JP2018524284A - 抗ｒｏｒ１抗体 - Google Patents

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Abstract

本発明の目的は、正常な組織に対する副作用を最小限に抑えながら癌細胞を標的として死滅させる、高度に特異的かつ高親和性の抗ＲＯＲ１モノクローナル抗体を開発することである。本発明は、抗体に関し、特に、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体（ＲＯＲ）に対する特異性を示す抗体、及び、例えば、癌の治療における、その使用に関する。本発明は、抗体をコードするポリヌクレオチド及びポリペプチド配列、ならびにそれらの治療的使用、ならびにそれらの分子を含む診断キットにまで及ぶ。本発明はまた、抗体−薬物複合体、及び治療におけるそれらの使用にまで及ぶ。
【選択図】図４

Description

関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下、２０１５年７月１６日に出願した米国特許仮出願第６２／１９３，２３７号、及び２０１５年５月１８日に出願した米国特許仮出願第６２／１６３，２４１号の利益を主張するものであり、それらは各々、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
配列表に関する記載
本願に関連する配列表は、ハードコピーの代わりにテキスト形式で提供され、参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称は、ＦＩＶＥ＿００４＿０２ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。このテキストファイルは１８５ＫＢであり、２０１６年５月１７日に作成され、本明細書の出願と同時にＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出される。
本発明は、抗体に関し、特に、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体（ＲＯＲ）に対する特異性を示す抗体、及び、例えば、癌の治療における、その使用に関する。本発明は、抗体をコードするポリヌクレオチド及びポリペプチド配列、ならびにこれらの分子を含む組成物及びその治療的使用にまで及ぶ。これらの分子を含む診断キット及び方法についても記載される。本発明はまた、抗体−薬物複合体及び治療におけるその使用にまで及ぶ。
受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体（ＲＯＲ）は、膜透過性のＩ型受容体チロシンキナーゼである２つのファミリーメンバーＲＯＲ１及びＲＯＲ２からなる、受容体チロシンキナーゼの保存されたファミリーに属する。ＲＯＲ１及びＲＯＲ２の細胞外領域は、免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン、システインリッチドメイン（ＣＲＤ）（フリズルド（Ｆｚ）ドメインとも称される）、及びクリングル（Ｋｒ）ドメインを含有する。３つ全てのドメインが、タンパク質間相互作用に関与する。細胞内に、ＲＯＲ１及びＲＯＲ２が、チロシンキナーゼ（ＴＫ）ドメイン及びプロリンリッチドメイン（ＰＲＤ）を保有し、２つのセリン／スレオニン−リッチドメインがそこにまたがっている。
このファミリーの細胞機能は、骨格及び神経の発達を含む発達過程において、細胞遊走、平面内細胞極性（ＰＣＰ）及び頂端−基底細胞極性、ならびに軸索伸長を制御することである。Ｗｎｔ５ａは、発癌において重要な意味を持つ糖タンパク質であり、ＲＯＲ１及びＲＯＲ２に結合して活性化することによりこれらの機能を制御することが判明している（Ｎｉｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２０（６）：３４６−５４）。ＲＯＲ２及びその共受容体であるフリズルドドメインに結合したＷｎｔ５ａは、ＩＮＫ経路及びフィラミンＡを活性化して、細胞の遊走及び浸潤を制御し、Ｒａｃｌ及びＲｈｏＡに細胞極性を制御させ、ＳｒｃファミリーメンバーがＭＭＰ１、２、１３等のマトリックスメタロプロテアーゼの発現を調節するよう誘導し、正準Ｗｎｔ経路を阻害することができる。ＲＯＲ２とは異なり、ＲＯＲ１細胞機能の制御の背景にある分子機構は未だに明らかになっていない。最近の研究により、ＲＯＲ１は、Ｗｎｔ５ａと共発現させると、ＮＦ−Ｂを介して細胞増殖を促進することができることが示された（Ｆｕｋｕｄａ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１０５（８）：３０４７−５２）。ＲＯＲタンパク質は、胚性タンパク質である。マウスにおいて、それらは発達段階中にのみ発現される。ＲＯＲの発現は、出生後急速に低減し、成獣組織中では検出不能である。ＲＯＲ１またはＲＯＲ２ノックアウトマウスは、新生児致死性を呈し、出生後まもなく死亡する。ＲＯＲ１ノックアウトは、正常に発達し、目に見える表現型を示さない。ＲＯＲ２ノックアウトを有するマウスには、短い鼻、四肢、尾、及び口蓋裂等の骨格異常、ならびに心室中隔の膜性部における欠損が現れる。
ＲＯＲ１は、Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）及びマントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）において異常に発現する。マウスの相対物と同様に、ヒトＲＯＲ１の発現は、脂肪組織中に低レベルで検出される以外、正常な血液細胞及び他の成人組織中には検出されない。研究により、ＲＯＲ１及びフィブロモジュリンのノックアウトが、ＣＬＬ細胞の著しく増加したアポトーシスをもたらすことが実証されている（Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ．１５１（４）：３２７−３５）。
ＣＬＬは、西半球で最も多く見られるヒト白血病の形態である。Ｌｅｕｋｅｍｉａ ａｎｄ Ｌｙｍｐｈｏｍａ Ｓｏｃｉｅｔｙによれば、米国では毎年約１６，０００件の新しいＣＬＬの症例が診断されており、年間４，４００人の人々がこの疾患が原因で死亡している。ＣＬＬは、骨髄、血液、リンパ組織、及び他の器官における機能的に未熟な細胞の蓄積によって特徴付けられる。これは、成熟Ｂ細胞の悪性腫瘍であり、時には若年成人に発生することもあるが、５５歳以上の成人に発症することが最も多く、その２／３は男性である。ＣＬＬのための新規の改善された治療選択肢について、満たされていない重要な医学的必要性が存在する。化学療法及び幹細胞移植を用いた治療にもかかわらず、ＣＬＬは、５年生存率わずか５０％の不治の病である。
高レベルのＲＯＲ１及びＲＯＲ２の発現が、神経芽細胞腫患者における低い生存率と相関していることが、統計的有意性を持って報告されている（図１及び２）。前駆Ｂ細胞性ＡＬＬ患者の遺伝子発現プロファイルデータも、ＲＯＲ１の上方制御と、Ｅ２Ａ−ＰＢＸ１融合タンパク質を形成し、前駆Ｂ細胞性ＡＬＬのサブタイプのバイオマーカーとしての役割を果たす、ｔ（１；１９）転座との相関を示唆している（図３）。
Ｎｉｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２０（６）：３４６−５４ Ｆｕｋｕｄａ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１０５（８）：３０４７−５２ Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ．１５１（４）：３２７−３５
最近の腫瘍学適応のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の進歩により、独立型の治療として、または化学療法計画との併用におけるＣＬＬの治療に新しい選択肢が生まれた。２００７年には、Ｃａｍｐａｔｈ（抗ＣＤ５２ヒト化抗体）が、ＣＬＬの第一次治療薬としてＦＤＡの認可を得た。以前は、Ｃａｍｐａｔｈは、アルキル化剤及びＦｌｕｄａｒａに反応を示さなくなったＣＬＬ患者の第二次治療薬として承認された。Ｃａｍｐａｔｈによる治療は、初期治療薬としてクロラムブシルを使用することと比較して、有意に優れた患者反応を示した。Ｃａｍｐａｔｈはまた、好ましい毒性プロファイルも示した。抗ＣＤ２０抗体薬であるＲｉｔｕｘａｎは、他の２つの化学療法薬、フルダラビン及びシクロホスファミドとの併用において、ＣＬＬに罹患する患者の治療のためにＦＤＡによって承認された。これら全ての進歩をもってしても、患者の約２０％は、なおも完全な疾患の管理を達成することができず、最終的には、ほとんどの患者が利用可能な治療に対する耐性を生じる。したがって、より有効かつ革新的なＣＬＬ治療薬の大きな必要性が未だに存在する。
本発明をよりよく理解するために、また本発明の実施形態をどのように実行に移すかを示すために、次に、例として添付の図面を参照する。
高レベルのＲＯＲ１遺伝子発現を示す神経芽細胞腫患者の統計的に有意により低い生存率を示すグラフである。 高レベルのＲＯＲ２遺伝子発現を示す神経芽細胞腫患者の統計的に有意により低い生存率を示すグラフである。 前駆Ｂ細胞性ＡＬＬ患者におけるＲＯＲ１のｍＲＮＡ発現を示す。 前駆Ｂ細胞性ＡＬＬ患者におけるＲＯＲ１のｍＲＮＡ発現を示す。 前駆Ｂ細胞性ＡＬＬ患者におけるＲＯＲ１のｍＲＮＡ発現を示す。 前駆Ｂ細胞性ＡＬＬ患者におけるＲＯＲ１のｍＲＮＡ発現を示す。 前駆Ｂ細胞性ＡＬＬ患者におけるＲＯＲ１のｍＲＮＡ発現を示す。 ＲＯＲ１ファージディスプレイパニングのストラテジーを表す。 ＲＯＲ１ファージ抗体のＥＬＩＳＡの結果の一例を示すグラフである。 ＲＯＲ１ファージ抗体の細胞ＥＬＩＳＡの結果の一例を示すグラフである。 ファージ競合ＥＬＩＳＡによる親和性ランキングの方法を示す。 エピトープクラスＩ抗体のＣＤＲ配列解析を示す。 エピトープクラスＩＩ抗体のＣＤＲ配列解析を示す。 エピトープクラスＩＩＩ抗体のＣＤＲ配列解析を示す。 エピトープクラスＩＶ抗体のＣＤＲ配列解析を示す。 ＥＬＩＳＡによるＲＯＲ１陽性ファージクローンの結合特異性の一例を示すグラフである。 ＥＬＩＳＡによるヒトＲＯＲ１及びヒトＲＯＲ２の両方に結合する陽性ファージクローンの一例を示すグラフである。 ヒト抗ＲＯＲ１完全長ＩｇＧ１抗体の発現ベクターのプラスミドマップである。 ヒト抗ＲＯＲ１完全長ＩｇＧ１抗体の発現ベクターのプラスミドマップである。 本発明の抗ＲＯＲ１完全長ＩｇＧ１抗体のある実施形態のヒト抗体定常ドメインのタンパク質配列を示す。 精製したヒト抗ＲＯＲ１完全長ＩｇＧ１抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。 バイオレイヤー干渉法による抗ＲＯＲ１完全長ＩｇＧ１抗体のＫｄ結合親和性解析を示す。 バイオレイヤー干渉法による抗ＲＯＲ１完全長ＩｇＧ１抗体のＫｄ結合親和性解析を示す。 抗体６０１−３−２エピトープマッピングのＥＬＩＳＡデータを表す。強調表示した領域は、ヒトＲＯＲ１タンパク質配列の６０１−３−２エピトープを示す。 抗体６０１−３−２エピトープマッピングのＥＬＩＳＡデータを表す。強調表示した領域は、ヒトＲＯＲ１タンパク質配列の６０１−３−２エピトープを示す。 抗体６０１−３−１２エピトープマッピングのＥＬＩＳＡデータを表す。強調表示した領域は、ヒトＲＯＲ１タンパク質配列の６０１−３−１２エピトープを示す。 抗体６０１−３−１２エピトープマッピングのＥＬＩＳＡデータを表す。強調表示した領域は、ヒトＲＯＲ１タンパク質配列の６０１−３−１２エピトープを示す。 抗体６０１−３−１６エピトープマッピングのＥＬＩＳＡデータを表す。強調表示した領域は、ヒトＲＯＲ１タンパク質配列の６０１−３−１６エピトープを示す。 抗体６０１−３−１６エピトープマッピングのＥＬＩＳＡデータを表す。強調表示した領域は、ヒトＲＯＲ１タンパク質配列の６０１−３−１６エピトープを示す。 ヒトＲＯＲ１、ヒトＲＯＲ２、及びマウスＲＯＲ１に対する抗ＲＯＲ１完全長ＩｇＧ１抗体のＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。 ヒトＲＯＲ１、ヒトＲＯＲ２、及びマウスＲＯＲ１に対する抗ＲＯＲ１完全長ＩｇＧ１抗体のＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。 ヒトＲＯＲ１、ヒトＲＯＲ２、及びマウスＲＯＲ１に対する抗ＲＯＲ１完全長ＩｇＧ１抗体のＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。 ＦＡＣＳによる抗ＲＯＲ１完全長ＩｇＧ１抗体の結合解析を示すグラフである。 ＦＡＣＳによる抗ＲＯＲ１完全長ＩｇＧ１抗体の結合解析を示すグラフである。 ＦＡＣＳによる抗ＲＯＲ１完全長ＩｇＧ１抗体の結合解析を示すグラフである。 抗ＲＯＲ１完全長ＩｇＧ１抗体のＣｌｑ結合を示すグラフである。 ＭＤＡ−ＭＢ−２３１に対する抗ＲＯＲ１完全長ＩｇＧ１抗体のＡＤＣＣ活性を示すグラフである。 ＭＤＡ−ＭＢ−２３１に対する抗ＲＯＲ１完全長ＩｇＧ１抗体のＡＤＣＣ活性を示すグラフである。 ＭＤＡ−ＭＢ−２３１に対する抗ＲＯＲ１完全長ＩｇＧ１抗体のＡＤＣＣ活性を示すグラフである。 抗ＲＯＲ１完全長ＩｇＧ１抗体によるＷｎｔ５ａリガンド結合のブロッキングを示す。 ＲＯＲ１抗体の内部移行を示すグラフである。 ＲＯＲ１細胞外ドメインの単量体形態及び二量体形態に結合する抗ＲＯＲ１抗体の正規化したセンサーグラムを示す。 同じ濃度のアイソタイプ対照抗体について得られたＭＦＩを差し引くことにより信号補正した、患者１３からのＣＬＬ細胞に対する４つの異なる濃度（各抗体につき左から右に向かって１０、２．５、０．６３、０．１６μｇ／ｍＬ）の抗ＲＯＲ１抗体の結合を示す。 同じ濃度のアイソタイプ対照抗体について得られたＭＦＩを差し引くことにより信号補正した、患者１３からのＣＬＬ細胞に対する４つの異なる濃度の抗ＲＯＲ１抗体の結合（各抗体につき左から右に向かって１０、２．５、０．６３、０．１６μｇ／ｍＬ）を示す。
本発明者は、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）が、ＣＬＬ及び他の癌のための有望な新規癌標的であると考えたため、それに調査の焦点を絞った。しかしながら、本発明者は、ＲＯＲ１を標的とする有効なモノクローナル抗体診断薬及び治療薬の開発に関わる重大な問題は、ＲＯＲ１がＣＬＬ癌細胞の表面上で非常に低い発現レベルを有することであると気付いた。実際に、研究によって、ＣＬＬ癌細胞上でのＲＯＲ１の発現は、細胞当たりわずか数千分子であると推定されることが示されている（Ｂａｓｋａｒ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｊａｎ １５；１４（２）：３９６−４０４）。対照的に、ほとんどの抗体治療薬は、癌細胞表面上で高度に発現する分子を標的としている。例えば、Ｒｏｃｈｅ社の抗体乳癌薬Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎは、細胞当たり＞５０，０００コピーと推定される発現レベルを有するＨｅｒ２抗原を標的としている。したがって、有効なＣＬＬの抗体治療薬は、ＲＯＲ１コピー数が極端に少ないにもかかわらず、ＣＬＬ癌細胞を同定することができなければならない。癌細胞表面上のＲＯＲ１のコピー数が少ないという課題を克服するための１つの方法は、低密度のＲＯＲ１にもかかわらずＲＯＲ１陽性癌細胞に効率的に結合することができる高親和性抗体を同定することである。
したがって、本発明の目的は、正常な組織に対する副作用を最小限に抑えながら癌細胞を標的として死滅させる、高度に特異的かつ高親和性の抗ＲＯＲ１モノクローナル抗体を開発することである。完全ヒト抗体ファージライブラリを用いた、ヒトＲＯＲ１細胞外ドメイン（ＥＣＤ）タンパク質に対する労力を要するパニングにより、本発明者は、高度に特異的なヒトＲＯＲ１特異的抗体を単離することができた。
したがって、本発明の第１の態様によれば、ヒト抗受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）抗体、またはその機能的断片が提供される。
有利には、本発明者は、第１のヒトＲＯＲ１免疫特異的抗体を単離して、西半球で最も多く見られるヒト白血病の形態であるＢ細胞性慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）等のＲＯＲ１陽性癌種のためにＲＯＲ１を標的とする抗体治療薬を開発し、それによって未だに満たされていない医学的必要性に対応する。癌治療のために本発明による抗体を用いてＲＯＲ１を標的とすることは、ＲＯＲ１が、癌細胞中には異常に発現するが、正常な血液細胞及び正常な成人組織中には存在せず、したがって、癌細胞及び腫瘍のみを標的とする高度に特異的な治療薬を提供するという重要な科学的所見に基づいている。
実施例に記載されるように、本発明の完全ヒト抗体及び特有の抗ＲＯＲ１抗体のいくつかの異なる実施形態が単離されており、これらの抗体の各々が、驚くほど高い親和性でＲＯＲ１タンパク質上の異なる結合エピトープを認識することが可能である。有利には、実施例に記載されるように、本発明の抗体は、（ｉ）補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を媒介することができ、（ｉｉ）種々のＲＯＲ１陽性癌細胞株に対して抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介することができ、（ｉｉｉ）Ｗｎｔ５ａのＲＯＲ１への結合をブロックすることができ、かつ／または（ｉｖ）Ｗｎｔ５ａによって誘導されるＲＯＲ１のリン酸化を阻害することができる。本発明者は、完全ヒト抗ＲＯＲ１抗体が、単離、同定、及び配列決定されたのは初めてのことであると考える。したがって、本発明の抗体は、単独で、または強力な抗癌試薬を送達することが可能なビヒクルとして、または増強された免疫機能を示す改変抗体として使用されるとき、非常に有効な治療薬を提供する。付加的に、本発明の抗体は、診断ツールまたは予後ツールとしても使用され得る。有利には、胚発生中にのみ発現される胎児抗原としてのその特有の発現プロファイル、及び複数の癌における優先的発現プロファイルに基づいて、ＲＯＲ１を標的とする有効な抗体治療薬は、広範な癌患者集団の寿命を向上させ、かつ延長し、長期の医療費を削減する。
本発明は、ＲＯＲ１タンパク質、好ましくはその細胞外ドメインに対する免疫特異性を有する全抗体（すなわち、免疫グロブリン）、及びその機能的断片の両方にまで及ぶ。そのような断片は、対応する完全長抗体の少なくとも１つの抗原結合領域を保持する。抗体またはその機能的断片は、モノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体またはその機能的断片を含み得る。
抗体または機能的断片は、一価、二価、または多価であり得る。一価の抗体は、ジスルフィド架橋によって軽鎖（Ｌ）に結合された重鎖（Ｈ）を含む二量体（ＨＬ）である。二価の抗体は、少なくとも１つのジスルフィド架橋によって結合された２つの二量体を含む四量体（Ｈ２Ｌ２）である。また多価の抗体も、例えば、複数の二量体を連結することによって、産生され得る。本発明のＲＯＲ１抗体は、キメラ抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、ヒト化抗体及び／またはヒト抗体であり得る。抗体分子の基本構造は、非共有結合的に結合し、またジスルフィド結合によって連結され得る、２つの同一の軽鎖及び２つの同一の重鎖からなる。各重鎖及び軽鎖は、約１１０個のアミノ酸のアミノ末端可変領域と、鎖の残りの部分の定常配列とを含有する。可変領域は、抗体分子の抗原結合部位を形成し、抗原、例えば、ＲＯＲ１またはそのエピトープに対する特異性を決定する、いくつかの超可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。重鎖及び軽鎖のＣＤＲの両側は、フレームワーク領域であり、ＣＤＲを係留及び配向する、アミノ酸の比較的保存された配列である。
定常領域は、５つの重鎖配列（μ、γ、ζ、α、またはε）のうちの１つと、２つの軽鎖配列（κまたはλ）のうちの１つとからなる。重鎖定常領域配列は、抗体のアイソタイプ、及び分子のエフェクター機能を決定する。
本明細書で使用される場合、「ヒト抗体」という用語は、ＲＯＲ１タンパク質に対する免疫特異性を示す特定のヒト抗体中に見出されるものと実質的に同じ重鎖及び軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列を含む、モノクローナル抗体等の抗体を意味し得る。重鎖または軽鎖ＣＤＲと実質的に同じであるアミノ酸配列は、基準配列と比較した場合にかなりの量の配列同一性を示す。そのような同一性は、特定のヒト抗体のアミノ酸配列を表すものとして明確に知られているかまたは認識可能である。実質的に同じである重鎖及び軽鎖のＣＤＲアミノ酸配列は、例えば、アミノ酸の若干の修飾または保存的置換を有することができる。そのようなヒト抗体は、ＲＯＲ１タンパク質に選択的に結合するというその機能を維持する。ヒト抗体は、限定されないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含む非ヒト動物中に産生される抗体、例えば、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）、及びファージディスプレイ等のｉｎ ｖｉｔｒｏ法を用いて選択される抗体を含み、その場合、抗体レパートリーは、ヒト免疫グロブリン配列に基づく。
「ヒトモノクローナル抗体」という用語は、例えば、ファージライブラリによる、リンパ球による、またはハイブリドーマ細胞による産生等の組換え法によって産生されるヒトＣＤＲアミノ酸配列を実質的に有するモノクローナル抗体を含み得る。
「ヒト化抗体」という用語は、ヒトにおいて自然に産生される抗体に対する類似性を高めるようにタンパク質配列が修飾された、非ヒト種（例えば、マウス）由来の抗体を意味し得る。「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト可変領域（マウス、ラット、カニクイザル、ニワトリ等）中のフレームワーク領域の少なくとも１つのアミノ酸が、ヒト可変領域からの対応するアミノ酸で置き換えられた抗体を指す。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体は、少なくとも１つのヒト定常領域またはその断片を含む。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体は、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、（Ｆａｂ’）２等である。
本明細書で使用される「キメラ抗体」は、第１の種（マウス、ラット、カニクイザル等）由来の少なくとも１つの可変領域と、第２の種（ヒト、カニクイザル、ニワトリ等）由来の少なくとも１つの定常領域とを含む抗体を指す。いくつかの実施形態において、キメラ抗体は、少なくとも１つのマウス可変領域と、少なくとも１つのヒト定常領域とを含む。いくつかの実施形態において、キメラ抗体は、少なくとも１つのカニクイザル可変領域と、少なくとも１つのヒト定常領域とを含む。いくつかの実施形態において、キメラ抗体の可変領域の全てが、第１の種に由来し、キメラ抗体の定常領域の全てが、第２の種に由来する。
本明細書で使用される「二重特異性抗体」は、第１の抗原に結合する重鎖／軽鎖の組み合わせを含む第１のアームと、第２の抗原に結合する重鎖／軽鎖の組み合わせを含む第２のアームとを含む抗体を指す。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体のアームの一方は、ＲＯＲ１に結合する重鎖／軽鎖の組み合わせを含む。
抗体は、組換え抗体であってもよい。「組換えヒト抗体」という用語は、組換えＤＮＡ技術を用いて産生したヒト抗体を含み得る。
「抗原結合領域」という用語は、その標的抗原、例えば、ＲＯＲ１タンパク質に対する特異的結合親和性を有する抗体の領域を意味し得る。結合領域は、超可変ＣＤＲまたはその機能的部分であり得る。ＣＤＲの「機能的部分」という用語は、標的抗原に対する特異的親和性を示すＣＤＲ内の配列を意味し得る。ＣＤＲの機能的部分は、ＲＯＲ１タンパク質に特異的に結合するリガンドを含み得る。
「ＣＤＲ」という用語は、重鎖及び軽鎖可変領域中の超可変領域を意味し得る。抗体の重鎖及び軽鎖の各々には、１つ、２つ、３つ、またはそれ以上のＣＤＲが存在し得る。通常、各鎖上に少なくとも３つのＣＤＲが存在し、それらが一緒に構成されると、抗原結合部位、すなわち、抗原が結合するかまたは特異的に反応する３次元の結合部位を形成する。しかしながら、いくつかの抗体の重鎖には４つのＣＤＲが存在し得ると想定されている。
ＣＤＲの定義はまた、互いに比較した場合のアミノ酸残基の重複またはサブセットも含む。特定のＣＤＲ、またはその機能的部分を包含する正確な残基数は、ＣＤＲの配列及びサイズに応じて異なる。当業者は、抗体の可変領域のアミノ酸配列を考慮して、どの残基が特定のＣＤＲを含むかをルーチン的に決定することができる。
抗体の「機能的断片」という用語は、機能的活性を保持する抗体の一部分を意味し得る。機能的活性は、例えば、抗原結合活性または抗原特異性（例えば、抗原結合断片）であり得る。機能的活性はまた、例えば、抗体の定常領域によって提供されるエフェクター機能であってもよい。「機能的断片」という用語はまた、例えば、ヒトモノクローナル抗体のプロテアーゼによる消化または還元によって、及び当業者に既知の組換えＤＮＡ法によって産生される断片を含むことを意図する。ヒトモノクローナル抗体の機能的断片は、例えば、個々の重鎖または軽鎖及びそれらの断片、例えば、ＶＬ、ＶＨ、及びＦｄ、一価の断片、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、及びＦａｂ’、二価の断片、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、及びＦｃ断片を含む。
「ＶＬ断片」という用語は、ＣＤＲを含む、軽鎖可変領域の全てまたは一部を含むヒトモノクローナル抗体の軽鎖の断片を意味し得る。ＶＬ断片は、軽鎖定常領域配列をさらに含み得る。
「ＶＨ断片」という用語は、ＣＤＲを含む、重鎖可変領域の全てまたは一部を含むヒトモノクローナル抗体の重鎖の断片を意味し得る。
「Ｆｄ断片」という用語は、重鎖の可変領域及び定常領域に連結された軽鎖の可変領域及び定常領域、すなわち、ＶＬ ＣＬ及びＶＨ ＣＨ−１を意味し得る。
「Ｆｖ断片」という用語は、重鎖及び軽鎖の可変領域の全てまたは一部を含み、重鎖及び軽鎖の定常領域が存在しない、ヒトモノクローナル抗体の一価の抗原結合断片を意味し得る。重鎖及び軽鎖の可変領域は、例えば、ＣＤＲを含む。例えば、Ｆｖ断片は、重鎖及び軽鎖の両方の約１１０個のアミノ酸のアミノ末端可変領域の全てまたは一部を含む。
「Ｆａｂ断片」という用語は、Ｆｖ断片よりも大きいヒトモノクローナル抗体の一価の抗原結合断片を意味する。例えば、Ｆａｂ断片は、可変領域、ならびに重鎖及び軽鎖の第１の定常ドメインの全てまたは一部を含む。したがって、Ｆａｂ断片は、例えば、重鎖及び軽鎖の約１１０〜約２２０個のアミノ酸残基を付加的に含む。
「Ｆａｂ’断片」という用語は、Ｆａｂ断片よりも大きいヒトモノクローナル抗体の一価の抗原結合断片を意味し得る。例えば、Ｆａｂ’断片は、軽鎖の全て、重鎖の可変領域の全て、ならびに重鎖の第１及び第２の定常ドメインの全てまたは一部を含む。例えば、Ｆａｂ’断片は、重鎖のアミノ酸残基２２０〜３３０のいくつかまたは全てを付加的に含み得る。
「Ｆ（ａｂ’）２断片」という用語は、ヒトモノクローナル抗体の二価の抗原結合断片を意味し得る。Ｆ（ａｂ’）２断片は、例えば、２つの重鎖及び２つの軽鎖の可変領域の全てまたは一部を含み、２つの重鎖及び２つの軽鎖の第１の定常ドメインの全てまたは一部をさらに含み得る。
「一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）」という用語は、短いリンカーペプチドで接続された重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合物を意味し得る。
当業者は、ヒトモノクローナル抗体の断片の正確な境界は、該断片が機能的活性を維持する限り、重要ではないことを知っている。周知の組換え法を用いて、当業者は、特定の用途に望ましい任意のエンドポイントを有する機能的断片を発現するようにポリヌクレオチド配列を操作することができる。抗体の機能的断片は、ヒト抗体と実質的に同じ重鎖及び軽鎖可変領域を有する断片を含み得る。好ましくは、機能的断片は、ＲＯＲ１特異的である。
機能的断片は、結合領域配列のうちの少なくとも１つが、抗体、より好ましくはＲＯＲ１特異的ヒト抗体の結合領域配列と実質的に同じアミノ酸配列を有する断片を含み得る。機能的断片は、ＶＨ、ＶＬ、Ｆｄ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｃ断片からなる群から選択される断片のいずれかを含み得る。
機能的断片は、ヒト抗体のＶＬの抗原結合領域配列のいずれか１つ、ＶＨの抗原結合領域配列のいずれか１つ、またはＶＬ及びＶＨの抗原結合領域の組み合わせを含み得る。ＶＨ及びＶＬの抗原結合領域配列の適切な数及び組み合わせは、機能的断片の所望の親和性及び特異性ならびに意図される用途に応じて当業者によって決定され得る。抗体の機能的断片は、当業者に周知の方法を用いて容易に産生及び単離され得る。そのような方法は、例えば、タンパク質分解法、組換え法、及び化学合成を含む。機能的断片の単離のためのタンパク質分解法は、出発材料としてヒト抗体を使用することを含む。ヒト免疫グロブリンのタンパク質分解に好適な酵素は、例えば、パパイン及びペプシンを含み得る。適切な酵素は、例えば、一価の断片が必要であるかまたは二価の断片が必要であるかに応じて、当業者によって容易に選択され得る。例えば、パパイン切断によって、抗原に結合する２つの一価Ｆａｂ’断片、及びＦｃ断片が生じる。ペプシン切断によって、例えば、二価のＦ（ａｂ’）断片が生じる。本発明のＦ（ａｂ’）２断片は、２つの一価Ｆａｂ’断片を産生するために、例えば、ＤＴＴまたは２−メルカプトエタノールを使用してさらに還元することができる。
タンパク質分解によって生成された機能的断片は、親和性クロマトグラフィー手順及びカラムクロマトグラフィー手順によって精製され得る。例えば、未消化の抗体及びＦｃ断片は、プロテインＡへの結合によって除去され得る。付加的に、機能的断片は、例えば、イオン交換クロマトグラフィー及びゲル濾過クロマトグラフィーを用いて、それらの電荷及びサイズによって精製され得る。そのような方法は、当該技術分野で周知である。
ヒト抗体またはその機能的断片は、組換え法によって産生され得る。好ましくは、抗体の重鎖及び軽鎖の所望の領域をコードするポリヌクレオチドを最初に単離する。そのような領域は、例えば、重鎖及び軽鎖の可変領域の全てまたは一部を含み得る。好ましくは、そのような領域は、特に、重鎖及び軽鎖の抗原結合領域、好ましくは抗原結合部位、最も好ましくはＣＤＲを含み得る。
本発明のヒト抗体または機能的断片をコードするポリヌクレオチドは、当業者に既知の方法を用いて生成され得る。抗体またはその機能的断片をコードするポリヌクレオチドは、当該技術分野で既知のオリゴヌクレオチド合成の方法によって直接合成されてもよい。代替的に、より小さな断片を合成し、当該技術分野で既知の組換え法を用いてより大きな機能的断片を形成するように連結してもよい。
本明細書で使用される場合、「免疫特異性」という用語は、結合領域が、ＲＯＲ１タンパク質と特異的に結合することにより該タンパク質と免疫反応することが可能であることを意味し得る。抗体またはその機能的断片は、約１０−５〜１０−１３Ｍ−１、好ましくは１０−６〜１０−９Ｍ−１、さらにより好ましくは１０−１０〜１０−１２Ｍ−１の親和性定数で抗原（例えば、ＲＯＲ１ペプチド）と選択的に相互作用することができる。
「対象」は、脊椎動物、哺乳動物、または飼育動物であり得る。よって、本発明による薬物は、任意の哺乳動物、例えば、家畜（例えば、ウマ）、ペットを治療するために使用され得るか、または他の獣医学的用途に使用され得る。最も好ましくは、対象はヒトである。
抗体またはその断片の「治療有効量」は、対象に投与されたときに、癌を治療するため、または所望の効果をもたらすために必要とされる薬剤の量である、任意の量である。
「抗癌組成物」という用語は、対象における癌の治療寛解、予防、または治療に使用される薬学的配合物を意味し得る。
本明細書で言及される「薬学的に許容されるビヒクル」は、薬学的組成物を配合する際に有用であることが当業者に知られている任意の既知の化合物または既知の化合物の組み合わせである。
図１７に示されるように、動的結合解析によって、ピコモル範囲のＫｄを伴う完全長ＩｇＧ１抗体のｈＲＯＲ１−ＥＣＤへの特異的結合が確認された。したがって、好ましくは、ＲＯＲ１に対する抗体またはその断片のＫＤは、１×１０−１０未満、好ましくは１×１０−１１未満、より好ましくは１×１０−１２未満であり得る。抗体またはその断片は、約１０−７〜１０−１０Ｍ−１のＲＯＲ１に対するＩＣ５０を示し得る。
「免疫反応する」という用語は、結合領域が、ＲＯＲ１タンパク質、またはそのエピトープと結合すると、免疫反応を誘発することが可能であることを意味し得る。
「エピトープ」という用語は、抗体またはその断片の結合領域を誘発し、それと組み合わさる能力を有する、抗原の任意の領域を意味し得る。
図２３及び２４に示されるように、抗体またはその断片は、ＲＯＲ１を発現する腫瘍細胞の死滅を媒介することが可能であり得る。死滅は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）及び／または抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）によるものであり得る。
図２５に示されるように、抗体またはその断片は、Ｗｎｔ５ａのＲＯＲ１タンパク質への結合をブロックすることが可能であり得る。
図２６に示されるように、抗体またはその断片は、ＲＯＲ１に結合するとエンドサイトーシスによって取り込まれることが可能であり得る。
抗体またはその断片は、Ｗｎｔ５ａによるＲＯＲ１のリン酸化をブロックすることが可能であり得る。抗体またはその断片は、癌細胞の増殖を抑制することが可能であり得る。
「ＲＯＲ１」という用語は、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体のファミリー１（ｍＲＮＡ：ＮＭ＿００５０１２．２、タンパク質：ＮＰ＿００５００３．２）を指すことができる。ヒトＲＯＲ１の一実施形態をコードするＤＮＡ配列は、本明細書において配列番号１として提供される。
ヒトＲＯＲ１の一実施形態のポリペプチド配列は、本明細書において配列番号２として提供される。
実施例に記載されるように、本発明者は、本発明の第１の態様による抗体または機能的断片の４５個の異なる実施形態を単離した。本発明者は、エピトープマッピングを行い、抗体またはその断片の実施形態が、ＲＯＲ１タンパク質上の種々の異なるエピトープに結合することが可能であることを発見した：これらのエピトープは、本明細書においてエピトープクラスＩ〜ＩＶとして表される。エピトープＩは、残基ＫＮＤＡＰＶＶＱＥＰＲＲＬＳＦＲＳＴＩＹＧＳＲ（配列番号２３７；すなわち、配列番号２のアミノ酸９３〜１１５）及びＡＡＮＣＩＲＩＧＩＰＭＡＤＰＩ（配列番号２３８；すなわち、配列番号２のアミノ酸２９３〜３０７）として定義され得、エピトープＩＩは、残基ＳＳＴＧＶＬＦＶＫＦＧＰＰＰＴＡＳＰＧ（配列番号２３９；すなわち、配列番号２のアミノ酸１４１〜１５９）及びＳＮＰＭＩＬＭＲＬＫＬＰＮＣＥ（配列番号２４０；すなわち、配列番号２のアミノ酸２６９〜２８３）として定義され得、エピトープＩＩＩ及びエピトープＩＶは、配列番号２の残りの細胞外配列として定義され得る。したがって、抗体またはその断片は、好ましくは、ＲＯＲ１タンパク質上のエピトープＩ〜ＩＶ、またはこれらのエピトープのいずれか１つの機能的断片または変異体のうちの１つ以上に結合することが可能である。これらの種々のエピトープに関する知識は、新規ＲＯＲ１特異的抗体を作製するために使用することができることを理解されたい。
よって、第２の態様において、抗受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）抗体、またはその機能的断片を作製するためのエピトープの使用が提供され、エピトープは、ＫＮＤＡＰＶＶＱＥＰＲＲＬＳＦＲＳＴＩＹＧＳＲ（配列番号２３７；すなわち、配列番号２のアミノ酸９３〜１１５）；ＡＡＮＣＩＲＩＧＩＰＭＡＤＰＩ（配列番号２３８；すなわち、配列番号２のアミノ酸２９３〜３０７）；ＳＳＴＧＶＬＦＶＫＦＧＰＰＰＴＡＳＰＧ（配列番号２３９；すなわち、配列番号２のアミノ酸１４１〜１５９）；ＳＮＰＭＩＬＭＲＬＫＬＰＮＣＥ（配列番号２４０；すなわち、配列番号２のアミノ酸２６９〜２８３）；及び配列番号２の残りの細胞外配列；またはこれらのエピトープのいずれかの機能的断片もしくは変異体からなるエピトープの群から選択される。
いくつかの実施形態において、配列ＫＮＤＡＰＶＶＱＥＰＲＲＬＳＦＲＳＴＩＹＧＳＲ（配列番号２３７；すなわち、配列番号２のアミノ酸９３〜１１５）を有するペプチドに結合する抗ＲＯＲ１抗体が提供される。いくつかの実施形態において、配列ＡＡＮＣＩＲＩＧＩＰＭＡＤＰＩ（配列番号２３８；すなわち、配列番号２のアミノ酸２９３〜３０７）を有するペプチドに結合する抗ＲＯＲ１抗体が提供される。いくつかの実施形態において、配列ＳＳＴＧＶＬＦＶＫＦＧＰＰＰＴＡＳＰＧ（配列番号２３９；すなわち、配列番号２のアミノ酸１４１〜１５９）を有するペプチドに結合する抗ＲＯＲ１抗体が提供される。いくつかの実施形態において、配列ＳＮＰＭＩＬＭＲＬＫＬＰＮＣＥ（配列番号２４０；すなわち、配列番号２のアミノ酸２６９〜２８３）を有するペプチドに結合する抗ＲＯＲ１抗体が提供される。
いくつかの実施形態において、ＲＯＲ１への結合について抗体６０１−３−２と競合する抗ＲＯＲ１抗体が提供される。いくつかの実施形態において、ＲＯＲ１への結合について抗体６０１−３−１２と競合する抗ＲＯＲ１抗体が提供される。いくつかの実施形態において、ＲＯＲ１への結合について抗体６０１−３−１６と競合する抗ＲＯＲ１抗体が提供される。
本発明者はまた、本発明のＲＯＲ１特異的抗体の重鎖及び軽鎖の両方の相補性決定領域（ＣＤＲ）を決定し、これら４つのエピトープクラスの各々の中で高度に保存されたモチーフを発見した。驚くべきことに、図８〜１１に示されるように、彼らは、抗体の実施形態が結合することができる、エピトープクラスＩの３つのサブグループ（すなわち、サブグループＩａ、Ｉｂ、及びＩｃ）、エピトープクラスＩＩの５つのサブグループ（すなわち、サブグループＩＩａ、ＩＩｂ、ＩＩｃ、及びＩＩｄ）、ならびにエピトープクラスＩＩＩ（すなわち、サブグループＩＩＩａ及びＩＩＩｂ）及びＩＶの各々の２つのサブグループ（すなわち、サブグループＩＶａ及びＩＶｂ）が存在することを発見した。いくつかの実施形態において、ＲＯＲ１の結合についてエピトープクラスＩの抗体と競合する（例えば、サブグループＩａ、ＩｂまたはＩｃの抗体と競合する）抗体が提供される。いくつかの実施形態において、ＲＯＲ１の結合についてエピトープクラスＩＩの抗体と競合する（例えば、サブグループＩＩａ、ＩＩｂ、ＩＩｃ、またはＩＩｄの抗体と競合する）抗体が提供する。いくつかの実施形態において、ＲＯＲ１の結合についてエピトープクラスＩＩＩの抗体と競合する（例えば、サブグループＩＩＩａまたはＩＩＩｂの抗体と競合する）抗体が提供される。いくつかの実施形態において、ＲＯＲ１の結合についてエピトープクラスＩＶの抗体と競合する（例えば、サブグループＩＶａまたはＩＶｂの抗体と競合する）抗体が提供される。
実施例２に記載されるように、本発明者は、ＲＯＲ１に対して免疫特異的である抗体を全部で４５個単離し、それらのうち１４個が好ましい。これらの１４個の好ましい抗体は、（ｉ）上記エピトープクラス及びそれらのサブグループの全てを表し、（ｉｉ）高いＲＯＲ１結合親和性を有し、（ｉｉｉ）完全ＩｇＧ分子に変換され得るプールを形成する。本明細書に記載される全ての抗体は、治療用途及び診断用途のために開発することができるため、明らかに貴重である。
いくつかの実施形態において、抗ＲＯＲ１抗体が提供され、該抗体は、抗体６０１−１、抗体６０１−２（３−１２）、抗体６０１−３（３−１６）、抗体６０１−４、抗体６０１−５（３−２）、抗体６０１−６、抗体６０１−９、抗体６０１−１３、抗体６０１−１４、抗体６０１−１７、抗体６０１−１８抗体６０１−２８、抗体６０１−３７、抗体６０１−４０、抗体６０１−４３、抗体６０１−５０、抗体６０１−５１、抗体６０１−５６、抗体６０１−５７、抗体６０１−６５、抗体６０１−６６、抗体６０１−６９、抗体６０１−７０、抗体６０１−８１、抗体６０１−８６、抗体６０１−８７、抗体６０１−１００、抗体６０１−１０１、抗体６０１−１０２、抗体６０１−１０３、抗体６０１−１０８、抗体６０１−１０９、抗体６０１−１１０、抗体６０１−１１２、抗体６０１−１１９、抗体６０１−１２０、抗体６０１−１２８、抗体６０１−１３０、抗体６０１−１３４、抗体６０１−１３６、抗体６０１−１３７、抗体６０１−１４１、抗体６０１−１４７、抗体６０１−１４９、または抗体６０１−１５３から選択される抗ＲＯＲ１抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。これらの抗体の重鎖及び軽鎖可変領域は、例えば、「特定の軽鎖可変領域配列の表」及び「特定の重鎖可変領域配列の表」という標題の本明細書中の表に示される。
いくつかの実施形態において、抗ＲＯＲ１抗体が提供され、該抗体は、抗体６０１−１、抗体６０１−２（３−１２）、抗体６０１−３（３−１６）、抗体６０１−４、抗体６０１−５（３−２）、抗体６０１−６、抗体６０１−９、抗体６０１−１３、抗体６０１−１４、抗体６０１−１７、抗体６０１−１８、抗体６０１−２８、抗体６０１−３７、抗体６０１−４０、抗体６０１−４３、抗体６０１−５０、抗体６０１−５１、抗体６０１−５６、抗体６０１−５７、抗体６０１−６５、抗体６０１−６６、抗体６０１−６９、抗体６０１−７０、抗体６０１−８１、抗体６０１−８６、抗体６０１−８７、抗体６０１−１００、抗体６０１−１０１、抗体６０１−１０２、抗体６０１−１０３、抗体６０１−１０８、抗体６０１−１０９、抗体６０１−１１０、抗体６０１−１１２、抗体６０１−１１９、抗体６０１−１２０、抗体６０１−１２８、抗体６０１−１３０、抗体６０１−１３４、抗体６０１−１３６、抗体６０１−１３７、抗体６０１−１４１、抗体６０１−１４７、抗体６０１−１４９、または抗体６０１−１５３から選択される抗ＲＯＲ１抗体の重鎖可変領域と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である重鎖可変領域を含む。いくつかのそのような実施形態において、抗体は、基準抗体の重鎖ＣＤＲを含む。これらの抗体の各々の重鎖ＣＤＲは、例えば、「特定の重鎖ＣＤＲ配列の表」という標題の本明細書中の表に示される。
いくつかの実施形態において、抗ＲＯＲ１抗体が提供され、該抗体は、抗体６０１−１、抗体６０１−２（３−１２）、抗体６０１−３（３−１６）、抗体６０１−４、抗体６０１−５（３−２）、抗体６０１−６、抗体６０１−９、抗体６０１−１３、抗体６０１−１４、抗体６０１−１７、抗体６０１−１８抗体６０１−２８、抗体６０１−３７、抗体６０１−４０、抗体６０１−４３、抗体６０１−５０、抗体６０１−５１、抗体６０１−５６、抗体６０１−５７、抗体６０１−６５、抗体６０１−６６、抗体６０１−６９、抗体６０１−７０、抗体６０１−８１、抗体６０１−８６、抗体６０１−８７、抗体６０１−１００、抗体６０１−１０１、抗体６０１−１０２、抗体６０１−１０３、抗体６０１−１０８、抗体６０１−１０９、抗体６０１−１１０、抗体６０１−１１２、抗体６０１−１１９、抗体６０１−１２０、抗体６０１−１２８、抗体６０１−１３０、抗体６０１−１３４、抗体６０１−１３６、抗体６０１−１３７、抗体６０１−１４１、抗体６０１−１４７、抗体６０１−１４９、または抗体６０１−１５３から選択される抗ＲＯＲ１抗体の軽鎖可変領域と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である軽鎖可変領域を含む。いくつかのそのような実施形態において、抗体は、基準抗体の軽鎖ＣＤＲを含む。これらの抗体の各々の軽鎖ＣＤＲは、例えば、「特定の軽鎖ＣＤＲ配列の表」という標題の本明細書中の表に示される。
図８〜１１は、本発明者が、ＣＤＲを形成する（Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３は、軽鎖の３つのＣＤＲであり、Ｈ１、Ｈ２、及びＨ３は、重鎖の３つのＣＤＲである）、単離された抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域に対するコンセンサス配列を決定したことを示す。明らかに、これらの保存された残基は、抗体の結合特異性、及びＲＯＲ１タンパク質、好ましくはその細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に対する親和性を定義するために重要であり、したがって、抗体の結合プロファイルを改変及び改善するために抗体エンジニアリングに関する有用な情報を提供する。本発明者は、実施例２に記載されるように、好ましい１４個の抗体の各々のアミノ酸及びＤＮＡ配列を決定した。
したがって、一実施形態において、抗体またはその機能的断片は、（ｉ）配列番号８、（ｉｉ）配列番号９、（ｉｉｉ）配列番号１０、（ｉｖ）配列番号１６、（ｖ）配列番号１７、及び（ｖｉ）配列番号１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、少なくとも１つの抗原結合領域を含み得る。
別の実施形態において、抗体またはその機能的断片は、（ｉ）配列番号２４、（ｉｉ）配列番号２５、（ｉｉｉ）配列番号２６、（ｉｖ）配列番号３２、（ｖ）配列番号３３、及び（ｖｉ）配列番号３４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、少なくとも１つの抗原結合領域を含み得る。
別の実施形態において、抗体またはその機能的断片は、（ｉ）配列番号４０、（ｉｉ）配列番号４１、（ｉｉｉ）配列番号４２、（ｉｖ）配列番号４８、（ｖ）配列番号４９、及び（ｖｉ）配列番号５０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、少なくとも１つの抗原結合領域を含み得る。
別の実施形態において、抗体またはその機能的断片は、（ｉ）配列番号５６、（ｉｉ）配列番号５７、（ｉｉｉ）配列番号５８、（ｉｖ）配列番号６４、（ｖ）配列番号６５、及び（ｖｉ）配列番号６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、少なくとも１つの抗原結合領域を含み得る。
別の実施形態において、抗体またはその機能的断片は、（ｉ）配列番号７２、（ｉｉ）配列番号７３、（ｉｉｉ）配列番号７４、（ｉｖ）配列番号８０、（ｖ）配列番号８１、及び（ｖｉ）配列番号８２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、少なくとも１つの抗原結合領域を含み得る。
別の実施形態において、抗体またはその機能的断片は、（ｉ）配列番号８８、（ｉｉ）配列番号８９、（ｉｉｉ）配列番号９０、（ｉｖ）配列番号９６、（ｖ）配列番号９７、及び（ｖｉ）配列番号９８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、少なくとも１つの抗原結合領域を含み得る。
別の実施形態において、抗体またはその機能的断片は、（ｉ）配列番号１０４、（ｉｉ）配列番号１０５、（ｉｉｉ）配列番号１０６、（ｉｖ）配列番号１１２、（ｖ）配列番号１１３、及び（ｖｉ）配列番号１１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、少なくとも１つの抗原結合領域を含み得る。
別の実施形態において、抗体またはその機能的断片は、（ｉ）配列番号１２０、（ｉｉ）配列番号１２１、（ｉｉｉ）配列番号１２２、（ｉｖ）配列番号１２８、（ｖ）配列番号１２９、及び（ｖｉ）配列番号１３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、少なくとも１つの抗原結合領域を含み得る。
別の実施形態において、抗体またはその機能的断片は、（ｉ）配列番号１３６、（ｉｉ）配列番号１３７、（ｉｉｉ）配列番号１３８、（ｉｖ）配列番号１４４、（ｖ）配列番号１４５、及び（ｖｉ）配列番号１４６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、少なくとも１つの抗原結合領域を含み得る。
別の実施形態において、抗体またはその機能的断片は、（ｉ）配列番号１５２、（ｉｉ）配列番号１５３、（ｉｉｉ）配列番号１５４、（ｉｖ）配列番号１６０、（ｖ）配列番号１６１、及び（ｖｉ）配列番号１６２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、少なくとも１つの抗原結合領域を含み得る。
別の実施形態において、抗体またはその機能的断片は、（ｉ）配列番号１６８、（ｉｉ）配列番号１６９、（ｉｉｉ）配列番号１７０、（ｉｖ）配列番号１７６、（ｖ）配列番号１７７、及び（ｖｉ）配列番号１７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、少なくとも１つの抗原結合領域を含み得る。
別の実施形態において、抗体またはその機能的断片は、（ｉ）配列番号１８４、（ｉｉ）配列番号１８５、（ｉｉｉ）配列番号１８６、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、少なくとも１つの抗原結合領域を含み得る。
（ｉｖ）配列番号１９２、（ｖ）配列番号１９３、及び（ｖｉ）配列番号１９４。
別の実施形態において、抗体またはその機能的断片は、（ｉ）配列番号２００、（ｉｉ）配列番号２０１、（ｉｉｉ）配列番号２０２、（ｉｖ）配列番号２０８、（ｖ）配列番号２０９、及び（ｖｉ）配列番号２１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、少なくとも１つの抗原結合領域を含み得る。
別の実施形態において、抗体またはその機能的断片は、（ｉ）配列番号２１６、（ｉｉ）配列番号２１７、（ｉｉｉ）配列番号２１８、（ｉｖ）配列番号２２４、（ｖ）配列番号２２５、及び（ｖｉ）配列番号２２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、少なくとも１つの抗原結合領域を含み得る。
一実施形態において、抗体またはその機能的断片は、（ｉ）配列番号５、（ｉｉ）配列番号６、（ｉｉｉ）配列番号７、（ｉｖ）配列番号１３、（ｖ）配列番号１４、及び（ｖｉ）配列番号１５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、核酸によってコードされる少なくとも１つの抗原結合領域を含み得る。
別の実施形態において、抗体またはその機能的断片は、（ｉ）配列番号２１、（ｉｉ）配列番号２２、（ｉｉｉ）配列番号２３、（ｉｖ）配列番号２９、（ｖ）配列番号３０、及び（ｖｉ）配列番号３１からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、核酸によってコードされる少なくとも１つの抗原結合領域を含み得る。
一実施形態において、抗体またはその機能的断片は、（ｉ）配列番号３７、（ｉｉ）配列番号３８、（ｉｉｉ）配列番号３９、（ｉｖ）配列番号４５、（ｖ）配列番号４６、及び（ｖｉ）配列番号４７からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、核酸によってコードされる少なくとも１つの抗原結合領域を含み得る。
一実施形態において、抗体またはその機能的断片は、（ｉ）配列番号５３、（ｉｉ）配列番号５４、（ｉｉｉ）配列番号５５、（ｉｖ）配列番号６１、（ｖ）配列番号６２、及び（ｖｉ）配列番号６３からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、核酸によってコードされる少なくとも１つの抗原結合領域を含み得る。
一実施形態において、抗体またはその機能的断片は、（ｉ）配列番号６９、（ｉｉ）配列番号７０、（ｉｉｉ）配列番号７１、（ｉｖ）配列番号７７、（ｖ）配列番号７８；及び（ｖｉ）配列番号７９からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、核酸によってコードされる少なくとも１つの抗原結合領域を含み得る。
一実施形態において、抗体またはその機能的断片は、（ｉ）配列番号８５、（ｉｉ）配列番号８６、（ｉｉｉ）配列番号８７、（ｉｖ）配列番号９３、（ｖ）配列番号９４、及び（ｖｉ）配列番号９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、核酸によってコードされる少なくとも１つの抗原結合領域を含み得る。
一実施形態において、抗体またはその機能的断片は、（ｉ）配列番号１０１、（ｉｉ）配列番号１０２、（ｉｉｉ）配列番号１０３、（ｉｖ）配列番号１０９、（ｖ）配列番号１１０、及び（ｖｉ）配列番号１１１からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、核酸によってコードされる少なくとも１つの抗原結合領域を含み得る。
一実施形態において、抗体またはその機能的断片は、（ｉ）配列番号１１７、（ｉｉ）配列番号１１８、（ｉｉｉ）配列番号１１９、（ｉｖ）配列番号１２５、（ｖ）配列番号１２６、及び（ｖｉ）配列番号１２７からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、核酸によってコードされる少なくとも１つの抗原結合領域を含み得る。
一実施形態において、抗体またはその機能的断片は、（ｉ）配列番号１３３、（ｉｉ）配列番号１３４、（ｉｉｉ）配列番号１３５、（ｉｖ）配列番号１４１、（ｖ）配列番号１４２、及び（ｖｉ）配列番号１４３からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、核酸によってコードされる少なくとも１つの抗原結合領域を含み得る。
一実施形態において、抗体またはその機能的断片は、（ｉ）配列番号１４９、（ｉｉ）配列番号１５０、（ｉｉｉ）配列番号１５１、（ｉｖ）配列番号１５７、（ｖ）配列番号１５８、及び（ｖｉ）配列番号１５９からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、核酸によってコードされる少なくとも１つの抗原結合領域を含み得る。
一実施形態において、抗体またはその機能的断片は、（ｉ）配列番号１６５、（ｉｉ）配列番号１６６、（ｉｉｉ）配列番号１６７、（ｉｖ）配列番号１７３、（ｖ）配列番号１７４、及び（ｖｉ）配列番号１７５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、核酸によってコードされる少なくとも１つの抗原結合領域を含み得る。
一実施形態において、抗体またはその機能的断片は、（ｉ）配列番号１８１、（ｉｉ）配列番号１８２、（ｉｉｉ）配列番号１８３、（ｉｖ）配列番号１８９、（ｖ）配列番号１９０、及び（ｖｉ）配列番号１９１からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、核酸によってコードされる少なくとも１つの抗原結合領域を含み得る。
一実施形態において、抗体またはその機能的断片は、（ｉ）配列番号１９７、（ｉｉ）配列番号１９８、（ｉｉｉ）配列番号１９９、（ｉｖ）配列番号２０５、（ｖ）配列番号２０６、及び（ｖｉ）配列番号２０７からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、核酸によってコードされる少なくとも１つの抗原結合領域を含み得る。
一実施形態において、抗体またはその機能的断片は、（ｉ）配列番号２１３、（ｉｉ）配列番号２１４、（ｉｉｉ）配列番号２１５、（ｉｖ）配列番号２２１、（ｖ）配列番号２２２；及び（ｖｉ）配列番号２２３からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、核酸によってコードされる少なくとも１つの抗原結合領域を含み得る。
抗原結合領域は、抗体、またはその機能的断片の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み得ること、及び、抗体またはその機能的断片のＣＤＲ間のフレームワーク領域に突然変異が存在し得ることを理解されたい。組換え免疫グロブリンは、本明細書に記載される抗原結合領域のいずれかまたは全てを含み得る。組換え免疫グロブリンは、抗原が結合し、好ましくは免疫学的応答を誘発する抗原結合部位を含み得る。好ましくは、少なくとも１つの抗原結合領域は、抗原結合部位の少なくとも一部を形成する。抗体またはその機能的断片は、第１の態様で定義される少なくとも２つ、好適には少なくとも３つ、より好適には少なくとも４つの抗原結合領域を含み得る。抗体または機能的断片は、少なくとも５つ、より好ましくは少なくとも６つの抗原結合領域を含み得る。抗体またはその断片は、したがって、本明細書に記載される抗体の任意の実施形態において（ｉ）〜（ｖｉ）に定義される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのアミノ酸配列を含み得る。好ましくは、抗体またはその断片は、任意の実施形態における（ｉ）〜（ｖｉ）の全てを含む。
抗体またはその機能的断片の一実施形態において、軽鎖の可変領域のポリペプチド配列は、配列番号４、２０、３６、５２、６８、８４、１００、１１６、１３２、１４８、１６４、１８０、１９６、もしくは２１２に実質的に記載されるアミノ酸配列、またはその機能的変異体もしくは断片を含み得る。
抗体またはその機能的断片の重鎖の可変領域のポリペプチド配列は、配列番号１２、２８、４４、６０、７６、９２、１０８、１２４、１４０、１５６、１７２、１８８、２０４、もしくは２２０に実質的に記載されるアミノ酸配列、またはその機能的変異体もしくは断片を含み得る。
抗体またはその機能的断片は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び／または重鎖可変領域（ＶＨ）を含み得、軽鎖可変領域は、配列番号４、２０、３６、５２、６８、８４、１００、１１６、１３２、１４８、１６４、１８０、１９６、もしくは２１２に実質的に記載されるアミノ酸配列、またはその機能的断片もしくは変異体を含み、重鎖可変領域は、配列番号１２、２８、４４、６０、７６、９２、１０８、１２４、１４０、１５６、１７２、１８８、２０４、もしくは２２０に実質的に記載されるアミノ酸配列、またはその機能的断片もしくは変異体を含む。
抗体またはその機能的断片の一実施形態において、軽鎖の可変領域のＤＮＡ配列は、配列番号３、１９、３５、５１、６７、８３、９９、１１５、１３１、１４７、１６３、１７９、１９５、もしくは２１１に実質的に記載されるヌクレオチド配列、またはその機能的変異体もしくは断片を含み得る。抗体またはその機能的断片の一実施形態において、重鎖の可変領域のＤＮＡ配列は、配列番号１１、２７、４３、５９、７５、９１、１０７、１２３、１３９、１５５、１７１、１８７、２０３、もしくは２１９実質的に記載されるヌクレオチド配列、またはその機能的変異体もしくは断片を含み得る。
抗体またはその機能的断片は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び／または重鎖可変領域（ＶＨ）を含み得、軽鎖可変領域は、配列番号３、１９、３５、５１、６７、８３、９９、１１５、１３１、１４７、１６３、１７９、１９５、もしくは２１１に実質的に記載されるヌクレオチド配列、またはその機能的断片もしくは変異体を含むポリヌクレオチドによってコードされ、重鎖可変領域は、配列番号１１、２７、４３、５９、７５、９１、１０７、１２３、１３９、１５５、１７１、１８７、２０３、もしくは２１９に実質的に記載されるヌクレオチド配列、またはその機能的断片もしくは変異体を含むポリヌクレオチドによってコードされる。
本発明の抗体の一実施形態の軽鎖の定常領域のポリペプチド配列は、配列番号２２７に実質的に記載されるアミノ酸配列、またはその機能的断片もしくは変異体を含み得る。本発明の抗体の一実施形態の重鎖の定常領域のポリペプチド配列は、配列番号２２８に実質的に記載されるアミノ酸配列、またはその機能的断片もしくは変異体を含み得る。
本発明の抗体の一実施形態の軽鎖の定常領域をコードするＤＮＡ配列は、配列番号２２９に実質的に記載されるヌクレオチド配列、またはその機能的断片もしくは変異体を含み得る。本発明の抗体の一実施形態の重鎖の定常領域をコードするＤＮＡ配列は、配列番号２３０に実質的に記載されるヌクレオチド配列、またはその機能的断片もしくは変異体を含み得る。
第３の態様によれば、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）タンパク質に結合することが可能な単離されたペプチドが提供され、該ペプチドは、
（ｉ）配列番号８、９、１０、１６、１７及び／もしくは１８、
（ｉｉ）配列番号２４、２５、２６、３２、３３及び／もしくは３４、
（ｉｉｉ）配列番号４０、４１、４２、４８、４９及び／もしくは５０、
（ｉｖ）配列番号５６、５７、５８、６４、６５及び／もしくは６６、
（ｖ）配列番号７２、７３、７４、８０、８１及び／もしくは８２、
（ｖｉ）配列番号８８、８９、９０、９６、９７及び／もしくは９８、
（ｖｉｉ）配列番号１０４、１０５、１０６、１１２、１１３及び／もしくは１１４、
（ｖｉｉｉ）配列番号１２０、１２１、１２２、１２８、１２９及び／もしくは１３０、
（ｉｘ）配列番号１３６、１３７、１３８、１４４、１４５及び／もしくは１４６、
（ｘ）配列番号１５２、１５３、１５４、１６０、１６１及び／もしくは１６２、
（ｘｉ）配列番号１６８、１６９、１７０、１７６、１７７及び／もしくは１７８、
（ｘｉｉ）配列番号１８４、１８５、１８６、１９２、１９３及び／もしくは１９４、
（ｘｉｉｉ）配列番号２００、２０１、２０２、２０８、２０９及び／もしくは２１０、ならびに／または
（ｘｉｖ）配列番号２１６、２１７、２１８、２２４、２２５及び／もしくは２２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
第３の態様のペプチドは、好ましくは、ＲＯＲ１タンパク質の細胞外ドメインに結合することが可能である。よって、第３の態様の単離されたペプチドは、抗受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）抗体、またはその機能的断片であり得る。抗体は、ヒトであってもまたはなくてもよい。例えば、抗体またはその断片は、マウスであってもよい。またそれは組換えであってもよい。第３の態様の（ｉ）〜（ｘｉｖ）の各々に定義されるアミノ酸配列は、第１の態様の抗体またはその機能的断片のＣＤＲであることを理解されたい。したがって、単離されたペプチドは、（ｉ）〜（ｘｉｖ）のいずれかに定義される少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのアミノ酸配列を含み得る。好ましくは、ペプチドは、（ｉ）〜（ｘｉｖ）のいずれかに定義される全てのアミノ酸配列を含む。
ペプチドは、配列番号４、２０、３６、５２、６８、８４、１００、１１６、１３２、１４８、１６４、１８０、１９６、もしくは２１２に実質的に記載されるアミノ酸配列、またはその機能的変異体もしくは断片を含み得る。ペプチドは、配列番号１２、２８、４４、６０、７６、９２、１０８、１２４、１４０、１５６、１７２、１８８、２０４、もしくは２２０に実質的に記載されるアミノ酸配列、またはその機能的変異体もしくは断片を含み得る。ペプチドは、配列番号２２７もしくは２２８に実質的に記載されるアミノ酸配列、またはその機能的断片もしくは変異体を含み得る。
第４の態様によれば、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）タンパク質に結合することが可能なペプチドをコードする単離された核酸が提供され、該核酸は、
（ｉ）配列番号５、６、７、１３、１４及び／もしくは１５、
（ｉｉ）配列番号２１、２２、２３、２９、３０及び／もしくは３１、
（ｉｉｉ）配列番号３７、３８、３９、４５、４６及び／もしくは４７、
（ｉｖ）配列番号５３、５４、５５、６１、６２及び／もしくは６３、
（ｖ）配列番号６９、７０、７１、７７、７８及び／もしくは７９、
（ｖｉ）配列番号８５、８６、８７、９３、９４及び／もしくは９５、
（ｖｉｉ）配列番号１０１、１０２、１０３、１０９、１１０及び／もしくは１１１、
（ｖｉｉｉ）配列番号１１７、１１８、１１９、１２５、１２６及び／もしくは１２７、
（ｉｘ）配列番号１３３、１３４、１３５、１４１、１４２及び／もしくは１４３、
（ｘ）配列番号１４９、１５０、１５１、１５７、１５８及び／もしくは１５９、
（ｘｉ）配列番号１６５、１６６、１６７、１７３、１７４及び／もしくは１７５、
（ｘｉｉ）配列番号１８１、１８２、１８３、１８９、１９０及び／もしくは１９１、
（ｘｉｉｉ）配列番号１９７、１９８、１９９、２０５、２０６及び／もしくは２０７、ならびに／または
（ｘｉｖ）配列番号２１３、２１４、２１５、２２１、２２２及び／もしくは２２３からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
好ましくは、核酸は、抗受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）抗体、またはその機能的断片をコードし得る。抗体は、ヒトであってもまたはなくてもよい。例えば、抗体またはその断片は、マウスであってもよい。またそれは組換えであってもよい。第４の態様の（ｉ）〜（ｘｉｖ）の各々に定義されるヌクレオチド配列は、第１の態様の抗体またはその機能的断片のＣＤＲをコードすることを理解されたい。よって、核酸は、（ｉ）〜（ｘｉｖ）のいずれかに定義される少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのヌクレオチド配列を含み得る。好ましくは、核酸は、（ｉ）〜（ｖｉ）のいずれかに定義される全てのヌクレオチド配列を含む。好ましくは、核酸は、ヒト抗体、またはその機能的断片の少のなくとも１つの抗原結合領域のアミノ酸配列を実質的にコードするヌクレオチド配列を含む。
核酸は、配列番号３、１９、３５、５１、６７、８３、９９、１１５、１３１、１４７、１６３、１７９、１９５、もしくは２１１に実質的に記載されるヌクレオチド配列、またはその機能的変異体もしくは断片を含み得る。核酸は、配列番号１１、２７、４３、５９、７５、９１、１０７、１２３、１３９、１５５、１７１、１８７、２０３、もしくは２１９に実質的に記載されるヌクレオチド配列、またはその機能的変異体もしくは断片を含み得る。核酸は、配列番号２２９もしくは２３０に実質的に記載されるヌクレオチド配列、またはその機能的断片を含み得る。
有利には、抗体またはその機能的断片は、それ自体で治療薬の有用性を有し、非ヒト領域（例えば、マウス）、例えば、Ｆｃ断片もしくはフレームワーク領域、または少なくとも１つのマウス抗原結合領域もしくは相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗体を用いる治療に対する著しい改善である。しかしながら、それに加えて、抗体またはその機能的断片のＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害）及び／またはＣＤＣ（補体依存性細胞傷害）活性を増強するためのグリコシル化操作、放射線、細胞傷害性薬物または毒素等の細胞傷害性部分との複合化、及び一方のアームが腫瘍細胞を標的とし、他方のアームが細胞傷害性Ｔ細胞を誘引する二重特異性抗体の作製を含む、薬効を最大限に生かすための技術が評価された。
したがって、第５の態様において、第１の態様の抗体またはその機能的断片と、細胞傷害性部分とを含む抗体‐薬物複合体（ＡＤＣ）が提供される。
抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）は、抗体を介して標的細胞に強力な細胞傷害性薬物を選択的に送達するために使用され得る。そのような方法は、腫瘍抗原標的に適用されると、抗体の抗腫瘍活性を増強し、化学療法の腫瘍対正常組織の選択性を向上させることができる。ＡＤＣ開発のための重要なパラメータの１つは、抗体が、標的抗原に結合するとエンドサイトーシスによって取り込まれ得、したがって、標的癌細胞に複合化薬物を送達できるということである。図２６は、本発明の抗体がエンドサイトーシスによって効果的に取り込まれることを示している。
細胞傷害性部分は、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、またはメイタンシン等の毒素であり得る。薬物部分は、２２５Ａｃ標識等のα線を放出する放射性ヌクレオチドであり得る。これらの毒素は、切断可能なリンカー、例えば、ジスルフィド結合、ヒドラゾンリンカー、もしくはペプチドリンカーを介して、または切断不可能なリンカー、例えば、ＳＭＣＣ（Ｎ−スクシイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−ｌ−カルボキシレート）リンカーを用いたチオエーテル結合を介して、抗体またはその機能的断片（すなわち、その抗原結合断片）に連結され得る。
第６の態様によれば、治療または診断に使用するために、各々が任意選択的に誘導体化された、第１の態様で定義される抗体もしくはその機能的断片、第３の態様で定義されるペプチド、第４の態様で定義される核酸、または第５の態様で定義される抗体−薬物複合体が提供される。
第１の態様で定義される抗体もしくはその機能的断片、第３の態様で定義されるペプチド、第４の態様で定義される核酸、または第５の態様で定義される抗体−薬物複合体は、薬物として使用され得、それらは、好ましくは、癌の治療、改善、または予防における用途に適合される。
したがって、第７の態様によれば、癌の治療、予防、または改善に使用するための、各々が任意選択的に誘導体化された、第１の態様で定義される抗体もしくはその機能的断片、第３の態様で定義されるペプチド、第４の態様で定義される核酸、または第５の態様で定義される抗体−薬物複合体が提供される。
「誘導体化される」という用語は、抗体もしくはその機能的断片、ペプチド、核酸、または複合体が、好ましくは、その誘導体または変異体を生成するために、使用前に修飾され得ることを意味し得る。誘導体化の例として、ＰＥＧ化抗体もしくはＰＥＧ化抗体断片、または抗体−サイトカイン融合タンパク質を挙げることができる。しかしながら、いくつかの実施形態において、抗体もしくはその機能的断片、ペプチド、核酸、または複合体は、誘導体化されなくてもよい。
ＲＯＲ１は、多種多様なヒト癌種において発現されるため、抗体もしくはその機能的断片、ペプチド、核酸、または複合体は、ＲＯＲ１陽性癌種の治療、予防、改善、または診断に用いられ得る。
抗ＲＯＲ１抗体を用いて治療することができる非限定的な例示的な癌は、細胞腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病を含む。そのような癌のより具体的な非限定例として、扁平上皮癌、小細胞肺癌、下垂体癌、食道癌、星状細胞腫、軟部肉腫、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、腹膜癌、肝細胞癌、消化器癌、膵癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、腎癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌、脳癌、神経芽細胞腫、子宮内膜癌、精巣癌、胆管細胞癌、胆嚢癌、胃癌、メラノーマ、及び種々の種類の頭頸部癌が挙げられる。いくつかの実施形態において、肺癌は、非小細胞肺癌または肺扁平上皮癌である。いくつかの実施形態において、白血病は、急性骨髄性白血病、Ｂ細胞性急性リンパ性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、または慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）である。いくつかの実施形態において、リンパ腫は、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）または辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）である。いくつかの実施形態において、乳癌は浸潤乳癌である。いくつかの実施形態において、卵巣癌は、卵巣漿液性嚢胞腺癌である。いくつかの実施形態において、腎臓癌は、腎明細胞癌である。いくつかの実施形態において、結腸癌は結腸腺癌である。いくつかの実施形態において、膀胱癌は、膀胱尿路上皮癌である。上に記載した癌のいずれにおいても、癌はＲＯＲ１陽性癌であり得る。
第８の態様によれば、対象における癌の治療、予防、または改善の方法が提供され、該方法は、そのような治療を必要とする患者に、各々が任意選択的に誘導体化された、治療有効量の第１の態様で定義される抗体もしくはその機能的断片、第３の態様で定義されるペプチド、第４の態様で定義される核酸、または第５の態様で定義される抗体−薬物複合体を投与することを含む。
本発明による抗体、断片、ペプチド、核酸、及び複合体（本明細書において集合的に「薬剤」と称される）は、癌を治療、改善、または予防するために、単剤療法（例えば、抗体もしくはその断片単独での使用、または抗体−薬物複合体単独での使用）に使用され得ることを理解されたい。代替的に、本発明による薬剤は、癌を治療、改善、または予防するための既知の治療の補助として、または該治療と併用して使用され得る。そのような治療薬は、限定されないが、化学療法、抗血管新生剤、増殖阻害剤、免疫療法、放射線療法等を含む。
本明細書に記載される抗ＲＯＲ１抗体と組み合わせることができる非限定的な例示的な化学療法剤は、限定されないが、チオテパ及びＣｙｔｏｘａｎ（登録商標）シクロホスファミド等のアルキル化剤；スルホン酸アルキル、例えば、ブスルファン、インプロスルファン、及びピポスルファン；アジリジン、例えば、ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ、及びウレドーパ；エチレンイミン及びメチラメラミン（アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド、及びトリメチローロメラミンを含む）；アセトゲニン（特に、ブラタシン及びブラタシノン）；カンプトテシン（合成類似体トポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン、及びバイゼレシンの合成類似体を含む）；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体、ＫＷ−２１８９、及びＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチイン；スポンジスタチン；ナイトロジェンマスタード、例えばクロランブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニマスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード；ニトロスウレア、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、及びラニムスチン；エンジイン抗生物質等の抗生物質（例えば、カリチアマイシン、特にカリチアマイシンγＩ及びカリチアマイシンωＩ１（例えば、Ａｇｎｅｗ，Ｃｈｅｍ Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３３：１８３−１８６（１９９４）を参照）；ジネミシンＡを含むジネミシン；クロドロネート等のビスホスネート；エスペラミシン；ならびにネオカルチノスタチン発色団及び関連色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アウトラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシニス、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標）ドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン、及びでオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン（マイトマイシンＣ等）、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；メトトレキサート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）等の代謝拮抗薬；葉酸類似体、例えば、デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート；プリン類似体、例えば、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジン類似体、例えば、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン；アンドロゲン、例えば、カルステロン、ドロモスタノロンプロピオナート、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗アドレナル、例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；フォリン酸等の葉酸補給剤；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジクオン；エルフォミチン；エリプチニウムアセテート；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン；メイタンシン及びアンサミトシン等のメイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール；ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）ポリサッカリド複合体（ＪＨＳ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特に、Ｔ−２毒素、ベラクリンＡ、ロリジンＡ、及びアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、Ｔａｘｏｌ（登録商標）パクリタキセル（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）（クレモフォールを含まない、パクリタキセルのアルブミン改変ナノ粒子製剤）（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐａｒｔｎｅｒｓ、Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）、及びＴａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）ドキセタキセル（Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ、Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ）；クロラムブシル；Ｇｅｍｚａｒ（登録商標）ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金類似体、例えば、シスプラチン、オキサリプラチン、及びカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（登録商標）ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ，ＣＰＴ−１１）（５−ＦＵ及びロイコボリンを用いたイリノテカンの治療計画を含む）；トポイソメラーゼ阻害薬ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸等のレチノイド；カペシタビン；コンブレタスタチン；ロイコボリン（ＬＶ）；オキサリプラチン（オキサリプラチン治療計画（ＦＯＬＦＯＸ）を含む）；細胞増殖を低下させるＰＫＣ−α、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ、ＥＧＦＲ（例えば、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標）））、及びＶＥＧＦ−Ａの阻害剤、ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体を含む。
さらなる非限定的な例示的な化学療法剤は、癌に対するホルモンの作用を制御または阻害するように作用する抗ホルモン剤、例えば、抗エストロゲン及び選択的エストロゲン受容体調節物質（ＳＥＲＭｓ）（例えば、タモキシフェン（Ｎｏｌｖａｄｅｘ（登録商標）タモキシフェンを含む）、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェンＬＹ１１７０１８、オナプリストン、及びＦａｒｅｓｔｏｎ（登録商標））トレミフェンを含む）；副腎におけるエストロゲンの産生を制御する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤、例えば、４（５）−イミダゾール、アミノグルテチミド、Ｍｅｇａｓｅ（登録商標）酢酸メゲストロール、Ａｒｏｍａｓｉｎ（登録商標）エキセメスタン、フォルメスタン、ファドロゾール、Ｒｉｖｉｓｏｒ（登録商標）ボロゾール、Ｆｅｍａｒａ（登録商標）レトロゾール、及びＡｒｉｍｉｄｅｘ（登録商標）アナストロゾール等；抗アンドロゲン、例えば、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリン；ならびにトロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に、異常な細胞増殖に関与するシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの、例えば、例えば、ＰＫＣ−α、Ｒａｌｆ、及びＨ−Ｒａｓ；リボザイム、例えば、ＶＥＧＦ発現阻害剤（例えば、Ａｎｇｉｏｚｙｍｅ（登録商標）リボザイム）及びＨＥＲ２発現阻害剤；遺伝子治療ワクチン等のワクチン、例えば、Ａｌｌｏｖｅｃｔｉｎ（登録商標）ワクチン、Ｌｅｕｖｅｃｔｉｎ（登録商標）ワクチン、及びＶａｘｉｄ（登録商標）ワクチン；Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）ｒＩＬ−２；Ｌｕｒｔｏｔｅｃａｎ（登録商標）トポイソメラーゼ１阻害剤；Ａｂａｒｅｌｉｘ（登録商標）ｒｍＲＨ；ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体を含む。
非限定的な例示的な抗血管新生剤は、血管新生剤に対する抗体または他のアンタゴニスト、例えば、ＶＥＧＦ−Ａに対する抗体（例えば、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ））またはＶＥＧＦ−Ａ受容体に対する抗体（例えば、ＫＤＲ受容体もしくはＦｌｔ−１受容体）、Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標）（イマチニブメシル酸塩）等の抗ＰＤＧＦＲ阻害剤、ＶＥＧＦ受容体のシグナル伝達をブロックする小分子（例えば、ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２８４、ＳＵ６６６８、Ｓｕｔｅｎｔ（登録商標）／ＳＵ１１２４８（スニチニブリンゴ酸塩）、ＡＭＧ７０６、または、例えば、国際特許出願第ＷＯ２００４／１１３３０４号に記載されているものを含む。抗血管新生剤はまた、天然の血管新生阻害剤、例えばアンジオスタチン、エンドスタチン等を含む。例えば、Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ ａｎｄ Ｄ’Ａｍｏｒｅ（１９９１）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５３：２１７−３９；Ｓｔｒｅｉｔ ａｎｄ Ｄｅｔｍａｒ（２００３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２２：３１７２−３１７９（例えば、悪性メラノーマの抗血管新生療法を列挙している表３）；Ｆｅｒｒａｒａ＆Ａｌｉｔａｌｏ（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ５（１２）：１３５９−１３６４；Ｔｏｎｉｎｉ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２２：６５４９−６５５６（例えば、既知の抗血管新生因子を列挙している表２）；及びＳａｔｏ（２００３）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．８：２００−２０６（例えば、臨床試験で使用される抗血管新生剤を列挙している表１）を参照されたい。
増殖阻害剤の例として、限定されないが、（Ｓ期以外の位置の）細胞周期の進行をブロックする薬剤、例えば、Ｇ１停止及びＭ期停止を誘導する薬剤を含む。古典的なＭ期ブロッカーは、ビンカス（ビンクリスチン及びビンブラスチン）、タキソール、及びトポイソメラーゼＩＩ阻害剤、例えば、ドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンを含む。Ｇ１を停止する薬剤はまた、Ｓ期停止にまで及び、例えば、ＤＮＡアルキル化剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、及びアラ−Ｃである。さらなる情報は、Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ ａｎｄ Ｉｓｒａｅｌ，ｅｄｓ．，Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，Ｃｈａｐｔｅｒ １，ｅｎｔｉｔｌｅｄ「Ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ，ａｎｄ ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ｄｒｕｇｓ」ｂｙ Ｍｕｒａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．（Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１９９５）の例えばｐ．１３に見出すことができる。タキサン（パクリタキセル及びドセタキセル）は、両方ともイチイの樹に由来する抗癌薬である。ヨーロッパイチイに由来するドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ）は、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）の半合成誘導体である。パクリタキセル及びドセタキセルは、チューブリン二量体からの微小管の集合を促進し、解重合を防止することによって微小管を安定化し、その結果、細胞における有糸分裂を阻害する。
本明細書に記載される抗ＲＯＲ１抗体と組み合わせることができる例示的な治療剤は、化学療法剤、増殖阻害剤、細胞傷害剤、放射線療法で使用される薬剤、抗血管新生剤、癌免疫療法剤、アポトーシス剤、抗チューブリン剤、及び癌を治療するための他の薬剤、例えば、抗ＨＥＲ−２抗体、抗ＣＤ２０抗体、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）アンタゴニスト（例えば、チロシンキナーゼ阻害剤）、ＨＥＲ１／ＥＧＦＲ阻害剤（例えば、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標））、血小板由来増殖因子阻害剤（例えば、Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標）（イマチニブメシル酸塩））、ＣＯＸ−２阻害剤（例えば、セレコキシブ）、インターフェロン、ＣＴＬＡ４阻害剤（例えば、抗ＣＴＬＡ抗体イピリムマブ（ＹＥＲＶＯＹ（登録商標）））、ＰＤ−１阻害剤（例えば、抗ＰＤ１抗体、ＢＭＳ−９３６５５８）、ＰＤＬ１阻害剤（例えば、抗ＰＤＬ１抗体、ＭＰＤＬ３２８０Ａ）、ＰＤＬ２阻害剤（例えば、抗ＰＤＬ２抗体）、ＴＩＭ３阻害剤（例えば、抗ＴＩＭ３抗体）、サイトカイン、以下の標的のうちの１つ以上に結合するアンタゴニスト（例えば、中和抗体）：ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＰＤＧＦＲ−β、ＢｌｙＳ、ＡＰＲＩＬ、ＢＣＭＡ、ＰＤ−１、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、またはＶＥＧＦ受容体（複数可）、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２、ならびに他の生理活性剤及び有機化学剤等を含む。それらの組み合わせも本発明に含まれる。
本発明による薬剤は、特に組成物が使用される様式に応じて、多くの異なる形態を有する組成物中に組み合わせることができる。したがって、例えば、組成物は、散剤、錠剤、カプセル、液体、軟膏、クリーム、ゲル、ヒドロゲル、エアロゾル、スプレー、ミセル溶液、経皮パッチ、リポソーム懸濁液の形態、または治療を必要とするヒトもしくは動物に投与してもよい任意の他の好適な形態であり得る。本発明による薬物のビヒクルは、それを投与される対象が良好な耐容性を示すものであるべきであり、好ましくは、血液脳関門を横断する薬剤の送達を可能にすることを理解されたい。
本発明による薬剤を含む薬物は、多くの方法に使用され得る。例えば、経口投与が必要とされ得、その場合、薬剤は、例えば、錠剤、カプセル、または液体の形態で経口摂取され得る組成物内に含有され得る。本発明の薬剤及び薬物を含む組成物は、吸入によって（例えば、鼻腔内に）投与されてもよい。組成物はまた、局所使用のために配合されてもよい。例えば、クリームまたは軟膏は、皮膚に塗布されてもよい。本発明による薬剤及び薬物はまた、除放デバイスまたは遅延放出デバイス内に組み込まれてもよい。そのようなデバイスは、例えば、皮膚上または皮下に挿入され得、薬物は、数週間またはさらには数ヶ月にわたって放出され得る。デバイスは、治療部位に少なくとも隣接して配置され得る。そのようなデバイスは、本発明による薬剤を使用した長期治療が必要とされ、通常、頻繁な投与（例えば、少なくとも毎日注射）を必要とする場合、特に有利であり得る。
好ましい実施形態において、本発明による薬剤及び薬物は、血流中への注射によって、または治療を必要とする部位への直接的な注射によって対象に投与されてもよい。注射は、静脈内（ボーラスもしくは点滴）、または皮下（ボーラスもしくは点滴）、または皮内（ボーラスもしくは点滴）であり得る。必要とされる抗体、断片、ペプチド、及び核酸（すなわち、薬剤）の量は、その生物学的活性及び生物学的利用能によって決定され、ひいては、投与様式、薬物の生理化学的特性、及びそれが単剤療法として使用されるのかまたは併用療法において使用されるのかに依存することを理解されたい。投与頻度もまた、治療される対象内の薬物の半減期による影響を受ける。投与されるべき最適な投与量は、当業者によって決定され得、使用中の特定の薬剤、薬学的組成物の強度、投与様式、及び細菌感染の進行によって異なるであろう。治療される特定の対象に応じた追加要因により、対象の年齢、体重、性別、食生活、及び投与期間を含む投与量を調節する必要性が生じる。
一般に、どの薬剤であるかに応じて、１日用量０．００１μｇ／ｋｇ体重〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の本発明による薬剤が、癌を治療、改善、または予防するために使用され得る。より好ましくは、薬剤の１日用量は、０．０１μｇ／ｋｇ体重〜１ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは０．１μｇ／ｋｇ体重〜１００μｇ／ｋｇ体重、最も好ましくは約０．１μｇ／ｋｇ体重〜１０μｇ／ｋｇ体重である。
薬剤は、癌の発症前、発症中、または発症後に投与され得る。１日用量は、単回投与（例えば、１日１回の注射）として与えられてもよい。代替的に、薬物は、１日の間に２回以上の投与を必要とする場合がある。一例として、薬物は、０．０７ｇ〜７００ｍｇ（すなわち、体重が７０ｋｇであると仮定して）の１日２回（または、治療される癌感染症の重症度に応じてそれ以上）の用量として投与されてもよい。治療を受ける患者は、起床時に１回目の投与を受け、次いで、夕方に（２回投与計画の場合）、またはその後３〜４時間の間隔を空けて、２回目の投与を受けてもよい。代替的に、反復投与を必要としない患者に最適な用量の本発明による薬剤を提供するために、徐放デバイスが用いられてもよい。医薬品業界で従来用いられているもの等の既知の手順（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ実験、臨床試験等）を用いて、本発明による薬剤の特定の配合、及び正確な治療計画（薬剤の１日用量及び投与頻度等）を形成してもよい。
本発明の第９の態様において、各々が任意選択的に誘導体化された、第１の態様で定義される抗体もしくはその機能的断片、第３の態様で定義されるペプチド、第４の態様で定義される核酸、または第５の態様で定義される抗体−薬物複合体と、薬学的に許容されるビヒクルと、を含む薬学的組成物が提供される。
組成物は、抗癌組成物であり得る。
抗体もしくはその機能的断片、ペプチド、または核酸は、誘導体化されなくてもよい。
また、本発明は、第１０の態様において、第９の態様による組成物を作製するためのプロセスも提供し、該プロセスは、各々が任意選択的に誘導体化された、治療有効量の第１の態様で定義される抗体もしくはその機能的断片、第３の態様で定義されるペプチド、第４の態様で定義される核酸、または第５の態様で定義される抗体−薬物複合体と、薬学的に許容されるビヒクルと、を組み合わせることを含む。
抗体またはその断片は、第１の態様に関して定義された通りであり得る。
いくつかの実施形態において、使用される治療有効量の抗体またはその断片は、約０．００１ｎｇ〜約１ｍｇ、好ましくは約０．０１ｎｇ〜約１００ｎｇであり得る。抗体または断片の量が、約０．１ｎｇ〜約１０ｎｇの量であることが好ましく、最も好ましくは約０．５ｎｇ〜約５ｎｇである。
一実施形態において、薬学的に許容されるビヒクルは固体であってもよく、組成物は、散剤または錠剤の形態であってもよい。薬学的に許容される固体ビヒクルは、香味剤、滑沢剤、可溶化剤、懸濁化剤、色素、増量剤、流動促進剤、圧縮補助剤、不活性結合剤、甘味剤、防腐剤、色素、コーティング剤、または錠剤崩壊剤として作用し得る１つ以上の物質を含み得る。ビヒクルはまた、カプセル化材料であってもよい。散剤において、ビヒクルは、本発明による微細な活性剤と混合物された微細な固体である。錠剤において、活性剤は、必要な圧縮特性を有するビヒクルと好適な割合で混合され、所望の形状及びサイズに圧縮されてもよい。散剤及び錠剤は、好ましくは最大９９％の活性物質を含有する。好適な固体ビヒクルは、例えば、リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、デキストリン、デンプン、ゼラチン、セルロース、ポリビニルピロリジン、低融点ワックス、及びイオン交換樹脂を含む。別の実施形態において、薬学的ビヒクルはゲルであってもよく、組成物はクリーム等の形態であってもよい。
しかしながら、薬学的ビヒクルは液体であってもよく、薬学的組成物は溶液の形態であってもよい。液体ビヒクルは、溶液、懸濁液、乳濁液、シロップ、エリキシル、及び加圧組成物を調製する際に使用される。本発明による活性剤は、薬学的に許容される液体ビヒクル、例えば、水、有機溶媒、それら両方の混合物、または薬学的に許容される油もしくは脂肪中に溶解または懸濁され得る。液体ビヒクルは、可溶化剤、乳化剤、緩衝剤、保存剤、甘味剤、香味剤、懸濁化剤、増粘剤、着色剤、粘度調節剤、安定化剤、または浸透圧調節剤等の他の好適な薬学的添加剤を含有し得る。経口及び非経口投与のための液体ビヒクルの好適な例として、水（上記添加剤、例えば、セルロース誘導体、好ましくはカルボキシメチルセルロースナトリウム溶液を一部含む）、アルコール（一価アルコール、及び多価アルコール、例えば、グリコールを含む）及びそれらの誘導体、ならびに油（例えば、分留ヤシ油及びラッカセイ油）が挙げられる。非経口投与の場合、ビヒクルは、オレイン酸エチル及びミリスチン酸イソプロピル等の油性エステルであり得る。滅菌された液体ビヒクルは、非経口投与用の滅菌された液体形態の組成物において有用である。加圧組成物用の液体ビヒクルは、ハロゲン化炭化水素または他の薬学的に許容される噴射剤であり得る。
滅菌された溶液または懸濁液である薬学的液体組成物は、例えば、筋肉内、髄腔内、硬膜外、腹腔内、静脈内、特に皮下注射によって利用され得る。薬剤は、滅菌水、生理食塩水、または他の適切な滅菌注射媒体を用いて投与時に溶解または懸濁され得る滅菌された固体組成物として調製されてもよい。
本発明の薬剤及び組成物は、他の溶質または懸濁化剤（例えば、溶液を等張にするのに十分な生理食塩水またはグルコース）、胆汁酸塩、アカシア、ゼラチン、ソルビタンモノオレエート、ポリソルベート８０（ソルビトールのオレイン酸エステル、及びエチレンオキシドと共重合したその無水物）等を含有する滅菌された溶液または懸濁液の形態で経口投与され得る。本発明に従って使用される薬剤は、液体または固体の組成物形態で経口投与することもできる。経口投与に好適な組成物は、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、錠剤、及び散剤等の固体形態、ならびに溶液、シロップ、エリキシル、及び懸濁液等の液体形態を含む。非経口投与に有用な形態は、滅菌溶液、乳濁液、及び懸濁液を含む。
本発明はまた、癌に罹患する患者を診断するためのキットも提供する。したがって、本発明の第１１の態様によれば、癌に罹患するかもしくは癌を発症し易い対象を診断するため、または対象の状態の予後を提供するためのキットが提供され、該キットは、試験対象からの試料中に存在する抗原の濃度を検出するための検出手段を含み、該検出手段は、各々が任意選択的に誘導体化された、第１の態様によって定義される抗体もしくはその機能的断片、第３の態様によって定義されるペプチド、または第４の態様によって定義される核酸を含み、試料中の抗原の存在は、対象が癌に罹患することを示唆する。
第１２の態様によれば、癌に罹患するかもしくは癌を発症し易い対象を診断するため、または対象の状態の予後を提供するための方法が提供され、該方法は、対象から得られた試料中に存在する抗原の濃度を検出することを含み、該検出は、各々が任意選択的に誘導体化された、第１の態様によって定義される抗体もしくはその機能的断片、第３の態様によって定義されるペプチド、または第４の態様によって定義される核酸を使用して達成され、試料中の抗原の存在は、対象が癌に罹患することを示唆する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗ＲＯＲ１抗体を用いた治療のために患者を選択する方法は、対象がＲＯＲ１を発現する癌を有するかどうかを決定することを含む。そのような方法は、例えば、本明細書に記載される抗ＲＯＲ１抗体を用いて、患者由来の癌細胞上のＲＯＲ１の存在を検出することを含み得る。
好ましくは、抗原は、ＲＯＲ１タンパク質、より好ましくはその細胞外ドメインを含む。試料は、血液、尿、組織等を含み得る。
好ましくは、キットまたは方法は、試料中のＲＯＲ１陽性細胞の存在もしくは非存在を同定する、または試料中のその濃度を決定するために使用される。「ＲＯＲ１陽性細胞」という用語は、その表面上にＲＯＲ１を発現している細胞を意味し得る。検出手段は、試料中のＲＯＲ１陽性細胞の存在及び／または非存在を検出するように適合されたアッセイを含み得る。キットまたは方法は、アッセイが比較され得る陽性対照及び／または陰性対照を含んでもよい。例えば、キットは、癌に罹患するか（すなわち、陽性対照）または罹患しない（すなわち、陰性対照）個体からの試料中のＲＯＲ１陽性細胞の濃度に関する基準を含んでもよい。キットは、検出され得る標識をさらに含んでもよい。「標識」という用語は、抗体、断片、ペプチド、または核酸に結合することができる部分を意味し得る。部分は、例えば、治療手技または診断手技に使用することができる。治療用標識は、例えば、本発明の抗体またはその断片に結合し、抗体のＲＯＲ１タンパク質への結合を監視するために使用することができる部分を含む。診断用標識は、例えば、分析方法によって検出することができる部分を含む。分析方法は、例えば、定性的手順及び定量的手順を含む。定性的な分析方法は、例えば、免疫組織化学的検査及び間接的免疫蛍光染色法を含む。定量的な分析方法は、例えば、ＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳ分析等の免疫親和性手順を含む。分析方法はまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの両方の撮像手順も含む。分析手段によって検出され得る診断用標識の特定の例として、酵素、放射性同位元素、蛍光色素、化学発光マーカー、及びビオチンが挙げられる。標識は、本発明の抗体、その断片、ペプチド、もしくは核酸に直接結合させてもよいか、または本発明の分子に特異的に結合する二次結合剤に結合させてもよい。そのような二次結合剤は、例えば、二次抗体であり得る。二次抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルのいずれかであってもよく、またヒト、げっ歯類、またはキメラ起源であり得る。
実施例３に記載されるように、本発明者は、本発明の組換え完全長ＩｇＧ１ヒトモノクローナル抗体がどのように作製されるかを示した。例えば、抗体またはその機能的断片は、バクテリオファージ発現系によって産生されてもよい。好ましくは、バクテリオファージ発現系は、ファージディスプレイライブラリを含む。
抗体またはその機能的断片をコードするポリヌクレオチドを単離するための有用な手順は、ＣＬＬ等の癌に罹患する個体から単離したＲＮＡから逆転写することができるｃＤＮＡの単離から始まる。この病態は、ＲＯＲ１に対する免疫特異性を有する抗体の存在によって特徴付けられる。ｃＤＮＡ合成の方法は、当該技術分野で周知である。重鎖または軽鎖を含む抗体またはその機能的断片をコードするｃＤＮＡは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、好ましくは逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて増幅することができる。
ＰＣＲに好適なプライマーは、重鎖または軽鎖の特定の機能的断片に隣接する保存された配列を用いて、当業者によって決定され得る。好適なＰＣＲ条件は、当業者によって決定され得る。
好ましくは、ＰＣＲは、重鎖、より好ましくはＶＨ ＣＨ１断片、さらにより好ましくは重鎖可変断片（ＶＨ）を増幅するように適合される。代替的に、または付加的に、ＰＣＲは、軽鎖、より好ましくはＶＬ ＣＬ断片、さらにより好ましくは軽鎖可変断片（ＶＬ）を増幅するように適合され得る。好ましくは、ＰＣＲ産物は、好適な発現ベクター、より好ましくはファージ発現ベクターにクローン化され、その一実施形態が図１４ａ及び１４ｂに示される。好ましくは、ベクターは、重鎖断片、好ましくは軽鎖断片の発現が起こるように、好適な宿主、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）に導入される。好適なベクター及び宿主細胞系は、例えば、重鎖及び軽鎖の機能的断片の共発現及び集合を可能にし得る。好ましくは、ベクターは、電気穿孔により宿主に導入される。抗体断片の発現のための他の好適な系は、当業者によって決定され得、例えば、Ｍ１３ファージ発現ベクターを含む。組換えモノクローナル抗体またはその機能的断片は、当該技術分野で既知の方法を用いて実質的に精製することができ、該方法は、使用される特定のベクター及び宿主の発現系に依存する。
第１３の態様において、第４の態様の核酸を含む遺伝子構築物が提供される。本発明の遺伝子構築物は、発現カセットの形態であってもよく、宿主細胞におけるコードされたポリペプチドの発現に好適であり得る。遺伝子構築物は、ベクターに組み込まれることなく、宿主細胞に導入され得る。例えば、核酸分子であり得る遺伝子構築物は、リポソームまたはウイルス粒子中に組み込まれてもよい。代替的に、精製された核酸分子（例えば、ヒストンを含まないＤＮＡ、または裸のＤＮＡ）が、好適な手段、例えば、直接的なエンドサイトーシスによる取り込みによって、宿主細胞に直接挿入されてもよい。遺伝子構築物は、遺伝子導入、感染、電気穿孔、マイクロインジェクション、細胞融合、プロトプラスト融合、または弾道衝撃によって、宿主対象の細胞（例えば、細菌細胞）に直接導入され得る。代替的に、本発明の遺伝子構築物は、粒子銃を用いて宿主細胞に直接導入されてもよい。代替的に、遺伝子構築物は、好適な宿主細胞における発現のために、組換えベクターの内部に含まれてもよい。
したがって、第１４の態様において、第１３の態様による遺伝子構築物を含む組換えベクターが提供される。
組換えベクターは、プラスミド、コスミド、またはファージであり得る。そのような組換えベクターは、第１３の態様の遺伝子構築物を用いて宿主細胞を形質転換するため、及びその中の発現カセットを複製するために有用である。当業者は、本発明の遺伝子構築物が、発現目的で多くの種類のバックボーンベクターと組み合わせられ得ることを理解するであろう。好適なバックボーンベクターの例として、図１４ａ及び１４ｂに示すものが挙げられる。組換えベクターは、遺伝子発現を開始するための好適なプロモーターを含む様々な他の機能的要素を含み得る。例えば、組換えベクターは、宿主細胞の細胞質中で自律的に複製するように設計されてもよい。この場合、組換えベクター中に、ＤＮＡ複製を誘導または制御する要素が必要な場合がある。代替的に、組換えベクターは、宿主細胞のゲノムに組み込まれるように設計されてもよい。この場合、（例えば、非相同組換えによる）標的とする組込みに有利なＤＮＡ配列が想定される。
組換えベクターはまた、クローン化プロセスにおいて選択可能マーカーとして使用され得る、すなわち、形質導入または形質転換された細胞の選択を可能にし、異種ＤＮＡが組み込まれたベクターを内部に含む細胞の選択を可能にするために使用され得る遺伝子をコードするＤＮＡを含んでもよい。代替的に、選択可能マーカー遺伝子は、対象となる遺伝子を含有するベクターと同時に使用される異なるベクター中に存在してもよい。ベクターはまた、コード配列の発現を制御することに関与するＤＮＡ、または発現されたポリペプチドを宿主細胞のある特定の部分に標的化するためのＤＮＡを含んでもよい。
第１５の態様において、第１３の態様による遺伝子構築物、または第１４の態様による組換えベクターを含む宿主細胞が提供される。
宿主細胞は、細菌細胞であり得る。宿主細胞は、動物細胞、例えば、マウスまたはラット細胞であり得る。宿主細胞がヒト細胞ではないことが好ましい。宿主細胞は、既知の技術を用いて、本発明による遺伝子構築物またはベクターによって形質転換され得る。宿主細胞に遺伝子構築物を導入するための好適な手段は、細胞の種類に依存する。第１６の態様によれば、組換え抗体またはその機能的断片を調製する方法が提供され、該方法は、（ｉ）必要とされる抗体またはその機能的断片を発現させることが可能な、第１５の態様で定義される少なくとも１つの細胞を培養することと、（ｉｉ）抗体またはその機能的断片を単離することと、を含む。
本明細書に記載されるように、本発明による抗体は、ＲＯＲ１に結合することができる。しかしながら、本発明者は、本発明の抗体またはその機能的断片が、ＲＯＲファミリーの他のメンバーに対して免疫特異性を示す抗体の開発のための枠組みとしての役割を果たすために使用され得ることを認識している。例えば、本明細書に記載されるＲＯＲ１特異的抗体のＣＤＲに突然変異を導入しても、一実施形態においてＲＯＲ２を、または別の実施形態においてＲＯＲ１及びＲＯＲ２の両方を認識することができる抗体を単離することが可能である。
よって、第１７の態様によれば、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体２（ＲＯＲ２）に結合する能力を有する抗体またはその機能的断片を単離する方法が提供され、該方法は、
（ｉ）第１の態様で定義される抗体またはその機能的断片を突然変異させて突然変異体を生成することと、
（ｉｉ）ＲＯＲ２に対する免疫特異性に合わせて突然変異体を選択することと、を含む。
突然変異体は、ＲＯＲ２に、またはＲＯＲ１及びＲＯＲ２の両方に特異的であり得る。
第１の実施形態において、前記突然変異ステップは、例えば、縮重ＰＣＲを用いた、ランダム変異誘発を含み得る。例えば、抗体のｃＤＮＡがＰＣＲ反応における鋳型として使用され、該反応には、変異原性ヌクレオシド三リン酸、例えばｄＰ及び８オキソ−２’デオキシグアノシン等の変異原が加えられてもよい。有利には、これにより、ｃＤＮＡの至るところに高度に制御された様式で突然変異が導入され、突然変異ライブラリを生成することが可能になる。得られた突然変異のライブラリは、ファージの表面上に提示され得、次いで、ＲＯＲ２に対する抗体が選択され得る。
得られた突然変異抗体のライブラリは、バイオパニングを用いてＲＯＲ２に対して選択され得る。例えば、ＥＬＩＳＡプレートを、ＲＯＲ２で、例えば、重炭酸緩衝液（ｐＨ８．６）中のＲＯＲ２の１ｐｇ／ｍ１−１溶液１００μ１でコーティングして、４℃で一晩インキュベートしてもよい。次いで、ＴＢＳ等の緩衝液でプレートを洗浄してもよい。次いで、プレートを、例えば、ＰＢＳ中の５％ＢＳＡでブロックし、３７℃で１時間インキュベートしてもよい。さらに２回洗浄した後、１００μ１のファージ懸濁液を各ウェルに加え、プレートを３７℃で２時間インキュベートしてもよい。
ファージを除去し、ＴＢＳ０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＴＢＳＴ）でウェルを満たし、激しくピペット撹拌してもよい。５分後に、ＴＢＳＴを除去してもよく、１回目のパニングのために、この方法によりプレートを１回洗浄してもよい。２回目のパニングでは５回の洗浄が用いられてもよく、３回目及びそれ以降の回では１０回の洗浄が用いられてもよい。次いで、ウェル当たり５０ｐｌの溶出緩衝液でファージを溶出し、室温で１０分間インキュベートしてもよい。激しいピペット撹拌の後、溶出したファージを除去し、３ｐｌの２Ｍ Ｔｒｉｓ塩基で中和してもよい。
第２の実施形態において、前記突然変異は、ＲＯＲ２に対する免疫特異性を有する少なくとも１つのリガンドを、第１の態様の抗体の少なくとも１つの抗原結合領域に導入することを含み得る。少なくとも１つのリガンドは、
軽鎖ＣＤＲ１：ＲＳＳＱＳＬＶＨＳＤＧＮＴＹＬＮ（配列番号２３１）、
軽鎖ＣＤＲ２：ＫＶＳＮＲＤＳ（配列番号２３２）、
軽鎖ＣＤＲ３：ＭＱＧＴＱＷＰＩＴ（配列番号２３３）、
重鎖ＣＤＲ１：ＳＹＳＭＮ（配列番号２３４）、
重鎖ＣＤＲ２：ＹＩＳＳＳＳＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２３５）、及び
重鎖ＣＤＲ３：ＤＹＧＧＮＳＧＹＹＹＹＹＹＭＤＶ（配列番号２３６）を含み得る、ＲＯＲ２特異的抗体の６つのＣＤＲのうちの少なくとも１つを含んでもよい。
少なくとも１つの抗原結合領域は、重鎖及び／または軽鎖の可変断片中に存在し得る。好ましくは、少なくとも１つのリガンドは、免疫グロブリンまたはその機能的断片の重鎖の抗原結合領域のいずれかに導入される。
リガンドは、分子モデリングを含む様々な技術によって決定される適切な部位に、制限酵素消化によって挿入され得る。リガンドのペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列は、切断された制限酵素部位にライゲーションされてもよく、これに関する正確な詳細は、使用されるリガンド及びＣＤＲの性質に依存する。
第１８の態様によれば、第１７の態様で定義される方法を用いて作製した組換え抗体またはその機能的断片のライブラリまたはパネルが提供される。
本発明は、その機能的変異体または機能的断片を含む、本明細書で言及される配列のいずれかの実質的にアミノ酸または核酸配列を含む、任意の核酸またはペプチドまたは変異体、その誘導体または類似体にまで及ぶことを理解されたい。「実質的にアミノ酸／ヌクレオチド／ペプチド配列」、「機能的変異体」、及び「機能的断片」は、本明細書で言及される配列のいずれかのアミノ酸／ヌクレオチド／ペプチド配列と少なくとも４０％の配列同一性を有する配列であり得、例えば、配列番号２として同定された配列（すなわち、ヒトＲＯＲ１の一実施形態のポリペプチド配列）または配列番号１として同定されたヌクレオチド（すなわち、ヒトＲＯＲ１の一実施形態をコードするＤＮＡ配列）と４０％同一性を有する等である。
言及される配列のいずれかに対して５０％を超える、より好ましくは６５％、７０％、７５％を超える配列同一性、またさらにより好ましくは８０％を超える配列同一性を有するアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列もまた想定される。好ましくは、アミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列は、言及される配列のいずれかと少なくとも８５％の同一性、より好ましくは少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、また最も好ましくは、本明細書で言及される配列のいずれかと少なくとも９９％の同一性を有する。
当業者は、２つのアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列間のパーセンテージ同一性をどのように算出するかを理解するであろう。２つのアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列間のパーセンテージ同一性を算出するために、２つの配列のアライメントを最初に作成した後、配列同一性の値を算出しなければならない。２つの配列のパーセント同一性は、（ｉ）配列を整列させるために使用される方法、例えばＣｌｕｓｔａｌＷ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ（異なるプログラムで実施）、または３Ｄ比較からの構造アライメント、及び（ｉｉ）アライメント法、例えば、ローカルアライメント対グローバルアライメントによって使用されるパラメータ、使用されるペアスコア行列（例えば、ｂｌｏｓｕｍ６２、ｐａｍ２５０、ｇｏｎｎｅｔ等）、及びギャップペナルティ、例えば、関数形態及び定数に応じて異なる値を取り得る。
アライメントを行ってから、２つの配列間のパーセント同一性を算出する多くの異なる方法が存在する。例えば、（ｉ）最も短い配列の長さ、（ｉｉ）アライメントの長さ、（ｉｉｉ）配列の平均長さ、（ｉｖ）非ギャップ位置の数、または（ｉｖ）オーバーハングを除く同等の位置の数によって同一性の数を除してもよい。さらに、パーセント同一性もまた非常に長さ依存性であることを理解されたい。したがって、一対の配列が短いほど、偶然起こると予測され得る配列同一性が高くなる。
よって、タンパク質またはＤＮＡ配列の正確なアライメントは複雑なプロセスであることを理解されたい。一般的な多重アラインメントプログラムＣｌｕｓｔａｌＷ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２，４６７３−４６８０；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２４，４８７６−４８８２）は、本発明によるタンパク質またはＤＮＡの多重アライメントを作成するための好ましい方法である。ＣｌｕｓｔａｌＷの好適なパラメータは、次の通りであり得る：ＤＮＡアライメントの場合：ギャップ開始ペナルティ＝１５．０、ギャップ伸長ペナルティ＝６．６６、及びマトリックス＝同一性。タンパク質アライメントの場合：ギャップ開始ペナルティ＝１０．０、ギャップ伸長ペナルティ＝０．２、及びマトリックス＝Ｇｏｎｎｅｔ。ＤＮＡ及びタンパク質アライメントの場合：ＥＮＤＧＡＰ＝−１、及びＧＡＰＤＩＳＴ＝４。当業者は、最適な配列アラインメントのためにこれら及び他のパラメータを変更する必要があり得ることを認識するであろう。
好ましくは、次いで、２つのアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列間のパーセント同一性の計算が、そのようなアライメントから（Ｎ／Ｔ）＊１００として算出され得、式中、Ｎは、配列が同一の残基を共有する位置の数であり、Ｔは、ギャップを含むがオーバーハングを除外して比較した位置の総数である。したがって、２つの配列間のパーセント同一性を算出するための最も好ましい方法は、（ｉ）例えば、上述のような好適な一連のパラメータを用いて、ｃｌｕｓｔａｌｗプログラムを使用して配列アライメントを作成することと、（ｉｉ）ｎ及びｔの値を、配列同一性＝（Ｎ／Ｔ）＊１００という式に挿入することとを含む。
類似する配列を同定するための代替方法が、当業者には既知であろう。例えば、実質的に類似するヌクレオチド配列は、ストリンジェントな条件下で本明細書に示される核酸配列またはそれらの相補体のいずれかとハイブリダイズする配列によってコードされるであろう。ストリンジェントな条件とは、ヌクレオチドが、約４５℃の３×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でフィルタに結合したＤＮＡまたはＲＮＡにハイブリダイズした後、約２０〜６５℃の０．２×ｓｓｃ／０．１％ＳＤＳ中で少なくとも１回洗浄されることを意味する。代替的に、実質的に類似するポリペプチドは、少なくとも１個であるが、５、１０、２０、５０、または１００個未満のアミノ酸が、本明細書に示される配列と異なり得る。
遺伝子コードの縮重に起因して、本明細書に記載されるいかなる核酸配列も、それによってコードされるタンパク質の配列に実質的に影響を及ぼすことなく、その機能的変異体を提供するように変更するかまたは変化させることができることは明らかである。好適なヌクレオチド変異体は、配列内の同じアミノ酸をコードする異なるコドンの置換によって変化させ、したがってサイレント変化を生じる配列を有する変異体である。他の好適な変異体は、相同なヌクレオチド配列を有するが、保存的変化をもたらすために、置換するアミノ酸に同様の生物物理学的特性の側鎖を有するアミノ酸をコードする異なるコドンの置換によって変化させた、配列の全てまたは一部を含む変異体である。例えば、小さな非極性疎水性アミノ酸は、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、及びメチオニンを含む。大きな非極性疎水性アミノ酸は、フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンを含む。極性中性アミノ酸は、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン、及びグルタミンを含む。正電荷（塩基性）アミノ酸は、リジン、アルギニン、及びヒスチジンを含む。負電荷（酸性）アミノ酸は、アスパラギン酸及びグルタミン酸を含む。したがって、どのアミノ酸が、同様の生物物理学的特性を有するアミノ酸で置き換えられ得るかが理解され、当業者は、これらのアミノ酸をコードするヌクレオチド配列が分かるであろう。
本明細書に記載される特徴の全て（添付のあらゆる特許請求の範囲、要約及び図面を含む）及び／またはそのように開示される任意の方法もしくはプロセスのステップの全ては、そのような特徴及び／またはステップの少なくともいくつかが互いに排他的である組み合わせを除いて、任意の組み合わせで上述の態様のいずれかと組み合わせることができる。
実施例１．ヒトＲＯＲ１細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に対して免疫特異的な治療用ヒトｍＡｂ候補の作製
完全ヒト抗体ファージライブラリを使用したヒトＲＯＲ１細胞外ドメイン（ＥＣＤ）タンパク質に対するパニングにより、広範な親和性を示す複数のＲＯＲ１特異的抗体を同定した（ファージレベルでＩＣ５０＝０．１１−２６３ｎＭ、表１を参照）。
表１．ＩＣ５０によるＲＯＲ１陽性ファージクローンの親和性ランキング
このプロセスは、図４に示すフローチャートに記載される。全部で１５１９個の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）及び断片抗原結合性（Ｆａｂ）ファージ抗体を、濃縮されたパニングプールからタンパク質ＥＬＩＳＡ及び細胞ＥＬＩＳＡによりスクリーニングし、ヒトＲＯＲ１ ＥＣＤの天然の立体構造を認識する抗体を同定した。本発明者は、タンパク質ＥＬＩＳＡを用いて、ヒトＲＯＲ１（ｈＲＯＲ１）の単量体及び二量体の両方のＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質への陽性結合、ならびに対照Ｆｃ−融合タンパク質及びブランク対照への陰性結合を示す、１００を超える特有のクローンを選択した（図５）。
本発明者は、細胞ＥＬＩＳＡにより、ＲＯＲ１陽性細胞は認識するがＲＯＲ１陰性細胞は認識しない４５個の特有のクローンをさらに同定した（図６）。特有のＤＮＡコード配列を有するこれらの４５個の細胞ＥＬＩＳＡ陽性ファージ抗体クローン（表２に示される）が、次いで、さらなる特徴付けに供された。
表２．ＲＯＲ１ファージ抗体ディスプレイパニングの概要
４５個の特有の細胞ＥＬＩＳＡ陽性ファージクローンの結合親和性を、ファージ結合競合ＥＬＩＳＡによって推定した。ＲＯＲ１競合ＥＬＩＳＡのデザインを示す図を図７に示す。精製したファージ抗体を、最初にＰＢＳＴ緩衝液中で連続的に希釈し、ＲＯＲ１でコーティングしたプレートへの結合について試験した。５０〜８０％の飽和シグナルが得られた希釈物を溶液結合アッセイで使用し、最初に、ＲＯＲ１の濃度を上昇させながら１〜２時間ファージをインキュベートし、次いで、ＲＯＲ１でコーティングしたプレートに１０〜１５分間移して未結合のファージを捕捉させた。ＩＣ５０を、固定化ＲＯＲ１へのファージの結合を５０％阻害した溶液結合段階におけるＲＯＲ１の濃度として算出し、試験した４５個のクローンのＩＣ５０を表１にまとめる。
表３に示されるように、次いで、エピトープ分類アッセイにより、４５個の特有のファージ抗体を、ＲＯＲ１上のそれらの個々の結合エピトープに応じて４つの異なるクラスに分類した。
表３．バケットソートによるＲＯＲ１陽性ファージクローンのエピトープの概要
このアッセイでは、既知の及び異なる結合エピトープを用いて、固定化抗ＲＯＲ１モノクローナル完全長抗体によりＲＯＲ１を捕捉した。次いで、精製したファージ抗体を溶液に加えた。ＲＯＲ１と固定化ｍＡｂとの間の結合が、ファージ抗体のＲＯＲ１への結合をブロックした場合、このファージ抗体を、固定化ｍＡｂと非常に近いかまたは同じ結合エピトープを有すると見なした。そうでない場合、ファージ抗体は異なるエピトープを有すると考えられる。
ＲＯＲ１特異的抗体の重鎖及び軽鎖の両方の相補性決定領域（ＣＤＲ）領域を分析し、図８〜１１に示されるように、各エピトープクラス（クラスＩ〜ＩＶ）内で高度に保存モチーフが同定した。図８は、エピトープクラスＩの抗体ＣＤＲ配列解析を示し、図９は、エピトープクラスＩＩのＣＤＲ配列解析を示し、図１０は、エピトープクラスＩＩＩのＣＤＲ配列解析を示し、図１１は、エピトープクラスＩＶのＣＤＲ配列解析を示す。
図中に見られるように、エピトープクラスＩには３つのサブグループ、エピトープクラスＩＩには５つのサブグループ、そしてエピトープクラスＩＩＩ及びＩＶの各々には２つのサブグループが存在する。保存された残基は、ｈＲＯＲ１−ＥＣＤに対する抗体の結合特異性及び親和性を定義するために重要であり、結合プロファイルを改変するための将来的なタンパク質エンジニアリングに有用な情報を提供する。
４５個のファージ抗体結合特異性を、ヒトＲＯＲ１−ＥＣＤ、ヒトＲＯＲ２−ＥＣＤ、及びマウスＲＯＲ１−ＥＣＤに対するタンパク質ＥＬＩＳＡにより決定した（図１２）。４５個全ての抗体は、ＲＯＲ１への特異的結合を示す。４５個の抗体のうち３８個が、表４にまとめたように、ヒト及びマウスの両方のＲＯＲ１−ＥＣＤ（それぞれ、ｈＲＯＲ１及びｍＲＯＲ１）を認識しており、これは将来的な前臨床動物試験を容易にする望ましい特性である。
表４．ＲＯＲ１ファージ抗体の結合特異性
別のパニングの試みにおいて、本発明者は、Ｒｏｒｌ及びＲｏｒ２の両方に結合するクローンを発見し、ＲＯＲ１／ＲＯＲ２二重特異性抗体の開発の実現可能性が高いことを実証した（図１３）。
実施例２．好ましいＲＯＲ１特異的抗体の概要
本発明者は、本発明による４５個の抗体を単離した。抗体は、治療用途または診断用途のために開発され得る。以下の基準に従って１４個の抗体を選択した：
１．全てのエピトープクラス及びサブグループを提示すること、
２．高いＲＯＲ１結合親和性を有すること、及び
３．さらなる分析のために完全ＩｇＧ分子に変換される可能性が高いプールを形成すること。
各抗体について、情報は次のように体系化される：
１．抗体の名称
２．エピトープクラス及びサブグループ
３．軽鎖可変領域ＤＮＡ配列
４．軽鎖可変領域タンパク質配列
５．軽鎖ＣＤＲ：Ｌｌ、Ｌ２、Ｌ３ＤＮＡ配列
６．軽鎖ＣＤＲ：Ｌｌ、Ｌ２、Ｌ３アミノ酸配列
７．重鎖可変領域ＤＮＡ配列
８．重鎖可変領域タンパク質配列
９．重鎖ＣＤＲ：Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３ＤＮＡ配列、及び
１０．重鎖ＣＤＲ：Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３アミノ酸配列。
１）抗体６０１−１；エピトープクラスＩ；サブグループｌａ６０１−１軽鎖可変領域（ＤＮＡ配列）
６０１−１軽鎖可変領域（タンパク質配列）
６０１−１軽鎖ＣＤＲ：Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３（ＤＮＡ配列）
６０１−１軽鎖ＣＤＲ：Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３（タンパク質配列）
６０１−１重鎖可変領域（ＤＮＡ配列）
６０１−１重鎖可変領域（タンパク質配列）
６０１−１重鎖ＣＤＲ：Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３（ＤＮＡ配列）
６０１−１重鎖ＣＤＲ：Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３（タンパク質配列）
２）抗体６０１−５；エピトープクラスＩ；サブグループｌａ
６０１−５軽鎖可変領域（ＤＮＡ配列）
６０１−５軽鎖可変領域（タンパク質配列）
６０１−５軽鎖ＣＤＲ：Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３（ＤＮＡ配列）
６０１−５軽鎖ＣＤＲ：Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３（タンパク質配列）
６０１−５重鎖可変領域（ＤＮＡ配列）
６０１−５重鎖可変領域（タンパク質配列）
６０１−５重鎖ＣＤＲ：Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３（ＤＮＡ配列）
６０１−５重鎖ＣＤＲ：Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３（タンパク質配列）
３）抗体６０１−５１；エピトープクラスＩ；サブグループｌｂ
６０１−５１軽鎖可変領域（ＤＮＡ配列）
６０１−５１軽鎖可変領域（タンパク質配列）
６０１−５１軽鎖ＣＤＲ：Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３（ＤＮＡ配列）
６０１−５１軽鎖ＣＤＲ：Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３（タンパク質配列）
６０１−５１重鎖可変領域（ＤＮＡ配列）
６０１−５１重鎖可変領域（タンパク質配列）
６０１−５１重鎖ＣＤＲ：Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３（ＤＮＡ配列）
６０１−５１重鎖ＣＤＲ：Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３（タンパク質配列）
４）抗体６０１−４；エピトープクラスＩ；サブグループｌｃ
６０１−４軽鎖可変領域（ＤＮＡ配列）
６０１−４軽鎖可変領域（タンパク質配列）
６０１−４軽鎖ＣＤＲ：Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３（ＤＮＡ配列）
６０１−４軽鎖ＣＤＲ：Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３（タンパク質配列）
６０１−４重鎖可変領域（ＤＮＡ配列）
６０１−４重鎖可変領域（タンパク質配列）
６０１−４重鎖ＣＤＲ：Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３（ＤＮＡ配列）
６０１−４重鎖ＣＤＲ：Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３（タンパク質配列）
５）抗体６０１−２；エピトープクラスＩＩ；サブグループ２ａ６０１−２軽鎖可変領域（ＤＮＡ配列）
６０１−２軽鎖可変領域（タンパク質配列）
６０１−２軽鎖ＣＤＲ：Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３（ＤＮＡ配列）
６０１−２軽鎖ＣＤＲ：Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３（タンパク質配列）
６０１−２重鎖可変領域（ＤＮＡ配列）
６０１−２重鎖可変領域（タンパク質配列）
６０１−２重鎖ＣＤＲ：Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３（ＤＮＡ配列）
６０１−２重鎖ＣＤＲ：Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３（タンパク質配列）
６）抗体６０１−１７；エピトープクラスＩＩ；サブグループ２ｂ
６０１−１７軽鎖可変領域（ＤＮＡ配列）
６０１−１７軽鎖可変領域（タンパク質配列）
６０１−１７軽鎖ＣＤＲ：Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３（ＤＮＡ配列）
６０１−１７軽鎖ＣＤＲ：Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３（タンパク質配列）
６０１−１７重鎖可変領域（ＤＮＡ配列）
６０１−１７重鎖可変領域（タンパク質配列）
６０１−１７重鎖ＣＤＲ：Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３（ＤＮＡ配列）
６０１−１７重鎖ＣＤＲ：Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３（タンパク質配列）
７）抗体６０１−１１９；エピトープクラスＩＩ；サブグループ２ｃ
６０１−１１９軽鎖可変領域（ＤＮＡ配列）
６０１−１１９軽鎖可変領域（タンパク質配列）
６０１−１１９軽鎖ＣＤＲ：Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３（ＤＮＡ配列）
６０１−１１９軽鎖ＣＤＲ：Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３（タンパク質配列）
６０１−１１９重鎖可変領域（ＤＮＡ配列）
６０１−１１９重鎖可変領域（タンパク質配列）
６０１−１１９重鎖ＣＤＲ：Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３（ＤＮＡ配列）
６０１−１１９重鎖ＣＤＲ：Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３（タンパク質配列）
８）抗体６０１−１４；エピトープクラスＩＩ；サブグループ２ｄ
６０１−１４軽鎖可変領域（ＤＮＡ配列）
６０１−１４軽鎖可変領域（タンパク質配列）
６０１−１４軽鎖ＣＤＲ：Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３（ＤＮＡ配列）
６０１−１４軽鎖ＣＤＲ：Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３（タンパク質配列）
６０１−１４重鎖可変領域（ＤＮＡ配列）
６０１−１４重鎖可変領域（タンパク質配列）
６０１−１４重鎖ＣＤＲ：Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３（ＤＮＡ配列）
６０１−１４重鎖ＣＤＲ：Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３（タンパク質配列）
９）抗体６０１−８６；エピトープクラスＩＩ；サブグループ２ｅ
６０１−８６軽鎖可変領域（ＤＮＡ配列）
６０１−８６軽鎖可変領域（タンパク質配列）
６０１−８６軽鎖ＣＤＲ：Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３（ＤＮＡ配列）
６０１−８６軽鎖ＣＤＲ：Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３（タンパク質配列）
６０１−８６重鎖可変領域（ＤＮＡ配列）
６０１−８６重鎖可変領域（タンパク質配列）
６０１−８６重鎖ＣＤＲ：Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３（ＤＮＡ配列）
６０１−８６重鎖ＣＤＲ：Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３（タンパク質配列）
１０）抗体６０１−４０；エピトープクラスＩＩＩ；サブグループ３ａ
６０１−４０軽鎖可変領域（ＤＮＡ配列）
６０１−４０軽鎖可変領域（タンパク質配列）
６０１−４０軽鎖ＣＤＲ：Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３（ＤＮＡ配列）
６０１−４０軽鎖ＣＤＲ：Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３（タンパク質配列）
６０１−４０重鎖可変領域（ＤＮＡ配列）
６０１−４０重鎖可変領域（タンパク質配列）
６０１−４０重鎖ＣＤＲ：Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３（ＤＮＡ配列）
６０１−４０重鎖ＣＤＲ：Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３（タンパク質配列）
１１）抗体６０１−１３；エピトープクラスＩＩＩ；サブグループ３ｂ
６０１−１３軽鎖可変領域（ＤＮＡ配列）
６０１−１３軽鎖可変領域（タンパク質配列）
６０１−１３軽鎖ＣＤＲ：Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３（ＤＮＡ配列）
６０１−１３軽鎖ＣＤＲ：Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３（タンパク質配列）
６０１−１３重鎖可変領域（ＤＮＡ配列）
６０１−１３重鎖可変領域（タンパク質配列）
６０１−１３重鎖ＣＤＲ：Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３（ＤＮＡ配列）
６０１−１３重鎖ＣＤＲ：Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３（タンパク質配列）
１２）抗体６０１−１０９；エピトープクラスＩＶ；サブグループ４ａ
６０１−１０９軽鎖可変領域（ＤＮＡ配列）
６０１−１０９軽鎖可変領域（タンパク質配列）
６０１−１０９軽鎖ＣＤＲ：Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３（ＤＮＡ配列）
６０１−１０９軽鎖ＣＤＲ：Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３（タンパク質配列）
６０１−１０９重鎖可変領域（ＤＮＡ配列）
６０１−１０９重鎖可変領域（タンパク質配列）
６０１−１０９重鎖ＣＤＲ：Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３（ＤＮＡ配列）
６０１−１０９重鎖ＣＤＲ：Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３（タンパク質配列）
１３）抗体６０１−１３７；エピトープクラスＩＶ；サブグループ４ｂ
６０１−１３７軽鎖可変領域（ＤＮＡ配列）
６０１−１３７軽鎖可変領域（タンパク質配列）
６０１−１３７軽鎖ＣＤＲ：Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３（ＤＮＡ配列）
６０１−１３７軽鎖ＣＤＲ：Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３（タンパク質配列）
６０１−１３７重鎖可変領域（ＤＮＡ配列）
６０１−１３７重鎖可変領域（タンパク質配列）
６０１−１３７重鎖ＣＤＲ：Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３（ＤＮＡ配列）
６０１−１３７重鎖ＣＤＲ：Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３（タンパク質配列）
１４）抗体６０１−３；エピトープクラスＩＩ；サブグループ２ａ
６０１−３軽鎖可変領域（ＤＮＡ配列）
６０１−３軽鎖可変領域（タンパク質配列）
６０１−３軽鎖ＣＤＲ：Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３（ＤＮＡ配列）
６０１−３軽鎖ＣＤＲ：Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３（タンパク質配列）
６０１−３重鎖可変領域（ＤＮＡ配列）
６０１−３重鎖可変領域（タンパク質配列）
６０１−３重鎖ＣＤＲ：Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３（ＤＮＡ配列）
６０１−３重鎖ＣＤＲ：Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３（タンパク質配列）
本発明者はまた、抗体の一実施形態の定常領域について、アミノ酸及びＤＮＡ配列を次のように決定した。
抗体軽鎖定常領域（タンパク質配列）
抗体重鎖定常領域（タンパク質配列）
抗体軽鎖定常領域（ＤＮＡ配列）
抗体重鎖定常領域（ＤＮＡ配列）
実施例３．選択したｓｃＦｖ断片を使用して完全長モノクローナル抗体を操作する
ファージディスプレイ技術により抗原特異的ｓｃＦｖ断片の迅速な選択及び生成が可能であるが、Ｆｃドメインを含む完全なモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、ｓｃＦｖに勝る数多くの利点を有する。第一に、完全長抗体のみが、Ｆｃドメインによって媒介される補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）及び抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）等の免疫学的機能を発揮する。第二に、二価のモノクローナル抗体は、単量体Ｆａｂ Ａｂよりも強い抗原結合親和性を提供する。第三に、Ｆａｂと二価のｍＡｂとでは、血漿半減期及び腎臓クリアランスが異なる。第四に、二価のｍＡｂは、ｓｃＦｖとは異なる速度で内部移行され得、免疫機能または担体機能を変化させる。α放射体は、標的を死滅させるために内部移行される必要はないが、多くの薬物及び毒素は免疫複合体の内部移行の恩恵を受ける。したがって、競合ＥＬＩＳＡによって得られた親和性ランキングの結果に従って（表１を参照）、高い結合親和性を有する３つのクローンを次に選択し、完全長ヒトＩｇＧ１組換え抗体に再構成してさらに特徴付けした。
チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）において組換えヒトモノクローナルＩｇＧを産生するために、本発明者は、Ｔｏｍｏｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ７３（７）：１４６５−１４６９による方法に基づいて完全長ＩｇＧ１ ｍＡｂを遺伝子操作した。一致するκ軽鎖定常配列及びＩｇＧ１サブクラスＦｃ（図１５）を用いて、抗体可変領域を哺乳類発現ベクターにサブクローン化した（図１４ａ及び１４ｂ）。精製した完全長ＩｇＧ１抗体は、還元条件下及び非還元条件下の両方で予想された分子量を示した（図１６）。動的結合解析によって、ピコモル範囲のＫｄを伴う完全長ＩｇＧ１抗体のｈＲＯＲ１−ＥＣＤへの特異的結合が確認された（図１７）。
実施例４．ＲＯＲ１特異的完全長ＩｇＧ１モノクローナル抗体の特徴付け
１．エピトープマッピング
薬物候補としてのＲＯＲ１特異的抗体の構造的基礎をよりよく理解するために、ＥＬＩＳＡによりＲＯＲ１ペプチドアレイに対する標準的なエピトープマッピングを行った。ペプチドアレイでＲＯＲ１タンパク質細胞外ドメインの全長を覆ったところ、９６個のペプチドが重複していた（それぞれ、５個のアミノ酸が重複した１５個のアミノ酸）。ペプチドをＮ末端でビオチン化し、ストレプトアビジンＥＬＩＳＡプレート上にそれらを固定化した。柔軟性を提供するためにスペーサー（ＳＧＳＧ）を用いた。一次抗体としてＲＯＲ１抗体を用いてＥＬＩＳＡアッセイを行い、抗ヒトＦｃＡＰ−複合化抗体を検出のために用いた。
図１８、１９、及び２０に示されるように、抗体６０１−３−１２（図１９）及び６０１−３−１６（図２０）が、類似する結合エピトープを共有する一方で、抗体６０１−３−２（図１８）は、６０１−３−１２及び６０１−３−１６とは異なる結合エピトープを有する。
２．結合特性
３つの精製した完全長ＩｇＧ１抗体を用いて、結合特異性を再び試験した。タンパク質ＥＬＩＳＡにより、それらは全て、ヒト及びマウスの両方のＲＯＲ１ ＥＣＤを認識するが、ヒトＲＯＲ２ ＥＣＤは認識しないことが確認された（図２１）。
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、Ａ５４９、Ｈ１２９９、及びＪｅｋｏ−１を含む、ＲＯＲ１の発現に陽性を示す異なる癌細胞株を用いて、ＦＡＣＳ分析によりｈＩｇＧ１ ｍＡｂの細胞表面ＲＯＲ１への結合を決定した。３つ全ての抗体が、癌細胞の表面上で発現されたＲＯＲ１を認識する。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を用いたＦＡＣＳの一例を図２２に示す。０．１ｕｇ／ｍｌ、１ｕｇ／ｍｌ、１０ｕｇ／ｍｌ、及び１００ｕｇ／ｍｌの抗体を、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞とともにインキュベートし、次いで、洗浄後にＦＩＴＣ標識二次抗体とともにインキュベートした。ＦＡＣＳにより結合を測定し、平均蛍光強度（ＭＦＩ）として表した。二次抗体とともにインキュベートした細胞のみを、陰性対照として使用した。図２２は、１０ｕｇ／ｍｌのＲＯＲ１特異的ｍＡｂの結果を示す。
３．免疫活性
次いで、本発明者は、ＣＤＣ及びＡＤＣＣ等の、ＲＯＲ１ＩｇＧ特異的１ ｍＡｂのｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫エフェクター機構を評価した。
Ａ）補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性
ｍＡｂが細胞を死滅させる重要な機構は、標的細胞表面に結合した抗体が補体を修復し、その結果、補体カスケード及び膜侵襲複合体（ＭＡＣ）の集合を開始し、最終的に標的細胞を溶解する。本発明者は、ＲＯＲ１特異的ＩｇＧ ｍＡｂが、補体複合体の形成を開始する最初のステップであるＣｌｑ結合を誘引することが可能かどうかを調査した。種々の濃度のＲＯＲ１抗体をプレート上にコーティングし、２ｕｇ／ｍＬのＣｌｑタンパク質をプローブとして用いた。西洋ワサビタンパク質（ＨＲＰ）複合化抗Ｃｌｑ抗体を用いて結合シグナルを報告した。図２３に示されるように、抗体が標的細胞の補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を媒介することができる限り、３つ全ての抗体は、用量依存様式でＣｌｑに結合することが可能である。
Ｂ）ＲＯＲ１陽性癌細胞株に対する抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）
抗体依存性細胞傷害は、ｍＡｂ治療の重要なエフェクター機構の１つである。抗体は、標的分子を発現する腫瘍細胞と、ＮＫ細胞等の細胞傷害性細胞とを架橋して、ＮＫが標的とする標的細胞の死滅を媒介することができる。ＡＤＣＣアッセイを次の通りに行った。１００ｕｌの標的細胞懸濁液（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１またはＪｅｋｏ−１）を、３７℃の９６ウェルプレートで、種々の濃度の５０ｕｌの試験ｍＡｂとともに３０分間プレインキュベートした。次いで、５０ｕｌの新しく単離されたヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、２５：１のエフェクター／標的細胞比で加えた。１６時間インキュベートした後、プレートを遠心沈殿し、５０ｕｌの細胞不含上清を新しいプレートに移した。死滅した癌細胞から放出されたＬＤＨをＰｒｏｍｅｇａ社のＣｙｔｏＴｏｘ９６ Ｎｏｎ−ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙにより測定した。式（Ｅ−Ｓ）／（Ｍ−Ｓ）（Ｅ：実験的放出、Ｓ：自発放出、Ｍ：最大放出）により細胞溶解を算出した。非特異的抗体を陰性対照として用いた。本発明者は、３つ全ての抗体がＡＤＣＣアッセイにおいてＲＯＲ１を発現する腫瘍細胞の死滅を媒介することが可能であることを発見した。図２４は、ＲＯＲ１特異的ｍＡｂによるＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に対するＡＤＣＣの結果を示す。
４．Ｗｎｔ５ａリガンド結合の遮断
さらに、３つの生物学的アッセイにおいて３つのｍＡｂを試験し、それらの機能活性を評価した。
（ｉ）Ｗｎｔ５ａのＲＯＲ１への結合のブロッキング
（ｉｉ）Ｗｎｔ−５ａによって誘導されるＲＯＲ１のリン酸化のブロッキング
ＦｏｒｔｅＢｉｏアッセイは、３つの抗体候補がＷｎｔ−５ａのＲＯＲ１への結合をブロックする能力を試験するように設計された。ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔを使用してＲＯＲ１／Ｗｎｔ５Ａ相互作用を測定した。次いで、３つの抗ＲＯＲ１ｍＡｂ及び１つのｈＩｇＧ１陰性対照抗体Ｍ９０１をそれぞれ加え、結合の低下（測定される偽ｋａ（１／Ｍ．ｓ）を測定した。陰性対照ＩｇＧ１抗体と比較して、３つ全ての抗体が、Ｗｎｔ−５ａのＲＯＲ１への結合を種々の程度までブロックすることが可能であった（図２５）。
ＲＯＲ１に結合すると、Ｗｎｔ５ａは、ＲＯＲ１のリン酸化及び下流シグナル伝達カスケードの活性化を誘発する。ＲＯＲ１のリン酸化は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動上でＲｏｒ１のより緩徐な遊走を引き起こす。ＲＯＲ１に対する有力候補抗体がＷｎｔ５ａのＲＯＲ１への結合を機能的にブロックすることができるかどうかを判定するために、この可能性を試験するための代理実験としてこのアッセイを利用した。血清枯渇ＲＯＲ１を発現する細胞株Ｊｅｋｏ−１を３００ｎＭ Ｗｎｔ５ａとともにインキュベートし、１０ｌａｇの抗体を用いてまたは用いずに２時間処理した。細胞を溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動により分離し、ＲＯＲ１に対する抗体でブロッティングした。Ｗｎｔ５ａのみを用いた細胞の処理は、非リン酸化と比較してＲｏｒ１のより緩徐な遊走を引き起こした。
しかしながら、Ｗｎｔ５ａ及び抗体の両方を細胞と共インキュベートしたときに、Ｗｎｔ５ａがＲＯＲ１の遊走に与える影響は、３つの有力候補のうちの２つ（クローン３−１２及びクローン３−１６）によって完全に抑制された。この結果は、これらの抗体がＷｎｔ５ａのＲＯＲ１への結合を効果的に防止することができること、及びこのリガンド結合の遮断がＲＯＲ１の活性化を無効にすることを実証するものである。
５．癌細胞増殖の阻害
細胞増殖アッセイを行って抗体が癌細胞増殖を阻害するかどうかを判定した。標的細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１またはＳＫＢＲ３細胞）を９６ウェルプレートにウェル当たり５×１０３細胞で播種した。１０ｕｇ／ｍｌのＲＯＲ１特異的ｍＡｂを細胞に加え、５％ＣＯ２インキュベータ内で、３７℃でインキュベートした。７２時間の処理後、製造業者の指示に従ってＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、細胞を増殖についてアッセイした。未処理細胞の生存率を１００％として設定し、未処理細胞と比較した割合としてデータを示した。非特異的抗体（９０１）を陰性対照として用いた。各データ点は、平均±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）を表す。
実施例５．ＲＯＲ１抗体ドラッガビリティのさらなる改善の探求
１．細胞傷害性部分への複合化
１）抗体薬物複合体
抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）は、抗体が標的細胞に強力な細胞傷害性薬物を選択的に送達するために使用される。そのような方法は、腫瘍抗原標的に適用されると、抗体の抗腫瘍活性を増強し、化学療法の腫瘍対正常組織の選択性を向上させることができる。ＡＤＣ開発の重要なパラメータの１つは、抗体は、標的抗原に結合するとエンドサイトーシスによって取り込まれ得、したがって、標的癌細胞に複合化薬物を送達できるということである。
本発明のＲＯＲ１抗体を用いたＡＤＣストラテジー開発の可能性を検討するために、本発明者は、ＲＯＲ１−抗体結合によって誘発される抗体のエンドサイトーシスを評価した。このアッセイでは、５％ＦＢＳを含むＰＢＳ中でＦＩＴＣ標識ＲＯＲ１抗体（１０ｕｇ／ｍｌ）を用いて、氷上で６０分間Ｊｅｋｏ細胞を表面標識し、次いで、冷ＰＢＳで３回洗浄し、５％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ中３７℃で３時間インキュベートし、表面蛍光を内部移行させた。細胞を急速に冷却し、洗浄し、５００ｕｌのストリッピング緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣ１＋ＨＣＬ、ｐＨ２．５）を用いて（ストリップ）または用いずに（非ストリップ）室温で５分間インキュベートし、遠心沈降し、ＰＢＳで２回洗浄し、次いで、１％冷ＰＦＡ／ＰＢＳで固定し、フローサイトメトリーにより直ちに分析した。不完全な表面ストリッピングから補正した後、ストリップ及び非ストリップ試料のデータから内部移行した蛍光を算出した。
図２６に示されるように、本発明者は、ＲＯＲ１抗体が徐々に内部移行されることを発見した。
２）α線を放出する放射性ヌクレオチドへの複合化
α粒子は、強力であるが選択的な単一細胞の細胞傷害が可能な、高エネルギー、高線形エネルギー移動ヘリウム核である。標的化可能なナノジェネレーターは、白血病、リンパ腫、及び他の固形腫瘍の死滅において極めて強力かつ特異的であることが実証されている２２５Ａｃ標識モノクローナル抗体である（ＭｃＤｅｖｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９４（５５４６）：１５３７−１５４０）。本発明者は、二官能性キレート剤を用いてＲＯＲ１抗体をα粒子放射体に複合化することを決定した。ＲＯＲ１に対する卓越した特異性を考慮すると、完全長ｍＡｂ及びＳｃＦｖ／Ｆａｂは、強力な抗腫瘍試薬を送達するための優れたビヒクルであり得る。ＳｃＦｖ／Ｆａｂは、それらの小さいサイズ、血液からの迅速なクリアランス、及び腫瘍への浸透性によって、腫瘍を標的とするα放射体の理想的な選択となるはずである。本発明者は、Ｂｏｒｃｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６３：５−８４−５０９０に記載される２段階標識法を用いて、全ての形態のｍＡｂ（完全長ＩｇＧ、ｓｃＦＶ、及びＦａｂ）をα粒子放射体に複合化した。
３）ＲＯＲ１陽性癌細胞株に対する複合体のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性を試験する
ＲＯＲ１陽性細胞株のパネルを、０．０１−１０ｕｇ／ｍｌの範囲の複合化ＲＯＲ１ＩｇＧ抗体、及び陰性対照抗体複合体を用いてまたは用いずに２４〜９６時間処理した。細胞増殖は、３Ｈチミジンの取り込みによって、生存率はＡＴＰｌｉｔｅアッセイによって判定した（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ７３１：４５１−６５ Ｓｕｎ，ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２４：７３８１−８８）。
４）ＲＯＲ１を発現する癌細胞を有するＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおいて、複合体のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性を試験する
Ａ）ＮＯＤ／ＳＣＩＤ異種移植片モデルに対する構築物の治療効果
ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスは、ＮＫ細胞の機能障害、循環補体の不在、ＡＰＣ（抗原提示細胞）の分化及び機能の欠陥によって特徴付けられる。したがって、ＮＯＤ／ＳＣＩＤモデルは、ヒト腫瘍細胞株の異種移植片に好適であり、また、標的となる分子を発現する腫瘍細胞に対するｍＡｂの直接的な効果を試験するために好適である。同様のプロトコルが、マウスモデルを確立し、複合化ｍＡｂの治療効果を判定するための治療研究を行うために用いられた（Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｂｌｏｏｄ １０２：１４５８−１４６５）。
Ｂ）複合体の生物学的分布
これは、両方の形態のｍＡｂを１１１Ｉｎで標識し、注射後、異なる時点で、マウス由来の種々の組織からの放射活性をカウントすることによって測定した（Ｓｉｎｇｈ Ｊａｇｇｉ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｐｌｏｓ Ｏｎｅ ２（３）：ｅ２６７）。正常なマウスから得られた結果に基づいて、ヒト白血病のＮＯＤ／ＳＣＩＤ異種移植片を使用して、以前に記載されたようなγ線撮像により構築物の腫瘍取り込みを判定した。
５）抗体の細胞傷害能を増強するためにそれらの新規形態を操作する
１．二重特異性抗体
ヒトＩｇＧ１Ｆｃについて以前に記載されたように、免疫Ｔ細胞上のＲＯＲ１及びＣＤ３の両方を認識するように二重特異性抗体を構築した（Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５：１９６３７−１９６４６；Ｒｏｓｓｉ ＥＡ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０３：６８４１−６）。二重特異性抗体は、Ｆｃエフェクター機能及び長期ｉｎ ｖｉｖｏ半減期を維持する一方で、ＲＯＲ１陽性癌細胞に細胞傷害性Ｔ細胞を動員して標的化することが予想された。二重特異性抗体によって媒介される癌細胞の特異的な死滅には、（ｉ）活性化Ｔ細胞による死滅、（ｉｉ）ＡＤＣＣ活性、（ｉｉｉ）ＣＤＣ活性の３つの機構が関与している。タンデムｓｃＦｖ分子（ｔａＦｖ）、ダイアボディ（Ｄｂ）、または一本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）、及び融合ヒト血清アルブミンとの融合タンパク質等の二重特異性抗体の他の形態が構築されてもよいが（Ａｓａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８６：１８１２−１８１８；Ｌｏｆｆｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ９５（６）：２０９８−２１０３；Ｗｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５２（５）：２３８５−２３９２；Ｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２：１２６５０−１２６６０）、それらには異なる薬物動態プロファイルを示すＦｃエフェクター機能が欠如している。
２．ＡＤＣＣの増強
ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／００８１１９５に記載されるように、グリコール改変ＣＨＯ細胞中で組み換えにより抗体を発現させることにより、ＲＯＲ１標的特異的ＡＤＣＣ活性を増強した。Ａｓｎ２９７上の修飾オリゴ糖Ｎ−グルカンは、エフェクター機能を次のように改変する：ヒトナチュラルキラー細胞によって媒介される改善されたＡＤＣＣ活性のための、ＣＤ１６／ＦｃＲＩＩＩａへのより高い親和性結合、２）好中球等のエフェクター細胞によって、またマクロファージ及びＤＣ細胞による抗原提示によって媒介される改善されたＡＤＣＣ活性のための、（ＮＫ細胞を除く）複数の種類の免疫細胞において発現される抑制性受容体であるＣＤ３２ｂ／ＦｃＲＩＩｂへの結合親和性の低下。
実施例６．抗ＲＯＲ１抗体の結合親和性
抗ＲＯＲ１抗体に対するＲＯＲ１細胞外ドメイン二量体及び単量体の結合親和性を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により判定した。ＲＯＲ１細胞外ドメインＦｃ融合「二量体」及びＲＯＲ１細胞外ドメインＦｃ融合：Ｆｃヘテロ二量体「単量体」は、それぞれ、親和性分析に使用されるＲＯＲ１の二量体及び単量体の形態である。端的に述べると、アミンカップリングキット、及びブロッキング剤として１００ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ Ｂｏｒａｔｅ緩衝液（ｐＨ８．０）中の１００ｍＭエチレンジアミンを使用して、ＲＯＲ１の二量体及び単量体をＣＭ４チップに直接固定化した。約１００〜１５０ＲＵのＲＯＲ１二量体及び単量体を別個のフローセル上に固定化し、非誘導体化フローセルを基準対照として用いた。各抗ＲＯＲ１抗体をＨＢＳ−Ｐ＋泳動用緩衝液中で希釈し、５つまたは６つの濃度（０ｎＭ、１．２３ｎＭ、３．７ｎＭ、１１．１ｎＭ、３３．３ｎＭ、及び１００ｎＭ）で１２０秒間３０μｌ／分で注入した。その後、１８０秒間の解離を行った。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ １：１結合モデルを使用して、会合定数、解離定数、及び各抗ＲＯＲ１抗体の親和性を算出した。
表５に示されるように、結合試験により、１：１結合モデルにフィットさせたときに、１９の抗ＲＯＲ１抗体が同様の親和性でＲＯＲ１の単量体及び二量体の両方に結合することが実証された。抗ＲＯＲ１とＲＯＲ１−Ｆｃ融合二量体との相互作用は、二価の分析物を用いて分析することができるが、ＲＯＲ１の単量体及び二量体の両方の結合曲線が類似しているため、１：１結合モデルを使用して分析を行った。抗ＲＯＲ１抗体のＲＯＲ１二量体への結合について見かけの親和性が示される。図２７は、ＲＯＲ１の単量体及び二量体の両方に対する抗体結合の正規化されたセンサーグラムを示す。センサーグラムは、会合段階の最後ではあるが、解離段階の前である「結合安定性点」を用いて１００ＲＵに正規化した。
表５：ＲＯＲ１細胞外ドメインの単量体及び二量体の結合動態と、ＳＰＲによる抗ＲＯＲ１抗体への親和性
実施例７．抗ＲＯＲ１抗体のＣＬＬ細胞への結合
原発性慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）細胞の表面上で抗体がＲＯＲ１に結合する能力をフローサイトメトリーによって判定した。ＲＯＲ１は、正常な健康な成人血液細胞上では発現されないが、ＣＬＬの実質的に全ての症例の悪性細胞上及び異なる種類の固形腫瘍に見られる。試験した抗体のうち３７個が、フローサイトメトリーによりＣＬＬ細胞への検出可能な結合を示した。
方法
ＣＤ５、ＣＤ１９、及び抗ＲＯＲ１抗体によるＣＬＬ細胞の細胞表面染色
製造業者の指示に従って、Ｚｅｎｏｎ（登録商標）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７ヒトＩｇＧ標識キット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して抗ＲＯＲ１及び対照ＩｇＧ１抗体を標識した。ＣＬＬ患者からの凍結した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）（ＡｌｌＣｅｌｌｓ ＬＬＣ）を解凍し、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、２％熱不活性化ＦＢＳ、０．１％ＮａＮ３）中で洗浄した。ＣＬＬ細胞を数え、４×１０Ｅ６細胞／ｍＬでＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁した。次いで、１００ｐｔ ＦＡＣＳ緩衝液中で、フィコエリトリン（ＰＥ）標識抗ＣＤ５、ｆｌｕ６０１−５ｃｅｉｎイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識抗ＣＤ１９（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、及びＺｅｎｏｎ（登録商標）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識抗ＲＯＲ１、または対照ヒトＩｇＧ１ ＥＴ９０１（Ｅｕｒｅｋａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）を用いて、試験当たり２×１０Ｅ５細胞を氷上で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、ＦＡＣＳ緩衝液中で細胞を２回洗浄し、ＰＢＳ中２％のパラホルムアルデヒド（最終濃度）中に固定した。細胞をＢＤ ＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にかけ、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ）を使用して分析した。
ＣＤ５及びＣＤ１９に二重陽性であると同定されたＣＬＬ細胞を、抗ＲＯＲ１または対照Ｉｇの染色について評価した。図２８及び２９は、ＣＬＬ細胞上の種々の濃度の抗ＲＯＲ１抗体の幾何学的平均蛍光強度（ｇＭＦＩ）を示す。
総括
ヒトＲＯＲ１特異的抗体を対象としている。有利には、この抗体は、ヒト起源であり、したがって、ヒト患者に投与されたときに、非ヒト要素を含む抗体を使用した場合とは対照的に、あらゆる免疫応答を最小限に抑える可能性が高い。さらに、本明細書に記載される抗体またはその機能的断片、抗体またはその機能的断片をコードするアミノ酸配列及びヌクレオチド配列、ならびに複合体は、組成物及び診断薬の製造、ならびに、例えば、癌の治療におけるそれらの使用に有効に使用され得る。
表６．特定の軽鎖可変領域配列
表７．特定の重鎖可変領域配列
表８．特定の軽鎖ＣＤＲ配列
表９．特定の重鎖ＣＤＲ配列

Claims (44)

  1. 単離されたヒト抗受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）抗体またはその機能的断片。
  2. 前記機能的断片は、ＶＨ、ＶＬ、Ｆｄ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｃ断片からなる群から選択される断片を含む、請求項１に記載の単離された抗体またはその機能的断片。
  3. 前記抗体またはその機能的断片は、約１０−５〜１０−１３Ｍ−１、好ましくは１０−６〜１０−９Ｍ−１、さらにより好ましくは１０−１０〜１０−１２Ｍ−１の親和性定数でＲＯＲ１ペプチドと選択的に相互作用する、請求項１に記載の単離された抗体またはその機能的断片。
  4. 前記抗体またはその断片は、ＲＯＲ１に対して約１０−７〜１０−１０Ｍ−１のＩＣ５０を示す、請求項１に記載の単離された抗体またはその機能的断片。
  5. 前記抗体またはその断片は、ＲＯＲ１を発現する腫瘍細胞の死滅を媒介することが可能である、請求項１に記載の単離された抗体またはその機能的断片。
  6. 前記抗体またはその断片は、Ｗｎｔ５ａのＲＯＲ１タンパク質への結合をブロックすることが可能である、請求項１に記載の単離された抗体またはその機能的断片。
  7. 前記抗体またはその断片は、Ｗｎｔ５ａ ＲＯＲ１のリン酸化をブロックすることが可能である、請求項１に記載の単離された抗体またはその機能的断片。
  8. 前記抗体またはその断片は、癌細胞増殖を阻害することが可能である、請求項１に記載の単離された抗体またはその機能的断片。
  9. 前記抗体またはその断片は、ＲＯＲ１に結合するとエンドサイトーシスによって取り込まれ得る、請求項１に記載の単離された抗体またはその機能的断片。
  10. 前記抗体またはその断片は、ＲＯＲ１タンパク質上のエピトープＩ〜ＩＶのうちの１つ以上に結合することが可能であり、エピトープＩは、残基ＫＮＤＡＰＶＶＱＥＰＲＲＬＳＦＲＳＴＩＹＧＳＲ（配列番号２３７）及びＡＡＮＣＩＲＩＧＩＰＭＡＤＰＩ（配列番号２３８）を含み、エピトープＩＩは、残基ＳＳＴＧＶＬＦＶＫＦＧＰＰＰＴＡＳＰＧ（配列番号２３９）及びＳＮＰＭＩＬＭＲＬＫＬＰＮＣＥ（配列番号２４０）を含み、エピトープＩＩＩ及びエピトープＩＶは、配列番号２の残りの細胞外配列、またはこれらのエピトープのいずれか１つの機能的断片もしくは変異体を含む、請求項１に記載の単離された抗体またはその機能的断片。
  11. 前記抗体またはその機能的断片は、
    （ｉ）配列番号８、９、１０、１６、１７及び／もしくは１８、
    （ｉｉ）配列番号２４、２５、２６、３２、３３及び／もしくは３４、
    （ｉｉｉ）配列番号４０、４１、４２、４８、４９及び／もしくは５０、
    （ｉｖ）配列番号５６、５７、５８、６４、６５及び／もしくは６６、
    （ｖ）配列番号７２、７３、７４、８０、８１及び／もしくは８２、
    （ｖｉ）配列番号８８、８９、９０、９６、９７及び／もしくは９８、
    （ｖｉｉ）配列番号１０４、１０５、１０６、１１２、１１３及び／もしくは１１４、
    （ｖｉｉｉ）配列番号１２０、１２１、１２２、１２８、１２９及び／もしくは１３０、
    （ｉｘ）配列番号１３６、１３７、１３８、１４４、１４５及び／もしくは１４６、
    （ｘ）配列番号１５２、１５３、１５４、１６０、１６１及び／もしくは１６２、
    （ｘｉ）配列番号１６８、１６９、１７０、１７６、１７７及び／もしくは１７８、
    （ｘｉｉ）配列番号１８４、１８５、１８６、１９２、１９３及び／もしくは１９４、
    （ｘｉｉｉ）配列番号２００、２０１、２０２、２０８、２０９及び／もしくは２１０、ならびに／または
    （ｘｉｖ）配列番号２１６、２１７、２１８、２２４、２２５及び／もしくは２２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、少なくとも１つの抗原結合領域を含む、請求項１に記載の単離された抗体またはその機能的断片。
  12. 前記抗体またはその機能的断片は、
    （ｉ）配列番号５、６、７、１３、１４及び／もしくは１５、
    （ｉｉ）配列番号２１、２２、２３、２９、３０及び／もしくは３１、
    （ｉｉｉ）配列番号３７、３８、３９、４５、４６及び／もしくは４７、
    （ｉｖ）配列番号５３、５４、５５、６１、６２及び／もしくは６３、
    （ｖ）配列番号６９、７０、７１、７７、７８及び／もしくは７９、
    （ｖｉ）配列番号８５、８６、８７、９３、９４及び／もしくは９５、
    （ｖｉｉ）配列番号１０１、１０２、１０３、１０９、１１０及び／もしくは１１１、
    （ｖｉｉｉ）配列番号１１７、１１８、１１９、１２５、１２６及び／もしくは１２７、
    （ｉｘ）配列番号１３３、１３４、１３５、１４１、１４２及び／もしくは１４３、
    （ｘ）配列番号１４９、１５０、１５１、１５７、１５８及び／もしくは１５９、
    （ｘｉ）配列番号１６５、１６６、１６７、１７３、１７４及び／もしくは１７５、
    （ｘｉｉ）配列番号１８１、１８２、１８３、１８９、１９０及び／もしくは１９１、
    （ｘｉｉｉ）配列番号１９７、１９８、１９９、２０５、２０６及び／もしくは２０７、ならびに／または
    （ｘｉｖ）配列番号２１３、２１４、２１５、２２１、２２２及び／もしくは２２３からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされる少なくとも１つの抗原結合領域を含む、請求項１に記載の単離された抗体、またはその機能的断片。
  13. 前記抗体または機能的断片は、（ｉ）〜（ｘｉｖ）のいずれかに定義される少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、または６つの抗原結合領域を含む、請求項１２に記載の単離された抗体またはその機能的断片。
  14. 前記抗体またはその機能的断片は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び／または重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、前記軽鎖可変領域は、配列番号４、２０、３６、５２、６８、８４、１００、１１６、１３２、１４８、１６４、１８０、１９６、もしくは２１２に実質的に記載されるアミノ酸配列、またはその機能的断片もしくは変異体を含み、前記重鎖可変領域は、配列番号１２、２８、４４、６０、７６、９２、１０８、１２４、１４０、１５６、１７２、１８８、２０４、もしくは２２０に実質的に記載されるアミノ酸配列、またはその機能的断片もしくは変異体を含む、請求項１に記載の単離された抗体またはその機能的断片。
  15. 前記抗体またはその機能的断片は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び／または重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、前記軽鎖可変領域は、配列番号３、１９、３５、５１、６７、８３、９９、１１５、１３１、１４７、１６３、１７９、１９５、もしくは２１１に実質的に記載されるヌクレオチド配列、またはその機能的断片もしくは変異体を含むポリヌクレオチドによってコードされ、重鎖可変領域は、配列番号１１、２７、４３、５９、７５、９１、１０７、１２３、１３９、１５５、１７１、１８７、２０３、もしくは２１９に実質的に記載されるヌクレオチド配列、またはその機能的断片もしくは変異体を含むポリヌクレオチドによってコードされる、請求項１に記載の単離された抗体またはその機能的断片。
  16. ＲＯＲ１への結合について請求項１〜１５に記載の抗体のいずれか１つと競合する、単離された抗体。
  17. 受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）タンパク質に結合することが可能な単離されたペプチドであって、
    （ｉ）配列番号８、９、１０、１６、１７及び／もしくは１８、
    （ｉｉ）配列番号２４、２５、２６、３２、３３及び／もしくは３４、
    （ｉｉｉ）配列番号４０、４１、４２、４８、４９及び／もしくは５０、
    （ｉｖ）配列番号５６、５７、５８、６４、６５及び／もしくは６６、
    （ｖ）配列番号７２、７３、７４、８０、８１及び／もしくは８２、
    （ｖｉ）配列番号８８、８９、９０、９６、９７及び／もしくは９８、
    （ｖｉｉ）配列番号１０４、１０５、１０６、１１２、１１３及び／もしくは１１４、
    （ｖｉｉｉ）配列番号１２０、１２１、１２２、１２８、１２９及び／もしくは１３０、
    （ｉｘ）配列番号１３６、１３７、１３８、１４４、１４５及び／もしくは１４６、
    （ｘ）配列番号１５２、１５３、１５４、１６０、１６１及び／もしくは１６２、
    （ｘｉ）配列番号１６８、１６９、１７０、１７６、１７７及び／もしくは１７８、
    （ｘｉｉ）配列番号１８４、１８５、１８６、１９２、１９３及び／もしくは１９４、
    （ｘｉｉｉ）配列番号２００、２０１、２０２、２０８、２０９及び／もしくは２１０、ならびに／または
    （ｘｉｖ）配列番号２１６、２１７、２１８、２２４、２２５及び／もしくは２２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたペプチド。
  18. 前記単離されたペプチドは、抗受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）抗体、またはその機能的断片である、請求項１７に記載の単離されたペプチド。
  19. 前記単離されたペプチドは、（ｉ）〜（ｘｉｖ）のいずれかに定義される少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載の単離されたペプチド。
  20. 前記ペプチドは、配列番号４、２０、３６、５２、６８、８４、１００、１１６、１３２、１４８、１６４、１８０、１９６、もしくは２１２に実質的に記載されるアミノ酸配列、またはその機能的変異体もしくは断片、あるいは配列番号１２、２８、４４、６０、７６、９２、１０８、１２４、１４０、１５６、１７２、１８８、２０４、もしくは２２０に実質的に記載されるアミノ酸配列、またはその機能的変異体もしくは断片を含む、請求項１７に記載の単離されたペプチド。
  21. 受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）タンパク質に結合することが可能なペプチドをコードする単離された核酸であって、
    （ｉ）配列番号５、６、７、１３、１４及び／もしくは１５、
    （ｉｉ）配列番号２１、２２、２３、２９、３０及び／もしくは３１、
    （ｉｉｉ）配列番号３７、３８、３９、４５、４６及び／もしくは４７、
    （ｉｖ）配列番号５３、５４、５５、６１、６２及び／もしくは６３、
    （ｖ）配列番号６９、７０、７１、７７、７８及び／もしくは７９、
    （ｖｉ）配列番号８５、８６、８７、９３、９４及び／もしくは９５、
    （ｖｉｉ）配列番号１０１、１０２、１０３、１０９、１１０及び／もしくは１１１、
    （ｖｉｉｉ）配列番号１１７、１１８、１１９、１２５、１２６及び／もしくは１２７、
    （ｉｘ）配列番号１３３、１３４、１３５、１４１、１４２及び／もしくは１４３、
    （ｘ）配列番号１４９、１５０、１５１、１５７、１５８及び／もしくは１５９、
    （ｘｉ）配列番号１６５、１６６、１６７、１７３、１７４及び／もしくは１７５、
    （ｘｉｉ）配列番号１８１、１８２、１８３、１８９、１９０及び／もしくは１９１、
    （ｘｉｉｉ）配列番号１９７、１９８、１９９、２０５、２０６及び／もしくは２０７、ならびに／または
    （ｘｉｖ）配列番号２１３、２１４、２１５、２２１、２２２及び／もしくは２２３からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
  22. 前記核酸は、抗受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）抗体、またはその機能的断片をコードし、任意選択的に、前記核酸は、（ｉ）〜（ｘｉｖ）のいずれかに定義される少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのヌクレオチド配列を含む、請求項２１に記載の単離された核酸。
  23. 前記核酸は、配列番号３、１９、３５、５１、６７、８３、９９、１１５、１３１、１４７、１６３、１７９、１９５、もしくは２１１に実質的に記載されるヌクレオチド配列、またはその機能的変異体もしくは断片、あるいは配列番号１１、２７、４３、５９、７５、９１、１０７、１２３、１３９、１５５、１７１、１８７、２０３、もしくは２１９に実質的に記載されるヌクレオチド配列、またはその機能的変異体もしくは断片を含む、請求項２１に記載の単離された核酸。
  24. 請求項１に記載の抗体またはその機能的断片と、細胞傷害性部分と、を含む、抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）。
  25. 前記細胞傷害性部分は、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、もしくはメイタンシン等の毒素、または２２５Ａｃ標識等のα線を放出する放射性ヌクレオチドである、請求項２４に記載の複合体。
  26. 対象における癌の治療、予防、または改善の方法であって、そのような治療を必要とする患者に、各々が任意選択的に誘導体化された、治療有効量の請求項１に記載の抗体もしくはその機能的断片、請求項１７に記載のペプチド、請求項２１に記載の核酸、または請求項２４に記載の抗体−薬物複合体を投与することを含む、方法。
  27. 前記抗体もしくはその機能的断片、ペプチド、核酸、または複合体は、ＲＯＲ１陽性癌種の治療、予防、改善、または診断に使用される、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記癌は、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、Ｂ細胞性急性リンパ性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）、神経芽細胞腫、腎癌、肺癌、または乳癌である、請求項２６に記載の方法。
  29. 各々が任意選択的に誘導体化された、請求項１に記載の抗体もしくはその機能的断片、請求項１７に記載のペプチド、請求項２１に記載の核酸、または請求項２４に記載の抗体−薬物複合体と、任意選択的に薬学的に許容されるビヒクルと、を含む薬学的組成物。
  30. 前記組成物は、抗癌組成物である、請求項２９に記載の組成物。
  31. 各々が任意選択的に誘導体化された、治療有効量の請求項１に記載の抗体もしくはその機能的断片、請求項１７に記載のペプチド、請求項２１に記載の核酸、または請求項２４に記載の抗体−薬物複合体と、薬学的に許容されるビヒクルと、を組み合わせることを含む、請求項２９に記載の組成物を作製するためのプロセス。
  32. 癌に罹患するかもしくは癌を発症し易い対象を診断するため、または前記対象の状態の予後を提供するためのキットであって、前記キットは、試験対象からの試料中に存在する抗原の濃度を検出するための検出手段を含み、前記検出手段は、各々が任意選択的に誘導体化された、請求項１に記載の抗体もしくはその機能的断片、請求項１７に記載のペプチド、または請求項２１に記載の核酸を含み、前記試料中の抗原の存在は、前記対象が癌に罹患することを示唆する、キット。
  33. 前記抗原は、ＲＯＲ１タンパク質、より好ましくはその細胞外ドメインを含む、請求項３２に記載のキット。
  34. 前記キットは、前記試料中のＲＯＲ１陽性細胞の存在もしくは非存在を同定するため、または前記試料中のＲＯＲ１陽性細胞の濃度を決定するために使用される、請求項３２に記載のキット。
  35. 前記キットは、アッセイが比較される陽性対照及び／または陰性対照を含む、請求項３２に記載のキット。
  36. 前記キットは、検出され得る標識をさらに含む、請求項３２に記載のキット。
  37. 癌に罹患するかもしくは癌を発症し易い対象を診断するため、または前記対象の状態の予後を提供するための方法であって、前記方法は、対象から得られた試料中に存在する抗原の濃度を検出することを含み、前記検出は、各々が任意選択的に誘導体化された、請求項１に記載の抗体もしくはその機能的断片、請求項１７に記載のペプチド、または請求項２１に記載の核酸を使用して達成され、前記試料中の抗原の存在は、前記対象が癌に罹患することを示唆する、方法。
  38. 請求項２１に記載の核酸を含む、遺伝子構築物。
  39. 請求項３８に記載の遺伝子構築物を含む、組換えベクター。
  40. 請求項３８に記載の遺伝子構築物を含む、宿主細胞。
  41. 組換え抗体またはその機能的断片を調製する方法であって、（ｉ）必要とされる抗体またはその機能的断片を発現させることが可能な、請求項４０に記載の少なくとも１つの細胞を培養することと、（ｉｉ）前記抗体またはその機能的断片を単離することと、を含む、方法。
  42. 受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体２（ＲＯＲ２）に結合する能力を有する抗体またはその機能的断片を単離する方法であって、
    （ｉ）請求項１に記載の抗体またはその機能的断片を突然変異させて突然変異体を生成することと、
    （ｉｉ）ＲＯＲ２に対する免疫特異性に合わせて突然変異体を選択することと、を含む、方法。
  43. 請求項４２に記載の方法を用いて作製される、組換え抗体またはその機能的断片のライブラリまたはパネル。
  44. 抗受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）抗体、またはその機能的断片を作製するためのエピトープの使用であって、前記エピトープは、ＫＮＤＡＰＶＶＱＥＰＲＲＬＳＦＲＳＴＩＹＧＳＲ（配列番号２３７；すなわち、配列番号２のアミノ酸９３〜１１５）；ＡＡＮＣＩＲＩＧＩＰＭＡＤＰＩ（配列番号２３８；すなわち、配列番号２のアミノ酸２９３〜３０７）；ＳＳＴＧＶＬＦＶＫＦＧＰＰＰＴＡＳＰＧ（配列番号２３９：すなわち、配列番号２のアミノ酸１４１〜１５９）；ＳＮＰＭＩＬＭＲＬＫＬＰＮＣＥ（配列番号２４０；すなわち、配列番号２のアミノ酸２６９〜２８３）；及び配列番号２の残りの細胞外配列；またはこれらのエピトープのいずれかの機能的断片もしくは変異体からなるエピトープの群から選択される、エピトープの使用。

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