KR20210108978A - 이작용성 항-pd-1/il-7 분자 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 항-PD-1 항체 및 IL-7을 포함하는 이작용성 분자 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

이작용성 항-PD-1/IL-7 분자
발명의 분야
본 발명은 면역치료요법(immunotherapy) 분야에 관한 것이다. 본 발명은 항-PD1 항체 또는 이의 항체 단편을 포함하는 이작용성 분자(bifunctional molecule)를 제공한다.
발명의 배경
치료학적 항체를 사용한 탈-억제(de-inhibition)용 T 세포 억제 체크포인트(T cell inhibition checkpoint)를 표적화하는 접근법은 집중 연구 영역이다(고찰을 위한 참고: Pardoll, Nat Rev Cancer. 2012; 12:253-264). 적응 면역(adaptive immunity)의 면역 체크포인트를 표적화하는 것은 다수의 암과 싸우기 위한 큰 치료 효능을 나타내었지만, 환자 중 제한된 비율에서만 나타내었다. 면역 체크포인트 치료요법을 다른 면역치료학적 전략과 조합하는 것은 전임상 모델에서 큰 효능이 입증되었지만 임상에서는 도전과제로 남아있다.
면역 세포 활성화는 균형 공-자극성 및 공-억제성 신호의 통합에 의해 통제된다. T 세포 수용체(TCR)-매개된 T 세포 활성화는 공-자극성 및 공-억제성 신호 둘 모두에 의해 조절된다. 항원-독립적인 제2의 신호는 항원성 펩타이드-MHC 복합체와 TCR의 상호작용에 의해 제공된, 제1의 신호를 변형시키며, 이는 반응에 대한 특이성을 부여한다. T 세포 공-자극성 및 공-억제성 경로는 효과기(effector), 기억 및 조절성 T 세포 뿐만 아니라 나이브(naive) T 세포를 제어하는 광범위한 면역조절 기능을 갖는다. 이러한 경로의 치료학적 조절은 암을 치료하기 위한 효과적인 새로운 전략으로 바뀌고 있다(검토를 위한 참고: Schildberg et al., 44(5), Immunity, 2016). 면역 반응의 조절에 대해 진행되고 있는 연구는 암 치료요법의 개발을 위해 표적화될 수 있는 다수의 면역학적 경로의 확인을 이끌었다. 이러한 분자는 본원에서 면역 체크포인트 공-활성인자 또는 공-억제인자로서 지칭된다(검토를 위한 참고: Sharma et al., Cell, 161(2), 2015 및 Pardoll, Nature Reviews 암, 12(4), 2012).
프로그램화된 세포 사멸 단백질(programmed cell death protein) 1(PD-1, 또한 CD279로 공지됨)은 면역글로불린 상과(superfamily)에 속하는 세포 표면 단백질 분자이다. 이는 T 및 B 림프구 및 대식구에서 발현되며, 세포 운명 및 분화에서 역할을 담당한다. PD-1에 대한 2개의 리간드, PD-L1 및 PD-L2가 확인되었으며, 이는 PD-1과의 결합시 T 세포 활성화를 하향조절하는 것으로 밝혀졌다(Freeman et al. (2000) J Exp Med 192: 1027-34; Latchman et al. (2001) Nat Immunol 2:261-8; Carter et al. (2002) Eur J Immunol 32:634-43). PD-1과 이의 리간드 사이의 상호작용은 종양 침윤 림프구에서의 감소, T-세포 수용체 매개된 증식에서의 감소, 및 암 세포에 의한 면역 회피(immune evasion)를 야기한다. 특히, PD1 연결은 T 세포 상에서 TCR 자극의 하류로 신호를 감소시켜, T 세포 반응을 억제하고 활성화 및 사이토킨 생산을 감소시킨다.
PD-1/PD-L1 치료요법은 FDA에 의해 매우 광범위한 혈액 암 및 고형 암에 대한 제1 및 제2 라인 치료요법으로서의 치료용으로 승인되었지만 RECIST 기준에 의해 정의된 바와 같이 30% 이상의 종양 크기 감소를 기반으로 한 객관적인 반응은 암 아형 사이에서 매우 가변성이다.
높은 반응율은 난치성 호지킨 림프종(refractory Hodgkin's lymphoma)(65 내지 85%)(Borcherding N et al J Mol Biol. 2018 Jul 6; 430(14):2014-2029) 또는 높은 미세위성 불안전성 결장 암종(high microsatellite instability colon carcinoma)(MSI-H, 25% 내지 80%) 또는 메르켈 세포 암종(Merkel cell carcinoma)(56%)을 지닌 종양에서 관찰되었다.
중간의 객관적인 반응율이 흑색종(24 내지 44%) 및 비-소세포 폐암 환자(12.8 내지 43.7%)에서 관찰되며, 여기서 항 PD-1 치료요법이 제1 라인 치료로서 사용된다. 환자 중 일부만이 치료요법으로부터 이익을 얻을 지라도, PD-1/PD-L1 치료요법은 오래된 표준 보호 화학치료요법과 비교하여 전반적인 생존을 증진시켰다.
일부 고형 종양, 특히 췌장 암, 비-MSI 결장직장 암, 위암 및 일부 유방 암에서, 임상 반응이 낮거나 전혀 관찰되지 않았다(Borcherding N et al J Mol Biol. 2018 Jul 6;430(14):2014-2029).
다수의 메카니즘이 기술되었으며 PD-1/PD-L1 체크포인트 치료요법에 대한 차등적인 효능 및 내성을 설명할 수 있으며, 특히 이들 중 몇개는 T-세포 생물학, 예를 들면, (1) 기억 T-세포의 손상된 형성 (2) 손상된 T 세포 침윤 (3) 종양 특이적인 T 세포의 불충분한 생성 (4) T 세포의 부적절한 기능 및 (5) 조절성 T 세포에 의해 유도된 면역억제성 미세환경에 관한 것이다. IL-7 신호전달(signaling)을 표적화함으로써 치료를 조합하는 것은 T 세포 침윤을 자극하고, T 세포 효과기 능력을 유지하고 조절성 T 세포 확장 및 생존을 자극시키지 않고 장기-지속되는 기억 T 세포 반응을 촉진시킴으로써 항-PD-1 내성 환자를 극복하는 양호한 전략일 수 있다.
인터류킨-7은 적응성 면역계에서 중요한 역할을 하고 B 세포 및 T 세포에 의해 매개된 면역 반응을 촉진하는 IL-2 상과의 면역조절성 사이토킨 구성원이다. 이러한 사이토킨은 T 세포 및 B 세포의 생존 및 분화, 림프 세포의 생존, 천연 킬러(natural killer)(NK) 세포의 활성의 자극을 통해 면역 기능을 활성화시킨다. IL-7은 또한 림프 조직 유도인자(lymphoid tissue inducer)(LTi) 세포를 통한 림프구의 발달을 조절하고 나이브 T 세포 또는 기억 T 세포의 생존 및 분열을 촉진한다. 또한, IL-7은 IL-2 및 인터페론-γ의 분비를 촉진함으로써 인간에서 면역 반응을 향상시킨다. IL-7의 수용체는 이종이량체성이며 IL-7Rα(CD127) 및 공통 γ 쇄(CD132)로 이루어진다. γ 쇄는 모든 조혈 세포형에서 발현되지만 IL-7Rα는 주로 B 및 T 림프 전구체, 나이브 T 세포 및 기억 T 세포를 포함하는 림프구에 의해 발현된다. IL-7Rα의 낮은 발현은 보다 높은 수준을 발현하는 효과기/나이브 T 세포와 비교하여 조절성 T 세포에서 관찰되며, 이로써 CD127은 이러한 2개 집단을 구별하기 위한 표면 마커로서 사용된다. IL-7Rα는 또한 선천성 림프 세포 상에서 NK 및 위-관련 림프 조직(gut-associated lymphoid tissue)(GALT)-유래된 T 세포로서 발현된다. IL-7Rα(CD127) 쇄는 TSLP(종양 기질 림포포이에틴(Tumor stromal lymphopoietin))과 공유되며 CD132는 IL-2, IL-4, IL-9, IL-15 및 인터류킨-21과 공유된다. 2개의 주요 신호전달 경로는 CD127/CD132 (1) 야누스 키나제(Janus kinase)/STAT 경로(즉, Jak-Stat-3 및 5) 및 (2) 포스파티딜-이노시톨-3 키나제 경로(즉, PI3K-Akt)에 의해 유도된다. IL-7 투여는 환자에서 잘 용인되며 CD8 및 CD4 세포 확장 및 CD4+ T 조절 세포의 상대적인 감소를 이끈다. 재조합 네이키드(naked) IL-7 또는 항체의 Fc의 N 말단 도메인에 융합된 IL-7은 Fc 도메인의 융합을 통해 IL-7 반감기를 증가시키고 치료의 장기 지속 효능을 향상시킨다는 이유로, 임상에서 시험되었다. IL-2는 Treg 및 T 효과기 세포 둘 다에 작용하는 반면 IL-7은 T 효과기 세포를 선택적으로 활성화시키므로 IL-7 신호전달의 표적화가 IL-2 신호전달과 비교하여 보다 더 큰 가능성을 유지해야 한다.
항-PD1 면역치료요법의 효능을 증가시키고 환자에서 잠재적인 항 PD-1 내성을 극복하기 위하여, IL-7 신호전달을 표적화하는 조합 치료요법을 개발하는 것은 T 세포 침윤을 자극하여, T 세포 효과기 능력을 지속시키고 조절 T 세포 확장 및 생존을 자극하지 않고 장기-지속하는 기억 T 세포 반응을 촉진시키는 양호한 전략이 될 수 있다. 실제로, 항 PD-1 치료요법은 IL-7에 반응하는 이의 능력의 증가 및 인터페론-γ(IFN-γ) 및 종양 괴사 인자-α(TNF-α)의 증진된 동시생산에 의해 고갈된 T 세포 상에서 CD127의 발현을 증가시킨다(Pauken et al., Science. 2016 Dec 2;354(6316):1160-1165, Shi et al., Nat Commun. 2016 Aug 8;7:12335).
그러나, 조합된 면역치료요법의 검증(validation) 및 개발은 생물치료요법의 비용 및 이러한 면역치료요법에 대한 제한된 접근에 의해 강력하게 제한된다. 따라서, 특히 암에 대한 안전한 면역치료요법, 적응 면역 반응을 위한, 특히 T 세포 면역 반응에서 효과적인 긍정적 영향으로 T 세포를 표적화하기 위한 신규하고 개선된 제제에 대한 당해 분야에서의 상당한 필요성이 남아있다. 본 발명자들은 본원에 개시된 발명을 사용하여 유의적인 진보를 이루었다.
발명의 요약
본 발명자들은 다수의 치료학적 적용용, 특히 암 치료용으로 유망한 항-hPD-1 항체 및 인간 IL-7을 포함하는 이작용성 분자를 제공한다. 본 발명은 PD-1에 대해 높은 결합 친화성 및 이의 리간드 PD-L1 및 PD-L2와 강력한 경쟁을 나타내는 인간 PD-1을 특이적으로 표적화하는 항체의 개발을 기반으로 한다. 놀랍게도, 항-hPD-1 항체의 Fc 영역의 C-말단에 대한 IL-7의 N-말단 끝(terminal end)의 융합은 강력한 IL-7R 활성화를 시사하는, 내인성 IL-7에 대한 유사한 연장에 대해 CD127(IL7 수용체)에 대한 이의 고 친화성의 보존을 허용한다. IL-7에 대한 Fc 도메인의 융합은 또한 생성물 반감기를 증가시킨다. 또한, 본원에 개시된 이작용성 항-PD1/IL-7 분자는 PD-1+ T 세포 침윤물 속에서 IL-7의 축적 및 PD-1+ T 세포 상에서 IL-7의 재-국재화를 허용한다. 특히, 항-PD-1/IL-7 이작용성 분자는 사이토킨(예컨대, IFNγ) 분비 및 인테그린(예컨대, 알파4 및 베타7 및 LFA-1) 발현에 의해 반영된 나이브, 부분 고갈된 및 완전 고갈된 T-세포 서브세트의 증식 및 활성화를 유도한다. 이러한 항-hPD-1/IL-7 이작용성 분자는 관련된 내성 메카니즘을 극복하고 항 PD-1 면역치료요법의 효능을 증진시키는 능력을 갖는다.
제1 양태에서, 본 발명은:
(a) (i) HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH), 및
(ii) LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는, 항-인간 PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및
(b) 인간 인터류킨 7(IL-7) 또는 이의 단편을 포함하는 이작용성 분자에 관한 것이며,
여기서 항체 또는 이의 단편은 인간 IL-7 또는 이의 단편에 융합 단백질로서, 바람직하게는 펩타이드 링커에 의해 공유결합으로 연결된다.
특히, 인간 IL-7 또는 이의 단편의 N-말단 끝은 항-인간 PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 둘 다의 중쇄 또는 경쇄의 C-말단 끝에 연결되어 있다.
일 양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 키메라(chimeric), 인간화된 또는 인간 항체이다.
특수한 양태에서, 본 발명은 항-인간 PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 이작용성 분자에 관한 것이며, 이는:
(i) HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH), 및
(ii) LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하거나 이로 이루어지고,
여기서:
- 중쇄 CDR1(HCDR1)은 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고;
- 중쇄 CDR2(HCDR2)는 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고;
- 중쇄 CDR3(HCDR3)은 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고,
여기서 X1은 D 또는 E이고 X2는 바람직하게는 H, A, Y, N, 및 E로 이루어진 그룹 내에서 T, H, A, Y, N, E 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
- 경쇄 CDR1(LCDR1)은 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 여기서 X는 G 또는 T이고;
- 경쇄 CDR2(LCDR2)는 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고,
- 경쇄 CDR3(LCDR3)은 서열 번호:16의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
특히, 항-인간 PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 (a) 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 VH(여기서, X1은 D 또는 E이고 X2는 바람직하게는 H, A, Y, N 및 E로 이루어진 그룹 내 T, H, A, Y, N, E 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택된다); (b) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 VL(여기서 X는 G 또는 T이다)를 포함하거나 이로 이루어진다.
보다 특히, 본 발명은 항-인간 PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 이작용성 분자에 관한 것이며, 이는:
(i) 서열 번호: 24의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 영역(VH); 및 (ii) 서열 번호: 28의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하거나 이로 이루어진다.
대안적으로, 항-PD1 항체는 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 세미플리맙, PDR001, 및 모노클로날 항체 5C4, 17D8, 2D3, 4H1, 4A11, 7D3, 및 5F4로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
특히, IL-7 또는 이의 변이체는 야생형 인간 IL-7(wth-IL-7)과 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 특수한 양탸에서, IL-7은 서열 번호: 51로 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
대안적으로, IL-7은 IL-7 변이체이고 여기서 IL-7 변이체는 서열 번호: 51로 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 야생형 인간 IL-7(wth-IL-7)과 적어도 75% 동일성(identity)을 나타내고, 여기서 변이체는 IL-7 수용체(IL-7R)에 대한 wth-IL-7의 친화성과 비교하여 IL-7R에 대한 IL-7 변이체의 친화성을 감소시키고, ii) wth-IL-7을 포함하는 이작용성 분자와 비교하여 IL-7 변이체를 포함하는 이작용성 분자의 약동학을 증진시키는 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함한다.
특히, 적어도 하나의 돌연변이는 (i) C2S-C141S 및 C47S-C92S, C2S-C141S 및 C34S-C129S, 또는 C47S-C92S 및 C34S-C129S, (ii) W142H, W142F 또는 W142Y, (iii) D74E, D74Q 또는 D74N, iv) Q11E, Y12F, M17L, Q22E 및/또는 K81R; 또는 이의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 치환 또는 아미노산 치환의 그룹일 수 있다.
일 양태에서, IL-7 변이체는 C2S-C141S 및 C47S-C92S, C2S-C141S 및 C34S-C129S, 및 C47S-C92S 및 C34S-C129S로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 치환의 그룹을 포함한다.
다른 양태에서, IL-7 변이체는 W142H, W142F 및 W142Y로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 치환을 포함한다.
다른 양태에서, IL-7 변이체는 D74E, D74Q 및 D74N으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 치환을 포함한다.
바람직하게는, IL-7 변이체는 서열 번호: 53 내지 66으로 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 심지어 보다 바람직하게는, IL-7 변이체는 서열 번호: 54, 56 또는 63으로 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
특수한 양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 카파 경쇄 불변 도메인으로부터 유래된 경쇄 불변 도메인 및 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 중쇄 불변 도메인, 바람직하게는 IgG1 또는 IgG4 중쇄 불변 도메인으로부터 유래된 중쇄 불변 도메인을 포함한다.
보다 구체적인 양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 임의로, T250Q/M428L; M252Y/S254T/T256E + H433K/N434F; E233P/L234V/L235A/G236A + A327G/A330S/P331S; E333A; S239D/A330L/I332E; P257I/Q311; K326W/E333S; S239D/I332E/G236A; N297A; L234A/L235A; N297A + M252Y/S254T/T256E; K322A 및 K444A로 이루어진 그룹으로부터 선택된, 바람직하게는 임의로 M252Y/S254T/T256E, 및 L234A/L235A과 함께 N297A로 이루어진 그룹으로부터 선택된 치환 또는 치환의 조합을 지닌, 인간 카파 경쇄 불변 도메인으로부터 유래된 경쇄 불변 도메인 및 인간 IgG1 중쇄 불변 도메인으로부터 유래된 중쇄 불변 도메인을 포함한다.
다른 보다 구체적인 양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 임의로 S228P; L234A/L235A, S228P + M252Y/S254T/T256E 및 K444A로 이루어진 그룹으로부터 선택된 치환 또는 치환의 조합을 지닌, 인간 카파 경쇄 불변 도메인로부터 유래된 경쇄 불변 도메인 및 인간 IgG4 중쇄 불변 도메인으로부터 유래된 중쇄 불변 도메인을 포함한다.
임의로, 항체 또는 이의 단편은 링커 서열, 바람직하게는 (GGGGS)3, (GGGGS)4, (GGGGS)2, GGGGS, GGGS, GGG, GGS 및 (GGGS)3로 이루어진 그룹으로부터 선택된, 링커 서열에 의해, 보다 바람직하게는 (GGGGS)3 또는 (GGGS)3에 의해 IL-7 또는 이의 변이체에 연결된다.
매우 구체적인 양태에서, IL-7 변이체는 C2S-C141S 및 C47S-C92S, C2S-C141S 및 C34S-C129S, C47S-C92S 및 C34S-C129S, W142H, W142F, W142Y, D74E, D74Q 및 D74N로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 치환의 그룹을 포함하고; 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 임의로 T250Q/M428L; M252Y/S254T/T256E + H433K/N434F; E233P/L234V/L235A/G236A + A327G/A330S/P331S; E333A; S239D/A330L/I332E; P257I/Q311; K326W/E333S; S239D/I332E/G236A; N297A; L234A/L235A; N297A + M252Y/S254T/T256E; K322A 및 K444A로 이루어진 그룹으로부터 선택된, 바람직하게는 임의로 M252Y/S254T/T256E, 및 L234A/L235A와 함께, N297A로 이루어진 그룹으로부터 선택된 치환 또는 치환의 조합과 함께, 인간 카파 경쇄 불변 도메인으로부터 유래된 경쇄 불변 도메인 및 인간 IgG1 중쇄 불변 도메인으로부터 유래된 중쇄 불변 도메인을 포함하고, 항체 또는 이의 단편은 링커(GGGGS)3에 의해 IL-7 변이체에 연결된다.
다른 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 이작용성 분자를 암호화하는 단리된 핵산 서열 또는 단리된 핵산 분자의 그룹, 본원에 개시된 핵산 또는 핵산 분자의 그룹을 포함하는 벡터, 및/또는 본원에 개시된 바와 같은 벡터, 핵산 또는 핵산 분자의 그룹을 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 바와 같은 숙주 세포를 배양하는 단계 및 임의로 이작용성 분자를 단리하는 단계를 포함하는, 이작용성 분자의 생산 방법에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 바와 같은 이작용성 분자, 핵산 또는 핵산 분자의 그룹, 벡터 또는 숙주 세포 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
임의로, 약제학적 조성물은 바람직하게는 알킬화제, 혈관형성 억제제, 항체, 항대사제, 항유사분열제(antimitotic), 항증식제, 항바이러스제, 아우로라 키나제 억제제(aurora kinase inhibitor), 세포자멸사 프로모터(예를 들면, Bcl-2 계열 억제제), 사멸 수용체 경로의 활성인자, Bcr-Abl 키나제 억제제, BiTE(Bi-Specific T cell Engager) 항체, 항체 약물 접합체, 생물학적 반응 개질제, 브루톤 타이로신 키나제(Bruton's tyrosine kinase)(BTK) 억제제, 사이클린-의존성 키나제 억제제, 세포 주기 억제제, 사이클로옥시게나제-2 억제제, DVD, 백혈병 바이러스 종양유전자 동족체(leukemia viral oncogene homolog)(ErbB2) 수용체 억제제, 성장 인자 억제제, 열 쇼크 단백질(heat shock protein)(HSP)-90 억제제, 히스톤 데아세틸라제(HDAC) 억제제, 호르몬 치료요법, 면역제(immunological), 세포자멸사 단백질의 억제제(Inhibitor of apoptosis protein)(IAP)의 억제제, 인터컬레이팅 항생제(intercalating antibiotic), 키나제 억제제, 키네신 억제제, Jak2 억제제, 라파마이신 억제제의 포유동물 표적, 마이크로RNA, 유사분열물질-활성화된 세포외 신호-조절된 키나제 억제제, 다가 결합 단백질, 비-스테로이드성 소염 약물(non-steroidal anti-inflammatory drug)(NSAID), 폴리 ADP(아데노신 디포스페이트)-리보스 폴리머라제(PARP) 억제제, 백금 화학치료제, 폴로-유사 키나제(polo-like kinase)(Plk) 억제제, 포스포이노시티드-3 키나제(phosphoinositide-3 kinase)(PI3K) 억제제, 프로테오솜(proteasome) 억제제, 푸린 유사체, 피리미딘 유사체, 수용체 타이로신 키나제 억제제, 레티노이드/델토이드 식물 알칼로이드, 작은 억제성 리보핵산(small inhibitory ribonucleic acid(siRNA), 토포이소머라제 억제제, 유비퀴틴 리가제 억제제, 하이포메틸화제, 체크포인트 억제제, 펩타이드 백신 등, 종양 항원으로부터의 에피토프(epitope) 또는 네오에피토프(neoepitope) 뿐만 아니라 이러한 제제 하나 이상의 조합으로 이루어진 그룹에서 선택된 추가의 치료제를 추가로 포함한다.
특히, 약제학적 조성물, 이작용성 분자, 핵산 또는 핵산 분자의 그룹, 벡터 또는 숙주 세포는 의약으로서 사용하기 위한 것이다.
본 발명은 최종적으로 의약으로서 사용하기 위한, 바람직하게는 암, 바람직하게는 혈액 악성 종양(hematologic malignancy) 또는 PD-1 및/또는 PD-L1의 발현과 관련된 고형 종양, 예를 들면, 혈액림프구 신생물(hematolymphoid neoplasm), 혈관면역모구 T 세포 림프종, 골수이형성 증후군, 및 급성 골수성 백혈병으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 암, 바이러스에 의해 유도되거나 면역결핍증과 관련된 암, 예를 들면, 카포시 육종(예컨대, 카포시 육종 헤르페스 바이러스와 관련됨); 자궁경부, 항문, 음경 및 외음부 편평 세포 암 및 구강인두 암(예컨대, 인간 파필로마 바이러스와 관련됨); B 세포 비-호지킨 림프종(NHL), 예를 들면, 광범위 큰 B-세포 림프종, 버킷 림프종(Burkitt lymphoma), 형질모세포 림프종, 원발성 중추신경계 림프종, HHV-8 원발성 흉막삼출성 림프종, 전통적인 호지킨 림프종, 및 림프증식성 장애(예컨대, 엡슈타인-바르 바이러스(Epstein-Barr virus)(EBV) 및/또는 카포시 육종 헤르페스 바이러스(Kaposi sarcoma herpes virus)와 관련됨); 간세포 암종(예컨대, B형 및/또는 C형 바이러스와 관련됨); 메르켈 세포 암종(Merkel cell carcinoma)(예컨대, 메르켈 세포 폴리오마 바이러스(Merkel cell polyoma virus)(MPV)와 관련됨)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 암; 및 인간 면역결핍성 바이러스(human immunodeficiency virus)(HIV) 감염과 관련된 암, 및 전이성 또는 비전이성의, 흑색종, 악성 중피종, 비-소 세포 폐암, 신장 세포 암종, 호지킨 림프종, 두경부 암, 요로상피세포 암종, 결장직장 암, 간세포 암종, 소 세포 폐암, 전이성 메르켈 세포 암종, 위암 또는 위식도 암 및 자궁경부 암으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 암의 치료에 사용하기 위한 본원에 개시된 바와 같은 약제학적 조성물, 이작용성 분자, 핵산 또는 핵산 분자의 그룹, 벡터, 또는 숙주 세포에 관한 것이다.
임의로, 이작용성 분자, 약제학적 조성물, 단리된 핵산 분자 또는 단리된 핵산 분자의 그룹, 벡터, 또는 숙주 세포는 방사선치료요법 또는 바람직하게는 알킬화제, 혈관형성 억제제, 항체, 항대사제, 항유사분열제, 항증식제, 항바이러스제, 아우로라 키나제 억제제, 세포자멸사 증진제(apoptosis promoter)(예를 들면, Bcl-2 계열 억제제), 사멸 수용체 경로의 활성인자, Bcr-Abl 키나제 억제제, BiTE(이-특이적 T 세포 인게이저) 항체, 항체 약물 접합제, 생물학적 반응 개질제, 브루톤 타이로신 키나제(BTK) 억제제, 사이클린-의존성 키나제 억제제, 세포 주기 억제제, 사이클로옥시게나제-2 억제제, DVD, 백혈병 바이러스 종양유전자 동족체(ErbB2) 수용체 억제제, 성장 인자 억제제, 열 쇼크 단백질(HSP)-90 억제제, 히스톤 데아세틸라제(HDAC) 억제제, 호르몬 치료요법, 면역제, 세포자멸사 단백질의 억제제(IAP)의 억제제, 인터컬레이팅 항체, 키나제 억제제, 키네신 억제제, Jak2 억제제, 라파마이신 억제제의 포유동물 표적, 마이크로RNA, 유사분열물질-활성화된 세포외 신호-조절된 키나제 억제제, 다가 결합 단백질, 비-스테로이드성 소염 약물(NSAID), 폴리 ADP(아데노신 디포스페이트)-리보스 폴리머라제(PARP) 억제제, 백금 화학치료제, 폴로-유사 키나제(Plk) 억제제, 포스포이노시티드-3 키나제(PI3K) 억제제, 프로테오솜 억제제, 푸린 유사체, 피리미딘 유사체, 수용체 타이로신 키나제 억제제, 레티노이드/델토이드 식물 알칼로이드, 작은 억제성 리보핵산(siRNA), 토포이소머라제 억제제, 유비퀴틴 리가제 억제제, 저메틸화제(hypomethylating agent), 체크포인트 억제제, 펩타이드 백신 등, 에피토프 또는 종양 항원으로부터의 네오에피토프 뿐만 아니라 이러한 제제 하나 이상의 조합으로 이루어진 그룹에서 선택된 추가의 치료제와 함께 사용하기 위한 것이다
본원에 개시된 바와 같은 약제학적 조성물, 이작용성 분자, 핵산 또는 핵산 분자의 그룹, 벡터 또는 숙주 세포 또는 용도는 T 조절인자 세포의 억제 활성을 억제하고/하거나 T 효과기 세포를 활성화시키고/시키거나 나이브, 부분적으로 고갈된 및 완전히 고갈된 T-세포를 자극시키는데 사용하기 위함이다.
본원에 개시된 약제학적 조성물, 이작용성 분자, 핵산 또는 핵산 분자의 그룹, 벡터 또는 숙주 세포 또는 용도는 또한 감염성 질환, 바람직하게는 만성 감염성 질환, 심지어 보다 바람직하게는 만성 바이러스 감염의 치료에 사용될 수 있다. 바람직하게는, 감염성 질환은 HIV, 간염 바이러스, 헤르페스 바이러스(herpes virus), 아데노바이러스(adenovirus), 인플루엔자 바이러스(influenza virus), 플라비바이러스(flavivirus), 에코바이러스(echovirus), 리노바이러스(rhinovirus), 콕사키에 바이러스(coxsackie virus), 코로나바이러스(coronavirus), 호흡기 합포체 바이러스(respiratory syncytial virus), 멈프스 바이러스(mumps virus), 로타바이러스(rotavirus), 홍역 바이러스, 루벨라 바이러스(rubella virus), 파라보바이러스(parvovirus), 박시니아 바이러스(vaccinia virus), HTLV 바이러스, 뎅기열 바이러스(dengue virus), 파필로마바이러스(papillomavirus), 연우종 바이러스(molluscum virus), 폴리오바이러스(poliovirus), 라비스 바이러스(rabies virus), JC 바이러스 및 아르보바이러스성 뇌염 바이러스(arboviral encephalitis virus)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 바이러스에 의해 유발된다.
도 1: PD-1 결합 ELISA 검정. 인간 재조합 PD-1(rPD1) 단백질을 고정시키고 항체를 상이한 농도에서 가하였다. 레벨레이션(revelation)을 퍼옥시다제에 커플링된 항-인간 Fc 항체를 사용하여 수행하였다. 비색법을 450 nm에서 TMB 기질을 사용하여 측정하였다. A. 항-PD1(■), 항-PD1VL-IL7(o) 및 항-PD1VH-IL7(●)을 재조합 PD1(rPD1)에 대한 이들의 결합에 대해 비교하였다. B. 이의 중쇄 및/또는 경쇄에서 IL7에 융합된 항-PD1 항체의 키메라 Bicki(chimeric Bicki)(●) 대 인간화된 Bicki(■) 형태의 비교: 항-PD1VH-IL7(좌측 그래프), 항-PD1VL-IL7(중간 그래프) 또는 항-PD1VHandVL-IL7(우측 그래프). 분자를 상이한 농도에서 인간 PD1 재조합 단백질로 코팅된 플레이트에 가하였다. C. 키트루다(Keytruda)(●) 및 옵디보(Opdivo)(■)로 작제한 Bicki 항 PD-1/IL-7의 PD-1 결합. 골격을 인간 PD1 재조합 단백질로 코팅한 플레이트 상에서 상이한 농도로 시험하였다.
도 2: PD-1/PD-L1 및 PD1/PDL2 상호작용을 차단하는 Bicki 항-PD1-IL7 분자의 길항 능력. A. ELISA 검정: PD-L1을 막시소프 플레이트(Maxisorp plate) 위에 고정시키고, 복합체 항체 + 바이오티닐화된 재조합 인간 PD-1을 가하였다. 당해 복합체를 시험한 고정된 농도의 PD1(0.6 μg/mL) 및 상이한 농도의 항-PD1(■), 항-PD1VH-IL7(●) 또는 항-PD1VL-IL7(o)항체로 생성시켰다. B: 항-PD1 항체, 항-PD1VH-IL7 또는 항-PD1VL-IL7 항체와 함께 예비-항온처리된 인간 PD-L2 재조합 단백질 상에서 PD-1 재조합 단백질의 비아코어(Biacore)에 의한 친화성 평가. 인간 재조합 PD-L2를 CM5 바이오칩(biochip) 위에 고정시키고 복합체 항체(200nM) + 재조합 인간 PD-1(100 nM)을 가하였다. 데이타는 비아코어로 측정한 것으로서 상호작용의 상대적 반응 %로 나타낸다: 100% = PD-1 상대적 반응.
도 3: Bicki 항-PD1-IL7 분자는 인간 PBMC에서 생체외( ex vivo ) STAT5 포스포릴화로 측정한 것으로서 IL-7R 신호전달 경로를 자극한다. 건강한 자원자의 말초 혈액으로부터 단리한 PBMC를 재조합 IL-7(rIL7)(회색 ●) +/- 항-PD1(회색 ▽), 항-PD1VH-IL7(■) 또는 항-PD1VL-IL7(●)과 함께 15분 동안 항온처리(incubating)하였다. 이후에, 세포를 고정시키고, 투과하고 AF647 로딩된 항-pSTAT5(클론 47/Stat5(pY694))로 염색하였다. 데이타는 MFI pSTAT* %pSTAT5 + 집단을 계산하여 수득하였으며 정규화하였으며(100% = rIL-7 (57.5 nM)) 2개의 별도의 실험에서 3명의 상이한 공여자의 평균을 나타낸다.
도 4: Bicki 항-PD1-IL7은 시험관내( in vitro )에서 T 세포 활성화를 강화한다. (A) 발견자의 x PD-1 경로 헌터 생검정(Path Hunter Bioassay): 베타-gal 단편(ED)에 융합된 가공된 PD-1 수용체 및 보충하는 베타-gal 단편(EA)에 융합된 가공된 SHP1을 안정하게 발현하는 저켓 T 세포. 항-PD1 길항제 항체의 첨가는 생물발광성 신호(RLU)의 손실을 이끄는 PD-1 신호전달을 차단한다. 항-PD1(■) 또는 항-PD1VH-IL7(●)을 상이한 몰 농도에서 시험하였다. 데이타는 RLU(상대적인 발광성 신호)로 나타낸다. (B) Promega PD-1/PD-L1 생검정: (1) 효과기 T 세포(PD-1, NFAT-유도된 루시퍼라제를 안정하게 발현하는 저켓) 및 (2) 활성화 표적 세포(PDL1 및 항원-의존적 방식으로 동계(cognate) TCR을 활성화시키도록 설계된 표면 단백질을 안정하게 발현하는 CHO K1 세포)을 공-배양하였다. BioGloTM 루시페린을 가한 후, 발광성을 정량화하여 T 세포 활성화를 반영시켰다. 항-PD1 항체 +/- 재조합 IL-7(rIL-7) 또는 Bicki 항-PD1VH-IL7 또는 항-PD1VL-IL7 항체의 일련의 몰 농도를 시험하였다. 각각은 하나의 실험의 EC50을 나타내지 않는다. (C) NFAT를 자극하는 키트루다(Keytruda) 또는 옵디보 골격(Opdivo Backbone)으로 작제된 Bicki 항 PD-1/IL-7의 능력. T 세포 활성화를 또한 Promega PD-1/PD-L1 생검정을 사용하여 시험하였다. 키트루다 단독 또는 옵디보 단독(●) 대 펨브롤리주맙 VH IL-7 또는 니볼루맙 VH IL-7(○)을 상이한 농도에서 시험하였다.
도 5: Bicki 항 PD1-IL7 분자는 IFNg 분비를 향상시킨다. 건강한 자원자의 말초 혈액으로부터 단리한 T 세포를 OKT3/PDL1 코팅된 플레이트(각각 2 및 5 μg/mL)로 동형 대조군, 항-PD1 +/- rIL7, 항-PD1VH-IL7, 항-PD1VL-IL7, 동형VH-IL7의 존재하에 5 μg/ml의 최종 항체 농도에서 자극시켰다. 자극 5일 후, 분비된 IFNγ를 샌드위치 ELISA로 조사하였다. 결과는 4명의 공여자(n=2회 실험)를 나타낸다.
도 6: Bicki 항-PD1-IL7은 재조합 가용성 IL-7에 대한 유사한 연장까지 T 세포 증식을 향상시킨다. 건강한 자원자의 말초 혈액으로부터 단리한 PBMC 세포를 항-CD3/CD28로 자극시켰다. 자극 12시간 후, PBMC를 수거하고 OKT3/PDL1 코팅된 플레이트(각각 2 및 5 μg/mL) 상에서 rIL-7 또는 Bicki 항-PD1VH-IL7의 존재하에 자극시켰다. (A) 고정된 용량(29nM의 BiCKI 또는 3,2 nM의 rIL-7) 또는 (B) 다중 용량의 rIL-7(□) 항-PD1 단독 또는 항-PD1VH-IL7(●) 또는 항-PD1VL-IL7(■) 또는 동형 VH IL-7(▲)을 시험하였다. 자극 5일 후, T 세포 증식을 3H 티미딘 혼입으로 평가하였다. 데이타를 정규화(100% = rIL7 10nM)하고 3명의 상이한 공여자에서 수득한 평균을 나타낸다. EC50(pM)은 T 세포 증식의 50%에 이르는 농도를 지칭한다.
도 7. Bicki 항-PD1VH-IL7은 T 세포 표면에서 인테그린의 발현을 자극한다. 인간 PBMC를 3일 동안 어떠한 분자 없이(회색 막대그래프) 또는 rIL-7 /rIL-2 또는 rIL-7(50 ng/mL) 또는 항-PD-1 또는 항-PD1VH-IL7(5 μg/mL)이 존재하에 항온처리하였다. A. 알파 4 및 베타 7 인테그린 세포 표면 발현 분석. FACS를 LSR로 분석하고 데이타는 각각의 공여자에 대해 대조군(비처리)의 형광성의 중간값에 상응하는 1로 정규화시킨 배수 변화를 나타낸다. B. LSR을 사용한 FACS에 의한 LFA-1 세포 표면 발현 분석(CD11a 및 CD18). 결과는 중간 형광형으로 나타낸다. 각각의 점은 3개의 별개의 실험의 1명의 공여자를 나타낸다.
도 8. 고갈된 T 세포를 이끄는 T 세포의 만성 항원 자극의 모델화. 인간 PBMC를 CD3 CD28 코팅된 플레이트(3 μg/mL의 OKT3 및 3 μg/mL의 CD28.2 항체) 상에서 3일마다 반복적으로 자극시켰다. (A) 자극 24시간 후, T 세포를 PD-1, Lag3 및 Tim3 억제성 수용체에 대해 염색하였다. 발현을 유동 세포분석법으로 플루오로크롬 표지된 항체 및 FACS LSRII를 사용하여 분석하였다. 데이타는 3명의 공여자(1명의 공여자 = 1개의 곡선)에 대한 양성 세포의 %로 나타낸다. (B) 각각의 자극 5일 후, T 세포 증식능을 티미딘 3H 혼입에 의해 측정하였다. (C) 각각의 자극 24시간 후, 상층액 IFNg 분비를 ELISA(pg/ml)로 분석하였다.
도 9. 고갈된 T 세포의 IL7 경로 활성화: 각각의 자극 후 48시간 째에 STAT5의 포스포릴화를 측정함에 의한 세포와 rIL-7 또는 Bicki 항-PD1VH-IL7의 15분 항온처리에 대한 고갈된 T 세포의 반응. 이후에, 세포를 고정시키고, 투과시키고 AF647 표지된 항-pSTAT5(클론 47/Stat5 (pY694))로 염색하였다. 회색 막대그래프는 rIL7로 처리된 세포를 나타내고 검정색 막대그래프는 Bicki 항-PD1VH-IL7로 처리된 세포를 나타낸다. 데이타를 정규화시키고(MFI pSTAT*%pSTAT5 집단) 4개의 상이한 공여자를 나타낸다. (B) pSTAT5의 ED50을 각각의 자극에 대해 pM 단위로 측정하고 pSTAT5 활성화의 50%에 도달하는데 요구된 rIL-7(■ 회색) 또는 Bicki 항-PD1VH-IL7(■ 검정색)의 농도를 지칭한다.
도 10: IL-7 자극시 고갈된 T 세포의 증식. 인간 PBMC를 CD3 CD28 코팅된 플레이트(3 μg/mL의 OKT3 및 3 μg/mL의 CD28.2 항체) 상에서 반복적으로 자극시켰다. (A) 각각의 자극 24시간 후, T 세포를 OKT3 코팅된 플레이트(2 μg/mL) 상에서 항-PD1, rIL-7 또는 Bicki 항-PD1-IL7(항-PD1VH-IL7 또는 항-PD1VL-IL7)의 존재하에 재자극시켰다. H3 혼입 검정을 5일째에 수행하여 T 세포 증식을 측정하였다. 미가공 증식 데이타는 자극 (STIM) 3, 4 및 5 후 1명의 공여자로부터의 (H3 혼입(cpm))을 나타낸다. (B) 3회 자극시킨 T 세포를 더 이상 자극되지하지 않거나(No Stim) 항-CD3(StimOKT3), 항-CD3+재조합 PDL1(Stim OKT3/PDL1) 또는 항-CD3+재조합 PDL2(StimOKT3/PDL2) 코팅된 플레이트(각각 2 및 5 μg/mL) 상에서 재자극시켰다. H3 혼입 검정을 5일째에 수행하고 데이타를 정규화하였다(1=동형 항체를 사용한 H3 혼입). n=4명의 공여자 및 2회의 상이한 실험.
도 11. CD8 효과기 T 세포의 증식에서 Treg 억제 활성.
CD8+ 효과기 T 세포 및 CD4+ CD25high CD127low Treg를 건강한 공여자의 말초 혈액으로부터 단리하고, 세포 증식 염료(CD8+ T 세포의 경우 CPDe450)로 염색하였다. 이후에 Treg/CD8+Teff를 1:1의 비에서 OKT3 코팅된 플레이트(2 μg/mL) 위에서 rIL-7, 항 PD-1, 항-PD-1 + rIL-7, 항-PD1VH-IL7의 존재하에 5일 동안 공-배양하였다. 효과기 T 세포의 증식을 세포유동분석기(cytofluorometry)로 분석하였다. A. 데이타는 증식 Teff 단독의 %(검정색 막대그래프) 또는 Treg와 공-배양된 Teff(회색 막대그래프) +/- CD8 T 효과기 세포 집단(n=4회의 상이한 실험으로 4명의 공여자)에서 CPD 마커의 손실을 기반으로 한 SEM으로 나타낸다. B. Treg 증식을 상이한 등몰 용량의 IL-7(▲), IL-2(●), IL-15(■) 또는 항-PD1VH-IL7(▼)와 항온처리 후 CPD 증식 염료를 사용하여 평가하였다.
도 12: 인간화된 마우스 모델에서 Bicki 항-PD1-IL7 항체의 생체내( in vivo ) 효능. 인간 PBMC를 마우스내로 복강내 주사하였다. 마우스를 2주마다 항-PD1 항체 단독 또는 Bicki 항-PD1VH-IL7(5 mg/kg)로 처리하였다. 주사 16일 후에, 혈액을 수거하고 마우스를 희생시켰다. (A) 말초 인간 CD3 T 세포의 퍼센트를 인간 CD45+ 세포 집단 속에서 유동 세포분석기로 분석하였다. 각각의 점은 1마리의 마우스를 나타낸다. (B) 인간 IFNg를 혈장 속에서 ELISA로 조사하였다. 각각의 점은 1마리의 마우스를 나타낸다. (C) 인간 CD3+ 세포의 침윤을 결장, 간 및 폐에서 면역조직형광성으로 정량화하였다. 근위 및 원위 결장, 간 및 폐를 조직 Tek® OCT 속에 포매(embedding)하고, Dapi 및 인간 CD3에 대해 염색하였다. 각각의 점은 1마리의 마우스를 나타내고 결장의 경우 각각의 점은 3개의 슬라이스의 CD3+ 수의 평균을 나타낸다.
도 13: 인간 종양 침윤 림프구의 면역표현형(immunophenotyping). T 세포를 신장 암(△)(▽), 대사성 결장직장 암(□), 췌장 암(○) 간세포 암종(●)(◇)으로부터 추출하고 CD3, CD4, CD8, PD-1, CD127 및 CD132에 대해 염색하였다. 면역형광성을 FACS LSRII로 분석하였다. 데이타를 CD4+CD3+ 또는 CD8+CD3+ 집단에 대해 나타낸다.
도 14: 생체외 종양에서 종양내 조절성 T 세포 또는 효과기 T 세포의 STAT5 활성화. 세포를 신경집종(▼), 신장(○), 간세포 암종(□)(■), 전이성 결장직장(●) 또는 췌장 암(▲) 환자의 종양으로부터 추출하고 15분 동안 rIL-7 또는 Bicki 항-PD1VH-IL7(29 nM)로 처리하였다. 이후에, 세포를 고정시키고, 투과하고 pSTAT5(클론 47/Stat5(pY694)), CD3 및 Foxp3에 대해 염색하였다. 막대그래프는 CD3+ FoxP3+ 집단(T 조절 세포) 또는 CD3+ FoxP3-(효과기 T 세포)에서 pSTAT5 형광성 중앙값을 나타낸다.
도 15. 인간 암 생검을 Bicki 항-PD1-IL7로 처리한 후 IFNγ 분비의 시험관내 연구: 인간 종양의 생검을 완전 배지 속에서 으깨어 세포를 분리하였다. 세포를 동형 대조군, 항-PD1, B12-IL7 동형 대조군 항체(동형-VH IL-7), 항 PD-1 + 재조합 IL-7, 또는 항 Bicki 항-PD1VH-IL7이 들어있는 완전 배지 속에 5 μg/mL의 농도로 재현탁시켰다. 48시간 후, 상층액을 수거하고 IFNγ 분비를 MSD 기술(메소 규모 발견(Meso scale Discovery))로 분석하였다. A.는 결장직장 암 세포에서의 결과를 나타낸다. B. 개개 종양(CC: 결장직장 암 생검, HCC: 간암종 생검, KC: 신장 암)에서의 결과.
도 16. Bicki 항-PD1VH-IL7로 처리한 후 종양내 조절성 T 세포 또는 효과기 T 세포의 STAT5 활성화. (A) 결장직장 암, 신경집종, 신장 암 또는 간세포 암종의 종양내로 종양내 FoxP3 Treg 세포의 퍼센트 (B) 결장직장 암(●), 신경집종(○) 및 췌장 암(□)으로부터의 세포를 STAT5 활성화에 대해 FoxP3-CD3+ 효과기 T 세포 대 FoxP3-CD3+ Treg 세포 내에서 rIL7 또는 항-PD1VH-IL7(29nM)(15분 항온처리)로 처리한 후 분석하였다. 이후에, 세포를 고정시키고, 투과하고 pSTAT5(클론 47/Stat5(pY694)), CD3 및 Foxp3에 대해 염색하였다.
도 17: bicki IL-7 돌연변이체의 PD-1 결합 ELISA 검정. 인간 재조합 PD-1(rPD1) 단백질을 고정시키고 항체를 상이한 농도에서 가하였다. 레벨레이션(revelation)을 퍼옥시다제에 커플링된 항-인간 Fc 항체로 수행하였다. 비색을 450 nm에서 TMB 기질을 사용하여 측정하였다. A. 항-PD1 항체 및 아미노산 D74, Q22, Y12F, M17, Q11, K81에서 돌연변이된 IL-7의 이작용성 분자의 PD-1 결합. B. 아미노산 W142 상에서 돌연변이된 IL-7을 포함하는 이작용성 분자의 PD-1 결합. C. IL-7의 이황화물 결합내에서 돌연변이된 이작용성 분자(SS1, SS2 및 SS3 돌연변이체)의 PD-1 결합. 당해 도에서 시험한 모든 분자를 IgG4m 동형 및 Fc와 IL-7 도메인 사이의 GGGGSGGGGSGGGGS 링커를 사용하여 작제하였다.
도 18: IgG 융합된 돌연변이된 IL-7의 CD127 결합 ELISA 검정. PD-1 재조합 단백질을 플레이트 위에 고정시킨 다음, 이작용성 항-PD-1 IL-7 분자를 CD127 재조합 단백질(히스티딘 태그됨, Sino 참고번호: 10975-H08H)과 함께 예비항온처리하고 웰에 가하였다. 레벨레이션을 바이오틴에 커플링된 항-히스티딘 항체 + 퍼옥시다제에 커플링된 스트렙타비딘의 혼합물로 수행하였다. 비색을 450 nm에서 TMB 기질을 사용하여 측정하였다. A. 아미노산 D74, Q22, M17, Q11, Y12F, K81 상에서 돌연변이된 IL-7을 포함하는 이작용성 분자의 CD127 결합. B. 아미노산 W142 상에서 돌연변이된 IL-7을 포함하는 이작용성 분자의 CD127 결합.
도 19: STAT5 포스포릴화로 측정된 상이한 이작용성 분자의 IL-7-7R 신호전달 경로. 건강한 자원자의 말초 혈액으로부터 단리된 인간 PBMC를 15분 동안 이작용성 항-PD-1 IL-7 분자와 함께 항온처리하였다. 이후에, 세포를 고정시키고, 투과하고 AF647 표지된 항-pSTAT5(클론 47/Stat5(pY694))으로 염색하였다. 데이타는 CD3 T 세포 속에서 MFI pSTAT5를 계산함으로써 수득하였다. A. 아미노산 D74, Q22, M17, Y12F, Q11, K81 상에서 돌연변이된 IL-7을 포함하는 항-PD-1 IL-7 이작용성 분자의 pSTAT5 활성화. B. 아미노산 W142에서 돌연변이된 IL-7을 포함하는 항 PD-1 IL-7 이작용성 분자의 pSTAT 활성화. C. 항 PD-1 IL-7 WT(● 회색)과 비교하여 IL-7, SS2(● 검정색) 및 SS3(▲)의 이황화물 결합에서 돌연변이된 IL-7을 포함하는 항 PD-1 IL-7 이작용성 분자의 pSTAT5 활성화. 당해 도에서 시험한 모든 분자는 IgG4m 동형 및 Fc와 IL-7 도메인 사이의 GGGGSGGGGSGGGGS 링커를 사용하여 작제하였다.
도 20: 마우스내에서 항 PD-1 IL-7 이작용성 분자의 약동학. 마우스에게 1회 용량의 IgG 융합된 IL-7 야생형 또는 돌연변이된 IL-7을 정맥내 주사하였다. 혈청 속의 분자의 농도를 주사 후 다수의 시점에서 ELISA로 분석하였다. A. IgG4-G4S3 IL7 WT(■ 회색); IgG4-G4S3 IL7 D74E(● 검정색)의 주사. B. IgG4-G4S3 IL7 WT(■ 회색) 또는 IgG4-G4S3 IL7 W142H(● 검정색)의 주사. C. IgG4-G4S3 IL7 WT(■ 회색); IgG4-G4S3 IL7 SS2(●) 또는 IgG4-G4S3 IL7 SS3(▲)의 주사. D. 각각의 분자의 PK 대 ED50 pSTAT5(nM)로부터 계산된 곡선하 영역(Area under the curve)(AUC) 사이의 관련성. 당해 도에서 시험한 모든 분자를 IgG4m 동형 및 Fc와 IL-7 도메인 사이의 GGGGSGGGGSGGGGS 링커를 사용하여 작제하였다.
도 21: 항 PD-1과 IL-7 사이의 이황화물 결합의 첨가는 pSTAT5 활성화를 감소시키지만 이는 생체내에서 약물 노출을 증가시킨다. A. 항 PD-1 IL-7 이작용성 분자 WT(회색 ●) 또는 추가의 이황화물 결합(검정색 ●)을 지닌 항 PD-1 IL-7 이작용성 분자로 처리 후 인간 PBMC에서 pSTAT5 활성화에 의해 측정된 IL7R 신호전달. B. 항 PD-1 IL-7 이작용성 분자 WT(회색 ●) 또는 추가의 이황화물 결합(검정색 ●) 분자를 지닌 항 PD-1 IL-7 이작용성 분자의 마우스내 약동학. 마우스에게 1회 용량의 항 PD-1 IL7 이작용성 분자를 정맥내 주사하였다. 혈청 속의 분자의 농도를 주사 후 다수 시점에서 ELISA로 측정하였다. 당해 도에서 시험한 모든 분자를 IgG4m 동형 및 Fc와 IL-7 도메인 사이의 GGGGSGGGGSGGGGS 링커를 사용하여 작제하였다.
도 22: PD-1 결합 ELISA 검정. 인간 재조합 PD-1(rPD1) 단백질을 고정시키고 항체를 상이한 농도에서 가하였다. 레벨레이션을 퍼옥시다제에 커플링된 항-인간 Fc 항체로 수행하였다. 비색을 450 nm에서 TMB 기질을 사용하여 측정하였다. A. IgG4m를 지닌 항 PD-1 IL-7 WT 이작용성 분자의 PD-1 결합(● 회색), IgG1m을 지닌 항 PD-1 IL-7 WT 이작용성 분자(▲ 검정색), IgG1m 동형을 지닌 항 PD-1 IL-7 D74E 이작용성 분자(■) 또는 IgG1m을 지닌 항 PD-1 IL-7 W142H 이작용성 분자(◇)의 PD-1 결합. B. 다른 실험에서, IgG4m 동형을 지닌 항 PD-1 IL-7 SS2 이작용성 분자(■) 또는 IgG1m을 지닌 항 PD-1 IL-7 SS2 이작용성 분자(▲)의 PD-1 결합을 시험하였다.
도 23: IgG1N298A 또는 IgG4 동형으로 작제된 항 PD-1 IL-7 이작용성 분자의 CD127 결합 ELISA 검정. 항체 골격에 의해 표적화된 재조합 단백질을 고정시키고, 이후에 IL-7에 융합된 항체를 CD127 재조합 단백질(히스톤 태그됨, Sino 참고번호: 10975-H08H)와 함께 예비항온처리하였다. 레벨레이션을 바이오틴에 커플링된 항-히스티딘 항체 및 퍼옥시다제에 커플링된 스트렙타비딘의 혼합물로 수행하였다. 비색을 450 nm에서 TMB 기질을 사용하여 측정하였다. A. IgG4m 동형을 지닌 항 PD-1 IL-7 W142H 이작용성 분자(● 회색), IgG1m을 지닌 항 PD-1 IL-7 W142H 이작용성 분자(▲ 검정색), 또는 IgG1m 동형을 지닌 항 PD-1 IL-7 WT 이작용성 분자(● 검정색)의 CD127 결합. B. IgG4m 동형을 지닌 항 PD-1 IL-7 SS2 이작용성 분자(● 회색), IgG1m을 지닌 항 PD-1 IL-7 SS2 이작용성 분자(▲ 검정색) 또는 IgG1m을 지닌 항 PD-1 IL-7 WT 이작용성 분자(● 검정색)의 CD127 결합. C. IgG4m 동형을 지닌 항 PD-1 IL-7 SS3 이작용성 분자(● 회색), IgG1m을 지닌 항 PD-1 IL-7 SS3 이작용성 분자(▲ 검정색) 또는 항 PD-1 IL-7 WT 이작용성 분자 IgG1m(● 검정색)의 CD127 결합. D. 동형 IgG1m(● 검정색) 또는 동형 IgG1m + YTE(● 회색)을 지닌 항 PD-1 W142H 이작용성 분자의 CD127 결합. 동형 IgG1m(▲ 검정색) 또는 동형 IgG1m + YTE(▲ 회색)을 지닌 항 PD-1 D74E 이작용성 분자의 CD127 결합을 또한 시험하였다. 당해도에서 시험한 모든 분자를 Fc와 IL-7 도메인 사이의 GGGGSGGGGSGGGGS 링커를 사용하여 작제하였다.
도 24: IgG1N298A 또는 IgG4 동형으로 작제된 항 PD-1 IL-7 이작용성 분자의 IL-7R 신호전달 분석. 인간 PBMC 또는 저켓 PD1+ CD127+ 세포를 15분 동안 항 PD-1 IL7 이작용성 분자와 함께 항온처리하였다. 이후에, 세포를 고정시키고, 투과시키고 AF647 표지된 항-pSTAT5(클론 47/Stat5(pY694))로 염색하였다. 데이타는 CD3 T 세포 내 pSTAT5의 %로 계산함으로써 수득하였다. A. 돌연변이 D74E를 지닌 이작용성 분자 항 PD-1 IL-7를 IgG4m 동형(● 회색) 또는 IgG1m 동형(▲ 검정색)으로 처리한 후 처리 후 인간 PBMC에서 pSTAT5 신호전달. B. 항 PD-1 IL-7 SS2를 IgG4m 동형(● 회색)으로 처리하거나 항 PD-1 IL-7 SS2를 IgG1m(▲ 검정색))로 처리한 후 인간 PBMC에서 pSTAT5 신호전달. C. 항 PD-1 IL-7 SS3을 IgG4m 동형(● 회색) 또는 IgG1m(▲ 검정색)으로 처리한 후 인간 PBMC에서 pSTAT5 신호전달. D. (좌측 패널) 작제된 항 PD-1 IL-7 WT를 항 IgG4m(● 회색) 또는 IgG1m(▲검정색) 동형으로 처리한 후 처리한 후 저켓 PD1+CD127+ 세포에서 pSTAT5 신호전달. D. (우측 패널) 항 PD-1 IL-7 SS2를 IgG4m 동형(● 회색)으로 또는 항 PD-1 IL-7 SS2를 IgG1m(▲ 검정색)으로 처리한 후 pSTAT5 신호전달.
도 25: 항 PD-1 IL-7 돌연변이된 이작용성 분자는 시험관내에서 T 세포 활성화를 강화시킨다. Promega PD-1/PD-L1 생검정: (1) 효과기 T 세포(PD-1, NFAT-유도된 루시퍼라제를 안정하게 발현하는 저켓) 및 (2) 활성화 표적세포(PDL1 및 선천성 TCR을 항원-의존성 방식으로 활성화하도록 설계된 표면 단백질을 안정하게 발현시키는 CHO K1 세포)를 공-배양하였다. BioGloTM 루시페린을 가한 후, 발광성을 정량화하고 T 세포 활성화를 반영한다. 항-PD1 항체 +/- 재조합 IL-7(rIL-7) 또는 항-PD1IL7 이작용성 분자의 일련의 몰 농도를 시험하였다. 각각의 점은 1개 실험의 EC50을 나타낸다. A. IgG4m 동형(● 회색 ) 또는 항 PD-1(▲) 또는 항 PD-1 + rIL-7(○)을 사용한 항 PD-1 IL-7 WT 이작용성 분자의 NFAT 활성화. B. 항 PD-1 IL-7 D74E IgG4m(●), PD-1 IL-7 D74E IgG1m(▲ 점선), 및 항 PD-1 단독(검정색 ▲)의 NFAT 활성화. C. IgG4m를 지닌 항 PD-1 IL-7 W142H 이작용성 분자(●), IgG1m를 지닌 PD-1 IL-7 W142H 이작용성 분자(▲ 점선), 및 항 PD-1 단독(검정색 ▲)의 NFAT 활성화. D. IgG4m을 지닌 항 PD-1 IL-7 SS2 이작용성 분자(●), 및 항 PD-1 단독(검정색 ▲)의 NFAT 활성화.
도 26: IgG1m 또는 IgG4m 동형으로 작제된 항 PD-1 IL-7 이작용성 분자의 약동학. 마우스에 IL-7 야생형 또는 돌연변이된 IL-7에 융합된 IgG를 사용하여 1회 용량으로 정맥내 주사하였다. 혈청 속의 약물의 농도를 주사 후 다수의 시점에서 ELISA로 평가하였다. A. IgG4m을 지닌 항 PD-1 IL-7 WT 이작용성 분자(● 회색 평선(plain line)), IgG1m을 지닌 항 PD-1 IL-7 WT 이작용성 분자(● 회색 파선(dashed line)), IgG1m을 지닌 항 PD-1 IL-7 D74E 이작용성 분자(▲ 검정색 사선), IgG4m을 지닌 항 PD-1 IL-7 W142H 이작용성 분자(○ 검정색 평선), IgG1m을 지닌 항 PD-1 IL-7 W142H 이작용성 분자(○ 사선처리된 검정색 평선), IgG4를 지닌 항 PD-1 IL-7 SS3(■ 평선), 및 IgG1m을 지닌 항 PD-1 IL-7 SS3(■ 파선)의 약동학. B. IgG1m을 지닌 항 PD-1 IL-7 D74E, D74Q, W142H, D74E+W142H 돌연변이체 이작용성 분자의 약동학.
도 27: IgG1 N298A+K444A 동형으로 작제된 항 PD-1 IL-7 이작용성 분자의 약동학. 마우스에 1회 용량의 동형 IgG1N298A(■) 또는 동형 IgG1m+ K444A 돌연변이 동형(●)을 지닌 항 PD-1 IL7 D74E 이작용성 분자의 약동학. 항체의 농도를 주사 후 다수 시점에서 ELISA로 평가하였다.
도 28: 링커의 길이는 약동학에 유의적으로 영향을 미치지 않지만 IL-7R 신호전달의 자극을 감소시킨다. A. 상이한 링커 (GGGGS), (GGGGS)2, (GGGGS)3)로 작제된 항 PD-1 IL-7 WT 이작용성 분자의 약동학. B. 상이한 링커 (GGGGS), (GGGGS)2, (GGGGS)3)으로 작제한 항 PD-1 IL-7 D74 이작용성 분자의 약동학. C. 상이한 링커((GGGGS)2, (GGGGS)3)로 작제한 항 PD-1 IL-7 W142H 이작용성 분자의 약동학. 마우스에 IL-7 야생형 또는 돌연변이된 IL-7에 융합된 IgG를 사용하여 1회 용량으로 정맥내 주사하였다. IL-7에 융합된 IgG의 농도를 주사 후 다수 시점에서 ELISA로 평가하였다. D. 링커의 부재하에서 또는 with GGGGS, (GGGGS)2, (GGGGS)3 링커로 작제된 항 PD-1 IL-7 이작용성 분자의 pSTAT5 신호전달.
도 29: 항 PD-1 IL-7 돌연변이체는 PD-1-CD127+ 세포보다 PD-1+ CD127+ 세포를 우선적으로 표적화한다. CD127+을 발현하거나 CD127+ 및 PD-1+를 동시 발현하는 저켓 세포를 45nM의 항 PD-1 IL-7 이작용성 분자로 염색하고 항 IgG-PE(Biolegend, 클론 HP6017)으로 나타낸다. 데이타는 PD1- 세포 CD127+ 저켓 세포에서 수득된 중앙값 형광성에 걸쳐 PD-1+CD127+ 저켓 세포에서 중간값 형광성의 비를 나타낸다. 당해 검정에서, 항 PD-1 IL-7 WT 이작용성 분자 IgG1m, 항 PD-1 IL-7 D74E 이작용성 분자 IgG1m, 항 PD-1 IL-7 W142H 이작용성 분자 IgG1m, 항 PD-1 IL-7 SS2 이작용성 분자 IgG4m, 항 PD-1 IL-7 SS3 이작용성 분자 IgG1m을 시험하였다.
도 30: 항 PD-1 IL-7 분자는 T 세포의 증식을 향상시키고 시노몰구스 원숭이(cynomolgus monkey)에서 전임상 안전성을 입증한다. c는 PD-1-CD127+ 세포에 걸쳐 PD-1+ CD127+ 세포를 표적화한다. 시노몰구스 원숭이에게 1회 용량의 비키(bicki) 항 PD-1 IL-7 WT(6,87nM/kg (n=2)) 또는 34,35nM(n=1))를 정맥내 주사하였다. 혈액 분석을 주사 후 15일 또는 4시간 까지 수행하였다. A. 림프구 수를 다중 시점에서 말초 혈액에서 평가하고, Bicki 항 PD-1 IL-7 WT를 6,87nM/kg(n=2)에서 주사하였다. B. CD4/CD8 또는 B세포의 증식을 유동 세포분석법에 의해 혈액 속에서 6,87nM/kg에서 주사된 Ki67/CD4/CD8 및 CD19 마커 Bicki 항 PD-1 IL-7 WT를 사용하여 평가하였다(n=2). C. pSTAT5를 다중 시점에서 CD3+ T 세포내에서 6,87nM/kg에서 주사된 FACS Bicki 항 PD-1 IL-7 WT를 사용하여 평가하였다(n=2). D/E/F 및 G. 생화학적 및 세포 혈액 분석을 다수의 시점에서 평가하였다.
도 31: 본 발명에 따른 Bicki 항-PD1-IL-7의 작용 메카니즘의 예시.
발명의 상세한 설명
도입
본 발명의 항체는 특이적인 항-PD-1 효과 및 항-PD-1 항체에 융합된 인간 인터류킨 7의 효과를 조합하므로 이작용성이다. 실제로, 본 발명은 항-PD-1 항체 및 IL-7, 항-PD-1 항체의 폴리펩타이드 쇄에 공유결합으로 연결된 인터류킨, 항체의 경쇄 또는 중쇄 또는 이들 둘 다 또는 이의 단편을 포함하는 이작용성 분자에 관한 것이다. 항-PD-1 항체 또는 이의 단편 및 IL-7의 쇄는 융합 단백질로서 제조된다. 특수한 양태에서, IL-7의 N-말단 끝은 항-PD-1 항체 또는 이의 단편의 쇄의 C 말단 끝에, 임의로 펩타이드 링커를 통해 연결된다.
당해 분야의 기술자에게 공지된 바와 같이, 종양 세포는 많은 암에서 관찰된, T 세포 고갈로 불리는 현상으로 인하여 T 세포에 의해 충분히 제거되지 않는다. 예를 들면, 지앙, 와이.(Jiang, Y.), 리, 유.(Li, Y.) 및 츄, 비.(Zhu, B)(Cell Death Dis 6, e1792 (2015))에 의해 기술된 바와 같이, 종양 환경내에서 고갈된 T 세포는 억제성 수용체의 과발현, 효과기 사이토킨 생산의 감소 및 세포분해 활성을 초래하여, 암 제거의 실패 및 일반적으로 암 면역 회피를 초래할 수 있다. 이후에 고갈된 T 세포의 회복은 암 치료용으로 예상된 임상 전략이다.
PD-1은 T-세포 고갈을 조절하는 주요 억제성 수용체이다. 실제로, 높은 PD-1 발현을 지닌 T 세포는 암 세포를 제거하는 감소된 능력을 갖는다. 항-PD1 치료 화합물, 특히 항-PD1 항체는 PD1-PDL1 상호작용(T 세포 상에서 PD1 및 종양 세포 상에서 PDL1)의 억제 효과 및 T 세포 고갈을 차단하기 위한 암 치료에 임상적으로 사용된다. 그러나, 항-PD1 항체가 고갈된 T 세포의 <<재>> 활성화를 허용하기에 항상 충분히 효율적이지는 않다.
본 출원인은 본원에서 본 발명에 따른 이작용성 항-PD1-IL-7 분자가 항 PD-1 단독과 비교하여, T 세포, 특히 고갈된 T 세포의 활성화(NFAT 매개된 활성화)를 강화시킴을 나타낸다. 특히, 항-PD1-IL-7 이작용성 분자는 사이토킨(예컨대 IFNγ) 분비에 의해 반영된 것으로서 나이브, 부분적으로 고갈된 및 완전히 고갈된 T-세포 서브세트의 증식 및 활성화를 유도한다. 이러한 항-PD1-IL-7 이작용성 분자는 관련된 내성 메카니즘을 극복하고 항 PD-1 면역치료요법의 효능을 증진시키는 능력을 갖는다.
본 출원인은 특히 항-PD1-IL-7 이작용성 분자와 i) PD1 및 ii) IL-7 수용체를 발현하는 단일 T 세포의 상호작용이 특히 고갈된 T 세포에서, T 세포 활성화에 있어 긍정적인 효과와 함께 NFAT 경로(TCR 신호전달)의 예측하지 못한 활성화를 초래함으로써, 종양 세포를 제거하는 T 세포의 능력을 호전시킴을 나타낸다.
이는 한편으로는, 본 발명의 이작용성 분자의 IL-7이 IL-7 수용체를 표적화하여, PSTAT5 경로를 활성화시키고, 다른 한편으로, 이작용성 분자의 항-PD1 부분이 PD-1/PD-L1 상호작용을 차단함을 의미한다. BICKI 분자는 동일한 세포에서 PD-1에 대한 IL-7 둘 다를 표적화한다. 이는 TCR(NFAT) 신호전달의 상승적 활성화를 야기하며, 이는 항-PD1 항체 및 IL-7의 조합을 별도로(2개의 별개의 화합물로서) 사용하서는 절대로 관찰될 수 없다. 이러한 활성화는 PD-L1을 표적화하는 이작용성 분자에 의해 제공될 수 없다. 실제로, PD-L1이 종양 세포에서 발현되나 면역 세포, 예를 들면, T 세포에서는 발현되지 않음이 알려져 있다.
또한, 이작용성 항-PD1/IL-7 분자는 PD-1+ T 세포 침윤물 속에서 IL-7의 축적 및 PD-1+ T 세포에서 IL-7의 재국재화를 허용한다. PD-1+ T 세포 근처에서 IL-7의 이러한 축적은 이러한 T 세포의 활성화 또는 재-활성화를 위해 고 용량의 IL-7을 요구하는 고갈된 T 세포의 맥락에서 특히 흥미롭다.
T 세포 활성화에서의 상승 효과는 본 발명의 특수한 항-PD-1 항체를 사용해서 뿐만 아니라 2개의 다른 참고 항-PD-1, 즉 옵디보(Opdivo) 및 티트루다(Keytruda)를 사용하여 관찰되었다.
또한, 이작용성 항-PD1/IL-7 분자는 종양내로 T-세포 침윤을 촉진시키는 능력을 갖는다. 종양 부위내에서 T 세포 침윤의 결여가 오늘날 항-PD1 항체를 사용한 치료 효능에 대한 주요 장애물임을 고려할 때, 이러한 능력은 항-PD-1 항체에 의한 치료를 최적화하기 위한 장점이다.
또한, 이작용성 항-PD1/IL-7 분자는 Treg 매개된 억제 효과를 차단한다. 따라서, 이작용성 분자는 T reg 세포가 아닌 T 효과기 세포를 구체적으로 활성화시킬 수 있지만 항-PD1 항체는 T 효과기 세포에서 Treg 억제성 활성을 억제할 수 없다. 이후에, 발명자는 이작용성 항-PD1-IL7 분자가 효과기 T-세포 증식 및 생존을 자극하지만 조절성 T 세포를 아낌으로써 T 조절성 면역 균형보다 T 세포 효과기를 호전시킴을 나타내었다.
또한, IL7 항-PD-1 이작용성 분자는 다른 장점을 갖는다.
본 발명자는 IL7 항-PD-1 이작용성 분자가 주로 T 효과기 세포(Teff) 대 T 조절성 세포(Treg)를 활성화시킴을 나타낸다. IL7 항-PD-1 이작용성 분자는 T Reg의 증식을 촉진하지 않고, T Reg의 불활성화를 유도하고, T 세포, 특히 고갈된 T 세포의 활성화를 유도하는 장점을 가진다.
게다가 IL7 항-PD-1 이작용성 분자는 양호한 치료학적 지수(치사량(DL50)과 치료학적 유효 용량 사이의 비)를 나타내도록 한다. 특히, IL7은 전형적으로 환자에 대해 10 내지 1500 μg/Kg, 유리하게는 200 내지 1200 μg/Kg으로 사용될 수 있고; 고 용량, 예를 들면, 1200 μg/Kg도 환자에 의해 잘 용인된다. 이후에, IL7 항-PD-1 이작용성 분자는 미가공(raw) 화합물 및 최종 생성물의 적절한 투여량에서 치료학적 화합물을 생산하도록 한다. 더욱이, 잘 용인된 IL7의 고 용량(예를 들면, IL7의 경우 1,2mg/kg)은 항체에 대해 약 2mg/kg의 양에 상응하며, 이는 환자에 투여될 용량을 만족시킨다.
IL7 항-PD-1 이작용성 분자는 부분적으로만 고갈된 고갈된 T 선조 세포를 필수적으로 표적화하도록 하는 장점을 가지며, 이는 상술한 의학적 요건을 만족시키는 주요 표적이다. 만성 활성화가 T 세포의 유사한 고갈과 관련된 바이러스 감염의 경우에 중요하다는 것이 추가되므로, 바이러스 병리학이 본 출원의 새로운 생성물에 의해 표적화된 병리학 영역내에 포함된다.
최종적으로, 구체적인 양태에서, 본 발명자는 IL-7 돌연변이체 또는 변이체를 포함하는 이작용성 분자를 설계하였다. IL-7 돌연변이체 또는 변이체는 i) 야생형 IL-7의 친화성과 비교하여 IL-7 수용체(IL-7R)에 대해 친화성이 감소되어 있고, ii) 야생형 IL-7을 포함하는 이작용성 분자와 비교하여 IL-7 변이체를 포함하는 이작용성 분자의 약동학을 증진시킴을 특징으로 한다. 첫째로, 이작용성 분자내에서 IL-7 변이체의 사용은 이작용성 분자의 생체내 약동학을 증가시키기에 중요하다. 둘째로, 이의 수용체에 대한 IL-7 변이체의 친화성을 감소시킴으로써, 이는 이작용성 분자의 항-PD-1 항체 모이어티에 의해 표적화된 T 세포에 우선적으로 결합하여 이러한 세포에서 특이적인 효과를 나타낼 뿐 아니라 동일한 T 세포에서 이작용성 분자의 2개 부분의 작용과 관련된 상승 효과의 장점을 취하는 이작용성 분자의 능력을 증가시킨다. IL-7 변이체를 지닌 이작용성 분자는 양호한 결합 및 PD-1의 길항 활성을 갖는다. 또한, 이작용성 분자는 PD-1에 대한 이의 친화성과 IL-7R에 대한 친화성 사이에 적합한 평형을 나타낸다. 놀랍게도, 본 발명자는 IgG1 중쇄 불변 도메인을 갖는 이작용성 분자가 IgG4 중쇄 불변 도메인을 지닌 동일한 분자와 비교하여 IL-7 변이체(pStat5 신호, 상승 효과 및 CD127 결합)의 증진될 활성을 가짐을 관찰하였다. 또한, 항체와 IL-7 사이의 링커 (GGGGS)3의 사용은 IL-7 변이체의 활성(pStat5 신호 및 CD127 결합)을 극대화한다.
본 발명의 이작용성 분자는 특히 다음 이점들 중 1개 또는 수개를 갖는다:
- 이작용성 분자는 나이브, 부분 고갈된 및 완전 고갈된 T-세포 서브세트의 증식을 유도하고 및 항-PD1/PDL1 치료요법을 사용하는 바와 같은 부분적으로 고갈된 T-세포 만의 증식은 유도하지 않는다. 보다 특히, 이는 T 세포 활성화의 상승 효과를 갖는다.
- 이작용성 분자는 PD-1+ 고갈된 T 세포에 근접한 또는 위에서 IL-7의 종양 내로의 국재화를 허용하여, IL-7의 보다 높은 농도를 필요로 하는 세포를 표적화한다. 이는 특히 PD-1+ T 세포 침윤물 속에서 IL-7의 축적 및 PD-1+ T 세포에서 IL-7의 재-국재화를 유도한다.
- 항-PD-1 차단은 고갈된 T 세포를 종양의 장-기간 청소를 제한하는 활성 기억 T 세포로 재프로그램하지 못하지만, 이작용성 분자는 IL-7의 존재를 통해 기억 T 세포의 형성, 생존 및 증식을 촉진한다. 이후에, 이작용성 분자는 지속적이고 확장된 기억 T 세포 반응을 통해 내구성있는 항-종양 면역성을 유도한다.
- 항-PD1/PD-L1 치료요법 효능은 기존의 T 세포 침윤 및 T 세포 효과기 기능, 특히 IFNγ 특징과 관련되어 있지만, 이작용성 분자는 효과기 T 세포의 증식 및 IFNγ를 분비하는 이의 능력을, 상승적 효과로 증가시킨다.
- 이작용성 분자는 T reg 집단을 감소시키고 TGFβ(억제성 사이토킨)의 분비를 억제함으로써 면역억제성 미세환경을 감소시킬 수 있다. 보다 특히, 이작용성 분자는 T reg를 자극하지 않고 효과기 T 세포를 특이적으로 자극시킨다.
- IL-7이 중쇄 및/또는 경쇄의 C-말단 부분에 융합될 수 있고/있거나 IL-7이 CD127에 대해 높은 친화성을 보존하는 이작용성 분자는 네이키드(naked)/천연 IL-7과 유사하다. 이작용성 분자는 IL-7R 활성화 및 반감기의 측면에서 보다 강력할 수 있다.
- 이는 이작용성 분자로서 높은 생산 수율로 생산된다.
- 이작용성 분자는 T reg의 수를 감소시킴으로써 종양 미세환경 내로 T reg 세포의 면역억제 활성을 감소시킨다. 보다 특히, 이작용성 분자는 T reg를 자극시키지 않고 효과기 T 세포를 특이적으로 자극시킨다.
- 이작용성 화합물은 항-PD1 반응 단독과 비교하여 조직 및/또는 종양내로 T 세포 침윤을 촉진하는 인테그린(즉, Alpha4 및/또는 베타7 및 LFAT)의 발현을 증가시킨다. 특히, 이작용성 화합물은 T 세포 이주 및 종양 침윤을 촉진한다.
- 이작용성 분자는 본 발명자에 의해 확인된 것으로서 IL-7 변이체 또는 돌연변이체를 포함함으로써 IL-7 및 IL-7R과 항-PD-1 및 PD-1 사이의 적합한 친화성 균형과 함께, IL-7 활성 및 항-DP-1 항체의 길항체 활성을 유지시키면서 약동학을 극대화시킬 수 있다.
정의
본 발명이 보다 용이하게 이해될 수 있도록 하기 위해, 특정 용어를 이후 정의한다. 추가의 정의는 상세한 설명 전체에 나타낸다.
달리 정의하지 않는 한, 본원에 사용된 당해 분야의 모든 용어, 표기법 및 다른 과학적 전문용어는 본 발명이 속한 분야의 기술자가 일반적으로 이해한 의미를 갖는 것으로 의도된다. 일부 경우에, 일반적으로 이해된 의미를 갖는 용어가 명확성 및/또는 용이한 이해를 위해 본원에 정의되어 있으며, 본원의 이러한 정의의 포함은 당해 분야에서 일반적으로 이해되는 것보다 차이를 나타내는 것으로 필수적으로 고려되지 않아야 한다. 본원에 기술되고 참고된 기술 및 과정은 일반적으로 잘 이해되며 당해 분야의 기술자에 의해 통상적 방법을 사용하여 일반적으로 사용된다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "인터류킨-7", "IL-7" 및 "IL-7"는 포유동물의 내인성 분비성 당단백질, 특히 예컨대, 표준 생물검정 또는 IL-7 수용체 결합 친화성의 검정에서, IL-7 폴리펩타이드, 야생형 포유동물 IL-7에 대해 실질적인 아미노산 서열 동일성을 갖는 이의 유도체 및 유사체를 지칭한다. 예를 들면, IL-7은 i) IL-7 폴리펩타이드의 천연적으로 또는 비-천연적으로 존재하는 대립형질 변이체, ii) IL-7 폴리펩타이드의 생물학적으로 활성인 단편, iii) IL-7 폴리펩타이드의 생물학적으로 활성인 폴리펩타이드 유사체, 또는 iv) IL-7 폴리펩타이드의 생물학적으로 활성인 변이체의 아미노산 서열을 갖는 재조합 또는 비-재조합 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 지칭한다. IL-7은 이의 펩타이드 신호를 포함하거나 이를 결여할 수 있다. 이러한 분자의 대안적인 지정은 "전(pre)-B 세포 성장 인자" 및 "림포포이에틴-1"이다. 바람직하게는, 용어 "IL-7"은 인간 IL-7을 지칭한다. 예를 들면, 인간 IL-7 아미노산 서열은 약 152개 아미노산(신호 펩타이드의 부재하에)이고 제NP_000871.1호의 진뱅크 수탁 번호를 가지며, 유전자는 염색체 8q12-13에 위치한다. 인간 IL-7는 UniProtKB - P13232로 기술되어 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "야생형 인터류킨-7", "wt-IL-7" 및 "wt-IL7"은 포유동물의 내인성 분비성 당단백질, 특히 IL-7 폴리펩타이드, 예컨대, 표준 생물검정 또는 IL-7 수용체 결힙 친화성에서, 야생형 기능성 포유동물 IL-7에 대해 실질적인 아미노산 서열 동일성 및 실질적으로 동일한 생물학적 활성을 갖는 이의 유도체 및 유사체를 지칭한다. 예를 들면, wt-IL-7은 i) 천연의 또는 천연적으로 존재하는 IL-7 폴리펩타이드, ii) IL-7 폴리펩타이드의 생물학적으로 활성인 단편, iii) IL-7 폴리펩타이드의 생물학적으로 활성인 폴리펩타이드 유사체, 또는 iv) 생물학적으로 활성인 IL-7 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 갖는 재조합 또는 비-재조합 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 지칭한다. IL-7wt는 이의 펩타이드 신호를 포함할 수 있거나 이를 결여할 수 있다. 이러한 분자에 대한 대안의 정의는 "전-B 세포 성장 인자" 및 "림포포이에틴-1"이다. 바람직하게는, 용어 "wt-IL-7"는 인간 IL-7(wth-IL7)을 지칭한다. 예를 들면, 인간 wt-IL-7 아미노산 서열은 약 152 아미노산(신호 펩타이드의 부재하에)이고 제NP_000871.1호의 진뱅크 수탁번호를 가지고, 유전자는 염색체 8q12-13 상에 위치한다. 인간 IL-7은 예를 들면 UniProtKB - P13232로 기술되어 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "프로그램화된 사멸 1", "프로그램화된 세포 사멸 1", "PD1", "PD-1", "PDCD1", "PD-1 항원", "인간 PD-1", "hPD-1" 및 "hPD-1"은 상호교환적으로 사용되며 CD279로 또한 알려진, 프로그램화된 사멸-1 수용체를 지칭하고, 인간 PD-1의 변이체 및 동형, 및 PD-1과 적어도 하나의 일반적인 에피토프를 갖는 유사체를 포함한다. PD-1은 면역 반응의 역치(threshold) 및 말초 면역 내성의 주요 조절인자이다. 이는 활성화된 T 세포, B 세포, 단핵구, 및 수지 세포에서 발현되며 이의 리간드 PD-L1 및 PD-L2에 결합한다. 인간 PD-1은 PDCD1 유전자에 의해 암호화된다. 예로서, 인간 PD-1의 아미노산 서열은 진뱅크 수탁 번호 제NP_005009호 하에 개시되어 있다. PD1은 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 상에서 발현된 4개의 스플라이스 변이체를 갖는다. 따라서, PD-1 단백질은 전체 길이의 PD-1 뿐만 아니라 PD-1의 대안의 스플라이스 변이체, 예를 들면, PD-1Aex2, PD-1Aex3, PD-1Aex2,3 및 PD-1Aex2,3,4를 포함한다. 달리 명시하지 않는 한, 용어는 PBMC에 의해 천연적으로 발현되거나 PD-1 유전자로 형질감염된 세포에 의해 발현된 인간 PD-1의 임의의 변이체 및 동형을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "항체"는 면역글로불린 분자의 유형을 기술하며 이의 가장 광범위한 의미로 사용된다. 특히, 항체는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자, 즉 항원 결합 부위를 함유하는 분자의 면역학적으로 활성인 단편을 포함한다. 면역글로불린 분자는 임의의 유형(예컨대, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 부류(예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 서브부류일 수 있다. 면역글로불린의 상이한 부류에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마, 및 뮤로 물린다. 달리 구체적으로 나타내지 않는 한, 용어 "항체"는 완전한 면역글로불린 및 "항체 단편" 또는 "항원 결합 단편"(예를 들면, Fab, Fab', F(ab')2, Fv), 단일 쇄(scFv), 이의 돌연변이체, 항체 부위를 포함하는 분자, 디아바디(diabody), 선형 항체, 단일 쇄 항체, 및 요구된 특이성의 항원 인식 부위를 포함하는 면역글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 구조, 예를 들면, 항체의 글리코실화 변이체, 항체의 아미노산 서열 변이체를 포함한다. 바람직하게는, 용어 항체는 인간화된 항체를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은, 항체의 "항원-결합 단편"은 항체의 부분, 즉, 본 발며으이 항체의 구조 중 일부에 상응하는 분자를 의미하며, 이는 가능하게는 이의 천연 형태에서, PD-1에 대해 항원-결합능을 나타내고; 이러한 단편은 상응하는 4개의 쇄 항체의 항원-결합 특이성과 비교하여 상기 항원에 대해 동일하거나 실질적으로 동일한 항원-결합 특이성을 나타낸다. 유리하게는, 항원-결합 단편은 상응하는 4개-쇄 항체와 유사한 결합 친화성을 갖는다. 그러나, 상응하는 4개-쇄 항체와 관련하여 감소된 항원-결합 친화성을 갖는 항원-결합 단편이 또한 본 발명 내에 포함된다. 항원-결합능은 항체와 표적 단편 사이에 친화성을 측정함으로써 측정할 수 있다. 이러한 항원-결합 단편은 또한 항체의 "기능성 단편'으로 지정될 수 있다. 항체의 항원-결합 단편은 CDR(상보성 결정 영역)을 지정하는 이의 초가변 도메인 또는 항원에 대한 인식 부위를 포함하는 이의 부분(들), 즉, PD1의 세포외 도메인을 포함함으로써, 항원 인식 특이성을 정의하는 단편이다.
"Fab" 단편은 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1의 불변 도메인(CH1)을 포함한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터 하나 이상의 사이토신을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카복실 말단에서 약간의 잔기를 첨가함으로써 Fab 단편과 상이하다. F(ab') 단편은 F(ab')2 펩신 소화 생성물의 힌지(hinge) 시스테인에서 이황화물 결합의 절단으로 생산된다. 항체 단편의 추가의 화학적 커플링은 당해 분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. Fab 및 F(ab')2 단편은 완전한 항체의 Fc 단편을 결여하고 있으며, 동물의 순환으로부터 보다 신속하게 청소되며, 완전한 항체보다 거의 비-특이적인 조직 결합을 가질 수 있다(참고: 예컨대, Wahl et al, 1983, J. Nucl. Med. 24:316).
"Fv" 단편은 완전한 표적 인식 및 결합 부위를 함유하는 항체의 최소의 단편이다. 이러한 영역은 강력한, 비-공유결합성 연합(VH-VL 이량체)내에서 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 이루어져 있다. 이는 각각의 도메인의 3개의 CDR이 VH-VL 이량체의 표면에서 표적 결합 부위를 정의하기 위해 상호작용하는 구조로 존재한다. 흔히, 6개의 CDR은 항체에 대해 표적 결합 특이성을 부여한다. 그러나, 일부 예에서 심지어 단일 가변 도메인(또는 표적에 대해 특이적인 단지 3개의 CDR을 포함하는 Fv 중 1/2)은 전체 결합 부위보다 더 낮은 친화성에서이지만, 표적을 인식하여 이에 결합하는 능력을 가질 수 있다.
"단일-쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 결합 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하고, 여기서 이러한 도메인은 단일의 폴리펩타이드 쇄내에 존재한다. 일반적으로, Fv 폴리펩타이드는 또한 scFv가 표적 결합을 위해 목적한 구조를 형성하도록 하는 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 폴리펩타이드 링커를 포함한다.
"단일 도메인 항체"는 PD-1에 대해 충분한 친화성을 나타내는 단일의 VH 또는 VL 도메인으로 구성된다. 구체적인 구현에에서, 단일 도메인 항체는 카멜화된 항체(camelized antibody)이다(참고: 예컨대, Riechmann, 1999, Journal of Immunological Methods 231 :25-38).
구조 측면에서, 항체는 이황화물 결합에 의해 상호연결된 중(H) 쇄 및 경(L) 쇄를 가질 수 있다. 경쇄, 람다(λ) 및 카파(κ)의 2개 유형이 존재한다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 불변 영역 및 가변 영역(또는 "도메인")을 포함한다. 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 "상보설-결정 영역" 또는 "CDR"로 또한 불리는, 3개의 초가변 영역에 의해 차단된 "골격" 영역을 함유한다. 골격 영역 및 CDR의 정도는 정의되어 있다(참고: Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 및 U.S. Department of Health and Human Services, 1991, 이는 본원에 참고로 포함된다). 바람직하게는, CDR은 카밧 방법(Kabat method)에 따라 정의된다. 골격 영역은 쇄간, 비-공유결합성 상호작용에 의해 정확한 배향으로 CDR을 위치시키기 위해 제공하는 스캐폴드를 형성하기 위해 작용한다. CDR은 항원의 에피토프에 대한 결합에 주요 관여한다. 각각의 쇄의 CDR은 전형적으로 N-말단으로부터 출발하여 순차적으로 번호매김된, "상보성 결정 영역 1" 또는 "CDR1", "CDR2", 및 "CDR3"을 지칭한다. 본 발명에 따른 항체의 VL 및 VH 도메인은 4개의 골격 영역 또는 "FR의 것"을 포함할 수 있고,이는 당해 분야에서 및 본원에서 각각 "골격 영역 1 " 또는 "FR1", "FR2", "FR3", 및 "FR4"로 지칭된다. 이러한 골격 영역 및 상보성 결정 영역은 바람직하게는 다음의 순서로 작동적으로 연결된다: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4(아미노 말단으로부터 카복실 말단까지). 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "항체 골격"은 가변 도메인의 부분, VL 및/또는 VH를 지칭하며, 이는 이러한 가변 도메인의 항원 결합 루프(CDR)에 대한 스캐폴드로서 제공된다.
본원에 사용된 바와 같은, "항체 중쇄"는 항체 구조 내에 존재하는 보다 큰 2개 유형의 폴리펩타이드 쇄를 지칭한다. 항체 중쇄의 CDR은 "HCDR1", "HCDR2" 및 "HCDR3"로 전형적으로 지칭된다. 항체 중쇄의 골격 영역은 "HFR1", "HFR2", "HFR3" 및 "HFR4"로서 전형적으로 지칭된다.
본원에 사용된 바와 같은, "항체 경쇄"는 항체 구조 내에 존재하는 보다 작은 2개 유형의 폴리펩타이드를 지칭한다; κ 및 λ 경쇄는 2개의 주요 항체 경쇄 동형을 지칭한다. 항체 경쇄의 CDR은 전형적으로 "LCDR1", "LCDR2" 및 "LCDR3"로서 지칭된다. 항체 경쇄의 골격 영역은 전형적으로 "LFR1", "LFR2", "LFR3" 및 "LFR4"로서 지칭된다.
표적 분자에 대한 항체의 결합과 관련하여, 용어 "결합하다" 또는 "결합"은 항원을 인식하여 접촉하는 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 융합 단백질, 분자 및 항체(예를 들면, 항체 단편)를 지칭한다. 바람직하게는, 이는 항원-항체형 상호작용을 지칭한다. 특수한 항원 항원(예컨대, PD-1) 또는 특수한 항원(예컨대, PD-1) 상의 에피토프에 대한 용어 "특이적인 결합", "에 특이적으로 결합하다" "에 대해 특이적인", "선택적으로 결합하는" 및 "에 대해 선택적인"은 항체가 특이적인 항원을 인식하여 결합하지만 샘플 속에서 다른 분자를 실질적으로 인식하여 결합하지 않음을 의미한다. 예를 들면, PD-1 또는 PD-1 에피토프에 특이적으로(또는 우선적으로) 결합하는 항체는 이러한 PD-1 에피토프에 예를 들면, 보다 큰 친화성, 항원항체결합력(avidity), 보다 용이하게, 및/또는 이것이 다른 PD-1 에피토프 또는 비-PD-1 에피토프에 결합하는 것보다 더 긴 기간으로 결합하는 항체이다. 바람직하게는, 용어 "특이적인 결합"은 항체와 항원 사이의 10-7 M 이하의 결합 친화성으로의 접촉을 의미한다. 특정의 양태에서, 항체는 10-8 M, 10-9 M 또는 10-10 M 이하의 친화성으로 결합한다.
본원에 사용된 바와 같은, "PD-1 항체", "항-PD-1 항체", "PD-1 Ab", "PD-1-특이적인 항체", "항-PD-1 Ab"는 상호교환적으로 사용되며 본원에 기술된 바와 같이, PD-1, 특히 인간 PD-1에 특이적으로 결합하는 항체를 지칭한다. 일부 구현예에서, 항체는 PD-1의 세포외 도메인에 결합한다. 특히, 항-PD-1 항체는 PD-1 항체에 결합할 수 있는 항체이며 PD-1-매개된 신호전달 경로를 억제함으로써 T 세포 활성화와 같은 면역 반응을 향상시킨다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "이작용성 분자", "이작용성 화합물", "이작용성 단백질", "비키", "비기 항체", "이작용성 항체" 및 "이작용성 체크포인트 억제제 분자"는 동일한 의미를 가지며 상호교환적으로 사용될 수 있다. 이러한 용어는 당해 항원에 대해 특이적인 적어도 하나의 영역(예컨대, 항체의 가변 영역으로부터 유래됨), 및 폴리펩타이드인 제2의 영역을 지님으로써 하나의 항원을 인식하는 항체를 지칭한다. 보다 구체적으로, 이작용성 분자는 항체 또는 이의 부위, 바람직하게는 이의 항원 결합 단편과 다른 폴리펩타이드 또는 이의 폴리펩타이드 단편의 융합 단백질이다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "키메라 항체"는 하나의 종으로부터 유래된 중쇄 및/또는 경쇄의 부위, 및 상이한 종으로부터 유래된 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지 부위를 갖는 항체 또는 항원-결합 단편을 의미한다. 예시적인 예에서, 키메라 항체는 인간으로부터 유래된 불변 영역 및 비-인간 종, 예를 들면, 마우스로부터의 가변 영역을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "인간화된 항체"는 다른 포유동물 종, 예를 들면, 마우스의 배선으로부터 유래된 CDR 서열이 인간 골격 서열 상에 이식된 항체(예컨대, 비-인간 항체로부터 유래된 최소의 서열을 함유하는 키메라 항체)를 지칭한다. "인간화된 항체", 예컨대, 비-인간 항체는 또한 인간화를 겪은 항체를 지칭한다. 인간화된 항체는 일반적으로 인간 면역글로불린(수용체 항체)이며 여기서 하나 이상의 CDR로부터의 잔기는 목적한 특이성, 친화성, 및 원래의 항체의 능력을 유지하면서 비-인간 항체(공여체 항체)의 적어도 하나의 CDR로부터의 잔기로 대체되어 있다. 공여체 항체는 임의의 적합한 비-인간 항체, 예를 들면, 마우스, 랫트, 토끼, 닭, 또는 목적한 특이성, 친화성, 또는 생물학적 효과를 갖는 비-인간 영장류 항체일 수 있다. 일부 예에서, 수용체 항체의 선택된 골격 영역 잔기는 공여체 항체로부터의 골격 영역 잔기로 대체된다. 대안적으로, 공여체 항체의 선택된 골격 영역 잔기는 인간 또는 인간화된 항체로부터의 공격 영역 잔기로 대체된다. 추가의 골격 영역 변형은 인간 골격 서열내에서 이루어질 수 있다. 따라서, 인간화된 항체는 수용체 항체 또는 공여체 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 아미노산 변형은 항체 기능 및/또는 증가된 인간화 공정을 추가로 개선시키기 위해 이루어질 수 있다. "아미노산 변화" 또는 "아미노산 변형"은 본원에서 폴리펩타이드의 아미노산 서열내 변화를 의미한다. "아미노산 변형"은 폴리펩타이드 서열내 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함한다. 본원에서 "아미노산 치환" 또는 "치환"은 모 폴리펩타이드내 특수한 위치에서 아미노산의 다른 아미노산으로의 대체를 의미한다. "아미노산 삽입" 또는 "삽입"은 모 폴리펩타이드 서열내 특수한 위치에서 아미노산의 첨가를 의미한다. "아미노산 결실" 또는 "결실"은 모 폴리펩타이드 서열내 특수한 위치에서 아미노산의 제거를 의미한다. 아미노산 치환은 보존적일 수 있다. 보존적 치환은 주어진 아미노산 잔기의 유사한 화학적 특성(예컨대, 전하, 부피 및/또는 소수성)을 지닌 측쇄("R-그룹")을 갖는 다른 잔기로의 대체이다. 본원에 사용된 바와 같은, "아미노산 위치" 또는 "아미노산 위치 번호"는 상호교환적으로 사용되며 일반적으로 아미노산에 대해 1 문자 코드로 규정한, 아미노산 서열내 특수한 아미노산의 위치를 지칭한다. 아미노산 서열내 제1의 아미노산(즉, N 말단으로부터 출발하여)은 1번 위치를 가진 것으로 고려될 수 있다.
보존적 치환은 주어진 아미노산 잔기의 유사한 화학적 특성(예컨대, 전하, 부피 및/또는 소수성)을 지닌 측쇄("R-그룹")를 가진 다른 잔기로의 대체이다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환은 단백질의 기능적 특성을 실질적으로 변경하지 않을 것이다. 보존적 치환 및 상응하는 법칙은 당해 분야의 상태에서 잘 기술되어 있다. 예를 들면, 보존적 치환은 다음의 표에 반영된 아미노산 그룹내 치환으로 정의될 수 있다:
[표 A]
Figure pct00001

[표 B]
Figure pct00002

[표 C]
Figure pct00003

본원에 사용된 바와 같은, "단리된 항체"는 이의 천연 환경의 구성성분으로부터 분리 및/또는 회수된 항체이다. 단리된 항체는 항체의 천연 환경의 적어도 하나의 구성성분이 존재하지 않으므로, 재조합 세포내에서 동일계내(in situ) 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 균질성으로 및/또는 예를 들면,(예컨대, SDS-PAGE, 전기영동 포커싱(isoelectric focusing)(IEF), 모세관 전기영동) 또는 환원 또는 비-환원 조건 하에서 크로마토그래피(예컨대, 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의해 측정된 것으로서, 90%, 95% 또는 99% 이상의 순도로 정제된다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "로부터 유래된다" 및 "로부터 유래된"은 모 화합물 또는 단백질의 구조로부터 유래된 구조를 가지고 이의 구조가 본원에 개시된 것과 충분히 유사하며 이러한 유사성을 기반으로, 청구된 화합물과 동일하거나 유사한 ?헝, 활성 및 활용도를 나타내는 것으로 당해 분야의 기술자에게 예측될 수 있는 화합물을 지칭한다. 예를 들면, 쥐 항체로부터 유래된 인간화된 항체는 쥐와 유사한 특성을 공유하는, 예컨대, 동일한 에피토프를 인식하고, 항체의 인간화에 관여하고/하거나 이를 증가시킨 변형된 잔기를 지닌 유사한 VH 및 VL을 공유하는 항체 또는 항체 단편을 지칭한다.
용어 "치료"는 환자의 건강 상태를 완화시키는 것으로 의도된 임의의 활동, 예를 들면, 치료요법, 질환 또는 질환의 증상의 방지, 예방 또는 지연을 지칭한다. 이는 질환의 치유적 치료 및/또는 예방학적 치료 둘 다를 지정한다. 치유적 치료는 치유를 야기하는 치료 또는 질환 또는 질환의 증상 또는 이것이 직접 또는 간접적으로 유발하는 고통의 완화 및/또는, 개선 및/또는 제거, 감소 및/또는 안정화를 야기하는 치료로 정의된다. 예방학적 치료는 질환의 예방 및 질환의 진행 및/또는 발생 정도 또는 이의 출현 위험성을 감소시키고/시키거나 지연시키는 치료 둘 다를 포함한다. 특정의 구현예에서, 이러한 용어는 질환, 장애, 감염 또는 이것과 관련된 증상의 증진 또는 근절을 지칭한다. 다른 구현예에서, 이러한 용어는 암의 확산 또는 악화를 최소화시킴을 지칭한다. 본 발명에 따른 치료는 필수적으로 100% 또는 완전한 치료를 내포하지 않는다. 오히려, 당해 분자의 통상의 기술자가 잠재적인 이익 또는 치료학적 효과를 갖는 것으로 인식하는 이의 다양한 치료 정도가 존재한다. 바람직하게는, 용어 "치료"는 예를 들면, PD-1에 의해 매개된 신호전달 경로와 관련된 장애/질환을 가진, 대상체에게 하나 이상의 활성제를 포함하는 조성물의 적용 또는 투여를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "장애" 또는 "질환"은 유전적 또는 발달 오류, 감염, 독, 영양 결핍 또는 불균형, 독성, 또는 선호하지 않는 환경 인자로부텨 야기되는 신체의 부정확하게 작용하는 기관, 부분, 구조, 또는 시스템을 지칭한다. 바람직하게는, 이러한 용어는 건강 장애 또는 질환, 예컨대, 정상의 물리적 또는 정신적 기능을 파괴하는 질병을 지칭한다. 보다 바람직하게는, 용어 장애는 동물 및/또는 인간에게 영향을 미치는 면역 미/ㅊ또는 염증 질환, 예를 들면, 암을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "면역 질환"은 대상체 자체의 세포, 조직 및/또는 기관에 대한 대상체의 면역학적 반응에 의해 유발된 세포, 조직 및/또는 기관 손상에 의해 특징화된 대상체내 상태를 지칭한다. 용어 "염증 질환"은 염증, 예컨대, 만성 염증에 의해 특징화된 대상체내 상태를 지칭한다. 자가면역 장애는 염증과 관련되거나 관련되지 않을 수 있다. 더욱이, 염증은 자가면역 장애에 의해 유발되거나 유발되지 않을 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "암"은 신속한 및 제어되지 않는 비정상 세포의 성장에 의해 특징화된 장애로서 정의된다. 암 세포는 국소적으로 또는 혈류 및 림프계를 통해 신체의 다른 부분으로 확산될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "PD-1과 관련된 또는 이에 관한 질환", "PD-1 양성 암", 또는 "PD-1 양성 감염 질환"은 PD-1 발현으로부터 야기되거나 PD-1 발현의 증상/특징을 갖는 암 또는 감염 질환(예컨대, 바이러스 및/또는 세균에 의해 유발된), 즉, PD-1의 증가된 또는 감소된 발현 또는 활성에 의해 유발되거나, 가속화되거나, 또는 달리는 이에 연결된 임의의 상태를 지칭하는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "대상체", "숙주", "개체", 또는 "환자"는 성인 및 어린이를 포함하는 인간을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은, "약제학적 조성물"은 활성제 하나 이상, 예를 들면, 본 발명에 따른 이작용성 분자와 임의의 화학적 구성성분, 예를 들면, 생리학적으로 적합한 담체 및 부형제를 포함하는 제제를 지칭한다. 약제학적 조성물의 목적은 유기체에 대한 활성제의 투여를 촉진시키는 것이다. 본 발명의 조성물은 통상의 투여 경로 또는 사용에 적합한 형태일 수 있다. 일 구현예에서, "조성물"은 전형적으로 활성제, 예컨대, 화합물 또는 조성물, 및 천연적으로 존재하거나 비-천연적으로 존재하는 담체, 불활성(예를 들면, 검출가능한 제제 또는 표지) 또는 활성제, 예를 들면, 보조제, 희석제, 결합제, 안정화제, 완충제, 염, 친지성 용매, 방부제, 보조제 등의 조합을 의도하며 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본원에 지칭된 바와 같은, "허용가능한 비히클" 또는 "허용가능한 담체"는 당해 분야의 기술자에게 약제학적 조성물을 제형화하는데 유용한 것으로 알려진 임의의 공지된 화합물 또는 화합물의 조합이다.
본원에 사용된 것으로서 "유효량" 또는 "치료학적 유효량"은 단독 또는 하나 이상의 다른 활성제와 함께, 대상체에서 치료학적 효과를 부여하는데 필요한 활성제의 양, 예컨대, 표적화된 질환 또는 장애를 치료하거나 바람직한 효과를 생산하기 위해 필요한 활성제의 양을 지칭한다. "유효량"은 제제(들), 질환 및 이의 중증도, 치료될 대상체의 특성, 예를 들면, 연령, 물리적 상태, 체격, 성별 및 체중, 치료 기간, 공존하는 치료요법의 특성(경우에 따라), 구체적인 투여 경로 및 건강 요원의 지식 및 경험내 유사 인자에 따라 변할 것이다. 이러한 인자는 당해 분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있고 통상의 기술로 초점이 맞춰질 수 있다. 개개 구성성분 또는 이의 조합의 최대 용량, 즉, 정상의 의학적 판단에 따라 최고로 안전한 용량을 사용하는 것이 일반적으로 바람직하다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "의약"은 장애 또는 질환에 대해 치유 또는 방지 특성을 지닌 임의의 물질 또는 조성물을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "와 조합"은 하나 이상의 치료요법(예컨대, 예방제 및/또는 치료제)의 사용을 지칭한다. 용어 "조합된"은 치료요법(예컨대, 예방제 및/또는 치료제)가 지로한 또는 장애를 지닌 대상체에게 투여되는 순서를 제한하지 않는다.
용어 "폴리뉴클레오타이드", "핵산" 및 "핵산 서열"은 동일하며 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체 형태, 예를 들면, RNA 또는 DNA 또는 이의 유사체를 지칭한다. 핵산(예컨대, 핵산의 구성성분, 또는 부위)는 천연적으로 존재하거나, 변형 또는 가공된, 단리된 및/또는 비-천연일 수 있다. 가공된 핵산은 재조합 핵산 및 합성 핵산을 포함한다.
"항-PD1 항체를 암호화하는 단리된 핵산"은 항체 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자(또는 이의 단편), 예를 들면, 단일 벡터 또는 별도의 벡터내 이러한 핵산 분자(들), 및 숙주 세포내 하나 이상의 위치에 존재하는 이러한 핵산 분자(들)을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "핵산 작제물", "플라스미드", 및 "벡터"는 동일하며 전령(passenger) 핵산 서열, 예를 들면, DNA 또는 RNA를 숙주 세포내로 전달하는 작용을 하는 핵산 분자를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "숙주 세포"는 본 발명의 작제물을 암호화하는 벡터, 외인성 핵산 분자, 및 폴리뉴클레오타이드일 수 있거나 인 임의의 개체 세포 또는 세포 배양물; 및/또는 장체 작제물 자체의 수용체를 포함하는 것으로 의도된다. 세포내로 각각의 물질의 도입은 형질전환, 형질감염 등의 방식으로 수행할 수 있다. 용어 "숙주 세포"는 또한 단일 세포의 후대세포 또는 잠재적인 후대세포를 포함하는 것으로 의도된다. 숙주 세포는 예를 들면, 세균, 미생물, 식물 또는 동물 세포를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, "면역 세포"는 선천성 및 적응성 면역성에 관여한 세포, 예를 들면, 골수 속에서 생산된 조혈 줄기 세포(HSC)로부터 유래된 적혈 세포(백혈구), 림프구(T 세포, B 세포, 천연 킬러(NK) 세포 및 천연 킬러 T 세포(NKT) 및 골수구-유래된 세포(호중구, 호산구, 호염기구, 단핵구, 대식구, 수지 세포)를 지칭한다. 특히, 면역 세포는 B 세포, T 세포, 특히 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포, NK 세포, NKT 세포, APC 세포, 수지 세포 및 단핵구를 포함하는 비-완전 몰록에서 선택될 수 있다. 본원에 사용된 것으로서 "T 세포"는 예를 들면 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, T 헬퍼 제1형 T 세포, T 헬퍼 제2형 T 세포, T 헬퍼 17형 T 세포 및 억제성 T 세포를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "T 효과기 세포", "T eff" 또는 "효과기 세포"는 자극, 예를 들면, 공-자극에 활성적으로 반응하는 수개의 T 세포를 포함하는 면역 세포의 그룹을 기술한다. 이는 특히 예컨대, 항원을 제거하도록 기능하는(예컨대, 다른 세포의 활성화를 조절하는 사이토킨을 생산함에 의해 또는 세포독성 활성에 의해) T 세포를 포함한다. 이는 특히 CD4+, CD8+, Treg 세포, 세포독성 T 세포 및 헬퍼 T 세포(Th1 및 Th2)를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "조절성 T 세포", Treg 세포" 또는 "T reg"는 면역계를 조절하고, 자가-항원에 대한 내성을 유지하고, 자가면역 질환을 방지하는 T 세포의 소집단을 지칭한다. Treg는 면역억제성이고 일반적으로 효과기 T 세포의 유도 및 증식을 하양조절한다. Treg는 생물마커 CD4, FOXP3, 및 CD25를 발현하며 나이브 CD4 세포와 동일한 계통으로부터 유래되는 것으로 고려된다.
용어 "고갈된 T 세포"는 기능이상(즉, "고갈") 상태의 T 세포의 집단을 지칭한다. T 세포 고갈은 기능의 점진적인 손실, 전사 프로파일에서의 변화 및 억세성 수용체의 지속된 발현에 의해 특징화된다. 고갈된 T 세포는 이의 사이토킨 생산능, 이의 고 증식능 및 이의 데호독성 효능을 상실하며, 이는 궁극적으로 이의 결실을 초래한다. 고갈된 T 세포는 전형적으로 CD62L 및 CD127의 보다 낮은 발현과 조합된 보다 높은 수준의 CD43, CD69 및 억제성 수용체를 나타낸다.
용어 "면역 반응"은 예를 들면, 림프구, 항원 제시 세포, 대식 세포, 과립구, 및 인간 신체로부터 침범하는 병원체, 병원체로 감염된 세포 또는 조직, 암 세포, 또는, 자가면역성 또는 병원성 염증의 경우에, 정상 인간 세포 또는 조직에 대한 선택적인 손상, 이의 파괴, 또는 제거를 야기하는 상기 세포 또는 간에 의해 생산된 가용성 거대세포(예를 들면, 항체, 사이토킨, 및 상보체)의 작용을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "길항제"는 다른 물질의 활성 또는 기능성을 차단하거나 감소시키는 물질을 지칭한다. 특히, 당해 용어는 참고 물질(예컨대 PD-L1 및/또는 PD-L2)로서 세포 수용체(예컨대, PD-1)에 결합하여, 이를 이의 유용한 생물학적 효과 모두 또는 일부의 생산(예컨대, 면역 억제 미세환경의 생성)을 방지하는 항체를 지칭한다. 본 발명에 따른 항체의 길항제 활성은 경쟁적 ELISA로 평가할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "단리된"은 인용된 물질(예컨대, 항체, 폴리펩타이드, 핵산 등)이 이것이 천연에서 함께 존재하는 다른 물질로부터 실질적으로 분리되거나, 이와 비교하여 농축됨을 나타낸다. 특히, "단리된 항체"는 이의 천연 환경의 구성성분으로부터 확인되어 분리되고/되거나 회수된 것이다. 예를 들면, 단리된 항체는 로우리 방법(Lowry method)으로 측정된 것으로서 항체의 75 중량% 이상까지, 또는 환원 또는 비-환원 조건 하에서 SDS-PAGE에 의한 균질성까지 정제된다. 단리된 항체는 항체의 천연 환경의 적어도 하나의 구성성분이 존재하지 않을 재조합 세포내에서 자체내 항체를 포함한다. 그러나, 통상적으로 단리된 항체는 적어도 하나의 정제 단계에 의해 분리될 것이다.
본원에 사용된 것으로서 용어 "및/또는"은 다른 것의 존재 또는 부재하에 2개의 규정된 특징 또는 구성성분 각각의 구체적인 개시내용으로서 취해진다. 예를 들면, "A 및/또는 B"는 각각이 개별적으로 설정된 경우와 같이, (i) A, (ii) B 및 (iii) A와 B 각각의 구체적인 개시내용으로서 취해져야 한다.
용어 단수("a" 또는 "an")는 이것이 문맥상으로 성분 중 하나 또는 성분 중 하나 이상이 기술된 것이 명백하지 않는 한, 이것이 수정하는 성분 중 하나 또는 다수를 지칭할 수 있다(예컨대, "시약"은 하나 이상의 시약을 의미할 수 있다).
임의의 및 모든 값(수치 범위의 하부 및 상부 끝 포함)과 관련하여 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "약"은 +/- 10%(예컨대, +/- 0.5%, +/-1 %, +/- 1.5%, +/- 2%, +/- 2.5%, +/- 3%, +/- 3.5%, +/- 4%, +/- 4.5%, +/- 5%, +/- 5.5%, +/- 6%, +/- 6.5%, +/- 7%, +/- 7.5%, +/- 8%, +/- 8.5%, +/- 9%, +/- 9.5%)의 허용가능한 편차의 범위를 갖는 임의의 값을 의미한다. 일련의 값의 개시부에서 용어 "약"의 사용은 값 각각을 변형시킨다(즉, "약 1, 2 및 3"은 약 1, 약 2 및 약 3을 지칭한다). 또한, 값의 목록이 본원에 기술된 경우(예컨대 약 50%, 60%, 70%, 80%, 85% 또는 86%) 목록은 이의 모든 중간체 및 분획 값(예컨대, 54%, 85.4%)을 포함한다.
항-PD-1 항체
본 발명에 따른 이작용성 분자는 항-hPD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 제1의 실체(entity)를 포함한다.
특히 인간 PD-1에 결합하는 항체가 본원에 제공된다. 일부 양태에서, 항체는 인간 PD-1, 바람직하게는 인간 PD-1의 세포외 도메인에 특이적으로 결합한다. 일부 양태에서, 항체는 하나 이상의 완전한 길이의 인간 PD-1, PD-1Aex2, PD-1Aex3, PD-1Aex2,3 및 PD-1Aex2,3,4에 선택적으로 결합한다.
일부 양태에서, 항-PD1 항체는 단리된 항체, 특히 비-천연의 단리된 항체이다. 이러한 단리된 항-PD1 항체는 적어호 하나의 정제 단계에 의해 제조될 수 있다. 일부 구현예에서, 단리된 항-PD1 항체는 적어도 80 중량%, 85 중량%, 90 중량%, 95 중량% 또는 99 중량%까지 정제된다. 일부 구현예에서, 단리된 항-PD1 단리된 항체는 적어도 85 중량%, 90 중량%, 95 중량%, 98 중량%, 99 중량% 내지 100 중량%, 및 용매 속에 용해된 다른 용질의 중량을 포함하는 중량의 나머지를 포함하는 용액으로서 제공된다.
바람직하게는, 이러한 항체는 PD-1와 적어도 이의 리간드 중 하나(예컨대 PD-L1 및/또는 PD-L2) 사이의 상호작용을 차단하거나 억제하는 능력을 갖는다. 본원에 사용된 것으로서 "결합을 차단하는" 또는 "상호작용을 차단하는" 또는 "상호작용을 억제하는" 능력은 2개의 분자(예컨대 PD-1 및 이의 리간드 PD-L1 및/또는 PD-L2) 사이의 결합 상호작용을 임의의 검출가능한 정도까지 방지하는 항체 또는 항원-결합 단편의 능력을 지칭한다.
바람직하게는, 항-PD1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 PD-1에 대한 인간 PD-L1 및/또는 PD-L2, 보다 바람직하게는 인간 PD-1에 대한 인간 PD-L1 및 PD-L2의 결합의 길항제이다.
특정의 구현예에서, 항-hPD1 항체 또는 항원-결합 단편은 PD-1과 이의 리간드 중 적어도 하나(예컨대 PD-L1 및/또는 PD-L2, 바람직하게는 PD-L1 및 PD-L2) 사이의 결합 상호작용을 적어도 50％까지 억제한다. 특정의 구현예에서, 이러한 억제는 60％ 이상, 70％ 이상, 80％ 이상, 또는 90％ 이상일 수 있다.
본 발명에 따른 항-hPD1 항체는 면역글로불린, 임의의 부류의 면역글로불린, 예를 들면, IgD, IgE, IgG, IgA, 또는 IgM(또는 이의 서브-부류), 인간 PD-1을 표적화하는 비-인간(예컨대, 쥐) 면역글로불린으로부터 유래된 최소의 서열을 함유하는 면역글로불린 쇄 또는 이의 단편(예를 들면, Fv, Fab, Fab', F(ab')2, scFv 또는 항체의 다른 항원-결합 서브서열)을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 항-hPD-1 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4, 바람직하게는 IgG4 또는 IgG1으로부터 유래된다.
일 구현예에서, 항체의 항원-결합 단편은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 중쇄 및 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 가변 도메인을 포함하는 경쇄, 및 중쇄 불변 도메인의 단편을 포함한다. 중쇄 불변 도메인의 단편에 의해, 따라서 항원-결합 단편은 완전한 중쇄 불변 도메인의 적어도 일부를 포함하는 것으로 이해될 수 있다. 예로서, 중쇄 불변 도메인은 적어도 중쇄의 CH1 도메인, 또는 적어도 중쇄의 CH1 및 CH2 도메인, 또는 적어도 중쇄의 CH1, CH2 및 CH3 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 중쇄 불변 도메인의 단편은 또한 중쇄의 Fc 도메인 중 적어도 일부를 포함하는 것으로 정의될 수 있다. 따라서, 항체의 항원-결합 단편은 완전한 항체의 Fab 일부, 완전한 항체의 F(ab')2 일부, 완전한 항체의 Fab' 부위를 포함하는 것으로 이해될 수 있다. 중쇄 불변 도메인은 또한 예를 들면, 본 기술에 나타낸 바와 같이, 완전한 중쇄 불변 도메인을 포함하거나 이로 이루어질 수 있고, 여기서 수개의 완전한 중쇄 불변 도메인이 기술되어 있다. 본 발명의 특수한 구현예에서, 및 항체의 항원-결합 단편이 완전한 중쇄 불변 도메인의 일부를 포함하거나 이로 이루어진 경우, 중쇄 불변 도메인 단편은 적어도 10개의 아미노산 잔기로 이루어질 수 있거나; 10 내지 300개의 아미노산 잔기, 특히 210개의 아미노산 잔기로 이루어질 수 있다.
바람직하게는, 인간 PD-1에 대한 항체는 모노클로날 항체이다. 본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균일한 항체의 집단으로부터 수득된 항체, 즉, 동일하고/하거나 동일한 에피토프에 결합하는 집단을 포함하는 개개 항체를 지칭한다. 바람직하게는, 이러한 모노클로날 항체(mAb)는 포유동물, 예를 들면, 마우스, 설치류, 토끼, 염소, 영장류, 비-인간 영장류 또는 인간으로부터 유래된다. 이러한 모노클로날 항체를 제조하는 기술은 예컨대, Stites et al. (eds.) BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY (4th ed.) Lange Medical Publications, Los Altos, CA, 및 references cited therein; Harlow and Lane (1988) ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL CSH Press; Goding (1986) MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES 및 PRACTICE (2d ed.) Academic Press, New York, NY에서 찾을 수 있다.
특정의 구현예에서, 본원에 제공된 항-hPD1 항체는 키메라 항체이다. 하나의 예에서, 키메라 항체는 비-인간 가변 영역(예컨대, 마우스, 랫트, 햄스터, 토끼, 또는 비-인간 영장류, 예를 들면, 원숭이로부터 유래된 가변 영역) 및 인간 불변 영역을 포함한다. 추가의 예에서, 키메라 항체는 "부류 스위치된(class switched)" 항체이고 여기서 부류 또는 서브부류는 모 항체의 것으로부터 변화된다. 키메라 항체는 이의 항원-결합 단편을 포함한다.
특정의 구현예에서, 항-hPD1 항체는 인간화된 항체이다. 인간화된 항체는 전형적으로 하나 이상의 가변 도메인을 포함하고, 여기서 CDR(또는 이의 일부)는 비-인간 항체로부터 유래되고, FR(또는 이의 일부)은 인간 또는 인간화된 항체 서열로부터 유래된다. 대안적으로, 일부 FR 잔기는 항체 특이성, 친화성 및/또는 인간화를 회복하거나 증진시키도록 치환될 수 있다. 인간화된 항체는 임의로 또한 인간 또는 인간화된 불변 영역(Fc) 중 적어도 일부를 포함할 것이다. 항체 인간화 방법은 당해 분야에 잘 알려져 있다. 예를 들면, Winter and Milstein, Nature, 1991, 349:293-299; Riechmann et al., Nature, 332, pp. 323 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239, pp. 1534 (1988), Rader et al, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 1998, 95:8910-8915; Steinberger et al, J. Biol. Chem., 2000, 275:36073-36078; Queen et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1989, 86: 10029-10033; Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633; Kashmiri, S.V. et al, Methods 36 (2005) 25-34 (describing SDR (a-CDR) grafting); Padlan, E.A., Mol. Immunol. 28 (1991) 489-498 (describing "resurfacing"); Dall'Acqua, W.F. et al, Methods 36 (2005) 43-60 (describing "FR shuffling"); 및 Osbourn, J. et al, Methods 36 (2005) 61-68 및 Klimka, A. et al, Br. J. 암 83 (2000) 252-260 (describing the "guided selection" approach to FR shuffling) 및 미국 특허 5,585,089, 5,693,761, 5,693,762, 5,821,337, 7,527,791, 6,982,321, 및 7,087,409; 및 6,180,370를 참고한다. 바람직하게는, 인간 PD-1에 대한 인간화된 항체는 모노클로날 항체이다.
특히, 인간화된 항체는 적어도 80% 또는 적어도 85%, 보다 바람직하게는 적어도 88%, 심지어 보다 바람직하게는 적어도 90%의 T20 인간화 점수(humanness score), 가장 바람직하게는 85% 내지 95%, 바람직하게는 88% 내지 92%의 T20 인간화 점수를 갖는 것이다.
"인간화"는 일반적으로 문헌: Gao S H, Huang K, Tu H, Adler A S. BMC Biotechnology. 2013: 13:55에 기술된 바와 같이 모노클로날 항체의 가변 영역의 인간화를 정량하기 위한 T20 점수 분석기를 사용하여 측정된다. T20 인간화 점수는 가오(Gao) 등(BMC Biotechnol., 2013, 13, 55)에 의해 최초로 개시된 항체 인간화 분야에서 일반적으로 사용된 매개변수이다. T20 인간화 점수는 일반적으로 인간화된 항체를 정의하기 위해 특허원(예컨대, WO15161311, WO17127664, WO18136626, WO18190719, WO19060750, 또는 WO19170677)에서 일반적으로 사용된다.
웹-기반 도구(web-based tool)가 T20 컷오프 인간 데이타베이스: http://abAnalyzer.lakepharma.com를 사용하여 항체 서열의 T20 점수를 계산하기 위해 제공된다. T20 점수의 계산시, 투입(input) VH, VK, 또는 VL 가변 영역 단백질 서열을 우선 카밧 번호매김으로 지정하고, CDR 잔기를 확인한다. 완전한 길이의 서열 또는 골격 만의 서열(CDR 잔기가 제거됨)을 각각의 항체 데이타베이스에스 blastp 단백질-단백질 BLAST 알고리즘을 사용하여 모든 서열에 대해 비교한다. 각각의 쌍식 비교(pairwise comparison) 사이의 서열 동일성을 단리하고, 데이타베이스내에서 모든 서열을 분석한 후, 서열을 투입 서열에 대해 서열 동일성을 기반으로 고 내지 저로 분류한다. 상위 20개의 일치된 서열의 동일성 퍼센트를 평균내어 T20 점수를 수득한다.
"모든 인간 데이타베이스"내 각각의 쇄 유형(VH, VK, VL) 및 서열 길이(완전한 또는 골격 만)에 대해, 각각의 항체 서열을 T20 점수 분석기를 사용하여 이의 각각의 데이타베이스로 점수내었다. T20 점수는 투입 서열 자체를 배제한 후 상위 20개의 일치된 서열로부터 수득하였다(서열 1이 항상 투입 항체 자체이므로 서열 2 내지 21의 동일성 퍼센트를 평균내었다). 점수에 있어서의 감소는 서열 대부분에 대해 거의 선형이었다; 그러나 항체의 하위 15 퍼센트에 대한 T20 점수는 급격하게 감소하기 시작하였다. 따라서, 서열 중 하위 15 퍼센트는 제거하였고 나머지 서열이 T20 컷오프 인간 데이타베이스를 형성하였으며, 여기서 T20 점수 컷오프는 새로운 데이타베이스내 서열의 최저 T20 점수를 나타낸다.
따라서, 본 발명에 따른 이작용성 분자에 포함된 인간화된 항-PD1 항체는 적어도 80% 또는 적어도 85%, 보다 바람직하게는 적어도 88%, 심지어 보다 바람직하게는 적어도 90%의 T20 인간화 점수, 가장 바람직하게는 85% 내지 95%, 바람직하게는 88% 내지 92%의 T20 인간화 점수를 갖는다.
일 구현예에서, 항-PD1 항체는 펨브롤리주맙(또는 키트루다 람브롤리주맙으로 공지됨, MK-3475), 이볼루맙(Opdivo, MDX-1106, BMS-936558, ONO-4538), 피디릴주맙(CT-011), 세니플리맙(Libtayo), 맘렐리주맙, AUNP12, AMP-224, AGEN-2034, BGB-A317(티슬레이주맙), PDR001(스파르탈리주맙), MK-3477, SCH-900475, PF-06801591, JNJ-63723283, 게놀리주맙(CBT-501), LZM-009, BCD-100, SHR-1201, BAT-1306, AK-103(HX-008), MEDI-0680(또한 AMP-514로서 공지됨) MEDI0608, JS001(참고: Si-Yang Liu et al., J. Hematol. Oncol.10:136 (2017)), BI-754091, CBT-501, INCSHR1210(또한 SHR-1210으로서 공지됨), TSR-042(또한 ANB011로서 공지됨), GLS-010(또한 WBP3055로서 공지됨), AM-0001(Armo), STI-1110(참고: WO 2014/194302), AGEN2034(참고: WO 2017/040790), MGA012(참고: WO 2017/19846), 또는 IBI308(참고: WO 2017/024465, WO 2017/025016, WO 2017/132825, 및 WO 2017/133540), WO 2006/121168에 기술된 모노클로날 항체 5C4, 17D8, 2D3, 4H1, 4A11, 7D3, 및 5F4로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. PD-1을 표적화하는 이작용성 또는 이특이성 분자, 예를 들면, RG7769(Roche), XmAb20717(Xencor), MEDI5752(AstraZeneca), FS118(F-star), SL-279252(Takeda) 및 XmAb23104(Xencor)가 또한 공지되어 있다.
특수한 구현예에서, 항-PD1 항체는 펨브롤리주맙(또한 키트루다 람브롤리주맙으로 공지됨, MK-3475) 또는 니볼루맙(Opdivo, MDX-1106, BMS-936558, ONO-4538)이다.
인간화된 항-hPD1 항체의 특수한 예는 이후 이의 CDR, 골격 영역 및 Fc 및 힌지(힌지) 영역에 의해 기술된다.
CDR
"상보성 결정 영역" 또는 "CDR"은 당해 분야에서 항체 가변 영역내 아미노산의 비-연속 서열을 지칭하는 것으로 공지되어 있으며, 이는 항원 특이성 및 결합 친화성을 부여한다. 주어진 CDR의 정밀한 아미노산 서열 경계부(boundary)는 임의의 수의 잘-공지된 반응식, 예를 들면, 카밧 등의 문헌(Sequences of Proteins of Immunological Interest 5th ed. (1991) "Kabat" numbering scheme); Al-Lazikani et al., 1997, J. Mol. Biol, 273:927-948 ("초티아(Chothia)" 번호매김 도식); MacCallum et al, 1996, J. Mol. Biol. 262:732-745 ("접촉" 번호매김 도식); Lefranc et al., Dev. Comp. Immunol., 2003, 27:55-77 ("IMGT" numbering scheme); 및 Honegge and Pluckthun, J. Mol. Biol, 2001, 309:657-70 ("AHo" 번호매김 도식)을 사용하여 용이하게 측정할 수 있다. 달리 구체화하지 않는 한, 본원의 특수한 CDR의 확인을 위해 사용된 번호매김 도식은 카밧 번호매김 도식이다.
일 구현예에서, 이작용성 분자는 인간화된 항-hPD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 인간화된 항체의 CDR 영역은 i) 매우 높은 수준의 인간화(85% 이상) 및 안정성을 지닌 안전한 인간화된 항체를 제공하고; ii) 포유동물 세포에서 생산된 경우 항체 특성, 보다 특히 보다 높은 제조능 및 이들이 인간 PD-1에 대해 10-7 M 미만, 바람직하게는 10-8 M 미만의 결합 친화성(KD)을 가지므로, 길항 활성(즉, 인간 PD-1에 대한 인간 PD-L1의 결합의 억제)을 보존하면서, 포유동물 세포, 예를 들면, COS 및 HCO 세포에서 보다 높은 생산 수율을 증가시키도록 최적화되어 있다.
매우 특수한 구현예에서, 이작용성 분자는 항-인간-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 바람직하게는 다음을 포함하는 인간화된 항-인간-PD-1 항체 또는 항원 결합 단편을 포함한다:
(i) HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 및
(ii) LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 도메인,
여기서:
- 중쇄 CDR1(HCDR1)은 서열 번호: 1의 임의의 위치 그러나 3번 위치에서 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고;
- 중쇄 CDR2(HCDR2)는 서열 번호: 2의 임의의 위치 그러나 13, 14 및 16번 위치에서 임의로 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 2의 아미노산 서열 2의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어고;
- 중쇄 CDR3(HCDR3)은 임의로 서열 번호: 3의 임의의 위치 그러나 2, 3, 7 및 8번 위치에서 임의로 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고 여기서 X1은 D 또는 E이고 X2는 T, H, A, Y, N, E 및 S으로 이루어진 그룹, 바람직하게는 H, A, Y, N, E로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
- 경쇄 CDR1(LCDR1)은 임의로 서열 번호: 12의 임의의 위치 그러나 5, 6, 10, 11 및 16번 위치에서 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고 여기서 X는 G 또는 T이고;
- 경쇄 CDR2(LCDR2)는 임의로 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고;
- 경쇄 CDR3(LCDR3)는 서열 번호: 16의 임의의 위치 그러나 1, 4 및 6번 위치에서, 임의로 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일 양태에서, 이작용성 분자는 다음을 포함하는 인간화된 항-hPD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다:
(i) HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 및
(ii) LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 도메인,
여기서:
- 중쇄 CDR1(HCDR1)은 임의로 서열 번호: 1의 임의의 위치 그러나 3번 위치에서 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고;
- 중쇄 CDR2(HCDR2)는 서열 번호: 2의 임의의 위치 그러나 13, 14 및 16번 위치에서 임의로 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 2의 아미노산을 포함하거나 이로 이루어지고;
- 중쇄 CDR3(HCDR3)은 서열 번호: 3의 임의의 위치 그러나 2, 3, 7 및 8번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고 여기서 X1은 D이고 X2는 T, H, A, Y, N, E, 및 S로 이루어진 그룹, 바람직하게는 H, A, Y, N, E로 이루어진 그룹으로부터 선택되거나; X1은 E이고 X2는 T, H, A, Y, N, E 및 S으로 이루어진 그룹, 바람직하게는 H, A, Y, N, E 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
- 경쇄 CDR1(LCDR1)은 임의로 서열 번호:12의 임의의 위치에서 그러나 5, 6, 10, 11 및 16번 위치에서, 임의로 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고 여기서 X는 G 또는 T이고;
- 경쇄 CDR2(LCDR2)는 임의로 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고;
- 경쇄 CDR3(LCDR3)은 서열 번호: 16의 임의의 위치에서 그러나 1, 4 및 6번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
다른 구현예에서, 이작용성 분자는 다음을 포함하는 인간화된 항-hPD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다:
(i) HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 및
(ii) LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 도메인,
여기서:
- 중쇄 CDR1(HCDR1)은 서열 번호: 1의 임의의 위치에서 그러나 3번 위치에서, 임의로 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고;
- 중쇄 CDR2(HCDR2)는 서열 번호: 2의 임의의 위치에서 그러나 13, 14 및 16번 위치에서, 임의로 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고;
- 중쇄 CDR3(HCDR3)은 서열 번호: 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11의 임의의 위치 그러나 2, 3, 6 및 8번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고;
- 경쇄 CDR1(LCDR1)은 서열 번호: 13 또는 서열 번호: 14의 임의의 위치에서 그러나 5, 6, 10, 11 및 16번 위치에서, 서열 번호: 13 또는 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고;
- 경쇄 CDR2(LCDR2)는 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고;
- 경쇄 CDR3(LCDR3)은 서열 번호: 16의 임의의 위치에서 그러나 1, 4 및 6번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
다른 양태에서, 이작용성 분자는 다음을 포함하는 인간화된 항-hPD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다:
(i) HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 및
(ii) LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 도메인,
여기서:
(a) 경쇄 CDR1(LCDR1)은 서열 번호: 13의 임의의 위치 그러나 5, 6, 10, 11 및 16번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지거나;
(b) 경쇄 CDR2(LCDR2)는 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지거나;
(c) 경쇄 CDR3(LCDR3)은 서열 번호: 16의 임의의 위치에서 그러나 1, 4 및 6번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지거나;
(d) 중쇄 CDR1(HCDR1)은 서열 번호: 1의 임의의 위치에서 그러나 3번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 1;서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지거나;
(e) 중쇄 CDR2(HCDR2)는 서열 번호: 2의 임의의 위치에서 그러나 13, 14 및 16번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지거나;
(f) 중쇄 CDR3(HCDR3)은 서열 번호: 4의 임의의 위치에서 그러나 2, 3, 7 및 8번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지거나;
- 중쇄 CDR3(HCDR3)은 서열 번호: 5의 임의의 위치에서 그러나 2, 3, 7 및 8번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지거나;
- 중쇄 CDR3(HCDR3)은 서열 번호: 6의 임의의 위치에서 그러나 2, 3, 7 및 8번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지거나;
- 중쇄 CDR3(HCDR3)은 서열 번호: 7의 임의의 위치에서 그러나 2, 3, 7 및 8번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지거나;
- 중쇄 CDR3(HCDR3)는 서열 번호: 8의 임의의 위치에서 그러나 2, 3, 7 및 8번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지거나;
- 중쇄 CDR3(HCDR3)은 서열 번호: 9의 임의의 위치에서 그러나 2, 3, 7 및 8번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 9서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지거나;
- 중쇄 CDR3(HCDR3)은 서열 번호: 10의 임의의 위치에서 그러나 2, 3, 7 및 8번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 10;서열 번호: 10의 아미노산 서열을 포함하거나;
- 중쇄 CDR3(HCDR3)은 서열 번호: 11의, 임의의 위치에서 그러나 2, 3, 7 및 8번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 11서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
다른 양태에서, 이작용성 분자는 다음을 포함하는 인간화된 항-hPD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다:
(i) HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 및
(ii) LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 도메인,
여기서:
(a) 경쇄 CDR1(LCDR1)는 서열 번호:14의 임의의 위치에서 그러나 5, 6, 10, 11 및 16번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고;
(b) 경쇄 CDR2(LCDR2)는, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고;
(c) 경쇄 CDR3(LCDR3)은 서열 번호: 16의 임의의 위치에서 그러나 1, 4 및 6번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고;
(d) 중쇄 CDR1(HCDR1)은 서열 번호: 1의 임의의 위치에서 그러나 3번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고;
(e) 중쇄 CDR2(HCDR2)는 서열 번호: 2의 임의의 위치에서 그러나 13, 14 및 16번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고;
(f) 중쇄 CDR3(HCDR3)은 서열 번호: 4의 임의의 위치에서 그러나 2, 3, 7 및 8번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지거나;
- 중쇄 CDR3(HCDR3)은 서열 번호: 5의 임의의 위치에서 그러나 2, 3, 7 및 8번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지거나;
- 중쇄 CDR3(HCDR3)은 서열 번호: 6의 임의의 위치에서 그러나 2, 3, 7 및 8번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지거나;
- 중쇄 CDR3(HCDR3)은 서열 번호: 7의 임의의 위치에서 그러나 2, 3, 7 및 8번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지거나;
- 중쇄 CDR3(HCDR3)은 서열 번호: 8의 임의의 위치에서 그러나 2, 3, 7 및 8번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지거나;
- 중쇄 CDR3(HCDR3)은 서열 번호: 9의 임의의 위치에서 그러나 2, 3, 7 및 8번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지거나;
- 중쇄 CDR3(HCDR3)은 서열 번호: 10의 임의의 위치에서 그러나 2, 3, 7 및 8번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 10의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지거나;
- 중쇄 CDR3(HCDR3)은 서열 번호: 11의 임의의 위치에서 그러나 2, 3, 7 및 8번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
특수한 구현예에서, 변형은 치환, 특히 보존적 치환이다.
일 구현예에서, 항-인간-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 (i) 서열 번호: 1의 CDR1, 서열 번호: 2의 CDR2 및 서열 번호: 3의 CDR3을 포함하는 중쇄(여기서 X1은 D 또는 E이고 X2는 T, H, A, Y, N, E 및 S로 이루어진 그룹, 바람직하게는 H, A, Y, N 및 E로 이루어진 그룹으로부터 선택된다); (ii) 서열 번호: 11의 CDR1(여기서 X는 G 또는 T이다), 서열 번호: 15의 CDR2 및 서열 번호: 16의 CDR3을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일 구현예에서, 항-인간-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 (i) 서열 번호: 1의 CDR1, 서열 번호: 2의 CDR2 및 서열 번호: 3의 CDR3을 포함하는 중쇄(여기서 X1은 D이고 X2는 T, H, A, Y, N 및 E로 이루어진 그룹, 바람직하게는 H, A, Y, N 및 E로 이루어진 그룹으로부터 선택되거나; 또는 여기서 X1은 E이고 X2는 T, H, A, Y, N, E, 및 S로 이루어진 그룹, 바람직하게는 H, A, Y, N, E 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택된다); 및 (ii) 서열 번호: 12의 CDR1(여기서 X는 G 또는 T이다), 서열 번호: 15의 CDR2 및 서열 번호: 16의 CDR3을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일 구현예에서, 항-인간-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 (i) 서열 번호: 1의 CDR1, 서열 번호: 2의 CDR2 및 서열 번호: 3의 CDR3(여기서 X1은 D이고 X2는 T, H, A, Y, N 및 E로 이루어진 그룹, 바람직하게는 H, A, Y, N 및 E로 이루어진 그룹으로부터 선택된다)을 포함하는 중쇄; 및 (ii) 서열 번호: 12의 CDR1(여기서 X는 G 또는 T이다), 서열 번호: 15의 CDR2 및 서열 번호: 16의 CDR3을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일 구현예에서, 항-인간-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 (i) 서열 번호: 1의 CDR1, 서열 번호: 2의 CDR2 및 서열 번호: 3의 CDR3(여기서 X1은 E이고 X2는 T, H, A, Y, N, E, 및 S로 이루어진 그룹, 바람직하게는 H, A, Y, N, E 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택된다)을 포함하는 중쇄; 및 (ii) 서열 번호: 12의 CDR1(여기서 X는 G 또는 T이다), 서열 번호: 15의 CDR2 및 서열 번호: 16의 CDR3을 포함하는 경쇄를 포함한다.
다른 구현예에서, 항-인간-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 (i) 서열 번호: 1의 CDR1, 서열 번호: 2의 CDR2 및 서열 번호: 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11의 CDR3을 포함하는 중쇄; 및 (ii) 서열 번호: 13의 CDR1 또는 서열 번호:14, 서열 번호: 15의 CDR2 및 서열 번호: 16의 CDR3을 포함하는 경쇄를 필수적으로 포함하거나 이로 이루어진다.
다른 구현예에서, 항-인간-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은
(i) 서열 번호: 1의 CDR1, 서열 번호: 2의 CDR2 및 서열 번호: 4의 CDR3을 포함하는 중쇄; 및 (ii) 서열 번호: 13의 CDR1, 서열 번호: 15의 CDR2 및 서열 번호: 16의 CDR3을 포함하는 경쇄; 또는
(i) 서열 번호: 1의 CDR1, 서열 번호: 2의 CDR2 및 서열 번호: 5의 CDR3을 포함하는 중쇄; 및 (ii) 서열 번호: 13의 CDR1, 서열 번호: 15의 CDR2 및 서열 번호: 16의 CDR3을 포함하는 경쇄, 또는
(i) 서열 번호: 1의 CDR1, 서열 번호: 2의 CDR2 및 서열 번호: 6의 CDR을 포함하는 중쇄; 및 (ii) 서열 번호: 13의 CDR1, 서열 번호: 15의 CDR2 및 서열 번호: 16의 CDR3을 포함하는 경쇄; 또는
(i) 서열 번호: 1의 CDR1, 서열 번호: 2의 CDR2 및 서열 번호: 7의 CDR을 포함하는 중쇄; 및 (ii) 서열 번호: 13의 CDR1, 서열 번호: 15의 CDR2 및 서열 번호: 16의 CDR3을 포함하는 경쇄; 또는
(i) 서열 번호: 1의 CDR1, 서열 번호: 2의 CDR2 및 서열 번호: 8의 CDR3을 포함하는 중쇄; 및 (ii) 서열 번호: 13의 CDR1, 서열 번호: 15의 CDR2 및 서열 번호: 16의 CDR3를 포함하는 경쇄; 또는
(i) 서열 번호: 1의 CDR1, 서열 번호: 2의 CDR2 및 서열 번호: 9의 CDR3을 포함하는 중쇄; 및 (ii) 서열 번호: 1의 CDR13, 서열 번호: 15의 CDR2 및 서열 번호: 16의 CDR3을 포함하는 경쇄; 또는
(i) 서열 번호: 1의 CDR1, 서열 번호: 2의 CDR2 및 서열 번호: 10의 CDR3을 포함하는 중쇄; 및 (ii) 서열 번호: 13의 CDR1, 서열 번호: 15의 CDR2 및 서열 번호: 16의 CDR3을 포함하는 경쇄; 또는
(i) 서열 번호: 1의 CDR1, 서열 번호: 2의 CDR2 및 서열 번호: 11의 CDR3을 포함하는 중쇄; 및 (ii) 서열 번호: 13의 CDR1, 서열 번호: 15의 CDR2 및 서열 번호: 16의 CDR3을 포함하는 경쇄를 필수적으로 포함하거나 이로 이루어진다.
다른 구현예에서, 항-인간-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은
(i) 서열 번호: 1의 CDR1, 서열 번호: 2의 CDR2 및 서열 번호: 4의 CDR3을 포함하는 중쇄; 및 (ii) 서열 번호: 14의 CDR1, 서열 번호: 15의 CDR2 및 서열 번호: 16의 CDR3을 포함하는 경쇄; 또는
(i) 서열 번호: 1의 CDR1, 서열 번호: 2의 CDR2 및 서열 번호: 5의 CDR3을 포함하는 중쇄; 및 (ii) 서열 번호: 14의 CDR1, 서열 번호: 15의 CDR2 및 서열 번호: 16의 CDR3을 포함하는 경쇄; 또는
(i) 서열 번호: 1의 CDR1, 서열 번호: 2의 CDR2 및 서열 번호: 6의 CDR3을 포함하는 중쇄; 및 (ii) 서열 번호: 14의 CDR1, 서열 번호: 15의 CDR2 및 서열 번호: 16의 CDR3을 포함하는 경쇄; 또는
(i) 서열 번호: 1의 CDR1, 서열 번호: 2의 CDR2 및 서열 번호: 7의 CDR3을 포함하는 중쇄; 및 (ii) 서열 번호: 14의 CDR1, 서열 번호: 15의 CDR2 및 서열 번호: 16의 CDR3을 포함하는 경쇄; 또는
(i) 서열 번호: 1의 CDR1, 서열 번호: 2의 CDR2 및 서열 번호: 8의 CDR3을 포함하는 중쇄; 및 (ii) 서열 번호: 14의 CDR1, 서열 번호: 15의 CDR2 및 서열 번호: 16의 CDR3을 포함하는 경쇄; 또는
(i) 서열 번호: 1의 CDR1, 서열 번호: 2의 CDR2 및 서열 번호: 9의 CDR3을 포함하는 중쇄; 및 (ii) 서열 번호: 14의 CDR1, 서열 번호: 15의 CDR2 및 서열 번호: 16의 CDR3을 포함하는 경쇄; 또는
(i) 서열 번호: 1의 CDR1, 서열 번호: 2의 CDR2 및 서열 번호: 10의 CDR3을 포함하는 중쇄; 및 (ii) 서열 번호: 14의 CDR1, 서열 번호: 15의 CDR2 및 서열 번호: 16의 CDR3을 포함하는 경쇄; 또는
(i) 서열 번호: 1의 CDR1, 서열 번호: 2의 CDR2 및 서열 번호: 11의 CDR3을 포함하는 중쇄; 및 (ii) 서열 번호: 14의 CDR1, 서열 번호: 15의 CDR2 및 서열 번호: 16의 CDR3을 포함하는 경쇄를 필수적으로 포함하거나 이로 이루어진다.
골격
일 구현예에서, 본 발명에 따른 항-PD1 항체 또는 항원 결합 단편은 골격 영역, 특히 중쇄 가변 영역 골격 영역(HFR) HFR1, HFR2, HFR3 및 HFR4 및 경쇄 가변 영역 골격 영역(LFR) LFR1, LFR2, LFR3 및 LFR4를 포함한다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 항-PD1 항체 또는 항원 결합 단편은 인간 또는 인간화된 골격 영역을 포함한다. 본원의 목적을 위한 "인간 수용체 골격"은 하기 정의된 바와 같은, 인간 면역글로불린 골격 또는 인간 컨센수스(consensus) 골격으로부터 유래된 경쇄 가변 도메인(VL) 골격 또는 중쇄 가변 도메인(VH) 골격의 아미노산 서열을 포함한다. 인간 면역글로불린 골격 또는 인간 컨센수스 골격으로부터 유래된 인간 수용체 골격은 이의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 이는 아미노산 서열 변화를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 아미노산 변화의 수는 10 이하, 9 이하, 8 이하, 7 이하, 6 이하, 5 이하, 4 이하, 3 이하, 또는 2 이하이다. 일부 구현예에서, VL 수용체 인간 골격은 VL 인간 면역글로불린 골격 서열 또는 인간 컨센수스 골격 서열에 대해 동일하다. "인간 컨센수스 골격"은 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 골격 서열의 선택시 가장 일반적으로 존재하는 아미노산 잔기를 나타내는 골격이다.
특히, 항-PD1 항체 또는 항원 결합 단편은 HFR3, 즉, 서열 번호: 43의 임의의 위치에서 그러나 27, 29 및 32번 위치에서 서열 번호: 41, 42, 43 및 44 각각의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 골격 영역s (HFR) HFR1, HFR2, HFR3 및 HFR4를 포함한다. 바람직하게는, 항-PD1 항체 또는 항원 결합 단편은 서열 번호: 41의 HFR1, 서열 번호: 42의 HFR2, 서열 번호: 43의 HFR3 및 서열 번호: 44의 HFR4를 포함한다.
대안적으로 또는 추가로, 항-PD1 항체 또는 항원 결합 단편은 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 45, 46, 47 및 48 각각의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 골격 영역(LFR) LFR1, LFR2, LFR3 및 LFR4를 포함한다. 바람직하게는, 인간화된 항-PD1 항체 또는 항원 결합 단편은 서열 번호: 45의 LFR1, 서열 번호: 46의 LFR2, 서열 번호: 47의 LFR3 및 서열 번호: 48의 LFR4를 포함한다.
VH-VL
본 발명에 따른 이작용성 분자에 포함된 항 hPD1 항체의 VL 및 VH 도메인은 바람직하게는 다음의 순서로 작동적으로 연결된 3개의 상보성 결정 영역에 의해 차단된 4개의 골격 영역을 포함할 수 있다: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4(아미노 말단으로부터 카복시 말단까지).
제1 구현예에서, 이작용성 분자 내에 포함된 항-인간-PD-1 인간화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은:
(a) 서열 번호: 17의 임의의 위치에서 그러나 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112번의 위치에서, 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 영역(VH)(여기서 X1은 D 또는 E이고 X2는 T, H, A, Y, N, E 및 S로 이루어진 그룹, 바람직하게는 H, A, Y, N, E로 이루어진 그룹으로부터 선택된다);
(b) 서열 번호: 26의 임의의 위치에서 그러나 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 영역(VL)(여기서 X는 G 또는 T이다)을 포함한다.
제2의 구현예에서, 이작용성 분자 내에 포함된 항-인간-PD-1 인간화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은:
(a) 서열 번호: 17의 임의의 위치에서 그러나 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112번 위치에서 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 영역(VH)(여기서 X1은 D이고 X2는 T, H, A, Y, N, E로 이루어진 그룹, 바람직하게는 H, A, Y, N, E로 이루어진 그룹으로부터 선택된다)이거나; X1은 E이고 X2는 T, H, A, Y, N, E 및 S로 이루어진 그룹, 바람직하게는 H, A, Y, N, E 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택된다);
(b) 서열 번호: 26의 임의의 위치에서 그러나 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 영역(VL)(여기서 X는 G 또는 T이다)을 포함한다.
제3 구현예에서, 이작용성 분자 내에 포함된 항-인간-PD-1 인간화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은:
(a) 서열 번호: 17의 임의의 위치에서 그러나 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112번 위치에서 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 영역(VH)(여기서 X1은 D이고 X2는 T, H, A, Y, N, E로 이루어진 그룹, 바람직하게는 H, A, Y, N, E로 이루어진 그룹으로부터 선택된다);
(b) 서열 번호: 26의 임의의 위치에서 그러나 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 영역(VL)(여기서 X는 G 또는 T이다)를 포함한다.
다른 구현예에서, 이작용성 분자 내에 포함된 항-인간-PD-1 인간화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은:
(a) 서열 번호: 17의 임의의 위치에서 그러나 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112번 위치에서 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 영역(VH)(여기서 X1은 E이고 X2는 T, H, A, Y, N, E 및 S로 이루어진 그룹, 바람직하게는 H, A, Y, N, E 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택된다);
(b) 서열 번호: 26의 임의의 위치에서 그러나 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105번 위치에서 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 영역(VL)(여기서 X는 G 또는 T이다)을 포함한다.
다른 구현예에서, 이작용성 분자 내에 포함된 항-인간-PD-1 인간화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은:
(a) 서열 번호: 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25 각각의 임의의 위치에서 그러나 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 임서열 번호: 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 영역(VH);
(b) 서열 번호: 27 또는 서열 번호: 28의 임의의 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 27 또는 서열 번호: 28의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
다른 구현예에서, 이작용성 분자 내에 포함된 항-인간-PD-1 인간화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은:
(a) 서열 번호: 18의 임의의 위치에서 그러나 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 18의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 영역(VH); 및 (b) 서열 번호: 27의 임의의 위치에서 그러나 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105번 위치에서 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 영역(VL); 또는
(a) 서열 번호: 19의 임의의 위치에서 그러나 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112번 위치에서 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 영역(VH); 및 (b) 서열 번호: 27의 임의의 위치에서 그러나 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105번 위치에서 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 영역(VL); 또는
(a) 서열 번호: 20의 임의의 위치에서 그러나 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112번의 위치에서 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 영역(VH); 및 (b) 서열 번호: 27의 임의의 위치에서 그러나 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 영역(VL), 또는
(a) 서열 번호: 21의 임의의 위치에서 그러나 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112번의 위치에서 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 영역(VH); 및 (b) 서열 번호: 27의 임의의 위치에서 그러나 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 영역(VL), 또는
(a) 서열 번호: 22의 임의의 위치에서 그러나 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 영역(VH); 및 (b) 서열 번호: 27의 임의의 위치에서 그러나 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 영역(VL), 또는
(a) 서열 번호: 23의 임의의 위치에서 그러나 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 23의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 영역(VH); 및 (b) 서열 번호: 27의 임의의 위치에서 그러나 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105번 위치에서 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 영역(VL), 또는
(a) 서열 번호: 24의 임의의 위치에서 그러나 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 24의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 영역(VH); 및 (b) 서열 번호: 27의 임의의 위치에서 그러나 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 영역(VL); 또는
(a) 서열 번호: 25의 임의의 위치에서 그러나 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 25의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 영역(VH); 및 (b) 서열 번호: 27의 임의의 위치에서 그러나 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 영역(VL); 또는
(a) 서열 번호: 18의 임의의 위치에서 그러나 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 18의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 영역(VH); 및 (b) 서열 번호: 28의 임의의 위치에서 그러나 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 28의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 영역(VL); 또는
(a) 서열 번호: 19의 임의의 위치에서 그러나 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 영역(VH); 및 (b) 서열 번호: 28의 임의의 위치에서 그러나 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 28의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 영역(VL); 또는
(a) 서열 번호: 20의 임의의 위치에서 그러나 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 영역(VH); 및 (b) 서열 번호: 28의 임의의 위치에서 그러나 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105번 위치에서 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 28의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 영역(VL); 또는
(a) 서열 번호: 21의 임의의 위치에서 그러나 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 영역(VH); 및 (b) 서열 번호: 28의 임의의 위치에서 그러나 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105번 위치에서 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 28의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 영역(VL); 또는
(a) 서열 번호: 22의 임의의 위치에서 그러나 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 영역(VH); 또는 (b) 서열 번호: 28의 임의의 위치에서 그러나 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 28의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 영역(VL); 또는
(a) 서열 번호: 23의 임의의 위치에서 그러나 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 23의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 영역(VH); 및 (b) 서열 번호: 28의 임의의 위치에서 그러나 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 28의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 영역(VL); 또는
(a) 서열 번호: 24의 임의의 위치에서 그러나 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 24의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 영역(VH); 및 (b) 서열 번호: 28의 임의의 위치에서 그러나 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 28의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 영역(VL); 또는
(a) 서열 번호: 25의 임의의 위치에서 그러나 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 25의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 영역(VH); 및 (b) 서열 번호: 28의 임의의 위치에서 그러나 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 28의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
특수한 구현예에서, 변형은 치환, 특히 보존적 치환이다.
CH-CL
일 구현예에서, 중쇄(CH) 및 경쇄(CL)는 본원의 상기에 기술된 바와 같은 VL 및 VH 서열을 포함한다.
특수한 구현예에서, 이작용성 분자 내에 포함된 항-인간-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은:
(a) 서열 번호: 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36 각각의 임의의 위치에서 그러나 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112의 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄, 및
(b) 서열 번호: 37 또는 서열 번호: 38의 임의의 위치에서 그러나 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 37 또는 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄를 포함한다.
다른 구현예에서, 이작용성 분자 내에 포함된 항-인간-PD-1 인간화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은:
(a) 서열 번호: 29의 임의의 위치에서 그러나 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112번의 위치에서 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 29로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄, 및 (b) 서열 번호: 37의 임의의 위치에서 그러나 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105번의 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄; 또는
(a) 서열 번호: 30의 임의의 위치에서 그러나 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 30으로부터 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄, 및 (b) 서열 번호: 37의 임의의 위치에서 그러나 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄; 또는
(a) 서열 번호: 31의 임의의 위치에서 그러나 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112번의 위치에서 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 31으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄, 및 (b) 서열 번호: 37의 임의의 위치에서 그러나 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄; 또는
(a) 서열 번호: 32의 임의의 위치에서 그러나 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 32로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄, 및 (b) 서열 번호: 37의 임의의 위치에서 그러나 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄; 또는
(a) 서열 번호: 33의 임의의 위치에서 그러나 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112번의 위치에서 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 33로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄, 및 (b) 서열 번호: 37의 임의의 위치에서 그러나 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄, 또는
(a) 서열 번호: 34의 임의의 위치에서 그러나 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 34로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄, 및 (b) 서열 번호: 37의 임의의 위치에서 그러나 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄, 또는
(a) 서열 번호: 35의 임의의 위치에서 그러나 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 35로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄, 및 (b) 서열 번호: 37의 임의의 위치에서 그러나 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄, 또는
(a) 서열 번호: 36의 임의의 위치에서 그러나 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 36으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄, 및 (b) 서열 번호: 37의 임의의 위치에서 그러나 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄; 또는
(a) 서열 번호: 29의 임의의 위치에서 그러나 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 29로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄, 및 (b) 서열 번호: 38의 임의의 위치에서 그러나 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄, 또는
(a) 서열 번호: 30의 임의의 위치에서 그러나 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112번 위치에서 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 30으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄, 및 (b) 서열 번호: 38의 임의의 위치에서 그러나 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄, 또는
(a) 서열 번호: 31의 임의의 위치에서 그러나 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112번의 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 31로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄, 및 (b) 서열 번호: 38의 임의의 위치에서 그러나 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄, 또는
(a) 서열 번호: 32의 임의의 위치에서 그러나 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 32로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄, 및 (b) 서열 번호: 38의 임의의 위치에서 그러나 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄, 또는
(a) 서열 번호: 33의 임의의 위치에서 그러나 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 33으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄, 및 (b) 서열 번호: 38의 임의의 위치에서 그러나 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄, 또는
(a) 서열 번호: 34의 임의의 위치에서 그러나 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 34로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄, 및 (b) 서열 번호: 38의 임의의 위치에서 그러나 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄, 또는
(a) 서열 번호: 35의 임의의 위치에서 그러나 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 35로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄, 및 (b) 서열 번호: 38의 임의의 위치에서 그러나 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄, 또는
(a) 서열번호: 36의 임의의 위치에서 그러나 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 36으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄, 및 (b) 서열 번호: 38의 임의의 위치에서 그러나 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄를 포함한다.
바람직하게는, 변형은 치환, 특히 보존적 치환이다.
Fc 및 힌지 영역
치료학적 항체를 개발하기 위한 수명의 연구자는 Fc 영역을 가공하여 항체 특성을 최적화함으로써 이의 요구되는 약리학 활성에 보다 적합한 분자의 생성을 허용하는 것을 이끌어 왔다. 항체의 Fc 영역은 이의 혈청 반감기 및 효과기 기능, 예를 들명, 상보체-의존성 세포독성(CDC), 항체-의존성 세포 세포독성(ADCC) 및 항체-의존성 세포 식세포작용(ADCP)을 매개한다. CH2 도메인과 CH3 도메인 사이의 계면에 위치한 수개의 돌연변이, 예를 들어, T250Q/M428L 및 M252Y/S254T/T256E + H433K/N434F는 FcRn에 대한 결합 친화성 및 생체내에서 IgG1의 반감기를 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 증가된 FcRn 결합과 증진된 반감기 사이에 항상 직접적인 관계가 존재하지는 않는다. 치료학적 항체의 효능을 증진시키기 위한 한가지 접근법은 이의 혈청 지속성을 증가시켜, 보다 높은 순환 수준, 빈번하지 않은 투여 및 감소된 용량을 허용하는 것이다. Fc 영역을 가공하는 것은 항체의 효과기 기능을 감소시키거나 증가시키는데 바람직할 수 있다. 세포-표면 분자, 특히 면역 세포 상의 것을 표적화하는 항체의 경우, 효과기 기능을 폐기하는 것이 요구된다. 역으로, 종양학 용도로 의도된 항체의 경우, 효과기 기능을 증가시키는 것은 치료학적 활성을 증진시킬 수 있다. 4개의 인간 IgG 동형은 활성화 Fcγ 수용체(FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIIa), 억제성 FcγRIIb 수용체, 및 상보체(C1q)의 제1 구성성분과 상이한 친화성으로 결합하여, 매우 상이한 효과기 기능을 생성한다. FcγR 또는 C1q에 대한 IgG의 결합은 힌지 영역 및 CH2 도메인 내에 위치한 잔기에 의존한다. CH2 도메인의 2개 영역은 FcγR 및 C1q 결합에 중요하며, IgG2 및 IgG4 내에서 독특한 서열을 갖는다.
본 발명에 따른 항체는 적어도 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 일부, 전형적으로 포유동물 면역글로불린, 심지어 보다 바람직하게는 인간 또는 인간화된 면역글로불린의 것을 임의로 포함한다. 바람직하게는, Fc 영역은 본원에 기술된 항-hPD-1 항체의 부분이다. 본 발명의 이작용성 분자 내에 포함된 항-hPD1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 면역글로불린의 불변 영역 또는 불변 영역의 단편, 유사체, 변이체, 돌연변이체, 또는 유도체를 포함할 수 있다. 당해 분야의 기술자에게 잘 공지된 바와 같이, 중쇄 불변 도메인의 IgG 동형의 선택은 특이적인 기능이 요구되는지의 여부 및 생체내 반감기에 적합한 필요성의 여부에 집중된다. 예를 들면, 암 세포의 선택적인 근절을 위해 설계된 항체는 전형적으로 상보체 활성화 및 항체-의존성 세포-매개된 세포독성에 의한 효과기-매개된 세포 사멸을 허용하는 활성 동형을 필요로 한다. 인간 IgG1 및 IgG3(보다 짧은 반감기) 동형 둘 다, 특히 인간 IgG1 동형(야생형 및 변이체)은 이러한 기준을 충족시킨다. 특히, 중쇄 불변 도메인(특히 인간 야생형 및 변이체 IgG1 동형)의 IgG 동형에 따라, 본 발명의 항-hPD1 항체는 CDC, ADCC 및/또는 ADCP 메카니즘을 통해 PD-1을 발현하는 세포에 대해 세포독성일 수 있다. 실제로, 단편 결정화가능한(Fc) 영역은 다양한 보조 분자와 상호작용하여 간접적인 효과기 기능, 예를 들면, 항체-의존적 세포 세포독성(ADCC), 항체-의존성 세포 식균작용(ADCP) 및 상보체-의존성 세포독성(CDC)을 매개한다.
바람직한 구현예에서, 불변 영역은 인간 면역글로불린 중쇄, 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 또는 다른 부류로부터 유래된다. 추가의 양태에서, 인간 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG2, IgG3 및 IgG4로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 바람직하게는, 항-PD1 항체는 IgG1 또는 IgG4 Fc-영역을 포함한다. 심지어 보다 바람직하게는, 항-hPD1 항체는 IgG4를 안정화시키는 S228P를 지닌 IgG4 Fc-영역을 포함한다.
일 구현예에서, 항-PD1 항체는 트렁케이트된(truncated) Fc 영역 또는 Fc 영역의 단편을 포함한다. 일 구현예에서, 불변 영역은 CH2 도메인을 포함한다. 다른 구현예에서, 불변 영역은 CH2 및 CH3 도메인을 포함하거나 힌지-CH2-CH3을 포함한다. 대안적으로, 불변 영역은 힌지 영역, CH2 도메인 및/또는 CH3 도메인 중 모두 또는 일부를 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 불변 영역은 인간 IgG4 중쇄로부터 유래된 CH2 및/또는 CH3 도메인을 함유한다. 일부 구현예에서, 불변 영역은 인간 IgG4 중쇄로부터 유래된 CH2 및/또는 CH3 도메인을 함유한다.
다른 구현예에서, 불변 영역은 CH2 도메인 및 적어도 힌지 영역의 일부를 포함한다. 힌지 영역은 면역글로불린 중쇄, 예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 또는 다른 부류로부터 유래될 수 있다. 바람직하게는, 힌지 영역은 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 또는 다른 적합한 부류로부터 유래되며, 돌연변이되거나 돌연변이되지 않는다. 보다 바람직하게는 힌지 영역은 인간 IgG1 중쇄로부터 유래된다. 일 구현예에서, 불변 영역은 제1의 항체 동형으로부터 유래된 CH2 도메인 및 제2의 항체 동형으로부터 유래된 힌지 영역을 포함한다. 구체적인 구현예에서, CH2 도메인은 인간 IgG2 또는 IgG4 중쇄로부터 유래되는 반면, 힌지 영역은 변경된 인간 IgG1 중쇄로부터 유래된다.
일 구현예에서, 불변 영역은 Fc 수용체에 대한 친화성을 감소시키거나 Fc 효과기 기능을 감소시킨다. 예를 들면, 불변 영역은 IgG 중쇄의 불변 영역내 글리코실화 부위를 제거하는 돌연변이를 함유할 수 있다.
다른 구현예에서, 불변 영역은 CH2 도메인 및 적어도 힌지 영역의 부위를 포함한다. 힌지 영역은 면역글로불린 중쇄, 예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 또는 다른 부류로부터 유래된다. 바람직하게는, 힌지 영역은 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 또는 다른 적합한 부류로부터 유래된다. IgG1 힌지 영역은 3개의 시스테인을 가지며, 이들 중 2개는 면역글로불린의 2개의 중쇄 사이에 이황화물 결합에 관여한다. 이러한 동일한 시스테인은 Fc 부위 사이에 효율적이로 일관된 이황화물 결합 형성을 허용한다. 따라서, 본 발명의 바람직한 힌지 영역은 IgG1, 보다 바람직하게는 인간 IgG1으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 인간 IgG1 힌지 영역 내 제1의 시스테인은 다른 아미노산, 바람직하게는 세린으로 돌연변이된다. IgG2 동형 힌지 영역은 올리고머화 및 가능하게는 재조합 시스템내 분비 동안 부적확한 이황화물 결합을 촉진하는 경향이 있는 4개의 이환화물 결합을 갖는다. 적합한 힌지 영역은 IgG2 힌지로부터 유래될 수 있고; 처음 2개의 시스테인은 각각 바람직하게는 다른 아미노산으로 돌연변이된다. IgG4의 힌지 영역은 쇄간 이황화물 결합을 비효율적으로 형성하는 것으로 알려져 있다. 그러나, 본 발명에 적합한 힌지 영역은 바람직하게는 중새-유래된 모이어티 사이의 이황화물 결합의 정확한 형성을 향상시키는 돌연변이를 함유하는 IgG4 힌지 영역으로부터 유래될 수 있다(Angal S, et al. (1993) Mol. Immunol., 30:105-8). 보다 바람직하게는 힌지 영역은 인간 IgG4 중쇄로부터 유래된다.
일 구현예에서, 불변 영역은 제1의 항체 동형으로부터 유래된 CH2 도메인 및 제2의 항체 동형으로부터 유래된 힌지 영역을 포함한다. 구체적인 구현예에서, CH2 도메인은 인간 IgG4 중쇄로부터 유래된 반면, 힌지 영역은 변경된 인간 IgG1 중쇄로부터 유래된다.
본 발명에 따라서, 불변 영역은 CH2 및/또는 CH3 도메인 및 상이한 항체 동형으로부터 유래된 힌지 영역, 즉, 하이브리드 불변 영역을 함유할 수 있다. 예를 들면, 일 구현예에서, 불변 영역은 IgG2 또는 IgG4로부터 유래된 CH2 및/또는 CH3 도메인 및 IgG1으로부터 유래된 돌연변이체 힌지 영역을 함유한다. 대안적으로, 다른 IgG 서브부류로부터의 돌연변이체 힌지 영역이 하이브리드 불변 영역에서 사용된다. 예를 들면, 2개의 중쇄 사이에 효율적인 이황화물 결합을 허용하는 IgG4 힌지의 돌연변이체 형태가 사용될 수 있다. 돌연변이체 힌지는 또한 IgG2 힌지로부터 유래될 수 있으며 여기서 처음 2개의 시스테인은 다른 아미노산으로 각각 돌연변이된다. 이러한 하이브리드 불변 영역의 조립은 미국 특허원 제20030044423호에 기술되어 있고, 이의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다.
일 구현예에서, 불변 영역은 CH2를 함유할 수 있고/있거나 CH3는 하기 표 D에 기술된 돌연변이 중 하나, 또는 이의 임의의 조합을 갖는다.
[표 D]
Figure pct00004

중쇄 불변 영역 내 잔기의 번호매김은 EU 번호매김에 따른다(Edelman, G.M. et al., Proc. Natl. Acad. USA, 63, 78-85 (1969); www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html#refs).
특수한 양태에서, 이작용성 분자, 바람직하게는 결합 모이어티는 임의로 T250Q/M428L; M252Y/S254T/T256E + H433K/N434F; E233P/L234V/L235A/G236A + A327G/A330S/P331S; E333A; S239D/A330L/I332E; P257I/Q311; K326W/E333S; S239D/I332E/G236A; N297A; L234A/L235A; N297A + M252Y/S254T/T256E; K322A 및 K444A로 이루어진 그룹으로부터 선택된, 바람직하게는 임의로 M252Y/S254T/T256E, 및 L234A/L235A와 함께, N297A로 이루어진 그룹으로부터 선택된 치환 또는 치환의 조합과 함께 인간 IgG1 중쇄 불변 도에인 또는 IgG1 Fc 도메인을 포함한다.
다른 양태에서, 결합 모이어티는 임의로 S228P; L234A/L235A, S228P + M252Y/S254T/T256E 및 K444A로 이루어진 그룹으로부터 선택된 치환 또는 치환의 조합과 함께, 인간 IgG4 중쇄 불변 도메인 또는 인간 IgG4 Fc 도메인을 포함한다. 심지어 보다 바람직하게는, 이작용성 분자, 바람직하게는 결합 모이어티는 IgG4를 안정화시키는 S228P를 지닌 IgG4 Fc-영역을 포함한다.
특정의 구현예에서, 아미노산 변형은 본원에 제공된 항체의 Fc 영역 내로 도입되어 Fc 영역 변이체를 생성할 수 있다. 특정의 구현예에서, Fc 영역 변이체는 일부, 그러나 전부가 아닌, 효과기 기능을 지닌다. 이러한 항체는 예를 들면, 생체내 항체의 반감기가 중요한 적용에서 유용할 수 있지만, 여전히 특정의 효과기 기능은 불필요하거나 유해하다. 효과기 기능의 예는 상보체-의존성 세포독성(CDC) 및 항체-지시된 상보체-매개된 세포독성(ADCC)을 포함한다. 변경된 효과기 기능을 지닌 다수의 치환 또는 치환 또는 결실은 당해 분야에 공지되어 있다.
일 구현예에서, 불변 영역은 Fc 수용체에 대한 친화성을 감소시키거나 Fc 효과기 기능을 감소시키는 돌연변이를 함유한다. 예를 들면, 불변 영역은 IgG 중쇄의 불변 영역 내에서 글리코실화 부위를 제거하는 돌연변이를 함유할 수 있다. 바람직하게는, CH2 도메인은 CH2 도메인내 글리코실화 부위를 제거하는 돌연변이를 함유한다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 항-hPD1은 서열 번호: 39 또는 52의 중쇄 불변 도메인 및/또는 서열 번호: 40의 경쇄 불변 도메인, 특히 서열 번호: 39 또는 52의 중쇄 불변 도메인 및 서열 번호: 40의 경쇄 불변 도메인을 갖는다.
다른 구현예에서, 본 발명에 따른 항-hPD1는 서열 번호: 52의 중쇄 불변 도메인 및/또는 서열 번호: 40의 경쇄 불변 도메인, 특히 서열 번호: 52의 중쇄 불변 도메인 및 서열 번호: 40의 경쇄 불변 도메인을 갖는다.
[표 E]
Figure pct00005

Fc 부위 및 비-Fc 부위의 연결부 근처의 아미노산의 변경은 Fc 융합 단백질의 혈청 반감기를 현저히 증가시킬 수 있다(PCT 공보 WO 01/58957). 따라서, 본 발명의 단백질 또는 폴리펩타이드의 연결부 영역은 면역글로불린 중쇄 및 에리트로포이에틴의 천연적으로 존재하는 서열에 대해, 바람직하게는 연결부 점의 약 10개 아미노산 내에 있는 변경을 함유할 수 있다. 이러한 아미노산 변화는 소수성에 있어서의 증가를 유발시킬 수 있다. 일 구현예에서, 불변 영역은 IgG 서열로부터 유래되며 여기서 C-말단 라이신 잔기가 대체된다. 바람직하게는, IgG 서열의 C-말단 라이신은 비-라이신 아미노산, 예를 들면, 알라닌 또는 루이신으로 대체되어, 혈청 반감기를 추가로 증가시킨다.
인간 IgG의 모든 서브부류는 순환시 절단되는 항체 중쇄(K444)의 C-말단 라이신 잔기를 수반한다. 혈액 속의 이러한 절단은 IL-7을 방출함으로써 이작용성 분자의 생물활성을 절충할 수 있다. 이러한 쟁점을 피하기 위해, IgG1 또는 IgG4 도메인 내 K444 아미노산은 알라닌에 의해 치환되어 항체에 대해 일반적으로 사용된돌연변이인, 단백질분해성 절단을 감소시킨다. 이후에, 일 구현예에서, 항-PD1 항체는 K444A로 이루어진 적어도 하나의 추가의 아미노산 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 항-PD1 항체는 IgG의 C-말단 도메인에서 추가의 시스테인 잔기를 포함함으로써 추가의 이황화물 결합을 생성하고 이작용성 분자의 유연성을 잠재적으로 제한한다.
특정의 구현예에서, 항체는 이것이 글리코실화된 정도를 증가, 감소 또는 제거하도록 변경될 수 있다.
체크포인트 억제제
본 발명자는 본원에서 본 발명에 따른 이작용성 분자가 IL-7 수용체 상의 IL-7 변이체 또는 돌연변이체의 효과 및 PD-1의 억제성 효과의 차단을 조합하며, 체크포인트 억제제, 예를 들면, 항-PD-1 항체의 효과를 최적화하는데 적합하다. 특히, T 세포, 특히 고갈된 T 세포의 활성화, 보다 특히 TCR 신호전달에서의 상승 효과가 밝혀져 있다. 본 발명자는 특히 동일한 세포에서 활성화를 나타내며, 단, 항-PD-1 항체 및 IL-7의 결합은 동일한 면역 세포 상의 이작용성 분자내에 포함된다. 이러한 상승 효과는 별개의 화합물로서 IL-7 및 항-PD-1 항체를 사용하여 결코 관찰지 않았다. 이후에, IL-7R을 발현하는 면역 세포 상에서 발현된 PD-1 이외에 임의의 다른 분자는 본 발명에 따른 이작용성 작제물, 특히 고갈 인자에 의해 개시될 수 있음이 고려될 수 있다. 이후에, 구현예에서, 이작용성 분자는 PD-1 이외의 면역 세포 상에서 발현된 표적에 대해 지시된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 예를 들면, 표적은 면역 세포, 특히 T 세포의 표면에서 발현된 수용체일 수 있다. 수용체는 억제제 수용체일 수 있다. 대안적으로, 수용체는 활성화 수용체일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "표적"은 면역 세포의 외부 표면에서 발현된 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 항원 또는 에피토프를 지칭한다. 면역 세포의 표면에서 표적의 발현과 관련하여, 용어 "발현된"은 세포의 외부 표면에 존재하거나 나타난 표적을 지칭한다. 용어 "구체적으로 발현된"은 표적이 면역 세포 상에서 발현되지만, 다른 세포형, 특히, 예를 들면, 종양 세포에 의해 실질적으로 발현되지 않는다.
일 구현예에서, 표적은 건강한 대상체 또는 질환, 특히 예를 들면, 암을 앓고 있는 대상체에서 면역 세포에 의해 구체적으로 발현된다. 이는 표적이 다른 세포에서보다 면역 세포 내에서 보다 높은 발현 수준을 갖거나 전체 면역 세포에 의해 표적을 발현하는 면역 세포의 비가 전체 다른 세포에 의해 표적을 발현하는 다른 세포의 비보다 더 높음을 의미한다. 바람직하게는 발현 수준 또는 비는 인자 2, 5, 10, 20, 50 또는 100보다 더 높다. 보다 구체적으로, 이는 특수한 유형의 면역 세포, 예를 들면, T 세포, 보다 구체적으로 CD8+ T 세포, 효과기 T 세포 또는 고갈된 T 세포, 또는 특수한 문맥에서, 예를 들면, 질환, 예를 들면 암 또는 감염을 앓고 있는 대상체에 대해 측정될 수 있다.
일 양태에서, 표적은 면역 체크포인트이다. 바람직하게는, 표적은 PD-1, CD28, CD80, CTLA-4, BTLA, TIGIT, CD160, CD40L, ICOS, CD27, OX40, 4-1BB, GITR, HVEM, Tim-1, LFA-1, TIM3, CD39, CD30, NKG2D,? LAG3, B7-1, 2B4, DR3, CD101, CD44, SIRPG, CD28H, CD38, CXCR5, CD3, PDL2, CD4 및 CD8로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 이러한 표적은 보다 특히 하기 표 F에 기술되어 있다.
[표 F]
Figure pct00006

Figure pct00007

Figure pct00008

이후에, 당해 양태에서, 본 발명에 따른 이작용성 분자에 포함된 항체 또는 이의 항원 단편은 CD28, CD80, CTLA-4, BTLA, TIGIT, CD160, CD40L, ICOS, CD27, OX40, 4-1BB, GITR, HVEM, Tim-1, LFA-1, TIM3, CD39, CD30, NKG2D, LAG3, B7-1, 2B4, DR3, CD101, CD44, SIRPG, CD28H, CD38, CXCR5, CD3, PDL2, CD4 및 CD8로 이루어진 그룹으로부터 선택된 표적에 결합한다.
바람직한 양태에서, 본 발명에 따른 이작용성 분자에 포함된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CTLA-4, BTLA, TIGIT, LAG3 및 TIM3으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
TIM3 및 TIM3을 표적화하는 이작용성 또는 이특이적 분자, 예를 들면, Sym023, TSR-022, MBG453, LY3321367, INCAGN02390, BGTB-A425, LY3321367, RG7769(Roche)에 대해 지시된 항체가 또한 공지되어 있다. 일부 구현예에서, TFM-3 항체는 국제 특허원 공보 WO2013006490, WO2016/161270, WO 2018/085469, 또는 WO 2018/129553, WO 2011/155607, U.S. 8,552,156, EP 2581113 및 U.S 2014/044728에 개시된 바와 같다.
CTLA-4 및 CTLA-4를 표적화하는 이작용성 또는 이특이적 분자, 예를 들면, 이필리무맙, 트레멜리무맙, MK-1308, AGEN-1884, XmAb20717(Xencor), MEDI5752(AstraZeneca)에 대해 지시된 항체가 또한 공지되어 있다. 항-CTLA-4 항체는 또한 WO18025178, WO19179388, WO19179391, WO19174603, WO19148444, WO19120232, WO19056281, WO19023482, WO18209701, WO18165895, WO18160536, WO18156250, WO18106862, WO18106864, WO18068182, WO18035710, WO18025178, WO17194265, WO17106372, WO17084078, WO17087588, WO16196237, WO16130898, WO16015675, WO12120125, WO09100140 및 WO07008463에 개시되어 있다.
LAG-3 및 LAG-3를 표적화하는 이작용성 또는 이특이적 분자, 예를 들면, BMS- 986016, IMP701, MGD012 또는 MGD013에 대해 지시된 항체(이특이적 PD-1 및 LAG-3 항체)가 또한 공지되어 있다. 항-LAG-3 항체는 또한 WO2008132601, EP2320940, WO19152574에 개시되어 있다.
BTLA에 대해 지시된 항체, 예를 들면, hu Mab8D5, hu Mab8A3, hu Mab21H6, hu Mab19A7, 또는 hu Mab4C7이 또한 문헌에 공지되어 있다. BTLA에 대해 지시된 항체 TAB004는 현재 진전된 악성 종양을 지닌 대상체에서 임상 시도 중에 있다. 항-BTLA 항체는 또한 WO08076560, WO10106051(예컨대, BTLA8.2), WO11014438(예컨대, 4C7), WO17096017 및 WO17144668(예컨대, 629.3)에 공지되어 있다.
TIGIT에 대해 지시된 항체, 예를 들면, BMS-986207 또는 AB154, BMS-986207 CPA.9.086, CHA.9.547.18, CPA.9.018, CPA.9.027, CPA.9.049, CPA.9.057, CPA.9.059, CPA.9.083, CPA.9.089, CPA.9.093, CPA.9.101, CPA.9.103, CHA.9.536.1, CHA.9.536.3, CHA.9.536.4, CHA.9.536.5, CHA.9.536.6, CHA.9.536.7, CHA.9.536.8, CHA.9.560.1, CHA.9.560.3, CHA.9.560.4, CHA.9.560.5, CHA.9.560.6, CHA.9.560.7, CHA.9.560.8, CHA.9.546.1, CHA.9.547.1, CHA.9.547.2, CHA.9.547.3, CHA.9.547.4, CHA.9.547.6, CHA.9.547.7, CHA.9.547.8, CHA.9.547.9, CHA.9.547.13, CHA.9.541.1, CHA.9.541.3, CHA.9.541.4, CHA.9.541.5, CHA.9.541.6, CHA.9.541.7, 및 CHA.9.541.8이 또한 WO19232484에 개시된 바와 같이 공지되어 있다. 항-TIGIT 항체는 또한 WO16028656, WO16106302, WO16191643, WO17030823, WO17037707, WO17053748, WO17152088, WO18033798, WO18102536, WO18102746, WO18160704, WO18200430, WO18204363, WO19023504, WO19062832, WO19129221, WO19129261, WO19137548, WO19152574, WO19154415, WO19168382 및 WO19215728에 개시되어 있다.
CD160에 대해 지시된 항체, 예를 들면, WO06015886에 개시된 바와 같은 CL1-R2 CNCM I-3204, 또는 WO10006071, WO10084158, WO18077926에 개시된 바와 같은 다른 것이 또한 당해 분야에 공지되어 있다.
특수한 구현예에서, 본 발명에 따른 이작용성 분자는 항-CTLA-4 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 바람직하게는 인간, 인간화된 또는 키메라 항-CTLA-4 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 바람직하게는, 항체는 CTLA-4의 길항제이다. 따라서, 이작용성 분자는 IL-7 수용체 상에서 IL-7wt, 변이체 또는 이의 돌연변이체의 효과 및 CTLA-4의 억제 효과의 차단을 조합하며, T 세포, 특히 고갈된 T 세포의 활성화, 보다 특히 TCR 신호전달에서 상승 효과를 가질 수 있다.
다른 특수한 양태에서, 본 발명에 따른 이작용성 분자는 항-BTLA 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 바람직하게는 인간, 인간화된 또는 키메라 항-BTLA 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 바람직하게는, 항체는 BTLA의 길항제이다. 따라서, 이작용성 분자는 IL-7 수용체에서 IL-7wt, 이의 변이체 또는 돌연변이체의 효과 및 BTLA의 억제 효과의 차단을 조합하며, T 세포, 특히 고갈된 T 세포의 활성화, 보다 특히 TCR 신호전달에서 상승 효과를 가질 수 있다.
다른 특수한 양태에서, 본 발명에 따른 이작용성 분자는 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 바람직하게는 인간, 인간화된 또는 키메라 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 바람직하게는, 항체는 TIGIT의 길항제이다. 따라서, 이작용성 분자는 IL-7 수용체 상에서 IL-7wt, 이의 변이체 또는 돌연변이체의 효과 및 TIGIT의 억제 효과의 차단을 조합하며, T 세포, 특히 고갈된 T 세포의 활성화, 보다 특히 TCR 신호전달에서 상승 효과를 가질 수 있다.
다른 특수한 양태에서, 본 발명에 따른 이작용성 분자는 항-LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 바람직하게는 인간, 인간화된 또는 키메라 항-LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 바람직하게는, 항체는 LAG-3의 길항제이다. 따라서, 이작용성 분자는 IL-7 수용체에서 IL-7wt, 이의 변이체 또는 돌연변이체의 효과 및 LAG-3의 억제 효과의 차단을 조합하며, T 세포, 특히 고갈된 T 세포의 활성화, 보다 특히 TCR 신호전달에서 상승효과를 가질 수 있다.
다른 특수한 양태에서, 본 발명에 따른 이작용성 분자는 항-TIM3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 바람직하게는 인간, 인간화된 또는 키메라 항-TIM3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 바람직하게는, 항체는 TIM3의 길항제이다. 따라서, 이작용성 분자는 IL-7 수용체에서 IL-7 변이체 또는 돌연변이체의 효과 및 TIM3의 억제 효과의 차단을 조합하며, T 세포, 특히 고갈된 T 세포의 활성화, 보다 특히 TCR 신호전달에서 상승 효과를 가질 수 있다.
펩타이드 링커
본 발명은 항-PD-1 항체 또는 이의 단편과 IL-7 사이에 펩타이드 링커를 포함하는 이작용성 분자를 포함한다. 펩타이드 링커는 일반적으로 이들 사이의 링커와 연결된 2개의 단백질 성분이 공간에서 충분히 자유로와서 이의 기능을 발휘하며 재조합 이작용성 분자의 안전성에 있어서 α-나선 및 β-폴드(fold)의 형성의 영향을 피하는 것을 보증하기에 충분한 길이 및 유연성을 갖는다.
본 개시내용의 양태에서, 항-hPD1 항체는 바람직하게는 펩타이드 링커에 의해 IL-7에 연결된다. 다시 말해서, 본 발명은 쇄 내에 본원에 상세히 기술된 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 이작용성 분자에 관한 것이며, 쇄, 예컨대, 경쇄 또는 중쇄 또는 이의 단편, 바람직하게는 중쇄 또는 이의 단편은 펩타이드 링커를 통해 IL-7에 연결된다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "링커"는 IL-7 및 항-PD-1 면역글로불린 서열 부위를 연결하는 적어도 하나의 아미노산의 서열을 지칭한다. 이러한 링커는 입체적 장애를 방지하는데 유용할 수 있다. 링커는 일반적으로 길이가 3 내지 44개 아미노산 잔기이다. 바람직하게는, 링커는 3 내지 30개 아미노산 잔기이다. 일부 구현예에서, 링커는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 아미노산 잔기를 갖는다.
구현예에서, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 IL-7을 포함하는 이작용성 분자에 관한 것이며, 여기서 항체의 쇄, 예컨대, 경쇄 또는 중쇄, 바람직하게는 중쇄, 심지어 보다 바람직하게는 중쇄 또는 경쇄의 C-말단은 IL-7, 바람직하게는 IL-7의 N-말단에 펩타이드 링커에 의해 연결된다.
특수한 구현예에서, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 항-hPD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 이작용성 분자에 관한 것이며, 여기서 IL-7은 상기 항체의 중쇄의 C-말단(예컨대, 중쇄 불변 도메인의 C-말단)에, 바람직하게는 펩타이드 링커에 의해 연결된다.
구현예에서, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 이작용성 분자에 관한 것이며, 여기서 IL-7은 상기 항체의 경쇄의 C-말단(예컨대, 경쇄 불변 도메인의 C-말단)에, 바람직하게는 펩타이드 링커에 의해 연결된다.
링커 서열은 천연적으로 존재하는 서열 또는 비-천연적으로 존재하는 서열일 수 있다. 치료학적 목적을 위해 사용된 경우, 링커는 바람직하게는 이작용성 분자가 투여된 대상체에서 비-면역원성이다. 링커 서열의 하나의 유용한 그룹은 WO 96/34103 및 WO 94/04678에 기술된 바와 같이 중쇄 항체의 힌지 영역으로부터 유래된 링커이다. 다른 예는 폴리-알라닌 링커 서열이다. 링커 서열의 추가로 바람직한 예는 상이한 길이의 Gly/Ser 링커, 예를 들면, (Gly4Ser)4, (Gly4Ser)3, (Gly4Ser)2, Gly4Ser, Gly3Ser, Gly3, Gly2ser 및 (Gly3Ser2)3, 특히 (Gly4Ser)3이다. 바람직하게는, 링커는 (Gly4Ser)4, (Gly4Ser)3, 및 (Gly3Ser2)3로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 이작용성 분자에 포함된 링커는 (Gly4Ser)4, (Gly4Ser)3, (Gly4Ser)2, Gly4Ser, Gly3Ser, Gly3, Gly2ser 및 (Gly3Ser2)3로 이루어진 그룹에서 선택되고, 바람직하게는 (Gly4Ser)3이다. 바람직하게는, 링커는 (Gly4Ser)4, (Gly4Ser)3, 및 (Gly3Ser2)3로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 심지어 보다 바람직하게는, 링커는 (GGGGS)3이다.
구현예에서, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 항-PD-1 항체 또는 이의 단편을 포함하는 이작용성 분자에 관한 것이고 여기서 항체 또는 이의 단편은 IL-7에 바람직하게는 (GGGGS)3, (GGGGS)4, (GGGGS)2, GGGGS, GGGS, GGG, GGS 및 (GGGS)3로 이루어진 그룹으로부터 선택된 링커 서열, 심지어 보다 바람직하게는 (GGGGS)3에 의해 연결된다. 바람직하게는, 링커는 (GGGGS)3, (GGGGS)4, 및 (GGGS)3로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
바람직하게는, 항-PD-1 항체의 중쇄, 바람직하게는 중쇄의 C 말단은 일반적으로 유연한 (Gly4Ser)3 링커를 통해 IL-7의 N-말단에 융합된다. 융합 접합시, 항체 중쇄의 C-말단 라이신 잔기는 알라닌으로 돌연변이되어 단백질분해 절단을 감소시킬 수 있다.
바람직하게는, 항-PD-1 항체의 중쇄, 바람직하게는 경쇄의 C 말단은 일반적으로 유연성 (Gly4Ser)3 링커를 통해 IL-7의 N-말단에 융합된다. 융합 접합에서, 항체 경쇄의 C-말단 잔기는 알라닌으로 돌연변이되어 단백질분해 절단을 감소시킬 수 있다.
IL-7
본 발명에 따른 이작용성 분자는 인터류킨 7, 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함하는 추가 또는 제2의 실체를 포함한다.
바람직하게는, IL-7 단백질은 인간 IL-7 또는 이의 변이체이다. 따라서, IL-7 또는 이의 변이체는 야생형 IL-7, 특히 서열 번호: 51의 단백질과 적어도 75%의 동일성을 가진 아미노산 서열을 갖는다.
일 구현예에서, 이작용성 분자는 152개 아미노산(서열 번호: 51)의 대표적인 야생형 IL-7 인간 단백질을 포함한다. 바람직하게는 IL-7 단백질은 서열 번호: 51의 단백질이다. IL-7 단백질은 이의 펩타이드 신호를 포함할 수 있거나 이를 포함하지 않을 수 있다.
IL-7 단백질의 "변이체"는 하나 이상의 아미노산에 의해 변경된 아미노산 서열로서 정의된다. 변이체는 "보존적" 변형 또는 "비-보존적" 변형을 가질 수 잇다. 이러한 변형은 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 포함할 수 있다. 생물학적 특성(예컨대, 활성, 결합능 및/또는 구조)를 폐기하지 않고 치환되거나, 삽입되거나 결실될 수 있는 많은 아미노산 잔기 및 방법을 측정하는데 있어서의 안내는 당해 분야에 잘 공지된 컴퓨터 프로그램, 예를 들면, 분자 모델링 또는 정렬 생산용 소프트웨어를 사용하여 찾을 수 있다. 특수한 구현예에서, 본 발명 내에 포함된 변이체 IL-7 단백질은 야생형 IL-7과 비교하여 실질적으로 등가의 생물학적 IL-7 특성을 보유한 IL-7 단백질을 구체적으로 포함한다. 대안의 양태에서, 본 발명내에 포함된 변이체 IL-7 단백질은 구체적으로 야생형 IL-7과 비교하여 실질적으로 등가의 생물학적 특성(예컨대, 활성, 결합능 및/또는 구조)를 보유하지 않는 IL-7 단백질을 포함한다. IL-7의 변이체는 또한 IL-7의 변경된 폴리펩타이드 서열(예컨대 산화된, 감소된, 탈아민화된 또는 트렁케이트된 형태)을 포함한다. 특히, 완전한 길이의 IL-7 단백질과 비교가능한 생물학적 특성을 보유한 IL-7의 트렁케이션 또는 단편이 본 발명의 영역내에 포함된다. 일 구현예에서, 인터류킨 7은 이의 임의의 생물학적 활성 단편이다. IL-7의 변이체는 보다 바람직하게는 천연 다형체, 예를 들면, SNP, 스플라이싱 변이체 등으로부터 생성된 천연 대립형질 변이체를 포함한다.
IL-7 단백질의 생물학적 활성은 시험관내 세포 증식 검정을 사용하여 측정할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 IL-7 변이체는 야생형 인간 IL-7과 비교하여 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 바람직하게는 야생형 IL-7과 비교하여 적어도 80%, 90%, 95% 및 심지어 보다 바람직하게는 99%의 생물학적 활성을 유지한다.
변이체 IL-7 단백질은 또한 야생형 IL-7, 특히 서열 번호: 51의 단백질과 적어도 약 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
본 발명에 따른 바람직한 IL-7은 서열 번호: 51, EP 314 415 또는 WO2004/018681 A2에 기술된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 인간 IL-7 폴리펩타이드, 뿐만 아니라 임의의 이의 천연 변이체 또는 동족체이다.
일 양태에서, 본 발명에 사용된 IL-7 폴리펩타이드는 재조합 IL-7이다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "재조합"은 폴리펩타이드가 재조합 발현 시스템으로부터, 즉, 숙주 세포(예컨대, 미생물 또는 곤충 또는 식물 또는 포유동물)의 배양물로부터 또는 IL-7 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자를 함유하도록 가공된 유전자이식 식물 또는 동물의 배양물로부터 수득되거나 유래됨을 의미한다. 바람직하게는, 재조합 IL-7은 인간 재조합 IL-7(예컨대, 재조합 발현 시스템에서 생산된 인간 IL-7)이다.
본 발명은 또한 야생형 IL-7 단백질과 비교하여 향상된 생물학적 활성을 갖는 IL-7 단백질을 포함하는 이작용성 분자를 제공한다. 예를 들면, US7960514에 기술된 바와 같이, Cys2-Cys92, Cys34-Cys129 및 Cys47-141의 이황화물 결합 패턴을 갖는 IL-7 단백질은 야생형 재조합 IL-7 단백질보다 생체내에서 보다 활성이다. EP1904635에 기술된 바와 같이 IL-7의 초글리코실화(hyperglycosylation)는 또한 IL-7 생물학적 활성, 예를 들면 IL-7 단백질을 증진시키며 여기서 Asn116은 비-글리코실화되지만 Asn70 및 Asn91은 글리코실화된다.
대안적으로, 본 발명은 특히 면역 반응에 대해 자극할 수 있는 IL-7 내에 T-세포 에피토프를 제거함으로써, 야생형 IL-7 단백질과 비교하여 감소된 면역원성을 갖는 IL-7 단백질을 포함하는 이작용성 분자를 제공한다. 이러한 IL-7의 예는 WO 2006061219에 기술되어 있다.
특수한 양태에서, 본 개시내용은 또한 IL-7 변이체 또는 돌연변이체를 포함하는 이작용성 분자를 제공한다. 용어 "인터류킨-7 돌연변이체", "돌연변이된 IL-7", "IL-7 돌연변이체", "IL-7 변이체", "IL-7m" 또는 IL-7v"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
당해 맥락에서, IL-7 변이체 또는 돌연변이체는 야생형 IL-7과 비교하여 실질적으로 등가의 생물학적 특성(예컨대 활성, 결합능 및/또는 구조)를 보유하지 않는다. IL-7 돌연변이체 또는 변이체는 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 특히, 적어도 하나의 돌연변이는 IL-7 수용체(IL-7R)에 대한 IL-7 변이체 또는 돌연변이체의 친화성을 감소시키지만 IL-7R의 인식의 상실을 초래하지 않는다. 따라서, IL-7 돌연변이체 또는 변이체는 예를 들면, Bitar et al., Front. Immunol., 2019, volume 10에 개시된 바와 같이, 예를 들면, pStat5 신호에 의해 측정된 것으로서, IL-7R을 활성화시키는 능력을 보유한다. IL-7 단백질의 생물학적 활성은 시험관내 세포 증식 검정을 사용하거나 T 세포내로 P-Stat5를 ELISA 또는 FACS에 의해 측정함으로써 측정할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 IL-7 변이체는 야생형 IL-7, 바람직하게는 wth-IL7과 비교하여 적어도 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 250, 500, 750,1000, 2500, 5000, 또는 8000 인자가지 생물학적 특성(예컨대, 활성, 결합능 및/또는 구조)를 갖는다. 보다 바람직하게는, IL-7 변이체는 IL-7 수용체에 대해 감소된 결합을 가지지만 IL-7R을 활성화시키는 능력을 보유한다. 예를 들면, IL-7 수용체에 대한 결합은 야생형 IL-7과 비교하여 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% 까지 감소시킬 수 있고 야생형 IL-7과 비교하여 적어도 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30% 또는 20% 까지 IL-7R을 활성화시키는 능력을 보유한다.
일 양태에서, IL-7 변이체 또는 돌연변이체는 i) IL-7R에 대한 wt-IL-7의 친화성과 비교하여 IL-7 수용체(IL-7R)에 대한 IL-7 변이체의 친화성을 감소시키고, ii) wt-IL7과 비교하여 IL7 변이체의 약동학을 증진시키는 적어도 하나의 아미노산 돌연변이까지 wt-IL-7과는 상이하다. 보다 특히, IL-7 변이체 또는 돌연변이체는 특히 pStat5 신호전달을 통해, IL-7R을 활성화시키는 능력을 추가로 보유한다.
다른 양태에서, IL-7 변이체 또는 돌연변이체를 포함하는 이작용성 분자는 i) wt-IL-7을 포함하는 이작용성 분자의 IL-7R에 대한 친화성과 비교하여 IL-7 수용체(IL-7R)에 대한 이작용성 분자의 친화성을 감소시키고, ii) wt-IL-7을 포함하는 이작용성 분자와 비교하여 IL-7 변이체 또는 돌연변이체를 포함하는 이작용성 분자의 약동학을 증진시키는 적어도 하나의 아미노산 돌연변이까지 wt-IL-7과는 상이하다. 보다 특히, IL-7 변이체 또는 돌연변이체를 포함하는 이작용성 분자는 특히 pStat5 신호전달을 통해, IL-7R을 활성화시키는 능력을 추가로 보유한다. 예를 들면, IL-7 수용체에 대한 IL-7 변이체 또는 돌연변이체를 포함하는 결합 이작용성 분자는 야생형 IL-7을 포함하는 이작용성 분자와 비교하여 적어도 10 %, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%까지 감소될 수 있고, 야생형 IL-7을 포함하는 이작용성 분자와 비교하여 IL-7R을 활성화시키는 능력을 적어도 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30% 또는 20% 까지 보유한다.
특수한 양태에서, IL-7 변이체 또는 돌연변이체는 IL-7R에 대한 wth-IL-7의 친화성과 비교하여 IL-7 수용체(IL-7R)에 대해 감소된 친화성을 나타낸다. 특히, IL-7 변이체 또는 돌연변이체는 wth-IL-7 for CD127 및/또는 CD132 각각에 대한 wth-IL-7의 친화성과 비교하여 CD127 및/또는 CD132에 대해 감소된 친화성을 나타낸다. 바람직하게는, IL-7 변이체 또는 돌연변이체는 CD127에 대한 wth-IL-7의 친화성과 비교하여 CD127에 대해 감소된 친화성을 나타낸다.
바람직하게는, 적어도 하나의 아미노산 돌연변이는 IL-7R에 대한 wt-IL-7의 친화성과 비교하여, IL-7R, 특히 CD132 또는 CD127에 대한 IL-7 변이체 또는 돌연변이체의 친화성을, 적어도 10, 100, 1000, 10 000 또는 100 000 인자까지 감소시킨다. 이러한 친화성 비교는 당해 분야의 기술자에게 공지된 임의의 방법, 예를 들면, ELISA 또는 Biacore에 의해 수행할 수 있다.
바람직하게는, 적어도 하나의 아미노산 돌연변이는 pStat5 신호에 의해 측정된 것으로서, IL-7R에 대한 IL-7 변이체 또는 돌연변이체의 친화성을 감소시키지만 IL-7 wt와 비교하여 IL-7 변이체 또는 돌연변이체의 생물학적 활성을 감소시키지 않는다.
대안적으로, 적어도 하나의 아미노산 돌연변이는 특히 pStat5 신호에 의해 측정된 것으로서, IL-7R에 대한 IL-7 변이체 또는 돌연변이체의 친화성을 감소시키지만 IL-7 wt와 비교하여 IL-7m의 생물학적 활성을 유의적으로 감소시키지 않는다.
추가로 또는 대안적으로, IL-7 변이체 또는 돌연변이체는 야생형 IL-7을 포함하는 이작용성 분자와 비교하여 IL-7 변이체 또는 돌연변이체를 포함하는 이작용성 분자의 약동학을 증진시킨다. 특히, 본 발명에 따른 IL-7 변이체 또는 돌연변이체는 IL-7을 포함하는 이긴으성 분자와 비교하여 IL-7 변이체 또는 돌연변이체를 포함하는 이작용성 분자의 약동학을 적어도 10, 100 또는 1000 인자까지 감소시킨다. 약동학 프로파일 비교는 당해 분야의 기술자에게 공지된 임의의 방법, 예를 들면, 실시예 9에 나타낸 바와 같이, 예를 들면, 약물 및 혈청 속의 약물의 ELISA 투여량을 다수의 시점에서 생체내 주사함으로써 수행할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "약동학" 및 "PK"는 상호교환적으로 사용되며 살아있는 유기체에게 투여된 화합물, 물질 또는 약물의 수명을 지칭한다. 약동학은 특히 ADME 또는 LADME 체계를 포함하며, 이는 유리(즉, 조성물로부터 물질의 방출), 흡수(즉, 혈액 순환시 물질의 도입), 분포(즉, 신체를 통한 물질의 분산 또는 보급), 대사(즉, 물질의 형질전환 또는 분해) 및 배출(즉, 유기체로부터 물질의 제거 또는 청소)를 나타낸다. 물질대사 및 배출의 2개의 상은 또한 표제 제거 하에 그룹화할 수 있다. 상이한 약동학 매개변수, 예를 들어, 제거 반감기, 제거 고정 속도, 청소(즉, 단위 시간 당 약물이 청소된 혈장의 용적), Cmax(최대 혈청 농도), 및 약물 노출(곡선하 면적으로 측정함)운 당해 분야의 기술자에 의해 모니터링될 수 있다(Scheff et al, Pharm Res., 2011, 28, 1081-9).
이후에, IL-7 변이체 또는 돌연변이체의 사용에 의한 약동학의 증진은 상술한 매개변수 중 적어도 하나의 증진을 지칭한다. 바람직하게는, 이는 이작용성 분자의 제거 반감기의 증진, 즉, 반감기 기간, 또는 Cmax의 증가를 지칭한다.
특수한 구현예에서, IL-7 변이체 또는 돌연변이체의 적어도 하나의 돌연변이는 IL-7 wt를 포함하는 이작용성 분자와 비교하여 IL-7 변이체 또는 돌연변이체를 포함하는 이작용성 분자의 제거 반감기를 증진시킨다.
일 구현예에서, IL-7 변이체 또는 돌연변이체는 서열 번호: 51에 개시된 것과 같은, 152개 아미노산의 야생형 인간 IL-7 (wth-IL-7) 단백질과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 나타낸다. 바람직하게는, IL-7 변이체 또는 돌연변이체는 서열 번호: 51과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 나타낸다.
특히, 적어도 하나의 돌연변이는 IL-7의 아미노산 위치 74 및/또는 142번에서 일어난다. 추가로 또는 대안적으로, 적어도 하나의 돌연변이는 아미노산 위치 2 및 141, 34 및 129, 및/또는 47 및 92번에서 일어난다. 이러한 위치는 서열 번호: 51에 나타낸 아미노산의 위치를 지칭한다.
특히, 적어도 하나의 돌연변이는 C2S-C141S 및 C47S-C92S, C2S-C141S 및 C34S-C129S, C47S-C92S 및 C34S-C129S, W142H, W142F, W142Y, Q11E, Y12F, M17L, Q22E, K81R, D74E, D74Q 및 D74N 또는 이의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 치환 또는 아미노산 치환의 그룹이다. 이러한 돌연변이는 서열 번호: 51에 나타낸 아미노산의 위치를 지칭한다. 이후에, 예를 들면, 돌연변이 W142H는 142번 아미노산 위치에서 히스티딘을 갖는 IL-7m을 수득하기 위한, wth-IL7의 트립토판의 히스티딘으로의 치환을 나타낸다. 이러한 돌연변이체는 예를 들면 서열 번호: 56 하에 기술되어 있다.
일 구현예에서, IL-7 변이체 또는 돌연변이체는 C2와 C141, C47과 C92, 및 C34 내지 C129 사이에 이황화물 결합을 파괴하기 위한 치환의 세트를 포함한다. 특히, IL-7 변이체 또는 돌연변이체는 C2와 C141, 및 C47와 C92; C2와 C141, 및 C34 내지 C129; 또는 C47과 C92, 및 C34 내지 C129 사이의 이황화물 결합을 파괴하기 위한 2개의 치환의 세트를 포함한다. 예를 들면, 시스테인 잔기는 이황화물 결합 형성을 방지하기 위하여 세린에 의해 치환될 수 있다. 따라서, 아미노산 치환은 C2S-C141S 및 C47S-C92S("SS2"로 지칭됨), C2S-C141S 및 C34S-C129S("SS1"으로 지칭됨), 및 C47S-C92S 및 C34S-C129S("SS3"으로 지칭됨)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 이러한 돌연변이는 서열 번호: 51에 나타낸 아미노산의 위치를 지칭한다. 이러한 IL-7 변이체 또는 돌연변이체는 특히 서열 번호 :53 내지 55(각각 SS1, SS2 및 SS3)에 나타낸 서열 하에 기술되어 있다. 바람직하게는, IL-7 변이체 또는 돌연변이체는 아미노산 치환 C2S-C141S 및 C47S-C92S를 포함한다. 심지어 보다 바람직하게는, IL-7 변이체 또는 돌연변이체는 서열 번호: 54에 나타낸 서열을 포함한다.
다른 구현예에서, IL-7 변이체 또는 돌연변이체는 W142H, W142F, 및 W142Y로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 이러한 IL-7 변이체 또는 돌연변이체는 특히 서열 번호: 57 및 58 각각에 나타낸 서열 하에 기술되어 있다. 바람직하게는, IL-7 변이체 또는 돌연변이체는 돌연변이 W142H를 포함한다. 심지어 보다 바람직하게는, IL-7 변이체 또는 돌연변이체는 서열 번호: 56에 나타낸 서열을 나타낸다.
다른 구현예에서, IL-7 변이체 또는 돌연변이체는 D74E, D74Q 및 D74N로 이루어진 그룹, 바람직하게는 D74E 및 D74Q로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 이러한 IL-7 변이체 또는 돌연변이체는 특히 서열 번호: 63 내지 65 각각 하에 기술되어 있다. 바람직하게는, IL-7 변이체 또는 돌연변이체는 돌연변이 D74E를 포함한다. 심지어 보다 바람직하게는, IL-7 변이체 또는 돌연변이체는 서열 번호: 63에 나타낸 서열을 나타낸다.
다른 구현예에서, IL-7 변이체 또는 돌연변이체는 Q11E, Y12F, M17L, Q22E 및/또는 K81R로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 이러한 돌연변이는 서열 번호: 51에 나타낸 아미노산의 위치를 지칭한다. 이러한 IL-7 변이체 또는 돌연변이체는 특히 서열 번호: 59, 60, 61, 62 및 66 각각에 나타낸 서열 하에 기술되어 있다.
일 구현예에서, IL-7 변이체 또는 돌연변이체는 i) W142H, W142F 또는 W142Y 및/또는 ii) D74E, D74Q 또는 D74N, 바람직하게는 D74E 또는 D74Q 및/또는 iii) C2S-C141S 및 C47S-C92S, C2S-C141S 및 C34S-C129S, 또는 C47S-C92S 및 C34S-C129S로 이루어진 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.
일 구현예에서, IL-7 변이체 또는 돌연변이체는 W142H 치환 및 i) D74E, D74Q 또는 D74N, 바람직하게는 D74E 또는 D74Q 및/또는 ii) C2S-C141S 및 C47S-C92S, C2S-C141S 및 C34S-C129S, 또는 C47S-C92S 및 C34S-C129S로 이루어진 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.
일 구현예에서, IL-7 변이체 또는 돌연변이체는 D74E 치환 및 i) W142H, W142F 또는 W142Y 및/또는 ii) C2S-C141S 및 C47S-C92S, C2S-C141S 및 C34S-C129S, 또는 C47S-C92S 및 C34S-C129S로 이루어진 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.
일 구현예에서, IL-7 변이체 또는 돌연변이체는 돌연변이 C2S-C141S 및 C47S-C92S 및 i) W142H, W142F 또는 W142Y 및/또는 ii) D74E, D74Q 또는 D74N, 바람직하게는 D74E 또는 D74Q로 이루어진 적어도 하나의 치환을 포함한다.
일 구현예에서, IL-7 변이체 또는 돌연변이체는 i) D74E 및 W142H 치환 및 ii) 돌연변이 C2S-C141S 및 C47S-C92S, C2S-C141S 및 C34S-C129S, 또는 C47S-C92S 및 C34S-C129S를 포함한다.
IL IL-7 변이체 또는 돌연변이체는 이의 펩타이드 신호를 포함할 수 있거나 이것이 없을 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 이작용성 분자는 서열 번호: 53 내지 58 또는 63 내지 65에 나타낸 아미노산을 포함하거나 이로 이루어진 IL-7 변이체를 포함한다. 심지어 보다 바람직하게는, 본 발명에 따른 이작용성 분자는 서열 번호 54, 56 또는 63에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 IL-7 변이체를 포함한다.
이작용성 분자 또는 "비키"
본 발명은 특히 상기 본원에 개시된 바와 같은 항-hPD1 항체 또는 이의 항체 단편, 특히 융합 단백질로서 본원의 상기에 개시된 바와 같이 바람직하게는 펩타이드 링커에 의해 IL-7에 공유결합으로 연결된 항-hPD1 항체 또는 이의 항체 단편을 포함하거나 이로 이루어진 이작용성 분자를 제공한다.
특히, 본 발명에 따른 이작용성 분자는 2개의 실체를 포함한다: 항-hPD1 항체 또는 이의 단편을 포함하거나 필수적으로 이루어진 제1의 실체; 인터류킨 7(IL-7), 바람직하게는 인간 IL-7을 포함하거나 필수적으로 이루어진 제1의 실체, 이들 2개의 실체는 펩타이드 링커에 의해 임의로 연결된다.
특히, 본 발명에 따른 이작용성 분자는 1, 2, 3 또는 4개의 IL-7의 분자를 포함한다. 특히, 이작용성 분자는 항-PD-1 항체의 단지 하나의 경쇄 또는 중쇄에 연결된 IL-7의 단지 하나의 분자를 포함할 수 있다. 이작용성 분자는 또한 항-PD-1 항체의 경쇄 또는 중쇄에 연결된, IL-7의 2개의 분자를 포함할 수 있다. 이작용성 분자는 또한 IL-7의 2개의 분자를 포함할 수 있고, 첫번째 것은 항-PD-1 항체의 경쇄에 연결되고 두번째 것은 항-PD-1 항체의 중쇄에 연결된다. 이작용성 분자는 또한 IL-7의 3개의 분자를 포함할 수 있고, 이들 중 2개는 항-PD-1 항체의 경쇄 또는 중쇄에 연결되고 마지막 것은 항-PD-1 항체의 다른 쇄에 연결된다. 최종적으로, 이작용성 분자는 또한 IL-7의 4개의 분자를 포함할 수 있고, 2개의 분자는 항-PD-1 항체의 경쇄에 연결되고 2개의 분자는 항-PD-1 항체의 중쇄에 연결된다. 따라서, 이작용성 분자는 본원에 개시된 바와 같은 면역치료제의 1 내지 4개의 분자를 포함한다.
일 구현예에서, 경쇄 중 단지 하나는 IL7의 하나의 분자를 포함하거나(예컨대, 이작용성 분자는 IL7의 하나의 분자를 포함한다), 중쇄 중 단지 하나는 IL7의 하나의 분자를 포함하거나(예컨대, 이작용성 분자는 IL7의 하나의 분자를 포함한다), 각각의 경쇄는 IL-7의 하나의 분자를 포함하거나(예컨대, 이작용성 분자는 IL7의 2개의 분자를 포함한다), 각각의 중쇄는 IL-7의 하나의 분자를 포함하거나(예컨대, 이작용성 분자는 IL7의 2개의 분자를 포함한다), 경쇄 중 단지 하나 및 중쇄 중 단지 하나는 면역치료제의 하나의 분자를 포함하거나(예컨대, 이작용성 분자는 IL7의 2개의 분자를 포함한다), 각각의 경쇄는 IL-7의 하나의 분자를 포함하거나 중쇄 중 단지 하나는 IL7의 하나의 분자를 포함하거나(예컨대, 이작용성 분자는 IL7의 3개의 분자를 포함한다), 각각의 중쇄는 IL-7의 하나의 분자를 포함하거나 경쇄 중 단지 하나는 IL7의 하나의 분자를 포함하거나(예컨대, 이작용성 분자는 IL7의 3개의 분자를 포함한다), 또는 경쇄 및 중쇄 둘 다는 IL-7의 하나의 분자를 포함한다(예컨대, 이작용성 분자는 IL-7의 4개의 분자를 포함한다).
일 구현예에서, 본 발명에 따른 이작용성 분자는 다음을 포함하거나 이로 이루어진다:
(a) (i) 중쇄, 및 (ii) 경쇄를 포함하는 항-인간 PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 및
(b) 인간 인터류킨 7(IL-7) 또는 이의 단편 또는 변이체,
여기서, 항체 중쇄 및/또는 경쇄 또는 이의 단편은 IL-7에 펩타이드 링커에 의해, 바람직하게는 융합 단백질로서 공유결합으로 연결된다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 이작용성 분자는 다음을 포함하거나 이로 이루어진다:
(a) (i) 중쇄, 및 (ii) 경쇄를 포함하는 인간화된 항-인간 PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 및
(b) 인간 인터류킨 7 (IL-7) 또는 변이체 또는 이의 단편,
여기서 항체 중쇄 또는 경쇄 또는 이의 단편은 IL-7에 펩타이드 링커에 의해, 바람직하게는 융합 단백질로서 공유결합으로 연결된다.
바람직하게는, 이러한 이작용성 분자는 IL-7의 N-말단을 항-인간 PD-1 항체의 중쇄 또는 경쇄 또는 둘 다의 C-말단에 연결시키는 적어도 하나의 펩타이드 링커를 포함하고, 펩타이드 링커는 바람직하게는 (GGGGS)3, (GGGGS)4, (GGGGS)2, GGGGS, GGGS, GGG, GGS 및 (GGGS)3로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 심지어 보다 바람직하게는 (GGGGS)3이다.
바람직하게는, IL-7의 N-말단 끝은 적어도 하나의 펩타이드 링커를 통해 항-인간 PD-1 항체의 중쇄 또는 경쇄 또는 둘 다의 C-말단 끝에 연결된다. 대안적으로, IL-7의 C-말단 끝은 적어도 하나의 펩타이드 링커를 통해 항-인간 PD-1 항체의 중쇄 또는 경쇄 또는 둘 다의 N-말단 끝에 연결된다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 이작용성 분자는 다음을 포함하거나 이로 이루어진다:
(a) (i) 중쇄, 및 (ii) 경쇄를 포함하는 항-인간 PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편,
(b) 인간 인터류킨 7(IL-7) 또는 변이체 또는 이의 단편, 및
(c) IL-7의 N-말단 끝을 항-인간 PD-1 항체의 중쇄 또는 경쇄 또는 둘 다의 C-말단 끝에 연결시키는 펩타이드 링커(펩타이드 링커는 바람직하게는 (GGGGS)3, (GGGGS)4, (GGGGS)2, GGGGS, GGGS, GGG, GGS 및 (GGGS)3로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 심지어 보다 바람직하게는 (GGGGS)3이다.
특수한 구현예에서, 본 발명에 따른 이작용성 분자는 다음을 포함하거나 이로 이루어진다:
(a) (i) HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 및
(ii) LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항-인간 PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편,
여기서:
- 중쇄 CDR1(HCDR1)은 임의의 위치에서, 그러나 서열 번호: 1의 3번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고;
- 중쇄 CDR2(HCDR2)는 서열 번호: 2의 임의의 위치에서 그러나 13, 14 및 16번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고 2;
- 중쇄 CDR3(HCDR3)은 서열 번호: 3의 임의의 위치에서 그러나 2, 3, 7 및 8번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 3의 아미노산 서열(여기서 X1은 D 또는 E이고 X2는 T, H, A, Y, N, E 및 S로 이루어진 그룹, 바람직하게는 H, A, Y, N 및 E로 이루어진 그룹에서 선택된다)을 포함하거나 이로 이루어지고;
- 경쇄 CDR1(LCDR1)은 서열 번호: 12의 임의의 위치에서 그러나 5, 6, 10, 11 및 16번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 12의 아미노산 서열(여기서 X는 G 또는 T이다)을 포함하거나 이로 이루어지고;
- 경쇄 CDR2(LCDR2)는 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고;
- 경쇄 CDR3(LCDR3)는 서열 번호: 16의 임의의 위치에서 그러나 1, 4 및 6번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다;
(b) 서열 번호: 51의 인간 인터류킨 7 또는 변이체 또는 이의 단편,
여기서 항체 중쇄 및/또는 경쇄 또는 이의 단편은 융합 단백질로서 IL-7에, 바람직하게는 펩타이드 링커에 의해 공유결합으로 연결된다.
다른 구현예에서, 본 발명에 따른 이작용성 분자는 다음을 포함하거나 이로 이루어진다:
(a) (i) HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 및
(ii) LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항-인간 PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편,
여기서:
- 중쇄 CDR1(HCDR1)은 서열 번호: 1의 임의의 위치에서 그러나 3번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고;
- 중쇄 CDR2(HCDR2)는 서열 번호: 2의 임의의 위치에서 그러나 13, 14 및 16번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고;
- 중쇄 CDR3(HCDR3)은 서열 번호: 3의 임의의 위치에서 그러나 2, 3, 7 및 8번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 3의 아미노산 서열(여기서 X1은 D이고 X2는 T, H, A, Y, N, E로 이루어진 그룹, 바람직하게는 H, A, Y, N, E로 이루어진 그룹으로부터 선택되거나; X1은 E이고 X2는 T, H, A, Y, N, E 및 S로 이루어진 그룹, 바람직하게는 H, A, Y, N, E 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택된다)을 포함하거나 이로 이루어지고;
- 경쇄 CDR1(LCDR1)은 서열 번호: 12의 임의의 위치에서 그러나 5, 6, 10, 11 및 16번의 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 12의 아미노산 서열(여기서 X는 G 또는 T이다)을 포함하거나 이로 이루어지고;
- 경쇄 CDR2(LCDR2)는 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고;
- 경쇄 CDR3(LCDR3)은 서열 번호: 16의 임의의 위치에서 그러나 1, 4 및 6번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다;
(b) 서열 번호: 51의 인간 인터류킨 7 또는 변이체 또는 이의 단편,
여기서 항체 중쇄 또는 경쇄 또는 둘 다 또는 이의 단편은 IL-7에 융합 단백질로서, 바람직하게는 펩타이드 링커에 의해 연결된다.
다른 구현예에서, 본 발명에 따른 이작용성 분자는 다음을 포함하거나 이로 이루어진다:
(a) 다음을 포함하는 인간화된 항-인간 PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편:
- 중쇄 CDR1(HCDR1)은 서열 번호: 1의 임의의 위치에서 그러나 3번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고;
- 중쇄 CDR2(HCDR2)는 서열 번호: 2의 임의의 위치에서 그러나 13, 14 및 16번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고;
- 중쇄 CDR3(HCDR3)는 서열 번호: 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11의 임의의 위치에서 그러나 2, 3, 7 및 8번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고;
- 경쇄 CDR1(LCDR1)은 서열 번호: 13 또는 서열 번호: 14의 임의의 위치에서 그러나 5, 6, 10, 11 및 16번의 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 13 또는 서열 번호:14의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고;
- 경쇄 CDR2(LCDR2)는 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고;
- 경쇄 CDR3(LCDR3)은 서열 번호: 16의 임의의 위치에서 그러나 1, 4 및 6번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다; 및
(b) 서열 번호: 51의 인간 인터류킨 7 또는 변이체 또는 이의 단편,
여기서 항체 중쇄 또는 경쇄 또는 이의 단편은 IL-7에 융합 단백질로서, 바람직하게는 펩타이드 링커에 의해 연결된다.
바람직하게는, 펩타이드 링커는 (GGGGS)3, (GGGGS)4, (GGGGS)2, GGGGS, GGGS, GGG, GGS 및 (GGGS)3로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 심지어 보다 바람직하게는 (GGGGS)3이다.
다른 구현예에서, 본 발명은 다음을 포함하는 이작용성 분자에 관한 것이다:
(a) 다음을 포함하는 인간화된 항-hPD1 항체:
(i) 서열 번호: 17의 임의의 위치에서 그러나 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 영역(VH)(여기서 X1은 D 또는 E이고 X2는 T, H, A, Y, N, E 및 S으로 이루어진 그룹, 바람직하게는 H, A, Y, N, E로 이루어진 그룹으로부터 선택된다);
(ii) 서열 번호: 26의 임의의 위치에서 그러나 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 영역(VL)(여기서 X는 G 또는 T이다), 및
(b) 서열 번호: 51의 인간 인터류킨 7 또는 변이체 또는 이의 단편,
(c) 항-hPD1 항체 및 인간 IL-7 또는 변이체 또는 이의 단편의 경쇄 및/또는 중쇄 사이에 (GGGGS)3, (GGGGS)4, (GGGGS)2, GGGGS, GGGS, GGG, GGS 및 (GGGS)3로 이루어진 그룹으로부터 선택된, 심지어 보다 바람직하게는 (GGGGS)3인 펩타이드 링커.
바람직하게는, IL-7의 N-말단 끝은 항-인간 PD-1 항체의 중쇄 또는 경쇄 또는 둘 다의 C-말단 끝에 적어도 하나의 펩타이드 링커를 통해 연결된다. 대안적으로, IL-7의 C-말단 끝은 항-인간 PD-1 항체의 경쇄, 중쇄 또는 둘 다의 N-말단 끝에, 적어도 하나의 펩타이드 링커를 통해 연결된다.
다른 구현예에서, 본 발명은 다음을 포함하거나 이로 이루어진 이작용성 분자에 관한 것이다:
(a) 다음을 포함하는 인간화된 항-hPD1 항체:
(i) 서열 번호: 17의 임의의 위치에서 그러나 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 영역(VH)(여기서 X1은 D 또는 E이고 X2는 T, H, A, Y, N, E 및 S로 이루어진 그룹, 바람직하게는 H, A, Y, N, E로 이루어진 그룹으로부터 선택된다);
(ii) 서열 번호: 26의 임의의 위치에서 그러나 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 영역(VL)(여기서 X는 G 또는 T이다), 및
(b) 서열 번호: 51의 인간 인터류킨 7 또는 변이체 또는 이의 단편,
여기서 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 중쇄 및/또는 경쇄(들)의 C-말단 끝은 IL-7의 N-말단 끝에 바람직하게는 (GGGGS)3 펩타이드 링커에 의해 공유결합으로 연결되어 있다.
다른 구현예에서, 본 발명은 다음을 포함하거나 이로 이루어진 이작용성 분자에 관한 것이다:
a) 다음을 포함하는 인간화된 항-hPD1 항체:
(i) 서열 번호: 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25 각각의 임의의 위치에서 그러나 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 영역(VH);
(ii) 서열 번호: 27 또는 서열 번호: 28의 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105번의 임의의 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 27 또는 서열 번호: 28의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 영역(VL).
(b) 서열 번호: 51의 인간 인터류킨 7 또는 변이체 또는 이의 단편,
여기서 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 중쇄 및/또는 경쇄(들)의 C-말단 끝은 바람직하게는 (GGGGS)3 펩타이드 링커에 의해 IL7의 N-말단 끝에 공유결합으로 연결되어 융합 단백질을 형성한다.
바람직한 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 중쇄의 C-말단 끝은 IL-7의 N-말단 끝에 공유결합으로 연결되어 융합 단백질을 형성한다. 바람직하게는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 중쇄 만이 IL-7에 공유결합으로 연결된다.
다른 구현예에서, 본 발명은 다음을 포함하거나 이로 이루어진 이작용성 분자에 관한 것이다:
a) 다음을 포함하는 인간화된 항-hPD1 항체:
(i) 서열 번호: 17의 임의의 위치에서 그러나 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 영역(VH)(여기서 X1은 D 또는 E이고 X2는 T, H, A, Y, N, E 및 S로 이루어진 그룹, 바람직하게는 H, A, Y, N, E로 이루어진 그룹으로부터 선택된다);
(ii) 서열 번호: 26의 임의의 위치에서 그러나 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105번 위치에서, 임의의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)과 함께, 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 영역(VL)(여기서 X는 G 또는 T이다), 및
(b) 서열 번호: 51의 인간 인터류킨 7 또는 변이체 또는 이의 단편,
여기서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 중쇄의 C-말단 끝은 바람직하게는 (GGGGS)3 펩타이드 링커에 의해, IL7의 N-말단 끝에 공유결합으로 연결되어 융합 단백질을 형성한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 다음을 포함하거나 이로 이루어진 이작용성 분자에 관한 것이다:
a) 다음을 포함하는 인간화된 항-hPD1 항체:
(i) 서열 번호: 24의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 영역(VH);
(ii) 서열 번호: 28의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 영역(VL);
(b) 서열 번호: 51의 인간 인터류킨 7 또는 a 변이체 또는 이의 단편,
여기서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 중쇄의 C-말단 끝은 바람직하게는 (GGGGS)3 펩타이드 링커에 의해 IL7의 N-말단 끝에 공유결합으로 연결되어 융합 단백질을 형성한다.
바람직하게는, 항체 또는 이의 항체 단편은 IgG1 또는 IgG4 Fc 도메인을 갖는다.
일 양태에서, 항체 또는 이의 항체 단편은 임의로 T250Q/M428L; M252Y/S254T/T256E + H433K/N434F; E233P/L234V/L235A/G236A + A327G/A330S/P331S; E333A; S239D/A330L/I332E; P257I/Q311; K326W/E333S; S239D/I332E/G236A; N297A; L234A/L235A; N297A + M252Y/S254T/T256E; K322A 및 K444A로 이루어진 그룹으로부터 선택된 치환 또는 치환의 조합, 바람직하게는 임의로 M252Y/S254T/T256E, 및 L234A/L235과 함께 N297A로 이루어진 그룹으로부터 선택된 치환 또는 치환의 조합을 지닌 IgG1 Fc 도메인, 심지어 보다 바람직하게는 상술한 바와 같은 돌연변이 N297A를 갖는 IgG1 Fc 도메인을 갖는다.
다른 양태에서, 항체 또는 이의 항체 단편은 임의로 S228P; L234A/L235A, S228P + M252Y/S254T/T256E 및 K444A로 이루어진 그룹으로부터 선택된 치환 또는 치환의 조합을 지닌 IgG4 Fc 도메인, 심지어 보다 바람직하게는 상술한 바와 같은 돌연변이 S228P를 갖는 IgG4 Fc 도메인을 갖는다.
임의로, 임의의 상기 정의된 구현예에서, IL-7은 IL-7 변이체 또는 돌연변이체이다.
보다 특히, IL-7 변이체 또는 돌연변이체는 서열 번호: 51로 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 야생형 인간 IL-7(wth-IL-7)과 적어도 75% 동일성을 나타내고, 이러한 IL-7 변이체는 i) IL-7R에 대한 wth-IL-7의 친화성과 비교하여 IL-7 수용체(IL-7R)에 대한 IL-7 변이체의 친화성을 감소시키고, ii) wth-IL-7을 포함하는 이작용성 분자와 비교하여 IL-7 변이체를 포함하는 이작용성 분자의 약동학을 증진시키는 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 보다 바람직하게는, 이러한 돌연변이는 i) IL-7R에 대한 wth-IL-7의 친화성과 비교하여 IL-7 수용체(IL-7R)에 대한 IL-7 변이체의 친화성을 감소시키고, 및 ii) IL-7R을 활성화시키는 능력을 보유하고; iii) wth-IL-7을 포함하는 이작용성 분자와 비교하여 IL-7 변이체를 포함하는 이작용성 분자의 약동학을 증진시킨다.
보다 구체적으로, IL-7 변이체 또는 돌연변이체는 서열 번호: 51에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 야생형 인간 IL-7(wth-IL-7)과 적어도 75% 동일성을 나타낼 수 있고, 이러한 IL-7 변이체는: (i) C2S-C141S 및 C47S-C92S, C2S-C141S 및 C34S-C129S, 또는 C47S-C92S 및 C34S-C129S, (ii) W142H, W142F 또는 W142Y, (iii) D74E, D74Q 또는 D74N, 바람직하게는 D74E 또는 D74Q; iv) Q11E, Y12F, M17L, Q22E 및/또는 K81R; 또는 이의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.
IL-7 변이체 또는 돌연변이체는 C2S-C141S 및 C47S-C92S("SS2"로서 지칭됨), C2S-C141S 및 C34S-C129S("SS1"으로서 지칭됨), 및 C47S-C92S 및 C34S-C129S("SS3"으로서 지칭됨)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 치환 세트를 포함할 수 있다. 이러한 돌연변이는 서열 번호: 51에 나타낸 아미노산의 위치를 지칭한다. 이러한 IL-7 변이체 또는 돌연변이체는 특히 서열 번호 :53 내지 55(SS1, SS2 및 SS3 각각)에 나타낸 서열 하에 기술되어 있다. 바람직하게는, IL-7 변이체 또는 돌연변이체는 아미노산 치환 C2S-C141S 및 C47S-C92S를 포함한다. 심지어 보다 바람직하게는, IL-7 변이체 또는 돌연변이체는 서열 번호: 54로 나타낸 서열을 나타낸다.
IL-7 변이체 또는 돌연변이체는 W142H, W142F, 및 W142Y로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함할 수 있다. 이러한 IL-7 변이체 또는 돌연변이체는 특히 서열 번호: 57 및 58 각각으로 나타낸 서열 하에 기술되어 있다. 바람직하게는, IL-7 변이체 또는 돌연변이체는 돌연변이 W142H를 포함한다. 심지어 보다 바람직하게는, IL-7 변이체 또는 돌연변이체는 서열 번호: 56으로 나타낸 서열을 나타낸다.
IL-7 변이체 또는 돌연변이체는 D74E, D74Q 및 D74N, 바람직하게는 D74E 또는 D74Q로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함할 수 있다. 이러한 IL-7 변이체 또는 돌연변이체는 특히 서열 번호: 63 내지 65 각각으로 나타낸 서열 하에 기술되어 있다. 바람직하게는, IL-7 변이체 또는 돌연변이체는 돌연변이 D74E를 포함한다. 심지어 보다 바람직하게는, IL-7 변이체 또는 돌연변이체는 서열 번호: 63으로 나타낸 서열을 나타낸다.
IL-7 변이체 또는 돌연변이체는 Q11E, Y12F, M17L, Q22E 및/또는 K81R로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함할 수 있다. 이러한 돌연변이는 서열 번호: 51로 나타낸 아미노산의 위치를 지칭한다. 이러한 IL-7 변이체 또는 돌연변이체는 특히 서열 번호: 59, 60, 61, 62 및 66 각각으로 나타낸 서열 하에 기술되어 있다.
IL-7 변이체 또는 돌연변이체는 i) W142H, W142F 또는 W142Y 및/또는 ii) D74E, D74Q 또는 D74N, 바람직하게는 D74E 또는 D74Q 및/또는 iii) C2S-C141S 및 C47S-C92S, C2S-C141S 및 C34S-C129S, 또는 C47S-C92S 및 C34S-C129S로 이루어진 적어도 하나의 돌연변이를 포함할 수 있다.
IL-7 변이체 또는 돌연변이체는 W142H 치환 및 i) D74E, D74Q 또는 D74N, 바람직하게는 D74E 또는 D74Q 및/또는 ii) C2S-C141S 및 C47S-C92S, C2S-C141S 및 C34S-C129S, 또는 C47S-C92S 및 C34S-C129S로 이루어진 적어도 하나의 돌연변이를 포함할 수 있다.
IL-7 변이체 또는 돌연변이체는 D74E 치환 및 i) W142H, W142F 또는 W142Y 및/또는 ii) C2S-C141S 및 C47S-C92S, C2S-C141S 및 C34S-C129S, 또는 C47S-C92S 및 C34S-C129S로 이루어진 적어도 하나의 돌연변이를 포함할 수 있다.
IL-7 변이체 또는 돌연변이체는 돌연변이 C2S-C141S 및 C47S-C92S 및 i) W142H, W142F 또는 W142Y 및/또는 ii) D74E, D74Q 또는 D74N로 이루어진 적어도 하나의 치환을 포함할 수 있다.
IL-7 변이체 또는 돌연변이체는 i) D74E 및 W142H 치환 및 ii) 돌연변이 C2S-C141S 및 C47S-C92S, C2S-C141S 및 C34S-C129S, 또는 C47S-C92S 및 C34S-C129S를 포함할 수 있다.
IL-7 변이체 또는 돌연변이체는 서열 번호: 53, 54, 55, 56, 57, 58, 63, 64 또는 65로 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.
특수한 양태에서, IL-7은 본 발명에 따른 IL-7 변이체이고 항체 또는 이의 항체 단편은 임의로 T250Q/M428L; M252Y/S254T/T256E + H433K/N434F; E233P/L234V/L235A/G236A + A327G/A330S/P331S; E333A; S239D/A330L/I332E; P257I/Q311; K326W/E333S; S239D/I332E/G236A; N297A; L234A/L235A; N297A + M252Y/S254T/T256E; K322A 및 K444A로 이루어진 그룹으로부터 선택된, 바람직하게는 임의로 M252Y/S254T/T256E, 및 L234A/L235와 함께 N297A로 이루어진 그룹으로부터 선택된 치환 또는 치환의 조합을 지닌 IgG1 Fc 도메인, 심지어 보다 바람직하게는 상술한 바와 같은 돌연변이 N297A를 지닌 IgG1 Fc 도메인을 갖는다. 바람직하게는, 항체 또는 이의 단편은 IL-7 또는 이의 변이체에 (GGGGS)3, (GGGGS)4, 및 (GGGS)3로 이루어진 그룹으로부터 선택된 링커, 보다 바람직하게는 (GGGGS)3에 의해 연결된다. 바람직하게는, IL-7 변이체는 C2S-C141S 및 C47S-C92S, C2S-C141S 및 C34S-C129S, C47S-C92S 및 C34S-C129S, W142H, W142F, W142Y, D74E, D74Q 및 D74N으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 치환의 그룹을 포함한다. 보다 바람직하게는, IL-7 변이체는 C2S-C141S 및 C47S-C92S, C2S-C141S 및 C34S-C129S, W142H, W142F, W142Y, D74E, D74Q 및 D74N으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 치환의 그룹을 포함한다. 여전히 보다 바람직하게는, IL-7 변이체는 C2S-C141S 및 C47S-C92S, C2S-C141S 및 C34S-C129S, W142H 및 D74E로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 치환의 그룹을 포함한다.
특수한 양태에서, 본 발명에 따른 이작용성 분자는 다음을 포함하거나 이로 이루어진 융합 단백질이다:
(a) 면역 세포 표면, 바람직하게는 T 세포 상에서 발현된 표적, 보다 바람직하게는 PD-1, CD28, CD80, CTLA-4, BTLA, TIGIT, CD160, CD40L, ICOS, CD27, OX40, 4-1BB, GITR, HVEM, Tim-1, LFA-1, TIM3, CD39, CD30, NKG2D, LAG3, B7-1, 2B4, DR3, CD101, CD44, SIRPG, CD28H, CD38, CXCR5, CD3, PDL2, CD4 및 CD8, 바람직하게는 PD-1, TIM3, CD244, LAG-3, BTLA, TIGIT 및 CD160으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 표적에 특이적으로 결합한 본원의 상기 기술된 바와 같은 항체 또는 이의 항체 단편;
(b) 서열 번호: 51의 인간 인터류킨 7 또는 변이체 또는 이의 단편, 및
(c) 임의로 (GGGGS)3, (GGGGS)4, (GGGGS)2, GGGS, GGG, GGS 및 (GGGS)3, 바람직하게는 (GGGGS)3로 이루어진 그룹으로부터 선택된 펩타이드 링커.
이작용성 항-PD-1 분자에 대한 모든 또는 임의의 상기 상세한 구체적인 양태 및 구현예는 이러한 대안의 이작용성 분자에 적용될 수 있다.
특수한 양태에서, 면역 세포 표면, 바람직하게는 T 세포 상에서 발현된 표적, 바람직하게는 T 세포, 보다 바람직하게는 PD-1, CD28, CD80, CTLA-4, BTLA, TIGIT, CD160, CD40L, ICOS, CD27, OX40, 4-1BB, GITR, HVEM, Tim-1, LFA-1, TIM3, CD39, CD30, NKG2D, LAG3, B7-1, 2B4, DR3, CD101, CD44, SIRPG, CD28H, CD38, CXCR5, CD3, PDL2, CD4 및 CD8, 바람직하게는 PD-1, TIM3, CD244, LAG-3, BTLA, TIGIT 및 CD160으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 표적에 특이적으로 결합하는 본원의 상술된 바와 같은 항체 또는 이의 항체 단편; IL-7은 본 발명에 따른 IL-7 변이체이고 항체 또는 이의 항체 단편은 T250Q/M428L; M252Y/S254T/T256E + H433K/N434F; E233P/L234V/L235A/G236A + A327G/A330S/P331S; E333A; S239D/A330L/I332E; P257I/Q311; K326W/E333S; S239D/I332E/G236A; N297A; L234A/L235A; N297A + M252Y/S254T/T256E; K322A 및 K444A, 바람직하게는 임의로 M252Y/S254T/T256E, 및 L234A/L235과 함께 N297A로 이루어진 그룹으로부터 선택된 치환 또는 치환의 조합을 지닌 IgG1 Fc 도메인, 심지어 보다 바람직하게는 상술한 바와 같은 돌연변이 N297A를 지닌 IgG1 Fc 도메인을 갖는다 바람직하게는, 항체 또는 이의 단편은 IL-7 또는 이의 변이체에 (GGGGS)3, (GGGGS)4, 및 (GGGS)3로 이루어진 그룹으로부터 선택된 보다 바람직하게는 (GGGGS)3인 링커에 의해 연결된다. 바람직하게는, IL-7 변이체는 C2S-C141S 및 C47S-C92S, C2S-C141S 및 C34S-C129S, C47S-C92S 및 C34S-C129S, W142H, W142F, W142Y, D74E, D74Q 및 D74N으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 치환의 그룹을 포함한다. 보다 바람직하게는, IL-7 변이체는 C2S-C141S 및 C47S-C92S, C2S-C141S 및 C34S-C129S, W142H, W142F, W142Y, D74E, D74Q 및 D74N으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 치환의 그룹을 포함한다. 여전히 보다 바람직하게는, IL-7 변이체는 C2S-C141S 및 C47S-C92S, C2S-C141S 및 C34S-C129S, W142H 및 D74E로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 치환의 그룹을 포함한다.
이의 특이적인 표적에 대한 이작용성 분자의 결합은 예를 들면, 효소-연결된 면역흡착 검정(ELISA), 방사선면역검정(RIA), FACS 분석, 생물검정(예컨대, 성장 억제), 또는 웨스턴 블롯 검정(Western Blot assay)에 의해 확인할 수 있다. 이러한 검정 각각은 일반적으로 목적한 복합체에 대해 특이적인 표지된 시약(예컨대, 항체)를 사용함으로써 특지 목적한 단백질-항체 복합체를 검출한다. 예를 들면, 항-hPD-1 항체/IL-7 복합체는 IL-7 또는 IL-7의 수용체를 인식하여 이에 특이적으로 결합하는 효소-연결된 항체 또는 항체 단편을 사용하여 검출할 수 있다.
일부 예에서, 본원에 기술된 이작용성 분자는 PD-1 신호전달 경로를 적어도 20%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 90%, 적어도 100%, 또는 적어도 2배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 50배, 적어도 100배, 또는 적어도 1000배까지 억제한다.
바람직하게는, 이러한 이작용성 분자는 PD-1과 이의 리간드(예컨대 PD-L1 및/또는 PD-L2) 사이의 상호작용을 차단하거나 억제하는 능력을 갖는다. 특정의 구현예에서, 이작용성 분자는 PD-1과 이의 리간드(예컨대 PD-L1 및/또는 PD-L2) 사이의 결합 상호작용을 적어도 50％까지 억제한다. 특정의 구현예에서, 이러한 억제는 60％ 초과, 70％ 초과, 80％ 초과, 또는 90％ 초과일 수 있다.
일부 예에서, 본원에 기술된 이작용성 분자는 PD-1 신호전달 경로를 적어도 20%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 90%, 적어도 100%, 또는 by 적어도 2배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 50배, 적어도 100배, 또는 적어도 1000배까지 억제한다.
일부 예에서, 본원에 기술된 이작용성 분자는 IFN 감마 분비 및/또는 Alpha4 및 Beta7을 자극한다.
다른 예에서, 본원에 기술된 이작용성 분자는 종양내에서 T 세포 침윤을 촉진한다.
일부 예에서, 본원에 기술된 이작용성 분자는 IL-7R 신호전달 경로를 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 90%, 적어도 100%, 또는 적어도 2배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 50배, 적어도 100배, 또는 적어도 1000배까지 자극한다.
다른 양태에서, 본원에 기술된 이작용성 분자는 야생형 IL-7과 비교하여 실질적으로 등가의 생물학적 IL-7 특성을 보유한다. 예를 들면, 이는 전체 길이의 IL-7 단백질과 비교하여 실질적으로 등가의 생물학적 IL-7 특성을 보유한다. 예를 들면, 이는 전체 길이의 IL-7 단백질과 비교가능한 생물학적 특성을 보유한다. IL-7 단백질의 생물학적 활성은 시험관내 세포 증식 검정을 사용하거나 T 세포 내로의 P-Stat5를 ELISA 또는 FACS로 측정함으로써 측정할 수 있다. 바람직하게는, 본원에 기술된 IL-7 이작용성 분자는 야생형 인간 IL-7과 비교하여 적어도 10 %, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%의 생물학적 활성, 바람직하게는 야생형 인간 IL-7과 비교하여 적어도 80%, 90%, 95% 및 심지어 보다 바람직하게는 99%의 생물학적 활성을 유지한다. 예를 들면, 생물학적 활성은 IL-7R에 대한 본원에 기술된 이작용성 분자의 결합능 및/또는 IL-7R에 대한 결합에 대해 야생형 IL-7과 경쟁하는 능력을 측정함으로써 평가할 수 있다.
다른 예에서, 본원에 기술된 이작용성 분자는 사이토킨 분비, 및/또는 나이브, 특히 부분 고갈된 및/또는 완전히 고갈된 T-세포 서브세트의 증식을 유도한다.
이작용성 분자 - 이작용성 분자를 암호화하는 핵산 분자, 재조합 발현 벡터 및 이를 포함하는 숙주 세포의 제조
본 발명의 이작용성 분자를 생성하기 위하여, 본 발명의 항-hPD1 항체를 IL-7 또는 이의 변이체에 기능적으로 연결시킨다.
이작용성 분자의 실체 둘 다를 동일한 벡터 내에 암호화시키고 융합 단백질로서 생산한다. 따라서, 본원에 기술된 임의의 이작용성 분자를 암호화하는 핵산, 이러한 발현 벡터와 같은 벡터 또는 이러한 핵산을 포함하는 재조합 바이러스, 및 핵산 및/또는 벡터를 포함하는 숙주 세포가 본원에 개시되어 있다.
본 발명에 따라서, 포유동물 세포에 의해 안정한 형태로 분비되는 이작용성 융합 단백질을 생산하기 위하여, 이작용성 분자를 암호화하는 핵산 서열을 일반적으로 포유동물 세포를 형질감염시키는데 사용된 발현 벡터내로 아클로닝한다. 항체 서열을 포함하는 분자를 생산하기 위한 일반적인 기술은 이의 내용이 본원에 참고로 포함된, 문헌: Coligan et al. (eds.), Current protocols in immunology, at pp. 10.19.1-10.19.11 (Wiley Interscience 1992) 및 분자의 생산과 관련된 설명이 각각의 내용 전체에 분산되어 있는, "Antibody engineering: a practical guide" from W. H. Freeman 및 Company (1992)에 기술되어 있다.
일반적으로, 이러한 방법은 다음의 단계를 포함한다:
(1) 숙주 세포를 본 발명의 재조합 이작용성 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(들) 또는 이의 변이체 또는 폴리뉴클레오타이드(들)을 암호화하는 벡터로 형질감염 또는 형질전환시키는 단계;
(2) 숙주 세포를 적절한 배지 속에서 배양하는 단계; 및
(3) 임의로 배지 또는 숙주 세포로부터 단백질을 단리 또는 정제하는 단계.
본 발명은 또한 상기 개시된 바와 같은 이작용성 분자를 암호화하는 핵산, 본 발명의 핵산을 포함하는 벡터, 바람직하게는 발현 벡터, 본 발명의 벡터로 또는 재조합 이작용성 분자를 암호화하는 서열로 직접 형질전환된 유전적으로 가공된 숙주 세포, 및 재조합 기술에 의해 본 발명의 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다.
핵산, 벡터 및 숙주 세포는 보다 특히 이후 기술된다.
핵산 서열
본 발명은 상기 정의된 바와 같은 이작용성 분자를 암호화하는 핵산 분자 또는 상기 정의된 바와 같은 이작용성 분자를 암호화하는 핵산 분자의 그룹에 관한 것이다.
항체 DNA 서열은 예를 들면, PCR을 사용하여 클로닝된 면역글로불린으로 합성된, 또는 공지된 신호 펩타이드 아미노산 서열을 암호화하는 올리고뉴클레오타이드를 통해 합성된, 면역글로불린을 합성하는 세포의 RNA로부터 증폭될 수 있다.
바람직하게는, 펩타이드 신호는 VH 및/또는 CH에 대해 서열 번호: 49의 아미노산 서열; 및/또는 VL 및/또는 CL에 대해 서열 번호: 50의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 특히, 펩타이드 신호는 CH, VH, CL 및/또는 VL의 N-말단 내에 존재한다.
이러한 핵산은 항체(예컨대, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄)의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 암호화할 수 있다. 이러한 핵산은 통상의 과정을 사용하여 용이하게 단리하거나 서열분석할 수 있다.
특히, 상술한 바와 같은 이작용성 분자를 암호화하는 핵산 분자는 다음을 포함한다:
- 임의로 서열 번호: 49의 펩타이드 신호와 함께, 본원에 개시된 바와 같은 항-hPD-1 항체의 가변 중쇄 도메인을 암호화하는 제1의 핵산 분자, 및
- 임의로 서열 번호: 50의 펩타이드 신호와 함께, 본원에 개시된 바와 같은 항-hPD-1 항체의 가변 경쇄 도메인을 암호화하는 제2의 핵산 분자, 및
- 임의로 펩타이드 링커를 암호화하는 핵산을 통해 제1의 핵산 또는 제2의 핵산 또는 둘 다에 작동적으로 연결된, IL-7을 암호화하는 제3의 핵산 분자 또는 이의 변이체, 바람직하게는 인간 IL-7 또는 이의 변이체.
바람직하게는, 상기 정의된 바와 같은 이작용성 분자를 암호화하는 핵산 분자는 다음을 포함한다:
- 임의로 서열 번호: 49의 펩타이드 신호화 함께, 서열 번호: 17의 가변 중쇄 도메인을 포함하는 제1의 핵산 분자(여기서 X1은 D 또는 E이고 X2는 T, H, A, Y, N, E 및 S로 이루어진 그룹, 바람직하게는 H, A, Y, N, 및 E로 이루어진 그룹으로부터 선택된다), 및
- 임의로 서열 번호: 50의 펩타이드 신호와 함께, 서열 번호: 26의 가변 경쇄 도메인을 암호화하는 제2의 핵산 분자(여기서 X는 G 또는 T이다), 및
- 임의로 펩타이드 링커를 암호화하는 핵산을 통해 제1의 핵산 또는 제2의 핵산 또는 둘 다에 작동적으로 연결된, 서열 번호: 51, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 또는 63의 인간 IL-7을 암호화하는 제3의 핵산 분자.
바람직하게는, 상기 정의된 바와 같은 이작용성 분자를 암호화하는 핵산 분자는 다음을 포함한다:
- 임의로 서열 번호: 49의 펩타이드 신호와 함께, 서열 번호: 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25로 나타낸 아미노산 서열의 가변 중쇄 도메인을 암호화하는 제1의 핵산 분자, 및
- 임의로 서열 번호: 50의 펩타이드 신호와 함께, 서열 번호: 27 또는 서열 번호: 28로 나타낸 아미노산 서열의 가변 경쇄 도메인을 암호화하는 제2의 핵산 분자, 및
- 임의로 펩타이드 링커를 암호화하는 핵산을 통해 제1의 핵산 또는 제2의 핵산 또는 둘 다에 작동적으로 연결된 서열 번호: 51, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 또는 63의 인간 IL-7을 암호화하는 제3의 핵산 분자 또는 이의 변이체.
매우 특수한 구현예에서, 가변 중쇄 도메인을 암호화하는 핵산 분자는 서열 번호: 73으로 나타낸 서열을 갖고/갖거나 가변 경쇄 도메인을 암호화하는 핵산 분자는 서열 번호: 74로 나타낸 서열을 갖는다.
작동적으로 연결된은 핵산이 가변 중쇄 또는 경쇄 도메인, 임의로 펩타이드 링커, 및 IL-7을 포함하는 단백질 융합체를 암호화하는 것으로 의도된다. 바람직하게는, 링커는 (GGGGS)3, (GGGGS)4, (GGGGS)2, GGGGS, GGGS, GGG, GGS 및 (GGGS)3로 이루어진 그룹으로부터 선택되고 심지어 보다 바람직하게는 (GGGGS)3이다.
일 구현예에서, 핵산 분자는 단리된, 특히 비-천연 핵산 분자이다.
본 발명에 따른 이작용성 분자를 암호화하는 핵산 분자 또는 핵산 분자의 그룹은 바람직하게는 벡터 또는 벡터의 그룹 내에 포함된다.
벡터
다른 양태에서, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 핵산 분자 또는 핵산 분자의 그룹을 포함하는 벡터에 관한 것이다.
본원에 사용된 바와 같은, "벡터"는 세포 내로 유전 물질을 전달하기 위한 비히클로서 사용된 핵산 분자이다. 용어 "벡터"는 플라스미드, 바이러스, 코스미드 및 인공 염색체를 포함한다. 일반적으로, 가공된 벡터는 복제 오리진, 다중클로닝 부위 및 선택가능한 마커를 포함한다. 벡터 자체는 일반적으로 뉴클레오타이드 서열, 일반적으로 DNA 서열이며, 삽입체(전이유전자) 및 벡터의 "골격"으로서 제공되는 보다 큰 서열을 포함한다. 현대의 벡터는 전이유전자 삽입체 및 골격 외에 추가의 특징: 프로모터, 유전 마커, 항생제 내성, 리포터 유전자, 표적 서열, 단백질 정제 태그를 포함할 수 있다. 발현 벡터(발현 작제물)로 불리는 벡터는 구체적으로 표적 세포내에서 전이유전자의 발현을 위한 것이며, 일반적으로 제어 서열을 갖는다.
일 구현예에서, 중쇄 및 경쇄 암호화 서열 둘 모두 및/또는 항-PD1 항체의 불변 영역은 하나의 발현 벡터 내에 포함된다. 중쇄 암호화 서열 및 경쇄 암호화 서열 각각은 적합한 프로모터에 대해 작동가능한 연결일 수 있고, 중쇄 및/또는 경쇄는 본 발명에 따른 면역치료제에 작동적 연결로 존재한다. 대안적으로, 중쇄 및 경쇄 둘 다의 발현은 동일한 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 다른 구현예에서, 항체의 중쇄 및 경쇄 각각은 개개 벡터 내로 클로닝되며, 중쇄 및 경쇄 중 하나 또는 둘다, 중쇄 및/또는 경쇄는 본 발명에 따른 면역치료제에 작동적으로 연결된다. 후자의 경우에, 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 발현 벡터는 쇄 둘 다의 발현을 위해 숙주 세포 내로 동시-형질감염될 수 있고, 이는 조립되어 생체내 또는 시험관내에서 완전한 항체를 형성한다. 대안적으로, 중쇄를 암호화하는 및 경쇄를 암호화하는 벡터는 각각의 중쇄 및 경쇄의 발현을 위해 상이한 숙주 세포내로 도입될 수 있고, 이는 이후 정제 및 조질되어 시험관내에서 완전한 항체를 형성할 수 있다.
인간화된 항-PD-1 항체 또는 항체 이의 단편을 암호화하는 핵산 분자는 당해 분야의 기술자에 의해 벡터내로 클로닝된 후, 숙주 세포 내로 형질던환될 수 있다. 따라서, 본 발명은ㄴ 또한, 본 발명은 항-PD-1 항체 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 하나의 바람직한 구현예에서, 발현 벡터는 또한 프로모터 및 분비 신호 펩타이드, 및 임의로 스크리닝을 위한 적어도 하나의 약물-내성 유전자를 암호화하는 핵산 서열을 추가로 포함한다.
적합한 발현 벡터는 전형적으로 (1) 세균 복제 오리진 및 세균 숙주 내에서 발현 벡터의 성장 및 선택을 위해 제공된 항생제 내성 마커를 암호화하는 원핵세포 DNA 성분; (2) 전사의 개시를 제어하는 진핵 DNA 성분, 예를 들면, 프로모터; 및 (3) 전사체의 프로세싱을 제어하는 DNA 성분, 예를 들면, 전사 종결/폴리아데닐화 서열을 함유한다.
당해 분야의 기술자에게 공지된 방법을 사용하여 본원에 기술된 이작용성 분자의 핵산 서열 및 전사/해독을 위한 적절한 조절 구성성분을 함유하는 발현 벡터를 작제할 수 있다. 이러한 방법은 시험관내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술, 생체내 재조합 기술 등을 포함한다. DNA 서열은 발현 벡터 내에서 적절한 프로모터에 효율적으로 연결되어 mRNA의 합성을 지시할 수 있다. 발현 벡터는 또한 해독을 개시하기 위한 리보소옴-결합 부위, 전시 터미네이터 등을 포함할 수 있다.
발현 벡터는 다양한 기술, 예를 들면, 인산칼슘 형질감염, 리포좀-매개된 형질감염, 전기천공 등을 사용하여 숙주 세포로 도입할 수 있다. 바람직하게는, 형질감염된 세포를 선택하고 증식시키며 여기서 발현 벡터는 숙주 세포 게놈내로 안정하게 통합되어 안정한 형질전환체를 생산한다. 벡터를 진핵 세포내로 도입하기 위한 기술 및 안정한 형질전환체를 우세한 선택성 마커를 사용하여 선택하는 기술은 문헌: Sambrook, by Ausubel, by Bebbington, "Expression of Antibody Genes in Nonlymphoid Mammalian Cells," in 2 METHODS: A companion to methods in enzymology 136 (1991), 및 by Murray (ed.), Gene transfer 및 expression protocols (Humana Press 1991)에 기술되어 있다. 적합한 클로닝 벡터는 문헌: Sambrook et al. (eds.), MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Second Edition (Cold Spring Harbor Press 1989) (hereafter "Sambrook"); by Ausubel et al. (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Wiley Interscience 1987) (hereafter "Ausubel"); 및 by Brown (ed.), MOLECULAR BIOLOGY LABFAX (Academic Press 1991)에 기술되어 있다.
숙주 세포
다른 양태에서, 본 발명은 예를 들면, 이작용성 분자 생산 목적을 위한, 상기 정의된 바와 같은 벡터 또는 핵산 분자 또는 핵산 분자의 그룹을 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "숙주 세포"는 벡터, 외인성 핵산 분자, 및 본 발명의 항체 작제물을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 수용체일 수 있거나 이었던 임의의 개개 세포 또는 세포 배양물; 및/또는 항체 작제물 또는 이작용성 분자 자체의 수용체를 포함하는 것으로 의도된다. 각각의 물질의 세포내로의 도입은 형질전환, 형질감염 등의 방식으로 수행될 수 있다. 용어 "숙주 세포"는 또한 단일 세포의 후대세포 또는 잠재적인 후대세포를 포함하는 것으로 의도된다. 적합한 숙주 세포는 원핵 또는 진핵 세포를 포함하고, 또한 세균, 효모 세포, 진균 세포, 식물 세포, 및 동물 세포, 예를 들면, 곤충 세포 및 포유동물 세포, 예컨대, 쥐, 랫트, 토끼, 마카퀴(macaque) 또는 인간을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일 구현예에서, 숙주 세포는 다음을 포함한다(예컨대, 다음에 의해 형질전환되었다): (1) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열 및/또는 항체의 불변 영역을 포함하는 벡터, 또는 (2) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 제1의 벡터 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 제2의 벡터.
다른 구현예에서, 숙주 세포는 이작용성 분자 전체 둘 다를 포함하는 벡터를 포함한다(예컨대, 이에 의해 형질전환되었다). 바람직하게는, 숙주 세포는 IL-7 또는 이의 변이체 또는 돌연변이체를 암호화하는 제3의 핵산에 작동적으로 연결된, 본원에 개시된 바와 같은 항-hPD-1 항체의 가변 중쇄 도메인을 암호화하는 제1의 핵산 분자, 및 본원에 개시된 바와 같은 항-hPD-1 항체의 가변 경쇄 도메인을 암호화하는 제2의 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함한다(예컨대, 다음에 의해 형질전환되었다).
인간화된 항-PD1 항체 생산 방법이 또한 본원에 제공된다. 방법은 상기 제공된 바와 같은 항체를 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 항체의 발현에 적합한 조건 하에서 배양하는 단계, 및 임의로 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 항체를 회수하는 단계를 포함한다. 특히, 인간화된 항-PD1 항체의 재조합 생산을 위해, 예컨대, 상술한 바와 같은 항체를 암호화하는 핵산을 잔리하여 숙주 세포 내에서 추가의 클로닝 및/도는 발현을 위해 하나 이상의 벡터내로 삽입한다.
본 발명의 이작용성 분자는 바람직하게는 진핵 세포, 예를 들면, 포유동물 세포, 식물 세포, 곤충 세포 또는 효모 세포내에서 발현되다. 포유동물 세포는 글리코실화와 같은 적합한 해독 후 변형을 제공하므로, 포유동물 세포가 특히 바람직한 진핵 숙주이다. 바람직하게는, 이러한 적합한 진핵 숙주 세포는 진균, 예를 들면, 키키아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae),스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe); 곤충 세포, 예를 들면, 마이팀나 세파라테(Mythimna separate); 식물 세포, 예를 들면, 담배 및 포유동물 세포, 예를 들면, BHK 세포, 293 세포, CHO 세포, NSO 세포 및 COS 세포일 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV 유전자와 함께 원래의 CV-1 세포(COS 세포), SV40로 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주(COS-7); 인간 배아 신장 세포주(예컨대, 문헌: Graham, F.L. et al, J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74에 기술된 바와 같은, 293 또는 293 세포); 아기 햄스터 신장 세포(BHK); 마우스 세르톨리 세포(예컨대, 문헌: Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252에 기술된 바와 같은 TM4 세포); 인간 상피 신장 세포(HEK 세포); 원숭이 신장 세포(CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76); 인간 자궁경부 암종 세포(HELA); 개 신장 세포(MDCK; 버팔로 랫트 간 세포(buffalo rat liver cell)(BRL 3 A); 인간 폐 세포(W138); 인간 간 세포(Hep G2); 마우스 유방 종양(MMT 060562); 예컨대, 문헌: Mather, J.P. et al, Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68에 기술된 바와 같은, TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 챠이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, 예를 들면, DHFR" CHO 세포(Urlaub, G. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220); 및 골수종 세포주, 예를 들면, Y0, NSO 및 Sp2/0일 수 있다. 항체 생산에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주의 고찰을 위해서는, 예컨대, 문헌: Yazaki, P. 및 Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp. 255-268을 참고한다. 예를 들면, 현탁액 속에서 성장하도록 적응된 포유동물 세포주가 유용할 수 있다.
특히, 본 발명의 숙주 세포는 CHO 세포, COS 세포, NSO 세포, 및 HEK 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
포유동물 숙주의 경우, 발현 벡터의 전사 및 해독 조절 신호는 바이러스 공급원, 예를 들면, 아데노바이러스(adenovirus), , 소 파필로마 바이러스(bovine papilloma virus), 시미안 바이러스(simian virus) 등으로부터 유래될 수 있고, 여기서 조절 신호는 높은 발현 수준을 갖는 특수한 유전자와 관련된다. 적합한 전사 및 해독 조절 서열이 또한 포유동물 유전자, 예를 들면, 액틴, 콜라겐, 미오신, 및 메탈로티오네인 유전자로부터 수득될 수 있다.
본 발명에 따른 이작용성 분자를 생산하는 안정한 형질전환체는 다양한 방법을 사용하여 확인할 수 있다. 분자-생산 세포를 확인한 후, 숙주 세포를 이의 성장 및 이작용성 분자 발현에 적합한 조건(예컨대, 온도, 배지) 하에서 배양한다. 이후에, 이작용성 분자를 당해 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 단리하고/하거나 정제한다. 이러한 방법은 통상의 변형 처리, 단백질 침전에 의한 처리(예를 들면, 염 침전), 원심분리, 삼투압에 의한 세포 분해, 초음파처리, 한외원심분리, 분자체 크로마토그래피 또는 겔 크로마토그래피, 흡수 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, HPLC, 임의의 다른 액체 크로마토그래피, 및 이의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예를 들면, 콜리간(Coligan에 의해 기술된 바와 같이, 이작용성 분자 단리 기술은 특히 단백질-A 세파로즈를 사용한 친화성 크로마토그래피, 크기-배제 크로마토그래피 및 이온 교환 크로마토그래피를 포함한다. 바람직하게는 단백질 A를 사용하여 본 발명의 이작용성 분자를 단리한다.
약제학적 조성물 및 이의 투여 방법
본 발명은 바람직하게는 활성 성분 또는 화합물로서, 본원에 기술된 임의의 이작용성 분자, 상술한 바와 같은 핵산 분자, 핵산 분자의 그룹, 벡터 및/또는 숙주 세포를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 제형은 멸균될 수 있고, 경우에 따라 보조제, 예를 들면, 약제학적으로 허용되는 담체 및 본 발명의 이작용성 분자, 본 발명의 핵산, 벡터 및/또는 숙주 세포와 유해하게 상호작용하지 않는 부형제와 혼합될 수 있다. 임의로, 약제학적 조성물은 하기 상세히 설명한 바와 같은 추가의 치료제를 또한 포함할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 약제학적 조성물은 본원에 기술된 바와 같은 이작용성 분자, 상술된 바와 같은 핵산 분자, 핵산 분자의 그룹, 벡터 및/또는 숙주 세포를 하나 이상의 약제학적으로 또는 생리학적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제, 염, 및 이후 기술된 바와 같은 항-산화제와 함께 포함할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 이작용성 분자의 목절한 면역 강화 효과에 역으로 영향을 미치지 않는 약제학적으로 허용되는 형태가 사용된다. 투여를 용이하게 하기 위하여, 본원에 기술된 바와 같은 이작용성 분자를 생체내 투여용 약제학적 조성물로 제조할 수 있다. 이러한 조성물을 제조하기 위한 수단은 당해 분야에 기술되어 있다(참고: 예를 들면, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins, 21st edition (2005).
특히, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 임의의 통상의 투여 경로, 예를 들면, 국소, 장내, 경구, 비경구, 비강, 정맥내, 근육내, 피하 또는 안내 투여 등을 위해 제형화될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 장내 또는 비경구 투여 경로를 위해 제형화된다. 비경구 투여용 조성물 및 제형은 완충제, 희석제 및 침투 향상제, 카더 화합물(carder compound) 및 다른 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 다른 적합한 첨가제를 함유할 수 있다.
약제학적 조성물은 목적한 정도의 순도를 갖는 제제를 임의의 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합함으로써(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), 동결건조된 제형 또는 수용액으로 제조할 수 있다. 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제는 사용된 투여량 및 농도에서 수용체에 대해 무독성이며, 완충제, 예를 들면, 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산; 항산화제, 예를 들면, 아스코르브산 및 메티오닌; 방부제(예를 들면, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예를 들면, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저 분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩타이드; 단백질, 예를 들면, 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들면, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들면, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 라이신; 단단류, 이달류, 및 다른 탄수화물, 예를 들면, 글루코즈, 만노즈, 또는 덱스트린; 킬레이팅제, 예를 들면, EDTA; 당, 예를 들면, 슈크로즈, 만니톨, 트레할로즈 또는 소르비톨; 염-형성 반대-이온, 예를 들면, 나트륨; 금속 복합체(예컨대, Zn-단백질 복합체); 및/또는 비-이온성 표면활성제, 예를 들면, TWEEN TM, PLURONICS TM 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다.
고형 약제학적으로 허용되는 비히클은 풍미제, 윤활제, 가용화제, 현탁제, 염료, 충전제, 활주제, 압착 보조제, 불활성 결합제, 감미제, 방부제, 염료, 코팅, 또는 정제-붕해제로서 작용할 수 있는 하나 이상의 물질을 포함할 수 있다. 적합한 고체 비히클은 예를 들면, 인산칼슘, 스테아르산마그네슘, 활석, 당, 락토즈, 덱스트린, 전분, 젤라틴, 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 저 융점 왁스 및 이온 교환 수지를 포함한다. 약제학적으로 허용되는 담체는 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 주사 용액 또는 현탁액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 임의의 통상의 매질 또는 제제가 활성 화합물과 비양립성인 한, 본 발명의 약제학적 조성물 속의 이의 사용이 고려된다.
본 발명에 따른 이작용성 분자는 약제학적으로 허용되는 액체 비히클, 예를 들면, 물, 유기 용매, 에탄올, 폴리올(예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜, 등) 및 이들 둘 다의 혼합물 또는 약제학적으로 허용되는 오일 또는 지방 및 이의 적합한 혼합물 속에 용해되거나 현탁될 수 있다. 액체 비히클은 다른 적합한 약제학적 첨가제, 예를 들면, 가용화제, 유화제, 완충제, 방부제, 감미제, 풍미제, 현탁화제, 습윤제, 증점제, 색상, 점도 조절제, 안정화제 또는 삼투압 조절제를 함유할 수 있다. 경구 및 장내 투여용 액체 비히클의 적합한 예는 물(부분적으로 상기와 같은 첨가제, 예컨대, 셀룰로즈 유도체, 바람직하게는 카복시메틸 셀룰로즈 용액), 알코올(예를 들면, 1가 알코올 및 다가 알코올, 예컨대, 글리콜) 및 이의 유도체, 및 오일(예컨대, 분획화된 코코넛 오일 및 땅콩 오일)을 포함한다. 비경구 투여를 위해, 비히클은 또한 오일성 에스테르, 예를 들면, 에틸 올레이트 및 이소프로필 미리스테이트일 수 있다. 적합한 액체 비히클은 장내 투여용 멸균 액체 형 조성물에서 유용하다. 가압된 조성물용 액체 비히클은 할로겐화된 탄화수소 또는 다른 약제학적으로 허용되는 추진제일 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 염을 추가로 포함할 수 있다. "약제학적으로 허용되는 염"은 모 화합물의 목적한 생물학적 활성을 보유하고 어떠한 목적하지 않은 독성 효과를 제공하지 않는 염을 지칭한다. 이러한 염의 예는 산 부가 염 및 염기 부가 염을 포함한다. 산 부가 염은 비독성 무기 산, 예를 들면, 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 인산 등 뿐만 아니라 비독성 유기 산, 예를 들면, 지방족 모노- 및 디카복실산, 페닐-치환된 알칸산, 하이드록시 알칸산, 방향족 산, 지방족 및 방향족 설폰산 등으로부터 유래된 것을 포함한다. 염기 첨가 염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토 금속, 예를 들면, 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등 뿐만 아니라 비독성 유기 아민, 예를 들면, N,N'-디벤질에틸렌디아민, N-메틸글루카민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, 프로카인 등으로부터 유래된 것을 포함한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 또한 약제학적으로 허용되는 항-산화제를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 항산화제의 예는: 수용성 항산화제, 예를 들면, 아스코르브산, 시스테인 하이드로클로라이드, 아황산수소나트륨, 메타황산나트륨, 아황산나트륨 등; 지용성 항산화제, 예를 들면, 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화된 하이드록시아니솔(BHA), 부틸화된 하이드록시톨루엔(BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 등; 및 금속 킬레이팅제, 예를 들면, 시트르산, 에틸렌디아민 테트라-아세트산(EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 인산 등을 포함한다.
전달을 용이하게 하기 위하여, 임의의 이작용성 분자 또는 이의 암호화 핵산을 차페론 제제(chaperon agent)와 접합시킬 수 있다. 차페론 제제는 천연적으로 존재하는 물질, 예를 들면, 단백질(예컨대, 인간 혈청 알부민, 저-밀도 지단백질, 또는 그롤불린), 탄수화물(예컨대, 덱스트란, 풀룰란, 키틴, 키토산, 이눌린, 사이클로덱스트린 또는 하이알루론산), 또는 지질일 수 있다. 이는 또한 재조합 또는 합성 분자, 예를 들면, 합성 중합체, 예컨대, 합성 폴리아미노산일 수 있다. 폴리아미노산의 예는 폴리라이신(PLL), 폴리 L 아스파르트산, 폴리 L-글루탐산, 스티렌-말레산 무수물 공중합체, 폴리(L-락타이드-코-글리콜리드) 공중합체, 디비닐 에테르-말레산 무수물 공중합체, N-(2-하이드록시프로필)메타크릴아미드 공중합체(HMPA), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리우레탄, 폴리(2-에틸아크릴산), N-이소프로필아크릴아미드 중합체, 및 폴리포스파진을 포함한다. 하나의 예엿, 차페론 제제는 미셀(micelle), 리포좀, 나노입자, 또는 미세구이다. 이러한 미셀, 리포좀, 나노입자, 또는 미세구를 제조하는 방법은 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 예컨대, 미국 특허 5,108,921; 5,354,844; 5,416,016; 및 5,527,5285를 참고한다.
약제학적 조성물은 전형적으로 제조 및 저장 조건 하에서 멸군성이고 안정하여야 한다. 약제학적 조성물은 액제, 미세-유제, 리포좀, 또는 고 약물 농도에 적합하고/하거나 주사에 적합한 다른 주문된 구조로 제형화될 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들면, 코팅, 예를 들면, 레시틴을 사용함으로써, 분산제의 경우에 필요한 입자 크기를 유지함에 의해 및 표면활성제를 사용함에 의해 유지될 수 있다.
일 구현예에서, 약제학적 조성물은 다양한 담체, 예를 들면, 식물성 오일, 디메틸락타미드, 디메틸포름아미드, 에틸 락테이트, 에틸 카보네이트, 이소프로필 미리스테이트, 에탄올, 및 폴리올(글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등)을 함유할 수 있는 주사가능한 조성물이다. 정맥내 주사를 위해, 수용성 항체를 점적법에 의해 투여할 수 있으며, 이에 의해 항체 및 생리학적으로 허용되는 부형제를 함유하는 약제학적 제형이 주입된다. 생리학적으로 허용되는 부형제는 예를 들면, 5% 덱스트로즈, 0.9% 염수, 링거액(Ringer's solution) 또는 다른 적합한 부형제를 포함할 수 있다. 근육내 제제, 예컨대, 항체의 적합한 가용성 염 형태의 멸균 제형을 용해시켜 약제학적 부형제, 예를 들면, 주사용수(Water-for-Injection), 0.9% 염수, 또는 5% 글루코즈 용액으로 투여될 수 있다.
멸균 주사가능한 액제는 활성 화합물을 필요한 양으로 적절한 용매 속에서 상기 열거된 성분 중 하나 또는 조합과 함께 혼입한 다음, 필요에 따라 멸균 미세여과함으로써 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산제는 활성 화합물을 염기성 분산 매질 및 상기 열거된 것으로부터의 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클내로 혼입시킴으로써 제조한다. 멸균 주사가능한 액제의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 이의 이미 멸균 여과된 용액으로부터 활성 성분 및 임의의 추가의 목적한 성분의 분말을 생성하는 진공 건조 및 냉동-건조(동결건조)이다. 주사가능한 조성물의 연장된 흡수는 조성물 속에 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들면, 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 포함시킴으로써 가져올 수 있다.
미생물의 존재의 방지는 멸균 과정에 의해, 및 다양한 항세균 및 항진균제, 예를 들면, 클로로부탄올, 페놀 소르브산 등을 혼입시킴에 의해 둘 다 보증될 수 있다. 이는 또한 등장성 제제, 예를 들면, 당, 염화나트륨 등을 조성물 내로 포함시키기에 바람직할 수 있다. 또한, 주사가능한 약제학적 형태의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들면, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 혼입시킴으로써 가져올 수 있다.
본 발명의 제형이 인간 혈액과 등장성일 수 있는, 즉, 본 발명의 제형이 인간 혈액과 필수적으로 동일한 삼투압을 가지는 것은 당해 분야의 기술자에 의해 이해될 것이다. 이러한 등장성 제형은 일반적으로 약 250 mOSm 내지 약 350 mOSm의 삼투압을 가진다. 등장성은 예를 들면, 증기압 또는 얼음-냉동형 삼투압계(ice-freezing type osmometer)로 측정할 수 있다. 제형의 강직성은 강직성 조절제의 사용으로 조절된다. "강직성 조절제"는제형의 등장성을 제공하기 위해 제형에 첨가될 수 있는 약제학적으로 허용되는 불활성 물질이다. 본 발명에 적합한 강직성 조절제는 사카라이드, 염 및 아미노산을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물은 투여시 실질적으로 즉시 또는 임의의 예정된 시간 또는 투여 후 기간에 활성 성분(예컨대, 본 발명의 이작용성 분자)을 방출하도록 제형화될 수 있다. 일부 양태에서, 약제학적 조성물은 일부 양태에서 지속 방출(time-released), 지연된 방출, 및 지효성 방출 전달 시스템을 사용함으로써 조성물의 전달이 치료될 부위의 감작화를 유발하기 전에, 및 충분한 시간으로 발생하도록 한다. 당해 분야에 공지된 수단을 사용하여 이것이 표적 조직 또는 기관에 도달할 때까지 조성물의 방출 및 흡수를 방지하거나 최소화하거나, 조성물의 지속 방출을 보증할 수 있다. 이러한 시스템은 조성물의 반복된 투여를 방지함으로써 대상체 및 주치의에 대해 편의성을 증가시킬 수 있다.
담체 물질과 조합하여 단일 투여량 형태를 생산할 수 있는 활성 성분의 양은 치료되는 대상체, 및 특수한 투여 방식에 따라 변할 것이다. 담체 물질과 조합되어 단일 투여량 형태를 생산할 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로 치료학적 효과를 생산하는 조성물의 양일 것이다.
대상체, 요법 및 투여
본 발명은 의약으로서 사용하기 위한 또는 질병의 치료시 사용하기 위한 또는 대상체에서 투여하기 위한 또는 의약으로서 사용하기 위한 본원에 개시된 바와 같은 이작용성 분자; 이를 암호화하는 핵산 또는 벡터, 숙주 세포 또는 약제학적 조성물, 핵산, 벡터 또는 숙주 세포에 관한 것이다. 이는 또한 대상체에서 질환을 치료하기 위한 의약의 제조시 본 발명의 본 발명의 약제학적 조성물, 핵산, 벡터 또는 숙주 세포 또는 항-PD1 항체 또는 항체 이의 단편 및 IL-7 또는 이의 변이체를 포함하는 이작용성 분자의 용도에 관한 것이다. 최종적으로, 이는 치료학적 유효량의, 항-PD1 항체 또는 항체 이의 단편 및 IL-7 또는 이의 변이체를 포함하는 약제학적 조성물 또는 이작용성 분자를 대상체에게 투여함을 포함하여, 대상체에서 질환 또는 장애르 ㄹ치료하는 방법에 관한 것이다. 치료의 예는 보다 특히 "방법 및 용도" 단락 하에 본원의 이후에 기술된다.
치료할 대상체는 인간, 특히 태아, 신생아, 어린이, 유아, 청소년 또는 성인, 특히 적어도 30세, 40세의 성인, 바람직하게는 적어도 50세의 성인, 여전히 보다 바람직하게는 적어도 60세의 성인, 심지어 보다 바람직하게는 적어도 70세의 성인인 인간일 수 있다.
특히, 대상체는 PD-1/PD-L1 경로를 포함할 수 있는, 특히 여기서, PD-1의 리간드(예컨대 PD-L1 및/또는 PD-L2)중 적어도 하나 또는 PD-1이 발현, 특히 과발현된 질환으로 영향받는다. 바람직하게는, 대상체는 암, 심지어 보다 바람직하게는 PD1, PD-L1 및/또는 PD-L2 양성 암 또는 PD-1 양성 암을 앓고 있다. 질환 및 암의 예는 보다 특히 이후 "방법 및 용도" 단락 하에 기술되어 있다.
특수한 구현예에서, 대상체는 이미 치료의 적어도 하나의 라인, 바람직하게는 치료의 수개 라인을 본 발명에 따른 항-PD1 항체 또는 항체 이의 단편 및 IL-7 또는 이의 변이체를 포함하는 이작용성 분자 또는 본 발명에 따른 약제학적 조성물을 투여하기 전에 제공받았다.
의약 분야의 통상의 기술자에게 공지된, 통상의 방법을 사용하여 본원에 개시된 이작용성 분자 또는 약제학적 조성물을 치료될 질환의 유형 또는 질환의 부위에 따라, 대상체에게 투여할 수 있다. 이러한 조성물은 통상의 경로를 통해 투여될 수 있는데, 예컨대, 경구적으로, 비경구적으로, 장내로, 흡입 분무에 의해, 국소적으로, 직장으로, 비강으로, 볼내로, 질내로 또는 이식된 저장기를 통해 투여할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "비경구적으로"는 피하, 피부내, 정맥내, 근육내, 동맥내, 활막내, 종양내, 흉골내, 수막내, 병변내, 및 두개내 주사 또는 주입 기술을 포함한다. 장내 투여된 경우, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 바람직하게는 경구 투여 경로로 투여된다. 이러한 조성물은 또한 국소적으로 투여될 수 있다.
약제학적 조성물의 형태, 약제학적 조성물 또는 본 발명에 따른 이작용성 분자의 투여 경로 및 투여 용량은 감염의 유형 및 중증도, 및 환자, 특히 이의 연령, 체중, 성별, 및 일반적인 육체적 상태에 따라 당해 분야의 기술자에 의해 조절될 수 있다. 본 발명의 조성물은 국소 또는 전신 치료가 요구되는 여부에 따라 다수의 방식으로 투여될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 이작용성 분자 또는 약제학적 조성물을 사용한 치료는 규칙적으로, 바람직하게는 매일, 매주 또는 매달, 보다 바람직하게는 매일과 1주, 2주, 3주 또는 4주 마다 사이에서 투여된다. 특수한 구현예에서, 치료는 1일에 수회, 바람직하게는 1일에 2 또는 3회 투여된다.
본 발명에 따른 이작용성 분자 또는 약제학적 조성물을 사용한 치료 기간은 바람직하게는 1일 내지 20주, 보다 바람직하게는 1일 내지 10주, 여전히 보다 바람직하게는 1일 내지 4주, 심지어 보다 바람직하게는 1일 내지 2주 사이를 포함한다. 대안적으로, 치료는 질환이 계속되는 한 지속될 수 있다.
본원에 개시된 이작용성 분자는 약 1 ng/kg의 체중 내지 약 30 mg/kg의 체중, 1 μg/kg 내지 약 20 mg/kg, 10 μg/kg 내지 약 10 mg/kg, 또는 100 μg/kg 내지 5 mg/kg의 유효량 범위에서, 임의로 매주, 2주, 3주 또는 4주마다, 바람직하게는, 비경구 또는 경구 투여에 의해, 특히 정맥내 또는 피하 투여에 의해 제공될 수 있다.
특히, 본 발명에 따른 이작용성 분자는 준치료 용량으로 투여될 수 있다. 본원에 사용된 것으로서 용어 "준치료 용량"은 질환을 치료하는데 일반적으로 사용된 유효한 단독치료요법 투여량 수준, 또는 현재 항-hPD1 항체를 사용한 효과적인 단독치료요법에서 통상적으로 사용되지 않는 용량 이하인 용량을 지칭한다.
방법 및 용도
질환의 치료시 용도
본 발명의 이작용성 분자, 핵산, 벡터, 숙주 세포, 조성물 및 방법은 다수의 시험관내 및 생체내 활용 및 적용을 갖는다. 예를 들면, 본원에 기술된 이작용성 분자, 핵산, 벡터, 숙주 세포 및/또는 약제학적 조성물은 치료제, 진단제 및 의학적 연구로서 사용될 수 있다. 특히, 본원에 제공된 임의의 이작용성 분자, 핵산 분자, 핵산 분자의 그룹, 벡터, 숙주 세포 또는 약제학적 조성물이 치료 방법에서 및/또는 치료학적 목적을 위해 사용될 수 있다. 특히, 본원에 제공된 이작용성 분자, 핵산, 벡터 또는 약제학적 조성물은 바람직하게는 PD-1이 관여하는 임의의 질환 또는 상태의 치료, 예를 들면, 암, 자가면역 질환, 및 면역 결핍증과 관련된 감염 또는 다른 질환, 예를 들면, T 세포 기능이상의 치료에 유용할 수 있다. 심지어 보다 바람직하게는, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 상기 정의된 바와 같은 이작용성 분자 또는 약제학적 조성물의 유효량을 투여함을 포함하여, 상기 대상체에서, 암, 감염성 질환 및 만성 바이러스 감염으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 이러한 질환의 예는 보다 특히 이후 기술된다.
특히, 본 발명에 따른 이작용성 분자는 PD-1/PD-L1/PD-L2 및 IL7 경로 둘 다를 표적화하므로, "이작용성 체크포인트 억제제"로 불린다.
본 발명은 특히 PD-1에 대한 PD-L1 및/또는 PD-L2의 결합의 억제로 방지되거나 치료될 수 있는 병리학, 질환 및/또는 장애의 치료시 사용을 위한, 이작용성 분자, 이를 암호화하는 핵산, 핵산의 그룹 또는 벡터, 또는 이를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 이작용성 분자는 CD127+ 면역 세포, 특히 CD127+ T 세포를 표적화한다. 이러한 세포는 다음의 특수한 목적의 부위에서 발견된다: 림프절에서 잔류하는 림프 세포(모낭내 임시 세포와 함께, 주로, 곁피질 내에서), 편도선내(여포 부위내), 비장(주로 백색 속질의 근동맥 림프 피복(Peri-Arteriolar Lymphoid Sheath)(PALS) 및 적색 속질내 일부 산포된 세포), 흉선(주로 수질(medulla)내; 또한 피질내), 골수(산포된 분산), GALT(위 관련된 림프 조직)내, 주로 소화관(위장, 십이지장, 공장, 회장, 결장, 직장) 전체의 여포 부위 및 고유판(lamina propria)내, 방광의 MALT(점막-관련 림프 조직) 내. 따라서, 본 발명의 이작용성 분자는 이러한 부위에 위치하거나 이와 관련된 질환, 특히 암을 치료하는데 특히 관심이 있다.
따라서, 치료가 필요한 대상체에게 유효량의 본원에 기술된 임의의 이작용성 분자 또는 약제학적 조성물을 투여함을 포함하는, 특히 PD-1 및/또는 PD-1/PD-L1 및/또는 PD-1/PD-L2 신호전달 경로와 관련된, 질환의 치료 방법이 본원에 개시되어 있다. 환자의 생리학적 데이타(예컨대, 연령, 체격, 및 체중) 및 투여 경로가 또한 치료학적 유효량이 환자에게 투여되도록 하는데 적절한 투여량을 결정하기 위해 고려되어야 한다.
다른 양태에서 본원에 개시된 이작용성 분자는 대상체에게, 예컨대, 생체내에서 투여되어 면역성을 향상시키고, 바람직하게는 장애 및/또는 질환을 치료할 수 있다. 따라서, 일 양태에서, 본 발명은 대상체에게 본 발명의 이작용성 분자, 핵산, 벡터 또는 약제학적 조성물을 투여함으로써 대상체내 면역 반응이 변형되도록 함을 포함하여, 대상체에서 면역 반응을 변형시키는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 면역 반응은 향상되거나, 증가되거나, 자극되거나 상향-조절된다. 이작용성 분자 또는 약제학적 조성물을 사용하여 치료가 필요한 대상체에서 T 세포 활성화와 같은 면역 반응을 향상시킬 수 있다. 면역 반응 향상은 PD-1에 대한 PD-L1 및/또는 PD-L2의 결합을 억제함으로써 면역억제성 환경을 감소시키고, 인간 T-세포의 증식 및/또는 활성화 및/또는 인간 PBMC에 의한 IFNγ 분비를 자극할 수 있다.
본 발명은 특히 대상체에게 치료학적 유효량의 본원에 기술된 것을 포함하는 이작용성 분자, 핵산, 벡터 또는 약제학적 조성물을 투여함으로서 대상체내 면역 반응이 향상되도록 함을 포함하여, 대상체에서 면역 반응을 향상시키는 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 이작용성 분자의 양은 PD-1 신호전달을 억제하는데(예컨대, PD-1 신호전달을 대조군과 비교하여 적어도 20%, 30%, 50%, 80%, 100%, 200%, 400%, 또는 500% 감소시키는데) 효과적이다. 다른 구현예에서, 본원에 기술된 이작용성 분자의 양은 면역반응을 활성화(예컨대, 대조군과 비교하여 적어도 20%, 30%, 50%, 80%, 100%, 200%, 400%, 또는 500% 까지)시키는데 효과적이다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 이작용성 분자의 양은 인간 PD-1에 대한 인간 PD-L1 및/또는 PD-L2의 결합을 억제하는데, 예컨대, 대조군과 비교하여 결합을 적어도 20%, 30%, 50%, 80%, 100%, 200%, 400%, 또는 500% 까지 억제하는데 효과적이다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 이작용성 분자의 양은 인간 PD-1에 대한 인간 PD-L1 및/또는 PD-L2의 길항제 활성을 갖기에, 예컨대, 대조군과 비교하여 결합을 적어도 20%, 30%, 50%, 80%, 100%, 200%, 400%, 또는 500% 까지 억제하기에 충분하다.
본 발명은 또한 대상체에서 장애 및/또는 질환의 치료에 사용하기 위한 및/또는 의약 또는 백신으로서 사용하기 위한, 본원에 기술된 이작용성 분자; 이를 암호화하는 핵산 또는 벡터, 또는 이를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 이는 또한 대상체에서 질환 및/또는 장애의 치료용 의약의 제조시 본원에 기술된 바와 같은 이작용성 분자; 이를 암호화하는 핵산 또는 벡터, 또는 이를 포함하는 약제학적 조성물의 용도에 관한 것이다. 최종적으로, 이는 대상체에게 치료학적 유효량의 약제학적 조성물 또는 이작용성 분자를 투여함을 포함하여, 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다.
질환 및/또는 장애를 지닌 환자를 치료하는 방법이 본원에 개시되어 있으며, 당해 방법은: (a) 치료가 필요한 환자를 확인하는 단계; 및 (b) 환자에게 치료학적 유효량의 본원에 기술된 임의의 이작용성 분자, 핵산, 벡터 또는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
치료가 필요한 대상체는 PD-1에 의해 매개된 신호전달 경로와 관련된 질환을 가지거나, 가질 위험이 있거나, 가진 것으로 예측된 인간일 수 있다. 이러한 환자는 통상의 의학적 실험으로 확인할 수 있다. 예를 들면, 치료에 적합한 대상체는 이러한 대상체가 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2 양성 세포를 수반하는지의 여부를 실험함으로써 확인할 수 있다. 바람직하게는, "PD-L1 양성 종양 세포" 또는 "PD-L2 양성 종양 세포"는 PD-L1 또는 PD-L2 각각이 종양 세포의 적어도 10%에서, 바람직하게는 종양 세포의 적어도 20, 30, 40 또는 50%에서 발현된 종양 세포의 집단을 지칭한다.
일 구현예에서, 치료가 필요한 대상체는 바람직하게는 PD-1, PDL1 및/또는 PDL2 양성 질환, 심지어 보다 바람직하게는 PD-1 및/또는 PD-1의 적어도 하나의 리간드가 과발현된 질환을 가지거나, 가진 것으로 예측되거나, 가질 위험이 있는 환자이다. 이러한 대상체에서, PD-1/PD-L1 및/또는 PD-1/PD-L2 상호작용의 파괴는 본 발명에 따른 이작용성 분자 또는 약제학적 조성물의 투여가 대상체의 면역 반응을 향상시킬 수 있는 덕분이다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 임의의 인간화된 항-PD-1 항체 또는 약제학적 조성물은 PD-1 양성 세포를 치료하는데 사용될 수 있다.
- 암
항체에 의한 PD-1의 차단은 환자에서 암성 세포에 대한 면역 반응을 향상시킬 수 있는 것으로 당해 분야에 알려져 있다. 따라서, 일 양태에서, 본 발명은 개체에게 유효량의 이작용성 분자 또는 약제학적 조성물을 투여함으로써, 바람직하게는 PD1/PD-L1 및/또는 PD-1/PD-L2 상호작용을 파괴하거나 억제하고/하거나 IL7 수용체를 활성화시킴을 포함하여, 암을 가진 대상체의 치료시 사용하기 위한, 이작용성 분자 또는 약제학적 조성물을 제공한다.
일 구현예에서, 치료가 필요한 대상체는 질환, 바람직하게는 PD-1 양성 암, 심지어 보다 바람직하게는 PD-1이 발현되거나 과발현되는 암을 가지거나, 가진 것으로 예측되거나, 가질 위험이 있는 대상체이다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 임의의 항-PD-1 항체 또는 약제학적 조성물은 PD-1 양성 종양 세포를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 치료에 적합한 환자는 이러한 환자가 PD-1 양성 종양 세포를 수반하는지의 여부를 실험함으로써 확인할 수 있다.
다른 구현예에서, 대상체는 암 발달, 바람직하게는 PD-L1 및/또는 PD-L2 양성 암을 가지거나, 가진 것으로 예측되거나, 가질 위험이 있는 환자이다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 임의의 이작용성 분자 또는 약제학적 조성물은 PD-L1 및/또는 PD-L2 양성 종양을 치료하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 치료에 적합한 인간 환자는 이러한 환자가 PD-L1 및/또는 PD-L2 양성 암 세포를 수반하는지의 여부를 실험함으로써 확인할 수 있다.
추가의 양태에서, 암, 바람직하게는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2 양성 암, 심지어 보다 바람직하게는 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2이 과발현된 암을 치료하는데 사용하기 위한 이작용성 분자 또는 약제학적 조성물이 제공된다.
다른 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 암의 치료용, 예를 들면, 종양 세포, 바람직하게는 바람직하게는 PD-1, PD-L1, PD-L2 양성 종양 세포의 성장 억제용 의약의 제조시 본원에 개시된 바와 같은 이작용성 분자 또는 약제학적 조성물의 용도를 제공한다.
본 개시내용의 양태에서, 치료될 암은 고갈된 T 세포와 관련된다.
따라서, 일 구현예에서, 본 발명은 대상체에게 치료학적 유효량의 본 발명에 따른 이작용성 분자 또는 약제학적 조성물을 투여함을 포함하여, 대상체에서, 암을 치료하기 위한, 예를 들면, 종양 세포의 성장을 억제하기 위한 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 이작용성 분자를 사용하여 암 세포가 억제되도록 하는 대상체의 치료에 관한 것이다.
본원에 제공된 이작용성 분자에 의해 치료될 수 있는 임의의 적합한 암은 조혈성 암 또는 고형 암일 수 있다. 이러한 암은 암종, 자궁경부 암, 결장직장 암,식도 암, 위암, 위장 암, 두경부 암, 신장 암, 간 암, 폐 암, 림프종, 아교종, 중피종, 흑색종, 위장 암, 요도 암, 환경적으로 유발된 암 및 상기 암의 임의의 조합을 포함한다. 본 발명은 또한 전이성 암, 특히 PD-L1을 발현하는 전이성 암의 치료에 유용하다(Iwai et al. (2005) Int. Immunol. 17: 133-144). 추가로, 본 발명은 난치성 또는 재발성 악성종양을 포함한다.
바람직하게는, 치료되거나 방지될 암은 전이성이거나 전이성이 아닌, 흑색종, 악성 중피종, 비-소 세포 폐 암, 신장 세포 암종, 호지킨 림프종, 두경부 암, 요로 상피 암종, 결장직장 암, 간세포 암종, 소 세포 폐 암, 전이성 메르켈 세포 암종, 위 또는 위식도 암 및 자궁경부 암으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
특수한 양태에서, 암은 PD-1 및/또는 PD-L1의 높은 발현을 지닌 조혈 악성종양 또는 고형 종양이다. 이러한 암은 혈액림프구 신생물, 혈관면역모구 T 세포 림프종, 골수이형성 증후군, 및 급성 골수성 백혈병으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 특수한 양태에서, 암은 바이러스에 의해 유도되거나 면역결핍증과 관련된 암이다. 이러한 암은 카포시 육종(예컨대, 카포시 육종 헤르페스 바이러스와 관련됨); 자궁경부, 항문, 음경 및 외음부 편평 세포 암 및 구강인두 암(예컨대, 인간 파필로마 바이러스와 관련됨); B 세포 비-호지킨 림프종(NHL), 예를 들면, 광범위 큰 B-세포 림프종, 버킷 림프종, 형질모세포 림프종, 원발성 중추신경계 림프종, HHV-8 원발성 흉막삼출성 림프종, 전통적인 호지킨 림프종, 및 림프증식성 장애(예컨대, 엡슈타인-바르 바이러스(EBV) 및/또는 카포시 육종 헤르페스 바이러스와 관련됨); 간세포 암종(예컨대, B형 및/또는 C형 바이러스와 관련됨); 메르켈 세포 암종(예컨대, 메르켈 세포 폴리오마 바이러스(MPV)와 관련됨); 및 인간 면역결핍증 바이러스 감염(HIV) 감염과 관련된 암으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
치료를 위한 바람직한 암은 면역치료요법에 대해 전형적으로 반응성인 암을 포함한다. 대안적으로, 치료용의 바람직한 암은 면역치료요법에 대해 비-반응성인 암이다.
바람직하게는, 본원에 개시된 이작용성 분자, 핵산, 벡터, 숙주 세포 또는 조성물은 불량한 예후를 지닌 암을 앓고 있는 대상체의 치료에 사용하기 위함이다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "불량한 예후"는 감소된 대상체 생존 및/또는 조기 암 진행 및/또는 즌가된 또는 조기 암 재발 및/또는 증가된 전이 위험성 또는 발생을 지칭한다. 특히, 불량한 예후는 Treg 세포의 집단이 종양내에 존재하고 여기서 Treg/Teff 비가 종양 내에서 높은 암과 관련된다(Chraa et al., 2018 J Leukoc Biol. 2018;1-13.)
예로써 및 이론에 얽매이지 않고, 항-암 항체 또는 항-암 면역접합체 또는 암 세포 사멸을 초래하는 다른 항-암 치료요법을 사용한 치료는 PD-1에 의해 매개된 면역 반응을 강화시킬 수 있다. 따라서, 고 증식성 질환(예컨대, 암 종양)의 치료는 항-암 치료와 동시에 또는 순차적으로 또는 이의 임의의 조합으로 조합된 이작용성 분자를 포함할 수 있으며, 이는 숙주에 의한 항-종양 면역 반응을 강화시킬 수 있다. 바람직하게는, 이작용성 분자는 다른 면역원성 제제, 표준 암 치료, 또는 다른 항체와 함께 사용될 수 있다.
- 감염성 질환
본 발명의 이작용성 분자, 핵산, 핵산의 그룹, 벡터, 숙주 세포 또는 약제학적 조성물을 사용하여 특수한 독(toxin) 또는 병원체에 노출된 환자를 치료한다. 따라서, 본 발명의 양태는 본 발명에 따른 이작용성 분자, 또는 이를 포함하는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여함으로써, 바람직하게는 대상체가 감염성 질환에 대해 치료되도록 함을 포함하여 대상체에서 감염성 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
임의의 적합한 감염은 본원에 제공된 본 발명에 따른 이작용성 분자, 핵산, 핵산의 그룹, 벡터, 숙주 세포 또는 약제학적 조성물에 의해 치료될 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 치료될 수 있는 감염을 유발하는 병원성 바이러스의 일부 예는 HIV, 간염(A, B, 또는 C), 헤르페스 바이러스(예컨대, VZV, HSV-1, HAV-6, HSV-II, 및 CMV, 엡슈타인 바르 바이러스), 아데노바이러스, 인플루엔자 바이러스, 플라비바이러스, 에코바이러스, 리노바이러스, 콕사키에 바이러스, 코로나바이러스, 호흡기 합포체 바이러스(respiratory syncytial virus), 볼거리 바이러스, 로타바이러스, 홍역 바이러스, 루벨라 바이러스, 파르보바이러스, 박시니아 바이러스, HTLV 바이러스, 뎅기열 바이러스, 파필로마바이럿, 몰루스쿰 바이러스(molluscum virus), 폴리오바이러스, 라비에스 바이러스, JC 바이러스 및 아르보바이러스성 뇌염 바이러스(arboviral encephalitis virus)을 포함한다.
특히, 본 발명의 이작용성 분자 또는 약제학적 조성물을 사용하여 만성 바이러스 감염, 예를 들면, 레트로바이러스(Retroviruse), 아넬로바이러스(Anellovirus), 시르코바이러스(Circovirus), 헤르페스바이러스(Herpesvirus), 바리셀라 조스터 바이러스(Varicella zoster virus)(VZV), 사이토메갈로바이러스(Cytomegalovirus)(CMV), 엡슈타인-바르 바이러스(Epstein-Barr virus)(EBV), 폴리오마바이러스(Polyomavirus) BK, 폴리오마바이러스, 아데노-관련 바이러스(Adeno-associated virus)(AAV), 헤르페스 단성 제1형(Herpes simplex type 1)(HSV-1), 아데노바이러스(Adenovirus), 헤르페스 단성 제2형(Herpes simplex type 2)(HSV-2), 카포시 육종 헤프레스바이러스(Kaposi's sarcoma herpesvirus)(KSHV), B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus)(HBV), GB 바이러스 C, 파필로마 바이러스(Papilloma virus), C형 간염 바이러스(Hepatitis C virus)(HCV), 인간 면역결핍증 바이러스(Human immunodeficiency virus)(HIV), D형 간염 바이러스(Hepatitis D virus)(HDV), 인간 T 세포 림프종 바이러스 제1형(Human T cell leukemia virus type 1)(HTLV1), 친이종 쥐 백혈병 바이러스-고나련 바이러스(Xenotropic murine leukemia virus-related virus)(XMLV), 루벨라 바이러스(Rubella virus), 독일 홍역(German measles), 파르보바이러스(Parvovirus) B19, 홍역 바이러스(Measles virus), 콕사키에 바이러스(Coxsackie virus)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 바이러스에 의해 유발된다.
본 발명의 방법에 의해 치료될 수 있는 감염을 유발하는 병원성 세균의 일부 예는 클라미디아(chlamydia), 리켓챠 세균(rickettsial bacteria), 마이코박테리아(mycobacteria), 스타필로콕키(staphylococci), 스트렙토콕키(streptococci), 뉴모노콕키(pneumonococci), 메닝고콕키(meningococci) 및 코노콕키(conococci), 클렙시엘라(klebsiella), 프로테우스(proteus), 세라티아(serratia), 슈도모나스(pseudomonas), 레지오넬라(legionella), 디프테리아(diphtheria), 살모넬라(salmonella), 바실리(bacilli), 콜레라(cholera), 파상풍(tetanus), 보툴리눔 식중독(botulism), 탄저병(anthrax), 플라그(plague), 렙토스피라병(leptospirosis), 및 라임병 세균(Lymes disease bacteria)을 포함한다.
본 발명의 방법에 의해 치료될 수 있는 감염을 유발하는 병원성 진균의 일부 예는 칸디다(Candida)(알비칸스(albicans), 크루세이(krusei), 글라브라타(glabrata), 트로피칼리스(tropicalis) 등), 크립토코쿠스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 아스퍼길러스(Aspergillus)(푸미가투스(fumigatus), 나이거(niger) 등), 털곰팡이 속(Genus Mucorales)(무코르(mucor), 압시디아(absidia), 리조푸스(rhizophus)), 스포로트릭스 스켄키이(Sporothrix schenkii), 블라스토마이세스 데르마티티디스(Blastomyces dermatitidis), 라라콕시디오이데스 브라실리엔시스(Paracoccidioides brasiliensis), 콕시디오이데스 이미티스(Coccidioides immitis) 및 히스토플라스마 캅술라툼(Histoplasma capsulatum)을 포함한다.
본 발명의 방법에 의해 치료될 수 있는 감염을 유발하는 병원성 기생충의 일부 예는 엔타모에바 히스톨리티카(Entamoeba histolytica), 발란티디움 콜리(Balantidium coli), 아에글레리아포울레리(Naegleriafowleri), 아칸타모에바 종(Acanthamoeba sp.), 기아르디아 람비아(Giardia lambia), 크립토포리디움 종(Cryptosporidium sp.), 뉴모시스티스 카리니이(Pneumocystis carinii), 플라스모디움 비박스(Plasmodium vivax), 바베시아 미크로티(Babesia microti), 트리파노소마 브루세이(Trypanosoma brucei), 트리파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi), 레이슈마이나 도노바니(Leishmania donovani), 톡소플라스마 곤디(Toxoplasma gondi), 및 니포스트롱길루스 브라실리엔시스(Nippostrongylus brasiliensis)를 포함한다.
상기 방법 모두에서, 이작용성 분자는 면역치료요법의 다른 형태, 예를 들면, 사이토킨 치료(예컨대, 인터페론, GM-CSF, G-CSF, IL-2), 또는 종양 항원의 향상된 제시를 제공하는 임의의 치료요법과 조합될 수 있다.
조합 치료요법
특히, 본 발명의 이작용성 분자는 임상 개발시 또는 이미 시장에서 제제를 사용하여 면역 회피 메카니즘(immune evasion mechanism)을 극복하기 위한 일부 다른 잠재적인 전략과 조합될 수 있다(참고: 문헌: Antonia et al. Immuno-oncology combinations: a review of clinical experience and future prospects. Clin. Cancer Res. Off. J. Am. Assoc. Cancer Res. 20, 6258-6268, 2014로부터의 표 1). 본 발명에 따른 이작용성 분자와의 이러한 조합은 특히 다음을 위해 유용할 수 있다:
1- 적응 면역성의 억제(T-세포 체크포인트 경로의 차단)의 억제;
2- 적응 면역성에서의 스위칭(Switching)(효능제 분자, 특히 항체를 사용한 T-세포 공자극성 수용체 신호전달의 촉진),
3- 선천성 면역 세포의 기능의 증진;
4- 예를 들면, 백신-기반 전략을 통한 면역계의 활성화(면역-세포 효과기 기능의 강화).
따라서, 본원에 기술된 바와 같은 PD-1 신호전달과 관련된 임의의 질환에 대해 본원에 기술된 바와 같은 임의의 이작용성 분자 또는 이를 포함하는 약제학적 조성물 및 적합한 제2 제제와의 조합 치료요법이 본원에 또한 제공된다. 일 양태에서, 이작용성 분자 및 제2 제제는 상술한 바와 같은 약제학적 조성물 속에 존재할 수 있다. 대안적으로, 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "조합 치료요법" 또는 "조합된 치료요법"은 이러한 2개의 제제(예컨대, 본원에 기술된 바와 같은 이작용성 분자 및 추가의 또는 제2의 적합한 치료제)의 순차적인 방식으로의 투여(즉, 여기서 각각의 치료제는 상이한 시간으로 투여된다) 뿐만 아니라, 이러한 치료제, 또는 적어도 2개의 제제의 실질적으로 동시 방식으로의 투여를 포함한다. 각각의 제제의 순차적인 또는 실질적으로 동시 투여는 임의의 적절한 경로에 의해 실행될 수 있다. 제제는 동일한 경로 또는 상이한 경로에 의해 투여될 수 있다. 예를 들면, 제1의 제제(예컨대, 이작용성 분자)는 경구적으로 투여될 수 있고, 추가의 치료제(예컨대, 항-암제, 항-감염제; 또는 면역 조절인자)가 정맥내로 투여될 수 있다. 대안적으로, 선택된 조합 제제는 정맥내 주사로 투여될 수 있지만 조합의 다른 제제는 경구 투여될 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 치료학적 수단, 특히 조합 생성물 수단에 관한 것이며, 이는 활성 성분으로서: 상기 정의된 바와 같은 이작용성 분자 및 추가의 치료제를 포함하고, 여기서 상기 활성 성분은 별도의, 순차적인 또는 조합 치료요법용으로, 특히 조합된 또는 순차적인 용도용으로 제형화된다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "순차적"은 달리 규정하지 않는 한, 일정한 배열 또는 순서에 의해 특징되됨을 의미하는데, 예컨대, 투여량 요법이 이작용성 분자 및 제2의 제제의 투여를 포함하는 경우, 순차적인 투여량 요법은 제2 제제의 투여 전, 동시, 실질적으로 동시, 또는 투여 후에 본 발명의 이작용성 분자의 투여를 포함할 수 있지만, 제제 둘 다는 일정한 배열 또는 순서로 투여될 것이다. 용어 "별도의"는 달리 규정하지 않는 한, 하나를 다른 것으로부터 이격하여 유지시킴을 의미한다. 용어 "동시에"는 달리 규정하지 않는 한, 동일한 시간에 일어나거나 수행됨을, 즉, 본 발명의 제제가 동일한 시간에 투여됨을 의미한다. 용어 "실질적으로 동시에"는 제제가 서로 수분 내에(예컨대, 서로 15분 내에) 투여됨을 의미하고 결합 투여 뿐만 아니라 연속 투여를 포함하는 것으로 의도되지만, 투여가 연속적인 경우 이는 단지 짧은 기간(예컨대, 이것이 의학 숙련의가 2개의 화합물을 별도로 투여하는데 걸릴 수 있는 시간) 동안의 시간으로 분리된다.
본원에 기술된 임의의 조합을 본원에 기술된 장애 또는 질환을 치료하기 위한 임의의 배열로 사용할 수 있음을 인식해야 한다. 본원에 기술된 조합은 다수의 요인을 기반으로 선택될 수 있으며, 이는 표적 질환 진행의 억제 또는 방지 효능, 조합의 다른 제제의 부작용을 완화시키기 위한 효능, 또는 표적 질환과 관련된 증상을 완화시키는 효능을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예를 들면, 본원에 기술된 조합된 치료요법은 조합의 각각의 개개 구성원과 조합된 임의의 부작용을 감소시킬 수 있다.
본 발명은 또한 상기 대상체에게 치료학적 유효량의 본원에 기술된 이작용성 분자 또는 약제학적 조성물 및 치료학적 유효량의 추가의 또는 제2의 치료제를 투여함을 포함하여, 대상체에서 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.
본원에 기술된 이작용성 분자 또는 약제학적 조성물이 추가의 치료제와 동시-사용된 경우, 이작용성 분자, 약제학적 조성물 또는 제2의 제제의 준-치료학적 투여량, 또는 이들 둘 다의 준-치료학적 투여량이 대상체, 바람직하게는 PD-1에 의해 매개된 세포 신호전달과 관련된 질환 또는 장애를 가지거나, 발달할 위험이 있는 대상체의 치료에 사용될 수 있다.
추가의 또는 제2의 치료제의 구체적인 예는 WO 2018/053106, 36 내지 43면에 제공된다.
일 양태에서, 추가의 또는 제2의 치료제는 알킬화제, 혈관형성 억제제, 항체, 항대사제, 항유사분열제, 항증식제, 항바이러스제, 아우로라 키나제 억제제, 세포자멸사 증진제(예를 들면, Bcl-2 계열 억제제), 사열 수용체 경로의 활성화제, Bcr-Abl 키나제 억제제, BiTE(이-특이적 T 세포 인게이저) 항체, 항체 약물 접합체, 생물학적 반응 개질제, 브루톤 타이로신 키나제(Bruton's tyrosine kinase)(BTK) 억제제, 사이클린-의존성 키나제 억제제, 세포 주기 억제제, 사이클로옥시게나제-2 억제제, DVD, 백혈병 바이러스 종양유전자 동족체(ErbB2) 수용체 억제제, 성장 인자 억제제, 열 소크 단백질(HSP)-90 억제제, 히스톤 데아세틸아제(HDAC) 억제제, 호르몬 치료요법, 면역제(immunological), 세포자멸사 단백질의 억제제(IAP)의 억제제, 인터컬레이팅 항생제, 키나제 억제제, 키네신 억제제, Jak2 억제제, 라파마이신 억제제의 포유동물 표적, 마이크로RNA, 유사분열물질-활성화된 세포외 신호-조절된 키나제 억제제, 다가 결합 단백질, 비-스테로이드상 소염 약물(NSAID), 폴리 ADP(아데노신 디포스페이트)-리보스 폴리머라제(PARP) 억제제, 백금 화학치료요법, 폴로-유사 키나제 (Plk) 억제제, 포스포이노시티드-3 키나제(PI3K) 억제제, 프로테오좀 억제제, 퓨린 유사체, 피리미딘 유사체, 수용체 타이로신 키나제 억제제, 레티노이드/델토이드 식물 알칼로이드, 작은 억제성 리보핵산(siRNA), 토포이소머라제 억제제, 유비퀴틴 리가제 억제제, 하이포메틸화제, 체크포인트 억제제, 펩타이드 백신 등, 종양 항원으로부터의 에피토프 또는 네오에피토프 뿐만 아니라, 이러한 제제의 하나 이상의 조합을 포함하는 대략적인 목록에서 선택될 수 있다.
예를 들면, 추가의 치료제는 화학치료요법, 방사선치료요법, 표적화된 치료요법, 혈관형성억제제, 저메틸화 작용제(hypomethylating agent), 암 백신, 종양 항원으로부터의 에피토프 또는 네오에피토프, 골수 체크포인트 억제제, 다른 면역치료제, 및 HDAC 억제제로 이루어진 그룹에서 선택된다.
바람직한 구현예에서, 제2의 치료제는 화학치료제, 방사선치료제, 면역치료제, 세포 치료요법제(예를 들면, CAR-T 세포), 항생제 및 프로바이오틱스(probiotics)로 이루어진 그룹에서 선택될 수 있다. 상기 면역치료제는 또한 종양 항원을 표적화하는 항체일 수 있고, 특히 항-Her2, 항-EGFR, 항-CD20, 항-CD19, 항-CD52로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명은 상기 정의한 바와 같은 조합 치료요법에 관한 것이며, 여기서 제2의 치료제는 특히 적응성 면역 세포(T 및 B 림프구)의 치료학적 백신, 면역 체크포인트 차단제 또는 활성화제, 및 항체-약물 접합체로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 임의의 본 발명에 따른 항-hPD-1 항체 또는 이의 단편 또는 약제학적 조성물과 함께 동시-사용하기에 적합한 제제는 공-자극성 수용체(예컨대, OX40, CD40, ICOS, CD27, HVEM 또는 GITR)에 결합하는 항체, 면역원성 세포 사멸을 유도하는 제제(예컨대, 화학치료제, 방사선-치료제, 항-혈관형성제, 또는 표적화된 치료요법용 제제), 체크포인트 분자를 억제하는 제제(예컨대, CTLA4, LAG3, TIM3, B7H3, B7H4, BTLA, 또는 TIGIT), 암 백신, 면역억제성 효소를 변형시키는 제제(예컨대, IDO1 또는 iNOS), Treg 세포를 표적화하는 제제, 입양 세포 치료요법용 제제, 또는 골수 세포를 조절하는 제제를 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 조합된 치료요법에 관한 것이며, 여기서 제2의 치료제는 항-CTLA4, 항-CD2, 항-CD28, 항-CD40, 항-HVEM, 항-BTLA, 항-CD160, 항-TIGIT, 항-TIM-1/3, 항-LAG-3, 항-2B4, 및 항-OX40, 항-CD40 작용제, CD40-L, TLR 작용제, 항-ICOS, ICOS-L 및 B-세포 수용체 작용제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 면역 체크포인트 차단제 또는 적응성 면역 세포(T 또는 B 림프구)의 활성화제이다.
일 구현예에서, 제2의 치료제는 특히 항-Her2, 항-EGFR, 항-CD20, 항-CD19, 항-CD52로 이루어진 그룹으로부터 선택된 종양 항원을 표적화하는 항체이다.
조합 치료요법은 또한 이작용성 분자의 투여와 수술, 화학치료요법(예컨대, 도세탁셀 또는 데카르바진과 같은), 방사선치료요법, 면역치료요법(예컨대 CD40, CTLA-4를 표적화하는 항체와 같은), 유전자 표적화 및 조절, 및/또는 다른 제제, 예를 들면, 면역-조절인자, 혈관형성 억제제 및 임의의 이의 조합의 조합에 의존할 수 있다.
키트
본원에 기술된 임의의 이작용성 분자 또는 조성물은 본 발명에 의해 제공된 키트 내에 포함될 수 있다. 본 개시내용은 특히 면역 반응을 향상시키고/시키거나 PD-1 신호전달 또는 IL-7 신호전달과 관련된 질환(예컨대, 암 및/또는 감염)을 치료하는데 사용하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명의 맥락에서 용어 "키트"는 2개 이상의 구성성분(이중 하나는 본 발명의 이작용성 분자, 핵산 분자, 벡터 또는 세포에 상응한다)이 용기, 수용기 또는 기타 내에 패키지되어 있음을 의미한다. 따라서, 키트는 특정 목표를 달성하기에 충분한 생성물 및/또는 기수의 세트로서 기술될 수 있으며, 이는 단일 단위로 시판될 수 있다.
특히, 본 발명에 따른 키트는 다음을 포함할 수 있다:
- 상기 정의된 바와 같은 이작용성 분자,
- IL-7 또는 이의 변이체에 연결된 항-hPD1 항체 또는 이의 항원-결합 단편,
- 상기 이작용성 분자를 암호화하는 핵산 분자 또는 핵산 분자의 그룹,
- 상기 핵산 분자 또는 핵산 분자의 그룹을 포함하는 벡터, 및/또는
- 상기 벡터 또는 핵산 분자 또는 핵산 분자의 그룹을 포함하는 세포.
따라서, 키트는 적합한 용기 수단 속에, 본 발명의 약제학적 조성물, 및/또는 이작용성 분자, 및/또는 숙주 세포, 및/또는 본 발명의 핵산 분자를 암호화하는 벡터, 및/또는 핵산 분자 또는 본 발명의 관련 시약을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 개체로부터 샘플을 취하고/취하거나 샘플을 검정하는 수단이 제공될 수 잇다. 특정의 구현예에서, 키트는 세포, 완충제, 세포 배지, 벡터, 프라이머, 제한 효소, 염 등을 포함한다. 키트는 또한 멸균의, 약제학적으로 허용되는 완충제 및/또는 다른 희석제를 함유하기 위한 수단을 포함할 수 있다.
용기는 단위 용량, 큰 패키지(bulk package)(예컨대, 다중-용량 패키지) 또는 서브-단위 용량일 수 있다. 구현예에서, 본 발명은 단일-용량 투여 단위용으로 상기 정의된 바와 같은 키트에 관한 것이다. 본 발명의 키트는 건조된/동결건조된 이작용성 분자를 포함하는 제1의 수용체 및 수성 제형을 포함하는 제2의 수용체를 함유할 수 있다. 본 발명의 특정의 구현예에서, 단일-챔버된 및 다중-챔버된 예비-충전 주사기(예컨대, 액체 주사기 및 동결주사기(lyosyringe))를 함유하는 키트가 제공된다.
본 발명의 키트는 적합한 패키징으로 존재할 수 있다. 적합한 패키징은 바이알, 병, 항아리(jar), 유연성 패키지(예컨대, 밀봉된 마일러(Mylar) 또는 플라스틱 백) 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 또한 특수한 장치, 예를 들면, 흡입기, 비강 투여 장치(예컨대, 분무기) 또는 주입 장치, 예를 들면, 미니펌프과 함께 사용하기 위한 패키지이다. 키트는 멸균 수용 포트를 가질 수 있다(예를 들면, 용기는 정맥내 용액 백 또는 피하 주사 침에 의해 침투가능한 스토퍼(stopper)를 갖는 바이알일 수 있다). 조성물 속의 적어도 하나의 활성제는 IL-7 또는 이의 변이체, 또는 IL-7m에 연결된 항-hPD1 항체를 포함하는 본원에 기술된 바와 같은 이작용성 분자이다.
본 발명에 따른 키트내에 포함된 조성물은 주사기 혼용성 조성물로 제형화될 수 있다. 이러한 경우에, 용기는 자체적으로 주사기, 피펫, 및/또는 다른 이러한 유사 장치일 수 있으며, 이로부터 제형이 신체의 감염된 부위에 적용될 수 있고/있거나 심지어 키트의 다른 성분에 적용되고/되거나 이와 혼합될 수 있다. 키트의 구성성분은 대안적으로 건조된 분말(들)로서 제공될 수 있다. 시약 및/또는 구성성분이 무수 분말로 제공된 경우, 가용성 조성물이 적합한 용매의 첨가에 의해 재구성될 수 있다. 용매가 또한 다른 용기 수단으로 제공될 수 있고 투여에 적합할 수 있음이 고려된다.
일부 구현예에서, 키트는 또한 암 또는 감염성 질환 치료용 첨가제를 포함하며, 첨가제는 본 발명의 이작용성 분자, 또는 키트의 다른 구성성분과 조합될 수 있거나 키트내에 별도로 제공될 수 있다. 특히, 본원에 기술된 키트는 하나 이상의 추가의 치료제, 예를 들면, 본원의 상기에 기술된 "조합된 치료요법"에 기술된 것을 포함할 수 있다. 키트(들)는 개체에 대해 특수한 암에 대해 조율될 수 있고 본원의 상기에 기술된 바와 같은 개체용의 각각의 제2의 암 치료요법을 포함한다.
본원에 기술된 이작용성 분자 또는 약제학적 조성물의 사용과 관련된 설명서는 일반적으로 투여량, 투여 스케쥴, 의도된 치료를 위한 투여 경로, 이작용성 분자를 재구성하기 위한 수단 및/또는 본 발명의 이작용성 분자를 희석하기 위한 수단에 대한 정보를 포함한다. 본 발명의 키트내에 공급된 설명서는 전형적으로 표지 또는 패키지 삽입물(예컨대, 키트내에 전단 또는 설명서 매뉴얼의 형태로 포함된 종이 시이트) 상에 서면 설명서이다. 일부 구현예에서, 키트는 본원에 기술된 임의의 방법에 따라 사용하기 위한 설명서를 포함할 수 있다. 포함된 설명서는 본원에 기술된 바와 같이 면역 반응을 향상시키고/시키거나 질환을 치료하기 위한 이작용성 분자를 포함하는 약제학적 조성물의 투여 설명을 포함할 수 있다. 키트는 또한 개체가 PD-1 신호전달과 관련된 질환, 예컨대, 본원에 기술된 것을 가지고 있는지의 여부를 확인하는 것을 기반으로 치료에 적합한 개체를 선택하는 설명을 포함할 수 있다.
실시예
다음의 도 및 실시예는 완전한 개시내용 및 본 발명의 제조 및 사용 방법의 설명을 당해 분야의 통상의 기술자에게 제공하기 위해 나타내며, 발명자가 이들의 발현으로서 고려하거나 이들이 하기 실험이 수행된 모든 또는 유일한 실험들임을 나타냄을 의도하는 것의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 본 발명이 이의 구체적인 구현예를 참고로 기술되었지만, 당해 분야의 기술자는 본 발명의 취지 및 영역을 벗어나지 않고 다양한 변화가 이루어지고 등가물이 치환될 수 있음을 이해할 수 있다. 또한, 많은 변형이 본 발명의 특수한 상황, 물질, 물질의 조성, 공정, 공정 단계 또는 단계들, 목적, 취지 및 영역을 채택하기 위해 이루어질 수 있다. 모든 이러한 변형은 여기에 첨부된 청구범위의 영역내에 있는 것으로 의도된다.
실시예 1: IL7R 및 PD1에 대한 비키 항-hPD1-IL7 분자의 결합 :
재조합 IL-7 사이토킨(rIL7)(Biorad PHP046), Fc 도메인(IL7-Fc, CHI-HF-22007 Adipogen)에 융합된 IL-7, 및 CD127 (A) 또는 CD132 (B)에 대한 이의 중쇄(항-PD1VH-IL7, 키메라 형태) 또는 경쇄(항-PD1VL-IL7, 키메라 형태) 상에서 IL-7에 융합된 비키 항-PD1 항체의 Biacore에 의한 친화성 평가. CD127(Sinobiological, 10975-H03H-50)을 CM5 바이오칩(biochip) 상에 20 μg/ml의 농도에서 고정시키고 나타낸 단백질을 일련의 농도(0.34; 1.03; 3.11; 9.3; 28 nM)에서 가하였다. IL7-Fc 및 항-PD1-IL7가 이량체 형태이므로, 친화성을 2 상 반응 모델 및 2가 모델을 사용하여 분석하였다. CD132에 대한 IL-7의 친화성을 평가하기 위하여, 복합체 CD127/IL-7을 바이오칩 상에서 수행한 다음 CD132 수용체(Sinobiological 10555-H08B)를 상이한 농도 125, 250, 500, 1000 및 2000nM에서 가하였다.
블리츠 방법(Blitz method)을 블리츠(Blitz)(Forte Bio; USA; 참고 C22-2 번호 61010-1)를 사용하여 수행하였다. 재조합 hPD1-His(Sino Biologicals, 중국 베이징; 참고번호 10377-H08H)를 10 μg/ml에서 히스티딘 테일을 사용하여 Ni-NTA 바이오센서(Forte Bio; USA; 참고 번호 18-0029) 내로 30초 동안 고정시켰다. 이후에, 항-PD1 항체를 20 μg/mL에서 120초 동안 관련시켰다. 항-PD1 항체의 해리를 동력학 완충제(kinetics buffer) 속에서 120초 동안 이루었다. 분석 데이타를 Blitz pro 1.2 소프트웨어를 사용하여 제작하였으며, 이는 연합 상수(ka) 및 해리 상수(kd)를 계산하고 친화성 상수 KD(ka/kd)를 측정하였다.
[표 1]
Figure pct00009
[표 2]
Figure pct00010
결과
본 발명자는 Fc 부위의 N-말단 부분에 대한 IL-7의 융합(IL7-Fc)이 CD127 수용체에 대한 친화성을 감소시키지만(표 1), 예측치못하게, 중쇄의 중쇄의 Fc 영역의 C-말단 및 경쇄의 불변 도메인에 대한 IL-7의 융합이 CD127에 대한 이의 높은 친화성을 rIL-7보다 유사한 연장까지 보존함을 관찰하였다. 이러한 데이타는, 항-PD1 항체(중쇄 또는 경쇄 상에서)에 대한 IL-7의 C-말단 융합이 통상의 IL7-Fc 화합물과 비교한 것으로서 IL-7R 활성화 경로의 측면에서 및 치료학적 용도를 위한 IL7 재조합 사이토킨과 비교한 것으로서 환자 신체내로의 제거 반감기의 측면에서 보다 강력할 것임을 입증한다.
표 2 및 도 1a 및 1b는 비키 항-PD1-IL7 분자(키메라 또는 인간화된)가 인간 재조합 PD-1 단백질에 결합함을 입증한다. 항-PD-1 항체의 인간화된 형태는 PD-1 재조합 단백질에 대한 키메라 항체 보다 유사한 효능으로 결합한다. 그러나, 도 1a의 A 부분은 항-PD1 항체 단독과 비교하여 비키의 결합 효능의 감소를 나타낸다. 본 발명자는 다른 항 PD-1 항체 골격(펨브롤리주맙 또는 니볼루맙)을 지닌 비키 IL7 분자를 작제하였다. 도 1c는 이러한 비키 분자가 PD-1에 대해 양호한 결합을 보존함을 입증한다.
또한, IL7-Fc와 비교하여, 이작용성 항-PD1/IL-7 분자는 PD-1+ T 세포 침윤물 속에서 IL-7의 축적 및 PD-1+ T 세포 상에서 IL-7의 재-국재화를 허용한다.
실시예 2: PD-1/PD-L1 및 PD1-PDL2 상호작용을 차단하는 비키 항-PD1-IL7 분자의 길항능
PD-L1을 맥시소프 플레이트(Maxisorp plate)에 고정시키고 복합체 항-PD1 항체+바이오티닐화된 재조합 인간 PD-1을 가하였다. 당해 복합체를 고정된 농도의 PD1(0.6 μg/mL)을 사용하여 생성시키고 상이한 농도의 항-PD-1 항체를 시험하였다. PD-1 항체의 키메라 형태를 당해 시험에 사용하였다. 레벨레이션을 스트렙타비딘 퍼옥시다제를 사용하여 수행함으로써 바이오티닐화된 PD1 분자를 검출하고 450 nm에서 TMB 기질을 사용하여 비색계로 나타내었다. 인간 PD-L2 재조합 단백질 사에서 항-PD1 항체, 항-PD1VH-IL7 또는 항-PD1VL-IL7 항체와 함께 예비-항온처리된 PD-1 재조합 단백질의 Biacore에 의한 친화성 평가. 인간 재조합 PD-L2를 CM5 바이오칩 상에 고정시키고 복합체 항체(200nM) + 재조합 인간 PD-1(100 nM)을 가하였다. 데이타는 Biacore: 100% = PD-1 상대적인 반응으로 측정된 상호작용의 상대적인 반응 %로 나타낸다. PD-1 항체의 키메라 형태를 당해 실험에서 사용하였다.
결과
도 2에 나타낸 바와 같이, 비키 항-PD1-IL7 분자는 PD-L1 뿐만 아니라 PD-L2에 대한 PD1의 상호작용을 차단하는 매우 양호한 능력을 나타낸다. 항-PD1 만이 ELISA 검정에서 비키 분자와 비교하여 PD1에 대해 최고의 결합을 나타내었지만, 예측치않게도, PD1-PDL1 또는 PD-1-PDL2의 상호작용의 억제는 항체와 비키 양식 사이에 비교가능하며 본 발명의 비키 항-PD1-IL7 분자가 항-PD1 항체로서 강력할 수 있음을 입증한다.
실시예 3: 비키 항-PD1-IL7 분자를 사용한 자극 후 인간 PBMC에서 생체외, IL-7R 신호전달 경로 분석
인간 건강한 지원자의 말초 혈액으로부터 단리된 PBMC를 15분 동안 재조합 IL-7, 비키 항-PD1-IL-7(PD-1VH-IL7 / PD1VL-IL7)과 함께 항온처리하였다. 이후에, 세포를 고정시키고, 투과성화시키고 AF647 표지된 항-pSTAT5(클론 47/Stat5(pY694))으로 염색하였다. 데이타는 MFI pSTAT*%pSTAT5+ 집단을 계산함으로써 수득하고 정규화(100% = rIL-7 57.5 nM)하였으며 2개의 별도의 실험에서 3명의 상이한 공여자의 평균을 나타낸다.
결과
비키 항-PD1-IL7 분자의 IL7R에 대한 결합의 분석 후, IL7R 활성화를 총 인간 PBMC 중 STAT5포스포릴화에서 또는 CD4+ 및 CD8+ T 세포에서 유동 세포분석기에 의해 측정하였다.
도 3은 STAT5 포스포릴화가 중쇄 또는 경쇄에 융합된 비키 항-PD1-IL7 분자와 유사하게 유도되었음을 나타낸다. 비키 항-PD1-IL7 분자의 최대 활성은 EC50이 약 0.7 nM인 재조합 IL-7 단독과 유사하였다.
실시예 4: 비키 항-PD1-IL7 분자로 처리된 T 세포 활성화 및 증식의 시험관내 및 생체외 분석
- 세포-기반 검정, Discover' x PD-1 Path Hunter 생물검정 키트(Bioassay kit)를 수행하였다. 베타-gal 단편(ED)에 융합된 가공된 PD-1 수용체 및 상보성 베타-gal 단편(EA)에 융합된 가공된 SHP1을 안정하게 발현하는 저켓 T 세포를 저켓 세포와 PD-L1을 발현하는 세포의 공-배양물에 사용하여 PD-1 포스포릴화 및 EA 및 EA 단편의 가공된 SHP-1 보완 상보성의 보충 및 활성 베타-gal 효소의 생성을 야기하였다. 기질 첨가 후, 베타 Gal 효소는 PD-1 신호전달 활성화와 비례하는 화학발광성 신호를 생성한다. 항 PD-1 항체의 첨가는 PD-1 신호전달을 차단하여 생물발광성 신호(RLU)의 손실을 초래한다. 항 PD-1 항체 또는 비키 항-PD1-IL7 분자를 상이한 몰 농도에서 시험하였다.
- Promega PD-1/PD-L1 생물검정 키트를 수행하였다. 2개의 세포주, (1) 효과기 T 세포(PD-1, NFAT-유도된 루시퍼라제를 발현하는 저켓) 및 (2) 활성화 표적 세포(PDL1 및 항원-의존성 방식으로 선천성 TCR을 활성화시키도록 고안된 표면 단백질을 안정하게 발현하는 CHO K1 세포)를 사용하였다. 세포를 공배양하는 경우, PD-L1/PD-1 상호작용은 TCR 매개된 활성화를 직접 억제함으로써 NFAT 활성화 및 루시퍼라제 활성을 차단한다. 항-PD1 항체의 첨가는 억제성 신호를 차단하여 NFAT 활성화 및 루시퍼라제 합성을 이끈다. BioGloTM 루시페린을 가한 후, 발광성을 정량화하고 T 세포 활성화를 반영시켰다. 일련의 몰 농도의 항-PD1 항체 또는 비키 항-PD1-IL7 항체를 시험하였다.
- 건강한 자원자의 말초 혈액으로부터 단리된 인간 PBMC 세포를 항 CD3/CD28 코팅된 플레이트(각각 클론 OKT3 및 CD28.2, 3 μg/mL)로 자극시켜 PD-1 발현을 유도하였다. 20회 자극 후, PBMC를 수거하고 OKT3/PDL1 코팅된 플레이트(각각 2 및 5 μg/mL) 상에서 재조합 IL7(rIL-7) 또는 중쇄(항-PD-1 VH IL-7) 또는 경쇄(항-PD-1 VL IL-7) 상에서 IL-7에 융합된 항-PD1 항체의 존재하에 재자극시켰다. 비키 항-PD1-IL7 항체이 키메라 형태를 당해 시험에서 고정된 용량(5 μg/ml)의 항체 또는 다중 용량에서 사용하였다. 자극 5일 후, T 세포 증식을 3H 티미딘 혼입으로 평가하고 분비된 IFN-γ를 샌드위치 ELISA로 조사하였다.
결과
세포-기반 검정에서 PD-1 신호전달을 차단하는 비키 항-PD1-IL7 분자의 능력을 측정하기 위하여, Discover'x PD-1 Path Hunter 생물검정 키트를 수행하였다. 도 4a에 나타낸 결과는, 비키 항-PD1VH-IL7가 92.1 μM의 농도에서 SHP1 활성화의 50%를 억제할 수 있음을 나타낸다. 당해 결과는 80.66 μM인 항-PD1 단독으로 수득된 결과와 매우 유사하며, PD1 경로 억제를 초래하는 PD1/PDL1 상호작용의 우수한 억제 효능을 나타낸다. 동시에, T 세포 표면에서 PD1과 PDL1의 상호작용에 의해 유도된 억제성 신호의 억제를 NFAT 생물검정을 사용하여 측정하였다. 도 4b는 각각의 항체 또는 시험한 치료학적 조합의 EC50을 나타낸다. 놀라운 방식으로, 본 발명자는 시험한 비키 항-PD1-IL7 분자 둘 다의 EC50가 항-PD1 또는 항-PD1+rIL7 조합보다 유의적으로 보다 우수함을 관찰하였다(비키 VH-IL7 및 VL-IL7의 경우 0.41 및 0.33 nM 대 항-PD1 및 항-PD1+rIL7의 경우 3.6 및 6 nM). 예측하지 않게도, 당해 결과는 비키 항-PD1-IL7이 항-PD1 + IL-7의 조합보다 PD-1+ T 림프구에서 T 세포 활성화를 보다 효율적으로 유도하며, PD1+ T 세포에서 비키 분자의 상승 효과를 입증함을 강조한다. 도 4c는 펨브롤리주맙 및 니볼루맙과 함께 작제된 이러한 비키 IL7 분자가 항 PD-1 단독과 비교하여 유사한 상승 효과를 지님을 입증하며, 본 발명이 다른 항 PD-1 골격과 함께 적합할 수 있음을 입증한다.
동시에, 생체외 T 세포 활성화 및 증식을 항-PD1 항체, rIL7 또는 항-PD1 + rIL7 또는 비키 항-PD1-IL7 분자를 사용한 치료로 시험하였다. 도 5 및 6에 나타낸 결과는 항-PD1에 융합된 IL7이 IFNg 분비를 유도하고 IL7 사이토킨 단독과 비교가능한 방식으로 T 세포 증식을 유도함을 나타낸다. 그러나, 도 6b는 50 pM의 EC50을 가진 IL7 사이토킨과 비교하여 20 pM의 EC50을 나타냄으로써 T 세포 증식을 유도하는 비키 분자의 보다 우수한 효능을 나타낸다.
실시예 5: 비키 항-PD1-IL7 분자 처리 후 세포 표면에서 비키 인테그린 발현
인간 PBMC를 IL-7(50ng/mL) 또는 항 PD-1 또는 항-PD1VH-IL7(5 μg/mL)와 함께 3일 동안 항온처리하고 알파 4(BDbiosciences, 프랑스 룽기 소재, 참고 번호 559881), 베타 7(BDBiosciences, 참고 번호 555945) 또는 LFA-1 인테그린(CD11a/CD18)(BDBiosciences, CD11a 참고 번호 555380 및 CD18 참고 번호 557156)에 대해 염색하였다. FACS를 LSR로 분석하고 각각의 마커에 대한 중간 형광성을 나타낸다. 데이타는 3개의 상이한 공여자를 사용한 3개의 독립된 실험을 나타낸다.
결과
본 발명자는 비키 항-PD1-IL7 분자가 일부 인테그린, 예를 들면, 알파4 및 베타7 소화관 호밍 인테그린(gut homing integrin) 및 LFA1 인테그린(CD11a 및 CD18)의 과발현을 rIL7와 같이 양호하게 자극함을 나타낸다. 비교시, IL-2 및 IL-5 사이토킨은 이러한 인테그린(a4, 베타7)의 발현을 유의적으로 변형시키지 않거나 IL-7 및 비키 항-PD-1 IL-7에 대해 적어도 유의적으로 보다 낮은 정도로 변형시키지 않았다. 이러한 데이타는 PD-1 내성 결장직장 암의 치료를 위한 비키 항-PD1-IL7 분자의 관심을 뒷받침하는데 이는 이것이 IL-7을 통한 종양 부위내로 T 세포 침윤을 촉진시키는 이의 능력을 입증한다. 내피 세포에서 이의 리간드 ICAM-1에 대한 결합을 통해, LFA-1은 악화된 조직내 T 세포 트래피킹(trafficking) 및 분출(extravasation)을 매개한다. 다른 연구는, IL-7이 임의의 악화된 조직내로 T 세포의 이주를 촉진하는 LFA-1 및 VLA-4 부착 분자의 발현을 자극시킴을 입증하였다. 이러한 데이타는 항 PD-1/IL-7 이작용성 분자가 다중 암 서브형에서 T-세포 침윤을 촉진할 수 있음을 입증하였다. 종양 부위에서 T 세포 침윤의 결여는 지금까지 항-PD1 효능에 대한 주요 장애물이다.
실시예 6: 비키 항-PD1-IL7 분자로 처리한 나이브, 부분 고갈된 및 완전히 고갈된 T-세포의 증식 및 활성화.
고갈을 초래하는 T 세포의 만성 항원 자극
인간 PBMC를 CD3 CD28 코팅된 플레이트(3 μg/mL의 OKT3 및 3 μg/mL의 CD28.2 항체) 상에서 3일마다 반복적으로 자극시켰다. 자극 24시간 후, T 세포를 PD-1, Lag3 및 Tim 3 억제성 수용체에 대해 염색하여 각각의 자극 후 이들의 고갈 상태를 분석하였다. 발현을 플루오로크롬 표지된 항체 및 FACS LSRII를 사용하여 유동 세포분석법으로 분석하였다. 각각의 자극 24시간 후, T 세포를 CD3/PD-L2 코팅된 플레이트 상에서 재자극시키고, 증식 능력을 각각의 자극 후 5일째에 티미딘 3H 혼입으로 측정하고 IFNg 분비를 ELISA에 의해 상층액 내로 분석하였다. IL-7 및 비키 항-PD1-IL7 분자에 대한 고갈된 T 세포의 반응을 각각의 자극 48시간 후 STAT5 포스포릴화로 분석하였다.
T 세포를 15분 동안 일련의 희석(29 nM로부터 출발하여 0.29 fM까지의 재조합 IL-7, IL-7에 융합된 항-PD-1(PD-1 VH IL-7/PD-1 VL IL-7) 또는 IL-7에 융합된 동형 대조군(B12 VH IL-7)과 함께 항온처리하였다. 이후에, 세포를 고정시키고, 침투시키고 AF647 표지된 항-pSTAT5(클론 47/Stat5(pY694))로 염색하였다. pSTAT5+ 세포의 퍼센트를 각각의 자극 후 29nM의 IL-7 또는 비키 항-PD1VH-IL7 분자를 사용한 처리 후 분석하였다.
인간 PBM를 CD3 CD28 코팅된 플레이트(3 μg/mL의 OKT3 및 3 μg/mL의 CD28.2 항체) 상에서 반복적으로 자극시켰다. 각각의 자극 24시간 후, T 세포를 OKT3 코팅된 플레이트(2 μg/mL) 상에서 항 PD-1, IL-7에 융합된 IL-7 또는 항 PD-1(항 D-1 VH IL7 또는 항 PD-1 VL IL-7)의 존재하에 재자극시켰다. H3 혼입 검정을 5일째에 수행하여 T 세포 증식을 측정하였다. 3회 자극시킨 T 세포를 항-CD3, 항 CD3 + 재조합 PDL1 또는 항 CD3 + 재조합 PDL2 코팅된 플레이트(각각 2 및 5 μg/mL) 상에서 재-자극시켰다. H3 혼입 검정을 5일째에 수행하였다.
결과
시험관내에서 반복된 TCR 자극 모델을 사용하여, 본 발명자는 면역원성 종양의 문맥에서와 같이 T 세포의 만성 항원 자극을 되풀이하고 만성 항원 자극-유도된 T-세포 고갈 후 IL-7에 반응하는 T 세포의 ?력을 특성화하였다(도 8 및 9). 당해 모델에서, T 세포는 자극에 걸쳐 억제성 수용체(Tim 3, PD1, Lag3)를 고도로 발현하였고 고갈된 T 세포의 주요 특성인, 사이토킨을 증식하여 분비하는 이들의 능력을 상실하였다(도 8). 고갈된 T-세포에서 IL7R의 강력한 감소를 기반으로 문헌에 이미 보고되고 예측된 것과는 대조적으로, 본 발명자는 부분적으로 및 완전히 고갈된 인간 T 세포가 pSTAT5 활성화에 의해 나타난 바와 같이 IL-7에 대해 여전히 반응하며(도 9), IL-7이 T 세포가 완전히 고갈된 경우에서조차(5회 자극) T 세포 증식의 능력을 증가시킴(도 10)을 관찰하였다. 그러나, IL-7에 대한 민감성은 T 세포를 활성화시키는데 요구되는 IL-7의 양이 감소되므로 반복된 자극에 따라 감소된다(도 9b 및 도 10a 및 도 10b). 이러한 데이타는 만성적으로 자극된 고갈된 T 세포를 활성화시키는데 종양 미세환경내로 높은 IL-7 농도의 필요성을 만족시킨다. IL-7의 이러한 높은 국소 농도는 IL-7 반감기를 증가시킴으로써, 예를 들면, 항체 또는 Fc 단편 재조합 단백질과 융합시킴으로써 달성될 수 있었다. Fc-도메인(IL7-Fc)에 IL-7을 융합시키는 다른 장점은 본 발명의 항-PD1 항체를 사용한 PD1의 표적화가 정확하게는 IL-7의 보다 높은 농도를 필요로 하는 세포 상에서 종양내 PD-1+ 고갈된 T 세포에 근접하게 또는 직접적으로 IL-7의 특이적인 국재화를 유도할 것이라는 것이다. 또한, PD-1+ T 세포가 종양 미세환경내에 축적되므로, 비키 항-PD1-IL7 분자는 PD-1+ 세포가 축적된 IL-7의 국소 농도를 증가시킬 것이다.
실시예 7: 효과기 T 세포에서 Treg 억제 활성의 생체외 분석
CD8+ 효과기 T 세포 및 CD4+ CD25high CD127low Treg를 건강한 공여자의 말초 혈액으로부터 단리하고, 세포 증식 염료(CD8+ T 세포이 경우 CPDe450)로 염색하였다. 이후에 Treg/CD8+Teff를 1:1의 비에서 OKT3 코팅된 플레이트(2μg/mL)에 rIL-7(10ng/mL, 0,58nM), 항-PD1(0,58nM), 항-PD1 + rIL-7(0,58nM, 비키 항-PD1VH-IL7(0,58nM)의 존재 또는 부재하에서 5일 동안 공-배양하였다. 효과기 T 세포의 증식을 세포분석법으로 분석하였다.
항-PD1 치료요법은 T 세포 효과기 기능을 자극하지만, 면역억제성 분자(TGFB, IDO, IL-10...) 및 조절 세포(Treg, MDSCs, M2 대식구)는 치료요법의 전체 잠재능을 제한하는 반대 미세환경(hostile microenvironment)을 생성한다. 이후에, IL-7 처리에 대한 종양내 T reg 반응을 효과기 T 세포의 증식을 측정함으로써 시험하였다(도 11). Treg 세포가 낮은 수준의 IL-7R(CD127)을 발현하지만, 이는 여전히 IL-7 처리 후 pSTAT5를 자극할 수 있다. 억제 검정에서, Treg 및 T 효과기 세포를 공배양함으로써, 본 발명자는, IL-7 또는 비키 항-PD1-IL7 처리가 Treg 매개된 억제 효과를 차단하는 도 11을 관찰하였다. 항-PD1 항체는 T 효과기 세포에서 Treg 억제 활성을 억제할 수 없다. IL7은 Treg 억제 기능을 해제시키는 것으로 알려져 있다(Allgauer A, et al. J. Immunol. 2015). 본 발명자는 도 11에서 비키 항-PD1-IL7 분자가 Treg 매개된 억제를 해제시켜 IL7 사이토킨과 같이 양호하게 효과기 T 세포의 증식을 초래함을 나타낸다. Treg 세포가 낮은 수준의 IL-7 수용체를 발현하지만, IL-7이 Treg에 직접적으로 영향을 미쳐 이의 억제 기능을 폐기시킴은 잘 기술되어 있다(Liu W, et al. J Exp Med. 2006 Jul 10; Liu W et al. ; Seddiki N, et al. J exp Med 2006 Jul 10 ; Codarri L, et al. 2007; Heninger AK , et al. J immuonl 2012 Dec 15). 더욱이, 도 11b는 IL-7 및 비키 항 PD-1/IL-7와는 대조적으로 Treg 둘 다의 증식을 강력하게 자극하므로 IL-7 신호전달의 표적화가 IL-2 및 IL-15 신호전달과 비교하여 보다 큰 전망을 유지할 수 있음을 나타낸다. 본 발명자는 당해 실험에서 비키 항-PD1-IL7 분자가 효과기 T-세포 증식 및 생존을 자극하지만 조절성 T 세포를 아낌으로써 T 조절성 면역 균형보다 T 세포 효과기를 촉진함을 나타낸다. IL-7 신호전달의 표적화는, IL-2가 Treg 및 T 효과기 세포 둘 다에서 작용하지만 IL-7이 T 효과기 세포를 선택적으로 활성화시키므로, IL-2 신호전달과 비교하여 보다 큰 전망을 유지할 수 있다.
실시예 8: 인간화된 마우스 모델 및 종양으로부터의 생체외 인간 T-세포 또는 생체외 인간 종양 이식체 배양물에서 비키 항-PD1-IL7 분자의 효능
인간화된 마우스 모델:
1e6 인간 PBMC를 마우스에게 복강내 주사하였다. 마우스를 항-PD1 항체 또는 비키 항-PD1VH-IL7 분자(5 mg/kg)로 주당 2회 처리하였다. 주사 16일 후 혈액을 수거하고 마우스를 희생시켰다. 인간 CD3 T 세포의 퍼센트를 유동 세포분석법으로 인간 CD45 세포에서 분석하고, 인간 IFN 감마를 혈장 속에서 ELISA로 조사하고, 인간 CD3+ 세포의 침윤물을 마우스의 결장 속에서 면역-조직형광성(immune-histofluorescence)으로 정량하였다. 근위 및 원위 결장, 간 및 폐를 조직 Tek® OCT 속에 포매하였다. 슬라이스를 Dapi 및 인간 CD3로 염색하였다. 간 및 폐의 경우, CD3 침윤을 픽셀(pixel)2/mm2로 정량화하고, CD3+ 침윤된 T 세포를 계수하였다.
상이한 암으로부터 생체외 T 세포 연구:
T 세포를 신장 암, 전이성 결장직장 암, 간세포 암종, 슈반세포종(schwannoma) 생검으로부터 추출하고 CD3, CD4, CD8, PD-1, CD127 및 CD132에 대해 염색하였다. 면역형광성을 FACS LSRII로 분석하였다. CD4+CD3+ 또는 CD8+CD3+ 집단을 분석하였다.
세포를 15분 동안 재조합 IL-7 또는 항-PD1VH-IL7 항체(29nM)로 처리하였다. 이후에, 세포를 고정시키고, 침투시키고 pSTAT5(클론 47/Stat5(pY694)), CD3, CD4 및 CD8에 대해 염색하였다. 이후에, 세포를 원심분리로 세척하고 완전 배지 속에 동형 대조군, 항 PD-1, Il-7에 융합된 동형(동형-VH IL-7) 또는 IL-7에 융합된 항 PD-1(항-PD-1 VH IL-7)과 함께 5 μg/mL의 농도에서 재현탁시켰다. 48시간 후, 상층액을 수거하고 IFNγ 분비를 MSD 기술(Meso scale Discovery)을 사용하여 조사하였다.
CD3+ T 세포 집단에서 종양내 FoxP3 Treg 염색. 재조합 IL-7 또는 항 PD-1 VHIL7(29nM)(15분 항온처리)을 사용한 처리 후 FoxP3-CD3+ 효과기 T 세포 대 FoxP3-CD3+ Treg 세포 내에서 pSTAT5의 Facs 분석. 이후에 세포를 고정시키고, 투과하고 pSTAT5(클론 47/Stat5(pY694)), CD3 및 Foxp3에 대해 염색하였다.
결과
인간화된 마우스 모델에서(도 12), 본 발명자는 항-PD1 항체 및 PBS를 사용한 음성 대조군과 비교하여, 말초 혈액에서 CD3 양성 세포의 퍼센트의 증가 및 비키 항-PD1-IL7 분자로 처리한 후 IFNg 분비의 증가를 관찰하였으며, 이는 생체내에서 비키 분자가 인간 T-세포 확장, 생존 및 활성화를 증가시킴을 입증한다. 이러한 차이는 또한 결장 뿐만 아니라 간 및 폐 내로 높은 T 세포 침윤과 관련되며 비키 분자의 IL-7 부분이 악화된 조직내에서 인간 T 세포 이주를 촉진함을 입증한다.
인간 종양내로의 T 세포 표현형 분석은 종양내 T 세포가 PD-1, IL-7R/감마 일반적인 쇄(CD127 및 CD132)를 발현함을 증명하며, 이는 비키 항-PD1-IL7 분자가 문헌으로부터 예측된 것과는 대조적으로 종양내 인간 T 세포를 자극하는데 국소적으로 효율적일 수 있음을 입증한다(도 13). 또한, 종양내 T 세포는 pSTAT5 염색에 의해 나타난 바와 같이 IL-7 및 비키 항-PD1-IL7 분자에 반응하며(도 14) 이는 생체외 종양으로부터 정제된 인간 T-세포에서 비키 항-PD1-IL7 분자가 다양한 종양 서브형의 치료에 유리할 수 있음을 입증한다. 이후에, 종양 세포를 함유하는 인간 종양 이식체의 생체외 배양 모델을 사용하지만 또한 인간 면역 세포 및 기질 세포를 포함하는 모든 종양 미세환경을 사용하여, 항-PD1, 동형VH-IL7, 비키 항-PD1-IL7 분자 또는 IL-7로 처리하였다(도 15). IFNg 분비를 상층액 속에서 T-세포 활성화의 특이적인 마커 및 항-PD1에 대한 반응과 관련된 주변 마커로서 다양한 임상 시도에서 분석하였다. 발명자는 비키 항 PD-1 IL7 처리된 인간 종양 배양물이 보다 많은 IFNg를 유의적으로 분비하며 IL7이 종양 층에서 국소적으로 작용하여 T-세포 활성화를 국소적으로 증가시킴을 관찰하였다. 흥미롭게도, 비키 항-PD1-IL7 분자로 처리한 인간 종양 세포 배양물은 항-PD1 단독 또는 IL7/동형 VHIL7 단독보다 보다 많은 IFNg를 분비하였고, 이는 항-PD-1과 IL-7의 조합으로 종양내 T 세포를 활성화시키는 상승 효과를 입증한다(도 15b). 종양내 T reg(FoxP3+)의 퍼센트를 또한 암 환자(결장직장 암, 슈반세포종, 신장 암 및 간세포 암종)로부터 분석하였다. 도 16a는 시험한 각각의 암이 Treg 세포를 해제시키기 위한 비키 항-PD1-IL7 분자에 대한 표적일 수 있는 Treg 세포를 나타냄을 나타낸다. 이후에, 종양내 효과기(FoxP3-) 및 조절인자 T 세포(FoxP3+)에서 STAT5 활성화(pSTAT5)를 비키 항-PD1-IL7 분자로 처리한 후 분석하였다. 결장직장 암, 슈반세포종 및 췌장 암으로부터 입수한 세포로 수득하여 도 16b에 나타낸 결과는 비키 분자가 종양내 효과기 및 조절인자 T 세포내에서 IL-7R 경로를 활성화시킬 수 있음을 나타낸다. 이러한 결과는 Treg 억제 활성을 폐기하면서 종양내로의 효과기 T 세포 활성화를 촉진하기 위한 비키 항-PD1-IL7 분자의 이중 엣지 블레이드(double edge blade)를 강조한다.
실시예 9. Fc 융합된 IL-7의 돌연변이는 IL-7R에 대한 결합 및 pSTAT5 신호전달을 변형시키고 생체내에서 약동학을 증진시킨다.
IL-7 돌연변이체를 수득하기 위하여, CD127에 대한 IL7 상호작용에 연루된 아미노산을 유사한 본질 및 특성을 지닌 아미노산으로 치환시켰다. 수개의 돌연변이체, 즉, Q11E, Y12F, M17L, Q22E, D74E, D74Q, D74N, K81R, W142H, W142F 및 W142Y를 생성시켰다.
IL-7 이황화물 결합은 시스테인 잔기를 세린 잔기로 대체함으로써 파괴하여, 치환 C2S-C141S + C34S-C129S("SS1"로 명명된 돌연변이체), 또는 C2S-C141S + C47S-C92S ("SS2"로 명명된 돌연변이체), 또는 C47S-C92S + C34S-C129S("SS3"로 명명된 돌연변이체)를 이끌었다.
[표 3]
Figure pct00011
[표 4]
Figure pct00012
[표 5]
Figure pct00013
[표 6]
Figure pct00014
[표 7]
Figure pct00015
IL7 서열내 하나의 아미노산의 치환은 PD-1 수용체에 결합하는 이의 능력을 변형시키지 않았다(도 17a, 17b 및 17c). 그러나, 이러한 돌연변이는 생체외 T 세포 검정에서 CD127 결합 및 pSTAT5 신호전달에 의해 나타난 바와 같이 이의 생물학적 활성을 변형시킨다(도 18 및 19 및 표 3 및 6). 돌연변이 D74E 및 W142H는 CD127에 대한 IL-7 결합 및 T 림프구에서 pStat5의 활성화 둘 다를 감소시키는데 가장 효율적인 돌연변이이다(도 18a, 18b 및 19a, 19b 및 표 3 및 7). 다른 실험에서, 이황화물 결합된 파괴의 효과를 분석하였다(도 18c). 고 농도(10μg/ml)에서, SS2 또는 SS3은 IL-7 WT로부터의 3log 편차와 함께, T 림프구내에서 pStat5를 활성화시킬 수 있었다(도 18c 및 표 6).
이러한 돌연변이체의 결합 능력을 확인하기 위하여, Biacore 검정을 수행함으로써 KD(수용체와 이의 항원 사이의 평형 해리 상수, 참고: 표 4)를 측정하였다. 돌연변이체 SS2 및 W142H는 7 내지 57 nM에 가까운 KD로 CD127에 대해 보다 낮은 친화성을 갖는다. SS3 돌연변이체는 3 μM에 가까운 KD로 CD127에 대해 최저의 친화성을 갖는다. CD132 수용체에 대한 친화성을 또한 표 5에 나타낸 바와 같이 평가하였다. 당해 실험에서, CD127이 IL-7의 부재하에서 CD132와 함께 이량체화되므로 IgG4 만을 기본선 KD 친화성으로 사용하였다. IL-7 돌연변이체 W142H는 CD132에 결합하나 IgG IL-7WT와 비교하여 친화성이 5배 더 높다. 이러한 데이타는 돌연변이 W142H가 CD127에 대한 결합을 감소시키고 CD132 수용체에 대한 IL-7의 결합을 재지시하여, 도 18에 나타낸 바와 같이 T 세포에서 pSTAT5 활성화의 손실을 야기함을 입증한다. 대조적으로, 본 발명자는 시험한 조건에서 SS2 돌연변이체가 CD132 수용체에 결합하는 능력을 상실함을 관찰하였고, 이는 SS2 돌연변이체가 CD132 수용체보다 CD127에 우선적으로 결합하여 T 세포에서 pSTAT5 활성의 감소를 초래함을 제시한다(도 19).
생체내에서 항 PD-1 IL-7의 약동학/약력학을 측정하기 위하여, 마우스에게 1회 용량의 IgG-IL-7(34,4nM/kg)를 정맥내 주사하였다. 혈장 약물 농도를 인간 IgG에 대해 특이적인 ELISA로 분석하였다. 도 19 및 표 7은 수득된 Cmax(주사 15분 후 최대 농도)가 이론적인 농도보다 30배 더 낮으므로 IgG4 IL-7 WT 분자가 신속한 분포를 가짐을 나타낸다. 시험한 W142Y, F, H 돌연변이체 모두는 IL-7 WT보다 5 내지 10배 더 높은 Cmax로 보다 우수한 분포 프로파일을 나타내었다(도 19a 및 표 7). W142H 돌연변이체는 가장 우수한 Cmax를 나타낸다. 항 PD-1 IL-7 D74E 돌연변이체 또한 양호한 Cmax를 입증하였다. 돌연변이체 SS2 및 SS3은 IL-7 WT보다 7 내지 13배 더 높은 Cmax로 가장 우수한 PK 프로파일 및 양호한 선형 프로파일 곡선을 나타낸다. 동시에, AUC(곡선하 영역)을 측정하였으며(표 7 및 도 20d), AUC는 약물 노출 정도 및 신체로부터 이의 청소율에 대한 통찰력을 제공한다. 이러한 데이타는 AUC가 IL-7 돌연변이체로 증가되었음을 입증하며 이는 IL-7 돌연변이체가 개선된 약물 노출을 가짐을 의미한다. 도 20d에 나타낸 바와 같이, 본 발명자는 약물 노출이 돌연변이체의 IL-7 잠재능과 관련됨을 관찰하였다(pSTAT5 EC50으로 측정됨) 결론적으로, IL-7의 친화성은 생성물의 약동학과 관련되어 있다. 이의 수용체 CD127 및 CD132에 대한 IL-7의 친화성의 감소는 생체내에서 IL_7 이작용성 분자의 흡수 및 분포를 증진시킨다.
실시예 10: IgG의 C-말단 도메인에서 시스테인의 첨가는 IL7 분자의 유동성을 감소시키고 생체내에서 약동학을 증진시킨다.
IgG의 C-말단 도메인에서 C-말단 도메인에서 시스테인의 첨가를 또한 시험하여 추가의 이황화물 결합을 생성시키고 IL-7 분자의 유연성을 잠재적으로 제한하였다. 당해 돌연변이체는 "C-IL-7"로 명명되었다. 도 21은 IgG 구조내 이황화물 결합의 첨가가 항 PD-1 IL7 WT 이작용성 분자와 비교하여 IL-7의 pSTAT5 활성을 감소시키고(도 21a) 생체내 약동학 검정에서 Cmax를 증가시킴(5배)을 나타낸다(도 21b).
실시예 11: IgG1N298A 동형으로 작제된 항 PD-1 IL-7 돌연변이체는 IL-7R에 대해 보다 우수한 결합, 보다 높은 pSTAT5 신호전달 및 생체내에서 양호한 약동학 프로파일을 갖는다.
항 PD-1 IL-7 이작용성 분자의 상이한 동형을 IgG4m(S228P) 또는 IgG1m(번호매김 방법에 따라 N298A 또는 N297A)으로 시험하였다. IgG4 동형은 S228P 돌연변이를 포함함으로써 생체내에서 Fab 아암(arm)-교환을 방지하고 IgG1 동형은 면역카이네킨("IgG4m" 또는 "IgG1N298A"로 명명된 돌연변이체)의 비-특이적인 결합을 감소시킬 수 있는 FcγR 수용체에 대한 IgG1 동형 결합을 폐기하는 N298A 돌연변이를 포함한다. 이후에, 항 PD-1 IL-7 이작용성 분자를 2개의 상이한 동형, N297A 내에서 돌연변이된 IgG1(IgG1m로 명명함) 동형 대 IgG4 S288P 동형(IgG4m으로 명명됨)으로 작제하여 동형 구조가 IL-7의 생물학적 활성 및 이의 약동학 프로파일을 변경시키는지의 여부를 측정하였다.
도 22a 및 22b는 IgG4m 또는 IgG1m 동형으로 작제된 항 PD-1 IL7 이작용성 분자가 PD-1 수용체에 대해 동일한 결합 특성을 가지며, 동형이 VH 및 VL의 구조 및 PD-1에 대한 항 PD-1 항체의 친화성을 변경시키지 않음을 나타낸다. 그러나, 본 발명자는 IgG1m 동형이 CD127에서 IL-7 D74, SS2의 결합 및 SS3의 결합(약간)(도 23a, 23b, 23c 및 23d) 및 인간 PBMC에서 pSTAT5 활성화(도 24a, 24b 및 24c)를 예측치않게 증진시킴을 관찰하였다. pSTAT5 신호전달에서 이러한 증가는 다른 T 세포주(PD-1 및 CD127를 발현하는 저켓 세포, 참고: 도 24d)에서 SS2 돌연변이체에 대해 확인되었지만, 놀라운 방식으로, IgG1m 동형은 항 PD-1 IL-7 WT 이작용성 분자의 pSTAT5 활성을 변형시키지 않았으며, 이는 IgG1m 동형 만이 IL-7 돌연변이체의 활성을 증진시킴을 제시한다. 항-PD1 항체 및 IL7 돌연변이체를 포함함으로써 TCR 매개된 신호전달을 재활성화시키는 이작용성 분자의 능력을 측정하기 위하여, NFAT 생물검정을 수행하였다. 도 25a에 나타낸 결과는 이작용성 분자가 TCR 매개된 신호전달(NFAT)을 활성화시키는데 항-PD1 또는 항-PD1+rIL7(별개의 화합물로서)보다 더 우수함을 나타내며, 이는 PD1+ T 세포에서 이작용성 분자의 상승 효과를 입증한다. 본 발명자는 다음에 항 PD-1 항체 및 IgG4m 대 IgG1m 동형으로 작제된 IL-7 돌연변이체(돌연변이 D74E, W142H 또는 SS2를 지님)를 포함하는 이작용성 분자의 상승효과 능력을 평가하였다(도 25b, 25c, 25d). 시험한 돌연변이체 모두는 특히 IL-7 D74E과 IgG4m을 지닌 이작용성 분자에 대한 pSTAT5 신호전달을 활성화시키는 이의 능력과 관련된 활성화의 수준으로 NFAT 신호전달을 활성화시키는 상승 효과를 보존한다.
마우스에서 약동학적 연구는 IgG1 동형이 IL7WT 및 SS3 분자에 대한 약물 노출을 변형시키지 않고 W142H 분자에서 최소의 영향을 미침을 입증한다(도 26a). 이와 함께 이러한 데이타는 최적화된 동형(IgG1m)이 생체내에서 생성물의 양호한 약동학을 보존시키면서 돌연변이체의 생물학적 활성을 향상시키는데 충분함을 나타낸다. IgG1m 동형을 사용하여, 다른 IL-7 돌연변이체를 시험하였다: D74N, D74Q 및 D74E+ W142H 돌연변이의 조합. 항 PD-1 IL-7 D74E 돌연변이체를 사용한 차이는 pSTAT5 활성화(도 25b) 및 약동학(도 26b)에서 관찰되지 않았다. 이중 돌연변이체 D74E + W142H는 W124H IgG1와 비교하여 유사한 프로파일을 나타내었고 D74Q는 D74E 돌연변이체와 비교하여 유사한 프로파일을 나타내었다. 본 발명자는 또한 IgG1m 동형 + YTE 돌연변이(M252Y/S254T/T256E)를 지닌 이작용성 분자를 작제하였다. 이러한 돌연변이는 FcRn 수용체에 대한 결합을 증가시킴으로써 항체의 반감기를 증가시키는 것으로 기술되었다. 도 23d에 나타낸 바와 같이, YTE 돌연변이는 D74 또는 the W142H 돌연변이체를 포함하는 이작용성 분자의 pSTAT5 신호전달을 변형시키지 않는다.
실시예 12: C-말단 라이신 잔기내로의 돌연변이 K444A는 생체내에서 약동학에 영향을 미치지 않는다.
인간 IgG의 모든 서브부류는 순환시 제거될 수 있는 항체 중쇄(K444)의 C-말단 라이신 잔기를 수반한다. 혈액 속에서 이러한 절단은 연결된 IL-7을 IgG에 방출함으로써 면역사이토킨의 생물활성을 잠재적으로 상충할 수 있다. 이러한 쟁점을 피하기 위하여, IgG 도메인내 K444 아미노산을 알라닌으로 치환시켜 항체에 일반적으로 사용된 돌연변이인, 단백질분해성 절단을 감소시켰다. 도 27에 나타낸 바와 같이, 유사한 곡선이 IgG WT IL-7 대 IgG K444A IL-7 사이에서 수득되었으며, 이는 돌연변이가 약물의 약동학적 프로파일에 영향을 미치지 않음을 시사한다.
실시예 13: IgG 항체 사이의 링커는 생체내에서 약동학을 변형시키지 않지만 pSTAT5 신호전달의 활성화를 증진시킨다.
IgG Fc 도메인과 IL-7m 사이의 상이한 링커를 시험하여 유연성을 변형시켰다. 몇가지 조건을 시험하였다(예컨대, 링커 없음, GGGGS, GGGGSGGGS, GGGGSGGGGS, GGGGSGGGGSGGGGS).
실시예 1 및 2의 경우, Fc의 C-말단 도메인과 IL-7의 N-말단 도메인 사이의 링커 (G4S)3을 IgG4m-IL7 및 IgG1m-IL-7 작제 각각에 사용하였다. 당해 링커는 높은 유연성 및 IL7 활성화 신호의 증진을 허용하였다. CD127에 대한 IL7의 친화성을 감소시키고 약동학을 증진시키기 위하여, 상이한 작제물을 링커(링커 없음, G4S, (G4S)2 또는 (G4S)3)의 길이를 변화시키면서 시험하였다. 비교를 위해, IgG1m 또는 IgG4m Fc IL-7 WT를 또한 다양한 링커를 사용하여 생성시켰다.
약동학 연구는 링커의 길이가 시험한 작제물에 대한 생성물의 분포, 흡수 및 제거에 영향을 미치지 않음을 입증한다: 항 PD-1 IL7 WT(도 28a), 항 PD-1 IL-7 D74(도 28b) 및 항 PD-1 IL-7 W142H(도 28c). 그러나, 링커의 길이는 도 28d에 나타낸 바와 같이 pStat5의 활성화에 영향을 미친다. 더욱이, 링커(G4S)3으로 작제된 항 PD-1 IL7은 pSTAT5 신호전달을 활성화시키는데 있어 (G4S)2 또는 G4S3 링커로 작제된 항 PD-1 IL-7와 비교하여 보다 강력하며 링커없이 작제된 항 PD-1 IL-7과 비교하여 심지어 보다 더 강력하다. 이러한 데이타는 생체내에서 약물의 약동학을 절충시키지 않고 IL-7의 유연성을 허용하는 (G4S)3 링커의 용도를 강조한다.
실시예 14: 항 PD-1 IL-7 돌연변이체는 PD-1+ CD127+ 세포에서 PD-1-CD127+ 세포보다 우선적인 결합을 허용한다.
다음에, 본 발명자는 PD-1+ T 세포를 표적화하는 항 PD-1 IL-7 이작용성 분자의 능력을 평가하였다. CD127+을 발현하거나 CD127+ 및 PD-1+를 동시 발현하는 저켓 세포를 45 nM의 다음의 이작용성 분자로 염색하였다: 항 PD-1 IL-7 WT, D74, W142H, SS2 및 SS3. 결합을 항 IgG-PE(Biolegend, 클론 HP6017)으로 검출하고 유동 세포분석법으로 분석하였다.
결과 : 도 29는 항 PD-1 IL-7 WT 및 D74 돌연변이체가 PD-1+/CD127+ 세포 대 PD-1-/CD127+ 세포와 유사한 효능으로 결합하지만, 항 PD-1 IL-7 돌연변이체 SS2, SS3은 PD-1+/CD127+ 세포 대 PD-1-/CD127+ 세포에 대해 2 내지 3배 더 높은 효능으로 결합함을 나타낸다. 항 PD-1 IL-7 W142H 이작용성 분자는 중간 효과를 나타내고 PD-1+/CD127+ 세포에 대해 1.4배 더 높은 효능으로 결합한다. 이와 함께, 이러한 데이타는 IL-7 돌연변이가 약물의 보다 우수한 약동학을 허용할 뿐 아니라, PD-1+ 세포에서 IL-7의 우선적인 결합, 즉, 동일한 세포에서 약물의 표적화를 허용함을 나타낸다. 이러한 양태는 항 PD-1 IL-7이 CD127+ 나이브 T 세포보다 PD-1+CD127+ 고갈된 T 세포 상에서 IL-7을 종양 미세환경으로 농축시킬 것이므로, 생체내에서 약물의 생물학적 활성에 대한 흥미를 갖는다.
실시예 15: 분자 비키 항 PD-1 IL-7은 CD4 및 CD8 T 세포의 증식을 허용하고 시노몰구스 원숭이에서 전임상 안전성을 입증한다.
시노몰구스 원숭이에게 항체에 대해 6,87nM/kg(n=2) 또는 34,35 nM(n=1)(1mg/kg 또는 5mg/Kg과 동일)을 주사하였다. 혈액 분석을 주사 후 15일 또는 4시간 까지 수행하였다. CD4/CD8 T 세포 또는 B 세포의 증식을 Ki67 마커를 사용하여 혈액 속에서 평가하였다. pSTAT5를 다수 시점에서 CD3+ T 세포 속에서 세포의 고정 및 투과 후 FACS로 분석하였다.
결과: 도 30a 및 30b는 비키 항 PD-1 IL-7의 단일 주사가 CD4 및 CD8 T 세포의 증식을 유도하지만 B 세포의 증식을 유도하지 않음을 나타낸다. 주사 후, pSTAT5의 신속한 활성화가 도 30c에서 입증된 바와 같이 1 내지 24시간째에 최대 활성화로 관찰되었다. 약물은 당해 용량에서 견디어지고 안전하였으며, 도 30 d/e/f에 나타난 바와 같이, 임상 매개변수(생화학적 및 혈액 세포수)는 분자의 주사 후 정상 범위 내이거나 이에 근접하였다. 이러한 데이타는 분자가 생체내에서 T 세포를 활성화시킬 수 있고 전임상 안전성을 나타냄을 나타낸다.
결론
Fc 부위의 C-말단 도메인에 융합된 IL-7 사이토킨을 지닌 비키 항-PD1-IL7 항체 양식은 CD127 수용체에 대한 결합을 유지한 반면, 예측치 않게도, Fc의 N-말단에 융합된 IL7(IL7-Fc)은 이의 결합 능력을 상실한다. 비키 양식은 환자에서 IL-7R 활성화 및 제거 반감기의 측면에서 보다 강력할 것이다. 더욱이, IL7-Fc 화합물과 비교하여, 비키 항-PD1-IL7 항체 양식은 PD-1+ T 세포 침윤물 속에서 IL-7의 축적 및 항-PD1 + IL7 재조합 단백질의 사용의 조합과 비교하여 비키를 사용하여 증가된 T-세포 활성화로 PD-1+ T 세포에서 IL-7의 재-국재화를 허용한다. 또한, 비키 항-PD1-IL7 분자는 단일의 이중 엣지 검(double edge sword)인데, 한편으로는 시험관내 및 생체내 모델에서 효과기 T 세포의 증식 및 IFNg 사이토킨의 분비에 의해 반영된 이의 활성화를 증가시키고, 다른 한편으로는 T-세포에서 Treg 억제 기능을 해제시킨다. 이는 다양한 종양형으로부터 단리된 인간 T 세포에서 입증되었으며 비키 항-PD1-IL7 분자가 다양한 종양 서브형에 대해 유리할 수 있음을 시사한다. PD-1 치료요법에 대해 내성인 종양은 T 세포 배출을 나타낸다. PD-1 반응이 종양 침윤 T 세포의 양과 관련되어 있음은 알려져 있다. 비키 항-PD1-IL7 분자는 세포 표면에서 인테그린 발현을 증가시키며 이는 본 발명의 이작용성 분자가 다수의 암 서브형에서 종양내로의 T-세포 침윤을 촉짐함을 시사한다.
물질 및 방법
ELISA 결합 PD1
활성 ELISA 검정을 위해, 재조합 hPD1(Sino Biologicals, 중국 베이징 소재; 참고 번호 10377-H08H)을 플라스틱 위에 카보네이트 완충액(pH 9.2) 중 0.5μg/ml에서 고정시키고 정제된 항체를 가하여 결합을 측정하였다. 항온처리 및 세척 후, 퍼옥시다제-표지된 당나귀 항-인간 IgG(Jackson Immunoresearch; 미국; 참고 번호 709-035-149)를 가하고 통상의 방법으로 나타내었다.
Biacore 방법을 사용한 친화성 측정
CD127(A) 또는 CD132(B)에 대해 이의 중쇄에서 IL-7에 융합된 IgG의 Biacore에 의한 친화성 평가. CD127(Sinobiological, 10975-H03H-50)을 CM5 바이오칩에 20μg/ml에서 고정시키고 나타낸 단백질을 일련의 농도(0.35; 1.1; 3.3; 10; 30nM)에서 가하였다. 친화성을 2상 반응 모델을 사용하여 분석하였다. CD132에 대한 IL-7의 친화성을 평가하기 위하여, CD127을 CM5 바이오칩에 고정시키고 각각의 IL-7 작제물을 30nM의 농도에서 주사하였다. CD132 수용체(Sinobiological 10555-H08B)를 상이한 농도, 예컨대 31.25, 52.5, 125, 250, 500 nM에서 가하였다. 정체상 친화성 모델을 분석에 사용하였다.
CD127 결합 ELISA
CD127 결합을 샌드위치 ELISA 방법으로 평가하였다. 항체 골격에 의해 표적화된 재조합 단백질을 고정시킨 다음, CD127 재조합 단백질(히스티딘 태그됨, Sino 참고번호: 10975-H08H)과 함께 예비항온처리된 항체 융합된 IL-7을 항온처리하였다. 레벨레이션을 바이오틴에 커플링된 항-히스티딘 항체(MBL #D291-6) 및 퍼옥시다제(JI 016-030-084)에 커플링된 스트렙타비딘의 혼합물을 사용하여 수행하였다. 비색법을 450에서 TMB 기질을 사용하여 측정하였다.
생체내에서 pSTAT5 분석
인간 건강한 자원자의 말초 혈액으로부터 단리한 PBMC를 15분 동안 재조합 IL-7, 또는 IgG 융합된 IL-7과 함께 항온처리하였다. 이후에, 세포를 고정시키고, 투과시키고 AF647 표지된 항-pSTAT5(클론 47/Stat5(pY694))로 염색하였다. 데이타는 CD3+ T 세포 집단에서 MFI pSTAT5를 계산함으로써 수득하였다.
생체내에서 IgG 융합된 IL-7의 약동학
IL-7 면역사이토킨의 약동학을 분석하기 위하여, 단일 용량의 분자를BalbcRJ 마우스(6내지 9주령의 암컷)에 안화내로 주사하였다. 혈장 속의 약물 농도를 ELISA로 IgG 융합된 Il-7을 함유하는 고정된 항-인간 경쇄 항체(클론 NaM76-5F3) 희석된 혈청을 사용하여 측정하였다. 검출을 퍼옥시다제-표지된 당나귀 항-인간 IgG(Jackson Immunoresearch; 미국; 참고번호: 709-035-149)를 사용하여 수행하고 통상의 방법으로 나타내었다.
시노몰구스 원숭이에게 비키 IL-7을 2회 용량에서 정맥내 주사하였다. 혈액을 주사 후 다수의 시점에서 수거하여(15/30분, 1/2/4시간, 1/2/3/6/10/14일) 생화학적 및 세포 수를 분석하였다.
Promega 세포-기반 생물검정을 사용한 T 세포 활성화 검정
T 세포 활성화를 회복시키는 항-PD-1 항체의 능력을 Promega PD-1/PD-L1 키트(참고번호: J1250)를 사용하여 시험하였다. 2개의 세포주: (1) 효과기 T 세포(PD-1, NFAT-유도된 루시퍼라제를 안정하게 발현하는 저켓) 및 (2) 활성화 표적 세포(항원-의존적 바익으로 선천성 TCR을 자극하도록 설계된 PDL1 및 표면 단백질을 안정하세 발현하는 CHO K1 세포)를 사용한다. 세포를 공배양한 경우, PD-L1/PD-1 상호작용은 TCR 매개된 활성화를 억제함으로써 NFAT 활성화 및 루시퍼라제 활성을 차단한다. 항- PD-1 항체의 첨가는 PD-1 매개된 억제 신호를 차단함으로써 NFAT 활성화 및 루시퍼라제 합성 및 생물발광성 신호의 방출을 초래한다. 실험은 제조업자의 추천에 따라 수행하였다. PD-1 항체의 일련 희석물을 시험하였다. PD-L1+ 표적 세포, PD-1 효과기 세포 및 항 PD-1 항체의 공배양 4시간 후, BioGloTM 루시페린 기질을 웰에 가하고 플레이트를 TecanTM 광도계를 사용하여 판독하였다.
항체 및 이작용성 분자
다음의 항체 및 이작용성 분자를 본원에 개시된 상이한 실험에서 사용하였다: 펨브롤리주맙(Keytrudra, Merck), 니볼루맙(Opdivo, Bristol-Myers Squibb), 및 서열 번호: 19, 22 또는 24로 정의된 바와 같은 중쇄 및 서열 번호: 28로 정의된 바와 같은 경쇄를 포함하는 항-PD1 인간화된 항체 또는 서열 번호: 71로 정의된 바와 같은 중쇄 및 서열 번호: 72로 정의된 바와 같은 경쇄를 포함하는 항-PD1 키메라 항체를 포함하는 이작용성 분자.
SEQUENCE LISTING <110> OSE IMMUNOTHERAPEUTICS <120> BIFUNCTIONAL anti-PD-1/IL-7 MOLECULE <130> B2913PC <160> 74 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> artificial <220> <223> HC CDR1 <400> 1 His Tyr Ala Met Asn 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> artificial <220> <223> HC CDR2 <400> 2 Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe Thr 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> artificial <220> <223> HC CDR3 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> X is X1 (D or E) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> X is X2 and is T, H, A, Y, N, E or S <400> 3 Glu Arg Glu Pro Gly Met Xaa Xaa 1 5 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> artificial <220> <223> HC CDR3 <400> 4 Glu Arg Glu Pro Gly Met Asp Ser 1 5 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> artificial <220> <223> HC CDR3 <400> 5 Glu Arg Glu Pro Gly Met Asp Thr 1 5 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> artificial <220> <223> HC CDR3 <400> 6 Glu Arg Glu Pro Gly Met Glu Ser 1 5 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> artificial <220> <223> HC CDR3 <400> 7 Glu Arg Glu Pro Gly Met Asp His 1 5 <210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> artificial <220> <223> HC CDR3 <400> 8 Glu Arg Glu Pro Gly Met Asp Ala 1 5 <210> 9 <211> 8 <212> PRT <213> artificial <220> <223> HC CDR3 <400> 9 Glu Arg Glu Pro Gly Met Asp Tyr 1 5 <210> 10 <211> 8 <212> PRT <213> artificial <220> <223> HC CDR3 <400> 10 Glu Arg Glu Pro Gly Met Asp Asn 1 5 <210> 11 <211> 8 <212> PRT <213> artificial <220> <223> HC CDR3 <400> 11 Glu Arg Glu Pro Gly Met Asp Glu 1 5 <210> 12 <211> 16 <212> PRT <213> artificial <220> <223> LC CDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> X is G or T <400> 12 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ala Asn Xaa Asn Thr Tyr Leu Glu 1 5 10 15 <210> 13 <211> 16 <212> PRT <213> artificial <220> <223> LC CDR1 <400> 13 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ala Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu 1 5 10 15 <210> 14 <211> 16 <212> PRT <213> artificial <220> <223> LC CDR1 <400> 14 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ala Asn Thr Asn Thr Tyr Leu Glu 1 5 10 15 <210> 15 <211> 7 <212> PRT <213> artificial <220> <223> LC CDR2 <400> 15 Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> artificial <220> <223> LC CDR3 <400> 16 Phe Gln Gly Thr His Val Pro Asn Thr 1 5 <210> 17 <211> 117 <212> PRT <213> artificial <220> <223> HC variable domain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (105)..(105) <223> X is X1, D or E <220> <221> MISC_FEATURE <222> (106)..(106) <223> X is X2, and is T, H, A, Y, N, E or S <400> 17 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Arg Glu Pro Gly Met Xaa Xaa Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 18 <211> 117 <212> PRT <213> artificial <220> <223> HC variable domain <400> 18 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Arg Glu Pro Gly Met Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 19 <211> 117 <212> PRT <213> artificial <220> <223> HC variable domain <400> 19 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe 50 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5 <212> PRT <213> artificial <220> <223> linker G4S <400> 68 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 69 <211> 10 <212> PRT <213> artificial <220> <223> linker (G4S)2 <400> 69 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 70 <211> 15 <212> PRT <213> artificial <220> <223> linker (G4S)3 <400> 70 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 71 <211> 444 <212> PRT <213> artificial <220> <223> HC anti-PD1 chimeric <400> 71 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Glu Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Ala Ala Phe 65 70 75 80 Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Lys Glu Arg Glu Pro Gly Met Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Ser 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro 210 215 220 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 225 230 235 240 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 245 250 255 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe 260 265 270 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 275 280 285 Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 290 295 300 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 305 310 315 320 Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 325 330 335 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln 340 345 350 Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 355 360 365 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 370 375 380 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 385 390 395 400 Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu 405 410 415 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 420 425 430 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 <210> 72 <211> 219 <212> PRT <213> artificial <220> <223> LC anti-PD1 chimeric <400> 72 Asp Val Leu Leu Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ala 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Thr Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 73 <211> 2670 <212> DNA <213> artificial <220> <223> VH-VK <400> 73 cagatccagc tggtgcagag cggctctgag ctgaagaagc caggcgcttc tgtgaaggtg 60 tcctgcaagg ccagcggcta caccttcaca cactatgcta tgaattgggt gagacaggct 120 ccaggacagg gactggagtg gatgggctgg atcaacacca atacaggcga gcctacctac 180 gctcagggct ttacaggccg cttcgtgttt tctctggata cctccgtgag cacagcctat 240 ctgcagatct ccagcctgaa ggctgaggac accgccgtgt actattgtgc tagggagagg 300 gagccaggaa tggataactg gggacagggc accctggtga cagtgtcttc cgctagcacc 360 aagggcccat cggtcttccc cctggcgccc tgctccagga gcacctccga gagcacagcc 420 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 480 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 540 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacgaagac ctacacctgc 600 aacgtagatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga gagttgagtc caaatatggt 660 cccccatgcc caccatgccc agcacctgag ttcctggggg gaccatcagt cttcctgttc 720 cccccaaaac ccaaggacac tctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac gtgcgtggtg 780 gtggacgtga gccaggaaga ccccgaggtc cagttcaact ggtacgtgga tggcgtggag 840 gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagttca acagcacgta ccgtgtggtc 900 agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtc 960 tccaacaaag gcctcccgtc ctccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 1020 cgagagccac aggtgtacac cctgccccca tcccaggagg agatgaccaa gaaccaggtc 1080 agcctgacct gcctggtcaa aggcttctac cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 1140 aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 1200 ttcttcctct acagcaggct aaccgtggac aagagcaggt ggcaggaggg gaatgtcttc 1260 tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cacagaagag cctctccctg 1320 tctccgggta aatgacagat ccagctggtg cagagcggct ctgagctgaa gaagccaggc 1380 gcttctgtga aggtgtcctg caaggccagc ggctacacct tcacacacta tgctatgaat 1440 tgggtgagac aggctccagg acagggactg gagtggatgg gctggatcaa caccaataca 1500 ggcgagccta cctacgctca gggctttaca ggccgcttcg tgttttctct ggatacctcc 1560 gtgagcacag cctatctgca gatctccagc ctgaaggctg aggacaccgc cgtgtactat 1620 tgtgctaggg agagggagcc aggaatggat aactggggac agggcaccct ggtgacagtg 1680 tcttccgcta gcaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg cgccctgctc caggagcacc 1740 tccgagagca cagccgccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 1800 gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 1860 tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacg 1920 aagacctaca cctgcaacgt agatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagagagtt 1980 gagtccaaat atggtccccc atgcccacca tgcccagcac ctgagttcct ggggggacca 2040 tcagtcttcc tgttcccccc aaaacccaag gacactctca tgatctcccg gacccctgag 2100 gtcacgtgcg tggtggtgga cgtgagccag gaagaccccg aggtccagtt caactggtac 2160 gtggatggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gttcaacagc 2220 acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag 2280 tacaagtgca aggtctccaa caaaggcctc ccgtcctcca tcgagaaaac catctccaaa 2340 gccaaagggc agccccgaga gccacaggtg tacaccctgc ccccatccca ggaggagatg 2400 accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctaccccag cgacatcgcc 2460 gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 2520 gactccgacg gctccttctt cctctacagc aggctaaccg tggacaagag caggtggcag 2580 gaggggaatg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacacag 2640 aagagcctct ccctgtctcc gggtaaatga 2670 <210> 74 <211> 660 <212> DNA <213> artificial <220> <223> VL-VD <400> 74 gacgtggtca tgacacagag cccactgtct ctgcctgtga ccctgggaca gccagcctct 60 atctcctgca gatccagcca gtctctggtg cacgctaaca ccaatacata cctggagtgg 120 tatcagcaga ggccaggaca gtccccaagg ctgctgatct acaaggtgtc caacagattc 180 agcggagtgc cagaccgctt tagcggatct ggatccggaa ccgacttcac cctgaagatc 240 tccagggtgg aggctgagga tgtgggcgtg tactattgtt tccagggcac ccatgtgcct 300 aatacatttg gccagggcac caagctggag atcaagcgta cggtggctgc accatctgtc 360 ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420 ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480 tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 540 agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 600 gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgttag 660

Claims (33)

  1. (a) (i) HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH), 및
    (ii) LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는, 항-인간 PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및
    (b) 인간 인터류킨 7(IL-7) 또는 이의 단편 또는 변이체(variant)를 포함하는 이작용성(bifunctinal) 분자로서, 여기서 항체 또는 이의 단편이 융합 단백질로서, 바람직하게는 펩타이드 링커에 의해 인간 IL-7 또는 이의 단편 또는 변이체에 공유결합으로 연결되어 있는 이작용성 분자.
  2. 제1항에 있어서, 인간 IL-7 또는 이의 단편의 N-말단 끝(N-terminal end)이 항-인간 PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 중쇄 또는 경쇄 또는 둘 다의 C-말단 끝에 연결되는 이작용성 분자.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 키메라, 인간화된 또는 인간 항체인 이작용성 분자.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 항-인간 PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편이:
    (i) HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH), 및
    (ii) LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 이작용성 분자로서,
    여기서:
    - 중쇄 CDR1(HCDR1)이 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고;
    - 중쇄 CDR2(HCDR2)가 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고;
    - 중쇄 CDR3(HCDR3)이 서열 번호: 3의 아미노산 서열(여기서 X1은 D 또는 E이고 X2는 T, H, A, Y, N, E 및 S로 이루어진 그룹, 바람직하게는 H, A, Y, N, 및 E로 이루어진 그룹으로부터 선택된다)을 포함하거나 이로 이루어지고;
    - 경쇄 CDR1(LCDR1)이 서열 번호: 12의 아미노산 서열(여기서 X는 G 또는 T이다)을 포함하거나 이로 이루어지고;
    - 경쇄 CDR2(LCDR2)가 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고,
    - 경쇄 CDR3(LCDR3)이 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 이작용성 분자.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 항-인간 PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편이, (a) 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 VH(여기서 X1은 D 또는 E이고 X2는 T, H, A, Y, N, E 및 S로 이루어진 그룹, 바람직하게는 H, A, Y, N 및 E로 이루어진 그룹으로부터 선택된다); 및 (b) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 VL(여기서 X는 G 또는 T이다)을 포함하거나 이로 이루어진 이작용성 분자.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 항-인간 PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 (i) 서열 번호: 24의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 영역(VH); 및 (ii) 서열 번호: 28의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하거나 이로 이루어진 이작용성 분자.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 항-PD1 항체가 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 세미플리맙, PDR001, 및 모노클로날 항체 5C4, 17D8, 2D3, 4H1, 4A11, 7D3, 및 5F4로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 이작용성 분자.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, IL-7 또는 이의 변이체가 야생형 인간 IL-7(wth-IL-7)과 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 이작용성 분자.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, IL-7이 서열 번호: 51로 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 이작용성 분자.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, IL-7이 IL-7 변이체이고, 여기서 IL-7 변이체가 서열 번호: 51에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 야생형 인간 IL-7(wth-IL-7)과 적어도 75% 동일성을 나타내고, 여기서 변이체는 i) IL-7R에 대한 wth-IL-7의 친화성과 비교하여 IL-7 수용체(IL-7R)에 대한 IL-7 변이체의 친화성을 감소시키고, ii) wth-IL-7을 포함하는 이작용성 분자와 비교하여 IL-7 변이체를 포함하는 이작용성 분자의 약동학을 증진시키는 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 이작용성 분자.
  11. 제10항에 있어서, 적어도 하나의 돌연변이가 (i) C2S-C141S 및 C47S-C92S, C2S-C141S 및 C34S-C129S, 또는 C47S-C92S 및 C34S-C129S, (ii) W142H, W142F 또는 W142Y, (iii) D74E, D74Q 또는 D74N, iv) Q11E, Y12F, M17L, Q22E 및/또는 K81R; 또는 이의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 치환 또는 아미노산 치환의 그룹인 이작용성 분자.
  12. 제10항에 있어서, IL-7 변이체가 C2S-C141S 및 C47S-C92S, C2S-C141S 및 C34S-C129S, 및 C47S-C92S 및 C34S-C129S로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 치환의 그룹을 포함하는 이작용성 분자.
  13. 제10항에 있어서, IL-7 변이체가 W142H, W142F 및 W142Y로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 치환을 포함하는 이작용성 분자.
  14. 제10항에 있어서, IL-7 변이체가 D74E, D74Q 및 D74N으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 치환을 포함하는 이작용성 분자.
  15. 제1항 내지 제8항 및 제10항 중 어느 한 항에 있어서, IL-7 변이체가 서열 번호: 53 내지 66에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 이작용성 분자.
  16. 제1항 내지 제8항 및 제10항 중 어느 한 항에 있어서, IL-7 변이체가 서열 번호: 54, 56 또는 63에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 이작용성 분자.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 인간 카파 경쇄 불변 도메인으로부터 유래된 경쇄 불변 도메인 및 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 중쇄 불변 도메인, 바람직하게는 IgG1 또는 IgG4 중쇄 불변 도메인으로부터 유래된 중쇄 불변 도메인을 포함하는 이작용성 분자.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 임의로 T250Q/M428L; M252Y/S254T/T256E + H433K/N434F; E233P/L234V/L235A/G236A + A327G/A330S/P331S; E333A; S239D/A330L/I332E; P257I/Q311; K326W/E333S; S239D/I332E/G236A; N297A; L234A/L235A; N297A + M252Y/S254T/T256E; K322A 및 K444A로 이루어진 그룹, 바람직하게는 임의로 M252Y/S254T/T256E, 및 L234A/L235A와 함께 N297A로 이루어진 그룹으로부터 선택된 치환 또는 치환의 조합과 함께, 인간 카파 경쇄 불변 도메인으로부터 유래된 경쇄 불변 도메인 및 인간 IgG1 중쇄 불변 도메인으로부터 유래된 중쇄 불변 도메인을 포함하는 이작용성 분자.
  19. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편이, 임의로 S228P; L234A/L235A, S228P + M252Y/S254T/T256E.17 및 K444A로 이루어진 그룹으로부터 선택된 치환 또는 치환의 조합과 함께, 인간 카파 경쇄 불변 도메인으로부터 유래된 경쇄 불변 도메인 및 인간 IgG4 중쇄 불변 도메인으로부터 유래된 중쇄 불변 도메인을 포함하는 이작용성 분자.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 단편이 바람직하게는 (GGGGS)3, (GGGGS)4, (GGGGS)2, GGGGS, GGGS, GGG, GGS 및 (GGGS)3으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 링커 서열에 의해, 보다 바람직하게는 (GGGGS)3에 의해 IL-7 또는 이의 변이체에 연결되는 이작용성 분자.
  21. 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편이, 임의로 T250Q/M428L; M252Y/S254T/T256E + H433K/N434F; E233P/L234V/L235A/G236A + A327G/A330S/P331S; E333A; S239D/A330L/I332E; P257I/Q311; K326W/E333S; S239D/I332E/G236A; N297A; L234A/L235A; N297A + M252Y/S254T/T256E; K322A 및 K444A로 이루어진 그룹, 바람직하게는 임의로 M252Y/S254T/T256E, 및 L234A/L235A와 함께 N297A로 이루어진 그룹으로부터 선택된 치환 또는 치환의 조합과 함께, 인간 카파 경쇄 불변 도메인으로부터 유래된 경쇄 불변 도메인 및 인간 IgG1 중쇄 불변 도메인으로부터 유래된 중쇄 불변 도메인을 포함하고, 항체 또는 이의 단편이 IL-7 변이체에 링커 (GGGGS)3에 의해 연결되는 이작용성 분자.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 이작용성 분자를 암호화하는 단리된 핵산 분자 또는 단리된 핵산 분자의 그룹.
  23. 제22항에 따른 핵산 또는 핵산 분자의 그룹을 포함하는 벡터(vector).
  24. 제23항에 따른 벡터 또는 제22항에 따른 핵산 또는 핵산 분자의 그룹을 포함하는 숙주 세포.
  25. 제24항에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계 및 임의로 이작용성 분자를 단리하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 이작용성 분자를 생산하는 방법.
  26. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 이작용성 분자, 제22항에 따른 핵산 또는 핵산 분자의 그룹, 제23항에 따른 벡터 또는 제24항에 따른 숙주 세포 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  27. 제26항에 있어서, 알킬화제, 혈관형성 억제제, 항체, 항대사제, 항유사분열제(antimitotic), 항증식제, 항바이러스제, 아우로라 키나제 억제제(aurora kinase inhibitor), 세포자멸사 프로모터(예를 들면, Bcl-2 계열 억제제), 사멸 수용체 경로의 활성인자, Bcr-Abl 키나제 억제제, BiTE(이-특이적인 T 세포 인게이저(Engager)) 항체, 항체 약물 접합체, 생물학적 반응 개질제, 브루톤 타이로신 키나제(Bruton's tyrosine kinase)(BTK) 억제제, 사이클린-의존성 키나제 억제제, 세포 주기 억제제, 사이크롤옥시게나제-2 억제제, DVD, 백혈병 바이러스 종양유전자 동족체(leukemia viral oncogene homolog)(ErbB2) 수용체 억제제, 성장 인자 억제제, 열 쇼크 단백질(heat shock 단백질)(HSP)-90 억제제, 히스톤 데아세틸라제(HDAC) 억제제, 호르몬 치료요법, 면역제(immunological), 세포자멸사 단백질의 억제제(Inhibitor of apoptosis 단백질)(IAP)의 억제제, 인터컬레이팅 항생제(intercalating antibiotic), 키나제 억제제, 키네신 억제제, Jak2 억제제, 라파마이신 억제제의 포유동물 표적, 마이크로RNA, 유사분열물질-활성화된 세포 신호-조절된 키나제 억제제, 다가 결합 단백질, 비-스테로이드성 소염 약물(non-steroidal anti-inflammatory drug)(NSAID), 폴리 ADP(아데노신 디포스페이트)-리보스 폴리머라제(PARP) 억제제, 백금 화학치료제, 폴로-유사 키나제(polo-like kinase)(Plk) 억제제, 포스포이노시티드-3 키나제(phosphoinositide-3 kinase)(PI3K) 억제제, 프로테오솜(proteasome) 억제제, 푸린 유사체, 피리미딘 유사체, 수용체 타이로신 키나제 억제제, 레티노이드/델토이드 식물 알칼로이드, 작은 억제성 리보핵산(small inhibitory ribonucleic acid(siRNA), 토포이소머라제 억제제, 유비퀴틴 리가제 억제제, 하이포메틸화제, 체크포인트 억제제, 펩타이드 백신 등, 종양 항원으로부터의 에피토프 또는 네오에피토프(neoepitope) 뿐만 아니라 이러한 제제 하나 이상의 조합으로 이루어진 그룹에서 선택된 추가의 치료제를 추가로 포함하는 약제학적 조성물.
  28. 의약으로서 사용하기 위한, 제26항 또는 제27항에 따른 약제학적 조성물, 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 이작용성 분자, 제22항에 따른 핵산 또는 핵산 분자의 그룹, 또는 제23항에 따른 벡터, 또는 제24항에 따른 숙주 세포.
  29. 암으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 질환의 치료시 사용하기 위한, 제28항에 따라 사용하기 위한 약제학적 조성물, 이작용성 분자, 핵산 또는 핵산 분자의 그룹, 벡터, 또는 숙주 세포.
  30. 제29항에 있어서, 암이 혈액 악성 종양(hematologic malignancy) 또는 PD-1 및/또는 PD-L1의 발현과 관련된 고형 종양, 예를 들면, 혈액림프구 신생물(hematolymphoid neoplasm), 혈관면역모구 T 세포 림프종, 골수이형성 증후군, 및 급성 골수성 백혈병으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 암, 바이러스에 의해 유도되거나 면역결핍증과 관련된 암, 예를 들면, 카포시 육종(예컨대, 카포시 육종 헤르페스 바이러스와 관련됨); 자궁경부, 항문, 음경 및 외음부 편평 세포 암 및 구강인두 암(예컨대, 인간 파필로마 바이러스와 관련됨); B 세포 비-호지킨 림프종(NHL), 예를 들면, 광범위 큰 B-세포 림프종, 버킷 림프종(Burkitt lymphoma), 형질모세포 림프종, 원발성 중추신경계 림프종, HHV-8 원발성 흉막삼출성 림프종, 전통적인 호지킨 림프종, 및 림프증식성 장애(예컨대, 엡슈타인-바르 바이러스(Epstein-Barr virus)(EBV) 및/또는 카포시 육종 헤르페스 바이러스(Kaposi sarcoma herpes virus)와 관련됨); 간세포 암종(예컨대, B형 및/또는 C형 바이러스와 관련됨); 메르켈 세포 암종(Merkel cell carcinoma)(예컨대, 메르켈 세포 폴리오마 바이러스(Merkel cell polyoma virus)(MPV)와 관련됨)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 암; 및 인간 면역결핍성 바이러스(human immunodeficiency virus)(HIV) 감염과 관련된 암, 및 전이성 또는 비전이성의, 흑색종, 악성 중피종, 비-소 세포 폐암, 신장 세포 암종, 호지킨 림프종, 두경부 암, 요로상피세포 암종, 결장직장 암, 간세포 암종, 소 세포 폐암, 전이성 메르켈 세포 암종, 위 암 또는 위식도 암 및 자궁경부 암으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 약제학적 조성물, 이작용성 분자, 핵산 또는 핵산 분자의 그룹, 벡터, 또는 숙주 세포.
  31. 제28항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 방사선치료요법 또는 바람직하게는 알킬화제, 혈관형성 억제제, 항체, 항대사제, 항유사분열제, 항증식제, 항바이러스제, 아우로라 키나제 억제제, 세포자멸사 증진제(apoptosis promoters)(예를 들면, Bcl-2 계열 억제제), 사멸 수용체 경로의 활성인자, Bcr-Abl 키나제 억제제, BiTE(이-특이적 T 세포 인게이저) 항체, 항체 약물 접합제, 생물학적 반응 개질제, 브루톤 타이로신 키나제(BTK) 억제제, 사이클린-의존성 키나제 억제제, 세포 주기 억제제, 사이클로옥시게나제-2 억제제, DVD, 백혈병 바이러스 종양유전자 동족체(ErbB2) 수용체 억제제, 성장 인자 억제제, 열 쇼크 단백질(HSP)-90 억제제, 히스톤 데아세틸라제(HDAC) 억제제, 호르몬 치료요법, 면역제, 세포자멸사 단백질의 억제제(IAP)의 억제제, 인터컬레이팅 항체, 키나제 억제제, 키네신 억제제, Jak2 억제제, 라파마이신 억제제의 포유동물 표적, 마이크로RNA, 유사분열물질-활성화된 세포외 신호-조절된 키나제 억제제, 다가 결합 단백질, 비-스테로이드성 소염 약물(NSAID), 폴리 ADP(아데노신 디포스페이트)-리보스 폴리머라제(PARP) 억제제, 백금 화학치료제, 폴로-유사 키나제(Plk) 억제제, 포스포이노시티드-3 키나제(PI3K) 억제제, 프로테오솜 억제제, 푸린 유사체, 피리미딘 유사체, 수용체 타이로신 키나제 억제제, 레티노이드/델토이드 식물 알칼로이드, 작은 억제성 리보핵산(siRNA), 토포이소머라제 억제제, 유비퀴틴 리가제 억제제, 저메틸화제(hypomethylating agent), 체크포인트 억제제, 펩타이드 백신 등, 에피토프 또는 종양 항원으로부터의 네오에피토프 뿐만 아니라 이러한 제제 하나 이상의 조합으로 이루어진 그룹에서 선택된 추가의 치료제와 함께 사용하기 위한, 약제학적 조성물, 이작용성 분자, 핵산 또는 핵산 분자의 그룹, 벡터, 또는 숙주 세포.
  32. 제28항에 있어서, 감염성 질환, 바람직하게는 만성 감염성 질환, 심지어 보다 바람직하게는 만성 바이러스 감염의 치료에 사용하기 위한, 약제학적 조성물, 이작용성 분자, 핵산 또는 핵산 분자의 그룹, 벡터 또는 숙주 세포.
  33. 제32항에 있어서, 감염성 질환이 HIV, 간염 바이러스, 헤르페스 바이러스(herpes virus), 아데노바이러스(adenovirus), 인플루엔자 바이러스(influenza virus), 플라비바이러스(flavivirus), 에코바이러스(echovirus), 리노바이러스(rhinovirus), 콕사키에 바이러스(coxsackie virus), 코로나바이러스(coronavirus), 호흡기 합포체 바이러스(respiratory syncytial virus), 멈프스 바이러스(mumps virus), 로타바이러스(rotavirus), 홍역 바이러스, 루벨라 바이러스(rubella virus), 파라보바이러스(parvovirus), 박시니아 바이러스(vaccinia virus), HTLV 바이러스, 뎅기열 바이러스(dengue virus), 파필로마바이러스(papillomavirus), 연우종 바이러스(molluscum virus), 폴리오바이러스(poliovirus), 라비스 바이러스(rabies virus), JC 바이러스 및 아르보바이러스성 뇌염 바이러스(arboviral encephalitis virus)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 바이러스에 의해 유발된, 사용하기 위한 약제학적 조성물, 이작용성 분자, 핵산 또는 핵산 분자의 그룹, 벡터 또는 숙주 세포.
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3883966B1 (en) 2018-12-21 2023-07-12 OSE Immunotherapeutics Humanized anti-human-pd-1 antibody
CR20220512A (es) 2020-04-15 2022-11-07 Hoffmann La Roche Inmunoconjugados
KR20230129441A (ko) 2020-12-17 2023-09-08 오제 이뮈노테라프틱스 이기능성 항-pd1/il-7 분자
WO2022214653A1 (en) 2021-04-09 2022-10-13 Ose Immunotherapeutics New scaffold for bifunctional molecules with improved properties
WO2023046047A1 (zh) * 2021-09-27 2023-03-30 盛禾(中国)生物制药有限公司 一种异源二聚体蛋白质及其应用
WO2023062048A1 (en) 2021-10-14 2023-04-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Alternative pd1-il7v immunoconjugates for the treatment of cancer
CA3234731A1 (en) 2021-10-14 2023-04-20 F. Hoffmann-La Roche Ag New interleukin-7 immunoconjugates
CN117050178B (zh) * 2023-10-13 2024-01-12 北京百普赛斯生物科技股份有限公司 特异性检测il-7的抗体及应用

Family Cites Families (109)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
ZA887773B (en) 1987-10-26 1989-07-26 Immunex Corp Interleukin-7
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5354844A (en) 1989-03-16 1994-10-11 Boehringer Ingelheim International Gmbh Protein-polycation conjugates
US5108921A (en) 1989-04-03 1992-04-28 Purdue Research Foundation Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules
DE122004000008I1 (de) 1991-06-14 2005-06-09 Genentech Inc Humanisierter Heregulin Antikörper.
PT1498427E (pt) 1992-08-21 2010-03-22 Univ Bruxelles Imunoglobulinas desprovidas de cadeias leves
US5275285A (en) 1992-12-30 1994-01-04 Clegg Industries Business card holder with sound generating microchip
EP0739981A1 (en) 1995-04-25 1996-10-30 Vrije Universiteit Brussel Variable fragments of immunoglobulins - use for therapeutic or veterinary purposes
PT1034298E (pt) 1997-12-05 2012-02-03 Scripps Research Inst Humanização de anticorpo murino
DK1252192T3 (da) 2000-02-11 2006-11-20 Merck Patent Gmbh Forbedring af antistofbaserede fusionsproteiners serumhalveringstid
MXPA03008031A (es) 2001-03-07 2003-12-04 Merck Patent Gmbh Tecnologia de expresion para proteinas que contienen porcion de anticuerpo isotipo hibrida.
EP1391513A1 (en) 2002-08-08 2004-02-25 Cytheris IL-7 drug substance, IL-7 comprising composition, preparation and uses thereof
BRPI0418286A (pt) 2003-12-30 2007-05-02 Merck Patent Gmbh proteìnas de fusão de il-7
RU2386638C2 (ru) 2004-03-31 2010-04-20 Дженентек, Инк. Гуманизированные анти-тфр-бета-антитела
EP1626059A1 (en) 2004-08-09 2006-02-15 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Angiogenic and immunologic applications of anti-CD160 specific compounds obtainable from mAb CL1-R2
WO2010006071A1 (en) 2008-07-08 2010-01-14 La Jolla Institute For Allergy And Immunology Hvem/btla, hvem/cd160 and hvem/gd cis complexes and methods of use
KR20070085886A (ko) 2004-12-09 2007-08-27 메르크 파텐트 게엠베하 감소된 면역원성의 ｉｌ-7 변이체
AU2006244885B2 (en) 2005-05-09 2011-03-31 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Human monoclonal antibodies to programmed death 1(PD-1) and methods for treating cancer using anti-PD-1 antibodies alone or in combination with other immunotherapeutics
BRPI0612408A2 (pt) 2005-07-07 2010-11-03 Pfizer terapia para tratamento de cáncer em combinação com anticorpo anti-ctla-4 e oligodesoxinucleotìdeo sintético contendo o motivo cpg
EP1746161A1 (en) 2005-07-20 2007-01-24 Cytheris Glycosylated IL-7, preparation and uses
EA200970477A1 (ru) 2006-11-15 2009-12-30 Медарекс, Инк. Человеческие моноклональные антитела к btla и способы применения
EP1987839A1 (en) 2007-04-30 2008-11-05 I.N.S.E.R.M. Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale Cytotoxic anti-LAG-3 monoclonal antibody and its use in the treatment or prevention of organ transplant rejection and autoimmune disease
WO2009100140A1 (en) 2008-02-04 2009-08-13 Medarex, Inc. Anti-clta-4 antibodies with reduced blocking of binding of ctla-4 to b7 and uses thereof
AR072999A1 (es) 2008-08-11 2010-10-06 Medarex Inc Anticuerpos humanos que se unen al gen 3 de activacion linfocitaria (lag-3) y los usos de estos
EP2210903A1 (en) 2009-01-21 2010-07-28 Monoclonal Antibodies Therapeutics Anti-CD160 monoclonal antibodies and uses thereof
EP3002296B1 (en) 2009-03-17 2020-04-29 Université d'Aix-Marseille Btla antibodies and uses thereof
EP3199551A3 (en) 2009-07-31 2017-10-18 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Fully human antibodies to btla
AU2011262758B8 (en) 2010-06-11 2014-09-04 Kyowa Kirin Co., Ltd. Anti-tim-3 antibody
GB201103955D0 (en) 2011-03-09 2011-04-20 Antitope Ltd Antibodies
WO2013006490A2 (en) 2011-07-01 2013-01-10 Cellerant Therapeutics, Inc. Antibodies that specifically bind to tim3
KR20140025836A (ko) * 2012-08-22 2014-03-05 한화케미칼 주식회사 항 ＨＥＲ2/Ｎｅｕ 단일클론항체와 ＩＬ-7가 연결된 융합 단일클론 항체 및 이를 포함하는 암 치료용 조성물
EP2911669B1 (en) * 2012-10-26 2024-04-10 The University of Chicago Synergistic combination of immunologic inhibitors for the treatment of cancer
CN105683217B (zh) 2013-05-31 2019-12-10 索伦托治疗有限公司 与pd-1结合的抗原结合蛋白
WO2015069770A1 (en) * 2013-11-05 2015-05-14 Cognate Bioservices, Inc. Combinations of checkpoint inhibitors and therapeutics to treat cancer
ES2843546T3 (es) 2014-04-18 2021-07-19 The Research Foundation Of The State Univ Of New York Anticuerpos humanizados anti-antígeno-TF
CN105296433B (zh) 2014-08-01 2018-02-09 中山康方生物医药有限公司 一种ctla4抗体、其药物组合物及其用途
AP2017009765A0 (en) 2014-08-19 2017-02-28 Merck Sharp & Dohme Anti-tigit antibodies
KR102644115B1 (ko) 2014-12-23 2024-03-05 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 Tigit에 대한 항체
WO2016130986A1 (en) 2015-02-13 2016-08-18 Sorrento Therapeutics, Inc. Antibody therapeutics that bind ctla4
MA41867A (fr) 2015-04-01 2018-02-06 Anaptysbio Inc Anticorps dirigés contre l'immunoglobuline de cellule t et protéine 3 de mucine (tim-3)
TWI715587B (zh) 2015-05-28 2021-01-11 美商安可美德藥物股份有限公司 Ｔｉｇｉｔ結合劑和彼之用途
PL3303394T3 (pl) 2015-05-29 2020-11-16 Agenus Inc. Przeciwciała anty-ctla-4 i sposoby ich zastosowania
LT3328419T (lt) 2015-07-30 2021-11-10 Macrogenics, Inc. Pd-1 surišančios molekulės ir jų panaudojimo būdai
AU2016306597A1 (en) * 2015-08-07 2018-02-22 Pieris Pharmaceuticals Gmbh Novel fusion polypeptide specific for LAG-3 and PD-1
WO2017024465A1 (en) 2015-08-10 2017-02-16 Innovent Biologics (Suzhou) Co., Ltd. Pd-1 antibodies
CN105111314B (zh) * 2015-08-13 2019-01-08 成都百世博生物技术有限公司 一种新型融合蛋白、药物组合物及其制备方法和用途
CN115925931A (zh) 2015-08-14 2023-04-07 默沙东公司 抗tigit抗体
BR112018003186A2 (pt) 2015-09-01 2018-09-25 Agenus Inc. anticorpos anti-pd-1 e seus métodos de uso
WO2017037707A1 (en) 2015-09-02 2017-03-09 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Antibodies specific to human t-cell immunoglobulin and itim domain (tigit)
CR20180225A (es) 2015-09-25 2018-07-09 Genentech Inc Anticuerpo anti-tigit y métodos de uso
JO3739B1 (ar) 2015-11-18 2021-01-31 Merck Sharp & Dohme روابط ctla4
EP3383904A4 (en) 2015-11-19 2019-12-04 Zeling Cai CTLA-4 ANTIBODIES AND USES THEREOF
KR20180100122A (ko) 2015-12-02 2018-09-07 주식회사 에스티사이언스 당화된 btla(b- 및 t-림프구 약화인자)에 특이적인 항체
BR112018012113A2 (pt) 2015-12-15 2018-12-04 Oncoimmune Inc anticorpos monoclonais de ctla4 anti-humana quiméricos e humanizados e usos dos mesmo
BR112018014615A2 (pt) 2016-01-20 2018-12-11 The Scripps Research Institute composições de anticorpo para ror1 e métodos relacionados
EP3402255B1 (en) 2016-02-02 2021-03-31 Huawei Technologies Co., Ltd. Emission power verification method, user equipment, and base station
WO2017132827A1 (en) 2016-02-02 2017-08-10 Innovent Biologics (Suzhou) Co., Ltd. Pd-1 antibodies
JP6991979B2 (ja) * 2016-02-05 2022-03-04 オリオニス バイオサイエンシズ ビーブイ Ｃｄ８結合物質
MX2018010295A (es) 2016-02-26 2019-06-06 Inst Nat Sante Rech Med Anticuerpos que tienen especificidad para atenuador de linfocitos b y t (btla) y usos de los mismos.
KR102355950B1 (ko) 2016-03-04 2022-01-26 제이엔 바이오사이언시즈 엘엘씨 Tigit에 대한 항체
SG10201603721TA (en) 2016-05-10 2017-12-28 Agency Science Tech & Res Anti-CTLA-4 Antibodies
NL2017270B1 (en) 2016-08-02 2018-02-09 Aduro Biotech Holdings Europe B V New anti-hCTLA-4 antibodies
MY194032A (en) 2016-08-17 2022-11-09 Compugen Ltd Anti-tigit antibodies, anti-pvrig antibodies and combinations thereof
WO2018035710A1 (en) 2016-08-23 2018-03-01 Akeso Biopharma, Inc. Anti-ctla4 antibodies
PL3512547T3 (pl) 2016-09-14 2021-03-08 Abbvie Biotherapeutics Inc. Przeciwciała anty-pd-1
US10618962B2 (en) 2016-10-10 2020-04-14 Crown Bioscience (Taicang) Inc. Anti-CTLA4 antibodies
CN110121508A (zh) 2016-10-25 2019-08-13 法国国家健康和医学研究院 与cd160跨膜同种型结合的单克隆抗体
MA46113A (fr) 2016-11-01 2019-07-10 Anaptysbio Inc Anticorps dirigés contre l'immunoglobuline de lymphocyte t et la protéine 3 de mucine (tim-3)
JP7126269B2 (ja) 2016-11-30 2022-08-26 メレオ バイオファーマ ５ インコーポレイテッド Ｔｉｇｉｔ結合物質を含む、がんの処置のための方法
WO2018102746A1 (en) 2016-12-02 2018-06-07 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Antigen binding molecules to tigit
CA3046082A1 (en) 2016-12-07 2018-06-14 Agenus Inc. Antibodies and methods of use thereof
JP6992068B2 (ja) 2016-12-07 2022-02-03 アジェナス インコーポレイテッド 抗ｃｔｌａ－４抗体およびそれらの使用方法
CN108250303B (zh) * 2016-12-19 2023-01-03 南京金斯瑞生物科技有限公司 单域抗体融合蛋白及其应用
CN110382000A (zh) 2017-01-09 2019-10-25 泰萨罗公司 用抗tim-3抗体治疗癌症的方法
CN110431150A (zh) 2017-01-18 2019-11-08 威特拉公司 抗体分子-药物偶联物及其用途
US11319372B2 (en) 2017-02-21 2022-05-03 Remd Biotherapeutics, Inc. Cancer treatment using antibodies that bind cytotoxic T-lymphocyte antigen-4 (CTLA-4)
MX2019009660A (es) 2017-02-28 2019-10-02 Bristol Myers Squibb Co Uso de anticuerpos antigeno 4 del linfocito t (ctla-4) con citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (adcc) mejorada para mejorar la respuesta inmune a una vacuna.
MX2019010206A (es) 2017-02-28 2019-12-11 Seattle Genetics Inc Anticuerpos anti inmunorreceptor de linfocitos t con dominios de motivo de inactivación basado en tirosina de inmunorreceptor e inmunoglobulina (tigit).
JP2020513819A (ja) 2017-03-15 2020-05-21 スージョウ ギャラクシー バイオファーマ カンパニー リミテッド Ｃｔｌａ４抗体、医薬組成物およびその使用
BR112019017329A2 (pt) * 2017-04-03 2020-04-14 Hoffmann La Roche imunoconjugados, um ou mais polinucleotídeos e vetores, métodos para a produção de um imunoconjugado, tratamento de uma doença e para a estimulação do sistema imunológico, composição, uso do imunoconjugado, invenção e usos da composição
JP7160833B2 (ja) 2017-04-13 2022-10-25 サイロパ ビー．ブイ． 抗ｓｉｒｐアルファ抗体
EP3615070A1 (en) 2017-04-26 2020-03-04 Bristol-Myers Squibb Company Methods of antibody production that minimize disulfide bond reduction
PL3618863T3 (pl) 2017-05-01 2023-11-06 Agenus Inc. Przeciwciała anty- tigit i sposoby ich zastosowania
CA3060618A1 (en) 2017-05-19 2018-11-22 Wuxi Biologics (Shanghai) Co. Ltd. Novel monoclonal antibodies to cytotoxic t-lymphocyte-associated protein 4 (ctla-4)
WO2019023504A1 (en) 2017-07-27 2019-01-31 Iteos Therapeutics Sa ANTI-TIGIT ANTIBODIES
TWI799432B (zh) 2017-07-27 2023-04-21 美商再生元醫藥公司 抗ctla-4抗體及其用途
AU2017432728A1 (en) 2017-09-21 2020-02-27 Eucure (Beijing) Biopharma Co. Ltd. Anti-CTLA4 antibodies and uses thereof
EP3684369A4 (en) 2017-09-23 2021-06-23 Memorial Sloan Kettering Cancer Center A33-ANTIBODY COMPOSITIONS AND METHOD OF USING THEREOF IN RADIOIMMUNOTHERAPY
CN111051347B (zh) 2017-09-29 2021-12-21 江苏恒瑞医药股份有限公司 Tigit抗体、其抗原结合片段及医药用途
DK3710484T3 (da) 2017-12-20 2023-11-27 Harbour Biomed Shanghai Co Ltd Ctla-4-bindende antistoffer og anvendelser deraf
US11905327B2 (en) 2017-12-28 2024-02-20 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Single-domain antibodies and variants thereof against TIGIT
TWI816729B (zh) 2017-12-30 2023-10-01 英屬開曼群島商百濟神州有限公司 抗tigit抗體及其作為治療和診斷的用途
KR20200109313A (ko) 2018-01-15 2020-09-22 난징 레전드 바이오테크 씨오., 엘티디. Tigit에 대한 항체 및 이의 변이체
EP3568417A4 (en) * 2018-01-25 2020-07-15 I-Mab Biopharma US Limited ANTI-PD-L1 ANTIBODIES AND IL-7 FUSIONS
US20210363243A1 (en) 2018-02-01 2021-11-25 Merck Sharp & Dohme Corp. Methods for treating cancer or infection using a combination of an anti-pd-1 antibody, an anti-lag3 antibody, and an anti-tigit antibody
WO2019148444A1 (en) 2018-02-02 2019-08-08 Adagene Inc. Anti-ctla4 antibodies and methods of making and using the same
KR102224556B1 (ko) 2018-02-06 2021-03-09 아이-맵 바이오파마 유에스 리미티드 Ig 및 itim 도메인을 갖는 t 세포 면역 수용체 (tigit)에 대한 항체 및 이것의 사용
MX2020008795A (es) 2018-02-28 2020-10-08 Yuhan Corp Anti cuerpos anti tigit y usos de los mismos.
US20210024632A1 (en) 2018-03-05 2021-01-28 Etablissement Francais Du Sang Recombinant single chain immunoglobulins
CN110272490B (zh) 2018-03-14 2021-05-14 上海开拓者生物医药有限公司 靶向ctla-4抗体、其制备方法和用途
WO2019179391A1 (en) 2018-03-19 2019-09-26 Wuxi Biologics (Shanghai) Co., Ltd. Novel bispecific pd-1/ctla-4 antibody molecules
WO2019179388A1 (en) 2018-03-19 2019-09-26 Wuxi Biologics (Shanghai) Co., Ltd. Novel anti-ctla-4 antibody polypeptide
CA3097679A1 (en) 2018-05-09 2019-11-14 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Antibodies specific to human nectin4
WO2019232484A1 (en) 2018-06-01 2019-12-05 Compugen Ltd Anti-pvrig/anti-tigit bispecific antibodies and methods of use
JP2022515223A (ja) * 2018-12-21 2022-02-17 オーエスイー・イミュノセラピューティクス ヒトｐｄ－１に対する二機能性分子
EP3883966B1 (en) * 2018-12-21 2023-07-12 OSE Immunotherapeutics Humanized anti-human-pd-1 antibody
CN114369167A (zh) * 2020-10-15 2022-04-19 苏州泽璟生物制药股份有限公司 抗pd-l1抗体和il-7构成的双功能融合蛋白
CN116848140A (zh) * 2020-12-17 2023-10-03 Ose免疫疗法公司 双功能抗pd1/il-7分子

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