CN110944651A - 用于自然杀伤细胞激活的多特异性结合蛋白及其治疗癌症的治疗性用途 - Google Patents

Abstract

描述了结合肿瘤相关抗原、NKG2D受体和CD16的多特异性结合蛋白以及可用于治疗癌症的药物组合物和治疗方法。

Description

用于自然杀伤细胞激活的多特异性结合蛋白及其治疗癌症的 治疗性用途

与相关申请的交叉引用

本申请要求2017年2月8日提交的美国临时专利申请号62/456,535的利益和优先权，其全部内容为所有目的通过参考并入本文。

序列表

本申请含有以ASCII格式电子提交并整体通过参考并入本文的序列表。所述在2018年2月6日生成的ASCII拷贝被命名为DFY-001PC_SL.txt，大小为71,169个字节。

技术领域

本发明涉及结合肿瘤相关抗原、NKG2D受体和CD16的多特异性结合蛋白。

背景技术

尽管在文献中已报道了治疗癌症的大量研究尝试和科学进展，但这种疾病依然是显著的健康问题。一些最经常被诊断到的癌症包括前列腺癌、乳腺癌和肺癌。前列腺癌是男性中最常见的癌症形式。乳腺癌仍然是女性中死亡的主导原因。当前用于这些癌症的治疗选项不对所有患者有效和/或可能具有严重副作用。其他类型的癌症对于使用现有治疗选项治疗来说也仍然具有挑战性。

癌症免疫疗法是理想的，因为它们是高度特异性的并且可以使用患者自己的免疫系统来促进癌细胞的破坏。融合蛋白例如双特异性T-细胞衔接器是文献中描述的结合到肿瘤细胞和T-细胞以促进肿瘤细胞破坏的癌症免疫疗法。结合到某些肿瘤相关抗原和结合到某些免疫细胞的抗体在文献中已有描述。参见例如WO 2016/134371和WO 2015/095412。

自然杀伤(NK)细胞是先天性免疫系统的组成部分，占循环淋巴细胞的大约15％。NK细胞事实上浸润所有组织，并且最初因它们不需前期致敏即可杀伤肿瘤细胞的能力而被表征。激活的NK细胞通过与细胞毒性T细胞相似的手段杀伤靶细胞，即通过含有穿孔素和颗粒酶的细胞溶解颗粒以及通过死亡受体途径。激活的NK细胞还分泌炎性细胞因子例如IFN-γ和促进其他白细胞向靶组织的招募的趋化因子。

NK细胞通过它们表面上的各种不同激活和抑制受体对信号作出响应。例如，当NK细胞遇到健康的自体细胞时，它们的活性通过杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)的激活而被抑制。或者，当NK细胞遇到外来细胞或癌细胞时，它们通过它们的激活激活性受体(例如NKG2D、NCR、DNAM1)而被激活。NK细胞也通过它们表面上的CD16受体被某些免疫球蛋白的恒定区激活。NK细胞对激活的总体灵敏度取决于刺激性和抑制性信号的总和。

发明内容

本发明提供了结合到癌细胞上的肿瘤相关抗原和自然杀伤细胞上的NKG2D受体和CD16受体以激活自然杀伤细胞的多特异性结合蛋白，包含这些多特异性结合蛋白的药物组合物，以及使用这些多特异性蛋白和药物组合物的治疗方法，包括用于治疗癌症的治疗方法。这些蛋白质可以结合一种以上NK激活激活性受体，并且可以阻断天然配体与NKG2D的结合。在某些实施方式中，所述蛋白质可以在人类和其他物种例如啮齿动物和食蟹猴中激动NK细胞。本发明的各个不同方面和实施方式将在下文中更详细描述。

在某些实施方式中，所述多特异性结合蛋白可以包含结合NKG2D的第一抗原结合位点，结合肿瘤相关抗原的第二抗原结合位点，和抗体Fc结构域、其足以结合CD16的部分或结合CD16的第三抗原结合位点。

在某些实施方式中，所述多特异性结合蛋白是三价的，其包括均结合同一肿瘤相关抗原的第一和第二抗原结合位点，结合NKG2D的第三抗原结合位点，和抗体Fc结构域或其足以结合CD16的部分。

在某些实施方式中，所述多特异性结合蛋白是四价的，其包括均结合同一肿瘤相关抗原的第一和第二抗原结合位点，均结合NKG2D的第三和第四抗原结合位点，和抗体Fc结构域或其足以结合CD16的部分。

所述抗原结合位点可以各自包含抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域(例如像在抗体中那样排列或融合在一起以形成scFv)，或者一个或多个所述抗原结合位点可以是单域抗体，例如V_HH抗体如骆驼抗体、或V_NAR抗体如在软骨鱼中发现的。在某些情况下，所述肿瘤相关抗原可以选自HER2、CD20、CD33、B-细胞成熟抗原(BCMA)、EpCAM、CD2、CD19、CD30、CD38、CD40、CD52、CD70、EGFR/ERBB1、IGF1R、HER3/ERBB3、HER4/ERBB4、MUC1、cMET、SLAMF7、PSCA、MICA、MICB、TRAILR1、TRAILR2、MAGE-A3、B7.1、B7.2、CTLA4和PD1。

本发明的另一方面提供了一种在患者中治疗癌症的方法。所述方法包括向需要的患者施用治疗有效量的本文描述的多特异性结合蛋白，以治疗所述癌症。使用所述多特异性结合蛋白治疗的示例性癌症包括例如表达HER2的癌。

附图描述

图1是一种多特异性结合蛋白的图示，其含有NKG2D结合结构域(右臂)、肿瘤相关抗原结合结构域(左臂)和Fc结构域或其结合到CD16的部分。

图2是一种多特异性结合蛋白的图示，其含有采取scFv格式的NKG2D结合结构域(右臂)、肿瘤相关抗原结合结构域(左臂)和Fc结构域或其结合到CD16的部分。

图3是采取双特异性抗体(Triomab)型的TriNKET的图示，其是一种维持IgG样形状的三功能双特异性抗体。该嵌合体由源自于两个亲本抗体的两个半抗体构成，各自具有一条轻链和一条重链。Triomab型可以是含有¹/₂的大鼠抗体和¹/₂的小鼠抗体的异二聚体构建体。

图4是采取KiH共同轻链(LC)型的TriNKET的图示，其包含杵臼结构(KIH)技术。KiH是含有结合到靶标1和2的2个Fab和通过异二聚作用突变稳定化的F_C的异二聚体。采取KiH格式的TriNKET可以是具有结合到靶1和靶2的2个fab，含有2条不同重链和1条与两个HC配对的共同轻链的异二聚体构建体。

图5是采取双可变结构域免疫球蛋白(DVD-Ig^TM)型的TriNKET的图示，其将两个单克隆抗体的靶结合结构域通过柔性的天然存在的连接物结合，并产生四价IgG样分子。DVD-Ig^TM是同型二聚体构建体，其中靶向抗原2的可变结构域被融合到靶向抗原1的Fab的可变结构域的N端。该构建体含有正常的Fc。

图6是采取正交Fab界面(Ortho-Fab)型的TriNKET，其是含有结合于融合到Fc的靶1和靶2的2个Fab的异二聚体构建体。LC-HC配对通过正交界面来确保。异二聚化通过Fc中的突变来确保。

图7是采取二合一Ig格式的TrinKET的图示。

图8是采取ES型的TriNKET的图示，其是含有结合于融合到Fc的靶1和靶2的2个不同Fab的异二聚体构建体。异二聚作用通过Fc中的静电操控突变来确保。

图9是采取Fab臂交换型的TriNKET的图示：通过将重链(HC)和附连的轻链(LC)(半分子)与来自于另一个分子的重链-轻链对交换来交换Fab臂以产生双特异性抗体的抗体。Fab臂交换型(cFae)是含有结合到靶1和2的2个Fab和通过异二聚化突变稳定化的Fc的异二聚体。

图10采取SEED体型的TriNKET的图示，其是含有结合到靶1和2的2个Fab和通过异二聚作用突变稳定化的Fc的异二聚体。

图11是采取LuZ-Y型的TriNKET的图示，其中使用亮氨酸拉链来诱导两个不同HC的异二聚作用。LuZ-Y型是含有结合于融合到Fc的靶1和2的两个不同scFab的异二聚体。异二聚作用通过融合到Fc的C-端的亮氨酸拉链基序来确保。

图12是采取Cov-X体型的TriNKET的图示。

图13A-13B是采取Kλ体型的TriNKET的图示，其是具有融合到通过异二聚作用突变稳定化的Fc的2个不同Fab的异二聚体构建体：靶向抗原1的Fab1含有κLC，而靶向抗原2的第二个Fab含有λLC。图13A是Kλ体的一种型的示例性图示；图13B是另一种Kλ体的示例性图示。

图14是在ELISA测定法中证实了NKG2D结合结构域(作为克隆列出)对人类重组NKG2D的结合亲和力的图。

图15是在ELISA测定法中证实了NKG2D结合结构域(作为克隆列出)对食蟹猴重组NKG2D的结合亲和力的图。

图16是在ELISA测定法中证实了NKG2D结合结构域(作为克隆列出)对小鼠重组NKG2D的结合亲和力的图。

图17是通过流式细胞术证实了NKG2D结合结构域(作为克隆列出)结合到表达人类NKG2D的EL4细胞的图，示出了与背景相比的平均荧光强度(MFI)倍数。

图18是通过流式细胞术证实了NKG2D结合结构域(作为克隆列出)结合到表达小鼠NKG2D的EL4细胞的图，示出了与背景相比的平均荧光强度(MFI)倍数。

图19是通过与天然配体ULBP-6的竞争证实了NKG2D结合结构域(作为克隆列出)对重组人类NKG2D-Fc的特异性结合亲和力亲和力的图。

图20是通过与天然配体MICA的竞争证实了NKG2D结合结构域(作为克隆列出)对重组小鼠NKG2D-Fc的特异性结合亲和力的图。

图21是通过与天然配体Rae-1δ的竞争证实了NKG2D结合结构域(作为克隆列出)对重组小鼠NKG2D-Fc的特异性结合亲和力的图。

图22是通过定量表达人类NKG2D-CD3ζ融合蛋白的TNF-α阳性细胞的百分率显示出人类NKG2D被NKG2D结合结构域(作为克隆列出)激活的图。

图23是通过定量表达小鼠NKG2D-CD3ζ融合蛋白的TNF-α阳性细胞的百分率显示出小鼠NKG2D被NKG2D结合结构域(作为克隆列出)激活的图。

图24是显示了人类NK细胞被NKG2D结合结构域(作为克隆列出)激活的图。

图25是显示了人类NK细胞被NKG2D结合结构域(作为克隆列出)激活的图。

图26是显示了小鼠NK细胞被NKG2D结合结构域(作为克隆列出)激活的图。

图27是显示了小鼠NK细胞被NKG2D结合结构域(作为克隆列出)激活的图。

图28是显示了NKG2D结合结构域(作为克隆列出)对肿瘤细胞的细胞毒性效应的图。

图29是显示了通过差示扫描荧光测定法测量的NKG2D结合结构域(作为克隆列出)的解链温度的图。

图30是显示了人类NK细胞被多特异性结合蛋白激活的图。

图31是显示了多特异性结合蛋白诱导的人类NK细胞对肿瘤靶细胞的较高水平的细胞毒性的图。

图32是显示了多特异性结合蛋白诱导的人类NK细胞对肿瘤靶细胞的较高水平的细胞毒性的图。

图33是显示了多特异性结合蛋白诱导的人类NK细胞对肿瘤靶细胞的较高水平的细胞毒性的图。

图34是显示了多特异性结合蛋白诱导的人类NK细胞对肿瘤靶细胞的较高水平的细胞毒性的图。

图35是显示了多特异性结合蛋白诱导的小鼠NK细胞对肿瘤靶细胞的较高水平的细胞毒性的图。

图36是显示了多特异性结合蛋白诱导的小鼠NK细胞对肿瘤靶细胞的较高水平的细胞毒性的图。

图37是靶向CD33的TriNKET与EL4细胞上表达的NKG2D的结合概况图。图37示出了当CD33结合结构域被用作第二靶向臂时两种TriNKET的结合。

图38是靶向HER2的TriNKET与EL4细胞上表达的NKG2D的结合概况图。图38示出了现在与HER2第二靶向臂配对的相同的两个NKG2D结合结构域。

图39是靶向BCMA的TriNKET与EL4细胞上表达的NKG2D的结合概况图。

图40是结合到EL4细胞上表达的NKG2D的靶向CD20的TriNKET的直方图。未染色的EL4细胞被用作荧光信号的阴性对照。未染色的：实心的；CD20-TriNKET-F04：实线；CD20-TriNKET-C26：虚线。

图41是靶向CD33的TriNKET与MV4-11人类AML细胞上表达的CD33的结合概况图。

图42是靶向HER2的TriNKET与人类786-O肾细胞癌细胞上表达的HER2的结合概况图。

图43是靶向BCMA的TriNKET与MM.1S人类骨髓瘤细胞上表达的BCMA的结合概况图。

图44是结合到Raji人类淋巴瘤细胞上表达的CD20的靶向CD20的TriNKET的直方图。未染色的细胞被用作荧光信号的阴性对照。未染色的：实心的；CD20-TriNKET-F04：实线；CD20-TriNKET-C26：虚线。

图45A-45C是NK细胞使用CD16和NKG2D的协同激活的柱状图。图45A展示了CD107a的水平；图45B展示了IFNγ的水平；图45C展示了CD107a和IFNγ的水平。图指示了平均值(n＝2)±SD。数据代表了使用5位不同健康供体的5个独立实验。

图46是显示了用靶向NKG2D和CD16的TriNKET激活NK细胞的柱状图。试验的抗体是人类IgG1同种型。图指示了平均值(n＝2)±SD。

图47A–47C是证实了TriNKET和曲妥珠单抗能够激活与HER2阳性人类肿瘤细胞共培养的原代人类NK细胞的柱状图，所述激活由CD107a脱颗粒和IFNγ细胞因子生产的增加所指示。与单克隆抗体曲妥珠单抗相比，两种TriNKET在使用各种不同的人类HER2癌细胞时显示出人类NK细胞的超强激活。图47A显示出人类NK细胞在与SkBr-3细胞培养时被TriNKET激活。图47B显示出人类NK细胞在与Colo201细胞培养时被TriNKET激活。图47C显示出人类NK细胞在与HCC1954细胞培养时被TriNKET激活。

图48A–48B是证实了与表达CD33的人类AML细胞系MV4-11共培养的静息或IL-2激活的人类NK细胞的TriNKET介导的激活的线形图。图48A示出了静息人类NK细胞的TriNKET介导的激活。图48B示出了来自于同一供体的IL-2激活的人类NK细胞的TriNKET介导的激活。

图49A–49B是使用IL-2激活的和静息的人类NK细胞证实了细胞毒性活性的TriNKET增强的图。图49A示出了SkBr-3肿瘤细胞被静息人类NK细胞特异性裂解的百分数。图49B示出了SkBr-3肿瘤细胞被IL-2激活的人类NK细胞特异性裂解的百分数。

图50A-50B是证实了TriNKET与曲妥珠单抗相比针对中和低HER2癌症提供更大优势的图。图50示出了高HER2-SkBr-3肿瘤细胞被激活的人类NK细胞的杀伤。图50B示出了低HER2-786-O肿瘤细胞被人类NK细胞的杀伤。TriNKET与曲妥珠单抗相比针对具有低HER2表达的癌细胞提供更大优势。

图51A–51C是示出了在三种人类AML细胞系Molm-13细胞系(图51A)、Mv4-11细胞系(图51B)和THP-1细胞系(图51C)上高亲和力FcRγI(CD64)的表达的直方图。

图52A-52B是与Molm-13(图52B)或THP-1(图52A)细胞共培养的人类NK细胞的单克隆抗体或TriNKET介导的激活的线形图。

图53A–53C是使用三种人类AML细胞系作为靶的人类NK细胞毒性测定法的线形图。图53A显示出以比THP-1更低的水平表达CD64的Mv4-11细胞在使用单克隆抗CD33抗体时显示出降低的功效。图53B证实了针对CD33的单克隆抗体对不表达CD64的Molm-13细胞显示出良好的功效。图53C证实了THP-1细胞在使用单独的单克隆抗CD33抗体是不显示出效果。在图53C中标注的线形图的身份也适用于图53A-53B中的线形图。

图54A和54B是显示出来自于健康供体的B细胞对TriNKET介导的裂解敏感的柱状图。

图54C和54D是显示出髓系细胞对TriNKET介导的裂解具有抗性的柱状图。

图55是在长期共培养物中TriNKET介导的SkBr-3肿瘤细胞被hPBMC的杀伤的线形图。

图56是RMA/S-HER2皮下SC2.2功效的研究设计的流程图。

图57是显示出SC2.2对皮下RMA/S-HER2肿瘤生长没有影响的线形图。

图58A–58B是显示出mcFAE-C26.99 TriNKET的体外结合的图。向2x10⁵个B16F10肿瘤细胞(图58A)或EL4-mNKG2D细胞(图58B)添加60μg/mL的具有4倍稀释度的所指示的抗体。结合使用山羊抗小鼠PE第二抗体，然后通过流式细胞术分析来分析。

图59是显示出由mcFAE-C26.99 TriNKET介导的NK细胞毒性提高的图。

图60A–60B显示了mcFAE-C26.99 TriNKET在B16F10 s.c.模型中的抗肿瘤功效。将小鼠用以150μg的剂量注射(第6、8、10、12、14、16和21天)的(图60A)同种型对照小鼠IgG2amab C1.18.4和小鼠抗Tyrp-1单克隆抗体或(图60B)同种型对照小鼠IgG2a mab C1.18.4和mcFAE-C26.99 TriNKET进行腹膜内治疗。对肿瘤生长进行28天的评估。图显示了个体小鼠的肿瘤生长曲线。

图61A–61B显示了mcFAE-C26.99 TriNKET在B16F10 i.v.模型中的抗肿瘤功效。图61A表示当抗体以150-μg剂量施用(第4、6、8、11、13、15天)时的肿瘤负荷。图61B表示当抗体以150-μg剂量施用(第7、9、11、13、15天)时的肿瘤负荷。在肿瘤挑战后18天，将小鼠安乐死并对表面肺转移肿瘤进行评分。

图62是显示了人类NK细胞在与CD20+Raji细胞培养时被TriNKET激活的柱状图。

图63是显示了人类NK在与BCMA阳性MM.1S人类骨髓瘤细胞培养时的激活的柱状图。

图64是显示了TriNKET增强人类NK细胞对KMS12-PE骨髓瘤细胞的裂解的图。

图65是显示了具有不同NKG2D结合结构域的靶向BCMA的TriNKET增强人类NK细胞对KMS12-PE骨髓瘤细胞的裂解的图。

图66是线形图，显示了一个分子中的三特异性结合对最大NK细胞活性来说是重要的。

图67是Oasc-Fab异二聚体构建体，其包括融合到Fc的结合到靶1的Fab和结合到靶2的scFab。异二聚作用通过Fc中的突变来确保。

图68是DuetMab，其是含有结合到抗原1和2的2个不同Fab和通过异二聚化突变稳定化的F_C的异二聚体构建体。Fab 1和2含有不同的S-S桥，其确保正确的LC和HC配对。

图69是CrossmAb，其是具有融合到通过异二聚化稳定化的Fc的结合到靶1和2的2个不同Fab的异二聚体构建体。CL和CH1结构域与Vh和VL结构域被调换，例如CH1与VL内联融合，而CL与VH内联融合。

图70是Fit-Ig，其是一种同二聚体构建体，其中结合到抗原2的Fab被融合到结合到抗原1的Fab的HC的N端。所述构建体含有野生型Fc。

详细描述

本发明提供了结合癌细胞上的肿瘤相关抗原和自然杀伤细胞上的NKG2D受体和CD16受体以激活所述自然杀伤细胞的多特异性结合蛋白，包含这些多特异性结合蛋白的药物组合物，以及使用这些多特异性蛋白和药物组合物的治疗方法，包括用于治疗癌症的治疗方法。本发明的各个不同方面在下文分章节阐述；然而，在一个特定章节中描述的本发明的方面不应限于任何特定章节。

为了便于本发明的理解，下文定义了许多术语和短语。

当在本文中使用时，没有具体数目的指称意味着“一个或多个”，并包括复数指称物，除非上下文不适合。

当在本文中使用时，术语“抗原结合位点”是指免疫球蛋白分子中参与抗原结合的部分。在人类抗体中，抗原结合位点由重(“H”)链和轻(“L”)链的N-端可变(“V”)区的氨基酸残基形成。所述重链和轻链的V区内的三个高度趋异的区段被称为“高变区”，它们插入在被称为“构架区”或“FR”的更保守的侧翼区段之间。因此，术语“FR”是指天然存在于免疫球蛋白中的高变区之间并与其相邻的氨基酸序列。在人类抗体分子中，轻链的三个高变区和重链的三个高变区在三维空间中相对于彼此配置，以形成抗原结合表面。所述抗原结合表面与被结合的抗原的三维表面互补，并且每个重链和轻链的三个高变区被称为“互补决定区”或“CDR”。在某些动物例如骆驼和软骨鱼类中，抗原结合位点由单条抗体链形成，提供了“单域抗体”。抗原结合位点可以存在于完整抗体中、抗体的保留了抗原结合表面的抗原结合片段中或重组多肽例如scFv中，所述scFv在单一多肽中使用肽连接物将重链可变结构域连接到轻链可变结构域。

当在本文中使用时，术语“肿瘤相关抗原”意味着与癌症相关的任何抗原，包括但不限于蛋白质、糖蛋白、神经节苷脂、糖类、脂类。这些抗原可以表达在恶性细胞上或肿瘤微环境中，例如与肿瘤相关的血管、细胞外基质、间充质基质或免疫浸润物。

当在本文中使用时，术语“受试者”和“患者”是指将要通过本文描述的方法和组合物治疗的生物体。这些生物体优选地包括但不限于哺乳动物(例如鼠科、猿猴、马科、牛科、猪科、犬科、猫科动物等)，更优选地包括人类。

当在本文中使用时，术语“有效量”是指化合物(例如本发明的化合物)的足以实现有益或期望结果的量。有效量可以在一次或多次施用、应用或剂量中施用，并且不打算限于特定制剂或施用途径。当在本文中使用时，术语“治疗”包括导致病症、疾病、障碍等的改善的任何效应例如减轻、降低、调节、改善或消除或改善其症状。

当在本文中使用时，术语“药物组合物”是指活性药剂与惰性或有活性的载体的组合，使得所述组合物特别适合于体内或离体诊断或治疗用途。

当在本文中使用时，术语“可药用载体”是指任何标准的制药载体，例如磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液(例如油/水或水/油乳液)和各种不同类型的润湿剂。所述组合物也可以包括稳定剂和防腐剂。对于载体、稳定剂和佐剂的实例，参见例如Martin，《Remington's制药学》(Remington's Pharmaceutical Sciences)，第15版，Mack Publ.Co.,Easton,PA[1975]。

当在本文中使用时，术语“可药用盐”是指本发明的化合物的任何制药上可接受的盐(例如酸或碱式盐)，其在施用到受试者后，能够提供本发明的化合物或其有活性的代谢物或残留物。正如本领域技术人员所知，本发明的化合物的“盐”可以源自于无机或有机酸和碱。示例性的酸包括但不限于盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、延胡索酸、马来酸、磷酸、乙醇酸、乳酸、水杨酸、琥珀酸、对甲苯磺酸、酒石酸、乙酸、柠檬酸、甲磺酸、乙磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、萘-2-磺酸、苯磺酸等。其他酸例如草酸，尽管本身不是可药用的，但可用于制备在获得本发明的化合物及其可药用酸加成盐中可用作中间体的盐。

示例性的碱包括但不限于碱金属(例如钠)氢氧化物、碱土金属(例如镁)氢氧化物、氨和式NW₄ ⁺的化合物(其中W是C_1-4烷基)等。

示例性的盐包括但不限于：乙酸盐，己二酸盐，藻酸盐，天冬氨酸盐，苯甲酸盐，苯磺酸盐，硫酸氢盐，丁酸盐，柠檬酸盐，樟脑酸盐，樟脑磺酸盐，环戊烷丙酸盐，二葡萄糖酸盐，十二烷基硫酸盐，乙磺酸盐，延胡索酸盐，氟代庚酸盐，甘油磷酸盐，半硫酸盐，庚酸盐，己酸盐，盐酸盐，氢溴酸盐，氢碘酸盐，2-羟基乙磺酸盐，乳酸盐，马来酸盐，甲磺酸盐，2-萘磺酸盐，烟酸盐，草酸盐，棕榈酸盐，果胶酸盐，过硫酸盐，苯基丙酸盐，苦味酸盐，新戊酸盐，丙酸盐，琥珀酸盐，酒石酸盐，硫氰酸盐，甲苯磺酸盐，十一烷酸盐等。盐的其他实例包括与适合的阳离子例如Na⁺、NH₄ ⁺和NW₄ ⁺(其中W是C_1-4烷基)等化合的本发明的化合物的阴离子。

对治疗应用来说，设想的本发明的化合物的盐是可药用的。然而，不可药用的酸和碱的盐也可用于例如可药用化合物的制备或纯化中。

在整个本描述中，在组合物被描述为具有、包括或包含特定组分时，或在过程和方法被描述为具有、包括或包含特定步骤时，设想了另外还存在基本上由所叙述的组分构成或由所叙述的组分构成的本发明的组合物，并且还存在基本上由所叙述的过程步骤构成或由所叙述的过程步骤构成的符合本发明的过程和方法。

一般来说，除非另有规定，否则规定百分率的组成是以重量计的。此外，如果变量不伴有定义，则以所述变量的以前的定义为准。

I.蛋白质

本发明提供了结合癌细胞上的肿瘤相关抗原和自然杀伤细胞上的NKG2D受体和CD16受体以激活所述自然杀伤细胞的多特异性结合蛋白。所述多特异性结合蛋白在本文描述的药物组合物和治疗方法中有用。所述多特异性结合蛋白与自然杀伤细胞上的NKG2D受体和CD16受体的结合增强了所述自然杀伤细胞对癌细胞的破坏的活性。所述多特异性结合蛋白与癌细胞上的肿瘤相关抗原的结合将所述癌细胞带到所述自然杀伤细胞附近，促进了所述癌细胞被所述自然杀伤细胞的直接和间接破坏。示例性的多特异性结合蛋白的进一步描述在下文中提供。

所述多特异性结合蛋白的第一组分结合到表达NKG2D受体的细胞，其可以包括但不限于NK细胞、γδT细胞和CD8⁺αβT细胞。在结合NKG2D后，所述多特异性结合蛋白可以阻断天然配体例如ULBP6和MICA结合到NKG2D。

所述多特异性结合蛋白的第二组分结合到一种或多种肿瘤相关抗原，其可以包括但不限于HER2、CD20、CD33、BCMA、EpCAM、CD2、CD19、CD30、CD38、CD40、CD52、CD70、EGFR/ERBB1、IGF1R、HER3/ERBB3、HER4/ERBB4、MUC1、cMET、SLAMF7、PSCA、MICA、MICB、TRAILR1、TRAILR2、MAGE-A3、B7.1、B7.2、CTLA4和PD1。

所述多特异性结合蛋白的第三组分结合到表达CD16的细胞，所述CD16是白细胞包括自然杀伤细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜曙红细胞、肥大细胞和滤泡树突细胞的表面上的Fc受体。

所述多特异性结合蛋白可以采取几种格式，如下述实例中所示但不限于它们。一种格式是异二聚体、多特异性抗体，其包括第一免疫球蛋白重链、第二免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链。所述第一免疫球蛋白重链包括第一Fc(铰链-CH2-CH3)结构域、第一可变重链结构域和任选的第一CH1重链结构域。所述免疫球蛋白轻链包括可变轻链结构域和恒定轻链结构域；与所述第一免疫球蛋白重链一起，所述免疫球蛋白轻链形成结合NKG2D的抗原结合位点。所述第二免疫球蛋白重链包含第二Fc(铰链-CH2-CH3)结构域、第二可变重链结构域和第二任选的CH1重链结构域，其可以与所述第一免疫球蛋白重链所配对的轻链相一致的免疫球蛋白轻链配对，除了当免疫球蛋白轻链与所述第二免疫球蛋白重链配对时之外，得到的抗原结合位点结合到肿瘤抗原。所述第一Fc结构域和第二Fc结构域一起能够结合到CD16(图1)。

另一种示例性格式涉及一种异二聚体、多特异性抗体，其包括第一免疫球蛋白重链、免疫球蛋白轻链和第二免疫球蛋白重链。所述第一免疫球蛋白重链包括第一Fc(铰链-CH2-CH3)结构域，其通过连接物或抗体铰链融合到结合NKG2D的单链Fv(scFv)。各种不同的连接物可用于将所述scFv连接到所述第一Fc结构域或所述scFv自身内部的连接。此外，所述scFv可以包含能够形成二硫键以使整个scFv结构稳定的突变。所述scFv还可以包含突变以修改所述整个第一免疫球蛋白重链的等电点和/或能够更容易进行下游纯化。所述第二免疫球蛋白重链包括第二Fc(铰链-CH2-CH3)结构域和第二可变重链结构域和第二任选的CH1重链结构域。所述免疫球蛋白轻链包括可变轻链结构域和恒定轻链结构域。所述第二免疫球蛋白重链与所述免疫球蛋白轻链配对并结合到肿瘤抗原。所述第一Fc结构域和第二Fc结构域一起能够结合到CD16(图2)。

所述异二聚体多特异性蛋白的可选格式包括第一免疫球蛋白重链、第二免疫球蛋白重链、第一免疫球蛋白轻链和第二免疫球蛋白轻链。所述第一免疫球蛋白重链包括第一Fc(铰链-CH2-CH3)结构域、第一可变重链结构域和任选的第一CH1重链结构域。所述第一免疫球蛋白轻链包括可变轻链结构域和恒定轻链结构域。与所述第一免疫球蛋白重链一起，所述第一免疫球蛋白轻链形成结合肿瘤抗原的抗原结合位点。所述第二免疫球蛋白重链包含第二Fc(铰链-CH2-CH3)结构域、第二可变重链结构域和第二任选的CH1重链结构域。所述第二免疫球蛋白轻链包括可变轻链结构域和恒定轻链结构域。与所述第二免疫球蛋白重链一起，所述免疫球蛋白轻链形成结合到同一肿瘤抗原的抗原结合位点。所述第二免疫球蛋白重链可以与免疫球蛋白轻链配对，所述轻链可以与所述第一免疫球蛋白重链所配对的免疫球蛋白轻链相一致，除了当免疫球蛋白轻链与所述第二免疫球蛋白重链配对时之外，得到的抗原结合位点是结合到肿瘤抗原的第二抗原结合位点。在某些实施方式中，所述第一Fc结构域和第二Fc结构域一起能够结合到CD16(图1)。

一个或多个另外的结合基序，可以任选地通过连接物序列融合到所述恒定区CH3结构域的C-端。在某些实施方式中，所述抗原结合位点可以是单链或二硫键稳定的可变区(ScFv)或可以形成四价或三价分子。

在某些实施方式中，所述多特异性结合蛋白采取三功能抗体型，其是维持IgG样形状的三功能、双特异性抗体。这种嵌合体由源自于两个亲本抗体的两个半抗体构成，各自具有一条轻链和一条重链。

在某些实施方式中，所述多特异性结合蛋白是KiH共同轻链(LC)型，其涉及杵臼结构(KIH)技术。所述KIH包括工程化的C_H3结构域，以在每条重链中产生“杵”或“臼”来促进异二聚作用。在“杵臼结构(KiH)”Fc技术背后的概念是通过将小残基用大体积的残基替换而在一个CH3结构域(CH3A)中引入“杵”(即采取EU编号的T366W_CH3A)。为了容纳所述“杵”，通过将最邻近所述杵的残基用较小的残基代替，在另一个CH3结构域(CH3B)上产生互补的“臼”表面(即T366S/L368A/Y407V_CH3B)。所述“臼”突变通过结构化指导的噬菌体筛选进行优化(Atwell S,Ridgway JB,Wells JA,Carter P.，使用噬菌体展示文库从同二聚体的结构域界面的重塑得到的稳定的异二聚体(Stable heterodimers from remodeling the domaininterface of a homodimer using a phage display library)，J Mol Biol(1997)270(1):26–35)。KiH Fc变体的X-射线晶体结构(Elliott JM,Ultsch M,Lee J,Tong R,TakedaK,Spiess C等，杵和臼非糖基化半抗体同二聚体的反平行构象由CH2-CH3疏水相互作用介导(Antiparallel conformation of knob and hole aglycosylated half-antibodyhomodimers is mediated by a CH2-CH3 hydrophobic interaction)，J Mol Biol(2014)426(9):1947–57；Mimoto F,Kadono S,Katada H,Igawa T,Kamikawa T,Hattori K等，对FcγR具有提高的亲和性的新的不对称工程化Fc变体的晶体结构(Crystal structure of anovel asymmetrically engineered Fc variant with improved affinity forFcgammaRs)，Mol Immunol(2014)58(1):132–8)证实了由CH3结构域间核心界面处的空间互补性驱动的疏水相互作用使异二聚作用在热力学上有利，而杵-杵和臼-臼界面分别由于空间位阻和有利相互作用的破坏而不利于同二聚作用。

在某些实施方式中，所述多特异性结合蛋白采取双可变结构域免疫球蛋白(DVD-Ig^TM)形成，其通过柔性的天然存在的连接物将两个单克隆抗体的靶结合结构域合并，并得到四价IgG样分子。

在某些实施方式中，所述多特异性结合蛋白采取正交Fab界面(Ortho-Fab)型。在ortho-Fab IgG方法中(Lewis SM,Wu X,Pustilnik A,Sereno A,Huang F,Rick HL等，通过正交Fab界面的基于结构的设计产生双特异性IgG抗体(Generation of bispecific IgGantibodies by structure-based design of an orthogonal Fab interface)，Nat.Biotechnol.(2014)32(2):191–8)，基于结构的区域性设计在仅仅一个Fab中的LC和HC_VH-CH1界面处引入互补突变，对另一个Fab没有做出任何改变。

在某些实施方式中，所述多特异性结合蛋白采取二合一Ig格式。在某些实施方式中，所述多特异性结合蛋白采取ES型，其是含有融合到Fc的结合到靶1和靶2的2个不同Fab的异二聚体构建体。异二聚作用通过所述Fc中的静电操控突变来确保。在某些实施方式中，所述多特异性结合蛋白采取Kλ体型，其是具有融合到通过异二聚作用突变稳定化的Fc的2个不同Fab的异二聚体构建体：靶向抗原1的Fab1含有κLC，而靶向抗原2的第二Fab含有λLC。图13A是一种型的Kλ体的示例性图示；图13B是另一种Kλ体的示例性图示。

在某些实施方式中，所述多特异性结合蛋白采取Fab臂交换型(通过将重链和附连的轻链(半分子)与来自于另一个分子的重链-轻链对交换来交换Fab臂以产生双特异性抗体的抗体)。在某些实施方式中，所述多特异性结合蛋白采取SEED型(所述链交换工程化结构域(SEED)平台被设计成产生不对称且双特异性的抗体样分子，这种能力扩展了天然抗体的治疗性应用。这种蛋白质工程化平台是基于保守的CH3结构域内免疫球蛋白的结构相关的序列的交换。所述SEED设计允许高效产生AG/GA异二聚体，而不利于AG和GA SEED CH3结构域的同二聚作用。(Muda M.等，Protein Eng.Des.Sel.，2011,24(5):447-54))。在某些实施方式中，所述多特异性结合蛋白采取LuZ-Y型，其中使用亮氨酸拉链来诱导两个不同HC的异二聚作用(Wranik,BJ.等，J.Biol.Chem.(2012),287:43331-9)。

在某些实施方式中，所述多特异性结合蛋白采取Cov-X型(在双特异性CovX体中，两个不同的肽使用支链氮杂环丁酮连接物联结在一起，并在温和条件下以位点特异性方式融合到支架抗体)。所述抗体支架提供长的半衰期和Ig样分布，而所述药效团负责功能活性。所述药效团可以被化学优化或用其他药效团代替，以产生优化的或独特的双特异性抗体(Doppalapudi VR等，PNAS(2010),107(52)；22611-22616)。

在某些实施方式中，所述多特异性结合蛋白下去Oasc-Fab异二聚体型，其包括融合到Fc的结合到靶1的Fab和结合到靶2的scFab。异二聚作用通过所述Fc中的突变来确保。

在某些实施方式中，所述多特异性结合蛋白采取DuetMab型，其是含有结合到抗原1和2的2个不同Fab和通过异二聚作用突变稳定化的F_C的异二聚体构建体。Fab 1和2含有不同的S-S桥，其确保正确的LC和HC配对。

在某些实施方式中，所述多特异性结合蛋白采取CrossmAb型，其是具有融合到通过异二聚作用稳定化的Fc的结合到靶1和2的2个不同Fab的异二聚体构建体。CL和CH1结构域与VH和VL结构域被调换，例如CH1与VL内联融合，而CL与VH内联融合。

在某些实施方式中，所述多特异性结合蛋白采取Fit-Ig型，其是一种同二聚体构建体，其中结合到抗原2的Fab被融合到结合到抗原1的Fab的HC的N端。所述构建体含有野生型Fc。

表1列出了相组合可以结合到NKG2D的重链可变结构域和轻链可变结构域的肽序列。

或者，由SEQ ID NO：69所定义的重链可变结构域可以与由SEQ ID NO：70所定义的轻链可变结构域配对，以形成如US 9,273,136中所示的可以结合到NKG2D的抗原结合位点。

SEQ ID NO：69

QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAFIRYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDRGLGDGTYFDYWGQGTTVTVSS

SEQ ID NO：70

QSALTQPASVSGSPGQSITISCSGSSSNIGNNAVNWYQQLPGKAPKLLIYYDDLLPSGVSDRFSGSKSGTSAFLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGPVFGGGTKLTVL

或者，由SEQ ID NO：71所定义的重链可变结构域可以与由SEQ ID NO：72所定义的轻链可变结构域配对，以形成如US 7,879,985中所示的可以结合到NKG2D的抗原结合位点。

SEQ ID NO：71

QVHLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSDDSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGHISYSGSANYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCANWDDAFNIWGQGTMVTVSS

SEQ ID NO：72

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIK

在所述Fc结构域内，CD16结合由所述铰链区和CH2结构域介导。例如，在人类IgG1内，与CD16的相互作用主要聚焦于氨基酸残基Asp 265-Glu 269、Asn 297-Thr 299、Ala327-Ile 332、Leu 234-Ser 239和CH2结构域中的糖残基N-乙酰基-D-葡萄糖胺(参见Sondermann等，Nature,406(6793):267-273)。在所述已知结构域的基础上，可以选择突变以提高或降低与CD16的结合亲和力，例如通过使用噬菌体展示文库或酵母表面cDNA文库，或者可以在相互作用的已知三维结构的基础上设计突变。

异二聚体抗体重链的组装可以通过在同一细胞中表达两种不同抗体重链序列来实现，这可能导致每种抗体重链的同二聚体的组装以及异二聚体的组装。促进异二聚体的偏好性组装可以通过在每种抗体重链恒定区的CH3结构域中并入不同的突变来实现，如US13/494870、US16/028850、US11/533709、US12/875015、US13/289934、US14/773418、US12/811207、US13/866756、US14/647480、US14/830336中所示。例如，可以在人类IgG1的基础上在CH3结构域中制造突变，并在第一多肽和第二多肽内并入不同对的氨基酸替换，以允许这两条链选择性地彼此异二聚化。下面示出的氨基酸替换的位置都按照Kabat中的EU指数来编号。

在一种情形中，所述第一多肽中的氨基酸替换将原始氨基酸用选自精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)或色氨酸(W)的较大氨基酸代替，并且所述第二多肽中的至少一个氨基酸替换将原始氨基酸用选自丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)或缬氨酸(V)的较小氨基酸代替，使得所述较大氨基酸替换(突起)契合到所述较小氨基酸替换(孔穴)的表面中。例如，一个多肽可以包含T366W替换，并且另一个多肽可以包含三个替换，包括T366S、L368A和Y407V。

本发明的抗体重链可变结构域可以被任选地偶联到与抗体恒定区、例如包括铰链、CH2和CH3结构域并含有或不含CH1结构域的IgG恒定区至少90％同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述恒定区的氨基酸序列与人类抗体恒定区例如人类IgG1恒定区、IgG2恒定区、IgG3恒定区或IgG4恒定区至少90％同一性。在某些其他实施方式中，所述恒定区的氨基酸序列与来自于另一种哺乳动物例如兔、狗、猫、小鼠或马的抗体恒定区至少90％同一性。与人类IgG1恒定区相比可以在所述恒定区内并入一个或多个突变，例如在Q347、Y349、L351、S354、E356、E357、K360、Q362、S364、T366、L368、K370、N390、K392、T394、D399、S400、D401、F405、Y407、K409、T411和/或K439处。示例性的替换包括例如Q347E、Q347R、Y349S、Y349K、Y349T、Y349D、Y349E、Y349C、T350V、L351K、L351D、L351Y、S354C、E356K、E357Q、E357L、E357W、K360E、K360W、Q362E、S364K、S364E、S364H、S364D、T366V、T366I、T366L、T366M、T366K、T366W、T366S、L368E、L368A、L368D、K370S、N390D、N390E、K392L、K392M、K392V、K392F、K392D、K392E、T394F、T394W、D399R、D399K、D399V、S400K、S400R、D401K、F405A、F405T、Y407A、Y407I、Y407V、K409F、K409W、K409D、T411D、T411E、K439D和K439E。

在某些实施方式中，可以并入到人类IgG1恒定区的CH1中的突变可以在氨基酸V125、F126、P127、T135、T139、A140、F170、P171和/或V173处。在某些实施方式中，可以并入到人类IgG1恒定区的Cκ中的突变可以在氨基酸E123、F116、S176、V163、S174和/或T164处。

或者，氨基酸替换可以选自下面表2中示出的成组替换。

表2
				第一多肽	第二多肽
组1	S364E/F405A	Y349K/T394F
			组2	S364H/D401K	Y349T/T411E
组3	S364H/T394F	Y349T/F405A
			组4	S364E/T394F	Y349K/F405A
组5	S364E/T411E	Y349K/D401K
			组6	S364D/T394F	Y349K/F405A
组7	S364H/F405A	Y349T/T394F
			组8	S364K/E357Q	L368D/K370S
组9	L368D/K370S	S364K
			组10	L368E/K370S	S364K
组11	K360E/Q362E	D401K
			组12	L368D/K370S	S364K/E357L
组13	K370S	S364K/E357Q
			组14	F405L	K409R
组15	K409R	F405L

或者，氨基酸替换可以选自下面表3中示出的成组替换。

或者，氨基酸替换可以选自下面表4中示出的成组替换。

表4
				第一多肽	第二多肽
组1	T366K/L351K	L351D/L368E
			组2	T366K/L351K	L351D/Y349E
组3	T366K/L351K	L351D/Y349D
			组4	T366K/L351K	L351D/Y349E/L368E
组5	T366K/L351K	L351D/Y349D/L368E
			组6	E356K/D399K	K392D/K409D

或者，每个多肽链中的至少一个氨基酸替换可以选自表5。

或者，至少一个氨基酸替换可以选自下面表6中的成组替换，其中在所述第一多肽列中标注的位置被任何已知的带负电荷的氨基酸代替，并且在所述第二多肽列中标注的位置被任何已知的带正电荷的氨基酸代替。

表6
		第一多肽	第二多肽
K392、K370、K409或K439	D399、E356或E357

或者，至少一个氨基酸替换可以选自下面表7中的成组替换，其中在所述第一多肽列中标注的位置被任何已知的带正电荷的氨基酸代替，并且在所述第二多肽列中标注的位置被任何已知的带负电荷的氨基酸代替。

或者，氨基酸替换可以选自下面表8中的成组替换

表8
		第一多肽	第二多肽
T350V、L351Y、F405A和Y407V	T350V、T366L、K392L和T394W

可选地或另外地，异多聚体蛋白的结构稳定性可以通过在所述第一或第二多肽链任一者上引入S354C并在相对的多肽链上引入Y349C来提高，所述突变在所述两个多肽的界面内形成人造二硫桥。

上述的多特异性蛋白可以使用本领域技术人员公知的重组DNA技术来制造。例如，可以将编码所述第一免疫球蛋白重链的第一核酸序列克隆到第一表达载体中；可以将编码所述第二免疫球蛋白重链的第二核酸序列克隆到第二表达载体中；可以将编码所述免疫球蛋白轻链的第三核酸序列克隆到第三表达载体中；可以将所述第一、第二和第三表达载体一起稳定转染到宿主细胞中，以产生所述多聚体蛋白。

为了获得所述多特异性蛋白的最高产量，可以探索所述第一、第二和第三表达载体的不同比率，以确定用于转染到所述宿主细胞中的最佳比率。在转染后，可以使用本领域中已知的方法例如有限稀释法、ELISA、FACS、显微术或Clonepix来分离单一克隆，用于细胞库产生。

可以将克隆在适合于生物反应器规模放大的条件下培养，并维持所述多特异性蛋白的表达。所述多特异性蛋白可以使用本领域中已知的方法包括离心、深度过滤、细胞裂解、匀浆、冻融、亲和纯化、凝胶过滤、离子交换层析、疏水相互作用交换层析和混合模式层析来分离和纯化。

II.TriNKET的特征

在某些实施方式中，本文中描述的包括NKG2D结合结构域和用于肿瘤相关抗原的结合结构域的TriNKET结合到表达人类NKG2D的细胞。在某些实施方式中，包括NKG2D结合结构域和用于肿瘤相关抗原的结合结构域的TriNKET以与具有相同肿瘤相关抗原结合结构域的单克隆抗体可比的水平结合到所述肿瘤相关抗原。例如，包括NKG2D结合结构域和来自于曲妥珠单抗的HER2结合结构域的TriNKET可以以与曲妥珠单抗可比的水平结合到表达在细胞上的HER2。

然而，本文中描述的TriNKET在降低肿瘤生长和杀伤癌细胞中更加有效。例如，靶向表达HER2的肿瘤/癌细胞的本公开的TriNKET比SC2.2更加有效，所述SC2.2是通过将源自于曲妥珠单抗的scFv连接到NKG2D配体ULBP-6构造而成的一种单链双特异性分子。SC2.2同时结合HER2+癌细胞和NKG2D+NK细胞。因此，调查了SC2.2在减少HER2+癌细胞数中的有效性。体外激活和细胞毒性测定法证实，SC2.2在激活和杀伤NK细胞中有效。然而，SC2.2在RMA/S-HER2皮下肿瘤模型中没有表现出功效。还使用过表达RMA/S-HER2的同系小鼠模型在体内试验了SC2.2的功效。在这个小鼠模型中，SC2.2与介质对照相比未能显示出肿瘤生长的控制。因此，尽管SC2.2能够激活和杀伤NK细胞并结合到HER2+癌细胞，但这些性质不足以有效控制HER2+肿瘤生长。

在某些实施方式中，本文中描述的包括NKG2D结合结构域和用于肿瘤相关抗原的结合结构域的TriNKET，当与表达所述抗原的肿瘤细胞培养时激活原代人类NK细胞。NK细胞激活以CD107a脱颗粒和IFNγ细胞因子生产的增加为标志。此外，与包括所述肿瘤相关抗原结合结构域的单克隆抗体相比，在表达所述抗原的肿瘤细胞存在下TriNKET显示出人类NK细胞的更高的激活。例如，与单克隆抗体曲妥珠单抗相比，在表达HER2的癌细胞存在下具有HER2结合结构域的本公开的TriNKET具有人类NK细胞的更高的激活。

在某些实施方式中，本文中描述的包括NKG2D结合结构域和用于肿瘤相关抗原的结合结构域的TriNKET，在表达所述抗原的肿瘤细胞存在下提高静息和IL-2激活的人类NK细胞的活性。与IL-2激活的NK细胞相比，静息NK细胞显示出更少的背景IFNγ生产和CD107a脱颗粒。在某些实施方式中，与IL-2激活的NK细胞相比，静息NK细胞显示出IFNγ生产和CD107a脱颗粒的更大的改变。在某些实施方式中，IL-2激活的NK细胞在用TriNKET刺激后显示出变成IFNγ+；CD107a+细胞的更大的百分率。

在某些实施方式中，本文中描述的包括NKG2D结合结构域和用于肿瘤相关抗原(肿瘤相关抗原的非限制性实例包括CD20、BCMA和HER2)的结合结构域的TriNKET，在表达所述抗原的肿瘤细胞存在下提高静息和IL-2激活的人类NK细胞的细胞毒性活性。此外，包括用于肿瘤相关抗原(肿瘤相关抗原的非限制性实例包括CD20、BCMA和HER2)的结合结构域的TriNKET(例如A40-TriNKET、A44-TriNKET、A49-TriNKET、C26-TriNKET、F04-TriNKET、F43-TriNKET、F47-TriNKET和F63-TriNKET)，与包括相同肿瘤相关抗原结合位点的单克隆抗体相比，更强有力地指导激活和静息的NK细胞针对所述肿瘤细胞的应答。在某些实施方式中，与包括相同肿瘤抗原结合位点的单克隆抗体相比，TriNKET针对表达中和低肿瘤抗原的肿瘤细胞提供优势。因此，包括TriNKET的疗法可能优于单克隆抗体疗法。

在某些实施方式中，与单克隆抗体相比，本文中描述的包括用于肿瘤相关抗原(肿瘤相关抗原的非限制性实例包括CD20、BCMA和HER2)的结合结构域的TriNKET(例如A40-TriNKET、A44-TriNKET、A49-TriNKET、C26-TriNKET、F04-TriNKET、F43-TriNKET、F47-TriNKET和F63-TriNKET)，在具有Fc受体(FcR)的高表达的癌症或驻留在具有高水平FcR的肿瘤微环境中的癌症的治疗中是有利的。单克隆抗体通过包括ADCC、CDC、吞噬作用和信号阻断等的多种机制发挥它们对肿瘤生长的作用。在FcγR中，CD16对IgG Fc具有最低的亲和性；FcγRI(CD64)是高亲和性FcR，其比CD16强约1000倍地结合到IgG Fc。CD64通常表达在许多造血谱系例如髓系谱系上，并且可以表达在源自于这些细胞类型的肿瘤例如急性髓性白血病(AML)细胞上。浸润到所述肿瘤中的免疫细胞例如MDSC和单核细胞也表达CD64，并已知浸润所述肿瘤微环境。CD64被所述肿瘤或在肿瘤微环境中的表达可能对单克隆抗体疗法具有有害效应。CD64在肿瘤微环境中的表达使得这些抗体难以接合NK细胞表面上的CD16，因为所述抗体优先结合所述高亲和性受体。TriNKET通过靶向NK细胞表面上的两种激活激活性受体可以克服CD64表达(在肿瘤或肿瘤微环境上)对单克隆抗体疗法的有害效应。不论所述肿瘤细胞上是否存在CD64表达，TriNKET都能介导针对所有肿瘤细胞的人类NK细胞应答，因为NK细胞上的两个激活激活性受体的双重靶向提供了与NK细胞的更强的特异性结合。

在某些实施方式中，本文中描述的包括用于肿瘤相关抗原(肿瘤相关抗原的非限制性实例包括CD20、BCMA和HER2)的结合结构域的TriNKET(例如A40-TriNKET、A44-TriNKET、A49-TriNKET、C26-TriNKET、F04-TriNKET、F43-TriNKET、F47-TriNKET和F63-TriNKET)，通过减少中靶偏离肿瘤(on-target off-tumor)副作用而提供更好的安全性。自然杀伤细胞和CD8 T细胞两者能够直接裂解肿瘤细胞，尽管NK细胞和CD8 T细胞识别正常的自身细胞和肿瘤细胞所通过的机制不同。NK细胞的活性受到来自于激活(NCR、NKG2D、CD16等)和抑制(KIR、NKG2A等)受体的信号的平衡调控。这些激活和抑制信号的平衡允许NK细胞确定是健康的自身细胞还是应激的、病毒感染的或转化的自身细胞。这种自体耐受的“内置”机制将帮助保护正常的健康组织免于NK细胞应答。为扩展这个原理，NK细胞的自体耐受将允许TriNKET靶向在自体和肿瘤两者上表达的抗原而没有偏离肿瘤副作用，或者具有增加的治疗窗口。不同于自然杀伤细胞，T细胞需要识别被MHC分子呈递的特定肽才能激活和发挥效应功能。T细胞已作为免疫疗法的主要靶点，并且已经开发了许多策略来重新引导针对肿瘤的T细胞应答。T细胞双特异性物质、检查点抑制剂和CAR-T细胞都已被FDA批准，但通常苦于剂量限制性毒性。T细胞双特异性物质和CAR-T细胞通过使用结合结构域来靶向肿瘤细胞表面上的抗原并使用工程化的信号传导结构域将激活信号传导到效应细胞中，围绕TCR-MHC识别系统工作。尽管在引发抗肿瘤免疫应答中有效，但这些疗法通常伴有细胞因子释放综合征(CRS)和中靶偏离肿瘤副作用。在这种背景下TriNKET是独特的，因为它们不“重写”NK细胞激活和抑制的天然系统。相反，TriNKET被设计成动摇所述平衡并为NK细胞提供另外的激活信号，同时维持对健康自体细胞的NK耐受。

在某些实施方式中，本文描述的包括用于肿瘤相关抗原(肿瘤相关抗原的非限制性实例包括CD20、BCMA和HER2)的结合结构域并包括NKG2D结合结构域的TriNKET(例如A40-TriNKET、A44-TriNKET、A49-TriNKET、C26-TriNKET、F04-TriNKET、F43-TriNKET、F47-TriNKET和F63-TriNKET)，与包括相同肿瘤抗原结合结构域的单克隆抗体相比，更有效地延迟肿瘤的进展。在某些实施方式中，包括NKG2D结合结构域和肿瘤抗原结合结构域的TriNKET与包括相同肿瘤抗原结合结构域的单克隆抗体相比，对癌症转移更加有效。

上面的描述描述了本发明的多个方面和实施方式。本专利申请具体设想了所述方面和实施方式的所有组合和排列。

III.治疗性应用

本发明提供了使用本文描述的包括用于肿瘤相关抗原(肿瘤相关抗原的非限制性实例包括CD20、BCMA和HER2)的结合结构域的多特异性结合蛋白(例如A40-TriNKET、A44-TriNKET、A49-TriNKET、C26-TriNKET、F04-TriNKET、F43-TriNKET、F47-TriNKET和F63-TriNKET)和/或本文中描述的药物组合物治疗癌症的方法。所述方法可用于治疗各种不同的癌症，包括实体肿瘤、淋巴瘤和白血病。理想情况下，待治疗的癌症的类型与所述多特异性结合蛋白结合的癌细胞的类型匹配。例如，表达上皮细胞黏附分子(EpCAM)的癌症例如表达EpCAM的结肠癌的治疗，理想情况下使用本文中描述的结合到多特异性结合蛋白的多特异性结合蛋白来治疗。所述治疗方法的其他方面和实施方式在下文描述。

因此，本发明的一个方面提供了一种在患者中治疗癌症的方法，其中所述方法包括向需要的患者施用治疗有效量的本文描述的包括用于肿瘤相关抗原(肿瘤相关抗原的非限制性实例包括CD20、BCMA和HER2)的结合结构域的多特异性结合蛋白(例如A40-TriNKET、A44-TriNKET、A49-TriNKET、C26-TriNKET、F04-TriNKET、F43-TriNKET、F47-TriNKET和F63-TriNKET)，以治疗所述癌症。用于治疗的示例性癌症包括实体肿瘤、白血病和淋巴瘤。

所述治疗方法可以根据待治疗的癌症来表征。例如，在某些实施方式中，所述癌症是实体肿瘤。在某些其他实施方式中，所述癌症是脑癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、食管癌、白血病、肺癌、肝癌、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌、胃癌、睾丸癌或子宫癌。在其他实施方式中，所述癌症是血管化肿瘤、鳞状细胞癌、腺癌、小细胞癌、黑素瘤、神经胶质瘤、神经母细胞瘤、肉瘤(例如血管肉瘤或软骨肉瘤)、喉癌、腮腺癌、胆管癌、甲状腺癌、肢端雀斑痣样黑素瘤、光化性角化病、急性淋巴细胞性白血病、急性髓性白血病、腺样囊性癌、腺瘤、腺肉瘤、腺鳞癌、肛管癌、肛门癌、肛门直肠癌、星形胶质细胞瘤、巴氏腺癌、基底细胞癌、胆管癌、骨癌、骨髓癌、支气管癌、支气管腺体癌、类癌瘤、胆管癌、软骨肉瘤、脉络丛乳头状瘤/癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓系白血病、透明细胞癌、结缔组织癌、囊腺瘤、消化系统癌症、十二指肠癌、内分泌系统癌症、内胚窦瘤、子宫内膜增生、子宫内膜间质肉瘤、子宫内膜样腺癌、内皮细胞癌、室管膜癌、上皮细胞癌、尤文氏肉瘤、眼和眼眶癌、女性生殖器癌、局灶性结节性增生、胆囊癌、胃窦癌、胃底癌、胃泌素瘤、胶质母细胞瘤、胰高血糖素瘤、心脏癌症、成血管细胞瘤、血管内皮瘤、血管瘤、肝腺瘤、肝腺瘤病、肝胆管癌、肝细胞癌、霍奇金氏病、回肠癌、胰岛细胞瘤、上皮内瘤变、上皮内鳞状细胞瘤变、肝内胆管癌、侵入性鳞状细胞癌、空肠癌、关节癌、卡波斯肉瘤、盆腔癌、大细胞癌、大肠癌、平滑肌肉瘤、恶性雀斑样痣黑素瘤、淋巴瘤、男性生殖器癌、恶性黑素瘤、恶性间皮肿瘤、成神经管细胞瘤、髓上皮瘤、脑膜癌、间皮癌、转移性癌、口腔癌、粘液表皮样癌、多发性骨髓瘤、肌肉癌、鼻道癌、神经系统癌症、神经上皮腺癌、结节性黑素瘤、非上皮性皮肤癌、非霍奇金氏淋巴瘤、燕麦细胞癌、少突神经胶质癌、口腔癌、骨肉瘤、浆液性乳头状腺癌、阴茎癌、舌咽癌、垂体肿瘤、浆细胞瘤、假性肉瘤、肺母细胞瘤、直肠癌、肾细胞癌、呼吸系统癌症、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、浆液性癌、窦癌、皮肤癌、小细胞癌、小肠癌、平滑肌癌、软组织癌、分泌生长抑素的肿瘤、脊椎癌、鳞状细胞癌、横纹肌癌、间皮下癌、浅表扩散性黑素瘤、T细胞白血病、舌癌、未分化癌、输尿管癌、尿道癌、尿道膀胱癌、泌尿系统癌症、宫颈癌、宫体癌、葡萄膜黑素瘤、阴道癌、疣状癌、血管活性肠肽瘤、外阴癌、高分化癌或肾母细胞瘤。

在某些其他实施方式中，所述癌症是非霍奇金氏淋巴瘤例如B-细胞淋巴瘤或T-细胞淋巴瘤。在某些实施方式中，所述非霍奇金氏淋巴瘤是B-细胞淋巴瘤，例如弥漫性大B-细胞淋巴瘤、原发性纵隔B-细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区B-细胞淋巴瘤、淋巴结外边缘区B-细胞淋巴瘤、淋巴结边缘区B-细胞淋巴瘤、脾边缘区B-细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、毛细胞白血病或原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤。在某些其他实施方式中，所述非霍奇金氏淋巴瘤是T-细胞淋巴瘤，例如前T淋巴母细胞淋巴瘤、外周T-细胞淋巴瘤、皮肤T-细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞T-细胞淋巴瘤、淋巴结外自然杀伤细胞/T-细胞淋巴瘤、肠病型T-细胞淋巴瘤、皮下脂膜炎样T-细胞淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤或外周T-细胞淋巴瘤。

所述待治疗的癌症可以根据在所述癌细胞表面上表达的特定抗原的存在来表征。在某些实施方式中，所述癌细胞表达下述一者或多者：HER2，CD20，CD33，BCMA，EpCAM，CD2，CD19，CD30，CD38，CD40，CD52，CD70，EGFR/ERBB1，IGF1R，HER3/ERBB3，HER4/ERBB4，MUC1，cMET，SLAMF7，PSCA，MICA，MICB，TRAILR1，TRAILR2，MAGE-A3，B7.1，B7.2，CTLA4和PD1。

在某些实施方式中，通过将肿瘤或癌细胞和自然杀伤细胞暴露于本公开的包括用于肿瘤相关抗原(肿瘤相关抗原的非限制性实例包括CD20、BCMA和HER2)的结合结构域的蛋白质(例如A40-TriNKET、A44-TriNKET、A49-TriNKET、C26-TriNKET、F04-TriNKET、F43-TriNKET、F47-TriNKET和F63-TriNKET)，本公开的蛋白质被用于直接或间接增加肿瘤细胞死亡(与裂解、杀灭、消融、减少存活或细胞增殖等同义)的方法中，或用于制造在直接或间接增加肿瘤细胞死亡(与裂解、杀灭、消融、减少存活或细胞增殖等同义)的方法中使用的药物。对如上所述的蛋白质具有响应性的肿瘤细胞表达所述蛋白质的第二抗原结合位点结合的肿瘤相关抗原。例如，在示例性实施方式中，C26-TriNKET-CD20被用于靶向表达CD20的肿瘤或癌细胞(静息的或激活的)；在另一个示例性实施方式中，C26-TriNKET-BMCA被用于靶向表达BMCA的肿瘤或癌细胞(静息的或激活的)。

在某些实施方式中，本公开的蛋白质被用于在需要的受试者中治疗癌症的方法中，或者用于制造在需要的受试者中治疗癌症的方法中使用的药物，所述方法包括向所述受试者施用本公开的包括用于肿瘤相关抗原(肿瘤相关抗原的非限制性实例包括CD20、BCMA和HER2)的结合结构域的蛋白质(例如A40-TriNKET、A44-TriNKET、A49-TriNKET、C26-TriNKET、F04-TriNKET、F43-TriNKET、F47-TriNKET和F63-TriNKET)或包含所述蛋白质的制剂。对如上所述的蛋白质具有响应性的癌细胞表达所述蛋白质的第二抗原结合位点结合的肿瘤相关抗原。例如，在示例性实施方式中，C26-TriNKET-CD20被用于靶向表达CD20的癌细胞(静息的或激活的)；在另一个示例性实施方式中，C26-TriNKET-BMCA被用于靶向表达BMCA的肿瘤或癌细胞(静息的或激活的)。

IV.组合疗法

本发明的另一方面提供了组合疗法。将本文描述的多特异性结合蛋白与其他治疗剂组合使用以治疗癌症。

可以在治疗癌症中用作组合疗法的一部分的示例性治疗剂包括例如放射线、丝裂霉素、维甲酸、盐酸苯达莫司汀(ribomustin)、吉西他滨、长春新碱、依托泊苷、克拉屈滨、二溴甘露醇、甲氨蝶呤、多柔比星、卡波醌、喷司他丁、硝基可润、净司他丁、西曲瑞克、来曲唑、雷替曲塞、柔红霉素、法倔唑、福莫司汀、胸腺法新、索布佐生、奈达铂、阿糖胞苷、比卡鲁胺、长春瑞滨、维司力农、氨鲁米特、安吖啶、丙谷胺、依利醋铵、酮色林、去氧氟尿苷、依曲替酯、异维甲酸、链脲佐菌素、尼莫司汀、长春地辛、氟他胺(flutamide)、氟他胺(drogenil)、布缩宫素、卡莫氟、雷佐生、西佐喃、卡铂、二溴卫矛醇、替加氟、异环磷酰胺、泼尼莫司汀、毕西巴尼、左旋咪唑、替尼泊苷、英丙舒凡、依诺他滨、麦角乙脲、羟甲烯龙、他莫昔芬、孕酮、美雄烷、环硫雄醇、福美司坦、干扰素-α、干扰素-2α、干扰素-β、干扰素-γ、集落刺激因子-1、集落刺激因子-2、地尼白介素、白介素-2、黄体生成激素释放因子和上述药剂的可能表现出对同源受体的差异结合和增加或减少的血清半衰期的变化型。

可以在治疗癌症中用作组合疗法的一部分的另一类药剂是免疫检查点抑制剂。示例性的免疫检查点抑制剂包括抑制下述一者或多者的药剂：(i)细胞毒性T-淋巴细胞相关抗原4(CTLA4)，(ii)程序化细胞死亡蛋白1(PD1)，(iii)PDL1，(iv)LAG3，(v)B7-H3，(vi)B7-H4，和(vii)TIM3。CTLA4抑制剂伊匹单抗已被美国食品和药品监督管理局(United StatesFood and Drug Administration)批准用于治疗黑素瘤。

可以在治疗癌症中用作组合疗法的一部分的另一类药剂是靶向非检查点靶的单克隆抗体(例如赫赛汀)和非细胞毒性药剂(例如酪氨酸激酶抑制剂)。

另一类抗癌药剂包括例如：(i)选自ALK抑制剂、ATR抑制剂、A2A拮抗剂、碱基切除修复抑制剂、Bcr-Abl酪氨酸激酶抑制剂、Bruton's酪氨酸激酶抑制剂、CDC7抑制剂、CHK1抑制剂、周期蛋白依赖性激酶抑制剂、DNA-PK抑制剂、DNA-PK和mTOR两者的抑制剂、DNMT1抑制剂、DNMT1抑制剂加2-氯-脱氧腺苷、HDAC抑制剂、Hedgehog信号传导途径抑制剂、IDO抑制剂、JAK抑制剂、mTOR抑制剂、MEK抑制剂、MELK抑制剂、MTH1抑制剂、PARP抑制剂、磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂、PARP1和DHODH两者的抑制剂、蛋白酶体抑制剂、拓扑异构酶-II抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、VEGFR抑制剂和WEE1抑制剂的抑制剂；(ii)OX40、CD137、CD40、GITR、CD27、HVEM、TNFRSF25或ICOS的激动剂；和(iii)选自IL-12、IL-15、GM-CSF和G-CSF的细胞因子。

本发明的蛋白质也可用作原发性病灶的手术去除的辅助物。

为了实现所需的组合治疗效果，可以选择多特异性结合蛋白和其他治疗剂的量和施用的相对时间安排。例如，当向需要这种施用的患者施用组合疗法时，所述组合的治疗剂或包含所述治疗剂的一种或多种药物组合物可以以任何顺序施用，例如顺序、并行、一起、同时施用等。此外，例如，多特异性结合蛋白可以在所述其他治疗剂发挥其预防或治疗效果的时间内施用，或与之相反。

V.药物组合物

本公开还描述了含有治疗有效量的本文中描述的包括用于肿瘤相关抗原(肿瘤相关抗原的非限制性实例包括CD20、BCMA和HER2)的结合结构域的蛋白质(例如A40-TriNKET、A44-TriNKET、A49-TriNKET、C26-TriNKET、F04-TriNKET、F43-TriNKET、F47-TriNKET和F63-TriNKET)的药物组合物。所述组合物可以被配制成用于各种不同的药物递送系统。对于适合的制剂来说，一种或多种生理上可接受的赋形剂或载体也可以包含在所述组合物中。适合在本公开中使用的制剂参见《Remington's制药学》(Remington's PharmaceuticalSciences,Mack Publishing Company,Philadelphia,Pa.,17th ed.,1985)。对于用于药物递送的方法的简要综述，参见例如Langer(Science 249:1527-1533,1990)。

本公开的静脉内药物递送制剂可以包含在袋子、笔或注射器中。在某些实施方式中，所述袋子可以被连接到包含管和/或针头的通道。在某些实施方式中，所述制剂可以是冷冻干燥制剂或液体制剂。在某些实施方式中，所述制剂可以被冷冻干燥(冻干)并包含在约12-60个小瓶中。在某些实施方式中，所述制剂可以被冷冻干燥，并且可以将45mg所述冷冻干燥的制剂包含在一个小瓶中。在某些实施方式中，可以将约40mg-约100mg所述冷冻干燥的制剂包含在一个小瓶中。在某些实施方式中，将来自于12、27或45个小瓶的冷冻干燥的制剂合并，以获得所述蛋白质在静脉内药物制剂中的治疗剂量。在某些实施方式中，所述制剂可以是液体制剂，并以约250mg/小瓶至约1000mg/小瓶储存。在某些实施方式中，所述制剂可以是液体制剂并以约600mg/小瓶储存。在某些实施方式中，所述制剂可以是液体制剂并以约250mg/小瓶储存。

本公开可以以水性液体药物制剂的形式存在，其在形成制剂的缓冲溶液中包括治疗有效量的所述蛋白质。

这些组合物可以通过常规的灭菌技术灭菌，或者可以除菌过滤。得到的水性溶液可以原样包装以备使用，或者可以被冷冻干燥，所述冷冻干燥的制剂在施用之前与无菌水性载体合并。所述制剂的pH通常在3至11之间，更优选地在5至9之间或6至8之间，最优选地在7至8之间，例如7至7.5。所述得到的固体形式的组合物可以被包装在多个单一剂量单元中，各自含有固定量的上述一种或多种药剂。所述固体形式的组合物也可以以灵活的量包装在容器中。

在某些实施方式中，本公开提供了具有延长的储存期限的制剂，其包含本公开的蛋白质与甘露糖醇、单水柠檬酸、柠檬酸钠、二水磷酸氢二钠、二水磷酸二氢钠、氯化钠、聚山梨醇酯80、水和氢氧化钠的组合。

在某些实施方式中，制备了一种水性制剂，其在pH缓冲的溶液中包含本公开的蛋白质。本发明的缓冲液可以具有约4至约8，例如约4.5至约6.0或约4.8至约5.5范围内的pH，或者可以具有约5.0至约5.2的pH。在上述pH之间的范围也打算作为本公开的一部分。例如，打算包括使用任何上述值的组合作为上限和/或下限的值范围。将pH控制在这个范围之内的缓冲剂的实例包括乙酸盐(例如乙酸钠)、琥珀酸盐(例如琥珀酸钠)、葡萄糖酸盐、组氨酸、柠檬酸盐和其他有机酸缓冲剂。

在某些实施方式中，所述制剂包括含有柠檬酸盐和磷酸盐的缓冲系统，以将pH维持在约4至约8的范围内。在某些实施方式中，所述pH范围可以是约4.5至约6.0或约pH 4.8至约5.5，或在约5.0至约5.2的pH范围内。在某些实施方式中，所述缓冲系统包括单水柠檬酸、柠檬酸钠、二水磷酸氢二钠和/或二水磷酸二氢钠。在某些实施方式中，所述缓冲系统包括约1.3mg/mL柠檬酸(例如1.305mg/mL)、约0.3mg/mL柠檬酸钠(例如0.305mg/mL)、约1.5mg/mL二水磷酸氢二钠(例如1.53mg/mL)、约0.9mg/mL二水磷酸二氢钠(例如0.86)和约6.2mg/mL氯化钠(例如6.165mg/mL)。在某些实施方式中，所述缓冲系统包括1-1.5mg/mL柠檬酸、0.25至0.5mg/mL柠檬酸钠、1.25至1.75mg/mL二水磷酸氢二钠、0.7至1.1mg/mL二水磷酸二氢钠和6.0至6.4mg/mL氯化钠。在某些实施方式中，所述制剂的pH用氢氧化钠调节。

充当等渗剂并且可以使抗体稳定的多元醇，也可以包含在所述制剂中。所述多元醇以可能根据制剂的所需等渗性而变的量添加到所述制剂。在某些实施方式中，所述水性制剂可以是等渗的。添加的多元醇的量也可能根据所述多元醇的分子量而变。例如，与二糖(例如海藻糖)相比，可以添加较低量的单糖(例如甘露糖醇)。在某些实施方式中，可以在所述制剂中用作等渗剂的多元醇是甘露糖醇。在某些实施方式中，甘露糖醇的浓度可以是约5至约20mg/mL。在某些实施方式中，甘露糖醇的浓度可以是约7.5至15mg/mL。在某些实施方式中，甘露糖醇的浓度可以是约10-14mg/mL。在某些实施方式中，甘露糖醇的浓度可以是约12mg/mL。在某些实施方式中，多元醇山梨糖醇可以包含在所述制剂中。

也可以向所述制剂添加去污剂或表面活性剂。示例性的去污剂包括非离子型去污剂例如聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯20、80等)或泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188)。添加的去污剂的量使得它减少所述配制的抗体的聚集和/或将所述制剂中颗粒物的形成降至最低和/或减少吸附。在某些实施方式中，所述制剂可以包含作为表面活性剂的聚山梨醇酯。在某些实施方式中，所述制剂可以含有去污剂聚山梨醇酯80或吐温80。吐温80是用于描述聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇单油酸酯的术语(参见Fiedler,Lexikon der Hifsstoffe,EditioCantor Verlag Aulendorf,4th edi.,1996)。在某些实施方式中，所述制剂可以含有约0.1mg/mL至约10mg/mL之间或约0.5mg/mL至约5mg/mL之间的聚山梨醇酯80。在某些实施方式中，可以在所述制剂中添加约0.1％聚山梨醇酯80。

在实施方式中，本公开的蛋白质产品被配制成液体制剂。所述液体制剂可以以10mg/mL的浓度存在于USP/Ph Eur I型50R小瓶中，用橡胶塞封闭并用铝制压合密封盖密封。所述橡胶塞可以由符合USP和Ph Eur的弹性体制成。在某些实施方式中，小瓶可以装填有61.2mL所述蛋白质产品溶液，以便允许可抽出体积为60mL。在某些实施方式中，可以将所述液体制剂用0.9％盐水溶液稀释。

在某些实施方式中，本公开的液体制剂可以被制备成浓度为10mg/mL的溶液，并与稳定剂水平的糖相组合。在某些实施方式中，所述液体制剂可以在水性载体中制备。在某些实施方式中，稳定剂可以以不超过可能产生对静脉内施用来说不理想或不适合的黏度的量添加。在某些实施方式中，所述糖可以是二糖例如蔗糖。在某些实施方式中，所述液体制剂也可以包括一种或多种缓冲剂、表面活性剂和防腐剂。

在某些实施方式中，所述液体制剂的pH可以通过添加可药用酸和/或碱来设定。在某些实施方式中，所述可药用酸可以是盐酸。在某些实施方式中，所述碱可以是氢氧化钠。

除了聚集之外，脱酰胺是肽和蛋白质在发酵、收获/细胞澄清、纯化、药物物质/药物制品储存期间和样品分析期间可能发生的常见产品变异。脱酰胺是从蛋白质失去NH₃，形成琥珀酰亚胺中间体，其可能经历水解。所述琥珀酰亚胺中间体引起母体肽的质量减少17道尔顿。随后的水解导致质量增加18道尔顿。由于在水性条件下不稳定，所述琥珀酰亚胺中间体的分离是困难的。因此，脱酰胺通常可检测为质量增加1道尔顿。天冬酰胺的脱酰胺产生天冬氨酸或异天冬氨酸。影响脱酰胺速率的参数包括pH、温度、溶剂介电常数、离子强度、一级序列、局部多肽构象和三级结构。在肽链中与Asn相邻的氨基酸残基影响脱酰胺速率。蛋白质序列中Asn之后的Gly和Ser导致对脱酰胺更高的敏感性。

在某些实施方式中，本公开的液体制剂可以在防止所述蛋白质产品脱酰胺的pH和湿度条件下保存。

本文中感兴趣的水性载体是可药用(对于向人类施用来说安全且无毒)并且可用于制备液体制剂的水性载体。说明性载体包括无菌注射用水(SWFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)、无菌盐水溶液、林格氏溶液或右旋糖溶液。

防腐剂可以任选地添加到本发明的制剂以减少细菌作用。防腐剂的添加可以例如便于生产多次使用(多剂)制剂。

在特定情况下，例如当患者在医院中在移植后通过IV途径接受所有药物时，静脉内(IV)制剂可能是优选的施用途径。在某些实施方式中，在施用前将所述液体制剂用0.9％氯化钠溶液稀释。在某些实施方式中，所述稀释的注射用药物产品是等渗的，并适合于通过静脉内输注施用。

在某些实施方式中，盐或缓冲剂组分可以以10mM-200mM的量添加。所述盐和/或缓冲剂是可药用的，并源自于各种不同的已知酸(无机和有机酸)和“成碱”金属或胺。在某些实施方式中，所述缓冲剂可以是磷酸盐缓冲剂。在某些实施方式中，所述缓冲剂可以是甘氨酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐缓冲剂，在所述情况下，钠、钾或铵离子可以充当平衡离子。

防腐剂可以任选地添加到本发明的制剂以减少细菌作用。防腐剂的添加可以例如便于生产多次使用(多剂)制剂。

本文中感兴趣的水性载体是可药用(对于向人类施用来说安全且无毒)并且可用于制备液体制剂的水性载体。说明性载体包括无菌注射用水(SWFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)、无菌盐水溶液、林格氏溶液或右旋糖溶液。

本公开可以以冷冻干燥制剂的形式存在，其包括所述蛋白质和冻干保护剂。所述冻干保护剂可以是糖例如二糖。在某些实施方式中，所述冻干保护剂可以是蔗糖或麦芽糖。所述冷冻干燥制剂也可以包括一种或多种缓冲剂、表面活性剂、增量剂和/或防腐剂。

可用于使所述冷冻干燥的药物制品稳定的蔗糖或麦芽糖的量可以是蛋白质与蔗糖或麦芽糖至少1:2的重量比。在某些实施方式中，所述蛋白质与蔗糖或麦芽糖的重量比可以为1:2至1:5。

在某些实施方式中，在冷冻干燥之前，所述制剂的pH可以通过添加可药用酸和/或碱来设定。在某些实施方式中，所述可药用酸可以是盐酸。在某些实施方式中，所述可药用碱可以是氢氧化钠。

在冷冻干燥之前，含有本公开的蛋白质的溶液的pH可以被调整到6至8之间。在某些实施方式中，用于所述冷冻干燥的药物制品的pH范围可以是7至8。

在某些实施方式中，盐或缓冲剂组分可以以10mM-200mM的量添加。所述盐和/或缓冲剂是可药用的，并源自于各种不同的已知酸(无机和有机酸)和“成碱”金属或胺。在某些实施方式中，所述缓冲剂可以是磷酸盐缓冲剂。在某些实施方式中，所述缓冲剂可以是甘氨酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐缓冲剂，在所述情况下，钠、钾或铵离子可以充当平衡离子。

在某些实施方式中，可以添加“增量剂”。“增量剂”是为冻干混合物增添质量并对冻干饼的物理结构有贡献(例如便于生产维持开放孔隙结构的基本上均匀的冻干饼)的化合物。说明性的增量剂包括甘露糖醇、甘氨酸、聚乙二醇和山梨糖醇。本发明的冷冻干燥制剂可以含有这些增量剂。

防腐剂可以任选地添加到本发明的制剂以减少细菌作用。防腐剂的添加可以例如便于生产多次使用(多剂)制剂。

在某些实施方式中，所述冷冻干燥的药物制品可以用水性载体构造。本文中感兴趣的水性载体是可药用(例如对于向人类施用来说安全且无毒)并且可用于在冷冻干燥后制备液体制剂的水性载体。说明性稀释剂包括无菌注射用水(SWFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)、无菌盐水溶液、林格氏溶液或右旋糖溶液。

在某些实施方式中，本公开的冷冻干燥的药物制品用USP级无菌注射用水(SWFI)或USP级0.9％氯化钠注射液重构。在重构期间，将所述冷冻干燥的粉剂溶解在溶液中。

在某些实施方式中，本公开的冷冻干燥的蛋白质产品构造到约4.5mL注射用水，并用0.9％盐水溶液(氯化钠溶液)稀释。

本发明的药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以改变，以便获得对特定患者、组合物和施用方式来说有效实现所需治疗响应并且对所述患者无毒的活性成分的量。

具体剂量可以是对每位患者来说均一的剂量，例如50-5000mg蛋白质。或者，患者的剂量可以根据所述患者的近似体重或表面积定制。确定适合剂量的其他因素可以包括待治疗或预防的疾病或病症、疾病的严重性、施用途径和患者的年龄、性别和医疗状况。确定用于治疗的适合剂量所必需的计算的进一步精化由本领域技术人员按常规进行，特别是根据本文中公开的剂量信息和测定法。所述剂量也可以通过使用用于确定使用剂量的已知测定法并联合适合的剂量响应数据来确定。当监测到疾病进展时，个体患者的剂量可以进行调整。可以测量患者中可靶向构建体或复合物的血液水平，以观察是否需要调整剂量来达到或维持有效浓度。可以使用药物基因组学来确定哪些可靶向构建体和/或复合物及其剂量最可能对给定个体有效(Schmitz等，Clinica Chimica Acta 308:43-53,2001；Steimer等，Clinica Chimica Acta 308:33-41,2001)。

一般来说，基于体重的剂量是每kg体重约0.01μg至约100mg，例如约0.01μg至约100mg/kg体重、约0.01μg至约50mg/kg体重、约0.01μg至约10mg/kg体重、约0.01μg至约1mg/kg体重、约0.01μg至约100μg/kg体重、约0.01μg至约50μg/kg体重、约0.01μg至约10μg/kg体重、约0.01μg至约1μg/kg体重、约0.01μg至约0.1μg/kg体重、约0.1μg至约100mg/kg体重、约0.1μg至约50mg/kg体重、约0.1μg至约10mg/kg体重、约0.1μg至约1mg/kg体重、约0.1μg至约100μg/kg体重、约0.1μg至约10μg/kg体重、约0.1μg至约1μg/kg体重、约1μg至约100mg/kg体重、约1μg至约50mg/kg体重、约1μg至约10mg/kg体重、约1μg至约1mg/kg体重、约1μg至约100μg/kg体重、约1μg至约50μg/kg体重、约1μg至约10μg/kg体重、约10μg至约100mg/kg体重、约10μg至约50mg/kg体重、约10μg至约10mg/kg体重、约10μg至约1mg/kg体重、约10μg至约100μg/kg体重、约10μg至约50μg/kg体重、约50μg至约100mg/kg体重、约50μg至约50mg/kg体重、约50μg至约10mg/kg体重、约50μg至约1mg/kg体重、约50μg至约100μg/kg体重、约100μg至约100mg/kg体重、约100μg至约50mg/kg体重、约100μg至约10mg/kg体重、约100μg至约1mg/kg体重、约1mg至约100mg/kg体重、约1mg至约50mg/kg体重、约1mg至约10mg/kg体重、约10mg至约100mg/kg体重、约10mg至约50mg/kg体重、约50mg至约100mg/kg体重。

药剂可以每日、每周、每月或每年施用一次或多次，或甚至每2至20年施用一次，本领域普通技术人员可以根据体液或组织中可靶向构建体或复合物的测量到的停留时间和浓度，容易地估算施用的重复率。本发明的施用可以是静脉内、动脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、胸膜内、鞘内、腔内、通过导管灌注或通过直接病灶内注射。这可以施用每日一次或多次、每周一次或多次、每月一次或多次或每年一次或多次。

上面的描述描述了本发明的多个方面和实施方式。本申请具体来说设想了所述方面和实施方式的所有组合和排列。

实施例

现在正一般性描述的本发明，通过下面的实施例将更容易被理解，包括所述实施例仅仅是出于说明本发明的某些方面和实施方式，并不打算限制本发明。

实施例1–NKG2D结合结构域结合到NKG2D

NKG2D结合结构域结合到纯化的重组NKG2D

将人类、小鼠或食蟹猴NKG2D胞外结构域(ectodomains)的核酸序列与编码人类IgG1 Fc结构域的核酸序列融合，并引入到哺乳动物细胞中进行表达。在纯化后，将NKG2D-Fc融合蛋白吸附到微孔板的孔。在用牛血清白蛋白阻断所述孔以防止非特异性结合后，对NKG2D结合结构域进行滴定并将其添加到预先吸附有NKG2D-Fc融合蛋白的孔。第一抗体结合使用偶联到辣根过氧化物酶并特异性识别人类κ轻链以避免Fc交叉反应性的第二抗体来检测。向所述孔添加辣根过氧化物酶的底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)以可视化结合信号，所述信号在450nm处测量并在540nm处校正。向每个孔添加NKG2D结合结构域克隆、同种型对照或阳性对照(选自SEQ ID NO：45-48，或可以在eBioscience获得的抗小鼠NKG2D抗体克隆MI-6和CX-5)。

所述同种型对照显示出与重组NKG2D-Fc蛋白极小的结合，而所述阳性对照最强结合到所述重组抗原。由所有克隆产生的NKG2D结合结构域都表现出跨人类(图14)、小鼠(图16)和食蟹猴(图15)重组NKG2D-Fc蛋白的结合，尽管在不同克隆之间具有不同的亲和力。总体来说，每种抗NKG2D克隆以相近的亲和性结合到人类(图14)和食蟹猴(图15)重组NKG2D-Fc，但结合到小鼠(图16)重组NKG2D-Fc的亲和性较低。

NKG2D结合结构域结合到表达NKG2D的细胞

对EL4小鼠淋巴瘤细胞系进行工程化改造，以表达人类或小鼠NKG2D-CD3ζ信号传导结构域嵌合抗原受体。将NKG2D结合克隆、同种型对照或阳性对照以100nM的浓度用于染色在所述EL4细胞上表达的细胞外NKG2D。抗体结合使用荧光团偶联的抗人类IgG第二抗体来检测。细胞通过流式细胞术进行分析，并使用表达NKG2D的细胞与母体EL4细胞的平均荧光强度(MFI)的比较来计算背景的倍数(FOB)。

由所有克隆产生的NKG2D结合结构域都结合到表达人类和小鼠NKG2D的EL4细胞。阳性对照抗体(选自SEQ ID NO：45-48，或可以在eBioscience获得的抗小鼠NKG2D抗体克隆MI-6和CX-5)给出最好的FOB结合信号。在表达人类(图17)和小鼠(图18)NKG2D的细胞之间，每种克隆的NKG2D结合亲和力相近(分别为图17-18)。

实施例2–NKG2D结合结构域阻断天然配体结合到NKG2D

与ULBP-6的竞争

将重组人类NKG2D-Fc蛋白吸附到微孔板的孔，并将所述孔用牛血清白蛋白阻断以降低非特异性结合。向所述孔添加饱和浓度的ULBP-6-His-生物素，然后添加NKG2D结合结构域克隆。在孵育2小时后，将孔清洗，并通过链亲合素偶联的辣根过氧化物酶和TMB底物检测仍结合于NKG2D-Fc包被的孔的ULBP-6-His-生物素。吸收值在450nm处测量并在540nm处校正。在减去背景后，从被阻断与孔中的NKG2D-Fc蛋白结合的ULBP-6-His-生物素的百分率，来计算NKG2D结合结构域与NKG2D-Fc蛋白的特异性结合。阳性对照抗体(选自SEQ IDNO：45-48)和各种不同的NKG2D结合结构域阻断ULBP-6结合到NKG2D，而同种型对照显示与ULBP-6的竞争很小(图19)。

与MICA的竞争

将重组人类MICA-Fc蛋白吸附到微孔板的孔，并将所述孔用牛血清白蛋白阻断以降低非特异性结合。向所述孔添加NKG2D-Fc-生物素，然后添加NKG2D结合结构域。在孵育和清洗后，使用链亲合素-HRP和TMB底物检测仍结合于MICA-Fc包被的孔的NKG2D-Fc-生物素。吸收值在450nm处测量并在540nm处校正。在减去背景后，从被阻断与MICA-Fc包被的孔结合的NKG2D-Fc-生物素的百分率，来计算NKG2D结合结构域与NKG2D-Fc蛋白的特异性结合。阳性对照抗体(选自SEQ ID NO：45-48)和各种不同的NKG2D结合结构域阻断MICA结合到NKG2D，而同种型对照显示出与MICA的竞争很小(图20)。

与Rae-1δ的竞争

将重组小鼠Rae-1δ-Fc(购自R&D Systems)吸附到微孔板的孔，并将所述孔用牛血清白蛋白阻断以降低非特异性结合。向所述孔添加小鼠NKG2D-Fc-生物素，然后添加NKG2D结合结构域。在孵育和清洗后，使用链亲合素-HRP和TMB底物检测仍结合于Rae-1δ-Fc包被的孔的NKG2D-Fc-生物素。吸收值在450nm处测量并在540nm处校正。在减去背景后，从被阻断与Rae-1δ-Fc包被的孔结合的NKG2D-Fc-生物素的百分率，来计算NKG2D结合结构域与NKG2D-Fc蛋白的特异性结合。阳性对照(选自SEQ ID NO：45-48，或可以在eBioscience获得的抗小鼠NKG2D抗体克隆MI-6和CX-5)和各种不同的NKG2D结合结构域克隆阻断Rae-1δ结合到小鼠NKG2D，而同种型对照抗体显示出与Rae-1δ的竞争很小(图21)。

实施例3–NKG2D结合结构域克隆激活NKG2D

将人类和小鼠NKG2D的核酸序列融合到编码CD3ζ信号传导结构域的核酸序列以获得嵌合抗原受体(CAR)构建体。然后将所述NKG2D-CAR构建体使用Gibson组装克隆到逆转录病毒载体中，并转染到expi293细胞中用于逆转录病毒生产。将EL4细胞用含有NKG2D-CAR的病毒与8μg/mL聚凝胺一起感染。感染后24小时，通过流式细胞术分析所述EL4细胞中NKG2D-CAR的表达水平，并选择在细胞表面上表达高水平NKG2D-CAR的克隆。

为了确定NKG2D结合结构域是否激活NKG2D，将它们吸附到微孔板的孔，并将NKG2D-CAR EL4细胞在布雷菲德菌素-A和莫能菌素存在下在抗体片段包被的孔上培养4小时。通过流式细胞术测定细胞内TNF-α生产这种NKG2D激活的指示。将TNF-α阳性细胞相对于用阳性对照归一化处理。所有NKG2D结合结构域激活人类(图22)和小鼠(图23)NKG2D两者。

实施例4–NKG2D结合结构域激活NK细胞

原代人类NK细胞

使用密度梯度离心从人类外周血血沉棕黄层分离外周血单核细胞(PBMC)。使用磁珠负选择从PBMC分离NK细胞(CD3^-CD56⁺)，分离到的NK细胞的纯度通常>95％。然后将分离的NK细胞在含有100ng/mL IL-2的培养基中培养24-48小时，然后将它们转移到吸附有NKG2D结合结构域的微孔板孔，并在含有荧光团偶联的抗CD107a抗体、布雷菲德菌素-A和莫能菌素的培养基中培养。在培养后，使用荧光团偶联的针对CD3、CD56和IFN-γ的抗体通过流式细胞术测定NK细胞。在CD3^-CD56⁺细胞中分析CD107a和IFN-γ染色，以评估NK细胞激活。CD107a/IFN-γ双阳性细胞的增加指示了通过接合两个激活激活性受体而不是一个受体的更好的NK细胞激活。NKG2D结合结构域和阳性对照(选自SEQ ID NO：45-48)与同种型对照相比显示出变成CD107a⁺和IFN-γ⁺的NK细胞的百分率更高(图24和图25代表了两个独立实验，其各自使用不同供体的PBMC用于NK细胞制备)。

原代小鼠NK细胞

从C57Bl/6小鼠获得脾脏并将其通过70μm细胞筛压碎，以获得单细胞悬液。将细胞离心沉淀并重悬浮在ACK裂解缓冲液(购自Thermo Fisher Scientific#A1049201；155mM氯化铵，10mM碳酸氢钾，0.01mM EDTA)中，以除去红细胞。将剩余的细胞用100ng/mL hIL-2培养72小时，然后收获并准备用于NK细胞分离。然后用磁珠使用反向贫化技术从脾细胞分离NK细胞(CD3^-NK1.1⁺)，通常纯度>90％。将纯化的NK细胞在含有100ng/mL mIL-15的培养基中培养48小时，然后将它们转移到吸附有NKG2D结合结构域的微孔板孔，并在含有荧光团偶联的抗CD107a抗体、布雷菲德菌素-A和莫能菌素的培养基中培养。在NKG2D结合结构域包被的孔中培养后，使用荧光团偶联的针对CD3、NK1.1和IFN-γ的抗体通过流式细胞术测定NK细胞。在CD3^-NK1.1⁺细胞中分析CD107a和IFN-γ染色，以评估NK细胞激活。CD107a/IFN-γ双阳性细胞的增加指示了通过接合两个激活激活性受体而不是一个受体的更好的NK细胞激活。NKG2D结合结构域和阳性对照(选自可以在eBioscience获得的抗小鼠NKG2D抗体克隆MI-6和CX-5)与同种型对照相比显示出变成CD107a⁺和IFN-γ⁺的NK细胞的百分率更高(图26和图27代表了两个独立实验，其各自使用不同小鼠用于NK细胞制备)。

实施例5–NKG2D结合结构域能够引起对靶肿瘤细胞的细胞毒性

人类和小鼠原代NK细胞激活测定法证实了在与NKG2D结合结构域孵育后NK细胞上的细胞毒性标志物增加。为了研究这是否转变成肿瘤细胞裂解的增加，利用了基于细胞的测定法，其中将每个NKG2D结合结构域开发成单特异性抗体。将Fc区用作一个靶向臂，而Fab区(NKG2D结合结构域)充当另一个靶向臂，以激活NK细胞。将人类起源并表达高水平Fc受体的THP-1细胞用作肿瘤靶，并使用Perkin Elmer DELFIA细胞毒性试剂盒。将THP-1细胞用BATDA试剂标记，并以10⁵/mL重悬浮在培养基中。然后将标记的THP-1细胞与NKG2D抗体和分离的小鼠NK细胞在微孔板的孔中合并，在37℃下孵育3小时。在孵育后，取出20μl培养上清液，与200μl Europium溶液混合，并在暗处振摇孵育15分钟。通过装备有时间分辨荧光模块(激发337nm，发射620nm)的PheraStar读板器随时间测量荧光，并按照试剂盒说明书计算特异性裂解。

阳性对照ULBP-6、即NKG2D的天然配体，显示出THP-1靶细胞被小鼠NK细胞的特异性裂解的增加。NKG2D抗体也增加了THP-1靶细胞的特异性裂解，而同种型对照抗体显示出特异性裂解的减少。虚线指示在不添加抗体的情况下THP-1细胞被小鼠NK细胞的特异性裂解(图28)。

实施例6–NKG2D抗体显示出高的热稳定性

使用差示扫描荧光测定法测定NKG2D结合结构域的解链温度。外推的表观解链温度相对于典型的IgG1抗体来说更高(图29)。

实施例7–多特异性结合蛋白表现出提高的激活NK细胞的能力

使用密度梯度离心从人类外周血血沉棕黄层分离外周血单核细胞(PBMC)。使用磁珠负选择从PBMC分离NK细胞(CD3^-CD56⁺)，分离到的NK细胞的纯度通常>95％。然后将分离的NK细胞在含有100ng/mL IL-2的培养基中培养24-48小时，然后将它们转移到分别吸附有多特异性和双特异性结合蛋白的微孔板孔，并在含有荧光团偶联的抗CD107a抗体、布雷菲德菌素-A和莫能菌素的培养基中培养。在培养后，使用荧光团偶联的针对CD3、CD56和IFN-γ的抗体通过流式细胞术测定NK细胞。在CD3^-CD56⁺细胞中分析CD107a和IFN-γ染色，以评估NK细胞激活。CD107a/IFN-γ双阳性细胞的增加指示了更好的NK细胞激活。AL2.2是一种含有HER2结合结构域(曲妥珠单抗)、NKG2D结合结构域(ULBP-6)和人类IgG1 Fc结构域的多特异性结合蛋白。它从曲妥珠单抗同二聚体和ULBP-6-Fc同二聚体开始，通过受控Fab臂交换反应(cFAE)来制造(参见Labrijn等，Nature Protocols 9,2450-2463)。SC2.2是一种包括源自于曲妥珠单抗和ULBP-6的scFv的单链蛋白(SEQ ID NO：73)。

SEQ ID NO：73

MAAAAIPALLLCLPLLFLLFGWSRARRDDPHSLCYDITVIPKFRPGPRWCAVQGQVDEKTFLHYDCGNKTVTPVSPLGKKLNVTMAWKAQNPVLREVVDILTEQLLDIQLENYTPKEPLTLQARMSCEQKAEGHSSGSWQFSIDGQTFLLFDSEKRMWTTVHPGARKMKEKWENDKDVAMSFHYISMGDCIGWLEDFLMGMDSTLEPSAGAPLAMSSGTTQLRATATTLILCCLLIILPCFILPGI

CD107a和IFN-γ染色的分析表明同种型对照IgG不显示出NK细胞的激活，而与双特异性蛋白相比，在用多特异性结合蛋白刺激后变成CD107a⁺和IFN-γ⁺的NK细胞的百分率更高，证实了通过接合两个激活激活性受体(NKG2D和CD16)而不是仅仅一个激活激活性受体(NKG2D)的更强的NK细胞激活(图30)。预期这种NK细胞激活的增加将转变成更强有力的肿瘤细胞灭杀。

实施例8–多特异性结合蛋白对靶肿瘤细胞表现出增强的细胞毒性

原代人类NK细胞细胞毒性测定法

使用密度梯度离心从人类外周血血沉棕黄层分离外周血单核细胞(PBMC)。使用磁珠负选择从PBMC分离NK细胞(CD3^-CD56⁺)，分离到的NK细胞的纯度通常>95％。然后在用于细胞毒性测定法之前，将NK细胞在含有100ng/mL IL-2的培养基中培养过夜。第二天，将NK细胞以5x10⁵/mL重悬浮在新鲜培养基中。将人类乳腺癌细胞SkBr-3细胞按照Perkin ElmerDELFIA细胞毒性试剂盒用BATDA试剂标记，并以5x10⁴/mL重悬浮在培养基中。在培养基中制造所述多特异性结合蛋白的各种不同的稀释液。然后将NK细胞、标记的SkBr-3细胞和所述多特异性结合蛋白合并在微孔板的孔中，并在37℃孵育3小时。在孵育后，取出20μl培养上清液，与200μl Europium溶液混合并在暗处振摇孵育15分钟。通过装备有时间分辨荧光模块(激发337nm，发射620nm)的PheraStar读板器随时间测量荧光，并按照试剂盒说明书计算特异性裂解。AL0.2是一种含有HER2结合结构域(曲妥珠单抗)、NKG2D结合结构域(选自SEQID NO：1-44)和人类IgG1 Fc结构域的多特异性结合蛋白。它从曲妥珠单抗同二聚体和抗NKG2D抗体同二聚体开始，通过受控Fab臂交换反应(cFAE)来制造。AL0.2si基于AL0.2，并在Fc结构域中含有另外的D265A突变，其废止了CD16结合。曲妥珠单抗-si基于曲妥珠单抗，并在Fc结构域中含有另外的D265A突变，其废止了CD16结合。AL2.2是含有HER2结合结构域(曲妥珠单抗)、NKG2D结合结构域(ULBP-6)和人类IgG1 Fc结构域的多特异性结合蛋白。SC2.2是包括源自于曲妥珠单抗和ULBP-6的scFv的单链蛋白。

与曲妥珠单抗相比，AL0.2显示出以剂量依赖性方式增强SkBr-3靶细胞被人类NK细胞的裂解，在EC50下p值为0.0311(图31)。与AL0.2相比，AL0.2si(图32)和曲妥珠单抗-si(图33)显示出功效和SkBr-3细胞的最大特异性裂解两者的降低，在EC50下p-值分别为0.0002和0.0001(图32-33)。此外，与AL2.2相比，AL0.2显示出以剂量依赖性方式增强SkBr-3细胞的裂解(图34)。同种型对照IgG在试验的任何浓度下不显示出特异性裂解的增加。合在一起，所述数据证实了接合NK细胞上的2个激活激活性受体和一个肿瘤抗原的多特异性结合蛋白，与结合NK细胞上的一个激活激活性受体和一个肿瘤抗原的双特异性蛋白相比，引起肿瘤细胞被人类NK细胞更强力的杀伤。

原代小鼠NK细胞细胞毒性测定法

从C57Bl/6小鼠获得脾脏并将其通过70μm细胞筛压碎，以获得单细胞悬液。将细胞离心沉淀并重悬浮在ACK裂解缓冲液(购自Thermo Fisher Scientific#A1049201；155mM氯化铵，10mM碳酸氢钾，0.01mM EDTA)中，以除去红细胞。将剩余的细胞用100ng/mL hIL-2培养72小时，然后收获并准备用于NK细胞分离。然后用磁珠使用反向贫化技术从脾细胞分离NK细胞(CD3^-NK1.1⁺)，通常纯度>90％。将纯化的NK细胞在含有100ng/mL mIL-15的培养基中培养48小时，然后以10⁶/mL重悬浮在培养基中，用于细胞毒性测定法。将被工程化改造以表达HER2和dTomato的小鼠肿瘤细胞系的RMA-HER2-dTomato及其对照对应物即表达zsGreen的RMA细胞用作靶。将它们以2x10⁵/mL重悬浮在培养基中，并以1:1的比例接种到微孔板的孔中。在培养基中制造多特异性蛋白的稀释液，并与NK细胞一起添加到所述RMA细胞。在使用5％CO₂在37℃下孵育过夜后，通过流式细胞术确定RMA-HER2-dTomato和RMA-zsGreen细胞的百分率，使用荧光报告物来鉴定这两种细胞类型。特异性靶细胞死亡＝(1-((处理中RMA-Ca2T-dTomato细胞的％*对照组中RMA-zsGreen细胞的％)/(对照组中RMA-Ca2T-dTomato细胞的％*处理组中RMA-zsGreen细胞的％)))*100％。

与SC2.2(图36)和曲妥珠单抗(图35)相比，AL2.2在重新引导针对肿瘤靶的NK细胞应答中更加强力。对照蛋白对特异性靶死亡显示出很小影响。这些数据证实，接合NK细胞上的2个激活激活性受体和一个肿瘤抗原的多特异性结合蛋白，与结合NK细胞上的一个激活激活性受体和一个肿瘤抗原的双特异性蛋白相比，引起肿瘤细胞被小鼠NK细胞更强力的杀伤。

实施例9–多特异性结合蛋白结合到NKG2D

将EL4小鼠淋巴瘤细胞系工程化改造以表达人类NKG2D三特异性结合蛋白(TriNKET)，其如图1中所示各自含有NKG2D结合结构域、肿瘤相关抗原结合结构域(例如CD33、HER2、CD20或BCMA结合结构域)和结合到CD16的Fc结构域，并试验它们对EL4细胞上表达的细胞外NKG2D的亲和性。所述多特异性结合蛋白与NKG2D的结合使用荧光团偶联的抗人类IgG第二抗体来检测。将细胞通过流式细胞术进行分析，并使用表达NKG2D的细胞与母体EL4细胞的平均荧光强度(MFI)的比较来计算背景的倍数(FOB)。

所试验的TriNKET包括CD33-TriNKET-C26(ADI-28226和CD33结合结构域)、CD33-TriNKET-F04(ADI-29404和CD33结合结构域)、HER2-TriNKET-C26(ADI-28226和HER2结合结构域)、HER2-TriNKET-F04(ADI-29404和HER2结合结构域)、CD20-TriNKET-C26(ADI-28226和CD20结合结构域)、CD20-TriNKET-F04(ADI-29404和CD20结合结构域)、BCMA-TriNKET-C26(ADI-28226和BCMA结合结构域)、BCMA-TriNKET-F04(ADI-29404和BCMA结合结构域)、BCMA-TriNKET-F43(ADI-29443和BCMA结合结构域)和BCMA-TriNKET-F47(ADI-29447和BCMA结合结构域)。在所述试验的分子中使用的HER2结合结构域由曲妥珠单抗的重链可变结构域和轻链可变结构域构成。所述CD33结合结构域由下面列出的重链可变结构域和轻链可变结构域构成。

SEQ ID NO：74：

SEQ ID NO：75：

在所述试验的分子中使用的CD20结合结构域由重链可变结构域和轻链可变结构域构成。在所述试验的分子中使用的BCMA结合结构域由如下所列的重链可变结构域和轻链可变结构域构成。

EM-801重链可变结构域(SEQ ID NO：82)：

EM-801轻链可变结构域(SEQ ID NO：83)：

EM-901重链可变结构域(SEQ ID NO：76)：

EM-901轻链可变结构域(SEQ ID NO：77)：

所述数据显示，当本公开的蛋白质包括肿瘤抗原结合结构域例如CD33、HER2、CD20和BCMA时，所述TriNKET结合到NKG2D。

实施例10–多特异性结合蛋白结合到人类肿瘤抗原

三特异性结合蛋白结合到CD33、HER2、CD20和BCMA

将表达CD33的人类AML细胞系MV4-11用于测定TriNKET与肿瘤相关抗原的结合。将TriNKET和母体抗CD33单克隆抗体与所述细胞孵育，并使用荧光团偶联的抗人类IgG第二抗体检测结合。通过流式细胞术来分析细胞，并使用来自于TriNKET和母体单克隆抗CD33抗体的归一化到第二抗体对照的平均荧光强度(MFI)来计算背景的倍数(FOB)。与母体抗CD33抗体相比，CD33-TriNKET-C26和CD33-TriNKET-F04显示出可比的结合到CD33的水平(图41)。

将表达HER2的人类癌细胞系用于测定TriNKET与肿瘤相关抗原的结合。肾细胞癌细胞系786-O表达低水平的HER2。将TriNKET和任选地母体抗HER2单克隆抗体(曲妥珠单抗)与所述细胞孵育，并使用荧光团偶联的抗人类IgG第二抗体检测结合。通过流式细胞术来分析细胞，并使用来自于TriNKET和曲妥珠单抗的归一化到第二抗体对照的平均荧光强度(MFI)来计算背景的倍数(FOB)。与曲妥珠单抗相比，HER2-TriNKET-C26和HER2-TriNKET-F04显示出可比的结合到786-O细胞上表达的HER2的水平(图42)。

将表达BCMA的MM.1S人类骨髓瘤细胞用于测定TriNKET与肿瘤相关抗原BCMA的结合。将TriNKET和任选地母体抗BCMA单克隆抗体(EM-801)与所述细胞孵育，并使用荧光团偶联的抗人类IgG第二抗体检测结合。通过流式细胞术来分析细胞，并使用来自于TriNKET和EM-801的归一化到第二抗体对照的平均荧光强度(MFI)来计算背景的倍数(FOB)。与EM-801相比，C26--TriNKET-BCMA、F04-TriNKET-BCMA、F43-TriNKET-BCMA和F47-TriNKET-BCMA显示出可比的结合到MM.1S细胞上表达的BCMA的水平(图43)。

将表达CD20的Raji人类淋巴瘤细胞用于测定TriNKET与肿瘤相关抗原CD20的结合。将TriNKET与所述细胞孵育，并使用荧光团偶联的抗人类IgG第二抗体检测结合。通过流式细胞术来分析细胞并进行直方图作图。如图44中所示，CD20-TriNKET-C26和CD20-TriNKET-F04同等良好地结合到CD20。

实施例11–多特异性结合蛋白激活NK细胞

使用密度梯度离心从人类外周血血沉棕黄层分离外周血单核细胞(PBMC)。使用磁珠负选择从PBMC分离NK细胞(CD3^-CD56⁺)，分离到的NK细胞的纯度通常>90％。将分离的NK细胞在含有100ng/mL IL-2的培养基中培养用于激活或在没有细胞因子的情况下静息过夜。IL-2激活的NK细胞在激活后24-48小时内使用。

收获表达肿瘤抗原的人类癌细胞，并以2x10⁶/mL重悬浮在培养基中。将靶向所述肿瘤抗原的单克隆抗体或TriNKET在培养基中稀释。收获激活的NK细胞，将其清洗并以2x10⁶/mL重悬浮在培养基中。然后将癌细胞与单克隆抗体/TriNKET和激活的NK细胞在IL-2存在下混合。也向混合的培养基添加布雷菲德菌素-A和莫能菌素以阻断蛋白质运输出细胞，用于细胞内细胞因子染色。向所述混合的培养基添加荧光团偶联的抗CD107a抗体并将培养基孵育4小时，然后准备样品，用于使用荧光团偶联的针对CD3、CD56和IFN-γ的抗体进行FACS分析。在CD3^-CD56⁺细胞中分析CD107a和IFN-γ染色以评估NK细胞激活。CD107a/IFN-γ双阳性细胞的增加指示了通过接合两个激活激活性受体而不是一个受体的更好的NK细胞激活。

TriNKET介导分别与表达HER2的SkBr-3细胞(图47A)、Colo201细胞(图47B)和HCC1954细胞(图47C)共培养的人类NK细胞的激活，正如CD107a脱颗粒和IFN-γ生产的增加所指示的。SkBr-3细胞和HCC1954细胞具有高水平的表面HER2表达，并且Colo201具有中等的HER2表达。与单克隆抗体曲妥珠单抗相比，TriNKET在人类癌细胞存在下显示出人类NK细胞的更好的激活。单独的NK细胞、NK细胞加SkBr-3细胞被用作阴性对照。

TriNKET(C26-TriNKET-HER2和F04-TriNKET-HER2)介导与表达CD33的人类AMLMv4-11细胞共培养的人类NK细胞的激活，显示出CD107a脱颗粒和IFN-γ生产的增加。与单克隆抗CD33抗体相比，TriNKET(C26-TriNKET-HER2和F04-TriNKET-HER2)在表达HER2的人类癌细胞存在下显示出人类NK细胞的更好的激活(图47A-47C)。

在与表达靶的人类癌细胞系的共培养物中原代人类NK细胞被TriNKET激活

将原代人类NK细胞与CD20阳性人类癌细胞共培养导致TriNKET介导的原代人类NK细胞的激活(图62)。靶向CD20的TriNKET(例如C26-TriNKET-CD20和F04-TriNKET-CD20)介导与CD20阳性Raji细胞共培养的人类NK细胞的激活，正如CD107a脱颗粒和IFNγ细胞因子生产的增加所指示的(图62)。与单克隆抗体利妥昔单抗相比，两种TriNKET(例如C26-TriNKET-CD20和F04-TriNKET-CD20)显示出人类NK细胞的更好的激活(图62)。

利妥昔单抗_vH

利妥昔单抗_vL

将原代人类NK细胞与BCMA阳性MM.1S骨髓瘤细胞共培养导致TriNKET介导的原代人类NK细胞的激活。靶向BCMA的TriNKET(例如C26-TriNKET-BMCA和F04-TriNKET-BMCA)介导与MM.1S骨髓瘤细胞共培养的人类NK细胞的激活，正如CD107a脱颗粒和IFNγ细胞因子生产的增加所指示的(图63)。与同种型TriNKET相比，靶向BCMA的TriNKET(例如A44-TriNKET-BMCA、A49-TriNKET-BMCA、C26-TriNKET-BMCA、F04-TriNKET-BMCA、F43-TriNKET-BMCA、F43-TriNKET-BMCA、F47-TriNKET-BMCA和F63-TriNKET-BMCA)显示出提高的NK细胞活性(图63)。

实施例12–三特异性结合蛋白能够引起对靶癌细胞的细胞毒性

使用密度梯度离心从人类外周血血沉棕黄层分离外周血单核细胞(PBMC)。使用磁珠负选择从PBMC分离NK细胞(CD3-CD56⁺)，分离到的NK细胞的纯度通常>90％。将分离的NK细胞在含有100ng/mL IL-2的培养基中培养用于激活或在没有细胞因子的情况下静息过夜。IL-2激活的或静息NK细胞在第二天用于细胞毒性测定法。

为了试验人类NK细胞在TriNKET存在下裂解癌细胞的能力，按照制造商的说明书使用来自于Promega的cyto Tox 96无放射活性细胞毒性测定法(G1780)。简单来说，将表达肿瘤抗原的人类癌细胞收获，清洗，并以1-2x10⁵/mL重悬浮在培养基中。将静息和/或激活的NK细胞收获，清洗，并以10⁵-2.0x10⁶/mL重悬浮在与所述癌细胞相同的培养基中。在96孔板的每个孔中，将50μl癌细胞悬液与含有或不含靶向在所述癌细胞上表达的肿瘤抗原的TriNKET的50μl NK细胞悬液混合。在37℃和5％CO₂下孵育3小时15分钟后，向只含癌细胞的孔和只含培养基的孔添加10x裂解缓冲液，分别用于最大裂解和阴性试剂对照。然后将所述板放回到温箱另外45分钟，以达到总共4小时的孵育。然后将细胞离心沉积，将培养上清液转移到新的96孔板，并与用于显色的底物混合。将所述新的板在室温孵育30分钟，并在SpectraMax i3x上在492nm处读取吸光值。癌细胞的特异性裂解的百分率如下计算：特异性裂解的％＝((实验裂解–来自于单独的NK细胞的自发裂解–来自于单独的癌细胞的自发裂解)/(最大裂解–阴性试剂对照))x100％。

TriNKET介导人类NK细胞针对CD33阳性Molm-13人类AML细胞系的细胞毒性。如图53B中所示，将静息人类NK细胞与Molm-13癌细胞混合，并且TriNKET(例如C26-TriNKET-CD33和F04-TriNKET-CD33)能够以剂量响应性方式提高静息人类NK细胞针对所述癌细胞的细胞毒性活性。虚线指示不含TriNKET的静息NK细胞的细胞毒性活性。将激活的人类NK细胞与Molm-13癌细胞混合，并且TriNKET与抗CD33抗体相比，甚至更进一步地以剂量响应性方式提高激活的人类NK细胞针对所述癌细胞的细胞毒性活性(图53B)。

与曲妥珠单抗这种抗HER2单克隆抗体的细胞毒性活性相比，TriNKET提高NK细胞针对具有低的表面表达的靶的细胞毒性。将静息人类NK细胞与高表达HER2的SkBr肿瘤细胞和低表达HER2-expressing的786-O癌细胞混合，并且测定到TriNKET以剂量响应性方式提高静息人类NK细胞针对高和低表达HER2的癌细胞的细胞毒性活性的能力。图50A和图50B中的虚线指示在不存在TriNKET的情况下静息NK细胞针对所述癌细胞的细胞毒性活性。如图50B中所示，在将激活的人类NK细胞与低表达HER2的786-O细胞和TriNKET(例如CD26-TriNKET-HER2和F04-TriNKET-HER2)混合后，观察到激活的人类NK细胞针对所述癌细胞的剂量响应性细胞毒性活性。

测定到TriNKET介导的BCMA阳性骨髓瘤细胞的裂解。图64显示了TriNKET介导的BCMA阳性KMS12-PE骨髓瘤细胞被静息人类NK效应细胞的裂解。试验了使用相同的NKG2D结合结构域(A49)但不同的BCMA靶向结构域的两种TriNKET(cFAE-A49.801和cFAE-A49.901)的体外功效。两种TriNKET以相近的程度增加KMS12-PE细胞的NK细胞裂解，但使用EM-901靶向结构域的TriNKET提供更高的功效。

图65显示了使用不同的NKG2D结合结构域(A40、A44、A49、C26和F47)但相同的BCMA靶向结构域的几种TriNKET的细胞毒性活性。所述靶向BCMA的TriNKET的NKG2D结合结构域的改变产生最大灭杀以及TriNKET的功效的变动。与EM-901单克隆抗体相比，所有TriNKET都表现出提高的KMS12-PE靶细胞的灭杀(图65)。

实施例13

调查了人类NK细胞被交联的NKG2D和CD 16的协同激活。

原代人类NK细胞激活测定法

使用密度梯度离心从人类外周血血沉棕黄层分离外周血单核细胞(PBMC)。使用负磁珠(StemCell#17955)从PBMC纯化NK细胞。通过流式细胞术确定NK细胞为>90％CD3^-CD56⁺。然后将分离的NK细胞在含有100ng/mL hIL-2(Peprotech#200-02)的培养基中扩增48小时，然后用于激活测定法中。将抗体以2μg/ml(抗CD16抗体，Biolegend#302013)和5μg/mL(抗NKG2D抗体，R&D#MAB139)的浓度，在100μl无菌PBS中在96孔平底板上在4℃包被过夜，然后充分清洗所述孔以除去过量抗体。为了评估脱颗粒，将IL-2激活的NK细胞以5×10⁵个细胞/ml重悬浮在增补有100ng/mL hIL2和1μg/mL APC偶联的抗CD107a mAb(Biolegend#328619)的培养基中。然后将1×10⁵个细胞/孔添加到抗体包被的板上。分别以1:1000和1:270的最终稀释度添加蛋白质转运抑制剂布雷菲德菌素A(BFA，Biolegend#420601)和莫能菌素(Biolegend#420701)。将铺板的孔在5％CO₂中在37℃下孵育4小时。对于IFN-γ的细胞内染色来说，将NK细胞用抗CD3抗体(Biolegend#300452)和抗CD56 mAb(Biolegend#318328)标记，然后固定并通透化，并用抗IFN-γmAb(Biolegend#506507)标记。在对活的CD56⁺CD3^-细胞进行门选后，通过流式细胞术分析NK细胞的CD107a和IFN-γ表达。

为了调查受体组合的相对功效，通过板结合刺激进行了NKG2D或CD16的交联和两种受体的共同交联。如图45(图45A-45C)中所示，CD16和NKG2D的组合刺激产生大大提高的CD107a水平(脱颗粒)(图45A)和/或IFN-γ生产(图45B)。虚线表示每种受体的单独刺激的累加效应。

在用抗CD16抗体、抗NKG2D抗体或两种单克隆抗体的组合进行4小时的板结合刺激后，分析IL-2激活的NK细胞的CD107a水平和细胞内IFN-γ生产。图指示了平均值(n＝2)±SD。图45A展示了CD107a的水平；图45B展示了IFNγ的水平；图45C展示了CD107a的水平和IFNγ生产。图45A-45C中示出的数据代表了使用5位不同健康供体的5个独立实验。

在用曲妥珠单抗、抗NKG2D抗体或源自于曲妥珠单抗和抗NKG2D抗体的结合结构域的TriNKET进行4小时的板结合刺激后，分析IL-2激活的NK细胞的CD107a脱颗粒和细胞内IFN-γ生产(图46)。在所有情况下试验的抗体都是人类IgG1同种型。图指示了平均值(n＝2)±SD。

实施例14

TriNKET结合到细胞表达的人类NKG2D的评估

将用人类NKG2D转导的EL4细胞用于试验与细胞表达的人类NKG2D的结合。将TriNKET稀释到20μg/mL，然后连续稀释。将mAb或TriNKET稀释液用于染色细胞，并使用荧光团偶联的抗人类IgG第二抗体检测所述TriNKET或mAb的结合。通过流式细胞术分析细胞，将结合MFI归一化到第二抗体对照，以获得高于背景的倍数值。

TriNKET结合到细胞表达的人类癌抗原的评估

将表达CD33或HER2的人类癌细胞系用于评估源自于不同NKG2D靶向克隆的TriNKET的肿瘤抗原结合。将人类AML细胞系MV4-11用于评估TriNKET与细胞表达的CD33的结合。人类肾细胞癌细胞系786-O表达低水平的HER2，并被用于评估TriNKET与细胞表达的HER2的结合。将TriNKET稀释到20μg/mL并与相应的细胞温育。TriNKET的结合使用荧光团偶联的抗人类IgG第二抗体来检测。通过流式细胞术分析细胞，将对细胞表达的CD33和HER2的结合MFI归一化到第二抗体对照，以获得高于背景的倍数值。

人类HER2阳性癌细胞系的抗体结合容量的确定

测量了HER2阳性人类癌细胞系的抗体结合容量(ABC)。使用来自于的Bangs Lab的Quantum Simply Cellular试剂盒(#815)，并按照制造商的说明书制备抗体标记的珠子。简单来说，将4个珠子群体中的每一者用饱和量的抗HER2抗体染色，并且也将细胞群体用饱和量的相同抗体染色。获取每个珠子群体以及细胞群体的样品数据。使用伴随试剂盒提供的QuickCal工作表产生标准曲线，并为每个细胞系外推ABC值。

原代NK细胞被TriNKET的激活

使用密度梯度离心从人类外周血血沉棕黄层分离PBMC。将分离的PBMC清洗并准备用于NK细胞分离。NK细胞使用负选择技术用磁珠分离；分离到的NK细胞的纯度通常>90％CD3-CD56+。将分离到的NK细胞在含有100ng/mL IL-2的培养基中培养用于激活或在不含细胞因子的情况下静息过夜。IL-2激活的NK细胞在24-48小时后使用；静息NK细胞总是在纯化后一天使用。

从培养物收获表达感兴趣的癌症靶的人类癌细胞系，并将细胞调整到2x10⁶/mL。将靶向所述感兴趣的癌症靶的单克隆抗体或TriNKET在培养基中稀释。从培养物收获静息和/或激活的NK细胞，将细胞清洗并以2x10⁶/mL重悬浮在培养基中。向所述NK细胞添加IL-2和荧光团偶联的抗CD107a抗体用于激活培养。将布雷菲德菌素-A和莫能菌素稀释到培养基中以阻断蛋白质运输到细胞外，用于细胞内细胞因子染色。在96孔板中，对于200μl的总培养体积来说，添加50μl肿瘤靶、mAb/TriNKET、BFA/莫能菌素和NK细胞。将所述板温育4小时，然后准备样品用于FACS分析。

在4小时激活培养后，制备细胞用于通过流式细胞术、使用荧光团偶联的针对CD3、CD56和IFNγ的抗体进行分析。在CD3-CD56+群体中分析CD107a和IFNγ染色，以评估NK细胞激活。

原代人类NK细胞细胞毒性测定法

使用密度梯度离心从人类外周血血沉棕黄层分离PBMC。将分离的PBMC清洗并准备用于NK细胞分离。NK细胞使用负选择技术用磁珠分离，分离到的NK细胞的纯度通常>90％CD3-CD56+。将分离到的NK细胞在含有100ng/mL IL-2的培养基中培养或在不含细胞因子的情况下静息过夜。IL-2激活的或静息NK细胞在第二天用于细胞毒性测定法。

Cyto Tox 96 LHD释放测定法：

使用来自于Promega的cyto Tox 96无放射活性细胞毒性测定法(G1780)，在添加或不添加的TriNKET的情况下测量人类NK细胞裂解肿瘤细胞的能力。从培养物收获表达感兴趣的癌症靶的人类癌细胞系，将细胞用PBS清洗并以1-2x10⁵/mL重悬浮在生长培养基中以用作靶细胞。向每个孔添加50μl所述靶细胞悬液。将靶向感兴趣的癌抗原的单克隆抗体或TriNKET在培养基中稀释，向每个孔添加50μl稀释的mAb或TriNKET。从培养物收获静息和/或激活的NK细胞，将细胞清洗并根据所需的E:T比率以10⁵-2.0x10⁶/mL重悬浮在培养基中。向每个板孔添加50μl NK细胞，使总培养体积为150μl。将所述板在37℃和5％CO2下温育3小时15分钟。在所述温育后，向单独靶细胞的孔和仅含有培养基的孔添加10x裂解缓冲液，分别用于最大裂解和体积对照。然后将所述板放回到温箱另外45分钟，以使显色之前的总共温育4小时。

在温育后，将所述板从温箱取出，通过以200g离心5分钟将细胞沉积。将50μl培养上清液转移到清洁的微孔板，并向每个孔添加50μl底物溶液。将所述板避光并在室温温育30分钟。向每个孔添加50μl终止溶液，并在SpectraMax i3x上在492nm处读取吸光值。特异性裂解的％如下计算：特异性裂解的％＝((实验释放–来自于效应细胞的自发释放–来自于靶的自发释放)/(最大释放–自发释放))*100％。

DELFIA细胞毒性测定法：

从培养物收获表达感兴趣的靶的人类癌细胞系，将细胞用PBS清洗并以10⁶/mL重悬浮在生长培养基中，用于使用BATDA试剂(Perkin Elmer AD0116)进行标记。按照制造商的说明书标记所述靶细胞。在标记后，将细胞用PBS清洗3x，并以0.5-1.0x10⁵/mL重悬浮在培养基中。为了制备背景孔，放置标记细胞的等分试样，并将细胞从培养基离心出来。小心地一式三份向孔添加100μl所述培养基，以避免扰动沉积的细胞。向96孔板的每个孔添加100μl BATDA标记的细胞。保留用于来自于靶细胞的自发释放的孔，并通过添加1％Triton-X制备用于靶细胞的最大裂解的孔。将针对感兴趣的肿瘤靶的单克隆抗体或TriNKET在培养基中稀释，并向每个孔添加50μl稀释的mAb或TriNKET。从培养收获静息和/或激活的NK细胞，将细胞清洗，并根据所需E:T的比率以10⁵-2.0x10⁶/mL重悬浮在培养基中。向每个板孔添加50μl NK细胞，以使总培养体积为200μl。在测定法显色之前将所述板在37℃和5％CO2下温育2-3小时。

在培养2-3小时后，将板从温箱取出并通过以200g离心5分钟将细胞沉积。将20μl培养上清液转移到由制造商提供的清洁的微孔板，向每个孔添加200μl室温的europium溶液。将板避光并在摇板器上以250rpm温育15分钟。使用Victor 3或SpectraMax i3X仪器读板。特异性裂解的％如下计算：特异性裂解的％＝((实验释放–自发释放)/(最大释放–自发释放))*100％。

长期人类PBMC细胞毒性测定法：

将SkBr-3靶细胞用BacMam 3.0NucLight Green(#4622)标记以允许靶细胞的追踪。遵照制造商的流程进行SkBr-3靶细胞的标记。将膜联蛋白V Red(Essen Bioscience#4641)稀释并按照制造商的说明书制备。将单克隆抗体或TriNKET稀释在培养基中。向已经含有标记的SkBr-3细胞得96孔板的孔添加50μl mAb或TriNKET、膜联蛋白V和静息NK细胞；添加50ul完全培养基，以获得总共200μl的培养体积。

在IncuCyte S3上设置图像收集。每小时收集相、绿色和红色通道的图像，每个孔两张图像。图像分析使用IncuCyte S3软件进行。产生用于绿色和红色通道的遮罩以分别计数肿瘤细胞和膜联蛋白V阳性细胞的数目。为了计算膜联蛋白V阳性Mv4-11靶细胞的％，使用了下述公式。膜联蛋白V阳性SkBr-3细胞的％＝((重叠受试者计数)/(绿色受试者计数))*100％。

靶向HER+癌细胞的TriNKET与SC2.2的比较

靶向HER2的TriNKET比曲妥珠单抗在减少SkBr-3细胞数量上更加有效，在60小时后，只有60％的来自于零时的细胞留下。本公开的靶向表达HER2的肿瘤/癌细胞的TriNKET比SC2.2更加有效，所述SC2.2是由连接到NKG2D配体ULBP-6的源自于曲妥珠单抗的scFv建造而成的单链双特异性分子。SC2.2同时结合HER2+癌细胞和NKG2D+NK细胞。因此，调查了SC2.2在减少HER2+癌细胞数目中的有效性。体外激活和细胞毒性测定法证实了SC2.2在激活和杀伤NK细胞中有效。然而，SC2.2在RMA/S-HER2皮下肿瘤模型中未能证实功效。也使用过表达RMA/S-HER2的同系小鼠模型在体内试验了SC2.2的功效。在这个小鼠模型中，与介质对照相比，SC2.2未能证实肿瘤生长的控制。因此，尽管SC2.2能够激活和杀伤NK细胞并结合到HER2+癌细胞，但它们的性能不足以有效控制HER2+肿瘤生长。

SC2.2在C57Bl/6小鼠中的血清半衰期的评估

为了确定SC2.2在C57Bl/6小鼠中的血清半衰期，将SC2.2用荧光标签标记以追踪它的体内浓度。将SC2.2用IRDye 800CW(Licor#929-70020)标记。将所述标记的蛋白质静脉内注射到3只C57Bl/6小鼠中，在所指示的时间点从每只小鼠采血。在收集后将血液以1000g离心15min，从每个样品收集血清并储存在4℃下，直至所有时间点都已采集。

血清使用Odyssey CLx红外成像系统成像，并使用Image J软件定量来自于800通道的荧光信号。将图像强度归一化到第一个时间点，并将数据拟合到双相衰变方程。在这个实验系统中，SC2.2的β半衰期被计算为7小时左右。

SC2.2对抗RMA/S-HER2皮下肿瘤的体内试验

根据图56设计了一种体内研究来试验SC2.2对抗皮下RMA/S-HER2肿瘤的功效。将10⁶个用人类HER2转导的RMA/S细胞皮下注射到20只C57Bl/6小鼠的胁部。从肿瘤接种后第2天开始，每天通过IP注射施用SC2.2。SC2.2以高和低浓度与介质对照一起施用。从肿瘤接种后第4天开始，在研究期内的星期一、星期三和星期五测量肿瘤。肿瘤体积使用下述公式计算：肿瘤体积＝长度x宽度x高度。

TriNKET结合到表达人类NKG2D的细胞

确定了TriNKET结合表达人类NKG2D的细胞的能力。图37和图38显示了含有不同NKG2D结合结构域的两种TriNKET的剂量响应性结合。图37显示了当使用CD33结合结构域作为第二靶向臂时两种TriNKET的结合。图38显示了现在与HER2第二靶向臂配对的同样的两个NKG2D结合结构域。使用两种肿瘤靶向结构域时所述6种NKG2D结合结构域保持相同的结合概况图。

TriNKET结合到表达人类癌抗原的细胞

确定了TriNKET结合表达人类癌抗原的细胞的能力。图41和图42显示了TriNKET与细胞表达的CD33(图41)和HER2(图42)的结合。在NKG2D结合结构域之间，TriNKET与细胞表达的抗原的结合是一致的。TriNKET以与母体单克隆抗体可比的水平结合。

人类HER2阳性癌细胞系的抗体结合容量

表9显示了HER2表面定量的结果。SkBr-3和HCC1954细胞被鉴定为具有高(+++)水平的表面HER2。ZR-75-1和Colo201显示出中等水平(++)的表面HER2，786-O显示出最低水平的HER2(+)。

表9:HER2阳性癌细胞系的ABC

细胞系	HER2表达	ABC
			786-0	低	28,162
Colo201	中	273,568
			ZR-75-1	中	281,026
SkBr-3	高	6,820,532
			HCC1954	高	10,569,869

原代人类NK细胞在与表达不同水平的HER2的人类癌细胞系的共培养物中被TriNKET激活

图47A–47C显示了TriNKET和曲妥珠单抗能够在与HER2阳性人类肿瘤细胞的共培养物中激活原代人类NK细胞，其由CD107a脱颗粒和IFNγ细胞因子生产的增加所指示。使用各种不同的人类HER2癌细胞时，两种TriNKET与单克隆抗体曲妥珠单抗相比显示出人类NK细胞的更好的激活。

图47A显示了人类NK细胞当与SkBr-3细胞共培养时被TriNKET激活。图47B显示了人类NK细胞当与Colo201细胞共培养时被TriNKET激活。图47C显示了人类NK细胞当与HCC1954细胞共培养时被TriNKET激活。

TriNKET提高静息和IL-2激活的人类NK细胞的活性

图48A–48B显示了TriNKET介导的静息或IL-2激活的人类NK细胞在与表达CD33的人类AML细胞系MV4-11的共培养物中的激活。图48A显示了TriNKET介导的静息人类NK细胞的激活。图48B显示了TriNKET介导的来自于相同供体的IL-2激活的人类NK细胞的激活。静息NK细胞与IL-2激活的NK细胞相比显示出更少的背景IFNγ生产和CD107a脱颗粒。静息NK细胞与IL-2激活的NK细胞相比显示出IFNγ生产和CD107a脱颗粒的更大的变化。IL-2激活的NK细胞在用TriNKET刺激后显示出变成IFNγ+CD107a+的细胞的更高的百分率。

TriNKET增强静息和IL-2激活的人类NK细胞的细胞毒性

图49A–49B使用IL-2激活的和静息人类NK细胞显示了细胞毒性活性的TriNKET增强。图49A显示了静息人类NK细胞对SkBr-3肿瘤细胞的特异性裂解百分数。图49B显示了IL-2激活的人类NK细胞对SkBr-3肿瘤细胞的特异性裂解百分数。IL-2激活的和静息NK细胞群体来自于相同供体。与曲妥珠单抗相比，TriNKET更强力地引导激活的或静息NK细胞群体针对SkBr-3细胞的应答。

TriNKET增强NK细胞针对具有低表面表达的靶的细胞毒性

图50A-50B显示TriNKET与曲妥珠单抗相比，针对具有中等和低HER2的癌症提供了更大优势。图50A显示了高HER2的SkBr-3肿瘤细胞被激活的人类NK细胞的杀伤。图50B显示了低HER2的786-O肿瘤细胞被人类NK细胞的杀伤。TriNKET与曲妥珠单抗相比针对具有低HER2表达的癌细胞提供了更大优势。TriNKET针对具有低表面表达的靶提供了最大优势。

TriNKET在治疗具有FcR高表达的癌症或具有高水平FcR的肿瘤微环境中的优势

单克隆抗体疗法已被批准用于治疗许多癌症类型，包括血液和实体肿瘤两者。尽管在癌症治疗中使用单克隆抗体已改进了患者结果，但仍存在限制。机制研究证实，单克隆抗体通过多种机制包括ADCC、CDC、吞噬作用和信号阻断等发挥它们对肿瘤生长的效应。

最显著的是，ADCC被认为是单克隆抗体发挥其效应的主要机制。ADCC依赖于自然杀伤细胞表面上的低亲和性FcγRIII(CD16)的抗体Fc接合，其介导肿瘤细胞的直接裂解。在FcγR中，CD16对IgG Fc具有最低的亲和性，FcγRI(CD64)是高亲和性FcR，并且与CD16相比约1000倍强地结合到IgG Fc。

CD64通常表达在许多造血谱系例如髓系谱系上，并且可以表达在源自于这些细胞类型的肿瘤例如急性髓性白血病(AML)细胞上。浸润到所述肿瘤中的免疫细胞例如MDSC和单核细胞也表达CD64，并已知浸润所述肿瘤微环境。CD64被所述肿瘤或在肿瘤微环境中的表达可能对单克隆抗体疗法具有有害效应。CD64在肿瘤微环境中的表达使得这些抗体难以接合NK细胞表面上的CD16，因为所述抗体优先结合所述高亲和性受体。通过靶向NK细胞表面上的两种激活激活性受体，TriNKET可能可以克服CD64表达对单克隆抗体疗法的有害效应。

三种AML细胞系上的FcRγI(CD64)表达

开发了一种体外培养体系来测试TriNKET和单克隆抗体针对具有高和低水平CD64表面表达的肿瘤的活性。Molm-13和THP-1是两种具有相似的表面CD33表达的人类AML细胞系，但Molm-13细胞不表达CD64，而THP-1细胞在它们的表面上表达CD64(图51A–51C)。使用导向靶CD33的单克隆抗体或TriNKET，试验了肿瘤的CD64表达对单克隆抗体或TriNKET疗法的影响。图51A–51C显示了在三种人类AML细胞系即Molm-13细胞系(图51A)、Mv4-11细胞系(图51B)和THP-1细胞系(图51C)上高亲和性FcRγI(CD64)的表达。Molm-13细胞不表达CD64，而Mv4-11细胞具有低水平并且THP-1具有高水平的细胞表面CD64。

TriNKET在靶向具有FcR的高表面表达的肿瘤细胞中具有优势

图52A-52B显示了单克隆抗体或TriNKET介导的与Molm-13(图52B)或THP-1(图52A)细胞共培养的人类NK细胞的激活。针对人类CD33的单克隆抗体在Molm-13共培养系统中证实了人类NK细胞的良好激活，正如CD107a脱颗粒和IFNγ生产的增加所证实的。所述单克隆抗体在THP-1共培养系统中没有效果，其中在所述肿瘤上存在高水平的CD64。有趣的是，TriNKET有效地对抗Molm-13(图52B)和THP-1(图52A)细胞两者，而单克隆抗体不能激活与FcR-Hi THP-1细胞共培养的NK细胞，表明TriNKET能够克服与肿瘤上的CD64的结合并有效地靶向NK细胞进行激活。NK细胞上的两种激活激活性受体的双重靶向提供了与NK细胞的更强的特异性结合。仅靶向NK细胞上的CD16的单克隆抗体可以被其他高亲和性FcR结合并阻止接合NK细胞上的CD16。

使用Molm-13和THP-1共培养系统的人类NK细胞的细胞毒性测定法提供了另外的证据来支持TriNKET在高水平CD64存在下的功效。在这些细胞毒性测定法中使用了第三种人类AML细胞系Mv4-11。Mv4-11细胞(图51B)表达低水平的CD64，并且其表面上的CD64水平落于THP-1(图51C)与Molm-13(图51A)细胞之间。

不论FcγRI表达如何，TriNKET在AML细胞系上显示出功效

图53A–53C显示了使用三种人类AML细胞系作为靶的人类NK细胞毒性测定。针对CD33的单克隆抗体显示出针对不表达CD64的Molm-13细胞的良好功效(图53B)。表达CD64但水平比THP-1更低的Mv4-11细胞(图53A)，在使用单克隆抗CD33抗体时显示出降低的功效。THP-1细胞(图53C)在使用单独的单克隆抗CD33抗体时没有显示出效果。不论肿瘤细胞上的CD64表达如何，TriNKET能够介导人类NK细胞对这里试验的所有肿瘤细胞的应答。

图53A–53C显示出THP-1细胞由于它们表面上高水平的高亲和性FcR表达而受到保护，对单克隆抗体疗法没有响应。TriNKET通过靶向NK细胞表面上的两种激活激活性受体避开了这种保护。细胞毒性数据与在共培养激活实验中看到的结果直接相关。TriNKET能够避开使用THP-1细胞时看到的来自于mAb疗法的保护，并且尽管存在高水平的FcR仍能诱导NK细胞介导的裂解。

PBMC培养物中正常髓系细胞和正常B血细胞的杀伤：TriNKET通过更少的中靶偏离肿瘤副作用提供更好的安全性

自然杀伤细胞和CD8 T细胞两者都能够直接裂解肿瘤细胞，尽管NK细胞和CD8 T细胞识别正常的自身细胞和肿瘤细胞所通过的机制不同。NK细胞的活性受到来自于激活(NCR、NKG2D、CD16等)和抑制(KIR、NKG2A等)受体的信号的平衡调控。这些激活和抑制信号的平衡允许NK细胞确定是健康的自身细胞还是应激的、病毒感染的或转化的自身细胞。这种自体耐受的“内置”机制将帮助保护正常的健康组织免于NK细胞应答。为扩展这个原理，NK细胞的自体耐受将允许TriNKET靶向在自体和肿瘤两者上表达的抗原而没有偏离肿瘤副作用，或者具有增加的治疗窗口。

不同于自然杀伤细胞，T细胞需要识别被MHC分子呈递的特定肽才能激活和发挥效应功能。T细胞已作为免疫疗法的主要靶点，并且已经开发了许多策略来重新引导针对肿瘤的T细胞应答。T细胞双特异性物质、检查点抑制剂和CAR-T细胞都已被FDA批准，但通常苦于剂量限制性毒性。T细胞双特异性物质和CAR-T细胞通过使用结合结构域来靶向肿瘤细胞表面上的抗原并使用工程化的信号传导结构域将激活信号传导到效应细胞中，围绕TCR-MHC识别系统工作。尽管在引发抗肿瘤免疫应答中有效，但这些疗法通常伴有细胞因子释放综合征(CRS)和中靶偏离肿瘤副作用。在这种背景下TriNKET是独特的，因为它们不“重写”NK细胞激活和抑制的天然系统。相反，TriNKET被设计成动摇所述平衡并为NK细胞提供另外的激活信号，同时维持对健康自体细胞的NK耐受。

通过密度梯度离心从全血分离PBMC。通过在ACK裂解缓冲液中温育，将任何污染的红细胞裂解。将PBMC在PBS中清洗3x并对总PBMC进行计数。将PBMC在原代细胞培养基中调整到10⁶/mL。将1mL PBMC接种到24孔板的孔中，并将指示的TriNKET或mAb以10ug/mL添加到所述PBMC培养物。将细胞在37℃和5％CO2下培养过夜。第二天(24hr后)从培养物收获PBMC并制备用于FACS分析。在不同处理组中分析CD45+；CD19+B细胞和CD45+；CD33+；CD11b+髓系细胞的百分率。

图54B和54D显示自体髓系细胞受到保护免于TriNKET介导的NK细胞应答。图54A和54B显示来自于健康供体的B细胞对TriNKET介导的裂解敏感，而髓系细胞对TriNKET裂解有抗性。用靶向CD20的TriNKET处理的PBMC显示出使用CD45+淋巴细胞群体时CD19+B细胞的频率降低(图54A)，但在CD45+,CDD3-,CD56-淋巴细胞群体中没有影响(图54C)。在这些培养物中，CD45+,CD19+髓系细胞的频率(图54B)或CD33+,CD 33+,CD11b+髓系细胞的频率(图54D)未改变。

在长期共培养物中TriNKET介导SkBr-3肿瘤细胞的hPBMC杀伤原代人类PBMC细胞毒性测定法

图55显示了SkBr-3细胞在与人类PBMC的培养物中的长期杀伤。当单独培养时，SkBr-3细胞增殖并且在60小时内几乎倍增。当在培养物中向SkBr-3细胞添加人类PBMC时，增殖速率减缓，并且当添加靶向CD33的同种型对照TriNKET时增殖也减缓，但程度较低。当将培养物用曲妥珠单抗处理时，SkBr-3不再增殖，并且在60小时后，只有80％的来自于零时的细胞留下。由于SkBr-3细胞对HER2信号阻断敏感，因此对SkBr-3细胞生长的影响可能由HER2信号阻断或通过Fc效应物功能例如ADCC介导。

实施例15

mcFAE-C26.99 TriNKET在体外的抗肿瘤功效

为了验证鼠类cFAE-C26.99 TriNKET的结合活性，通过流式细胞术测定法测量了针对Tyrp-1阳性B16F10黑素瘤细胞(图58A)和过表达鼠类NKG2D的EL4细胞(EL4-mNKG2D，图58B)的直接结合，并与它的单克隆抗体进行比较。

为了试验mcFAE-C26.99 TriNKET是否保留介导细胞毒性的活性，测量了Tyrp-1阳性B16F10肿瘤靶被鼠类IL-2激活的NK细胞的杀伤。如图59中所示，在mcFAE-C26.99存在下鼠类NK细胞的细胞毒性活性提高。重要的是，抗Tyrp-1单克隆抗体TA99仅表现出边缘效应。

由mcFAE-C26.99 TriNKET介导的NK细胞毒性的提高

在测定前2天每孔接种约5x10³个B16F10黑素瘤细胞。在实验当天，在TA99 mab或mcFAE-C26.99 TriNKET(mcFAE-C26.99是具有小鼠IgG2c作为Fc的mC26和TA99的异二聚体。Gm突变是指用于产生异二聚体的异二聚作用突变)存在下添加5x10⁴个鼠类IL-2激活的NK细胞。使用20μg/mL 4倍稀释的抗体。在共培养4小时后，使用用于LDH释放的CytoTox96试剂盒评估细胞毒性的百分率。虚线表示在不存在抗体的情况下的基线细胞毒性。

mC26_hvL_mCL(粗体部分)(斜体下划线氨基酸是用于产生异二聚体的异二聚作用突变)：

mC26_hvH_IgG2CGmB

TA99_mvL_mCL

TA99_mvH_IgG2CGmA

实施例16

mcFAE-C26.99 TriNKET的体内抗肿瘤功效

为了试验mcFAE-C26.99是否在体内引发抗肿瘤功能，将C57BL/6小鼠用2x10⁵个B16F10肿瘤细胞皮下注射。将小鼠用同种型对照、单克隆TA99抗体或mcFAE-C26.99TriNKET治疗。使用单克隆TA99抗体的治疗显示出与使用同种型治疗的对照组中相似的肿瘤进展。然而，mcFAE-C26.99 TriNKET的施用与同种型治疗的组相比引起延迟的肿瘤进展。将约2x10⁵个B16F10黑素瘤细胞皮下注射到C57BL/6小鼠的胁部。在肿瘤接种后第6天，将小鼠随机分组(n＝每组10只)。小鼠用(图60A)同种型对照小鼠IgG2a mab C1.18.4和小鼠抗Tyrp-1单克隆抗体或(图60B)同种型对照小鼠IgG2a mab C1.18.4和mcFAE-C26.99TriNKET腹膜内治疗，它们以150μg的剂量注射(第6、8、10、12、14、16和21天)。肿瘤生长的评估进行28天。图显示了个体小鼠的肿瘤生长曲线。

除了所述皮下B16F10肿瘤模型之外，也在散播性肿瘤背景下试验了mcFAE-C26.99TriNKET的抗肿瘤功效。将1x10⁵个B16F10细胞静脉内注射到小鼠中。使用低(300μg/注射)和高(600μg/注射)抗体剂量的治疗始于第4天或第7天。在肿瘤接种后第18天，对肺转移肿瘤进行计数。当以高浓度使用TA99单克隆抗体或mcFAE-C26.99 TriNKET时，与同种型治疗的对照组相比，始于肿瘤接种后第4和7天的治疗引起肺转移肿瘤的数目减少。在低浓度下，只有mcFAE-C26.99 TriNKET降低肿瘤负荷(图61A)。当抗体在肿瘤接种后第7天开始施用时观察到类似的效应。总的来说，在所有试验的条件下，mcFAE-C26.99 TriNKET疗法与单克隆TA99抗体相比引起肺转移肿瘤的数目降低。将约1x10⁵个B16F10黑素瘤细胞静脉内注射到C57BL/6小鼠的尾静脉中(n＝每组8只)。小鼠留下来不治疗，或者用对照mab(同种型，克隆C1.18.4)、单克隆TA99抗体或TA99 TriNKET(mcFAE-C26.99)腹膜内治疗。图61A表示当抗体以150-μg的剂量施用时(第4、6、8、11、13、15天)的肿瘤负荷。图61B表示当抗体以150-μg的剂量施用时(第7、9、11、13、15天)的肿瘤负荷。在肿瘤挑战后18天，将小鼠安乐死并对表面肺转移肿瘤进行评分(图61B)。

实施例17

由TriNKET、单克隆抗体或双特异性抗体介导的静息人类NK细胞针对HER2阳性细胞的细胞毒性活性

使用密度梯度离心从人类外周血血沉棕黄层分离PBMC。将分离的PBMC清洗并准备用于NK细胞分离。NK细胞使用负选择技术通过磁珠进行分离，分离到的NK细胞的纯度通常为>90％CD3-CD56+。将分离到的NK细胞在含有100ng/mL IL-2的培养基中培养或在没有细胞因子的情况下静息过夜。IL-2激活的或静息NK细胞在第二天用于细胞毒性测定法中。

DELFIA细胞毒性测定法：

从培养物收获表达感兴趣的靶的人类癌细胞系，将细胞用HBS清洗并以10⁶/mL重悬浮在生长培养基中，用于使用BATDA试剂(Perkin Elmer AD0116)进行标记。按照制造商的说明书标记所述靶细胞。在标记后，将细胞用HBS清洗3x，并以0.5-1.0x10⁵/mL重悬浮在培养基中。为了制备背景孔，放置标记细胞的等分试样，并将细胞从培养基离心出来。小心地一式三份向孔添加100μl所述培养基，以避免扰动沉积的细胞。向96孔板的每个孔添加100μl BATDA标记的细胞。保留用于来自于靶细胞的自发释放的孔，并通过添加1％Triton-X制备用于靶细胞的最大裂解的孔。将针对感兴趣的肿瘤靶的单克隆抗体或TriNKET在培养基中稀释，并向每个孔添加50μl稀释的mAb或TriNKET。从培养收获静息和/或激活的NK细胞，将细胞清洗，并根据所需E:T的比率以10⁵-2.0x10⁶/mL重悬浮在培养基中。向每个板孔添加50μl NK细胞，以使总培养体积为200μl。在测定法显色之前将所述板在37℃和5％CO2下温育2-3小时。

在培养2-3小时后，将板从温箱取出并通过以200g离心5分钟将细胞沉积。将20μl培养上清液转移到由制造商提供的清洁的微孔板，向每个孔添加200μl室温的europium溶液。将板避光并在摇板器上以250rpm温育15分钟。使用Victor 3或SpectraMax i3X仪器读板。特异性裂解的％如下计算：特异性裂解的％＝((实验释放–自发释放)/(最大释放–自发释放))*100％。

单克隆抗体和双特异性NK细胞衔接器的组合不能重演TriNKET活性：

图66显示了由TriNKET、单克隆抗体或双特异性抗体介导的静息人类NK细胞针对HER2阳性Colo-201细胞系的细胞毒性活性。靶向HER2的TriNKET(ADI-29404(F04))诱导静息人类NK细胞对Colo-201细胞的最大裂解。将D265A突变引入到TriNKET的CH2结构域中以废除FcR结合。HER2-TriNKET(ADI-29404(F04))-D265A不能介导Colo-201细胞的裂解，证实了对NK细胞上CD16和NKG2D的双重靶向的重要性。为了进一步证实NK细胞上的双重靶向的重要性，将单克隆抗体曲妥珠单抗用于靶向HER2并介导NK细胞的ADCC，单独的曲妥珠单抗能够提高Colo-201细胞的NK细胞裂解，但通过单独的曲妥珠单抗获得的最大裂解与TriNKET相比低约4倍。为了了解在同一分子上具有CD16和NKG2D靶向的重要性，将TriNKET(ADI-29404(F04))活性与靶向HER2和NKG2D的双特异性抗体与曲妥珠单抗的组合的活性进行比较。当以等摩尔浓度使用时，双特异性抗体与曲妥珠单抗的组合不能介导Colo-201细胞被静息人类NK细胞的最大裂解。曲妥珠单抗+双特异性抗体组合的失败证实了在一个分子中含有TriNKET的三特异性结合的重要性。

通过参考并入

本文中提到的每个专利文献和科学论文的整个公开内容为所有目的通过参考并入本文。

等同性

本发明可以以其他特定形式体现而不背离其精神或本质特征。因此，前述实施方式应该在所有情况下被认为是说明性的而不是限制本文描述的发明。因此，本发明的范围由随附的权利要求书而不是上面的描述指明，并且打算将进入权利要求书的意义和等同性范围之内的所有变化涵盖在其中。

Claims (24)

1.一种蛋白质，其包含：

(a)结合NKG2D的第一抗原结合位点；

(b)结合肿瘤相关抗原的第二抗原结合位点；和

(c)抗体Fc结构域或其足以结合CD16的部分或结合CD16的第三抗原结合位点。

2.如权利要求1所述的蛋白质，其中所述第一抗原结合位点结合到人类、非人类灵长动物和啮齿动物中的NKG2D。

3.如权利要求1或2所述的蛋白质，其中所述第一抗原结合位点包含重链可变结构域和轻链可变结构域。

4.如权利要求3所述的蛋白质，其中所述重链可变结构域和轻链可变结构域存在于同一多肽上。

5.如权利要求3或4所述的蛋白质，其中所述第二抗原结合位点也包含重链可变结构域和轻链可变结构域。

6.如权利要求5所述的蛋白质，其中所述第一抗原结合位点的轻链可变结构域具有与所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域的氨基酸序列相同的氨基酸序列。

7.如权利要求1或2所述的蛋白质，其中所述第一抗原结合位点是单域抗体。

8.如权利要求7所述的蛋白质，其中所述单域抗体是V_HH片段或V_NAR片段。

9.如权利要求1-4或7-8任一项所述的蛋白质，其中所述第二抗原结合位点是单域抗体。

10.如权利要求9所述的蛋白质，其中所述第二抗原结合位点是V_HH片段或V_NAR片段。

11.如权利要求1、2、7或8所述的蛋白质，其中所述第二抗原结合位点包含重链可变结构域和轻链可变结构域。

12.如前述权利要求任一项所述的蛋白质，其中所述第一抗原结合位点包含与SEQ IDNO：1至少90％同一性的重链可变结构域。

13.如权利要求1-11任一项所述的蛋白质，其中所述第一抗原结合位点包含与SEQ IDNO：41至少90％同一性的重链可变结构域和与SEQ ID NO：42至少90％同一性的轻链可变结构域。

14.如权利要求1-11任一项所述的蛋白质，其中所述第一抗原结合位点包含与SEQ IDNO：43至少90％同一性的重链可变结构域和与SEQ ID NO：44至少90％同一性的轻链可变结构域。

15.如权利要求1-11任一项所述的蛋白质，其中所述第一抗原结合位点包含与SEQ IDNO：69至少90％同一性的重链可变结构域和与SEQ ID NO：70至少90％同一性的轻链可变结构域。

16.如权利要求1-11任一项所述的蛋白质，其中所述第一抗原结合位点包含与SEQ IDNO：71至少90％同一性的重链可变结构域和与SEQ ID NO：72至少90％同一性的轻链可变结构域。

17.如前述权利要求任一项所述的蛋白质，其中所述肿瘤相关抗原选自HER2、CD20、CD33、BCMA、EpCAM、CD2、CD19、CD30、CD38、CD40、CD52、CD70、EGFR/ERBB1、IGF1R、HER3/ERBB3、HER4/ERBB4、MUC1、cMET、SLAMF7、PSCA、MICA、MICB、TRAILR1、TRAILR2、MAGE-A3、B7.1、B7.2、CTLA4和PD1。

18.如前述权利要求任一项所述的蛋白质，其中所述蛋白质包含抗体Fc结构域的足以结合CD16的部分，其中所述抗体Fc结构域包含铰链和CH2结构域。

19.如权利要求1-17任一项所述的蛋白质，其中所述蛋白质包含与人类IgG1抗体的234-332位氨基酸至少90％同一性的氨基酸序列。

20.一种制剂，其包含如前述权利要求任一项所述的蛋白质和可药用载体。

21.一种细胞，其包含一种或多种编码如权利要求1-19任一项所述的蛋白质的核酸。

22.一种直接或间接增强肿瘤细胞死亡的方法，所述方法包括将肿瘤和自然杀伤细胞暴露于如权利要求1-19任一项所述的蛋白质。

23.一种治疗癌症的方法，其中所述方法包括向患者施用如权利要求1-19任一项所述的蛋白质或如权利要求20所述的制剂。

24.如权利要求23所述的方法，其中所述癌症选自急性髓性白血病、急性骨髓单核细胞性白血病、B细胞淋巴瘤、膀胱癌、乳腺癌、结肠直肠癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤、食管癌、尤文氏肉瘤、滤泡性淋巴瘤、胃癌、胃肠癌、胃肠道间质肿瘤、胶质母细胞瘤、头颈癌、黑素瘤、间皮瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、肾细胞癌、神经母细胞瘤、非小细胞肺癌、神经内分泌肿瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肉瘤、小细胞肺癌、T细胞淋巴瘤、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、尿路上皮癌、髓样来源的抑制性细胞浸润的癌症、细胞外基质沉积的癌症、高水平反应性基质的癌症和新血管生成的癌症。

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