CN104662044B - 用于治疗ror1癌症并抑制转移的抗体和疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及使用抗ROR1抗体或抗原结合片段、ROR1结合肽和ROR1疫苗抑制转移的药物组合物和方法。

Description

用于治疗ROR1癌症并抑制转移的抗体和疫苗
相关申请资料
本申请依据35 U.S.C.§119(e)要求2012年8月24日提交的美国专利申请号61/693,230、2012年10月2日提交的美国专利申请号 61/709,055和2012年10月4日提交的美国专利申请号61/709,803的优先权益，这些专利申请的全部内容以引用的方式并入本文中。
序列表
随附序列表中的材料特此以全文引用的方式并入。命名为“ST-UCSD3820-1WO_ST25.txt”的随附文件在2013年3月14日创建并且为33Kb。这个文件可以在使用Windows OS的计算机上使用 Microsoft Word访问。
授权信息
本发明是在政府支持下按照国家卫生研究院(National Institutes of Health)和DR1-01430加州再生医学研究所(California Institute of Regenerative Medicine)授权的P01-CA081534和R37-CA049870来进行。政府在本发明中具有一定权利。
技术领域
本发明一般涉及受体酪氨酸激酶样孤儿受体1抗体和疫苗，以及抑制转移的方法。
发明背景
癌症是仅次于冠状动脉疾病的第二大人类死亡病因。在世界范围内，每年有数百万人死于癌症。单在美国，癌症每年导致大大超过 50万人死亡，每年诊断出约140万个新病例。虽然心脏病所致的死亡已有显著下降，但由癌症引起的死亡一般处于上升中。受体酪氨酸激酶(RTK)在细胞分化、增殖、迁移、血管生成和存活中起关键作用。受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)是进化上保守的I型膜蛋白，其属于ROR亚家族并且具有含有免疫球蛋白(Ig)样结构域、卷曲状 (Frizzled)结构域和三环(Kringle)结构域的胞外域。ROR1缺陷小鼠展现出骨骼和泌尿生殖系统内的多种表型缺陷，以及出生后生长迟缓。 ROR1在胚胎发生期间由多种不同癌症而不由正常的产后组织表达，并且可以被视为致癌胚胎表面抗原。功能资料表明，ROR1可以在非经典的WNT信号传导中发挥功能以促进恶性细胞的存活。较新的研究已经显示，非经典的WNT信号传导在乳癌转移的基底样和其它亚型中起主要作用。ROR1人类乳癌的表达还与AKT-CREB路径的活化和增强的肿瘤细胞生长相关联。
受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)是保守的胚胎蛋白，其表达在哺乳动物的胚胎发育期间变得逐渐下降。包括胞外域的完整蛋白质似乎不会在正常的成年哺乳动物组织中显著表达。详细地说，研究尚未鉴别到ROR1在正常成年人类组织的细胞表面(包括正常的非癌性B细胞)上的显著表达(Baker等,Clin.Cancer Res.,14:396(2008)； DaneshManesh等,Int.J.Cancer,123:1190(2008)；以及Fukuda等,Proc. Nat'l.Acad.Sci.USA,105:3047(2008))。然而，ROR1在恶性B细胞 (B-CLL)和套细胞淋巴瘤(MCL)的细胞表面上表达。还有报导，ROR1 在包括伯基特氏淋巴瘤(Burkett's lymphoma)、肾细胞癌、结肠癌和乳癌的某些其它癌细胞系中表达(美国专利申请2007/02075110)。因此， ROR1可以被视为这些癌症的选择性标志物。
发明概要
本发明提供了针对ROR1的抗体，其可以抑制癌细胞生长和转移。本发明提供了针对ROR1的抗体、ROR1结合肽和ROR1肽疫苗。进一步提供了使用抗ROR1抗体或其抗原结合片段、ROR1抗体免疫缀合物、ROR1肽疫苗或ROR1结合肽抑制转移的组合物和方法。在一个实施方案中，本发明提供了一种分离的抗人ROR1抗体，其具有与抗体99961相同的结合特异性。在一个方面，抗体结合到与人类 ROR-1(hROR1)的CRD结构域相连的Ig样结构域。在另一个方面，抗体结合到定位于hROR-1的氨基酸42-160的表位。在另一个方面，抗体结合到定位于hROR-1的氨基酸130-160的表位。在另一个方面，抗体需要在hROR-1的位置138处存在谷氨酸以供结合。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种分离的抗人ROR1抗体，其包含选自由SEQID.NO:1、SEQ ID.NO:5、SEQ ID.NO:9、SEQ ID.NO:13和SEQ ID.NO:17组成的组的重链可变区，以及选自由SEQ ID.NO:3、SEQ ID.NO:7、SEQ ID.NO:11、SEQ ID.NO:15和SEQ ID. NO:19组成的组的轻链可变区。在一个方面，抗体的重链可变区是 SEQ ID NO:5并且轻链可变区是SEQ ID NO:7。
在一个实施方案中，本发明提供了一种分离的抗人ROR1抗体，其包含选自由SEQID.NO:27、SEQ ID.NO:28、SEQ ID.NO:29、SEQ ID.NO:33、SEQ ID NO:34和SEQ ID.NO:35组成的组的包含CDR1、 CDR2和CDR3的重链可变区，以及选自由SEQ ID.NO:30、SEQ ID. NO:31、SEQ ID.NO:32、SEQ ID.NO:36、SEQ ID NO:37和SEQ ID. NO:38组成的组的包含CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区。在一个方面，包含CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区由SEQ ID.NO:27、 SEQ ID.NO:28和SEQ ID.NO:29组成，并且包含CDR1、CDR2和 CDR3的轻链可变区选自由SEQ ID.NO:30、SEQ ID.NO:31和SEQ ID. NO:32组成的组。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种抗人ROR-1抗体，其具有高于41nM的结合亲和力。在一个方面，抗体的结合亲和力介于约500pM与约6nM之间。在一个方面，抗体的结合亲和力为约800 pM。
在一个方面，抗体是99961或其人源化形式，包括抗体99961.1、 99961.2、99961.3或99961.4。在另一个方面，抗体抑制转移。在另一个方面，抗体内化并抑制细胞迁移。在另一个方面，抗体内化并下调波形蛋白(vimentin)、snail1/2或ZEB。在一个优选方面，抗体是人类、人源化或嵌合的。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种药物制剂，其包含针对 ROR1的抗体和药学上可接受的载体。
另一个实施方案提供了一种分离的核酸，其编码针对ROR1的抗体。在另一个实施方案中，本发明提供了一种表达载体，其包含编码针对hROR1的抗体的核酸。在另一个实施方案中，本发明提供了一种宿主细胞，其包含编码针对hROR1的抗体的核酸。在另一个实施方案中，本发明提供了一种产生抗人ROR1抗体的方法，其包括在用以产生抗体的条件下培养宿主细胞，然后任选地回收这种抗体。
在一个实施方案中，本发明提供了一种针对ROR-1表达细胞的疫苗，这种疫苗包含分离的或合成产生的肽的药学上可接受的组合物，这种肽具有与抗体D10的ROR-1结合区具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一个方面，抗体D10的ROR-1结合区的氨基酸序列是VATNGKEVVSSTGVLFVKFGPC。在另一个方面，抗体D10 的ROR-1结合区的氨基酸序列是EVVSSTGVLFVKFGPC。在另一个方面，ROR-1表达细胞是癌细胞。在另一个方面，癌细胞是B细胞白血病、淋巴瘤、CLL、AML、B-ALL、T-ALL、卵巢癌、结肠癌、肺癌、皮肤癌、胰脏癌、睾丸癌、膀胱癌、子宫癌、前列腺癌或肾上腺癌。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种疫苗，其包含具有与VATNGKEVVSSTGVLFVKFGPC具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的ROR1结合肽和药学上可接受的载体。在一个方面，这种肽是哺乳动物的。在另一个方面，ROR1结合肽是嵌合的和/或具有人类、小鼠、大鼠、猪、牛、灵长类动物、猫、犬、兔、山羊、鸡或熊起源。在另一个方面，疫苗进一步包含免疫原性佐剂。在另一个方面，佐剂是缀合到结合肽的免疫原性载体部分。在一个方面，结合肽的氨基酸序列是VATNGKEVVSSTGVLFVKFGPC。在另一个方面，免疫原性载体部分是载体肽，如钥孔戚血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、卵白蛋白、氢氧化铝或其它药学上可接受的免疫佐剂。药学上可接受的免疫佐剂的实例可以在Methods inMolecular Medicine,第42卷: Vaccine adjuvants:Preparation,Methods and ResearchProtocols；D.T. O'Hagan编；Humana Press Inc.,Totowa NJ and European Agency forthe Evaluation of Medicinal Products,Committee for Proprietary MedicinalProducts,Guidelines on Adjuvants in Vaccines,London 2004中找到。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种疫苗，其包含具有与 EVVSSTGVLFVKFGPC具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的 ROR1结合肽和药学上可接受的载体。在另一个方面，ROR1结合肽是嵌合的和/或具有人类、小鼠、大鼠、猪、牛、灵长类动物、猫、犬、兔、山羊、鸡或熊起源。在另一个方面，佐剂是缀合到结合肽的免疫原性载体部分。在一个方面，结合肽的氨基酸序列是 VATNGKEVVSSTGVLFVKFGPC。在另一个方面，免疫原性载体部分是载体肽，如钥孔戚血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、卵白蛋白、氢氧化铝或其它药学上可接受的免疫佐剂。药学上可接受的免疫佐剂的实例可以在Methods in Molecular Medicine,第42卷:Vaccine adjuvants:Preparation,Methods and Research Protocols；D.T.O'Hagan 编；Humana Press Inc.,Totowa NJ and European Agency for the Evaluationof Medicinal Products,Committee for Proprietary Medicinal Products,Guidelineson Adjuvants in Vaccines,London 2004中找到。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种包含疫苗的药物制剂，这种疫苗包含具有与VATNGKEVVSSTGVLFVKFGPC具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的ROR1结合肽和药学上可接受的载体。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种包含疫苗的药物制剂，这种疫苗包含具有与EVVSSTGVLFVKFGPC具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的ROR1结合肽和药学上可接受的载体。
在一个实施方案中，本发明提供了一种ROR1结合肽，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26。在一个方面，这种肽具有与VATNGKEVVSSTGVLFVKFGPC具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在另一个方面，这种肽具有与 EVVSSTGVLFVKFGPC具有至少95％序列同一性的氨基酸肽序列。在另一个方面，结合肽是哺乳动物的。在另一个方面，结合肽是嵌合的和/或具有人类、小鼠、大鼠、猪、牛、灵长类动物、猫、犬、兔、山羊、鸡或熊起源。
在一个实施方案中，本发明提供了一种药物制剂，其包含有包含选自由以下组成的组的氨基酸序列的ROR1结合肽：SEQ ID NO:25 和SEQ ID NO:26，以及药学上可接受的载体。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种分离的核酸，其编码包含SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26的氨基酸序列的ROR1结合肽。在另一个实施方案中，本发明提供了一种包含核酸的表达载体，这种核酸编码包含SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26的氨基酸序列的ROR1结合肽。在另一个实施方案中，本发明提供了一种包含核酸的宿主细胞，这种核酸编码包含SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26的氨基酸序列的ROR1结合肽。在另一个实施方案中，本发明提供了一种产生肽的方法，其包括在用以产生包含SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26的氨基酸序列的ROR1结合肽的条件下培养编码这种结合肽的宿主细胞。在一个方面，用以产生肽的方法进一步包括回收结合肽。
在一个实施方案中，本发明提供了一种抑制ROR-1表达癌的转移的方法，这种方法包括通过施用具有单克隆抗体99961的结合特异性的抗体、包含具有与抗体D10的ROR-1结合区具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的肽的疫苗或具有与VATNGKEVVSSTGVLFVKFGPC具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的ROR-1结合肽来破坏肿瘤细胞的上皮-间质转化。在一个方面，ROR-1表达癌是B细胞白血病、淋巴瘤、CLL、AML、B-ALL、T-ALL、卵巢癌、结肠癌、肺癌、皮肤癌、胰脏癌、睾丸癌、膀胱癌、子宫癌、前列腺癌或肾上腺癌。
在一个实施方案中，本发明提供了一种抑制ROR-1表达癌的转移的方法，这种方法包括通过施用具有单克隆抗体99961的结合特异性的抗体、包含具有与抗体D10的ROR-1结合区具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的肽的疫苗或具有与EVVSSTGVLFVKFGPC具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的ROR-1结合肽来破坏肿瘤细胞的上皮-间质转化。在一个方面，ROR-1表达癌是B细胞白血病、淋巴瘤、CLL、AML、B-ALL、T-ALL、卵巢癌、结肠癌、肺癌、皮肤癌、胰脏癌、睾丸癌、膀胱癌、子宫癌、前列腺癌或肾上腺癌。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种治疗或预防受试者的癌症的方法，这种方法包括向这个受试者施用具有单克隆抗体99961的结合特异性的抗体、包含具有与抗体D10的ROR-1结合区具有至少 95％序列同一性的氨基酸序列的肽的疫苗或具有与VATNGKEVVSSTGVLFVKFGPC具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的ROR-1结合肽。在一个方面，癌症是B细胞白血病、淋巴瘤、 CLL、AML、B-ALL、T-ALL、卵巢癌、结肠癌、肺癌、皮肤癌、胰脏癌、睾丸癌、膀胱癌、子宫癌、前列腺癌或肾上腺癌。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种治疗或预防受试者的癌症的方法，这种方法包括向这个受试者施用具有单克隆抗体99961的结合特异性的抗体、包含具有与抗体D10的ROR-1结合区具有至少 95％序列同一性的氨基酸序列的肽的疫苗或具有与EVVSSTGVLFVKFGPC具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的 ROR-1结合肽。在一个方面，癌症是B细胞白血病、淋巴瘤、CLL、AML、B-ALL、T-ALL、卵巢癌、结肠癌、肺癌、皮肤癌、胰脏癌、睾丸癌、膀胱癌、子宫癌、前列腺癌或肾上腺癌。
附图简述
图1示出了ROR1在乳癌中的高水平表达与较短的无转移存活期和EMT基因标签相关联。(A)这个图来源于通过PubMed GEO数据库 (GSE2603、GSE5327、GSE2034和GSE12276)可获得的已发布数据。卡普兰-迈耶曲线(Kaplan-Meier curve)描绘了ROR1表达对总体无转移存活期的预后影响。对于每个分析来说，将582个病例分成三分位组(tertile)，其中指定为ROR1H的组代表了患有具有最高水平的 ROR1mRNA的肿瘤的三分之一的患者，并且指定为ROR1L的组代表了患有具有最低水平的ROR1mRNA的癌症的三分之一的患者。患有具有ROR1mRNA的中间表达的肿瘤的三分之一的患者被指定为 ROR1M。无转移存活期是通过卡普兰-迈耶分析来测定，并且统计差异是通过对数秩检验来测定。每个类别中的患者数目、总转移事件以及对应的P值(卡方检验)示于内嵌的表格中。(B)热图，其示出了ROR1 (顶部)、EMT相关基因(编码Snail-1和Snail-2的SNAI1和SNAI2、编码ZEB-1的ZEB1、编码波形蛋白的VIM、编码N-钙粘蛋白 (N-Cadherin)的CDH2、编码E-钙粘蛋白(E-Cadherin)的CDH1、编码ZO-1的TJP1、编码ZO-3的TJP3、编码CK-19的KRT19或编码紧密连接蛋白3(Claudin 3)的CLDN3在从患者分离的原发性乳癌细胞中的表达。(C)热图，其示出了从经过ROR1-siRNA或CTRL-siRNA处理的MDA-MB-231(左侧)、HS-578T(中间)、BT549(右侧)细胞分离的EMT相关基因的表达。(D)用如顶部所指示的CTRL-shRNA或 ROR1-shRNA转染的MDA-MB-231、HS-578T或BT549(如底部所指示)的蛋白质溶解产物的免疫印迹。使用对左侧所指示的蛋白质具有特异性的抗体来探测免疫印迹。(E)用如顶部所指示的对照载体或 ROR1表达载体转染的MCF7的蛋白质溶解产物的免疫印迹。使用对左侧所指示的蛋白质具有特异性的抗体来探测免疫印迹。
图2示出了乳癌细胞系对ROR1的表达与EMT的特征和较高的转移潜力相关联。(A)用如顶部所指示的CTRL-shRNA或 ROR1-shRNA转染的MDA-MB-231、HS-578T或BT549(如左侧所指示)的形态变化(40×)。(B)CK-19、E-钙粘蛋白或波形蛋白的表达是通过免疫荧光染色在用CTRL-shRNA或ROR1-shRNA转染的 MDA-MB-231细胞中在63×放大率下检测。(C)用对照载体或ROR1 表达载体(如顶部所指示)转染的MCF7细胞的形态变化(40×)。(D) CK-19、E-钙粘蛋白或波形蛋白的表达是通过用对照载体或ROR1表达载体转染的MCF7细胞的免疫荧光染色(63×放大率)来检测。(E)对用CTRL-shRNA(黑色)或ROR1-shRNA(白色)转染的MDA-MB-231、 HS-578T或BT549进行的细胞迁移(左侧直方图)或侵入(右侧直方图) 的试验。将所有数据都标准化到用CTRL-shRNA转染的细胞的结果，这些结果与对于亲本细胞系所提到的那些结果没有差别。结果是每个测试组的平均值(±SEM)(每个测试组的n＝3)。(F)在细胞迁移(顶部) 或侵入(底部)的试验中CTRL-shRNA转染的MDA-MB-231(左图)或 ROR1-shRNA转染的MDA-MB-231(右图)的代表性显微照片。数据用平均值±SEM示出；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，与 CTRL-shRNA组相比较。
图3示出了在乳房垫(mammary pad)异种移植之后ROR1沉默减少乳癌转移。(A)描绘研究的第I阶段或第II阶段的图。(B)在第I阶段中随时间(天)而变的肿瘤体积。(C)从每个组切除的肿瘤的重量。(D) 每个组的原发性肿瘤的离体光子通量。(E-F)在第II阶段中每只小鼠的体内(e)肺光子通量或(f)肝光子通量用每只小鼠的原发性肿瘤光子通量来标准化。直方图描绘了每个组的标准化的肺和肝光子通量。(G) 在每个组的第II阶段中的体内肺光子通量。(H)水平条指示了第21天每个组的小鼠的平均离体肺光子通量(左侧)。右侧是从每个组摘除的肺的代表性生物发光图像。(I)直方图代表了每个组的肺重量指数。(J) 代表性的H&E染色的肺切片。(K)水平条指示了第21天每个组的小鼠的平均离体肝光子通量(左侧)。右侧是第21天每个组的摘除的肝的代表性生物发光图像。(l)第21天每个组的经过注射的小鼠的肝的代表性的H&E染色的切片。数据用平均值±SEM示出。数据用平均值±SEM示出；P>0.05被视为不显著的(N.S.)，*P<0.05，**P<0.01， ***P<0.001，与CTRL-shRNA组相比较。
图4示出了ROR1沉默减少体内MDA-MB-231细胞的实验性肺转移和骨转移。A)用5×105个CTRL-shRNA转染或ROR1-shRNA 转染的细胞静脉内(i.v.)注射的小鼠的卡普兰-迈耶存活曲线(P<0.001，通过对数秩检验)。(B)在注射之后每个组随时间而变的体内肺光子通量(左侧)。来自每个组的小鼠的代表性生物发光图像描绘于右侧。(C-E) (c)第3天、(d)第21天以及(e)第28天肺的代表性的H&E染色的切片。 (F)底部直方图提供了第28天每个组的离体肺GFP光子通量。第28 天摘除的肺的代表性生物发光图像。(G)第28天每个组的肺重量指数 (底部)。每个组的肺(顶部)的代表性照片。(H)用1×105个 CTRL-shRNA转染或ROR1-shRNA转染的细胞心内(i.c.)注射的小鼠的卡普兰-迈耶存活曲线(P＝0.0017，通过对数秩检验)。(I)在心内肿瘤注射之后小鼠的代表性生物发光图像。白色框界定了我们获取(j)中所呈现的生物发光数据的区域。(J)直方图提供了每个组的标准化的体内骨光子通量。(K)第21天每个组的取出的骨盆骨的离体骨光子通量。取出的骨盆骨的代表性生物发光图像描绘于右侧。(L)来自每个组的小鼠的代表性的H&E染色的组织学骨切片。小鼠动画从参考文献(30) 加以修改。数据用平均值±SEM示出；*P<0.05，**P<0.01，***P< 0.001，与CTRL-shRNA组相比较。
图5示出了抗ROR1抗体减少体内MDA-MB-231细胞的肺转移。 (A)D10mAb促使ROR1内化。在冰上用对照IgG-Alexa647(红色)或 D10-Alexa647将MDA-MB-231细胞染色30分钟，然后保持于冰上(蓝色)或转移到37℃下保持1小时(橙色)，随后进行流式细胞测量术。(B)在37℃下孵育1小时之前和之后D10染色(绿色)的MDA-MB-231细胞的共聚焦显微分析。(C)用或不用(-)对照IgG(IgG)或D10处理 MDA-MB-231细胞24小时，随后用荧光色素标记的非交叉阻断抗ROR1染色，而没有生存力损失。示出了经过处理的细胞的平均荧光强度(MFI)(***P<0.001，通过单因子ANOVA)。(D)在用D10或对照 IgG处理之前(0小时)或处理1、4或24小时之后从MDA-MB-231制备的溶解产物的波形蛋白(顶部)或β-肌动蛋白(底部)探测的代表性免疫印迹。下面提供了波形蛋白与β-肌动蛋白的带强度的比率。(E)使用对照IgG(IgG)或抗ROR1(ROR1)的MDA-MB-231细胞溶解产物的免疫沉淀物用于使用对波形蛋白(顶部)或ROR1(底部)具有特异性的抗体探测的免疫印迹分析。(F)直方图提供了用D10或对照IgG预处理1小时的迁移的MDA-MB-231细胞的数目。(G)左侧，描绘体内肺光子通量的直方图。右侧，肺的代表性的H&E染色的切片。(H)这个图描绘了标准化的体内肺光子通量。(I)经过IgG(顶部)或D10(底部) 处理的用肿瘤注射的小鼠的代表性生物发光图像。(J)直方图描绘了肺重量指数。(K)肺的代表性的H&E染色的切片。数据用平均值±SEM 示出；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，与IgG组相比较。
图6示出了用于定位ROR1抗体D10的表位的嵌合构建体。构建体的明亮部分是小鼠的并且较暗部分是人类的。
图7描绘了不与小鼠ROR1蛋白质反应的D10抗体的表位定位。小鼠或人类ROR1蛋白质在氨基酸位置138、142或160处具有不同的氨基酸残基；人类ROR1蛋白质在这些位置处分别具有氨基酸残基 E、S或Y，而小鼠ROR1蛋白质在氨基酸位置138、142或160处分别具有氨基酸残基K、T或S。我们产生了仅在这些位置处具有小鼠或人类氨基酸残基的重组人类ROR1蛋白质。在非变性聚丙烯酰胺凝胶中分离这些重组蛋白质，然后将其转移到尼龙上，使用D10mAb 进行探测。如这个图中可见，D10与重组蛋白质1、3、4和7反应，但不与2、5或6反应，这些重组蛋白质描述于下面的图例中。注意到，用位置138处的小鼠氨基酸残基T取代人类ROR1蛋白质的位置 138处的人类氨基酸残基E消除了D10结合。
图8示出了抗人ROR1抗体4A5的表位定位。小鼠或人类ROR1 蛋白质在氨基酸位置88、105、109或111处具有不同的氨基酸残基；人类ROR1蛋白质在这些位置处分别具有氨基酸残基T、L、S或I，而小鼠ROR1蛋白质在氨基酸位置88、105、109或111处分别具有氨基酸残基S、I、A或N。我们产生了仅在这些位置处具有小鼠或人类氨基酸残基的重组人类ROR1蛋白质。在非变性聚丙烯酰胺凝胶中分离这些重组蛋白质，然后将其转移到尼龙上，使用4A5mAb进行探测。如这个图中可见，4A5可以结合到重组蛋白质1、2、3或5，但不会结合到4。重组蛋白质4是人类ROR1蛋白质，但在位置111 处具有小鼠氨基酸残基N而不是在人类ROR1蛋白质中发现的氨基酸残基I。
图9展示了抗人ROR1抗体D10抑制乳癌细胞的转移。A-B.D10 单克隆抗体促进ROR1受体内化。C.24小时的抗ROR1抗体D10处理降低MDA-MB-231细胞中的ROR1表面表达。D.ROR1与乳癌 MDA-MB-231细胞中的波形蛋白形成复合物。E.体外的D10抗体处理可以降低波形蛋白表达。F.抗人ROR1抗体减少体外乳癌迁移。 G.D10单克隆抗体抑制MDA-MB-231乳癌早期(第2天)肺转移。H. D10单克隆抗体抑制MDA-MB-231乳癌肺转移。I.用5E5 MDA-MB-231细胞注射的代表性小鼠以背卧位示出。J.抗人ROR1 抗体处理减轻带有MDA-MB-231的小鼠的肺重量。K.在抗ROR1抗体处理之后来自带有MDA-MB-231的小鼠的代表性肺H&E组织学。误差条指示了SEM；*p<0.05，**p<0.01；基于未配对双侧司徒顿氏t检验(student's t-test)。
图10描绘了针对由mAb D10、99451、99961或99221识别的 ROR1表位产生的高亲和力抗体。小鼠或人类ROR1蛋白质在氨基酸位置138、142或160处具有不同的氨基酸残基；人类ROR1蛋白质在这些位置处分别具有氨基酸残基E、S或Y，而小鼠ROR1蛋白质在氨基酸位置138、142或160处分别具有氨基酸残基K、T或S。我们产生了仅在这些位置处具有小鼠或人类氨基酸残基的重组人类 ROR1蛋白质。在非变性聚丙烯酰胺凝胶中分离这些重组蛋白质，然后将其转移到尼龙上，使用如左边缘所指示的三种mAb 99451、99961 或99221中的每一者进行探测。如这个图中可见，这些抗体中的每一者与重组蛋白质2、4、5和8反应，但不与2、3、6或7反应，这些重组蛋白质描述于下面的图例中。注意到，用位置138处的小鼠氨基酸残基T取代人类ROR1蛋白质的位置138处的人类氨基酸残基E 消除了99451、99961或99221的结合。
图11描绘了抗体D10或99961对野生型或重组ROR1蛋白质的结合活性。将编码人类或嵌合ROR1蛋白质的载体转染到293细胞中。这允许产生重组人类-小鼠嵌合ROR1蛋白质，然后可以在非变性 PAGE凝胶(右侧)或SDS-PAGE凝胶(左侧)中按大小分离用于使用不同的抗ROR1mAb进行免疫印迹分析。结果指示，D10与99961抗体都结合到Ig样结构域的C端的相同区域，并且D10和99961在变性条件与天然条件下都可以结合到ROR1。注意到，D10和99961结合到除了13之外的所有重组蛋白质。13号嵌合蛋白质如图6中所描述。全人胞外域提供于任一凝胶的最左边的泳道上。
图12示出了抗人ROR1抗体99961的表征。A、B.99961抗体能够阻断转基因小鼠中的CLL植入。C.99961抗体具有比D10抗体约高50倍的结合亲和力。
图13示出了针对CLL细胞的99961在人类脐带血重建的免疫缺陷小鼠中的特异性活性。A.99961抗体消除>90％的CLL细胞。B、 C.99961抗体对正常的B或T细胞发育没有影响。
图14示出了99961在ROR+原发性AML中的特异性活性。
图15示出了由99961识别的表位不会被正常的造血干细胞或祖细胞表达。
图16示出了99961不与正常成体组织交叉反应。
图17示出了在免疫缺陷小鼠中对99961进行的PK研究。
图18图解了ROR1肽疫苗的设计。三个不同的抗体表位用于制造肽A19、R22和K19。在对应于人类(顶部)或小鼠(底部)ROR1的条上方是标记为A19、R22或K19的条。这些条描述了ROR1胞外域中肽A19、R22或K19的位置。
图19示出了用于将KLH缀合到肽的方法。
图20示出了肽R22的肽设计。将半胱氨酸添加到肽的C端以用于缀合到KLH。
图21示出了D10和99961结合到R22肽，而4A5不会这样。
图22示出了BALB/c小鼠的R22免疫的免疫方案。
图23示出了R22诱导的ROR1抗体在ROR1上结合的表位的免疫印迹分析。
图24示出了C57BL/6小鼠中R22-KLH的免疫方案。
图25示出了ROR1阳性MDA-MB-231乳癌细胞的FACS分析，这些细胞已经在4℃或37℃下与抗R22-KLH抗血清一起孵育1小时，然后在冰上用同型对照Alexa647标记抗体或4A5-Alexa647缀合物复染30分钟，随后进行ROR1表达的FACS分析。结果显示，来自转基因小鼠的抗ROR1血清在37℃下诱导ROR1受体内化，但在4℃下不会这样。
图26示出了来自用R22-KLH免疫的转基因小鼠的抗ROR1血清抑制体外乳癌迁移。
图27示出了C57BL/6小鼠中R-22-KLH的免疫方案。
图28示出了用图18中所描述的三种肽中的任一者的KLH缀合物免疫的小鼠的抗血清的滴定曲线。如经由ELISA所评估，描绘了抗血清与涂布有人类ROR1蛋白质的聚苯乙烯板的结合。
图29示出了EW36、JeKo-1或CLL细胞的FACS分析。对于这个研究来说，在4℃下将来自用R22-KLH免疫的小鼠的抗血清的稀释液与这些细胞一起孵育20分钟。然后洗涤细胞，然后用与荧光色素缀合的山羊抗小鼠Ig标记以通过流式细胞测量术进行检测。空心直方图是在没有首先将细胞与R22-KLH抗血清一起孵育的情况下用山羊抗小鼠Ig染色的细胞。阴影直方图是首先与抗R22-KLH抗血清一起孵育的细胞的荧光。细胞荧光的增大是归因于结合到表面的小鼠抗ROR1抗体，然后用山羊抗小鼠Ig检测这些抗体。这些小鼠的免疫前抗血清或用KLH免疫的小鼠的抗血清不会结合到这些细胞。
图30-洗涤图例中所指示的细胞并且将25μl以每孔5×105个细胞涂于圆底96孔板(Corning Costar)中的RPMI/10％FBS中。每孔添加经过稀释的抗血清(25μl)和25μl幼兔补体的1:5稀释液。D10mAb 用作阳性对照。所有条件都一式三份进行。将板在37℃下孵育4小时，并且通过DiOC6/PI染色和流式细胞测量分析立即定量细胞的生存力。这个研究指示，针对R22-KLH肽产生的D10或抗血清可以引导带有人类ROR1的细胞的补体介导的溶解。不带有ROR1的细胞不会被杀死(未示出)。
图31示出了C57BL/6小鼠的第一R22-KLH免疫方案。这种肽与钥孔戚血蓝蛋白(KLH)缀合，然后用于根据上文所说明的方案使 C57BL/6小鼠免疫。KLH或R22-KLH的第一次注射是在完全弗氏佐剂(complete Freund's adjuvant；CFA)中。第二次和后续注射是在不完全弗氏佐剂(incomplete Freund's adjuvant；IFA)中。在用紫色箭头标注的天数下将动物放血。在第一次注射的天数之后44天，将C57BL/6 小鼠用起源于人类ROR1转基因C57BL/6小鼠的人类ROR1表达CLL 攻击，这只小鼠对于T细胞白血病1(TCL1基因)也是转基因的，TCL1 基因也在B细胞特异性启动子/增强子(E-Cμ)的控制下。这种白血病类似于人类CLL并且表达人类表面ROR1。
图32示出了用R22-KLH免疫的结果。A.来自用KLH免疫的小鼠对比用R22-KLH免疫的小鼠的代表性脾。B.通过在C57BL/6小鼠中用ROR1肽R22-KLH免疫而抑制ROR1+CLL的植入。
图33示出了C57BL/6小鼠中R22-KLH的第二免疫方案。
图34示出了用R22肽免疫的结果。A.来自用KLH免疫的小鼠以及用R22-KLH免疫的小鼠的脾。B.在C57BL/6小鼠中用R22-KLH免疫之后抑制ROR1+CLL的植入。
图35是使用对B220(y轴)或ROR1(x轴)具有特异性的荧光色素缀合的mAb，对来自用KLH(顶行)或R22-KLH(底行)免疫的C57BL/6 小鼠的脾细胞的FACS分析。用于将细胞染色的mAb相比由R22-KLH 诱导的抗体结合到ROR1的非交叉阻断表位。框描画了检测到白血病细胞的区域。注意到，在用R22-KLH疫苗免疫的小鼠的脾中存在少得多(如果有的话)的白血病细胞。
图36是ROR1+CLL细胞上的ROR1的FACS分析，其指示了在 C57BL/6小鼠中用R22-KLH免疫之后下调ROR1。
图37是存在于用KLH或R22-KLH免疫的小鼠中的CD8+T细胞的FACS分析。A.用R22免疫促使CD8+T细胞的数目增加，这不存在于用KLH免疫的小鼠中。底图示出了来自早在75天前用KLH 或R22-KLH首先免疫的小鼠的脾的CD8+T细胞的百分比。
图38示出了ROR1转基因小鼠的R22-KLH免疫的免疫方案。
图39是通过在ROR1-Tg小鼠中用ROR1肽R22免疫而抑制 ROR+CLL植入的FACS分析。
图40示出了在ROR1转基因小鼠中用R22-KLH免疫的结果。在 ROR1转基因小鼠中用R22-KLH免疫之后抑制ROR1+CLL。
图41是ROR1+CLL细胞上的ROR1的FACS分析，其指示了在ROR1转基因小鼠中用R22-KLH免疫之后下调ROR1。
图42是存在于用KLH或R22-KLH免疫的ROR1-Tg小鼠中的 CD3+T淋巴细胞的FACS分析。图A示出了用R22-KLH免疫促使T 淋巴细胞增殖。图B示出了第75天从小鼠的脾中收集的CD3+T淋巴细胞的百分比。
图43是存在于用KLH或R22-KLH免疫的小鼠中的CD4+T细胞的FACS分析。图A示出了用R22-KLH免疫促使CD4+T细胞的数目增加，这在用KLH免疫的小鼠中检测不到。图B示出了第75 天从小鼠的脾中收集的CD4+T细胞的百分比。
图44是存在于用KLH或R22-KLH免疫的小鼠中的CD8+T细胞的FACS分析。图A示出了用R22-KLH免疫促使CD8+T细胞的数目增加，这在用KLH免疫的小鼠中检测不到。图B示出了第75 天从小鼠的脾中收集的CD8+T细胞的百分比。
图45示出了ROR1在乳癌中的高水平表达与较短的肺、骨和脑无转移存活期相关联。这个图来源于通过PubMed GEO数据库 (GSE2603、GSE5327、GSE2034和GSE12276)可获得的已发布数据。卡普兰-迈耶曲线描绘了ROR1表达对(A)肺无转移存活期、(B)骨无转移存活期或(C)脑无转移存活期的预后影响。对于每个分析来说，将 582个病例分成三分位组，其中指定为ROR1H的组代表了患有具有最高水平的ROR1mRNA的肿瘤的三分之一的患者，并且指定为 ROR1L的组代表了患有具有最低水平的ROR1mRNA的癌症的三分之一的患者。患有具有ROR1mRNA的中间表达的肿瘤的三分之一的患者被指定为ROR1M。无转移存活期是通过卡普兰-迈耶分析来测定，并且统计差异是通过对数秩检验来测定。每个类别中的患者数目、总转移事件以及对应的P值(卡方检验)示于内嵌的表格中。
图46示出了ROR1在乳癌中的高水平表达与较短的无转移存活期相关联，并且与其ER、PR和HER2状态无关。将582名乳腺癌患者的组群包括在存活分析中。(A)ERNeg(n＝242)与ER+(n＝325)乳癌患者(左图)、PRNeg(n＝274)与PR+(n＝271)乳癌患者(中图)以及HER2Neg(n＝404)与HER2+(n＝106)乳癌患者(右图)的恶性细胞的 ROR1mRNA表达水平的比较。结果是平均值±SEM。p值是通过司徒顿氏t检验来测定。(B)ER状态对总体无转移存活期的预后影响(P＝ 0.13，通过对数秩检验)。(C)ER状态和ROR1mRNA表达对总体无转移存活期的预后影响(P<0.0001，通过对数秩检验)。(D)PR状态对总体无转移存活期的预后影响(P＝0.0007，通过对数秩检验)。(E)PR 状态和ROR1mRNA表达对总体无转移存活期的预后影响(P< 0.0001，通过对数秩检验)。(F)HER2状态对总体无转移存活期的预后影响(P＝0.16，通过对数秩检验)。(G)HER2状态和ROR1mRNA 表达对总体无转移存活期的预后影响(P<0.0001，通过对数秩检验)。
图47示出了乳癌细胞系对ROR1的表达与EMT的特征相关联。 (A)使用对如左侧所指示的ROR1(顶部)或β-肌动蛋白(底部)具有特异性的抗体来探测来自用CTRL-shRNA或ROR1-shRNA转染的 MDA-MB-231的溶解产物的免疫印迹。(B)VIM和KRT19的平均量(±SEM)，如经由对一式三份样品的qRT-PCR所检测。数据用平均值± SEM示出；*P<0.05，**P<0.01，与CTRL-shRNA组相比较。
图48示出了使ROR1沉默降低CXCR4的表达。(A)直方图，其指示了经由qRT-PCR在用如每个直方图的底部所指示的 CTRL-shRNA2或ROR1-shRNA2转染的MDA-MB-231的一式三份样品中检测的CXCR4mRNA的量。(B)ROR1-shRNA2(具有绿线的空心直方图)或CTRL-shRNA2(具有蓝线的空心直方图)转导的分别用抗CXCR4-APC mAb或同型对照mAb(阴影直方图)染色的 MDA-MB-231细胞的代表性流式细胞测量术荧光直方图。(C)将细胞接种到没有BDMatrigelTM的trans-well的上室中以检查对CXCL12 的趋化性，将CXCL12添加到下室中达到200ng/ml的最终浓度。在10×放大率下计数在37℃下六小时后迁移的细胞。直方图各自提供了接种有用如直方图的底部所指示的CNTL-shRNA或ROR1-shRNA转染的MDA-MB-231细胞的三个室中的每一者中迁移的细胞的数目。结果是3个独立实验的代表。数据用平均值±SEM示出；*P<0.05， **P<0.01，***P<0.001，与CTRL-shRNA组相比较。
图49示出了使ROR1沉默调控EMT基因的表达。直方图，其指示了如每个直方图的底部所指示的多种基因的相对mRNA量，经由qRT-PCR在用CTRL-siRNA或ROR1-siRNA转染的MDA-MB-231(A)、HS578T(B)和BT549(C)的一式三份样品中检测。结果是2个独立实验的代表。数据用平均值±SEM示出；*P<0.05， **P<0.01，与CTRL-siRNA组相比较。
图50示出了使ROR1沉默实现在注射部位处原位异种移植的适度晚期生长抑制，但实现实验性肺转移的强抑制。(A)向RAG-/-γc-/- 小鼠皮下(s.c.)或静脉内(i.v.)注射CTRL-shRNA转染或ROR1-shRNA 转染的MDA-MB-231。将每只小鼠的经过注射的乳房脂肪垫中的原发性肿瘤或肺的生物发光光子通量针对在注射肿瘤之后第一次测量所检测的光子通量进行标准化(100代表了在初始测量当天检测的光子通量的100％)(顶图)。顶部三个图描绘了皮下注射1×106个(左侧)、 5×105个(中间)或2.5×105个(右侧)所指示的细胞的小鼠的乳房脂肪垫的标准化的生物发光光子通量。底图提供了静脉内注射1×106个 (左侧)、5×105个(中间)或2.5×105个(右侧)所指示的细胞的小鼠的肺的标准化的生物发光光子通量。(注意：底部左图描绘了静脉内注射1×106个所指示的细胞的小鼠的肺的实际平均生物发光光子通量。(B)直方图描绘了第21天(n＝5-8)用CTRL-shRNA转染(黑色)或ROR1-shRNA转染(灰色)的MDA-MB-231或没有用细胞(白色)静脉内注射的每个组的小鼠的肺重量指数。P值是通过单因子ANOVA来测定。(C)第21天代表来自每个组的小鼠的肺的H&E染色的切片。数据用平均值±SEM示出；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，与 CTRL-shRNA组相比较。
图51示出了实验性转移灶的免疫组织化学。向RAG-/-γc-/-小鼠静脉内(i.v.)注射5×105个CTRL-shRNA转染的MDA-MB-231(顶图) 或ROR1-shRNA转染的MDA-MB-231(底图)。(A)第21天从施以安乐死的动物制备肺的切片。用ROR1-shRNA转染的细胞注射的小鼠的肺具有很少的转移灶，鉴别这些转移灶用于免疫组织化学分析。用对Ki67+、CK-19或波形蛋白具有特异性的mAb或末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记(Tunnel)将切片染色(40×放大率)。(B)用对磷酸化AKT(左图)或磷酸化CREB(右图)具有特异性的mAb将(a)中的肺切片染色(40×放大率)。
图52示出了使ROR1沉默减少体内源自MDA-MB-231的细胞系 LM2-4175和BoM-1833的肺转移和骨转移。(A)示意图，其示出了 LM2-4175细胞优先转移到肺并且BoM-1833细胞优先转移到骨。流式细胞测量分析，其示出了LM2-4175和BoM-1833中的ROR1表达。小鼠动画从参考文献(Cancer Cell,2009；1；67-78)加以修改。(B-C)流式细胞测量分析，其示出了使用ROR1-shRNA2在LM2-4175和 BoM-1833中的ROR1沉默效率。(D)向小鼠各自静脉内注射2×105 个CTRL-shRNA转染或ROR1-shRNA转染的LM2-4175细胞。左侧，每个组的代表性生物发光图像；右侧，每个组的标准化的体内肺光子通量。(E)用2×105个所指示的LM2-4175细胞静脉内注射的小鼠的卡普兰-迈耶存活曲线(P<0.0001，通过对数秩检验)。(F)第21天每个组的肺重量指数(底部)。每个组的肺的代表性照片(顶部)。(G)第21 天每个组的离体肺GFP光子通量(底部)。每个组的骨的代表性照片(顶部)。(H)第21天肺的代表性的H&E染色的组织切片。(I)向小鼠各自心内注射1×105个CTRL-shRNA转染或ROR1-shRNA转染的 BoM-1833细胞。顶部，每个组的代表性生物发光图像；底部，每个组的标准化的体内骨光子通量。(J)第21天骨的代表性的骨离体光子通量和H&E染色的组织切片。(K)第21天肝的代表性的肝离体光子通量和H&E染色的组织切片。数据用平均值±SEM示出；*P<0.05， **P<0.01，***P<0.001，与CTRL-shRNA组相比较。
图53示出了使ROR1沉默抑制体外HS-578T和BT549的迁移。数据用平均值±SEM示出；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，与经过对照IgG处理的细胞相比较。
发明详述
本发明涉及使用抗ROR1抗体或其抗原结合片段、ROR1抗体免疫缀合物、ROR1肽疫苗或ROR1结合肽抑制转移的组合物和方法的开创性发现。
在描述本发明组合物和方法之前，应了解，本发明并不限于所描述的特定组合物、方法和实验条件，因为所述组合物、方法和条件可能有变化。还应了解，本文所用的术语仅为了描述特定实施方案的目的，并且不打算有限制性，这是因为本发明的范围将仅在随附权利要求书中受限制。
除非本文另有明确指示，否则如本说明书和随附权利要求书中所用的单数形式“一种(个)”和“这种(个)”包括复数参考物。因此，举例来说，提及“这种方法”包括本文所描述的类型的一种或多种方法和/或一个或多个步骤，其将在本领域的技术人员阅读本公开之后变得显而易见，等等。
除非另有规定，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的一般技术人员通常所理解的含义相同的含义。尽管类似或等效于本文所描述的那些的任何方法和材料可以用于实施或测试本发明，但现在描述优选的方法和材料。
ROR1
申请者先前已经发现了全长ROR1在众多癌细胞系和样品中表达，但不在其它组织中表达，包括非白血病患者或正常成年供体的血液或脾淋巴细胞，并且还产生针对全长人类ROR1的小鼠抗血清。 Fukuda等,Blood:ASH Annual Meeting Abstracts 2004 104,Abstract 772 (2004)(以全文引用的方式并入本文中)。ROR1的多肽和编码序列在别处已有报道并且也以引用的方式并入本文中(参看例如入藏号 NP_005003.1和NM_005012.1)。表达Wnt5a蛋白质的癌细胞(如CLL 细胞)不仅结合ROR1，而且具有作为结果所赋予的存活优势。本发明因此提供了利用ROR-1表达在癌细胞中的特异性来治疗或预防癌症的手段。
已经显示，ROR1表达增强对细胞凋亡的抗性并且促进癌细胞生长。如实施例中所示，ROR1的表达与胚胎发生和癌转移期间所发生的上皮-间质转化(EMT)相关联。ROR1的高水平表达与乳腺癌患者的提高的复发和转移速率相关联。使易转移的乳癌细胞系中的ROR1沉默减弱EMT相关蛋白质(例如波形蛋白、Snail-1/2和ZEB)的表达，增强上皮细胞角蛋白和紧密连接蛋白(例如CK-19和ZO-1)的表达，并且削弱其迁移/侵入能力和转移潜力。用D10(一种对ROR1具有特异性的mAb)处理MDA-MB-231下调波形蛋白(其与ROR1相关联)以抑制癌细胞迁移。将D10施用于植入有MDA-MB-231的免疫缺陷小鼠显著抑制肿瘤转移。
抗体
某些实施方案包含针对人类ROR1蛋白质的免疫肽。本文所描述的免疫球蛋白肽或抗体显示出结合到ROR1蛋白质。ROR1结合活性是特异性的；所观测的抗体与ROR1的结合实质上不受非特异性试剂阻断。这些ROR1特异性抗体可以用于区分ROR1细胞与正常细胞。ROR1特异性抗体还可以用于针对ROR1癌症的免疫疗法中，以测定在治疗ROR-1癌症之后的反应并且抑制转移。所述免疫肽可以用本领域中已知的多种手段来产生。
如本文所用的术语抗体涵盖所有类型的抗体和抗体片段，例如多克隆抗体、单克隆抗体以及通过噬菌体展示方法产生的那些。本发明的特别优选的抗体是对ROR1具有相对高度的亲和力的抗体。在某些实施方案中，抗体对ROR1展现出约Kd<10-8M的亲和力。
实质上纯化一般指的是基本上不含在非纯化(例如天然)状态或环境中抗体所缔合的其它细胞组分的组合物。纯化的抗体一般呈同质状态，不过其可以呈干燥状态或处于水溶液中。纯度和同质性通常使用分析化学技术来测定，如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法。
实质上纯化的ROR-1特异性抗体将通常包含在抗体与药物载体、赋形剂、佐剂、缓冲剂、吸收增强剂、稳定剂、防腐剂、佐剂或其它联合成分混合或配制之前存在于制剂中的所有大分子物质的80％以上。抗体更通常被纯化到代表存在于纯化的制剂中的所有蛋白质的 90％以上。在特定实施方案中，抗体被纯化到高于95％的纯度或可以是基本上同质的，其中其它大分子物质通过常规技术不可检测到。
免疫球蛋白肽包括例如多克隆抗体、单克隆抗体和抗体片段。以下描述了经由可以被本领域的技术人员用来制造功能上等效于实施例中所用的那些的具有类似亲和力和特异性的其它适合的免疫球蛋白肽的方法来产生免疫球蛋白肽，特别是ROR1抗体。
多克隆抗体
多克隆抗体可以由本领域的一般技术人员从多种温血动物容易地产生，这些温血动物如马、乳牛、各种家禽、兔、小鼠或大鼠。简单地说，利用ROR1抗原与如弗氏完全或不完全佐剂的佐剂一起经由腹膜内、肌肉内、眼内或皮下注射使动物免疫。在几次加强免疫之后，收集血清的样品并且测试与ROR1的反应性。特别优选的多克隆抗血清将在这些试验之一中产生比背景至少高三倍的信号。在动物的滴度在其与ROR1的反应性方面已经达到平稳状态后，可以通过每周放血或通过为动物抽血来容易地获得更大量的抗血清。
单克隆抗体
单克隆抗体(mAb)技术可以用于获得针对ROR1的mAb。简单地说，使用来自用人类ROR1抗原免疫的小鼠的脾细胞产生杂交瘤。例如使用Galfre,G.和Milstein,C.,MethodsEnzymol.,73:3-46(1981)的聚乙二醇融合方法将每只免疫的小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤Sp 2/0细胞融合。使用标准方法(Galfre,G.和Milstein,C.,Methods Enzymol., 73:3-46(1981))进行杂交瘤的生长、在HAT培养基中的选择、针对抗原的克隆体的克隆和筛选。
如Galfre,G.和Milstein,C.,Methods Enzymol.,73:3-46(1981)所描述，将HAT选择的克隆体注射到小鼠中以在腹水中产生大量的mAb，其可以使用蛋白质A柱色谱法(BioRad,Hercules,Calif.)来纯化。mAb 是基于其(a)对ROR-1的特异性、(b)高结合亲和力、(c)同型以及(d) 稳定性来选择。
可以使用多种标准技术中的任一者针对ROR1特异性来筛选或测试mAb，这些技术包括Western印迹法(Koren,E.等,Biochim. Biophys.Acta 876:91-100(1986))和酶联免疫吸附试验(ELISA)(Koren, E.等,Biochim.Biophys.Acta 876:91-100(1986))。
人源化抗体
可以通过重组DNA技术(参看例如Queen等,Proc.Natl.Acad.Sci. USA 86:10029-10033,1989和WO 90/07861，各自以引用的方式并入) 将非人类抗体的CDR区连接到人类恒定区来产生人源化形式的小鼠抗体。可以使用噬菌体展示方法(参看例如Dower等,WO 91/17271； McCafferty等,WO 92/01047)获得人类抗体。在这些方法中，产生噬菌体的文库，其中成员在其外表面上展示不同抗体。抗体通常以Fv 或Fab片段展示。可以通过亲和富集来选择展示具有所需特异性的抗体的噬菌体。
抗体片段
可能需要产生和使用mAb的功能片段用于特定应用。典型IgG 分子的熟知的基本结构是约150,000到200,000道尔顿的对称的四聚Y形分子，其由两条相同的轻多肽链(含有约220个氨基酸)和两条相同的重多肽链(含有约440个氨基酸)组成。重链经由至少一个二硫键彼此连接。每条轻链通过二硫键键联连接到相连的重链。抗原结合位点或结构域位于Y形抗体分子的每个臂中并且在每对二硫键键联的轻链和重链的氨基端区域之间形成。轻链和重链的这些氨基端区域由其开头约110个氨基端氨基酸组成并且被称为轻链和重链的可变区。
另外，在轻链和重链的可变区内存在高变区，其含有氨基酸序列的延伸段，被称为互补决定区(CDR)。CDR负责抗体对抗原分子上的一个特定位点(称为表位)的特异性。因此，典型IgG分子是二价的，这是在于其可以结合两个抗原分子，因为每个抗原结合位点能够结合每个抗原分子的特异性表位。轻链和重链的羧基端区域与其它抗体分子的那些区域类似或相同并且被称为恒定区。特定抗体的重链的恒定区的氨基酸序列界定了抗体的种类，例如IgG、IgD、IgE、IgA或IgM。一些种类的抗体含有呈多价抗原结合排列的两个或更多个彼此缔合的相同抗体。
结合ROR-1的mAb的Fab和F(ab')2片段可以用于替代全mAb。因为Fab和F(ab')2片段小于完整抗体分子，所以当使用全抗体分子时更多的抗原结合域是可用的。用木瓜蛋白酶对典型IgG分子进行蛋白水解切割据知产生两个独立的抗原结合片段(称为Fab片段)，其含有经由二硫键键联连接到相连的重链的氨基端部分的完整轻链。木瓜蛋白酶消化的免疫球蛋白分子的其余部分被称为Fc片段并且由抗体的保持完整并且经由二硫键连接在一起的羧基端部分组成。如果用胃蛋白酶消化抗体，那么就产生被称为F(ab')2片段的片段，其缺乏Fc区，但含有由相连的轻链和重链(作为Fab片段)之间的二硫键以及相连的重链的其余部分之间的二硫键键联保持在一起的两个抗原结合域 (Handbook of ExperimentalImmunology.第1卷:Immunochemistry, Weir,D.M.编,Blackwell ScientificPublications,Oxford(1986))。
已经开发了重组DNA方法，其允许产生和选择重组免疫球蛋白肽，这些肽是单链抗原结合多肽，被称为单链Fv片段(ScFv或ScFv 抗体)。此外，ScFv可以二聚产生双链抗体(diabody)。ScFv结合所关注的特异性表位并且可以使用多种基于重组噬菌体的方法中的任一者来产生，例如，如Lowman等(1991)Biochemistry,30,10832-10838； Clackson等(1991)Nature 352,624-628；以及Cwirla等(1990)Proc. Natl.Acad.Sci.USA 87,6378-6382中所描述。这些方法通常基于产生遗传上改变的丝状噬菌体，如重组M13或fd噬菌体，其在噬菌体粒子的表面上展示重组融合蛋白，这种重组融合蛋白含有抗原结合 ScFv抗体作为融合蛋白的氨基端区域和次要噬菌体外壳蛋白g3p作为融合蛋白的羧基端区域。可以使用熟知的噬菌体方法使所述重组噬菌体容易地生长并分离。此外，完整噬菌体粒子通常可以直接针对其表面上抗原结合ScFv的存在(展示)进行筛选，而没有必要分离ScFv 与噬菌体粒子。
为了产生ScFv，使用标准逆转录酶方案首先从分离自杂交瘤的 mRNA产生cDNA，这种杂交瘤产生靶向ROR1抗原的mAb。然后，可以通过标准聚合酶链反应(PCR)方法，使用一组用于小鼠免疫球蛋白重链和轻链可变区的引物来扩增编码mAb的重链和轻链的可变区的cDNA分子(Clackson(1991)Nature,352,624-628)。然后，用连接子寡核苷酸将编码mAb重链和轻链可变区的扩增的cDNA连接在一起以产生重组ScFv DNA分子。将ScFv DNA接合到丝状噬菌体质粒中，这种质粒经过设计以将扩增的cDNA序列融合到编码次要外壳蛋白(称为g3p)的噬菌体基因的5'区域中。然后用重组噬菌体质粒转化大肠杆菌(Escherichia coli)细菌细胞，并且使丝状噬菌体生长并收集。所需的重组噬菌体展示融合到次要外壳蛋白的氨基端区域的抗原结合域。然后，可以例如使用被称为“淘选(panning)”的方法使所述“展示噬菌体”在固定的抗原上通过，参看Parmley和Smith(1989)Adv. Exp.Med.Biol.251,215-218；Cwirla等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci. USA 87,6378-6382，以吸附含有能够结合抗原的ScFv抗体蛋白质的那些噬菌体粒子。然后，可以通过标准噬菌体感染方法扩增抗原结合噬菌体粒子，并且针对抗原结合能力再次选择扩增的重组噬菌体群体。所述连续轮次的针对抗原结合能力进行选择、继而扩增、在ScFv 中针对增强的抗原结合能力进行选择展示于重组噬菌体上。针对增加的抗原结合亲和力进行选择可以通过调整条件来完成，在这些条件下发生结合需要更严格的结合活性。
另一种针对增强的抗原结合活性进行选择的方法是改变编码 ScFv的结合域的cDNA内的核苷酸序列并且对重组噬菌体群体进行连续轮次的针对抗原结合活性的选择和扩增(参看Lowman等(1991) Biochemistry 30,10832-10838；以及Cwirla等(1990)Proc.Natl.Acad. Sci.USA 87,6378-6382)。
在选择ScFv后，可以使用与大肠杆菌菌株HB2151联合的适当载体产生游离形式的重组ROR1抗体。这些细菌实际上分泌可溶形式的ScFv，而不含噬菌体组分(Hoogenboom等(1991)Nucl.Acids Res. 19,4133-4137)。从HB2151细菌培养基中纯化可溶的ScFv可以通过亲和色谱法，使用固定于如AFFIGELTM(BioRad,Hercules,Calif.)的固体支撑物上的抗原分子来实现。
重组抗体技术的其它发展证明了进一步改进的可能性，例如通过 ScFv聚合成二聚体和四聚体而增加结合的亲合力(参看Holliger等 (1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90,6444-6448)。
因为ScFv是比Fab或F(ab')2片段甚至更小的分子，所以其在固定于固体支撑材料上时与使用全抗体、F(ab')2或Fab片段可能获得的结果相比可以用于获得每单位表面积甚至更高的抗原结合位点的密度。此外，重组抗体技术与杂交瘤相比提供更稳定的抗体遗传来源。重组抗体还可以使用标准噬菌体产生方法更快速而经济地产生。
本发明的抗体或其抗原结合片段、变异体或衍生物包括(但不限于)多克隆、单克隆、多特异性、人类、人源化、灵长类化或嵌合抗体、单链抗体、表位结合片段，例如Fab、Fab'和F(ab')2、Fd、Fv、单链Fv(scFv)、单链抗体、二硫键键联的Fv(sdFv)、包含VL或VH 结构域的片段、由Fab表达文库产生的片段，以及抗独特型(抗Id)抗体(包括例如针对本文所公开的ROR1抗体的抗Id抗体)。ScFv分子在本领域中是已知的并且描述于例如美国专利号5,892,019中。本发明的免疫球蛋白或抗体分子可以是免疫球蛋白分子的任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、种类(例如IgG1、IgG2、IgG3、 IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。针对人类ROR1的scFv的实例包括SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24。
抗体片段(包括单链抗体)可以包含单独的或与以下整体或一部分组合的可变区：铰链区、CH1、CH2和CH3结构域。本发明中还包括了抗原结合片段，其也包含可变区与铰链区、CH1、CH2和CH3 结构域的任何组合。本发明的抗体或其免疫特异性片段可以来自任何动物起源，包括鸟类和哺乳动物。优选地，抗体是人类、鼠类、驴、兔、山羊、天竺鼠、峰驼、无峰驼、马或鸡抗体。在另一个实施方案中，可变区可以起源于海洋生物(condricthoid)(例如来自鲨鱼)。如本文所用的“人类”抗体包括具有人类免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体并且包括从人类免疫球蛋白文库或从对于一种或多种人类免疫球蛋白是转基因的并且不会表达内源免疫球蛋白的动物分离的抗体，如下文和例如美国专利号5,939,598(Kucherlapati等)中所描述。
重组抗体产生
为了以重组方式产生本文所描述的抗体，将编码任选地连接到恒定区的轻链和重链可变区的核酸插入到表达载体中。可以在相同或不同的表达载体中克隆轻链和重链。举例来说，根据本发明可以使用 SEQ ID NO:1-5的重链和轻链。以全文引用的方式并入本文中的美国专利号6,287,569(Kipps等)的教义以及其中所提供的方法可以容易地被本领域的技术人员修改以产生本发明的疫苗。将编码抗体链的 DNA区段可操作地连接到确保抗体链的表达的表达载体中的控制序列。所述控制序列可以包括信号序列、启动子、增强子和转录终止序列。
表达载体通常在宿主生物体中作为游离体或作为宿主染色体的组成部分是可复制的。大肠杆菌是一种特别适用于表达本发明的抗体的原核宿主。适合于使用的其它微生物宿主包括芽孢杆菌，如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilus)，以及其它肠杆菌，如沙门氏菌(Salmonella)、沙雷氏菌(Serratia)和各种假单胞菌属(Pseudomonas species)。在这些原核宿主中也可以制造表达载体，其通常含有与宿主细胞相容的表达控制序列(例如复制起点)，以及调控序列，如乳糖启动子系统、色氨酸 (trp)启动子系统、β-内酰胺酶启动子系统或来自噬菌体λ的启动子系统。其它微生物(如酵母)也可以用于表达。酵母是优选的宿主，其中适合的载体具有表达控制序列，如启动子，包括3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶，以及复制起点、终止序列等等(必要时)。哺乳动物组织细胞培养物也可以用于表达并产生本发明的抗体(参看例如 Winnacker,From Genes to Clones VCH Publishers,N.Y.,1987)。真核细胞是优选的，因为已经开发了许多能够分泌完整抗体的适合宿主细胞系。用于表达编码本发明的免疫球蛋白的核酸的优选的适合宿主细胞包括：由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾系；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞(CHO)；小鼠塞尔托利细胞(sertoli cell)；猴肾细胞(CV1，ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL 1587)；人子宫颈癌细胞(HELA， ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法罗大鼠肝细胞(buffalo rat liver cell)(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138， ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；以及TRI细胞。
可以将含有所关注的多核苷酸序列(例如，重链和轻链编码序列以及表达控制序列)的载体转移到宿主细胞中。氯化钙转染通常用于原核细胞，而磷酸钙处理或电穿孔可以用于其它细胞宿主(参看例如 Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,第2版,1989)。当在独立的表达载体上克隆重链和轻链时，将载体共转染以获得完整免疫球蛋白的表达和组装。在引入重组 DNA之后，表达免疫球蛋白产物的细胞系是所选细胞。能够稳定表达的细胞系是优选的(即，在细胞系五十次传代之后表达水平没有降低)。
在表达后，本发明的全抗体、其二聚体、个别的轻链和重链或其它免疫球蛋白形式可以根据本领域的标准程序来纯化，包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱色谱法、凝胶电泳等等(参看例如Scopes,Protein Purification,Springer-Verlag,N.Y.,1982)。具有至少约90％到95％的同质性的实质上纯的免疫球蛋白是优选的，并且98％到99％或更高的同质性是最优选的。
多重特异性抗体、抗体免疫缀合物和融合分子
本发明的ROR1抗体或其抗原结合片段、变异体或衍生物可以是“多特异性的”，例如双特异性的、三特异性的或具有更高的多特异性，这意味着其同时识别并结合到存在于一个或多个不同抗原(例如蛋白质)上的两个或更多个不同表位。因此，ROR1抗体是“单特异性的”还是“多特异性的”，例如“双特异性的”，指的是与结合多肽反应的不同表位的数目。多特异性抗体可以对本文所描述的目标多肽的不同表位具有特异性，或可以对目标多肽以及对异源表位(如异源多肽或固体支撑材料)具有特异性。
如本文所用的术语“效价”指的是存在于ROR1抗体、结合多肽或抗体中的潜在结合域(例如抗原结合域)的数目。每个结合域特异性地结合一个表位。当ROR1抗体、结合多肽或抗体包含一个以上结合域时，每个结合域可以特异性地结合相同表位，对于具有两个结构域的抗体来说，被称为“二价单特异性”；或结合到不同表位，对于具有两个结构域的抗体来说，被称为“二价双特异性”。抗体还可以是双特异性的并且对于每种特异性是二价的(被称为“双特异性四价抗体”)。在另一个实施方案中，可以制造四价微型抗体(minibodies)或结构域缺失的抗体。
双特异性二价抗体和其制造方法描述于例如美国专利号 5,731,168、5,807,706、5,821,333以及美国申请公布号2003/020734和 2002/0155537中，其所有的公开内容以引用的方式并入本文中。双特异性四价抗体和其制造方法描述于例如WO 02/096948和WO 00/44788中，这两者的公开内容以引用的方式并入本文中。一般参看 PCT公布WO 93/17715、WO92/08802、WO 91/00360、WO 92/05793； Tutt等,J.Immunol.147:60-69(1991)；美国专利号4,474,893、 4,714,681、4,925,648、5,573,920、5,601,819；Kostelny等,J.Immunol. 148:1547-1553(1992)。
本发明包括多特异性ROR1抗体。举例来说，双特异性抗体包含两个scFv抗体片段，这两者都结合ROR1。scFv抗体片段可以结合 ROR1上的相同或不同表位。另举一例，多特异性抗体可以是双链抗体，其结合到具有选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:39或SEQ ID NO:42组成的组的重链可变区，以及选自由SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:41或SEQ ID NO:45组成的组的轻链可变区的抗体的表位。
本发明进一步延伸到融合蛋白。融合蛋白是嵌合分子，其包含例如具有至少一个靶向结合位点的免疫球蛋白抗原结合域，以及至少一个异源部分，即，在自然界中天然地不连接的部分。氨基酸序列通常可以存在于独立的蛋白质中，这些蛋白质在融合多肽中集合在一起；或其通常可以存在于同一蛋白质中，但在融合多肽中置于新的排列中。融合蛋白可以例如通过化学合成，或通过产生并翻译以所需的关系编码肽区域的多核苷酸来产生。
本发明的ROR1抗体或其抗原结合片段、变异体或衍生物可以进一步以重组方式融合到异源多肽的N端或C端，或以化学方式缀合(包括共价和非共价缀合)到多肽或其它组合物。举例来说，ROR1特异性抗体可以以重组方式融合或缀合到适用作检测试验中的标记的分子和效应分子，如异源多肽、药物、放射性核素或毒素。参看例如 PCT公布WO 92/08495、WO 91/14438、WO 89/12624；美国专利号 5,314,995；以及EP 396,387。本发明的放射性标记的ROR1抗体将特别适用，而抗体药物缀合物(ADC)仍然有待开发。
本发明的ROR1抗体或其抗原结合片段、变异体或衍生物包括经过修饰的衍生物，即，通过任何类型的分子与抗体共价连接以使得共价连接不会阻止抗体结合ROR1。举例来说，但不作为限制，抗体衍生物包括已经过修饰的抗体，例如，通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、磷酰化、酰胺化、由已知保护基/阻断基衍生处理、蛋白水解切割、连接到细胞配体或其它蛋白质，等等。众多化学修饰中的任一者可以通过已知技术来进行，包括(但不限于)特异性化学切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成，等等。另外，衍生物可以含有一个或多个非经典氨基酸。
本发明的ROR1抗体或其抗原结合片段、变异体或衍生物可以由用肽键或经修饰的肽键(即，肽等排体(peptide isosteres))彼此连接的氨基酸组成，并且可以含有除了20个基因编码的氨基酸以外的氨基酸。 ROR1特异性抗体可以通过天然过程(如翻译后加工)，或通过本领域中熟知的化学修饰技术来修饰。所述修饰充分描述于基本文本中和更详细的专题论文中，以及长篇研究文献中。修饰可以在ROR1特异性抗体中的任何地方发生，包括肽骨架、氨基酸侧链和氨基端或羧基端，或在如碳水化合物的部分上。应了解，相同类型的修饰可以在给定的 ROR1特异性抗体中的几个位点处以相同或不同的程度存在。
本发明还提供了融合蛋白，其包含ROR1抗体或其抗原结合片段、变异体或衍生物，以及异源多肽。与抗体融合的异源多肽可以适用于发挥功能，或适用于靶向ROR1多肽表达细胞。在一个实施方案中，本发明的融合蛋白包含多肽，其具有本发明抗体的VH区中的任何一者或多者的氨基酸序列或本发明抗体或其片段或变异体的VL区中的任何一者或多者的氨基酸序列，以及异源多肽序列。
在另一个实施方案中，用于本文所公开的治疗方法中的融合蛋白包含多肽，其具有ROR1特异性抗体或其片段、变异体或衍生物的选自由SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28和SEQID NO:29组成的组的 VH-CDR中的任何一者、两者、三者的氨基酸序列或ROR1特异性抗体或其片段、变异体或衍生物的选自由SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31 和SEQ ID NO:32组成的组的VL-CDR中的任何一者、两者、三者的氨基酸序列，以及异源多肽序列。在一个实施方案中，融合蛋白包含多肽，其具有本发明的ROR1特异性抗体或其片段、衍生物或变异体的VH-CDR3的氨基酸序列，以及异源多肽序列，这种融合蛋白特异性地结合到ROR1的至少一个表位。在另一个实施方案中，融合蛋白包含多肽，其具有本发明的ROR1特异性抗体的至少一个VH区的氨基酸序列和本发明的ROR1特异性抗体或其片段、衍生物或变异体的至少一个VL区的氨基酸序列，以及异源多肽序列。优选地，融合蛋白的VH和VL区对应于特异性地结合ROR1的至少一个表位的单一来源的抗体(或scFv或Fab片段)。在另一个实施方案中，用于本文所公开的诊断和治疗方法中的融合蛋白包含多肽，其具有ROR1特异性抗体的VH CDR中的任何一者、两者、三者或更多者的氨基酸序列和ROR1特异性抗体或其片段或变异体的VL CDR中的任何一者、两者、三者或更多者的氨基酸序列，以及异源多肽序列。优选地， VH-CDR或VL-CDR中的两者、三者、四者、五者、六者或更多者对应于本发明的单一来源的抗体(或scFv或Fab片段)。本发明还涵盖了编码这些融合蛋白的核酸分子。
融合蛋白可以使用本领域中熟知的方法来制备(参看例如美国专利号5,116,964和5,225,538)。可以凭经验选择进行融合的确切位点以使融合蛋白的分泌或结合特征最佳化。然后将编码融合蛋白的DNA 转染到宿主细胞中以供表达。
本发明提供了一种特别优选的抗人ROR1抗体；即，具有与抗体 99961相同的结合特异性的分离的抗ROR1抗体。在一个方面，抗体结合到与ROR1的CRD结构域相连的Ig样结构域。在另一个方面，抗体结合到hROR1的氨基酸42-160。在另一个方面，抗体结合到ROR-1的氨基酸130-160。在另一个方面，抗体需要在hROR1的位置138处存在谷氨酸以供结合。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种分离的抗ROR1抗体，其包含选自由SEQID.NO:1、SEQ ID.NO:5、SEQ ID.NO:9、SEQ ID. NO:13和SEQ ID.NO:17组成的组的重链可变区，以及选自由SEQ ID. NO:3、SEQ ID.NO:7、SEQ ID.NO:11、SEQ ID.NO:15和SEQ ID. NO:19组成的组的轻链可变区。在一个方面，抗体的重链可变区是 SEQ ID NO:5并且轻链可变区是SEQ ID NO:7。
在一个实施方案中，本发明提供了一种分离的抗人ROR1抗体，其包含选自由SEQID.NO:27、SEQ ID.NO:28、SEQ ID.NO:29、SEQ ID.NO:33、SEQ ID NO:34和SEQ ID.NO:35组成的组的包含CDR1、 CDR2和CDR3的重链可变区，以及选自由SEQ ID.NO:30、SEQ ID. NO:31、SEQ ID.NO:32、SEQ ID.NO:36、SEQ ID NO:37和SEQ ID. NO:38组成的组的包含CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区。在一个方面，包含CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区由SEQ ID.NO:27、 SEQ ID.NO:28和SEQ ID.NO:29组成，并且包含CDR1、CDR2和 CDR3的轻链可变区选自由SEQ ID.NO:30、SEQ ID.NO:31和SEQ ID. NO:32组成的组。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种抗人ROR1抗体，其具有高于41nM的结合亲和力。在一个方面，抗体的结合亲和力介于约 500pM与约6nM之间。在一个方面，抗体的结合亲和力为约800pM。
在另一个方面，抗体抑制转移。在另一个方面，抗体内化并抑制细胞迁移。在另一个方面，抗体内化并下调波形蛋白、snail1/2或ZEB。在另一个方面，抗体是人类、人源化或嵌合的。在一个方面，抗体是 99961、99961.1、99961.2、99961.3或99961.4。在一个优选方面，抗体是99961.1。
本发明的一个实施方案提供了一种药物制剂，其包含针对ROR1 的抗体和药学上可接受的载体。在另一个实施方案中，本发明提供了一种分离的核酸，其编码针对ROR1的抗体。在另一个实施方案中，本发明提供了一种表达载体，其包含根据编码针对ROR1的抗体的核酸的核酸。在另一个实施方案中，本发明提供了一种宿主细胞，其包含编码针对ROR1的抗体的核酸。在另一个实施方案中，本发明提供了一种产生抗ROR1抗体的方法，其包括在用以产生抗体的条件下培养宿主细胞。在一个方面，产生抗体的方法进一步包括回收这种抗体。
如实施例中所示，抗ROR1抗体D10抑制小鼠和人类CLL植入，可以引导补体依赖性细胞毒性，诱导白血病负荷的显著降低，并且阻断乳癌细胞向肺和骨的转移。
D10已经显示具有生物活性，而其它已知的抗ROR1抗体(例如 4A5和K19)并不展现出生物活性，尽管4A5对ROR1具有显著更高的结合亲和力。抗体4A5已经显示结合到与D10不同的表位。还显示了，在癌症是ROR+的癌症患者的子组中产生针对ROR1的抗血清。患者的另一个子组制得抑制Wnt5a活性的抗体，由此得出并非所有 ROR1抗体都具有生物活性的结论。
如实施例中进一步描述，进行表位定位以确定D10和4A5的表位。这些研究确定了D10结合到与ROR1上的CRD相连的Ig样结构域的C端的表位。4A5的表位也被定位于Ig样结构域，但更接近这个结构域的氨基端。这些发现已经得出以下结论：结合到与D10相同的表位的抗体将抑制ROR1生物活性，而在别处结合的抗体可能不会这样。
如实施例中所示，使用D10表位选择高亲和力的重组抗体来得到高亲和力抗体，即，99961。所选抗体之一，99961，相比D10对 ROR1具有显著更高的结合亲和力。99961抗体具有比D10高50倍的结合亲和力，即，800pM对比41nM。另外，使99961人源化，产生四种不同抗体。实验确认了99961具有与D10相同的表位。实验确认了这个表位在正常的造血干细胞和祖细胞中不会表达。此外，99961 不与正常成体组织交叉反应。这种抗体还展示出针对CLL细胞的活性、在ROR+原发性AML中的活性以及诱导ROR1内化。
疫苗
另外，本发明提供了一种用于治疗或预防受试者的癌症或抑制转移的疫苗，其由分离的或合成产生的ROR1结合肽的药学上可接受的组合物组成。本发明还提供了一种ROR1结合肽，其与D10的ROR-1 结合区具有至少95％序列同一性。在另一个方面，本发明提供了一种 ROR1结合肽，其与D10的结合区具有至少95％、96％、97％、98％、 99％或100％序列同一性。在一个方面，D10的结合区是 VATNGKEVVSSTGVLFVKFGPC。在另一个方面，D10的结合区是 EVVSSTGVLFVKFGPC。在一个方面，D10的结合区是至少22个氨基酸。在另一个方面，D10的结合区是至少10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19、20、21或22个氨基酸。
本发明还提供了ROR1结合肽疫苗对抗涉及ROR1的表达的疾病的用途，这些疾病如淋巴瘤，例如CLL。因为正常成体组织似乎不会表达ROR-1，所以ROR-1代表了在主动免疫疗法中可以靶向的肿瘤特异性抗原。举例来说，通过向患者施用治疗有效量的ROR1结合肽疫苗可以下调ROR1的水平，这种疫苗在动物中产生针对ROR1的保护性或治疗性免疫反应以及对其表达的影响。疫苗可以包括肽。使用所述肽的方法包括在疫苗中使用以及用于产生针对ROR1的抗体。 ROR1结合肽还可以包括免疫佐剂。免疫佐剂可以是缀合到结合肽的免疫原性载体部分。在一个方面，免疫原性载体部分是肽。用于疫苗的适合载体的实例进一步包含免疫原性佐剂。在另一个方面，佐剂是缀合到结合肽的免疫原性载体部分。免疫原性载体部分可以是载体肽，如钥孔戚血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、卵白蛋白、氢氧化铝或其它药学上可接受的免疫佐剂。药学上可接受的免疫佐剂的实例可以在Methods inMolecular Medicine,第42卷:Vaccine adjuvants: Preparation,Methods and ResearchProtocols；D.T.O'Hagan编；Humana Press Inc.,Totowa NJ and European Agency forthe Evaluation of Medicinal Products,Committee for Proprietary MedicinalProducts, Guidelines on Adjuvants in Vaccines,London 2004中找到。通常，疫苗组合物还将包括药学上可接受的载体或稀释剂。
在一个实施方案中，本发明提供了一种针对ROR-1表达细胞的疫苗，这种疫苗包含分离的或合成产生的肽的药学上可接受的组合物，这种肽具有与抗体D10的ROR-1结合区具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在疫苗的一个方面，抗体D10的ROR-1结合区的氨基酸序列是VATNGKEVVSSTGVLFVKFGPC。在疫苗的另一个方面，抗体D10的ROR-1结合区的氨基酸序列是EVVSSTGVLFVKFG PC。在另一个方面，ROR1表达细胞是癌细胞。在另一个方面，癌细胞是来自B细胞白血病、淋巴瘤、CLL、AML、B-ALL、T-ALL、卵巢癌、结肠癌、肺癌、皮肤癌、胰脏癌、睾丸癌、膀胱癌、子宫癌、前列腺癌或肾上腺癌。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种疫苗，其包含具有与VATNGKEVVSSTGVLFVKFGPC具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的ROR1结合肽和药学上可接受的载体。在一个方面，这种肽是哺乳动物的。在另一个方面，这种肽是嵌合的和/或具有人类、小鼠、大鼠、猪、牛、灵长类动物、猫、犬、兔、山羊、鸡或熊起源。在另一个方面，疫苗进一步包含免疫原性佐剂。在另一个方面，佐剂是缀合到结合肽的免疫原性载体肽。在一个方面，结合肽的氨基酸序列是 VATNGKEVVSSTGVLFVKFGPC。在另一个方面，免疫原性载体肽是钥孔戚血蓝蛋白(KLH)。疫苗进一步包含免疫原性佐剂。在另一个方面，佐剂是缀合到结合肽的免疫原性载体部分。在一个方面，结合肽的氨基酸序列是VATNGKEVVSSTGVLFVKFGPC。免疫原性载体部分可以是载体肽，如钥孔戚血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、卵白蛋白、氢氧化铝或其它药学上可接受的免疫佐剂。药学上可接受的免疫佐剂的实例可以在Methods in Molecular Medicine,第42卷: Vaccine adjuvants:Preparation,Methodsand Research Protocols；D.T. O'Hagan编；Humana Press Inc.,Totowa NJ andEuropean Agency for the Evaluation of Medicinal Products,Committee forProprietary Medicinal Products,Guidelines on Adjuvants in Vaccines,London2004中找到。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种疫苗，其包含具有与 EVVSSTGVLFVKFGPC具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的 ROR1结合肽和药学上可接受的载体。在一个方面，这种肽是哺乳动物的。在另一个方面，这种肽是嵌合的和/或具有人类、小鼠、大鼠、猪、牛、灵长类动物、猫、犬、兔、山羊、鸡或熊起源。在另一个方面，疫苗进一步包含免疫原性佐剂。在另一个方面，佐剂是缀合到结合肽的免疫原性载体肽。在一个方面，结合肽的氨基酸序列是 EVVSSTGVLFVKFGPC。免疫原性载体部分可以是载体肽，如钥孔戚血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、卵白蛋白、氢氧化铝或其它药学上可接受的免疫佐剂。药学上可接受的免疫佐剂的实例可以在 Methods in Molecular Medicine,第42卷:Vaccine adjuvants:Preparation, Methods and Research Protocols；D.T.O'Hagan编；Humana Press Inc.,Totowa NJ and European Agency for the Evaluation of Medicinal Products,Committee for Proprietary Medicinal Products,Guidelines on Adjuvants inVaccines,London 2004中找到。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种包含疫苗的药物制剂，这种疫苗包含具有与VATNGKEVVSSTGVLFVKFGPC具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的ROR1结合肽和药学上可接受的载体。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种包含疫苗的药物制剂，这种疫苗包含具有与EVVSSTGVLFVKFGPC具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的ROR1结合肽和药学上可接受的载体。
如实施例中所示，开发了如图18中所示的肽疫苗。基于ROR1 抗体D10、4A5和K19的表位使用三种肽。用三种肽使动物免疫。所有三种肽都诱导ROR1抗血清的产生。结果证明，用R22肽免疫产生最高的抗体滴度。如实施例中所指示，ROR1抗血清结合到ROR1，降低白血病负荷，诱导ROR1内化，介导补体依赖性细胞毒性，抑制乳癌细胞迁移并且抑制ROR+白血病细胞的植入。因此，本发明提供了一种使患者对ROR1免疫以允许诱导抗体抑制ROR+癌细胞迁移和转移的能力的方法。
ROR1结合肽
在一个实施方案中，本发明提供了一种ROR1结合肽，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26。在一个方面，这种肽具有与VATNGKEVVSSTGVLFVKFGPC具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在另一个方面，这种肽具有与 EVVSSTGVLFVKFGPC具有至少95％序列同一性的氨基酸肽序列。在另一个方面，结合肽是哺乳动物的。在另一个方面，结合肽是嵌合的和/或具有人类、小鼠、大鼠、猪、牛、灵长类动物、猫、犬、兔、山羊、鸡或熊起源。
在一个实施方案中，本发明提供了一种药物制剂，其包含有包含选自由以下组成的组的氨基酸序列的ROR1结合肽：SEQ ID NO:25 和SEQ ID NO:26，以及药学上可接受的载体。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种分离的核酸，其编码包含SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26的氨基酸序列的ROR1结合肽。在另一个实施方案中，本发明提供了一种包含核酸的表达载体，这种核酸编码包含SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26的氨基酸序列的ROR1结合肽。在另一个实施方案中，本发明提供了一种包含核酸的宿主细胞，这种核酸编码包含SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26的氨基酸序列的ROR1结合肽。在另一个实施方案中，本发明提供了一种产生肽的方法，其包括在用以产生包含SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26的氨基酸序列的ROR1结合肽的条件下培养编码这种结合肽的宿主细胞。在一个方面，用以产生肽的方法进一步包括回收结合肽。
抑制转移
在一个实施方案中，本发明提供了一种抑制ROR-1表达癌的转移的方法，这种方法包括通过施用具有单克隆抗体99961的结合特异性的抗体、包含具有与抗体D10的ROR-1结合区具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的肽的疫苗、具有与VATNGKEVVSSTGVLFVKFGPC具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的ROR-1结合肽或具有与EVVSSTGVLFVKFGPC具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的ROR-1结合肽来破坏肿瘤细胞的上皮-间质转化。在一个方面，R OR-1表达癌是B细胞白血病、淋巴瘤、CLL、AML、B-ALL、T-AL L、卵巢癌、结肠癌、肺癌、皮肤癌、胰脏癌、睾丸癌、膀胱癌、子宫癌、前列腺癌或肾上腺癌。
实施例提供了以下证据：ROR1抗体、结合肽和疫苗具有抑制 ROR+癌细胞迁移或转移的能力。
治疗
如本文所用的术语“治疗(treat/treatment)”指的是治疗性治疗与预防性或预防性措施，其中目的在于预防或减缓(减轻)不合需要的生理变化或病症，如癌症的发展或扩散。有益或所需的临床结果包括(但不限于)症状的减轻、疾病程度的减弱、疾病的稳定(即，不恶化)状态、疾病进展的延迟或减缓、疾病病况的改善或缓和，以及缓解(部分或完全的)，无论是可检测的还是不可检测的。“治疗”还可以意味着与没有接受治疗的预期存活期相比延长存活期。需要治疗者包括已经患有病状或病症者以及倾向于患有病状或病症者或有待预防病状或病症者。
如本文所用的术语“癌症”或“癌细胞”或“ROR1表达癌”或“ROR1 表达癌细胞”指的是所有赘生性细胞生长和增殖，无论是恶性还是良性的，包括所有转化的细胞和组织以及所有癌性细胞和组织。癌症包括(但不限于)赘生物，无论是良性还是恶性的，其位于：前列腺、结肠、腹部、骨、乳房、消化系统、肝、胰脏、腹膜、内分泌腺(肾上腺、甲状旁腺、垂体、睾丸、卵巢、胸腺、甲状腺)、眼睛、头和颈、神经(中枢和周围)、淋巴系统、骨盆、皮肤、软组织、脾、胸和泌尿生殖道。在某些实施方案中，所述赘生物表达、过度表达或异常表达 ROR1。
癌症还包括(但不限于)B细胞白血病、淋巴瘤、CLL、AML、 B-ALL、T-ALL、卵巢癌、结肠癌、肺癌、皮肤癌、胰脏癌、睾丸癌、膀胱癌、子宫癌、前列腺癌和肾上腺癌。
本文所描述的抗ROR1抗体、ROR1结合肽和ROR1疫苗可以用于在受试者中治疗或预防ROR1癌症或抑制ROR1癌细胞的转移。
抗体
在某些治疗性实施方案中，所选抗体通常将为抗ROR1抗体，其可以单独或与一种或多种组合治疗剂组合施用，或缀合到一种或多种组合治疗剂。当本文所描述的抗体作为治疗剂单独施用时，其可以在受试者中通过多种机制发挥有益作用。在某些实施方案中，特异性地结合hROR-1的单克隆抗体经过纯化并且施用于患者以中和hROR-1 的一种或多种形式，阻断hROR-1的一种或多种活性，或阻断或抑制 hROR-1的一种或多种形式与另一种生物分子的相互作用。
本发明的免疫治疗性试剂可以包括人源化抗体，并且可以与额外的活性或惰性成分(例如在常规的药学上可接受的载体或稀释剂中，例如免疫原性佐剂)组合并且任选地与助剂或组合活性剂(如抗肿瘤药)组合用于治疗用途。
在其它实施方案中，本文所描述的治疗性抗体与组合治疗剂协同施用，与组合治疗剂共同配制，或偶合到(例如共价键合)组合治疗剂，例如放射性核素、分化诱导剂、药物或毒素。可以采用多种已知的放射性核素，包括90Y、123I、125I、131I、186Re、188Re和211At。用于所述组合治疗制剂和方法中的适用药物包括甲氨蝶呤(methotrexate)以及嘧啶和嘌呤类似物。适合的分化诱导剂包括佛波醇酯(phorbol ester) 和丁酸。适合的毒素包括篦麻毒素、相思豆毒素、白喉毒素(diptheria toxin)、霍乱毒素、白树毒素(gelonin)、假单胞菌外毒素、志贺毒素 (Shigella toxin)和美洲商陆抗病毒蛋白。这些组合治疗剂可以直接或间接(例如经由连接基团)偶合到抗ROR1抗体。药剂与抗体之间的直接反应在每一者具有能够与另一者反应的取代基时是可能发生的。举例来说，一者上的亲核基团(如氨基或巯基)能够与另一者上的含羰基基团(如酸酐或酰基卤)或含烷基的良好的离去基团(例如卤化物)反应。或者，可能需要经由作为间隔基的连接基团偶合组合治疗剂与抗体以使抗体与组合治疗剂隔开一段距离，从而避免干扰结合能力。连接基团还可以用来增加药剂或抗体上的取代基的化学反应性，并且因此增加偶合效率。本领域的技术人员将进一步显而易见的是，多种双功能或多功能试剂(同功能与异功能的)(例如Pierce Chemical Co., Rockford,Ill.的目录中所描述的那些)可以用作连接基团。偶合可以例如经由氨基、羧基、巯基或氧化的碳水化合物残基来实现。
还可能需要将一种以上药剂偶合到抗ROR1抗体。在一个实施方案中，将药剂的多个分子偶合到一个抗体分子。在另一个实施方案中，可以将一种以上类型的药剂偶合到一种抗体。与特定实施方案无关，具有一种以上药剂的免疫缀合物可以按多种方式制备。举例来说，可以将一种以上药剂直接偶合到抗体分子，或可以使用提供多个连接位点的连接基。或者，可以使用载体。
可以使用多种用于抗体和免疫缀合物的施用途径。通常，施用是静脉内、肌肉内或皮下。
将显而易见的是，抗体/免疫缀合物的精确剂量将取决于以下因素而变化：如所使用的抗体、抗原密度和抗体的清除速率。抗ROR1 药剂的安全而有效的量是例如将在患者中产生所需治疗作用，同时使不合需要的副作用减到最小的量。一般来说，治疗有效量是足以促进一种或多种细胞因子产生和/或引起补体介导的细胞毒性或抗体依赖性细胞毒性的量。给药方案将由熟练的临床医师基于以下因素来决定：如正在治疗的病状的确切性质、病状的严重性、患者的年龄和一般身体状况，等等。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种治疗或预防受试者的癌症的方法，这种方法包括向这个受试者施用具有单克隆抗体99961的结合特异性的抗体、包含具有与抗体D10的ROR-1结合区具有至少 95％序列同一性的氨基酸序列的肽的疫苗、具有与VATNGKEVVSSTGVLFVKFGPC具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的ROR-1结合肽或具有与EVVSSTGVLFVKFGPC具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的ROR-1结合肽。在一个方面，癌症是B 细胞白血病、淋巴瘤、CLL、AML、B-ALL、T-ALL、卵巢癌、结肠癌、肺癌、皮肤癌、胰脏癌、睾丸癌、膀胱癌、子宫癌、前列腺癌或肾上腺癌。
通过靶向ROR1抑制转移。
赘生性细胞从其原始部位向身体的远端区域扩散是造成90％的癌症相关死亡的原因。转移过程包括原发性肿瘤细胞向远端器官的物理易位以及随后定植。一些不良预后的基因标签表明一些原发性肿瘤中的细胞易发生转移。然而，对转移的分子和细胞决定因素的理解是有限的，并且由此肿瘤细胞经历这个事件的过程在很大程度上是未知的。最近已经集中关注于被称为上皮-间质转化(EMT)的细胞生物程序，其现在被认为显著地将肿瘤进展、运动性获取、侵入性、转移和自我更新性状纳入在内。
EMT向赘生性上皮细胞赋予完成侵入-转移级联的大多数步骤所需的生物性状。在正常发育与癌症转移中，EMT似乎受上皮细胞从其微环境接收的情境信号调控。通过使用胚胎形态发生和创口愈合中所涉及的多个路径，癌细胞可以伴随地获取能够侵入和转移的属性。
界定在疗法之后可以导致癌症转移或复发的癌症干细胞(CSC)的工作已经鉴别出与各种肿瘤内的CSC的一个或多个亚群相关的多种性状。这些研究中的一些已经发现了EMT中细胞的表型特征的获取可以诱导非CSC进入到类CSC状态中。因此，已经可能经历EMT 的转移性癌细胞可以展现出CSC表型并且获取侵入特性，这些特性促进在循环中存活、外渗到远端器官中、血管生成以及在转移部位处不受控的生长。
如实施例中进一步详述，ROR1在癌细胞中的高水平表达与复发和/或转移疾病的较高速率相关联。实施例1中所描述的乳腺癌患者中ROR1表达和沉默的作用说明了实施本发明来抑制转移。如所示，使易转移的乳癌细胞系中的ROR1表达沉默在体外和体内逆转与EMT相关的表型特征并且削弱迁移、侵入和转移。此外，对ROR1 具有特异性的本发明抗体抑制异种移植到免疫缺陷小鼠中的人类乳癌细胞的转移。这些研究鉴别出先前未知的乳癌转移路径并且验证 ROR1作为癌症治疗的有前景的靶点。低ROR1表达水平与较长的无转移存活期相关联，并且更重要地，用抗ROR1抗体治疗性靶向ROR1 可以抑制乳癌转移发展。
转移是癌细胞从其原发位置向身体的其它部分扩散。在癌症变成转移性的之后，其无法有效地通过手术或放射线疗法治疗。此外，癌症患者的死亡率的主要原因是转移。受体酪氨酸激酶(RTK)据知在许多细胞过程中起关键作用，这些过程包括分化、增殖、迁移、血管生成和存活。尽管已经发现ROR2有助于黑素瘤和前列腺癌细胞转移，但在侵袭性与非侵袭性乳癌细胞系之间的ROR2表达不存在显著差异。然而，ROR1的表达与侵袭性乳癌细胞系具有强相关性。
虽然本发明不受关于其作用机制的理论所限制，但值得注意的是，ROR1使编码乳癌转移中所牵涉的蛋白质的基因活化，这些蛋白如Snail-1、Snail-2、TCF8/ZEB、CK-19、波形蛋白、CXCR4。最近报道了AKT与转移的功能有关，包括EMT、对细胞凋亡的抗性和血管生成。如实施例中所展示，ROR1上调AKT活性并且使 MDA-MB-231细胞暴露于抗ROR1抗体D10降低p-AKT活性。这些资料表明，抑制ROR1调控的AKT活化可能是D10发挥其抗肿瘤作用的一种机制。
特别关于乳癌转移，使用基因表达标签发现，ROR1在原发性乳房肿瘤中的表达与乳癌转移相关联，包括骨、肺和脑转移。在所分析的582个病例当中，复发率与ROR1低的组中的37％相比在ROR1 高的组中是55％。重要地，这种复发率在ROR1第75-第100组中增加到63％。ROR1表达还与临床上侵袭性的乳癌肿瘤标志物强相关，包括ER-、PR-和Her2-。尽管基于乳癌的T分期在组之间不存在统计上显著的差异，但ROR1高的患者的百分比在T1和T4分期中分别从 51％增加到77％。器官特异性转移(乳癌转移到肺或骨)通过根据本发明的ROR1敲除显著受抑制。这些资料表明，ROR1可以调控某些肺和骨特异性基因，如CXCR4。
人类趋化因子由结合到19种不同的G蛋白偶合趋化因子受体的 48种配体的超家族组成。已经假设，转移性肿瘤细胞可以‘拦截’趋化因子受体介导的细胞迁移通路。乳癌肿瘤细胞表达所选的趋化因子受体，包括CXCR4。根据本发明抑制CXCL12-CXCR4轴可以阻断细胞系MDA-MB 231向肺的体内转移。ROR1沉默的MDA-MB-231细胞与亲本MDA-MB-231或用CTRL-shRNA转染的MDA-MB-231相比具有更低的CXCR4表达。
使用基因表达分析发现，ROR1的表达还与肺(图1B)、骨(图1C) 和脑(图1D)转移相关联。基于风险比分析，ROR1被确定为比ER、 PR和HER2甚至更好的总体、骨和肺转移预测因子。基于乳癌患者的总体复发率(由ER和ROR1状态引起的总体复发)，ROR1也可以是转移相关的预测基因。尽管在无转移存活期的早期在ER+与ER-病例之间存在一些差异，但只有ROR1低和ROR1高的病例在无转移存活期的后期才具有显著差异。因此，本发明提供了一种抑制转移并改进患者存活期的路径。
一般来说，所施用的ROR1抗体、ROR1抗体组分、结合肽疫苗组合物、其免疫缀合物和融合蛋白的剂量将取决于以下因素而变化：如患者的年龄、体重、身高、性别、一般医学状况和先前医学病史。通常需要提供具有一定剂量的抗体组分、疫苗、免疫缀合物或融合蛋白的容器，这种剂量在约1ng/kg到20mg/kg(药剂量/患者体重)的范围内，不过根据特定情况也可以施用更低或更高的剂量。
抗体、抗体组分、疫苗、免疫缀合物或融合蛋白向患者的施用可以是静脉内、动脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、胸膜内、鞘内、通过经区域导管灌注或通过直接病灶内注射。当通过注射施用治疗性蛋白质、肽或缀合物时，施用可以通过持续输注或通过单次或多次推注。
本领域的技术人员意识到，静脉内注射提供了一种有用的施用模式，这是归因于循环在快速分布抗体方面的彻底性。然而，静脉内施用受到血管屏障的限制，这种血管屏障包含血管结构的内皮细胞和内皮下基质。血管屏障仍然是治疗性抗体被实体肿瘤吸收的更值得注意的问题。淋巴瘤具有相对高的血流速率，从而促成有效的抗体递送。淋巴管内施用途径，如皮下或肌肉内注射或通过淋巴管插管，也提供了一种治疗淋巴瘤的有用手段。
优选地，ROR1抗体、结合肽、其免疫缀合物和融合蛋白以低蛋白质剂量施用，如20到3000毫克蛋白质/剂量，肠道外给予一次或重复给予。或者，施用的剂量是100到300毫克蛋白质/剂量或300 到1000毫克蛋白质/剂量、1000到2000毫克蛋白质/剂量。
本发明还涵盖了ROR1抗体组分经过放射性标记或补充有放射性标记的免疫缀合物或融合蛋白施用的治疗方法。在一种变型中， ROR1抗体作为低剂量的放射性标记的ROR1抗体或片段施用或与其一起施用。作为一个替代方案，ROR1抗体可以与低剂量的放射性标记的ROR1-细胞因子免疫缀合物一起施用。本领域的一般技术人员将熟悉药学上可接受的放射性标记分子和其适当剂量水平。为作参考，考虑“低剂量”的131I标记的免疫缀合物，其中优选的剂量在15到40 mCi的范围内，而最优选的范围是20到30mCi。相比之下，90Y标记的免疫缀合物的优选剂量在10到30mCi的范围内，而最优选的范围是10到20mCi。
以下实施例中进一步说明了本发明的所有方面。然而，这些实施例并不限制随附权利要求书所界定的本发明的范围。
实施例1
ROR1与乳腺癌的早期转移复发相关联
询问从582名患者的组合组群中的患者分离的乳癌细胞的GEO 数据库中的转录组数据。约三分之二(582名中的426名)的这些病例在手术的时候在区域淋巴结中并没有可检测到的癌症并且不施用佐剂疗法。其余的病例在区域淋巴结中患有可检测到的疾病并且接受佐剂激素疗法和/或化学疗法。在582个病例当中，46％复发(n＝270)，并且具有22.1个月的中位无转移存活时间。我们基于ROR1的相对癌细胞表达将患者分成三个组。具有上三分之一水平的ROR1mRNA 表达(ROR1H)的肿瘤患者相比具有ROR1的下三分之一水平(ROR1L) 或中间水平(ROR1M)表达的肿瘤患者具有显著更短的无转移存活期(p <0.0001；图1A)。检查器官部位的无转移存活期。发现患有ROR1H 肿瘤的患者相比患有ROR1L或ROR1M乳癌的患者具有更高的向肺(p ＝0.002；图45A)、骨(p＝0.004；图45B)或脑(p＝0.04；图45C)的转移速率。ROR1H癌症相比具有ROR1L或ROR1M的癌症具有显著更低比例的具有良好预后特征(例如雌激素/孕酮受体或HER2)的肿瘤。
ROR1的高水平表达还充当了预测较短的无转移存活期的独立因素。不论ER、PR或HER2状态如何，患有ROR1H肿瘤的患者相比患有ROR1L/M肿瘤的患者具有更高的转移速率、更早复发以及更差的存活期(图46)。此外，询问乳癌中EMT基因标签的GSE2034、 GSE2603、GSE5327和GSE12276阵列数据揭示，ROR1L肿瘤相比 ROR1H肿瘤具有与上皮细胞相关的基因的显著更高的表达水平，这些基因如CDH1(编码E-钙粘蛋白)、TJP1(编码ZO1)和TJP3(编码ZO3)，但具有与间质细胞相关的基因的更低表达水平，这些基因如SNAI1 (编码Snail-1)、SNAI2(编码Snail-2)、CDH2(编码N-钙粘蛋白)或VIM (编码波形蛋白)(图1B)。
实施例2
ROR1+乳癌细胞系
检查十四种不同的乳癌上皮细胞系的ROR1表达，包括六种基底型乳癌细胞系和八种管腔型乳癌细胞系。基底型乳癌细胞系中ROR1 的表达水平相对于一般不表达ROR1的管腔型乳癌细胞系显著更高。此外，ROR1的相对表达水平与侵袭性肿瘤表型(如三阴性ERNegPRNegHER2/NeuNeg)以及体外的高水平迁移和侵入能力相关联。
使用靶向两个不同ROR1序列中的任一者的短发夹RNA(shRNA) 在高侵入性的基底型乳癌细胞系(例如MDA-MB-231)中使ROR1沉默。ROR1蛋白质的表达在用ROR1-shRNA1或ROR1-shRNA2转染的细胞中受抑制，这与用对照shRNA(CTRL-shRNA)转染的细胞成对比(图47A)。询问用CTRL-shRNA或ROR1-shRNA(GEO入藏号： GSE31631)转染的MDA-MB-231之间的基因表达差异的阵列数据揭示，ROR1沉默的细胞相比亲本MDA-MB-231或用CTRL-shRNA转染的MDA-MB-231具有KRT19(编码CK19)的更高表达水平、CXCR4 和VIM的更低表达水平。这些发现是通过qRT-PCR来确认(图47B、图48A)。流式细胞测量分析也展示了CXCR4的细胞表面表达在ROR1沉默的细胞中更低(图48B)。
为了评估ROR1在调控EMT中的潜在作用，我们检查了用 CTRL-shRNA或ROR1-shRNA处理的细胞中的EMT相关标志物。在三种不同的基底型乳癌细胞系(MDA-MB-231、HS-578T或BT549)中的任一者中用ROR1-siRNA或ROR1-shRNA1/2抑制ROR1的表达削弱其mRNA和/或与EMT相关的编码蛋白质(例如波形蛋白、 SNAIL-1/2和ZEB1)的表达。相反地，使ROR1沉默增加mRNA和编码的上皮细胞角蛋白(例如CK-19)的表达。尽管在所检查的3种细胞系中的任一者中编码ZO-1的TJP1mRNA不存在显著变化，但ROR1 沉默的细胞具有这种紧密连接蛋白的更高表达水平，表明ZO-1可能在转录后控制下(图1C-D和图49)。最后，转染ROR1阴性MCF7细胞以表达ROR1减少了上皮蛋白质(例如E-钙粘蛋白和CK19)的表达，并且增加了EMT转录因子(如SNAIL1/2)的表达(图1E)。
在培养物中，MDA-MB-231、HS-578T或BT549细胞通常已经展现出星状形态，其类似于体外间质细胞的形态。然而，在用ROR1 -shRNA转染之后，这些细胞呈现更像球形的形态，其类似于上皮细胞的形态(图2A)。用CTRL-shRNA转染这些细胞不会诱导所述变化。此外，免疫荧光染色揭示，用ROR1-shRNA转染诱导MDA-MB-231 细胞表达适度水平的E-钙粘蛋白和更高水平的CK-19，但降低波形蛋白的表达(图2B)。对于HS-578T或BT549细胞也观测到类似的结果。另一方面，与未处理的细胞或用对照载体转染的细胞相比，RO R1阴性MCF7细胞显现出与间质细胞的形态相似性，并且当经过转染以表达ROR1时具有减少的上皮标志物(例如CK19和E-钙粘蛋白) 表达和增加的间质标志物(如波形蛋白)表达。此外，ROR1沉默的细胞与用CTRL-shRNA处理的细胞相比具有更低的迁移/侵入能力(图2 E和F)。还发现，朝向CXCL12的趋化性在ROR1沉默的细胞中显著降低(图48)。使用用ROR1-shRNA1或ROR1-shRNA2沉默的细胞获得几乎相同的结果。总体来说，这些结果指示，ROR1的表达可以促成EMT和肿瘤转移。
实施例3
使ROR1沉默抑制原位肺转移
细胞培养
乳癌细胞系MDA-MB-231、HS-578T、BT549、MDA-MB-415、 MDA-MB-435、MDA-MB-436、MDA-MB-157、MDA-MB-134、MCF7、 BT-474、MDA-MB-453、SKBR3、MDA-MB-330和BT-483获自美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection；ATCC)并且如先前所描述(Neve等Cancer Cell,10:515(2006))来维持。
ROR1敲除
如先前所描述(Zhang,S.等,Cancer Cell,16:67(2009))，通过靶向序列5'-TCCGGA TTG GAA TTC CCA TG-3'(shRNA1)和5'-CTT TAC TAG GAG ACG CCA ATA-3'(shRNA2)来实现ROR1的敲除。通过靶向序列5'-AGC GGA CTA AGT CCA TTG C-3'来产生非特异性shRNA 对照。根据制造商的说明书，使用VirapowerTM慢病毒表达系统 (Invitrogen)来表达shRNA。ROR1-shRNA1和CTRL-shRNA1构建体还编码红色荧光蛋白(RFP)。合成(IntegratedDNA Technologies)ROR1-shRNA1和CTRL-shRNA1构建体的寡核苷酸，并且将其插入到RFP-pLKO.1载体中。ROR1-shRNA2和CTRL-shRNA2 构建体购自Open Biosystems(Rockford,IL)。通过转染293-FT包装细胞系来获得用于感染乳癌细胞系的病毒粒子，并且在转染后48和72小时从细胞上清液中收集。过滤上清液并且以43,000×g离心来浓缩病毒粒子，其用于在5μg/ml聚凝胺存在下感染亚汇合培养物过夜。
转染后二十四小时，用2μg/ml嘌呤霉素选择细胞。通过流式细胞测量术，使用抗ROR1mAb(4A5)分选敲除细胞。稳定表达shRNA1 或shRNA2的分选细胞分别被指定为ROR1-shRNA1或 ROR1-shRNA2。将在没有进行亚克隆的情况下细胞分选之后在第10 代获得的敲除细胞的汇集群体注射到rag-/-γ-/-小鼠中用于体内实验。通过定量PCR，使用逆转录(qRT-PCR)Sybr绿色基因表达试验 (Applied Biosystems)或western免疫印迹分析(抗ROR1抗体，S4102， Cell Signaling)来确认ROR1的敲除效率。β2-微球蛋白和肌动蛋白分别用作qRT-PCR和western印迹法的内源对照。
Trans-well迁移和侵入试验
在补充有0.2％胎牛血清(FBS)而没有生长因子的达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco's modified Eagle's medium)中调节癌细胞过夜。次日，对细胞进行胰蛋白酶处理，并且使其再悬浮于没有生长因子的 0.2％FBS DMEM培养基中。将肿瘤细胞以每孔25,000个细胞的密度接种于trans-well插入物(3μM孔径，BD Falcon)中用于迁移试验，或以每孔50,000个细胞的密度接种于基质胶(matrigel)涂布的、生长因子减少的侵入室(8μM孔径，BD Biosciences)中。用磷酸盐缓冲盐水 (PBS)洗涤孔，并且在6小时后用4％多聚甲醛固定用于迁移试验或在 22小时后用4％多聚甲醛固定用于侵入试验。通过刮擦来去除每个插入物的顶面上的细胞。将已经迁移到膜的基底面的细胞染色，并且用 Nikon倒置显微镜来观察。
分析mRNA和蛋白质表达
使用RNeasy试剂盒(Qiagen)纯化总RNA，并且2μg的每个样品用于使用高容量cDNA逆转录试剂盒(ABI)来产生cDNA。一式三份使用ABI 7500快速实时PCR系统(AppliedBiosystem)分析每个 cDNA。通过免疫印迹分析，使用含有蛋白酶抑制剂(Roche)的溶解缓冲液(20mM HEPES(pH 7.9)、25％甘油、0.5N NaCl、1mM EDTA、 1％NP-40、0.5mM二硫苏糖醇和0.1％脱氢胆酸盐)中的细胞溶解产物(40-60μg)，使用抗ROR1(Cell Signaling)和抗β-肌动蛋白抗体(Cell Signaling)来评估蛋白质表达水平。
流式细胞测量术
将乳癌细胞染色或通过流式细胞测量术进行汇集物分选。洗涤细胞，并且使其再悬浮于含2％牛血清白蛋白(BSA)(Sigma)的PBS溶液中并且加以染色用于根据制造商的方案使用Alex488缀合的抗体(克隆体4A5或克隆体D10)或Alex488缀合的IgG2b或IgG2a同型对照进行ROR1表达。使用FACSCalibur细胞计数器(BD Biosciences)收集流式细胞测量术的数据并且使用FlowJo软件分析。
免疫荧光和免疫组织化学分析
用4％多聚甲醛固定小鼠肺，并且将其包埋于石蜡中或在OCT中冷冻用于组织病理学检查。制备组织切片(5μm厚)，并且用苏木精和曙红(hematoxylin&eosin；H&E)或p-AKT(Ser473，D9E，Cell Signaling)、p-Creb(Ser133，87G3，Cell Signaling)、CK-19(RCK108，Dako)或波形蛋白(D21H3，Cell Signaling)一级抗体染色。使用Delta Vision显微镜收集图像并且用SPOT软件处理。
分析转移
向雌性Rag-/-γ-/-小鼠注射：亲本MDA-MB-231ROR1-shRNA1 细胞的汇集物(第1组)，和亲本MDA-MB-231的对照shRNA细胞(第 2组)。在100μl PBS中经由侧尾静脉静脉内注射细胞(对于第1-2组， 5×105个；对于第3-4组，2×105个)或在100μl PBS中通过心内注射施用细胞(对于第5-6组，1×105个)。每周用IVIS 200成像系统进行非侵入性生物发光成像。在注射后3-4周对先前尚未死亡或看似病态的所有小鼠施以安乐死，并且移出其肺并固定于10％福尔马林中。
为了研究ROR1对乳房垫异种移植物的体内转移的影响，在八周大的雌性Rag-/-γ-/-小鼠中通过将100μl单细胞悬浮液(1×106个活细胞/小鼠)皮下注射到右腹部乳腺的第二脂肪垫区域中来诱发乳癌肿瘤。每隔3天测量肿瘤大小。当肿瘤体积达到300mm3时去除肿瘤。为了研究抗ROR1单克隆抗体在乳癌转移中的治疗作用，在八周大的雌性Rag-/-γ-/-小鼠中经由静脉内注射100μl单细胞悬浮液(5×105个细胞/小鼠)来诱发乳癌肿瘤。每周静脉内注射小鼠IgG或抗ROR1 mAb。每周进行非侵入性生物发光成像。在建立异种移植物之后五周，将小鼠处死，并且移出肺并固定于10％福尔马林中。
Oncomine基因表达数据分析
编译来自Pubmed GEO数据库(GEO2603、GSE5327、GSE2034 和GSE12276)的582名患者的微阵列数据集。用log2转换这些数据集，并且将每个微阵列集中到所有探针的中央。对于每名患者来说，无转移存活期被定义为在手术与诊断出转移之间的时间间隔。通过已发布的基因表达数据集的Oncomine癌症微阵列数据库分析(www.oncomine.org)来确定人类组织中ROR1mRNA表达的相对水平。将数据进行log2转换，其中中值设定为0并且标准偏差设定为1。
统计分析。使用对数秩检验进行卡普兰-迈耶曲线之间的比较。将数据呈现为平均值±平均值的标准误差(SEM)。除非另有指示，否则使用未配对司徒顿氏t检验来比较两个组。p<0.05被视为统计上显著的。
通过多变量分析，使用Cox比例风险回归模型来分析ROR1在预测无转移存活期中的表现。报道了每个协变量的风险比和其95％置信区间。基于正态分布来计算P值，从而评估虚假设(风险比＝1，即，没有预后意义)为真的概率。
将CTRL-shRNA转染的转移潜力与在原位模型中使用荧光素酶 /GFP表达载体稳定转染的ROR1-shRNA转染的MDA-MB-231细胞相比较(图3A)。将2.5-10×105个细胞注射到免疫缺陷RAG-/-γc-/-小鼠的皮下乳腺脂肪垫中在注射部位处产生可以经由生物发光而监测的原发性肿瘤。如先前研究中所指出，我们直到注射至少1×106个细胞之后3周或3周以上才观测到通过注射CTRL-shRNA转染对比 ROR1-shRNA转染的细胞而产生的肿瘤的生物发光的渐进式增加的显著差异。为了检查‘自发’癌症转移速率的差异，通过注射1×106个细胞而产生的原发性肿瘤当其达到300mm3的体积(虚线，图3B) 时用手术去除。由于生长速率不同，因此从细胞注射到手术去除原发性肿瘤的中位天数对于用ROR1沉默的细胞注射的小鼠(40±2.5天) 显著高于接受相等数目的CTRL-shRNA转染的细胞的小鼠(31±0.5 天)(图3B)。摘除的原发性肿瘤具有类似的体积、重量和离体生物发光(图3，C到E)。在去除原发性肿瘤之后，我们经由生物发光来监测转移性疾病。用CTRL-shRNA转染的细胞注射的动物在原发性肿瘤切除的时候与用ROR1沉默的细胞植入的小鼠在较晚的时候当其已经切除了原发性肿瘤时相比在肺或肝中具有显著更高的生物发光(图 3，E和F)。用ROR1沉默的细胞注射的动物相对于用CTRL-shRNA 转染的细胞注射的小鼠具有更少的肺生物发光的可检测增加(图3G)。在切除原发性肿瘤之后21天将动物处死以检查肺(图3，H到J)和肝 (图3，K和L)的离体生物发光、大小和组织学。用CTRL-shRNA转染的细胞注射的小鼠的摘除的肺和肝相比用ROR1沉默的细胞注射的小鼠具有显著更高的生物发光和重量。此外，用CTRL-shRNA转染的细胞注射的小鼠的肺和肝普遍具有广泛转移性疾病，这在用 ROR1沉默的细胞注射的小鼠的组织中没有观测到(图3，J和L)。
实施例4
使ROR1沉默抑制实验性肺和骨转移
将ROR1-shRNA或CTRL-shRNA转染的MDA-MB-231细胞经由静脉内(5×105个细胞)或心内(1×105个细胞)注射施用于6周大的 Rag-/-γ-/-小鼠以评估注射到静脉或动脉血中的细胞的转移潜力。在侧尾静脉中接受CTRL-shRNA转染的细胞的所有动物在注射32天内因肺转移而死亡。具有相等数目的注射到尾静脉中的ROR1-shRNA转染的细胞的动物存活显著更长时间(图4A)。用CTRL-shRNA转染的细胞注射的动物相比用ROR1沉默的细胞注射的小鼠分别在第21天或第28天在肺中具有高19倍或60倍的生物发光(图4B)。我们也在另一个实验中在多个时间将动物处死以检查肺的转移性疾病。尽管在注射CTRL-shRNA转染的细胞之后3天容易地检测到新生转移灶，但在用ROR1沉默的细胞注射的动物的肺中甚至在更晚的时间点只可以检测到极少(如果有的话)的转移灶(图4C-E)。此外，从用 CTRL-shRNA转染的细胞注射的小鼠摘除的肺相比用ROR1沉默的细胞注射的小鼠的肺具有显著更高的离体生物发光和中位重量(第21 天和第28天分别是3倍和6倍)(图4F-G，数据未示出)。在用 CTRL-shRNA转染的细胞注射的动物中发展的转移灶相比我们在用 ROR1沉默的细胞注射的小鼠中检测到的极少转移灶还表达更高水平的磷酸化AKT和磷酸化CREB并且具有更大比例的增殖细胞，而这些极少转移灶替代地表达更高水平的CK-19和更低水平的波形蛋白 (图47)。
我们还检查了在将1×105个细胞注射到左心室中之后的转移性疾病。接受CTRL-shRNA转染的细胞的所有小鼠在这次注射的30天内死亡，而用ROR1沉默的细胞注射的动物存活显著更长时间(图 4H)。用CTRL-shRNA转染的细胞注射的小鼠显现出大量的股骨/骨盆区生物发光，这在用ROR1沉默的肿瘤细胞注射的小鼠中检测不到 (图4，I和J)。我们在第21天将动物处死，并且发现用CTRL-shRNA 转染的细胞注射的小鼠的分离的股骨/骨盆骨由于广泛的骨髓转移(图 4L)而具有高的生物发光(图4K)，这在用ROR1沉默的细胞注射的小鼠中并不明显。
最近的研究已经发现，不同的组织部位对于循环癌细胞建立转移施加了不同的要求。从MDA-MB-231中选择人类乳癌细胞系 BoM1833和LM2-4175以具有不同的组织嗜性。BoM-1833优先转移到骨，并且LM2-4175优先转移到肺。我们发现，这些细胞系中的每一者都保留ROR1的表达(图5A)。用ROR1-shRNA2转染每个细胞系使ROR1的表达沉默(图5B和C)，从而允许我们检查在静脉内注射2 ×105个LM2-4175或心内注射1×105个BoM-1833到6周大的RAG-/-γc-/-小鼠中之后器官特异性转移的ROR1依赖性。用ROR1沉默的LM2-4175注射的小鼠相比用CTRL-shRNA转染的LM2-4175注射的小鼠具有显著更低的肺生物发光的中位增加和显著更长的中位存活期(图5D和E)。与这些观测结果一致，在注射ROR1沉默的 LM2-4175之后21天分离的小鼠的肺相比用CTRL-shRNA转染的 LM2-4175注射的小鼠具有显著更低的中位重量、离体生物发光以及更少和更小的转移灶(图5F到H)。类似地，用ROR1沉默的BoM-1833 注射的小鼠相比用相等数目的CTRL-shRNA转染的BoM-1833注射的小鼠具有显著更低的骨骼生物发光的增加(图5I和J)。此外，在心内注射之后21天处死的动物的尸体剖检揭示在骨或肝中具有极少(如果有的话)可检测的转移灶。这与在用CTRL-shRNA转染的BoM-1833注射的动物中在这些部位中的每一者处检测到的广泛转移性疾病成鲜明对比(图5J和K)。
实施例5
抗ROR1抗体抑制癌症转移
产生对ROR1的胞外域具有特异性的单克隆抗体(mAb)，并且被指定为D10的一者可以在37℃下诱导表面ROR1的快速下调(图5A)。如经由共聚焦显微分析来评估，用D10处理MDA-MB-231促使ROR1 内化(图5B)。如经由流式细胞测量术，使用对ROR1的不同的非交叉阻断表位具有特异性的不同mAb来评估，这使得表面ROR1显著减少(图5C)。用D10处理MDA-MB-231还降低细胞质波形蛋白的表达 (图5D)，这种波形蛋白在共免疫沉淀研究中结合到ROR1(图5E)。用D10处理还显著抑制体外MDA-MB-231的迁移和侵入能力(图5F 和G)。D10还可以抑制其它ROR1+癌细胞系(例如HS-578T和BT549 (图9))的迁移/侵入能力。
评估D10对注射到RAG-/-γc-/-小鼠的尾静脉中的MDA-MB-231 的侵入和转移的抑制。在注射5×105个细胞之后，向小鼠静脉内注射5mg/kg的对照IgG或D10，然后在3天后处死。来自给予D10的动物的肺的离体生物发光显著低于用对照IgG处理的动物(图5H)。此外，接受对照IgG的动物的肺具有多个转移灶，这些转移灶在用D10 处理的小鼠中不可检测到。在另一个实验中，每只小鼠接受5×105个MDA-MB-231的静脉内注射，然后给予5mg/kg的对照IgG或D10 的3次每周静脉内注射。用D10处理的小鼠相比给予对照IgG的小鼠显现出显著更少的肺生物发光(图5，I和J)。当第35天处死时，用 D10处理的小鼠的肺相比给予对照IgG的动物的肺具有显著更轻的重量(图5K)和更少的转移灶(图5L)。总体来说，这些资料指示，D10 可以抑制免疫缺陷小鼠中的转移。
总之，借此证明了ROR1可以介导乳癌转移并且ROR1的治疗性靶向可以延迟乳癌转移的发展。尽管胚胎干细胞表达可检测的ROR1 蛋白质并且ROR1的损失可以增强ROR2缺陷小鼠中的心脏和骨骼异常，但主要成体组织除了在胰脏和脂肪组织中低水平表达之外很少表达ROR1蛋白质，从而提供了具有ROR1癌症特异性的本发明的抗体和其使用方法。
实施例6
ROR1高亲和力抗体
对上文所描述的ROR1抗体D10进行表位研究。产生一系列具有人类和小鼠ROR1的延伸段的嵌合蛋白质以定位由D10识别的表位，D10可以下调ROR1，实现波形蛋白表达的降低，并且抑制体外癌细胞迁移(癌症形成转移的能力的良好替代性标志物)。所涉及的 ROR1的唯一区域是在ROR1的氨基端的Ig样结构域。每个构建体含有嵌合Ig样结构域以及人类CRD和三环结构域(小鼠部分是亮的，人类部分是暗的)。这里只示出了Ig样结构域(图6)。这些构建体在自由型293细胞中表达。培养基用于免疫印迹法并且纯化的蛋白质用于 ELISA。因为D10mAb抗ROR1识别人类ROR1，但不识别小鼠ROR1，所以这些构建体中哪些可以或不可以结合的发现可以帮助定位由识别D10的表位。结果指示，抗体D10在与CRD结构域相连的Ig样结构域的C端结合到ROR1(图7)。图8示出了ROR1抗体4A5的表位的定位。如所指示，4A5表位不同于D10表位。
如上文所描述，抗ROR1抗体(即，D10)可以抑制体内 MDA-MB-231细胞的肺转移。D10单克隆抗体促进ROR1受体内化(图 9A、B)。在冰上用同型Alex647或D10-Alex647将MDA-MB-231细胞染色30分钟。然后将染色的细胞分成两个部分。一个部分在冰上保持1小时并且将其它部分转移到37℃下保持15分钟、30分钟。抗 ROR1抗体D10处理二十四小时降低MDA-MB-231细胞中的ROR1 表面表达(图9C)。ROR1与乳癌MDA-MB-231细胞中的波形蛋白形成复合物(图9D)。体外D10抗体处理可以降低波形蛋白表达(图9E)。抗ROR1抗体减少体外乳癌迁移(图9F)。D10单克隆抗体抑制 MDA-MB-231乳癌早期(第2天)肺转移(图9G)。D10单克隆抗体抑制 MDA-MB-231乳癌肺转移(图9H)。第1天向异种移植小鼠静脉内(i.v.) 注射200mg抗ROR1抗体，并且第3天、第7天、第14天和第21 天注射100mg抗ROR1抗体。示出了来自带有MDA-MB-231的小鼠的肺的标准化的光子通量。用5E5MDA-MB-231细胞注射的代表性小鼠以背卧位示出(图9I)。抗ROR1抗体处理减轻带有MDA-MB-231 的小鼠的肺重量(图9J)。在抗ROR1抗体处理之后来自带有 MDA-MB-231的小鼠的代表性肺H&E组织学(图9K)。误差条指示了 SEM；*p<0.05，**p<0.01；基于未配对双侧司徒顿氏t检验。
图6中所描绘的构建体用于选择高亲和力的重组抗体。天然 Western法还指示了所有三种人源化D10样mAb都靶向与D10相同的表位，并且需要氨基酸138用于结合到人类ROR1(图10)。将人类和嵌合ROR1-ex构建体转染到293细胞中。这允许产生重组人类-小鼠嵌合ROR1蛋白质，其可以在非变性PAGE凝胶或SDS PAGE凝胶中按大小分离用于使用不同的抗ROR1mAb进行免疫印迹分析。结果指示，D10与99961抗体都结合到Ig样结构域的C端的相同区域，并且D10和99961在变性条件与天然条件下都可以结合到ROR1。全人胞外域提供于任一凝胶的最左边的泳道上(图11)。抗体99961对ROR1的结合亲和力比D10高50倍并且比D10减少更多的白血病负荷(图12)。使99961抗体人源化以产生四种抗体，被指定为99961.1、99961.2、99961.3和99961.4。
表征ROR1抗体99961
进行试验以展示针对CLL细胞的99961在人类脐带血重建的免疫缺陷小鼠中的特异性活性。向用人类脐带血(CB)细胞重建以发展人类免疫系统的Rag-/-γ-/-小鼠腹膜内(i.p.)注射新鲜或冷冻的CLL PBMC。次日，向小鼠静脉内给予1mg/kg的99961或D10或对照mIgG。七天后，收集来自腹膜腔的CLL PBMC细胞并且通过流式细胞测量术分析(图13A)。资料指示，99961消除>90％的CLL细胞并且对正常人类B或T细胞发育没有影响(图13B、C)。
还进行研究以展示99961在ROR+原发性AML中的特异性活性。结果指示，99961降低原发集落的存活率和继发集落的自我更新能力 (图14)。
99961mAb的表位定位展示，这个表位仅在多种癌症上表达，并且不在来源于胎肝的脐带血细胞或成年人类细胞和祖细胞或干细胞上表达(图15)。还显示，99961结合到白血病细胞，但不与正常成体组织交叉反应(图16)。具有来自40个淋巴瘤的切片的来自Lifescan Biosciences(LS-SLYCA5)的淋巴瘤多组织阵列具有5个病例，其中 Ab9991结合到恶性细胞。具有来自多个不同正常组织的切片的来自 Biomax(FDA999)的正常多组织阵列显示没有与99961结合的特异性区域。使用来自DAKO(Carpenteria,CA)的高pH缓冲液进行热诱导的抗原修复，接下来使用生物素基酪胺放大(来自DAKO的CSA试剂盒)增强来进行免疫组织化学。
使用静脉内注射到Rag-/-γ-/-小鼠中的1mg/小鼠抗体进行99961 的PK研究。在不同时间点抽出血液，并且通过ELISA测量血浆中 99961mAb的水平。结果指示，抗体半衰期为11.4天，体积为1.18mL (47mL/kg)，并且清除率为0.072毫升/天(0.12mL/h/kg)，全部与其它大分子和临床上利用的抗体一致(图17)。
实施例7
ROR1肽疫苗
如上文所讨论，已经显示，D10在与ROR1的CRD结构域相连的Ig样结构域的羧基端结合。抗体4A5结合到Ig样结构域中的不同表位并且缺乏生物活性。mAb的表位是通过嵌合ROR1-ex以及人类与小鼠ROR1之间的不同氨基酸的位点突变来确认。构建对应于D10、 4A5和其它ROR1抗体结合的ROR1的胞外域的肽A19、R22和K19。 A19肽对应于由4A5mAb识别的表位；R22肽对应于由D10mAb、 99961mAb(即，VATNGKEVVSSTGVLFVKFGPC)和人源化99961 mAb识别的表位；并且K19肽对应于三环结构域中由对ROR1具有特异性的其它mAb识别的区域(图18)。三种肽各自在C端与钥孔戚血蓝蛋白(KLH)缀合用于在佐剂完全弗氏佐剂(CFA)或不完全弗氏佐剂(IFA)中免疫。将半胱氨酸(C)添加到C端并且用于使用MBS缀合到KLH(图20)。缀合反应描绘于图19中。示出了缀合的肽结合到 D10和99961(图21)。用缀合的肽使C57BL/6和转基因小鼠免疫。在免疫后4周收集抗体滴度。R22-KLH疫苗在C57BL/6小鼠或ROR1-Tg 小鼠中诱导抗ROR1抗血清的最高滴度(图28)。用D10表位的16氨基酸肽(也诱导与人类ROR1蛋白质反应的抗体的R16)重复这个实验，不过滴度一般低于由R22-KLH诱导的滴度(数据未示出)。
由R22-KLH疫苗诱导的抗ROR1抗体显示结合到存在于EW36、 JeKo-1或CLL细胞上的表面ROR1(图29)。对于这个研究来说，在4℃下将来自用R22-KLH免疫的小鼠的抗血清的稀释液与这些细胞一起孵育20分钟。然后洗涤细胞，然后用与荧光色素缀合的山羊抗小鼠Ig标记以通过流式细胞测量术进行检测。空心直方图是在没有首先将细胞与R22-KLH抗血清一起孵育的情况下用山羊抗小鼠Ig染色的细胞。阴影直方图是首先与抗R22-KLH抗血清一起孵育的细胞的荧光。细胞荧光的增大是归因于结合到表面的小鼠抗ROR1抗体，然后用山羊抗小鼠Ig检测这些抗体。这些小鼠的免疫前抗血清或用KLH免疫的小鼠的抗血清不会结合到这些细胞(图29)。
测试R22-KLH诱导的抗血清的补体依赖性细胞毒性。洗涤 EW36、Jeko-1、CLL-1和CLL-2细胞，并且将25μl以每孔5×105个细胞涂于圆底96孔板(Corning Costar)中的RPMI/10％FBS中。每孔添加经过稀释的抗血清(25μl)和25μl幼兔补体的1:5稀释液。D10mAb 用作阳性对照。所有条件都一式三份进行。将板在37℃下孵育4小时，并且通过DiOC6/PI染色和流式细胞测量分析立即定量细胞的生存力。这个研究指示，针对R22肽产生的D10或抗血清可以引导带有人类ROR1的细胞的补体介导的溶解(图30)。不带有ROR1的细胞不会被杀死。
检查由R22-KLH诱导的抗体的Ig亚类。为此，我们使用了使用涂布有人类ROR1的板的ELISA，然后将这些板与经过稀释的抗血清一起孵育，洗涤，然后使用对如x轴上所指示的IgG亚类中的每一者具有特异性的酶缀合的二级抗体进行检测。结果显示，IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3都以不同的程度被诱导。IgG2a、IgG2b和IgG3与Th1 型态相关联，并且IgG1与Th2型态相关联。这些结果指示，Th1与 Th2CD4+T辅助细胞在接种疫苗后都被活化。
如图31中所示，R22-KLH用于使C57BL/6小鼠免疫。KLH或 R22-KLH肽的第一次注射是在CFA中。第二次和后续注射是在IFA 中。在用紫色箭头标注的天数下将动物放血。在第一次注射的天数之后44天，将C57BL/6小鼠用起源于人类ROR1转基因小鼠的人类 ROR1表达CLL细胞攻击。这只小鼠对于T细胞白血病1(TCL1基因) 是转基因的。两个转基因都在B细胞特异性启动子/增强子(E-Cμ)的控制下。这种白血病类似于人类CLL并且表达人类表面ROR1。
所收集的抗血清在用R22-KLH免疫的小鼠中引起白血病细胞负荷的显著降低，但在用KLH免疫的小鼠中不会这样(图32)。
C57BL/6小鼠
根据如图33中所示的方案，R22-KLH用于使C57BL/6小鼠免疫。 KLH或R22-KLH肽的第一次注射是在CFA中。第二次和后续注射是在IFA中。在用紫色箭头标注的天数下将动物放血。在第一次注射的天数之后44天，将C57BL/6小鼠用起源于人类ROR1转基因小鼠的人类ROR1表达CLL细胞攻击，这只小鼠对于T细胞白血病1(TCL1 基因)也是转基因的。两个转基因都在B细胞特异性启动子/增强子 (E-Cμ)的控制下。这种白血病类似于人类CLL并且表达人类表面 ROR1。
第42天在用R22-KLH免疫的小鼠中观测到对人类ROR1的抗体反应，但在用KLH免疫的小鼠中没有观测到。如经由ELISA，使用涂布有重组人类ROR1蛋白质的胞外域的板来检测，用R22-KLH免疫的全部4只小鼠都产生针对人类ROR1的高滴度抗体。这些资料指示，用R22-KLH肽免疫可以打破对在这些ROR1-Tg小鼠的所有B细胞上表达的ROR1的自身耐受性。来自给予R22-KLH肽的小鼠的脾保持类似于对照动物，但KLH小鼠具有显著更大的脾(图34)。
使用对CD5或ROR1具有特异性的荧光色素缀合的mAb，来自用KLH或R22-KLH免疫的C57BL/6小鼠的脾细胞的流式细胞测量术。用于将细胞染色的mAb相比由R22-KLH诱导的抗体结合到 ROR1的非交叉阻断表位。注意到，在用R22-KLH疫苗免疫的小鼠的脾中存在少得多(如果有的话)的白血病细胞(图39)。
在用1×105个人类ROR1+CLL细胞注射30天前用R22-KLH肽注射的C57BL/6小鼠的脾中所发现的白血病细胞的总数显著低于用 KLH注射的小鼠的脾。每个脾的白血病细胞的数目是通过脾细胞群体中白血病细胞的百分比(如经由流式细胞测量术来评估)乘以从脾中收集的脾细胞的数目而得到(图34)。
通过流式细胞测量术测定用KLH或R22-KLH免疫的小鼠的脾中 CD8+细胞的数目。在用R22-KLH免疫之后，CD8T细胞有显著增加，这些细胞在用KLH免疫的小鼠中没有增加。底行指示了第75天从小鼠的脾中收集的CD8T细胞的绝对数目(图37)
C57BL/6ROR1转基因小鼠
如图38中所示，向转基因小鼠注射R22-KLH或KLH。小鼠在B 细胞特异性启动子/增强子(E-Cμ)下对于人类ROR1是转基因的。KLH 或R22-KLH肽的第一次注射是在CFA中。第二次和后续注射是在IFA 中。在用紫色箭头标注的天数下将动物放血。在第一次注射的天数之后44天，将C57BL/6小鼠用起源于ROR1-Tg小鼠的人类ROR1表达 CLL细胞攻击，这只小鼠对于T细胞白血病1(TCL1基因)也是转基因的。两个转基因都在B细胞特异性启动子/增强子(E-Cμ)的控制下。因此，这些ROR1-Tg小鼠具有表达人类ROR1的B细胞。结果证明， R22-KLH肽可以在表达ROR1的小鼠中诱导抗ROR1保护性免疫并且因此打破自身耐受性。
第42天在用R22-KLH免疫的ROR1-Tg小鼠中观测到对人类 ROR1的抗体反应，但在用KLH免疫的小鼠中没有观测到。如经由 ELISA，使用涂布有重组人类ROR1蛋白质的胞外域的板来检测，用 R22-KLH免疫的全部4只小鼠都产生针对人类ROR1的高滴度抗体。通过流式细胞测量术的进一步分析展示，在用R22-KLH疫苗免疫的小鼠的脾中相比用KLH免疫的小鼠存在更少(如果有的话)的白血病细胞(图40)。FAC分析还显示，ROR1在用R22-KLH免疫的小鼠中下调，但在用KLH免疫的小鼠中没有这样。来自用R22-KLH免疫的小鼠的脾与用KLH免疫的小鼠相比具有显著更少的白血病细胞。如同C57BL/6小鼠一样，用R22肽-KLH免疫使得CD8T细胞显著增加，这些细胞在用KLH免疫的小鼠中没有增加(图39)。用CD4+T细胞(图43)和CD3+T细胞(图42)观察到类似结果。
BALB/c小鼠
如图22中所示，用KLH或R22-KLH使BALB/c小鼠免疫。为此，使KLH或KLH缀合的肽各自与佐剂(CFA或IFA)形成乳液。CFA 用于第一次免疫，并且IFA用于后续加强。指示了放血和肽注射的天数。
通过ELISA测定R22-KLH诱导的抗ROR1抗体水平。将纯化的 ROR1胞外域涂布于96孔板上，并且从个别的放血天数开始在指定的稀释时间下孵育抗血清。ELISA结果指示，在经过免疫的BALB/c 小鼠中随时间诱导抗ROR1抗体的浓度。在免疫之前从这些动物收集的血清甚至在低血清稀释度下也不与ROR1蛋白质反应。
免疫印迹分析还指示，通过BALB/c小鼠的R22-KLH免疫产生的抗ROR1抗体产生了与D10具有相同表位特异性的抗ROR1抗体 (图23)。另外，似乎抗血清也与小鼠蛋白质反应。
FACS分析确认了来自R22-KLH免疫的BALB/c小鼠的抗血清结合到细胞表面上的ROR1。
转基因小鼠II
如图24中所示，用KLH或R22-KLH使转基因小鼠免疫。将KLH 缀合的肽与佐剂(CFA或IFA)混合。CFA用于第一次免疫，并且IFA 用于后续加强。ELISA结果指示，在R22-KLH免疫的ROR1转基因小鼠中随时间诱导抗ROR1抗体的浓度。FACS分析确认了来自 R22-KLH免疫的ROR1转基因小鼠的抗血清结合到细胞表面上的 ROR1。
检查来自R22-KLH免疫的小鼠的抗血清的ROR1受体内化能力。在4℃或37℃下将MDA-MB-231细胞与来自转基因小鼠的抗血清一起孵育1小时，然后在冰上用同型Alexa647或4A5-Alexa647染色30 分钟，随后进行ROR1表达的FACS分析。结果显示，来自用R22-KLH免疫的转基因小鼠的抗ROR1血清诱导ROR1受体内化(图25)。
检查来自R22-KLH免疫的小鼠的抗血清以确定其在乳癌迁移中的作用。在抗血清处理1小时，然后在37℃下孵育16小时后，在10×放大率下观测迁移的细胞。结果是平均值±s.e.m.。n＝3。**p<0.01。结果指示，来自转基因小鼠的抗ROR1血清可以减少体外乳癌迁移(图 26)。

Claims (14)

1.一种分离的抗ROR-1抗体，其包含人源化的重链可变区和人源化的轻链可变区，
其中所述人源化的重链可变区包含SEQ ID.NO:27、SEQ ID.NO:28和SEQ ID.NO:29所示的序列；并且
其中所述人源化的轻链可变区包含SEQ ID.NO:30、SEQ ID.NO:31和SEQ ID.NO:32所示的序列。
2.根据权利要求1所述的分离的抗ROR-1抗体，其中所述抗体结合到人ROR-1的氨基酸130-160。
3.根据权利要求2所述的分离的抗ROR-1抗体，其中人ROR-1的氨基酸138是谷氨酸，并且其中如果人ROR-1的氨基酸138是谷氨酸，则所述抗体结合到人ROR-1。
4.根据权利要求1所述的分离的抗ROR-1抗体，其中所述抗体的结合亲和力为500pM至6nM。
5.根据权利要求4所述的分离的抗ROR-1抗体，其中所述结合亲和力为800pM。
6.根据权利要求1所述的分离的抗ROR-1抗体，其中所述抗体抑制ROR-1表达癌的转移。
7.根据权利要求1所述的分离的抗ROR-1抗体，其中所述抗体是人类、人源化或嵌合的。
8.一种分离的核酸，其编码根据权利要求1所述的抗ROR-1抗体。
9.根据权利要求1所述的分离的抗ROR-1抗体对于制备用于抑制ROR-1表达癌的转移的药物制剂的应用，其中所述分离的抗ROR-1抗体破坏肿瘤细胞的上皮-间质转化。
10.根据权利要求9所述的应用，其中所述ROR-1表达癌选自由以下组成的组：B细胞白血病、淋巴瘤、CLL、AML、B-ALL、T-ALL、卵巢癌、结肠癌、肺癌、皮肤癌、胰脏癌、睾丸癌、膀胱癌、子宫癌、前列腺癌和肾上腺癌。
11.根据权利要求1所述的分离的抗ROR-1抗体对于制备用于治疗受试者的ROR-1表达癌的药物制剂的应用。
12.根据权利要求11所述的应用，其中所述ROR-1表达癌选自由以下组成的组：B细胞白血病、淋巴瘤、CLL、AML、B-ALL、T-ALL、卵巢癌、结肠癌、肺癌、皮肤癌、胰脏癌、睾丸癌、膀胱癌、子宫癌、前列腺癌和肾上腺癌。
13.根据权利要求1所述的分离的抗ROR-1抗体，其中所述抗体缀合到治疗剂。
14.根据权利要求1所述的分离的抗ROR-1抗体，其中所述抗体是IgG同型。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102134088B1 (ko) 2012-08-24 2020-07-14 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 Ror1 암을 치료하고 전이를 저해하는데 이용을 위한 항체와 백신
EP3110429A4 (en) 2014-02-27 2018-02-21 Lycera Corporation Adoptive cellular therapy using an agonist of retinoic acid receptor-related orphan receptor gamma & related therapeutic methods
WO2015171610A2 (en) 2014-05-05 2015-11-12 Lycera Corporation Tetrahydroquinoline sulfonamide and related compounds for use as agonists of rory and the treatment of disease
WO2015171558A2 (en) 2014-05-05 2015-11-12 Lycera Corporation BENZENESULFONAMIDO AND RELATED COMPOUNDS FOR USE AS AGONISTS OF RORγ AND THE TREATEMENT OF DISEASE
EP3453406B1 (en) * 2014-07-29 2021-04-14 Cellectis Ror1 (ntrkr1) specific chimeric antigen receptors for cancer immunotherapy
US10544201B2 (en) 2014-07-31 2020-01-28 Cellectis ROR1 specific multi-chain chimeric antigen receptor
CN107074975A (zh) 2014-08-28 2017-08-18 生物蛋白有限公司 用于修饰的t细胞的条件活性嵌合抗原受体
ES2777305T3 (es) 2014-09-04 2020-08-04 Cellectis Receptores de antígeno quiméricos específicos de la glicoproteína trofoblástica (5T4, TPBG) para inmunoterapia contra el cáncer
AU2015329965A1 (en) 2014-10-09 2017-04-27 Engmab Sàrl Bispecific antibodies against CD3epsilon and ROR1
CA2973964A1 (en) * 2015-01-16 2016-07-21 Juno Therapeutics, Inc. Antibodies and chimeric antigen receptors specific for ror1
JP6704000B2 (ja) * 2015-04-24 2020-06-03 ザ・リージエンツ・オブ・ザ・ユニバーシテイー・オブ・カリフオルニア Ｒｏｒ１−ｒｏｒ２結合のモジュレーター
US10421751B2 (en) 2015-05-05 2019-09-24 Lycera Corporation Dihydro-2H-benzo[b][1,4]oxazine sulfonamide and related compounds for use as agonists of RORγ and the treatment of disease
EP3842072A1 (en) * 2015-05-18 2021-06-30 Eureka Therapeutics, Inc. Anti-ror1 antibodies
TW201706300A (zh) 2015-05-20 2017-02-16 瑟勒提斯公司 用於癌症免疫療法之抗－ｇｄ３專一性嵌合抗原受體
CA2987289A1 (en) 2015-06-11 2016-12-15 Lycera Corporation Aryl dihydro-2h-benzo[b][1,4]oxazine sulfonamide and related compounds for use as agonists of ror.gamma. and the treatment of disease
US11707488B2 (en) 2015-08-28 2023-07-25 Rohto Pharmaceutical Co., Ltd. ROR1-positive mesenchymal stem cells and method for preparing same, pharmaceutical composition containing ROR1-positive mesenchymal stem cells and method for preparing same, and method for preventing or treating disease using ROR1-positive mesenchymal stem cells
SG11201803098VA (en) 2015-10-30 2018-05-30 Nbe Therapeutics Ag Anti-ror1 antibodies
BR112018014615A2 (pt) 2016-01-20 2018-12-11 The Scripps Research Institute composições de anticorpo para ror1 e métodos relacionados
CN108495864A (zh) * 2016-01-22 2018-09-04 詹森生物科技公司 抗ror1抗体、ror1×cd3双特异性抗体及其使用方法
US10968275B2 (en) 2016-02-02 2021-04-06 Fred Hutchinson Cancer Research Center Anti-ROR1 antibodies and uses thereof
IL262404B2 (en) 2016-05-13 2024-04-01 Bioatla Llc Antibodies, Antibody Fragments and Their Immunomodules Against ROR2 and Their Uses
EP3474854A4 (en) 2016-06-27 2020-02-19 The Regents of The University of California DRUG ASSOCIATIONS FOR THE TREATMENT OF CANCER
WO2018119314A1 (en) * 2016-12-22 2018-06-28 Ardeagen Corporation Anti-ror1 antibody and conjugates thereof
MX2019015057A (es) * 2017-06-23 2020-08-03 Velosbio Inc Inmunoconjugados de anticuerpos receptor huérfano similar al receptor tirosina cinasa 1 (ror1).
EP3645049A4 (en) * 2017-06-25 2021-06-30 Systimmune, Inc. MULTISPECIFIC ANTIBODIES AND ASSOCIATED PREPARATION AND USE PROCESSES
CN110869389B (zh) * 2017-06-25 2023-07-28 西雅图免疫公司 抗ror1抗体及其制备和使用方法
GB201710836D0 (en) 2017-07-05 2017-08-16 Ucl Business Plc ROR1 Car T-Cells
GB201710835D0 (en) * 2017-07-05 2017-08-16 Ucl Business Plc ROR1 Antibodies
GB201710838D0 (en) 2017-07-05 2017-08-16 Ucl Business Plc Bispecific antibodies
CA3071212C (en) 2017-08-07 2023-12-12 Nbe-Therapeutics Ag Anthracycline-based antibody drug conjugates having high in vivo tolerability
WO2019051135A1 (en) 2017-09-06 2019-03-14 Fred Hutchinson Cancer Research Center METHODS FOR IMPROVING ADOPTIVE CELL THERAPY
EP3697435A1 (en) 2017-10-20 2020-08-26 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods of immunotherapy targeting tigit and/or cd112r or comprising cd226 overexpression
CN109836498A (zh) * 2017-11-25 2019-06-04 深圳宾德生物技术有限公司 一种靶向ror1的单链抗体、嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用
GB201721802D0 (en) 2017-12-22 2018-02-07 Almac Discovery Ltd Ror1-specific antigen binding molecules
EP3759130A1 (en) 2018-02-26 2021-01-06 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods for cellular immunotherapy
WO2019173843A1 (en) * 2018-03-09 2019-09-12 The Regents Of The University Of California Combination treatment of chemoresistant cancers
SG11202010235QA (en) * 2018-04-18 2020-11-27 Exelixis Inc Anti-ror antibody constructs
WO2020018964A1 (en) 2018-07-20 2020-01-23 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods for controlled expression of antigen-specific receptors
EP3917570A1 (en) 2019-01-29 2021-12-08 Juno Therapeutics, Inc. Antibodies and chimeric antigen receptors specific for receptor tyrosine kinase like orphan receptor 1 (ror1)
MX2021011494A (es) * 2019-03-26 2021-12-15 Univ California Células t modificadas con el receptor de antígeno quimérico (t car) para el tratamiento de cánceres hematológicos y tumores sólidos.
KR20220139916A (ko) 2020-02-07 2022-10-17 벨로스바이오 인코포레이티드 항-ror1 항체 및 조성물
CN112522206A (zh) * 2020-12-15 2021-03-19 苏州恒康生命科学有限公司 一种ror1基因敲除肿瘤细胞株的构建方法及其应用
GB202020154D0 (en) 2020-12-18 2021-02-03 Almac Discovery Ltd ROR1-specific variant antigen binding molecules
WO2022167460A1 (en) 2021-02-02 2022-08-11 Numab Therapeutics AG Multispecific antibodies having specificity for ror1 and cd3
JP2024513239A (ja) * 2021-04-09 2024-03-22 ソレント・セラピューティクス・インコーポレイテッド Ｒｏｒ１に結合する抗原結合タンパク質
US11806405B1 (en) 2021-07-19 2023-11-07 Zeno Management, Inc. Immunoconjugates and methods
WO2023016488A1 (zh) 2021-08-13 2023-02-16 昆山新蕴达生物科技有限公司 一种基于微管抑制剂的抗体偶联药物
CN117881431A (zh) 2021-08-24 2024-04-12 昆山新蕴达生物科技有限公司 一种由可断裂连接子偶联的抗体偶联药物
US20230310605A1 (en) 2021-10-28 2023-10-05 Lyell Immunopharma, Inc. Methods for culturing cells expressing ror1-binding protein
WO2024064952A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 Lyell Immunopharma, Inc. Methods for culturing nr4a-deficient cells overexpressing c-jun
WO2024064958A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 Lyell Immunopharma, Inc. Methods for culturing nr4a-deficient cells
WO2024077174A1 (en) 2022-10-05 2024-04-11 Lyell Immunopharma, Inc. Methods for culturing nr4a-deficient cells

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012097313A2 (en) * 2011-01-14 2012-07-19 The Regents Of The University Of California Therapeutic antibodies against ror-1 protein and methods for use of same

Family Cites Families (216)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4714681A (en) 1981-07-01 1987-12-22 The Board Of Reagents, The University Of Texas System Cancer Center Quadroma cells and trioma cells and methods for the production of same
US4474893A (en) 1981-07-01 1984-10-02 The University of Texas System Cancer Center Recombinant monoclonal antibodies
US5892019A (en) 1987-07-15 1999-04-06 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of a single-gene-encoded immunoglobulin
EP0428534B1 (en) 1988-06-14 1995-03-29 Cetus Oncology Corporation Coupling agents and sterically hindered disulfide linked conjugates prepared therefrom
US4925648A (en) 1988-07-29 1990-05-15 Immunomedics, Inc. Detection and treatment of infectious and inflammatory lesions
US5601819A (en) 1988-08-11 1997-02-11 The General Hospital Corporation Bispecific antibodies for selective immune regulation and for selective immune cell binding
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
US5225538A (en) 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
IE63847B1 (en) 1989-05-05 1995-06-14 Res Dev Foundation A novel antibody delivery system for biological response modifiers
EP0739904A1 (en) 1989-06-29 1996-10-30 Medarex, Inc. Bispecific reagents for aids therapy
DE69133566T2 (de) 1990-01-12 2007-12-06 Amgen Fremont Inc. Bildung von xenogenen Antikörpern
US5314995A (en) 1990-01-22 1994-05-24 Oncogen Therapeutic interleukin-2-antibody based fusion proteins
AU654811B2 (en) 1990-03-20 1994-11-24 Trustees Of Columbia University In The City Of New York, The Chimeric antibodies with receptor binding ligands in place of their constant region
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
US5219837A (en) 1990-06-21 1993-06-15 Trustees Of The University Of Pennsylvania Method of stimulating myelination of cells
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
JP3583420B2 (ja) 1990-10-05 2004-11-04 メダレツクス・インコーポレーテツド 二特異的試薬を用いた標的免疫化
US5858725A (en) 1990-10-10 1999-01-12 Glaxo Wellcome Inc. Preparation of chimaeric antibodies using the recombinant PCR strategy
AU8727291A (en) 1990-10-29 1992-06-11 Cetus Oncology Corporation Bispecific antibodies, method of production, and uses thereof
ATE218889T1 (de) 1990-11-09 2002-06-15 Stephen D Gillies Cytokine immunokonjugate
ES2093778T3 (es) 1991-04-26 1997-01-01 Surface Active Ltd Nuevos anticuerpos y metodos para su uso.
GB9115364D0 (en) 1991-07-16 1991-08-28 Wellcome Found Antibody
US5843749A (en) 1991-07-26 1998-12-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Ehk and Ror tyrosine kinases
DK0627940T3 (da) 1992-03-05 2003-09-01 Univ Texas Anvendelse af immunokonjugater til diagnose og/eller terapi af vaskulariserede tumorer
US5855885A (en) 1993-01-22 1999-01-05 Smith; Rodger Isolation and production of catalytic antibodies using phage technology
US7473423B2 (en) 1994-04-29 2009-01-06 Mayo Foundation For Medical Education And Research Human IgM antibodies, and diagnostic and therapeutic uses thereof particularly in the central nervous system
CN1183802A (zh) 1994-12-30 1998-06-03 行星生物技术有限公司 在植物中生产含有保护性蛋白质的免疫球蛋白的方法和应用
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
WO1996040921A1 (en) 1995-06-07 1996-12-19 Ortho Farmaceutical Corporation Cdr-grafted anti-tissue factor antibodies and methods of use thereof
US6037454A (en) 1996-11-27 2000-03-14 Genentech, Inc. Humanized anti-CD11a antibodies
US6133426A (en) 1997-02-21 2000-10-17 Genentech, Inc. Humanized anti-IL-8 monoclonal antibodies
US6001575A (en) 1997-03-19 1999-12-14 Johns Hopkins University Therapeutic uses of grip and grip-related molecules
US6287569B1 (en) 1997-04-10 2001-09-11 The Regents Of The University Of California Vaccines with enhanced intracellular processing
EP1032660B1 (en) 1997-11-17 2009-11-04 Micromet AG Method of identifying binding site domains that retain the capacity of binding to an epitop
AU752730B2 (en) 1998-04-03 2002-09-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Humanized antibody against human tissue factor (TF) and process for constructing humanized antibody
US6897044B1 (en) 1999-01-28 2005-05-24 Biogen Idec, Inc. Production of tetravalent antibodies
US6605709B1 (en) 1999-04-09 2003-08-12 Genome Therapeutics Corporation Nucleic acid and amino acid sequences relating to Proteus mirabilis for diagnostics and therapeutics
WO2001070266A2 (en) 2000-03-17 2001-09-27 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Method of inhibiting stenosis and restenosis with a mixture of antibodies anti cd18 and anti ccr2
WO2002002641A1 (en) 2000-06-16 2002-01-10 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to blys
US7105348B2 (en) 2000-10-31 2006-09-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US6586251B2 (en) 2000-10-31 2003-07-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US20050144655A1 (en) 2000-10-31 2005-06-30 Economides Aris N. Methods of modifying eukaryotic cells
US7214786B2 (en) 2000-12-14 2007-05-08 Kovalic David K Nucleic acid molecules and other molecules associated with plants and uses thereof for plant improvement
US20090137416A1 (en) 2001-01-16 2009-05-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Isolating Cells Expressing Secreted Proteins
US20140072980A1 (en) 2001-01-16 2014-03-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Isolating cells expressing secreted proteins
IL156910A0 (en) 2001-01-16 2004-02-08 Regeneron Pharma Isolating cells expressing secreted proteins
US20140072979A1 (en) 2001-01-16 2014-03-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Isolating cells expressing secreted proteins
WO2002096948A2 (en) 2001-01-29 2002-12-05 Idec Pharmaceuticals Corporation Engineered tetravalent antibodies and methods of use
US20030020733A1 (en) 2001-07-24 2003-01-30 Yin Memphis Zhihong Computer display having selective area magnification
WO2003014960A2 (en) 2001-08-03 2003-02-20 Medical Research Council Method of identifying a consensus sequence for intracellular antibodies
JP2005509412A (ja) 2001-08-23 2005-04-14 アールエスアール リミテッド チロトロフィン（ｔｓｈ）受容体の抗原決定領域、その使用およびその抗体
US7226594B2 (en) 2001-11-07 2007-06-05 Agensys, Inc. Nucleic acid and corresponding protein entitled 161P2F10B useful in treatment and detection of cancer
AU2002362197A1 (en) 2001-12-28 2003-07-24 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of stabilizing protein
US7714113B2 (en) 2002-02-13 2010-05-11 Ludwig Institute For Cancer Research Fusion proteins of humanized g250 specific antibodies and uses thereof
US7314974B2 (en) 2002-02-21 2008-01-01 Monsanto Technology, Llc Expression of microbial proteins in plants for production of plants with improved properties
US7193069B2 (en) 2002-03-22 2007-03-20 Research Association For Biotechnology Full-length cDNA
WO2003102132A2 (en) 2002-04-26 2003-12-11 Genetech, Inc. Non-affinity purification of proteins
IL149820A0 (en) 2002-05-23 2002-11-10 Curetech Ltd Humanized immunomodulatory monoclonal antibodies for the treatment of neoplastic disease or immunodeficiency
EP1544291A4 (en) 2002-07-19 2006-08-02 Towa Kagaku Co Ltd A NEW METHOD FOR THE PRODUCTION OF ANTIBODY CYME, NEW ANTIBODY CYM AND USE THEREOF
EP2298806A1 (en) 2002-10-16 2011-03-23 Purdue Pharma L.P. Antibodies that bind cell-associated CA 125/0722P and methods of use thereof
US7223393B2 (en) 2003-02-07 2007-05-29 Pdl Biopharma, Inc Amphiregulin antibodies and their use to treat cancer and psoriasis
US7605235B2 (en) 2003-05-30 2009-10-20 Centocor, Inc. Anti-tissue factor antibodies and compositions
RU2005137325A (ru) 2003-05-31 2006-09-10 Микромет Аг (De) Фармацевтическая композиция, содержащая конструкт, специфичный к ерсам
US7569389B2 (en) 2004-09-30 2009-08-04 Ceres, Inc. Nucleotide sequences and polypeptides encoded thereby useful for modifying plant characteristics
WO2005035753A1 (ja) 2003-10-10 2005-04-21 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 機能蛋白質を代替する二重特異性抗体
EP1673398B1 (en) 2003-10-16 2010-12-29 Micromet AG Multispecific deimmunized cd3-binders
US7612179B2 (en) 2003-11-28 2009-11-03 Astrazeneca Ab antibodies binding to a C-terminal fragment of apoliopoprotein E
CN102838675B (zh) 2003-12-10 2014-07-30 梅达雷克斯有限责任公司 Ip-10抗体及其用途
DE602005027309D1 (de) 2004-01-16 2011-05-19 Regeneron Pharma Zur aktivierung von rezeptoren fähige fusionspolypeptide
US8298532B2 (en) 2004-01-16 2012-10-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Fusion polypeptides capable of activating receptors
SI1716178T1 (sl) 2004-02-16 2010-11-30 Micromet Ag Manj imunogene vezne molekule
AU2005214382B2 (en) 2004-02-19 2011-08-04 Genentech, Inc. CDR-repaired antibodies
US7192709B2 (en) 2004-03-15 2007-03-20 Digigenomics Co., Ltd. Methods for identification, assessment, prevention, and therapy of cancer
US7504086B2 (en) 2004-03-31 2009-03-17 Canon Kabushiki Kaisha Structure and method for releasing substance therefrom
US20080318212A1 (en) * 2004-04-06 2008-12-25 Wilson Cindy A Orphan Receptor Tyrosine Kinase as a Target in Breast Cancer
KR100914377B1 (ko) 2004-04-22 2009-08-28 프라운호퍼-게젤샤프트 추르 푀르데룽 데어 안제반텐 포르슝 에 파우 스트랩토코쿠스 표면 항원 Ⅰ/Ⅱ와 특이적으로 결합하는ｄｉａｂｏｄｙ 및 이의 이용 방법
WO2005105998A1 (ja) 2004-04-27 2005-11-10 Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute ヒト抗アミロイドβペプチド抗体およびその抗体フラグメント
MY148646A (en) 2004-05-10 2013-05-15 Abgenomics Cooperatief Ua Anti-psgl-1 antibodies
RU2006146939A (ru) 2004-06-09 2008-07-20 Дженентек Способ лечения кольцевидной гранулемы или саркоида
EP2166105A3 (en) 2004-08-16 2010-04-14 CropDesign N.V. Plants having improved growth characteristics and method for making the same
TWI309240B (en) 2004-09-17 2009-05-01 Hoffmann La Roche Anti-ox40l antibodies
WO2006037604A1 (en) 2004-10-01 2006-04-13 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Novel antibodies directed to the mammalian eag1 ion channel protein
CA2591665C (en) 2004-12-20 2015-05-05 Crucell Holland B.V. Binding molecules capable of neutralizing west nile virus and uses thereof
DK1848744T3 (da) 2005-01-27 2012-03-19 Novimmune Sa Humane anti-interferon-gamma-antistoffer og fremgangsmåder til anvendelse heraf
US8088976B2 (en) 2005-02-24 2012-01-03 Monsanto Technology Llc Methods for genetic control of plant pest infestation and compositions thereof
EP2143795B1 (en) 2005-03-31 2011-07-20 Biomedics Inc. Anti-CD20 monoclonal antibody
JP5004154B2 (ja) 2005-04-06 2012-08-22 一般財団法人化学及血清療法研究所 組換え抗ボツリヌス神経毒素抗体
EA016038B1 (ru) 2005-04-22 2012-01-30 Эли Лилли Энд Компани Антитело к tgf-бета и его применение
EP2478760A1 (en) 2005-05-10 2012-07-25 Monsanto Technology LLC Genes and uses for plant improvement
US7736647B2 (en) 2005-06-15 2010-06-15 Monoclonal Antibodies Therapeutics Anti-CD71 monoclonal antibodies and uses thereof for treating malignant tumor cells
EP3190125A1 (en) 2005-08-31 2017-07-12 Merck Sharp & Dohme Corp. Engineered anti-il-23 antibodies
WO2008103849A2 (en) * 2007-02-21 2008-08-28 The Regents Of The University Of California Methods and compounds for lymphoma cell detection and isolation
EP1948680A4 (en) 2005-10-28 2010-01-13 Univ California METHOD AND COMPOUNDS FOR DETECTING AND ISOLATING LYMPHOMA CELLS
CA2627075A1 (en) 2005-11-14 2007-05-18 Bioren, Inc. Antibody ultrahumanization by predicted mature cdr blasting and cohort library generation and screening
EP3406621A1 (en) 2006-02-14 2018-11-28 BP Corporation North America Inc. Xylanases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
JPWO2007102200A1 (ja) 2006-03-07 2009-07-23 国立大学法人大阪大学 抗ｃｄ２０モノクローナル抗体
WO2007146957A2 (en) 2006-06-13 2007-12-21 Irm Llc Ror1 as a therapeutic target for lung cancer
CA2660286A1 (en) 2006-08-09 2008-02-21 Homestead Clinical Corporation Organ-specific proteins and methods of their use
AR062435A1 (es) 2006-08-18 2008-11-05 Xoma Technology Ltd Anticuerpo especifico prlr (receptor de prolactina) y sus usos
PL2066694T3 (pl) 2006-09-29 2016-04-29 Oncomed Pharm Inc Kompozycje i sposoby diagnozowania i leczenia nowotworu
WO2008066691A2 (en) 2006-11-08 2008-06-05 Macrogenics West, Inc. Tes7 and antibodies that bind thereto
FR2909092B1 (fr) 2006-11-24 2012-10-19 Pf Medicament Nouveaux anticorps anti-proliferation
WO2008076868A2 (en) 2006-12-18 2008-06-26 Abbott Laboratories Methods and compositions related to modulation of receptor tyrosine kinase orphan receptor-1 (ror-1)
AU2007338670A1 (en) 2006-12-22 2008-07-03 Merck Sharp & Dohme Corp. Antibodies to CD200R
WO2008097439A2 (en) 2007-02-07 2008-08-14 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Anti-autoimmune antibodies for treatment of pemphigus
US9745367B2 (en) 2007-03-23 2017-08-29 Novelmed Theraputics, Inc. Alternative pathway specific antibodies for treating arthritis
US8163279B2 (en) 2007-04-13 2012-04-24 Stemline Therapeutics, Inc. IL3Rα antibody conjugates and uses thereof
WO2008137629A2 (en) 2007-05-03 2008-11-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Identifying germline competent embryonic stem cells
WO2008143666A2 (en) 2007-05-17 2008-11-27 Genentech, Inc. Crystal structures of neuropilin fragments and neuropilin-antibody complexes
US8546546B2 (en) 2007-07-04 2013-10-01 Forerunner Pharma Research Co., Ltd. Anti-Muc 17 antibody
US8299318B2 (en) 2007-07-05 2012-10-30 Ceres, Inc. Nucleotide sequences and corresponding polypeptides conferring modulated plant characteristics
CA2694396A1 (en) 2007-07-25 2009-01-29 Astrazeneca Ab Targeted binding agents directed to kdr and uses thereof - 035
US20110263825A1 (en) 2007-09-06 2011-10-27 Osaka University Anti-cd20 monoclonal antibodies
US8362325B2 (en) 2007-10-03 2013-01-29 Ceres, Inc. Nucleotide sequences and corresponding polypeptides conferring modulated plant characteristics
CA2702555A1 (en) 2007-10-19 2009-04-23 Seattle Genetics, Inc. Cd19 binding agents and uses thereof
CA2705923A1 (en) 2007-11-16 2009-05-22 Nuvelo, Inc. Antibodies to lrp6
MX337081B (es) 2007-12-05 2016-02-10 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpo anti-nr10 y su uso.
AU2008338591B8 (en) 2007-12-14 2014-02-20 Bristol-Myers Squibb Company Binding molecules to the human OX40 receptor
JP2011506614A (ja) 2007-12-17 2011-03-03 ダイアックス コーポレーション Ｍｍｐ−１４結合タンパク質を含む、骨溶解性障害を処置するための組成物および方法
US8414893B2 (en) 2007-12-21 2013-04-09 Amgen Inc. Anti-amyloid antibodies and uses thereof
CA2710680C (en) 2007-12-26 2018-10-16 Vaccinex, Inc. Anti-c35 antibody combination therapies and methods
EP2250201B1 (en) 2008-01-29 2014-04-30 Ludwig Institute for Cancer Research Ltd. Membrane transporter napi2b (slc34a2) epitope for antibody therapy, antibodies directed thereto, and target for cancer therapy
US9029636B2 (en) 2008-02-05 2015-05-12 Monsanto Technology Llc Isolated novel nucleic acid and protein molecules from soy and methods of using those molecules to generate transgenic plants with enhanced agronomic traits
AR070316A1 (es) 2008-02-07 2010-03-31 Merck & Co Inc Antagonistas de pcsk9 (proproteina subtilisina-kexina tipo 9)
US8747847B2 (en) 2008-02-11 2014-06-10 Curetech Ltd. Monoclonal antibodies for tumor treatment
CA2717576A1 (en) 2008-03-03 2009-09-11 Dyax Corp. Metalloproteinase 9 binding proteins
EP2262837A4 (en) 2008-03-12 2011-04-06 Merck Sharp & Dohme PD-1 BINDING PROTEINS
CA2720614A1 (en) 2008-04-07 2009-10-15 Kalobios Pharmaceuticals, Inc. Neutralization of gm-csf for the treatment of heart failure
WO2009129538A2 (en) 2008-04-18 2009-10-22 Xencor, Inc. Human equivalent monoclonal antibodies engineered from nonhuman variable regions
EP2282769A4 (en) 2008-04-29 2012-04-25 Abbott Lab DUAL VARIABLE DOMAIN IMMUNOGLOBULINS AND ITS USES
US8410251B2 (en) 2008-06-20 2013-04-02 National University Corporation Okayama University Antibody against calcified globule and use of the same
WO2010002862A2 (en) 2008-07-01 2010-01-07 Aveo Pharmaceuticals, Inc. Fibroblast growth factor receptor 3 (fgfr3) binding proteins
BRPI0913991A2 (pt) 2008-07-02 2015-11-17 Emergent Product Dev Seattle imunoterápicos da il6
AU2009272284C1 (en) 2008-07-16 2014-05-15 Institute For Research In Biomedicine Human cytomegalovirus neutralizing antibodies and use thereof
EP2316491B1 (en) 2008-07-18 2016-10-12 National University Corporation Nagoya University Cell proliferation inhibitor
CN102144033A (zh) 2008-07-31 2011-08-03 巴斯夫植物科学有限公司 具有修饰的生长特征的植物及其制备方法
BRPI0917370A2 (pt) 2008-08-20 2015-11-17 Centocor Ortho Biotech Inc anticorpos anti-il-13 manipulados, composições, métodos e usos.
CN102245773B (zh) 2008-11-03 2014-08-27 阿莱斯亚生物疗法股份有限公司 特异性地阻滞肿瘤抗原的生物活性的抗体
US8183346B2 (en) 2008-12-05 2012-05-22 Eli Lilly And Company Anti-ferroportin 1 monoclonal antibodies and uses thereof
US9012723B2 (en) 2009-01-16 2015-04-21 Monsanto Technology Llc Isolated novel acid and protein molecules from soy and methods of using those molecules to generate transgene plants with enhanced agronomic traits
US8673307B1 (en) 2009-03-09 2014-03-18 The Rockefeller University HIV-1 anti-core neutralizing antibodies that target a conformational epitope within the ALPHA5-helix of GP120
EP2408816B1 (en) 2009-03-20 2019-09-04 Amgen Inc. Alpha-4-beta-7 heterodimer specific antagonist antibody
RU2542394C2 (ru) 2009-03-24 2015-02-20 ТЕВА БИОФАРМАСЬЮТИКАЛЗ ЮЭсЭй, ИНК. Гуманизированные антитела против light и их применение
HUE025726T2 (en) 2009-03-25 2016-04-28 Genentech Inc Anti-FGFR3 antibodies and their use
WO2010117455A2 (en) 2009-04-08 2010-10-14 U.S. Army Medical Research Institute Of Infectious Diseases Human monoclonal antibodies protective against bubonic plaque
WO2010119704A1 (en) 2009-04-17 2010-10-21 Immunas Pharma, Inc. Antibodies that specifically bind to a beta oligomers and use thereof
US9316646B2 (en) * 2009-04-23 2016-04-19 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Anti-human ROR1 antibodies
CN102459346B (zh) 2009-04-27 2016-10-26 昂考梅德药品有限公司 制造异源多聚体分子的方法
JP5762408B2 (ja) 2009-08-13 2015-08-12 クルセル ホランド ベー ヴェー ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ｒｓｖ）に対する抗体および使用方法
KR101778813B1 (ko) 2009-08-28 2017-09-14 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 다수의 ｃｃ 케모카인에 결합하는 항카인 항체
US8926976B2 (en) 2009-09-25 2015-01-06 Xoma Technology Ltd. Modulators
US9175070B2 (en) 2009-09-25 2015-11-03 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to HIV-1 and their use
ES2826883T3 (es) 2009-10-14 2021-05-19 Janssen Biotech Inc Métodos de maduración por afinidad de anticuerpos
CA2778568A1 (en) 2009-10-30 2011-05-05 Toray Industries, Inc. Antibody having activity of inhibiting hepatitis c virus (hcv) infection and use thereof
WO2011054007A1 (en) 2009-11-02 2011-05-05 Oxford Biotherapeutics Ltd. Ror1 as therapeutic and diagnostic target
LT2499161T (lt) 2009-11-11 2017-11-27 Ganymed Pharmaceuticals Gmbh Specifiniai antikūnai, skirti klaudinui 6 (cldn6)
US8937159B2 (en) 2009-12-16 2015-01-20 Abbvie Biotherapeutics Inc. Anti-HER2 antibodies and their uses
WO2011079902A2 (en) 2009-12-18 2011-07-07 Biolnvent International Ab Biological materials and uses thereof
AU2011215685B2 (en) 2010-02-12 2015-08-20 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Methods for identifying and isolating cells expressing a polypeptide
US8609095B2 (en) 2010-03-04 2013-12-17 Symphogen A/S Anti-HER2 antibodies and compositions
EP2542589A4 (en) 2010-03-04 2013-08-07 Symphogen As ANTIBODIES AND COMPOSITIONS ANTI-HER2
MX336682B (es) 2010-03-05 2016-01-27 Hoffmann La Roche Anticuerpos contra csf-1r humanos y usos de los mismos.
US8468130B2 (en) 2010-04-02 2013-06-18 Skyfire Labs, Inc. Assisted hybrid mobile browser
WO2011125015A2 (en) 2010-04-05 2011-10-13 Bar-Ilan University Protease-activatable pore-forming polypeptides
CA2799746C (en) 2010-05-17 2020-11-24 Sai Reddy Rapid isolation of monoclonal antibodies from animals
JO3330B1 (ar) 2010-06-10 2019-03-13 Lilly Co Eli الأجسام المضادة cgrp
JP2012021943A (ja) 2010-07-16 2012-02-02 National Cancer Center 子宮体がんの検査方法、子宮体がんの検査薬、並びに子宮体がん抗原に対する抗体
WO2012012695A2 (en) 2010-07-23 2012-01-26 Fred Hutchinson Cancer Research Center A method for the treatment of obesity
EP2619228A1 (en) 2010-09-22 2013-07-31 Novo Nordisk A/S Therapeutic factor viii antibodies
EP2621954A1 (en) 2010-10-01 2013-08-07 Oxford Biotherapeutics Ltd. Anti-rori antibodies
EP2632490A4 (en) 2010-10-29 2014-10-22 Immunogen Inc NOVEL MOLECULES BINDING TO THE EGF RECEPTOR AND IMMUNOCONJUGATES THEREOF
JO3756B1 (ar) 2010-11-23 2021-01-31 Regeneron Pharma اجسام مضادة بشرية لمستقبلات الجلوكاجون
EP2455403A1 (en) 2010-11-23 2012-05-23 Pierre Fabre Medicament Homogeneous humanized antibodies against JAM-A that inhibit proliferation
EP2646469B1 (en) * 2010-12-01 2017-11-01 The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Chimeric rabbit/human ror1 antibodies
GB201020995D0 (en) 2010-12-10 2011-01-26 Bioinvent Int Ab Biological materials and uses thereof
EP2661450A4 (en) 2011-01-06 2014-04-23 Dyax Corp PROTEINS BINDING TO PLASMA KALLIKREINE
AU2012217867A1 (en) 2011-02-14 2013-09-05 Theraclone Sciences, Inc. Compositions and methods for the therapy and diagnosis of influenza
WO2012118693A1 (en) 2011-02-28 2012-09-07 Northshore University Healthsystem Methods of diagnosing clostridium difficile infection
RU2754446C2 (ru) 2011-04-22 2021-09-02 ВАЙЕТ ЭлЭлСи Композиции, относящиеся к мутантному токсину CLOSTRIDIUM DIFFICILE, и способы их применения
NZ724296A (en) 2011-05-13 2020-05-29 Ganymed Pharmaceuticals Ag Antibodies for treatment of cancer expressing claudin 6
WO2013019730A1 (en) 2011-07-29 2013-02-07 The Washington University Antibodies to tip-1 and grp78
WO2013025446A2 (en) 2011-08-12 2013-02-21 Omeros Corporation Anti-fzd10 monoclonal antibodies and methods for their use
PE20141537A1 (es) 2011-09-23 2014-11-17 Oncomed Pharm Inc Agentes de ligacion al factor de crecimiento endotelial vascular/ligando 4 similar a delta (vegf/dll4) y usos de los mismos
KR101637915B1 (ko) 2011-10-13 2016-07-11 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 Cd40l을 길항하는 항체 폴리펩티드
EP2589609A1 (en) 2011-11-03 2013-05-08 Pierre Fabre Medicament Antigen binding protein and its use as addressing product for the treatment of cancer
EP2617319A1 (en) 2012-01-17 2013-07-24 Braun GmbH Head portion and handle portion of an oral care device
WO2013125636A1 (ja) 2012-02-21 2013-08-29 東レ株式会社 癌の治療及び／又は予防用医薬組成物
IN2014KN01715A (zh) 2012-02-21 2015-10-23 Toray Industries
BR112014020826A8 (pt) 2012-02-24 2017-09-19 Stem Centrx Inc Anticorpo que se liga especificamente a um epítopo, ácido nucleico, vetor ou célula hospedeira, conjugado de fármaco – anticorpo, composição farmacêutica compreendendo o referido anticorpo, uso do mesmo, kit e método de preparação do conjugado
JP6280031B2 (ja) 2012-03-29 2018-02-14 中外製薬株式会社 抗ｌａｍｐ５抗体およびその利用
CA2869120C (en) 2012-03-30 2023-05-23 Toray Industries, Inc. Pharmaceutical composition for treatment and/or prevention of liver cancer
PL2832366T3 (pl) 2012-03-30 2018-04-30 Toray Industries, Inc. Kompozycja farmaceutyczna do leczenia i/lub zapobiegania rakowi pęcherzyka żółciowego
AU2013243570B2 (en) 2012-04-03 2017-12-14 Novelmed Therapeutics, Inc. Humanized and chimeric anti-factor Bb antibodies and uses thereof
AR090903A1 (es) 2012-05-01 2014-12-17 Genentech Inc Anticuerpos e inmunoconjugados anti-pmel17
BR112014027905A2 (pt) 2012-05-14 2017-06-27 Genentech Inc anticorpo, célula, ácido nucleico, métodos de identificação de um primeiro anticorpo, de inibição do crescimento de uma célula, de tratamento terapêutico, de determinação da presença de uma proteína, de diagnóstico da presença de um tumor e de distribuição de agente citotóxico.
CN103421113B (zh) 2012-05-22 2018-01-19 武汉华鑫康源生物医药有限公司 抗BLyS抗体
JO3462B1 (ar) 2012-08-22 2020-07-05 Regeneron Pharma أجسام مضادة بشرية تجاه gfr?3 وطرق لاستخدامها
KR102134088B1 (ko) 2012-08-24 2020-07-14 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 Ror1 암을 치료하고 전이를 저해하는데 이용을 위한 항체와 백신
CN103792364B (zh) 2012-10-31 2016-06-08 张宝弘 用于检测外周血中循环肿瘤细胞ror1蛋白的试剂及其应用
TWI675044B (zh) 2012-11-14 2019-10-21 美商再生元醫藥公司 重組細胞表面捕捉蛋白質
RS58873B1 (sr) 2013-02-22 2019-08-30 Abbvie Stemcentrx Llc Antidll3-antitelo-pbd konjugati i njihova upotreba
EP2789630A1 (en) 2013-04-09 2014-10-15 EngMab AG Bispecific antibodies against CD3e and ROR1
WO2014174111A1 (en) 2013-04-26 2014-10-30 Pierre Fabre Medicament Axl antibody-drug conjugate and its use for the treatment of cancer
AR096364A1 (es) 2013-05-20 2015-12-23 Genentech Inc Anticuerpos receptores de antitransferina y métodos de uso
WO2015014376A1 (en) 2013-07-31 2015-02-05 Biontech Ag Diagnosis and therapy of cancer involving cancer stem cells
AU2014312210A1 (en) 2013-08-28 2016-04-07 Abbvie Stemcentrx Llc Engineered anti-DLL3 conjugates and methods of use
KR20160070191A (ko) 2013-11-06 2016-06-17 스템센트알엑스 인코포레이티드 신규한 항-클라우딘 항체 및 사용 방법
US9546384B2 (en) 2013-12-11 2017-01-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the targeted modification of a mouse genome
TW201533060A (zh) 2013-12-13 2015-09-01 Genentech Inc 抗ｃｄ３３抗體及免疫結合物
RS60443B1 (sr) 2013-12-17 2020-07-31 Genentech Inc Anti-cd3 antitela i postupci upotrebe
WO2015099838A2 (en) 2013-12-24 2015-07-02 Novelmed Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating ocular diseases
AU2015218633A1 (en) 2014-02-21 2016-09-01 Abbvie Stemcentrx Llc Anti-DLL3 antibodies and drug conjugates for use in melanoma
BR112016022727A8 (pt) 2014-04-01 2018-12-04 Biontech Cell & Gene Therapies Gmbh imunorreceptores específicos de claudina-6 e epítopos de células t
LT3134125T (lt) 2014-04-25 2020-01-10 Pierre Fabre Médicament Antikūno ir vaisto konjugatas bei jo panaudojimas vėžio gydymui

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012097313A2 (en) * 2011-01-14 2012-07-19 The Regents Of The University Of California Therapeutic antibodies against ror-1 protein and methods for use of same

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ROR1 Is Expressed in Human Breast Cancer and Associated with Enhanced Tumor-Cell Growth;Suping Zhang et al.;《PLOS ONE》;20120305;第7卷(第3期);1-12 *
Sivasubramanian Baskar et al..Targeting Human B Cell Chronic Lymphocytic Leukemia With a Monoclonal Antibody Specific for the Receptor Tyrosine Kinase ROR1.《J Immunother》.2008,第31卷(第9期),969. *

Also Published As

Publication number Publication date
EP2888283A1 (en) 2015-07-01
KR102312856B1 (ko) 2021-10-13
PH12015500390B1 (en) 2015-04-27
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IL264057A (en) 2019-01-31
EP3489261A1 (en) 2019-05-29
MX2015002337A (es) 2015-08-14
PL2888283T3 (pl) 2019-03-29
CN109369808B (zh) 2023-11-07
AU2013306390A1 (en) 2015-02-26
PT2888283T (pt) 2018-11-16
ES2845184T3 (es) 2021-07-26
EP3489261B1 (en) 2020-10-21
IL236962B (en) 2019-01-31
DK3489261T3 (da) 2020-12-14
KR101935088B1 (ko) 2019-01-04
CL2015000431A1 (es) 2016-02-26
US9758591B2 (en) 2017-09-12
US20150232569A1 (en) 2015-08-20
MX362456B (es) 2019-01-18
JP7138735B2 (ja) 2022-09-16
EP2888283B1 (en) 2018-09-19
US20190389962A1 (en) 2019-12-26
EP3838923A1 (en) 2021-06-23
CA2881966A1 (en) 2014-02-27
PH12015500390A1 (en) 2015-04-27
CN104662044A (zh) 2015-05-27
KR20200079561A (ko) 2020-07-03
JP2019110906A (ja) 2019-07-11
WO2014031174A1 (en) 2014-02-27
PL3489261T3 (pl) 2021-08-16
KR102134088B1 (ko) 2020-07-14
BR112015003757A2 (pt) 2017-11-28
JP2022174167A (ja) 2022-11-22
JP6479660B2 (ja) 2019-03-06
US20180066063A1 (en) 2018-03-08
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KR20150046111A (ko) 2015-04-29
DK2888283T3 (en) 2018-11-19
AU2018241099B2 (en) 2020-08-13
US20230110249A1 (en) 2023-04-13
US11312787B2 (en) 2022-04-26
IL264057B (en) 2020-03-31
MY181648A (en) 2020-12-30
CN109369808A (zh) 2019-02-22
EP3838923B1 (en) 2024-05-01
AU2013306390B2 (en) 2018-07-05
ES2702315T3 (es) 2019-02-28
AU2018241099A1 (en) 2018-10-25
NI201500024A (es) 2015-07-16
BR112015003757B1 (pt) 2022-08-16
US10344096B2 (en) 2019-07-09
JP6823094B2 (ja) 2021-01-27
EP2888283A4 (en) 2016-07-13
SG11201500730XA (en) 2015-02-27
JP2015532644A (ja) 2015-11-12
CA2881966C (en) 2020-10-06
AU2020267172A1 (en) 2020-12-03

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