KR20230008269A - 생체 내 내성이 높은 항체 약물 결합체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 생체 내 내성(in vivo tolerability)의 개선된 특성을 나타내는 항체 약물 결합체(antibody drug conjugates; ADCs)에 관한 것이다.

Description

생체 내 내성이 높은 항체 약물 결합체{Antibody drug conjugates having high in vivo tolerability}
본 발명은 강력한 약물을 운반하고 생체 내에서 개선된 특성, 특히 개선된 생체 내 내성(in vivo tolerability)을 제공하는 항체 약물 결합체(antibody drug conjugates)에 관한 것이다.
저분자량 독소(독성 "소분자", 분자량 <2,500 달톤)와 결합 단백질, 특히 종양 세포 특이적 항체,의 공유 결합체는 특히 암세포를 표적화하여 이들을 파괴할 수 있는 강력한 도구이다. 이러한 항체 약물 결합체(antibody drug conjugates; 이하 "ADC")는 암 치료와 관련하여 의학적 및 상업적 관심이 높다. 암 치료를 위한 효과적이고 안전한 항체 약물 결합체(ADC)를 개발하려면 여러 가지 측면이 고려되어야 한다: 첫째, 항체는, 정상 또는 건강한 조직 세포에서 거의 발현되지 않거나 또는 바람직하게 발현되지 않는 주어진 종양 특이적 항원(tumore specific antigen, 이하 "TSA")에 대해 특이적이어야 한다. 둘째, 혈류 내의 독성 탑재물(payload)이 의도치 않게 방출되는 것을 막기 위하여, 순환 시(in circulation) 상기 약물과 상기 항체/결합 단백질 사이의 공유 결합 또는 연결은 충분히 안정적이어야 하며, 암세포에 결합 및/또는 암세포로 내재화(internalization) 될 경우 상기 약물을 효과적으로 방출하여야 한다. 셋째, 상기 항체 약물 결합체(ADC)는 상당한 양이 내재화되어야 한다. 넷째, 독성 탑재물(payload)이 상기 항체에서 방출되어 독성을 발휘하려면 적절한 세포 구획(cellular compartment)으로 들어가야 한다. 다섯째, 잠재적으로 제한된 양의 종양 특이적 항원(TSA)이 암세포에서 발현되어 단지 잠재적으로 제한된 양의 항체 약물 결합체(ADC)가 암세포에서 내재화되거나, 또는 상기 암세포에 결합 시 또는 상기 암세포로의 내재화 이후, 상기 독성 탑재물의 방출이 충분히 높은 효율로 수행되지 않는 경우에도, 상기 독성 탑재물(payload)은 상기 암세포를 파괴할 수 있는 충분히 높은 독성 또는 효능을 가져야 한다.
그러나, 마찬가지로, 항체 약물 결합체(ADC)는 하기를 통해 일반적으로 매개되는 부작용의 유도 역시 회피할 수 있어야 한다: (a) 건강한 세포에서 종양 특이적 항원(TSA)의 발현으로 인한 비표적 조직(non-target tissues)에서의 표적 내 결합(on-target binding), (b) 의도된 종양 특이적 항원(TSA) 이외의 항원의 결합으로 인한 표적 외 결합(off-target binding) 및/또는 (c) 혈류에서 약물 탑재물(payload)의 조기(premature) 방출, 용해된 표적 세포들로부터 방출된 탑재물 또는 방출된 대사 산물로 인해 야기될 수 있는 일반적인 독성.
항체 약물 결합체(ADC)의 개발과 관련한 이들 여러 제한으로 인해 이런 유형의 치료법은 임상 평가를 극복하기 위한 가장 어려운 문제 중 하나다. 또한, 이러한 생물학적 기반 제품의 제조 및 검사 비용이 높기 때문에, 당업자는 특정 결합 부위(들) 및 독소와 항체의 비율 뿐 아니라, 모든 가능한 변이체 및 항체, 링커 및 독소의 조합을 자유롭게 체계적으로 검사할 수 없다
실제로, 문헌은 다수의 가능한 독소 탑재물 및 링커에 대해 개시하고 있으며(Jain et al., 2015 실시예 참조), 또한, 다수의 가능한 결합 부위 및 결합 방법에 관한 것이다.
“Location Matters: Site of Conjugation Modulates Stability and Pharmacokinetics of Antibody Drug Conjugates” (Strop et al., Chemistry & Biology, 20, 2013)에서, 상기 저자들은 미생물 트랜스글루타미나아제(transglutaminases)에 의해 결합된 항체 약물 결합체(ADC)에 대해 보고하고 있다. 자체의 항체 중쇄 및 경쇄의 C-말단에 결합된 MMAD 독소는 생체 내 및 실험실 내에서 유사한 효능을 보여 주었다. 랫트(rats)는 10 mg/kg 및 25 mg/kg의 항체 약물 결합체(ADC)의 용량 모두에 뛰어난 내성을 나타내었다.
놀랍게도, 본 출원인은 안트라사이클린 독소를 함유하는 항체 약물 결합체(ADC)가 하나 이상의 특정 부위(즉, 하나 또는 두 항체 모두(또는 항체 유도체)의 경쇄의 C-말단)에 독점적으로(exclusively) 결합하는 것을 발견하였는데, 치료학적으로 효과적일 뿐 아니라, 현저하게, 대체 부위(즉, 항체 중쇄 중 하나 또는 둘 모두의 C-말단 또는 항체 중쇄 및 경쇄의 C-말단의 조합)에 안트라사이클린 독소가 결합된 비슷한(comparable) 항체 약물 결합체(ADC)보다 생체 내에서 더 높은 내성을 보였다. 이러한 교시는 WO2016/150564(이의 내용은 본원에 참조로 포함됨)에 개시되어 있지 않으며, 이는 동일한 클래스의 독소를 의미하지만, 항체 중쇄 및 경쇄의 C-말단의 조합에 대한 부착만을 의미한다.
항체 C-말단의 독소 부착 수단, 즉 WO2014/140317(이의 내용은 본원에 참조로 포함됨)에 관한 교시 또한 안트라사이클린 독소가 경쇄의 C-말단에 우선적으로 부착(preferential attachment)함을 개시하고 있지 않다.
따라서, 본 발명의 목적은 생체 내에서 개선된 특성을 나타내는, 특히 생체 내에서 내성이 우수한, 항체 약물 결합체(ADC)를 제공하는 것이다. 특히, 본 발명의 목적은 동일한 독소들을 동일한 수로 포함하지만 대안적인 C-말단들에 부착된 이의 대응물(counterpart)보다 생체 내에서 더 뛰어난 내성을 보이는 항체 약물 결합체(ADC)를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 이러한 항체 약물 결합체(ADC)를 포함하는 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 이러한 항체 약물 결합체(ADC)를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 신생물 질환(neoplastic disease)을 앓고 있거나, 발병 위험이 있거나 및/또는 진단되는 대상체의 치료에 사용하기 위한 항체 약물 결합체(ADC)를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 면역 질환 또는 장애를 앓고 있거나, 발병 위험이 있거나 및/또는 진단되는 대상체의 치료에 사용하기 위한 항체 약물 결합체(ADC)를 제공하는 것이다.
상기 목적들 및 기타 다른 목적들은 본 발명의 독립항들에 따른 방법 및 수단들을 만족시킨다. 종속항들은 특정 실시예들과 관련이 있다.
본 발명은 개선된 생체 내 내성(in vivo tolerability) 특성을 포함한 개선된 생체 내 특성들을 나타내는 항체 약물 결합체(ADC)를 제공하고자 한다.
본 발명은 개선된 생체 내 내성(in vivo tolerability) 특성을 포함한 개선된 생체 내 특성들을 나타내는 항체 약물 결합체(ADC)를 제공한다. 본 발명 및 본 발명의 특징들의 일반적인 장점은 이하 상세히 논의된다.
본 발명에 따르면 개선된 생체 내 내성(in vivo tolerability) 특성을 포함한 개선된 생체 내 특성들을 나타내는 항체 약물 결합체(ADC)가 제공된다.
도 1은 본 발명에 따른 일반적인 안트라사이클린을 포함하는 항체 약물 결합체(ADC)를 도시하며, 여기서 Ab는 항체 또는 단편 또는 유도체를 의미하는 것으로서, 항체 또는 단편 또는 유도체의 경쇄 불변 영역 C-말단 중 하나 또는 둘 모두가 펩타이드 서열을 포함하는 링커에 연결되고, 안트라사이클린 분자 독소로 이어진다.
도 2는 본 발명에 따른 안트라사이클린 분자를 포함하는 항체 약물 결합체(ADC)의 바람직한 실시예를 도시하며, 여기서:
- 상기 안트라사이클린 분자는 화학식 (i)의 PNU 유도체에 해당하고;
- L1은 선택적 링커로서, 절단 가능한 링커일 수 있고;
- m은 1 이상 11 이하로서, 바람직하게 m은 2이고;
- n은 1 이상 21 이하이고, 바람직하게 n은 1, 2, 3, 4 또는 5이고;
- 여기서 소르타제 인식 서열(Sortase Recognition Sequence)은 소르타제 효소 인식 모티프의 특정 절단 생성물(예; LPXT)(도면에서 C-말단에서 N-말 단 방향으로 도시됨)을 나타내며, 여기서 X는 임의의 아미노산을 의미하고;
- 상기 스페이서 서열은 선택 사항(도면에서 C-말단에서 N-말단 방향으로 도시됨)이고;
- Ab는 항체로서, 이의 경쇄 불변 영역 C-말단 중 하나 또는 둘 모두가 스페이서 서열(존재하는 경우), 또는 상기 소르타제 인식 서열(상기 스페이서 서열이 존재하지 않는 경우)에 연결된다.
도 3은 실시예에서 사용된 (A) 펜타글리신-변형(modified) PNU 유도체(G5-PNU), (B) 트리글리신-변형 PNU 유도체(G3-PNU) 및 (C) 디글리신-변형 PNU 유도체(G2-PNU)를 도시하고 있다.
도 4는 하기 항체 약물 결합체(ADC)를 포함하는 (A) SKBR3(HER2-양성 인간 유방암) 및 (B) 카르파스(Karpas)-299(HER2-음성 인간 T 세포 림프종) 세포주들에 대한 실험실 내 세포 살해 분석(in vitro cell killing assays)의 용량-반응 곡선(dose-response curve)을 도시하고 있다:
Tras-HC-PNU(두 중쇄의 C-말단 모두에 연결된 안트라사이클린 분자를 포함하는 HER2-표적화 항체 약물 결합체(ADC)); 및
Tras-LC-PNU(두 경쇄의 C-말단에 연결된 안트라사이클린 분자를 포함하는 HER2-표적화 항체 약물 결합체(ADC)).
중쇄 상에만 독점적으로 탑재되거나 또는 경쇄 상에만 독점적으로 탑재되는 안트라사이클린 탑재물을 포함하는 항체 약물 결합체들(ADCs)은 그 효능이 항원 매개되는 실험실 내 효능에 필적할만하다.
도 5는 하기 항체 약물 결합체(ADC)를 포함하는 SKOV3(HER2-양성 인간 난소암) 세포주들에 대한 실험실 내 세포 살해 분석(in vitro cell killing assays)의 용량-반응 곡선(dose-response curve)을 도시하고 있다:
Tras-HC-PNU(두 중쇄의 C-말단 모두에 연결된 안트라사이클린 분자를 포함하는 HER2-표적화 항체 약물 결합체(ADC)); 및
Tras-LC-PNU(두 경쇄의 C-말단에 연결된 안트라사이클린 분자를 포함하는 HER2-표적화 항체 약물 결합체(ADC));
Ac10-HC-PNU(두 중쇄의 C-말단 모두에 연결된 안트라사이클린 분자를 포함하는 CD30-표적화 항체 약물 결합체(ADC)); 및
Ac10-LC-PNU(두 경쇄의 C-말단에 연결된 안트라사이클린 분자를 포함하는 CD30-표적화 항체 약물 결합체(ADC)).
중쇄 상에만 독점적으로 탑재되거나 또는 경쇄 상에만 독점적으로 탑재되는 안트라사이클린 탑재물을 포함하는 항체 약물 결합체들(ADCs)은 그 효능이 항원-매개되는 실험실 내 효능에 필적할만하다.
도 6은 하기 항체 약물 결합체들(ADCs)로 처리된 암컷 CD1 마우스에서 시간에 따른 ADC IgG 및 안트라사이클린 독소의 혈청 농도를 도시하고 있다:
(A) hu4-2-17-PNU(중쇄 및 경쇄의 C-말단 모두에 연결된 안트라사이클린 탑재물을 포함하는 ROR1-표적화 항체 약물 결합체(ADC));
(B) hu4-2-17-HC-PNU(중쇄의 C-말단에 연결된 안트라사이클린 탑재물을 포함하는 ROR1-표적화 항체 약물 결합체(ADC)); 또는
(C) hu4-2-17-LC-PNU(경쇄의 C-말단에 연결된 안트라사이클린 탑재물을 포함하는 ROR1-표적화 항체 약물 결합체(ADC)) [상기 LC-PNU가 순환 시(in circulation) 더 긴 체류 시간을 가진다는 결론을 내릴 수 있을까?]
도 7은 조작된 마우스 EMT-6 유방암 세포에서 인간 ROR1의 발현에 대한 FACS 분석을 도시하고 있다. ROR1의 발현과 관련하여, 생체 내 연구를 위해 선택된 EMT-6-ROR1 클론 14를 형광 표지된 항-ROR1 항체 클론 2A2로 FACS 염색하여 분석하였다. 음성 대조군은 형광 표지된 이소타입(isotype)-매칭 대조군 항체로 동일 세포를 염색한 것을 나타낸다.
도 8은 하기 항체 약물 결합체(ADC)를 포함하는 (A) ROR1-과발현 EMT6 클론 14 세포들 및 (B) CS1-양성 L363(인간 형질(plasma) 세포 백혈병) 세포들에 대한 실험실 내 세포 살해 분석(in vitro cell killing assays)의 용량-반응 곡선(dose-response curve)을 도시하고 있다:
huERCS-409-LC-PNU(경쇄의 C-말단에 연결된 G3-PNU를 포함하는 CS1-표적화 항체 약물 결합체(ADC));
huERCS-409-HC-PNU(중쇄의 C-말단에 연결된 G3-PNU를 포함하는 CS1-표적화 항체 약물 결합체(ADC));
huERCS-409-LC-PNU(경쇄의 C-말단에 연결된 G2-PNU를 포함하는 CS1-표적화 항체 약물 결합체(ADC));
huERCS-409-HC-PNU(중쇄의 C-말단에 연결된 G2-PNU를 포함하는 CS1-표적화 항체 약물 결합체(ADC));
hu4-2-17-LC-PNU(경쇄의 C-말단에 연결된 G3-PNU를 포함하는 ROR1-표적화 항체 약물 결합체(ADC));
hu4-2-17-HC-PNU(중쇄의 C-말단에 연결된 G3-PNU를 포함하는 ROR1-표적화 항체 약물 결합체(ADC));
hu4-2-17-LC-PNU(경쇄의 C-말단에 연결된 G2-PNU를 포함하는 ROR1-표적화 항체 약물 결합체(ADC)); 및
hu4-2-17-HC-PNU(중쇄의 C-말단에 연결된 G2-PNU를 포함하는 ROR1-표적화 항체 약물 결합체(ADC)).
이들 결과는 중쇄 상에만 독점적으로 탑재되거나 또는 경쇄 상에만 독점적으로 탑재되는 안트라사이클린 탑재물을 포함하는 항체 약물 결합체들(ADCs)의 효능이 항원 매개되는 실험실 내 효능에 필적함을 보여 준다.
도 9는 종양 세포를 정위적으로(orthotopically) 이식한 후, 비히클 대조군; 0.5 mg/kg의 이소타입 대조군 항체 약물 결합체(ADC)(두 중쇄의 C-말단 모두에 연결된 안트라사이클린 분자를 포함하는 CD30-표적화 항체 약물 결합체(ADC)); 0.5 mg/kg의 hu4-2-17-PNU(중쇄 및 경쇄의 C-말단 모두에 연결된 안트라사이클린 탑재물을 포함하는 ROR1-표적화 항체 약물 결합체(ADC)), 1.0 mg/kg의 hu4-2-17-HC-PNU(중쇄의 C-말단에 연결된 안트라사이클린 탑재물을 포함하는 ROR1-표적화 항체 약물 결합체(ADC)), 및 1.0 mg/kg의 hu4-2-17-LC-PNU(경쇄의 C-말단 상에 안트라사이클린 탑재물을 포함하는 ROR1-표적화 항체 약물 결합체(ADC))로 처리한, BALB/c 암컷 마우스의 ROR1-과발현 EMT-6(클론 14) 종양 부피(캘리퍼로 측정: 평균 표준 오차에 해당하는 오차 막대가 있는 그룹당 평균)의 진화를 도시하고 있다. 독소를 동일한 양으로 로딩하였을 경우, 중쇄 및 경쇄의 C- 말단 모두에 독소를 포함하는 ROR1-표적화 항체 약물 결합체들(ADCs)에 비해, 중쇄 또는 경쇄의 C-말단에서만 독소를 포함하는 ROR1-표적화 항체 약물 결합체들(ADCs)이 더욱 우수한 생체 내 효능을 나타내었다. 중쇄의 C-말단에서만 또는 경쇄의 C-말단에서만 독소를 포함하는 ROR1-표적화 항체 약물 결합체들(ADCs)은 본질적으로 동일한 생체 내 효능을 나타내었다.
정의(Definitions)
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 또한, 본 발명의 실시와 관련하여 독자의 이해를 돕기 위해 하기 정의를 제공한다.
용어 "항체(antibody)"는 주어진 항원, 에피토프(epitope) 또는 에피토프들(epitopes)에 대한 강한 1가, 2가 또는 다가 결합을 나타내는 폴리펩타이드 사슬(들)을 의미한다. 달리 언급되지 않는 한, 항체는 임의의 적합한 기술(예를 들어, 하이브리도마 기술(hybridoma technology), 리보솜 디스플레이(ribosome display), 파지 디스플레이(phage display), 유전자 셔플링 라이브러리(gene shuffling libraries), 반합성(semi-synthetic) 또는 완전 합성(fully synthetic) 라이브러리 또는 이들의 조합을 이용하여 생성할 수 있다. 본 발명의 항체는 온전한(intact) 항체(예; 본원에서 예시된 IgG1 항체)이다. 본원에서 달리 명시되지 않는 한, 모든 항체 및 항원-결합 단편 서열을 포함하는 모든 펩타이드 서열은 N -> C의 순서를 의미한다.
온전한 항체는 통상적으로 이황화 결합에 의해 상호 연결된 적어도 2 개의 중쇄(H)(약 45-70 kD) 및 2 개의 경쇄(L)(약 20-25 kD)를 포함한다. 항체 사슬을 암호화하는 인식된(recognized) 면역글로불린 유전자는 무수한 면역글로불린 가변 영역 유전자 뿐 아니라 카파(kappa), 람다(lambda), 알파(alpha), 감마(gamma), 델타(delta), 엡실론(epsilon) 및 뮤(mu) 불변 영역 유전자를 포함한다. 경쇄는 카파 또는 람다로 분류된다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 엡실론으로 분류되며, 이들은 다시 면역글로불린 클래스인 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE를 각각 정의한다. 항체의 각 중쇄는 중쇄 가변 영역(VH) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. IgG의 경우, 상기 중쇄 불변 영역은 CH1, CH2 및 CH3의 3 개의 영역으로 구성된다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역(VL) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 상기 경쇄 불변 영역은 하나의 영역, CL로 구성된다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호 작용하는 결합 영역을 포함한다. 상기 항체의 불변 영역은, Fc 수용체 및 보존적 보체 시스템(classical complement system)의 제 1 성분(C1q)을 발현하는 면역계의 다양한 세포를 포함하는 면역글로불린의 숙주 조직 또는 인자들(factors)에 대한 결합을 매개한다. 모노클로날 항체(mAbs)는 (이들의 암호화된 아미노산 서열들과 관련하여) 동일한 항체 분자들로 구성된다.
상기 항체의 VH 및 VL 영역들은 상보성 결정 영역(complementarity-determining regions; CDRs)으로도 불리는 초가변 영역(regions of hypervariability)으로 세분될 수 있으며, 이들은 더욱 보존된 프레임워크 영역 (framework regions; FRs)과 함께 산재되어 있다. VH 및 VL은 각각 아미노-말단에서 카르복실-말단까지 하기의 순서로 배열된 3 개의 상보성 결정 영역(CDR) 및 4 개의 프레임워크 영역(FR)들로 구성되어 있다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. CDR 및 FR 영역의 위치 및 넘버링 시스템(예; IMGT 시스템 및 카바트(Kabat) 시스템)이 정의되었다.
더욱이, 상기 항체는 제한없이 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM을 포함하는 임의의 이소타입일 수 있다. 따라서, 예를 들어, 상기 항체는 IgA1 또는 IgA2와 같은 임의의 IgA, 또는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 또는 합성 IgG와 같은 임의의 IgG 일 수 있다.
더욱이, 상기 항체는 이중 가변 도메인 면역글로불린(dual variable domain immunoglobulin; DVD-Ig) 포맷 및 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM과의 단일쇄 가변 단편(single-chain variable fragment; scFv) 융합과 같은 유도체 포맷("항체 유도체(antibody derivative)")으로 포함될 수 있다. 단일쇄 가변 영역 단편(scFv)은 단일쇄 항체, 즉, 일반적으로 스페이서 펩타이드를 통해 연결되는 폴리펩타이드 연결(linkage)에서 VH 영역 및 VL 영역을 포함하는 폴리펩타이드이다. 단일쇄 가변 영역 단편(scFv) 융합은 중쇄의 N-말단 또는 C-말단, 또는 경쇄의 N-말단에 연결된다. 상기 이중 가변 도메인 면역글로불린(DVD-Ig) 포맷은 각각의 VL/VH 쌍이 N-말단에 또 다른 VL/VH 쌍을 보유하는 Ig 형태의 항체로 구성된다. 상기 2 개의 VL/VH 쌍은 같거나 다른 항원 결합 특이성(antigen binding specificity)을 가진다. 또한, 상기 항체는 F(ab), F(ab')2 또는 단일 사슬 FV(scFv)와 같은 전형적인 항체 포맷의 단편(fragment)으로 존재할 수 있다. 의혹을 불식시키기 위해, 항체 유도체 및 항체 단편이라는 용어는 모두 표적 결합 능력(target binding capacity)을 보유하는 실시예들을 의미하고, 즉, 표적에 더이상 결합할 수 없는 실시예들을 배제한다.
용어 "키메라 항체(chimeric antibody)"는 한 종(species)으로부터의 항원을 표적으로 하는 항원-결합 영역들(VH 및 VL)과 다른 종(species)의 면역글로불린 서열에 상응하는 불변 영역을 포함하는 항체를 의미한다.
"비인간 항체(non-human antibody)"는 인간 면역글로불린 서열에 상응하는 불변 영역을 포함하지 않는 항체를 의미한다.
용어 "인간화된 항체(humanized antibody)"는, 실질적으로 모든 FR 영역들은 인간 면역글로불린 서열의 것들에 상응하는 반면, 일부 또는 전부(예를 들어, Rader C. et al., 1998 에서와 같이 경쇄 및 중쇄의 비인간 CDR3 서열만 유지), 또는 실질적으로 모든 상보성 결정 영역(CDR)이 비인간 기원이 되도록, 인간 및 비인간(예; 토끼) 면역글로불린으로부터 유래된 서열들을 포함하는 키메라 항체를 의미한다
본원에 기재된 항체 또는 단편 또는 유도체는 온전한 항체의 효소적 또는 화학적 변형에 의해 생성될 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법론을 사용하여 신규(de novo) 합성하거나, 또는 파지 디스플레이 라이브러리를 사용하여 식별할 수 있다. 이들 항체 또는 항체 유도체를 생성하는 방법은 당업계에 공지되어 있다.
본 발명의 항체 또는 단편 또는 유도체는 임의의 적합한 기술, 예를 들어, 임의의 진핵 생물 또는 원핵(non-eukaryotic) 생물 발현 또는 무세포 시스템(cell-free system)을 이용하여 생성할 수 있다. 특정 실시예들에서, 항체 또는 단편 또는 유도체는 포유동물의 발현 시스템을 이용하여 생성된다. 특정 실시예들에서, 항체 또는 단편 또는 유도체는 곤충의 발현 시스템을 이용하여 생성된다.
"치료학적 활성 화합물(Therapeutically active compounds)"은 본 발명에서 치료학적으로 유익한 효과를 제공하는 화합물을 의미하며, 특히, 항체 약물 결합체(ADC)를 포함한다. 치료학적 활성 화합물은 종종 조성물로서 제형화되며, 예를 들어 생리학적으로 허용되는 완충제로 제형화된다.
“내성(Tolerability)”은 인간 또는 다른 동물(예; 마우스, 랫트, 토끼, 원숭이 등) 또는 일단의 인간이나 일단의 동물들이 투여된 조성물(치료학적 활성 화합물을 포함하거나 이로 구성됨)의 부작용을 견딜 수 있는 정도를 의미한다. 일 실시예에서, 내성은 사망률(rate of mortality)과 관련하여 결정될 수 있다.
"부작용(Adverse effects or events)"은 치료학적 활성 화합물의 투여로 인한 바람직하지 않은 효과 또는 결과이다. 특히, 부작용은 체중의 감소, 특히 치료학적 활성 화합물로 처리한 날의 초기 체중 대비 10%, 15% 또는 20%를 초과하는 체중 감소를 포함한다. 특히, 부작용은 사망(자연 발생 모델에서 또는 안락사 기준의 이행 이후 동물 모델에서)을 포함한다. 특히, 사망에 관한 부작용은 치료학적 활성 화합물의 단일 또는 반복(일정하거나 또는 증가하는) 투여 용량에 따라, 대안적인 치료학적 활성 화합물 및/또는 완충액 대조군과 비교하여, 동물 모델 (예; 마우스, 랫트 등)에서 평가된다. 특히, 내성은 동물 모델에서 최대 허용 투여 용량(maximum tolerated dose), 즉, 치료학적 활성 화합물로 처리된 동물 그룹 내 사망자 수로 평가하며, 여기서 주어진 그룹은 투여 용량 범위에 걸쳐 주어진 투여 용량의 화합물로 처리된다.
본원에서 사용된 용어 "치료하다(treat)", "치료하는(treating)", "치료(treatment)" 및 "치료학적으로 효과적인(therapeutically effective)"은 반드시 100% 치료 또는 완전한 치료를 의미하지는 않는다. 오히려, 당업자에게 잠재적 유익 또는 치료 효과를 갖는 것으로 인식되는 다양한 정도의 치료가 존재한다. 이런 점에서, 본 발명의 방법은 임의 수준의 치료의 임의 양을 제공할 수 있다. 본 발명의 방법은 치료되는 질환의 하나 이상의 상태 또는 증상의 치료를 포함할 수 있다.
본 발명을 상세하게 기재하기 전에, 본 발명은 기재된 장치의 특정 구성 부분들 또는 기재된 방법의 프로세스 단계로 제한되지 않음을 이해해야 하는데 이는 이들 장치와 방법들이 다양하기 때문이다. 또한, 본원에 사용된 용어들은 오직 특정 실시예들을 설명하기 위한 것이며 이들을 제한하고자 하는 것이 아님을 이해해야 한다. 명세서 및 첨부된 청구 범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태("일(a)", "하나(an)"및 "상기(the)")는 문맥상 명백하게 달리 지시되지 않는 한 단수 및/또는 복수의 지칭 대상을 포함한다는 점에 유의해야 한다. 더욱이, 수치로 제한되는 매개 변수의 범위가 주어지는 경우, 이들 범위는 이러한 한계 값을 포함하는 것으로 간주된다는 것을 이해해야 한다.
또한, 본원에 개시된 실시예들은 서로 관련이 없는 개별적인 실시예들로서 이해되도록 의도된 것이 아님을 이해해야 한다. 일 실시예와 관련하여 논의된 특징들은 본원에 도시된 다른 실시예들과 관련하여서도 개시되도록 의도된다. 만일, 어떤 경우에, 특정 특징이 하나의 실시예로 개시되지 않고 다른 실시예로 개시된다면, 당업자는 상기 특징이 반드시 상기 다른 실시예로 개시되는 것을 의미하는 것은 아니라는 것을 이해할 것이다. 당업자는 다른 실시예에 대해서도 상기 특징을 개시하는 것이 본 출원의 요지임을 이해할 것이나, 그러나 그것은 명확성을 목적으로 한 것으로서 명세서를 관리 가능한 분량으로 유지하기 위한 것임을 이해할 것이다.
또한, 본원에 언급된 종래 기술 문헌의 내용은 참조로 포함된다. 이는 특히 표준 또는 일상적인 방법들을 공개하는 종래 기술 문서에 대한 것이다. 이 경우, 참조에 의한 통합은 주로 충분한 실시가능성 개시를 제공하고 장황한 반복을 피하기 위함이다.
항체 약물 결합체(ADCs)
제 1 측면에 따르면, 본 발명은:
● 적어도 하나의 경쇄 불변 영역 C-말단을 포함하는, 표적 결합 특성을 유지하는 항체, 또는 항체 단편 또는 유도체; 및
● 안트라사이클린계 소분자(anthracycline-based small molecule)를 포함하는 항체 약물 결합체(ADC)에 관한 것이며,
여기서, 상기 안트라사이클린 분자(들)은 독점적으로 상기 항체, 단편 또는 유도체의 경쇄 불변 영역 C-말단(들)에 독점적으로 연결되며, 그리고
상기 안트라사이클린계 소분자는 펩타이드 서열을 포함하는 링커를 통해 상기 항체, 항체 단편 또는 이의 유도체에 연결된다.
상기 "안트라사이클린계 소분자"는 본원에서 "안트라사이클린 분자"로도 지칭된다.
본 발명의 항체 약물 결합체(ADC)와 관련하여, 안트라사이클린 분자는 항체 또는 단편 또는 유도체 경쇄 불변 영역 C-말단 중 하나 또는 둘 모두 이외의 부위에서 항체에 공유 결합되지 않는 것으로 의도된다.
본 발명에 따른 항체 약물 결합체(ADC)의 시각적 묘사는 도 1에 도시되어 있다.
항체 관련 본 발명의 측면들
본 발명의 항체는 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 이소타입일 수 있다. 따라서, 예를 들어, 항체는 IgA1 또는 IgA2와 같은 임의의 IgA, 또는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 또는 합성 IgG와 같은 임의의 IgG 일 수 있다.
더욱이, 상기 항체는 이중 가변 영역 면역글로불린(dual variable domain immunoglobulin; DVD-Ig) 포맷 및 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM과의 단일쇄 가변 단편(single-chain variable fragment; scFv) 융합과 같은 유도체 포맷("항체 유도체(antibody derivative)")으로 포함될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 상기 항체 유도체는 DVD-Ig 포맷이다.
항체 또는 단편 또는 유도체는 1가, 2가 또는 다가 항체 일 수 있다.
항체 또는 단편 또는 유도체는 단일-특이적(mono-specific)이거나 다중-특이적(multi-specific)이다. 상기 용어 "다중-특이적(multi-specific)"은 주어진 항원의 둘 이상의 상이한 에피토프에 대해 특이성을 갖거나 또는 적어도 2 개의 다른 항원에 특이성을 갖는 항체 또는 단편 또는 유도체를 의미한다.
바람직한 실시예에서, 항체는 IgG 항체이다.
항체 또는 단편 또는 유도체는 임의의 항원을 표적으로 하거나(또는 결합하지만), 종양 특이적이거나 건강한 조직보다 종양 조직에서 더 높은 비율로 발현되는 항원을 우선적으로(preferentially) 표적으로 한다.
본원에서 "더 높은 비율로 발현된"이란 표현은 10% 이상, 바람직하게는 20% 이상 더 높은 발현; 보다 바람직하게는 30% 이상, 보다 바람직하게는 40% 이상, 보다 바람직하게는 50% 이상, 보다 바람직하게는 60% 이상,보다 바람직하게는 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상,보다 바람직하게는 90% 이상, 및 훨씬 더 바람직하게는 100% 이상 더 높은 비율로 발현됨을 의미한다. 발현 비율은 RT-PCR 또는 면역 조직 화학(Immunohistochemistry)과 같은 당업자에게 공지된 기술의 방법들로 결정될 수 있다.
특히, 상기 항원은 인간 항원일 수 있다. 바람직한 실시예에서, 상기 항원은 ROR1, ROR2, CS1, 메소텔린(mesothelin) 또는 HER2이고, 더욱 바람직하게는 ROR1, CS1 또는 HER2이며, 더욱 바람직하게는 ROR1 또는 HER2이다. 특히, 상기 항원은 인간 ROR1(GenBank 서열 NP_005003을 토대로 함), 인간 ROR2 (GenBank 서열 NP_004551.2을 기초로 함), 인간 CS1 (GenBank 서열 NM_021181.3을 토대로 함), 인간 메소텔린(GenBank 서열 NP_037536 을 토대로 함) 또는 인간 HER2 (GenBank 서열 NP_004439을 토대로 함)일 수 있다. 일 실시예에서, 항체 또는 단편 또는 유도체는 인간 및/또는 마우스 CS1에 결합하지 않으며, 본 실시예에서, 바람직하게는 항체 또는 단편 또는 유도체는 인간 CS1에 결합하지 않는다.
바람직한 실시예에서, 항체 또는 단편 또는 유도체는 상기 실시예들에 제시된 항체 또는 항체 유도체들의 상보성 결정 영역들(CDRs)을 포함한다. 특히, 항체 또는 단편 또는 유도체는 트라스투주맙의 상보성 결정 영역들(CDRs)(abYsis 소프트웨어를 이용하고 카바트 넘버링(Kabat numbering)에 기초함)을 포함할 수 있다:
Figure pat00001
특히, 항체 또는 단편 또는 유도체는 hu4-2-17의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함할 수 있다(카밧트 넘버링(Kabat numbering)에 기초함):
Figure pat00002
특히, 항체 또는 단편 또는 유도체는 huERCS-409의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함할 수 있다(카밧트 넘버링(Kabat numbering)에 기초함):
Figure pat00003
바람직한 실시예에서, 항체 또는 단편 또는 유도체는 상기 실시예들에 제시된 항체의 가변 영역을 포함한다. 특히, 항체 또는 단편 또는 유도체는 트라스투주맙의 가변 영역들(표 2의 서열 번호 1/2의 가변 영역들)을 포함할 수 있다. 특히, 항체 또는 단편 또는 유도체는 hu4-2-17의 가변 영역들(표 2의 서열 번호 4/5의 가변 영역들)을 포함할 수 있다. 특히, 항체 또는 단편 또는 유도체는 huERCS-409의 가변 영역들(표 2의 서열 번호 7/8의 가변 영역들)을 포함할 수 있다.
독소 관련 본 발명의 측면들
본 발명의 항체 약물 결합체(ADC)는 하나 또는 두 개의 안트라사이클린계 소분자들("안트라사이클린 분자")를 포함하며, 여기서 각 안트라사이클린 분자는 펩타이드 서열을 포함하는 링커를 통하여 경쇄 불변 영역 C-말단에서 상기 항체 또는 항체 유도체에 연결된다.
안트라사이클린(anthracyclines)은 암 치료에서 임상 검증된 화학 요법 약물이므로, 항체 약물 결합체(ADC)를 위한 탑재물로 사용하는 데 있어서 많은 관심을 불러 일으키는 부류의 DNA 삽입 독소이다(Minotti, 2004). 안트라사이클린은 원래 스트렙토마이세스 종(Streptomyces species)에서 유래한 항종양 활성이 높은 붉은색 폴리케타이드(polyketides)이다. 지난 40년간 다양한 고형암 및 혈액암(hematological cancers)에 화학 요법 약물로서 일상적으로 사용되는 몇몇(예; 독소루비신(doxorubicin)(아드리마이신(adriamycin)으로도 불리움), 다우노루비신(daunorubicin), 에피루비신(epirubicin), 이다루비신(idarubicin), 피라루비신(pirarubicin), 조루비신(zorubicin), 아클라루비신(aclarubicin), 카미노마이신(caminomycin) 및 발루비신(valrubicine))을 포함한 많은 유도체들이 사용되어 왔다. PNU-159682로도 불리우는 안트라사이클린 신규 유도체는 Nemorubicin의 대사 산물로 기재된 바 있으며(Quintieri, 2005), 상기 유도체는 하나의 난소암 세포주(A2780) 및 하나의 유방암(MCF7) 세포주를 이용하여 피코몰(picomolar) 내지 펨토몰(femtomolar) 범위(pico- to femtomolar range)의 실험실 내 세포 살해(in vitro cell killing)에서 매우 높은 효능을 나타내는 것으로 개시된 바 있다(WO2012/073217).
일 실시예에서, 본 발명의 항체 약물 결합체(ADC)는 펩타이드 서열을 포함하는 링커를 통하여 경쇄 불변 영역 C-말단에서 상기 항체 또는 단편 또는 유도체에 연결된 1 개의 안트라사이클린 분자를 포함한다. 일 실시예에서, 상기 항체 약물 결합체(ADC)는 펩타이드 서열을 포함하는 링커를 통하여 두 경쇄 불변 영역 C-말단의 각각에서 상기 항체 또는 단편 또는 유도체에 연결된 2 개의 안트라사이클린 분자를 포함한다.
일 실시예에서, 적어도 하나의 안트라사이클린계 소분자는 독소루비신이 아니다.
일 실시예에서, 안트라사이클린계 소분자는 화학식 (i)의 구조를 포함하는 PNU-159682 또는 이의 유도체, 또는 하기 화학식 (i)의 구조를 포함하는 이의 유도체로부터 선택된다. 바람직한 실시예에서, 물결선(wavy line)에서 링커에 결합된 독소는 WO 2016/102679에 기재된 바와 같은 식 (i)의 구조이며, 이는 본원에 참조로 포함된다:
Figure pat00004
식 (i)
Quintieri et al. (2005)에 기재된 바와 같은 PNU-159682.
안트라사이클린 분자가 아닌 독소는 식물, 곰팡이 또는 박테리아 분자일 수 있다. 몇몇 실시예에서, 상기 안트라사이클린 분자가 아닌 독소는 소분자 세포 독소, 펩타이드 독소 또는 단백질 독소이다. 이들 독소의 많은 구체적 실시예들은 당 업계에 잘 알려져 있다(예; Dyba et al., Curr. Pharm. Des. 10:2311-34, 2004; Kuyucak et al., Future Med. Chem. 6:1645-58, 2014; Beraud et al., Inflamm. Allergy Drug Targets. 10:322-42, 2011; 및 Middlebrook et al., Microbiol. Rev. 48:199-221, 1984. 참조). 몇몇 실시예에서, 상기 안트라사이클린 분자가 아닌 독소는 메이탄시노이드(maytansinoid)(예; 메이탄시놀(maytansinol) 또는 DM1 메이탄시노이드), 탁산(taxane), 칼리키아마이신(calicheamicin), 세마도틴(cemadotin), 모노메틸라우리스타틴(monomethylauristatin)(예; 모노메틸라우리스타틴 E 또는 모노메틸라우리스타틴 F) 또는 피롤로벤조디아제핀(pyrrolobenzodiazepine; PBD)일 수 있다. 상기 안트라사이클린 분자가 아닌 독소는 빈크리스틴(vincristine) 및 프레드니손(prednisone)일 수 있다. 다양한 실시예에서, 상기 안트라사이클린 분자가 아닌 독소는 항-대사제(antimetabolite)(예; 메토트렉세이트(methotrexate)와 같은 항엽산(antifolate), 5-플루오로우라실과 같은 플루오로피리미딘, 시토신 아라비노사이드(cytosine arabinoside), 또는 퓨린 또는 아데노신의 유사체); 미토 마이신-C(mitomycin-C), 닥티노마이신(dactinomycin) 또는 미트라마이신(mithramycin), 또는 피롤로벤조디아제핀(pyrrolobenzodiazepine)과 같은 비(non)-안트라사이클린 삽입성 제제(intercalating agents); 칼리키아마이신(calicheamicin), 티아시마이신(tiancimycins) 및 기타 엔다이인(enediynes)과 같은 DNA-반응제(DNA-reactive agent); 백금 유도체(예; 시스플라틴(cisplatin) 또는 카보플라틴(carboplatin)); 알킬화제(예; 질소 머스타드(nitrogen mustard), 멜팔란(melphalan), 클로람부실(chlorambucil), 부술판(busulphan), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드 니트로소우레아(ifosfamide nitrosoureas) 또는 티오테파(thiotepa)); α-아마니틴과 같은 RNA 폴리머라제 억제제; 유사 분열 억제제(antimitotic agent)(예; 빈크리스틴(vincristine)과 같은 빈카 알칼로이드(vinca alkaloid), 또는 파클리탁셀(paclitaxel) 또는 도세탁셀(docetaxel)과 같은 탁소이드(taxoid)); 토포이소머라제 억제제(예; 에토포시드(etoposide), 테니포시드(teniposide), 암사 크린(amsacrine), 토포테칸(topotecan)); 세포주기 억제제(예; 플라보피리돌(flavopyridol)); 또는 미세소관제(microbtubule agent)(예; 에포틸론(epothilone), 튜불리신(tubulysine), 전-튜불리신(pre-tubulysine), 디스코더몰라이드(discodermolide) 유사체 또는 엘레우테로빈(eleutherobin) 유사체일 수 있다. 상기 안트라사이클린 분자가 아닌 독소는 프로테아좀(proteosome) 억제제, 토포이소머라제(topoisomerase) 억제제(예; 보르테조밉(bortezomib), 암사크린(amsacrine), 에토포시드(etoposide), 에토포시드 포스페이트, 테니포시드eniposide) 또는 독소루비신(doxorubicin)), 또는 요오드(131I), 이트륨(90Y), 루테튬(177Lu), 악티늄(225Ac), 프라세오디뮴(praseodymium), 아스타틴(astatine; At), 레늄(rhenium; Re), 비스무트(bismuth; Bi 또는 Bi) 및 로듐(rhodium; Rh)를 포함하는 방사성 동위 원소일 수 있다.
상기 안트라사이클린 분자가 아닌 독소는 바람직하게는 하기로 이루어진 그룹에서 선택된다:
● 메이탄신(maytansine)을 포함하는 메이탄시노이드(maytansinoids);
● 모노메틸 아우리스타틴(monomethyl auristatin) MMAE 및 모노메틸 아우리스타틴(monomethyl auristatin) MMAF를 포함한 아우리스타틴(auristatins);
● 칼리키아마이신(calicheamicins);
● 튜불리신(tubulysins);
● 듀오카마이신(duocarmycins);
● 방사성 동위 원소들;
● 독성 탑재물을 포함하는 리포좀(liposomes);
● 단백질 독소들(protein toxins)
● 탁산(taxanes); 및/또는
● 피롤로벤조디아제핀(pyrrolobenzodiazepines).
또한, 상기 항체 약물 결합체(ADC)는 특히 이미징이 가능하도록 라벨(label) 또는 염료(dye)를 포함할 수 있다. 상기 라벨 또는 염료는 하기로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나일 수 있다: 형광 표지(형광 염료 또는 형광 단백질 포함), 발색단(chromophore) 라벨, 요오드(iodine)를 함유하는 방사성 동위 원소 라벨(예; 요오드(125I), 갈륨(67Ga), 인듐(111I), 테크네튬(99mTc), 인(32P), 탄소(14C), 삼중 수소(3H), 기타 방사성 동위 원소(예; 방사성 이온), 및/또는 단백질 라벨(예; 아비딘(avidin) 또는 스트렙타비딘(streptavidin)).
링커 관련 본 발명의 측면들
본 발명은:
● 적어도 하나의 경쇄 불변 영역 C-말단을 포함하는, 표적 결합 특성을 유지하는 항체, 또는 항체 단편 또는 유도체; 및
● 안트라사이클린계 소분자(anthracycline-based small molecule)를 포함하는 항체 약물 결합체(ADC)에 관한 것이며,
여기서, 상기 안트라사이클린 분자(들)은 독점적으로 상기 항체, 단편 또는 유도체의 경쇄 불변 영역 C-말단(들)에 독점적으로 연결되며, 및
상기 안트라사이클린계 소분자는 펩타이드 서열을 포함하는 링커를 통해 상기 항체, 항체 단편 또는 이의 유도체에 연결된다.
바람직한 실시예에서, 상기 링커의 상기 펩타이드 서열은 소르타제 효소 인식 모티프의 특이적 절단으로부터 생성된 펩타이드 모티프를 포함하거나 이로 구성되며, 상기 소르타제 효소 인식 모티프는 바람직하게는 펜타 펩타이드를 포함한다.
바람직한 실시예에서, 상기 소르타제 효소 인식 모티프는 -LPXTG-, -LPXAG-, -LPXSG-, -LAXTG-, -LPXTG-, -LPXTA- 및 -NPQTG-로 이루어진 군에서 선택되며, 여기서 X는 임의의 아미노산이며, 바람직하게는 X는 E 또는 Q이다.
WO2014140317 뿐 아니라 본원의 다른 곳에 개시된 바와 같이, 그 내용은 본원에 참조로 포함되며, 소르타제(소르타제 트랜스펩티다제(sortase transpeptidases)라고도 함)는 특정 펩타이드 모티프를 포함하는 특정 분류 신호(sorting signal)를 인식하고 절단하여 표면 단백질을 변형시키는 원핵 생물 효소군(a group of prokaryotic enzymes)을 형성한다. 상기 이 펩타이드 모티프는 본 명세서에서 "소르타제 효소 인식 모티프", "소르타제 인식 모티프", "소르타제 태그" 또는 "소르타제 인식 태그"로도 지칭된다. 대개, 주어진 소르타제 효소는 인식되는 하나 이상의 소르타제 효소 인식 모티프를 갖는다.
소르타제 효소들은 자연적으로 발생하거나 유전 공학적 조작을 거칠 수 있다(Doerr et al., 2014). 소르타제 클래스 및 이들의 상응하는 인식 서열들은 일반적으로 Spirig et al. (2011)에서 논의된다(Engineered sortases, including A 2A-9 and A 4S-9 from Staphylococcus aureus, are described in Dorr et al. (2014) 및 in Chen et al. (2011)).
소르타제 펩타이드 전이(transpeptidation)의 총괄적 개념을 배경으로 그리고 예시를 위하여, 소르타제 A는, 예를 들어, 펩타이드 전이를 촉매하기 위해 올리고-글리신-스트레치(oligo-glycine-stretch)를 친핵체(nucleophile)로 사용하며, 이로 인해, 상기 올리고-글리신의 말단 아미노기가 소르타제 인식 서열의 마지막 2 개의 C-말단 잔기를 결합시키는 펩타이드 결합에 관한 친핵성 공격에 영향을 미친다. 이는 상기 펩타이드 결합의 파괴(breakage) 및 소르타제 태그의 C-말단의 끝에서 두 번째 잔기(C-terminally second-to-last residue)와 올리고-글리신 펩타이드의 N-말단 글리신 사이에 새로운 펩타이드 결합의 형성(즉, 펩타이드 전이)를 초래한다.
하기 표는 비제한적 소르타제 효소 인식 모티프 및 특이적 절단에 따라 생성되는 펩타이드 모티프의 예를 보여주며, 후자는 항체 약물 결합체(ADC) 링커 내에 포함된다(N에서 C- 말단 방향으로):
소르타제 예시적 소르타제 효소 인식 서열 특정 절단으로 인한 해당 펩타이드 모티프
클라스 A 소르타제(예; 스타필로코커스 아우레우스 소르타제 A) LPXTG LPXT
스타필로코커스 아우레우스 소르타제 A 또는 스타필로코커스 아우레우스 기원의 조작된 소르타제 A 4S-9 LPXSG LPXS
스트렙토코커스 피오게네스 소르타제 A LPXTA LPXT
클라스 B 소르타제 NPQTN NPQT
클라스 C 소르타제 LPLTG LPLT
클라스 C 소르타제 LAFTG LAFT
클라스 D 소르타제 LPNTA LPNT
스타필로코커스 아우레우스 기원의 조작된 소르타제 A 2A-9 및 클라스 E 소르타제 LAXTG LAXT
표 1. X가 임의의 아미노산인 경우, 특정 절단으로 인한 소트라제 인식 서열 및 펩타이드 모티프소르타제의 결합(conjugation) 전에, 소르타제 효소 인식 모티프는 C-말단에서 His-태그, Myc-태그 또는 Strep-태그와 같은 다른 태그를 더 보유할 수 있다(WO2014140317의 도 4a 참조, 이 내용은 본원에 참조로 포함된다). 그러나, 소르타제 효소 인식 모티프의 4 번째 및 5 번째 아미노산 사이의 펩타이드 결합이 소르타제-매개 결합(conjugation)에 의해 절단되기 때문에, 이러한 추가적 태그들은 결합된(conjugated) 생성물에 나타나지 않는다.
소르타제 효소 인식 모티프는 유전적 융합에 의해 항체 경쇄의 C-말단(들)에 융합될 수 있고, 이와 함께 공동 발현된다. 상기 소르타제 효소 인식 모티프는 면역글로불린 경쇄 중 하나 또는 둘 모두의 마지막 자연 발생 C-말단 아미노산에 부가될 수 있으며, 이는 인간 면역글로불린 카파(kappa) 경쇄의 경우, C-말단 시스테인 잔기이다. 상기 융합 또는 부속물(appendage)은 본원의 다른 곳에 기재된 추가적 링커 요소들을 통해 직접적으로 또는 간접적으로 수행될 수 있다.
우리는 몇몇 경우에(예; 면역글로불린(Ig) 카파 경쇄의 C-말단, Beerli et al. (2015) 참조), 상기 결합 단백질(binding protein)의 C-말단과 상기 소르타제 효소 인식 모티프 사이에 아미노산을 추가로 첨가하는 것이 유리하다고 기재한 바 있다(여기서는“스페이서 서열”로 칭함). 이는 결합 단백질에 대한 탑재물의 소르타제 효소 결합 효율을 향상시키는 것으로 나타났다. Ig 카파 경쇄의 경우, 5 개의 아미노산을 상기 면역글로불린(Ig) 카파 경쇄의 마지막 C-말단 시스테인 아미노산과 상기 소르타제 효소 인식 서열 사이에 첨가하면, 결합의 동력학이 향상되는 것으로 관찰되었다(Beerli et al. (2015) 참조). 따라서, 또 다른 바람직한 실시예로서, 임의로 ≥ 1 및 ≤ 11의 아미노산들("스페이서 서열")을 항체의 마지막 C-말단 아미노산과 소르타제 인식 서열 사이에 첨가한다. 바람직한 실시예에서, 펩타이드 서열 GqS(여기서, q는 바람직하게는 1 내지 10, 보다 바람직하게는 4 또는 5 임)가 마지막 경쇄의 C-말단 아미노산과 소르타제 효소 인식 모티프 사이에 첨가된다
바람직한 실시예에서, 상기 링커의 상기 펩타이드 서열은 Gn 또는 Glyn으로 표시되는 올리고글리신 서열( "태그")을 포함하거나 이로 이루어지며, 여기서 n은 1 내지 21이고, 바람직하게는 n은 1, 2, 3, 4 또는 5이다.
바람직한 실시예에서, 상기 링커의 상기 펩타이드 서열은 소르타제 효소 인식 모티프의 특정 절단으로부터 생성된 펩타이드 모티프를 포함하거나 이로 구성되며, 바람직하게는 -LPXTGn-, -LPXAGn-, -LPXSGn-, -LAXTGn-, -LPXTGn- 및 -NPQTGn-로 구성된 군에서 선택되며, 여기서 X는 임의의 아미노산이며 바람직하게는 X는 E 또는 Q이며, 여기서 n은 1 내지 21이고, 바람직하게는 n은 1, 2, 3, 4 또는 5이다. 바람직한 실시예에서, 상기 링커의 상기 펩타이드 서열은 -LPXTGn-을 포함하거나 이로 구성되며, 여기서 X는 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 X는 E 또는 Q이고, n은 1 내지 21이고, 바람직하게는 n은 1, 2, 3, 4 또는 5이다.
안트라사이클린 분자가 화학식 (i)인 일 실시예에서, 상기 링커는 NH2-(CH2)m-NH2 형태의 알킬디아미노기를 추가로 포함하는 것이 바람직하며, 여기서 m ≥ 1 및 ≤ 11, 바람직하게는 m = 2이다. 본 실시예에서, NH2-(CH2)m-NH2의 하나의 아미노기는 화학식 (i)의 물결선(wavy line)에서 직접 연결되어 아미드 결합을 형성하는 것이 바람직하다.
안트라사이클린 분자가 화학식 (i)인 다른 실시예에서, 상기 링커는 NH2-(CH2)m-NH2 형태의 알킬디아미노기를 추가로 포함하며, 여기서 m ≥ 1 및 ≤ 11, 바람직하게는 m = 2이고, 하나의 아미노기는 링커 요소 L1을 통해 화학식 (i)의 물결 선에 연결될 수 있다.
또한, 상기 알킬디아미노기의 제 2 아미노기는 올리고펩타이드 링커에 연결되는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 올리고글리신(Glyn)이다. 바람직하게는, 올리고글리신은 1 내지 21 개의 글리신 잔기의 길이(즉, n은 1 내지 21), 바람직하게는 1, 2, 3, 4 또는 5 개의 아미노산 길이를 갖는다.
본 발명의 항체 약물 결합체(ADC)의 특정 비제한적 실시예들의 시각적 묘사는 도 2에 도시되어 있다.
다른 실시예에서, 상기 링커는 하나 이상의 추가의 절단 가능한 또는 절단 불가능한 링커를 추가로 포함할 수 있고, 바람직하게는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 히드라진 링커, 티오 우레아 링커, 자가-희생(self-immolative) 링커, 숙신이미딜 트랜스-4-(말레이미딜메틸)사이클로헥산-1-카르복실레이트(succinimidyl trans-4-(maleimidylmethyl)cyclohexane-1-carboxylate(SMCC)) 링커, 디설파이드 링커, 셀레노에테르(selenoether) 링커, 아미드 링커, 티오에테르 링커 및/또는 말레이미드 링커.
당업자는 추가의 링커들이 적합할 수 있음을 이해한다. 이러한 링커들은 절단이 불가능하거나 pH 변화, 산화 환원 전위(redox potential) 또는 특이적 세포내/세포외 효소에 의해 절단될 수 있다. 절단 가능한 올리고 펩타이드 링커는 프로테아제-또는 매트릭스 메탈로프로테아제(matrix metalloprotease)-절단 가능한 링커를 포함한다. 상기 링커는 상기 조합을 포함할 수 있는 것으로 이해된다. 예를 들어, 링커는 상기 링커는 발린-시트룰린(valine-citruline) PAB 링커일 수 있다.
약물 항체 비(drug antibody ratio; DAR) 관련 본 발명의 측면
바람직한 실시예에서, 각 경쇄 불변 영역의 C-말단에 연결된 안트라사이클린 세포를 갖도록 설계된 본 발명의 항체 약물 결합체(ADC)는, 항체와 탑재물 사이에, 1 내지 ≤ 2, 바람직하게는 1.75 내지 ≤ 2, 보다 바람직하게는 1.9 내지 ≤ 2의 임의의 값의 화학양론비를 갖는다. 이 비율은 또한 약물 대 항체 비율(drug to antibody ratio; 이하 "DAR")로 지칭될 수도 있다. 약물 대 항체 비율(DAR)을 결정하는 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있으며 역상 크로마토그래피(Reverse Phase Chromatography) 또는 HPLC-MS를 사용하는 방법을 포함한다. 소르타제-매개 펩타이드 전이 반응(transpeptidation reaction)이 100% 완전하지 않아서 상기 기재된 약물 대 항체 비율(DAR)을 갖는 항체 약물 결합체(ADC)의 제조가 이루어지는 것으로 이해된다.
항체 약물 결합체(ADC)가 추가적으로 비-안트라사이클린 독소를 포함하는 실시예들에서, DAR은 1 내지 ≤ 4 사이의 임의의 값일 수 있다.
다른 바람직한 실시예에서, 상기 하나의 경쇄 불변 영역 C-말단에만 연결된 안트라사이클린 세포를 갖도록 설계된 본 발명의 항체 약물 결합체(ADC)는, 항체와 탑재물 사이에, 0.5 내지 ≤ 1, 바람직하게는 0.75 내지 ≤ 1, 보다 바람직하게는 0.9 내지 ≤ 1의 화학량론비를 갖는다.
기능적 특성과 관련된 본 발명의 측면들
일 실시예에서, 본 발명은:
● 적어도 하나의 경쇄 불변 영역 C-말단을 포함하는, 표적 결합 특성을 유지하는 항체, 또는 항체 단편 또는 유도체; 및
● 안트라사이클린계 소분자(anthracycline-based small molecule)를 포함하는 항체 약물 결합체(ADC)에 관한 것이며,여기서, 상기 안트라사이클린 분자(들)은 독점적으로 상기 항체, 단편 또는 유도체의 경쇄 불변 영역 C-말단(들)에 독점적으로 연결되며, 그리고
상기 안트라사이클린계 소분자는 펩타이드 서열을 포함하는 링커를 통해 상기 항체, 항체 단편 또는 이의 유도체에 연결되며;
여기서, 상기 항체 약물 결합체(ADC)는 개선된 생체 내 내성, 바람직하게는 동일한 수 및 유형의 안트라사이클린 분자를 갖는 필적할만한 항체 약물 결합체들(ADCs)과 비교하여,을 나타내지만, 상기 안트라사이클린 분자(들)는 중쇄 불변 영역 C-말단 또는 중쇄 및 경쇄 불변 영역 C-말단들의 혼합물에 연결된다.
본 실시예와 관련하여, 마우스 모델에서 7 일 내지 14 일의 기간에 걸쳐, 주어진 투여 용량에 대한 사망률에 대해 내성을 평가하는 것이 바람직하다. 본 실시예와 관련하여, 내성을 2.5 내지 40 mg/kg 범위의 항체 약물 결합체(ADC)의 투여 용량을 사용하여 평가하는 것이 바람직하다.
필적할만한(comparable) 항체 약물 결합체들(ADCs)이 실험실 내에서 매우 유사한 세포 살해(cell killing) 활성을 나타낸 반면, 예기치 않게, 항체의 경쇄에 독점적으로 연결된 안트라사이클린을 갖는 항체 약물 결합체(ADC)는, 독점적으로 상기 중쇄 또는 중쇄와 경쇄 모두에 연결된 필적할만한(comparable) 항체 약물 결합체들(ADCs)(낮은 투여 용량에서는 1/5의 마우스 사망률과 높은 투여 용량에서는 5/5의 마우스 사망률을 각각 나타냄)과 비교하여, 검사된 2 개의 동일한 투여 용량 수준에서 생체 내 사망률을 나타내지 않았다(표 5 참조). 유사하게, 상기 경쇄에 독점적으로 연결된 안트라사이클린을 갖는 항체 약물 결합체(ADC)에 대한 별도의 실험에서, 상기 항체 약물 결합체(ADC)는, 상기 독소가 중쇄 단독 또는 중쇄 및 경쇄에 연결된 항체 약물 결합체들(ADCs)에 비해, 상당히 더 높은 투여 용량에서 내성을 가짐을 보여주었다. 확실히, 환자에게 안전한 투여 용량의 척도로서, 더 높은 내성은 약제에 있어 유익한 것이다.
일 실시예에서, 본 발명은:
● 적어도 하나의 경쇄 불변 영역 C-말단을 포함하는, 표적 결합 특성을 유지하는 항체, 또는 항체 단편 또는 유도체; 및
● 안트라사이클린계 소분자(anthracycline-based small molecule)를 포함하는 항체 약물 결합체(ADC)에 관한 것이며,여기서, 상기 안트라사이클린 분자(들)은 독점적으로 상기 항체, 단편 또는 유도체의 경쇄 불변 영역 C-말단(들)에 독점적으로 연결되며, 그리고
상기 안트라사이클린계 소분자는 펩타이드 서열을 포함하는 링커를 통해 상기 항체, 단편 또는 유도체에 연결되며;
여기서, 상기 항체 약물 결합체(ADC)는 동일한 수 및 유형의 안트라사이클린 분자를 갖는 필적할만한 항체 약물 결합체들(ADCs)에 비해 더 큰 생체 내 치료 지수(therapeutic index)를 제공하지만, 그러나 상기 안트라사이클린 분자(들)는 상기 중쇄 불변 영역 C-말단 또는 중쇄 및 경쇄 불변 영역 C-말단들의 혼합물에 연결된다. 상기 치료 지수는 치료 효과를 보이는 치료제의 양과 독성을 보이는 양의 비교를 나타낸다. 본 발명은 예기치 않게 경쇄의 C-말단들에 연결된 동일한 양의 독소가, 동일한 투여 용량의 중쇄의 C-말단과 비교하여, 생체 내에서 더 높은 효능을 가져옴을 보여 주었다(도 9 참조).
일 실시예에서, 본 발명은:
● 적어도 하나의 경쇄 불변 영역 C-말단을 포함하는, 표적 결합 특성을 유지하는 항체, 또는 항체 단편 또는 유도체; 및
● 안트라사이클린계 소분자(anthracycline-based small molecule)를 포함하는 항체 약물 결합체(ADC)에 있어서,
상기 안트라사이클린 분자(들)은 독점적으로 상기 항체, 단편 또는 유도체의 경쇄 불변 영역 C-말단(들)에 독점적으로 연결되며, 그리고
상기 안트라사이클린계 소분자는 펩타이드 서열을 포함하는 링커를 통해 상기 항체, 항체 단편 또는 이의 유도체에 연결되는, 항체 약물 결합체(ADC)에 관한 것이고;
여기서, 동일한 치료 효능을 위해, 상기 항체 약물 결합체(ADC)는, 바람직하게는 동일한 수와 유형의 안트라사이클린 분자를 갖는 필적할만한 항체 약물 결합체들(ADCs)에 비해, 생체 내 투여 빈도 감소 및/또는 투여 용량 감소가 요구되나, 그러나 안트라사이클린 분자(들)는 상기 중쇄 불변 영역 C-말단 또는 중쇄 및 경쇄 불변 영역 C-말단들의 혼합물에 연결된다.
일 실시예에서, 본 발명은:
● 적어도 하나의 경쇄 불변 영역 C-말단을 포함하는, 표적 결합 특성을 유지하는 항체, 또는 항체 단편 또는 유도체; 및
● 안트라사이클린계 소분자(anthracycline-based small molecule)를 포함하는 항체 약물 결합체(ADC)에 관한 것이며,
여기서, 상기 안트라사이클린 분자(들)은 독점적으로 상기 항체, 단편 또는 유도체의 경쇄 불변 영역 C-말단(들)에 독점적으로 연결되며, 그리고
상기 안트라사이클린계 소분자는 펩타이드 서열을 포함하는 링커를 통해 상기 항체, 항체 단편 또는 이의 유도체에 연결되며;
여기서, 상기 항체 약물 결합체(ADC)는, 바람직하게는 동일한 수 및 유형의 안트라사이클린 분자를 갖는 필적할만한 항체 약물 결합체들(ADCs)에 비해, 감소된 소수성(hydrophobicity)을 나타내며, 그러나 상기 안트라사이클린 분자(들)는 상기 중쇄 불변 영역 C-말단 또는 중쇄 및 경쇄 불변 영역 C-말단들의 혼합물에 연결된다. 이러한 감소된 소수성은 항체 약물 결합체(ADC)의 취급(handling) 및 제형(formulation)을 개선할 수 있다.
약학적 조성물
일부 관련 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 치료학적 유효량의 항체 약물 결합체(ADC) 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제 조성물을 제공한다.
상기 약학적으로 허용가능한 담체는 인간 또는 수의과 대상체(veterinary subject)에 투여하기에 적합한 하나 이상의 상용성(compatible) 고체 또는 액체 충진제, 희석제, 기타 부형제 또는 캡슐화 물질들(encapsulating substances)일 수 있다(예; 생리학적으로 허용가능한 담체 또는 약학적으로 허용가능한 담체). 상기 용어 "담체"는 천연 또는 합성된 유기 또는 무기 성분을 나타내며, 유효 성분의 사용(예; 유효 성분을 대상체에게 투여)을 용이하게 하기 위해 유효 성분과 혼합된다. 상기 약학적으로 허용가능한 담체는, 조성물에 둘 이상의 약학적으로 허용가능한 담체들이 원하는 약학적 효능을 실질적으로 손상시키지 않는 방식으로 상기 조성물에 존재하는 경우, 하나 이상의 활성 성분들(active components)(예; 하이브리드 분자)과 및 상호 간에 공동 혼합(co-mingled)할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체들은 통상적으로 메스꺼움, 현기증, 발진 또는 위통(gastric upset)과 같은 바람직하지 않은 생리적 효과를 야기시킴 없이 대상체(예; 환자)에 투여될 수 있다. 치료 목적으로 인간 환자에게 투여될 때, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물은 면역원성(immunogenic)이 아닌 것이 바람직하다.
본 발명의 약학적 조성물은, 예를 들어 아세트산염, 구연산염, 붕산염 및 인산염을 포함하는, 적합한 완충제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 조성물은 또한 벤즈알코늄 클로라이드(benzalkonium chloride), 클로로부탄올(chlorobutanol), 파라벤(parabens) 및 티메로살(thimerosal)과 같은 적합한 보존제를 임의로 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 단위 투여(unit dosage) 형태로 제공될 수 있으며, 이들 중 다수는 약학 분야에 잘 알려진 임의의 적합한 방법에 의해 제조될 수 있다. 이들 방법은 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편을 하나 이상의 보조 성분(accessory ingredients)을 구성하는 담체와 유대(association)시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 상기 조성물은 유효 성분(active agent)을 액체 담체, 미분(finely divided) 고체 담체 또는 둘 모두와 균일하고 밀접하게 결합시킨 후, 필요 시 생성물을 성형(shaping)함으로써 제조된다.
비경구 투여에 적합한 조성물은 본 발명의 조성물의 멸균 수성 제제(preparation)를 편리하게 포함하며, 이는 바람직하게는 수혜자(recipient)의 혈액과 등장성(isotonic)이다. 상기 수성 제제는 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁 제를 사용하여 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다. 멸균 주사용 제제는 비독성 비경구적으로 허용가능한 희석제 또는 용매 상의 멸균 주사용 용액 또는 현탁액, 예를 들어, 1,3-부탄디올 상의 용액일 수 있다. 사용될 수 있는 허용가능한 비히클 및 용매로는 물, 링거액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 멸균 고정유(fixed oils)가 통상적으로 용매 또는 현탁 매질로서 사용된다. 이를 위해, 합성 모노-또는 디-글리세리드(di-glycerides)와 같은 임의의 블랜드 고정유(fixed oils)가 사용될 수 있다. 또한, 올레산과 같은 지방산이 주사제의 제조에 사용될 수 있다. 경구, 피하, 정맥 내, 근육 내 투여 등에 적합한 담체 제형들(formulations)은 Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA. 에서 찾을 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 제조 및 다양한 투여 경로는 당업계에 공지된 방법에 따라 수행될 수 있다. 본 발명의 문맥상 유용한 전달 시스템은, 본 발명의 조성물이 치료할 부위의 감작(sensitization)을 유발하기 전에 충분한 시간을 두고 전달될 수 있도록, 시간 경과에 따른 방출(time-released), 지연 방출(delayed release) 및 서방성 방출(sustained release) 전달 시스템들을 포함한다. 본 발명의 조성물은 다른 치료제 또는 치료 요법과 함께 사용될 수 있다. 이러한 시스템들은 본 발명의 조성물을 반복적으로 투여하는 것을 피할 수 있으며, 이로써 대상체 및 의사에 대한 편의성을 증대하고, 본 발명의 특정 조성물에 특히 적합할 수 있다.
많은 유형의 방출 전달 시스템이 현재 이용 가능하고 당업자에게도 공지되어 있다. 적합한 방출 전달 시스템은 폴리(락티드-글리콜라이드)(poly(lactide-glycolide)), 코폴리옥살레이트(copolyoxalates), 폴리카프로락톤(polycaprolactones), 폴리에스테르아미드(polyesteramides), 폴리오르토에스테르(polyorthoesters), 폴리히드록시 부티르산(polyhydroxybutyric acid) 및 폴리 무수물(polyanhydrides)과 같은 중합체 염기 시스템(polymer base systems)을 포함한다. 약물을 포함하는 상기 중합체의 마이크로 캡슐은 예를 들어 미국 특허 5,075,109에 기재되어있다. 또한, 전달 시스템은 콜레스테롤, 콜레스테롤 에스테르와 같은 스테롤, 및 모노(mono-), 디(di-), 및 트리글리세리드(triglycerides)와 같은 지방산 또는 중성 지방; 하이드로겔 방출 시스템; 실라스틱(sylastic) 시스템; 펩타이드 기반 시스템; 왁스 코팅; 통상적인 결합제 및 부형제를 사용하는 압축 정제(compressed tablets); 부분적으로 융합된 임플란트 등을 포함하는 지질(lipids)인 비중합체(non-polymer) 시스템을 포함한다. 구체적 실시예들은 (a) 활성 조성물이 미국 특허 4,452,775, 4,667,014, 4,748,034 및 5,239,660에 기재 된 것과 같은 매트릭스 내의 형태로 포함된 침식 시스템(erosional systems) 및 (b) 미국 특허 3,832,253 및 3,854,480에 기재된 바와 같이 활성 성분이 중합체로부터 제어된 속도로 침투하는 확산 시스템을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 펌프-기반 하드웨어 전달 시스템을 사용할 수 있으며, 이 중 일부는 이식(implantation)에 적합하다.
일반적으로, 본 발명의 항체 약물 결합체(ADC) 또는 약학 조성물은 적절히 포장된다(예; 약병, 파우치, 앰플 및/또는 치료 방법에 적합한 임의의 용기). 성분은 농축액(동결 건조 조성물 포함)으로 제공될 수 있으며, 이는 사용 전에 추가로 희석되거나, 또는 사용 농도로 제공될 수 있다. 생체 내에서 본 발명의 항체 약물 결합체(ADC)를 사용하기 위해, 단일 투여 용량(single dosages)을 바람직한 성분의 양 및 농도를 갖는 멸균 용기에 제공할 수 있다.
항체 약물 결합체(ADC)를 생산하는 수단 및 방법에 의해 수득한 항체 약물 결합체(ADC)s
첫 번째 측면에 따르면, 본 발명은:
● 적어도 하나의 경쇄 불변 영역 C-말단을 포함하는, 표적 결합 특성을 유지하는 항체, 또는 항체 단편 또는 유도체; 및
● 안트라사이클린계 소분자(anthracycline-based small molecule)를 포함하는 항체 약물 결합체 (ADC)에 관한 것이며,
여기서, 상기 안트라사이클린 분자(들)은 독점적으로 상기 항체, 단편 또는 유도체의 경쇄 불변 영역 C-말단(들)에 독점적으로 연결되며, 그리고
상기 안트라사이클린계 소분자는 펩타이드 서열을 포함하는 링커를 통해 상기 항체, 항체 단편 또는 이의 유도체에 연결된다.
일 실시예에서, 본 발명의 항체 약물 결합체(ADC)는:
a) 경쇄의 C-말단들에서 소르타제(sortase) 효소 인식 모티프를 보유하는 항체 또는 단편 또는 유도체; 및
b) 하나 이상의 안트라사이클린계 소분자(여기서 각 소분자는 올리고 글리신(oligoglycine) 태그를 보유함)를 부위-특이적(site-specific) 소르타제(sortase) 효소-매개 결합에 의해 수득될 수 있다.
본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는 본 발명의 항체 약물 결합체(ADC)의 생산 방법에 관한 것이다:
a) 경쇄의 C-말단(들)에서 소르타제(sortase) 효소 인식 모티프를 보유하는 항체 또는 유도체를 제공하는 단계;
b) 올리고글리신(oligoglycine) 태그를 각각 보유하는 하나 이상의 안트라사이클린계 소분자를 제공하는 단계; 및
C) 상기 소르타제(sortase) 효소 인식 모티프를 인식하는 소르타제(sortase) 효소를 이용하여, 소르타제(sortase) 효소-매개 결합에 의해, 상기 항체 또는 유도체와 상기 하나 이상의 안트라사이클린계 소분자를 결합하는 단계.
바람직하게는, 본원에서 논의된 모든 실시예들에서, 상기 소르타제 효소 인식 모티프는 경쇄의 C-말단(들)에만 독점적으로 제공된다.
본원에서 논의된 모든 실시예(스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) 소르타제 A가 사용되는 경우)에서, 올리고-글리신 Glyn은 올리고-알라닌 Alan으로 임의 대체될 수 있음을 이해하는 것이 중요하다.
본원에 언급된 임의의 다른 제한들 뿐 아니라 이전에 언급된 모든 항체 또는 항체 단편 또는 이의 유도체, 안트라사이클린계 소분자, 링커 및 소르타제와 관련한 제한들은 본 발명의 항체 약물 결합체(ADC)와 관련된 실시예들의 바람직한 실시예들은 부위-특이적 소르타제 효소-매개 결합 및 ADC의 제조 방법에 의해 수득된다.
의학적 용도 및 치료 방법
본 발명은 추가로 본원에 기재된 바와 같은 신생물성 질환(neoplastic disease)을 앓고 있거나, 발병 위험이 있거나 및/또는 진단되는 대상체의 치료에 사용하기 위한 항체 약물 결합체(ADC)에 대한 것이다.
본 발명은 추가로 본원에 기재된 바와 같은 면역 질환(immune disease) 또는 면역 이상(immune disorder)을 앓고 있거나, 발병 위험이 있거나 및/또는 진단되는 대상체의 치료에 사용하기 위한 항체 약물 결합체(ADC)에 대한 것이다. 대안으로서, 신생물 질환을 앓고 있거나, 발병 위험이 있거나 및/또는 진단되는 환자를 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 치료학적 유효량 또는 투여 용량으로 상기 기재에 따른 항체 약물 결합체(ADC)를 투여하는 것을 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "치료하는" 또는 "치료"는 반드시 100% 또는 완전한 치료를 의미하지는 않는다. 오히려, 당업자에게 잠재적 이익 또는 치료학적 효과를 갖는 것으로 인식되는 다양한 정도의 치료가 존재한다. 이런 관점에서, 본 발명의 방법은 임의의 양의 임의의 수준의 치료를 제공할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법에 의해 제공되는 치료는 치료되는 질환의 하나 이상의 상태 또는 증상의 치료를 포함할 수 있다. 특히, 상기 치료는 정맥 내 주입(intravenous infusion)으로 투여될 수 있다.
일 실시예에서, 상기 항체 약물 결합체(ADC)는 단독 요법(monotherapy)으로 투여된다. 대안적인 실시예에서, 상기 항체 약물 결합체(ADC)는 추가적인 치료제와 함께 또는 추가 치료제와 병행하여 투여된다.
특히, 상기 항체 약물 결합체(ADC)는 약 0.1-20 mg/kg의 용량으로 투여될 수 있다.
상기 용어 "대상체(subject)"는 인간 및 비인간 동물(특히 비인간 포유동물), 바람직하게는 인간 동물을 의미한다.
실시예
본 발명이 도면 및 상기 기재에서 상세하게 도시되고 기재되었지만, 이러한 예시 및 기재는 예시적이거나 실례적인 것에 제한되지 않는 것으로 간주되어야 하며; 본 발명은 개시된 실시예들에 제한되지 않는다. 개시된 실시예들에 대한 다른 변형은 도면, 개시 및 첨부된 청구 범위의 연구로부터 청구된 발명을 실시함에 있어 당업자에 의해 이해되고 효력을 가질 수 있다. 청구 범위에서, "포함하는(comprising)"이라는 단어는 다른 요소 또는 단계를 배제하지 않으며, 부정 관사 "일(a)" 또는 "하나의(an)"는 복수를 배제하지 않는다. 특정 조치들이 서로 다른 종속항들에서 인용된다는 사실은 이러한 조치들의 조합이 유리하게 사용될 수 없다는 것을 의미하지 않는다. 청구 범위의 임의의 참조 부호(reference signs)는 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
본원에 개시된 모든 아미노산 서열은 N-말단에서 C-말단으로 표시된다 (도 1을 제외하고, 방향(orientation)은 C- 내지 N-말단으로 도시됨); 본원에 개시된 모든 핵산 서열은 5 '-> 3'으로 도시되어 있다.
실시예 1: 항체 발현 및 정제(purification)
발현 벡터: 인간 CS1에 결합하도록 상기 결정된 Fab 서열을 인간 발현을 위해 코돈-최적화하였고; 가변 영역을 GenScript(Piscataway, USA)에서 DNA로 합성하고 적절한 제한 부위(restriction sites) 및 적절한 불변 영역을 함유하는 발현 벡터 내에 포함시켰다(HEK293T 세포 내 발현은 Waldmeier et al. 2016에 따르고 CHO 세포 내 발현은 Beerli et al. 2015 에 따름).
HEK 발현(expression) 및 정제(purification):
고농도 글루코스(4.5 g/l) DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 성장 배지(L-글루타민과 10%(v/v) 송아지 태아 혈청(FCS)), 100 IU/mL의 펜-스트렙-펀지존(pen-strep-fungizone) 및 2 mM L-글루타민(전체 구입: Bioconcept, Allschwil, 스위스))에서 PLUS™ 시약과 Lipofectamine® LTX 시약(Thermo Fisher Scientific, Reinach, 스위스, 15388100)을 사용하여 37°C, 5% CO2 조건에서 하루 동안 배양 후, 발현 벡터들을 HEK293T 세포로 형질감염시키고(transfected)(Thermo Fisher Scientific, Reinach, 스위스, 15388100); 선택 조건 하(2 μg/mL의 퓨로마이신(Sigma-Aldrich, Buchs SG, 스위스, 2 mg/mL의 P8833-25 mg 스톡(stock))에서 상기 세포들을 확산시켰다(expanded). 상기 세포들을 분할(split) 후, 추가로 확산시켰다(expanded)(37°C, 5% CO2); 일단 상기 세포들이 세포 밀집상태(confluency)에 도달하면, 조직 배양 접시를 20 ℃/ml의 폴리-L-라이신(Sigma-Aldrich, P1524)으로 37 ℃에서 2 시간 동안 코팅하고 PBS로 2 회 세척하였다. 이어서, 상기 세포들을 트립신으로 처리하고 폴리-L-라이신-코팅된 플레이트 상에 1:3으로 분할하였다(split). 세포 밀집상태(confluency)에 도달 후, 상기 세포들을 PBS로 세척 후 1 μg/mL puromycin(Sigma, P8833), 100 IU/mL의 펜-스트렙-펀지존(pen-strep-fungizone)(Bioconcept), 161 μg/mL의 N-아세틸-L-시스테인(Sigma-Aldrich, A8199) 및 10 μg/mL의 환원형 L-글루타치온(L-glutathione reduced)(Sigma-Aldrich, G6529)이 보충된 생산 배지(DMEM/F-12, Gibco/Thermo Fisher Scientific, 31330-03)로 배지를 교체하였다. 상등액을 격주로 수거 후 여과하여 세포를 제거한 후 정제(purification)할 때까지 4°C에서 보관하였다.
정제를 위해, 여과된 상등액을 PBS-평형화된 단백질 A 컬럼에 로딩하고 PBS로 세척하였다; 순수 AKTA(GE Healthcare) 상에서 0.1 M 글리신(pH 2.5)을 사용하여 용출(elution)을 수행하였다. 분획물들을 1 M Tris-HCl 완충액(pH 8.0)으로 즉시 중화시키고 단백질 순도 및 온전성(integrity)을 SDS-PAGE로 분석하였다. 단백질을 포함하는 분획물들을 모아서 Amicon 여과 장치(Millipore, Schaffhausen, 스위스, UFC901008)를 사용하여 완충액 교환을 실시하여 1:100으로 희석 후, 저 유지 필터(low retention filter; 0.20 μm, Carl Roth, Karlsruhe, 독일, PA49.1)를 이용하여 멸균 여과하였다.
CHO 발현 및 정제: 각각의 전장(full-length) 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 발현 벡터들을 포유동물 발현 벡터에 조립하였다. CHO 세포에서 항체를 당업계에 공지된 방법에 의해 일시적으로 발현시키고, 당업계에 공지된 대로, 재조합 항체를 CHO 세포 상등액으로부터 표준 단백질 A 정제에 의해 정제하였다. 간단히 말하면, CHO 세포 상등액을 FPLC-기반 친화성 정제를 하기 전에 단백질 A 컬럼을 사용하여원심분리에 의해 수확하고 멸균 여과(0.2 μm)하였다. 결합된 항체를 0.1 M 글리신(pH 2.5 내지 3.5)에서 용출시킨 후, 즉시 1 M 트리스-HCl 완충액(pH 7.5)으로 중화시켰다. 원하는 최종 제형 완충액으로의 완충액 교환은 당업계에 공지된 바와 같이 수행되었다(예; 투석 또는 TFF). 상기 재조합 항체의 순도 및 온전성(integrity)은 SDS-PAGE, SEC 및 MS에 의해 분석하였다.
서열 번호
이름		 아미노산 서열( 밑줄이 있는 불변 영역, abYsis 소프트웨어를 이용하여 Kabat 시스템을 기반으로 CDRs가 식별됨, Swindells et al., 2017, 볼드체)
HC: 중쇄, LC: 경쇄
서열 번호 1
트라스투주맙 HC
(K467R 돌연변이)		 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGR
서열 번호 2
트라스투주맙 LC		 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
서열 번호 3
트라스투주맙 HC		 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
서열 번호 4
hu4-2-17 HC		 QVQLRESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFDISSYYMSWVRQPPGKGLEWIGAIGISGNAYYASWAKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDHPTYGMDLWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
서열 번호 5
hu4-2-17 LC		 SYELTQPPSVSVAPGKTARITCEGNNIGSKAVHWYQQKPGQAPVLVIYDDDERPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSAYVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHKSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
서열 번호 6
hu4-2-17 HC (K467R 돌연변이)		 QVQLRESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFDISSYYMSWVRQPPGKGLEWIGAIGISGNAYYASWAKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDHPTYGMDLWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGR
서열 번호 7
huERCS-409 HC		 EQQVVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFSLNSYGVIWVRQAPGKGLEYVSIIGSSGNTYYASSVKGRFTISRDTRLNTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARYYGDSGFDSWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
서열 번호 8
huERCS-409 LC		 DQQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIGSWLSWYQQKPGKAPKLLIYGASNLASGVPSRFSGSRSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCLGASPNGWAFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
서열 번호 9
huERCS-409 HC (K467R 돌연변이)		 EQQVVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFSLNSYGVIWVRQAPGKGLEYVSIIGSSGNTYYASSVKGRFTISRDTRLNTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARYYGDSGFDSWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGR
서열 번호 10
Ac10 HC		 QIQLQQSGPEVVKPGASVKISCKASGYTFTDYYITWVKQKPGQGLEWIGWIYPGSGNTKYNEKFKGKATLTVDTSSSTAFMQLSSLTSEDTAVYFCANYGNYWFAYWGQGTQVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
서열 번호 11
Ac10 LC		 DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDFDGDSYMNWYQQKPGQPPKVLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
표 2. 실시예들의 항체 아미노산 서열들 표 3은 후속 실시예들에서 사용된 항체 배치(batches)의 발현 및 정제에 사용되는 프로토콜 및 이들의 최종 농도 및 완충액을 열거하고 있다.
항체
(참조 기호)		 항체 서열
중쇄/경쇄(HC/LC) 		C-말단 태그드
(HC: 중쇄, LC: 경쇄) 		CHO/
HEK 		완충액
Tras
(mab183)		 HC: 서열 번호 1
LC: 서열 번호2		 HC: LPETG-Strep
LC: G4SLPETG-Strep		 CHO 100 mM L-아르기닌을 포함하는 PBS
Tras-HC
(mab090)		 HC: 서열 번호 3
LC: 서열 번호 2		 HC: LPETG-Strep
LC: 없음		 CHO PBS
Tras-LC
(mab106)		 HC: 서열 번호 3
LC: 서열 번호 2		 HC: 없음
LC: G4SLPETG-Strep		 CHO PBS
Tras
(mab302)		 HC: 서열 번호 1
LC: 서열 번호 2		 HC: LPETG-Strep
LC: G4SLPETG-Strep		 HEK PBS
Tras-HC
(mab364)		 HC: 서열 번호 3
LC: 서열 번호 2		 HC: LPETG-Strep
LC: 없음		 HEK PBS
Tras-LC
(mab363)		 HC: 서열 번호 3
LC: 서열 번호 2		 HC: 없음
LC: G4SLPETG-Strep		 HEK PBS
hu4-2-17
mab321		 HC: 서열 번호 6
LC: 서열 번호 5		 HC: LPETG-Strep
LC: G4SLPETG-Strep		 CHO PBS
hu4-2-17
mab339		 HC: 서열 번호 6
LC: 서열 번호 5		 HC: LPETG-Strep
LC: 없음		 CHO PBS
hu4-2-17
mab338		 HC: 서열 번호 4
LC: 서열 번호 5		 HC: 없음
LC: G4SLPETG-Strep		 CHO PBS
huERCS-409 (mab325) HC: 서열 번호 9
LC: 서열 번호 8		 HC: LPETG-Strep
LC: G4SLPETG-Strep		 HEK PBS
huERCS-409-HC (mab331) HC: 서열 번호 9
LC: 서열 번호 8		 HC: LPETG-Strep
LC: 없음		 HEK PBS
huERCS-409-LC (mab332) HC: 서열 번호 7
LC: 서열 번호 8		 HC: 없음
LC: G4SLPETG-Strep		 HEK PBS
hu4-2-17
(mab405)		 HC: 서열 번호 6
LC: 서열 번호 5		 HC: LPETG-TwinStrep
LC: G4SLPETG-TwinStrep		 CHO 20 mM 히스티딘, pH 6.5, 150 mM NaCl
hu4-2-17
(mab461)		 HC: 서열 번호 6
LC: 서열 번호 5		 HC: LPQTGG
LC: 없음		 CHO 20 mM 히스티딘, pH 6.5, 150 mM NaCl
hu4-2-17
(mab462)		 HC: 서열 번호 6
LC: 서열 번호 5		 HC: 없음
LC: G4SLPQTGG		 CHO 20 mM 히스티딘, pH 6.5, 150 mM NaCl
Ac10-HC
(mab341)		 HC: 서열 번호 10
LC: 서열 번호 11		 HC: LPETG-TwinStrep
LC: 없음		 CHO PBS
Ac10-LC
(mab340)		 HC: 서열 번호 10
LC: 서열 번호 11		 HC: 없음
LC: G4SLPETG-TwinStrep		 CHO PBS
표 3. 실시예들에서 사용되는 항체 배치(batches)의 발현 및 정제에 사용되는 프로토콜 소르타제 A. WO2014140317A1에 개시된 바와 같이, 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 기원의 재조합 및 친화성 정제된 소르타제 A 효소를 대장균에서 제조하였다.
글리신-변형(modified) 독소의 생성. 펜타글리신-변형 EDA-안트라사이클린 유도체(G5-PNU), 트리글리신-변형 EDA-안트라사이클린 유도체(G3-PNU) 및 디글리신-변형 EDA- 안트라사이클린 유도체(G2-PNU)는 Concortis/Levena에 의해 제조되었다(각각 도 3(A), 3(B), 및 3(C)). 글리신-변형 독소의 온전성(identity) 및 순도는 질량 분석(mass-spectrometry) 및 HPLC에 의해 확인되었다. 각 Gly-변형 독소는 HPLC 크로마토그램에서 단일 피크에 의해 측정 시> 95% 순도를 나타내었다.
소르타제-매개 항체 결합(antibody conjugation). 상기 언급된 독소들은, 표 4에 따라, 태그된 mAb [10μM]를 결합 완충액(conjugation buffer)(50 mM HEPES, pH 7.5, 1 mM CaCl2, 150 mM NaCl, 10% 부피 글리세롤)에서 글리신 변형 독소[200μM] 및 3-4 μM 소르타제 A와 함께 25°C에서 3.5 시간 배양함으로써 항체에 결합되었다. 상기 결과물을 단백질 A 컬럼에 통과시켜 반응을 정지시켰다(rProtein A Gravitrap 컬럼, GE Healthcare). 결합된 결합체(conjugate)를 5 컬럼 부피의 용출 완충액(elution buffer)(0.1 M 글리신 pH 2.5, 50 nM NaCl)으로 용출시키고, 1 컬럼 부피 분획물을 최대 25%(v/v) 1 M Tris- 또는 HEPES(pH 8) 염기를 포함하는 튜브에 수집하여 중화시켰다. 단백질 포함 분획물을 수집 후 표 4의 제형 완충액(formulation buffer)에서 제형화하였다.
항체 약물 결합체(ADC) 분석(analytics). 약물 항체 비(DAR)를 Polymer Labs PLRP(25-분 선형 구배(0.05 및 0.1% TFA/H2O 와 0.04 내지 0.1% TFA/CH3CN)를 가지는 2.1 mm x 5 cm, 5μm column을 1 mL/min/80°C에서 수행)에서 수행된 역상 크로마토그래피(Reverse Phase Chromatography)로 평가하였다. 샘플들을 DTT와 함께 37 ℃, pH 8.0에서 15 분 동안 배양함으로써 우선 환원시켰다(reduced). 역상 크로마토그래피에 의해 측정된 약물 항체 비(DAR)는 하기 표 4에 요약되어 있다.
항체 약물 결합체(ADC)
(참조 기호)		 mAb
(참조 기호)		 독소 제형 완충액 약물 항체 비(DAR)
Tras-PNU
(adc424)		 mab183 G5-PNU 10 mM 숙신산염 pH 5.0, 175 mM 수크로오스, 0.02% 트윈20 3.90
Tras-HC-PNU (adc421) mab090 G5-PNU 10 mM 숙신산염 pH 5.0, 175 mM 수크로오스, 0.02% 트윈20 1.96
Tras-LC-PNU (adc422) mab106 G5-PNU 10 mM 숙신산염 pH 5.0, 175 mM 수크로오스, 0.02% 트윈20 1.95
Tras-PNU
(adc667)		 mab302 G3-PNU 10 mM 숙신산염 pH 5.0, 175 mM 수크로오스, 0.02% 트윈20 3.90
Tras-HC-PNU (adc668) mab364 G3-PNU 10 mM 숙신산염 pH 5.0, 175 mM 수크로오스, 0.02% 트윈20 1.96
Tras-LC-PNU (adc669) mab363 G3-PNU 10 mM 숙신산염 pH 5.0, 175 mM 수크로오스, 0.02% 트윈20 1.97
hu4-2-17-PNU (adc519) mab321 G3-PNU 15 mM 히스티딘 pH 6.5, 175 mM 수크로오스, 0.02% 트윈20 3.91
hu4-2-17-HC-PNU (adc520) mab339 G3-PNU 15 mM 히스티딘 pH 6.5, 175 mM 수크로오스, 0.02% 트윈20 1.98
hu4-2-17-LC-PNU (adc521) mab338 G3-PNU 15 mM 히스티딘 pH 6.5, 175 mM 수크로오스, 0.02% 트윈20 1.96
huERCS-409-PNU (adc489) mab325 G3-PNU 15 mM 히스티딘 pH 6.5, 175 mM 수크로오스, 0.02% 트윈20 3.89
huERCS-409-HC-PNU (adc490) mab331 G3-PNU 15 mM 히스티딘 pH 6.5, 175 mM 수크로오스, 0.02% 트윈20 1.98
huERCS-409-LC-PNU (adc522) mab332 G3-PNU 15 mM 히스티딘 pH 6.5, 175 mM 수크로오스, 0.02% 트윈20 1.83
hu4-2-17-PNU (adc828) mab405 G2-PNU 15 mM 히스티딘 pH 6.5, 175 mM 수크로오스, 0.02% 트윈20 3.92
hu4-2-17-HC-PNU (adc822) mab461 G2-PNU 15 mM 히스티딘 pH 6.5, 175 mM 수크로오스, 0.02% 트윈20 1.98
hu4-2-17-LC-PNU (adc826) mab462 G2-PNU 15 mM 히스티딘 pH 6.5, 175 mM 수크로오스, 0.02% 트윈20 1.98
Tras-LC-PNU (adc588) mab363 G3-PNU 10 mM 숙신산염 pH 5.0, 175 mM 수크로오스, 0.02% 트윈20 1.92
Tras-HC-PNU (adc589) mab364 G3-PNU 10 mM 숙신산염 pH 5.0, 175 mM 수크로오스, 0.02% 트윈20 1.97
Ac10-HC-PNU (adc782) mab341 G3-PNU PBS 1.97
Ac10-LC-PNU (adc611) mab340 G3-PNU PBS 1.93
huERCS-409-LC-PNU (adc572) mab356 G3-PNU 15 mM 히스티딘 pH 6.5, 175 mM 수크로오스, 0.02% 트윈20 1.89
huERCS-409-HC-PNU (adc758) mab404 G3-PNU 15 mM 히스티딘 pH 6.5, 175 mM 수크로오스, 0.02% 트윈20 1.97
huERCS-409-LC-PNU (adc763) mab422 G2-PNU 15 mM 히스티딘 pH 6.5, 175 mM 수크로오스, 0.02% 트윈20 1.89
huERCS-409-HC-PNU (adc762) mab421 G2-PNU 15 mM 히스티딘 pH 6.5, 175 mM 수크로오스, 0.02% 트윈20 1.94
hu4-2-17-LC-PNU (adc573) mab357 G3-PNU 15 mM 히스티딘 pH 6.5, 175 mM 수크로오스, 0.02% 트윈20 1.92
hu4-2-17-HC-PNU (adc759) mab406 G3-PNU 15 mM 히스티딘 pH 6.5, 175 mM 수크로오스, 0.02% 트윈20 1.97
hu4-2-17-LC-PNU (adc761) mab420 G2-PNU 15 mM 히스티딘 pH 6.5, 175 mM 수크로오스, 0.02% 트윈20 1.92
hu4-2-17-HC-PNU (adc760) mab419 G2-PNU 15 mM 히스티딘 pH 6.5, 175 mM 수크로오스, 0.02% 트윈20 1.91
표 4. 실시예들에서 사용되는 항체 약물 결합체(ADC)의 생성에 사용되는 프로토콜실시예 2:
모든 내성 평가는 Aurigon에서 수행되었다. 상기 표 5의 항체 약물 결합체들(ADCs)(PBS에 제형화됨)를 5 마리의 CD-1 암컷 마우스(5-6 주령; Charles River, Sulzfeld, 독일) 그룹에 14 일(제 1일 및 제 8 일에, 볼루스를 통하여(via bolus) 정맥 내 투여에 의해)에 걸쳐 지시된 용량으로 2 회 투여하였다. 마우스를 케이지 당 5 마리의 동물 그룹으로 수용하였고, 물 및 펠렛(pellets)을 자유로이(ad libitum) 제공하였다. 연구 전체에 걸쳐 매일 2 회 모니터링된 파라미터로서 사망률 및 케이지측(cage-side) 임상 관찰을 포함하였다.
항체 약물 결합체(ADC) 제 14일의 사망률
(그룹당 5 마리의 초기 마우스와 비교)
투여 용량 수준 [mg/kg] 3 10
Tras-PNU (adc424) 1/5 5/5
Tras-HC-PNU (adc421) 1/5 5/5
Tras-LC-PNU (adc422) 0/5 0/5
표 5. 항체 약물 결합체(ADC)로 처리된 마우스의 사망률표 5의 결과는, 동일한 항체 약물 결합체(ADC) 투여 용량으로 처리 시, 중쇄의 C-말단에 안트라사이클린 탑재물을 포함하는 항체 약물 결합체(ADC)(Tras-HC-PNU) 또는 중쇄 및 경쇄의 C-말단 모두에 안트라사이클린 탑재물을 포함하는 항체 약물 결합체(ADC)(Tras-PNU)로 처리된 마우스와 비교하여, 경쇄의 C-말단에 안트라사이클린 탑재물을 포함하는 항체 약물 결합체(ADC)(Tras-LC-PNU)로 처리된 마우스에서 현저히 낮은 사망률을 나타내었다.
실시예 3:
표 6의 항체 약물 결합체들(ADCs)(PBS로 제형화됨)을 제 1일에 3 마리의 CD-1 암컷 마우스 그룹(4-6 주령; Charles Sul, Sulzfeld, 독일)에 지시된 용량으로 투여(볼루스를 통하여(via bolus) 정맥 내 투여) 후, 14 일(2.5 mg/kg 및 5 mg/kg 용량) 또는 28 일(10 mg/kg, 15 mg/kg 및 20 mg/kg 용량) 동안 관찰되었다. 마우스를 케이지 당 3 마리의 동물 그룹으로 수용하였고, 물 및 펠렛(pellets)을 자유로이(ad libitum) 제공하였다. 연구 전체에 걸쳐 매일 2 회 모니터링된 파라미터로서 사망률 및 케이지측(cage-side) 임상 관찰을 포함하였다.
항체 약물 결합체(ADC) 제 14일 또는 제 28일의 사망률
(그룹당 3 마리의 초기 마우스와 비교)
투여 용량 수준 [mg/kg] 2.5 5 10 15 20
Tras-PNU (adc667) 0/3 2/3 (그룹 1)
3/3 (그룹 2)		 - - -
Tras-HC-PNU (adc668) 0/3 0/3 3/3 - -
Tras-LC-PNU (adc669) - 0/3 0/3 1/3 3/3
표 6. 항체 약물 결합체(ADC)로 처리된 마우스의 사망률상기 표 6의 결과는, 경쇄의 C-말단에 안트라사이클린 탑재물을 포함하는 항체 약물 결합체(ADC)(Tras-LC-PNU)로 처리된 마우스와는 대조적으로, 중쇄의 C-말단에 안트라사이클린 탑재물을 포함하는 항체 약물 결합체(ADC)(Tras-HC-PNU) 또는 중쇄 및 경쇄의 C-말단에 안트라사이클린 탑재물을 포함하는 항체 약물 결합체(ADC)(Tras-PNU)로 처리된 마우스가, 훨씬 낮은 투여 용량에서 마우스의 사망률을 유발함을 보여주었다.
실시예 4:
표 7의 HER2-표적화 항체 약물 결합체들(ADCs)의 세포 독성을 HER2-양성 인간 SKBR3 세포주를 사용하여 조사하였다. HER2-음성 인간 세포주 Karpas-299를 대조군으로 사용하였다. 이를 위해, 5000 SKBR3 및 5000 Karpas-299 세포들을 웰당 75μL의 DMEM 또는 RPMI 배지를 포함하는, 웰 당 10% 부피의 태아 송아지 혈청(FCS), 100 IU/mL의 펜-스트렙-펀지존(pen-strep-fungizone) 및 2 mM L-글루타민을 보충한, 96-웰 플레이트(물을 포함한 가장자리 웰(edge well) 제외) 상에 6.66 × 104 세포의 밀도로 각각 플레이팅한 후, 5% CO2 분위기 하에 37 ℃ 가습 인큐베이터에서 배양하였다. 하루 인큐베이션 후, 각 항체 약물 결합체(ADC)를 성장 배지(항체 약물 결합체(ADC)의 출발 농도를 80 μg/mL로 하고 최종 농도를 20 μg/ml 내지 0.89 ng/ml 범위로 함)에서 25μL의 3.5 배 연속 희석액을 각각의 웰에 첨가하였다. 추가 4 일 후, 상기 플레이트들을 인큐베이터에서 제거 후 실온으로 평형화시켰다. 약 30분 후, 50μL의 CellTiter-Glo® 2.0 발광 용액(Promega, G9243)을 각 웰에 첨가하였다. 상기 플레이트들을 750 rpm에서 5분간 진탕 후, 진탕없이 10 분 동안 인큐베이션 한 후, 웰 당 1 초의 통합 시간(integration time)을 갖는 Spark 10M 플레이트 판독기에서 발광성을 측정하였다. 발광 곡선 대 항체 약물 결합체(ADC) 농도(ng/mL)를 그래프 패드 프리즘 소프트웨어(Graphpad Prism Software)로 맞추었다(fitted). 내장된 로그(억제제) 대 응답-가변 기울기(log(inhibitor) vs. response -- Variable slope) (4 개의 매개 변수)" IC50 결정 기능을 이용하여 결정된 IC50 값은 표 7에 제시하였다.
항체 약물 결합체(ADC)/세포 유형 SKBR3 Karpas-299
HER2 expression status 양성 음성
Tras-HC-PNU (adc668) 1.7 27'000
Tras-LC-PNU (adc669) 1.8 48'000
표 7: 항체 약물 결합체(ADC)(ng/mL)에 의한 실험실 내 세포 살해(cell killing) 도 4는 표 7의 항체 약물 결합체들(ADCs)을 SKBR3 및 Karpas-299 세포주에 처리 후 실험실 내 세포 살해(cell killing) 분석의 용량-반응 곡선을 보여준다. 상기 도 및 표에 따라, 중쇄 상에만 독점적으로 또는 경쇄 상에만 독점적으로 안트라사이클린 탑재물을 포함하는 필적할만한 항체 약물 결합체들(ADCs)이 실험실 내에서 필적할만한 효능을 나타냄을 보여준다.
실시예 5:
표 8의 HER2-표적화 항체 약물 결합체들(ADCs)의 세포 독성을 HER2-양성 인간 SKOV3 세포주를 사용하여 조사하였다. 필적할만한 CD30-표적화 항체 약물 결합체(ADC)를 이소타입 대조군으로 사용하였다. 이를 위해, 실시예 4의 프로토콜을 수행하되, 2'000 SKOV3 세포들을 웰당 75μL의 DMEM 배지를 포함하는, 웰당 10% 부피의 태아 송아지 혈청(FCS), 100 IU/mL의 펜-스트렙-펀지존(pen-strep-fungizone) 및 2 mM의 L-글루타민을 보충한, 96-웰 플레이트(물을 포함한 가장자리 웰(edge well) 제외) 상에 2.66 × 104 세포의 밀도로 각각 플레이팅하였다.
항체 약물 결합체(ADC)/세포 유형 SKOV3
HER2 발현 현황 양성
Tras-HC-PNU (adc589) 4.4
Tras-LC-PNU (adc588) 4.6
Ac10-HC-PNU (adc782) 10,000
Ac10-LC-PNU (adc611) 10,000
표 8: 항체 약물 결합체(ADC)(ng/mL)에 의한 실험실 내 세포 살해(cell killing)도 5는 표 8의 항체 약물 결합체들(ADCs)을 SKOV3 세포주에 처리 후 실험실 내 세포 살해(cell killing) 분석의 용량-반응 곡선을 보여준다. 상기 도 및 표에 따라, 중쇄 상에만 독점적으로 또는 경쇄 상에만 독점적으로 안트라사이클린 탑재물을 포함하는 필적할만한 항체 약물 결합체들(ADCs)이 실험실 내에서 필적할만한 효능을 나타내고 항원-매개됨을 보여준다.
실시예 6:
표 9의 항체 약물 결합체들(ADCs)(PBS로 제형화됨)을 제 1일에 3 내지 6 마리의 CD-1 암컷 마우스 그룹(4-6 주령; Charles Sul, Sulzfeld, 독일)에 지시된 용량으로 투여(볼루스를 통하여(via bolus) 정맥 내 투여) 후, 7 내지 10 일 동안 관찰되었다. 마우스를 케이지 당 3 마리의 동물 그룹으로 수용하였고, 물 및 펠렛(pellets)을 자유로이(ad libitum) 제공하였다. 연구 전체에 걸쳐 매일 2 회 모니터링된 파라미터로서 사망률 및 케이지측(cage-side) 임상 관찰을 포함하였다.
검사 항목 제 7일 - 제 10일 사망률
(그룹 당 3 - 6 마리의 초기 마우스와 비교)
투여 용량 수준 [mg/kg] 2.5 5 10 15 20 40
huERCS-409-PNU (adc489) 2/3 (그룹 1)
3/3 (그룹 2)		 - - - - -
huERCS-409-HC-PNU (adc490) 1/3 2/3 (그룹 1)
6/6 (그룹 2)		 - - - -
huERCS-409-LC-PNU (adc522) - 0/3 0/3 1/3 3/3 -
hu4-2-17-PNU (adc519) 0/3 3/3 - - - -
hu4-2-17-HC-PNU (adc520) 0/3 1/3 3/3 - - -
hu4-2-17-LC-PNU (adc521) - 0/3 0/3 - 0/3 3/3
표 9. 항체 약물 결합체들(ADCs)로 처리된 마우스의 치사율상기 표 9의 결과는, 경쇄의 C-말단에 안트라사이클린 탑재물을 포함하는 항체 약물 결합체(ADC)로 처리된 마우스와는 대조적으로, 중쇄의 C-말단에 안트라사이클린 탑재물을 포함하는 항체 약물 결합체(ADC) 또는 중쇄 및 경쇄의 C-말단에 안트라사이클린 탑재물을 포함하는 항체 약물 결합체(ADC)로 처리된 마우스가, 훨씬 더 낮은 투여 용량에서 마우스의 사망률을 야기함을 보여주었다.
실시예 7:
표 10의 항체 약물 결합체들(ADCs)(PBS로 제형화됨)을 15 마리의 CD1 스위스 암컷 이계 교배(outbred) 마우스(체중 21-26g; Janvier, Saint Berthevin, 프랑스; 간단한 무작위적 할당으로 그룹에 할당) 그룹에 1 mg/kg의 용량으로 투여(볼루스를 통하여(via bolus) 정맥 내 투여)하였다. 마우스를 케이지 당 3 마리의 동물 그룹으로 수용하였고, 물 및 펠렛(pellets)을 자유로이(ad libitum) 제공하였다. 처리군 당 3 마리의 마우스 그룹들을 항체 약물 결합체(ADC) 투여로부터 1 시간, 24 시간, 제 3일, 제 7일 및 제 14일 시점에 깊은 마취 후 치명적 출혈(terminal bleed)을 통하여 안락사시켰다. 주어진 그룹 및 시점에 혈청을 수집 후 ELISA에 의해 분석하였다.
2 ㎍/ml의 huROR1 항원으로 코팅된 ELISA 플레이트 상에 일련의 희석 혈청 샘플(희석 인자: 3.5)을 포획하였다. 상기 결합된 항체 약물 결합체(ADC)는 사내(in-house) 개발된 마우스 항-PNU mAb(인간 IgG-PNU 결합체(conjugate)로 마우스를 면역화하고 BSA-PNU 결합체(conjugate)로 스크리닝함으로써 생성됨), 상기 결합된 총 IgG는 HRP-결합된 당나귀 항-인간 IgG의 1:2500 희석(Jackson Immunoresearch, 709-035-149)으로 검출되었다. 항체 약물 결합체(ADC) 및 총 IgG의 혈청 농도는 공지된 농도와 동일한 농도의 항체 약물 결합체(ADC)의 샘플과 비교함으로써 샘플 적정(titrations) 최대치의 절반으로부터 계산되었다. 도 6은 시간에 따른 혈청 농도의 곡선을 나타내고; 이들은 표 10에 제시된 바와 같이 프리즘의 곡선하 면적(area under the curve; AUC) 기능을 이용하여 분석하여 곡선하 면적(AUC)을 결정하였다.
검사 항목 IgG 탐지를 토대로 한
곡선하 면적(AUC)(㎍*일/mL) 		독소 탐지를 토대로 한
곡선하 면적(AUC)(㎍*일/mL)
hu4-2-17-PNU (adc828) 460 ± 48 456 ± 48
hu4-2-17-HC-PNU (adc822) 730 ± 44 584 ± 42
hu4-2-17-LC-PNU (adc826) 1281 ± 119 1241 ± 126
표 10. 마우스에서 항체 약물 결합체(ADC)의 곡선하 면적(AUC)상기 표 10의 결과는, 중쇄 및 경쇄의 C-말단에 안트라사이클린 탑재물을 포함하는 항체 약물 결합체(ADC) 또는 중쇄 및 경쇄의 C-말단에 안트라사이클린 탑재물을 포함하는 항체 약물 결합체(ADC)로 처리된 마우스 또는 중쇄의 C-말단에 안트라사이클린 탑재물을 포함하는 항체 약물 결합체(ADC)로 처리된 마우스의 노출(곡선하 면적(AUC))에 비하여, 경쇄의 C-말단에 안트라사이클린 탑재물을 포함하는 항체 약물 결합체(ADC)로 처리된 마우스의 노출(곡선하 면적(AUC))이 훨씬 더 큰 것을 보여주고 있다. 또한, 표 10은 중쇄 C-말단에 안트라사이클린 탑재물을 포함하는 항체 약물 결합체(ADC)가 상당한 정도로 손실되는 것을 보여준다.
실시예 8:
마우스(murine) EMT-6 유방암 세포를 완전 DMEM 배지(L-글루타민과 10%(v/v) 송아지 태아 혈청(FCS)), 100 IU/mL의 펜-스트렙-펀지존(pen-strep-fungizone) 및 2 mM L-글루타민을 포함하는 고농도 글루코스(4.5g/L) DMEM 배지(전체 구입: Bioconcept, Allschwil, 스위스))에서 37°C and 5% CO2 조건에서 배양하였다. 세포를 하기와 같이 전위(transposition)에 의해 ROR1을 과발현하도록 조작하였다: 세포를 원심 분리(6 분, 1200 rpm, 4°C)한 후, RPMI-1640 배지(5 ×106 세포/mL)에 재현탁하였다. 400μL의 세포 현탁액을 13.3μg의 전위성(transposable) 벡터 pPB-PGK-Puro-ROR1(퓨로마이신-내성 유전자와 함께 전장(full-length) ROR1 (NP_005003.2)의 공동 발현을 감독함)와 6.6μg의 전위 효소(transposase)-포함 벡터 pCDNA3.1_hy_mPB을 포함하는 400μL의 RPMI에 첨가하였다. DNA/EMT-6 세포 혼합물을 전기 천공 큐벳(electroporation cuvettes(0.4 cm-갭, 165-2088, BioRad, Cressier, 스위스))으로 옮긴 후 300V 및 950μF에서 커패시턴스 익스텐더(capacitance extender)와 함께 Biorad Gene Pulser II를 이용하여 전기 천공하였다. 그 후, 세포를 실온에서 5-10분간 배양하였다. 배양 후, 세포를 1200 rpm에서 6분간 원심 분리하고, 1 회 세척 후, 이어서 5% CO2 분위기에서 37 ℃의 가습 배양기에서 배양하기 전에 DMEM에서 재현탁하였다. 전기 천공 후 하루 후에, 3 μg/mL 퓨로마이신(Sigma-Aldrich, P8833)을 첨가하여 인간 ROR1을 안정적으로 발현하는 세포 풀(cell pools)을 선택하였다. ROR1을 발현하는 단세포 클론(Single-cell clones)은 항생제-선택된(antibiotic-selected) EMT-6-ROR1 세포로부터 유래되었다. 이어서 상기 세포들을 항-ROR1 항체 2A2와 함께 30분간 배양(4°C, 최종 농도: 2 μg/mL) 후, 원심분리 및 세척하였다. 이후, 상기 세포들을 이전과 같이 재현탁시키고 항-인간 IgG 항체(Fc 감마-특이적) PE(eBioscience, Vienna, 오스트리아, 12-4998-82)와 함께 암실(30 분, 4°C)에서 배양 후. FACSAriaII 도구(BD Biocsiences, San Jose, 미국)를 사용하여 FACS에 의해 항원-발현 세포를 단일 세포로 분류 시까지 완충액에서 1 회 세척하고 얼음 위에 정치시켰다. 하기 실험에 사용된 클론 14에서의 ROR1의 발현은 FACS에 의해 결정되었다(도 7).
실시예 9:
표 11의 CS1-표적화 항체 약물 결합체(ADC) 및 ROR1-표적화 항체 약물 결합체(ADC)의 세포 독성은 실시예 8의 ROR1-과발현 EMT6 클론 14 세포 및 CS1-양성 L363 세포주를 사용하여 조사하였다. 이를 위해, 실시예 4의 프로토콜을 따르되, 10% 부피의 송아지 태아 혈청(FCS), 100 IU/mL의 펜-스트렙-펀지존(pen-strep-fungizone) 및 2 mM L-글루타민이 보충된 75μL의 DMEM 배지에서 웰 당 1000 EMT6 클론 14 및 10000 L363 세포를 웰 당 각각 1.3 × 104 세포 및 1.3 × 105 세포의 밀도로 플레이팅하였다.
항체 약물 결합체(ADC)/세포 유형 ETM6 (클론 14) L363
ROR1 발현 현황 양성 음성
CS1 발현 현황 음성 양성
huERCS-409-LC-PNU (adc572), (G3-PNU) 17.5 14,077
huERCS-409-HC-PNU (adc758), (G3-PNU) 14.4 5,316
huERCS-409-LC-PNU (adc763), (G2-PNU) 17.5 14,178
huERCS-409-HC-PNU (adc762), (G2-PNU) 16.7 7,959
Hu4-2-17-LC-PNU (adc573), (G3-PNU) 수렴되지 않음 10.3
Hu4-2-17-HC-PNU (adc759), (G3-PNU) 수렴되지 않음 16.4
Hu4-2-17-LC-PNU (adc761), (G2-PNU) 수렴되지 않음 18.2
Hu4-2-17-HC-PNU (adc760), (G2-PNU) 수렴되지 않음 23.1
표 11: 항체 약물 결합체(ADC)(ng/mL)에 의한 실험실 내 세포 살해(cell killing)도 8은 표 11의 항체 약물 결합체(ADC)를 사용하여 ROR1-과발현 EMT6 클론 14 세포들 및 L363 세포들에 대한 실험실 내 세포 살해(cell killing) 분석의 용량-반응 곡선을 보여주고 있다. 상기 도 및 표에 따라, 중쇄 상에만 독점적으로 또는 경쇄 상에만 독점적으로 안트라사이클린 탑재물을 포함하는 필적할만한 항체 약물 결합체들(ADCs)이 실험실 내에서 항원-매개되는 필적할만한 효능을 나타냄을 보여준다.
실시예 10:
하기 연구는 ProQinase에서 수행되었다. 제 0일에, 100 ㎕의 PBS 중 1 × 106 개의 EMT-6-ROR1 클론 14 종양 세포(실시예 8)를 각 5 내지 6 주령 암컷 BALB/c 마우스의 유선 지방 패드(mammary fat pad)에 정위적으로(orthotopically) 이식하였다. 표 12의 항체 약물 결합체들(ADCs)(PBS로 제형화됨)을 제 3일에 지시된 용량(볼러스를 통한(via bolus) 정맥 내 투여)으로 투여하였다. 평균 종양 부피가 제 3일에 대략 30-80 mm3(캘리퍼 측정)에 도달하면, 마우스를 종양 크기에 따라 각 그룹당 6 마리의 동물로 블록-랜덤화하였다(block-randomized). 표 12의 항체 약물 결합체들(ADCs)(PBS로 제형화됨)을 제 3일에 지시된 용량(볼러스를 통한(via bolus) 정맥 내 투여)으로 투여하였다. 마우스는 물과 펠렛(pellets)을 자유로이(ad libitum) 제공받았다. 캘리퍼로 주 2 회 평가한 종양 부피의 변화(evolution)(그룹당 평균 및 상기 평균의 표준 오차에 해당하는 오차 막대)는 도 9에 도시되어 있다.
항체 약물 결합체(ADC) 투여 용량(mg/kg)
비히클 대조군(PBS) -
이소타입 대조군(Ac10-G3-PNU (adc517) 0.5
hu4-2-17-PNU (adc519) 0.5
hu4-2-17-HC-PNU (adc520) 1.0
hu4-2-17-LC-PNU (adc521) 1.0
표 12: 정위적(orthotopic) 유방암 모델에서 항체 약물 결합체(ADC) 투여도 9의 결과는 오직 중쇄의 C-말단에서만 또는 오직 경쇄의 C-말단에서만 안트라사이클린 분자를 포함하는 본 발명의 항체 약물 결합체들(ADC)이 본질적으로는 생체 내에서 동일한 효과를 가짐을 보여주고 있다; 이들을 추적해보면 본질적으로 완전히 오버레이(overlay)된다.
본원에 제시된 실시예들에 따라, 경쇄의 C-말단에 안트라사이클린 분자를 포함하는 본 발명의 항체 약물 결합체들(ADC)은 중쇄의 C-말단에 안트라사이클린 분자를 포함하는 항체 약물 결합체들(ADC)에 비해 종양 세포 및 종양에 대한 효과면에서 동일하지만, 그러나, 경쇄의 C-말단에 안트라사이클린 분자를 포함하는 본 발명의 항체 약물 결합체들(ADC)은 내성 및 안정성을 포함하여 현저히 우수한 생체 내 특성을 제공한다.
참조 문헌(References)
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Swindells, et al., “abYsis: Integrated Antibody Sequence and Structure-Management, Analysis, and Prediction”; J. Mol. Biol. 429, 356-364, 2017
서열(SEQUENCES)
하기 서열들은 본 출원 개시의 일부로서 제공된다. 본 출원에는 WIPO ST 25 호환성(compatible) 전자 서열 목록도 제공된다. 의혹을 불식시키기 위하여, 하기 표(Table)의 서열들과 전자 서열 목록 간에 불일치 부분이 있을 경우, 본 표(Table)의 서열들이 옳은 것으로 간주한다.
아미노산 서열(밑줄이 있는 불변 영역, abYsis 소프트웨어를 이용하여 카바트(Kabat) 시스템을 토대로 상보성 결정 영역들(CDRs)이 식별됨, Swindells et al., 2017, 볼드체) HC: 중쇄, LC: 경쇄
NO. 유형(Type)
1 트라스투주맙 HC
(K467R 돌연변이)		 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGR
2 트라스투주맙 LC DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
3 트라스투주맙 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
4 hu4-2-17 HC QVQLRESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFDISSYYMSWVRQPPGKGLEWIGAIGISGNAYYASWAKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDHPTYGMDLWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
5 hu4-2-17 LC SYELTQPPSVSVAPGKTARITCEGNNIGSKAVHWYQQKPGQAPVLVIYDDDERPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSAYVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHKSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
6 hu4-2-17 HC
(K467R 돌연변이)		 QVQLRESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFDISSYYMSWVRQPPGKGLEWIGAIGISGNAYYASWAKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDHPTYGMDLWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGR
7 huERCS-409 HC EQQVVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFSLNSYGVIWVRQAPGKGLEYVSIIGSSGNTYYASSVKGRFTISRDTRLNTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARYYGDSGFDSWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
8 huERCS-409 LC DQQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIGSWLSWYQQKPGKAPKLLIYGASNLASGVPSRFSGSRSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCLGASPNGWAFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
9 huERCS-409 HC (K467R 돌연변이) EQQVVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFSLNSYGVIWVRQAPGKGLEYVSIIGSSGNTYYASSVKGRFTISRDTRLNTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARYYGDSGFDSWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGR
10 Ac10 HC QIQLQQSGPEVVKPGASVKISCKASGYTFTDYYITWVKQKPGQGLEWIGWIYPGSGNTKYNEKFKGKATLTVDTSSSTAFMQLSSLTSEDTAVYFCANYGNYWFAYWGQGTQVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
11 Ac10 LC DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDFDGDSYMNWYQQKPGQPPKVLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
12 소르타제
인식 태그		 LPXTG
13 소르타제
인식 태그		 LPXAG
14 소르타제
인식 태그		 LPXSG
15 소르타제
인식 태그		 LAXTG
16 소르타제
인식 태그		 LPXTA
17 소르타제
인식 태그		 NPQTG
18 소르타제
인식 태그		 NPQTN
19 소르타제
인식 태그		 LPLTG
20 소르타제
인식 태그		 LAFTG
21 소르타제
인식 태그		 LPNTA
SEQUENCE LISTING <110> NBE Therapeutics <120> Antibody drug conjugates having high in vivo tolerability <130> ND 40653 <160> 21 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> >Trastuzumab HC (K467R mutation) <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 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110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 3 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> >Trastuzumab HC <400> 3 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 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Claims (1)

  1. 적어도 하나의 경쇄 불변 영역 C-말단을 포함하는, 표적 결합 특성을 유지하는 항체, 항체 단편 또는 유도체; 및 안트라사이클린계 소분자(anthracycline-based small molecule)를 포함하는 항체 약물 결합체(antibody drug conjugate; ADC)에 있어서,
    상기 안트라사이클린 분자(들)는 독점적으로 상기 항체, 단편 또는 유도체의 경쇄 불변 영역 C-말단(들)에 독점적으로 연결되며, 및
    상기 안트라사이클린계 소분자는 펩타이드 서열을 포함하는 링커를 통해 상기 항체, 단편 또는 유도체에 연결되는, 항체 약물 결합체.
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