327G/A330S/P331S; E333A; S239D/A330L/I332E; P257I/Q311; K326W/E333S; S239D/I332E/G236A; N297A; L234A/L235A; P329G; N297A + M252Y/S254T/T256E; K322A 및 K444A로 이루어진 군으로부터 선택되는, 바람직하게는 선택적으로 M252Y/S254T/T256E와 조합된 N297A, 및 선택적으로 P329G가 있는 L234A/L235A로 이루어진 군으로부터 선택되는 치환 또는 치환의 조합이 있다.
특정 양태에서, 이기능성 분자는 인간 IgG1 중쇄 불변 도메인 또는 IgG1 Fc 도메인을 포함하며, 선택적으로 T250Q/M428L; M252Y/S254T/T256E + H433K/N434F; E233P/L234V/L235A/G236A + A327G/A330S/P331S; E333A; S239D/A330L/I332E; P257I/Q311; K326W/E333S; S239D/I332E/G236A; N297A; L234A/L235A; P329G; N297A + M252Y/S254T/T256E; K322A,K444A, K444E, K444D, K444G, K444S, M428L, L309D, Q311H, N434S, M428L + N434S 및 L309D + Q311H + N434S로 이루어진 군으로부터 선택되는, 바람직하게는 선택적으로 M252Y/S254T/T256E와 조합하여 N297A, 및 선택적으로 P329G가 있는 L234A/L235A로 이루어진 군으로부터 선택되는 치환 또는 치환의 조합이 있다.
치환 L234A/L235A/P329G의 조합이 있는 인간 IgG1 중쇄 불변 도메인 또는 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 이기능성 분자는 상기 이기능성 분자에 의해 야기되는 ADCC, ADCP 및/또는 CDC를 크게 감소시키거나 함께 억제하여, 비특이적인 세포독성을 감소시킨다.
또 다른 양태에서, 이기능성 분자는, 선택적으로 S228P; L234A/L235A; P329G, S228P + M252Y/S254T/T256E 및 K444A로 이루어진 군으로부터 선택되는 치환 또는 치환의 조합이 있는, 인간 IgG4 중쇄 불변 도메인 또는 인간 IgG4 Fc 도메인을 포함한다. 보다 더 바람직하게는, 이기능성 분자, 바람직하게는 본 발명에 따른 이기능성 분자는 IgG4를 안정화하는 S228P가 있는 IgG4 Fc-영역을 포함한다.
또 다른 양태에서, 이기능성 분자는, 선택적으로 S228P; L234A/L235A; L234A/L235A/P329G, P329G, S228P + M252Y/S254T/T256E, K444A K444E, K444D, K444G 및 K444S로 이루어진 군으로부터 선택되는 치환 또는 치환의 조합이 있는, 인간 IgG4 중쇄 불변 도메인 또는 인간 IgG4 Fc 도메인을 포함한다. 보다 더 바람직하게는, 이기능성 분자, 바람직하게는 본 발명에 따른 이기능성 분자는 IgG4를 안정화하는 S228P가 있는 IgG4 Fc-영역을 포함한다.
본원에서 언급된 바와 같이, "/" 및 "+"은 누적되는 돌연변이를 지칭한다. 따라서, 돌연변이 S228P + M252Y/S254T/T256E는 S228P, M252Y, S254T 및 T256E 돌연변이를 의미한다.
치환 P329G이 있는 인간 IgG4 중쇄 불변 도메인 또는 IgG4 Fc 도메인을 포함하는 이기능성 분자는 상기 이기능성 분자에 의해 야기되는 ADCC 및/또는 CDC를 감소시키고, 이에 따라 비특이적인 세포독성을 감소시킨다.
인간 IgG의 모든 하위 부류는 순환에서 절단되기 쉬운 항체 중쇄(K444)의 C-말단 라이신 잔기를 가지고 있다. 혈액에서 이러한 절단은 연결된 IL-7m을 이기능성 분자에 방출함으로써 이기능성 분자의 생체 활성을 손상시키거나 감소시킬 수 있다.
이러한 문제를 피하기 위해, 단백질 분해 절단을 줄이기 위해 IgG 도메인의 K444 아미노산을 다른 아미노산으로 대체할 수 있으며, 이는 항체에 일반적으로 사용되는 돌연변이이다. 그런 다음, 한 양태에서, 이기능성 분자는 K444A, K444E, K444D, K444G 또는 K444S, 바람직하게는 K444A로 이루어진 적어도 하나의 추가 아미노산 치환을 포함한다.
특히, IgG 도메인의 K444 아미노산은 단백질 분해 절단을 줄이기 위해 알라닌으로 치환될 수 있으며, 이는 항체에 일반적으로 사용되는 돌연변이이다. 그런 다음, 한 양태에서, 이기능성 분자는 K444A로 이루어진 적어도 하나의 추가 아미노산 치환을 포함한다.
선택적으로, 이기능성 분자는 추가의 이황화 결합을 생성하고 이기능성 분자의 유연성을 잠재적으로 제한하기 위해 Fc 도메인의 C-말단 도메인에 추가의 시스테인 잔기를 포함한다.
일 양태에서, 이기능성 분자는 SEQ ID NO: 39 또는 52의 하나의 중쇄 불변 도메인 및/또는 SEQ ID NO: 40의 하나의 경쇄 불변 도메인, 특히 SEQ ID NO: 39 또는 52의 하나의 중쇄 불변 도메인 또는 Fc 도메인 및 SEQ ID NO: 40의 하나의 경쇄 불변 도메인, 특히 예를 들어 하기 표 H에 개시된 것들을 포함한다.
[표 H]
하나의 특정한 양태에서, 본 발명에 따른 이기능성 분자는 전술된 바와 같은 "노브 인투 홀(knob into holes)" 변형을 포함하는 Fc 도메인의 이종이량체를 포함한다. 바람직하게는, 이러한 Fc 도메인은 상기 기재된 바와 같은 IgG1 또는 IgG4 Fc 도메인이고, 더욱 더 바람직하게는 상기 기재된 바와 같은 돌연변이 N297A를 포함하는 IgG1 Fc 도메인이다.
예를 들어, 제1 Fc 사슬은 "홀" 또는 H 사슬이고, 치환 T366S/L368A/Y407V/Y349C 및 선택적으로 N297A를 포함하고, 제2 Fc 사슬은 "노브" 또는 K 사슬이고, 치환 T366W/S354C 및 선택적으로 N297A를 포함한다. 바람직하게는, 제1 Fc 사슬은 "홀" 또는 H 사슬이고 치환 T366S/L368A/Y407V/Y349C 및 N297A를 포함하고, 제2 Fc 사슬은 "노브" 또는 K 사슬이고, 치환 T366W/S354C 및 N297A를 포함한다. 보다 특히, 제2 Fc 사슬은 SEQ ID NO: 75를 포함할 수 있거나 이로 이루어질 수 있고/있거나 제1 Fc 사슬은 SEQ ID NO: 77을 포함할 수 있거나 이로 이루어질 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명에 따른 IL-7m은 이종이량체 Fc 도메인의 노브-사슬 및/또는 홀 사슬에 연결된다. 따라서, 본 발명에 따른 이기능성 분자는 Fc 도메인의 홀-사슬 또는 노브-사슬에 연결된 단일 IL-7m을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 이기능성 분자는 Fc 도메인의 홀-사슬에 연결된 단일 IL-7m을 포함한다.
제1 양태에서, 이기능성 분자는 Fc 도메인의 노브-사슬의 C-말단에 연결된 IL-7m을 포함하며, 이러한 Fc 도메인의 노브-사슬은 항원 결합 도메인에 연결된다.
제2 양태에서, 이기능성 분자는 Fc 도메인의 홀-사슬의 C-말단에 연결된 IL-7m을 포함하며, 이러한 Fc 도메인의 홀-사슬은 이의 N- 말단 단부에서 항원 결합 도메인에 연결된다.
선택적으로, 이기능성 분자는 Fc 도메인의 홀-사슬의 C-말단에 연결된 단일 IL-7m을 포함하며, 상기 이기능성 분자는 Fc 도메인의 홀 사슬의 N-말단 단부에 연결된 단일 항원 결합 도메인만을 포함한다. 이러한 양태에서, 노브 사슬 도메인은 IL-7m 및 항원 결합 도메인이 결여되어 있다.
선택적으로, 이기능성 분자는 Fc 도메인의 노브-사슬의 C-말단에 연결된 단일 IL-7m을 포함하며, 상기 이기능성 분자는 Fc 도메인의 노브 사슬의 N-말단 단부에 연결된 단일 항원 결합 도메인만을 포함한다. 이러한 양태에서, 홀 사슬 도메인은 IL-7m 및 항원 결합 도메인이 결여되어 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 N-말단에서 C-말단까지 항원-결합 도메인(또는 적어도 그의 중쇄에 상응하는 부분), Fc 사슬(노브 또는 홀 Fc 사슬), 바람직하게는 Fc 도메인의 홀-사슬, 및 IL-7m을 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이다. 상보적 사슬은 IL-7m 및 항원 결합 도메인이 결여되어 있는 상보적 Fc 사슬, 바람직하게는 Fc 도메인의 노브-사슬을 포함한다.
매우 특정한 양태에서, 이기능성 분자는 PD-1을 표적화 하고 하기를 포함한다:
(a) SEQ ID NO: 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄, 선택적으로 각각 SEQ ID NO: 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36의 위치 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112을 제외한 임의의 위치에서 치환, 부가, 결실, 및 이들의 조합으로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 변형이 있음, 그리고 상기 치환은 홀 또는 노브 사슬, 바람직하게는 홀 사슬, 보다 구체적으로 표 F에 개시된 바와 같은 것, 특히, SEQ ID NO: 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36에서, T363S/L365A/Y4047V/Y346C 또는 T363W/S351C, 바람직하게는 T363S/L365A/Y4047V/Y346C, 및 선택적으로 SEQ ID NO: 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36 중 어느 하나에서의 N294A에 해당함;
(b) SEQ ID NO: 37 또는 SEQ ID NO: 38의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄, 선택적으로 SEQ ID NO: 37 또는 SEQ ID NO: 38의 위치 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105를 제외한 임의의 위치에서 치환, 부가, 결실, 및 이들의 조합으로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 변형이 있음.
또 다른 양태에서, 이기능성 분자는 중쇄(CH) 및 경쇄(CL)의 하기들 조합 중 임의의 것을 포함하거나 이로 이루어진다:
상기 중쇄는 홀 또는 노브 사슬, 바람직하게는 홀 사슬, 보다 구체적으로 표 F에 개시된 바와 같은 것, 특히 SEQ ID NO: 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36에서, 특히 T366S/L368A/Y407V/Y349C 또는 T366W/S354C, 바람직하게는 T366S/L368A/Y407V/Y349C, 및 선택적으로 SEQ ID NO: 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36 중 임의의 하나에서 N297A에 해당하는 치환을 포함하고, 상기 치환 위치는 EU 넘버링에 따라 정의된다.
매우 특정한 양태에서, 이기능성 분자는 PD-1을 표적화하고, SEQ ID NO: 37 또는 38을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄를 포함한다.
따라서, 이기능성 분자는 SEQ ID NO: 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 및 36 중 어느 하나를 포함하는 하나의 중쇄를 포함할 수 있고, Fc 사슬은 이종이량체 Fc 도메인을 형성하기 위해 Fc 사슬의 이종이량체화를 촉진하기 위해 선택적으로 변형된다. 보다 구체적으로, 중쇄는 홀 또는 노브 사슬, 바람직하게는 홀 사슬, 보다 구체적으로 표 F에 개시된 바와 같은 것, 특히 T366S/L368A/Y407V/Y349C 또는 T366W/S354C, 바람직하게는 T366S/L368A/Y407V/Y349C, 및 선택적으로 SEQ ID NO: 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36 중 어느 하나에서의 N297A에 해당하는 치환을 포함하며, 상기 치환 위치는 EU 넘버링에 따라 정의된다. 중쇄는, 선택적으로 링커를 통해, 이의 C 말단 단부에서 IL-7m에 연결된다.
바람직한 작제물
특정 양태에서, 분자는 선택적으로 펩티드 링커를 통해 제1 Fc 사슬에 공유적으로 연결된 항원-결합 도메인으로서, 상기 제1 Fc 사슬은 선택적으로 펩티드 링커를 통해 IL-7 변이체에 공유적으로 연결된 것, 및 상보적인 제2 Fc 사슬을 포함하는 제2 단량체를 포함하며, 바람직하게는 항원-결합 도메인 및 IL-7 변이체가 없고, 상기 제1 및 제2 Fc 사슬은 이량체 Fc 도메인을 형성한다. 선택적으로, 이량체 Fc 도메인은 이종이량체 Fc 도메인이다. 보다 특히, 분자는 선택적으로 펩티드 링커를 통해 제1 이종이량체 Fc 사슬의 N-말단 단부에 공유적으로 연결된 항원-결합 도메인을 포함하는 제1 단량체로서, 상기 제1 이종이량체 Fc 사슬은 선택적으로 펩티드 링커를 통해 IL-7 변이체에 이의 C-말단 단부에 의해 공유적으로 연결된 것, 및 항원-결합 도메인 및 IL-7 변이체가 없는, 바람직하게는 임의의 다른 분자가 없는 상보적인 제2 이종이량체 Fc 사슬을 포함하는 제2 단량체를 포함한다. 보다 더 특히, 분자는 선택적으로 펩티드 링커를 통해 제1 이종이량체 Fc 사슬의 N-말단 단부에 C-말단 단부를 통해 공유적으로 연결된 항원-결합 도메인을 포함하는 제1 단량체로서, 상기 제1 이종이량체 Fc 사슬은 선택적으로 펩티드 링커를 통해 IL-7 변이체의 N-말단 단부에 이의 C-말단 단부에 의해 공유적으로 연결된 것, 및 항원-결합 도메인 및 IL-7 변이체가 없는, 바람직하게는 임의의 다른 분자가 없는 상보적인 제2 이종이량체 Fc 사슬을 포함하는 제2 단량체를 포함한다. 이러한 분자는 예를 들어 도 1에 "작제물 3"으로서 예시되어 있다.
특히, 본 발명에 따른 이기능성 분자는 단일 항 PD-1 항원 결합 도메인 및 단일 IL-7 W142H 변이체를 포함한다(이러한 작제물은 항 PD-1*1 IL-7 W142H*1로도 지칭됨). 특히, 이러한 작제물은 SEQ ID NO: 24에 정의된 가변 중쇄(VH) 및 SEQ ID NO: 28에 정의된 가변 경쇄(VL)를 포함한다. 분자는 SEQ ID NO: 83에 정의된 IL-7 W142H에 결합된 중쇄, SEQ ID NO: 75에 정의된 Fc 영역 및 SEQ ID NO: 80에 정의된 경쇄를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명에 따른 이기능성 분자는 단일 항 PD-1 항원 결합 도메인 및 단일 IL-7 W142H 변이체를 포함한다(이러한 작제물은 항 PD-1*1 IL-7 W142H*1로도 지칭됨). 특히, 이러한 작제물은 SEQ ID NO: 24에 정의된 가변 중쇄(VH) 및 SEQ ID NO: 88 또는 90에 정의된 가변 경쇄(VL)를 포함한다.
이러한 양태에서, 본 발명은 단일 항원 결합 도메인 및 단일 IL-7 변이체를 포함하는 이기능성 분자에 관한 것으로서, 여기서:
- 이기능성 분자는 선택적으로 펩티드 링커를 통해 제1 Fc 사슬의 N-말단 단부에 C-말단 단부를 통해 공유적으로 연결된 항원-결합 도메인을 포함하는 제1 단량체, 및 항원-결합 도메인 및 IL-7 변이체가 없는 상보적인 제2 Fc 사슬을 포함하는 제2 단량체를 포함하고;
- i) IL-7 변이체는 선택적으로 펩티드 링커를 통해 상기 제1 Fc 사슬의 C-말단 단부에 공유적으로 연결되거나; ii) 단일 항원 결합 도메인은 가변 중쇄 및 가변 경쇄를 포함하고 IL-7 변이체는 경쇄의 C-말단 단부에 공유적으로 연결되고;
- 항원 결합 도메인은 PD-1에 결합하고;
- IL-7 변이체는 SEQ ID NO: 1로 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 야생형 인간 IL-7(wth-IL-7)과 적어도 75% 동일성을 나타내고, IL-7 변이체는 i) IL-7R에 대한 wth-IL-7의 친화도와 비교하여 IL-7 수용체(IL-7R)에 대한 IL-7 변이체의 친화도를 감소시키고, ii) wth-IL-7을 포함하는 이기능성 분자와 비교하여 IL-7 변이체를 포함하는 이기능성 분자의 약동학을 개선한다.
특히, IL-7 변이체는 (i) W142G, W142A, W142V, W142C, W142L, W142I, W142M, W142H, W142Y 및 W142F, 바람직하게는 W142H, W142F 또는 W142Y, (ii) C2S-C141S 및 C47S-C92S, C2S-C141S 및 C34S-C129S, 또는 C47S-C92S 및 C34S-C129S, (iii) D74E, D74Q 또는 D74N, iv) Q11E, Y12F, M17L, Q22E 및/또는 K81R; 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하고, 아미노산 넘버링은 SEQ ID NO: 1에 제시된 바와 같고, 바람직하게는 아미노산 치환 W142H, 보다 더 바람직하게는 SEQ ID NO: 5에 정의된 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 단일 항원 결합 도메인 및 단일 IL-7 변이체를 포함하는 이기능성 분자에 관한 것으로서,
여기서:
- 이기능성 분자는 선택적으로 펩티드 링커를 통해 제1 Fc 사슬의 N-말단 단부에 C-말단 단부를 통해 공유적으로 연결된 항원-결합 도메인을 포함하는 제1 단량체, 및 항원-결합 도메인 및 IL-7 변이체가 없는 상보적인 제2 Fc 사슬을 포함하는 제2 단량체를 포함하고;
- i) IL-7 변이체는 선택적으로 펩티드 링커를 통해 상기 제1 Fc 사슬의 C-말단 단부에 공유적으로 연결되거나; ii) 단일 항원 결합 도메인은 가변 중쇄 및 가변 경쇄를 포함하고 IL-7 변이체는 경쇄의 C-말단 단부에 공유적으로 연결되고;
- 항원 결합 도메인은 상기 "면역 세포 상의 PD-1을 표적화하는 항원 결합 도메인" 단락에 기술된 바와 같고;
- IL-7은 상기 "IL7 및 IL-7 변이체" 단락에 기술된 바와 같고;
- Fc 도메인은 상기 "Fc 도메인" 단락에 기술된 바와 같고;
- 펩티드 링커는 상기 "펩티드 링커" 단락에 기술된 바와 같다.
바람직하게는, 펩티드 링커는 (GGGGS)3. 또는 GGGGSGGGGSGGGGS이거나 SEQ ID NO: 70에 정의된 바와 같다.
바람직하게는, Fc 도메인은 인간 IgG1 또는 IgG4로부터 유래된다. 제1 Fc 사슬은 홀 또는 H 사슬이고 치환 T366S/L368A/Y407V/Y349C 및 선택적으로 N297A를 포함하고 제2 Fc 사슬은 노브 또는 K 사슬이고 치환 T366W/S354C 및 선택적으로 N297A를 포함한다. 바람직하게는, Fc 사슬은 홀 또는 H 사슬이고 치환 T366S/L368A/Y407V/Y349C 및 N297A를 포함하고 제2 Fc 사슬은 노브 또는 K 사슬이고 치환 T366W/S354C 및 N297A를 포함한다. 보다 바람직하게는, 제2 Fc 사슬은 SEQ ID NO: 75를 포함하거나 이로 이루어지고/지거나 제1 Fc 사슬은 SEQ ID NO: 77을 포함하거나 이로 이루어진다.
바람직하게는, IL-7은 아미노산 치환 W142H를 포함하고, 아미노산 넘버링은 SEQ ID NO: 1에 제시된 바와 같고, 특히 예를 들어 SEQ ID NO: 5에 정의된 것이다.
바람직하게는, 항원 결합 도메인은 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 세미플리맙, 캄렐리주맙, AUNP12, AMP-224, AGEN-2034, BGB-A317, 스파르탈리주맙, MK-3477, SCH-900475, PF-06801591, JNJ-63723283, 제놀림주맙, LZM-009, BCD-100, SHR-1201, BAT-1306, AK-103, MEDI-0680, MEDI0608, JS001, BI-754091, CBT-501, INCSHR1210, TSR-042, GLS-010, AM-0001, STI-1110, AGEN2034, MGA012, 또는 IBI308, 5C4, 17D8, 2D3, 4H1, 4A11, 7D3, 및 5F4로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체로부터 유래된다. 보다 바람직하게는, 항원 결합 도메인은 하기를 포함하거나 이로 본질적으로 이루어진다: (i) SEQ ID NO: 51의 CDR1, SEQ ID NO: 53의 CDR2 및 SEQ ID NO: 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 또는 62의 CDR3을 포함하는 중쇄, 및 (ii) SEQ ID NO: 64 또는 65의 CDR1, SEQ ID NO: 66의 CDR2 및 SEQ ID NO: 16의 CDR3을 포함하는 경쇄. 보다 더 바람직하게는, 항원 결합 도메인은 하기를 포함하거나 이로 본질적으로 이루어진다: (i) SEQ ID NO: 51의 CDR1, SEQ ID NO: 53의 CDR2 및 SEQ ID NO: 61의 CDR3을 포함하는 중쇄, 및 (ii) SEQ ID NO: 65의 CDR1, SEQ ID NO: 66의 CDR2 및 SEQ ID NO: 16의 CDR3을 포함하는 경쇄. 바람직하게는 항원-결합 도메인은 하기를 포함하거나 이로 본질적으로 이루어진다: (i) SEQ ID NO: 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25, 바람직하게는 SEQ ID NO: 24의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 영역(VH); 및 (ii) SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID No: 88 또는 SEQ ID NO: 90 바람직하게는 SEQ ID NO: 28의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 영역(VL). 바람직하게는 항원-결합 도메인은 하기를 포함하거나 이로 본질적으로 이루어진다: (a) SEQ ID NO: 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25, 바람직하게는 SEQ ID NO: 24의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 영역(VH); 및 (b) SEQ ID NO: 27 또는 SEQ ID NO: 28, 바람직하게는 SEQ ID NO: 28의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 영역(VL).
특정 양태에서, 본 발명에 따른 이기능성 분자는 SEQ ID NO: 24의 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 28의 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하거나 이로 본질적으로 이루어진 항-PD-1 항원-결합 도메인 및 아미노산 치환 W142H을 포함하는 IL-7 변이체를 포함하고, 아미노산 넘버링은 SEQ ID NO: 1에 제시된 바와 같고, 바람직하게는 예를 들어 SEQ ID : 5에 정의되어 있다.
특히, 본 발명에 따른 이기능성 분자는 (i) SEQ ID NO: 24의 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 28, 88 또는 99의 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하거나 이로 본질적으로 이루어진 항-PD-1 항원-결합 도메인,
(ii) SEQ ID : 5에 정의된 서열을 포함하거나 이로 본질적으로 이루어진 IL-7 변이체,
(iii) SEQ ID NO: 75를 포함하거나 이로 본질적으로 이루어진 제2 Fc 사슬 및/또는 SEQ ID NO: 77를 포함하거나 이로 본질적으로 이루어진 제1 Fc 사슬, 및
(iv) 선택적으로 SEQ ID NO: 70을 포함하거나 이로 본질적으로 이루어진 펩티드 링커를 포함한다.
특히, 본 발명에 따른 이기능성 분자는 (i) SEQ ID NO: 24의 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 28의 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하거나 이로 본질적으로 이루어진 항-PD-1 항원-결합 도메인,
(ii) SEQ ID : 5에 정의된 서열을 포함하거나 이로 본질적으로 이루어진 IL-7 변이체,
(iii) SEQ ID NO: 75를 포함하거나 이로 본질적으로 이루어진 제2 Fc 사슬 및/또는 SEQ ID NO: 77를 포함하거나 이로 본질적으로 이루어진 제1 Fc 사슬, 및
(iv) 선택적으로 SEQ ID NO: 70을 포함하거나 이로 본질적으로 이루어진 펩티드 링커를 포함한다.
매우 특정한 양태에서, 이기능성 분자는 SEQ ID NO: 38을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 및 SEQ ID NO: 35를 포함하는 하나의 중쇄를 포함하고, Fc 사슬은 선택적으로 Fc 사슬의 이종이량체화를 촉진하도록 변형되어 이종이량체 Fc 도메인을 형성한다. 일 양태에서, 중쇄는 이의 C 말단 단부에서 IL-7m에 선택적으로 링커를 통해 연결된다. 대안적인 양태에서, 경쇄는 이의 C 말단 단부에서 IL-7m에 선택적으로 링커를 통해 연결된다.
매우 특정한 양태에서, 이기능성 분자는 SEQ ID NO: 75의 제2 단량체 및 Fc 사슬 SEQ ID NO: 77을 포함하는 제1 단량체(이는 N-말단 단부에서, 선택적으로 링커에 의해, (예를 들어 SEQ ID NO: 79의) 항원 결합 도메인에 연결된다)를 포함할 수 있다. 보다 바람직하게는, 이기능성 분자는 SEQ ID NO: 75의 제2 단량체 및 Fc 사슬 SEQ ID NO: 77을 포함하는 제1 단량체(이는 N-말단 단부에서, 선택적으로 링커에 의해, (예를 들어 SEQ ID NO: 79의) 항원 결합 도메인에 연결되고, C-말단 단부에서, 선택적으로 링커에 의해, 본원에 개시된 임의의 IL-7m에 연결된다)를 포함할 수 있다.
선택적으로, IL-7m이 IL-7 변이체인 경우, 이기능성 분자는 SEQ ID NO: 75의 제2 단량체, SEQ ID NO: 83의 제1 단량체, 및 SEQ ID NO: 37, 38 또는 80, 바람직하게는 SEQ ID NO: 38 또는 80의 제3 단량체를 포함할 수 있다.
선택적으로, IL-7m이 IL-7 변이체인 경우, 이기능성 분자는 SEQ ID NO: 75의 제2 단량체, SEQ ID NO: 84의 제1 단량체, 및 SEQ ID NO: 37, 38 또는 80, 바람직하게는 SEQ ID NO: 38 또는 80의 제3 단량체(이는 이의 말단 단부에서, 선택적으로 링커에 의해, IL-7 변이체, 특히 SEQ ID No: 2 내지 15 중 어느 하나, 특히 SEQ ID NO: 5의 변이체에 연결된다)를 포함할 수 있다.
또 다른 매우 특정한 양태에서, 이기능성 분자는 SEQ ID NO: 77의 제2 단량체 및 Fc 사슬 SEQ ID NO: 75를 포함하는 제1 단량체(이는 N-말단 단부에서, 선택적으로 링커에 의해, (예를 들어 SEQ ID NO: 79의) 항원 결합 도메인에 연결되고, C-말단 단부에서, 선택적으로 링커에 의해, 본원에 개시된 임의의 IL-7m에 연결된다)를 포함할 수 있다.
또 다른 매우 특정한 양태에서, 이기능성 분자는 SEQ ID NO: 77의 제2 단량체 및 Fc 사슬 SEQ ID NO: 75를 포함하는 제1 단량체(이는 N-말단 단부에서, 선택적으로 링커에 의해, (예를 들어 SEQ ID NO: 79의) 항원 결합 도메인에 연결된다), 및 SEQ ID NO: 37, 38 또는 80, 바람직하게는 SEQ ID NO: 38 또는 80의 제3 단량체(이는 이의 말단 단부에서, 선택적으로 링커에 의해, 본원에 개시된 임의의 IL-7m에 연결된다)를 포함할 수 있다.
특히, IL-7m은 SEQ ID NO: 1 또는 이와 적어도 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99%의 동일성을 갖거나 야생형 단백질에 대해 부가, 결실, 치환 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 변형을 갖는 이의 변이체를 포함하거나 이로 본질적으로 이루어진다.
선택적으로, 이기능성 분자는 SEQ ID NO: 77의 제2 단량체, SEQ ID NO: 82의 제1 단량체, 및 SEQ ID NO: 37 38 또는 80, 바람직하게는 SEQ ID NO: 38 또는 80의 제3 단량체를 포함할 수 있다.
매우 특정한 양태에서, 본 발명에 따른 이기능성 분자는 SEQ ID NO: 75의 제1 단량체, SEQ ID NO: 83의 제2 단량체, 및 SEQ ID NO: 80, 100 또는 101의 제3 단량체를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 이기능성 분자는 SEQ ID NO: 75의 제1 단량체, SEQ ID NO: 83의 제2 단량체, 및 SEQ ID NO: 80의 제3 단량체를 포함한다.
이기능성 분자의 제조 - 본 발명의 이기능성 분자를 코딩하는 핵산 분자, 이를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 숙주 세포
본 발명에 따른 이기능성 분자를, 특히 포유류 세포에 의해 생산하기 위해, 이기능성 분자를 코딩하는 핵산 서열 또는 핵산 서열군이 하나 이상의 발현 벡터에 서브클로닝된다. 이러한 벡터는 일반적으로 포유류 세포를 형질감염하기 위해 사용된다. 항체 서열을 포함하는 분자를 생산하기 위한 일반적인 기술은, 그 내용이 본원에 인용되어 포함된 문헌[Coligan et al. (eds.), Current protocols in immunology, at pp. 10.19.1-10.19.11 (Wiley Interscience 1992)], 및 문헌["Antibody engineering: a practical guide" from W. H. Freeman and Company (1992)]에 기술되어 있으며, 이에는 분자 생산과 관련된 주석이 각 텍스트 전체에 분산되어 있다.
일반적으로, 이러한 방법은 하기 단계를 포함한다:
(1) 본 발명의 재조합 이기능성 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터로 적절한 숙주 세포를 형질감염 또는 형질전환하는 단계;
(2) 숙주 세포를 적절한 배지에서 배양하는 단계; 및
(3) 선택적으로 배지 또는 숙주 세포로부터 이기능성 분자를 단리 또는 정제하는 단계.
본 발명은 또한 상기 개시된 이기능성 분자를 코딩하는 핵산, 본 발명의 핵산을 포함하는 벡터, 바람직하게는 발현 벡터, 본 발명의 벡터로 형질전환되었거나 재조합 이기능성 분자를 코딩하는 서열로 직접적으로 형질전환된 유전적으로 조작된 숙주 세포, 및 재조합 기술에 의해 본 발명의 이기능성 분자를 생산하는 방법에 관한 것이다.
핵산, 벡터 및 숙주 세포가 보다 특히 후술되어 있다.
핵산 서열
본 발명은 또한 상기 정의된 이기능성 분자를 코딩하는 핵산 분자 또는 상기 정의된 이기능성 분자를 코딩하는 핵산 분자 군에 관한 것이다. 본원에 개시된 이기능성 분자를 코딩하는 핵산은 PCR과 같은 당업계에 공지된 임의의 기술에 의해 증폭될 수 있다. 이러한 핵산은 통상적인 절차를 사용하여 용이하게 단리되고 서열분석될 수 있다.
특히, 본원에 정의된 이기능성 분자를 코딩하는 핵산 분자는 하기를 포함한다:
- 선택적으로 펩티드 링커를 통해 제1 Fc 사슬에 공유적으로 연결된 항원-결합 도메인을 포함하는 제1 단량체를 코딩하는 제1 핵산 분자로서, 상기 제1 Fc 사슬은 선택적으로 펩티드 링커를 통해 IL7m에 공유적으로 연결된 것, 및
- 상보적인 제2 Fc 사슬을 포함하는 제2 단량체를 코딩하는 제2 핵산 분자,
- 항원-결합 도메인의 경쇄를 코딩하는 제3 핵산 분자.
또 다른 양태에서, 본원에 정의된 이기능성 분자를 코딩하는 핵산 분자는 하기를 포함한다:
- 선택적으로 펩티드 링커를 통해 제1 Fc 사슬에 공유적으로 연결된 항원-결합 도메인을 포함하는 제1 단량체를 코딩하는 제1 핵산 분자,
- 상보적인 제2 Fc 사슬을 포함하는 제2 단량체를 코딩하는 제2 핵산 분자, 및
- 항원-결합 도메인의 경쇄를 코딩하는 제3 핵산 분자로서, 상기 경쇄는 선택적으로 펩티드 링커를 통해 본 발명에 따른 IL7 변이체에 공유적으로 연결된 것.
일 실시형태에서, 핵산 분자는 단리된, 특히 비-천연 핵산 분자이다.
특히, 핵산은 SEQ ID NO: 2 내지 15에 제시된 아미노산 서열을 갖는 IL-7m을 코딩한다.
대안적인 양태에서, 본원에 정의된 이기능성 분자를 코딩하는 핵산 분자는 SEQ ID NO: 73에 제시된 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인 및/또는 SEQ ID NO: 74에 제시된 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
벡터
또 다른 양태에서, 본 발명은 상기 정의된 핵산 분자 또는 핵산 분자 군을 포함하는 벡터에 관한 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, "벡터"는 유전 물질을 세포 내로 전달하기 위한 비히클로서 사용되는 핵산 분자이다. "벡터"라는 용어는 플라스미드, 바이러스, 코스미드 및 인공 염색체를 포함한다. 일반적으로, 조작된 벡터는 복제 기점, 다중클로닝 부위 및 선택가능한 마커를 포함한다. 벡터 자체는 일반적으로 삽입(트랜스진)과 벡터의 "백본" 역할을 하는 더 큰 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열, 일반적으로 DNA 서열이다. 현대 벡터는 트랜스진 삽입물 및 백본 외에 추가 기능을 포함할 수 있다: 프로모터, 유전적 마커, 항생제 내성, 리포터 유전자, 표적화 서열, 단백질 정제 태그. 발현 벡터(발현 작제물)라고 하는 벡터는 구체적으로 표적 세포에서 트랜스진의 발현을 위한 것으로, 일반적으로 제어 서열을 갖는다.
이기능성 분자, 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 당업자에 의해 벡터로 클로닝된 다음, 숙주 세포로 형질전환될 수 있다. 이들 방법에는 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술, 생체 내 재조합 기술 등이 포함된다. 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 본원에 기재된 이기능성 분자, 변이체 및 전사/번역을 위한 적절한 조절 성분의 핵산 서열을 함유하는 발현 벡터를 작제할 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 이기능성 분자를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 하나의 바람직한 양태에서, 발현 벡터는 프로모터 및 분비 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열, 및 선택적으로 스크리닝을 위한 적어도 하나의 약물-내성 유전자를 추가로 포함한다. 발현 벡터는 번역을 개시하기 위한 리보솜-결합 부위, 전사 종결자 등을 추가로 포함할 수 있다.
적합한 발현 벡터는 전형적으로 (1) 박테리아 숙주에서 발현 벡터의 성장 및 선택을 제공하기 위해 박테리아 복제 기점 및 항생제 내성 마커를 코딩하는 원핵 DNA 요소; (2) 프로모터와 같은 전사 개시를 제어하는 진핵 DNA 요소; 및 (3) 전사 종결/폴리아데닐화 서열과 같은 전사물의 처리를 제어하는 DNA 요소를 함유한다.
발현 벡터는 인산칼슘 형질감염, 리포솜-매개 형질감염, 전기천공법 등을 비롯한 다양한 기술을 사용하여 숙주 세포에 도입될 수 있다. 바람직하게는, 형질감염된 세포가 선택되고 증식되며, 여기서 발현 벡터는 숙주 세포 게놈에 안정적으로 통합되어 안정한 형질전환체를 생성한다.
숙주 세포
또 다른 양태에서, 본 발명은, 예를 들어 이기능성 분자 생산 목적을 위한, 상기 정의된 바와 같은 벡터 또는 핵산 분자 또는 핵산 분자의 군을 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "숙주 세포"는 벡터, 외인성 핵산 분자, 및 본 발명에 따른 이기능성 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 수혜자일 수 있거나, 수혜자인, 임의의 개별 세포 또는 세포 배양물을 포함하는 것으로 의도된다. "숙주 세포"라는 용어는 또한 단일 세포의 자손 또는 잠재적 자손을 포함하는 것으로 의도된다. 적합한 숙주 세포는 원핵 또는 진핵 세포를 포함하며, 또한 박테리아, 효모 세포, 진균 세포, 식물 세포, 및 동물 세포, 예컨대 곤충 세포 및 포유동물 세포, 예를 들어 뮤린, 래트, 토끼, 마카크 또는 인간을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
적합한 숙주 세포는 특히 글리코실화와 같은 적절한 번역후 변형을 제공하는 진핵 숙주 세포이다. 바람직하게는, 이러한 적합한 진핵 숙주 세포는 진균류, 예컨대 피치아 파스토리스, 사카로마이세스 세레비지애, 쉬조사카로마이세스 폼베; 미팀나 세파라테(Mythimna separate)와 같은 곤충 세포; 담배와 같은 식물 세포, 및 BHK 세포, 293 세포, CHO 세포, NSO 세포 및 COS 세포와 같은 포유류 세포일 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 숙주 세포는 CHO 세포, COS 세포, NSO 세포 및 HEK 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
그런 다음 숙주 세포는 본 발명에 따른 이기능성 분자를 안정적으로 또는 일시적으로 발현한다. 이러한 발현 방법은 당업자에게 공지되어 있다.
이기능성 분자의 생산 방법이 또한 본원에 제공된다. 이러한 방법은 상기 제공된 바와 같은 이기능성 분자를 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 그의 발현에 적합한 조건 하에 배양하는 단계, 및 선택적으로 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 이기능성 분자를 회수하는 단계를 포함한다. 특히, 이기능성 분자의 재조합 생산을 위해, 예를 들어 상기 기재된 바와 같은 이기능성 분자를 코딩하는 핵산이 단리되고, 숙주 세포에서의 추가 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터에 삽입된다. 이기능성 분자는 이후 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 단리 및/또는 정제된다. 이러한 방법에는 통상적인 재생 처리, 단백질 침전제에 의한 처리(예컨대, 염 침전), 원심분리, 삼투에 의한 세포 용해, 초음파 처리, 과원심분리, 분자체 크로마토그래피 또는 겔 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, HPLC, 기타 액체 크로마토그래피 및 이들의 조합이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, Coligan에 의해 기술된 바와 같이, 이기능성 분자 단리 기술은 특히 단백질-A 세파로스를 사용한 친화성 크로마토그래피, 크기-배제 크로마토그래피 및 이온 교환 크로마토그래피를 포함할 수 있다. 단백질 A는 바람직하게는 본 발명의 이기능성 분자를 단리하기 위해 사용된다.
약학 조성물 및 이의 투여 방법
본 발명은 또한 바람직하게는 활성 성분 또는 화합물로서 본원에 기재된 이기능성 분자, 핵산 분자, 핵산 분자의 군, 상기 기재된 바와 같은 벡터 및/또는 숙주 세포를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 제형은 멸균될 수 있고, 원하는 경우 본 발명의 이기능성 분자, 본 발명의 핵산, 벡터 및/또는 숙주 세포와 유해하게 상호작용하지 않아, 임의의 바람직하지 않은 독성 효과를 부여하지 않는 보조제, 예컨대 약학적으로 허용되는 담체, 부형제, 염, 항산화제 및/또는 안정화제와 혼합될 수 있다. 선택적으로, 약학 조성물은 추가 치료제를 추가로 포함할 수 있다.
특히, 본 발명에 따른 약학 조성물은 국소, 장내, 경구, 비경구, 비강내, 정맥내, 근육내, 피하 또는 안내 투여 등을 포함하는 임의의 통상적인 투여 경로를 위해 제형화될 수 있다. 투여를 용이하게 하기 위해, 본원에 기재된 바와 같은 이기능성 분자는 생체 내 투여를 위한 약학 조성물로 제조될 수 있다. 이러한 조성물을 제조하는 수단은 당업계에 기술되어 있다(예를 들어, 문헌[Remington: Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins, 21st edition(2005)] 참조).
약학 조성물은 원하는 정도의 순도를 갖는 이기능성 분자를 동결건조된 제형 또는 수용액 형태의 선택적으로 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 항산화제 및/또는 안정화제와 혼합함으로써 제조될 수 있다. 이러한 적합한 담체, 부형제, 항산화제, 및/또는 안정화제는 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 기재되어 있다.
전달을 용이하게 하기 위해, 이기능성 분자 또는 이의 코딩 핵산 중 임의의 것이 샤페론 제제와 접합될 수 있다. 샤페론 제제는 단백질(예를 들어, 인간 혈청 알부민, 저밀도 지단백질 또는 글로불린), 탄수화물(예를 들어, 덱스트란, 풀루란, 키틴, 키토산, 이눌린, 사이클로덱스트린 또는 히알루론산), 또는 지질과 같은 자연 발생 물질일 수 있다. 이는 또한 합성 중합체, 예를 들어 합성 폴리펩티드와 같은 재조합 또는 합성 분자일 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 실질적으로 투여 즉시 또는 투여 후 임의의 예정된 시간 또는 기간에 활성 성분(예를 들어, 본 발명의 이기능성 분자)을 방출하도록 제형화될 수 있다. 일부 양태에서 약학 조성물은 조성물의 전달이 치료될 부위의 감작화 이전에 그리고 유발하기에 충분한 시간과 함께 일어나도록 시간-방출, 지연 방출 및 지속 방출 전달 시스템을 사용할 수 있다. 당업계에 공지된 수단을 사용하여 조성물이 표적 조직 또는 기관에 도달할 때까지 조성물의 방출 및 흡수를 방지하거나 최소화하거나, 조성물의 적시 방출을 보장할 수 있다. 이러한 시스템은 조성물의 반복 투여를 피할 수 있고, 이에 따라 대상체 및 의사에게 편의성을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 제형이 인간 혈액과 등장성일 수 있다는 것, 즉 본 발명의 제형이 인간 혈액과 본질적으로 동일한 삼투압을 갖는다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 이러한 등장성 제형은 일반적으로 약 250 mOSm 내지 약 350 mOSm의 삼투압을 갖는다. 등장성은 예를 들어 증기압 또는 빙결형 삼투압계에 의해 측정될 수 있다.
약학 조성물은 일반적으로 제조 및 보관 조건 하에서 멸균되고 안정해야 한다. 미생물의 존재 방지는 멸균 절차(예를 들어, 미세여과) 및/또는 다양한 항균제 및 항진균제의 포함에 의해 보장될 수 있다.
단일 투여 형태를 생성하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 치료되는 대상체 및 특정 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 단일 투여 형태를 생성하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로 치료 효과를 생성하는 조성물의 양일 것이다.
대상체, 요법 및 투여
본 발명은, 의약으로 사용하기 위한, 또는 질환의 치료에 사용하기 위한, 또는 대상체에서의 투여를 위한, 또는 의약으로 사용하기 위한 본원에 개시된 바와 같은 이기능성 분자, 이를 코딩하는 핵산 또는 벡터, 숙주 세포 또는 약학 조성물에 관한 것이다. 이는 또한 치료적 유효량의 약학 조성물 또는 이기능성 분자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체의 질환 또는 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다.
치료할 대상체는 인간, 특히 태아기의 인간, 신생아, 어린이, 유아, 청소년 또는 성인, 특히 바람직하게는 적어도 30세, 40세의 성인, 바람직하게는 적어도 50세의 성인, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 60세의 성인, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 70세의 성인일 수 있다.
특정 양태에서, 대상체는 면역억제되거나 면역저하될 수 있다.
의학 분야의 통상의 기술자에게 공지된 통상적인 방법을 사용하여 치료할 질환의 유형 또는 질환의 부위에 따라, 본원에 개시된 이기능성 분자 또는 약학 조성물이 예를 들어, 경구, 비경구, 장내, 흡입 스프레이, 국소, 직장, 비강, 협측, 질 또는 이식된 저장소를 통해 대상체에게 투여될 수 있다. 바람직하게는, 이기능성 분자 또는 약학 조성물은 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 동맥내, 활막내, 종양내, 흉골내, 경막내, 병변내, 및 두개내 주사 또는 주입 기술을 통해 투여된다.
본 발명에 따른 약학 조성물 또는 이기능성 분자의 약학 조성물의 형태, 투여 경로 및 투여량은 감염의 유형 및 중증도에 따라, 그리고 환자, 특히 연령, 체중, 체격, 성별 및/또는 일반적인 신체 상태에 따라 당업자에 의해 조정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 국소 또는 전신 치료가 바람직한지에 따라 다양한 방식으로 투여될 수 있다.
질환 치료에 있어서의 용도
본 발명의 이기능성 분자, 핵산, 벡터, 숙주 세포, 조성물 및 방법은 수많은 시험관 내 및 생체 내 유용성 및 용도를 갖는다. 특히, 본원에 제공된 이기능성 분자, 핵산 분자, 핵산 분자의 군, 벡터, 숙주 세포 또는 약학 조성물은 치료 방법 및/또는 치료 목적으로 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 대상체의 장애 및/또는 질환의 치료에 사용하기 위한, 및/또는 의약 또는 백신으로 사용하기 위한, 이기능성 분자, 이를 코딩하는 핵산 또는 벡터, 또는 이를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 이는 또한 대상체의 질환 및/또는 장애를 치료하기 위한, 본원에 기재된 바와 같은 이기능성 분자; 이를 코딩하는 핵산 또는 벡터, 이를 포함하는 약학 조성물의 용도에 관한 것이다. 마지막으로, 본 발명은 치료적 유효량의 약학 조성물 또는 이기능성 분자, 이를 코딩하는 핵산 또는 벡터를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 대상체에게 상기 정의된 바와 같은 이기능성 분자 또는 약학 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 암, 감염성 질환 및 만성 바이러스 감염으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환 및/또는 장애의 치료 방법에 관한 것이다. 이러한 질환의 예는 이하에서 보다 구체적으로 설명된다.
일 양태에서, 치료 방법은 (a) 치료가 필요한 환자를 식별하는 단계; 및 (b) 본원에 기재된 치료적 유효량의 이기능성 분자, 핵산, 벡터 또는 약학 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
치료를 필요로 하는 대상체는 질환에 걸리거나, 질환에 걸릴 위험이 있거나, 질환이 의심되는 인간일 수 있다. 이러한 환자는 일상적인 건강 검진으로 식별할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본원에 개시된 이기능성 분자는 면역을 향상시키기 위해, 바람직하게는 장애 및/또는 질환을 치료하기 위해, 예를 들어 생체 내에서 대상체에게 투여될 수 있다. 따라서, 한 양태에서, 본 발명은 대상체에서 면역 반응이 변형되도록 본 발명의 이기능성 분자, 핵산, 벡터 또는 약학 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 변형시키는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 면역 반응이 강화, 증가, 자극 또는 상향 조절된다. 이기능성 분자 또는 약학 조성물은 치료를 필요로 하는 대상체에서 T 세포 활성화와 같은 면역 반응을 향상시키기 위해 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 이기능성 분자 또는 약학 조성물을 사용하여 T 세포 고갈을 감소시키거나 고갈된 T 세포를 재활성화할 수 있다.
본 발명은 특히 대상체에게 치료적 유효량의 임의의 이기능성 분자, 핵산, 벡터 또는 본원에 기재된 것을 포함하는 약학 조성물을 투여하여, 대상체에서 면역 반응을 향상시키는 단계를 포함하는, 대상체의 면역반응을 향상시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 이기능성 분자 또는 약학 조성물을 사용하여 T 세포 고갈을 감소시키거나 고갈된 T 세포를 재활성화할 수 있다.
본 발명에 따른 IL-7 변이체를 포함하는 이기능성 분자는 CD127+ 면역 세포, 특히 CD127+ T 세포를 표적으로 한다. 이러한 세포는 다음과 같은 특별한 관심 영역에서 발견될 수 있다: 림프절의 상주 림프구 세포(주로 피질 주위, 여포에 가끔 세포가 있음), 편도선(여포 간 영역), 비장(주로 백색 펄프의 동맥주위 림프초(PALS) 내에 있고 적색 펄프에 일부 흩어져 있는 세포), 흉선(주로 수질에; 또한 피질에도 있음), 골수(산란 분포), 소화관(위, 십이지장, 공장, 회장, 맹장, 직장) 전체의 GALT(장내 림프조직, 주로 간-소낭 부위 및 고유판), 담낭의 MALT(점막-연관-림프-조직(Mucosa-Associated-Lymphoid-Tissue)). 따라서, 본 발명의 이기능성 분자는 이러한 영역에 위치하거나 관련된 질환, 특히 암을 치료하는 데 특히 중요하다.
특정 양태에서, 이기능성 분자는 IL-7 변이체, 특히 W142H, 및 PD-1에 결합하여 이를 길항하는 항원 결합 도메인을 포함한다.
이러한 이기능성 분자 및 이를 포함하는 약학 조성물은 환자, 특히 암이 있는 환자에서, 종양 침윤 림프구(TIL) 증가, 아폽토시스로부터 T 림프구 보호, T 기억 반응 유도/향상, T-reg 억제 및/또는 Treg 억제 활성 제거, 완전히 고갈된 T 세포, 특히 고갈된 종양 침윤 림프구의 증식 회복 및/또는 유지를 위해 사용될 수 있다.
이러한 이기능성 분자 및 이를 포함하는 약학 조성물은 환자, 특히 암이 있는 환자에서 종양 침윤 림프구(TIL) 증가, 아폽토시스로부터 T 림프구 보호, T 기억 반응 유도/향상, T-reg 억제 및/또는 Treg 억제 활성 제거, 완전히 고갈된 T 세포, 특히 고갈된 종양 침윤 림프구의 증식 회복 및/또는 유지를 위한 약제의 제조에서 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 환자, 특히 암이 있는 환자에서, 종양 침윤 림프구(TIL) 증가, 세포 사멸로부터 T 림프구 보호, T 기억 반응 유도/향상, T-reg 억제 및/또는 Treg 억제 활성 제거, 완전히 고갈된 T 세포, 특히 고갈된 종양 침윤 림프구의 증식 회복 및/또는 유지 방법에 관한 것으로서, 이는 IL-7 변이체, 특히 W142H 및 PD-1에 결합하여 이를 길항하는 항원 결합 도메인을 포함하는 이기능성 분자, 특히 본원에 개시된 이러한 임의의 이러한 특정한 분자의 치료 유효량을 상기 환자에 투여하는 단계를 포함한다.
암
또 다른 양태에서, 본 발명은 예를 들어 대상체내 종양 세포의 성장을 억제하기 위한 암 치료용 의약의 제조에서 본원에 개시된 바와 같은 이기능성 분자 또는 약학 조성물의 용도를 제공한다.
본원에 사용된 용어 "암"은 비정상적인 세포의 빠르고 제어되지 않는 성장을 특징으로 하는 질환으로 정의된다. 암세포는 국소적으로 또는 혈류와 림프계를 통해 신체의 다른 부분으로 퍼질 수 있다.
따라서, 한 양태에서, 본 발명은 대상체에게 치료적 유효량의 본 발명에 따른 이기능성 분자 또는 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 예를 들어 종양 세포의 성장을 억제하기 위한, 암을 치료하는 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 암 세포의 성장이 억제되도록 이기능성 분자를 사용하는, 대상체의 치료에 관한 것이다.
본 개시내용의 이러한 양태에서, 치료될 암은 고갈된 T 세포와 연관된다.
본원에 제공된 임의의 적합한 암은 조혈암 또는 고형암일 수 있다. 이러한 암에는 암종, 자궁경부암, 결장직장암, 식도암, 위장암, 위장관암, 두경부암, 신장암, 간암, 폐암, 림프종, 신경교종, 중피종, 흑색종, 위암, 요도암 환경 유발 암 및 상기 암의 임의의 조합이 포함된다. 추가로, 본 발명은 난치성 또는 재발성 악성종양을 포함한다. 바람직하게는, 치료 또는 예방될 암은 전이성 또는 비전이성, 흑색종, 악성 중피종, 비-소세포 폐암, 신장 세포 암종, 호지킨 림프종, 두경부암, 요로상피암종, 결장직장암, 간세포 암종, 소세포 폐암 전이성 메르켈 세포 암종, 위장암 또는 위식도암 및 자궁경부암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 양태에서, 암은 혈액 악성종양 또는 고형 종양이다. 이러한 암은 혈림프성 신생물, 혈관면역모세포성 T 세포 림프종, 골수이형성 증후군, 급성 골수성 백혈병으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
특정 양태에서, 암은 바이러스에 의해 유도되거나 면역결핍과 관련된 암이다. 이러한 암은 카포시 육종(예를 들어, 카포시 육종 헤르페스 바이러스와 관련됨); 자궁경부암, 항문암, 음경암 및 외음부 편평세포암 및 구강인두암(예를 들어, 인유두종 바이러스와 관련됨); 미만성 거대 B-세포 림프종, 버킷 림프종, 형질모세포 림프종, 원발성 중추신경계 림프종, HHV-8 원발성 삼출 림프종, 고전적 호지킨(Hodgkin) 림프종 및 림프증식성 장애를 포함한 B 세포 비호지킨 림프종(NHL)(예를 들어, 엡스타인-바 바이러스(EBV) 및/또는 카포시 육종 헤르페스 바이러스와 관련됨); 간세포 암종(예를 들어, B형 및/또는 C형 간염 바이러스와 관련됨); 메르켈 세포 암종(예를 들어, 메르켈 세포 폴리오마 바이러스(MPV)와 관련됨); 및 인간 면역결핍 바이러스 감염(HIV) 감염과 관련된 암으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
치료를 위한 바람직한 암은 면역요법에 전형적으로 반응성인 암을 포함한다. 대안적으로, 치료를 위한 바람직한 암은 면역요법에 비반응성인 암이다.
감염성 질환
본 발명의 이기능성 분자, 핵산, 핵산 군, 벡터, 숙주 세포 또는 약학 조성물은 특정 독소 또는 병원체에 노출된 환자를 치료하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 한 양태는 본 발명에 따른 이기능성 분자, 또는 이를 포함하는 약학 조성물을, 바람직하게는 대상체가 감염성 질환에 대해 치료되도록 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 감염성 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
임의의 적합한 감염은 본원에 제공된 바와 같은 이기능성 분자, 핵산, 핵산 군, 벡터, 숙주 세포 또는 약학 조성물로 치료될 수 있다.
본 발명의 방법으로 치료할 수 있는 감염을 유발하는 병원성 바이러스의 일부 예는 HIV, 간염(A, B, 또는 C), 헤르페스 바이러스(예를 들어, VZV, HSV-1, HAV-6, HSV-II, 및 CMV, 엡스타인 바 바이러스), 아데노바이러스, 인플루엔자 바이러스, 플라비바이러스, 에코바이러스, 리노바이러스, 콕사키 바이러스, 코로나바이러스, 호흡기 융합 바이러스, 멈프스 바이러스, 로타바이러스, 홍역 바이러스, 풍진 바이러스, 파보바이러스, 백시니아 바이러스, HTLV 바이러스, 뎅기열 바이러스, 유두종바이러스, 몰루스컴 바이러스, 폴리오바이러스, 광견병 바이러스, JC 바이러스 및 아르보바이러스 뇌염 바이러스를 포함한다.
본 발명의 방법으로 치료할 수 있는 감염을 유발하는 병원성 박테리아의 일부 예에는 클라미디아, 리케차 박테리아, 마이코박테리아, 스타필로코커스, 스트렙토코커스, 폐렴구균, 수막구균 및 구균, 클렙시엘라, 프로테우스, 세라티아, 슈도모나스, 레지오넬라, 디프테리아, 살모넬라, 바실러스, 콜레라, 테타누스, 보툴리누스 중독, 탄저병, 전염병, 렙토스피라증 및 라임스병 박테리아가 포함된다.
본 발명의 방법으로 치료할 수 있는 감염을 유발하는 병원성 진균의 일부 예는 칸디다(알비칸스, 크루세이, 글라브라타, 트로피컬리스 등), 크립토코커스 네오포르만스, 아스페르길루스(후미가투스, 니제르 등), 무코랄레스 속(무코르, 압시디아, 리조푸스), 스포로트릭스 첸키아이(Sporothrix schenkii), 블라스토마이세스 더마티티디스(Blastomyces dermatitidis), 파라코키디오이데스 브라실리엔시스(Paracoccidioides brasiliensis), 코키디오이데스 이미티스(Coccidioides immitis) 및 히스토플라스마 캅슐라툼(Histoplasma capsulatum)을 포함한다.
본 발명의 방법으로 치료할 수 있는 감염을 유발하는 병원성 기생충의 일부 예에는 엔타메바 히스톨리티카, 발란티디움 콜라이, 네글레리아파울러리, 아칸타메바 종, 지아르디아 람비아, 크립토스포리디움 종, 뉴모시스티스 카리니, 플라스모디움 비박스, 바베시아 마이크로티, 트리파노소마 브루시, 트리파노소마 크루시, 레이쉬마니아 도노바니, 톡소플라스마 곤디, 및 니포스트롱길루스 브라실리엔시스가 포함된다.
병용 요법
본 발명에 따른 이기능성 분자는 임상 개발 중이거나 이미 시판 중인 제제를 사용하여 면역 회피 기전을 극복하기 위한 일부 다른 잠재적인 전략과 병용될 수 있다(문헌[Antonia et al. Immuno-oncology combinations: a review of clinical experience and future prospects. Clin. Cancer Res. Off. J. Am. Assoc. Cancer Res. 20, 6258-6268, 2014]의 표 1 참조). 본 발명에 따른 이기능성 분자와의 이러한 병용은 특히 다음과 같은 경우에 유용할 수 있다:
1- 적응 면역 억제 역전(T-세포 체크포인트 경로 차단);
2- 적응 면역 켜기(작용제 분자, 특히 항체를 사용하여 T-세포 공동자극 수용체 신호전달 촉진),
3- 선천성 면역 세포의 기능 개선;
4- 예를 들어 백신-기반 전략을 통한 면역 체계 활성화(면역-세포 이펙터 기능 강화).
따라서, 질환 또는 장애의 치료를 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 임의의 이기능성 분자 또는 이를 포함하는 약학 조성물과 적합한 제2 작용제와의 병용 요법이 또한 본원에 제공된다. 이러한 양태에서, 이기능성 분자 및 제2 작용제는 상기 기재된 바와 같은 고유한 약학 조성물에 존재할 수 있다. 대안적으로, 본원에 사용된 용어 "병용 요법" 또는 "병용된 요법"은 이들 2가지 작용제(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 이기능성 분자 및 추가 또는 제2의 적합한 치료제)를 순차적 방식으로 투여하는 것을 포괄하며, 즉, 여기서 각각의 치료제는 상이한 시간에 투여될 뿐만 아니라 이들 치료제 또는 적어도 2개의 작용제를 실질적으로 동시적인 방식으로 투여한다. 각 작용제의 순차적 또는 실질적 동시 투여는 적절한 경로에 의해 영향을 받을 수 있다. 작용제는 동일한 경로 또는 다른 경로로 투여될 수 있다. 예를 들어, 제1 작용제(예를 들어, 이기능성 분자)는 경구로 투여될 수 있고, 추가 치료제(예를 들어, 항암제, 항감염제, 또는 면역 조절제)는 정맥내로 투여될 수 있다. 대안적으로, 선택된 병용의 작용제는 정맥내 주사에 의해 투여될 수 있는 반면, 병용의 다른 작용제는 경구 투여될 수 있다.
이러한 양태에서, 추가의 치료제는 알킬화제, 혈관신생 억제제, 항체, 항대사물질, 항유사분열제, 항증식제, 항바이러스제, 오로라 키나제 억제제, 세포자멸 촉진제(예를 들어, Bcl-2 계열 억제제), 사멸 수용체 경로 활성화제, Bcr-Abl 키나제 억제제, BiTE(Bi-특이적 T 세포 연결체) 항체, 항체 약물 접합체, 생물학적 반응 조절제, 브루톤 티로신 키나제(BTK) 억제제, 사이클린-의존성 키나제 억제제, 세포 주기 억제제, 사이클로옥시게나제-2 억제제, 백혈병 바이러스 종양유전자 동족체(ErbB2) 수용체 억제제, 성장 인자 억제제, 열 충격 단백질(HSP)-90 억제제, 히스톤 데아세틸라제(HDAC) 억제제, 호르몬 요법, 면역제, 세포자멸사 단백질 억제제(IAP) 억제제, 삽입 항생제, 키나제 억제제, 키네신 억제제, Jak2 억제제, 라파마이신 억제제의 포유동물 표적, 마이크로RNA, 미토겐-활성화 세포외 신호-조절 키나제 억제제, 다가 결합 단백질, 비스테로이드성 항염증제(NSAID), 폴리ADP(아데노신 이인산)-리보스 폴리머라제(PARP) 억제제, 백금 화학요법, 폴로-유사 키나제(Plk) 억제제, 포스포이노시티드-3 키나제(PI3K) 억제제, 프로테아좀 억제제, 퓨린 유사체, 피리미딘 유사체, 수용체 티로신 키나제 억제제, 레티노이드/델토이드 식물 알칼로이드, 작은 억제 리보핵산(siRNA), 토포이소머라제 억제제, 유비퀴틴 리가제 억제제, 저메틸화제, 체크포인트 억제제, 펩티드 백신 등, 종양 항원으로부터의 에피토프 또는 네오에피토프, 뿐만 아니라 이들 작용제 중 하나 이상의 조합을 포함하는 비제한적 목록에서 선택될 수 있다.
예를 들어, 추가 치료제는 화학요법, 방사선 요법, 표적화요법, 항혈관형성제, 저메틸화제, 암 백신, 종양 항원의 에피토프 또는 네오에피토프, 골수 체크포인트 억제제, 기타 면역요법제, 및 HDAC 억제제로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
실시형태에서, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 병용 요법에 관한 것으로서, 여기서 제2 치료제는 특히 치료 백신, 면역 체크포인트 차단제 또는 활성화제로 이루어진 군, 특히 적응 면역 세포(T 및 B 림프구) 및 항체-약물 접합체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 임의의 이기능성 분자 또는 본 발명에 따른 약학 조성물과 함께 공동 사용하기에 적합한 작용제는 공동-자극 수용체(예를 들어, OX40, CD40, ICOS, CD27, HVEM 또는 GITR)에 결합하는 항체, 면역 세포 사멸을 유도하는 작용제(예를 들어, 화학치료제, 방사선치료제, 항신생혈관제, 또는 표적화된 요법의 작용제), 체크포인트 분자(예를 들어, CTLA4, LAG3, TIM3, B7H3, B7H4, BTLA, 또는 TIGIT)를 억제하는 작용제, 암 백신, 면역억제 효소(예를 들어, IDO1 또는 iNOS)를 변형하는 작용제, Treg 세포를 표적화하는 작용제, 적응 세포 요법용 작용제, 또는 골수 세포를 조절하는 작용제를 포함한다.
실시형태에서, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 병용 요법에 관한 것으로서, 여기서 제2 치료제는 항-CTLA4, 항-CD2, 항-CD28, 항-CD40, 항-HVEM, 항-BTLA, 항-CD160, 항-TIGIT, 항-TIM-1/3, 항-LAG-3, 항-2B4, 및 항-OX40, 항-CD40 작용제, CD40-L, TLR 작용제, 항-ICOS, ICOS-L 및 B-세포 수용체 작용제로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역 체크포인트 차단제 또는 적응 면역 세포(T 및 B 림프구)의 활성화제이다.
본 발명은 또한 치료 유효량의 본원에 기술된 이기능성 분자 또는 약학 조성물 및 치료 유효량의 추가의 또는 제2 치료제를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.
추가 또는 제2 치료제의 구체적인 예가 국제특허공개 WO 2018/053106호의 36 내지 43페이지에 제공되어 있다.
바람직한 실시형태에서, 제2 치료제는 화학요법제, 방사선 요법제, 면역요법제, 세포요법제(예를 들어 CAR-T 세포), 항생제 및 프로바이오틱스로 이루어진 군으로부터 선택된다.
병용 요법은 또한 이기능성 분자의 투여와 수술의 병용에 의존할 수 있다.
특히, 본 발명에 따른 이기능성 분자는 면역 세포 표면 상에 특이적으로 발현된 표적에 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 도메인 및 적어도 하나의 면역-자극 사이토카인을 포함하는 제2 이기능성 분자의 병용에서 사용하기 위한 것이다.
보다 특히, 이러한 제2 이기능성 분자에서, 면역-자극 사이토카인은 IL2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-12A, IL-12B, IL-13; IL-15, IL-18, IL-21, IL-23, IL-24; IFNα, IFNβ, BAFF, LTα, 및 LTβ, 또는 이들의 변이체를 포함하는 군으로부터 선택된다. 바람직한 실시형태에서, 면역-자극 사이토카인은 IL2, 또는 이의 변이체이다.
보다 특히, 이러한 제2 이기능성 분자에서, 면역 세포 표면 상에서 특이적으로 발현되는 표적은 PD-1, CD28, CTLA-4, BTLA, TIGIT, CD160, CD40L, ICOS, CD27, OX40, 4-1BB, GITR, HVEM, Tim-1, LFA-1, TIM3, CD39, CD30, NKG2D, LAG3, B7-1, 2B4, DR3, CD101, CD44, SIRPG, CD28H, CD38, CD3, PDL2, 및 PDL1로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직하게는, PD-1에 대한 단일 항원 결합 도메인 및 단일 IL-7 변이체를 포함하는 본 발명에 따른 이기능성 분자는 i) PD-1에 대한 항원 결합 도메인 및 ii) IL-2, 또는 IL-2 돌연변이체를 포함하는 이기능성 분자와 병용하여 사용하기 위한 것이다.
본 발명의 이기능성 분자 및 제2 이기능성 분자는 동시에 또는 순차적으로 투여된다. 순차적인 투여의 예에서, 본 발명의 이기능성 분자는 제2 이기능성 분자의 투여 전에 투여된다. 또 다른 예에서, 본 발명의 이기능성 분자는 제2 이기능성 분자의 투여 후에 투여된다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명은 면역 세포 표면 상에서 특이적으로 발현되는 표적에 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 도메인 및 적어도 하나의 IL2를 포함하는 제2 이기능성 분자와 병용하여 사용하기 위한 이기능성 분자, 핵산, 숙주 세포 또는 약학 조성물에 관한 것으로서, 여기서 본 발명의 이기능성 분자는 제2 이기능성 분자의 투여 후에 투여된다.
키트
본원에 기재된 임의의 이기능성 분자 또는 조성물은 본 발명에 의해 제공되는 키트에 포함될 수 있다. 본 개시내용은 특히 면역 반응을 향상시키고/시키거나 질환 또는 장애(예를 들어, 암 및/또는 감염)를 치료하는데 사용하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명의 맥락에서, "키트"라는 용어는 용기, 수용기 또는 다른 방식으로 포장된 2개 이상의 구성요소들(이 중 하나는 본 발명의 이기능성 분자, 핵산 분자, 벡터 또는 세포에 상응함)을 의미한다. 따라서, 키트는 단일 단위로 판매될 수 있는, 특정 목표를 달성하기에 충분한 제품 및/또는 기구 세트로 설명될 수 있다. 본 발명의 키트는 적합한 포장으로 되어 있다.
특히, 본 발명에 따른 키트는 하기를 포함할 수 있다:
- 상기 정의된 바와 같은 이기능성 분자,
- 상기 이기능성 분자를 코딩하는 핵산 분자 또는 핵산 분자 군,
- 상기 핵산 분자 또는 핵산 분자 군을 포함하는 벡터, 및/또는
- 상기 벡터 또는 핵산 분자 또는 핵산 분자 군을 포함하는 세포.
따라서, 키트는 적합한 용기 수단에 본 발명의 약학 조성물, 융합 단백질 또는 이기능성 분자, 및/또는 숙주 세포, 및/또는 본 발명의 핵산 분자를 코딩하는 벡터, 및/또는 본 발명의 핵산 분자 또는 관련 시약을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서 개체로부터 샘플을 채취하고/하거나 샘플을 분석하는 수단이 제공될 수 있다. 본 발명에 따른 키트에 포함된 조성물은 특히 주사기 상용성 조성물로 제형화될 수 있다.
일부 실시형태에서, 키트는 암 또는 감염성 질환을 치료하기 위한 추가 작용제를 추가로 포함하고, 추가 작용제는 본 발명의 약학 조성물, 융합 단백질 또는 이기능성 분자, 및/또는 숙주 세포, 및/또는 본 발명의 핵산 분자를 코딩하는 벡터, 및/또는 본 발명의 핵산 분자, 또는 본 발명의 키트의 다른 성분과 조합될 수 있거나, 키트에 별도로 제공될 수 있다. 특히, 본원에 기재된 키트는 상기 기재된 "병용 요법"에 기재된 것과 같은 하나 이상의 추가 치료제를 포함할 수 있다. 키트는 개체에 대한 특정 암에 맞춰질 수 있고, 상기 기재된 바와 같이 개체에 대한 각각의 2차 암 치료법을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 이기능성 분자 또는 약학 조성물의 사용과 관련된 지침은 일반적으로 투여량, 투여 일정, 의도된 치료를 위한 투여 경로, 이기능성 분자를 재구성하기 위한 수단 및/또는 본 발명의 이기능성 분자를 희석하기 위한 수단에 관한 정보를 포함한다. 본 발명의 키트에 제공된 지침은 전형적으로 라벨 또는 패키지 삽입물(예를 들어, 전단지 또는 지침 매뉴얼의 형태로 키트에 포함된 종이 시트)에 기재된 지침이다.
실시예
IL-7 돌연변이체의 획득은 특히 본원에 인용되어 포함된 국제특허공개 WO 2020/12377호에 기술되어 있다.
실시예 1. 1개의 IL-7 W142H 사이토카인 및 1개 또는 2개의 항 PD-1 아암(arm)이 있는 항 PD-1 IL-7 분자는 PD-1+ IL-7R+ 세포로 시스 활성을 촉진하고 생체 내 에서 IL-7RT T 세포 증식을 자극하는 높은 효능과 TCR 신호전달을 재활성화하는 상승적 능력을 입증하였다.
본 발명자들은 도 1에 기재된 바와 같이 1개 또는 2개의 항 PD-1 결합 도메인 및 1개 또는 2개의 IL7 W142H 돌연변이를 포함하는 이기능성 분자의 다중 구조의 생물학적 활성을 설계하고 비교하였다.
작제물 1은 2개의 항 PD-1 항원 결합 도메인 및 2개의 IL-7 W142H 변이체를 포함한다(작제물 1은 또한 항 PD-1*2 IL-7 W142H*2로도 지칭됨). 이러한 분자는 또한 BICKI-IL-7 W142H로도 지칭된다. 이러한 예에서, BICKI-IL-7 WT로 지칭되는 대조군 분자는 작제물 1에 해당하지만 야생형 IL-7을 포함한다.
작제물 2는 2개의 항 PD-1 항원 결합 도메인 및 단일 IL-7 W142H 변이체를 포함한다(작제물 2는 항 PD-1*2 IL-7 W142H*1로도 지칭됨).
작제물 3은 단일 항 PD-1 항원 결합 도메인 및 단일 IL-7 W142H 변이체를 포함한다(작제물 3은 또한 항 PD-1*1 IL-7 W142H*1로도 지칭됨). 항-PD-1*1로 지칭되는 대조군 작제물은 IL-7 변이체가 없는 것을 제외하고 작제물 3과 유사하다.
작제물 4는 단일 항 PD-1 항원 결합 도메인 및 2개의 IL-7 W142H 변이체를 포함한다(작제물 4는 항 PD-1*1 IL- W142H*2로도 지칭됨).
작제물 2, 3 및 4를 IgG1 N298A 이소형로 조작하고 Fc 부분에서 아미노산 서열을 돌연변이시켜 중쇄 A의 CH2 및 CH3 상에 노브를 생성하고 중쇄 B의 CH2 및 CH3 상에 홀을 생성하였다.
모든 항 PD-1 IL7 작제물은 ELISA 분석에 의해 입증되는 바와 같이 PD-1 수용체에 대한 높은 친화도를 갖는다(도 2a 및 표 1). 2개의 항 PD-1 아암(항-PD-1*2)을 가진 항 PD-1 IL-7 분자는 IL-7이 없는 항 PD-1*2에 비해 동일한 결합 효능(동일한 EC50)을 갖는다. 유사하게, 1개의 항 PD-1 아암(항 PD-1*1 IL7 W142H*1 및 항 PD-1*1 IL7 W142H*2)을 가진 항 PD-1 IL-7 분자는 IL-7이 없는 항 PD-1*1에 비해 동일한 결합 효능을 입증하였으며, 항 PD-1 IL7의 경우 0.086 및 0.111 nM과 동일한 EC50 대 항 PD-1의 경우 0.238 nM을 가졌다. 이러한 데이터는 IL-7의 융합이 시험된 작제물과 관계 없이 PD-1 결합을 방해하지 않음을 보여준다.
더욱이, PD-L1/PD-1 길항제 생물검정(도 2b)은 1개 또는 2개의 항 PD-1 아암을 갖는 항 PD-1 IL7 분자가 PD-1 수용체에 대한 PD-L1의 결합을 차단하는 고효율을 나타낸다는 것을 입증한다. 작제물 3 및 4에서 항 PD-1의 한 아암이 제거되었지만, 모든 항 PD-1*1 IL7 작제물은 높은 길항제 특성을 나타낸다. 항 PD-1*2 IL7 작제물과 비교하여 단지 2.5배 감소된 활성이 작제물 3 및 4에 대한 EC50(표 2)으로 계산되었다.
다음으로 본 발명자들은 Biacore 분석 및 ELSA 분석을 사용하여 CD127 수용체에 대한 상이한 작제물의 친화도를 평가하였다. 하나의 IL-7 분자가 작제물 2 및 3에서 제거되었기 때문에, CD127 수용체에 대한 더 낮은 결합 능력 및 더 낮은 pSTAT5 활성화가 IL-7 이종이량체 작제물와 비교하여 이들 분자에 대해 예상되었다. 그러나, 본 발명자들은 항 PD-1*2 IL-7 W142H*1 분자가 항 PD-1*2 IL-7 W142H*2(BICKI-IL-7 W142H)에 비해 CD127 수용체에 유사한 친화도를 갖고 예상한 바와 같이 IL-7 야생형 형태를 포함하는 항 PD-1 IL7 이기능성 분자와 비교하여 더 낮은 친화도를 가짐을 관찰하였다(표 3). 놀랍게도, 항 PD-1*2 IL7 W142H *1 및 항 PD-1*1 IL7 W142H *1 분자는 IL-7 야생형 형태를 포함하는 PD-1 IL7 이기능성 분자와 유사한 높은 pSTAT5 활성을 나타냈다(도 3). 이러한 관찰에 기초하여, W142H IL-7 돌연변이와 결합된 IL-7의 단량체 형태는 IL-7 분자의 최적 형태가 인간 T 세포로의 IL-7 신호전달을 촉진하도록 허용하는 것으로 보인다. IL7이 하나만 있더라도, W142H IL-7 돌연변이가 있는 분자는 2개의 사이토카인이 있는 IL7 wt가 있는 분자만큼 우수한 활성화 효과(pSTAT5)를 나타낸다. 이 결과는 야생형 IL-7보다 수용체에 대한 친화도가 더 낮은 IL-7 변이체와 관련하여 놀라운 것이다.
하나의 IL-7 W142H 돌연변이체에 융합된 하나의 항 PD-1 아암으로 작제된 항 PD-1 IL7 분자로 유사한 결론이 도출되었다. 항 PD-1*2 IL-7WT*2, the 항 PD-1*2 IL-7 W142H*1 및 항 PD-1*1 IL-7 W142H*1 작제물에서 유사하고 비슷한 높은 pSTAT5 활성이 얻어졌다(도 3c)
CD127을 센서 칩에 고정화하고 항 PD-1 IL-7 이기능성 분자를 점증하는 투여량으로 첨가하여 친화도를 측정하였다.
상이한 항 PD-1 IL-7 작제물의 효능을 결정하기 위해 생체 내 실험을 수행하였다. 항 PD-1 IL-7 분자의 1회 용량을 동등한 몰 농도(34 nM/kg)로 마우스에 주사했다. 처리 후 4일째에, CD4 및 CD8 T 세포 증식을 Ki67 마커를 사용하여 유동 세포측정법으로 정량화하였다. 도 4는 단일 W142H 돌연변이체(항 PD-1*2 IL-7 W142H*1 및 항 PD-1*1 IL-7 W142H *1) 단일 PD-1 원자가 및 2개의 IL7 W142H 사이토카인(항 PD-1*1IL7W142H*2)을 갖는 PD-1 IL7 분자가 CD8 촉진에 대한 높은 효능 및 더 적은 정도의 CD4 T 세포 증식을 나타냄을 보여준다.
항-PD1 항체(1개 또는 2개의 원자가) 및 1개 또는 2개의 IL7 돌연변이체 사이토카인을 포함하는 이기능성 분자가 TCR 매개 신호전달을 재활성화하는 능력을 결정하기 위해 NFAT 생물검정을 수행했다. 도 5a는 2개의 항 PD-1 아암과 1개의 IL-7 사이토카인으로 작제된 이기능성 분자가 항 PD-1 항체 단독에 비해 NFAT의 활성화를 향상시킴을 보여주며, 이는 TCR 매개 신호전달을 강화하는 약물의 상승적 활성이 단 하나의 IL-7 사이토카인으로 작제된 항 PD-1 IL-7 이기능성 분자로 보존됨을 입증한다. 도 9a에서 볼 수 있는 바와 같이, 항-PD1과 IL7의 조합으로 세포를 처리한 경우에는 그러한 상승작용이 없었다.
또한, 본 발명자들은 다음으로 단 하나의 항 PD-1 원자가(항 PD-1*1)로 설계된 항 PD-1 IL-7 분자의 활성을 평가하였으며 항 PD-1*1 IL-7 W142H 작제물(항 PD-1*1 IL7 W142H *1 및 *2)이 이의 상승적 활성을 보유하는 반면, PD-1*1 + 이소형 IL-7 W142H*2 병용 처리는 TCR 신호전달(NFAT 활성화) 자극에서 더 낮은 효율을 나타냄을 입증하였다(도 5b).
마지막으로, 상이한 항 PD-1 IL-7 작제물의 특이적 시스-표적화 및 시스-활성을 공동-배양 검정에서 분석하였다. U937 PD-1+ CD127+ 세포를 PD-1-CD127+ 세포와 혼합(비율 1:1)한 다음, 증량하는 용량에서 상이한 작제물과 함께 인큐베이션하였다. 결합 및 IL-7R 신호전달(pSTAT5)을 유동 세포측정법으로 정량화했다. 결합 및 pSTAT5 활성화의 EC50(nM)을 각각의 작제물 및 각각의 PD-1 + 및 PD-1- 세포 집단에 대해 결정하였다(도 6a 및 b). 본 발명자들은 다양한 항 PD-1 IL-7 돌연변이된 분자(항 PD-1*2 IL7 W142H*1, 항 PD-1*1 IL7 W142H*1 항 PD-1*1 IL7 W142H*2)가, PD-1+ 세포 내로 IL7R 신호전달 pSTAT5의 큰 활성화로 실질적으로 바람직하게는 PD-1+ 세포 내로 IL-7R에 결합함을 검증하였다. 중요한 것은, 작제물 PD-1*1 IL7 W142H*1이 다른 작제물(항 PD-1*2 IL7 W142H*1, 및 항 PD-1*1 IL7 W142H*2)과 비교하여 PD-1+ 세포 내로 pSTAT5 신호전달을 촉진하는 가장 높은 활성을 입증하였다. 이러한 데이터는 하나의 항 PD-1 아암과 하나의 IL-7로 작제된 이기능성 분자가 암과 관련하여 PD-1+ 활성화된 T 세포로 IL-7R의 우선적 활성화를 허용하는 최적의 형태와 활성을 가짐을 시사한다.
실시예 2: 1개 또는 2개의 항 PD-1 아암 및 1개 또는 2개의 IL7 W142H 사이토카인으로 작제된 항 PD-1 IL-7 분자는 생체 내 에서 우수한 약동학적 프로파일을 갖는다
도 1에 기술된 바와 같은 항 PD-1 IL-7 이기능성 분자 작제물 2, 3 및 4의 약동학 연구를 평가하였다. 인간화 PD1 KI 마우스에 1회 용량의 항 PD-1 IL-7 분자(34.4 nM/kg)를 복강내 주사하였다. 혈장 약물 농도는 인간 IgG에 특이적인 ELISA로 분석했다(도 7). 곡선 아래 면적도 계산하였으며(표 4 참조) 각 작제물에 대한 시간 경과에 따른 총 약물 노출을 나타낸다. 항 PD-1*2IL-7 W142H*1, 항 PD-1* 1 IL-7 W142H*1 및 항 PD-1*1 IL-7 W142H*2 작제물은 항 PD-1*2 IL7WT*1에 비해 매우 유리하게 향상된 PK 프로파일을 입증하였다. Cmax는 항 PD-1*1 IL7WT *2에 비해 2,8 내지 19배 더 높은 것으로 관찰되었다. 중요한 것은, 생체 내 만족스러운 PK 값에 해당하는 높은 약물 농도(11 내지 15 nM)가 항 PD-1*1 IL7 W142H*1 항 PD-1*1 IL7 W142H*2 분자를 사용하여 적어도 96시간 동안 유지되는 반면, 항 PD-1*2 IL7WT*2 분자로는 단지 2 nM이 혈장에서 검출되었다는 것이다. 항 PD-1*2 IL-7 W142H*1의 잔류 약물 농도는 항 PD-1*2 IL7WT*2 농도보다 2,5배 더 높다. 혈장 약물 노출은 종종 생체 내 효능과 관련이 있다. 여기서, 본 발명자들은 항 PD-1의 한 아암으로 작제된 모든 항 PD-1 IL-7 W142H 분자가 단일 주사 후 장기간 약물 노출을 허용함을 입증한다. 항 PD-1*2IL-7 W142H*1, 항 PD-1*1 IL-7 W142H*1 및 항 PD-1*1 IL-7 W142H*2가 생체 내에서 유사한 유리한 PK 프로파일을 나타내었지만, 도 6b는 작제물 항 PD-1*1 IL-7 W142H*1이 PD-1+ 세포를 활성화하는 더 높은 능력을 가지고 있음을 입증한다.
실시예 3. 1개의 항 PD-1 원자가 및 1개의 융합된 단백질 X로 작제된 이기능성 항체는 2개의 항 PD-1 원자가 및 1개의 융합 사용된 단백질 X로 작제된 이기능성 항체와 비교하여 포유류 세포에 의해 더 높은 생산성을 입증하였다.
포유류 세포에 의한 이기능성 항체의 포맷 B 및 포맷 C의 생산성을 평가하고 비교하였다. IL-7에 융합된 Fc가 있는 전체 중쇄를 경쇄와 함께 CHO 현탁 세포에 일시적으로 동시 형질감염시켰다. 생산 및 정제 후 얻은 항체의 양은 샌드위치 ELISA(마우스 항 인간 카파 + 퍼옥시다아제 접합 염소 항 마우스 항체로 탐지 및 계시를 위한 고정화된 당나귀 항 인간 Fc 항체)를 사용하여 정량화하였다. 농도를 인간 IvIgG 표준으로 결정하였다. 생산성은 수집된 배양 상등액 1리터 당 정제된 항체의 양으로 계산하였다.
결과: 이기능성 항체, 항 PD-1*2/ IL-7 *1(포맷 B) 및 항체 PD-1*1 IL-7 *1(포맷 C)을 CHO 포유류에서 생성하였고 그 결과를 도 8에 나타내었다. 놀라운 방식으로, 항 PD-1*1/ IL-7 *1 작제물(포맷 C)은 항 PD-1*2/ IL-7 *1(포맷 B)보다 생산 수율(mg/L)이 훨씬 더 우수하다. 유의한 1.7배(+/-0.7; n=5) 더 높은 생산성이 얻어졌다. 이러한 결과는 항 PD-1*1/ IL-7*1(포맷 C)이 임상 개발 및 치료 적용의 다음 단계에 매우 중요한 매우 우수한 제조 가능성을 나타냄을 나타낸다.
특히 두 개의 서로 다른 아암을 포함하는 이기능성 항체의 경우, 가장 큰 문제 중 하나는 사슬의 미스페어링과 사슬 A(노브 체인)와 사슬 B(홀 체인)의 잘못된 결합이다. 실제로, 바람직하지 않은 동종이량체 형성(사슬 A + 사슬 A 또는 사슬 B + 사슬 B)이 일반적으로 발생한다. 이것은 일반적으로 동종이량체 이기능성 항체(포맷 A)의 생산과 비교하여 이종이량체성 이기능성 항체(포맷 B 및 C)의 낮은 수율 및 순도를 초래할 것이며, 이는 상당한 단점이다. 핵심 과제는 고품질의 균일한 이기능 항체를 생산하고 제한적이거나 무시할 수 있는 부산물과 불순물을 생산하는 방법이 남아있다.
그러나, 본 발명자들은, 포맷 C의 최적화된 전략 설계를 사용함으로써 동종이량체 포맷 B에 비해 놀랍게도 이기능성 항체의 더 높은 생산이 유도됨을 입증하였다. 또한, 항 PD-1*1-IL- 7 *1의 생산성 수율은 항 PD-1 단독(항 PD-1*1 또는 항 PD-1*2)과 유사한 범위이며, 이의 생산성은 유사한 생산 조건에서 45 mg/L(n=5)이다.
이종이량체 항체 생산의 다른 주요 문제는 순도이다. 노브-인투-홀(Knob-into hole) 전략은 이종이량체 생산(사슬 A+ 사슬 B)을 선호하고 동종이량체 사슬 A 또는 동종이량체 사슬 B 생산을 감소시키지만, 이 전략은 100% 효과적이지 않으며 이종이량체 작제물을 분리하기 위해 추가 정제가 필요하다(문헌[Wang et al, 2019, Antibodies, 8, 43].
그러나, 본 발명자들은 항 PD-1*1/ IL-7 *1 포맷 C의 생산 후에 이종이량체의 높은 수율이 얻어진다는 것을 관찰하였다. 도 9는 단백질 A 정제 후 항 PD-1*1/IL-7wt*1(도 9a) 및 항 PD-1*1/IL-7v*1(도 9b)의 크기 배제 크로마토그래피를 보여준다. 하나의 주요 피크는 이종이량체 형태 사슬 A와 사슬 B에 해당하는 반면, 동종이량체 형태 Fc/Fc(사슬 A+ 사슬 A)는 검출되지 않았고 동종이량체 형태(사슬 A+ 사슬 A)는 매우 미미했다(2% 미만). 이들 데이터는 본 발명의 항 PD-1*1/IL-7*1이 생산성에 최적화되어 있고 미스페어링을 방지함을 시사한다. 선행 기술과 비교하여, 동일한 KIH-s 전략을 사용하여 다른 이중특이적 항체 백본으로 약 70 내지 75%의 이종이량체 수율이 얻어진다.
이러한 순도를 얻기 위해 본 발명자들은 분자의 설계를 최적화하였다. 사실, 사슬 A가 Fc 도메인이고 사슬 B가 항 PD-1*1 IL-7*1인 경우에만 이러한 고순도가 얻어진다는 것을 관찰했다. 홀 돌연변이를 함유하는 VL + 단독 사슬 B(항 PD-1*1/IL-7v*1)를 CHO 포유류 세포로 동시 형질감염하는 것은 사슬 B의 동종이량체의 생성을 유도하지 않는다(0 mg/L). 반대로, PD-1*1/IL-7v*1이 노브 돌연변이를 포함하는 사슬 A인 경우, VL + 단독 사슬 A(항 PD-1*1/IL-7v*1)의 동시 형질감염 후 동종이량체 사슬 A의 높은 생산이 관찰되었다(88 mg/L). 이들 데이터에 따르면, 본 발명자들은 사슬 A의 동종이량체의 생성을 피하기 위해 사슬 A로서 Fc 및 사슬 B로서 항 PD-1*1/IL-7*1을 갖는 분자를 설계하기로 선택하였다.
종합하면, 이들 데이터는 사슬 A(노브 돌연변이가 있는 Fc 도메인) 및 사슬 B(홀 돌연변이가 있는 항 PD-1*1/IL-7*)가 있는 본 발명의 항 PD-1*1/IL-7*1에 따른 포맷 C가 제품의 높은 생산성과 순도를 위한 최고의 작제물임을 보여준다. 이는 대규모 생산성을 위한 치료제로서의 개발을 용이하게 한다.
실시예 4: 항 PD-1/사이토카인 이기능성 항체는 일차 인간 T 세포로의 pSTAT5 신호전달을 활성화한다.
본 발명자들은 다음으로 항 PD-1 항체에 융합된 단백질의 생물학적 활성을 평가하고 활성화된 1차 T 세포에 대한 모든 항 PD-1/사이토카인 이기능성 분자의 능력을 시험하였다. 이를 위해 인간 말초 혈액 T 세포를 다양한 농도의 항 PD-1*1/IL-7wt*1, 항 PD-1*1/IL-7v*1, 항 PD-1*1/IL-15*1, 항 PD-1*1/IL-21*1 작제물로 37℃에서 15분 동안 처리하였다. 인큐베이션 후, 세포를 고정, 투과화하고 항 pSTAT5 항체로 염색하였다.
결과 : 도 10a는 항 PD-1*1/IL-7wt*1, 항 PD-1*1/IL-7v*1, 항 PD-1*1/IL-15*1 및 항 PD-1*1/IL-21*1이 1차 T 세포(CD3+ T 세포) 내로 pSTAT5 신호전달을 효율적으로 유도함을 보여주며, 이는 포맷 C의 항-PD-1 분자의 Fc 도메인에 융합된 사이토카인이 인간 T 세포를 자극하는 이의 능력을 보유함을 시사한다. 본 발명자들은 다음으로 pSTAT5 신호전달을 활성화하는 항 PD-1/IL-7 포맷 A(항 PD-1*2/IL7v*2) 대 항 PD-1*1/IL-7v*1 포맷 C의 효율을 비교하였다. 작제물 항 PD-1*1/IL-7v*1이 오직 하나의 IL-7v 사이토카인을 포함하므로, 포맷 A에 비해 이러한 분자에 대한 더 낮은 pSTAT5 활성화가 예상되었다. 그러나, 도 10b에 도시된 바와 같이, 항 PD-1*2/IL-7v*2 작제물(포맷 A)에 비해 항 PD-1*1/IL-7v*1(포맷 C)로 더 높은 pSTAT5 활성화가 놀랍게도 관찰되었으며, 이는 본 발명의 항 PD-1/IL-7*1 작제물(포맷 C)이 1차 T 세포 내로 IL-7 신호전달의 활성화를 촉진하기 위한 IL-7 분자의 최적의 구성을 허용함을 시사한다.
실시예 5: 항 PD-1 이기능성 분자는 PD-1- 세포보다 PD-1+ 세포에 대한 우선적인 결합을 허용하고 항 PD-1/IL7 분자는 PD-1+ T 세포 내로 TCR 신호전달의 상승적인 활성화를 허용한다.
본 발명자들은 PD-1+ T 세포를 표적화하고 사이토카인 또는 PD-1 + 세포에 융합된 단백질의 우선적인 전달 및 시스-결합을 허용하는 항 PD-1 이기능성 분자의 능력을 평가하였다. U937 PD-1- 세포 및 U937 PD1+ CD127+ 세포를 동시 배양하고(1:1 비율) 상승적인 용량으로 항 PD1/ IL-7 분자와 함께 인큐베이션하였다. 결합 및 IL-7R 신호전달(pSTAT5)을 유세포 분석법으로 정량화했다. 결합 및 pSTAT5 활성화의 EC50(nM)을 각각의 작제물 및 각각의 PD-1 + 및 PD-1- 세포 집단에 대해 결정하였다. 병행하여 항 IgG-PE(Biolegend, 클론 HP6017)로 이기능성 항체의 결합을 검출하고 유세포 분석기로 분석하였다.
결과: 도 11a 및 11b는 CD127+만을 발현하거나 CD127 및 PD-1 수용체를 동시 발현하는 세포에서 항 PD-1*1/IL-7wt*1 및 항 PD-1*1/IL7v*1 분자의 결합을 보여준다. 데이터는 두 분자가 바람직하게는 PD-1-CD127+ 세포보다 PD-1+CD127 + 세포에, 항 PD-1 단독(항 PD-1*2)에 필적할 만한 효능으로 결합함을 보여준다. 병행하여, PD-1+ 세포 대 PD-1- 세포 내로의 PSTAT5 신호전달의 활성화를 또한 도 11c에 상술된 바와 같이 평가하였다. 항 PD-1*1/IL-7wt 또는 IL7v*1 항체로 처리한 후 PD-1-CD127+ 세포에 비해 PD-1+CD127+ 세포 내로의 IL7R 신호전달 pSTAT5의 강력한 활성화(58 내지 315배 더 높은 활성화) 반면 이소형/IL7 항체는 PD-1+ 및 PD-1- 세포에서 유사한 효능을 가졌으며, 이를 통해 항 PD-1*1/IL-7*1 분자의 항 PD-1 도메인이 PD-1+ 세포에 대한 IL-7의 우선적인 결합, 즉, 약물 표적화 및 동일한 세포 상에서 활성화를 확인하였다. 이러한 양태는 생체 내에서 약물의 생물학적 활성화에 대한 관심을 갖는데, 그 이유는 PD-1 음성 나이브 T 세포에 비해 PD-1+ 종양 특이적 T 세포 상의 IL-7 또는 이기능성 분자에 융합된 다른 분자를 종양 미세환경 내로 집중시킬 것이기 때문이다. 종합하면, 이 데이터는 PD-1+ 세포에서 융합된 사이토카인의 선택적인 전달을 허용하기에 항 PD-1의 단지 하나의 아암이 충분하다는 것을 보여준다.
다음으로, 본 발명자들은 PD-1+ T 세포에 대한 항 PD-1 이기능성 분자의 시스-표적화의 생물학적 영향을 평가하였다. Promega PD-1/PD-L1 키트(참조 J1250) 분석을 사용하였다. 간략하게, 2개의 세포주가 사용된다 (1) 이펙터 T 세포(PD-1, NFAT-유도된 루시퍼라제를 안정적으로 발현하는 Jurkat) 및 (2) 활성화 표적 세포(PD-L1 및 동족 TCR을 자극하도록 설계된 표면 단백질을 항원 독립적인 방식으로 안정적으로 발현하는 CHO K1 세포). 세포가 공동 배양될 때, PD-L1/PD-1 상호작용은 TCR 매개된 활성화를 억제하여 NFAT 활성화 및 루시퍼라제 활성을 차단한다. 항-PD-1 항체의 추가는 PD-1 매개된 억제 신호를 차단하고 TCR 매개된 신호를 복원하여 NFAT 활성화 및 루시퍼라제 합성 및 생물발광 신호 방출을 유도한다.
생물분석 결과를 도 12a에 나타냈으며 이는 이기능성 항 PD-1*1/IL7wt*1 분자가 항-PD1*1 또는 항-PD1*1+ 비 표적화된 이소형-IL7(별개의 화합물로서)에 비해 TCR 매개된 신호전달(NFAT)을 활성화하는데 더 우수하다는 것을 나타내며, 이는 PD1+ 세포 상에서 이기능성 분자의 상승적 효과를 입증한다. IL-7 돌연변이체를 포함하는 항 PD-1*1/IL-7v*1 분자는 또한 T 세포 상의 NFAT 신호전달을 재활성화하기 위한 유의한 상승적 효과를 보여주었다(도 12b). 이러한 데이터는 하나의 항 PD-1*1에 융합된 하나의 IL-7 사이토카인이 TCR 신호전달의 더 높은 활성화를 유리하게 유도하는 반면 두 개의 개별 화합물과 같은 조합 전략은 그러한 효능을 유도하지 않음을 입증한다.
실시예 6. 하나의 항 PD-1 원자가를 갖는 이기능성 분자는 생체 내 에서 더 우수한 약동학을 입증하였다.
생성물의 약동학 및 약력학은 단일 주사 후 마우스에서 평가하였다. C57bl6JRj 마우스(암컷 6 내지 9주)에 단일 용량(34 nmol/kg)의 항 PD-1 또는 이기능성 항체를 정맥내 또는 복강내 주사하였다. 혈장 약물 농도는 고정화된 항-인간 경쇄 항체(클론 NaM76-5F3)를 사용하여 ELISA에 의해 결정하였고, 이어서 혈청-함유 항체를 첨가하였다. 검출은 퍼옥시다제-표지된 당나귀 항-인간 IgG(Jackson Immunoresearch; 미국 소재; 참조 709-035-149)를 첨가하여 수행하였으며, 기존의 방법으로 밝혀냈다. 각 작제물에 대해 약물 노출에 해당하는 곡선 아래 면적을 계산하였다.
결과: 본 발명자들은 먼저 모든 상이한 이기능성 포맷(포맷 A, B 및 C)의 약동학을 비교하였다. 도 13은 단일 정맥내(도 13a) 또는 복강내(도 13b) 주사 후 1개 또는 2개의 IL-7v 사이토카인 및 1개 또는 2개의 항 PD-1 원자가로 작제된 항 PD-1/IL-7v의 약동학 프로파일을 보여준다. 항 PD-1*1/IL-7v*1(포맷 C)은 항 PD-1*2/IL-7v*2(포맷 A) 및 항 PD-1*2/IL-7v*1(포맷 B)과 비교하여 최고의 약동학 프로파일을 입증하였다. 정맥내 및 복강내 주사 모두 항 PD-1*1/IL-7*1(포맷 C)이 이기능성 분자의 약동학을 향상시키기 위한 최적의 작제물임을 입증하였다.
다음으로, 본 발명자들은 1개의 항 PD-1 아암(항 PD-1*1) 및 IL-7을 갖는 이기능성 분자가 2개의 항 PD-1 아암으로 작제된 동일한 이기능성 분자와 비교하여 더 우수한 생체 내 약동학적 프로파일을 나타내는지 여부를 시험하였다. 도 14는 개별 작제물에 대한 결과를 보여준다. 데이터는 모든 이기능성 분자 항 PD-1*1/ IL-7(포맷 C)이 상응하는 이기능성 분자 항 PD-1*2/ IL-7*1(포맷 B)에 비해 상당히 우수한 약동학 프로파일을 입증했음을 보여준다.
또 다른 실험에서, 항 PD-1*2 또는 항 PD-1*1 항체 단독의 약동학을 또한 평가하여 항 PD-1 작제물 단독이 더 나은 약동학 프로파일을 허용하는지 또는 이러한 관찰이 이기능성 분자에만 적용가능한지 여부를 이해했다. 도 15는 항 PD-1*2 및 항 PD-1*1 모두가 정맥내(도 15a) 또는 복강내(도 15b) 주사 후 유사한 프로파일을 가짐을 보여주며, 이는 놀랍게도 항 PD-1*1 작제물이 이기능성 분자에 대해서만 더 나은 약동학 프로파일을 유도함을 시사한다.
불량한 약동학 프로파일은 이기능성 항체에 대한 잘 알려진 문제이다. 이기능성 항체는 빠르게 제거되며 임상에서의 사용을 제한하는 생체 내 짧은 반감기를 나타낸다. 생체 내 만족스러운 PK 값에 해당하는 우수한 약물 농도(20 및 100 nM)는 항 PD-1*1/ IL-7*1 작제물로 적어도 48 내지 72시간 동안 유지되는 반면 단지 2 nM의 항 PD-1*2 IL7*2 분자만이 혈장에서 검출된다. 본 발명의 포맷 C 항 PD-1*1/ IL-7*1은 이기능성 항체의 다른 포맷(포맷 B 및 C)과 비교하여 더 긴 기간의 노출로, 생체 내에서 개선된 약동학적 프로파일을 허용한다.
실시예 7 항 PD-*1/IL-7*1 이기능성 분자는 T 세포의 생체 내 증식을 촉진하고 항 PD-1*2/ IL*7*2 또는 항 PD-1*2/ IL*7*1 작제물에 비해 유의한 항-종양 효능을 유도한다.
T 세포의 생체 내 증식은 이기능성 분자(34 nM/kg)의 단일 투여량을 피하 MC38 종양에 복강내 주사한 후에 평가하였다. 처리 후 4일째에, 혈액 및 종양을 수집하고, T 세포를 항 Ki67 항체로 염색하여 유세포 분석법에 의해 증식을 정량화하였다.
생체 내 효능은 2개의 상이한 동소위 동계 모델, 즉 간암종 모델 및 중피종 동소위 모델에서 평가하였다. 인간 PD-1(엑손 2)을 발현하도록 유전적으로 변형된 면역적격 마우스를 이들 실험에 사용하였다. 중피종 모델의 경우, AK7 중피 세포를 복강내 주사하였다(3*106 세포/마우스). Hepa 1.6 모델의 경우 문맥에 2.5*106 세포를 주입하였다. 실험 1에서, 유사한 약물 노출 농도의 PBS, 항 PD-1 대조군(항 PD-1*2), 항 PD-1*1/IL*7v*1로 마우스를 처리하였다. 실험 2에서, 유사한 약물 노출 농도의 PBS, 항 PD-1 대조군(항 PD-1*2), 항 PD-1*1/IL*7wt*1로 마우스를 처리하였다. AK7 세포는 안정적으로 루시퍼라제를 발현하여 D-루시페린 주입 후 생체 내 종양 부담의 정량화를 가능하게 한다. 데이터는 스테라디안 당 cm2 당 초 당 광자 단위로 분석되었으며 등쪽 및 복부 신호의 평균을 나타낸다.
결과: 도 16a는 항 PD-1*1/IL7wt*1 또는 IL7v*1 이기능성 분자(포맷 C)가 항-PD-1 항체(항 PD-1*1 또는 항 PD-1*2)보다 더 높은 정도로 CD4 및 CD8 T 세포의 유의한 증식을 촉진함을 보여준다. 항 PD-1*2/IL7*2(포맷 A) 및 항 PD-1*2/IL7*1(포맷 B) 작제물에 비해, 이들 2개 작제물의 유의하게 더 많은 CD4 T 세포가 또한 관찰되었다. 유사하게, 항 PD-1*2/IL7*2(포맷 A) 및 항 PD-1*2/IL7*1(포맷 B) 작제물에 비해 항 PD-1*1/IL7wt*1 또는 항 PD-1*1/IL-7v*1로 처리한 후 더 높은 증식이 관찰되었다. 이러한 데이터는 pSTAT5 신호를 T 세포로 활성화하는 다양한 작제물의 효율성을 뒷받침하며(도 10a), 여기서 항 PD-1*1/IL7*1 작제물은 항 PD-1*2/IL7*2 작제물에 비해 더 높은 pSTAT5 신호전달을 유도하였다.
흥미롭게도, 본 발명자들은 항 PD-1*1/IL7wt*1 또는 IL7v*1이, 항 PD-1*2 IL-7*2 및 항 PD-1*2 분자에 대해 유의하게 더 높은 정도로, 줄기-유사 이펙터 기억 CD8 T 세포의 증식을 종양 내로 유의하게 유도함을 관찰하였다(도 16b). TCF1+ 줄기 유사 CD8 T 세포 집단을 부스팅하기 위한 항 PD-1*1 IL-7*1의 능력은 암의 면역조절에 대해 중요하기 때문에 특히 흥미롭다. 이 세포는 높은 이펙터 기능을 가진 종양 특이적 T 세포 풀을 생성하기 위해 자체 재생이 가능하다.
도 17a 및 17b는 동소위 간암종 모델에서 항 PD-1*1 IL-7wt*1 및 항 PD-1*1 IL-7v*1의 생체 내 효능을 보여준다. 두 개의 개별 실험에서 항 PD-1*1/IL*7*1(wt 및 변이체 둘 모두)(포맷 C)은 항 PD-1*2 항체에 비해 유의하게 우수한 효능을 보여주었다. 항 PD-1*1/IL7v*로 처리한 후 완전한 종양 박멸(완전 반응)의 85%를 얻은 반면, 항 PD-1*2로 처리한 마우스의 16%만이 완전한 종양 반응을 보였다.
비교하여, 본 발명자들은 또한 작제물 항 PD-1*2/IL7v*2를 시험하였고, 동일한 간암종 모델에서 항 PD-1*2/IL-7*2 작제물로 낮은 항-종양 효능이 관찰되었으며, 이는 항 PD-1*2/IL-7*2에 비해 항 PD-1*1/IL7*1 작제물의 생체 내 더 우수한 활성을 강조한다.
중피종 동소위 모델(도 18 a 및 b)에서, 항 PD-1*1/IL7v*1은 항 PD-1*2 항체 처리와 유사한, 완전한 반응의 85% 초과의 높은 항-종양 효능을 입증하였다. 이러한 데이터는 항 PD-1 민감성 모델에서 항 PD-1*1/IL7v*1이 매우 효과적임을 보여주며, 포맷 C가 오직 하나의 항 PD-1 아암(항 PD-1*1)을 포함한다 할지라도, 약물은 2개의 원자가를 갖는 항 PD-1과 유사한 효능을 나타냄을 시사한다.
종합하면, 이러한 데이터는 이기능성 항체의 설계가 생체 내에서 항종양 효능을 얻는 데 중요하다는 것을 강조한다. 하나의 사이토카인 또는 단백질을 항 PD-1*1(포맷 C)에 융합하면 최고의 항종양 효능과 T 세포 생체 내 증식을 나타내는 반면, 2개의 항 PD-1 아암과 하나 또는 두 개의 사이토카인 또는 단백질로 작제된 이기능성 분자는 생체 내에서 T 세포의 효율적인 증식을 유도하지 못하거나 항종양 효능을 나타내지 않는다.
실시예 8: 항 PD-1*1 IL-7v*1 작제물은 IL-7 사이토카인 및 항 PD-1*1 IL7WT*1 이기능성 항체보다 더 높은 정도로 시험관 내에서 Treg의 억제 기능을 제거한다.
항-PD1 요법이 T 세포 이펙터 기능을 자극하지만, 면역억제 분자(TGFB, IDO, IL-10...) 및 조절 세포(Treg, MDSC, M2 대식세포)는 치료의 전체 잠재력을 제한하는 적대적인 미세 환경을 생성한다. Treg 세포는 낮은 수준의 IL-7R(CD127)을 발현하지만, IL-7 처리 후 pSTAT5를 여전히 자극할 수 있으며 IL7은 Treg 억제 기능을 해제하는 것으로 알려져 있다(문헌[Allgauer A, et al. J. Immunol. 2015, 195, 31393148]; 문헌[Liu W, et al. J Exp Med. 2006, 203, 1701-1711]; 문헌[Seddiki N, et al. J exp Med 2006, 203, 1693-1700]; 문헌[Codarri L, et al. J exp Med 2007, 204, 1533-1541]; 문헌[Heninger AK , et al. J immunol 2012, 189, 5649-5658]). IL-7과 비교하여 Treg 기능을 해제하는 항 PD-1/IL7 작제물의 효능을 평가하기 위해, Treg 및 T 이펙터 세포를 공동 배양하여 억제 분석을 수행하였다. 본 발명자들은 도 19에서 IL-7 또는 항-PD1-IL7 처리가 Treg 세포의 존재 하에서도 Teff 세포의 증식을 허용하는 Treg 매개 억제 효과를 차단한다는 것을 관찰하였다. 항-PD1 항체는 T 이펙터 세포에 대한 Treg 억제 활성을 억제할 수 없다.
놀랍게도, 항 PD-1*1 IL7 W142H*1은 IL-7 사이토카인(**p<0.05)뿐만 아니라 항 PD-1*1 IL7WT*1 작제물과 비교하여 Treg 기능을 억제하는 가장 높은 효능을 입증하였다. 이들 데이터는 네이키드 IL-7 사이토카인 또는 항 PD-1*1 IL7*1 이기능성 항체의 돌연변이되지 않은 버전에 비해 항 PD-1*IL7W142H*1 작제물을 사용하는 것의 이점을 강조한다. 1가 변이체가 Treg 제거 및 동시에 강력한 T 세포 증식에 영향을 미치고, 이는 선택된 IL7 변이체 W142H가 IL-7 사이토카인 야생형 형태에 비해 IL7R에 대해 더 낮은 친화도를 나타내기 때문에 이중 효과인 것은 예상치 못한 일이었다.
방법: CD8 이펙터 T 세포 증식에 대한 시험관 내 Treg의 억제 활성 평가. CD8+ 이펙터 T 세포 및 자가 CD4+ CD25high CD127low Treg를 세포 증식 염료(CD8+ T 세포에 대한 CPDe450)로 염색된 건강한 공여자의 말초 혈액에서 분류하였다. 그런 다음 Treg/CD8+Teff를 5일 동안 OKT3 코팅된 플레이트(2 μg/mL)에서 1:1 비율로 공동 배양하고 Teff 세포의 증식을 CPD 마커의 손실과 함께 유세포 분석법으로 정량화하였다.
실시예 9: 항 PD-1*1 IL-7v*1은 2개의 상이한 종양 모델에서 항 PD-1*1 IL7WT*1 작제물에 비해 생체 내 에서 우수한 효능을 입증하였다.
생체 내 효능은 2개의 상이한 동소위 동계 모델, 간암종 모델 및 중피종 동소위 모델에서 평가하였다. 인간 PD-1(엑손 2)을 발현하도록 유전적으로 변형된 면역적격 마우스를 이들 실험에 사용하였다. 중피종 모델의 경우, AK7 중피 세포를 복강내 주사하였다(3*106 세포/마우스). Hepa 1.6 모델의 경우, 문맥에 2.5*106 세포를 주입하였다. 실험 1에서는 유사한 약물 노출 농도의 PBS, 항 PD-1 대조군(항 PD-1*2), 항 PD-1*1/IL7v*1(항 PD-1*1 IL7W142H*1) 또는 항 PD-1*1 IL7wt*1로 마우스를 처리하였다. AK7 세포 및 Hepa1.6은 안정적으로 루시퍼라제를 발현하여 D-루시페린 주입 후 생체 내 종양 부담의 정량화를 가능하게 한다. 데이터는 스테라디안 당 cm2 당 초 당 광자 단위로 분석되었으며 등쪽 및 복부 신호의 평균을 나타낸다.
AK7 복강내 모델은 PD-1을 발현하는 높은 CD4+ 및 CD8+ T 세포 침윤과 관련된 PD-1 항체 치료에 매우 민감하며, 도 18에서 입증된 바와 같이 항 PD-1 항체의 양호한 반응을 허용하는 종양 미세환경으로 관찰되었다. 본 실험에서, 항 PD-1*1 IL7v*1의 효능을 이의 야생형 IL7 상동체 작제물(항 PD-1*1 IL7wt*1)과 비교하였다. 항 PD-1*1 IL7v*1 작제물은 완전한 반응의 92%를 유도하였고(n=1 사망/14 마우스) 중간 정도의 항-종양 효능(완전한 반응의 62%)을 유도하는 항 PD-1*1 IL7wt*1 작제물에 비해 효능이 우수하였다(도 20a). 종양 생물발광 분석을 통해 항 PD-1*1 IL7v*1이 처리 후 11 내지 18일차 이내에 종양 제거를 유도한 반면, 항 PD-1*1 IL7wt*1 군에서는, 처리 후 종양의 축소가 결국에 재발하는 것(데이터는 도시되지 않음)을 확인하였으며, 이는 낮은 친화도 IL-7(IL7W142H)로 구축된 이기능성 항체와 비교하여 IL-7 야생형 작제물의 효능이 일시적일 수 있음을 나타낸다.
항 PD-1*1 IL7v*1 처리에 의해 유도된 기억 반응을 평가하기 위해, 항 PD-1*1 IL7v*1로 처리된 모든 치유된 마우스에 AK7 중피종 세포의 두 번째 주입을 다시 시도하였다. 도 20b에 도시된 바와 같이, 종양 재주입 후 종양 생물발광이 검출되지 않은 반면, 나이브 주입된 마우스에서는 여러 시점에서 높은 생물발광 신호가 검출되었다. 이러한 데이터는 항 PD-1*1 IL7v*1이 임의의 새로운 처리가 없을 때 강력하고 장기적인 특이적인 기억 항-종양 반응을 유도한다는 것을 입증하였다.
항 PD-1*1 IL7v*1은 IL-7R에 대한 더 낮은 친화도를 갖지만, 이러한 작제물은 항 PD-1*IL-7wt*1 작제물에 비해 예기치 않은 더 높은 효능을 입증하였고 PD-1 민감성 종양 모델에서 항 PD-1 *2 항체와 같이 이의 길항제 항 PD-1 활성을 보유한다. 이러한 데이터는 항 PD-1*1 IL7v*1이 생체 내에서 PD-1 억제 수용체의 차단 활성을 유지하기 위한 바람직한 작제물임을 강조한다. 본 발명자들은 IL-7의 돌연변이가 PD-1- CD127+ 비 종양 특이적 T 세포에 비해(도 11c에 도시된 바와 같음) PD-1+ 종양 특이적 T 세포에 대한 이기능성 항체의 친화도의 균형을 맞춰서 생체 내에서 더 우수한 효능을 초래할 것이라고 가정한다.
항 PD(L)1 불응성 모델에서 암 환자의 1차 내성을 모방하는 효능을 평가하기 위해, 간세포 암종 Hepa1.6의 뮤린 모델을 선택하였다. 이는 면역적격 마우스(인간 PD-1 발현)에서 구현된 동소위 동계 모델이다. 이 모델은 설명된 종양으로부터 종양 T 세포 배제로 인해 특히 관심이 있다(문헌[Gauttier V et al.　2020, Clin Invest, 130, 6109-6123]). IL7R에 대해 낮은 친화도를 갖는 항 PD-1*1 IL7v*1와 IL7R에 대해 높은 친화도를 갖는 항 PD-1*1 IL7wt*1의 효능을 본 실험에서 나란히 비교하였다. 별개의 군에서, 동일한 약물 농도의 PBS(대조군), 항 PD-1*2 또는 이소형*1 IL7*v*1(항-바이러스 단백질 엔벨로프를 표적화하고 본 실험에서 이소형 대조군으로서 사용한 이특이적 항체의 상동체 작제물)로 마우스를 처리하였다. 도 21에 도시된 바와 같이 항 PD-1*1 IL7v*1은 높은 친화도 야생형 IL7로 작제된 항 PD-1*1 IL7wt*1(단지 완전한 반응의 47%)보다 60%의 명확하게 더 우수한 완전한 종양 반응을 달성하였다. 이러한 모델에서, 예상한 바와 같이, 항 PD1 항체는 효능이 없었다. 또한, 이소형*1 IL7v*1은 이러한 모델에서 효능이 없었으며 이는 항 PD-1/IL7 작제물을 사용하여 항 PD-1 및 IL-7 처리를 결합하는 것이 PD-1 불응성 모델에서 T 세포 활성화 및 항종양 반응을 향상시키는 좋은 치료 전략임을 입증한다.
항 PD-1*1 IL7v*1 처리에 의해 유도된 기억 반응도 이 모델에서 시험하였으며 동일한 종양 부재가 관찰되었다.
전체적으로 이들 데이터는 하나의 항 PD-1 원자가 및 CD127 수용체에 대해 더 낮은 친화도를 갖는 돌연변이된(W142H) 하나의 IL-7 사이토카인을 갖는 항 PD-1/IL-7 작제물의 우수한 효능을 확인시켜준다.
실시예 10: 항 PD-1 불응성 모델에서 입증된 항 PD-1*1 IL-7v*1은 항 PD-1 수용체의 강력한 전사 활성 및 줄기 유사 기억 CD8 T 세포 하위집단(TCF1+독소 세포)의 종양내 증식과 상관관계가 있다.
항 PD-1*1 IL7v*1이 종양 미세환경에 미치는 영향을 더 잘 이해하기 위해 전체 종양의 전사체 분석도 또한 수행하였다. Nanostring 기술(nCounter® PanCancer Immune 프로파일링 패널)을 사용하여 유전자 발현을 검출하고 정량화하였다. 데이터는 음성 대조군의 기하 평균에 대한 배경 임계값을 사용하여 패널에 포함된 여러 참조 유전자로 정규화된다. 유전자의 차등 발현(DEG)은 R 패키지를 사용하여 분석되었다. 도 22의 DESeq2 분석으로부터의 DEG의 감독되지 않은 계층적 클러스터링 히트맵은 전사 발현 패턴이 항 PD-1과 항 PD-1*1 IL7W14H*1 군 간에 매우 유사하고 PBS군과는 유의하게 다르다는 것을 보여주며, 이는 항 PD-1*1 IL7v*1 작제물의 항 PD-1 도메인이 하나의 항 PD-1 원자가에도 불구하고 생체 내 길항제 생체 활성을 보존했음을 시사한다. PBS 조건과 비교하여 항 PD-1*2 또는 항 PD-1*1 IL7W142H*1로 처리한 후 상향조절된 유전자의 STRING을 사용한 단백질-단백질 상호작용 네트워크 기능 강화 분석을 통해, 화학주성 면역 수용체 활성, Jak-STAT 사이토카인 신호전달 및 항원 제시(MHC 단백질 복합체 결합 및 TCR 신호전달)에 관여하는 여러 유전자 클러스터를 확인하였다. 항 PD-1*2와 항 PD-1*1 IL7W142H*1 사이에서 차등적으로 발현되는 유전자 중에서, 본 발명자들은 R 패키지 GSVA로부터의 단일 샘플 GSEA(ssGSEA) 시그니처 알고리즘을 사용하여 항-PD-1군 및 PBS군(도 22b)에 비해 항 PD-1*1 IL7W142H*1군에서 TCF7, CCR7, SELL, IL7R 유전자의 발현과 관련된 CD8 또는 CD4 T 조기 활성화/기억 줄기 유사 T 세포의 유의한 상향조절을 관찰하였다. 반대로, 고갈된 CD8 T 세포 유전자(LAG3, PRF1, CD8A, HAVRC2, GZMB, CD8B1, KLRD1, TNFRSF9, TIGIT, CTSW, CCL4, CD63, IFNG, CXCR6, FASL, CSF1)의 상향조절이 예상한 바와 같이 항 PD-1 처리된 군에서 관찰되었다. 고갈된 T 세포의 유전자 특징 및 나이브 유사/줄기 유사 기억 T 세포 특징을 문헌[(Andreatta et al;, Nature comm 2021)]에서 채택하였으며, 이는 단일 세포 전사체 분석을 사용하여 암에서 상이한 T 세포 하위 집합을 정의한다.
항 PD-1*1 IL7v*1 처리에 의해 유도된 집단을 추가로 특성화하기 위해 CD8 T 세포 침윤 림프구의 유세포분석에 의한 표현형 분석을 또한 생체 외에서 수행하였다. 이 내성 모델에서 초기에 기술된 종양으로부터의 T 세포 배제에도 불구하고, 종양 침윤 림프구(TIL) 조성은 항 PD-1*1 IL7W142H*1 처리 후 크게 증가하고 생성물은 T 세포 하위집합을 극적으로 변형시켰다(도 22b 및 22c, 23c). 유세포 분석은 항 PD-1*1 IL7 W142H*1이 종양 미세환경의 조성을 변형시키고, CD4에 비해 CD8 T 세포의 우호적인 축적과 동시에 Treg을 아낀다는 것을 입증하였다(도 23a). 줄기-유사 기억 T 세포(CD3+CD8+CD44+TCF1+TOX-)의 표현형을 갖는 CD8+ CD44+ 활성화된 T 세포의 백분율의 높은 증가가 처리 후 관찰되며(도 23b), 이는 또한 ki67 증식 마커를 발현한다(도 23c). 항 PD-1 처리는 TOX-TCF1- 또는 TOX+ TCF1-관련 고갈 표현형의 종양으로의 축적을 유도한다(문헌[Utzschneider et al., Immunity 2016, 45, 415-427]; 문헌[Mann et al., 2019 Nature immunology, 20, 1092-1094]). 이러한 데이터는 전사체 분석으로 뒷받침되고 항 PD-1*1 IL7W142H*1 분자에 의해 활성화된 T 세포가 CD44 활성화 마커를 발현한다는 것을 추가로 결정하여, 이러한 T 세포 하위 집합이 나이브 T 세포 하위 집합이 아니라 조기 활성화된 줄기 유사 기억 T 세포 하위 집합(TCF1+TOX-)임을 시사한다. 이러한 데이터는 또한 또 다른 종양 모델에서 생체 내 줄기 유사 기억 T 세포의 축적 및 증식을 촉진하는 항 PD-1*1 IL7W142H*1의 효능을 설명하는 실시예 9를 확인시켜준다.
실시예 11: 항 PD-1*1 IL7v*1은 만성적으로 자극된 인간 T 세포의 생존을 유지하고 TCF1+ T 세포의 증식을 유도한다.
인간 T 세포에 대한 항 PD-1*1IL7v*1의 효과를 확인하기 위해, 본 발명자들은 시험관 내 만성 항원 자극 모델에서 항 PD-1/IL7 작제물의 효과를 시험하였다. 인간 PBMC는 3일 마다 CD3 CD28 코팅된 플레이트(3 μg/mL의 OKT3 및 3 μg/mL, CD28.2 항체)에서 반복적으로 자극하였다. 각각의 자극에서, 항 PD-1*1 IL7v*1(항 PD-1*1 IL7W142H*1) 작제물, 이소형 대조군 또는 항 PD-1*1 항체를 배양에 첨가하였다. 5차 자극 후 24시간 후에, T 세포 생존력 및 표현형을 유세포 분석으로 평가하였다.
도 24a는 항 PD-1*1 IL7W142H*1이 항 PD-1 처리에 비해 만성적으로 고갈된 T 세포의 생존을 유지함을 나타낸다. T 세포의 표현형 분석(도 24b)은 항 PD-1*1 IL7v*1이 특이적 증식을 촉진하고 TCF1+ CD8 T 세포 하위 집합을 유지함을 입증하였다. TCF1+ T 세포 집단은 자가 재생 및 장기 효과적인 반응이 가능한 줄기-유사 T 세포 집단으로서 설명된다. 이러한 결과는 암의 초기 단계(보강 또는 신보강 상황)에서 TIL을 항 PD-1*1 IL7v*1로 재활성화하여 면역 종양 치료 또는 기타 암 치료에 대한 1차 또는 2차 저항성 및 다양한 면역 종양 탈출 상황에서 고갈된 T 세포 증식을 방지하는 고형 종양에서 장기적인 효과를 예상할 수 있게 한다.
실시예 12: 항 PD-1*1 IL-7v*1은 PD-1 요법에 대해 내성인 상이한 인간화 모델에서 생체 내 단독요법 효능을 입증하였다.
삼중음성유방암(TNBC) 모델(유방암 세포 MDA-MB231을 피하 이식한 면역결핍 마우스)에서, 마우스를 4명의 다른 공여자로부터 인간 말초혈액 단핵세포(PBMC)로 인간화한 다음 PBS, 항 PD-1*2 또는 항 PD-1*1 IL7W142H*1 이기능성 항체로 처리하였다. 시험된 모든 PBMC 공여자에서, 항 PD-1*1 IL7v*1은 종양 성장을 감소시킨 반면 항 PD-1*2는 단독으로는 효과가 없었다(도 25).
또 다른 인간화 마우스 모델인 폐암 모델(A549)에서, 항 PD-1*1 IL7v*1의 효능은 항 PD-1*1 처리된 마우스(34일)의 혈청에서 IFNg 분비 증가와 관련된 항 PD-1*1에 대해 확인하였다(도 26). 이 두 모델은 모두 항 PD-1*1IL7v가 또한 항 PD-1*2보다 높은 정도로 생체 내 인간 면역-매개 항종양 반응을 조절할 수 있음을 입증한다.
실시예 13: 항 PD-1*1 IL7v *1은 시노몰구스 원숭이에서 항 PD-1*1 IL7wt*1 분자에 비해 우수한 약동학적 프로파일을 입증하였다.
시노몰구스 원숭이에게 1회 용량의 항 PD-1*1 IL7wt*1(0.8 mg/kg, 4.01 mg/kg) 또는 1회용량의 항 PD-1*1 IL7v*1(항 PD-1*1 IL7 W142H*1) 0.8 mg/kg, 4.01 mg/kg 또는 25 mg/kg)을 정맥 내로 주입하였다. 주입 후, 여러 시점에서 혈청을 수집하여 MSD 기술을 사용하여 ELISA 면역분석에 의해 항 PD-1 IL7 작제물을 정량화하였다. 간략하게, 인간 PD1 단백질을 고정화하고 혈청 항 PD-1*1 IL7*1 항체를 첨가하였다. ELISA를 통해 설포-태그된 항-인간 카파 경쇄 모노클로날 항체로 밝혔다.
약동학적 데이터는 선형이었고, 두 작제물 모두에 대해 용량 관련이 있었다. 그러나, 항 PD-1*1 IL7v*1 작제물에서는, 항 PD-1*1 IL7wt*1 작제물에 비해 더 나은 약동학적 프로파일이 관찰된다(도 27)(곡선 아래 면적 29.6 대 108, 투여량 4.01 mg/kg에서 IL7wt 대 IL7v). 흥미롭게도, IL7 수용체에 대한 친화도가 낮은 항 PD-1*1 IL7v*1은 10 내지 14일까지 생체 내에서 CD8 T 세포의 증식을 유도하여, 약물의 생물학적 효과가 약동학 노출 이상으로 확장됨을 보여주었다. 이러한 데이터는 비인간 영장류의 T 세포 하위 집합에 대한 장기 효과를 측정하고 인간 상황에 적용가능한 새로운 약력학 모델을 허용한다: 즉, 항 PD-1*1 IL7v*1 이기능성 항체를 단 한 번 주사한 후 CD8+ T 세포 증식.
실시예 14: IgG1 N297A 이소형 또는 LALA PG IgG1 이소형으로 작제된 항 PD-1*1 IL7v *1은 인간 T 세포로 pSTAT5 신호전달을 활성화하는 동일한 효능을 갖는다.
실시예 1 내지 13에서, 항 PD-1*1/사이토카인 작제물을 위해 포맷 IgG1 N297A를 사용하였다. 본 발명자들은 LALA PG 추가 돌연변이를 갖는 또 다른 Fc 사일런트 형식을 시험하였으며, 이러한 돌연변이는 LALA PG 돌연변이가 FcR 수용체에 대한 결합을 손상시키기 때문에 ADCC, ADCP 및 CDC 활성을 완전히 제거하는 것으로 설명되었다.
항 PD-1*1 IL7W142H*1의 IL-7R 활성을 pSTAT5 활성에 의해 평가하였다(도 28). CD4 및 CD8 인간 T 세포에 대한 활성 기간의 차이는 2개의 작제물 사이에서 발견되지 않았으며 이는 본 발명이 상이한 Fc 사일런트 이소형으로 작제될 수 있음을 나타낸다.
실시예 15: IgG1 N297A 이소형 또는 RcRn 결합을 개선하기 위한 변이체 또는 더 낮은 전하 pHi를 갖는 변이체로 작제된 항 PD-1*1 IL7v *1은 인간 T 세포로 pSTAT5 신호전달을 활성화하는 동일한 효능을 갖는다.
본 발명자들은 새로운 항 PD-1*1 IL7W142H*1 돌연변이체: FcRn 결합을 개선하기 위한 Fc 도메인의 돌연변이(YTE, LS, DHS) 또는 도 29에 기술된 바와 같은 경쇄 항 PD-1*1에서의 돌연변이를 포함하는 이기능성 분자의 여러 구조를 설계하고 이의 생물학적 활성을 비교하였다. 모든 항 PD-1/IL7 W142H 작제물은 ELISA 분석에 의해 입증된 바와 같이 항 PD-1*1 IL7W142H*1 N297A 항체와 유사하게 PD-1 수용체에 대해 높은 친화성을 갖는다(도 29). 이러한 항 PD-1*1 IL7W142H*1 돌연변이체는 SEQ ID NO: 24에 정의된 VH 및 SEQ ID NO: 5에 정의된 IL-7, 및 SEQ ID NO: 28, 88 또는 99에 정의된 VL을 포함한다.
항 PD-1/IL7 W142H 돌연변이체 분자는 항 PD-1*1 IL7W142H*1 N297A 이기능성 분자와 유사한 높은 pSTAT5 활성을 보여주었으며, 이는 나이브 T 림프구(PD1-세포) 상에서 항 PD-1*1 IL-7wt*1보다 더 낮은 활성을 가졌다(도 30). 이러한 관찰에 기초하여, Fc 도메인 또는 VL 도메인으로의 돌연변이는 본 발명의 맥락에서 유용한 대안적인 백본을 뒷받침한다.
재료 및 방법
ELISA 결합 PD1
활성 ELISA 분석을 위해, 재조합 hPD1(Sino Biologicals, 중국 베이징 소재; 참조 10377-H08H)을 탄산염 완충액(pH 9.2)에서 0.5 μg/ml로 플라스틱에 고정화하고, 정제된 항체를 첨가하여 결합을 측정했다. 인큐베이션 및 세척 후, 퍼옥시다제-표지된 당나귀 항-인간 IgG(Jackson Immunoresearch; 미국 소재; 참조 709-035-149)를 첨가하고 통상적인 방법에 의해 밝혀내었다.
ELISA 길항제: PDL1과 인간화 항-PD1 간의 경쟁
PD-1:PD-L1 억제제 스크리닝 ELISA 분석 쌍(AcroBiosystems; 미국 소재; 참조 EP-101)에 의해 경쟁적 ELISA 분석을 수행하였다. 이 분석에서, 재조합 hPDL1은 PBS pH7.4 완충액에서 2 μg/ml로 플라스틱에 고정하였다. 정제된 항체(상이한 농도)를 0.66 μg/ml 최종(고정 농도) 비오티닐화 인간 PD1(AcroBiosystems; 미국 소재; 참조 EP-101)과 혼합하여 37℃에서 2시간 동안 경쟁적 결합을 측정하였다. 인큐베이션 및 세척 후, 비오틴-PD-1Fc 결합을 검출하기 위해 퍼옥시다아제-표지된 스트렙타비딘(Vector laboratoring; 미국 소재; 참조 SA-5004)을 첨가하고 통상적인 방법으로 밝혀냈다.
pSTAT5 분석
건강한 인간 지원자의 말초 혈액에서 단리된 PBMC를 항 PD-1/IL-7 분자와 함께 37℃에서 15분 동안 인큐베이션했다.
시스 활성을 측정하기 위해, CD127 및 PD-1로 형질도입된 U937 세포를 CD127+로만 형질도입된 U937 세포와 혼합하였다. 세포를 1:1 비율로 혼합된 세포 증식 염료(CPDe450 또는 CPDe670, thermofisher)로 염색하고 37℃에서 15분 동안 시험된 분자로 처리하였다. 각각의 세포의 하위 집합을 세포 증식 염료(CPDe450 또는 CPDe670)로 표지하고 배양하였다. 이어서 세포를 고정하고, 투과화하고 AF647 표지된 항-pSTAT5(클론 47/Stat5(pY694), BD Bioscience)로 염색하였다. 인간 PBMC의 경우, CD3+ T 세포 집단 내로의 pSTAT5 활성화를 평가하였다. U937 분석을 위해, U937 PD1+ CD127+ 세포 및 U937 CD127+ 세포 내로의 pSTAT5 활성화를 평가하였다.
세포 결합 분석
CD127 및 PD-1으로 형질도입된 U937를 CD127+만으로 형질도입된 U937과 혼합했다. 세포를 1:1의 비율로 혼합된 세포 증식 염료(CPDe450 또는 CPDe670, Thermofisher)로 염색하였다. 세포를 황색/생존 사멸 고정가능한 염색(Thermofisher)으로 염색한 다음, PBS 2% 인간 혈청(BD Bioscience) 중에 희석된 인간 Fc Block으로 염색하였다. 이어서 세포를 연속 농도의 시험된 분자로 염색하고 항-인간 IgG-PE 항체(Biolegend, 클론 HP6017)를 사용하여 항체를 밝혀내고 유세포 분석으로 분석하였다.
생체 내 항 PD-1/IL7의 약동학
약동학을 분석하기 위해, 분자의 단일 용량을 C57bl6JrJ 마우스(암컷 6 내지 9주)에 안와 내 또는 복강 내로 또는 정맥 내(안와 후) 주사하였다. 혈장 중 약물 농도는 IgG 융합된 Il67을 함유하는 고정된 항-인간 경쇄 항체(클론 NaM76-5F3) 희석된 혈청을 사용하여 ELISA에 의해 결정하였다. 검출은 퍼옥시다제-표지된 당나귀 항-인간 IgG(Jackson Immunoresearch; 미국 소재; 참조 709-035-149)를 이용하여 수행하였고 통상적인 방법으로 밝혀내었다.
Promega 세포-기반 생물분석을 사용한 T 세포 활성화 분석
Promega PD-1/PD-L1 키트(참조 J1250)를 사용하여 항-PD-1 항체 복원 T 세포 활성화의 능력을 시험하였다. (1) 이펙터 T 세포(PD-1, NFAT-유도 루시퍼라제를 안정적으로 발현하는 Jurkat) 및 (2) 활성화 표적 세포(항원-독립적 방식으로 동족 TCR을 자극하도록 설계된 PDL1 및 표면 단백질을 안정적으로 발현하는 CHO K1 세포)의 2개의 세포주를 사용하였다. 세포를 공배양할 때, PD-L1/PD-1 상호작용은 TCR 매개 활성화를 억제하여 NFAT 활성화 및 루시퍼라제 활성을 차단한다. 항 PD-1 항체의 추가는 NFAT 활성화 및 루시퍼라제 합성 및 생물발광 신호 방출로 이어지는 PD-1 매개 억제 신호를 차단한다. 실험은 제조업체의 권장 사항에 따라 수행되었다. 시험 분자의 연속 희석액을 시험하였다. PD-L1+ 표적 세포, PD-1 이펙터 세포 및 시험 분자의 공동 배양 후 4시간 후에, BioGloTM 루시페린 기질을 웰에 첨가하고 플레이트를 TecanTM 발광계를 사용하여 판독했다.
생체 내 증식
이기능성 분자(34 nM/kg)의 단일 용량을 피하 MC38 종양이 있는 C57bl6JrJ 마우스(암컷 6 내지 9주)에 복강내 주사했다. 마우스를 복강 내 주사를 통해 1회 용량(34 nM/kg)으로 처리하였다. 치료 후 4일째에, 혈액을 수집하고, T 세포를 항 CD45, CD3, 항 CD8, 항 CD4 항체 및 항 ki67 항체로 염색하여 유세포 분석으로 증식을 정량화하였다.
생체 내 인간화 PD1 녹 인 마우스 모델
항 PD-1/IL-7 분자의 효능을 인간 PD-1(엑손 2)을 발현하도록 유전적으로 변형된 동계 면역적격 마우스 모델에서 생체 내에서 평가하였다. 동소위 중피종 모델의 경우, AK7 중피 세포를 복강 내로 주입하고(3e6 세포/마우스) 4/6/8일차에 동등한 약물 노출 용량[항 PD-1*2(1mg/kg), 항 PD-1*1/IL-7*1, 4 mg/kg]으로 처리하였다. 주입된 AK7 세포는 루시퍼라제를 안정적으로 발현하여 D-루시페린(3μg/마우스, GoldBio, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재, 참조 115144-35-9)의 복강 내 주입 후 생물발광 신호를 생체 내에서 생성할 수 있다. 루시페린 주입 10분 후, 생물발광 신호를 마우스의 등쪽 및 복부 상에서 Biospace Imager에 의해 1분 동안 측정하였다. 데이터는 스테라디안 당 cm2 당 초 당 광자 단위로 분석되었으며 등쪽 및 복부 신호의 평균을 나타낸다. 각각의 군은 군 당 5 내지 7마리 마우스의 평균 +/- SEM을 나타낸다. 간암종 모델의 경우, Hepa1.6 간암종 세포를 문맥에 2.5e6 세포로 피하로 주입하였다. 이어서 마우스를 4/6/8일차에 동등한 약물 노출 용량[항 PD-1*2(1 mg/kg), 항 PD-1*1/IL-7*1, 4 mg/kg]으로 처리하였다.
항체 및 이기능성 분자
하기 항체 및 이기능성 분자가 본원에 개시된 상이한 실험에서 사용되었다: 펨브롤리주맙(키트루드라, Merck) 니볼루맙(옵디보, Bristol-Myers Squibb), 및 서열번호 24에 정의된 바와 같은 가변 중쇄(VH) 및 서열번호 28, 88 또는 99에 정의된 바와 같은 가변 경쇄(VL)를 포함하는 항-PD1 인간화 항체, 또는 서열번호 71에 정의된 바와 같은 중쇄 및 서열번호 72에 정의된 바와 같은 경쇄를 포함하는 항-PD1 키메라 항체를 포함하는 본원에 개시된 이작용성 분자.
작제물 1은 2개의 항 PD-1 항원 결합 도메인 및 2개의 IL-7 W142H 변이체를 포함한다(작제물 1은 항 PD-1*2 IL-7 W142H*2로도 지칭됨). 이러한 분자는 실시예 1 내지 7에서 시험한 작제물에 해당한다. 이러한 분자는 또한 BICKI-IL-7 W142H로도 지칭된다. 특히, 작제물 1은 SEQ ID NO: 24에 정의된 가변 중쇄(VH) 및 SEQ ID NO: 28에 정의된 가변 경쇄(VL)를 포함하거나 항-PD1 키메라 항체는 SEQ ID NO: 71에 정의된 중쇄 및 SEQ ID NO: 72에 정의된 경쇄를 포함한다. 분자는 또한 SEQ ID No: 5에 정의된 바와 같은 IL7 변이체를 포함한다.
실시예에서, BICKI-IL-7 WT로 지칭되는 대조군 분자는 작제물 1이지만 야생형 IL-7을 갖는 것에 해당한다. 이는 SEQ ID NO: 24에 정의된 가변 중쇄(VH) 및 SEQ ID NO: 28에 정의된 가변 경쇄(VL)를 포함한다. 분자는 IgG4 S288P 이소형을 갖는다.
또 다른 대조군 분자는 항-PD1*2(임의의 IL7 없음)이다. 분자는 SEQ ID NO: 79에 정의된 중쇄 및 SEQ ID NO: 80에 정의된 경쇄를 포함한다.
작제물 2는 2개의 항 PD-1 항원 결합 도메인 및 단일 IL-7 W142H 변이체를 포함한다(작제물 2는 항 PD-1*2 IL-7 W142H*1로도 지칭됨). 특히, 작제물 2는 SEQ ID NO: 24에 정의된 가변 중쇄(VH) 및 SEQ ID NO: 28에 정의된 가변 경쇄(VL)를 포함한다. 분자는 특히 SEQ ID NO: 83(홀)에 정의된 IL-7 W142H에 결합된 중쇄 또는 SEQ ID NO: 81(노브)에 정의된 중쇄 및 SEQ ID NO: 80에 정의된 경쇄를 포함한다.
작제물 3은 단일 항 PD-1 항원 결합 도메인 및 단일 IL-7 W142H 변이체를 포함한다(작제물 3은 항 PD-1*1 IL-7 W142H*1로도 지칭됨). 특히, 작제물 3은 SEQ ID NO: 24에 정의된 가변 중쇄(VH) 및 SEQ ID NO: 28에 정의된 가변 경쇄(VL)를 포함한다. 분자는 SEQ ID NO: 83에 정의된 IL-7 W142H에 결합된 중쇄, SEQ ID NO: 75에 정의된 Fc 영역 및 SEQ ID NO: 80에 정의된 경쇄를 포함한다.
항-PD-1*1로 지칭되는 대조군 작제물은 IL-7 변이체가 없다는 것을 제외하고 작제물 3과 유사하다. 이러한 대조군은 SEQ ID NO: 24에 정의된 가변 중쇄(VH) 및 SEQ ID NO: 28에 정의된 가변 경쇄(VL)를 포함한다. 분자는 SEQ ID NO: 81에 정의된 중쇄, SEQ ID NO: 75에 정의된 Fc 영역 및 SEQ ID NO: 80에 정의된 경쇄를 포함한다.
작제물 4는 단일 항 PD-1 항원 결합 도메인 및 2개의 IL-7 W142H 변이체를 포함한다(작제물 4는 항 PD-1*1 IL- W142H*2로도 지칭됨). 특히, 작제물 4는 SEQ ID NO: 24에 정의된 가변 중쇄(VH) 및 SEQ ID NO: 28에 정의된 가변 경쇄(VL)를 포함한다. 분자는 SEQ ID NO: 83에 정의된 IL-7 W142H에 결합된 중쇄, SEQ ID NO: 76에 정의된 IL-7 W142H에 결합된 Fc 영역 및 SEQ ID NO: 80에 정의된 경쇄를 포함한다.
작제물 2, 3 및 4를 IgG1 N298A 이소형으로 조작하고 아미노산 서열을 Fc 영역에서 돌연변이시켜 중쇄 A의 CH2 및 CH3 상의 노브 및 중쇄 B의 CH2 및 CH3 상의 홀을 생성하였다. 모든 항 PD-1 IL-7 및 항 PD-1*1 작제물은 IgG4 S288P 이소형으로 작제한 항 PD-1*2 작제물(IL-7 결여) 및 항-PD-1*2 IL7wt*2(BICKI-IL-7 WT)를 제외하고 IgG1N298A 돌연변이된 이소형을 포함한다.
실시예 3 내지 8에서 사용한 작제물의 설명
이기능성 항체의 상이한 작제물을 시험하고 비교하였다. 하기 포맷을 시험하였다: (1) 포맷 A(항 PD-1*2/IL-7*2), (2) 포맷 B(항 PD-1*2/ IL-7*1) (3) 포맷 C(중쇄에 융합된 항 PD-1*1/ IL-7*1). 포맷 C의 경우, Fc 도메인은 CH1 CH2 및 힌지 부분을 함유한다. 모든 작제물을 IgG1 N298A 이소형으로 조작하고 아미노산 서열을 Fc 부분에서 돌연변이시켜 중쇄 A의 CH2 및 CH3 상의 노브 및 중쇄 B의 CH2 및 CH3 상의 홀을 생성하였다. 모든 작제물은 Fc 도메인과 융합된 IL-7m 단백질 사이에 GGGGSGGGGSGGGGS 링커(SEQ ID NO: 70)를 포함한다.
SEQUENCE LISTING <110> OSE IMMUNOTHERAPEUTICS <120> BIFUNCTIONAL anti-PD-1/IL-7 MOLECULE <130> B3168PC01 <160> 101 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 152 <212> PRT <213> artificial <220> <223> IL7 <400> 1 Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu 1 5 10 15 Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser 20 25 30 Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp 35 40 45 Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg 50 55 60 Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu 65 70 75 80 Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val 85 90 95 Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser 100 105 110 Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu 115 120 125 Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys 130 135 140 Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His 145 150 <210> 2 <211> 152 <212> PRT <213> artificial <220> <223> IL7-SS1 <400> 2 Asp Ser Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu 1 5 10 15 Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser 20 25 30 Asn Ser Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp 35 40 45 Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg 50 55 60 Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu 65 70 75 80 Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val 85 90 95 Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser 100 105 110 Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu 115 120 125 Ser Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Ser Trp Asn Lys 130 135 140 Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His 145 150 <210> 3 <211> 152 <212> PRT <213> artificial <220> <223> IL7-SS2 <400> 3 Asp Ser Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu 1 5 10 15 Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser 20 25 30 Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Ser Asp 35 40 45 Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg 50 55 60 Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu 65 70 75 80 Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Ser Thr Gly Gln Val 85 90 95 Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser 100 105 110 Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu 115 120 125 Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Ser Trp Asn Lys 130 135 140 Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His 145 150 <210> 4 <211> 152 <212> PRT <213> artificial <220> <223> IL7-SS3 <400> 4 Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu 1 5 10 15 Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser 20 25 30 Asn Ser Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Ser Asp 35 40 45 Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg 50 55 60 Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu 65 70 75 80 Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Ser Thr Gly Gln Val 85 90 95 Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser 100 105 110 Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu 115 120 125 Ser Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys 130 135 140 Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His 145 150 <210> 5 <211> 152 <212> PRT <213> artificial <220> <223> IL7-W142H <400> 5 Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu 1 5 10 15 Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser 20 25 30 Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp 35 40 45 Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg 50 55 60 Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu 65 70 75 80 Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val 85 90 95 Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser 100 105 110 Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu 115 120 125 Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys His Asn Lys 130 135 140 Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His 145 150 <210> 6 <211> 152 <212> PRT <213> artificial <220> <223> IL7-W142Y <400> 6 Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu 1 5 10 15 Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser 20 25 30 Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp 35 40 45 Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg 50 55 60 Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu 65 70 75 80 Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val 85 90 95 Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser 100 105 110 Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu 115 120 125 Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Tyr Asn Lys 130 135 140 Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His 145 150 <210> 7 <211> 152 <212> PRT <213> artificial <220> <223> IL7-W142F <400> 7 Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu 1 5 10 15 Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser 20 25 30 Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp 35 40 45 Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg 50 55 60 Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu 65 70 75 80 Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val 85 90 95 Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser 100 105 110 Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu 115 120 125 Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Phe Asn Lys 130 135 140 Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His 145 150 <210> 8 <211> 152 <212> PRT <213> artificial <220> <223> IL7-Q11E <400> 8 Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Glu Tyr Glu Ser Val Leu 1 5 10 15 Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser 20 25 30 Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp 35 40 45 Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg 50 55 60 Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu 65 70 75 80 Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val 85 90 95 Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser 100 105 110 Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu 115 120 125 Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys 130 135 140 Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His 145 150 <210> 9 <211> 152 <212> PRT <213> artificial <220> <223> IL7-Y12F <400> 9 Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Phe Glu Ser Val Leu 1 5 10 15 Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser 20 25 30 Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp 35 40 45 Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg 50 55 60 Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu 65 70 75 80 Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val 85 90 95 Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser 100 105 110 Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu 115 120 125 Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys 130 135 140 Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His 145 150 <210> 10 <211> 152 <212> PRT <213> artificial <220> <223> IL7-M17L <400> 10 Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu 1 5 10 15 Leu Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser 20 25 30 Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp 35 40 45 Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg 50 55 60 Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu 65 70 75 80 Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val 85 90 95 Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser 100 105 110 Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu 115 120 125 Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys 130 135 140 Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His 145 150 <210> 11 <211> 152 <212> PRT <213> artificial <220> <223> IL7-Q22E <400> 11 Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu 1 5 10 15 Met Val Ser Ile Asp Glu Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser 20 25 30 Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp 35 40 45 Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg 50 55 60 Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu 65 70 75 80 Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val 85 90 95 Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser 100 105 110 Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu 115 120 125 Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys 130 135 140 Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His 145 150 <210> 12 <211> 152 <212> PRT <213> artificial <220> <223> IL7-D74E <400> 12 Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu 1 5 10 15 Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser 20 25 30 Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp 35 40 45 Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg 50 55 60 Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Glu Phe Asp Leu His Leu Leu 65 70 75 80 Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val 85 90 95 Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser 100 105 110 Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu 115 120 125 Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys 130 135 140 Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His 145 150 <210> 13 <211> 152 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL7-D74Q <400> 13 Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu 1 5 10 15 Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser 20 25 30 Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp 35 40 45 Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg 50 55 60 Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Gln Phe Asp Leu His Leu Leu 65 70 75 80 Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val 85 90 95 Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser 100 105 110 Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu 115 120 125 Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys 130 135 140 Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His 145 150 <210> 14 <211> 152 <212> PRT <213> artificial <220> <223> IL7-D74N <400> 14 Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu 1 5 10 15 Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser 20 25 30 Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp 35 40 45 Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg 50 55 60 Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asn Phe Asp Leu His Leu Leu 65 70 75 80 Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val 85 90 95 Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser 100 105 110 Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu 115 120 125 Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys 130 135 140 Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His 145 150 <210> 15 <211> 152 <212> PRT <213> artificial <220> <223> IL7-K81R <400> 15 Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu 1 5 10 15 Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser 20 25 30 Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp 35 40 45 Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg 50 55 60 Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu 65 70 75 80 Arg Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val 85 90 95 Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser 100 105 110 Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu 115 120 125 Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys 130 135 140 Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His 145 150 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> artificial <220> <223> LC CDR3 <400> 16 Phe Gln Gly Thr His Val Pro Asn Thr 1 5 <210> 17 <211> 117 <212> PRT <213> artificial <220> <223> HC variable domain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (105)..(105) <223> X is X1, D or E <220> <221> MISC_FEATURE <222> (106)..(106) <223> X is X2, and is T, H, A, Y, N, E or S <400> 17 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Arg Glu Pro Gly Met Xaa Xaa Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 18 <211> 117 <212> PRT <213> artificial <220> <223> HC variable domain <400> 18 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Arg Glu Pro Gly Met Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 19 <211> 117 <212> PRT <213> artificial <220> <223> HC variable domain <400> 19 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Arg Glu Pro Gly Met Asp Thr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 20 <211> 117 <212> PRT <213> artificial <220> <223> HC variable domain <400> 20 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Arg Glu Pro Gly Met Glu Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 21 <211> 117 <212> PRT <213> artificial <220> <223> HC variable domain <400> 21 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Arg Glu Pro Gly Met Asp His Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 22 <211> 117 <212> PRT <213> artificial <220> <223> HC variable domain <400> 22 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Arg Glu Pro Gly Met Asp Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 23 <211> 117 <212> PRT <213> artificial <220> <223> HC variable domain <400> 23 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Arg Glu Pro Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 24 <211> 117 <212> PRT <213> artificial <220> <223> HC variable domain <400> 24 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Arg Glu Pro Gly Met Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 25 <211> 117 <212> PRT <213> artificial <220> <223> HC variable domain <400> 25 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Arg Glu Pro Gly Met Asp Glu Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 26 <211> 112 <212> PRT <213> artificial <220> <223> LC variable domain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (34)..(34) <223> X is G or T <400> 26 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ala 20 25 30 Asn Xaa Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Thr His Val Pro Asn Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 27 <211> 112 <212> PRT <213> artificial <220> <223> LC variable domain <400> 27 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ala 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Thr His Val Pro Asn Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 28 <211> 112 <212> PRT <213> artificial <220> <223> LC variable domain <400> 28 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ala 20 25 30 Asn Thr Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Thr His Val Pro Asn Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 29 <211> 444 <212> PRT <213> artificial <220> <223> HC <400> 29 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Arg Glu Pro Gly Met Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro 210 215 220 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 225 230 235 240 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 245 250 255 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe 260 265 270 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 275 280 285 Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 290 295 300 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 305 310 315 320 Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 325 330 335 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln 340 345 350 Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 355 360 365 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 370 375 380 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 385 390 395 400 Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu 405 410 415 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 420 425 430 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 <210> 30 <211> 444 <212> PRT <213> artificial <220> <223> HC <400> 30 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Arg Glu Pro Gly Met Asp Thr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro 210 215 220 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 225 230 235 240 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 245 250 255 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe 260 265 270 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 275 280 285 Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 290 295 300 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 305 310 315 320 Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 325 330 335 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln 340 345 350 Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 355 360 365 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 370 375 380 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 385 390 395 400 Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu 405 410 415 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 420 425 430 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 <210> 31 <211> 444 <212> PRT <213> artificial <220> <223> HC <400> 31 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Arg Glu Pro Gly Met Glu Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro 210 215 220 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 225 230 235 240 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 245 250 255 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe 260 265 270 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 275 280 285 Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 290 295 300 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 305 310 315 320 Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 325 330 335 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln 340 345 350 Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 355 360 365 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 370 375 380 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 385 390 395 400 Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu 405 410 415 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 420 425 430 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 <210> 32 <211> 444 <212> PRT <213> artificial <220> <223> HC <400> 32 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Arg Glu Pro Gly Met Asp His Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro 210 215 220 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 225 230 235 240 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 245 250 255 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe 260 265 270 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 275 280 285 Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 290 295 300 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 305 310 315 320 Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 325 330 335 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln 340 345 350 Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 355 360 365 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 370 375 380 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 385 390 395 400 Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu 405 410 415 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 420 425 430 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 <210> 33 <211> 444 <212> PRT <213> artificial <220> <223> HC <400> 33 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Arg Glu Pro Gly Met Asp Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro 210 215 220 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 225 230 235 240 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 245 250 255 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe 260 265 270 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 275 280 285 Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 290 295 300 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 305 310 315 320 Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 325 330 335 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln 340 345 350 Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 355 360 365 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 370 375 380 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 385 390 395 400 Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu 405 410 415 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 420 425 430 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 <210> 34 <211> 444 <212> PRT <213> artificial <220> <223> HC <400> 34 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Arg Glu Pro Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro 210 215 220 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 225 230 235 240 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 245 250 255 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe 260 265 270 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 275 280 285 Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 290 295 300 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 305 310 315 320 Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 325 330 335 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln 340 345 350 Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 355 360 365 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 370 375 380 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 385 390 395 400 Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu 405 410 415 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 420 425 430 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 <210> 35 <211> 444 <212> PRT <213> artificial <220> <223> HC <400> 35 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Arg Glu Pro Gly Met Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro 210 215 220 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 225 230 235 240 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 245 250 255 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe 260 265 270 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 275 280 285 Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 290 295 300 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 305 310 315 320 Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 325 330 335 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln 340 345 350 Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 355 360 365 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 370 375 380 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 385 390 395 400 Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu 405 410 415 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 420 425 430 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 <210> 36 <211> 444 <212> PRT <213> artificial <220> <223> HC <400> 36 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Arg Glu Pro Gly Met Asp Glu Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro 210 215 220 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 225 230 235 240 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 245 250 255 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe 260 265 270 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 275 280 285 Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 290 295 300 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 305 310 315 320 Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 325 330 335 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln 340 345 350 Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 355 360 365 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 370 375 380 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 385 390 395 400 Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu 405 410 415 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 420 425 430 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 <210> 37 <211> 219 <212> PRT <213> artificial <220> <223> LC <400> 37 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ala 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Thr His Val Pro Asn Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 38 <211> 219 <212> PRT <213> artificial <220> <223> LC <400> 38 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ala 20 25 30 Asn Thr Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Thr His Val Pro Asn Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 39 <211> 327 <212> PRT <213> artificial <220> <223> HC constant domain <400> 39 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 <210> 40 <211> 107 <212> PRT <213> artificial <220> <223> LC contant domain <400> 40 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 41 <211> 30 <212> PRT <213> artificial <220> <223> HFR1 <400> 41 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30 <210> 42 <211> 14 <212> PRT <213> artificial <220> <223> HFR2 <400> 42 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly 1 5 10 <210> 43 <211> 32 <212> PRT <213> artificial <220> <223> HFR3 <400> 43 Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 44 <211> 11 <212> PRT <213> artificial <220> <223> HFR4 <400> 44 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 45 <211> 23 <212> PRT <213> artificial <220> <223> LFR1 <400> 45 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys 20 <210> 46 <211> 15 <212> PRT <213> artificial <220> <223> LFR2 <400> 46 Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 47 <211> 32 <212> PRT <213> artificial <220> <223> LFR3 <400> 47 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 48 <211> 10 <212> PRT <213> artificial <220> <223> LFR4 <400> 48 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 49 <211> 19 <212> PRT <213> artificial <220> <223> signal peptide <400> 49 Met Asp Trp Leu Trp Asn Leu Leu Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser 1 5 10 15 Ile Gln Ala <210> 50 <211> 19 <212> PRT <213> artificial <220> <223> signal peptide <400> 50 Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala 1 5 10 15 Ser Ser Ser <210> 51 <211> 5 <212> PRT <213> artificial <220> <223> HC CDR1 <400> 51 His Tyr Ala Met Asn 1 5 <210> 52 <211> 330 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Heavy chain constant domain (IgG1m-N298A) <400> 52 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 53 <211> 17 <212> PRT <213> artificial <220> <223> HC CDR2 <400> 53 Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe Thr 1 5 10 15 Gly <210> 54 <211> 8 <212> PRT <213> artificial <220> <223> HC CDR3 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> X is X1 (D or E) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> X is X2 and is T, H, A, Y, N, E or S <400> 54 Glu Arg Glu Pro Gly Met Xaa Xaa 1 5 <210> 55 <211> 8 <212> PRT <213> artificial <220> <223> HC CDR3 <400> 55 Glu Arg Glu Pro Gly Met Asp Ser 1 5 <210> 56 <211> 8 <212> PRT <213> artificial <220> <223> HC CDR3 <400> 56 Glu Arg Glu Pro Gly Met Asp Thr 1 5 <210> 57 <211> 8 <212> PRT <213> artificial <220> <223> HC CDR3 <400> 57 Glu Arg Glu Pro Gly Met Glu Ser 1 5 <210> 58 <211> 8 <212> PRT <213> artificial <220> <223> HC CDR3 <400> 58 Glu Arg Glu Pro Gly Met Asp His 1 5 <210> 59 <211> 8 <212> PRT <213> artificial <220> <223> HC CDR3 <400> 59 Glu Arg Glu Pro Gly Met Asp Ala 1 5 <210> 60 <211> 8 <212> PRT <213> artificial <220> <223> HC CDR3 <400> 60 Glu Arg Glu Pro Gly Met Asp Tyr 1 5 <210> 61 <211> 8 <212> PRT <213> artificial <220> <223> HC CDR3 <400> 61 Glu Arg Glu Pro Gly Met Asp Asn 1 5 <210> 62 <211> 8 <212> PRT <213> artificial <220> <223> HC CDR3 <400> 62 Glu Arg Glu Pro Gly Met Asp Glu 1 5 <210> 63 <211> 16 <212> PRT <213> artificial <220> <223> LC CDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> X is G or T <400> 63 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ala Asn Xaa Asn Thr Tyr Leu Glu 1 5 10 15 <210> 64 <211> 16 <212> PRT <213> artificial <220> <223> LC CDR1 <400> 64 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ala Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu 1 5 10 15 <210> 65 <211> 16 <212> PRT <213> artificial <220> <223> LC CDR1 <400> 65 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ala Asn Thr Asn Thr Tyr Leu Glu 1 5 10 15 <210> 66 <211> 7 <212> PRT <213> artificial <220> <223> LC CDR2 <400> 66 Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 67 <211> 9 <212> PRT <213> artificial <220> <223> linker C <400> 67 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 68 <211> 5 <212> PRT <213> artificial <220> <223> linker G4S <400> 68 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 69 <211> 10 <212> PRT <213> artificial <220> <223> linker (G4S)2 <400> 69 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 70 <211> 15 <212> PRT <213> artificial <220> <223> linker (G4S)3 <400> 70 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 71 <211> 444 <212> PRT <213> artificial <220> <223> HC anti-PD1 chimeric <400> 71 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Glu Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Ala Ala Phe 65 70 75 80 Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Lys Glu Arg Glu Pro Gly Met Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Ser 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro 210 215 220 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 225 230 235 240 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 245 250 255 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe 260 265 270 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 275 280 285 Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 290 295 300 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 305 310 315 320 Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 325 330 335 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln 340 345 350 Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 355 360 365 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 370 375 380 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 385 390 395 400 Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu 405 410 415 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 420 425 430 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 <210> 72 <211> 219 <212> PRT <213> artificial <220> <223> LC anti-PD1 chimeric <400> 72 Asp Val Leu Leu Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ala 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Thr Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 73 <211> 2670 <212> DNA <213> artificial <220> <223> VH-VK <400> 73 cagatccagc tggtgcagag cggctctgag ctgaagaagc caggcgcttc tgtgaaggtg 60 tcctgcaagg ccagcggcta caccttcaca cactatgcta tgaattgggt gagacaggct 120 ccaggacagg gactggagtg gatgggctgg atcaacacca atacaggcga gcctacctac 180 gctcagggct ttacaggccg cttcgtgttt tctctggata cctccgtgag cacagcctat 240 ctgcagatct ccagcctgaa ggctgaggac accgccgtgt actattgtgc tagggagagg 300 gagccaggaa tggataactg gggacagggc accctggtga cagtgtcttc cgctagcacc 360 aagggcccat cggtcttccc cctggcgccc tgctccagga gcacctccga gagcacagcc 420 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 480 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 540 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacgaagac ctacacctgc 600 aacgtagatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga gagttgagtc caaatatggt 660 cccccatgcc caccatgccc agcacctgag ttcctggggg gaccatcagt cttcctgttc 720 cccccaaaac ccaaggacac tctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac gtgcgtggtg 780 gtggacgtga gccaggaaga ccccgaggtc cagttcaact ggtacgtgga tggcgtggag 840 gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagttca acagcacgta ccgtgtggtc 900 agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtc 960 tccaacaaag gcctcccgtc ctccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 1020 cgagagccac aggtgtacac cctgccccca tcccaggagg agatgaccaa gaaccaggtc 1080 agcctgacct gcctggtcaa aggcttctac cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 1140 aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 1200 ttcttcctct acagcaggct aaccgtggac aagagcaggt ggcaggaggg gaatgtcttc 1260 tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cacagaagag cctctccctg 1320 tctccgggta aatgacagat ccagctggtg cagagcggct ctgagctgaa gaagccaggc 1380 gcttctgtga aggtgtcctg caaggccagc ggctacacct tcacacacta tgctatgaat 1440 tgggtgagac aggctccagg acagggactg gagtggatgg gctggatcaa caccaataca 1500 ggcgagccta cctacgctca gggctttaca ggccgcttcg tgttttctct ggatacctcc 1560 gtgagcacag cctatctgca gatctccagc ctgaaggctg aggacaccgc cgtgtactat 1620 tgtgctaggg agagggagcc aggaatggat aactggggac agggcaccct ggtgacagtg 1680 tcttccgcta gcaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg cgccctgctc caggagcacc 1740 tccgagagca cagccgccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 1800 gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 1860 tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacg 1920 aagacctaca cctgcaacgt agatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagagagtt 1980 gagtccaaat atggtccccc atgcccacca tgcccagcac ctgagttcct ggggggacca 2040 tcagtcttcc tgttcccccc aaaacccaag gacactctca tgatctcccg gacccctgag 2100 gtcacgtgcg tggtggtgga cgtgagccag gaagaccccg aggtccagtt caactggtac 2160 gtggatggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gttcaacagc 2220 acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag 2280 tacaagtgca aggtctccaa caaaggcctc ccgtcctcca tcgagaaaac catctccaaa 2340 gccaaagggc agccccgaga gccacaggtg tacaccctgc ccccatccca ggaggagatg 2400 accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctaccccag cgacatcgcc 2460 gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 2520 gactccgacg gctccttctt cctctacagc aggctaaccg tggacaagag caggtggcag 2580 gaggggaatg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacacag 2640 aagagcctct ccctgtctcc gggtaaatga 2670 <210> 74 <211> 660 <212> DNA <213> artificial <220> <223> VL-VD <400> 74 gacgtggtca tgacacagag cccactgtct ctgcctgtga ccctgggaca gccagcctct 60 atctcctgca gatccagcca gtctctggtg cacgctaaca ccaatacata cctggagtgg 120 tatcagcaga ggccaggaca gtccccaagg ctgctgatct acaaggtgtc caacagattc 180 agcggagtgc cagaccgctt tagcggatct ggatccggaa ccgacttcac cctgaagatc 240 tccagggtgg aggctgagga tgtgggcgtg tactattgtt tccagggcac ccatgtgcct 300 aatacatttg gccagggcac caagctggag atcaagcgta cggtggctgc accatctgtc 360 ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420 ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480 tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 540 agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 600 gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgttag 660 <210> 75 <211> 227 <212> PRT <213> artificial <220> <223> KIH-FcG1m (Knob) <400> 75 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly Lys 225 <210> 76 <211> 394 <212> PRT <213> artificial <220> <223> KIH-FcG1m-(G4S)3-W142H (Knob) <400> 76 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 225 230 235 240 Gly Ser Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser 245 250 255 Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile 260 265 270 Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile 275 280 285 Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys 290 295 300 Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His 305 310 315 320 Leu Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly 325 330 335 Gln Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr 340 345 350 Lys Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn 355 360 365 Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys His 370 375 380 Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His 385 390 <210> 77 <211> 227 <212> PRT <213> artificial <220> <223> KIH-FcG1m (Hole) <400> 77 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly Lys 225 <210> 78 <211> 394 <212> PRT <213> artificial <220> <223> KIH-FcG1m-(G4S)3-W142H (Hole) <400> 78 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 225 230 235 240 Gly Ser Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser 245 250 255 Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile 260 265 270 Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile 275 280 285 Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys 290 295 300 Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His 305 310 315 320 Leu Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly 325 330 335 Gln Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr 340 345 350 Lys Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn 355 360 365 Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys His 370 375 380 Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His 385 390 <210> 79 <211> 220 <212> PRT <213> artificial <220> <223> VHOSE279-CH1 <400> 79 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Arg Glu Pro Gly Met Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 <210> 80 <211> 219 <212> PRT <213> artificial <220> <223> VLOSE279-CL <400> 80 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ala 20 25 30 Asn Thr Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Thr His Val Pro Asn Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 81 <211> 447 <212> PRT <213> artificial <220> <223> VHOSE279-CH1-KIH-FcG1m (Knob) <400> 81 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Arg Glu Pro Gly Met Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 210 215 220 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 82 <211> 614 <212> PRT <213> artificial <220> <223> VHOSE279-CH1-KIH-FcG1m-(G4S)3-W142H (Knob) <400> 82 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Arg Glu Pro Gly Met Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 210 215 220 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly 435 440 445 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Cys 450 455 460 Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met Val 465 470 475 480 Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn Cys 485 490 495 Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp Ala Asn 500 505 510 Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln Phe 515 520 525 Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu Lys Val 530 535 540 Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val Lys Gly 545 550 555 560 Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser Leu Glu 565 570 575 Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe 580 585 590 Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys His Asn Lys Ile Leu 595 600 605 Met Gly Thr Lys Glu His 610 <210> 83 <211> 614 <212> PRT <213> artificial <220> <223> VHOSE279-CH1-KIH-FcG1m-(G4S)3-W142H (Hole) <400> 83 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Arg Glu Pro Gly Met Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 210 215 220 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly 435 440 445 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Cys 450 455 460 Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met Val 465 470 475 480 Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn Cys 485 490 495 Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp Ala Asn 500 505 510 Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln Phe 515 520 525 Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu Lys Val 530 535 540 Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val Lys Gly 545 550 555 560 Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser Leu Glu 565 570 575 Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe 580 585 590 Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys His Asn Lys Ile Leu 595 600 605 Met Gly Thr Lys Glu His 610 <210> 84 <211> 447 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-PD-1-CH1-KIH-FcG1m (Hole) <400> 84 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Arg Glu Pro Gly Met Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 210 215 220 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 85 <211> 614 <212> PRT <213> artificial <220> <223> anti-PD-1+CH1 IL7wt <400> 85 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Arg Glu Pro Gly Met Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 210 215 220 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly 435 440 445 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Cys 450 455 460 Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met Val 465 470 475 480 Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn Cys 485 490 495 Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp Ala Asn 500 505 510 Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln Phe 515 520 525 Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu Lys Val 530 535 540 Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val Lys Gly 545 550 555 560 Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser Leu Glu 565 570 575 Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe 580 585 590 Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu 595 600 605 Met Gly Thr Lys Glu His 610 <210> 86 <211> 614 <212> PRT <213> artificial <220> <223> anti-PD-1+CH1 IL7 W142H <400> 86 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Arg Glu Pro Gly Met Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 210 215 220 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly 435 440 445 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Cys 450 455 460 Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met Val 465 470 475 480 Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn Cys 485 490 495 Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp Ala Asn 500 505 510 Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln Phe 515 520 525 Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu Lys Val 530 535 540 Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val Lys Gly 545 550 555 560 Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser Leu Glu 565 570 575 Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe 580 585 590 Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys His Asn Lys Ile Leu 595 600 605 Met Gly Thr Lys Glu His 610 <210> 87 <211> 614 <212> PRT <213> artificial <220> <223> anti-PD-1-CH1-KIH-FcG1mIL7WT (Hole) <400> 87 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Arg Glu Pro Gly Met Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 210 215 220 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly 435 440 445 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Cys 450 455 460 Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met Val 465 470 475 480 Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn Cys 485 490 495 Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp Ala Asn 500 505 510 Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln Phe 515 520 525 Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu Lys Val 530 535 540 Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val Lys Gly 545 550 555 560 Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser Leu Glu 565 570 575 Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe 580 585 590 Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu 595 600 605 Met Gly Thr Lys Glu His 610 <210> 88 <211> 112 <212> PRT <213> artificial <220> <223> VLCNDOwt <400> 88 Asp Val Leu Leu Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ala 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Thr Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 89 <211> 16 <212> PRT <213> artificial <220> <223> CDR1 VLCNDOwt et VLvA-v3-11 <400> 89 Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ala Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu 1 5 10 15 <210> 90 <211> 9 <212> PRT <213> artificial <220> <223> CDR3 VLCNDOwt et VLvA-v3-11 <400> 90 Phe Gln Gly Ser His Val Pro Asn Thr 1 5 <210> 91 <211> 23 <212> PRT <213> artificial <220> <223> VLCNDOwt FR1 <400> 91 Asp Val Leu Leu Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys 20 <210> 92 <211> 15 <212> PRT <213> artificial <220> <223> VLCNDOwt FR2 <400> 92 Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 93 <211> 32 <212> PRT <213> artificial <220> <223> VLCNDOwt FR3 <400> 93 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Lys Ile Thr Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 94 <211> 10 <212> PRT <213> artificial <220> <223> VLCNDOwt FR4 <400> 94 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 95 <211> 23 <212> PRT <213> artificial <220> <223> VLvA-v3-11 FR1 <400> 95 Glu Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys 20 <210> 96 <211> 15 <212> PRT <213> artificial <220> <223> VLvA-v3-11 FR2 <400> 96 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 97 <211> 32 <212> PRT <213> artificial <220> <223> VLvA-v3-11 FR3 <400> 97 Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 98 <211> 10 <212> PRT <213> artificial <220> <223> VLvA-v3-11 FR4 <400> 98 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 99 <211> 112 <212> PRT <213> artificial <220> <223> VLvA-v3-11 <400> 99 Glu Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ala 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ile Pro 50 55 60 Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80 Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Asn Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 100 <211> 220 <212> PRT <213> artificial <220> <223> VLCNDOwt-CL <400> 100 Asp Val Leu Leu Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ala 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Thr Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 115 120 125 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 130 135 140 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 145 150 155 160 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 165 170 175 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 180 185 190 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 195 200 205 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 220 <210> 101 <211> 220 <212> PRT <213> artificial <220> <223> VLvA-v3-11 - CL <400> 101 Glu Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ala 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ile Pro 50 55 60 Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80 Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Asn Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 115 120 125 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 130 135 140 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 145 150 155 160 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 165 170 175 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 180 185 190 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 195 200 205 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 220

Claims (42)

  1. 단일 항원 결합 도메인 및 단일 IL-7 변이체를 포함하는 이기능성 분자로서,
    상기 이기능성 분자는 선택적으로 펩티드 링커를 통해 제1 Fc 사슬의 N-말단 단부에 C-말단 단부를 통해 공유적으로 연결된 항원-결합 도메인, 및 항원-결합 도메인 및 IL-7 변이체가 없는 상보적인 제2 Fc 사슬을 포함하는 제2 단량체를 포함하고,
    상기 i) IL-7 변이체는 선택적으로 펩티드 링커를 통해 상기 제1 Fc 사슬의 C-말단 단부에 공유적으로 연결되거나; ii) 단일 항원 결합 도메인은 가변 중쇄 및 가변 경쇄를 포함하고, IL-7 변이체는 경쇄의 C-말단 단부에 공유적으로 연결되고;
    상기 항원 결합 도메인은 PD-1에 결합하고;
    IL-7 변이체는 SEQ ID NO: 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 야생형 인간 IL-7(wth-IL-7)과 적어도 75% 동일성을 나타내고; IL-7 변이체는 i) IL-7 수용체(IL-7R)에 대한 wth-IL-7의 친화도와 비교하여 IL-7R에 대한 IL-7 변이체의 친화도를 감소시키고, ii) wth-IL-7을 포함하는 이기능성 분자와 비교하여 IL-7 변이체를 포함하는 이기능성 분자의 약동학을 개선하는, 이기능성 분자.
  2. 제1항에 있어서,
    IL-7 변이체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는, 이기능성 분자:
    (i) W142G, W142A, W142V, W142C, W142L, W142I, W142M, W142H, W142Y 및 W142F, 바람직하게는 W142H, W142F 또는 W142Y,
    (ii) C2S-C141S 및 C47S-C92S, C2S-C141S 및 C34S-C129S, 또는 C47S-C92S 및 C34S-C129S,
    (iii) D74E, D74Q 또는 D74N,
    iv) Q11E, Y12F, M17L, Q22E 및/또는 K81R; 또는 이들의 임의의 조합, 상기 아미노산 넘버링은 SEQ ID NO: 1에 제시되어 있음.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    IL-7 변이체는 바람직하게는 이의 N-말단 단부에 의해 제1 Fc 사슬의 C-말단 단부에 연결되는, 이기능성 분자.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    IL-7 변이체는 W142H, W142F 및 W142Y로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 치환을 포함하고, 상기 아미노산 넘버링은 SEQ ID NO: 1에 제시되어 있는, 이기능성 분자.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    IL-7 변이체는 아미노산 치환 W142H를 포함하는, 이기능성 분자.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    IL-7 변이체는 SEQ ID NO: 2 내지 15에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진, 이기능성 분자.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    IL-7 변이체는 SEQ ID NO: 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진, 이기능성 분자.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    이기능성 분자는 인간 IgG1의 중쇄 불변 도메인, 바람직하게는 Fc 도메인을 포함하고, 선택적으로 T250Q/M428L; M252Y/S254T/T256E + H433K/N434F; E233P/L234V/L235A/G236A + A327G/A330S/P331S; E333A; S239D/A330L/I332E; P257I/Q311; K326W/E333S; S239D/I332E/G236A; N297A; L234A/L235A; N297A + M252Y/S254T/T256E; N297A+N298A+ M252Y/S254T/T256E+ K444A, K322A, K444A, K444E, K444D, K444G, K444S, P329G, L234A/L235A/P329G, M428L, L309D, Q311H, N434S, M428L + N434S 및 L309D + Q311H + N434S로 이루어진 군으로부터 선택되는, 바람직하게는 선택적으로 M252Y/S254T/T256E, 및 L234A/L235A 또는 L234A/L235A/P329G와 조합된 N297A로 이루어진 군으로부터 선택되는 치환 또는 치환의 조합을 갖는, 이기능성 분자.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    본 발명에 따른 이기능성 분자는 인간 IgG1의 중쇄 불변 도메인, 바람직하게는 Fc 도메인을 포함하고, 선택적으로 T250Q/M428L; M252Y/S254T/T256E + H433K/N434F; E233P/L234V/L235A/G236A + A327G/A330S/P331S; E333A; S239D/A330L/I332E; P257I/Q311; K326W/E333S; S239D/I332E/G236A; N297A; L234A/L235A; N297A + M252Y/S254T/T256E; K322A 및 K444A로 이루어진 군, 바람직하게는 선택적으로 M252Y/S254T/T256E, 및 L234A/L235A와 조합된 N297A으로 이루어진 군으로부터 선택되는 치환 또는 치환의 조합을 갖는, 이기능성 분자.
  10. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    이기능성 분자는 인간 IgG4의 중쇄 불변 도메인, 바람직하게는 Fc 도메인을 포함하고, 선택적으로 S228P; L234A/L235A, S228P + M252Y/S254T/T256 + K444A, P329G, K444E, K444D, K444G, K444S, 및 L234A/L235A/P329G로 이루어진 군으로부터 선택되는 치환 또는 치환의 조합을 갖는, 이기능성 분자.
  11. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    본 발명에 따른 이기능성 분자는 인간 IgG4의 중쇄 불변 도메인, 바람직하게는 Fc 도메인을 포함하고, 선택적으로 S228P; L234A/L235A, S228P + M252Y/S254T/T256E 및 K444A로 이루어진 군으로부터 선택되는 치환 또는 치환의 조합을 갖는, 이기능성 분자.
  12. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    Fc 도메인은 돌연변이 LALA(L234A/L352A) 또는 LALA PG(L234A/L235A/P329G)를 포함하는 IgG1 또는 IgG4인, 이기능성 분자.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 Fc 사슬 및 제2 Fc 사슬은 이종이량체 Fc 도메인, 특히 노브-인투-홀(knob-into-hole) 이종이량체 Fc 도메인을 형성하는, 이기능성 분자.
  14. 제13항에 있어서,
    제1 Fc 사슬은 홀 또는 H 사슬이고, 치환 T366S/L368A/Y407V/Y349C 및 N297A를 포함하고, 제2 Fc 사슬은 노브 또는 K 사슬이고, 치환 T366W/S354C 및 N297A를 포함하는, 이기능성 분자.
  15. 제13항에 있어서,
    제2 Fc 사슬은 SEQ ID NO: 75를 포함하거나, 이로 이루어지고/지거나, 제1 Fc 사슬은 SEQ ID NO: 77을 포함하거나, 이로 이루어진, 이기능성 분자.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    이기능성 분자는 선택적으로 펩티드 링커를 통해 제1 이종이량체 Fc 사슬의 N-말단 단부에 C-말단 단부를 통해 공유적으로 연결된 항원-결합 도메인으로서, 상기 제1 이종이량체 Fc 사슬은 선택적으로 펩티드 링커를 통해 IL-7 변이체의 N-말단 단부에 C-말단 단부를 통해 공유적으로 연결되는 항원-결합 도메인을 포함하는 제1 단량체, 및 항원-결합 도메인이 없는 상보적인 제2 이종이량체 Fc 사슬을 포함하는 제2 단량체를 포함하는, 이기능성 분자.
  17. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    IL-7 변이체는 GGGGS(SEQ ID NO: 68), GGGGSGGGS(SEQ ID NO: 67), GGGGSGGGGS(SEQ ID NO: 69) 및 GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO: 70)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 바람직하게는 (GGGGS)3인 펩티드 링커에 의해 항원 결합 도메인 또는 Fc 도메인에 융합된, 이기능성 분자.
  18. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    IL-7 변이체는 SEQ ID 70의 펩티드 링커에 의해 항원 결합 도메인 또는 Fc 도메인에 융합된, 이기능성 분자.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원-결합 도메인은 Fab 도메인, Fab', 단일-사슬 가변 단편(scFV) 또는 단일 도메인 항체(sdAb)인, 이기능성 분자.
  20. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원-결합 도메인은 Fab 도메인 또는 Fab'인, 이기능성 분자.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원 결합 도메인은 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 세미플리맙, 캄렐리주맙, AUNP12, AMP-224, AGEN-2034, BGB-A317, 스파르탈리주맙, MK-3477, SCH-900475, PF-06801591, JNJ-63723283, 제놀림주맙, LZM-009, BCD-100, SHR-1201, BAT-1306, AK-103, MEDI-0680, MEDI0608, JS001, BI-754091, CBT-501, INCSHR1210, TSR-042, GLS-010, AM-0001, STI-1110, AGEN2034, MGA012, 또는 IBI308, 5C4, 17D8, 2D3, 4H1, 4A11, 7D3, 및 5F4로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체로부터 유래하는, 이기능성 분자.
  22. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원 결합 도메인은 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 세미플리맙, 캄렐리주맙, 스파르탈리주맙 및 제놀림주맙으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체로부터 유래하는, 이기능성 분자.
  23. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원 결합 도메인은 펨브롤리주맙 또는 니볼루맙으로부터 유래하는, 이기능성 분자.
  24. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원 결합 도메인은 (i) SEQ ID NO: 51의 CDR1, SEQ ID NO: 53의 CDR2 및 SEQ ID NO: 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 또는 62의 CDR3을 포함하는 중쇄; 및 (ii) SEQ ID NO: 64 65, 89의 CDR1, SEQ ID NO: 66의 CDR2 및 SEQ ID NO: 16 또는 90의 CDR3을 포함하는 경쇄를 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어진, 이기능성 분자.
  25. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원 결합 도메인은 (i) SEQ ID NO: 51의 CDR1, SEQ ID NO: 53의 CDR2 및 SEQ ID NO: 61의 CDR3을 포함하는 중쇄; 및 (ii) SEQ ID NO: 65의 CDR1, SEQ ID NO: 66의 CDR2 및 SEQ ID NO: 16의 CDR3을 포함하는 경쇄를 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어진, 이기능성 분자.
  26. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원 결합 도메인은 하기를 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어진, 이기능성 분자:
    (a) SEQ ID NO: 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 영역(VH);
    (b) SEQ ID NO: 27 SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 88 또는 SEQ ID NO :99의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 영역(VL).
  27. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원 결합 도메인은 SEQ ID NO: 24의 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 28의 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어진, 이기능성 분자.
  28. 제1항 내지 제20항, 또는 제26항, 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원-결합 도메인은 SEQ ID NO: 24의 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 28의 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지고, IL-7 변이체는 아미노산 치환 W142H를 포함하고, 아미노산 넘버링은 SEQ ID NO: 1에 제시된 바와 같고, 바람직하게는 SEQ ID: 5에 정의된 바와 같은, 이기능성 분자.
  29. 제1항 내지 제20항, 또는 제26항 내지 제 28항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 항원-결합 도메인은 SEQ ID NO: 24의 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 28의 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지고;
    (ii) IL-7 변이체는 SEQ ID: 5에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지고;
    (iii) 제2 Fc 사슬은 SEQ ID NO: 75를 포함하거나, 이로 이루어지고/지거나 제1 Fc 사슬이 SEQ ID NO: 77을 포함하거나, 이로 이루어진, 이기능성 분자.
  30. 제29항에 있어서,
    이기능성 분자는 SEQ ID NO: 70의 펩티드 링커를 추가로 포함하는, 이기능성 분자.
  31. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    이기능성 분자는 SEQ ID NO: 83의 제1 단량체, SEQ ID NO: 75의 제2 단량체, 및 SEQ ID NO: 37, 38, 80, 100 또는 101 바람직하게는 SEQ ID NO: 38 또는 80의 제3 단량체를 포함하는, 이기능성 분자.
  32. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    이기능성 분자는 SEQ ID NO: 83을 포함하거나, 이로 이루어진 제1 단량체, SEQ ID NO: 75를 포함하거나, 이로 이루어진 제2 단량체, 및 SEQ ID NO: 80을 포함하거나, 이로 이루어진 제3 단량체를 포함하는, 이기능성 분자.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 이기능성 분자를 코딩하는 단리된 핵산 서열 또는 단리된 핵산 분자의 군.
  34. 제33항에 따른 단리된 핵산을 포함하는 숙주 세포.
  35. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 이기능성 분자, 제33항에 따른 단리된 핵산 또는 제34항에 따른 숙주 세포를, 선택적으로 약학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는 약학 조성물.
  36. 약제로서 사용하기 위한, 특히 암 또는 감염 질환의 치료에서 사용하기 위한, 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 이기능성 분자, 제33항에 따른 단리된 핵산, 제34항에 따른 숙주 세포 또는 제35항의 약학 조성물.
  37. 제36항에 있어서,
    이펙터 기억 줄기 유사 T 세포의 자극에 의해 암 또는 바이러스 감염의 치료에서 사용하기 위한, 이기능성 분자, 핵산, 숙주 세포 또는 약학 조성물.
  38. 암 또는 바이러스 감염의 치료를 필요로 하는 대상체에서 암 또는 바이러스 감염의 치료 방법으로서,
    상기 방법은 치료 유효량의 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 이기능성 분자, 제33항의 단리된 핵산, 제34항의 숙주 세포, 또는 제35항의 약학 조성물을 투여하여 이펙터 기억 줄기 유사 T 세포를 자극하는 단계를 포함하는, 방법.
  39. 제36항 또는 제37항, 또는 제38항에 있어서,
    암은 조혈암, 고형암, 암종, 자궁경부암, 결장직장암, 식도암, 위암, 위장관암, 두경부암, 신장암, 간암, 폐암, 림프종, 신경교종, 중피종, 흑색종, 위암, 요도암 환경적으로 유발된 암 및 상기 암의 임의의 조합, 전이성 또는 비 전이성, 흑색종, 악성 중피종, 비-소세포 폐암, 신세포 암종, 호지킨 림프종, 두경부암, 요로상피 암종, 결장직장암, 간세포 암종, 소세포 폐암 전이성 메르켈 세포 암종, 위암 또는 위식도암, 자궁경부암, 혈액림프양 신생물, 혈관면역모세포 T 세포 림프종, 골수이형성 증후군, 급성 골수성 백혈병, 카포시 육종; 인간 유두종 바이러스와 관련된 자궁경부암, 항문암, 음경암 및 외음부 편평 세포 암 및 구강인두암; 미만성 거대 B-세포 림프종을 포함하는 B 세포 비-호지킨 림프종(NHL), 버킷 림프종, 형질모구 림프종, 원발성 중추 신경계 림프종, HHV-8 원발성 삼출성 림프종, 고전적 호지킨 림프종, 및 엡스타인-바 바이러스(EBV) 및/또는 카포시 육종 헤르페스 바이러스와 관련된 림프증식성 장애; B형 간염 및/또는 C형 간염 바이러스와 관련된 간세포 암종; 메르켈 세포 폴리오마 바이러스(MPV)와 관련된 메르켈 세포 암종; 및 인간 면역결핍 바이러스 감염(HIV) 감염과 관련된 암으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 이기능성 분자, 핵산, 숙주 세포 또는 약학 조성물, 또는 방법.
  40. 제36항 또는 제37항, 또는 제38항에 있어서,
    바이러스 감염은 HIV, 간염 바이러스 예컨대 A형, B형, 또는 C형 간염, 헤르페스 바이러스 예컨대 VZV, HSV-1, HAV-6, HSV-II, CMV 및 엡스타인 바 바이러스, 아데노바이러스, 인플루엔자 바이러스, 플라비바이러스, 에코바이러스, 리노바이러스, 콕사키 바이러스, 코로나바이러스, 호흡기 융합 바이러스, 멈프스 바이러스, 로타바이러스, 홍역 바이러스, 풍진 바이러스, 파보바이러스, 백시니아 바이러스, HTLV 바이러스, 뎅기열 바이러스, 유두종바이러스, 몰루스컴 바이러스, 폴리오바이러스, 광견병 바이러스, JC 바이러스 및 아르보바이러스 뇌염 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스에 의해 야기되는, 이기능성 분자, 핵산, 숙주 세포 또는 약학 조성물, 또는 방법.
  41. 제36항, 제37항, 제39항, 또는 제40항에 있어서,
    화학요법, 방사선 요법, 표적화요법, 항혈관형성제, 저메틸화제, 암 백신, 종양 항원의 에피토프 또는 네오에피토프, 골수 체크포인트 억제제, 면역요법제, 및 HDAC 억제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 치료제 또는 요법과 병용하여 사용하기 위한, 이기능성 분자, 핵산, 숙주 세포 또는 약학 조성물.
  42. 제41항에 있어서,
    치료제는 항-CTLA4, 항-CD2, 항-CD28, 항-CD40, 항-HVEM, 항-BTLA, 항-CD160, 항-TIGIT, 항-TIM-1/3, 항-LAG-3, 항-2B4, 및 항-OX40, 항-CD40 작용제, CD40-L, TLR 작용제, 항-ICOS, ICOS-L 및 B-세포 수용체 작용제로 이루어진 군으로부터 선택되는 적응 면역 세포(T 및 B 림프구)의 면역 체크포인트 차단제 또는 활성화제인, 이기능성 분자, 핵산, 숙주 세포 또는 약학 조성물.
KR1020237023523A 2020-12-17 2021-12-17 이기능성 항-pd1/il-7 분자 KR20230129441A (ko)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/EP2020/086600 WO2021122866A1 (en) 2019-12-17 2020-12-17 Bifunctional molecules comprising an il-7 variant
EPPCT/EP2020/086600 2020-12-17
EP21305462.0 2021-04-09
EP21305462 2021-04-09
EP21200350 2021-09-30
EP21200350.3 2021-09-30
PCT/EP2021/086471 WO2022129512A1 (en) 2020-12-17 2021-12-17 Bifunctional anti-pd1/il-7 molecules

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20230129441A true KR20230129441A (ko) 2023-09-08

Family

ID=79024880

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020237023523A KR20230129441A (ko) 2020-12-17 2021-12-17 이기능성 항-pd1/il-7 분자

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20240067727A1 (ko)
EP (1) EP4263606A1 (ko)
JP (1) JP2023554097A (ko)
KR (1) KR20230129441A (ko)
AU (1) AU2021402065A1 (ko)
CA (1) CA3201729A1 (ko)
IL (1) IL303745A (ko)
MX (1) MX2023007301A (ko)
WO (1) WO2022129512A1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2022307460A1 (en) * 2021-07-09 2024-01-04 Bright Peak Therapeutics Ag Checkpoint inhibitors conjugated to il-2, and uses thereof

Family Cites Families (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2162823T5 (es) 1992-08-21 2010-08-09 Vrije Universiteit Brussel Inmunoglobulinas desprovistas de cadenas ligeras.
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
EP0739981A1 (en) 1995-04-25 1996-10-30 Vrije Universiteit Brussel Variable fragments of immunoglobulins - use for therapeutic or veterinary purposes
CN1406249B (zh) 2000-02-11 2010-06-16 默克专利股份有限公司 增加基于抗体的融合蛋白的循环半衰期
WO2005063820A2 (en) * 2003-12-30 2005-07-14 Merck Patent Gmbh Il-7 fusion proteins
CA2591297C (en) 2004-12-09 2015-01-13 Stephen D. Gillies Il-7 variants with reduced immunogenicity
CA2607147C (en) 2005-05-09 2018-07-17 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. Human monoclonal antibodies to programmed death 1 (pd-1) and methods for treating cancer using anti-pd-1 antibodies alone or in combination with other immunotherapeutics
EP2038417A2 (en) * 2006-07-06 2009-03-25 Merck Patent GmbH Compositions and methods for enhancing the efficacy of il-2 mediated immune responses
MX352929B (es) 2010-11-05 2017-12-13 Zymeworks Inc DISEÑO DE ANTICUERPOS HETERODIMÉRICOS ESTABLES CON MUTACIONES EN EL DOMINIO Fc.
EA201892619A1 (ru) * 2011-04-29 2019-04-30 Роше Гликарт Аг Иммуноконъюгаты, содержащие мутантные полипептиды интерлейкина-2
EP3587448B1 (en) 2013-03-15 2021-05-19 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
CA2913977C (en) 2013-05-31 2022-11-29 Sorrento Therapeutics, Inc. Antigen binding proteins that bind pd-1
GEP20227419B (en) 2015-07-30 2022-10-10 Macrogenics Inc Pd-1-binding molecules and methods of use thereof
WO2017024465A1 (en) 2015-08-10 2017-02-16 Innovent Biologics (Suzhou) Co., Ltd. Pd-1 antibodies
KR20220131277A (ko) 2015-09-01 2022-09-27 아게누스 인코포레이티드 항-pd-1 항체 및 이를 이용하는 방법
CN111385767A (zh) 2016-02-02 2020-07-07 华为技术有限公司 确定发射功率的方法、用户设备和基站
WO2017132827A1 (en) 2016-02-02 2017-08-10 Innovent Biologics (Suzhou) Co., Ltd. Pd-1 antibodies
CA3035932A1 (en) 2016-09-14 2018-03-22 Abbvie Biotherapeutics Inc. Anti-pd-1 antibodies and their uses
BR112020010536A2 (pt) 2018-01-25 2020-12-01 I-Mab Biopharma Us Limited molécula de fusão, proteína e célula isoladas, composição, e, método para tratar um câncer
EP3781598A1 (en) * 2018-04-18 2021-02-24 Xencor, Inc. Tim-3 targeted heterodimeric fusion proteins containing il-15/il-15ra fc-fusion proteins and tim-3 antigen binding domains
AU2019256539A1 (en) * 2018-04-18 2020-11-26 Xencor, Inc. PD-1 targeted heterodimeric fusion proteins containing IL-15/IL-15Ra Fc-fusion proteins and PD-1 antigen binding domains and uses thereof
EP3820724B1 (en) 2018-07-10 2023-08-30 Iveco S.p.A. Vehicle comprising a suspension system
CN113614109A (zh) 2018-12-21 2021-11-05 Ose免疫疗法公司 双功能抗pd-1/il-7分子
MX2021007290A (es) 2018-12-21 2022-03-17 Ose Immunotherapeutics Anticuerpo humanizado anti-pd-1 humana.
CN110256583B (zh) * 2019-07-11 2022-05-20 中国科学院生物物理研究所 一种il-2突变体与抗体的融合蛋白及其应用
AU2020406083A1 (en) * 2019-12-17 2022-06-16 Ose Immunotherapeutics Bifunctional molecules comprising an IL-7 variant

Also Published As

Publication number Publication date
WO2022129512A1 (en) 2022-06-23
CA3201729A1 (en) 2022-06-23
JP2023554097A (ja) 2023-12-26
AU2021402065A1 (en) 2023-06-29
MX2023007301A (es) 2023-07-04
US20240067727A1 (en) 2024-02-29
EP4263606A1 (en) 2023-10-25
IL303745A (en) 2023-08-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9382319B2 (en) Hybrid constant regions
KR102371173B1 (ko) 인간화된 항-인간-pd-1 항체
EP2760891B1 (en) Hybrid constant regions
KR20210107058A (ko) 인간 pd-1에 대항하는 이작용성 분자
KR20210108978A (ko) 이작용성 항-pd-1/il-7 분자
WO2021122866A1 (en) Bifunctional molecules comprising an il-7 variant
KR20210107062A (ko) 이작용성 항-PD-1/SIRPα 분자
US20230303648A1 (en) Bifunctional molecules comprising an il-7 variant
CN116848140A (zh) 双功能抗pd1/il-7分子
KR20230129441A (ko) 이기능성 항-pd1/il-7 분자
EP4047021A1 (en) Ox40/pd-l1 bispecific antibody
KR20240005741A (ko) 특성이 향상된 이작용성 분자용 신규한 스캐폴드
WO2024028386A1 (en) Multifunctional molecule directed against cd28