KR20180101554A - Ｒｏｒ１ 항체 조성물 및 관련 방법 - Google Patents

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Abstract

ROR1 항체 조성물 및 관련된 방법. 본 발명은 사람 ROR1을 특이적으로 인식하는, 항체, 항체 약물 접합체, 항체-계 단편 또는 항체 단편(항원-결합 단편), 및 또한 항체 약물 접합체(ADC) 및 키메라 항원 수용체(CAR), 및 관련된 조성물을 제공한다. 또한, 다양한 진단학적 및 치료학적 적용에서 이러한 항체를 사용하는 방법이 본 발명에 제공된다.

Description

ＲＯＲ１ 항체 조성물 및 관련 방법
관련 출원에 대한 교차-참고
본 특허원은 미국 가특허원 제62/280,843호(2016년 1월 20일자로 출원됨)에 대한 우선권의 이익을 청구한다. 우선권 출원의 전체 개시내용은 이의 전문으로 및 모든 목적을 위해 본원에 참고로 포함된다.
발명의 배경
암은 사망의 주요 원인들 중 하나이다. 이는 염색체 전좌(translocation), 종양 억제 유전자, 전사 인자 또는 성장-인자 수용체내 돌연변이와 같은, 유전적 변경에 의해 유발되어, 세포의 불멸화(immortalization)를 초래하는, 건강한 세포의 악성 형질전환에 의해 유발되는 질환의 부류이다. 불멸화가 과도한 증식과 결합되면, 불멸화된 세포는 전이되거나 전이되지 않는 종양(고형 종양의 경우) 또는 백혈병 및 림프종(혈액의 암)을 생성한다. 결함이 있는 세포자멸사(apoptosis) 또는 프로그램화된 세포 사멸은 세포의 악성 형질전환에 추가로 기여하여 암을 유발할 수 있다.
수용체 타이로신 키나제 오르판 수용체-1 및 -2(receptor tyrosine kinase orphan receptors-1 및 -2: ROR1 및 ROR2)로 이루어진, 막 관련 수용체 타이로신 키나제 계열은 특수 암과 구체적으로 관련된 것으로 기술되었지만(Rebagay et al. (2012) Front Oncol. 2(34)), 거의 예외없이 건강한 조직에서의 발현에는 거의 부재한다(Balakrishnan et al. (2016) Clin Cancer Res. doi: 10.1158/1078-0432). ROR 발현이 종양형성과 기능적으로 관련되어 있는지의 여부는 명확하지 않다. 그러나, ROR 계열 구성원의 매우 종양-선택적인 발현으로 인하여, 이들은 표적화된 암 치료요법을 위한 관련 표적을 나타낸다. 수용체 타이로신 키나제 오르판 수용체-1(ROR1)은 만성 림프성 백혈구(CLL)과 이의 거의 100% 관련성(Cui et al. (2016) Blood 128(25), p. 2931) 및 폐 및 유방의 고형 종양과 같은, 특정의 고형 종양에서 또한 발현된다는 관찰(Balakrishnan et al. (2016) Clin Cancer Res. doi: 10.1158/1078-0432)로 인하여, 암 표적으로서 특히 관심이 있다. ROR 계열의 구성원은 3개의 명백한 세포외 도메인인, Ig, 크링클(Kringle) 및 프리즐드 도메인(Frizzled domain)에 이어서, 전이막 스패닝 영역(transmembrane spanning region), 및 세포내 부위를 함유하는 제I형 전이막 단백질이다. 세포내 부위에서, ROR1은 타이로신 키나제 도메인, 2개의 세린/트레오닌이 풍부한 도메인 및 프롤린이 풍부한 도메인을 지닌다. ROR은 다양한 동족체를 통해 배아 패턴화(embryonic patterning) 및 신경발생의 맥락에서 연구되어 왔다. 이들 생리학적 기능은 키나제 도메인의 요건을 기반으로 양분된다. 확대되고 있는 문헌은 ROR1을 ROR1 발현이 거의 100% 관련되어 있는 만성 림프구성 백혈병(CLL), 일부 급성 림프모구 백혈병(ALL), 외투세포 림프종(mantle cell lymphoma), 및 일부 다른 혈액 악성종양과 같이, 암에 대한 마커로서 확립하여 왔다. 또한, ROR1은 신경아세포종, 육종, 신장 세포 암종, 유방 암, 폐 암, 결장 암, 두경부암, 흑색종, 및 다른 암에서와 같이, 다수의 고형 종양의 발달에 중요하게 관여되어 있다. ROR1은 세포자멸사를 억제하고 EGFR 시그날링(signaling)을 강화하며, 상피-간엽성 전이(epithelial-mesenchymal transition: EMT)를 유도하고, 포낭(caveolae) 형성에 기여하는 것으로 밝혀졌다. 중요하게도, ROR1은 배아 조직에서 주로 검출가능하며 단백질을 암 치료요법을 위한 이상적인 약물 표적으로 만드는 성체 조직 속에는 일반적으로 부재한다. 이와 같이, ROR1은 ROR1 특이적인 항체의 개발을 위한 표적으로서 이미 인식되어 왔다. 그러나, 사람과 시노몰구스 몽키(cynomolgus monkey) 사이의 아미노산 수준에서 100% 보존되어 있고, 사람과 마우스 사이에 96.7% 상동성이며, 사람과 토끼 사이에 96.3% 상동성인, 상이한 포유동물 종 사이에 ROR1의 높은 상동성으로 인하여, 동물 면역화와 같은 표준 기술에 의해 당해 표적에 대한 고 친화성 항체를 발생시키는 것이 어려웠다.
소수의 쥐 및 토끼 항체가 문헌에서 논의되어 왔다. 예를 들면, 제WO 2007/051077호는 CLL, 소 림프구성 림프종(small lymphocytic lymphoma), 변연부 B-세포 림프종 및 버킷 림프종(Burkett's lymphoma)을 포함하는 림프종에서 발견된 천연 ROR1에 대해 지시된 사람화된 항체를 포함하는 모노클로날 항체를 논의하였다. ROR1 키나제 활성을 억제하는 ROR1-결합 항체일 수 있는, 제제를 사용한 종양 세포의 성장을 억제하는 방법은 제WO 2007/146957호의 주제이다. 제WO 2011/054007호는 ROR1의 세포외 도메인이 특이적인 ROR1-표적화 항체의 투여에 의해 발현된 암의 치료 또는 예방 방법을 논의하였다.
또한, 제WO 2010/124188호는 항-사람 ROR1 항체, 및 특히 명칭 2A2로 언급된 모노클로날 뒤 항체를 논의하였으나, 제WO 2012/075158호는 R11 및 R12로 명명된 모노클로날 토끼 항체를 언급하고 있다. 특수한 ROR1-표적화 항체 또한 제WO 2016/094873호에 언급되어 있다. 제WO 2011/079902호 및 제WO 2012/076066호 둘 다는 선택된 세포외 ROR1 도메인 서열에 결합하는 세포 사멸을 유도할 수 있는 ROR1의 생물학적 억제제를 논의하였다. 제WO 2014/031174호는 99961로 명명된 항체와 동일한 결합 특이성을 갖는 항-ROR1 항체를 언급하고 있다. 항-ROR1 항체의 결합 에피토프는 제WO 2016/187220호에 추가로 언급되어 있다. 제WO 2011/159847호는 ROR1에 결합하는 특수한 scFv 항체 단편 접합체(conjugate)를 논의하였다. 제WO 2014/167022호, 제WO 2016/055592호 및 제WO 2016/055593호는 이-특이적 ROR1-표적화 항체 및 이의 용도를 논의하였지만, 제WO 2015/184203호는 삼-특이적 결합 분자를 논의하였다. 특히, 사람화된 항-ROR1 모노클로날 항체를 개시하는 보다 새로운 문서들은 2A2, R11, R12 또는 D10과 같이 원래 개시된 마우스 또는 토끼 항체를 기반으로 한다.
적은 수의 이용가능한 ROR1 특이적인 모노클로날 항체로 인하여, 공지된 항체 클론(clone)이 지니지 않은 보다 높은 친화성 또는 다른 기능적 특성을 갖는 보다 우수한 항-ROR1 항체가 당해 분야에서 요구되고 있다. 또한 예를 들면, 웨스턴 블롯팅(Western blotting) 및/또는 면역조직화학(IHC)에 의해 ROR1-관련된 질환 상태에서 ROR1 발현을 검출하기 위한 추가의 진단 도구가 요구되고 있다.
발명의 요약
일 국면에서, 본 발명은 사람 수용체 타이로신 키나제-유사 오르판 수용체 1(hROR1)의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하며 포유동물 세포내에서 미끼로서 발현된 사람 ROR1(hROR1) 세포외 도메인의 매우 다양한 파아지-디스플레이 라이브러리(phage-display library)로부터 선택된 토끼 항체의 신규한, 고-친화성 결합 도메인을 제공한다. 토끼 항체의 가변 영역은 재조합체 단백질로서 및 또한 포유동물 숙주 세포의 표면에서 과-발현된 hROR1의 결합을 기반으로 하는 둘 다로서 hROR1의 ECD에 대한 결합에 대해 스크리닝(screening)함으로써 선택되어 왔다. 당해 전략에 의해, 전례없는 품질 및 유리한 기능적 특성이 확인되었다. 또한, 본 발명은 사람 IgG1 항체의 불변 영역 도메인에 융합된 토끼 가변 도메인의 키메라 완전 길이 항체(chimeric full-length antibody)를 제공한다. 또한, 본 발명은 가변 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 골격내로 본원에 개시된 토끼 항-ROR1 항체의 CDR 그래프팅(grafting)에 의해 생성된 신규한, 고-친화성의 사람화된 항체를 제공한다. 이러한 사람화된 항체는 내인성의 완전한 사람 항체에 대한 상기 사람화된 항체의 높은 상동성으로 인하여 사람 질환의 치료요법에 사용될 수 있다. 본 발명의 제2 국면에서, 초-강력 안트라사이클린 독소를 지닌 키메라 토끼-사람 및 사람화된 항-사람 ROR1 (hROR1) 항체를 기반으로 한 부위-특이적으로 접합된 항체 약물 접합체(ADC)가 본 발명에 의해 제공된다. 부위-특이적인 접합은 특히 본원에 참고로 포함된, 제WO2014140317호에 개시된 바와 같이, 소르타제 효소(sortase enzyme)를 사용한 효소적 접합에 의해 달성된다. 다양한 시험관내(in vitro) 및 생체내(in vivo) 종양 모델에서 전례없는 효능을 지닌 항-hROR1 ADC를 생성하는 초-강력 안트라사이클린 독소는 본원에 참고로 포함된 제WO2016102679호에 개시되어 있다.
마지막으로, 본 발명은 시험관내에서 높은 효능을 나타내는 항-hROR1 결합 도메인을 사용하는, 키메라 항원 수용체(CAR) 및 이들 CAR로 가공된 T 세포, 즉, 소위 CAR-T 세포를 제공한다.
따라서, 본 발명은 (1) 서열 번호: 1 및 서열 번호: 14; (2) 서열 번호: 2 및 서열 번호: 15; (3) 서열 번호: 3 및 서열 번호: 16; (4) 서열 번호: 4 및 서열 번호: 17; (5) 서열 번호: 5 및 서열 번호: 18; (6) 서열 번호: 6 및 서열 번호: 19; (7) 서열 번호: 7 및 서열 번호: 20; (8) 서열 번호: 8 및 서열 번호: 21; (9) 서열 번호: 9 및 서열 번호: 22; (10) 서열 번호: 10 및 서열 번호: 23; (11) 서열 번호: 11 및 서열 번호: 24; (12) 서열 번호: 12 및 서열 번호: 25; (13) 서열 번호: 13 및 서열 번호: 26; (14) 서열 번호: 130 및 서열 번호: 136; (15) 서열 번호: 131 및 서열 번호: 137; (16) 서열 번호: 132 및 서열 번호: 138; (17) 서열 번호: 133 및 서열 번호: 139; (18) 서열 번호: 134 및 서열 번호: 140; 또는 (19) 서열 번호: 135 및 서열 번호: 141에 각각 나타낸, 면역글로불린 중쇄 가변 영역 서열 및 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열을 함유하는 hROR1 특이적인 항체의 결합 특이성과 동일한 hROR1에 대한 결합 특이성을 지닌 항-hROR1 항체, 항체-계 결합 단백질, 이의 항체 단편, 항체 약물 접합체(ADC), 또는 CAR에 관한 것이다.
본 발명은 또한 (1) 서열 번호: 27-29 및 서열 번호: 66-68, (2) 서열 번호: 30-32 및 서열 번호: 69-71, (3) 서열 번호: 33-35 및 서열 번호: 72-74, (4) 서열 번호: 36-38 및 서열 번호: 75-77, (5) 서열 번호: 39-41 및 서열 번호: 78-80, (6) 서열 번호: 42-44 및 서열 번호: 81-83, (7) 서열 번호: 45-47 및 서열 번호: 84-86, (8) 서열 번호: 48-50 및 서열 번호: 87-89, (9) 서열 번호: 51-53 및 서열 번호: 90-92, (10) 서열 번호: 54-56 및 서열 번호: 93-95, (11) 서열 번호: 57-59 및 서열 번호: 96-98, (12) 서열 번호: 60-62 및 서열 번호: 99-101, 또는 (13) 서열 번호: 63-65 및 서열 번호: 102-104에 대해 각각 적어도 90%, 또는 적어도 95% 또는 95% 이상, 그러나 100% 미만으로 동일한 면역글로불린 중쇄 CDR 서열 및 면역글로불린 경쇄 CDR 서열을 포함하는 항-hROR1 항체, 항체-계 결합 단백질, 이의 항체 단편, 항체 약물 접합체(ADC), 또는 CAR에 관한 것이다.
본 발명은 또한 (1) 서열 번호: 27-29 및 서열 번호: 66-68, (2) 서열 번호: 30-32 및 서열 번호: 69-71, (3) 서열 번호: 33-35 및 서열 번호: 72-74, (4) 서열 번호: 36-38 및 서열 번호: 75-77, (5) 서열 번호: 39-41 및 서열 번호: 78-80, (6) 서열 번호: 42-44 및 서열 번호: 81-83, (7) 서열 번호: 45-47 및 서열 번호: 84-86, (8) 서열 번호: 48-50 및 서열 번호: 87-89, (9) 서열 번호: 51-53 및 서열 번호: 90-92, (10) 서열 번호: 54-56 및 서열 번호: 93-95, (11) 서열 번호: 57-59 및 서열 번호: 96-98, (12) 서열 번호: 60-62 및 서열 번호: 99-101, 또는 (13) 서열 번호: 63-65 및 서열 번호: 102-104에 대해 각각 동일한 면역글로불린 중쇄 CDR 서열 및 면역글로불린 경쇄 CDR 서열을 포함하는 항-hROR1 항체, 항체-계 결합 단백질, 이의 항체 단편, 항체 약물 접합체(ADC), 또는 CAR에 관한 것이다.
본 발명은 (1) 서열 번호: 1 및 서열 번호: 14; (2) 서열 번호: 2 및 서열 번호: 15; (3) 서열 번호: 3 및 서열 번호: 16; (4) 서열 번호: 4 및 서열 번호: 17; (5) 서열 번호: 5 및 서열 번호: 18; (6) 서열 번호: 6 및 서열 번호: 19; (7) 서열 번호: 7 및 서열 번호: 20; (8) 서열 번호: 8 및 서열 번호: 21; (9) 서열 번호: 9 및 서열 번호: 22; (10) 서열 번호: 10 및 서열 번호: 23; (11) 서열 번호: 11 및 서열 번호: 24; (12) 서열 번호: 12 및 서열 번호: 25; 또는 (13) 서열 번호: 13 및 서열 번호: 26에 각각 나타낸 면역글로불린 중쇄 가변 영역 서열 및 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열에 대해 적어도 90%, 또는 적어도 95%, 또는 95% 이상 그러나 100% 미만으로 동일한 면역글로불린 중쇄 가변 영역 서열 또는 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항-hROR1 항체, 항체-계 결합 단백질, 이의 항체 단편, 항체 약물 접합체(ADC), 또는 CAR에 관한 것이다.
본 발명은 또한 서열 번호: 27 내지 65로 이루어진 그룹으로부터 선택된 면역글로불린 중쇄 CDR 서열을 포함하는 항-hROR1 항체, 항체-계 결합 단백질, 이의 항체 단편, 항체 약물 접합체(ADC), 또는 CAR에 관한 것이다. 본 발명은 또한 서열 번호: 66 내지 104로 이루어진 그룹으로부터 선택된 면역글로불린 경쇄 CDR 서열을 포함하는 항-hROR1 항체, 이의 항체 단편, 항체 약물 접합체(ADC), 또는 CAR에 관한 것이다. 일부 구현예에서, hROR1-특이적인 항체, 항체-계 결합 단백질, 또는 이의 항체 단편, 항체 약물 접합체(ADC), 또는 CAR은 서열 번호: 27-29, 서열 번호: 30-32, 서열 번호: 33-35, 서열 번호: 36-38, 서열 번호: 39-41, 서열 번호: 42-44, 서열 번호: 45-47, 서열 번호: 48-50, 서열 번호: 51-53, 서열 번호: 54-56, 서열 번호: 57-59, 서열 번호: 60-62, 또는 서열 번호: 63-65에 대해 각각 동일한 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 함유한다.
본 발명은 또한 (1) 서열 번호: 1 및 서열 번호: 14; (2) 서열 번호: 2 및 서열 번호: 15; (3) 서열 번호: 3 및 서열 번호: 16; (4) 서열 번호: 4 및 서열 번호: 17; (5) 서열 번호: 5 및 서열 번호: 18; (6) 서열 번호: 6 및 서열 번호: 19; (7) 서열 번호: 7 및 서열 번호: 20; (8) 서열 번호: 8 및 서열 번호: 21; (9) 서열 번호: 9 및 서열 번호: 22; (10) 서열 번호: 10 및 서열 번호: 23; (11) 서열 번호: 11 및 서열 번호: 24; (12) 서열 번호: 12 및 서열 번호: 25; (13) 서열 번호: 13 및 서열 번호: 26; (14) 서열 번호: 130 및 서열 번호: 136; (15) 서열 번호: 131 및 서열 번호: 137; (16) 서열 번호: 132 및 서열 번호: 138; (17) 서열 번호: 133 및 서열 번호: 139; (18) 서열 번호: 134 및 서열 번호: 140; 또는 (19) 서열 번호: 135 및 서열 번호: 141에 대해 동일한 면역글로불린 중쇄 가변 영역 서열 또는 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항-hROR1 항체, 항체-계 결합 단백질, 이의 항체 단편, 항체 약물 접합체(ADC), 또는 CAR에 관한 것이다.
본 발명은 또한 (1) 서열 번호: 1 및 서열 번호: 14; (2) 서열 번호: 2 및 서열 번호: 15; (3) 서열 번호: 3 및 서열 번호: 16; (4) 서열 번호: 4 및 서열 번호: 17; (5) 서열 번호: 5 및 서열 번호: 18; (6) 서열 번호: 6 및 서열 번호: 19; (7) 서열 번호: 7 및 서열 번호: 20; (8) 서열 번호: 8 및 서열 번호: 21; (9) 서열 번호: 9 및 서열 번호: 22; (10) 서열 번호: 10 및 서열 번호: 23; (11) 서열 번호: 11 및 서열 번호: 24; (12) 서열 번호: 12 및 서열 번호: 25; (13) 서열 번호: 13 및 서열 번호: 26; (14) 서열 번호: 130 및 서열 번호: 136; (15) 서열 번호: 131 및 서열 번호: 137; (16) 서열 번호: 132 및 서열 번호: 138; (17) 서열 번호: 133 및 서열 번호: 139; (18) 서열 번호: 134 및 서열 번호: 140; 또는 (19) 서열 번호: 135 및 서열 번호: 141에 대해 각각 동일한 면역글로불린 중쇄 가변 영역 서열 및 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항-hROR1 특이적인 항체, 항체-계 결합 단백질 또는 이의 항체 단편을 포함하는 항-hROR1 항체, 항체-계 결합 단백질, 이의 항체 단편, 항체 약물 접합체(ADC), 또는 CAR에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 항-hROR1 항체, 항체-계 결합 단백질, 이의 항체 단편, 항체 약물 접합체(ADC), 또는 CAR은 서열 번호: 66-104로 이루어진 그룹으로부터 선택된 면역글로불린 경쇄 CDR 서열을 포함한다. 이들 분자들 중 일부는 서열 번호: 27-65로 이루어진 그룹으로부터 선택된 면역글로불린 중쇄 CDR 서열을 추가로 지닌다. 이들 분자들 중 일부는 서열 번호: 66-68, 서열 번호: 69-71, 서열 번호: 72-74, 서열 번호: 75-77, 서열 번호: 78-80, 서열 번호: 81-83, 서열 번호: 84-86, 서열 번호: 87-89, 서열 번호: 90-92, 서열 번호: 93-95, 서열 번호: 96-98, 서열 번호: 99-101, 또는 서열 번호: 102-104와 각각 동일한 면역글로불린 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 지닌다. 일부 구현예에서, 항-hROR1 항체, 항체-계 결합 단백질, 이의 항체 단편, 항체 약물 접합체(ADC), 또는 CAR은 (1) 서열 번호: 27-29 및 서열 번호: 66-68, (2) 서열 번호: 30-32 및 서열 번호: 69-71, (3) 서열 번호: 33-35 및 서열 번호: 72-74, (4) 서열 번호: 36-38 및 서열 번호: 75-77, (5) 서열 번호: 39-41 및 서열 번호: 78-80, (6) 서열 번호: 42-44 및 서열 번호: 81-83, (7) 서열 번호: 45-47 및 서열 번호: 84-86, (8) 서열 번호: 48-50 및 서열 번호: 87-89, (9) 서열 번호: 51-53 및 서열 번호: 90-92, (10) 서열 번호: 54-56 및 서열 번호: 93-95, (11) 서열 번호: 57-59 및 서열 번호: 96-98, (12) 서열 번호: 60-62 및 서열 번호: 99-101, 또는 (13) 서열 번호: 63-65 및 서열 번호: 102-104에 각각 나타낸 면역글로불린 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열 및 면역글로불린 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 (14) 서열 번호: 130 및 서열 번호: 136; (15) 서열 번호: 131 및 서열 번호: 137; (16) 서열 번호: 132 및 서열 번호: 138; (17) 서열 번호: 133 및 서열 번호: 139; (18) 서열 번호: 134 및 서열 번호: 140; 또는 (19) 서열 번호: 135 및 서열 번호: 141로 제공된 면역글로불린 중쇄 또는 면역글로불린 경쇄에 대해 적어도 90%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 95% 그러나 100% 미만의 상동성을 지닌 hROR1-특이적인 사람화된 항체, 항체-계 결합 단백질, 이의 항체 단편, 항체 약물 접합체(ADC), 또는 CAR에 관한 것이다.
여전히 추가의 구현예에서, hROR1-특이적인 항체, 항체-계 결합 단백질 또는 이의 항체 단편은 IgAl, IgA2, IgD, IgE, IgGl, IgG2, IgG3 IgG4, 또는 IgM 동형, 또는 이의 F(ab)2, Fv, scFv, IgGACH2, F(ab')2, scFv2CH3, Fab, VL, VH, scFv4, scFv3, scFv2, dsFv, Fv, scFv-Fc, (scFv)2 단편, 또는 비-고갈 IgG, 디아보디(diabody) 또는 2가 항체이다. 분자들 중 일부는 천연적으로 존재하는 IgGl, IgG2, IgG3, IgG4 동형, 또는 합성 IgG로 이루어진 그룹으로부터 선택된 IgG이다. 분자들 중 일부는 Fab, scFv, 또는 dsFv이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 hROR1-특이적인 항체, 항체-계 결합 단백질 또는 이의 항체 단편은 합성 분자에 접합된다. 합성 분자는 예컨대, 표지, 세포독성제, 방사선동위원소, 또는 리포좀일 수 있다. 세포독성제는 예컨대, 소 분자량 독소, 펩타이드 독소, 또는 단백질 독소일 수 있다. 일부 구현예에서, hROR1-특이적인 항체, 항체-계 결합 단백질 또는 이의 항체 단편은 전이막 영역 및 세포내 T-세포 수용체(TCR) 시그날링 도메인에 접합되어 키메라 항원 수용체(CAR)를 형성한다.
본 발명은 또한 hROR1 특이적인 세포를 효율적으로 사멸시키는 독소 페이로드(toxin payload)를 지닌 hROR1-특이적인 사람화된 또는 키메라 항체, 항체-계 결합 단백질 또는 항체 단편을 포함하는 항체 약물 접합체(ADC)에 관한 것이다. 상기 ADC에서 독소 페이로드는 말레이미드 작용성을 지닌 전통적인 화학 링커, 또는 라이신 또는 시스테인 아미노산 측쇄에 대한 접합을 매개할 수 있는 당해 분야에 공지된 다른 화학물질을 사용하여 라이신 또는 시스테인 아미노산 측쇄를 통해 항체, 항체-계 결합 단백질 또는 항체 단편에 비-부위-특이적으로 접합될 수 있다. 상기 ADC에서 소 분자량 페이로드는 또한 예컨대, 이작용성 링커, 효소 개질된 항체를 형성하는 포르밀-글리신 상의 픽테트-스펭글러 화학(Pictet-Spengler chemistry)을 허용하는 링커를 사용하는 것과 같이, 당해 분야에 공지된 화학적, 화학-효소적, 또는 효소적 접합에 의해, 글리칸-리모델링된 항체에 의해, 또는 세균 트랜스글루타미나제 또는 소르타제 효소에 의해 부위-특이적으로 접합될 수 있다.
일부 관련된 국면에서, 본 발명은 본원에 기술된 치료학적 유효량의 항-hROR1 항체, 항체-계 결합 단백질, 이의 항체 단편, 항체 약물 접합체(ADC) 및 약제학적으로 허용되는 담체를 함유하는 약제학적 조성물 또는 키트(kit)를 제공한다. 본 발명의 일부 키트는 또한 하나 이상의 면역검정 완충액을 함유할 수 있다. 또한 본원에 개시된 항-hROR1 항체, 항체-계 결합 단백질, 이의 항체 단편, 항체 약물 접합체(ADC), 또는 CAR의 면역글로불린 중쇄 또는 면역글로불린 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 및 또한 이러한 폴리뉴클레오타이드 서열을 지닌 발현 벡터가 본 발명에서 제공된다.
다른 국면에서, 본 발명은 hROR1을 발현하는 세포의 성장을 사멸하거나 억제하는 방법을 제공한다. 당해 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 치료학적 유효량의 본 발명의 항-hROR1 항체, 항체-계 결합 단백질, 이의 항체 단편, 항체 약물 접합체(ADC), 또는 CAR을 투여함을 포함하며, 이는 대상체에서 hROR1을 발현하는 세포의 성장을 사멸시키거나 억제할 수 있다. 이들 방법들 중 일부는 구체적으로 종양 세포를 사멸하거나 억제하는 것에 관한 것이다. 다른 국면에서, 본 발명은 대상체에서 hROR1의 상승된 발현과 관련된 질환 또는 상태를 치료하는 방법을 제공한다. 이들 방법은 치료학적 유효량의 본 발명의 항-hROR1 항체, 항체-계 결합 단백질, 이의 항체 단편, ADC, 또는 CAR을 hROR1의 상승된 발현과 관련된 질환 또는 상태로 영향받는 대상체에게 투여함을 포함하며, 이는 대상체에서 hROR1의 상승된 발현과 관련된 질환 또는 상태의 치료를 허용한다. 이들 치료학적 방법들 중 일부는 구체적으로 암의 치료에 관한 것이다. 예를 들면, 상기 방법은 예컨대, CLL, ALL, 외투 세포 림프종, 신경아세포종, 육종, 신장 세포 암종, 유방 암, 폐 암, 결장 암, 두경부암 암, 및 흑색종을 포함하는 다양한 유형의 암으로 고생하는 대상체를 치료하는데 사용될 수 있다.
여전히 다른 국면에서, 본 발명은 대상체에서 변경된 ROR1 수준을 검출하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 (a) 대상체로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계; (b) 샘플을 본 발명의 항-hROR1 항체, 항체-계 결합 단백질 또는 이의 항체 단편과 접촉시키는 단계; (c) 생물학적 샘플 속에서 ROR1의 수준을 측정하는 단계; 및 (d) 생물학적 샘플 속의 ROR1의 수준을 ROR1의 대조군 수준과 비교함으로써 생물학적 샘플 속의 ROR1 수준이 ROR1의 대조군 수준과 비교하여 변경되었는지를 측정하는 단계를 포함한다. 이들 방법들 중 일부에서, 대조군 수준과 비교하여 대상체 내에서 증가된 ROR1 수준은 대상체내에서 ROR1의 증가된 발현과 관련된 질환 또는 상태의 지표이다. 본 방법에 적합한 구체적인 질환 또는 상태의 예는 예를 들면, CLL, ALL, 외투 세포 림프종, 신경아세포종, 육종, 신장 세포 암종, 유방 암, 폐 암, 결장 암, 두경부암 암, 또는 흑색종을 포함한다.
다른 관련된 국면에서, 본 발명은 대상체에서 ROR1-발현 종양을 검출하는 방법을 제공한다. 당해 방법은 (a) 본 발명의 hROR1 항체, 항체-계 결합 단백질 또는 이의 항체 단편을 ROR1-발현 종양을 가진 것으로 예측되거나 이로 발달할 위험이 있는 대상체에게 투여하는 단계; 및 (b) 접합된 표지 밀도 또는 농도가 변경된 영역에 대해 대상체를 영상화하는 단계를 포함하며, 여기서 밀도 또는 농도는 (i) 인접한 조직에서의 배경 또는 (ii) 대상체의 동일한 영역에서 이미 검출된 밀도 또는 농도와 관련됨으로써, 접합된 표지 밀도 또는 농도가 변경된 영역의 존재는 대상체에서 ROR1-발현 종양의 존재의 지표이다.
본 발명의 특징 및 장점의 추가의 이해는 본 명세서의 나머지 부분 및 청구범위를 참고로 실현될 수 있다.
도면의 설명
도 1은 신규한 토끼 항-hROR1 mAb의 가변 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열을 나타낸다. 토끼 가변 도메인(Vκ, Vλ, 및 VH)의 아미노산 서열 정렬은 카바트 번호매김(Kabat numbering)을 사용하여 골격 영역(FR) 및 상보성 결정 영역(CDR)으로 나타낸다. 도면에 XBR1-402, ERR1-301, ERR1-306, ERR1-316, ERR1-324, ERR1-403, ERR1-409, ERR1-TOP4, ERR1-TOP15, ERR1-TOP22, ERR1-TOP40, ERR1-TOP43, 및 ERR1-TOP54로 지정된 13개 항체의 중쇄 가변 도메인 서열(각각 서열 번호: 1 내지 13) 및 경쇄 가변 도메인 서열(각각 서열 번호: 14 내지 26)이 나타나 있다. 도면에 나타낸 바와 같이, 클론 XBR1-402, ERR1-301, ERR1-306, ERR1-316, ERR1-403, ERR1-409, ERR1-TOP4, ERR1-TOP15, ERR1-TOP22, ERR1-TOP43, 및 ERR1-TOP54는 면역글로불린 λ 경쇄의 가변 도메인이지만, 항체 ERR1-324 및 ERR1-TOP40은 면역글로불린 κ 경쇄의 가변 도메인이다.
도 2는 사람 IgG1 항체의 사람 Fc 도메인에 대한 hROR1 및 mROR1의 세포외 도메인(EDC)의 융합 단백질로서 나타낸 사람 ROR1(hROR1) 및 마우스 ROR1(mROR1)에 대한 키메라 토끼/사람 Fab의 결합 활성을 나타낸다. 사람 IgG1 Fc에 융합된 hROR1 및 mROR1(hFc-hROR1 및 hFc-mROR1)에 대한 각각의 키메라 토끼/사람 Fab의 결합을 ELISA로 분석하였다. hFc-ROR1 또는 hFc-mROR1를 플레이트(plate)에 고정된 항-사람 IgG1 Fc 항체로 포획한 후 마우스 항-His tag를 사용한 검출을 통해 His-tag를 포함하는 hROR1 특이적인 Fab와 함께 항온처리하였다. Fab의 특이성을 대조군으로서 사람 IgG1 항체의 사람 Fc 도메인을 지닌 hROR2(hFc-hROR2)의 세포외 도메인 (ECD)의 융합 단백질을 사용함으로써 확인하였다.
도 3은 쥐 preB 세포주 63-12의 세포 표면에 발현된 천연 사람 ROR1 단백질에 대한 키메라 토끼/사람 Fab의 결합 활성을 나타낸다(참고: 실시예 1). 마우스 예비-B 세포(63-12) 표면에서 이소성으로 발현된(ectopically expressed) 사람 ROR1에 대한 각각의 키메라 토끼/사람 Fab의 결합을 유동 세포분석법으로 분석하였다. ERR2-TOP35는 동형-매치된 대조군(isotype-matched control)으로서 제공된 hROR2에 대한 mAb이다.
도 4는 사람 ROR1의 세포외 도메인의 상이한 부분을 포함하는 6개의 상이한 고정된 IgG1-Fc 융합 단백질: hFc-hROR1-Ig(hROR1의 면역글로불린-도메인 포함), hFc-hROR1-Fr(hROR1의 프리즐드 도메인(Frizzled domain) 포함), hFc-hROR1-Kr(hROR1의 크링글 도메인(Kringle domain) 포함), hFc-hROR1-Ig-Fr(hROR1의 면역글로불린 및 프리즐드 도메인 포함), hFc-hROR1-Fr-Ki(hROR1의 프리즐들 및 크링글 도메인 포함) 및 hFc-hROR1(hROR1의 전체 세포외 도메인(ECD) 포함)에서 키메라 토끼/사람 Fab에 대한 에피토프 맵핑 연구를 나타낸다.
도 5는 표면 플라스몬 공명으로 수행된 에피토프 결합 연구를 나타낸다. CM5 칩 위에 고정된 항-사람 Fcγ 항체에 의해 포획된 hFc-hROR1에 대한 상이한 Fab의 결합에 대해 수득된 SPR 센소그램(sensogram)을 나타낸다. Fab를 상이한 순서로 주사하여 독립된 및 오버랩핑된(overlapping) 에피토프를 확인하였다. 먼저 주사된 Fab에 대해 발견된 값을 초과한 공명 단위(RU, y 축) 증가는 독립된 에피토프를 나타내는데, 그 이유는 이들이 동시 결합을 허용하기 때문이다. 예를 들면, Fab R11의 결합에 대해 발견된 증가는 XBR1-402 단독에 대해 발견된 값을 초과하였으며, 이는 Fab R11 및 XBR1-402가 사람 ROR1에 동시 결합할 수 있음을 나타낸다. 대조적으로, Fab XBR1-402의 에피토프는 ERR1-301, ERR1-403 및 R12의 에피토프와 오버랩되며(좌측 그래프); Fab ERR1-TOP43의 에피토프는 ERR1-306, XBR1-402 및 ERR1-TOP40의 에피토프와 오버랩된다. x 축은 초 단위(s)의 시간을 나타낸다.
도 6은 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의한 hROR1 ECD에 대한 항-hROR1 특이적인 Fab의 친화성 측정을 나타낸다. (A) 즉각적인 배경 고갈 후 CM5 칩 위에 고정된 항-사람 Fcγ 항체에 의해 포획된 hFc-hROR1에 대한 각각의 Fab의 결합에 대해 수득된 비아코어(Biacore) X100 센소그램이 나타나 있다. Fab를 표 (B)에 나타낸 최대 농도를 사용하여 5개의 상이한 농도로 주사하였으며, 5개 농도들 중 하나는 2회 시험하였다. (B) 각각의 Fab의 1가 친화성을 표에 나타낸다. 평형 해리 상수(K d )를 k off /k on (k on , 연합 속도 상수; k off , 해리 속도 상수)로부터 계산하였다.
도 7은 실시예 9에 기술된 바와 같이 항-사람 ROR1 항체 2A2를 사용한 다양한 사람 암 세포주에서 hROR1의 FACS-계 세포 염색을 나타낸다. 세포주 분석된 계통은 697(사람 급성 림프성 백혈병, ALL), Kasumi-2(사람 예비B 급성 림프성 백혈병), 사람 3중-음성 유방 암 세포주 MDA-MB-231, MDA-MB-468 및 HS-578T, 및 사람 유방 암 세포주 T47D를 포함한다. T47D 사람 유방 암 세포주를 제외하고는, 평가된 세포 모두는 hROR1 발현에 대해 양성이다.
도 8은 형광성 활성화된 세포 분류(FACS)에 의해 측정된 유방 암 세포에서 발현된 내인성 hROR1에 대한 선택된 키메라 토끼/사람 IgG1의 결합 활성을 나타낸다. 사람 유방 암 세포주 MDA-MB-231은 hROR1을 발현하는 것으로 알려져 있고, 사람 유방 암 세포주 T47D는 hROR1에 대해 음성인 것으로 알려져 있다. 대조적으로, T47D는 ROR2 양성인 것으로 알려져 있는 반면, MDA-MB-231은 ROR-2 발현에 대해 음성인 것으로 알려져 있다. ERR1-Top54, ERR1-Top43, ERR1-324, XBR1-402는 선택된 항-hROR1 특이적인 mAb이었고, XBR2-401은 특이성 대조군으로서 사용된 hROR2 특이적인 mAb이었다. (A) 유방 암 세포에서 내인성 hROR1 및 hROR2의 발현을 상업적으로 이용가능한 염소 항-사람 ROR1 및 염소 항-사람 ROR2 폴리클로날 항체(R&D Systems) 각각을 사용하여 유동 세포분석법에 이어서, Alexa Fluor 647-접합된 AffiniPure F(ab')2 당나귀 항-염소 IgG (H+L) 폴리클로날 항체(Jackson ImmunoResearch Laboratories)로 검출하였다. 대조군 염색(staining)을 Alexa Fluor 647-접합된 AffiniPure F(ab')2 당나귀 항-염소 IgG (H+L) 폴리클로날 항체 단독으로 수행하였다. (B) ROR1 발현 사람 유방 암 세포주 MDA-MB-231 및 ROR2 발현 사람 유방 암 세포주 T47D에 대한 선택된 클론 ERR1-Top54, ERR1-Top43, ERR1-324, XBR1-402(모두 hROR1 특이적임) 및 XBR2-401(hROR2 특이적임)의 키메라 토끼/사람 IgG1의 결합을 제1 항체로서 키메라 토끼/사람 IgG1을 사용하고 제2 항체로서 APC-표지된 염소 항-사람 Fc-특이적인 폴리클로날 항체를 사용하여 유동 세포분석법로 분석하였다.
도 9는 웨스턴-블롯 실험에서 변성된 hROR1에 대한 키메라 토끼/사람 IgG1 XBR1-402 및 ERR1-TOP43(둘 다 hROR1 특이적임)의 결합 활성을 나타낸다. 세포 표면 K562 세포에서 발현된 hROR1 또는 정제된 단백질을 변성시키고 웨스턴 블롯팅으로 검출하였다. 웨스턴 블롯은 나타낸 바와 같이 다음의 샘플을 함유하였다: 레인 1: 완전한 길이의 hROR1을 이소성으로 발현하는 K562 세포. 레인 2: 형질감염되지 않은 K62 세포. 레인 3: hROR1의 정제된 세포외 도메인. 레인 4: hROR2의 정제된 세포외 도메인.
도 10은 재조합체, 정제된 hROR1(패널 A) 및 음성 대조군으로서 재조합체, 정제된 hROR2(패널 B)에 대한 선택된 클론 ERR1-301, XBR1-402, ERR1-306, ERR1-324, ERR1-403 및 ERR1-Top43의 선택된 hROR1 특이적인 토끼-사람-Fc 키메라 항체의 ELISA에 의해 분석된 결합을 나타낸다.
도 11은 본 발명에 개시된 부위-특이적으로 접합된 ADC가 생성되는 방법을 개략적으로 나타낸다. (A)는 제WO2014140317호에 개시된 바와 같은 소르타제-효소 매개된 항체 접합(sortase-enzyme mediated antibody conjugation: SMAC-기술)의 메카니즘을 개략적으로 나타낸다. 부위-특이적으로 접합된 ADC를 생성하기 위하여, 재조합체 항체를 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로부터의 소르타제 효소 A(SrtA)에 대한 인식 부위로서 제공되는, C-말단 펜타펩타이드 모티프(motif) LPXTG (서열 번호: 144)로 발현시킬 필요가 있다. 글리신 변형된 독소 기질을 항체 및 소르타제 A 효소를 함유하는 펩타펩타이드 모티프 LPXTG와 함께 항온처리하는 경우, 상기 소르타제 A 효소는 펩타이드전이 반응을 촉매하며 이에 의해 글리신-변형된 독소는 LPXTG 모티프의 C-말단 글리신을 대체시켜 나머지 LPXT(서열 번호: 147) 서열의 트레오닌에 공유결합으로 커플링된다. 당해 방식의 C-말단적으로 독소-접합된 ADC가 고 효율로 생성될 수 있다. (B)는 바람직한 독소인, 제WO2016102697호에 개시된 바와 같은, 안트라사이클린 구조의 C13에서 카보닐 그룹에 5x 글리신 스트레치(stretch)를 연결시키는 에틸렌-디아미노(EDA) 링커를 포함하는 PNU-159682 유도체의 구조를 나타낸다.
도 12는 (패널 A) 공지된 hROR1-표적화 ADC(2A2-G5-PNU, R12-G5-PNU) 및 본 발명에서 제공된 신규한 ADC(ERR1-Top43-G5-PNU)를 지닌 불멸화된 사람 유방 암 세포주 MDA-MB-468, 및 (패널 B) 공지된 hROR1-표적화 ADC(2A2-G5-PNU, R12-G5-PNU) 및 본 발명에서 제공된 신규한 ADC(XBR1-402-G5-PNU 및 ERR1-Top43-G5-PNU)를 지닌 불멸화된 사람 유방암 세포주 HS578T에서 수행된 시험관내(in vitro) 세포 사멸 검정에 대한 효능을 나타낸다. CD30 표적화 ADC Ac10-G5-PNU를 패널 둘 다에서 동형-매치된 대조군 ADC로서 사용하였다.
도 13은 항체 클론 2A2, R11 및 R12를 기반으로 하는 ADC, 및 본원에 개시된 항-ROR1-항체 클론 XBR1-402를 기반으로 하는 ADC를 포함하는 4개의 항-ROR1-PNU ADC를 지닌 ROR1 양성의 급성 림프성 백혈병 세포주 697의 세포 사멸에 대한 시험관내 잠재능을 나타낸다. 모든 항체는 토끼-사람(R11, R12, XBR-402) 또는 쥐-사람(2A2) 키메라 IgG1으로 나타낸다. (A)는 각각 ADC를 지닌 독소 페이로드 Gly5-EDA-PNU(G5-PNU로 약술)에 특이적으로 접합된 ADC의 농도 범위에 걸친 세포 사멸을 나타낸다. (B)는 각각의 항-ROR1 ADC에 대한 (A)에서의 곡선으로부터 계산된 세포 사멸에 대한 수치적 IC50 값을 나타낸다.
도 14는 Gly5-EDA-PNU 독소 페이로드(G5-PNU로 약술)에 대해 특이적으로 접합된 선택된 항-hROR1 ADC 부위를 사용한 ROR1 양성 ALL 세포주 Kasumi-2(A) 및 697(B)의 시험관내 세포 사멸을 나타낸다. ADC는 나타낸 바와 같이 항-ROR1 항체 클론 2A2 및 R12, 및 항-ROR1 클론 XBR1-402를 기반으로 한다. Gly5-EDA-PNU 독소 페이로드에 부위 특이적으로 접합된, HER-2 특이적인 트라스투주마브를 동형 매치된 대조군 ADC로서 사용하였다. 패널 C 및 D는 제1 항체로서 항체 2A2 대 동형-매치된 대조군 항체를 사용하여 FACS에 의해 분석된 Kasumi-2 및 697의 세포 표면에서 측정된 ROR1의 발현 수준을 나타낸다.
도 15. (A)는 EDA-Gly5-PNU ADC를 지닌 ROR1-양성 697의 산재성 마우스 모델에서 ADC의 생체내 효능을 나타낸다. 마우스(8마리의 동물의 그룹)에 106개의 697 사람 ALL 세포를 정맥내 이식하고 7 및 14일 후 항체 2A2 및 신규한 항체 XBR1-402를 기반으로 한 각각 1 mg/kg의 PNU-ADC, 또는 음성 대조군으로서, HER2-특이적인 항체 트라스투주마브를 기반으로 한 PNU-ADC로 처리하였다. 마우스의 그룹에서의 생존퍼센트를 시간에 따라 플롯팅하였다. (B)는 항-사람 Fcg 시약을 사용한 포획 및 항체 농도에 대한 항-카파-경쇄 검출 항체 및 ADC 농도에 대한 항-PNU 검출 항체를 사용한 검출을 사용하여 면역-계 ELISA 검정으로 측정한 12 및 19일 후 1 mg/kg을 제공받은 마우스에서 측정한 ADC의 혈장 농도를 나타낸다.
도 16. 패널 (A)는 둘 다 키메라 사람 IgG1 항체로서 발현된, 항-ROR1 항체 R12 및 신규한 항체 XBR1-402를 기반으로 한 부위-특이적으로 접합된 PNU-ADC를 사용하여 hROR1 형질감염된 마우스 유방 암 세포주 EMT6-클론14(EMT6-cl14로 약술)의 시험관내 세포 사멸을 나타낸다. HER2에 대해 특이적인 트라스투주마브-G5-PNU ADC를 동형-매치된 대조군 ADC로서 사용하였다. (B) 추가의 대조군으로서 동일한 ADC를 사용한 동일한 세포 사멸 실험을 또한 형질감염되지 않은(및 ROR1-음성) EMT6 모 세포에서 수행하였다. 패널(C)는 ROR1-특이적인 항체 2A2를 사용한 FACS에 의해 측정하는 경우 hROR1 형질감염된 EMT6 세포 대 hROR1 형질감염되지 않은 EMT6 세포에서 HROR1의 상대적인 발현을 나타낸다.
도 17. 각각 키메라 사람 IgG1 항체로서 발현된, 항-ROR1 항체 ms961 및 신규한 항체 XBR1-402 및 ERR1-324을 기반으로 한 부위-특이적으로 접합된 PNU-ADC를 지닌 hROR1 형질감염된 마우스 유방 암 세포주 EMT6-클론14(EMT6-cl.14로 약술)의 시험관내 세포 사멸을 나타낸다. HER2에 대해 특이적인 트라스투주마브-G5-PNU ADC를 동형-매치된 대조군 ADC로서 사용하였다.
도 18 (A)는 Balb/c 야생형 마우스의 유선 지방체(mammary fat pad)내로 이식된 hROR1 형질감염된 EMT6 마우스 유방 암 세포주를 사용하여 동소 마우스 유방 암 모델을 사용한 시험관내 효능 연구의 결과를 나타낸다. 상부 패널은 대조군 ADC 트라스투주마브-G5-PNU로 2회 처리한 마우스의 생존 곡선을 나타낸다. 중간 패널은 항-ROR1 항체 R12를 기반으로 한 PNU-ADC를 사용하여 처리한 마우스의 생존 곡선을 나타내고, 하부 패널은 신규한 항-ROR1 항체 XBR1-402을 기반으로 한 PNU-ADC로 처리한 마우스의 생존 곡선을 나타낸다. x-축 아래의 작은 삼각형은 종양의 이식 후 14 및 21일째에 각각 1 mg/kg의 각각의 ADC를 사용한 2회 처리를 나타낸다. (B)는 패널 (A)에 나타낸 3개 실험의 카플란-마이어 플롯(Kaplan-Meier Plot)을 나타낸다.
도 19는 전체 항체(실선) 또는 완전한 ADC(점선)를 검출하는 면역-계 ELISA 검정에 의해 분석한 NOD SCID 마우스 혈청(패널 A) 및 사람 혈청(패널 B)에서의 XBR1-402-G5-PNU ADC의 시험관내 안정성을 나타낸다.
도 20은 암컷 DC-1 마우스에서 평가한 신규한 네이키드(naked) 항-ROR1 항체 XBR1-402, 및 XBR1-402-G5-PNU ADC의 생체내 혈장 안정성을 나타낸다. 사람 Fc 검출 시약으로 검출한 총 IgG 및 PNU-특이적인 검출 시약으로 검출한 완전한 ADC의 면역-계 ELISA 검정에 의해 측정한 혈장 안정성이 나타나 있다.
도 21은 2개의 대조군 세포주 Kasumi-2 (사람 ALL 세포주) 및 A549 (사람 폐 암 세포주)으로부터의 분해물을 포함하는, 웨스턴-블롯 분석에 의한 hROR1 단백질 발현에 대한 상이한 환자 기원한 종양 분해물의 분석을 나타낸다. 환자-기원한 종양 분해물은 다음 정의 및 기원이다: PXF 1118: 가슴막중피종, RXF 486: 콩팥세포암종, PXF 541, 가슴막중피종, SXFS 1407: 신경섬유육종, CXF 533: 선암종.
도 22는 비히클 대조군으로 처리한 마우스와 비교하여 CXF533, RXF 486, PXF 1118, SXFS 1407 및 PXF 541 환자-기원한 종양 물질이 이식된 암컷 NMRI 누드 마우스에서 확립된 상이한 환자 기원한 종양 모델(PDX 모델)에서 부위-특이적으로 접합된 PNU-ADC의 효능을 나타낸다.
도 23은 신규한 항-ROR1 항체 XBR1-402로부터 기원한 사람화된 항체의 VH 및 VL 아미노산 서열을 나타낸다. 사람화된 가변 도메인(Vλ 및 VH)의 아미노산 서열 정렬은 카바트 번호매김을 사용하여 골격 영역(FR) 및 상보성 결정 영역(CDR)과 함께 나타낸다. HuXBR1-402(3), HuXBR1-402(8), HuXBR1-402(15), HuXBR1-402(17), HuXBR1-402(19), 및 HuXBR1-402(26)로 지정된 6개의 항체의 중쇄 가변 도메인 서열(각각 서열 번호: 130 내지 135) 및 경쇄 가변 도메인 서열(각각 서열 번호: 136 내지 141)이 도면에 나타나 있다.
도 24는 나타낸 것으로서 kon 및 koff 데이타를 포함하는 모 mAb XBR1-402의 신규한 사람화된 클론을 사용한 친화성 측정의 데이타를 제공한다.
도 25는 hROR1-표적화 모 XBR1-402-G5-PNU 및 사람화된 항체: huXBR1-402-3-G5-PNU, huXBR1-402-8-G5-PNU, huXBR1-402-15-G5-PNU, huXBR1-402-17-G5-PNU, huXBR1-402-19-G5-PNU 및 huXBR1-402-26-G5-PNU를 기반으로 한 ADC를 사용한 사람 697 ALL 암 세포에서 수행된 시험관내 세포 사멸 검정의 투여량-반응 곡선(패널 A)을 나타낸다. HER2-표적화 항체 트라스투주마브를 기반으로 한 PNU-ADC를 동형 대조군 ADC(Tras-G5-PNU)로서 사용하였다. 패널 B는 생체내 세포 사멸 효능(IC50)의 정량화를 나타낸다.
도 26은 ROR1-표적화 XBR1-402 CAR-T 및 R12 CAR-T의 시험관내 활성의 비교를 나타낸다.
도 27은 짧은 및 긴 스페이서를 지닌 ROR1-표적화 XBR1-402 CAR-T의 시험관내 활성의 비교를 나타낸다.
도 28은 레트로게닉스 세포 미세배열 플랫포옴(Retrogenix Cell Microarray Platform)을 사용하여, 키메라 토끼/사람 항-사람 ROR1 IgG1 XBR1-402 및 대조군으로서 키메라 토끼/사람 항-사람 ROR2 IgG1 XBR2-401의 특이성 분석의 개관을 제공한다.
도 29는 레트로게닉스 세포 미세배열 플랫포옴을 사용한 키메라 토끼/사람 항-사람 ROR1 IgG1 XBR1-402 및 대조군으로서, 키메라 토끼/사람 항-사람 ROR2 IgG1 XBR2-401의 특이성 분석을 나타낸다. 4,336개의 사람 혈장막 단백질(참고: 도 28)을 포함하는 거대 스크린으로부터의 주요 결합 히트(hit)를 단일 슬라이드 위에서 결합시키고 키메라 토끼/사람 항-사람 ROR1 IgG1 XBR1-402 및 대조군으로서, 키메라 토끼/사람 항-사람 ROR2 IgG1 XBR2-401 및 리툭시마브 바이오시밀러(biosimilar)로 염색하였다. 좌측의 ZsGreen1 시그날은 다양한 사람 막 단백질의 발현 수준을 나타낸다. 이들 각각의 항원(ROR1, ROR2, 및 CD20) 외에도, IgG1 양식으로 시험한 항체는 또한 예측한 바와 같이, Fcγ 수용체 FCGR3B (CD16B), FCGR1A (CD64A), 및 FCGR2A (CD32A)에 결합한다. 제2 항체 만을 사용한 염색은 예측한 바와 같이 사람 IgG3 중쇄 (IGHG3)를 검출한다.
상세한 설명
I. 개관
본 발명은 본 발명자들에 의한 거대한 나이브(naive) 키메라 토끼/사람 Fab 라이브러리의 생성 및 파아지 디스플레이를 통한 사람 ROR1에 대한 결합인자의 선택을 기술한다. 수용체 타이로신 키나제 오르판 수용체-1 및 -2, ROR1 및 ROR2는 전체 구조 설계 및 일부 기능적 유사성을 기반으로 하여, 새로운 수용체 타이로신 키나제 계열을 정의하는 단지 2개의 계열 구성원이다. ROR1 및 ROR2 단백질 둘 다는 면역글로불린 도메인, 시스테인이 풍부한 프리즐드 도메인 및 크링글 도메인으로 이루어진 세포외 도메인(ECD)을 지닌 제I형-단일 통과 전이막 수용체이다. 이들 3개의 세포외 도메인은 키나제 도메인을 포함하는 단백질의 세포내 부위에 ECD를 연결하는 전이막 도메인을 수반한다(Rabagay et al. (2012) Frontiers Oncol. 2: 1-8). 사람 ROR1 및 ROR2 단백질은 서로 58% 상동성이지만, ROR 단백질 각각은 종들 사이에서 고도로 보존되어 있다. 실제로 937 aa 길이의 단백질인 ROR1 단백질은 사람과 모든 서열분석된 비-사람 영장류 종 사이에서 98.5% 이상 동일하고 사람 및 마우스 및 토끼 ROR1 각각에서 심지어 96.7 및 96.3% 상동성이다(Borcherding et al. (2014) Protein Cell 5: 496-502). 따라서, 마우스 또는 토끼 면역화에 의해 고 품질의 항-ROR1 항체를 생성하기 위한 시도가 있어 왔으며 허용되는 친화성을 갖는 단지 매우 적은 공지된 항체가 존재한다. 예컨대, 제WO 2010/124188호(쥐 모노클로날 항체 2A2), 제WO 2012/075158호(토끼 항체 R11 및 R12), 제WO 2012/097313호(마우스 모노클로날 항체 D10) 및 제WO2014/031174호(mAb D10에 의한 것과 동일한 에피토프에 결합하는, 마우스 mAb 99961의 사람화된 버젼)를 참고한다.
마우스/토끼 ROR1과 사람 ROR1(mAb 2A2, R11, R12, D10 및 99961의 확인에서의 경우와 같이) 사이의 최대 분기(divergence)의 에피토프에 대하여 항체를 지시할 수 있는 마우스/토끼의 통상의 면역화/스크리닝에 의한 항-ROR1 항체의 생성을 반복하지 않기 위하여, 본 발명자들은 천연의 사람 ROR1 단백질과 반응성인 가장 기능적이고 다양한 항체 클론을 선택하기 위하여, 파아지에 의해 나타낸 매우 고도로-복잡한 나이브 토끼 항체 Fab 라이브러리를 생성하여 당해 라이브러리를 ROR1의 천연의 포유동물 재조합체 ECD 및 세포-표면 발현된 사람 ROR1에 대한 결합에 대해 스크리닝하였다. 당해 전략은 의도한 항체 레퍼토리가 여전히 천연의 토끼 B 림프구로부터 기원해서 면역계 예비-선택된 항체 중쇄 및 경쇄에 대해 선택되기 때문에 선택하였다. 그러나, 천연의 재조합 및 세포-발현된 사람 ROR1을 포함하는 적용된 스크리닝 전략으로 인하여, 우수한 발달성 및 기능적 품질을 지니고 특히 ROR1-양성 암과 같이, ROR1 발현과 관련된 사람 질환의 치료요법에 특히 유용한 hROR1 특이적인 항체를 확인할 수 있었다.
선택된 전략의 결과로서, 다양한 CDR1, 2 및 3 클론형(도 1)을 지니고 사람 ROR1에 대한 고 결합 선택성을 지니나, 이의 가장 관련된 "시스터 분자(sister molecule)"인, 사람 ROR2에 대해서는 고 결합 선택성을 지니지 않는(도 2, 3, 및 10) 다수의 신규한 토끼 고 -친화성 항-사람 ROR1 항체가 확인되었다. hROR1-특이적인 항체들 중 일부는 hROR1 표적에 대해 고 친화성(단일-자리 nM 친화성)을 나타내었다(도 6). 본원에 설명된 바와 같이, 상이한 중쇄 및 경쇄 서열을 지닌 키메라 토끼/사람 Fab 양식의 13개의 모노클로날 항체(mAb)가 수득되었다. 이들 mAb는 실험적으로 "XBR1-402", "ERR1-301", "ERR1-306", "ERR1-316", "ERR1-324", "ERR1-403", "ERR1-409", "ERR1-TOP4", "ERR1-TOP15", "ERR1-TOP22", "ERR1-TOP40", "ERR1-TOP43", 및 "ERR1-TOP54"로 명명되었다. 모든 13개의 항체는 ELISA에 의해 분석된 것으로서 정제된 사람 ROR1 및 유동 세포분석법으로 분석한 것으로서 세포 표면 사람 ROR1에 결합한다. 어느 것도 ROR1과 가장 관련된 ROR2에 결합하고, ROR1과 58% 아미노산 서열 동일성을 공유하지 않는다. 2개의 mAb("ERR1-306" 및 "ERR1-TOP22")는 사람 및 마우스 ROR1 둘 다에 결합하지만 나머지 11개의 mAb는 사람 ROR1에만 결합한다.
모든 13개의 mAb의 친화성은 바이오층 간섭계법(biolayer inferometry) 및 표면 플라스몬 공명으로 측정하였다. 또한, 7개의 mAb("ERR-301", "ERR-306", "ERR-403", "XBR1-402", "ERR1-324", "ERR1-TOP43", 및 "ERR1-TOP54")는 키메라 토끼/사람 IgG1 양식으로 전환하여, 포유동물 세포내에서 발현하고, 단백질 A 친화성 크로마토그래피로 정제하였다. 특히, 추가의 평가에서 최대 친화성 클론 XBR1-402 및 ERR1-TOP43은 사람 ROR1 과발현(도 3) 및 천연적으로 hROR1 발현하는 포유동물 세포(도 8)를 사용한 FACS에 의해 최대 염색 활성을 나타내었다. 2개의 상부-결합 클론 XBR1-402 및 ERR1-TOP43은 또한 웨스턴-블롯팅에 의해 변성된 ROR1 단백질을 검출할 수 있으므로(도 9), ROR1 발현 암에 대한 동반 진단제의 개발을 위한 이들 클론의 사용을 허용하였다.
또한, 수개의 mAb를 C-말단 소르타제-인식 태그를 지닌 키메라 토끼/사람 IgG1로서 발현시켜 필수적으로 제WO2014140317호에 기술된 바와 같은 소르타제-효소 매개된 항체 접합 기술(SMAC-technologyTM)에 의한 항체 C-말단에 대한 페이로드의 부위-특이적인 접합을 허용하였다. 이들 항-hROR1 항체는 이후에 고 잠재성의 안트라사이클린-계 PNU-159682 독소 유도체인, Gly5-EDA-PNU에 부위-특이적으로 접합하여(도 11, B) 필수적으로 제WO2016102679호(이는 본원에 참고로 포함되고 이의 내용은 본 출원에 대한 부록으로서 포함된다)에 개시된 바와 같은 고 잠재성의 항체 약물 접합체(ADC)를 생성하였다. 이들 ADC는 공지된 항-hROR1 항체를 기반으로 생성된 ADC에 대한 다양한 시험관내 및 생체내 종양 모델에서 평가하여 왔다. XBR1-402로 불리는 하나의 특별한 선도 클론(lead clone)은 다양한 공지된 항체(예컨대, 2A2(제WO 2010/124188호로부터), R11, R12(둘 다 제WO 2012/075158호로부터), 또는 ms961(제WO 2014/031174호로부터)와 비교하여 최대 잠재능 및 효능을 나타내었음이 관찰되었고, 이는 네이키드 IgG1 mAb로서 CLL에서 현재 임상 시도 중인, 사람화된 항-hROR1 mAb 시름투주마브(cirmtuzumab)의 기본을 형성한다.
ADC와 같이 종양 세포 사멸의 기능성의 측면에서 동종 최상인 특성을 기반으로 하여, 선도 클론 XBR1-402가 이후에 사람화되었으며, 이는 "huXBR1-402-3", "huXBR1-402-8", "huXBR1-402-15", "huXBR1-402-17", "huXBR1-402-19" 및 "huXBR1-402-26"로 불리는, hROR1에 대해 추가의 증가된 친화성을 지닌 몇가지 사람화된 클론을 생성하였다. 선도 클론 XBR1-402의 이들 사람화된 버젼은 또한 부위 특이적으로 접합된 PNU-ADC로서 평가되었으며 이들 각각은 시험관내 hROR1 종양 모델에서 또한 개선된 종양 세포 사멸을 나타내었다.
ROR1-표적화 mAb의 치료학적 용도를 추가로 시험하기 위하여, XBR1-402를 기반으로 하는 CAR-T 세포를 공지된 ROR1-표적화 mAb R11 및 R12 (Hudecek, M., Lupo-Stanghellini, M. T., Kosasih, P. L., Sommermeyer, D., Jensen, M. C., Rader, C., and Riddell, S. R. (2013) Receptor affinity and extracellular domain modifications affect tumor recognition by ROR1-specifc chimeric antigen receptor T cells. Clin. Cancer Res. 19, 3153-3164)에 대해 앞서 기술된 방법을 사용하여 가공하였다. 요약하면, 생체외(ex vivo) 확장된 건강한 공여체 CD8+ CD62L+ T 세포를, XBR1-402를 함유하는 EF1α 프로모터-구동된 발현 카세트를 scFv 양식으로, 이어서 짧거나 긴 스페이서(spacer), 사람 CD28의 전이막 도메인, 4-1BB의 시그날링 도메인, CD3ζ의 시그날링 도메인, 및 트렁케이트된 리간드 결합 및 타이로신 키나제 도메인을 지닌 T2A-분리된 전이막 EGFR 단편을 사용하여 렌티바이러스적으로 형질도입하였다. EGFR+ 형질도입된 T 세포의 FACS 분리는 >90%의 CAR-T 세포에서 강한 항-ROR1 인식을 나타내었다. 짧은 스페이서를 지닌 ROR1-표적화 XBR1-402 CAR-T의 활성을 유방 암 세포주 MDA-MB-231(ROR1+ ROR2-) 및 T47D(ROR1-ROR2+)에 대해 시험하였다. ROR1+ ROR2의 존재 하에서, 그러나 ROR1-ROR2+ 표적 세포의 부재 하에서, XBR1-402 CAR-T는 신속하게 증식하여, IFN-γ 및 IL-2를 대량으로 분비하였으며, 시험관내에서 표적 세포를 강력하게 사멸시켰다(도 26). 특히, 직접적인 비교시,XBR1-402 CAR-T는 동일하게 짧은 스페이서 및 시그날링 도메인을 사용한 임상적으로 시험된 R12 CAR-T와 동일하거나 이보다 더 강력함이 밝혀졌다.
더욱이, 본 발명자들은 T 세포와 표적 세포 사이의 최적의 거리가 보다 짧은 스페이서를 사용하여 CAR-T 세포 표적화 막-말단 에피토프(distal epitope)를 장착함으로써 및 이의 역으로 장착함으로써 달성될 수 있다고 가설을 세웠다. 당해 가설을 기반으로 하여, R12와의 오버래핑 에피토프를 갖는 XBR1-402 CAR-T가 긴 스페이서에 비하여 짧은 스페이서를 사용하여 장착되는 경우 보다 활성일 것으로 예측된다. 실제로, ROR1+ ROR2-표적 세포의 존재하에서, 짧은 링커를 지닌 XBR1-402 CAR-T는 긴 스페이서를 지닌 XBR1-402 CAR-T보다 더 신속하게 증식하였으며(도 27) 또한 유의적으로 보다 많은 IFN-γ 및 IL-2를 분비하였다. 그러나, 시험관내 세포독성은 동일하게 강력한 것으로 밝혀졌다(도 27).
이들 연구에 따라서, 본 발명은 ROR1을 특이적으로 인식하는 신규한 모노클로날 토끼 및 사람화된 항체 및 관련된 항체-계 결합 단백질 및 이의 항체 단편, 및 시험관내 및 생체내에서 hROR1 발현 종양 모델에서 특이적인 항-종양 활성을 지닌 항체 약물 접합체 및 CAR를 제공한다. 또한 본 발명에서 비정상적이거나 상승된 ROR1 발현을 지닌 질환 및 상태, 예컨대 암에 대한 치료학적 및 진단학적 적용에 있어서 이들 항체 제제를 사용하는 방법이 제공된다.
본 발명의 항체 및 관련된 조성물은 다른 놀랄만하게 유리한 특성을 입증하였다. 다양한 시험관내 및 생체내 모델을 사용하는, 매우 강력한 PNU-안트라사이클린 페이로드를 사용하는 부위-특이적으로 접합된 ACD로서 신규한 클론의 기능적 평가는 특히 신규한 클론 XBR1-402가 공지된 항체 중 어느 것보다 더 우수하게 수행하였음을 나타내었다. 예를 들면, R11-계 ADC는 시험관내 종양 모델에서 이미 제한된 잠재능을 가졌다(도 13). 항체 클론 99961(ms961), 2A2 및 R12와 비교하여, 본원에 기술된 신규한 XBR1-402는 또한 시험관내 종양 모델에서 보다 우수하게 일관적으로 수행하였으며(도 13, 14, 17), 이는 심지어 생체내 종양 모델에서 보다 명확하였다(도 15 & 18). 4,336개의 사람 혈장막 단백질에 대해(도 29), 및 평가된 마우스 혈장 및 다른 혈청(도 15 B, 도 19 및 도 20)에서 ADC의 양호한 안정성을 시험하는 경우, ROR1의 이의 매우 특이적인 인식 측면에서 XBR1-402 클론의 양호한 특성과 함께, XBR1-402-계 ADC는 ADC 치료요법에 대한 높은 잠재력을 지닌 동종최상의 항-ROR1 표적화 생성물의 잠재력을 갖는 것으로 여겨진다.
또한, 항-ROR1 mAb XBR1-402의 사람화된 버젼은 예측치 않게도 모 토끼 클론 XBR1-402에 대해 훨씬 더 높은 친화성을 나타내었는데(도 24), 이는 친화성이 흔히 비-사람 항체의 사람화 공정 동안 감소되기 때문이다(Margreitter et al. (2016) J. Mol. Recognit. 29: 266-275). 증가된 친화성은 또한 ACD와 같은 항-종양 활성에 대해 평가하는 경우 이들 사람화된 mAb의 개선된 잠재력과 관련된다(도 25). 이들 데이타는 사람 질환의 치료요법을 위한 사람화된 XBR1-402 항체를 기반으로 하여, 평가된 항-ROR1 ADC의 높은 잠재력을 입증한다. XBR1-402 및/또는 사람화된 XBR1-402를 기반으로 한 PNU-ADC의 효과적인 종양 치료요법에 대한 이러한 높은 잠재력은 다양한 hROR1 발현 환자 기원한 이종이식체 모델에서 XBR1-402 기반 ADC의 높은 효능에 의해 뒷받침된다(도 22).
본원에 기술된 고도로 기능성인 항-hROR1 항체 및 관련된 조성물은 ROR1 발현과 관련된 사람 암의 치료요법에서 치료학적 제제로서 사용하기 위한 필수적인 기능적 특성을 나타내었다. 이들은 본원에 기술된 다양한 hROR1 항체, 항체 단편, 항체-계 결합 단백질, ADC 또는 CAR를 포함하며, 이는 본원에 예시된 구체적인 항체(예컨대, XBR1-402)에 의해 입증된 바와 같이 동일하거나 필수적으로 동일한 결합 특성을 갖는다. 따라서, 본원에 예시된 항체에 의해 입증된 양호한 특성 및 높은 치료학적 잠재력은 본 발명에 개시된 상동성 항체, 항체 단편, 항체-계 결합 단백질, ADC, 다양한 중쇄 및/또는 경쇄의 CDR 서열 중 일부 또는 모두를 함유하는 CAR, 또는 본 발명에 개시된 다양한 중쇄 및/또는 경쇄의 필수적으로 유사한 CDR 서열로 확장될 수 있다. 양호한 특성 및/또는 높은 치료학적 잠재력은 또한 개시된 항체의 2개의 면역글로불린 쇄들 중 하나(즉, 중쇄 또는 경쇄), 또는 예시된 항체에 대해 상동성인 2개의 면역글로불린 쇄들 중 하나(즉, 중쇄 또는 경쇄)를 단지 함유하는 CAR로 확장될 수 있다.
II. 정의
달리 정의하지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속한 당해 분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 하기한 참고문헌들은 본 발명에서 사용된 많은 용어들의 일반적인 정의를 숙련가에게 제공한다: Academic Press Dictionary of Science and Technology, Morris (Ed.), Academic Press (1st ed., 1992); Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, Smith et al. (Eds.), Oxford University Press (revised ed., 2000); Encyclopaedic Dictionary of Chemistry, Kumar (Ed.), Anmol Publications Pvt. Ltd. (2002); Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, Singleton et al. (Eds.), John Wiley & Sons (3rd ed., 2002); Dictionary of Chemistry, Hunt (Ed.), Routledge (1st ed., 1999); Dictionary of Pharmaceutical Medicine, Nahler (Ed.), Springer-Verlag Telos (1994); Dictionary of Organic Chemistry, Kumar and Anandand (Eds.), Anmol Publications Pvt. Ltd. (2002); 및 A Dictionary of Biology (Oxford Paperback Reference), Martin and Hine (Eds.), Oxford University Press (4th ed., 2000). 또한, 다음의 정의는 본 발명의 실시에서 독자들을 보조하기 위해 제공된다.
"면역글로불린" (Ig), 또는 "항원-결합 단편"으로 또한 동의어로 불리는 용어 "항체"는 제공된 항원, 에피토프 또는 에피토프들에 결합하는 강력한 1가, 2가 또는 다가 결합을 나타내는 폴리펩타이드 쇄(들)을 말한다. 달리 나타내지 않는 한, 본 발명에서 사용된 항체 또는 항원-결합 단편은 어떠한 척추동물 종으로부터 기원한 서열도 가질 수 있다. 이들은 어떠한 적합한 기술, 예를 들면, 하이브리도마 기술, 리보소옴 디스플레이, 파아지 디스플레이, 유전자 셔플링 라이브러리(gene shuffling library), 반-합성 또는 완전 합성 라이브러리 또는 이의 조합을 사용하여 생성할 수 있다. 달리 나타내지 않는 한, 본 발명에 사용된 바와 같은 용어 "항체"는 하기 기술되거나 당해 분야에 잘 공지된 완전한 항체, 항원-결합 폴리펩타이드 단편 및 다른 설계자 항체(designer antibody)를 포함한다(참고: 예를 들면, Serafini, J Nucl. Med. 34:533-6, 1993).
완전한 "항체"는 전형적으로 이황화물 결합에 의해 내부-연결된 적어도 2개의 중(H) 쇄(약 50-70 kD) 및 2개의 경(L) 쇄(약 25 kD)를 포함한다. 항체 쇄를 암호화하는 인식된 면역글로불린 유전자는 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 엡실론, 및 뮤(mu) 고정 영역 유전자, 및 또한 미리아드(myriad) 면역글로불린 가변 영역 유전자를 포함한다. 경쇄는 카파 또는 람다로 분류된다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타, 또는 엡실론으로 분류되며, 이는 최종적으로 면역글로불린 부류, IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE 각각을 정의한다.
항체의 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(VH) 및 중쇄 불변 영역(constant region)으로 구성된다. 대부분의 IgG 동형(소 부류)의 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3으로 구성되며 IgM 또는 IgE와 같은 일부 IgG 동형은 제4의 불변 영역 도메인, CH4를 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (VL) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인, CL로 구성된다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포 및 전통적인 상보체 시스템의 제1 성분(Clq)을 포함하는, 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
항체의 VH 및 VL 영역은 또한 보다 보존된 골격 영역(FR) 사이에 배치된, 또한 상보성 결정 영역(CDR)으로 명명된, 초가변성 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 다음의 순서로 아미노-말단으로부터 카복실-말단까지 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. CDR 및 FR 영역의 위치 및 번호매김 시스템은 예컨대, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office (1987 and 1991)에 의해 정의되어 있다.
본원에 사용된 바와 같은, "항체-계 결합 단백질"은 다른 비-면역글로불린, 또는 비-항체 기원한 성분의 맥락에서 적어도 하나의 항체-기원한 VH, VL, 또는 CH 면역글로불린 도메인을 함유하는 어떠한 단백질도 나타낼 수 있다. 이러한 항체-계 단백질은 (i) 면역글로불린 CH 도메인의 모두 또는 일부를 지닌 수용체 또는 수용체 성분을 포함하는 결합 단백질의 Fc-융합 단백질, (ii) VH 및/또는 VL 도메인이 대안적 분자 스캐폴드에 커플링된 결합 단백질, 또는 (iii) 면역글로불린 VH, 및/또는 VL, 및/또는 CH 도메인이 천연적으로 존재하는 항체 또는 항체 단편에서 일반적으로 발견되지 않는 양식으로 조합되고/되거나 조립된 분자를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
"결합 친화성"은 일반적으로 평형 연합 또는 해리 상수(각각 KA 또는 KD) 측면에서 표현되며, 이는 궁극적으로 해리 및 연합 속도 상수(각각 koff 및 kon)의 역 비(reciprocal ratio)이다. 따라서, 등가 친화성은 속도 상수의 비가 동일하게 남아있는 한, 상이한 속도 상수에 상응할 수 있다. 항체의 결합 친화도는 일반적으로 항체의 1가 단편(예컨대, Fab 단편)의 KD로 표시되며, 단일 자리수 나노몰 범위 이하(나노몰 이하 또는 피코몰)의 KD 값은 치료학적 및 진단학적 관련성이 매우 높은 것으로 고려된다.
본원에 사용된 것으로서 용어 "결합 특이성"은 항원(또는 이의 에피토프 또는 항원 결정인자)에 대한 항체, 리간드에 대한 수용체, 및 기질에 대한 효소의 결합과 같은 다른 분자에 대한 하나의 분자의 선택적인 친화성을 말한다. 따라서, 실체의 특수한 항원성 결정인자(예컨대, ROR1 또는 ROR2의 특이적인 에피토프)의 특수한 항원성 결정인자에 결합하는 모든 모노클로날 항체는 이러한 실체에 대해 동일한 결합 특이성을 갖는 것으로 고려된다.
용어 "항체 약물 접합체", 또는 "ADC"는 치료학적 활성 물질 또는 활성 약제학적 성분(API)이 공유결합으로 커플링됨으로써, 치료학적으로 활성인 물질 또는 활성인 약제학적 성분(API)이 이의 약리학적 기능을 나타내기 위해 항체의 결합 표적에 대해 표적화될 수 있는 항체를 말한다. 치료학적 활성 물질 또는 활성 약제학적 성분은 ADC에 의해 표적화된 세포, 바람직하게는 악성 세포 또는 암 세포를 사멸시킬 수 있는 세포 독소일 수 있다. 치료학적 활성 물질, 활성 약제학적 성분 또는 세포 독소의 공유결합적 부착은 페이로드를 라이신 또는 시스테인 잔기에 커플링시키는 표준 화학 링커를 사용하여 비-부위 특이적인 방식으로 수행될 수 있거나, 바람직하게는 접합은 부위-특이적인 방식으로 수행되며, 이는 접합 부위 및 생성될 ADC의 약물 대 항체 비(DAR)를 완전히 조절하도록 한다.
용어 "보존적으로 변형된 변이체"는 아미노산 및 핵산 서열 둘 다에 적용된다. 특수한 핵산 서열과 관련하여, 보존적으로 변형된 변이체는 동일하거나 필수적으로 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 지칭하거나, 핵산이 아미노산 서열을 암호화하지 않는 경우, 필수적으로 동일한 서열을 지칭한다. 유전 코드의 축퇴(degeneracy)로 인하여, 거대한 수의 기능적으로 동일한 핵산은 특정의 제공된 단백질을 암호화한다. 예를 들면, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU 모두는 아미노산 알라닌을 암호화한다. 따라서, 알라닌이 코돈에 의해 구체화된 경우의 모든 위치에서, 당해 코돈은 암호화된 폴리펩타이드를 변경시키지 않으면서 기술된 상응하는 코돈 중 어느 것으로 변경될 수 있다. 이러한 핵산 변이는 "사일런트 변이(silent variation)"이며, 이는 보존적으로 변형된 변이의 하나의 종(species)이다. 본원에서 폴리펩타이드를 암호화하는 각각의 핵산 서열은 또한 핵산의 모든 가능한 사일런트 변이를 기술한다. 숙련가는 핵산내 각각의 코돈(주로 메티오닌에 대한 유일한 코돈인 AUG, 및 주로 트립토판에 대한 유일한 코돈인 TGG는 제외)을 변형시켜 기능적으로 동일한 분자를 수득할 수 있음을 인식할 것이다. 따라서, 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 각각의 사일런트 변이는 각각 기술된 서열내에 내포되어 있다.
폴리펩타이드 서열의 경우, "보존적으로 변형된 변이체"는 보존적인 아미노산 치환, 유사한 전하를 지닌 측쇄를 갖는 다른 아미노산으로 대체된 아미노산 잔기를 갖는 변이체를 지칭한다. 유사한 전하를 지닌 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 계열은 당해 분야에 정의되어 왔다. 이들 계열은 염기성 측쇄(예컨대, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예컨대, 아스파르트산, 글루탐산), 하전되지 않은 극성 측쇄(예컨대, 글리신, 아르파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 타이로신, 시스테인), 비극성 측쇄(예컨대, 알라닌, 발린, 루이신, 이소루이신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-측쇄된 측쇄(예컨대, 트레오닌, 발린, 이소루이신) 및 방향족 측쇄(예컨대, 타이로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 지닌 아미노산을 포함한다.
용어 "접촉"은 이의 보통의 의미를 가지며 2개 이상의 제제(예컨대, 폴리펩타이드 또는 파아지), 결합제 및 세포를 결합하거나, 상이한 세포의 2개 집단을 결합하는 것을 말한다. 접촉은 시험관내에서, 예컨대, 시험 튜브 또는 성장 배지 속에서 항체 및 세포를 혼합하거나 항체의 집단과 세포의 집단을 혼합시켜 발생시킬 수 있다. 접촉은 또한 세포내에서 또는 반응계내에서(in situ), 예컨대, 2개의 폴리펩타이드를 암호화하는 재조합체 폴리뉴클레오타이드의 세포 속에서, 또는 세포 분해물 속에서 동시-발현에 의해 세포 속에서 2개의 폴리펩타이드를 접촉시켜 발생시킬 수 있다. 접촉은 또한 대상체 내에서 생체내에서, 예컨대, 제제를 표적 세포에 전달하기 위해 제제를 대상체에게 투여함으로써 발생시킬 수 있다.
"사람화된 항체"는 Gao et al. (2013) BMC Biotechnol. 13, pp. 55에 정의된 바와 같은, T20 점수가 80 초과인 사람 VH 또는 VL 항체 골격에 대해 상동성인 항체 VH 또는 VL 도메인을 포함하는 항체 또는 항체 단편, 항원-결합 단편, 또는 항체-계 결합 단백질이다.
2개 이상의 핵산 또는 폴리펩타이드 서열의 맥락에서, 용어 "동일한" 또는 "동일성" 퍼센트는 동일한 2개 이상의 서열 또는 서브서열을 지칭한다. 2개의 서열이 비교 윈도우(comparison window)에 걸쳐 최대 상응성에 대해 비교하거나 정렬되거나, 다음의 서열 비교 알고리즘들 중 하나를 사용하거나 수동 정렬 및 가시적 관찰에 의해 측정된 바와 같은 영역을 지정하는 경우, 동일한(즉, 구체적인 영역에 걸쳐, 또는 구체화되지 않은 경우, 전체 서열에 걸쳐 60% 동일성, 임의로 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 동일성) 구체화된 퍼센트의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드를 갖는 경우, 이들 2개의 서열은 "실질적으로 동일"하다. 임의로, 동일성은 길이가 적어도 약 50개 뉴클레오타이드(또는 10개의 아미노산)인 영역에 걸쳐, 또는 보다 바람직하게는 길이가 100 내지 500개 또는 1000개 이상의 뉴클레오타이드(또는 20, 50, 200개 이상의 아미노산)인 영역에 걸쳐 존재한다.
비교를 위한 서열의 정렬 방법은 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 비교를 위한 서열의 최적의 정렬을 예를 들면, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482c, 1970의 국소 상동성 알고리즘에 의해; Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970의 상동성 정렬 알고리즘에 의해; Pearson and Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988의 유사성 방법에 대한 조사에 의해; 이들 알고리즘의 컴퓨터화된 실행에 의해(Wisconsin Genetics Software Package에서 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA, Genetics Computer Group, 위스콘신주 매디슨 소재); 또는 수동 정렬 및 가시적 관찰(참고: 예컨대, Brent et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (ringbou ed., 2003))에 의해 수행될 수 있다. 서열 동일성 퍼센트 및 서열 유사성에 적합한 알고리즘의 2개의 예는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이며, 이는 Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, 1977; 및 Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990에 각각 기술되어 있다.
용어 "대상체"는 사람 및 비-사람 동물(특히, 비-사람 포유동물)을 지칭한다. 용어 "대상체"는 본원에서, 예를 들면, 치료 및 진단 방법과 관련하여, 사람 또는 동물 대상체를 지칭하기 위해 사용된다. 동물 대상체는 CLL, ALL, 외투 세포 림프종, 신경아세포종, 육종, 신장 세포 암종, 유방 암, 폐 암, 결장 암, 두경부암, 흑색종, 및 다른 암과 같은 상승된 ROR1 발현과 관련된 상태 또는 장애의 포유동물 모델과 같은 동물 모델을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 비-사람 대상체의 다른 구체적인 예는 예컨대, 소, 말, 양, 돼지, 고양이, 개, 마우스, 랫트, 토끼, 기니 피그(ginea pig), 원숭이를 포함한다.
인공 T 세포 수용체(또한 키메라 T 세포 수용체, 키메라 면역수용체, 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 T-보디(body)로 공지됨)는 가공된 수용체이며, 이는 면역 효과기 세포로 임의의 특이성을 이식한다. 전형적으로, 이들 수용체는 모노클로날 항체의 특이성을 T 세포로 이식하기 위해 사용되며; 이들의 암호화 서열의 전달은 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터에 의해 또는 트랜스포존(transposon)에 의해 촉진된다. CAR-가공된 T 세포(또한 CAR-T 세포로 약술)는 이의 세포외 인식 단위가 항체-기원한 인식 도메인으로 구성되고 이의 세포내 영역이 하나 이상의 림프구 자극 모이어티(moeity)로부터 기원하는 키메라 수용체를 사용하여 아암(arm) 처리된 유전적으로 가공된 T 세포이다. 원형(prototypic) CAR의 구조는 다양한 기능성 도메인을 수용함으로써 T 세포의 특이성 및 조절된 활성화의 선택이 가능하도록 설계된, 모듈러(modular)이다. 바람직한 항체-기원한 인식 단위는 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 둘 다의 특이성 및 결합 잔기를 결합시키는 단쇄 가변 단편(scFv)이다. 가장 일반적인 림프구 활성화 모이어티는 T-세포 트리거화(triggering)(예컨대, CD3zeta) 모이어티와 나란한 T-세포 공자극(예컨대, CD28) 도메인을 포함한다. 이러한 키메라 수용체를 사용하여 효과기 림프구(예를 들면, T 세포 및 천연 킬러 세포)에 아암을 처리함으로써, 가공된 세포를 비-HLA 제한된 방식으로, 어떠한 바람직한 표적 항원에 대해서도 예비-정의된 특이성으로 재-지시한다. CAR 작제물은 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터 또는 트랜스포존을 사용하여 제공된 환자의 말초 림프구로부터 T 세포내로 생체외(ex vivo) 도입시킨다. 수득되는 CAR-가공된 T 세포를 환자내로 다시 주입한 후, 이들이 교섭(traffic)하여, 이들의 표적 부위에 이르고 이들의 표적 세포 또는 조직과 상호작용하면, 이들은 활성화를 겪고 이들의 예정된 효과기 기능을 수행한다. CAR 시도를 위한 치료학적 표적은 암 및 HIV-감염된 세포, 또는 자가면역 효과기 세포를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "치료하다", "치료하는", "치료", 및 "치료학적으로 유효한"은 필수적으로 100% 또는 완전한 치료를 내포하지 않는다. 오히려, 당해 분야의 통상의 기술자는 잠재적인 이점 또는 치료학적 효과를 가지는 것으로 인식된 다양한 정도의 치료가 존재한다. 이와 관련하여, 본 발명의 방법은 어떠한 치료 수준의 어떠한 양으로도 제공될 수 있다. 또한, 본 발명에 의해 제공된 치료는 치료되는 질환의 하나 이상의 상태 또는 증상의 치료를 포함한다.
"벡터"는 다른 폴리뉴클레오타이드 분절이 부착하여 부착된 분절의 복제를 유발할 수 있는 플라스미드, 파아지 또는 코스미드와 같은 레플리콘(replicon)이다. 하나 이상의 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자의 발현을 지시할 수 있는 벡터는 "발현 벡터"로 지칭된다.
III. ROR1 및 관련 유도체 화합물에 특이적으로 결합하는 항체, 항체-계 결합 단백질, 이의 항체 단편, 항체 약물 접합체(ADC), 또는 CAR
일 국면에서, 본 발명은 본원에 예시된 항-ROR1 항체의 결합 특이성과 동일한 결합 특이성을 갖는 사람 ROR1에 특이적으로 결합하는 신규한 항체, 항체-계 결합 단백질, 이의 항체 단편, ADC 또는 CAR을 제공한다(도 1 및 23). 본 발명의 항체는 완전한 항체(예컨대, 본원에 예시된 IgG1 항체), 동족 항원, ROR1에 결합하는 능력을 보유하는 완전한 항체의 항원-결합 부위를 함유하는 항체 단편 또는 항원-결합 단편(예컨대, 본원에 예시된 Fab 단편), 항체-계 결합 단백질, ADC 및 CAR을 포함한다. 이러한 항체 단편의 예는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편인, Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 이황화물 브릿지(disulfide bridge)에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인, F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 완전한 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (v) 구조적으로 보존된 골격 영역들 사이에서 가공된 쇄간(interchain) 이황화물 결합을 갖는 이황화물 안정화된 Fv(dsFv); (vi) VH 또는 VL 도메인으로 이루어진 단일 도메인 항체(dAb)(참고: 예컨대, Ward et al., Nature 341:544-546, 1989); 및 (vii) 선형 또는 사이클릭 펩타이드로서 분리된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 항체-계 결합 단백질의 예는 항체의 결합 도메인이 다른 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 도메인, 예컨대, 대안적 분자 스캐폴드(scafold), Fc-영역, 추가의 결합 특성을 지닌 분자, 예컨대, 이- 또는 다-특이적 단백질 또는 항체를 생성하는 다른 펩타이드 또는 항체의 다른 기능성 또는 결합 도메인과 결합된 폴리펩타이드이다. 이러한 폴리펩타이드는 천연적으로 존재하는 항체 또는 항체 단편에서는 일반적으로 발견되지 않는 결합 또는 기능성 도메인의 배열을 창조할 수 있다.
본 발명의 항체는 또한 단일 쇄 항체(single chain antibody)와 같은 항체 단편(또는 "항원-결합 단편")을 포함한다. 용어 "단일 쇄 항체"는 스페이서 펩타이드를 통해 일반적으로 연결된 폴리펩타이드 연결내에 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하는 폴리펩타이드을 지칭하며, 이는 아미노- 및/또는 카복실-말단에서 추가의 도메인 또는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 단일 쇄 항체는 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 연결시키기 위한 테써 분절(tether segment)을 포함할 수 있다. 예로서, 단일 쇄 가변 영역 단편(scFv)은 단일 쇄 항체이다. 별도의 유전자에 의해 암호화되는 Fv 단편의 VL 및 VH 도메인과 비교하여, scFv는 합성 링커에 의해 연결된(예컨대, 재조합 방법을 통해) 2개의 도메인을 갖는다. 이는 이들이 단일 단백질 쇄로 제조되도록 하며, 여기서 VL 및 VH 영역은 쌍을 이루어 1가 분자를 형성한다.
본 발명의 항체는 또한 단일 도메인 항원-결합 단위를 포함하며, 이는 카멜리드 스캐폴드(camelid scaffold)를 갖는다. 카멜리드 계열의 동물은 낙타, 라마, 및 알파카를 포함한다. 카멜리드는 경쇄가 없는 기능성 항체를 생산한다. 중쇄 가변(VH) 도메인은 자체적으로 겹쳐서 항원-결합 단위로서 독립적으로 기능한다. 이의 결합 표면은 전통적인 항원-결합 분자(Fab) 또는 단일 쇄 가변 단편(scFv)에서 6개의 CDR과 비교하여 단지 3개의 CDR을 포함한다. 카멜리드 항체는 통상의 항체의 것과 비교가능한 결합 친화성을 획득할 수 있다.
본원에 기술된 다양한 항체, 항체-계 결합 단백질, 및 이의 항체 단편은 완전한 항체의 효소적 또는 화학적 변형에 의해 생산될 수 있거나, 재조합체 DNA 방법론을 사용하여 새로이(de novo) 합성될 수 있거나 또는 파아지 디스플레이 라이브러리를 사용하여 확인할 수 있다. 이들 항체, 항체-계 결합 단백질, 및 이의 항체 단편을 생성하는 방법은 당해 분야에 잘 알려져 있다. 예를 들면, 단일 쇄 항체는 파아지 디스플레이 라이브러리 또는 리보소옴 디스플레이 라이브러리, 유전자 셔플드 라이브러리(gene shuffled library)를 사용하여 확인할 수 있다(참고: 예를 들면, McCafferty et al., Nature 348:552-554, 1990; 및 미국 특허 제4,946,778호). 특히, scFv 항체는 예컨대, Bird et al., Science 242:423-426, 1988; 및 Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883, 1988에 기술된 바와 같이 수득할 수 있다. Fv 항체 단편은 Skerra and Pl
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ckthun, Science 240:1038-41, 1988에 기술된 바와 같이 생성할 수 있다. 이황화물-안정화된 Fv 단편(dsFv)은 예컨대, Reiter et al., Int. J. Cancer 67:113-23, 1996에 기술된 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 유사하게, 단일 도메인 항체(dAb)는 예컨대, Ward et al., Nature 341:544-546, 1989; 및 Cai and Garen, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:6280-85, 1996에 기술된 다양한 방법으로 생산할 수 있다. 카멜리드 단일 도메인 항체는 당해 분야, 예컨대, Dumoulin et al., Nat. Struct. Biol. 11:500-515, 2002; Ghahroudi et al., FEBS Letters 414:521-526, 1997; 및 Bond et al., J. Mol. Biol. 332:643-55, 2003에 잘 공지된 방법을 사용하여 생산할 수 있다. 다른 유형의 항원-결합 단편(예컨대, Fab, F(ab')2 또는 Fd 단편)은 또한 통상적으로 실시된 면역학 방법으로 용이하게 생산할 수 있다. 예컨대, Harlow & Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1998을 참고한다.
본 발명의 항체는 또한 Gao et al. (2013) BMC Biotechnol. 13, pp. 55에 의해 정의된 바와 같이, 바람직하게는 T20 점수가 80 초과인, 설치류 VH 또는 VL 도메인보다 사람 항체 VH 또는 VL 도메인에 대해 사람화된 항체 VH 또는 VL 도메인의 아미노산 수준에서 보다 높은 상동성을 지닌 사람화된 항체를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체, 항체 단편, 항체-계 결합 단백질, ADC 또는 CAR은 도 1 또는 도 23에 나타낸 항체의 것과 실질적으로 동일한 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 갖는다. 예시된 항체의 경쇄 및 중쇄 CDR 서열은 모두 도면에 나타나 있다. 이들 구현예 중 일부에서, 항체, 항체 단편, 항체-계 결합 단백질, ADC 또는 CAR은 각각 (1) 서열 번호: 27 내지 29와 실질적으로 동일한 중쇄 CDR1-3 서열; 및 각각 서열 번호: 66 내지 68과 실질적으로 동일한 경쇄 CDR1-3 서열; (2) 각각 서열 번호: 30 내지 32와 실질적으로 동일한 중쇄 CDR1-3 서열; 및 각각 서열 번호: 69 내지 71과 실질적으로 동일한 경쇄 CDR1-3 서열; (3) 각각 서열 번호: 33 내지 35와 실질적으로 동일한 중쇄 CDR1-3 서열; 및 각각 서열 번호: 72 내지 74와 실질적으로 동일한 경쇄 CDR1-3 서열; (4) 각각 서열 번호: 36 내지 38과 실질적으로 동일한 중쇄 CDR1-3 서열; 및 각각 서열 번호: 75 내지 77과 실질적으로 동일한 경쇄 CDR1-3 서열; (5) 각각 서열 번호: 39 내지 41과 실질적으로 동일한 중쇄 CDR1-3 서열; 및 각각 서열 번호: 78 내지 80과 실질적으로 동일한 경쇄 CDR1-3 서열; (6) 각각 서열 번호: 42 내지 44와 실질적으로 동일한 중쇄 CDR1-3 서열; 및 각각 서열 번호: 81 내지 83과 실질적으로 동일한 경쇄 CDR1-3 서열; (7) 각각 서열 번호: 45 내지 47과 실질적으로 동일한 중쇄 CDR1-3 서열; 및 각각 서열 번호: 84 내지 86과 실질적으로 동일한 경쇄 CDR1-3 서열; (8) 각각 서열 번호: 48 내지 50과 실질적으로 동일한 중쇄 CDR1-3 서열; 및 각각 서열 번호: 87 내지 89와 실질적으로 동일한 경쇄 CDR1-3 서열; (9) 각각 서열 번호: 51 내지 53과 실질적으로 동일한 중쇄 CDR1-3 서열; 및 각각 서열 번호: 90 내지 92와 실질적으로 동일한 경쇄 CDR1-3 서열; (10) 각각 서열 번호: 54 내지 56과 실질적으로 동일한 중쇄 CDR1-3 서열; 및 각각 서열 번호: 93 내지 95과 실질적으로 동일한 경쇄 CDR1-3 서열; (11) 각각 서열 번호: 57 내지 59와 실질적으로 동일한 중쇄 CDR1-3 서열; 및 각각 서열 번호: 96 내지 98 실질적으로 동일한 경쇄 CDR1-3 서열; (12) 각각 서열 번호: 60 내지 62과 실질적으로 동일한 중쇄 CDR1-3 서열; 및 각각 서열 번호: 99 내지 101과 실질적으로 동일한 경쇄 CDR1-3 서열; 또는 (13) 각각 서열 번호: 63 내지 65과 실질적으로 동일한 중쇄 CDR1-3 서열; 및 각각 서열 번호: 102 내지 104과 실질적으로 동일한 경쇄 CDR1-3 서열을 갖는다.
일부 구현예에서 본 발명의 항체, 항체 단편, 항체-계 결합 단백질, ADC 또는 CAR은 (1) 서열 번호: 27 내지 29 및 서열 번호: 66 내지 68 (항체 XBR1-402), (2) 서열 번호: 30 내지 32 및 서열 번호: 69 내지 71 (항체 ERR1-301), (3) 서열 번호: 33 내지 35 및 서열 번호: 72 내지 74 (항체 ERR1-306), (4) 서열 번호: 36 내지 38 및 서열 번호: 75 내지 77 (항체 ERR1-316), (5) 서열 번호: 39 내지 41 및 서열 번호: 78 내지 80 (항체 ERR1-324), (6) 서열 번호: 42 내지 44 및 서열 번호: 81 내지 83 (항체 ERR1-403), (7) 서열 번호: 45 내지 47 및 서열 번호: 84 내지 86 (항체 ERR1-409), (8) 서열 번호: 48 내지 50 및 서열 번호: 87 내지 89 (항체 ERR1-TOP4), (9) 서열 번호: 51 내지 53 및 서열 번호: 90 내지 92 (항체 ERR1-TOP15), (10) 서열 번호: 54 내지 56 및 서열 번호: 93 내지 95 (항체 ERR1-TOP22), (11) 서열 번호: 57 내지 59 및 서열 번호: 96 내지 98 (항체 ERR1-TOP40), (12) 서열 번호: 60 내지 62 및 서열 번호: 99 내지 101 (항체 ERR1-TOP43), 또는 (13) 서열 번호: 63 내지 65 및 서열 번호: 102 내지 104 (항체 ERR1-TOP54)에 나타낸 서열과 각각 동일한 중쇄 CDR1-CDR3 및 경쇄 CDR1-CDR3 서열을 포함한다.
다른 구현예에서, 사람 ROR1에 특이적으로 결합하는 본 발명의 항체, 항체 단편, 항체-계 결합 단백질, ADC 또는 CAR은 (a) 서열 번호: 14 내지 26 또는 136 내지 141 중 어느 하나와 실질적으로 동일한 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인, (b) 서열 번호: 1 내지 13 또는 130 내지 135 중 어느 하나와 실질적으로 동일한 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인, 또는 (c) (a)의 경쇄 및 (b)의 중쇄 둘 다를 함유한다. 일부 구현예에서, 항체는 (a)의 경쇄 및 (b)의 중쇄 둘 다를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체, 항체 단편, 항체-계 결합 단백질, ADC 또는 CAR은 (a) 서열 번호: 14 내지 26 또는 136 내지 141 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인, (b) 서열 번호: 1 내지 13 또는 130 내지 135 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인, 또는 (c) (a)의 경쇄 및 (b)의 중쇄 둘 다를 포함한다. 일부 구현예에서, 동일성 퍼센트는 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%, 또는 심지어 100%일 수 있다. 일부 구현예에서, 경쇄 가변 도메인은 서열 번호: 14 내지 26 또는 136 내지 141 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 경쇄 가변 도메인은 서열 번호: 14 내지 26 또는 136 내지 141 중 어느 하나에 대해 적어도 100% 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 항체, 항체 단편, 항체-계 결합 단백질, ADC 또는 CAR은 서열 번호: 1 내지 13 또는 130 내지 135 중 어느 하나에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인을 함유한다. 다른 구현예에서, 동일성 퍼센트는 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%, 또는 심지어 100%일 수 있다. 일부 구현예에서, 중쇄 가변 도메인은 서열 번호: 1 내지 13 또는 130 내지 135 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 중쇄 가변 도메인은 서열 번호: 1 내지 13 또는 130 내지 135 중 어느 하나에 대해 100% 동일성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체, 항체 단편, 항체-계 결합 단백질, ADC 또는 CAR은 본원에 예시된 것들과 같은 어떠한 적합한 경쇄와 함께 본원에 기술된 바와 같은 어떠한 중쇄(예컨대, 도 1 및 23에 나타낸 중쇄)도 포함할 수 있다. 유사하게, 항체는 본원예 예시된 것들과 같은 어떠한 적합한 중쇄와 함께 상술한 바와 같은 경쇄(예컨대, 도 1 및 23에 나타낸 경쇄) 중 어느 것도 포함할 수 있다. 예를 들면, 바람직한 구현예에서, 항체는 서열 번호: 14에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 경쇄 및 서열 번호: 1에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 중쇄(항체 XBR1-402), 서열 번호: 18에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 경쇄 및 서열 번호: 5에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 중쇄(항체 ERR1-324), 서열 번호: 25에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 경쇄 및 서열 번호: 12에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 중쇄(항체 ERR1-TOP43), 또는 서열 번호: 26에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 경쇄 및 서열 번호: 13에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 중쇄(항체 ERR1-TOP54)를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 각각 (1) 서열 번호: 14 및 서열 번호: 1, (2) 서열 번호: 18 및 서열 번호: 5, (3) 서열 번호: 25 및 서열 번호: 12, 또는 (4) 서열 번호: 26 및 서열 번호: 13에 나타낸 경쇄 및 중쇄 서열을 포함한다. 다양한 구현예에서, 펩타이드 서열의 동일성 퍼센트(%)는 예를 들면, 100 x [(동일한 위치)/min(TGA, TGB)](여기서, TGA 및 TGB는 TGA 및 TGB를 최소화하는 정렬내 펩타이드 서열 A 및 B에서 잔기 및 내부 갭 위치의 수의 합이다)로서 계산될 수 있다(참고: 예컨대, Russell et al, J. Mol. Biol., 244: 332-350 (1994).
본 발명의 항체는 사람 ROR1의 세포외 도메인을 특이적으로 인식하거나 이에 결합하는 완전한 길이의 항체, 항체 단편, 항체-계 결합 단백질을 포함하는 어떠한 항체일 수 있다. 예를 들면, 항체, 항체 단편 또는 항체-계 결합 단백질은 폴리클로날, 모노클로날, 재조합체, 키메라, 또는 사람화될 수 있다. 또한, 항체는 IgA, IgD, IgE, IgG, 또는 IgM을 포함하나, 이에 제한되지 않는 어떠한 동형일 수 있다. 따라서, 예를 들면, 항체는 IgAl 또는 IgA2와 같은 어떠한 IgA, 또는 IgGl, IgG2, IgG3, IgG4와 같은 어떠한 IgG, 또는 합성 IgG일 수 있다. 항체는 또한 F(ab)2, Fv, scFv, IgGACH2, F(ab')2, scFv2CH3, Fab, VL, VH, scFv4, scFv3, scFv2, dsFv, Fv, scFv-Fc, (scFv)2, 디아보디(diabody), 2가, 이특이적, 또는 다특이적인 항체와 같은 사람 ROR1의 세포외 도메인에 대해 특이성을 갖는 어떠한 항체 단편 또는 항체-계 결합 단백질일 수 있다. 항체는 비-고갈 IgG 항체, CAR, 또는 항체의 다른 Fc 또는 Fab 변이체를 포함하나, 이에 한정되지 않는 어떠한 변형된 또는 합성의 항체일 수 있다.
상술한 중쇄 외에도, 본 발명의 이의 항체, 항체-계 결합 단백질 또는 항체 단편은 순차적인 나이브 쇄 셔플링(sequential naive chain shuffling)을 사용하여 Fab 라이브러리로부터 선택된 경쇄를 추가로 포함할 수 있다. 유사하게, 상술한 경쇄 외에도, 본 발명의 항체는 순차적인 나이브 쇄 셔플링을 사용하여 Fab 라이브러리로부터 선택된 중쇄를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 예시된 항-ROR1 항체의 보존적으로 변형된 변이체인 항체, 항체-계 결합 단백질 또는 이의 항체 단편을 제공한다. 전형적으로, 이들 변이체의 가변 영역은 하나 이상의 아미노산 잔기에서 보존적 치환을 제외하고는 이들 예시된 서열 중 하나와 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체, 항체 단편, 항체-계 결합 단백질, ADC 또는 CAR은 사람 ROR1에 특이적으로 결합하며 서열 번호: 27 내지 104로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 갖는 적어도 하나의 CDR을 함유한다. 본 발명은 또한 외부 CDR 서열 또는 실질적으로 동일한 CDR 서열의 하나 이상의 변이체를 함유하는 ROR1에 대해 특이성을 갖는 분리된 항체를 제공한다. 이들 항체내에서 변이체 CDR 서열은 서열 번호: 27 내지 104로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열내에 1, 2, 또는 3개의 치환, 삽입, 결실, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들면, 재조합체 키메라 또는 사람화된 항체(또는 이의 단편)는 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 외부 CDR 서열을 포함할 수 있다. 그러나, 일부 구현예에서, 재조합체 키메라 또는 사람화된 항체(또는 이의 단편)는 동일한 경쇄 또는 중쇄의 3개의 CDR 서열, 예컨대, 서열 번호: 66 내지 68, 서열 번호: 78 내지 80, 서열 번호: 99 내지 101, 또는 서열 번호: 102 내지 104에 나타낸 경쇄 CDR; 및 서열 번호: 27 내지 29, 서열 번호: 39 내지 41, 서열 번호: 60 내지 62, 또는 서열 번호: 63 내지 65에 나타낸 중쇄 CDR을 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합체 키메라 또는 사람화된 항체(또는 이의 단편)는 동일한 항체의 6개의 CDR 서열, 예컨대, (a) 서열 번호: 66 내지 68 및 서열 번호: 27 내지 29(항체 XBR1-402); (b) 서열 번호: 78 내지 80 및 서열 번호: 39 내지 41(항체 ERR1-324); (c) 서열 번호: 99 내지 101 및 서열 번호: 60 내지 62 (항체 ERR1-TOP43), 또는 (d) 서열 번호: 102 내지 104 및 서열 번호: 63 내지 65 (항체 ERR1-TOP54)을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 ROR1에 대한 결합활성(avidity)이 약 10 μM 이하, 5 μM 이하, 2 μM 이하, 1 μM 이하, 500 nM 이하, 400 nM 이하, 300 nM 이하, 또는 200 nM 이하인 항체, 항체-계 결합 단백질 또는 이의 항체 단편을 제공한다. 일부 구현예에서, 항체, 항체 단편, 항체-계 결합 단백질, ADC 또는 CAR는 ROR1에 대해 약 100 nM 이하, 약 75 nM 이하, 약 50 nM 이하, 약 25 nM 이하, 약 10 nM 이하, 또는 약 5 nM 이하의 결합활성으로 결합한다. 일부 구현예에서, 항체, 항체 단편, 항체-계 결합 단백질, ADC 또는 CAR은 ROR1에 약 1 nM 이하, 약 800 pM 이하, 약 700 pM 이하, 약 600 pM 이하, 약 500 pM 이하, 약 400 pM 이하, 약 300 pM 이하, 약 200 pM 이하, 또는 약 100 pM 이하의 결합활성으로 결합한다. 결합활성은 ELISA, 바이오층 인페로메트리(biolayer inferometry), 또는 표면 플라스몬 공명과 같은, 당해 분야에 공지된 기술을 사용하여 측정할 수 있다.
본 발명의 항체, 항체-계 결합 단백질 또는 이의 항체 단편은 어떠한 적합한 기술에 의해, 예를 들면, 어떠한 적합한 진핵세포 또는 비-진핵세포 발현 시스템을 사용하여 생산할 수 있다. 특정의 구현예에서, 항체는 포유동물 발현 시스템을 사용하여 생산한다. 본 발명의 항체 항체-계 결합 단백질 또는 이의 항체 단편을 생성하기 위한 일부 특수한 기술이 본원에 예시되어 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체, 항체-계 결합 단백질 또는 이의 항체 단편은 세균 발현 시스템과 같은 적합한 비-진핵세포 발현 시스템을 사용하여 생산할 수 있다. 세균 발현 시스템을 사용하여 F(ab)2, Fv, scFv, IgGACH2, F(ab')2, scFv2CH3, Fab, VL, VH, scFv4, scFv3, scFv2, dsFv, Fv, scFv-Fc, (scFv)2, 및 디아보디와 같은 단편을 생산할 수 있다. DNA 암호화 서열을 변경하여 이러한 단편을 생산하는 기술은 당해 분야에 공지되어 있다.
본 발명의 항체, 항체-계 결합 단백질 또는 이의 항체 단편은 어떠한 유형의적합한 접합을 사용하여서도 합성 분자에 접합시킬 수 있다. 재조합 가공 및 혼입된 셀레노시스테인(예컨대, 2014년 12월 23일 허여된 미국 특허 제8,916,159호에 기술된 바와 같음)을 사용하여 합성 분자를 접합시킬 수 있다. 다른 접합 방법은 천연 또는 가공된 라이신 측쇄 아민 또는 시스테인 측쇄 티올을 공유결합 커플링시킴을 포함할 수 있다. 예컨대, Wu et al., Nat. Biotechnol, 23: 1 137-1 146 (2005)를 참고한다.
바람직한 구현예에서, 합성 분자에 접합된 본 발명의 항체, 항체-계 결합 단백질 또는 이의 항체 단편(독소인 합성 분자와의 항체 약물 접합체의 경우 "ADC"로 불림)은 부위-특이적인 소르타제-효소 매개된 항체 접합에 의해 수득된다. 제WO2014140317호에 개시된 바와 같이, 소르타제(또한 소르타제 트랜스펩티다제로 불림)는 "소르타제 인식 태그" 또는 "소르타제 태그"로 불리는 특이적인 펩타이드 모티프를 인식하여 분할함으로써 표면 단백질을 변형시키는 원핵세포 효소의 그룹을 형성한다. 일반적으로, 제공된 소르타제 효소는 하나 이상의 소르타제 인식 태그를 인식한다. 소르타제 효소는 천연적으로 존재할 수 있거나, 유전 가공을 겪을 수 있다(Dorr et al., PNAS 2014; 111, 13343-8).
바람직한 구현예에서, 접합체는 (a) 하나 이상의 소르타제 인식 태그를 수반하는 본원에 기술된 바와 같은 항체, 항체-계 결합 단백질 또는 이의 항체 단편, 및 (b) 글리신 또는 올리고글리신 태그, Gly(n)를 수반하는 하나 이상의 합성 분자의 부위-특이적인 소르타제-효소 매개된 접합에 의해 수득된다.
바람직하게는, 소르타제 인식 태그는 항체의 적어도 하나의 서브도메인의 C-말단에 융합되거나 접합된다. 상기 소르타제 인식 태그는 바람직하게는 LPXSG (서열 번호: 142), LPXAG (서열 번호: 143), LPXTG (서열 번호: 144), LAXTG (서열 번호: 145), 및 NPQTG (서열 번호: 146)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
바람직하게는, 올리고글리신 태그, Gly(n)는 길이가 1 내지 21개 글리신 잔기(n은 1 내지 21 중 어느 수이다), 바람직하게는 길이가 3 내지 5개 아미노산(n은 3 내지 5이며, 즉, Gly(3), Gly(4) , 또는 Gly(5))이다.
합성 분자는 종양을 표적화하는 것과 같은 어떠한 분자일 수 있다. 일부 구현예에서, 항체에 접합하기 위한 합성 분자는 단백질(예컨대, 항체) 또는 RNA 또는 DNA 아프타머(aptamer)이다.
하나의 구현예에서, 합성 분자에 접합된 본 발명의 항체, 항체-계 결합 단백질 또는 이의 항체 단편은 식 A - (L - P)n (여기서, A는 본원에 기술된 바와 같은 항체, 항체-계 결합 단백질 또는 이의 항체 단편이고, L은 하나 이상의 링커이며, P는 표지 및 세포독성 또는 세포정지제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 페이로드이고, n은 ≥1 과 ≤ 10 사이의 정수이다)를 갖는다.
당해 구현예에서, 링커는 바람직하게는 올리고펩타이드 링커(분할가능한 및 분할가능하지 않은 올리고펩타이드 링커), 하이드라진 링커, 티오우레아 링커, 자기-희생 링커(self-immolative linker), 석신이미딜 트랜스-4-(말레이미딜메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트(SMCC) 링커, 말레이미드 링커, 디설파이드 링커, 티오에테르 링커, 및/또는 말레이미드 링커로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나를 포함하거나 이로 이루어진다.
숙련가들은 추가의 링커도 적합할 수 있음을 이해한다. 이러한 링커는 분할가능하지 않을 수 있거나 pH, 산화환원 전위 또는 특이적인 세포내 효소에 있어서의 변화에 의해 분할될 수 있다. 분할가능한 올리고펩타이드 링커는 프로테아제- 또는 매트릭스 메탈로프로테아제-분할가능한 링커를 포함한다. 링커는 상기 것들의 조합을 포함할 수 있음이 이해된다. 예를 들면, 링커는 발린-시트룰린 PAB 링커일 수 있다.
바람직한 구현예에서, 링커는 펜타-펩타이드 모티프 LPXSG (서열 번호: 142), LPXAG (서열 번호: 143), LPXTG (서열 번호: 144), LAXTG (서열 번호: 145), 또는 NPQTG (서열 번호: 146)(여기서, X는 어떠한 아미노산이다)를 함유하는 서열을 지닌 올리고펩타이드에 이어서 올리고-글리신 스트레치, Gly(n)(여기서, n은≥ 1 과 ≤ 21 사이의 정수이다)를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 링커는 항체, 항체-계 결합 단백질 또는 이의 항체 단편의 적어도 하나의 서브도메인의 C-말단에 접합된다.
다양한 구현예에서, 항체에 접합시키기 위한 적합한 합성 분자("페이로드")는 예컨대, 세포독성, 세포정지, 또는 항혈관형성제, 방사선동위원소, 및 리포좀을 포함한다. 세포독성제는 식물, 진균, 또는 세균 분자일 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체에 접합시키기 위한 세포독성제는 소 분자량 독소(MW< 2'000 달톤(Dalton), 바람직하게는 MW < 1'000 달톤), 펩타이드 독소, 또는 단백질 독소이다. 이들 독소의 많은 구체적인 예는 당해 분야에 공지되어 있다. 예컨대, Dyba et al., Curr. Pharm. Des. 10:2311-34, 2004; Kuyucak et al., Future Med. Chem. 6:1645-58, 2014; Beraud et al., Inflamm. Allergy Drug Targets. 10:322-42, 2011; 및 Middlebrook et al., Microbiol. Rev. 48:199-221, 1984를 참고한다. 일부 구현예에서, 치료제는 항체에 접합된다. 예를 들면, 치료제는 마이탄시노이드(예컨대, 마이탄시노이드 또는 DM1 마이탄시노이드), 탁산, 칼리케아미신, 세마도틴, 모노메틸라우리스타틴(예컨대, 모노메틸라우리스타틴 E 또는 모노메틸라우리스타틴 F), 피롤로벤조디아제핀(PBD) 또는, 바람직하게는 안트라사이클린, 보다 바람직하게는 매우 강력한 안트라사이클린 PNU-159682의 유도체일 수 있다. 매우 강력한 안트라사이클린 PNU-159682의 특히 바람직한 유도체는 제WO2016102679호(이는 본원에 참고로 포함됨)에 개시되어 있다. 치료제는 또한 빈크리스틴 및 프레드니손을 포함한다. 다양한 구현예에서, 본 발명에 사용될 수 있는 치료제는 항대사산물(예컨대, 메토트렉세이트와 같은 안티폴레이트, 5-플루오로우라실과 같은 플루오로피리미딘, 사이토신 아라비노시드, 또는 푸린 또는 아데노신의 유사체); 인터컬레이팅제(intercalating agent)(예를 들면, 독소루비신, 네오루비신, 또는 바람직하게는 PNU-159682의 유도체와 같은 안트라사이클린), 다우노마이신, 에피라비신, 이다루비신, 미토마이신-C, 닥티노마이신, 또는 미트라마이신, 또는 피롤로벤조이아제핀과 같은 다른 인터컬레이팅제; 칼리케아미신, 티안시마이신, 및 다른 에네디인과 같은 DNA-반응성 제제; 백금 유도체(예컨대, 시스플라틴 또는 카르보플라틴); 알킬화제(예컨대, 질소 무스타드, 멜팔란, 클로람부실, 부설판, 사이클로포스파미드, 이포스파미드 니트로소우레아 또는 티오테파); α-아마니틴과 같은 RNA 폴리머라제 억제제; 항유사분열제(예컨대, 빈크리스틴과 같은 빈카 알칼로이드, 또는 파클리탁셀 또는 도세탁셀과 같은 탁소이드); 토포이소머라제 억제제(예를 들면, 에토포시드, 테니포시드, 암사크린, 토포테칸); 세포 주기 억제제(예를 들면, 플라보피리돌); 또는 마이크로튜블제(microbtubule agent)(예컨대, 에포틸론, 투불라이신, 예비-투불라이신, 디스코데르몰리드 유사체, 또는 엘레우테로빈 유사체)일 수 있다. 치료제는 프로테아좀 억제제 또는 토포이소머라제 억제제, 예를 들면, 보르테조미브, 암사크린, 에토포시드, 에토포시드 포스페이트, 테니포시드, 또는 독소루비신이다. 치료학적 방사선동위원소는 요오드(131I), 이트륨(90Y), 루테튬(177Lu), 악티늄(225Ac), 프라세오다이뮴, 아스타틴(At), 레늄(Re), 비스무쓰(Bi 또는 Bi), 및 로듐(Rh)을 포함한다. 항혈관형성제는 리노마이드, 베바쿠지마브, 안지오텐신, 및 라족산을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 합성 독소 분자는 Quintieri et al. (2005)에 기술된 바와 같은 PNU-159682 및 이의 유도체(참고: 하기 식(i)), 마이탄신, 모노메틸 아우리스타틴 MMAE, 및 모노메틸 아우리스타틴 MMAF로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서, 이의 파선에서 링커에 연결된 독소는 제WO 2016102679호(이는 본원에 참고로 포함됨)에 기술된 바와 같은 식(i)이다:
식(i)
Figure pct00002
합성 분자가 식(i)인 구현예에서, 링커는 NH2-(CH2)m-NH2(여기서, m ≥ 1 및 ≤ 11, 바람직하게는 m=2이어서 하나의 아미노 그룹은 식(i)의 파선에서 직접 연결되어 아미드 결합을 형성한다)의 알킬디아미노 그룹을 포함하는 것이 바람직하다. 제2 아미노 그룹이 보다 바람직하게는 올리고글리신 Gly(n)(여기서, n은 ≥1 및 ≤ 21이다)인 올리고펩타이드 링커에 연결되는 것이 또한 바람직하다. 가장 바람직한 페이로드는 도 11(B)에 나타나 있다.
일부 구현예에서, 합성 분자는 어떠한 항체, 항체-계 결합 단백질, 또는 항체-단편에도 접합될 수 있다. 일부 구현예에서, 합성 분자는 표지(label)일 수 있다. 표지는 진단 적용에 유용할 수 있으며 예를 들면, 조영제를 포함할 수 있다. 조영제는 요오드(131I 또는 125I), 인듐(111In), 테크네튬(99Tc), 인(32P), 탄소(14C), 트리튬(3H), 기타 방사선동위원소(예컨대, 방사활성 이온)와 같은 방사선동위원소 표지, 또는 상기 나열된 치료학적 방사선동위원소 중 하나와 같은 치료학적 방사선동위원소일 수 있다. 또한, 조영제는 방사선불투과성 물질, 자기 공명 영상화(MRI) 제제, 초음파 영상화제, 및 동물 신체를 영상화하는 장치에 의한 검출에 적합한 어떠한 다른 조영제를 포함할 수 있다. 합성 분자는 또한 형광성 표지, 생물학적으로 활성인 효소 표지, 발광성 표지, 또는 염색단 표지일 수 있다.
일부 다른 구현예에서, 합성 분자는 Bendas, BioDrugs, 15: 215-224, 2001에 기술된 바와 같은 리포좀일 수 있다. 이러한 구현예에서, 항체는 콜로이드성 입자, 예컨대, 리포좀에 접합되어 질환이 있는 세포로 제제의 조절된 전달을 위해 사용될 수 있다. 리포좀, 예컨대, 면역리포좀에 접합된 항체를 제조하는데 있어서, 화학치료제와 같은 제제 또는 다른 약물을 표적 세포에 전달하기 위해 리포좀 내에 인트랩(entrap)시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체, 항체-계 결합 단백질 또는 이의 항체 단편은 또한 ROR1 외에 하나 이상의 항원에 대해 특이성을 가질 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 항체는 ROR1 및 다른 종양 항원, 예컨대, 신경아세포종, 신장 세포 암종, 유방 암, 위 암, 전립샘 암, 결장 암(예컨대, 결장 선암종), 또는 유방 암(예컨대, 유방 선암종)과 관련된 항원에 대해 특이성을 가지도록 가공(예컨대, 2가 디아보디 또는 접합된 Fab 이량체 또는 삼량체)될 수 있다. 항체는 ROR1 및 세포독성 효과기 세포(effector cell)의 활성화 또는 표적화를 촉진하는 항원에 대해 선택성을 갖도록 가공될 수 있다.
IV. ROR1 항체를 생산하기 위한 폴리뉴클레오타이드, 벡터 및 숙주 세포
본 발명은 본원에 기술된 항체, 항체-계 결합 단백질 또는 이의 항체 단편 쇄의 분절 또는 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 서열과 동일하거나 이에 대해 상보성인 실질적으로 정제된 폴리뉴클레오타이드(DNA 또는 RNA)를 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 도 1 및 23에 나타낸 중쇄 또는 경쇄 도메인 서열을 암호화한다. 적절한 발현 벡터로부터 발현되는 경우, 이들 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 폴리펩타이드는 ROR1 항원 결합능을 나타낼 수 있다. 또한 본원에 기술된 항체의 중쇄 또는 경쇄로부터의 적어도 하나의 CDR 영역 및 일반적으로 모두 3개의 CDR 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 본 발명에서 제공된다. 일부 다른 폴리뉴클레오타이드는 예시된 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 영역 서열 중 모두 또는 실질적으로 모두를 암호화한다. 예를 들면, 이들 폴리뉴클레오타이드중 일부는 어느 하나의 서열 번호: 1 내지 13 또는 130 내지 135에 나타낸 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열, 및/또는 어느 하나의 서열 번호: 14 내지 26 또는 136 내지 141에 나타낸 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 암호화한다. 코드의 축퇴로 인하여, 다양한 핵산 서열은 면역글로불린 아미노산 서열 각각을 암호화할 것이다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 예시된 항체의 가변 영역 서열 만을 암호화할 수 있다. 이들은 또한 항체의 가변 영역 및 불변 영역 둘 다를 암호화할 수 있다. 본 발명의 핵산의 폴리뉴클레오타이드 서열 중 일부는 어느 하나의 서열 번호: 1 내지 13 또는 130 내지 135에 나타낸 성숙한 중쇄 가변 영역 서열에 대해 실질적으로 동일한 (예컨대, 적어도 80%, 90%, 95% 또는 99%) 성숙한 중쇄 가변 영역 서열을 암호화한다. 일부 다른 폴리뉴클레오타이드 서열은 어느 하나의 서열 번호: 14 내지 26 또는 136 내지 141에 나타낸 성숙한 경쇄 가변 영역 서열에 대해 실질적으로 동일한(예컨대, 적어도 80%, 90%, 95% 또는 99%) 성숙한 경쇄 가변 영역 서열을 암호화한다. 폴리뉴클레오타이드 서열들 중 일부는 예시된 항체 중 하나의 중쇄 또는 경쇄의 가변 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화한다. 일부 다른 폴리뉴클레오타이드는 예시된 항체 중 하나의 중쇄 또는 경쇄의 가변 영역에 대해 각각 실질적으로 동일한 2개의 폴리펩타이드 분절을 암호화한다.
폴리뉴클레오타이드 서열은 예시된 기능성 항체를 암호화하는 기존 서열(예컨대, 하기 실시예에 기술된 바와 같은 서열)의 신규한 고체-상 DNA 합성 또는 PCR 돌연변이유발에 의해 생산될 수 있다. 핵산의 직접적인 화학적 합성은 Narang et al., Meth. Enzymol. 68:90, 1979의 포스포트리에스테르 방법; Brown et al., Meth. Enzymol. 68:109, 1979의 포스포디에스테르 방법; Beaucage et al., Tetra. Lett., 22:1859, 1981의 디에틸포스포르아미디트 방법; 및 미국 특허 제4,458,066호의 고체 지지체 방법과 같이, 당해 분야에 공지된 방법으로 달성할 수 있다. PCR에 의해 폴리뉴클레오타이드 서열내로 돌연변이를 도입하는 것은 예컨대, PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H.A. Erlich (Ed.), Freeman Press, NY, NY, 1992; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al. (Ed.), Academic Press, San Diego, CA, 1990; Mattila et al., Nucleic Acids Res. 19:967, 1991; 및 Eckert et al., PCR Methods and Applications 1:17, 1991에 기술된 바와 같이 수행될 수 있다.
또한 본원에 기술된 기능적 항체를 생산하기 위한 발현 벡터 및 숙주 세포가 본 발명에 제공된다. 항체를 발현하기 위한 플라스미드 및 트랜스포존(transposon)계 벡터의 구체적인 예는 하기 실시예에 기술되어 있다. 다양한 다른 발현 벡터 또한 사용하여 기능적 항체 쇄 또는 결합 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 발현시킬 수 있다. 바이러스-계 및 비바이러스(nonviral) 발현 벡터 둘 다를 사용하여 포유동물 숙주 세포내에서 항체를 생산할 수 있다. 비바이러스 벡터 및 시스템은 전형적으로 단백질 또는 RNA, 및 사람 인공 염색체를 발현하기 위한 발현 카세트와 함께, 플라스미드, 에피소옴 벡터를 포함한다(참고: 예컨대, Harrington et al., Nat. Genet. 15:345, 1997). 예를 들면, 포유동물(예컨대, 사람) 세포내에서 항체 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드의 발현에 유용한 비바이러스 벡터는 pCEP4, pREP4, pThioHis A, B & C, pcDNA3.1/His, pEBVHis A, B & C (Invitrogen, San Diego, CA), MPSV 벡터, 및 다른 단백질을 발현하기 위한 당해 분야에 공지된 다수의 다른 벡터를 포함한다. 다른 유용한 비바이러스 벡터는 슬리핑 뷰티(Sleeping Beauty), 피기백(PiggyBack) 및 다른 트랜스포존 시스템으로 고정시킬 수 있는 발현 카세트를 포함하는 벡터를 포함한다. 유용한 바이러스 벡터는 렌티바이러스 또는 다른 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스 바이러스를 기반으로 하는 벡터, SV40, 파필로마 바이러스, HBP 엡슈타인 바르 바이러스(Epstein Barr virus), 박시니아 바이러스 벡터 및 셈리키 포레스트 바이러스(Semliki Forest virus: SFV)를 기반으로 하는 벡터를 포함한다. Brent et al., supra; Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49:807, 1995; 및 Rosenfeld et al., Cell 68:143, 1992를 참고한다.
발현 벡터의 선택은 벡터가 발현될 의도된 숙주 세포에 의존한다. 전형적으로, 발현 벡터는 프로모터 및 기능적 항체 쇄 또는 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동적으로 연결되는 다른 조절 서열(예컨대, 인핸서)을 함유한다. 일부 구현예에서, 유도성 프로모터를 사용하여 유도 조건 하에서를 제외하고는 삽입된 서열의 발현을 방지한다. 유동가능한 프로모터는 예컨대, 아라비노즈, lacZ, 메탈로티오네인 프로모터 또는 열 소크 프로모터를 포함한다. 형질전환된 유기체의 배양물은 이의 발현 생성물이 숙주 세포에 의해 보다 더 우수하게 견디어지는 암호화 서열에 대한 집단의 편향없이 비-유도 조건 하에서 확장시킬 수 있다. 프로모터 이외에, 다른 조절 성분 또한 기능적 항체 쇄 또는 단편의 효율적인 발현에 필요할 수 있거나 요구될 수 있다. 이들 성분은 전형적으로 ATG 개시 코돈 및 인접한 리보소옴 결합 부위(코작 콘센수스(Kozak consensus) 서열) 또는 다른 서열을 포함한다. 또한, 발현 효율은 사용하는 세포 시스템에 적절한 인핸서를 도입함으로써 향상시킬 수 있다(참고: 예컨대, Scharf et al., Results Probl. Cell Differ. 20:125, 1994; 및 Bittner et al., Meth. Enzymol., 153:516, 1987). 예를 들면, SV40 인핸서 또는 CMV 인핸서를 사용하여 포유동물 숙주 세포내에서 발현을 증가시킬 수 있다.
발현 벡터는 또한 삽입된 기능적 항체 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드와 함께 융합 단백질을 형성하는 분비 시그날 서열 위치를 제공할 수 있다. 보다 흔히, 삽입된 기능적 항체 서열은 벡터내에서 도입 전 시그날 서열에 연결된다. 기능적 항체 경쇄 및 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 서열을 수용하는데 사용될 벡터는 때때로 불변 영역 또는 이의 일부도 암호화한다. 이러한 벡터는 불변 영역과의 융합 단백질로서 가변 영역의 발현을 허용함으로써 완전한 항체 또는 이의 단편의 생산을 이끈다. 전형적으로, 이러한 불변 영역은 사람, 및 바람직하게는 사람 IgG1 항체이다.
기능적 항체 쇄를 지니며 발현하는 숙주 세포는 원핵세포 또는 진핵세포일 수 있다. 일부 바람직한 구현예에서, 포유동물 숙주 세포를 사용하여 본 발명의 항체 폴리펩타이드를 발현하고 생산한다. 예를 들면, 이들은 내인성 면역글로불린 유전자를 발현하는 하이브리도마 세포주 또는 외인성 발현 벡터를 지닌 포유동물 세포주일 수 있다. 이들은 어떠한 정상의 필멸(mortal) 또는 정상 또는 비정상의 불멸의 동물 또는 사람 세포도 포함한다. 본원에 예시된 세포주 외에도, 완전한 면역글로불린을 분비할 수 있는 다수의 다른 적합한 숙주 세포가 또한 당해 분야에 공지되어 있다. 이들은 예컨대, CHO 세포주, 다양한 HEK 293 세포주, 다양한 Cos 세포주, HeLa 세포, 흑색종 세포주, 형질전환된 B-세포 및 하이브리도마를 포함한다. 폴리펩타이드를 발현하는 포유동물 조직 세포 배양물의 용도는 일반적으로 예컨대, Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987에 논의되어 있다. 포유동물 숙주 세포에 대한 발현 벡터는 복제 오리진(origin of replication), 프로모터, 및 인핸서와 같은 발현 조절 서열, 및 리보소옴 결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위, 및 전사 종결인자 서열과 같은 필요한 프로세싱 정보 부위를 포함할 수 있다. 이들 발현 벡터는 일반적으로 포유동물 유전자로부터 또는 포유동물 바이러스로부터 기원한 프로모터를 함유한다. 적합한 프로모터는 구성적이고/이거나, 세포형-특이적이고/이거나, 단계-특이적이고/이거나, 조율가능하거나 조절가능할 수 있다. 유용한 프로모터는 본원에 예시된 EF1α 및 사람 UbC 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 구성적 아데노바이러스 메이저 레이트 프로모터(constitutive adenovirus major late promoter), 덱사메타손-유도성 MMTV 프로모터, SV40 프로모터, MRP pol III 프로모터, 구성적 MPSV 프로모터, 테트라사이클린-유도성 CMV 프로모터(예를 들면, 사람 이미디어트-얼리(immediate-early) CMV 프로모터), 구성적 CMV 프로모터, 및 당해 분야에 공지된 프로모터-인핸서 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
목적한 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유하는 발현 벡터를 도입하는 방법은 세포 숙주의 유형에 의존하여 변한다. 예를 들면, 염화칼슘 형질전환은 원핵 세포용으로 일반적으로 사용되는 반면, 인산칼슘 처리 또는 전기천공은 다른 세포 숙주용으로 사용될 수 있다(참고: 일반적으로 Sambrook et al., supra). 다른 방법은 예컨대, 전기천공, 인산칼슘 처리, 리포좀-매개된 형질전환, 주입 및 미세주입, 발리스틱 방법(ballistic method), 비로소옴(virosome), 면역리포좀, 다가양이온:핵산 접합체, 네이키드(naked) DNA, 인공 비리온(artificial virion), 헤르페스 바이러스 구조 단백질 VP22에 대한 융합(Elliot and O'Hare, Cell 88:223, 1997), DNA의 제제-향상된 흡수, 및 생체외 형질도입을 포함한다. 재조합체 단백질의 장기간의, 고 수율 생산을 위해, 안정한 발현이 흔히 요구될 것이다. 예를 들면, 항체 쇄 또는 결합 단편을 안정하게 발현하는 세포주를 바이러스 복제 오리진 또는 내인성 발현 성분 및 선택가능한 마커 유전자의 바이러스 기원을 함유하는 본 발명의 발현 벡터를 사용하여 제조할 수 있다. 벡터의 도입에 이어서, 세포를 선택성 배지로 이들을 스위치(switch)하기 전에 농축 배지 속에서 1 내지 2일 동안 성장시킬 수 있다. 선택가능한 마커의 목적은 선택에 대한 내성을 부여하는 것이며, 이의 존재는 선택성 배지 속에서 도입된 서열을 성공적으로 발현하는 세포의 성장을 허용한다. 내성인, 안정하게 형질감염된 세포는 세포 유형에 적절한 조직 배양 기술을 사용하여 증식시킬 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체, 항체-계 결합 단백질 또는 이의 항체 단편을 생산하도록 재조합적으로 가공된 진핵 세포 또는 비-진핵 세포(예컨대, T 림프구)를 제공한다. 진핵 세포 또는 비-진핵세포의 세포를 발현 시스템으로 사용하여 본 발명의 항체를 생산할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 ROR1 특이적인 항체를 재조합적으로 발현하도록 가공된 ROR1 표적화된 면역 세포를 제공한다. 예를 들면, 본 발명은 본 발명의 항체(예컨대, scFv, scFv-Fc, 또는 (scFv)2)를 발현하도록 가공된 T 세포를 제공하며, 이는 다음의 도메인: 스페이서 또는 힌지 영역(예컨대, CD28 서열 또는 IgG4 힌지-Fc 서열), 전이막 영역(예컨대, 전이막 카노이칼 도메인), 및 세포내 T-세포 수용체(TCR) 시그날링 도메인 중 하나 이상을 함유하는 합성 분자에 연결됨으로써, 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 T-보디를 형성한다. CAR(또는 T-보디) 속에 포함될 수 있는 세포내 TCR 시그날링 도메인은 CD3ζ, FcR-γ, 및 Syk-PT 시그날링 도메인 및 또한 CD28, 4-1BB, 및 CD134 공-시그날링 도메인을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. T-세포 발현 CAR(또는 T-보디)를 작제하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 예컨대, Marcu-Malina et al., Expert Opinion on Biological Therapy, Vol. 9, No. 5 (posted online on April 16, 2009)를 참고한다.
V. 치료학적 및 진단학적 적용
본원에 개시된 ROR1 항체, 항체-계 결합 단백질, 이의 항체 단편, ADC 및 CAR은 다양한 치료학적 및 진단학적 적용에서 사용할 수 있다. ROR1은 다양한 종양의 발달시 발현되고 연류된다(참고: 예컨대, Rebagay et al., Front Oncol. 2, 34, 2012; 및 Shabani et al., Expert Opin. Ther. Targets 19, 941-955, 2015). 예를 들면, ROR1은 CLL, ALL, 외투 세포 림프종, 신경아세포종, 육종, 신장 세포 암종, 유방 암, 폐 암, 결장 암, 두경부암, 흑색종, 및 다른 암에서 종양 세포 표면에서 발현된다. 중요하게도, ROR1은 배아발생시 발현되지만 출생 후 크게 정지한다. 극소수의 성체의 건강한 조직 및 세포는 ROR1을 발현한다. 일관되게, 항-ROR1 CAR-가공된 T 세포는 비사람 영장류에서 안전하고 활성인 것으로 밝혀졌으며, 암에서 치료학적 표적으로서 ROR1 입증되었다(Berger (2015) Cancer Immunol Res. 3(2), page 2016). 따라서, ROR1에 대한 mAb는 암에서 높은 치료학적 및 진단학적 유용성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본 발명은 세포를 본 발명의 항체, 항체-계 결합 단백질, 이의 항체 단편, ADC 또는 CAR과 접촉시킴으로써 ROR1(ROR1 세포)을 발현하는 세포를 억제하는 방법을 제공한다. 항체, 항체-계 결합 단백질 또는 이의 항체 단편은 네이키드(접합되지 않은) 분자 또는, 합성 분자, 예컨대, 세포독성, 세포정지 또는 항혈관형성제, 방사선동위원소, 또는 심지어 리포좀에 접합된 항체, 항체-계 결합 단백질, 이의 항체 단편일 수 있다. 바람직하게는, 세포는 접합된 세포독성 분자를 포함하는 ADC와 접촉된다. 상기 방법을 사용하여 시험관내 또는 대상체(즉, 생체내)에서 ROR1 세포를 억제할 수 있다. 접촉된 ROR1 세포는 예를 들면, ROR1의 상승된 수준과 관련된 장애의 세포 배양물 또는 동물 모델에 존재할 수 있다. 상기 방법은 예를 들면, 특이적인 ROR1 세포형에 대한 항체의 억제 활성을 측정하고/하거나 순위를 매기는데(다른 항체와 비교하여) 유용하다. ROR1 세포를 억제하는 것은 ROR1 세포의 활성 또는 성장을 차단하거나 감소시킴을 포함할 수 있다. 억제는 또한 ROR1 세포를 사멸시키는 것을 포함할 수 있다. 상기 방법이 어떠한 특수한 작용 메카니즘에 의해 결합되거나 이것으로 한정되지 않지만, 억제 활성은 또한 ROR1-매개된 시그날링을 차단하거나 ROR1 관련된 수용체의 시그날링을 차단함으로써 매개될 수 있다. 억제 활성은 ROR1 세포를 공격하는 면역계 효과기의 보충에 의해, 예컨대, 항체-의존성 세포-매개된 세포독성(ADCC) 또는 상보체 시스템의 성분을 활성화시킴에 의해 매개될 수 있다.
일부 관련된 구현예에서, 본 발명은 ROR1의 발현과 관련된 장애를 가지거나 이로 발달할 위험이 있는 것으로 예측되는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 일반적으로, 상기 방법은 치료학적 유효량의 본 발명의 분리된 항체, 항체-계 결합 단백질, 이의 항체 단편, ADC 또는 CAR을 대상체에게 투여함을 포함한다. 항체는 본원에 기술된 바와 같은 어떠한 항-ROR1 항체, 항-ROR1 항체 단편, 항-ROR1 항체-계 결합 단백질일 수 있다. 따라서, 항체는 키메라, 사람화된, 합성의, F(ab)2, Fv, scFv, IgGACH2, F(ab')2, scFv2CH3, Fab, VL, VH, scFv4, scFv3, scFv2, dsFv, Fv, 또는 (scFv)2일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 IgG, scFv, dsFv, F(ab')2, 디아보디, 또는 2가 항체를 투여함을 포함한다. 투여된 항체, 항체-계 결합 단백질, 이의 항체 단편은 위에 기술된 합성 분자, 예컨대, 세포독성, 세포정지, 또는 항혈관형성제, 치료학적 방사선동위원소, 또는 리포좀에 접합될 수 있다. 예시적인 세포독성제는 슈도모나스 외독소 A(PE38)이다. 치료될 수 있는 장애는 CLL, ALL, 외투 세포 림프종, 신경아세포종, 육종, 신장 세포 암종, 유방 암, 폐 암, 결장 암, 두경부암, 흑색종, 및 상승된 ROR1 발현과 관련된 다른 장애를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 ROR1에 선택적으로 결합하는 키메라 항원 수용체(CAR)로서 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편을 발현하는, 본원에 기술된 유전적으로 가공된 T-세포의 입양 전달에 의해 ROR1의 상승된 수준과 관련된 장애를 갖거나 이로 발달할 위험이 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 재조합체 기술을 사용하여 CAR-암호화 유전 물질을 어떠한 적합한 T-세포, 예컨대, 치료될 대상체로부터의 중추 기억(central memory) T-세포내로 도입할 수 있다. 유전 물질을 전달하는 T 세포는 확장될 수 있다(예컨대, 사이토킨의 존재하에서). 유전적으로 가공된 T-세포는 전형적으로 주입에 의해 환자에게 형질전달된다. 본 발명의 형질전달된 T-세포는 이후 대상체내 ROR1 발현 세포에 대해 면역 반응을 시작할 수 있다. 입양 전달 방법은 예를 들면, CLL, ALL, 외투 세포 림프종, 신경아세포종, 육종, 신장 세포 암종, 유방 암, 폐 암, 결장 암, 두경부암, 흑색종, 및 기타 암을 포함하는, ROR1과 관련된 어떠한 암도 가지거나 가진 것으로 예측되는 대상체를 치료하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 앞서의 치료 방법은 또한 상승된 ROR1과 관련된 장애를 치료하기 위한 제2의 치료제를 동시-투여함을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, 치료될 장애가 ROR1-발현 암을 포함하는 경우, 상기 방법은 또한 예를 들면, 세포독성, 세포정지, 또는 항혈관형성 또는 면역-자극제(예컨대, 예를 들면, 암을 치료하기에 적합한 PD1, PDL1, CTLA4, OX40, TIM3, GITR, LAG3 등에 결합하는 것들, 그러나 이에 한정되지 않는 면역-체크포인트 억제제 항체)의 동시-투여를 추가로 포함할 수 있다. 암이 B-세포 악성종양인 경우, 상기 방법은 또한 예를 들면, 리툭시마브, 알렘투주마브, 오파투무마브, 오크렐리주마브, 또는 CHOP 화학치료학적 요법의 동시-투여를 포함할 수 있다.
일부 다른 구현예에서, 본 발명은 FACS, 면역조직화학(IHC) 또는 웨스턴 블롯팅(Western Blotting)에 의해, 예를 들면, 대조군에 비해 변경된 ROR1의 수준(예컨대, 세포 표면 ROR1)을 생물학적 샘플 속에서 검출하는 방법을 제공한다. 일반적으로, 상기 방법은 생물학적 샘플을 본 발명의 항체, 항체-계 결합 단백질, 이의 항체 단편과 접촉시키는 단계 및 상기 샘플 속에서 물질(예컨대, 세포)에 선택적으로 결합하는 항체의 양을 측정함으로써 생물학적 샘플 속에서 ROR1의 수준을 측정하는 단계를 포함한다. 생물학적 샘플은 세포 배양물 또는 시험 대상체, 예컨대, 대상체내에서 상승된 ROR1과 관련된 질환 또는 상태를 가지거나 이로 발달할 위험이 있는 것으로 예측되는 대상체로부터의 혈장 또는 조직 샘플로부터 기원할 수 있다. 대조군 수준은 바람직하게는 하나 이상의 대조군 배양물 또는 질환이 없는 대상체로부터의 상응하는 샘플(들) 속에서 동일한 항체를 사용하여 검출된 ROR1 수준에 상응한다. 본 발명의 항체를 사용하여 ROR1 수준을 측정하는 방법은 면역-(웨스턴) 블롯팅, 효소-연결된 면역흡착 검정(ELISA), 면역조직화학(IHC) 및 유동 세포분석법, 예컨대, 형광성-활성화된 세포 분류(FACS) 분석과 같은 어떠한 면역검정도 포함할 수 있다.
검출 방법을 사용하여 상승된 ROR1과 관련된 장애의 존재를 스크리닝할 수 있다. 상기 방법은 스크리닝이 필요한 시험 대상체, 예컨대, 상승된 ROR1과 관련된 장애를 가지거나, 이로 발달할 위험이 있는 것으로 예측된 대상체로부터 샘플을 수득하는 단계를 포함한다. 샘플 속에서 ROR1의 수준(예컨대, 양 또는 농도)은 본 발명의 항체, 항체-계 결합 단백질, 이의 항체 단편을 사용하여 측정하며, 샘플 속의 수준은 ROR1의 대조군 수준과 비교한다. 대조군 수준은 예를 들면, 상승된 ROR1과 관련된 장애를 가지지 않은 하나 또는, 바람직하게는 다수의 대조군 그룹 대상체들로부터의 샘플(들)에서의 평균 수준(예컨대, 양 또는 농도)을 나타낸다. 대안적으로, 대조군 수준은, 시험 대상체가 상승된 ROR1과 관련된 상태를 가지지 않았거나, 나타내지 않았던 경우와 같이, 하나 이상의 이전 시기에 시험 대상체로부터 취한 하나 이상의 샘플 속에서 ROR1의 수준 또는 평균 수준에 상응할 수 있다. 대조군 수준과 비교하여 생물학적 샘플 속에서 ROR1의 유의적으로 보다 높은 수준은 대상체에서 상승된 ROR1과 관련된 장애의 지표이다. 세포 표면 ROR1 발현이 배아 발달에 대해 크게 제한되는, 사람과 같은 대상체에서, ROR1의 대조군 수준은 0일 수 있거나 없을 수 있다. 따라서, 본 발명에 의해 제공된 검출 방법의 일부 구현예에서, 생물학적 샘플 속의 어떠한 유의적인 및 검출가능한 양의 ROR1은 대상체에서 상승된 ROR1과 관련된 장애의 지표일 수 있다.
또한, 상기 검출 방법을 사용하여 상승된 ROR1과 관련된 장애의 진전을 모니터할 수 있다. 상기 방법은 스크리닝이 필요한 대상체, 예컨대, 상승된 ROR1과 관련된 장애를 가진 것으로 진단되거나 예측된 대상체로부터 샘플을 수득하는 단계를 포함한다. 샘플 속에서의 ROR1의 수준은 본 발명의 항체, 항체-계 결합 단백질, 이의 항체 단편을 사용하여 측정하며 샘플 속의 수준은 하나 이상의 이전 시기에 시험 대상체로부터 취한 하나 이상의 샘플 속에서 ROR1의 수준 또는 평균 수준에 상응하는 대조군 수준과 비교한다. 대조군과 비교하여 유의적으로 상승되거나 감소된 ROR1의 수준은 대상체의 장애가 악화되거나 개선됨을 나타낸다. 상기 검출 방법을 사용하여 예를 들면, CLL, ALL, 외투 세포 림프종, 신경아세포종, 육종, 신장 세포 암종, 유방 암, 폐 암, 결장 암, 두경부암, 흑색종, 및 기타 암을 포함하는 장애의 존재에 대해 스크리닝하거나 이의 진전을 모니터할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명은 ROR1의 변경된 수준에 대해 대상체를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 일반적으로, 상기 방법은 대상체에게 표지(예컨대, 조영제)에 접합된 본 발명의 항체, 항체-계 결합 단백질, 이의 항체 단편을 투여하는 단계, 상기 표지를 검출하기에 적합한 방식으로 상기 대상체를 영상화하는 단계, 및 상기 대상체내 영역이 근접한 조직내에서 표지의 배경 수준과 비교하여 표지의 변경된 밀도 또는 농도를 갖는지를 측정하는 단계를 포함한다. 대안적으로, 상기 방법은 대상체의 영역에서 이미 검출된 표지의 밀도 또는 농도와 비교하여 동일한 영역에서 표지의 변경된 밀도 또는 농도가 있는지를 측정하는 단계를 포함한다. 대상체를 영상화하는 방법은 항체에 접합된 표지를 검출하기에 적합한 것으로서, x-선 영상화, x-선 컴퓨터 단층촬영(CT) 영상화(예컨대, CT 혈관 촬영(CTA) 영상화), 자기 공명(MR) 영상화, 자기 공명 혈관촬영(MRA), 핵 의약, 초음파(US) 영상화, 광학 영상화, 탄성영상(elastography), 적외선 영상화, 초단파 영상화 등을 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 대상체는 CLL, ALL, 외투 세포 림프종, 신경아세포종, 육종, 신장 세포 암종, 유방 암, 폐 암, 결장 암, 두경부암, 흑색종, 및 기타 암과 같이, ROR1-발현 종양을 갖거나, 이로 발달할 위험이 있는 것으로 예측되며, 상기 방법을 사용하여 종양의 존재에 대해 스크리닝하거나 이의 존재를 검출한다. 다른 구현예에서, 상기 방법을 사용하여 시간에 따라, 예컨대, 치료 과정 동안, ROR1-발현 종양의 크기 또는 밀도를 모니터할 수 있다.
VI. 약제학적 조성물 및 조합
다른 국면에서, 본 발명은 본원에 기술된 항체, 항체 단편, 항체-계 결합 단백질, 또는 ADC 및 약제학적으로 허용되는 담체를 함유하는 약제학적 조성물을 제공한다. 약제학적 조성물은 본원에 기술된 어떠한 항체로부터도 제조할 수 있다. 예시적인 조성물은 하나 이상의 서열 번호: 14 (경쇄) 및/또는 서열 번호: 1 (중쇄)을 갖는 키메라 항체, 서열 번호: 18 (경쇄) 및/또는 서열 번호: 5 (중쇄)를 갖는 키메라 항체, 서열 번호: 25 (경쇄) 및/또는 서열 번호: 12 (중쇄)를 갖는 키메라 항체, 및 서열 번호: 26 (경쇄) 및/또는 서열 번호: 13 (중쇄)을 갖는 키메라 항체 중 하나 이상을 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 적합한 다른 항체, 항체 단편, 항체-계 결합 단백질, 또는 ADC는 서열 번호: 14 내지 26 또는 136 내지 141에 나타낸 경쇄 서열, 및/또는 서열 번호: 1 내지 13 또는 130 내지 135에 나타낸 중쇄 서열을 갖는 것들을 포함한다. 본 발명의 다른 예시적인 조성물은 서열 번호: 130 내지 141에 예시된 것과 같은, 서열 번호: 27 내지 104로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 갖는 사람화된 항체를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 도 1에 나타낸 동일한 예시된 경쇄 또는 중쇄의 3개의 CDR 서열을 포함한다. 이들은 (1) 서열 번호: 27 내지 29 및 서열 번호: 66 내지 68 (항체 XBR1-402), (2) 서열 번호: 30 내지 32 및 서열 번호: 69 내지 71 (항체 ERR1-301), (3) 서열 번호: 33 내지 35 및 서열 번호: 72 내지 74 (항체 ERR1-306), (4) 서열 번호: 36 내지 38 및 서열 번호: 75 내지 77 (항체 ERR1-316), (5) 서열 번호: 39 내지 41 및 서열 번호: 78 내지 80 (항체 ERR1-324), (6) 서열 번호: 42 내지 44 및 서열 번호: 81 내지 83 (항체 ERR1-403), (7) 서열 번호: 45 내지 47 및 서열 번호: 84 내지 86 (항체 ERR1-409), (8) 서열 번호: 48 내지 50 및 서열 번호: 87 내지 89 (항체 ERR1-TOP4), (9) 서열 번호: 51 내지 53 및 서열 번호: 90 내지 92 (항체 ERR1-TOP15), (10) 서열 번호: 54 내지 56 및 서열 번호: 93 내지 95 (항체 ERR1-TOP22), (11) 서열 번호: 57 내지 59 및 서열 번호: 96 내지 98 (항체 ERR1-TOP40), (12) 서열 번호: 60 내지 62 및 서열 번호: 99 내지 101 (항체 ERR1-TOP43), 또는 (13) 서열 번호: 63 내지 65 및 서열 번호: 102 내지 104 (항체 ERR1-TOP54)에 나타낸 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열 각각을 포함한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 도 1에 예시된 동일한 항체의 6개의 CDR 서열, 예컨대, (a) 서열 번호: 66 내지 68 및 서열 번호: 27 내지 29 (항체 XBR1-402); (b) 서열 번호: 78 내지 80 및 서열 번호: 39 내지 41(항체 ERR1-324); (c) 서열 번호: 99 내지 101 및 서열 번호: 60 내지 62 (항체 ERR1-TOP43), 또는 (d) 서열 번호: 102 내지 104 및 서열 번호: 63 내지 65 (항체 ERR1-TOP54)을 갖는 항체를 포함한다. 여전히 다른 예시적인 약제학적 조성물은 당해 분야의 통상의 기술자에게 적절하고 이해되는 것으로서 아미노산 서열에 대한 하나 이상의 변형을 포함할 수 있는 dsFv 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 항체, 항체 단편, 항체-계 결합 단백질 또는 ADC에 대한 담체, 바람직하게는 약제학적으로 허용되는 담체를 함유한다. 약제학적으로 허용되는 담체는 어떠한 적합한 약제학적으로 허용되는 담체일 수 있다. 이는 사람 또는 가축 환자에게 투여하기에 적합한(예컨대, 생리학적으로 허용되는 담체 또는 약리학적으로 허용되는 담체) 하나 이상의 혼용성(compatible) 고체 또는 액체 충전제, 희석제, 다른 부형제, 또는 봉입 물질(encapsulating material)일 수 있다. 용어 "담체"는 이와 함께 활성 성분이 조합되어 활성 성분의 사용, 예컨대, 대상체에게 활성 성분의 투여를 촉진시키는, 유기 또는 무기의, 천연 또는 합성 성분을 나타낸다. 약제학적으로 허용되는 담체는 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체가 요구되는 약제학적 효능에 실질적으로 영향을 미치지 않는 방식으로, 조성물 속에 존재하는 경우, 하나 이상의 활성 성분, 예컨대, 하이브리드 분자, 및 서로와 혼합될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 물질은 전형적으로 대상체, 예컨대, 환자에게, 오심, 현기증, 발진, 또는 위 부조화(gastric upset)와 같은 유의적인 바람직하지 않은 생리학적 효과를 생산하지 않고 투여할 수 있다. 예를 들면, 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물은 치료학적 목적으로 사람 환자에게 투여되는 경우 면역원성이 아닌 것이 바람직하다.
본 발명의 약제학적 조성물은 예를 들면, 염 중의 아세트산, 염 중의 시트르산, 염 중의 붕산, 및 염 중의 인산을 포함하는, 적합한 완충제를 추가로 함유할 수 있다. 조성물은 또한 벤즈알코늄 클로라이드, 클로로부탄올, 파라벤, 및 티메로살과 같은, 적합한 방부제를 임의로 함유할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 단위 투여량 형으로 존재할 수 있으며 어떠한 적합한 방법에 의해서도 제조될 수 있고, 이의 많은 것이 약학 분야에 잘 공지되어 있다. 이러한 방법은 본 발명의 항체를 하나 이상의 보조 성분을 구성하는 담체와 연합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 조성물은 활성제를 액체 담체, 미분된 고체 담체, 또는 둘 다와 균일하게 및 친밀하게 연합시킨 후, 경우에 따라 생성물로 성형하여 제조한다.
비경구 투여용으로 적합한 조성물은 편리하게는, 바람직하게는 수용체의 혈액과 등장성인, 본 발명의 조성물의 멸균 수성 제제를 포함한다. 당해 수성 제제는 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁제를 사용하여 공지된 방법에 따라 제형화할 수 있다. 멸균 주사가능한 제제는 또한 예를 들면, 1,3-부탄 디올 속의 용액으로서, 무-독성의 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매 속의 멸균 주사가능한 액제 또는 현탁제일 수 있다. 사용될 수 있는 허용되는 비히클 및 용매 중에는 물, 링거액(Ringer's solution), 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 멸균된, 고정 오일을 용매 또는 현탁화 매질로서 편리하게 사용한다. 당해 목적으로 위해, 어떠한 블랜드 고정 오일(bland fixed oil), 예를 들면, 합성 모노- 또는 디-글리세라이드를 사용할 수 있다. 또한, 올레산과 같은 지방산을 주사제의 제조시 사용할 수 있다. 경구, 피하, 정맥내, 근육내 등의 투여에 적합한 담체 제형은 Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA에서 찾을 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 제조 및 이의 다양한 투여 경로는 당해 분야에 잘 공지된 방법에 따라 수행될 수 있다. 예컨대, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Co., 20th ed., 2000; 및 Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978을 참고한다. 본 발명의 맥락에서 유용한 전달 시스템은 본 발명의 조성물의 전달이 치료될 부위의 감작화(sensitization)를 유발하기 전에, 및 이를 유발하기에 충분한 시간으로 일어나도록 시간-방출성, 서방성, 및 지속 방출성 전달 시스템을 포함한다. 본 발명의 조성물은 다른 치료제 또는 치료요법과 함께 사용될 수 있다. 이러한 시스템은 본 발명의 조성물의 반복된 투여를 피함으로써, 대상체 및 주치의에게 편리성을 증가시킬 수 있고, 특히 본 발명의 특정 조성물에 적합할 수 있다.
많은 유형의 방출 전달 시스템이 이용가능하며 당해 분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 적합한 방출 시스템은 폴리(락타이드-글리콜라이드), 코폴리옥살레이트, 폴리카프롤락톤, 폴리에스테르아미드, 폴리오르토에스테르, 폴리하이드록시부티르산, 및 다가무수물과 같은 중합체계 시스템을 포함한다. 약물을 함유하는 앞서의 중합체의 미세캅셀은 예를 들면, 미국 특허 제5,075,109호에 기술되어 있다. 전달 시스템은 또한 콜레스테롤과 같은 스테롤, 콜레스테롤 에스테르, 및 모노-, 디- 및 트리글리세라이드와 같은 지방산 또는 천연 지방을 포함하는 지질; 하이드로겔 방출 시스템; 실라스틱 시스템(sylastic system); 펩타이드계 시스템; 왁스 피복물; 통상의 결합제 및 부형제를 사용한 압착 정제; 부분적으로 융합된 이식물; 등인 비-중합체 시스템을 포함한다. 구체적인 예는 다음을 포함하나, 이에 한정되지 않는다: (a) 활성 조성물이 미국 특허 제4,452,775호, 제4,667,014호, 제4,748,034호, 및 제5,239,660호에 기술된 것들과 같은 매트릭스(matrix)내에 형태로서 함유된 부식 시스템 및 (b) 활성 성분이 미국 특허 제3,832,253호 및 제3,854,480호에 기술된 것과 같이 중합체로부터 조절된 속도로 침투하는 확산 시스템. 또한, 펌프-계 하드웨어 전달 시스템을 사용할 수 있으며, 이들 중 일부는 이식용으로 채택되어 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 방법을 수행하기 위한 키트(kit)를 제공한다. 전형적으로, 키트는 본 발명의 치료학적 또는 진단학적 방법을 수행하는데 요구되는 2개 이상의 성분을 함유한다. 키트 성분은 본 발명의 하나 이상의 항체, 항체-계 결합 단백질, 이의 항체 단편, 또는 ADC, 적절한 시약 및/또는 장치를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 키트는 본 발명의 항체, 항체-계 결합 단백질, 이의 항체 단편 및 ROR1을 검출하는데 적합한 면역검정 완충액(예컨대, ELISA, 유동 세포분석법, 자기 분류, FACS에 의함)을 함유할 수 있다. 키트는 또한 하나 이상의 미세역가 플레이트, 표준물, 검정 희석액, 세척 완충액, 접착성 플레이트 커버, 자기 비드(magnetic bead), 자석, 및/또는 당해 키트를 사용하여 본 발명의 방법을 수행하기 위한 지시사항을 함유할 수 있다. 키트 스캔(kit scan)은 적합하게 포장되고 ROR1을 검출하기에 유용한 기판(예컨대, 다중-웰 플레이트 또는 칩)에 결합된 본 발명의 항체, 항체-계 결합 단백질, 이의 항체 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 형광성 표지, 생물학적으로 활성인 효소 표지, 발광성 표지, 또는 염색단 표지와 같은, 표지에 접합된 본 발명의 항체, 항체-계 결합 단백질, 이의 항체 단편을 포함한다. 키트는 또한 접합된 항체, 항체-계 결합 단백질, 이의 항체 단편, 예컨대, 효소용 기질을 가시화하기 위한 시약을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 키트는 조영제 및, 임의로 대상체 속의 항체를 영상화하는데 유용한 하나 이상의 시약 또는 피이스(piece)에 접합된 본 발명의 항체, 항체-계 결합 단백질, 이의 항체 단편을 포함한다.
일반적으로, 키트 속의 본 발명의 항체, 항체-계 결합 단백질, 이의 항체 단편은 예컨대, 치료학적 또는 진단학적 방법에 적절한 바이알, 파우치, 앰플, 및/또는 어떠한 용기 속에 적합하게 포장된다. 키트 성분은 사용 직전에 추가로 희석시킬 수 있는 농축액(동결건조된 조성물 포함)으로 제공될 수 있거나, 이들은 사용 농도로 제공될 수 있다. 본 발명의 항체를 생체내에서 사용하기 위해, 단일 투여량을 바람직한 양 및 농도의 성분을 갖는 멸균된 용기 속에 제공할 수 있다.
실시예
다음의 실시예는 본 발명을 추가로 설명하기 위해 제공되나 이의 영역을 한정하지는 않는다. 본 발명의 다른 변형은 당해 분야의 통상의 기술자에게 용이하게 명백할 것이며 첨부된 청구범위에 포함된다.
실시예 1. 세포주
세포주: MDA-MB-231, MDA-MB-469, 697, Kasumi-2, T47D, HS578T, 63-12 및 63-12/hROR1 및 63-12/hROR2 감염체, K562 및 K562/hROR1 감염체, EMT-6 및 EMT-6/ROR1 감염체를 10% (v/v) 열 불활성화된 FBS(Thermo Scientific; 유타주 로간 소재), 100 U/mL 페니실린, 및 100 mg/mL 스트렙토마이신(Invitrogen)이 보충된 DMEM(Invitrogen; 캘리포니아주 칼스바드 소재) 속에서 배양하였다. HEK 293F 세포는 Invitrogen으로부터 구입하여 1% (v/v) 열 불활성화된 FBS (Thermo Scientific)이 보충된 FreeStyle 배지 속에 유지시켜 부착성 배양을 뒷받침하거나 현탁액 배양을 위한 FBS, 100 U/mL의 페니실린, 및 100 mg/mL의 스트렙토마이신(Invitrogen)을 배제시켰다
완전한 길이의 hROR1 및 hROR1 포유동물 발현 벡터의 클로닝: 수송가능한 벡터 골격(pPB-Puro)을 서열-확인된 시판되는 벡터로부터 합성하거나 기원하고 미국 특허 제WO2014013026A1호에 상세히 기술된 플랭킹 제한 부위를 사용하여 모듈러 부분(modular part)으로부터 조립하였다. 이들 원래의 수송가능한 벡터 골격은 원래의 벡터 속의 푸로마이신 내성 유전자의 IRES-구동된 발현을 별도의, 포스포글리세레이트 키나제 프로모터(PGK) 구동된 발현으로 교환하여 변형시켰다. 이는 IRES 서열을 다수의 클로닝 부위의 3'에 위치한 SV40-pA 서열로 대체한 후, 푸로마이신 내성 유전자의 PGK-프로모터 서열 5'를 도입시켜 수행하였다. 완전한 길이의 ROR1/2 개방 판독 프레임을 플랭킹 제한 부위(5'NotI/3'BstBI)를 지닌 총 유전자 합성(Genscript, Piscataway)으로 합성한 후 각각의 제한 효소를 사용하여 수송가능한 벡터의 다수의 클로닝 부위내로 클로닝하였다.
63-12 쥐 A-MuLV-형질전환된 preB 세포주내에서 hROR1 또는 hROR2의 이소성 발현을 위한 세포주 가공: 마우스 Abelson 쥐 예비-B 세포주 63-12(Shinkai et al. (1992) Cell 68:855-67)를 2% (v/v) FCS, 100 IU/mL Pen/Strep/Fungizone(Amimed, 4-02F00-H), 200 mM L-글루타민(Amimed, 5-10K00-H) 및 50 μM 2-머캅토에탄올(Amresco, 0482)이 보충된 배양 배지(17.7g/L Gibco® IMDM (Life Technologies, 42200-030), 3.024 g/L NaHCO3 (Sigma-Aldrich, p.a., >99.7%), 10 mL/L 100x 비-필수 아미노산(Life Technologies, 11140035), 5 mg/L 인슐린(Sigma-Aldrich, I-5500), H2O 중 3 mL/L의 10% 프리마톤 RL/UF (Sheffield Bioscience), 및 H2O 중 1 mL/L의 50 mM 2-머캅토에탄올(Sigma-Aldrich, M-3148)) 속에서 37℃ 및 7.5% CO2 속에서 배양하였다. 세포를 가공하여 다음과 같은 전위(transposition)에 의해 hROR1 및 hROR2를 과발현시켰다: 세포를 원심분리(6 min, 1200 rpm, 4℃)하고 RPMI-1640 배지(5x106 개의 세포/mL) 속에 재현탁시켰다. 이후에, 400 μL의 세포 현탁액을 10 μg의 수송가능한 벡터 pPB-PGK-Puro-ROR1(완전한 길이의 ROR1 (NP_005003.2) 및 푸로마이신-내성 유전자의 동시-발현을 지시함), 또는 10 μg의 수송가능한 벡터 pPB-PGK-Puro-ROR2 (완전한 길이의 ROR2 (NP_004551.2) 및 푸로마이신-내성 유전자의 동시-발현을 지시함)를 함유하는 400 μL의 RPMI에, 10 μg의 트랜스포사제-함유 벡터 pCDNA3.1_hy_mPB와 함께 가하였다. DNA/63-12 세포 혼합물을 전기천공 큐베트(0.4 cm-갭(gap), 165-2088, BioRad, 스위스 크레시어 소재)에 이전시키고 300V 및 950 μF에서 전기용량 증량제가 장착된 Biorad Gene Pulser II를 사용하여 전기천공하였다. 이후에, 세포를 실온에서 5 내지 10분 동안 항온처리하였다. 항온처리 후, 세포를 1200 rpm에서 6분(4℃) 동안 항온처리하고, 1회 세척한 후 2% (v/v) FCS, 100 IU/mL Pen/Strep/Fungizone (Amimed, 4-02F00-H), 200 mM L-글루타민(Amimed, 5-10K00-H) 및 50 μM 2-머캅토에탄올(Amresco, 0482)이 보충된 수성 배양 배지(17.7g/L Gibco® IMDM (Life Technologies, 42200-030), 3.024 g/L NaHCO3 (Sigma-Aldrich, p.a., >99.7%), 10 mL/L 100x 비-필수 아미노산 (Life Technologies, 11140035), 5 mg/L 인슐린(Sigma-Aldrich, I-5500), H2O 중 3 mL/L의 10% 프리마톤 RL/UF (Sheffield Bioscience), 및 H2O 중 1 mL/L의 50 mM 2-머캅토에탄올(Sigma-Aldrich, M-3148))에 현탁시켰다. 5% CO2 대기에서 습윤화된 항온처리기 속에서 37℃에서 2일동안 항온처리한 후, hROR1 또는 hROR2를 안정하게 발현하는 세포 혼주물(cell pool)을 2 μg/mL 푸로마이신(Sigma-Aldrich, P8833)을 가하여 선택하였다.
4 내지 5일 후에, 가공된 세포에서 hROR1 또는 hROR2 발현을 유동 세포분석법으로 확인하였다. 요약하면, 106개의 세포를 FACS 튜브 속에서 원심분리하고; 수득된 펠렛(pellet)을 완충액(2% (v/v) FCS가 들어있는 PBS) 속에 재현탁시켰다. hROR1-가공된 세포의 경우에, 세포를 이후에 2A2 (ROR1을 표적화하는 mAb066 항체, 2 μg/mL의 최종 농도)를 30분 동안 4℃에서 항온처리한 후, 원심분리하고 세척하였다. 세포를 앞서와 같이 재현탁하고 항-사람 IgG 항체(Fc 감마-특이적인) PE(eBioscience, Vienna, Austria, 12-4998-82)와 함께, 1:100 희석으로, 암실(30 min, 4℃) 속에서 항온처리하고, 완충액으로 1회 세척하며 FACS 분류까지 빙상에 유지시켰다. hROR2-가공된 63-12 세포의 경우, 동일한 프로토콜을 수행하나 제1 항체로서 EPR3779(ROR2를 표적화하는 Abcam 항체; 1:100 희석) 및 제2 항체로서 알로피코시아닌-접합된 AffiniPure F(ab')2 염소 항-토끼 IgG (H+L)(Jackson Immunoresearch, 111-136-144)을 사용하였다.
hROR1-가공된 63-12 세포의 경우에, 세포는 FACS Aria II를 사용하여 웰(well)당 200 μL의 보충된 배양 배지를 함유하는 96-웰 평편-바닥 플레이트내로 분류된 단일 세포였다. 플레이트를 37℃에서 항온처리하고 클론을 분석 전에 6-웰 플레이트로 확장시켰다. 표적 발현을 FACSCalibur 장치(BD Biosciences) 및 FlowJo 분석 소프트웨어(Tree Star, 오레건 주 아쉬랜드 소재)를 사용하여 유동 세포분석법으로 확인하였다.
EMT-6 쥐 유방 암 세포주에서 hROR1의 이소성 발현을 위한 세포주 가공: 쥐 EMT-6 유방 암 세포(스위스의 바젤의 대학병원의 의학박사 Alfred Zippelius로부터의 선물)를 DMEM 완전 배지(L-글루타민과 10% (v/v) 태아 송아지 혈청(FCS), 100 IU/mL의 Pen-Strep-Fungizone 및 2 mM L-글루타민(모두 Bioconcept, 스위스 알츠윌 소재)이 들어있는 둘베코 개질된 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium: DMEM) 고 글루코즈(4.5 g/l)) 속에서 37℃ 및 5% CO2로 배양하였다. 세포를 가공하여 다음과 같이 전위시켜 ROR1을 과발현시켰다: 세포를 원심분리(6 min, 1200 rpm, 4℃)하고 RPMI-1640 배지(5x106 세포/mL) 속에 재현탁시켰다. 이후에, 400 μL의 당해 세포 현탁액을 완전한 길이의 ROR1(NP_005003.2) 및 푸로마이신-내성 유전자의 동시-발현을 지시하는, 13.3 μg의 수송가능한 벡터, 및 6.6 μg의 트랜스포사제-함유 벡터 pCDNA3.1_hy_mPB를 함유하는 400 μL의 RPMI에 가하였다. DNA/EMT-6 세포 혼합물을 전기천공 큐베트(0.4 cm-gap, 165-2088, BioRad, 스위스 크레시어 소재)에 이전시키고 300V 및 950 μF에서 정전용량 증량제가 장착된 Biorad Gene Pulser II를 사용하여 전기천공하였다. 이후에, 세포를 5 내지 10분 동안 실온에서 항온처리하였다. 항온처리 후, 세포를 1200 rpm에서 6분 동안 원심분리하고, 1회 세척한 후 5% CO2 대기에서 습윤화된 항온처리기 속에서 37℃에서 항온처리하기 전에 DMEM 완전 배지 속에 재현탁시켰다. 전기천공 후 1일째에, 사람 ROR1을 안정하게 발현하는 세포 혼주물을 3 μg/mL 푸로마이신(Sigma-Aldrich, P8833)을 가하여 선택하였다.
선택된 EMT-6-ROR1 세포에서의 ROR1 발현을 유동 세포분석법으로 확인하였다. 요약하면, 트립신처리 후, 106개의 세포를 FACS 튜브 속에서 원심분리하고; 수득된 펠렛을 완충액(2% (v/v) FCS가 들어있는 PBS) 속에 재현탁시켰다. 이후에, 세포를 2A2 (mAb066; 30 min, 4℃에서, 2 μg/mL의 최종 농도)와 함께 항온처리한 후, 원심분리하고 세척하였다. 이후에, 세포를 앞서와 같이 재현탁시키고 항-사람 IgG 항체 (Fc 감마-특이적인) PE(eBioscience, Vienna, Austria, 12-4998-82)와 함께 1:250 희석으로 암실(30 min, 4℃)에서 항온처리하고, 완충액 속에서 1회 세척하고 FACS 분류까지 빙상에 유지시켰다.
FACS Aria II를 사용하면, 세포는 웰당 200 μL의 완전한 DMEM을 함유하는 96-웰 평편-바닥 플레이트내로 분류된 단일 세포였다. 당해 플레이트를 37℃에서 항온처리하고 클론을 상기 요약한 바와 같이 유동 세포분석법에 의해 ROR1-발현의 분석 전에, 분석을 위한 FACSCalibur 장치(BD Biosciences) 및 FlowJo 분석 소프트웨어(Tree Star, 오레건주 아쉬랜드 소재)를 사용하여, 6-웰 플레이트로 확장시켰다.
도 16, C는 항-ROR1 항체 2A2 (mAb066)로 검출된, 클론 14(고 ROR1-발현) 및 WT(ROR1 음성) EMT-6의 FACS 분석 데이타를 나타낸다.
실시예 2. 고-복잡성 토끼 Fab 라이브러리 및 스크리닝용 시약의 생성
재조합체 사람 ROR1 단백질의 작제, 발현, 및 정제: 사람 ROR1 또는 마우스 ROR1의 상이한 도메인을 함유하는 hFc 융합 단백질의 작제, 발현, 정제 및 바이오티닐화가 기술되었다(Yang et al., PloS One 6:e21018, 2011). hROR1-AVI-6XHIS 융합 단백질의 경우, 사람 ROR1 (24-403)의 세포외 도메인을 프라이머 pCEP4-hROR1-F 및 pCEP4-hROR1-Avi tag-R (AVI tag는 프라이머 pCEP4-hROR1-Avi tag-R에 의해 ROR1의 C말단으로 도입되었음에 주목한다)를 사용하여 PCR 증폭한 후, 프라이머 pCEP4-시그날-F-KpnI 및 pCEP4-6HIS-R-XhoI를 사용하여 연장 PCR에 의해 시그날 펩타이드 및 6XHIS 태그를 KpnI/XhoI을 통해 pCEP4 내로 클로닝하기 전에 별도로 N 및 C 말단에 가하였다. 이후에, 당해 작제물을 293fectin(Invitrogen)을 사용하여 HEK 293F 세포 (Invitrogen) 내로 일시적으로 형질감염시키고, 단백질을 Kwong and Rader, Curr Protoc protein Sci Chapter 6:Unit 6 10, 2009에 기술된 바와 같이 1-mL HisTrap 컬럼(GE Healthcare)을 사용하여 고정된 금속 이온 친화성 크로마토그래피(Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography)로 정제하였다. 정제된 hROR1-AVI-6XHIS의 품질 및 양을 각각 SDS-PAGE 및 A280 흡광도로 분석하였다. 후속적으로, 융합 단백질을 Avidity(Aurora, Colorado)로 부터의 BirA 효소 키트에 의해 프로토콜에 따라 바이오티닐화하였다. 요약하면, 10 mM 트리스-HCl(pH 8) 중 40 μM에서 2 mg ROR1-AVI-6XHIS를 37℃에서 30분 동안 항온처리 후 바이오틴의 존재하에서 10 μg BirA를 사용하여 바이오티닐화한 후, 상술한 바와 같이 1-mL HisTrap 컬럼(GE Healthcare)을 사용하여 다시 정제하였다. pCEP4-hROR1-F: 5'-atcctgtttctcgtagctgctgcaactggagcacactccgcccggggcgccgccgcccag-3' (서열 번호: 105); pCEP4-hROR1- Avi-tag-R: 5'-ccactcgatcttctgggcctcgaagatgtcgttcaggccctccatcttgttcttctcctt-3' (서열 번호: 106); pCEP4-signal-F-KpnI: 5' gctgggtaccggcgcgccaccatggactggacttggagaatcctgtttctcgtagctgct-3' (서열 번호: 107); pCEP4-6HIS-R-XhoI: 5'-gccggcctcgagtcagtgatggtgatggtggtgctcgtgccactcgatcttctgggcctc-3' (서열 번호: 108).
재조합체 사람 ROR1 (hROR1-His) 및 사람 ROR2 (hROR2-His) 단백질의 작제, 발현, 및 정제: hROR1-His는 주형으로서 pCEP4-hFc-hROR1(Yang et al., PloS One 6:e21018, 2011)을 사용하여 프라이머 SP-hROR1_F (5' gctgggtaccggcgcgccaccatggactggacttggagaatcctgtttctcgtagctgctgcaactggagcacactccgcccggggcgccgccgcccag 3') (서열 번호: 109) 및 hROR1-His_R (5' cggcctcgagtcagtgatggtgatggtggtgctccatcttgttcttctcctt 3') (서열 번호: 110)로 PCR-증폭시키나, hROR2-His는 주형으로서 pCEP4-hFc-hROR2를 사용하여 프라이머 SP-hROR2_F (gctgggtaccggcgcgccaccatggactggacttggagaatcctgtttctcgtagctgctgcaactggagcacactccgaagtggaggttctggatccg) (서열 번호: 111) 및 hROR2-His_R (cggcctcgagtcagtgatggtgatggtggtgccccatcttgctgctgtctcg) (서열 번호: 112)로 PCR-증폭시켰다. 이후에, 이들을 KpnI/XhoI을 통해 pCEP4(Invitrogen) 내로 별도로 클로닝하였다. 이들 작제물을 이후에 별도로 및 일시적으로 HEK 293F 세포(Invitrogen) 내로 293fectin(Invitrogen)을 사용하여 클로닝하고, 상응하는 단백질을 Kwong and Rader, Curr Protoc Protein Sci Chapter 6:Unit 6 10, 2009에 기술된 바와 같이, 1-mL HisTrap 컬럼(GE Healthcare)을 사용하는 고정된 금속 이온 친화성 크로마토그래피로 정제하였다. 정제된 hROR1-His 및 hROR2-His의 품질 및 양을 각각 SDS-PAGE 및 A280 흡광도에 의해 분석하였다.
나이브 키메라 토끼/사람 Fab 라이브러리의 생성 및 선택: 모든 토끼 취급은 Pocono Rabbit Farm & Laboratory(펜실바이아주 카나덴시스 소재) 또는 R & R Research(워싱톤주 스탠우드 소재)에서 수의학과 요원에 의해 수행되었다. 총 9마리의 토끼(3 내지 4개월령)을 사용하였다. 이들 토끼들 중 5마리는 뉴질랜드 화이트(New Zealand White: NZW) 혈통이었고, 3마리는 Pocono Rabbit Farm & Laboratory(펜실바이나주 카나덴시스 소재)로부터 및 2마리는 R & R Research(워싱톤주 스탠우드 소재)로부터 구입하였다. 4마리의 b9 야생형 토끼는 알레르기 및 감염 질환의 국립 기관(National Institute of Allergy and Infectious Diseases: NIAID)에서 개발하여 특성화한 순종의 콜로니로부터 기원한 별도의 R&R Research(워싱톤주 스탠우드 소재)로부터 기원하였다(McCartney-Francis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 81:1794-1798, 1984; 및 Popkov et al., J. Mol. Biol. 325:325-335, 2003). 각각의 토끼로부터의 비장 및 골수를 수집하고, 확립된 프로토콜(Rader, Methods Mol Biol 525:101-128, xiv, 2009)을 사용하여 토끼 Vκ, Vλ, 및 VH 암호화 서열의 총 RNA 제조 및 RT-PCR 증폭을 위해 가공하였다. 토끼(rb) Vκ/사람(hu) Cκ/rbVH 및 rbVλ/huCλ/rbVH 분절 각각을 3-단편 오버랩 연장 PCR을 기반으로 하는 1회 융합 단계에서 조립하였다. b9 토끼로부터 기원한 VL은 또한 NZW 토끼로부터의 VH과 조립되었음에 주목한다. Fab-암호화 단편을 SfiI로 분해하고 SfiI-처리된 파아지 디스플레이 벡터 pC3C(Hofer et al., J Immunol Meth 318:75-87, 2007)로 16℃에서 24시간 동안 연결시켰다. 후속적으로 15 μg의 정제된 pC3C-rbVκ/hCκ/rbVH 연결된 생성물을 이. 콜라이 균주 SR320(캐나다 온타리오, 토론토 소재의 토론토대의 Sachdev S. Sidhu 박사로부터의 선물)내로 30회의 별도의 전기천공(각각 50 μl의 전기허용성(electrocompetent) 세포 중 0.5 μg DNA를 사용)으로 형질전환시켜 라이브러리 κ에 대해 7.5 x 109개의 독립된 형질전환체를 수득하였다. 라이브러리 λ의 경우에는, 4.8 x 109개의 독립된 형질전환체를 동일한 과정을 사용하여 수득하였다. VCSM13 헬퍼 파아지(Stratagene; La Jolla, CA)를 사용하여, 파아지미드 라이브러리를 파아지 라이브러리로 전환시키고 -80℃에서 저장하였다. 파아지 라이브러리 κ 및 라이브러리 λ를 XL1-Blue (Stratagene) 또는 ER2738 (Lucigen)를 사용하여 재-증폭시키고 바이오티닐화된 hFc-hROR1 또는 hROR1-AVI-6HIS에 대한 4 라운드의 패닝(panning) 전에 균일하게 혼합하였다. 패닝 동안, 5 μg/mL 항원을 스트렙타비딘 피복된 자기 비드(Dynabeads MyOne Streptavidin C1; Invitrogen)와 함께 37℃에서 30분 동안 예비-항온처리한 후 hFc-ROR1가 사용된 경우 파아지 라이브러리로부터의 결합제를 1 mg/mL의 비특이적인 폴리클로날 사람 IgG (Thermo Scientific)의 존재하에 포획하였다. 제3 라운드의 패닝으로부터 출발하여, 투입 파아지는 항원-로딩된 비드에 대한 선택 전에 엠티 비드(empty bead)와의 항온처리에 의해 음으로 고갈되었다. 선택 후, IPTG-유도된 세균 클론의 상층액을 ELISA 및 유동 세포분석법으로 분석하였다. 반복된 클론을 AluI을 사용한 DNA 핑거프린팅(fingerfrinting)으로 확인하고, 유일한 클론의 VL 및 VH 서열을 DNA 서열분석으로 측정하였다(도 1).
실시예 3. 키메라 토끼/사람 Fab 및 완전한 길이의 IgG1 항체의 발현 및 정제
키메라 토끼/사람 Fab 및 IgG1의 작제, 발현, 및 정제: 키메라 토끼/사람 Fab 양식의 MAb XBR1-402를 이. 콜라이 발현 플라스미드 pC3C-His 내로 클로닝하고 Kwong and Rader, Curr Protoc Protein Sci Chapter 6:Unit 6 10, 2009에 기술된 바와 같이 발현시키고 정제하였다. 키메라 토끼/사람 IgG1 양식으로 mAb XBR1-402의 발현을 위해, 앞서 기술된 벡터 PIGG-R11을 사용하였다(Yang et al., PloS One 6:e21018, 2011). Fab XBR1-402의 VH 암호화 서열을 프라이머 4-2_VH_F 및 4-2_VH_R을 사용하여 PCR 증폭시키고 ApaI/SacI을 통해 PIGG-R11내로 클로닝하였다. 이후에, XBR1-402의 경쇄 암호화 서열을 프라이머 4-2_λ_F 및 LEAD-B를 사용하여 PCR 증폭시키고 HindIII/XbaI을 통해 PIGG-R11 내로 상응하는 중쇄 암호화 서열과 함께 클로닝하였다. Fab XBR1-402의 VH 암호화 서열의 FR4내 내부 ApaI 부위는 프라이머 4-2_VH_R 내에서 사일런트 돌연변이(silent mutation)에 의해 제거되었음에 주목한다. 또한, 본 발명자들은 이. 콜라이 균주 XL1-Blue내에서 선택 동안 천연의 VH의 제1 아미노산(도 1)을 암호화하는 CAG(글루타민)에 대해 억제되었던 TAG 정지 코돈을 프라이머 4-2_VH_F로 교환하였다. 수득되는 PIGG-XBR1-402 플라스미드를 HEK 293F 세포(Invitrogen) 내로 293fectin (Invitrogen)을 사용하여 일시적으로 형질감염시키고, 단백질을 1-mL의 재조합체 단백질 A HiTrap 컬럼(GE Healthcare, 뉴저지주 피스카타웨이 소재)으로 기술한 바와 같이(Yang et al., PloS One 6:e21018, 2011; 및 Yang 및 Rader, Methods Mol Biol 901:209-232, 2012) 정제하였다. 정제된 IgG1의 품질 및 양을 각각 SDS-PAGE 및 A280 흡광도로 분석하였다.
키메라 토끼/사람 Fab 양식의 모든 다른 mAb를 이. 콜라이 발현 플라스미드 pET11a 내로 클로닝하고 기술된 바와 같이(Yang et al., PloS One 6:e21018, 2011) 발현하고 정제하였다. 키메라 토끼/사람 IgG1 양식의 mAb ERR1-324, ERR1-TOP43 및 ERR1-TOP54의 발현을 위해, pCEP4(Invitrogen)을 사용하여 중쇄 및 경쇄를 별도로 클로닝하였다. 중쇄의 경우, 중쇄 시그날 펩타이드 암호화 서열을 함유하는 gBlock, ERR2-302의 VH(hROR2에 대한 mAb) 및 사람 IgG1의 CH1(1-49)을 IDT(캘리포니아주 산 호세 소재)에 의해 합성하고 프라이머 KpnI/AscI-Signal 및 CH1-internal/overlap-R을 사용하여 증폭시키며, 프라이머 KpnI/AscI-Signal 및 HC-CH3-R-XhoI을 사용한 오버랩 연장 PCR에 의해 프라이머 CH1-internal/overlap-F 및 HC-CH3-R-XhoI을 사용하여 PIGG로부터 증폭된 CH1 (50-88)-CH2-CH3에 융합시킨 후, AscI/XhoI에 의해 pCEP4 내로 클로닝하였다. EheI 부위는 gBlock이 합성된 경우 동일 돌연변이(synonymous mutation)에 의해 Ala12에서 CH1내로 도입되었음에 주목한다. 결과적으로, 당해 작제물은 AscI/EheI을 사용하여 VH를 대체함으로서 다른 mAb의 중쇄를 클로닝하기 위한 벡터로서 제공되었으며: ERR1-324, ERR1-TOP43 및 ERR1-TOP54의 VH는 전방(forward) 프라이머 ERR1-324 HC-F, ERR1-TOP43 HC-F 및 ERR1-TOP54 HC-F 및 역방(reverse) 프라이머 VH-CH1-R-EheI을 별도로 사용하여 증폭시킨 후, 연장 PCR에 의해 시그날 펩타이드를 프라이머 KpnI/AscI-Signal 및 VH-CH1-R-EheI를 사용하여 가하였다. 이후에, 각각의 VH를 AscI/EheI을 사용하여 벡터내로 삽입하였다. 경쇄 클로닝을 위해, ERR1-TOP43 및 ERR1-TOP54의 람다 경쇄는 LC-R-XhoI와 별도로 조합된 프라이머 ERR1-TOP43 LC-F 및 ERR1-TOP54 LC-F를 사용하여 증폭시켰으며, ERR1-324의 카파-경쇄는 프라이머 ERR1-324 KC-F 및 KC-R-XhoI을 사용하여 증폭시켰다. 이후에, 시그날 펩타이드 암호화 서열을 전방 프라이머 KpnI/AscI-Signal 및 역방 프라이머 LC-R-XhoI 또는 KC-R-XhoI을 사용하여 연장 PCR에 의해 가하였다. 후속적으로, 각각의 경쇄 PCR 생성물을 AscI/XhoI에 의해 pCEP4내로 클로닝하였다. 각각의 IgG에 대한 중쇄 또는 경쇄를 함유하는 수득되는 작제물을 293fectin (Invitrogen)을 사용하여 HEK 293F 세포 (Invitrogen) 내로 일시적으로 동시-형질감염시키고, 상응하는 단백질을 1-mL 재조합체 단백질 A HiTrap 컬럼(GE Healthcare, 뉴저지주 피스카타웨이 소재)으로 기술한 바와 같이(Yang et al., PloS One 6:e21018, 2011; 및 Yang 및 Rader, Methods Mol Biol 901:209-232, 2012) 정제하였다. 정제된 IgG1의 품질 및 양을 각각 SDS-PAGE 및 A280 흡광도로 분석하였다.
항체 서열의 클로닝을 위한 프라이머 서열
프라이머 서열 서열 번호:
4-2_VH_F GAGGAGGAGCTCACTCTCAGGAGCAGCAGAAGGAGTCCGGG 113
4-2_VH_R CGATGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAAGAGACGGTGACGAGGGTCCCTGGCCCCCAGAGGTC 114
4-2_λ_F GAGAAGCTTGTTGCTCTGGATCTCTGGTGCCTACGGGTCCTATGAGCTGACACAGCTGCC 115
LEAD-B GGCCATGGCTGGTTGGGCAGC 116
KpnI/AscI-Signal GGTACCGGCGCGCCACCATGGACTGGACTTGGAGAATCCTGTTTCTCGTAGCTGCTGCAA 117
CH1-internal/overlap-R GCCCTGGTCAGGGCTCCTG 118
CH1-internal/overlap-F CAGGAGCCCTGACCAGCGGC 119
HC-CH3-R-XhoI GGCCTCGAGTCATTTACCCGGAGACAGGGA 120
ERR1-324 HC-F TTTCTCGTAGCTGCTGCAACTGGAGCACACTCC CAGTCGCTGGAGGAGTCCGGG 121
ERR1-TOP43 HC-F TTTCTCGTAGCTGCTGCAACTGGAGCACACTCC CAGTCGTTGGAGGAGTCCGGG 122
ERR1-TOP54 HC-F ERR1-TOP43 HC-F와 동일 123
VH-CH1-R-EheI GGAGGGCGCCAGGGGGAAGACCGATGGGCCCTTGGT 124
ERR1-TOP43 LC-F TTTCTCGTAGCTGCTGCAACTGGAGCACACTCC TCCTATGAGCTGACACAGCTG 125
ERR1-TOP54 LC-F ERR1-TOP43 LC-F와 동일 126
ERR1-324 KC-F TTTCTCGTAGCTGCTGCAACTGGAGCACACTCC GAGCTCGTGCTGACCCAGACT 127
LC-R-XhoI GGCCTCGAGTTATGAACATTCTGTAGGGGC 128
KC-R-XhoI. GGCCTCGAGTTAACACTCTCCCCTGTTGAA 129
실시예 4. 항체 결합 활성의 시험
ELISA: ELISA(도 2)를 위해, 96-웰 Costar 3690 플레이트(Corning, 뉴욕주 코닝 소재)의 각각의 웰을 25 μL의 피복 완충액 (0.1 M Na2CO3, 0.1 M NaHCO3, pH 9.6) 중 100 ng의 항-사람 IgG1 Fc로 1시간 동안 37℃에서 피복하였다. 150 μL의 3% (w/v) BSA/TBS로 1시간 동안 37℃에서 차단한 후, hFc-hROR1 또는 hFc-mROR1을 100 ng / 50 μL에서 1시간 동안 37℃에서 항온처리 후 포획하였다. 이후에, 100 ng / 50 μL의 Fab를 각각의 웰에 37℃에서 적용시켰다. 2시간 후, 1% (w/v) BSA/TBS중 서양 고추냉이 퍼옥시다제(HRP) (R&D Systems, 미네소타주 미네아폴리스 소재)에 접합된 마우스 항-His tag mAb의 1:1000 희석물 50 μL를 사용하여 Fab를 검출하였다. 에피토프를 측정하기 위해(도 4), hROR1의 상이한 도메인을 함유하는 hFc 융합 단백질을 직접 피복한 후, HRP에 접합된 마우스 항-His tag mAb에 의한 검출 전에 Fab와 함께 항온처리하였다. PBS를 사용한 세척을 반복하고 열량계 검출을 제조업자의 지시에 따라 기질로서 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤즈티아졸린)-6-설폰산(Roche)을 사용하여 수행하였다. 흡광도를 405 nm에서 SpectraMax M5 미세역가 판독기(Molecular Devices; 캘리포니아주 서니베일 소재) 및 SoftMax Pro 소프트웨어(Molecular Devices)를 사용하여 측정하였다.
유동 세포분석법: 세포를 표준 세포 유동분석법 방법으로 염색하였다. 요약하면, 정제된 항-ROR1 Fab(도 3)의 경우, 0.1~1 x 106개의 세포를 1000 ng / 100 μL의 Fab를 사용하여 빙상에서 1시간 동안 염색하였다. 빙냉된 유동 세포분석법 완충액(1% (v/v) BSA, 0.1% 나트륨 아지드 및 1 mM EDTA를 함유하는 PBS)으로 2회 세척한 후에, 세포를 빙상에서 30분 동안 100 μL 유동 세포분석법 완충액 중 Alexa Fluor 488 (Qiagen)에 접합된 마우스 항-His tag mAb의 1;1000 희석액과 함께 항온처리하였다. 정제된 항-ROR1 IgG1(도 8)의 경우, 0.1~1 x 106개의 세포를 4% 염소 혈청으로 15분 동안 실온에서 차단한 후 100 ng / 100 μL의 IgG과 함께 빙상에서 1시간 동안 항온처리하였다. 빙냉된 유동 세포분석법 완충액으로 2회 세척한 후, 세포를 빙상에서 30분 동안 100 μL의 유동 세포분석법 완충액 중 APC (Jackson ImmunoResearch)에 접합된 염소 항-사람 IgG, Fcγ pAb의 1:500 희석액으로 염색시켰다. 시판되는 염소 항 사람 ROR1 폴리클로날 항체(도 8)의 경우, 0.1~1 x 106개의 세포를 빙상에서 1시간 동안 200 ng / 100 μL의 Ab로 염색시켰다. 빙-냉된 유동 세포분석법 완충액(1% (v/v) BSA, 0.1% 나트륨 아지드 및 1 mM EDTA를 함유하는 PBS)으로 2회 세척한 후, 세포를 빙상에서 30분 동안 100 μL의 유동 세포분석법 완충액 중 Alexa Fluor 647-접합된 AffiniPure F(ab')2 당나귀 항 염소 IgG (H+L)의 1:1000 희석액과 함께 항온처리하였다. 최종적으로, 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)을 100 ng / mL의 최종 농도로 가하여 분석물로부터 사멸 세포를 배제시켰다. 세포를 FACSCalibur 장치(BD Biosciences) 및 FlowJo 분석 소프트웨어(Tree Star, 오레건주 아쉬랜드 소재)를 사용하여 분석하였다.
표면 플라스몬 공명: hFc-hROR1에 대한 모든 Fab의 친화성의 측정 및 에피토프 맵핑 연구를 위한 표면 플라스몬 공명을 Biacore X100 장치에서 Biacore 시약 및 소프트웨어(GE Healthcare, 뉴저지주 피스카타웨이 소재)를 사용하여 수행하였다. 항-사람 IgG (Fc) 항체를 CM5 센서 칩 위에 사람 항체 포획 키트(GE Healthcare, 뉴저지주 피스카타웨이 소재)의 지시에 따라 고정시켰다. 이후에, hFc-hROR1 융합 단백질을 특정 밀도에서 포획하였다(도 5 및 도 6에 나타냄). 센서 칩은 즉각적인 배경 결실을 위한 엠티 유동 셀(empty flow cell)을 포함하였다. 모든 결합 검정은 1x HBS-EP+ 러닝 완충액(running buffer)(10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA (pH 7.4), 및 0.05% (v/v) 표면활성제 P20) 및 30 mL/min의 유속을 사용하였다. 친화성 측정을 위해, 모든 Fab를 5개의 상이한 농도에서 주입하고(희석 인자는 2이었다), 최저 농도를 2회 시험하였다(각각의 Fab에 대한 최대 농도는 도 6, B에 나타낸다). 센서 칩을 결합능의 어떠한 손실도없이 사람 항체 포획 키트로부터 3회의 MgCl2를 사용하여 재생시켰다. 연합(k on) 및 해리(k off) 속도 상수의 계산은 1:1 랭뮤어 결합 모델(Langmuir binding model)을 기반으로 하였다. 평형 해리 상수(Kd)는 k off/k on으로부터 계산하였다. 에피토프 맵핑 연구를 위해, 각각의 Fab를 1x HBS-EP+ 러닝 완충액 속에서 500 nM 만으로 제조한 후 도 5에 나타낸 바와 같은 순서대로 주입하였다.
웨스턴 블롯팅: 세포 또는 단백질을 1x 샘플 완충액(1% β-머캅토에탄올 함유)로 분해하고 NuPAGE Novex 4-12% 비스-트리스 겔(Invitrogen)에서 러닝시키기 전에 비등시켰다. 막 이동 및 5% 우유에 의한 차단 후, XBR1-402 또는 ERR1-TOP43의 키메라 토끼/사람 IgG1 2 μg/mL를 적용하여 변성된 단백질을 검출한 후, ECL 프라임 웨스턴 블롯팅 검출 시약(Prime Western Blotting Detection Reagent)(GE Healthcare)을 사용하여 전개시키기 전에 HRP에 접합된 1/1000 항-사람 Fcγ와 함께 항온처리하였다(도 9).
실시예 5 정제된, 재조합체 strep-태그된 사람 ROR1 및 사람 트윈 strep-태그된 사람 ROR2의 발현
StrepII-태그된 사람 ROR1-세포외 도메인을 다음과 같이 생산하였다: 사람 ROR1(NP_005003.2)의 세포외 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 시그날 서열 (MNFGLRLIFLVLTLKGVQC)에 N-말단적으로 융합시키고 strepII-tag (GWSHPQFEK)를 암호화하는 서열과 함께 C-말단적으로 융합시켰다. 플랭킹된 5'NotI 및 3'HindIII 부위를 지닌 전체 뉴클레오타이드 서열을 전체 유전자 합성(GenScript, 미국 피스카타웨이 소재)으로 생산하고, Evitria AG(스위스 슐리렌 소재)에 의해 등록된 포유동물 발현 벡터 pEvi5 속에서 조립하고 DNA 서열분석으로 입증하였다.
단백질의 발현을 Evitria AG(스위스 슐리렌 소재)에 의해 현탁액-적응시킨 CHO K1 세포 속에서 수행하였다. 형질감염된 CHO K1 세포의 혼주물로부터의 상층액을 원심분리로 수거하고 StrepTactin 컬럼(IBA GmbH, 독일 괴팅겐 소재)을 사용하는 FPLC-계 친화성 정제 전에 멸균 여과하였다(0.2 μm).
재조합체 사람 트윈 strep-태그된 ROR2 (NP_004551.2)을 발현하여 다음 프로토콜에 따라 내부적으로 정제하였다: TwinStep tag를 사용하여 C-말단적으로 태그된, ROR2 세포외 도메인 (ECD)의 발현을 지시하는 EBNA 발현 벡터 pCB14b-ROR2-ECD-TwinStrep을 Lipofectamine® LTX와 PLUSTM 시약(Thermo Fisher Scientific, 15388100)을 사용하여 HEK293T 내로 형질감염시켰다. 1일 항온처리(37℃, 5% CO2, 성장 배지: 둘베코 개질된 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium: DMEM) 고 글루코즈(4.5 g/l)와 L-글루타민과 10% (v/v) 태아 송아지 혈청(FCS), 100 IU/mL의 Pen-Strep-Fungizone 및 2 mM L-글루타민(모두 Bioconcept 제조원)) 후에, 세포를 선택 조건(2 μg/mL의 푸로마이신(Sigma-Aldrich, 2 mg/mL에서 P8833-25 mg 스톡)) 하에 확장시켰다. 세포를 분할하고 추가로 확장시키고(37℃, 5% CO2); 합치(confluency)에 도달하면, 조직 배양 디쉬를 20 μg/ml의 폴리-L-라이신(Sigma-Aldrich, P1524)으로 2시간 동안 37℃에서 피복하고 PBS로 2회 세척하였다. 이후에, 세포를 트립신처리하고, PBS로 세척하며 폴리-L-라이신-피복된 플레이트 위에 1:3으로 분할하였다. 다시 합치에 이른 후, 세포를 PBS로 세척한 후 1 μg/mL 푸로마이신(Sigma-Aldrich, P8833), 100 IU/mL의 Pen-Strep-Fungizone (Bioconcept, 4-02F00-H), 161 μg/mL의 N-아세틸-L-시스테인(Sigma-Aldrich, A8199) 및 10 μg/mL의 환원된 L-글루타티온(Sigma-Aldrich, G6529)이 보충된 생산 배지(DMEM/F-12, Gibco/Thermo Fisher Scientific, 31330-03)를 사용하여 배지 교체하고, 주당 2회 수거하여 여과(0.22 μm)함으로써 세포를 제거하고, 정제할 때까지 4℃에 저장하였다. 정제를 위해, 여과된 상층액을 Streptactin® Superflow® 고 용량 카트릿지(IBA, Goettingen, Germany, 2-1238-001) 컬럼 위에 로딩하고; 정제 및 용출을 제조업자의 프로토콜에 따라 AEKTA 퓨어(pure) (GE Healthcare)에서 수행하였다. 분획을 단백질 순도 및 통합성에 대해 SDS-PAGE로 분석하였다. 단백질-함유 분획을 혼합하고 아미콘(Amicon) 여과 단위(Millipore, 스위스 샤프하우젠)를 사용하여 완충액 교환에 적용하여 PBS 속에서 ≥1:100의 희석에 도달하도록 한 후, 저 보유 여과기(0.20 μm, Carl Roth, 독일 카를스루헤 소재, PA49.1)를 사용하여 멸균 여과하였다.
실시예 6. 재조합체 사람화된 항-사람 ROR1 및 동형 대조군 항체의 발현
발현 벡터: 항체 가변 영역 암호화 영역을 리더 서열로서 MNFGLRLIFLVLTLKGVQC를 사용하는 전체 유전자 합성(GenScript)에 의해 생산하고, 발현 벡터 pCB14 속에서 적용가능한 것으로서, 사람 IgH-γ 1 및 IgL-κ 또는 IgL-λ 불변 영역과 함께 조립하였다. 당해 벡터, 에피소말 포유동물 발현 벡터 pCEP4 (Invitrogen)는 EBV 복제 오리진을 수반하며, EBV 핵 항원(EBNA-1)을 암호화함으로써 염색체외 복제를 허용하고, 원래의 하이드로마이신 B 내성 유전자 대신에 푸로마이신 선택 마커를 함유한다.
내부적 발현 및 정제: pCB14-계 발현 벡터를 Lipofectamine® LTX 시약과 PLUSTM 시약(Thermo Fisher Scientific, 스위스 라이나크 소재, 15388100)을 사용하여 HEK293T 세포내로 형질감염시킨 후; 1일 항온처리(37℃, 5% CO2, 성장 배지: 둘베코 개질된 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium: DMEM) 고 글루코즈(4.5 g/l)와 L-글루타민과 10% (v/v) 태아 송아지 혈청(FCS), 100 IU/mL의 Pen-Strep-Fungizone 및 2 mM L-글루타민(모두 Bioconcept 제조원, 스위스 알슈빌 소재))하고, 세포를 선택 조건(2 μg/mL의 푸로마이신(Sigma-Aldrich, 스위스 부크스 에스지 소재, 2 mg/mL에서 P8833-25 mg 스톡)) 하에서 확장시켰다. 세포를 분할하고 추가로 확장(37℃, 5% CO2)시키며; 합치에 도달하면, 조직 배양 디쉬를 20 μg/ml의 폴리-L-라이신(Sigma-Aldrich, P1524)으로 2시간 동안 37℃에서 피복시키고 PBS로 2회 세척하였다. 이후에, 세포를 트립신처리하고 폴리-L-라이신-피복된 플레이트 위에 1:3으로 분할하였다. 다시 합치에 도달한 후, 세포를 PBS로 세척한 후 배지를 1 μg/mL 푸로마이신(Sigma, P8833), 100 IU/mL의 Pen-Strep-Fungizone (Bioconcept), 161 μg/mL의 N-아세틸-L-시스테인(Sigma-Aldrich, A8199) 및 10 μg/mL의 환원된 L-글루타티온(Sigma-Aldrich, G6529)이 보충된 생산 배지(DMEM/F-12, Gibco/Thermo Fisher Scientific, 31330-03)로 배지 교체하였다. 상층액을 주당 2회 수거하고 여과(0.22 μm)하여 세포를 제거하고, 정제할 때까지 4℃에서 저장하였다.
정제를 위해, 여과된 상층액을 PBS-평형화된 단백질 A HiTrap 컬럼(GE Healthcare, 독일 프랑크푸르트 암 마인 소재, 17-0405-01) 또는 JSR AmsphereTM 단백질 A 컬럼(JSR Life Sciences, 벨기에 루벤 소재, JWT203CE) 위에 로딩하고 PBS로 세척하며; 용출을 0.1 M 글리신(pH 2.5)을 사용하여 AEKTA pure(GE Healthcare)에서 수행하였다. 분획을 1 M 트리스-HCl 완충액(pH 8.0)으로 즉시 중화시키고 단백질 순도 및 통합성에 대해 SDS-PAGE로 분석하였다. 단백질-함유 분획을 혼합하고 아미콘 여과 단위(Millipore, 스위스 샤프하우젠 소재, UFC901008)를 사용하여 완충액 교환하여 표 2에 나열된 완충액 속에서 1:100의 희석에 이르도록 한 후, 저 보유 여과기(0.20 μm, Carl Roth, 독일 카를스루헤 소재, PA49.1)를 사용하여 여과하였다.
항체를 당해 분야에 공지된 방법에 의해 CHO 세포 내에서 일시적으로 발현시키고, 재조합체 항체를 표준 단백질 A 정제에 의해, CHO 세포 상층액으로부터, 당해 분야에 공지된 바와 같이 정제하였다. 재조합체 항체의 순도 및 통합성을 SDS-PAGE로 분석하였다.
표 2는 후속적인 실시예에서 사용된 항체와 함께, 이들의 최종 농도 및 완충액을 나열한다.
실시예에 사용된 항체의 목록
항체
(참고번호) 		양식 항체 서열 번호
HC/LC 		C-말단 태그(HC: 중쇄, LC: 경쇄) 완충액 최종 농도 (mg/mL)
XBR1-402 (mAb031) IgG HC: 서열 번호: 1
LC: 서열 번호: 14		 HC: LPETG-Strep
LC: G5SLPETG-Strep		 PBS 3.9
ERR1-301 (mAb027) IgG HC: 서열 번호: 2
LC: 서열 번호: 15		 HC: LPETG-Strep
LC: G5SLPETG-Strep		 PBS 3.8
ERR1-306 (mAb033) IgG HC: 서열 번호: 3
LC: 서열 번호: 16		 HC: LPETG-Strep
LC: G5SLPETG-Strep		 PBS 3.0
ERR1-324 (mAb034) IgG HC: 서열 번호: 5
LC: 서열 번호: 18		 HC: LPETG-Strep
LC: G5SLPETG-Strep		 PBS 3.0
ERR1-403 (mAb035) IgG HC: 서열 번호: 6
LC: 서열 번호: 19		 HC: LPETG-Strep
LC: G5SLPETG-Strep		 PBS 2.9
ERR1-Top43 (mAb036) IgG HC: 서열 번호: 12
LC: 서열 번호: 25		 HC: LPETG-Strep
LC: G5SLPETG-Strep		 PBS 3.0
XBR1-402 (mAb186) IgG HC: 서열 번호: 1
LC: 서열 번호: 14		 HC: LPETG-Strep
LC: G5SLPETG-Strep		 PBS 3.9
ERR1-324(mAb188) IgG HC: 서열 번호: 5
LC: 서열 번호: 18		 HC: LPETG-Strep
LC: G5SLPETG-Strep		 PBS 7.1
ERR1-Top43 (mAb189) IgG HC: 서열 번호: 12
LC: 서열 번호: 25		 HC: LPETG-Strep
LC: G5SLPETG-Strep		 PBS 7.0
XBR1-402 (mAb202) IgG HC: 서열 번호: 1
LC: 서열 번호: 14		 HC: LPETG-Strep
LC: G5SLPETG-Strep		 PBS 6.3
Ms961 (mAb190) IgG HC: 서열 번호: 148
LC: 서열 번호: 149		 HC: LPETG-Strep
LC: G5SLPETG-Strep		 PBS 6.4
2A2 (mAb066) IgG HC: 서열 번호: 150
LC: 서열 번호: 151		 HC: LPETG-Strep
LC: G5SLPETG-Strep		 PBS 8.0
hu2A2 (mAb038) IgG HC: 서열 번호: 152
LC: 서열 번호: 153		 HC: LPETG-Strep
LC: G5SLPETG-Strep		 PBS 4.7
R11 (mAb062) IgG HC: 서열 번호: 154
LC: 서열 번호: 155		 HC: LPETG-Strep
LC: G5SLPETG-Strep		 PBS 6.6
R12 (mAb067) IgG HC: 서열 번호: 156
LC: 서열 번호: 157		 HC: LPETG-Strep
LC: G5SLPETG-Strep		 PBS 5.7
트라스투주마브 ("Tras" mAb042) IgG HC: 서열 번호: 158
LC: 서열 번호: 159		 HC: LPETG-Strep
LC: G5SLPETG-Strep		 PBS 2.7
Ac10 (mAb046) IgG HC: 서열 번호: 160
LC: 서열 번호: 161		 HC: LPETG-Strep
LC: G5SLPETG-Strep		 PBS 7.9
Ms961은 제WO 2014/031174호의 서열 번호: 1에 따른 중쇄 및 서열 번호: 3에 따른 경쇄를 지닌 항-ROR1 항체에 상응한다. 2A2는 제WO 2010/124188호에 기술된 바와 같은 항-ROR1 항체를 말하는 반면, hu2A2는 공개되지 않은 제PCT/EP2016/076244호에 기술된 바와 같은 사람화된 2A2를 말한다. R11 및 R12는 제WO 2012/075158호에 기술된 항-ROR1 항체이다. 동형 대조군 항체 트라스투주마브 및 Ac10은 HER-2 및 CD30 각각을 표적화한다. 사람 CD30 표적에 대해 특이적인 모노클로날 항체 브렌툭시마브(클론 cAc10)의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열은 특허 제US2008213289A1호로부터 수득되었으며, 시판되는 항체 헤르셉틴(트라스투주마브)에 함유된 사람 HER-2 특이적인 트라스투주마브 항체의 것은, 또는 이의 유도된 ADC Kadcyla®은 온라인 IMGT 데이타베이스(VH: http://www.imgt.org/3Dstructure-DB/cgi/details.cgi?pdbcode=7637&Part= Chain&Chain=7637H & VL: http://www.imgt.org/3Dstructure-DB/cgi/ details.cgi?pdbcode=7637&Part=Chain&Chain=7637L로부터 기원하였다.
실시예 7. mAb ROR1 및 ROR2-결합 - ELISA에 의한 특성화
96-웰 플레이트의 각각의 웰을 0.1 M 중탄산염 피복 완충액(pH 9.6) 중 100 μL의 2 μg/mL strep-태그된 사람 ROR1(실시예 5로부터)으로 피복하고, 4℃에서 12시간 동안 항온처리하였다. 제2의 96-웰 플레이트를 트윈-strep 태그된 사람 ROR2(실시예 5로부터)으로 제조하였다.
150 μL의 3% (w/v) 소 혈청 알부민(BSA)/TBS을 사용하여 37℃에서 1시간 동안 차단한 후, 다음의 항체를 각각의 플레이트내 웰에 0.5 μg/mL의 농도로 가하고, 37℃에서 1시간 동안 항온처리하기 전에 1% (w/v) BSA/TBS로 일련 희석(희석 인자 4)하였다: ERR1-301 (mAb027), XBR1-402 (mAb031), ERR1-306 (mAb033), ERR1-324 (mAb034), ERR1-403 (mAb035) 및 ERR1-Top43 (mAb036). HRP-접합된 F(ab')2 항-사람 FC-감마 (Jackson Immunoresearch, 109-036-008)을 이후에 1:20'000 희석에서 웰당 100 μl로 가하고, Spark 10M 플레이트 판독기(Tecan)를 사용하여 검출하기 전에 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 도 10에 나타낸 바와같이, 항-사람 ROR1 항체는 사람 ROR1 (패널 A)에 결합하며 사람 ROR2 (패널 B)와 교차-반응하지 않는다.
실시예 8.항-hROR1-특이적인 항체 XBR1-402의 사람화
사람화된 가변 영역 서열(7개의 hu4-2 VH 변이체 및 4 hu4-2 VL 변이체)을 융합 항체(아일랜드 벨패스트 소재)에 의해 설계하였다. 요약하면, 토끼 가변 영역내 골격을 사람 골격 영역(후속되는 인-실리코(in-silico) 보조된 CDR-이식 시도는 소유주의 알고리즘을 기반으로 한다)으로 교환하여 28개의 가능한 중쇄/경쇄 쌍을 형성시켰다.
모든 28개의 가능한 중쇄/경쇄 쌍을 나타내는 항체의 발현은 pCB14-계 발현 작제물을 HEK-293T 세포 내로 일시적으로 형질감염시키고 세포 상층액을 수거함으로써 달성하였다.
일시적인 항체 발현을 위해, 세포를 Avanti 형질감염 시약 I (Avanti Polar Lipids, 미국 알라바스터 소재)을 사용하여 24-웰 플레이트에서 형질감염시켰다. 웰 당, 0.5μg의 총 DNA를 형질감염시키고, 신선한 성장 배지를 다음날 가하고 4일 동안 조건화시켰다. 상층액을 멸균-여과하고 분석할 때까지 -20℃에서 저장하였다.
친화성 스크리닝을 이후에 수행하여 가장 우수한 결합제를 선택하였다. 친화성은 Biacore T200 instrument(GE Healthcare, 미국 버킹햄셔 소재)를 사용하여 측정하고 데이타를 Biacore Evaluation T200 V2.0 소프트웨어를 사용하여 평가하였다. mAb를 포획하기 위하여, 염소 α-사람 Fc-감마-특이적인 IgG(Jackson ImmunoResearch, # 109-005-098)를 CM5 칩(GE Healthcare, # BR-1005-30)에 공유결합으로 고정시켰다.
요약하면, mAb를 HEK293T 상층액 속에서 포획하기 위해, 희석되지 않은 상층액을 30μl/min의 유동으로 120s 동안 포획하였다. ROR1-strep을 러닝 완충액(HBS-EP+ pH 7.4 (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.05 % 트윈 20) 속에서 20nM로 희석시켰다. 연합은 30μl/min의 유동으로 120s 동안 측정하고, 해리는 200s 동안 30μl/min의 유동에서 측정하였다. 포획 수준은 31.8 RU 내지 59.4 RU의 범위였다.
선택된 항체를 발현시키고 실시예 6에서와 같이 하기 표 3의 조건을 적용하여 정제하였다.
실시예에 사용된 사람화된 mAb의 프로토콜 및 농도
항체
(참고 번호) 		양식 항체 서열 번호 HC/LC C-말단 태그(HC: 중쇄, LC: 경쇄) 완충액 최종 농도 (μg/mL) KD (nM)
HuXBR1-402(3) (mAb288) IgG HC: 서열 번호: 130
LC: 서열 번호: 136		 HC: LPETG-TwinStrep
LC: G5SLPETG- TwinStrep		 PBS 0.49 3.16
HuXBR1-402(8) (mAb289) IgG HC: 서열 번호: 131
LC: 서열 번호: 137		 HC: LPETG- TwinStrep
LC: G5SLPETG- TwinStrep		 PBS 0.48 2.14
HuXBR1-402(15) (mAb290) IgG HC: 서열 번호: 132
LC: 서열 번호: 138		 HC: LPETG- TwinStrep
LC: G5SLPETG- TwinStrep		 PBS 0.45 3.55
HuXBR1-402(17) (mAb291) IgG HC: 서열 번호: 133
LC: 서열 번호: 139		 HC: LPETG- TwinStrep
LC: G5SLPETG- TwinStrep		 PBS 0.63 3.34
HuXBR1-402(19) (mAb295) IgG HC: 서열 번호: 134
LC: 서열 번호: 140		 HC: LPETG- TwinStrep
LC: G5SLPETG- TwinStrep		 PBS 0.50 2.98
HuXBR1-402(26) (mAb296) IgG HC: 서열 번호: 135
LC: 서열 번호: 141		 HC: LPETG- TwinStrep
LC: G5SLPETG- TwinStrep		 PBS 0.49 3.13
실시예 9. hROR1 발현을 위한 세포의 FACS 염색
5x105개의 각각의 세포 유형을 96-웰 플레이트에 웰당 가하였다. 플레이트를완충액(2% (v/v)의 FCS가 보충된 PBS) 중 재-현탁액과 함께 원심분리(3 min, 1300 rpm)하였다. 2A2 (mAb066)를 각각의 웰에 가하여 2 μg/mL의 농도가 되도록 하였다. 이후에, 플레이트를 빙상에서 30분 동안 항온처리하고 항-사람 IgG 항체 (Fc gamma-특이적인) PE (eBioscience 12-4998-82)가 1:250 희석에서 보충된 200 μL의 완충액 속에 재현탁하기 전에 200 μL의 완충액으로 세척하였다. 빙상에서 30분 항온처리 후 1회 세척하고, 세포를 FACSCalibur 장치(BD Biosciences)를 사용하여 분석하고 데이타를 FlowJo 분석 소프트웨어(Tree Star, 오래건주 아쉬랜드 소재)를 사용하여 분석하였다.
도 7은 ROR1-양성 사람 ALL 세포주 697 및 Kasumi-2, 사람 3중-음성 유방 암 세포주 MDA-MB-231, MDA-MB-468 및 HS-578T, 및 음성 대조군으로서 ROR1-음성 사람 유방 암 세포주 T47D의 FACS 분석 데이타를 나타낸다.
실시예 10. SMAC-기술을 사용한 부위-특이적으로 접합된 ADC의 생성
소르타제 A 효소. 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로부터의 재조합체 및 친화성 정제된 소르타제 A 효소를 제WO2014140317A1호에 개시된 바와 같이 이. 콜라이내에서 생산하였다.
글리신-변형된 독소의 생성. SMAC-technologyTM 접합된 ADC를 생성하기 위하여, 펜타글리신-변형된 PNU-159682 유도체 Gly5-EDA-PNU(도 11, B)를 제WO2016102697호에 개시된 바와 같이 제조하였다. 펜타글리신-변형된 PNU 독소의 실체 및 순도를 질량-분광법 및 HPLC로 확인하였다. Gly5-변형된 독소는 HPLC 크로마토그램에서 단일 피크로 측정하는 경우, > 95% 순도를 나타내었다.
소르타제-매개된 항체 접합. LPETG-태그된 mAb[10μM]를 글리신 변형된 독소 [200μM] 및 3 μM 소르타제 A와 나열된 접합 완충액 속에서 3.5h 동안 25℃에서 항온처리함으로써 표 3에서와 같이 상술한 독소를 항-ROR1 항체에 접합시켰다. 반응은 이를 r단백질 A GraviTrap 컬럼(BioRad)에 통과시켜 중지시켰다. 결합된 접합체를 5 컬럼 용적의 용출 완충액(0.1 M 글리신 pH 2.5, 50 nM NaCl)으로 용출시키고, 1개 컬럼 용적 분획을 25% v/v 1M HEPES pH 8을 함유하는 튜브 내로 수집하여 산을 중화시켰다. 분획을 함유하는 단백질을 혼주시키고 ZebaSpin 탈염 컬럼을 사용하여 표 7의 제형 완충액 속에 제형화하였다.
ADC 분석. DAR은 0.05 내지 0.1%의 TFA/H2O와 0.04 내지 0.1%의 TFA/CH3CN 사이의 25분 선형 구배를 사용하여 1mL/min/80℃에서 러닝하는 Polymer Labs PLRP 2.1mm x 5cm, 5μm 컬럼에서 수행된 역상 크로마토그래피로 평가하였다. 샘플을 우선 pH 8.0에서 37℃로 15분 동안 DTT로 항온처리함으로써 우선 환원시켰다. 역상 크로마토그래피로 측정된 DAR은 하기 표 4에 요약한다.
당해 연구에서 제조된 ADC의 제조 조건 및 분석 요약. DAR, 약물 대 항체 비. ND 측정되지 않음.
ADC (참고번호) mAb (참고 번호) 독소 접합 완충액 제형 완충액 DAR
XBR1-402-G5-PNU (Adc135) XBR1-402 (mAb031) G5-PNU 50mM HEPES (pH 7.5), 150mM NaCl, 5mM CaCl2 Ca2+ 및 Mg2+가 없는 PBS(Amimed-Bioconcept) ND
ERR1-301-G5-PNU (Adc200) ERR1-301 (mAb027) G5-PNU 50mM HEPES (pH 7.5), 150mM NaCl, 1mM CaCl2 Ca2+ 및 Mg2+가 없는 PBS(Amimed-Bioconcept) 3.7
ERR1-306-G5-PNU (Adc201) ERR1-306 (mAb033) G5-PNU 50mM HEPES (pH 7.5), 150mM NaCl, 1mM CaCl2 Ca2+ 및 Mg2+가 없는 PBS(Amimed-Bioconcept) 3.7
ERR1-324-G5-PNU (Adc202) ERR1-324 (mAb034) G5-PNU 50mM HEPES (pH 7.5), 150mM NaCl, 1mM CaCl2 Ca2+ 및 Mg2+가 없는 PBS(Amimed-Bioconcept) 3.6
ERR1-403-G5-PNU (Adc203) ERR1-403 (mAb035) G5-PNU 50mM HEPES (pH 7.5), 150mM NaCl, 1mM CaCl2 Ca2+ 및 Mg2+가 없는 PBS(Amimed-Bioconcept) 3.7
Top43-G5-PNU (Adc204) ERR1-Top43 (mAb036) G5-PNU 50mM HEPES (pH 7.5), 150mM NaCl, 1mM CaCl2 Ca2+ 및 Mg2+가 없는 PBS(Amimed-Bioconcept) 3.6
XBR1-402-G5-PNU (Adc262) XBR1-402 (mAb186) G5-PNU 50mM HEPES (pH 7.5), 150mM NaCl, 5mM CaCl2 Ca2+ 및 Mg2+가 없는 PBS(Amimed-Bioconcept) 3.7
XBR1-402-G5-PNU (Adc288) XBR1-402 (mAb186) G5-PNU 50mM HEPES (pH 7.5), 150mM NaCl, 1mM CaCl2 Ca2+ 및 Mg2+가 없는 PBS(Amimed-Bioconcept) 3.7
XBR1-402-G5-PNU (Adc394) XBR1-402 (mAb202) G5-PNU 50mM HEPES (pH 7.5), 10% (v/v) 글리세롤, 1mM CaCl2 Ca2+ 및 Mg2+가 없는 PBS(Amimed-Bioconcept) 3.9
ERR1-324-G5-PNU (Adc395) ERR1-324(mAb188) G5-PNU 50mM HEPES (pH 7.5), 10% (v/v) 글리세롤, 1mM CaCl2 Ca2+ 및 Mg2+가 없는 PBS(Amimed-Bioconcept) 3.8
XBR1-402-G5-PNU (Adc409) XBR1-402 (mAb202) G5-PNU 50mM HEPES (pH 7.5), 10% (v/v) 글리세롤, 1mM CaCl2 Ca2+ 및 Mg2+가 없는 PBS(Amimed-Bioconcept) ND
2A2-G5-PNU (adc165) 2A2 (mAb066) G5-PNU 50mM HEPES (pH 7.5), 150mM NaCl, 1mM CaCl2 HEPES 완충액 염수 pH 6.8 3.8
hu2A2-G5-PNU (adc287) hu2A2 (mAb038) G5-PNU 50mM HEPES (pH 7.5), 150mM NaCl, 1mM CaCl2 Ca2+ 및 Mg2+가 없는 PBS(Amimed-Bioconcept) 3.7
R11-G5-PNU (adc041) R11 (mAb062) G5-PNU 50mM HEPES (pH 7.5), 150mM NaCl, 1mM CaCl2 Ca2+ 및 Mg2+가 없는 PBS(Amimed-Bioconcept) ND
R12-G5-PNU (adc263) R12 (mAb067) G5-PNU 50mM HEPES (pH 7.5), 150mM NaCl, 1mM CaCl2 Ca2+ 및 Mg2+가 없는 PBS(Amimed-Bioconcept) 3.6
R12-G5-PNU (adc292) R12 (mAb067) G5-PNU 25mM HEPES (pH 7.5), 150mM NaCl, 1mM CaCl2, 10% (v/v) 글리세롤 10 mM 석시네이트 pH 5.0, 175 mM 슈크로즈, 0.02% Tween 20 3.8
R12-G5-PNU (adc327) R12 (mAb067) G5-PNU 25mM HEPES (pH 7.5), 150mM NaCl, 1mM CaCl2, 10% (v/v) 글리세롤 10 mM 석시네이트 pH 5.0, 175 mM 슈크로즈, 0.02% 트윈 20 3.8
Ms961-G5-PNU (adc396) Ms961 (mAb190) G5-PNU 50mM HEPES (pH 7.5), 1mM CaCl2, 10% (v/v) 글리세롤 10 mM 석시네이트 pH 5.0, 175 mM 슈크로즈, 0.02% Tween 20 ND
Tras-G5-PNU (adc196) 트라스투주마브 (mAb042) G5-PNU 50mM HEPES (pH 7.5), 150mM NaCl, 1mM CaCl2 Ca2+ 및 Mg2+가 없는 PBS(Amimed-Bioconcept) 3.6
Tras-G5-PNU (adc286) 트라스투주마브 (mAb042) G5-PNU 50mM HEPES (pH 7.5), 150mM NaCl, 1mM CaCl2 25 mM HEPES pH6.8, 15mM NaCl 3.7
Ac10-G5-PNU (adc159) Ac10 (mAb046) G5-PNU 50mM HEPES (pH 7.5), 150mM NaCl, 1mM CaCl2 Ca2+ 및 Mg2+가 없는 PBS(Amimed-Bioconcept) 3.8
HuXBR1-402(3)-G5-PNU (Adc456) HuXBR1-402(3) (mAb288) G5-PNU 50mM HEPES (pH 7.5), 150mM NaCl, 1mM CaCl2, 2% (w/v) 글리세롤 Ca2+ 및 Mg2+가 없는 PBS(Amimed-Bioconcept) ND
HuXBR1-402(8)-G5-PNU (Adc457) HuXBR1-402(8) (mAb289) G5-PNU 50mM HEPES (pH 7.5), 150mM NaCl, 1mM CaCl2, 2% (w/v) 글리세롤 Ca2+ 및 Mg2+가 없는 PBS(Amimed-Bioconcept) ND
HuXBR1-402(15)-G5-PNU (Adc458) HuXBR1-402(15) (mAb290) G5-PNU 50mM HEPES (pH 7.5), 150mM NaCl, 1mM CaCl2, 2% (w/v) 글리세롤 Ca2+ 및 Mg2+가 없는 PBS(Amimed-Bioconcept) ND
HuXBR1-402(17)-G5-PNU (Adc459) HuXBR1-402(17) (mAb291) G5-PNU 50mM HEPES (pH 7.5), 150mM NaCl, 1mM CaCl2, 2% (w/v) 글리세롤 Ca2+ 및 Mg2+가 없는 PBS(Amimed-Bioconcept) ND
HuXBR1-402(19)-G5-PNU (Adc460) HuXBR1-402(19) (mAb295) G5-PNU 50mM HEPES (pH 7.5), 150mM NaCl, 1mM CaCl2, 2% (w/v) 글리세롤 Ca2+ 및 Mg2+가 없는 PBS(Amimed-Bioconcept) ND
HuXBR1-402(26)-G5-PNU (Adc461) HuXBR1-402(26) (mAb296) G5-PNU 50mM HEPES (pH 7.5), 150mM NaCl, 1mM CaCl2, 2% (w/v) 글리세롤 Ca2+ 및 Mg2+가 없는 PBS(Amimed-Bioconcept) ND
이들 분석으로부터, SMAC-technologyTM 접합이 고 효율로 진행되어 IgG-format 항-ROR1 항체-독소 조합의 경우 약 3.5 내지 4.0의 범위에서 전체 평균 DAR을 생성하였다고 결론지을 수 있다.
실시예 11. ROR1-표적화 ADC XBR1-402-G5-PNU의 시험관내 혈청 안정성
XBR1-402-G5-PNU의 시험관내 혈청 안정성을 ELISA-계 혈청 안정성 검정으로 평가하였다. 요약하면, ADC를 NOD SCID 마우스(스위스 바젤 대학 연구소의 Alfred Zippelius 의학 박사로부터의 선물) 및 사람 혈청(SRK blood donation center으로부터, 스위스 바젤 소재; 혈청을 수득하기 위해 2000g에서 15분 원심분리한 남성:여성 혈액의 50:50 혼합물)내에서 100 μg/mL의 농도로 희석시키고, 37℃에서 항온처리하였다. 샘플을 액체 질소 속에서 0, 3, 7 및 14일 째에 결빙 동결(snap- frozen)시키고 -80℃에서 ELISA 분석까지 저장하였다. 마우스 혈청의 경우. ADC 혈청 샘플의 일련 희석물(희석 인자 3.5, 5 내지 0.0008 μg/ml)을 2 μg/ml의 내부적으로 개발된 마우스 항-PNU mAb(마우스를 사람 IgG-PNU 접합체로 면역화하고 BSA-PNU 접합체를 스크리닝하여 생성함)로 피복된 ELISA 플레이트 위에 포획하여 ADC를 결합시키거나, 염소 항-사람 Fc F(ab')2(Jackson Immunoresearch, 109-006-098)로 피복하여 총 IgG를 결합시키고, HRP-접합된 당나귀 항-사람 IgG(Jackson Immunoresearch, 709-035-149)의 1:2500 희석으로 검출하였다. 사람 혈청의 경우, 2 μg/ml의 재조합체 사람 ROR1(strep-태그됨, 실시예 5)을 ELISA 플레이트 위에서 피복시키고 HRP-접합된 당나귀 항-사람 IgG (Jackson Immunoresearch, 709-035-149) 또는 2 μg/ml의 마우스 항-PNU IgG(내부적으로 생산함)의 1:2500 희석에 이어 1:5000 희석된 HRP-접합된 염소 항-마우스 Fcγ F(ab')2 (Jackson Immunoresearch, 115-036-071)를 총 IgG 및 ADC 각각을 검출하는데 사용하였다. ADC 및 총 IgG의 혈청 농도는 공지된 농도의 동일한 ADC의 샘플과 비교함으로써 샘플 적정의 최대 값의 1/2로부터 계산하였다. 도 19에 나타낸 바와 같이, XBR1-402-G5-PNU는 혈청 둘 다에 필수적으로 안정하게 남는다.
실시예 12. 야생형 EMT-6 및 ROR1-과발현 EMT-6 유방 암 세포에서 항-ROR1 항체-계 ADC의 시험관내 세포독성 검정
항-ROR1 ADC XBR1-402-G5-PNU (adc262)의 세포독성을 야생형(WT) EMT-6 및 가공된 EMT-6 세포를 사용하여 시험함으로써 사람 ROR1(실시예 2로부터)을 과발현시켰다. Tras-G5-PNU (adc286)를 동형 대조군으로서 포함시켰다.
이를 위해, 웰 당 1Х103개의 WT EMT-6 및 hROR1 과발현 EMT-6 세포를 10용적%의 FCS, 100 IU/ml Pen-Strep-Fungizone 및 2 mM L-글루타민이 보충된 75 μL DMEM 중 96-웰 플레이트(물을 함유한 가장자리 웰은 제외)에 플레이팅(plating)하고 습윤화된 항온처리기 속에서 37℃로 7.5% CO2 대기에서 성장시켰다. 1일 항온처리 후, 각각의 ADC를 각각의 웰에 성장 배지(20 μg/mL 내지 0.88 ng/ml의 최종 ACD 농도 생성) 속에 25μL의 양의 3.5-배 일련 희석액 속의 각각의 웰에 가하였다. 추가로 4일 후, 플레이트를 항온처리기로부터 제거하고 실온에서 평형화시켰다. 대략 30분 후에, 50 μL를 각각의 웰로부터 제거한 후, 50 μL의 CellTiter-Glo® 2.0 발광성 용액(Promega, G9243)을 각각의 웰에 가하였다. 플레이트를 450 rpm에서 5분 동안 진탕한 다음 진탕하지 않고 10분 동안 항온처리하고, 발광을 Tecan Spark 10M 플레이트 판독기 위에서 웰당 250 ms의 노출 시간(integration time)으로 측정하였다. 발광성 대 ADC 농도(ng/mL)의 곡선을 Graphpad Prism 소프트웨어로 조절하였다. Prism 소프트웨어의 빌트-인(built-in) "로그(억제제) 대 반응 -- 다양한 기울기(4개의 매개변수)" IC50 측정 기능을 사용하여 측정된 IC50 값을 표 5에 보고한다.
항-ROR1 또는 동형 대조군 ADC(IC50, ng/mL)에 의한 EMT-6 세포 (WT 및 가공된 클론 14)의 시험관내 세포 사멸
ADC WT EMT-6 hROR1-과발현 EMT-6
XBR1-402-G5-PNU (adc262) 3'359 15
Tras-G5-PNU (adc286) 4'713 4'293
도 16은 표 5의 ADC를 사용한 WT 및 hROR1-과발현 EMT6 세포에서 시험관내 세포 사멸 검정의 용량-반응 곡선을 나타낸다. 상기 표 및 도 16에서와 같이, XBR1-402-G5-PNU는 ROR1 발현 상태에 의존적인 특이적인 사멸을 제공한다.
실시예 13. ROR1-과발현 EMT-6 세포에서 신규한 및 공지된 항-ROR1 항체-계 ADC의 시험관내 세포독성 검정
항-ROR1 ADC XBR1-402-G5-PNU (adc409)의 세포독성을 사람 ROR1(실시예 2로부터)를 과발현하기 위해 가공된 사람 EMT-6 세포를 사용하여 시험하고, 항체 Ms961 (adc396)를 기반으로 항-ROR1 ADC와 비교하였다. Tras-G5-PNU (adc394)을 동형 대조군으로 포함시켰다.
이를 위해, 웰당 1Х103개의 hROR1 과발현 EMT-6 세포를 10 용적%의 FCS, 100 IU/ml Pen-Strep-Fungizone 및 2 mM L-글루타민이 보충된 75 μL DMEM 중 96-웰 플레이트(물을 함유한 자장자리 웰을 배제함) 위에 플레이팅하고 37℃에서 습윤화된 항온처리기 속에서 7.5% CO2 대기에서 성장시켰다. 1일 항온처리 후, 각각의 ADC를 각각의 웰에 성장 배지(20 μg/mL 내지 0.88 ng/ml의 최종 ACD 농도를 생성) 속에서 25μL 양의 3.5-배 일련 희석물의 양으로 가하였다. 추가로 4일 후, 플레이트를 항온처리기로부터 제거하고 실온으로 평형화시켰다. 대략 30분 후에, 50 μL를 각각의 웰로부터 제거한 후, 50 μL의 CellTiter-Glo® 2.0 발광성 용액(Promega, G9243)을 각각의 웰에 가하였다. 플레이트를 450 rpm에서 5분 동안 진탕시킨 다음 진탕없이 10분 동안 항온처리한 후에, 발광성을 Tecan Spark 10M 플레이트 판독기에서 웰 당 250 ms의 노출 시간으로 측정하였다. 발광성 대 ADC 농도(ng/mL)의 곡선을 Graphpad Prism 소프트웨어로 조절하였다. Prism 소프트웨어의 빌트-인 "로그(억제제) 대 반응 -- 다양한 기울기(4개의 매개변수)" IC50 측정 기능을 사용하여 측정된 IC50 값을 표 6에 보고한다.
본 발명 및 공지된 항-ROR1 또는 동형 대조군 ADC(IC50, ng/mL)에 의한 가공된 EMT-6 세포의 시험관내 세포 사멸
ADC hROR1-과발현 EMT-6
XBR1-402-G5-PNU (adc409) 1.1
Ma961-G5-PNU(adc396) 11.5
Tras-G5-PNU (adc394) 3469
도 17은 표 6의 ADC를 사용한 hROR1-과발현 EMT6 세포에서 시험관내 세포 사멸 검정의 용량-반응 곡선을 나타낸다. 상기 표 및 도 17에서와 같이, XBR1-402-G5-PNU는 항체 Ms961을 기반으로 한 비교가능한 ADC보다 더 강력한 사멸을 제공한다.
실시예 14. 사람 697 및 Kasumi-2 ALL 세포에서 신규 및 공지된 항-ROR1 항체-계 ADC의 시험관내 세포독성 검정
항-ROR1 ADC XBR1-402-G5-PNU (adc262)의 세포독성을 사람 세포주 697을 사용하여 시험하고, 공지된 항체 2A2, R11 및 R12(도 13)을 기준으로 항-ROR1 ADC와 비교하거나, 다시 697 및 Kasumi-2 ALL 세포를 사용하는 별도의 실험에 의해 2A2 및 R12에 대해 비교하였다.
이를 위해, 웰당 2/5Х103개의 697 또는 Kasumi-2 세포를 10 용적%의 FCS, 100 IU/ml Pen-Strep-Fungizone 및 2 mM L-글루타민이 보충된 75 μL RPMI 중 96-웰 플레이트(물을 함유한 자장자리 웰을 배제함) 위에 플레이팅하고 37℃에서 습윤화된 항온처리기 속에서 7.5% CO2 대기에서 성장시켰다. 1일 항온처리 후, 각각의 ADC를 각각의 웰에 성장 배지(20 μg/mL 내지 0.88 ng/ml의 최종 ACD 농도를 생성) 속에서 25μL 양의 3.5-배 일련 희석물의 양으로 가하였다. 추가로 4일 후, 플레이트를 항온처리기로부터 제거하고 실온에서 평형화시켰다. 대략 30분 후, 50 μL를 각각의 웰로부터 제거한 후, 50 μL의 CellTiter-Glo® 2.0 발광성 용액(Promega, G7570)을 각각의 웰에 가하였다. 플레이트를 750 rpm에서 5분 동안 진탕시킨 다음 진탕없이 20분 동안 항온처리한 후에, 발광성을 Tecan Infinity F200 플레이트 판독기에서 웰당 1 초의 노출 시간으로 측정하였다. 발광성 대 ADC 농도(ng/mL)의 곡선을 Graphpad Prism 소프트웨어로 조절하였다. Prism 소프트웨어의 빌트-인 "로그(억제제) 대 반응 -- 다양한 기울기(4개의 매개변수)" IC50 측정 기능을 사용하여 측정된 IC50 값을 표 7에 보고한다.
항-ROR1 또는 동형 대조군 ADC(IC50, ng/mL)에 의한 697 세포의 시험관내 세포 사멸
ADC 697
2A2-G5-PNU 38.0
R11-G5-PNU(adc041) 469.9
R12-G5-PNU(adc292) 72.1
XBR1-402-G5-PNU(adc262) 17.6
도 13은 표 7의 ADC를 사용한 697 세포에서 시험관내 세포 사멸 검정의 용량-반응 곡선을 나타낸다. 상기 표 및 도 13에서와 같이, 본 발명의 ACD는 공지된 항-ROR1 항체를 기반으로 ACD보다 더 우수한 사람 697 B 세포 전구체 백혈구 세포의 사멸을 제공한다.
실시예 15. 유방 암 MDA-MB-468 및 HS 578T 세포에서 항-ROR1 항체-계 ADC의 시험관내 세포 독성 검정
항-ROR1 ADCs 2A2-G5-PNU (adc165), XBR1-402-G5-PNU (adc135), R12-G5-PNU (adc292), ERR1-Top43-G5-PNU (adc204), 및 ERR1-324-G5-PNU (adc202) 및 2A2-G5-PNU (adc165)의 50:50 중량 혼합물, ERR1-324-G5-PNU (adc202) 및 XBR1-402-G5-PNU (adc135)의 50:50 중량 혼합물, ERR1-324-G5-PNU (adc202) 및 R12-G5-PNU (adc292)의 50:50 중량 혼합물, 및 ERR1-324-G5-PNU (adc202) 및 ERR1-Top43-G5-PNU (adc204)의 50:50 중량 혼합물의 세포 독성을 사람 세포주: MDA-MB-468, HS 578T를 사용하여 시험하였다. Ac10-G5-PNU (adc159)을 동형 대조군으로서 포함시켰다.
이를 위해, 웰당 다음의 세포를 96-웰 플레이트(물을 함유한 가장자리 웰을 배제함)에 플레이팅하고 37℃에서 습윤화된 항온처리기 속에서 7.5% CO2 대기에서 성장 배지(10 용적%의 FCS, 100 IU/ml Pen-Strep-Fungizone 및 2 mM L-글루타민이 보충된 DMEM) 속에서 성장시켰다.
실시예 17의 세포 플레이팅
세포형 웰당 세포
MDA-MD-468 6.7Х104
HS 578T 2.7Х104
1일 항온처리 후, 각각의 ADC를 각각의 웰에 성장 배지(20 μg/mL 내지 0.88 ng/ml의 최종 ACD 농도를 생성) 속에서 25μL 양의 3.5-배 일련 희석물의 양으로 가하였다. 추가로 4일 후에, 플레이트를 항온처리기로부터 제거하고 실온으로 평형화시켰다. 대략 30분 후에, 50 μL를 각각의 웰로부터 제거한 후, 50 μL의 CellTiter-Glo® 2.0 발광성 용액(Promega, G9243)을 각각의 웰에 가하였다. 플레이트를 750 rpm에서 5분 동안 진탕시킨 다음 진탕없이 10분 동안 항온처리한 후에, 발광성을 Tecan Infinity F200 플레이트 판독기 속에서 웰당 1초의 노출 시간으로 측정하였다. 발광성 대 ADC 농도(ng/mL)의 곡선을 Graphpad Prism 소프트웨어로 조절하였다. Prism 소프트웨어의 빌트-인 "로그(억제제) 대 반응 -- 다양한 기울기(4개의 매개변수)" IC50 측정 기능을 사용하여 측정된 IC50 값을 표 9에 보고한다.
항-ROR1 ADC 및 동형 대조군(IC50 값은 ng/mL로 제공된다)에 의한 다양한 사람 암 세포의 시험관내 세포 사멸
ADC/세포형 양성 hROR1-과발현 EMT-6
hROR1 status 양성 양성
2A2-G5-PNU (adc165) 456 1'784
XBR1-402-G5-PNU (adc135) ND 1'403
R12-G5-PNU (adc292) 349 3'498
ERR1-Top43-G5-PNU (adc204) 143 707
Ac10-G5-PNU (adc159) 3'593 8'408
도 12는 표 9의 ADC를 사용하여 MDA-MB-468 및 HS 578T 세포에서 시험관내 세포 사멸 검정의 용량-반응 곡선을 나타낸다. 상기 표 및 도 12에서와 같이, 본 발명의 선택된 ADC는 공지된 항-ROR1 항체 2A2 및 R12보다 더 우수한 특정의 사람 암 세포 사멸을 제공한다.
실시예 16. 697 세포에서 사람화된 항-ROR1 항체-계 ADC의 시험관내 세포독성 검정
사람화된 항-ROR1 ADCs huXBR1-402-3-G5-PNU (adc456), huXBR1-402-8-G5-PNU (adc457), huXBR1-402-15-G5-PNU (adc458), huXBR1-402-17-G5-PNU (adc459), huXBR1-402-19-G5-PNU (adc460) 및 huXBR1-402-26-G5-PNU (adc461)이 세포독성을 사람 697 세포를 사용하여 시험하였다. Tras-G5-PNU (adc286)를 동형 대조군으로서 포함시켰다.
이를 위해, 웰당 5Х104개의 세포를 10용적%의 FCS, 100 IU/ml Pen-Strep-Fungizone 및 2 mM L-글루타민이 보충된 75 μL DMEM 중 96-웰 플레이트(물을 함유한 가장자리 웰은 제외)에 플레이팅하고 습윤화된 항온처리기 속에서 37℃로 7.5% CO2 대기에서 성장시켰다. 1일 항온처리 후에, 각각의 ADC를 각각의 웰에 성장 배지(20 μg/mL 내지 0.88 ng/ml의 최종 ACD 농도 생성) 속에 25μL의 양의 3.5-배 일련 희석액 속의 각각의 웰에 2회 가하였다. 추가로 4일 후, 플레이트를 항온처리기로부터 제거하고 실온으로 평형화시켰다. 대략 30분 후, 50 μL를 각각의 웰로부터 제거한 후, 50 μL의 CellTiter-Glo® 2.0 발광성 용액(Promega, G9243)을 각각의 웰에 가하였다. 플레이트를 450 rpm에서 5분 동안 진탕한 다음 진탕하지 않고 10분 동안 항온처리한 후에, 발광을 Tecan Spark 10M 플레이트 판독기 위에서 웰당 250 ms의 노출 시간으로 측정하였다. 발광성 대 ADC 농도(ng/mL)의 곡선을 Graphpad Prism 소프트웨어로 조절하였다. Prism 소프트웨어의 빌트-인 "로그(억제제) 대 반응 -- 다양한 기울기(4개의 매개변수)" IC50 측정 기능을 사용하여 측정된 IC50 값을 표 10에 보고한다.
비-사람화된 및 사람화된 항-ROR1 또는 동형 대조군 ADC(IC50, ng/mL)에 의한 697 세포의 시험관내 세포 사멸
ADC 697 세포에서의 IC 50 값(ng/ml)
XBR1-402-G5-PNU (adc394) 211.6
HuXBR1-402(3)-G5-PNU (Adc456) 98.1
HuXBR1-402(8)-G5-PNU (Adc457) 164.2
HuXBR1-402(15)-G5-PNU (Adc458) 105.6
HuXBR1-402(17)-G5-PNU (Adc459) 70.6
HuXBR1-402(19)-G5-PNU (Adc460) 91.7
HuXBR1-402(26)-G5-PNU (Adc461) 93.9
Tras-G5-PNU (Adc286) 5214
도 25는 표 10의 사람화된 ADC를 사용하는 697 세포에서 시험관내 세포 사멸 검정의 용량-반응 곡선을 나타낸다. 상기 표 및 도 25에서와 같이, 사람화된 ADC는 모(parental), 비-사람화된 mAb로 제조된 ADC와 비교하여 보다 강력하다.
실시예 17. CD-1 야생형 마우스 균주에서 항-ROR1 XBR1-402 항체 및 XBR1-402-G5-PNU ADC의 생체내 약력학적 연구
다음의 연구를 ABPRO(미국 매사츄세츠주 버링톤 소재)에서 수행하였다. 케이지당 5 마리 이하의 동물의 그룹으로 가둔 암컷 CD-1 마우스(연구 시작시 적어도 6-주령, Taconic Biosciences로부터 입수, 미국 뉴욕주 저먼터운 소재)를 중량에 따라 각각 9마리의 2개 그룹으로 무작위로 나누었다. 하나의 그룹에 1 mg/kg의 XBR1-402 (mAb202)의 단일 용량을 정맥내 제공하는 한편, 제2 그룹에는 단일 용량의 1 mg/kg의 XBR1-402-G5-PNU (adc409)를 제공하였다. 용량 후 혈액 샘플을 표 11의 프로토콜에 따라 각각 3마리의 동물로 이루어진 서브그룹으로부터 수집하였다. 턱밑 정맥의 란셋 구멍(lancet puncture)으로 혈액 샘플링(대략 200 μL 수집)을 진행하였으며, 21일째 샘플링은 예외적으로, 심장 구멍(대략 600 μL 수집)으로 진행하였다. 서브그룹으로부터의 샘플을 매 시점에 혼주시켰다. 혈장을 1'500g에서 10분 동안 혈액 원심분리하여 분리하고, ELISA에 의해 내부적으로 분석할 때까지 -80℃에서 멸균 동결바이알 속에 저장하였다.
약력학적 연구 혈액 샘플링 프로토콜
치료 그룹(동물의 번호) 서브 그룹(동물의 번호) 투여 후 혈액 샘플링
1 mg/kg XBR1-402 (9) 1 (3) 1h, 7일
2 (3) 24h, 14일
3 (3) 3일, 21일 (말단 방혈)
1 mg/kg XBR1-402-G5-PNU (9) 1 (3) 1h, 7일
2 (3) 24h, 14일
3 (3) 3일, 21일 (말단 방혈)
혈장을 혈액으로부터 1500g에서 10분 동안 원심분리하여 분리하고, ELISA로 분석할 때까지 -80℃에서 저장을 위해 멸균 동결바이알에 이전시켰다. mAb XBR1-402 및 ADC XBR1-402-G5-PNU의 생체내 안정성을 ELISA-계 검정으로 평가하였다. ADC 혈청 샘플의 일련의 희석물을 2 μg/ml의 마우스 항-PNU mAb(마우스를 사람 IgG-PNU 접합체로 면역화하고 BSA-PNU 접합체로 스크리닝하여 자체적으로 생산함)로 피복한 ELISA 플레이트 위에서 포획시켜 ADC를 결합시키거나, 항-사람 Fc F(ab')2(Jackson Immunoresearch)를 사용하여 총 IgG를 결합시키고, HRP-접합된 항-사람 IgG F(ab')2 (Jackson Immunoresearch)의 1:2500 희석으로 검출하였다. ADC 및 총 IgG의 혈청 농도를 공지된 농도의 동일한 ADC의 샘플과 비교함으로써 샘플 적정의 최대 값의 1/2로부터 계산하였다.
도 20의 데이타는 본 발명의 ADC의 고 안전성을 나타낸다.
실시예 18. NOD-SCID 마우스에서 사람 급성 림프성 백혈병 (ALL) 세포주 697의 산재성 이종이식체 모델에서 ADC의 생체내 효능의 평가
다음의 연구를 Pipeline Biotech(덴마크 트리지 소재)에서 수행하였다. XBR1-402-G5-PNU (adc288) 및 사람화된 hu2A2-G5-PNU(adc287; 공개되지 않은 제PCT/EP2016/076244호를 기준으로 함)를 hROR1 양성 697 ALL 세포가 주사된 암컷 NOD-SCID 마우스 중 산재성 이종이식체 모델에서 비교하였다. HER2 특이적인 항체 트라스투주마브, Tras-G5-PNU (adc286)를 기준으로 한 ADC는 음성의 동형-매치된 대조군 ADC로서 제공하였다.
각각 적어도 20g으로 칭량된 9주령의 마우스에게 연구 0일째에 697개 종양 세포 (5x106 세포/동물, 200 μL PBS 중)을 접종하였다. PBS 속에 제형화된, 각각의 ADC를 6마리의 그룹에 1.0 mg/kg으로 7, 14 및 21일째에, 마우스 IgG(Jackson ImmunoResearch, 015-000-003), 30 mg/kg)와 함께 각각의 ADC 투여 20시간 전에 투여(정맥내)하였다. 실험 연구에서 동물에 대한 유럽 및 덴마크 법에 따라 중간의 통증, 중간의 고통, 특정 정도의 고생, 또는 연구 특이적인 사람 종점의 한계를 초과하는 어떠한 임상 신호를 나타내는 어떠한 동물도 안락사시켰다. 혈액(EDTA 바이알 중 90 μL)을 각각의 동물의 꼬리 정맥으로부터 12 및 19일 째에 수집하였다. 혈장을 표준 과정에 따라 혈액 원심분리로 분리하였다. 처리 그룹으로부터의 샘플을 각각의 시점에 대해 혼주시켰다.
ADC 혈장 샘플의 일련의 희석물을 2 μg/ml의 마우스 항-PNU mAb(마우스를 사람 IgG-PNU 접합체로 면역화하고 BSA-PNU 접합체로 스크리닝하여 생산함)로 피복시킨 ELISA 플레이트 위에서 포획하여 ADC를 결합시키거나, 항-사람 Fc F(ab')2 (Jackson Immunoresearch, 109-006-098)로 피복시킨 ELISA 플레이트 위에서 포획하여 총 IgG를 결합시키고, HRP-접합된 항-사람 IgG F(ab')2 (Jackson Immunoresearch, 709-035-149)의 1:2500 희석으로 검출하였다. ADC 및 총 IgG의 혈청 농도를 공지된 농도의 동일한 ADC의 샘플과 비교함으로써 샘플 적정의 최대 값의 1/2로부터 계산하였다.
데이타 분석을 소프트웨어 PRISM을 사용하여 수행하였다. 본 발명의 XBR1-402-G5-PNU ADC로 처리한 마우스는 비교가능한 ROR1-표적화 hu2A2-G5-PNU ADC, 또는 동형 대조군 ADC로 처리된 것들과 비교하여 연장된 생존을 나타내었다(도 15, 패널 A). 더욱이, XBR1-402-G5-PNU ADC의 농도는 공지되거나 동형 대조군 ADC보다 혈장 속에서 더 높게 남았다(도 15, 패널 B).
실시예 19. hROR1-과발현 EMT-6 세포를 사용하여 확립된 동소 유방 암 모델에서 항-ROR1 ADC의 생체내 효능의 평가
신규한 항-ROR1 항체 XBR1-402-G5-PNU (adc262)를 기준으로 한 ADC를 R12-G5-PNU (adc327), 공지된 항체 R12를 기준으로 한 ADC 및 동형 대조군 Tras-G5-PNU (adc286) ADC에 대해 다음 마우스 모델에서 표 13의 연구 프로토콜에 따라 비교하였다.
ADC의 평가에 사용된 동소 유방 암 모델
모델 마우스 균주 및 성별 종양 확립
hROR1-과발현 EMT-6, 클론 14 (실시예 2로부터) 동계 암컷 BALB/c 마우스, 4 내지 8주령에 이식 유방 지방 패드내로 1x106개의 세포를 주사함. 100 내지 150 mm3로부터 무작위의 종양 용적
ROR1(클론(cl14))을 과발현하는 동소 이식된 EMT6 세포를 지닌 동소 유방암 모델에서 항-ROR1 XBR1-402-G5-PNU ADC의 평가를 위해 사용된 프로토콜
그룹 마우스 번호 총 용량 이식 후 투여일 경로
1 (Tras-G5-PNU, adc286) 6 1 mg/kg/일의 Tras-G5-PNU (PBS 중) 14, 21, 28 정맥내
2 (XBR1-402-G5-PNU, adc409) 6 1 mg/kg/일의 XBR1-402-G5-PNU (PBS 중) 14, 21, 28 정맥내
3 (R12-G5-PNU, adc327) 6 1 mg/kg/일의 R12-G5-PNU (PBS 중) 14, 21, 28 정맥내
도 18은 6마리의 개개 마우스 각각에서 연구에 걸쳐 진행되는 종양 용적을 나타낸다. ROR1-음성 WT EMT-6 모델의 비-반응과 대치되는 것으로서, 높은 hROR1 발현을 지닌 동소 유방 암 모델은 본 발명의 ADC를 사용한 치료에 대해 유의적으로 반응한다. 본 발명의 ADC의 현저한 반응은 또한 공지된 R12 ROR1-표적화 항체를 기반으로 한 비교가능한 ADC보다 유의적인 개선을 입증한다.
실시예 20. 웨스턴 블롯에 의한 사람 환자 기원한 종양 분해물에서의 hROR1 발현의 분석
사람 환자-기원한 이종이식체(PDX) 모델(Charles River, 독일 프라이부르크 소재)의 종양 분해물 및 대조군으로서 고도로 ROR1-양성 불멸화된 세포주의 분해물(Koasumi-2), 및 또한 불멸화된 A549 암 세포로부터의 분해물을 웨스턴 블롯에 의해 hROR1 단백질 발현에 대해 조사하였다. 이를 위해, 분해물을 5x SDS-PAGE 로딩 완충액(250 mM 트리스-HCl pH 6.8, 10% SDS, 30% 글리세롤, 5% μ-머캅토에탄올)과 혼합하고 99℃에서 5분 동안 가열하여 변성시켰다. SDS-PAGE에 의한 분리 후, 단백질을 eblot 이전 시스템(Genscript)을 사용하여 PVDF 막으로 이전시켰다. 이후에, 막을 4℃에서 밤새 10% 말 혈청(Amimed, 스위스 바이오컨셉 소재)을 함유하는 TBST (20 mM 트리스-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.6, 0.1% 트윈-20) 속에 1:200으로 희석된 상업적으로 이용가능한 폴리클로날 토끼 항-ROR1 항체 4102(Cell Signaling Technology, 미국 댄버 소재)과 함께 항온처리하였다. TBST로 2회 세척한 후, 막을 HRP-커플링된 항-토끼 제2 항체(WesternSure HRP 염소-항-토끼 IgG, LiCor, 미국 링콜른 소재)와 함께 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 시그날은 막을 발광성 기질(SuperSignal West Femto (34094, Thermo Fisher) 속에서 항온처리하고 cDigit 웨스턴 블롯 판독기(Western blot reader)(LiCor, 미국 링컨 소재)를 사용하여 영상화함으로써 나타났다. 하우스키핑 유전자(housekeeping gene) GAPDH의 검출은 로딩 대조군으로서 제공되었다.
실시예 22의 종양 분해물 hROR1 상태
종양 지정 종양 기원 hROR1 상태
PXF 1118 폐, 페우라중피종(peuramesothelioma) +++
RXF 486 신장 종양, 부신종 +
PXF 541 폐, 페우라중피종 +++
SXFS 1407 연조직 육종, 신경섬유육종 ++
CX 533 결장 암, 선암종 +
Kasumi-2 B 세포 전구체 백혈병 +++
A549 폐 암종 +
도 21은 사람 종양 분해물, 및 불멸화된 암 세포로부터의 분해물의 웨스턴 블롯을 나타낸다.
실시예 21. 환자-기원한 종양 이종이식체 모델에서 ADC XBR1-402-G5-PNU의 생체내 효능의 분석
다음의 연구를 챨스 리버(Charles River)(독일 프라이부르크 소재의 Oncotest GmbH)에서 수행하였다.
XBR1-402-G5-PNU ADC의 평가를 위해 사용된 환자-기원한 종양 이종이식체 모델
모델 마우스 균주 및 성별 종양 확립
PXF 1118 (폐, 페우라중피종), 편측성 암컷 NMRI 누드 마우스, 5 내지 7주령에서 이식 편측성 또는 양측성 종양 이식, 및 50 내지 250 mm3의 무작위의 피하 종양 용적
RXF 486 (신장 종양, 부신종)
PXF 541 (폐, 페우라중피종)
SXFS 1407 (연조직 육종, 신경섬유육종)
CX 533 (결장 암, 선암종)
앞서 내독소가 없는 것으로 확인된 XBR1-402-G5-PNU (adc409) ADC를 다음의 연구 프로토콜에 따라 각각의 모델에서 시험하였다.
환자-기원한 종양 이종이식체 모델에서 항-ROR1 XBR1-402-G5-PNU ADC의 평가에 사용된 프로토콜
그룹 마우스 번호 총 1일 용량 투여일 경로
1(비히클 대조군) 3 10 ml/kg/일의 PBS 0, 8. 15 정맥내
2 (XBR1-402-G5-PNU, adc409) 3 1 mg/kg/일의 XBR1-402-G5-PNU (PBS 중) 0, 8. 15 정맥내
마우스에게 PDX 물질을 피하 이식(일측(PXF 111, RXF 486, CX 533) 또는 양측으로(SXFS 1407, PXF 541)하였다. 종양이 100 cm3의 크기에 도달하면 마우스를 무작위로 분배하고 ADC를 1mg/kg에서 또는 비히클을 총 3회 동안 처리하였다. 종양 용적을 캘리퍼 측정으로 측정하고 체중을 주당 2회 기록하였다. 마우스를 종양이 크기가 2000 mm3(일측) 또는 1700 mm3(양측)에 이를 때, 또는 유의적인 체중 손실(전체적으로 30% 이상, 또는 2일내 20% 이상)시 안락사시켰다.
도 22는 연구시 종양 용적 평가를 나타낸다. 높은 hROR1 발현을 갖는 환자-기원한 종양 물질로 확립된 종양 이종이식체는 본 발명의 ADC를 사용한 처리에 유의적으로 반응한다.
실시예 22. XBR1-402 CAR-T의 시험관내 활성
XBR1-402를 기반으로 한 CAR-T 세포를 ROR1-표적화 mAbs R11 및 R12에 대해 앞서 기술한 방법을 사용하여 가공하였다(Hudecek, M., Lupo-Stanghellini, M. T., Kosasih, P. L., Sommermeyer, D., Jensen, M. C., Rader, C., 및 Riddell, S. R. (2013). 수용체 친화성 및 세포외 도메인 변형은 ROR1-특이적인 키메라 항원 수용체 T 세포에 의한 종양 인식에 영향을 미친다(Clin. Cancer Res. 19, 3153-3164). 생체외 확장된 주요 사람 CD8+ CD62L+ T 세포를 CD3ζ 및 4-1BB 시그날링 도메인 및 짧은 스페이서를 함유하는 XBR1-402 또는 R12-기원한 CAR로 렌티바이러스적으로 형질도입하였다. 형질도입된 T 세포를 tEGFR을 통해 FACS로 정제하고 이들의 표현형을 기능적 검정 전 날에 평가하였다. CD8+ 순도는 97% 내지 99% 사이에서 변하였으며, tEGFR 발현은 95% 내지 99%에서 변하였다. ROR1-양성 또는 ROR1-음성 사람 유방 암 세포와 함께 72 시간 동시-배양 후, CFSE-염색된 CD8+ CD62L+ 세포를 유동 세포분석법으로 분석하였으며, XBR1-402 및 R12 CAR-T의 표적-의존성 증식을 나타내었다(도 26; 상부 좌측 패널). 24시간의 동시 배양 후 취한 상층액 중 IFNγ 및 IL2 농도를 ELISA로 측정하였다(도 26; 상부 우측 패널). 선택적인 세포독성을 ROR1-양성 및 ROR1-음성 세포를 사용한 11시간의 동시-배양 후 루시퍼라제-계 세포독성을 사용하여 측정하였다(도 26; 하부 패널).
동일한 실험을 반복하여 짧은 스페이서를 지닌 XBR1-402 CAR-T를 긴 스페이서를 지닌 XBR1-402 CAR-T와 비교하였다. ROR1-양성 또는 ROR1-음성 사람 유방 암 세포와 72시간 동시-배양 후, CFSE-염색된 CD8+ CD62L+ 세포를 유동 세포분석법으로 분석하였으며, 짧은 스페이서를 지닌 XBR1-402 CAR-T의 보다 강력한 증식을 나타내었다(도 27; 상부 패널). ROR1-양성 및 ROR1-음성 세포와 11시간의 동시-배양 후 루시퍼라제-계 세포독성 검정을 사용한 선택적인 세포독성은 짧은 및 긴 스페이서를 지닌 XBR1-402 CAR-T 둘 다에 대해 선택적인 세포독성을 나타내었다(도 27; 하부 패널).
실시예 23. XBR1-402의 특이성 분석
도 28은 레트로게닉스 세포 미세배열 플랫폼(Retrogenix Cell Microarray Platform)의 개요를 나타낸다. 1차 스크린: 정제된 키메라 토끼/사람 IgG1 XBR1-402 및 정제된 키메라 토끼/사람 IgG1 XBR2-401을 각각 2 μg/mL의 농도로 혼주시켰다. 혼주물을 개별적으로 4,336개의 사람 혈장막 단백질(13개의 슬라이드 세트; n=슬라이드 세트당 2개의 슬라이드)을 발현하는 고정된 HEK293 세포/슬라이드에 대한 결합에 대해 스크리닝하였다. 모든 형질감염 효율은 최소 역치(minimum threshold)를 초과하였다. AlexaFluor647 항-사람 IgG Fc 검출 항체를 사용하였다. 주요 히트(Primary hit)(2개의 점)을 ImageQuant 상에서 형광성(AlexaFluor647 및 ZsGreen1)을 분석하여 확인하였다. 모든 히트를 암호화하는 벡터를 서열분석하여 이들의 정확한 실체를 확인하였다. 확인 스크린: 모든 히트를 암호화하는 벡터와, 대조군 벡터를 새로운 슬라이드에 2회 스폿팅하고, 앞서와 같이 사람 HEK293 세포를 역 형질감염시키는데 사용하였다. 모든 형질감염 효율은 최소 역치를 초과하였다. 동일한 고정된 슬라이드를 개별적으로 2개의 시험 항체(XBR1-402 및 XBR2-401) 각각과, 양성 및 음성 대조군(n=처리당 2개의 슬라이드)으로 처리하였다. 슬라이드를 앞서와 같이 분석하였다(도 29).
***
상기한 발명은 설명의 방식으로 및 이해의 명확성 목적을 위한 예로서 일부 상세히 기술되었지만, 본 발명의 교시의 측면에서 본 발명에 대한 특정 변화 및 변형이 첨부된 청구범위의 취지 또는 영역으로부터 벗어나지 않고 이루어질 수 있음이 당해 분야의 통상의 기술자에게 용이하게 명백할 것이다.
본 명세서에 인용된 모든 공보, 데이타베이스, 진뱅크(GenBank) 서열, 특허, 및 특허원은 각각이 참고로 포함된 것으로 구체적으로 및 개별적으로 나타낸 경우와 같이 참고로 본원에 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> NBE-Therapeutics AG The Scripps Research Institute <120> ROR1 Antibody Compositions and Related Methods <130> 1713.1PC <140> <141> 2017-01-20 <150> 62/280,843 <151> 2016-01-20 <160> 161 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 117 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 1 Gln Glu Gln Gln Lys Glu Ser Gly Gly Gly Leu Phe Lys Pro Thr Asp 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asp Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Asn Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Gly Ile Ser Gly Asn Ala Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys 50 55 60 Ser Arg Ser Thr Ile Thr Arg Asn Thr Asn Leu Asn Thr Val Thr Leu 65 70 75 80 Lys Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala 85 90 95 Arg Asp His Pro Thr Tyr Gly Met Asp Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 118 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 2 Gln Glu Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Thr Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Thr Tyr 20 25 30 His Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ser Ile Tyr Ala Gly Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Val 50 55 60 Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asn Thr Thr Gln Asn Thr Val Ser 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Thr Val Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Asp His Pro Ser Tyr Gly Met Asp Leu Trp Gly Pro Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 3 <211> 125 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 3 Gln Glu Gln Leu Lys Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asp Leu Ser Asn Tyr 20 25 30 Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asp Pro Thr Phe Asp Tyr Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Val 50 55 60 Asn Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Glu Asn Thr Gln Asn Thr Val Ser 65 70 75 80 Leu Gln Ile Asn Ser Leu Thr Pro Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Trp Val Tyr Gly Val Asp Asp Tyr Gly Asp Gly Asn Trp Leu 100 105 110 Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Ile Ser Ser 115 120 125 <210> 4 <211> 117 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 4 Gln Glu Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr 1 5 10 15 Pro Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Phe Leu Ser Ser Tyr 20 25 30 Tyr Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Gly Thr Gly Gly Ser Ala Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys 50 55 60 Ser Arg Ser Thr Ile Thr Arg Asn Thr Asn Leu Ser Thr Val Thr Leu 65 70 75 80 Lys Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala 85 90 95 Arg Asp His Pro Asn Tyr Gly Met Asp Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 5 <211> 113 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 5 Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Glu Ser 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Arg Asn Gly 20 25 30 Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Ile Ile Thr Ser Ser Gly Asp Lys Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met 65 70 75 80 Thr Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly 85 90 95 Thr Val Ser Ser Asp Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Ile Ser 100 105 110 Ser <210> 6 <211> 115 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 6 Gln Glu Gln Leu Lys Glu Ser Gly Arg Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Gly Trp 20 25 30 Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Thr Ile Gly Thr Thr Lys Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Val 50 55 60 Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asn Ala Gln Asn Thr Val Asp Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Thr Ala Ala Asp Arg Ala Thr Tyr Phe Cys Val 85 90 95 Arg Gly Ser Asp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Ile Ser Ser 115 <210> 7 <211> 120 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 7 Gln Glu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Thr Ile Tyr Gly Gly Ser Gly Ser Thr Trp Tyr Ala Ser Trp Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Ala Val Asp Leu Lys 65 70 75 80 Ile Thr Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg 85 90 95 Ser Tyr Pro Gly Trp Thr Thr Glu Pro Tyr Phe Asp Ile Trp Gly Pro 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 8 <211> 121 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 8 Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Ile Asp Leu Ser Arg Tyr Ala 20 25 30 Val Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Val Ile Ser Gly Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Thr 65 70 75 80 Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Trp 85 90 95 Ala Thr Asp Gly Ile Phe Asp Tyr Asp Asp Thr Phe Asn Leu Trp Gly 100 105 110 Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 9 <211> 115 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 9 Gln Glu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Thr Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Pro Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Tyr Val Asp Ser Gly Ser Ala Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala 50 55 60 Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Asp Leu 65 70 75 80 Lys Met Thr Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Phe Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Gly Trp Gly Ser Asp Val Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Ile Ser Ser 115 <210> 10 <211> 113 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 10 Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Tyr 20 25 30 Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Thr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Val Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met Thr 65 70 75 80 Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Leu 85 90 95 Asp Tyr Asp Met Asp Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 100 105 110 Ser <210> 11 <211> 117 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 11 Gln Glu Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr 1 5 10 15 Pro Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile 35 40 45 Gly Ile Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys 65 70 75 80 Ile Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg 85 90 95 Leu Tyr Val Ser Asp Ser Thr Ala Asn Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 12 <211> 114 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 12 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Oryctolagus cuniculus <400> 31 Ser Ile Tyr Ala Gly Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Val Asn 1 5 10 15 Gly <210> 32 <211> 9 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 32 Asp His Pro Ser Tyr Gly Met Asp Leu 1 5 <210> 33 <211> 5 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 33 Asn Tyr Gly Val Ser 1 5 <210> 34 <211> 17 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 34 Tyr Ile Asp Pro Thr Phe Asp Tyr Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Val Asn 1 5 10 15 Gly <210> 35 <211> 16 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 35 Trp Val Tyr Gly Val Asp Asp Tyr Gly Asp Gly Asn Trp Leu Asp Leu 1 5 10 15 <210> 36 <211> 5 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 36 Ser Tyr Tyr Val Ser 1 5 <210> 37 <211> 16 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 37 Ala Ile Gly Thr Gly Gly Ser Ala Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Ser 1 5 10 15 <210> 38 <211> 9 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 38 Asp His Pro Asn Tyr Gly Met Asp Leu 1 5 <210> 39 <211> 5 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 39 Arg Asn Gly Met Thr 1 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cuniculus <400> 84 Asn Arg Asp Ser Gly Asn Ile Glu Asp Tyr Tyr Val His 1 5 10 <210> 85 <211> 7 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 85 Asn Asp Asp Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 86 <211> 9 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 86 Leu Ser Ser Asp Ser Ser Ala Tyr Val 1 5 <210> 87 <211> 11 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 87 Gly Gly Asp Ser Ile Glu Ser Lys Ala Val His 1 5 10 <210> 88 <211> 7 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 88 Asn Asp Asp Glu Arg Pro Ser 1 5 <210> 89 <211> 9 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 89 Gln Leu Trp Asp Gly Ser Ala Tyr Val 1 5 <210> 90 <211> 11 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 90 Gly Gly Asn Ser Ile Gly Ser Lys Ala Val His 1 5 10 <210> 91 <211> 7 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 91 Asp Asp Asp Glu Arg Pro Ser 1 5 <210> 92 <211> 11 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 92 Gln Leu Trp Asp Ser Ser Ala Gly Ala Tyr Val 1 5 10 <210> 93 <211> 11 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 93 Gly Gly Asn 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sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 115 gagaagcttg ttgctctgga tctctggtgc ctacgggtcc tatgagctga cacagctgcc 60 <210> 116 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 116 ggccatggct ggttgggcag c 21 <210> 117 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 117 ggtaccggcg cgccaccatg gactggactt ggagaatcct gtttctcgta gctgctgcaa 60 <210> 118 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 118 gccgctggtc agggctcctg 20 <210> 119 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 119 caggagccct gaccagcggc 20 <210> 120 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 120 ggcctcgagt catttacccg gagacaggga 30 <210> 121 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 121 tttctcgtag ctgctgcaac tggagcacac tcccagtcgc tggaggagtc cggg 54 <210> 122 <211> 54 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> 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Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 159 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 159 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 160 <211> 461 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 160 Gln Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Ile Thr Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Phe 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Asn Tyr Gly Asn Tyr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln 100 105 110 Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 210 215 220 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Leu 435 440 445 Pro Glu Thr Gly Gly Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys 450 455 460 <210> 161 <211> 237 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 161 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Phe Asp 20 25 30 Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Val Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 115 120 125 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 145 150 155 160 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 175 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 180 185 190 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 195 200 205 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Leu 210 215 220 Pro Glu Thr Gly Gly Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys 225 230 235

Claims (45)

  1. 제2 항체의 결합 특이성과 동일한 결합 특이성을 지닌 사람 수용체 타이로신 키나제-유사 오르판 수용체 1(ROR1)의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 항체, 항체-계 결합 단백질 또는 항체 단편으로서, 여기서 상기 제2 항체는 (1) 서열 번호: 1 및 서열 번호: 14; (2) 서열 번호: 2 및 서열 번호: 15; (3) 서열 번호: 3 및 서열 번호: 16; (4) 서열 번호: 4 및 서열 번호: 17; (5) 서열 번호: 5 및 서열 번호: 18; (6) 서열 번호: 6 및 서열 번호: 19; (7) 서열 번호: 7 및 서열 번호: 20; (8) 서열 번호: 8 및 서열 번호: 21; (9) 서열 번호: 9 및 서열 번호: 22; (10) 서열 번호: 10 및 서열 번호: 23; (11) 서열 번호: 11 및 서열 번호: 24; (12) 서열 번호: 12 및 서열 번호: 25; (13) 서열 번호: 13 및 서열 번호: 26; (14) 서열 번호: 130 및 서열 번호: 136; (15) 서열 번호: 131 및 서열 번호: 137; (16) 서열 번호: 132 및 서열 번호: 138; (17) 서열 번호: 133 및 서열 번호: 139; (18) 서열 번호: 134 및 서열 번호: 140; 또는 (19) 서열 번호: 135 및 서열 번호: 141에 각각 나타낸, 중쇄 가변 영역 서열 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는, 항체, 항체-계 결합 단백질 또는 항체 단편.
  2. 청구항 1에 있어서, 이들 중 하나 또는 둘 다가 (1) 서열 번호: 1 및 서열 번호: 14; (2) 서열 번호: 2 및 서열 번호: 15; (3) 서열 번호: 3 및 서열 번호: 16; (4) 서열 번호: 4 및 서열 번호: 17; (5) 서열 번호: 5 및 서열 번호: 18; (6) 서열 번호: 6 및 서열 번호: 19; (7) 서열 번호: 7 및 서열 번호: 20; (8) 서열 번호: 8 및 서열 번호: 21; (9) 서열 번호: 9 및 서열 번호: 22; (10) 서열 번호: 10 및 서열 번호: 23; (11) 서열 번호: 11 및 서열 번호: 24; (12) 서열 번호: 12 및 서열 번호: 25; (13) 서열 번호: 13 및 서열 번호: 26; (14) 서열 번호: 130 및 서열 번호: 136; (15) 서열 번호: 131 및 서열 번호: 137; (16) 서열 번호: 132 및 서열 번호: 138; (17) 서열 번호: 133 및 서열 번호: 139; (18) 서열 번호: 134 및 서열 번호: 140; 또는 (19) 서열 번호: 135 및 서열 번호: 141에 각각 나타낸, 중쇄 가변 영역 서열 및 경쇄 가변 영역 서열에 대해 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한, 중쇄 가변 영역 서열 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체, 항체-계 결합 단백질 또는 항체 단편.
  3. 청구항 1에 있어서, 이들 중 하나 또는 둘 다가 (1) 서열 번호: 1 및 서열 번호: 14; (2) 서열 번호: 2 및 서열 번호: 15; (3) 서열 번호: 3 및 서열 번호: 16; (4) 서열 번호: 4 및 서열 번호: 17; (5) 서열 번호: 5 및 서열 번호: 18; (6) 서열 번호: 6 및 서열 번호: 19; (7) 서열 번호: 7 및 서열 번호: 20; (8) 서열 번호: 8 및 서열 번호: 21; (9) 서열 번호: 9 및 서열 번호: 22; (10) 서열 번호: 10 및 서열 번호: 23; (11) 서열 번호: 11 및 서열 번호: 24; (12) 서열 번호: 12 및 서열 번호: 25; (13) 서열 번호: 13 및 서열 번호: 26; (14) 서열 번호: 130 및 서열 번호: 136; (15) 서열 번호: 131 및 서열 번호: 137; (16) 서열 번호: 132 및 서열 번호: 138; (17) 서열 번호: 133 및 서열 번호: 139; (18) 서열 번호: 134 및 서열 번호: 140; 또는 (19) 서열 번호: 135 및 서열 번호: 141에 각각 나타낸 중쇄 가변 영역 서열 및 경쇄 가변 영역 서열과 동일한, 중쇄 가변 영역 서열 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는, 항체, 항체-계 결합 단백질 또는 항체 단편.
  4. 청구항 1에 있어서, 이들 중 하나 또는 둘 다가 (1) 서열 번호: 1 및 서열 번호: 14; (2) 서열 번호: 2 및 서열 번호: 15; (3) 서열 번호: 3 및 서열 번호: 16; (4) 서열 번호: 4 및 서열 번호: 17; (5) 서열 번호: 5 및 서열 번호: 18; (6) 서열 번호: 6 및 서열 번호: 19; (7) 서열 번호: 7 및 서열 번호: 20; (8) 서열 번호: 8 및 서열 번호: 21; (9) 서열 번호: 9 및 서열 번호: 22; (10) 서열 번호: 10 및 서열 번호: 23; (11) 서열 번호: 11 및 서열 번호: 24; (12) 서열 번호: 12 및 서열 번호: 25; (13) 서열 번호: 13 및 서열 번호: 26; (14) 서열 번호: 130 및 서열 번호: 136; (15) 서열 번호: 131 및 서열 번호: 137; (16) 서열 번호: 132 및 서열 번호: 138; (17) 서열 번호: 133 및 서열 번호: 139; (18) 서열 번호: 134 및 서열 번호: 140; 또는 (19) 서열 번호: 135 및 서열 번호: 141에 각각 나타낸 중쇄 가변 영역 서열 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는, 항체, 항체-계 결합 단백질 또는 항체 단편.
  5. 청구항 1에 있어서, (1) 서열 번호: 27-29 및 서열 번호: 66-68, (2) 서열 번호: 30-32 및 서열 번호: 69-71, (3) 서열 번호: 33-35 및 서열 번호: 72-74, (4) 서열 번호: 36-38 및 서열 번호: 75-77, (5) 서열 번호: 39-41 및 서열 번호: 78-80, (6) 서열 번호: 42-44 및 서열 번호: 81-83, (7) 서열 번호: 45-47 및 서열 번호: 84-86, (8) 서열 번호: 48-50 및 서열 번호: 87-89, (9) 서열 번호: 51-53 및 서열 번호: 90-92, (10) 서열 번호: 54-56 및 서열 번호: 93-95, (11) 서열 번호: 57-59 및 서열 번호: 96-98, (12) 서열 번호: 60-62 및 서열 번호: 99-101, 또는 (13) 서열 번호: 63-65 및 서열 번호: 102-104에 대해 각각 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한 중쇄 CDR 서열 및 경쇄 CDR 서열을 포함하는, 항체, 항체-계 결합 단백질 또는 항체 단편.
  6. 청구항 1에 있어서, 서열 번호: 27 내지 65로 이루어진 그룹으로부터 선택된 중쇄 CDR 서열을 포함하는, 항체, 항체-계 결합 단백질 또는 항체 단편.
  7. 청구항 6에 있어서, 서열 번호: 66 내지 104로 이루어진 그룹으로부터 선택된 경쇄 CDR 서열을 추가로 포함하는, 항체, 항체-계 결합 단백질 또는 항체 단편.
  8. 청구항 6에 있어서, 서열 번호: 27-29, 서열 번호: 30-32, 서열 번호: 33-35, 서열 번호: 36-38, 서열 번호: 39-41, 서열 번호: 42-44, 서열 번호: 45-47, 서열 번호: 48-50, 서열 번호: 51-53, 서열 번호: 54-56, 서열 번호: 57-59, 서열 번호: 60-62, 또는 서열 번호: 63-65에 대해 각각 동일한 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 항체, 항체-계 결합 단백질 또는 항체 단편.
  9. 청구항 8에 있어서, (1) 서열 번호: 27-29 및 서열 번호: 66-68, (2) 서열 번호: 30-32 및 서열 번호: 69-71, (3) 서열 번호: 33-35 및 서열 번호: 72-74, (4) 서열 번호: 36-38 및 서열 번호: 75-77, (5) 서열 번호: 39-41 및 서열 번호: 78-80, (6) 서열 번호: 42-44 및 서열 번호: 81-83, (7) 서열 번호: 45-47 및 서열 번호: 84-86, (8) 서열 번호: 48-50 및 서열 번호: 87-89, (9) 서열 번호: 51-53 및 서열 번호: 90-92, (10) 서열 번호: 54-56 및 서열 번호: 93-95, (11) 서열 번호: 57-59 및 서열 번호: 96-98, (12) 서열 번호: 60-62 및 서열 번호: 99-101, 또는 (13) 서열 번호: 63-65 및 서열 번호: 102-104에 각각 나타낸 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는, 항체, 항체-계 결합 단백질 또는 항체 단편.
  10. 청구항 1에 있어서, 서열 번호 66-104로 이루어진 그룹으로부터 선택된 경쇄 CDR 서열을 포함하는, 항체, 항체-계 결합 단백질 또는 항체 단편.
  11. 청구항 10에 있어서, 서열 번호 27-65로 이루어진 그룹으로부터 선택된 중쇄 CDR 서열을 포함하는, 항체, 항체-계 결합 단백질 또는 항체 단편.
  12. 청구항 10에 있어서, 서열 번호: 66-68, 서열 번호: 69-71, 서열 번호: 72-74, 서열 번호: 75-77, 서열 번호: 78-80, 서열 번호: 81-83, 서열 번호: 84-86, 서열 번호: 87-89, 서열 번호: 90-92, 서열 번호: 93-95, 서열 번호: 96-98, 서열 번호: 99-101, 또는 서열 번호: 102-104에 대해 각각 동일한 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는, 항체, 항체-계 결합 단백질 또는 항체 단편.
  13. 청구항 1에 있어서, 키메라 항체 또는 사람화된 항체를 포함하는, 항체, 항체-계 결합 단백질 또는 항체 단편.
  14. 청구항 1에 있어서, (1) 서열 번호: 130-135으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 90% 동일한 면역글로불린 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 (2) 서열 번호: 136-141으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 90% 동일한 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는, 항체, 항체-계 결합 단백질 또는 항체 단편.
  15. 청구항 14에 있어서, (1) 서열 번호: 130-135로부터 선택된 서열과 동일한 면역글로불린 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 (2) 서열 번호: 136-141로부터 선택된 서열과 동일한 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는, 항체, 항체-계 결합 단백질 또는 항체 단편.
  16. 청구항 14에 있어서, (1) 서열 번호: 130 및 서열 번호: 136; (2) 서열 번호: 131 및 서열 번호: 137; (3) 서열 번호: 132 및 서열 번호: 138; (4) 서열 번호: 133 및 서열 번호: 139; (5) 서열 번호: 134 및 서열 번호: 140; 또는 (6) 서열 번호: 135 및 서열 번호: 141에 각각 나타낸 중쇄 가변 영역 서열 및 경쇄 가변 영역 서열에 대해 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는, 항체, 항체-계 결합 단백질 또는 항체 단편.
  17. 청구항 1에 있어서, IgAl, IgA2, IgD, IgE, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, 합성 IgG , IgM, F(ab)2, Fv, scFv, IgGACH2, F(ab')2, scFv2CH3, Fab, VL, VH, scFv4, scFv3, scFv2, dsFv, Fv, scFv-Fc, (scFv)2, 비-고갈 IgG, 디아보디(diabody), 및 2가 항체인, 항체, 항체-계 결합 단백질 또는 항체 단편.
  18. 청구항 1에 있어서, 합성 분자에 접합되는, 항체, 항체-계 결합 단백질 또는 항체 단편.
  19. 청구항 18에 있어서, 상기 합성 분자가 표지, 세포독성제, 치료학적 방사선동위원소, 또는 리포좀인, 항체, 항체-계 결합 단백질 또는 항체 단편.
  20. 청구항 19에 있어서, 상기 세포독성제가 소 분자량 독소, 또는 펩타이드 독소, 또는 단백질 독소인, 항체, 항체-계 결합 단백질 또는 항체 단편.
  21. 청구항 1에 따른 항체 또는 항체 단편 및 적어도 하나의 세포독성제를 포함하는 항체 약물 접합체(ADC).
  22. 청구항 21에 있어서, 상기 세포독성제가 소 분자량 독소, 펩타이드 독소, 또는 단백질 독소인 항체 약물 접합체.
  23. 청구항 21에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 소르타제 효소 매개된 항체 접합(SMAC)을 통해 세포독성제에 접합된 항체 약물 접합체.
  24. 청구항 21에 있어서, 상기 세포독성제가 안트라사이클린 (PNU) 독소 유도체 Gly(n)-EDA-PNU(여기서, n은 1 내지 21의 어떠한 수이다)인 항체 약물 접합체.
  25. 청구항 21에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 키메라 또는 사람화된 항체 약물 접합체.
  26. 청구항 21에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 (1) 서열 번호: 27-29 및 서열 번호: 66-68, (2) 서열 번호: 39-41 및 서열 번호: 78-80 또는 (3) 서열 번호: 60-62 및 서열 번호: 99-101로 각각 나타낸 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 항체 약물 접합체.
  27. 청구항 21에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 (1) 서열 번호: 130 및 서열 번호: 136; (2) 서열 번호: 131 및 서열 번호: 137; (3) 서열 번호: 132 및 서열 번호: 138; (4) 서열 번호: 133 및 서열 번호: 139; (5) 서열 번호: 134 및 서열 번호: 140; (6) 서열 번호: 135 및 서열 번호: 141; (7) 서열 번호: 1 및 서열 번호: 14; (8) 서열 번호: 5 및 서열 번호: 18; 또는 (9) 서열 번호: 12 및 서열 번호: 25에 각각 나타낸 중쇄 가변 영역 서열 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체 약물 접합체.
  28. 전이막 영역(transmembrane region) 및 세포내 T-세포 수용체(TCR) 시그날링 도메인에 융합되는, 청구항 1에 따른 항체 또는 항체 단편을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR).
  29. 청구항 28에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 키메라 또는 사람화되는 키메라 항원 수용체.
  30. 청구항 28에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 (1) 서열 번호: 27-29 및 서열 번호: 66-68에 각각 나타낸 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 키메라 항원 수용체.
  31. 청구항 28에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 (1) 서열 번호: 130 및 서열 번호: 136; (2) 서열 번호: 131 및 서열 번호: 137; (3) 서열 번호: 132 및 서열 번호: 138; (4) 서열 번호: 133 및 서열 번호: 139; (5) 서열 번호: 134 및 서열 번호: 140; (6) 서열 번호: 135 및 서열 번호: 141; 또는 (7) 서열 번호: 1 및 서열 번호: 14에 각각 나타낸 중쇄 가변 영역 서열 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 키메라 항원 수용체.
  32. (1) 치료학적 유효량의 (a) 청구항 1에 따른 항체, 항체-계 결합 단백질 또는 항체 단편 또는 (b) 청구항 21에 따른 항체 약물 접합체(ADC), 및 (2) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  33. (1) 청구항 1에 따른 항체, 항체-계 결합 단백질 또는 항체 단편 또는 (2) 청구항 21에 따른 항체 약물 접합체(ADC)를 포함하는 키트(kit).
  34. 청구항 1에 따른 항체, 항체-계 결합 단백질 또는 항체 단편의 중쇄 또는 경쇄의 가변 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
  35. 청구항 34에 따른 폴리뉴클레오타이드를 지닌 벡터.
  36. 청구항 32에 따른 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함으로써 상기 대상체에서 ROR1을 발현하는 세포를 사멸시키거나 이의 성장을 억제함을 포함하는, 대상체내에서 ROR1을 발현하는 세포를 사멸시키거나 이의 성장을 억제하는 방법.
  37. 청구항 36에 있어서, 상기 세포가 종양 세포인 방법.
  38. 청구항 36에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 세포독성제에 접합되는 청구항 1에 따른 항체, 항체-계 결합 단백질 또는 항체 단편을 포함하는 항체 약물 접합체(ADC)를 포함하는 방법.
  39. 청구항 38에 있어서, 상기 세포독성제가 소 분자량 독소, 펩타이드 독소, 또는 단백질 독소인 방법.
  40. 청구항 32에 따른 약제학적 조성물을 ROR1의 상승된 발현과 관련된 질환 또는 상태를 가진 대상체에게 투여함으로써, 상기 대상체에서 ROR1의 상승된 발현과 관련된 질환 또는 상태를 치료함을 포함하여, 상기 대상체에서 ROR1의 상승된 발현과 관련된 질환 또는 상태를 치료하는 방법.
  41. 청구항 40에 있어서, 상기 질환 또는 상태가 암인 방법.
  42. 청구항 40에 있어서, 상기 질환 또는 상태가 만성 림프성 백혈병 (CLL), 급성 림프모구 백혈병(ALL), 외투세포 림프종(mantle cell lymphoma), 신경아세포종, 육종, 신장 세포 암종, 유방 암, 폐 암, 결장 암, 두경부암 암, 및 흑색종으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  43. 청구항 40에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 세포독성제에 접합되는 청구항 1에 따르는 항체, 항체-계 결합 단백질 또는 항체 단편을 포함하는 항체 약물 접합체(ADC)를 포함하는 방법.
  44. 청구항 43에 있어서, 상기 세포독성제가 소 분자량 독소, 펩타이드 독소, 또는 단백질 독소인 방법.
  45. 청구항 40에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 전이막 영역 및 세포내 T-세포 수용체(TCR) 시그날링 도메인에 융합되어 키메라 항원 수용체(CAR)를 형성하는 방법.
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