KR20210107062A - 이작용성 항-PD-1/SIRPα 분자 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 항-PD-1 항체 및 SIRPa를 포함하는 이작용성 분자 및 그의 용도에 관한 것이다.

Description

이작용성 항-PD-1/SIRPα 분자
본 발명은 면역요법 분야에 관한 것이다. 본 발명은 SIRPa에 연결된 항-PD1 항체 또는 이의 항체 단편을 포함하는 이작용성 분자 및 이의 용도를 제공한다.
치료용 항체를 이용한 탈 억제를 위한 T 세포 억제 체크포인트를 표적화하는 접근법은 집중적인 조사 영역이다(검토를 위해 문헌[Pardoll, Nat Rev Cancer. 2012; 12:253-264] 참조). 적응 면역의 면역 체크포인트를 표적화하는 것은 제한된 비율의 환자에게만 수많은 암과 싸우는 데 큰 치료 효과를 보였다. 선천성 골수 세포(대식세포, 수지상 세포, MDSC, PMN)에 대한 면역 체크포인트는 여전히 제대로 연구되지 않았지만, 이러한 세포는 많은 고형 종양에서 가장 풍부한 면역 세포 유형을 나타내며, 종종 결과가 좋지 않다. 선천성(골수성 세포에 의해 매개됨) 및 적응성(T 세포에 의해 매개됨) 면역 반응을 모두 표적화하는 면역 체크포인트 요법을 결합하여 전임상 모델에서 큰 효율성을 입증하였지만 임상에서는 여전히 도전 과제이다.
면역 세포 활성화는 균형 공동-자극 및 공동-억제 신호의 통합에 의해 제어된다. T 세포 수용체(TCR)-매개 T 세포 활성화는 공동-자극 및 공동-억제 신호 모두에 의해 조절된다. 항원-독립적인 제2 신호는 항원성 펩타이드-MHC 복합체와 TCR의 상호작용에 의해 제공되는 제1 신호를 변형시켜 반응에 특이성을 부여한다. T 세포 공동-자극 및 공동-억제 경로는 광범위한 면역조절 기능, 조절 이펙터, 기억 및 조절 T 세포뿐만 아니라 나이브 T 세포를 갖는다. 이러한 경로의 치료적 조절은 암 치료를 위한 효과적인 새로운 전략으로 전환되고 있다(검토를 위해, 문헌[Schildberg et al., 44(5), Immunity, 2016] 참조). 면역 반응의 조절에 대한 지속적인 연구를 통해 암 치료법의 개발을 목표로 할 수 있는 여러 면역학적 경로가 확인되었다. 이러한 분자는 본원에서 면역 체크포인트 공동-활성화제 또는 공동-억제제로 지칭된다(검토를 위해, 문헌[Sharma et al., Cell, 161(2), 2015] 및 [Pardoll, Nature Reviews Cancer, 12(4), 2012] 참조).
프로그래밍된 세포 사멸 단백질 1(PD-1, CD279라고도 함)은 면역글로불린 수퍼패밀리에 속하는 세포 표면 단백질 분자이다. T 및 B 림프구와 대식세포에서 발현되며, 세포 운명과 분화에 중요한 역할을 한다. 특히 면역 체크포인트 역할을 하는 PD-1은 T 세포의 활성화를 막아 면역 체계를 하향조절하는 데 중요한 역할을 하여, 이는 차례로 자가면역을 감소시키고 자기-내성을 촉진한다. PD-1에 대한 2개의 리간드인 PD-L1 및 PD-L2가 확인되었으며, 이는 PD-1에 결합할 때 T 세포 활성화를 하향조절하는 것으로 나타났다(문헌[Freeman et al. (2000) J Exp Med 192:1027-34]; [Latchman et al. (2001) Nat Immunol 2:261-8]; 문헌[Carter et al. (2002) Eur J Immunol 32:634-43]). PD-1과 그의 리간드 사이의 상호작용으로 인해 종양 침윤 림프구의 감소, T-세포 수용체 매개 증식의 감소, 및 암세포에 의한 면역 회피가 초래된다. 특히, PD1 결찰은 T 세포에 대한 TCR 자극의 하류 신호를 감소시켜 T 세포 반응을 억제하여 활성화 및 사이토카인 생성을 감소시킨다.
항-PD1 및 항-PDL1 억제제를 사용하여 이들의 상호작용을 방해하는 두 가지 전략 모두 암 치료에서 성공했다(문헌[Brahmer et al., N Eng J Med, 366(26), 2012]; [Powles et al., Nature, 515(7528), 2014]; [Topalian et al., N Eng J Med, 366(26), 2012]; [Ansell, Curr Opin Hematol, 22(4), 2015]). 그러나, 종양 미세-환경 내에서 면역억제 및 저-자극 골수 세포의 축적은 T-세포 반응의 효율성과 면역요법, 특히 PD-1/PD-L1과 같은 면역 체크포인트에서 표적화하는 면역요법의 효능을 제한한다. 예를 들어, 췌장암, 비 MSI 결장직장암, 위암 및 일부 유방암 아형에서 임상 반응이 낮거나 전혀 나타나지 않았다(문헌[Brahmer et al., N Engl J Med. 2012 Jun 28; 366(26):2455-65], [Feng et al., Cancer Lett. 2017 Oct 28; 407:57-65], [Borcherding et al., J Mol Biol. 2018 Jul 6; 430(14):2014-2029]). (1) 기억 T 세포 형성 장애, (2) T 세포 침윤 장애, (3) 종양 특이적 T 세포의 불충분한 생성, (4) T 세포의 부적절한 기능, 및 (5) 조절 T 세포에 의해 유도된 면역억제 미세환경과 같은, 여러 메커니즘이 설명되어 있으며, PD-1/PD-L1 체크포인트 요법에 대한 이러한 낮은 효능과 내성을 설명할 수 있다.
현재까지 대부분의 치료법은 PD-1/PD-L1 축을 표적화하여 고갈된 T 세포를 구제하고 항종양 반응을 복원하는 제제를 포함하여, 암을 공격하는 적응 면역계를 자극하는 데 초점을 두었다(문헌[Brahmer et al., N Eng J Med, 366(26), 2012]; [Topalian et al., N Eng J Med, 366(26), 2012]; [Wolchok et al., N Engl J Med. 2013 Jul 11; 369(2):122-133]). 그러나 대식세포 및 기타 골수성 면역 세포는 암 면역요법의 이펙터로서의 가능성을 제공한다. CD47/신호 조절 단백질 알파(SIRPα) 축은 골수 세포 활성화의 중요한 조절자이며, 골수-특이적 면역 체크포인트로서 광범위한 역할을 한다.
신호 조절 단백질 알파 또는 SIRPa(SIRPα, CD172a 또는 SHPS-1으로도 지정됨)는 단핵구, 조직 대식세포의 대부분의 하위집단, 과립구, 림프 조직의 수지상 세포 하위집합, 일부 골수 전구 세포에서, 그리고 뇌의 시냅스-풍부한 영역에서 현저하게 높은 발현을 보이는, 뉴런 상에서 다양한 수준으로 발현된다. 골수 세포에 의해 발현되는 SIRPa와 일부 암 세포에서 과발현되지만 대부분의 건강한 세포에 의해 낮은 수준으로 널리 발현되는 유비쿼터스 CD47과의 상호작용은 골수 기능의 조절과 관련된 선천적 반응의 또 다른 중요한 면역 체크포인트이다. CD47은 SIRPa와 상호작용하여“나를 먹지 마시오”신호를 식세포의 대식세포로 전달하여 표적 세포에 남아 잠재적으로 종양 세포가 영향을 받지 않게 한다. 대식세포에 의한 항체-의존성 식세포작용을 강화함으로써 CD47을 표적화하는 작용제를 통한 CD47/SIRPa 경로의 차단은 치료용 항암 항체를 고갈시켜 시너지 효과를 내고, 다양한 전임상 모델에서 시험관 내에서 암세포의 식균작용을 자극하고, 생체 내에서 항-종양 면역 반응을 자극하는 것으로 설명되었다.
발명의 내용
항-PD1 면역요법의 효능을 높이고 환자에서 잠재적인 항 PD-1 내성을 극복하기 위해, SIRPα/CD47을 표적화하는 병용 치료법을 개발하는 것이 좋은 전략이 될 수 있다. 따라서, 적응성 면역 반응, 특히 T 세포 면역 반응에 효과적인 긍정적인 영향을 미치는 선천성 골수성 면역 세포를 표적화하는, 특히 암에 대한 안전한 면역요법을 위한 새롭고 개선된 작용제에 대한 당 업계에 상당한 요구가 남아있다. 본 발명자들은 본원에 개시된 발명으로 상당한 진전을 이루었다. 강력한 유익하고 예상치 못한 효과는 특히 상세한 설명의 시작 부분과 실시예에서 개시되고 설명된다. 본 발명자들은 항-hPD-1 항체, 및 특히 암 치료를 위한 수많은 치료적 적용을 위한 유망한 인간 SIRPα를 포함하는 이작용성 분자를 제공한다. 본 발명은 PD-1에 대한 높은 결합 친화도 및 그의 리간드 PDL-1 및 PD-L2와의 강력한 경쟁을 보이는 인간 PD-1을 특이적으로 표적화하는 항체의 개발에 기초한다. 놀랍게도, SIRPa의 N-말단 단부를 항-hPD-1 항체의 Fc 영역의 C-말단 단부에 융합하면 CD47(SIRPa 리간드)에 대한 높은 친화도를 보존하여 내인성 SIRPa까지 유사하게 확장할 수 있다. Fc 도메인과 SIRPa의 융합은 또한 제품 반감기를 증가시킨다. 더욱이, 본원에 개시된 이작용성 항-PD1-SIRPa 분자는 항 PD-1 단독에 비해 T 세포의 활성화(NFAT 매개 활성화)를 강화시킨다. 특히, 항-PD1-SIRPa 이작용성 분자는 사이토카인(예를 들어, IFNγ) 분비에 의해 반영된 나이브한, 부분적으로 고갈된 하위집단의 증식 및 활성화를 유도한다. 이작용성 항-PD1-SIRPa 분자는 놀라운 상승 효과를 보여준다. 이러한 항-hPD1-SIRPa 이작용성 분자는 관련된 내성 메커니즘을 극복하고 항 PD-1 면역요법의 효능을 개선하는 능력을 갖는다.
제1 양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 이작용성 분자에 관한 것이며:
(a) 하기를 포함하는 항-인간 PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편:
(i) HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH), 및
(ii) LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL), 및
(b) 인간 SIRPa 또는 이의 단편 또는 변이체,
여기서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 중쇄 및/또는 경쇄(들)의 C-말단 단부는 융합 단백질로서, 바람직하게는 펩타이드 링커에 의해 SIRPa 또는 이의 단편 또는 변이체의 N-말단 단부에 공유적으로 연결된다.
특히, 항체는 키메라, 인간화 또는 인간 항체이다.
바람직하게는, SIRPa 단편은 SIRPa의 세포 외 도메인을 포함하거나 이로 구성된다. 더욱 더 바람직하게는, SIRPa 단편은 이의 세포 내 부분 및 선택적으로 이의 막관통 도메인이 없고, 바람직하게는 SIRPa가 서열번호 51에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하거나 이로 구성된다.
특정 양태에서, 본 발명은 하기를 포함하거나 이로 구성된 항-인간 PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 이작용성 분자에 관한 것이며:
(i) HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH), 및
(ii) LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL),
여기서:
- 중쇄 CDR1(HCDR1)은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되며;
- 중쇄 CDR2(HCDR2)는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되며;
- 중쇄 CDR3(HCDR3)은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되며, 여기서, X1은 D 또는 E이고 X2는 T, H, A, Y, N, E 및 S로 이루어진 군으로부터, 바람직하게는 H, A, Y, N 및 E로 이루어진 군으로부터 선택되고;
- 경쇄 CDR1(LCDR1)은 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되며, 여기서, X는 G 또는 T이고;
- 경쇄 CDR2(LCDR2)는 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되며,
- 경쇄 CDR3(LCDR3)은 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다.
특히, 항-인간 PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함하거나 이로 구성된다:
(a) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 VH(여기서, X1은 D 또는 E이고, X2는 T, H, A, Y, N, E 및 S로 이루어진 군으로부터, 바람직하게는 H, A, Y, N 및 E로 이루어진 군으로부터 선택됨); 및
(b) 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 VL(여기서, X는 G 또는 T임).
특정 양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 카파 경쇄 불변 도메인으로부터 유래된 경쇄 불변 도메인 및 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 중쇄 불변 도메인, 바람직하게는 IgG1 또는 IgG4 중쇄 불변 도메인으로부터 유래된 중쇄 불변 도메인을 포함한다.
보다 구체적인 양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 선택적으로 T250Q/M428L; M252Y/S254T/T256E + H433K/N434F; E233P/L234V/L235A/G236A + A327G/A330S/P331S; E333A; S239D/A330L/I332E; P257I/Q311; K326W/E333S; S239D/I332E/G236A; N297A; L234A/L235A; N297A + M252Y/S254T/T256E; 및 K322A 및 K444A로 이루어진 군으로부터 선택된, 바람직하게는 M252Y/S254T/T256E 및 L234A/L235A와 선택적으로 조합된 N297A로 이루어진 군으로부터 선택된 치환 또는 치환의 조합을 갖는, 인간 카파 경쇄 불변 도메인으로부터 유래된 경쇄 불변 도메인 및 인간 IgG1 중쇄 불변 도메인으로부터 유래된 중쇄 불변 도메인을 포함한다.
또 다른 보다 구체적인 양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 선택적으로 S228P; L234A/L235A, S228P + M252Y/S254T/T256E 및 K444A로 이루어진 군으로부터 선택된 치환 또는 치환의 조합을 갖는, 인간 카파 경쇄 불변 도메인으로부터 유래된 경쇄 불변 도메인 및 인간 IgG4 중쇄 불변 도메인으로부터 유래된 중쇄 불변 도메인을 포함한다.
특히, 항-PD1 항체는 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 세미플리맙, PDR001 및 단일클론 항체 5C4, 17D8, 2D3, 4H1, 4A11, 7D3 및 5F4로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 바와 같은 이작용성 분자를 암호화하는 단리된 핵산 서열 또는 단리된 핵산 분자의 그룹, 본원에 개시된 바와 같은 핵산 또는 핵산 분자의 그룹을 포함하는 벡터, 및/또는 벡터를 포함하는 숙주 세포, 본원에 개시된 핵산 또는 핵산 분자 그룹에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 바와 같은 숙주 세포를 배양하는 단계 및 선택적으로 이작용성 분자를 단리하는 단계를 포함하는 이작용성 분자를 생산하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 바와 같은 이작용성 분자, 핵산 또는 핵산 분자 그룹, 벡터 또는 숙주 세포 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
선택적으로, 약제학적 조성물은 바람직하게는 알킬화제, 혈관신생 억제제, 항체, 항 대사물질, 항 유사분열제, 항 증식제, 항 바이러스제, 오로라 키나제 억제제, 아폽토시스 촉진제(예를 들어, Bcl-2 계열 억제제), 사멸 수용체 경로 활성화제, Bcr-Abl 키나제 억제제, BiTE(Bi-특이적 T 세포 인게이저(Engager)) 항체, 항체 약물 접합체, 생물학적 반응 조절제, 브루톤 티로신 키나제(BTK) 억제제, 사이클린-의존성 키나제 억제제, 세포주기 억제제, 사이클로옥시게나제-2 억제제, DVD, 백혈병 바이러스 종양유전자 동족체(ErbB2) 수용체 억제제, 성장 인자 억제제, 열 쇼크 단백질(HSP)-90 억제제, 히스톤 데아세틸라제(HDAC) 억제제, 호르몬 요법, 면역학적 물질, 아폽토시스 단백질 억제제의 억제제(IAP), 인터칼레이팅 항생제, 키나제 억제제, 키네신 억제제, Jak2 억제제, 라파마이신 억제제의 포유류 표적, 마이크로RNA, 미토겐-활성화 세포 외 신호-조절 키나제 억제제, 다가 결합 단백질, 비-스테로이드성 항염증제(NSAID), 폴리ADP(아데노신 디포스페이트)-리보스 중합효소(PARP) 억제제, 백금 화학요법제, 폴로-유사 키나제(Plk) 억제제, 포스포이노시티드-3 키나제(PI3K) 억제제, 프로테아좀 억제제, 퓨린 유사체, 피리미딘 유사체, 수용체 티로신 키나제 억제제, 레티노이드/델토이드 식물 알칼로이드, 작은 억제 리보핵산(siRNA), 토포이소머라제 억제제, 유비퀴틴 리가제 억제제, 저메틸화제, 체크포인트 억제제, 펩타이드 백신 등, 종양 항원으로부터의 에피토프 또는 네오에피토프, 뿐만 아니라 이들 작용제 중 하나 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 추가 치료제를 추가로 포함한다. 특히, 약제학적 조성물, 이작용성 분자, 핵산 또는 핵산 분자 그룹, 벡터 또는 숙주 세포는 약제로 사용하기 위한 것이다.
본 발명은 최종적으로 약제로서 사용하기 위한 본원에 개시된 바와 같은 약제학적 조성물, 이작용성 분자, 핵산 또는 핵산 분자 그룹, 벡터 또는 숙주 세포에 관한 것이다.
특정 양태에서, 암, 바람직하게는 PD-1 및/또는 PD-L1의 발현을 갖는 혈액 악성 종양 또는 고형 종양으로 이루어진 군으로부터 선택된 암, 예컨대 혈액림프구성(hematolymphoid) 종양, 혈관면역모세포 T세포 림프종, 골수이형성 증후군 및 급성 골수성 백혈병으로 이루어진 군으로부터 선택된 암, 바이러스에 의해 유발되거나 면역결핍과 관련된 암, 예컨대 카포시 육종(예를 들어, 카포시 육종 헤르페스 바이러스와 관련됨); 자궁경부암, 항문암, 음경암 및 외음부 편평 세포 암 및 구인두암(예를 들어, 인간 유두종 바이러스와 관련됨)으로 이루어진 군으로부터 선택된 암; 미만성 거대 B-세포 림프종, 버킷 림프종, 형질모세포 림프종, 원발성 중추 신경계 림프종, HHV-8 원발성 삼출 림프종, 고전적인 호지킨 림프종 및 림프증식성 장애(예를 들어, 엡스타인-바아 바이러스(EBV) 및/또는 카포시 육종 헤르페스 바이러스와 관련됨)를 포함하는 B 세포 비-호지킨 림프종(NHL); 간세포 암종(예를 들어, B형 및/또는 C형 간염 바이러스와 관련됨); 메르켈 세포 암종(예를 들어, 메르켈 세포 폴리오마 바이러스(MPV)와 관련됨); 및 인간 면역결핍 바이러스 감염(HIV) 감염과 관련된 암, 및 전이성 또는 비전이성, 흑색종, 악성 중피종, 비소세포 폐암, 신장 세포 암종, 호지킨 림프종, 두경부암, 요로상피 암종, 결장직장암, 간세포 암종, 소세포 폐암, 전이성 메르켈 세포 암종, 위암 또는 위식도암 및 자궁경부암으로 이루어진 군으로부터 선택된 암; 또는, 바람직하게는 HIV, 간염 바이러스, 헤르페스 바이러스, 아데노바이러스, 인플루엔자 바이러스, 플라비바이러스, 에코바이러스, 라이노바이러스, 콕사키 바이러스, 코로나바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 볼거리 바이러스, 로타바이러스, 홍역 바이러스, 풍진 바이러스, 파보바이러스, 우두 바이러스, HTLV 바이러스, 뎅기 바이러스, 유두종바이러스, 연체동물 바이러스, 소아마비 바이러스, 광견병 바이러스, JC 바이러스 및 아르보바이러스 뇌염 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스에 의해 발생하는 감염성 질환, 바람직하게는 만성 감염성 질환, 더욱더 바람직하게는 만성 바이러스 감염의 치료에 사용하기 위한 본원에 개시된 바와 같은 약제학적 조성물, 이작용성 분자, 핵산 또는 핵산 분자의 그룹, 벡터 또는 숙주 세포.
바람직하게는, 암은 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2 양성 암, 특히 PD-L1 양성 암이다.
선택적으로, 이작용성 분자, 약제학적 조성물, 단리된 핵산 분자 또는 단리된 핵산 분자의 그룹, 벡터 또는 숙주 세포는 방사선 요법, 또는 바람직하게는 알킬화제, 혈관신생 억제제, 항체, 항 대사물질, 항 유사분열제, 항 증식제, 항 바이러스제, 오로라 키나제 억제제, 아폽토시스 촉진제(예를 들어, Bcl-2 계열 억제제), 사멸 수용체 경로 활성화제, Bcr-Abl 키나제 억제제, BiTE(Bi-특이적 T 세포 인게이저(Engager)) 항체, 항체 약물 접합체, 생물학적 반응 조절제, 브루톤 티로신 키나제(BTK) 억제제, 사이클린-의존성 키나제 억제제, 세포주기 억제제, 사이클로옥시게나제-2 억제제, DVD, 백혈병 바이러스 종양유전자 동족체(ErbB2) 수용체 억제제, 성장 인자 억제제, 열 쇼크 단백질(HSP)-90 억제제, 히스톤 데아세틸라제(HDAC) 억제제, 호르몬 요법, 면역학적 물질, 아폽토시스 단백질 억제제의 억제제(IAP), 인터칼레이팅 항생제, 키나제 억제제, 키네신 억제제, Jak2 억제제, 라파마이신 억제제의 포유류 표적, 마이크로RNA, 미토겐-활성화 세포 외 신호-조절 키나제 억제제, 다가 결합 단백질, 비-스테로이드성 항염증 약물(NSAID), 폴리ADP(아데노신 디포스페이트)-리보스 중합효소(PARP) 억제제, 백금 화학요법제, 폴로-유사 키나제(Plk) 억제제, 포스포이노시티드-3 키나제(PI3K) 억제제, 프로테아좀 억제제, 퓨린 유사체, 피리미딘 유사체, 수용체 티로신 키나제 억제제, 레티노이드/델토이드 식물 알칼로이드, 작은 억제 리보핵산(siRNA), 토포이소머라제 억제제, 유비퀴틴 리가제 억제제, 저메틸화제, 체크포인트 억제제, 펩타이드 백신 등, 종양 항원으로부터의 에피토프 또는 네오에피토프, 뿐만 아니라 이들 작용제 중 하나 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 추가 치료제와 함께 사용하기 위한 것이다.
일 양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 약제학적 조성물, 이작용성 분자, 핵산 또는 핵산 분자의 그룹, 벡터 또는 숙주 세포는 T 조절자 세포의 억제 활성 억제, T 이펙터 세포 활성화 및/또는 나이브 부분적으로 고갈된 T-세포의 증식 자극에 사용하기 위한 것이다.
도 1: 항 PD-1 항체 대 항 PD-1/SIRPa 이작용성 분자의 PD-1 결합 ELISA 분석. 인간 재조합 PD-1 단백질을 고정시키고, 항-PD-1 이작용성 분자를 다른 농도로 첨가하였다. 퍼옥시다제에 결합된 항-인간 Fc 항체로 발현이 수행되었다. 비색계는 TMB 기재를 사용하여 450 nm에서 결정되었다. (A) 항-PD1VH-SIRPa 항체 키메라(●) 대 인간화(■)의 데이터. (B) 항-PD1VL-SIRPa 항체 키메라(●) 대 인간화 형태(■)의 데이터. 이 실험에서, 이작용성 분자는 서열번호 18에 개시된 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 28에 개시된 경쇄 가변 도메인을 갖는 인간화 항-PD1 항체를 포함한다.
도 2: 항 PD-1/SIRPa 이작용성 분자는 PD1/PDL1 상호작용을 차단한다. 경쟁 PD-1/PD-L1 ELISA 분석. PD-L1을 고정시키고, 복합 항체+비오틴화된 재조합 인간 PD-1을 첨가하였다. 다양한 농도의 항-PD-1 항체를 테스트하고, rec PD1을 0.6 μg/mL로 첨가하였다. 항-PD-1 항체(■) 또는 Bicki 항-PD1VH-Sirpa(●) 또는 항-PD1VL-Sirpa(○) 항체를 다른 농도로 첨가하였다. PD1 분자를 검출하기 위해 스트렙타비딘 퍼옥시다제로 발현이 수행되었으며, TMB 기재를 사용하여 450 nm에서 비색계로 밝혀졌다. 이 실험에서, 이작용성 분자는 서열번호 53에 정의된 중쇄 및 서열번호 54에 정의된 경쇄를 포함하는 키메라 항-PD1 항체를 포함한다.
도 3: 브릿징(bridging) ELISA 결합 분석. PD1-His 재조합 단백질을 고정시키고 Bicki 항-PD1VHSirpa(●) 또는 항-PD1VLSirpa(○)를 연속 농도로 첨가하였다. CD47 Fc 재조합 단백질을 1 μg/mL로 첨가하였다. 검출은 항 CD47 마우스 항체(클론 B6H12)+퍼옥시다제에 결합된 항 IgG 마우스 항체로 수행되었다. ELISA는 TMB 기재를 사용하여 450 nm에서 비색계로 밝혀졌다. 히스토그램은 플레이트에 고정된 재조합 rSIRPa 단백질을 나타내며, ELISA에 대한 양성 대조군으로 사용되었다. 이 실험에서, 이작용성 분자는 서열번호 53에 정의된 중쇄 및 서열번호 54에 정의된 경쇄를 포함하는 키메라 항-PD1 항체를 포함한다.
도 4: PD1+CD47+ 발현 T 세포에서 Bicki 항-PD1-SIRPa 분자의 표적화 및 결합. CD47+만을 발현하거나(회색 막대), CD47+ 및 PD-1+를 공동-발현하는(검은색 막대) Jurkat 세포를 4.5 nM의 BiCKi 항 PD-1 SIRPa 또는 SIRPa-Fc로 염색하고, 항 IgG-PE(Biolegend, 클론 HP6017)로 밝혀냈다. 데이터는 PD1- 세포 CD47+ Jurkat 세포에서 얻은 중간 형광 대비 PD-1+ CD47+ Jurkat 세포의 중간 형광의 비율을 나타낸다. 이 실험에서, 이작용성 분자는 서열번호 24에 개시된 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 28에 개시된 경쇄 가변 도메인을 갖는 인간화 항-PD1 항체를 포함한다.
도 5: Bicki 항-PD1-Sirpa 분자는 NFAT 신호전달을 자극하여 시험관 내 에서 T 세포 활성화를 상승적으로 강화한다. 이 실험을 위해 프로메가 PD-1/PD-L1 생물검정을 수행하여, NFAT 루시퍼라제 리포터 시스템을 사용하여 T 세포 활성화를 결정하였다. 2개의 세포주들은 (1) 이펙터 T 세포(PD-1, NFAT-유도된 루시퍼라제를 안정적으로 발현하는 Jurkat) 및 (2) 활성화 표적 세포(PDL1을 안정적으로 발현하는 CHO K1 세포 및 항원-독립적인 방식으로 동족 TCR을 활성화하도록 설계된 표면 단백질)를 사용하였다. 세포가 공배양될 때 PD-L1/PD-1 상호작용은 TCR 매개 활성화를 직접 억제하여, NFAT 활성화 및 루시퍼라제 활성을 차단한다. 항-PD1 항체의 첨가는 NFAT 활성화 및 루시퍼라제 합성으로 이어지는 억제 신호를 차단한다. BioGloTM 루시페린을 첨가한 후 발광계를 사용하여 발광을 정량화하고, T 세포 활성화를 반영한다. (A) 이펙터 리포터 T 세포주(항-PD-1 Pecy7, BD Bioscience 클론 EH12.2; 항 CD47(클론 B6H12) + 항 마우스 IgG AF647에 대한 PD-1 및 CD47 발현. (B) 항-PD1 항체 단독의 연속 희석(▼) 또는 bicki 항-PD1VH-SIRPa 항체(◆) 또는 이소형 대조군(■), 항 PD-1 항체 + 이소형 대조군 VH-SIRPa 항체(●) 또는 항-PD1 항체 + SIRPa Fc(○)를 시험하였다. (C) 이펙터 Jurkat 세포를 항 CD47 차단 항체(B6H12)(●) 또는 차단 항체없이(◆) 사전 인큐베이션한 다음, 다른 농도의 Bicki 항-PD1VH-SIRPa와 함께 인큐베이션했다. 기준선 활성화로 Jurkat 세포를 또한 항 PD-1 항체 단독(▼)과 함께 인큐베이션되었다. (D) IgG4 S228P(◆) 또는 IgG1 N298A(■)로 작제된 Bicki 항-PD1VH-SIRPa의 효능을 평가하고, 항 PD-1 단독과 비교했다(▼). (E) 또 다른 실험에서, Bicki VH SIRPa(○)) 대 항체 항 PD-1 단독(●)의 상승적 활성을 다른 항 PD-1 백본인 펨브롤리주맙(왼쪽 그래프) 및 니볼루맙(오른쪽 그래프)으로 시험하였다. (F) 또 다른 bicki 항-PD1-타입 I 단백질 항체(●)를 시험하고 항-PD1 항체(■)와 비교했다. 이 실험에서, 이작용성 분자는 서열번호 24에 개시된 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 28에 개시된 경쇄 가변 도메인을 갖는 인간화 항-PD1 항체를 포함한다.
도 6: Bicki 항-PD1-SIRPa 분자는 T 세포에서 칼슘 플럭스 신호전달을 강화하여 CD28 공동-자극까지 유사하게 확장한다. CD47+ PD1+ Jurkat 세포를 Fura-red로 염색하여, 유세포 분석을 사용하여 활성화 후 세포 내 Ca2+ 방출을 측정했다. T 세포를 BiCKI SIRPa 단독(○ 회색 선) 또는 CD3(OKT3) 자극(○ 검정색 선)과 조합하여 자극했다. 대조군으로, 세포는 a-CD3 단독(●) 또는 a-CD3 + CD28(■)로 자극했다. (A) 그래프는 4 내지 6개의 실험의 평균을 나타내고, 화살표는 자극의 추가를 나타낸다. 비율 BV711(연결된 Ca2+)/PercyP5.5 5(유리 Ca2+) MFI를 계산하여 데이터를 얻었다. 이 비율은 자극되지 않은 비율로 정규화되었다(자극 전 처음 20초의 평균). (B) 데이터는 계산된 곡선 아래 영역(AUC)을 나타내며; 각 점은 하나의 실험을 나타낸다. p 값은 짝비교 t 검정을 사용하여 계산되었다(*p<0.05). 이 실험에서, 이작용성 분자는 서열번호 24에 개시된 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 28에 개시된 경쇄 가변 도메인을 갖는 인간화 항-PD1 항체를 포함한다.
도 7: Bicki 항-PD1-SIRPa 분자는 PBMC의 증식과 IFNg의 분비를 자극한다. (A) 3명의 건강한 공여자로부터 PBMC를 단리하고, 이소형 대조군, 항-PD1 항체 또는 Bicki 항-PD1VH-SIRPa 또는 항-PD1VL-SIRPa의 존재 하에 고정화된 CD3 항체(OKT3.3 μg/mL)로 활성화했다. 증식은 6일째에 티미딘 혼입 3H에 의해 평가되었다. (B) 건강한 공여자로부터 단리된 PBMC를 항-PD-1 항체 단독, 항-PD1+ rSIRPa 단백질, Bicki 항-PD1VH-Sirpa 또는 항-PD1VL-Sirpa의 존재 하에 고정화된 항 CD3 항체(OKT23 1 ug/mL) 및 항-CD28 항체(클론 CD28.2)로 활성화시켰다. 활성화 후 2일. 상청액을 수확하고 IFNg를 ELISA로 투여하였다. 데이터는 3명의 다른 공여자를 대표한다. 이 실험에서, 이작용성 분자는 서열번호 24에 개시된 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 28에 개시된 경쇄 가변 도메인을 갖는 인간화 항-PD1 항체를 포함한다.
도 8: Bicki 항-PD1-SIRPa 분자는 활성화된 T 세포 증식과 IFNg 분비를 향상시킨다. CD3 CD28 사전-활성화된 T 세포는 항-PD1VH-SIRPa 또는 항-PD1VL-SIRPa의 존재 하에 CD3/PDL1 코팅된 플레이트에서 재자극되었다. (10 ug/mL). 항-PD-1 항체 및 이소형 항체가 대조군으로 사용된다. (A) T 세포 증식은 6일차에 H3 티미딘 혼입에 의해 평가되었다. (B) 6일차에 상청액을 수집하고 IFNg 분비물을 ELISA에 의해 투여하였다. 활성화 후, 상청액을 수확하고 IFNg를 ELISA에 의해 투여하였다. 데이터는 3명의 다른 공여자를 대표한다. 이 실험에서, 이작용성 분자는 서열번호 24에 개시된 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 28에 개시된 경쇄 가변 도메인을 갖는 인간화 항-PD1 항체를 포함한다.
도 9: Bicki 항-PD1-SIRPa 이작용성 분자는 고갈된 T 세포의 증식을 향상시킨다. 인간 PBMC는 CD3 CD28 코팅된 플레이트(3 ug/mL의 OKT3 및 3 μg/mL CD28.2 항체)에서 3일마다 반복적으로 자극되었다. 3차 자극 후, T 세포를 CD3/PD-L1 코팅된 플레이트에서 재활성화하고, 이소형 대조군 또는 항-PD1, rSIRPa 단백질 또는 Bicki 항-PD1-VH-Sirpa 항체와 함께 인큐베이션하였다. H3 혼입 분석은 5일차에 수행하여, T 세포 증식을 결정하였다. 데이터는 배수 변화로 표현되며, 3개의 서로 다른 공여자를 나타낸다(1 = 이소형 대조군). 이 실험에서, 이작용성 분자는 서열번호 24에 개시된 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 28에 개시된 경쇄 가변 도메인을 갖는 인간화 항-PD1 항체를 포함한다.
도 10: Bicki 항-PD1-SIRPa 이작용성 분자는 종양으로의 T 세포 이동을 향상시킨다. 3D 다세포 스페로이드는 낮은 부착 플레이트에서 A549 종양 세포, MRC-5 섬유아세포 및 인간 단핵구를 공동배양하여 생성되었다. 3일차에 인간 T 세포를 웰에 첨가하고, 공동배양 72시간 후, T 세포 침윤을 면역형광(항-인간 CD3 + 항-당나귀 A488 2차 항체)으로 분석하고 모든 세포를 DAPI 핵 마커로 염색하였다. 형광 신호를 공초점 현미경으로 정량화하고 FIJI 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 데이터는 스페로이드/1e6, DAPI+ 총 세포에 침윤된 CD3+ 양성 세포의 수를 나타내고, 각 점은 하나의 스페로이드의 분석을 나타낸다. 이 분석에서 스페로이드는 3일 동안 이소형 대조군(IgG4) 또는 biCKI SIRPa(50 nM)로 처리되었다. 통계적 유의성은 만 휘트니(Mann Whitney) 테스트 *p<0.05를 사용하여 결정되었다. 이 실험에서, 이작용성 분자는 서열번호 24에 개시된 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 28에 개시된 경쇄 가변 도메인을 갖는 인간화 항-PD1 항체를 포함한다.
도 11: 마우스에서 Bicki 항-PD1-SIRPa 이작용성 분자의 약동학. 마우스에 IgG1N298A(○) 또는 IgG4 S228P 이소형(●)으로 작제된 항 PD-1 SIRPa 1회 용량(34.34 nM/kg)을 정맥 주사하였다. 혈청 내 Bicki의 농도는 주사 후 여러 시점에서 샌드위치 ELISA로 평가되었다. 이 실험에서, 이작용성 분자는 서열번호 24에 개시된 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 28에 개시된 경쇄 가변 도메인을 갖는 인간화 항-PD1 항체를 포함한다.
도 12: 종래 기술과 비교하여 Bicki 항-PD1-SIRPa 이작용성 분자의 작용 메커니즘의 예시. 도면의 왼쪽 부분은 암세포를 표적화하는 종래 기술의 항-PD-L1-SIRPa 이작용성 분자의 메커니즘을 예시한다. 도면의 오른쪽 부분은 T 세포, 특히 동일한 T 세포를 표적화하여 고갈된 T 세포를 상승적으로 재활성화하는 능력을 갖는 본 발명의 항-PD-1-SIRPa 이작용성 분자의 메커니즘을 예시한다.
도입
본 발명의 항체는 특정 항-PD-1 효과 및 항-PD-1 항체에 융합된 SIRPa의 효과를 결합하기 때문에 이작용성이다. 실제로, 본 발명은 항-PD-1 항체 및 SIRPa를 포함하는 이작용성 분자에 관한 것으로, 단백질 SIRPa는 항-PD-1 항체의 폴리펩타이드 사슬, 항체의 경쇄 또는 중쇄, 또는 둘 다 또는 이의 임의의 단편에 공유 결합되어있다. 항-PD-1 항체의 사슬 또는 이의 단편과 SIRPa는 융합 단백질로 준비된다. 이 특정 양태에서, SIRPa의 N 말단 단부는 선택적으로 펩타이드 링커를 통해 항-PD-1 항체 또는 이의 단편 사슬의 C 말단 단부에 연결된다.
첫째, SIRPa가 항-SIRPa 항체의 표적이 되는 것으로 선행 기술에 알려져 있음이 강조된다. 이들 항체는 종양 세포의 CD47과 골수 세포, 특히 대식세포의 SIRPa 간의 상호작용을 차단하며; 상기 상호작용(소위 트랜스 상호작용, 상이한 세포 사이)은 대식세포에 의한 종양 세포의 식세포작용 억제를 유도한다. 반대로, SIRPa 및 T 세포, 특히 PD-1에서 발현되는 리간드에 대한 항체를 포함하는 본 발명의 이작용성 단백질은 T 세포 활성화 메커니즘에 관여하는 것으로 알려지지 않았다.
상세하게 설명되고 도시된 바와 같이, 특히 본 출원의 실시예 및 도 12에 예시된 바와 같이, 본 발명자들은 예기치 않게 동일한 T 세포를 표적화하는 강력한 이점을 모두 갖는 이작용성 SIRPa-항-PD-1 분자를 얻었다:
- T 세포상의 PD-1: 이작용성 SIRPa-항-PD-1 분자의 항-PD1 항체 부분; 및
- CD47(종양 세포상의 CD47뿐만 아니라): 이작용성 SIRPa-항-PD-1 분자의 SIRPa 부분.
동일한 T 세포에 대한 이러한 이중 표적화는 NFAT 경로의 보충 활성화에 의해 나타난 바와 같이 이전에 알려지지 않은 시너지 효과로 이어진다. 이 능력은 하기와 같은 이유로 특히 중요하다.
당업자에게 공지된 바와 같이, 종양 세포는 T 세포의 고갈과 관련하여 T 세포에 의해 충분히 제거되지 않는다. 항 PD-1 치료 화합물은 PD1-PDL1 상호작용(T 세포에 대한 PD1 및 종양 세포에 대한 PDL1)의 억제 효과를 억제하여 T 세포를 활성화하기 위해 임상적으로 사용된다. 보다 정확하게는, 암에 걸린 인간에게서 T 세포 고갈이 관찰된다. 예를 들어 문헌[Jiang, Y., Li, Y. 및 Zhu, B(Cell Death Dis 6, e1792(2015)]에 설명된 바와 같이, 종양 미세환경에서 고갈된 T 세포는 과발현된 억제 수용체, 감소된 이펙터 사이토카인 생산 및 세포용해 활성을 나타내어, 암 제거 실패로 이어진다. 고갈된 T 세포를 복원하는 것은 암 치료를 위한 임상 전략을 나타낸다. 종양 미세환경에서 대부분의 T 세포는 고갈되어, 암 면역 회피로 이어진다. PD-1은 T-세포 고갈을 조절하는 주요 억제 수용체이며, PD-1 발현이 높은 T 세포는 암을 제거하는 능력을 상실한다. 항-PD-1 항체는 고갈된 T 세포의 ≪재≫활성화를 허용하기에 항상 충분히 효율적인 것은 아니다. 따라서, 이것은 현재 중요한 의학적 필요성이다. 본 발명자들은 본원에 개시된 이작용성 항-PD1-SIRPa 분자가 항 PD-1 단독 또는 SIRPa와 조합된 것과 비교하여 T 세포, 특히 고갈된 T 세포의 활성화(NFAT 매개 활성화, 칼슘 방출)를 강화한다는 것을 보여주었다. 특히, 항-PD1-SIRPa 이작용성 분자는 사이토카인(예를 들어, IFNγ) 분비에 의해 반영된 나이브한, 부분적으로 고갈된 T-세포 하위집단의 증식 및 활성화를 유도한다. 이러한 항-hPD1-SIRPa 이작용성 분자는 관련된 내성 메커니즘을 극복하고 항 PD-1 면역요법의 효능을 개선하는 능력을 갖는다.
출원인은 또한 i) PD1 및 ii) SIRPa 수용체를 발현하는 단일 T 세포와 이작용성 항-PD1-SIRPa 분자의 상호작용이, 종양 세포를 제거하는 T 세포의 능력을 선호하는, T 세포 활성화, 특히 고갈된 T 세포에 긍정적인 영향을 미치는 NFAT 경로(TCR 신호전달)의 예상치 못한 활성화를 유도함을 보여준다.
이는 한쪽에서 BICKI 분자의 SIRPa가 SIRPa 수용체(CD47)를 표적화하여 SIRPa 단독과 같이 이 경로를 활성화하고, 다른 쪽에서는 BICKI 분자의 항-PD1 부분이 PD-1을 차단한다는 것을 의미한다. 이작용성 분자는 동일한 세포에서 CD47과 PD-1을 모두 표적화한다. 이는 항-PD1 항체와 SIRPa의 조합을 별도로 사용하여 관찰된 적이 없는 TCR(NFAT) 신호전달의 상승적 활성화를 초래한다(항-PD1 및 SIRPa를 2개의 개별 화합물로 투여). 예를 들어, 동일한 세포에 작용함으로써 이러한 활성화는 PD-L1을 표적화하는 이작용성 분자에 의해 제공될 수 없다. 실제로, PD-L1은 T 세포와 같은 면역 세포가 아닌 종양 세포에서 주로 발현된다는 것이 당 업계에 알려져있다.
또한, 본 발명의 특정 인간화된 항-PD-1뿐만 아니라 참조의 다른 2개의 항-PD-1, 즉 펨브롤리주맙 및 니볼루맙과 함께 상승 효과가 관찰되었다. 이작용성 항-PD1-SIRPa 분자의 설계는 CD47+ PD-1+ 고갈된 T 세포를 다른 CD47+ 세포보다 적어도 2배 이상 표적화할 수 있게 한다. 이작용성 항-PD1-SIRPa 분자는 항-PD1 효과를 강화하고, 다음을 강력하게 제안한다. CD47상의 SIRPa 결합이 "나를 먹지 마시오" 억제 식세포 신호를 차단할뿐만 아니라 놀랍게도 CD47-의존성 T-세포 공동-자극을 촉진한다. 마지막으로, 이작용성 항-PD1-SIRPa 분자는 T 세포의 종양 미세환경으로의 이동을 강화하여, 종양 미세환경으로의 T 세포 부족으로 인한 항 PD-1 단일요법과 관련된 주요 내성 메커니즘 중 하나를 극복한다.
본 발명의 이작용성 분자는 특히 하기 장점들 중 하나 또는 여러 가지를 갖는다:
- 이들은 항-PD1 항체의 인간화 형태와 키메라 형태의 차이 없이 PD-1에 결합하는 능력을 보존한다.
- 이들은 CD47, SIRPa 리간드 단백질에 결합하는 능력을 보존한다.
- 이들은 PD-1/PD-L1 및/또는 PD-1/PD-L2 상호작용에 길항한다.
- 이들은 항 PD-1 단독에 비해 T 세포의 활성화(NFAT 매개 활성화 및 칼슘 플럭스 자극)를 상승적으로 강화한다.
- 이들은 나이브한, 활성화되고 고갈된 T 세포의 증식을 자극하는 시너지 효과를 입증한다.
- 이들은 T 세포에 의한 IFNg 분비를 자극하는 시너지 효과를 입증한다.
- 이들은 T 세포의 이동을 강화한다.
- 이들은 좋고 선형적인 약동학 프로파일을 입증한다.
정의
본 발명을 보다 쉽게 이해할 수 있도록 하기 위해, 특정 용어를 이하에 정의한다. 상세한 설명 전체에 추가 정의가 명시되어 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 용어, 표기법 및 기타 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는 것으로 의도된다. 일부 경우에, 일반적으로 이해되는 의미를 갖는 용어는 명확성을 위해 및/또는 용이한 참조를 위해 본원에서 정의되며, 본원의 이러한 정의의 포함은 반드시 당해 분야에서 일반적으로 이해되는 것과 차이를 나타내는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 명세서에 설명되거나 참조된 기술 및 절차는 일반적으로 잘 이해되고 당업자에 의해 통상적인 방법론을 사용하여 일반적으로 사용된다.
본원에 사용된 용어 "신호-조절 단백질 알파", "SIRPα" 및 "SIRPa"는 CD47에 대한 포유류 면역글로불린-유사 세포 표면 수용체인 수용체-유형 막관통 당 단백질을 지칭한다. 이는 특히, 예를 들어 표준 생물검정 또는 SIRPa 수용체 결합 친화도의 검정에서 야생형 포유동물 SIRPa에 대한 실질적인 아미노산 서열 동일성 및 실질적으로 동등한 생물학적 활성을 갖는 SIRPa 폴리펩타이드, 이의 유도체 및 유사체를 지칭한다. 예를 들어, SIRPa는 i) SIRPa 폴리펩타이드의 천연 또는 자연-발생 대립유전자 변이체, ii) SIRPa 폴리펩타이드의 생물학적 활성 단편, iii) SIRPa 폴리펩타이드의 생물학적 활성 폴리펩타이드 유사체, 또는 iv) SIRPa 폴리펩타이드의 생물학적 활성 변이체의 아미노산 서열을 갖는 재조합 또는 비-재조합 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 지칭한다. SIRPa는 막관통 도메인 및/또는 세포질 도메인을 포함하거나, 그것의 부재일 수 있다. SIRPa는 바람직하게는 그것의 세포 외 도메인을 포함하거나 이로 구성된다. 이 분자에 대한 대체 명칭은 "티로신-단백질 포스파타제 비-수용체 유형 기질 1" 및 "SHP 기질 1", "CD172 항원-유사 패밀리 구성원 A", "p84" 및 "대식세포 융합 수용체"이다. 바람직하게는, 용어 "SIRPa"는 인간 SIRPa를 지칭한다. 예를 들어, 인간 SIRPa 아미노산 서열은 약 504개의 아미노산이고, NP_001035111.1, NP_001035112.1, NP_001317657.1 또는 NP_542970.1의 Genbank 수탁 번호를 가지고 있다. 바람직하게는, 인간 SIRPa는 이소형 1이다. 더욱 바람직하게는, SIRPa는 본질적으로 전술한 서열의 위치 31~373의 아미노산, 즉 그의 세포 외 도메인으로 구성된다. 인간 SIRPa는 UniProtKB-P78324에 기재되어 있다.
본원에 사용된 용어 "프로그램된 사멸 1", "프로그램된 세포 사멸 1", "PD1", "PD-1", "PDCD1", "PD-1 항원", "인간 PD-1", "hPD-1 " 및 "hPD-1"은 상호교환적으로 사용되며, CD279로도 알려진 프로그램된 사멸-1 수용체를 지칭하며, 인간 PD-1의 변이체 및 이소형, 및 PD-1과 적어도 하나의 공통 에피토프를 갖는 유사체를 포함한다. PD-1은 면역 반응의 역치 및 말초 면역 내성의 주요 조절자이다. 활성화된 T 세포, B 세포, 단핵구 및 수지상 세포에서 발현되며, 그의 리간드 PD-L1 및 PD-L2에 결합한다. 인간 PD-1은 PDCD1 유전자에 의해 암호화된다. 예를 들어, 인간 PD-1의 아미노산 서열은 GenBank 수탁 번호 NP_005009로 개시된다. PD1은 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 발현되는 4개의 스플라이스 변이체를 가지고 있다. 따라서, PD-1 단백질은 전장 PD-1뿐만 아니라 PD-1Aex2, PD-1Aex3, PD-1Aex2,3 및 PD-1Aex2,3,4와 같은 PD-1의 대체 스플라이스 변이체를 포함한다. 달리 명시되지 않는 한, 용어는 PBMC에 의해 자연적으로 발현되거나 PD-1 유전자로 형질감염된 세포에 의해 발현되는 인간 PD-1의 임의의 변이체 및 이소형을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "항체"는 면역글로불린 분자의 유형을 설명하며, 가장 넓은 의미로 사용된다. 특히, 항체는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 단편, 즉 항원 결합 부위를 함유하는 분자를 포함한다. 면역글로불린 분자는 모든 유형(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 클래스(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 하위클래스일 수 있다. 상이한 클래스의 면역글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤라 불린다. 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 용어 "항체"는 온전한 면역글로불린 및 "항체 단편" 또는 "항원-결합 단편"(예컨대, Fab, Fab', F(ab')2, Fv), 단일 사슬(scFv), 이의 돌연변이체, 항체 부분을 포함하는 분자, 디아바디, 선형 항체, 단일 사슬 항체, 및 항체의 글리코실화 변이체, 항체의 아미노산 서열 변이체를 포함하는 필요한 특이성의 항원 인식 부위를 포함하는 면역글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 구성을 포함한다. 바람직하게는 용어 항체는 인간화 항체를 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 항체의 "항원-결합 단편"은 가능하게는 그의 기본 형태로, 항체의 일부, 즉 PD-1에 대한 항원-결합 능력을 나타내는 본 발명의 항체 구조의 일부에 상응하는 분자를 의미하며; 이러한 단편은 특히 상응하는 4-쇄 항체의 항원-결합 특이성과 비교하여 상기 항원에 대해 동일하거나 실질적으로 동일한 항원-결합 특이성을 나타낸다. 유리하게는, 항원-결합 단편은 상응하는 4-쇄 항체와 유사한 결합 친화성을 갖는다. 그러나, 상응하는 4-쇄 항체에 대해 감소된 항원-결합 친화성을 갖는 항원-결합 단편도 본 발명에 포함된다. 항원-결합 능력은 항체와 표적 단편 사이의 친화도를 측정하여 결정할 수 있다. 이들 항원-결합 단편은 또한 항체의 "기능적 단편"으로 지정될 수 있다. 항체의 항원-결합 단편은 항원, 즉 PD1의 세포 외 도메인에 대한 인식 부위를 포함하는 CDR(상보적 결정 영역) 또는 이의 일부(들)로 지정된 초가변 도메인을 포함하여 항원 인식 특이성을 정의하는 단편이다.
"Fab" 단편은 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)을 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복실 말단에 몇개의 잔기를 추가한다는 점에서 Fab 단편과 상이하다. F(ab') 단편은 F(ab')2 펩신 소화 생성물의 힌지 시스테인에서 이황화 결합의 절단에 의해 생성된다. 항체 단편의 추가적인 화학적 커플링은 당업자에게 알려져 있다. Fab 및 F(ab')2 단편은 온전한 항체의 Fc 단편이 부족하고, 동물의 순환에서 더 빠르게 클리어되며, 온전한 항체보다 비특이적 조직 결합이 적을 수 있다(예를 들어, 문헌[Wahl et al, 1983, J. Nucl. Med. 24:316] 참조).
"Fv" 단편은 완전한 표적 인식 및 결합 부위를 함유하는 항체의 최소 단편이다. 이 영역은 단단한 비공유 결합(VH-VL 이량체)에서 하나의 중쇄 가변 도메인과 하나의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 구성된다. 이 구성에서 각 가변 도메인의 3개의 CDR이 상호작용하여 VH-VL 이량체의 표면에 표적 결합 부위를 정의한다. 종종, 6개의 CDR은 항체에 표적 결합 특이성을 부여한다. 그러나, 일부 경우에는 단일 가변 도메인(또는 표적에 특이적인 3개의 CDR만 포함하는 Fv의 절반)조차도 전체 결합 부위보다 낮은 친화성에 있지만 표적을 인식하고 결합하는 능력을 가질 수 있다.
"단쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 결합 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하며, 이들 도메인은 단일 폴리펩타이드 사슬에 존재한다. 일반적으로, Fv 폴리펩타이드는 scFv가 표적 결합을 위한 원하는 구조를 형성할 수 있도록 하는 VH와 VL 도메인 사이의 폴리펩타이드 링커를 추가로 포함한다.
"단일 도메인 항체"는 PD-1에 충분한 친화성을 나타내는 단일 VH 또는 VL 도메인으로 구성된다. 특정 구현예에서, 단일 도메인 항체는 낙타화 항체이다(예를 들어, 문헌[Riechmann, 1999, Journal of Immunological Methods 231:25-38 참조).
구조의 측면에서 항체는 이황화 결합에 의해 상호연결된 중(H)쇄 및 경(L)쇄를 가질 수 있다. 경쇄에는 람다(λ)와 카파(κ)의 두 가지 유형이 있다. 각 중쇄 및 경쇄는 불변 영역과 가변 영역(또는 "도메인")을 포함한다. 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 "상보성-결정 영역" 또는 "CDR"이라고도 하는 3개의 초가변 영역에 의해 중단된 "프레임워크" 영역을 함유한다. 프레임워크 영역 및 CDR의 범위가 정의되었다(문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, and U.S. Department of Health and Human Services, 1991], 이들은 본원에 참고로 포함됨). 바람직하게는 CDR은 Kabat 방법에 따라 정의된다. 프레임워크 영역은 사슬 간 비공유 상호작용에 의해 CDR을 올바른 배향으로 배치하기 위해 제공하는 스캐폴드를 형성하는 역할을 한다. CDR은 주로 항원의 에피토프에 대한 결합을 담당한다. 각 사슬의 CDR은 전형적으로 "상보성 결정 영역 1" 또는 "CDR1", "CDR2" 및 "CDR3"으로 지칭되며, N-말단부터 순차적으로 번호가 매겨진다. 본 발명에 따른 항체의 VL 및 VH 도메인은 당 업계 및 본원에서 "프레임워크 영역 1" 또는 "FR1", "FR2", "FR3" 및 "FR4"로 각각 지칭되는 4개의 프레임워크 영역 또는 "FR"을 포함할 수 있다. 이러한 프레임워크 영역 및 상보적 결정 영역은 바람직하게는 하기 순서로 작동 가능하게 연결된다: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4(아미노 말단에서 카르복시 말단까지). 본원에 사용된 용어 "항체 프레임워크"는 가변 도메인의 일부, VL 및/또는 VH를 지칭하며, 이는 이 가변 도메인의 항원 결합 루프(CDR)에 대한 스캐폴드 역할을 한다.
본원에 사용된 "항체 중쇄"는 항체 입체형태에 존재하는 2가지 유형의 폴리펩타이드 사슬 중 더 큰 것을 의미한다. 항체 중쇄의 CDR은 전형적으로 "HCDR1", "HCDR2" 및 "HCDR3"으로 지칭된다. 항체 중쇄의 프레임워크 영역은 전형적으로 "HFR1", "HFR2", "HFR3" 및 "HFR4"로 지칭된다.
본원에 사용된 "항체 경쇄"는 항체 입체형태에 존재하는 2가지 유형의 폴리펩타이드 사슬 중 더 작은 것을 지칭하고; κ 및 λ 경쇄는 2가지 주요 항체 경쇄 이소형을 지칭한다. 항체 경쇄의 CDR은 전형적으로 "LCDR1", "LCDR2" 및 "LCDR3"로 지칭된다. 항체 경쇄의 프레임워크 영역은 전형적으로 "LFR1", "LFR2", "LFR3" 및 "LFR4"로 지칭된다.
표적 분자에 대한 항체의 결합과 관련하여, 용어 "결합하다" 또는 "결합"은 항원을 인식하고 접촉하는 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 융합 단백질, 분자 및 항체(항체 단편 포함)를 지칭한다. 바람직하게는, 항원-항체 유형 상호작용을 의미한다. 특정 항원(예를 들어, PD-1) 또는 특정 항원(예를 들어, PD-1)상의 에피토프에 대한 "특이적 결합", "특이적으로 결합하는", "에 대해 특이적으로", "선택적으로 결합하는" 및 "선택적"이라는 용어는 항체가 특정 항원을 인식하고 결합하지만, 샘플의 다른 분자를 실질적으로 인식하거나 결합하지 않음을 의미한다. 예를 들어, PD-1 또는 PD-1 에피토프에 특이적으로(또는 우선적으로) 결합하는 항체는 이 PD-1 에피토프에 예를 들어 다른 PD-1 에피토프 또는 비-PD-1 에피토프에 결합하는 것보다 더 큰 친화도, 결합력, 더 쉽게 및/또는 더 긴 기간으로 결합하는 항체이다. 바람직하게는, 용어 "특이적 결합"은 결합 친화도가 10-7 M 이하인 항체와 항원 사이의 접촉을 의미한다. 특정 양태에서, 항체는 10-8 M, 10-9 M 또는 10-10 M 이하의 친화도로 결합한다.
본원에 사용된 "PD-1 항체", "항-PD-1 항체", "PD-1 Ab", "PD-1-특이적 항체" 또는 "항-PD-1 Ab"는 상호교환적으로 사용되며, PD-1, 특히 인간 PD-1에 특이적으로 결합하는 본원에 기재된 항체를 지칭한다. 일부 구현예에서, 항체는 PD-1의 세포 외 도메인에 결합한다. 특히, 항-PD-1 항체는 PD-1 항원에 결합할 수 있는 항체이고, PD-1-매개 신호전달 경로를 억제하여 T 세포 활성화와 같은 면역 반응을 향상시킨다.
본원에 사용된 용어 "이작용성 분자", "이작용성 화합물", "이작용성 단백질", "Bicki", "Bicki 항체", "이작용성 항체" 및 "이작용성 체크포인트 억제제 분자"는 동일한 의미를 가지며, 상호교환적으로 사용될 수 있다. 이들 용어는 이 항원에 특이적인 적어도 하나의 영역(예를 들어, 항체의 가변 영역으로부터 유래됨) 및 적어도 폴리펩타이드인 제2 영역을 보유함으로써 하나의 항원을 인식하는 항체를 지칭한다. 보다 구체적으로, 이작용성 분자는 항체 또는 이의 일부, 바람직하게는 이의 항원-결합 단편과 다른 폴리펩타이드 또는 이의 폴리펩타이드 단편의 융합 단백질이다.
본원에 사용된 용어 "키메라 항체"는 하나의 종에서 유래된 중쇄 및/또는 경쇄의 일부와 상이한 종에서 유래된 나머지 중쇄 및/또는 경쇄를 갖는 항체 또는 항원-결합 단편을 의미한다. 예시적인 예에서, 키메라 항체는 인간으로부터 유래된 불변 영역 및 마우스와 같은 비인간 종으로부터의 가변 영역을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "인간화 항체"는 마우스와 같은 다른 포유류 종의 생식계열로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열에 이식된 항체(예를 들어, 비인간 항체에서 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체)를 지칭하는 것으로 의도된다. "인간화 항체", 예를 들어 비-인간 항체는 또한 인간화를 겪은 항체를 지칭한다. 인간화 항체는 일반적으로 원래 항체의 원하는 특이성, 친화성 및 능력을 유지하면서 하나 이상의 CDR로부터의 잔기가 비인간 항체(공여자 항체)의 적어도 하나의 CDR로부터의 잔기로 대체되는 인간 면역글로불린(수혜자 항체)이다. 공여자 항체는 마우스, 래트, 토끼, 닭과 같은 적합한 비인간 항체, 또는 원하는 특이성, 친화성 또는 생물학적 효과를 갖는 비-인간 영장류 항체일 수 있다. 일부 경우, 수혜자 항체의 선택된 프레임워크 영역 잔기는 공여자 항체로부터의 프레임워크 영역 잔기로 대체된다. 대안적으로, 공여자 항체의 선택된 프레임워크 영역 잔기는 인간 또는 인간화 항체로부터의 프레임워크 영역 잔기로 대체된다. 추가 프레임워크 영역 변형은 인간 프레임워크 서열 내에서 이루어질 수 있다. 따라서, 인간화 항체는 또한 수혜자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 아미노산 변형은 항체 기능을 추가로 개선하고/하거나 인간화 과정을 증가시키기 위해 이루어질 수 있다. "아미노산 변화" 또는 "아미노산 변형"은 본원에서 폴리펩타이드의 아미노산 서열의 변화를 의미한다. "아미노산 변형"은 폴리펩타이드 서열에서의 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함한다. 본원에서 "아미노산 치환" 또는 "치환"은 모 폴리펩타이드 서열의 특정 위치에 있는 아미노산을 다른 아미노산으로 대체하는 것을 의미한다. "아미노산 삽입" 또는 "삽입"은 모 폴리펩타이드 서열의 특정 위치에 아미노산의 추가를 의미한다. "아미노산 결실" 또는 "결실"은 모 폴리펩타이드 서열의 특정 위치에서 아미노산의 제거를 의미한다. 아미노산 치환은 보존적일 수 있다. 보존적 치환은 주어진 아미노산 잔기를 유사한 화학적 특성(예를 들어, 전하, 벌크 및/또는 소수성)을 갖는 측쇄("R-기")를 갖는 또 다른 잔기로 대체하는 것이다. 본원에서 사용되는 "아미노산 위치" 또는 "아미노산 위치 번호"는 상호교환적으로 사용되며, 일반적으로 아미노산에 대한 하나의 문자 코드로 지정된, 아미노산 서열에서 특정 아미노산의 위치를 지칭한다. 아미노산 서열의 첫 번째 아미노산(즉, N 말단에서 시작)은 위치 1을 갖는 것으로 간주되어야 한다.
보존적 치환은 주어진 아미노산 잔기를 유사한 화학적 특성(예를 들어, 전하, 벌크 및/또는 소수성)을 갖는 측쇄("R-기")를 갖는 또 다른 잔기로 대체하는 것이다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환은 단백질의 기능적 특성을 실질적으로 변화시키지 않을 것이다. 보존적 치환 및 해당 규칙은 최신 기술에 잘 설명되어 있다. 예를 들어, 보존적 치환은 하기 표에 반영된 아미노산 그룹 내의 치환으로 정의될 수 있다.
[표 A]
Figure pct00001
[표 B]
Figure pct00002
[표 C]
Figure pct00003
본원에 사용된 "단리된 항체"는 자연 환경의 성분으로부터 분리 및/또는 회수된 항체이다. 단리된 항체는 항체의 천연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않기 때문에 재조합 세포 내에서 인 시츄로 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 예를 들어 전기영동(예를 들어, SDS-PAGE, 등전 포커싱(IEF), 모세관 전기영동) 또는 환원 또는 비-환원 조건 하에서 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의해 결정된 바와 같이 균질성 및/또는 90%, 95% 또는 99% 초과 순도로 정제된다.
본원에 사용된 용어 "로부터 유래된다" 및 "로부터 유래된"은 모 화합물 또는 단백질의 구조로부터 유래된 구조를 갖고 그의 구조가 본원에 개시된 것과 충분히 유사하고 그 유사성에 기초하여 청구된 화합물과 동일하거나 유사한 특성, 활성 및 유용성을 나타낼 것으로 당업자에 의해 예상되는 화합물을 지칭한다. 예를 들어, 뮤린 항체로부터 유래된 인간화 항체는 뮤린 항체와 유사한 특성을 공유하는, 예를 들어, 동일한 에피토프를 인식하고, 항체의 인간화에 참여하고/하거나 이를 증가시키는 변형된 잔기와 유사한 VH 및 VL을 공유하는 항체 또는 항체 단편을 지칭한다.
용어 "치료"는 질환 또는 질환의 증상의 치료, 방지, 예방 및 지연과 같은 환자의 건강 상태를 개선하기 위한 임의의 행위를 지칭한다. 이는 질환의 치유적 치료 및/또는 예방적 치료를 모두 지정한다. 치유적 치료는 질환 또는 질환의 증상 또는 그것이 직접 또는 간접적으로 야기하는 고통을 완화, 개선 및/또는 제거, 감소 및/또는 안정화시키는 치유 또는 치료를 초래하는 치료로 정의된다. 예방적 치료는 질환의 예방을 초래하는 치료와 질환의 진행 및/또는 발병 또는 발병 위험을 감소 및/또는 지연시키는 치료를 모두 포함한다. 특정 구현예에서, 이러한 용어는 이와 관련된 질환, 장애, 감염 또는 증상의 개선 또는 근절을 지칭한다. 다른 구현예에서, 이 용어는 암의 확산 또는 악화를 최소화하는 것을 의미한다. 본 발명에 따른 치료는 반드시 100% 또는 완전한 치료를 의미하는 것은 아니다. 오히려, 당업자가 잠재적인 이점 또는 치료 효과를 갖는 것으로 인식하는 다양한 정도의 치료가 존재한다. 바람직하게는, 용어 "치료"는 예를 들어 PD-1에 의해 매개되는 신호전달 경로와 관련된 장애/질환을 앓고 있는 대상체에게 하나 이상의 활성제를 포함하는 조성물을 적용하거나 투여하는 것을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "장애" 또는 "질환"은 유전적 또는 발달 오류, 감염, 독극물, 영양 결핍 또는 불균형, 독성 또는 불리한 환경 요인의 영향으로 인해 신체의 잘못 기능하는 기관, 일부, 구조 또는 시스템을 지칭한다. 바람직하게는, 이들 용어는 건강 장애 또는 질환, 예를 들어, 정상적인 신체적 또는 정신적 기능을 방해하는 질환을 지칭한다. 보다 바람직하게는, 용어 장애는 암과 같은 동물 및/또는 인간에 영향을 미치는 면역 및/또는 염증성 질환을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "면역 질환"은 자신의 세포, 조직 및/또는 기관에 대한 대상체의 면역 반응에 의해 야기되는 세포, 조직 및/또는 기관 손상을 특징으로 하는 대상체의 상태를 지칭한다. 용어 "염증성 질환"은 염증, 예를 들어 만성 염증을 특징으로 하는 대상체의 상태를 지칭한다. 자가면역 장애는 염증과 관련이 있을 수도 있고 아닐 수도 있다. 더욱이, 염증은 자가면역 장애에 의해 유발될 수도 있고 유발되지 않을 수도 있다.
본원에 사용된 용어 "암"은 비정상 세포의 신속하고 제어되지 않는 성장을 특징으로 하는 질환으로 정의된다. 암세포는 국소적으로 또는 혈류 및 림프계를 통해 신체의 다른 부분으로 퍼질 수 있다.
본원에 사용된 용어 "PD-1과 연관된 또는 관련된 질환", "PD-1 양성 암" 또는 "PD-1 양성 감염성 질환"은 PD-1 발현에 기인하거나 PD-1 발현의 증상/특징, 즉 PD-1의 발현 또는 활성의 증가 또는 감소에 의해 유발되거나 악화되거나 이와 관련되는 임의의 상태를 갖는 암 또는 감염성 질환(예를 들어, 바이러스 및/또는 박테리아에 의해 유발됨)을 의미하는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 용어 "대상체", "숙주", "개체" 또는 "환자"는 성인 및 아동을 포함한 인간을 지칭한다.
본원에 사용된 "약제학적 조성물"은 생리학적으로 적합한 담체 및 부형제와 같은 임의의 다른 화학적 성분과 함께 본 발명에 따른 이작용성 분자를 포함하는 것과 같은 활성제 중 하나 이상의 제제를 지칭한다. 약제학적 조성물의 목적은 유기체로의 활성제의 투여를 용이하게 하는 것이다. 본 발명의 조성물은 임의의 통상적인 투여 경로 또는 사용에 적합한 형태일 수 있다. 일 구현예에서, "조성물"은 전형적으로 활성 작용제의 조합, 예를 들어 화합물 또는 조성물, 및 자연-발생 또는 비-자연-발생 담체, 비활성(예를 들어, 검출가능한 작용제 또는 표지) 또는 활성, 예컨대, 보조제, 희석제, 결합제, 안정화제, 완충제, 염, 친유성 용매, 보존제, 보조제 등을 의도하고, 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본원에 언급된 "허용되는 비히클" 또는 "허용되는 담체"는 약제학적 조성물을 제형화하는데 유용한 것으로 당업자에게 공지된 임의의 공지된 화합물 또는 화합물들의 조합이다.
본원에 사용된 "유효량" 또는 "치료적 유효량"은 단독으로 또는 하나 이상의 다른 활성제와 조합하여 대상체에게 치료 효과를 부여하는 데 필요한 활성제의 양, 예를 들어, 표적 질환 또는 장애를 치료하거나 원하는 효과를 생성하는 데 필요한 활성제의 양을 지칭한다. "유효량"은 약제(들), 질환 및 그의 중증도, 연령, 신체 상태, 키, 성별 및 체중을 포함한 치료될 대상체의 특징, 치료 기간, 병행 요법의 성격(있는 경우), 특정 투여 경로 및 의료 종사자의 지식과 전문 지식 내의 유사 요인에 따라 달라질 것이다. 이들 요인들은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 일상적인 실험만으로 해결할 수 있다. 일반적으로 개별 성분 또는 이들의 조합의 최대 용량, 즉 건전한 의학적 판단에 따라 가장 안전한 용량을 사용하는 것이 바람직하다.
본원에서 사용되는 용어 "약제"는 장애 또는 질환에 대한 치료 또는 예방 특성을 갖는 임의의 물질 또는 조성물을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "조합하여"는 하나 이상의 요법(예를 들어, 예방 및/또는 치료제)의 사용을 지칭한다. 용어 "조합하여"의 사용은 질환 또는 장애가 있는 대상체에게 요법제(예를 들어, 예방 및/또는 치료제)가 투여되는 순서를 제한하지 않는다.
용어 "폴리뉴클레오타이드", "핵산" 및 "핵산 서열"은 동등하며, 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체 형태, 예를 들어 RNA 또는 DNA 또는 이의 유사체를 지칭한다. 본 발명의 핵산(예를 들어, 핵산의 성분 또는 부분)은 자연 발생, 변형된 또는 조작된, 단리된 및/또는 비-천연일 수 있다. 조작된 핵산에는 재조합 핵산 및 합성 핵산이 포함된다. "항-PD1 항체를 암호화하는 단리된 핵산"은 단일 벡터 또는 개별 벡터에서 이러한 핵산 분자(들)을 포함하는 항체 중쇄 및 경쇄(또는 이의 단편)를 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자를 의미하며, 상기 핵산 분자(들)은 숙주 세포에서 하나 이상의 위치에 존재한다. 본원에 사용된 용어 "핵산 작제물", "플라스미드" 및 "벡터"는 동등하며, DNA 또는 RNA와 같은 패신저 핵산 서열을 숙주 세포로 전달하는 역할을 하는 핵산 분자를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "숙주 세포"는 벡터, 외인성 핵산 분자 및 본 발명의 항체 작제물을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 수혜자; 및/또는 항체 작제물 자체의 수혜자일 수 있거나, 수용된 임의의 개별 세포 또는 세포 배양물을 포함하는 것으로 의도된다. 세포 내로 각각의 물질의 도입은 형질전환, 형질감염 등에 의해 수행될 수 있다. 용어 "숙주 세포"는 또한 단일 세포의 자손 또는 잠재적 자손을 포함하는 것으로 의도된다. 숙주 세포에는 예를 들어 박테리아, 미생물, 식물 및 동물 세포가 포함된다.
본원에 사용된 "면역 세포"는 선천성 및 적응성 면역에 관여하는 세포, 예컨대 골수에서 생산된 조혈 줄기 세포(HSC)로부터 유래된 백혈구(백혈구), 림프구(T 세포, B 세포, 자연 살해(NK) 세포 및 자연 살해 T 세포(NKT) 및 골수-유래 세포(호중구, 호산구, 호염기구, 단핵구, 대식세포, 수지상 세포)를 지칭한다. 특히, 면역 세포는 B 세포, T 세포, 특히 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포, NK 세포, NKT 세포, APC 세포, 수지상 세포 및 단핵구를 포함하는 비-포괄 목록에서 선택될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "T 세포"는 예를 들어 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, T 헬퍼 1형 T 세포, T 헬퍼 2형 T 세포, T 헬퍼 17형 T 세포 및 억제성 T 세포를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "T 이펙터 세포", "T eff" 또는 "이펙터 세포"는 공동-자극과 같은 자극에 능동적으로 반응하는 여러 T 세포 유형을 포함하는 면역 세포 그룹을 설명한다. 특히 (예를 들어, 다른 세포의 활성화를 조절하는 사이토카인을 생성하거나, 세포독성 활성에 의해) 항원을 제거하는 기능을 하는 T 세포를 포함한다. 특히 CD4+, CD8+, Treg 세포, 세포독성 T 세포 및 헬퍼 T 세포(Th1 및 Th2)를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "조절 T 세포", Treg 세포" 또는 "T reg"는 면역계를 조절하고, 자가-항원에 대한 내성을 유지하고, 자가면역 질환을 예방하는 T 세포의 하위집단을 지칭한다. Treg는 면역억제성이며, 일반적으로 이펙터 T 세포의 유도 및 증식을 억제하거나 하향조절한다. Treg는 바이오마커 CD4, FOXP3 및 CD25를 발현하며, 나이브 CD4 세포와 동일한 계통에서 유래된 것으로 생각된다.
용어 "고갈된 T 세포"는 기능장애 상태(즉, "고갈")에 있는 T 세포의 집단을 지칭한다. T 세포 고갈은 기능의 점진적인 상실, 전사 프로파일의 변화 및 억제 수용체의 지속적인 발현을 특징으로 한다. 고갈된 T 세포는 사이토카인 생산 능력, 그들의 높은 증식 능력 및 그들의 세포독성 잠재력을 잃어, 결국 그들의 결실로 이어진다. 고갈된 T 세포는 전형적으로 CD62L 및 CD127의 낮은 발현과 조합된 더 높은 수준의 CD43, CD69 및 억제 수용체를 나타낸다.
용어 "면역 반응"은 예를 들어 림프구, 항원 제시 세포, 식세포, 과립구 및 상기 세포 또는 간(항체, 사이토카인 및 보체 포함)에 의해 생성된 가용성 거대분자의 작용을 의미하며, 침입하는 병원체, 병원체에 감염된 세포 또는 조직, 암성 세포, 또는 자가면역 또는 병리적 염증의 경우 정상 인간 세포 또는 조직의 인체 손상, 파괴 또는 제거를 초래한다.
본원에 사용된 용어 "길항제"는 또 다른 물질의 활성 또는 기능을 차단하거나 감소시키는 물질을 지칭한다. 특히, 이 용어는 참조 물질(예를 들어, PD-L1 및/또는 PD-L2)로서 세포 수용체(예를 들어, PD-1)에 결합하여 그의 일반적인 생물학적 효과의 전부 또는 일부를 생성하지 못하게(예를 들어, 면역 억제성 미세환경의 생성) 하는 항체를 의미한다. 본 발명에 따른 항체의 길항제 활성은 경쟁 ELISA에 의해 평가될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "단리된"은 언급된 물질(예를 들어, 항체, 폴리펩타이드, 핵산 등)이 자연에서 발생하는 다른 물질로부터 실질적으로 분리되거나 그에 비해 풍부함을 나타낸다. 특히, "단리된" 항체는 그의 자연 환경의 성분으로부터 확인되고 분리되고/되거나 회수된 항체이다. 예를 들어, 단리된 항체는 (1) Lowry 방법에 의해 결정된 항체의 75 중량% 초과로 정제되거나, (2) 환원 또는 비-환원 조건 하에서 SDS-PAGE에 의해 균질성으로 정제된다. 단리된 항체는 항체의 자연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문에 재조합 세포 내에서 항체를 인 시츄로 포함한다. 그러나, 일반적으로 단리된 항체는 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
본 명세서에서 사용된 용어 "및/또는"은 서로를 갖거나 갖지 않는 2개의 특정된 특징 또는 구성요소 각각의 특정 개시로 간주되어야 한다. 예를 들어, "A 및/또는 B"는 마치 각각이 개별적으로 설정된 것처럼 (i) A, (ii) B 및 (iii) A 및 B 각각의 특정 공개로 간주된다.
단수 용어("a" 또는 "an")는 설명된 요소 중 하나 또는 하나 이상의 요소가 문맥 상 명확하지 않은 경우 변형하는 요소 중 하나 또는 복수를 지칭할 수 있다(예를 들어, "시약"은 하나 이상의 시약을 의미할 수 있음).
임의의 및 모든 값(수치 범위의 하한 및 상한 포함)과 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "약"은 허용 가능한 편차 범위가 최대 +/- 10%(예를 들어, +/-0.5%, +/-1%, +/-1.5%, +/-2%, +/-2.5%, +/-3%, +/-3.5%, +/-4%, +/-4.5%, +/-5%, +/-5.5%, +/-6%, +/-6.5%, +/-7%, +/-7.5%, +/-8%, +/-8.5%, + /-9%, +/-9.5%)인 임의의 값을 의미한다. 값 문자열의 시작 부분에서 용어 "약"의 사용은 각 값을 수정한다(즉, "약 1, 2 및 3"은 약 1, 약 2 및 약 3을 의미함). 또한, 값의 목록이 본원에 설명된 경우(예를 들어, 약 50%, 60%, 70%, 80%, 85% 또는 86%), 목록은 이들의 모든 중간 및 분수 값(예를 들어, 54%, 85.4%)을 포함한다.
항-PD-1 항체
본 발명에 따른 이작용성 분자는 항-hPD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 제1 개체를 포함한다.
인간 PD-1에 특히 결합하는 항체가 본원에 제공된다. 일부 양태에서, 항체는 인간 PD-1, 바람직하게는 인간 PD-1의 세포 외 도메인에 특이적으로 결합한다. 일부 양태에서, 항체는 전장 인간 PD-1, PD-1Aex2, PD-1Aex3, PD-1Aex2,3 및 PD-1Aex2,3,4 중 하나 이상에 선택적으로 결합한다.
일부 양태에서, 항-PD1 항체는 단리된 항체, 특히 비-천연 단리된 항체이다. 이러한 단리된 항-PD1 항체는 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조될 수 있다. 일부 구현예에서, 단리된 항-PD1 항체는 중량 기준으로 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%로 정제된다. 일부 구현예에서, 단리된 항-PD1 단리된 항체는 항체의 적어도 85중량%, 90중량%, 95중량%, 98중량%, 99중량% 내지 100중량%의 항체를 포함하는 용액으로서 제공되며, 나머지 중량은 용매에 용해된 다른 용질의 중량을 포함한다.
바람직하게는, 이러한 항체는 PD-1과 그의 리간드 중 적어도 하나(예를 들어, PD-L1 및/또는 PD-L2) 사이의 상호작용을 차단하거나 억제하는 능력을 갖는다. 본원에 사용된 "결합을 차단" 또는 "상호작용을 차단" 또는 "상호작용을 억제"하는 능력은 항체 또는 항원-결합 단편이 두 분자(예를 들어, PD-1 및 그의 리간드 PD-L1 및/또는 PD-L2) 사이의 결합 상호작용을 임의의 검출가능한 정도로 방지하는 능력을 지칭한다.
바람직하게는, 항-PD1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 PD-L1 및/또는 PD-L2의 인간 PD-1로의 결합, 보다 바람직하게는 인간 PD-L1 및 PD-L2의 인간 PD-1로의 결합의 길항제이다.
특정 구현예에서, 항-hPD1 항체 또는 항원-결합 단편은 PD-1과 그의 리간드 중 적어도 하나(예를 들어, PD-L1 및/또는 PD-L2, 바람직하게는 PD-L1 및 PD-L2) 사이의 결합 상호작용을 적어도 50%까지 억제한다. 특정 구현예에서, 이러한 억제는 60% 초과, 70% 초과, 80% 초과, 또는 90% 초과일 수 있다.
본 발명에 따른 항-hPD1 항체는 인간 PD-1을 표적화하는 비-인간(예를 들어, 뮤린) 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 면역글로불린, IgD, IgE, IgG, IgA 또는 IgM과 같은 임의의 클래스의 면역글로불린(또는 이의 하위-클래스), 면역글로불린 사슬 또는 이의 단편(예컨대, Fv, Fab, Fab', F(ab')2, scFv 또는 항체들의 다른 항원-결합 하위서열)을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 항-hPD-1 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4, 바람직하게는 IgG4 또는 IgG1에서 유래한다.
일 구현예에서, 항체의 항원-결합 단편은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 중쇄 및 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 가변 도메인을 포함하는 경쇄, 및 중쇄 불변 도메인의 단편을 포함한다. 중쇄 불변 도메인의 단편에 의해, 항원-결합 단편이 따라서 전체 중쇄 불변 도메인의 적어도 일부를 포함한다는 것을 이해해야 한다. 예로서, 중쇄 불변 도메인은 중쇄의 적어도 CH1 도메인, 또는 중쇄의 적어도 CH1 및 CH2 도메인, 또는 중쇄의 적어도 CH1, CH2 및 CH3 도메인을 포함하거나 이들로 구성될 수 있다. 중쇄 불변 도메인의 단편은 또한 중쇄의 Fc 도메인의 적어도 일부를 포함하는 것으로 정의될 수 있다. 따라서, 항체의 항원-결합 단편은 전체 항체의 Fab 부분, 전체 항체의 F(ab')2 부분, 전체 항체의 Fab' 부분을 포함한다. 중쇄 불변 도메인은 또한 예를 들어 본 명세서에 예시된 바와 같은 전체 중쇄 불변 도메인을 포함하거나 이로 구성될 수 있으며, 여러개의 전체 중쇄 불변 도메인이 기술된다. 본 발명의 특정 구현예에서, 그리고 항체의 항원-결합 단편이 완전 중쇄 불변 도메인을 포함하거나 그 일부로 구성된 중쇄 불변 도메인의 단편을 포함하는 경우, 중쇄 불변 도메인 단편은 적어도 10개의 아미노산 잔기로 구성될 수 있거나; 또는 10 내지 300개의 아미노산 잔기, 특히 210개의 아미노산 잔기로 구성될 수 있다.
바람직하게는, 인간 PD-1에 대한 항체는 단일클론 항체이다. 본원에 사용된 용어 "단일클론 항체"는 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하며, 즉 집단을 포함하는 개별 항체는 동일하고/하거나 동일한 에피토프에 결합한다. 바람직하게는, 이러한 단일클론 항체(mAb)는 마우스, 설치류, 토끼, 염소, 영장류, 비-인간 영장류 또는 인간과 같은 포유동물로부터 유래한다. 이러한 단일클론 항체를 제조하는 기술은 예를 들어 문헌[Stites et al. (eds.) BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY(4th ed.) Lange Medical Publications, Los Altos, CA] 및 본원에 인용된 참고 문헌; [Harlow and Lane(1988) ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL CSH Press; Goding(1986) MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE (2d ed.) Academic Press, New York, NY]에서 찾아볼 수 있다.
일 구현예에서, 항-PD1 항체는 WO 2006/121168에 설명된, 펨브롤리주맙(Keytruda - MK-3475), 니볼루맙(Opdivo, MDX-1106, BMS-936558, ONO-4538), 피딜리주맙(CT-011), 세미플리맙(Libtayo) PDR001, 단일클론 항체 5C4, 17D8, 2D3, 4H1, 4A11, 7D3 및 5F4로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 항-hPD1 항체는 단리된 항체이다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 항-hPD1 항체는 키메라 항체이다. 한 예에서, 키메라 항체는 비-인간 가변 영역(예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼 또는 원숭이와 같은 비인간 영장류로부터 유래된 가변 영역) 및 인간 불변 영역을 포함한다. 추가 예에서, 키메라 항체는 클래스 또는 서브클래스가 모 항체의 것에서 변경된 "클래스 전환된" 항체이다. 키메라 항체에는 이의 항원-결합 단편이 포함된다.
특정 구현예에서, 항-hPD1 항체는 인간화 항체이다. 인간화 항체는 전형적으로 CDR(또는 이의 일부)이 비-인간 항체로부터 유래되고 FR(또는 이의 일부)이 인간 또는 인간화 항체 서열로부터 유래된 하나 이상의 가변 도메인을 포함한다. 대안적으로, 일부 FR 잔기는 항체 특이성, 친화도 및/또는 인간화를 복원하거나 개선하기 위해 치환될 수 있다. 인간화 항체는 선택적으로 인간 또는 인간화 불변 영역(Fc)의 적어도 일부를 또한 포함할 것이다. 항체 인간화 방법은 당 업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 문헌[Winter and Milstein, Nature, 1991, 349:293-299]; [Riechmann et al., Nature, 332, pp. 323 (1988)]; [Verhoeyen et al., Science, 239, pp. 1534 (1988)], [Rader et al, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 1998, 95:8910-8915]; [Steinberger et al, J. Biol. Chem., 2000, 275:36073-36078]; [Queen et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1989, 86: 10029-10033]; [Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633]; [Kashmiri, S.V. et al, Methods 36 (2005) 25-34](SDR(a-CDR) 이식을 설명함); [Padlan, E.A., Mol. Immunol. 28 (1991) 489-498]("리서페이싱"을 설명함); [Dall'Acqua, W.F. et al, Methods 36 (2005) 43-60]("FR 셔플링"을 설명함); 및 [Osbourn, J. et al, Methods 36 (2005) 61-68] 및 [Klimka, A. et al, Br. J. Cancer 83 (2000) 252-260](FR 셔플링에 대한 "가이드 선택" 접근 방식을 설명함) 및 미국 특허 번호 제5,585,089호, 제5,693,761호, 제5,693,762호, 제5,821,337호, 제7,527,791호, 제6,982,321호, 및 제7,087,409호; 및 제6,180,370호를 참고한다. 바람직하게는, 인간 PD-1에 대한 인간화 항체는 단일클론 항체이다.
특히, 인간화 항체는 적어도 80% 또는 적어도 85%, 보다 바람직하게는 적어도 88%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 90%의 T20 인간성 점수, 가장 바람직하게는 85% 내지 95%, 바람직하게는 88% 내지 92% 사이에 포함된 T20 인간성 점수를 갖는 항체이다.
"인간성"은 일반적으로 문헌[Gao S H, Huang K, Tu H, Adler A S. BMC Biotechnology. 2013:13:55]에 설명된대로 단일클론 항체의 가변 영역의 인간성을 정량화하기 위해 T20 점수 분석기를 사용하여 측정된다. T20 인간성 점수는 Gao 등(문헌[BMC Biotechnol., 2013, 13, 55])에 의해 처음 개시된 항체 인간화 분야에서 일반적으로 사용되는 매개변수이다. T20 인간성 점수는 일반적으로 인간화 항체를 정의하기 위한 특허 출원에서 사용된다(예를 들어, WO15161311, WO17127664, WO18136626, WO18190719, WO19060750 또는 WO19170677).
T20 컷오프 인간 데이터베이스(Cutoff Human Databases): http://abAnalyzer.lakepharma.com을 사용하여 항체 서열의 T20 점수를 계산하기 위해 웹-기반 도구가 제공된다. T20 점수를 계산할 때, 입력 VH, VK 또는 VL 가변 영역 단백질 서열이 먼저 Kabat 넘버링에 할당되고, CDR 잔기가 식별된다. 전장 서열 또는 프레임워크 전용 서열(CDR 잔기가 제거됨)은 blastp 단백질-단백질 BLAST 알고리즘을 사용하여 각 항체 데이터베이스의 모든 서열과 비교된다. 각 쌍별 비교 사이의 서열 동일성이 분리되고, 데이터베이스의 모든 서열이 분석된 후, 서열은 입력 서열에 대한 서열 동일성을 기반으로 높은 순서에서 낮은 순서로 정렬된다. 상위 20개 일치 서열의 동일성 백분율을 평균하여 T20 점수를 얻는다.
"모든 인간 데이터베이스"의 각 사슬 유형(VH, VK, VL) 및 서열 길이(전체 길이 또는 프레임워크 단독)에 대해 각 항체 서열은 T20 점수 분석기를 사용하여 그의 각 데이터베이스로 점수를 매겼다. T20 점수는 입력 서열 자체가 제외된 후 상위 20개 일치 서열에 대해 획득되었다(서열 1이 항상 입력 항체 자체이기 때문에 서열 2 내지 21의 동일성 백분율은 평균화됨). 각 그룹의 T20 점수는 높은 것에서 낮은 것으로 분류되었다. 점수의 감소는 대부분의 서열에서 거의 선형적이었으며; 그러나, 항체의 최하위 ~15%에 대한 T20 점수는 급격히 감소하기 시작했다. 따라서, 서열의 하위 15%가 제거되고, 나머지 서열은 T20 컷오프 인간 데이터베이스를 형성했으며, 여기서, T20 점수 컷오프는 새 데이터베이스에서 서열의 가장 낮은 T20 점수를 나타낸다.
따라서, 본 발명에 따른 이작용성 분자에 포함된 인간화 항-PD1 항체는 적어도 80% 또는 적어도 85%, 보다 바람직하게는 적어도 88%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 90%의 T20 인간성 점수, 가장 바람직하게는 85% 내지 95%, 바람직하게는 88% 내지 92% 사이에 포함된 T20 인간성 점수를 갖는 항체이다.
일 구현예에서, 항-PD1 항체는 펨브롤리주맙(Keytruda 람브롤리주맙으로도 알려짐, MK-3475), 니볼루맙(Opdivo, MDX-1106, BMS-936558, ONO-4538), 피딜리주맙(CT-011), 케미플리맙(Libtayo), 캄렐리주맙, AUNP12, AMP-224, AGEN-2034, BGB-A317(티슬레이주맙), PDR001(스파르탈리주맙), MK-3477, SCH-900475, PF-06801591, JNJ-63723283, 게놀림주맙(CBT-501), LZM-009, BCD-100, SHR-1201, BAT-1306, AK-103(HX-008), MEDI-0680(AMP-514로도 알려짐) MEDI0608, JS001(문헌[Si-Yang Liu et al., J. Hematol. Oncol.10:136 (2017)] 참고), BI-754091, CBT-501, INCSHR1210(SHR-1210으로도 알려짐), TSR-042(ANB011로도 알려짐), GLS-010(WBP3055로도 알려짐), AM-0001(Armo), STI-1110(WO 2014/194302 참고), AGEN2034(WO 2017/040790 참고), MGA012(WO 2017/19846 참고), 또는 IBI308(WO 2017/024465, WO 2017/025016, WO 2017/132825, 및 WO 2017/133540 참고), WO 2006/121168에 기재된 단일클론 항체들 5C4, 17D8, 2D3, 4H1, 4A11, 7D3, 및 5F4로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. PD-1을 표적화하는 이작용성 또는 이중특이적 분자는 또한 RG7769(Roche), XmAb20717(Xencor), MEDI5752(AstraZeneca), FS118(F-star), SL-279252(Takeda) 및 XmAb23104(Xencor)와 같이 알려져 있다.
특정 구현예에서, 항-PD1 항체는 펨브롤리주맙(Keytruda 람브롤리주맙으로도 알려짐, MK-3475) 또는 니볼루맙(Opdivo, MDX-1106, BMS-936558, ONO-4538)일 수 있다.
인간화 항-hPD1 항체의 특정 예는 이후에 그의 CDR, 프레임워크 영역 및 Fc 및 힌지 영역에 의해 설명된다.
CDR
"상보성 결정 영역" 또는 "CDR"은 항원 특이성 및 결합 친화성을 부여하는, 항체 가변 영역 내의 아미노산의 비-연속적 서열을 지칭하는 것으로 당 업계에 공지되어있다. 주어진 CDR의 정확한 아미노산 서열 경계는 Kabat et al., (Sequences of Proteins of Immunological Interest 5th ed. (1991) "Kabat" 넘버링 체계); Al-Lazikani et al., 1997, J. Mol. Biol, 273:927-948 ("Chothia" 넘버링 체계); MacCallum et al, 1996, J. Mol. Biol. 262:732-745 ("Contact" 넘버링 체계); Lefranc et al., Dev. Comp. Immunol., 2003, 27:55-77 ("IMGT" 넘버링 체계); 및 Honegge and Pluckthun, J. Mol. Biol, 2001, 309:657-70 ("AHo" 넘버링 체계)에 의해 기술된 것을 포함하여 많은 잘 알려진 체계를 사용하여 쉽게 결정할 수 있다. 달리 명시되지 않는 한, 본원에서 특정 CDR의 식별에 사용되는 넘버링 체계는 Kabat 넘버링 체계이다.
일 구현예에서, 이작용성 분자는 인간화된 항-hPD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 인간화 항체의 CDR 영역은 뮤린 항체로부터 유래될 수 있으며, i) 매우 높은 수준의 인간화(85% 이상) 및 안정성을 갖는 안전한 인간화 항체를 제공하고; 및 ii) 길항제 활성을 보존하면서(즉, 인간 PD-L1의 인간 PD-1로의 결합 억제) COS 및 HCO 세포와 같은 포유동물 세포에서 생산될 때보다 특히 더 높은 제조가능성 및 더 높은 생산 수율을 증가시키도록 최적화되고, 이들은 인간 PD-1에 대한 결합 친화도(KD)가 10-7 M 미만, 바람직하게는 10-8 M 미만이다.
매우 특정한 구현예에서, 이작용성 분자는 하기를 포함하는 항-인간-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다:
(i) HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 및
(ii) LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 도메인,
여기서:
- 중쇄 CDR1(HCDR1)은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되며, 선택적으로 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 가지며;
- 중쇄 CDR2(HCDR2)는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되며, 선택적으로 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 가지며;
- 중쇄 CDR3(HCDR3)은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되며, 여기서, X1은 D 또는 E이고 X2는 T, H, A, Y, N, E 및 S로 이루어진 군, 바람직하게는 H, A, Y, N, E로 이루어진 군으로부터 선택되며; 서열번호 3의 위치 2, 3, 7 및 8을 제외한 임의의 위치에 선택적으로 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 가지며;
- 경쇄 CDR1(LCDR1)은 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되며, 여기서, X는 G 또는 T이고, 서열번호 12의 위치 10, 11 및 16을 제외한 임의의 위치에 선택적으로 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 가지며;
- 경쇄 CDR2(LCDR2)는 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되며, 선택적으로 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 가지며;
- 경쇄 CDR3(LCDR3)은 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되며, 서열번호 16의 위치 1 및 6을 제외한 임의의 위치에 선택적으로 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 가진다.
또 다른 구현예에서, 이작용성 분자는 상기 명시된 바와 같은 HCDR1, HCDR2, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 인간화 항-hPD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고, 중쇄 CDR3(HCDR3)은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되며, 여기서, X1은 D이고 X2는 T, H, A, Y, N, E 및 S로 이루어진 군, 바람직하게는 H, A, Y, N, E로 이루어진 군으로부터 선택되며; 또는 X1은 E이고 X2는 T, H, A, Y, N, E 및 S로 이루어진 군, 바람직하게는 H, A, Y, N, E 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되며; 서열번호 3의 위치 2, 3, 7 및 8을 제외한 임의의 위치에 선택적으로 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 가지며; 경쇄 CDR1(LCDR1)은 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되며, 여기서 X1은 G 또는 T이고, 서열번호 12의 위치 5, 6, 10, 11 및 16을 제외한 임의의 위치에 선택적으로 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 가진다.
또 다른 구현예에서, 이작용성 분자는 상기 명시된 바와 같은 HCDR1, HCDR2, LCDR2 및 LCDR3, 및
- 서열번호 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11의 위치 2, 3, 7 및 8을 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 서열번호 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 중쇄 CDR3(HCDR3); 및
- 서열번호 13 또는 서열번호 14의 위치 5, 6, 10, 11 및 16을 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 서열번호 13 또는 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 경쇄 CDR1(LCDR1)
을 포함하는 인간화 항-hPD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 이작용성 분자는 상기 명시된 바와 같은 HCDR1, HCDR2, LCDR2 및 LCDR3, 및
- 서열번호 4의 위치 2, 3, 7 및 8을 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 중쇄 CDR3(HCDR3); 및 서열번호 13의 위치 5, 6, 10, 11 및 16을 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 경쇄 CDR1(LCDR1); 또는
- 서열번호 5의 위치 2, 3, 7 및 8을 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 중쇄 CDR3(HCDR3); 및 서열번호 13의 위치 5, 6, 10, 11 및 16을 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 경쇄 CDR1(LCDR1); 또는
- 서열번호 6의 위치 2, 3, 7 및 8을 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 중쇄 CDR3(HCDR3); 및 서열번호 13의 위치 5, 6, 10, 11 및 16을 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 경쇄 CDR1(LCDR1); 또는
- 서열번호 7의 위치 2, 3, 7 및 8을 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 중쇄 CDR3(HCDR3); 및 서열번호 13의 위치 5, 6, 10, 11 및 16을 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 경쇄 CDR1(LCDR1); 또는
- 서열번호 8의 위치 2, 3, 7 및 8을 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 중쇄 CDR3(HCDR3); 및 서열번호 13의 위치 5, 6, 10, 11 및 16을 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 경쇄 CDR1(LCDR1); 또는
- 서열번호 9의 위치 2, 3, 7 및 8을 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 중쇄 CDR3(HCDR3); 및 서열번호 13의 위치 5, 6, 10, 11 및 16을 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 경쇄 CDR1(LCDR1); 또는
- 서열번호 10의 위치 2, 3, 7 및 8을 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 중쇄 CDR3(HCDR3); 및 서열번호 13의 위치 5, 6, 10, 11 및 16을 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 경쇄 CDR1(LCDR1); 또는
- 서열번호 11의 위치 2, 3, 7 및 8을 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 중쇄 CDR3(HCDR3); 및 서열번호 13의 위치 5, 6, 10, 11 및 16을 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 경쇄 CDR1(LCDR1); 또는
- 서열번호 4의 위치 2, 3, 7 및 8을 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 중쇄 CDR3(HCDR3); 및 서열번호 14의 위치 5, 6, 10, 11 및 16을 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 경쇄 CDR1(LCDR1); 또는
- 서열번호 5의 위치 2, 3, 7 및 8을 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 중쇄 CDR3(HCDR3); 및 서열번호 14의 위치 5, 6, 10, 11 및 16을 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 경쇄 CDR1(LCDR1); 또는
- 서열번호 6의 위치 2, 3, 7 및 8을 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 중쇄 CDR3(HCDR3); 및 서열번호 14의 위치 5, 6, 10, 11 및 16을 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 경쇄 CDR1(LCDR1); 또는
- 서열번호 7의 위치 2, 3, 7 및 8을 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 중쇄 CDR3(HCDR3); 및 서열번호 14의 위치 5, 6, 10, 11 및 16을 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 경쇄 CDR1(LCDR1); 또는
- 서열번호 8의 위치 2, 3, 7 및 8을 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 중쇄 CDR3(HCDR3); 및 서열번호 14의 위치 5, 6, 10, 11 및 16을 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 경쇄 CDR1(LCDR1); 또는
- 서열번호 9의 위치 2, 3, 7 및 8을 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 중쇄 CDR3(HCDR3); 및 서열번호 14의 위치 5, 6, 10, 11 및 16을 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 경쇄 CDR1(LCDR1); 또는
- 서열번호 10의 위치 2, 3, 7 및 8을 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 중쇄 CDR3(HCDR3); 및 서열번호 14의 위치 5, 6, 10, 11 및 16을 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 경쇄 CDR1(LCDR1); 또는
- 서열번호 11의 위치 2, 3, 7 및 8을 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 중쇄 CDR3(HCDR3); 및 서열번호 14의 위치 5, 6, 10, 11 및 16을 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 경쇄 CDR1(LCDR1)
을 포함하는 인간화 항-hPD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
특정 양태에서, 변형은 치환, 특히 보존적 치환이다.
일 구현예에서, 항-인간-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 (i) 서열번호 1의 CDR1, 서열번호 2의 CDR2 및 서열번호 3의 CDR3을 포함하는 중쇄로서, 여기서, X1은 D 또는 E이고 X2는 T, H, A, Y, N, E 및 S로 이루어진 군, 바람직하게는 H, A, Y, N, 및 E로 이루어진 군으로부터 선택되는, 중쇄; 및 (ii) 서열번호 12의 CDR1(여기서, X는 G 또는 T임), 서열번호 15의 CDR2 및 서열번호 16의 CDR3을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일 구현예에서, 항-인간-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 (i) 서열번호 1의 CDR1, 서열번호 2의 CDR2 및 서열번호 3의 CDR3을 포함하는 중쇄로서, 여기서, X1은 D이고 X2는 T, H, A, Y, N 및 E로 이루어진 군, 바람직하게는 H, A, Y, N 및 E로 이루어진 군으로부터 선택되거나; 또는 X1은 E이고 X2는 T, H, A, Y, N, E 및 S로 이루어진 군, 바람직하게는 H, A, Y, N, E 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되는, 중쇄; 및 (ii) 서열번호 12의 CDR1(여기서, X는 G 또는 T임), 서열번호 15의 CDR2 및 서열번호 16의 CDR3을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일 구현예에서, 항-인간-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 (i) 서열번호 1의 CDR1, 서열번호 2의 CDR2 및 서열번호 3의 CDR3을 포함하는 중쇄로서, 여기서, X1은 D이고 X2는 T, H, A, Y, N 및 E로 이루어진 군, 바람직하게는 H, A, Y, N 및 E로 이루어진 군으로부터 선택되는, 중쇄; 및 (ii) 서열번호 12의 CDR1(여기서, X는 G 또는 T임), 서열번호 15의 CDR2 및 서열번호 16의 CDR3을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일 구현예에서, 항-인간-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 (i) 서열번호 1의 CDR1, 서열번호 2의 CDR2 및 서열번호 3의 CDR3을 포함하는 중쇄로서, 여기서, X1은 E이고 X2는 T, H, A, Y, N, E 및 S로 이루어진 군, 바람직하게는 H, A, Y, N, E 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되는, 중쇄; 및 (ii) 서열번호 12의 CDR1(여기서, X는 G 또는 T임), 서열번호 15의 CDR2 및 서열번호 16의 CDR3을 포함하는 경쇄를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 항-인간-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 (i) 서열번호 1의 CDR1, 서열번호 2의 CDR2 및 서열번호 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11의 CDR3을 포함하는 중쇄; 및 (ii) 서열번호 13 또는 서열번호 14의 CDR1, 서열번호 15의 CDR2 및 서열번호 16의 CDR3을 포함하는 경쇄를 포함하거나 이로 필수적으로 구성된다.
또 다른 구현예에서, 항-인간-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은
(i) 서열번호 1의 CDR1, 서열번호 2의 CDR2 및 서열번호 4의 CDR3을 포함하는 중쇄; 및 (ii) 서열번호 13의 CDR1, 서열번호 15의 CDR2 및 서열번호 16의 CDR3을 포함하는 경쇄; 또는
(i) 서열번호 1의 CDR1, 서열번호 2의 CDR2 및 서열번호 5의 CDR3을 포함하는 중쇄; 및 (ii) 서열번호 13의 CDR1, 서열번호 15의 CDR2 및 서열번호 16의 CDR3을 포함하는 경쇄; 또는
(i) 서열번호 1의 CDR1, 서열번호 2의 CDR2 및 서열번호 6의 CDR3을 포함하는 중쇄; 및 (ii) 서열번호 13의 CDR1, 서열번호 15의 CDR2 및 서열번호 16의 CDR3을 포함하는 경쇄; 또는
(i) 서열번호 1의 CDR1, 서열번호 2의 CDR2 및 서열번호 7의 CDR3을 포함하는 중쇄; 및 (ii) 서열번호 13의 CDR1, 서열번호 15의 CDR2 및 서열번호 16의 CDR3을 포함하는 경쇄; 또는
(i) 서열번호 1의 CDR1, 서열번호 2의 CDR2 및 서열번호 8의 CDR3을 포함하는 중쇄; 및 (ii) 서열번호 13의 CDR1, 서열번호 15의 CDR2 및 서열번호 16의 CDR3을 포함하는 경쇄; 또는
(i) 서열번호 1의 CDR1, 서열번호 2의 CDR2 및 서열번호 9의 CDR3을 포함하는 중쇄; 및 (ii) 서열번호 13의 CDR1, 서열번호 15의 CDR2 및 서열번호 16의 CDR3을 포함하는 경쇄; 또는
(i) 서열번호 1의 CDR1, 서열번호 2의 CDR2 및 서열번호 10의 CDR3을 포함하는 중쇄; 및 (ii) 서열번호 13의 CDR1, 서열번호 15의 CDR2 및 서열번호 16의 CDR3을 포함하는 경쇄; 또는
(i) 서열번호 1의 CDR1, 서열번호 2의 CDR2 및 서열번호 11의 CDR3을 포함하는 중쇄; 및 (ii) 서열번호 13의 CDR1, 서열번호 15의 CDR2 및 서열번호 16의 CDR3을 포함하는 경쇄; 또는
(i) 서열번호 1의 CDR1, 서열번호 2의 CDR2 및 서열번호 4의 CDR3을 포함하는 중쇄; 및 (ii) 서열번호 14의 CDR1, 서열번호 15의 CDR2 및 서열번호 16의 CDR3을 포함하는 경쇄; 또는
(i) 서열번호 1의 CDR1, 서열번호 2의 CDR2 및 서열번호 5의 CDR3을 포함하는 중쇄; 및 (ii) 서열번호 14의 CDR1, 서열번호 15의 CDR2 및 서열번호 16의 CDR3을 포함하는 경쇄; 또는
(i) 서열번호 1의 CDR1, 서열번호 2의 CDR2 및 서열번호 6의 CDR3을 포함하는 중쇄; 및 (ii) 서열번호 14의 CDR1, 서열번호 15의 CDR2 및 서열번호 16의 CDR3을 포함하는 경쇄; 또는
(i) 서열번호 1의 CDR1, 서열번호 2의 CDR2 및 서열번호 7의 CDR3을 포함하는 중쇄; 및 (ii) 서열번호 14의 CDR1, 서열번호 15의 CDR2 및 서열번호 16의 CDR3을 포함하는 경쇄; 또는
(i) 서열번호 1의 CDR1, 서열번호 2의 CDR2 및 서열번호 8의 CDR3을 포함하는 중쇄; 및 (ii) 서열번호 14의 CDR1, 서열번호 15의 CDR2 및 서열번호 16의 CDR3을 포함하는 경쇄; 또는
(i) 서열번호 1의 CDR1, 서열번호 2의 CDR2 및 서열번호 9의 CDR3을 포함하는 중쇄; 및 (ii) 서열번호 14의 CDR1, 서열번호 15의 CDR2 및 서열번호 16의 CDR3을 포함하는 경쇄; 또는
(i) 서열번호 1의 CDR1, 서열번호 2의 CDR2 및 서열번호 10의 CDR3을 포함하는 중쇄; 및 (ii) 서열번호 14의 CDR1, 서열번호 15의 CDR2 및 서열번호 16의 CDR3을 포함하는 경쇄; 또는
(i) 서열번호 1의 CDR1, 서열번호 2의 CDR2 및 서열번호 11의 CDR3을 포함하는 중쇄; 및 (ii) 서열번호 14의 CDR1, 서열번호 15의 CDR2 및 서열번호 16의 CDR3을 포함하는 경쇄
를 포함하거나, 이로 필수적으로 구성된다.
프레임워크
일 구현예에서, 본 발명에 따른 항-PD1 항체 또는 항원 결합 단편은 프레임워크 영역, 특히 중쇄 가변 영역 프레임워크 영역(HFR) HFR1, HFR2, HFR3 및 HFR4 및 경쇄 가변 영역 프레임워크 영역(LFR) LFR1, LFR2, LFR3 및 LFR4를 포함한다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 항-PD1 항체 또는 항원 결합 단편은 인간 또는 인간화 프레임워크 영역을 포함한다. 본원의 목적을 위한 "인간 수용체 프레임워크"는 하기에 정의된 바와 같이, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크로부터 유래된 경쇄 가변 도메인(VL) 프레임워크 또는 중쇄 가변 도메인(VH) 프레임워크의 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크이다. 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크로부터 유래된 인간 수용체 프레임워크는 그의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 아미노산 서열 변화를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 아미노산 변화의 수는 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 또는 2개 이하이다. 일부 구현예에서, VL 수용체 인간 프레임워크는 VL 인간 면역글로불린 프레임워크 서열 또는 인간 컨센서스 프레임워크 서열과 서열이 동일하다. "인간 컨센서스 프레임워크"는 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선택에서 가장 흔히 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다.
특히, 항-PD1 항체 또는 항원 결합 단편은 HFR3의, 즉 서열번호 43의 위치 27, 29 및 32를 제외한 임의의 위치에서 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는, 각각 서열번호 41, 42, 43 및 44의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 프레임워크 영역(HFR) HFR1, HFR2, HFR3 및 HFR4를 포함한다. 바람직하게는, 항-PD1 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 41의 HFR1, 서열번호 42의 HFR2, 서열번호 43의 HFR3 및 서열번호 44의 HFR4를 포함한다.
대안적으로 또는 추가적으로, 항-PD1 항체 또는 항원 결합 단편은 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는, 각각 서열번호 45, 46, 47 및 48의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 프레임워크 영역(LFR) LFR1, LFR2, LFR3 및 LFR4를 포함한다. 바람직하게는, 항-PD1 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 45의 LFR1, 서열번호 46의 LFR2, 서열번호 47의 LFR3 및 서열번호 48의 LFR4를 포함한다.
VH-VL
본 발명에 따른 이작용성 분자에 포함된 항 hPD1 항체의 VL 및 VH 도메인은 바람직하게는 하기 순서로: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4(아미노 말단에서 카르복시 말단까지) 작동 가능하게 연결된 3개의 상보적 결정 영역에 의해 중단된 4개의 프레임워크 영역을 포함할 수 있다.
제1 구현예에서, 이작용성 분자에 포함된 항-인간-PD-1 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기를 포함한다:
(a) 서열번호 17의 위치 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112를 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는, 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역(VH)(여기서, X1은 D 또는 E이고 X2는 T, H, A, Y, N, E 및 S로 이루어진 군, 바람직하게는 H, A, Y, N, E로 이루어진 군으로부터 선택됨);
(b) 서열번호 26의 위치 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105를 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는, 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역(VL)(여기서, X는 G 또는 T임).
제2 구현예에서, 이작용성 분자에 포함된 항-인간-PD-1 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기를 포함한다:
(a) 서열번호 17의 위치 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112를 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는, 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역(VH)(여기서, X1은 D이고 X2는 T, H, A, Y, N, E로 이루어진 군, 바람직하게는 H, A, Y, N, E로 이루어진 군으로부터 선택되거나; X1은 E이고 X2는 T, H, A, Y, N, E 및 S로 이루어진 군, 바람직하게는 H, A, Y, N, E 및 S로 이루어진 군으로부터 선택됨);
(b) 서열번호 26의 위치 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105를 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는, 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역(VL)(여기서, X는 G 또는 T임).
제3 구현예에서, 이작용성 분자에 포함된 항-인간-PD-1 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기를 포함한다:
(a) 서열번호 17의 위치 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112를 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는, 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역(VH)(여기서, X1은 E이고 X2는 T, H, A, Y, N, E 및 S로 이루어진 군, 바람직하게는 H, A, Y, N, E 및 S로 이루어진 군으로부터 선택됨);
(b) 서열번호 26의 위치 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105를 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는, 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역(VL)(여기서, X는 G 또는 T임).
또 다른 구현예에서, 이작용성 분자에 포함된 항-인간-PD-1 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기를 포함한다:
(a) 서열번호 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25의 위치 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112를 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는, 서열번호 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역(VH);
(b) 서열번호 27 또는 서열번호 28의 위치 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105를 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는, 서열번호 27 또는 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역(VL).
또 다른 구현예에서, 이작용성 분자에 포함된 항-인간-PD-1 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기를 포함한다:
(a) 서열번호 18의 위치 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112를 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는, 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역(VH); 및 (b) 서열번호 27의 위치 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105를 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는, 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역(VL); 또는
(a) 서열번호 19의 위치 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112를 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는, 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역(VH); 및 (b) 서열번호 27의 위치 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105를 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는, 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역(VL); 또는
(a) 서열번호 20의 위치 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112를 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는, 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역(VH); 및 (b) 서열번호 27의 위치 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105를 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는, 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역(VL); 또는
(a) 서열번호 21의 위치 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112를 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는, 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역(VH); 및 (b) 서열번호 27의 위치 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105를 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는, 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역(VL); 또는
(a) 서열번호 22의 위치 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112를 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는, 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역(VH); 및 (b) 서열번호 27의 위치 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105를 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는, 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역(VL); 또는
(a) 서열번호 23의 위치 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112를 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는, 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역(VH); 및 (b) 서열번호 27의 위치 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105를 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는, 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역(VL); 또는
(a) 서열번호 24의 위치 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112를 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는, 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역(VH); 및 (b) 서열번호 27의 위치 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105를 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는, 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역(VL); 또는
(a) 서열번호 25의 위치 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112를 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는, 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역(VH); 및 (b) 서열번호 27의 위치 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105를 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는, 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역(VL); 또는
(a) 서열번호 18의 위치 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112를 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는, 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역(VH); 및 (b) 서열번호 28의 위치 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105를 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는, 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역(VL); 또는
(a) 서열번호 19의 위치 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112를 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는, 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역(VH); 및 (b) 서열번호 28의 위치 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105를 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는, 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역(VL); 또는
(a) 서열번호 20의 위치 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112를 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는, 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역(VH); 및 (b) 서열번호 28의 위치 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105를 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는, 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역(VL); 또는
(a) 서열번호 21의 위치 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112를 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는, 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역(VH); 및 (b) 서열번호 28의 위치 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105를 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는, 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역(VL); 또는
(a) 서열번호 22의 위치 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112를 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는, 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역(VH); 및 (b) 서열번호 28의 위치 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105를 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는, 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역(VL); 또는
(a) 서열번호 23의 위치 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112를 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는, 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역(VH); 및 (b) 서열번호 28의 위치 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105를 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는, 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역(VL); 또는
(a) 서열번호 24의 위치 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112를 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는, 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역(VH); 및 (b) 서열번호 28의 위치 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105를 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는, 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역(VL); 또는
(a) 서열번호 25의 위치 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112를 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는, 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역(VH); 및 (b) 서열번호 28의 위치 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105를 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는, 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역(VL).
특정 양태에서, 변형은 치환, 특히 보존적 치환이다.
CH-CL
일 구현예에서, 중쇄(CH) 및 경쇄(CL)는 위에 설명된 VL 및 VH 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 이작용성 분자에 포함된 항-인간-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기를 포함한다:
(a) 서열번호 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36의 위치 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112를 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는, 서열번호 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄, 및
(b) 서열번호 37 또는 서열번호 38의 위치 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105를 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는, 서열번호 37 또는 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄.
또 다른 구현예에서, 이작용성 분자에 포함된 항-인간-PD-1 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기를 포함한다:
(a) 서열번호 29의 위치 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112를 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는, 서열번호 29로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄, 및 (b) 서열번호 37의 위치 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105를 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는, 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄; 또는
(a) 서열번호 30의 위치 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112를 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는, 서열번호 30으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄, 및 (b) 서열번호 37의 위치 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105를 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는, 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄; 또는
(a) 서열번호 31의 위치 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112를 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는, 서열번호 31로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄, 및 (b) 서열번호 37의 위치 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105를 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는, 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄; 또는
(a) 서열번호 32의 위치 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112를 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는, 서열번호 32로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄, 및 (b) 서열번호 37의 위치 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105를 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는, 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄; 또는
(a) 서열번호 33의 위치 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112를 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는, 서열번호 33으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄, 및 (b) 서열번호 37의 위치 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105를 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는, 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄; 또는
(a) 서열번호 34의 위치 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112를 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는, 서열번호 34로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄, 및 (b) 서열번호 37의 위치 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105를 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는, 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄; 또는
(a) 서열번호 35의 위치 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112를 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는, 서열번호 35로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄, 및 (b) 서열번호 37의 위치 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105를 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는, 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄; 또는
(a) 서열번호 36의 위치 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112를 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는, 서열번호 36으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄, 및 (b) 서열번호 37의 위치 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105를 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는, 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄; 또는
(a) 서열번호 29의 위치 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112를 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는, 서열번호 29로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄, 및 (b) 서열번호 38의 위치 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105를 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는, 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄; 또는
(a) 서열번호 30의 위치 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112를 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는, 서열번호 30으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄, 및 (b) 서열번호 38의 위치 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105를 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는, 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄; 또는
(a) 서열번호 31의 위치 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112를 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는, 서열번호 31로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄, 및 (b) 서열번호 38의 위치 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105를 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는, 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄; 또는
(a) 서열번호 32의 위치 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112를 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는, 서열번호 32로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄, 및 (b) 서열번호 38의 위치 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105를 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는, 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄; 또는
(a) 서열번호 33의 위치 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112를 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는, 서열번호 33으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄, 및 (b) 서열번호 38의 위치 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105를 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는, 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄; 또는
(a) 서열번호 34의 위치 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112를 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는, 서열번호 34로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄, 및 (b) 서열번호 38의 위치 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105를 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는, 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄; 또는
(a) 서열번호 35의 위치 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112를 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는, 서열번호 35로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄, 및 (b) 서열번호 38의 위치 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105를 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는, 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄; 또는
(a) 서열번호 36의 위치 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112를 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는, 서열번호 36으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄, 및 (b) 서열번호 38의 위치 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105를 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는, 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄.
바람직하게는, 변형은 치환, 특히 보존적 치환이다.
Fc 및 힌지 영역
치료용 항체를 개발하기 위한 여러 연구를 통해 Fc 영역을 조작하여 항체 특성을 최적화하여, 이들에게 필요한 약리학 활성에 더 적합한 분자를 생성할 수 있게 되었다. 항체의 Fc 영역은 보체-의존적 세포독성(CDC), 항체-의존적 세포의 세포독성(ADCC) 및 항체-의존적 세포의 식세포작용(ADCP)과 같이, 그의 혈청 반감기 및 이펙터 기능을 매개한다. T250Q/M428L 및 M252Y/S254T/T256E + H433K/N434F와 같은 CH2와 CH3 도메인 사이의 계면에 위치한 여러 돌연변이는 FcRn에 대한 결합 친화도 및 생체 내 IgG1의 반감기를 증가시키는 것으로 나타났다. 그러나, 증가된 FcRn 결합과 개선된 반감기 사이에 항상 직접적인 관계가 있는 것은 아니다. 치료용 항체의 효능을 개선하기 위한 한 가지 접근법은 혈청 지속성을 증가시켜 더 높은 순환 수준, 덜 빈번한 투여 및 감소된 용량을 허용하는 것이다. 항체의 이펙터 기능을 감소시키거나 증가시키기 위해 조작적 Fc 영역이 바람직할 수 있다. 세포-표면 분자, 특히 면역 세포에 있는 분자를 표적화하는 항체의 경우, 이펙터 기능을 제거할 필요가 있다. 반대로 종양학 사용을 위한 항체의 경우, 이펙터 기능을 증가 시키면 치료적 활성이 향상될 수 있다. 4개의 인간 IgG 이소형은 활성화 Fcγ 수용체(FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIIa), 억제형 FcγRIIb 수용체 및 서로 다른 친화성을 가진 보체의 제1 성분(C1q)에 결합하여, 매우 다른 이펙터 기능을 생성한다. FcγR 또는 C1q에 대한 IgG의 결합은 힌지 영역과 CH2 도메인에 위치한 잔기에 따라 달라진다. CH2 도메인의 두 영역은 FcγR 및 C1q 결합에 중요하며, IgG2 및 IgG4에서 고유한 서열을 가지고 있다.
본 발명에 따른 항체는 선택적으로 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 포유동물 면역글로불린의 부분, 더욱더 바람직하게는 인간 또는 인간화 면역글로불린을 포함한다. 바람직하게는, Fc 영역은 본원에 기재된 항-hPD-1 항체의 일부이다. 본 발명의 이작용성 분자에 포함된 항-hPD1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 면역글로불린의 불변 영역 또는 불변 영역의 단편, 유사체, 변이체, 돌연변이체 또는 유도체를 포함할 수 있다. 당업자에게 잘 알려진 바와 같이, 중쇄 불변 도메인의 IgG 이소형의 선택은 특정 기능이 필요한지 여부 및 적합한 생체 내 반감기에 대한 필요성에 중점을 둔다. 예를 들어, 암세포의 선택적 박멸을 위해 설계된 항체는 전형적으로 항체-의존적 세포-매개 세포독성에 의한 보체 활성화 및 이펙터-매개 세포 사멸을 허용하는 활성 이소형을 필요로 한다. 인간 IgG1 및 IgG3(더 짧은 반감기) 이소형, 특히 인간 IgG1 이소형(야생형 및 변이체)이 이러한 기준을 충족한다. 특히, 중쇄 불변 도메인의 IgG 이소형(특히 인간 야생형 및 변이체 IgG1 이소형)에 따라, 본 발명의 항-hPD1 항체는 CDC, ADCC 및/또는 ADCP 메커니즘을 통해 PD-1을 발현하는 세포에 대해 세포독성일 수 있다. 사실, 단편 결정화 가능(Fc) 영역은 다양한 보조 분자와 상호작용하여, 항체-의존적 세포의 세포독성(ADCC), 항체-의존적 세포의 식세포작용(ADCP) 및 보체-의존적 세포독성(CDC)과 같은 간접 이펙터 기능을 매개한다.
바람직한 구현예에서, 불변 영역은 인간 면역글로불린 중쇄, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 또는 다른 클래스로부터 유래된다. 추가 양태에서, 인간 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG2, IgG3 및 IgG4로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 이작용성 분자에 포함된 항-hPD1 항체는 IgG1 또는 IgG4 Fc-영역을 포함한다. 특정 양태에서, 인간화 항-PD1 항체는 선택적으로 T250Q/M428L; M252Y/S254T/T256E + H433K/N434F; E233P/L234V/L235A/G236A + A327G/A330S/P331S; E333A; S239D/A330L/I332E; P257I/Q311; K326W/E333S; S239D/I332E/G236A; N297A; L234A/L235A; N297A + M252Y/S254T/T256E; K322A 및 K444A로 이루어진 군으로부터 선택된, 바람직하게는 M252Y/S254T/T256E, 및 L234A/L235A와 선택적으로 조합된 N297A로 이루어진 군으로부터 선택된, 치환 또는 치환들의 조합을 갖는, 인간 IgG1 Fc 영역을 포함한다.
보다 바람직하게는, 인간화 항-hPD1 항체는 선택적으로 S228P; L234A/L235A, S228P + M252Y/S254T/T256E 및 K444A로 이루어진 군으로부터 선택된 치환 또는 치환들의 조합을 갖는, IgG4 Fc-영역을 포함한다. 더욱 더 바람직하게는, 항-hPD1 항체는 IgG4를 안정화시키는 S228P를 갖는 IgG4 Fc-영역을 포함한다.
일 구현예에서, 항-PD1 항체는 절단된 Fc 영역 또는 Fc 영역의 단편을 포함한다. 일 구현예에서, 불변 영역은 CH2 도메인을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 불변 영역은 CH2 및 CH3 도메인을 포함하거나, 힌지-CH2-CH3을 포함한다. 대안적으로, 불변 영역은 힌지 영역, CH2 도메인 및/또는 CH3 도메인의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 불변 영역은 인간 IgG4 중쇄로부터 유래된 CH2 및/또는 CH3 도메인을 함유한다.
일부 구현예에서, 불변 영역은 인간 IgG4 중쇄로부터 유래된 CH2 및/또는 CH3 도메인을 함유한다.
또 다른 구현예에서, 불변 영역은 CH2 도메인 및 힌지 영역의 적어도 일부를 포함한다. 힌지 영역은 면역글로불린 중쇄, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 또는 다른 클래스로부터 유래될 수 있다. 바람직하게는, 힌지 영역은 돌연변이 여부에 관계없이 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 또는 다른 적합한 클래스로부터 유래된다. 보다 바람직하게는 힌지 영역은 인간 IgG1 중쇄로부터 유래된다. 일 구현예에서, 불변 영역은 제1 항체 이소형으로부터 유래된 CH2 도메인 및 제2 항체 이소형으로부터 유래된 힌지 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, CH2 도메인은 인간 IgG2 또는 IgG4 중쇄로부터 유래되는 반면, 힌지 영역은 변경된 인간 IgG1 중쇄로부터 유래된다.
일 구현예에서, 불변 영역은 Fc 수용체에 대한 친화성을 감소시키거나 Fc 이펙터 기능을 감소시키는 돌연변이를 함유한다. 예를 들어, 불변 영역은 IgG 중쇄의 불변 영역 내에서 글리코실화 부위를 제거하는 돌연변이를 함유할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 불변 영역은 CH2 도메인 및 힌지 영역의 적어도 일부를 포함한다. 힌지 영역은 면역글로불린 중쇄, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 또는 다른 클래스로부터 유래될 수 있다. 바람직하게는, 힌지 영역은 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 또는 다른 적합한 클래스로부터 유래된다. IgG1 힌지 영역에는 3개의 시스테인이 있으며, 이중 2개는 면역글로불린의 두 중쇄 사이의 이황화 결합에 관여한다. 이러한 동일한 시스테인은 Fc 부분 사이에 효율적이고 일관된 이황화 결합 형성을 허용한다. 따라서, 본 발명의 바람직한 힌지 영역은 IgG1, 보다 바람직하게는 인간 IgG1에서 유래한다. 일부 구현예에서, 인간 IgG1 힌지 영역 내의 제1 시스테인은 또 다른 아미노산, 바람직하게는 세린으로 돌연변이된다. IgG2 이소형 힌지 영역에는 올리고머화를 촉진하는 경향이 있는 4개의 이황화 결합과, 가능하게는, 재조합 시스템에서 분비되는 동안 잘못된 이황화 결합이 있다. 적합한 힌지 영역은 IgG2 힌지에서 유래될 수 있으며; 처음 2개의 시스테인은 각각 바람직하게는 또 다른 아미노산으로 돌연변이된다. IgG4의 힌지 영역은 비효율적으로 사슬 간 이황화 결합을 형성하는 것으로 알려져 있다. 그러나, 본 발명에 적합한 힌지 영역은 IgG4 힌지 영역으로부터 유래될 수 있으며, 바람직하게는 중쇄-유래 모이어 티 사이의 이황화 결합의 정확한 형성을 향상시키는 돌연변이를 함유한다(문헌[Angal S, et al. (1993) Mol. Immunol., 30:105-8]). 보다 바람직하게는 힌지 영역은 인간 IgG4 중쇄로부터 유래된다.
일 구현예에서, 불변 영역은 제1 항체 이소형으로부터 유래된 CH2 도메인 및 제2 항체 이소형으로부터 유래된 힌지 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, CH2 도메인은 인간 IgG4 중쇄로부터 유래되는 반면, 힌지 영역은 변경된 인간 IgG1 중쇄로부터 유래된다.
본 발명에 따르면, 불변 영역은 CH2 및/또는 CH3 도메인 및 상이한 항체 이소형으로부터 유래된 힌지 영역, 즉 하이브리드 불변 영역을 함유할 수 있다. 예를 들어, 일 구현예에서, 불변 영역은 IgG2 또는 IgG4에서 유래된 CH2 및/또는 CH3 도메인 및 IgG1에서 유래된 돌연변이 힌지 영역을 함유한다. 대안적으로, 또 다른 IgG 서브클래스로부터의 돌연변이 힌지 영역이 하이브리드 불변 영역에 사용된다. 예를 들어, 두 중쇄 사이에 효율적인 이황화 결합을 허용하는 돌연변이 형태의 IgG4 힌지가 사용될 수 있다. 돌연변이 힌지는 또한 처음 2개의 시스테인이 각각 또 다른 아미노산으로 돌연변이되는 IgG2 힌지로부터 유래될 수 있다. 이러한 하이브리드 불변 영역의 조립은 미국 특허 공개 번호 20030044423에 설명되어 있으며, 그 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.
일 구현예에서, 불변 영역은 CH2를 함유할 수 있고/있거나 CH3은 하기 표 D에 기재된 돌연변이 중 하나, 또는 이들의 임의의 조합을 갖는다.
[표 D]
Figure pct00004
중쇄 불변 영역의 잔기 넘버링은 EU 넘버링(문헌[Edelman, G.M. et al., Proc. Natl. Acad. USA, 63, 78-85 (1969)]; www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html#refs)에 따른다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 항체의 Fc 영역으로 아미노산 변형이 도입되어, Fc 영역 변이체를 생성할 수 있다. 특정 구현예에서, Fc 영역 변이체는 전부는 아니지만 일부 이펙터 기능을 보유한다. 이러한 항체는 예를 들어 생체 내 항체의 반감기가 중요하지만 특정 이펙터 기능이 불필요하거나 해로운 용도에서 유용할 수 있다. 이펙터 기능의 예에는 보체-의존적 세포독성(CDC) 및 항체-지향성 보체-매개 세포독성(ADCC)이 포함된다. 변경된 이펙터 기능을 갖는 수많은 치환 또는 치환 또는 결실이 당 업계에 공지되어있다.
일 구현예에서, 불변 영역은 Fc 수용체에 대한 친화성을 감소시키거나 Fc 이펙터 기능을 감소시키는 돌연변이를 함유한다. 예를 들어, 불변 영역은 IgG 중쇄의 불변 영역 내에서 글리코실화 부위를 제거하는 돌연변이를 함유할 수 있다. 바람직하게는, CH2 도메인은 CH2 도메인 내의 글리코실화 부위를 제거하는 돌연변이를 함유한다.
Fc 부분과 비-Fc 부분의 접합부 근처의 아미노산의 변경은 Fc 분자의 혈청 반감기를 극적으로 증가시킬 수 있다(PCT 공개 WO 01/58957, 이의 개시내용은 본원에 참조로 포함됨). 따라서, 본 발명의 단백질 또는 폴리펩타이드의 접합 영역은 면역글로불린 중쇄 및 에리트로포이에틴의 자연-발생 서열에 비해 바람직하게는 접합점의 약 10개 아미노산 내에 있는 변경을 함유할 수 있다. 이러한 아미노산 변화는 소수성을 증가시킬 수 있다. 일 구현예에서, 불변 영역은 C-말단 리신 잔기가 대체된 IgG 서열로부터 유래된다. 바람직하게는, IgG 서열의 C-말단 리신은 혈청 반감기를 추가로 증가시키기 위해 알라닌 또는 류신과 같은 비-리신 아미노산으로 대체된다.
특정 구현예에서, 항체는 글리코실화되는 정도를 증가, 감소 또는 제거하기 위해 변경될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 항-hPD1은 서열번호 39 또는 52의 중쇄 불변 도메인 및/또는 서열번호 40의 경쇄 불변 도메인, 특히 서열번호 39 또는 52의 중쇄 불변 도메인 및 서열번호 40의 경쇄 불변 도메인을 갖는다.
또 다른 구현예에서, 본 발명에 따른 항-hPD1은 서열번호 52의 중쇄 불변 도메인 및/또는 서열번호 40의 경쇄 불변 도메인, 특히 서열번호 52의 중쇄 불변 도메인 및 서열번호 40의 경쇄 불변 도메인을 갖는다.
[표 E]
Figure pct00005
인간 IgG의 모든 서브클래스는 순환 중에 절단되는 항체 중쇄(K444)의 C-말단 리신 잔기를 운반한다. 혈액에서 이러한 절단은 SIRPa를 방출함으로써 이작용성 분자의 생물활성을 손상시킬 수 있다. 이 문제를 피하기 위해, IgG1 또는 IgG4 도메인의 K444 아미노산이 알라닌으로 치환되어 항체에 일반적으로 사용되는 돌연변이인 단백질분해 절단을 감소시킬 수 있다. 그런 다음, 일 구현예에서, 항-PD1 항체는 K444A로 이루어진 적어도 하나의 추가 아미노산 치환을 포함한다.
일 구현예에서, 항-PD1 항체는 IgG의 C-말단 도메인에 추가 시스테인 잔기를 포함하여, 추가 이황화 결합을 생성하고, 이작용성 분자의 유연성을 잠재적으로 제한한다.
펩타이드 링커
본 발명은 항-PD-1 항체 또는 이의 단편과 SIRPa 사이에 펩타이드 링커를 포함할 수 있는 이작용성 분자를 포함한다. 펩타이드 링커는 일반적으로 그 사이에 링커와 연결된 두 단백질 요소가 그의 기능을 발휘하고 재조합 이작용성 분자의 안정성에 대한 a-나선 및 β-배 형성의 영향을 피하기에 충분한 공간의 자유도를 보장하기에 충분한 길이와 유연성을 가지고 있다.
본 개시내용의 일 양태에서, 항-hPD1 항체는 바람직하게는 펩타이드 링커에 의해 SIRPa에 연결된다. 즉, 본 발명은 펩타이드 링커를 통해 SIRPa에 연결된 사슬, 예를 들어 경쇄 또는 중쇄 또는 이의 단편, 바람직하게는 중쇄 또는 이의 단편을 갖는 본원에 상세히 설명된 항-PD1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 이작용성 분자에 관한 것이다. 본원에 사용된 용어 "링커"는 SIRPa 및 항-PD-1 면역글로불린 서열 부분을 연결하는 적어도 하나의 아미노산 서열을 지칭한다. 이러한 링커는 입체 장애를 예방하는 데 유용할 수 있다. 링커는 일반적으로 길이가 3~44개 아미노산 잔기이다. 바람직하게는, 링커는 3~30개의 아미노산 잔기를 갖는다. 일부 구현예에서, 링커는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 아미노산 잔기를 갖는다.
일 구현예에서, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 SIRPa를 포함하는 이작용성 분자에 관한 것이며, 여기서, 항체의 사슬, 예를 들어 경쇄 또는 중쇄, 바람직하게는 중쇄, 더욱더 바람직하게는 중쇄 또는 경쇄의 C-말단은 펩타이드 링커에 의해 SIRPa, 바람직하게는 SIRPa의 N-말단에 연결된다.
특정 양태에서, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 항-hPD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 이작용성 분자에 관한 것이며, 여기서, SIRPa는 상기 항체의 중쇄의 C-말단 단부(예를 들어, 중쇄 불변 도메인의 C-말단 단부)에, 바람직하게는 펩타이드 링커에 의해 연결된다.
일 구현예에서, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 이작용성 분자에 관한 것이며, 여기서, SIRPa는 상기 항체의 경쇄의 C-말단 단부(예를 들어, 경쇄 불변 도메인의 C-말단 단부)에, 바람직하게는 펩타이드 링커에 의해 연결된다.
링커 서열은 자연 발생 서열 또는 비-자연 발생 서열일 수 있다. 치료 목적으로 사용되는 경우, 링커는 바람직하게는 이작용성 분자가 투여되는 대상체에서 비-면역원성이다. 하나의 유용한 링커 서열 그룹은 WO 96/34103 및 WO 94/04678에 기재된 바와 같이 중쇄 항체의 힌지 영역으로부터 유래된 링커이다. 다른 예는 폴리-알라닌 링커 서열이다. 링커 서열의 추가의 바람직한 예는 (Gly4Ser)4, (Gly4Ser)3, (Gly4Ser)2, Gly4Ser, Gly3Ser, Gly3, Gly2ser 및 (Gly3Ser2)3, 특히 (Gly4Ser)3을 포함하는 상이한 길이의 Gly/Ser 링커이다.
일 구현예에서, 이작용성 분자에 포함된 링커는 (Gly4Ser)4, (Gly4Ser)3, (Gly4Ser)2, Gly4Ser, Gly3Ser, Gly3, Gly2ser 및 (Gly3Ser2)3으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 바람직하게는 (Gly4Ser)3이다.
일 구현예에서, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 항-PD-1 항체 또는 이의 단편을 포함하는 이작용성 분자에 관한 것이며, 여기서, 항체 또는 이의 단편은 바람직하게는 (GGGGS)3, (GGGGS)4, (GGGGS)2, GGGGS, GGGS, GGG, GGS 및 (GGGS)3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 링커 서열에 의해, 훨씬 더 바람직하게는 (GGGGS)3에 의해 SIRPa에 연결된다.
바람직하게는, 항-PD-1 항체의 중쇄, 바람직하게는 중쇄의 C 말단은 가요성 (Gly4Ser)3 링커를 통해 SIRPa의 N-말단에 유전적으로 융합된다. 융합 접합부에서, 항체 중쇄의 C-말단 리신 잔기는 단백질분해 절단을 감소시키기 위해 알라닌으로 돌연변이될 수 있다.
바람직하게는, 항-PD-1 항체의 중쇄, 바람직하게는 경쇄의 C 말단은 가요성 (Gly4Ser)3 링커를 통해 SIRPa의 N-말단 단부에 유전적으로 융합된다. 융합 접합부에서, 항체 경쇄의 C-말단 리신 잔기는 단백질분해 절단을 감소시키기 위해 알라닌으로 돌연변이될 수 있다.
SIRPa 분자
본 발명에 따른 이작용성 분자는 SIRPa 분자, 이의 단편 또는 변이체를 포함하는 추가 또는 제2 개체를 포함한다.
바람직하게는, SIRPa 단백질은 바람직하게는 인간 SIRPa 또는 이의 단편 및 변이체이다. 일 구현예에서, 이작용성 분자는 선택적으로 추가 N-말단 메티오닌 잔기(서열번호 51)를 갖는, 약 504개 아미노산의 전형적인 야생형 SIRPa 인간 단백질, 바람직하게는 야생형 인간 SIRPa 단백질의 세포 외 도메인(예를 들어, 야생형 인간 SIRPa의 위치 31 내지 373으로부터의 아미노산으로 이루어짐)을 포함한다. 바람직하게는 SIRPa 단백질은 서열번호 51의 단백질이다. SIRPa는 바람직하게는 그의 막관통 도메인 및/또는 세포질 도메인이 없다. 바람직하게는, SIRPa 단백질은 그의 세포 외 도메인으로 이루어지며, 더욱더 바람직하게는 야생형 인간 SIRPa의 31 내지 373개 아미노산으로 필수적으로 이루어진다.
SIRPa 단백질의 "변이체"는 하나 이상의 아미노산에 의해 변경되는 아미노산 서열로 정의된다. 변이체는 "보존적" 변형 또는 "비-보존적" 변형을 가질 수 있다. 이러한 변형에는 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입이 포함될 수 있다. 생물학적 특성(예를 들어, 활성, 결합 능력 및/또는 구조)을 제거하지 않으면서 어떤, 그리고 얼마나 많은 아미노산 잔기가 치환, 삽입 또는 결실될 수 있는지 결정하는 지침은 분자 모델링을 위한, 또는 정렬을 생성하기 위한 소프트웨어와 같은 당 업계에 잘 알려진 컴퓨터 프로그램을 사용하여 찾을 수 있다. 본 발명에 포함된 변이체 SIRPa 단백질은 구체적으로 야생형 SIRPa와 비교하여 실질적으로 동등한 생물학적 특성을 보유하는 SIRPa 단백질을 포함한다. SIRPa의 변이체는 또한 SIRPa의 변경된 폴리펩타이드 서열(예를 들어, 산화, 환원, 탈아민화 또는 절단된 형태)을 포함한다. 특히, 전장 SIRPa 단백질과 유사한 생물학적 특성을 유지하는 SIRPa의 절단체 또는 단편이 본 발명의 범위 내에 포함된다. 일 구현예에서, SIRPa는 그의 임의의 생물학적 활성 단편이다. SIRPa의 변이체는 보다 바람직하게는 SNP, 스플라이싱 변이체 등을 포함하는 자연적 다형성으로 인한 자연 대립유전자 변이체를 포함한다.
가장 일반적인 인간 SIRPa 변이체는 SIRPa v1 및 SIRPa v2(수탁 번호 NP_542970(P78324) 및 CAA71403)이다. SIRPa 계열은 이 두 하위집합으로 나눌 수 있으며; 즉, SIRPa v1 이소형 계열과 SIRPa v2 이소형 계열이다. 이러한 계열에는 각각 SIRPa 이소형 2(식별자: P78324-2) 및 SIRPa 이소형 4(식별자: P78324-4)가 포함된다. 일 구현예에서, SIRPa 변이체는 SIRPa 이소형 2(P78324-2) 및 SIRPa 이소형 4(P78324-4)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
변이체 SIRPa 단백질은 또한 야생형 SIRPa와 적어도 약 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
일 구현예에서, SIRP알파의 변이체는 야생형 SIRPa에 대해 전형적으로 55% 서열 동일성을 나타내는 SIRP 감마이다. 본원에서 사용되는 용어 "SIRP 감마", "SIRPg" 및 "SIRPγ"는 상호교환적으로 사용된다. 예를 들어, 인간 SIRPg 아미노산 서열은 UniProtKB-Q9P1W8에 설명되어 있다.
SIRPγ는 유사한 세포 외 구조를 갖지만, 대조되는 유형의 신호를 제공하는 다른 세포질 영역을 가지고 있다. 실제로 SIRP알파 및 SIRP감마는 3개의 Ig-유사 세포 외 도메인:아미노산 32~137(도메인 D1)에 의해 암호화된 Ig-유사 V-타입, 위치 148~247(도메인 D2)에서 아미노산에 의해 암호화된 Ig-유사 C1-타입 1, 위치 254~348(도메인 D3)의 아미노산에 의해 암호화된 Ig-유사 C1-타입 2를 포함한다.
이어서, 일 구현예에서, SIRPa 변이체는 i) SIRPg의 D1 도메인, SIRPa의 D2 및 D3 도메인 ii) SIRPg의 D1 및 D2 도메인 및 SIRPa의 D3 도메인 iii) SIRPg의 D1 도메인, SIRPa의 D2 도메인 및 SIRPg의 D3 도메인, iv) SIRPa의 D1 도메인, SIRPg의 D2 및 D3 도메인, v) SIRPa의 D1 및 D2 도메인 및 SIRPg의 D3 도메인 또는 vi) SIRPa의 D1 도메인, SIRPg의 D2 도메인 및 SIRPa의 D3 도메인을 포함한다.
본 발명에 따른 바람직한 SIRPa는 서열번호 51, US20160319256, WO 2013109752 또는 WO2016024021에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 인간 SIRPa 폴리펩타이드, 뿐만 아니라 이의 임의의 천연 변이체 및 상동체이다.
일부 구현예에서, SIRP-α 변이체 작제물은 질환 부위(예를 들어, 비-질환 부위보다는 종양 부위)에서 우선적 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, SIRP-α 변이체는 질환 부위에서 SIRP-α 변이체 작제물의 우선적 결합을 허용하는 히스티딘 잔기로 또는 다른 아미노산으로의 아미노산의 하나 이상의 치환을 함유한다.
특정 구현예에서, SIRPa는 SIRPa의 세포 외 도메인의 절단 또는 단편으로 이루어지며, 특히 CD47과 상호작용하는 접촉 잔기 세트 내의 아미노산 또는 결합 영역을 포함하거나 이로 구성된다.
일 구현예에서, SIRPa 단백질의 친화성은 시험관 내 분석을 사용하여 측정될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 SIRPa 변이체는 야생형 인간 SIRPa와 비교하여 CD47에 대해 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 바람직하게는 야생형 SIRPa와 비교하여 적어도 80%, 90%, 95% 및 훨씬 더 바람직하게 99%의 친화성을 유지한다.
본 발명은 또한 예를 들어 WO 2013109752에 기술된 바와 같이 야생형 SIRPa 단백질과 비교하여 CD47에 대한 친화성이 강화된 SIRPa 단백질을 포함하는 이작용성 분자를 제공한다. 특정 구현예에서, SIRP-α 변이체 작제물은 질환 세포(예를 들어, 종양 세포) 상의 CD47에 대해 더 높은 결합 친화성을 갖는다. 일부 구현예에서, SIRP-α 변이체는 예를 들어 US 20160319256에 기재된 바와 같이 생리적 조건 하에서 보다 산성 pH(예를 들어, 약 pH 7 미만) 및/또는 저산소 조건 하에서 CD47에 더 높은 친화도로 결합한다.
일 양태에서, 본 발명에서 사용되는 SIRPa 폴리펩타이드는 재조합 SIRPa이다. 본원에 사용된 용어 "재조합"은 폴리펩타이드가 재조합 발현 시스템으로부터, 즉 숙주 세포(예를 들어, 미생물 또는 곤충 또는 식물 또는 포유류)의 배양으로부터, 또는 SIRPa 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자를 함유하도록 조작된 트랜스제닉 식물 또는 동물로부터 수득되거나 유래됨을 의미한다. 바람직하게는, 재조합 SIRPa는 인간 재조합 SIRPa(예를 들어, 재조합 발현 시스템에서 생산된 인간 SIRPa)이다.
이작용성 분자 또는 "Bicki"
본 발명은 특히 상기 개시된 바와 같은 항-hPD1 항체 또는 이의 항체 단편 및 SIRPa를 포함하거나 이로 구성되는 이작용성 분자를 제공하고, 항-hPD1 항체 또는 이의 항체 단편은 바람직하게는 상기 개시된 바와 같은 펩타이드 링커에 의해, 특히 융합 단백질로서 SIRPa에 공유 결합된다.
특히, 본 발명에 따른 이작용성 분자는 2개의 개체를 포함한다: 항-hPD1 항체 또는 이의 단편을 포함하거나 필수적으로 이로 구성되는 제1 개체; SIRPa, 바람직하게는 인간 SIRPa, 더욱더 바람직하게는 인간 SIRPa 이소형 1의 세포 외 도메인을 포함하거나 필수적으로 이로 구성되는 제2 개체(이 두 개체는 선택적으로 펩타이드 링커에 의해 연결됨).
특히, 본 발명에 따른 이작용성 분자는 1, 2, 3 또는 4개의 SIRPa 분자를 포함한다. 특히, 이작용성 분자는 항-PD-1 항체의 단 하나의 경쇄 또는 중쇄에 연결된 단 하나의 SIRPa 분자를 포함할 수 있다. 이작용성 분자는 또한 항-PD-1 항체의 경쇄 또는 중쇄에 연결된 2개의 SIRPa 분자를 포함할 수 있다. 이작용성 분자는 또한 2개의 SIRPa 분자, 즉 항-PD-1 항체의 경쇄에 연결된 제1 분자 및 항-PD-1 항체의 중쇄에 연결된 제2 분자를 포함할 수 있다. 이작용성 분자는 또한 3개의 SIRPa 분자를 포함할 수 있으며, 이들 중 2개는 항-PD-1 항체의 경쇄 또는 중쇄에 연결되고, 마지막 1개는 항-PD-1 항체의 다른 사슬에 연결된다. 마지막으로, 이작용성 분자는 또한 4개의 SIRPa 분자를 포함할 수 있으며, 두 분자는 항-PD-1 항체의 경쇄에 연결되고, 두 분자는 항-PD-1 항체의 중쇄에 연결된다. 따라서, 이작용성 분자는 본원에 개시된 바와 같은 1 내지 4개 분자의 면역치료제를 포함한다.
일 구현예에서, 경쇄 중 하나만이 1개의 SIRPa 분자를 포함하고(예를 들어, 이작용성 분자는 1개의 SIRPa 분자를 포함함), 중쇄 중 하나만이 1개의 SIRPa 분자를 포함하며(예를 들어, 이작용성 분자가 1개의 SIRPa 분자를 포함함), 각 경쇄는 1개의 SIRPa 분자를 포함하고(예를 들어, 이작용성 분자는 2개의 SIRPa 분자를 포함함), 각 중쇄는 1개의 SIRPa 분자를 포함하고(예를 들어, 이작용성 분자는 2개의 SIRPa 분자를 포함함), 경쇄 중 하나만, 그리고 중쇄 중 하나만이 1개의 면역치료제 분자를 포함하고(예를 들어, 이작용성 분자가 2개의 SIRPa 분자를 포함함), 각 경쇄는 1개의 SIRPa 분자를 포함하고, 중쇄 중 하나만 1개의 SIRPa 분자를 포함하고(예를 들어, 이작용성 분자는 3개의 SIRPa 분자를 포함함), 각 중쇄는 1개의 SIRPa 분자를 포함하고 경쇄 중 하나만 1개의 SIRPa 분자를 포함하며(예를 들어, 이작용성 분자는 3개의 SIRPa 분자를 포함함), 또는 경쇄 및 중쇄는 모두 1개의 SIRPa 분자를 포함한다(예를 들어, 이작용성 분자는 4개의 SIRPa 분자를 포함함).
일 구현예에서, 본 발명에 따른 이작용성 분자는:
(a) (i) 중쇄 및 (ii) 경쇄를 포함하는 항-인간 PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 및
(b) 인간 SIRPa 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하거나 이로 구성되며,
여기서, 항체 중쇄 및/또는 경쇄 또는 이의 단편은 융합 단백질로서, 바람직하게는 펩타이드 링커에 의해 SIRPa에 공유적으로 연결된다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 이작용성 분자는:
(a) (i) 중쇄 및 (ii) 경쇄를 포함하는 인간화된 항-인간 PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 및
(b) 인간 SIRPa 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하거나 이로 구성되며,
여기서, 항체 중쇄 또는 경쇄 또는 이의 단편은 펩타이드 링커에 의해 SIRPa에 공유적으로 연결된다.
바람직하게는, 이러한 이작용성 분자는 SIRPa의 N-말단을 항-인간 PD-1 항체의 중쇄 또는 경쇄 또는 둘 모두의 C-말단에 연결하는 적어도 하나의 펩타이드 링커를 포함하며, 상기 펩타이드 링커는 (GGGGS)3, (GGGGS)4, (GGGGS)2, GGGGS, GGGS, GGG, GGS 및 (GGGS)3으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 더욱 바람직하게는 (GGGGS)3이다.
바람직하게는, SIRPa의 N-말단 단부는 적어도 하나의 펩타이드 링커를 통해 항-인간 PD-1 항체의 중쇄 또는 경쇄 또는 둘 모두의 C-말단 단부에 연결된다. 대안적으로, SIRPa의 C-말단 단부는 적어도 하나의 펩타이드 링커를 통해 항-인간 PD-1 항체의 중쇄 또는 경쇄 또는 둘 모두의 N-말단 단부에 연결된다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 이작용성 분자는:
(a)(i) 중쇄 및 (ii) 경쇄를 포함하는 항-인간 PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편,
(b) 인간 SIRPa 또는 이의 단편 또는 변이체, 및
(c) SIRPa의 N-말단 단부를 항-인간 PD-1 항체의 중쇄 또는 경쇄 또는 둘 모두의 C-말단 단부에 연결하는 펩타이드 링커를 포함하거나 이로 구성되며, 상기 펩타이드 링커는 바람직하게는 (GGGGS)3, (GGGGS)4, (GGGGS)2, GGGGS, GGGS, GGG, GGS 및 (GGGS)3으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 더욱더 바람직하게는 (GGGGS)3이다.
보다 구체적으로, 항-인간 PD-1 또는 이의 항원 결합 단편은 "항-PD-1" 섹션에서 이전에 개시된 바와 같은 임의의 항체일 수 있고, 인간 SIRPa, 이의 단편 또는 변이체는 "SIRPa 분자" 섹션에서 이전에 개시된 바와 같은 임의의 SIPRa일 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명에 따른 이작용성 분자는 하기를 포함하거나 이로 구성된다:
(a) 하기를 포함하는 항-인간 PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편:
(i) HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 및
(ii) LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 도메인,
여기서:
- 중쇄 CDR1(HCDR1)은 서열번호 1의 위치 3을 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되며;
- 중쇄 CDR2(HCDR2)는 서열번호 2의 위치 13, 14 및 16을 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되며;
- 중쇄 CDR3(HCDR3)은 서열번호 3(여기서, X1은 D 또는 E이며, X2는 T, H, A, Y, N, E 및 S로 이루어진 군, 바람직하게는 H, A, Y, N, 및 E로 이루어진 군으로부터 선택됨)의 위치 2, 3, 7 및 8을 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되며;
- 경쇄 CDR1(LCDR1)은 서열번호 12(여기서, X1은 G 또는 T임)의 위치 5, 6, 10, 11 및 16을 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되며;
- 경쇄 CDR2(LCDR2)는 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되며;
- 경쇄 CDR3(LCDR3)은 서열번호 16의 위치 1, 4 및 6을 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되며;
(b) 서열번호 51의 인간 SIRPa 또는 이의 단편 또는 변이체,
상기 항체 중쇄 및/또는 경쇄 또는 이의 단편은 융합 단백질로서, 바람직하게는 펩타이드 링커에 의해 SIRPa에 공유적으로 연결된다.
바람직하게는, 펩타이드 링커는 (GGGGS)3, (GGGGS)4, (GGGGS)2, GGGGS, GGGS, GGG, GGS 및 (GGGS)3으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 더욱더 바람직하게는 (GGGGS)3이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 하기를 포함하거나 이로 구성된 이작용성 분자에 관한 것이다:
(a) 하기를 포함하는 인간화 항-hPD1 항체:
(i) 서열번호 17(여기서, X1은 D 또는 E이고, X2는 T, H, A, Y, N, E 및 S로 이루어진 군, 바람직하게는 H, A, Y, N, E로 이루어진 군으로부터 선택됨)의 위치 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112를 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 중쇄 가변 영역(VH);
(ii) 서열번호 26(여기서, X1은 G 또는 T임)의 위치 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105를 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 경쇄 가변 영역(VL); 및
(b) 서열번호 51의 인간 SIRPa 또는 이의 변이체,
(c) 항-hPD1 항체 및 인간 SIRPa 또는 이의 변이체의 경쇄 및/또는 중쇄 사이의, (GGGGS)3, (GGGGS)4, (GGGGS)2, GGGGS, GGGS, GGG, GGS 및 (GGGS)3으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 더욱더 바람직하게는 (GGGGS)3인, 펩타이드 링커.
바람직하게는, SIRPa의 N-말단 단부는 적어도 하나의 펩타이드 링커를 통해 항-인간 PD-1 항체의 중쇄 또는 경쇄, 또는 둘 모두의 C-말단 단부에 연결된다. 대안적으로, SIRPa의 C-말단 단부는 적어도 하나의 펩타이드 링커를 통해 항-인간 PD-1 항체의 중쇄 또는 경쇄 또는 둘 모두의 N-말단 단부에 연결된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 하기를 포함하거나 이로 구성된 이작용성 분자에 관한 것이다:
(a) 하기를 포함하는 인간화 항-hPD1 항체:
(i) 서열번호 17(여기서, X1은 D 또는 E이고, X2는 T, H, A, Y, N, E 및 S로 이루어진 군, 바람직하게는 H, A, Y, N, E로 이루어진 군으로부터 선택됨)의 위치 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112를 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 중쇄 가변 영역(VH);
(ii) 서열번호 26(여기서, X1은 G 또는 T임)의 위치 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105를 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 경쇄 가변 영역(VL); 및
(b) 서열번호 51의 인간 SIRPa 또는 이의 변이체,
여기서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 중쇄 및/또는 경쇄(들)의 C-말단 단부는 바람직하게는 (GGGGS)3 펩타이드 링커에 의해 SIRPa의 N-말단 단부에 공유적으로 연결되어 융합 단백질을 형성한다.
바람직한 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 중쇄의 C-말단 단부는 SIRPa의 N-말단 단부에 공유적으로 연결되어 융합 단백질을 형성한다. 바람직하게는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 중쇄 만이 SIRPa에 공유적으로 연결된다.
특정 구현예에서, 본 발명은 하기를 포함하거나 이로 구성된 이작용성 분자에 관한 것이다:
(a) 하기를 포함하는 인간화 항-hPD1 항체:
(i) 서열번호 17(여기서, X1은 D 또는 E이고, X2는 T, H, A, Y, N, E 및 S로 이루어진 군, 바람직하게는 H, A, Y, N, E로 이루어진 군으로부터 선택됨)의 위치 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112를 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 중쇄 가변 영역(VH);
(ii) 서열번호 26(여기서, X1은 G 또는 T임)의 위치 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105를 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 경쇄 가변 영역(VL); 및
(b) 서열번호 51의 인간 SIRPa 또는 이의 변이체,
여기서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 중쇄의 C-말단 단부는 바람직하게는 (GGGGS)3 펩타이드 링커에 의해 SIRPa의 N-말단 단부에 공유적으로 연결되어 융합 단백질을 형성한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 하기를 포함하거나 이로 구성된 이작용성 분자에 관한 것이다:
(a) 하기를 포함하는 인간화 항-hPD1 항체:
(i) 서열번호 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25의 위치 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112를 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 서열번호 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 중쇄 가변 영역(VH);
(ii) 서열번호 27 또는 서열번호 28의 위치 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105를 제외한 임의의 위치에서의 치환(들), 첨가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 선택적으로 갖는 서열번호 27 또는 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 경쇄 가변 영역(VL);
(b) 서열번호 51의 인간 SIRPa 또는 이의 변이체,
여기서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 중쇄 및/또는 경쇄(들)의 C-말단 단부는 바람직하게는 (GGGGS)3 펩타이드 링커에 의해 SIRPa의 N-말단 단부에 공유적으로 연결되어 융합 단백질을 형성한다.
특정 표적에 대한 이작용성 분자의 결합은 예를 들어 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA), 방사면역분석(RIA), FACS 분석, 생물검정(예를 들어, 성장 억제) 또는 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인될 수 있다. 이들 분석 각각은 일반적으로 관심 복합체에 특이적인 표지된 시약(예를 들어, 항체)을 사용하여 특정 관심 단백질-항체 복합체의 존재를 검출한다. 예를 들어, 항-hPD-1 항체/SIRPa 복합체는 예를 들어 SIRPa 또는 SIRPa의 수용체를 인식하고 이에 특이적으로 결합하는 효소-결합 항체 또는 항체 단편을 사용하여 검출될 수 있다.
일부 예에서, 본원에 기재된 이작용성 분자는 PD-1 신호전달 경로를 적어도 20%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 90%, 적어도 100% 또는 적어도 2배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 50배, 적어도 100배 또는 적어도 1000배까지 억제한다.
바람직하게는, 이러한 이작용성 분자는 PD-1과 그의 리간드(예를 들어, PD-L1 및/또는 PD-L2) 사이의 상호작용을 차단하거나 억제하는 능력을 갖는다. 특정 구현예에서, 이작용성 분자는 PD-1과 그의 리간드(예를 들어, PD-L1 및/또는 PD-L2) 사이의 결합 상호작용을 적어도 50% 억제한다. 특정 구현예에서, 이러한 억제는 60% 초과, 70% 초과, 80% 초과, 또는 90% 초과일 수 있다.
일부 예에서, 본원에 기재된 이작용성 분자는 PD-1 신호전달 경로를 적어도 20%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 90%, 적어도 100% 또는 적어도 2배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 50배, 적어도 100배 또는 적어도 1000배까지 억제한다.
일부 예에서, 본원에 기재된 이작용성 분자는 IFN 감마 분비를 자극한다.
일부 예에서, 본원에 기재된 이작용성 분자는 CD47 발현 세포(예를 들어, 종양 세포)와 SIRPa 발현 세포(예를 들어, 대식세포와 같은 항원 제시 세포(APC)) 사이의 상호작용을 차단한다.
일부 예에서, 본원에 기재된 이작용성 분자는 SIRPa/CD47 신호전달 경로를 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 90%, 적어도 100% 또는 적어도 2배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 50배, 적어도 100배 또는 적어도 1000배까지 억제하거나 감소시킨다.
또 다른 예에서, 본원에 기재된 이작용성 분자는 T 세포의 활성화를 강화하고, T 세포에 의한 IFNg의 분비를 자극하고/하거나 T 세포와 같은 면역 세포의 증식을 자극한다.
또 다른 예에서, 본원에 기재된 이작용성 분자는 사이토카인 분비 및/또는 나이브한, 부분적으로 고갈된 T-세포 하위집단의 증식을 유도한다.
이작용성 분자의 제조 - 이작용성 분자를 암호화하는 핵산 분자, 재조합 발현 벡터 및 이를 포함하는 숙주 세포
본 발명의 이작용성 분자를 생성하기 위해, 본 발명의 항-hPD1 항체는 SIRPa에 기능적으로 연결된다.
이작용성 분자의 두 개체는 동일한 벡터에서 암호화되고, 융합 단백질로 생성된다. 따라서, 본원에 기재된 임의의 이작용성 분자를 암호화하는 핵산, 이러한 핵산을 포함하는 발현 벡터 또는 재조합 바이러스와 같은 벡터, 및 핵산 및/또는 벡터를 포함하는 숙주 세포도 본원에 개시된다.
본 발명에 따르면, 포유동물 세포에 의해 안정한 형태로 분비되는 이작용성 융합 단백질을 생산하기 위해, 일반적으로 포유동물 세포를 형질감염시키는 데 사용되는 발현 벡터에 이작용성 분자를 암호화하는 핵산 서열이 서브클로닝된다. 항체 서열을 포함하는 분자를 생산하기 위한 일반적인 기술은 문헌[Coligan et al. (eds.), Current protocols in immunology, at pp. 10.19.1-10.19.11(Wiley Interscience 1992)]에 기재되어 있으며, 그 내용은 본원에, 및 "Antibody engineering: a practical guide" from W. H. Freeman and Company (1992)에 참조로 포함되어 있으며, 여기서, 분자 생산과 관련된 주석은 각 텍스트에 분산되어 있다.
일반적으로 이러한 방법은 하기 단계들을 포함한다:
(1) 본 발명의 재조합 이작용성 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(들) 또는 이의 변이체 또는 폴리뉴클레오타이드(들)를 함유하는 벡터로 적절한 숙주 세포를 형질감염 또는 형질전환시키는 단계;
(2) 적당한 배지에서 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
(3) 선택적으로 배지 또는 숙주 세포로부터 단백질을 단리 또는 정제하는 단계.
본 발명은 또한 상기 개시된 바와 같은 이작용성 분자를 암호화하는 핵산, 본 발명의 핵산을 포함하는 벡터, 바람직하게는 발현 벡터, 본 발명의 벡터로 또는 재조합 이작용성 분자를 암호화하는 서열로 직접 형질전환된 유전자 조작된 숙주 세포, 및 재조합 기술에 의해 본 발명의 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다.
핵산, 벡터 및 숙주 세포는 이하에서 보다 구체적으로 설명된다.
핵산 서열
본 발명은 또한 상기 정의된 바와 같은 이작용성 분자를 암호화하는 핵산 분자, 또는 상기 정의된 바와 같은 이작용성 분자를 암호화하는 핵산 분자 그룹에 관한 것이다.
항체 DNA 서열은 예를 들어 면역글로불린을 합성하는 세포의 RNA로부터 증폭되거나, 클로닝된 면역글로불린에 의한 PCR을 사용하여 합성되거나, 알려진 신호 펩타이드 아미노산 서열을 암호화하는 올리고뉴클레오타이드를 통해 합성될 수 있다. 바람직하게는, 펩타이드 신호는 VH 및/또는 CH에 대한 서열번호 49의 아미노산 서열; 및/또는 VL 및/또는 CL에 대한 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 특히, 펩타이드 신호는 CH, VH, CL 및/또는 VL의 N-말단에 있다.
이러한 핵산은 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열(예를 들어, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄)을 암호화할 수 있다. 이러한 핵산은 통상적인 절차를 사용하여 쉽게 단리되고 시퀀싱될 수 있다.
특히, 상기 정의된 이작용성 분자를 암호화하는 핵산 분자는 하기를 포함한다:
- 선택적으로 서열번호 49의 펩타이드 신호와 함께, 본원에 개시된 항-hPD-1 항체의 가변 중쇄 도메인을 암호화하는 제1 핵산 분자, 및
- 선택적으로 서열번호 50의 펩타이드 신호와 함께, 본원에 개시된 항-hPD-1 항체의 가변 경쇄 도메인을 암호화하는 제2 핵산 분자, 및
- 선택적으로 링커를 암호화하는 핵산을 통해, SIRPa 또는 이의 변이체, 바람직하게는 인간 SIRPa, 더욱더 바람직하게는 제1 핵산 또는 제2 핵산 또는 둘 모두에 작동 가능하게 연결된 인간 SIRPa 이소형 1의 세포 외 도메인 또는 이의 변이체를 암호화하는 제3 핵산.
일 구현예에서, 상기 정의된 바와 같은 이작용성 분자를 암호화하는 핵산 분자는 하기를 포함한다:
- 선택적으로 서열번호 49의 펩타이드 신호를 갖는, 서열번호 17(여기서, X1은 D 또는 E이고 X2는 T, H, A, Y, N, E 및 S로 이루어진 군, 바람직하게는 H, A, Y, N, 및 E로 이루어진 군으로부터 선택됨)의 가변 중쇄 도메인을 암호화하는 제1 핵산 분자, 및
- 선택적으로 서열번호 50의 펩타이드 신호를 갖는, 서열번호 26(여기서, X는 G 또는 T임)의 가변 경쇄 도메인을 암호화하는 제2 핵산 분자, 및
- 선택적으로 링커를 암호화하는 핵산을 통해 제1 핵산 또는 제2 핵산 또는 둘 모두에 작동 가능하게 연결된 서열번호 51의 인간 SIRPa를 암호화하는 제3 핵산 또는 이의 변이체.
바람직하게는, 상기 정의된 이작용성 분자를 암호화하는 핵산 분자는 하기를 포함한다:
- 선택적으로 서열번호 49의 펩타이드 신호를 갖는, 서열번호 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25에 제시된 아미노산 서열의 가변 중쇄 도메인을 암호화하는 제1 핵산 분자, 및
- 선택적으로 서열번호 50의 펩타이드 신호를 갖는, 서열번호 27 또는 서열번호 28에 제시된 아미노산 서열의 가변 경쇄 도메인을 암호화하는 제2 핵산 분자, 및
- 선택적으로 펩타이드 링커를 암호화하는 핵산을 통해 제1 핵산 또는 제2 핵산 또는 둘 모두에 작동 가능하게 연결된 서열번호 51의 인간 SIRPa를 암호화하는 제3 핵산 또는 이의 변이체.
매우 특정한 구현예에서, 가변 중쇄 도메인을 암호화하는 핵산 분자는 서열번호 55에 제시된 서열을 갖고/갖거나 가변 경쇄 도메인을 암호화하는 핵산 분자는 서열번호 56에 제시된 서열을 갖는다.
작동 가능하게 연결된 것은 핵산이 가변 중쇄 또는 경쇄 도메인, 선택적으로 펩타이드 링커 및 SIRPa를 포함하는 단백질 융합을 암호화하는 것으로 의도된다. 바람직하게는, 링커는 (GGGGS)3, (GGGGS)4, (GGGGS)2, GGGGS, GGGS, GGG, GGS 및 (GGGS)3으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 더욱더 바람직하게는 ((GGGGS)3이다.
일 구현예에서, 핵산 분자는 단리된, 특히 비-천연 핵산 분자이다.
본 발명에 따른 이작용성 분자를 암호화하는 핵산 분자 또는 핵산 분자 그룹은 바람직하게는 벡터 또는 벡터 그룹에 포함된다.
벡터
또 다른 양태에서, 본 발명은 상기 정의된 핵산 분자 또는 핵산 분자 그룹을 포함하는 벡터에 관한 것이다.
본원에서 사용되는 "벡터"는 유전 물질을 세포로 전달하기 위한 비히클로서 사용되는 핵산 분자이다. 용어 "벡터"는 플라스미드, 바이러스, 코스미드 및 인공 염색체를 포함한다. 일반적으로, 조작된 벡터는 복제 기점, 다중클로닝 부위 및 선택 가능한 마커로 구성된다. 벡터 자체는 일반적으로 삽입물(이식 유전자) 및 벡터의 "백본" 역할을 하는 더 큰 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 서열, 일반적으로 DNA 서열이다. 현대 벡터는 이식 유전자 삽입 및 백본 외에 추가 특징을 포함할 수 있다: 프로모터, 유전자 마커, 항생제 내성, 리포터 유전자, 표적화 서열, 단백질 정제 태그. 특히 발현 벡터(발현 작제물)라고 하는 벡터는 표적화된 세포에서 이식 유전자의 발현을 위한 것이며, 일반적으로 제어 서열을 가지고 있다.
일 구현예에서, 항-PD1 항체의 중쇄 및 경쇄 암호화 서열 및/또는 불변 영역 모두가 하나의 발현 벡터에 포함된다. 중쇄 암호화 서열 및 경쇄 암호화 서열 각각은 적합한 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있고, 중쇄 및/또는 경쇄는 본 발명에 따른 면역치료제에 작동 가능하게 연결되어 있을 수 있다. 대안적으로, 중쇄 및 경쇄 모두의 발현은 동일한 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 항체의 중쇄 및 경쇄 각각은 개별 벡터, 중쇄 및 경쇄 중 하나 또는 둘 모두에 클로닝되고, 중쇄 및/또는 경쇄는 본 발명에 따른 면역치료제에 작동 가능하게 연결되어 있다. 후자의 경우, 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 발현 벡터는 두 사슬의 발현을 위해 하나의 숙주 세포로 공동 형질감염될 수 있으며, 이는 생체 내 또는 시험관 내에서 온전한 항체를 형성하도록 조립될 수 있다. 대안적으로, 중쇄를 암호화하는 발현 벡터 및 경쇄를 암호화하는 발현 벡터는 각각의 중쇄 및 경쇄를 발현하기 위해 상이한 숙주 세포에 도입될 수 있으며, 이어서 정제되고 조립되어 시험관 내에서 온전한 항체를 형성할 수 있다.
인간화 항 PD-1 항체 또는 이의 항체 단편을 암호화하는 핵산 분자는 당업자에 의해 벡터로 클로닝된 다음 숙주 세포로 형질전환될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 한 바람직한 구현예에서, 발현 벡터는 프로모터 및 분비 신호 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열, 및 선택적으로 스크리닝을 위한 적어도 하나의 약물 내성 유전자를 추가로 포함한다.
적합한 발현 벡터는 전형적으로 (1) 박테리아 복제 기원을 암호화하는 원핵 DNA 요소 및 박테리아 숙주에서 발현 벡터의 성장 및 선택을 제공하기 위한 항생제 내성 마커; (2) 프로모터와 같은 전사 개시를 제어하는 진핵 DNA 요소; 및 (3) 전사 종결/폴리아데닐화 서열과 같은 전사물의 처리를 제어하는 DNA 요소를 함유한다.
당업자에게 공지된 방법은 본원에 기재된 이작용성 분자의 핵산 서열 및 전사/번역을 위한 적당한 조절 성분을 함유하는 발현 벡터를 작제하는데 사용될 수 있다. 이러한 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술, 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. DNA 서열은 mRNA 합성을 지시하기 위해 발현 벡터의 적절한 프로모터에 효율적으로 연결된다. 발현 벡터는 번역, 전사 종결자 등을 개시하기 위한 리보솜-결합 부위를 추가로 포함할 수 있다.
인산 칼슘 형질감염, 리포-매개 형질감염, 전기천공 등을 포함한 다양한 기술을 사용하여 발현 벡터가 숙주 세포에 도입될 수 있다. 바람직하게는, 형질감염된 세포가 선택되고 증식되며, 여기서, 발현 벡터는 숙주 세포 게놈에 안정적으로 통합되어 안정한 형질전환체를 생성한다. 진핵 세포에 벡터를 도입하는 기술 및 우성 선택 마커를 사용하여 안정한 형질전환체를 선택하는 기술은 문헌[Sambrook, by Ausubel, by Bebbington, "Expression of Antibody Genes in Nonlymphoid Mammalian Cells," in 2 METHODS: A companion to methods in enzymology 136 (1991), and by Murray (ed.), Gene transfer and expression protocols (Humana Press 1991)]에 설명되어 있다. 적합한 클로닝 벡터는 문헌[Sambrook et al. (eds.), MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Second Edition (Cold Spring Harbor Press 1989)](이하 "Sambrook"); [Ausubel et al. (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Wiley Interscience 1987)](이하 "Ausubel"); 및 [Brown (ed.), MOLECULAR BIOLOGY LABFAX (Academic Press 1991)]에 설명되어 있다.
숙주 세포
또 다른 양태에서, 본 발명은 예를 들어 이작용성 분자 생산 목적을 위해 상기 정의된 바와 같은 벡터 또는 핵산 분자 또는 핵산 분자 그룹을 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
본원에 사용된 용어 "숙주 세포"는 벡터, 외인성 핵산 분자 및 본 발명의 항체 작제물을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 수혜자; 및/또는 항체 작제물 또는 이작용성 분자 자체의 수혜자일 수 있거나 수혜자인 임의의 개별 세포 또는 세포 배양물을 포함하는 것으로 의도된다. 세포 내로 각각의 물질의 도입은 형질전환, 형질감염 등에 의해 수행될 수 있다. 용어 "숙주 세포"는 또한 단일 세포의 자손 또는 잠재적 자손을 포함하는 것으로 의도된다. 적합한 숙주 세포는 원핵 또는 진핵 세포를 포함하고, 또한 박테리아, 효모 세포, 진균 세포, 식물 세포, 및 곤충 세포 및 포유동물 세포와 같은 동물 세포, 예를 들어 뮤린, 래트, 토끼, 마카크 또는 인간을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다.
일 구현예에서, 숙주 세포는: (1) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 항체의 VH 및/또는 항체의 불변 영역을 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 제1 벡터 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 제2 벡터를 포함한다(예를 들어, 이들로 형질전환된다).
또 다른 구현예에서, 숙주 세포는 이작용성 분자의 개체 둘 모두를 포함하는 벡터를 포함한다(예를 들어, 이들로 형질전환된다). 바람직하게는, 숙주 세포는 SIRPa 또는 이의 변이체를 암호화하는 제3 핵산에 작동 가능하게 연결된, 본원에 개시된 바와 같은 항-hPD-1 항체의 가변 중쇄 도메인을 암호화하는 제1 핵산 분자 및 본원에 개시된 항-hPD-1 항체의 가변 경쇄 도메인을 암호화하는 제2 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함한다(예를 들어, 이들로 형질전환된다).
인간화 항-PD1 항체 생산 방법도 본원에서 제공된다. 상기 방법은 항체의 발현에 적합한 조건 하에서 상기 제공된 바와 같은 항체를 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 선택적으로 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 항체를 회수하는 단계를 포함한다. 특히, 인간화 항-PD1 항체의 재조합 생산을 위해, 예를 들어 상기 기재된 바와 같은 항체를 암호화하는 핵산이 단리되고 숙주 세포에서 추가 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터에 삽입된다.
본 발명의 이작용성 분자는 바람직하게는 포유동물 세포, 식물 세포, 곤충 세포 또는 효모 세포와 같은 진핵 세포에서 발현된다. 포유동물 세포는 글리코실화와 같은 적합한 번역 후 변형을 제공하기 때문에 포유동물 세포가 특히 바람직한 진핵 숙주이다. 바람직하게는, 이러한 적합한 진핵 숙주 세포는 피치카 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)와 같은 진균; 미팀나 세파라테(Mythimna Separate)와 같은 곤충 세포; 담배와 같은 식물 세포 및 BHK 세포, 293 세포, CHO 세포, NSO 세포 및 COS 세포와 같은 포유동물 세포일 수 있다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 다른 예는 SV40 유전자 세포(COS 세포)를 갖는 기원의 CV-1, SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 계통(COS-7); 인간 배아 신장 계통(예를 들어, 문헌[Graham, F.L. et al, J. Gen Virol. 36(1977) 59-74]에 기재된 바와 같은 293 또는 293 세포); 아기 햄스터 신장 세포(BHK); 마우스 세르톨리(Sertoli) 세포(예를 들어, 문헌[Mather, J.P., Biol. Reprod. 23(1980) 243-252]에 기재된 바와 같은 TM4 세포); 인간 상피 신장 세포(HEK 세포); 원숭이 신장 세포(CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76); 인간 자궁경부 암종 세포(HELA); 개 신장 세포(MDCK; 버팔로 래트 간 세포(BRL 3 A); 인간 폐 세포(W138); 인간 간 세포(Hep G2); 마우스 유방 종양(MMT 060562); 예를 들어, 문헌[Mather, J.P. et al, Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68]에 기재된 바와 같은 TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 DHFR" CHO 세포(문헌[Urlaub, G. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220])를 포함한 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포; 및 Y0, NSO 및 Sp2/0와 같은 골수종 세포주를 포함한다. 항체 생산에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주의 검토를 위해, 예를 들어 문헌[Yazaki, P. and Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp. 255-268]을 참조한다. 예를 들어, 현탁액에서 성장하도록 적응된 포유동물 세포주가 유용할 수 있다.
특히, 본 발명의 숙주 세포는 CHO 세포, COS 세포, NSO 세포 및 HEK 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
포유동물 숙주의 경우, 발현 벡터의 전사 및 번역 조절 신호는 아데노바이러스, 소 유두종 바이러스, 유인원 바이러스 등과 같은 바이러스 공급원으로부터 유래될 수 있으며, 여기서, 조절 신호는 높은 수준의 발현을 갖는 특정 유전자와 관련된다. 적합한 전사 및 번역 조절 서열은 또한 액틴, 콜라겐, 미오신 및 메탈로티오네인 유전자와 같은 포유동물 유전자로부터 얻을 수 있다.
본 발명에 따른 이작용성 분자를 생성하는 안정한 형질전환체는 다양한 방법을 사용하여 확인될 수 있다. 분자-생산 세포가 확인된 후, 숙주 세포는 그들의 성장 및 이작용성 분자 발현에 적합한 조건(예를 들어, 온도, 배지)에서 배양된다. 이어서, 이작용성 분자는 당 업계에 공지된 임의의 방법에 의해 단리되고/되거나 정제된다. 이러한 방법에는 통상적인 재생 처리, 단백질 침전제(예를 들어, 염 침전)에 의한 처리, 원심분리, 삼투에 의한 세포용해, 초음파 처리, 초원심분리, 분자체 크로마토그래피 또는 겔 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, HPLC, 기타 액체 크로마토그래피 및 이들의 조합이 포함되지만, 이들로 한정되지는 않는다. 예를 들어, Coligan에 의해 기술된 바와 같이, 이작용성 분자 단리 기술은 특히 단백질-A 세파로스를 사용한 친화도 크로마토그래피, 크기-배제 크로마토그래피 및 이온 교환 크로마토그래피를 포함할 수 있다. 단백질 A는 바람직하게는 본 발명의 이작용성 분자를 단리하기 위해 사용된다.
약제학적 조성물 및 이의 투여 방법
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 임의의 이작용성 분자, 핵산 분자, 핵산 분자의 그룹, 벡터 및/또는 상기 기재된 바와 같은 숙주 세포를, 바람직하게는 활성 성분 또는 화합물로서 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 제형은 멸균될 수 있고, 원한다면 본 발명의 이작용성 분자, 핵산, 벡터 및/또는 숙주 세포와 유해하게 상호작용하지 않는 약제학적으로 허용되는 담체 및 부형제와 같은 보조제와 혼합될 수 있다. 선택적으로, 약제학적 조성물은 하기에 상세히 설명된 바와 같은 추가 치료제를 추가로 포함할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 약제학적 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 이작용성 분자, 핵산 분자, 핵산 분자의 그룹, 벡터 및/또는 상기 기재된 바와 같은 숙주 세포를 하나 이상의 약제학적 또는 생리학적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제, 염 및 항산화제와 조합하여 포함할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 이작용성 분자의 원하는 면역 강화 효과에 악영향을 미치지 않는 약제학적으로 허용되는 형태가 사용된다. 투여를 용이하게 하기 위해, 본원에 기재된 바와 같은 이작용성 분자는 생체 내 투여를 위한 약제학적 조성물로 제조될 수 있다. 그러한 조성물을 제조하는 수단은 당 업계에 설명되어있다(예를 들어, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins, 21st edition (2005] 참조).
특히, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 국소, 장내, 경구, 비경구, 비내, 정맥 내, 근육 내, 피하 또는 안내 투여 등을 포함하는 임의의 통상적인 투여 경로를 위해 제형화될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 장내 또는 비경구 투여 경로를 위해 제형화된다. 비경구 투여용 조성물 및 제형은 완충제, 희석제 및 침투 증강제, 카더 화합물 및 기타 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 같은(이에 제한되지 않음) 다른 적합한 첨가제를 또한 함유할 수 있는 멸균 수용액을 포함할 수 있다.
약제학적 조성물은 원하는 순도를 갖는 작용제를 동결건조된 제형 또는 수용액 형태로 임의의 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제(문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)])와 혼합하여 제조될 수 있다. 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수혜자에게 무독성이며, 인산염, 구연산염 및 기타 유기산과 같은 완충액; 아스코르브 산 및 메티오닌을 포함한 항산화제; 보존제(예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤잘코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(잔기 약 10개 미만) 폴리펩타이드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 단당류, 이당류 및 포도당, 만노스 또는 덱스트린을 포함한 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨과 같은 당; 염-형성 반대-이온, 예컨대 나트륨; 금속 복합체(예를 들어, Zn-단백질 복합체); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 TWEEN TM, PLURONICS TM 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다.
고체 약제학적으로 허용되는 비히클은 향미제, 윤활제, 가용화제, 현탁제, 염료, 충전제, 활택제, 압축 보조제, 비활성 결합제, 감미료, 보존제, 염료, 코팅제 또는 정제-붕해제로도 작용할 수 있는 하나 이상의 물질을 포함할 수 있다. 적합한 고체 비히클은 예를 들어 인산 칼슘, 스테아르산 마그네슘, 활석, 당, 락토스, 덱스트린, 전분, 젤라틴, 셀룰로스, 폴리비닐피롤리딘, 저융점 왁스 및 이온 교환 수지를 포함한다. 약제학적으로 허용되는 담체는 멸균 주사 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 분말을 포함한다. 임의의 통상적인 매질 또는 작용제가 활성 화합물과 양립할 수 없는 경우를 제외하고는, 본 발명의 약제학적 조성물에 이를 사용하는 것이 고려된다.
본 발명에 따른 이작용성 분자는 물, 유기 용매, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 혼합물과 같은 약제학적으로 허용되는 액체 비히클 또는 약제학적으로 허용되는 오일 또는 지방 및 이들의 적합한 혼합물에 용해되거나 현탁될 수 있다. 액체 비히클은 가용화제, 유화제, 완충제, 보존제, 감미제, 향미제, 현탁제, 습윤제, 증점제, 착색제, 점도 조절제, 안정화제 또는 삼투-조절제와 같은 기타 적합한 약제학적 첨가제를 함유할 수 있다. 경구 및 장내 투여를 위한 액체 비히클의 적합한 예는 물(부분적으로 상기와 같은 첨가제, 예를 들어 셀룰로스 유도체, 바람직하게는 소듐 카르복시메틸 셀룰로스 용액 포함), 알코올(1가 알코올 및 다가 알코올, 예를 들어 글리콜 포함) 및 이의 유도체, 및 오일(예를 들어, 분획 코코넛 오일 및 땅콩 오일)을 포함한다. 비경구 투여를 위해, 비히클은 또한 에틸 올레이트 및 이소프로필 미리스테이트와 같은 유성 에스테르일 수 있다. 멸균 액체 비히클은 장내 투여를 위한 멸균 액체 형태 조성물에 유용하다. 가압 조성물을 위한 액체 비히클은 할로겐화 탄화수소 또는 다른 약제학적으로 허용되는 추진제일 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 염을 추가로 포함할 수 있다. "약제학적으로 허용되는 염"은 모 화합물의 원하는 생물학적 활성을 유지하고 원치 않는 독성 효과를 부여하지 않는 염을 의미한다. 이러한 염의 예는 산 부가 염 및 염기 부가 염을 포함한다. 산 부가 염에는 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화 수소산, 요오드 수소산, 인 등과 같은 무독성 무기산뿐만 아니라 지방족 모노- 및 디카르복실산, 페닐-치환 알칸 산, 하이드록시 알칸 산, 방향족 산, 지방족 및 방향족 술폰산 등과 같은 무독성 유기산으로부터 유래된 염이 포함된다. 염기 부가 염은 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등과 같은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속으로부터 유도된 것뿐만 아니라 N,N'-디벤질에틸렌디아민, N-메틸글루카민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, 프로카인 등과 같은 무독성 유기 아민으로부터 유래된 염을 포함한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 또한 약제학적으로 허용되는 항산화제를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 항산화제의 예는: 수용성 항산화제, 예컨대 아스코르브 산, 시스테인 염산염, 중황산나트륨, 메타중아황산나트륨, 아황산나트륨 등; 지용성 항산화제, 예컨대 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 하이드록시아니솔(BHA), 부틸화 하이드록시톨루엔(BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 등; 및 금속 킬레이트제, 예컨대 구연산, 에틸렌디아민 테트라-아세트산(EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 인산 등을 포함한다.
전달을 용이하게 하기 위해, 임의의 이작용성 분자 또는 그것의 암호화 핵산은 샤페론 제제와 접합될 수 있다. 샤페론 제제는 단백질(예를 들어, 인간 혈청 알부민, 저밀도 지질단백질 또는 글로불린), 탄수화물(예를 들어, 덱스트란, 풀루란, 키틴, 키토산, 이눌린, 사이클로덱스트린 또는 히알루론산), 또는 지질과 같은 자연 발생 물질일 수 있다. 또한 합성 중합체, 예를 들어 합성 폴리아미노산과 같은 재조합 또는 합성 분자일 수 있다. 폴리아미노산의 예로는 폴리리신(PLL), 폴리 L 아스파르트 산, 폴리 L-글루탐산, 스티렌-말레 산 무수물 공중합체, 폴리(L-락타이드-공-당화) 공중합체, 디비닐 에테르-말레 산 무수물 공중합체, N-(2-하이드록시 프로필) 메타크릴아미드 공중합체(HMPA), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리우레탄, 폴리(2-에틸아크릴산), N-이소프로필아크릴아미드 중합체 및 폴리포스파진이 포함된다. 한 예에서, 샤페론 제제는 미셀, 리포솜, 나노입자 또는 마이크로스피어이다. 이러한 미셀, 리포솜, 나노입자 또는 마이크로스피어를 제조하는 방법은 당 업계에 잘 알려져있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,108,921호; 제5,354,844호; 제5,416,016호; 및 제5,527,5285호를 참고한다.
약제학적 조성물은 전형적으로 제조 및 보관 조건 하에서 멸균되고 안정적이어야한다. 약제학적 조성물은 용액, 마이크로-에멀젼, 리포솜, 또는 높은 약물 농도에 적합하고/하거나 주사에 적합한 다른 정렬된 구조로 제형화될 수 있다. 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅의 사용, 분산의 경우 필요한 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용에 의해 적절한 유동성이 유지될 수 있다.
일 구현예에서, 약제학적 조성물은 식물성 오일, 디메틸락트아미드, 디메틸포름아미드, 에틸 락테이트, 에틸 카르보네이트, 이소프로필 미리스테이트, 에탄올 및 폴리올(글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등)과 같은 다양한 담체를 함유할 수 있는 주사 가능한 조성물이다. 정맥 주사의 경우, 수용성 항체는 드립(drip) 법에 의해 투여될 수 있으며, 이에 의해 항체 및 생리학적으로 허용되는 부형제를 함유하는 약제학적 제형이 주입된다. 생리학적으로 허용되는 부형제는 예를 들어 5% 덱스트로스, 0.9% 식염수, 링거 용액 또는 기타 적합한 부형제를 포함할 수 있다. 근육 내 제제, 예를 들어 항체의 적합한 가용성 염 형태의 멸균 제형은 주사용수, 0.9% 식염수 또는 5% 글루코스 용액과 같은 약제학적 부형제에 용해되고 투여될 수 있다.
멸균 주사 용액은 필요에 따라 상기 열거된 성분들 중 하나 또는 조합과 함께 적당한 용매에 필요한 양의 활성 화합물을 혼입한 다음 멸균 미세여과함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 염기성 분산 매질과 상기 열거된 것들로부터 필요한 기타 성분을 함유하는 멸균 비히클에 활성 화합물을 통합하여 제조된다. 멸균 주사 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 동결-건조(동결건조)로, 활성 성분의 분말과 이의 이전에 멸균-여과된 용액에서 원하는 임의의 추가 성분을 생성한다. 주사 가능한 조성물의 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 조성물에 포함시킴으로써 연장될 수 있다.
미생물의 존재는 살균 절차에 의해, 그리고 클로로부탄올, 페놀 소르브산 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 포함시킴으로써 방지될 수 있다. 또한 당, 염화나트륨 등과 같은 등장제를 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 흡수를 지연시키는 작용제를 포함시킴으로써 주사 가능한 약제학적 형태의 흡수를 연장시킬 수 있다.
당업자는 본 발명의 제형이 인간 혈액과 본질적으로 동일한 삼투압을 갖는, 본 발명의 제형이 인간 혈액과 등장성일 수 있음을 이해할 것이다. 이러한 등장성 제형은 일반적으로 약 250 mOSm 내지 약 350 mOSm의 삼투압을 갖는다. 등장성은 예를 들어 증기압 또는 빙결식 삼투압계로 측정될 수 있다. 제형의 긴장성은 긴장성 조절제를 사용하여 조정된다. "긴장성 조절제"는 제형의 등장성을 제공하기 위해 제형에 첨가될 수 있는 약제학적으로 허용되는 불활성 물질이다. 본 발명에 적합한 긴장성 조절제는 당류, 염 및 아미노산을 포함하지만 이들로 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물은 실질적으로 투여 즉시 또는 투여 후 임의의 미리 결정된 시간 또는 기간에 활성 성분(예를 들어, 본 발명의 이작용성 분자)을 방출하도록 제형화될 수 있다. 일부 양태에서 약제학적 조성물은 치료될 부위의 감작을 유발하기에 충분한 시간을 두고, 그리고 그 전에 조성물의 전달이 발생하도록 시간 방출, 지연 방출 및 지속 방출 전달 시스템을 사용할 수 있다. 당 업계에 공지된 수단을 사용하여 조성물이 표적 조직 또는 기관에 도달할 때까지 조성물의 방출 및 흡수를 방지 또는 최소화하거나, 조성물의 지속적인 방출을 보장할 수 있다. 이러한 시스템으로 인해 조성물의 반복적인 투여를 피할 수 있고, 이에 따라 대상체와 의사의 편의를 증가시킬 수 있다.
단일 투여 형태를 만들기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 치료되는 대상체 및 특정 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 단일 투여 형태를 만들기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로 치료 효과를 내는 조성물의 양일 것이다.
대상체, 요법 및 투여
본 발명은 본원에 개시된 이작용성 분자; 이들을 암호화하는 핵산 또는 벡터, 약제로 사용하기 위한, 또는 질환 치료에 사용하기 위한, 또는 대상체에게 투여하기 위한, 또는 약제로 사용하기 위한, 숙주 세포 또는 약제학적 조성물, 핵산, 벡터 또는 숙주 세포에 관한 것이다. 치료의 예는 이후 "방법 및 용도" 섹션에서 보다 구체적으로 설명된다. 또한, 대상체의 질환을 치료하기 위한 약제를 제조하는데 있어서 본 발명의 약제학적 조성물, 핵산, 벡터 또는 숙주 세포, 또는 항-PD1 항체 또는 이의 항체 단편 및 SIRPa를 포함하는 이작용성 분자의 용도에 관한 것이다. 마지막으로, 이는 항-PD1 항체 또는 이의 항체 단편 및 SIRPa를 포함하는 약제학적 조성물 또는 이작용성 분자의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체의 질환 또는 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다. 치료의 예는 이후 "방법 및 용도" 섹션에서 보다 구체적으로 설명된다.
치료 대상체는 인간, 특히 산전 단계의 인간, 신생아, 아동, 유아, 청소년 또는 성인, 특히 적어도 30세, 40세, 바람직하게는 적어도 50세의 성인, 더욱더 바람직하게는 적어도 60세의 성인, 더욱더 바람직하게는 적어도 70세의 성인일 수 있다.
특히, 대상체는 PD-1/PDL-1 경로를 수반할 수 있는 질환으로 영향을 받았으며, 특히 PD-1(예를 들어, PDL-1 및/또는 PDL-2) 또는 PD-1의 리간드 중 적어도 하나가 발현되고, 특히 과다발현된다. 바람직하게는, 대상체는 암, 더욱더 바람직하게는 PD1, PD-L1 및/또는 PD-L2 양성 암 또는 PD-1 양성 암을 앓고 있다. 질환 및 암의 예는 이하 "방법 및 용도" 섹션에서 보다 구체적으로 설명된다.
특정 구현예에서, 대상체는 항-PD1 항체 또는 이의 항체 단편 및 본 발명에 따른 SIRPa를 포함하는 이작용성 분자 또는 본 발명에 따른 약제학적 조성물을 투여하기 전에 적어도 한 라인의 치료, 바람직하게는 여러 라인의 치료를 이미 받았다.
의학 분야의 통상의 기술자에게 알려진 통상적인 방법을 사용하여 치료할 질환의 유형 또는 질환의 부위에 따라 본원에 개시된 이작용성 분자 또는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여할 수 있다. 이 조성물은 통상적인 경로를 통해, 예를 들어 경구, 비경구, 장내, 흡입 스프레이, 국소, 직장, 비강, 협측, 질 또는 이식된 저장소를 통해 투여될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "비경구"는 피하, 피내, 정맥 내, 근육 내, 관절 내, 동맥 내, 활 막내, 종양 내, 흉골 내, 척수 내, 병변 내 및 두개 내 주사 또는 주입 기술을 포함한다. 비경구 투여 시, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 바람직하게는 정맥 내 투여 경로로 투여된다. 장내 투여 시, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 바람직하게는 경구 투여 경로로 투여된다. 이 조성물은 또한 국소적으로 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물의 형태, 약제학적 조성물 또는 이작용성 분자의 투여 경로 및 투여량은 감염의 유형 및 중증도에 따라, 및 환자, 특히 그의 연령, 체중, 성별 및 일반적인 신체 상태에 따라 당업자에 의해 조정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 국소 또는 전신 치료가 바람직한 지에 따라 다양한 방식으로 투여될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 이작용성 분자 또는 약제학적 조성물을 사용한 치료는 규칙적으로, 바람직하게는 매일, 매주 또는 매월, 더 바람직하게는 매일 내지 1주마다, 2주마다, 3주마다, 또는 4주마다 투여된다. 특정 구현예에서, 치료는 1일 수회, 바람직하게는 1일 2회 또는 3회 투여된다.
본 발명에 따른 이작용성 분자 또는 본 발명에 따른 약제학적 조성물을 사용한 치료 기간은 바람직하게는 1일 내지 20주, 더욱 바람직하게는 1일 내지 10주, 더욱더 바람직하게는 1일 내지 4주, 훨씬 더 바람직하게는 1일 내지 2주로 구성된다. 대안적으로, 질환이 지속되는 한 치료가 지속될 수 있다.
본원에 개시된 이작용성 분자는 약 1 ng/kg 체중 내지 약 30 mg/kg 체중, 1 μg/kg 내지 약 20 mg/kg, 10 μg/kg 내지 약 10 mg/kg, 또는 100 μg/kg 내지 5 mg/kg의 유효 용량 범위로, 선택적으로 1, 2, 3 또는 4주마다, 바람직하게는 비경구 또는 경구 투여, 특히 정맥 내 또는 피하 투여로 제공될 수 있다.
전형적으로, 본원에 개시된 이작용성 분자는 항체의 안전한 투여에 적합하고 임상적 필요에 매우 적절한 약 1 mg/kg 체중 내지 약 20 mg/kg 체중, 유리하게는 2 내지 10 mg/kg, 특히 3, 4, 5, 6, 7 mg/kg의 유효 용량 범위로 제공될 수 있다.
특히, 본 발명에 따른 이작용성 분자는 치료 용량 이하로 투여될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "치료 용량 이하"은 질환을 치료하는 데 일반적으로 사용되는 효과적인 단일요법 용량 수준 미만인 용량, 또는 현재 항-hPD1 항체를 사용한 효과적인 단일요법에 전형적으로 사용되지 않는 용량을 지칭한다.
방법 및 용도
질환 치료에 사용
본 발명의 이작용성 분자, 핵산, 벡터, 숙주 세포, 조성물 및 방법은 수많은 시험관 내 및 생체 내 유용성 및 용도를 갖는다. 예를 들어, 본원에 기재된 이작용성 분자, 핵산, 벡터, 숙주 세포 및/또는 약제학적 조성물은 치료제, 진단제 및 의학 연구로서 사용될 수 있다. 특히, 본원에 제공된 임의의 이작용성 분자, 핵산 분자, 핵산 분자군, 벡터, 숙주 세포 또는 약제학적 조성물은 치료 방법 및/또는 치료 목적으로 사용될 수 있다. 특히, 본원에 제공된 이작용성 분자, 핵산, 벡터 또는 약제학적 조성물은 바람직하게는 PD-1과 연관된 임의의 질환 또는 상태, 예컨대 암, 자가면역 질환, 및 면역결핍과 관련된 감염 또는 기타 질환, 예컨대 T 세포 기능장애의 치료에 유용할 수 있다. 더욱더 바람직하게는, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 이작용성 분자 또는 약제학적 조성물의 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 암, 감염성 질환 및 만성 바이러스 감염으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환 및/또는 장애의 치료 방법에 관한 것이다. 이러한 질환의 예는 이하에서 보다 구체적으로 설명된다.
특히, 본 발명에 따른 이작용성 분자는 PD-1/PD-L1/PD-L2 및 SIRPa 경로를 모두 표적으로 하기 때문에 "이작용성 체크포인트 억제제"라고 불린다.
본 발명은 특히 PD-L1 및/또는 PD-L2와 PD-1의 결합 억제에 의해; 및/또는 SIRPa에 대한 CD47의 결합의 억제에 의해 예방되거나 치료될 수 있는 병리, 질환 및/또는 장애의 치료에 사용되기 위한 이작용성 분자, 핵산, 핵산 군 또는 이를 암호화하는 벡터, 또는 이를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
따라서, 본원에 기재된 임의의 이작용성 분자 또는 약제학적 조성물의 유효량을 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 질환, 특히 PD-1 및/또는 PD-1/PD-L1 및/또는 PD-1/PD-L2 신호전달 경로와 관련된 질환을 치료하기 위한 방법이 본원에 개시된다. 환자의 생리학적 데이터(예를 들어, 연령, 크기 및 체중) 및 투여 경로도 고려하여 적당한 용량을 결정해야 하므로, 치료적 유효량이 환자에게 투여될 것이다.
추가로 또는 대안적으로, 본원에 기재된 임의의 이작용성 분자 또는 약제학적 조성물의 유효량을 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 질환, 특히 SIRPa/CD47 경로와 관련된 질환을 치료하기 위한 방법이 본원에 개시된다.
또 다른 양태에서, 본원에 개시된 이작용성 분자는 면역을 향상시키기 위해, 바람직하게는 장애 및/또는 질환을 치료하기 위해, 예를 들어 생체 내에서 대상체에게 투여될 수 있다. 따라서, 일 양태에서, 본 발명은 대상체에서 면역 반응이 변형되도록 본 발명의 이작용성 분자, 핵산, 벡터 또는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 변형시키는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 면역 반응은 강화, 증가, 자극 또는 상향-조절된다. 이작용성 분자 또는 약제학적 조성물은 치료가 필요한 대상체에서 T 세포 활성화와 같은 면역 반응을 향상시키는 데 사용될 수 있다. 면역 반응 향상은 PD-L1 및/또는 PD-L2의 PD-1로의 결합 및/또는 CD47의 SIRPa로의 결합을 억제하여 면역억제 환경을 감소시키고, 인간 PBMC에 의한 인간 T-세포 및/또는 IFNγ 분비의 증식 및/또는 활성화를 자극할 수 있다.
본 발명은 특히, 본 명세서에 기재된 것을 포함하는 임의의 이작용성 분자, 핵산, 벡터 또는 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체의 면역 반응을 향상시키는 방법을 제공하여, 대상체의 면역 반응이 향상된다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 이작용성 분자의 양은 PD-1 신호전달을 억제하는 데 효과적이다(예를 들어, PD-1 신호전달을 대조군과 비교하여 적어도 20%, 30%, 50%, 80%, 100%, 200%, 400% 또는 500% 감소). 다른 구현예에서, 본원에 기재된 이작용성 분자의 양은 (예를 들어, 대조군과 비교하여 적어도 20%, 30%, 50%, 80%, 100%, 200%, 400% 또는 500%까지) 면역 반응을 활성화하는 데 효과적이다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 이작용성 분자의 양은 인간 PD-L1 및/또는 PD-L2의 인간 PD-1에 대한 결합 억제에 효과적이며, 예를 들어 대조군과 비교하여 결합을 적어도 20%, 30%, 50%, 80%, 100%, 200%, 400% 또는 500% 억제시키는데 효과적이다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 이작용성 분자의 양은 인간 PD-L1 및/또는 PD-L2의 인간 PD-1에 대한 결합의 길항제 활성을 갖기에 충분하며, 예를 들어 대조군과 비교하여 결합을 적어도 20%, 30%, 50%, 80%, 100%, 200%, 400% 또는 500% 억제시키는데 효과적이다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 이작용성 분자의 양은 SIRPa/CD47 신호전달을 억제하는 데 효과적이다(예를 들어, SIRPa/CD47 신호전달을 대조군과 비교하여 적어도 20%, 30%, 50%, 80%, 100%, 200%, 400% 또는 500% 감소). 다른 구현예에서, 본원에 기재된 이작용성 분자의 양은 면역 반응을 활성화하는 데 효과적이다(예를 들어, 대조군과 비교하여 적어도 20%, 30%, 50%, 80%, 100%, 200%, 400% 또는 500%까지).
일부 구현예에서, 본원에 기재된 이작용성 분자의 양은 종양 세포에 의해 발현된 CD47의, APC에 의해 발현된 인간 SIRPa에 대한 결합의 억제에 효과적이며, 예를 들어 결합을 (즉, 본 발명의 이작용성 분자가 없는) 대조군 조건과 비교하여 적어도 20%, 30%, 50%, 80%, 100%, 200%, 400% 또는 500% 억제하는데 효과적이다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 이작용성 분자의 양은 CD47의 결합에 대한, 특히 대식세포와 같은 SIRPa를 발현하는 인간 면역 세포와의 경쟁, 예를 들어, CD47과 SIRPa 양성 세포 사이의 결합을 (즉, 본 발명의 이작용성 분자가 없는) 대조군 조건과 비교하여 적어도 20%, 30%, 50%, 80%, 100%, 200%, 400% 또는 500% 억제하는데 대한 경쟁 활성을 갖기에 충분하다.
본 발명은 또한 대상체의 장애 및/또는 질환의 치료에 사용하기 위한, 및/또는 약제 또는 백신으로서 사용하기 위한, 본원에 기재된 이작용성 분자; 이를 암호화하는 핵산 또는 벡터, 또는 이를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 이는 또한 대상체의 질환 및/또는 장애를 치료하기 위한 약제의 제조에 본원에 기재된 이작용성 분자; 이를 암호화하는 핵산 또는 벡터, 또는 이를 포함하는 약제학적 조성물의 용도에 관한 것이다. 마지막으로, 본 발명에 따른 약제학적 조성물 또는 이작용성 분자의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 대상체의 질환 또는 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다.
질환 및/또는 장애가 있는 환자를 치료하는 방법이 본원에 개시되며, 상기 방법은 (a) 치료가 필요한 환자를 식별하는 단계; 및 (b) 본원에 기재된 임의의 이작용성 분자, 핵산, 벡터 또는 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
치료를 필요로 하는 대상체는 PD-1에 의해 매개되는 신호전달 경로와 관련된 질환을 갖거나, 가질 위험이 있거나, 가질 것으로 의심되는 인간일 수 있다. 그러한 환자는 일상적인 건강 검진으로 확인할 수 있다. 예를 들어, 치료에 적합한 대상체는 그러한 대상체가 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2 양성 세포를 보유하는지 여부를 조사함으로써 식별될 수 있다. 바람직하게는, "PD-L1 양성 종양 세포" 또는 "PD-L2 양성 종양 세포"는 PD-L1 또는 PD-L2가 각각 종양 세포의 적어도 10%, 바람직하게는 종양 세포의 적어도 20, 30, 40 또는 50%에서 발현되는 종양 세포 집단을 의미하는 것으로 의도된다.
일 구현예에서, 치료를 필요로 하는 대상체는 질환, 바람직하게는 PD-1, PDL1 및/또는 PDL2 양성 질환, 더욱더 바람직하게는 PD-1 및/또는 PD-1의 적어도 하나의 리간드가 과발현되는 질환을 갖거나, 가질 위험이 있거나, 가질 것으로 의심되는 환자이다. 이러한 대상체에서, 본 발명에 따른 이작용성 분자 또는 약제학적 조성물의 투여로 인한 PD-1/PD-L1 및/또는 PD-1/PD-L2 상호작용의 방해는 대상체의 면역 반응을 향상시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 인간화 항-PD-1 항체 또는 약제학적 조성물은 PD-1 양성 세포를 치료하기 위해 사용될 수 있다.
- 암
항체에 의한 PD-1의 차단이 환자의 암세포에 대한 면역 반응을 향상시킬 수 있다는 것은 당 업계에 알려져 있다. 따라서, 일 양태에서, 본 발명은 고갈된 T 세포를 활성화할 수 있는, 바람직하게는 PD1/PD-L1 및/또는 PD1/PD-L2 상호작용을 방해하거나 억제할 수 있고, 바람직하게는 대상체에서 자연적으로 발생하는 CD47/SIRPa 상호작용을 적어도 부분적으로 예방, 방해하거나 억제할 수 있는, 유효량의 이작용성 분자 또는 약제학적 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암에 걸린 대상체의 치료에 사용하기 위한 이작용성 분자 또는 약제학적 조성물을 제공한다.
일 구현예에서, 치료가 필요한 대상체는 질환, 바람직하게는 PD-1 양성 암, 더욱더 바람직하게는 PD-1이 발현되거나 과발현되는 암을 갖거나, 가질 것으로 의심되거나, 가질 위험이 있는 환자이다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 항-PD-1 항체 또는 약제학적 조성물은 PD-1 양성 종양 세포를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 치료에 적합한 환자는 그러한 환자가 PD-1 양성 종양 세포를 보유하고 있는지 여부를 조사하여 식별될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 대상체는 암 발병, 바람직하게는 PD-L1 및/또는 PD-L2 양성 암을 갖거나, 가질 것으로 의심되거나, 가질 위험이 있는 환자이다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 이작용성 분자 또는 약제학적 조성물은 PD-L1 및/또는 PD-L2 양성 종양을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 치료에 적합한 인간 환자는 그러한 환자가 PD-L1 및/또는 PD-L2 양성 암 세포를 보유하고 있는지 여부를 조사하여 식별될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 대상체는 암 발병, 바람직하게는 CD47 양성 암을 갖거나, 가질 것으로 의심되거나, 가질 위험이 있는 환자이다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 이작용성 분자 또는 약제학적 조성물은 CD47 양성 종양을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 치료에 적합한 인간 환자는 그러한 환자가 CD47 양성 암세포를 보유하고 있는지 여부를 조사하여 식별될 수 있다.
추가 양태에서, 암, 바람직하게는 PD-1, CD47, PD-L1 및/또는 PD-L2 양성 암, 더욱더 바람직하게는 PD-1, CD47, PD-L1 및/또는 PD-L2가 과발현되는 암을 치료하는데 사용하기 위한 이작용성 분자 또는 약제학적 조성물이 제공된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 암을 치료하기 위한 약제, 예를 들어 대상체 내에서 종양 세포, 바람직하게는 PD-1, CD47, PD-L1, PD-L2 양성 종양 세포의 성장을 억제하기 위한 약제의 제조에서의 본원에 개시된 바와 같은 이작용성 분자 또는 약제학적 조성물의 용도를 제공한다.
본 개시내용의 일 양태에서, 치료될 암은 고갈된 T 세포와 관련된다.
따라서, 일 구현예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 치료학적 유효량의 이작용성 분자 또는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체의 암을 치료하기 위한, 예를 들어 종양 세포의 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 암세포의 성장이 억제되도록 이작용성 분자를 이용한 대상체의 치료에 관한 것이다.
임의의 적합한 암은 본원에 제공된 이작용성 분자로 치료될 수 있으며, 조혈세포 암 또는 고형암일 수 있다. 이러한 암에는 암종, 자궁경부암, 결장직장암, 식도암, 위암(gastric cancer), 위장암, 두경부암, 신장암, 간암, 폐암, 림프종, 신경아교종, 중피종, 흑색종, 위암(stomach cancer), 요도 암 환경 유발 암 및 상기 암들의 임의의 조합이 포함된다. 본 발명은 또한 전이성 암, 특히 PD-L1을 발현하는 전이성 암의 치료에 유용하다(문헌[Iwai et al. (2005) Int. Immunol. 17:133-144]). 추가로, 본 발명은 불응성 또는 재발성 악성종양을 포함한다.
특정 양태에서, 암은 PD-1 및/또는 PD-L1의 높은 발현을 갖는 혈액 악성종양 또는 고형 종양이다. 이러한 암은 혈액림프구성 종양, 혈관면역모세포 T 세포 림프종, 골수이형성 증후군, 급성 골수성 백혈병으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
특정 양태에서, 암은 바이러스에 의해 유도되거나 면역결핍과 관련된 암이다. 이러한 암은 카포시 육종(예를 들어, 카포시 육종 헤르페스 바이러스와 관련됨); 자궁경부암, 항문암, 음경암 및 외음부 편평 세포 암 및 구인두암(예를 들어, 인간 유두종 바이러스와 관련됨); 미만성 거대 B-세포 림프종, 버킷 림프종, 형질모세포 림프종, 원발성 중추 신경계 림프종, HHV-8 원발성 삼출 림프종, 고전적인 호지킨 림프종 및 림프증식성 장애(예를 들어, 엡스타인-바아 바이러스(EBV) 및/또는 카포시 육종 헤르페스 바이러스와 관련)를 포함한 B-세포 비호지킨 림프종(NHL); 간세포 암종(예를 들어, B형 및/또는 C형 간염 바이러스와 관련됨); 메르켈 세포 암종(예를 들어, 메르켈 세포 폴리오마 바이러스(MPV)와 관련됨); 및 인간 면역결핍 바이러스 감염(HIV) 감염과 관련된 암으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
바람직하게는, 치료 또는 예방될 암은 전이성 또는 비전이성, 흑색종, 악성 중피종, 비소세포 폐암, 신장 세포 암종, 호지킨 림프종, 두경부암, 요로상피세포 암종, 결장직장암, 간세포 암종, 소세포 폐암 전이성 메르켈 세포 암종, 위 또는 위식도암 및 자궁경부암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
치료를 위한 바람직한 암은 전형적으로 면역요법에 반응하는 암을 포함한다. 대안적으로, 치료를 위한 바람직한 암은 면역요법에 반응하지 않는 암이다.
예를 들어 이론에 얽매이고 싶지 않은 경우, 항암 항체 또는 항암 면역접합체 또는 암세포사멸을 초래하는 다른 현재의 항암 요법으로 치료하면 PD-1에 의해 매개되는 면역 반응이 강화될 것이다. 따라서, 과증식성 질환(예를 들어, 암 종양)의 치료는 항암 치료와 동시에 또는 순차적으로 또는 이들의 임의의 조합과 조합된 이작용성 분자를 포함할 수 있으며, 이는 숙주에 의한 항-종양 면역 반응을 강화할 수 있다. 바람직하게는, 이작용성 분자는 다른 면역원성 작용제, 표준 암 치료법, 또는 이후에 설명되는 다른 항체와 조합하여 사용될 수 있다.
- 감염성 질환
본 발명의 이작용성 분자, 핵산, 핵산 군, 벡터, 숙주 세포 또는 약제학적 조성물은 특정 독소 또는 병원체에 노출된 환자를 치료하는데 사용된다. 따라서, 본 발명의 양태는 대상체에게 본 발명에 따른 이작용성 분자 또는 이를 포함하는 약제학적 조성물을 투여하여, 바람직하게는 대상체가 감염성 질환에 대해 치료되도록 하는 단계를 포함하는, 대상체의 감염성 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
임의의 적합한 감염은 본원에 제공된 이작용성 분자, 핵산, 핵산 군, 벡터, 숙주 세포 또는 약제학적 조성물로 치료될 수 있다.
본 발명의 방법으로 치료할 수 있는 감염을 유발하는 병원성 바이러스의 일부 예는 HIV, 간염(A, B 또는 C), 헤르페스 바이러스(예를 들어, VZV, HSV-1, HAV-6, HSV-II 및 CMV, 엡스타인 바아 바이러스), 아데노바이러스, 인플루엔자 바이러스, 플라비바이러스, 에코바이러스, 라이노바이러스, 콕사키 바이러스, 코로나바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 볼거리 바이러스, 로타바이러스, 홍역바이러스, 풍진 바이러스, 파보바이러스, 우두 바이러스, HTLV 바이러스, 뎅기열 바이러스, 유두종 바이러스, 연체동물 바이러스, 소아마비 바이러스, 광견병 바이러스, JC 바이러스 및 아르보바이러스성 뇌염 바이러스를 포함한다.
특히, 본 발명의 이작용성 분자 또는 약제학적 조성물은 레트로바이러스, 아 넬로바이러스, 서코바이러스, 헤르페스바이러스, 수두 대상포진 바이러스(VZV), 사이토메갈로바이러스(CMV), 엡스타인 바아 바이러스(EBV), 폴리오마바이러스 BK, 폴리오마바이러스, 아데노-관련 바이러스(AAV), 단순 헤르페스 바이러스 1형(HSV-1), 아데노바이러스, 단순 헤르페스 바이러스 2형(HSV-2), 카포시 육종 헤르페스바이러스(KSHV), B형 간염 바이러스(HBV), GB 바이러스 C, 유두종 바이러스, C형 간염 바이러스(HCV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), D형 간염 바이러스(HDV), 인간 T 세포 백혈병 바이러스 1형(HTLV1), 이종 뮤린 백혈병 바이러스-관련 바이러스(XMLV), 풍진 바이러스, 독일 홍역, 파보바이러스 B19, 홍역 바이러스, 콕사키 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된 바이러스에 의해 유발되는 만성 바이러스 감염 환자를 치료하는 데 사용된다.
본 발명의 방법에 의해 치료할 수 있는 감염을 유발하는 병원성 박테리아의 일부 예는 클라미디아, 리케차 박테리아, 마이코박테리아, 포도상구균, 연쇄상구균, 폐렴구균, 수막구균 및 코노구균, 클렙시엘라, 프로테우스, 세라티아, 슈도모나스, 레지오넬라, 디프테리아, 살모넬라, 간균, 콜레라, 파상풍, 보툴리누스 중독, 탄저병, 전염병, 렙토스피라증, 및 라임 병 박테리아를 포함한다.
본 발명의 방법으로 치료할 수 있는 감염을 유발하는 병원성 진균의 일부 예는 칸디다(알비칸, 크루세이, 글라브라타, 트로피칼리스 등), 크립토코커스 네오포르만스, 아스페르길루스(푸미가투스, 니제르 등), 속 뮤코랄레스(뮤코르, 압시디아, 리조푸스), 스포로쓰릭스감염증(Sporothrix schenkii), 블라스토마이세스 더마티티디스(Blastomyces dermatitidis), 파라코키디오이데스 브라실리엔시스(Paracoccidioides brasiliensis), 코키디오이데스 임미티스(Coccidioides immitis) 및 히스토플라스마 캡슐라툼(Histoplasma capsulatum)을 포함한다.
본 발명의 방법에 의해 치료 가능한 감염을 유발하는 병원성 기생충의 일부 예는 엔타메바 히스토리티카(Entamoeba histolytica), 발란티디움 콜라이(Balantidium coli), 네글레리아파울러리(Naegleriafowleri), 아칸타메바 종(Acanthamoeba sp.), 지아르디아 람비아(Giardia lambia), 크립토스포리디움 종(Cryptosporidium sp.), 뉴모시스티스 카리니(Pneumocystis carinii), 플라스모디움 비박스(Plasmodium vivax), 바베시아 마이크로티(Babesia microti), 트리파노소마 브루세이(Trypanosoma brucei), 트리파노소마 크루시(Trypanosoma cruzi), 레이쉬마니아 도노바니(Leishmania donovani), 톡소플라스마 곤디(Toxoplasma gondi) 및 닙포스트론길루스 브라실리엔시스(Nippostrongylus brasiliensis)를 포함한다.
위의 모든 방법에서, 이작용성 분자는 사이토카인 치료(예를 들어, 인터페론, GM-CSF, G-CSF, IL-2)와 같은 다른 형태의 면역요법 또는 종양 항원의 향상된 제시를 제공하는 임의의 요법과 조합될 수 있다.
조합 요법
특히, 본 발명의 이작용성 분자는 임상 개발 중이거나 이미 시판중인 작용제를 사용하여 면역 회피 메커니즘을 극복하기 위한 다른 잠재적인 전략과 결합될 수 있다(Antonia et al. Immuno-oncology 조합의 표 1 참조: 임상 경험 검토 및 미래 전망. Clin. Cancer Res. Off. J. Am. Assoc. Cancer Res. 20, 6258-6268, 2014). 본 발명에 따른 이작용성 분자와의 이러한 조합은 특히 다음에 대해 유용할 수 있다:
1- 적응 면역 억제를 역전(T-세포 체크포인트 경로 차단);
2- 적응 면역 스위칭(작용제 분자, 특히 항체를 사용하여 T-세포 공동자극 수용체 신호전달 촉진),
3- 선천성 면역 세포의 기능 향상;
4- 예를 들어 백신-기반 전략을 통해 면역 체계 활성화(면역-세포 이펙터 기능 강화).
따라서, 본원에서는 또한 본원에 기재된 바와 같은 임의의 이작용성 분자 또는 이를 포함하는 약제학적 조성물 및 적합한 제2 작용제와 조합한, 본원에 기재된 바와 같은 PD-1 신호전달 및/또는 SIRPa 신호전달과 관련된 임의의 질환에 대한 조합 요법이 본원에 제공된다. 일 양태에서, 이작용성 분자 및 제2 작용제는 상기 기재된 바와 같은 약제학적 조성물에 존재할 수 있다. 대안적으로, 본원에 사용된 용어 "조합 요법" 또는 "조합된 요법"은 이들 2가지 작용제(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 이작용성 분자 및 추가 또는 제2 적합한 치료제)의 순차적인 투여를 포함하며, 즉 여기서, 각각의 치료제는 상이한 시간에 투여될뿐만 아니라 이들 치료제 또는 적어도 2개의 작용제를 실질적으로 동시에 투여한다. 각 작용제의 순차적 또는 실질적으로 동시 투여는 적당한 경로에 의해 영향을 받을 수 있다. 작용제는 동일한 경로 또는 다른 경로로 투여될 수 있다. 예를 들어, 제1 작용제(예를 들어, 이작용성 분자)는 경구로 투여될 수 있고, 추가 치료제(예를 들어, 항암제, 항감염제; 또는 면역조절제)가 정맥 내로 투여될 수 있다. 대안적으로, 선택된 조합의 작용제는 정맥 내 주사로 투여될 수 있는 반면, 조합의 다른 작용제는 경구로 투여될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 활성 성분으로서: 상기 정의된 이작용성 분자 및 추가 치료제를 포함하는 치료 수단, 특히 조합 생성물 수단에 관한 것이며, 여기서, 상기 활성 성분은 별개의, 순차적 또는 조합된 요법을 위해, 특히 조합된 또는 순차적 사용을 위해 제형화된다.
본원에 사용된 용어 "순차적"은 달리 명시되지 않는 한, 규칙적인 서열 또는 순서를 특징으로 하는 것을 의미하며, 예를 들어, 투여 요법이 이작용성 분자 및 제2 작용제의 투여를 포함하는 경우, 순차적 투여 요법은 제2 작용제의 투여 전, 동시에, 실질적으로 동시에 또는 후에, 본 발명의 이작용성 분자의 투여를 포함할 수 있지만, 두 작용제는 규칙적인 서열 또는 순서로 투여될 것이다. 용어 "분리된"은 달리 명시되지 않는 한 서로를 분리하는 것을 의미한다. 용어 "동시에"는 달리 명시되지 않는 한, 동시에 발생하거나 수행되는 것을 의미하며, 즉, 본 발명의 작용제가 동시에 투여된다. 용어 "실질적으로 동시에"는 작용제가 서로 몇 분 이내에 (예를 들어, 서로 15분 이내에) 투여되고 연속 투여뿐만 아니라 공동 투여를 포함하려는 의도를 의미하지만, 투여가 연속적이면, 시간이 단기간(예를 들어, 의사가 두 가지 화합물을 별도로 투여하는 데 걸리는 시간)에만 서로 떨어져 있다.
본원에 기재된 임의의 조합은 본원에 기재된 장애 또는 질환을 치료하기 위한 임의의 순서로 사용될 수 있음을 이해해야 한다. 본원에 기재된 조합은 표적 질환 진행을 억제하거나 예방하는 효과, 조합의 또 다른 작용제의 부작용을 완화하는 효과, 또는 표적 질환과 관련된 증상 완화의 효과를 포함하지만 이들로 한정되지 않는 다수의 요인에 기초하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 조합 요법은 조합의 각 개별 구성원과 관련된 임의의 부작용을 감소시킬 수 있다.
본 발명은 또한 대상체에게 본원에 기재된 치료적 유효량의 이작용성 분자 또는 약제학적 조성물 및 치료적 유효량의 추가의 또는 제2 치료제를 투여하는 단계를 포함하는, 대상체의 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.
본원에 기재된 이작용성 분자 또는 약제학적 조성물이 추가 치료제와 함께 사용될 때, 이작용성 분자, 약제학적 조성물 또는 제2 작용제의 치료적 투여량 이하 또는 둘 모두의 치료적 투여량 이하는 대상체, 바람직하게는 PD-1 및/또는 SIRPa에 의해 매개되는 세포 신호전달과 관련된 질환 또는 장애를 갖거나 발병할 위험이 있는 대상체의 치료에 사용될 수 있다.
추가 또는 제2 치료제의 구체적인 예는 WO 2018/053106, 페이지 36~43에 제공된다.
일 양태에서, 추가 또는 제2 치료제는 알킬화제, 혈관신생 억제제, 항체, 항 대사물질, 항 유사분열제, 항 증식제, 항 바이러스제, 오로라 키나제 억제제, 아폽토시스 촉진제(예를 들어, Bcl-2 계열 억제제), 사멸 수용체 경로 활성화제, Bcr-Abl 키나제 억제제, BiTE(Bi-특이적 T 세포 인게이저(Engager)) 항체, 항체 약물 접합체, 생물학적 반응 조절제, 브루톤 티로신 키나제(BTK) 억제제, 사이클린-의존성 키나제 억제제, 세포주기 억제제, 사이클로옥시게나제-2 억제제, DVD, 백혈병 바이러스 종양유전자 동족체(ErbB2) 수용체 억제제, 성장 인자 억제제, 열 쇼크 단백질(HSP)-90 억제제, 히스톤 데아세틸라제(HDAC) 억제제, 호르몬 요법, 면역학적 물질, 아폽토시스 단백질 억제제의 억제제(IAP), 인터칼레이팅 항생제, 키나제 억제제, 키네신 억제제, Jak2 억제제, 라파마이신 억제제의 포유류 표적, 마이크로RNA, 미토겐-활성화 세포 외 신호-조절 키나제 억제제, 다가 결합 단백질, 비-스테로이드성 항염증제(NSAID), 폴리ADP(아데노신 디포스페이트)-리보스 중합효소(PARP) 억제제, 백금 화학요법제, 폴로-유사 키나제(Plk) 억제제, 포스포이노시티드-3 키나제(PI3K) 억제제, 프로테아좀 억제제, 퓨린 유사체, 피리미딘 유사체, 수용체 티로신 키나제 억제제, 레티노이드/델토이드 식물 알칼로이드, 작은 억제 리보핵산(siRNA), 토포이소머라제 억제제, 유비퀴틴 리가제 억제제, 저메틸화제, 체크포인트 억제제, 펩타이드 백신 등, 종양 항원으로부터의 에피토프 또는 네오에피토프, 뿐만 아니라 이들 작용제 중 하나 이상의 조합을 포함하는 비전면 목록(non-exhaustive list)에서 선택될 수 있다. 예를 들어, 추가 치료제는 화학요법, 방사선 요법, 표적 요법, 항 혈관신생제, 저메틸화제, 암 백신, 종양 항원으로부터의 에피토프 또는 네오에피토프, 골수성 체크포인트 억제제, 기타 면역요법 및 HDAC 억제제로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 제2 치료제는 화학요법제, 방사선요법제, 면역치료제, 세포 요법제(예컨대, CAR-T 세포), 항생제 및 프로바이오틱스로 이루어진 군으로부터 선택된다. 상기 면역치료제는 또한 특히 항-Her2, 항-EGFR, 항-CD20, 항-CD19, 항-CD52로 이루어진 군으로부터 선택된 종양 항원을 표적화하는 항체일 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명은 상기 정의된 조합 요법에 관한 것으로, 여기서, 제2 치료제는 특히 치료 백신, 면역 체크포인트 차단제 또는 활성화제, 특히 적응 면역 세포(T 및 B 림프구) 및 항체-약물 접합체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 임의의 항-hPD-1 항체 또는 이의 단편과 함께, 또는 본 발명에 따른 약제학적 조성물과 함께 사용하기에 적합한 제제는 공동-자극 수용체(예를 들어, OX40, CD40, ICOS, CD27, HVEM 또는 GITR)에 결합하는 항체, 면역원성 세포사멸을 유도하는 제제(예를 들어, 화학요법제, 방사선 치료제, 항-혈관형성제 또는 표적 치료용 작용제), 체크포인트 분자(예를 들어, CTLA4, LAG3, TIM3, B7H3, B7H4, BTLA 또는 TIGIT)를 억제하는 제제, 암 백신, 면역억제 효소(예를 들어, IDO1 또는 iNOS)를 변형시키는 제제, Treg 세포를 표적화하는 제제, 입양 세포 치료용 제제, 또는 골수 세포를 조절하는 제제를 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은 제2 치료제가 항-CTLA4, 항-CD2, 항-CD28, 항-CD40, 항-HVEM, 항-BTLA, 항-CD160, 항-TIGIT, 항-TIM-1/3, 항-LAG-3, 항-2B4 및 항-OX40, 항-CD40 작용제, CD40-L, TLR 작용제, 항-ICOS, ICOS-L 및 B-세포 수용체 작용제로 이루어진 군으로부터 선택된 적응 면역 세포(T 및 B 림프구)의 면역 체크포인트 차단제 또는 활성화제인, 상기 정의된 조합 요법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 제2 치료제는 특히 항-Her2, 항-EGFR, 항-CD20, 항-CD19, 항-CD52로 이루어진 군으로부터 선택된 종양 항원을 표적화하는 항체이다.
조합 요법은 또한 수술, 화학요법(예를 들어, 예컨대 도세탁셀 또는 데카르바진), 방사선 요법, 면역요법(예를 들어, 예컨대 CD40, CTLA-4를 표적화하는 항체), 유전자 표적화 및 조절, 및/또는 면역-조절제, 혈관신생 억제제 및 이들의 임의의 조합과 같은 다른 제제와 조합한, 이작용성 분자의 투여의 조합에 의존할 수 있다.
키트
본원에 기재된 임의의 이작용성 분자 또는 조성물은 본 발명에 의해 제공되는 키트에 포함될 수 있다. 본 개시내용은 특히 PD-1 신호전달, SIRPa/CD47 신호전달과 관련된 면역 반응을 향상시키고/거나 질환(예를 들어, 암 및/또는 감염)을 치료하는데 사용하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "키트"는 용기, 수용체 또는 다른 방법으로 포장된 2개 이상의 성분들(이중 하나는 본 발명의 이작용성 분자, 핵산 분자, 벡터 또는 세포에 해당)을 의미한다. 따라서, 키트는 단일 단위로 판매될 수 있는, 특정 목표를 달성하기에 충분한 제품 및/또는 도구 세트로 설명될 수 있다.
특히, 본 발명에 따른 키트는 하기를 포함할 수 있다:
- 상기 정의된 이작용성 분자,
- SIRPa 또는 이의 변이체에 연결된 항-hPD1 항체 또는 이의 항원-결합 단편,
- 상기 이작용성 분자를 암호화하는 핵산 분자 또는 핵산 분자의 그룹,
- 상기 핵산 분자 또는 핵산 분자의 그룹을 포함하는 벡터, 및/또는
- 상기 벡터 또는 핵산 분자 또는 핵산 분자 그룹을 포함하는 세포.
따라서, 키트는 적합한 용기 수단에, 본 발명의 약제학적 조성물 및/또는 이작용성 분자 및/또는 숙주 세포, 및/또는 본 발명의 핵산 분자를 암호화하는 벡터, 및/또는 본 발명의 핵산 분자 또는 관련 시약을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 개체로부터 샘플을 채취하고/하거나 샘플을 분석하는 수단이 제공될 수 있다. 특정 구현예에서, 키트는 세포, 완충액, 세포 배지, 벡터, 프라이머, 제한 효소, 염 등을 포함한다. 키트는 또한 멸균된, 약제학적으로 허용되는 완충액 및/또는 기타 희석제를 함유하기 위한 수단을 포함할 수 있다.
용기는 단위 용량, 벌크 패키지(예를 들어, 다중-용량 패키지) 또는 하위-단위 용량일 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명은 단일-용량 투여 단위에 대해 상기 정의된 바와 같은 키트에 관한 것이다. 본 발명의 키트는 또한 건조/동결건조된 이작용성 분자를 포함하는 제1 수용체 및 수성 제형을 포함하는 제2 수용체를 함유할 수 있다. 본 발명의 특정 구현예에서, 단일-챔버 및 다중-챔버 사전-충전 주사기(예를 들어, 액체 주사기 및 라이오시린지)를 포함하는 키트가 제공된다.
본 발명의 키트는 적합하게 포장되어 있다. 적합한 포장은 바이알, 병, 단지, 가요성 포장(예를 들어, 밀봉된 마일라 또는 플라스틱 백) 등을 포함하지만 이들로 한정되지 않는다. 흡입기, 비강 투여 장치(예를 들어, 네뷸라이저) 또는 미니 펌프와 같은 주입 장치와 같은 특정 장치와 조합하여 사용하기 위한 패키지도 고려된다. 키트에는 멸균 액세스 포트가 있을 수 있다(예를 들어, 용기는 정맥 내 용액 백 또는 피하 주사 바늘로 관통할 수 있는 마개가 있는 바이알일 수 있다). 용기는 또한 멸균 접근 포트를 가질 수 있다(예를 들어, 용기는 정맥 내 용액 백 또는 피하 주사 바늘로 관통할 수 있는 마개가 있는 바이알일 수 있다). 조성물 중 적어도 하나의 활성제는 SIRPa 또는 이의 변이체에 연결된 항-hPD1 항체를 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 이작용성 분자이다.
본 발명에 따른 키트에 포함된 조성물은 또한 주사기 호환 조성물로 제형화될 수 있다. 이 경우, 용기 수단은 그 자체가 주사기, 피펫 및/또는 기타 유사한 기구일 수 있으며, 이로부터 제형은 신체의 감염된 부위에 적용될 수 있고/있거나 심지어 키트의 다른 구성요소에 적용하고/하거나 혼합될 수 있다. 키트의 구성요소는 대안적으로 건조된 분말(들)로 제공될 수 있다. 시약 및/또는 성분이 건조 분말로 제공되는 경우, 적합한 용매를 첨가하여 가용성 조성물이 재구성될 수 있다. 용매는 또한 다른 용기 수단에 제공될 수 있고 투여에 적합할 수 있다고 생각된다.
일부 구현예에서, 키트는 암 또는 감염성 질환을 치료하기 위한 추가 작용제를 추가로 포함하고, 추가 제제는 본 발명의 키트의 이작용성 분자 또는 다른 구성요소와 조합될 수 있거나, 키트에 별도로 제공될 수 있다. 특히, 본원에 기재된 키트는 상기 기재된 "조합 요법"에 기재된 것과 같은 하나 이상의 추가 치료제를 포함할 수 있다. 키트(들)는 개체를 위한 특정 암에 맞춰질 수 있고, 상기에 기재된 바와 같이 개체를 위한 각각의 2차 암 요법을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 이작용성 분자 또는 약제학적 조성물의 사용과 관련된 지침은 일반적으로 투여량, 투여 일정, 의도된 치료를 위한 투여 경로, 이작용성 분자를 재구성하기 위한 수단 및/또는 본 발명의 이작용성 분자를 희석하기 위한 수단에 관한 정보를 포함한다. 본 발명의 키트에 제공된 지침은 전형적으로 라벨 또는 패키지 삽입물(예를 들어, 전단지 또는 지침 매뉴얼의 형태로 키트에 포함된 종이 시트)에 작성된 서면 지침이다. 일부 구현예에서, 키트는 본원에 기재된 임의의 방법에 따른 사용 지침서를 포함할 수 있다. 포함된 지침서는 면역 반응을 향상시키고/시키거나 본원에 기재된 바와 같은 질환을 치료하기 위한 이작용성 분자를 포함하는 약제학적 조성물의 투여에 대한 설명을 포함할 수 있다. 키트는 개체가 PD-1 신호전달과 관련된 질환, 예를 들어 본원에 기재된 질환을 가지고 있는지 여부를 확인하는 것에 기초하여 치료에 적합한 개체를 선택하는 것에 대한 설명을 추가로 포함할 수 있다.
실시예
하기 도면들 및 실시예는 당업자에게 본 발명을 제조하고 사용하는 방법에 대한 완전한 개시 및 설명을 제공하기 위해 제시된 것이며, 본 발명자들이 자신의 발명으로 간주하는 범위를 제한하려는 의도는 아니며, 본 발명은 아래의 실험이 모든 또는 수행된 유일한 실험임을 나타내기 위한 것도 아니다. 본 발명이 특정 구현예를 참조하여 설명되었지만, 본 발명의 진정한 사상 및 범주를 벗어나지 않으면서 다양한 변경이 이루어질 수 있고 균등물이 대체될 수 있음을 당업자는 이해해야 한다. 또한, 본 발명의 목적, 정신 및 범주에 특정 상황, 재료, 물질의 구성, 공정, 공정 단계 또는 단계들을 적용하기 위해 많은 변형이 이루어질 수 있다. 그러한 모든 변형은 본원에 첨부된 청구범위의 범주 내에 있는 것으로 의도된다.
이작용성 분자(Bicki)
항-PD-1 항체 및 인간 SIRPa를 포함하는 이작용성 분자로서, 단백질은 항-PD-1 항체의 폴리펩타이드쇄에 공유적으로 연결되며, 상기 항체의 경쇄(항-PD1VL-SIRPa 항체) 또는 중쇄(항-PD1VH-SIRPa 항체).
실시예 1: PD1에 대한 결합 및 PD1-PDL1 상호작용에 대한 그의 길항제 능력에 대한 이작용성 분자 항-PD1-SIRPa의 효과
PD1 재조합 분자에 대한 Bicki 분자의 결합 능력을 평가하고, PD1-PDL1 상호작용에 대한 Bicki 분자의 억제 효능을 ELISA에 의해 수행하였다. 결과는 도 1 및 2에 제시되어 있다. SIRPa가 항체의 중쇄 또는 경쇄에 융합된 Bicki 항-PD1-Sirpa 분자는 PD1에 대한 결합을 변형시키지 않는다. Bicki 항-PD1-Sirpa 분자는 항-PD1 항체 단독에 비해 PD1-PDL1 상호작용을 여전히 억제할 수 있다. 항체의 중쇄 또는 경쇄에 융합된 Bicki 분자 간에는 유의한 차이가 관찰되지 않았다.
이러한 데이터는 표면 플라즈몬 공명 실험(Biacore assay)에 의해 확인되었으며, 센서 칩에 항-인간 Fc 항체를 포획하여 항 PD-1 단독 또는 이작용성 분자를 포획하였다. 그런 다음, 다른 농도의 PD-1 재조합 단백질(6.25 내지 100 nM)을 첨가하여 친화도를 측정하였다. 항 PD-1 단독은 항-PD1-Sirpa 이작용성 분자(3.83 nM)와 비교하여 3.46 nM의 KD로 PD-1과 유사한 높은 친화도를 나타낸다.
실시예 2: Bicki 항-PD1-Sirpa 분자의 CD47에 대한 결합
Bicki 항-PD1-Sirpa 분자의 CD47(SIRPa 리간드)에 대한 결합 능력을 ELISA에 의해 평가하였다. 도 3에 제시된 결과는 Bicki 항-PD1-Sirpa 분자가 SIRPa 리간드, 즉 CD47에 결합하는 능력을 보존했음을 보여준다. 놀랍게도, Bicki 항-PD1VL-Sirpa 분자에 비해 Bicki 항-PD1VH-Sirpa 분자에 대해 더 높은 효능이 관찰되었다.
실시예 3: 수용체 CD47 및 PD1 둘 다를 발현하는 T 세포상의 분자 BiCKI SIRPa의 결합. 동일한 세포에서 CD47 및 PD-1 단백질 모두를 결합함으로써 T 세포를 표적화하는 BiCKI SIRPa의 능력을 평가하였다. CD47 수용체만 발현하거나 PD-1 및 CD47 단백질을 공동 발현하는 Jurkat 세포를 BiCKI SIRPa 분자 또는 SIRPa-Fc 분자와 함께 인큐베이션하였다. 결합은 항-인간 IgG Fc-PE로 밝혀졌다. 도 4는 분자가 CD47만을 발현하는 세포에 비해 CD47+PD-1+를 발현하는 세포에 대해 2배 더 높은 효능으로 결합하기 때문에 동일한 T 세포에 작용하는 BiCKI SIRPa의 메커니즘을 확인한다. 이러한 실험은 이작용성 Bicki SIRPa 분자가 다른 CD47+ 세포보다 CD47+ PD-1+ 고갈된 T 세포를 우선적으로 표적화하도록 설계되었음을 입증한다.
실시예 4: PBMC 및 T 세포 증식 및 활성화에 대한 Bicki 항-PD1-Sirpa 분자의 시험관 내 및 생체 외 효능
Bicki 항-PD1-Sirpa 분자를 항 PD-1 단독과 비교하기 위해 T 세포 활성화를 측정하기 위한 시험관 내 생물검정을 수행했다. 우선, 생물검정에 사용된 T 세포주에서 PD1과 CD47의 발현을 FACS로 측정하였다. 도 5a는 세포 표면에서 PD1 및 CD47 분자 모두의 우수한 발현을 보여준다. 예기치 않게, 도 5b에서 발명자들은 Bicki 항-PD1-Sirpa 분자(EC50 = 0.6 nM)가 항-PD1 항체 단독(EC50 = 5 nM)보다 더 나은 NFAT TCR-매개 활성화를 유도한다는 것을 관찰했다(도 5b). 놀라운 방식으로, 본 발명자들은 또한 Bicki SIRPa가 항 PD-1 + 이소형 SIRPa 조합에 비해 NFAT 신호전달을 활성화하는 데 더 효율적임을 관찰했으며, 이는 Bicki 분자에서 항 PD-1과 SIRPa의 융합이 T 세포를 활성화하는 시너지 효과를 달성함을 입증한다. 이 효과는 CD47 차단 항체(클론 B6H12)의 사용이 BiCKI SIRPa의 시너지 효과를 완전히 폐지함에 따라 CD47 매개 신호전달의 활성화를 필요로 한다(도 5b). PD-1 수용체를 표적화함으로써, Bicki 분자의 항 PD-1 도메인은 SIRPa의 가교를 허용하고, 이어서 T 세포에서 CD47 분자의 클러스터화를 허용한다. CD47 매개 신호전달은 항 PD-1 효과를 강화하여, 더 나은 T 세포 활성화로 이어진다. 도 5d에 도시된 바와 같이, IgG1 N298A 또는 IgG4 S228P 이소형으로 구성된 Bicki SIRPa 분자에서도 유사한 상승 효과가 관찰되었다.
본 발명자들은 다른 항 PD-1 백본(펨브롤리주맙 또는 니볼루맙)을 사용하여 Bicki SIRPa 분자를 작제하였다. 도 5e는 이러한 Bicki 분자가 항 PD-1 단독과 비교하여 유사한 상승 효과를 가지고 있음을 보여주며, 이는 본 발명이 다른 항 PD-1 백본에 적합할 수 있음을 시사한다. 또한 다른 유형 1 단백질에 중쇄에 융합된 Bicki 항-PD1을 사용하여 생물검정을 수행하였다. 도 5의 F 부분은 NFAT 활성화에 대한 대조군 항-PD1과 Bicki 항-PD1VH-유형 I 단백질 사이에 차이가 거의 없음을 나타내며, 관찰된 향상된 효과는 Bicki SIRPa 분자에 대해 특이적이며, 어떤 Bicki 분자에도 적용할 수 없음을 나타낸다.
또 다른 생물학적 분석에서, 본 발명자들은 T 세포 이펙터 기능의 활성화를 위한 또 다른 필수 매개체인 T 세포에서 칼슘 신호를 자극하는 Bicki SIRPa 분자의 효능을 평가했다. 도 6a 및 b는 Bicki SIRPa 분자가 aCD3 자극에 의해 유도된 칼슘 신호를 CD28 자극까지 유사한 정도로 강화한다는 것을 보여준다. 흥미롭게도, Bicki SIRPa 분자만으로는 효과가 없으며(도 6a), Bicki SIRPa 분자가 공동-자극 신호로 작용하고 TCR 참여 T 세포의 활성화만 촉진할 것임을 시사한다.
전체적으로, 이러한 결과는 항-PD1 항체에 융합된 Sirpa를 갖는 이작용성 분자가 항-PD1 효과를 강화하고 CD47에 대한 SIRPa 결합이 "나를 먹지 마시오(don't EAT-ME)" 억제 식세포작용 신호를 차단할뿐만 아니라 CD47-의존성 T-세포 공동자극을 촉진한다는 것을 강하게 시사한다. 증식 및 활성화에 대한 Bicki 항-PD1-Sirpa 분자의 효능을 연구하기 위해 인간 PBMC 및 T 세포에서 생체 외 분석을 수행했다. 결과가 도 7 및 8에 제시되어 있다. 이러한 결과는 Bicki 항-PD1-Sirpa 분자가 IFNg 분비에 의해 반영된 바와 같이 인간 PBMC의 증식 및 활성화를 증가시켰지만, 항-PD1 단독 또는 분리된 재조합 인간 SIRPa 단백질을 가진 항-PD1의 조합을 사용하는 경우는 아니었다는 것을 명확하고 놀랍게도 나타내며, 항-PD1 상의 SIRPa를 Bicki 분자로 융합하여 T 세포 증식 및 활성화를 증가시키는 시너지 효과를 확인했다. 인간 T 세포에 대한 결과는 Bicki 항-PD1-Sirpa 분자가 항-PD1 단독보다 T 세포 증식을 향상시키고 T 세포를 더 잘 활성화시킨다는 것을 확인했다. 특히, Bicki 항-PD1-Sirpa 분자에 의해 유도된 IFNg 분비(다양한 임상 시험에서 항-PD1 효능을 예측하기 위해 관찰되는 주요 결정 인자)의 양은 항-PD1 단독(<500 pg/ml)에 비해 매우 높다(> 10,000 pg/ml)이다.
도 9는 만성 항원 자극 후 고갈된 인간 T 세포의 증식을 자극하는 강력한 시너지 효과를 확인한다. 실제로, SIRPa 재조합 단백질 또는 항 PD-1 단독은 이소형 대조군과 비교하여 T-세포 증식을 유도하지 않는 반면, 놀랍게도 Bicki 항-PD1-Sirpa 분자는 고갈된 T 세포의 증식을 강력하게 자극한다. 이 차이는 2개의 개별 분자를 사용하는 조합 요법에 비해 이작용성 항체의 이점을 강조한다. 본 발명의 Bicki 항-PD1-Sirpa 분자는 PD1+ 세포 클러스터링 SIRPa 분자에 분자를 도킹함으로써 T 세포로의 CD47 신호전달 및 T 세포의 증식을 자극한다.
실시예 5: Bicki 항-PD1-Sirpa 분자가 T 세포의 종양으로의 이동을 강화한다
3D 종양 스페로이드-기반 분석을 사용하여 T 세포의 이동을 조사하였다. A549 종양 세포를 섬유아세포 및 단핵구와 함께 공배양하여 고형 종양 미세환경의 복잡성을 모방하여 종양 스페로이드를 생성하였다. 인간 T 세포를 웰에 첨가하고 종양 스페로이드로의 T 세포 이동을 면역형광 및 공초점 현미경 분석에 의해 평가하였다. 도 10은 BiCKI SIRPa 분자를 사용한 처리가 이소형 대조군 처리에 비해 종양으로의 T 세포/종양 세포의 수를 향상시킨다는 것을 보여준다. 종양 미세환경에 T 세포가 부족한 것은 항 PD-1 단일요법과 관련된 주요 내성 메커니즘 중 하나이다. 이러한 데이터는 BiCKi SIRPa 분자가 T 세포의 종양 미세환경으로의 이동을 강화함으로써 이러한 내성을 극복할 수 있음을 시사한다.
실시예 6: 생체 내 Bicki 항-PD1 SIRPa 분자의 약동학 특성
Bicki 분자의 약동학을 분석하기 위해 BalbcRJ(여성 6~9주)를 단일 용량의 BiCKi SIRPa 분자로 안와 내 치료했다. 혈장 내 Bicki 분자 농도는 고정화된 항-인간 경쇄 항체(클론 NaM76-5F3)를 사용하여 ELISA로 평가하고, 항-PD-1 항체를 함유하는 희석된 혈청을 첨가하였다. 퍼옥시다제-표지된 당나귀 항-인간 IgG(Jackson Immunoresearch; USA; 참고 709-035-149)를 사용하여 검출을 수행했으며, 기존 방법으로 밝혀졌다.
이 분석에서는 두개의 서로 다른 Bicki SIRPa 분자를 테스트하고, (1) IgG1 N298A 이소형을 갖는 BiCKI SIRPa 분자와 Fc와 SIRPa 도메인 사이의 GGGGS 링커, 및 (2) IgG4 S228P 및 GGGGSGGGGSGGGGS 링커를 사용하는 BiCKI SIRPa 분자를 비교했다. 두 분자에 대한 선형 약동학적 프로파일은 유사한 흡수 단계에서 관찰된다(도 11). 주입 후 15분에 두 작제물 모두에 대해 약 200 nM의 Cmax가 얻어졌다. 그러나, 놀랍게도 GGGS 및 IgG1 이소형을 갖는 biCKI SIRPa 분자는 IgG4 백본 및 긴 링커로 작제된 BiCKI SIRPa 분자에 비해 더 낮은 제거/분포 단계를 나타냈다. 이러한 데이터는 Bicki SIRPa 작제를 위한 짧은 링커와 함께 IgG1 N298A를 사용하면 생체 내 약물 노출을 연장하고 이후 약물의 치료 효능을 향상시킬 수 있음을 시사한다.
재료 및 방법
ELISA 결합 PD1 및 브리징 ELISA 분석
PD-1 결합 ELISA 분석을 위해, 재조합 hPD1(Sino Biologicals, Beijing, China; 참조 10377-H08H)을 탄산염 완충액(pH 9.2)에서 0.5 μg/ml로 플라스틱에 고정시키고, 정제된 항체를 첨가하여 결합을 측정했다. 인큐베이션 및 세척 후, 퍼옥시다제-표지 당나귀 항-인간 IgG(Jackson Immunoresearch; USA; 참고 709-035-149)를 첨가하고 통상적인 방법으로 밝혀냈다.
브릿징 ELISA 분석을 위해 유사한 방법을 사용하였다. 재조합 hPD1을 고정하고 정제된 이작용성 항체를 연속 희석으로 첨가하였다. 인큐베이션 및 세척 후, CD47fc 재조합 단백질(Sino Biologicals, 참조 12283-H02H)을 1 μg/mL로 첨가하였다. 항-CD47 특이적 마우스 항체(클론 B6H12) 및 퍼옥시다제-표지 당나귀 항 마우스 IgG 항체(참조 715-036-151)를 사용하여 검출을 수행했다. 종래 방법으로 밝혀냈다.
ELISA 길항제: PDL1과 인간화 항-PD1 간의 경쟁
PD-1:PD-L1 억제제 스크리닝 ELISA 분석 쌍(AcroBiosystems; USA; 참조 EP-101)에 의해 경쟁 ELISA 분석을 수행하였다. 이 분석에서, 재조합 hPDL1을 PBS pH 7.4 완충액에서 2 μg/ml로 플라스틱에 고정하였다. 정제된 항체(다른 농도)를 비오티닐화된 인간 PD1(AcroBiosystems; USA; 참조 EP-101)의 0.66 μg/ml 최종(고정 농도)과 혼합하여 37℃에서 2시간 동안 경쟁 결합을 측정했다. 인큐베이션 및 세척 후, 퍼옥시다제-표지된 스트렙타비딘(Vector laboratoring; USA; 참조 SA-5004)을 첨가하여 비오틴-CD47Fc 결합을 검출하고, 기존 방법으로 밝혀냈다.
IFN 감마 분비 및 T 세포 증식 분석
실험에는 말초 혈액 단핵 세포 또는 건강한 공여자로부터 단리된 정제된 T 세포를 사용하였다.
나이브 PBMC를 사용한 실험을 위해, 항 CD3 +/- CD28(클론 OKT3 및 CD28.2, 3 ug/mL) 코팅된 플레이트에서 이소형 대조군(B12G4M), 항 PD-1, 항 PD-1+ rSIRPa(Sino Biologicals, 참조 11612-H08H), BiCKI 항 PD-1 VH SIRPa 또는 BiCKI 항 PD-1 VH SIRPa와 함께 PBMC를 인큐베이션하였다. 2일에 수확된 상청액에서 ELISA에 의해 IFNg를 투여하였다(인간 IFNg ELISA 세트, 미국 BD Bioscience, 참조 555142). 6일에 H3 티미딘 혼입에 의해 증식을 평가하였다. T 세포를 항-CD3(클론 OKT3, 항-CD28 유무에 관계없이 3 ug/mL(클론 CD28.2, 3 ug/mL))로 자극하였다.
활성화된 T 세포를 사용한 실험을 위해, 먼저 항-CD3/CD28 코팅된 플레이트(각각 3 ug/mL)에서 T 세포를 자극했다. 자극 24시간 후, T 세포를 수확하고 계수하고 항-CD3(클론 OKT3, 2 ug/mL) + 재조합 인간 PD-L1(Sinobiological, 참조 10084-H02H, 5 ug/mL)에서 이소형 대조군, 항-PD-1 또는 BiCKI VH SIRPa 및 BiCKI VL SIRPa(10 ug/mL)의 존재 하에 재자극하였다. 6일에, H3 티미딘 혼입에 의해 증식을 정량화하고, 상청액을 수확하여 IFNg 분비를 정량화하였다.
만성적으로 자극된 PBMC를 사용한 실험을 위해, 3일마다 CD3 CD28 코팅된 플레이트(3 ug/mL의 OKT3 및 3 ug/mL CD28.2 항체)에서 인간 PBMC를 반복적으로 자극하였다. 3차 자극 후, T 세포를 이소형 대조군 또는 항 PD-1, 재조합 SIRPa 단백질 또는 BiCKI 항 PD-1 VH SIRPa(5 ug/mL)와 함께 인큐베이션하였다. T 세포 증식을 결정하기 위해 5일에 H3 혼입 분석을 수행하였다.
Promega 세포-기반 생물검정을 사용한 T 세포 활성화 분석
Promega PD-1/PD-L1 키트(참조 J1250)를 사용하여 항-PD-1 항체 복원 T 세포 활성화의 능력을 테스트하였다. (1) 이펙터 T 세포(PD-1, NFAT-유도 루시퍼라제를 안정적으로 발현하는 Jurkat) 및 (2) 활성화 표적 세포(PDL1을 안정적으로 발현하는 CHO K1 세포 및 항원-독립적 방식으로 동족 TCR을 자극하도록 설계된 표면 단백질)를 사용하였다. 세포가 공동배양되면 PD-L1/PD-1 상호작용이 TCR 매개 활성화를 억제하여, NFAT 활성화 및 루시퍼라제 활성을 차단한다. 항 PD-1 항체를 추가하면 PD-1 매개 억제 신호를 차단하여 NFAT 활성화 및 루시퍼라제 합성 및 생물발광 신호의 방출을 유도한다. 제조업체의 권장 사항에 따라 실험을 수행하였다. PD-1 항체의 연속 희석을 테스트했다. PD-L1+ 표적 세포, PD-1 이펙터 세포 및 항 PD-1 항체의 공동 배양 후 4시간 후, BioGloTM 루시페린 기질을 웰에 첨가하고 TecanTM 발광계를 사용하여 플레이트를 판독했다.
칼슘 플럭스 분석
CD47+ PD1+ Jurkat 세포를 HBSS 배지에서 37℃에서 30분 동안 Fura-red(Thermofisher, #F3021, 5 uM)로 염색한 다음, HEPES(10 mM), BSA 1% 및 CaCl2(1 mM)가 보충된 HBSS 배지로 2회 세척하고, 동일한 배지로 재현탁하였다. 형광 배경을 설정하기 위해 LSR FAC에서 1분 동안 획득한 후 Bicki 항-PD1-SIRPa 항체 단독(45 nM 10 ug/mL) 또는 CD3 항체와 혼합(클론 OKT3, 10X 10ug/mL)을 세포에 첨가하였다. BV711/PercP5.5 MFI 비율을 획득 초당 계산하였고, 자극 전 MFI에 해당하는 1로 정규화하였다(평균 20초). 그래프 패드 소프트웨어를 사용하여 각 자극에 대해 AUC(곡선 아래 영역)를 계산하고 보고했다.
생체 내 biCKI Sirpa의 약동학
약동학을 분석하기 위해 BalbcRJ(여성 6~9주)를 단일 용량의 분자로 안와 내로 투여했다. 고정된 항-인간 경쇄 항체(클론 NaM76-5F3)를 사용하여 ELISA에 의해 혈장 내 약물 농도를 결정하였다. 퍼옥시다제-표지 당나귀 항-인간 IgG(Jackson Immunoresearch; USA; 참고 문헌 709-035-149)를 사용하여 검출을 수행했으며, 기존 방법으로 밝혀냈다.
3D-스페로이드 이동 분석
3D 세포 배양은 96-웰 U-바닥 저 부착 플레이트(6055330 Perkin Elmer)에서 확립되었고, 각각 A549, MRC-5 및 신선한 단핵구에 대해 5000, 1500 및 10,000 세포/웰을 접종했다. 스페로이드가 형성되고, 완전한 RPMI에서 GM-CSF(10 ng/ml)와 함께 인큐베이션하였다. 세포는 3일 동안 이소형(IgG4) 또는 BICKI-Sirpα(50 nM)로 처리하였다. 3일째에, 250,000 T 세포/웰을 스페로이드에 추가하였다. 72시간 공동-배양 후, 스페로이드를 실온에서 PFA 4%에서 15분 고정하고, PBS에서 3회 세척하고, 염색할 때까지 PBS-FBS-EDTA 완충액에서 4℃에서 보관했다. 그런 다음, 스페로이드를 PBS-0.5% 트리톤에서 투과시키고, 실온에서 PBS-0.1% 트리톤-1% BSA에서 1시간의 포화 단계 후, 스페로이드를 1차 토끼 항-인간 CD3(A045229-2; 6 μg/ml, 4℃에서 염색)과 함께 인큐베이션한 다음, 실온에서 2시간 2차 당나귀 항-토끼 A488 항체(10 μg/ml) 및 DAPI(10 μg/ml)와 함께 인큐베이션하였다. 형광 검출에는 A1RSi 공초점 현미경(Nikon)이 사용되었으며, morpholibJ, LoG 및 3D-suite 플러그인을 사용하여 FIJI 소프트웨어를 통해 공초점 z-슬라이스 이미지를 분석했다.
항체 및 이작용성 분자
하기 항체들 및 이작용성 분자들은 본 명세서에 개시된 상이한 실험에서 사용되었다: 펨브롤리주맙(Keytrudra, Merck) 니볼루맙(Opdivo, Bristol-Myers Squibb) 및 서열번호 19, 22 또는 24에 정의된 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 28에 정의된 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항-PD1 인간화 항체, 또는 서열번호 53에 정의된 중쇄 및 서열번호 54에 정의된 경쇄를 포함하는 항-PD1 키메라 항체를 포함하는 본 명세서에 개시된 바와 같은 이작용성 분자.
SEQUENCE LISTING <110> OSE IMMUNOTHERAPEUTICS <120> BIFUNCTIONAL anti-PD-1/SIRPa MOLECULE <130> B2914EP <160> 56 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> artificial <220> <223> HC CDR1 <400> 1 His Tyr Ala Met Asn 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> artificial <220> <223> HC CDR2 <400> 2 Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe Thr 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> artificial <220> <223> HC CDR3 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> X is X1 (D or E) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> X is X2 and is T, H, A, Y, N, E or S <400> 3 Glu Arg Glu Pro Gly Met Xaa Xaa 1 5 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> artificial <220> <223> HC CDR3 <400> 4 Glu Arg Glu Pro Gly Met Asp Ser 1 5 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> artificial <220> <223> HC CDR3 <400> 5 Glu Arg Glu Pro Gly Met Asp Thr 1 5 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> artificial <220> <223> HC CDR3 <400> 6 Glu Arg Glu Pro Gly Met Glu Ser 1 5 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> artificial <220> <223> HC CDR3 <400> 7 Glu Arg Glu Pro Gly Met Asp His 1 5 <210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> artificial <220> <223> HC CDR3 <400> 8 Glu Arg Glu Pro Gly Met Asp Ala 1 5 <210> 9 <211> 8 <212> PRT <213> artificial <220> <223> HC CDR3 <400> 9 Glu Arg Glu Pro Gly Met Asp Tyr 1 5 <210> 10 <211> 8 <212> PRT <213> artificial <220> <223> HC CDR3 <400> 10 Glu Arg Glu Pro Gly Met Asp Asn 1 5 <210> 11 <211> 8 <212> PRT <213> artificial <220> <223> HC CDR3 <400> 11 Glu Arg Glu Pro Gly Met Asp Glu 1 5 <210> 12 <211> 16 <212> PRT <213> artificial <220> <223> LC CDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> X is G or T <400> 12 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ala Asn Xaa Asn Thr Tyr Leu Glu 1 5 10 15 <210> 13 <211> 16 <212> PRT <213> artificial <220> <223> LC CDR1 <400> 13 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ala Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu 1 5 10 15 <210> 14 <211> 16 <212> PRT <213> artificial <220> <223> LC CDR1 <400> 14 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ala Asn Thr Asn Thr Tyr Leu Glu 1 5 10 15 <210> 15 <211> 7 <212> PRT <213> artificial <220> <223> LC CDR2 <400> 15 Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> artificial <220> <223> LC CDR3 <400> 16 Phe Gln Gly Thr His Val Pro Asn Thr 1 5 <210> 17 <211> 117 <212> PRT <213> artificial <220> <223> HC variable domain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (105)..(105) <223> X is X1, D or E <220> <221> MISC_FEATURE <222> (106)..(106) <223> X is X2, and is T, H, A, Y, N, E or S <400> 17 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Arg Glu Pro Gly Met Xaa Xaa Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 18 <211> 117 <212> PRT <213> artificial <220> <223> HC variable domain <400> 18 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Arg Glu Pro Gly Met Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 19 <211> 117 <212> PRT <213> artificial <220> <223> HC variable domain <400> 19 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Arg Glu Pro Gly Met Asp Thr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 20 <211> 117 <212> PRT <213> artificial <220> <223> HC variable domain <400> 20 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Arg Glu Pro Gly Met Glu Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 21 <211> 117 <212> PRT <213> artificial <220> <223> HC variable domain <400> 21 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Arg Glu Pro Gly Met Asp His Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 22 <211> 117 <212> PRT <213> artificial <220> <223> HC variable domain <400> 22 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Arg Glu Pro Gly Met Asp Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 23 <211> 117 <212> PRT <213> artificial <220> <223> HC variable domain <400> 23 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Arg Glu Pro Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 24 <211> 117 <212> PRT <213> artificial <220> <223> HC variable domain <400> 24 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Arg Glu Pro Gly Met Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 25 <211> 117 <212> PRT <213> artificial <220> <223> HC variable domain <400> 25 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Arg Glu Pro Gly Met Asp Glu Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 26 <211> 112 <212> PRT <213> artificial <220> <223> LC variable domain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (34)..(34) <223> X is G or T <400> 26 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ala 20 25 30 Asn Xaa Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Thr His Val Pro Asn Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 27 <211> 112 <212> PRT <213> artificial <220> <223> LC variable domain <400> 27 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ala 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 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10 <212> PRT <213> artificial <220> <223> LFR4 <400> 48 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 49 <211> 19 <212> PRT <213> artificial <220> <223> signal peptide <400> 49 Met Asp Trp Leu Trp Asn Leu Leu Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser 1 5 10 15 Ile Gln Ala <210> 50 <211> 19 <212> PRT <213> artificial <220> <223> signal peptide <400> 50 Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala 1 5 10 15 Ser Ser Ser <210> 51 <211> 343 <212> PRT <213> artificial <220> <223> SIRPa <400> 51 Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Asp Leu Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn 65 70 75 80 Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu 100 105 110 Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala 115 120 125 Arg Ala Thr Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly 130 135 140 Phe Ser Pro Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu 145 150 155 160 Leu Ser Asp Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu Ser Val Ser 165 170 175 Tyr Ser Ile His Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg Glu Asp Val 180 185 190 His Ser Gln Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln Gly Asp 195 200 205 Pro Leu Arg Gly Thr Ala Asn Leu Ser Glu Thr Ile Arg Val Pro Pro 210 215 220 Thr Leu Glu Val Thr Gln Gln Pro Val Arg Ala Glu Asn Gln Val Asn 225 230 235 240 Val Thr Cys Gln Val Arg Lys Phe Tyr Pro Gln Arg Leu Gln Leu Thr 245 250 255 Trp Leu Glu Asn Gly Asn Val Ser Arg Thr Glu Thr Ala Ser Thr Val 260 265 270 Thr Glu Asn Lys Asp Gly Thr Tyr Asn Trp Met Ser Trp Leu Leu Val 275 280 285 Asn Val Ser Ala His Arg Asp Asp Val Lys Leu Thr Cys Gln Val Glu 290 295 300 His Asp Gly Gln Pro Ala Val Ser Lys Ser His Asp Leu Lys Val Ser 305 310 315 320 Ala His Pro Lys Glu Gln Gly Ser Asn Thr Ala Ala Glu Asn Thr Gly 325 330 335 Ser Asn Glu Arg Asn Ile Tyr 340 <210> 52 <211> 330 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Heavy chain constant domain (IgG1m-N298A) <400> 52 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 53 <211> 444 <212> PRT <213> artificial <220> <223> HC anti-PD1 chimeric <400> 53 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Glu Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Ala Ala Phe 65 70 75 80 Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Lys Glu Arg Glu Pro Gly Met Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Ser 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro 210 215 220 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 225 230 235 240 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 245 250 255 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe 260 265 270 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 275 280 285 Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 290 295 300 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 305 310 315 320 Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 325 330 335 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln 340 345 350 Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 355 360 365 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 370 375 380 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 385 390 395 400 Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu 405 410 415 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 420 425 430 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 <210> 54 <211> 219 <212> PRT <213> artificial <220> <223> LC anti-PD1 chimeric <400> 54 Asp Val Leu Leu Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ala 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Thr Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 55 <211> 2670 <212> DNA <213> artificial <220> <223> VH-VK <400> 55 cagatccagc tggtgcagag cggctctgag ctgaagaagc caggcgcttc tgtgaaggtg 60 tcctgcaagg ccagcggcta caccttcaca cactatgcta tgaattgggt gagacaggct 120 ccaggacagg gactggagtg gatgggctgg atcaacacca atacaggcga gcctacctac 180 gctcagggct ttacaggccg cttcgtgttt tctctggata cctccgtgag cacagcctat 240 ctgcagatct ccagcctgaa ggctgaggac accgccgtgt actattgtgc tagggagagg 300 gagccaggaa tggataactg gggacagggc accctggtga cagtgtcttc cgctagcacc 360 aagggcccat cggtcttccc cctggcgccc tgctccagga gcacctccga gagcacagcc 420 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 480 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 540 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacgaagac ctacacctgc 600 aacgtagatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga gagttgagtc caaatatggt 660 cccccatgcc caccatgccc agcacctgag ttcctggggg gaccatcagt cttcctgttc 720 cccccaaaac ccaaggacac tctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac gtgcgtggtg 780 gtggacgtga gccaggaaga ccccgaggtc cagttcaact ggtacgtgga tggcgtggag 840 gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagttca acagcacgta ccgtgtggtc 900 agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtc 960 tccaacaaag gcctcccgtc ctccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 1020 cgagagccac aggtgtacac cctgccccca tcccaggagg agatgaccaa gaaccaggtc 1080 agcctgacct gcctggtcaa aggcttctac cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 1140 aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 1200 ttcttcctct acagcaggct aaccgtggac aagagcaggt ggcaggaggg gaatgtcttc 1260 tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cacagaagag cctctccctg 1320 tctccgggta aatgacagat ccagctggtg cagagcggct ctgagctgaa gaagccaggc 1380 gcttctgtga aggtgtcctg caaggccagc ggctacacct tcacacacta tgctatgaat 1440 tgggtgagac aggctccagg acagggactg gagtggatgg gctggatcaa caccaataca 1500 ggcgagccta cctacgctca gggctttaca ggccgcttcg tgttttctct ggatacctcc 1560 gtgagcacag cctatctgca gatctccagc ctgaaggctg aggacaccgc cgtgtactat 1620 tgtgctaggg agagggagcc aggaatggat aactggggac agggcaccct ggtgacagtg 1680 tcttccgcta gcaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg cgccctgctc caggagcacc 1740 tccgagagca cagccgccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 1800 gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 1860 tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacg 1920 aagacctaca cctgcaacgt agatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagagagtt 1980 gagtccaaat atggtccccc atgcccacca tgcccagcac ctgagttcct ggggggacca 2040 tcagtcttcc tgttcccccc aaaacccaag gacactctca tgatctcccg gacccctgag 2100 gtcacgtgcg tggtggtgga cgtgagccag gaagaccccg aggtccagtt caactggtac 2160 gtggatggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gttcaacagc 2220 acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag 2280 tacaagtgca aggtctccaa caaaggcctc ccgtcctcca tcgagaaaac catctccaaa 2340 gccaaagggc agccccgaga gccacaggtg tacaccctgc ccccatccca ggaggagatg 2400 accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctaccccag cgacatcgcc 2460 gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 2520 gactccgacg gctccttctt cctctacagc aggctaaccg tggacaagag caggtggcag 2580 gaggggaatg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacacag 2640 aagagcctct ccctgtctcc gggtaaatga 2670 <210> 56 <211> 660 <212> DNA <213> artificial <220> <223> VL-VD <400> 56 gacgtggtca tgacacagag cccactgtct ctgcctgtga ccctgggaca gccagcctct 60 atctcctgca gatccagcca gtctctggtg cacgctaaca ccaatacata cctggagtgg 120 tatcagcaga ggccaggaca gtccccaagg ctgctgatct acaaggtgtc caacagattc 180 agcggagtgc cagaccgctt tagcggatct ggatccggaa ccgacttcac cctgaagatc 240 tccagggtgg aggctgagga tgtgggcgtg tactattgtt tccagggcac ccatgtgcct 300 aatacatttg gccagggcac caagctggag atcaagcgta cggtggctgc accatctgtc 360 ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420 ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480 tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 540 agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 600 gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgttag 660

Claims (22)

  1. 하기를 포함하는 이작용성 분자:
    (a) 하기를 포함하는 항-인간 PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편:
    (i) HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH), 및
    (ii) LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL), 및
    (b) 인간 SIRPa 또는 이의 단편 또는 변이체.
    (여기서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 중쇄 및/또는 경쇄(들)의 C-말단 단부는 융합 단백질로서, 바람직하게는 펩타이드 링커에 의해 SIRPa 또는 이의 단편 또는 변이체의 N-말단 단부에 공유적으로 연결됨).
  2. 제1항에 있어서,
    상기 항체는 키메라, 인간화 또는 인간 항체인, 이작용성 분자.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 SIRPa 단편은 SIRPa의 세포 외 도메인을 포함하거나 이로 구성된, 이작용성 분자.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 SIRPa 단편은 이의 세포 내 부분 및 선택적으로 이의 막관통 도메인이 없고, 바람직하게는 상기 SIRPa가 서열번호 51에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하거나 이로 구성된, 이작용성 분자.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항-인간 PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함하는, 이작용성 분자:
    (i) HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH), 및
    (ii) LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL).
    (여기서:
    - 중쇄 CDR1(HCDR1)은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되며;
    - 중쇄 CDR2(HCDR2)는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되며;
    - 중쇄 CDR3(HCDR3)은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되며, 여기서, X1은 D 또는 E이고 X2는 T, H, A, Y, N, E 및 S로 이루어진 군으로부터, 바람직하게는 H, A, Y, N 및 E로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    - 경쇄 CDR1(LCDR1)은 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되며, 여기서, X는 G 또는 T이고;
    - 경쇄 CDR2(LCDR2)는 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되며,
    - 경쇄 CDR3(LCDR3)은 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성됨).
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항-인간 PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함하거나 이로 구성되는, 이작용성 분자:
    (a) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 VH(여기서, X1은 D 또는 E이고, X2는 T, H, A, Y, N, E 및 S로 이루어진 군으로부터, 바람직하게는 H, A, Y, N 및 E로 이루어진 군으로부터 선택됨); 및
    (b) 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 VL(여기서, X는 G 또는 T임).
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 카파 경쇄 불변 도메인으로부터 유래된 경쇄 불변 도메인 및 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 중쇄 불변 도메인, 바람직하게는 IgG1 또는 IgG4 중쇄 불변 도메인으로부터 유래된 중쇄 불변 도메인을 포함하는, 이작용성 분자.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 선택적으로 T250Q/M428L; M252Y/S254T/T256E + H433K/N434F; E233P/L234V/L235A/G236A + A327G/A330S/P331S; E333A; S239D/A330L/I332E; P257I/Q311; K326W/E333S; S239D/I332E/G236A; N297A; L234A/L235A; N297A + M252Y/S254T/T256E; 및 K322A 및 K444A로 이루어진 군으로부터 선택된, 바람직하게는 M252Y/S254T/T256E 및 L234A/L235A와 선택적으로 조합된 N297A로 이루어진 군으로부터 선택된 치환 또는 치환의 조합을 갖는, 인간 카파 경쇄 불변 도메인으로부터 유래된 경쇄 불변 도메인 및 인간 IgG1 중쇄 불변 도메인으로부터 유래된 중쇄 불변 도메인을 포함하는, 이작용성 분자.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 선택적으로 S228P; L234A/L235A, S228P + M252Y/S254T/T256E 및 K444A로 이루어진 군으로부터 선택된 치환 또는 치환의 조합을 갖는, 인간 카파 경쇄 불변 도메인으로부터 유래된 경쇄 불변 도메인 및 인간 IgG4 중쇄 불변 도메인으로부터 유래된 중쇄 불변 도메인을 포함하는, 이작용성 분자.
  10. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항-PD1 항체는 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 세미플리맙, PDR001 및 단일클론 항체 5C4, 17D8, 2D3, 4H1, 4A11, 7D3 및 5F4로 이루어진 군으로부터 선택되는, 이작용성 분자.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 이작용성 분자를 암호화하는 단리된 핵산 분자 또는 단리된 핵산 분자의 그룹.
  12. 제11항에 따른 핵산 또는 핵산 분자의 그룹을 포함하는, 벡터.
  13. 제12항에 따른 벡터 또는 제11항의 핵산 또는 핵산 분자의 그룹을 포함하는, 숙주 세포.
  14. 제13항에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계 및 선택적으로 이작용성 분자를 단리하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 이작용성 분자의 생산 방법.
  15. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 이작용성 분자, 제11항에 따른 핵산 또는 핵산 분자의 그룹, 제12항의 벡터 또는 제13항의 숙주 세포 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  16. 제15항에 있어서,
    알킬화제, 혈관신생 억제제, 항체, 항 대사물질, 항 유사분열제, 항 증식제, 항 바이러스제, 오로라 키나제 억제제, 아폽토시스 촉진제(예를 들어, Bcl-2 계열 억제제), 사멸 수용체 경로 활성화제, Bcr-Abl 키나제 억제제, BiTE(Bi-특이적 T 세포 인게이저(Engager)) 항체, 항체 약물 접합체, 생물학적 반응 조절제, 브루톤 티로신 키나제(BTK) 억제제, 사이클린-의존성 키나제 억제제, 세포주기 억제제, 사이클로옥시게나제-2 억제제, DVD, 백혈병 바이러스 종양유전자 동족체(ErbB2) 수용체 억제제, 성장 인자 억제제, 열 쇼크 단백질(HSP)-90 억제제, 히스톤 데아세틸라제(HDAC) 억제제, 호르몬 요법, 면역학적 물질, 아폽토시스 단백질 억제제의 억제제(IAP), 인터칼레이팅 항생제, 키나제 억제제, 키네신 억제제, Jak2 억제제, 라파마이신 억제제의 포유류 표적, 마이크로RNA, 미토겐-활성화 세포 외 신호-조절 키나제 억제제, 다가 결합 단백질, 비-스테로이드성 항염증제(NSAID), 폴리ADP(아데노신 디포스페이트)-리보스 중합효소(PARP) 억제제, 백금 화학요법제, 폴로-유사 키나제(Plk) 억제제, 포스포이노시티드-3 키나제(PI3K) 억제제, 프로테아좀 억제제, 퓨린 유사체, 피리미딘 유사체, 수용체 티로신 키나제 억제제, 레티노이드/델토이드 식물 알칼로이드, 작은 억제 리보핵산(siRNA), 토포이소머라제 억제제, 유비퀴틴 리가제 억제제, 저메틸화제, 체크포인트 억제제, 펩타이드 백신 등, 종양 항원으로부터의 에피토프 또는 네오에피토프, 뿐만 아니라 이들 작용제 중 하나 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 추가 치료제를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
  17. 약제로 사용하기 위한, 제15항 또는 제16항의 약제학적 조성물 또는 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 이작용성 분자, 또는 제11항에 따른 핵산 또는 핵산 분자의 그룹, 또는 제12항의 벡터, 또는 제13항의 숙주 세포.
  18. 제17항에 있어서,
    암 치료에 사용하기 위한, 약제학적 조성물, 이작용성 분자, 핵산 또는 핵산 분자의 그룹, 벡터 또는 숙주 세포.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 암은 PD-1 및/또는 PD-L1의 발현을 갖는 혈액 악성종양 또는 고형 종양으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 예컨대 혈액림프구성(hematolymphoid) 종양, 혈관면역모세포 T세포 림프종, 골수이형성 증후군 및 급성 골수성 백혈병으로 이루어진 군으로부터 선택된 암, 바이러스에 의해 유발되거나 면역결핍과 관련된 암, 예컨대 카포시 육종(예를 들어, 카포시 육종 헤르페스 바이러스와 관련됨); 자궁경부암, 항문암, 음경암 및 외음부 편평 세포 암 및 구인두암(예를 들어, 인간 유두종 바이러스와 관련됨)으로 이루어진 군으로부터 선택된 암; 미만성 거대 B-세포 림프종, 버킷 림프종, 형질모세포 림프종, 원발성 중추 신경계 림프종, HHV-8 원발성 삼출 림프종, 고전적인 호지킨 림프종 및 림프증식성 장애(예를 들어, 엡스타인-바아 바이러스(EBV) 및/또는 카포시 육종 헤르페스 바이러스와 관련됨)를 포함하는 B 세포 비-호지킨 림프종(NHL); 간세포 암종(예를 들어, B형 및/또는 C형 간염 바이러스와 관련됨); 메르켈 세포 암종(예를 들어, 메르켈 세포 폴리오마 바이러스(MPV)와 관련됨); 및 인간 면역결핍 바이러스 감염(HIV) 감염과 관련된 암, 및 전이성 또는 비전이성, 흑색종, 악성 중피종, 비소세포 폐암, 신장 세포 암종, 호지킨 림프종, 두경부암, 요로상피 암종, 결장직장암, 간세포 암종, 소세포 폐암, 전이성 메르켈 세포 암종, 위암 또는 위식도암 및 자궁경부암으로 이루어진 군으로부터 선택된 암인, 약제학적 조성물, 이작용성 분자, 핵산 또는 핵산 분자의 그룹, 벡터 또는 숙주 세포.
  20. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    방사선 요법 또는, 바람직하게는 알킬화제, 혈관신생 억제제, 항체, 항 대사물질, 항 유사분열제, 항 증식제, 항 바이러스제, 오로라 키나제 억제제, 아폽토시스 촉진제(예를 들어, Bcl-2 계열 억제제), 사멸 수용체 경로 활성화제, Bcr-Abl 키나제 억제제, BiTE(Bi-특이적 T 세포 인게이저(Engager)) 항체, 항체 약물 접합체, 생물학적 반응 조절제, 브루톤 티로신 키나제(BTK) 억제제, 사이클린-의존성 키나제 억제제, 세포주기 억제제, 사이클로옥시게나제-2 억제제, DVD, 백혈병 바이러스 종양유전자 동족체(ErbB2) 수용체 억제제, 성장 인자 억제제, 열 쇼크 단백질(HSP)-90 억제제, 히스톤 데아세틸라제(HDAC) 억제제, 호르몬 요법, 면역학적 물질, 아폽토시스 단백질 억제제의 억제제(IAP), 인터칼레이팅 항생제, 키나제 억제제, 키네신 억제제, Jak2 억제제, 라파마이신 억제제의 포유류 표적, 마이크로RNA, 미토겐-활성화 세포 외 신호-조절 키나제 억제제, 다가 결합 단백질, 비-스테로이드성 항염증제(NSAID), 폴리ADP(아데노신 디포스페이트)-리보스 중합효소(PARP) 억제제, 백금 화학요법제, 폴로-유사 키나제(Plk) 억제제, 포스포이노시티드-3 키나제(PI3K) 억제제, 프로테아좀 억제제, 퓨린 유사체, 피리미딘 유사체, 수용체 티로신 키나제 억제제, 레티노이드/델토이드 식물 알칼로이드, 작은 억제 리보핵산(siRNA), 토포이소머라제 억제제, 유비퀴틴 리가제 억제제, 저메틸화제, 체크포인트 억제제, 펩타이드 백신 등, 종양 항원으로부터의 에피토프 또는 네오에피토프, 뿐만 아니라 이들 작용제 중 하나 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 추가 치료제와 조합하여 사용하기 위한, 약제학적 조성물, 이작용성 분자, 핵산 또는 핵산 분자의 그룹, 벡터 또는 숙주 세포.
  21. 제17항에 있어서,
    감염성 질환, 바람직하게는 만성 감염성 질환, 더욱더 바람직하게는 만성 바이러스 감염의 치료에 사용하기 위한, 약제학적 조성물, 이작용성 분자, 핵산 또는 핵산 분자의 그룹, 벡터 또는 숙주 세포.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 감염성 질환이 HIV, 간염 바이러스, 헤르페스 바이러스, 아데노바이러스, 인플루엔자 바이러스, 플라비바이러스, 에코바이러스, 라이노바이러스, 콕사키 바이러스, 코로나바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 볼거리 바이러스, 로타바이러스, 홍역 바이러스, 풍진 바이러스, 파보바이러스, 우두 바이러스, HTLV 바이러스, 뎅기 바이러스, 유두종바이러스, 연체동물 바이러스, 소아마비 바이러스, 광견병 바이러스, JC 바이러스 및 아르보바이러스 뇌염 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스에 의해 발생하는, 약제학적 조성물, 이작용성 분자, 핵산 또는 핵산 분자의 그룹, 벡터 또는 숙주 세포.
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Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN118027200A (zh) 2016-12-09 2024-05-14 艾利妥 抗SIRPα抗体及其使用方法
BR112019014917A2 (pt) 2017-01-25 2020-03-31 Ose Immunotherapeutics Método para fabricar uma emulsão estável para entrega de peptídeo
WO2019226973A1 (en) 2018-05-25 2019-11-28 Alector Llc Anti-sirpa antibodies and methods of use thereof
WO2020127366A1 (en) 2018-12-21 2020-06-25 Ose Immunotherapeutics Humanized anti-human-pd-1 antibody
WO2022214652A1 (en) 2021-04-09 2022-10-13 Ose Immunotherapeutics Scaffold for bifunctioanl molecules comprising pd-1 or cd28 and sirp binding domains
CN114805592A (zh) * 2022-05-13 2022-07-29 南京吉盛澳玛生物医药有限公司 一种三特异性抗体的设计、制备及用途
WO2024028386A1 (en) * 2022-08-02 2024-02-08 Ose Immunotherapeutics Multifunctional molecule directed against cd28
CN115386550A (zh) * 2022-10-26 2022-11-25 成都诺医德医学检验实验室有限公司 一种评价免疫细胞抗癌有效性的方法
WO2024098939A1 (zh) * 2022-11-07 2024-05-16 北京伟德杰生物科技有限公司 双功能融合蛋白及其应用

Family Cites Families (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5354844A (en) 1989-03-16 1994-10-11 Boehringer Ingelheim International Gmbh Protein-polycation conjugates
US5108921A (en) 1989-04-03 1992-04-28 Purdue Research Foundation Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules
JP4124480B2 (ja) 1991-06-14 2008-07-23 ジェネンテック・インコーポレーテッド 免疫グロブリン変異体
JP3444885B2 (ja) 1992-08-21 2003-09-08 フリーイェ・ユニヴェルシテイト・ブリュッセル Ｌ鎖欠落免疫グロブリン
US5275285A (en) 1992-12-30 1994-01-04 Clegg Industries Business card holder with sound generating microchip
EP0739981A1 (en) 1995-04-25 1996-10-30 Vrije Universiteit Brussel Variable fragments of immunoglobulins - use for therapeutic or veterinary purposes
CA2312208C (en) 1997-12-05 2011-01-25 The Scripps Research Institute Humanization of murine antibody
JP5179689B2 (ja) 2000-02-11 2013-04-10 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 抗体ベース融合タンパク質の循環系内半減期の増強
BR0207854A (pt) 2001-03-07 2004-08-24 Merck Patent Gmbh Tecnologia de expressão para proteìnas contendo uma porção de anticorpo de isotipo hìbrido
AU2005230848B9 (en) 2004-03-31 2011-06-02 Genentech, Inc. Humanized anti-TGF-beta antibodies
JP4361545B2 (ja) 2005-05-09 2009-11-11 小野薬品工業株式会社 ＰｒｏｇｒａｍｍｅｄＤｅａｔｈ１（ＰＤ−１）に対するヒトモノクローナル抗体および抗ＰＤ−１抗体単独または他の免疫療法と併用した癌治療方法
EP3766511A1 (en) 2012-01-17 2021-01-20 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University High affinity sirp-alpha reagents
CA3175360C (en) 2013-05-31 2024-05-28 Sorrento Therapeutics, Inc. Antigen binding proteins that bind pd-1
BR112016024214B8 (pt) 2014-04-18 2023-12-26 Univ New York State Res Found Anticorpo monoclonal parcialmente humanizado, composição farmacêutica e uso de um anticorpo monoclonal
TWI759810B (zh) 2014-08-08 2022-04-01 美商Ａｌｘ腫瘤技術股份有限公司 信號調節蛋白α(signal-regulatory proteinα, SIRP-α)變體構築物及其用途
KR20170036796A (ko) 2014-08-15 2017-04-03 메르크 파텐트 게엠베하 Sirp-알파 면역글로불린 융합 단백질
SI3328419T1 (sl) 2015-07-30 2021-11-30 Macrogenics, Inc. PD-1-vezavne molekule in postopki uporabe le-teh
WO2017024465A1 (en) 2015-08-10 2017-02-16 Innovent Biologics (Suzhou) Co., Ltd. Pd-1 antibodies
JP6869987B2 (ja) 2015-09-01 2021-05-12 アジェナス インコーポレイテッド 抗ｐｄ−１抗体及びその使用方法
KR20180101554A (ko) 2016-01-20 2018-09-12 더 스크립스 리서치 인스티튜트 Ｒｏｒ１ 항체 조성물 및 관련 방법
WO2017127707A1 (en) * 2016-01-21 2017-07-27 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Treatment of cancer with combinations of immunoregulatory agents
WO2017132827A1 (en) 2016-02-02 2017-08-10 Innovent Biologics (Suzhou) Co., Ltd. Pd-1 antibodies
CN111491361B (zh) 2016-02-02 2023-10-24 华为技术有限公司 确定发射功率的方法、用户设备和基站
CN107459578B (zh) * 2016-05-31 2021-11-26 泰州迈博太科药业有限公司 一种靶向cd47与pd-l1的双功能融合蛋白
US9914783B1 (en) 2016-09-14 2018-03-13 Abbvie Biotherapeutics Inc. Anti-PD-1 antibodies and their uses
EP3571223A1 (en) 2017-01-18 2019-11-27 Visterra, Inc. Antibody molecule-drug conjugates and uses thereof
CN108623689B (zh) * 2017-03-15 2020-10-16 宜明昂科生物医药技术（上海）有限公司 新型重组双功能融合蛋白及其制备方法和用途
CN110958888A (zh) * 2017-03-28 2020-04-03 延龄草治疗公司 Cd47阻断疗法
MX2019012233A (es) 2017-04-13 2020-01-14 Aduro Biotech Holdings Europe Bv Anticuerpos anti-sirpa.
AU2018338322A1 (en) 2017-09-23 2020-04-09 Memorial Sloan Kettering Cancer Center A33 antibody compositions and methods of using the same in radioimmunotherapy
JP7497292B2 (ja) 2018-03-05 2024-06-10 エタブリスモン フランセ ドュ サン 遺伝子組換え単鎖免疫グロブリン

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