CN107847596B - 抗ror1抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及抗体，并且具体地说，涉及对受体酪氨酸激酶样孤儿受体(Receptor tyrosine kinase‑like Orphan Receptor，ROR)展现特异性的抗体，以及其例如用于治疗癌症的用途。本发明延伸到编码抗体的多核苷酸和多肽序列，以及其治疗用途，以及包含这些分子的诊断试剂盒。本发明还延伸到抗体‑药物结合物和其在疗法中的用途。

Description

抗ROR1抗体
相关申请的交叉引用
依据35U.S.C.§119(e)本申请要求2015年7月16日提交的美国临时申请第62/193,237号和2015年5月18日提交的美国临时申请第62/163,241号的权益，每个临时申请都以全文引用的方式并入本文中。
关于序列表的声明
以文本格式代替纸本拷贝来提供与本申请相关的序列表，并且在此以引用的方式并入本说明书中。含有序列表的文本文件的名称是FIVE_004_02WO_ST25.txt。文本文件是185KB，创建于2016年5月17日，并经由EFS网电子提交，同时进行说明书的编档。
技术领域
本发明涉及抗体，并且具体地说，涉及对受体酪氨酸激酶样孤儿受体(Receptortyrosine kinase-like Orphan Receptor，ROR)展现特异性的抗体，以及其例如用于治疗癌症的用途。本发明延伸到编码抗体的多核苷酸和多肽序列，以及包含这些分子的组合物，以及其治疗用途。还描述了包含这些分子的诊断试剂盒和方法。本发明还延伸到抗体-药物结合物和其在疗法中的用途。
背景技术
受体酪氨酸激酶样孤儿受体(ROR)属于保守的受体酪氨酸激酶家族，其由两个家族成员ROR1和ROR2组成，所述两个家族成员是I型跨膜受体酪氨酸激酶。ROR1和ROR2的细胞外域含有免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)结构域、富含半胱氨酸结构域(cysteine-richdomain，CRD)(又称为卷曲(Frizzled，Fz)结构域)和三环(Kringle，Kr)结构域。所有三个结构域都与蛋白质-蛋白质相互作用有关。在细胞内，ROR1和ROR2具有酪氨酸激酶(TK)结构域和富含脯氨酸结构域(PRD)，两个富含丝氨酸/苏氨酸结构域横跨前述结构域。
此家族的细胞功能是调节包括骨骼和神经元发育在内的发育过程中的细胞迁移、平面细胞极性(planar cell polarity，PCP)和顶端-基底细胞极性以及轴突生长。Wnt5a是在癌发生中具有关键作用的糖蛋白，已经确定其通过结合和活化ROR1和ROR2来调节这些功能(西谷(Nishita)等人,2010,《细胞生物学趋势(Trends Cell Biol.)》20(6):346-54)。Wnt5a结合于ROR2和其辅助受体卷曲结构域可以活化INK通路和细丝蛋白A，以调节细胞迁移和侵袭，使Racl和Rho A调节细胞极性，并诱发Src家族成员调控例如MMP 1、2、13等基质金属蛋白酶的表达，并抑制典型Wnt通路。不同于ROR2，调节ROR1细胞功能背后的分子机制仍然不清楚。近期研究表明当与Wnt5a共表达时ROR1可能通过NF-B促进细胞增殖(福田(Fukuda)等人,2008,《美国国家科学院院刊(Proc Natl.Acad Sci U S A.)》105(8):3047-52)。ROR蛋白是胚胎蛋白。在小鼠中，其仅仅在发育阶段期间表达。ROR表达在出生后迅速沉默，并且在成人组织中无法检测到。ROR1或ROR2敲除的小鼠展现新生致死现象并且在出生后不久死亡。ROR1敲除的小鼠正常发育，并且未展示可见表型。ROR2敲除的小鼠表现出骨骼缺陷，例如口鼻、肢体、尾巴缩短和腭裂，以及心室间隔的膜部分缺陷。
ROR1在B细胞慢性淋巴细胞性白血病(B-cell chronic lymphocytic leukemia，CLL)和套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma，MCL)中异常表达。像小鼠对应部分一样，除脂肪组织中的低水平以外，无法在正常血细胞和其它成人组织中检测到人类ROR1表达。研究已经证明ROR1和纤维调节素的敲低引起CLL细胞的细胞凋亡显著增加(乔杜里(Choudhury)等人,2010,《英国血液学杂志(Br J Haematol.)》151(4):327-35)。
CLL是西半球最常见的人类白血病形式。根据白血病与淋巴瘤协会，每年美国诊断出约16,000例新的CLL病例，并且每年4,400人死于此病。CLL的特征在于功能性不成熟的细胞累积在骨髓、血液、淋巴组织和其它器官中。它是成熟B细胞的恶性病，并且最常影响55岁以上的成年人，其中三分之二是男性，不过有时发生在青年人中。对新颖并改善的CLL治疗选择存在显著未满足的医疗需求。尽管使用化学疗法和干细胞移植进行治疗，但是CLL是一种无法治愈的疾病，平均五年存活率只有50％。
已经报告，在统计显著性下，神经母细胞瘤患者中高水平的ROR1和ROR2表达与较低存活率相关(图1和2)。来自前B ALL患者的基因表达谱分析数据还表明ROR1上调与t(1；19)易位之间的相关性，此产生E2A-PBX1融合蛋白并充当前B-ALL的亚型的生物标记物(图3)。
近期用于肿瘤适应症的单克隆抗体(monoclonal antibody，mAb)的进展产生了治疗CLL的新选择，作为独立疗法或与化学疗法方案组合。2007年，坎帕斯(Campath，抗CD52人源化抗体)经FDA批准作为CLL的一线治疗。先前，坎帕斯经批准作为对烷基化剂和福达华(Fludara)停止回应的CLL患者的二线治疗。与使用苯丁酸氮芥(chlorambucil)作为初始治疗相比，坎帕斯治疗展示显著优良的患者反应。坎帕斯还展示有利的毒性特征。美罗华(Rituxan)是一种抗CD20抗体药物，经FDA批准用于与两种其它化学疗法药物氟达拉宾(fludarabine)和环磷酰胺(cyclophosphamide)组合治疗CLL患者。在所有这些进展下，约20％的患者仍然未实现完全的疾病控制，并且大部分患者最终对可用疗法发展抗性。因此，仍然极大地需要更有效和创新的CLL疗法。
附图说明
为更好地了解本发明和展示其实施例如何实现，现将通过实例参考随附图式。
图1是展示具有高水平ROR1基因表达的神经母细胞瘤患者统计学上显著较低的存活的图。
图2是展示具有高水平ROR2基因表达的神经母细胞瘤患者统计学上显著较低的存活的图。
图3展示前B ALL患者中的ROR1 mRNA表达。
图4表示ROR1噬菌体展示淘选策略。
图5是展示ROR1噬菌体抗体ELISA结果的一实例的图。
图6是展示ROR1噬菌体抗体细胞ELISA结果的一实例的图。
图7说明通过噬菌体竞争ELISA进行的亲和力评级的方法。
图8说明表位I类抗体CDR序列分析。
图9说明表位II类抗体CDR序列分析。
图10说明表位III类抗体CDR序列分析。
图11说明表位IV类抗体CDR序列分析。
图12是展示通过ELISA，ROR1阳性噬菌体克隆的结合特异性的一实例的图。
图13是展示通过ELISA，阳性噬菌体克隆结合于人类ROR1与人类ROR2的一实例的图。
图14a和14b是人类抗ROR1全长IgG1抗体表达载体的质粒图谱。
图15展示本发明的抗ROR1全长IgG1抗体的一实施例的人类抗体恒定域的蛋白质序列。
图16说明纯化人类抗ROR1全长IgG1抗体的SDS-PAGE。
图17a和17b展示通过生物膜层干涉技术，抗ROR1全长IgG1抗体的Kd结合亲和力分析。
图18A和18B表示抗体601-3-2表位定位ELISA数据。突出显示区说明人类ROR1蛋白序列中的601-3-2表位。
图19A和19B表示抗体601-3-12表位定位ELISA数据。突出显示区说明人类ROR1蛋白序列中的601-3-12表位。
图20A和20B表示抗体601-3-16表位定位ELISA数据。突出显示区说明人类ROR1蛋白序列中的601-3-16表位。
图21a-21c是展示抗ROR1全长IgG1抗体针对人类ROR1、人类ROR2和小鼠ROR1的ELISA结果的图。
图22a-22c是展示通过FACS，抗ROR1全长IgG1抗体的结合分析的图。
图23是展示抗ROR1全长IgG1抗体的C1q结合的图。
图24a-24c是展示抗ROR1全长IgG1抗体针对MDA-MB-231的ADCC活性的图。
图25展示抗ROR1全长IgG1抗体对Wnt5a配体结合的阻断；以及
图26是展示ROR1抗体内化的图。
图27展示抗ROR1抗体结合于ROR1胞外结构域单体和二聚体形式的标准化传感图。
图28展示在四种不同浓度(每一种抗体，从左到右，10、2.5、0.63、0.16μg/mL)下抗ROR1抗体与来自患者13的CLL细胞的结合，其中信号通过减去针对相同浓度的同型对照抗体获得的MFI来校正。
图29展示在四种不同浓度(每一种抗体，从左到右，10、2.5、0.63、0.16μg/mL)下抗ROR1抗体与来自患者13的CLL细胞的结合，其中信号通过减去针对相同浓度的同型对照抗体获得的MFI来校正。
具体实施方式
本发明人的研究集中于受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)，因为他们视其为CLL以及其它癌症的有前景的新颖癌症标靶。然而，本发明人发现与研发有效的靶向ROR1的单克隆抗体诊断学和疗法有关的一个显著问题是ROR1在CLL癌细胞的表面上的表达水平非常低。实际上，研究表明CLL癌细胞上的ROR1表达据估计仅仅是每个细胞几千个分子(巴斯卡(Baskar)等人,2008,《临床癌症研究(Clin Cancer Res.)》15年1月；14(2):396-404。相比之下，大部分抗体疗法靶向在癌细胞表面上高度表达的分子。举例来说，罗氏(Roche)的抗体乳癌药物赫赛汀(Herceptin)靶向Her2抗原，据估计Her2抗原具有每个细胞>50,000个拷贝的表达水平。因此，尽管ROR1拷贝数惊人地低，但CLL的有效抗体治疗必须能够鉴别CLL癌细胞。一种克服癌细胞表面上ROR1低拷贝数的挑战的方式是鉴别尽管ROR1密度低，仍可以有效结合于ROR1阳性癌细胞的高亲和力抗体。
因此，本发明的目标是研发将以对正常组织最小的副作用靶向和杀死癌细胞的高特异性和高亲和力抗ROR1单克隆抗体。通过使用完全人类抗体噬菌体库针对人类ROR1胞外结构域(extracellular domain，ECD)蛋白费力地淘选，本发明人已经能够分离高特异性人类ROR1特异性抗体。
因此，根据本发明的第一方面，提供一种人类抗受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)抗体或其功能片段。
有利的是，本发明人已经分离第一人类ROR1免疫特异性抗体，并研发了针对ROR1阳性癌症类型的靶向ROR1的抗体疗法，例如B细胞慢性淋巴细胞性白血病(B-cell ChronicLymphocytic Leukemia，CLL)-西半球最常见的人类白血病形式，因此解决了未满足的医疗需求。用于癌症疗法的根据本发明的抗体靶向ROR1是基于以下重要的科学发现：ROR1在癌细胞中异常表达，但在正常血细胞和正常成人组织中不存在，并且因此提供一种仅仅靶向癌细胞和肿瘤的高特异性疗法。
如实例中所述，已经分离本发明的完全人类和独特抗ROR1抗体的若干不同实施例，这些抗体中的每一种能够以意外高的亲和力识别ROR1蛋白上的不同结合表位。有利的是，如实例中所述，本发明的抗体可以：(i)介导补体依赖性细胞毒性(complement-dependent cytotoxicity，CDC)；(ii)介导针对多种ROR1阳性癌细胞系的抗体依赖性细胞毒性(antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC)；(iii)阻断Wnt5a与ROR1的结合；和/或(iv)抑制Wnt5a诱发的ROR1磷酸化。本发明人相信这是完全人类抗ROR1抗体第一次被分离、鉴别和测序。因此，本发明的抗体在单独使用时呈现高效治疗剂或作为能够递送有效抗癌试剂的媒剂或作为展现增强的免疫功能的工程化抗体。另外，本发明的抗体还可以用作诊断或预后工具。有利的是，基于其作为仅仅在胚胎发育期间表达的胎儿抗原的独特表达特征，以及在多种癌症中的优先表达特征，靶向ROR1的有效抗体疗法将改善和延长广泛癌症患者群体的生命，并降低长期医疗费用。
本发明延伸到对ROR1蛋白具有免疫特异性的全抗体(即，免疫球蛋白)，优选其胞外结构域，以及其功能片段。此类片段保留对应全长抗体的至少一个抗原结合区。抗体或其功能片段可以包含单克隆或多克隆抗体或其功能片段。
抗体或功能片段可以是单价、二价或多价。单价抗体是重(H)链由二硫桥与轻链(L)缔合的二聚体(HL)。二价抗体是包含由至少一个二硫桥缔合的两个二聚体的四聚体(H2L2)。多价抗体也可以例如通过连接多个二聚体来产生。本发明的ROR1抗体可以是嵌合抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、人源化抗体和/或人类抗体。抗体分子的基础结构由两个一致轻链和两个一致重链组成，轻链和重链非共价缔合并且可以由二硫键连接。每个重链和轻链含有约110个氨基酸的氨基端可变区，和链剩余部分中的恒定序列。可变区包括若干高变区或互补决定区(CDR)，高变区或互补决定区形成抗体分子的抗原结合位点并决定其对抗原，例如ROR1或其表位的特异性。在重链和轻链的CDR的两侧上是构架区，构架区是锚定CDR和CDR取向的氨基酸的相对保守序列。
恒定区由五个重链序列(μ、γ、ζ、α或ε)之一和两个轻链序列(κ或λ)之一组成。重链恒定区序列决定抗体的同型和分子的效应功能。
如本文所用，术语“人类抗体”可以意指包含基本上与在对ROR1蛋白展现免疫特异性的特定人类抗体中所发现相同的重链和轻链CDR氨基酸序列的抗体，例如单克隆抗体。基本上与重链或轻链CDR相同的氨基酸序列在与参考序列相比较时展现相当大量的序列一致性。此类一致性确定性地已知或可识别为表示特定人类抗体的氨基酸序列。基本上相同的重链和轻链CDR氨基酸序列可以具有例如氨基酸的少量修饰或保守取代。此类人类抗体维持其选择性结合于ROR1蛋白的功能。人类抗体包括(但不限于)在例如
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等包含人类免疫球蛋白基因的非人类动物中产生的抗体，以及使用例如噬菌体展示等体外方法选择的抗体，其中抗体谱系是基于人类免疫球蛋白序列。
术语“人类单克隆抗体”可以包括例如通过重组方法产生，例如通过噬菌体库、淋巴细胞或融合瘤细胞产生的具有基本上人类CDR氨基酸序列的单克隆抗体。
术语“人源化抗体”可以意指蛋白质序列已经修饰以增加其与人类中天然产生的抗体的相似性的来自非人类物种(例如小鼠)的抗体。术语“人源化抗体”是指其中非人类可变区(例如小鼠、大鼠、食蟹猕猴、鸡等)的构架区中的至少一个氨基酸经来自人类可变区的对应氨基酸替换的抗体。在一些实施例中，人源化抗体包含至少一个人类恒定区或其片段。在一些实施例中，人源化抗体是Fab、scFv、(Fab')2等。
如本文中所用的“嵌合抗体”是指包含至少一个来自第一物种(例如小鼠、大鼠、食蟹猕猴等)可变区和至少一个来自第二物种(例如人类、食蟹猕猴、鸡等)的恒定区的抗体。在一些实施例中，嵌合抗体包含至少一个小鼠可变区和至少一个人类恒定区。在一些实施例中，嵌合抗体包含至少一个食蟹猕猴可变区和至少一个人类恒定区。在一些实施例中，嵌合抗体的所有可变区来自第一物种，并且嵌合抗体的所有恒定区来自第二物种。
如本文中所用之“双特异性抗体”是指包含有包含结合第一抗原的重链/轻链组合的第一臂和包含结合第二抗原的重链/轻链组合的第二臂的抗体。在一些实施例中，双特异性抗体的一个臂包含结合ROR1的重链/轻链组合。
抗体可以是重组抗体。术语“重组人类抗体”可以包括使用重组DNA技术产生的人类抗体。
术语“抗原结合区”可以意指对其标靶抗原，例如ROR1蛋白具有特异性结合亲和力的抗体区域。结合区可以是高变CDR或其功能性部分。术语CDR的“功能性部分”可以意指CDR内对标靶抗原展示特异性亲和力的序列。CDR的功能性部分可以包含特异性结合于ROR1蛋白的配体。
术语“CDR”可以意指可变重链和轻链中的高变区。抗体的每个重链和轻链中可存在一个、两个、三个或更多个CDR。通常，每个链上存在至少三个CDR，所述CDR在配置在一起时形成抗原结合位点，即抗原结合或特异性反应的三维组合位点。然而，假定一些抗体的重链中可存在四个CDR。
CDR的定义还包括当彼此比较时重叠氨基酸残基或氨基酸残基子集。涵盖特定CDR或其功能性部分的精确残基数目将取决于CDR的序列和尺寸而变化。在给出抗体的可变区氨基酸序列下，本领域的技术人员可以按常规确定哪些残基构成特定CDR。
术语抗体的“功能片段”可以意指保持功能活性的抗体部分。功能活性可以是例如抗原结合活性或特异性(例如抗原结合片段)。功能活性还可以是例如由抗体恒定区提供的效应功能。术语“功能片段”还意图包括例如通过人类单克隆抗体的蛋白酶消化或还原和通过本领域的技术人员已知的重组DNA方法产生的片段。人类单克隆抗体功能片段包括例如个别重链或轻链和其片段，例如VL、VH和Fd；单价片段，例如Fv、Fab和Fab'；二价片段，例如F(ab')2；单链Fv(scFv)；以及Fc片段。
术语“VL片段”可以意指包括轻链可变区的全部或部分，包括CDR的人类单克隆抗体的轻链片段。VL片段可以进一步包括轻链恒定区序列。
术语“VH片段”可以意指包括重链可变区的全部或部分，包括CDR的人类单克隆抗体的重链的片段。
术语“Fd片段”可以意指偶合于重链可变区和恒定区的轻链可变区和恒定区，即VLCL和VH CH-1。
术语“Fv片段”可以意指包括重链和轻链可变区的全部或部分并缺乏重链和轻链恒定区的人类单克隆抗体的单价抗原结合片段。重链和轻链的可变区包括例如CDR。举例来说，Fv片段包括重链和轻链的约110个氨基酸的氨基端可变区的全部或部分。
术语“Fab片段”意指大于Fv片段的人类单克隆抗体的单价抗原结合片段。举例来说，Fab片段包括重链和轻链的可变区以及第一恒定域的全部或部分。因此，Fab片段另外包括例如重链和轻链的约110个到约220个氨基酸残基。
术语“Fab片段”可以意指大于Fab片段的人类单克隆抗体的单价抗原结合片段。举例来说，Fab'片段包括轻链全部、重链可变区全部和重链的第一恒定域和第二恒定域的全部或部分。举例来说，Fab'片段可以另外包括重链的氨基酸残基220到330中的一些或全部。
术语“F(ab')2片段”可以意指人类单克隆抗体的二价抗原结合片段。F(ab')2片段包括例如两个重链和两个轻链的可变区的全部或部分，并且可以进一步包括两个重链和两个轻链的第一恒定域的全部或部分。
术语“单链Fv(scFv)”可以意指重链(VH)和轻链(VL)的可变区通过短连接肽连接的融合物。
本领域的技术人员知道人类单克隆抗体的片段的精确边界是不重要的，只要片段维持功能活性即可。使用众所周知的重组方法，本领域的技术人员可以将多核苷酸序列工程化以表达具有特定应用所需的任何终点的功能片段。抗体的功能片段可以包含具有基本上与人类抗体相同的重链和轻链可变区的片段。优选地，功能片段是ROR1特异性的。
功能片段可以包括其中至少一个结合区序列具有基本上与抗体，更优选ROR1特异性人类抗体的结合区序列相同的氨基酸序列的片段。功能片段可以包含选自由以下组成的群组的片段：VH、VL、Fd、Fv、Fab、Fab'、scFv、F(ab')2和Fc片段。
功能片段可以包含VL的任一抗原结合区序列、VH的任一抗原结合区序列或者人类抗体的VL和VH抗原结合区的组合。VH和VL抗原结合区序列的适当数目和组合可以通过本领域的技术人员，根据功能片段的所需亲和力和特异性以及预期用途来确定。抗体的功能片段容易使用本领域的技术人员众所周知的方法产生和分离。此类方法包括例如蛋白水解方法、重组方法和化学合成。用于分离功能片段的蛋白水解方法包含使用人类抗体作为起始物质。适合于人类免疫球蛋白的蛋白分解的酶可以包括例如木瓜蛋白酶和胃蛋白酶。本领域的技术人员容易根据例如需要单价还是二价片段来选择适当酶。举例而言，木瓜蛋白酶裂解产生结合抗原的两个单价Fab'片段和Fc片段。胃蛋白酶裂解例如产生二价F(ab')片段。本发明的F(ab')2片段可以使用例如DTT或2-巯基乙醇进一步还原以产生两个单价Fab'片段。
蛋白水解产生的功能片段可以通过亲和力和柱色谱程序来纯化。举例来说，未消化的抗体和Fc片段可以通过结合于蛋白A来去除。另外，功能片段可以根据其电荷和尺寸，使用例如离子交换和凝胶过滤色谱法来纯化。此类方法是本领域的技术人员众所周知的。
人类抗体或其功能片段可以通过重组方法产生。优选地，最初分离编码抗体重链和轻链的所需区域的多核苷酸。此类区域可以包括例如重链和轻链的可变区的全部或部分。优选地，此类区域可以尤其包括重链和轻链的抗原结合区，优选抗原结合位点，最优选CDR。
编码本发明的人类抗体或功能片段的多核苷酸可以使用本领域的技术人员已知的方法产生。编码抗体或其功能片段的多核苷酸可以直接通过本领域中已知的寡核苷酸合成方法合成。可替代地，可以合成较小的片段并且使用本领域中已知的重组方法接合形成较大的功能片段。
如本文所用，术语“免疫特异性”可以意指结合区通过与ROR1蛋白特异性结合而能够与其免疫反应。抗体或其功能片段可以选择性地与抗原(例如ROR1肽)相互作用，亲和力常数是约10-5到10-13M-1、优选10-6到10-9M-1、甚至更优选10-10到10-12M-1。
“受试者”可以是脊椎动物、哺乳动物或家畜。因此，根据本发明的药物可以用于治疗任何哺乳动物，例如牲畜(例如马)、宠物，或可以用于其它兽医学应用。最优选地，受试者是人类。
抗体或其片段的“治疗有效量”是在给予受试者时作为药剂治疗癌症或产生所欲影响所需要的量的任何量。
术语“抗癌组合物”可以意指用于治疗学上改善、预防或治疗受试者癌症的药物配制物。
如本文中所提到的“药学上可接受的媒剂”是本领域的技术人员已知的可用于配制药物组合物的任何已知化合物或已知化合物的组合。
如图17中所示，动力学结合分析证实全长IgG1抗体特异性结合hROR1-ECD，Kd在皮摩尔范围内。因此，优选地，抗体或其片段针对ROR1的KD可以小于1×10-10，优选小于1×10-11，更优选地小于1×10-12。抗体或其片段可以展现约10-7到10-10M-1的对ROR1的IC50。
术语“免疫反应”可以意指结合区在结合ROR1蛋白或其表位时能够引发免疫反应。
术语“表位”可以意指能够诱出和组合抗体或其片段的结合区的任何抗原区域。
如图23和24中所示，抗体或其片段能够介导表达ROR1的肿瘤细胞的杀死。杀死可以经由补体依赖性细胞毒性(CDC)和/或经由抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。
如图25中所示，抗体或其片段能够阻断Wnt5a与ROR1蛋白的结合。
如图26中所示，抗体其片段能够在结合ROR1时被内吞。
抗体或其片段能够阻断Wnt5a ROR1磷酸化。抗体或其片段能够抑制癌细胞增殖。
术语“ROR1”可以指受体酪氨酸激酶样孤儿受体第1家族(mRNA：NM_005012.2，蛋白质：NP_005003.2)。编码人类ROR1的一实施例的DNA序列在本文中以SEQ ID NO:1提供。
人类ROR1的一实施例的多肽序列在本文中以SEQ ID NO:2提供。
如实例中所述，本发明人已经分离根据本发明的第一方面的抗体或功能片段的45个不同实施例。本发明人已经进行表位定位，并发现抗体或其片段的实施例能够结合于ROR1蛋白上的多个不同表位，这些表位在本文中指示为表位I-IV类。表位I可以被定义为残基KNDAPVVQEPRRLSFRSTIYGSR(SEQ ID NO:237；即SEQ ID NO:2的氨基酸93-115)和AANCIRIGIPMADPI(SEQ ID NO:238；即SEQ ID NO:2的氨基酸293-307)，表位II可以被定义为残基SSTGVLFVKFGPPPTASPG(SEQ ID NO:239；即SEQ ID NO:2的氨基酸141-159)和SNPMILMRLKLPNCE(SEQ ID NO:240；即SEQ ID NO:2的氨基酸269-283)，并且表位III和表位IV可以被定义为SEQ ID NO:2的细胞外序列的其余部分。因此，抗体或其片段优选能够结合于ROR1蛋白上的表位I到IV中的一或多个，或任一这些表位的功能片段或变异体。应了解这些多个表位的知识可以用于产生新颖ROR1特异性抗体。
因此，在第二方面，提供表位用于产生抗受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)抗体或其功能片段的用途，其中表位选自由以下组成的表位的群组：KNDAPVVQEPRRLSFRSTIYGSR(SEQ ID NO:237；即SEQ ID NO:2的氨基酸93-115)；AANCIRIGIPMADPI(SEQ ID NO:238；即SEQ ID NO:2的氨基酸293-307)；SSTGVLFVKFGPPPTASPG(SEQ ID NO:239；即SEQ ID NO:2的氨基酸141-159)；SNPMILMRLKLPNCE(SEQ ID NO:240；即SEQ ID NO:2的氨基酸269-283)；以及SEQ ID NO:2的细胞外序列的其余部分；或任一这些表位的功能片段或变异体。
在一些实施例中，提供结合于具有序列KNDAPVVQEPRRLSFRSTIYGSR(SEQ ID NO:237；即SEQ ID NO:2的氨基酸93-115)的肽的抗ROR1抗体。在一些实施例中，提供结合于具有序列AANCIRIGIPMADPI(SEQ ID NO:238；即SEQ ID NO:2的氨基酸293-307)的肽的抗ROR1抗体。在一些实施例中，提供结合于具有序列SSTGVLFVKFGPPPTASPG(SEQ ID NO:239；即SEQID NO:2的氨基酸141-159)的肽的抗ROR1抗体。在一些实施例中，提供结合于具有序列SNPMILMRLKLPNCE(SEQ ID NO:240；即SEQ ID NO:2的氨基酸269-283)的肽的抗ROR1抗体。
在一些实施例中，提供与抗体601-3-2竞争结合于ROR1的抗ROR1抗体。在一些实施例中，提供与抗体601-3-12竞争结合于ROR1的抗ROR1抗体。在一些实施例中，提供与抗体601-3-16竞争结合于ROR1的抗ROR1抗体。
本发明人也已经确定本发明的ROR1特异性抗体的重链和轻链的互补决定区(CDR)，并且已经发现这四个表位类别中的每一个内的高度保守基元。意外地，如图8-11中所示，发现抗体的实施例可以结合表位I类中的三个亚组(即亚组Ia、Ib和Ic)、表位II类中的五个亚组(即亚组IIa、IIb、IIc和IId)和表位类别III(即亚组IIIa和IIIb)和IV(即亚组IVa和IVb)中的两个亚组。在一些实施例中，提供与抗体在表位I类中竞争结合ROR1(例如与抗体竞争亚组Ia、Ib或Ic)的抗体。在一些实施例中，提供与抗体在表位II类中竞争结合ROR1(例如与抗体竞争亚组IIa、IIb、IIc或IId)的抗体。在一些实施例中，提供与抗体在表位III类中竞争结合ROR1(例如与抗体竞争亚组IIIa或IIIb)的抗体。在一些实施例中，提供与抗体在表位IV类中竞争结合ROR1(例如与抗体竞争亚组IVa或IVb)的抗体。
如实例2中所述，本发明人已经分离总共45个对ROR1具有免疫特异性的抗体，其中14个是优选的。这14个优选的抗体：(i)代表所有以上提及的表位类别和其亚组；(ii)具有高ROR1结合亲和力；以及(iii)形成可以转化成完全IgG分子的池。可以针对治疗和诊断用途研发本文所述的所有抗体并且因此明显是有价值的。
在一些实施例中，提供和抗ROR1抗体，其中抗体包含选自以下的抗ROR1抗体的重链可变区和轻链可变区：抗体601-1；抗体601-2(3-12)；抗体601-3(3-16)；抗体601-4；抗体601-5(3-2)；抗体601-6；抗体601-9；抗体601-13；抗体601-14；抗体601-17；抗体601-18抗体601-28；抗体601-37；抗体601-40；抗体601-43；抗体601-50；抗体601-51；抗体601-56；抗体601-57；抗体601-65；抗体601-66；抗体601-69；抗体601-70；抗体601-81；抗体601-86；抗体601-87；抗体601-100；抗体601-101；抗体601-102；抗体601-103；抗体601-108；抗体601-109；抗体601-110；抗体601-112；抗体601-119；抗体601-120；抗体601-128；抗体601-130；抗体601-134；抗体601-136；抗体601-137；抗体601-141；抗体601-147；抗体601-149；或抗体601-153。那些抗体的重链可变区和轻链可变区展示在例如本文中的标题是“某些轻链可变区序列表”和“某些重链可变区序列表”的表中。
在一些实施例中，提供一种抗ROR1抗体，其中抗体包含与选自以下的抗ROR1抗体的重链可变区至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致的重链可变区：抗体601-1；抗体601-2(3-12)；抗体601-3(3-16)；抗体601-4；抗体601-5(3-2)；抗体601-6；抗体601-9；抗体601-13；抗体601-14；抗体601-17；抗体601-18；抗体601-28；抗体601-37；抗体601-40；抗体601-43；抗体601-50；抗体601-51；抗体601-56；抗体601-57；抗体601-65；抗体601-66；抗体601-69；抗体601-70；抗体601-81；抗体601-86；抗体601-87；抗体601-100；抗体601-101；抗体601-102；抗体601-103；抗体601-108；抗体601-109；抗体601-110；抗体601-112；抗体601-119；抗体601-120；抗体601-128；抗体601-130；抗体601-134；抗体601-136；抗体601-137；抗体601-141；抗体601-147；抗体601-149；或抗体601-153。在一些此类实施例中，抗体包含参考抗体的重链CDR。那些抗体中的每一抗体的重链CDR展示在例如本文中标题是“某些重链CDR序列表”的表中。
在一些实施例中，提供一种抗ROR1抗体，其中抗体包含与选自以下的抗ROR1抗体的轻链可变区至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致的轻链可变区：抗体601-1；抗体601-2(3-12)；抗体601-3(3-16)；抗体601-4；抗体601-5(3-2)；抗体601-6；抗体601-9；抗体601-13；抗体601-14；抗体601-17；抗体601-18抗体601-28；抗体601-37；抗体601-40；抗体601-43；抗体601-50；抗体601-51；抗体601-56；抗体601-57；抗体601-65；抗体601-66；抗体601-69；抗体601-70；抗体601-81；抗体601-86；抗体601-87；抗体601-100；抗体601-101；抗体601-102；抗体601-103；抗体601-108；抗体601-109；抗体601-110；抗体601-112；抗体601-119；抗体601-120；抗体601-128；抗体601-130；抗体601-134；抗体601-136；抗体601-137；抗体601-141；抗体601-147；抗体601-149；或抗体601-153。在一些此类实施例中，抗体包含参考抗体的轻链CDR。那些抗体中的每一抗体的轻链CDR展示于例如本文中的标题是“某些轻链CDR序列表”的表中。
图8-11展示本发明人已经确定分离抗体的重链和轻链的可变区的共同序列，其形成CDR(L1、L2和L3是轻链的三个CDR，并且H1、H2和H3是重链的三个CDR)。明显地，这些保守残基对于界定抗体对ROR1蛋白，优选其胞外结构域(ECD)的结合特异性和亲和力是重要的，因此为抗体工程化提供有用的信息以改善和提高抗体的结合特征。本发明人已经确定优选的14个抗体中的每一抗体的氨基酸和DNA序列，如实例2中所述。
因此，在一个实施例中，抗体或其功能片段可以包含至少一个包含选自由以下组成的群组的氨基酸序列的抗原结合区：(i)SEQ ID NO:8；(ii)SEQ ID NO:9；(iii)SEQ IDNO:10；(iv)SEQ ID NO:16；(v)SEQ ID NO:17；和(vi)SEQ ID NO:18。
在另一实施例中，抗体或其功能片段可以包含至少一个包含选自由以下组成的群组的氨基酸序列的抗原结合区：(i)SEQ ID NO:24；(ii)SEQ ID NO:25；(iii)SEQ ID NO:26；(iv)SEQ ID NO:32；(v)SEQ ID NO:33；和(vi)SEQ ID NO:34。
在另一实施例中，抗体或其功能片段可以包含至少一个包含选自由以下组成的群组的氨基酸序列的抗原结合区：(i)SEQ ID NO:40；(ii)SEQ ID NO:41；(iii)SEQ ID NO:42；(iv)SEQ ID NO:48；(v)SEQ ID NO:49；和(vi)SEQ ID NO:50。
在另一实施例中，抗体或其功能片段可以包含至少一个包含选自由以下组成的群组的氨基酸序列的抗原结合区：(i)SEQ ID NO:56；(ii)SEQ ID NO:57；(iii)SEQ ID NO:58；(iv)SEQ ID NO:64；(v)SEQ ID NO:65；和(vi)SEQ ID NO:66。
在另一实施例中，抗体或其功能片段可以包含至少一个包含选自由以下组成的群组的氨基酸序列的抗原结合区：(i)SEQ ID NO:72；(ii)SEQ ID NO:73；(iii)SEQ ID NO:74；(iv)SEQ ID NO:80；(v)SEQ ID NO:81；和(vi)SEQ ID NO:82。
在另一实施例中，抗体或其功能片段可以包含至少一个包含选自由以下组成的群组的氨基酸序列的抗原结合区：(i)SEQ ID NO:88；(ii)SEQ ID NO:89；(iii)SEQ ID NO:90；(iv)SEQ ID NO:96；(v)SEQ ID NO:97；和(vi)SEQ ID NO:98。
在另一实施例中，抗体或其功能片段可以包含至少一个包含选自由以下组成的群组的氨基酸序列的抗原结合区：(i)SEQ ID NO:104；(ii)SEQ ID NO:105；(iii)SEQ ID NO:106；(iv)SEQ ID NO:112；(v)SEQ ID NO:113；和(vi)SEQ ID NO:114。
在另一实施例中，抗体或其功能片段可以包含至少一个包含选自由以下组成的群组的氨基酸序列的抗原结合区：(i)SEQ ID NO:120；(ii)SEQ ID NO:121；(iii)SEQ ID NO:122；(iv)SEQ ID NO:128；(v)SEQ ID NO:129；和(vi)SEQ ID NO:130。
在另一实施例中，抗体或其功能片段可以包含至少一个包含选自由以下组成的群组的氨基酸序列的抗原结合区：(i)SEQ ID NO:136；(ii)SEQ ID NO:137；(iii)SEQ ID NO:138；(iv)SEQ ID NO:144；(v)SEQ ID NO:145；和(vi)SEQ ID NO:146。
在另一实施例中，抗体或其功能片段可以包含至少一个包含选自由以下组成的群组的氨基酸序列的抗原结合区：(i)SEQ ID NO:152；(ii)SEQ ID NO:153；(iii)SEQ ID NO:154；(iv)SEQ ID NO:160；(v)SEQ ID NO:161；和(vi)SEQ ID NO:162。
在另一实施例中，抗体或其功能片段可以包含至少一个包含选自由以下组成的群组的氨基酸序列的抗原结合区：(i)SEQ ID NO:168；(ii)SEQ ID NO:169；(iii)SEQ ID NO:170；(iv)SEQ ID NO:176；(v)SEQ ID NO:177；和(vi)SEQ ID NO:178。
在另一实施例中，抗体或其功能片段可以包含至少一个包含选自由以下组成的群组的氨基酸序列的抗原结合区：(i)SEQ ID NO:184；(ii)SEQ ID NO:185；(iii)SEQ ID NO:186；
(iv)SEQ ID NO:192；(v)SEQ ID NO:193；和(vi)SEQ ID NO:194。
在另一实施例中，抗体或其功能片段可以包含至少一个包含选自由以下组成的群组的氨基酸序列的抗原结合区：(i)SEQ ID NO:200；(ii)SEQ ID NO:201；(iii)SEQ ID NO:202；(iv)SEQ ID NO:208；(v)SEQ ID NO:209；和(vi)SEQ ID NO:210。
在另一实施例中，抗体或其功能片段可以包含至少一个包含选自由以下组成的群组的氨基酸序列的抗原结合区：(i)SEQ ID NO:216；(ii)SEQ ID NO:217；(iii)SEQ ID NO:218；(iv)SEQ ID NO:224；(v)SEQ ID NO:225；和(vi)SEQ ID NO:226。
在一个实施例中，抗体或其功能片段可以包含至少一个由包含选自由以下组成的群组的核苷酸序列的核酸编码的抗原结合区：(i)SEQ ID NO:5；(ii)SEQ ID NO:6；(iii)SEQ ID NO:7；(iv)SEQ ID NO:13；(v)SEQ ID NO:14；和(vi)SEQ ID NO:15。
在另一实施例中，抗体或其功能片段可以包含至少一个由包含选自由以下组成的群组的核苷酸序列的核酸编码的抗原结合区：(i)SEQ ID NO:21；(ii)SEQ ID NO:22；(iii)SEQ ID NO:23；(iv)SEQ ID NO:29；(v)SEQ ID NO:30；和(vi)SEQ ID NO:31。
在一个实施例中，抗体或其功能片段可以包含至少一个由包含选自由以下组成的群组的核苷酸序列的核酸编码的抗原结合区：(i)SEQ ID NO:37；(ii)SEQ ID NO:38；(iii)SEQ ID NO:39；(iv)SEQ ID NO:45；(v)SEQ ID NO:46；和(vi)SEQ ID NO:47。
在一个实施例中，抗体或其功能片段可以包含至少一个由包含选自由以下组成的群组的核苷酸序列的核酸编码的抗原结合区：(i)SEQ ID NO:53；(ii)SEQ ID NO:54；(iii)SEQ ID NO:55；(iv)SEQ ID NO:61；(v)SEQ ID NO:62；和(vi)SEQ ID NO:63。
在一个实施例中，抗体或其功能片段可以包含至少一个由包含选自由以下组成的群组的核苷酸序列的核酸编码的抗原结合区：(i)SEQ ID NO:69；(ii)SEQ ID NO:70；(iii)SEQ ID NO:71；(iv)SEQ ID NO:77；(v)SEQ ID NO:78；和(vi)SEQ ID NO:79。
在一个实施例中，抗体或其功能片段可以包含至少一个由包含选自由以下组成的群组的核苷酸序列的核酸编码的抗原结合区：(i)SEQ ID NO:85；(ii)SEQ ID NO:86；(iii)SEQ ID NO:87；(iv)SEQ ID NO:93；(v)SEQ ID NO:94；和(vi)SEQ ID NO:95。
在一个实施例中，抗体或其功能片段可以包含至少一个由包含选自由以下组成的群组的核苷酸序列的核酸编码的抗原结合区：(i)SEQ ID NO:101；(ii)SEQ ID NO:102；(iii)SEQ ID NO:103；(iv)SEQ ID NO:109；(v)SEQ ID NO:110；和(vi)SEQ ID NO:111。
在一个实施例中，抗体或其功能片段可以包含至少一个由包含选自由以下组成的群组的核苷酸序列的核酸编码的抗原结合区：(i)SEQ ID NO:117；(ii)SEQ ID NO:118；(iii)SEQ ID NO:119；(iv)SEQ ID NO:125；(v)SEQ ID NO:126；和(vi)SEQ ID NO:127。
在一个实施例中，抗体或其功能片段可以包含至少一个由包含选自由以下组成的群组的核苷酸序列的核酸编码的抗原结合区：(i)SEQ ID NO:133；(ii)SEQ ID NO:134；(iii)SEQ ID NO:135；(iv)SEQ ID NO:141；(v)SEQ ID NO:142；和(vi)SEQ ID NO:143。
在一个实施例中，抗体或其功能片段可以包含至少一个由包含选自由以下组成的群组的核苷酸序列的核酸编码的抗原结合区：(i)SEQ ID NO:149；(ii)SEQ ID NO:150；(iii)SEQ ID NO:151；(iv)SEQ ID NO:157；(v)SEQ ID NO:158；和(vi)SEQ ID NO:159。
在一个实施例中，抗体或其功能片段可以包含至少一个由包含选自由以下组成的群组的核苷酸序列的核酸编码的抗原结合区：(i)SEQ ID NO:165；(ii)SEQ ID NO:166；(iii)SEQ ID NO:167；(iv)SEQ ID NO:173；(v)SEQ ID NO:174；和(vi)SEQ ID NO:175。
在一个实施例中，抗体或其功能片段可以包含至少一个由包含选自由以下组成的群组的核苷酸序列的核酸编码的抗原结合区：(i)SEQ ID NO:181；(ii)SEQ ID NO:182；(iii)SEQ ID NO:183；(iv)SEQ ID NO:189；(v)SEQ ID NO:190；和(vi)SEQ ID NO:191。
在一个实施例中，抗体或其功能片段可以包含至少一个由包含选自由以下组成的群组的核苷酸序列的核酸编码的抗原结合区：(i)SEQ ID NO:197；(ii)SEQ ID NO:198；(iii)SEQ ID NO:199；(iv)SEQ ID NO:205；(v)SEQ ID NO:206；和(vi)SEQ ID NO:207。
在一个实施例中，抗体或其功能片段可以包含至少一个由包含选自由以下组成的群组的核苷酸序列的核酸编码的抗原结合区：(i)SEQ ID NO:213；(ii)SEQ ID NO:214；(iii)SEQ ID NO:215；(iv)SEQ ID NO:221；(v)SEQ ID NO:222；和(vi)SEQ ID NO:223。
应了解抗原结合区可以包含抗体或其功能片段的互补决定区(CDR)，并且突变可以存在于抗体或其功能片段的CDR之间的构架区中。重组免疫球蛋白可以包含任何或所有本文所述的抗原结合区。重组免疫球蛋白可以包含抗原结合，优选引发免疫反应的抗原结合位点。优选地，至少一个抗原结合区形成抗原结合位点的至少一部分。抗体或其功能片段可以包含至少两个、适当地至少三个、更适当地至少四个在第一方面中定义的抗原结合区。抗体或功能片段可以包含至少五个、更优选地至少六个抗原结合区。因此，抗体或其片段可以包含至少一个、二个、三个、四个、五个或六个在本文所述的抗体的任何实施例中的(i)到(vi)中定义的氨基酸序列。优选地，抗体或其片段包含任何实施例中的(i)到(vi)全部。
在抗体或其功能片段的一个实施例中，轻链可变区的多肽序列可以包含基本上如SEQ ID NO:4、20、36、52、68、84、100、116、132、148、164、180、196或212中阐述的氨基酸序列或者其功能变异体或片段。
抗体或其功能片段的重链可变区的多肽序列可以包含基本上如SEQ ID NO:12、28、44、60、76、92、108、124、140、156、172、188、204或220中阐述的氨基酸序列或者其功能变异体或片段。
抗体或其功能片段可以包含轻链可变区(VL)和/或重链可变区(VH)，所述轻链可变区包含基本上如SEQ ID NO:4、20、36、52、68、84、100、116、132、148、164、180、196或212中阐述的氨基酸序列或者其功能片段或变异体，所述重链可变区包含基本上如SEQ ID NO:12、28、44、60、76、92、108、124、140、156、172、188、204或220中阐述的氨基酸序列或者其功能片段或变异体。
在抗体或其功能片段的一个实施例中，轻链可变区的DNA序列可以包含基本上如SEQ ID NO:3、19、35、51、67、83、99、115、131、147、163、179、195或211中阐述的核苷酸序列或者其功能变异体或片段。在抗体或其功能片段的一个实施例中，重链可变区的DNA序列可以包含基本上如SEQ ID NO:11、27、43、59、75、91、107、123、139、155、171、187、203或219中阐述的核苷酸序列或者其功能变异体或片段。
抗体或其功能片段可以包含轻链可变区(VL)和/或重链可变区(VH)，所述轻链可变区由包含基本上如SEQ ID NO:3、19、35、51、67、83、99、115、131、147、163、179、195或211中阐述的核苷酸序列或者其功能片段或变异体的多核苷酸编码，所述重链可变区由包含基本上如SEQ ID NO:11、27、43、59、75、91、107、123、139、155、171、187、203或219中阐述的核苷酸序列或者其功能片段或变异体的多核苷酸编码。
本发明抗体的一个实施例的轻链恒定区的多肽序列可以包含基本上如SEQ IDNO:227中阐述的氨基酸序列或者其功能片段或变异体。本发明抗体的一个实施例的重链恒定区的多肽序列可以包含基本上如SEQ ID NO:228中阐述的氨基酸序列或者其功能片段或变异体。
编码本发明抗体的一个实施例的轻链恒定区的DNA序列可以包含基本上如SEQ IDNO:229中阐述的核苷酸序列或者其功能片段或变异体。编码本发明抗体的一个实施例的重链恒定区的DNA序列可以包含基本上如SEQ ID NO:230中阐述的核苷酸序列或者其功能片段或变异体。
根据第三方面，提供一种能够结合于受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)蛋白的分离肽，所述肽包含选自由以下组成的群组的氨基酸序列：
(i)SEQ ID NO:8、9、10、16、17和/或18；
(ii)SEQ ID NO:24、25、26、32、33和/或34；
(iii)SEQ ID NO:40、41、42、48、49和/或50；
(iv)SEQ ID NO:56、57、58、64、65和/或66；
(v)SEQ ID NO:72、73、74、80、81和/或82；
(vi)SEQ ID NO:88、89、90、96、97和/或98；
(vii)SEQ ID NO:104、105、106、112、113和/或114；
(viii)SEQ ID NO:120、121、122、128、129和/或130；
(ix)SEQ ID NO:136、137、138、144、145和/或146；
(x)SEQ ID NO:152、153、154、160、161和/或162；
(xi)SEQ ID NO:168、169、170、176、177和/或178；
(xii)SEQ ID NO:184、185、186、192、193和/或194；
(xiii)SEQ ID NO:200、201、202、208、209和/或210；和/或
(xiv)SEQ ID NO:216、217、218、224、225和/或226。
第三方面的肽优选能够结合于ROR1蛋白的胞外结构域。因此，第三方面的分离肽可以是抗受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)抗体或其功能片段。抗体可以是或可以不是人类。举例来说，抗体或其片段可以是鼠类。其也可以是重组的。应了解在第三方面的(i)到(xiv)中的每一个中定义的氨基酸序列是第一方面的抗体或其功能片段的CDR。因此，分离肽可以包含至少两个、三个、四个、五个或六个在(i)到(xiv)任一个中定义的氨基酸序列。优选地，肽包含(i)到(xiv)任一个中定义的所有氨基酸序列。
肽可以包含基本上如SEQ ID NO:4、20、36、52、68、84、100、116、132、148、164、180、196或212中阐述的氨基酸序列或者其功能变异体或片段。肽可以包含基本上如SEQ ID NO:12、28、44、60、76、92、108、124、140、156、172、188、204或220中阐述的氨基酸序列或者其功能变异体或片段。肽可以包含基本上如SEQ ID NO:227或228中阐述的氨基酸序列或者其功能片段或变异体。
根据第四方面，提供一种编码能够结合于受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)蛋白的肽的分离核酸，所述核酸包含选自由以下组成的群组的核苷酸序列：
(i)SEQ ID NO:5、6、7、13、14和/或15；
(ii)SEQ ID NO:21、22、23、29、30和/或31；
(iii)SEQ ID NO:37、38、39、45、46和/或47；
(iv)SEQ ID NO:53、54、55、61、62和/或63；
(v)SEQ ID NO:69、70、71、77、78和/或79；
(vi)SEQ ID NO:85、86、87、93、94和/或95；
(vii)SEQ ID NO:101、102、103、109、110和/或111；
(viii)SEQ ID NO:117、118、119、125、126和/或127；
(ix)SEQ ID NO:133、134、135、141、142和/或143；
(x)SEQ ID NO:149、150、151、157、158和/或159；
(xi)SEQ ID NO:165、166、167、173、174和/或175；
(xii)SEQ ID NO:181、182、183、189、190和/或191；
(xiii)SEQ ID NO:197、198、199、205、206和/或207；和/或
(xiv)SEQ ID NO:213、214、215、221、222和/或223。
优选地，核酸可以编码抗受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)抗体或其功能片段。抗体可以是或可以不是人类。举例来说，抗体可以是鼠类。其也可以是重组的。应了解第四方面的(i)到(xiv)中的每一个中定义的核苷酸序列编码第一方面的抗体或其功能片段的CDR。因此，核酸可以包含至少两个、三个、四个、五个或六个在(i)到(xiv)任一个中定义的核苷酸序列。优选地，核酸包含(i)到(vi)任一个定义的所有核苷酸序列。优选地，核酸包含基本上编码人类抗体的至少一个抗原结合区的氨基酸序列的核苷酸序列或其功能片段。
核酸可以包含基本上如SEQ ID NO:3、19、35、51、67、83、99、115、131、147、163、179、195或211中阐述的核苷酸序列或者其功能变异体或片段。核酸可以包含基本上如SEQID NO:11、27、43、59、75、91、107、123、139、155、171、187、203或219中阐述的核苷酸序列或者其功能变异体或片段。核酸可以包含基本上如SEQ ID NO:229或230中阐述的核苷酸序列或者其功能片段或变异体。
有利的是，抗体或其功能片段自身用作治疗剂，并且显著改善使用包含非人类区域(例如鼠类)，例如Fc片段或构架区或至少一个鼠类抗原结合区或互补决定区(CDR)的抗体的疗法。然而，另外，已经评估最大化药物功效的技术，包括增强抗体或其功能片段的ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)和/或CDC(补体依赖性细胞毒性)活性的糖基化工程；与例如放射线、细胞毒性药物或毒素等细胞毒性部分的结合；以及产生具有靶向肿瘤细胞的一个臂和吸引细胞毒性T细胞的另一个臂的双特异性抗体。
因此，在第五方面中，提供一种抗体-药物结合物(ADC)，其包含第一方面的抗体或其功能片段和细胞毒性部分。
抗体药物结合物(ADC)可以用于将有效细胞毒性药物经由抗体选择性地递送到标靶细胞。当应用到肿瘤抗原标靶时，此类方法可以增强抗体的抗肿瘤活性并提高化学疗法的肿瘤-正常组织的选择性。ADC研发的一个关键参数是抗体一旦结合于标靶抗原就可以被内吞，并因此递送结合的药物到标靶癌细胞中。图26展示本发明的抗体有效地内吞。
细胞毒性部分可以是毒素，例如单甲基奥瑞他汀E(monomethyl auristatin E，MMAE)、单甲基奥瑞他汀F(monomethyl auristatin F，MMAF)或美登素。药物部分可以是发射α粒子的放射性核苷酸，例如225Ac标记。这些毒素可以经由可裂解连接子，例如二硫键、腙连接子或肽连接子，或者经由不可裂解连接子，例如硫醚键，使用SMCC(N-丁二酰亚胺基-4-(N-顺丁烯二酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧酸酯)连接子连接到抗体或其功能片段(即，其抗原结合片段)。
根据第六方面，提供分别任选地衍生的如第一方面中定义的抗体或其功能片段、如第三方面中定义的肽、如第四方面中定义的核酸或如第五方面中定义的抗体-药物结合物，其用于疗法或诊断中。
如第一方面中定义的抗体或其功能片段、如第三方面中定义的肽、如第四方面中定义的核酸或如第五方面中定义的抗体-药物结合物可以用作药物，优选适用于治疗、改善或预防癌症。
因此，根据第七方面，提供分别任选地衍生的如第一方面中定义的抗体或其功能片段、如第三方面中定义的肽、如第四方面中定义的核酸或如第五方面中定义的抗体-药物结合物，用于治疗、预防或改善癌症。
术语“衍生”可以意指抗体或其功能片段、肽、核酸或结合物可以在使用前进行修饰，优选产生其衍生物或变异体。衍生的实例可以包括聚乙二醇化抗体或聚乙二醇化抗体片段或者抗体-细胞因子融合蛋白。然而，在一些实施例中，抗体或其功能片段、肽、核酸或结合物可能不衍生。
ROR1在各种人类癌症类型中表达，并且因此抗体或其功能片段、肽、核酸或结合物可以用于治疗、预防、改善或诊断ROR1阳性癌症类型。
可以用抗ROR1抗体治疗的非限制性示例性癌症包括癌瘤、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。此类癌症的更特定非限制性实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、垂体癌、食道癌、星形细胞瘤、软组织肉瘤、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰脏癌、神经胶母细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝瘤、乳癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、肾脏癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌瘤、脑癌、神经母细胞瘤、子宫内膜癌、睾丸癌、胆管癌、胆囊癌、胃癌、黑色素瘤和不同类型头颈癌。在一些实施例中，肺癌是非小细胞肺癌或肺鳞状细胞癌。在一些实施例中，白血病是急性骨髓白血病、B细胞急性成淋巴细胞性白血病(B-ALL)；或慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。在一些实施例中，淋巴瘤是套细胞淋巴瘤(MCL)或边缘区淋巴瘤(MZL)。在一些实施例中，乳癌是侵袭性乳癌。在一些实施例中，卵巢癌是卵巢浆液性囊腺癌。在一些实施例中，肾癌是肾透明细胞癌。在一些实施例中，结肠癌是结肠腺癌。在一些实施例中，膀胱癌是膀胱尿道上皮癌。在任一上述癌症中，癌症可以是ROR1阳性癌症。
根据第八方面，提供一种治疗、预防或改善受试者癌症的方法，所述方法包含向需要此类治疗的患者给予治疗有效量的分别任选地衍生的如第一方面中定义的抗体或其功能片段、如第三方面中定义的肽、如第四方面中定义的核酸或如第五方面中定义的抗体-药物结合物。
应了解根据本发明的抗体、片段、肽、核酸和结合物(本文中统称为“药剂”)可以用于单一疗法(例如仅仅使用抗体或其片段，或仅仅使用抗体-药物结合物)中，用于治疗、改善或预防癌症。可替代地，根据本发明的药剂可以用作已知的治疗、改善或预防癌症的疗法的佐剂或与其组合。此类疗法包括(但不限于)化学疗法、抗血管生成剂、生长抑制剂、免疫疗法、放射线疗法等。
可以与本文所述的抗ROR1抗体组合的非限制性示例性化学治疗剂包括(但不限于)烷基化剂，例如噻替派(thiotepa)和
Figure GDA0003195537570000201
环磷酰胺(cyclosphosphamide)；烷基磺酸盐，例如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶，例如苯唑多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、米特多巴(meturedopa)和尤利多巴(uredopa)；乙烯亚胺和甲基三聚氰胺，包括六甲蜜胺(altretamine)、三伸乙基三聚氰胺(triethylenemelamine)、三亚乙基磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三亚乙基硫代磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide)和三羟甲基三聚氰胺(trimethylolomelamine)；乙酰精宁(acetogenin)(尤其布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜树碱(包括合成类似物拓朴替康(topotecan))；苔藓虫素(bryostatin)；卡利他汀(callystatin)；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；念珠藻环肽(尤其念珠藻环肽1和念珠藻环肽8)；海兔毒素(dolastatin)；倍癌霉素(duocarmycin)(包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；水鬼蕉碱(pancratistatin)；沙考地汀(sarcodictyin)；海绵毒素(spongistatin)；氮芥，例如苯丁酸氮芥、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、甲氮芥(mechlorethamine)、甲氮芥氧化物盐酸盐(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新恩比兴(novembichin)、芬司特瑞(phenesterine)、泼尼氮芥(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝基脲，例如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，例如烯二炔抗生素(例如卡奇霉素(calicheamicin)，尤其卡奇霉素γ1I和卡奇霉素ωI1(参见例如《应用化学国际版英文版(Agnew,Chem Intl.Ed.Engl.)》,33:183-186(1994))；达米辛(dynemicin)，包括达米辛A；双膦酸盐，例如氯屈膦酸盐(clodronate)；埃斯培拉霉素(esperamicin)；以及新抑癌蛋白生色团和相关色蛋白烯二炔抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomysins)、放射菌素(actinomycin)、氨茴霉素(authramycin)、氮杂丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycins)、放线菌素C(cactinomycin)、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycinis)、放线菌素D(dactinomycin)、道诺霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-侧氧基-L-正亮氨酸、
Figure GDA0003195537570000211
小红莓(doxorubicin)(包括吗啉基-小红莓、氰基吗啉基-小红莓、2-吡咯啉基-小红莓和脱氧小红莓)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、艾达霉素(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycin)(例如丝裂霉素C(mitomycin C))、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycins)、培洛霉素(peplomycin)、泼非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、奎那霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑霉素(streptonigrin)、链脲霉素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、左柔比星(zorubicin)；抗代谢物，例如甲氨蝶呤(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)；叶酸类似物，例如迪诺特宁(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，例如氟达拉宾、6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine)、噻咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，例如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双去氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素，例如二甲睾酮(calusterone)、屈他雄酮酮丙酸盐(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺素，例如胺鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，例如亚叶酸；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；倍思塔布(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；艾达曲克(edatraxate)；得弗伐胺(defofamine)；秋水仙碱(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依氟鸟氨酸(elfornithine)；依利铵乙酸盐(elliptinium acetate)；埃坡霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖(lentinan)；罗尼达宁(lonidainine)；类美登素，例如美登素和安丝菌素(ansamitocins)；丙脒腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidanmol)；硝拉维林(nitraerine)；喷司他汀(pentostatin)；凡那明(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；
Figure GDA0003195537570000221
多糖复合物(俄勒冈州尤金的JHS天然产品公司(JHS NaturalProducts,Eugene,OR))；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西佐糖(sizofiran)；螺旋锗；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2"-三氯三乙胺；单端孢霉烯(尤其T-2毒素、粘液霉素A(verracurin A)、杆孢菌素A(roridin A)和蛇形菌素(anguidine))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；甲托辛(gacytosine)；阿拉伯糖苷(arabinoside)(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替派；类紫杉醇，例如
Figure GDA0003195537570000222
太平洋紫杉醇(paclitaxel)(新泽西州普林斯顿的布里斯托尔-迈尔斯·斯奎布肿瘤学公司(Bristol-Myers Squibb Oncology,rinceton,N.J.))、
Figure GDA0003195537570000223
太平洋紫杉醇的无Cremophor的白蛋白工程化纳米粒子配制物(伊利诺伊州绍姆堡的美国药物搭配物公司(American Pharmaceutical Partners,Schaumberg,Illinois))和
Figure GDA0003195537570000224
多西他赛(doxetaxel)(法国安东尼的罗纳-普朗克制药公司(Rhone-Poulenc Rorer,Antony,France))；苯丁酸氮芥；
Figure GDA0003195537570000225
吉西他滨(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤(6-thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤；铂类似物，例如顺铂(cisplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)和卡铂(carboplatin)；长春碱(vinblastine)；铂；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱(vincristine)；
Figure GDA0003195537570000226
长春瑞宾(vinorelbine)；诺凡特龙(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基喋呤(aminopterin)；希罗达(xeloda)；伊班膦酸盐(ibandronate)；伊立替康(irinotecan)(坎普土沙(Camptosar)，CPT-11)(包括伊立替康与5-FU和甲酰四氢叶酸的治疗方案)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(difluorometlhylornithine，DMFO)；类视黄素，例如视黄酸；卡培他滨(capecitabine)；考布他汀(combretastatin)；甲酰四氢叶酸(leucovorin，LV)；奥沙利铂，包括奥沙利铂治疗方案(FOLFOX)；减少细胞增殖的PKC-α、Raf、H-Ras、EGFR(例如埃罗替尼(erlotinib)
Figure GDA0003195537570000227
)和VEGF-A的抑制剂，以及任一以上各物的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
其它非限制性示例性化学治疗剂包括用于调节或抑制激素对癌症的作用的抗激素剂，例如抗雌激素和选择性雌激素受体调节剂(selective estrogen receptormodulator，SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括
Figure GDA0003195537570000228
他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、雷洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和
Figure GDA0003195537570000229
托瑞米芬(toremifene)；抑制调节肾上腺中的雌激素产生的酶芳香酶的芳香酶抑制剂，例如4(5)-咪唑、胺鲁米特(aminoglutethimide)、
Figure GDA0003195537570000231
甲地孕酮乙酸盐、
Figure GDA0003195537570000232
依西美坦(exemestane)、福美司坦(formestanie)、法屈唑(fadrozole)、
Figure GDA0003195537570000233
伏罗唑(vorozole)、
Figure GDA0003195537570000234
来曲唑(letrozole)和
Figure GDA0003195537570000235
阿那曲唑(anastrozole)；以及抗雄激素，例如氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、亮丙立德(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；以及曲沙他滨(troxacitabine)(1,3-二氧杂环戊烷核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，尤其抑制例如PKC-α、Ralf和H-Ras等基因在异常细胞增殖中所涉及的信号传导通路中的表达的反义寡核苷酸；核酶，例如VEGF表达抑制剂(例如
Figure GDA0003195537570000236
核糖核酸酶)和HER2表达抑制剂；疫苗，例如基因疗法疫苗，例如
Figure GDA0003195537570000237
疫苗、
Figure GDA0003195537570000238
疫苗和
Figure GDA0003195537570000239
疫苗；
Figure GDA00031955375700002310
rIL-2；
Figure GDA00031955375700002311
拓扑异构酶1抑制剂；
Figure GDA00031955375700002312
rmRH；以及任一以上各物的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
非限制性示例性抗血管生成剂包括血管生成剂的抗体或其它拮抗剂，例如VEGF-A的抗体(例如贝伐单抗(bevacizumab)(阿瓦斯汀(Avastin))或VEGF-A受体(例如KDR受体或Flt-1受体)的抗体、抗PDGFR抑制剂(例如
Figure GDA00031955375700002313
(伊马替尼甲磺酸盐(ImatinibMesylate)))、阻断VEGF受体信号传导的小分子(例如PTK787/ZK2284、SU6668、
Figure GDA00031955375700002314
/SU11248(舒尼替尼苹果酸盐(sunitinib malate))、AMG706或例如国际专利申请WO 2004/113304中描述的小分子)。抗血管生成剂还包括天然血管生成抑制剂，例如血管生长抑素、内皮生长抑素等。参见例如克拉布朗(Klagsbrun)和德安摩尔(D'Amore)(1991)《生理学年评(Annu.Rev.Physiol.)》53:217-39；斯特赖特(Streit)和德特马(Detmar)(2003)《致癌基因(Oncogene)》22:3172-3179(例如表3列出恶性黑色素瘤中的抗血管生成疗法)；费拉拉(Ferrara)和阿利塔罗(Alitalo)(1999)《自然·医学(Nature Medicine)》5(12):1359-1364；托尼(Tonini)等人(2003)《致癌基因》22:6549-6556(例如表2列出已知的抗血管生成因子)；以及佐藤(Sato)(2003)《国际临床肿瘤学杂志(Int.J.Clin.Oncol.)》8:200-206(例如表1列出临床试验中使用的抗血管生成剂)。
生长抑制剂的实例包括(但不限于)阻断细胞周期进程(处于除S期外的阶段)的药剂，例如诱发G1阻滞和M期阻滞的药剂。经典的M期阻断剂包括长春类(长春新碱和长春碱)、紫杉烷和拓扑异构酶II抑制剂，例如小红莓、表柔比星、道诺霉素、依托泊苷和博莱霉素。阻滞G1的那些药剂还溢出到S期阻滞，例如DNA烷基化剂，例如他莫昔芬、泼尼松(prednisone)、达卡巴嗪、甲氮芥(mechlorethamine)、顺铂、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶和ara-C。其它信息可以见于以下中：蒙德尔森(Mendelsohn)和伊莎列(Israel)编,《癌症的分子基础(The Molecular Basis of Cancer)》,第1章,标题是《细胞周期调节、致癌基因和抗赘生性药物》,穆拉卡米(Murakami)等人(费城的W.B.桑德斯(W.B.Saunders,Philadelphia),1995，)例如第13页。紫杉烷(太平洋紫杉醇和多烯紫杉醇)是两种来源于紫杉树的抗癌药物。来源于欧洲紫杉的多烯紫杉醇(
Figure GDA0003195537570000241
罗纳-普朗克制药公司)是太平洋紫杉醇(
Figure GDA0003195537570000242
布里斯托尔-迈尔斯·斯奎布公司)的半合成类似物。太平洋紫杉醇和多烯紫杉醇促进微管从微管蛋白二聚体装配并且通过预防解聚来稳定化微管，从而抑制细胞中的有丝分裂。
可以与本文所述的抗ROR1抗体组合的示例性治疗剂包括化学治疗剂、生长抑制剂、细胞毒性剂、用于放射线疗法中的药剂、抗血管生成剂、癌症免疫治疗剂、细胞凋亡剂、抗微管蛋白剂和治疗癌症的其它药剂，例如抗HER-2抗体、抗CD20抗体、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)拮抗剂(例如酪氨酸激酶抑制剂)、HER1/EGFR抑制剂(例如埃罗替尼(erlotinib)
Figure GDA0003195537570000243
血小板衍生生长因子抑制剂(例如
Figure GDA0003195537570000244
(伊马替尼甲磺酸盐))、COX-2抑制剂(例如塞内昔布(celecoxib))、干扰素、CTLA4抑制剂(例如抗CTLA抗体伊派利单抗(ipilimumab)
Figure GDA0003195537570000245
)、PD-1抑制剂(例如抗PD1抗体、BMS-936558)、PDL1抑制剂(例如抗PDL1抗体、MPDL3280A)、PDL2抑制剂(例如抗PDL2抗体)、TIM3抑制剂(例如抗TIM3抗体)、细胞因子、结合于以下标靶中的一或多个的拮抗剂(例如中和抗体)：ErbB2、ErbB3、ErbB4、PDGFR-β、BlyS、APRIL、BCMA、PD-1、PDL1、PDL2、CTLA4、TIM3或VEGF受体、TRAIL/Apo2，和其它生物活性和有机化学药剂等。其组合也包括于本发明中。
根据本发明的药剂可以组合在具有许多不同形式的组合物中，取决于尤其使用组合物的方式。因此，举例来说，组合物可以呈粉末、片剂、胶囊、液体、软膏、乳膏、凝胶、水凝胶、气溶胶、喷雾、胶束溶液、经皮贴片、脂质体悬浮液或可以给予需要治疗的个人或动物的任何其它合适的形式。应了解根据本发明的药物的媒剂应该是其给予的受试者良好耐受，并且优选地能够跨越血脑屏障递送药剂的媒剂。
包含本发明的药剂的药物可以依照多种方式使用。举例来说，可能需要经口给予，在此情况下，药剂可以含于可以例如呈片剂、胶囊或液体形式经口摄取的组合物内。包含本发明的药剂和药物的组合物可以通过吸入(例如鼻内)来给予。组合物也可以被配制成用于局部使用。举例来说，乳膏或软膏可以涂覆到皮肤。根据本发明的药剂和药物也可以并入缓慢或延迟释放装置内。此类装置可以例如插入皮肤上或皮肤下，并且药物可以历经数周或甚至数月释放。装置可以位于至少与治疗部位相邻处。当需要长期用根据本发明使用的药剂治疗并且通常需要频繁给予(例如至少每天注射)时，此类装置可能特别有利。
在一个优选实施例中，根据本发明的药剂和药物可以通过注射到血流中或直接注射到需要治疗的部位来给予受试者。注射可以是静脉内(推注或输注)或皮下(推注或输注)或皮内(推注或输注)。应了解所需要的抗体、片段、肽和核酸(即，药剂)的量由其生物活性和生物可用性决定，其生物活性和生物可用性又取决于给予模式、药剂的物理化学特性以及其呈单一疗法还是组合疗法使用。给予频率还受药剂在所治疗的受试者内的半衰期影响。待给予的最佳剂量可以由本领域的技术人员确定，并将随使用的具体药剂、药物组合物的强度、给予模式和细菌感染的进展而变化。取决于所治疗的具体受试者的其它因素将产生调整剂量的需要，包括受试者年龄、体重、性别、膳食和给予时间。
一般来说，每公斤体重0.001μg与每公斤体重10mg之间的日剂量的根据本发明的药剂可以用于治疗、改善或预防癌症，取决于何种药剂。更优选地，药剂的日剂量在每公斤体重0.01μg与每公斤体重1mg之间，更优选每公斤体重0.1μg与每公斤体重100μg之间，并且最优选每公斤体重约0.1μg与每公斤体重10μg之间。
药剂可以在癌症发作之前、期间或之后给予。日剂量可以作为单次给予(例如单次每天注射)给予。可替代地，药剂可能需要一天内给予两次或更多次。作为一个实例，药剂可以给予两个(或更多个，取决于所治疗的癌症感染的严重程度)0.07g与700mg之间的日剂量(即，假设体重70kg)。接受治疗的患者在醒时可能采用第一剂量，并接着在晚上(如果采用两剂量方案)或此后3或4小时时间间隔采用第二剂量。可替代地，缓慢释放装置可以用于向患者提供根据本发明的药剂的最佳剂量，无需给予重复剂量。已知的程序，例如制药行业(例如体内实验、临床试验等)通常采用的程序，可以用于形成根据本发明的药剂的特定配制物和精确的治疗方案(例如药剂的日剂量和给予频率)。
在本发明的第九方面，提供一种药物组合物，其包含分别任选地衍生的如第一方面中定义的抗体或其功能片段、如第三方面中定义的肽、如第四方面中定义的核酸或如第五方面中定义的抗体-药物结合物；以及任选药学上可接受的媒剂。
组合物可以是抗癌组合物。
抗体或其功能片段、肽或核酸可以不衍生。
在第十方面，本发明还提供一种制备根据第九方面的组合物的方法，所述方法包含将治疗有效量的分别任选地衍生的如第一方面中定义的抗体或其功能片段、如第三方面中定义的肽、如第四方面中定义的核酸或如第五方面中定义的抗体-药物结合物与药学上可接受的媒剂组合。
抗体或其片段可以如关于第一方面所定义。
在一些实施例中，抗体或其片段的治疗有效量可以是约0.001ng到约1mg，并且优选地是约0.01ng到约100ng。优选地，抗体或片段的量是约0.1ng到约10ng并且最优选约0.5ng到约5ng的量。
在一个实施例中，药学上可接受的媒剂可以是固体，并且组合物可以呈粉剂或片剂形式。固体药学上可接受的媒剂可以包括一或多种物质，这些物质还可以充当调味剂、润滑剂、增溶剂、悬浮剂、染料、填充剂、滑动剂、压缩助剂、惰性粘合剂、甜味剂、防腐剂、染料、包衣或片剂崩解剂。媒剂也可以是囊封物质。在粉剂中，媒剂是与根据本发明的细粉状活性剂混合的细粉状固体。呈片剂时，活性剂可以与具有所需压缩特性的媒剂以合适的比例混合并且压成所希望的形状和大小。粉剂和片剂优选含有多达99％活性剂。合适的固体媒剂包括例如磷酸钙、硬脂酸镁、滑石、糖、乳糖、糊精、淀粉、明胶、纤维素、聚乙烯吡咯烷、低熔点蜡和离子交换树脂。在另一实施例中，药物媒剂可以是凝胶并且组合物可以呈乳膏等形式。
然而，药物媒剂可以是液体，并且药物组合物呈溶液形式。液体媒剂用于制备溶液、悬浮液、乳液、糖浆、酏剂和加压组合物。根据本发明的活性剂可以溶解或悬浮于例如水、有机溶剂、两者的混合物或药学上可接受的油或油脂等药学上可接受的液体媒剂中。液体媒剂可以含有其它合适的药物添加剂，例如增溶剂、乳化剂、缓冲剂、防腐剂、甜味剂、调味剂、悬浮剂、增稠剂、着色剂、粘度调节剂、稳定剂或渗透压调节剂。用于经口和肠胃外给予的液体媒剂的合适实例包括水(部分含有如上所述的添加剂，例如纤维素衍生物，优选羧甲基纤维素钠溶液)、醇(包括一元醇和多元醇，例如乙二醇)和其衍生物，以及油(例如分馏椰子油和花生油)。对于肠胃外给予，媒剂还可以是油性酯，例如油酸乙酯和十四烷酸异丙酯。无菌液体媒剂可用于供肠胃外给予的无菌液体形式组合物。用于加压组合物的液体媒剂可以是卤代烃或其它药学上可接受的推进剂。
呈无菌溶液或悬浮液的液体药物组合物可以用于例如肌肉内、鞘内、硬膜外、腹膜内、静脉内和尤其皮下注射。药剂可以制备成无菌固体组合物，其可以在给予时使用无菌水、盐水或其它适当无菌可注射介质溶解或悬浮。
本发明的药剂和组合物可以呈含有其它溶质或悬浮剂(例如足够使溶液等张的盐水或葡萄糖)、胆汁盐、阿拉伯胶、明胶、脱水山梨糖醇单油酸酯、聚山梨醇酯80(山梨糖醇的油酸酯和其与环氧乙烷共聚的酸酐)等的无菌溶液或悬浮液形式经口给予。根据本发明使用的药剂还可以呈液体或固体组合物形式经口给予。适合于经口给予的组合物包括固体形式，例如丸剂、胶囊、颗粒、片剂和粉剂，以及液体形式，例如溶液、糖浆、酏剂和悬浮液。可用于肠胃外给予的形式包括无菌溶液、乳液和悬浮液。
本发明还提供一种用于诊断患有癌症的患者的试剂盒。因此，根据本发明的第十一方面，提供一种用于诊断患有或易患癌症的受试者或用于提供受试者的病状的预后的试剂盒，所述试剂盒包含用于检测来自测试受试者的样品中存在的抗原浓度的检测装置，其中所述检测装置包含分别任选地衍生的如由第一方面定义的抗体或其功能片段、如由第三方面定义的肽或如由第四方面定义的核酸，其中所述样品中抗原的存在表明所述受试者患有癌症。
根据第十二方面，提供一种用于诊断患有癌症或易患癌症的受试者或用于提供受试者的病状的预后的方法，所述方法包含检测从受试者获得的样品中存在的抗原浓度，其中所述检测使用分别任选地衍生的如由第一方面定义的抗体或其功能片段、如由第三方面定义的肽或如由第四方面定义的核酸，并且其中所述样品中抗原的存在表明所述受试者患有癌症。
在一些实施例中，选择患者用于用本文所述的抗ROR1抗体治疗的方法包含确定所述受试者是否患有表达ROR1的癌症。此类方法可以包含例如使用本文所述的抗ROR1抗体检测来自患者的癌细胞上ROR1的存在。
优选地，抗原包含ROR1蛋白，更优选其胞外结构域。样品可以包含血液、尿、组织等。
优选地，试剂盒或方法用于鉴别样品中ROR1阳性细胞的存在或不存在，或测定其在样品中的浓度。术语“ROR1阳性细胞”可以意指在表面上表达ROR1的细胞。检测装置可以包含适用于检测样品中ROR1阳性细胞存在和/或不存在的分析。试剂盒或方法可以包含使用分析可以进行比较的阳性对照和/或阴性对照。举例来说，试剂盒可以包含来自患有(即，阳性对照)或未患(即，阴性对照)癌症的个体的样品中ROR1阳性细胞的浓度的参考。试剂盒可以进一步包含可以检测到的标记。术语“标记”可以意指可以附接于抗体、片段、肽或核酸的部分。部分可以例如用于治疗或诊断程序。治疗标记包括例如可以附接于本发明的抗体或其片段和用于监测抗体与ROR1蛋白的结合的部分。诊断标记包括例如可以通过分析方法检测的部分。分析方法包括例如定性和定量程序。定性分析方法包括例如免疫组织化学和间接免疫荧光。定量分析方法包括例如免疫亲和力程序，例如放射免疫分析、ELISA或FACS分析。分析方法还包括体外与体内成像程序。可以通过分析方式检测的诊断标记的特定实例包括酶、放射性同位素、荧光染料、化学发光标记物和生物素。标记可以直接附接于本发明的抗体、其片段、肽或核酸，或附接于特异性结合本发明的分子的二级结合剂。此类二级结合剂可以是例如二级抗体。二级抗体可以是多克隆或单克隆抗体，并且是人类、啮齿动物或嵌合来源。
如实例3中所述，本发明人已经证明如何制备本发明的重组全长IgG1人类单克隆抗体。举例来说，抗体或其功能片段可以通过噬菌体表达系统产生。优选地，噬菌体表达系统包含噬菌体展示库。
适用于分离编码抗体或其功能片段的多核苷酸的程序从分离cDNA开始，所述cDNA可以从RNA逆转录，RNA从患有例如CLL等癌症的个体中分离。此疾病病况的特征在于存在对ROR1具有免疫特异性的抗体。用于合成cDNA的方法是本领域众所周知的。编码包括重链或轻链的抗体或其功能片段的cDNA可以使用例如聚合酶链式反应(polymerase chainreaction，PCR)、优选逆转录PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)扩增。
用于PCR的合适引物可以由本领域的技术人员，使用侧接重链或轻链的特定功能片段的保守序列确定。合适PCR条件可以由本领域的技术人员确定。
优选地，PCR适于扩增重链，更优选VH CH1片段，并且甚至更优选重链可变片段(VH)。可替代地或另外，PCR可以适用于扩增轻链，更优选VL CL片段，并且甚至更优选轻链可变片段(VL)。优选地，PCR产物克隆到合适表达载体，更优选噬菌体表达载体中，其一实施例展示在图14a和14b中。优选地，载体引入到合适宿主，例如中国仓鼠卵巢(Chinesehamster ovary，CHO)细胞中，以表达重链片段并且优选表达轻链片段。合适载体和宿主细胞系统可以允许例如重链和轻链的功能片段的共表达和装配。优选地，载体通过电穿孔引入到宿主。其它适用于表达抗体片段的系统可以由本领域的技术人员确定并且包括例如M13噬菌体表达载体。重组单克隆抗体或其功能片段可以基本上使用所属领域中已知并且取决于使用的具体载体和宿主表达系统的方法纯化。
在第十三方面，提供一种基因构建体，其包含第四方面的核酸。本发明的基因构建体可以呈表达盒形式，所述表达盒可以适合于在宿主细胞中表达编码多肽。在不并入载体下，基因构建体可以引入宿主细胞中。举例来说，可以是核酸分子的基因构建体可以并入脂质体或病毒粒子内。可替代地，纯化核酸分子(例如无组蛋白的DNA或裸DNA)可以通过合适方式，例如直接内吞摄取而直接插入宿主细胞。基因构建体可以通过转染、感染、电穿孔、微注射、细胞融合、原生质体融合或弹道轰击直接引入宿主受试者的细胞(例如细菌细胞)中。可替代地，本发明的基因构建体可以使用粒子枪直接引入到宿主细胞中。可替代地，基因构建体可以容纳在重组载体内，以在合适宿主细胞中表达。
因此，在第十四方面，提供一种重组载体，其包含根据第十三方面的基因构建体。
重组载体可以是质粒、粘粒或噬菌体。此类重组载体可用于用第十三方面的基因构建体转化宿主细胞，以及用于在其中复制表达盒。熟练的技术人员将了解本发明的基因构建体可以与许多类型的骨架载体组合用于达成表达的目的。合适骨架载体的实例包括图14a和14b中展示的载体。重组载体可以包括多种其它功能元件，包括起始基因表达的合适启动子。举例来说，重组载体可以被设计成其在宿主细胞的细胞溶质中自主复制。在此情况下，重组载体中可能需要诱发或调节DNA复制的元件。可替代地，重组载体可以被设计成其整合到宿主细胞的基因组中。在此情况下，设想促进靶向整合(例如通过同源重组)的DNA序列。
重组载体还可以包含编码可以在克隆过程中用作可选标记物，即能够选择已经转染或转化的细胞以及能够选择含有并有异源DNA的载体的细胞的基因的DNA。可替代地，可选标记基因可以在不同载体中，以同时用于含有相关基因的载体。载体还可以包含与调节编码序列的表达有关或用于使表达的多肽靶向宿主细胞某一部分的DNA。
在第十五方面，提供一种宿主细胞，其包含根据第十三方面的基因构建体或根据第十四方面的重组载体。
宿主细胞可以是细菌细胞。宿主细胞可以是动物细胞，例如小鼠或大鼠细胞。优选地，宿主细胞不是人类细胞。宿主细胞可以用根据本发明的基因构建体或载体，使用已知技术转化。合适的用于将基因构建体引入到宿主细胞中的方式将取决于细胞类型。根据第十六方面，提供一种制备重组抗体或其功能片段的方法，所述方法包含(i)培养至少一种在第十五方面中定义的能够表达所需抗体或其功能片段的细胞；以及(ii)分离抗体或其功能片段。
如本文所述，根据本发明的抗体可以结合于ROR1。然而，本发明人认识到本发明的抗体或其功能片段可以用于充当研发对ROR家族的其它成员展示免疫特异性的抗体的构架。举例来说，通过将突变引入到本文所述的ROR1特异性抗体的CDR中，可以分离在一个实施例中可以识别ROR2或在另一实施例中识别ROR 1和ROR2两者的抗体。
因此，根据第十七方面，提供一种分离能够结合于受体酪氨酸激酶样孤儿受体2(ROR2)的抗体或其功能片段的方法，所述方法包含：
(i)使如第一方面中定义的抗体或其功能片段突变以产生突变体，以及
(ii)针对ROR2免疫特异性，选择所述突变体。
突变体可以对ROR2或ROR1与ROR2两者具有特异性。
在第一实施例中，所述突变步骤可以包含随机突变诱发，例如使用简并性PCR。举例来说，用于抗体的cDNA在PCR反应中用作模板，其可以掺杂有诱变剂，例如突变诱发三磷酸核苷，例如dP和8氧代-2'脱氧鸟苷。有利的是，这允许在整个cDNA中突变以高度控制方式引入，从而产生突变体库。所得突变体库可以展示在噬菌体的表面上，并且接着可以针对ROR2选择抗体。
可以针对ROR2，使用生物淘选来选择所得突变抗体库。举例来说，ELISA盘可以涂有ROR2，例如涂有100μl 1pg/m1-1 ROR2于碳酸氢盐缓冲液pH 8.6中的溶液，并在4℃下培育过夜。接着盘可以用例如TBS等缓冲液洗涤。接着盘可以例如用含5％BSA的PBS阻断并在37℃下培育一小时。两次进一步洗涤后，100μ1噬菌体悬浮液可以加入每一孔中并且盘可以在37℃下培育两小时。
可以去除噬菌体并且用TBS 0.05％吐温20(TBST)填充孔并用力吸取。5分钟后，可以去除TBST，并且对于第一轮淘选，盘可以通过此方法洗涤一次。在第二轮淘选中，可以使用5次洗涤，并且在第三轮和后续数轮中，可以使用10次洗涤。接着可以用每孔50pl洗脱缓冲液洗脱噬菌体并在室温下培育10分钟。用力吸取后，可以去除洗脱噬菌体并用3pl 2MTris碱中和。
在第二实施例中，所述突变可以包含将至少一种对ROR2具有免疫特异性的配体引入到第一方面的抗体的至少一个抗原结合区。至少一种配体可以包含ROR2特异性抗体的六个CDR中的至少一个，其可以包括：
轻链CDR1：RSSQSLVHSDGNTYLN(SEQ ID NO:231)；
轻链CDR2：KVSNRDS(SEQ ID NO:232)；
轻链CDR3：MQGTQWPIT(SEQ ID NO:233)；
重链CDR1：SYSMN(SEQ ID NO:234)；
重链CDR2：YISSSSSTIYYADSVKG(SEQ ID NO:235)；及
重链CDR3：DYGGNSGYYYYYYMDV(SEQ ID NO:236)。
至少一种抗原结合区可以在重链和/或轻链可变片段中。优选地，至少一种配体引入到免疫球蛋白或其功能片段的重链中的任一抗原结合区。
配体可以通过限制酶消化插入到由包括分子建模在内的多种技术确定的适当位点。编码配体肽序列的多核苷酸序列可以接合到切割限制位点中，此精确细节取决于配体的性质和所使用的CDR。
根据第十八方面，提供重组抗体或其功能片段的库或组，其使用第十七方面中定义的方法产生。
应了解本发明延伸到包含基本上本文中提及的任一序列的氨基酸或核酸序列，包括其功能变异体或功能片段的任何核酸或肽或其变异体、衍生物或类似物。术语“基本上氨基酸/核苷酸/肽序列”、“功能变异体”和“功能片段”可以是具有与本文中提及的任一序列的氨基酸/核苷酸/肽序列至少40％序列一致性，例如与鉴别为SEQ ID NO:2的序列(即，人类ROR1的一实施例的多肽序列)或鉴别为SEQ ID NO:1的核苷酸(即，编码人类ROR1的一实施例的DNA序列)等等40％一致性的序列。
还设想与任一提及序列的序列一致性超过50％、更优选超过65％、70％、75％并且更优选序列一致性超过80％的氨基酸/多核苷酸/多肽序列。优选地，氨基酸/多核苷酸/多肽序列与本文中提及的任一序列具有至少85％一致性，更优选与本文中提及的任一序列具有至少90％、92％、95％、97％、98％一致性并且最优选至少99％一致性。
熟练的技术人员将了解如何计算两个氨基酸/多核苷酸/多肽序列之间的一致性百分比。为了计算两个氨基酸/多核苷酸/多肽序列之间的一致性百分比，必须首先准备比对两个序列，接着计算序列一致性值。两个序列的一致性百分比可以采取不同值，取决于：(i)用于比对序列的方法，例如ClustalW、BLAST、FASTA、史密斯-沃特曼(Smith-Waterman)(以不同程序实施)，或来自3D比较的结构比对；以及(ii)比对方法所使用的参数，例如局部对比整体对准、使用的成对评分矩阵(例如blosum62、pam250、gonnet等)和间隙罚分，例如函数形式和常数。
进行比对，存在许多不同的计算两个序列之间的一致性百分比的方式。举例来说，可以将一致性数目除以：(i)最短序列长度；(ii)比对长度；(iii)平均序列长度；(iv)非间隙位置数目；或(iv)排除悬垂物的同等位置的数目。此外，应了解一致性百分比还强烈依赖于长度。因此，一对序列越短，可以预期偶然出现的序列一致性越高。
因此，应了解蛋白质或DNA序列的准确比对是一个复杂的过程。流行的多序列比对程序ClustalW(汤普森(Thompson)等人,1994,《核酸研究(Nucleic Acids Research)》,22,4673-4680；汤普森等人,1997,《核酸研究》,24,4876-4882)是一种优选用于产生根据本发明的蛋白质或DNA的多次比对的方式。适于ClustalW的参数可以如下：对于DNA比对：间隙开口罚分＝15.0，间隙延伸罚分＝6.66，以及矩阵＝一致性。对于蛋白质比对：间隙开口罚分＝10.0，间隙延伸罚分＝0.2，并且矩阵＝Gonnet。对于DNA和蛋白质比对：ENDGAP＝-1，以及GAPDIST＝4。本领域的技术人员将了解可能需要改变这些和其它参数以进行最佳序列比对。
优选地，接着可以从此类比对计算两个氨基酸/多核苷酸/多肽序列之间的一致性百分比是(N/T)×100，其中N是序列共享一致残基的位置数目，并且T是比较的位置的总数，包括间隙但排除悬垂物。因此，最优选用于计算两个序列之间的一致性百分比的方法包含(i)使用clustalw程序，使用例如如以上阐述的合适一组参数，准备序列比对；以及(ii)将n和t的值插入下式：序列一致性＝(N/T)×100。
本领域的技术人员已知用于鉴别类似序列的替代方法。举例来说，基本上类似的核苷酸序列将由与本文中显示的任一核酸序列或其补体在严格条件下杂交的序列编码。严格条件意指核苷酸与滤纸结合的DNA或RNA在3x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中在约45℃下杂交，接着在0.2x ssc/0.1％SDS中在约20-65℃下洗涤至少一次。可替代地，基本上类似的多肽与本文中显示的序列可能相差至少1个，但小于5、10、20、50或100个氨基酸。
由于遗传密码的简并，显然本文所述的任何核酸序列可以在基本上不影响由此编码的蛋白质下变化或改变，以提供其功能变异体。合适核苷酸变异体是具有因编码序列内相同氨基酸的不同密码子的取代而改变的序列，因此产生沉默变化的变异体。其它合适变异体是如下变异体，其具有同源核苷酸序列，但包含因编码侧链与取代的氨基酸的生物物理特性类似的氨基酸的不同密码子的取代而改变的序列全部或部分，以产生保守变化。举例来说，小的非极性疏水性氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸和甲硫氨酸。大的非极性疏水性氨基酸包括苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。极性中性氨基酸包括丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电荷(碱性)的氨基酸包括赖氨酸、精氨酸和组氨酸。带负电荷(酸性)的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。因此，了解哪些氨基酸可以经具有类似生物物理特性的氨基酸置换，并且熟练的技术人员将已知编码这些氨基酸的核苷酸序列。
本文所述的所有特征(包括任何所附权利要求书、摘要和附图)和/或如此公开的任何方法或过程的所有步骤可以与呈任何组合的以上方面中的任一者组合，除其中这类特征和/或步骤中的至少一些相互排斥的组合之外。
实例
实例1-对人类ROR1胞外结构域(ECD)具有免疫特异性的治疗性人类mAb的候选物 的产生
通过使用完全人类抗体噬菌体库针对人类ROR1胞外结构域(ECD)蛋白淘选，鉴别展现各种亲和力(噬菌体水平上，IC50＝0.11-263nM；参见表1)的多种ROR1特异性抗体。
表1-通过IC50，ROR1阳性噬菌体克隆的亲和力评级
克隆编号 IC50(nM)
P601-1 0.11
P601-40 0.20
P601-109 0.22
P601-43 0.23
P601-3(601-3-16)* 0.27
P601-17 0.62
P601-51 0.62
P601-108 0.76
P601-4 0.93
P601-13 1.21
P601-101 1.50
P601-153 1.53
P601-2(601-3-12)* 1.75
P601-137 1.82
P601-86 1.84
P601-56 1.85
P601-120 1.92
P601-6 2.12
P601-18 2.44
P601-134 2.68
P601-81 2.76
P601-149 2.76
P601-112 2.89
P601-136 3.02
P601-130 3.08
P601-14 3.22
P601-87 3.86
P601-66 4.05
P601-147 4.05
P601-57 4.08
P601-65 4.23
P601-110 4.57
P601-141 5.68
P601-100 5.80
P601-5(601-3-2)* 7.99
P601-28 8.05
P601-103 8.72
P601-69 9.81
P601-102 10.21
P601-9 14.62
P601-119 17.70
P601-50 24.06
P601-37 27.93
P601-70 74.00
P601-128 263.18
*被选择转化成全长人类IgG1抗体的克隆
所述方法描述在图4中所示的流程图中。通过蛋白质ELISA和细胞ELISA，从富集的淘选池筛选总共1519个单链可变片段(scFv)和片段抗原结合(Fab)噬菌体抗体，以鉴别识别人类ROR1 ECD的天然构形的抗体。使用蛋白质ELISA，本发明人选择超过100个展现阳性结合于人类ROR1(hROR1)单体和二聚ECD-Fc融合蛋白以及阴性结合于对照Fc-融合蛋白和空白对照的独特克隆(图5)。
通过细胞ELISA，本发明人进一步鉴别45个识别ROR1阳性细胞但不识别ROR1阴性细胞的独特克隆(图6)。然后这45个具有独特DNA编码序列的细胞ELISA阳性噬菌体抗体克隆(如表2中所示)进行进一步表征。
表2-ROR1噬菌体抗体展示淘选概述
Figure GDA0003195537570000341
45个独特细胞ELISA阳性噬菌体克隆的结合亲和力通过竞争性噬菌体结合ELISA来估计。说明ROR1竞争性ELISA的设计的图在图7中示出。首先在PBST缓冲液中连续稀释纯化噬菌体抗体，并且测试与ROR1涂布的盘的结合。在溶液结合分析中使用得到50％-80％饱和信号的稀释，其中噬菌体首先与递增浓度的ROR1一起培育一到两小时，接着转移到ROR1涂布的盘，历时10-15分钟，以捕捉未结合的噬菌体。IC50被计算为溶液结合阶段中抑制50％噬菌体与固定ROR1结合的ROR1浓度，并且表1概括测试的45个克隆的IC50。
通过表位分组分析，接着根据ROR1上的不同结合表位，将45个独特噬菌体抗体分组成四个不同类别，如表3中所示。
表3-ROR1阳性噬菌体克隆的表位铲斗概述
总计 45
表位I类 16
表位II类 10
表位III类 11
表位IV类 8
在此分析中，ROR1由具有已知和不同结合表位的固定抗ROR1单克隆全长抗体捕捉。然后，将纯化噬菌体抗体加入溶液。在ROR1与固定mAb之间的结合阻断噬菌体抗体与ROR1的结合的情况下，此噬菌体抗体视为具有与固定mAb非常接近或相同的结合表位。否则，认为噬菌体抗体具有不同表位。
已经分析ROR1特异性抗体的重链和轻链的互补决定区(CDR)并且已经鉴别每个表位类别(I类到IV类)内的高度保守基元，如图8-11中所示。图8展示表位I类抗体CDR序列分析，图9展示表位II类CDR序列分析，图10说明表位III类CDR序列分析，并且图11展示表位IV类CDR序列分析。
如图中可见，表位I类中存在三个亚组，表位II类中存在五个亚组，并且表位III类和IV类中的每一个中存在两个亚组。保守残基对于界定抗体对hROR1-ECD的结合特异性和亲和力来说是重要的，并且提供有用的关于改变结合特征的未来蛋白质工程的信息。
45个噬菌体抗体的结合特异性通过蛋白质ELISA，针对人类ROR1-ECD、人类ROR2-ECD和小鼠ROR1-ECD来确定(图12)。所有45个抗体展示对ROR1的特异性结合。45个抗体中的三十八个识别人类与小鼠ROR1-ECD(分别hROR1和mROR1)，如表4中概述，此是促进未来临床前动物研究的所需特性。
表4-ROR1噬菌体抗体的结合特异性
特异性 阳性率
仅仅hROR1阳性 7/45
hROR1和mROR1阳性 38/45
hROR1和hROR2阳性 0/45
在另一淘选工作中，本发明人发现结合于Rorl与Ror2的克隆，证实ROR1/ROR2双特异性抗体的研发是高度可行的(图13)。
实例2-优选ROR1特异性抗体的概述
本发明人分离根据本发明的45个抗体。可以研发抗体用于治疗或诊断用途。通过以下准则选择十四个抗体：
1.其代表所有表位类别和亚组；
2.其具有高ROR1结合亲和力；以及
3.其形成可能转化成完全IgG分子的池，供进一步分析。
对于每一抗体，信息如下组织：
1.抗体的名称；
2.表位类别和亚组；
3.轻链可变区DNA序列；
4.轻链可变区蛋白质序列；
5.轻链CDR：L1、L2、L3 DNA序列；
6.轻链CDR：L1、L2、L3氨基酸序列；
7.重链可变区DNA序列；
8.重链可变区蛋白质序列；
9.重链CDR：H1、H2、H3DNA序列；以及
10.重链CDR：H1、H2、H3氨基酸序列。
1)抗体601-1；表位I类；亚组1a 601-1轻链可变区(DNA序列)
Gccatccggatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccaggcgagtcaggacattagcaactatttaaattggtatcagcagaaaccagggaaagcccctaagctcctgatctacgatgcatccaatttggaaacaggggtcccatcaaggttcagtggaagtggatctgggacagattttactttcaccatcagcagcctgcagcctgaagatattgcaacatattactgtcaacagtatgataatctccccctcactttcggcggagggaccaaggtggaaatcaaacgt
[SEQ ID NO:3]
601-1轻链可变区(蛋白质序列)
AIRMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYDNLPLTFGGGTKVEIKR
[SEQ ID NO:4]
601-1轻链CDR：L1、L2、L3(DNA序列)
caggcgagtcaggacattagcaactatttaaat[SEQ ID NO:5]
gatgcatccaatttggaaaca[SEQ ID NO:6]
caacagtatgataatctccccctcact[SEQ ID NO:7]
601-1轻链CDR：L1、L2、L3(蛋白质序列)
QASQDISNYLN[SEQ ID NO:8]
DASNLET[SEQ ID NO:9]
QQYDNLPLT[SEQ ID NO:10]
601-1重链可变区(DNA序列)
gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtcaagcctggaggatccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtgactactacatgagctggatccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtttcatacattagtgatagtactaataccatatactacgcagactctgtgaagggccgattcaccgtctccagggacaaccccaaaaactcactctatctgcaaatgatcagcctgagagccgaggacacggccgtgtattattgtgcgagagctgtgggagctggcgagggctttgaccactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctca
[SEQ ID NO:11]
601-1重链可变区(蛋白质序列)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWVSYISDSTNTIYYADSVKGRFTVSRDNPKNSLYLQMISLRAEDTAVYYCARAVGAGEGFDHWGQGTLVTVSS
[SEQ ID NO:12]
601-1重链CDR：H1、H2、H3(DNA序列)
gactactacatgagc[SEQ ID NO:13]
tacattagtgatagtactaataccatatactacgcagactctgtgaagggc[SEQ ID NO:14]
gctgtgggagctggcgagggctttgaccac[SEQ ID NO:15]
601-1重链CDR：H1、H2、H3(蛋白质序列)
DYYMS[SEQ ID NO:16]
YISDSTNTIYYADSVKG[SEQ ID NO:17]
AVGAGEGFDH[SEQ ID NO:18]
2)抗体601-5；表位I类；亚组1a
601-5轻链可变区(DNA序列)
gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccaggcgagtcaggacattagcaactatttaaattggtatcagcagaaaccagggaaagcccctaagctcctgatctacgatgcatccaatttggaaacaggggtcccatcaaggttcagtggaagtggatctgggacagattttaccttcaccatcagcagcctgcagcctgaagatattgcaacatattactgtcaacagtatgataatctccccctcactttcggcggagggaccaagctggagatcaaacgt
[SEQ ID NO:19]
601-5轻链可变区(蛋白质序列)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYDNLPLTFGGGTKLEIKR
[SEQ ID NO:20]
601-5轻链CDR：L1、L2、L3(DNA序列)
caggcgagtcaggacattagcaactatttaaat[SEQ ID NO:21]
gatgcatccaatttggaaaca[SEQ ID NO:22]
caacagtatgataatctccccctcact[SEQ ID NO:23]
601-5轻链CDR：L1、L2、L3(蛋白质序列)
QASQDISNYLN[SEQ ID NO:24]
DASNLET[SEQ ID NO:25]
QQYDNLPLT[SEQ ID NO:26]
601-5重链可变区(DNA序列)
gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtcaagcctggagggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtgactactacatgggctgggtccgccaggctccggggaagggccttaagtggctttcatacattagtgatcgtgcgcataccatatacgacacagactctgtgaagggccgattcaccatttccagggacgacgccaagagttcgctttatctgcgaatgaacaacctgagagtcgaggacacggccgtttactactgtgcgagggcagtgggagctggggagggctttgactactggggccaaggcaccctggtgaccgtctcctca
[SEQ ID NO:27]
601-5重链可变区(蛋白质序列)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMGWVRQAPGKGLKWLSYISDRAHTIYDTDSVKGRFTISRDDAKSSLYLRMNNLRVEDTAVYYCARAVGAGEGFDYWGQGTLVTVSS
[SEQ ID NO:28]
601-5重链CDR：H1、H2、H3(DNA序列)
gactactacatgggc[SEQ ID NO:29]
tacattagtgatcgtgcgcataccatatacgacacagactctgtgaagggc[SEQ ID NO:30]
gcagtgggagctggggagggctttgactac[SEQ ID NO:31]
601-5重链CDR：H1、H2、H3(蛋白质序列)
DYYMG[SEQ ID NO:32]
YISDRAHTIYDTDSVKG[SEQ ID NO:33]
AVGAGEGFDY[SEQ ID NO:34]
3)抗体601-51；表位I类；亚组1b
601-51轻链可变区(DNA序列)
cagtctgccctgactcagcctgcctccgtgtctgggtctcctggacagtcgatcaccatctcctgcactggaaccagcagtgactttggtgattatgactatgtctcttggtaccaacaacacccaggcaaagcccccaaactcatgatttatgatgtcagtgatcggccctcaggggtttctaatcgcttctctggctccaagtctggcaacacggcctccctgaccatctctgggctccaggctgaggacgaggctgattatttctgcagctcatttacaaccagcagcactctggtgttcggcggagggaccaagctgaccgtcctaggt
[SEQ ID NO:35]
601-51轻链可变区(蛋白质序列)
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDFGDYDYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSDRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYFCSSFTTSSTLVFGGGTKLTVLG
[SEQ ID NO:36]
601-51轻链CDR：L1、L2、L3(DNA序列)
actggaaccagcagtgactttggtgattatgactatgtctct[SEQ ID NO:37]
gatgtcagtgatcggccctca[SEQ ID NO:38]
agctcatttacaaccagcagcactctggtg[SEQ ID NO:39]
601-51轻链CDR：L1、L2、L3(蛋白质序列)
TGTSSDFGDYDYVS[SEQ ID NO:40]
DVSDRPS[SEQ ID NO:41]
SSFTTSSTLV[SEQ ID NO:42]
601-51重链可变区(DNA序列)
caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggatacaccttcaccggctactatatgcactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggatggatcaaccctaacagtggtggcacaaactatgcacagaagtttcagggcagggtcaccatgaccagggacacgtccatcagcacagcctacatggagctgagcaggctgagatctgacgacacggccgtgtattactgtgcgagagatggggatatggtctatgatagtagtgggcctgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctca
[SEQ ID NO:43]
601-51重链可变区(蛋白质序列)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDGDMVYDSSGPDYWGQGTLVTVSS
[SEQ ID NO:44]
601-51重链CDR：H1、H2、H3(DNA序列)
Ggctactatatgcac[SEQ ID NO:45]
Tggatcaaccctaacagtggtggcacaaactatgcacagaagtttcagggc[SEQ ID NO:46]
Gatggggatatggtctatgatagtagtgggcctgactac[SEQ ID NO:47]
601-51重链CDR：H1、H2、H3(蛋白质序列)
GYYMH[SEQ ID NO:48]
WINPNSGGTNYAQKFQG[SEQ ID NO:49]
DGDMVYDSSGPDY[SEQ ID NO:50]
4)抗体601-4；表位I类；亚组1c
601-4轻链可变区(DNA序列)
cagtctgtgctgactcagccaccctcagcgtctggggcccccgggcagagggtcaccatctcctgttccggaggcatctccaacgtcgggactaatggtgttaactggtaccagcacctcccaggaacggcccccaaactcctcgtcgatgctatgaatcagcggccctcaggagtccctgaccgattctctggctccaggtctggcacgtcaggctccctggccatcactgggctccggtctgaagatgaggctgactattattgtgcaacatgggatgacagcctgagtggtgtactattcggcggagggaccaagctgaccgtcctaggt
[SEQ ID NO:51]
601-4轻链可变区(蛋白质序列)
QSVLTQPPSASGAPGQRVTISCSGGI SNVGTNGVNWYQHLPGTAPKLLVDAMNQRPSGVPDRFSGSRSGTSGSLAITGLRSEDEADYYCATWDDSLSGVLFGGGTKLTVLG
[SEQ ID NO:52]
601-4轻链CDR：L1、L2、L3(DNA序列)
tccggaggcatctccaacgtcgggactaatggtgttaac[SEQ ID NO:53]
gctatgaatcagcggccctca[SEQ ID NO:54]
gcaacatgggatgacagcctgagtggtgtacta[SEQ ID NO:55]
601-4轻链CDR：L1、L2、L3(蛋白质序列)
SGGISNVGTNGVN[SEQ ID NO:56]
AMNQRPS[SEQ ID NO:57]
ATWDDSLSGVL[SEQ ID NO:58]
601-4重链可变区(DNA序列)
gaggtgcagctggtgcagtctggcccaggactggtgaagccttcggggaccctgtccctcacctgcgctgtctctggtggctccatcagcagtagtaactggtggagttgggtccgccagcccccagggaaggggctggagtggattggggaaatctatcatagtgggagcaccaactacaacccgtccctcaagagtcgagtcaccatatcagtagacaagtccaagaaccagttctccctgaagctgggctctgtgaccgccgcggacacagccacatattactgtgcgcgcgatctgtggctgggtgagtgggatttgtggggccaaggcaccctggtcaccgtctcctca
[SEQ ID NO:59]
601-4重链可变区(蛋白质序列)
EVQLVQSGPGLVKPSGTLSLTCAVSGGSISSSNWWSWVRQPPGKGLEWIGEIYHSGSTNYNPSLKSRVTISVDKSKNQFSLKLGSVTAADTATYYCARDLWLGEWDLWGQGTLVTVSS
[SEQ ID NO:60]
601-4重链CDR：H1、H2、H3(DNA序列)
agtagtaactggtggagt[SEQ ID NO:61]
gaaatctatcatagtgggagcaccaactacaacccgtccctcaagagt[SEQ ID NO:62]
gatctgtggctgggtgagtgggatttg[SEQ ID NO:63]
601-4重链CDR：H1、H2、H3(蛋白质序列)
SSNWWS[SEQ ID NO:64]
EIYHSGSTNYNPSLKS[SEQ ID NO:65]
DLWLGEWDL[SEQ ID NO:66]
5)抗体601-2；表位II类；亚组2a 601-2轻链可变区(DNA序列)
gaaattgtgttgacgcagtctccagacaccctgtccttgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttagcagcaacttagcctggtaccagcagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctatggtgcatccaccagggccactggtatcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggacagagttcactctcaccatcagcagcctgcagtctgaagattttgcagtttattactgtcagcagtataataactggcctccgtacacttttggccaggggaccaaggtggaaatcaaacgt
[SEQ ID NO:67]
601-2轻链可变区(蛋白质序列)
EIVLTQSPDTLSLSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNNWPPYTFGQGTKVEIKR
[SEQ ID NO:68]
601-2轻链CDR：L1、L2、L3(DNA序列)
agggccagtcagagtgttagcagcaacttagcc[SEQ ID NO:69]
ggtgcatccaccagggccact[SEQ ID NO:70]
cagcagtataataactggcctccgtacact[SEQ ID NO:71]
601-2轻链CDR：L1、L2、L3(蛋白质序列)
RASQSVSSNLA[SEQ ID NO:72]
GASTRAT[SEQ ID NO:73]
QQYNNWPPYT[SEQ ID NO:74]
601-2重链可变区(DNA序列)
caggtcaccttgaaggagtctgggcccacgctggtgaaacccacacagaccctcacgctgacgtgcaccttctctggcttctcactcagtagttttggagtggctgtgggctggttccgtcagcccccaggaaaggccctggagtggcttggacttatttattgggatgatgataagcgctacagcccatctctgaagaccaggctcaccatcaccaaggacacctccaaaaaccaggtggtccttacaatgaccaacatggaccctgtggacacagccacatattattgtgcccacaaagggggtatagcaacaactggcagccccaactggttcgacccctggggccagggaaccctggtcaccgtctcctca
[SEQ ID NO:75]
601-2重链可变区(蛋白质序列)
QVTLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSSFGVAVGWFRQPPGKALEWLGLIYWDDDKRYSPSLKTRLTITKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCAHKGGIATTGSPNWFDPWGQGTLVTVSS
[SEQ ID NO:76]
601-2重链CDR：H1、H2、H3(DNA序列)
agttttggagtggctgtgggc[SEQ ID NO:77]
cttatttattgggatgatgataagcgctacagcccatctctgaagacc[SEQ ID NO:78]
aaagggggtatagcaacaactggcagccccaactggttcgacccc[SEQ ID NO:79]
601-2重链CDR：H1、H2、H3(蛋白质序列)
SFGVAVG[SEQ ID NO:80]
LIYWDDDKRYSPSLKT[SEQ ID NO:81]
KGGIATTGSPNWFDP[SEQ ID NO:82]
6)抗体601-17；表位II类；亚组2b
601-17轻链可变区(DNA序列)
gaaattgtgttgacgcagtctccaggcaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttagcagcagctacttagcctggtaccagcagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctatggtgcatccagcagggccactggcatcccagacaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagactggagcctgaagattttgcagtgtattactgtcagcagtatggtagcctttttggccaggggaccaaggtggagatcaaacgt
[SEQ ID NO:83]
601-17轻链可变区(蛋白质序列)
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSLFGQGTKVEIKR
[SEQ ID NO:84]
601-17轻链CDR：L1、L2、L3(DNA序列)
agggccagtcagagtgttagcagcagctacttagcct[SEQ ID NO:85]
ggtgcatccagcagggccact[SEQ ID NO:86]
cagcagtatggtagcctt[SEQ ID NO:87]
601-17轻链CDR：L1、L2、L3(蛋白质序列)
RASQSVSSSYLA[SEQ ID NO:88]
GASSRAT[SEQ ID NO:89]
QQYGSL[SEQ ID NO:90]
601-17重链可变区(DNA序列)
gaggtccagctggtacagtctggggctgaggtgaggaaacctgggtcctcggtgaaggtctcctgcaaggcctctggaggctccctcagcagtcatggtgtcagttgggtgcgtcaggcccctggacaagggcttgagtggatggccaggatcatccccatgtttggtctaacagactacgcacagaacttccaggccagagtcacgatttccgcggacagatccacgaacacagtttacatggagatcagcaacctgggatctgaagacacggccgtctatttctgtgcgagagagagtctgggagcaacatttgagtattggggccagggaaccctggtcaccgtctcctca
[SEQ ID NO:91]
601-17重链可变区(蛋白质序列)
EVQLVQSGAEVRKPGSSVKVSCKASGGSLSSHGVSWVRQAPGQGLEWMARIIPMFGLTDYAQNFQARVTISADRSTNTVYMEISNLGSEDTAVYFCARESLGATFEYWGQGTLVTVSS
[SEQ ID NO:92]
601-17重链CDR：H1、H2、H3(DNA序列)
agtcatggtgtcagt[SEQ ID NO:93]
aggatcatccccatgtttggtctaacagactacgcacagaacttccaggcc[SEQ ID NO:94]
gagagtctgggagcaacatttgagtat[SEQ ID NO:95]
601-17重链CDR：H1、H2、H3(蛋白质序列)
SHGVS[SEQ ID NO:96]
RIIPMFGLTDYAQNFQA[SEQ ID NO:97]
ESLGATFEY[SEQ ID NO:98]
7)抗体601-119；表位II类；亚组2c
601-119轻链可变区(DNA序列)
cagtctgccctgactcagcctgcctccgtgtctgcgtctcctggacagtcgatcaccatctcctgcactggaaccagcagtgacgttggtggttataactatgtcacctggtaccaacagcacccaggcaaagcccccaaactcatgatttatgatgtcagtaagcggccctcaggggtccttgatcgcttctctggctccaagtctggcaacacggcctccctgaccatctctgggctccaggctgaggacgaggctgattatttctgcagctcatatacaagcagttccaccctggtgtttggcggagggaccaagctgaccgtcctaggt
[SEQ ID NO:99]
601-119轻链可变区(蛋白质序列)
QSALTQPASVSASPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVTWYQQHPGKAPKLMIYDVSKRPSGVLDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYFCSSYTSSSTLVFGGGTKLTVLG
[SEQ ID NO:100]
601-119轻链CDR：L1、L2、L3(DNA序列)
actggaaccagcagtgacgttggtggttataactatgtcacc[SEQ ID NO:101]
gatgtcagtaagcggccctca[SEQ ID NO:102]
agctcatatacaagcagttccaccctggtg[SEQ ID NO:103]
601-119轻链CDR：L1、L2、L3(蛋白质序列)
TGTSSDVGGYNYVT[SEQ ID NO:104]
DVSKRPS[SEQ ID NO:105]
SSYTSSSTLV[SEQ ID NO:106]
601-119重链可变区(DNA序列)
caggtgcagctggtgcaatctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcggtacctatagcatgaactgggtccgccaggctccaggaaaggggctggagtgggtctcatccattagtagtagtagtagttacatatactacgcagactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtgcgagaggtctcggtggctggacccatgatgcttttgatatctggggccaagggaccacggtcaccgtctcctca
[SEQ ID NO:107]
601-119重链可变区(蛋白质序列)
QVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFGTYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGLGGWTHDAFDIWGQGTTVTVSS
[SEQ ID NO:108]
601-119重链CDR：H1、H2、H3(DNA序列)
acctatagcatgaac[SEQ ID NO:109]
tccattagtagtagtagtagttacatatactacgcagactcagtgaagggc[SEQ ID NO:110]
ggtctcggtggctggacccatgatgcttttgatatc[SEQ ID NO:111]
601-119重链CDR：H1、H2、H3(蛋白质序列)
TYSMN[SEQ ID NO:112]
SISSSSSYIYYADSVKG[SEQ ID NO:113]
GLGGWTHDAFDI[SEQ ID NO:114]
8)抗体601-14；表位II类；亚组2d
601-14轻链可变区(DNA序列)
cagtctgtgctgactcagcctgcctccgtgtctgggtctcctggacagtcgatcaccatctcctgcactggaaccagcagtgacgttggtggttataactatgtctcctggtaccaacaacacccaggcaaagcccccaaactcatgatttatgatgtcagtaatcggccctcaggggtttctaatcgcttctctggctccaagtctggcaacacggcctccctgaccatctctgggctccaggctgaggacgaggctgattattactgcagctcatatacaagcagcagcactctttgggtgttcggcggagggaccaagctgaccgtcctaggt
[SEQ ID NO:115]
601-14轻链可变区(蛋白质序列)
QSVLTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLWVFGGGTKLTVLG
[SEQ ID NO:116]
601-14轻链CDR：L1、L2、L3(DNA序列)
actggaaccagcagtgacgttggtggttataactatgtctcc[SEQ ID NO:117]
gatgtcagtaatcggccctca[SEQ ID NO:118]
agctcatatacaagcagcagcactctttgggtg[SEQ ID NO:119]
601-14轻链CDR：L1、L2、L3(蛋白质序列)
TGTSSDVGGYNYVS[SEQ ID NO:120]
DVSNRPS[SEQ ID NO:121]
SSYTSSSTLWV[SEQ ID NO:122]
601-14重链可变区(DNA序列)
caggtgcagctggtgcagtctggagcagaggtgaaaaagcccggggagtctctgaagatctcctgtaaggattctggatacagctttaccaactactggctcggctgggtgcgccagatgcccgggaaaggcctggagtggatgggaatcatctatccgggtgactctgataccagatacagcccgtccttccgaggccaggtcaccatctcagccgacaagtccatcagcaccgcctacctgcagtggagcagcctgaaggcctcggacaccgccatgtattactgtgcgagacttaatcttgccacacatacagcttttgacatatggggccaagggaccacggtcaccgtctcctca
[SEQ ID NO:123]
601-14重链可变区(蛋白质序列)
QVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKDSGYSFTNYWLGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTRYSPSFRGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARLNLATHTAFDIWGQGTTVTVSS
[SEQ ID NO:124]
601-14重链CDR：H1、H2、H3(DNA序列)
aactactggctcggc[SEQ ID NO:125]
atcatctatccgggtgactctgataccagatacagcccgtccttccgaggc[SEQ ID NO:126]
cttaatcttgccacacatacagcttttgacata[SEQ ID NO:127]
601-14重链CDR：H1、H2、H3(蛋白质序列)
NYWLG[SEQ ID NO:128]
IIYPGDSDTRYSPSFRG[SEQ ID NO:129]
LNLATHTAFDI[SEQ ID NO:130]
9)抗体601-86；表位II类；亚组2e
601-86轻链可变区(DNA序列)
gacatccagatgacccagtctccatcttctgtgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgtcgggcgagtcaaggtattagcaccttgttggcctggtatcagcagaaaccagggaaagcccctaagctcctgatatcttctgcatccagtttgcaaagtggggtcccagcaaggttcagcggcagtggatctgggacagatttcactctcactatcagcagcctgcagcctgaggattttgcaacttactactgccagcaaagttacagagccccgactttcggccaggggaccaaggtggagatcaaacgt
[SEQ ID NO:131]
601-86轻链可变区(蛋白质序列)
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISTLLAWYQQKPGKAPKLLISSASSLQSGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYRAPTFGQGTKVEIKR
[SEQ ID NO:132]
601-86轻链CDR：L1、L2、L3(DNA序列)
cgggcgagtcaaggtattagcaccttgttggcc[SEQ ID NO:133]
tctgcatccagtttgcaaagt[SEQ ID NO:134]
cagcaaagttacagagccccgact[SEQ ID NO:135]
601-86轻链CDR：L1、L2、L3(蛋白质序列)
RASQGISTLLA[SEQ ID NO:136]
SASSLQS[SEQ ID NO:137]
QQSYRAPT[SEQ ID NO:138]
601-86重链可变区(DNA序列)
caggtcaccttgaaggagtctggtcctacgctgctgaaacccacacagaccctcacgctgacctgcaccttctctgggttctcactcagtactagaggagtgggggtgggctggatccgtcagcccccaggacaggccctggagtggcttacactcatttattgggatgatgataagcgctacagcccttctctaaagagcaggctcaccatcaccaaggacacatccaaaaaccaggtggtccttacaatgaccaacatggaatctgtggacacagccacatattactgtgcacagcagactatgaccggtgcttttgatatctggggccaagggaccacggtcaccgtctcctca
[SEQ ID NO:139]
601-86重链可变区(蛋白质序列)
QVTLKESGPTLLKPTQTLTLTCTFSGFSLSTRGVGVGWIRQPPGQALEWLTLIYWDDDKRYSPSLKSRLTITKDTSKNQVVLTMTNMESVDTATYYCAQQTMTGAFDIWGQGTTVTVSS
[SEQ ID NO:140]
601-86重链CDR：H1、H2、H3(DNA序列)
actagaggagtgggggtgggc[SEQ ID NO:141]
ctcatttattgggatgatgataagcgctacagcccttctctaaagagc[SEQ ID NO:142]
cagactatgaccggtgcttttgatatc[SEQ ID NO:143]
601-86重链CDR：H1、H2、H3(蛋白质序列)
TRGVGVG[SEQ ID NO:144]
LIYWDDDKRYSPSLKS[SEQ ID NO:145]
QTMTGAFDI[SEQ ID NO:146]
10)抗体601-40；表位III类；亚组3a
601-40轻链可变区(DNA序列)
gacatccagttgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgggcaagtcagaacattaacaactatttaaattggtatcagcagaaaccagggaaagcccctaagctcctgctctatgctgcatccagtttgcaaagtggggtcccatcaaggttcagtggcagtggatctgggacagaattcactctcaccatcagcagtctgcaccctgaagattttgcaacttactactgtcaacagagttacaataccccattcaccttcggccctgggaccaaagtggatatcaaacgt
[SEQ ID NO:147]
601-40轻链可变区(蛋白质序列)
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNINNYLNWYQQKPGKAPKLLLYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTE
FTLTISSLHPEDFATYYCQQSYNTPFTFGPGTKVDIKR
[SEQ ID NO:148]
601-40轻链CDR：L1、L2、L3(DNA序列)
cgggcaagtcagaacattaacaactatttaaat[SEQ ID NO:149]
gctgcatccagtttgcaaagt[SEQ ID NO:150]
caacagagttacaataccccattcacc[SEQ ID NO:151]
601-40轻链CDR：L1、L2、L3(蛋白质序列)
RASQNINNYLN[SEQ ID NO:152]
AASSLQS[SEQ ID NO:153]
QQSYNTPFT[SEQ ID NO:154]
601-40重链可变区(DNA序列)
caggtacagctgcagcagtcaggagctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggttacacctctaccaactatggtatcagctgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggatggatcagcacttacaatggtaacacaaactatgcacagaagctccagggcagagtcaccatgaccacagacacatccacgagcacagcctacatggagctgaggagcctgagatctgacgacacggccgtgtattactgtgcgagagactattactctgatagtagtggttattgggacgatgcttttgatatctggggccaagggacaatggtcaccgtctcttca
[SEQ ID NO:155]
601-40重链可变区(蛋白质序列)
QVQLQQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTSTNYGISWVRQAPGQGLEWMGWISTYNGNTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDYYSDSSGYWDDAFDIWGQGTMVTVSS
[SEQ ID NO:156]
601-40重链CDR：H1、H2、H3(DNA序列)
aactatggtatcagc[SEQ ID NO:157]
tggatcagcacttacaatggtaacacaaactatgcacagaagctccagggc[SEQ ID NO:158]
gactattactctgatagtagtggttattgggacgatgcttttgatatc[SEQ ID NO:159]
601-40重链CDR：H1、H2、H3(蛋白质序列)
NYGIS[SEQ ID NO:160]
WISTYNGNTNYAQKLQG[SEQ ID NO:161]
DYYSDSSGYWDDAFDI[SEQ ID NO:162]
11)抗体601-13；表位III类；亚组3b
601-13轻链可变区(DNA序列)
gacatcgtgatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccaggcgagtcaggacattagcaactatttaaattggtatcagcagaaac cagggaaagcccctaagctcctgatctacgatgcatccaatttggaaacaggggtcccatcaaggttcagtggaagtggatctgggacagattttattttcaccatcagcagcctgcagcctgaagatattgcaacatattactgtcaacagtttgataatctcccttacacttttggccaggggaccaaggtggagatcaaacgt
[SEQ ID NO:163]
601-13轻链可变区(蛋白质序列)
DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFIFTISSLQPEDIATYYCQQFDNLPYTFGQGTKVEIKR
[SEQ ID NO:164]
601-13轻链CDR：L1、L2、L3(DNA序列)
caggcgagtcaggacattagcaactatttaaat[SEQ ID NO:165]
gatgcatccaatttggaaaca[SEQ ID NO:166]
caacagtttgataatctcccttacact[SEQ ID NO:167]
601-13轻链CDR：L1、L2、L3(蛋白质序列)
QASQDISNYLN[SEQ ID NO:168]
DASNLET[SEQ ID NO:169]
QQFDNLPYT[SEQ ID NO:170]
601-13重链可变区(DNA序列)
gaggtccagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctgggtcctcggtgaaggtctcctgcaaggcttctggtggcaccttcagcacctttgcgatcaactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggaggggtcatccctgtctctggaacagaagactactcacagaagttccagggcagactctcacttaccgcggacgagtccacgggcacagcctacatggagctgagcagcctgagatctgacgacacggccgtgtattactgtgcgagagatcgaagtggccgcgattgggactactttgactattggggccagggaaccctggtcaccgtctcctca
[SEQ ID NO:171]
601-13重链可变区(蛋白质序列)
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSTFAINWVRQAPGQGLEWMGGVIPVSGTEDYSQKFQGRLSLTADESTGTAYMELSSLRSDDTAVYYCARDRSGRDWDYFDYWGQGTLVTVSS
[SEQ ID NO:172]
601-13重链CDR：H1、H2、H3(DNA序列)
acctttgcgatcaac[SEQ ID NO:173]
ggggtcatccctgtctctggaacagaagactactcacagaagttccagggc[SEQ ID NO:174]
gatcgaagtggccgcgattgggactactttgactat[SEQ ID NO:175]
601-13重链CDR：H1、H2、H3(蛋白质序列)
TFAIN[SEQ ID NO:176]
GVIPVSGTEDYSQKFQG[SEQ ID NO:177]
DRSGRDWDYFDY[SEQ ID NO:178]
12)抗体601-109；表位IV类；亚组4a
601-109轻链可变区(DNA序列)
caatctgccctgactcagcctgcctccgtgtctgggtctcctggacagtcgatcaccatctcctgcactggaaccagcagtgacgttggtggttataactatgtctcctggtaccaacagcacccaggcaaagcccccaaactcttgatttatgaggtcagtcagcggccctcaggggtccctgatcgattctctggctccaagtctggcaacacggcctccctgaccgtctctggcctccaggctgaagatgaggctgactattattgcagctcatatgcaggcgacagggacgtcttcggaactgggacccagctcaccgttttaagt
[SEQ ID NO:179]
601-109轻链可变区(蛋白质序列)
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLLIYEVSQRPSGVPDRFSGSKSGNTASLTVSGLQAEDEADYYCSSYAGDRDVFGTGTQLTVLS
[SEQ ID NO:180]
601-109轻链CDR：L1、L2、L3(DNA序列)
actggaaccagcagtgacgttggtggttataactatgtctcc[SEQ ID NO:181]
gaggtcagtcagcggccctca[SEQ ID NO:182]
agctcatatgcaggcgacagggacgtc[SEQ ID NO:183]
601-109轻链CDR：L1、L2、L3(蛋白质序列)
TGTSSDVGGYNYVS[SEQ ID NO:184]
EVSQRPS[SEQ ID NO:185]
SSYAGDRDV[SEQ ID NO:186]
601-109重链可变区(DNA序列)
cagatgcagctggtgcagtctgggggagacttggtccagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtagctatagcatgaactgggtccgccaggctccaggaaaggggctggagtgggtctcatccattagtagtagtagtagttacatatactacgcagactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtgcgagaggtctcggtggctggacccatgatgcttttgatatctggggccaagggaccacggtcaccgtctcctca
[SEQ ID NO:187]
601-109重链可变区(蛋白质序列)
QMQLVQSGGDLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGLGGWTHDAFDIWGQGTTVTVSS
[SEQ ID NO:188]
601-109重链CDR：H1、H2、H3(DNA序列)
agctatagcatgaac[SEQ ID NO:189]
tccattagtagtagtagtagttacatatactacgcagactcagtgaagggc[SEQ ID NO:190]ggtctcggtggctggacccatgatgcttttgatatc[SEQ ID NO:191]
601-109重链CDR：H1、H2、H3(蛋白质序列)
SYSMN[SEQ ID NO:192]
SISSSSSYIYYADSVKG[SEQ ID NO:193]
GLGGWTHDAFDI[SEQ ID NO:194]
13)抗体601-137；表位IV类；亚组4b
601-137轻链可变区(DNA序列)
cagtctgccctgactcagccaccctcagcgtctgggacccccgggcagagggtcaccatctcttgttctggaagcagctccaacatcggaagtaattatgtatactggtaccagcagctcccaggaacggcccccaaactcctcatctataggaataatcagcggccctcaggggtccctgaccgattctctggctccaagtctggcacctcagcctccctggccatcagtgggctccggtccgaggatgaggctgattattactgtgcagcatgggatgacagcctgagtgcctgggtgttcggcggagggaccaagctgaccgtcctaggt
[SEQ ID NO:195]
601-137轻链可变区(蛋白质序列)
QSALTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNYVYWYQQLPGTAPKLLIYRNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDDSLSAWVFGGGTKLTVLG
[SEQ ID NO:196]
601-137轻链CDR：L1、L2、L3(DNA序列)
tctggaagcagctccaacatcggaagtaattatgtatac[SEQ ID NO:197]
aggaataatcagcggccctca[SEQ ID NO:198]
gcagcatgggatgacagcctgagtgcctgggtg[SEQ ID NO:199]
601-137轻链CDR：L1、L2、L3(蛋白质序列)
SGSSSNIGSNYVY[SEQ ID NO:200]
RNNQRPS[SEQ ID NO:201]
AAWDDSLSAWV[SEQ ID NO:202]
601-137重链可变区(DNA序列)
caggtacagctgcagcagtcaggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtttcctgcaaggcatctggatacaccttctccagatactatatccactgggtgcgacaggcccctggtcaagggcttgagtggatgggaataatcaacactgatggtggcaccacaacctacgcacagaagtttcagggcagactcaccatgaccagggacacgtccacgagcaccgtctacatggaactgagcagcctgagatctgacgacacggccgtctattactgtgcgagagattatgggactatagatgctcgtcgttttgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctca
[SEQ ID NO:203]
601-137重链可变区(蛋白质序列)
QVQLQQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFSRYYIHWVRQAPGQGLEWMGIINTDGGTTTYAQKFQGRLTMTRDTSTSTVYMELSSLRSDDTAVYYCARDYGTIDARRFDYWGQGTLVTVSS
[SEQ ID NO:204]
601-137重链CDR：H1、H2、H3(DNA序列)
agatactatatccac[SEQ ID NO:205]
ataatcaacactgatggtggcaccacaacctacgcacagaagtttcagggc[SEQ ID NO:206]
gattatgggactatagatgctcgtcgttttgactac[SEQ ID NO:207]
601-137重链CDR：H1、H2、H3(蛋白质序列)
RYYIH[SEQ ID NO:208]
IINTDGGTTTYAQKFQG[SEQ ID NO:209]
DYGTIDARRFDY[SEQ ID NO:210]
14)抗体601-3；表位II类；亚组2a
601-3轻链可变区(DNA序列)
gaaatagtgatgacgcagtccccagccaccctgtctgtgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttagcagcaacttagcctggtaccagcagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctatggtgcatccaccagggccactggtatcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggacagagttcactctcaccatcagcagcctgcagtctgaagattttgcagtttattactgtcagcagtataataactggcctccgtacacttttggccaggggaccaaggtggagatcaaacgt
[SEQ ID NO:211]
601-3轻链可变区(蛋白质序列)
EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNNWPPYTFGQGTKVEIKR
[SEQ ID NO:212]
601-3轻链CDR：L1、L2、L3(DNA序列)
agggccagtcagagtgttagcagcaacttagcc[SEQ ID NO:213]
ggtgcatccaccagggccact[SEQ ID NO:214]
cagcagtataataactggcctccgtacact[SEQ ID NO:215]
601-3轻链CDR：L1、L2、L3(蛋白质序列)
RASQSVSSNLA[SEQ ID NO:216]
GASTRAT[SEQ ID NO:217]
QQYNNWPPYT[SEQ ID NO:218]
601-3重链可变区(DNA序列)
caggtcaccttgaaggagtctgggcccacgctggtgaaacccacacagaccctcacgctgacgtgcaccttctctggcttctcactcaatagttttggagtggctgtgggctggttccgtcagcccccaggaaaggccctggagtggcttggacttatttattgggatgatgacaggcgctacttcccatcgctggagggcaggctctccatcaccaaggacgcctccgataacaacgtggtcctgacaatgatgaacgtggaccctgcggacacagccacatattattgtgcacggacttcccctatggttcagggaattgcaaactactacgctatggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcctca
[SEQ ID NO:219]
601-3重链可变区(蛋白质序列)
QVTLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLNSFGVAVGWFRQPPGKALEWLGLIYWDDDRRYFPSLEGRLSITKDASDNNVVLTMMNVDPADTATYYCARTSPMVQGIANYYAMDVWGQGTTVTVSS
[SEQ ID NO:220]
601-3重链CDR：H1、H2、H3(DNA序列)
agttttggagtggctgtgggc[SEQ ID NO:221]
cttatttattgggatgatgacaggcgctacttcccatcgctggagggc[SEQ ID NO:222]
acttcccctatggttcagggaattgcaaactactacgctatggacgtc[SEQ ID NO:223]
601-3重链CDR：H1、H2、H3(蛋白质序列)
SFGVAVG[SEQ ID NO:224]
LIYWDDDRRYFPSLEG[SEQ ID NO:225]
TSPMVQGIANYYAMDV[SEQ ID NO:226]
本发明人也已经确定抗体的一实施例的恒定区的氨基酸和DNA序列，如下。
抗体轻链恒定区(蛋白质序列)
EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNNWPPYTFGQGTKVEIKR
[SEQ ID NO:227]
抗体重链恒定区(蛋白质序列)
QVTLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLNSFGVAVGWFRQPPGKALEWLGLIYWDDDRRYFPSLEGRLSITKDASDNNVVLTMMNVDPADTATYYCARTSPMVQGIANYYAMDVWGQGTTVTVSS
[SEQ ID NO:228]
抗体轻链恒定区(DNA序列)
gaaatagtgatgacgcagtccccagccaccctgtctgtgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttagcagcaacttagcctggtaccagcagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctatggtgcatccaccagggccactggtatcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggacagagttcactctcaccatcagcagcctgcagtctgaagattttgcagtttattactgtcagcagtataataactggcctccgtacacttttggccaggggaccaaggtggagatcaaacgt
[SEQ ID NO:229]
抗体重链恒定区(DNA序列)
caggtcaccttgaaggagtctggacccacgctggtgaaacccacacagaccctcacgctgacgtgcaccttctctggcttctcactcaatagttttggagtggctgtgggctggttccgtcagcccccaggaaaggccctggagtggcttggacttatttattgggatgatgacaggcgctacttcccatcgctggagggcaggctctccatcaccaaggacgcctccgataacaacgtggtcctgacaatgatgaacgtggaccctgcggacacagccacatattattgtgcacggacttcccctatggttcagggaattgcaaactactacgctatggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcctca
[SEQ ID NO:230]
实例3-使用所选scFv片段工程化全长单克隆抗体
虽然噬菌体展示技术允许快速选择和产生抗原特异性scFv片段，但包括Fc结构域的完整单克隆抗体(mAb)具有许多优于scFv的优点。首先，仅仅全长抗体发挥免疫功能，例如经由Fc结构域介导的补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。其次，二价单克隆抗体提供比单体Fab Ab更强的抗原结合亲和力。第三，Fab和二价mAb的血浆半衰期和肾清除率将是不同的。第四，二价mAb可以在不同于scFv的速率下内化，改变免疫功能或运载功能。虽然α发射体杀死标靶无需内化，但许多药物和毒素将得益于免疫复合物的内化。因此，根据通过竞争性ELISA获得的亲和力评级结果(参见表1)，然后选择具有高结合亲和力的三个克隆，并且重新构筑成全长人类IgG1重组抗体并进一步表征。
为了在中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)细胞中产生重组人类单克隆IgG，本发明人基于松友(Tomomatsu)等人,2009,《生物科学、生物技术与生物化学(BiosciBiotechnol Biochem)》73(7):1465-1469的方法工程化全长IgG1 mAb。抗体可变区亚克隆到哺乳动物表达载体(图14a和14b)中，其中匹配κ轻链恒定序列和IgG1子类Fc(图15)。纯化全长IgG1抗体展示在还原和非还原两种条件下的预期分子量(图16)。动力学结合分析证实全长IgG1抗体特异性结合hROR1-ECD，Kd在皮摩尔范围内(图17)。
实例4-ROR1特异性全长IgG1单克隆抗体的表征
1.表位定位：
为了更好地了解ROR1特异性抗体作为候选药物的结构基础，通过ELISA，针对ROR1肽阵列，进行标准表位定位。肽阵列用96个重叠肽覆盖ROR1蛋白胞外结构域的全长(每15个氨基酸重叠5个氨基酸)。肽在N端生物素化以固定其到抗生蛋白链菌素ELISA盘上。间隔子(SGSG)用于提供灵活性。ELISA分析用ROR1抗体作为初级抗体进行，并且抗人类Fc AP结合抗体用于检测。
如图18、19和20中所示，抗体601-3-12(图19)和601-3-16(图20)共享类似的结合表位，而抗体601-3-2(图18)具有与601-3-12和601-3-16不同的结合表位。
2.结合特性：
使用三个纯化全长IgG1抗体，再次测试结合特异性。蛋白质ELISA证实其都识别人类与小鼠ROR1 ECD，但不识别人类ROR2 ECD(图21)。
hIgG1 mAb结合于细胞表面ROR1通过FACS分析，使用ROR1表达阳性的不同癌细胞系，包括MDA-MB-231、A549、H1299和Jeko-1来测定。所有三个抗体都识别癌细胞表面上表达的ROR1。使用MDA-MB-231细胞的FACS的一个实例展示在图22中。将0.1ug/ml、1ug/ml、10ug/ml和100ug/ml的抗体与MDA-MB-231细胞一起培育，然后在洗涤后与FITC标记的二级抗体一起培育。结合通过FACS来测量并表示为平均荧光强度(mean fluorescence intensity，MFI)。与仅仅二级抗体一起培育的细胞用作阴性对照。图22展示10ug/ml ROR1特异性mAb的结果。
3.免疫活性：
然后本发明人评估ROR1特异性IgG1 mAb的体外免疫效应机制，例如CDC和ADCC：
A)补体依赖性细胞毒性(Complement-Dependent Cytotoxicity，CDC)活性
mAb杀死细胞的一个重要机制是结合于标靶细胞表面的抗体固定补体，起始补体级联和攻膜复合物(MAC)的装配，最终使标靶细胞溶解。本发明人研究ROR1特异性IgG mAb是否能够吸引C1q结合，这是起始补体复合物形成的第一步骤。将多种浓度ROR1抗体涂布到盘上，并且2ug/mL C1q蛋白质用作探针。辣根蛋白质(Horse Radish Protein，HRP)结合的抗C1q抗体用于报告结合信号。如图23中所示，所有三个抗体都能够以剂量依赖性方式结合于C1q，证明抗体可以介导标靶细胞的补体依赖性细胞毒性(CDC)。
B)针对ROR1阳性癌细胞系的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)
抗体依赖性细胞毒性是mAb疗法的重要效应机制之一。抗体可以桥联表达标靶分子的肿瘤细胞和例如NK细胞等细胞毒性细胞，并且介导NK引导的标靶细胞杀死。如下进行ADCC分析：将100ul标靶细胞悬浮液(MDA-MB-231或Jeko-1)与50ul多种浓度的测试mAb一起在96孔盘中在37℃下预先培育半小时。然后50ul刚分离的人类外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)以25:1的效应/标靶细胞比率加入。培育16小时后，将盘短暂离心，并且将50ul无细胞上清液转移到新盘。来自杀死的癌细胞的释放LDH通过来自普洛麦格(Promega)的CytoTox96非放射性细胞毒性分析来测量。细胞溶解通过式(E-S)/(M-S)(E：实验释放，S：自发释放，M：最大释放)来计算。非特异性抗体用作阴性对照。在ADCC分析中本发明人发现所有三个抗体都能够介导表达ROR1的肿瘤细胞的杀死。图24展示ROR1特异性mAb针对MDA-MB-231细胞的ADCC的结果。
4.Wnt5a配体结合的阻断：
此外，在三个生物分析法中测试三个mAb以评估其功能活性：
(i)Wnt5a与ROR1结合的阻断；以及
(ii)Wnt-5a诱发的ROR1磷酸化的阻断
ForteBio分析被设计成测试三个候选抗体阻断Wnt-5a与ROR1结合的能力。使用ForteBio Octet测量ROR1/Wnt5A相互作用。然后分别加入三个抗ROR1 mAb和一个hIgG1阴性对照抗体M901，以测量结合的减少(测量假ka(1/M.s)。与阴性对照IgG1抗体相比较，所有三个抗体能够阻断Wnt-5a与ROR1的结合到多种程度(图25)。
在结合于ROR1时，Wnt5a触发ROR1磷酸化和下游信号级联活化。ROR1磷酸化导致SDS-PAGE电泳上Ror1较慢迁移。为了确定针对ROR1的主要候选抗体是否可能功能上阻断Wnt5a与ROR1的结合，利用此分析作为替代实验以测试此可能性。将血清饥饿的表达ROR1的细胞系Jeko-1与用或未用10lag抗体处理的300nM Wnt5a一起培育2小时。使细胞溶解，通过SDS-PAGE电泳分离，并用针对ROR1的抗体印迹。当与非磷酸化相比时，用单独Wnt5a处理细胞引起ROR1较慢迁移。
然而，当Wnt5a和抗体两者与细胞共同培育时，三个主要候选物中的两个(克隆3-12和克隆3-16)彻底消除了Wnt5a对ROR1迁移的影响。结果证实这些抗体可以有效地预防Wnt5a与ROR1结合，并且配体结合的此阻断消除ROR1活化。
5.癌细胞增殖的抑制
进行细胞增殖分析以确定抗体是否抑制癌细胞增殖。将标靶细胞(MDA-MB-231或SKBR3细胞)以每孔5×103个细胞涂铺到96孔盘中。将10ug/ml ROR1特异性mAb加入细胞并在5％CO2培育箱中在37℃下培育。处理72小时后，使用CellTiter 96AQueous单溶液细胞增殖分析(普洛麦格)，根据制造商的说明书，分析细胞的增殖。未经处理的细胞的存活率设定为100％并且数据展示为与未经处理的细胞相比的百分比。非特异性抗体(901)用作阴性对照。每个数据点表示平均值±S.D.(n＝3)。
实例5-对ROR1抗体可药化性的进一步改善的探索
1.结合于细胞毒性部分
1)抗体药物结合物
抗体-药物结合物(ADC)用于抗体选择性递送有效细胞毒性药物到标靶细胞。当应用于肿瘤抗原标靶时，此类方法可以增强抗体的抗肿瘤活性并提高化学疗法的肿瘤-正常组织的选择性。ADC研发的一个关键参数是抗体一旦结合于标靶抗原可以被内吞，并因此递送结合的药物到标靶癌细胞中。
为探索用本发明的ROR1抗体研发ADC策略的可能性，本发明人评估通过ROR1抗体结合诱发的抗体的内吞作用。在分析中，将Jeko细胞在冰上在含5％FBS的PBS中用FITC标记的ROR1抗体(10ug/ml)进行表面标记60分钟，并接着用冷PBS洗涤三次并在37℃下在具有5％FBS的RPMI中培育3小时，以内化表面荧光。细胞快速冷却，洗涤并且在室温下与(剥离)或不与(非剥离)500ul剥离缓冲液(150mM NaC1+HCL，pH 2.5)一起培育5分钟，短暂离心，用PBS洗涤两次并且接着用冷1％PFA/PBS固定，并通过流式细胞测量术立刻分析。在从不完整表面剥离校正后，从剥离和非剥离样品数据计算内化荧光。
如图26中所示，本发明人发现ROR1抗体缓慢内化。
2)结合于发射α粒子的放射性核素
α粒子是能够发出强烈但具选择性的单细胞细胞毒性的高能量的高线性能量传递氦核。可靶向纳米发电机是225Ac标记的单克隆抗体，已经证明其极其有效并特异性地杀死白血病、淋巴瘤和其它实体肿瘤(麦克德维特(McDevitt)等人,2001,《科学(Science)》294(5546):1537-1540)。本发明人决定用双官能螯合剂将ROR1抗体结合到α粒子发射体。假定其对ROR1的敏锐特异性，全长mAb和ScFv/Fab可以是递送有效抗肿瘤试剂的优良媒剂。其小尺寸、从血液快速清除和肿瘤穿透特性应使得ScFv/Fab成为一种选择用于靶向肿瘤的α发射体的理想格式。本发明人使用如博查德(Borchardt)等人,2003,《癌症研究(CancerRes)》63:5-84-5090中所述的两步标记法，使所有形式的mAb(全长IgG、scFV和Fab)结合于α粒子发射体。
3)测试结合物针对ROR1阳性癌细胞系的体外细胞毒性
一组ROR1阳性细胞系用或不用在0.01-10ug/ml范围内的结合ROR1 IgG抗体和阴性对照抗体结合物处理24-96小时。通过3H-胸苷并入来测定细胞增殖，并通过ATPlite分析测定存活力(格里菲思(Griffiths)等人,2011,《分子生物学方法(Methods Mol Biol)》731:451-65孙(Sun)等人,2005,《致癌基因(Oncogene)》24:7381-88)。
4)测试结合物在载有表达ROR1的癌细胞的NOD/SCID小鼠中的体内抗肿瘤活性
A)构建体对NOD/SCID异种移植模型的治疗功效
NOD/SCID小鼠的特征在于NK细胞中的功能缺陷，缺乏循环补体以及APC(抗原呈递细胞)的分化和功能的缺陷。因此，NOD/SCID模型适合于人类肿瘤细胞系的异种移植和测试mAb对表达靶向分子的肿瘤细胞的直接作用。类似方案用于建立小鼠模型并进行治疗研究以确定结合mAb的治疗功效(弗朗西斯科(Francisco)等人,2003,《血液(Blood)》102:1458-1465)。
B)结合物的生物分布
此通过用111In标记mAb的两个形式并在注射后的不同时间点计数来自小鼠的多种组织的放射性来测量(金基格(Singh Jaggi)等人,2007,《公共科学图书馆·综合(PlosOne)》2(3):e267))。基于从正常小鼠获得的结果，通过如先前所描述的γ成像，使用人类白血病的NOD/SCID异种移植物，确定构建体的肿瘤吸收。
5)将抗体的新颖形式工程化以增强其细胞毒性能力
1.双特异性抗体
如所描述用人类IgG1 Fc构筑双特异性抗体以识别免疫T细胞上的ROR1和CD3两者(古纳萨卡拉(Gunasekaran)等人,2010,《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》285:19637-19646；罗西(Rossi EA)等人,2006,《美国国家科学院院刊》103:6841-6)。预期双特异性抗体将细胞毒性T细胞募集和靶向ROR1阳性癌细胞，同时维持Fc效应功能和体内长半衰期。三个机制与双特异性抗体介导的癌细胞的特异性杀死有关：(i)通过活化T细胞进行的杀死；(ii)ADCC活性；(iii)CDC活性。可以构筑双特异性抗体的其它格式，例如串联scFv分子(taFv)、双功能抗体(Db)或单链双功能抗体(scDb)和与人类血清白蛋白的融合蛋白(浅野(Asano)等人,《生物化学杂志》286:1812-1818；罗福乐(Loffler)等人,《血液》95(6):2098-2103；韦纳(Weiner)等人,《免疫学杂志(J.Immunology)》152(5):2385-2392；穆勒(Muller)等人,《生物化学杂志》282:12650-12660)，但缺乏具有不同药物动力学特征的Fc效应功能。
2.ADCC增强
ROR1标靶特异性ADCC活性通过在二醇工程化CHO细胞中以重组方式表达抗体来增强，如PCT/US2010/0081195中所述。Asn297上修饰的寡糖N-聚糖如下改变效应功能：更高亲和力结合于CD16/FcRIIIa，从而提高人类自然杀伤细胞介导的ADCC活性；2)对CD32b/FcRIIb(在多个类型免疫细胞(除NK细胞外)中表达的一种抑制受体)的结合亲和力减小，从而提高例如嗜中性白细胞等效应细胞介导的ADCC活性以及巨噬细胞和DC细胞的抗原呈递。
实例6-抗ROR1抗体结合亲和力
ROR1胞外结构域二聚体和单体对抗ROR1抗体的结合亲和力通过表面电浆子共振(surface plasmon resonance，SPR)来确定。ROR1胞外结构域Fc融合物、“二聚体”和ROR1胞外结构域Fc融合物:Fc杂二聚体、“单体”分别是用于亲和力分析的ROR1的二聚体和单体形式。简单来说，使用胺偶合试剂盒和100mM乙二胺，在作为阻断试剂的100mM硼酸钠缓冲液pH8.0中，ROR1二聚体和单体直接固定到CM4芯片。约100-150RU ROR1二聚体和单体固定于分开流动槽上并且未衍生流动槽用作参考对照。每个抗ROR1抗体在HBS-P+操作缓冲液中稀释并以5或6种浓度(0nM、1.23nM、3.7nM、11.1nM、33.3nM和100nM)在30μl/min下注射120秒。接着解离180秒。使用Biacore T200评估软件1:1结合模型计算每个抗ROR1抗体的缔合常数、解离常数和亲和力。
结合研究证明当与1:1结合模型拟合时，19个抗ROR1抗体以类似亲和力结合于ROR1单体与二聚体，如表5中所示。虽然抗ROR1与ROR1-Fc融合二聚体之间的相互作用可以用二价分析物分析，但使用1:1结合模型进行分析，因为ROR1单体与二聚体的结合曲线是类似的。显示抗ROR1抗体结合于ROR1二聚体的表观亲和力。图27展示抗体结合于ROR1单体与二聚体的标准化传感图。在缔合阶段结束时但在解离阶段之前，使用“结合稳定性点”，将传感图相对于100RU标准化。
表5：通过SPR，ROR1胞外结构域单体和二聚体与抗ROR1抗体的结合动力学和亲和力
Figure GDA0003195537570000601
Figure GDA0003195537570000611
*报告ROR1二聚体结合于抗体的表观亲和力。
实例7-抗ROR1抗体结合于CLL细胞
抗体结合于初级慢性淋巴细胞性白血病(CLL)细胞上的ROR1的能力通过流式细胞测量术来测定，ROR1不在正常健康成人血细胞上表达，但在实际上CLL的所有病例的恶性细胞上和不同类型的实体肿瘤上发现。三十七个测试抗体展示通过流式细胞测量术可检测的与CLL细胞的结合。
方法
CLL细胞通过CD5、CD19和抗ROR1抗体的细胞表面染色
使用
Figure GDA0003195537570000614
Alexa
Figure GDA0003195537570000615
647人类IgG标记试剂盒(生命技术(LifeTechnologies))，根据制造商的指导，标记抗ROR1和对照IgG1抗体。使来自CLL患者(澳塞尔斯公司(AllCells LLC))的冷冻的外周血单核细胞(PBMC)解冻并在FACS缓冲液(PBS、2％热不活化FBS、0.1％NaN3)中洗涤。将CLL细胞计数并以4×10E6个细胞/毫升悬浮于FACS缓冲液中。然后以每个测试2×10E5个细胞在100pt FACS缓冲液中与藻红蛋白(PE)标记的抗CD5、flu601-5cein异硫氰酸酯(FITC)标记的抗CD19(碧迪生物科学(BD Biosciences))和
Figure GDA0003195537570000612
Alexa
Figure GDA0003195537570000613
647标记的抗ROR1或对照人类IgG1 ET901(尤里卡治疗公司(EurekaTherapeutics))一起冰上培育30分钟。培育后，细胞在FACS缓冲液中洗涤两次并在含2％多聚甲醛的PBS(最终浓度)中固定。细胞在BD LSRII流式细胞仪(碧迪生物科学)上运行并使用FlowJo软件(森星(Treestar))分析。
评估被鉴别为CD5和CD19双重阳性的CLL细胞的抗ROR1或对照Ig染色。图28和29展示多种浓度的抗ROR1抗体在CLL细胞上的几何平均荧光强度(geometric meanfluorescence intensity，gMFI)。
概述
本发明是针对一种人类ROR1特异性抗体。有利的是，抗体是人类来源，因此与使用包含非人类元件的抗体对比，可能在给予人类患者时将任何免疫反应降到最低。另外，抗体或其功能片段、编码抗体或其功能片段的氨基酸序列和核苷酸序列以及本文所述的结合物可以有效地用于制造组合物和诊断剂，以及其例如治疗癌症的用途。
表6.某些轻链可变区序列
Figure GDA0003195537570000621
Figure GDA0003195537570000631
Figure GDA0003195537570000641
Figure GDA0003195537570000651
表7.某些重链可变区序列
Figure GDA0003195537570000652
Figure GDA0003195537570000661
Figure GDA0003195537570000671
Figure GDA0003195537570000681
表8.某些轻链CDR序列
Figure GDA0003195537570000682
Figure GDA0003195537570000691
表9.某些重链CDR序列
Figure GDA0003195537570000692
Figure GDA0003195537570000701
序列表
<110> 优瑞科生物技术公司（Eureka Therapeutics, Inc.）
布莱恩·黄（Wong, Brian）
艾玛·曼斯特勒（Masteller, Emma）
刘诚（Liu, Cheng）
许奕阳（Xu, Yiyang）
刘宏（Liu, Hong）
言甦（Yan, Su）
向京宜（Xiang, Jingyi）
王培（Wang, Pei）
<120> 抗ROR1抗体
<130> FIVE-004/02WO
<150> US 62/193,237
<151> 2015-07-16
<150> US 62/163,241
<151> 2015-05-18
<160> 502
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2814
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
atgcaccggc cgcgccgccg cgggacgcgc ccgccgctcc tggcgctgct ggccgcgctg 60
ctgctggccg cacgcggggc tgctgcccaa gaaacagagc tgtcagtcag tgctgaatta 120
gtgcctacct catcatggaa catctcaagt gaactcaaca aagattctta cctgaccctc 180
gatgaaccaa tgaataacat caccacgtct ctgggccaga cagcagaact gcactgcaaa 240
gtctctggga atccacctcc caccatccgc tggttcaaaa atgatgctcc tgtggtccag 300
gagccccgga ggctctcctt tcggtccacc atctatggct ctcggctgcg gattagaaac 360
ctcgacacca cagacacagg ctacttccag tgcgtggcaa caaacggcaa ggaggtggtt 420
tcttccactg gagtcttgtt tgtcaagttt ggcccccctc ccactgcaag tccaggatac 480
tcagatgagt atgaagaaga tggattctgt cagccataca gagggattgc atgtgcaaga 540
tttattggca accgcaccgt ctatatggag tctttgcaca tgcaagggga aatagaaaat 600
cagatcacag ctgccttcac tatgattggc acttccagtc acttatctga taagtgttct 660
cagttcgcca ttccttccct gtgccactat gccttcccgt actgcgatga aacttcatcc 720
gtcccaaagc cccgtgactt gtgtcgcgat gaatgtgaaa tcctggagaa tgtcctgtgt 780
caaacagagt acatttttgc aagatcaaat cccatgattc tgatgaggct gaaactgcca 840
aactgtgaag atctccccca gccagagagc ccagaagctg cgaactgtat ccggattgga 900
attcccatgg cagatcctat aaataaaaat cacaagtgtt ataacagcac aggtgtggac 960
taccggggga ccgtcagtgt gaccaaatca gggcgccagt gccagccatg gaattcccag 1020
tatccccaca cacacacttt caccgccctt cgtttcccag agctgaatgg aggccattcc 1080
tactgccgca acccagggaa tcaaaaggaa gctccctggt gcttcacctt ggatgaaaac 1140
tttaagtctg atctgtgtga catcccagcg tgcgattcaa aggattccaa ggagaagaat 1200
aaaatggaaa tcctgtacat actagtgcca agtgtggcca ttcccctggc cattgcttta 1260
ctcttcttct tcatttgcgt ctgtcggaat aaccagaagt catcgtcggc accagtccag 1320
aggcaaccaa aacacgtcag aggtcaaaat gtagagatgt caatgctgaa tgcatataaa 1380
cccaagagca aggctaaaga gctacctctt tctgctgtac gctttatgga agaattgggt 1440
gagtgtgcct ttggaaaaat ctataaaggc catctctatc tcccaggcat ggaccatgct 1500
cagctggttg ctatcaagac cttgaaagac tataacaacc cccagcaatg gacggaattt 1560
caacaagaag cctccctaat ggcagaactg caccacccca atattgtctg ccttctaggt 1620
gccgtcactc aggaacaacc tgtgtgcatg ctttttgagt atattaatca gggggatctc 1680
catgagttcc tcatcatgag atccccacac tctgatgttg gctgcagcag tgatgaagat 1740
gggactgtga aatccagcct ggaccacgga gattttctgc acattgcaat tcagattgca 1800
gctggcatgg aatacctgtc tagtcacttc tttgtccaca aggaccttgc agctcgcaat 1860
attttaatcg gagagcaact tcatgtaaag atttcagact tggggctttc cagagaaatt 1920
tactccgctg attactacag ggtccagagt aagtccttgc tgcccattcg ctggatgccc 1980
cctgaagcca tcatgtatgg caaattctct tctgattcag atatctggtc ctttggggtt 2040
gtcttgtggg agattttcag ttttggactc cagccatatt atggattcag taaccaggaa 2100
gtgattgaga tggtgagaaa acggcagctc ttaccatgct ctgaagactg cccacccaga 2160
atgtacagcc tcatgacaga gtgctggaat gagattcctt ctaggagacc aagatttaaa 2220
gatattcacg tccggcttcg gtcctgggag ggactctcaa gtcacacaag ctctactact 2280
ccttcagggg gaaatgccac cacacagaca acctccctca gtgccagccc agtgagtaat 2340
ctcagtaacc ccagatatcc taattacatg ttcccgagcc agggtattac accacagggc 2400
cagattgctg gtttcattgg cccgccaata cctcagaacc agcgattcat tcccatcaat 2460
ggatacccaa tacctcctgg atatgcagcg tttccagctg cccactacca gccaacaggt 2520
cctcccagag tgattcagca ctgcccacct cccaagagtc ggtccccaag cagtgccagt 2580
gggtcgacta gcactggcca tgtgactagc ttgccctcat caggatccaa tcaggaagca 2640
aatattcctt tactaccaca catgtcaatt ccaaatcatc ctggtggaat gggtatcacc 2700
gtttttggca acaaatctca aaaaccctac aaaattgact caaagcaagc atctttacta 2760
ggagacgcca atattcatgg acacaccgaa tctatgattt ctgcagaact gtaa 2814
<210> 2
<211> 937
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 2
Met His Arg Pro Arg Arg Arg Gly Thr Arg Pro Pro Leu Leu Ala Leu
1 5 10 15
Leu Ala Ala Leu Leu Leu Ala Ala Arg Gly Ala Ala Ala Gln Glu Thr
20 25 30
Glu Leu Ser Val Ser Ala Glu Leu Val Pro Thr Ser Ser Trp Asn Ile
35 40 45
Ser Ser Glu Leu Asn Lys Asp Ser Tyr Leu Thr Leu Asp Glu Pro Met
50 55 60
Asn Asn Ile Thr Thr Ser Leu Gly Gln Thr Ala Glu Leu His Cys Lys
65 70 75 80
Val Ser Gly Asn Pro Pro Pro Thr Ile Arg Trp Phe Lys Asn Asp Ala
85 90 95
Pro Val Val Gln Glu Pro Arg Arg Leu Ser Phe Arg Ser Thr Ile Tyr
100 105 110
Gly Ser Arg Leu Arg Ile Arg Asn Leu Asp Thr Thr Asp Thr Gly Tyr
115 120 125
Phe Gln Cys Val Ala Thr Asn Gly Lys Glu Val Val Ser Ser Thr Gly
130 135 140
Val Leu Phe Val Lys Phe Gly Pro Pro Pro Thr Ala Ser Pro Gly Tyr
145 150 155 160
Ser Asp Glu Tyr Glu Glu Asp Gly Phe Cys Gln Pro Tyr Arg Gly Ile
165 170 175
Ala Cys Ala Arg Phe Ile Gly Asn Arg Thr Val Tyr Met Glu Ser Leu
180 185 190
His Met Gln Gly Glu Ile Glu Asn Gln Ile Thr Ala Ala Phe Thr Met
195 200 205
Ile Gly Thr Ser Ser His Leu Ser Asp Lys Cys Ser Gln Phe Ala Ile
210 215 220
Pro Ser Leu Cys His Tyr Ala Phe Pro Tyr Cys Asp Glu Thr Ser Ser
225 230 235 240
Val Pro Lys Pro Arg Asp Leu Cys Arg Asp Glu Cys Glu Ile Leu Glu
245 250 255
Asn Val Leu Cys Gln Thr Glu Tyr Ile Phe Ala Arg Ser Asn Pro Met
260 265 270
Ile Leu Met Arg Leu Lys Leu Pro Asn Cys Glu Asp Leu Pro Gln Pro
275 280 285
Glu Ser Pro Glu Ala Ala Asn Cys Ile Arg Ile Gly Ile Pro Met Ala
290 295 300
Asp Pro Ile Asn Lys Asn His Lys Cys Tyr Asn Ser Thr Gly Val Asp
305 310 315 320
Tyr Arg Gly Thr Val Ser Val Thr Lys Ser Gly Arg Gln Cys Gln Pro
325 330 335
Trp Asn Ser Gln Tyr Pro His Thr His Thr Phe Thr Ala Leu Arg Phe
340 345 350
Pro Glu Leu Asn Gly Gly His Ser Tyr Cys Arg Asn Pro Gly Asn Gln
355 360 365
Lys Glu Ala Pro Trp Cys Phe Thr Leu Asp Glu Asn Phe Lys Ser Asp
370 375 380
Leu Cys Asp Ile Pro Ala Cys Asp Ser Lys Asp Ser Lys Glu Lys Asn
385 390 395 400
Lys Met Glu Ile Leu Tyr Ile Leu Val Pro Ser Val Ala Ile Pro Leu
405 410 415
Ala Ile Ala Leu Leu Phe Phe Phe Ile Cys Val Cys Arg Asn Asn Gln
420 425 430
Lys Ser Ser Ser Ala Pro Val Gln Arg Gln Pro Lys His Val Arg Gly
435 440 445
Gln Asn Val Glu Met Ser Met Leu Asn Ala Tyr Lys Pro Lys Ser Lys
450 455 460
Ala Lys Glu Leu Pro Leu Ser Ala Val Arg Phe Met Glu Glu Leu Gly
465 470 475 480
Glu Cys Ala Phe Gly Lys Ile Tyr Lys Gly His Leu Tyr Leu Pro Gly
485 490 495
Met Asp His Ala Gln Leu Val Ala Ile Lys Thr Leu Lys Asp Tyr Asn
500 505 510
Asn Pro Gln Gln Trp Thr Glu Phe Gln Gln Glu Ala Ser Leu Met Ala
515 520 525
Glu Leu His His Pro Asn Ile Val Cys Leu Leu Gly Ala Val Thr Gln
530 535 540
Glu Gln Pro Val Cys Met Leu Phe Glu Tyr Ile Asn Gln Gly Asp Leu
545 550 555 560
His Glu Phe Leu Ile Met Arg Ser Pro His Ser Asp Val Gly Cys Ser
565 570 575
Ser Asp Glu Asp Gly Thr Val Lys Ser Ser Leu Asp His Gly Asp Phe
580 585 590
Leu His Ile Ala Ile Gln Ile Ala Ala Gly Met Glu Tyr Leu Ser Ser
595 600 605
His Phe Phe Val His Lys Asp Leu Ala Ala Arg Asn Ile Leu Ile Gly
610 615 620
Glu Gln Leu His Val Lys Ile Ser Asp Leu Gly Leu Ser Arg Glu Ile
625 630 635 640
Tyr Ser Ala Asp Tyr Tyr Arg Val Gln Ser Lys Ser Leu Leu Pro Ile
645 650 655
Arg Trp Met Pro Pro Glu Ala Ile Met Tyr Gly Lys Phe Ser Ser Asp
660 665 670
Ser Asp Ile Trp Ser Phe Gly Val Val Leu Trp Glu Ile Phe Ser Phe
675 680 685
Gly Leu Gln Pro Tyr Tyr Gly Phe Ser Asn Gln Glu Val Ile Glu Met
690 695 700
Val Arg Lys Arg Gln Leu Leu Pro Cys Ser Glu Asp Cys Pro Pro Arg
705 710 715 720
Met Tyr Ser Leu Met Thr Glu Cys Trp Asn Glu Ile Pro Ser Arg Arg
725 730 735
Pro Arg Phe Lys Asp Ile His Val Arg Leu Arg Ser Trp Glu Gly Leu
740 745 750
Ser Ser His Thr Ser Ser Thr Thr Pro Ser Gly Gly Asn Ala Thr Thr
755 760 765
Gln Thr Thr Ser Leu Ser Ala Ser Pro Val Ser Asn Leu Ser Asn Pro
770 775 780
Arg Tyr Pro Asn Tyr Met Phe Pro Ser Gln Gly Ile Thr Pro Gln Gly
785 790 795 800
Gln Ile Ala Gly Phe Ile Gly Pro Pro Ile Pro Gln Asn Gln Arg Phe
805 810 815
Ile Pro Ile Asn Gly Tyr Pro Ile Pro Pro Gly Tyr Ala Ala Phe Pro
820 825 830
Ala Ala His Tyr Gln Pro Thr Gly Pro Pro Arg Val Ile Gln His Cys
835 840 845
Pro Pro Pro Lys Ser Arg Ser Pro Ser Ser Ala Ser Gly Ser Thr Ser
850 855 860
Thr Gly His Val Thr Ser Leu Pro Ser Ser Gly Ser Asn Gln Glu Ala
865 870 875 880
Asn Ile Pro Leu Leu Pro His Met Ser Ile Pro Asn His Pro Gly Gly
885 890 895
Met Gly Ile Thr Val Phe Gly Asn Lys Ser Gln Lys Pro Tyr Lys Ile
900 905 910
Asp Ser Lys Gln Ala Ser Leu Leu Gly Asp Ala Asn Ile His Gly His
915 920 925
Thr Glu Ser Met Ile Ser Ala Glu Leu
930 935
<210> 3
<211> 324
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 3
gccatccgga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc aggcgagtca ggacattagc aactatttaa attggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctacgat gcatccaatt tggaaacagg ggtcccatca 180
aggttcagtg gaagtggatc tgggacagat tttactttca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagatattg caacatatta ctgtcaacag tatgataatc tccccctcac tttcggcgga 300
gggaccaagg tggaaatcaa acgt 324
<210> 4
<211> 108
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 4
Ala Ile Arg Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 5
<211> 33
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 5
caggcgagtc aggacattag caactattta aat 33
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 6
gatgcatcca atttggaaac a 21
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 7
caacagtatg ataatctccc cctcact 27
<210> 8
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 8
Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 9
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 9
Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr
1 5
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 10
Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Leu Thr
1 5
<210> 11
<211> 357
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 11
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtcaagc ctggaggatc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt gactactaca tgagctggat ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtttcatac attagtgata gtactaatac catatactac 180
gcagactctg tgaagggccg attcaccgtc tccagggaca accccaaaaa ctcactctat 240
ctgcaaatga tcagcctgag agccgaggac acggccgtgt attattgtgc gagagctgtg 300
ggagctggcg agggctttga ccactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357
<210> 12
<211> 119
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 12
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Asp Ser Thr Asn Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ile Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Val Gly Ala Gly Glu Gly Phe Asp His Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 13
<211> 15
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 13
gactactaca tgagc 15
<210> 14
<211> 51
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 14
tacattagtg atagtactaa taccatatac tacgcagact ctgtgaaggg c 51
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 15
gctgtgggag ctggcgaggg ctttgaccac 30
<210> 16
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 16
Asp Tyr Tyr Met Ser
1 5
<210> 17
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 17
Tyr Ile Ser Asp Ser Thr Asn Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 18
Ala Val Gly Ala Gly Glu Gly Phe Asp His
1 5 10
<210> 19
<211> 324
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 19
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc aggcgagtca ggacattagc aactatttaa attggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctacgat gcatccaatt tggaaacagg ggtcccatca 180
aggttcagtg gaagtggatc tgggacagat tttaccttca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagatattg caacatatta ctgtcaacag tatgataatc tccccctcac tttcggcgga 300
gggaccaagc tggagatcaa acgt 324
<210> 20
<211> 108
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 20
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
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<211> 33
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 21
caggcgagtc aggacattag caactattta aat 33
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<211> 21
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 22
gatgcatcca atttggaaac a 21
<210> 23
<211> 27
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 23
caacagtatg ataatctccc cctcact 27
<210> 24
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 24
Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 25
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 25
Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr
1 5
<210> 26
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 26
Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Leu Thr
1 5
<210> 27
<211> 357
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 27
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtcaagc ctggagggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt gactactaca tgggctgggt ccgccaggct 120
ccggggaagg gccttaagtg gctttcatac attagtgatc gtgcgcatac catatacgac 180
acagactctg tgaagggccg attcaccatt tccagggacg acgccaagag ttcgctttat 240
ctgcgaatga acaacctgag agtcgaggac acggccgttt actactgtgc gagggcagtg 300
ggagctgggg agggctttga ctactggggc caaggcaccc tggtgaccgt ctcctca 357
<210> 28
<211> 119
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 28
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Leu
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Asp Arg Ala His Thr Ile Tyr Asp Thr Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Ser Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Arg Met Asn Asn Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Val Gly Ala Gly Glu Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 29
<211> 15
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 29
gactactaca tgggc 15
<210> 30
<211> 51
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 30
tacattagtg atcgtgcgca taccatatac gacacagact ctgtgaaggg c 51
<210> 31
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 31
gcagtgggag ctggggaggg ctttgactac 30
<210> 32
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 32
Asp Tyr Tyr Met Gly
1 5
<210> 33
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 33
Tyr Ile Ser Asp Arg Ala His Thr Ile Tyr Asp Thr Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 34
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 34
Ala Val Gly Ala Gly Glu Gly Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 35
<211> 333
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 35
cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60
tcctgcactg gaaccagcag tgactttggt gattatgact atgtctcttg gtaccaacaa 120
cacccaggca aagcccccaa actcatgatt tatgatgtca gtgatcggcc ctcaggggtt 180
tctaatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgaccat ctctgggctc 240
caggctgagg acgaggctga ttatttctgc agctcattta caaccagcag cactctggtg 300
ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta ggt 333
<210> 36
<211> 111
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 36
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Phe Gly Asp Tyr
20 25 30
Asp Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Asp Val Ser Asp Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Ser Ser Phe Thr Thr Ser
85 90 95
Ser Thr Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
<210> 37
<211> 42
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 37
actggaacca gcagtgactt tggtgattat gactatgtct ct 42
<210> 38
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 38
gatgtcagtg atcggccctc a 21
<210> 39
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 39
agctcattta caaccagcag cactctggtg 30
<210> 40
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 40
Thr Gly Thr Ser Ser Asp Phe Gly Asp Tyr Asp Tyr Val Ser
1 5 10
<210> 41
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 41
Asp Val Ser Asp Arg Pro Ser
1 5
<210> 42
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 42
Ser Ser Phe Thr Thr Ser Ser Thr Leu Val
1 5 10
<210> 43
<211> 366
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 43
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggata caccttcacc ggctactata tgcactgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcaacccta acagtggtgg cacaaactat 180
gcacagaagt ttcagggcag ggtcaccatg accagggaca cgtccatcag cacagcctac 240
atggagctga gcaggctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagagatggg 300
gatatggtct atgatagtag tgggcctgac tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 360
tcctca 366
<210> 44
<211> 122
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 44
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gly Asp Met Val Tyr Asp Ser Ser Gly Pro Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 45
<211> 15
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 45
ggctactata tgcac 15
<210> 46
<211> 51
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 46
tggatcaacc ctaacagtgg tggcacaaac tatgcacaga agtttcaggg c 51
<210> 47
<211> 39
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 47
gatggggata tggtctatga tagtagtggg cctgactac 39
<210> 48
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 48
Gly Tyr Tyr Met His
1 5
<210> 49
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 49
Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 50
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 50
Asp Gly Asp Met Val Tyr Asp Ser Ser Gly Pro Asp Tyr
1 5 10
<210> 51
<211> 333
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 51
cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctggggccc ccgggcagag ggtcaccatc 60
tcctgttccg gaggcatctc caacgtcggg actaatggtg ttaactggta ccagcacctc 120
ccaggaacgg cccccaaact cctcgtcgat gctatgaatc agcggccctc aggagtccct 180
gaccgattct ctggctccag gtctggcacg tcaggctccc tggccatcac tgggctccgg 240
tctgaagatg aggctgacta ttattgtgca acatgggatg acagcctgag tggtgtacta 300
ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta ggt 333
<210> 52
<211> 111
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 52
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Gly Ile Ser Asn Val Gly Thr Asn
20 25 30
Gly Val Asn Trp Tyr Gln His Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Val Asp Ala Met Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Arg Ser Gly Thr Ser Gly Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Ser Gly Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
<210> 53
<211> 39
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 53
tccggaggca tctccaacgt cgggactaat ggtgttaac 39
<210> 54
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 54
gctatgaatc agcggccctc a 21
<210> 55
<211> 33
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 55
gcaacatggg atgacagcct gagtggtgta cta 33
<210> 56
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 56
Ser Gly Gly Ile Ser Asn Val Gly Thr Asn Gly Val Asn
1 5 10
<210> 57
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 57
Ala Met Asn Gln Arg Pro Ser
1 5
<210> 58
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 58
Ala Thr Trp Asp Asp Ser Leu Ser Gly Val Leu
1 5 10
<210> 59
<211> 354
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 59
gaggtgcagc tggtgcagtc tggcccagga ctggtgaagc cttcggggac cctgtccctc 60
acctgcgctg tctctggtgg ctccatcagc agtagtaact ggtggagttg ggtccgccag 120
cccccaggga aggggctgga gtggattggg gaaatctatc atagtgggag caccaactac 180
aacccgtccc tcaagagtcg agtcaccata tcagtagaca agtccaagaa ccagttctcc 240
ctgaagctgg gctctgtgac cgccgcggac acagccacat attactgtgc gcgcgatctg 300
tggctgggtg agtgggattt gtggggccaa ggcaccctgg tcaccgtctc ctca 354
<210> 60
<211> 118
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 60
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gly
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser
20 25 30
Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Gly Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Leu Trp Leu Gly Glu Trp Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 61
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 61
agtagtaact ggtggagt 18
<210> 62
<211> 48
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 62
gaaatctatc atagtgggag caccaactac aacccgtccc tcaagagt 48
<210> 63
<211> 27
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 63
gatctgtggc tgggtgagtg ggatttg 27
<210> 64
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 64
Ser Ser Asn Trp Trp Ser
1 5
<210> 65
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 65
Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 66
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 66
Asp Leu Trp Leu Gly Glu Trp Asp Leu
1 5
<210> 67
<211> 327
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 67
gaaattgtgt tgacgcagtc tccagacacc ctgtccttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcaacttag cctggtacca gcagaaacct 120
ggccaggctc ccaggctcct catctatggt gcatccacca gggccactgg tatcccagcc 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagag ttcactctca ccatcagcag cctgcagtct 240
gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag tataataact ggcctccgta cacttttggc 300
caggggacca aggtggaaat caaacgt 327
<210> 68
<211> 109
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 68
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Pro
85 90 95
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 69
<211> 33
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 69
agggccagtc agagtgttag cagcaactta gcc 33
<210> 70
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 70
ggtgcatcca ccagggccac t 21
<210> 71
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 71
cagcagtata ataactggcc tccgtacact 30
<210> 72
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 72
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala
1 5 10
<210> 73
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 73
Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr
1 5
<210> 74
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 74
Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Pro Tyr Thr
1 5 10
<210> 75
<211> 375
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 75
caggtcacct tgaaggagtc tgggcccacg ctggtgaaac ccacacagac cctcacgctg 60
acgtgcacct tctctggctt ctcactcagt agttttggag tggctgtggg ctggttccgt 120
cagcccccag gaaaggccct ggagtggctt ggacttattt attgggatga tgataagcgc 180
tacagcccat ctctgaagac caggctcacc atcaccaagg acacctccaa aaaccaggtg 240
gtccttacaa tgaccaacat ggaccctgtg gacacagcca catattattg tgcccacaaa 300
gggggtatag caacaactgg cagccccaac tggttcgacc cctggggcca gggaaccctg 360
gtcaccgtct cctca 375
<210> 76
<211> 125
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 76
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Val Ala Val Gly Trp Phe Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Leu Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Thr Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala His Lys Gly Gly Ile Ala Thr Thr Gly Ser Pro Asn Trp Phe
100 105 110
Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 77
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 77
agttttggag tggctgtggg c 21
<210> 78
<211> 48
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 78
cttatttatt gggatgatga taagcgctac agcccatctc tgaagacc 48
<210> 79
<211> 45
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 79
aaagggggta tagcaacaac tggcagcccc aactggttcg acccc 45
<210> 80
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 80
Ser Phe Gly Val Ala Val Gly
1 5
<210> 81
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 81
Leu Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser Leu Lys Thr
1 5 10 15
<210> 82
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 82
Lys Gly Gly Ile Ala Thr Thr Gly Ser Pro Asn Trp Phe Asp Pro
1 5 10 15
<210> 83
<211> 318
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 83
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gcctttttgg ccaggggacc 300
aaggtggaga tcaaacgt 318
<210> 84
<211> 106
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 84
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Leu Phe
85 90 95
Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 85
<211> 37
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 85
agggccagtc agagtgttag cagcagctac ttagcct 37
<210> 86
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 86
ggtgcatcca gcagggccac t 21
<210> 87
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 87
cagcagtatg gtagcctt 18
<210> 88
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 88
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 89
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 89
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr
1 5
<210> 90
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 90
Gln Gln Tyr Gly Ser Leu
1 5
<210> 91
<211> 354
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 91
gaggtccagc tggtacagtc tggggctgag gtgaggaaac ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cctctggagg ctccctcagc agtcatggtg tcagttgggt gcgtcaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatggccagg atcatcccca tgtttggtct aacagactac 180
gcacagaact tccaggccag agtcacgatt tccgcggaca gatccacgaa cacagtttac 240
atggagatca gcaacctggg atctgaagac acggccgtct atttctgtgc gagagagagt 300
ctgggagcaa catttgagta ttggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctca 354
<210> 92
<211> 118
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 92
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Arg Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Ser Leu Ser Ser His
20 25 30
Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Ala Arg Ile Ile Pro Met Phe Gly Leu Thr Asp Tyr Ala Gln Asn Phe
50 55 60
Gln Ala Arg Val Thr Ile Ser Ala Asp Arg Ser Thr Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Ile Ser Asn Leu Gly Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Ser Leu Gly Ala Thr Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
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<211> 15
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 93
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<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 94
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<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 95
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<211> 5
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 96
Ser His Gly Val Ser
1 5
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<211> 17
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 97
Arg Ile Ile Pro Met Phe Gly Leu Thr Asp Tyr Ala Gln Asn Phe Gln
1 5 10 15
Ala
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<211> 9
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 98
Glu Ser Leu Gly Ala Thr Phe Glu Tyr
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<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 99
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tttggcggag ggaccaagct gaccgtccta ggt 333
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 100
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Ala Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Thr Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Asp Val Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Leu Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser
85 90 95
Ser Thr Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
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<400> 101
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 104
Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Thr
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 105
Asp Val Ser Lys Arg Pro Ser
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 106
Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Thr Leu Val
1 5 10
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<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 107
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tca 363
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 108
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Thr Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
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<400> 113
Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
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Gly
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 114
Gly Leu Gly Gly Trp Thr His Asp Ala Phe Asp Ile
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<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 115
cagtctgtgc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60
tcctgcactg gaaccagcag tgacgttggt ggttataact atgtctcctg gtaccaacaa 120
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caggctgagg acgaggctga ttattactgc agctcatata caagcagcag cactctttgg 300
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<211> 112
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 116
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
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Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
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Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser
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Ser Thr Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
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<400> 119
agctcatata caagcagcag cactctttgg gtg 33
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Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser
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Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser
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<212> PRT
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<400> 122
Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Thr Leu Trp Val
1 5 10
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<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 123
caggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc 60
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 124
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Asp Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Arg Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Asn Leu Ala Thr His Thr Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<211> 15
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 125
aactactggc tcggc 15
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<211> 51
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 126
atcatctatc cgggtgactc tgataccaga tacagcccgt ccttccgagg c 51
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<211> 33
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 127
cttaatcttg ccacacatac agcttttgac ata 33
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<211> 5
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 128
Asn Tyr Trp Leu Gly
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<211> 17
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 129
Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Arg
1 5 10 15
Gly
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<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 130
Leu Asn Leu Ala Thr His Thr Ala Phe Asp Ile
1 5 10
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<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 131
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<210> 132
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 132
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Thr Leu
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Ser Ser Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Arg Ala Pro Thr
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<211> 33
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 133
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<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 134
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<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 135
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 136
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Thr Leu Leu Ala
1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 137
Ser Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 138
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 138
Gln Gln Ser Tyr Arg Ala Pro Thr
1 5
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<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 139
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<211> 119
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 140
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Leu Lys Pro Thr Gln
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Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Arg
20 25 30
Gly Val Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Gln Ala Leu Glu
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Trp Leu Thr Leu Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser
50 55 60
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65 70 75 80
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Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
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<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 141
actagaggag tgggggtggg c 21
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<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 142
ctcatttatt gggatgatga taagcgctac agcccttctc taaagagc 48
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<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 143
cagactatga ccggtgcttt tgatatc 27
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<212> PRT
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<400> 144
Thr Arg Gly Val Gly Val Gly
1 5
<210> 145
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 145
Leu Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser Leu Lys Ser
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 146
Gln Thr Met Thr Gly Ala Phe Asp Ile
1 5
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<211> 324
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 147
gacatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
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<211> 108
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 148
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Asn Asn Tyr
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Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Leu
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Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu His Pro
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Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Asn Thr Pro Phe
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Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg
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<212> DNA
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Arg Ala Ser Gln Asn Ile Asn Asn Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 153
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<400> 153
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
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1 5
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tcctgcaagg cttctggtta cacctctacc aactatggta tcagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcagcactt acaatggtaa cacaaactat 180
gcacagaagc tccagggcag agtcaccatg accacagaca catccacgag cacagcctac 240
atggagctga ggagcctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagagactat 300
tactctgata gtagtggtta ttgggacgat gcttttgata tctggggcca agggacaatg 360
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 156
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Ser Thr Asn Tyr
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Gly
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<211> 324
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 163
gacatcgtga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc aggcgagtca ggacattagc aactatttaa attggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctacgat gcatccaatt tggaaacagg ggtcccatca 180
aggttcagtg gaagtggatc tgggacagat tttattttca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagatattg caacatatta ctgtcaacag tttgataatc tcccttacac ttttggccag 300
gggaccaagg tggagatcaa acgt 324
<210> 164
<211> 108
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 164
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ile Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asp Asn Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 165
<211> 33
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 165
caggcgagtc aggacattag caactattta aat 33
<210> 166
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 166
gatgcatcca atttggaaac a 21
<210> 167
<211> 27
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 167
caacagtttg ataatctccc ttacact 27
<210> 168
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 168
Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 169
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 169
Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr
1 5
<210> 170
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 170
Gln Gln Phe Asp Asn Leu Pro Tyr Thr
1 5
<210> 171
<211> 363
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 171
gaggtccagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggtgg caccttcagc acctttgcga tcaactgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg gtcatccctg tctctggaac agaagactac 180
tcacagaagt tccagggcag actctcactt accgcggacg agtccacggg cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagagatcga 300
agtggccgcg attgggacta ctttgactat tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc 360
tca 363
<210> 172
<211> 121
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 172
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Thr Phe
20 25 30
Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Val Ile Pro Val Ser Gly Thr Glu Asp Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Leu Ser Leu Thr Ala Asp Glu Ser Thr Gly Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Ser Gly Arg Asp Trp Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 173
<211> 15
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 173
acctttgcga tcaac 15
<210> 174
<211> 51
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 174
ggggtcatcc ctgtctctgg aacagaagac tactcacaga agttccaggg c 51
<210> 175
<211> 36
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 175
gatcgaagtg gccgcgattg ggactacttt gactat 36
<210> 176
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 176
Thr Phe Ala Ile Asn
1 5
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<211> 17
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 177
Gly Val Ile Pro Val Ser Gly Thr Glu Asp Tyr Ser Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 178
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 178
Asp Arg Ser Gly Arg Asp Trp Asp Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 179
<211> 330
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 179
caatctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60
tcctgcactg gaaccagcag tgacgttggt ggttataact atgtctcctg gtaccaacag 120
cacccaggca aagcccccaa actcttgatt tatgaggtca gtcagcggcc ctcaggggtc 180
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caggctgaag atgaggctga ctattattgc agctcatatg caggcgacag ggacgtcttc 300
ggaactggga cccagctcac cgttttaagt 330
<210> 180
<211> 110
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 180
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Glu Val Ser Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Val Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Ala Gly Asp
85 90 95
Arg Asp Val Phe Gly Thr Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu Ser
100 105 110
<210> 181
<211> 42
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 181
actggaacca gcagtgacgt tggtggttat aactatgtct cc 42
<210> 182
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 182
gaggtcagtc agcggccctc a 21
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<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 183
agctcatatg caggcgacag ggacgtc 27
<210> 184
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 184
Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser
1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 185
Glu Val Ser Gln Arg Pro Ser
1 5
<210> 186
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 186
Ser Ser Tyr Ala Gly Asp Arg Asp Val
1 5
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<211> 363
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 187
cagatgcagc tggtgcagtc tgggggagac ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctatagca tgaactgggt ccgccaggct 120
ccaggaaagg ggctggagtg ggtctcatcc attagtagta gtagtagtta catatactac 180
gcagactcag tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagaggtctc 300
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tca 363
<210> 188
<211> 121
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 188
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Leu Gly Gly Trp Thr His Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 189
<211> 15
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 189
agctatagca tgaac 15
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<211> 51
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 190
tccattagta gtagtagtag ttacatatac tacgcagact cagtgaaggg c 51
<210> 191
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<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 191
ggtctcggtg gctggaccca tgatgctttt gatatc 36
<210> 192
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 192
Ser Tyr Ser Met Asn
1 5
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<211> 17
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 193
Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 194
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 194
Gly Leu Gly Gly Trp Thr His Asp Ala Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 195
<211> 333
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 195
cagtctgccc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60
tcttgttctg gaagcagctc caacatcgga agtaattatg tatactggta ccagcagctc 120
ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat aggaataatc agcggccctc aggggtccct 180
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tccgaggatg aggctgatta ttactgtgca gcatgggatg acagcctgag tgcctgggtg 300
ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta ggt 333
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<211> 111
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 196
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
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Ser Ala Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
<210> 197
<211> 39
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 197
tctggaagca gctccaacat cggaagtaat tatgtatac 39
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<211> 21
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 198
aggaataatc agcggccctc a 21
<210> 199
<211> 33
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 199
gcagcatggg atgacagcct gagtgcctgg gtg 33
<210> 200
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 200
Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Tyr Val Tyr
1 5 10
<210> 201
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 201
Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser
1 5
<210> 202
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 202
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ser Ala Trp Val
1 5 10
<210> 203
<211> 363
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 203
caggtacagc tgcagcagtc aggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60
tcctgcaagg catctggata caccttctcc agatactata tccactgggt gcgacaggcc 120
cctggtcaag ggcttgagtg gatgggaata atcaacactg atggtggcac cacaacctac 180
gcacagaagt ttcagggcag actcaccatg accagggaca cgtccacgag caccgtctac 240
atggaactga gcagcctgag atctgacgac acggccgtct attactgtgc gagagattat 300
gggactatag atgctcgtcg ttttgactac tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc 360
tca 363
<210> 204
<211> 121
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 204
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Thr Asp Gly Gly Thr Thr Thr Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Leu Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Tyr Gly Thr Ile Asp Ala Arg Arg Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 205
<211> 15
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 205
agatactata tccac 15
<210> 206
<211> 51
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 206
ataatcaaca ctgatggtgg caccacaacc tacgcacaga agtttcaggg c 51
<210> 207
<211> 36
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 207
gattatggga ctatagatgc tcgtcgtttt gactac 36
<210> 208
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 208
Arg Tyr Tyr Ile His
1 5
<210> 209
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 209
Ile Ile Asn Thr Asp Gly Gly Thr Thr Thr Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 210
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 210
Asp Tyr Gly Thr Ile Asp Ala Arg Arg Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 211
<211> 327
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 211
gaaatagtga tgacgcagtc cccagccacc ctgtctgtgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcaacttag cctggtacca gcagaaacct 120
ggccaggctc ccaggctcct catctatggt gcatccacca gggccactgg tatcccagcc 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagag ttcactctca ccatcagcag cctgcagtct 240
gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag tataataact ggcctccgta cacttttggc 300
caggggacca aggtggagat caaacgt 327
<210> 212
<211> 109
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 212
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Pro
85 90 95
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 213
<211> 33
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 213
agggccagtc agagtgttag cagcaactta gcc 33
<210> 214
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 214
ggtgcatcca ccagggccac t 21
<210> 215
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 215
cagcagtata ataactggcc tccgtacact 30
<210> 216
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 216
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala
1 5 10
<210> 217
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 217
Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr
1 5
<210> 218
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 218
Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Pro Tyr Thr
1 5 10
<210> 219
<211> 378
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 219
caggtcacct tgaaggagtc tgggcccacg ctggtgaaac ccacacagac cctcacgctg 60
acgtgcacct tctctggctt ctcactcaat agttttggag tggctgtggg ctggttccgt 120
cagcccccag gaaaggccct ggagtggctt ggacttattt attgggatga tgacaggcgc 180
tacttcccat cgctggaggg caggctctcc atcaccaagg acgcctccga taacaacgtg 240
gtcctgacaa tgatgaacgt ggaccctgcg gacacagcca catattattg tgcacggact 300
tcccctatgg ttcagggaat tgcaaactac tacgctatgg acgtctgggg ccaagggacc 360
acggtcaccg tctcctca 378
<210> 220
<211> 126
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 220
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Asn Ser Phe
20 25 30
Gly Val Ala Val Gly Trp Phe Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Leu Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Arg Arg Tyr Phe Pro Ser
50 55 60
Leu Glu Gly Arg Leu Ser Ile Thr Lys Asp Ala Ser Asp Asn Asn Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Met Asn Val Asp Pro Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Thr Ser Pro Met Val Gln Gly Ile Ala Asn Tyr Tyr Ala
100 105 110
Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 221
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 221
agttttggag tggctgtggg c 21
<210> 222
<211> 48
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 222
cttatttatt gggatgatga caggcgctac ttcccatcgc tggagggc 48
<210> 223
<211> 48
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 223
acttccccta tggttcaggg aattgcaaac tactacgcta tggacgtc 48
<210> 224
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 224
Ser Phe Gly Val Ala Val Gly
1 5
<210> 225
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 225
Leu Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Arg Arg Tyr Phe Pro Ser Leu Glu Gly
1 5 10 15
<210> 226
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 226
Thr Ser Pro Met Val Gln Gly Ile Ala Asn Tyr Tyr Ala Met Asp Val
1 5 10 15
<210> 227
<211> 109
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 227
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Pro
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Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 228
<211> 126
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 228
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Asn Ser Phe
20 25 30
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Trp Leu Gly Leu Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Arg Arg Tyr Phe Pro Ser
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Leu Glu Gly Arg Leu Ser Ile Thr Lys Asp Ala Ser Asp Asn Asn Val
65 70 75 80
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Cys Ala Arg Thr Ser Pro Met Val Gln Gly Ile Ala Asn Tyr Tyr Ala
100 105 110
Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
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<213> 智人(Homo sapiens)
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ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcaacttag cctggtacca gcagaaacct 120
ggccaggctc ccaggctcct catctatggt gcatccacca gggccactgg tatcccagcc 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagag ttcactctca ccatcagcag cctgcagtct 240
gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag tataataact ggcctccgta cacttttggc 300
caggggacca aggtggagat caaacgt 327
<210> 230
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<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 230
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acgtgcacct tctctggctt ctcactcaat agttttggag tggctgtggg ctggttccgt 120
cagcccccag gaaaggccct ggagtggctt ggacttattt attgggatga tgacaggcgc 180
tacttcccat cgctggaggg caggctctcc atcaccaagg acgcctccga taacaacgtg 240
gtcctgacaa tgatgaacgt ggaccctgcg gacacagcca catattattg tgcacggact 300
tcccctatgg ttcagggaat tgcaaactac tacgctatgg acgtctgggg ccaagggacc 360
acggtcaccg tctcctca 378
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<213> 智人(Homo sapiens)
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<213> 智人(Homo sapiens)
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<213> 智人(Homo sapiens)
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<213> 智人(Homo sapiens)
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1 5
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<213> 智人(Homo sapiens)
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1 5 10 15
Gly
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<213> 智人(Homo sapiens)
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 237
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1 5 10 15
Ser Thr Ile Tyr Gly Ser Arg
20
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 238
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1 5 10 15
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 239
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<213> 智人(Homo sapiens)
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 241
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Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 243
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
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<213> 智人(Homo sapiens)
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 245
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 249
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<213> 智人(Homo sapiens)
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<213> 智人(Homo sapiens)
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
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<213> 智人(Homo sapiens)
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<400> 264
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<400> 278
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<213> 智人(Homo sapiens)
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<400> 287
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 289
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<213> 智人(Homo sapiens)
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<213> 智人(Homo sapiens)
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 294
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<211> 119
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 295
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 296
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Trp Val Ser Ser Leu Gln Met Asp Asn Leu Arg Ala Glu Asp Leu Val
20 25 30
Lys Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ile Ser Ser Ser Ser Thr His Ile
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Tyr Tyr Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Thr Ser Cys Glu Ala
50 55 60
Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ala Asp Ser Leu Lys Gly Arg Phe Thr Ile
65 70 75 80
Ile Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Tyr Ser Met Asn Trp
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Val Arg Gln Ala Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Phe Leu Val
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Thr Val Ser Ser
115
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 297
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Pro Gly Gln Gly Leu Glu
1 5 10 15
Trp Met Gly Trp Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Val
20 25 30
Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Met Asn Pro Asn Ser Gly Asn
35 40 45
Ser Val Ser Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Ser Ser Cys Lys
50 55 60
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65 70 75 80
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Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
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<211> 121
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 298
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Ile Asn Pro Gly Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
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Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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100 105 110
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 299
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Pro Gly Gln Gly Leu Glu
1 5 10 15
Trp Met Gly Trp Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Val Lys
20 25 30
Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ile Ser Thr Tyr Asn Gly Asn Thr
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 300
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 301
Glu Ala Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Pro Gly Lys Gly Leu Lys
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 302
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Pro Gly Gln Gly Leu Glu
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Trp Met Gly Ile Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Val Lys
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<211> 11
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<211> 7
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Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser
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<213> 智人(Homo sapiens)
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 390
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Gly
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Asp
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Gly
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Gly
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Gly
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Gly
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<400> 444
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Gly
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Gly
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Gly
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Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ser Met Asn
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<211> 17
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Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
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Gly
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<213> 智人(Homo sapiens)
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 481
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<211> 17
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 482
Ser Ile Ser Ser Ser Ser Thr His Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Leu Lys
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Gly
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 483
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<212> PRT
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Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Ile His
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<211> 17
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
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Trp Met Asn Pro Asn Ser Gly Asn Ser Val Ser Ala Gln Lys Phe Gln
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Gly
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<211> 12
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
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<212> PRT
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Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Tyr Tyr Ile His
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<211> 17
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Leu Ile Asn Pro Gly Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
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Gly
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Tyr Tyr Ile His
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 491
Gly His Thr Phe Ser Asn Tyr Gly Ile Ser
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<211> 17
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Trp Ile Ser Thr Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu Gln
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Gly
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Asp Tyr Tyr Ser Asp Ser Ser Gly Tyr Trp Asp Asp Ala Phe Asp Ile
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 494
Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Tyr Tyr Ile His
1 5 10
<210> 495
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 495
Leu Ile Asn Pro Gly Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 496
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 496
Asp Tyr Gly Thr Ile Asp Ala Arg Arg Phe Asp Phe
1 5 10
<210> 497
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 497
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr Met Gly
1 5 10
<210> 498
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 498
Tyr Ile Ser Asp Arg Ala His Thr Ile Tyr Asp Thr Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 499
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 499
Ala Val Gly Ala Gly Glu Gly Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 500
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 500
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr Met His
1 5 10
<210> 501
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 501
Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 502
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 502
Gly Gly Tyr Thr Gly Trp Ser Pro Ser Asp Pro
1 5 10

Claims (23)

1.一种分离的人类抗受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)抗体或其抗原结合片段，其包含轻链(LC)可变区和重链(HC)可变区，所述LC可变区包含氨基酸序列为SEQ ID NO:381的LC互补决定区1(CDR1)、氨基酸序列为SEQ ID NO:382的LC互补决定区2(CDR2)和氨基酸序列为SEQ ID NO:383的LC互补决定区3(CDR3)；所述HC可变区包含氨基酸序列为SEQ IDNO:487的HC CDR1、氨基酸序列为SEQ ID NO:488的HC CDR2和氨基酸序列为SEQ ID NO:489的HC CDR3。
2.根据权利要求1所述的分离抗体或其抗原结合片段，其中所述LC可变区与SEQ IDNO:267至少90％一致和/或所述HC可变区与SEQ ID NO:298至少90％一致。
3.根据权利要求2所述的分离抗体或其抗原结合片段，其中所述LC可变区包含SEQ IDNO:267并且所述HC可变区包含SEQ ID NO:298。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的分离抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段包含选自以下的片段：VH、VL、Fv、Fab、Fab’、scFv和F(ab’)2。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的分离抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段展现针对ROR1的3.02nM的IC50。
6.根据权利要求1-3中任一项所述的分离抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段介导表达ROR1的肿瘤细胞的杀死，阻断Wnt5a与ROR1蛋白的结合，阻断Wnt5a诱导的ROR1磷酸化，抑制癌细胞增殖，或在结合ROR 1时被表达ROR1的肿瘤细胞内吞。
7.根据权利要求1-3中任一项所述的分离抗体或其抗原结合片段，其还包含细胞毒性部分以形成抗体-药物结合物(ADC)。
8.根据权利要求7所述的分离抗体或其抗原结合片段，其中所述细胞毒性部分是毒素或者发射α粒子的放射性核苷酸。
9.根据权利要求8所述的分离抗体或其抗原结合片段，其中所述毒素是单甲基奥瑞他汀E(monomethyl auristatin E，MMAE)、单甲基奥瑞他汀F(monomethyl auristatin F，MMAF)或美登素。
10.根据权利要求8所述的分离抗体或其抗原结合片段，其中所述发射α粒子的放射性核苷酸是225Ac标记。
11.一种多核苷酸，其包含编码权利要求1-10中任一项所述的分离抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。
12.权利要求1-10中任一项所限定的分离抗体或其抗原结合片段、或权利要求11所限定的多核苷酸在制备用于治疗或改善癌症的药物中的用途，其中所述癌症是ROR1阳性癌症类型。
13.根据权利要求12所述的用途，其中所述癌症是慢性淋巴细胞性白血病(chroniclymphocyticleukemia，CLL)；套细胞淋巴瘤(mantle celllymphoma，MCL)；B细胞急性成淋巴细胞性白血病(B-cell acute lymphoblastic leukemia，B-ALL)；边缘区淋巴瘤(marginal zone lymphoma，MZL)；神经母细胞瘤；肾癌；肺癌；或乳癌。
14.一种药物组合物，其包含权利要求1-10中任一项所限定的分离抗体或其抗原结合片段、或权利要求11所限定的多核苷酸；以及药学上可接受的媒剂。
15.一种制备权利要求14所述的组合物的方法，所述方法包含将治疗有效量的权利要求1-10中任一项所限定的分离抗体或其抗原结合片段、或权利要求11所限定的多核苷酸与药学上可接受的媒剂组合。
16.一种用于诊断患有癌症或易患癌症的受试者或用于提供受试者的病状的预后的试剂盒，所述试剂盒包含用于检测来自测试受试者的样品中存在的抗原浓度的检测装置，其中所述检测装置包含权利要求1-10中任一项所限定的分离抗体或其抗原结合片段、或权利要求11所限定的多核苷酸，其中所述试剂盒包含阳性对照和/或阴性对照，其中通过将所述样品中抗原的浓度相对于所述阳性对照和/或阴性对照进行比较来表明所述受试者是否患有癌症。
17.根据权利要求16所述的试剂盒，其中所述抗原包含ROR1蛋白。
18.根据权利要求17所述的试剂盒，其中所述抗原包含ROR1蛋白的胞外结构域。
19.根据权利要求16-18中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒用于鉴别所述样品中ROR1阳性细胞的存在或不存在，或确定其在所述样品中的浓度。
20.根据权利要求16-18中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒包含可以检测到的标记。
21.一种基因构建体，其包含权利要求11所述的多核苷酸。
22.一种宿主细胞，其包含权利要求21所述的基因构建体。
23.一种制备重组抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包含(i)培养至少一种权利要求22所限定的能够表达所需抗体或其抗原结合片段的宿主细胞；以及(ii)分离所述抗体或其抗原结合片段。
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